BRPI0620408A2 - compostos derivados de pirimidinil aril uréia sendo inibidores de fgf, uso dos mesmos, preparação farmaceutica e método para a sua fabricação - Google Patents

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Abstract

COMPOSTOS DERIVADOS DE PIRIMIDINIL ARIL URéIA SENDO INIBIDORES DE FGF, USO DOS MESMOS, PREPARAçãO FARMACEUTICA E MéTODO PARA A SUA FABRICAçãO. A invenção refere-se a heteroaríl aril uréias da fórmula IA, em que os radicais e simbolos tem os significados como aqui definido, o uso de tais compostos no tratamento de doenças dependentes de proteína cina-se; às preparações farmaceuticas compreendendo a referidas heteroaril aril uréias, aos processos para a fabricação de tais novos compostos e aos métodos de tratamento compreendendo o uso de tais heteroaril aril uréias.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS- TOS DERIVADOS DE PIRIMIDINIL ARIL URÉIA SENDO INIBIDORES DE FGF, USO DOS MESMOS, PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA A SUA FABRICAÇÃO".
Sumário da Invenção:
A invenção refere-se a novos compostos, formulações, métodos e usos. Mais particularmente refere-se a novas heteroaril aril uréias, e/ou o uso de ou métodos compreendendo o uso de compostos, que podem ser descritos como heteroaril aril uréias, no tratamento, ou na fabricação de formulações de farmacêuticas úteis no tratamento, de doenças dependentes de proteína cinase. A invenção também refere-se a métodos de uso de tais composto no tratamento das referidas doenças, preparações farmacêuticas compreendendo heteroaril aril uréias, e processos para a fabricação de das referida novas heteroaril aril uréias. A invenção refere-se a outro assunto como descrito abaixo.
Antecedentes da Invenção:
Proteína cinases (PKs) são enzimas que catalisam a fosforilação de resíduos de serina, treonina ou tirosina específicos em proteínas celula- res. Estas modificações pós-translacionais de proteínas de substrato agem como mudança molecular na regulação proliferação, ativação e/ou diferen- ciação celular. A atividade de PK anormal ou excessiva foi observada em muitos estados de doença incluindo distúrbios proliferativos benignos e ma- lignos. Em muitos casos, foi possível tratar doenças in vitro e em muitos ca- sos in vivo, tais como distúrbios proliferativos, fazendo uso de inibidores de PK.
As cinases classificam-se em grande parte em dois grupos, a- quelas específicas para fosforilação de serina e treonina, e aquelas especí- ficas para fosforilação de tirosina. Além disso, algumas cinases, referidas como cinases de "especificidade dual", são capazes de fosforilar resíduos de tirosina bem como de serina/treonina.
Proteína cinases podem da mesma forma ser caracterizadas por sua localização dentro da célula. Algumas cinases são proteínas receptoras transmembranas capazes de ligarem Iigantes externos à membrana da célu- la. A ligação dos Iigantes altera a atividade catalítica da proteína cinase re- ceptora. Outras são proteínas não receptoras desprovidas de um domínio de transmembrana e ainda outras são ectocinases que têm um domínio ca- talítico na porção extracelular (ecto) de uma proteína de transmembrana ou que são segregadas como proteínas extracelulares solúveis.
Muitas cinases estão envolvidas em cascatas reguladoras onde seus substratos podem incluir outras cinases cujas atividades são reguladas pelo seu estado de fosforilação. Desse modo, a atividade de um efetor a jusante é modulada por fosforilação resultando da ativação da série de rea- ção.
Proteína tirosina cinases receptoras (RPTKs) é uma subclasse de receptores de abrangência transmembrana dotados com atividade de tirosina cinase estimulável por ligante, intrínseca. A atividade de RPTK é firmemente controlada. Quando mutadas ou alteradas estruturalmente, as RPTKs podem se tornar oncoproteínas potentes, causando transformação celular ou pelo menos desregulação. Em princípio, para todas as RPTKs envolvidas em câncer, a desregulação oncogênica resulta da ajuda ou per- turbaçao de um ou vários dos mecanismos de autocontrole que asseguram a repressão normal de domínios catalíticos. Mais da metade das RPTKs co- nhecidas foram repetidamente encontradas em formas mutadas ou super- expressas associadas· com malignidades humanas (incluindo casos esporá- dicos; Blume-Jensen e outro, Nature 411: 355-365 (2001)).
A superexpressão de RPTK conduz a ativação de cinase consti- tutiva aumentando-se a concentração de dímeros. Exemplos são o receptor de fator do crescimento da epiderme (EGFR) e Neu/ErbB2, que são fre- qüentemente ampliados em carcinomas de mama e pulmão e os fatores de crescimento de fibroblastos (FGFR) associados com distúrbios esqueléticos e proliferativos (Blume-Jensen e outro, 2001).
Angiogênese é o mecanismo pelo qual novos capilares são for- mados a partir de vasos existentes. Quando requerido, o sistema vascular tem o potencial para gerar novas redes de capilares para manter o funcio- namento adequado de tecidos e órgãos. No adulto, entretanto, a angiogêne- se é bastante limitada, ocorrendo somente no processo de cicatrização de ferimento e neovascularização do endométrio durante a menstruação. Veja Merenmies e outro, Cell Growth & Differentiation, 8, 3-10 (1997). Por outro lado, angiogênese não desejada é uma marca oficial de várias doenças, tais como retinopatias, psoríase, artrite reumatóide, degeneração macular rela- cionada com a idade (AMD), e câncer (tumores sólidos). Folkman, Nature Med., 1, 27-31 (1995). As proteína cinases que mostrou estar envolvidas no processo angiogênico incluem três membros da família de tirosina cinase receptora do fator de crescimento: VEGF-R2 (receptor 2 de fator de cresci- mento endotelial vascular, também conhecido como KDR (receptor de do- mínio de inserção de cinase) e como FLK-1); FGF-R (receptor do fator de crescimento de fibroblastos); e TEK (também conhecido como Tie-2).
TEK (também conhecida como Tie-2) é uma tirosina cinase re- ceptora expressa somente em células endoteliais a qual mostrou desempe- nhar um papel em angiogênese. A ligação do fator de angiopoetina-1 resulta em autofosforilação do domínio de cinase de TEK e resulta em um processo de transdução de sinal que parece mediar a interação de células endoteliais com células de sustentação periendoteliais, desse modo, facilitando a matu- ração de vasos sangüíneos recentemente formados. O fator de angiopoeti- na-2, por outro lado, parece antagonizar a ação de angiopoetina-1 em TEK e interrompe angiogênese. Maisonpierre e outro, Science, 277, 55-60 (1997).
A administração de Ad-ExTek, um domínio extracelular expresso adenoviral solúvel de Tie-2, inibiu metástase de tumor quando liberado no momento da excisão cirúrgica de tumores primários em um modelo de ca- mundongo clinicamente relevante de metástase de tumor (Lin e outro, Proc Natl Acad Sci USA 95, 8829-8834 (1998)). A inibição da função de Tie-2 por ExTek pode ser uma conseqüência de seqüestração do Iigante de angiopoi- etina e/ou heterodimerização com o receptor de Tie-2 nativo. Este estudo demonstra que a interrupção de séries de reações de sinalização de Tie-2, primeiro, pode ser bem tolerada em organismos saudáveis e, segundo, pode fornecer benefício terapêutico.
O Cromossoma Filadélfia é uma marca oficial para leucemia mielogenosa crônica (CML) e transporta um gene híbrido que contém éxons de terminal N do gene bcr e a parte de terminal C principal (éxons 2-11) do gene c-abl. O produto de gene é uma proteína de 210 kD (p210 Bçr-Abl). A parte Abl da proteína de Bcr-Abl contém a abl-tirosina cinase que é rigoro- samente regulada na c-abl do tipo selvagem, porém, constitutivamente ati- vada na proteína de fusão de Bcr-Abl. Esta tirosina cinase desregulada inte- rage com múltiplas séries de reações de sinalização celular que conduzem a transformação e proliferação desregulada das células (Lugo e outro, Scien- ce 247, 1079 [1990]).
Formas mutantes da proteína de Bcr-Abl também foram identifi- cadas. Uma revisão detalhada das formas mutantes de Bcr-Abl foi publicada (Cowan-Jones e outro, Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, 4 285- 299).
EphB4 (também chamado HTK) e seu ligante, efrinB2 (HTKL) têm papéis críticos no estabelecimento e determinação de redes vasculares. No epitélio venoso, EphB4 é expresso especificamente, enquanto, durante estágios iniciais do desenvolvimento vascular, efrinB2 é especificamente e reciprocamente expresso em células endoteliais arteriais. Genes disfuncio- nais conduzem à Ietalidade embriônica em camundongos, e os embriões mostram defeitos idênticos na formação de conexões capilares no caso de qualquer dos dois efrinB2 e EphB4 com defeito. Ambos são expressos no primeiro sítio de hematopoiese e desenvolvimento vascular durante a embri- ogênese. Um papel essencial quanto ao desenvolvimento de mesoderma hematopoético, endotelial, hemangioblasto e primitivo adequado foi estabe- lecido. A deficiência de EphB4 resulta em uma alteração no resultado de diferenciação mesodérmico de células-tronco embrionárias. Expressão ec- tópica de EphB4 em tecido mamário resulta em arquitetura desordenada, função de tecido anormal e uma predisposição à malignidade (veja, por e- xemplo, N. Munarini e outro, J. Cell. Sci. 115, 25-37 (2002)). A partir destes e outro dados, foi concluído que a expressão de EphB4 inadequada pode estar envolvida na formação de malignidades e, desse modo, que a inibição de EphB4 pode ser esperada ser uma ferramenta para combater malignida- des, por exemplo, câncer e similares.
c-Src (também conhecida como p60 c-Src) é tirosina cinase não receptora, citossólica. c-Src está envolvida na transdução de sinais mitogê- nicos de vários fatores de crescimento de polipeptídeos tais como fator de crescimento da epiderme (EGF) e fator de crescimento derivado das plaque- tas (PDGF). c-Src é superexpressa em cânceres mamários, cânceres pan- creáticos, neuroblastomas, e outros. A c-Src mutante foi identificada em câncer de cólon humano. c-Src fosforila várias proteínas que estão envolvi- das na regulação de interferências entre a matriz extracelular e o citoesque- leto de actina citoplasmática. A atividade de cSrc de modulação poderia ter implicações em doenças relacionadas à proliferação, diferenciação e morte celular. Veja Bjorge, J. D., e outro (2000) Oncogene 19(49):5620-5635; Hâl- pern, M. S., e outro (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 93(2), 824-7; Bels- ches, A. P., e outro (1997) Frontiers in Bioscience 2:D501-D518; Zhan, X., e outro (2001) Chemical Reviews 101:2477-2496; Haskell, M. D., e outro (2001) Chemical Reviews 101:2425-2440.
A tirosina cinase receptora da tirosina cinase do tipo fms 3 (FLT3) é agora reconhecida como sendo um mediador crítico na patogênese de Ieucemias mielóides e algumas linfóides. A ativação de FLT3 em células leucêmicas através de Iigante de FLT3 conduz à dimerização de receptor e transdução de sinal em séries de reações que promovem o crescimento ce- lular e inibem a apoptose (Blood, Vol. 98, no. 3, páginas 885-887 (2001)).
O uso de inibidores de tirosina cinase para a terapia de AML é impedido pela aquisição de mutações no domínio catalítico de cinase, e no caso de BCR-ABL, estas mutações conferem resistência à imatiniba.
FLT3 é amplamente expressa em AML e alguns casos de Ieu- cernia linfocítica aguda. A ativação de mutações em FLT3 confere um fraco risco em pacientes com AML. Desse modo, FLT3 é um alvo promissor para intervenção terapêutica. Tirosina cinase de receptor de fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGFR) é expressa em vários tumores tais como câncer de pul- mão de célula pequena, câncer da próstata, e glioblastoma bem como nos compartimentos estromais e vasculares de muitos tumores. O termo de am- bos os receptores de PDGF e PDGF (PDGFRs) foi observado em câncer pancreático (Ebert M e outro, Int J Câncer, 62:529-535 (1995).
As Raf serina/treonina cinases são componentes essenciais do módulo de sinalização de Proteína Cinase ativada por Ras/Mitogênio (MAPK) que controla um programa transcricional complexo com respeito a estímulos celulares externos. Genes de Raf codificam para serina-treonina- específica de proteína cinases altamente conservadas que são conhecidas por ligar-se ao oncogene de ras. Elas são parte de uma série de reação de transdução de sinal que acredita-se consistir em tirosina cinases receptoras, p21 ras, Raf proteína cinases, Mekl (ativador de ERK ou MAPKK) cinases e ERK (MAPK) cinases, que finalmente fosforila fatores de transcrição. Nesta série de reação, Raf cinases são ativadas por Ras e fosforilam e ativam du- as isoformas de Proteína Cinase Ativada por Mitógeno (chamadas Mekl e Mek2), que são treonina/tirosina cinases de especificidade dual. Ambas os isoformas de Mek ativam Cinases 1 e 2 Ativadas por Mitógeno (MAPK, tam- bém chamadas Cinase 1 e 2 Reguladas por Ligante Extracelular ou Erkl e Erk2). As MAPKs fosforilam muitos substratos incluindo fatores de transcri- ção e fazendo assim estabelecem seu programa transcricional. A participa- ção de Raf cinase na série de reação de Ras/MAPK influencia e regula mui- tas funções celulares tais como proliferação, diferenciação, sobrevivência, transformação oncogênica e apoptose.
Tanto o papel essencial quanto a posição de Raf em muitas sé- ries de reações de sinalização foram demonstrados a partir de estudos utili- zando-se mutantes de Raf inibidores dominantes e desregulados em células de mamífero bem como a partir de estudos utilizando-se organismos modelo de técnicas bioquímicas e genéticas. Em muitos casos, a ativação de Raf por receptores que estimulam fosforilação de tirosina celular é dependente da atividade de Ras, indicando que Ras funciona a montante de Raf. Na ativação, Raf-1 então fosforila e ativa Mekl, resultando na propagação do sinal para efetores a jusante, tais como MAPK (proteína cinase ativada por mitógeno) (Crews e outro (1993) Cell 74:215). As Raf serina/treonina cina- ses são consideradas como sendo efetores de Ras primário envolvidos na proliferação de células de animal (Avruch e outro (1994) Trends Biochem. Sei. 19:279).
Raf cinase tem três isoformas distintas, Raf-1 (c-Raf), A-Raf, e B-Raf1 distinguidas pela sua capacidade para interagir com Ras, para ativar série de reação de MAPK cinase, distribuição de tecido e localização sub- celular (Marias e outro, Biochem. J. 351: 289-305, 2000; Weber e outro, On- cogene 19:169-176, 2000; Pritchard e outro, Mol. Cell. Biol. 15:6430-6442, 1995).
Recentes estudos mostraram que mutação de B-Raf nos nevos da pele é uma etapa crítica no início de neoplasia melanocítica (Pollock e outro, Nature Genetics 25: 1-2, 2002). Além disso, estudos mais recentes desenvolveram que mutação ativadora no domínio de cinase de B-Raf ocor- re em cerca de 66% dos melanomas, 12% dos carcinomas de cólon e 14% de cânceres de fígado (Davies e outro, Nature 417: 949-954, 2002) (Yuen e outro, Câncer Research 62: 6451-6455, 2002) (Brose e outro, Câncer Rese- arch 62: 6997-7000, 2002).
Inibidores de série de reação de Raf/MEK/ERK ao nível de Raf cinases podem ser potencialmente eficazes como agentes terapêuticos con- tra tumores com tirosina cinases receptoras superexpressas ou mutadas, tirosina cinases intracelulares ativadas, tumores com Grb2 anormalmente expresso (uma proteína adaptadora que permite a estimulação de Ras pelo fator de permuta de Sos) bem como tumores abrigando mutações ativado- ras do próprio Raf. Em indicações clínicas precoces um inibidor de Raf-1 cinase, que também inibe B-Raf, mostrou-se uma promessa como um agen- te terapêutico em terapia de câncer (Brutomp, Current Pharmaceutical De- sign 8: 2243-2248, 2002; Sebastien e outro, Current Pharmaceutical Design 8: 2249-2253, 2002).
A interrupção da expressão de Raf em linhagens celulares atra- vés de aplicação de tecnologia anti-sentido de RNA tem mostrado suprimir igualmente a tumorigenicidade mediada por Ras e Raf (Kolch e outro, Natu- re 349: 416-428, 1991; Monia e outro, Nature Medicine 2(6): 668-675, 1996). Fatores de Crescimento de Fibroblasto
O crescimento normal, bem como reparação e remodelação de tecido, requerem controle específico e delicado da ativação de fatores de crescimento e seus receptores. Fatores de Crescimento de Fibroblastos (FGFs) constituem uma família de mais de vinte polipeptídeos estrutural- mente relacionados que são progressivamente regulados e expressos em uma ampla variedade de tecidos. FGFs estimulam proliferação, migração e diferenciação celular e desempenham um papel principal em desenvolvi- mento esquelético e de membro, cicatrização de ferimento, reparação de tecido, hematopoese, angiogênese, e tumorigênese (examinado em Ornitz, Novartis Found Svmp 232: 63-76; discussão 76-80, 272-82 (2001)).
A ação biológica de FGFs é mediada por receptores de superfí- cie celular específica que pertencem à família de RPTK de proteína cinases. Estas proteínas consistem em um domínio de ligação de Iigante extracelular, um domínio de transmembrana único e um domínio de tirosina cinase intra- celular que sofre fosforilação na ligação de FG F. Quatro FGFRs foram iden- tificados até esta data: FGFR1 (também chamado Flg, gene do tipo fms, fIt- 2, bFGFR, N-bFGFR, ou Cek1) FGFR2 (também chamado Cinase Expressa por Bek Bacteriano-, KGFR, Ksam, Ksaml e Cek3), FGFR3 (também cha- mado Cek2) e FGFR4. Todos os FGFRs maduros compartilham uma estru- tura comum que consiste em um peptídeo de sinal de terminal amino, três domínios do tipo de imunoglobulina extracelulares (domínio de I de Ig, do- mínio Il de Ig, domínio Ill de Ig), com uma região acídica entre domínios de Ig (o domínio de "caixa acídica"), um domínio de transmembrana, e domí- nios de cinase intracelulares (Ullrich e Schlessinger, Cell 61: 203,1990; Johnson e Williams (1992) Adv. Câncer Res. 60: 1-41). os isoformas de FG- FR distintas têm diferentes afinidades de ligação para os diferentes Iigantes de FGF, desse modo FGF8 (fator de crescimento induzido por androgênio) e FGF9 (fator de ativação glial) parecem ter seletividade aumentada quanto a FGFR3 (Chellaiah e outro J Biol. Chem 1994; 269: 11620).
Outra classe principal de sítios de ligação de superfície celular inclui sítios de ligação para sulfatoproteoglicanos de heparana (HSPG) que são requeridos para interação de alta afinidade e ativação de todos os membros da família de FGF. O termo específica de tecido de variantes es- truturais de sulfato de heparana confere especificidade de receptor de Iigan- te e atividade de FG Fs. Doenças Relacionadas ao FGFR
Recentes descobertas mostram quê um número crescente de anormalidades esqueléticas, incluindo acondroplasia, a forma mais comum de nanismo humano, resulta em mutações em FGFRs.
Mutações pontuais específicas em domínios diferentes de FGF- R1, FGF-R2, FGFR3 estão associadas com displasias esqueléticas huma- nas dominantes auto-sômicas classificadas como síndromes de craniossi- neostose e síndromes de nanismo (Coumoul e Deng, Birth Defects Resear- ch 69: 286-304 (2003). Displasias esqueléticas associadas às mutações de FGF-R3 incluem hipocondroplasia, acondroplasia severa com desenvolvi- mento atrasado e acantose nigricans (SADDAN) e displasia tanatofórica (TD) (Webster e outro, Trends Genetics 13 (5): 178-182 (1997); Tavormina e outro, Am. J. Hum. Genet., 64: 722-731 (1999)). Mutações de FGFR3 foram da mesma forma descritas em dois fenótipos de craniossinostose: craniossi- nostose coronal de Muenke (Bellus e outro, Nature Genetics, 14: 174-176 (1996); Muenke e outro, Am. J. Hum. Genet., 60: 555-564 (1997)) e síndro- me de Crouzon com acantose nigricans (Meyers e outro, Nature Genetics, 11: 462-464 (1995)). A síndrome de Crouzon está associada com mutações pontuais específicas em FGFR2 e ambas as formas familiares e esporádi- cas de síndrome de Pfeiffer estão associadas com mutações em FGFR1 e FGFR2 (Galvin e outro, PNAS USA, 93: 7894-7899 (1996); Schell e outro, Hum Mol Gen, 4: 323-328 (1995)). Mutações em FGFRs resultam na ativa- ção constitutiva dos receptores mutados e atividade de proteína tirosina ci- nase receptora aumentada, tornando as células e tecido incapazes de dife- renciarem-se. Especificamente, a mutação de acondroplasia resulta na estabi- lidade realçada do receptor mutado, dissociação de ativação de receptor de sub-regulação, conduzindo à maturação de condrócito reprimida e inibição de crescimento ósseo (examinado em Vajo e outro, Endocrine Reviews, 21(1): 23-39 (2000)).
Há evidência acumulada quanto a mutações que ativam FGFR3 em vários tipos de câncer.
FGFR3 constitutivamente ativado em dois cânceres epiteliais comuns, bexiga e cérvice, bem como em mieloma múltiplo, é a primeira evi- dência de um papel oncogênico para FGFR3 em carcinomas. Além disso, um estudo muito recente relata a presença de mutações ativadoras de FG- FR3 em uma grande proporção de tumores de pele benignos (Logie e outro, Hum Mol Genet 2005). FGFR3 comumente parece ser o oncogene mais fre- qüentemente mutado em câncer de bexiga onde ele é mutado em quase 50% dos casos de câncer de bexiga total e em cerca de 70% de casos ten- do tumores de bexiga superficiais (Cappellen, e outro, Nature Genetics 1999, 23; 19-20; van Rhijn, e outro, Câncer Research 2001, 61: 1265-1268; Billerey, e outro, Am. J. PathoL 2001, 158:1955-1959, WO 2004/085676). A superexpressão anormal de FGFR3 foi relatada em câncer de bexiga (su- perficial e invasivo) (Gomez-Roman e outro Clinicai Câncer research 2005).
A superexpressão anormal de FGFR3 como uma conseqüência da translocação cromossômica t(4,14) é relatada em 10 a 25% de casos de mieloma múltiplo (Chesi e outro, Nature Genetics 1997, 16: 260-264; Ri- chelda e outro, Blood 1997, 90:4061-4070; Sibley e outro, BJH 2002, 118: 514-520; Santra e outro, Blood 2003, 101: 2374-2476). Mutações ativadoras de FGFR3 são observadas em 5 a 10% de mielomas múltiplos com t(4,14) e são associadas com a progressão do tumor (Chesi e outro, Nature Genetics 1997, 16: 260-264; Chesi e outro, Blood, 97 (3): 729-736 (2001); Intini, e outro, BJH 2001,114: 362-364).
Neste contexto, as conseqüências de sinalização de FGFR3 pa- recem ser específicas do tipo de célula. Em condrócitos, a hiperativação de FGFR3 resulta em inibição do crescimento (examinado em Omitz, 2001), enquanto que na célula de mieloma ela contribui para a progressão do tu- mor (Chesi e outro, 2001).
A inibição da atividade de FGFR3 constatou-se representar um método para tratamento de doenças inflamatórias ou auto-imunes mediadas por célula T, como por exemplo, no tratamento de doenças inflamatórias ou auto-imunes mediadas por célula T incluindo mas não limitadas à artrite reumatóide (RA), artrite de colágenó II, esclerose múltipla (MS), lúpus erite- matoso sistêmico (SLE), psoríase, diabetes juvenil, doença de Sjogren1 do- ença da tiróide, sarcoidose, uveíte auto-imune, doença inflamatória do intes- 10 tino (colite de Crohn e ulcerativa), doença celíaca e miastenia grave. Veja WO 2004/110487.
Distúrbios que resultam em mutações de FGFR3 também são descritos nos WO 03/023004 e WO 02/102972.
Entre as doenças promovidas por FGFR3 e também outros FG- FRs (especialmente com relação a por exemplo, níveis de soro de FGF23 anormais), também Raquitismo Hipofosfatêmicos Dominantes Autossômicos (ADHR), raquitismos hipofosfatêmicos ligados ao cromossoma X (XLH), Os- teomalacia induzida por tumor (TIO), displasia fibrosa do osso (FH) serão mencionados (veja também X. Yu e outro, Cytokine & Growth Fator Reviews 16, 221-232 (2005), e X. Yu e outro, Therapeutic Apheresis and Dialysis 9(4), 308-312(2005)).
Amplificação e/ou süperexpressão de gene de FGFR1, FGFR2 e FGFR4 foi/foram implicada(s) no câncer de mama (Penault-Llorca e outro, Int J Câncer 1995; Theillet e outro, Genes Chrom. Câncer 1993; Adnane e outro, Oncogene 1991; Jaakola e outro, Int J Câncer 1993; Yamada e outro, Neuro Res 2002). A süperexpressão de FGFR1 e FGFR4 também está as- sociada com astrocitomas e adenocarcinomas pancreáticos (Kobrin e outro, Câncer Research 1993; Yamanaka e outro, Câncer Research 1993; Shah e outro, Oncogene 2002; Yamaguchi e outro, PNAS 1994; Yamada e outro, Neuro Res 2002). Câncer de próstata também foi relacionado a süperex- pressão de FGFR1 (Giri e outro, Clin Câncer Res 1999). FGFs/FGFRs estão também envolvidos na angiogênese. Portan- to, o alvejamento do sistema de FGFR é também previsto como uma terapia antiangiogênica para tratar tumores primários, bem como metástase. (veja por exemplo, FVesta e outro, Citokine & Growth Factor Reviews 16, Í59-178 (2005)).
Mutações, especialmente em FGFR3 (por exemplo, FGFR3b) foram também descritas ser responsáveis para ativação constitutiva destes receptores no caso de carcinoma de célula escamosa oral (veja por exem- plo, Y. Zhang e outro, Int. J. Câncer 117. 166-168 (2005).
Expressão realçada (especialmente bronquial) de FGFRs, espe- cialmente FGFR1, foi relatada estar associada com Doença Pulmonar Obs- trutiva Crônica (COPD) (veja por exemplo, A. Kranenburg e outro, J. Patol. 206.28-38(2005)).
Translocações cromossômicas envolvendo o local de FGF-R1 e resultando em formas ativadas de FGR-R1 foram relatadas ser responsáveis por síndrome mieloproliferativa 8p11 = Síndrome Mieloproliferativa Eosinofí- lica (EMS) (veja D. Macdonald e outro, Cross NCP (2002) Acta Haematolo- gica 107: 101-107).
Métodos de antagonizar FGFRs, especialmente FGFR1 ou FG- FR4, foram também descritos ser úteis no tratamento de obesidade, diabe- tes e/ou doenças relacionadas a isso, tal como síndrome metabólica, doen- ças cardiovasculares, hipertensão, níveis de triglicerídeo e colesterol anor- mais, distúrbios dermatológicos (por exemplo, infecções, veias varicosas, Acantose nigricans, eczema, intolerância a exercício, diabetes tipo 2, resis- tência à insulina, hipercolesterolemia, colelitíase, lesão ortopédica, doença tromboembólica, restrição coronária ou vascular (por exemplo, aterosclero- se), sonolência durante o dia, apnéia do sono, doenças renais em estágio terminal, doença da vesícula biliar, gota, distúrbios térmicos, resposta imune comprometida, função respiratória comprometida, infecções depois de feri- mentos, infertilidade, doença hepática, dor do dorso inferior, complicações obstétricas e ginecológicas, pancreatite, acidente vascular cerebral, compli- cações cirúrgicas, incotinência por estresse urinária e/ou distúrbios gastroin- testinais (veja por exemplo, WO 2005/037235 A2).
Fator de Crescimento de Fibroblasto Ácido (especialmente FGF- 1) e FGFR1 foram também descritos por estarem envolvidos na sinalização anormal em retinoblastoma, levando à proliferação na ligação de FGF-1 (ve- ja por exemplo, S. Siffroi-Fernandez e outro, Arch. Ophtalmology 123, 368- 376 (2005)).
O crescimento de sarcomas sinoviais mostrou ser inibido por rompimento da Série de Reação de Sinalização de Fator de Crescimento de Fibroblato (veja por exemplo, T. Ishibe et al., Clin. Câncer Res. 11 (7), 2702- 2712(2005)).
Além disso, envolvimento de FGFR no caso de carcinoma da tireóide poderia ser demonstrado.
Família de Fator de Crescimento da Epiderme e doenças relacionadas
O receptor de fator de crescimento da epiderme (EGF-R) e ErbB-2 cinase são receptores de proteína tirosina cinase que, juntos com seus membros familiares ErbB-3 e ErbB-4, desempenham um papel funda- mental na transmissão de sinal em um grande número de células de mamí- feros, incluindo células humanas, especialmente células epiteliais, células do sistema imune e células do sistema nervoso central e periférico. Por e- xemplo, em vários tipos de células, a ativação induzida por EGF de proteína tirosina cinase associada com receptor é um pré-requisito para a divisão ce- lular e conseqüentemente para a proliferação da população de células. Mais importante, a superexpressão do EGF-R (HER-1) e/ou ErbB-2 (HER-2) foi observada em frações substanciais de muitos tumores humanos. EGF-R, por exemplo, constatou ser superexpresso em cânceres de pulmão de célu- la pequena, carcinoma escamoso (cabeça e pescoço), cânceres de mama, gástricos, ovarianos, de cólon e de próstata bem como em gliomas. ErbB-2 foi constatado ser superexpresso em carcinoma escamoso (cabeça e pes- coço), cânceres de mama, gástricos, e ovarianos bem como em gliomas.
Em todos os casos mencionados acima onde proteína cinases estão envolvidas, a modulação de uma atividade anormal (especialmente a inibição de uma atividade de uma tal cinase) pode ser esperado razoavel- mente ser útil nas doenças mencionadas.
Há, desse modo, uma necessidade imprópria quanto às molécu- las seletivas e/ou altamente capazes de bloquear a atividade de proteína tirosina cinase receptora constitutiva anormal, em particular atividade de FGFR, desse modo controlando as manifestações clínicas associadas com as mutações anteriormente mencionadas, e modulando as várias funções biológicas.
Devido ao grande número de inibidores de proteína cinase e a multidão de doenças proliferativas e outras relacionadas com PK, há uma necessidade já existente de fornecer novas classes de compostos que são úteis como inibidores de PK e desse modo no tratamento destas doenças relacionadas com Proteína Tirosina Cinase (PTK). O que é requerido são novas classes de compostos de inibição de PK farmaceuticamente vantajo- sos.
Descrição geral da invenção
Foi agora constatado que os compostos produzidos em mais detalhes abaixo, que podem ser descritos como pertencendo à classe de heteroaril aril uréia, mostraram inibição de várias proteína tirosina cinases, especialmente qualquer tal cinase mencionada aqui, mais especialmente de FGFR.
Como exemplos de cinases inibidas pelos compostos da descri- ção pode haver FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4 especialmente mencio- nados. Outra cinase inibida é a tirosina cinase receptora de VEGF-R, em particular o KDR receptor de VEGF (VEGF-R2). Os compostos descritos são apropriadas para a inibição de um ou mais destes e/ou outras cinases de tirosina de proteína e/ou para a inibição de mutantes destas enzimas. Devi- do a estas atividades, os compostos podem ser utilizados para o tratamento de doenças realacionadas a, especialmente, atividade anormal ou excessiva de tais tipos de cinases, especialmente aquelas mencionadas.
Os compostos da descrição podem existir em formas diferentes, tais como ácidos livres, bases livres, ésteres e outras pró-fármacos, sais e tautômeros, por exemplo, e a descrição compreende todas as formas vari- antes dos compostos.
A extensão de proteção inclui produtos falsificados ou fraudulen- tos que contêm ou pretendem conter um composto da invenção indepen- dente de se eles de fato contêm um tal composto e independente de se qualquer tal composto está contido em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Incluído no escopo de proteção, portanto, são pacotes que incluem uma descrição ou instruções que indicam que o pacote contém uma espécie ou formulação farmacêutica ou composição da invenção e um produto que é ou compreende, ou pretende ser ou compreender, uma tal formulação, composição ou espécies.
Em toda a descrição e reivindicações desta especificação, o singular abrange o plural a menos que o contexto exija de outra forma. Em particular, onde o artigo indefinido é utilizado, a especificação deve ser en- tendida como considerada pluralidade bem como singularidade, a menos que o contexto exija de outra forma.
Aspectos, números inteiros, características, compostos, porções ou grupos químicos descritos em conjunção com um aspecto, modalidade ou exemplo particular da invenção deve ser entendido ser aplicáveis a qual- quer outro aspecto, modalidade ou exemplo descrito aqui a menos que in- compatível com este.
Em toda a descrição e reivindicações desta especificação, as palavras "compreendem" e "contém" e variações das palavras, por exemplo, "compreendendo" e "compreende", significam "incluindo, mas não limitados a", e não são pretendidas (e não pretendem) excluir outras porções, aditi- vos, componentes, números inteiros ou etapas.
Outros aspectos e modalidades da descrição são mencionados na seguinte descrição e reivindicações.
Descripão Detalhada da Invenção
Foi agora constatado que os novos compostos da fórmula IA, <formula>formula see original document page 17</formula>
(ΙΑ)
em que
dois dentre X, Y e Z são N (nitrogênio), o terceiro é CH ou N (preferivelmen- te Y e Z são N e Z é CH); e
R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, piperazin-1-ila ou 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila; ou fenila que é substituída por (i) ha- lo ou C1-C7-alcóxi e adição (ii) por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7-alquila, pirrolidino-C1-C7-alcóxi, 1 -(C1-C7- alquil)-piperidin-4-ila, morfolino-C1-C7-alcóxi, tiomorfolino-C1-C7-alcóxi, pipe- razin-1-ila, 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila, 4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1- ila, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alquila, N-mono - ou N,N-di-(C1-C7- alquil)-amino-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7- alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)- piperazin-1-il]-carbonila; R2 é hidrogênio, C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi ou halo; R3 é hidrogênio, C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, cada R4 é, independentemente dos outros, C1-C7-alquila, halo-C1-C7-alquila, halo ou C1-C7-alcóxi, e η é O, 1, 2, 3, 4 ou 5;
R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, piperazin-1-ila, 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila; N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino- C1-C7-alquila, pirrolidino-C1-C7-alcóxi, 1-(C1-C7-alquil)-piperidin-4-ila, morfoli- no-C1-C7-alcóxi, tiomorfolino-C1-C7-alcóxi, 4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila, [4- (C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)- amino-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7alquil)-amino-C1-C7-alcóxi,
em que
20 ou [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]- carbonila; ou fenila que leva um dos substituintes mencionados até agora no presente parágrafo e além disso um substituinte selecionado a partir de halo
e C1-C7-alcóxi;
R2 é hidrogênio, C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi ou halo;
R3 é hidrogênio, C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila,
R5 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, e
η é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi e ha- lo, com a condição que pelo menos um de cada dentrentre C1-C7-alquila, C1-
C7-alcóxi e halo esteja presente;
η é 2 e um R4 é halo-C1-C7-alquila, o outro R4 é C1-C7-alcóxi; η é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de halo, iodo e C1-C7-alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentrentre halo, iodo e C1-C7-alcóxi, esteja presente;
η é 3, 4 ou 5 e R4 é seleciondo a partir de halo, halo-C1-C7-alquila e C1-C7- alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentre halo, halo-C1-C7- alquila e C1-C7-alcóxi esteja presente; ou
YeZ são N (nitrogênio) e X é CH, em que ou
R1 é 3-piridila que é monossubstituída por N-C1-C7-alquil-piperazin-1-ila,
R2 é hidrogênio,
R3 é hidrogênio,
cada R4 é, independentemente dos outros, C1-C7-alquila, halo-C1-C7-alquila, halo ou C1-C7-alcóxi,
R5 é hidrogênio e η é 1, 2, 3, 4 ou 5; ou
um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é hidrogênio, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH; ou
um composto da fórmula IA em que R1 é 3-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)- fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH, ou
um composto da fórmula IA em que R1 é 3-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH, ou
um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH, ou
um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(1-etil-piperidin-4-iÍ)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, YeZsão N eXé CH, ou
um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(4-etil-pipeazin-1-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é etila, R4 é 2- e 6-cloro e 3-e 5-metóxi, n é 4, R5 é hi- drogênio, YeZ são N e X é CH, e/ou ou
um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(4-etil-piperazina-1-carbonil)- fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH; ou misturas de dois ou mais compostos da fórmula IA;
ou em cada caso de um composto da fórmula IA (como mencionado acima ou abaixo) sais, pró-fármacos, N-óxidos ou ésteres destes, são úteis no tratamento de distúrbios relacionados à atividade de proteína cinase, especialmente com respeito a doenças que podem ser tratadas por compostos de modulação de Proteína Tirosina Cinase modulando compos- tos, mais especialmente compostos de modulação de FGFR.
Portanto, a invenção refere-se a um ou mais destes compostos da fórmula IA1 sais, pró-fármacos, N-óxidos ou ésteres destes, bem como para os usos, métodos e formulações farmacêuticas mencionadas acima.
Em particular, as presentes invenções referem-se a compostos de fórmula IA, em que
dois dentre X, Y e Z são N (nitrogênio), o terceiro é CH ou N (preferivelmen- te Y e Z são N e Z é CH); e ou
(A) R1 é fenila que e substituída por hidróxi, por fenil-C1-C7alquiloxi (especi- almente benzilóxi), por piperazin-1-ila ou por 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin- 1-ila (especialmente 4-benzil-piperazin-1-ila); ou fenila que é substituída (i) (uma vez) por halo (especialmente fIuoro ou cloro) ou C1-C7-alcóxi (especi- almente metóxi) e além disso (ii) (uma vez) por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi (especialmente benzilóxi), N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7- alquila (especialmente dimetilaminometila), pirrolidino-C1-C7-alcóxi (especi- almente 2-pirrolidino-etóxi), 1-(C1-C7-alquil)-piperidin-4-ila (especialmente 1- etil-piperidin-4-il), morfolino-C1-C7-alcóxi (especialmente 2-tiomorfolino- etóxi), tiomorfolino-C1-C7-alcóxi (especialmente 2-tiomorfolino-etóxi), pipera- zin-1-ila, 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila (especialmente 4- benzilpiperazin-1-l), 4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila (especialmente 4-(metil, etil ou isopropil)-piperazin-1-il), [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alquila (especialmente 2-[4-(metil ou etil)-piperazin-1-il]-etila), N-mono- ou N,N-di- (C1-C7-alquil)-amino-C1-C7-alquila (especialmente dimetilaminometila), N- mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7-alcóxi (especialmente 2- (dimetilamino)-etóxi), [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1 -il]-C1-C7-alcóxi (especial- mente 2-(4-metilpiperazin-1-il)-etóxi) ou [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]- carbonila (especialmente 4-etilpiperazin-1-carbonila);
R2 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi ou (com preferência inferior) halo;
R3 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila (preferido) ou fenil-C1-C7-alquila, cada R4 é, independentemente dos outros, C1-C7-alquila, halo-C1-C7-alquila, halo ou C1-C7-alcóxi,
R5 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, e n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; ou
(B) em que R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi (es- pecialmente benzilóxi), piperazin-1-ila, 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila (especialmente 4-benzil-piperazin-1-ila), N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)- amino-C1-Cyalquila (especialmente dimetilaminometila), pirrolidino-C1-C7- alcóxi (especialmente 2-pirrolidino-etóxi), 1-(C1-C7-alquil)-piperidin-4-Íla (es- pecialmente 1-etil-piperidin-4-ila), morfolino-C1-C7-alcóxi (especialmente 2- morfolino-etóxi), tiomorfolino-C1-C7-alcóxi (especialmente 2-tiomorfolino- etóxi), 4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila (especialmente 4-(metil, etil ou isopro- pil)-piperazin-1-ila), [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alquila (especial- mente 2-[4-(metil ou etil)-piperazin-1-il]-etila), N-mono- ou N,N-di-(C1-C7- alquil)-amino-C1-C7-alquila (especialmente dimetilaminometila), N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-GrC7-alcóxi (especialmente 2-(dimetilamino)- etóxi), [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alcóxi (especialmente 2-(4- metilpiperazin-1-il)-etóxi) ou [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-carbonila (espe- cialmente 4-etilpiperazin-1-carbonila); ou fenila que leva um dos substituin- tes mencionados até aqui para R1 no presente parágrafo e além disso um substituinte selecionado a partir de halo e C1-C7-alcóxi; R2 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi ou (com preferência inferior) halo;
R3 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila (preferido) ou fenil-C1-C7-alquila, R5 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, e
n é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi e ha- lo, com a condição que pelo menos um de cada dentrentre C1-C7-alquila, C1- C7-alcóxi e halo esteja presente;
n é 2 e um R4 é halo-C1-C7-alquila, o outro R4 é C1-C7-alcóxi; n é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de halo, iodo e C1-C7-alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentre halo, iodo e C1-C7-alcóxi, este- ja presente;
n é 3, 4 ou 5 e R4 I selecionado a partir de halo, halo-C1-C7-alquila e C1-C7- alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentrentre halo, halo-
C1-C7-alquila e C1-C7-alcóxi esteja presente;
(C) ou um composto da fórmula IA com os nomes
1-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-3-{6-[4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino]- pirimidin-4-il}-uréia (onde, referindo-se à fórmula IA, R1 é 4-(2-morfolin-4-il- etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é hidrogênio, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5- metóxi e η é 4 e R5 é hidrogênio),
3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -metil-1 -{6-[3-(4-metil-piperazin-1 -ilmetil)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia (onde, referindo-se à fórmula IA, R1 é 3-(4- metil-piperazin-1-ilmetil)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6- cloro e 3- e 5-metóxi e η é 4, e R5 é hidrogênio), 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-{6-[3-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino]- pirimidin-4-il}-1 -metil-uréia (onde, referindo-se à fórmula IA, R1 é 3-(4-etil- piperazin-1-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e η é 4, e R5 é hidrogênio),
3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-metil-1-{6-[4-(2-morfolin-4-il-etóxi)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia (onde, referindo-se à fórmula IA, R1 é 4-(2- morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e η é 4, e R5 é hidrogênio), 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[4-(1 -etil-piperidin-4-il)-fenilamino]-
pirimidin-4-il}-1-metil-uréia (onde, referindo-se à fórmula IA, R1 é 4-(1-etil- piperidin-4-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e η é 4, e R5 é hidrogênio),
3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -etil-1 -{6-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia (onde, referindo-se à fórmula IA, R1 é 4-(4- etil-pipeazin-1-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é etila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e η é 4, e R5 é hidrogênio) ou
3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[4-(4-etil-piperazina-1 -carbonil)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia (onde, referindo-se à fórmula IA, R1 é 4-(4-etil-piperazina-1-carbonil)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é
2-e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e η é 4, e R5 é hidrogênio), (onde em cada destes compostos as porções correspondentes a R1, R2, R3, R4, R5, X, Y e Z e η na fórmula IA são definidas pelos respectivos significa- dos como determinado para estes compostos, respectivamente); onde em cada destes compostos YeZ são nitrogênio e X é CH; e em cada caso de um composto da fórmula IA (como mencionado acima ou abaixo) sais, pró-fármacos, N-óxidos ou ésteres destes.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece compostos de fórmula IA, em que
YeZ são N (nitrogênio) eXé CH, em que
R1 é 3-piridila qüe é monossubstituída por N-C1-C7-alquil-piperazin-1-ila,
R2 é hidrogênio,
R3 é hidrogênio,
cada R4 é, independentemente dos outros, C1-C7-alquila, halo-C1-C7-alquila, halo ou C1-C7-alcóxi,
R5 é hidrogênio, e η é 1, 2, 3, 4 ou 5.
Em tal modalidade, preferivelmente R4 é, independentemente dos outros, halo ou C1-C7-alcóxi, e η é preferivelmente 3, 4 ou 5, preferivel- mente 4.
Definições preferidas
Os termos gerais utilizados aqui abaixo e em seguida preferi- velmente têm dentro do contexto desta descrição os seguintes significados, a menos que de outra maneira indicado:
O prefixo "inferior" ou "C1-C7" denota um radical tendo até e in- cluindo um máximo de 7 átomos em-cadeia, especialmente até e incluindo um máximo de 4 átomos em-cadeia. Classes particulares de alquila e alifáti- co compreendem 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono. Os radicais em questão sendo ou lineares ou ramificados com ramificações únicas ou múltiplas.
Alquila inferior ou C1-C7-alquila é preferivelmente alquila com de e incluindo 1 até e incluindo 7 átomos de carbono, preferivelmente 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono, e é linear ou se ramificado; por exemplo, alquila infe- rior é butila, tal como n-butila, sec-butila, isobutila, terc-butila, propila, tal como n-propila ou isopropila, etila ou metila. Alquila inferior exemplar é meti- la, etila ou isopropila.
Onde a forma plural é utilizada para compostos, sais, e simila- res, isto é utilizado para indicar da mesma forma um único composto, sal, ou similar.
Onde fenila está presente em R1 como ligaçção de anel R1 a NR5 na fórmula IA, os substituintes de hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, pipera- zin-1-ila, 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-il; N-mono- ou N,N-di-(C1-C7- alquil)-amino-C1-C7-alquila, pirrolidino-C1-C7-alcóxi, 1 -(C1-C7-alquil)-piperidin- 4-ila, morfolino-C1-C7-alcóxi, tiomorfolino-C1-C7-alcóxi, 4-(C1-C7-alquil)- piperazin-1-ila, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)- amino-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)-pipèrazin-1-il]-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7- alquil)-piperazin-1-il]-carbonila estão preferivelmente presentes nas posições 3- ou 4- relativo à ligação a NR3.
Quaisquer átomos de carbono assimétricos podem estar presen- tes na configuração (R)-, (S)- ou (R1S)-, preferivelmente na configuração (R)- ou (S)-. Radicais tendo qualquer insaturação estão presentes na forma eis-, trans - ou (eis, trans). Os compostos podem desse modo estar presentes como misturas de isômeros ou como isômeros puros, preferivelmente como enantiômero - diastereômeros puros.
A invenção refere-se da mesma forma a possíveis tautômeros dos compostos descritos.
Devido à relação íntima entre compostos da fórmula IA na forma livre e na forma dos seus sais, incluindo aqueles sais que podem ser utiliza- dos como intermediários, por exemplo, na purificação ou identificação dos novos compostos, e tautômeros ou misturas tautoméricas e seus sais, qual- quer referência aqui anteriormente e em seguida a estes compostos, deve ser a como referindo-se da mesma forma aos tautômeros correspondentes destes compostos, ou sais de quaisquer destes, quando apropriado e con- veniente e se não mencionado de outra maneira.
Tautômeros podem, por exemplo, estar presentes em casos on- de amino ou hidróxi, cada qual com pelo menos uma ligação de hidrogênio, é ligado a átomos de carbono que são ligados a átomos adjacentes por liga- ções duplas (por exemplo, ceto-enol ou tautomeroismo de imina-enamina).
Onde "um composto..., um tautômero destes; ou um sal destes" ou similar é mèncionado, isto significa "um composto..., um tautômero des- tes, ou um sal do composto e/ou o tautômero".
Halogênio (halo) especialmente é flúor, cloro, bromo, ou iodo, especialmente (preferivelmente em compostos da fórmula I) flúor, cloro, ou iodo.
Halo-C1-C7alquila significa um C1-C7-alquila em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por átomos de halogênio, por exem- plo, trifluorometila.
[4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-carbonila significa [4-(C1-C7- alquil)-piperazin-1-il]-C(=0)-.
A presente invenção refere-se a compostos da Fórmula IA como descrito acima e sais, éster, N-óxido ou pró-fármaco destes. Em um aspec- to, portanto, a invenção fornece produtos que são compostos da Fórmula IA e/ou sais, ésteres, N-óxidos ou pró-fármacos destes.
Sais são especialmente os sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos da Fórmula (I) (ou fórmula exemplar desta), especialmente se eles estão formando grupos de formação de sal.
Grupos de formação de sal são grupos ou radicais que têm pro- priedades básicas ou acídicas. Compostos tendo pelo menos um grupo bá- sico ou pelo menos um radical básico, por exemplo, nitrogênio básico, tal como amino, um grupo amino secundário que não forma uma ligação de peptídeo ou amino terciário, podem formar sais de adição ácidos, por exem- plo, com ácidos inorgânicos, tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou um ácido fosfórico, ou com ácidos sulfônicos ou carboxílicos orgânicos adequa- dos, por exemplo, ácidos mono- ou dicarboxílicos alifáticos, tais como ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido succí- nico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido hidroximaléico, ácido málico, áci- do tartárico, ácido cítrico ou ácido oxálico, ou aminoácidos tais como argini- na ou lisina, ácidos carboxílicos aromáticos, tais como ácido benzóico, ácido 2-fenoxi-benzóico, ácido 2-acetoxi-benzóico, ácido salicílico, ácido 4- aminossalicílico, ácidos carboxílicos aromático-alifáticos, tais como ácido mandélico ou ácido cinâmico, ácidos carboxílicos heteroaromáticos, tais co- mo ácido nicotínico ou ácido isonicotínico, ácidos sulfônicos alifáticos, tais como ácido metano-, etano- ou 2-hidroxietanossulfônico, ou ácidos sulfôni- cos aromáticos, por exemplo, ácido benzeno-, p-tolueno- ou naftaleno-2- sulfônico. Quando vários grupos básicos estão presentes, sais de adição de mono- ou poliácidos podem ser formados.
Compostos que têm grupos ácidos, um grupo carbóxi ou um grupo hidróxi fenólico, podem formar sais de metal ou amônio, tais como sais de metal de álcali ou metal alcalinoterroso, por exemplo, sais de sódio, potássio, magnésio ou cálcio, ou sais de amônio com amônia ou aminas orgânicas adequadas, tais como monoaminas terciárias, por exemplo, trieti- lamina ou tri-(2-hidróxi-etil)-amina, ou bases heterocíclicas, por exemplo, N- etil-piperidina ou N,N-dimetilpiperazina. Misturas de sais são possíveis.
Compostos que têm ambos os grupos ácidos e básicos podem formar sais internos.
Para os propósitos de isolamento ou purificação, bem como no caso de compostos que são utilizados também como intermediários, é tam- bém possível utilizar sais farmaceuticamente inaceitáveis, por exemplo, os picratos. Somente sais não-tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados para propósitos terapêuticos, entretanto, e esses sais são por- tanto preferidos.
Devido à relação íntima entre os novos compostos ou N-óxidos destes na forma livre e aqueles na forma de seus sais, incluindo aqueles sais que podem ser utilizados como intermediários, por exemplo, na purifi- cação ou identificação dos novos compostos, qualquer referência aos com- postos livres (incluindo compostos da fórmula IA, intermediários e materiais de partida) aqui anteriormente e em seguida deve ser entendido como refe- rindo-se também aos N-óxidos correspondentes, e/ou sais, hidratos, solva- tos e/ou formas cristalinas dos compostos ou seus N-óxidos, como apropri- ado e expediente. Os compostos da fórmula IA (ou fórmulas exemplares destes) têm propriedades farmacológicas valiosas, como descrito anteriormente e em seguida. Biologia
A eficácia dos compostos da invenção como inibidores de ativi- dade de tirosina cinase receptora de Bcr-Abl, c-KIT, EfB4, EGF-R, VEGF-R2 (KDR), FGF-R, Tie-2 (Tek), Ret1 PDGFR, raf, FLT3, c-src e/ou FGFR3 pode ser demonstrada como segue:
No seguinte, "inibidores", "compostos ativos" ou similar refere-se a compostos da fórmula IA.
Teste para atividade contra Bcr-Abl:
A linhagem celular progenitora mielóide de murino 32Dcl3 trans- fectada com o vetor de expressão de p210 Bcr-Abl pGDp210Bcr/Abl (32D- bcr/abl) foi obtida de J. Griffin (Dana Faber Câncer Institute, Bosten, MA, E.U.A.). As células expressam a proteína de fusão de Bcr-Abl com uma abi cinase constitutivamente ativa e proliferam independente de fator de cresci- mento. As células são ampliadas em RPMI 1640 (AMIMED), soro de bezerro fetal a 10%, glutamina a 2 mM (Gibco) (,,meio completo"), e uma matéria- prima de trabalho é preparada por congelamento de alíquotas de 2 x 106 células por frasco em meio de congelamento (95% de FCS, 5% de DMSO (SIGMA)). Após descongelamento, as células são utilizadas de forma máxi- ma durante 10 a 12 passagens para as experiências. O anticorpo de domí- nio de SH3 anti-abl cat. #06-466 de Upstate Biotechnology é utilizado para o ELISA. Para detecção de fosforilação de bcr-abl, o anticorpo antifosfotirosi- na Ab PY20, rotulado com fosfatase alcalina (PY10(AP)) de ZYMED (cat. #03-7722) é utilizado. Como composto de comparação e referência, (N-{5- [4-(4-metil-piperazino-metil)-benzoilamido]-2-metilfenil}-4-(3-piridil)-2- pirimidina-amina, na forma do sal de sulfonato de metano (monomesilato) (STI571) (comercializado como Gleevec® ou Glivec®, Novartis), é utilizado. Uma solução de matéria-prima de 10 mM é preparada em DMSO e armaze- nada a -20°C. Para os ensaios celulares, a solução de matéria-prima é diluí- da em meio completo em duas etapas (1: 100 e 1: 10) para produzir uma concentração de partida de 10 μΜ seguido por preparação de diluições de três vezes em série em meio completo. Nenhum problema de solubilidade é encontrado utilizando-se este procedimento. Os compostos de teste são tra- tados analogamente. Para o ensaio, 200.000 células de 32D-bcr/abl em 50 μl são semeadas por cavidade em placas de cultura de tecido de base re- donda de 96 cavidades. 50 μl por cavidade de diluições de três vezes em série do composto teste são adicionados às células em triplicata. A concen- tração final do composto teste varia, por exemplo, de 5 μΜ até 0,01 μΜ. Cé- lulas não tratadas são utilizadas como controle. O composto é incubado jun- to com as células durante 90 minutos a 37°C, CO2 a 5%, seguido por centri- fugação das placas de cultura de tecido em 1300 rpm (centrífuga Beckman GPR) e remoção dos sobrenadantes por aspiração cuidadosa tomando cui- dado para não remover qualquer das células peletizadas. As péletes de cé- lulas são lisadas por adição de 150 μl de tampão de lise (Tris/HCl a 50 mM, pH 7,4, cloreto de sódio a 150 mM, EDTA a 5 mM, EGTA a 1 mM, NP-40 a 1% (detergente não-iônico, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alema- nha), orto-vanadato de sódio a 2 mM, sulfonilfluoreto de fenilmetila a 1 mM, aprotinina a 50 pg/ml e Ieupeptina a 80 pg/ml) e ou utilizadas imediatamente para o ELISA ou armazenadas congeladas a -20°C até o uso. O anticorpo de domínio de SH3 anti-abl é revestido a 200 ng em 50 μl de PBS por cavi- dade em placas de ELISA pretas (placas pretas Packard HTRF-96; 6005207) durante a noite a 4°C. Depois de lavar 3x com 200 μl/cavidade de PBS contendo Tween 20 a 0,05% (PBST) e TopBIock a 0,5% (Juro, Cat. #TB 232010), sítios de ligação de proteína residual são bloqueados com 200 μl/cavidade de PBST, TopBIock a 3% durante 4 horas em temperatura am- biente, seguido por incubação com 50 μl de lisados de células não tratadas ou tratadas com composto teste (20 μg de proteína total por cavidade) du- rante 3 a 4 horas a 4°C. Depois de lavar 3x, 50 μl/cavidade de PY20(AP) (Zymed) diluídos a 0,5 pg/ml em tampão de bloqueio são adicionados è in- cubados durante noite (4°C). Para todas as etapas de incubação, as placas são cobertas com seladores de placa (Costar, cat. # 3095). Finalmente, as placas são lavadas mais três vezes com tampão de lavagem e uma vez com água desionizada antes da adição de 90 μl/cavidade do substrato de AP CPDStar RTU com Emerald II. As placas agora seladas com seladores de placa Packard Top Seal®-A (cat. #6005185) são incubadas durante 45 minu- tos em temperatura ambiente no escuro e a luminescência é quantificada calculando-se as contagens por segundo (CPS) com um Contador de Cinti- lação de Microplaca Packard Top Count (Top Count). Para a versão otimi- zada final do ELISA, 50 μl dos lisados das células cultivadas, tratadas e li- sadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades, são transferidos dire- tamente destas placas para as placas de ELISA que são pré-revestidas com 50 ng/cavidade do domínio AB 06-466 ant-abl-SH3 policlonal de coelho de Upstate. A concentração antifosfotirosina AB PY20 (AP) pode ser reduzida para 0,2 pg/ml. Lavagem, bloqueio e incubação com o substrato lumines- cente são como acima. A quantificação é obtida como segue: A diferença entre a leitura do ELISA (CPS) obtida para com os lisados das células 32D- bcr/abl não tratadas e a leitura de dados para a base do ensaio (todos os componentes, mas sem o lisado celular) é calculada e considerada como 100% refletindo a proteína de bcr-abl constitutivamente fosforilada presente nestas células. A atividade do composto na atividade de bcr-abl cinase é expressa como percentual de redução da fosforilação de bcr-abl. Os valores para o IC50 são determinados a partir das curvas de dose resposta por inter- ou extrapolação gráfica. Os compostos da invenção aqui de preferência a- presentam valores de IC50 ria faixa de 15 nM a 500 μΜ, mais preferivelmen- te 15 nM a 200 μΜ. ·
Para ensaios celulares, os compostos são dissolvidos em DMSO e diluídos com meio completo para produzir uma concentração de partida de 10 μΜ seguida por preparação de diluições em série de 3 vezes em meio completo. Células 32D ou Ba/F3 expressando mutantes 'wt'-Bcr-Abl ou Bcr- Abl (por exemplo, T-315-1) foram semeadas em 200.000 células em 50 μl de meio completo, são semeadas por cavidade em placas de cultura de te- cido de base arredondada de 96 cavidades. 50 μL por cavidade de diluições em série de 3 vezes do composto teste são adicionados às células em tripli- cata. Células não tratadas são utilizadas como controle. O composto é incu- bado junto com as células durante 90 minutos a 37°C, CO2 a 5%, seguido por centrifugação das placas de cultura de tecido em 1.300 rpm (centrífuga Beckmann GPR) e remoção dos sobrenadantes por aspiração cuidadosa tomando cuidado para não remover qualquer das células peletizadas. Os péletes de células são lisados por adição de 150 μL de tampão de lise (Tris/HCI a 50 mM, pH 7,4, cloreto de sódio a 150 mM, EDTA a 5 mM, EGTA a 1 mM, NP-40 a 1%, orto-vanadato de sódio a 2 mM, PMSF a 1 mM, apro- tinina a 50 pg/mL e leupeptina a 80 pg/mL) e ou são utilizadas imediatamen- te para o ELISA ou armazenadas congeladas nas placas a -20°C até o uso.
O domínio Ab 06-466 de anti-abl-SH3 policlonal de coelho de Upstate foi revestido a 50 ng em 50 μΙ de PBS por cavidade em placas ELI- SA pretas (placas pretas Packard HTRF-96; 6005207) durante noite a 4°C. Depois de lavar 3 vezes com 200 μ L/cavidade de PBS contendo Tween20 a 0,05% (PBST) e TopBlock a 0,5% (Juro), sítios de ligação de proteína resi- duais são bloqueados com 200 pL/cavidade de PBST, TopBlock a 3% du- rante 4 horas em temperatura ambiente seguido por incubação com 50 L de lisados de células não tratadas ou tratadas com composto (20 μg de proteí- na total por cavidade) durante 3 a 4 horas a 4°C. Depois de 3 lavagens, 50 pL/cavidade de Ab PY20(AP) antifosfotirosina rotulado com fosfatase alcali- no (Zymed) diluídos em 0,2 μg/mL em tampão de bloqueio são adicionados e incubados durante noite (4°C). Durante todas as etapas de incubação, as placas são cobertas com seladores de placa (Costar). Finalmente, as placas são lavadas mais três vezes com tampão de lavagem e uma vez com água desionizada antes da adição de 90 pL/cavidade do substrato de AP CDPS- tar RTU com Emerald II. As placas agora seladas com seladores de placa Packard TopSeal™-A, são incubadas, durante 45 minutos em temperatura ambiente no escuro e a luminescência é quantificada calculando-se as con- tagens por segundo (CPS) com uma Contadora de Cintilação de Microplaca Packard Top Count (Top Count).
A diferença entre a leitura de dados de ELISA (CPS) obtida para os lisados das células de 32D-bcr/abl não tratadas e a leitura de dados para a base do ensaio (todos os componentes, mas sem o lisado celular) é calcu- lada e considerada como 100% refletindo a proteína de bcr-abl constitutiva- mente fosforilada presente nestas células. A atividade do composto sobre a atividade de Bcr-Abl cinase é expressa como o percentual de redução da fosforilação de Bcr-Abl. Os valores para a IC50 (e IC90) são determinados a partir das curvas de dose resposta por extrapolação gráfica.
Os compostos da invenção aqui de preferência apresentam va- lores de IC50 abaixo de 500 nM para inibição de autofosforilação e inibição de proliferação independente de IL-3 de mutantes de Bcr-Abl em células transfectadas com Ba/F3, em particular T315I.
As células 32D cl3 foram obtidas da American Type Culture Col- lection (ATCC CRL11346) e as células Ba/F3 da German Collection of Mi- croorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig e DSMZ Ns ACC 300) Palacios e outro, Nature, 309: 1984, 126, PubMed ID 6201749. PaIaciOS e outro, Cell, 41: 1985, 727, PubMed ID 3924409
As células Ba/F3.p210 e as células 32D cl3 hematopoiéticas de murino, (células 32D p210) foram obtidas por transfecção da linhagens celu- lares de Ba/F3 hematopoéticas de murino dependentes de IL-3 com um ve- tor pGD contendo cDNA de p21 OBCR-ABL (B2A2).
Daley e Baltimore, 1988; Sattler e outro, 1996; Okuda e outro, 1996.
Daley, G.Q., Baltimore, D., (1988) Transformation of an interleu- kin 3-dependent hematopoietic cell Iine by the chronic myeloid Ieukemia- specific p210 BCR-ABL protein. PNAS 85, 9312-9316
Sattler M, Salgia R, Okuda K, Uemura N, Durstin MA, Pisick E, e outro, (1996) The proto-oncogene product p120CBL and the adaptor prote- ins CRKL and c-CRK link c-ABL, p190BCR-ABL and p21 OBCR-ABL to the phosphatidylinositol-3' kinase pathway. Oncogene 12, 839-46.
Okuda K, Golub TR, Griffin JD. (1996) p21 OBCR-ABL, p190BCR-ABL, and TEUABL activate similar signal transduction pathways in hematopoietic cell Unes. Oncogene 13, 1147-52. Teste para atividade contra c-KIT
O vetor doador de baculovírus pFbacGOI GIBCO é utilizado pa- ra gerar um baculovírus recombinante que expressa os aminoácidos 544- 976 da região de aminoácido dos domínios de cinase citoplásmica de c-Kit humano. As seqüências de codificação para o domínio citoplásmico de c-Kit são amplificadas por PCR de uma biblioteca de c-DNA de útero humano (Clontech). O fragmento de DNA amplificado e o vetor de pFbacGOl são tornados compatíveis para ligação por digestão com BamHI e EcoRI. A li- gação destes fragmentos de DNA resulta no plasmídeo c-Kit doador de ba- culovírus. A produção dos vírus, a expressão de proteínas em células Sf9 e a purificação das proteínas fundidas por GST são realizadas como segue:
Produção de vírus: O vetor de transferência pFbacGOl -c-Kit contendo o domínio de c-Kit cinase é transfectado na linhagem de célula DH1 OBac (GIBCO) e as células transfecctadas são semeadas nas placas de ágar seletivas. Colônias sem inserção da seqüência de fusão no genoma viral (transportado pelas bactérias) são azuis. Colônias brancas isoladas são selecionadas e o DNA viral (bacmid) é isolado das bactérias através de pro- cedimentos de purificação de plasmídeo padrão. Células Sf9 ou células de Sf21 Coleção de Cultura do Tipo Americano são em seguida transfectadas em frascos de 25 cm2 com o DNA viral utilizando-se reagentes Cellfectin.
Determinação de expressão de proteína em pequena em células Sf9. Meios contendo vírus são coletados da cultura celular transfectada e utilizada para infecção para aumentar seu título. Meios contendo vírus obti- dos após dois ciclos de infecção são utilizados para expressão de proteína em grande escala. Para a expressão de proteína em grande escala, placas de cultura de tecido redondas de 100 cm2 são semeadas com 5 x 107 de de células/placas e infectadas com 1 mL de meios contendo vírus (aprox. 5 MOIs). Depois de 3 dias, as células são raspadas da placa e centrifugadas a 500 rpm durante 5 minutos. Péletes de células, de 10 a 20 placas de 100 cm2, são ressuspensas em 50 mL de tampão de lise gelado (Tris-HCl a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, NP-40 a 1%, DTT a 1 mM, PMSF a 1 mM). As células são agitadas em gelo durante 15 minutos e em seguida centrifuga- das a 5000 rpm durante 20 minutos.
Purificação de proteína rotulada por GST: O lisado celular centri- fugado é carregado em uma coluna de glutationa-sefarose de 2 mL (Phar- macia) e lavado três vezes com 10 mL de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, DTT a 1 mM, NaCI a 200 mM. A proteína rotulada por GST é eluída por 10 aplicações (1 mL cada) de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, glutationa redu- 5 zida a 10 mM, NaCI a 100 mM, DTT a 1 mM, Glicerol a 10% e armazenada a -70°C.
Ensaio de cinase: Ensaios de tirosina proteína cinase com GST- c-Kit purificado são realizados em um volume final de 30 μL contendo 200 - 1800 ng de proteína de enzima (dependendo da atividade específica), Tris- HCI a 20 mM, pH 7,6, MnCI2 a 3 mM, MgCI2 a 3 mM, DTT a 1 mM, Na3VO4 a 10 μΜ, poly(Glu,Tyr) 4:1 a 5 μg/mL, DMSO a 1%, ATP a 1,0 μΜ e [γ33P] ATP a 0,1 0.1 pCi. A atividade é analisada na presença ou ausência de inibido- res, medindo-se a incorporação de 33P de [γ33P] ATP no substrato de po- li(Glu,Tyr) 4:1. O ensaio (30 μL) é realizado em placas de 96 cavidades a temperatura ambiente durante 20 minutos sob condições descritas abaixo e terminado pela adição de 20 pL de EDTA a 125 mM. Subseqüentemente, 40 pL da mistura reacional são transferidos em membrana Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, E.U.A.) anteriormente saturada durante 5 minutos com metanol, enxaguada com água, e em seguida satuada durante 5 minu- tos com H3PO4 a 0,5% e montada em tubulação a vácuo com a fonte de vá- cuo desconectada. Após o manchamento de todas as amostras o vácuo é conectado e cada cavidade enxaguada com 200 pL de H3PO4 a 0,5%. As membranas são removidas e lavadas 4 χ em um agitador com H3PO4 a 1,0% e uma vez com etanol. As membranas são contadas após secagem à temperatura ambiente, montagem em estrutura de 96 cavidades Packard TopCount, e adição de 10 pL/cavidade de Microscint ®(Packard). Valores de IC50 são calculados por análise de regressão linear do percentual de inibição de cada composto em duplicata, a quatro concentrações (normalmente 0,01, 0,1, 1 e 10 μΜ). Uma unidade de atividade de proteína cinase é definida como 1 nmol de 33P ATP transferido de [Y33P] ATP para a proteína de subs- trato por minuto por mg de proteína a 37°C. Valores de IC50 variando préfe- rivelmente entre 50 nM a 500 μΜ pode ser encontrado com um composto da fórmula IA de acordo com a invenção. Teste para atividade contra EfB4
A eficácia de compostos da fórmula I como inibidores ou cinases receptoras de Efrina B4 (EphB4) pode ser demonstrada como segue: Geração de vetor de expressão de fusão por GST Bac-to-Bac® (Invitrogen Life Technologies, Basel, Suíça): Regiões de codificação citoplasmática in- teiras da classe de EphB são amplificadas por PCR a partir de bibliotecas de cDNA derivadas de placenta ou cérebo humano, respectivamente. Baculoví- rus recombinantes são gerados os quais expressam a região 566-987 de aminoácido do receptor de EphB4 humano (SwissProt Database, Acessão Ns P54760). A seqüência de GST é clonada em vetor de pFastBaCi® (Invi- trogen Life Technologies, Basel, Suíça) e PCR amplificado. Domínios de receptor de EphB4 codificando cDNAs, respectivamente são clonados na estrutura 3' principal para a seqüência de GST neste vetor de FastBaCi mo- difiçado para gerar vetores doadores pBac-to-Bac®. Colônias isoladas origi- nando-se da transformação são inoculadas para produzir durante a noite culturas para preparação de plasmídeo de pequena escala. A análise de enzima de restrição de DNA de plasmídeo revela que vários clones contêm inserções do tamanho esperado. Pelo seqüenciamento automatizado as in- serções e aproximadamente 50 bp das seqüências de vetor de flanquea- mento são confirmadas em ambos os filamentos.
Produção de vírus: Vírus para cada uma das cinases são produzidos de acordo com o protocolo fornecido por GIBCO se não estabelecido de outra forma. Em resumo, vetores de transferência contendo os domínios de cina- se são transfectados nas linhagens celulares de DHIOBac (GIBCO) e se- meados em placas de ágar seletivas. Colônias sem inserção da seqüência de fusão no genoma viral (transportado pelas bactérias) são azuis. Colônias brancas isoladas são selecionadas e o DNA viral (bacmid) isolado das bac- térias através de procedimentos de purificação de plasmídeo padrões. Célu- las Sf9 ou células Sf21 são em seguida transfectadas em frascos de 25 cm2 com o DNA viral utilizando-se reagente Cellfectin de acordo com o protocolo. Purificação de cinases rotuladas por GST: O Iisado celular centrifugado é carregado em uma coluna de glutationa-sefarose de 2 ml_ (Pharmacia) e lavado três vezes com 10 mL de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2mM, DTT a 1 mM, NaCI a 200 mM. As proteínas rotuladas por GST- são em se- guida eluídas por 10 aplicações (1 mL cada) de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, glutationa reduzida a 10 mM, NaCI a 100 mM, DTT a 1 mM, Glicerol a 10% e armazenadas a -70gC.
Ensaios de proteína cinase: As atividades de proteína cinases são anali- sadas na presença ou ausência de inibidores, medindo-se a incorporação de 33P de [t^PJATP em um polímero de ácido glutâmico e tirosina (po- Ii(GIu1Tyr)) como um substrato. Os ensaios de cinase com GST-EphB purifi- cado (30 ng) são realizados durante 15-30 minutos a temperatura ambiente em um volume final de 30 μL contendo Tris HCI a 20 mM, pH 7,5, MgCI2 a 10 mM, MnCI2 a 3 - 50 mM, Na3VO4 a 0,01 mM, DMSO a 1%, DTT a 1 mM, poli(Glu,Tyr) 4:1 a 3 pg/mL (Sigma; St. Louis, Mo., E.U.A.) e ATP a 2,0 - 3,0 μΜ (γ-[33Ρ]-ΑΤΡ 0,1 pCi). O ensaio é terminado pela adição de 20 μ!_ de EDTA a 125 mM. Subseqüentemente, 40 μΙ da mistura reacional são trans- feridos em membrana ImmobiIon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, E.U.A.) an- teriormente saturada durante 5 minutos com metanol, enxaguada com água, em seguida saturada durante 5 minutos com H3PO4 a 0,5% e montada em tubulação a vácuo com fonte de vácuo desconectada. Após o manchamento de todas as amostras, o vácuo é conectado e cada cavidade enxaguada com 200 μΐ de H3PO4 a 0,5%. As membranas são removidas e lavadas 4 χ em um agitador com H3PO4 a 1,0%, uma vez com etanol. As membranas são contadas após secagem à temperatura ambiente, montagem em estru- tura de 96 cavidades Packard TopCount, e adição de 10 μL cavidade de Microscint® (Packard). Os valores de IC50 são calculados por análise de re- gressão linear do percentual de inibição de cada composto em duplicata, em quatro concentrações (normalmente 0,01, 0,1, 1 e 10 μΜ). Uma unidade de atividade de proteína cinase é definida como 1 nmol de 33P ATP transferido de [T33P] ATP para a proteína de substrato por minuto pôr mg de proteína a 37 2C. Valores de IC5o preferivelmente variando de 50 nM a 500 μΜ pode ser encontrado com compostos da fórmula IA de acordo com a invenção. Teste para atividade contra EGF-R:
A inibição de atividade de EGF-R tirosina cinase pode ser de- monstrada utilizando-se métodos conhecidos, por exemplo, utilizando-se o domínio intracelular recombinante do receptor de EGF [EGF-R ICD; veja, por exemplo, E. McGIynn e outro, Europ. J. Biochem. 207, 265-275 (1992)]. Comparados com o controle sem inibidor, os compostos de fórmula I inibem a atividade de enzima em 50% (IC50), por exemplo, em uma concentração de 0,5 a 500 μΜ.
Bem como ou em vez de inibir atividade de EGF-R tirosina cina- se, os compostos de fórmula IA também inibem outros membros desta famí- lia de receptores, como ErbB-2. A atividade inibidora (IC50) está aproxima- damente na faixa de 0,01 a 500 μΜ. A inibição de ErbB-2 tirosina cinase (HER-2) pode ser determinada, por exemplo, analogamente ao método utili- zado para EGF-R proteína tirosina cinase [veja C. House e outro, Europ. J. Biochem. 140, 363-367 (1984)]. A ErbB-2 cinase pode ser isolada, e sua atividade determinada, por meio de protocolos conhecidos de per si, por e- xemplo, de acordo com T. Akiyama e outro, Science 232, 1644 (1986).
Teste para atividade contra VEGF-R2 (KDR):
A inibição de autofosforilação de receptor induzida por VEGF pode ser confirmada com outros experimentos in vitro em células tais como células de CHO transfectadas, que permanentemente expressam de recep- tor de VEGF-R2 humano (KDR), são semeadas em meio de cultura comple- to (com soro de bezerro fetal a 10% = FCS) em placas de cultura de células de 6 cavidades e incubadas a 37°C sob CO2 a 5% até que eles apresentem cerca de 80% de confluência. Os compostos a serem testados são em se- guida diluídos em meio de cultura (sem FCS, com albumina de soro bovino a 0,1%) e adicionados às células. (Controles compreendem meio sem com- postos teste). Depois de duas horas de incubação a 37eC, VEGF recombi- nante é adicionado; a concentração de VEGF final é 20 ng/ml. Depois de uma outra incubação de cinco minutos a 372C, as células são lavadas duas vezes com PBS gelado (salina tamponada por fosfato) e imediatamente li- sadas em 100 μl de tampão de Iise por cavidade. Os Iisados são em seguida centrifugados para remover os núcleos de células, e as concentrações de proteína dos sobrenadantes são determinadas utilizando-se um ensaio de proteína comercial (BIORAD). Os Iisados podem então ou ser imediatamen- te utilizados ou', se necessário, armazenados a -20°C.
Um teste ELISA intercalado é realizado para medir a fosforilação de VEGF-R2: um anticorpo monoclonal para VEGF-R2 (por exemplo, Mab 1495.12.14; preparado, por H. Towbin, Novartis ou anticorpo monoclonal comparável) é imobilizado em placas de ELISA pretas (OptiPlate® HTRF-96 de Packard). As placas são em seguida lavadas e os sítios de ligação de proteína livre restantes são saturados com TopBlock® a 3% (Juro, Cat. #TB232010) em solução salina tamponada por fosfato com Tween 20® (monolaurato de polioxietileno(20)sorbitano, ICI/Uniquema) (PBST). O Usa- dos de células (20 pg de proteína por cavidades) são em seguida incubados nestas placas durante a noite a 4SC juntos com um anticorpo antifosfotirosi- na acoplado com fosfatase alcalina (PY20:AP de Zymed). As placas são lavadas de novo e a ligação do anticorpo de antifosfotirosina ao receptor fosforilado capturado é em seguida demonstrada utilizando-se um substrato AP Iuminescente (CDP-Star, pronto para o uso, com Emerald II; Applied Bi- osystems). A luminescência é medida em um Contador de Cintilação de Mi- croplaca Packard Top Count. A diferença entre o sinal do controle positivo (estimulado com VEGF) e aquele do controle negativo (não estimulado com VEGF) corresponde à fosforilação de VEGF-R2 induzida por VEGF (= 100%). A atividade das substâncias testadas é calculada como percentual de inibição de fosforilação de VEGF-R2 induzida VEGF, onde a concentra- ção de substância que induz metade da inibição máxima é definida como o IC5O (dose inibidora para 50% de inibição). Valores de IC50 preferivelmente variando de 20 nM a 500 μΜ podem ser encontrados com compostos da fórmula IA de acordo com a invenção.
Teste para atividade contra proteína cinases recombinantes Ret (Ret- Men2A), Tie-2 (Tek) e FGFR3-K650E:
Clonagem e expressão de proteína cinases recombinantes: (Ret); O Ve- tor doador de Baculovírus pFB-GSTX3 foi utilizado para gerar um Baculoví- rus recombinante que expressa a região 658-1072 de aminoácidos do do- mínio de cinase intra-citoplásmica de Ret-Men2A humano que corresponde ao domínio de cinase do tipo selvagem de Ret. A seqüência de codificação para o domínio citoplásmico de Ret foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo RET-Men2A de pBABEpuro que foi recebido do Dr. James Fagin, Faculdade de Medicina, Universidade de Cincinnati (colaboração de Novar- tis). Os fragmentos de DNA amplificados e o vetor pFB-GSTX3 tornaram-se compatíveis para ligação por digestão com Sall e Kpnl. A ligação destes fragmentos de DNA resultou no plasmídeo doador de baculovírus pFB-GX3- Ret(-Men2A).
(Tie-2/Tek): O vetor doador de baculovírus pFbacGOl foi utilizado para gerar um baculovírus recombinante que expressou os 773-1124 aminoácidos da região de aminoácido do domínio de cinase citoplásmica Tek humana, N- terminalmente fundido em GST (Fornecido por Dr. Marmé, Institute of Mole- cular Medicine, Freiburg, Germany based on a Reseach Collaboration). Tek foi reclonada no vetor de transferência pFbacGOl por excisão de EcoRI e ligação no pFbacGOl digerido por EcoRI (FBG-Tie2/Tek). (FGFR-3-K650E): O vetor doador de baculovírus pFastBacGST2 foi utilizado para gerar um baculovírus recombinante que expressou os aminoácidos 411-806 da região de aminoácidos (aa) do domínio citoplásmico de FGFR-3 humano, N-terminalmente fundido a GST (Fornecido pelo Dr. Jim Griffin, Dana Farber Câncer Institute, Boston, E.U.A. based on a Research Collabo- ration). O DNA codificando os aminoácidos 411-806 foi amplificado por P- CR, inserido no vetor de pFastBac-GT2 para produzir pFB-GT2-FGFR3-wt. Este plasmídeo foi por sua vez utilizado para gerar um vetor codificando FGFR3(411-806) com uma mutação em K650 utilizando-se o Kit de Muta- gênese Direcionada ao Sítio Stratagene XL para produzir pFB-GT2-FGFR3- K650E. A produção dos vírus, a expressão de proteínas em células Sf9 e a purificação das proteínas fundidas por GST foram realizadas tal como des- crito nas seções seguintes.
Produção de vírus: Vetores de transferência contendo os domínios de ci- nase foram transfectados na linhagens celulares DHIOBac (GIBCO) e se- meados em placas de ágar seletivas. Colônias sem inserção da seqüência de fusão no genoma viral (transportado pelas bactérias) são azuis. Colônias brancas isoladas foram selecionadas e o DNA viral (bacmid) isolado das bactérias através de procedimentos padrões de purificação de plasmídeo. Células Sf9 ou células de Sf21 foram em seguida transfectadas em frascos de 25 cm2 com o DNA viral utilizando-se reagente Cellfectin. Determinação de expressão de proteína em pequena escala em células Sf9: Meios contendo vírus foram coletados da cultura de células transfecta- das e utilizados para infecção para aumentar seu título. Meios contendo ví- rus obtidos depois de dois círculos de infecção foram utilizados para expres- são de proteína em grande escala. Para expressão de proteína de grande escala, placas de cultura de tecido redondas de 100 cm2 foram semeados com 5 x 107 de células/placa e infectadas com 1 mL de meios contendo ví- rus (aprox. 5 Mols). Depois de 3 dias, as células foram raspadas da placa e centrifugadas em 500 rpm durante 5 minutos. Péletes de célula de 10 a 20 placas de 100 cm2 foram ressuspensas em 50 mL de tampão de lise gelado (Tris-HCI a 25mM, pH 7,5, EDTA a 2mM, NP-40 a 1%, DTT a 1mM, PMSF a 1mM). As células foram agitadas em gelo durante 15 minutos e em seguida centrifugadas a 5000 rpm durante 20 minutos.
Purificação de proteínas rotuladas por GST: O lisado celular centrifugado foi carregado em uma coluna de glutationa-sefarose de 2 mL e lavado três vezes com 10 mL de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, DTT a 1 mM, NaCI a 200 mM. As proteínas rotuladas por GST foram em seguida eluídas por 10 aplicações (1 mL cada) de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, glutationa redu- zida a 10 mM, NaCI a 100 mM, DTT a 1 mM, Glicerol a 10% e armazenadas a -70°C.
Medida da atividade de enzima: Ensaios de tirosina proteína cinase com qualquer um GST-Ret, GST-Tek ou GST-FGFR-3-K650E purificado foram realizados em um volume final de 30 μL com concentrações finais dos com- ponentes seguintes: Ret incluiu 15 ng de GST-Ret, Tris-HCI a 20 mM, pH 7,5, MnCI2 a 1 mM, MgCI2 a 10 mM, DTT a 1 mM, poli(Glu,Tyr) 4:1 a 3 μg/mL, DMSO a 1 % e ATP a 2,0 μΜ (γ-[33Ρ]-ΑΤΡ 0,1 μCi). Tek incluiu 150 ng de GST-Tek, Tris-HCI a 20 mM, pH 7,5, MnCI2 a 3 mM, MgCI2 a 3 mM, DTT a 1 mM, Na3VO4 a 0,01 mM, PEG 20.000 a 250 pg/mL, poli(Glu,Tyr) 4:1 a 10 pg/mL, DMSO a 1% e ATP a 4,0 μΜ (y-[33P]-ATP 0,1 pCi). FGFR- 3-K650E incluiu 10 ng de GST-FGFR-3-K650E, Tris-HCI a 20 mM, pH 7,5, MnCl2 a 3 mM, MgCl2 a 3 mM, DTT a 1 mM, PEG 20.000 a 0,01 mM, po- li(GIu1Tyr) 4:1 a 10 pg/mL, DMSO a 1% e ATP a 4,0 μΜ (y-[33P]-ATP 0,1 pCi). A atividade foi analisada na presença ou ausência de inibidores, me- dindo-se a incorporação de 33P de [y33P] ATP em poli(Glu,Tyr) 4:1. O ensaio foi realizado em placas de 96 cavidades à temperatura ambiente durante 30 minutos sob condições descritas abaixo e terminado pela adição de 50 μl de EDTA a 125 mM. Subseqüentemente, 60 μL da mistura reacional foram transferidos em membrana Immobilon-PVDF (Millipore) anteriormente satu- rada durante 5 minutos com metanol, enxaguada com água, em seguida saturada durante 5 minutos com H3PO4 a 0,5% e montado em tubulação a vácuo com a fonte de vácuo desconectada. Após o manchamento de todas as amostras o vácuo foi conectado e cada cavidade enxaguada com 200 μl H3PO4 a 0,5%. As membranas foram removidas e lavadas 4 χ em um agita- dor com H3PO4 a 1,0%, uma vez com etanol. As membranas foram conta- das depois de secagem à temperatura ambiente, montagem em estrutura de 96 cavidades Packard TopCount, e adição de 10μL/cavidade de Microscint® (Packard). Os valores de IC50 foram calculados através de análise de re- gressão linear do porcentual de inibição de cada composto erri duplicata, em quatro concentrações (normalmente 0,01, 0,1, 1 e 10 μΜ). Uma unidade de atividade de proteína cinase é definida como 1 nmol de 33P ATP transferida de [Y33P] ATP para a proteína de substrato por minuto por mg de proteína a 37°C. Valores de IC50 preferivelmente variando de 50 nM a 500 μΜ podem ser encontrados com compostos da fórmula IA de acordo com a invenção.
FGFR3 (Ensaio Enzimático)
Ensaio de atividade de cinase com FGFR3 purificado (Upstate) é realizado em um volume final de 10 μι. contendo 0,25 μg/mL de enzima em tampão de cinase (Tris-HCl a 30 mM, pH 7,5, MgCl2 a 15 mM, MnCl2 a 4,5 mM, Na3VO4 a 15 μΜ e BSA a 50 μg/mL), e substratos (biotina-poli- EY(Glu, Tyr) a 5 pg/mL (CIS-US, Inc.) e ATP a 3 μΜ). Duas soluções são preparadas: a primeira solução de 5 μΙ contém a enzima de FGFR3 em tam- pão de cinase foi primeiro distribuída em ProxiPlate® formato 384 (Perkin- Elmer) seguida por adição de 50 nL de compostos dissolvidos em DMSO, em seguida 5 μΙ da segunda solução contendo o substrato (poli-EY) e ATP em tampão de cinase foram adicionados a cada cavidade. As reações são incubadas a temperatura ambiente durante uma hora, interrompidas por adi- ção de 10 μL de mistura de detecção de HTRF1 que contém Tris-HCl a 30 mM, pH 7,5, M KF a 0,5, ETDA a 50 mM, BSA a 0,2 mg/mL, estreptavidina- XL665 a 15 μg/mL (CIS-US, Inc.) e anticorpo antifosfotirosina conjugado com criptato a 150 ng/mL (CIS-US, Inc.). Depois de uma hora de incubação à temperatura ambiente para permitir interação de estreptavidina-biotina, sinais florescentes resolvidos com o tempo são lidos em Analyst GT (Mole- cular Devices Corp.). Valores de IC5o são calculados por análise de regres- são linear da inibição em porcentagem de cada composto em 12 concentra- ções (diluição de 1:3 de 50 μΜ a 0,28 nM). Neste ensaio, os compostos da invenção, por exemplo, podem preferivelmente ter uma IC50 na faixa de 2 nM a 400 μΜ, mais preferivelmente na faixa de 5 nM a 100 μΜ. FGFR3 (Ensaio Celular)
Os compostos da invenção (= da fórmula IA) são testados quan- to a sua capacidade de inibir proliferação de células Ba/F3-TEL-FGFR3 transformadas, que depende da atividade de cinase celular de FGFR3. Ba/F3-TEL-FGFR3 são cultivadas até 800.000 célula/mL em suspensão, com RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10% como o meio de cultura. As células são distribuídas em placas de formato de 384 cavidades a 5000 célula/cavidade em 50 μL de meio de cultura. Os compostos da in- venção são dissolvidos e diluídos em dimetilsufóxido (DMSO). Diluições em série 1:3 de doze pontos são preparadas em DMSO para criar gradiente de concentrações variando tipicamente de 10 mM a 0,05 μΜ. As células são adicionadas com 50 nL de compostos diluídos e incubados durante 48 horas em incubadora de cultura de células. AlamarBIue® (TREK Diagnostic Sys- tems) que pode ser utilizado para monitorar a redução de ambiente criada pela proliferação das células, é adicionado às células a concentração final de 10%. Depois de quatro horas adicionais de incubação em uma incubado- ra de cultura celular a 37°C, sinais de fluorescência de AlamarBlue® reduzi- do (Excitação a 530 nm, Emissão a 580 nm) são quantificados em Analyst GT (Molecular Devices Corp.). Valores de IC5o são calculados por análise de regressão linear da inibição em porcentagem de cada composto em 12 con- centrações. Valores de IC50 preferivelmente variando de 2 nM a 400 μΜ po- dem ser encontrados com um composto da fórmula IA de acordo com a in- venção.
Upstate KinaseProfiler® - Ensaio de ligação de filtragem radioenzimá- tica
Os compostos da invenção são avaliados quanto a sua capaci- dade de inibir membros individuais de um painel de cinases (uma lista parci- al, não Iimitante de cinases inclui: Abl, BCR-Abl, BMX, FGFR3, Lck, JNK1, JNK2, CSK, RAF, MKK6 e P38). Os compostos são testados em duplicatas a uma concentração final de 10 μΜ seguindo este protocolo genérico. Nota- se que a composição de tampão de cinase e os substratos variam para as diferentes cinases incluídas no painel "Upstate KinaseProfiler®". Os com- postos são testados em duplicatas a uma concentração final de 10 μΜ se- guindo este protocolo genérico. Note que a composição de tampão de cina- se e os substratos variam para as diferentes cinases incluídas no painel "Upstate KinaseProfiler®". Tampão de cinase (2,5 μL., 10 x - contendo MnCl2 quando requerido), cinase ativa (0,001 - 0,01 Unidade; 2,5 μL), peptídeo de Poli(Glu4-Tyr) ou específico (5 - 500 μΜ ou 0,01 mg/ml) em tampão de ci- nase e tampão de cinase (50 μΜ; 5 μL) são misturados em um eppendorf em gelo. Uma mistura de Mg/ATP (10 μι; MgCI2 a 67,5 (ou 33,75) mM, ATP a 450 (ou 225) μΜ e [γ-32Ρ]-ΑΤΡ a 1 μCi/μl (3000 Ci/mmols)) é adicionada e a reação é incubada a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 10 minutos. A mistura reacional é manchada (20 μL) em um P81 de 2 cm x 2 cm (fosfocelulose, para substratos de peptídeo positivamente carregados) ou quadrado de papel Whatman Ne 1 (para substrato de peptídeo de Poli (Glu4-Tyr)). Os quadrados de ensaio são lavados 4 vezes, durante 5 minu- tos cada, com ácido fosfórico a 0,75% e lavados uma vez com acetona du- rante 5 minutos. Os quadrados de ensaio são transferidos para um frasco de cintilação, 5 ml de coquetel de cintilação são adicionados e a incorporação 32P (cpm) ao substrato de peptídeo é quantificada com um contador de cinti- lação Beckman. A inibição em porcentagem é calculada para cada reação.
Os compostos da fórmula IA podem também inibir outras tirosina proteína cinases tal como especialmente a cinase c-Src que desempenha um papel em regulação de crescimento e transformação em animais, espe- cialmente células de mamífero, incluindo células humanas. Um ensaio apro- priado é descrito em Andre-jauskas-Buchdunger e outro, Câncer Res. 52, 5353-8 (1992). Utilizando-se este sistema de teste, compostos da fórmula IA podem mostrar valores de IC50 para inibição de c-Src na faixa de por exem- plo, 0,05 a 500 μΜ.
Além disso, compostos da fórmula IA podem também ser utiliza- dos para inibir b-raf (V599E). A atividade de B-Raf-V599E é avaliada na pre sença ou ausência de inibidores que medem a incorporação de 33P de [γ33P]ATP em (His)-I.Β. O composto teste é dissolvido em DMSO (10 mM) e armazenado a - 20°C. Diluições seriais são feitas em DMSO frescamente e também diluídas com água pura para obter soluções de teste concentradas 3 vezes em 3% de DMSO. O volume final (30 μl) do ensaio contém 10 μl de solução teste (DMSO a 1%), 10 μl de mistura de ensaio (20 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 3 mM de MnCI2, 3 mM de MgCl2, 1 nM de DTT, 3 μg/ml (His)-IkB. 1 % de DMSO e 3,5 μΜ de ATP [γ33P]-ATP 0,1 μCi) e 10 μl de diluição de en- zima (600 ng of GST-B-Raf-V599E). As etapas de pipetagem são progra- madas para ser realizadas nos robôs MultiPROBE lix,- MultiPROBE IILx ou HamiltonSTAR no formato de 96 cavidades. O ensaio é realizado como des- crito na literatura (veja C. Garcia-Echeverria e outro, Câncer Cel.. 5, 231-9 (2004)) terminado pela adição de 20 μl de 125 mM de EDTA. A captura dos peptídeos fosforilados pelo método de ligação de filtro é realizada como se- guindo: 40 μl da mistura reacional são transferidos em membranas de Im- mobilon-PVDF previamente impregnadas durante 5 minutos com metanol, enxaguado com água, em seguida empregnado durante 5 minutos com 0,5% de H3PO4 e montado em tubulação a vácuo com fonte a vácuo desco- nectada. Depois de manchar todas as amostras, vácuo é conectado e cada cavidade enxaguada com 200 μl de 0,5% de H3PO4. Membranas livres são removidas e lavadas 4 x em um agitador com 1,0% de H3PO4, uma vez com etanol. Membranas são contadas depois de secar em temperatura ambien- te, montando em estrutura de 96 cavidades Packard TopCount 96 e adição de 10 μl/cavidade de Microscint®. As placas são eventualmente seladas e contadas em uma contadora de cintilação de microplaca (TopCount NXT, TopCount NXT HTS). No caso do método de placa flash, a reação de cinase é primeiro realizada em placas de plástico com base em poliestireno e em seguida interrompida depois de 60 minutos pela adição de 20 μl de 125 mM de EDTA. Para capturar (60 minutos, RT), o substrato biotinilado é transferi- do em placas flash revestidas por Níquel. As placas de ensaio são lavadas três vezes com PBS e secadas em temperatura ambiente. Posteriormente, as placas são seladas e contadas em uma contadora de cintilação de mi- croplaca (TopCount NXT, TopCount NXT HTS). Valores de IC50 são calcula- dos por análise de regressão linear de inibição de porcentagem pelo com- posto em duplicata, em quatro concentrações (normalmente 0,01, 0,1, 1 e 10 μΜ) ou como IC5o de único ponto 8 partindo a 10 μΜ seguido por 1:3 dilu- ições. Para inibição de b-raf, compostos da fórmula que IA preferivelmente podem mostrar valores de IC50 na faixa de 0,05 a 500 μΜ. Cinase receptora de FLT3
Para procurar compostos marcadores por FLT3, dois tipos dife- rentes de ensaios podem ser utilizados:
Atividade de Flt3 cinase é determinada como segue: O vetor doador de baculovírus pFbacGOI (GIBCO) é utilizado para gerar um baculo- vírus recombinante expressando a região de aminoácido a de aminoácidos 563-993 do domínio de cinase citoplásmico de Flt3 humano. A seqüência de codificação para o domínio citoplásmico de Flt3 é ampliada por PCR de bi- bliotecas de c-DNA humanas (Clontech). Os fragmentos de DNA ampliados e o vetor de pFbacGOI são feitos compatíveis para ligação por digestão com BamHI e Hindlll. Ligação destes fragmentos de DNA resulta no plasmídeo doador de baculovírus Flt-3(1,1). A produção dos vírus, a expressão de pro- teína em células Sf9 e a purificação da proteína fundida por GST é realizada como segue:
Produção de vírus: Vetor de transferência (pFbacG01-Flt-3) contendo o do- mínio de Flt3-cinase é transfectado na linhagem de célula DHIOBac (GIB- CO) e as células transfecctadas são semeadas nas placas de ágar seletivas. Colônias sem inserção da seqüência de fusão no genoma viral (transportado pelas bactérias) são azuis, Colônias brancas isoladas são selecionadas e o DNA viral (bacmid) é isolado das bactérias através de procedimentos de pu- rificação de plasmídeo padrões. Células Sf9 e Sf21 (American Type Culture Collection) são em seguida transfectadas em frascos com o DNA viral utili- zando-se reagente de Cellfectin.
Determinação de expressão de proteína em escala pequena em células Sf9: Meios contendo vírus são coletados a partir da cultura de célula trans- fectadas e utilizados para infecção para aumentar seu título. Meios contendo vírus obtidos após dois ciclos de infecção são utilizados para expressão de proteína em grande escala. Para a expressão de proteína em grande escala, placas de cultura de tecido redondas de 100 cm2 são semeadas com 5 χ 107 de células/placas e infectadas com 1 mL de meios contendo vírus (aproxi- madamente 5 MOIs). Depois de 3 dias, as células são raspadas da placa e centrifugadas a 500 rpm durante 5 minutos. Péletes de células, de 10 a 20 placas com cada qual 100 cm2, são ressuspensas em 50 mL de tampão de lise gelado (Tris-HCl a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, NP-40 a 1%, DTT a 1 mM, PMSF a 1 mM). As células são agitadas em gelo durante 15 minutos e em seguida centrifugadas a 5000 rpm durante 20 minutos.
Purificação de proteína rotulada por GST: O Iisado celular centrifugado é carregado em uma coluna de glutationa-sefarose de 2 mL (Pharmacia) e lavado três vezes com 10 mL de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, DTT a 1 mM, NaCI a 200 mM. A proteína rotulada por GST é eluída por 10 aplicações (1 mL cada) de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, glutationa reduzida a 10 mM, NaCI a 100 mM, DTT a 1 mM, Glicerol a 10% e armazenada a - 70°C. Medida de atividade de Enzima: Ensaios de Tirosina proteína cinase com GST-Flt2 purificado são realizados em um volume final de 30 μl contendo 200 - 1800 ng de proteína de enzima (dependendo da atividade específica), Tris-HCI a 20 mM, pH 7,6, MnCI2 a 3 mM, MgCI2 a 3 mM, DTT a 1 mM, Na3VO4 a 10 μΜ, poly(Glu,Tyr) DMSO a 1%, ATP a 6,0 μΜ e [γ33Ρ]ΑΤΡ a 0,1 μCi. A atividade é analisada na presença ou ausência de inibidores, me- dindo-se a incorporação de 33P de [/3P] ATP no substrato de poli(Glu.Tyr). O ensaio (30 μL por cavidade) é realizado em placas de 96 cavidades em temperatura ambiente durante 20 minutos sob condições descritas abaixo e terminado pela adição de 20 μL de EDTA a 125 mM. Subseqüentemente, 40 μL. da mistura reacional são transferidos em membrana ImmobiIon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, E.U.A.) anteriormente saturada durante 5 minutos com metanol, erixaguada com água, e em seguida satuada durante 5 minu- tos com H3PO4 a 0,5% e montada em tubulação a vácuo com a fonte de vá- cuo desconectada. Após o manchamento de todas as amostras o vácuo é conectado e cada cavidade enxaguada com 200 μL_ H3PO4 a 0,5%. As membranas são removidas e lavadas 4 x em um agitador com H3PO4 a 1,0% e uma vez com etanol. As membranas são em seguida contadas indi- vidualmente depois da secagem em temperatura ambiente, montagem em estrutura de 96 cavidades Packard TopCount, e adição de 10 ^L/cavidade de Microscint® (Packard). Valores de IC5o são calculados por análise de re- gressão linear do percentual de Inibição de cada composto em duplicata, em quatro concentrações (normalmente 0,01, 0,1, 1 e 10 μΜ). Uma unidade de proteína cinase é definida como 1 nmol de 33P ATP transferido de [γ33Ρ] ATP ao polipeptídeo de substrato por minuto por mg de proteína a 37°C. Os compostos da fórmula IA aqui preferivelmente pode mostrar valores de IC50 na faixa entre 0,05 e 500 μΜ.
Alternativamente ou além disso, uma ensaio com base em célu- la pode ser utilizado para identificar inibidores de tirosina cinase receptoras de FLT3 mutante. A técnica geral envolve comparar os efeitos de possíveis inibidores em linhagem celular que dependem do FLT3 mutante para prolife- ração, versus linhagens celulares que não dependem de FLT3 mutante para proliferação. Linhagens celulares expressando duas formas diferentes de FLT3 mutado, ativado são utilizadas:
- Células de Ba/F3-FLT3-ITD expressando um mutante de FLT3 com uma "Duplicação de' Tandem Interna" (ITD) dentro do domínio de justamembrana do receptor.
- Células de Ba/F3-FLT3-D835Y expressando um receptor de FLT3 conten- do uma mutação que converte Asparagina na posição 835 para Tirosina.
Preferivelmente, compostos da fórmula IA podem ser mostrados para inibir a proliferação de ambas as células Ba/F3-FLT3-ITD e Ba/F3- D835Y em uma IC50 de 50 nM a 500 μΜ enquanto por outro lado elas nor- malmente não inibem crescimento de células de Bá/F3 não transformadas em concentrações de até 500nM, e os efeitos inibitórios de crescimento de um composto da fórmula IA em células de Ba/F3-FLT3-ITD pode ser reverti- da pela adição de concentrações altas de IL-3 para fornecer de um sinal de viabilidade alternativo. Às concentrações requeridas para inibir a proliferação de linhagens celulares dependentes de FLT3, compostos da fórmula IA po- dem ser mostrados para não ser citotóxicos contra várias Ieucemias huma- nas e linhagens celulares de Iinfoma que não têm receptores de FLT3 mu- tante (cinases hiperativadas), sugerindo que o fármaco tem um grau alto inesperado de especificidade como um agente citóxico. Especialmente, es- tes resultados indicam que compostos da fórmula IA podem ser inibidores potentes de atividade de tirosina cinase receptora de FLT3 mutante e são um candidato promissor para uso no tratamento em pacientes com recepto- res de FLT3 mutante. Em particular, compostos da fórmula IA podem ser mostrados inibir a atividade de atividade de tirosina cinase receptora de FLT3 em concentrações na faixa de 0,05 a 500 μΜ.
Com base nos estudos inibidores aqui anteriormente descritos, um composto da Fórmula IA (ou fórmula exemplar deste) de acordo com a invenção apresenta eficácia terapêutica especialmente contra distúrbios de- pendente de (= especialmente respondendo a modulação, mais especifica- mente inibição de) proteína cinase, especialmente doenças proliferativas, tais como as doenças mencionadas acima sob "Antecedentes da invenção". Há também experiências para demonstrar a atividade antitumor de compostos da Fórmula I in vivo. Por exemplo, para testar se um compos- to da fórmula IA inibe o crescimento de carcinoma de bexiga, o seguinte sis- tema teste pode ser aplicado:
As linhagens celulares de carcinoma de célula transiçional de bexiga urinária humanas RT-112 são utilizadas como um modelo modelo in vivo para o teste de atividade in vivo de compostos descritos na invenção. Esta linhagem celular é derivada de um paciente fêmea (idade desconheci- da) com carcinoma de bexiga urinário primário não tratado em 1973. Esta linhagem celular expressa níveis altos de FGF-R3.
5 x106 de células com matrigel são inoculadas subcutaneamente no flanco de camundongos nus fêmeas (n=8) e tumores são permitidos de- senvolver. Tamánhos de tumor são manualmente medidos a cada dois a três dias utilizando um calibrador. Peso animal é monitorado como uma me- dida de saúde animal.
Tratamento com inibidor começa quando volumes de tumores alcançarem -100 mm3 (~7 dias). Camundongos são aleatorizados de acordo com volume de tumor e tratados com veículo (NMP/PEG300) ou o composto teste (n=8) durante 14 dias. Via de administração é gavagem oral e horário é 1x dia/7x semanas. Atividade antitumor é calculada como % de T/C ((volume de tumor de mudança média de animais tratados/mudança média de volu- mes de tumor de animais de controle) x 100).
Tamanhos de tumor de xenoenxerto são manualmente medidos com calibrador e volume de tumor são calculados utilizando a fórmula (W x H x L) x π/6, onde largura (W)1 altura (H) e comprimento (L) são os três diâ- metros maiores.
Avaliações estatísticas são feitas utilizando SigmaStat 2,03. Se mais do que dois grupos de animais são incluídos em uma experiência, a avaliação estatística é feita nos volumes de tumor absolutos ou pesos cor- porais no dia de avaliação, utilizando teste de ANOVA de um modo. Teste pós Dunnett1S ad hoc é utilizado quando um grupo de controle é comparado com todos os outros grupos de tratamento. Tukey e SNK (Student-Newman- Keuls) ad hoc pós teste são utilizados quando todos os grupos são avalia- dos contra um ao outro.
Amostras de tumor são dissecadas e imediatamente congeladas em N2 líquido. Tumores são pulverizados enquanto mantendo congelado. Uma alíquota do pó congelado é Iisada em tampão de extração de triton a 1% contendo inibidores de protease e fosfatase. Lisados são clareados por centrifugação e concentração de proteína determinada. Lisado de proteína é utilizado para determinar o grau de inibição do receptor de FGFR e série de reação nos tumores.
Compostos da fórmula IA descritos nesta invenção podem inibir crescimento de tumor e induzir regressão em doses iguais e acima de 10 mg/kg.
Como exemplos de cinases inibidas pelos compostos da fórmula IA como descritos podem ser mencionados c-Abl e Bcr-Abl, em particular, inibição de Bcr-Abl pode ser mencionada. Outra cinase inibida é a tirosina cinase receptora VEGF-R, em particular o KDR receptor de VEGF (VEGF- R2). Os compostos da presente invenção também inibem formas mutantes das cinases de Bcr-Abl. Os compostos descritos são apropriados para a ini- bição de uma ou mais destas e/ou outras proteína tirosina cinases e/ou a tirosina cinase não receptora Raf, e/ou para a inibição de mutantes destas enzimas. Devido a estas atividades, os compostos podem ser utilizados para o tratamento de doenças relacionadas a, especialmente, atividade anormal ou excessiva de tais tipos de cinases, especialmente aquelas mencionadas.
A capacidade para modular tal atividade de proteína cinase pre- ferivelmente refere-se à inibição de tal atividade de proteína cinase.
Por exemplo, como inibidores de atividade de tirosina cinase receptora de VEGF, os compostos da invenção podem primariamente inibir o crescimento de vasos sangüíneos e são desse modo, por exemplo, efica- zes contra várias doenças associadas com angiogênese desregulada, espe- cialmente doenças causadas por neovascularização ocülar, especialmente retinopatias, tais como retinopatia diabética ou degeneração macular rela- cionada com a idade, psoríase, hemangioblastoma, tais como hemangioma, distúrbios proliferativos de células mesangiais, tais como doenças renais crônicas ou agudas, por exemplo, nefropatia diabética, nefroesclerose ma- ligna, síndromes de microangiopatia trombótica ou rejeição ao transplante, ou especialmente doença renal inflamatória, tal como glomerulonefrite, es- pecialmente glomerulonefrite mesangioproliferativa, síndrome hemolítico- urêmica, nefropatia diabética, nefroesclerose hipertensiva, ateroma, reeste- nose arterial, doenças auto-imunes, diabetes, endometriose, asma crônica, e especialmente doenças neoplásicas (tumores sólidos, mas também leu- cemias e outro "tumores líquidos", especialmente aqueles que expressam c- kit, KDR, Flt-1 ou Flt-3), tais como especialmente câncer de mama, câncer do cólon, câncer do pulmão (especialmente câncer de pulmão de célula pe- quena), câncer da próstata ou sarcoma de Kaposi. Um composto da Fórmu- la IA (ou fórmula exemplar deste) (ou um N-óxido deste) inibe o crescimento de tumores e é especialmente adequado para prevenir a dispersão metastá- tica de tumores e o crescimento de micrometástases.
Uma classe de cinases alvos dos compostos da presente inven- ção são mutantes de Bcr-Abl. Os mutantes Glu255->Lisina, Glu255->Valina ou o Thr315-»lsoleucina podem ser especialmente mencionados, mais es- pecialmente o mutante Thr315->lsoleucina.
Outros mutantes de Bcr-Abl incluem Met244->Val, Phe317—>Leu, Leu248->Val, Met343->Thr, Gly250->Ala, Met351->Thr, Gly250—>Glu, Glu355n>Gly, Gln252->His, Phe358->Ala, Gln252->Arg, Phe359->Val, TyR253->His, Val379->lle, TyR253->Phe, Phe382->Leu, Glu255—>Lys, Leu387->Met, Glu255->Val, His396->Pro, Phe311->lle, His396->Arg, Phe311->Leu, Ser417->Tyr, Thr315->lle, Glu459->Lys e Phe486->Ser.
Os compostos da Fórmula IA são em particular úteis para tratar AML por meio de inibição do domínio de tirosina cinase de Flt-3. Uma outra modalidade da presente invenção é um método de tratar leucemia mielóide aguda (AML) que compreende administrar uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de um composto reivindicado.
Os compostos da fórmula IA (ou seus sais especialmente far- maceuticamente aceitáveis), devido à sua capacidade de inibir FGFR, são especialmente úteis no tratamento de (especialmente anormal) crescimento, reparo de tecido, remodelagem; migração celular, diferenciação celular, de- senvolvimento esquelético e/ou membro, cicatrização de ferida, transdução de sinal, hematopoiese e/ou angiogênese, bem como tumorigênese, ou tu- mores ou cânceres, incluindo metástase e formação de metástase, especi- almente no tratamento de tumores humanos, tais cornos cânceres câncer de pulmão de célula não pequena, carcinoma escamoso (cabeça e pescoço), mama, gástrico, por exemplo, cânceres de adenocarcinomas pancreáticos, ovário, de cólon e/ou da próstata bem como em e astrocitomas, gliomas, câncer de bexiga, cânceres epiteliais, por exemplo, da bexiga ou cérvice, mieloma múltiplo, carcinoma escamoso (cabeça e pescoço), tal como carci- noma de célula escamosa oral, retinoblastoma, sarcoma, tal como carcino- ma sinovial, e/ou tumores da pele; síndrome mieloproliferativa 8p11 = Sin- drome Mieloproliferativa Eosinofílica (EMS); anormalidades esqueléticas, nanismo humano, incluindo acondroplasia, síndromes de craniosineostose e síndrome de nanismo, displasias esqueléticas incluindo hipocondroplasia, acondroplasia severa com desenvolvimento atrasado, acantose nigricans, displasia tanatofórica, fenótipos de craniossinostose, por exemplo, cranios- sinostose coronal de Muenke ou síndrome de Crouzon com acantose nigri- cans, síndrome de Pfeiffer, maturação de condrócito reprimida, inibição de crescimento ósseo; doenças inflamatórias ou auto-imunes, tal como artrite reumatóide (RA), artrite de colágeno II, esclerose múltipla (MS), lúpus erite- matoso sistêmico (SLE), psoríase, diabetes juvenil, doença de Sjogren, do- ença da tiróide, sarcoidose, uveíte auto-imune, doença inflamatória intestinal (colite de Crohn e ulcerativa), doença celíaca e miastenia grave; Raquitis- mos Hipofosfatêmicos Dominantes Autossômicos (ADHR), Raquitismos hi- pofosfatêmicos ligados ao cromossoma X (XLH), Osteomalacia induzida por tumor (TIO), displasia fibrosa do osso (FH); Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (COPD); obesidade, diabetes e/ou doenças relacionadas a isso, tal como síndrome metabólica, doenças cardiovasculares, hipertensão, níveis de triglicerídeo e colesterol anormais, distúrbios dermatológicos (por exem- pio, infecções, veias varicosas, acantose nigricans, eczema, intolerância ao exercício, diabetes tipo 2, resistência a insulina, hipercolesterolemia, coleliti- ase, lesão ortopédica, doença tromboembólica, restrição coronária ou vas- cular (por exemplo, aterosclerose), sonolência durante o dia, apnéia do so- no, doença renal de estágio terminal, doença da vesícula biliar, gota, distúr- bios térmicos, resposta imune comprometida, função respiratória comprome- tida, infecções seguindo ferimentos, infertilidade, doença hepática, dor do dorso inferior, complicações obstétriças e ginecológicas, pancreatite, aciden- te vascular cerebral, complicações cirúrgicas, incotinência por estresse uri- nária e/ou distúrbios gastrointestinais.
Um método de promover neocondrogênese localizada em uma cartilagem em um mamífero compreendendo administrar localmente à carti- lagem certos inibidores de cinase é descrito no WO2006/038112. Surpreen- dentemente, foi constatado que os compostos da fórmula IA como definido aqui podem ser utilizados da mesma maneira. Conseqüentemente, a pre- sente invenção também refere-se a um método de promover neocondrogê- nese localizada em uma cartilagem em um mamífero compreendendo admi- nistrar localmente à cartilagem derivados de uréia da fórmula (IA) como de- finido acima ou sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos, solvatos, éste- res, derivados protegidos por N-óxidos, isômeros individuais e mistura de isômeros destes ou pró-fármacos destes, em uma quantidade que é eficaz para promover neocondrogênese localizada. O composto da fórmula IA é também útil no tratamento de osteoartrite no contexto de neocondrogênese.
O termo "tratamento" inclui também profilaxia incluindo trata- mento preventivo, por exemplo, em pacientes onde mutações ou mudanças foram constatadas indicar que elas são ou podem estar propensas ao de- senvolvimento de uma doença, ou preferivelmente tratamento terapêutico (incluindo porém não limitado a paliativo, curativo, alívio de sintoma, redução de sintoma, supressão de doença ou sintoma, retardamento de progressão, regulação de cinase e/ou inibição de cinase) das referidas doenças, especi- almente de qualquer uma ou mais das doençãs mencionadas acima.
Tratamento de um animal é preferido. Um animal é preferível- mente um animal de sangue quente, mais preferivelmente um mamífero. Um ser humano (que geralmente também cai sob o termo geral "animal") é es- pecialmente um paciente ou uma pessoa que (por exemplo, devido a algu- mas mutações ou outras características) é propensa a um risco para uma doença como definido acima ou abaixo.
Preparações farmacêuticas, métodos, e usos
A presente, invenção refere-se também a composições farma- cêuticas que compreendem um composto da Fórmula IA (ou fórmula exem- plar desta) ou um N-óxido deste como ingrediente ativo e que pode ser utili- zado especialmente no tratamento das doenças anteriormente menciona- das.
Os compostos farmacologicamente aceitáveis da presente in- venção podem ser utilizados, por exemplo, para a preparação de composi- ções farmacêuticas que compreendem uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta), ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, como ingrediente ativo junto ou em mistura com uma quantidade significante de um ou mais veículos farmaceu- ticamente aceitáveis, sólidos ou líquidos, orgânicos ou inorgânicos.
A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica que é adequada para administração a um animal de sangue quente, especi- almente um ser humano (ou a células ou linhagens celulares derivadas de um animal de sangue quente, especialmente um ser humano , por exemplo, linfócitos), para o tratamento ou, em um aspecto mais amplo da invenção, prevenção de (= profilaxia contra) uma doença que responde a inibição da atividade de tirosina proteína cinase, especialmente um das doenças men- cionadas acima como sendo preferida para uso de um composto da Fórmula IA(ou fórmula exemplar desta), compreendendo uma quantidade de um no- vo composto da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta), ou um sal farma- ceuticamente aceitável deste, que é eficaz para a referida inibição, junta- mente com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.
Composições para administração entérica, tal como administra- ção nasal, bucal, retal ou, especialmente, oral, e para administração paren- teral, tal como administração intravenosa, intramuscular ou subcutânea, a animais de sangue quente, especialmente seres humanos, são especial- mente preferidas. As composições compreendem o ingrediente ativo sozi- nho, de preferência, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. A dosagem do ingrediente ativo depende da doença a ser tratada e da espé- cie, sua idade, peso, e condição individual, os dados farmacocinéticos indi- viduais, e o modo de administração.
A presente invenção refere-se especialmente a composições farmacêuticas que compreendem um composto da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta), um tautômero, um N-óxido ou um sal farmaceuticamente aceitável, ou um hidrato ou solvato deste, e pelo menos um veículo farma- ceuticamente aceitável.
A invenção refere-se também às composições farmacêuticas para uso em um método para controle profilático especialmente terapêutico do corpo humano ou animal, a um processo para a preparação desta (espe- cialmente na forma de composições para o tratamento de tumores) e a um método de tratamento (especialmente tumor) de doenças, especialmente aquelas mencionadas aqui anteriormente.
A invenção refere-se também a processos e ao uso de compos- tos da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta) ou N-óxidos destes para a preparação de preparações farmacêuticas que compreendem compostos da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta) ou N-óxidos destes como compo- nente ativo (ingrediente ativo).
As composições farmacêuticas compreendem aproximadamente de 1% a aproximadamente 95% de ingrediente ativo, formas de administra- ção de dose única compreendendo na modalidade preferida aproximada- mente de 20% a aproximadamente 90% de ingrediente ativo e formas que não são do tipo dose única compreendendo na modalidade preferida apro- ximadamente de 5% a aproximadamente 20% de ingrediente ativo. Formas de dose unitárias são, por exemplo, comprimidos revestidos e não revesti- dos, ampolas, frascnetes, supositórios, ou cápsulas. Outras formas de do- sagem são, por exemplo, ungüentos, cremes, pastas, espumas, tinturas, contexto sendo utilizadas, entre outras, soluções de açúcar concentradas que podem compreender goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, ou soluções de revestimento em solventes or- gânicos adequados, ou, para a preparação de revestimentos entéricos, so- luções de preparações de celulose adequadas, tais como ftalato de etilcelu- lose ou ftalato de hidroxipropilmetilcelulose. Cápsulas são cápsulas de en- chimento seco feitas de gelatina e cápsulas seladas macias feitas de gelati- na e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de enchi- mento seco podem compreender o ingrediente ativo na forma de grânulos, por exemplo, com cargas, tais como lactose, aglutinantes, tais como amidos, e/ou deslizantes, tais como talco ou estearato de magnésio, e se desejado com estabilizantes. Em cápsulas macias, o ingrediente ativo é de preferên- cia dissolvido ou suspenso em excipientes oleosos adequados, tais como óleos graxos, óleo de parafina ou polietileno glicóis líquidos, sendo possível também quanto a estabilizantes e/ou agentes antibacterianos serem adicio- nados. Tinturas ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos drágeas ou os invólucros de cápsulas, por exemplo, para pro- pósitos de identificação ou para indicar diferentes doses de ingrediente ati- vo.
Núcleos de comprimidos podem ser fornecidos com revestimen- tos adequados, opcionalmente entéricos, através do uso de, entre outras, soluções de açúcar concentradas que podem compreender goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, ou soluções de revestimento em solventes orgânicos adequados ou misturas do solven- te, ou, para a preparação de revestimentos entéricos, soluções de prepara- ções de celulose adequadas.
Composições farmacêuticas para administração oral também incluem cápsulas duras consistindo em gelatina, e também cápsulas sela- das macias, consistindo em gelatina e um plastificante. As cápsulas duras podem conter o ingrediente ativo na forma de grânulos, por exemplo, em mistura com cargas, aglutinantes, e/o deslizantes, e opcionalmente estabili- zantes. Em cápsulas macias, o ingrediente ativo é de preferência dissolvido dróxi, álcool, por exemplo, metanol, etanol, propanol, butanol ou pentanol ou os isômeros destes, mas especialmente glicol e glicerol. Os exemplos se- guintes de ésteres de ácido graxo por esse motivo devem ser mencionados: oleato de etila, miristato de isopropila, palmitato de isopropila, "Labrafil M 2375" (trioleato de glicerol de polioxietileno, Gattefossé, Paris), "Miglyol 812" (triglicerídeo de ácidos graxo saturados com um tamanho de cadeia de C8 a C12, Hüls AG, Germany), mas especialmente óleos vegetais, tais como óleo de caroço de algodão, óleo de amêndoa, azeite de oliva, óleo de rícino, óleo gergelim, óleo de soja e mais especialmente óleo de amendoim.
Composições de injeção são preparadas de maneira habitual sob condições estéreis; o mesmo aplica-se também para introdução das composições em ampolas ou frasconetes e selagem dos recipientes.
Composições farmacêuticas para administração oral podem ser obtidas por combinação do ingrediente ativo com veículos sólidos, se dese- jado granulação de uma mistura resultante, e processamento da mistura, se desejado ou necessário, após a adição de excipientes apropriados, em com- primidos, núcleos de drágeas ou cápsulas. Também é possível para elas serem incorporadas em veículos plásticos que permitem os ingredientes ati- vos difundir-se ou ser liberados em quantidades medidas.
Veículos adequados são especialmente cargas, tais como açú- cares, por exemplo, lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, preparações de celulose e/ou fosfato de cálcio, por exemplo, fosfato de tricálcio ou hidroge- no fosfato de cálcio, e aglutinantes, tais como pastas de amido empregando por exemplo, amido de milho, trigo, arroz ou batata, gelatina, tragacanto, metilcelulose, idroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose sódica e/ou po- livinilpirrolidona, e/ou, se desejado, disintegradores, tais como os amidos acima mencionados, e/ou amido de carboximetila, polivinílpirrolidona reticu- lada, ágar, ácido algínico ou um sal deste, tal como alginato de sódio. Exci- pientes são especialmente condicionadores de fluidez e lubrificantes, por exemplo, ácido silícico, talco, ácido esteárico ou sais deste, tais como estea- rato de magnésio ou cálcio, e/ou polietileno glicol. Núcleos de drágeas são fornecidos com revestimentos adequados, opcionalmente entéricos, neste contexto sendo utilizadas, entre outras, soluções de açúcar concentradas que podem compreender goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, ou soluções de revestimento em solventes or- gânicos adequados, ou, para a preparação de revestimentos entéricos, so- luções de preparações de celulose adequadas, tais como ftalato de etilcelu- lose ou ftalato de hidroxipropilmetilcelulose. Cápsulas são cápsulas de en- chimento seco feitas de gelatina e cápsulas seladas macias feitas de gelati- na e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de enchi- mento seco podem compreender o ingrediente ativo na forma de grânulos, por exemplo, com cargas, tais como lactose, aglutinantes, tais como amidos, e/ou deslizantes, tais como talco ou estearato de magnésio, e se desejado com estabilizantes. Em cápsulas macias, o ingrediente ativo é de preferên- cia dissolvido ou suspenso em excipientes oleosos adequados, tais como óleos graxos, óleo de parafina ou polietileno glicóis líquidos, sendo possível também quanto a estabilizantes e/ou agentes antibacterianos serem adicio- nados. Tinturas ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos drágeas ou os invólucros de cápsulas, por exemplo, para pro- pósitos de identificação ou para indicar diferentes doses de ingrediente ati- vo.
Núcleos de comprimidos podem ser fornecidos com revestimen- tos adequados, opcionalmente entéricos, através do uso de, entre outras, soluções de açúcar concentradas que podem compreender goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, ou soluções de revestimento em solventes orgânicos adequados ou misturas do solven- te, ou, para a preparação de revestimentos entéricos, soluções de prepara- ções de celulose adequadas.
Composições farmacêuticas para administração oral também incluem cápsulas duras consistindo em gelatina, e também cápsulas sela- das macias, consistindo em gelatina e um plastificante. As cápsulas duras podem conter o ingrediente ativo na forma de grânulos, por exemplo, em mistura com cargas, aglutinantes, e/o deslizantes, e opcionalmente estabili- zantes. Em cápsulas macias, o ingrediente ativo é de preferência dissolvido ou suspenso em excipientes líquidos adequados aos quais estabilizantes e detergentes também podem ser adicionados.
Composições farmacêuticas adequadas para administração retal são, por exemplo, supositórios que consistem em uma combinação do in- grediente ativo e uma base de supositório.
Para administração parenteral, soluções aquosas de um ingre- diente ativo em forma solúvel em água, por exemplo, de um sal solúvel em água, ou suspensões de injeção aquosas que contêm substâncias que au- mentam a viscosidade, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana, e, se desejado, estabilizantes são especialmente adequados.
O ingrediente ativo, opcionalmente junto com excipientes, pode também es- tar na forma de um liofilizado e pode ser preparado em uma solução antes da administração parenteral pela adição do solventes adequados.
Soluções tais como são utilizadas, por exemplo, para adminis- tração parenteral podem também ser utilizadas como soluções de infusão.
A invenção refere-se igualmente a um processo ou um método para o tratamento de um das doenças (condições patológicas) mencionadas aqui, especialmente uma doença que responde a uma inibição de uma tiro- sina cinase, mais especialmente como mencionado acima, mais especial- mente FGFR, especialmente uma doença neoplástica correspondente. Os compostos da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta) ou N-óxidos destes (isto também incluindo sais, ésteres ou similar) podem ser administrados tal como ou especialmente na forma de composições farmacêuticas, profilâti- camente ou terapeuticamente, preferivelmente em uma quantidade eficaz contra as referidas doenças, a um animal, preferivelmente a um de sangue quente, por exemplo, um ser humano , cada qual preferivelmente requeren- do tal tratamento. No caso de um indivíduo tendo um peso corporal de cerca de 70 kg a dose diária administrada é de aproximadamente 0,001 g a apro- ximadamente 12 g, preferivelmente por exemplo, de aproximadamente 0,1 g a aproximadamente 3 g, de um composto da presente invenção. "Aproxima- damente" preferivelmente significa com até 10% de desvio, mais preferivel- mente com menos do que 1% de desvio do determinado número, respecti- vãmente.
Uma doença "que responde" é aquela onde pode ser mostrado que algum efeito benéfico pode ser encontrado.
A invenção também fornece um método de tratar de uma doen- ça dependente de proteína cinase, compreendendo administrar a um animal de sangue quente, por exemplo, um ser humano, um ou mais compostos citostáticos ou citotóxicos por exemplo, Glivec® em combinação com um composto da invenção, seja ao mesmo tempo, ou em um tempo separado. O termo "o mesmo tempo" é empregado para indicar em seqüência rápida ou imediatamente após a outro.
A presente invenção refere-se especialmente também ao uso de um composto da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta) ou N-óxidos deste, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, especialmente um composto da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta) que é referido ser preferido, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, como tal ou na forma de uma formulação farmacêutica com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável para o controle terapêutico e também profilático de uma ou mais das doenças mencionada aqui anteriormente, preferivelmente uma doença que responde a uma inibição de uma proteína cinase, especialmente uma doença neoplástica, mais especialmente leucemia que responde a uma ini- bição da Abl tirosina cinase.
A quantidade dè dose preferida, composição, e preparação de formulações farmacêuticas (medicinas) que será utilizada em cada caso é descrita acima.
Um composto da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta) pode também ser utilizada com vantagem em combinação com outros agentes antiproliferativos. Tais agentes antiproliferativos incluem, porém não estão limitados a inibidores de aromatase, antiestrogênios, inibidores de topoiso- merase I, inibidores de topoisomerase II, agentes ativos de microtubulo, a- gentes de alquilação, inibidores de histona desacetilase, inibidores de farne- sil transferase, inibidores de COX-2, inibidores de MMP, inibidores de mTOR, antimetabólitos antineoplásicos, compostos de platina, compostos que diminuem a atividade de proteína cinase e atividade de ATPase, tam- bém compostos antiangiogênicos, agonistas de gonadorelina, antiandrogê- nios, bengamidas, bisfosfonatos, anticorpos antiproliferativos e temozolomi- da (TEMODAL®) esteróides, tipo dexametasona, inibidores de proteassoma, tipo velcade e/ou talidomida.
O termo "inibidores de aromatase" quando utilizado aqui refere- se a compostos que inibem a produção de estrogênio, isto é, a conversão dos substratos androstenodiona e testosterona para estrona e estradiol, respectivamente. Õ termo inclui, porém não está limitado a esteróides, es- pecialmente exemestano e formestano e, em particular, não-esteróides, es- pecialmente aminoglutetimida, vorozol, fadrozol, anastrozol e, muito especi- almente, IetrozoL Exemestano pode ser administrado, por exemplo, na for- ma como ele é fabricado, por exemplo, sob a marca comecial AROMASIN®. Formestano pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é co- mercializado, por exemplo, sob a marca comercial LENTARON®. Fadrozol pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial AFEMA®. Anastrozol pode ser adminis- trado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial ARIMIDEX®. Letrozol pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial FEMARA® ou FEMAR®. Aminoglutetimida pode ser administrado, por e- xemplo, na forma como ela é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial ORIMETEN®.
Uma combinação da invenção compreendendo um agente anti- neoplásico que é um inibidor de aromatase é particularmente útil para o tra- tamento de tumores de mama positivos para receptor de hormônio.
O termo "antiestrogênios" quando utilizado aqui refere-se aos compostos que antagonizam o efeito de estrogênios no nível de receptor de estrogênio. O termo inclui, porém não está limitado a tamoxifeno, fulvestran- te, raloxifeno e cloridrato de raloxifeno. Tamoxifeno pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a mar- ca comercial NOLVADEX®. Cloridrato de raloxifeno pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a mar- ca comercial EVISTA®. Fulvestrante pode ser formulado como descrito na Patente US 4.659.516 ou pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial FASLO- DEX®.
O termo "inibidores de topoisomerase I" como utilizada aqui in- clui, porém não está limitado a topotecano, irinotecano, 9-nitrocamptotecina e o conjugado de camptotecina macromolecular PNU-166148 (composto A1 em W099/17804). Irinotecano pode ser administrado, por exemplo, na for- ma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial CAMP- TOSAR®. Topotecano pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial HYCAMTIN®.
O termo "inibidores de topoisomerase II" quando utilizado aqui, porém não está limitado às antraciclinas doxorrubicina (incluindo Formula- ção lipossômica, por exemplo, CAELYX®), epirrubicina, idarrubicina e ne- morrubicina, as antraquinonas mitoxantrona e losoxantrona, e as podofilloto- xinas etoposida e teniposida. Etoposida pode ser administrada, por exem- plo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comer- cial ETOPOPHOS®. Teniposida pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial VM 26-BRISTOL®. Doxorrubicina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial ADRI- BLASTIN®. Epirrubicina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial FARMORUBI- CIN®. Idarrubicina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial ZAVEDOS®. Mitoxan- trona pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comerciali- zada, por exemplo, sob a marca comercial NOVANTRON®.
O termo "agentes ativos de microtúbulo" refere-se aos agentes de estabilização de microtúbulos e desestabilização de microtúbulos incluin- do, porém não limitados aos taxanos paclitaxel e docetaxel, os alcalóides de vinca, por exemplo, vimblastina, especialmente sulfato de vimblastina, vin- cristina especialmente sulfato de vincristina, e vinorelbina, discodermolida e epotilonas, tais como epotilona BeD. Docetaxel pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial TAXOTERE™. Sulfato de vimblastina pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial VINBLASTIN R.P.®. Sulfato de vincristina pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a mar- ca comercial FARMISTIN™.
O termo "agentes de alquilação" quando utilizado aqui inclui, porém não está limitado a ciclofosfamida, ifosfamida e melfalan. Ciclofosfa- mida pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comerciali- zada, por exemplo, sob a marca comercial CICLOSTIN™. Ifosfamida pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por e- xemplo, sob a marca comercial HOLOXAN™.
O termo "inibidores de histona desacetilase" refere-se aos com- postos que inibem a histona desacetilase e que possuem atividade antiproli- ferativa.
O termo "inibidores de farnesil transferase" refere-se aos com- postos que inibem a farnesil transferase e que possuem atividade antiprolife- rativa.
O termo "inibidores de COX-2" refere-se aos compostos que inibem a enzima ciclooxigenase tipo 2 (COX-2) e que possuem atividade antiproliferativa tal como celecoxib (Celebrex®, rofecoxibe (Vioxx® e Iumira- coxibe (COX189).
O termo "inibidores de MMP" refere-se aos compostos que ini- bem a metaloproteinase matriz (MMP) e que possuem atividade antiprolife- rativa.
O termo "inibidores de mTOR" refere-se aos compostos que ini- bem o alvo mamífero de rapamicina (mTOR) e que possuem atividade anti- proliferativa tias como sirolimus (Rapamune®, everolimus (Certican®), CCI- 779 e ABT578.
O termo "antimetabólitos antineoplásicos" inclui, mas não está limitada a 5-fluorouracila, tegafur, capecitabina, cladribina, citarabina, fosfato de fludarabina, fluorouridina, gencitabina, 6-mercaptopurina, hidroxiuréia, metotrexato, edatrexato e sais de tais compostos, e além disso ZD 1694 (RALTITREXED®), LY231514 (ALIMTA®), LY264618 (LOMOTREXOL®) e OGT719.
O termo "compostos de platina" quando utilizado aqui inclui, po- rém não está limitado a a carboplatina, cisplatina e oxaliplatina. Carboplatina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial CARBOPLAT®. Oxaliplatina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exem- plo, sob a marca comercial ELOXATIN®.
O termo "compostos que reduz a atividade de proteína cinase e também compostos antiangiogênicos" quando utilizado aqui inclui, porém não está limitado a compostos que reduzem a atividade, por exemplo, do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), do Fator de Crescimento da Epiderme (EGF), c-Src, proteína cinase C, do Fator de Crescimento Deri- vado das Plaquetas (PDGF)1 Bcr-Abl, c-Kit, Flt-3, do Receptor do Fator I de Crescimento Semelhante à Insulina (IGF-IR) e das Cinases dependentes de Ciclina (CDKs), e compostos antiangiogênicos tendo outro mecanismo de ação de redução da atividade de proteína cinase.
Compostos que reduzem a atividade de VEGF são especialmen- te compostos que inibem o receptor de VEGF, especialmente a atividade de tirosina cinase do receptor de VEGF, e compostos ligante-se a VEGF, e são em particular aqueles compostos, proteínas e anticorpos monoclonais ge- ralmente e especificamente descritos nos WO 98/35958, WO 00/09495, WO 00/27820, WO 00/59509, WO 98/11223, WO 00/27819, WO 01/55114, WO 01/58899 e EP 0 769 947; aqueles como descritos por M. Prewett e outro em Câncer Research 59 (1999) 5209-5218, por F. Yuan e outro em Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., vol. 93, pp. 14765-14770, dezembro de 1996, porZ. Zhu e outro em Câncer Res. 58, 1998, 3209-3214, e por J. Mordenti e outro em Toxicologic Pathology1 vol. 27, n° 1, pp 14-21, 1999; nos WO 00/37502 e WO 94/10202; Angiostatin®, descrito por M. S. O1ReiIIy e outro, Cell 79, 1994, 315-328; e Endostatin®, descrito por M. S. O1ReiIIy e outro, Cell 88, 1997,277-285;
compostos que reduzem a atividade de EGF são especialmente compostos que inibem o receptor de EGF, especialmente a atividade de tirosina cinase do receptor de EGF1 e compostos ligante-se a EGF, e são em particular a- queles compostos genericamente e especificamente descritos nos WO 97/02266, EP O 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 e, especialmente, WO 96/33980; compostos que reduzem a atividade c-Src incluem, mas não estão limitados a, compostos inibindo a atividade de c-Src proteína tirosina cinase tal como definido abaixo e a inibidores de interação de SH2 tais como aqueles descri- tos nos W097/07131 e W097/08193;
compostos inibidores da atividade de c-Src proteína tirosina cinase incluem, mas não estão limitados a, compostos pertencentes às classes de estrutura de pirrolopirimidinas, especialmente pirrolo[2,3-d]pirimidinas, purinas, pira- zopirimidinas, especialmente pirazo[3,4-d]pirimidinas, pirazopirimidinas, es- pecialmente pirazo[3,4-d]pirimidinas e piridopirimidinas, especialmente piri- do[2,3-d]pirimidinas. De preferência, o termo refere-se à aqueles compostos descritos nos WO 96/10028, WO 97/28161, W097/32879 e W097/49706; compostos que reduzem a atividade da proteína cinase C especialmente aqueles derivados de estaurosporina descritos em EP 0 296 110 (prepara- ção farmacêutica descrita em WO 00/48571) cujos os compostos são inibi- dores de proteína cinase C; outros compostos específicos que reduzem a atividade de proteína cinase e que também podem ser utilizados em combinação com os compostos da presente invenção são Imatinibe (Gleevec®/Glivec®), PKC412, Iressa™ (ZD1839), PK1166, PTK787, ZD6474, GW2016, CHIR-200131, CEP- 7055/CEP-5214, CP-547632, KRN-633 e SU5416; compostos antiangiogênicos tendo outro mecanismo de ação de redução da atividade de proteína cinase incluem, mas não estão limitados a por exem- plo, talidomida (THALOMID), celecoxibe (CeIebrex) e ZD6126. O termo "agonista de gonadorelina" tal como empregada aqui inclui, mas não está limitada a abarelix, gosserrelina e acetato de gosserreli- na. Gosserrelina é descrita na patente US 4.100.274 e é administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial ZOLADEX®. Abarelix pode ser formulado, por exemplo, tal como descrito na Patente US 5.843.901.
O termo "anti-androgênios" quando utilizado aqui inclui, porém não está limitado à bicalutamida (CASODEX™) que pode ser formulado por exemplo, tal como descoberto em US 4.636.505.
O termo "bengamidas" refere-se a bengamidas e derivados des- ta tendo propriedades antiproliferativas.
O termo "bisfosfonatos" quando utilizado aqui inclui, porém não está limitado a ácido etridônico, ácido clodrônico, ácido tiludrônico, ácido pamidrônico, ácido alendrônico, ácido ibandrônico, ácido risedrônico e ácido zoledrônico. "Ácido etridônico" pode ser administrado, por exemplo, na for- ma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial Dl- DRONEL®. "Ácido clodrônico" pode ser administrado, por exemplo, na for- ma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial BONE- FOS®. "Ácido tiludrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial SKELID®.
"Ácido pamidrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial AREDIA®. "Ácido alendrônico" pode ser· administrado, por exemplo, na forma como ele é co- mercializado, por exemplo, sob a marca comercial FOSAMAX®. "Ácido i- bandrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é co- mercializado, por exemplo, sob a marca comercial BONDRANAT®. "Ácido risedrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é co- mercializado, por exemplo, sob a marca comercial ACTONEL®. "Ácido zole- drônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comer- cializado, por exemplo, sob a marca comercial ZOMETA®.
O termo "anticorpos antiproliferativos" tal como aqui empregada inclui, mas não está limitada a trastuzumabe (Herceptin®), Trastuzumab- DM1, erlotinibe (Tarceva®), bevacizumabe (Avastin®), rituximabe (Ritu- xan®), PR064553 (anti-CD40) e Anticorpo de 2C4.
Para o tratamento de leucemia mielóide aguda (AML), compos- tos da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta) podem ser utilizados em combinação com terapias de leucemia padrões, especialmente em combi- nação com terapias utilizadas para o tratamento de AML. Em particular, os compostos da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta) podem ser adminis- trados em combinação com por exemplo, inibidores de farnesiltransferase e/ou outras drogas úteis para o tratamento de AML, tais como Daunorrubici- na, Adriamicina, Ara-C, VP-16, Teniposida, Mitoxantrona, Idarrubicina, Car- boplatina e PKC412.
A estrutura dos agentes ativos identificados pelos números de código; nomes genéricos ou comerciais podem ser apanhados da edição atual do compêndio padrão "The Merck Index" ou de bases de dados, por exemplo, Patentes Internacionais (por exemplo, IMS World Publications).
Os compostos acima mencionados que podem ser utilizados em combinação com um composto da Fórmula IA (ou fórmula exemplar desta), podem ser preparados e administrados tal como descrito na técnica tal co- mo nos documentos citados acima.
Os termos "co-administração" ou "administração combinada" ou similar quando utilizado aqui são pretendidos abranger administração dos agentes terapêuticos selecionados a um único paciente, e são pretendidos incluir regimes de tratamento em que os agentes necessariamente não são administrados pela mesma via de administração ou ao mesmo tempo.
Onde subseqüentemente acima o termo "uso" é mencionado (como verbo ou substantivo) (relativo ao uso de um composto da fórmula IA ou um sal destes (especialmente farmaceuticamente aceitável), isto (se não identificado diferentemente ou sugerido diferentemente pelo contexto) inclui quaisquer uma ou mais das seguintes modalidades modalidades da inven- ção, respectivamente (se não declarado de outra maneira): o uso no trata- mento de uma doença responsiva de modulação de proteína cinase (espe- cialmente tirosina) (especialmente inibição), o uso para a fabricação de composições farmacêuticas para uso no tratamento de uma doença respon- siva de modulação de proteína cinase (especialmente inibição), métodos de uso de um ou mais compostos da fórmula IA no tratamento de uma doença responsiva e/ού proliferativa de modulação de proteína cinase (especialmen- te inibição), preparações farmacêuticas compreendendo um ou mais com- postos da fórmula IA para o tratamento da referida doença responsiva de modulação de proteína cinase (especialmente inibição), e um ou mais com- postos da fórmula IA no tratamento da referida doença responsiva de modu- lação de proteína cinase (especialmente inibição), quando apropriado e ex- pediente, se não declarado de outra maneira. Em particular, doenças a ser tratadas e são desse modo preferidas para "uso" de um composto da fórmu- la IA são selecionadas a partir de responsiva de modulação de proteína ci- nase (especialmente tirosina) (especialmente inibição) (significando tam- bém, "suportada" não apenas "dependente", incluindo também situações onde uma doença é responsável para modulação, especialmente inibição, de uma proteína cinase, isto é, a atividade da proteína cinase suporta ou ainda causa manifestação de doença) doenças mencionadas acima ou, es- pecialmente doenças proliferativas mencionadas acima ou abaixo. Preferi- velmente, uma doença responsiva de modulação de proteína cinase (espe- cialmente inibição) é uma que responde a inibição de uma ou mais das ci- nases mencionadas acima e abaixo, porém preferivelmente FGFR.
Processo de Fabricação
Um composto da fórmula IA é analogamente preparado em mé- todos que, para outras compostos, é em princípio conhecido na técnica, de forma que para os novos compostos da fórmula IA o processo é novo como processo de analogia, preferivelmente reagindo-se um composto de anilina da fórmula IIA,
<formula>formula see original document page 67</formula>
em que R4 e n são como definido para um composto da fórmula IA, com uma amina da fórmula IIIA, <formula>formula see original document page 68</formula>
em que R1, R2, R3, R51 X1 Y e Z são como definido para um composto da fórmula IA, na presença de um derivado de ácido carbônico bisreativos; e, se desejado, transformando um composto de fórmula IA em um composto diferente da fórmula IA, transformando um sal de um composto obtenível da fórmula IA no composto livre ou um sal diferente, transformando um com- posto livre obtenível da fórmula IA em um sal destes, e/ou separando uma mistura obtenível de isômeros de um composto da fórmula I em isômeros individuais.
Na reação, os derivados de ácido carbônico bisreativo é preferi- velmente um anidrido de ácido carbônico ou mais preferivelmente um dialo- geneto carbônico, especialmente dicloreto carbônico (fosgênio). A reação pode preferivelmente ocorrer reagindo-se primeiro um composto da fórmula IIA (preferido) ou um composto da fórmula IIIA com o dericado de ácido car- bônico bisreativo ao isocianato correspondente o qual em seguida o outro composto (da fórmula IIIA ou IIA, respectivamente) é adicionado. A primeira reação preferivelmente ocorre em um solvente apropriado, tal como um éter, por exemplo, dioxano, em temperaturas elevadas, por exemplo, de 20°C à temperatura de refluxo da mistura reacional, e pode preferivelmente ser se- guido por concentração da solução de isocianato resultante para fornecer o isocianato preferivelmente dentro sólido ou forma de óleo. A segunda rea- ção do isocianato em seguida ocorre depois da adição de um solvente apro- priado, especialmente N-metilpirrolidona (NMP) e/ou tolueno, em temperatu- ra elevada, por exemplo, de 20°C à temperatura de refluxo da mistura rea- cional, e adição da amina complementar da fórmula formula IIIA ou IIA, res- pectivamente.
Ambas as reações preferivelmente ocorrem sob um gás de pro- teção, especialmente nitrogênio ou argônio.
Reações Opcionais e Conversões
Um composto da fórmula que IA pode ser convertido em com- postos diferentes da fórmula I.
Por exemplo, em um composto da fórmula IA em que R1 é ben- ziloxifenilamino ou 4-benzil-piperazin-1-il-fenilamino, a porção de benzila pode ser removido por hidrogenação, por exemplo, na presença de catalisa- dor de metal nobre, tal como paládio em carvão, em um solvente apropria- do, tal como um álcool, por exemplo, metanol, em temperaturas apropria- das, por exemplo, de 0 a 50°C, no caso de remoção nitrogênio de piperazina na presença adicional de um ácido, por exemplo, HCI, para produzir o com- posto correspondente em que em vez da porção de benzila um hidrogênio está presente.
Um composto de fórmula que IA pode ser convertido a um N- óxido correspondente. A reação é realizada com agente de oxidação adequado, preferivelmente um peróxido, por exemplo, ácido m- cloroperbenzóixco, em um solvente adequado, por hidrocarboneto halogenado, tipicamente clorofórmio ou diclorometano, ou em um ácido alcanocarboxílico inferior, tipicamente ácido acético, preferivelmente em uma temperatura entre 0°C e a temperatura de ebulição da mistura reacional, especialmente a cerca de temperatura ambiente.
Compostos da invenção na forma não oxidada podem ser pre- parados a partir de N-óxidos de compostos da invenção por tratamento com um agente de redução (por exemplo, enxofre, dióxido de enxofre, trifenil fos- fina, boroidreto de lítio, boroidreto de sódio, tricloreto de fósforo, tribrometo, ou similares) em um solvente orgânico inerte adequado (por exemplo, ace- tonitrila, etanol, dioxano aquoso, ou similares) a 0 a 80°C.
Sais de compostos de fórmula IA que tem pelo menos um grupo formador de sal podem ser preparados de maneira conhecida por si própria. Por exemplo, um sal de adição ácido de compostos de fórmula IA com gru- pos básicos (por exemplo, nitrogênio básico) pode ser obtido de maneira habitual, por exemplo, por tratamento de um composto da fórmula IA com um ácido ou um reagente de troca aniônica adequado. Um sal de um com- posto de fórmula IA tendo grupos ácidos pode ser formado tratando-se o composto com um composto de metal, tal como um sal de metal de ácali de um ácido carboxílico orgânico adequado, por exemplo, o sal sódico de ácido 2-etilexanóico, com um composto de metal de álcali orgânico ou metal alca- linoterroso, tal como o hidróxido correspondente, carbonato ou hidrogeno- carbonato, tal como o hidróxido de sódio ou de potássio, carbonato ou hi- drogenocarbonato, com um composto de cálcio correspondente ou com a- mônia ou uma amina orgânica adequada, quantidades estequiométricas ou apenas um pequeno excesso do agente de formação de sal preferivelmente a ser utilizado. Sais internos de compostos de fórmula IA que contém grupos de formação de sal básico ou ácido, por exemplo, um grupo carbóxi e um grupo amino livre, podem ser formados, por exemplo, pela neutralização de sais, tais como sais de adição ácido, ao ponto isoelétrico, por exemplo, com bases fracas, ou por tratamento com trocadores iônicos.
Um sal de um composto da fórmula IA (= composto da inven- ção) pode ser convertido de maneira habitual no composto livre; um metal ou sal de amônio pode ser convertido, por exemplo, por tratamento com um ácido adequado, e um sal de adição de ácido, por exemplo, por tratamento com um agente básico adequado em um sal diferente. Em ambos os casos, trocadores iônicos adequados podem ser utilizados.
Misturas estereoisoméricas, por exemplo, misturas de diastere- ômeros, podem ser separadas em seus isômeros correspondentes de uma maneira conhecida por si própria por meios de métodos de separação apro- priados. Misturas diastereoméricas, por exemplo, podem ser separadas em seus diastereômeros individuais por meios de cristalização fracionada, cro- matografia, distribuição do solvente, e procedimentos similares. Esta sepa- ração pode ocorrer no nível de um dos composto de partida ou em um com- posto da Fórmula IA propriamente dito. Enantiômeros podem ser separados através da formação de sais de diastereoméricos, por exemplo, por forma- ção de sal com um ácido quiral enantiomericamente puro, ou por meios de cromatografia, por exemplo, por HPLC, utilizando-se substratos cromatográ- ficos com Iigantes quirais. Uma descrição mais detalhada das técnicas apli- cáveisl à resolução de estereoisômeros de compostos a partir de sua mistu- ra racêmica pode ser encontrada em Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, "Enantiómes, Racemates and Resolutions", John Wiley E Sons, Inc., 1981.
Derivados de pró-fármaco dos compostos da invenção podem ser preparados por métodos conhecidos por aqueles de experiência ordinária na técnica (por exemplo, para mais detalhes veja Saulnier e outro, (1994), Bio- organic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, pág. 1985). Por exemplo, pró-fármacos apropriadas podem ser preparadas por reação de um compos- to não derivado da invenção com um agente de carbamilação adequado (por exemplo, 1,1-aciloxialquilcarbanocloridato, carbonato de para- nitrofenila, ou similares).
Derivados protegidos dos compostos da invenção podem ser feitos por meios conhecidos por aqueles de experiência ordinária na técnica. Uma descrição detalhada de técnicas aplicáveis à criação de grupos de pro- teção e sua remoção pode ser encontrada em T. W. Greene, "Protecting Groups in Organic Chemistry", 3§ edição, John Wiley e Filhos, Inc,, 1999.
Compostos da presente invenção podem ser convenientemente preparados, ou formados durante o processo da invenção, como solvatos (por exemplo, hidratos). Hidratos de compostos da presente invenção po- dem ser convenientemente preparados por recristalização de uma mistura do solvente aquosa/ orgânica, utilizando-se solventes orgânicos tais como dioxina, tetraidrofurano ou metanol.
Intermediários e produtos finais podem ser elaborados e/ou puri- ficados de acordo com métodos padrão, por exemplo, utilizando-se métodos cromatográficos, métodos de distribuição, (re-) cristalização, e similares. Materiais de Partida
Materiais de partida e intermediários (ambos em cada caso in- cluindo sais destes), especialmente das fórmulas IIA e MIA, podem ser pre- parados em analogia aos métodos descritos nos Exemplos, de acordo com ou em analogia aos métodos que são conhecidos na técnica e/ou eles estão comercialmente disponíveis.
Por exemplo, materiais de partida podem ser preferivelmente preparados como segue:
Onde nos materiais de partida e intermediários R1, R2, R3, R4, R51 Χ, Y, Z e η são utilizados, estes símbolos têm preferivelmente os os sig- nificados dados para um composto da fórmula IA, se não indicados de outra maneira.
Um composto da fórmula IIA que transporta uma ou mais por- ções de halo pode, por exemplo, ser preparado por halogenação, por exem- pio, com um haleto de ácido inorgânico, tal como cloreto de sulfurila, em um solvente apropriado, por exemplo, acetonitrila, diclorometano e/ou tetraídro- furano, preferivelmente nas temperaturas na faixa de -40 a 25°C, de um composto correspondente à fórmula IIA, em que até 4 outras porções R4 selecionadas de C1-C7-alquila, halo-C1-C7-alquila, halo e C1-C7-alcóxi estão presentes e o grupo amino é protegido, por exemplo, por acetila ou terc- butoxicarbonila (introdução dos grupos protetores, veja, por exemplo, nos Exemplos ou sob as Condições de processo gerais abaixo), seguido por re- moção do grupo protetor (por exemplo, acetila por tratamento com um hi- dróxido de metal de álcali, tal como hidróxido de potássio, em um solvente 20 apropriado, tal como etanol, em temperaturas elevadas, por exemplo, de 30°C à temperatura de refluxo da mistura, terc-butoxicarbonila por eação com um ácido, por exemplo, HCI, em um solvente apropriado, por exemplo, dioxano, em temperaturas por exemplo, a partir de -20 a 30°C).
R4 = C1-C7-alquila, especialmente metila, pode ser introduzida por alquilação do anel de fenila (especialmente onde anteriormente porções de C1-C7-alcóxi R4 estão presentes) em um composto precursor correspon- dente da mesma forma da fórmula IIA (com proteção e deproteção do grupo amino como no parágrafo precedente) com um C1-C7-alquilalogeneto (por exemplo, -iodeto) em um solvente apropriado, por exemplo, tetraidrofurano, em temperaturas preferivelmente a partir de -50 a 25°C, depois da reação do composto precursor da fórmula IIA com uma base forte, por exemplo, butil- ou terc-butil-lítio, em um solvente apropriado, por exemplo, pentano e tetraidrofurano, as temperaturas preferidas na faixa a partir de -80 a 0°C.
Um composto da fórmula que IIIA pode, por exemplo, ser prepa- rados como segue reagindo-se um composto da fórmula VIA,
<formula>formula see original document page 73</formula>
em que Hal é halogênio, especialmente cloro ou bromo, com uma amina da fórmula o VA,
<formula>formula see original document page 73</formula>
na presença de um ácido, por exemplo, ácido acético ou ácido clorídrico, em um solvente apropriado, por exemplo, água ou dioxano, em temperaturas elevadas, por exemplo, na faixa de 50 a 160°C (se requerida em um tubo).
Alternativamente, um composto da fórmula IIIA em que R1 é fe- nila substituída por [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-carbonila pode ser obtido reagindo-se um composto da fórmula o IVA como definido acima com um composto da fórmula VIA,
<formula>formula see original document page 73</formula>
em que A é hidrogênio, C1-C7-alcóxi ou halo, preferivelmente na presença de um ácido, por exemplo, HCI, em um solvente apropriado, por exemplo, dioxano, em temperaturas elevadas, por exemplo, de 50 a 170°C (por e- xemplo, em um forno de microondas), e em seguida reagindo-se o compos- to resultante da fórmula VIIA <formula>formula see original document page 74</formula>
em que as porções são como definidas sob a fórmula IVA e VIA, na presen- ça de um agente de acoplamento, tal como anidrido propilfosfônico, em um solvente apropriado, tal como DMF, na presença de base de nitrogênio, por exemplo, trietilamina e/ou 4-dimetilamino-piridina, preferivelmente nas tem- peraturas na faixa de 0 a 50°C ao composto correspondente da fórmula IIIA.
Um composto da fórmula VA em que R5 é hidrogênio pode, por exemplo, ser obtido reduzindo-se um composto correspondente em que em vez do grupo amino (NR3) um grupo nitro está presente, por exemplo, com pó de ferro em etanol, água e ácido acético em temperaturas elevadas, por exemplo, a partir de 30 a 100°C, ou com hidrogênio na presença de um ca- talisador, por exemplo, Ni Raney em metanol em temperaturas, por exem- plo, a partir de 0 a 50°C. Em ambos os casos, outros solventes habituais são possíveis. Um composto correspondente da fórmula VA em que R5 é C1-C7-alquila pode, em seguida, ser obtido por alquilação, por exemplo, com um C1-C7alquilalogeneto correspondente.
Os materiais de partida correspondentes bem como outros com- postos da fórmula VA podem ser obtidos em analogia a ou pelos métodos descritos nos Exemplos, de acordo com procedimentos conhecidos na téc- nica ou eles estão comercialmente disponíveis.
Condições de processo gerais
O seguinte aplica-se em geral a todos os processos menciona- dos aqui anteriormente e em seguida, embora as condições de reação es- pecificamente mencionadas acima ou abaixo sejam preferidas:
Em quaisquer das reações mencionados aqui anteriormente e em seguida, os grupos de proteção podem ser utilizados onde apropriado ou desejado, até mesmo se este não foi especificamente mencionado, para proteger grupos funcionais que não estão destinados a tomar parte em uma determinada reação, e eles podem ser apresentados e/ou removidos ém estágios apropriados ou desejados. Reações que compreendem o uso de grupos protetores são, portanto, incluídas quando possível sempre que as reações sem mencionamento específico de proteção e/ou desproteção são descritas neste relatório.
Dentro do escopo desta descrição apenas um grupo facilmente removível que não é um constituinte do produto final desejado particular de fórmula IA é designado um "grupo protetor", a menos que o contexto indique de outra maneira. A proteção de grupos funcionais por tais grupos proteto- res, os grupos protetores por si próprios, e as reações apropriadas para sua remoção são descritas, por exemplo, nos trabalhos de referência padrão, tal como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London e New York 1973, em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, "Pro- tective Groups in Organic Synthesis", Terceira edição, Wiley, New York 1999, em "The Peptides"; Volume 3 (editores: E. Gross e J. Meienhofer), Academic Press, London e New York 1981, em "Methoden der organischen Chemie" (Methods of Organic Chemistry), Houben Weyl, 4a edição, Volume 15/1, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, em H.-D. Jakubke e H. Jeschkeit, "Aminosàuren, Peptide1 Proteine" (Amino acids, Peptides, Proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, e Basel 1982, e em Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate" (Chemistry of Carbohydrates: Monosaccharides and Derivatives), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974. Uma característica de grupos protetores é que eles podem ser removidos facilmente (isto é, sem a ocorrência de reações secundárias indesejadas) por exemplo, por solvólise, redução, fotólise ou alternativamen- te sob condições fisiológicas (por exemplo, por clivagem enzimática).
Todas as etapas de processo supracitadas podem ser realiza- das sob condições de reação que são conhecidas jdot si prórpias, preferi- velmente aquelas especificamente mencionadas, na ausência ou, habitual- mente, na presença do solventes ou diluentes, preferível mente solventes ou diluentes que são inertes para os reagentes utilizados e dissolvê-los, na au- sência ou presença de agentes de neutralização, condensação ou catalisa- dores, por exemplo, trocadores iônicos, tais como trocadores catiônicos, por exemplo, na forma de H+, dependendo da natureza da reação e/ou de rea- gentes em temperatura reduzida, normal ou elevada, por exemplo, em uma faixa de temperatura de cerca de -100 °C a cerca de 190°C, preferivelmente de aproximadamente -80°C a aproximadamente 150SC, por exemplo, de -80 a -60°C, em temperatura ambiente, de -20 a 40 °C ou em temperatura de refluxo, sob pressão atmosférica ou em um vaso fechado, onde apropriado sob pressão, e/ou em uma atmosfera inerte, por exemplo, sob uma atmosfe- ra de argônio ou nitrogênio.
Os solventes a partir dos quais estes solventes que são ade- quados para qualquer reação particular podem ser selecionados incluem aqueles mencionados especificamente ou, por exemplo, água, ésteres, tais como alquila inferior-alcanoatos inferiores, por exemplo, acetato de etila, éteres, tais como éteres alifáticos, por exemplo, dietil éter, ou éteres cíclicos, por exemplo, tetraidrofurano ou dioxano, hidrocarbonetos aromáticos líqui- dos, tal como benzeno ou tolueno, álcoois, tal como metanol, etanol ou 1- ou 2-propanol, nitrilas, tal como acetonitrila, hidrocarbonetos halogenados, por exemplo, cloreto de metileno ou clorofórmio, amidas ácidas, tal como dime- tilformamida ou dimetil acetamida, bases, tais como bases de nitrogênio he- terocíclicos, por exemplo, piridina ou N-metilpirrolidin-2-ona, anidridos de ácido carboxílico, tais como anidridos de ácido alcanóico inferior, por exem- plo, anidrido acético, hidrocarbonetos cíclicos, lineares ou ramificados, tal como cicloexano, hexano ou isopentano, ou misturas destes, por exemplo, soluções aquosas, a menos que de outra maneira indicado na descrição dos processos. Tais misturas do solventes podem da mesma forma ser utiliza- dos na elaboração, por exemplo, por cromatografia ou divisão.
A invenção da mesma forma refere-se àquelas formas do pro- cesso no qual um composto obtinível como intermediário em qualquer está- gio do processo é utilizado como material de partida e as etapas de proces- so restantes são realizadas, ou em que um material de partida é formado sob as condições de reação ou é utilizado na forma de um derivado, por e- xemplo, em forma desprotegida ou na forma de um sal, ou um composto obtenível pelo processo de acordo com a invenção é produzido sob condi- ções de processo e processados também in situ. No processo da presente invenção, aqueles materiais de partida são preferivelmente utilizados, os quais resultam em compostos de fórmula IA descrito como sendo preferido. A invenção da mesma forma refere-se a novos intermediários e/ou materiais e partida. Preferência especial é dada às condições de reação e novos in- termediários que são idênticos ou análogos àqueles mencionados nos E- xemplos.
Modalidades preferidas de acordo com a invenção:
Nas modalidades preferidas bem como nas modalidades seguin- tes e anteriores do escopo mais geral, da mesma forma nas reivindicações, quaisquer uma ou mais ou todas as expressões gerais ou símbolos, inde- pendentemente um do outro, podem ser substituídos pelas definições mais específicas correspondentes fornecidas acima e abaixo, desse modo produ- zindo modalidades mais preferidas da invenção.
Preferidas são as modalidades dadas nas reivindicações que são, portanto, incorporadas aqui por referência. Especialmente preferido é um composto da fórmula IA como dado em qualquer um grupo A, B ou C acima. Muito preferido são um ou mais compostos da fórmula IA dados nos Exemplos, bem como sais (especialmente farmaceuticamente aceitáveis) destes. EXEMPLOS:
Os Exemplos seguintes servem para ilustrar a invenção sem limitar o escopo desta. Temperaturas são medidas em graus Celsius. A me- nos que de outra maneira indicado, as reações ocorrem em temperatura ambiente. Os valores de Rf que indicam a relação da distância movida por cada substância para a distância movida pela frente de eluente são determi- nados em placas de camada fina de sílica-gel, placas de TLC de 5 x 10 cm, sílica-gel F254 (Merck, Darmstadt, Germany) por cromatografia de camada fina utilizando os sistemas do solvente indicados abaixo. Condições de HPLC analíticas:
Sistema 1
Gradiente linear 20-100% de CH3CN em 5 min + 1,5 min 100% de CH3CN (0,1% de TFA); detecção em 215 nm, taxa de fluxo 1 mL/min a 30°C. Colu- na: Nucleosil 100-3 C18 (70 χ 4,0mm).
Abreviações e Acrônimos:
AcOH Ácido acético
API-MS espectroscopia de massa por ionização de pressão atmosférico salmoura solução saturada de NaCI em água
celite Celite® (The Celite Corporation) = auxiliar de filtragem com base em terra diatomácea
CH3CN acetonitrila
DCM diclorometano
conc. concentrado
DIEA diisopropiletilamina
DMAP 4-dimetilamino-piridina
DMF dimetil formamida
DMP 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetraidro-2-(1H)-pirimidinona
DMSO dimetilsulfóxido
equiv equivalente(s)
ESI-MS espectroscopia de massa de ionização por eletrovaporiza- ção
Et2O dietil éter
Et3N trietilamina
EtOAc acetato de etila
EtOH Etanol
HNO3 ácido nítrico
H2SO4 ácido sulfúrico
h hora(s)
Hex hexano
HCI ácido clorídrico
H2O água HPLC cromatografia líquida de alta pressão
L litro(s)
LiOH hidróxido de lítio
Me metila
MeOH Metanol
mL mililitro(s)
min minuto(s)
m.p. ponto de fusão
MPLC cromatografia líquida de média pressão
MS espectro de massa
NaH hidreto de sódio
Na2COa carbonato de sódio
NaHC03 bicarbonato de sódio
Na2SO4 sulfato de sódio
NH3aq amôniaaquosa
NMP 1-metil-2-pirrolidona
NMR Ressonância Magnética Nuclear
PdCl2(dppf) [1,1 '-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaládio(II)
Pd(PPh3)4 Tetracis(trifenilfosfina)paládio(0)
Pd(PhCN)2Cl2 Cloreto de bis(benzonitrila)paládio (II)
Ph Fenila
Rf Relação de frentes (TLC)
RT temperatura ambiente
TBTU tetrafluoroborato de O-(Benzotriazol-1-N)-N,N,N',N'- tetrametilurônio
TFA CF3COOH (ácido trifluoroacético)
THF Tetraidrofurano
TLC cromatografia de camada fina
TR tempo de retenção wt. peso
Mecanismo de microonda: Emris Qptimizer (Biotaqe) Exemplo para Esquema de Reação
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Exemplo 1: 1-(2.6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-3-(6-r4-(2-morfolin-4-il-etóxi)- fenilamino1-pirimidin-4-il)-uréia
Fosgênio (20% em tolueno, 0,8 mL, 1,58 mmols, 2,4 equivalen- te) é adicionado a uma solução de 2,6-dicloro-3,5-dimetoxianilina (175 mg, 0,79 mmols, 1,2 equivalente) em dioxano (2,5 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura é aquecida em refluxo, agitada durante 1 hora, permitida resfriar em temperatura ambiente, e concentrada em vácuo. 0 isocianato resultante é adicionado a uma solução de N-[4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenil]- pirimidina-4,6-diamina (208,5 mg, 0,66 mmols) em NMP (2 mL), a 75°C e sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é agitada a 75°C durante 2 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, e é em seguida diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada aquosa é separada e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, se- cada (Na2SO4), filtrada e concentrada. A purificação do produto bruto por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 96:4), se- guido por trituração do material resultante em MeOH1 proporciona o compos- to do título como um sólido branco: ESI-MS: 562,9/564,9 [MH]+; tR = 2,99 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: R, = 0,36 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
Etapa 1.1: N-[4-(2-Morfolin-4-il-etóxi)-fenil]-pirimidina-4,6-diamina
Uma mistura de 6-cloro-pirimidin-4-ilamina (194 mg, 1,5 mmols, 1,3 equiv), 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamina (256 mg, 1,15 mmols) em H2O (1 mL) e ácido acético glacial (5 mL) é agitada durante 16 horas a 100°C. Depois da evaporação do solvente, o resíduo é apreendido em DCM e diluí- do com uma solução aquosa saturada de NaHC03. A camada aquosa é se- parada e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, seca- da (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é triturado em EtOAc para fornecer o composto do título como um sólido cinza: ESI-MS: 316,2 [MH]+; tR = 1,00 min (pureza: 95%, sistema 1); TLC: Rf = 0,22 (DCM/MeOH + 1% NH3aq,93:7).
Etapa 1.2: 4-(2-Morfolin-4-il-etóxi)-fenilamina
Cloridrato de 4-(2-Cloro-etil)-morfolina (4,2 g, 22 mois, 1,2 equiv) é adicionado em uma porção a uma mistura de 4-aminofenol (2 g, 18,3 mois) e hidróxido de sódio finamente pulverizado (1,87 g, 45,8 mois, 2,5 e- quiv) em DMF (32 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é agitada durante 23,5 horas em temperatura ambiente. A suspensão escura resultante é filtrada. O filtrado é diluído com DCM (200 ml) e lavado com salmoura (2 χ 60 mL).· A fase orgânica é secada (sulfato de sódio), filtrada e concentrada. Purificação do resíduo por cromatografia de coluna em sílica- gel (DCM/EtOH, 95:5 (7:3) fornece o composto do título como um sólido amarelo-marrom: API-MS: 223,2 [MH]+; TLC: R, = 0,31 (DCM/EtOH, 9:1). Etapa 1.3: 2.6-Dicloro-3,5-dimetoxianilina
Em uma solução de N-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-acetamida (34,5 g, 264 mois) em etanol (1,3 L), 2M de KOH (0,72 L) é adicionado. Em seguida, a mistura reacional é aquecida em refluxo, agitada durante 44 ho- ras em refluxo, em seguida permitida resfriar em temperatura ambiente. A suspensão resultante é resfriada a O°C agitada durante 1 hora, e filtrada. O resíduo é lavado com uma porção pequena de EtOH frio/H20 (1:1) e com H2O frio até neutralidade, e secada para fornecer o composto do título como um sólido branco: ESI-MS: 222,0/224,0 [MH]+, TLC: Rf = 0,52 (Hex/EtOAc, 1:1).
Etapa l .4: N-(2.6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-acetamida
Sulfurilcloreto (26,9 ml, 325 mois, 1,93 equiv) é adicionado (em 7 min) a uma suspensão fria (O0C) de A/-(3,5-dimetoxifenil)-acetamida (32,9 g, 169 mois) em CH3CN (500 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura amarelada resultante é permitida agitar durante 30 minutos e extinguida por adição gota a gota de uma solução aquosa saturada de bicarbonato de só- dio (250 mL). O precipitado resultante é coletado por filtração a vácuo, lava- do com H2O (300 ml) e secado para proporcionar 20 g do produto desejado (grupo 1). O filtrado é diluído com uma solução aquosa saturada de NaHC03 (300 mL) e extraído com EtOAc (2 χ 300 mL). A fase orgânica é lavada com H2O e salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é puri- ficado por cromatografia de coluna em sílica-gel (EtOAc/Hex, 1:1 ^ 2:1) pa- ra fornecer 8,8 g do produto (batelada 2). Batelada 1 e 2 são combinadas e agitadas em hexano. O sólido é coletado por filtração, lavado com hexano e secado para proporcionar o composto do título como um sólido branco. ESI-
MS: 264,0/266,0 [MH]+, TLC: Rf = 0,15 (Hex/EtOAc, 1:1). Etapa 1.5: N-(3.5-Dimetóxi-fenil)-acetamida
Anidrido acético (13 ml, 137 mois, 1,05 equiv) é adicionado (em minutos) a uma suspensão de 3,5-dimetoxianilina (20 g, 131 mois) èm tolueno (110 mL), mantendo a temperatura interna na faixa de 35-45°C. A mistura reacional é permitida agitar durante 20 horas em temperatura ambi- ente. A suspensão grossa, cinza resultante é diluída com hexano (55 mL) e filtrada. O resíduo no filtro é lavado com tolueno/Hex (2:1, 70 mL) e Hex, e secado para fornecer o composto do título como um sólido branco. API-ES- MS: 196,1 [MH]+, tR = 3,03 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
Exemplo 2: 3-(2,6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-1 -metil-1 -(6-f3-(4-metil- piperazin-1-ilmetil)-fenilamino]-pirimidin-4-ill-uréia
Fosgênio (20% em tolueno, 1 mL, 2,0 mois, 2,4 equiv) é adicio- nado a uma solução de 2,6-dicloro-3,5-dimetoxianilina (221 mg, 1,0 mmols, 1,2 equiv) em dioxano (2,5 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura é aquecida em refluxo, agitada durante 1 hora, permitida resfriar em tempera- tura ambiente, e concentrada em vácuo. G isocianato resultante é adiciona- do a uma solução de N-metil-N'-[3-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-fenil]- pirimidina-4,6-diamina (Etapa 2,1) (259 mg, 0,83 mmols) em tolueno (5 mL), em refluxo e sob uma atmosfera dê argônio. A mistura reacional é agitada em refluxo durante 3 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, e diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada aquosa é separada e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com sal- moura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. A purificação do produto bruto por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) proporciona o composto do título como um sólido amarelo: ESI-MS: 560,0/562,0 [MH]+; tR = 3,26 min (pureza: 99%, sistema 1); TLC: Rf = 0,37 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
Etapa 2.1: N-metil-N'-f3-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-fenin-pirimidina-4.6-dia- mina
Uma mistura de (6-cloro-pirimidin-4-il)-metil-amina (385 mg, 2,68 mmols, 1,1 equiv), 3-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-fenilamina (500 mg, 2,44 mmols) e 4N de HCI em dioxano (7 mL) é aquecida em um tubo selado a 150°C durante 17,5 horas. O solvente é removido e o resíduo diluído com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada aquosa é se- parada e extraída com DCM e DCM/MeOH (95:5). A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4)1 filtrada e concentrada. Purificação do resí- duo por sílica-gel MPLC (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) proporciona o com- posto do título como um sólido bege: ESI-MS: 313.2 [MH]+; tR = 1,00 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,05 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1). Etapa 2.2: 3-(4-metil-piperazin-1-ilmetilHenilamina
Uma suspensão de 1-metil-4-(3-nitro-benzil)-piperazina (6,9 g, 29,14 mmols) e Níquel raney (2 g) em MeOH (150 mL) é agitada durante 5 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistu- ra reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo: ESI-MS: 206,1 [MH]+.
Etapa 2.3: 1-metil-4-(3-nitro-benzil)-piperazina
Uma mistura de 3-nitrobenzilcloreto (5 g, 29,14 mols), N- metilpiperazina (3,9 mL, 34,97 mols, 1,2 equiv), carbonato de potássio (8 g, 58,28, 2 equiv), e acetona (100 ml) é agitada durante 15 horas em refluxo. A mistura reacional é permitida resfriar em temperatura ambiente, filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por MPLC em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para proporcionar o composto do título como um óleo mar- ron: ESI-MS: 236,0 [MH]+; tR = 1,40 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,31 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
Exemplo 3: 3-(2.6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-1-(6-[3-(4-etil-piperazin-1-il)- fenil-aminol-pirimidin-4-ilH-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 559,9/561,9 [MH]+; tn = 3,75 minutos (pure- za: 100%, sistema 1); TLC: R, = 0,37 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 92:8). Etapa 3.1: N-r3-(4-etil-piperazin-1 -il)-fenil1-N'-metil-pirimidina-4,6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,1: ESI-MS: 313,2 [MH]+; tR = 1,20 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,10 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1). Etapa 3.2: 3-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,2: API-MS: 206,2 [MH]+; TLC: Rf = 0,31 (DCM/EtOH, 9:1).
Etapa 3.3: 1-etil-4-(3-nitro-fenil)-piperazina
Uma mistura de 1-fluoro-3-nitrobenzeno (3,2 mL, 29,7 mols) e N- etil-piperazina (7,6 mL, 59,4 mols, 2 equiv) é aquecida em refluxo e agitada durante 117 horas. A mistura reacional é permitida resfriar em temperatura ambiente e diluída com H2O (40 mL) e DCM/MeOH (9:1, 80 mL). A camada aquosa é separada e extraída com DCM/MeOH (9:1). A fase orgânica é la- vada com salmoura, secada (Na2S04), filtrada e concentrada. A purificação do produto bruto por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH, 1:0 (95:5) proporciona o composto do título como um óleo marrom: ESI-MS: 236,0 [MH]+; tR = 2,49 minutos (pureza: 99%, sistema 1); TLC: Rf = 0,26 (DCM/MeOH, 95:5).
Exemplo 4: 3'-(2,6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-1-metil-1 -(6-[4-(2-morfolin-4-il- etóxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il)-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 577,0/579,0 [MH]+; tR = 3,53 minutos (pure- za: 95%, sistema 1); TLC: Rf = 0,40 (DCM/MeOH + 1 % NH3aq, 93:7).
Etapa 4.1: N-metil-N'-[4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenin-pirimidina-4,6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 330,2 [MH]+; tR = 1,10 minuto (pureza: 100%, sistema 1); TLC: R, = 0,16 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7). Exemplo 5: 1 -r6-(4-Benzilóxi-fenilamino)-pirimidin-4-il1-3-(2.6-dicloro-3.5- dimetóxi-fenil)-1 -metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 553,9/555,9 [MH]+; tR = 5,16 minutos (pure- za: 100%, sistema 1).
Etapa 5,1: N-(4-Benzilóxi-fenil)-N'-metil-pirimidina-4,6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 307,2 [MH]+; tR = 3,72 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
Exemplo 6: 3-(2.6-Diclòro-3.5-dimetóxi-fenil)-1-í6-(4-hidróxi-fenilamino)- pirimidin-4-il]-1 -metil-uréia
Uma suspensão de 1-[6-(4-benzilóxi-fenilamino)-pirimidin-4-il]-3- (2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-metil-uréia (Exemplo 5) (67 mg, 0,121 mmols), paládio em carbono (20 mg), e MeOH (3,5 mL) é agitada durante 3 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistu- ra reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para fornecer o composto do título como um sólido marrom: ESI-MS: 464,2/466,2 [MH]+; tR = 3,91 minutos (pureza: 100%, sistema 1). Exemplo 7: 1 -(2-Cloro-3.5-dimetóxi-6-metil-fenil)-3-(6-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)- fenilamino1-pirimidin-4-il)-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 526,1/528,1 [MH]+; tR = 3,12 minutos (pure- za: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,13 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7). Etapa 7.1: N-í4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenill-pirimidina-4,6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 299,1 [MH]+; tR = 1,00 minuto (pureza: >95%, sistema 1).
Etapa 7.2: 4-(4-Etilpiperazin-1-il)-anilina
Uma suspensão de 1 -etil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina (6,2 g, 26,35 mols) e Níquel raney (2 g) em MeOH (120 mL) é agitada durante 7 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacio- nal é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para propor- cionar o composto do título como um sólido violeta: ESI-MS: 206,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,15 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1). Etapa 7.3: 1-etil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina
Uma mistura de 1 -bromo-4-nitrobenzeno (6 g, 29,7 mmols) e 1- etilpiperazina (7,6 mL, 59,4 mmols, 2 equiv) é aquecida a 80°C durante 15 horas. Depois de resfriar em temperatura ambiente, a mistura reacional é diluída com água e DCM/MeOH, 9:1. A camada aquosa é separada e extra- ída com DCM/MeOH, 9:1. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (sulfato de sódio), filtrada e concentrada. A purificação do resíduo através de cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1) pro- porciona o composto do título como um sólido amarelo: ESI-MS: 236,0 [MH]+; tR = 2,35 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,50 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
Etapa 7.4: 2-Cloro-3.5-dimetóxi-6-metil-fenil-amina
HCl (91 mL, 360 mols, 8 equiv, 4N em dioxano) é adicionado gota a gota a uma solução resfriada (10°C) terc-butil éster de ácido (2-cloro- 3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-carbâmico (13,8 g, 45,7 mmols) em dioxano (150 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é permitida aquecer em temperatura ambiente, agitada durante 24 horas e concentrada. O resí- duo é diluído com EtOAc1 lavado com uma solução aquosa saturada de NaHC03, e salmoura, secado (Na2SO4), filtrado e concentrado. O resíduo é purificado por cristalização a partir de DCM/Hex para proporcionar o com- posto do título. ESI-MS: 202,0 [MH]+, TLC: Rf = 0,37 (DCM).
Etapa 7.5: terc-butil éster de ácido (2-Cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)- carbâmico
Uma solução de sulfurilcloreto (6,7 ml, 79,8 rnols, 1,05 equiv) em DCM (140 rríL) é adicionada gota a gota (75 minutos) a uma solução resfria- da (-15°C) de terc-butil éster de ácido (3,5-dimetóxi-2-metil-fenil)-carbâmico (20,4 g, 76,3 mois) em THF (330 ml), sob uma atmosfera de argônio. A mis- tura reacional é permitida agitar durante 3 horas a -15°C e em seguida verti- da sobre uma mistura de gelo/H20 (400 mL), uma solução aquosa saturada de NaHCOe (400 ml), e EtOAc (400 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 200 mL). A fase orgânica combinada é lavada com H2O (3 x 200 mL) e salmoura (200 mL), secada (Na2SO4), fil- trada e concentrada. O resíduo é purificado por trituração em dietil éter se- guido por cromatografia de coluna em sílica-gel (Hex/acetona, 95:5) para proporcionar o composto do título. ESI-MS: 302,2 [MH]+, TLC: Rf = 0,13 (Hex/acetona, 9:1).
Etapa 7.6: terc-butil éster de ácido (3.5-Dimetóxi-2-metil-fenil)-carbâmico Uma solução dê terc-butilítio (200 mL, 340 mois, 2,4 equiv, 1,7M em pentano) é adicionada gota a gota a uma solução resfriada (-65°C) solu- ção de terc-butil éster de ácido (3,5-dimetóxi-fenil)-carbâmico (36,1 g, 142 mois) em THF (250 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura é agitada durante 15 minutos a -65°C e em seguida permitida aquecer a -25°C. Uma solução de metiliodeto (10,7 mL, 171 mois, 1,2 equiv) em THF (140 mL) é em seguida adicionada. A mistura reacional é permitida agitar durante 1 ho- ra a -25°C e em seguida vertida sobre uma mistura de gelo/H20 (300 mL) e EtOAc (300 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 150 mL). A fase orgânica combinada é lavada com H2O (3 x 150 mL) e salmoura (200 mL), secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (Hex/acetona, 95:5 (9:1 (4:1) para fornecer o composto do título. ESI-MS: 268,1 [MH]+, TLC: Rf = 0.25 (Hex/acetona, 9:1).
Etapa 7.7: terc-butil éster de ácido (3,5-Dimetóxi-fenil)-carbâmico
Uma solução de di-terc-butil-dicarbonato (145 g, 651 mois, 1,3 equiv) em THF (200 mL) é adicionada gota a gota a uma solução de 3,5- dimetoxianilina (78,2 g, 500 mois) em THF (1,5 L) em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é aquecida em refluxo durante 4,5 horas (sob aquecimento evolução de gás considerável é obser- vada), permitida resfriar em temperatura ambiente e concentrada. O resíduo é diluído com EtOAc (800 mL) e H2O (800 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 χ 200 mL). A fase orgânica combi- nada é lavada com 0,1 N de HCI (200 mL), H2O, e salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é cristalizado a partir de DCM/Hex para fornecer o composto do título. ESI-MS: 252,1 [M-H]-, TLC: Rf = 0,34 (Hex/EtOAc, 3:1).
Exemplo 8: 3-(2-Cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-pjperazin-1 -il)- fenilamino]-pirimidin-4-il)-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 540,1/542,1 [MH]+; tR = 3,56 minutos (pure- za: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,13 (DCM/MeOH + 1% NHgaq, 93:7). Exemplo 9: 3-(2-Cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-{6-[4-(2-dimetilamino- etóxi)-fenilamino1-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 515,2/517,2 [MH]+; tR = 3,47 min (pureza: >95%, sistema 1).
Etapa 9.1: N-[4-(2-Dimetilamino-etóxi)-fenil1-N'-metil-pirimidina-4,6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 288,2 [MH]+; tR = 0,95 min (pureza: 95%, sis- temal).
Etapa 9.2: 4-(2-Dimetilamino-etóxi)-fenilamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,2: ESI-MS: 181,2 [MH]+; TLC: Rf = 0,18 (DCM/MeOH, 7:3).
Exemplo 10: 3 (2-Cloro-3.5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-metil-(6-(4-[2-(4-métil- piperazin-1 il)-étoxi1-fenilamino)-pirimidin-4 il)-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 570,0 [MH]+; tR = 3,20 minutos (pureza: 90%, sistema 1), TLC: R, = 0,13 (DCM/MeOH + 1 % NH3aq, 93:7).
Etapa 10.1: N-metil-NW4-f2-(4-metil-piperazin-1-il)-etóxi1-fenil)-pirimidina-4.6- diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 343,2 [MH]+; tR = 1,00 minuto (pureza: 95%, sistema 1), TLC: R, = 0,23 (DCM/MeOH + 1 % NH3aq, 9:1). Exemplo 11: 3-(2-Cloro-6-iodo-3.5-dimetóxi-fenil)-1 -(6-[4-(4-etil-piperazin-1 - il)-fenilamino)-pirimidin-4-il)-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 651,8/653,7 [MH]+; tR = 3,20 minutos (pure- za: 95%, sistema 1), TLC: Rf = 0,18 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7). Etapa 11.1 N-f4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenin-N'-metil-pirimidina-4.6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 313,2 [MH]+; tR = 1,10 min (sistema 1); TLC: R, = 0,21 (DCM/MeOH, 93:7).
Etapa 11.2: 2-Cloro-6-iodo-3.5-dimetóxi-fenil-amina
HCl (6,46 mL, 26 mois, 9,1 equiv, 4N em dioxano) é adicionado a uma solução resfriada (10°C) de terc-butil éster de ácido (2-cloro-3,5- dimetóxi-6-metil-fenil)-carbâmico (1,28 g, 2,85 mois, 92% pureza) em dioxa- no (10 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é permitida aquecer em temperatura ambiente e em seguida agitada durante 1,5 hora. O resíduo é diluído com EtOAc e gelo/água, e tornado básico por adição de uma solução aquosa saturada de NaHCO3. As camadas são separadas. A camada aquosa é extraída com EtOAc. A fase orgânica é lavada com sal- moura, secada (Na2S04), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM) para proporcionar o composto do título. API-ES-MS: 314,0 [MH]+, TLC: Rf = 0,53 (DCM).
Etapa 11.3: terc-butil éster de ácido (2-Cloro-6-iodo-3.5-dimetóxi-fenil)- carbâmico
Uma solução de sulfurilcloreto (0,92 ml, 11,0 rnols, 1,16 equiv) em DGM (20 mL) é adicionada gota a gota (30 min) a uma solução fria (- 15°C) de terc-butil éster de ácido (2-iodo-3,5-dimetóxi-fenil)-carbâmico (3,6 g, 9,49 mois) em THF (48 ml), sob uma atmosfera de argônio. A mistura re- acional é permitida agitar durante 1 hora a -15°C e em seguida vertida sobre uma mistura de gelo/H20 (100 mL), uma solução aquosa saturada de NaH- CO3 (80 ml), e EtOAc (100 mL). As camadas são separadas e a fase aquo- sa é extraída com EtOAc (2 χ 100 mL). A fase orgânica combinada é lavada com H2O (3 χ 60 mL) e salmoura (60 mL), secada (Na2SO4), filtrada e con- centrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM) seguido por cristalização a partir de DCM/Hex para proporcionar o composto do título. ESI-MS: 411,9, 413,9 [M-H]", TLC: Rf = 0,18 (DCM/Héx, 7:3).
Etapa 11.4: terc-butil éster de ácido (2-lodo-3,5-dimetóxi-fenil)-carbâmico
Uma solução de terc-butilítio (14,1 mL, 24 mois, 2,4 equiv, 1,7M em pentano) é adicionada gota a gota (15 minutos) a uma solução fria (- 65°C) de terc-butil éster de ácido (3,5-dimetóxi-fenil)-carbâmico (2,53 g, 10 mois) em THF (18 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura é agitada durante 15 minutos a -65°C e em seguida permitida aquecer a -25°C. Um excesso de trifluorometiliodeto é borbulhado na mistura reacional amarela. A mistura escura resultante é vertida sobre uma mistura de gelo/H20 (60 mL) e EtOAc (60 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 χ 30 mL). A fase orgânica combinada é lavada com H2O (3 χ 40 mL), e salmoura (60 mL), secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O re- síduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/Hex, 2:1) para fornecer o composto do título. ESI-MS: 380,1 [MH]+, TLC: Rf = 0,27 (DCM/Hex, 2:1).
Etaoa 11.5: terc-butil éster de ácido (3,5-Dimetóxi-fenil)-carbâmico Uma solução de di-terc- butil-dicarbonato (69,5 g, 312 mois, 1,3 equiv) em THF (100 mL) é adicionado a uma solução de 3,5-dimetoxianilina (37,5 g, 240 mois) em THF (600 mL). A mistura reacional é aquecida em refluxo durante 3 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, agitada durante a noite, e concentrada. O resíduo é dividido entre EtOAc (500 mL) e H2O (500 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 100 mL). A fase orgânica combinada é lavada com 0,1 N de HCl (2 x 100 mL), H2O e salmoura, secada (Na2SO4)1 filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por trituração com hexano para proporcionar o compos- to do título. ÉSI-MS: 254,1 [MH]+, TLC: R, = 0,42 (Hex/EtOAc, 3:1). Exemplo 12: 3-(2-Cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1 -(6-[4-(4-isopropil- piperazin-1 -il)-fenilamino1-pirimidin-4-il)-1 -metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 554,0/555,0 [MH]+; tR = 3,49 minutos (pure- za: >95%, sistema 1), TLC: R, = 0,13 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7). Etapa 12.1: N-f4-(4-lsopropil-piperazin-1-il)-fenin-N'-metil-pirimidina-4.6- diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 288,2 [MH]+; tR = 0,95 min (pureza: 95%, sis- tema 1).
Etapa 12.2: 4-(4-lsopropilpiperazin-1-il)-anilina
Uma suspensão de 1-isopropil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina (5,18 g, 20,80 mois) e 5% de paládio em carbono (0,5 g) em MeOH (100 mL) é agitado durante 2,7 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um sólido viole- ta: ESI-MS: 220,1 [MH]+; tR = 0,95 min (sistema 1). Etapa 12.3: 1-lsopropil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina
Uma mistura de 1-bromo-4-nitrobenzeno (6 g, 29,7 mois) e 1- etilpiperazina (7,6 ml, 59,4 mois, 2 equiv) é aquecida a 80°C durante 15 ho- ras. Depois de resfriar em temperatura ambiente a mistura reacional é con- centrada. A purificação do resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH, 95:5) proporciona o composto do título como um sólido ama- relo: ESI-MS: 250,1 [MH]+; tR = 2,57 minutos (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,16 (DCM/MeOH, 95:5).
Exemplo 13: 1 -(6-[4-(4-benzil-piperazin-1 -il)-fenilamino1-pirimidin-4-il)-3-(2.6- dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-1 -metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 621,9/623,9 [MH]+; tR = 4,04 minutos (pure- za: 100%, sistema 1).
Etapa 13.1: N-[4-(4-benzil-piperazin-1 -il)-fenin-N'-metil-pirimidina-4,6-diamina O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 375,1 [MH]+; tR = 2,36 minutos (pureza: 95%, sistema 1).
Etapa 13.2: 4-(4-benzil-piperazin-1-il)-fenilamina
Pó de férro (5,4 g, 97 mois, 4 equiv) é adicionado porção a por- ção a uma mistura a 80°C de 1-benzil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina (7,2 g, 24,2 mols), EtOH (150 mL), H2O (40 mL), e AcOH (20 mL). A mistura reacional é agitada durante 1,75 hora a 80°C, permitida resfriar em temperatura ambien- te, e concentrada. O resíduo é diluído com EtOAc e uma solução saturada aquosa de Na2C03. As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc. A fase orgânica combinada é lavada com salmoura, secada (Na2S04), filtrada e concentrada para proporcionar o composto do título: ES- MS: 268,3 [MH]+; único pico em tR = 1,30 minuto (sistema 1).
Etapa 13.3: 1-benzil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina
Uma mistura de 1 -bromo-4-nitrobenzeno (5 g, 24,8 mols) e 1- benzilpiperazina (8,6 ml, 49,5 mols, 2 equiv) é aquecida a 80°C durante 17 horas. A mistura reacional é permitida resfriar em temperatura ambiente, e é diluída com DCM/H20. As camadas são separadas e a fase aquosa é extra- ída com DCM. A fase orgânica combinada é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. A purificação do resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel (Hex/EtOAc, 1:1) proporciona o composto do título como um sólido amarelo: ESI-MS: 298,3 [MH]+; tR = 3,25 minuto (pureza: 100%, sistema 1). Exemplo 14: 3-(2.6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-1 -metil-1-[6-(4-piperazin-1-il- fenilamino)-pirimidin-4-il]-uréia
Uma suspensão de 1-{6-[4-(4-benzil-piperazin-1-il)-fenilaminò]- pirimidin-4-il}-3:-(2(6-dicloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1 -metil-uréia (100 mg, 0,161 mmols) (Exemplo 13), paládio em carbono (30 mg), MeOH (6 mL), e HCl (37%, 16 μL) é agitado durante 5 dias em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada e concentrada. Purificação do resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/2N de NH3 em MeOH, 95:5) proporciona o composto do título como um sólido bege: ESI-MS: 532,0/534,0 [MH]+; tR = 3,39 min (pureza: 100%, sistema 1).
Exemplo 15: 3-(2-Cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-[6-(3-dimetilaminometil- fenilamino)-pirimidin-4-il1-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 485,0/487,0 [MH]+; tR = 3,69 minutos (pure- za: 100%, sistema 1).
Exemplo 16: 3-(2-Cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1 -(6-[3-(4-etil-piperazin-1 - il)-fenilamino]-pirimidin-4-il)-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 540,0/542,0 [MH]+; tR = 3,74 minutos (pure- za: 100%, sistema 1).
Exemplo 17: 3-(2-Cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-metil-1-(6-[4-(2- pirrolidin-1-il-etóxi)-fenilamino]-pirimidin-4-ill-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 541,0/543,0 [MH]+; tR = 3,66 minutos (pure- za: 100%, sistema 1).
Etapa 17.1: N-metil-N'-r4-(2-pirrolidin-1 -il-etóxi)-fenin-pirimidina-4.6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,1: ESI-MS: 314,1 [MH]+; tR = 1,15 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,15 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
Etapa 17.2: 4-(2-Pirrolidin-1-il-etóxi)-fenilamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,2: ESI-MS: 207,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,22 (DCM/MeOH, 1:1).
Exemplo 18: 3-(2-Cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-metil-1 -(6-[3-fluoro-4-(2- pirrolidin-1-il-etóxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-urea
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 578,9/580,9 [MH]+; tR = 3,96 min (pureza: 100%, sistema 1); TLG: Rf = 0,38 (DCM/MeOH + 1 % NH3aq, 92:8).
Etapa 18.1: N-[3-Fluoro-4-(2-pirrolidin-1-il-etóxi)-fenil1-N'-metil-pirimidina-4,6- diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 332,2 [MH]+; tR = 1,30 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,37 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 99:1).
Etapa 18.2: 3-Fluoro-4-(2-pirrolidin-1-il-etóxi)-fenilamina
Uma suspensão de 1-[2-(2-fluoro-4-nitro-fenóxi)-etil]-pirrolidina (1,25 g, 4,92 mols) e 10% de paládio em carbono (0,2 g) em EtOH (20 mL) é agitada durante 1 hora em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um óleo mar- rom: ESI-MS: 225,1 [MH]+; tR = 0,80 min (sistema 1).
Etapa 18.3: 1-[2-(2-Fluoro-4-nitro-fenóxi)-etil]-pirrolidina
Cloridrato de 1-(2-Cloro-etil)-pirrolidina (1,2 g, 7,0 mols, 1,1 e- quiv) é adicionado a uma suspensão de 2-fluoro-4-nitrofenol (1 g, 6,4 mols) e carbonato de césio (5,2 g, 15,9 mmols, 2,5 equiv) em DMF (20 mL). A mis- tura resultante é aquecida a 80°C e agitadau durante 18 horas. Cloridrato de 1-(2-cloro-etil)-pirrolidina adicional (1 g) é adicionado e a mistura é agitada durante 3 horas a 80°C. A mistura reacional é resfriada em temperatura am- biente, diluída com EtOAc e H2O. As camadas são separadas e a camada aquosa é extraída com EtOAc. A fase orgânica é lavada com H2O, secada (Na2SO4)1 filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para fornecer o composto do título como um sólido amarelo. ESI-MS: 255,1 [MH]+; tR = 2,57 min (sistema 1); TLC: R, = 0,55 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
Exemplo 19: 3-(2,6-Dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-(6-[4-(1-etil-piperidin-4-il)- fenilaminol-pirimidin-4-il}-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 558,9/560,9 [MH]+; tR = 3,85 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: R, = 0,14 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
Etapa 19.1: N-[4-(1-etil-piperidin-4-il)-fenil-N'-metil-pirimidina-4,6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 312,2 [MH]+; tR = 1,3 min (sistema 1); TLC: R, = 0,27 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 92:8).
Etapa 19.2: 4-(1-etil-piperidin-4-il)-fenilamina
Uma suspensão de 1-etil-4-(4-nitro-fenil)-piperidina (0,8 g, 4,92 mols) e 10% de paládio em carbono (0,1 g) em EtOH (10 mL) é agitada du- rante 3 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concen- trada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1 % NH3aq, 95:5) para fornecer o composto do título. ESI-MS: 205,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,29 (DCM/MeOH + 1% NH3acV 95:5).
Etapa 19.3: 1-etil-4-(4-nitro-fenil)-piperidina
Triacetoxiboroidreto de sódio (3,1 g, 14,6 mols, 3 equiv) é adi- cionado a uma solução fria (5°C) de 4-(4-nitro-fenil)-piperidina (1 g, 4,9 mols) e acetaldeído (0,82 mL, 14,6 mols, 3 equiv) em DCM (20 mL). A mistura re- acional é agitada durante 1 hora a 5°C e em seguida diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCO3. As camadas são separadas e a camada aquosa é extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmou- ra, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cro- matografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 98:2) para for- necer o composto do título como um óleo amarelo. ESI-MS: 235,1 [MH]+; tR = 2,64 minutos (pureza: 85%, sistema 1); TLC: Rf = 0,14 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 98:2).
Etapa 19.4: 4-(4-Nitro-fenil)-piperidina
Uma solução de H2SO4 concentrada (2,65 mL) em AcOH (40 mL) e uma solução de HNO3 concentrado (2,1 mL) em AcOH (20 mL) são adicionadas seqüencialmente e gota a gota a uma solução de A- fenilpiperidina em AcOH (40 mL), mantendo-se a temperatura abaixo de 20°C. Em seguida, H2SO4 concentrado (40 mL) é adicionado (nenhum res- friamento aplicado; temperatura interna alcança 60°C). A mistura reacional é permitida resfriar em temperatura ambiente, vertida sobre gelo/água (100 g), neutralizada por adição de NaHC03 sólido (150 g), e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concen- trada. O resíduo é purificado através de trituração em Et2O para proporcio- nar o composto do título como um sólido amarelo. ESI-MS: 207,1 [MH]+; tR = 2,42 minutos (sistema 1).
Exemplo 20: 3-(2.6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-1 -etil-1 -(6-[4-(4-etil-piperazin- 1-il)-fenilaminol-pirimidin-4-il)-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 573,9/575,9 [MH]+; tR = 3,69 minutos (pure- za: 100%, sistema 1).
Etapa 20.1: N-etil-N'-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)-fenin-pirimidina-4,6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 327,2 [MH]+; tR = 1,5 minuto (sistema 1). Exemplo 21: 3-(2,6-Dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[2-fluoro-4-(2-pirrolidin-1 - il-etóxi)-fenilamino1-pirimidin-4-il} -metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento
descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 578,9/580,9 [MH]+; tR = 3,79 minutos (pure- za: 100%, sistema 1).
Etapa 21.1: N-{2-Fluoro-4-(2-pirrolidin-1 -il-etóxi)-fenin-N'-metil-pirimidina-4,6- diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2.1: ESI-MS: 332,2 [MH]+. Etapa 21.2: 2-Fluoro-4-(2-pirrolidin-1-il-etóxi)-fenilamina
Uma suspensão de 1-[2-(3-fluoro-4-nitro-fenóxi)-etil]-pirrolidina (1,96 g, 7,7 mols) e 10% de paládio em carbono (0,2 g) em MeOH (40 mL) é agitada durante 0,5 hora em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para fornecer o composto do título. ESI-MS: 225,1 [MH]+; tR = 0,95 min (sistema 1).
Etapa 21.3: 1-[2-(3-Fluoro-4-nitro-fenóxi)-etil1-pirrolidina
Cloridrato de 1-(2-Cloro-etil)-pirrolidina (2,6 g, 15,4 rnols, 1,3 e- quiv) é adicionado a uma mistura de 2-fluoro-4-nitrofenol (1,84 g, 11,7 mois) e carbonato de césio (9,1 g, 27,9 mois, 2.5 equiv) em DMF (40 mL). A mistu- ra resultante é aquecida a 80°C e agitada durante 3 horas. A mistura reacio- nal é resfriada em temperatura ambiente, em seguida diluída com DCM e H2O. As camadas são separadas e a camada aquosa é extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO^, filtrada e concen- trada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 97:3) para fornecer 1,96 g do composto do título como um sólido amarelo escuro. ESI-MS: 255,1 [MH]+; tR = 2,55 minutos (pureza: 93%, sistema 1); TLC: Rf = 0,40 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
Exemplo 22: 3-(2.6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-1 -(6-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)-2- metóxi-fenilaminol-pirimidin-4-il)-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2 API-MS: 589,9/591,8 [MH]+; tR = 3,59 minutos (siste- ma 1); TLC: R, = 0,13 (DCM/MeOH + 0,5% NH3aq, 95:5). Etapa 22.1: N-f4-(4-etil-piperazin-1-il)-2-metóxi-fenil1-N'-metil-pirimidina-4.6- diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 343,2 [MH]+; tR = 1,30 minuto (sistema 1).
Etapa 22.2: 4-(4-etil-piperazin-1-il)-2-metóxi-fenilamina
Uma suspensão de 1-etil-4-(3-metóxi-4-nitro-fenil)-piperazina (4 g, 15,1 mois) e Níquel raney (1 g) em MeOH (80 mL) é agitada durante 10,5 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistu- ra reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um óleo marrom: ESI-MS: 236,2 [MH]+; tR = 0,95 min (sistema 1).
Etapa 22.3: 1-etil-4-(3-metóxi-4-nitro-fenil)-piperazina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 248,3: ESI-MS: 266,1 [MH]+. Exemplo 23: 3-(2,6-Dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[4-(4-etil-piperazina-1 - carbonil)-fenilaminol-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 233: API-MS: 587,8/589,8 [MH]+; tR = 3,58 minutos (pu- reza: 94.8%, sistema 1); TLC: Rf = 0,47 (DCM/2N NH3 em MeOH, 9:1).
Etapa 23.1: (4-etil-piperazin-1 -il)-r4-(6-metilamino-pirimidin-4-ilamino)-fenil1- metanona
Anidrido propilfosfônico (50% em DMF, 2,72 mL, 4,7 mois, 2 e- quiv) é adicionado a uma solução de ácido 4-(6-metilamino-pirimidin-4- ilamino)-benzóico (0,570 g, 2,33 mois), N-etil-piperazina (0,33 mL, 2,57 mois, 1,1 equiv), DMAP (7 mg), e Et3N (3,3 mL, 23,3 mois, 10 equiv) em DMF (25 mL), em temperatura ambiente e sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é agitada em temperatura ambiente durante 1 hora, diluída com EtOAc e lavada com H2O. A camada aquosa é extraída com EtOAc. A fase orgânica combinada é lavada com salmoura, secada (Na2SO^, filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica- gel (DCM (DCM/2N NH3 em MeOH, 86:14) para fornecer o composto do títu- lo como uma espuma amarela: ES-MS: 341,2 [MH]+; tR = 1,00 minuto (sis- tema 1); Rf = 0,33 (CH2CI2/2 N NH3 em MeOH, 9:1).
Etapa 23.2: ácido 4-(6-Metilamino-pirimidin-4-ilamino)-benzóico
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,1: ESI-MS: 245,0 [MH]+; tR = 1,58 minuto (sistema 1). Exemplo 24: 3-(2,6-Dicloro-3.5-dimetóxi-feniiy-1 -(6-f4-(4-etil-piperazin-1 -il)-3- fluoro-fenilamino1-pirimidin-4-il)-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: API-MS: 577,9/579,9 [MH]+; tR = 3,87 minutos (pure- za: 90%, sistema 1); TLC: R, = 0,20 (DCM/MeOH + 1 % NH3aq, 95:5). Etapa 24.1: N-[4-(4-etil-piperazin-1-il)-3-fluoro-fenil1-N'-metil-pirimidina-4,6- diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2.1, porém agitando a mistura reacional durante 15 minu- tos a 160°C em um mecanismo de microonda. O produto bruto é purificado por trituração em EtOAc para proporcionar o composto dò título: ESI-MS: 331,2 [MH]+.
Etapa 24.2: 4-(4-etil-piperazin-1-il)-3-fluoro-fenilamina
Uma suspensão de 1-etil-4-(2-fluoro-4-nitro-fenil)-piperazina (1,24 g, 15,1 mols) e Níquel raney (13 mg) em MeOH (6 mL) é agitada du- rante 17 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é fiJtrada através de uma almofada de celite e concen- trada para proporcionar o composto do título como um óleo roxo: ESI-MS: 224,1 [MH]+; tR = 0,90 min (sistema 1).
Etapa 24.3: 1 -etil-4-(2-fluoro-4-nitro-fenil)-piperazina N-Etilpiperazina (0,96 mL·, 7,6 mols, 1,2 equiv) é adicionado a uma mistura de 3,4-difluoronitrobenzeno (0,7 mL, 6,32 mols) e carbonato de potássio (1,74 g, 12,6 mols, 2 equiv) em DMF (10 mL). A mistura reacional é agitada a 90°C durante 17 horas, permitida resfriar em temperatura ambien- te, diluída com H2O e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 97:3) para fornecer o composto do título como um sólido amarelo: ES-MS: 254,1 [MH]+; tR = 2,65 minutos (sistema 1); Rf = 0,30 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
Exemplo 25: 3-(2.4-Dicloro-5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)-1-(6-[4-(4-etil- piperazin-1-il)-fenilamino1-pirimidin-4-il)-1-metil-uréia
Fosgênio (20% em tolueno, 0,54 mL, 1,0 mmols, 2,0 equiv) é adicionado a uma solução de 2,4-dicloro-5-metóxi-3-trifluorometilanilina (156 mg, 0,60 mmols, 1,2 equiv) em dioxano (2 mL), sob uma atmosfera de nitro- gênio. A mistura é aquecida em refluxo, agitada durante 75 minutos, permi- tida resfriar em temperatura ambiente, e concentrada em vácuo. O sólido resultante 2,4-dicloro-5-metóxi-3-trifluorometil-fenilisocianato é adicionado porção a porção a uma solução de ebulição de N-[4-(4-etil-piperazin-1-il)- fenil]-N'-metil-pirimidina-4,6-diamina (156 mg, 0,50 mmols; preparação veja Etapa 25.5) em 6 ml de tolueno sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura reacional é agitada a 110°C durante 3,3 horas, permitida resfriar em tempe- ratura ambiente, e diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCOs. A camada aquosa é separada e extraída duas vezes com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2S04), filtrada e concen- trada. Trituração do sólido resultante com 2 porções de MeOH produz o composto do título: ESI-MS: 598/600 [MH]+; tR = 5,1 minutos (pureza: 97%, sistema 1).
Etapa 25.1: 2,4-Dicloro-5-metóxi-3-trifluorometilanilina
Uma solução a 2M de KOH em água (1,87 ml) é adicionada a uma solução de N-(2,4-dicloro-5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)-acetamida (104 mg, 0,344 mmols) em EtOH (3 ml). Depois de agitar durante 3,5 horas a 80°C seguido por resfriamento em temperatura ambiente, o solvente é eva- porado e o resíduo é apreendido em EtOAc e uma solução aquosa saturada de NaHCO3- A camada aquosa separada é extraída duas vezes com EtOAc.
As fases orgânicas são lavadas com salmoura, secadas (Na2S04), filtradas e concentradas, fornecendo o composto do título: ESI-MS: 258/260 [M-H]'; tR = 4,8 minutos (sistema 1); TLC: Rf = 0,54 (EtOAc). Etapa 25.2: N-(2,4-Dicloro-5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)-acetamida
Uma solução de N-(5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)-acetamida (233 mg, 1,0 mmols) sob uma atmosfera de nitrogênio é resfriada em um banho de gelo (precipitação). Em seguida 1,93 mL de uma solução de 1M de SO2Cb em DCM são adicionados. Depois de 2 horas, outro 1,93 mL da solução de SO2CI2 são adicionados e agitação é continuado durante total- mente 4 horas a 0°C. A suspensão é diluída com DCM e uma solução aquo- sa saturada de NaHC03. A fase inorgânica separada é extraída duas vezes com DCM. As fases orgânicas são lavadas com água e salmoura, secadas (Na2S04), filtradas e concentradas. Cromatografia de coluna (hexa- no/EtOAc, 7:3) fornece o composto do título: mp: 143-144°C; API-MS: 300/302 [M-H]'; TLC: Rf = 0,23 (Hex/EtOAc, 1:1); 1H-NMR (DMSO-d6) δ 2,13 (s, H3C), 3,88 (s, H3C), 7,84 (s, HfeniI), 9,81 (s, HN).
Etapa 25.3: N-(5-Metóxi-3-trifluorometil-fenil)-acetamida
Anidrido acético (1,22 ml, 12,8 mois) é adicionado durante 10 minutos a uma solução de 5-metóxi-3-trifluorometil-anilina (2,29 g, 12,0 mols) em tolueno (10 ml) a uma temperatura de 25-33°C. Depois de 90 mi- nutos em temperatura ambiente, hexano (10 ml) é adicionado e a suspen- são é agitada durante 20 minutos. Filtração, lavagem com tolueno/hexáno 2:1 e hexano produz o composto do título: mp: 123-124°C; API-MS: 234 [MH]+; TLC: Rf = 0.27 (Hex/EtOAc, 1:1).
Etapa 25.4: 5-Metóxi-3-trifluorometil-anilina
Hidrogenação de uma solução de 3-metóxi-5- nitrobenzotrifluoreto (6,19 g, 28 mols) em MeOH (140 ml) na presença de Pd-C (0,62 g, 10%), remoção do catalisador por filtração e concentração em vácuo do filtrado resultante produz o composto do título: API-MS: 190 [M-H]"; TLC: Rf = 0,7 (EtOAc).
Etapa 25.5: N-f4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenin-N'-metil-pirimidina-4,6-diamina
Uma mistura de 4-(4-etilpiperazin-1-il)-anilina (1 g, 4,88 mmols) (preparado em analogia ao Exemplo 238, Etapa 238,1), (6-cloro-pirimidin-4- il)-metil-amina (1,81 g, 12,68 mols, 1,3 eq.) e 4N de HCl em dioxano (15 ml) é aquecida em um tubo selado a 150°C durante 5 horas. A mistura reacional é concentrada, diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de bicar- bonato de sódio. A camada aquosa é separada e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (sulfato de sódio), filtrada e con- centrada. Purificação do resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH, 93:7) seguido por trituração em dietil éter proporciona o com- posto do título como um sólido branco: ESI-MS: 313,2 [MH]+; tR = 1,10 min (sistema 1); TLC: Rf =0,21 (DCM/MeOH, 93:7).
Exemplo 26: 3-(5-Metóxi-3-trifluorometil-fenil)-1-(6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)- fenilamino]-pirimidin-4-il)-1-metil-uréia
Fosgênio (20% em tolueno, 1,62 mL, 3,0 mols, 2,0 equiv) é adi- cionado a uma solução de 5-metóxi-3-trifluorometilanilina (344 mg, 1,8 mmols, 1.2 equiv) em dioxano (6 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura é aquecida em refluxo, agitada durante 80 minutos, permitida resfri- ar em temperatura ambiente, e concentrada em vácuo. Durante 45 min, uma solução concentrada do 5-metóxi-3-trifluorometil-fenilisocianato oleoso resul- tante em tolueno é adicionado porção a porção para uma solução de ebuli- ção de N-[4-(4-etil-piperazin-l-il)-fenil]-N'-metil-pirimidina-4,6-diamina (468 mg, 1,50 mmols; Etapa 242,1) em 18 ml de tolueno sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura reacional é agitada a 110°C durante 4 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, e diluída com DCM e uma solução aquo- sa saturada de NaHCO3. A camada aquosa é separada e extraída duas ve- zes com DCM. As fases orgânicas são lavadas com salmoura, secadas (Na2S04), filtradas e concentradas. Cromatografia de coluna (DCM/MeOH, 49:1 -» 24:1) fornece o composto do título: API-MS: 530/532 [MH]+; TLC: Rf = 0,4 (DCM/MeOH, 9:1); tR = 4,3 minutos (pureza: 100%, sistema 1). Exemplo 27: 3-(5-Metóxi-3-trifluorometil-fenil)-1 -(6-f3-cloro-4-(4-etil-pipera- zin-1 -il)-fenilamino1-pirimidin-4-il)-1 -metil-uréia
Porções de 0,4 mL de uma solução a 1M de SO2CI2 em DCM são adicionadas repetidamente durante um período de 27 horas a uma sus- pensão resfriada com gelo de 3-(5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)-1-{6-[4-(4-etil- piperazin-1-il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia (105 mg, 0,20 mmols) (Exemplo 26) em acetonitrila (6 mL). A reação é seguida por análise de H- PLC. A mistura reacional (ainda contendo material de partida) é diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada aquosa é se- parada e extraída duas vezes com DCM. As fases orgânicas são lavadas com salmoura, secadas (Na2SO4), filtradas e concentradas. MPLC de fase reversa (H20/CH3CN + 0,1% de TFA) produz, depois da neutralização do produto contendo frações com NaHCO3, concentração parcial e extração com DCM, o composto do título: API-MS: 564/566 [MH]+; TLC: Rf = 0,28 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5); 1H-NMR (DMSO-d6) δ 1,02 (t, H3C), 2,37 (q, H2C), 2,51 (m, 4H), 2,92 (m, 4H), 3,33 (s, H3C), 3,82 (s, H3C), 6,48 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 7,12 (d, 1H), 7,43 (m, 2H), 7,59 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 9,66 (s, HN), 12,33 (s, HN).
Exemplo 28: 1-{6-[2-Cloro-4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino1-pirimidin-4-il}-3- (2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2 (1 hora 20 minutos agitando em refluxo): ESI-MS: 593,8/595,8 [MH]+; tR = 3,80 min (pureza: 95%, sistema 1); TLC: Rf = 0,45 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
Etapa 28.1: N-[2-Cloro-4-(4-etil-piperazin-1 -il)-fenil1-N'-metil-pirimidina-4.6- diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 347,1/349,1 [MH]+; TLC: R, = 0,15 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
Etapa 28.2: 2-Cloro-4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamina
Uma suspensão de 1-(3-cloro-4-nitro-fenil)-4-etil-piperazina (1 g, 3,7 mols) e Níquel raney (0,1 g) em MeOH (20 mL) é agitada durante 8 !ιο- ras em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada. O re- síduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para proporcionar o composto do título como um sólido qua- se branco: ESI-MS: 240,1/242,1 [MH]+; tR = 0,90 min (sistema i); TLC: Rf = 0,46 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
Etapa 28.3: 1-(3-Cloro-4-nitro-fenil)-4-etil-piperazina
N-Etilpiperazina (4,3 mL, 34,3 mmols, 1,2 equiv) é adicionado a uma mistura de 2-cloro-4-fluoronitrobenzeno (5 g, 28,6 mmols) e carbonato de potássio (7,9 g, 57,1 mols, 2 equiv) em DMF (50 mL). A mistura reacional é agitada a 100°C durante 6 horas, permitida resfriar em temperatura ambi- ente, diluída com H2O e extraída com EtOAc. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado através de trituração em dietil éter para fornecer 5,6 g do composto do título como um sólido amarelo: ES-MS: 270,0 [MH]+; tR = 2,90 min (sistema 1).
Exemplo 29: 3-(2,6-Dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -l6-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)-2- fluoro-fenilamino]-pirimidin-4-il)-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2 (1 hora agitando em refluxo, e EtOAc utilizado em vez de DCM para extrair o produto): ESI-MS: 577,9/579,9 [MH]+; tR = 4,00 minu- tos (pureza: >95%, sistema 1); TLC: R, = 0,35 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 97:3). Etapa 29.1: N-f4-(4-etil-Diperazin-1-il)-2-fluoro-fenil1-N'-metil-pirimidina-4,6 diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,1, porém agitando a mistura reacional durante 1 hora a 160°C em um mecanismo de microonda e utilizando EtOAc em vez de DCM para extrair o produto. Composto do título: ESI-MS: 331,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,10 (DCM/MeOH+ 1% NH3aq, 95:5).
Etapa 29.2: 4-(4-etil-piperazin-1-il)-2-fluoro-fenilamina
Uma suspensão de 1-etil-4-(3-fluoro-4-nitro-fenil)-piperazina (7 g, 27,7 mois) e Pd (10%) em carbono (0,35 g) em MeOH (140 mL) é agitada durante 3 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogê- nio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e con- centrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para proporcionar o composto do título co- mo um sólido branco: ESI-MS: 224,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,54 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
Etapa 29.3: 1-etil-4-(3-fluoro-4-nitro-fenil)-piperazina
N-Etilpiperazina (4,8 mL, 37,7 mois, 1,2 equiv) é adicionada a uma mistura de 2,4-difluoronitrobenzeno (5 g, 31,4 mois) e carbonato de potássio (8,7 g, 62,9 mois, 2 equiv) em DMF (50 mL). A mistura reacional é agitada a 100°C durante 6 horas, permitida resfriar em temperatura ambien- te, diluída com H2O e extraída com EtOAc. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (NasSO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1 % NH3aq, 95:5) para fornecer o composto do título como um óleo amarelo: ES-MS: 254,1 [MH]+; TLC: R, = 0,67 (DCM/MeOH + 1 % NH3aq, 95:5).
Exemplo 30: 3-(2,6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-1 -(6-[6-(4-isopropil-piperazin- 1-il)-piridin-3-ilamino1-pirimidin-4-iÍ)-1-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1 (2 equiv de fosgênio para a formação de isocianato, 16 horas agitando a 70°C na etapa subseqüente, e EtOAc utilizado em vez de DCM para extrair o produto): ESI-MS: 574,8/576,8 [MH]+; tR = 3,32 minu- tos (sistema 1); TLC: Rf = 0,10 (DCM/MeOH/NH3aq, 94:5:1).
Etapa 30.1: N-f6-(4-lsopropil-piperazin-1-il)-piridin-3-in-N'-metil-pirimiclina- 4,6-diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1. Composto do título: ESI-MS: 328,2 [MH]+.
Etapa 30.2: 6-(4-lsopropil-piperazin-1-il)-piridin-3-ilamina
Uma mistura de pó de férro (1,4 g, 25,3 mois, 4 equiv), 1- isopropil-4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina (1,58 g, 6,32 mols), EtOH (20 mL), H2O (5 mL), e AcOH (2,5 mL) é agitado durante 2 horas a 90°C, permitida resfriar em temperatura ambiente, baseficada por adição de amônio aquoso, filtrada através de uma almofada de celite e parcialmente concentrada para remover EtOH. O resíduo aquoso é saturado com cloreto de sódio e extraído com EtOAc e DCM. A fase orgânica combinada é lavada com salmoura, se- cada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromato- grafia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH/NH3aq, 91:8:1) para proporcionar o composto do título como um sólido roxo: ESI-MS: 221,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,.20 (DCM/MeOH/NH3aq, 91:8:1).
Etapa 30.3: 1-lsopropil-4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina (NVP-BKT293) N-Isopropilpiperazina (1,8 mL, 12,7 mols, 2 equiv) é adicionada a uma mistura fria (5°C) de 2-cloro-5-nitropiridina (1g, 6,3 mols) em DCM (5 mL). A mistura reacional é permitida aquecer em temperatura ambiente, agi- tada durante 16 horas, diluída com DCM/H20 e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada para fornecer o composto do título como um sólido amarelo: ES-MS: 251,2 [MH]+; tR = 2,20 min (sistema 1).
Exemplo 31: 3-(2.6-Dicloro-3.5-dimetóxi-fenil)-1-l6-r6-(4-etil-piperazin-1-il)- piridin-3-ilamino]-pirimidin-4-ilM-metil-uréia
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1 (2 equiv de fosgênio para a formação de isocianato, 4 horas agitando em refluxo na etapa subseqüente, e EtOAc utilizado em vez de DCM para extrair o produto): ESI-MS: 560,8/562,8 [MH]+; tR = 3,20 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,35 (DCM/MeOH/NH3aq, 94:5:1). Etapa 31.1: N-[6-(4-etil-piperazin-1 -il)-piridin-3-il1-N'-metil-pirimidina-4.6- diamina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1. Composto do título: ESI-MS: 314,2 [MH]+; TLC: Rf = 0,20 (DCM/MeOH/NH3aq, 91:8:1).
Etapa 31.2: 6-(4-etil-piperazin-1-il)-piridin-3-ilamina
Uma suspensão de 1-etil-4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina (1,4 g) e níquel raney (140 mg) em MeOH (30 mL) é agitada durante 10 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacio- nal é filtrada através de uma almofada dê celite e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH/NH3aq, 94:5:1) para proporcionar o composto do título como um óleo roxo: ESI-MS: 207,1 [MH]+; TLC: R, = 0,26 (DCM/MeOH/NH3aq, 94:5:1).
Etapa 31.3: 1-etil-4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina
O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 30.3, porém utilizando N-etilpiperazina. O composto do título: ES-MS: 237,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,25 (DCM/MeOH/NH3aq, 96:3:1).
Exemplo 32: Cápsulas Macias
5000 cápsulas de gelatina macias, cada qual compreendendo como ingrediente ativo 0,05 g de qualquer um dos compostos da fórmula IA mencionados em qualquer um dos Exemplos anteriores 1 a 29 ou são pre- paradas como segue:
Composição
Ingrediente ativo 250 g
Lauroglicol 2 litros
Processo de preparação: O ingrediente ativo pulverizado é suspenso em Lauroglikol * (laurato de propileno glicol, Gattefossé S.A, Saint Priest, Fran- ce) e moído em um pulverizador úmido para produzir um tamanho de partí- cula de cerca de 1 a 3 μιτι. Porções de 0,419 g da mistura são em seguida introduzidas em cápsulas de gelatina macias utilizando uma máquina de carga de cápsula.
Exemplo 33: Comprimidos compreendendo compostos da fórmula IA Comprimidos, compreendendo, como ingrediente ativo, 100 mg de qualquer um dos compostos da fórmula IA em qualquer um dos Exem- plos anteriores 1 a 29 são preparados com a seguinte composição, seguin- do procedimentos padrões:
Composição
<table>table see original document page 107</column></row><table>
Fabricação: O ingrediente ativo é misturado com os materiais de veículo e comprimidos por meio de uma máquina de comprimido (Korsch EKO, diâ- metro do rótulo 10 mm).
Avicel® is microcrystalline ceIlulose (FMC, Philadelphia, USA). PVPPXL is polyvinil-polypyrrolidone cross-linked (BASF, Germany). Aerosil® is silicon dioxide (Degussa, Germany).

Claims (11)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que a fórmula IA, <formula>formula see original document page 108</formula> em que dois dentre X, Y e Z são N (nitrogênio), o terceiro é CH ou N (preferivelmen- te Y e Z são N e Z é CH); e em que ou R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, piperazin-1-ila ou 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila; ou fenila pela que é substituída (i) halo ou C1-C7-alcóxi e além disso (ii) por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, N- mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7-alquila, pirrolidino-C1-C7-alcóxi, 1 -(C1-C7-alquil)-piperidin-4-ila, morfolino-C1-C7-alcóxi, tiomorfolino-C1-C7- alcóxi, piperazin-1-ila, 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila, 4-(C1-C7-alquil)- piperazin-1-ila, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)- amino-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7- alquil)-piperazin-1 -il]-carbonila; R2 é hidrogênio, C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi ou halo; R3 é hidrogênio, C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, cada R4 é, independentemente dos outros, C1-C7-alquila, halo-C1-C7-alquila, halo ou C1-C7-alcóxi, e η é O, 1, 2, 3, 4 ou 5; ou R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, piperazin-1-ila, 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-il; N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino- C1-C7-alquila, pirrolidino-C1-C7-alcóxi, 1-(C1-C7-alquil)-piperidin-4-ila, morfoli- no-C1-C7-alcóxi, tiomorfolino-C1-C7-alcóxi, 4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila, [4- (C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-aIquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)- amino-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)-pipera2in-1-il]-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]- carbonila; ou fènila que leva um do substituintes mencionado até aqui no presente parágrafo e além disso um substituinte selecionado a partir de halo e C1-C7-alcóxi; R2 é hidrogênio, C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi ou halo; R3 é hidrogênio, C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, R5 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, e η é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi e ha- lo, com a condição que pelo menos um de cada dentrentre C1-C7-alquila, C1- C7-alcóxi e halo esteja presente; η é 2 e um R4 é halo-C1-C7-alquila, o outro R4 é C1-C7-alcóxi; η é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de halo, iodo e C1-C7-alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentre halo, iodo e C1-C7-alcóxi, este- ja presente; η é 3, 4 ou 5 e R4 I selecionado a partir de halo, halo-C1-7Calquila e C1-C7- alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentre halo, halo-C1-C7- alquila e C1-C7-alcóxi esteja presente; ' ou Y e Z são N (nitrogênio) e X é CH, em que ou R1 é 3-piridila que é monossubstituída por N-C1-C7-alquil-piperazin-1-ila, R2 é hidrogênio, R3 é hidrogênio, cada R4 é, independentemente dos outros, C1-C7-alquila, halo-C1-C7-alquila, halo ou C1-C7-alcóxi, R5 é hidrogênio e η é 1, 2, 3, 4 ou 5; ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é hidrogênio, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH; ou um composto da fórmula IA em que R1 é 3-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)- fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é -4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH, ou um composto da fórmula IA em que R1 é 3-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH, ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH, ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(1-etil-piperidin-4-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH, ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(4-etil-pipeazin-1-il)-fènilamino, R2 é hidrogênio, R3 é etila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é 4, R5 é hi- drogênio, YeZ são N e X é CH, e/ou ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(4-etil-piperazina-1-carbonil)- fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é -4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH; ou misturas de dois ou mais compostos da fórmula IA; ou um sal, um pró-fármaco, um N-óxido e ou um éster destes.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1 da fórmula IA, caracterizado pelo fato de que dois dentre X, Y e Z são N (nitrogênio), o terceiro é CH ou N (preferivelmen- te Y e Z são N e Z é CH); e em que ou R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, piperazin-1-il ou 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-il; ou fenila que é substituída (i) halo òu C1-C7-alcóxi e além disso (ii) por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7-alquila, pirrolidino-C1-C7-alcóxi, 1-(C1-C7- alquil)-piperidin-4-ila, morfolino-C1-C7-alcóxi, tiomorfolino-C1-C7-alcóxi, pipe- razin-1 -ila, 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1 -ila, 4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1 - ila, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7- alquil)-amino-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7- alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)- piperazin-1-il]-carbonila; R2 é hidrogênio, C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi ou halo; R3 é hidrogênio, C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, cada R4 é, independentemente dos outros, C1-C7-alquila, halo-C1-C7-alquila, halo ou C1-C7-alcóxi, R5 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, e n é O, 1, 2, 3, 4 ou 5; ou R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-C1-C7-alquilóxi, piperazin-1-ila, 4-(fenil-C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila; N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino- C1-C7-alquila, pirrolidino-C1-C7-alcóxi, 1-(C1-C7-alquil)-piperidin-4-ila, morfoli- no-C1-C7-alcóxi, tiomorfolinó-C1-C7-alcóxi, 4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-ila, [4- (C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)- amino-C1-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(C1-C7-alquil)-amino-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1 -il]-C1-C7-alcóxi, [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1 -il]- carbonila; ou fenila que leva um do substituintes mencionado até aqui no presente parágrafo e além disso um substituinte selecionado a partir de halo e C1-C7-alcóxi; R2 é hidrogênio, C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi ou halo; R3 é hidrogênio, C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, R5 é hidrogênio (preferido), C1-C7-alquila ou fenil-C1-C7-alquila, e η é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de C1-C7-alquila, C1-C7-alcóxi e ha- lo, com a condição que pelo menos um de cada dentre C1-C7-alquila, C1-C7- alcóxi e halo esteja presente; η é 2 e um R4 é halo-C1-C7-alquila, o outro R4 é C1-C7-alcóxi; η é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de halo, iodo e C1-C7-alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentre halo, iodo e C1-C7-alcóxi, este- ja presente; η é 3, 4 ou 5 e R4 I selecionado a partir de halo, halo-C1-C7-alquila e C1-C7- alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentre halo, halo-C1-C7- alquila e C1-C7-alcóxi esteja presente; ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é hidrogênio, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH; ou um composto da fórmula IA em que R1 é 3-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)- fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é -4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH, ou um composto da fórmula IA em que R1 é 3-(4-etil-piperazin-1-il)-fènilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH, ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH, ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(1-etil-piperidin-4-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é 4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH, ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(4-etil-pipeazin-1-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é etila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é 4, R5 é hi- drogênio, YeZ são N e X é CH, e/ou ou um composto da fórmula IA em que R1 é 4-(4-etil-piperazina-1-carbonil)- fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, η é -4, R5 é hidrogênio, YeZ são N e X é CH; ou misturas de dois ou mais compostos da fórmula IA; ou um sal, um pró-fármaco, um N-óxido e ou um éster destes.
3. Composto da fórmula IA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo de compostos que consistem em -1-[6-(4-benzilóxi-fenilamino)-pirimidin-4-il]-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fen metil-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-[6-(4-h'^ metil-uréia, -1-{6-[4-(4-benzil-piperazin-1-il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-3-(2,6-dicloro-3,5- dimetóxi-fenil)-1-metil-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -metil-1 -[6-(4-piperazin-1 -il-fenilamino)- pirimidin-4-il]-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[2-fluoro-4-(2-pirrolidin-1 -il-etóxi)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)-2-metóxi- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)-3-fluoro- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)-1-{6-[3-cloro-4-(4-etil-piperazin-1-il)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -1-{6-[2-cloro-4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-3-(2,6-dicloro- -3,5-dimetóxi-fenil)-1-metil-uréia e -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)-2-fluoro- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia; ou um sal, um pró-fármaco, um N-óxido e ou um éster destes.
4. Composto da fórmula IA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo de compostos que consistem em -1-(2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-3-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino]- pirimidin-4-il}-uréia, -3-(2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)ifenilamino]- pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-{6-[4-(2-dimetilamino-etóxi)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1 -metil-(6-{4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)- etóxi]-fenilamino}-pirimidin-4-il)-uréia, -3-(2-cloro-6-iodo-3,5-dimetóxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino}- pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-{6-[4-(4-isopropil-piperazin-1-il)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-[6-(3-dimetilaminometil-fenilamino)- pirimidin-4-il]-1-metil-uréia, -3-(2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-{6-[3-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino]- pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-metil-1-{6-[4-(2-pirrolidin-1-il-etóxi)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1-metil-1-{6-[3-fluoro-4-(2-pirrolidin-1-il- etóxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2,4-dicloro-5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia e -3-(5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino]- pirimidin-4-il}-1-metil-uréia; ou um sal, um pró-fármaco, um N-óxido e ou um éster destes.
5. Composto da fórmula IA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que selecionado a partir do grupo de compostos que consistem em -1-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-3-{6-[4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino]- pirimidin-4-il}-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-metil-1-{6-[3-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-{6-[3-(4-etil-piperãzin-1-il)-fenilamino]- pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-metil-1-{6-[4-(2-morfolin-4-il-etóxi)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-{6-[4-(1-etil-piperidin-4-il)-fenilaminò]- pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-etil-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-H fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia; e -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazina-1-carbonil)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia; ou um sal, um pró-fármaco, um N-óxido e ou um éster destes.
6. Composto da fórmula IA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que selecionado a partir do grupo de compostos que consistem em -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-{6-[6-(4-etil-piperazin-1-il)-piridin-3- ilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia; e -3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-{6-[6-(4-isopropil-piperazin-1-il)-piridin-3- ilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-uréia, ou um sal, um pró-fármaco, um N-óxido e ou um éster destes.
7. Preparação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto da fórmula IA, ou um sal farmaceuticamente a- ceitável, pró-fármaco, N-óxido ou éster destes, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. Composto da fórmula IA, ou um sal farmaceuticamente acei- tável, pró-fármaco, N-óxido ou éster destes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para uso no tra- tamento do animal ou corpo humano, especialmente para o tratamento de doenças que respondem à inibição de FGFR.
9. Uso de um composto da fórmula IA, ou um sal farmaceuti- camente aceitável, pró-fármaco, N-óxido ou éster destes, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que para a fabricação de uma preparação farmacêutica para o tratamento de proteína cinase, especial- mente FGFR, doenças dependentes.
10. Método para a fabricação de um composto da fórmula IA, de como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende, reagir um composto de anilina da fórmula IIA, <formula>formula see original document page 116</formula> em que R4 e η são como definido para um composto da fórmula IA, com uma amina da fórmula IIIA, <formula>formula see original document page 116</formula> em que R1, R2, R3, X, Y e Z são como definidos para um composto da fór- mula IA, na presença de um derivado de ácido carbônico bis-reativos; e, se desejado, transfórmando um composto da fórmula IA em um composto diferente da fórmula IA, transformando um sal de um composto obtenível da fórmula IA no composto livre ou um sal diferente, transformando um com- posto livre obtenível da fórmula IA em um sal destes, e/ou separar uma mis- tura obtenível de isômeros de um composto da fórmula I em isômeros indi- viduais.
11. Método de tratamento de uma tirosina cinase (especialmen- te FGFR) doença dependente, caracterizado pelo fato de que compreen- dendo administrar a uma pessoa em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz para o referido tratamento de um composto da fórmula IA, um N-óxido, um sal, um éster de um pró-fármaco destes, N como definido em qualquer uma dentre as reivindicações 1 a 6.
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