BRPI0620571A2 - formulação farmacêutica aquosa, forma de dosagem de exendina, solução aquosa, uso de uma formulação farmacêutica, e uso de uma formulação farmacêutica aquosa - Google Patents

Abstract

FORMULAçãO FARMACêUTICA AQUOSA, FORMA DE DOSAGEM DE EXENDINA, SOLUçãO AQUOSA, USO DE UMA FORMULAçãO FARMACêUTICA, E, USO DE UMA FORMULAçãO FARMACEUTICA AQUOSA. O que é descrito é uma formulação farmacêutica para administração intranasal de exendina a um mamífero, onde a formulação compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma exendina, um aprimorador da viscosidade, metil-<225>- ciclodextrina, um surfactante, tampão de tartarato para controlar o pH e um agente quelante para cátions, e onde tal forma de dosagem de exendina exibe pelo menos 95% de recuperação de exenatida após pelo menos 365 dias armazenado a 5<198>C.

Description

FORMULAÇAO FARMACÊUTICA AQUOSA, FORMA DE DOSAGEM DE EXENDINA, SOLUÇÃO AQUOSA, USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

Os ensinamentos de todas as referências aqui citadas estão aqui incorporados em sua totalidade por referência.

Peptídeos de exendina mostraram possuir potencial terapêutico no tratamento de diabetes mellitus insulino- dependente (DMID), diabetes gestacional ou diabetes mellitus não insulino-dependente (DMNID), no tratamento da obesidade e no tratamento da dislipidemia. Ver Patente Americana No. 6,5 06,724; Publicação de Aplicação de Patentes AmericanasNo. 20030036504A1; Patente Européia No. EP1083924B1; Publicação de Aplicação de Patentes Internacionais No. WO 98/30231A1; e Aplicação de Patentes Internacionais No. WO 00/73331A2. Porém, até o momento esses peptídeos só foram administrados a humanos através de injeção. A necessidade para injeções repetidas regulares é uma grande desvantagem do tratamento com peptídeos. As injeções interferem com as atividades diárias, causam dor e podem levar os pacientes a desenvolver fobia de agulhas. Mesmo com canetas especiais para auto- injeção, que são mais fáceis de usar e fornecem doses precisas, as injeções regulares ainda são exigidas.

Assim, há a necessidade de desenvolver modos de administração desses peptídeos além da injeção.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção satisfaz as necessidades precedentes e objetos adicionais e vantagens por fornecer métodos novos, eficazes, usos e composições para fornecimento mucoso, especialmente intranasal, de exendina para tratar a diabetes mellitus, hiperglicemia, dislipidemia, obesidade, induzir saciedade em um indivíduo e promover perda de peso em um indivíduo. 0 termo "exendina" é aqui usado para se referir a exendinas naturais e sintéticas, exendinas análogas e peptídeos de exendina, incluindo, mas não limitado, a exendina-4 natural e exendina-4 sintética (exenatídio). A exendina pode ser liberada sozinha ou em combinação com outros terapêuticos. Em certos aspectos da invenção, a exendina é liberada em formulações da mucosa intranasal. Preferencialmente, a exendina é um sal de exenatidío farmaceuticamente aceitável e o mamífero é um humano. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de ácidos inorgânicos, sais de amina orgânicos, sais ácidos orgânicos, sais de metais terrosos alcalinos, e suas misturas. Exemplos adequados de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam, halida, glucosamina, alquil glucosamina, sulfato, hidrocloreto, carbonato, hidrobrometo, N, N'- dibenziletileno-diamina, trietaolamina, dietanolamina, trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, diciclohexilamina, fosfato, sulfato, sulfonato, benzoato, acetato, salicilato, lactato, tartato, citrato, mesilato, gluconato, tosilato, maleato, fumarato, estearato e suas misturas.

Em outra personificação da presente invenção, uma formulação intranasal de exendina combinada com excipientes transmucosais resulta em uma permeação da exendina em um ensaio de permeação de tecidos in vitro maior do que a permeação da exendina sem excipientes transmucosais quando presente em uma formulação salina consistindo em água, a exendina, cloreto de sódio e um tampão, tendo as duas formulações pHs e osmolaridades idênticos, e onde ambas as formulações são testadas sob as mesmas condições de ensaio de permeação de tecido in vitro. Um exemplo de um ensaio de permeação de tecido in vitro adequado, é "Permeabilidade aumentada da exenatida marcada com Fluoresceína por uma barreira celular usando aprimoradores de permeação", descrito no Exemplo 4 dessa divulgação. Era personificações exemplares, os métodos aprimorados de liberação e composições da presente invenção fornecem liberação mucosa terapeuticamente eficaz da exendina para prevenção do tratamento de obesidade e distúrbios alimentares em pacientes mamíferos. Em um aspecto da invenção, formulações farmacêuticas adequadas para administração intranasal são fornecidas para compreenderem uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma exendina e um ou mais agentes aprimoradores da liberação intranasal como aqui descritos, cujas formulações são eficientes em um método da invenção de liberação mucosa nasal para prevenir o início da progressão de obesidade ou distúrbios alimentares em um paciente mamífero. A liberação nasal mucosa de uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma exendina e um ou mais agentes de melhoria de liberação intranasal gera níveis terapêuticos elevados da exendina no paciente.

A presente invenção também inclui um método para modular a farmacocinética para produzir um perfil farmacocinético de preferência dependendo das necessidades terapêuticas ideais. A modulação farmacocinética pode ser atingida pela adição de excipientes, atomização, ou modificação de batidas ancilares.

Os métodos de liberação melhorada e composições da presente invenção fornecem para a liberação mucosa de exendina terapeuticamente eficiente para prevenção de tratamento de uma variedade de doenças e condições em pacientes mamíferos. A exendina pode ser administrada através de uma variedade de vias mucosais, por exemplo, por contato da exendina a um epitélio mucosa nasal, epitélio mucosa bronquial ou pulmonar, superfície bucal oral ou superfície mucosa oral ou de intestino delgado. Em personificações exemplares, os métodos e composições estão dirigidos ou são formulados para liberação intranasal (ex., liberação mucosa nasal ou mucosa intranasal).

As formulações precedentes de exendina e métodos preparativos e de liberação da invenção fornecem liberação mucosa melhorada de exendina em pacientes mamíferos. Essas composições, usos, e métodos podem envolver formulação combinatória ou administração coordenada de uma ou mais exendinas com um ou mais agentes de melhora de liberação mucosa. Entre os agentes aprimoradores de liberação mucosa a serem selecionados para atingir essas formulações e métodos estão (A) agentes de solubilização; (B) agente de modificação de carga; (C) agentes de controle de pH; (D) inibidores de enzimas degradantes; (E) agentes mucolíticos ou de limpeza de muco; (F) agentes ciliostáticos; (G) agentes aprimoradores de penetração em membrana (ex. , (i) um surfactante, (ii) um sal biliar, (iii) um fosfolipidio ou aditivo de ácido graxo, micela mista, lipossoma, ou carregador, (iv) um álcool, (v) uma enamina, (vi) um composto NÃO doador, (vii) uma molécula anfipática de cadeia longa, (viii) um aprimorador de penetração hidrofóbica menor, (ix) derivado de sódio ou de ácido salicílico, (x) um éster glicerol de ácido acetoacético, (xi) um derivado de ciclodextrina ou beta- ciclodextrina, (xii) um ácido graxo de cadeia média, (xiii) um agente quelante, (xiv) um aminoácido ou seus sais, (xv) um N-acetilaminoácido ou seus sais, (xvi) uma enzima degradante de um componente de membrana selecionada, (xvii) um inibidor da síntese de ácidos graxos, (xviii) um inibidor da síntese de colesterol; ou (xix) qualquer combinação de agentes aprimoradores de penetração na membrana de (i)-(xviii)); (H) agentes moduladores de fisiologia de junção epitelial, como estimuladores do oxido nítrico (NO), quitosana e derivados da quitosana; (I) agentes vasodilatadores; (J) agentes aprimoradores de transporte seletivo; e (K) veículos de liberação estabilizantes, carregadores, suportes ou espécies formadoras de complexos com as quais a exendina é eficientemente combinada, associada, contida, encapsulada ou ligada para estabilizar o agente ativo para liberação mucosa melhorada. Em várias personificações da invenção, a exendina é combinada com um, dois, três, quatro ou mais agentes aprimoradores de liberação mucosa citados em (A) - (K), acima. Esses agentes aprimoradores de liberação mucosa podem ser misturados, sozinhos ou juntos, com a exendina, ou então combinados em uma formulação farmaceuticamente aceitável ou veículo de liberação. A formulação de exendina com um ou mais agentes aprimoradores de liberação mucosa de acordo com os ensinamentos (opcionalmente incluindo qualquer combinação de dois ou mais agentes aprimoradores de liberação mucosa selecionados de (A) - (K) acima) fornece biodisponibilidade aumentada da exendina após sua liberação para uma superfície mucosa de um paciente mamífero.

Assim, a presente invenção é um uso ou método para suprimir o apetite, promovendo perda de peso, diminuição no consumo alimentar, ou tratamento da obesidade e/ou diabetes em um mamífero compreendendo a administração de uma formulação compreendendo exendina e um agente aprimorador de liberação mucosa.

A presente invenção ainda fornece para o uso de exendina para produção de medicamentos para a transmucosa, a administração de exendina para tratamento de hiperglicemia, diabetes mellitus, dislipidemia, diminuição do apetite, promoção de perda de peso, diminuição do consumo de alimentos, ou tratamento de obesidade em um mamífero.

Uma dose de exendina eficiente para a mucosa dentro das formulações farmacêuticas da presente invenção, compreende, por exemplo, entre 0,001 pmol a cerca de 100 pmol por kg de peso corporal, entre cerca de 0,01 pmol a cerca de 10 umol por kg de peso corporal, ou entre cerca de 0,1 pmol a cerca de 5 pmol por kg de peso corporal. Em outras personificações exemplares, a dosagem de exendina está entre cerca de 0,5 umol a cerca de 1,0 pmol por kg de peso corporal. Em uma personificação preferida, uma dose intranasal varia de 0,1 - 100 ug/kg, ou cerca de 7-7000 pg, mais preferencialmente 0,5 - 20 ug/kg, ou 35 - 1400 ug. Doses mais específicas de exendina intranasal variam de 20 ug, 50 ug, 100 ug, 150 ug, 200 ug a 400 ug. As formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas uma ou mais vezes ao dia, ou 3 vezes por semana ou uma vez por semana por uma semana e pelo menos 96 semanas, ou mesmo durante toda a vida do paciente. Em certas personificações, as formulações farmacêuticas da invenção são administradas uma ou mais vezes ao dia, duas vezes ao dia, quatro vezes ao dia, seis vezes por dia, ou oito vezes ao dia.

Agentes aprimoradores de liberação intranasal são usados com melhoria de liberação de exendina dentro ou por toda a superfície da mucosa nasal. Para drogas absorvidas passivamente, a contribuição relativa de vias paracelulares e transcelulares ao transporte de drogas depende do pKa, coeficiente de partição, raio molecular e carga da droga, o pH do ambiente luminal no qual a droga é liberada, e a área de superfície de absorção. O agente aprimorador de liberação intranasal da presente invenção pode ser um agente de controle de pH. O pH da formulação farmacêutica da presente invenção é um fator que afeta a absorção de exendina através de vias paracelulares e transcelulares para o transporte de drogas. Em uma personificação, a formulação farmacêutica da presente invenção tem o pH ajustado entre pH 2 a 8. Em outra personificação, a formulação farmacêutica da presente invenção tem o pH ajustado para 3.0 a 6.0. Em outra personificação, a formulação farmacêutica da presente invenção tem o pH ajustado para entre pH 4.0 a 6.0. Geralmente, o pH é 4.7 ± 0.5.

Como notado acima, a presente invenção fornece usos aprimorados, métodos e composições para liberação de exendina na mucosa de pacientes mamíferos para tratamento ou prevenção de uma variedade de doenças e condições. Exemplos de pacientes mamíferos adequados ao tratamento e profilaxia de acordo com os métodos da invenção incluem, mas não se restringem, humanos e primatas, espécies de rebanhos, como eqüinos, bovinos, ovinos e caprinos, e espécies domésticas e de pesquisa, incluindo cães, gatos, camundongos, ratos, porcos-da-índia, e coelhos.

Para fornecer melhor compreensão da presente invenção, as seguintes definições são fornecidas:

Exendinas e Agonistas da Exendina

Exendinas são peptídeos que foram inicialmente isolados das secreções salivares do monstro-de-Gila, um lagarto encontrado no Arizona, e o Lagarto Perolado do México. Exendina-3 está presente nas secreções salivares de Heloderma horridum, e exendina-4 está presente nas secreções salivares de Heloderma suspectum [Eng, J., et al., J. Biol. Chem. 265:20259-62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem. 267:7402-05, 1992]. As exendinas possuem similaridade de seqüência com vários membros da família de peptídeos semelhantes ao glucagon, com a maior homologia, 53% sendo do hormônio incretina GLP-I [7-36] NH.2 [Goke, et al. J. Biol. Chem. 268:19650-55, 1993]. GLP-1[7-3 6]NH2, também conhecido como proglucagon [78-107] e mais comumente como "GLP-1," tem um efeito insulinotrópico, estimulando a secreção de insulina; a GLP-I também inibe a secreção de glucagon [Orskov, et al., Diabetes 42:658-61, 1993; D1Alessio, et al., J. Clin. Invest. 97:133-38, 1996], Relatou-se que a GLP-I inibe o esvaziamento gástrico [Williams, B., et al., J. Clin. Encocrinol. Metab. 81(1):327-32, 1996; Wettergren, Α., et al., Dig. Dis. Sei. 38 (4) : 665-73, 1993], e secreção de ácido gástrico. [Schjoldager, B.T., et al. , Dig. Dis. Sei. 34(5) :703-8, 1989; 0'Halloran, D.J., et al. , J. Endocrinol. 126 (1) .-169-73, 1990; Wettergren, A., et al. , Dig. Dis. Sei. 38(4):665-73, 1993]. A GLP-I[7-37], que possui um resíduo de glicina adicional em sua terminação carboxi, também estimula a secreção de insulina em humanos [Orskov, et al. , Diabetes 42:658-61, 1993]. Uma proteína-G transmembrana adenilato- ciclase acoplada a receptor parece ser a responsável pelo efeito insulinotrópico do GLP-1, e aparentemente foi clonada de uma linha celular a.beta [Thorens, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:8641-45, 1992].

Ineretina miméticas são uma classe de drogas que imitam as ações antidiabéticas ou diminuidoras de glicose de hormônios incretina que ocorrem naturalmente em humanos, como GLP-I. As ações das incretina miméticas incluem estimulação da habilidade do corpo em produzir insulina em resposta a altos níveis de açúcar no sangue, inibindo a liberação de hormônio glucagon, reduzindo a absorção de nutrientes na corrente sangüínea, reduzindo a taxa de esvaziamento gástrico, promovendo saciedade e reduzindo o consumo alimentar. As incretinas miméticas foram desenvolvidas para uso no tratamento de diabetes tipo 2 e atualmente incluem o seguinte: derivados do GLP-I (Liraglutídeos e CJC-1131) e Exenatida.

O nome genérico para a exendina-4 sintética é exenatida [WHO Drug Information, Vol. 18, Nov. 1, 2004], Exenatida é uma versão sintética da exendina-4 que ocorre naturalmente. A exenatida copia os efeitos da GLP-1, mas é mais potente por causa de sua resistência à degradação DPP- IV. BYETTA® é a versão comercialmente disponível de exenatida (AmyIin & Lilly) . 0 FDA dos EUA aprovou a injeção de BYETTA (exenatida) como uma terapia adjunta para diabetes tipo 2 onde tratamentos com metformina oral e/ou sulfoniluréia não são adequados para atingir controle glicêmico. Além de controle glicêmico aprimorado, pacientes nos estudos usando exenatida também experimentaram perda de peso.

A presente invenção é direcionada a novos métodos para o tratamento de diabetes e condições que seriam beneficiadas pela diminuição de glicose no plasma ou atraso e/ou retardamento do esvaziamento gástrico, ou inibição do consumo de alimentos compreendendo a administração intranasal de exendina, um análogo da exendina, um agonista da exendina, uma exendina modificada, um análogo de exendina modificado, ou um agonista de exendina modificado, ou quaisquer combinações, por exemplo:

Exendina-3:

His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser (SEQ ID NO: 1) , ou, exendina-4 (natural ou sintética (exenatida)): His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser onde a serina de término C é amidada (SEQ ID NO: 2),

ou fragmentos insulinotrópicos de exendina-4:

Exendina-4 (1-31) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro (SEQ ID NO: 3); y.sup.31 Exendina-4 (1-31 ) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Tyr (SEQ ID NO: 4) , ou fragmentos inibitórios de exendina-4:

Exendina-4 (9-39) Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser (SEQ ID NO: 5),

ou outros agonistas de exendina de preferência: exendina-4 (1-30) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly (SEQ ID NO: 6), exendina-4 (1- 30) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly-NH. sub. 2 (SEQ ID NO: 7), exendina-4 (1-28) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn-NH.sub.2 (SEQ ID NO: 8), .sup.14 Leu,.sup.25 Phe exendina-4 amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH.sub.2 (SEQ ID NO: 9), .sup.14 Leu, . sup. 25 Phe exendina-4 (1-28) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH.sub.2 (SEQ ID NO: 10), and .sup.14 Leu, .sup.22 Ala, .sup.25 Phe exendina-4 (1-28) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Ala Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH.sub.2 (SEQ ID No: 11).

ou seqüências incorporadas por referência que foram reveladas nas patentes Patente Americana No. 5,424,286; Patente Americana No. 6,506,724; Patente Americana No. 6,528,486; Patente Americana No. 6,593,295; Patente Americana No. 6,872,700; Patente Americana No. 6,902,744; Patente Americana No. 6,924,264; e Patente Americana No. 6,956,026,

ou outros compostos que eficientemente ligam-se ao receptor no qual a exendina exerce suas ações que são benéficas no tratamento de diabetes e condições que seriam beneficiadas por diminuição da glicose no plasma ou atraso e/ou retardo no esvaziamento gástrico ou inibição do consumo de alimentos. O uso de exendina-3 e exendina-4 como agentes insulinotróficos para o tratamento de diabetes mellitus e prevenção de hipergliceraia foi revelado na Patente Americana No. 5,424,286. Exendinas também mostraram ser úteis na modulação de níveis de triglicerídios e para tratar dislipidemia.

Assim a invenção fornece para os peptídeos ou fragmentos de peptídeos, feitos sinteticamente ou purificados de fontes naturais, que personificam a atividade biológica de exendinas, ou seus fragmentos, como descrito pela presente especificação.

De acordo com a presente invenção, as exendinas também incluem as bases livres, sais de adição de ácido ou sais de metais, como sais de potássio ou sódio dos peptídeos, e peptídeos de exendinas que foram modificados por tais processos como amidação, glicosilação, acilação, sulfação, fosforilação, acetilação, ciclização e outros métodos de modificação covalente conhecidos.

Assim, de acordo com a presente invenção, os peptídeos descritos acima são incorporados em formulações adequadas para liberação transmucosa, especialmente liberação intranasal.

Agentes Aprimoradores de Liberação em Mucosa

"Agentes aprimoradores de liberação em mucosa" são definidos como químicos e outros excipientes que, quando adicionados a uma formulação compreendendo água, sais e/ou tampões comuns e exendina (a formulação de controle), produzem uma formulação que produz um aumento significante no transporte de exendina por uma mucosa como medida pela concentração máxima de sangue, soro, ou fluido cérebro- espinhal (Cmax) ou pela área sob a curva, AUC, em gráfico de concentração versus tempo. A mucosa inclui as superfícies das mucosas nasal, oral, intestinal, bucal, broncopulmonar, vaginal e retal, e inclui todas as membranas secretoras de muco delineando todas as cavidades corporais ou passagens que se comunicam com o exterior. Agentes aprimoradores de liberação em mucosa são às vezes chamados de carregadores.

Formulação livre de Endotoxinas

"Formulação livre de endotoxinas" significa uma formulação que contém exendina e um ou mais agentes aprimoradores de liberação mucosa que é substancialmente livre de endotoxinas e/ou substâncias pirogênicas relacionadas, As endotoxinas incluem toxinas que estão confinadas dentro de um microorganismo e são liberadas apenas quando os microorganismos são divididos ou morrem. Substâncias pirogênicas incluem substâncias termostáveis indutoras de febre (glicoproteínas) da membrana externa de bactérias e outros microorganismos. Ambas as substâncias podem causar febre, hipotensão e choque se forem administradas em humanos. A produção de formulações que são livres de endotoxina pode exigir um equipamento especial, pessoas qualificadas, e pode ser significantemente mais cara do que fabricar formulações que não são livres de endotoxina. Devido à administração intravenosa de GLP ou amilina simultaneamente com infusão de endotoxina em roedores mostrar prevenir a hipotensão e mesmo a morte associada com a administração de endotoxina apenas (Patente Americana No. 4,839,343), a produção de formulações sem endotoxina destes ou agentes terapêuticos com exendina não era esperada ser necessária para a administração não-parental (não-injetada).

Administração Não-Infusada

"Administração não-infusada" significa qualquer método de liberação que não envolva uma injeção diretamente em uma artéria ou veia, um método que força ou dirige (tipicamente um fluido) para dentro de algo, e especialmente para introduzir em uma parte do corpo através de uma agulha, seringa ou outro método invasivo. A administração não- infusada inclui injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal e métodos de liberação para uma mucosa sem o uso de injeção.

Métodos e Composições de Liberação

Métodos e composições aprimorados para administração de exendina em mucosas para pacientes mamíferos melhoram os esquemas de dosagem de exendina. A presente invenção fornece liberação em mucosa de exendina formulada com um ou mais agentes aprimoradores da liberação em mucosas onde a dosagem de exendina é substancialmente normalizada e/ou sustentada para um período eficiente de liberação de exendina variando de aproximadamente 0,1 a 2,0 horas; 0,14 a 1,5 horas; 0,7 a 1,5 horas; ou 0,8 a 1,0 horas; após a administração em mucosa. A liberação sustentada de exendina atingida pode ser facilitada por administração repetida de exendina exógena utilizando métodos e composições da presente invenção.

Composições e Métodos de Liberação Sustentada

Métodos e composições aprimorados para administração de exendina em mucosas em pacientes mamíferos melhoram os esquemas de dosagem de exendina. A presente invenção fornece a liberação aprimorada em mucosas (ex., nasal) de uma formulação compreendendo exendina em combinação com um ou mais agentes aprimoradores de liberação em mucosas e um agente ou agentes aprimoradores de liberação opcional sustentados. Os agentes aprimoradores de liberação em mucosas da presente invenção geram um aumento eficiente na liberação, por exemplo, um aumento na concentração plasmática máxima (Cmax) para melhorar a atividade terapêutica da exendina administrada em mucosas. Um Segundo fator afetando a atividade terapêutica de exendina no plasma sangüíneo e SNC é o tempo de residência (TR). Agentes aprimoradores de liberação em mucosas sustentados, em combinação com agentes aprimoradores de liberação intranasal, aumentam a Cmax e aumentam o tempo de residência (TR) da exendina. Veículos de liberação polimérica e outros agentes e métodos da presente invenção que geram formulações aprimoradoras de liberação sustentadas, por exemplo, polietileno glicol (PEG), são aqui revelados. A presente invenção fornece um método aprimorado de liberação de exendina e forma de dosagem para o tratamento de sintomas relacionados à obesidade, câncer de cólon, câncer por exendina, ou câncer de mama em pacientes mamíferos.

Dentro da mucosa a liberação de formulações e métodos da invenção, a exendina é freqüentemente combinada ou coordenadamente administrada com um carregador adequado ou veículo para liberação em mucosas. Como aqui usado, o termo "carregador" significa um preenchedor sólido ou líquido farmaceuticamente aceitável, diluente, ou material encapsulante. Um carregador contendo líquidos pode conter aditivos farmaceuticamente aceitáveis como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes tampões, agentes quelantes, agentes de complexo, agentes solubilizantes, humectantes, solventes, agentes aprimoradores de suspensão e/ou viscosidade, agentes tonificantes, agentes

umidificadores ou outros materiais biocompatíveis. Uma tabulação de ingredientes listados pelas categorias acima pode ser encontrada no U.S. Pharmacopeia National Formulary, 1857-1859, 1990. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carregadores farmaceuticamente aceitáveis estão açúcares, como lactose, glucose e sucrose; amidos como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados como carboximetil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes como manteiga de cacau e ceras supositórias; óleos como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, como propileno glicol; polióis, como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ésteres como etil oleato e etil laurato; ágar; agentes tampões como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água sem pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer, álcool etílico e soluções tampão fosfato, assim como outras substâncias não tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas. Agentes umidificadores, emulsificantes e lubrificantes como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, assim como agentes colorantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, adoçantes, agentes saborizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes nas composições, de acordo com os desejos do formulador. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem antioxidantes solúveis em água como ácido ascórbico, hidrocloreto de cisteína, bissulfeto de sódio, metabissulfeto de sódio, sulfeto de sódio e semelhantes; antioxidantes solúveis em óleo como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato, alfa- tocoferol e semelhantes; e agentes quelantes de metal como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado com os materiais carregadores para produzir uma única forma de dosagem varia dependendo do modo de administração em particular.

Um "tampão" é geralmente usado para manter o pH de uma solução a um valor quase constante. Um tampão mantém o pH de uma solução, mesmo quando pequenas quantidades de ácido forte ou base forte são adicionadas à solução, por prevenção ou neutralização de grandes mudanças na concentração de hidrogênio e íons hidróxido. Um tampão geralmente consiste em ácidos fracos e seus sais apropriados (ou uma base fraca e seu sal apropriado) . 0 sal apropriado para um ácido fraco contém o mesmo íon negativo presente no ácido fraco (ver Lagowski, Macmillan Encyclopedia of Chemistry, Vol. 1, Simon & Schuster, New York, 1997, p. 273-4) . A equação de Henderson-Hasselbach, pH = pKa + IoglO [A-] / [HA] , é usada para descrever o tampão, e é baseada na equação padrão para dissociação de ácidos fracos, HA = H+ + A-. Exemplos de fontes de tampão comumente usadas incluem o seguinte: glutamato, acetato, citrato, glicina, histidina, arginina, lisina, metionina, lactato, formato, glicolato, tartarato e suas misturas.

A "capacidade do tampão" significa a quantidade de ácido ou base que pode ser adicionada a uma solução tampão antes que ocorra uma mudança significativa de pH. Se o pH estiver dentro da variação de pK-1 e pH+1 do ácido fraco a capacidade do tampão é apreciável, mas fora dessa variação cai para uma extensão de pouco valor. Portanto, um sistema fornecido apenas possui uma ação tampão útil em uma variação de uma unidade de pH nos dois lados do pK do ácido fraco (ou base fraca) (ver Dawson, Data for Biochemical Research, Third Edition, Oxford Science Publications, 1986, p. 419) . Geralmente, concentrações adequadas são escolhidas para que o pH da solução fique perto do pKa do ácido fraco (ou base fraca) (ver Lide, CRC Handbook of Chemistry and Physics, 86th Edition, Taylor & Francis Group, 2005-2006, p. 2-41). Além disso, soluções de ácidos e bases fortes não são normalmente classificadas como soluções tampão, e não mostram capacidade de tampão entre os valores de pH 2,4 a 11,6.

Dentro das composições de liberação em mucosa e métodos da invenção, vários agentes aprimoradores de liberação são usados para melhorar a liberação de exendina dentro ou sobre uma superfície de mucosa. Com essa relação, a liberação de exendina pelo epitélio da mucosa pode ocorrer "transcelularmente" ou "paracelularmente". A extensão na qual essas vias contribuem para o fluxo e biodisponibilidade totais da exendina depende do ambiente da mucosa, as propriedades físico-químicas do agente ativo, e as propriedades do epitélio da mucosa. 0 transporte paracelular envolve apenas difusão passiva, enquanto o transporte transcelular pode ocorrer por processos passivos, facilitados ou ativos. Geralmente, solutos hidrofílicos, passivamente transportados e polares difundem-se através da via paracelular, com mais solutos lipofxlicos usando a via transcelular. A absorção e biodisponibilidade (ex., como refletido por um coeficiente de permeabilidade ou ensaio fisiológico) , para solutos diversos, passivamente e ativamente absorvidos, podem ser prontamente avaliados, em termos de componentes de liberação paracelular e transcelular, para qualquer exendina selecionada dentro da invenção. Para drogas absorvidas passivamente, a contribuição relativa de vias paracelulares e transcelulares para o transporte de drogas depende do pKa, coeficiente de partição, raio molecular e carga da droga, do pH do ambiente luminal no qual a droga é liberada, e a área de superfície de absorção. A via paracelular representa uma fração relativamente pequena de área de superfície acessível do epitélio da mucosa nasal. Em termos gerais, relatou-se que as membranes celulares ocupam uma área de superfície da mucosa que é mil vezes maior do que a área ocupada pelos espaços paracelulares. Assim, a menor área acessível, e a discriminação com base no tamanho e na carga contra a permeação macromolecular sugeririam que a via paracelular seria uma via geralmente menos favorável do que a liberação transcelular para o transporte de drogas. Surpreendentemente, os métodos e composições da invenção fornecera um transporte significantemente aprimorado de bioterapêuticos dentro e sobre o epitélio da mucosa pela via paracelular. Portanto, os métodos e composições da invenção destinam-se com sucesso às vias paracelular e transcelular, alternativamente ou dentro de um único método ou composição.

Como aqui usado, "agentes aprimoradores de liberação em mucosa" incluem agentes que melhoram a liberação ou solubilidade (ex., a partir de uma formulação de veículo de liberação), taxa de difusão, capacidade de penetração e tempo, consumo, tempo de residência, estabilidade, meia-vida eficiente, níveis de concentração pico ou sustentados, eliminação e outras características de liberação em mucosa desejadas (ex. , como medido no local de liberação, ou em um local de atividade selecionado como a corrente sangüínea ou sistema nervoso central) de exendina ou outros compostos biologicamente ativos. A melhora da liberação em mucosas pode assim ocorrer por uma variedade de mecanismos, por exemplo por aumento da difusão, transporte, persistência ou estabilidade de exendina, aumentando a fluidez da membrana, modulando a disponibilidade ou ação do cálcio e outros íons que regulam a permeação intracelular ou paracelular, solubilização dos componentes da membrana mucosa (ex., lipídios), mudança dos níveis protéicos e não-protéicos de sulfidril em tecidos mucosos, aumento do fluxo de água pela superfície da mucosa, modulação da fisiologia juncional epitelial, redução da viscosidade do muco cobrindo o epitélio da mucosa, redução de taxas de separação mucociliar, e outros mecanismos.

Como aqui usado, uma "quantidade mucosamente eficiente de exendina" contempla a liberação eficaz em mucosa de exendina para um local para atividade da droga no paciente que pode envolver uma variedade de vias de liberação ou transporte. Por exemplo, um dado agente ativo encontrará seu caminho através de separações entre células da mucosa e atingem uma parede vascular adjacente, enquanto por outra via o agente pode, passivamente ou ativamente, ser levado para dentro de células da mucosa para agir dentro das células ou ser descarregado ou transportado para fora das células para atingir um local-alvo secundário, como a circulação sistêmica. Os métodos e composições da invenção podem promover a translocação de agentes ativos juntamente com uma ou mais vias alternativas, ou podem agir diretamente no tecido da mucosa ou tecido vascular proximal para promover absorção ou penetração dos agentes ativos. A promoção de absorção ou penetração neste contexto não se limita a esses mecanismos.

Como aqui usado, "pico de concentração (Cmax) de exendina em plasma sangüíneo", "área sob a curva de concentração vs. Tempo (AUC) de exendina em plasma sangüíneo", "tempo para concentração plasmática máxima (tmax) de exendina em plasma sangüíneo" são parâmetros farmacocinéticos conhecidos para os especialistas. Laursen, et al., Eur. J. Endocrinology 135:309-315, 1996. A "curva de concentração vs. tempo" mede a concentração de exendina em soro sangüíneo de um paciente vs. tempo após administração de uma dose de exendina ao paciente pelas vias de administração intranasal, intramuscular, subcutânea, ou outras vias parenterais. "Cmax" é a concentração máxima de exendina no soro sangüíneo de um paciente após uma única dose de exendina para o paciente, "tmax" é o tempo para atingir a concentração máxima de exendina no soro sangüíneo de um paciente após uma única dose de exendina para o paciente.

Como aqui usado, a "área sob a curva de concentração vs. curva de tempo (AUC) de exendina em plasma sangüíneo" é calculada de acordo com a regra trapezoidal linear e com a adição de áreas residuais. Uma diminuição de 23% ou um aumento de 3 0% entre duas doses seria detectado com uma probabilidade de 90% (erro tipo II β = 10%) . A "taxa de liberação" ou "taxa de absorção" é estimada por comparação do tempo (tmax) para atingir a concentração máxima (Cmax) . Cmax e tmax são analisados usando métodos não-paramétricos. Comparações da farmacocinética de administrações intramusculares, subcutâneas, intravenosas e intranasais de exendina foram realizadas por análise de variância (ANOVA). Para comparações em pares um procedimento seqüencial de Bonferroni-Holmes é usado para avaliar a significância. A relação dose-resposta entre as três doses nasais é estimada por análise de regressão. P < 0,05 é considerado significante. Os resultados são fornecidos como valores médios +/- SEM.

Enquanto o mecanismo de promoção de absorção pode variar com diferentes agentes aprimoradores de liberação em mucosas da invenção, reagentes úteis neste contexto não afetaram adversamente substancialmente o tecido da mucosa e serão selecionados de acordo com as características físico- químicas da exendina particular ou outro agente ativo ou de melhoria de liberação. Neste contexto, agentes aprimoradores da liberação que aumentam a penetração ou permeabilidade dos tecidos da mucosa normalmente resultarão em alguma alteração da barreira de permeabilidade protetora da mucosa. Para tais agentes aprimoradores da liberação serem de valor dentro da invenção, é geralmente desejável que quaisquer mudanças significantes na permeabilidade da mucosa sejam reversíveis dentro de um intervalo de tempo apropriado para a duração desejada da liberação da droga. Além disso, não deve haver toxicidade substancial ou cumulativa, nem mudanças deletérias permanentes induzidas nas propriedades de barreira da mucosa com uso em longo prazo.

Dentro de certos aspectos da invenção, agentes promotores da absorção para administração coordenada ou formulação combinatória com exendina da invenção são selecionados de pequenas moléculas hidrofílicas, incluindo, mas não se limitando, sulfóxido de dimetil (DMSO), dimetilformamida, etanol, propileno glicol, e 2-pirrolidonas. Alternativamente, moléculas anfipáticas de cadeia longa, por exemplo, deacilmetil sulfóxido, azona, lauril sulfato de sódio, ácido oléico, e os sais biliares, podem ser empregados para aprimorar a penetração da exendina na mucosa. Em aspectos adicionais, surfactantes (ex., polisorbatos) são empregados como compostos adjuntos, agentes processadores, ou aditivos da formulação para melhorar a liberação intranasal da exendina. Agentes como DMSO, polietileno glicol, e etanol podem, se presentes em concentrações suficientemente altas em ambiente de liberação (ex., por pré-administração ou incorporação em formulação terapêutica), entrar na fase aquosa da mucosa e alterar suas propriedades solubilizantes, portanto, aumentando a divisão da exendina do veículo dentro da mucosa.

Outros agentes aprimoradores de liberação em mucosa que são úteis dentro da administração coordenada e métodos de processamento e formulações combinatórias da invenção incluem, mas não se limitam, micelas mistas; enaminas; doadores de óxido nítrico (ex., S-nitroso-N-acetil-DL- penicilamina, NORl, N0R4 - que são preferencialmente co- administrados com um limpador de NO como carboxi-PITO ou diclofenaco de sódio); salicilato de sódio; ésteres de glicerol de ácido acetoacético (ex., gliceril-1,3- diacetoacetato ou 1,2-isopropilidenoglicerina-3- acetoacetato); e outros agentes de liberação-difusão ou promotores de penetração intra ou trans-epitelial que são fisiologicamente compatíveis para liberação em mucosa. Outros agentes promotores de absorção são selecionados de uma variedade de carregadores, bases e excipientes que melhoram a liberação em mucosa, estabilidade, atividade ou penetração trans-epitelial da exendina. Estes incluem, inter alia, ciclodextrinas e derivados da β-ciclodextrina (ex., 2- hidroxipropil-p-ciclodextrina e heptaquis (2, 6-di-0-metil-β- ciclodextrina). Esses compostos, opcionalmente conjugados com um ou mais ingredientes ativos e ainda opcionalmente formulados em base oleaginosa, melhoram a biodisponibilidade nas formulações em mucosa da invenção. Outros agentes aprimoradores de absorção adaptados para liberação em mucosas incluem ácidos graxos de cadeia média, incluindo mono e diglicerídios (ex., caprato de sódio - extratos de óleo de côco, Capmul) e triglicerídios (ex., amilodextrina, Estaram 299, Migliol 810).

As composições mucosas terapêuticas e profiláticas da presente invenção podem estar suplementadas com qualquer agente promotor de penetração que facilite a absorção, difusão ou penetração de exendina sobre barreiras mucosas. O promotor de penetração pode ser qualquer promotor que seja farmaceuticamente aceitável. Assim, em aspectos mais detalhados da invenção, as composições são fornecidas para incorporarem um ou mais agentes promotores da penetração selecionados de derivados de salicilato de sódio e ácido salicílico (acetil salicilato, colina salicilato, salicilamida, etc.); aminoácidos e seus sais (ex., ácidos monoaminocarboxílicos como glicina, alanina, fenilalanina, prolina, hidroxiprolina, etc; ácidos hidroxiamino como serina; ácidos aminoacídicos como ácido aspártico, ácido glutâmico, etc.; e aminoácidos básicos como lisina, etc. inclusive seus sais de álcali metais ou metais alcalino terrosos); e N-acetilaminoácidos (N-acetilamina, N- acetilfenilalanina, N-acetilserina, N-acetilglicina, N- acetilisina, N-ácido acetilglutâmico, N-acetilprolina, N- acetilhidroxiprolina, etc.) e seus sais (sais de metal álcali e sais de metais alcalino terrosos). Também fornecidos como agentes promotores de penetração dentro dos métodos e composições da invenção estão substâncias que são geralmente usadas como emulsificadores (ex., sódio oleil fosfato, sódio lauril fosfato, sódio lauril sulfato, sódio miristil sulfato, éteres alquil polioxietileno, ésteres alquil polioxietileno, etc.), ácido capróico, ácido lático, ácido málico e ácido cítrico e seus sais de metal álcali, ácidos pirrolidonacarboxílicos, ésteres de ácidos alquilpirrolidonacarboxílicos, N-alquilpirrolidonas, ésteres de acil prolina, e semelhantes.

Dentro de vários aspectos da invenção, formulações e métodos de liberação na mucosa nasal são fornecidos para permitirem liberação de exendina e outros agentes terapêuticos dentro da invenção sobre barreiras mucosas entre locais de administração e alvos selecionados. Certas formulações são especificamente adaptadas para uma célula- alvo, tecido ou órgão selecionado, mesmo um estado de doença em particular. Em outros aspectos, as formulações e métodos fornecem endo ou transcitose seletiva de exendina especificamente ao longo de uma via intracelular ou intercelular definida. Tipicamente, a exendina é eficientemente carregada em níveis eficientes de concentração em um carregador ou outro veículo de liberação, e é liberada e mantida em forma estabilizada, ex., na mucosa nasal e/ou durante a passagem através de compartimentos intracelulares e membranas para um local-alvo remoto para ação das drogas (ex., corrente sangüínea ou compartimento definido de tecido, órgão ou extracelular). A exendina pode ser fornecida em um veículo de liberação ou até mesmo modificada (ex., em forma de pró-droga), enquanto a liberação ou ativação da exendina é desencadeada por estímulo fisiológico (ex., mudança no pH, enzimas lisossomais, etc.) Normalmente, a exendina é farmacologicamente inativa até atingir seu local de atividade. Na maioria dos casos, a exendina e outros componentes da formulação não-tóxicos e não-imunogênicos.

Neste contexto, carregadores e outros componentes da formulação são geralmente selecionados por sua habilidade em rapidamente degradar e excretar sob condições fisiológicas. Ao mesmo tempo, formulações são quimicamente e fisicamente estáveis em forma de dose para armazenamento eficiente.

Peptideos e Análogos de Proteínas e Miméticos Incluídos dentro da definição de peptídeos ativos biologicamente e proteínas para uso dentro da invenção estão peptídeos naturais ou sintéticos, terapeuticamente ou profilaticamente ativos (compreendendo dois ou mais aminoácidos covalentemente ligados), proteínas, peptídeos, ou fragmentos de proteínas, análogos de peptídeos ou proteínas, e derivados quimicamente modificados de sais ou peptídeos ativos ou proteínas. Uma ampla variedade de análogos e miméticos úteis da exendina são contemplados para uso dentro da invenção e podem ser produzidos e testados para atividade biológica de acordo com métodos conhecidos. Normalmente, os peptídeos ou proteínas de exendina ou outros peptídeos ou proteínas biologicamente ativos para uso dentro da invenção são muteínas que são prontamente obtidas por substituição parcial, adição, ou supressão de aminoácidos dentro de uma seqüência de peptídeos ou proteínas ocorrendo naturalmente ou nativa (ex., selvagem, mutante ocorrendo naturalmente, ou variante alélico). Adicionalmente, fragmentos biologicamente ativos de peptídeos nativos ou proteínas são incluídos. Tais derivados de mutantes e fragmentos substancialmente retêm a atividade biológica desejada do peptídeo ou proteína nativos. No caso de peptídeos ou proteínas que tenham cadeias de carboidratos, variantes biologicamente ativas marcadas por alterações nessas espécies de carboidratos também são incluídos dentro da invenção.

Como aqui usado, o termo "substituição de aminoácidos conservantes" refere-se à permutabilidade de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo comumente permutável de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas é alanina, valina, leucina, e isoleucina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas-hidroxil é serina e treonina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo amido é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas é lisina, arginina, e histidina; e um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não-polar (hidrofóbico) como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro. Da mesma forma, a presente invenção contempla a substituição de um resíduo polar (hidrofilico) como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, e entre treonina e serina. Adicionalmente, a substituição de um resíduo básico como lisina, arginina ou histidina por outro ou a substituição de um resíduo acídico como ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro também é contemplada. Exemplos de grupos de substituição de aminoácidos conservadores são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, e asparagina-glutamina. Alinhando- se um peptídeo ou análogo de proteína otimamente com um peptídeo nativo ou proteína correspondente, e usando ensaios apropriados, ex., ensaios de proteína de adesão ou ligação de receptores, para determinar uma atividade biológica selecionada, pode-se prontamente identificar peptídeos e análogos de proteína operáveis para uso dentro dos métodos e composições da invenção. Análogos de peptídeos e proteínas operáveis são tipicamente especificamente imunoreativos com anticorpos elevados ao peptídeo ou proteína nativa correspondente.

Uma abordagem para estabilização de formulações de proteínas sólidas da invenção é aumentar a estabilidade física de proteína purificada, ex., liofilizada. Isso inibirá a agregação via interações hidrofóbicas, assim como através de vias covalentes que podem aumentar com o desdobramento das proteínas. A estabilização de formulações neste contexto normalmente inclui formulações baseadas em polímeros, por exemplo uma formulação biodegradável de hidrogel/sistema de liberação. Como notado acima, o papel crítico da água na estrutura da proteína, função, e estabilidade, é bem conhecido. Tipicamente, as proteínas são relativamente estáveis no estado sólido com água de excesso removida. Porém, formulações protéicas terapêuticas sólidas podem se tornar hidratadas em armazenamento em umidades elevadas ou durante a liberação de uma composição ou dispositivo de liberação sustentada. A estabilidade das proteínas geralmente cai com o aumento da hidratação. A água também pode desempenhar um papel significante na agregação de proteínas sólidas, por exemplo, aumentando a flexibilidade da proteína resultando em acessibilidade aumentada de grupos reativos, fornecendo uma fase móvel para reagentes, e servindo como reagente em vários processos deletérios como beta-eliminação e hidrólise.

Preparações protéicas contendo entre cerca de 6% a 28% de água são as mais instáveis. Abaixo desse nível, a mobilidade de água ligante e movimentos protéicos internos é baixa. Acima desse nível, a mobilidade da água e movimentos protéicos abordam a hidratação total. Até um ponto, a susceptibilidade aumentada na agregação de fase sólida com aumento de hidratação foi observada em vários sistemas. Porém, em alto conteúdo de água, menos agregação é observada por causa do efeito de diluição.

De acordo com esses princípios, um método eficiente para estabilização de peptídeos e proteínas contra agregação de estado sólido para liberação mucosa é controlar o conteúdo de água em uma formulação sólida e manter a atividade de água na formulação em níveis ótimos. Esse nível depende da natureza da proteína, mas em geral, as proteínas mantidas abaixo de suas "monocamadas" de cobertura de água exibirão estabilidade superior em estado sólido.

Uma variedade de aditivos, diluentes, bases e veículos de liberação são fornecidos dentro da invenção, que controlam eficientemente o conteúdo de água para melhor a estabilidade protéica. Esses reagentes e materiais carregadores eficientes como agentes anti-agregação neste sentido incluem, por exemplo, polímeros de várias funcionalidades, como polietileno glicol, dextrano, dietilaminoetil dextrano, e carboximetil celulose, que significantemente aumentam a estabilidade e reduzem a agregação de peptídeos em estado sólido e proteínas misturadas ou ligadas. Em algumas ocasiões, a atividade ou estabilidade física de proteínas também pode ser melhorada por vários aditivos em soluções aquosas de drogas com peptídeos ou proteínas. Por exemplo, aditivos, como polióis (incluindo açúcares), aminoácidos, proteínas como colágeno e gelatina, e vários sais podem ser usados.

Certos aditivos, em particular açúcares e outros polióis, também fornecem significante estabilidade física em seco, ex., proteínas Iiofilizadas. Esses aditivos também podem ser usados dentro da invenção para proteger as proteínas contra a agregação não apenas durante a liofilização, mas também durante o armazenamento em estado seco. Por exemplo, a sucrose e Ficoll 70 (polímero com unidades de sucrose) exibem significante proteção contra agregação de peptideos ou proteínas durante incubação de fase sólida sob várias condições. Esses aditivos também podem melhorar a estabilidade de proteínas sólidas dentro de matrizes de polímeros.

Aditivos adicionais, por exemplo, sucrose, estabilizam as proteínas contra agregação em estado sólido em atmosferas úmidas em temperaturas elevadas, como pode ocorrer em certas formulações de liberação sustentada da invenção. Proteínas como gelatina e colágeno também servem como agentes estabilizadores ou de volume para reduzir a desnaturação e agregação de proteínas instáveis nesse contexto. Esses aditivos podem ser incorporados em processos de derretimento polimérico e composições dentro da invenção. Por exemplo, micropartículas de polipeptídeos podem ser preparadas por simples liofilização ou secagem por spray de uma solução contendo vários aditivos estabilizantes descritos acima. A liberação sustentada de peptídeos não-agregados e proteínas pode, portanto, ser obtido por um período extenso de tempo.

Vários componentes e métodos preparativos adicionais, assim como aditivos de formulações específicas, são aqui fornecidos e geram formulações para liberação em mucosa de peptídeos e proteínas aptos a agregação, enquanto o peptídeo ou proteína é estabilizado em uma forma substancialmente pura, não-agregada usando um agente solubilizante. Uma variação de componentes e aditivos são contemplados para uso dentro desses métodos e formulações. Exemplos desses agentes solubilizantes são as ciclodextrinas (CDs), que seletivamente se ligam a cadeias laterais hidrofóbicas de polipeptídeos. Essas CDs mostraram ligar-se a partes hidrofóbicas de proteínas de forma que significantemente inibem a agregação. Essa inibição é seletiva com relação à CD e a proteína envolvida. Tal inibição seletiva de agregação de proteína fornece vantagens adicionais dentro dos métodos de liberação intranasal e composições da invenção. Agentes adicionais para uso nesse contexto incluem dímeros de CD, trímeros e tetrâmeros com geometrias variadas controladas por ligantes que especificamente bloqueiam a agregação de peptídeos e proteínas. Agentes de solubilização e métodos para incorporação dentro da invenção envolvem o uso de peptídeos e peptídeo miméticos para seletivamente bloquear interações proteína-proteína. Em um aspecto, a ligação específica de cadeias laterais hidrofóbicas relatada para multímeros de CD estende-se a proteínas através do uso de peptídeos e peptídeo miméticos que similarmente bloqueiam a agregação de proteínas. Uma ampla variação de métodos adequados e agentes anti-agregação está disponível para incorporação dentro das composições e procedimentos da invenção.

Modificação de Carga e Agentes e Métodos de Controle do pH

Para melhorar as características de transporte de agentes biologicamente ativos (incluindo exendina, outros peptídeos ativos e proteínas, e drogas macromoleculares e de moléculas pequenas) para liberação melhorada pelas barreiras de membrana mucosa hidrofóbicas, a invenção ainda fornece técnicas e reagentes para modificação de carga de agentes biologicamente ativos selecionados ou agentes aprimoradores de liberação aqui descritos. Em relação a isso, as permeabilidades relativas das macromoléculas são geralmente relacionadas a seus coeficientes de partição. O grau de ionização das moléculas, que é dependente do pKa da molécula e do pH da superfície da membrana mucosa, também afeta a permeabilidade das moléculas. A permeação e partição de agentes biologicamente ativos, incluindo exendina e análogos da invenção, para liberação em mucosa podem ser facilitadas por alteração de carga ou espalhamento da carga do agente ativo ou permeabilizante, que é atingida, por exemplo, por alteração de grupos funcionais carregados, por modificação do pH do veículo de liberação ou solução na qual o agente ativo é liberado, ou por administração coordenada de um reagente de alteração de carga ou pH com o agente reativo.

Consistente com esses ensinamentos gerais, a liberação em mucosa de espécies macromoleculares carregadas, incluindo exendina e outros peptídeos e proteínas biologicamente ativos, dentro dos métodos e composições da invenção, é substancialmente melhorada quando o agente ativo é liberado na superfície mucosa em um estado de carga não- ionizado, ou neutro, ou elétrico.

Certas exendinas e outras formulações componentes da mucosa de peptídeos e proteínas ativas, para uso dentro da invenção, terão carga modificada para gerar um aumento na densidade da carga positiva do peptídeo ou proteína. Essas modificações também se estendem para cationização de conjugados de peptídeos e proteínas, carregadores e outras formas de liberação aqui reveladas. A cationização oferece meios convenientes de alterar a biodistribuição e propriedades de transporte de proteínas e macromoléculas dentro da invenção. A cationização é levada de maneira que substancialmente preserve a atividade biológica do agente ativo e limite potencialmente efeitos colaterais adversos, incluindo danos teciduais e toxicidade.

Agentes Inibitórios Degradadores de Enzima e Métodos

Outro excipiente que pode estar incluído em uma preparação transmucosal é um inibidor de enzima degradativa. Complexos exemplares de inibidor mucoadesivo de polímero- enzima que são úteis dentro das formulações de liberação em mucosa e métodos da invenção incluem, mas não se limitam: Carboximetilcelulose-pepstatina (com atividade anti-pepsina) ; Poli(ácido acrílico)-inibidor de Bowman-Birk (anti- quimiotripsina); Poli (ácido acrílico)-quimostatina (anti- quimiotripsina); Poli (ácido acrílico)-elastatinal (anti- elastase); Carboximetilcelulose-elastatinal (anti-elastase) ; Policarbofil—elastatinal (anti-elastase); Quitosana—antipaína (anti-tripsina); Poli(ácido acrílico)—bacitracina (anti- aminopeptidase N); Quitosana—EDTA (anti-aminopeptidase N, anti-carboxipeptidase A); Quitosana—EDTA-antipaína (anti- tripsina, anti-quimiotripsina, anti-elastase). Como descrito abaixo com maiores detalhes, certas personificações da invenção opcionalmente incorporam um novo derivado de quitosana ou forma quimicamente modificada de quitosana. Um derivado novo para uso dentro da invenção é denotado como um polímero de β- [l→4]-2-guanidino-2-desoxi-D-glucose (poli- GuD).

Qualquer inibidor que iniba a atividade de uma enzima para proteger os agentes biologicamente ativos pode ser empregado funcionalmente nas composições e métodos da invenção. Inibidores de enzima úteis para a proteção de proteínas biologicamente ativas e peptídeos incluem, por exemplo, inibidor de tripsina de soja, inibidor de tripsina de exendina, inibidor de quimiotripsina e tripsina e inibidor de quimiotripsina isolado da batata (Solanum tuberosum L.). Uma combinação ou misturas de inibidores pode ser usada. Inibidores adicionais de enzimas proteolíticas para uso dentro da invenção incluem enzima ovomucóide, mesilato de gabaxato, antitripsina-alfa, aprotinina, amastatina, bestatina, puromicina, bacitracina, leupepsina, alfa-2- macroglobulina, pepstatina e inibidor da clara de ovo ou tripsina de soja. Esses e outros inibidores podem ser usados sozinhos ou era combinação. Os inibidores podem ser incorporados ou ligados a um carregador, ex. , um polímero hidrofílico, revestido na superfície da forma de dosagem que está em contato com a mucosa nasal, ou incorporado na fase superficial da superfície, em combinação com o agente biologicamente ativo ou em formulação administrada separadamente (ex., pré-administrado).

A quantidade de inibidor, ex. , de um inibidor de enzima proteolítica que é opcionalmente incorporada nas composições da invenção varia dependendo (a) das propriedades do inibidor específico, (b) o número de grupos funcionais presentes na molécula (que podem ser reagidos para introduzir insaturação etilênica necessária para copolimerização com hidrogel formando monômeros), e (c) o número de grupos lectina, como glicosídeos, que estão presentes na molécula do inibidor. Pode também depender do agente terapêutico específico que se pretende administrar. De maneira geral, uma quantidade útil de um inibidor de enzima é de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, normalmente de 0,2 mg/mL a cerca de 25 mg/mL, e mais comumente de 0,5 mg/mL a 5 mg/mL de uma das formulações (ex., uma formulação de inibidor de protease em separado ou formulação combinada com o inibidor e agente biologicamente ativo).

No caso da inibição de tripsina, inibidores adequados podem ser selecionados de, ex. , aprotinina, BBI, inibidor de tripsina de soja, ovomucóide de galinha, ovoinibidor de galinha, inibidor de tripsina de exendina humana, mesilato de camostato, inibidores de flavonóides, antipaína, leupeptina, p-aminobenzamidina, AEBSF, TLCK (tosillisina clorometilcetona), APMSF, DFP, PMSF, e derivados de poli (acrilato) . No caso de inibição de quimiotripsina, inibidores adequados podem ser selecionados de, ex., aprotinina, BBI, inibidor de tripsina de soja, quimiostatina, benziloxicarbonil-Pro-Phe-CHO, FK-448, ovoinibidor de galinha, complexos de ácidos de açúcar bifenilborônicos, DFP, PMSF, β-fenilpropionato, e derivados do poli (acrilato) . No caso da inibição da elastase, inibidores adequados podem ser selecionados de, ex., elastatinal, metoxisuccinil-Ala-Ala- Pro-Val-clorometilcetona (peptídeo revelado como SEQ ID NO: 12) (MPCMK), BBI, inibidor de tripsina de soja, ovoinibidor de galinha, DFP e PMSF.

Inibidores adicionais de enzimas para uso dentro da invenção são selecionados de uma ampla variação de inibidores não-protéicos que variam em seu grau de potência e toxicidade. Como descrito em mais detalhes abaixo, a imobilização desses agentes adjuntos para matrizes ou outros veículos de liberação, ou desenvolvimento de análogos quimicamente modificados, pode ser prontamente implementado para reduzir ou mesmo eliminar efeitos tóxicos, quando são encontrados. Entre esse amplo grupo de candidatos inibidores de enzima para uso dentro da invenção estão inibidores organofosforados, como diisopropilfluorofosfato (DFP) e fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF), que são inibidores potentes, irreversíveis de proteases de serina (ex., tripsina e quimiotripsina). A inibição adicional de acetilcolinesterase por esses compostos os faz altamente tóxicos em ajustes de liberação não controlados. Outro candidato a inibidor, 4-(2-aminoetil)-benzenosulfonil fluoreto (AEBSF), possui uma atividade inibitória comparável ao DFP e PMSF, mas é marcadamente menos tóxico. 0 (4- aminofenil)-metanosulfonil fluoreto hidrocloreto (APMSF) é outro potente inibidor da tripsina, mas é tóxico em ajustes não controlados. Em contraste a esses inibidores, 4-(4- isopropilpiperadinocarbonil)fenil 1,2,3,4-tetrahidro-l- naftoato metanosulfonato (FK 44 8) é uma substância pouco tóxica, representando um potente e específico inibidor de quimiotripsina. Outros representantes deste grupo não- protéico de candidatos inibidores, e também exibindo baixo risco tóxico, são o camostato mesulato (N,N'-dimetil carbamoilmetil-p- (p' -guanidino-benzoiloxi) fenilacetato metano-sulfonato).

Outro tipo de agente inibidor de enzima para uso dentro dos métodos e composições da invenção são aminoácidos e aminoácidos modificados que interferem com a degradação enzimática de compostos terapêuticos específicos. Para uso neste contexto, aminoácidos e aminoácidos modificados são substancialmente não-tóxicos e podem ser produzidos a baixo custo. Porém, devido a seu baixo peso molecular e boa solubilidade, são prontamente diluídos e absorvidos em ambientes de mucosas. Todavia, sob condições apropriadas, aminoácidos podem agir como inibidores reversíveis e competitivos de enzimas protease. Certos aminoácidos modificados podem exibir uma atividade inibitória bem mais forte. Um aminoácido modificado desejado neste contexto é conhecido como inibidor de 'estado de transição'. A forte atividade inibitória desses compostos é baseada em sua semelhança estrutural com um substrato em sua geometria de estado de transição, enquanto são geralmente selecionados por possuírem uma afinidade muito maior com o local ativo de uma enzima do que com o próprio substrato. Inibidores de estado de transição são reversíveis, inibidores competitivos. Exemplos desse tipo de inibidor são derivados do ácido a- aminoborônico, como boro-leucina, boro-valina, e boro- alanina. O átomo de boro nesses derivados pode formar um íon boronato tetraédrico. que acredita-se lembrar o estado de transição de peptídeos durante sua hidrólise por aminopeptidases. Esses derivados de aminoácidos são inibidores potentes e reversíveis de aminopeptidases e relata-se que a boro-leucina é mais de 100 vezes mais eficiente na inibição de enzimas do que a bestatina e mais de 1000 vezes mais eficiente do que a puromicina. Outro aminoácido modificado para o qual uma forte atividade inibidora de protease foi relatada é a N-acetilcisteína, que inibe a atividade enzimática da N-aminopeptidase. Esse agente adjunto também mostra propriedades mucolíticas que podem ser empregadas dentro dos métodos e composições da invenção para reduzir os efeitos da barreira de difusão de muco.

Outros inibidores de enzima úteis para uso dentro dos métodos de administração coordenada e formulações combinatórias da invenção podem ser selecionados a partir de peptídeos e inibidores de enzimas de peptideos modificados. Um importante representante desta classe de inibidores é o dodecapeptídeo cíclico, bacitracina, obtido do Bacillus licheniformis. Além desses tipos de peptideos, certos dipeptídeos e tripeptídeos mostram atividade inibidora fraca e não-específica com relação a algumas proteases. Por analogia com aminoácidos, sua atividade inibidora pode ser melhorada por modificações químicas. Por exemplo, análogos do dipeptídeo do ácido fosfínico também são inibidores do 'estado de transição' com uma atividade inibidora forte com relação às aminopeptidases. Relatou-se que eles foram usados para estabilizar a encefalina leucina administrada nasalmente. Outro exemplo de um análogo de estado de transição é a pepstatina pentapeptídeo modificada, que é um inibidor muito potente da pepsina. A análise estrutural da pepstatina, testando-se a atividade inibitória de vários análogos sintéticos, demonstrou as maiores características de estrutura-função das moléculas responsáveis pela atividade inibitória. Outro tipo especial de peptídeo modificado inclui inibidores com uma função aldeído terminalmente localizada em sua estrutura. Por exemplo, a seqüência benziloxicarbonil- Pro-Phe-CHO, que preenche os requisitos de especificidade primária e secundária conhecidos da quimiotripsina, revelou ser um potente inibidor reversível dessa proteinase alvo. As estruturas químicas de outros inibidores com uma função aldeído localizada terminalmente, ex., antipaína, leupeptina, quimiostatina e elastatinal, também são conhecidos, como sendo estruturas de outros inibidores de peptídeos conhecidos, reversíveis, modificados, como fosforamidona, bestatina, puromicina, e amastatina.

Devido a sua massa molecular comparavelmente alta, inibidores de protease polipeptídeos são mais amenistas do que compostos menores de liberação concentrada em uma matriz carregadora de drogas. Agentes adicionais para inibição de protease dentro das formulações e métodos de invenção envolvem o uso de agentes complexos. Esses agentes mediam a inibição de enzima por depleção do ambiente intranasal (ou composição preparativa ou terapêutica) de cátions divalentes, que são co-fatores para muitas proteases. Por exemplo, os agentes complexos EDTA e DTPA como agentes adjuntos coordenadamente administrados ou combinatoriamente formulados, em concentração adequada, serão suficientes para inibir proteases selecionadas para então melhorar a liberação intranasal de agentes biologicamente ativos de acordo com a invenção. Outros representantes desta classe de agentes inibitórios são o EGTA, 1, 10 -fenantrolina e hidroxiquinolina. Além disso, devido à sua propensão em quelar cátions divalentes, esses e outros agentes complexos são úteis dentro da invenção como agentes diretos, promotores de absorção.

Como aqui notado em mais detalhes, também se contempla usar vários polímeros, particularmente polímeros mucoadesivos, como agentes inibidores de enzima dentro da administração coordenada, multi-processamento e/ou métodos de formulação combinatória e composições da invenção. Por exemplo, derivados do poli(acrilato), como poli (ácido acrílico) e policarbofil, podem afetar a atividade de várias proteases, incluindo tripsina, quimiotripsina. O efeito inibitório desses polímeros também pode ser baseado no complexo de cátions divalentes como Ca+2 e Zn+2. É ainda contemplado que esses polímeros podem servir como parceiros conjugados ou carregadores para outros agentes inibidores de enzima, como descrito acima. Por exemplo, um conjugado de quitosana-EDTA foi desenvolvido e é útil dentro da invenção que exibe um forte efeito inibitório na atividade enzimática de proteases dependentes de zinco. As propriedades mucoadesivas dos polímeros após ligação covalente de outros inibidores de enzima neste contexto não são esperadas como substancialmente comprometidas, nem é de utilidade geral de tais polímeros como veículo de liberação para agentes biologicamente ativos dentro da invenção esperados a diminuírem. Pelo contrário, a distância reduzida entre o veículo de liberação e superfície da mucosa permitida pelo mecanismo mucoadesivo minimizará o metabolismo pré-sistêmico do agente ativo, enquanto os inibidores de enzimas ligados covalentemente permanecem concentrados no local de liberação da droga, minimizando efeitos de diluição indesejados dos inibidores, assim como tóxicos e outros efeitos também causados. Dessa forma, a quantidade eficiente de um inibidor de enzima administrado coordenadamente pode ser reduzida devido à exclusão de efeitos de diluição.

Complexos exemplares de inibidor mucoadesivo de polímero-enzima que são úteis dentro das formulações de mucosa e métodos da invenção incluem, mas não se limitam: Carboximetilcelulose-pepstatina (com atividade anti-pepsina) ; Poli(ácido acrílico)-inibidor de Bowman-Birk (anti- quimiotripsina); Poli (ácido acrílico)-quimostatina (anti- quimiotripsina); Poli (ácido acrílico)-elastatinal (anti- elastase); Carboximetilcelulose-elastatinal (anti-elastase); Policarbofil—elastatinal (anti-elastase); Quitosana—antipaína (anti-tripsina) ; Poli(ácido acrílico) —bacitracina (anti- aminopeptidase N) ; Quitosana—EDTA (anti-aminopeptidase N, anti-carboxipeptidase A) ; Quitosana—EDTA-antipaína (anti- tripsina, anti-quimiotripsina, anti-elastase) .

Agentes Mucolíticos e Limpadores de Muco e Métodos A liberação eficiente de agentes bioterapêuticos via administração intranasal deve levar em consideração a taxa diminuída de transporte de drogas pela camada mucosa protetora da mucosa nasal, além de perda de drogas devido à ligação com glicoproteínas da camada mucosa. O muco normal é uma substância viscoelástica, semelhante a gel, consistindo em água, eletrólitos, macromoléculas, e células epiteliais mortas. Serve primariamente como cobertura citoprotetora e lubrificante cobrindo os tecidos da mucosa abaixo. O muco é secretado por células secretoras randomicamente distribuídas localizadas no epitélio nasal e em outros epitélios da mucosa. A unidade estrutural do muco é a mucina. A glicoproteína é principalmente responsável pela natureza viscoelástica do muco, embora no muco das vias aéreas, tais macromoléculas incluem IgA, IgM, IgE, lisozimas e broncotransferrinas secretórias produzidas localmente, que também desempenham um papel importante em mecanismos de defesa do hospedeiro.

Os métodos de administração coordenada da invenção opcionalmente incorporam agentes mucolíticos eficazes ou limpadores de muco, que servem para degradar; muco fino ou claro de superfícies da mucosa intranasal para facilitar a absorção de agentes bioterapêuticos administrados intranasalmente. Dentro desses métodos, um agente mucolítico ou limpador de muco é administrado coordenadamente como um composto adjunto para melhorar a liberação intranasal do agente biologicamente ativo. Alternativamente, uma quantidade eficiente de agente mucolítico ou limpador de muco é incorporada com agente processador dentro de um método multi- processador da invenção, ou como aditivo dentro de uma formulação combinatória da invenção, para fornecer uma formulação melhorada que melhore a liberação intranasal de compostos bioterapêuticos por redução de efeitos de barreira do muco intranasal.

Uma variedade de agentes mucolíticos ou limpadores de muco está disponível para incorporação dentro dos métodos e composições da invenção. Baseado nos mecanismos de ação, os agentes mucolíticos e limpadores de muco podem normalmente ser classificados nos seguintes grupos: proteases (ex., pronase, papaína) que dividem o núcleo da proteína de glicoproteínas de mucina; compostos sulfidril que dividem as ligações dissulfeto da mucoproteína; e detergentes (ex., Triton X-100, Tween 20) que quebram as ligações não- covalentes dentro do muco. Compostos adicionais no contexto incluem, mas não se limitam, sais biliares e surfactantes, por exemplo, desoxicolato de sódio, taurodesoxicolato de sódio, glicocolato de sódio, e lisofosfatidilcolina.

A eficácia de sais biliares causando quebra estrutural de muco está na ordem desoxicolato > taurocolato > glicocolato. Outros agentes eficientes que reduzem a viscosidade do muco ou adesão para melhorar a liberação intranasal de acordo com os métodos da invenção incluem, ex., ácidos graxos de cadeia curta, e agentes mucolíticos que trabalham por quelação, como N-acilcolágeno peptídeos, ácidos biliares, e saponinas (estes funcionam em parte quelando o Ca2+ e/ou Mg2+ que desempenham um papel importante na manutenção da estrutura da camada de muco).

Outros agentes mucolíticos para uso dentro dos métodos e composições da invenção incluem N-acetil-L-cisteína (ACS), um potente agente mucolítico que reduz a viscosidade e aderência do muco broncopulmonar e relatou-se diminuir um pouco a biodisponibilidade nasal do hormônio humano do crescimento em ratos anestesiados (de 7,5 a 12,2%). Esses e outros agentes mucolíticos ou limpadores de muco entram em contato com a mucosa nasal, tipicamente em uma variação de concentração de cerca de 0,2 a 2 0 mM, coordenadamente com a administração do agente biologicamente ativo, para reduzir a viscosidade polar e/ou elasticidade do muco intranasal.

Ainda outros agentes mucolíticos e limpadores de muco são selecionados de uma variedade de enzimas glicosidases, que são capazes de dividir ligações glicosídicas dentro da glicoproteina do muco, α-amilase e β- amilase são representativas dessa classe de enzimas, embora seu efeito mucolítico pode ser limitado. Em contraste, as glicosidases bacterianas que permitem que esses microorganismos permeiem^ as camadas de muco de seus hospedeiros.

Para uso combinatório com a maioria dos agentes biologicamente ativos dentro da invenção, incluindo terapêuticas com peptídeo e proteínas, detergentes não- ionogênicos e geralmente também úteis como agentes mucolíticos e limpadores de muco. Esses agentes tipicamente não modificarão ou substancialmente danificarão a atividade de polipeptídeos terapêuticos.

Agentes Ciliostáticos e Métodos

Devido à capacidade de auto-limpeza de certos tecidos mucosos (ex., tecidos da mucosa nasal) por limpeza mucociliar é necessário como função protetora (ex., para remover poeira, alérgenos, e bactérias), foi geralmente considerado que essa função não deve ser substancialmente danificada por medicações mucosas. O transporte mucociliar no trato respiratório é um mecanismo de defesa particularmente importante contra infecções. Para atingir essa função, os batimentos ciliares nas passagens nasal e vias aéreas move uma camada de muco ao longo da mucosa para remover partículas inaladas e microorganismos.

Agentes ciliostáticos encontram uso dentro dos métodos e composições da invenção para aumentar o tempo de residência de exendina administrada mucosalmente (ex. , intranasalmente), análogos e miméticas, e outros agentes biologicamente ativos aqui revelados. Em particular, a liberação desses agentes dentro dos métodos e composições da invenção é significantemente melhorada em certos aspectos pela administração coordenada ou formulação combinatória de um ou mais agentes ciliostáticos que funcionam para inibir reversamente a atividade ciliar de células mucosas, para fornecer um aumento temporário, reversível no tempo de residência dos agentes ativos administrados mucosamente. Para uso dentro desses aspectos da invenção, os fatores ciliostáticos acima, específicos ou indiretos em sua atividade, são todos candidatos para uso de sucesso como agentes ciliostáticos em quantidades apropriadas (dependendo da concentração, duração e modo de liberação) para que gerem uma redução transiente (ex., reversível) ou cessação de limpeza mucociliar em um local de mucosa de administração para melhorar a liberação de exendina sem efeitos colaterais adversos inaceitáveis.

Dentro de mais aspectos detalhados, um fator ciliostático específico é usado em formulação combinada ou protocolo de administração coordenado com uma ou mais exendinas. Vários fatores ciliostáticos bacterianos isolados e caracterizados pela literatura podem ser usados dentro dessas personificações da invenção. Fatores ciliostáticos da bactéria Pseudomonas aeruginosa incluem um derivado da fenazina, um composto pio (2-alquil-4-hidroxiquinolinas), e um raranolipídio (também conhecido como hemolisina). 0 composto pio produziu ciliostase em concentrações de 50 μ5/ιηΙι e sem lesões ultraestruturais óbvias. O derivado de fenazina também inibiu a motilidade ciliar, mas causou certa interrupção da membrana, embora em concentrações substancialmente maiores de 4 00 μ9/πιΙϋ. A exposição limitada de explantes traqueais a ramnolipídios resultou em ciliostase, que está associado com membranas ciliares alteradas. A exposição mais extensa ao ramnolipídio está associado com a remoção de braços de dineína de axonemas.

Agentes Ativos de Superfície e Métodos

Dentro de aspectos mais detalhados da invenção, um ou mais agentes aprimoradores de penetração em membrana que podem ser usados dentro de um método de liberação ou formulação da invenção para melhorar a liberação em mucosa de exendina. Agentes melhoradores de penetração em membrada neste contexto podem ser selecionados de: (i) um surfactante, (ii) um sal biliar, (iii) um aditivo fosfolipídio, micela mista, lipossoma ou carregador, (iv) um álcool, (v) uma enamina, (vi) um composto NÃO doador, (vii) uma molécula anfipática de cadeia longa, (viii) um aprimorador de penetração hidrofóbica menor, (ix( derivado de ácido salicílico ou sódio, (x) um éster glicerol de ácido acetoacético, (xi) um derivado de ciclodextrina ou beta- ciclodextrina, (xii) um ácido graxo de cadeia média, (xiii) um agente quelante, (xiv) um aminoácido ou seu sal, (xv) um N-acetilaminoácido ou seu sal, (xvi) uma enzima degradativa de um componente de membrana selecionada, (xvii) um inibidor de síntese de ácidos graxos, (xviii) um inibidor da síntese de colesterol; ou (xix) qualquer combinação de agentes melhoradores de penetração em membrana recitados em (i) - (xviii).

Certos agentes de superfície ativa são prontamente incorporados dentro das formulações de liberação em mucosa e métodos da invenção como agentes aprimoradores de absorção em mucosa. Esses agentes, que podem ser coordenadamente administrados ou formulados em combinação com a exendina, podem ser selecionados de uma ampla montagem de surfactantes conhecidos. Surfactantes, que geralmente caem em três classes: (1) éteres polioxietileno não-iônicos; (2) sais biliares como glicocolato de sódio (SGC) e desoxicolato (DOC); e (3) derivados de ácido fusídico como taurodihidrodrofusidato de sódio (STDHF). Os mecanismos de ação dessas várias classes de agentes de superfície ativa tipicamente incluem solubilização do agente biologicamente ativo. Para proteínas e peptídeos que normalmente formam agregados, as propriedades de superfície ativa desses promotores de absorção podem permitir interações com proteínas para que unidades menores como monômeros revestidos por surfactantes podem ser mais prontamente mantidos em solução. Exemplos de outros agentes de superfície ativa são L-a-Fosfatidilcolina Didecanoil (DDPC) polisorbato 80 e polisorbato 20. Esses monômeros são presumivelmente unidades mais transportáveis do que agregados. Um segundo mecanismo em potencial é a proteção do peptídeo ou proteína de degradação proteolítica por proteases no ambiente de mucosa. Ambos os sais biliares e alguns derivados do ácido fusídico comprovadamente inibem a degradação proteolítica de proteínas por homogenados nasais em concentrações menores do que ou equivalentes às necessárias para melhorar a absorção de proteína. Esta inibição de protease pode ser especialmente importante para peptídeos com meias-vidas biológicas curtas.

Agentes Aprimoradores da Viscosidade

Agentes aprimoradores da viscosidade ou em suspensão podem afetar a taxa de liberação de uma droga de uma formulação de dosagem e absorção. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como agentes aprimoradores de viscosidade farmaceuticamente aceitos são metilcelulose (MC) ; hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) ; carboximetilcelulose (CMC); celulose; gelatina; amido; heta amido; poloxâmeros; plurônicos; CMC sódio; sorbital; acácia; povidona; carbopol; policarbofil; quitosana; microesferas de quitosana; microesferas de alginato; glutamato de quitosana; resina de amberlito; hialuronano; etil celulose; maltodextrina DE; amido de milho seco em tambor (DDWM) ; microesferas de amido degradáveis (DSM); desoxiglicocolato (GDC); hidroxietil celulose (HEC); hidroxipropil celulose (HPC); celulose microcristalina (MCC); ácido polimetacrílico e polietileno glicol; sulfobutiléter B ciclodextrina; bioesferas de amido eldexômetro de ligação cruzada; sodiotaurodihidrofusidato (STDHF); N-trimetil quitosana cloreto (TMC); microesferas de amido degradado; resina de amberlito; nanopartículas de quitosana; crospovidona seca em spray; microesferas de dextrano secas em spray; celulose microcristalina seca em spray; e microesferas de amido de eldexômetro de ligação cruzada.

Enzimas de Degradação e Inibidores de Ácidos Graxos e Síntese de Colesterol

Em aspectos relacionados da invenção, a exendina é formulada ou coordenadamente administrada com um agente aprimorador de penetração selecionado de uma enzima de degradação, ou um agente estimulatório metabólico ou inibidor da síntese de ácidos graxos, esteróis ou outros componentes selecionados da barreira epitelial, Patente Americana No. 6,190,894. Por exemplo, enzimas degradativas como fosfolipase, hialuronidase, neuraminidase, e condroitinase podem ser usadas para melhorar a penetração de exendina na mucosa sem causar dano irreversível à barreira mucosa. Em uma personificação, a condroitinase é usada dentro de um método ou composição como aqui fornecida para alterar constituentes de glicoproteína ou glicolipidio da barreira de permeabilidade da mucosa, melhorando assim a absorção de exendina na mucosa.

Com relação a inibidores de síntese de constituintes da barreira mucosa, nota-se que os ácidos graxos livres contam com 20-25% dos lipídios epiteliais por peso. Duas enzimas limitantes de taxa na biossíntese de ácidos graxos livres são a acetil CoA carboxilase e sintetase de ácido graxo. Através de uma série de etapas, os ácidos graxos livres são metabolizados em fosfolipldios. Assim, os inibidores da síntese de ácidos graxos livres e metabolismo para uso dentro dos métodos e composições da invenção incluem, mas não se limitam, inibidores da acetil CoA carboxilase como ácido 5-tetradeciloxi-2-furancarboxílico (TOFA); inibidores da sintetase de ácidos graxos; inibidores da fosfolipase A como a gomisina A, ácido 2-(p- amilcinamil)amino-4-clorobenzóico, brometo de bromofenacil, monoalida, ácido 7,7-dimetil-5,8-eicosadienóico, nicergolina, cefarantina, nicardipina, quercetina, AMP dibutiril-cíclico, R-24571, N-oleoiletanolamina, N-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol- 4-il) fosfostidil serina, ciclosporina A, anestésicos tópicos, incluindo dibucaína, prenilamina, retinóides, como todos os trans e ácido 13-cis-retinóico, W-7, trifluoperazina, R-24571 (calmidazólio), 1-hexadocil-3- trifluoroetil glicero-sn-2-fosfomentol (MJ33); bloqueadores do canal de cálcio incluindo nicardipina, verapamil, diltiazem, nifedipina, e nimodipina; agentes antimalária incluindo quinacrina, mepacrina, cloroquina e hidroxicloroquina; beta bloqueadores incluindo propanalol e labetalol; antagonistas da calmodulina; EGTA; timersol; glucocorticosteróides incluindo dexametasona e prednisolona; e agentes antiinflamatórios não-esteroidais incluindo indometacina e naproxeno.

Esteróis livres, primariamente o colesterol, contam com 20-25% dos lipídios epiteliais por peso. A enzima limitante de taxa na biossíntese do colesterol é 3-hidroxi-3- metilglutaril (HMG) CoA redutase. Inibidores da síntese do colesterol para uso dentro dos métodos e composições da invenção incluem, mas não se limitam, inibidores competitivos da (HMG) CoA redutase, como simvastatina, lovastatina, fluindostatina (fluvastatina) , pravastatina, mevastatina, assim como outros inibidores da HMG CoA redutase, como o colesterol oleato, colesterol sulfato e fosfato, e esteróis oxigenados, como 25-OH-- e 26-OH-- colesterol; inibidores da esqualeno sintetase; inibidores da esqualeno epoxidase; inibidores das redutases DELTA7 ou DELTA24 como 22,25- diazacolesterol, 20,25-diazacolestenol, AY9944, e triparanol.

Cada um dos inibidores da síntese de ácidos graxos ou inibidores da síntese de esterol podem ser coordenadamente administrados ou combinatoriamente formulados com uma ou mais proteínas de exendina, análogos e miméticos, e outros agentes biologicamente ativos aqui revelados para atingir a penetração epitelial melhorada dos agentes ativos. Uma variação de concentração eficaz para o inibidor de esterol em uma formulação terapêutica ou adjunta para liberação em mucosa é geralmente de cerca de 0,0001% a cerca de 20% por peso no total, mais tipicamente de cerca de 0,01% a cerca de 5%.

Agentes Doadores de Óxido Nítrico e Métodos

Dentro de outros aspectos relacionados da invenção, o doador de óxido nítrico (NO) é selecionado como um agente aprimorador de penetração em membrana para melhorar a liberação em mucosa de uma ou mais exendinas. Vários doadores de NO são conhecidos e são úteis em concentrações eficazes dentro dos métodos e formulações da invenção. Doadores exemplares de NO incluem, mas não se limitam, nitroglicerina, nitroprusida, N0C5 [3-(2-hidroxi-l-(metil-etil)-2- nitrosohidrazina)-1-propanamina], N0C12 [N-etil-2-(1-etil- hidroxi-2-nitrosohidrazina)-etanamina], SNAP [S-nitroso-N- acetil-DL-penicilamina], NORI e N0R4. Dentro dos métodos e composições da invenção, uma quantidade eficiente de um doador de NO selecionado é coordenadamente administrado ou combinatoriamente formulado com uma ou mais exendinas dentro ou através do epitélio da mucosa.

Agentes para Modulação da Estrutura de Junção Epitelial e/ou Fisiologia

A presente invenção fornece composição farmacêutica que contém uma ou mais exendinas em combinação com agentes aprimoradores de liberação em mucosa aqui revelados formulados em uma preparação farmacêutica para liberação em mucosa.

0 agente permeabilizante melhora de forma reversível o transporte paracelular da mucosa epitelial, tipicamente por modulação da estrutura epitelial e/ou fisiologia da superfície de mucosa epitelial no paciente. Esse efeito tipicamente envolve a inibição pelo agente permeabilizante de ligação homotípica ou heterotípica entre proteínas adesivas da membrana epitelial de células epiteliais vizinhas. Proteínas-alvo para esse bloqueio de ligação homotípica ou heterotípica podem ser selecionadas de várias moléculas de adesão juncional relacionadas (JAMs), ocludinas, ou claudinas. Exemplos disso são anticorpos, fragmentos de anticorpos, ou anticorpos de cadeia única que se ligam aos domínios extracelulares dessas proteínas.

Em personificações detalhadas adicionais, a invenção fornece peptídeos permeabilizantes e análogos de peptídeos e mimética para melhorar o transporte paracelular da mucosa epitelial. Os peptídeos e análogos de peptídeos e miméticos tipicamente trabalham dentro das composições e métodos da invenção modulando a estrutura juncional epitelial e/ou fisiologia em um paciente mamífero. Em certas personificações, os peptídeos e análogos dos peptídeos e miméticos eficientemente inibem a ligação homotípica e/ou heterotípica de uma proteína adesiva de membrana epitelial selecionada de uma molécula de adesão juncional (JAM), ocludina, ou claudina.

Tal agente tem sido extensivamente estudado na toxina bacteriana de Vibrio cholerae conhecido como "toxina de oclusão da zônula" (ZOT) . Esta toxina media a permeabilidade aumentada da mucosa intestinal e causa sintomas da doença, incluindo diarréia, em pacientes infectados. Fasano, et al. , Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 8:5242-5246, 1991. Quando testada na mucosa ileal de coelhos, ZOT aumentou a permeabilidade intestinal modulando a estrutura de junções intracelulares. Mais recentemente, descobriu-se que ZOT é capaz de abrir de forma reversiva as junções da mucosa intestinal. Também relatou-se que ZOT é capaz de abrir de forma reversível as junções na mucosa nasal. Patente Americana No. 5,908,825.

Dentro dos métodos e composições da invenção, ZOT, assim como vários análogos e miméticos de ZOT que funcionam como agonistas ou antagonistas da atividade ZOT, são úteis para melhorar a liberação intranasal de agentes biologicamente ativos - por aumento da absorção paracelular dentro e sobre a mucosa nasal. Neste contexto, ZOT age tipicamente causando uma reorganização estrutural de junções marcadas por localização alterada da proteína juncional ZOl.

Dentro desses aspectos da invenção, ZOT é coordenadamente administrada ou combinatoriamente formulada com o agente biologicamente ativo em quantidade eficiente para gerar uma absorção significantemente aprimorada pelo agente ativo, reversivelmente criando uma permeabilidade da mucosa nasal sem efeitos colaterais adversos substanciais.

Agentes Vasodilatadores e Métodos

Outra classe de agentes promotores de absorção que mostra utilidade benéfica dentro de métodos de administração coordenada e formulação combinatória e composições da invenção são compostos vasoativos, mais especificamente vasodilatadores. Esses compostos funcionam dentro da invenção para modular a estrutura e fisiologia da vasculatura da submucosa, aumentando a taxa de transporte da exendina dentro ou sobre o epitélio da mucosa e/ou para tecidos-alvo específicos ou compartimentos (ex., circulação sistêmica ou sistema nervoso central).

Agentes vasodilatadores para uso dentro da invenção tipicamente causam relaxamento dos vasos sangüíneos da submucosa por diminuição no cálcio citoplasmático, um aumento em óxido nítrico (NO) ou inibição da quinase de miosina de cadeia leve. Eles são divididos em 9 classes: antagonistas de calico, abridores do canal de potássio, inibidores ACE, antagonistas de receptores de angiotensina-II, antagonistas α-adrenérgicos e de receptor de imidazole, agonistas βΐ - adrenérgicos, inibidores da fosfodiesterase, eicosanóides e doadores de NO.

Apesar das diferenças químicas, as propriedades farmacocinéticas dos antagonistas de cálcio são semelhantes. A absorção na circulação sistêmica é alta, e esses agentes, portanto, passam por um metabolismo de primeiro passe considerável pelo fígado, resultando em variação individual em farmacocinética. Exceto para as drogas novas do tipo dihidropiridina (amilodipina, felodipina, isradipina, nilvadipina, nisoldipina, e nitrendipina), a meia-vida dos antagonistas de cálcio é curta. Portanto, para manter uma concentração eficiente de drogas para muitos desses pode exigir liberação em doses múltiplas, ou formulações de liberação controladas, como aqui descrito. O tratamento com o abridor de canal de potássio minoxidil também pode ser limitado em maneira e nível de administração devido aos efeitos colaterais adversos em potencial.

Os inibidores ACE previnem a conversão da angiotensina-I para angiotensina-II, e são mais eficientes quando a produção de renina é aumentada. Uma vez que o ACE é idêntico à quininase-II, que inativa o potente vasodilatador endógeno bradiquinina, a inibição de ACE causa uma redução na degradação de bradiquinina. Os inibidores de ACE fornecem a vantagem adicional de efeitos cardioprotetores e cardioreparadores, por prevenção e reversão da fibrose cardíaca e hipertrofia ventricular em modelos animais. A via de eliminação predominante da maioria dos inibidores de ACE é via excreção renal. Portanto, a falência renal está associada com eliminação reduzida e uma redução de dose de 25% para 50% é recomendada em pacientes com falência renal moderada a severa.

Com relação a doadores de NO, esses compostos são particularmente úteis dentro da invenção por seus efeitos adicionais na permeabilidade da mucosa. Além dos doadores NO notados acima, complexos de NO com nucleófilos chamados NO/nucleófilos, ou NONOatos, espontaneamente e não- enzimaticamente liberam NO quando dissolvidos em solução aquosa em pH fisiológico. Em contraste, nitro vasodilatadores como a nitroglicerina exigem atividade enzimática específica para liberação de NO. NONOatos liberam NO com uma estoiquiometria definida e em taxas previsíveis variando de < 3 minutos para dietilamina/NO para aproximadamente 20 horas para dietilenotriamina/NO (DETANO).

Dentro de certos métodos e composições da invenção, um agente vasodilatador selecionado é coordenadamente administrado (ex., sistemicamente ou intranasalmente, simultaneamente ou em associação temporal eficiente combinatoriamente) ou formulado combinatoriamente com uma ou mais exendinas em quantidade eficiente para melhorar a absorção em mucosa dos agentes ativos para atingir um tecido- alvo ou compartimento no paciente (ex., fígado, veia porta- hepática, tecido de SNC ou fluido, ou plasma sangüíneo).

Agentes Aprimoradores de Transporte Seletivo e Métodos

As composições e métodos de liberação da invenção opcionalmente incorporam um agente aprimorador de transporte seletivo que facilita o transporte de um ou mais agentes biologicamente ativos. Esses agentes aprimoradores de transporte podem ser empregados em formulação combinatória ou protocolo de administração coordenada com uma ou mais exendinas para coordenadamente melhorar a liberação de um ou mais agentes biologicamente ativos pelas barreiras de transporte em mucosa, para melhorar a liberação em mucosa dos agentes ativos para atingir um tecido alvo ou compartimento no paciente (ex., epitélio da mucosa, fígado, tecido ou fluido do SNC, ou plasma sangüíneo). Alternativamente, os agentes aprimoradores do transporte podem ser usados em formulação combinatória ou protocolo de administração coordenada para diretamente melhorar a liberação em mucosa de uma ou mais proteínas exendinas, análogas e miméticas, com ou sem liberação melhorada de um ou mais agentes biologicamente ativos.

Agentes exemplares seletivos aprimoradores do transporte para uso dentro desse aspecto da invenção incluem, mas não se limitam, glicosídeos, moléculas contendo açúcar, e agentes de ligação como agentes de ligação de Iectina, que são conhecidos por interagir especificamente com componentes da barreira de transporte epitelial. Por exemplo, ligantes "bioadesivos" específicos, incluindo várias lectinas de plantas e bactérias, que se ligam a metades dos açúcares das superfícies celulares por interações mediadas por receptores podem ser usadas como carregadores ou mediadores de transporte conjugado para melhorara liberação em mucosas, ex. nasal, de agentes biologicamente ativos dentro da invenção. Certos ligantes bioadesivos para uso dentro da invenção mediarão a transmissão de sinais biológicos para células alvo epiteliais que desencadeiam consumo seletivo do ligante adesivo por processos de transporte celular especializados (endocitose ou transcitose). Esses mediadores de transporte podem, portanto, como "sistema carregador" para estimular ou dirigir o consumo seletivo de uma ou mais proteínas exendinas, análogas e miméticas, e outros agentes biologicamente ativos dentro e/ou sobre o epitélio da mucosa. Esses e outros agentes aprimoradores de transporte seletivo significantemente melhoram a liberação em mucosa de biofarmacêuticos macromoleculares (particularmente vetores de peptídeos, proteínas, oligonucleotídios e polinucleotídios) dentro da invenção. Lectinas são proteínas de plantas que se ligam a açúcares específicos encontrados na superfície de glicoproteínas e glicolipídios de células eucarióticas. Soluções concentradas de lectinas possuem um efeito "mucotractivo", e vários estudos demonstraram endocitose mediada por receptor rápido (RME) de lectinas e conjugados de lectinas (ex., concanavalina A conjugada com partículas de ouro coloidal) por superfícies mucosas. Estudos adicionais relataram que os mecanismos de consumo para lectinas podem ser utilizados para alvos de drogas intestinais in vivo. Em alguns desses estudos, nanopartículas de poliestireno (500 nm) foram covalentemente acopladas a lectina de tomate e geraram um consumo sistêmico melhorado após administração oral em ratos. Além de lectinas de plantas, adesão microbiana e fatores de invasão fornecera uma rica fonte de candidatos para uso como carregadores de transporte seletivo/adesivo dentro dos métodos de liberação era mucosa, e composições da invenção. Dois componentes são necessários para processos de aderência bacteriana, uma "adesina" bacteriana (fator de aderência ou colonização) e um receptor na superfície da célula hospedeira. Bactérias que causam infecção nas mucosas necessitam penetrar na camada de muco antes de se ligarem à superfície epitelial. Esta ligação é normalmente mediada por fímbrias bacterianas ou estruturas pilosas, embora outros componentes da superfície celular também façam parte do processo. Bactérias aderentes colonizam o epitélio da mucosa por multiplicação e inicialização de uma série de reações bioquímicas dentro da célula alvo através de mecanismos de transdução de sinais (com ou sem ajuda de toxinas). Associadas com esses mecanismos invasivos, uma ampla diversidade de proteínas bioadesivas (ex., invasina, internalina) originalmente produzidas por várias bactérias e vírus são conhecidas. Elas permitem a ligação extracelular de tais microorganismos com uma seletividade impressionante para espécies hospedeiras e mesmo tecidos-alvo em particular. Sinais transmitidos por tais interações receptores-ligantes desencadeiam o transporte de microorganismos vivos intactos dentro, e eventualmente através, de células epiteliais por processos endo e transcitóticos. Tais fenômenos ocorrendo naturalmente podem ser armados (ex., por complexo de agentes biologicamente ativos como exendina com uma adesina) de acordo com os ensinamentos para melhora da liberação de compostos biologicamente ativos dentro ou sobre o epitélio da mucosa e/ou outros locais-alvo designados para ação da droga.

Várias toxinas bacterianas e de plantas que se ligam a superfícies em uma maneira específica e semelhante à lectina também são úteis dentro dos métodos e composições da invenção. Por exemplo, a toxina da difteria (DT) entra nas células hospedeiras rapidamente por RME. Da mesma forma, a subunidade B da E. coli aquece ligações de toxinas lábeis até a margem em escova das células epiteliais intestinais de maneira semelhante à lectina e altamente especifica. 0 consumo dessa toxina e transcitosepara o lado basolateral dos enterócitos foi relatado in vivo e in vitro. Outras pesquisas mostraram o domínio transmembrana da toxina da difteria em E.coli como proteína de fusão de ligação com maltose e acoplada quimicamente a alto-Mw poli-L-lisina. O complexo resultante é usado com sucesso para mediar a internalização de um gene relator in vitro. Além desses exemplos, o Staphylococcus aureus produz um conjunto de proteínas (ex. , enterotoxina estafilocóccica A (SEA), SEB, toxina da síndrome do choque tóxico 1 (TSST-I) que agem como superantígeos e toxinas. Estudos relacionados a essas proteínas relataram transcitose facilitada, dose-dependente de SEB e TSST-I em células Caco-2.

Hemaglutininas virais compreendem outro tipo de agente de transporte para facilitar a liberação em mucosa de agentes biologicamente ativos dentro dos métodos e composições da invenção. A etapa inicial em muitas infecções virais é a ligação de proteínas de superfície (hemaglutininas) às células mucosas. Essas proteínas de ligação foram identificadas para a maioria dos vírus, incluindo rotavírus, vírus zóster de varicela, vírus semliki da floresta, adenovírus, vírus da folha da batata, e reovírus. Essas e outras hemaglutininas virais exemplares podem ser usadas em uma formulação combinatória (ex., mistura ou formulação conjugada) ou protocolo de administração coordenada com uma ou mais exendinas, análogos e miméticos aqui revelados, para melhorar coordenadamente a liberação em mucosa de um ou mais agentes biologicamente ativos. Alternativamente, as hemaglutininas virais podem ser usadas em formulação combinatória ou protocolo de administração coordenada para diretamente melhorar a liberação em mucosa de uma ou mais proteínas exendinas, análogas e miméticas, com ou sem liberação melhorada de um ou mais agentes biologicamente ativos.

Uma variedade de fatores endógenos, de mediação de transporte seletivo, também estão disponíveis para uso dentro da invenção. Células de mamíferos desenvolveram uma variedade de mecanismos para facilitar a internalização de substratos específicos e levá-los a compartimentos definidos. Coletivamente, esses processos de deformações de membrana são nomeadas "endocitose" e compreendem fagocitose, pinocitose, endocitose mediada por receptores (RME mediada por clatrina) e potocitose (RME mediada por não-clatrina) . RME é um processo biológico celular altamente específico pelo qual, como o nome indica, vários ligantes ligam-se a receptores de superfície celular e são subseqüentemente internalizados e trafegados dentro da célula. Em muitas células o processo de endocitose é tão ativo que toda a superfície da membrana é internalizada e substituída em menos de meia hora. Duas classes de receptores são propostas baseadas em sua orientação na membrana celular; o término amino de receptores Tipo I está localizado no lado extracelular da membrana, enquanto receptores Tipo II possuem essa mesma terminação protéica no fundo intracelular.

Outras personificações da invenção ainda utilizam transferrina como carregador ou estimulante de RME ou agentes ativos biologicamente liberados. Transferrina, uma glicoproteína de transporte de ferro 80 kDa, é eficientemente tomada pelas células pelo RME. Receptores de transferrina são encontrados na superfície da maioria das células de proliferação, em números elevados em eritroblastos e em muitos tipos de tumores. A transcitose da transferrina (Tf) e conjugados de transferrina é aumentada na presença de Brefeldin A (BFA), um metabólito fúngico. Em outros estudos, o tratamento BFA rapidamente aumentou a endocitose apical da ricina e HRP em células MDCK. Assim, o BFA e outros agentes que estimulam transporte mediado por receptores podem ser usados dentro dos métodos da invenção como combinatoriamente formulado (ex., conjugado) e/ou agentes coordenadamente administrados para melhorar o transporte mediado por receptores de agente biologicamente ativos, incluindo a exendina.

Veículos de Liberação Polimérica e Métodos

Dentro de certos aspectos da invenção, proteínas de exendina, análogos e miméticos, outros agentes biologicamente ativos aqui revelados, e agentes aprimoradores de liberação como descritos acima, são, individualmente ou combinatoriamente, incorporados dentro de uma formulação administrada mucosamente (ex., nasalmente) que inclua um polímero biocompatível funcionando como carregador ou base.

Tais polímeros carregadores incluem pós poliméricos, matrizes ou veículos de liberação de micropartículas, entre outras formas de polímeros. 0 polímero pode ser de origem vegetal, animal, ou sintética. Normalmente o polímero tem ligação cruzada. Adicionalmente, nesses sistemas de liberação a exendina pode ser funcional izada de forma onde pode ser covalentemente ligada ao polímero e considerada inseparável do polímero por simples conexão. Em outras personificações, o polímero é quimicamente modificado com um inibidor de enzimas ou outros agentes que podem degradar ou inativar os agentes biologicamente ativos e/ou agentes aprimoradores de liberação. Em certas formulações, o polímero é parcialmente ou completamente insolúvel em água mas é um polímero inflável em água, ex., um hidrogel. Polímeros úteis neste aspecto da invenção são desejavelmente interativos com água e/ou hidrofílicos em natureza para absorver quantidades significantes de água, e normalmente formam hidrogéis quando colocados em contato com água ou outros meios aquosos por um período de tempo suficiente para atingir o equilíbrio com água. Em personificações mais detalhadas, o polímero é um hidrogel que, quando colocado em contato com água em excesso, absorve pelo menos duas vezes seu peso em água em equilíbrio quando exposto a água em temperatura ambiente, Patente Americana No. 6,004,583.

Sistemas de liberação de drogas em polímeros biodegradáveis são preferidos em muitas aplicações biomédicas porque tais sistemas são quebrados por hidrólise ou reação enzimática em moléculas não-tóxicas. A taxa de degradação é controlada por manipulação da composição da matriz do polímero biodegradável. Esses tipos de sistemas podem, portanto, ser empregados em certos ajustes de liberação em longo prazo de agentes biologicamente ativos. Polímeros biodegradáveis como o poli(ácido glicólico) (PGA), poli- (ácido lático) (PLA), e poli(ácido D, L-lático-co-glicólico) (PLGA), receberam atenção considerável como possíveis drogas carregadoras de liberação, uma vez que os produtos da degradação desses polímeros mostraram possuir baixa toxicidade. Durante a função metabólica normal do corpo, esses polímeros degradam em dióxido de carbono e água. Esses polímeros também mostraram excelente biocompatibilidade.

Por prolongar a atividade biológica da exendina, análogos e miméticos, e outros agentes biologicamente ativos aqui revelados, assim como agentes aprimoradores de liberação opcional, esses agentes podem ser incorporados em matrizes poliméricas, ex., poliortoésteres, polianidridos, ou poliésteres. Isso gera atividade sustentada e liberação dos agentes ativos, ex., como determinado pela degradação da matriz polimérica. Embora a encapsulação de moléculas bioterapêuticas dentro de polímeros sintéticos possa estabilizá-los durante o armazenamento e liberação, o maior obstáculo da tecnologia de liberação de polímeros é a perda de atividade das moléculas terapêuticas durante os processos de formulação que normalmente envolvem calor, som ou solventes orgânicos.

Polímeros promotores de absorção contemplados para uso dentro da invenção podem incluir derivados e versões quimicamente ou fisicamente modificadas dos tipos de polímeros precedentes, além de outros polímeros sintéticos ou ocorrendo naturalmente, gomas, resinas, e outros agentes, assim como misturas desses materiais uns com os outros ou outros polímeros, contanto que as alterações, modificações ou misturas não afetem adversamente as propriedades desejadas, como absorção de água, formação de hidrogel, e/ou estabilidade química para aplicação útil. Em aspectos mais detalhados da invenção, polímeros como nylon, acrilan e outros polímeros sintéticos normalmente hidrofóbicos podem ser suficientemente modificados por reação para se tornarem inflados com água e/ou formarem géis estáveis em meio aquoso.

Polímeros promotores de absorção da invenção podem incluir polímeros do grupo de homo e co-polímeros baseados em várias combinações dos seguintes monômeros de vinil: ácidos acrílico e metacrílico, acrilamida, metacrilamida, hidroxietilacrilato ou metacrilato, vinilpirrolidonas, assim como polivinilálcool e seus co e terpolímeros, polivinilacetato, seus co- e terpolímeros com os monômeros listados acima e 2-acrilamido-2-metil-ácido propanosulfônico (AMPS®). Muito úteis são os copolímeros dos monômeros listados acima com monômeros funcionais copolimerizáveis como acril ou metacril amido acrilato ou ésteres de metacrilato onde os grupos éster são derivados de alquil de cadeia reta ou ramificada, aril com até quatro anéis aromáticos que podem conter substitutos alquil de 1 a 6 carbonos; monômeros esteroidais, sulfatos, fosfatos ou catiônicos como N,N-dimetilaminoalquil (meta) acrilamida, dimetilaminoalquil (meta)acrilato, cloreto de (meta)acriloxialquiltrimetil- amônio, cloreto de (meta)acriloxialquildimetilbenzil amônio.

Outros polímeros promotores de absorção para uso dentro da invenção são os classificados como dextranos, dextrinas, e da classe de materiais classificados como gomas naturais e resinas, ou da classe de polímeros naturais como o colágeno processado, quitina, quitosana, pulalana, zooglana, alginatos e alginatos modificados como o "Quelcolóide" (um alginato modificado de polipropileno glicol), gomas como o "Quelocogel", gomas xantanas como "Queltrol", estastina, alfa hidroxi butirato e seus copolímeros, ácido hialurônico e seus derivados, ácidos polilácticos e glicólicos.

Uma classe muito útil de polímeros aplicáveis dentro da invenção são ácidos carboxílicos insaturados olefinicamente contendo pelo menos uma ligação ativada dupla carbono-carbono, e pelo menos um grupo carboxil; isto é, um grupo ácido ou funcional prontamente convertido a um ácido contendo uma ligação olefínica dupla que prontamente funciona em polimerização devido à sua presença na molécula de monômero, na posição alfa-beta com relação a um grupo carboxil, ou como parete de um agrupamento metiIeno terminal. Ácidos olefinicamente insaturados dessa classe incluem tais materiais como os ácidos acrílicos tipificados pelo próprio ácido acrílico, ácido alfa-ciano acrílico, ácido beta metilacrílico (ácido crotônico), ácido alfa-fenil acrílico, ácido beta-acriloxi propiônico, ácido cinâmico, ácido p-cloro cinâmico, ácido l-carboxi-4-fenil butadieno-1,3 itacônico, ácido citracônico, ácido mesacônico, ácido glutacônico, ácido aconítico, ácido maléico, ácido fumárico, e tricarboxi etileno. Como aqui usado, o termo "ácido carboxílico" inclui os ácidos policarboxílicos e aqueles anidridos ácidos, como o anidrido maléico, onde o grupo anidrido é formado pela eliminação de uma molécula de água de dois grupos carboxil localizados na mesma molécula de ácido carboxílico.

Acrilatos representatives, úteis como agentes promotores de absorção dentro da invenção, incluem metil acrilato, etil acrilato, propil acrilato, isopropil acrilato, butil acrilato, isobutil acrilato, metil metacrilato, metil etacrilato, etil metacrilato, octil acrilato, heptil acrilato, octil metacrilato, isopropil metacrilato, 2- etilhexil metacrilato, nonil acrilato, hexil acrilato, n- hexil metacrilato, e semelhantes. Esteres alquil acrílicos altos são decil acrilato, isodecil metacrilato, lauril acrilato, estearil acrilato, behenil acrilato e melissil acrilato e versões de metacrilato. Misturas de dois ou três ou mais ésteres acrílicos de cadeia longa podem ser polimerizados com sucesso com um dos monômeros carboxílicos. Outros commonômeros incluem olefinas, incluindo alfa olefinas, vinil éteres, vinil ésteres, e suas misturas.

Outros monômeros de vinilideno, incluindo nitrilos acrílicos, também podem ser usados como agentes promotores de absorção dentro dos métodos e composições da invenção para melhorar a liberação e absorção de uma ou mais proteínas exendinas, análogas e miméticas, e outros agentes biologicamente ativos, incluindo melhoria de liberação dos agentes ativos a um tecido ou compartimento-alvo no paciente (ex., fígado, veia porta-hepática, tecido ou fluido do SNC, ou plasma sangüíneo). Nitrilos úteis, alfa, beta- olefinicamente insaturados são preferencialmente nitrilos monoolefinicamente insaturados possuindo de 3 a 10 átomos de carbono como acrilonitrilo, metacrilonitrilo, e similares. Os mais preferidos são acrilonitrilo metacrilonitrilo. Amidas acrílicas contendo de 3 a 35 átomos de carbono incluindo amidas monolefinicamente insaturadas também podem ser usadas. Amidas representatives incluem acrilamida, metacrilamida, N- t-butil acrilamida, N-ciclohexil acrilamida, alquil amidas maiores, onde o grupo alquil no nitrogênio contém de 8 a 32 átomos de carbono, amidas acrílicas N-alquilol amidas de ácidos carboxílicos alfa, beta-olefinicamente insaturados incluindo os possuindo de 4 a 10 átomos de carbono como a Ν- metilol acrilamida, N-propanol acrilamida, N-metilol metacrilamida, N-metilol maleimida, ésteres do ácido N-metilol maleâmico, N-metilol-p-vinil benzamida, e similares.

Outros materiais úteis promotores de absorção são alfa-olefinas contendo de 2 a 18 átomos de carbono, preferencialmente de 2 a 8 átomos de carbono; dienos contendo de 4 a 10 átomos de carbono; vinil ésteres e alil ésteres como vinil acetato; vinil aromáticos como estireno, metil estireno e cloro-estireno; vinil e alil éteres e cetonas como vinil metil éter e metil vinil cetona; cloroacrilatos; cianoalquil acrilatos como alfa-cianometil acrilato, e alfa-, beta-, e gama-cianopropil acrilatos; alcoxiacrilatos como metoxi etil acrilato; haloacrilatos como cloroetil acrilato; vinil halidas e cloreto de vinila, cloreto de vinilideno e similares; divinil, diacrilatos e outros monômeros polifuncionais como divinil éter, dietileno glicol diacrilato, etileno glicol dimetacrilato, metileno-bis- acrilamida, alilpentaeritritol, e similares; e bis (beta- haloalquil) alquenil fosfonatos como bis (beta-cloroetil) vinil fosfonato e similares como conhecidos aos entendidos na prática. Copolímeros onde o monômero contendo carboxi é um pequeno constituinte e os outros monômeros de vinilideno apresentados como grandes componentes são prontamente preparados de acordo com os métodos aqui revelados.

Quando hidrogéis são empregados como agentes promotores de absorção dentro da invenção, esses podem ser compostos de copolímeros sintéticos do grupo de ácidos acrílicos e metacrílicos, acrilamida, metacrilamida, hidroxietilacrilato (HEA) ou metacrilato (HEMA), e vinilpirrolidonas que são interativos e infláveis em água. Exemplos ilustrativos específicos de polímeros úteis, especialmente para a liberação de peptídeos ou proteínas, são os seguintes tipos de polímeros: (meta) acrilamida e 0,1 a 99 wt. % ácido (meta)acrílico; (meta)acrilamidas e 0,1-75 wt % cloreto de (meta)acriloxietil trimetiamônio; (meta)acrilamida e 0,1-75 wt % (meta)acrilamida; ácido acrílico e 0,1-75 wt % alquil(meta)acrilatos; (meta)acrilamida e 0,1-75 wt % AMPS.RTM. (marca registrada de Lubrizol Corp.); (meta) acrilamida e 0 a 30 wt % alquil (meta) acrilamidas e 0,1- 75 wt % AMPS. RTM. ; (meta) acrilamida e 0,1-99 wt. % HEMA; (meta) acrilamida e 0,1 a 75 wt % HEMA e 0,1 a 99% ácido(meta)acrílico; ácido (meta)acrílico e 0,1-99 wt % HEMA; 50 mols % vinil éter e 50 mols % anidrido maléico; (meta) acrilamida e 0,1 a 75 wt % cloreto de (meta)acriloxialqui dimetil benzilamônio; (meta)acrilamida e 0,1 a 99 wt % vinil pirrolidona; (meta) acrilamida e 50 wt % vinil pirrolidona e 0,1-99.9 wt % ácido (meta)acrílico; ácido (meta) acrílico e 0,1 a 75 wt % AMPS. RTM e 0,1-75 wt % alquil(meta)acrilamida. Nos exemplos acima, alquil significa Cl a C30, preferencialmente Cl a C22, linear e ramificado e C4 a C16 cíclico; onde (meta) é usado, significa que os monômeros com e sem o grupo metil estão incluídos. Outros polímeros de hidrogel muito úteis são versões infláveis, mas insolúveis de poli (vinil pirrolidona) amido, carboximetil celulose e polivinil álcool.

Outros materiais de hidrogel polimérico úteis dentro da invenção incluem (poli) hidroxialquil (meta) acrilato: hidrogéis aniônicos e catiônicos: complexos poli (eletrólito); poli (vinil álcoois) com baixo acetato residual: uma mistura inflável de ágar de ligação cruzada e carboximetil celulose de ligação cruzada: uma composição inflável compreendendo metil celulose misturada com um ágar de ligação cruzada reduzida; um copolímero inflável em água produzido por dispersão de copolímero finamente dividido de anidrido maléico com estireno, etileno, propileno, ou isobutileno; um polímero inflável em água de N-vinil lactanas; sais de sódio infláveis de carboximetil celulose, e similares.

Outros fluidos em gel, embebidos em fluido e polímeros de retenção úteis para formar o hidrogel hidrofílico para liberação em mucosa de agentes biologicamente ativos dentro da invenção incluem pectina; polissacarídios como ágar, acácia, caraia, tragacanto, alginas e guar e suas versões de ligação cruzada; polímeros do ácido acrílico, copolímeros e derivados de sais, poliacrilamidas; polímeros de anidrido maléico indeno infláveis em água; copolímeros de enxertos de amidos; polímeros do tipo acrilato e copolímeros com absorbabilidade em água de cerca de 2 a 4 00 vezes seu peso original; diésteres de poliglucano; uma mistura de poli (vinil álcool) e poli (N-vinil-2-pirrolidona) de ligação cruzada; géis de copolímeros de bloqueio de polioxibutileno-polietileno; goma carobe; géis de poliéster; géis de poli uréia; géis de poliéter; géis de poliamida; géis de poliimida; géis de polipeptídeos; géis de ácido poliamino; géis poli celulósicos; polímeros de anidrido acrilato indeno-maléico de ligação cruzada; e polissacarídios.

Polímeros hidrogéis sintéticos para uso dentro da invenção podem ser feitos por uma combinação infinita de vários monômeros em várias taxas. 0 hidrogel pode ser ligado de forma cruzada e normalmente possui a habilidade de embeber e absorver fluidos ou expandir para um estado de equilíbrio aumentado. O hidrogel tipicamente infla ou se expande até a liberação na superfície da mucosa nasal, absorvendo cerca de 2-5, 5-10, 10-50, até 50-100 ou mais vezes seu peso em água. O grau ótimo de inflação para um dado hidrogel será determinado por agentes biologicamente ativos dependendo de fatores como peso molecular, tamanho, solubilidade e características de difusão do agente ativo carregado ou aprisionado ou encapsulado dentro do polímero, e o espaço específico e movimento de cadeia cooperativa associado com cada polímero individual.

Polímeros hidrofílicos úteis dentro da invenção são insolúveis em água mais infláveis em água. Tais polímeros infláveis em água são tipicamente referidos como hidrogéis ou géis. Tais géis podem ser convenientemente produzidos de polímeros solúveis em água pelo processo de ligação cruzada dos polímeros por um agente de ligação cruzada adequado. Porém, hidrogéis estáveis também podem ser formados de polímeros específicos sob condições definidas de pH, temperatura e/ou concentração iônica, de acordo com os métodos conhecidos. Tipicamente, os polímeros possuem ligação cruzada, isto é, possuem ligação cruzada na extensão que os polímeros possuem boas propriedades hidrofílicas, possuem integridade física melhorada (como comparados com polímeros sem ligação cruzada do mesmo tipo ou semelhantes) e exibem habilidade melhor de retenção dentro da rede de gel do agente biologicamente ativo de interesse e compostos adicionais para co-administração, como citocinas ou inibidores de enzimas, enquanto retêm a habilidade de liberar os agentes ativos no local e tempo apropriados.

Geralmente, polímeros de hidrogéis para uso dentro da invenção são ligados de forma cruzada com uma ligação cruzada difuncional na quantidade de 0,01 a 25 de peso percentual, baseados no peso dos monômeros que formam o copolímero, e mais preferencialmente de 0,1 a 20 de peso percentual e ainda 0,1 a 15 de peso percentual do agente de ligação cruzada. Outra quantidade útil de agente de ligação cruzada é 0,1 a 10 de peso percentual. Agentes de ligação cruzada tri, tetra ou mais multifuncionais também podem ser empregados. Quando tais reagentes são utilizados, quantidades menores podem ser necessárias para atingir densidade de ligação cruzada equivalente, ex., o grau de ligação cruzada, ou propriedades de rede que são suficientes para conter efetivamente os agentes biologicamente ativos.

As ligações cruzadas podem ser covalentes, iônicas ou ligações de hidrogênio com o polímero possuindo a habilidade de inflar na presença de água contendo fluidos. Tais ligantes cruzados e reações de ligação cruzada são conhecidos pelos especialistas e em muitos casos dependem do sistema do polímero. Assim, uma rede de ligação cruzada pode ser formada por copolimerização de radicais livres de monômeros insaturados. Hidrogéis poliméricos também podem ser formados por polímeros pré-formados por ligação cruzada por reação com grupos funcionais encontrados nos polímeros, como álcoois, ácidos, aminas com tais grupos como glioxal, formaldeído ou glutaraldeído, bis anidridos e similares.

Os polímeros também podem possuir ligação cruzada com qualquer polieno; ex., decadieno ou trivinil ciclohexano; acrilamidas, como N,N-metileno-bis(acrilamida); acrilatos polifuncionais, como trimetilo propano triacrilato; ou monômero de vinilideno polifuncional contendo pelo menos 2 grupos CH2 terminais, incluindo, por exemplo, divinil benzeno, divinil naftaleno, alil acrilatos e similares. Em certas personificações, monômeros de ligação cruzada para uso na preparação dos copolímeros são polialquenil poliésteres possuindo mais de um grupo alquenil éter por molécula, que pode opcionalmente possuir grupos alquenil nos quais uma ligação dupla olefínica está presente anexada a um grupo metileno terminal (ex., feita pela eterificação de um álcool polihidrico contendo pelo menos 2 átomos de carbono e pelo menos 2 grupos hidroxil). Compostos dessa classe podem ser produzidos por reação com um alquenil halida, como cloreto de alil ou brometo de alil, com uma solução alcalina aquosa forte de um ou mais álcoois polihídricos. O produto pode ser uma mistura complexa de poliéteres com números variados de grupos éter. A eficiência do agente de ligação cruzada de poliéter aumenta com o número de grupos potencialmente polimerizáveis na molécula. Tipicamente, poliéteres contendo uma média de dois ou mais grupos alquenil éter por molécula são usados. Outros monômeros de ligação cruzada incluem, por exemplo, dialil ésteres, dimetaalil éteres, alil ou metaalil acrilatos e acrilamidas, tetravinil silano, polialquenil metanos, diacrilatos, e dimetaacrilatos, compostos divinil como divinil benzeno, polialil fosfato, compostos dialiloxi e fosfito ésteres e similares. Agentes típicos são o alil pentaeritritol, alil sucrose, trimetilolpropano triacrilato, 1,6-hexanodiol diacrilato, trimetilolpropano dialil éter, pentaeritritol triacrilato, tetrametileno dimetaacrilato, etileno diacrilato, etileno dimetaacrilato, trietileno glicol dimetaacrilato, e similares. Alil pentaeritritol, trimetilolpropano dialiléter e alil sucrose fornecem polímeros adequados. Quando agentes de ligação cruzada estão presentes, as misturas poliméricas normalmente contêm entre cerca de 0,01 a 20 de peso percentual, ex., 1%, 5% ou 10% ou mais por peso de monômero de ligação cruzada baseado no total de monômeros de ácidos carboxílicos, mais outros monômeros.

Em aspectos mais detalhados da invenção, a liberação em mucosa de exendinas aprimorada por retenção do agente ativo em liberação lenta ou carregador ou veículo enzimaticamente ou fisiologicamente protetor, por exemplo um hidrogel que protege o agente ativo da ação de enzimas degradantes. Em certas personificações, o agente ativo é ligado por meios químicos ao carregador ou veículo, ao qual também podem ser conectados ou ligados agentes adicionais como inibidores de enzimas, citoquinas, etc. O agente ativo pode alternadamente ser imobilizado através de armadilha física suficiente dentro do carregador ou veículo, ex. , uma matriz de polímero.

Polímeros como hidrogéis úteis dentro da invenção podem incorporar agentes de ligação funcional como glicosídeos quimicamente incorporados no polímero por aprimorarem a biodisponibilidade intranasal de agentes ativos formulados. Exemplos de tais glicosídeos são glucosídeos, fructosídeos, galactosídeos, arabinosídeos, manosídeos e seus derivados alquil substituídos e glicosídeos naturais como arbutina, florizina, amigdalina, digitonina, saponina e indicano. Há várias maneiras nas quais um glicosídeo típico pode ser ligado a um polímero. Por exemplo, o hidrogênio dos grupos hidroxil de um glicosídeo ou outros carboidratos semelhantes pode ser substituído pelo grupo alquil de um polímero de hidrogel para formar um éter. Da mesma forma, os grupos hidroxil dos glicosídeos podem reagir para esterificar os grupos carboxil de um hidrogel polimérico para formar ésteres poliméricos in situ. Outra abordagem é empregar condensação de acetobromoglucose com colest-5-en-3-beta-ol em um copolímero de ácido maléico. Poliacrilamidas N- substituídas podem ser sintetizadas pela reação de polímeros ativados com ômega-aminoalquilglicosídeos: (1) (carbohidrato- espaçador) (n)-poliacrilamida, "pseudopolissacarídeos"; (2) (carbohidrato-espaçador) (n) -fosfatidiletanolamina (m) - poliacrilamida, neoglicolipídios, derivados de fosfatidiletanolamina; (3) (carbohidrato-espaçador)(n)- biotina(m)-poliacrilamida. Esses derivados biotinilados podem ligar-se a lectinas da superfície mucosa para facilitar a absorção de agentes biologicamente ativos, ex. , uma exendina de polímero encapsulado.

Dentro de aspectos mais detalhados da invenção, uma ou mais exendinas, análogos e miméticos, e/ou outros agentes biologicamente ativos, aqui revelados, opcionalmente incluindo agentes ativos secundários como inibidores da protease, citoquinas, moduladores adicionais de fisiologia juncional intercelular, etc. são modificados e ligados a um carregador polimérico da matriz. Por exemplo, isso pode ser atingido por ligação química de um agente ativo peptídeo ou proteína e outros agentes opcionais dentro de uma rede de polímero de ligação cruzada. Também é possível quimicamente modificar o polímero separadamente com um agente interativo como uma molécula contendo glicosídeo. Em certos aspectos, os agentes biologicamente ativos, e agentes ativos secundários opcionais, podem ser funcionalizados, ex. , onde um grupo reativo apropriado é identificado ou quimicamente adicionado ao agente ativo. Mais comumente, um grupo polimerizável etilênico é adicionado, e o agente ativo funcionalizado é então copolimerizado com monômeros e um agente de ligação cruzada usando um método de polimerização padrão como polimerização de solução (normalmente em água), emulsão, suspensão ou polimerização por dispersão. Normalmente, o agente funcionalizante é fornecido com uma concentração suficientemente alta de grupos funcionais ou polimerizáveis para assegurar que vários locais nos agentes ativos são funcionalizados. Por exemplo, em um polipeptídeo compreendendo 16 locais de amina, geralmente deseja-se funcionalizar pelo menos 2, 4, 5, 7 e até 8 ou mais desses locais.

Após a funcionalização, o agente ativo funcionalizado é misturado com monômeros e um agente de ligação cruzada que compreende os reagentes dos quais o polímero de interesse é formado. A polimerização é então induzida nesse meio para criar um polímero contendo os agentes ativos de ligação. 0 polímero é então lavado com água ou outros solventes apropriados e purificado para remover traços de impurezas não-reagentes e, se necessário, quebrado por meios físicos como agitação, forçando-o através de uma rede, ultrassom ou qualquer outro meio adequado para um tamanho de partícula desejado. 0 solvente, normalmente água, é então removido de forma a não desnaturar ou degradar os agentes ativos. Um método desejado é a Iiofiliziação (secagem em freezer), mas outros métodos estão disponíveis e podem ser usados (ex., secagem a vácuo, secagem a ar, secagem por spray, etc.)

Para introduzir grupos polimerizáveis em peptídeos, proteínas e outros agentes ativos dentro da invenção, é possível reagir grupos amino, hidroxil, tiol e outros reativos disponíveis com eletrófilos contendo grupos insaturados. Por exemplo, monômeros insaturados contendo grupos N-hidroxi succinimidil, carbonatos ativos como p- nitrofenil carbonato, triclorofenil carbonatos, tresilato, oxicarbonilimidazoles.epóxido, isocianatos e aldeído, e azidas carboximetil insaturadas e ortopiridil-sulfetos insaturados pertencentes a esta categoria de reagentes. Exemplos ilustrativos de reagentes insaturados são alil glicidil éter, alil cloreto, alilbrometo, alil iodeto, acriloil cloreto, alil isocianato, alilsulfonil cloreto, anidrido maléico, copolímeros de anidrido maléico e alil éter, e similares.

Todos os derivados ativos de lisina, exceto aldeído, podem geralmente reagir com outros aminoácidos como grupos imidazol de histidina e grupos hidroxil de tirosina e os grupos tiol de cistina se o ambiente local aumentar a nucleofilicidade desses grupos. Reagentes de funcionalização contendo aldeidos são específicos para a lisina. Esses tipos de reações com grupos disponíveis de lisinas, cisteínas, tirosinas, foram extensivamente documentados na literatura e são conhecidos aos especialistas.

No caso de agentes biologicamente ativos que contêm grupos amina, é conveniente reagir tais grupos com um cloreto de aciloil, como cloreto de acriloil, e introduzir o grupo acrílico polimerizável no agente reagido. Então, durante a preparação do polímero, como durante a ligação cruzada do copolímero de acrilamida e ácido acrílico, o agente ativo funcionalizado, através de grupos acrílicos, é ligado ao polímero e se torna então ligado.

Em aspectos adicionais da invenção, agentes biologicamente ativos, incluindo peptídeos, proteínas, nucleosídeos, e outras moléculas que são bioativas in vivo, são estabilizadas por conjugação por ligação covalente de um ou mais agentes ativos a um polímero incorporando como parte integral de uma metade hidrofílica, ex., um polialquileno glicol linear, um metade lipofílica, (ver ex., Patente Americana No. 5,681,811). Em um aspecto, um agente biologicamente ativo é covalentemente acoplado a um polímero compreendendo (i) uma metade de polialquileno glicol linear, e (ii) uma metade lipofílica, onde o agente ativo, a metade de polialquileno glicol linear, e a metade lipofílica estão conformacionalmente arranjadas em relação uma com a outra de forma que o agente terapêutico ativo possui uma resistência in vivo aumentada à degradação enzimática (ex., relativa à sua estabilidade sob condições semelhantes em forma não- conjugada sem o polímero acoplado). Em outro aspecto, a formulação estabilizada por conjugação possui uma conformação tridimensional compreendendo o agente biologicamente ativo covalentemente acoplado com um complexo de polisorbato compreendendo (i) uma metade de polialquileno glicol linear, e (ii) uma metade lipofílica, onde o agente ativo, a metade de polialquileno glicol linear, e a metade lipofílica estão conformacionalmente arranjadas em relação uma com a outra de forma que (a) a metade lipofílica está exteriormente disponível em conformação tridimensional, e (b) o agente ativo na composição possui uma resistência in vivo à degradação enzimática.

Em outro aspecto relacionado, um complexo conjugado de multiligantes é fornecido e compreende um agente biologicamente ativo covalentemente acoplado com uma metade de triglicerídios através de um grupo espaçador de polialquileno glicol ligado a um átomo de carbono da metade de triglicerídios, e pelo menos uma metade de ácido graxo covalentemente anexada diretamente a um átomo de carbono da metade de triglicerídios ou covalentemente ligado através de uma metade de espaçador de polialquileno glicol (ver, ex. , Patente Americana No. 5,681,811). Em um complexo de agentes terapêuticos conjugados de multiligantes, os átomos de carbono alfa e beta da metade bioativa de triglicerídios pode possuir metades de ácidos graxos anexados por ligações covalentes diretamente . ou indiretamente ligadas covalentemente através de metades de espaçador de polialquileno glicol. Alternativamente, uma metade de ácido graxo pode estar covalentemente ligada diretamente ou através de uma metade de espaçador de polialquileno glicol aos carbonos alfa e alfa' da metade de triglicerídios, com o agente terapêutico bioativo sendo covalentemente acoplado com o gama-carbono da metade de triglicerídio, diretamente ligado a ele covalentemente ou indiretamente ligado a ele através de uma metade espaçadora de polialquileno. Deve ser reconhecido que uma ampla variedade de formas estruturais, composicionais e conformacionais são possíveis pelo complexo de agentes terapêuticos conjugados de multiligantes compreendendo a metade de triglicerídios, dentro do escopo da invenção. É ainda notado que em tal complexo de agentes terapêuticos conjugados de multiligantes, os agentes biologicamente ativos podem com vantagem ser acoplados com a metade modificada de triglicerídios através de grupos espaçadores de alquil, ou alternativamente outros grupos espaçadores, dentro do escopo da invenção. Como usado em tal contexto, a aceptabilidade do grupo espaçador refere-se a características de aceptabilidade específica da aplicação de uso estérico, composicional e final.

Em outros aspectos da invenção, um complexo estabilizado por conjugação é fornecido e compreende um complexo de polisorbato compreendendo uma metade de polisorbato incluindo um triglicerídio covalentemente acoplado a átomos de carbono alfa, alfa' e beta e seus grupos funcionais incluindo (i) um grupo de ácidos graxos; (ii) um grupo de polietileno glicol possuindo um agente biologicamente ativo ou metade covalentemente ligada, ex. , ligada a uma funcionalidade apropriada do grupo polietileno glicol. Tal ligação covalente pode ser direta, ex., a uma funcionalidade hidroxi terminal do grupo polietileno glicol, ou alternativamente, a ligação covalente pode ser indireta, ex. , reativamente tampando-se o término hidroxi do grupo polietileno glicol com um grupo espaçador de funcionalidade carboxi terminal, para que o grupo polietileno glicol tampado possua uma funcionalidade carbóxi terminal à qual o agente biologicamente ativo ou metade pode ser covalentemente ligada.

Em outros aspectos adicionais da invenção, um complexo estável, solúvel em água, estabilizado por conjugação é fornecido e compreende uma ou mais proteínas exendinas, análogas e miméticas, e/ou outros grupos biologicamente ativos aqui revelados covalentemente acoplados a uma metade glicolipídica modificada de polietileno glicol fisiologicamente compatível (PEG). Em tal complexo, os agentes biologicamente ativos podem estar covalentemente acoplados à metade glicolipídica modificada PEG fisiologicamente compatível por uma ligação covalente lábil em um grupo aminoácido livre do agente ativo, onde a ligação covalente lábil é dividível in vivo por hidrólise bioquímica e/ou proteólise. A metade glicolipídica modificada de polietileno glicol fisiologicamente compatível PEG pode, com vantagem, compreender um polímero de polisorbato, ex. , um polímero de polisorbato compreendendo grupos de éster de ácidos graxos selecionados do grupo consistindo de monopalmitato, dipalmitato, monolaurato, dilaurato, trilaurato, monoleato, dioleato, trioleato, monostearato, distearato, e tristearato. Em tal complexo, a metade glicolipídica modificada de polietileno glicol fisiologicamente compatível PEG pode adequadamente compreender um polímero selecionado do grupo consistindo de éteres de polietileno glicol de ácidos graxos, e ésteres de polietileno glicol de ácidos graxos, onde os ácidos graxos, por exemplo, compreendem um ácido graxo selecionado do grupo consistindo dos ácidos láurico, palmítico, oléico, e esteárico.

Armazenamento de Material

Em certos aspectos da invenção, as formulações combinatórias e/ou métodos de administração coordenada aqui incorporam uma quantidade eficiente de peptídeos e proteínas que podem aderir-se a vidro carregado, reduzindo, portanto, a concentração efetiva no recipiente. Recipientes silanizados, por exemplo, recipientes de vidro silanizado, são usados para armazenar o produto acabado pra reduzir a absorção de polipeptídeos ou proteínas para um recipiente de vidro.

Em outros aspectos adicionais da invenção, um kit para tratamento de um paciente mamífero compreende uma composição farmacêutica estável de um ou mais compostos de exendina formulados para liberação em mucosa de um paciente mamífero onde a composição é eficiente para aliviar um ou mais sintomas de obesidade, câncer, ou desnutrição ou relacionada a câncer em tais pacientes sem efeitos colaterais adversos inaceitáveis. 0 kit ainda compreende um frasco de reagente farmacêutico para conter um ou mais compostos de exendinas. 0 frasco de reagente farmacêutico é composto de um polímero de grau farmacêutico, vidro ou outro material adequado. 0 frasco de reagente farmacêutico é, por exemplo, um frasco de vidro silanizado. O kit ainda compreende uma abertura para liberação da composição na superfície da mucosa nasal do paciente. A abertura de liberação é composta de um polímero de grau farmacêutico, vidro ou outro material adequado. A abertura de liberação é, por exemplo, um vidro silanizado.

Uma técnica de silanização combina uma técnica de limpeza especial para superfícies a serem silanizadas com um processo de silanização em baixa pressão. 0 silano está em fase gasosa e em temperatura aumentada das superfícies a serem silanizadas. O método fornece superfícies reproduzíveis com camadas de silano estáveis, homogêneas e funcionais com características de uma monocamada. As superfícies silanizadas previnem ligação ao vidro de polipeptídeos ou agentes aprimoradores de liberação em mucosa da presente invenção.

O procedimento é útil para preparar frascos de reagente farmacêutico silanizado para conter composições de exendina da presente invenção. Bandejas de vidro são limpas por enxágüe com água duplamente destilada (ddH20) antes do uso. A bandeja de si lano é então enxaguada com 95% EtOH, e a bandeja de acetona é enxaguada com acetona. Frascos de reagente farmacêutico são limpos em acetona por 10 minutos.

Após a limpeza com acetona, os frascos de reagente são enxaguados na bandeja de ddH20 pelo menos duas vezes. Os frascos de reagente são limpos em 0,1M NaOH por 10 minutos. Enquanto os frascos de reagente são limpos em NaOH, a solução de silano é feita em capela. (Solução de silano: 800 mL de etanol 95%; 96 1 de ácido acético glacial; 25 mL de glicidoxipropiltrimetoxi silano) . Após a limpeza com NaOH, os frascos de reagente são enxaguados na bandeja de ddH20 pelo menos duas vezes. Os frascos de reagente são limpos em solução de silano por 3 a 5 minutos. Os frascos de reagente são enxaguados na bandeja de EtOH 100%. Os frascos de reagente são secos com gás N2 pré-purifiçado e armazenados em forno a IOO0C por pelo menos 2 horas antes do uso.

Veículos de Liberação Bioadesiva e Métodos

Em certos aspectos da invenção, as formulações combinatórias e/ou métodos de administração coordenada aqui incorporam uma quantidade eficiente de um bioadesivo não- tóxico como composto adjunto ou carregador para melhorar a liberação em mucosa de um ou mais agentes biologicamente ativos. Agentes bioadesivos neste contexto exibem adesão geral ou específica a um ou mais componentes ou superfícies da mucosa alvo. 0 bioadesivo mantém um gradiente de concentração desejado do agente biologicamente ativo dentro ou sobre a mucosa para assegurar a penetração de moléculas ainda maiores (ex., peptídeos e proteínas) dentro ou através do epitélio da mucosa. Tipicamente, o uso de um bioadesivo dentro dos métodos e composições da invenção gera um desdobramento de dois a cinco, normalmente de cinco a dez de aumento na permeabilidade de peptídeos e proteínas dentro ou através do epitélio da mucosa. Essa melhoria da permeação epitelial normalmente permite a liberação transmucosa eficiente de grandes macromoléculas, por exemplo à porção basal do epitélio nasal ou dentro dos compartimentos extracelulares adjacentes ou plasma sangüíneo ou tecido ou fluido SNC.

Essa liberação melhorada fornece eficácia mais aprimorada de liberação de peptídeos bioativos, proteínas e outras espécies terapêuticas macromoleculares. Esses resultados dependerão em parte da hidrofilicidade do composto, enquanto a penetração maior será atingida por espécies hidrofílicas comparadas com compostos insolúveis em água. Além desses efeitos, o emprego de bioadesivos para melhorar a persistência da droga na superfície mucosa pode desvendar um mecanismo reservatório para liberação prolongada da droga, enquanto compostos não só penetram pelo tecido da mucosa mas também se difundem de volta à superfície da mucosa uma vez que o material da superfície está reduzido.

Uma variedade de bioadesivos adequados está revelada para administração oral, Patente Americana Nos. 3,972,995; 4,259,314; 4,680,323; 4,740,365; 4,573,996; 4,292,299; 4,715,369; 4,876,092; 4,855,142; 4,250,163; 4,226,848; 4,948,580; Patente Americana Reissue No. 33,093, que encontram uso dentro dos novos métodos e composições da invenção. O potencial de vários polímeros bioadesivos como mucosa, ex. , nasal, plataforma de liberação dentro dos métodos e composições da invenção pode ser prontamente avaliado por determinação de sua habilidade em reter e liberar exendina, assim como. sua capacidade de interagir com as superfícies mucosas após incorporação do agente ativo. Além disso, métodos bem conhecidos serão aplicados para determinar a biocompatibilidade de polímeros selecionados com o tecido no local de administração na mucosa. Quando a mucosa-alvo é coberta por muco (ex., na ausência de tratamento mucolítico ou de limpeza de muco), pode servir como meio de ligação com o epitélio da mucosa inferior. Portanto, o termo "bioadesivo" como aqui usado também cobre compostos mucoadesivos úteis para melhorar a liberação mucosa de agentes biologicamente ativos dentro da invenção. Porém, o contato adesivo com o tecido da mucosa mediado através de adesão a uma camada de gel de muco pode ser limitado por ligação incompleta ou temporária entre a camada de muco e o tecido inferior, particularmente em superfícies nasais onde uma limpeza rápida de muco ocorre. Com relação a isso, as glicoproteínas de mucina são continuamente secretadas e, imediatamente após sua liberação das células ou glândulas, formam um gel viscoelástico. A superfície luminal da camada de gel aderente, porém, é continuamente erodida por ação mecânica, enzimática, e/ou ciliar. Onde tais atividades são mais proeminentes ou onde tempos maiores de adesão são desejados, os métodos de administração coordenada e métodos de formulação combinatória da invenção podem ainda incorporar métodos mucolíticos e/ou ciliostáticos ou agentes como aqui revelados acima.

Tipicamente, polímeros mucoadesivos para uso dentro da invenção são macromoléculas naturais ou sintéticas que se aderem à superfícies de tecido de mucosa úmida por mecanismos complexos, mas não-específ icos. Além desses mucopolímeros adesivos, a invenção ainda fornece métodos e composições incorporando bioadesivos que se aderem diretamente a uma superfície celular, ao invés de muco, por meios de interações específicas, incluindo mediadas por receptor. Um exemplo de bioadesivos que funcionam dessa forma específica é o grupo de compostos conhecidos como lectinas. Elas são glicoproteínas com uma habilidade de especificamente reconhecer e ligarem-se a moléculas de açúcar, ex., glicoproteínas ou glicolipídios, que formam parte de membranas de células epiteliais intranasais e podem ser consideradas como "receptores de lectina".

Em certos aspectos da invenção, materiais bioadesivos para melhora da liberação intranasal de agentes biologicamente ativos compreendem uma matriz de um polímero hidrofílico, ex,, solúvel em água ou inflável, ou uma mistura de polímeros que podem aderir-se a uma superfície de rauco úmido. Esses adesivos podem ser formulados como pomadas, filmes finos de hidrogéis (ver acima), e outras formas de aplicação. Normalmente, esses adesivos possuem o agente biologicamente ativo misturado para efetuar liberação lenta ou liberação local do agente ativo. Alguns são formulados com ingredientes adicionais para facilitar a penetração do agente ativo através da mucosa nasal, ex., dentro do sistema circulatório do indivíduo.

Vários polímeros, naturais e sintéticos, mostram significante ligação ao muco e/ou superfícies epiteliais mucosas sob condições fisiológicas. A força dessa interação pode prontamente ser medida por descascamento mecânico ou testes de corte. Quando aplicados a uma superfície mucosa úmida, muitos materiais secos espontaneamente serão aderidos, pelo menos de leve. Após tal contato inicial, alguns materiais hidrofílicos começam a atrair água por adsorção, inflação ou forças capilares, e se essa água for absorvida do substrato inferior ou da interface polímero-tecido, a adesão pode ser suficiente para atingir o objetivo de melhorar a absorção da mucosa de agentes biologicamente ativos. Tal "adesão por hidratação" pode ser bem forte, mas formulações adaptadas para usar esse mecanismo devem contar com a inflação, que continua enquanto a dosagem transforma-se em mucilagem hidratada. Isto é projetado para muitos hidrocolóides úteis dentro da invenção, especialmente alguns derivados de celulose, que são geralmente não-adesivos quando aplicados em estado pré-hidratado. Todavia, sistemas de liberação de drogas bioadesivas para administração em mucosa são eficazes dentro da invenção quando tais materiais são aplicados na forma de pó polimérico seco, micro-esferas ou forma de liberação em filme.

Outros polímeros aderem-se a superfícies mucosas não só quando aplicados a seco, mas também em estado totalmente hidratado, e na presença de quantidades de água em excesso. A seleção de um mucoadesivo assim requer devida consideração das condições, fisiológicas e físico-químicas, sob as quais o contato com o tecido será formado e mantido. Em particular, a quantidade de água ou umidade normalmente apresentada no local pretendido de adesão, e o pH de prevalência, são conhecidos por afetarem amplamente a força de ligação mucoadesiva de diferentes polímeros.

Vários sistemas de liberação de drogas bioadesivas poliméricas foram fabricados e estudados nos últimos 2 0 anos, nem sempre com sucesso. Uma variedade de tais carregadores são, porém, atualmente usados em aplicações clínicas envolvendo usos dentais, ortopédicos, oftalmológicos e cirúrgicos. Por exemplo, hidrogéis com base em acrílico foram usados extensamente para aparelhos bioadesivos. Hidrogéis com base em acrílico são bem adequados para bioadesão devido à sua flexibilidade e características não-abrasivas no estado parcialmente inflado, que reduz o atrito causado por dano aos tecidos em contato. Além disso, sua alta permeabilidade no estado inflado permite um monômero não reagido, cadeias de polímero de ligação cruzada, e o iniciador a serem lavados para fora da matriz após a polimerização, que é uma apresentação importante para seleção de materiais bioadesivos para uso dentro da invenção. Aparelhos de polímeros baseados em acrílico exibem uma força de ligação adesiva muito alta. Para liberação em mucosa controlada de drogas com peptídeos e proteínas, os métodos e composições da invenção opcionalmente incluem o uso de carregadores, ex. , veículos de liberação polimérica que funcionam em parte para defender o agente biologicamente ativo de quebra proteolítica, enquanto ao mesmo tempo fornecem penetração melhorada do peptídeo ou proteína dentro ou através da mucosa nasal. Neste contexto, polímeros bioadesivos demonstraram considerável potencial para melhorar a liberação de uma droga oral. Como exemplo, a biodisponibilidade da 9-desglicinamida, 8-arginina vasopressina (DGAVP) administrada intraduodenalmente a ratos juntamente com uma dispersão salina 1% (peso/volume) do derivado mucoadesivo poli(ácido acrílico) policarbofil, possui a dobra 3-5 vezes maior quando comparado com uma solução aquosa da droga peptídeo sem esse polímero.

Polímeros mucoadesivos do tipo poli(ácido acrílico) são potentes inibidores de algumas proteases intestinais. O mecanismo da inibição de enzimas é explicado pela forte afinidade desta classe de polímeros para cátions divalentes, como cálcio ou zinco, que são cofatores essenciais de metalo- proteinases, como tripsina e quimiotripsina. Desprovendo as proteases de seus cofatores por poli(ácido acrílico) relatou induzir mudanças estruturais irreversíveis das proteínas de enzima que foram acompanhadas por perda de atividade enzimática. Ao mesmo tempo, outros polímeros mucoadesivos (ex., alguns derivados de celulose e quitosana) podem não inibir enzimas proteolíticas sob certas condições. Em contraste a outros inibidores enzimáticos contemplados para uso dentro da invenção (ex., aprotinina, bestatina), que são moléculas relativamente pequenas, a absorção trans-nasal de polímeros inibitórios é provavelmente mínima à luz do tamanho dessas moléculas, e portanto elimina possíveis efeitos colaterais adversos. Assim, polímeros mucoadesivos, particularmente do tipo poli(ácido acrílico), podem servir tanto como adesivos promotores de absorção e agentes protetores de enzima para melhorar a liberação controlada de drogas com peptídeos e proteínas, especialmente quando preocupações com segurança são consideradas.

Além de proteger contra a degradação enzimática, bioadesivos e outros agentes promotores de absorção poliméricos ou não-poliméricos para uso dentro da invenção podem diretamente aumentar a permeabilidade da mucosa para agentes biologicamente ativos. Para facilitar o transporte de moléculas grandes e hidrofílicas, como peptídeos e proteínas, pela barreira do epitélio nasal, polímeros mucoadesivos e outros agentes foram postulados para gerar efeitos de permeação melhorados além do que é contado para um tempo de residência pré-mucosa prolongado do sistema de liberação. O período de tempo das concentrações plasmáticas da droga sugeriram que as microesferas bioadesivas causaram um aumento agudo, mas transitório, da permeabilidade de insulina pela mucosa nasal. Outros polímeros mucoadesivos para uso dentro da invenção, por exemplo a quitosana, relatadamente melhoraram a permeabilidade de certos epitélios da mucosa mesmo quando foram aplicados como solução aquosa ou gel. Outro polímero mucoadesivo que supostamente afeta diretamente a permeabilidade epitelial é o ácido hialurônico e seus derivados de éster. Um agente bioadesivo particularmente útil dentro da administração coordenada, e/ou métodos de formulação combinatória e composições da invenção é a quitosana, assim como seus análogos e derivados. A quitosana é um polímero não-tóxico, biocompatível e biodegradável que é amplamente usado para aplicações médicas e farmacêuticas por causa de suas propriedades favoráveis de baixa toxicidade e boa biocompatibilidade. É um poliaminosacarídeo natural preparado a partir de quitina por N-desacetilação com álcali. Como usado dentro dos métodos e composições da invenção, a quitosana é usada para aumentar a retenção de proteínas exendinas, análogas e miméticas, e outros agentes biologicamente ativos aqui revelados em um local de aplicação em mucosa. Este modo de administração também pode melhorar a aceitação e conformidade do paciente. Como ainda fornecido aqui, os métodos e composições da invenção opcionalmente incorporam um novo derivado de quitosana ou forma quimicamente modificada de quitosana. Um derivado novo para uso dentro da invenção é denotado como um polímero de β- [1—>4]-2-guanidino-2-desoxi-D-glucose (poli-GuD) . Quitosana é o produto N-desacetilado de quitina, um polímero que ocorre naturalmente que tem sido usado extensivamente para preparar microesferas para formulações orais e intra-nasais. O polímero de quitosana tem sido proposto também como um carregador solúvel para liberação de droga parenteral. Dentro de um aspecto da invenção, a o-metilisouréia é usada para converter uma amina de quitosana para sua metade de guanidina. O composto de guanidina é preparado, por exemplo, pela reação entre soluções equi-normais de quitosana e o- metilisouréia em pH acima de 8,0.

Compostos adicionais classificados como agentes bioadesivos para uso dentro da presente invenção agem por mediação de interações específicas, tipicamente classificadas como "interações de receptor-ligante" entre estruturas complementares do composto bioadesivo e um componente da superfície epitelial da mucosa. Muitos exemplos naturais ilustram esta forma de bioadesão por ligação específica, como exemplificado por interações lectina-açúcar. Lectinas são (glico) proteínas de origem não-imune que se ligam a polissacarídios ou glicoconjugados.

Várias lectinas de plantas foram investigadas como possíveis agentes farmacêuticos promotores de absorção. Uma planta de lectina, a hemaglutinina de Phaseolus vulgaris (PHA) , exibe alta biodisponibilidade oral de mais de 10% após alimentação em ratos. A lectina do tomate (Lycopersicon esculeutum) (TL) parece segura para vários modos de administração.

Em resumo, os agentes bioadesivos são úteis nas formulações combinatórias e métodos de administração coordenada da invenção, que opcionalmente incorpora uma quantidade eficiente e forma de agente bioadesivo para prolongar a persistência ou aumentar a absorção em mucosa de uma ou mais proteínas de exendina, análogas e miméticas, e outros agentes biologicamente ativos. Os agentes bioadesivos podem ser coordenadamente administrados como compostos adjuntos ou aditivos dentro das formulações combinatórias da invenção. Em certas personificações, os agentes bioadesivos agem como "cola farmacêutica", enquanto em outras personificações a liberação adjunta ou formulação combinatória do agente bioadesivo serve para intensificar o contato do agente biologicamente ativo com a mucosa nasal, em alguns casos por promoção de interações específicas ligante- receptor com "receptores" de célula epitelial, e em outros por aumento da permeabilidade epitelial para aumentar significantemente o gradiente de concentração medido em um local-alvo de liberação (ex., fígado, plasma sangüíneo, fluido ou tecido do SNC). Outros agentes bioadesivos para uso dentro da invenção agem como um inibidor de enzima (ex., protease) para melhorar a estabilidade de agentes terapêuticos administrados em mucosa liberados coordenadamente ou em formulação combinatória com o agente bioadesivo.

Lipossomas e Veículos de Liberação Micelar

Os métodos de administração coordenada e formulações combinatórias da invenção opcionalmente incorporam carregadores eficientes com base em lipídios ou ácidos graxos, agentes processadores, ou veículos de liberação, para fornecerem melhores formulações para liberação de exendina em mucosa. Por exemplo, uma variedade de formulações e métodos são fornecidos para liberação em mucosa, que compreendem um ou mais desses agentes ativos, como um peptídeo ou proteína, misturados ou encapsulados por, ou coordenadamente administrados com, um lipossoma, carregador micelar misto, ou emulsão, para melhorar a estabilidade química e física e aumentar a meia-vida dos agentes biologicamente ativos (ex., por redução da susceptibilidade a proteólise, modificação química e/ou desnaturação) na liberação em mucosa.

Dentro de certos aspectos da invenção, sistemas de liberação especializados para agentes biologicamente ativos compreendem pequenas vesículas lipídicas conhecidas como lipossomas. Elas são tipicamente feitas de moléculas lipídicas naturais, biodegradáveis, não-tóxicas, e não- imunogênicas, e podem eficientemente encapsular ou ligar moléculas da droga, incluindo peptídeos e proteínas, ou dentro, de suas membranas. A atração dos lipossomos como sistema de liberação de peptídeos e proteínas dentro da invenção é aumentada pelo fato de que as proteínas encapsuladas podem permanecer em seu meio aquoso de preferência dentro das vesículas, enquanto a membrana lipossômica protege-os contra proteólise e outros fatores de desestabilização. Mesmo nem todos os métodos de preparação lipossômica conhecidos sendo possíveis na encapsulação de peptídeos e proteínas devido a suas propriedades físicas e químicas únicas, vários métodos permitem a encapsulação dessas macromoléculas sem desativação substancial.

Uma variedade de métodos está disponível para preparação de lipossomos para uso dentro da invenção, Patente Americana Nos. 4,235,871; 4,501,728; e 4,837,028. Para uso com a liberação de lipossomos, o agente biologicamente ativo é tipicamente encapsulado dentro do lipossomo, ou vesicula lipidica, ou é ligado ao lado externo da vesicula.

Como os lipossomos, ácidos graxos insaturados de cadeia longa, que também possuem atividade aprimorada para absorção em mucosas, podem formar vesículas fechadas com estruturas de duas camadas (também chamadas de "ufassomos"). Estes podem ser formados, por exemplo, usando-se ácido oléico para aprisionar peptídeos e proteínas biologicamente ativos para a mucosa, ex., intranasal, liberação dentro da invenção.

Outros sistemas de liberação para uso dentro da invenção combinam o uso de polímeros e lipossomos para aliar as propriedades vantajosas de ambos os veículos como a encapsulação dentro da fibrina de polímero natural. Além disso, a liberação de compostos bioterapêuticos desse sistema de liberação é controlável através do uso de ligação cruzada covalente e a adição de agentes antifibrinogênicos no polímero de fibrina.

Sistemas de liberação mais simplificados para uso dentro da invenção incluem o uso de lipídios catiônicos como veículos de liberação ou carregadores, que podem ser efetivamente empregados para fornecer uma interação eletrostática entre o carregador lipídico e tais agentes biologicamente ativos carregados como proteínas e ácidos nucléicos polianiônicos. Isto permite a embalagem eficiente das drogas em uma forma adequada para administração em mucosa e/ou subseqüente liberação a compartimentos sistêmicos.

Veículos de liberação adicionais para uso dentro da invenção incluem ácidos graxos de cadeia média e longa, assim como micelas mistas de surfactantes com ácidos graxos. Lipídios que ocorrem mais naturalmente em forma de ésteres possuem importantes implicações com relação a seu próprio transporte pelas superfícies mucosas. Ácidos graxos livres e seus monoglicerídios, que possuem dois grupos polares anexos,

1 foram demonstrados na forma de micelas mistas para agirem na barreira intestinal como melhoradores da penetração. Esta descoberta da função modificadora da barreira de ácidos graxos livres (ácidos carboxílicos com um comprimento de cadeia variando de 12 a 2 0 átomos de carbono) e seus derivados polares estimulou uma extensa pesquisa na aplicação desses agentes como melhoradores de absorção de mucosa.

Para uso dentro dos métodos da invenção, ácidos graxos de cadeia longa, especialmente lipídios fusogênicos (ácidos graxos insaturados e monoglicerídios como ácido oléico, ácido linoléico, monooleína, etc.) fornecem carregadores úteis para melhorar a liberação de exendina em mucosa. Ácidos graxos de cadeia média (C6 a C12) e monoglicerídios também mostraram possuir atividade melhorada em absorção de droga intestinal e podem ser adaptados para uso dentro de formulações de liberação em mucosa e métodos da invenção. Além disso, sais de sódio de ácidos graxos de cadeia média e longa são veículos de liberação eficiente e agentes melhoradores de absorção para liberação em mucosa de agentes biologicamente ativos dentro da invenção. Assim, ácidos graxos podem ser empregados em formas solúveis de sais de sódio ou pela adição de surfactantes não-tóxicos, ex. , óleo de rícino hidrogenado polioxietilado, taurocolato de sódio, etc. Outros ácidos graxos e preparações micelares mistas que são úteis dentro da invenção incluem, mas não se limitam, caprilato de sódio (C8), caprato de sódio (CIO), laurato de sódio (C12) ou oleato de sódio (C18), opcionalmente combinados com sais biliares, como glicocolato e taurocolato.

Peguilação

Métodos adicionais e composições fornecidas dentro da invenção envolvem modificação química de peptídeos biologicamente ativos e proteínas por ligação covalente de materiais poliméricos, por exemplo dextranos, polivinil pirrolidonas, glicopeptídeos, polietileno glicol e poliaminoácidos. Os peptídeos e proteínas conjugados resultantes retêm suas atividades biológicas e solubilidade para administração em mucosa. Em personificações alternatives, proteínas de exendina, análogas e miméticas, e outros peptídeos e proteínas biologicamente ativos, são conjugados em polímeros de óxido de polialquileno, particularmente polietileno glicóis (PEG). Patente Americana No. 4,179,337.

Polímeros PEG amino-reativos para uso dentro da invenção incluem SC-PEG com massas moleculares de 2000, 5000, 10000, 12000 e 20000; U-PEG-10000; NHS-PEG-3400-biotina; T- PEG-5000; T-PEG-12000; e TPC-PEG-5000. A Peguilação de peptídeos e proteínas biologicamente ativos pode ser atingida por modificação de sítios carboxílicos (ex., ácido aspártico ou grupos de ácido glutâmico além do término carboxílico). A utilidade da PEG-hidrazida na modificação seletiva de grupos carboxílicos com proteína ativada por carbodiimida sob condições acídicas tem sido descrita. Alternativamente, a modificação PEG bifuncional de peptídeos e proteínas biologicamente ativos pode ser empregada. Em alguns procedimentos, resíduos de aminoácidos carregados, incluindo lisina, ácido aspártico, e ácido glutâmico, possuem uma tendência marcada de serem acessíveis em solvente ou superfícies de proteínas.

Outras Modificações Estabilizantes de Agentes Ativos

Além da Peguilação, agentes biologicamente ativos como peptídeos e proteínas para uso dentro da invenção podem ser modificados para melhorar a meia-vida circulante por defender o agente ativo via conjugação cora outros compostos conhecidos de proteção ou estabilização, por exemplo, pela criação de proteínas de fusão com um peptídeo ativo, l; proteína, análogo ou mimético ligado a uma ou mais proteínas carregadoras, como uma ou mais cadeias de imunoglobulina.

Formulação e Administração

Formulações de liberação em mucosa da presente invenção compreendem exendina tipicamente combinada junto com um ou mais carregadores farmaceuticamente aceitáveis, e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos. Os carregadores necessitam ser "farmaceuticamente aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não elicitando um efeito deletério inaceitável no paciente. Tais carregadores estão aqui descritos acima ou são bem conhecidos aos especialistas na arte da farmacologia. Desejavelmente, a formulação não deve incluir substâncias como enzimas ou agentes oxidantes com os quais o agente biologicamente ativo a ser administrado é conhecido como incompatível. As formulações podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na arte da farmácia.

Dentro das composições e métodos da invenção, a exendina pode ser administrada a pacientes por uma variedade de modos de administração em mucosa, incluindo por liberação oral, retal, vaginal, intranasal, intrapulmonar, ou transdérmica, ou por liberação tópica nos olhos, ouvidos, pele ou outras superfícies mucosas. Opcionalmente, a exendina pode ser administrada coordenadamente ou adjuntivãmente por vias não-mucosas, incluindo as vias intramuscular, subcutânea, intravenosa, intra-atrial, intra-articular, intraperitoneal, ou parenteral. Em outras personificações alternativas, os agentes biologicamente ativos podem ser administrados ex vivo por exposição direta a células, tecidos, ou órgãos originados de um paciente mamífero, por exemplo, como componentes de formulações de tratamentos de tecidos ou órgãos ex vivo que contenham o agente biologicamente ativo em um carregador adequado liquido ou sólido.

As composições de acordo com a presente invenção são normalmente administradas em solução aquosa como spray nasal ou pulmonar e podem ser dispensadas em forma de spray por uma variedade de métodos conhecidos dos especialistas. Sistemas de preferência para dispensação de líquidos como spray nasal são revelados em Patente Americana No. 4,511,069. As formulações podem estar presentes em recipientes multi- dose, por exemplo, no sistema de dispensação lacrado revelado em Patente Americana No. 4,511,069. Formas adicionais de liberação em aerossol incluem, ex. , nebulizadores de ar comprimido, jato, ultra-sônico, e piezoelétricos, que fornecem o agente biologicamente ativo dissolvido ou suspenso em um solvente farmacêutico, ex., água, etanol, ou suas misturas.

Soluções de spray nasal ou pulmonar da presente invenção tipicamente compreendem a droga ou a droga a ser fornecida, opcionalmente formulada com um agente de superfície ativa, como um surfactante não-iônico (ex., polisorbato 80), e um ou mais tampões. Em algumas personificações da presente invenção, a solução de spray nasal ainda compreende um propelente. O pH da solução de spray nasal está opcionalmente entre cerca de pH 2,0 e 8, preferencialmente 4,7 ±0,5. Tampões adequados para o uso dentro dessas composições são descritos acima ou também conhecidos. Outros componentes podem ser adicionados para melhorar ou manter a estabilidade química, incluindo conservantes, surfactantes, dispersantes, ou gases. Conservantes adequados incluem, mas não se limitam, fenol, metil parabeno, parabeno, m-cresol, tiomersal, clorobutanol, cloreto de benzilalcônimo, benzoato de sódio, e similares. Surfactantes adequados incluem, mas não se limitam, ácido oléico, trioleato de sorbitano, polisorbatos, lecitina, fosfotidil colinas, e vários diglicerídios e fosfolipidios de cadeia longa. Dispersantes adequados incluem, mas não se limitam, ácido etilenodiaminotetraacético, e os similares. Gases adequados incluem, mas não se limitam, nitrogênio, hélio, clorofluorocarbonos (CFCs), hidrofluorocarbonos (HFCs), dióxido de carbono, ar, e similares.

Dentro de personificações alternativas, formulações de mucosas são administradas como formulações de pós secos compreendendo o agente biologicamente ativo em uma forma seca, normalmente liofilizada, de um tamanho apropriado de partículas, ou dentro de uma variação de tamanho apropriado de partículas, para liberação intranasal. O tamanho mínimo de partícula apropriado para deposição dentro das passagens nasal ou pulmonar é normalmente cerca de 0,5 μ de diâmetro aerodinâmico equivalente de massa média (MMEAD), comumente cerca de 1 μ MMEAD, e mais tipicamente cerca de 2 μ MMEAD. O tamanho máximo de partícula apropriado para deposição dentro das passagens nasais é normalmente cerca de 10 μ MMEAD, comumente cerca de 8 μ MMEAD, e mais tipicamente cerca de 4 μ MMEAD, Pós intranasalmente respiráveis dentro dessas variações de tamanho podem ser produzidos por uma variedade de técnicas convencionais, como moagem a jato, secagem por spray, precipitação de solvente, condensação de fluidos supercríticos, e similares. Esses pós secos de MMEAD apropriado podem ser administrados a um paciente via inalador de pí seco convencional (DPI) , que se baseia na respiração do paciente, por inalação nasal ou pulmonar, para dispersar a energia em uma quantidade em aerossol. Alternativamente, o pó seco pode ser administrado via aparelhos auxiliados por ar que usam uma fonte de energia externa para dispersar o pó em uma quantidade de aerossol, ex., uma bomba em pistão.

Aparelhos de pó seco tipicamente exigem uma massa em pó na variação de cerca de 1 mg a 2 0 mg para produzir uma única dose em aerossol ("puff") . Se a dose exigida ou desejada do agente biologicamente ativo for menor do que essa quantidade, o agente ativo em pó tipicamente será combinado com um pó a granel seco farmacêutico para fornecer a massa em pó total exigida. Pós a granel de preferência incluem sucrose, lactose, dextrose, manitol, glicina, trehalose, albumina sérica humana (HSA), e amido. Outros pós a granel adequados incluem celobiose, dextranos, maltotriose, pectina, citrato de sódio, ascorbato de sódio, e similares.

Para formular composições para liberação em mucosa dentro da presente invenção, o agente biologicamente ativo pode ser combinado com vários aditivos farmaceuticamente aceitáveis, assim como uma base ou carregador para dispersão dos agentes ativos. Aditivos desejáveis incluem, mas não se limitam, agentes de controle do pH, como arginina, hidróxido de sódio, glicina, ácido hidroclórico, ácido cítrico, ácido acético, etc. Além disso, anestésicos locais (ex., álcool benzílico), agentes isotonizantes (ex., cloreto de sódio, manitol, sorbitol), inibidores de absorção (ex., Tween 80), agentes melhoradores da solubilidade (ex., ciclodextrinas e seus derivados), estabilizadores (ex., albumina sérica), e agentes redutores (ex., glutation) podem ser incluídos. Quando a composição para liberação em mucosa for um líquido, a tonicidade da formulação, como medida com referência ã tonicidade de 0,9% (peso/volume) de solução fisiológica salina tomada como unidade, é tipicamente ajustada a um valor ao qual nenhum dano substancial e irreversível aos tecidos será induzido na mucosa nasal no local de administração. Geralmente, a tonicidade da solução é ajustada a um valor de cerca de 1/3 a 3, mais tipicamente 1/2 a 2, e mais comumente 3/4 a 1,7. A osmolaridade alvo da presente invenção é cerca de 200 mOsm, que é 2/3 da salina 0,9%.

O agente biologicamente ativo pode ser disperso em uma base ou veiculo, que pode compreender um composto hidrofilico com uma capacidade de dispersar o agente ativo e quaisquer aditivos desejados. A base pode ser selecionada de uma ampla variedade de carregadores adequados, incluindo mas não limitada, copolímeros de ácidos policarboxilicos ou seus sais, anidridos carboxílicos (ex., anidrido maléico) com outros monômeros (ex., metil (meta) acrilato, ácido acrílico, etc.), polímeros de vinil hidrofilico como acetato de polivinil, álcool polivinil, polivinilpirrolidona, derivados de celulose como hidroximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, etc. e polímeros naturais como quitosana, colágeno, alginato de sódio, gelatina, ácido hialurônico, e seus sais de metais não-tóxicos. Normalmente, um polímero biodegradável é selecionado como base ou carregador, por exemplo, ácido poliláctico, copolímero de poli (ácido láctico-ácido glicõlico), ácido polihidroxibutírico, copolímero de poli (ácido hidroxibutírico-ácido glicólico) e suas misturas. Alternativamente ou adicionalmente, ésteres de ácidos graxos sintéticos como ésteres de ácidos graxos de poliglicerina, ésteres de ácidos graxos de sucrose, etc. podem ser usados como carregadores. Polímeros hidrofílicos e outros carregadores podem ser usados sozinhos ou em combinação, e a integridade estrutural melhorada pode ser transmitida ao carregador por cristalização parcial, ligação iônica, ligação cruzada, e similares. O carregador pode ser fornecido em uma variedade de formas, incluindo soluções fluidas ou viscosas, géis, pastas, pós, microesferas e filmes para aplicação direta na mucosa nasal. O uso de um carregador selecionado neste contexto pode resultar em promoção de absorção do agente biologicamente ativo. O agente biologicamente ativo pode ser combinado com a base ou carregador de acordo com uma variedade de métodos, e liberação do agente ativo pode ser por infusão, desintegração do carregador, ou formulação associada de canais de água. Em algumas circunstâncias, o agente ativo é disperso em microcápsulas (microesferas) ou nanocápsulas (nanoesferas) preparadas de um polímero adequado, ex., isobutil 2-cianoacrilato e disperso em um meio de dispersão biocompatível aplicado na mucosa nasal, que gera liberação sustentada e atividade biológica por um tempo prolongado.

Para melhorar ainda mais a liberação em mucosa de agentes farmacêuticos dentro da invenção, as formulações que compreendem o agente ativo também podem conter um composto hidrofílico de baixo peso molecular como base ou excipiente. Tais compostos hidrofílicos de baixo peso molecular fornecem um meio de passagem através do qual um agente ativo solúvel em água, como um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativo, pode difundir-se através da base ã superfície do corpo onde o agente ativo é absorvido. O composto hidrofílico de baixo peso molecular opcionalmente absorve umidade da mucosa ou da atmosfera de administração e dissolve o peptídeo ativo solúvel em água. O peso molecular do composto hidrofílico de baixo peso molecular é geralmente não mais do que 10000 e preferencialmente não mais do que 3000. Compostos hidrofílicos de baixo peso molecular exemplares incluem compostos polióis, como oligo, di e monossacarídios como sucrose, manitol, sorbitol, lactose, L-arabinose, D-eritrose, D-ribose, D-xilose, D-manose, trehalose, D-galactose, lactulose, celobiose, gentibiose, glicerina e polietileno glicol. Outros exemplos de compostos hidrofílicos de baixo peso molecular úteis como carregadores dentro da invenção incluem N-metilpirrolidona, e álcoois (ex., álcool oligovinil, etanol, etileno glicol, propileno glicol, etc.). Esses compostos hidrofílicos de baixo peso molecular podem ser usados sozinhos ou em combinação uns com os outros ou com outros componentes ativos ou inativos da formulação intranasal.

As composições da invenção podem alternativamente conter como carregadores farmaceuticamente aceitáveis substâncias como exigidas para aproximar condições fisiológicas, como ajuste do pH e agentes tampão, agentes de ajuste da tonicidade, agentes umidificantes e similares, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano, trietanolamina oleato, etc. Para composições sólidas, carregadores convencionais não-tóxicos farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados e incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sucrose, carbonato de magnésio, e similares.

Composições terapêuticas para administração do agente biologicamente ativo também podem ser formuladas como solução, microemulsão, ou outras estruturas ordenadas para alta concentração de ingredientes ativos. O carregador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares) e suas misturas adequadas. A fluidez apropriada para soluções pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como a lecitina, pela manutenção de um tamanho de partícula desejado no caso de formulações dispersíveis, e pelo uso de surfactantes. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada do agente biologicamente ativo pode ser trazida por inclusão na composição de um agente que atrase a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Em certas personificações da invenção, o agente biologicamente ativo é administrado em uma formulação de liberação de tempo, por exemplo, em uma composição que inclua um polímero de liberação lenta. 0 agente ativo pode ser preparado com carregadores que protegerão contra liberação rápida, por exemplo, um veículo de liberação controlada como um polímero, sistema de liberação microencapsulada ou gel bioadesivo. A liberação prolongada do agente ativo, em várias composições da invenção, pode ser trazida por inclusão na composição de agentes que retardam a absorção, por exemplo, hidrogéis de monoestearato de alumínio e gelatina. Quando formulações de liberação controlada do agente biologicamente ativo são desejadas, ligantes de liberação controlada adequados para uso de acordo com a invenção incluem qualquer material de liberação controlada biocompatível que é inerte ao agente ativo e que é capaz de incorporar o agente biologicamente ativo. Numerosos materiais desse tipo são conhecidos. Ligantes de liberação controlada úteis são materiais que são metabolizados lentamente sob condições fisiológicas após sua liberação intranasal (ex., na superfície da mucosa nasal ou a presença de fluidos corporais após liberação transmucosa). Ligantes apropriados incluem mas não se limitam polímeros biocompatíveis e copolímeros previamente usados em formulações de liberação sustentada. Tais compostos biocompatíveis são não-tóxicos e inertes a tecidos ao redor, e não desencadeiam efeitos colaterais adversos significantes como irritação nasal, resposta imune, inflamação, ou similares. Eles são metabolizados em produtos metabólicos que também são biocompatíveis e facilmente eliminados do corpo.

Materiais poliméricos exemplares para uso neste contexto incluem, mas não se limitam, matrizes poliméricas derivadas de copolímeros e poliésteres homopoliméricos contendo ligações éster hidrolizáveis. Um número delas são conhecidas como sendo biodegradáveis e levam a produtos de degradação contendo nenhuma toxicidade ou baixa toxicidade. Polímeros exemplares incluem ácidos poliglicólicos (PGA) e ácidos polilácticos (PLA), poli (ácido DL-láctico-co-ácido glicólico)(DL PLGA), poli(ácido D-láctico-ácido coglicólico)(D PLGA) e poli(ácido L-láctico-co-ácido glicólico)(L PLGA). Outros polímeros biodegradáveis ou bioerodáveis úteis incluem, mas não se limitam, polímeros como poli (epsilon-caprolactona), poli(epsilon-aprolactona-CO- ácido láctico), poli(ε-aprolactone-CO-ácido glicólico), poli(beta-hidroxi ácido butírico), poli(alquil-2- cianoacrilato), hidrogéis como poli(hidroxietil metaacrilato), poliamidas, poli(aminoácidos) (ex., L-leucina, ácido glutâmico, L-ácido aspártico e similares), poli (éster uréia), poli (2-hidroxietil DL-aspartamida), polímeros de poliacetal, poliortoésteres, policarbonato, polimaleamidas, polisacarídeos e seus copolímeros. Muitos métodos para preparação de tais formulações são geralmente conhecidos aos especialistas. Outras formulações úteis incluem composições de liberação controlada, ex., microcápsulas, Patente Americana No. 4,652,441 e 4,917,893, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico úteis na fabricação de microcápsulas e outras formulações, Patente Americana Nos. 4,677,191 e 4,728,721, e composições de liberação sustentada para peptídeos solúveis em água, Patente Americana No. 4,675,189.

0 processo de fabricação do produto de spray nasal geralmente inclui a preparação de um diluente para o spray nasal de exendina, que inclui -85% de água mais os componentes da formulação de spray nasal sem exendina. 0 pH do diluente é então medido e ajustado ao pH 4,7+0,3 com hidróxido de sódio ou ácido hidroclórico, se necessário. O volume total é ajustado ao volume alvo com água. 0 spray nasal de exendina é preparado pela transferência não- asséptica de -85% do volume-alvo final do diluente para um frasco com tampa de rosca. Uma quantidade apropriada de exendina é adicionada e misturada até completamente dissolvida. 0 pH do diluente é medido e ajustado ao pH 4,7+0,3 com hidróxido de sódio ou ácido hidroclórico, se necessário. Uma quantidade suficiente de diluente é adicionada para atingir o volume-alvo final. Garrafas com tampa de rosca são preenchidas e as tampas afixadas. A descrição acima do processo de fabricação representa um método usado para preparar os lotes clínicos iniciais do produto de droga. Este método pode ser modificado durante o processo de desenvolvimento para aprimorar o processo de fabricação.

A exendina atualmente comercializada requer condições estéreis de fabricação para estar de acordo com os regulamentos da FDA. A administração parenteral, incluindo exendina para injeção ou infusão, requer um processo de fabricação estéril (asséptico). As Boas Práticas de Fabricação (GMP) atuais para fabricação de drogas estéreis incluem padrões para as características de projeto e construção (21 C.F.R. § 211.42 (1 de abril, 2005)); padrões para teste e aprovação ou rejeição dos componentes, recipientes do produto de droga, e fechamentos (§ 211.84); padrões para controle de contaminação microbiológica (§ 211.113); e outros requisitos de teste em especial (§ 211.167). Produtos não-parenterais (não-assépticos), como o produto intranasal da invenção, não requerem essas condições de fabricação especializadas e estéreis. Como pode ser prontamente apreciado, os requisitos para um processo de fabricação estéril são substancialmente maiores e correspondentemente mais custosos do que os exigidos para um processo de fabricação não-estéril. Esses custos incluem custos de capitalização muito maiores para instalações, assim como um custo de fabricação mais alto: instalações extras para fabricação estéril incluem salas adicionais e ventilação; custos extras associados com fabricação estéril incluem grande mão-de-obra, extenso controle de qualidade e garantia de qualidade, e suporte administrativo. Como resultado, custos de fabricação de um produto de exendina intranasal, como o da invenção, são bem menos do que um produto de exendina administrado intraparenteralmente. A presente invenção satisfaz a necessidade de um processo de fabricação não-estéril para a exendina.

Soluções estéreis podem ser preparadas incorporando-se o composto ativo na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como exigido, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos dos enumerados acima. No caso de pós estéreis, métodos de preparação incluem secagem a vácuo e secagem com gelo seco que gera um pó do ingrediente ativo mais um ingrediente adicional desejado de uma solução previamente filtrada estéril. A prevenção da ação de microorganismos pode ser atingida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e similares.

A administração em mucosa de acordo com a invenção segue a auto-administração eficiente de tratamento pelos pacientes, dado que meios de proteção suficientes estão no local para controlar e monitorar a dosagem e efeitos colaterais. A administração em mucosa também supera outras desvantagens de outras formas de administração, como injeções, que são dolorosas e expõem o paciente a possíveis infecções e podem apresentar problemas de biodisponibilidade da droga. Para liberação nasal e pulmonar, sistemas de distribuição em aerossol controlado de líquidos terapêuticos como spray são conhecidos. Em uma personificação, doses medidas de agentes ativos são fornecidas por meio de uma válvula de bomba mecânica especialmente construída, Patente Americana No. 4,511,069.

Dosagem

Para propósitos profiláticos e de tratamento, os agentes biologicamente ativos aqui revelados podem ser administrados ao paciente em uma liberação de bolus único, via fornecimento contínuo (ex., transdérmico contínuo, mucosa ou intravenoso) por um período de tempo estendido, ou em um protocolo de administração repetida (ex., por protocolo de administração repetida por hora, por dia ou semana). Neste contexto, uma dose terapeuticamente eficiente da exendina pode incluir doses repetidas dentro de um regime de tratamento ou profilaxia prolongada que gerará resultados clinicamente significantes para aliviar um ou mais sintomas ou condições detectáveis associadas com uma doença-alvo ou condição como declarado acima. A determinação de dosagens eficientes neste contexto é tipicamente baseada em estudos com modelo animal seguido por estudos clínicos em humanos e é guiada por determinação de dosagens eficientes e protocolos de administração que significantemente reduzem a ocorrência ou severidade de sintomas de doenças-alvo ou condições no paciente. Modelos adequados com esta relação incluem, por exemplo, camundongos, ratos, suínos, felinos, primatas não- humanos, e outros modelos animais aceitáveis conhecidos. Alternativamente, dosagens eficientes podem ser determinadas usando modelos in vivo (ex., ensaios imunológicos e histopatológicos). Usando tais modelos, apenas cálculos e ajustes comuns são tipicamente necessários para determinar uma concentração apropriada e dose a ser administrada em uma quantidade terapeuticamente eficiente dos agentes biologicamente ativos (ex., quantidades que são eficientes intranasalmente, transdermicamente, intravenosamente, ou intramuscularmente para obter uma resposta desejada) .

Em uma personificação alternativa, a invenção fornece composições e métodos para a liberação intranasal de exendina, onde os compostos de exendina são repetidamente administrados através de um regime de dosagem intranasal eficiente que envolve administrações múltiplas de exendina ao paciente durante um esquema diário ou semanal para manter um nível elevado e pulsátil diminuído terapeuticamente eficiente de exendina durante um período de dosagem estendido. As composições e métodos fornecem compostos de exendina que são auto-administrados pelo paciente em formulação nasal entre uma e seis vezes ao dia para manter um nível elevado e pulsátil diminuído terapeuticamente eficiente de exendina durante 8 horas a 24 horas de um período de dosagem estendido.

Kits

A invenção também inclui kits, embalagens e unidades multi-recipientes contendo as composições farmacêuticas descritas acima, ingredientes ativos, e/ou meios para administrar as mesmas para uso na prevenção e tratamento de doenças e outras condições em pacientes mamíferos. Brevemente, esses kits incluem um recipiente ou formulação que contém uma ou mais proteínas de exendina, análogas ou miméticas, e/ou outros agentes biologicamente ativos em combinação com agentes aprimoradores de liberação em mucosa aqui revelados em preparação farmacêutica para liberação em mucosa.

As formulações intranasais da presente invenção podem ser administradas usando qualquer garrafa de spray ou seringa, ou por instilação. Um exemplo de garrafa de spray nasal é a "Bomba Nasal com Clipe de Segurança, Pfeiffer SAP #60548", que fornece uma dose de 0,1 mL por borrifada e possui um tubo de comprimento de 36,05 mm. Pode ser adquirido de Pfeiffer of America, de Princeton, NJ.

Administração Nasal de Exendina em Aerossol

Descobrimos que as exendinas podem ser administradas intranasalmente usando-se um spray nasal ou aerossol. Isto é surpreendente porque muitas proteínas e peptídeos mostraram ser cortados ou desnaturados devido a forças mecânicas geradas pelo ativador na produção do spray ou aerossol. Nesta área as seguintes definições são úteis.

Aerossol - Um produto que é embalado sob pressão e contém ingredientes terapeuticamente ativos que são liberados por ativação de um sistema de válvula apropriado.

Aerossol em metro - Uma forma de dosagem pressurizada compreendendo válvulas de dose metradas, que permitem a liberação de uma quantidade uniforme de spray a cada ativação.

Aerossol em pó - Um produto que é embalado sob pressão e contém ingredientes terapeuticamente ativos em forma de pó, que são liberados por ativação de um sistema de válvula apropriado.

Aerossol em spray - Um produto em aerossol que utiliza um gás comprimido como propelente para fornecer a força necessária para expelir o produto como spray úmido; é geralmente aplicável a soluções de agentes medicinais em solventes aquosos.

Spray - Um líquido minuciosamente dividido por um jato de ar ou vapor. Produtos de droga em spray nasal contêm ingredientes terapeuticamente ativos dissolvidos ou suspensos em soluções ou misturas de excipientes em dispensadores não- pressurizados.

Spray em metro - Uma forma de dosagem não- pressurizada consistindo em válvulas que permitem a dispensação de uma quantidade específica de spray a cada ativação.

Spray em suspensão - Uma preparação líquida contendo partículas sólidas dispersas em um veículo líquido e em forma de gotas de curso ou sólidos finamente divididos.

A caracterização fluido dinâmica do spray aerossol emitido por bombas de spray nasal metradas como aparelho de liberação de drogas ("DDD"). A caracterização em spray é parte integral das submissões regulatórias necessárias para a aprovação da Food and Drug Administration ("FDA") em pesquisa e desenvolvimento, garantia de qualidade e procedimentos de teste de estabilidade para novas e existentes bombas de spray nasal.

A caracterização completa da geometria do spray mostrou ser o melhor indicador do desempenho total de bombas de spray nasal. Em particular, medidas do ângulo de divergência do spray (geometria de pluma) como sai do aparelho; a elipticidade cruzada do spray, uniformidade e distribuição de partículas/gotas (padrão de spray); e evolução de tempo do spray em desenvolvimento mostraram ser as quantidades de desempenho mais representativas na caracterização de uma bomba de spray nasal. Durante a garantia de qualidade e testes de estabilidade, medições da geometria de pluma e padrão do spray são identificadores- chave para verificar a consistência e conformidade com os critérios de dados aprovados para as bombas de spray nasal.

Definições:

Altura de Pluma - a medição da ponta do ativador ao ponto no qual o ângulo da pluma torna-se não-linear por causa da quebra do fluxo linear. Baseado em exame visual de imagens digitais, e para estabelecer um ponto de medição para largura que é consistente com o ponto de medição mais distante do padrão de spray, uma altura de 3 0 mm é definida para este estudo.

Eixo Maior - a maior corda que pode ser desenhada dentro do padrão de spray adequado que cruza o COMw em unidades de base (mm)

Eixo Menor - a menor corda que pode ser desenhada dentro do padrão de spray adequado que cruza o COMw em unidades de base (mm)

Raio de Elipticidade - a taxa do eixo maior para o eixo menor, preferencialmente entre 1,0 e 1,5, e mais preferencialmente entre 1,0 e 1,3.

DlO - o diâmetro de gotas para as quais 10% do total do volume líquido da amostra consiste em gotas de um diâmetro menor (μπι)

D50 - o diâmetro de gotas para as quais 50% do total do volume líquido da amostra consiste em gotas de um diâmetro menor (μτη) , também conhecido como diâmetro de massa mediana

D90 - o diâmetro de gotas para as quais 90% do total do volume líquido da amostra consiste em gotas de um diâmetro menor (μπι)

Amplitude - medição da largura da distribuição, quanto menor o valor, mais estreita a distribuição. A amplitude é calculada como:

(D90-D10) D50

% RSD - desvio padrão relativo em porcentagem, o desvio padrão dividido pela média de séries e multiplicado por 100, também conhecido como %CV.

Volume - o volume de líquido ou pó descarregado do aparelho de liberação com cada ativação, preferencialmente entre 0,01 mL e cerca de 2,5 mL e mais preferencialmente entre 0,02 mL e 0,25 mL.

B

Os seguintes exemplos são fornecidos por meios de ilustrações, não limitações.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Formulações de Exendina (Exenatida) Transmucosa Otimização In Vitro de Formulações de Exendina (Exenatida) Transmucosa Formulações de peptídeos de exendina transmucosa foram gerados por combinação de exenatida e excipientes (incluindo aprimoradores de permeação, solubilizadores, ativadores de superfície, quelantes, estabilizadores, tampões, tonificantes, e conservantes).

Múltiplas rodadas de triagem de formulação foram realizadas e divididas em duas séries, AeB. A Série A enfocou a mudança das concentrações de excipientes de solubilizantes (Με-β-CD), surfactantes (DDPC), quelantes (EDTA), e estabilizadores (gelatina). Tampões como tampão citrato, tampão tartarato, glutamato (MSG) também foram testados. A Série B classificou excipientes alternativos para seu potencial em melhorar a permeação de exenatida. Várias concentrações de aprimoradores de permeação potencial incluindo ciclodextrinas, glicosídeos, ácidos graxos, fosfatidilcolinas, compostos GRAS, PN159, gelatina, e outros, foram testadas. Além de classificar os aprimoradores de permeação potencial, variando concentrações de tampão (Tampão Citrato, Tampão Tartarato) e de tonificantes/estabilizadores, os excipientes (manitol, NaCl) também foram mudados. Conservantes como o benzoato de sódio (NaBz) e cloreto de benzalcônio (BAK) foram testados. A Tabela 1 lista os excipientes testados na triagem in vitro. De 372 formulações únicas testadas, onze formulações foram recomendadas para uso em estudos PK pré-clínicos in vivo em coelhos, ver Tabela 2. Tabela 1

Excipientes Testados In Vivo na Otimização da Formulação de Exenatida

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Tabela 2

Formulações de Exenatida para Estudos de Permeação in vitro

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EXEMPLO 2

Formulações de Exenatida Induzem a Abertura de Junções Estreitas In Vitro

Medições de Resistência Elétrica Transepitelial (TER) Usando um Modelo Epitelial Nasal In Vitro

Uma linha celular de Mat Tek. Corp. (Ashaland, MA) foi usada como fonte de células epiteliais normais, traqueais/bronquiais derivadas de humanos (Modelo de Tecido EpiAirway™). As células são altamente diferenciadas e retêm todas as propriedades de tecido epitelial respiratório. As células foram fornecidas como inserções crescidas em confluência em filtros Millipore Milicell-CM compreendidos de Teflon (PTFE) hidrofílico transparente. Após o recebimento, as membranas foram cultivadas em meio basal de 1 mL (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco livre de hidrocortisona e fenol vermelho) (DMEM) a 37°C com 5% C02 por 24-48 horas antes do uso. As medidas TER foram obtidas usando-se a Câmara de Medição de Resistência de Tecidos Endohm-12 conectada ao Voltômetro Epitelial EVOM (Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota, FL) com os eletrodos principais. Os eletrodos e um branco de cultura de tecido foram equilibrados por pelo menos vinte (20) minutos em solução tampão fosfato sem energia antes de checar a calibração. A resistência de fundo foi medida com 1,5 mL de meio em câmara de tecido de Endohm e 300 μL de meio em uma inserção de branco de Millicell-CM. O eletrodo superior foi ajustado para que fosse submerso no meio mas não entrar em contato com a superfície do topo da membrana de inserção. A resistência de fundo do branco inserido foi 5-12 ohms.

TER foi medida antes e após a incubação de sessenta (60) minutos. Para cada determinação TER inicial, o meio de 300 μΐ foi adicionado aos lados apical e basolateral das inserções após um período de vinte (20) minutos de incubação a temperatura ambiente antes da colocação na câmara de Endohm para medir o TER. Na superfície apical das inserções, 100 μΐ de formulação de teste foi aplicada, e as amostras colocadas em um agitador (-100 rpm) por sessenta (60) minutos a 37°C. Após a incubação de 60 minutos com as amostras de teste, 2 00 μI de meio fresco foi gentilmente adicionado à superfície apical de cada inserção de amostra de teste e a TER final foi

medida para cada inserção. O meio aplicado ao lado apical serviu como controle negativo, e o triton X aplicado ao lado apical foi o controle positivo para as medições TER. A resistência é expressa como a seguir: (resistência medida - branco) χ 0,6 cm2.

Para todas as formulações de exenatida contendo aprimoradores, a TER foi reduzida em aproximadamente 350-700 ohms χ cm2 para aproximadamente 5-20 ohms χ cm2 após o período de incubação de sessenta (60) minutos. Todas as formulações de exenatida, com exceção dos controles, continham EDTA. Como quelante de cálcio, o EDTA é conhecido por abrir junções estreitas por recolhimento de cálcio. Em um ambiente estático como o sistema de cultura de tecido in vitro aqui usado, a remoção do cálcio da solução leva a uma abertura significante da junção estreita. Nenhuma redução na

TER foi observada na exenatida mais controle de glutamato (MSG) contendo apenas exenatida em tampão glutamato com cloreto de sódio como tonificante. A exenatida mais controle de glutamato indica que a abertura das junções estreitas não são características inerentes da própria exenatida. A TER de inserções após sessenta (60) minutos de exposição ao controle de glutamato é similar à das inserções expostas ao meio por sessenta (60) minutos. 0 controle triton X foi a TER mais baixa possível, que resultou da morte da barreira celular. EXEMPLO 3

Formulações de Exenatida não Aumentam a Citotoxicidade Significantemente

Ensaio de Lactato Desidrogenase (LDH)

Para verificar a redução de TER pelas formulações de exenatida resultantes da modulação de junções estreitas pelos aprimoradores da permeação e não pela morte celular, ensaios de LDH e MTT foram realizados usando a mesma linha celular, MatTek Corp., como usada nos ensaios TER. A quantidade de morte celular foi estudada medindo-se a perda de lactato desidrogenase (LDH) das células usando um Kit de Estudo CytoTox 96 de Citotoxicidade (Promega Corp., Madison, WI). Um meio de cultura fresco e sem células foi usado como branco. 50 μL de meio colhido (armazenado a 4 °C) foi carregado em uma placa de 96 poços. A Solução de Substrato (50 μL) foi adicionada a cada poço e as placas foram incubadas por trinta (30) minutos em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, 50 μL de Solução de Parada foi adicionado a cada poço e a reação foi monitorada a A4 90 usando um leitor em placa de densidade óptica. 0 meio sozinho aplicado ao lado apical serviu como controle negativo enquanto o triton X serviu como controle positivo para o ensaio LDH.

As formulações de exenatida não mostraram um aumento significante na citotoxicidade medida por % de LDH. As formulações de exenatida tiveram menos de 5% de perda de LDH. Similarmente, o controle do meio não mostrou citotoxicidade. Em contraste, o grupo tratado com controle negativo Triton X mostrou toxicidade significante, como esperado.

Ensaio MTT

A viabilidade celular foi avaliada usando-se o ensaio MTT (MTT-100, kit MatTek). Concentrado MTT congelado e diluído foi pipetado (300 pL) em uma placa com 24 poços. Inserções de tecido foram gentilmente secas, colocadas nos poços da placa, e incubadas a 3 7 0C por três (3) horas no escuro. Após a incubação, cada inserção foi removida da placa, gentilmente coagulada, e colocada em uma placa de extração de 24 poços. As inserções de cultura celular foram então imersas em 2,0 mL da solução extratante por poço (para cobrir a amostra completamente)> A placa de extração foi coberta e selada para reduzir a evaporação do extratante.

Após uma incubação noturna a temperatura ambiente no escuro, o líquido dentro de cada inserção foi decantado de volta para dentro do poço do qual foi tirado, e as inserções descartadas. A solução extraída (200 pL) foi pipetada em uma placa de microtitulação de 96 poços, juntamente com os extratos brancos. A densidade óptica das amostras foi medida em A550 em um leitor de placa de densidade óptica (Molecular Devices, Palo Alto, CA) . O meio sozinho aplicado ao lado apical serviu como controle positivo enquanto o Triton X serviu como controle negativo para o ensaio MTT.

As formulações de exenatida não mostraram um aumento significante na citotoxicidade medida por % de MTT. As formulações de exenatida mostraram viabilidade maior do que 80% MTT. Similarmente, o controle do meio não mostrou citotoxicidade. Em contraste, o grupo tratado com controle negativo Triton X mostrou toxicidade significante, como esperado.

EXEMPLO 4

Permeabilidade Aumentada de Exenatida Através de uma Barreira Celular Usando Aprimoradores da Permeação

Série A: Permeação de Exenatida

A quantidade de Exendina-4 que permeou pela barreira celular in vitro foi determinada por análise EIA. Estudos iniciais enfocaram a otimização das concentrações de Me- β-CD, DDPC, EDTA, e gelatina para melhorar a permeação de exenatida por uma camada de tecido epitelial. A formulação inicial de exenatida, AKL_225-126-2, continha Me-β-CD (4 0 mg/ml), DDPC (1 mg/ml), e EDTA (2,5 mg/ml). Os dados de permeação AKL-225-126-2 mostraram um aumento significante na permeação de exenatida sobre o controle negativo sem aprimoradores (sem Me-β-CD, DDPC, e EDTA) . As variações de concentração dos aprimoradores foram testadas em até duas vezes a concentração usada em AKL-225-126-2, resultando em nenhum aumento significante acima da permeação AKL-225-126-2 com qualquer um dos aprimoradores.

Em seguida, um aprimorador de viscosidade, gelatina, foi adicionado à formulação com concentrações aumentadas de Me-β-CD, DDPC, e EDTA. Adicionalmente, o volume exigido para fornecer a dose foi diminuído. Por exemplo, para fornecer 3OOpg de exenatida em metade do volume (50 μΐ ao invés de 100 μΐ) , a concentração de exenatida foi aumentada para 6 mg/mL. Esta abordagem foi investigada em parte devido às concentrações do aprimorador serem dobradas com relação a suas concentrações em AKL-225-236-2. A adição de gelatina aumentou a permeação quando combinada com concentrações elevadas de Me-β-CD, DDPC, e EDTA. Por exemplo, as formulações JW-239-126-14 eJW-239-126-13 contêm 3 mg/mL de exenatida com 8 0 mg/mL de Me-β-CD, 2 mg/mL de DDPC, 5 mg/mL de EDTA, 30 mM de tampão tartarato, pH 4,5, e NaCl como tonificante com 2,5 mg/mL ou 5 mg/mL de gelatina, respectivamente, e resultou em uma dobra de 2,4 e aumento na dobra de 1,7 em permeação sobre o AKL-225-126-2. A viscosidade das formulações com gelatina foi cerca de 3,7 a cerca de 5,0 cps.

Quando o volume da dose foi cortado pela metade, a permeação in vitro também aumentou. Sem aumentar a concentração dos aprimoradores de permeação enquanto fornecem a dose de exenatida, a permeação aumentou 1,7 em desdobramento em relações ao AKL 225-126-2. Quando as concentrações de aprimoradores de permeação foram dobradas, o aumento na permeação também dobrou para um aumento de 3,6 no desdobramento sobre o AKL225-126-2. Estudos de permeação in vitro mostram um aumento na permeação de exenatida quando uma dose equivalente foi aplicada ao lado apical de uma barreira de tecido epitelial em metade do volume. Adicionalmente, in vitro, a gelatina mostrou aumentar a permeação da exenatida quando adicionada em formulações que continuam duas vezes as concentrações do aprimorador.

Série B: Permeação de Exenatida

Uma segunda rodada de estudos, a série B, sistematicamente classificou vário excipientes para seus potenciais para melhorar a permeação de exenatida em um grau maior do que as combinações de Me-β-CD, DDPC, EDTA, e gelatina. A Tabela 1 (Exemplo 1) lista os excipientes classificados na série B em rodadas in vitro, agrupando-os por classe de molécula. Inicialmente, cada excipiente (exceto os classificados como "geralmente considerados seguros" (GRAS) pela FDA, gelatinas recombinantes, e PN159) , foi testado em duas concentrações ou em combinação com Me-β-CD, DDPC, ou EDTA. Assim como com as formulações da série A, cada formulação foi avaliada para permeação de exenatida, habilidade em reduzir TER enquanto não afeta adversamente a viabilidade celular, e formulação da estabilidade física.

Seis fosfolipídios foram testados como aprimoradores de permeação para exenatida, como alternativas em potencial para o DDPC. Eles foram todos testados a concentrações de 0,177 e 1,77 mM, os equivalentes molares de 0,1 mg/mL e 1 mg/mL DDPC. Enquanto a maior parte deles não efetivou viabilidade celular, como medido por LDH e MTT, nenhum deles resultou em permeação de exenatida comparável com, ou melhor do que a observada na formulação AKL-225-126-2 a não ser que os fosfolipídios foram combinados com Me-β-CD e EDTA. Adicionalmente, o dinanonil glicero fosfatidilcolina e ambos os fosfatidilgliceróis apresentaram problemas de estabilidade física, tornando-se turvos em menos de duas semanas em condições refrigeradas. A permeação de exenatida não foi dramaticamente melhorada pela substituição de um desses fosfolipídios para DDPC.

Onze glicosídeos selecionados da literature foram testados para sua habilidade em melhorar a permeação de exenatida. Cinco foram maltopiranosídeos com cadeias laterais de 8, 10, 12, 14, ou 16 carbonos. Três outros continham cadeias laterais de 8-mer carbono com açúcares galacto ou glucopiranosídeo. Finalmente, este grupo de excipientes continham uma cadeia lateral de 7-mer em um glucopiranosídeo assim como decanoil e dodecanoil-sucrose. Além de serem classificados sozinhos por sua habilidaed em melhorar a permeação de exenatida, os glicosídeos também foram testados como uma alternativa ao DPPC, sendo testados em combinação com Me-β-CD e DDPC. As concentrações de glicosídeos variaram de 1-10 mg/mL.

Os glicosídeos com cadeias laterais de 12, 14, ou 16 carbonos foram tóxicos a 10 mg/mL. Adicionalmente, os maltosídeos com 14 e 16-mer cadeias laterais também foram fisicamente instáveis em solução aquosa, a não ser que Me-β- CD estivesse presente. 0 galactopiranosídeo e dodecanoilsucrose também foram tóxicos a 10 mg/mL. Três glicosídeos foram ainda explorados por sua habilidaed em melhorar a permeação de exenatida. Octil-a-glucopiranosídeo, n-octil-β-D-maltopiranosídeo, e dodecanoilsucrose foram testados em concentrações adicionais e com maior variação de aprimoradores adicionais. Porém, a permeação observada das formulações que não foram tóxicas e mantiveram a estabilidade física a 5°C por duas semanas não foram mais do que 1,5 de desdobramento melhores do que a permeação de exenatida observada em AKL-225-126-2.

Três alternatives para randomizar o metilado β- ciclodextrina (Me^-CD) foram testadas in vitro: β- ciclodextrina (β-CD), dimetil-β-ciclodextrina (DMe-β-CD), e hidroxipropil-β-ciclodextrina (ΗΡ-β-CD). Formulações contendo β-ciclodextrina tornaram-se turvas em condições refrigeradas. Enquanto o DMe^-CD melhorou a permeação de 1,5 de desdobramento em relação a AKL-225-126-2, foi mais tóxico para as células do que o Me-β-CD. O ΗΡ-β-CD não aumentou a permeação significantemente.

Dois ácidos graxos insaturados, caprato de sódio e caprilato de sódio foram classificados como melhoradores de permeação a 5-50 mM e 20-100 mM, respectivamente. Ambos demonstraram instabilidade física na ausência de Me-β-CD. O caprato de sódio produziu baixa viabilidade celular a 50 mM sozinho e resultou em permeação de exenatida comparável com AKL-225-126-2 apenas na presença de Me-β-CD e EDTA. O caprilato de sódio foi tóxico a 20 mM com Me-β-CD e EDTA e falhou em aprimorar a permeação de exenatida em nenhuma extensão sozinho ou com aprimoradores de permeação.

Três moléculas pequenas também foram testadas in vitro com exenatida: palmitoil-DL-carnitina, sódio glicocolato, e S-nitroso-N-acetil-penicilamina (SNAP). O Palmitoil-DL-carnitina foi fisicamente instável sem o Me-β-CD e foi tóxico em altas concentrações. 0 glicocolato de sódio também foi fisicamente instável em altas concentrações. Nenhuma das três moléculas pequenas aumentou a permeação de exenatida significantemente. Apenas na presença de Me-β-CD e EDTA a permeação de exenatida foi comparável com a da AKL- 225-126-2 .

0 Cremefor EL foi testado como uma alternativa ao Me-β-CD. Os resultados para formulações contendo cremefor EL foram semelhantes aos para a formulaçao AKL-225-126-2, que contém Me-β-CD: as formulações mantiveram clareza por duas semanas a 5 °C, não eram tóxicas, e apenas aumentaram a permeação de exenatida com DDPC e EDTA. Porém, a permeação com exenatida foi levemente maior para o cremefor contendo formulações do que para o AKL-225-126-2 .

Uma molécula de modulação de junção estreita, PN15 9, também foi testada com a exenatida para determinar sua habilidade para aumentar a permeação de exenatida pela mucosa nasal. Três concentrações de PN159 foram adicionadas à exenatida em tampão tartarato, pH 4,5: 25 μΜ, 50 μΜ, e 100 μΜ. PNl59 foi testado sozinho e com 5 mg/mL de EDTA. PN159 foi capaz de reduzir TER sem a adição de outros excipientes aprimoradores. A permeação de exenatida pela barreira tecidual aumentou com a adição de PN15 9 em maneira dependente de concentração. A adição de EDTA a PN159 não significantemente aumentou a permeação de exenatida. As formulações de PN159 não foram tóxicas como medidas para o LDH e MTT. Todas as formulações permaneceram claras em temperaturas refrigeradas por pelo menos duas semanas. Embora a permeação fosse aumentada pela adição de PN159, não foi equivalente à permeação de exenatida observada com Akl-225- 126-2 .

Devido à gelatina usada nos experimentos de permeação in vitro descritos acima ser um produto animal, gelatinas recombinantes de humanos também foram exploradas como uma alternativa. Duas gelatinas recombinantes, de alto e baixo peso molecular, foram testadas a 2,5 mg/mL com 80 mg/mL de Me-β-CD, 2 mg/mL de DDPC, e 5 mg/mL de EDTA. Embora realizaram similaridades com a gelatina, pareceram ser levemente mais tóxicas e demonstraram uma grande variabilidade na permeação de exenatida. Em um experimento em separado, outros aprimoradores da viscosidade foram testados, incluindo gelatina, gelatinas recombinantes, ou metilcelulose.

Finalmente, uma série de formulações qμe continham excipientes da lista FDA "Geralmente Consideradas Seguras" (GRAS) foram classificadas por sua habilidade em melhorar a permeação de exenatida. Esses excipientes incluíram etanol, Tween-80, lecitina, EDTA, ácido oléico, e propileno glicol.

As formulações contendo Tween-80, ácido oléico, lecitina e propileno glicol falharam em melhorar a permeação de exenatida na mesma extensão da formulação AKL-225-126-2. Apenas aquelas contendo Tween-8 0 e ácido oléico juntos atingiram o mesmo nível de permeação de exenatida; porém, a exposição da barreira tecidual a 3 mg/mL de ácido oléico resultou em viabilidade celular diminuída. 0 propileno glicol falhou por completo em melhorar a permeação. As únicas formulações GRAS que desempenharam bem, ou melhor do que, AKL-225-126-2, foram as que continham apenas EDTA. Mesmo assim, em 10 mg/mL de EDTA, a viabilidade celular começou a diminuir. A adição de etanol a EDTA não aumentou a permeação de exenatida. Devido à via regulatória potencialmente facilitada apresentada por uma formulação toda-GRAS, a formulação apenas com EDTA foi testada ainda para desenvolvimento da formulação.

Baseada nos resultados de sucesso da permeação in vitro, (% de permeação maior do que cerca de 5%) da Série A, onze formulações recomendadas para estudos PK in vivo continham combinações de Me-p-CD; DDPC, EDTA, e gelatina. As melhores formulações de desempenho com % de permeação maior do que cerca de 10% incluíram: 3 ou 6 mg/mL de exenatida, 8 0 mg/mL de mL de Me-β-CD, 2 mg/mL deDDPC, e 5 mg/mL de EDTA. A permeação foi ainda aumentada em cerca de 20-3 0% nas formulações contendo 6 mg/mL de exenatida, 80 mg/mL de Me-β- CD, 2 mg/mL de DDPC, 5 mg/mL de EDTA, e 2,5 mg/mL de gelatina. Nenhum dos excipientes classificados na Série B foram selecionados para testes em coelhos por uma combinação de motivos. A grande maioria deles falhou em melhorar a permeação sem afetar negativamente a viabilidade celular ou comprometer a estabilidade física da formulação.

EXEMPLO 5

Teste de Estabilidade de Formulações de Exenatida

Teste in vitro de formulações de exenatida incluíram uma tela de conservantes. A estabilidade física após o armazenamento a 5°C foi medida para todas as formulações testadas in vitro. As formulações de exenatida foram colocadas em frascos de vidro de 1 cc e fechadas com tampas revestidas de trialumínio e armazenadas a 50C por pelo menos duas semanas. A estabilidade física foi monitorada por medição da claridade. A claridade de uma formulação foi determinada por medição da absorbância a 630 nm, usando-se o leitor de placas de densidade óptica pQuant para cada formulação nos dias 0, 7 e 14. Um volume de 200μl de cada frasco foi colocado em uma placa com 96 poços e lido contra um fundo de água.

Todas as formulações testadas na Série A permaneceram claras por pelo menos duas semanas a 5°C, com exceção de AKL-225-126-2, que foi a formulação inicial que é conhecida por se tornar turva com o tempo. A Formulação JW- 239-33-3 contém o mesmo nível de excipientes aprimoradores do AKL-225-126-2 e contém o mesmo conservante (1 mg/mL de benzoato de sódio), mas está em tampão tartarato ao invés de tampão citrato. JW-239-33-3 permaneceu claro por pelo menos duas semanas a 5°C.

Conservantes foram adicionados à formulação AKL- 225-126-2. Três conservantes foram testados: benzoato de sódio (NaBz), clorobutanol e cloreto de benzalcônio (BAK). As formulações usadas na classificação de conservantes continham os mesmos aprimoradores encontrados em AKL-225-126-2: Me-p-CD (4 0 mg/ml), DDPC (1 mg/ml), e EDTA (2,5 mg/ml).

Enquanto o benzoato de sódio 1 mg/mL na formulação tamponada por tartarato mostrou melhor estabilidade física (comparar a formulação JW-239-33-3 com AKL-225-126-2), qualquer aumento na concentração do benzoato de sódio resultou em estabilidade física diminuída em pH 4,5. As formulações com 2 mg/mL de mais benzoato de sódio tornaram-se turvas dentro de 14 dias a 5 °C. As formulações contendo clorobutanol tornaram-se turvas em concentrações de clorobutanol de 5 mg/mL ou mais. Quando o clorobutanol foi combinado com cloreto de benzalcônio, embora a combinação fosse inicialmente clara, a formulação tornou-se turva dentro de 14 dias de armazenamento a 5°C. Finalmente, o cloreto de benzalcônio (BAK) foi testado a uma variação de concentrações de 0-1 mg/mL e também 9 mg/mL. Enquanto o BAK contendo formulações permaneceu fisicamente estável por duas semanas a 5°C, elas resultaram na diminuição da viabilidade celular com aumento da concentração de BAK. Nenhum dos conservantes testados diminui a permeação de exenatida.

Várias concentrações de benzoato de sódio (NaBz) e cloreto de benzalcônio (BAK) foram classificadas por seu efeito na estabilidade física das três formulações usadas em estudos in vivo. O benzoato de sódio foi adicionado a 1,0, 2,5 e 5,0 mg/mL, enquanto o BAK foi testado a 0,2, 1,0, 2,0 e 4,0 mg/mL. Para preparar as amostras, várias quantidades de soluções de estoque dos dois conservantes foram adicionadas às três formulações preparadas dosadas no estudo PK. Este método de preparação de amostras resultou em uma mudança de pH de 4,7 para mais de 5,0 para amostras contendo benzoato de sódio. As formulações resultantes foram armazenadas a 5°C por 5,5 semanas. A estabilidade física foi monitorada por medição da absorbância da solução a 63 0 nm.

A estabilidade física das formulações contendo conservantes foi monitorada a t= 0, 9, 14 e 3 9 dias. Notou-se que todas as formulações permaneceram fisicamente estáveis durante a duração do período de teste. Embora o benzoato de sódio seja mais solúvel em pH 5, também é inativo com um conservante em pH 5.

Concentrações variadas de benzoato de sódio (NaBz) e cloreto de benzalcônio (BAK) foram usadas para testar o efeito de conservantes na estabilidade física de formulações dosadas no estudo 3 em coelhos (JW-239-126-3, JW-239-126-15, JW-239-126-7, JW-239-126-19, JW-239-126-24, AKL-310-27-12) . O benzoato de sódio foi adicionado a concentrações de 1.0, a 5,0 mg/mL, enquanto o BAK foi testado a 0.05, 0,075 e 0.1 mg/mL. Para preparar as amostras, quantidades variadas de soluções de estoque dos dois conservantes foram adicionadas às formulações preparadas no estudo PK e o pH foi ajustado para 4,5 com HCl quando necessário. As formulações resultantes foram armazenadas a 5°C por 4 semanas. A estabilidade física foi monitorada por medição da absorbância da solução a 63 0 nm.

A estabilidade física das formulações com concentrações variadas de benzoato de sódio foi monitorada a t= 0, 3, 7, 14, e 28 dias. Com o pH corrigido para 4,5, as formulações contendo apenas 40 mg/mL de Me-p-CD (JW-239-126-3 e JW-239-126-15) mostraram instabilidade física em t = 28 dias com pouco mais de 1 mg/mL de benzoato de sódio. Porém, as formulações contendo 80 mg/mL de Me-p-CD em pH 4,5 (JW- 239-126-7, JW-239-126-19, JW-239-126 - 24, e AKL-310 - 27-12) demonstraram estabilidade física melhorada quando comparadas com as formulações com 1 aprimorador. As formulações com 2 aprimoradores mostraram estabilidade física de até t = 2 8 dias com cerca de 2,5 mg/mL. Ainda assim, as formulações com 1 aprimorador e 2 aprimoradores demonstraram estabilidade física limitada com benzoato de sódio; formulações com 1 aprimorador não permaneceram estáveis por nem uma semana com 1,5 mg/mL de benzoato de sódio e formulações com 2 aprimoradores não mantiveram a estabilidade física por uma semana com 5 mg/mL de benzoato de sódio. A estabilidade física das formulações com concentrações variadas de cloreto de benzalcônio foi monitorada a t= 0, 3, 7, 14, e 28 dias. Ambas as formulações permaneceram fisicamente estáveis por pelo menos um mês.

Reconhecer que a estabilidade física das formulações contendo benzoato de sódio foi melhorada com altas concentrações de Me- β -CD ou quando o pH foi aumentado para 5,0, três formulações alternativas de 1 aprimorador foram preparadas para explorar o efeito do pH e concentração de Με-β-CD em estabilidade física. A primeira testou o efeito da concentração de Me-β-CD levemente aumentada (45 mg/ml). A segunda formulação faltou um tampão para testar o efeito do próprio tampão na estabilidade física. A terceira formulação foi a mesma formulação na primeira parte dessa classificação de conservantes, JW-239-126-3, exceto quando benzoato de sódio foi adicionado, o pH não foi ajustado, então subiu para pH 5.

Uma melhora na estabilidade física foi observada: todas as três formulações contendo 1 mg/mL de benzoato de sódio mantiveram a estabilidade física por pelo menos um mês. Porém, a instabilidade física foi observada dentro de uma semana na formulação com Me-β-CD aumentado e a formulação com falta de tampão em ? 2 mg/mL de benzoato de sódio. A terceira formulação, JW-239-126-3 em pH 5, demonstrou estabilidade física melhorada quando comparada com a mesma formulação que foi ajustada para pH 4,5 na presença de benzoato de sódio. A formulação com 1 aprimorador foi capaz de manter a estabilidade física por pelo menos 1 mês com 2,5 mg/mL de benzoato de sódio a pH 5,0. A instabilidade foi notada na formulação quando o benzoato de sódio foi aumentado para 5 mg/mL.

EXEMPLO 6

Estudos PK em Coelhos para Formulação de Exenatida Três estudos da farmacocinética (PK) de coelhos foram conduzidos usando-se onze formulações intranasais (IN) de exenatida aprimoradas durante estudos in vitro.

Várias tendências de biodisponibilidade foram retiradas dos dados PK em coelhos. Inicialmente, aumentando- se a dose liberada de 3 mg/mL para 6 mg/mL de exenatida aumentou a biodisponibilidade. Segundo, duplicando-se as concentrações de Me-β-CD, DDPC e EDTA aumentou a biodisponibilidade da exenatida. Terceiro, a adição de gelatina aumentou a biodisponibilidade de exenatida e reduziu a variabilidade dos dados PK.

Coelhos broncos saudáveis, machos, da Nova Zelândia, foram randomicamente divididos em dois grupos. Os grupos continham de 4-8 animais. Os coelhos receberam uma única dose intranasal usando-se uma pipeta com uma ponta de plástico com exceção de um grupo, que recebeu uma única dose intravenosa como injeção de bolus na veia auricular marginal. Os níveis de dose foram selecionados baseados nas medições das superfícies nasais dos coelhos comparados às dos humanos. Amostras de sangue sérico (cerca de 0,5 mL cada) foram coletadas por punção venosa direta de uma veia auricular marginal em tubos de coleta de sangue contendo EDTA como anticoagulante. As amostras de sangue foram coletadas em 0, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 180, 240 e 360 minutos pós-dose para o grupo intranasal e 0, 1,5, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 180, 240 e 360 minutos pós-dose para o grupo intravenoso. O sangue foi coletado em tubos contendo EDTA dipotássico, e mantidos em gelo até a centrifugação (menos de 1 hora após a coleta). 0 plasma colhido foi dividido em 2 alíquotas, e congelado em gelo seco. A análise PK foi realizada usando todos os dados (sem exclusões) em a AUCall foi calculada de 0 a 360 para comparações.

Estudo em Coelhos 1: Estudo Preliminar In vivo Em Coelhos

No estudo 1, quatro amostras foram testadas: 1) uma formulação de controle intranasal (IN) que continha nenhum excipiente de aprimoramento de permeação (denominado glutamato); 2) formulação de AKL-225-126-2; 3) formulação de JW-239-9-21, que continha duas vezes a concentração de excipientes de melhora de permeação Me-β-CD, DDPC, e EDTA; e 4) um controle intravenoso (IV) . A Tabela 3 lista as formulações dosadas intranasalmente no estudo 1. Cada formulação foi dosada a 15 μl/kg, ou 4 5 pg/kg.

As formulações otimizadas resultaram em um aumento significante na biodisponibilidade da exenatida (BA) relativa ao controle glutamato (Tabela 6) . Enquanto o controle glutamato resultou em 0,3% de BA absoluta, a adição de 1 aprimorador resultou em um aumento de mais de dez desdobramentos na BA para 3,6%. Dobrando-se as concentrações do aprimorador resultou em quase um dobro do BA para 6,1%.

Os aumentos na BA correlacionam-se bem com os resultados da permeação in vitro para as formulações. A formulação AKL-225-126-2 forneceu um aumento de desdobramento de 346 na permeação, enquanto JW-239-9-21 resultou em um aumento de desdobramento de 500 na permeação relativa ao controle glutamato.

Estudo em Coelhos 2: Teste de Volume de Dose e Adição de Gelatina às Formulações

Todas as formulações testadas no segundo estudo em coelhos continham concentrações com 2 aprimoradores: 80 mg/mL Me-β-CD, 2 mg/mL DDPC, e 5 mg/mL EDTA. Adicionalmente, o tampão e tonificante para todas as formulações foram trocados para tampão tartarato e cloreto de sódio. A Tabela 4 mostra as formulações testadas no estudo 2.

A Formulação JW-239-126-14 continha 3 mg/mL de exenatida, a mesma concentração do estudo 1, e 2 concentrações de Me-β-CD, DDPC, e EDTA com adição de gelatina. Esta formulação foi dosada em volume total, 15 μL/kg, fornecendo uma dose de 4 5 pg/kg. In vitro, esta formulação resultou em uma permeação de mais de 800 desdobramentos de aumento em relação ao controle glutamato. A formulação JW-239-126-19 continha 6 mg/mL de exenatida com 2 aprimoradores sem gelatina e foi dosada em metade do volume, 7,5 μL/kg, fornecendo uma dose de 45 pg/kg. O aumento do desdobramento in vitro foi mais de 1400. A formulação JW-239- 24 continha 6 mg/mL de exenatida com 2 aprimoradores com gelatina e foi dosada pela metade, 7,5 μL/kg, ou volume total, 15 μL/kg, fornecendo doses de 45 μg/kg e 90 μg/kg( respectivamente. Para a dose de meio volume in vitro, o aumento do desdobramento foi mais de 2200, enquanto para o volume total da dose a permeação teve um aumento de 470 no desdobramento observado.

A dose total da formulação JW-239-126-14 que continha 2 aprimoradores e gelatina resultou em uma diminuição na biodisponibilidade relativa à formulação JW- 239-9-21, que continha o mesmo nível de aprimoradores de permeação mas sem gelatina. A biodisponibilidade resultante, 3,3% foi mais comparável à formulação AKL-225-126-2 que continha 1 aprimorador.

Dobrando-se a concentração de exenatida e reduzindo-se o volume da dose resultou em biodisponibilidade fraca. As formulações JW-239-126-19 e JW-239-126-24 foram dosadas em meio volume e ambas resultaram em uma biodisponibilidade da exenatida de menos de 2%. Esta BA fraca pode surgir de contato limitado da droga com a membrana do seio in vivo como resultado de um volume de dose diminuído.

Quando a formulação JW-239-126-24 foi dosada em volume total, fornecendo, assim, duas vezes a dose de exenatida (90 pg/kg) quando comparada com todas as outras amostras (45 pg/kg), a biodisponibilidade também aumentou. A dose completa de 6 mg/mL de exenatida em concentrações de 2 aprimoradores mais gelatina resultou em quase dobro de biodisponibilidade quando comparada à formulação JW-239-126- 14, que continha 3 mg/mL de exenatida na mesma formulação (as biodisponibilidades são 5,7% e 3,3%, respectivamente). Uma vez que a biodisponibilidade é dividida pela dose fornecida, espera-se que a biodisponibilidade não mude com o aumento da dose.

Estudo em Coelhos 3: Teste de Linearidade de Dose nas Formulações

Baseado na observação de que uma formulação de 6 mg/mL aumentou a biodisponibilidade relativa das formulações de 3 mg/mL, o terceiro estudo PK em coelhos investigou a linearidade da dose com formulações com 1 aprimorador e 2 aprimoradores. Além disso, a comparação de 2 aprimoradores com e sem gelatina foi testada. Finalmente, a formulação apenas com EDTA que foi otimizada na triagem in vitro foi testada in vivo. As formulações testadas no estudo 3 são mostradas na Tabela 5.

Os resultados do estudo 3, mostrados na Tabela 8, confirmaram a não-linearidade de liberação de dose observada no estudo 2. Quando as formulações de exenatida de 3 mg/mL e 6 mg/mL foram dosadas na mesma formulação, a biodisponibilidade aumentou em quase dois desdobramentos em cada caso. Por exemplo, as formulações JW-239-126-7 e JW-239- 126-19 com 2 aprimoradores, contendo 3 mg/mL e 6 mg/mL de exenatida respectivamente, foram dosadas in vivo; as biodisponibilidades resultantes foram 3,1% e 5,8%, respectivamente. Além disso, a adição de gelatina para a formulação com 2 aprimoradores com 6 mg/mL de exenatida (JW- 239-126-24) resultou em um aumento claro da biodisponibilidade para 9,1%. Deve-se notar que há um aumento significante na BA comparada com a mesma dose da mesma formulação no estudo 2, que resultou em 5,7% de BA absoluta. Finalmente, mesmo a formulação com EDTA mostrou um aumento modesto na BA quando comparada com o controle glutamato; a formulação AKL-310-27-12 forneceu um aumento de quase quatro desdobramentos na exenatida com uma BA de 1,1%.

Aumentando-se a dose liberada de 3 mg/mL para 6 mg/mL de exenatida aumentou a biodisponibilidade. Isto mostra que a biodisponibilidade é não-linear para dosagem IN de exenatida. Duplicando-se as concentrações de Μe-β-CD, DDPC e EDTA aumentou a biodisponibilidade da exenatida. A adição de gelatina aumentou a biodisponibilidade de exenatida e reduziu a variabilidade dos dados PK. Valores melhorados de BA para formulações testadas no estudo 3 podem ser por causa do tampão citrato e/ou presença de manitol auxiliando o consumo de exenatida através do epitélio nasal. Finalmente, mostrou- se que a adição de EDTA apenas à formulação aumentou a BA da exenatida relativa ao controle glutamato.

Duas formulações excederam a BA absoluta de 5%. A formulação JW-239-126-19, que continha 6 mg/mL de exenatida e 2 aprimoradores, e a formulação JW-239-126-24 que também continha 6 mg/mL de exenatida e 2 aprimoradores com gelatina, ambas produziram mais do que 5% de BA quando dosadas em volume total (15 μL/kg) no coelho.

Tabela 3

Estudo em Coelhos 1: Formulações de Exenatida Intranasal <table>table see original document page 127</column></row><table>

Tabela 4

Estudo em Coelhos 2: Formulações de Exenatida Intranasal

<table>table see original document page 127</column></row><table>

Tabela 5

Estudo em Coelhos 3: Formulações de Exenatida Intranasal

<table>table see original document page 127</column></row><table> <table>table see original document page 128</column></row><table>

Tabela 6

Estudo em Coelhos 1: Resultados de Biodisponibilidade

<table>table see original document page 128</column></row><table>

Tabela 7

Estudo em Coelhos 2: Resultados de Biodisponibilidade

<table>table see original document page 128</column></row><table>

Tabela 8

Estudo em Coelhos 3: Resultados de Biodisponibilidade

<table>table see original document page 128</column></row><table> EXEMPLO 7

Estudos PK em Primatas

Estudos PK em primatas foram conduzidos para desenvolver formulações intranasais de exenatida adequada para dosagem em humanos.

Baseado nos resultados in vitro, em coelhos e nos testes de triagem de conservantes, três formulações foram testadas no primeiro estudo PK em primatas. Inicialmente, a formulação AKL-310-81-1 (3 mg/mL, 1x apr) contém 3 mg/mL com 1 aprimorador e 0,2 mg/mL de BAK. A segunda formulação AKL- 310-119-1 (6 mg/mL, 1x apr) contém 6 mg/mL de exenatida com 1 aprimorador e gelatina e 0,2 mg/mL de BAK. Terceiro, a formulação AKL-310-89-4 (6 mg/mL, 2x apr) contém 6 mg/mL de exenatida com 2 aprimoradores mais gelatina e 0,2 mg/mL de BAK para explorar o efeito de duplicação dos níveis de aprimoradores na biodisponibilidade. AKL-310-89-4 (6 mg/mL, 2x apr) é essencialmente o melhor desempenho do estudo PK em coelhos. As formulações testadas no estudo PK em primatas estão mostradas na Tabela 9.

Tabela 9

Formulações de Exenatida para Estudos PK em Primatas

<table>table see original document page 129</column></row><table> <table>table see original document page 130</column></row><table>

Uma única dose do estudo PK em macacos foi conduzida usando-se formulações de exenatida otimizadas durante estudos in vitro e em coelhos. Macacos cinólogos saudáveis foram randomicamente escolhidos para os grupos de dosagem. Os grupos continham 6 animais. Os primatas receberam uma dose única intranasal usando uma pipeta com uma ponta plástica (instilador) ou uma única dose intranasal com ativador de Pfeiffer (IN), com exceção do grupo que recebeu uma única dose intravenosa com injeção de bolus. As doses incluíram 3 mg/mL de exenatida χ spray de 100 ul (~85ug/kg, macaco de 3,5 kg) ou 6 mg/mL de exenatida χ spray de 100 ul ou instilação (~85ug/kg, macaco de 3,5 kg) . Amostras de sangue sérico foram coletadas por venipunção direta em tubos de coleta de sangue contendo EDTA como anticoagulante. As amostras de sangue foram coletadas em 0, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 180, 240 e 360 minutos pós-dose para o grupo intranasal e 0, 1,5, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 180, 240 e 3 60 minutos pós-dose para o grupo intravenoso. O sangue foi coletado em tubos contendo EDTA dipotássico, e mantidos em gelo até a centrifugação (menos de 1 hora após a coleta) . O plasma colhido foi dividido em 2 alíquotas, e congelado em gelo seco. A análise PK incluiu área média sob a curva (AUCO- 8) para comparações; a dose foi ajustada baseada nas diferenças de peso do ativador para IN. Os frascos foram pesados antes e depois do ativador determinar a dose liberada. 0 PK foi ajustado para a dose atual liberada ao invés do volume inicial de IOOuL. A biodisponibilidade relativa percentual (%BA) foi calculada relativa à subcutânea.

Um resumo da %BA do primata, AUCO-8 média, e resultados Cmax é mostrada na Tabela 10. Inicialmente, a adição de aprimoradores (Me-β-CD, DDPC, e EDTA) aumenta a biodisponibilidade acima do controle do tampão glutamato, e a adição de gelatina aumenta ainda mais a biodisponibilidade. Como observado nos experimentos com coelhos, o aumento da dose liberada aos macacos de 3 mg/mL a 6 mg/mL de exenatida aumentou a biodisponibilidade. Da mesma forma, duplicando-se as concentrações de Me-β-CD, DDPC e EDTA aumentou a biodisponibilidade da exenatida. A biodisponibilidade mostrou não-linearidade na dosagem, como foi visto com os coelhos. As formulações de exenatida de 6 mg/mL resultaram em %BA maior do que a formulação de 3 mg/mL. (2,03% BA vs. 1,52% BA, respectivamente, quando em spray). Os maiores resultados de biodisponibilidade, 11,25% BA, foram observados com a exenatida de 6 mg/mL com 2 aprimoradores mais gelatina liberada por instilação.

Em Segundo, a média total resultante dos valores AUCO-8 para IN (3 mg/mL 1X apr, 18 8,334 pgxmin/ml; 6 mg/mL 1X apr, 54 9,691 pgxmin/ml; 6 mg/mL 2X apr, 1,13 6,3 98 pgxmin/ml) e instilação (6 mg/mL 1X apr, 1,659,883 pgxmin/ml; 6 mg/mL 2X apr, 3,4 72,731 pgxmin/ml) são semelhantes ao valor AUCO-8 após a administração subcutânea de uma dose de 10 mcg (250 ug/ml) de BYETTA (exenatida comercialmente disponível) observada em pacientes (1036 pgxh/ml) [Informações de Prescrição de BYETTA em http://pi.lilly.com/us/byetta- pi.pdf]. Os valores médios AUCO-8 de todas as formulações aprimoradoras foram maiores do que o controle com tampão glutamato (32,714 pgxmin/ml). A AUCO-8 média para 3mg/mL 1X apr Spray foi pelo menos 5 desdobramentos maior do que o controle com glutamato. A AUCO-8 média para 6mg/mL 1X apr

Spray foi pelo menos 15 desdobramentos maior do que o controle com glutamato. A AUCO-8 média para 6mg/mL 2X apr Spray foi pelo menos 30 desdobramentos maior do que o controle com glutamato. A AUCO-8 média para 6mg/mL 1X apr Instilação foi pelo menos 50 desdobramentos maior do que o controle com glutamato. A formulação de melhor desempenho no estudo em primatas foi AKL-310-89-4 (6 mg/mL 2X apr: Me-B-CD, DDPC, EDTA, e gelatina) fornecidos por instilação que teve um valor médio AUCO-8 pelo menos 100 desdobramentos maior do que o controle de tampão glutamato.

Finalmente, todas as formulações contendo aprimoradores aumentaram a Cmax comparadas com o controle de tampão glutamato. A Cmax média para 3mg/mL 1X apr Spray foi pelo menos 5 desdobramentos maior do que o controle com glutamato. A Cmax média para 6mg/mL 1X apr Spray foi pelo menos 12 desdobramentos maior do que o controle com glutamato. A Cmax média para 6mg/mL 2X apr Spray foi pelo menos 20 desdobramentos maior do que o controle com glutamato. A Cmax média para 6mg/mL 1X apr Instilação foi pelo menos 25 desdobramentos maior do que o controle com glutamato. A formulação de melhor desempenho no estudo em primatas foi AKL-310-89-4 (6 mg/mL 2X apr: Me-B-CD, DDPC7 EDTA, e gelatina) fornecidos por instilação que teve um valor médio Cmax pelo menos 70 desdobramentos maior do que o controle de tampão glutamato.

Tabela 10

Biodisponibilidade, AUCO-8 Média, e Resultados Cmax para Estudos PK em Primatas

<table>table see original document page 132</column></row><table> <table>table see original document page 133</column></row><table>

A Tmax para 3mg/mL IX apr Spray, 6mg/mL IX apr Spray, 6mg/mL 2X apr Spray, e 6mg/mL IX apr Instilação foi de cerca de 40 minutos. A formulação 6mg/mL 2X apr Instilação teve um Tmax de cerca de 3 0 minutos.

No Segundo estudo em primatas, a escalação da dose foi conduzida com 2 aprimoradores + formulação de gelatina. Macacos cinólogos saudáveis foram randomicamente escolhidos para os grupos de dosagem. Os primatas receberam uma única dose intranasal usando uma pipeta com ponta de plástico ("instilação"). Amostras de sangue sérico foram coletadas por venipunção direta em tubos de coleta de sangue contendo EDTA como anticoagulante. As amostras de sangue foram coletadas em 0, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 180, 240 e 360 minutos pós- dose para o grupo intranasal e 0, 1,5, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 180, 240 e 360 minutos pós-dose para o grupo intravenoso. A análise PK foi realizada usando todos os dados (sem exclusões) em a AUCO-8 foi calculada com intervalos de tempo de 0 a 3 60 para comparações.

Três formulações de 0,6 mg/mL, 2 mg/mL e 6 mg/mL de exenatida foram preparadas e dosadas nos primatas para instilação. Diferente do primeiro estudo, o volume de dose foi ajustado para 55 pL (ou 16 pL/kg) para contar com a área de superfície nasal do macaco. Para as respectivas formulações, a dose de 16 pL/kg correlaciona-se com as doses de exenatida de 9,6, 32, e 96 pg/kg. As formulações para o segundo estudo em macacos são mostradas na Tabela 11.

Tabela 11

Formulações de Exenatida para Estudos PK em Primatas <table>table see original document page 134</column></row><table>

Os resultados do segundo estudo em primatas estão

mostrados na Tabela 12. A biodisponibilidade relativa para todas as três doses foi alta, bem acima de 3%. Porém, diferente de estudos in vivo anteriores, este estudo não mostrou linearidade na escalação de doses.

Tabela 12

Resultados PK para o Segundo Estudo PK em Primatas

<table>table see original document page 134</column></row><table>

No primeiro estudo PK em primatas, assim como nos estudos PK em coelhos, um aumento de dois desdobramentos na concentração de exenatida de 3 mg/mL para 6 mg/mL resultou em mais do dobro da AUC, especificamente, cerca de um aumento AUC de 4 desdobramentos (ou aumento relativo de dois desdobramentos na biodisponibilidade) foi observado. Neste segundo estudo em primatas, a dose foi aumentada em 3,3 desdobramentos de 0,6 mg/mL para 2 mg/mL, e 3 desdobramentos de 2 mg/mL para 6 mg/mL. Em cada aumento da dose, a mudança na AUC é menos de 3 desdobramentos e a BA relativa resultante mostra uma leve diminuição com o aumento da dose. Apesar dessa ausência de não-linearidade na exposição com escalação da dose, a biodisponibilidade de todas as três doses é muito alta, comparável com a BA relativa vista na formulação com dois aprimoradores + gelatina em outros estudos in vivo. Duplicando-se as concentrações de Me-p-CD, DDPC e EDTA resultou no aumento da biodisponibilidade da exenatida.

EXEMPLO 8

Estabilidade "De Venda" de Formulações de Exenatida Nasal Contendo Tampão Tartarato

Estudos de estabilidade "de venda" são definidos com estudos envolvendo formulação armazenada dentro de um frasco fechado (ex., tampado), colocado em armazenamento especifico e em condições de temperatura acelerada por específicos períodos de tempo. A presente invenção inclui a estabilidade melhorada das formulações de exenatida nasal contendo tampão tartarato quando comparado com o tampão citrato. Seis formulações diretamente compararam o efeito dos tampões citrato vs. tartarato, e tonificantes cloreto de sódio vs. manitol na estabilidade de formulações com exenatida. As formulações testadas estão listadas na Tabela 13 .

Tabela 13

Formulações para Comparação de Estabilidade de Diferentes Tampões e Tonificantes

<table>table see original document page 135</column></row><table> <table>table see original document page 136</column></row><table>

As formulações foram colocadas a 5°C e 25 0C e monitoradas para conteúdos de peptldeos e recuperação a 0, 30, 60 e 90 dias por forte troca de cátios HPLC.

A dosagem intranasal das formulações acima em coelhos não mostrou mudanças na biodisponibilidade como resultado de mudanças no tampão ou tonificante. Além disso, todas as amostras mantiveram o pH, osmolal idade, e estabilidade física (clareza) em ambas as condições de temperatura pelo decorrer do estudo. Porém, estudos de pureza em peptídeos dessas formulações na condição acelerada de 25°C mostrou estabilidade aumentada após três meses de armazenamento com tampão tartarato relativo ao tampão citrato (ver Tabela 14).

Tabela 14

Dados de Pureza de Peptídeos em Três Meses para Formulações Dosadas em Estudo de Estabilidade

<table>table see original document page 136</column></row><table> <table>table see original document page 137</column></row><table>

As formulações com 2 e 1 aprimoradores mostraram a mesma tendência em aumentar a pureza dos peptídeos no tampão tartarato vs. tampão citrato. Quando armazenados a 25°C, uma diminuição linear na pureza da exenatida pelo decorrer de três meses foi observada. Enquanto o tonificador não teve efeito na estabilidade da formulação pela variação das condições testadas, amostras no tampão de tartarato mostraram uma estabilidade aumentada comparadas com as formulações de tampão citrato quando armazenadas a 25°C. Esses dados mostram que formulações com tampão de tartarato melhoram as condições de estabilidade para a exenatida.

Outros estudos de estabilidade foram realizados para formulações nasais de exenatida. Formulações para este estudo são mostradas na Tabela 15. Lotes de 0,36 mg/mL, 3 mg/mL e 6 mg/mL de exenatida, assim como placebos correspondentes, foram preparados.

Tabela 15

Formulações para Comparação da Estabilidade de Diferentes Tampões e Tonificantes

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Frascos de vidro tipo I de âmbar silanizado 1 cc foram preenchidos com 1,0 mL da formulação com tampas de polipropileno com três revestimentos. Os frascos de todas as formulações foram armazenados a 50C/ RH ambiente, 25°C/6 0%RH e 40°C/75% RH em câmaras de estabilidade. Após remoção em um determinado intervalo de tempo, os frascos são permitidos a atingir a temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos antes de se realizar qualquer teste. Todas as formulações contendo exenatida seguem o mesmo esquema de lotes e testes. Os placebos seguem o mesmo esquema de lotes, mas os testes são mais limitados. A 5°C, as amostras foram separadas em t = 0, 1, 2, 3, 6,. 9, 12, 18, e 24 meses. A 25°C, as amostras foram separadas em t = 1 semana, e 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18, e 24 meses. A 40°C, as amostras foram separadas em t = 1 e 2 semanas, e 1 e 3 meses. A 40°C, foram analisadas em até seis meses. Todas as formulações foram armazenadas a 5°C, 25°C e 40°C por três meses e continuaram até 24 meses para amostras a 5°C e 25°C, e até 12 meses para 40°C, com os pontos de teste de t = 0, 1 e 2 semanas, e 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18, e 24 meses. A pureza dos peptídeos por SCX-HPLC assim como pH, osmolalidade, e estabilidade física foi testada para todos os intervalos de tempo e todas as condições de armazenamento para formulações ativas. Placebos para cada formulação foram testados apenas para pH, osmolalidade, e estabilidade física em todas as condições.

Todas as amostras e seus placebos mantiveram o pH em todas as condições por doze meses. A 5°C e 25°C, a osmolalidade não mudou significantemente por doze meses em todas as formulações e seus placebos. Porém, a 40°C, um aumento na osmolalidade foi observado em todas as formulações por seis meses. Esta mudança na osmolalidade correlaciona-se com uma notável diminuição na pureza a 40°C. Um aumento da osmolalidade também foi observado nos placebos a 40°C, sugerindo alguma degradação também dos excipientes.

A estabilidade física de todas as formulações foi monitorada por observação visual. Duas formulações, 6 mg/mL de exenatida e 1 aprimorador + gelatina e em 2 aprimoradores + gelatina continham precipitados após três meses de armazenamento a 40°C. Após seis meses de armazenamento a 40°C, 3 mg/mL de exenatida em 1 aprimorador também foi observado em conter precipitado. Placebos não mostraram precipitado ou turbidez, mesmo após seis meses de armazenamento a 40°C. Exen-053-1, 0,6 mg/mL de exenatida em 2 aprimoradores + gelatina não precipitou-se a 40°C durante os seis meses de armazenamento. Em armazenamento a 25°C, o precipitado foi observado no tempo do décimo mês para apenas uma formulação, 3 mg/mL de exenatida em 1 aprimorador. Todas as outras formulações permaneceram claras, incolores e livres de material particulado após doze meses de armazenamento a 25°C. Todas as outras formulações permaneceram claras, incolores e livres de material particulado após doze meses de armazenamento a 5°C. A pureza da exenatida diminuiu cerca de 4% para todas as amostras armazenadas a 5°C por até doze meses (todas as formulações mostraram diminuição NMT de 4,1% na pureza de peptídeos) . Como esperado, em condições de temperaturas elevadas de 25°C ou 40°C, uma diminuição na pureza de exenatida (cerca de 75% da pureza do peptldeo em 12 meses) pelo decorrer do estudo de estabilidade foi observada.

Resumo da Estabilidade

Os estudos de estabilidade descritos neste relatório indicam que todas as formulações testadas exibiram estabilidade aceitável (como medido pela clareza, pH, osmolaridade, e pelo menos aproximadamente 95% da pureza de peptídeos) até um ano quando armazenados a 5°C.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em detalhes por meios de exemplos para propósitos de clareza e compreensão, será aparente ao artesão que certas mudanças e modificações são compreendidas pela revelação e podem ser praticadas sem experimentação indevida dentro do escopo das reivindicações em apêndice, que estão apresentadas por meios de ilustrações, e não limitações.

Claims (38)

1. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA, para a administração intranasal de exendina a um mamífero, caracterizada pelo fato de compreender: uma exendina, um tampão de tartrato, uma ciclodextrina, um intensificador de viscosidade selecionado entre gelatina, metil celulose ou hidroxipropilmetilcelulose, e um surfactante selecionado entre éter de polioxietileno não-iônico, ácido fusídico e seu derivados, taurodiidrofusidato de sódio, L-a-fosfatidilcolina didecanoila, polisorbato 80, polisorbato 20, polietileno glicol, álcool cetílico, polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, álcool de lanolina ou monooleato de sorbitan.

2. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a ciclodextrina é metil-β - ciclodextrina.

3. FORMULAÇÃO, de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um agente de quelação selecionado entre ácido etilenodiamina tetraacético ou ácido etilenoglicol tetraacético.

4. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o agente de quelação é o ácido etilenodiamina tetraacético.

5. FORMULAÇÃO, de acordo com as reivindicações de 1-4, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente pelo menos um tonificante.

6. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o tonificante é o cloreto de sódio.

7. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o tonificante é um poliol selecionado entre lactose, sorbitol, trehalose, sacarose, manose, manitol, maltose, ou derivados e homólogos dos mesmos.

8. FORMULAÇÃO, de acordo com as reivindicações de -1-7, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um conservante selecionado entre clorobutanol, metilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, benzoato de sódio, ácido sórbico, fenol, ou orto-, meta- ou para-cresol.

9. FORMULAÇÃO, de acordo com as reivindicações 1- -8, caracterizada pelo fato de que a formulação tem um pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 8.

10. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o intensif icador de viscosidade é gelatina.

11. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o intensif icador de viscosidade é metilcelulose ou hidroxipropilmetilcelulose.

12. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a viscosidade é de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 10,0 cps.

13. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a viscosidade é de até aproximadamente 5 cps.

14. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a viscosidade é de até aproximadamente 10 cps.

15. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a viscosidade é de aproximadamente 3,7 a aproximadamente 5,0 cps.

16. FORMA DE DOSAGEM DE EXENDINA, apropriada para a administração de múltiplos usos, caracterizada pelo fato de compreender um frasco lacrado que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação farmacêutica aquosa de conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a -18 para o tratamento de hiperglicemia, diabetes mellitus, dislipidemia, supressão do apetite, promoção da perda de peso, diminuição da ingestão de alimento, ou o tratamento da obesidade em um mamífero.

17. FORMA DE DOSAGEM DE EXENDINA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de ter uma recuperação de exendina de pelo menos de aproximadamente 98% depois de 60 dias sob armazenagem a 5°C.

18. FORMA DE DOSAGEM DE EXENDINA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de ter pelo menos aproximadamente uma recuperação de exendina de 95% após 3 65 dias sob armazenagem a 5°C.

19. FORMA DE DOSAGEM DE EXENDINA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de ter uma recuperação de exendina de pelo menos aproximadamente 93% após 60 dias sob armazenagem a 25°C.

20. FORMA DE DOSAGEM DE EXENDINA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de ter uma recuperação de exendina de pelo menos aproximadamente 8 9% após 90 dias sob armazenagem a 25°C.

21. FORMA DE DOSAGEM, de acordo com as reivindicações 16-20, caracterizada pelo fato de que a concentração de exendina é de pelo menos 1 mg/mL.

22. FORMA DE DOSAGEM, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a concentração de exendina é de pelo menos 2 mg/mL.

23. FORMA DE DOSAGEM, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a dita forma de dosagem é apropriada para a administração intra-nasal para obter uma dose de aproximadamente 100 ug a aproximadamente -600 ug da dita exendina.

24 . FORMA DE DOSAGEM DE EXENDINA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a formulação compreende pelo menos 10 mg/mL de ácido etileno diamina tetraacético.

25. SOLUÇÃO AQUOSA, para a aplicação farmacêutica intranasal de exendina, caracterizada pelo fato de compreender uma exendina, um ou mais intensificadores de viscosidade que aumentam a viscosidade da formulação até mais de aproximadamente 1,5 cps, uma ciclodextrina e um surfactante, em que a solução aquosa consiste em gotas líquidas aerosolisadas que têm um tamanho de partícula médio volumétrico (Dv, 50) de mais de aproximadamente 10 micra.

26. SOLUÇÃO AQUOSA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a ciclodextrina é metil-β- ciclodextrina.

27. USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença metabólica em um indivíduo humano ou animal, tratamento este que consiste na administração transmucosal ao indivíduo da dita formulação farmacêutica, em que a quantidade de exendina administrada é suficiente para diminuir os níveis de glicose do sangue no indivíduo.

28. USO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a formulação é administrada ao indivíduo intranasalmente.

29. USO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a exendina é exendina-4.

30. USO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a doença metabólica é selecionada entre diabetes mellitus insulino-dependente (DMID), diabetes gestacional, diabetes mellitus não insulino- dependente (DMNID), obesidade ou dislipidemia.

31. USO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende de aproximadamente 0,01 pmol a aproximadamente 10 pmol de exendina por quilograma do peso corpóreo do indivíduo.

32. USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a -15, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença metabólica em um indivíduo humano ou animal, tratamento este que consiste na administração transmucosal ao indivíduo da dita formulação farmacêutica, em que a formulação compreende de aproximadamente 20 ug a aproximadamente 400 ug de exendina.

33. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a formulação é administrada ao indivíduo intranasalmente.

34. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a doença metabólica é selecionada entre diabetes mellitus insulino-dependente (DMID), diabetes gestacional, diabetes mellitus não insulino- dependente (DMNID), obesidade ou dislipidemia.

35. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende de aproximadamente 0,01 pmol a aproximadamente 10 pmol de exendina por quilograma do peso corpóreo do indivíduo.

36. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizada pelo fato de servir como um farmacêutico para a aplicação transmucosal a um indivíduo humano ou animal.

37. USO DE UMA FORMULAÇÃO, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento transmucosal de um distúrbio metabólico.

38. USO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a doença metabólica selecionada entre diabetes mellitus insulino-dependent (DMID) , diabetes gestacional, diabetes mellitus não insulino dependente (DMNID), obesidade ou dislipidemia.