BRPI0619794A2 - uso de um fator de reprogramação, agente, célula-tronco pluripotente induzida, método para preparar célula-tronco pluripotente induzida e célula somática, e, uso de célula-tronco pluripotente induzida - Google Patents

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Abstract

USO DE UM FATOR DE REPROGRAMAçãO, AGENTE, CéLULA-TRONCO PLURIPOTENTE INDUZIDA, MéTODO PARA PREPARAR CéLULA-TRONCO PLURIPOTENTE INDUZIDA E CéLULA SOMáTICA, E, USO DE CéLULA-TRONCO PLURIPOTENTE INDUZIDA. é descrito um meio para induzir a reprogramação de uma célula diferenciada sem o uso de qualquer célula embrionária ou ES e estabelecimento de uma célula-tronco pluripotente possuindo pluripoténcia e capacidade crescimento para aquelas de uma célula ES em uma maneira simples e com reprodutibilidade boa. Como o meio, é proporcionado um fator de reprogramação nuclear para uma célula somática, que compreende produtos dos seguintes três genes: um gene da família Oct; um gene da família Klf; e um gene da família Myc.

Description

"USO DE UM FATOR DE REPROGRAMAÇÃO, AGENTE, CÉLULA- TRONCO PLURIPOTENTE INDUZIDA, MÉTODO PARA PREPARAR CÉLULA-TRONCO PLURIPOTENTE INDUZIDA E CÉLULA SOMÁTICA, E, USO DE CÉLULA-TRONCO PLURIPOTENTE INDUZIDA."
Campo Técnico
A presente invenção refere-se a um fator de reprogramação nuclear possuindo uma ação de reprogramação de uma célula somática diferenciada para derivar uma célula-tronco pluripotente induzida.
Arte Anterior
Células-tronco embrionárias (células ES) são células-tronco estabelecidas de embriões prematuros de humano ou de camundongo que possuem aspectos característicos com os quais podem ser cultivadas durante um período de tempo longo simultaneamente mantendo capacidade pluripotente para se diferenciarem em todos os tipos de células existentes em corpos vivos. É esperado que células-tronco embrionárias de humano sejam usadas como recursos para terapias de transplante celular para várias doenças tais como doença de Parkinson, diabetes juvenil, e leucemia, se beneficiando das propriedades acima mencionadas. Contudo, o transplante de células ES possui um problema de causa de rejeição na mesma maneira que o transplante de órgãos. Além disso, de um ponto de vista ético, há muitas opiniões discordantes contra o uso de células ES que são estabelecidas pela destruição de embriões humanos. Se diferenciação das próprias células somáticas diferenciadas do próprio paciente puder ser induzida para estabelecer células possuindo pluripotência e capacidade crescimento similares àquelas das células ES, (neste relatório descritivo, estas células são referidas como "células-tronco plutipotentes induzidas (células iPS)", apesar de elas algumas vezes serem chamadas de "células semelhantes às células-tronco embrionárias" ou "células tipo ES"), é antecipado que tais células poderiam ser usadas como células pluripotentes ideais, livres de dificuldades de rejeição ou éticas.
Como um método para reprogramação de um núcleo somático, por exemplo, uma técnica de estabelecimento de uma célula-tronco embrionária a partir de um embrião clonado, preparado por transplante de um núcleo de uma célula somática para dentro de um ovo, foi relatada (W.S. Hwang et al., Science, 303, pp. 1669-74, 2004; W.S. Hwang et al., Science, 308, pp. 1777-83, 2005: contudo, foi provado que estes artigos foram falsificações e mais tarde foram descartados). Entretanto, esta técnica de preparação de embrião clonado apenas para o propósito de estabelecimento de células ES, apresenta problemas éticos muito mais sérios quando comparada com as células ES ordinárias usando embriões excedentes produzidos em terapia de fertilização. Uma técnica de reprogramação de um núcleo de célula somática pela fusão de uma célula somática e uma célula ES também foi relatada (M. Tada et al., Curr. Biol., 11, pp.1553-1558, 2001; C.A. Cowan et al., Science, 309, pp.1369-73, 2005). Entretanto, este método resulta no uso de células ES de humano, que falham em proporcionar uma solução para as dificuldades éticas. Ademais, uma técnica de reprogramação de um núcleo de célula pela reação de um extrato de uma cepa de célula, derivada de um tumor de célula germinativa gerado em um humano, com uma célula diferenciada foi relatada (C.K. Taranger et al., Mol. Biol. Cell, 16, pp.5719-35, 2005). Contudo, foi completamente desconhecido qual componente no extrato induziu a reprogramação neste método, e portanto, este método apresenta problemas de confiabilidade técnica e de segurança.
Foi proposto um método para triagem de um fator de reprogramação nuclear possuindo uma ação de reprogramação de células somáticas diferenciadas para derivar células-tronco pluripotentes (Publicação Internacional W02005/80598). Este método compreende as etapas de contatar com cada substância de teste as células somáticas contendo um gene, no qual um gene marcador é posicionado de modo a receber controle de expressão por uma região de controle de expressão dos genes ECAT (transcrito associado à célula ES) (i.e., uma classe de genes especificamente expressados em células ES); examinar a presença ou a ausência da aparência de uma célula que expressa o gene marcador; e escolher uma substância de teste indutora da aparência de citada célula como uma candidata de um fator de reprogramação nuclear para células somáticas. Um método para reprogramação de uma célula somática é descrito em Exemplo 6 e semelhante da publicação acima. Contudo, esta publicação falha em relatar uma identificação real de um fator de reprogramação nuclear.
Documento de Patente 1: Publicação Internacional WO2005/80598
Descrição da Invenção
Um objetivo da presente invenção é a provisão de um fator de reprogramação nuclear. Mais especificamente, um objetivo da presente invenção é a provisão de um meio para induzir a reprogramação de uma célula diferenciada sem o uso de ovos, embriões, ou células-tronco, para convenientemente e elevadamente reproduzivelmente estabelecer uma célula- tronco pluripotente possuindo pluripotência e capacidade crescimento similares àquelas das células ES.
Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas para alcançar o objetivo acima mencionado e tentaram identificar um fator de reprogramação nuclear pelo uso do método de triagem para um fator de reprogramação nuclear descrito na Publicação Internacional WO2005/80598. Como um resultado, 24 tipos de genes candidatos foram encontrados como genes relacionados com a reprogramação nuclear, e dentre eles, três tipos de genes foram encontrados como genes essenciais para a reprogramação nuclear. A presente invenção foi realizada tendo por base as descobertas acima mencionadas.
A presente invenção assim proporciona um fator de reprogramação nuclear para uma célula somática, que compreende um produto de gene de cada um dos três tipos de genes: um gene da família Oct, um gene da família Klf, e um gene da família Myc. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, é proporcionado o fator acima mencionado compreendendo um produto de gene de cada um dos seguintes três tipos de genes: Oct3/4, Klf4 e c-Myc.
De acordo com outra modalidade preferida, é proporcionado o fator acima mencionado, que adicionalmente compreende um produto de gene do seguinte gene: um gene da família Sox, e como uma modalidade mais preferida, é proporcionado o fator acima mencionado, que compreende um produto de gene de Sox2.
De acordo com ainda outra modalidade, é proporcionado o fator acima mencionado, que compreende uma citocina juntamente com o produto de gene do gene da família Myc. Como uma modalidade mais preferida, é proporcionado o fator acima mencionado, no qual a citocina é fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) e/ou fator de célula-tronco (SCF).
De acordo com as modalidades particularmente preferidas, são proporcionados um fator de reprogramação nuclear para uma célula somática, que compreende um produto de gene de o gene TERT em adição a um produto de gene de cada um de um gene da família Oct, um gene da família K1f, um gene da família Myc, e um gene da família Sox; e o fator acima mencionado, que compreende um produto de gene ou produtos de gene de um ou mais tipos de genes selecionados do grupo consistindo dos seguintes genes: antígeno SV40 Large T, HPVl6 E6, HPV16 E7, e Bmil, em adição a um produto de gene de cada um de o Gene da família Oct, o Gene da família K1f, o Gene da família Myc, o Gene da família Sox, e o gene TERT. Em adição a estes fatores, é proporcionado o fator acima mencionado, que adicionalmente compreende um produto de gene ou produtos de gene de um ou mais tipos de genes selecionados do grupo consistindo dos seguintes: Fbxl5, Nanog, ERas, ECAT15-2, Tcll, e β- catenina.
De acordo com outra modalidade preferida da invenção acima mencionada, também é proporcionado o fator acima mencionado, que compreende um produto de gene ou produtos de gene de um ou mais tipos de genes selecionados do grupo consistindo dos seguintes: ECATl, Esgl, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Soxl5, ECATl5-1, Fthl 17, Sall4, Rexl, UTF1, Stella, Stat3, e Grb2.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a preparação de uma célula-tronco pluripotente induzida por reprogramação nuclear de uma célula somática, que compreende a etapa de contatar o fator de reprogramação nuclear acima mencionado com a célula somática.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, são proporcionados o método acima mencionado, que compreende a etapa de adicionar o fator de reprogramação nuclear acima mencionado em uma cultura de células somáticas; o método acima mencionado, que compreende a etapa de introduzir um gene codificador do fator de reprogramação nuclear acima mencionado na célula somática; o método acima mencionado, que compreende, a etapa de introduzir o citado gene na célula somática pelo uso de um vetor recombinante contendo pelo menos um tipo de gene codificador do fator de reprogramação nuclear acima mencionado; e o método acima mencionado, no qual uma célula somática isolada de um paciente é usada como a célula somática.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula-tronco pluripotente induzida obtida pelo método acima mencionado. Presente invenção também proporciona uma célula somática derivada pela indução de diferenciação da célula-tronco pluripotente induzida acima mencionada.
A presente invenção adicionalmente proporciona um método para terapia de célula-tronco, que compreende a etapa de transplantar uma célula somática, no qual a citada célula é obtida pela indução de diferenciação de uma célula-tronco pluripotente induzida obtida pelo método acima mencionado usando uma célula somática isolada e colhida de um paciente, para dentro de um paciente.
A presente invenção adicionalmente proporciona um método para avaliação de uma função fisiológica ou toxicidade um composto, um medicamento, um veneno ou semelhante pelo uso de várias célula obtidas pela indução de diferenciação uma célula-tronco pluripotente induzida obtida pelo método acima mencionado.
Presente invenção também proporciona um método para melhorar a capacidade diferenciação e/ou o crescimento de uma célula, que compreende a etapa de contatar o fator de reprogramação nuclear acima mencionado com a célula, e adicionalmente proporciona uma célula obtida pelo método acima mencionado, e uma célula somática derivada pela indução de diferenciação de uma célula obtida pelo método acima mencionado.
Pelo uso do fator de reprogramação nuclear proporcionado pela presente invenção, reprogramação de um núcleo de célula diferenciada pode ser conveniente e elevadamente reproduzivelmente induzida sem o uso de embriões ou de células ES, e uma célula-tronco pluripotente induzida, como uma célula não-diferenciada possuindo capacidade diferenciação, pluripotência, e capacidade crescimento similares àquelas de células ES, pode ser estabelecida. Por exemplo, uma célula-tronco pluripotente induzida possuindo capacidade crescimento e pluripotência de diferenciação altas pode ser preparada a parti de uma célula somática de paciente pelo uso do fator de reprogramação nuclear da presente invenção. Células obteníveis por diferenciação de citada célula (por exemplo, células de músculo cardíaco, células produtoras de insulina, células nervosas e semelhante) são extremamente úteis, porque podem ser utilizadas para terapias de transplante de célula-tronco para uma variedade doenças tais como insuficiência cardíaca, diabetes mellitus dependente de insulina, doença de Parkinson e lesão na espinha dorsal, deste modo o problema ético referente ao uso de embrião humano e à rejeição após o transplante pode ser evitado. Ademais, várias células obteníveis por diferenciação da célula-tronco pluripotente induzida (por exemplo, células de músculo cardíaco, células hepáticas e semelhante) são elevadamente úteis como sistemas para avaliação de eficácia e ou de toxicidade compostos, medicamentos, venenos e semelhante.
Breve Explanação dos Desenhos
Fig. 1 mostra um método de triagem para fatores de reprogramação usando fibroblastos embrionários (MEFs) de um camundongo possuindo o gene βgeo laiockin Fbxl5.
Fig. 2 mostra fotografias exibindo morfologia de células iPS obtidas pela introdução dos 24 genes mostrados em Tabela 1. Morfologias de células diferenciadas (MEF) e de células-tronco embrionárias normais (ES) também são mostradas como uma referência.
Fig. 3 mostra perfis de expressão de genes marcadores em células iPS. Os resultados de RT-PCR usando RNAs totais extraídos de células iPS, células ES e células MEF como modelos são mostrados.
Fig. 4 mostra estado de metilação de DNA em células iPS. DNAs genômicos extraídos de células iPS, células ES, e células MEF foram tratados com bissulfito. Os DNAs alvos foram amplificados por PCR e então inseridos em plasmídeo. Dez clones de plasmídeo foram isolados para cada um dos genes, e seqüenciados. CpGs metilados são indicados com círculos fechados, e CpGs não-metilados com círculos abertos. Fig. 5 mostra números de colônia de células G418 obtidas pela transdução de grupo de 24 genes e grupo de 23 genes nos quais cada gene individual foi removido do grupo de 24 genes. As partes inferiores do gráfico mostram números de colônia obtidos em uma semana após a seleção de G418, e as partes superiores do gráfico mostram números de clones obtidos em três semanas. Quando cada gene boxed (o número de referência para cada gene é o mesmo que indicado em Tabela 1) foi removido, nenhumas colônias foram obtidas, ou apenas umas pouco colônias foram observadas após 3 semanas.
Fig. 6 mostra os números de colônia de células G418 obtidas por transdução de grupo de 10 genes e grupos de 9 genes nos quais cada gene individual foi removido do grupo de 10 genes. Quando cada um dos genes #14, #15 ou #20 foi removido, nenhuma colônia foi removida. Quando o gene #22 foi removido, umas poucas colônias resistentes a G418 foram obtidas. Contudo, as células deram morfologia diferenciada que foi aparentemente diferente daquela de células iPS.
Fig. 7 mostra os números de colônias emergidas resistentes a G418 (colônia reprogramada) com grupo de 10 genes, grupo de 4 genes, grupo de 3 genes, ou grupo de 2 genes. Tamanhos e morfologia típicos das colônias são mostrados.
Fig. 8 exibe fotografias mostrando resultados de coloração de hematoxilina-eosina (Η & E) de tumores formados após transplante subcutâneo de células iPS derivadas de MEFs em camundongos nus. Diferenciação em uma variedade tecidos em um sistema triploblástico foi observada.
Fig. 9 exibe fotografias de embriões preparados pelo transplante de células iPS derivadas de fibroblastos dermais de adulto em blastocistos de camundongo e transplante das células para dentro dos úteros de camundongas pseudo-grávidas. Pode ser observado que, no embrião esquerdo superior, células derivadas de células iPS (emitindo fluorescência verde) foram sistemicamente distribuídas. Nas fotografias inferiores, pode ser observado que todas as células do coração, fígado, e medula espinhal do embrião foram positivas para GFP e foram derivadas das células iPS.
Fig. 10 exibe fotografias mostrando resultados de RT-PCR confirmando a expressão dos genes marcadores de célula ES. Nas fotografias, Sox2 menos indica células iPS estabelecidas pela transdução de 3 genes para dentro de MEFs, 4ECATs indica células iPS estabelecidas pela transdução de 4 genes para dentro de MEFs, 1 OECATs indica células iPS estabelecidas pela transdução de 10 genes para dentro de MEFs, fibroblasto 1 OECATs Skin indica células iPS estabelecidas pela transdução de 10 genes para dentro de fibroblastos dermais, ES indica células ES de camundongo, e MEF indica células MEF sem transdução de gene. Os valores numéricos sob os símbolos indicam os números de clones.
Fig. 11 mostra um efeito de bFGF sobre o estabelecimento de células iPS a partir de MEFs. Quatro fatores (linha superior) ou três fatores exceto para c-Myc (linha inferior) foram retroviralmente transduzidos para dentro de MEFs derivados de camundongos Fbxl5pge0/pge0, e cultivadas sobre células alimentadoras ordinárias (células STO) (esquerda) e células STO introduzidas com vetor de expressão de bFGF (direita). Seleção de G418 foi realizada por 2 semanas, e células foram coradas com azul cristal e fotografadas. Os valores numéricos indicam o número de colônias.
Fig. 12 exibe explanações dos experimentos usando camundongos Nanog-EGFP-IRES-Puro. A: cromossomo artificial de E. coli (BAC) contendo o gene Nanog de camundongo no centro foi isolado, e o cassete EGFP-IRES-Puro foi inserido a montante da região de codificação de Nanog por recombinação. B: Camundongos transgênicos foram preparados com BAC modificado. Expressão de GFP foi observada limitadamente em massas de célula internas de blastocistos e gônadas. Fig. 13 exibe explanações dos experimentos usando camundongos Nanog-EGFP-IRES-Puro. Dos embriões de camundongos Nanog-EGFP-IRES-Puro (13,5 dias após a fertilização), cabeça, víscera e gônadas foram removidas para estabelecimento de MEFs. Como um resultado da análise com um classificador de células, quase nenhumas células positivas para GFP existiram em MEFs derivados de camundongos Nanog-EGFP- IRES-Puro (Nanog) na mesma maneira que a de MEFs derivados de camundongos Fbx15βge0/βgeo° (Fbx15) ou de MEFs derivados de camundongo de tipo selvagem (Selvagem).
Fig. 14 exibe fotografias de células iPS estabelecidas de MEFs de camundongos Nanog-EGFP-IRES-Puro (esquerda) e as MEFs de camundongo Fbx15pgeo/pgeo (direita). As células foram selecionadas com puromicina e G418, respectivamente.
Fig. 15 mostra os resultados de crescimento de células iPS. 100.000 células de cada uma das células ES, células iPS derivadas de MEFs de camundongo Nanog-EGFP-IRES-Puro (Nanog iPS, esquerda), e células iPS derivadas de MEFs de camundongo Fbx15βge0/pge0 (Fbx iPS) foram semeadas sobre placas de 24 cavidades, e passadas a cada 3 dias. Resultados de contagem de células são mostrados. Os valores numéricos representam tempos de duplicação médios.
Fig. 16 mostra perfis de expressão de gene de células iPS. Expressões dos genes marcadores em MEFs, células ES, células iPS derivadas de MEFs de camundongo Nanog-EGFP-IRES-Puro (Nanog iPS, esquerda), e células iPS derivadas de MEFs de camundongo Fbx15βge0/pge0 (Fbx iPS) foram analisadas por RT-PCR. Os valores numéricos na parte inferior indicam os números de passagens.
Fig. 17 mostra formação de teratoma de células Nanog iPS. 1.000.000 de células de cada uma das células ES ou células Nanog iPS foram subcutaneamente injetadas para dentro das costas de camundongos nus, e a aparência de tumores formados após 3 semanas (esquerda) e imagens de tecido (direita, corados com H & E) são mostrados.
Fig. 18 mostra a preparação de camundongos quiméricos com as células Nanog iPS. Os camundongos quiméricos que foram nascidos após o transplante das células Nanog iPS (clone NPMF4EK-24, passaram 6 vezes) para dentro dos blastócitos. Quatro camundongos quiméricos nasceram de 90 embriões transplantados.
Fig. 19 mostra transmissão de linhagem germativa das células Nanog iPS. Análise por PCR de DNA genômico de camundongos, nascidos por acasalamento dos camundongos quiméricos mostrados em Fig. 18 e camundongos C57BL/6, revelou a existência de transgenes de Oct3/4 e Klf4 em todos os camundongos, confirmando deste modo a transmissão de linhagem germinativa.
Fig. 20 mostra a indução de diferenciação em células nervosas a partir de células iPS. Células nervosas (topo, βΙΙΙ tubulina-positivo), oligodendrócitos (esquerda, 04-positivo), e astrócitos (direita, GFAP- positivo) diferenciadas in vitro a partir de células iPS derivadas de fibroblastos dermais são mostradas.
Fig. 21 exibe explanações de estabelecimento de células iPS sem o uso de seleção de droga. MEFs a 10.000 a 100.000 células por placa de 10 cm foram semeados, e os 4 fatores foram retroviralmente transduzidos. Não apareceu colônia no controle (Falso, esquerda), enquanto que na placa com a transdução pelos 4 fatores, colônias inchadas semelhantes àquelas das células iPS foram observadas (centro), bem como colônias transformantes planas. Quando as células foram passadas, células semelhantes às células iPS foram obtidas (direita).
Fig. 22 mostra perfis de expressão de gene de células estabelecidas sem o uso de seleção de droga. RNA foi extraído das células estabelecidas mostradas na Fig. 21, e expressão de genes marcadores de célula ES foi analisada por RT-PCR.
Fig. 23 mostra células tipo iPS derivadas de fibroblastos de humano. As colônias obtidas por transdução retroviral com genes homólogos de humano dos 4 fatores para dentro de fibroblastos derivados de embriões de humano (esquerda), e as células após duas passagens (direita) são mostradas.
Fig. 24 mostra estabelecimento das células iPS de fibroblastos dermais de adulto de humano. Os fatores mencionados no coluna esquerda foram transduzidos retroviralmente para dentro de fibroblastos dermais de humano infectados com o receptor retroviral de camundongo com lentivírus. As fotografias mostram as imagens de contraste de fase (objetiva χ 10) no dia 8 após a infecção viral.
Melhor Modo para Realizar a Invenção
O fator de reprogramação nuclear da presente invenção é caracterizado pelo fato de que compreende um produto de gene de cada um dos seguintes três tipos de genes: um gene da família Oct5 um gene da família Klf5 e um gene da família Myc; e de acordo com uma modalidade preferida, é caracterizado pelo fato de que compreende um produto de gene de um gene da família Sox em adição aos três tipos de genes acima mencionados.
Como um meio para confirmar o fator de reprogramação nuclear da presente invenção, por exemplo, o método de triagem para fatores de reprogramação nuclear descritos na Publicação Internacional WO 2005/80598 pode ser usado. A descrição inteira da publicação acima mencionada é incorporada na descrição do relatório descritivo como referência. Pela referência à publicação acima mencionada, aquelas pessoas experientes na arte podem realizar a triagem de fatores de reprogramação nuclear para confirmar a existência e a ação do fator de reprogramação da presente invenção.
Por exemplo, como um sistema experimental permitindo a observação do fenômeno de reprogramação, um camundongo pode ser usado no qual o Pgeo (um gene de fusão do gene de β galactosidase e o gene de resistência à neomicina) é inserido dentro do locus Fbx 15. Os detalhes são descritos nos exemplos e no relatório descritivo O gene Fbxl 5 de camundongo é um gene especificamente expressado na diferenciação de células pluripotentes tais como células ES e embriões prematuros. Em um camundongo homomutante no qual pgeo é inserido dentro do gene Fbx 15 de camundongo de modo a ser deficiente na função Fbxl5, fenótipos anormais incluindo aqueles relacionados com geração ou pluripotência de diferenciação não são geralmente observados. Neste camundongo, a expressão de pgeo é controlada pelos intensificador e promotor do gene Fbx 15, e células somáticas diferenciadas nas quais Pgeo não é expressado possuem sensibilidade a G418 em uma concentração extremamente alta (mais alta do que 12 mg/mL). Pela utilização deste fenômeno, um sistema experimental pode ser construído para visualizar a reprogramação de células somáticas.
Pela aplicação do sistema experimental acima mencionado, fibroblastos (Fbxl5Pgeo/Pgeo MEFs) podem ser primeiro isolados de um embrião do camundongo homomutante Pgeo knockin (13,5 dias após a fertilização). As MEFs não expressam o gene Fbxl5, e conseqüentemente também não expressam Pgeo para dar sensibilidade a G418. Contudo, quando as MEFs são fusionadas com células ES livres de manipulação genética (também possuem sensibilidade a G418), Pgeo é expressado e as células se tornam resistentes a G418 como um resultado de reprogramação de núcleos de MEFs. Portanto, pela utilização deste sistema experimental, o fenômeno de reprogramação pode ser visualizado como resistência a G418.
Fatores de reprogramação nuclear podem ser selecionados pelo uso do sistema experimental acima mencionado. Como candidatos de genes relevantes para fatores de reprogramação nuclear, pode ser selecionada uma pluralidade genes que mostram expressão específica em células ES ou cujos papéis importantes na manutenção da pluripotência de células ES são sugeridos, e pode ser confirmado se ou não cada gene candidato pode induzir reprogramação nuclear sozinho ou em uma sua combinação apropriada. Por exemplo, uma combinação de todos os genes candidatos primários selecionados é confirmada em ser capaz de induzir a reprogramação de células diferenciadas em um estágio próximo daquele das células ES. Combinações são então preparadas pela remoção de cada gene individual da combinação acima mencionada, e as mesmas ações das combinações são confirmadas com o objetivo de selecionar cada gene candidato secundário cuja ausência causa uma redução da capacidade indução de reprogramação ou perda da capacidade indução de reprogramação. Pela repetição de etapas similares para os genes candidatos secundários selecionados como descrito acima, uma combinação essencial de genes de reprogramação nuclear pode ser selecionada, e pode ser confirmado que uma combinação de produtos de gene de cada um dos três tipos de genes, um gene da família Oct, um gene da família Klf, e um gene da família Myc, atua como um fator de reprogramação nuclear. Pode ser adicionalmente confirmado que uma combinação de um produto de gene de um gene da família Sox adicionalmente com os produtos de gene dos três tipos de gene acima mencionados possui características extremamente superiores como um fator de reprogramação nuclear. Exemplos específicos do método de seleção para os fatores de reprogramação nuclear são demonstrados nos exemplos do relatório descritivo. Portanto, pela referência às explicações gerais acima e às explanações específicas dos exemplos, aquelas pessoas experientes na arte podem prontamente confirmar que a combinação destes três tipos de genes induz a reprogramação de células somáticas, e que a combinação destes três tipos de produtos de gene é essencial para reprogramação nuclear.
O fator de reprogramação nuclear proporcionado pela presente invenção compreende pelo menos uma combinação de produtos de gene de um gene da família Oct, um gene da família Klf, e um gene da família Myc, por exemplo, uma combinação de produtos de gene de Oct3/4, Klf4, e c-Myc. Exemplos de gene da família Oct incluem, por exemplo, Oct3/4, OctlA5 Oct6, e semelhante. Oct3/4 é um fator de transcrição pertencente à família POU, e é relatado como um marcador de células não-diferenciadas (K. Okamoto et al., Cell, 60, pp461-72, 1990). Oct3/4 também é relatado em participar de pluripotência (J. Nichols et al., Cell, 95, pp379-91, 1998). Exemplos de gene da família Klfincluem Klfl, Klf2, Klf4, Klf5 e semelhante. Klf4 (fator-4 tipo Kruppel) é relatado como um fator repressor de tumor (A.M. Ghaleb et al., Cell Res., 15, pp92-6, 2005). Exemplos de gene da família Myc incluem c- Myc, N-Myc, L-Myc e semelhante. c-Myc é um fator de controle de transcrição envolvido em diferenciação e proliferação de células (S. Adhikary, M. Eilers, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, pp.635-45, 2005), e é relatado em estar envolvido na manutenção de pluripotência (P. Cartwright et al., Development, 132, pp.885-96, 2005). Os números de acesso de NCBI dos genes das famílias diferentes de Oct3/4, Klf4 e c-Myc são os seguintes:
Tabela 1
Camundongo Humano
<table>table see original document page 16</column></row><table>
Todos estes genes são aqueles comumente existentes em mamíferos incluindo humano, e para uso dos produtos de gene acima mencionados na presente invenção, genes derivados de mamíferos arbitrários (aqueles derivados de mamíferos tais como camundongo, rato, bovino, ovino, cavalo, e macaco) podem ser usados. Em adição aos produtos de gene de tipo selvagem, produtos de gene mutante incluindo substituição, inserção, e/ou deleção de vários (por exemplo, 1 a 10, preferivelmente 1 a 6, mais preferivelmente 1 a 4, ainda mais preferivelmente 1 a 3, e muito mais preferivelmente 1 ou 2) aminoácidos e possuindo função similar àquela dos produtos de gene de tipo selvagem também podem ser usados. Por exemplo, como um produto de gene de c-Myc, um produto do tipo estável (T58A) também pode ser usado bem como o produto de tipo selvagem. A explanação acima pode ser similarmente aplicada em outros produtos de gene.
O fator de reprogramação nuclear da presente invenção pode compreender um produto de gene diferente dos três tipos diferentes acima mencionados de produtos de gene. Um exemplo de tal produto de gene inclui um produto de gene de um gene da família Sox. Exemplos de gene da família Sox incluem, por exemplo, Soxl, Sox3, Sox7, Soxl5, Soxl7 e Soxl8, e exemplo preferido inclui Sox2. Um fator de reprogramação nuclear compreendendo pelo menos uma combinação dos produtos de gene de quatro tipos de genes, um gene da família Oct (por exemplo, Oct3/4), um gene da família Klf (por exemplo, Klf4), um gene da família Myc (por exemplo, c- Myc), e um gene da família Sox (por exemplo, Sox2) é uma modalidade preferida da presente invenção de um ponto de vista de eficiência de reprogramação, e em particular, uma combinação de um produto de gene de um gene da família Sox é algumas vezes preferida para obter pluripotência. Sox2, expressado em um processo desenvolvimento inicial, é um gene codificador de um fator de transcrição (A.A. Avilion et al., Genes Dev., 17, pp. 126-40, 2003). Os números de acesso de NCBI do gene da família Soxs diferente de Sox2 são como segue.
Tabela 2
Camundongo Humano
<table>table see original document page 17</column></row><table> <table>table see original document page 18</column></row><table>
Ademais, um produto de gene de um gene da família Myc
pode ser substituído por uma citocina. Como a citocina, por exemplo, SCF, bFGF ou semelhante é preferida. Contudo, citocinas não são limitadas a estes exemplos.
Como uma modalidade mais preferida, um exemplo inclui um fator que induz a imortalização de células, em adição aos três tipos acima mencionados de produtos de gene, preferivelmente, os quatro tipos de produtos de gene. Por exemplo, um exemplo inclui uma combinação de um fator compreendendo um produto de gene de gene TERT com um fator compreendendo um produto de gene ou produtos de gene de um ou mais tipos de genes selecionados do grupo consistindo dos seguintes genes: antígeno SV40 Large T, HPV16 E6, HPV16 E7, e Bmil. TERT é essencial para a manutenção da estrutura de telômero na extremidade cromossomo no momento da replicação de DNA, e o gene é expressado nas células-tronco ou células de tumor em humanos, enquanto não é expressado em muitas células somáticas (I. Horikawa, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 102, pp.18437- 442, 2005). Antígeno SV40 Large T, HPV16 E6, HPV16 E7, ou Bmil foi relatado em induzir imortalização de células somáticas de humano em combinação com antígeno Large T (S. Akimov et al., Stem Cells, 23, pp. 1423-1433, 2005; P. Salmon et al., Mol. Ther., 2, pp.404-414, 2000). Estes fatores são extremamente úteis particularmente quando células iPS são induzidas de células de humano. Os números de acesso de NCBI de genes TERT e Bmi 1 são como segue
Tabela 3
Camundongo Humano
<table>table see original document page 18</column></row><table>
Ademais, um produto de gene ou produtos de gene de um ou mais tipos de genes selecionados do grupo consistindo dos seguintes: Fbxl5, Nanog, ERas, ECATl 5-2, Tcl 1, e β-catenina pode(m) ser combinado(s). Como uma modalidade particularmente preferida de um ponto de vista de eficiência de reprogramação, um exemplo inclui um fator de reprogramação nuclear compreendendo um total dez tipos de produtos de gene, no qual os produtos de gene de Fbxl 5, Nanog, ERas, ECATl 5-2, Tcl 1, e β-catenina são combinados com os quatro tipos acima mencionados de produtos de gene. Fbx 15 (Y. Tokuzawa et al., Mol. Cell Biol, 23, pp.2699-708, 2003), Nanog (K. Mitsui et al., Cell, 113, pp.631-42, 2003), ERas (K. Takahashi, K. Mitsui, S. Yamanaka, Nature, 423, pp.541-5, 2003), e ECATl5-2 (A. Bortvin et al., Development, 130, pp. 1673-80, 2003) são genes especificamente expressados em células ES. Tcll está envolvido na ativação de Akt (A. Bortvin et al., Development, 130, pp. 1673-80, 2003), e β-catenina é um fator importante constituindo a rota de transmissão de sinal Wnt, e também é relatado em estar envolvido na manutenção de pluripotência (N. Sato et al, Nat. Med., 10, pp.55-63, 2004).
Ademais, o fator de reprogramação nuclear da presente invenção pode compreender, por exemplo, um produto de gene ou produtos de gene de um ou mais tipos de genes selecionados do grupo consistindo dos seguintes: ECAT1, Esgl, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Soxl5, ECAT15-1, Fthll7, Sall4, Rex 1, UTF1, Stella, Stat3, e Grb2. ECAT1, Esgl, ECAT8, Gdf3, e ECATl 5-1 são genes especificamente expressados em células ES (K. Mitsui et al., Cell, 113, pp.631-42, 2003). Dnmt3L é um fator relacionado com enzima de metilação de DNA, e Soxl 5 é uma classe de genes expressados em um processo desenvolvimento inicial e codificadores de fatores de transcrição (M. Maruyama et al., J. Biol. Chem., 280, pp.24371-9, 2005). Fthll7 codifica ferritina pesado tipo polipeptídeo 17 (A. colLoriot, T. Boon, C. De Smet, Int. J. Câncer, 105, pp.371-6, 2003), Sall4 codifica uma proteína dedo de Zn abundantemente expressada em células-tronco embrionárias (J. Kohlhase et al., Cytogenet. Genome Res., 98, pp.274-7, 2002), e Rex1 encodes a transcription factor locating downstream from Oct3/4 (E. Ben-Shushan, J.R. Thompson, LJ. Gudas, Y. Bergman, Mol. Cell Biol., 18, pp. 1866-78, 1998). UTFl é um cofator de transcrição localizado a jusante de Oct3/4, e é relatado que a supressão da proliferação de células ES é induzida quando este fator é suprimido (A. Okuda et al., EMBO J., 17, pp.2019-32, 1998). Stat3 é um fator de sinal para proliferação e diferenciação de células. A ativação de Stat3 dispara a operação de LIF, e deste modo o fator desempenha um papel importante para a manutenção de pluripotência (H. Niwa, T. Burdon, I. Chambers, A. Smith, Genes Dev., 12, pp.2048-60, 1998). Grb2 codifica uma mediação de proteína entre vários receptores de fator de crescimento existentes em membranas celulares e a cascata Ras/MAPK (A.M. Cheng et al., Cell, 95, pp.793-803, 1998).
Contudo, os produtos de gene que podem ser incluídos no fator de reprogramação nuclear da presente invenção não são limitados aos produtos de gene dos genes especificamente explicados acima. O fator de reprogramação nuclear da presente invenção pode conter um ou mais fatores relacionados com diferenciação, desenvolvimento, proliferação ou semelhante e fatores possuindo outras atividades fisiológicas, bem como outros produtos de gene que podem funcionar como um fator de reprogramação nuclear. É entendido que tais modalidades caem dentro do escopo da presente invenção. Pelo uso de células somáticas nas quais apenas um ou dois genes dentre os três tipos de gene Oct3/4, Klf4, e c-Myc são expressados, os outros produtos de gene que podem funcionar como um fator de reprogramação nuclear podem ser identificados, por exemplo, pela realização de triagem de um produto de gene que pode induzir reprogramação nuclear de citadas células. De acordo com a presente invenção, o método de triagem acima mencionado também é proporcionado como um método novo para a triagem de um fator de reprogramação nuclear. Os produtos de gene contidos no fator de reprogramação nuclear da presente invenção podem ser, por exemplo, uma proteína, per se, produzida do gene acima mencionada, ou alternativamente, em uma forma de um produto de gene de fusão de citada proteína com outra proteína, peptídeo ou semelhante. Por exemplo, uma proteína de fusão com proteína fluorescente verde (GFP) ou um produto de gene de fusão com um peptídeo tal como uma etiqueta histidina também pode ser usado. Ademais, pela preparação e pelo uso de uma proteína de fusão com o peptídeo TAT derivado do vírus HIV, captação intracelular do fator de reprogramação nuclear através de membranas celulares pode ser promovida, permitindo deste modo a indução de reprogramação apenas pela adição da proteína de fusão em um meio evitando assim operações complicadas tal como transdução de gene. Visto que métodos de preparação de tais produtos de gene de fusão são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte, técnicos experientes podem facilmente planejar e preparar um produto de gene de fusão apropriado dependendo do propósito.
Pelo uso do fator de reprogramação nuclear da presente invenção, o núcleo de uma célula somática pode ser reprogramado para obter célula-tronco pluripotente. No relatório descritivo, o termo "células-tronco pluripotentes induzidas" significa células possuindo propriedades similares àquelas de células ES, e mais especificamente o termo inclui células indiferenciadas possuindo pluripotência e capacidade crescimento. Contudo, o termo não deve ser entendido restritamente em qualquer sentido, e deve ser entendido no sentido mais amplo. O método para preparação de células- tronco pluripotentes induzidas pelo uso de um fator de reprogramação nuclear é explicado na Publicação Internacional W02005/80598 (o termo "células tipo ES" é usado na publicação), e um meio para isolamento de células-tronco pluripotentes também é especificamente explicado. Portanto, pela referência à publicação acima mencionada, aquelas pessoas experientes na arte podem facilmente preparar células-tronco pluripotentes induzidas pelo uso de fator de reprogramação nuclear da presente invenção.
O método para preparação de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células somáticas pelo uso do fator de reprogramação nuclear da presente invenção não é particularmente limitado. Qualquer método pode ser empregado desde quantidade efetiva o fator de reprogramação nuclear pode contatar com células somáticas sob um ambiente no qual as células somáticas e as células-tronco pluripotentes induzidas podem proliferar. Por exemplo, um produto de gene contido no fator de reprogramação nuclear da presente invenção pode ser adicionado em um meio. Alternativamente, pelo uso de um vetor contendo um gene que é capaz de expressar o fator de reprogramação nuclear da presente invenção, um meio de transdução de citado gene para dentro de uma célula somática pode ser empregado. Quando tal vetor é usado, dois ou mais tipos de genes podem ser incorporados no vetor, e cada um dos produtos de gene pode ser simultaneamente expressado em uma célula somática. Quando um ou mais dos produtos de gene contidos no fator de reprogramação nuclear da presente invenção já são expressados em uma célula somática a ser reprogramada, os citados produtos de gene podem ser excluídos do fator de reprogramação nuclear da presente invenção. E entendido que tal modalidade cai dentro do escopo da presente invenção.
Na preparação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo uso do fator de reprogramação nuclear da presente invenção, tipos de células somáticas a serem reprogramadas não são particularmente limitadas, e quaisquer tipos podem ser usados. Por exemplo, células somáticas maturadas podem ser usadas, bem como células somáticas de um período embriônico. Quando células-tronco pluripotentes induzidas são usadas para tratamento terapêutico de doenças, é desejável o uso de células somáticas isoladas de paciente. Por exemplo, células somáticas envolvidas em doenças, células somáticas participando em tratamento terapêutico de doenças e semelhante podem ser usadas. Um método para a seleção de células-tronco pluripotentes induzidas que aparecem em um meio de acordo com o método da presente invenção não é particularmente limitado, e um meio bem conhecido pode ser adequadamente empregado, por exemplo, um gene de resistência à droga ou semelhante pode ser usado como um gene marcador para isolar células-tronco pluripotentes induzidas usando resistência à droga como um índice. Vários meios que podem manter estado indiferenciado e pluripotência de células ES e vários meios que não podem manter tais propriedades são conhecidos no campo, e células-tronco pluripotentes induzidas podem ser eficientemente isoladas pelo uso de uma combinação de meios apropriados. Capacidades de diferenciação estágio de evaporador proliferação de células-tronco pluripotentes induzidas isoladas pode ser facilmente confirmada por aquelas pessoas experientes na arte pelo uso de meio de confirmação amplamente aplicado em células ES.
Usos de células-tronco pluripotentes induzidas preparadas pelo método da presente invenção não são particularmente limitados. As células podem ser usadas para quaisquer experimentos e pesquisas conduzidos com células ES, tratamentos terapêuticos utilizando células ES e semelhante. Por exemplo, as células diferenciadas desejadas (e.g., células nervosas, células de músculo cardíaco, células de hemácia e semelhante) podem ser derivadas pelo tratamento de células-tronco pluripotentes induzidas obtidas pelo método da presente invenção com ácido retinóico, fatores de crescimento tal como EGF, glicocorticóide ou semelhante, e terapia de célula-tronco baseada em auto- transplante celular pode ser realizada pelo retorno de células diferenciadas obtidas como descrito acima para o paciente. Contido, usos de células-tronco pluripotentes induzidas da presente invenção não são limitadas às modalidades específicas acima mencionadas.
Exemplos A presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos exemplos. Contudo, o escopo da presente invenção não é limitado aos exemplos seguintes.
Exemplo 1: Seleção de fator de reprogramação
Com o objetivo de identificar os fatores de reprogramação, um sistema experimental para fácil observação do fenômeno de reprogramação é requerido. Como um sistema experimental, um camundongo no qual Pgeo (um gene de fusão de gene de β-galactosidase e gene de resistência à neomicina) foi inserido no locus Fbx 15 foi usado. O gene Fbx 15 de camundongo é um gene especificamente expressado em diferenciação de células pluripotentes tais como células ES e embriões pré-maduros. Contudo, em um camundongo homomutante no qual Pgeo foi inserido no gene Fbxl 5 de camundongo de modo a deletar a função de Fbxl5, não foram observados fenótipos anormais incluindo aqueles referentes à pluripotência de diferenciação ou ao desenvolvimento. Neste camundongo, controle de expressão de Pgeo é alcançado pelos intensificador e promotor do gene Fbxl 5. Especificamente, Pgeo não é expressado em células somáticas diferenciadas, e possuem sensibilidade a G418. Em contraste, as , as células ES homomutantes Pgeo knockin possuem resistência contra G418 em uma concentração extremamente alta (mais alta do que 12 mg/mL). Pela utilização do fenômeno acima, um sistema experimental para visualização da reprogramação de células somáticas foi observado.
No sistema experimental acima mencionado, fibroblastos (Fbxl5Pgeo/,3geo MEFs) foram primeiro isolados de um embrião do camundongo homomutante Pgeo knockin (13,5 dias após a fertilização). Visto que MEFs não expressam o gene Fbxl5, as células também não expressam Pgeo e assim possuem sensibilidade a G418. Enquanto que, quando as MEFs são fusionadas com células ES que não têm sido gene-manipuladas (também possuindo sensibilidade a G418), os núcleos de MEFs são reprogramados, e como um resultado, Pgeo é expressado para dar resistência a G418. O fenômeno de reprogramação pode ser assim visualizado como resistência a G418 pelo uso deste sistema experimental (Publicação Internacional W02005/80598). Pesquisas para fatores de reprogramação foram realizadas pelo uso do sistema experimental acima mencionado (Fig. 1), e 24 tipos totais de genes foram selecionados como fatores de reprogramação candidatos, incluindo genes mostrando expressão específica em células ES e genes sugeridos em possuir papéis importantes na manutenção de pluripotência de diferenciação de células ES. Estes genes são mostrados em Tabelas 4 e 5 abaixo. Para β-catenina (#21) e c-Myc (#22), mutantes de tipo ativo (catenina: S33Y, c-Myc: T58A) foram usados.
Tabela 4
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Tabela 5
<table>table see original document page 26</column></row><table> <table>table see original document page 27</column></row><table>
cDNAs destes genes foram inseridos no vetor retroviral pMX- gw pela tecnologia de via. Primeiro, cada um dos 24 genes foi infectado nas Fbxl5Pgeo/Pgeo MEFs, e então a seleção de G418 foi realizada sob condições de cultura de célula ES. Contudo, não foi obtida colônia resistente a G418. A seguir, os vetores retrovirais de todos os 24 genes foram simultaneamente infectados nas Fbxl5pge0/pge° MEFs. Quando a seleção de G418 foi realizada sob condições de cultura de célula ES, foi obtida uma pluralidade colônias resistentes à droga. Estas colônias foram isoladas, e cultivo foi continuado. Foi verificado que cultivo destas células durante um período de tempo longo pôde ser realizado, e que estas células tiveram morfologia similar àquela de células ES (Fig. 2). Na figura, células iPS representam células-tronco pluripotentes induzidas (também chamadas "células tipo ES", "células tipo ES", ou "células ESL"), ES representa células-tronco embrionárias, e MEF representa células diferenciadas (fibroblastos embriônicos).
Quando perfis de expressão dos genes marcadores foram examinados por RT-PCR, marcadores de indiferenciação tais como Nanog e Oct3/4 foram encontrados expressados (Fig. 3). Foi verificado que a expressão de Nanog foi próxima daquela de células ES, enquanto que a expressão de Oct3/4 foi menor do que aquela de células ES. Quando estado de metilação de DNA foi examinado por seqüenciamento genômico de bissulfeto, foi verificado que o gene Nanog e o gene Fbx 15 estavam elevadamente metilados em MEFs, enquanto que estavam desmetilados nas células iPS (Fig. 4). Cerca de 50% de gene IGF2, um gene de impressão, estava metilado tanto em MEF quanto em células iPS. Visto que era sabido que a memória de impressão estava deletada e o gene IGF2 estava quase completamente metilado nas células germinativas primordiais a 13,5 dias após a fertilização, da qual Fbxl5pgeo/pgeo MEFs foram isoladas, foi concluído que as células iPS não foram derivadas das células germinativas primordiais contaminadas nas Fbxl5Pgeo/|3geo MEFs. Os resultados acima demonstraram que a reprogramação de células diferenciadas (MEFs) em um estado próximo àquele das células ES foi capaz de ser induzida com a combinação dos 24 tipos de fatores.
Então, foram realizados estudos para verificar se todos ou não todos os 24 tipos de genes foram requeridos para a reprogramação. Com remoção de cada gene individual, 23 genes foram transfectados nas Fbxl5Pgeo/Pgeo MEFs. Como um resultado, para 10 genes, formação de colônia foi verificada inibida para cada remoção dos mesmos (Fig. 5, os números de gene correspondem aos números de gene mostrados em Tabela 4, e os genes são os seguintes 10 tipos de genes: #3, #4, #5, #11, #14, #15, #18, #20, #21, e #22). Quando estes dez genes foram simultaneamente transfectados para FbxlSl3geoxpseo MEFs, colônias resistentes a G418 foram significativamente mais eficientemente obtidas em comparação com a transfecção simultânea com os 24 genes.
Ademais, 9 genes, com remoção de cada gene individual dos 10 genes, foram tranfectados em Fbxl5Pgeo/Pgeo MEFs. Como um resultado, foi verificado que as colônias de célula iPS resistente a G418 não foram formadas quando cada um dos 4 tipos de genes (#14, #15, #20, ou #22) foi removido (Fig. 6). Portanto, foi sugerido que estes quatro tipos de genes, dentre os dez genes, tiveram papéis particularmente importantes na indução de reprogramação.
Exemplo 2: Indução de reprogramação com combinação de 4 tipos de genes
Foi examinado se ou não indução de reprogramação de células somáticas era alcançável com os quatros tipos de genes cuja importância particular foi sugerida dentre os 10 genes. Pelo uso da combinação dos 10 tipos de genes acima mencionados, a combinação dos 4 tipos de genes acima mencionados, combinação de apenas 3 tipos de genes dos genes dentre os 4 tipos de genes, estes conjuntos de genes foram retroviralmente transduzidos nas células MEF como células somáticas nas quais Pgeo foi inserido no gene Fbxl5. Como um resultado, quando os 4 tipos de genes foram transduzidos, foram obtidas 160 colônias resistentes a G418. Embora este resultado fosse quase igual àquele obtido pela transdução com os 10 tipos de genes (179 colônias), as colônias obtidas pela transdução de 4 genes foram menores do que aquelas pela transdução de 10 genes. Quando estas colônias foram passadas, os números de colônias possuindo morfologia de célula iPS foi de 9 clones dentre 12 clones na caso da transdução de 10 genes, enquanto que houve uma tendência um pouco menor de 7 clones dentre 12 clones no caso da transdução de 4 genes. Como para os 4 genes, quase os mesmos números de células iPS foram obtidos com qualquer uma daquelas derivadas de camundongo ou daquelas derivadas de humano. Quando 3 genes selecionados dos 4 genes acima mencionados (#14, #15, e #20). Contudo, células iPS não foram observadas quando foram passadas. Com outra combinação (#14, #20, e #22), foram obtidas 54 colônias pequenas. Quando 6 das colônias relativamente grandes dentre aquelas colônias foram passadas, células similares às células ES foram obtidas para todos estes 6 clones. Contudo, pareceu que a adesão das células entre elas mesmas e na placa de cultura foi mais fraca do que aquela de células ES. A velocidade proliferação das células também foi mais lenta do que aquela observada no caso da transdução com os 4 genes. Ademais, um colônica de cada foi formada com cada um dos outros dois tipos de combinações de 3 genes dentre os 4 genes. Contudo, proliferação das células não foi observada quando as células foram passadas. Com qualquer uma das combinações de 2 genes selecionados dos 4 genes (6 combinações), não foram formadas colônias resistentes a G418. Os resultados acima são mostrados em Fig. 7.
Ademais, os resultados de observação de perfis de expressão dos genes marcadores de célula ES por RT-PCR são mostrados em Fig. 10. Os detalhes do método são os seguintes. Das células iPS estabelecidas pela transdução de 3 genes (Oct3/4, Klf4, e c-Myc: representado como "Sox2 menos"), 4 genes (Sox2 foi adicionado nos três genes: representado como "4ECAT"), e 10 genes (#3, #4, #5, #11, #18, e #21 em Tabela 1 foram adicionados nos quatro genes: representados como "10ECAT") em Fbxl5pgeo/pgeo MEFs, células iPS estabelecidas pela transdução de 10 genes em fibroblastos estabelecidos da ponta da cauda de um camundongo adulto no qual Pgeo foi inserido no gene Fbxl5 (representado como "fibroblasto 10ECAT Skin"), células ES de camundongo, e células MEF sem transdução de gene, RNAs totais foram purificados, e tratados com DNaseI para remover contaminação de DNA genômico. cDNAs de primeira fita foram preparados por uma reação de transcrição reversa, e perfis de expressão de genes marcadores de célula ES foram examinados por PCR. Para Oct3/4, Nanog, e ERas, PCR foi realizada pelo uso de iniciadores que apenas amplificaram um produto transcrito de um gene endógeno, não do retrovírus transduzido. As seqüências de iniciador são mostradas em Tabela 6.
Tabela 6
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Os resultados mostrados nesta figura revelaram que, por transdução dos 3 genes, expressão de cada um dos ERas e Fgf4 foi eficientemente induzida, mas expressão de cada um de Oct3/4 e Nanog, fatores essenciais para a manutenção de pluripotência, não foi induzida, ou foi muito fraca até mesmo quando induzida. Contudo, quando os 4 genes foram transduzidos, não houve um clone (#7) no qual Oct3/4 e Nanog foram relativamente fortemente induzidos dentre 4 clones examinados. Ademais, quando os 10 genes foram transduzidos, indução forte de cada um de Oct3/4 e Nanog foi observada em 3 clones dentre 5 clones examinados.
Estes resultados revelaram que uma combinação de pelo menos 3 genes (#14, #20, e #22) foi essencial para reprogramação, e nos casos do grupo de 4 genes e grupo de 10 genes incluindo os 3 tipos de genes, a eficiência de reprogramação foi aumentada em proporção ao número crescente de genes.
Exemplo 3: Análise de pluripotência de células reprogramadas Com o objetivo de avaliar a pluripotência de diferenciação das células iPS estabelecidas, as células iPS estabelecidas com 24 fatores, 10 fatores, e 4 fatores foram subcutaneamente transplantadas em camundongos nus. Como um resultado, tumores possuindo um tamanho similar àquele observado com células ES foram formados em todos os animais. Histologicamente, os tumores consistidos de uma pluralidade tipos de células, e tecidos cartilaginosos, tecidos nervosos, tecidos musculares, tecidos adiposos, e tecidos do trato gastrointestinal foram observados (Fig. 8), que verificaram a pluripotência de células iPS. Em contraste, embora tumores fossem formados quando células estabelecidas com os 3 fatores foram transplantadas em camundongos nus, foram formados histologicamente apenas de células indiferenciadas. Portanto, foi verificado que um gene da família Sox foi essencial para a indução de pluripotência de diferenciação.
Exemplo 4: Reprogramação de fibroblastos derivados de caudas de camundongos adultos
Os 4 fatores identificados nos fibroblastos embriônicos de camundongo (MEFs) foram transduzidos em fibroblastos derivados das caudas de camundongos adultos pgeo knockin Fbx 15 sistemicamente expressando proteína fluorescente verde (GFP). Então, as células foram cultivadas sobre células alimentadoras sob as mesmas condições que as condições de cultura de célula ES, e foi realizada seleção de G418. Em cerca de duas semanas após o início da seleção de droga, uma pluralidade colônias de células iPS foi obtida. Quando estas células foram subcutaneamente transplantadas em camundongos nus, foram formados teratomas consistindo de uma variedade todos os três tecidos da camada germinativa. Ademais, quando as células iPS derivadas de fibroblastos dermais de adulto foram transplantados para os blastocistos, e então transplantados para os úteros de camundongas pseudo-grávidas, embriões nos quais as células positivas para GFP estavam sistemicamente distribuídas foram observados dentre aqueles a 13,5 dias após a fertilização (Fig. 9), demonstrando que as células iPS tinham pluripotência e foram capazes de contribuir para a embriogênese de camundongo. Estes resultados indicam que a classe identificada de fatores tinha uma capacidade para induzir reprogramação não apenas de células somáticas em um período embriogênico, mas também de células somáticas de camundongos maduros. Praticamente, é extremamente importante que a reprogramação possa ser induzida em células derivadas de pele de adulto.
Exemplo 5
Um efeito de citocina sobre o estabelecimento de célula iPS foi investigado. Vetor de expressão viral (vetor retroviral pMX) para fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) ou fator de célula-tronco (SCF) foi transduzido em células alimentadoras (STO cells) para estabelecer células permanentemente expressando as citocinas. MEFs derivados de camundongo Fbxl5Pgeo/Pgeo (500.000 células/placa de 100 mm) foram cultivadas sobre estas células STO e transduzidas com os 4 fatores, e então submetidas à seleção de G418. Como um resultado, o número de colônias formadas aumentou 20 vezes ou mais sobre as células STO produzindo bFGF (Fig. 11) ou SCF (dados não mostrados), em comparação com a cultura sobre células STO normais. Ademais, embora nenhuma colônia de células iPS cell fosse formada sobre as células STO normais quando os 3 fatores diferentes de c-Myc foram transduzidos, a formação de colônia foi observada sobre as células STO produzindo bFGF (Fig. 11) ou SCF (dados não mostrados). Estes resultados revelaram que a estimulação com a citocina aumentou a eficiência do estabelecimento de células iPS a partir de MEFs, e a reprogramação nuclear foi alcançável pelo uso de uma citocina em vez de c-Myc.
Exemplo 6 Existem genes de família para todos os genes Oct3/4, Klf4, c- Myc, e Sox2 (Tabelas 1 e 2). Conseqüentemente, foram realizados estudos para verificar se as células iPS poderiam ser estabelecidas com os genes de família em vez de com os 4 genes. Em Tabela 7, são mostrados resultados experimentais combinados em duplicata. Com relação à família Sox, Soxl deu quase o mesmo número de colônias resistentes a G418 formadas e eficiência de estabelecimento de célula iPS como aquelas com Sox2. Como para Sox3, o número de colônias resistentes a G418 formado foi cerca de 1/10 daquele com Sox2, entretanto, eficiência de estabelecimento de célula iPS das colônias capturadas foi de fato maior do que aquele com Sox2. Como para Soxl5, tanto o número de colônias resistentes a G418 formadas quanto a eficiência de estabelecimento de célula iPS foram menores do que aqueles com Sox2. Como para Soxl7, o número de colônias resistentes a G418 formadas foi quase o mesmo que aquele com Sox2, contudo, eficiência de estabelecimento de célula iPS foi baixa. Com relação à família Klf, Klf2 deu um número de colônias resistentes a G418 menor do que Klf4, contudo, deram quase a mesma eficiência de estabelecimento de célula iPS. Com relação à família Myc, foi verificado que c-Myc de tipo selvagem foi quase o mesmo que um mutante de T58A tanto no número de colônias resistentes a G418 formadas quanto a eficiência de estabelecimento de célula iPS. Ademais, cada um de N-Myc e L-Myc (cada tipo selvagem) foi quase o mesmo que c-Myc em ambos o número de colônias resistentes a G418 formadas e a eficiência de estabelecimento de célula iPS.
Tabela 7
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Exemplo 7
Foram realizado estudos para verificar se as células iPS poderiam ser estabelecidas com um repórter diferente de Fbxl5-Pgeo. Cromossomo artificial de Escherichia. coli (BAC) contendo o gene Nanog no centro foi isolado, e então o gene GFP e o gene de resistência à puromicina foram inseridos por recombinação em E. coli (Fig. 12A). Subseqüentemente, o BAC modificado acima foi introduzido em células ES para confirmar se as células se tornaram positivas para GFP em uma maneira específica de estado indiferenciado (dados não mostrados). Então, estas células ES foram transplantadas em blastocistos de camundongo para criar camundongos via camundongos quiméricos. Nestes camundongos, células positivas para GFP foram especificamente observadas em massas celulares internas dos blastocistos ou das gônadas de embriões a 13,5 dias após a fertilização (Fig. 12B). As gônadas foram removidas dos embriões a 13,5 dias após a fertilização (híbrido de camundongos DBA, 129, e C57BL/6), e MEFs foram isolados. Os MEFs isolados foram confirmados em serem negativos para GFP (Fig. 13) por citometria de fluxo. Estes MEFs foram retroviralmente transduzidos com os 4 fatores e submetidos à seleção de puromicina, e como um resultado, um número plural de colônias resistentes foi obtido. Apenas cerca de 10 a 20% das colônias foram positivos para GFP. Quando as colônias positivas para GFP foram passadas, deram morfologia (Fig. 14) e proliferação (Fig. 15) similares àquelas de células ES. Exame do padrão de expressão de gene revelou que o padrão de expressão estava mais próximo daquele de células ES em comparação com as células iPS isoladas de Fbxl5Bgeo/Bgeo MEFs por seleção de G418 (Fig. 16). Quando estas células foram transplantadas para camundongos nus, foi induzida formação de teratoma, deste modo foi confirmado que as células eram células iPS (Fig. 17). Ademais, camundongos quiméricos foram nascidos pelo transplante das células iPS obtidas pela seleção de Nanog-GFP em blastocistos de camundongos C57BL/6 (Fig. 18). Quando estes camundongos quiméricos foram acasalados, foi observada transmissão de linhagem germinativa (Fig. 19). Nestas células iPS estabelecidas pela seleção de Nanog-GFP, que estavam mais próximas das células ES, as expressões dos 4 fatores dos retrovírus foram quase completamente silenciadas, sugerindo que a auto-replicação foi mantida por Oct3/4 e Sox2 endógenos.
Exemplo 8
Células iPS em confluência de 10 cm foram tripsinizadas e suspensas em meio de célula ES (as células STO foram removidas pela adesão em uma placa revestida com gelatina por 10 a 20 minutos após a suspensão). 2 χ 106 células foram cultivadas por quatro dias em uma placa de cultura de E. coli revestida com HEMA (metacrilato de 2-hidróxi-etila) como uma cultura de suspensão para formar corpos embrióides (EBs) (dias 1 a 4). No 4o dia da formação de EB (dia 4), todos os EBs foram transferidos para uma placa de cultura de tecido de 10 cm, e cultivados em meio de célula ES por 24 horas para permitir adesão. Após 24 horas (dia 5), o meio foi trocado por um meio contendo ITS/fibronectina. A cultura foi realizada por 7 dias (meio foi trocado a cada 2 dias), e células positivas para nestina foram selecionadas (células de outros pedigrees foram morrendo em alguma extensão em uma cultura sob condição livre de soro) (dias 5 a 12). Células positivas para A2B5 foram então induzidas. Após 7 dias (dia 12), as células foram separadas por tripsinização, e os EBs restantes foram removidos. 1 χ 105 células foram semeadas sobre uma placa de 24 cavidades revestida com poli-L-ornitina/fibronectina, e cultivadas por 4 dias em um meio contendo N2/bFGF (meio foi substituído a cada 2 dias) (dias 12 a 16). Após 4 dias (dia 16), o meio foi substituído por um meio contendo N2/bFGF/EGF, e a cultura foi continuada por 4 dias (meio foi substituído a cada 2 dias (dias 16 a 20). Após 4 dias (dia 20), o meio foi substituído por um meio contendo N2/bFGF/PDGF, e a cultura foi continuada por 4 dias (meio foi substituído a cada 2 dias (dias 20 a 24). Durante este período (dias 12 a 14), quando as células haviam aumentado excessivamente e alcançado a confluência, foram passadas em tempos apropriados, e 1 a 2 χ IO5 células foram semeadas (o número de células variou dependendo do tempo da passagem). Após 4 dias (dia 24), o meio foi substituído por um meio N2/T3, e a cultura foi continuada por 7 dias (dias 24 a 31) com troca de meio a cada 2 dias. No dia 31, as células foram fixadas e submetidas à imunocoloração. Como um resultado, foi observada a diferenciação das células iPS em células nervosas positivas para tubulina βΙΙΙ, oligodendrócitos positivos para 04, e astrocitos positivos para GFAP (Fig. 20).
Exemplo 9
Com o objetivo de estabelecer células iPS a partir de células somáticas de camundongo arbitrárias diferentes daquelas derivadas de camundongo knockin Fbxl5~Pgeo, foi desenvolvido um método para o estabelecimento sem o uso de seleção de droga. Fibroblastos de embrião de camundongo (MEFs) foram cultivados sobre uma placa de 10 cm (sobre células alimentadoras STO) em um número menor do que aqueles usados acima (10.000, 50.000, ou 100.000 células), e um DNA de controle ou os 4 fatores foram retroviralmente transduzidos. Quando a cultura foi realizada por 2 semanas no meio de célula ES (sem seleção de G418), não foi observada formação de colônia na placa na qual o DNA de controle foi transduzido, enquanto que na placa na qual os 4 fatores foram transduzidos, foi formada uma pluralidade colônias compactas bem como colônias planas consideradas para serem transformadas (Fig. 21). Quando 24 colônias foram capturadas destas colônias e a cultura foi continuada, foi observada a morfologia de célula tipo-ES. Seus perfis de expressão de gene foram examinados por RT- PCR, e como um resultado, a expressão de Esgl, um marcador de célula ES, foi observada em 7 clones. Indução de muitos marcadores de célula ES tais como Nanog, ERas, GDF3, Oct3/4, e Sox2 foi observada em clone 4, e portanto as células foram consideradas em serem células iPS (Fig. 22). Os resultados acima demonstraram que a seleção de droga usando knockin Fbxl5-Pgeo ou semelhante não foi indispensável para o estabelecimento de célula iPS cell, e células iPS puderam ser estabelecidas a partir de células somáticas arbitrárias derivadas de camundongo. Isto também sugeriu a possibilidade que as células iPS poderiam ser estabelecidas de células somáticas de um camundongo modelo de doença pela técnica acima mencionada.
Exemplo 10
Como células das quais as células iPS foram induzidas, hepatócitos e células de mucosa gástrica sendo células diferentes de fibroblastos foram examinadas. Hepatócitos foram isolados do fígado dos camundongos Fbxl5Pgeo/Pgeo por períusão. Estes hepatócitos foram retroviralmente introduzidos com os 4 fatores, e então submetidos à seleção de G418 para obter colônias de células iPS plurais. Como um resultado da análise do padrão de expressão de gene usando um microarranjo de DNA, foi verificado que as células iPS derivadas do fígado são mais simulares às células ES do que as células iPS derivadas de fibroblastos dermais ou fibroblastos embriônicos. Também foram obtidas células iPS a partir das células de mucosa gástrica na mesma maneira que a daquelas a partir de hepatócitos.
Exemplo 11
PD98059 é um inibidor de MAP cinase que suprime a proliferação de várias células diferenciadas. Contudo, é conhecida a promoção da manutenção de estado indiferenciado e a proliferação de células ES. Efeitos de PD98059 sobre o estabelecimento de célula iPS foram portanto examinados. MEFs estabelecidos de um camundongo possuindo os marcadores seletivos de Nanog-EGFP-IRES-Puro foram retroviralmente introduzidos com os 4 fatores e submetidos à seleção de puromicina. Quando PD98059 não foi adicionado, a percentagem de colônias positivas para GFP foi de 8% das colônias de célula iPS obtidas. Contudo, no grupo no qual PD98059 (concentração final: 25 μΜ) foi continuamente adicionado a partir do dia seguinte da transfecção retroviral, 45% das colônias obtidas foram positivas para GFP. Os resultados foram interpretados como sendo devido ao fato de que PD98059 promove a proliferação de células iPS positivas para GFP, que estão mais próximas de células ES, enquanto que PD98059 suprime a proliferação de células diferenciadas ou células iPS negativas para GFP. Destes resultados, foi demonstrado que PD98059 é capaz de ser usado para estabelecimento de células iPS mais próximas de células ES ou o estabelecimento de células iPS sem o uso de seleção de droga.
Exemplo 12
Um plasmídeo, contendo o gene de proteína de fluorescência vermelha a jusante do promotor de gene Oct3/4 de camundongo e o gene de resistência à higromicina a jusante do promotor PGK, foi introduzido por nucleofecção em fibroblastos dermais embriônicos de humano (HDFs) nos quais família 7 de veículo de soluto (Slc7al, número de acesso de NCBI deNM_007513) como um receptor de vírus ectrópico de camundongo foi expressada por transdução lentiviral. Seleção de higromicina foi realizada em cepas estabelecidas com expressão estável. 800.000 células foram semeadas sobre células STO tratadas com mitomicina, e no dia seguinte, Oct3/4, Sox2, Klf4, e c-Myc (cada um derivado de humano) foram retroviralmente transduzidos nas células. 24 Colônias foram capturadas daquelas obtidas após 3 semanas (Fig. 23, esquerda), e transferidas sobre uma placa de 24 cavidades sobre a qual as células STO foram semeadas e então cultivadas. Após 2 semanas, um clone crescido foi passado para uma placa de 6 cavidades sobre a qual células STO foram semeadas e cultivadas. Como um resultado, células morfologicamente similares às células ES foram obtidas (Fig. 23, direita), sugerindo que as células foram células iPS. O meio de célula ES de camundongo foi usado como cerca de meio.
Exemplo 13
Fibroblastos dermais de humano adulto (HDFs adultos) foram transduzidos com Slc7al (receptor retroviral de camundongo) pelo uso de lentivírus, e as células resultantes foram semeadas sobre 800.000 células alimentadoras (células STO tratadas com mitomicina). Os genes foram retroviralmente transduzidos como as seguintes combinações.
1. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, e antígeno SV40 Large T
2. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, HPVl6 E6
3. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, HPV16 E7
4. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
5. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, Bmil
(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc e TERT foram derivados de humano, e Bmi 1 foi derivado de camundongo)
A cultura foi continuada sob as condições de cultura para as células ES de camundongo sem seleção de droga. Como um resultado, as colônias consideradas em serem aquelas de células iPS emergiram no 8o dia após a transfecção viral sobre a placa na qual os fatores foram introduzidos de acordo com a Combinação 1 (Fig. 24). Colônias de célula tipo iPS também emergiram com outras combinações (2 a 5), embora não fossem tão evidentes quando comparadas com a Combinação 1. Quando apenas os 4 fatores foram transduzidos, não emergiram colônias.
Aplicabilidade Industrial
Pelo uso do fator de reprogramação nuclear proporcionado pela presente invenção, reprogramação de núcleos de células diferenciadas pode ser conveniente e elevadamente reproduzivelmente induzida sem o uso de embriões ou células ES3 e podem ser estabelecidas células-tronco pluripotentes induzidas como células indiferenciadas possuindo capacidade diferenciação, pluripotência e capacidade crescimento similares àquelas de células ES. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Kyoto University
<120> Fator que induz reprogramação linear
<130> A61682M
<160> 25
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
tgtggggccc tgaaaggcga gctgagat 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 2
atgggccgcc atacgacgac gctcaact 28
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 3
gaagtctggt tccttggcag gatg 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 4
actcgataca ctggcctagc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 5
caggtgtttg agggtagctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <4 00> 6
cggttcatca tggtacagtc 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 7
actgcccctc atcagactgc tact 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 8
cactgccttg tactcgggta gctg 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 9
gttccaacct gtgcctcgcg tctt 24 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <4 00> 10
agcgaggcat ggagagagcg gagcag 2 6
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 11
cgtggtgagc atcttcggag tgg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <4 00> 12
ccttcttggt ccgcccgttc tta 23
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 13
atggacgcaa ctgtgaacat gatgttcgca 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 14
ctttgaggtc ctggtccatc acgtgaccat 30
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 15
ccattagggg ccatcatcgc tttc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <400> 16
cactgctcac tggagggggc ttgc 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<400> 17
tgctgcggtc caggccatca agag 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 18
gggcactgtt cagttcagcg gatc 24
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<4 00> 19
tctttccacc aggcccccgg ctc 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <400> 20
tgcgggcgga catggggaga tcc 23 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <400> 21
attcttcgtt gtcaagccgc caaagtggag 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 22
agttgtttgc tgcggagttg tcatctcgtc 30
<210> 23 <211> 2127 <212> DNA
<213> virus SV40 LT (SV40 gp6) <400> 23
atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60
aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120
tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180
aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240
actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300
gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360
caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 420
gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 480
atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 540
gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 600
cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 660
ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 720
ttttctgtta ttgaggaaag tttgccaggt gggttaaagg agcatgattt taatccagaa 780
gaagcagagg aaactaaaca agtgtcctgg aagcttgtaa cagagtatgc aatggaaaca 840
aaatgtgatg atgtgttgtt attgcttggg atgtacttgg aatttcagta cagttttgaa 900
atgtgtttaa aatgtattaa aaaagaacag cccagccact ataagtacca tgaaaagcat 960
tatgcaaatg ctgctatatt tgctgacagc aaaaaccaaa aaaccatatg ccaacaggct 1020
gttgatactg ttttagctaa aaagcgggtt gatagcctac aattaactag agaacaaatg 1080
ttaacaaaca gatttaatga tcttttggat aggatggata taatgtttgg ttctacaggc 1140
tctgctgaca tagaagaatg gatggctgga gttgcttggc tacactgttt gttgcccaaa 1200
atggattcag tggtgtatga ctttttaaaa tgcatggtgt acaacattcc taaaaaaaga 1260
tactggctgt ttaaaggacc aattgatagt ggtaaaacta cattagcagc tgctttgctt 1320
gaattatgtg gggggaaagc tttaaatgtt aatttgccct tggacaggct gaactttgag 1380
ctaggagtag ctattgacca gtttttagta gtttttgagg atgtaaaggg cactggaggg 1440
gagtccagag atttgccttc aggtcaggga attaataacc tggacaattt aagggattat 1500
ttggatggca gtgttaaggt aaacttagaa aagaaacacc taaataaaag aactcaaata 1560
tttccccctg gaatagtcac catgaatgag tacagtgtgc ctaaaacact gcaggccaga 1620
tttgtaaaac aaatagattt taggcccaaa gattatttaa agcattgcct ggaacgcagt 1680
gagtttttgt tagaaaagag aataattcaa agtggcattg ctttgcttct tatgttaatt 1740
tggtacagac ctgtggctga gtttgctcaa agtattcaga gcagaattgt ggagtggaaa 1800
gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1860
atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1920
gaaaatgctg ataaaaatga agatggtggg gagaagaaca tggaagactc agggcatgaa 1980
acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2040
catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2100
acacctcccc ctgaacctga aacataa 2127
<210> 24
<211> 456
<212> DNA
<213> virus HPVl6 E6
<4 00> 24 atgtttcagg acaactatac gaggtatatg gctgtatgtg tatagtttgt attaggtgta aaaaagcaaa agatcatcaa
acccacagga atgatataat actttgcttt ataaatgttt atggaacaac ttaactgtca gattccataa gaacacgtag
gcgacccaga attagaatgt tcgggattta aaagttttat attagaacag aaagccactg tataaggggt agaaacccag
aagttaccac gtgtactgca tgcatagtat tctaaaatta caatacaaca tgtcctgaag cggtggaccg ctgtaa
agttatgcac agcaacagtt atagagatgg gtgagtatag aaccgttgtg aaaagcaaag gtcgatgtat
agagctgcaa actgcgacgt gaatccatat acattattgt tgatttgtta acatctggac gtcttgttgc
60 120 180 240 300 360 420 456
<210> 25 <211> 297 <212> DNA
<213> vírus HPV16 Ε7 <400> 25
atgcatggag atacacctac gatctctact gttatgagca ccagctggac aagcagaacc tgtgactcta cgcttcggtt gacctgttaa tgggcacact
attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60
attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120
ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180
gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240
aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297

Claims (25)

1. Uso de um fator de reprogramação, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma célula-tronco pluripotente induzida a partir de uma célula somática.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende genes ou produtos gênicos correspondentes que apresentam expressão específica em células embrionárias ou têm papéis importantes na manutenção da pluripotência de células embrionárias.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende pelo menos o gene Oct3/4 ou o produto do gene Oct3/4.
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende dois genes ou produtos gênicos correspondentes selecionados do grupo do gene Oct3/4, gene Sox2, gene c-Myc e gene Klf4.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende três genes ou produtos gênicos correspondentes selecionados do grupo do gene Oct3/4, gene Sox2, gene c-Myc e gene Klf4.
6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende o gene Oct3/4, gene Sox2, gene c-Myc e gene Klf4 ou produto do gene Oct3/4, produto do gene Sox2, produto do gene c-Myc e produto do gene Klf4.
7. Agente para a preparação de uma célula-tronco pluripotente induzida a partir de uma célula somática, caracterizado pelo fato de que compreende o fator de reprogramação.
8. Agente de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende genes ou produtos gênicos correspondentes que apresentam expressão específica em células embrionárias ou têm papéis importantes na manutenção da pluripotência de células embrionárias.
9. Agente de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os genes ou produtos gênicos compreendem pelo menos o gene Oct3/4 ou o produto do gene Oct3/4.
10. Agente de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende dois genes ou produtos gênicos correspondentes selecionados do grupo do gene Oct3/4, gene Sox2, gene c-Myc e gene Klf4.
11. Agente de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende três genes ou produtos gênicos correspondentes selecionados do grupo do gene Oct3/4, gene Sox2, gene c-Myc e gene Klf4.
12. Agente de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende o gene Oct3/4, gene Sox2, gene c-Myc e gene Klf4 ou produto do gene Oct3/4, produto do gene Sox2, produto do gene c-Myc e produto do gene Klf4.
13. Célula-tronco pluripotente induzida, caracterizada pelos seguintes (i)-(iii): (i) derivada de uma célula somática, (ii) pode ser obtida sem usar uma célula germinativa ou uma célula tronco embrionária (ES), e (iii) possuidora de capacidade pluripotente e de crescimento
14. Célula-tronco pluripotente induzida de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato da célula somática ser célula humana.
15. Célula-tronco pluripotente induzida de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de expressar endogenamente o gene Oct3/4 e o gene Nanog.
16. Método para preparar uma célula-tronco pluripotente induzida, caracterizada pelo fato de que compreende as seguintes etapas (i)- (iv): (i) introduzir fator de reprogramação em células somáticas, (ii) cultivar as células obtidas na etapa (i) em um meio para produzir células expressando endogenamente o gene Oct3/4 e o gene Nanog, (iii) selecionar as células produzidas na etapa (ii) que têm morfologia similar às células ES, e (iv) ainda cultivar as células selecionadas na etapa (iii) em um meio.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a célula somática é uma célula humana.
18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende genes que apresentam expressão específica em células embrionárias ou têm papéis importantes na manutenção da pluripotência de células embrionárias.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende pelo menos o gene Oct3/4.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende dois genes selecionados do grupo do gene Oct3/4, gene Sox2, gene c-Myc e gene Klf4.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende três genes selecionados do grupo do gene Oct3/4, gene Sox2, gene c-Myc e gene Klf4.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o fator de reprogramação compreende o gene Oct3/4, gene Sox2, gene c-Myc e gene Klf4.
23. Célula-tronco pluripotente induzida, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 22.
24. Método para preparar uma célula somática, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de indução da diferenciação das células- tronco pluripotente induzidas como definida em qualquer uma das reivindicações 13 a 15.
25. Uso de células-tronco pluripotentes induzidas como definidas em qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de ser por preparação de uma célula somática.
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