BRPI0620115A2 - anticorpo de domìnio recombinante, molécula de ácido nucleico isolada, composição farmacêutica, e, métodos para detectar o tnf-alfa humano em uma amostra e para tratar de um distúrbio distinguido pela atividade do tnf-alfa humano em um indivìduo humano - Google Patents

Abstract

ANTICORPO DE DOMìNIO RECOMBINANTE, MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, MéTODOS PARA DETECTAR O TNF-ALFA HUMANO EM UMA AMOSTRA E PARA TRATAR DE UM DISTURBIO DISTINGUIDO PELA ATIVIDADE DO TNF-ALFA HUMANO EM UM INDIVìDUO HUMANO A presente invenção fornece um anticorpo de domínio recombinante (dAb) que se Liga ao TNF-<244> humano, o dAb compreendendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, em que referido domínio variável compreende pelo menos uma região determinante da complementaridade (CDR) tendo uma seqúéncia derivada de um primata do Novo Mundo, em que a CDR é selecionada do grupo consistindo de YAATKLQS (SEQ ID NO: 1), YEASSLQS (SEQ ID NO: 2), YEASKLQS (SEQ ID NO: 3) e YSASNLET (SEQ ID NO: 4). O anticorpo de domínio recombinante é usado para detectar o TNF-<244> humano em uma amostra, e para tratar de um distúrbio caracterizado pela atividade do TNF-<244> humano.

Description

"ANTICORPO DE DOMÍNIO RECOMBINANTE, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS PARA DETECTAR O TNF-ALFA HUMANO EM UMA AMOSTRA E PARA TRATAR DE UM DISTÚRBIO DISTINGUIDO PELA ATIVIDADE DO TNF-ALFA HUMANO EM UM INDIVÍDUO HUMANO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção diz respeito a anticorpos de domínio (dAbs) recombinantes úteis para a terapia humana. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a um anticorpo de domínio (dAb) que se liga ao TNF-a humano, e ao seu uso no tratamento de distúrbios caracterizados pela atividade do TNF-α humano.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é uma citocina produzida por numerosos tipos de células, incluindo monócitos e macrófagos, que tenham sido implicados em mediar o choque e a fisiopatologia de uma variedade de doenças e distúrbios humanos, incluindo sepse, infecções, doenças autoimunes, rejeição de transplantes e a doença enxerto-versus- hospedeiro.

Em um esforço para contrariar os efeitos nocivos mediados pelo TNF-α humano, anticorpos que se liguem e neutralizem o TNF-α humano têm sido procurados como m meio de inibir a atividade do TNF-α. Alguns dos anticorpos mais primitivos direcionados contra o TNF-α humano foram os anticorpos monoclonais de camundongos secretados das linhagens de células de hibridomas preparadas dos linfócitos colhidos de camundongos imunizados com TNF-α humano. Embora tais anticorpos tenham sido eficazes na ligação e neutralização do TNF-α humano, seu uso na terapia in vivo foi limitado pelos problemas associados com a administração de anticorpos de camundongos aos seres humanos, em particular a eliciação de uma resposta imune indesejável contra o anticorpo de camundongos em um ser humano, referida como reações dos anticorpos humanos anticamundongos (HAMA).

Em uma tentativa de superar aqueles problemas, anticorpos de TNF-α anti-humanos de murinos foram geneticamente engendrados para serem mais semelhantes aos humanos. Por exemplo, foram criados anticorpos quiméricos humanos/de camundongos, nos quais as seqüências de região variável de anticorpos do genoma de camundongos são combinadas com as seqüência de região constante de anticorpos do genoma humano. Os anticorpos quiméricos apresentam as características de ligação do anticorpo parental de camundongo, e as funções efetoras associadas com a região constante humana. Embora estes anticorpos quiméricos tenham sido ousados na terapia humana, eles ainda retêm algumas seqüências murinas e, portanto, ainda podem eliciar as reações de anticorpos antiquiméricos em receptores humanos, particularmente quando administrados por períodos prolongados, assim limitando sua aplicação terapêutica.

Os anticorpos monoclonais humanos contra o TNF-α humano foram desenvolvidos com o uso de técnicas de hibridomas humanos. Esta abordagem, entretanto, padece de limitações éticas, clínicas e imunológicas na imunização de pacientes humanos.

Foi postulado que os anticorpos de primatas não humanos serão tolerados nos seres humanos porque eles são estruturalmente semelhantes aos anticorpos humanos [Ehrlich, Ρ. H. et ai. Human and primate monoclonal antibodies for in vivo therapy. Clin Chem. 34: 9 pp. 1681-1688 (1988)]. Além disso, tendo em vista serem os anticorpos humanos não imunogênicos nos macacos Reso (Ehrlich, Ρ. H. et al., Rhesus monkey responses to multiple injections of human monoclonal antibodies. Hybridoma 1987; 6: 151-160), é provável que o contrário seja também aplicável e os anticorpos de primatas sejam não imunogênicos nos seres humanos. Os primatas evolucionariamente distantes, como os primatas do Novo Mundo, não são apenas suficientemente diferentes dos seres humanos para possibilitar anticorpos contra os antígenos humanos a serem gerados, mas são suficientemente semelhantes ao seres humanos para terem anticorpos semelhantes aos anticorpos humanos, de modo que o hospedeiro não gere uma resposta imune de anticorpos quando tais anticorpos derivados dos primatas sejam introduzidos em um ser humano. Os primatas do Novo Mundo (subordem Platyrrhini) compreendem pelo menos 53 espécies comumente divididas em duas famílias, a Callithricidae e a Cebidae. A Callithricidae consiste de sagüis e tamarins. A Cebidae inclui o macaco-de- cheiro, o japuçá, o cuatá, o macaco-cabeludo, caiarara, macaco-da-noite e o macaco-gritador.

Estudos anteriores caracterizaram o repertório de cadeia pesada da imunoglobulina expressa do sagüi Callithrix jacchus (von Budingen, H-C et al., Characterization of the expressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Callithrix jacchus. Immunogenetics 2001; 53: 557-563). Foram identificados seis subgrupos de IGHV que apresentaram um alto grau de similaridade de seqüência com suas contrapartes de IGHV humano. As regiões da estrutura foram mais conservadas em comparação com as regiões de determinação da complementaridade (CDRs). O grau de similaridade entre C. jacchus e as seqüências de IGHV humanas foi menor do que entre os primatas do Velho Mundo e os seres humanos.

ANTICORPOS DE DOMÍNIO

Os anticorpos de domínio (dAb) são as menores unidades de ligação de anticorpos em funcionamento e correspondem às regiões variáveis das cadeias de anticorpos ou pesadas (Vh) ou leves (VL). Os anticorpos de domínios têm um peso molecular de aproximadamente 13 kDa, ou menos do que um décimo do tamanho de um anticorpo completo. As cadeias leves de imunoglobulina são referidas como cadeias leves ou capa ou lâmbida, e as cadeias pesadas como gama, mü, delta, alfa ou épsilon. A região variável dá ao anticorpo sua especificidade. Dentro de cada região variável acham-se as regiões de hipervariabilidade, de outra forma conhecidas como regiões determinantes da complementaridade (CDRs) que são flanqueadas por regiões mais conservadas referidas como regiões da estrutura. Dentro de cada região variável acham-se três CDRs e quatro regiões da estrutura.

Ao contrário dos anticorpos convencionais, os anticorpos de domínio são bem expressos nos sistemas bacterianos, de levedura e de I mamíferos. Seu pequeno tamanho leva em conta quantidades molares mais elevadas por grama do produto, assim provendo um aumento significativo na potência por dose. Além disso, os anticorpos de domínio podem ser usados como um bloco de construção para criar produtos terapêuticos tais como os dAbs de alvejamento múltiplo, em que uma construção contendo dois ou mais domínios variáveis se ligam a dois ou mais alvos terapêuticos, ou dAbs alvejados para administração pulmonar ou oral.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo de domínio (dAb) recombinante que se liga ao TNF-α humano, o dAb compreendendo um domínio variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, em que referido domínio variável compreende pelo menos uma região determinante da complementaridade (CDR) tendo uma seqüência derivada de um primata do Novo Mundo, em que a CDR é selecionada do grupo consistindo de AATKLQS (SEQ ID NO: 1), EASSLQS (SEQ ID NO: 2), EASKLQS (SEQ ID NO: 3) e SASNLET (SEQ ID NO: 4).

Em um segundo aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do dAb de acordo com o primeiro aspecto da invenção, junto com um portador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção leva em conta o uso de um dAb de acordo com o primeiro aspecto da invenção, em uma aplicação de diagnóstico para detectar o TNF-α humano.

Em um quarto aspecto, a invenção fornece um método para tratar de um distúrbio caracterizado pela atividade do TNF-α humano em um paciente humano, compreendendo administrar ao paciente uma composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção.

Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma seqüência de ácido nucléico codificando o dAb do primeiro aspecto da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra as seqüências de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) e de nucleotídeos (SEQ ID NO: 5) do dAb receptor.

A Figura 2 mostra as seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de onze (11) sagüis e seis (6) segmentos de genes Vk de macacos-da-noite.

A Figura 3 mostra as seqüências de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) e de nucleotídeos (ambas as fitas; SEQ ID Nos: 5 e 53) do dAb receptor. Os sítios de restrição da digestão para Kpn I e San Dl, que excitam uma região incluindo a CDR2, são indicados na figura. Os resíduos de CDR2 removidos acham-se sublinhados.

A Figura 4 mostra os alinhamentos de seqüências apresentando oligonucleotídeos usados durante a clonagem e a confirmação de seqüência final das seqüências de nucleotídeos (A; SEQ ID Nos: 5, 36, 54- 56, 37, 57-59, 14, 60-62, 15, 63-65, respectivamente) e de aminoácidos (B; SEQ ID Nos: 6, 42, 66-68, 43, 69-71, 25, 72-74, 26, 75-77, respectivamente) mostradas na Figura 2.

A Figura 5 demonstra a capacidade dos dAbs enxertados de CDR2 para inibir a ligação do TNF ao receptor de TNF recombinante. Os dAbs testados foram os seguintes: Macaco-da-noite 1 (CDR = AATKLQS; SEQ ID NO: 1), Macaco-da-noite 2 (CDR = EASSLQS; SEQ ID NO: 2), Sagüi 1 (CDR = EASKLQS; SEQ ID NO: 3), Sagüi 2 (CDR = SASNLET; SEQ ID NO: 4) e dAb Receptor (CDR = SASELQS; SEQ ID NO: 49).

A Figura 6 demonstra a capacidade melhorada dos Compostos 100 e 123 para neutralizar a atividade citotóxica do TNF sobre os fibroblastos L929 de camundongos relativos ao dAb receptor (Composto 145).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo de domínio recombinante (dAb) que se liga ao TNF-α humano, o dAb compreendendo um domínio variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, em que referido domínio variável compreende pelo menos uma região determinante da complementaridade (CDR) tendo uma seqüência derivada de um primata do Novo Mundo, em que a CDR é selecionada do grupo consistindo de AATKLQS (SEQ ID NO: 1), EASSLQS (SEQ ID NO: 2), EASKLQS (SEQ ID NO: 3), SASNLET (SEQ ID NO: 4). Preferivelmente, a CDR é CDR2.

Em uma forma de realização preferida, o dAb tem uma seqüência selecionada dentre:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQK PGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYC QQVVWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 145; SEQ ID NO: 7)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQ KPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 123; SEQ ID NO: 8)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQK PGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYCQ QWWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 100; SEQ ID NO: 9)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQ KPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYC QQWWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 196; SEQ ID NO: 10)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQK PGKPPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQ QWWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 134; SEQ ID NO: 50)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQK PGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYC QQVVWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 137; SEQ ID NO: 51)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQK PGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYCQ QWWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 121; SEQ ID NO: 52)

Em um outro aspecto, a invenção fornece uma seqüência de ácido nucléico codificando o dAb do primeiro aspecto da invenção.

A expressão "liga-se a", como aqui usada, refere-se à ligação de um antígeno por uma região variável de imunoglobulina com uma constante de dissociação (Kd) de 1 μΜ ou menos, medida pela análise de ressonância de plasmon de superfície com o uso, por exemplo, de um sistema de ressonância de plasmon de superfície BIAcore® e um programa de avaliação cinética BIAcore® (por exemplo, a versão 2.1). A afinidade ou constante de dissociação (Kd) para uma interação de ligação específica é de preferência de cerca de 500 nM ou menos, mais preferível de cerca de 300 nM ou menos e, preferivelmente, de pelo menos 300 nM a 50 pM, 200 nM a 50 pM, e o mais preferível de pelo menos 100 nM a 50 pM, 75 nM a 50 pM, 10 nM a 50 pM.

A expressão "domínio variável", como aqui usada, significa um domínio de polipeptídeo duplicado, que compreende seqüências características de domínios variáveis de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, e que especificamente se liga a um antígeno. O anticorpo do domínio ou dAb é equivalente a um polipeptídeo de domínio variável único.

Será observado pelas pessoas versadas na técnica que o remanescente da seqüência de domínio variável pode ser derivado ou da seqüência de domínio variável ou de um ser humano, de um primata do Novo Mundo ou de um primata do Velho Mundo, a qual, por causa de sua associação evolucionária com os seres humanos, compartilham um alto grau de homologia com a seqüência de seres humanos. Assim, por exemplo, uma CDR selecionada das seqüências acima pode ser enxertada na seqüência de região variável humana ou de primata para substituir a CDR do tipo selvagem.

Conseqüentemente, a invenção baseia-se ainda em um método para amplificação dos genes de domínio variável de imunoglobulina de primatas do Novo Mundo, por exemplo por reação em cadeia da polimerase (PCR) de ácido nucléico extraído dos linfócitos de primatas do Novo Mundo, usando iniciadores específicos para as famílias de genes de domínio variável de cadeias pesada e leve. Por exemplo, as informações com respeito aos limites dos domínios variáveis de genes de cadeia pesada e leve (VH e Vl respectivamente) podem ser usadas para designar os iniciadores de PCR que amplificam o domínio variável de uma seqüência codificadora da cadeia pesada ou leve clonada codificando um anticorpo conhecido para ligar um antígeno dado. O domínio variável amplificado é então introduzido ou sozinho ou como uma fusão com outra seqüência de polipeptídeos em um vetor de expressão adequado. O domínio variável expresso é então testado quanto à ligação de alta afinidade ao antígeno desejado.

O repertório dos domínios Vh e Vl pode ser um repertório de ocorrência natural das seqüências de imunoglobulina ou um repertório sintético. Um repertório de ocorrência natural é aquele preparado, por exemplo, das células que expressam a imunoglobulina colhidas de um ou mais primatas. Tais repertórios podem ser ingênuos, isto é, preparados de células que expressam a imunoglobulina de recém-nascidos, ou redistribuídos, isto é, preparados, por exemplo, de células B de primatas adultos. Se desejável, os clones identificados de um repertório natural, ou de qualquer repertório que ligue o antígeno alvo, ficam então sujeitos à mutagênese e outros testes de modo a produzir-se e selecionar-se variantes com características de ligação melhoradas.

Os repertórios sintéticos de domínios variáveis de imunoglobulina única são preparados pela introdução artificial de uma diversidade em um domínio variável clonado.

Um repertório dos domínios VH e VL pode ser testado quanto à especificidade de ligação desejada e ao comportamento funcional mediante, por exemplo, apresentação de fago. Métodos para a construção de bibliotecas de apresentação de bacteriófagos e bibliotecas de expressão de fago lâmbida, são bem conhecidos na técnica. A técnica de apresentação de fago foi descrita extensivamente na prática e exemplos de métodos e compostos para gerar e testar tais bibliotecas e amadurecer por afinidade os produtos delas, podem ser encontrados, por exemplo, em Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Dower et al. PCT. 91/17271, 15 Patente U.S. n2 5.427.908, Patente U.S. 5.580.717 e EP 527.839; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Garrard et al. PCT WO 92/09690; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Griffiths et al. Patente U.S. n2 5.885.793 e EP 589.877; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 20 226: 889-896; Hay et al., (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; Husc et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Knappik et al. (2000) J Mol Biol 296: 57-86; Knappik et al. PCT WO 97/08320; Ladncr et al. Patentes U.S. n2 5.223.409, n2 5.403.484, n2 5.571.698, n2 5.837.500 e EP 436.597; McCafferty et al. 25 (1990) Nature 348: 552-554; McCafferty et al. PCT. WO 92/01047, Patente U.S. nº 5.969.108 e EP 589.877; Salfeld et al. PCT WO 97/29131, Pedido Provisório U.S. n2 60/126.603; e Winter et al. PCT WO 92/20791 e EP 368.684.

Bibliotecas recombinantes expressando o repertório dos domínios de Vh e Vl podem ser expressas sobre a superfície de microorganismos, por exemplo, de levedura ou bactérias (ver a publicações PCT WO 99/36569 e 98/49286).

O Método de Anticorpos de Linfócitos Seletivos ou SLAM, como é referido no estado da técnica, é outro meio de gerar rapidamente anticorpos de alta afinidade. Ao contrário das abordagens de apresentação de fago, todos os anticorpos são completamente divalentes de modo a gerar anticorpos de primatas do Novo Mundo, os primatas do Novo Mundo são imunizados com um antígeno humano, por exemplo um polipeptídeo de TNF- a. Em seguida à imunização, as células são removidas e seletivamente proliferadas em micro-reservatórios individuais. Os sobrenadantes são removidos dos reservatórios e testados tanto quanto à ligação quanto à função. As seqüências de genes podem ser recuperadas para subseqüentes manipulações, por exemplo humanização, fragmento de Fab, geração de scFv ou dAb. Assim sendo, outro exemplo é a derivação do anticorpo ou espécies de anticorpos da invenção mediante o SLAM e seus derivados (Babcock, J. S. et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93; 7843-7848, Patente U.S. n° 5.627.052 e publicação PCT WO 92/02551). As adaptações do SLAM, tais como o uso de alternativas para testar sobrenadantes tais como a lavagem na bateia, também se situa dentro do escopo desta invenção.

Em um sistema de expressão, a biblioteca de peptídeo/proteína recombinante é apresentada em ribossomas (para exemplos, ver Roberts, R. W. e Szostak, J. W. 1997. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 94: 12297 - 123202 e Publicação PCT n° WO 98/31700). Assim, outro exemplo envolve a geração e a transcrição in vitro de uma biblioteca de DNA (por exemplo, de anticorpos ou derivados preferivelmente preparados de células imunizadas, mas não tão limitadas), translação da biblioteca de tal modo que a proteína e os mRNAs "imunizados" permaneçam sobre o ribossoma, seleção de afinidade (por exemplo pela ligação a RSP), isolamento do mRNA, translação reversa e subseqüente amplificação (por exemplo pela reação em cadeia da polimerase ou tecnologia relacionada). Rodadas adicionais de seleção e amplificação podem ser acopladas, quando necessário para a maturação de afinidade através da introdução de mutação somática neste sistema ou por outros métodos de maturação de afinidade como conhecido no estado da técnica.

Outro exemplo observa a aplicação da tecnologia de compartimentalização da emulsão para a geração dos anticorpos de domínio da invenção. Na compartimentalização da emulsão, métodos de separação in vitro e óptica são combinados com a co-compartimentalização da proteína transladada e sua seqüência codificadora de nucleotídeos na fase aquosa dentro de uma gotícula de óleo em uma emulsão (ver as publicações PCT n— WO 99026711 e WO 0040712). Os elementos principais para a geração e seleção de anticorpos são essencialmente semelhantes ao método in vitro de apresentação de ribossomas.

As seqüências de CDR podem ser obtidas de várias fontes, por exemplo dos bancos de dados como The National Centre for Biotechnology Information, dos bancos de dados de proteínas e nucleotídeos, The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest. Alternativamente, as regiões de CDR podem ser previstas do repertório dos domínios Vh e Vl [ver, por exemplo, Kabat, E. A. e Wu, Τ. T. Attempts to locate complementarity determining residues in the variable positions of light and heavy chains. Ann. NY Acad. Sei. 190: 382-393 (1971)]. A seqüência de CDR pode ser um DNA genômico ou um cDNA.

Existem vários meios nos quais a CDR de substituição pode ser enxertada em uma seqüência de domínio variável e tais métodos serão familiares àqueles habilitados na técnica. O método preferido da presente invenção envolve a substituição da CDR2 no domínio de região variável através da mutagênese dirigida ao iniciador. Este método consiste do recozimento de um oligonucleotídeo codificando uma mutação desejada a uma região alvo onde ela serve como um iniciador para a iniciação da síntese de DNA in vitro, prolongando o oligonucleotídeo por uma DNA polimerase para gerar um DNA de filamento duplo que carregue as mutações desejadas, e ligando e clonando a seqüência em um vetor de expressão apropriado.

Preferivelmente, o anticorpo do domínio de acordo com a invenção tem baixa imunogenicidade nos seres humanos.

Pela referência à expressão "baixa imunogenicidade" denota- se que o anticorpo de domínio não origina uma resposta do anticorpo, em um ser humano, de suficiente magnitude para reduzir a eficácia da administração continuada do anticorpo por um tempo suficiente para de obter a eficácia terapêutica.

Preferivelmente, a seqüência de região variável na qual a CDR é enxertada, é a "seqüência do receptor de dAb" (designada Composto 128) fornecida na Figura 1.

A seqüência do receptor de dAb consiste da seqüência de aminoácidos apresentada na SEQID NO: 5:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASELQSGWSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVV WRPFT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 6).

Esta seqüência é codificada pela seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 5:

GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT CCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC

ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA

GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA

CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG CAA ATC AAA CGG

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, uma seqüência de CDR de sagüi SASNLET (SEQ ID NO: 4) é enxertada na seqüência do receptor de dAb de modo a substituir a seqüência de CDR2 (SASELQS; SEQ ID NO: 49) da seqüência do receptor de dAb para produzir o seguinte dAb (designado Composto 145): Composto 145

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQK PGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYC QQWWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 7)

Assim sendo, em uma forma de realização preferida, o dAb que se liga ao TNF-α humano compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

Situa-se dentro do escopo da presente invenção, que a seqüência de dAb pode estar ainda sujeita à maturação de afinidade de modo a melhorar suas características de ligação a antígeno. Isto pode necessitar da modificação de certos resíduos de aminoácidos dentro da CDRl e da CDR3.

Por exemplo o dAb enxertado com CDR de sagüi apresentado na SEQ ID NO: 7 foi amadurecido por afinidade como apresentado em Materiais e Métodos, e testado por ligação de TNF. Em uma outra forma de realização preferida, o dAb que se liga ao TNF-α humano compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9. Estas foram designadas como Composto 123 e Composto 100, respectivamente, e suas seqüências são apresentadas abaixo: Composto 123

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQ KPGKAPKLLIYS ASNLETGVP SRP SGS GS GTDFTLTIS SLQPEDF ATYY CQQWW RPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 8)

Composto 100

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQK PGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYCQ QWWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 9)

Em uma forma de realização particularmente preferida, o dAb que se liga ao TNF-α humano compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Esta foi designada de Composto 196 e a seqüência é fornecida abaixo:

Composto 196

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQ KPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYC QQWWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 10)

O dAb de acordo com a invenção pode ainda compreender uma região constante de imunoglobulina (região Fc) a ele conectada. A seqüência de região constante pode ser originada das seqüências humanas ou de primatas. A seqüência de primatas pode ser uma de primata do Novo Mundo ou uma seqüência de primata do Velho Mundo. Os primatas do Velho Mundo adequados incluem o chimpanzé, ou macaco hominídeo, por exemplo um gorila ou um orangotango, o qual, por causa de sua íntima proximidade filogenética aos seres humanos, compartilham de um alto grau de homologia com a seqüência de região constante humana.

O dAb (com ou sem a região constante a ele conectada) pode ser originado ou ligado a outra molécula funcional. Por exemplo, o dAb pode ser funcionalmente ligado mediante acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou, de outra forma, a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como a outro anticorpo, um agente detectável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo que possam mediar a associação do anticorpo com outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou um rótulo de poli-histidina).

Agentes detectáveis úteis com os quais o dAb pode ser derivado, incluem compostos fluorescentes. Agentes exemplares detectáveis fluorescentes incluem a fluoresceína, o isotiocianato de fluoresceína, a rodamina, o cloreto de 5-dimetilamina-l-haftalenossulfonila, a ficoeritrina e outros. O dAb também pode ser derivado com enzimas detectáveis tais como a fosfatase alcalina, a peroxidase de raiz forte, a glicose oxidase etc. Quando um dAb é derivado com uma enzima detectável, ele é detectado pela adição de reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação detectável. Um dAb pode também ser derivado com biotina, e detectado através de medição indireta da ligação de avidina ou estreptavidina.

A presente invenção também se estende aos dAbs PEGuilados (com ou sem a região constante a eles conectados), os quais proporcionam meia-vida e resistência à degradação aumentadas sem uma perda na atividade (por exemplo, afinidade de ligação) em relação aos polipeptídeos de anticorpos não PEGuilados.

O dAb pode ser acoplado, com o uso de métodos conhecidos na técnica, a moléculas poliméricas (preferivelmente PEG) úteis para se obter as propriedades de meia-vida e resistência à degradação aumentadas. Os componentes poliméricos que podem ser utilizados na invenção podem ser sintéticos e de ocorrência natural e incluem, porém sem limitar, os polímeros de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada, ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado tal como um homo- ou heteropolissacarídeo. Exemplos preferidos de polímeros sintéticos que podem ser usados na invenção incluem os poli(etileno glicol) (PEG), poli(propileno glicol) ou o álcool polivinílico) de cadeia reta ou ramificada e seus derivados ou formas substituídas. Polímeros substituídos particularmente preferidos para articulação aos dAbs incluem o PEG substituído, incluindo o metóxi(polietileno glicol). Componentes poliméricos de ocorrência natural que podem ser usados além do PEG ou no lugar deste incluem a lactose, amilose, dextrano ou glicogênio, bem como os derivados destes que devem ser reconhecidos pelas pessoas habilitadas na técnica.

As formas de moléculas poliméricas derivadas incluem, por exemplo, os derivados que possuem componentes adicionais ou grupos reativos neles presentes para permitir a interação com os resíduos de aminoácidos dos polipeptídeos de anticorpos de domínio aqui descritos. Tais derivados incluem os ésteres ativos de N-hidroxilsuccinimida (NHS), os polímeros de propionato de succinimidila, e agentes reativos seletivos de sulfidrila, tais como a maleimida, a vinil sulfona e o tiol. Polímeros de PEG úteis na invenção podem ser moléculas lineares, ou podem ser ramificadas, em que os componentes de PEG múltiplos estejam presentes em um polímero único.

O grupo reativo (por exemplo, MAL, NHS, SPA, VS ou Tiol) pode ser articulado diretamente ao polímero de PEG ou pode ser articulado ao PEG através de uma molécula ligadora.

O tamanho dos polímeros úteis na invenção pode situar-se na faixa entre 500 Da a 60 kDa, por exemplo entre 1000 Da e 60 kDa, 10 kDa e 60 kDa, 20 kDa e 60 kDa, 30 kDa e 60 kDa, 40 kDa e 60 kDa, e até entre 50 kDa e 60 kDa. Os polímeros usados na invenção, particularmente o PEG. podem ser polímeros de cadeia reta ou podem possuir uma conformação ramificada.

As moléculas dos polímeros (PEG) úteis na invenção podem ser articuladas a um anticorpo de domínio usando-se métodos que são bem conhecidos na técnica. A primeira etapa na articulação do PEG ou de outros componentes poliméricos, a um monômero de polipeptídeo de anticorpo ou multímero da invenção, é a substituição doso grupos finais hidroxila do polímero de PEG por grupos funcionais contendo eletrófilos. Particularmente, os polímeros de PEG são articulados ou aos resíduos de cisteína ou de lisina presentes no anticorpo de domínio. Os resíduos de cisteína e de lisina podem ser de ocorrência natural, ou podem ser engendrados na molécula de polipeptídeo de anticorpo. Por exemplo, os resíduos de cisteína podem ser recombinantemente engendrados no término C de um polipeptídeo de dAb, ou os resíduos nas localizações acessíveis de solvente específico em um dAb ou outro polipeptídeo de anticorpo, podem ser substituídos com cisteína ou lisina.

O dAb de acordo com a invenção pode ser articulado a uma ou mais moléculas que possam aumentar sua meia-vida in vivo. Aquelas moléculas podem ser articuladas ao dAb através de um ligador, de modo que elas não interfiram/estericamente liguem o sítio de ligação de antígeno. Alternativamente, elas podem ser articuladas à região constante. Tipicamente, tais moléculas são polipeptídeos que de ocorrência natural in vivo e que resistem à degradação ou remoção por mecanismos endógenos. As moléculas que aumentam a meia-vida podem ser selecionadas do seguinte:

(a) proteínas da matriz extracelular, por exemplo colágeno, laminina, integrina e fibronectina;

(b) proteínas encontradas no sangue, por exemplo a fibrina a- 2, macroglobulina, albumina sérica, fibrinogênio A, fibrinogênio B, proteína A amilóide sérica, proteína de heptaglobina, ubiquitina, uteroglobulina, microglobulina β-2, plasminogênio, lisozima, cistatina C, alfa-1-antitripsina e inibidor da tripsina pancreática.

(c)proteínas séricas imunes, por exemplo IgE, IgG, IgM;

(d)proteínas de transporte, por exemplo a proteína de ligação ao retinol, a microglobulina α-1;

(e)defensinas, por exemplo a beta-defensina 1, as defensinas neutrófilas 1, 2 e 3;

(f)as proteínas encontradas na barreira hematoencefálica ou nos tecidos neurais, por exemplo o receptor da melanocortina, mielina, transportador do ascorbato;

(g)proteínas de fusão do agente neurofarmacêutico do ligando específico do receptor da transferrina (ver a U.S. 5977307); receptor de células endoteliais capilares do cérebro, transferrina, receptor da transferrina, insulina, receptor do fator 1 de crescimento insulinóide (IGF-1), receptor do fator 2 de crescimento insulinóide (IGF-2), receptor da insulina;

(h)proteínas localizadas nos rins, por exemplo a policistina, o colágeno do tipo IV, o transportador Kl de ânion orgânico, o antígeno de Heymann;

(i)proteínas localizadas no fígado, por exemplo álcool desidrogenase, G250;

(j)fator X de coagulação do sangue;

(k)antitripsina a-1;

(I)HNF la;

(m)proteínas localizadas nos pulmões, por exemplo o componente secretório (liga a IgA);

(n)proteínas localizadas no coração, por exemplo a HSP 27;

(o)proteínas localizadas na pele, por exemplo a ceratina;

(p)proteína específicas dos ossos, tais como as proteínas morfogênicas dos ossos (BMPs), por exemplo a BMP-2, -4, -5, -6, -7 (também referidas como proteína osteogênicas) (OP-I) e -8 (OP-2);

(q)proteínas específicas dos tumores, por exemplo antígeno trofoblasto humano, o receptor da herceptina, o receptor do estrogênio, catepsinas, por exemplo a catepsina B (encontrada no fígado e no baço);

(r)proteínas específicas da doença, por exemplo antígenos expressos apenas sobre as células T ativadas: incluindo LAG-3 (gene de ativação linfocítica); ligando de osteoprotegerina (OPGL) ver Nature 402, 304-309, 1999; 0X40 (um membro da família de receptores de TNF, expresso sobre as células T ativadas e a única molécula de células T coestimuladoras conhecidas como sendo especificamente suprarreguladas nas células produtoras do vírus tipo-1 da leucemia de células T humanas (HTLV- 1) - ver J. Immunol. 1 de julho de 2000; 16561): 263-270; metaloproteases (associadas com artrite/cânceres), incluindo a Drosophila CG6512, paraplegia humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH murina, fatores de crescimento angiogênico, incluindo o fator de crescimento de fibroblasto acídico (FGF-1), o fator de crescimento de fibroblasto básico (FGF-2), o fator de crescimento endotelial vascular/fator de permeabilidade vascular (VEGFA7PF), o fator-a de crescimento transformador (TGF-α), o fator-alfa de necrose tumoral (TNF- a), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), o fator de crescimento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), o fator de crescimento placentado (PIGF), o fator-BB de crescimento derivado de plaquetas de midcina (PDGF), fractalcina;

(s) proteínas de estresse (proteínas de choque térmico);

(t)proteínas envolvidas no transporte de Fe; e

(u) anticorpos, fragmentos ou derivados direcionados contra proteínas endógenas, por exemplo albumina sérica.

Em uma outra forma de realização da presente invenção, o dAb de acordo com o primeiro aspecto pode ser multimerizado, como, por exemplo, hetero- ou homodímeros, hetero- ou homotrímeros, hetero- ou homotetrâmeros, ou hetero- ou homomultímeros de ordem mais elevada. A multimerização pode aumentar a intensidade de ligação do antígeno, em que a intensidade de ligação é relacionada à soma das afinidades de ligação dos sítios de ligação múltipla.

Assim, a invenção fornece um anticorpo de domínio de acordo com o primeiro aspecto, em que o anticorpo de domínio é ligado pelo menos a um outro anticorpo de domínio. Cada dAb pode ligar-se ao mesmo ou a diferentes antígenos.

Os multímeros de dAb podem ainda compreender um ou mais dAbs que sejam ligados e em que cada dAb se liga a um antígeno diferente, ligandos multiespecíficos incluindo os assim chamados "ligandos específicos duais". Por exemplo, os ligandos específicos duais podem compreender um par de domínios VH ou um par de domínios VL- Tais ligandos específicos duais são descritos na WO 2004/003019 (PCT/GB 2003/002804) no nome de Domantis Ltd.

Em um segundo aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do dAb de acordo com o primeiro aspecto da invenção, junto com um portador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

Um "portador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifungicos, agentes de retardamento isotônico e de absorção, e outros, os quais sejam fisiologicamente compatíveis. Exemplos de portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais dentre água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e outros, bem como as combinações destes. Em muitos casos, será preferível incluir os agentes isotônicos, por exemplo açúcares, polialcoóis tais como o manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis tais como umectantes ou quantidades secundárias de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, preservativos ou tampões.

A composição pode estar em uma variedade de formas, incluindo as formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como as soluções líquidas (por exemplo, as soluções injetáveis e infiisíveis), dispersões ou suspensões, tabletes, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. Preferivelmente, a composição se acha na forma de uma solução injetável para imunização. A administração pode ser intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, intratecal e intra-arterial. As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de produção e armazenagem. As composições podem ser formuladas como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou oura estrutura ordenada adequada para alta concentração de medicamento. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo (isto é, o dAb) na quantidade requerida em um solvente apropriado, com um ou uma combinação dos ingredientes listados acima, seguida pela esterilização de filtração.

A composição pode também ser formulada como um pó estéril para a preparação das soluções injetáveis estéreis. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso de um revestimento tal como a lecitina e/ou tensoativos.

Em certas formas de realização, o composto ativo pode ser preparado com um portador que proteja o composto contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas microencapsulados de liberação. Polímeros compatíveis podem ser usados, tais como o acetato de etilenovinil, polissacarídeos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático.

A composição pode também ser formulada para administração oral. Nesta forma de realização, o dAb pode ser incluído em uma cápsula de gelatina de casca dura ou macia, comprimido em tabletes, ou incorporado diretamente na dieta do paciente.

A composição também pode ser formulada para administração retal.

Compostos ativos suplementares podem ser incorporados também na composição. O anticorpo de domínio pode ser coformulado e/ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo compostos antiinflamatórios, receptor de TNF-α solúvel ou um agente químico que iniba a produção de TNF-α humano, ou anticorpos que liguem outros alvos tais como citocinas ou moléculas superficiais celulares. Alternativamente, pode ser coadministrado com um reagente imunoquímico solúvel, tal como as proteínas A, C, G ou L.

Uma quantidade eficaz pode incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade profilaticamente eficaz fo dAb da invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade eficaz nas dosagens e por períodos de tempo necessários para se obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade profilaticamente eficaz refere-se a uma quantidade eficaz nas dosagens e por períodos de tempo necessários para se obter o resultado profilático desejado.

Em uma forma de realização preferida, a composição é administrada a mamíferos, preferivelmente a seres humanos ou primatas.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção leva em conta o uso de um dAb de acordo com o primeiro aspecto da invenção, em uma aplicação diagnostica para detectar o TNF-α humano.

Por exemplo, o dAb do TNF-α anti-humano de acordo com a invenção pode ser usado para detectar o TNF-α humano, por exemplo em uma amostra biológica, tal como soro ou plasma, com o uso de um imunoensaio convencional, tal como um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA) ou de imuno-histoquímica tecidual. O dAb de TNF-α anti-humano de acordo com a invenção pode ser ensaiado em fluidos biológicos por uma imunoensaio de competição com o uso de padrões de TNF-α humano recombinante rotulados com uma substância detectável e um anticorpo de TNF-α anti-humano não rotulado.

O dAb de TNF-α anti-humano de acordo com a invenção pode também ser usado para detectar o TNF-α de espécies outras que não os seres humanos, por exemplo o chimpanzé, o sagüi, o reso, camundongo, porco.

O dAb de TNF-α anti-humano de acordo com a invenção pode também ser usado nas aplicações de cultura celular em que se deseje inibir a atividade do TNF-a.

Em um quarto aspecto, a invenção fornece um método para tratar de um distúrbio caracterizado pela atividade do TNF-α humano em um paciente humano, compreendendo administrar ao paciente uma composição farmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção.

Pretende-se que um distúrbio caracterizado pela atividade do TNF-α humano inclua doenças e outros distúrbios em que a presença do TNF-α em um paciente sofrendo do distúrbio se tenha mostrado ser ou seja suspeita de ser ou responsável pela fisiopatologia do distúrbio ou um fator que contribua para uma piora do distúrbio. Preferivelmente, o distúrbio caracterizado pela atividade do TNF-α humano é selecionado do grupo consistindo de inflamação, doenças inflamatórias, sepse, incluindo choque séptico, choque endotóxico, sepse Gram-negativo e síndrome do choque tóxico; doenças autoimunes, incluindo a artrite reumatóide, a espondilite reumatóide, a osteoartrite e a artrite gotosa, alergia, esclerose múltipla, diabete autoimune, uveíte autoimune e síndrome nefrótica; doenças infecciosas, incluindo a febre e as mialgias devidas a infecção e caquexia secundária à infecção; doença enxerto-versus-hospedeiro; crescimento tumoral ou metástase; distúrbios pulmonares, incluindo a síndrome da insuficiência respiratória adulta, pulmão de choque, doença inflamatória pulmonar crônica, sarcoidose pulmonar, fibrose pulmonar e silicose; doenças inflamatórias intestinais, incluindo a doença de Crohn e a colite ulcerativa; distúrbios cardíacos, distúrbios inflamatórios dos ossos, hepatite, perturbações da coagulação, queimaduras, lesões de reperfusão, formação de quelóides, e formação de cicatrizes teciduais.

Em todo este relatório descritivo, a palavra "compreender" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento estabelecido, inteiro ou em etapas, ou grupo de elementos, inteiro ou em etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou em etapas, ou grupo de elementos, inteiros ou em etapas.

Todas as publicações mencionadas neste relatório descritivo ficam aqui incorporadas como referência. Qualquer exame dos documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou coisa parecida, que tenham sido incluídos no presente relatório descritivo, é unicamente para os fins de fornecer um contexto para a presente invenção. Não se deve considerar como a admissão de que qualquer ou todas estas matérias façam parte da base da técnica anterior, ou que tenham sido de conhecimento geral comum no campo relevante para a presente invenção, como ela existiu na Austrália ou em outra parte, antes da data de prioridade de cada reivindicação deste pedido.

A fim de que a natureza da presente invenção possa ser mais claramente entendida, suas formas preferidas serão agora descritas com referência aos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLO 1 MATERIAIS E MÉTODOS Isolamento dos genes VL de primatas do Novo Mundo Os DNAs genômicos de sagüi (gênero Callithrix, espécie desconhecida) e de macaco-da-noite (Aolus trivirgatus) foram obtidos da European Collection of Cell Cultures (ECACC), números do catálogo 85011419 e 90110510 respectivamente. O DNA de sagüi foi derivado da linhagem celular B95-8, enquanto o DNA do macaco-da-noite veio da linhagem celular OMK 637-69.

Os iniciadores degenerados com base nas seqüências condutoras Vk e nas seqüências de sinal de recombinação (RSS) foram derivados de Walter e Tomlinson, Antibody Engineering: A Practical Approach (1996). Os iniciadores usados para a amplificação do DNA Vk da linha germinal foram os seguintes: Iniciador VKlBL AATCKCAGGTKCCAGATG (SEQ ID NO: 11) Iniciador VK1BL3 5 a

GTTYRGGTKKGTAACACT (SEQ ED NO: 12) Iniciador VKlBL35b

ATGMCTTGTWACACTGTG (SEQ ID NO: 13) A PCR genômica (30 ciclos) foi realizada com o uso da Taq polimerase com qualquer par de iniciadores VKlBLxVKlBL35a ou VKlBLxVKlBL35b. Houve sobreposição entre as seqüências clonadas e os dois conjuntos de iniciadores usados.

Os produtos da PCR foram clonados no kit de clonagem TOPO TA da Invitrogen (Catálogo n° K4500-01) e seqüenciados com os iniciadores Ml3 dianteiro e pUC reverso. A seqüência foi confirmada nas direções dianteira e reversa. De modo a ainda confirmar, as seqüências chave não foram submetidas a erros de PCR, a PCR e o processo de clonagem foram repetidos duas vezes quanto às seqüências dos sagüis. Os nucleotídeos (SEQ ID NOs: 14 a 24 e SEQ ID NOs: 36 a 41) e o aminoácido (SEQ ID NOs: 25 a 35 e SEQ ID NOs: 42 a 47) são dados na Figura 2. As seqüências 1, 2 e 3 de sagüis foram confirmadas. As seqüências 4, 5, 6, 7 e 8 foram observadas apenas na PCR inicial. As seqüências 9, 10 e 11 foram observadas apenas na PCR de repetição (isto é, segunda) e na clonagem.

Síntese Oligo e Clonagem na Seqüência Receptora Quatro seqüências de CDR, a saber AATKLQS (SEQ ID NO: 1) da seqüência 1 do macaco-da-noite (SEQ ID NO: 42), EASSLQS (SEQ ID NO: 2) da seqüência 2 do macaco-da-noite (SEQ ID NO: 43) EASKLQS (SEQ ID NO: 3) da seqüência 1 de sagüi (SEQ ID NO: 25), e SASNLET (SEQ ID NO: 4) da seqüência 2 de sagüi (SEQ ID NO: 26), folha escolhidas das seqüências de aminoácidos apresentadas na Figura 2, como indicado. A seqüência 5 do Macaco-da-Noite, YASSLQS (SEQ ID NO: 48) foi observada ser idêntica a GI6176295, uma seqüência de cDNA de Aotus nancymase (macaco-da-noite de Ma), todas as outras seqüências foram únicas.

Uma seqüência de região variável receptora (anticorpo de domínio anti-TNF) no vetor de expressão (vetor proprietário Domantis) foi digerida (25 μg) seqüencialmente com KpnI e SanDI que excisa a maioria do FR2 bem como do CDR2, como indicado no mapa de digerido de restrição. O vetor foi então purificado em gel para remover a seqüência de FR2 e cDR2 do tipo selvagem excisada.

O cozimento de oligo foi realizado pela incubação dos pares de oligo (500 pmoles de cada, como mostrado nas Figuras 4A e 4B) em 95 0C por 5 minutos, seguidos por 65 0C por 5 minutos, e depois deixados alcançar a temperatura ambiente lentamente sobre um bloco quente. As sobreposições foram então enchidas durante uma reação de Klenow na presença de dNTPs.

Maturação de Afinidade

O Composto 145 de dAb enxertado com CDR de sagüi (SEQ ID NO: 7) foi amadurecido por afinidade pela construção de 14 bibliotecas separadas, cada uma delas uma diversificação da seqüência de SEQ ID NO: 7 em um resíduo de aminoácido único. Os resíduos selecionados são mostrados sombreados abaixo.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSI (ilegível)

LHWYQQKPGKA PK LIYS ASNLETGVP SRF SGSGS GT (ilegível) FTLTISSLQPEDFATYY CQQWW (ilegível) P (ilegível) TFGQGTKVEI KR

A seleção baseou-se nos resíduos em CDRl e CDR3 que são conhecidos como sendo diversificados no repertório de Ig humano maduro, e resíduos da estrutura que foram observados produzirem proteínas funcionais após a mutagênese nos dAbs relacionados. Para cada um dos resíduos selecionados, os pares de iniciadores da PCR complementares dianteiros e reverso foram projetados com degenerescência de NKK, e duas reações iniciais da PCR foram realizadas, cada uma com um iniciador mutagênico único e iniciador de flanqueio. Após a limpeza geral, os dois produtos de PCR foram recozidos e depois amplificados com o uso de iniciadores de flanqueio sozinhos (recomposição por extensão da sobreposição da PCR; Lowman, H. L. e Clackson, T. (eds), Phage Display: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido). Os clones foram inicialmente testados por ELISA com o uso de TNF de fase sólida, e os clones positivos foram seqüenciados. A proteína de dAb foi purificada dos melhores clones e avaliada quanto à potência nos ensaios de ligação de receptor e nos ensaios de citotoxicidade L929. Os compostos 100 (SEQ ID NO: 9) e 123 (SEQ ID NO: 8) foram observados terem neutralização de TNF melhorada em relação ao dAb precursor, o Composto 145 (SEQ ID NO: 7).

A combinação das substituições intensificadoras da afinidade dos Compostos 100 (SEQ ID NO: 9) e 123 (SEQ ID NO: 8) produziu um dAb anti-TNF com potência ainda melhorada no ensaio de citotoxicidade de L929 (Composto 196; SEQ ID NO: 10).

RESULTADOS

POTÊNCIA DOS CLONES DE dAb ANTI-TNF NO ENSAIO DE LIGAÇÃO DO RECEPTOR (RBA) E ENSAIO DE CITOTOXICIDADE.

A capacidade dos dAbs anti-TNF de inibirem a ligação do TNF ao seu receptor e de neutralizar a citotoxicidade das células L929 mediada pelo TNF, foi conduzida como segue:

Ensaio de Ligação do receptor

dAbs diversificados nas 14 posições selecionadas foram testados quanto à capacidade de inibir a ligação do TNF ao receptor 1 (p55) do TNF recombinante. Resumidamente, placas Maxisorp foram incubadas durante a noite com 30 mg/ml de anticorpo monoclonal de camundongo Fc anti-humano (Zymed, San Francisco, USA). Os reservatórios foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,05 % de Tween-20 e depois bloqueados com 1 % de BSA em PBS antes de serem incubados com 100 ng/ml da proteína de fusão Fc do receptor 1 de TNF (R&D Systems, Minneapolis, USA). Cada dAb foi misturado com TNF, que foi adicionado aos reservatórios lavados em uma concentração final de 10 ng/ml. A ligação do TNF foi detectada com 0,2 mg/ml de anticorpo anti-TNF biotinilado (HyCull Biotechnology, Uben, Países Baixos) seguido por diluição de 1 em 500 de estreptavidina rotulada com peroxidase de raiz forte (Amersham Bioscicnces, Reino Unido) e depois incubação com substrato de TMB (KPL, Gaithersburg, USA). A reação foi interrompida pela adição de HCl e a absorbância foi lida em 450 nm. A atividade do dAb anti-TNF levou a um decréscimo na ligação do TNF e, portanto, um decréscimo na absorbância, em comparação com o controle com apenas TNF (Figura 5).

Ensaio de Citotoxicidade L929

Os dAbs anti-TNF identificados pela abordagem de diversificação de minibibliotecas, incluindo os Compostos 100 (SEQ ID NO: 9) e 123 (SEQ ID NO: 8), também foram testados quanto à capacidade para neutralizar a atividade citotóxica do TNF sobre fibroblastos L929 de camundongos (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). Resumidamente, as células L929 plaqueadas nas placas de microtitulação foram incubadas durante a noite com dAb anti-TNF, 100 pg/ml de TNF e 1 mg/ml de actinomicina D (Sigma, Poole, Reino Unido). A viabilidade celular foi medida pela leitura da absorbância em 490 nm, em seguida a uma incubação com [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4- sulfofenil)-2H-tetrazólio (Promega, Madison, USA). A atividade do dAb anti- TNF levou a um decréscimo na citotoxicidade do TNF e, portanto, a um aumento na absorbância, em comparação com o controle com apenas TNF. Os resultados, em comparação com o Composto 145 (SEQ ID NO: 7) do dAb precursor, são apresentados na Figura 6. Será observado pelas pessoas habilitadas na técnica, que numerosas variações e/ou modificações poderão ser feitas na invenção, como mostrado nas formas de realização específicas, sem que se afaste do espírito ou escopo da invenção, como amplamente descrita. As presentes formas de realização devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas, e não restritivas. <table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table> <400>10

ASp Ile Gln «et Thr Gln ser Pro ser ser Leu ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala ser Slft Ala Ile Asp Ser Tyr

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr ser Ala ser Asn Leu Glu Ttir Gly vai Pro Ser Arg Wie ser Gly 50 55 60

Ser ely Ser Gly Thr Asp Pbe Thr Leu Tbr xle Ser Ser Leu Leu Pró 65 70 75 SO

Glu Asp Phe Ala Tlir Tyr Tyr cys Glrt Gln Val Val TTp Are Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys vai Glu ile Lys Arg. 100 105

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>Sintético

<400>11

aatckcaggt kccagatgl8 <210>12 <211>18 <212>DNA <213> Sintético

<400>12

gttyrggtkk gtaacactl8

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>Sintético

<400>13

atgmcttgtw acactgtgl8

<210>14

<211>267

<212>DNA

<213>Callithrix, espécie desconhecida <400>14

gacatccagji tgaccca&tc tecattttec ctgactgcat ctgtaggagg caaagteacc GO atcacttgcc Sggegagtca ggacafctaac aàgtggttag cctggtatca geagaaacca 120 gggacagtcc ctaagcççtx gatctatgag geatccaaac tgcaaagtgg ggtcccatca 180 apgttcagcg gcagtgçatc tgg$aeat3t ttt^ctccca ccatcagcag cctgcageet 240 gaagat^ctg Caacttattia etgteag 267

<210>15

<211>267

<212>DNA

<213>Callithrix, espécie desconhecida <table>table see original document page 35</column></row><table> <400>19

50

gacatccags tgacccagec tccatcctec ecgtctgeat ctgtaggaga cagagttacc

atcacttgcc gçgcgayrtca ggecartagt aamtttag cctggtatca gca$aaacca 170

gggaaaactc Ctzaggctcct gatctatgct gcatccagtt tacaaactgg garcccctct 180

cggttcagcg gcagtggatc tgggacagac tac&ctctca ccatcagcag eetgcagtct 240

gaagatgttg caattttatta ctgtcaa 267

<210>20

<211>267

<212>DNA

<213>Callithrix, espécie desconhecida <400>20

acarccaga tflacccagtc tccafccttcc ttgactgcax ctgtaggagg caaagtcaoe 60 atcacttgcc ggefagtca ggacattaae aagtggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggacagtcc ctaagcccct gatctatgag gcatceaaat tcaaagteg ggttttetta 180 aggctcagcg gcagtggatc tgggacatat ttcactctca ccateagcag cçtgcagcet 240 gaagatgctg caacttatta ctgtcag 267

<210>21

<211>267

<212>DNA

<213>Callithrix, espécie desconhecida

<400>21

60

gacatccaga tgacccagtc ttcatcttcc ctgactgcat ctstaggagg caâagtxacc

atcacttgcc gggcgagtca ggacattaac aagtggtcag cctggtatca gcagaaacca 120

gggacagtcc ctaagcccct gatctatgag gcatctaaat tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacatat trcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gâagatgctg caacttatta ccgtcag 267

<210>22

<211>267

<212>DNA

<213>Callithrix, espécie desconhecida <400>22

gacatccags tgacccagtc tccatcttcc ctgactgcat ct^tatfgagg caaagtcacc 60 atcacttgcc gggcgagtc* ggacattaac aagtggtta® ccxggtatcs gcagaaacca 130 gggacagtcc ctaagcccct gatctatgag gcatccaaat tgcaaagtgg ggtcccatca 160 aggttcagcg gcagtggatc tgggácãtát tttactctce ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgctg caacttatta ctgtcag

<210>23

<211>267

<212>DNA

<213>Callithrix, espécie desconhecida <4 00>23

gacatccAga tgacccagtc tccatcttcc ctgactecat ctgxasgagg caaagfecacc 60

âtcacttgcc gggcgagtea ggacattaae Bzçtggttag cct^ftatca gcagaaacea 120

gggacagtcx ttaagecçct getctatga® gceccoeet tgcaaagrgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagrggatç tgggacatat: tttacrctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatgctg caacttatta ctgteag 267

<210>24

<211>267

<212>DNA

<213>Callithrix, espécie desconhecida <400>24

gacatccaga tgacccagtc tccatctECC ctfsctgcat etgtaggsgg caaagtcacc 60

atcaettgcc çggcgagtca ggacattaac aegtggttap cctgftatca gesgaaaçca 120

gggacsgtcc ctaagcccct gatctat^ag gcatccaaar tgeaaagtsgg ggtcccatta ISQ

aogrtsagcg geagtggatc tgggacatat trcactctáa ccatcagcag cctgeagcct 240

gaagatgctg caacttatta ctstc&g 267

<210>25 <211>89 <212>PRT

<213>Callithrix, espécie desconhecida <4 00>25

Asp i1e Slh Wet Thr ei η ser Pra Ser Ser teu Thr a1 a ser Val 61 y 1 5 iiO 15

Gly Lys VaT Tftr Xle Hir Cys Arg Ala ser «In Asp ile Asn Lys Ttp £0 25 30

Uti Ala Tru Tyr Gln Sln Lys Pro Cly Thr vai pro Lys Pro teu ile 3S 40 45

xyr elu Ala sar Iys teu Gln sef Sly val Pro |er Ar3 Phe ser Gly

||Γ ely ser Cly Ittr ψ l>he Thr Ley Thr Xle Sln

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

<210>26 <211>89 <212>PRT

<213>Callithrix, espécie desconhecida <table>table see original document page 38</column></row><table> <table>table see original document page 39</column></row><table> <table>table see original document page 40</column></row><table> 11

<210>34 <211>89 <212>PRT

<213>Callithrix, espécie desconhecida <400>34

ASp xle Cln Ktt Thf-Gln Sar Pro ser ser uai Thr Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

ely Lys vai Thr IleThr Cy$ Arg aU ser eln Asp ile Asn Lys ire 20 25 50

Leu Ala Tm Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Val Leo Lys l>ro Leu ilê 3S 4a 45

Tyi4 Olu Ala Ser ivs Lca Glr> ser Gly vai Pro ser Arg Phe Ser gIy 50 5S 60

ser GTy ser Sly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr lie ser ser Leu Gln Pro 65 70 75 BO

Glsi Asp Ala Ala,Thr tyr Tyr Cys sli»

<210>35 <211>89 <212>PRT

<213>Callithrix, espécie desconhecida <400>35

ASp Πό oln wat Thr cln Sef Pro sar ser teu Thr Ala ser Vgl ely 1 5 10 15

Sly cysf vai fhr XM Tlir cys Arg Ala ser éln Asp Ile Asn Lys Trp 20 25 50

Leu Ala Trp Tyr Gln eln Lys pk> ely Thr Val Pro lvs Pro Leu ile 35 40 »5

Tyr GlU Ala jSer Lys Leu OTn ser Gly vai Pro Lew Arg Pbe ser Gly 50 SS BO

ser Sly Ser ely Thr tyr Phe Tbr teu Ttir lie ser Ser Leu Gln pro 65 70 75 80

GlM ASB Ala Ala Ttir Tyr Tyr tys Glti 85

<210>36

<211>267

<212>DNA

<213>Aotus trivirgatus <400>36

<400> 36

gacatccaaa tgaeccagtc tcwtccttc ctgietgcat ctgcag^afla cagagtcacc 60

atcaçctgcc aggtgagtca gggaattagc agtgaattac fcctgglatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctatgctctt gatçtatgct gcaacraaat tgcagtcggg aatcceatcc 160

cggttcagtfl geeategatc tgggacaeat ttcactetca ccaxcageag cccgcagcct 240

Qatgattttg ctacttatta ctgtcaa 267 <210>37

<211>267

<212>DNA

<213>Aotus trivirgatus <400>37

gjacatccega tgacceagtc tgcattctcc ctgtctgcat çtgtaggaga cagagtcacc 60

attscttgcc aggcgagtca gggcattacc agtgatrcag tctggtatca c^caaaagcca 120

gggaacfcct ctaagctcct gatctstgag gcatccagtt ,tacaaagega ggcçxcatca ISQ

aggttcaçcg gcagtggatc tgggagagat tttaetctca ccatx&gcag. cctgcagcet 240

gsagattttg Taacctatta ctgtcaa 267

<210>38

<211>267

<212>DNA

<213>Aotus trivirgatus <400>38

gacatccasa tgacccagâc tccatcctxc ctgtetgcat ctgtaggaga tâtjügtç&cc 60 acçaettgcC gggeg&gtca agacatttac 2axtattta$ cctggtatca gta^aaatcâ 120 gggaaàsüctc ctaggçtcit gateTatpct gcatccagtt tgcaaactgg gattccctcr MO cggtieagtg gcagtggatc tgggacagac zacactctca ccateagcag cctgcagçct 240 gat^attttg ccacttatta ctgtcaa Í67

<210>39

<211>267

<212>DNA

<213>Aotus trivirgatus <400>39

gaca.tceaga tgaeecagoe tccâtcctcc ctgcctecat ctgtaggaga caaa^tcacc 60 atc^cttgtc gsscaagtca gggt&ttâgc agctggttag cctgatatca gcsg&aacca 120 ggfiMieceC etaagctcct 9ft«C«atMB gíâtCÃMW tgôãáaçagg ggtcccatca UQ aggtteagtg gaagtggatc tgggacagat tttactctcá ccAtcagcag cctgcagcct 240 gaagatRtcg caacatatta ctgtcaa 267

<210>40

<211>267

<212>DNA

<213>Aotus trivirgatus <400>40

gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc ctgactgcat ctgteggaga caaagtcacc fo atcacttgec gggcaagtca gggeattagc aataatttag cctggtatca gtagaaacca 120 gggaaagtxc ctaagcecct gatctattat gcarecagtt tgcaaagcgg ggtcccatca 180 ag$tteageg gcagfcgsatc tggggcagat tacactctca çcaccagcag cctgcagcct 240 gaagattttg cascttatta ctgtcaa 267

<210>41 <211>267 <212>DNA

<213>Aotus trivirgatus <400>41

gacaaccaga tgatccagtc tccatcttcc ctgactçcat ctgtaggaga cagagtcaçc 60

atcacttgcc çagccagtca gagtattagc agctggttag eçtgrcatca gcagaaacca 12Ô

gggacagtcc ctaagcctcc gatctatgae gcatceaaât tgccaagtgg ggtcccatca aço

aggttcagtg gctgcggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg çaacttatta ctgtcaa 267

<210>42 <211>89 <212>PRT

<213>Aotus trivirgatus <400>42

Asn Ile Gln Met Thr aln Ser Pro ser Fhe Lea Ser Ala ser Ala Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie tht Cys Ctn Val Scr Gln Gly i1e ser Ser GIm 20 25 JQ

Leu Leu tra Tyr Cln Cln Lys Pro cpy tys Ala ero Met Leu Lea Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Lys Leu Gln ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser sly 50 55 60

His Ciy ser ely Thr aso Phe Thr Leu Tlir Ik ser ser Ley si π Pro 65 70 75 80

Asa Asp Phe Ala Thr Tyr Typ cys Gln 85

<210>43 <211>89 <212>PRT

<213>Aotus trivirgatus <400>43

Asd Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Ala Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Cln Val ser Gln Gly Ile Ser Ser Glu 20 25 30

Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Met Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Lys Leu Gln Ser Gly ITe Pro Ser Are Fhe Ser Gly 50 55 60

His Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 85

Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln 85

<210>44 <211>89 <212>PRT

<213>Aotus trivirgatus <table>table see original document page 44</column></row><table> <210>4 7 <211>89 <212>PRT

<213>Aotus trivirgatus <400>47

Asp Asn Ctn Het lie Gln ser Pro ser ser Leu Thr Ala ser VaT Gly 1 5 20 IS

ASp Arg vai Thr ile Thr Cys Arg Ala Ser Glft Sçr Ilfe Sef Ser Trp 10 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gtn Sln Lys Pro Gly Thr Val Pro Lys Pro Leu ile 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Lys Leu LeM Seri Gly vai Pro ser Arg píiô ser Sly SO 55 60

cys <ny ser Gly Thr Asp PN Thr Leu Thr He Sçr ser Leu do Pro 05 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Hiif Tyr Tyr cys Cln

<210>48

<211>8

<212>PRT

<213>Aotus trivirgatus <400>48

Tyr Tyr Ala ser ser Leu Gln ser 1 5 16

<210>4 9 <211>8 <212>PRT <213>Sintético

<400>4 9

Tyr ser Ala ser <slu Leu 6ln Ser 1 5

<210>50

<211>108

<212>PRT

<213>Sintético

<4 00>50

Asp Ile Gln «et Thr Glrt ser Pro Ser ser Leu ser ATa Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Are vai Ttir xie Thr Cys Arg Ala ser Gln ser Ile Asp s«r Tyr 20 25 30

Leti Ms Trp Tyr GTn Oln Lys Pró Gls tys Pro Pro Lys Leu Leu xle 35 40 45

ryr ser Ala S«r Asr» Leu Glu Ttir Cly vsl pro ser Arfl Ptie Scr Gly 50 55 60

ser Cly ser Cly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Πβ ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 60

OlU ASP Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Cln Gln Val vai Trp Arg Pn> phe 85 90 95

Thr phe Gly eln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <table>table see original document page 46</column></row><table>

Claims (12)

1. Anticorpo de domínio recombinante (dAb) que se liga ao TNF-α humano, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, em que referido domínio variável compreende pelo menos uma região determinante da complementaridade (CDR) tendo uma seqüência derivada de um primata do Novo Mundo, em que a CDR é selecionada do grupo consistindo de AATKLQS (SEQ ID NO: 1), EASSLQS (SEQ ID NO: 2), EASKLQS (SEQ ID NO: 3) e SASNLET (SEQ ID NO: 4).

2. dAb recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a CDR é CDR2.

3. dAb recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que tem uma seqüência selecionada das seqüências consistindo de: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVV WRPFT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 7); DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ WWRPFT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 8); DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVV WRPFT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 9); DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQWWRPFT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 10); DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIY SASNLETGWSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVV WRPFTF GQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 50); DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQ WWRPF TFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 51); e DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYCQQ WWRPFT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 52).

4. dAb recombinante de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que tem a seqüência: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYCQQ WWRPFT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 10).

5. dAb recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a CDR1 e/ou a CDR3 são modificadas para melhorar a ligação ao antígeno.

6. dAb recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que tem baixa imunogenicidade nos seres humanos.

7. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica o dAb como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo de domínio recombinante (dAb) como definido nas reivindicações 1 a 6, junto com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

9. Método para detectar o TNF-α humano em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da amostra com uma quantidade eficaz de um dAb recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e a detecção da quantidade de dAb ligado.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra biológica.

11. Método para tratar de um distúrbio distinguido pela atividade do TNF-α humano em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 8.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o distúrbio distinguido pela atividade do TNF-α humano é selecionado do grupo consistindo de inflamação, doenças inflamatórias, sepse, incluindo o choque séptico, o choque endotóxico, a sepse Gram- negativa e a síndrome do choque tóxico; a doença autoimune, incluindo a artrite reumatóide, a espondilite reumatóide, a osteoartrite e a artrite de gota, alergia, esclerose múltipla, diabete autoimune, uveíte autoimune e síndrome nefrótica; doença infecciosa, incluindo febre e mialgias devidas à infecção e caquexia secundária à infecção; enxerto versus doença hospedeira; crescimento tumoral ou metástase; distúrbios pulmonares, incluindo a síndrome da insuficiência respiratória em adulto, pulmão de choque, doença inflamatória pulmonar crônica, sarcoidose pulmonar, fibrose e silicose pulmonares; distúrbios inflamatórios intestinais incluindo a doença de Crohn e a colite ulcerativa; distúrbios cardíacos; distúrbios inflamatórios ósseos, hepatite, distúrbios da coagulação, queimaduras, lesão de reperfusão, formação de quelóides e formação de cicatrizes teciduais.