BRPI0707425A2 - construção de anticorpo de domìnio, molécula isolada de ácido nucleico, composição farmacêutica, e, métodos para detectar tnf-alfa humano em uma amostra, e para tratar um distúrbio - Google Patents

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Benjamin P Woolven
Ian M Tomlinson
Jennifer A Lee
Philip Anthony Jennings
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Abstract

CONSTRUçãO DE ANTICORPO DE DOMINIO, MOLéCULA ISOLADA DE áCIDO NUCLEICO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, METODOS PARA DETECTAR TNF-ALFA HUMANO EM UMA AMOSTRA E PARA TRATAR UM DISTURBIO A presente invenção fornece uma construção de anticorpo de domínio que se liga a TNF-<244>humano, a construção compreendendo: (a) um anticorpo de domínio (dAb) que se liga a TNF-<244> humano; (b) uma sequência modificada de região de articulação; (c) uma sequência de região constante de cadeia pesada de humano ou primata tendo um domínio C~H~1 truncado de não mais do que 20 resíduos, em que dita sequência modificada de região de articulação contém ou uma deleção ou uma única substituição de aminoácido de pelo menos um resíduo de cisteina que normalmente facilita formação de ligação dissulfeto entre cadeias pesadas e leves de anticorpos.

Description

"CONSTRUÇÃO DE ANTICORPO DE DOMÍNIO, MOLÉCULAISOLADA DE ÁCIDO NUCLÉICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,E, MÉTODOS PARA DETECTAR TNF-A HUMANO EM UMAAMOSTRA, E PARA TRATAR UM DISTÚRBIO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a uma construção de anticorpode domínio útil para terapia em humanos. Mais particularmente, a presenteinvenção se refere a uma construção de anticorpo de domínio que se liga aTNF-α humano e seu uso no tratamento de distúrbios distinguidos poratividade de TNF-a.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é uma citocina que foiimplicada em mediação de choque e na patofisiologia de uma variedade dedoenças e distúrbios humanos incluindo sepse, infecções, doenças autoimunespor exemplo artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa e outrascondições intestinais, psoríase, choque tóxico, rejeição de transplante edoença enxerto versus hospedeiro. TNF-α é produzido primariamente pormacrófagos e linfócitos T ativados, mas também por neutrófilos,queratinócitos endoteliais e fibroblastos durante reações inflamatórias agudas.
Por causa de seu papel em inflamação, TNF-α emergiu comoum importante alvo para inibição em esforços para reduzir os sintomas dedistúrbios inflamatórios. Várias abordagens para inibição de TNF-α para otratamento clínico de doença foram perseguidas, incluindo particularmente ouso de receptores solúveis de TNF-α e anticorpos específicos para TNF-α.
Anticorpos de domínio
Anticorpos de domínio (dAb) são as menores unidades deligação em funcionamento de anticorpos e correspondem às regiões variáveisdas cadeias ou pesadas (Vh) ou leves (Vl) de anticorpos. Anticorpos dedomínio têm um peso molecular de aproximadamente 13 kDa, ou menos doque um décimo do tamanho de um anticorpo completo.
Em contraste com anticorpos convencionais, anticorpos dedomínio são bem expressos em sistemas bacterianos, de levedura e demamífero. Seu pequeno tamanho permite quantidades molares superiores porgrama de produto, assim fornecendo um aumento significante em potênciapor miligrama de dose. Em adição, dAbs podem ser usados como blocos deconstrução para criar produtos terapêuticos tal como moléculas contendo dAbde múltiplo direcionamento nas quais dois ou mais dAbs se ligam a dois oumais alvos moleculares distintos, ou dAbs podem ser incorporados emestruturas concebidas para administração pulmonar ou oral.
Os presentes requerentes desenvolveram agora uma novaconstrução de anticorpo de domínio compreendendo um domínio variável deimunoglobulina ligado a uma região constante incluindo um domínio ChItrancado. E postulado que a inclusão de uma região constante irá auxiliar aprolongar a meia-vida in vivo do dAb a qual é tipicamente de uma curtaduração.
Imunoglobulina de Primatas do Novo Mundo
Primatas evolutivamente distantes, tal como primatas do NovoMundo são suficientemente similares a humanos para ter anticorpos similaresa anticorpos humanos de forma que o hospedeiro não gera uma respostaimune anti-anticorpo quando tais anticorpos derivados de primatas sãointroduzidos em um humano. Primatas do Novo Mundo (infra-ordem-Platyrrhini) compreendem pelo menos 53 espécies comumente divididas emduas famílias, a Calliticricidae e Cebiiiae. Os Callithriciciae consistem demicos e sagüis. A Ceblciae inclui o macaco-de-cheiro, zogue-zogue, macaco-aranha, macaco-barrigudo, macaco-prego, macaco-da-noite ou macaco-corujae o guariba.
Estudos prévios caracterizaram o repertório de cadeia pesadade imunoglobulina do mico Callithrix jacchus (von Budingen I-C et al.,Characterization of the expressed immunegkibulin IGHV repertoire in theNew World marmoset Callithrix jacchus. Irnintmogenetics; 53;557-563(2001)). Seis subgrupos de IGHV foram identificados que mostraram um altograu de similaridade de seqüência com suas contra-partes humanas de IGHV.
As regiões de arcabouço foram mais conservadas quando comparadas com asregiões de determinação de complementaridade (CDRs), com o maior grau devariabilidade localizado em CDR3. O grau de similaridade entre seqüênciasIGHV de C facchus e de humano foi menor do que entre macacos do VelhoMundo e humanos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece umaconstrução de anticorpo de domínio que se liga a TNF-α humano, aconstrução compreendendo:
(a) um anticorpo de domínio (dAb) que se liga a TNF-ahumano
(b) uma seqüência modificada de região de dobradiça;
(c) uma seqüência de região constante de cadeia pesada dehumano ou primata tendo um domínio ChI trancado de não mais do que 20resíduos, mais preferivelmente não mais do que 10 resíduos, ainda maispreferivelmente não mais do que 5 resíduos e ainda mais preferivelmente umúnico resíduo;
caracterizada pelo fato de que dita seqüência modificada deregião de dobradiça contém ou uma deleção ou uma única substituição deaminoácido do resíduo de cisteína que, normalmente facilita formação deligação dissulfeto entre cadeias pesadas e leves de anticorpos.
Em um segundo aspecto a presente invenção fornece umaseqüência de ácidos nucleicos codificando a construção de anticorpo dedomínio do primeiro aspecto da invenção.
Em um terceiro aspecto a presente invenção fornece umamolécula isolada de ácido nucleico compreendendo uma seqüênciacodificando de uma construção de anticorpo de domínio que se liga a TNF-ahumano, caracterizada pelo fato de que molécula de ácido nucleicocompreende uma seqüência de ácidos nucleicos pelo menos 60%,preferivelmente pelo menos 80% idêntica, mais preferivelmente pelo menos90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência apresentada em SEQ10 No:50 ou SEQ ID No:51 e mais preferivelmente, a seqüência apresentadaem SEQ ID No:50 ou SEQ ID No:51.
Em um quarto aspecto a presente invenção fornece umamolécula isolada de ácido nucleico compreendendo uma seqüênciacodificando uma construção de anticorpo de domínio que se liga a TNF-ahumano, caracterizada pelo fato de que molécula de ácido nucleicocompreende uma seqüência de ácidos nucleicos que hibridiza em condiçõesde alta estringência com a seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ113 N0:50 ou SEQ ID No:51.
Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz da construção deanticorpo de domínio de acordo com o quinto aspecto, junto com umcarreador ou diluente farmaceuticamente aceitável,
Em um sexto aspecto, a presente invenção sustenta o uso daconstrução de anticorpo de domínio de acordo com o quinto aspecto dainvenção em uma aplicação diagnostica para detectar TNF-α humano.
Em um sétimo aspecto, a invenção fornece um método paratratar um distúrbio distinguido por atividade de TNF-α humano em um sujeitohumano, compreendendo administrar ao sujeito uma composiçãofarmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID No:5) ede nucleotídeos (SEQ ID No:6) do dAb aceptor.Figura 2 mostra a estrutura das formas de realização preferidasda construção de anticorpo de domínio de acordo com a presente invençãocomo (A) um monômero e (B) um dímero.
Figura 3 mostra as seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de onze (11) segmentos de gene Vk de mico e seis (6) demacaco-coruja.
Figura 4 mostra a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeosde dAb aceptor (ambas as fitas). Os sítios de digestão com enzima de restriçãopara Kpn I e San DI que remove região incluindo a CDR2 é indicado nafigura. Resíduos de CDR2 removidos são indicados sublinhados.
Figura 5 mostra a capacidade de Composto 170 (SEQ IDNo: 11) de neutralizar citotoxicidade mediada por TNF-α em um ensaio deviabilidade de célula L929 murina.
Figura 6 mostra que Composto 170 (SEQ ID No:ll) previne ainteração de TNF-α com os receptores de TNF p55 ou p75 humanos.
Figura 7 mostra que marcação de Composto 170 (SEQ IDNo:l 1) de células NSO 27D4 expressando TNF-α transmembrana (linha pretasólida) mostra maior intensidade de fluorescência do que controle isotipo-pareado de especificidade irrelevante (preenchimento cinza),
Figura 8 mostra que Composto 170 (SEQ IDNo: 11) produzidoem um sistema de expressão bacteriano manteve ligação a TNF-α em umELISA.
Figura 9 mostra a eficácia de Composto 170 (SEQ ID No:I 1)em um modelo de artrite murina mediada por TNF em relação a IgGi humanacom controle de especificidade. Em intervalos semanais camundongos forampontuados (escore artrítico), A, e pesados, B.
Figura 10 mostra o efeito em expressão protéica de Composto112 (SEQ ID No:59) e Composto 170 (SEQ ID No:l 1).
Figura 11 mostra análise SDS PAGE não redutora de6
Composto 170 purificado por Proteína A (SEQ ID No: 11) a partir de 4 χfermentações de 10 L da linhagem celular líder; linha 1 = controle intra-ensaio; linha 2 = marcadores de peso molecular; linha 3 = branco; linha 4=Composto 170 purificado por Proteína A (SEQ No: 11) em fermentação deIOL ID (série 1); linha 5 = Composto 170 purificado por Proteína A emfermentação de IOL ID (série 2); linha 6 = Composto 170 purificado porProteína A em fermentação de IOL ID (série 3); linha 7 = Composto 170purificado por Proteína A em fermentação de IOL ID (série 4).
Figura 12 mostra análise SDS PAGE redutora de Composto170 purificado por Proteína A (SEQ. ID No:l 1) a partir de 4 χ fermentaçõesde 10 L da linhagem celular líder; linha I = controle intra-ensaio; linha 2 =marcadores de peso molecular; linha 3 = branco; linha 4 = Composto 170purificado por Proteína A (SEQ ID No: 11) em fermentação de IOL ID (série1); linha 5 = Composto 170 purificado por Proteína A em fermentação de IOLID (série 2); linha 6 = Composto 170 purificado por Proteína A emfermentação de 10L ID (série 3); linha 7 Composto 170 purificado porProteína A em fermentação de 10L ID (série 4).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os presentes requerentes geraram uma construção de anticorpode domínio que se liga a TNF-α humano e que é postulada exibir baixaimunogenicidade quando administrada a humanos. A construção de anticorpode domínio compreende uma porção correspondendo a um domínio variávelde uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina (isto é um anticorpo dedomínio (dAb)), uma região de dobradiça e uma porção correspondendo auma região constante de uma cadeia pesada de anticorpo mas caracterizadapelo fato de que a região constante tem um domínio ChI truncado
A inclusão da porção de região constante é postulada aumentara meia vida in vivo do dAb assim como fornecer funções efetoras que,acredita-se, sejam um componente do mecanismo antiinflamatório deanticorpos anti-TNF.
Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece umaconstrução de anticorpo de domínio que se liga a TNF-α humano, aconstrução compreendendo:
(a) um anticorpo de domínio (dAb) que se liga a TNF-ahumano
(b) uma seqüência modificada de região de dobradiça;
(c) uma seqüência de região constante de cadeia pesada dehumano ou primata tendo um domínio Ch 1 truncado de não mais do que 20resíduos, mais preferivelmente não mais do que 10 resíduos, ainda maispreferivelmente não mais do que 5 resíduos e ainda mais preferivelmente umúnico resíduo;
caracterizada pelo fato de que dita seqüência modificada deregião de dobradiça contém ou uma deleção ou uma única substituição deaminoácido do resíduo de cisteína que normalmente facilita formação deligação dissulfeto entre cadeias pesadas e leves de anticorpos.
Em uma forma de realização preferida a seqüência do domíniocH ι e a região de dobradiça é XEPKSZDKTIITCPPCPA caracterizada pelofato de que X é valina, leucina ou isoleucina e Z é ausente ou umaminoácido outro do que cisteína. É preferido que X seja valina e Z sejaserina.
Em uma forma de realização preferida da presente invenção odAb compreende um domínio variável de cadeia pesada ou leve deimunoglobulina, caracterizado pelo fato de que dito domínio variávelcompreende pelo menos uma região determinante de complementaridade(CDR) tendo uma seqüência derivada de um primata do Novo Mundocaracterizada pelo fato de que a CDR é selecionada a partir do grupoconsistindo de YAATKLQS (SEQ ID No:l), YEASSLQS (SEQ ID No:2),YEASKLQS (SEQ ID No:3), e YSASNLET (SEQ ID No:4)Em outra forma de realização preferida a CDR é CDR2.Em uma forma de realização preferida o dAb tem umaseqüência selecionada a partir do grupo consistindo de:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQ WWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 145; SEQ ID No:7);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQ VV WRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 123; SEQ. ID No:8);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFLTISSLLPEDFATYYCQQWWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 100; SEQ ID No:9);
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYCQQ VV WRPFTIGQGTKVElKR (Composto 196; SEQ ID No: 10);DIQMTQSPSSILSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQ WWRPFTFGQGTKVEIKR (Composto 134; SEQ ID No:52);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQ WWRPFIPGQGTKVEIKR (Composto 137; SEQ ID No:53);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVP SRF S GS GS GTDFTLTIS S L VPEDF AT YYCQQ V V WRPFTFGQGTKVETKR (Composto 121; SEQ ID No:54); e
uma seqüência pelo menos 95%, mais preferivelmente pelomenos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma destas seqüências.
Em uma forma de realização adicionalmente preferida a regiãoconstante compreende domínios CH2 e CH3 que juntos têm a seguinteseqüência:PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKE YKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSPGK; (SEQ ID NO:63)
ou uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 60%,preferivelmente pelo menos 80% idêntica, mais preferivelmente pelo menos90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a esta.
Em outra forma de realização preferida a construção deanticorpo de domínio compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelomenos 60%, preferivelmente pelo menos 80% idêntica, mais preferivelmentepelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11, e mais preferivelmente à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
O termo "se liga a" como usado neste lugar, é pretendido parase referir à ligação de um antígeno por uma região variável de imunoglobulinacom uma constante de dissociação (Kd) de ΙμΜ ou menos se medida poranálise de ressonância de plasmônio de superfície usando, por exemplo umsistema de ressonância de plasmônio de superfície de BlAcorem e aplicativocomputacional de avaliação cinética de BlAcorem (por exemplo versão 2.1). Aafinidade ou constante de dissociação (Kd) para uma interação de ligaçãoespecífica é preferivelmente de cerca de 500 nM ou menos, maispreferivelmente cerca de 300 nM ou menos e preferivelmente pelo menos 300nM a 50 pM, 200 nM a 50 pM, e mais preferivelmente pelo menos 100 nM a50 pM, 75 nM a 50 pM, 10 nM a 50 pM. O termo "dAb" como usado nestelugar se refere a um polipeptídeo de domínio variável único de anticorpo (VHou VL) que se liga especificamente a um antígeno.
Em uma forma de realização adicionalmente preferida dapresente invenção a construção de anticorpo de domínio forma um homo- ouheterodímero com outra construção de anticorpo de domínio de acordo com apresente invenção. Dimerização pode aumentar a força de ligação deantígeno, caracterizada pelo fato de que a força de ligação é relacionada àsoma das afinidades de ligação dos múltiplos sítios de ligação. Para facilitarformação de dímero, a região de dobradiça da construção de anticorpo dedomínio compreende pelo menos um, e preferivelmente dois, resíduos decisteína.
Em uma forma de realização particularmente preferida dapresente invenção, a construção de anticorpo de domínio forma umhomodímero com uma construção de anticorpo de domínio idêntica.
Por conseguinte em outro aspecto a presente invenção forneceuma construção dimérica de anticorpo de domínio que se liga a TNF-ahumano caracterizada pelo fato de que o dímero consiste de duas construçõesde anticorpo de domínio de acordo com a presente invenção.
E preferido que a construção dimérica de anticorpo de domínioseja um homodímero e é particularmente preferido que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreenda uma seqüênciade aminoácidos que é pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 80%idêntica, mais preferivelmente pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou99% idêntica à seqüência apresentada em SEQ ID NO: 11, e maispreferivelmente à seqüência apresentada em SEQ ID No:11.
Em um segundo aspecto a presente invenção fornece umaseqüência de ácidos nucleicos codificando a construção de anticorpo dedomínio do primeiro aspecto da invenção.
Em um terceiro aspecto a presente invenção fornece umamolécula isolada de ácido nucleico compreendendo uma seqüênciacodificando de uma construção de anticorpo de domínio que se liga a TNF-ahumano, caracterizada pelo fato de que molécula de ácido nucleicocompreende uma seqüência de ácidos nucleicos pelo menos 60%,preferivelmente pelo menos 80% idêntica, mais preferivelmente pelo menos90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência apresentada em SEQTD No:50 ou SEQ 10 N0:51 e mais preferivelmente, à seqüência apresentadaem SEQ ID No:50 ou SEQ ID No:51.
Em um quarto aspecto a presente invenção fornece umamolécula isolada de ácido nucleico compreendendo uma seqüênciacodificando de uma construção de anticorpo de domínio que se liga a TNF-ahumano caracterizada pelo fato de que molécula de ácido nucleicocompreende uma seqüência de ácidos nucleicos que hibridiza em condiçõesde alta estringência com a seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ IDNo:50 ou SEQ ID No:51.
Para determinar se duas seqüências de polipeptídeos caem ounão dentro dos limites de identidade percentual, aqueles versados na arteestarão cientes de que é necessário conduzir uma comparação lado a lado oualinhamento múltiplo de seqüências em tais comparações ou alinhamentos,irão surgir diferenças no posicionamento de resíduos não idênticos,dependendo do algoritmo usado para realizar o alinhamento. No presentecontexto, referência a uma 'identidade percentual' ou 'similaridade' entre duasou mais seqüências de aminoácidos deve ser adotada para se referir aonúmero de resíduos idênticos ou similares respectivamente, entre ditasseqüências se determinado usando qualquer algoritmo padrão conhecido poraqueles versados na arte. Por exemplo, identidades ou similaridades deseqüência de aminoácidos podem ser calculadas usando o programa GAP e/oualinhadas usando o programa PILEUP do Computer Genetics Group, Inc.,University Research Park, Madison, Wisconsin, United States of America(Devereaux et al., 1984). O programa GAP utiliza o algoritmo de Needlemanand Wunsch. (1970) para maximizar o número de resíduos idênticos/similarese para minimizar o número e comprimento de lacunas de seqüência noalinhamento. Alternativamente ou em adição, caracterizado pelo fato de quemais do que duas seqüências de aminoácidos estão sendo comparadas, oprograma Clustal W de Thompson et al, (1994) é usado.
Para determinar se duas seqüências de nucleotídeos caem ounão dentro destes limites de porcentagem, aqueles versados na arte estarãocientes de que é necessário conduzir uma comparação lado a lado oualinhamento múltiplo de seqüências. Em tais comparações ou alinhamentos,podem surgir diferenças no posicionamento de resíduos não idênticos,dependendo do algoritmo usado para realizar o alinhamento. No presentecontexto, referência a uma identidade percentual entre duas ou maisseqüências de nucleotídeos deve ser adotada para se referir ao número deresíduos idênticos entre ditas seqüências se determinada usando qualqueralgoritmo padrão conhecido por aqueles versados na arte. Por exemplo,seqüências de nucleotídeos podem ser alinhadas e sua identidade calculadausando o programa SESTI-Tr ou outro programa apropriado do ComputerGenetics Group, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, UnitedStates of America (Devereaux et al, Nucl. Acids Res., 12:337-395, 1984).
Alta estringência preferivelmente envolve hibridização emcondições de 65°C e O5IxSSC {IxSSC =0,15 M de NaCl, 0,015 M de Citratode Na3 pH 7,0}.
Em uma forma de realização, a invenção é adicionalmentebaseada em um método para amplificação de genes de região variável deimunoglobulina de primatas do Novo Mundo, por exemplo por reação emcadeia da polimerase (PCR) a partir de ácido nucleico extraído de linfócitosde primatas do Novo Mundo usando iniciadores específicos para famílias degene de região variável de cadeia pesada e leve. Por exemplo, informaçãoreferente aos limites dos domínios variáveis de genes de cadeia pesada e leve(VH e Vl respectivamente) pode ser usada para conceber iniciadores de PCRque amplificam o domínio variável de uma seqüência de codificação decadeia pesada ou leve clonada codificando um anticorpo conhecido por seligar a um dado antígeno. A região variável amplificada é então inserida ousozinha ou como uma fusão com outra seqüência de polipeptídeos para aseqüência de região constante de humano ou primata da invenção em umvetor de expressão adequado para produção da construção de anticorpo dedomínio da invenção. Vetores de expressão adequados serão familiares paraaqueles versados na arte.
O repertório de VH, Vl e domínios de região constante podeser um repertório naturalmente ocorrente de seqüências de imunoglobulina ouum repertório sintético. Um repertório naturalmente ocorrente é umpreparado, por exemplo, a partir de células expressando imunoglobulinacoletadas a partir de um ou mais primatas. Tais repertórios podem ser naiveisto é preparados a partir de células expressando imunoglobulina de recém-nascido, ou rearranjados isto é preparados a partir de, por exemplo, células βde primata adulto. Se desejado, clones identificados a partir de um repertórionatural, ou qualquer repertório que se ligue ao antígeno alvo são entãosujeitos a mutagênese e triagem adicional a fim de produzir e selecionarvariantes com características de ligação melhoradas.
Repertórios sintéticos de domínios variáveis deimunoglobulina únicos são preparados introduzindo artificialmentediversidade em um domínio variável clonado.
Um repertório de domínios Vh e Vl pode ser triado paraespecificidade de ligação e comportamento funcional desejados, por exemplopor apresentação em fagos. Métodos para a construção de bibliotecas deapresentação em bacteriófagos e bibliotecas de expressão de lambda fagos sãobem conhecidos na arte. A técnica de apresentação em fagos foi descritaextensivamente na arte e exemplos de métodos e compostos para gerar e triartais bibliotecas e amadurecer por afinidade os produtos destes podem serencontrados em, por exemplo, Barbas et at. (1991) PNAS 88:7978-7982;Clarkson et al, (1991) Nature 352:624-628; Dower et al. PCT. 91/17271,Patente US No. 5.427.908, Patente US No. 5.580.717 e Patente Européia527,839; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Garrad et al.(1991) Bio/Tcchnology 9.: 13731377; Garrard et at. PCT WO 92/09690; Gramet al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Griffiths et al. (1993) EMBO .1 12:725-734; Griffiths et at. Patente US No. 5.885.793 e Patente Européia 589.877;Hawkins et al. (1992) J Mel Biel 226:889-896; Hay et al. (1992) HumAntibod Hybridomas 3:81-85: Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res19:4133-4137; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Knappik et al.(2000) .1 Mol Biel 296:57-86; Knappik et al. PCT WO 97/08320; Ladner etal. Patente US No. 5.223.409, No. 5.403.484, No. 5.571.698, No. 5.837.500 ePatente Européia 436.597; McCafferty et al. (1990) Nature 348;552:554;McCafferty et al. PCT. WO 92/01047, Patente US No. 5.969.108 e PatenteEuropéia 589.877; Salfeld et at PCT WO 97/29131, Pedido Provisório dePatente US No. 60/1.26.603; e Winter et al. PCT WO 92/20791 e PatenteEuropéia 368.684.
Bibliotecas recombinantes expressando o repertório dedomínios Vh e VL> podem ser expressas na superfície de microorganismos porexemplo levedura ou bactérias (veja publicações de PCT WO 99/36569 e98649286).
A construção de anticorpo de domínio da invenção pode serproduzida por meios recombinantes, incluindo a partir de sistemaseucarióticos de expressão incluindo, por exemplo, células de levedura, vegetalsuperior, inseto e mamífero, assim como fungos e sistemas de expressãocodificados viralmente, como descrito neste lugar ou como conhecido na arte.
As construções de anticorpo de domínio da presente invençãopodem ser preparadas usando um anticorpo S codificando ácido nucleicopara fornecer plantas transgênicas e células vegetais cultivadas (porexemplo, mas não limitado a tabaco e milho) que produzam taisconstruções nas partes vegetais ou em células cultivadas a partir destas.Como um exemplo não limitante, folhas de tabaco transgênicoexpressando proteínas recombinantes foram usadas com sucesso parafornecer grandes quantidades de proteínas recombinantes, por exemplo,usando um promotor induzível (veja, por exemplo, Cramer et al., Curr.Top. Microbiol. Immunol. 240:95-118 1999) e referências citadas nestes.
Também, milho transgênico foi usado para expressar proteínas de mamíferosem níveis de produção comercial, com atividades biológicas equivalentesàquelas produzidas em outros sistemas recombinantes ou purificados a partirde fontes naturais (veja, por exemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol.464:127-147 1999 e referências citadas nestes). Anticorpos também foramproduzidos em grandes quantidades a partir de sementes de plantastransgênicas incluindo fragmentos de anticorpo, tal como anticorpos de cadeiaúnica (scFv's), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata (veja, porexemplo, Conrad et at, Plant Mot. Biol. 38:101-109 1998 e referência citadaneste). Assim, as construções de anticorpo de domínio da presente invençãotambém podem ser produzidas usando plantas transgênicas, de acordo commétodos conhecidos (veja também, por exemplo, Fischer et al., Biotechnol.Appl. Biochern. 30;99-108 October, 1999: Ma & Hein., Trends Biotechnot,13:522-7 1995; Ma et al., Plant Physioi, 109:341-6 1995; Whitelam et al.,Biochem, Soe. Trans. 22:940-944 1994; e referências citadas nestes; cadauma das referências acima é totalmente incorporada neste lugar porreferência).
As construções de anticorpo de domínio da presente invençãoincluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentosquímicos sintéticos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partirde um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, células de levedura,vegetal superior, inseto e mamífero. Dependendo do hospedeiro empregadoem um procedimento de produção recombinante, as construções de anticorposda presente invenção podem ser glicosiladas ou podem ser não glicosiladas,com glicosiladas preferidas. Tais métodos são descritos em muitos manuaisde laboratório padrão Sambrook, et ai., Molecular Cloning: A LaboratoryManai, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N,Y, 1989, Sections 17,37-17A2;Ausubcl et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology 1987-1993,Chapters IO, 12, 13, 16, 18 and 20, Colligan et al., Current Protocols inProtein Science, Joint Wiley & Sons, NY, N.Y. 1997-2001, Protein Science,Chapters 12-14, todos totalmente incorporados neste lugar por referência.
Em um sistema de expressão a biblioteca de peptídeo/proteínarecombinante é apresentada em ribossomos (por exemplos veja Roberts, RWand Szostak, LW: 1997 Proo,Natl.Acad.Sci,USA. 94:12297-423202 ePublicação de PCT No. W098/31700). Assim outro exemplo envolve ageração e transcrição in vitro de uma biblioteca de DNA (por exemplo, deanticorpos ou derivados preferivelmente preparados a partir de célulasimunizadas mas não dessa maneira limitado), tradução da biblioteca de formaque a proteína e mRNAs "imunizados" permaneçam no ribossomo, seleção deafinidade (por exemplo, por ligação a RSP), isolamento de mRNA, traduçãoreversa e subseqüente amplificação (por exemplo por reação em cadeia dapolimerase ou tecnologia relacionada). Ciclos adicionais de seleção eamplificação podem ser acoplados se necessário para maturação de afinidadeatravés de introdução de mutação somática neste sistema ou por outrosmétodos de maturação de afinidade como conhecido no estado da arte.
Outro exemplo vislumbra a aplicação de tecnologia decompartimentalização de emulsão para a geração dos anticorpos de domínioda invenção. Em compartimentalização de emulsão, métodos de classificaçãoin vitro e óticos são combinados com co-compartimentalização de proteínatraduzida e sua seqüência de codificação de nucleotídeos em fase aquosadentro de uma gota oleosa em uma emulsão (veja publicações de PCT no'sWO 99/026711 e WO 00/40712).
As seqüências de CDR podem ser obtidas a partir diversasfontes, por exemplo, bancos de dados tal como bancos de dados de proteínas enucleotídeos do National Centre for Biotechnology Informationwww.n.cbi.nlin.nih.gov, O banco de dados de Kabat de seqüências deProteínas de Interesse Imunológico www.kabatdatabase.com, ou o banco dedados de IMGT wwwdmo.cinestr. Alternativamente, as regiões CDR podemser previstas a partir do Vn e repertório de domínios (veja por exemplo RabatEA and Wu Tr Attempts to locate complementarity determining residues inthe variable positions of light and heavy chains. Ann. NY Acad. Sei. 190:382-393 (1971)). A seqüência de CDR pode ser um DNA genômico ou um cDNA.
Há diversas maneiras nas quais uma CDR de substituição podeser enxertada em uma seqüência de região variável e tais métodos serãofamiliares para aqueles versados na arte. O método preferido da presenteinvenção envolve substituição da CDR2 na região variável (ou d Ab) atravésde mutagênese dirigida por iniciador. Este método consiste de anelar umoligonucleotídeo sintético codificando uma(s) mutação(ões) desejada(s) auma região alvo onde ele serve como um iniciador para iniciação de síntesede DNA in vitro, prolongando o oligonucleotídeo por uma DNA polimerasepara gerar um DNA dupla fita que carrega a mutação desejada, e ligando eclonando a seqüência em um vetor de expressão apropriado.
Em uma forma de realização preferida da presente invenção, aseqüência de CDR de primata do Novo Mundo é enxertada em uma seqüênciade região variável que é de baixa imunogenicidade em humanos.
Por referência ao termo "baixa imunogenicidade " é pretendidoque a construção de anticorpo de domínio ou porção de ligação de antígenodesta, não produza uma resposta de anticorpo em um humano de, magnitudesuficiente para reduzir a efetividade de administração continuada daconstrução de anticorpo de domínio por um tempo suficiente para atingireficácia terapêutica.
Preferivelmente, a seqüência de região variável na qual a CDRde primata do Novo Mundo é enxertada é a "seqüência aceptora de dAb"(designada Composto 128), em Figura 1. A seqüência aceptora de dAbconsiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID No:5;DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYS ASELQSG VPSRF SGS GS GTDFTLTIS SLQPEDF ATYYCQQW WRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No:5).
Esta seqüência é codificada pela seqüência de nucleotídeosapresentada em SEQ ID No 16:
GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CPG TCT GCA TCTGTA GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAGAGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCAGGC AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAGTTC CAA AGT CGG GTC CCA TCA CCT TTC AGT GGC ACT GGATCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAACCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTGTGG CGT CCP TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG CTG GAAATC AAA CGG (SEQ ID No:6)
Em uma forma de realização preferida da presente invenção,uma seqüência de CDR de mico do Novo Mundo YSASNLET (SEQ IDNo:4) é enxertada na seqüência aceptora de dAb de região variável de forma asubstituir a seqüência de CDR2 (YSASELQS; SEQ ID No:55) da seqüênciaaceptora de dAb para produzir o seguinte dAb (designado Composto 145):
Composto 145
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYS ASNLETGVP SRF S GSGS GTDFTLTIS SLQPEDF ATYYCQQW WRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No:7);
Assim, em uma forma de realização preferida, o dAb daconstrução de anticorpo de domínio que se liga a TNF-α humano,compreende a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID No:7.Está dentro do escopo da presente invenção, que a seqüênciade região variável (dAb) da construção de anticorpo de domínio pode sersujeito adicional para maturação de afinidade a fim de melhorar suacaracterísticas de ligação de antígeno. Isto pode necessitar a modificação decertos resíduos de aminoácidos dentro de CDRl, CDR3 ou arcabouço daconstrução de anticorpo de domínio,
Por exemplo, SEQ ID No:7 foi maturada por afinidade comoapresentado nos Materiais e Métodos e testada para ligação de TNF-α. Emuma forma de realização adicionalmente preferida, a região variável (dAb) daconstrução de anticorpo de domínio que se liga a TNF-α humano,compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No:8 ou SEQ ID No:9.Estas foram designadas Composto 123 e Composto 100 respectivamente, esuas seqüências são mostradas abaixo:
Composto 123
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQ WWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ. ID No:8)
Composto 100
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFLTISSLLPEDF ATYYCQQ WWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No:9).
Em uma forma de realização particularmente preferida, aregião variável (dAb) da construção de anticorpo de domínio que se liga aTNF-α humano compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No: 10.Esta foi designada Composto 196 e a seqüência é fornecida abaixo:
Composto 196
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYCQQ WWRPFTTGQGTKVEIKR (Composto 196; SEQ ID No: 10).Será percebido por pessoas versadas na arte que a seqüência deregião constante da construção de anticorpo de domínio pode ser derivada deseqüências de humano ou de primata. A seqüência de primata pode serseqüência de primata do Novo Mundo ou de um primata do Velho Mundo.
Primatas do Novo Mundo adequados incluem chimpanzé, ou outro macacohominídeo por exemplo gorila ou orangotango, os quais por sua íntimaproximidade filogenética com humanos, compartilham um alto grau dehomologia com a seqüência de região constante humana. Preferivelmente, aregião constante é derivada de uma seqüência de anticorpo humana.Exemplos de tais seqüências podem encontrados em bancos de dados deproteínas e nucleotídeos do National Centre for Biotechnology Informationwww.ncbi.nlm.nihgov, e no Banco de Dados de Kabat de seqüências deProteínas de Interesse Imunológico www.kabatdatabase.com, ou no banco dedados de MGT www.imgt.cines.fr.
Para conceber a construção de anticorpo de domínio dapresente invenção, os requerentes truncaram o domínio ChI da regiãoconstante (Fe). Um número mínimo de resíduos de domínio ChI forammantidos a fim de fornecer flexibilidade na construção de anticorpo dedomínio ao redor da região de dobradiça. Preferivelmente, pelo menos 20resíduos de aminoácidos C-terminais do domínio ChI são mantidos, maispreferivelmente pelo menos 10 aminoácidos, ainda mais preferivelmente pelomenos 5 aminoácidos, ainda mais preferivelmente um único resíduo deaminoácido.
Assim, em uma forma de realização preferida,, a construção deanticorpo de domínio tem um formato compreendendo dAb-resíduo dedomínio Chl C terminal-região de dobradiça-domínio CH2-domínio CH3como ilustrado esquematicamente em Figura 2.
Em uma forma de realização particularmente preferida, aconstrução de anticorpo de domínio tem a seqüência de aminoácidosapresentada em SEQ ID No:l 1, Esta foi designada Composto 170.Composto 170
DIQMTQSP S SL S AS VGDRVTITCRAS Q AIDS YLH WYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYCQQ WWRFTFGQGTK VEIKRVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTFEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKE YKYSNALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCKKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKHSLSLSPGK (SEQID No: 11)
A região de dobradiça da imunoglobulina naturalmenteocorrente contém uma cadeia lateral de cisteína (C) que facilita a formação deuma ligação dissulfeto entre o domínio Chi da cadeia pesada e o domínioconstante da cadeia leve. Pelo fato da construção compreender apenas umúnico domínio variável e assim deixar um resíduo cisteína não pareadopotencialmente reativo, o resíduo de cisteína foi substituído por um resíduo deaminoácido que previne formação de ligação dissulfeto. As conseqüênciaspotenciais de ter uma cisteína não pareada podem incluir expressão protéicareduzida devido à agregação e desnaturação da construção.
Deve ser entendido que qualquer seqüência de região dedobradiça derivada de qualquer das classes de anticorpo seria apropriada parauso na presente invenção. Entretanto, é preferido que a região de dobradiçaseja derivada da subclasse de anticorpo IgGt. Preferivelmente, a região dedobradiça é baseada na seqüência naturalmente ocorrente da região dedobradiça de WI e compreende a seqüência EPKSSDKTHTCPPCPA (SEQID NO: 12). Nesta seqüência, a Cys que normalmente ocorre em posição 5 ésubstituída pelo resíduo de Ser em negrito sublinhado.
Preferivelmente, o resíduo de aminoácido C-terminal dodomínio ChI é derivado de IgGI. Mais preferivelmente, o resíduo de CrI éum resíduo de valina (V) ou uma substituição conservativa de aminoácido talcomo leucina, (L) ou isoleucina (1). Este resíduo está localizadoimediatamente ao lado da região de dobradiça e auxilia a aumentar aflexibilidade da construção ao redor da região de dobradiça.
Seqüências dos domínios CH2 e CH3 são preferivelmentederivadas de banco de dados de Swissprot número de acesso POl857:PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCYWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKE YKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSSPGK (SEQ ID No:63).
A construção de anticorpo de domínio pode ser derivada ouligada à outra molécula funcional. Por exemplo, a construção de anticorpo dedomínio pode ser funcionalmente ligada por acoplamento químico, fusãogenética, associação não covalente ou de outra maneira, a uma ou mais outrasentidades moleculares, tal como outro anticorpo, um agente detectável, umagente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo quepode mediar associação do anticorpo ou porção de ligação de anticorpo comoutra molécula (tal como uma região de core de estreptavidina ou umaetiqueta de poliistidina).
Agentes detectáveis úteis com os quais a construção deanticorpo de domínio pode ser derivada incluem compostos fluorescentes.Agentes detectáveis fluorescentes exemplares incluem fluoresceína,isotiocianato de fluoresceína, rodamina, 5-dimetilamina-l-nafitalenosulfonilcloreto, ficoeritrina e os semelhantes. A construção de anticorpo de domíniotambém pode ser derivada com enzimas detectáveis tal como fosfatasealcalina, peroxidase de rábano, glicose oxidase e os semelhantes. Quando aconstrução de anticorpo de domínio é derivada com uma enzima detectável,ela é detectada adicionando reagentes adicionais que a enzima usa paraproduzir um produto de reação detectável. A construção de anticorpo dedomínio também pode ser derivada com biotina, e detectada através demedida indireta de ligação de avidina ou estreptavidina.
A construção de anticorpo de domínio de acordo com ainvenção pode ser ligada a uma ou mais moléculas que fornecem meia-vidaaumentada e resistência à degradação sem perda em atividade (por exemploafinidade de ligação) in vivo. Estas moléculas podem ser ligadas à construçãode anticorpo de domínio através de um ligante de forma que elas nãointerferem/impedem estericamente o sítio de ligação de antígeno. Estasmoléculas adutoras incluem por exemplo dAbs dirigidos para uma moléculaendógena como descrito em pedido de Patente US 20D50271663.
Tipicamente, tais moléculas adutoras são polipeptídeos ou fragmentos depolipeptídeos que ocorrem naturalmente in vivo e que resistem à degradaçãoou remoção por mecanismos endógenos. Moléculas que aumentam meia vidapodem ser selecionadas a partir das seguintes:
(a) proteínas da matriz extracelular., por exemplo colágeno,luminina, integrina e fibronectina;
(b) proteínas encontradas no sangue, por exemplo fibrina a-2macroglobulina, albumina de soro, fibrinogênio A, fibrinogênio B, proteínaamilóide de soro A, heptaglobina, proteína , ubiquitina, uteroglobulina, β-2rnicroglobulina, plasminogênio, lisozima, cistatina C, alfa-l-antitrisina einibidor de tripsina pancreática;
(c) proteínas imunes de soro, por exemplo IgE, IgG, IgM;
(d).proteínas de transporte, por exemplo, proteína de ligaçãode retinol, α-1 rnicroglobulina;
(e) defensinas, por exemplo beta-defensina 1, defensinas deneutrófilo 1, 2 e 3;
(f) proteínas encontradas na barreira sangüínea encefálica ouem tecidos neurais, por exemplo receptor de melanocortina, mielina,transportador de ascorbato;
(g) proteínas de fusão de ligante específico de receptor detransferrina-agente neurofarmacêutico (veja Patente US 5977307); receptor decélula endotelial capilar de cérebro, transferrina, receptor de transferrina,receptor fator de crescimento tipo insulina 1 (KW 1), receptor fator decrescimento tipo insulina 2 (TOP 2), receptor de insulina;
(h) proteínas localizadas no rim, por exemplo policistina,colágeno tipo IV, transportador de ânion orgânico Kl, antígeno de Heymann;
(i) proteínas localizadas no fígado, por exemplo álcooldesidrogenase, 0230;
(j) fator de coagulação do sangue X.
(k) antitripsina;
(l)HNF I cx;
(m) proteínas localizadas no pulmão, por exemplo componentesecretor (se liga a IgA);
(n) proteínas localizadas no coração, por exemplo HSP 27;
(o) proteínas localizadas na pele, por exemplo, queratina;
(p) proteínas específicas de osso, tal como proteínasmorfogênicas de osso (BMPs) por exemplo, BMP-2, -4, -5, -6, -7 (tambémreferida como proteína osteogênica (0P-1) e -8 (OP-2);
(q) proteínas específicas de tumor, por exemplo antígeno detrofoblasto humano, receptor de herceptina, receptor de estrogênio, catepsinaspor exemplo catepsina B (encontrada em fígado e baço);
(r) Proteínas específicas de doença, por exemplo antígenosexpressos apenas em células T ativadas: incluindo LAG-3 (gene de ativaçãode linfócito), ligante de osteoprotegerina (OPGL) veja Kong YY et al Nature(1999) 402, 304-309, 0X40 (um membro da família de receptor TNF,expresso em células T ativadas e na única de célula T co-estimuladoraconhecida por ser especificamente aumentada em células produtoras de vírusde leucemia tipo I de célula T humana (HTLV-I)) Veja Pankow 23 R. et al I.Immunol, (2000) Jul l;165(0;263-70; Metaloproteases (associadas comartrite/cânceres), incluindo CG6512 Drosophila, paraplegina humana, FtsHhumano, AFG3L2 humano, ftsH murino; fatores de crescimento angiogênico,incluindo fator de crescimento de fibroblasto ácido (FGF-1), fator decrescimento de fibroblasto básico (FGF-2), Fator de crescimento endotelialvascular / fator de permeabilidade vascular (VEGF/VPF), fator decrescimento de transformação-a (TGF a), Fator de Necrose Tumoral-alfa(TNF-α), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), fator de10 crescimento endotelial derivado de plaqueta (PD-ECGF), fator de crescimentoplacentário (PIGF), fator de crescimento derivado de plaqueta ligado aheparina-BB (PDGF), fractalcina;
(s) proteínas de estresse (proteínas de choque térmico); e(t) proteínas envolvidas em transporte de Fc.
A presente invenção também se estende a uma construção deanticorpo de domínio PEGuilado que fornece meia-vida aumentada eresistência à degradação sem uma perda em atividade (por exemplo afinidadede ligação) em relação a polipeptídeos de anticorpo não PEGuilado.
A construção de anticorpo de domínio pode ser acoplada,usando métodos conhecidos na arte, a moléculas de polímero (preferivelmentePEG) úteis para atingir as propriedades de meia-vida aumentada e resistênciaà degradação. Unidades de polímeros que podem ser utilizadas na invençãopodem ser sintéticas ou naturalmente ocorrentes e incluem, mas não limitadoa polialquileno de cadeia linear ou ramificada, polímeros de polialcenileno oupolioxialquileno, ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado tal comoum homo ou heteropolissacarídeo. Exemplos preferidos de polímerossintéticos que podem ser usados na invenção incluem poli(etilenoglicol)(PEG) de cadeia linear ou ramificada, poli(propilonoglicol), ou álcoolpolivinílico) e derivados ou formas substituídas destes, Polímeros substituídosparticularmente preferidos para ligação com a construção de anticorpo dedomínio incluem PEG substituído, incluindo metóxi(polietilenoglicol).Unidades de polímeros naturalmente ocorrentes que podem ser usadas emadição a ou em lugar de PEG incluem lactose, amilose, dextrina, ouglicogênio, assim como derivados destes que seriam reconhecidos por pessoasversadas na arte.
As moléculas de polímero (PEG) úteis na invenção podem seracopladas à construção de anticorpo de domínio usando métodos que são bemconhecidos na arte. A primeira etapa no acoplamento de PEG ou outrasunidades de polímeros com a construção de anticorpo de domínio da invençãoé a substituição dos grupos terminais de hidroxila do polímero PI30 porgrupos funcionais contendo eletrófilo. Particularmente, polímeros PEG sãoacoplados a resíduos ou de cisteína ou lisina presentes nos monômeros oumultímeros de construção de anticorpo de domínio. Os resíduos de cisteína elisina podem ser naturalmente ocorrentes, ou podem ser manipulados namolécula de construção de anticorpo de domínio.
Peguilação das construções de anticorpo de domínio dainvenção pode ser realizada por qualquer número de meios (veja por exemploKozlowski-A & Barris-JM (2001) Journal of Controlled Release 72:217).PEG pode ser acoplado à construção de anticorpo de domínio ou diretamenteou por um ligante interveniente. Sistemas sem ligante para acoplarpolietilenoglicol a proteínas é descrito em Delgado et (1992), Cit. Rev. Them.Drug Carrier Sys. 9:249-304; Francis el at., (1998), Intern. 3. Hematol. 68:1-18; Patente US 4.002.531; Patente US 5.349.052: Patente Internacional95/06058; e Patente Internacional 98132466, as descrições de cada um dosquais são incorporadas neste lugar por referência.
Um sistema para acoplar polietilenoglicol diretamente aresíduos de aminoácidos de proteínas sem um ligante interveniente empregaMPEG tresilado, que é produzido pela modificação de mortometlioxipolietilenoglicol (MPEG) usando cloreto de tresila. Seguindo reação deresíduos de aminoácidos com MPEG tresilado, polietilenoglicol é diretamenteacoplado aos grupos amina. Assim, a invenção inclui conjugados de proteína-polietilenoglicol produzidos por proteínas reativas da invenção com umamolécula de polietilenoglicol tendo um grupo sulfonila 2,2,2-trifluoroetano.
Polietilenoglicol também pode ser acoplado a proteínas usandodiversos ligantes intervenientes diferentes. Por exemplo, Patente US5.612.460 descreve ligantes de uretano para conectar polietilenoglicol aproteínas. Conjugados proteína-polietilenoglicol caracterizados pelo fato deque o polietilenoglicol é acoplado à proteína por um ligante também podemser produzidos por reação de proteínas com compostos tal como MPEG-succinimidiilsuccinato, MPEG ativado com Ι,Γ-carbonildiimidazol, MPEG-2,4,5-tricloropenilcurbonato, MPEG-pnitrofenolcarbonato, e vários derivadosde MPEG-succinato. Diversos derivados adicionais de polietilenoglicol equímicas de reação para acoplar polietilenoglicol a proteínas são descritos emPatente Internacional 98/32466, a descrição inteira da qual é incorporadaneste lugar por referência.
Em uma forma de realização particularmente preferida dapresente invenção a construção de anticorpo de domínio é acopladadiretamente a polietilenoglicol através de um resíduo de lisina. Em outraforma de realização ainda preferida da presente invenção, a construção deanticorpo de domínio é acoplada diretamente a PEG através de um resíduo decisteína. O resíduo de cisteína não pareado pode pré-existir na seqüência,pode ser adicionado incorporando um resíduo de cisteína, por exemplo, notérmino C da construção de anticorpo de domínio. Alternativamente,acoplamento do PEG à construção de anticorpo de domínio pode serfacilitado através de uma cisteína ligada por dissulfeto tal como aqueladescrita em Patente US 20060210526.
Outras formas derivadas de moléculas de polímeros incluem,por exemplo, derivados que têm unidades ou grupos reativos adicionaispresentes nestas para permitir interação com resíduos de aminoácidos dasconstruções de anticorpo de domínio descritas neste lugar. Tais derivadosincluem ésteres ativos de N-hidroxilsuccinimida (NHS), polímeros de succinimidil propionato, e agentes reativos seletivos par sulfidrila tal comomaleimida, vinil sulfona, e tiol. Polímeros de PEG podem ser moléculaslineares, ou podem ser ramificadas caracterizadas pelo fato de que múltiplasunidades de PEG estão presentes em um único polímero.
O grupo reativo (por exemplo, MAL, NHS, SPA, VS, ou tiol)pode ser acoplado diretamente ao polímero de PEG ou pode ser acoplado aPEG através de uma molécula ligante.
O tamanho de polímeros úteis na invenção pode ser nointervalo de 500 Da a 60 kDa, por exemplo, entre 1000 Da e 60 kDa, 10 kDae 60 kDa, 20 kDa e 60 kDa, 30 kDa e 60 kDa, 40 kDa e 60 kDa, e até entre 50kDa e 60 kDa. Os polímeros usados na invenção, particularmente PEG,podem ser polímeros de cadeia linear ou podem possuir uma conformaçãoramificada.
Em uma forma de realização adicional, a construção deanticorpo de domínio de acordo com o quinto aspecto pode ser multimerizada,como por exemplo, hetero- ou homodímeros, hetero- ou homotrímeros, heteroou homotetrâmeros, ou hetero- ou homomultímeros de ordem superior.Multimerização pode aumentar a força de ligação de antígeno, caracterizadapelo fato de que a força de ligação é relacionada à soma ou às afinidades deligação dos múltiplos sítios de ligação.
Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de a construção deanticorpo de domínio de acordo com o quinto aspecto, junto com umcarreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Um "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer etodos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti-bacterianos e antifungicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção, e ossemelhantes que são fisiologicamente compatíveis. Exemplos de carreadoresfarmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, salina, salinatamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, e os semelhantes assimcomo combinações destes. Em muitos casos será preferível incluir agentesisotônicos, por exemplo, açúcares, poli-álcoois tal como manitol, sorbitol, oucloreto de sódio na composição. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis talcomo pequenas quantidades de substâncias auxiliares tal como agentesumectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões.
A composição pode estar em uma variedade de formas,incluindo formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tal comosoluções líquidas (por exemplo soluções inaláveis, injetáveis e infusíveis),dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomos esupositórios. Preferivelmente, a composição está na forma de uma soluçãoinjetável para imunização. A administração pode ser intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intra-peritoneal, ou intramuscular.
Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis eestáveis nas condições de fabricação e armazenamento. As composiçõespodem ser formuladas como uma solução, microemulsão, dispersão,lipossomo, ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração dedroga. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida por exemplo,por uso de um revestimento tal como lecitina e/ou tensoativos. Soluçõesinjetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo (istoé construção de anticorpo de domínio) na quantidade requerida em umsolvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes listadosacima, seguido por esterilização filtrada.
A composição também pode ser formulada como um pó estérilpara a preparação de soluções injetáveis estéreis.Em certas formas de realização, o composto ativo pode serpreparado com um carreador que irá proteger o composto contra liberaçãorápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindoimplantes, emplastros transdérmicos, e sistema de liberação5 microencapsulada. Polímeros compatíveis podem ser usados tal como etilenovinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres eácido poliláctico.
A composição também pode ser formulada para administraçãooral. Nesta forma de realização, a construção de anticorpo de domínio podeser embutida em uma cápsula de gelatina de invólucro duro ou mole,compreendida em comprimidos, ou incorporada diretamente na dieta dosujeito.
Formulações que permitem administração pulmonar, retal,transdérmica; intratecal e intraocular serão familiares para pessoas versadasna arte.
Compostos ativos suplementares também podem serincorporados na composição. A construção de anticorpo de domínio pode serco-formulada com e/ou co-administrada com um ou mais agentes terapêuticosadicionais por exemplo receptor de TNF-α solúvel ou um agente químico queinibe produção de TNF-α humano, ou anticorpos que se ligam a outros alvostal como citocinas ou moléculas de superfície celular. Alternativamente, ILpode ser co-administrado como um reagente imunoquímico solúvel tal comoproteína A, C. G ou L.
Uma quantidade eficaz pode incluir uma quantidadeterapeuticamente eficaz ou quantidade profilaticamente eficaz da construçãode anticorpo de domínio da invenção. Uma quantidade terapeuticamenteeficaz se refere a uma quantidade eficaz em dosagens e por períodos de temponecessários, para atingir o resultado terapêutico desejado. A quantidadeprofilaticamente eficaz se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e porperíodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático desejado.Devido ao fato de uma dose profilática ser administrada a um sujeito antes deou em um estágio anterior de doença, a quantidade profilaticamente eficazpode ser menor do que a quantidade terapeuticaménte eficaz.
Em um sexto aspecto, a presente invenção sustenta o uso daconstrução de anticorpo de domínio de acordo com o quinto aspecto dainvenção em uma aplicação diagnostica para detectar TNF-α humano.
Por exemplo, a construção de anticorpo de domínio anti-TNF-α humano de acordo com a invenção pode ser usada para detectar TNF-ahumano por exemplo em uma amostra biológica, tal como soro ou plasmausando um imunoensaio convencional, tal como um ensaio imunoenzimático(ELISA), a radioimunoensaio (RIA) ou imuno-histoquímica de tecido. Aconstrução de anticorpo de domínio anti-TNF-α humano de acordo com ainvenção pode ser ensaiada em fluidos biológicos por um imunoensaio decompetição usando padrões de TNF-α humano recombinante marcados comuma substância detectável e um anticorpo anti-TNF-α humano não marcado.
A construção de anticorpo de domínio anti-TNF-α humano deacordo com a invenção também pode ser usada para detectar TNF-α deespécies outra do que humanos tal como primatas não humanos incluindomacaco-caranguejeiro, chimpanzé, mico, rhesus e outras espécies tal comocachorro, rato, camundongo, coelho, gato, porco, bovino.
A construção de anticorpo de domínio anti-TNF-α humano deacordo com a invenção também pode ser usada em aplicações de culturacelular onde é desejado inibir atividade de TNF-α.
Em um sétimo aspecto, a invenção fornece um método paratratar um distúrbio distinguido por atividade de TNF-α humano em um sujeitohumano, compreendendo administrar ao sujeito uma composiçãofarmacêutica de acordo com o segundo aspecto da invenção.
Um distúrbio distinguido por atividade de TNF-α humano épretendida incluir doenças e outros distúrbios nos quais a presença de TNF-αem um sujeito sofrendo do distúrbio mostrou ser ou é suspeita de ser ouresponsável pela patofisiologia do distúrbio ou um fator que contribui para apiora do distúrbio. Preferivelmente, o distúrbio distinguido por atividade deTNF-α humano é selecionada a partir do grupo consistindo de inflamação,doenças inflamatórias, sepse, incluindo choque séptico, choque endotóxico,sepse gram negativa e síndrome de choque tóxico; doença autoimune,incluindo artrite reumatóide, artrite juvenil, espondilite reumatóide,espondilite anquilosante, síndrome de Sjogren, osteoartrite e artrite gotosa,alergia, esclerose múltipla, diabete autoimune, uveíte autoimune, psoríase,síndrome penfigóide e nefrótica; condições inflamatórias do olho, incluindodegeneração macular, uveíte, doença; doença infecciosa, incluindo febre emialgias devido à infecção e caquexia secundária à infecção; doença enxertoversus hospedeiro; crescimento de tumor ou metástase, malignidadeshematológicas; distúrbios pulmonares incluindo asma, síndrome dodesconforto respiratório adulto, pulmão de choque, doença inflamatóriapulmonar crônica, sarcoidose pulmonar, fibrose pulmonar e silicose;distúrbios inflamatórios de intestino incluindo doença de Crohn e coliteulcerativa; distúrbios cardíacos, insuficiência cardíaca congestiva; distúrbiosvasculares incluindo doença de Wegener, artrite de células gigantes;distúrbios inflamatórios ósseas, distúrbios de sistema nervoso central tal comomal de Alzheimer; distúrbios de sistema nervoso periférico tal como ciática,hepatite, distúrbios de coagulação, queimaduras, lesão de reperfusão,endometriose, formação de quelóide e formação de tecido cicatrizado.
Em uma forma de realização particularmente preferida, odistúrbio distinguido por atividade de TNF-α humano é degeneração macularrelacionada à idade. TNF-α, está implicado em estimular produção de VEGFe promover neovascularização no olho (Oh-H et al., 1999 InvestigativeOphthalmology & Visual Science 40:1891-98), e portanto inibidores deatividade de TNF-α, tal como as construções de anticorpo de domíniodescritas neste lugar, seriam úteis para terapia de distúrbios ocularesrelacionados à angiogênese incluindo degeneração macular relacionada àidade.
Ao longo deste relatório a palavra "compreendem", ouvariações tal como ''compreende" ou "compreendendo", será entendidaimplicando a inclusão de um elemento determinado, número inteiro ou etapa,ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão dequalquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos,números inteiros ou etapas.
Todas as publicações mencionadas neste relatório são nestelugar incorporadas por referência. Qualquer discussão de documentos, atos,materiais, dispositivos, artigos ou os semelhantes que foram incluídos nopresente relatório é apenas para o propósito de fornecer um contexto para apresente invenção. Não deve ser admitido que qualquer ou todas estasmatérias formem parte da base de arte anterior ou tenham sido deconhecimento geral comum no campo relevante para a presente invençãocomo existiram em Austrália ou qualquer outro lugar antes da data deprioridade de cada reivindicação deste pedido.
A fim de que a natureza da presente invenção possa ser maisclaramente compreendida, formas preferidas desta serão agora descritas comreferência aos seguintes exemplos não limitantes.
EXEMPLO 1
Materiais e Métodos
Isolamento de genes Vl de primatas do Novo Mundo
DNA genômico de mico (gênero Callithrix, espéciedesconhecida) e macaco-coruja (Aotus trivirgatus) foram obtidos a partir daEuropean Collection of Cell Cultures (ECACC), números de catálogo85011419 e 90110510 respectivamente. DNA de mico foi derivado delinhagem celular B95-8 enquanto que DNA de macaco-coruja veio delinhagem celular OMK 637-69.
Iniciadores degenerados baseados em seqüências líderes de Vke seqüências sinal de recombinação (RSS) foram derivados de Walter andTomlinson, Antibody Engineering: A Practical Approach (1996). Osiniciadores usados para amplificação de DNA de Vk de linhagem germinativaforam como segue:
Iniciador VKlBL
AATCKCAGCMCCAGATG (SEQ ID No: 13)
Iniciador VK1BL3 5a
GTTYROGTKKGTAACACT (SEQ ID NO: 14)
Iniciador VKlBL35ab
ATGMCTTGTWACACTGTG (SEQ. ID No: 15)
PCR (30 ciclos) foi realizado usando Tag polimerase ou compar de iniciadores VKlBLxVKlBL35a ou VKlBLxVKlBL35b. Houve umasobreposição entre as seqüências clonadas e os dois conjuntos de iniciadoresusados.
Produtos genômicos de PCR foram clonados em kit declonagem TOPO TA de Invitrogen (Cat No K4500-00 e seqüenciados cominiciadores M13 Direto e pUC Reverso. Seqüência foi confirmada emdireções direta e reversa. A fim de confirmar adicionalmente seqüênciaschave não foram sujeitas a erros de PCR, o PCR e processo de clonagem foirepetido duas vezes para seqüências de mico. Nucleotídeo (SEQ ID Nos: 16-26 e SEQ lD.Nos:38-43) e aminoácido (SEQ ID Nos:27-37 e SEQ IDNos;44-49) são dados em Figura 3. Seqüências de mico 1 , 2 e 3 foramconfirmadas. Seqüências 4, 5, 6, 7 e 8 foram vistas apenas no PCR inicial.Seqüências 9, 10 e 11 foram vistas apenas no PCR e clonagem repetido (iesegundo).
Oligo Síntese e Clonagem em Seqüência AceptoraQuatro seqüências de CDR, em outras palavras YAATKLQS(SEQ. ID No: 1) de seqüência de macaco-coruja 1 (SEQ ID No:44),YEASSLQS (SEQ ID No:2) de seqüência de macaco-coruja 2 (SEQ No:45),YEASKLQS (SEQ ID No:3) de seqüência de mico 1 (SEQ ID No:27), eYSASNLET (SEQ ID No:4) de seqüência de mico 2 (SEQ ID No:28), foramescolhidas a partir das seqüências de aminoácidos mostradas em Figura 3.Seqüência de macaco-coruja 5, YYASSLQS (SEQ ID No:56) foi encontradasendo idêntica a GI6176295 uma seqüência de cDNA de Aotus nancymane(macaco-coruja de Ma), todas as outras seqüências foram únicas.
A seqüência de região variável aceptora (anticorpo de domínioanti-TNF) no vetor de expressão (vetor de propriedade de Domantis) foidigerida (25 μg) seqüencialmente com Kpnl e SanDI o que remove a maioriade FR2 assim como CDR2 como indicado no mapa de digestão por restrição,Figura 4. O vetor foi então purificado em gel para remover a seqüência tiposelvagem de FR2 e CDR2 excisada.
Oligo anelamento foi realizado incubando oligo pares (500pmol, baseado em seqüências mostradas em Figura 3) a 95°C por 5 minutosseguido por 65°C por 5 minutos e então permitido para atingir temperaturaambiente lentamente em um bloqueio térmico. Sobreposições foram entãopreenchidas durante uma reação de Klenow na presença de d.NTPs.Clonagem molecular do DNA de dupla fita sintético (derivado por oligoanelamento e preenchimento de extremidade) na seqüência de região variávelaceptora foi atingida usando métodos padrão.
Maturação de afinidade
O dAb Composto 145 enxertado com CDR de mico (SEQ IDNo:7) foi maturado por afinidade construindo 14 bibliotecas separadas, cadauma diversificação da seqüência de SEQ ID No:7 em um único resíduo deaminoácido. Os resíduos selecionados são mostrados sombreados abaixo.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSLDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQ VV WRPFTFGQGTKVEIKR
A seleção foi baseada em resíduos em CDRl e CDR3 que sãoconhecidos por serem diversificados no repertório de Ig humana madura, eresíduos de arcabouço que foram observados produzindo proteínas funcionaisde pois de mutagênese em dAbs relacionados. Para cada um dos resíduosselecionados, pares de iniciador de PCR direto e reverso complementaresforam concebidos com degenerescência de NKK, e duas reações iniciais dePCR foram realizadas cada uma com um único iniciador mutagênico einiciador flanqueador. Depois de limpeza, os dois produtos de PCR foramanelados e então amplificados usando iniciadores flanqueadores apenas(processamento por extensão sobreposta de PCR; Lowman H.L. & Clackso-nT. (cds), Phagc Display: A practical approach, Oxford University Press ,Oxford, UK). Clones foram inicialmente triados por ELISA usando TNF defase sólida, e clones positivos foram seqüenciados. Proteína de dAb foipurificada a partir dos melhores clones e avaliada para potência em ensaios deligação de receptor e ensaios de citotoxicidade de L929. Compostos 100 (SEQID No:9) e 123 (SEQ No:8) foram encontrados tendo neutralização de TNFmelhorada em relação ao dAb parental, Composto 145 (SEQ ID No:7).
Combinação das substituições que aumentam afinidade deCompostos 100 e 123, produziu um dAb anti-TNF com potênciaadicionalmente melhorada no ensaio de citotoxicidade de L929 (Composto196; SEQ ID No: 10).
Cultura Celular
Células CHOKl SV (Lonza Biologies, UN), uma variante emsuspensão de CHOK1, foram mantidas em fase de crescimento logarítmicoem meio CD CHO suplementado com 6 mM de L-glutamina (Invitrogen CatNos. 10743-029 e 25030-081). Culturas foram incubadas a 36,5°C, 10% deCO2 e agitação a 140 rpm. 24 horas antes de transfecção número e viabilidadecelular foi verificado por exclusão de azul de tripano (Sigma Cat No. T8154)em um hemocitômetro. 8 χ 106 células viáveis foram peletizadas a 200 χ gpor 5 minutos e ressuspensas em 8 ml de meio CM25. (Lonza Biologies, UK)suplementado com 10% de soro fetal bovino dialisado inativado pelo calor(invitrogen Cat No. 26400-044) e 6 mM de L-glutamina. Células foramemplacadas a 500 μΐ por poço em uma placa de 24 poços e incubadas a36,5°C, 10% de C02.
3 horas antes de transfecção o Meio foi reabastecido com umaalíquota fresca de 500 μΐ de meio CM25 suplementado com 10% de soro fetalbovino dialisado inativado pelo calor e 6 mM de L. Glutamina.
Vetores de expressão
Seqüências gênicas para Composto 112 (SEQ ID No:50) eComposto 170 (SEQ ID No:51) foram otimizadas para expressão em célulade mamífero e sintetizadas.
Composto 112Composto 170
<formula>formula see original document page 39</formula>
Cada seqüência foi flanqueada na extremidade 5' com um sítioHind 111, uma seqüência Kozak (GCCACC; SEQ ID No:57) e uma seqüêncialíder kappa de Egt3 humano (seqüência de aminoácidosmsvrrQvi,GLILLWLTDA RC; SEQ 133 No:58). Na extremidade 3' doiscódons de parada e um sítio EcoR I foram adicionados a cada seqüência.Seguindo síntese genes foram fornecidos clonados em um vetor pCRScript(Stratagene) e foram liberados por digestão com Hind III / EcoR I no tampãode enzima de restrição apropriado (Roche Diagnostics Cat Nos.10656313001, 10703737001 e 1141707001 respectivamente). O vetor deexpressão GS pEE12.4 (Lonna Biologics, UK) foi similarmente digerido edesfosforilado usando fosfatase alcalina intestinal de bezerro RocheDiagnostics Cat No. 10713023001). Cada gene foi ligado no esqueleto depEE12.4 preparado usando o Sistema de Ligação de DNA LigaFast Rapid dePromega (Cat No. M8221). Ligações foram então transformadas em célulasOne Shot Top 10 quimicamente competentes (Invtrogen Cat No. C4040-03) ecolônias positivas identificadas por técnicas padrão. Grandes quantidades dosvetores resultantes (pF.E12A-PN0621 e pEE12.4-PN052( -SI I4C) forampreparadas por minipreparação de culturas noturnas usando colunas deminipreparação de QlAfilter (QIAgen Cat No. 12243). Vetores forampreparados para transfecção precipitando 20 μg em 100% de etanol com1/1 Ode volume de 3 M acetato de sódio (pH 5,2) (Sigma Cat Nos, E7023 e52889 respectivamente). Seguindo uma lavagem em 70% de etanol, vetoresforam ressuspensos em 40 μΐ de T.E. pH 8,0 (Sigma Cat No. T9285) em umaconcentração de utilização de 0,5 μ£/μ1.
Transfecção
Para cada transfecção 2 μΐ de Lipofectamina 2000 foiadicionado a 50 pi of Optitnem I media (Invitrogen Cat Nos. 11668-027 e31985-062) em um poço de uma placa de 96 poços. Em um segundo poço 1,6μl do vetor de expressão (0,8 μg) foi adicionado a 50 μΐ de meio Optimem 1.Seguindo uma incubação em temperatura ambiente por 5 minutos osconteúdos dos dois poços foram misturados juntos e deixados para umaincubação adicional de 20 minutos. Seguindo esta segunda incubação amistura de transfecção inteira foi adicionada a um poço na placa de 24 poçoscontendo as células CI-10K1SV. Células foram incubadas por pelo menos 72horas e sobrenadantes coletados. Sobrenadantes foram centrifugados a 4.000χ g por 5 minutos para peletizar fragmentos celulares e foram armazenados a -20°C até que expressão de Composto 112 (SEQ 111 No:59) e Composto 170(SEQ ID No:l 1) fosse ensaiada por ELISA de TNF.
Composto 112ELISA de TNF
Placas de microtítulo (por exemplo Sarstedt 82.9923-148)foram revestidas com uma solução de 1 μg/mL de TNF-α humanorecombinante (Peprotech Cat # 300-01 A) em tampão de revestimentocarbonato/bicarbonato pH 9,6, 100 μΙ7ροςο. Depois de incubação noturna a4°C, placas foram lavadas 3 vezes com PBS (0,01 M, pH 7,2) com 0,05% deTween 20, e 3 vezes com PBS. 200 pL de tampão de bloqueio (PBS com 1%de BSA [albumina de soro bovino, Sigma Cat # A-9647]) foi adicionado porpoço e incubado a 250C por 1 hora. Placas foram lavadas, como acima, epadrões de volumes de 100 \iL de amostra ou Composto 170 diluídos emdiluente de anticorpo (PBS com 1% de BSA e 0,05% de Tween 20) foramadicionados por poço. Depois de incubação por 1 hora a 25QC, placas foramlavadas, como acima, e volumes de 100 μΐ, de anticorpo secundário (anti-imunoglobulinas humanas de cabra conjugado a peroxidase, Zymed, Cat #81-7120) em diluição de 1:1000 em diluente de anticorpo foram adicionados porpoço. Placas foram lavadas e volumes de 100 μι de substrato ABTS (2,2'-Azino-bis(3-Etilbenz-Tiazolina-6-ácido sulfônico) sal diamônico, Sigma Cat# A-1888, 0,5 mg/mL em tampão citrato pH 4,4, com 0,03% de H2O2) foramadicionados por poço. Substrato foi desenvolvido por 30 minutos emtemperatura ambiente e absorbância lida em 405 nm (referência 620 nm).Concentrações de amostras foram determinadas em relação à curva padrão eforam expressas em relação à concentração média de Composto 112 expresso.
Resultados
Inclusão de ChI truncado
Inclusão do ChI truncado na construção de anticorpo dedomínio resulta em uma junção entre o domínio variável e dobradiça comhomologia mais alta para uma junção convencional de CrI -dobradiça de IgGi(91,7%) do que uma junção carecendo do ChI truncado (83,3%; calculadausando Align X em Vetor NTI (Invitrogen) com uma penalidade de aberturade lacuna de 1). Homologia aumentada é propensa a ser traduzida emsemelhança aumentada para seqüências peptídicas convencionais deimunoglobulina às quais pacientes humanos devem ser imunologicamentetolerantes, com isso reduzindo potencial imunogênico.
Seqüências:
Junção de região variável com ChI truncado-dobradiça de Composto 170:TKVEIKRVEPKS
Junção de CHl-dobradiça de IgGl (acesso de NCBI AAG00909):TKVDKRVEPKS
Junção de região variável-dobradiça de Composto 170 (CH1 truncadoausente): TKVEIKREPKS
Seqüência de ChI é sombreada como indicado.Domínio ChI (SEQ ID N0:60) obtido a partir de banco dedados de proteínas de NCBI (httn_://www.ncbi.nirn.nib.gov) AAG00909
<table>table see original document page 42</column></row><table>
Junção de CHl-dobradiça é indicada sublinhada.Neutralização de Citotoxicidade induzida por TNF-a
A capacidade do Composto 170 de construção de anticorpo dedomínio (SEQ No: 11) de neutralizar citotoxicidade mediada por TNF-α foiverificada usando um ensaio de viabilidade de célula L929 murina. Diluiçõesseriais de Composto 170 em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino(RPMI-FBS) foram preparadas em volumes de 50 μι volumes em placas de96 poços de fundo plano. A cada um destes poços foi adicionado 50 μΙ. deTNF-α humano recombinante (Strathmann Biotec, flamburg, Germany) emuma concentração de 360 pg/mL, seguido por 2,5x104 de células L929 em 50iL e 25 μΐ. de Actinomicina D a 40 μ§/πιΤ, todos preparados em RPMI-FBS.Controles incluíram poços sem nenhum TNP (para determinação de 100% deviabilidade), nenhuma célula (0% de viabilidade) e uma curva padrão deTNF-α variando de 2 pg/mL a 4200 pg/mL. Placas de cultura foram incubadasem uma atmosfera de 5% de C02 a 37"C por 20 horas, então por umas 3horas adicionais depois da adição de 25 μΙ, de 3- (4,5-dimetiltiazol-2il)-5-(3-carboxiincatoxifeni 1 )-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS)/etosulfato defenazina (PBS) (Promega CeilTiter 96 AQuemus One, Madison USA).Absorbância em 492 nm foi determinada contra um comprimento de onda dereferência de 630 nm e curvas de viabilidade foram plotadas usando valoresmédios calculados a partir de poços de teste em triplicata. A capacidadeneutralizante de TNF-α de Composto 170 é indicada aumentando viabilidadecelular com concentrações crescentes de Composto 170 (Figura 6).Neutralização de ligação de TNF-a a receptores de p55 e p75 humano
A capacidade do Composto 170 de construção de anticorpo dedomínio (SEQ ID No: 11) de inibir ligação de TNF-α a receptores de TNFp55 e p75 humano foi avaliada por ensaios de ligação de receptor. p55 (RnDsystems, Cat No: 372-RI) ou p75 (RnD systems, Cat No: 762R2) humano foi20 revestido em placas Maxisorb (Nuns) a 0,1 μg/mL em tampão derevestimento carbonato pH 9,2 por incubação noturna a 4 1C. Diluições seriaissemi-logarítmicas de Composto 170 variando de 100 μg/mL até 3,15 ng/mL(e um branco de controle sem Composto 170) foram preparadas em diluentede anticorpo (PBS pH 7,2, 0,05% de Tween-20, 1% de BSA) e forammisturadas com um volume igual de 60 ng/mL de TNF-α humano em diluentede anticorpo. Um branco não contendo nenhum PN0621 e nenhum TNF-αtambém foi preparado para medir ligação antecedente. Todas as misturasforam permitidas incubar por exatamente 1 hora em temperatura ambientecom agitação suave. Durante esta incubação as placas revestidas foramlavadas 3 vezes com PBS, 0,05% de Tween-20 e então 3 vezes com PBS. Asplacas foram então bloqueadas com 200 μΐ/poço de PBS, 1% de BSA por 45minutos em temperatura ambiente. Seguindo lavagem da placa, 100 μΐ dasmisturas de Composto 170/TNF-a foram adicionados a poços em triplicatapara cada concentração de Composto 170 testada junto com adição de todosos controles. A placa foi então incubada em temperatura ambiente por 1 hora.Seguindo lavagem da placa, um anticorpo anti-TNF-α humano biotinilado(WO Systems, Cat No: BAF2IO) foi adicionado a 0,6 μg/mL em diluente deanticorpo a cada poço e incubado por 1 hora em temperatura ambiente.
Seguindo lavagem um conjugado de Estreptavidina-HRP (Zymed, Cat No:434323) foi adicionado a 1:2000 em diluente de anticorpo e incubado emtemperatura ambiente por 45 min. Visualização foi realizada usando substratoTMB (Invitrogert, Cat No: 00-2023) parada com 1 M de HCl depois de 4minutos. Leituras de absorbância foram então medidas em 450 nm usandouma referência de 620 nm. Análise foi realizada calculando a absorbânciamédia das triplicatas. A média da ligação não específica (nenhum TNF-α) foisubtraída de cada valor de absorbância.
Os resultados são indicados em Figura 7 e mostram queComposto 170 previne a interação de TNF-α com os receptores de TNF p55 ep75 humano.
Ligação de TNF-α ligado a célula
Análise de ligação a TNF-α ligado a célula (trans membrana)foi realizada usando uma linhagem celular NS0, 27D4, estavelmentetransfectada com um gene codificando proteína TNF-α humana carecendo deum sítio de clivagem de TACE, de forma que TNF-α permanece associado àmembrana celular porque ele não pode ser clivado. Uma linhagem celularsimilar baseada em outro mieloma murino (SP2/0) foi descrita (Scatton et al„(1995) Cytokine 7 251-259).
Análise de citometria de fluxo foi realizada em 5 χ 105 células27D4 viáveis por amostra com todas as etapas realizadas a 4°C ou em gelo.Grânulos celulares foram ressuspensos com controle de teste (Composto 170;SEQ ID No: 11) ou isotipo-pareado de especificidade irrelevante (Sigma, CatNo: 15154) a 100 μg/ml em PBS contendo 2% de PBS, e incubados em gelopor 1 hora. Dois ciclos de lavagem celular foram realizados, compreendendocada, centrifugação por 10 minutos a 1000 χ g e ressuspensão do grânulocelular em PBS/2% de PBS. Seguindo outra etapa de centrifugação grânulocelular foi ressuspenso em 100 μΐ de conjugado de anticorpo secundário(conjugado Anti- Fc FITC humano, Sigma, Cat No: F9512) e incubado por 30min. As amostras foram então lavadas duas vezes como descrito acima egrânulos celulares ressuspensos em 500 μΐ de PBS/2%de PBS com 5 μg/mLde iodeto de propídio (Sigma, Cat no: P4864). Marcação fluorescente decélulas foi analisada em um citômetro de fluxo Beckman Coulter Cell LabQuanta e resultado foi processado usando WinMDL
Os resultados são indicados em Figura 8, e mostram quemarcação de Composto 170 de células NSO 27D4 expressando TNF-atransmembrana (linha preta sólida) mostra maior intensidade de fluorescênciado que controle isotipo-pareado de especificidade irrelevante (preenchimentocinza),
Criação de linhagens celulares expressando muito Composto 170Linhagens celulares estáveis de CHOKISV expressando
Composto 170 (SEQ ID No: 11) foram criadas usando o vetor de expressãodescrito nos Materiais e Métodos. Resumidamente 1 χ IO7 células em fase decrescimento logarítmico foram eletroporadas em meio livre de proteínaCDCHO livre de glutamina na presença de 40 μg de DNA de plasmídeolinearizado. 24 horas após transfecção uma pressão seletiva de 50 μΜ demetioninasulfoximina (Sigma) foi aplicada e células resistentes forampermitidas formar colônias em placas de 96 poços. Ao se aproximar deconfluência, colônias únicas foram transferidas para placas de 24 poços, T25e então frascos T75. Uma vez super confluentes em frascos T75 linhagenscelulares foram avançadas para cultura em frascos E125 Erlenmeyer eadaptadas para crescimento em suspensão divididas por 6 subculturas. Umavez adaptadas para crescimento em suspensão linhagens celulares foram crio-conservadas em uma mistura de congelamento de 92,5% de meioCDCH0:7,5% de DMSO.
Enquanto linhagens celulares estavam sendo expandidasatravés dos tamanhos diferenciais de poços e frascos, diversas verificações deprodutividade foram realizadas em paralelo ao progresso das linhagenscelulares para o próximo estágio. Assim nos estágios de placa de 24 poços efrasco E125 Erlenmeyer verificações de produtividade foram realizadas. Emcada caso células foram permitidas crescer por 14 dias e sobrenadantesavaliados pelo método de ELISA TNF descrito em Exemplo 1 para níveis deComposto 170. Linhagens celulares foram ranqueadas na produtividade e as10 maiores foram selecionadas para avaliação em uma verificação deprodutividade batelada-alimentada privada em Lanza Biologies.Produtividades obtidas foram entre 700 mg/L e 3371 mg/L. Uma linhagemcelular líder com uma produtividade de 2724 mg/L foi selecionada paraavaliação em fermentadores de escala laboratorial de 10 L.
Quatro fermentadores de escala laboratorial de 10 L separadosfuncionaram por 15 dias com a linhagem celular líder e um processo bateladaalimentado genérico privado baseado no meio CDCHO livre de proteína. Aprodutividade média resultante das 4 fermentações foi 4851 mg/L com amaior produtividade sendo 4925 mg/L (o maior nível registrado deprodutividade previamente registrada por Lanza Biologies para uma linhagemcelular não clonal em uma fermentação de 15 dias é 3560 mg/L). Osfermentadores de escala laboratorial de 10 L usados foram concebidos paraimitar as condições de fermentação encontradas em fermentadores de maiorescala de até 2000 L, portanto é esperado que a linhagem celular líder sejaadequada para fabricação em escala comercial. De fato níveis de expressãosimilares foram observados em um fermentador de 200 L.
Produto coletado das 4 χ fermentações de 10 L da linhagemcelular líder expressando Composto 170 (SEQ ID No:70) foi purificado porcromatografia de afinidade de Proteína A e analisado por SDS PAGE emcondições tanto redutoras como não redutoras. Como mostrado em Figura 11,Composto 170 é expresso como um monômero de aproximadamente 90 kDa.
Este monômero é composto de 2 subunidades de aproximadamente 40 kDaque estão aparentes em Figura 12 quando o SDS PAGE é corrido emcondições redutoras. Uma vez que SDS PAGE não é adequado paradimensionamento exato de proteínas análise adicional do monômeroComposto 170 foi realizada. ESI-MS (espectrometria de massa com ionizaçãopor eletropulverização) dimensionou o monômero Composto 170 em 78,739kDa. Isto está de acordo com o peso molecular previsto de 2 subunidades (2 χ38,058 -4: 76,116 kDa) cada uma das quais também carrega uma estrutura deaçúcar glucano bi-particulado de core fucosilado.
Meia-vida no soro longa em primatas não humanos
Composto 170 (SEQ ID No: 11) foi administradosubcutaneamente a macacos-caranguejeiros em doses de 0,5, 5 e 50 mg/kg, eamostras de sangue foram coletadas em 0,5 1, 2, 6 e 24 horas então em 1 dia,2, 4, 7, IOe 14 dias. Análise destas amostras para quantificação de níveis deComposto 170 foi realizada usando o método de ELISA anti-TNF descrito emExemplo 1. Meia-vida de eliminação foi determinada por análise dos níveisde Composto 170 nestas amostras. A 0.5 mg/Kg uma meia-vida de eliminaçãode 110,5 ± 13,9 horas foi calculada. A 5 Mg/Kg e 50 mg/Kg meias-vidas deeliminação de 110,9 ± 10,4 e 103,5 ± 11,5 horas foram calculadas.
Quando Composto 170 foi administrado por via intravenosa at50 mg/Kg amostras de sangue foram coletadas em 10, 30 e 60 minutos, 4 e 24horas, 2, 4, 7, 10 e 14 dias. Análise destas amostras para quantificação deníveis de Composto 170 foi realizada usando o método de ELISA anti-TNFdescrito em Exemplo 1. Meia-vida de eliminação foi determinada por análisedos níveis de Composto 170 nestas amostras. Seguindo administraçãointravenosa de 50 mg/Kg uma meia-vida de eliminação de 109,6 ± 10,7 horasfoi calculada.
Perfil de Segurança Favorável
Composto 170 (SEQ No; 11) fabricado para padrões de GAlPfoi avaliado em estudos de segurança e toxicologia animal.Segurança de dose única
Diferentes macacos administrados com doses únicas deComposto 170 a 0,5, 5 e 50 mg/kg por via subcutânea ou intravenosa deadministração não mostraram nenhum efeito relacionado a seu tratamentocom Composto 170, Nestes estudos avaliação microscópica de uma variedadede órgãos foi realizada e nenhum efeito foi observado.
Segurança de dose crescente e dose repetida
Começando com uma dose de 0,5 mg/kg dada ousubcutaneamente ou intravenosamente doses crescentes de até 50 mg/kgforam administrados a macacos-caranguejeiros a cada 7 dias. Animais foramverificados para uma ampla variedade de parâmetros fisiológicos ecomportamentais incluindo hematologia, química clínica, peso corporal e deórgão e inspeção macroscópica de órgãos seguindo necropsia. Ao longodestes estudos nenhuma reação adversa ao tratamento com Composto 170 foiregistrada. Seguindo a conclusão da fase de subida de dose de estudos aquelesanimais que receberam a dose crescente subcutaneamente foramadministrados com 4 doses adicionais de 50 mg/kg por um período adicionalde 4 semanas. Novamente nenhum efeito, ao longo da ampla variedade deparâmetros, relacionado ao tratamento com Composto 170 foi observado.Segurança cardiovascular
A segurança cardiovascular de Composto 170 a 50 mg/kg foiavaliada em macacos-caranguejeiros equipados com monitores deradiotelemetria. Estes monitores registram uma variedade de parâmetrosrespiratórios e cardiovasculares; diretamente dos macacos conscientes.Seguindo dosagem com Composto 170 nenhuma observação clínica adversarelacionada a tratamento foi registrada.
Expressão Bacteriana
Composto 170 (SEQ ID No: 11) em exemplos precedentes foiproduzido em sistemas de expressão de mamíferos. Composto Funcional 170também foi produzido usando um sistema de expressão bacteriano.
A seqüência de aminoácidos para Composto 170 menos a seqüência sinal foiretrotraduzida e otimizada por GeneOptimizermi para expressão em E. coli e sintetizada de nOVO emGoneArt GmbH. O gene sintetizado foi subclonado no vetor de expressãopBAD gTTI com etiqueta de His (Invitrogen) através de sítios de restriçãoNcol e HindIII (Roche) gerando um vetor pronto para expressão bacteriana.Células TOPlO (Invitrogen) foram transformadas com o vetor pelo método dechoque térmico e estoques de glicerol de colônias únicas gerados. Condiçõesde indução foram 0,002% de arabinose (Sigma;concentração final) e períodode 4 h de indução. Amostras protéicas de Composto 170 foram geradasusando o método de choque osmótico como detalhado no manual de sistemade expressão bacteriana em pBAD (Invitrogen). O ensaio BCA (Pierce) foiusado para determinar a concentração total de proteína das amostras.Composto 170 expresso bacterianamente foi ensaiado para ligação a TNF-aem um ELISA como descrito em Exemplo 1.
Figura 9 mostra que Composto 170 produzido em um sistemabacteriano manteve ligação a TNF-α em um ensaio ELISA.
A seqüência de DNA para expressão bacteriana de Composto170 é como segue:A seqüência de aminoácidos codificada por SEQ ID No:61 é
como segue:
Eficácia in vivo de Composto 170 em um modelo de artrite murinamediada por TNF humano
A linhagem transgênica de camundongo com TNF humano,Tg 197, mostra expressão desregulada de TNF e desenvolve poliartriteinflamatória crônica (Keefer, J. et, al. (1991) Transgenic mice expressinghuman tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBOJournal 10:4025-31). Administração de Composto 170 (SEQ ID No: 11)preveniu o desenvolvimento de artrite e perda de peso associada nestescamundongos (Figura IOA & Β).
Grupos de 8 Tg 197 heterozigotos (contendo cada 4 machos e 4fêmeas) foram tratados com injeções intraperitoneais bissemanais deComposto 170 e igGI humana de controle de especificidade irrelevante(palivizumabe (Synagis®), Medlmmune/Abbott) em PBS, ambos a 10 mg/kg.Tratamento começou quando camundongos estavam com 3 semanas de idade.Em intervalos semanais, camundongos foram pesados e pontuados (escoreartrítico) baseado em morfologia macroscópica de tornozelo (inchaço,distorção e grau de movimento).
Substituição de Cys em posição 114 em Composto 112 resulta em expressãoprotéica aumentada
Composto 112 (SEQ ID No: 59) é uma modificação deComposto 170 (SEQ ID No: 11) que contém um resíduo de cisteína emposição 114 ao invés de um resíduo de serina que está presente nesta posiçãoem Composto 170. O efeito de substituir cisteína 114 por serina em expressãoprotéica foi avaliado por comparação com Composto 170. Múltiplas Culturasde células hospedeiras transfectadas com construções gênicas para Composto112 e 170 foram ensaiadas para expressão protéica por ELISA com TNF defase sólida como especificado em Materiais e Métodos. Os resultados sãoespecificados em Figura 11.
Será percebido por pessoas versadas na arte que numerosasvariações e/ou modificações podem ser feitas à invenção como mostrado nasformas de realização específicas sem se afastar do espírito ou escopo dainvenção como amplamente descrito. As presentes formas de realização,portanto, devem ser consideradas em todos os respeitos como ilustrativas enão restritivas.LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA
<110> Peptech Cinrited
<120> Construção de anticorpo de domínio
<130> WJP GME 03 1411 5717
<160> 64
<170» patentin versão 3.3
<210> 1<211> S <2Í2> PRT
<213> Aotus trivirgatuS<400> 1
Tyr Ala Ala Thf Lys Leu 6"in Ser
<21Q> 2<í212> PftT
<213> Aotus t Hvirgatus<400* 2
Tyr Glu Ala ser Ser teu Glrv ser1 S
<2W> 3<211> 6<212 > IiRT
<213> Callithrix, espécie desconhecida<400> S
Tyr Glu Ata ser Lys teu Gln ser
<210> 4
<211> S .
<212 > PRT
<213> Callithrix, espécie desconhecida
<40&- 4
Tyr Ser Ala Ser Astt Leu Glu Thr1 S
c210s 5
<211> 108
<212> PRT
<Z13> Sintético
<400> 5
Asp He sln Ket Ttti' Glti s«r Pre ^er ser Leu Ser Ala Ser vai Glyl 5 10 15
Asp Arg Val Thr ϊΐό Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie aso s«?r Tyr20 25 30Leu His Trp Tyr GTn Glo Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45
TVr ser Ala ser Glu Leu Gln ser Gly vai Pro Ser Arg Phe ser GlySO 55 60
ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu ASP Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln çln Val vai Trp Arg Pro PheSS 90 95
Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys Arg100 105
<21Q> 6
<211> 324
<212> DNA
<213> Sintético
<400> 6
gacatccaga tgacccagtc tccatcctct ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattgat agttatrtac attggtacca gcagaaacca 120gggaaagccc cxaagctcct gatctatagt gcatccgágt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccaccagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324
■ <Z10> 7
<211> 108
<212> dd^
<213* Sintético
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser pro Ser ser Leu ser Ala ser Val Gly1 5 10 15
ASp Arg Val Tiir Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser He Asp Ser Tyr20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xle35 ' 40 45
Tyr Ser Ala ser Asn teu Glu Thr Gly vai Pro ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 SO
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln Val Val Trp Arg pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg100 105
<210> 8
<211> 108<212> PRT
<213> Sintético<400> 8
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro ser Ser Leu ser Ala ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg vai Thr lie Thr cys Arg Ala ser Glti Ala Ile Asp ser Tyr20 25 30 .
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45
Tyr ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly vai pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln vai Val Trp Arg Pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu ile Lys Arg100 105
<210> 9
<211> 108
<212> PRT
<213> Sintético
<400> 9
ASp Xle Gln Mec Thr Gln Ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala ser Gln Ser ile Asp ser Tyr20 25 30
Leu His Trp Tyr 6ln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Leu pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val vai Trp Arg Pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys Arg100 IOS
<210> 10<211> 108<212> PRT«c213> sintético<400> 10
Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro ser ser Leu ser Ala Ser vai GlyI S 10 IS
Asp Arg vai Thr ile Thr çys Arg Ala ser Gln Ala ile Asp ser Tyr20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45
Tyr ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly vai Pro ser Arg Phe ser Gly50 55 60
Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile ser ser Leu Leu Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr çys Gln Gln vai Val Trp Arg Pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 11<211> 341<212> PRT«213> Sintético
<400> 11
Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro ser ser Leu ser Ala Ser vai Gly1 5 10 15
Asp Arg vai Thr ile Thr cys Arg Ala ser Gln Ala ile Asp ser Tyr20 25 30
Leu Hi5 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Glv50 53 60
Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Leu Pro65 70 75 50Glu Asp phe Ala Tbr Tyr Tyr cys Gln Gln Val Val Trp Arg pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys yal Glu ile Lys Arg Val Glu Pro Lys100 105 110
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu115 120 125
Leu Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr130 IB5 140
Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu vai Thr Cys vai Val vai Asp vai145 150 155 160
ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly vai165 170 175
Glu vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn ser180 185 190
Thr Tyr Aro vai vai Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu195 200 205
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai ser Asn Lys Ala210 215 220
Leu Pro Ala
Pro ile Glu Lys Thr ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro225 230 235 240
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln245 250 255
Val Ser Leu Thr cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ilé Ala260 265 270
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr275 280 285
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu290 295 300
Thr Val Asp Lys ser Arg Trp Gln Glη Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser305 310 315 320
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser325 330 335
Leu ser Pro Gly Lys340<210> 12
<2ll> 16
<21Ζ> PHt
<213> Sintético
<400> 12
efu pro t-ys ser ser Asp tys Thr His Tijr cys Pro Prt> Cys pro Alá1 5 10 Ϊ5
<210> 13<211> 18<212> DNA
<Z13> Sintético
<400> 13
aatckcággt kçcagatg
<210> 14<211> 18<212> OMA
<213> sintético
<400> 14
gtCyrggtkfí gtaacact xa
<220> 15
<Z11> IS
<212> DMA
<213> sintético
<400> IS
a-rgmcttgtw acactgtg
<210> 16<211> 267
<212> CKA . r .
<213> Callithrix, espécie desconhecida
gacatccafa. çgaeccagtc tccaxçttcc ctgactgcat ctgtaggaçg caaaBteacc BOatcacttgcc gggcgagtca ggacattaac aagtggtfcag ectggtacea gcagaaacca 2.20gggacõgícc ctaagcccct gatctatgag gestccaaat tgeaaagtgg ^gtcccatci 150aggttcagcg gcagtygatc tgggacatat tttactctca ccatcaecag çctgcagcet 240gaas&tgcts caactwcta Ctgtcag 267
<210> 17<211> 26?<212> OWA
<213> Callithrix^ espécie desconhecida<400> 1T
gac&tççsga tgatccagtc tccatcctce ctgtctgcst ctgta-ggaeja csgagtcacc &0atcsctrsct g»<í<*agí.<;4 yygta^cagc tactggttag cctggtatca geagaaacca · 120gggasaoççc ctaAgctcct gatctatã$t gcatcaaatrt tagaaaeags' ggtcccatca 3.6QaggitcagEg çaa^ggatc caggaeagat tttactctca ccatreagcag cctgcagcct 240gaagatattg caacatatta ctgtcaa 267
<2lO> 18<211> 267<212> DNA
<2Ι3> Callithrix, espécie desconhecida<4O0> 18
gaçateeaga tgacccagac tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggsga cagagccaec 60ateacttgcc gggtaagtca gggtsttagc agctggttag çctggtatcá gçagaaacca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctacggg gcatcaaatt tggaaacagg ggtcccatca 180agattcageg gsagtggatc tgggacagat tttnctctca ccatcagcag tctgcagcct 240gsagatattg eaacaxatta ctgtcaa 267
<210> 19c211> 267<212> OHA
<213> CaXlithrix, espécie desconhecida<400> 19
gacatccaga tgatccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctçjtaggaga cagagtcaee 60atcacttgct gggcaagtca gggtarcagc cactggttag cctggtatcá gcagaaacca 120gggaaagccc etaagetcet gate«tagt gcatcaaatt taggaacagg ggtcccatca 180aggtrcagtg gaagtggatc çaggaeagat íttactctca ceatcageag cccgcagect 240gaagntattg caacatatca ctgtcaa 267
<210> 20<2X1> 267
<212> 0ΜΛ
<213> cailithrix, espécie desconhecida<400> 20
gacatccaga tgacçcagtc rccatcttce ctgactgcat ctgtaggagg câaagtcacc 60atcacttgcc ggtjcgEgtca ggacattaac aagtggttag CCtggtatca gcagaaacca 120gggaeagtcc ctaagcccct gatctatçjag ecatecaast tgcaaagtgg ggtcccatca 180aggi-tcagçg gcagtggatc tgggacarat ttrtactctca ccatcagcag cctgcagcct 240gaagargctg caacttatta crgteag 26?
<210> 21<211> 267<212> CMA
<213»· Cailithrix, espécie desconhecida<4&0> 21
gacatccaga tgaçccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagttacc 60atcacttgcc gggçgagtca gggcattagt aattatttag çctagi-atca gcagaaacca 120gggaaaactc ctaggctcct gatctatget gcatccagtt xacaaactgg gattccctct 150cggttcageg gcagtggatc tgggacagac tacacrctca ccatcagcag cctgcagtct: 240gaagatgttg caatttarta ctgccaa 267<210> 22<211> 267<212> DMA
<2l3> Callithrix, espécie desconhecida
gac&tcclga tgacccagre tceatcttcc ctgactgcat çtgtaggags caaagtcacc 60atcactrgcc gggegagtca ggaeattaac aagtggttag ççtggtãtca gcagaaacca IEOQggacagtcc ctaagcccct yatctatgag gcatccaaat tgcaaagtgg ggtcceatca ISOaggctcagcg gcsçtg&sxc tgggacax:a.t rccactctca ccatcagcag cctgcagcct 240gaagatgctg ca&cttatta Ctgtcag 267
<210> 23<21i> 26?<ZXZ> CNA
<2X3? callithrix, espécie desconhecida
gacâtccaga tgaccçagtc tecatcttcc ctgactgcat ctgcaggagg easagtcacç 60ãtcacfct-gec gggcgagtca gg&eattsac aagcggtcag ccçggcatca gcagaaacca 120gggôcagtcc çtaagccccc gatctatg&g gcatccaant tgcaaagigg ggtcccatca 180aggttcsgcg gcagtggatc tgggacâtat ctractctca ccatcagcag cctgcagcct 240gaagatgctg caacttarca crgtcag 267
<210*· 24
<aii> 26?
<212> OMA
<2l3> Callithrixf espécie desconhecida
gacatteaga tgacccagtc tccatcttcc ctgaçtgeat etgtaggagg ç&aagteacc 60
gtcacttgcc gggcgagtca ggacâttaac aãgtggttag cctggtarca gcagaaacea 120
gggacagtcc Ctaagcccct gatc^tgag gcatccaaat tgcaaagtgg ggtcccatca IBO
aggttcagegi gcagtggatc tgggacatat tttactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgctg caacttatta «gtcag 267
<220> 25<2U> 257<212> ONA
<213? Callithrix, espécie desconhecida
gacatctaga cgaeccagtc tccatctrcc exgactgCât ctgtaggagg caaagtcacc 60atcacttgcc gggcgagtca ggacattaac aagtggttag cctggtatca gcagaaâcca 120fggacagtcc ~t;sagecc.(.t: gatctatgag gcatccaaat tgeaaagtgg ggtcccatca ISOaggttcagcg gcagtggatc tgggatatat tttactctca ecatcagcag cctgcagcci; 240gaagatgctg caacttatta ctgtcag 267-ά10> 26<211> 207<21t> cna
<23.3> Callithrix, espécie desconhecida<4Ò0> 26
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc ctgaccgcat ctgtaggagg caaagtca.cc 60atcacttgcc gagcgagtca ggacattaac aagtggttag ectggtatca gcagaaacca 120gggac&gtcc ctaagcccct gatctatgag gcatccaaat tgcaaagtgg ggtcccatta i$0aygttcagcg gcagtggãtc tgggacatat tttactctca ccatcagcãg cçtgeagcct 240gaagatgctg caacttatta ctgtcag 267
<2Kh- 27<2li> Sd<212> PRT
<21S> Callithrix, espécie desconhecida<A00> 27
Asp Xle Gln «et ifhr Slη Ser pro Ser ser Leu Tfir Ala ser vai GlyIS 10 15
Gly Lys Val Thr 21 ô Thr eys Arg Ala Ser clm Asp ti β Asn Lys Trp20 25 30
Leti Ala "rrp Tyr elo Sln Lys Pro Gly Thr Val Pro Lys Pro Leu lie35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro ser Arg Fiie ser Gly50 55 60 .
Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr teu Thr ile ser Ser lgu Gln Pro6S 70 75 80
<}lu ASp Ala Ala rhr Tyr Tyr Cys tílnSS
*210> ZS
<zn> eô
<213> Callithrix, espécie desconhecida<405> 26
Asp ríe Gin mt Πβ Gln ser pfo Ser ser Jueu Ser Ala ser vai Gly1 5 10 15
ASp Aro vai Thr lie Thr cvs Trp Ala Ser dn Cly lie ser Wis TrpZO 25 30
Leu Ala Trp TVr Gln Gln Lys Prü Gly Lys Alá Pro LyS teu Leu Ile35 40 45
Tyr ser Ala ser Asn Leu Glu Tlir Gly vai pro Ser Arg Phe Ser Gly50 SS 60
Ser Gly ser Arg Ihr Asp Phe Thr teu Thr rle Ser ser Lèu Glrt pr&65 70 75 50
Glu Asp He Oa Thr Tyr Tyr Cys q1n85
<210> 29<21X> 89<212> PRT
<213> Calüthrix, espécie desconhecida<4Q0> 29
Asp lie Glr» Wet Thr Gln Thr Pro Sér Ser Leu Ser Ala ser vai GlyIS 10 3.5
Asp Arg vai Thr Jte Thr Cys Ara Ala Ser Gln Gly Ile ser ser τη>20 25 30
teu Ala Trp Tyr Gln Glw Lys Pro cly tys Ala Pro Lgs Leu Leu jtle
Tyr Gly Ala ser Asn Leu Glu Thr Gly vai Pro ser Arg Phfc ser GTy50 55 60
Ser Gly Ser GTy Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile ser ser teu dln Pre«5 70 80
Glu Asp lie: Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
<2IO 30
<2 ll> S9
<312? PBT
<213> c^nithrix, espécie desconhecida
<400» 30
ASp ile Gln Met Ile Gln ser Pro Ser ser lgu Ser Ala ser vai Gly2 5 10 . 15
Asp Arg vai Ttir Ile Thr çy$ Tr^ Als Ser Gln Gly Ser MiS Trp20 25 30
teu Ata Trp Tyr Gln Gln Lys PfO Gly Lys Ala Lys Leu teu.35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Lau Gly Thr Gly vai Pro Sar Arg Phe ser Gly50 55 60
Ser Gly ser Arg Thr Asp Pfie Thr Leu Thr Ile ser ser teu Gln Pro65 70 75 SOGlii Asp íle Ala Htr Tyr Tyr cys Gln83
<210» 31<211> 89<212> PRT
<213> Callitlirix^ espécie desconhecida<400> 31
ASp ϊϊβ CTfI Met ThP Gln ser Pro Ser ser uso Thf Ala Ser Val Gly1 5 10 ts
Gly Lys vai Thr ile thi- Cys Arg Ala Cys Gln Asp lie aso t.ys Trp
teu Ala Trp Tyr Gln 61 ri Lys pro Gly Thr vai Pro Lys Pro LeU fie35 40 4S
Tyr 61u Ala Ser Lys teu Gln ser Gly vai pro Ser Ard Phe ser GlySO 55 SO
ser Gly ser Cly Ttír ryr Phe Thr Leo Thr Ile Ser Ser Lea Gln pro65 70 75 80
GltI ASP Ala Ala Ttir Tyr Tyr Cys Gln
$5
<210> 32<211» 8$<212> PftT
<23J> Callithrix, espécie desconhecida
<40D> 32
Asp lia Glri Mec Thr Sln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser Val <31 y15 10....... 15
Asp Arg Val Thr ite Thr cys Arg ATa ser Gln Gly Ile ser açu Tyr20 25 30
teu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Tnr Pro Arq Lett Ley íle35 40 4S
Tyr Ala Ala -Ser ser Leu Gln Thr Gly Jle Pro Ser Arg Phe ser Gly50 SS 60
Ser Gly Ser Gly jhr Asp Tyr Thr Lfiu Ttir íle Ser ser Leti çln Ser65 70 7S 30
Gln Asp vai Ala i?e Tyr Tyr cys Gln85
<21Q> 33<Z11> SS<212> PRT<2i3> Callithrix7 espécie desconhecida<4QO> 33
ASp Ele Gln Met Thr Gln ser Pro sar ser teu Thr Ala ser Val cly1 5 10 IS
67y Lys vai Tfrr íle Thr Cys Ara Ala ser Gln Asp lie Asn Lys Trp20 2S 30
Leu Ala Trp tyr Glti Glri Lys pro Gly Thr vai Pro tvs pro Leu ile35 40 45
Tyr ClU Ala Ser Lys Leu elo ser Gly vai Pfo ser Arg Leu Ser CtySO 55 60
Ser cly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile ser ser teu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Ata Ala Thr Tyr Tyr Cys Glfs65
<210> 34<2U> 89<ZÍZ> PRT
<213> Callithrix, espécie desconhecida<400> 34
ASD Ile Glrt Met Thr Gln Ser pro ser Ser Leu Thr Ala Ser Val Gly15 10 ■ 15
61 y Lys Vâl Thr ile Thr Cys Arg Ala Ser cln Asp He Asn Lys Trp20 25 30
ser Ala Tfp Tyr Gln cio Lys Pro Gly Thr vai Pro Lys pro Leu Ile35 40 45
Tyr qlu Ala Ser Lys Leu Gln ser Gly Vâl J*rt> ser Arg Pha Ser Gly50 55 60
Ser Gly ser Sly Thr Tyr Phc Thr Leu Thr ile Ser Ser Leu Glni Pro65 70 75 BO
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 61 η85
<210? 3S<2ll> 89<212> PRT
<213? Callithrix, espécie desconhecida<4C0>
Asp Jtle Gln «et Thr Gln ser pro ser ser Leu Thr Ala Ser vai Sly1 S 10 15dly Iys Vil Thr Val Thr cys ArQ Ala Sêf Glo Asp rte Asn Lys Trp20 25 30
Leu Ala Tra Tyr Cln Gln Lys Pro Gly Tiir Val Pra Lys Pm Leu tle35 40 45
ryr çly Ala ser t,ys Leti Gln Ser Gly vai Pro Ser Arg Phe ser Gly50 SS 60
Ser Cly ser çly Thr TVr Phe Thr Leu Tfir xlé ser ser Leu' GTn pro6S 70 7S 80
GlU ASp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys GlnSS
<2lO> 35<2ϊϊ> 89<222> PRT
<t213> Calüthrix, espécie desconhecida<400 36
Asp Jle cln Met Thr Slri ser pro Ser Sef Leu Thr Ala Ser vai Cly1 5 10 IS
Gly Lys vai Thr Ile Thr cys Arg Als Ser cln asp Ile Asrr Lys Trp' ■ 20 2$ 30
Lea Ala Trp Tyr Gln cln.Lys Pro Gly Thr vai Leu Lys pro Lea lie35 40 45
Tyr Clu Ala ser Lys Leu Cln Ser Gly-vai Pro Ser Arg Phe Ser Cly50 5S 60
Ser Cly Ser Gly Tftr Tyr Phe Thr Leu Thr He ser ser lsm Clri Pro6S 70 75 80
clu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr cys Cln
$5
<210j- 37<211> 89<212> PRT
<2lB> Calüthrix, espécie desconhecida«400» 37
ASp Ile Oln fctes Ifhr Glrt ser Pro ser ser Leu ilir Ala ser vai Cly1 S 10 IS
Cly i-ys vai TNr íle inr cys Arg Ala ser cm Asp ιre ASn Lys Trp20 2S 30
Leu aIô Trp Tyr Gln Gln Lys pro Gly Thr vai Pro Lys Pro Leu IleJS 40 45Tyr Glu Afa ser Lys Leu Gln Ser Gly vai pro Leu Arg Phe Ser Gly50 55 60
ser Gly ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln pro65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln85
<210> 38<211> 267<212> DNA
<213> Aotus trivirgatus<400> 38
gacatccaga tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgcaggaga cagagtcacc 60atcacctgcc aggtgagtca gggaattagc agtgaattac tctggtatca gcagaaacca 120gggaaagccc ctatgctctt gatctatgct gcaaccaaat tgcagtcggg aatcccatct 180cggttcagtg gccatggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagca:g cctgcagcct 240gatgattttg ctacttatta ctgtcaa 267
<210> 39<211> 267<Z12> DNA
<213> Aotus trivirgatus<Λ00> 39
gacatccaga tgacccagtc tgcattctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc SOattacttgcc aggcgagtca gggcattacc agtgatttag cctggtatca gcaaaagcca 120gggaacgcct ctaagctcct gatctatgag gcatccagtt tacaaagcga ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggate tgggagagat tttactctca ccatcagcag cctgcagcct 240gaagattttg taacttatta ctgtcaa 267
<210> 40<21JL> 267<212> ONA
<213> Aotus trivirgatus<400> 40
gacatccaga tgacccagac tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc gggcgagtca agacatttac aattatttag Cctggtatca gcagaaacca 120gggaaaactc ctaggctctt gatctatgct gcatccagtt tgcaaactgg gattccctct 180cggttcagtg gcagtggatc tgggacagac tacactctca ccatcagcag cctgcagcct 240gatgattttg ccacttatta ctgtcaa 267
<210> 41
<211> 267
<212 DNA
<213> Aotus trivirgatus<400> 41
gacatccaga tgacccagac tccatcctcc ctgcctgcat ctgtaggaga caaagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ccaagctcct gatccataag gcatcaaatt tggaaacagg ggtcccatca 150
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatatcg caacatatta ctgtcaa 267
<210> 42<211> 267<212> DNA
<213> Aotus trivirgatus<400> 42
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc ctgactgcat ctgtaggaga caaagtcacc 60atcacttgcc gggcaagtcá gggcattagc aataatttag cctggtatca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagcccct gatctattat gcatccagtt tgcaaagcgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tggggcagat tacactctca ccaccagcag cctgcagcct 240gaagattttg caacttatta ctgtcaa 267
<210> 43<211> 267<212> DNA
<213> Aotus trivirgatus<400> 43
gacaaccaga tgatccagtc tccatcttcc ctgactgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc gagccagtca gagtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120gggacagtcc ctaagcctct gatctatgac gcatccaaat tgctaagtgg ggtcccatca 180aggttcagtg gctgtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag cctgcagcct 240gaagattttg caacttatta ctgtcaa 267
<210> 44
<211> S9
<212> PRT
<213> Aotus trivirgatus
<400> 44
ASp lie Gln Met Thr Gln ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala ser Ala Gly1 5 10 IS
Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Gln Val ser Gln Gly Ile Ser Ser Glu20 25 30
Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys pro Gly Lys Ala Pro Met Leu Leu rle55 4U 45
Tyr Ala Ala Thr Lys Leu 6ln Ser Gly Ile Pró ser Arg Phe Ser Gly50 S5 60Hls Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr teu Thr ile Ser ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Asp ASD Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln85
<2lQ> 45<211> 89<212> PRT
<213> AOtus trivírgatus<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ala Phe ser Leu Ser Ala Ser vai Gly1 5 10 15
Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Gln Ala ser Gln Gly Ile Thr ser AspZO 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala ser Lys Leu Leu ile35 40 45
Tyr Glu Ala ser ser Leu Gln Ser Glu Val Pro Ser Arg Phe ser Gly50 55 60
Ser Gly ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 .80
Glu Asp Phe vai Tttr Tyr Tyr cys Gln85
<210> 46<211> 89<21Z> PRT
<213> Aotus trivirgatus<400> 46
Asp lie Gln Met Thr Gln Thr pro ser ser Leu Ser Ala ser vai Gly15 10 15
Asp Arg Val Thr ile Thr Cys Arg Ala ser Gln Asp Ile Tyr Asn Tyr20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Tiu1 Abu Tyr Thr- Leu Tnr Ile Ser ber Leu C3In Pro65 70 75 SO
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln85<210> 47<211> 89<212> PRT
<213> Aotus trivirgatus<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Lys Val Tfir Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
His Lys Ala ser Asr» Leu Glu Thr Gly Val pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr ryr cys Gln85
<210> 48<211> 89<212> PRT
<213> Aotus trivirgatus<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser ser Leu Thr Ala Ser Val Gly15 10 15
Asp Lys Val Thr ile Thr cys Arg Ala ser Gln Gly Ile Ser Asn Asn20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu ile35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser ser Leu Gln ser Gly Val Pro ser Aro Phe Ser Gly50 55 60
ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Thr Stir Ser Leu Gln Pro65 70 75 $0
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln85
<210> 49<211> 89<212 PRT
<213> Aotus trivirgatus<400> 49
Asp Asn Gln Met Ile Gln Ser Pro ser Ser Leu Thr Ala ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg vai Thr lie Thr cys Arg Ala Ser Gln Ser He Ser ser Trp
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Leu ser Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly
SO 55 60
Cys Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Ser Leu Gln pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln85
<210> 50
<211> 1023
<Z1Z> DNA
<213> Sintético
<400> 50
gacatccaga tgacccagag eeccagcagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagagtgacc 60atcacctgca gagccagcca ggccatcgac agctacctgc actggtatca gcagaagcct 120ggcaaggccc ctaagctgct gatctacagc gccagcaatc tggagaccgg cgtgcctagc 180aaattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgctgcct 240gaggatttcg ccacctacta ctgccagcag gtggtgtgga. gacctttcac crtcggccag 300ggcaccaagg tggagatcaa gcgggtggag cccaagagct gcgataagac ccacacctgc 3G0eccccctgcc ctgcccccga gctgctgggc ggacccagcg tgttcctgtt cccccccaag 420cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc cccgaggtga cctgcgtggt ggtggatgtg 480«gccacgagg accctgaggt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat 540gccaagacca agcccaggga ggagcagtac aacagcaccn accgggtggt gtccgtgctg 600accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 660
gccçtgcctg cccctatcga gaaaaecatc agcaaggcca agggccagcc cagagagccc 720caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc 780
tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caacggccag 840
cccgagaaca actacaagac caccccccct gtçictggaca gcgatggcag cttcttcccg 900
tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga tggcagcagg gcaacgtgtt caqctqcaqc 960
gtgatgcacg aggccctgca caatcactac acccaganga gcctgagcct gtcccctggc 1020
aag 1023660
<210> 51<211> 1023<212> DUA<213> Sintético
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagagtgacc 60atcacctgca gagccagcca ggccatcgac agctacctgc actggtatca gcagaagcct 120ggcaaggccc ctaagctgct gatctacagc gccagcaatc tggagaccgg cgtgcctagc 180agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgctgcct 240gaggatttcg ccacctacta ctgccagcag gtggrgtgga gacctttcac cttcggccag 300ggcaccaagg tggagatcaa gcgggtggag cccaagagca gcgataagac ccacacctgc 360cccccctgcc ctgcccccga gctgctgggc ggacccagcg tgttcctgtt cccccccaag 420cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc cccgaggtga cctgcgtggt ggtggatgtg 480agccacgagg accctgaggt gaagttcaac xggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat S40gccaagacca agcccaggga ggagcagtac aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg 600accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaaggccctgccrg cccctatcga gaaaaccatc agcaaggcca agggccagcc cagagagccc 720caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat gagctgacca agaaccaggt grccctgacc 780tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caacggccag 840cccgaganca actacaagac caccccccct gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctgracagcaagc tgaccgtgga caagagcaga tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagcgtgatgcacg aggccctgca caatcactac acccagaaga gccxgagcct gtccçctggcaag
c210> 52<211> 108<212> PRT „ .<213> Sxntetico
<400> 52
As» Ile Gln Met Thr Gln ser pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Tbr.cys Arg Ala ser Gln Ser Ile Asp ser Tyr20 25 30
Ueu His Trp Tyr Gln Gln tys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Gln Pro65 70 75 80
90096010201023Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln vai Vnl Trp Arg pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Glo Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg100 105
<210> 53
<211> 10$
<212> PRT
<213> Sintético
<400> 53
Asp Xle Gln Met Thr Gln ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15
ASp Arg Val Thr Ile Thr cys Arg Ala ser 6ln Ser Ile ASp Ser Tyr20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 4S
Tyr ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Arg Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln Val vai Trp Arg Pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Gln Glv Thr Lys vai Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 54<211> 108<212> PRT<213> Sintético
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro ser ser Leu ser Ala Ser Val Gly15 10 15
Asp Arg Val Thr ile Thr Cys Arg Ala ser Gln ser lie Asp ser Tyr20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45
Tyr ser Ala Ser Asn Ltiu Glu Thr Gly Val cro ber Arg Phe ser Gly50 55 60
Ser Gly Scr Gly Thr Asp (?hè Thr Leu Thr ile ser Ser Leu Leu Pro65 70 75 SOGlu ASp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln vai vai Trp Arg Pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys vai Glu lie Lys Arg100 105
<210> 55<211> 8<212> PRT<213> Sintético
<4Q0> 55
Tyr ser Ala ser Glu Leu Gln Ser1 5
<210> 56
<211> δ
<212> PRT
<213> Aotus tri virgatus
<400> 56
Tyr Tyr Ala ser Ser Leu Gln Ser1 5
<210?· 57
<211> 6
<212> PRT
<213> Sintético
<400> 57
Gly Cys cys Ala Cys cys1 5
<210> 58
<211>- 20
<2X2> PRT
<213> Sintético
<400> 58
Met ser vai Pro Thr Gln vai Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thrι * 10 15
Asp Ala Arg cys20
<210> 59
<211> 342
<212> PRT
<213> Sintético
ρ/1ΠΛΙ P Λ
■s-ívüy «ry
Asp Ile Gln Met Thr. Gln ser Pro ser Ser Leu ser Ala ser vai Gly1 5 10 ISAsp Arg Val Thr Xle Thr cys Arg Ala ser Gln Ala He Asp Ser Tyr20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln tys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn teu Glu Thr Gly vai Pro ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser ser Leu teu Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val vai Trp Arg Pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Val GÍu pro Lys100 105 110
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys pro Pro cys Pro Ala pro Glu Leu115 120 125
Leu Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr130 135 140
Leu Mer lie Ser Arg Thr Pro Glu vai Thr cys vai vai vai Asp vai145 150 155 160
Ser His Glu Asp pro Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyrval Asp Gly vai165 170 175
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Glrt Tyr Asn ser180 185 190
Thr Tyr Arg vai vai Ser vai Ueu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu195 200 205
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala210 215 220
Pro Ile Glu Lys Thr Jle Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro225 230 235 240
Gln Val Tyr Thr Leu pro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln245 250 255
vai ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp lie Ala .260 265 270
vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr275 280 285
pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu290 295 300
Thic vai Asp Lys ser Arg Trp Gtn Gln Gly Asn vai Phe Ser cys ser305 JXO 315 320
Val Met His Glu Ala í.eu His Asrt His Tvr irhr GTn Lys ser Leu Ser325 330 335
Leu ser Pro Glg Lys
<Z10> 60<211> 329<212> PRT
<Z13> Sintético<40G> 60
ser Thr li1 5 10
Ser Thr Lys Gly Pro ser vai Phe Pro Leu Ala Pro ser Ser L^s ser
Thr Ser ely Gly Thr Ala Ala Lei» Gly CyS Leu vai Lys aso Tyr Ph«20 2S 30
Pru Glu f»ro VaI THr vai Sér Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ttir ser GlyBS 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Vat Leu Glrt Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu50 55 60
ser 5sr Val Val Thr Val Pra ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr65 70 75 80
Ile Cys Asri Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg55 90
vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hfs Thr Cys Pro Pro Cys Proΐδθ 105 110
Ala pro Glu leu Leu Gly Gly pro Ser vai Pbe leu Phe Pro Pro LysIiS IZO 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr pro Glu Val Thr Cys ValJ.30 135 140
Val vai Asp Vâl ser His Glu Asp Pro Glu V&l Lys Phe Asn Trp Tyr145 ISO 155 r 160
Val ASp Gly vai Glu vai His ASrt Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu103 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr tyr Arg Val Val ser Val Leu Thr vai Leu Kls150 185 WfOGln Asp Trp Leu Asri Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys Val Ser Asn Lys19S 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly Gln210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Glu Glu Met225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro245 250 255
Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln pro Glu Asn Asn260 265 270
Tyr Lys Thr Thr pro Pro vai Leu Asp ser Asp Gly ser Phe Phe Leu275 280 285
Tyr ser Lys Leu Thr Val ASp Lys Sér Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val290 295 300
Phe ser Cys ser Va 1 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln305 310 315 320
Lys ser Leu ser Leu ser Pro Gly Lys325
<210> 61<211> 1044<212> PNA<213> Sintético
<400> 61
atggcgagca ccgatattca gatgacccag agcccgagca gcctgagcgc gagcgtgggt 60
gatcgtgtga ccattacctg ccgtgcgagc caggcgattg atagctatct gcattggtat 120
cagcagaaac cgggcaaagc gccgaaactg ctgatttata gcgcgagcaa cctggaaacc 180
ggcgtgccga gccgttttag cggcagcggt agcggcaccg attttaccct gaccattagc 240
agcctgctgc cggaagattt tgcgacctat tattgccage aggtggtgtg gcgtccgttt 300
acctttggcc agggcaccaa agtggaaatt aaacgcgtgg aaccgaaaag cagcgataaa 360
acccacacgt gcccgccgtg tccggcgccg gaactgctgg gtggcccgag cgtgtttctg 420
xttccgccga aaccgaaaga taccctgatg attagccgta ccccggaagt gacctgcgtg 480
gtggtggatg tgagccatga agatccggaa gtgaaattca actggtatgt ggatggcgtg 540
gaagtgcata acgegaaaac caaaccgcgt gaagaacagt ataacagcac ctatcgtgtg 600
ytgõycyLyi- Lyaccgtgcx gcatcaggat tggctgaacg gcaaagaata caaatgeaaa 660
gtgtctaaca nagcgctgcc ggcgccgatt gaaaaaacca tcagcaaagc gaaaggccag 720
ccgcgtgaac cgcaggtgta taccctgccg ccgagccgtg atgaacrgac caaaaaccag 780gtgagcctga cctgcctggt gaaaggcttt tatccgagcg atattgcggt ggaatgggaa 840
agcaacggcc agccggaaaa caactataaa accaccccgc cggtgctgga tagcgatggc 900
agctttttcc tgtatagcaa actgaccgtg gataaaagcc gttggcagca gggcaacgtg 960
tttagctgca gcgtgatgca tgaagcgctg cataaccatt atacccagaa aagcctgagc 1020
ctgagcccgg gtaaagcggc ggcg 1044
<210> 62<211> 356
<21Ζ> PRT
<213> Sintético<400> 62
Met Ala ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ser ser leu Ser1 5 10 15
Ala ser vai Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr cys Arg Ala ser Gln Ala20 25 30
Ile Asp ser Tyr Leu HiS Trp Tyr Gln Gln uys Pro Gly Lys Ala Pro35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro ser50 55 60
Arg phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He ser65 70 75 80
ser Leu Leu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln vai vai85 90 95
Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg100 105 110
vai Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr cys Pro Pro cys Pro115 120 12S
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser vai Phe Leu Phe Pro Pro tys130 135 140
pro Lys Asp Thr teu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu vai Thr cys vai145 150 155 160
Val Vàl Asp vai Ser Hn's Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr165 170 175
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GluISO 185 190
Gln Tyr Asn ser Thr Tyr Arg vai vai ser vai Leu Thr vai Leu His195 200 205Gln Asp Trp Lew Asri Gly Uys Glu Typ Lys Cys Lys vai ser aso tys210 215 220
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gtu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys ely cln225 230 235 240
PrO Aro Slu Pro Gln Val Tyf Thr Leu Pro pro ser Arg Asp Glu Leu245 250 255
Thr Lys Asn Gln vai Ser Lew Thr cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro260 265 270
Ser AStt rle Ala vai Glu Tcp 61 u Ser Asn Gly Glrt Pro Glw Asn Asn275 280 2S5
Tyr Lys thr Thr pro pro vai Leu Asp ser Asp GTy Ser Phe phe Leu290 295 300
Tyr ser LyS Leu Tftr vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly ASn vai$05 310 315 320
Phe ser Cys ser vai Met His Glu Ala Lea Mis Asn hís Tyr Tbr Gln325 330 335
Lys ser LeW ser Leu ser Pro Gly Lys Alá Ala Ala vai Asp His His340 345 350
HÍS KlS HlS HÍS
355
<21Q> 63<Z11> ZlS<2!2> PRT
<2i3i· Seqüência de domínio CH2/CH3 de número de acesso de base
dados swissprot PO1857«4Ρ0>- 63
pro Glu Leu Leu Oly Gly Pro Ser Val Phe Leu Pfie Pro Pro Lys Pro1. 5 10 15
(.ys asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr pro Glu Val Tltr Cys Val vai20 25 30
vai Asp vai ser Nis Glu Asp pro Glu v^l Lys Phs Asn Trp Tyr vai35 40 45
Asp Sly vai Glu Val His ASn Ala Lys Thr Lys pro Arg clu Glu Glo50 55 60
Tyr Asn ser Thr Yyr Arg Val Val ser vai Leu Thr Val teu hís Gln65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys vai Ser ash Lys AlaSS 90 95
Lew Pro Ala Pro <j1«j Lys mr jie ser tys Ala Lys Gly cln Pro100 105 110
Arg dlu pro GJn vai Tyr Thr Lfiw pro Pro ser Afg Asp Glu teu Thr115 120 125
tys Asrj Gln Val Ser Lew Thr Cys teu Val LviS Sly Phe Tyr pro Ser130 1 135 140
Asp Ile Ala Val Gla Trp Glu Ser Asn Gly èln Pro çlu Asn Asn Tyr14 S ISO 155 ISO
Lys Thr Tlir pro pro vai teu Asp ser Asp Gly Ser Pbe Phe teu Tyr165 170 175
Ser uys Leu Thr vai Asp Lys ser Arg Trp Gln Qln Qly Asn Val PbeISO 1S5 190
ser çys ser vai Met"»ls Giu Ala Lei» His Asn Hfs Tyr Thr Glr» Lys195 200 205
Ser Leu ser Leu ser pro Gly Lys210 2ll
<2IQ> 64<221> 17
<212> PRY
Sintético
<22Q>
<221> MISC_F«ATO«Ç
X é valina, leucina ou isoleucina
<220*
<?21> MISC-FEATURE(6).;(6)
<223> y^ está ausente ou é um amino ácido outro que cisteína<40Q> 64
Xaa Glw prò tys ser xaa Asíj tys Thr hís Thr cys pro pro Cys pro1 S 10 15
Ala

Claims (60)

1. Construção de anticorpo de domínio que se liga a TNF-ahumano, caracterizada pelo fato de compreender:(a) um anticorpo de domínio (dAb) que se liga a TNF-ahumano;(b) uma seqüência modificada de região de articulação;(c) uma seqüência de região constante de cadeia pesada dehumano ou primata tendo um domínio ChI trancado de não mais do que 20resíduos,em que dita seqüência modificada de região de articulaçãocontém ou uma deleção ou uma única substituição de aminoácido de pelomenos um resíduo de cisteína que normalmente facilita formação de ligaçãodissulfeto entre cadeias pesadas e leves de anticorpos.
2. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a seqüência de regiãoconstante de cadeia pesada de humano ou primata tendo um domínio ChItrancado compreende não mais do que 10 resíduos.
3. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a seqüência de regiãoconstante de cadeia pesada de humano ou primata tendo um domínio ChItrancado compreende não mais do que 5 resíduos.
4. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a seqüência de regiãoconstante de cadeia pesada de humano ou primata tendo um domínio ChItrancado compreende não mais do que um único resíduo.
5. Construção de anticorpo de domínio de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que aseqüência do domínio ChI e a região de articulação éXEPKSZDKTHTCPPCPA (SEQ ID No: 64), em que X é valina, leucina ouisoleucina e Z é ausente ou um outro aminoácido do que cisteína.
6. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 5, caracterizada pelo fato de que X é valina e Z é serina.
7. Construção de anticorpo de domínio de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o dAbcompreende um domínio variável de cadeia pesada ou leve deimunoglobulina, em que dito domínio variável compreende pelo menos umaregião determinante de complementaridade (CDR) tendo uma seqüênciaderivada de um primata do Novo Mundo, em que a CDR é selecionada apartir do grupo consistindo de YAATKLQS (SEQ ID No:l), YEASSLQS(SEQ ID No:2), YEASKLQS (SEQ ID No:3), e YSASNLET (SEQ. ID N0:4).
8. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a CDR é CDR2.
9. Construção de anticorpo de domínio de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que oanticorpo de domínio tem uma seqüência selecionada a partir do grupoconsistindo de:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No:7);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQ WWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ. ID No:8);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFLTISSLLPEDFATYYCQQWWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No:9);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDF ATYYCQQ WWRPFTTGQGTKVEIKR (SEQ ID No:10);DIQMTQSPSSILSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQ WWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No:52);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWWRPFIPGQGTKVEIKR (SEQ ID No:53);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLVPEDF ATYYCQQ WWRPFTFGQGTKVETKR (SEQ ID No:54); euma seqüência pelo menos 95% idêntica a uma destasseqüências.
10. Construção de anticorpo de domínio de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que oresíduo de cisteína dentro da região de articulação que normalmente facilitaformação de ligação dissulfeto entre cadeias pesadas e leves de anticorpos ésubstituído por um resíduo de serina.
11. Construção de anticorpo de domínio de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que aregião de articulação compreende a seqüência EPKSSDKTHTCPPCPA (SEQID No: 12),
12. Construção de anticorpo de domínio de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que aregião constante compreende domínios CH2 e CH3 pelo menos 60% idênticosà seqüência apresentada em SEQ ID No:63.
13. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 12, caracterizada pelo fato de que os domínios CH2 e CH3 sãopelo menos 80% idênticos à seqüência apresentada em SEQ ID No:63.
14. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 13, caracterizada pelo fato de que os domínios CH2 e CH3 sãopelo menos 90% idênticos à seqüência apresentada em SEQ ID No:63.
15. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 14, caracterizada pelo fato de que os domínios CH2 e CH3 sãopelo menos 95% idênticos à seqüência apresentada em SEQ ID No:63.
16. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 15, caracterizada pelo fato de que os domínios CH2 e CH3 sãopelo menos 96% idênticos à seqüência apresentada em SEQ ID No:63.
17. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 16, caracterizada pelo fato de que os domínios CH2 e CH3 sãopelo menos 97% idênticos à seqüência apresentada em SEQ ID No:63.
18. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 17, caracterizada pelo fato de que os domínios CH2 e CH3 sãopelo menos 98% idênticos à seqüência apresentada em SEQ ID No:63.
19. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 18, caracterizada pelo fato de que os domínios CH2 e CH3 sãopelo menos 99% idênticos à seqüência apresentada em SEQ ID No:63.
20. Construção de anticorpo de domínio de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que CDRl,CDR3 ou pelo menos uma região de armação é modificada para melhorarligação de antígeno.
21. Construção de anticorpo de domínio de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que aseqüência de aminoácidos é pelo menos 60% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
22. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos épelo menos 80% idêntica à seqüência apresentada em SEQ ID No:l 1.
23. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos épelo menos 90% idêntica à seqüência apresentada em SEQ ID No:l 1.
24. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos épelo menos 95% idêntica à seqüência apresentada em SEQ ID No:l 1.
25. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos épelo menos 96% idêntica à seqüência apresentada em SEQ ID No:l 1.
26. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos épelo menos 97% idêntica à seqüência apresentada em SEQ ID No:l 1.
27. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos épelo menos 98% idêntica à seqüência apresentada em SEQ ID No:l 1.
28. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos épelo menos 99% idêntica à seqüência apresentada em SEQ ID No:l 1.
29. Construção de anticorpo de domínio de acordo comreivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos éidêntica à seqüência apresentada em SEQ ID No:l 1.
30. Construção de anticorpo de domínio de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que oanticorpo de domínio tem baixa imunogenicidade em humanos.
31. Construção de anticorpo de domínio dimérica que se liga aTNF-α humano, caracterizada pelo fato de que o dímero consiste de duasconstruções de anticorpo de domínio como definidas em qualquer uma dasreivindicações 1 a 30.
32. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a construção deanticorpo de domínio dimérica é um homodímero.
33. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreendem umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
34. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreendem umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
35. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreendem umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
36. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreendem umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
37. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreendem umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
38. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreendem umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 97% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
39. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreendem umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
40. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreendem umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No: 11.
41. Construção de anticorpo de domínio dimérica de acordocom reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que as construções deanticorpo de domínio constituindo o homodímero compreendem a seqüênciade aminoácidos apresentada em SEQ ID No: 11.
42. Molécula isolada de ácido nucleico, caracterizada pelo fatode codificar uma construção de anticorpo de domínio como definida emqualquer uma das reivindicações 1 a 30.
43. Molécula isolada de ácido nucleico, caracterizada pelo fatode compreender uma seqüência de ácidos nucleicos codificando de umaconstrução de anticorpo de domínio que se liga a TNF-α humano, em que aseqüência de ácidos nucleicos é pelo menos 60% idêntica à seqüênciaapresentada em SEQ ID No:50 ou SEQ ID No:51.
44. Molécula isolada de ácido nucleico de acordo comreivindicação 43, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácidosnucleicos é pelo menos 80% idêntica à seqüência apresentada em SEQ IDNo:50 ou SEQ ID No:51.
45. Molécula isolada de ácido nucleico de acordo comreivindicação 44, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácidosnucleicos é pelo menos 90% idêntica à seqüência apresentada em SEQ IDNo:50 ou SEQ ID No:51.
46. Molécula isolada de ácido nucleico de acordo comreivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácidosnucleicos é pelo menos 95% idêntica à seqüência apresentada em SEQ IDNo:50 ou SEQ ID No:51.
47. Molécula isolada de ácido nucleico de acordo comreivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácidosnucleicos é pelo menos 96% idêntica à seqüência apresentada em SEQ IDNo:50 ou SEQ ID No:51.
48. Molécula isolada de ácido nucleico de acordo comreivindicação 47, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácidosnucleicos é pelo menos 97% idêntica à seqüência apresentada em SEQ IDNo:50 ou SEQ ID No:51.
49. Molécula isolada de ácido nucleico de acordo comreivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácidosnucleicos é pelo menos 98% idêntica à seqüência apresentada em SEQ IDNo:50 ou SEQ ID No:51.
50. Molécula isolada de ácido nucleico de acordo comreivindicação 49, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácidosnucleicos é pelo menos 99% idêntica à seqüência apresentada em SEQ IDNo:50 ou SEQ ID No:51.
51. Molécula isolada de ácido nucleico de acordo comreivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácidosnucleicos é idêntica à seqüência apresentada em SEQ ID No:50 ou SEQ IDNo:51.
52. Molécula isolada de ácido nucleico, caracterizada pelo fatode compreender uma seqüência de ácidos nucleicos codificando umaconstrução de anticorpo de domínio que se liga a TNF-α humano, em que aseqüência de ácidos nucleicos hibridiza em condições de alta estringênciacom o nucleotídeo apresentado em SEQ ID No:50 ou SEQ ID No:51.
53. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender uma quantidade eficaz de uma construção de anticorpo dedomínio como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, junto comum carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável,
54. Composição farmacêutica, caracterizada por compreenderuma quantidade eficaz de uma construção de anticorpo de domínio diméricacomo definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 41, junto com umcarreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
55. Método para detectar TNF-α humano em uma amostra,caracterizado pelo fato de compreender colocar em contato a amostra comuma quantidade eficaz de uma construção de anticorpo de domínio comodefinida em qualquer uma das reivindicações 1 a 41 e detectar a quantidadede construção de anticorpo de domínio ligada.
56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizadopelo fato de que a amostra é uma amostra biológica.
57. Método para tratar um distúrbio distinguido pela atividadede TNF-α humano em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato decompreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de umacomposição farmacêutica como definida na reivindicação 55 ou reivindicação-56.
58. Método de acordo com reivindicação 57, caracterizadopelo fato de que o distúrbio distinguido pela atividade de TNF-α humano éselecionado a partir do grupo consistindo de inflamação, doençasinflamatórias, sepse, incluindo choque séptico, choque endotóxico, sepsegram negativa e síndrome de choque tóxico; doença autoimune, incluindoartrite reumatóide, artrite juvenil, espondilite reumatóide, espondiliteanquilosante, síndrome de Sjõgren, osteoartrite e artrite gotosa, alergia,esclerose múltipla, diabete autoimune, uveíte autoimune, psoríase, síndromepenfigóide e nefrótica; condições inflamatórias do olho, incluindodegeneração macular, uveíte, doença de Behçet; doença infecciosa, incluindofebre e mialgias devido a infecção e caquexia secundária à infecção; doençaenxerto versus hospedeiro; crescimento de tumor ou metástase, malignidadeshematológicas; distúrbios pulmonares incluindo asma, síndrome dodesconforto respiratório adulto, pulmão de choque, doença inflamatóriapulmonar crônica, sarcoidose pulmonar, fibrose pulmonar e silicose;distúrbios inflamatórias de intestino incluindo doença de Crohn e coliteulcerativa; distúrbios cardíacos, insuficiência cardíaca congestiva; distúrbiosvasculares incluindo doença de Wegener, artrite de células gigantes;distúrbios inflamatórias ósseas, distúrbios de sistema nervoso central tal comomal Alzheimer; distúrbios de sistema nervoso periférico tal como ciática,hepatite, distúrbios de coagulação, queimaduras, lesão de reperfusão,endometriose, formação de quelóide e formação de tecido cicatrizado.
59. Método de acordo com reivindicação 57 ou reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o distúrbio distinguido pela atividade deTNF-α humano é um distúrbio ocular relacionado a angiogênese.
60. Método de acordo com reivindicação 59 caracterizado pelofato de que o distúrbio ocular relacionado a angiogênese é degeneraçãomacular relacionada à idade.
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