BRPI0614867A2 - anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antìgeno do mesmo, método para produzir um anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antìgeno do mesmo, e, kit - Google Patents

Abstract

ANTICORPO QUIMéRICO OU UMA PORçãO DE LIGAçãO DE ANTìGENO DO MESMO, MéTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO QUIMéRICO OU UMA PORçãO DE LIGAçãO DE ANTìGENO DO MESMO, E, KIT. A presente invenção provê um anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo. A porção de ligação de antígeno compreende pelo menos duas regiões de determinação da complementaridade (CDR) e pelo menos três regiões de estrutura, em que pelo menos uma CDR é uma CDR de primata do Novo Mundo.

Description

"ANTICORPO QUIMÉRICO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DO MESMO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO QUIMÉRICO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DO MESMO, E, KIT"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo, em que a porção de ligação de antígeno compreende pelo menos duas seqüências de regiões de determinação da complementaridade (CDR) e pelo menos três regiões de estrutura, em que pelo menos uma CDR é uma CDR de primata do Novo Mundo, e ao uso de um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo no tratamento de doenças ou distúrbios.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Anticorpos (imunoglobulinas) desempenham um papel importante no sistema imune de um mamífero. Eles são produzidos por células do plasma que se desenvolveram de células B precursoras. Os anticorpos consistem de duas cadeias leves de polipeptídeo idênticas e duas cadeias pesadas de polipeptídeos idênticas que são unidas por pontes dissulfeto. As cadeias leves são referidas como ou cadeias leves capa ou lâmbda e as cadeias pesadas como gama, mu delta, alfa ou epsilon. Cada cadeia consiste de uma região constante ou variável. A região variável dá ao anticorpo sua especificidade. Dentre de cada região variável estão regiões de hipervariabilidade ou regiões de determinação da complementaridade (CDRs) que são flanqueadas por regiões mais conservadas referidas como regiões de estrutura. Dentro de cada região variável estão três CDRs e quatro regiões de estrutura.

Os anticorpos são moléculas bifuncionais, os segmentos variáveis N-terminais das cadeias pesada e leve se associam juntos em um modo específico para gerar uma estrutura tri-dimensional com afinidade para um epítopo em particular sobre a superfície de um antígeno. Os segmentos de região constante são responsáveis por meia-vida no soro prolongada e as funções efetuadoras do anticorpo e estão relacionados com a ligação do complemento, estímulo de fagocitose, citotoxicidade celular dependente do anticorpo, e disparo da liberação de grânulos granulócitos.

O desenvolvimento da tecnologia de hibridoma tem facilitado a produção de anticorpos monoclonais de uma especificidade particular. Tipicamente, estes hibridomas são hibridomas de murinos.

Os anticorpos quiméricos humano/camundongo foram criados em que as seqüências de região variável do anticorpo do genoma do camundongo são combinadas com seqüências de região constante de anticorpo do genoma humano. Os anticorpos quiméricos demonstram características de ligação do anticorpo do camundongo parental, e as funções de efetuador associadas com a região constante humana. Os anticorpos são produzidos por expressão em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de mieloma NSO, células COS e células SP2.

Estes anticorpos quiméricos tem sido usados em terapia humana, no entanto anticorpos para estes anticorpos quiméricos tem sido produzidos pelo recipiente humano. Estes anticorpos anti-quiméricos são prejudiciais para a terapia contínua com os anticorpos quiméricos.

Foi sugerido que os anticorpos monoclonais humanos são esperados como sendo uma melhora sobre os anticorpos monoclonais de camundongos para terapia humana in vivo. A partir do trabalho realizado com anticorpos de primatas do Novo Mundo (macacos rhezus e chimpanzés), foi postulado que estes anticorpos de primatas não humanos serão tolerados em humanos porque eles são estruturalmente similares aos anticorpos humanos (Ehrlich PH et al., Human and primate monoclonal antibodies for in vivo therapy. Clin Chem. 34:9 pg 168J- 1688 (1988)). Além disso, porque os anticorpos humanos são não imunogênicos em macacos Rhesus (Ehrich PH et al.. Rhesus monkey responses to multiple injections of human monoclonal antibodies. Hybridoma 1987; 6:15.1-60), é provável que o inverso é também aplicável e que os anticorpos de primatas serão não imunogênicos em humanos. Estes anticorpos monoclonais são secretados por hibridomas construídos por fusão de linfócitos para um heteromicloma humano χ camundongo.

EP 0 605 442 descreve anticorpos quiméricos que ligam a antígenos humanos. Estes anticorpos compreendem a região variável completa de um macaco do Novo Mundo e a região constante de um anticorpo humano ou chimpanzé. Uma das vantagens sugeridas nesta referência para estas construções é a capacidade de criar anticorpos em macacos do Novo Mundo em antígenos humanos que são menos imunogênicos em humanos comparados com os anticorpos criados em um hospedeiro de camundongo.

Os primatas do Novo Mundo (infra-ordem-Platyrrhini) compreende pelo menos 53 espécies comumente divididas em duas famílias, a Callithricidae e Cebidae. A Callithrieidae consiste de sagüis e macacos tamarins. Cebidae inclui o macaco esquilo, macaco japuçá, macaco cuatá, macaco lanudo, macaco cebo, uakaris, sagüis, macaco da noite e macaco coruja.

Os primatas evolucionariamente distantes, como primatas do Novo Mundo, não são apenas suficientemente diferentes dos humanos para permitir a geração de anticorpos contra antígenos humanos, mas são suficientemente similares aos humanos para terem anticorpos similares aos anticorpos humano, de modo que o hospedeiro não gera uma resposta imune anti-anticorpo quando estes anticorpos derivados de primatas são introduzidos em um humano.

Estudos anteriores tem caracterizado o repertório de cadeias pesadas de imunoglobulina expressadas do sagüi Callithrix jacchus (von Budingen H-C et al., Characterization of the expressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Callilhrix jacchus. Immunogenetics 2001; 53:557-563). Seis sub-grupos de IGHV foram identificados que mostraram um alto grau de similaridade de seqüência para suas contra-partes IGHV humanas. As regiões de estrutura foram mais conservadas quando comparadas com as regiões de determinação da complementaridade (CDRs). O grau de similaridade entre as seqüências IGHV de C. jacchus e humanos foi menor do que entre os primatas do Novo Mundo não humanos e humanos.

Anticorpos de domínio

Os anticorpos de domínio (dAb) são unidades de ligação funcionais que podem ser criadas usando estruturas de anticorpos e correspondem às regiões variáveis de cadeias ou pesadas (Vh) ou leves (Vl) de anticorpos. Os anticorpos de domínio tem um peso molecular de aproximadamente 13 kDa, ou menos do que um décimo do tamanho de um anticorpo completo.

As cadeias leves de imunoglobulina são referidas como ou cadeias leves capa ou lâmbda e as cadeias pesadas como gama, mu, delta, alfa ou epsilon. A região variável dá ao anticorpo sua especificidade. Dentro de cada região variável, estão regiões de hipervariabilidade, de outra forma conhecidas como regiões de determinação da complementaridade (CDRs) que são flanqueadas por regiões mais conservadas referidas como as regiões de estrutura. Dentro de cada região variável de cadeia leve e pesada estão três CDRs e quatro regiões de estrutura.

Em contraste com anticorpos convencionais, os anticorpos de domínio são bem expressados em sistemas bacterianos, leveduras e mamíferos. Seu tamanho pequeno permite que maiores quantidades molares por grama de produto, assim provendo um aumento significante em potência. Além disso, os anticorpos de domínio podem se usados como um bloco de construção para criar produtos terapêuticos como anticorpos de domínio de marcação múltipla, em que uma construção contendo duas ou mais domínios variáveis ligam a dois ou mais alvos terapêuticos, ou anticorpos de domínio marcados para administração pulmonar ou oral.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores verificaram que os primatas do Novo Mundo provêem uma fonte rica de domínios de ligação para anticorpos contra uma faixa de antígenos incluindo antígenos humanos. Além disso, devido à similaridade das seqüências entre humanos e primatas do Novo Mundo, é provável que estas seqüências de primata do Novo Mundo terão uma imunogenicidade relativamente baixa em humanos.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, em que a porção de ligação de antígeno compreende pelo menos duas

regiões de determinação da complementaridade (CDR) e pelo menos três regiões de estrutura, em que pelo menos uma CDR é CDR de primata do Novo Mundo.

Em outro aspecto a presente invenção provê um método para produzir um anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, o método compreendendo deletar uma CDR de uma região variável de anticorpo humano compreendendo pelo menos duas CDRs e pelo menos três regiões de estrutura e substituir a mesma com uma CDR de primata do Novo Mundo prevista para ser de baixa imunogenicidade para produzir uma região variável quimérica,

Em um aspecto relacionado, o método ainda compreende a etapa de recuperar a região variável quimérica.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê um anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo produzido de acordo com o método da presente invenção.

Em ainda outro aspecto, a invenção prove uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade efetiva do anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com à presente invenção, junto com um excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

Em ainda um outro aspecto, a invenção provê o uso de um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção em uma aplicação diagnostica para detectar um antígeno associado com a doença ou distúrbio particular.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por atividade de TNF - α humano em um indivíduo humano, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade efetiva de um anticorpo quimérico como descrito aqui, ou uma composição farmacêutica do mesmo em que o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo liga TNF-α.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS.

Figura 1 demonstra a ligação de AB138 a MOG de rato presente no lisado de medula espinhal do rato (trilha 2) e não para o lisado CHOKlSV (trilha 3). A trilha 1 contém marcadores de peso molecular.

Figura 2 demonstra a falta de ligação não específica de um anticorpo monoclonal anti-TNFa para a mesma amostra de MOG de rato presente no lisado de medula espinhal do rato (trilha 2) lisado CHOKlSV (trilha 3). A trilha 1 contém marcadores de peso molecular.

A figura 3 mostra a seqüência de aminoácido de anticorpo de domínio receptor e de nucleotídeo (ambos os filamentos). Os sítios de digerido de restrição para Kpn I e San Dl, que excisa uma região incluindo a CDR2, são indicados na figura. Os resíduos de CDR2 são indicados em sublinhado. A figura 4 é um alinhamento de seqüência da seqüência de receptor de anticorpo de domínio com um painel da seqüências de imunoglobulina derivadas de primata do Novo Mundo realizadas usando AlignX (Vector NTJ, Invitrogen, Austrália). CDR2 é realçada em texto em negrito.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um anticorpo quimérico ou uma porção dè ligação de antígeno do mesmo, em que a porção de ligação de antígeno compreende pelo menos duas regiões de determinação da complementaridade (CDR) e pelo menos três regiões de estrutura, em que pelo menos uma CDR é uma CDR de primata do Novo Mundo.

Prefere-se que a porção de ligação de antígeno compreenda três CDRs e quatro regiões de estrutura. Também prefere-se que a porção de ligação de antígeno compreenda pelo menos um, e preferivelmente duas CDRs humanos.

Em algumas formas de realização da presente invenção, o anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo compreende uma CDR de primata do Novo Mundo. Em outras formas de realização, o anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo compreende duas CDRs de primatas do Novo Mundo. Em outras formas de realização, a CDR2 do anticorpo ou porção de ligação de antígeno é uma CDR de primata do Novo Mundo.

Em outras formas de realização da presente invenção, o pelo menos uma CDR de primata do Novo Mundo não é de uma seqüência que liga a um antígeno de marcação .

Em outras formas de realização da presente invenção, as regiões de estrutura são seqüências de humano. As regiões de estrutura que são seqüências de humano incluem seqüências derivadas de regiões de estrutura humanas, ou seqüências sintéticas baseadas em regiões de estrutura humanas.

Está dentro do escopo da presente invenção, que a seqüência da porção de ligação de antígeno pode ser ainda submetida a uma maturação por afinidade para melhorar suas características de ligação de antígeno como ligação de antígeno ou potência.

Um aumento na ligação é demonstrado por uma diminuição no Ku (KoffZkon) para o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo. Um aumento em potência é demonstrado em testes biológicos. Por exemplo, testes que podem ser usados para medir a potência do anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo incluem o teste de neutralização de citotoxicidade de L929 induzida por TNF a, teste de proliferação de células mononucleares de sangue periférico ativado por PHA humano, induzido por IL-12 (PBMC), e diferenciação de osteoclastos mediado por RANKL de esplenócitos de camundongos (Stem, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6808 - 6812 (1990); Kong, Y-Y. et al. Nature 397:315 - 323 (1990); Matthews, N. e ML. Neale in Lymphokines and Interferons, a Practical Approach, 1987, MJ. Clemens, A.G. Morris e AJ.H. Gearing, cds., JRL Press, p. 22J)

Em ainda outra forma de realização preferida, pelo menos uma região de estrutura é modificada para aumentar a ligação e/ou para reduzir a imunogenicidade prevista em humanos,

Em outra forma de realização pelo menos uma seqüência de CDR é modificada para aumentar a ligação ou potência e ou para reduzir imunogenicidade prevista em humanos. Prefere-se que onde pelo menos uma seqüência de CDR que é modificada que ela não seja a CDR de primata do Novo Mundo. Onde dois ou mais CDRs de primatas do Novo Mundo estão presentes, então prefere-se que pelo menos uma CDR de primata do Novo Mundo não seja modificado.

Em outras formas de realização da presente invenção, pelo menos uma região de estrutura é modificada, além de pelo menos uma seqüência de CDR, para aumentar a ligação e ou para reduzir a imunogenicidade prevista em humanos. Prefere-se que a pelo menos uma seqüência de CDR que é modificada, ela não seja a seqüência de CDR de primata do Novo Mundo.

Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação de antígeno é um anticorpo de domínio.

Em ainda outra forma de realização da presente invenção, o anticorpo de domínio pode ser multimerizado, como por exemplo, hetero- ou homodímeros, (por exemplo, Vh/ Vh5 Vl/ Vl ou VH/VL), hetero- ou homodímeros (por exemplo, Vn/ Vh/ Vh, Vl/ Vl/ V L, Vh/ Vh/ Vl ou Vh/ Vl/ Vl), hetero- ou homotetrâmeros (por exemplo, VH/VH/ Vh/ Vh, Vl/ Vl/ V l/V L VH/VH/VH,VL, Vh/ Vh/ Vl/ Vl ou Vh/Vl/Vl/Vl), ou hetero- ou homomultímeros de ordem superior. A multimerização pode aumentar a resistência da ligação de antígeno, em que a resistência da ligação está relacionada com a soma das afinidades de ligação, ou parte da mesma, dos sítios de ligação múltiplos.

Assim, a invenção provê um anticorpo de domínio em que o anticorpo de domínio é ligado, a pelo menos um outro anticorpo de domínio. Cada anticorpo de domínio pode ligar ao mesmo ou a diferentes antígenos.

Os multímeros do anticorpo de domínio podem ainda compreender um ou mais anticorpos de domínio que são ligados e em que cada anticorpo de domínio liga a um antígeno diferente, ligandos multi- específicos incluindo os assim chamados "ligandos específicos duais". Por exemplo, os ligandos específicos duais podem compreender um par de domínios Vh ou um par de domínios VL. Estes ligandos específicos duais são descritos em

WO 2004/003019 (PCT/GB2003/002804) em nome de Domantis Ltd incorporado aqui por referência em sua totalidade. Preferivelmente, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno ainda compreende uma seqüência de região constante de humano ou primata não humano. Os exemplos de primatas não humanos incluem, mas não são limitados a chimpanzés, orangotangos e babuínos.

A presente invenção também provê um método para produzir um anticorpo quimérico ou um porção de ligação de antígeno do mesmo, o método compreendendo deletar uma CDR de uma região variável de anticorpo humano compreendendo pelo menos duas CDRs e pelo menos três regiões de estrutura e substituindo a mesma com uma CDR de primata do Novo Mundo prevista para ser de baixa imunogenicidade de modo a produzir uma região variável quimérica.

Em um aspecto relacionado, o método ainda compreende a etapa de recuperar a região variável quimérica.

Prefere-se que a CDR de primata do Novo Mundo selecionado seja CDR2. Prefere-se que a seqüência de CDR2 seja selecionado dentre KVSNRAS, RVSNRAS, KVSTRGP, AASKRAS, TSSNLQA, DASSLQP e YASFLQG. As seqüências particularmente preferidas são KVSNRAS, AASNRAS, TSSNLQA e KVSTRGP devido à sua imunogenicidade inferior prevista.

Em ainda outras formas de realização, o método ainda compreende modificar a seqüência da região variável quimérica para aumentar a ligação e/ou para diminuir a imunogenicidade em humanos. Prefere-se que a seqüência de CDR de primata do Novo Mundo não seja modificada. Onde duas ou mais seqüências de CDR de primata do Novo Mundos estão presentes, então prefere-se que pelo menos uma CDR de primata do Novo Mundo não seja modificada.

Em outras formas de realização da presente invenção pelo menos uma região de estrutura é modificada em adição a pelo menos uma seqüência de CDR, para aumentar a ligação e ou para reduzir a imunogenicidade prevista em humanos. Prefere-se que a pelo menos uma seqüência de CDR que é modificada,não seja uma seqüência de CDR de primata do Novo Mundo. A presente invenção também provê um anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo produzido pelo método da presente invenção.

O termo "anticorpo" como usado aqui, se destina a fazer referência a moléculas de imunoglobulina compostas de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta de uma região variável de cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, Ch 1, CH2, e Ch3. Cada cadeia leve é composta de uma região variável de cadeia leve (LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta de um domínio CL. As regiões Vh e Vl podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação da complementaridade (CDR), interdispersas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura (FR). Cada Vh e Vl é composto de três CDRs e quatro FRs, dispostos de amino-término para carbóxi término na seguinte ordem: FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo, como usado aqui refere-se a um ou mais componentes ou derivados de uma imunoglobulina que demonstra a capacidade de ligar a um antígeno. Foi demonstrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de anticorpo de comprimento completo. Os exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento mono valente consistindo dos domínios VL, VH, Cl e Ch 1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por um ponte dissulfeto na região de gancho; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios Vh e Ch 1; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios Vl e Vh do braço único de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et al, 1989, Nature 341 :544-54G) que consiste de um domínio Vh único, ou um domínio Vl (van don Beuken T et al, 2001, J. Mol. Biol, 310, 591); e (vi) uma região de determinação da complementaridade (CDR) isolada. Além disso, apesar dos dois domínios de fragmento Fv, Vl e VH, serem codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético que permite que os mesmos sejam feitos como uma cadeia de proteína única em que as regiões Vl e Vh estão em pares para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); (ver, por exemplo, Bird el al, 1988, Science 242:423-426 e Huston el al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Estes Fvs de cadeia única são também destinados a serem englobados no termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Outras formas de Fvs de cadeia única e moléculas relacionadas como diacorpos ou triacorpos podem também ser englobados. Os diacorpos são anticorpos bivalentes em que os domínios Vh e Vl são expressados em uma cadeia de polipeptídeo única, mas usando um ligador que é muito curto para permitir a formação dos pares entre os dois dominós na mesma cadeia, assim forçando os domínios a formarem pares com domínios de complementaridade de outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno (ver, por exemplo, JJolliger, P., et al.r 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448; Poljak, RJ., et al, 1994, Structure, 2:1121-1123).

Como usado aqui, o termo "quimérico" significa que o anticorpo ou porção de ligação de antígeno inclui seqüências de duas diferentes espécies.

Em uma forma de realização, o anticorpo de domínio compreende regiões de estrutura humana e pelo menos uma CDR de primata do Novo Mundo, mais preferivelmente CDRs de sagüi.

Preferivelmente, o primata do Novo Mundo é selecionado dentre o grupo consistindo de sagüis, macaco tamarin, macaco esquilo, macaco japuçá, macaco cuatá, macaco lanudo, macaco cebo, uakaris, sagüis, macaco da noite e o macaco coruja. Mais preferivelmente, o primata do Novo Mundo é um sagüi.

Os métodos de produção de anticorpos quiméricos de acordo com a invenção serão bem conhecidos dos versados, ver, por exemplo, Patente U.S.4.816.567, Patente U.S. 5.585.089 e US 2003/0039649 que são incorporados aqui por referência em sua totalidade. Estes métodos requerem o uso de técnicas recombinantes padrões.

Prefere-se que o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com à presente invenção tenha uma imunogenicidade baixa prevista em um hospedeiro humano.

Por "imunogenicidade baixa" significa-se que o anticorpo não cria uma resposta ao anticorpo em pelo menos a maior parte dos indivíduos recebendo o anticorpo de grandeza suficiente para reduzir a efetividade de administração continuada do anticorpo durante um tempo suficiente para obter uma eficácia terapêutica.

O nível de imunogenicidade em humanos pode ser previsto usando o programa de previsão de ligação de AlHC classe II Propred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred) usando uma análise de valor de limiar a 1% de todos os alelos. Outros programas que podem ser usados incluem:

Rankpep (http://bio.dfci. harvard.edu/Tools/rankperxhtml)

Epibase (Algonomies proprietary software: algonomics.com)

As moléculas de baixa imunogenicidade não irão conter ou irão conter números baixos de peptídeos previstos para ligar a alelos de MHC classe II que são altamente expressados na população alvo (Fmenor DR, Doytchinova ΙΑ. (2004) Immunoinformatics and the prediction of imunogenicity, Drug Discov Today, 9(2): 82-90).

As moléculas de imunogenieidade reduzida não irão conter ou irão conter números reduzidos de peptídeos previstos para ligar a alelos de MHC classe II que são altamente expressados na população alvo, com relação à molécula do doador de partida.

A análise funcional de ligação de MHC classe II pode ser realizada por geração de peptídeos de sobreposição correspondendo à proteína de interesse e teste das mesmas para sua capacidade de evocar a ativação de células T (teste de proliferação de células T) ou deslocar um peptídeo repórter, um peptídeo de ligação de MHC classe II conhecido (Hammer J el at., 1994, J. Kxp. Med., 180:2353).

A presente invenção é ainda baseada em um método para amplificação de genes de imunoglobulina de primata do Novo Mundo, por exemplo reação de cadeia polimerase (PCR) do ácido nucleico extraído dos linfócitos do primata do Novo Mundo usando iniciadores específicos para famílias de genes de região variável de cadeia pesada e leve. A região variável amplificada é então clonada em um vetor de expressão contendo um gene de região constante de humano ou primata para a produção de anticorpo recombinante quimérico de primata do Novo Mundo. As metodologias de DNA recombinantes padrões são usadas para obter genes de cadeia pesada e leve de anticorpos, incorporar estes genes em vetores de expressão recombinante e introduzir os vetores em células hospedeiras, como as descritas em Sambrook, Fritsch e Maniatis (eds), Molecular Cloning: a laboratory manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor, N.Y (1989).

Os vetores de expressão apropriados serão bem conhecidos dos versados. Os linfócitos de primata do Novo Mundo produzindo as imunoglobulinas são tipicamente imortalizados por fusão com uma linhagem de células de mieloma para gerar um hibridoma. As células hospedeiras de mamíferos preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem ovário de hamster chinês (CH), células de mieloma NSO, células COS e células SP2.

Além dos sistemas de expressão de mamíferos, a presente invenção também contempla o uso de sistemas de expressão não mamíferos como os que são derivados de plantas ou procarióticos (bacterianos). Estes sistemas de expressão serão bem conhecidos dos versados.

O repertório de VH, VL e domínios de região constante podem ser um repertório de ocorrência natural de seqüências de imunoglobulina ou um repertório sintético. Um repertório de ocorrência natural é um preparado, por exemplo, a partir de células expressando imunoglobulina coletadas de um ou mais primatas. Estes repertórios podem ser nativos, isto é, preparados a partir das células expressando imunoglobulina de recém-nascidos, ou rearranjados, isto é, preparados a partir de, por exemplo, células B de primatas adultos. Se desejado, os clones identificados de um repertório natural, ou qualquer repertório que liga ao antígeno de marcação são então submetidos a mutagenes e ainda triagem para produzir e selecionar variantes com características de ligação melhoradas.

Os repertórios sintéticos de domínios variáveis de imunoglobulina são preparados por introdução artificial de diversidade em um domínio variável clonado. Estas técnicas de maturação por afinidade serão familiares para os versados. (Irving R. A. et al (2001) Ribosome display and affinity maturation: from antibodies to single V- domains and steps towards câncer therapeutics, Journal of Immunological Methods, 248: 31-45).

A região variável, ou uma CDR da mesma, de um gene de anticorpo de primata do Novo Mundo pode ser clonada ao prover ácido nucléico, por exemplo cDNA, provendo um iniciador complementar à seqüência de cDNA codificando uma seqüência líder 5' de um gene de anticorpo, contatando este cDNA e o iniciador para formar um complexo híbrido e amplificando o cDNA para produzir ácido nucleico codificando a região variável (ou região CDR) do gene de anticorpo de primata do Novo Mundo.

Será notado pelos versados da presente invenção, que a seqüência de região variável de primata não pertencendo ao Novo Mundo pode ser usada como um receptor para enxertar seqüências de primata do Novo Mundo, particularmente, seqüências de CDR usando técnicas recombinantes padrões. Por exemplo, a patente US 5,585,089 descreve métodos para criar anticorpos quiméricos de baixa imunogenicidade que retém a elevada afinidade do anticorpo parental não humano e contém um ou mais CDRs de uma imunoglobulina do doador e uma região de estrutura de uma imunoglobulina humana. A publicação US no. 20030039649 descreve um método de humanização para criar anticorpos quiméricos de baixa imunogenicidade contendo seqüências de CDR de um anticorpo não humano e seqüências de estrutura de anticorpos humanos com base em uso de tipos de estrutura de CDR canônico do anticorpo não humano em comparação com os tipos de estrutura de CDR canônico de linhagem germinal de anticorpos humanos, como a base para selecionar as seqüências de estrutura humanas apropriadas para um anticorpo humanizado. Conseqüentemente, estes princípios podem ser aplicados ao enxerto de um ou mais CDRs de primata do Novo Mundo em uma região variável de receptor de primata não pertencendo ao Novo Mundo.

As seqüências de CDR podem ser obtidas de um DNA genômico isolado de um anticorpo, ou de seqüências presentes em uma base de dados, por exemplo, as bases de dados de proteínas e nucleotídeos de

The National Centre for Biotechnology Information, a base de dados Kabat de seqüências de proteínas de interesse imunológico. A seqüência de CDR pode ser um DNA genômico ou um cDNA.

Os métodos para enxertar CDR(s) de substituição em uma seqüência variável de receptor serão familiares para os versados na arte da presente invenção. Tipicamente, os CDRs serão enxertados em seqüências de região variável de receptor para cada uma dentre a cadeia leve variável e uma cadeia pesada variável ou uma cadeia única no caso de um anticorpo de domínio. O método preferido da presente invenção envolve a substituição de ou CDRl ou, mais preferivelmente, CDR2 em uma seqüência de região variável via mutagenese direcionada por iniciador. O método consiste de anelamento de um oligonucleotídeo sintético codificando uma mutação desejada para uma região de marcação onde ele serve como um iniciador para iniciar a síntese de DNA in vitro, estendendo o oligonucleotídeo por uma DNA polimerase para gerar um DNA de filamento duplo que transporta a mutação desejada, e ligando e clonando a seqüência em um vetor de expressão apropriado (Sambrook, Joseph; e David W. Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a. ed, Cold Spring Harbor, N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Ainda mais, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo pode ser uma parte de uma molécula de imunoadesão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais de outras proteínas ou peptídeos. Os exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso de região de núcleo de estreptavidina para fazer uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., et ai. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e uma etiqueta de poli-histidina C- terminal para fazer moléculas scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov, S. M., el al. (1994) Mol. Immunol. 31 :1047-1058). As porções de anticorpo, como fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparadas de anticorpos completos usando técnicas convencionais, como digestão de papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos completos. Além disso, os anticorpos, porções de anticorpo e molécula s de imunoadesão podem ser obtidos usando técnicas de DNA recombinantes padrões, como desejado aqui como bem conhecido do versado.

A seqüência de região constante (porção Fc) é preferivelmente obtida de uma seqüência de imunoglobulina de primata humano ou não humano. A seqüência de primata pode ser de um primata do Novo Mundo ou de uma seqüência de primata do Velho Mundo. Os primatas do Velho Mundo apropriados incluem chimpanzés, ou outros macacos hominídeos, por exemplo gorila ou orangotango, que devido à sua proximidade filogenética próxima com humanos, compartilham um elevado grau de homologia com a seqüência de região constante humana. As seqüências que codificam para regiões constantes de humanos ou primatas são disponíveis de bases de dados incluindo por exemplo as bases de dados de proteínas e nucleotídeos do The National Centre for Biotechnology Information, a base de dados Kabat de seqüências de proteínas de interesse imunológico.

O anticorpo ou porção de ligação de antígeno de acordo com a invenção é capaz de ligar a um antígeno humano ou não humano.

Preferivelmente, o antígeno ao qual o anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo liga, é peptídeo, proteína, carboidrato, glicoproteína, lipídeo ou glicolipídeo na natureza, selecionado dentre um antígeno associado com tumor incluindo antígeno carcinoembriônico, receptores de EpCAM, Lewis-Y, Lewis-Y/b, PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R5 Her-2, TRAIL e VEGF, um antígeno envolvido em uma doença ou distúrbio imune ou inflamatório incluindo CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC classe II, MHC classe II, GM- CSF, interferon-γ. IL-I, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-α, e IgE, um antígeno expressado em uma célula hospedeira incluindo glicoproteína Ilb/IIIa, P- glicoproteína, receptores purinérgicos e receptores de adesão incluindo CD11a CD11b, CD 1lc, CD18, CD56, CD58, CD62 ou CD144, um antígeno compreendendo uma citocina, fator de crescimento de quimiocinas, ou outro modulador fisiológico solúvel ou um receptor do mesmo incluindo eotaxina, IL-6, IL-8, TGF- β, C3a, C5a, VEGF, NGF e seus receptores, um antígeno envolvido em doenças ou distúrbios do sistema nervoso central incluindo β- amilóide e príons, um antígeno de origem não humana como antígenos microbianos, nanobiais ou virais ou toxinas incluindo proteína F de vírus sincicial respiratório, toxina de antrax, veneno de cascavel e digoxina; em que o anticorpo quimérico atua como um agonista ou antagonista ou é ativo para ou depletar (matar ou eliminar) células indesejadas (por exemplo anti-CD4) atuando com complemento, ou células exterminadoras (por exemplo células NK) ou é ativo como um agente citotóxico ou para causar ligação do receptor Fc por um fagócito ou neutraliza atividade biológica de seu alvo.

Mais preferivelmente, o antígeno é TNFα, preferivelmente TNF a humano.

Alternativamente, o anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo pode ligar a um antígeno não humano. Preferivelmente, o antígeno não humano é selecionado dentre o grupo consistindo de proteína F de vírus sincicial respiratório, citomegalovírus, venenos de cobra e digoxina.

O termo "liga a" como usado aqui destina-se a fazer referência à ligação de um antígeno por uma região variável de imunoglobulina de um anticorpo com uma constante de dissociação (Kp) de 1 μΜ ou menor, como medido por análise de ressonância de plasmon de superfície usando, por exemplo, um sistema de ressonância de plasmon de superfície Biacore ™ e software de avaliação de cinética BIAcore ™ (por exemplo versão 2.1). A afinidade ou constante de dissociação (Ku) para uma interação de ligação específica é preferivelmente cerca de 500 nM a cerca de 50 pM, mais preferivelmente cerca de 500 nM ou menor, mais preferivelmente cerca de 300 nM ou menor e preferivelmente pelo menos cerca de 300 nM a cerca de pM, cerca de 200 nM a cerca de 50 pM, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 100 nM a cerca de 50 pM, cerca de 75 nM a cerca de 50 pM, cerca de 10 nM a cerca de 50 pM.

Os anticorpos da presente invenção são vantajosos em terapia humana devido à possibilidade de indução de uma resposta anti-anticorpo humana ser reduzida.

Os anticorpos recombinante produzidos de acordo com a invenção que ligam a um antígeno de marcação podem ser identificados e isolados por triagem de uma biblioteca de imunoglobulina combinatorial (por exemplo uma biblioteca de mostra de fagos) para isolar os membros da biblioteca que demonstram especificidade de ligação desejada e comportamento funcional. Será entendido que todas as abordagens onde porções de ligação a antígeno ou derivados de anticorpo são usados, por exemplo domínios Fabs, scFv e V ou anticorpos de domínio, estão no escopo da presente invenção. A técnica de mostra de fagos foi descrita extensivamente na arte e exemplos de métodos e compostos para gerar e triar estas bibliotecas e maturação por afinidade de seus produtos podem ser encontrados em, por exemplo, Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982: Clarkson et al. (1991) Nature 352:624:628; Dower et al. PCT. 91/17271, Patente U.S. 5,427,908, Patente U.S. 5,580,717 e EP 527,839; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373:1377; Garrard et al. PCT WO 92/09690; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725:734; Grittiths et al. Patente U.S. 5.885.793 e EP 589,877; Hawkins et al. (1992) J MoI Biol 226:889-896; Hay et al, (1992) Hum Antibody Hybridomas 3:81 -H5; Hoogenboom et al. ( 1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Knappik et al. (2000) J MoI Biol 296:57-86; Knappik el al. PCT WO 97/08320; Ladner et al. Patente U.S. 5.223.409, No. 5.403.484, No. 5.571.698, No. 5.837.500 e EP 436.597; McCafferty et al (1990) Nature 348:552-554; McCafferty et al. PCT. WO 92/01047, Patente U.S. 5.969.108 e EP 589.877; Salfeld et al PCT WO 97/29131, pedido provisório US No. 60/126.603; e Winter et al. PCT WO 92/20791 e EP 368.684.

As bibliotecas recombinantes expressando os anticorpos da invenção podem ser expressados na superfície de microorganismos, por exemplo levedura ou bactérias (ver publicação PCT W099/36569 e 98/49286),

O método de anticorpo de linfócito s selecionado ou SLAM como é referido no estado na arte, é outro meio de gerar rapidamente anticorpos de alta afinidade. Diferente das abordagens de mostra de fagos, todos os anticorpos são totalmente divalentes. A fim de gerar anticorpos de primata do Novo Mundo, os primatas do Novo Mundo são imunizados com um antígeno humano, por exemplo, um polipeptídeo TNF a. Após imunização, as células são removidas e seletivamente proliferadas em micro- cavidades individuais. Os sobrenadantes são removidos das cavidades e testados tanto para ligação como função. As seqüências de genes podem ser recuperadas para subseqüentes manipulações, por exemplo humanização, fragmento Fab,ou geração de anticorpo de domínio scFv. Assim, outro exemplo é a derivação do ligando da invenção por SLAm e seus derivados (Babcook, J.S. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93; 7843-7848, Patente US 5,627,052 e publicação PCT W092/0255t). As adaptações de SLAM como o uso de alternativas para testar sobrenadantes como por bateia também estão no escopo da invenção.

Em um sistema de expressão, a bibliotecas de peptídeo/proteína recombinante é mostrada em ribossomas (por exemplo, ver Roberts, RW e Szostak, J.W.I 997. Proc.Natl. Acad. Sci.USA. 94:12297 - 123202 e publicação PCT No. W098/31700). Assim, outro exemplo envolve a geração e a transcrição in vitro de uma biblioteca de DNA (por exemplo de anticorpos e derivados) preferivelmente preparados a partir de células imunizadas, mas não assim limitadas), tradução da bibliotecas como que a proteína e mRNAs "imunizados" estejam no ribossoma, seleção por afinidade (por exemplo por ligação a RSP), isolamento de mRNA, tradução reversa e subseqüente amplificação (por exemplo por reação de cadeia polimerase ou tecnologia relacionada. Os ciclos adicionais de seleção e amplificação podem ser acoplados, como necessário à maturação por afinidade através de introdução de mutação somática neste sistema ou por outros métodos de maturação por afinidade, com bem conhecido no estado da arte.

Outro exemplo parece a aplicação de tecnologia de compartimentalização em emulsão para a geração dos anticorpos da invenção. Em compartimentalização em emulsão, os métodos de classificação in vitro e ópticos são combinados com co- compartimentalização de proteína traduzida e sua seqüência de codificação de nucleotídeos em fase aquosa dentro de uma gotícula de óleo em uma emulsão. Ver publicações PCT W099026711 e W00040712). Os elementos principal para a geração e seleção de anticorpos são essencialmente similares ao método in vitro de mostra de ribossomas.

O anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a invenção pode ser derivado ou ligado a outra molécula funcional. Por exemplo, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno pode ser funcionalmente ligado por copulação química, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma, a uma ou mais entidades moleculares, como outro anticorpo, um agente detectável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo que podem mediar a associação do anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo com outra molécula (como região de núcleo de estreptavidina ou uma etiqueta de poli-histidina).

Os agentes detectáveis utilizáveis com os quis um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo podem ser derivados incluem compostos fluorescentes. Os agentes detectáveis fluorescentes exemplares incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5- dimetil amina-l-naftelenossulfonila, ficocritrina e outros. Um anticorpo também pode ser derivado com enzimas detectáveis como fosfatase alcalina, peroxidase de raiz forte, glucose oxidase e outros. Quando um anticorpo é derivado com uma enzima detectável, ele é detectado por adição de reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação detectável. Um anticorpo também pode ser derivado com biotina, e detectado através de medida indireta de ligação de avidina ou estreptavidina.

A presente invenção também se estende a anticorpos PEGuilados ou porção de ligação ao anticorpo que provê aumentada meia- vida e resistência à degradação sem uma perda em atividade (por exemplo afinidade por ligação) com relação a polipeptídeos de anticorpo não PEGuilado.

O anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que pode ser copulado, usando métodos bem conhecidos, em moléculas de polímero (preferivelmente PEG) utilizáveis para obter a meia-vida aumentada e propriedades de resistência à degradação. As porções de polímero que podem ser utilizadas na invenção podem ser sintéticas ou de ocorrência natural e incluem, mas não são limitados a polímeros de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada, ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, como homo- ou heteropolissacarídeo. Os exemplos preferidos de polímeros sintéticos que podem ser usados na invenção incluem poli (etileno glicol) de cadeira reta ou ramificada (PEG), poli (propileno glicol) ou poli (álcool vinílico), e derivados ou formas substituídas dos mesmos. Os polímeros substituídos particularmente preferidos para ligação a anticorpos como descrito aqui incluem PEG substituído, incluindo metoxi (polietileno glicol). As porções de polímero de ocorrência natural que podem ser usados além de ou em vez de PEG incluem lactose, amilose, dextrano, ou glicogênio, assim como seus derivados, que poderiam ser reconhecidos pelos versados na arte. As formas derivadas de moléculas de polímero incluem, por exemplo, derivados que tem porções adicionais ou grupos reativos presentes na mesma para permitir a interação com resíduos de aminoácidos dos polipeptídeos do anticorpo aqui descritos. Estes derivados incluem ésteres ativos de N-hidroxil succinimida (NIJS), polímeros de propionato de succinimidila, e agentes reativos seletivos para sulfidrila como maleimida, vinil sulfona, e tiol. Os polímeros derivados particularmente preferidos incluem, mas não são limitados a polímeros PEG tendo as fórmulas: PEG-O- CH2CH2CH2-CO2-N HS; PEG-O-CH2-NHS; PEG-O- CH2CHz-C02-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NIJS; PEG-02CNH-CH(R)-C02-NHS; PEG- NHCO- CH2CH2-CO-NHS; e PeG-O-CH2-CO2-NHS; onde R é (CH2)4)NHC02(mPEG). Os polímeros PEG podem ser moléculas lineares, ou podem ser ramificados em que as porções PEG estão presentes em um polímero único.

O grupo reativo (por exemplo, MAL, NHS, SPA, VS, ou Tiol) pode ser fixado diretamente ao polímero PEG ou pode ser fixado a PEG via uma molécula de ligador.

O tamanho dos polímeros utilizáveis na invenção pode estar na faixa de entre 500 Da a 60 kDa, por exemplo, entre 1000 Da e 60 kDa, 10 kDa e 60 kDa, 20 kDa e 60 kDa, 30 kDa e 60 kDa, 40 kDa e 60 kDa, e até entre 50 kDa e 60 kDa. Os polímeros usados na invenção, particularmente PEG, podem ser polímeros de cadeia reta ou podem possuir uma conformação ramificada.

As moléculas de polímero (PEG) utilizáveis na invenção podem ser fixadas a um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo usando métodos que são bem conhecidos na arte. A primeira etapa na fixação de PEG ou outras porções de polímero para um monômero de polipeptídeo de anticorpo ou multímero da invenção é a substituição dos grupos terminais hidroxila do polímero PEG por grupos funcionais contendo eletrófilo. Particularmente, polímeros PEG são fixados a resíduos cisteína ou lisina nos monômeros de polipeptídeo de anticorpo ou multímeros. Os resíduos de cisteína e lisina podem ser de ocorrência natural ou podem ser engenheirados na molécula de polipeptídeo de anticorpo. Por exemplo, os resíduos de cisteína podem ser engenheirados de modo recombinante no término C do polipeptídeo de anticorpo, ou resíduos em locais acessíveis ao solvente específico em um polipeptídeo de anticorpo podem ser substituídos com cisteína ou lisina.

O anticorpo pode ser ligado a uma ou mais moléculas que podem aumentar sua meia-vida in vivo. Estas moléculas são ligadas ao anticorpo a um sítio no anticorpo diferente do sítio de ligação de antígeno, de modo que eles não interferem/impedem estéreo-quimicamente o sítio de ligação de antígeno. Tipicamente, estas moléculas são polipeptídeos de ocorrência natural in vivo e que resistente à degradação ou remoção por mecanismos endógenos. Será óbvio para o versado na arte que fragmentos ou derivados destas moléculas de ocorrência natural podem ser usadas, e que algumas podem não ser polipeptídeos. As moléculas que aumentam a meia- vida põem ser selecionadas das seguintes:

(a) proteínas de matriz extracelular, por exemplo colágeno, lamina, integraina e fibronectina,

(b) proteínas encontradas no sangue, por exemplo, fibrina a-2 macroglobulina, albumina no soro, fibrinogênio A, fibrinogênio B, proteína amilóide A no soro, heptaglobina, proteína, ubiquitina, uteroglobulina, β-2 microglobulina, plasminogênio, lisozima, cistatina C, alfa-l-antitripsina e inibidor de kipsina pancreática;

(c) proteínas de soro imunes, por exemplo IgE, IgG, IgM;

(d) proteínas de transporte, por exemplo proteína de ligação a retinol, a-1 microglobulina;

(e) defensinas, por exemplo beta-defensina 1, defensinas de neutrófilos 1, 2 e 3;

(f) proteínas encontradas na barreira sangue- cérebro ou em tecidos neurais, por exemplo receptor de melacortina, mielina, transportador de ascorbato,

(g) proteínas de fusão de agente neuro-farmacêutico ligando específica de receptor de transferrina (ver US5977307); receptor de célula endotelial capilar no cérebro, transferrina, receptor de transferrina, insulina, receptor de fator de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF 1), receptor de fator de crescimento semelhante a insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina,

(h) proteínas localizadas no fígado, por exemplo policistina, colágeno tipo IV, transportador aniônico orgânico Kl, antígeno de Heymann,

(i) proteínas localizadas no fígado, por exemplo álcool desidrogenase (G250),

(j) fator de coagulação do sangue X,

(ki) α 1-antitripsina,

(1) HNF 1 a,

(m) proteínas localizadas no pulmão, por exemplo componente secretório (liga IgA),

(n) proteínas localizadas no coração, por exemplo HSP 27,

(o) proteínas localizadas na pele, por exemplo queratina,

(p) proteínas específicas de osso, como proteínas morfogênicas do osso (BMPs), por exemplo BMP-2, 4, 5, 6, 7 (também referido como proteína osteogênica (OP-I) e -8 (OP-2),

(q) proteínas específicas de tumor, por exemplo antígeno de trofoblasto humano, receptor de herceptina, receptor de estrogênio, catepsinas por exemplo catepsina B (encontrada no fígado e baço),

(r) proteínas específicas de doença, por exemplo antígenos expressados apenas em células T ativadas, incluindo LAG-3 (gene de ativação de linfócitos, ligando de osteoprotegerina (OPGL) ver Nature 402, 304-309, 199S); 0X40 (um membro da família do receptor de TNFa5 expressado em células T ativadas a única molécula de células T co-estimulatórias conhecidas como sendo especificamente reguladas de modo positivo em células produtoras do vírus de leucemia de célula T humana (HTLV-I) tipo I, ver J. Immunol. 2000 JuI 1; J6561):263-70; metaloproteases (associadas com artrite/cânceres), incluindo CG6512 de Drosophila, paraplegina humana, RsH humano, AFG3L2 humano, flsH murino; fatores de crescimento angiogênicos, incluindo fator de crescimento de fibroblastos ácidos (FGF-2), fator de crescimento endotelial vascular/fator de permeabilidade vascular (VEGF/VPK), fator de crescimento-α de transformação (TGF-α), fator alfa de necrose de tumor (TNFa), angiogenina, interleucina 3 (IL-3), interleucina 8 (IL-8), fator de crescimento endotelial derivado de plaquetas (PD- BCGF), fator de crescimento placentário (PIGF), fator de crescimento derivado de plaquetas midkine BB (FDGF), fractalkina;

(s) proteínas de estresse (proteínas de choque térmico);

(t) proteínas envolvidas no transporte Fe; e

(u) vitaminas, por exemplo B12, Biotina.

Em outro aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade efetiva do anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com à presente invenção, junto com um excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Um "excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti-bacterianos e anti-füngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção, e outros, que são fisiologicamente compatíveis. Os exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais dentre água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, e outros, assim como suas combinações. Em muitos casos, prefere-se inclui agentes isotônicos, por exemplo açúcares, polialcoóis, como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis como quantidades umectantes ou menores de substâncias auxiliares como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões.

O termo "quantidade efetiva" refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo (incluindo composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo) suficiente para tratar uma doença específica ou distúrbio dou um ou mais dos sintomas e/ou para evitar a ocorrência da doença ou distúrbio.

O termo "quantidade diagnosticamente efetiva" ou quantidades efetivas para diagnóstico" e cognatos dos mesmos, refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo (incluindo composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo) suficientes para diagnosticar uma doença ou distúrbio específico e/ou uma ou mais de suas manifestações, onde o diagnóstico inclui a identificação da existência da doença ou distúrbio e/ou detecção da extensão ou severidade da doença ou distúrbio. Com freqüência, o diagnóstico será realizado com referência a uma linha de base ou nível de detecção de antecedentes observado para indivíduos sem a doença ou distúrbio. Os níveis de detecção acima dos níveis de fundo ou de linha de base (níveis elevados de detecção) são indicativos da presença e, em alguns casos, da severidade da condição.

Quando usado com relação aos métodos de tratamento e o uso do anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo (incluindo as composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo), um indivíduo em "necessidade do mesmo" pode ser um indivíduo que foi diagnosticado com ou previamente tratado para a doença ou distúrbio a ser tratada. Com relação aos métodos de diagnóstico, um indivíduo "em necessidade do mesmo" pode ser um indivíduo que se suspeita tenha uma doença ou distúrbio, está em risco para uma doença ou distúrbio, ou foi previamente diagnosticado com a doença ou distúrbio (por exemplo diagnóstico pode incluir monitoração da severidade (por exemplo progressão/regressão) da doença ou distúrbio com o tempo e/ou em conjunto com terapia.

Prefere-se que o anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo bloqueia ou estimula os receptores a funcionar ou neutralizar os produtos ativos, como uma ou mais de interleucinas, TNF a, ou C5a. Mais preferivelmente, o produto solúvel ativo é TNF α humano.

A composição pode ter várias formas, incluindo formas de dosagem líquida, semi-sólida ou sólida, como soluções líquidas (por exemplo soluções injetáveis e infundíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas ou supositórios. Preferivelmente, a composição está na forma de uma solução injetável para imunização. A e administração pode ser intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, transdermal, intratecal, e intra-arterial. Preferivelmente a forma de dosagem está na faixa de cerca de 0.001 mg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal administrada diariamente, semanalmente, bi- ou tri- semanalmente, mensalmente, mais preferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 5 mg/kg peso do corpo semanalmente.

A composição também pode ser formulada como um pó estéril, para a preparação de soluções injetáveis estéreis.

Em algumas formas de realização, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que irá proteger o composto contra liberação rápida, como formulação de liberação controlada, incluindo implantes, curativos transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Os polímeros compatíveis podem ser usados como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres ou ácido poliláctico.

A composição também pode ser formulada para administração oral. Nesta forma de realização, o anticorpo pode ser encerrado em uma cápsula de gelatina de envoltório duro ou mole, comprimida em comprimidos, ou incorporada diretamente na dieta do indivíduo.

A composição também pode ser formulada para administração retal.

O anticorpo pode ser administrado a fim de ligar e identificar células selecionadas in vitro e in vivo para ligar e destruir as células selecionadas in vivo, ou a fim de penetrar em e destruir as células selecionadas in vivo. Alternativamente, o anticorpo pode ser usado como uma imunotoxina para liberar um agente citotóxico, por exemplo uma toxina ou agente quimio-terapêutico a um tipo de célula em particular, por exemplo uma célula de tumor. A produção de imunotoxinas pode ser familiar para o versado na arte.

Os agentes citotóxicos comumente usados para gerar imunotoxinas incluem isótopos radioativos como 111 IN ou 90 Y, selênio, ribonucleases, toxinas microbianas truncadas deletadas em domínio de ligação, como exotoxina de Pseudomonas ou toxina de difteria, inibidores de tubulina como caliceamicina (ozagamicinaO, maitansinóides (incluindo DM- 1), auristatinas, e taxóides, proteínas inativando ribossoma como ricina, ebulina I, saporina e gelonina, e pró-drogas como melfalan.

Na forma de realização preferida, a composição é administrada a um humano.

A presente invenção também provê o uso do anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo em uma aplicação diagnostica para detectar um antígeno associado com a doença ou distúrbio particular,

Mais particularmente, a invenção provê o uso do anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo em um método para o diagnóstico de um indivíduo tendo um antígeno associado com uma doença ou distúrbio particular, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade diagnosticamente efetiva de uma composição farmacêutica de acordo com um terceiro aspecto. Preferivelmente, o indivíduo é um humano.

Por exemplo, o anticorpo quimérico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, preferivelmente rotulado, pode ser usado para detectar a presença de um antígeno, ou níveis elevados de um antígeno (por exemplo TNF a) em uma amostra biológica, como soro ou plasma usando um imunoteste de convenção, como mencionado teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA), um radioimunoteste (RIA) ou imuno-histoquímica de tecido.

Preferivelmente, o antígeno ao qual o anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo liga, é um peptídeo, proteína, carboidrato, glicoproteína, lipídeo ou glicolipídeo na natureza, selecionado dentre um antígeno associado com tumor incluindo antígeno carcinoembriônico, receptores de EpCAM, Lewis-Y, Lewis- Y/b, PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL e VEGF, um antígeno envolvido em uma doença ou distúrbio imune inflamatória ou incluindo CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC classe I, MHC classe II, GM- CSF, interferon-γ, IL-I, IL- 12, IL-13, IL-23, TNF-α, e IgR, um antígeno expressado em uma célula hospedeira incluindo glicoproteína Ilb/IIIa, P- glicoproteína, receptores purinérgicos e receptores de adesão incluindo CD11a, CD11b, CD11c, CD 18, CD56, CD58, CD62 ou CD144, um antígeno compreendendo uma citocina, quimiocina, fator de crescimento ou outro modulador fisiológico solúvel ou um receptor do mesmo incluindo eotaxina, JLL-6, IL-8, TGF-β, C3a, C5a, VRdF, NGF e seus receptores, um antígeno envolvido nas doenças ou distúrbios do sistema nervoso central incluindo β-amilóide e príons, um antígeno de origem não humana como antígenos microbianos, nanobiais ou virais ou toxinas incluindo proteína F de vírus sincicial respiratório, toxina de antrax, veneno de cascavel e digoxina; em que o anticorpo quimérico atua como um agonista ou antagonista ou é ativo ou para depletar (matar ou eliminar) células indesejadas (por exemplo anti-CD4) atuando com complemento, ou células exterminadoras (por exemplo células NK) ou é ativa como um agente citotóxico ou para causar ligação de receptor Fc por um fagócito ou neutraliza atividade biológica de seu alvo.

O anticorpo quimérico TNFα anti-humano ou porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a invenção também pode ser usada em aplicações de cultura de células onde se deseja inibir a atividade de TNF α.

A presente invenção também provê um método para tratar uma doença ou distúrbio caracterizada por atividade de TNFa humano em um indivíduo humano, compreendendo a administração ao indivíduo em necessidade do mesmo de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção em que o anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo liga TNF α.

O termo "doença ou distúrbio caracterizada por atividade de TNF α humano" como usado aqui se destina incluir doenças ou distúrbios em que a presença de TNFa em um indivíduo sofrendo da doença ou distúrbio foi mostrada ou se suspeita está sendo ou responsável pela patofisiologia da doença ou distúrbio ou um fator que contribui para a piora da doença ou distúrbio. Conseqüentemente, uma doença ou distúrbio em que a atividade de TNF α é prejudicial é uma doença ou distúrbio em que a inibição da atividade de TNF α é esperada como aliviando os sintomas e/ou a progressão da doença ou distúrbio. Estas doenças ou distúrbios podem ser evidenciados, por exemplo, por um aumento na concentração de TNFa em um fluido biológico em um indivíduo sofrendo da doença ou distúrbio (por exemplo um aumento na concentração de TNFa no soro, plasma, fluido sinovial, etc do indivíduo), que pode ser detectada, por exemplo, usando um anticorpo quimérico da invenção específico para TNFa.

Uma doença ou distúrbio caracterizada por atividade de TNFa humano se destina a incluir doenças ou distúrbios e outra doença ou distúrbio em que a presença de TNFa em um indivíduo sofrendo da doença ou distúrbio foi mostrada como sendo, ou que se suspeita seja, ou responsável pela patofisiologia da doença ou distúrbio ou um fator que contribui para a piora da doença ou distúrbio. Preferivelmente a doença ou distúrbio caracterizada por atividade de TNFa humano é selecionada dentre o grupo consistindo de sepsia, incluindo choque séptico, choque endotóxico, sepsia gram negativa, e síndrome de choque tóxico, doença autoimune, incluindo artrite reumatóide, espondilite reumatóide, osteoartrite, psoríase e artrite de gota, alergia, esclerose múltipla, diabete autoimune, uveíte autoimune e síndrome nefrótica, doença infecciosa, incluindo febre e mialgias devido a infecção e caquexia secundária a infecção, doença de enxerto versus hospedeiro, crescimento de tumor ou metástase, doença pulmonar incluindo síndrome de falta de ar do adulto, pulmão de choque, doença inflamatória pulmonar crônica, sarcoidose pulmonar, flbrose e silicose pulmonar, doença inflamatória intestinal, incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa, doença cardíaca, doença de osso inflamatória, hepatite, distúrbios da coagulação, queimaduras, dano de reperfusão, formação de quelóides e formação de tecido de cicatrizes.

Os compostos ativos suplementares podem ser incorporados na composição. O anticorpo ou fragmento de ligação ao anticorpo podem ser co- formulados com e/ou administrados simultaneamente, separadamente ou seqüencialmente, com um ou mais agentes terapêuticos adicionais por exemplo anticorpos que ligam a outros alvos como citocinas ou moléculas de superfície celular ou alternativamente um ou mais agentes químicos que inibem a produção de TNFa humano ou atividade.

Em outro aspecto, a invenção provê um kit compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno do mesmo, junto com embalagem e instruções para uso. Em algumas formas de realização, as instruções para uso incluem instruções de como administrar efetivamente uma quantidade terapêutica do anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno da invenção.

Em todo o relatório, a palavra "compreender" ou variações como "compreende" ou "compreendendo" será entendida como implicando a inclusão de um elemento, número ou etapa, ou grupo de elementos, números ou etapas, descritos mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número ou etapa, ou grupo de elementos, números ou etapas.

Todas as publicações mencionadas neste relatório são aqui incorporadas por referência. Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou semelhantes que podem ser incluídos no presente relatório é apenas para o fim de prover um contexto para a presente invenção. Não deve ser tomado como uma admissão de que qualquer uma ou todas estas matérias formam parte da base da arte anterior ou são de conhecimento geral comum no campo relevante à presente invenção, como ela existia na Austrália ou em outra parte antes da data de prioridade de cada reivindicação neste pedido.

A fim de que a natureza da presente invenção seja mais claramente entendida, as suas formas preferidas serão agora descritas com referência aos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLO 1

Fusão de região variável de sagüi para uma região constante humana

Materiais e métodos

Síntese de genes e clonagem

A cadeia Vh (número de acesso AAM 54057, SEQ ID NO: 1) de anticorpo derivado de sagüi específico para MOG. foi expressada com uma região constante humana ( domínios de cadeia pesada IgGl humana Ch 1, gancho, CH2 e CH3 (como número de acesso NCBI PO1857) (SEQ ID NO: 2).

Isto foi obtido por retro-tradução da seqüência de aminoácido em uma seqüência de DNA que foi otimizada por expressão de células de mamífero usando tecnologia Gene Optimizer e sintetizadas de novo por um conjunto de oligonucleotídeos sintéticos (GeneArt, Alemanha). Durante a otimização da seqüência de DNA, os sítios de enzima de restrição específicos Asc I e Tth IIII foram incluídos para permitir uma manipulação futura da região VH. Após a síntese de genes, a seqüência completa incluindo uma seqüência Kozak foi clonada no sítio de clonagem múltiplo do vetor acessório pEE6.4 GS (Lonza Biologies). A cadeia Vl (Número de acesso: A AM54058, SEQ ID NO: 3) do anticorpo derivado de sagüi específico de MOG foi expressado com uma região constante de cadeia leve Capa humana (como NCBI número de acesso AAA58989) (SEQ ID NO: 4). DNA codificando a seqüência de aminoácido de cadeia leve (VL - Capa) foi preparado como descrito acima para a cadeia pesada. Durante a otimização da seqüência de DNA e síntese dos sítios de enzima de restrição Bsi WIIRsr II foram incluídos para permitir a manipulação futura da região VL. Após a síntese do gene, toda a seqüência incluindo a seqüência Kozak foi clonada no sítio de clonagem múltipla do vetor de expressão

pEE12.4 GS (Lonza Biologies). Para a expressão estável de dois vetores de genes únicos (pEE6.4-VH-IgGI e pEE12.4-VL Capa) foram combinados em um de gene duplo. Isto foi feito por digestão da estrutura dorsal pEE6.4 do cassete de expressão de cadeia pesada (promotor hCM V- MTF,, seqüência Kozak, Vh de sagüi, região constante humana e sítio S V40 polyA) usando Not I e Bam HI.O resultante fragmento foi subclonado usando sítios Not I e BamH 1 no vetor pEEI2.4-VL-Capa a jusante do cassete de expressão de cadeia leve (promotor hCMV-MTE, seqüência Kozak, Vl de sagüi, região constante Capa humana e sítio SV40 polyA) criando um vetor expressando tanto as cadeias pesada como leve de AB 138 (SEQ ID NOs: 5 e 6).

Transfecção

Para cada transfecção, 175μ1 de Lipofectamine 2000 foram adicionado a 5 mL de meio Optimem (Invitrogen Cat Nos. 11668-027 e 31985-062) em uma cavidade de placas de 6 cavidades, Em uma segunda cavidade, 70 μl de vetor de expressão (70 μg) foram adicionados a 5 mL de meio Optimem I. Após 5 min de incubação em temperatura ambiente, os conteúdos das duas cavidades foi misturado junto e deixado por mais 20 min de incubação. Após esta segunda incubação, toda a mistura de transfecção foi adicionada a um frasco de cultura de tecido T175 contendo as células CHOKl SV. As células foram incubadas durante 72 a 96 h e sobrenadantes coletados. Os sobrenadantes foram centrifugados a 4.000 χ g durante 5 min para pelotizar os resíduos celulares, e foram esterilizados em filtro através de um filtro de cartucho de 0,22 μηι.

Purificação de anticorpos

O sobrenadante foi passado sobre uma coluna de proteína A HiTrap (Amersham Biosciences, no. de cat. 17-0492-01) três vezes em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. A coluna foi então lavada com20 mM fosfato de sódio durante 40 min a 1 mL/min. O anticorpo foi eluído com 0,1 M ácido cítrico pH 3,5 com frações coletadas e imediatamente neutralizadas com IM Tris-HCl pH 9,0. As amostras de anticorpo foram então dessalinizadas em uma coluna PD-10 (Amersham Biosciences, no. de cat. 17-0851-01). A análise do anticorpo por SDS- PAGE e HPLC de exclusão de tamanha confirmaram o peso molecular correto, presença de anticorpo montado e concentração do anticorpo.

Análise Western blot

A capacidade de AB138 de reter a ligação do antígeno de M26, MOG de rato glicoproteína de oligodendrócitos - mielina) foi investigada por Western Blot. 130 mg de medula de rato (IMVS, Australia) foram homogeneizados em 1.8 ml de reagente de lise de células CeLLytic M ( (SIGMA, C2978) e incubados durante 30 minutes a 4°C. Outra homogeneização foi realizada passando o lisado através de uma agulha 1/2 calibre 27 várias vezes seguido por centrifugação a 4°C e 13.000 g durante 30 min. A pelota e sobrenadantes foram diluídos em tampão de amostra SDS- PAGE (125 mM Tris-HCl pH 6,8, 5% SDS, 0,25% azul de bromofenol, 25% glicerol). Junto com isto, 200 μ de células CHOKlSV a 1 χ 10 6 células viáveis por ml foram giradas a 13.000 χ g a 4°C durante 1 min e recolocadas em suspensão em 200 μl de reagente de Iise de células CelLytic M (SIGMA). Após centrifugação a 4°C e 13.000 χ g durante 30 min, o sobrenadante foi misturado com quantidade apropriada de tampão de amostra SDS-PAGE. Todas as amostras, junto com uma amostra de marcadores de peso molecular, foram cicladas em um gel pré-moldado Novez a 4-20%. (Invitrogen Austrália) durante 2 h a 120 V. As proteínas foram então transferidas para PVDF (BioRad, Austrália), usando um aparelho de western blot em tampão 1 X tris-glicina com 20% metanol (BioRad Cat 161 + 0771) a 4°C a 250 mA durante 2 horas. A membrana foi então bloqueada por incubação com 5% leite desnatado, em pó, em PBS durante 1 h em temperatura ambiente. A membrana foi então lavada com 1 X PBS três vezes seguido por uma incubação durante a noite a 4°C, com AB138 em PBS a 10 μg/mL. Após lavagem, a membrana foi incubada com conjugado HRP IgG (μ+L) anti- humano de cabra (Sigma Austrália) diluído 1: 5.000 em 1 χ PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Após lavar, o anticorpo ligado foi detectado usando o sistema de análise Western Blotting ECL ((Amersham Biosciences, no. de cat. RPN 2109). Uma experiência paralela foi realizada em que ABI38 foi substituído com um anticorpo de controle negativo de especificidade irrelevante correspondente com isótipo (anticorpo monoclonal anti- TNFa) a fim de identificar quaisquer eventos de ligação não específica.

Resultados

Após a expressão e purificação de proteínas com sucesso, a análise western blot foi realizada em AB138 para determinar se ela retinha afinidade de ligação para MOG de rato. AB138 ligou uma proteína com tamanho aproximado de 25 kDa presente no lisado depurado de medula espinhal de rato, uma proteína não presente em lisado CHOKISY depurado (figura 3). O anticorpo de controle negativo não liga a proteína presente em ambos os lisados indicando a interação entre AB138 e a proteína de tamanho de 25 kDa não foi devido ao artefato ou a eventos de ligação não específicos associados com a região constante humana (figura 2). Esta proteína corresponde ao tamanho esperado de MOG de rato menos a seqüência de sinal (24,9 kDa). Este resultado indica que AB138 reteve a afinidade para MOG de rato presente no lisado de medula espinhal do rato e demonstra que um anticorpo de fusão de sagüi humano pode reter a capacidade de ligação de antígeno.

Será notado por alguns versados na arte que MOG de rato pode ser produzido usando tecnologia de DNA recombinante e a capacidade de ABI38 de ligar MOG de rato determinada em testes de ligação como ELISA ou análise Biacore.

EXEMPLO 2

Substituição de CDR2 de um anticorpo de domínio

A tecnologia de DNA recombinante padrão pode ser usada para produzir um anticorpo de domínio localmente engenheirado por substituição da CDR2 de um anticorpo de domínio anti-TNFa de receptor (Basran et al, WO 2004/081026; SEQ ID NO: 7; Figura 3) com uma CDR2 de uma imunoglobulina de primata do Novo Mundo doador. .

Aplicando as regras de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest" E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983) a CDR2 é identificada no anticorpo de domínio anti TNFa do receptor (SASELQS). A seqüência de receptor de anticorpo de domínio é então alinhada contra um painel de seqüências de imunoglobulina de primata do Novo Mundo. Estas seqüências são derivadas do macaco-da- noite Ma. (Aotus nancymaae)(SEQ ID NO: 8 - 18) e de sagüi comum (Callithrix jacchus) (SEQ ID NOs: 19-24) (Figura 4). As seqüências CDR2 seqüências das imunoglobulinas do primata do Novo Mundo que diferem da seqüência de CDR2 do receptor podem ser identificadas como SASTLQT, DASSLQP, GASTRAT, KVSNRAS, RVSNRAS, KVSTRGF, AASNRAS, TSSNLQA, KASTLQS, AASTLQS, YASSLQS, YASFLQG) (Tabela I). A análise BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) de cada uma destas seqüências de CDR2 de primata do Novo Mundo doador é realizada para remover seqüências que são correspondências exatas para seqüências de imunoglobulina humana. As seqüências singulares para os primatas do Novo Mundo foram KVSNRAS, RVSNRAS, KVSTRCGP, AASNRAS, TSSNLQA, DASSLQP, YASFLQG (Tabela 1).

Tabela 1 : Seqüências de CDR2 de primata do Novo Mundo e sua apropriabilidade como seqüências de doador

<table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table>

A CDR2 de receptor e as CDR2s do doador em potencial são examinadas para sua imunogenicidade prevista em humanos pelo programa de previsão de ligação de MHC classe II Propred (http://www.imleeh.res.in/raghava/propred) usando uma análise de valor de limiar de 1% de todos os alelos. A partir desta análise, o receptor CDR2 SASELQS, forma parte do peptídeo, LIYSASELQ, que é previsto para ligar MHC classe II codificado por 11 alelos (DRB1 .0306, DRB1 0307, DRB1 0308, DRB1_0311, DRB1-0401, DRB1_0426, DRB1_0806, DRB10813, DKBl _ 15001, DRBl _ 1502, DRB1 1506). A seqüência de CDR2 doador, KVSNRAS, forma parte de uma seqüência, LIYKVSNRAS, que é prevista para ligar MHC de classe II, codificado por 9 alelos (DRB 1 _0309, DRB1 0402, DRB1_0802, DRB1_0804, DRBl _ 0806, DRB1_0813, DRBl 1301, DRB 1_ 1327, DRBl _ 1328). A seqüência de CDR2 de doador, AASNRAS, forma parte de uma seqüência, L1YAASNRA, que é prevista para ligar MHC classe II codificado por 6 alelo s (DRB1_0402, DRB1 0404, DRB1 040S, DRB1_0423, DRB1_0813, DRBl _ 1506). A seqüência de CDR2 de doador, TSSNLQA, forma parte de uma seqüência, LIYTSSNLQA, que é prevista para ligar MHC classe 1, codificado por 10 alelos (DRB1 _ 0401, DRB 1_0402, DRB1_0404, DRBl _ 0410, DRBl _ 0423, DRBl _ 0442, DRB1_0813, DRB 1_ 1501, DRBl _ 1502, DRB 1_ 1506). A seqüência de CDR2 de doador, KVSTRGP, forma parte de uma seqüência LUYKVSTR, que é prevista para ligar MHC classe II codificado por 8 alelos (DRB1_0309, DRBI_0802, DRBI _ 0804, DRBl _ 0806, DRB 1_ 0813, DRBl_1301, DRB1_1327, DRB1 1328). Assim, a CDR2 do receptor pode ser substituída com uma CDR2 de doador de menor imunogenicidade prevista, incluindo KVSNRAS, AASNRAS, TSSNLQA e KVSTRGP.

Usando tecnologia de RNA recombinante, a CDR2 do receptor é substituída com as seqüências de CDR2 do doador, gerando os anticorpos de domínio localmente engenheirados (SEQ ID NO: 25-31). Os exemplos de tecnologia de DNA recombinante incluem os descritos por Winter et al (patente US 5 225 539) e incluem, mas não são limitados a técnicas como mutagenese sítio-dirigida e anelamento oligo. A expressão de proteína dos anticorpos de domínio é então realizada em BL21 (DE3) pLys de E. coli (Novagen, Alemanha), usando um vetor apropriado para expressão como pET21d(+) Novagen, Alemanha), ou por outros tais métodos bem conhecidos na arte como os descritos por Basran et al (WO 2004/ 081026). Após a Iise de células bacterianas, os anticorpos de domínio são purificados usando cromatografia de Proteína L (Pierce USA).

Após purificação, os anticorpos de domínio engenheirado são analisados para retenção de capacidade de ligação de TNFa por métodos bem conhecidos na arte, como teste neutralização de L929 ou o teste de ligação de receptor I de TNF α.

Para melhorar a afinidade de ligação de anticorpos de domínio engenheirado, a maturação por afinidade pode ser realizada por substituição de aminoácido dos resíduos de estrutura circundando e estabilizando CDR2 ou por outros métodos bem conhecidos na arte(Winter et al. (US 5.225.539); Griffiths et al (US 5.885.793); Rajpal, A. et at (2005) A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries, Proc.l Natl Acad Sci USA, 102(24) 8466-71; Irving R.A. el al. (2001) Ribosome display and affinity maturation: from antibodies to single V- dumains e steps towards câncer therapeutics, Joumal of Immunological Methods, 248: 31-45). Será apreciado pelos versados na arte que numerosas variações e/ou modificações podem ser feitas na invenção como mostrado nas formas de realização específicas sem sair do espírito e escopo da invenção como amplamente descrita. As presentes formas de realização são, assim, consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas. LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> Peptech Limilied

<120> Anticorpos localmente engenheirados

<13ü> WJP 03 1403 6006

<140> PCT

<141> 2006-08-15

<160> 31

<170> PatentIn versian 3.3

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> CallifhT jacchus

<400> 1

Cln Val Gln Leu Val Gln Scr Gly Ala Glu Val I.ys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Scr Cys Lys Ala Ser Cly Tyr Thr Phe Thr Sor Tyr 20 25 30

Ala Ile Ser Trp Ala Arg Cln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Mct 35 40 45

Gly Ala i?he Asp Pro Glu Tyr Gly Scr Thr Thr Tyr Ala Cln Lys Phe

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala UVr 65 70 7b 80

Met Glu Leu Ser Ser Ieu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Val Asn Phe Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ilb

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4Õ0> 2 Ala Ser Thr Jbys GIy Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15

Ser Thr Scr GTy Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cya Lcu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phc Pro Glu Pro Val Thr Val Snr Trp Asn Ser Gly Ala T,eu Thr Ser 35 40 45

Gly Val Ilis Thr Phe Pro Al.a Val Lcu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser T,eu Gly Thr Gln Tiir 65 70 75 80

Tyr Xle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn-Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys P-ro Pro Cys 100 105 110

Pr o Al a Pro Glu Lcu Leu Gly Cly Pro Ser Val Phe Lcu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Tlir Leu Met Ile Scr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu VaI Lys Phe Asn Trp 145 150 155 150

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Alá- Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu GIn Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Lcu 180 185 190

His Glxi Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln VaI Tyr Tiir Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Cly Fhci Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Scr Asn GIy Gln Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Tlir Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Cly Scr Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Sor Lys Lou Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 29b 300

Val Pho Sor Cys Scr Val Mch íris Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> Callithrix jacehus

<400> 3

Glu Tiqxi Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Sor Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Tiir Val Ser Cys Arg Ala Cly Gln Ser Val Ser Tyr Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gl.n T.ys Pro Gly Gln Aia Pro Arg Leu Lgu Tlo 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Scr Arg Scr- Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Lou Clu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phc Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Xlo Lys Arg 100 105 <210> 4

<211;> 106

<212> PRT

<21 3 > Homo sapiens

<400> 4

Thr Val Αία Ala Pro Ser VaI Pho Tle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln I 5 10 15

Lcu Lys Ser Cly Thr Ala Sor Val Val Cys Leu Leu Ann Asn Pho Tyr 20 25 30

Pro Arg Olu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr SO 55 60

Tyr Ser Leu Sor Ser Thr Leu Thr Leu Sor T.,ys Ala Asp Tyr Glu T.ys 65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hia GIn Gly Leu Sor Ser Pro 85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

<210> 5

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de cadeia pesada AB138

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys AIa Scr Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Ala Ile Ser Trp Ala Arg Cln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Ala Phe Asp Pro Glu Tyr Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Sejr Thr Ker Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met CJlu Lou Ser Set reu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala. Ajtçí Asp Val Ακη Pho Gly Ásn Tyr Phe Asp Tyr Trp Cly Gl-n Gly 100 105 110

Thr Teu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr l.ys Asn Pro Aap Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser lys Ser Thr- Ser Gly Cly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Jbys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Scr Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Tto Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 155 170 175

Gln Ser Ser CHy Lcu Tyr Ser Leu Ser Scr Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr UVr Ilc Cys Asn Val Aesti His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Vai Aap Lys Lya Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 23 5 220

Thr Hls Tlir Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Tlir I.eu Mot Ilo Ser 245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Scr His Glu Asp 260 265 270

Pro Glu Vai Lys Phe Asti Trp Tyr Val Asp Gly Vai, Glu Val IIis Asn 275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Lcu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 31b 320

IVr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Xle Glu Lya

325 330 335

Thr Ile Ser Tys Ala Lys Cly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Lcu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365

Cys Leu Lys Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415

Ser Arg Trp Gln Cln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GTy 435 440 445

Lys

<210> 6

<211> 214

<212> PKT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de cadeia leve AB138

<400> 6

Glu Leu Val Mot Thr Oln Ser Pro Tvla Thr Leu Ser Leu Sér Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Gly Gln Ser Val Ser Tyr Tyr 20 25 30 TiCU Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro CIly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Tlc 35 40 45

Tyr Gly Ala fier Thr Arg Ala Tlir Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Sor Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Xle Ser Sor Leu Glu P.ro 65 70 75 80

Glu Asp Pho Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Pro 85 90 95

Thx Phe Gly Gln Cly Thr Iys Tou Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe Tle Phe Pro Pro Sor Asp Glu Gln T.,eu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Sor vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Pho Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Tyo Val Gln Trp Tys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Scr Thr Tyr Ser Leu Sor 165 170 175

Sor Tlir Leu Thr Lcu Ser Lys Al a Asp Tyr Glu Lys Hi s Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr Hi= Gln Gly Leu Ser Scr Pro Val Thr I.ys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de aceptor de anticorpo de domínio

<400> 7

Asp Tle Gln Met Tbr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Gly Asp 1 5 10 15 Aror Val Thr Ilo Thr c:ys Arg Ala Ser GTn Ser Ile Aap Ser Tyr Lou 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Π e Tyr 30 35 40

Scr Ala Ser Glu Leu CHn Ser Gly Val Pro Scr Arg Phe Scr Gly Ser 50 55 60

Gly Scr Gly Thr Aap Phe Thr Leu Thr Ile Ser Scr Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe 1Itir 85 90 95

Phc Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile T..ys Arg 100 105

<210> 8 <211> 105 <212> PRT

<213> Aotus na.ncyxrtaae <400> 8

Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Tle Ser Cys Arg 1 5 10 15

Ser Ser Gln Ser Leu Teu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp 20 25 30

Tyr Lcu Glu Lys Pro Gly Lye Pro Pro Gln Leu Leu Vai. Tyr T.ys Vasl 35 40 45

Scr Asn Arg AIa Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val 65 70 75 80

Gly Vai Tyr Tyr Cys Meh Ser Tyr Leu Gln Ala Pro Met Tyr Thr Phe 85 90 95

Cly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9

<211> 99

<213> PRT

<213> AotAis nancymaae

<400> 9

Ser Ser Leu Ser Ala Scr Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Crys ITis 1 5 10 15

Ala Scr Glr Ser Ile Ser Asn Trp Lcu Ala Ττρ Tyr Gln Gln Lys Pro 20 25 30

Gly Lys Val Pro Lys Lou Leu Tle Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Oln Ser 35 40 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 60

Leu Thr Tlta Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80

Gln Lys Tyr Asp Sor Ser Pro Trp Thr Phe Gly Lys Cly Thr Lys Leu 85 90 95

Glu Ile Lys

<210> 10 <211> 99 <212> PRT <213> Aotus nancymaae <400> 10 Ser Ser Leu Scr Ala Ser

1 5 10 15

Thr Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp r,eu Ala Trp Tyr Gln Gln T.ys Pro

20 25 30

Gly Tys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Sor Gly Thr Asp Phe Thr

50 55 60 Leu Tle Ile Ser Ser T,cu Gln Pro Cilu Asp Val Ala Tlur Tyr Tyr Cys 65 70 7b 80

Gln Lys Tyr Asp Scx Ser Pro Tyr Tlir Phe Gly Cln Gly Thr Lys Val 85 ao 95

Glu Xle Lys

<210> 11

<211> 106

<212> PRT

<213> Aotas nancymaae

<400> 11

Tcu Ser Ticu Pro Tle Thr Leu Gly Glu Scr Ala Scr Ile Ser Cys Arq- 1 5 10 15

Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Scr Asp Tyr GIy Phe Tlur Tyr Leu Asp 20 25 30

Trp Tyr Lea Gln Lya Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Xle Tyr Ala. 3b 40 45

Ala Ser Asn Arg Ala Sor Gly Val PrO Asp Arg Phe Sor Gly Ser GIy 50 55 60

Ala Asp Tlir Asp Phe Thr T.ou Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp

65 70 75 80

Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Lys Gla Leu Pro Pro Phe Thr 85 90 95

Phe Gly Pro Gly Thr Lys VaI Glu Tlo Lys 100 105

<210> 12

<211> 99

<212> PRT

<213> Aotus nancymaae

<400> 12

Scr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr XIe Thr Cys Arg 1 5 10 15

AIa Ser Gln Asp lie Tyr Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln bys Pro 20 25 30 Clγ Lys Thr Pro Arg Leu Leu lie Tyr Thr Scr Ser Asn Lev Gln Ala 35 40 45

Gly Tle Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser GTy Ser Gly Thr Acp Tyr Thr 50 55 60

Ieu Thr Tle Ser Ser I.cu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80

Gln Hia Gly Tyr Asn Thr Pro Phs Ilir Phc Gly Pro Gly Thr Lys Val 85 90 95

Glu Ilc Lys

<210> 13

<211> 9y

<212> PKT

<213> Aotus nancymaae

<400> 33

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg 1 5 10 15

Ala Ser Gln Gly Ile Ser Lys Tyr Leu AIa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 20 25 30

Gly Lys Ala Pro Tys Pro Lea Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser T.cu Gln Ser 35 40 45

Gly Tle Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr 50 55 60

Lcu Thr Xle Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80

Gln Glri Tyr Asn Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lya Val 85 90 9b

Glu Tle Lys

<210> 14 <211> 99 <212> PRT <213> Aotua nancymaae <400> 14

Ser Ser- beu Scr Ala Ser Val Gly Asp Lys Val Thr Tlc Thr Cys Arg 1 5 10 15

Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 20 25 30

Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Xle Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Gly 35 40 45

Gly Val Pro Ser Ser Phe Ser Gly Ser Oly Ser Cly Ala Asp Tyr Tiir 50 55 60

Leu Thr Tle Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80

Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Ile 85 90 95

GHu Xle Tys

<210> 15

<211> 104

<212> PRT

<213> Aotus nancymaae

<400> 15

Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly G.1.U Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 1 5 10 15

Ser Ser Gln Ser Tou Leu His Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp 20 25 30

Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val 35 40 45

Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gl.y Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val 65 70 75 80 Gly Val Tyr Tyr Cys Het Asn Tyr Lev OIn Pro Pro Tyr Thr Pho Gly 05 90 95

Gln Cly Thr Lys Vel Glu Ilo Lys 100

<210> 1.6 <211) > 99 <212> PRT

<213> Aotus naneyinaao <400> 16

Ser Ser Jigu Ser A.la Pro Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys FTi ξ 1 5 10 15

Ala Ser Gln Ser Ilc Ser Asn Trp J.cu Ala Trp Tyr Cln Gln Lys Pro 20 25 30

Gly Tys Val Pro Lye l.ou Leu Xle Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser 35 40 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr bO 55 60

Leu Thr lie Ser Ser I.eu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Arg 65 70 75 80

Gln Lys Tyr Asp Sor Ser Pro Tyr Thr Phe CJly Gln Gly Thr Lys Va] 85 90 95

Glu Tle Lys

<210> 17 <211> 99 <212> PRT

<213> Aotus nancymaae <400> 17

Ala Thr Leu Scr Leu Ser Pro Lys Glu Tlir Ala Thr Leu Ser Cys Arg 1 5 10 15

Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Iys Pro 20 25 30

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 3b 40 45 GHy Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Sor Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 GO

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phc Ala Val Tyr Tyr Cys 65 70 75 80

Gln Gln Tyr Ser Asn Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Glv Thr Lys Val 85 90 95

Glu Ile Tys

<210> 18 <211> 04 <212> PRT <213> Aotus naricymaae <400> 10 Leu Ser Leu Pro Val Thr

1 5 10 15

Ser Ser Gln Ser Leu Leu IIis Ser Asn Gly Asn Tlir Tyr Leu Scr Trp 20 25 30

Phe Leu Gln Glu Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ho Tyr Lys Val 35 40 45

Ser Thr Arg Gly Pro Gly Val Pro Aap Arg Phc Ser Gly Ser Gly Ala 50 55 60

CJly Thr Asp Phc Thr Leu Lys Tlo Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val 65 70 75 30

Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Cln Ser Thr Gln His Pro Arg Thr Phe Gly 85 90 95

Lys Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100

<210> 19

<211> 130

<2l2> PKT

<213> Callithrix jacchus

<220> <221> Não identificado

<222> (108)..(108)

<400> 19

Glu Leu Thr Leu Thr Cln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Tle Thr Cys Arg Ala Ser Uln Asp Ile Arg Gly Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Cln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Scr Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Xle Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cln His Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Cly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Xaa Ala Va"l Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Glu Asp Gln Val Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala

130

<210> 20 <211> 130 <212> PHT

<213> CaHlithrix jacchus <400> 20

Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Lys 1 5 10 15

Clu Thr Ala Thr Leu Scr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Lcu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pto Ala Arg Phc SSer GDy 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Scr Leu Glu Pru 65 70 75 80

Glu Asp Pbo Ala Val Tyr Tyr Cya Ciln Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Thr 85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Tcu Glu Ile Tyn Arg Ala Val Ala Ala Pro

100 105 110

Thr Val Phc lie Pho Pro Thr Scr Glu Asp Gln vai Lys Scr Gly Thr Ilb 120 125

Ala Thr 130

<210> 21-

<211> 130

<212 > PliT

<213> Callithrix jacchus

<400> 21

Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Phe Ala Ser He Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Tle Arg Ser Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Arg Leu Leu Ile 3b 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu GIa Pro Gly Xle Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu Tlir Tle Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80

Asp Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Thr Pro Val 85 90 95

Thr Phe Gly Cln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Val Ala Ala 100 105 110 Pro -Ser VaT Phe 11α Phe Pro Pro Ser Glu Asp Gln Val Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala 130

<210> 22

<211> 130

<212> PRT

<213> Callithrix jacchus

<400> 22

Glu Teu Val Mnt Thr Cln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pto Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala CJly Gln Sor Val Sor Tyr Tyr 20 25 30

Lsu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Jbea Ile 35 10 45

Tyr Gly Ala Scr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Cly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly lThr Asp Phc Thr T.eu Thr Xle Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Pro BS 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Glu Asp Gln Val Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala 130

<210> 23 <211> 130 <212> PRT

<213> Calllthrix jacchus <400> 23

Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Lys 1 5 10 15 Glu Thr Ma Thr Leu Rer Cys Arg Ala Scr Gln Kcx Val Sor Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Tys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie 3b 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ilc Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr rcu Thr Tle Ser Arg Jbeu Glu Pio 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro T,eu 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Lcu Glu Ilc Lys Ar<7 Ala Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phc lie Phe Pro Pro Scr Glu Asp Gln Val Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala 130

<210> 24 <211> 130 <212> PRT

<213> Callithrix jacchus <400> 24

Glu Leu Thr Leu Thr Gln Ser Pro Val Tlir Leu Ser Leu Ser Pro Lys 1 5 10 15

Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arqr Ala Ser Clrx Ser Val Arg Ser Tyr 20 25 30

ICU Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Xle Pro Ala Arg Phc Ser Gly 50 55 GO

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Plie Thr Tcu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Clu Asp Phc Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Thr

85 90 95

Pho Gly Gln Cily Thr Lys Leu Glu lie T.ya Arg Ala Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phc Ile Vlie Pro Pro Ser Glu Asp Gln Vai. Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Thr

130

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de anticorpo de domínio com CDR2 substiuída por CDR2 de

AAF05517

<400> 25

Asp Tle GIti Met Thr Gln Ser Pro Sèr Ser r,ou Ser Ala Ser Gly Asp 1 5 10 15

Arg Val THr Jle Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Xle Asp Ser Tyr Leu 20 25 30

His Trp Tytr Gln Cln Lys Pro Cly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45

Lys Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Sor 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Cln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr 85 90 95

Phfe Gly Gln Cly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

<210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Seqüência de anticorpo de domínio com CDR2 substíuída por CDR2 de AAF05517

<400> 26

Aap Hr Gln Wct Thr Gln Scr Pro Rer Ser Leu Ser Ala Ser Gly Asp 1 5 10 15

Arg Val Thr Xle Thr Cys Arg Ala Ser Oln Ser lie Asp Ser Tyr Leu 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Tle Tyr 35 40 45

Ala Al a Ser Asn Arg Ala Scr Gly Val Pro Ser Arg Phe ,Ser Gly Ser 50 55 GO

GTy Ser Gly Thr Asp Phc Thr Leu Thr Xle Ser Ser T.cu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phc Ala Thr Tyr Tyr Cya Gln Cln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr 35 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lya Arg 100 105

<210> 27

<211> 107

c212> PKT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de anticorpo de domínio com CDR2 substíuída por CDR2 de AAF05517

<40ü> 27

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Gly Asp 1 5 10 15

Arg Val Thr Ilc Thr Cys Arg Ala Ser Gln Scr Ile Asp Ser Tyr Leu 20 25 30

His Trp Tyr Cln Gln Lys Pro Gly Lya Ala Pro Lys Leu T.cu Ile Tyr 35 40 45 Thr Ser ííer Asp Leu Gln Ala Cly Val Pro Seir Arg Phc Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Tiir Ilc Ser Scr Leu Gln Pro Glu 65 70 Vb 30

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Uln Gln Val Va] Trp Arg Pro Pbe TIir 85 90 95

Phe ClY Gln Gly Thr Lys Val Glu Xle Lys Arg 100 105

<210> 28 <211> 107 <212> PRT <21 3> Artificial

<220>

<223> Seqüência de anticorpo de domínio com CDR2 substiuída por CDR2 de AAF05517

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Gly Asp 1 5 10 15

Arg Val Thr Xle Thr Cys Arg Ala Sor Gln Scr Ile Asp Ser Tyr Leu 20 25 30

Iiis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro T-ys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45

Tyr Ala Scr Phe Teu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Giy Ser 50 55 60

GIy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 8O

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr 85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Xle Lys Arg 100 105

<210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Seqüência de anticorpo de domínio com CDR2 substíuída por CDR2 de AAF05517

<400> 29

Asp IIg GIn Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Scr Ala Ser Giy Asp 1 10 15

Arg VaI Tbr XIe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Asp Ser Tyr Leu 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lya Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Iie Tyr 35 40 45

Arg Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly VaI Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 5b 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Lea Thr Xle Ser Ser Leu GIn Pro Glu 65 70 75 80

Asp Pho Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr SS 90 95

Pha GIy Gln GIy Thr Lys Va3 Glu Ile Lys Arg 100 105

<210> 30 <211> 107 <212> PUT <213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de anticorpo de domínio com CDR2 substíuída por CDR2 de AAF05517

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Scr Leu Ser Ala Sor Gly Asp 1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Asp Ser Tyr Leu 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Lou Leu Xle Tyr 35 40 45 Lys Val Ser Thr Arg Gly Pro Oily Val Pro Ser Arg Phe f>'er Gly Síex· 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phc Tlir Leu Thr Ile Sar Ser Leu G] η Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Cln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr 85 90 95

Phe Gly Cln Gly Thr Lys Val Glu Tl.o Lys Arg 100 105

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de anticorpo de domínio com CDR2 substiuída por CDR2 de AAF05517

<100> 31

Asp Xle Gln Met Thr Cln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Gly Asp 1 5 10 Ib

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Lou 20 25 30

His Trp Tyr Cln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leii Xle Tyr 35 40 45

Asp AHa Ser Ser Leu Gln Pro Gly VaI Pro Scr Arg Phe Ser Gly Ser 50 5b 60

Gly Ser Gly TIlc Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr 85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu IIe Lys Arg 100 105

Claims (30)

1. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação de antígeno compreende pelo menos duas regiões de determinação da complementaridade (CDR) e pelo menos três regiões de estrutura, em que pelo menos, uma CDR é de CDR de primata do Novo Mundo.

2. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação de antígeno compreende três CDRs e quatro regiões de estrutura.

3. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação de antígeno compreende pelo menos uma CDR que é CDR de humano.

4. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação de antígeno compreende duas CDRs que são CDRs de humano.

5. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que CDR2 é uma CDR2 de primata do Novo Mundo.

6. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a seqüência de CDR2 é selecionada dentre o grupo consistindo de KVSNRAS, RVSNRAS, KVSTRGP, AASNRAS, TSSNLQA, DASSLQP e YASFLQG.

7. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a seqüência de CDR2 é selecionada dentre o grupo consistindo de KVSNRAS, AASNRAS, TSSNLQA e KVSTRGP.

8. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que tas regiões de estrutura são seqüências de humano.

9. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma região de estrutura é modificada para aumentar a ligação.

10. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma região de estrutura é modificada para reduzir a imunogenicidade prevista em humanos.

11. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma seqüência de CDR é modificada para aumentar a ligação, desde que a pelo menos seqüência de CDR de primata do Novo Mundo não é modificada.

12. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma seqüência de CDR é modificada para reduzir imunogenicidade prevista em humanos, desde que pelo menos uma seqüência de CDR de primata do Novo Mundo não é modificada.

13. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 11 ou reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma seqüência de CDR que é modificada não é a CDR de primata do Novo Mundo.

14. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação de antígeno é um anticorpo de domínio.

15. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação de antígeno ainda compreende uma seqüência de região constante de humano ou primata não humano.

16. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o primata do Novo Mundo é selecionado dentre o grupo consistindo de sagüis, tamarins, macaco esquilo, uakaris, sagüis, macaco japuçá, macaco cuatá, macaco lanudo, macaco cebo, macaco da noite e o macaco coruja.

17. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primata do Novo Mundo é um sagüi.

18. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga um antígeno que é peptídeo, proteína, carboidrato, glicoproteína, lipídeo ou glicolipídeo em natureza, selecionado dentre um antígeno associado com tumor incluindo antígeno carcinoembriônico, receptores de EpCAM, Lewis-Y, Lewis- Y/b, PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2 TRAIL e VEGF, um antígeno envolvido em uma doença ou distúrbio imune ou inflamatório incluindo CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC classe I, classe MHC II, GM-CSF, interferon-γ, IL-I, IL- 12, IL-13, IL-23, TNF- α e IgE, um antígeno expressado em uma célula hospedeira incluindo glicoproteína Ilb/IIIa, P- glicoproteína, receptores purinérgicos e receptores de adesão incluindo CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD56, CD58, CD62 ou CD 144, um antígeno compreendendo uma citocina, quimiocina, fator de crescimento ou outro modulador fisiológico solúvel ou um receptor do mesmo incluindo eotaxina, IL-6, IL-8, TGF-β, C3a, C5a, VEGF, NGF e seus receptores, um antígeno envolvido nas doenças ou distúrbios do sistema nervoso central incluindo β- amilóide e príons, um antígeno de origem não humana como antígenos microbianos, nanobiais ou virais ou toxinas incluindo proteína F de vírus sincicial respiratório, toxina de antrax, veneno de cascavel e digoxina.

19. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato em que o anticorpo liga a TNF α.

20. Método para produzir um anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender deletar uma CDR de uma região variável de anticorpo humano, compreendendo pelo menos duas CDRs e pelo menos três regiões de estrutura e substituir as mesmas com uma CDR de primata do Novo Mundo previsto para ser de baixa imunogenicidade para produzir uma região variável quimérica.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende a etapa de recuperar a região variável quimérica.

22. Método de acordo com a reivindicação 20 ou reivindicação -21, caracterizado pelo fato de que a CDR de primata do Novo Mundo é CDR2.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -20 a 22, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de modificar uma seqüência da região variável quimérica para aumentar a ligação, desde que a seqüência de CDR de primata do Novo Mundo não seja modificada.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações - 20 a 23, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de modificar a seqüência da região variável quimérica para diminuir a imunogenicidade em humanos, desde que pelo menos uma CDR de primata do Novo Mundo seqüência não seja modificada.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de em que o primata do Novo Mundo é selecionado dentre o grupo consistindo de sagüis, tamarins, macaco esquilo, macaco japuçá, macaco cuatá, macaco lanudo, macaco cebo, uakaris, sagüis, macaco da noite ou coruja e o macaco gritador.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o primata do Novo Mundo é um sagüi.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga a um antígeno que é peptídeo, proteína, carboidrato, glicoproteína, lipídeo ou glicolipídeo na natureza, selecionado dentre um antígeno associado com tumor incluindo antígeno carcinoembriônico, receptores EpCAM, Lewis-Y, Lewis- Y/b, PMSA, CD20, CD3Q, CD33, CD38, CD52, CDl54, EGF-R, Her-2, TRAIL e VEGF, um antígeno envolvido em uma doença ou distúrbio imune ou inflamatória incluindo CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC classe I, MHC classe II, GM-CSF, interferon-γ, IL-1, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-α, e IgE, um antígeno expressado em uma célula hospedeira incluindo glicoproteína Ilb/IIIa, P-glicoproteína, receptores purinérgicos e receptores de adesão, incluindo CDl la, CDl lb, CDl lc, CD18, CD56, CD58, CD62 ou CD144, um antígeno compreendendo uma citocina, quimiocina, fator de crescimento ou outro modulador fisiológico solúvel ou um receptor do mesmo incluindo eotaxina, IL-6, IL-8, TGF- P, C3a, C5a, VEGF, NGF e seus receptores, um antígeno envolvido nas doenças ou distúrbios do sistema nervoso central incluindo β-amilóide e príons, um antígeno de origem não humana como antígenos microbianos, nanobiais ou virais ou toxinas incluindo proteína F do vírus sincicial respiratório, toxina de antrax, veneno de cascavel e digoxina.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga a TNF a.

29. Anticorpo quimérico ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 28.

30. Kit, caracterizado pelo fato de compreender um anticorpo quimérico ou porção de ligação de antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, ou uma composição farmacêutica do mesmo, acondicionamento e instruções para uso.