BRPI0620819A2 - uso de uma neuregulina (nrg) de liberação prolongada, nrg em uma liberação prolongada de uma dosagem baixa constante, e, composição de liberação prolongada para prevenir, tratar ou retardar uma doença ou distúrbio em um mamìfero - Google Patents

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Abstract

USO DE UMA NEUREGULINA (NRG) DE LIBERAçãO PROLONGADA, NRG EM UMA LIBERAçãO PROLONGADA DE UMA DOSAGEM BAIXA CONSTANTE, E, COMPOSIçãO DE LIBERAçãO PROLONGADA PARA PREVENIR, TRATAR OU RETARDAR UMA DOENçA OU DISTúRBIO EM UM MAMìFERO. A presente invenção fornece composições de liberação prolongada que compreende neuregulina para prevenir, tratar ou retardar várias doenças ou distúrbios. A presente invenção também fornece métodos para prevenir, tratar ou retardar várias doenças ou distúrbios pela liberação prolongada de neuregulina.

Description

"USO DE UMA NEUREGULINA (NRG) DE LIBERAÇÃO PROLONGADA, NRG EM UMA LIBERAÇÃO PROLONGADA DE UMA DOSAGEM BAIXA CONSTANTE, E, COMPOSIÇÃO DE LIBERAÇÃO PROLONGADA PARA PREVENIR, TRATAR OU RETARDAR UMA DOENÇA OU DISTÚRBIO EM UM MAMÍFERO"
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício de prioridade dos pedidos provisórios U.S. Nes 60/755.124, depositado em 30 de dezembro de 2005 e 60/758.626, depositado em 13 de janeiro de 2006.
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção diz respeito no geral às composições e métodos para prevenir, tratar ou retardar várias doenças ou distúrbios cardíacos pela liberação prolongada de neuregulina a um mamífero.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A hipertrofia cardíaca (ventricular) é uma resposta fisiológica adaptativa importante ao estresse aumentado ou demandas quanto ao trabalho cardíaco. Uma das mudanças celulares iniciais que ocorrem depois de um estímulo para hipertrofia é a síntese de mitocôndria e a expansão de massa miofibrilar (espessamento de parede) com um aumento proporcional no tamanho das células individuais, mas nenhum (ou mínimo) aumento no número de células.
Quando o ventrículo é estressado, a resposta inicial é um aumento no comprimento do sarcômero. Isto é seguido por um aumento na massa muscular total. Quando a sobrecarga é severa; a contratibilidade miocárdica torna-se deprimida. Em sua forma mais branda, esta depressão é manifestada por uma redução na velocidade de encurtamento do miocárdio não carregado ou por uma redução na taxa de desenvolvimento de força durante a contração isométrica. A contratibilidade miocárdica torna-se mais deprimida, uma redução mais extensivas na velocidade de encurtamento do miocárdio não carregado ocorre, agora acompanhado por um declínio e encurtamento no desenvolvimento da força isométrica. Neste ponto, a compensação circulatória pode ser ainda fornecida pela dilatação cardíaca e um aumento na massa muscular, que tende a manter o estresse da parede em níveis normais. Conforme a contratibilidade falha ainda mais, a insuficiência cardíaca congestiva evidente, refletida em uma depressão do débito e trabalho cardíaco e/ou uma elevação do volume e pressão diastólicos finais ventriculares no repouso, sobrevêm.
A transição da hipertrofia para a insuficiência cardíaca é caracterizada pelas diversas alterações na organização celular. Por exemplo, as células hipertróficas normais têm um tamanho grande com unidades contráteis aumentadas e bem organizadas, assim como adesões de célula- célula forte. Ao contrário, as células patologicamente hipertróficas, que também têm tamanho grande e acúmulo de proteínas, demonstram desorganização de proteínas contráteis (desordem de estruturas sarcoméricas) e adesões de célula-célula deficientes (desordem de miofibras). Assim, na hipertrofia patológica, o tamanho aumentado e acúmulo de proteínas contráteis são associados com a montagem desorganizada de estruturas sarcoméricas e uma falta de interações de célula-célula robustas.
A insuficiência cardíaca afeta aproximadamente cinco milhões de Americanos, e mais do que 550.000 novos pacientes são diagnosticados com a condição a cada ano. A terapia medicamentosa corrente para a insuficiência cardíaca é primariamente direcionada aos inibidores da enzima que converte a angiotensina (ACE), que são vasodilatadores que fazem com que os vasos sangüíneos se expandam, diminuindo a pressão sangüínea e reduzindo a carga de trabalho cardíaco. Embora a redução percentual na mortalidade tenha sido significante, a redução real na mortalidade com os inibidores de ACE tem sido em média apenas de 3 % a 4 %, e existem diversos efeitos colaterais potenciais.
Os inibidores de ACE também foram administrados em combinação com outros medicamentos tais como digitalina, que aumenta a força das contrações cardíacas, e/ou um diurético, que ajuda a aliviar a carga de trabalho do coração fazendo com que os rins removam mais sódio e água da corrente sangüínea. Entretanto5 pelo menos um estudo não demonstrou nenhuma diferença na sobrevivência associada com o uso de digitalina comparada com placebo em pacientes com insuficiência cardíaca Classes II- III. Adicionalmente, os diuréticos podem melhorar alguns sintomas de insuficiência cardíaca mas não é adequado como um tratamento único.
As limitações adicionais são associadas com outras opções para prevenir ou tratar a insuficiência cardíaca. Por exemplo, o transplante de coração é claramente mais caro e invasivo do que o tratamento medicamentoso, e é ainda limitado pela disponibilidade de corações de doador. O uso de dispositivos mecânicos, tais como marca-passos biventriculares, são similarmente invasivos e caros. Assim, tem sido uma necessidade quanto a novas terapias dadas as deficiências nas terapias correntes.
Uma terapia nova promissora envolve a administração de neuregulina (a seguir aludida como "NRG") a um paciente que sofre de ou em risco de desenvolver insuficiência cardíaca. As NRGs compreendem uma família de fatores de crescimento e diferenciação estruturalmente relacionados que incluem NRG1, NRG2, NRG3 e NRG4 e isoformas destes. Por exemplo, mais de 15 isoformas distintas de NRGl foram identificadas e divididas em dois grupos grandes, conhecidos como tipos α e β, com base nas diferenças na seqüência de seus domínios equivalentes ao fator de crescimento epidérmico essencial (EGF).
As NRGs ligam-se à família de receptor de EGF, que compreende EGFR, ErbB2, ErbB3 e ErbB4, cada uma dos quais desempenha um papel importante em funções celulares múltiplas, incluindo o crescimento, diferenciação e sobrevivência celulares. Estes são receptores da tirosina quinase de proteína, consistindo de um domínio de ligação de ligando extracelular, domínio de transmembrana e domínio de tirosina quinase citoplásmica. Depois que a NRG liga-se ao domínio extracelular de ErbB3 ou ErbB4, a mesma induz uma mudança conformacional que leva à formação de heterodímero entre ErbB3, ErbB4 e ErbB2 ou formação de homodímero entre o próprio ErbB4, que resulta na fosforilação do domínio de terminal C do receptor dentro da membrana celular. O domínio intracelular fosforilado depois liga-se às proteínas de sinal adicionais dentro da célula, ativando a via de sinalização de AKT ou ERK a jusante correspondente, e induzindo uma série de reações celulares, tais como a estimulação ou depressão da proliferação de célula, diferenciação de célula, apoptose de célula, migração de célula ou adesão de célula. Entre estes receptores, principalmente ErbB2 e ErbB4 são expressados no coração.
Foi mostrado que os domínios equivalentes a EGF de NRG1, variando em tamanho de 50 a 64 aminoácidos, são suficientes para ligar e ativar estes receptores. Estudos anteriores têm mostrado que a neuregulina-1β (NRG-1β) pode ligar-se diretamente ao ErbB3 e ErbB4 com alta afinidade. O receptor órfão, ErbB2, pode formar heterodímero com ErbB3 ou ErbB4 com afinidade mais alta do que os homodímeros ErbB3 ou ErbB4. A pesquisa no desenvolvimento neural tem indicado que a formação do sistema nervoso simpático requer um sistema de sinalização de NRG-1β, ErbB2 e ErbB3 intactos. O rompimento alvejado da NRG-1β ou ErbB2 ou ErbB4 levou à letalidade embrionária devido aos defeitos no desenvolvimento cardíaco. Estudos recentes também salientaram os papéis de NRG-1β, ErbB2 e ErbB4 no desenvolvimento cardiovascular assim como na manutenção da função cardíaca normal no adulto. NRG-I β mostrou realçar a organização de sarcômero em cardiomiócitos adultos. A administração curta duração de um domínio equivalente a EGF de NRG-I β recombinante significantemente melhora ou protege contra a deterioração no desempenho miocárdico em três modelos de animal distinto de insuficiência cardíaca. Mais importantemente, NRG-I β significantemente prolonga a sobrevivência de animais com insuficiência cardíaca. Estes efeitos tornam a NRG-I β promisssora como um produto terapêutico de espectro amplo ou composto de vanguarda para a insuficiência cardíaca devido a uma variedade de doenças comuns. Entretanto, existe ainda uma necessidade quanto a métodos mais eficazes de usar NRG, que podem ser usados em um cenário clínico para a prevenção, tratamento ou retardo da insuficiência cardíaca e/ou hipertrofia cardíaca.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A liberação prolongada de NRG melhora enormemente o efeito de NRG no tratamento da insuficiência cardíaca e hipertrofia cardíaca comparado à NRG administrada por outros métodos. A liberação prolongada de NRG também tem o benefício de reduzir os efeitos colaterais adversos de NRG comparado com NRG administrado por outros métodos. Assim, a presente invenção diz respeito a composições e métodos para prevenir, tratar ou retardar várias doenças cardíacas ou distúrbios em mamíferos, particularmente em seres humanos; pelo prolongamento da liberação de uma proteína de NRG, ou um fragmento funcional deste, ou um ácido nucléico que codifica uma proteína de NRG, ou um fragmento funcional deste, ou um agente que realce a produção e/ou função da dita NRG.
Em um primeiro aspecto da invenção, um método é fornecido para prevenir, tratar ou retardar a insuficiência cardíaca em um mamífero, o método compreendendo a liberação prolongada de NRG em um mamífero em necessidade deste. Em uma forma de realização do método para prevenir, tratar ou retardar a insuficiência cardíaca em um mamífero, a liberação prolongada de NRG em um mamífero leva à ativação prolongada da via de sinalização de ERIC em células cardíacas.
Em uma outra forma de realização do método para prevenir, tratar ou retardar a insuficiência cardíaca em um mamífero em necessidade deste, a liberação prolongada de NRG em um mamífero resulta na ativação prolongada da via de sinalização de AKT em células cardíacas.
Em uma outra forma de realização do método para prevenir, tratar ou retardar a insuficiência cardíaca em um mamífero em necessidade deste, a liberação prolongada de NRG em um mamífero realça os valores de EF e/ou FS do ventrículo esquerdo de mamífero.
Em uma outra forma de realização do método para prevenir, tratar ou retardar a insuficiência cardíaca em um mamífero em necessidade deste, a liberação prolongada de NRG em um mamífero previne a hipertrofia cardíaca.
Qualquer tecnologia de liberação prolongada conhecida na técnica, incluindo, mas não limitado a, uma bomba osmótica ou bomba de seringa, ligação de polietileno glicol ("PEG"), e/ou empacotamento em lipossoma ou microesfera, pode ser usado na presente invenção.
Em um segundo aspecto da invenção, um método é fornecido para reduzir o diâmetro interno do ventrículo esquerdo, o método compreendendo a liberação prolongada de NRG em um mamífero em necessidade deste. Em uma forma de realização preferida, a liberação prolongada de NRG em um mamífero reduz o valor LVEDD em mais do que cerca de 2 %. Mais preferivelmente, a liberação prolongada de NRG em um mamífero reduz o valor de LVEDD em mais do que cerca de 5 %. Ainda mais preferivelmente, a liberação prolongada de NRG em um mamífero reduz o valor de LVEDD em mais do que cerca de 10 %. Mais preferivelmente, a liberação prolongada de NRG em um mamífero reduz o valor de LVEDD em mais do que cerca de 15 %. O mais preferivelmente, a liberação prolongada de NRG em um mamífero reduz o valor de LVEDD em mais do que cerca de 20 %.
Em uma outra forma de realização preferida, a liberação prolongada de NRG em um mamífero reduz o valor de LVESD em mais do que cerca de 2 %. Mais preferivelmente, a liberação prolongada de NRG em um mamífero reduz o valor de nível LVESD em mais do que cerca de 5 %.
Ainda mais preferivelmente, a liberação prolongada de NRG em um mamífero reduz o valor de LVESD em mais do que cerca de 10 %. Ainda mais preferivelmente, a liberação prolongada de NRG em um mamífero reduz o valor LVESD em mais do que cerca de 15 %. O mais preferivelmente, a liberação prolongada de NRG em um mamífero diminui o valor de LVESD em mais do que cerca de 20 %.
Em um terceiro aspecto da invenção, um método é fornecido para causar o crescimento e/ou diferenciação de cardiomiócito, o método compreendendo a liberação prolongada de NRG em um mamífero em necessidade deste ativando por meio desta a via da MAP quinase em células cardíacas e causando o crescimento e/ou diferenciação do cardiomiócito.
Em um quarto aspecto da invenção, um método é fornecido para induzir a remodelagem de estruturas sarcoméricas e citoesqueletais de célula muscular, ou adesões de célula-célula, o método compreendendo a liberação prolongada de NRG em um mamífero em necessidade deste ativando por meio desta a via da MAP quinase em células cardíacas e causando a remodelagem das estruturas celulares ou as adesões de célula- célula.
Em um quinto aspecto da invenção, um método é fornecido para tratar ou prevenir a desassociação da adesão de célula-célula do músculo cardíaco e/ou a desordem de estruturas sarcoméricas em um mamífero em necessidade deste, o método compreendendo a liberação prolongada de NRG em um mamífero.
Adicionalmente, porque a interação da NRG com receptores ErbB foi implicada em outras doenças e distúrbios, a liberação prolongada de NRG também pode melhorar enormemente o efeito de NRG no tratamento de outras tais doenças e distúrbios comparado com NRG administrado por outros métodos. Assim, a presente invenção também diz respeito às composições e métodos para prevenir, tratar ou retardar várias doenças ou distúrbios em mamíferos, particularmente em seres humanos, pelo prolongamento da liberação de uma proteína de NRG, ou um fragmento funcional deste, ou um ácido nucléico que codifica uma proteína de NRG, ou um fragmento funcional deste, ou um agente que realça a produção e/ou função da dita NRG. Tais doenças e distúrbios incluem no geral aqueles do sistema nervoso central ou periférico. Os exemplos de outras doenças e distúrbios, incluem, várias doenças cardiovasculares, câncer, doença do sistema neural e/ou doenças musculares, incluindo distrofia muscular (por exemplo, de Duchenne, das cinturas dos membros) e escleroses múltiplas, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, doenças oculares e otológicas, diabetes, esquizofrenia, e Alzheimer.
A invenção também fornece uma composição de liberação prolongada ou formulação de NRG para prevenir, tratar ou retardar a insuficiência cardíaca em um mamífero. Em uma forma de realização, a composição ou formulação favorece a ativação da via da sinalização de ERK em células cardíacas. Em uma outra forma de realização, a composição ou formulação favorece a ativação da via da sinalização de AKT em células cardíacas. Em uma outra forma de realização, a composição ou formulação realça os valores de EF e/ou FS do mamífero. Já em uma outra forma de realização, a composição ou formulação previne a hipertrofia cardíaca. A composição ou formulação pode incorporar o uso de qualquer tecnologia de liberação prolongada conhecida na técnica, incluindo, mas não limitado a, uma bomba osmótica ou bomba de seringa, ligação de polietileno glicol (PEG), e/ou empacotamento em lipossoma ou microesfera.
A invenção também fornece um kit que compreende uma composição ou formulação de NRG e uma tecnologia de liberação prolongada conhecida na técnica, incluindo, mas não limitado a, uma bomba osmótica ou bomba de seringa, ligação de polietileno glicol (PEG), e/ou empacotamento em lipossoma ou microesfera. Em algumas formas de realização, o kit compreende ainda uma instrução para o uso da composição ou formulação de NRG e ou tecnologia de liberação prolongada na prevenção, tratamento ou retardo da insuficiência cardíaca em um mamífero; prevenção, tratamento ou retardo da hipertrofia cardíaca em um mamífero; ou redução do diâmetro interno do ventrículo esquerdo em um mamífero.
Estes e outros aspectos, objetivos, vantagens e características da invenção estarão evidentes a estas pessoas habilitadas na técnica na leitura da divulgação da invenção como mais completamente descrito abaixo.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra a fosforilação de AKT e ERK no ventrículo esquerdo de ratos com o tempo depois que NRG foi infundido pela injeção intramuscular, injeção intravenosa e infusão de teste de tolerância à glicose intravenosa. "P-AKT," "P-ERK" e "NRG" significam AKT fosforilado, ERK fosforilado e neuregulina. "im," "iv," e "ivgtt" significam injeção intramuscular, injeção intravenosa e teste de tolerância à glicose intravenosa, respectivamente.
A Figura 2 mostra o gel tingido por BaI2 para detectar PEG. Na figura, "mistura" significa a solução de mistura de PEG e NRG depois da sua reação. "M", "picol", "pico2" e "pico3" significam a proteína marcadora e a fração do pico de eluição 1, 2 e 3 da mistura da coluna S100. "NRG- mono-PEG", "NRG-di-PEG" e "NRG-poli-PEG" significam NRG ligado a um PEG5 dois PEG e múltiplos (pelo menos 3) PEG, respectivamente.
A Figura 3 mostra gel tingido com coomassie para detectar a proteína de NRG. As abreviações são a mesma como na figura 2. Na linha M, o peso molecular para cada faixa (do, fundo para acima) é 14,4 kD, 20,1 kD, 31,0 kD, 43,0 kD, 66,2 kD e 97,4 kD respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Embora quaisquer métodos similares ou equivalentes àqueles aqui descritos podem ser usados na prática da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.
A presente invenção fornece métodos para tratar ou prevenir a insuficiência cardíaca ou hipertrofia cardíaca em um mamífero pela liberação prolongada de uma quantidade prolongada ou variada de NRG. Preferivelmente, o mamífero é um paciente humano que sofre de ou em risco de desenvolver insuficiência cardíaca.
Para clareza de divulgação, e não por via de limitação, a descrição detalhada da invenção a seguir é dividida nas subseções que seguem. Todas as publicações aqui mencionadas são incorporadas por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com que as publicações são citadas.
A. Definições
A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como é habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações aqui aludidas são incorporadas por referência em sua totalidade. Se uma definição apresentada nesta seção é contrária a ou que de outro modo incompatível com uma definição apresentada nas patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações que são aqui incorporadas por referência, a definição apresentada nesta seção prevalece sobre a definição que é aqui incorporada por referência.
Como aqui usado, as formas singulares "um", "uma", e "o", "a" significam "pelo menos um(a)" ou "um(a) ou mais" a menos que o contexto claramente imponha que de outro modo.
Como aqui usado, "neuregulina" ou "NRG" usado na presente invenção refere-se às proteínas ou peptídeos que podem ligar e ativar ErbB2, ErbB3; ErbB4 ou combinações deste, incluindo mas não limitado a todas as isoformas de neuregulina, apenas o domínio de EGF de neuregulina, polipeptídeos que compreendem o domínio equivalente a EGF de neuregulina, mutantes ou derivados de neuregulina, e qualquer tipo de produtos de gene equivalentes a neuregulina que também ativam os receptores acima como descrito em detalhes abaixo. Em formas de realização preferidas, a neuregulina usada na presente invenção liga-se a e ativa heterodímeros ErbB2/ErbB4 ou ErbB2/ErbB3. A neuregulina também inclui as proteínas NRG-1, NRG-2, NRG-3, e NRG-4, peptídeos, fragmentos e compostos que imitam as atividades de neuregulina. A neuregulina usada na presente invenção pode ativar os receptores de ErbB acima e modulam as suas reações biológicas, por exemplo, estimulam a diferenciação de célula de câncer de mama e secreção de proteína do leite; induzem a diferenciação de célula de crista neural em célula de Schwann; estimulam a síntese do receptor de acetilcolina em célula de músculo esqueletal; e/ou melhoram a diferenciação, sobrevivência de cardiócito e síntese de DNA. A neuregulina também inclui aquelas variantes com substituições de aminoácido conservativas que não alteram substancialmente a sua atividade biológica. As substituições conservativas adequadas de aminoácidos são conhecidos por aqueles de habilidade nesta técnica e podem ser feitas no geral sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Aqueles de habilidade nesta técnica reconhecem que, no geral, as substituições de aminoácido únicas em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. co., p. 224).
A proteína de neuregulina abrange a proteína e peptídeo de neuregulina. O ácido nucléico de neuregulina abrange o ácido nucléico de neuregulina e oligonucleotídeo de neuregulina.
Como aqui usado, "domínio equivalente ao fator de crescimento epidérmico" ou "domínio equivalente a EGF" refere-se a um motivo de polipeptídeo codificado pelo gene de neuregulina que se liga a e ativa ErbB2, ErbB3, ErbB4, ou combinações destes, e carrega uma similaridade estrutural para o domínio de ligação de receptor de EGF como divulgado na WO 00/64400, Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); Patentes U.S. Nss 5.530.109 e 5.716.930; Hijazi et al, Int. J. Oncol., 13: 1061- 1067 (1998); Chang et al., Nature, 387: 509-512 (1997); Carraway et al., Nature, 387: 512-516 (1997); Higashiyama et al., J. Biochem., 122: 675-680 (1997); e WO 97/09425, os conteúdos dos quais são todos aqui incorporados por referência. Em certas formas de realização, o domínio equivalente a EGF liga-se a e ativa heterodímeros ErbB2/ErbB4 ou ErbB2/ErbB3. Em certas formas de realização, domínio equivalente a EGF compreende a seqüência de aminoácido do domínio de ligação de receptor de NRG-1. Em algumas formas de realização, domínio equivalente a EGF compreende a seqüência de aminoácido que corresponde aos resíduos de aminoácido 177-226, 177-237, ou 177-240 de NRG-1. Em certas formas de realização, domínio equivalente a EGF compreende as seqüências de aminoácido do domínio de ligação de receptor de NRG-2. Em certas formas de realização, domínio equivalente a EGF compreende a seqüência de aminoácido do domínio de ligação de receptor de NRG-3. Em certas formas de realização, domínio equivalente a EGF compreende a seqüência de aminoácido do domínio de ligação de receptor de NRG-4. Em certas formas de realização, domínio equivalente a EGF compreende a seqüência de aminoácido de Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro, como descrito na Pat. U.S. Ns 5.834.229.
Como aqui usado, uma "quantidade eficaz" de um agente ativo para tratar uma doença particular é uma quantidade que seja suficiente para melhorar, ou em alguma maneira reduzir os sintomas associados com a doença. A quantidade pode curar a doença mas, tipicamente, é administrado de modo a melhorar os sintomas da doença.
Como aqui usado, "agente ativo" significa qualquer substância intencionada para o diagnóstico, cura, mitigação, tratamento, ou prevenção de doença em seres humanos e outros animais, ou para os quais de outro modo realce o bem estar físico e mental.
Como aqui usado, "melhora" dos sintomas de um distúrbio particular pela administração de um agente ativo particular refere-se a qualquer diminuição, seja permanente ou temporária, duradoura ou transitória que possa ser atribuída a ou associado com a administração do agente.
Como aqui usado, "tratar", "tratamento" e "que trata" referem- se a qualquer maneira em que os sintomas de uma condição, distúrbio ou doença são melhorados ou que de outro modo beneficamente alterados. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completa ou parcialmente uma doença ou sintoma deste e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. Tratamento também abrange qualquer uso farmacêutico das composições aqui.
Como aqui usado, "vetor (ou plasmídeo)" referem-se a elementos separados que são usados para introduzir DNA heterólogo em células para a expressão ou replicação deste. A seleção e uso de tais veículos são bem conhecidos dentro da habilidade do técnico. Um vetor de expressão inclui vetores capazes de expressar DNA que são operativamente ligados com seqüências regulatórias, tais como regiões promotoras, que são capazes de efetuar a expressão de tais fragmentos de DNA. Assim, um vetor de expressão refere-se a uma construção de DNA ou RNA recombinante, tal como um plasmídeo; um fago, vírus recombinante ou outro vetor que, na introdução em uma célula hospedeira apropriada, resulta na expressão do DNA clonado. Os vetores de expressão apropriados são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica e incluem aquelas que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e aquelas que permanecem epissômicas ou aquelas que integram no genoma da célula hospedeira.
Como aqui usado, "diferenciação de célula de músculo cardíaco" significa uma condição caracterizada pela diminuição na síntese de DNA em mais do que 10 %, inibição de outra síntese de DNA estimulada por fator em mais do que 10%, estruturas sarcoméricas e adesões de célula-célula bem organizadas, ativação prolongada de MAP quinases, e expressão realçada de p21clp1. Além disso, o debate é fornecido na WO 00/37095, os conteúdos da qual são aqui incorporados por referência em suas totalidades.
Como aqui usado, "fração de ejeção" ou "EF" significa a porção de sangue que é bombeada para fora de um ventrículo cheio como o resultado de um batimento cardíaco. A mesma pode ser definida pela seguinte fórmula: (volume diastólico LV - volume sistólico LV) / volume diastólico LV.
Como aqui usado, "encurtamento fracionário" ou "FS" significa uma razão da mudança no diâmetro do ventrículo esquerdo entre os estados contraído e relaxado. O mesmo pode ser definido pela seguinte fórmula: (diâmetro diastólico final LV - diâmetro sistólico final LV) / diâmetro diastólico final LV.
Como aqui usado, "insuficiência cardíaca" significa uma anormalidade da função cardíaca onde o coração não bombeia sangue na taxa necessária para as exigências dos tecidos metabolizantes. A insuficiência inclui uma ampla faixa de estados de doença tais como insuficiência cardíaca congestiva, infartação do miocárdio, taquiarritimia, cardiomiopatia hipertrófica familiar, doença cardíaca isquêmica, cardiomiopatia dilatada idiopática, miocardite e outros. A insuficiência cardíaca pode ser causada por qualquer número de fatores, incluindo, sem limitação, as formas isquêmicas, congênitas, reumáticas ou idiopáticas. A hipertrofia cardíaca crônica é um estado significantemente doente que é um precursor para a insuficiência cardíaca congestiva e parada cardíaca.
Como aqui usado, "infartação do miocárdio" refere-se a um bloqueio de uma artéria coronária ou interrupção do fluxo sangüíneo que leva à necrose focai de parte do miocárdio causada pela isquemia grave e persistente. Como aqui usado, "liberação prolongada" refere-se ao fornecimento de nível terapêutico contínuo de um agente ativo (por exemplo, neuregulina) em um período de tempo. A liberação prolongada inclui, sem limitação várias formas de liberação, tal como a liberação contínua, liberação controlada, liberação retardada, depósito, liberação gradual, liberação de longa duração, liberação programada, liberação prolongada, liberação proporcionada, liberação demorada, repositório, retardo, liberação lenta, liberação espaçada, liberação prolongada, revestimento com o tempo, liberação com o tempo, ação retardada, ação prolongada, ação com o tempo em camada, ação longa, ação prolongada; ação repetida, ação lenta, ação prolongada, medicações de ação prolongada, e liberação controlada. A capacidade para se obter a liberação prolongada, liberação controlada, liberação com o tempo, liberação prolongada, liberação retardada, ação longa, liberação pulsátil ou liberação imediata é realizada usando procedimentos e técnicas bem conhecidos disponíveis ao técnico de forma geral habilitado.
A quantidade de tempo em que o agente ativo continua a ser liberado depende das características do agente ativo e da tecnologia ou tecnologias de liberação prolongada usadas, mas em todos os casos é mais longo do que aquela da administração do agente ativo sem a tecnologia ou tecnologias de liberação prolongada.
Como aqui usado, "microesfera" é sinônimo com "micropartícula", "microcápsula", "nanoesfera", "nanopartícula" e "nanocápsula" a menos que o contexto claramente imponha de outro modo.
Como aqui usado, "peguilado" significa ligar pelo menos uma molécula de Poli(etileno glicol) ou pelo menos um derivado de Poli (etileno glicol) a um agente ativo ou outra molécula.
Como aqui usado, "organizado, ou organização realçada de sarcômeros ou estruturas sarcoméricas" significa uma condição caracterizada pela estrutura ordenada contínua de proteínas contráteis reveladas pelo tingimento imunofluorescente de α-actinina em células do músculo cardíaco. A estrutura ordenada contínua de proteínas de α-actinina em células pode ser distinguida pela microscopia e a sua fotografia conectada. Como aqui usado, "desorganizado ou desordem de sarcômeros ou estruturas sarcoméricas" significa o oposto do "organizado, ou organização realçada de sarcômeros ou estruturas sarcoméricas"
Como aqui usado, "organizado, ou organização realçada de estruturas de citoesqueleto" significa uma condição caracterizada pelas fibras de actina contínuas reveladas pelo tingimento de faloidina de células do músculo cardíaco. As fibras de actina contínuas nas células podem ser distinguidas pela microscopia e sua fotografia conectada como exemplificado nas figuras deste relatório descritivo. Como aqui usado, "desorganizado ou desordem de estruturas de citoesqueleto" significa o oposto de "organizado, ou organização realçada de estruturas de citoesqueleto".
Como aqui usado, "proteína" é sinônimo com "polipeptídeo" ou "peptídeo" a menos que o contexto claramente imponha de outro modo.
Como aqui usado, "ativação prolongada de MAP quinases" significa que o estado fosforilado de MAP quinases, p42/44, é mantido por pelo menos 21 horas nas células. Debate adicional é fornecido na WO00/37095, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência.
Os termos "sinergístico, "efeito sinergístico" e semelhante são aqui usados para descrever efeitos de tratamento melhorados obtidos pela combinação de um ou mais agentes terapêuticos com um ou mais compostos do ácido retinóico. Embora um efeito sinergístico em alguns campos é intencionado um efeito que seja mais do que aditivo (por exemplo, 1 + 1=3), no campo da terapia médica um aditivo (1 + 1 = 2) ou menos do que um efeito aditivo (1 + 1 = 1,6) podem ser sinergísticos. Por exemplo, se cada um de dois medicamentos foram para inibir o desenvolvimento da hipertrofia de célula muscular ventricular em 50 % se dados individualmente, não seria esperado que os dois medicamentos fossem combinados para deter completamente o desenvolvimento da hipertrofia de célula muscular ventricular. Em muitos casos, devido a efeitos colaterais inaceitáveis, os dois medicamentos não podem ser administrados juntos. Em outros casos, os medicamentos se anulam um ao outro e retardam o desenvolvimento da hipertrofia de célula muscular ventricular em menos de 50 % quando administrados juntos. Assim, um efeito sinergístico é dito ser obtido se os dois medicamentos retardam o desenvolvimento da hipertrofia de célula muscular ventricular em mais do que 50 % enquanto não causam um aumento inaceitável nos efeitos colaterais adversos.
Como aqui usado "hipertrofia cardíaca" significa uma condição caracterizada por um aumento no tamanho das células do músculo ventricular individuais, o aumento no tamanho da célula sendo suficiente para resultar em um diagnóstico clínico do paciente ou suficiente como para permitir que as células sejam determinadas como maiores (por exemplo, 2 vezes, ou mais, maiores do que as células não hipertróficas). Isto pode ser acompanhado pelo acúmulo de proteínas contráteis dentro das células cardíacas individuais e ativação da expressão de gene embrionário. Os métodos in vitro e in vivo para determinar a presença da hipertrofia de célula muscular ventricular são conhecidos. Os ensaios in vitro para a hipertrofia de célula muscular ventricular incluem aqueles métodos descritos na WO00/37095, por exemplo, o tamanho da célula aumentado e a expressão aumentada de fator natriurético atrial (ANP). As mudanças no tamanho da célula são usadas em um sistema de classificação para determinar o grau de hipertrofia. Estas mudanças podem ser visualizadas com um microscópio de fase invertida, e o grau de hipertrofia contada com uma escala arbitrária de 7 a O, com 7 sendo células totalmente hipertroficadas, e 3 sendo células não estimuladas. Os estados 3 e 7 podem ser observados em Simpson et al. (1982) Circulation Res. 51: 787-801, Figura 2, A e B, respectivamente.
A correlação entre contagem de hipertrofia e área de superfície celular (μm2) foi determinada ser linear (coeficiente de correlação = 0,99). Na hipertrofia induzida por fenilefrina, as células não expostas (normais) têm uma contagem de hipertrofia de 3 e uma área de superfície/célula de 581 μm2 e as células totalmente hipertroficadas têm uma contagem de hipertrofia de 7 e uma área de superfície/célula de 1811 μm2 , ou aproximadamente 200 % da normal. As células com uma contagem de hipertrofia de 4 têm uma área de superfície/célula de 771 μm2 , ou aproximadamente 30 % maior de tamanho do que as células não expostas; as células com uma contagem de hipertrofia de 5 têm uma área de superfície/célula de 1109 μm2 , ou aproximadamente 90 % maior de tamanho do que as células não expostas; e células com uma contagem de hipertrofia de 6 têm uma área de superfície/célula de 1366 μm2, ou aproximadamente 135 % maior de tamanho do que as células não expostas. A presença de hipertrofia de célula muscular ventricular preferivelmente inclui células que exibem um tamanho aumentado de cerca de 15 % (contagem de hipertrofia 3,5) ou mais. Indutores de hipertrofia variam na sua capacidade para induzir uma resposta hipertrófica máxima como contada pelo ensaio descrito acima. Por exemplo, o aumento máximo no tamanho da célula induzido pela endotelina é aproximadamente uma contagem de hipertrofia de 5.
Como aqui usado, "supressão de hipertrofia cardíaca" significa uma redução em um dos parâmetros que indicam a hipertrofia relativa à condição hipertróflca, ou uma prevenção de um aumento em um dos parâmetros indicando a hipertrofia em relação à condição normal. Por exemplo, a supressão de hipertrofia de célula muscular ventricular pode ser medida como uma redução no tamanho da célula em relação à condição hipertróflca. A supressão da hipertrofia de célula muscular ventricular significa uma diminuição do tamanho da célula de 10 % ou maior em relação àquela observada na condição hipertróflca. Mais preferivelmente, a supressão de hipertrofia significa uma diminuição no tamanho da célula de 30 % ou maior; mais preferivelmente, a supressão de hipertrofia significa uma diminuição do tamanho da célula de 50 % ou mais. Em relação ao ensaio de contagem de hipertrofia quando fenilefrina é usado como o agente indutor, esta diminuição correlacionar-se-ia com as contagens de hipertrofia de cerca de 6,5 ou menos, 5,0 a 5,5, e 4,0 a 5,0, respectivamente. Quando um agente diferente é usado como o agente indutor, a supressão é examinada em relação ao tamanho da célula máximo (ou contagem hipertróflca) medido na presença deste indutor.
A prevenção de hipertrofia de célula muscular ventricular é determinada pela prevenção de um aumento no tamanho da célula em relação às células normais, na presença de uma concentração de indutor suficiente para induzir totalmente a hipertrofia. Por exemplo, prevenção de hipertrofia significa um aumento no tamanho da célula de menos do que 200 % maior do que as células não induzidas na presença de concentração estimuladora máxima de indutor. Mais preferivelmente, prevenção de hipertrofia significa um aumento no tamanho de célula de menos do que 135 % maior do que as células não induzidas; e mais preferivelmente, a prevenção de hipertrofia significa um aumento do tamanho da célula de menos do que 90 % maior do que as células não induzidas. Em relação ao ensaio de contagem de hipertrofia quando fenilefrina é usada como o agente indutor, a prevenção de hipertrofia na presença de uma concentração estimuladora máxima de fenilefrina significa uma contagem hipertrófica de cerca de 6,0 a 6,5, 5,0 a 5,5, e 4,0 a 4,5, respectivamente.
A determinação in vivo de hipertrofia pode incluir a medição de parâmetros cardiovasculares tais como pressão sangüínea, freqüência cardíaca, resistência vascular sistêmica, contratibilidade, força de batimento cardíaco, hipertrofia concêntrica ou dilatada, pressão sistólica ventricular esquerda, pressão média ventricular esquerda, pressão diastólica final ventricular esquerda, débito cardíaco, índice de acidente vascular cerebral, parâmetros histológicos e tamanho ventricular e espessamento da parede. Os modelos de animal disponíveis para a determinação de desenvolvimento e supressão da hipertrofia de célula muscular ventricular in vivo incluem o modelo de camundongo de sobre carga de pressão, modelo disfuncional de murino RV, modelo de camundongo transgênico, e modelo de rato de pós infartação do miocárdio. Os métodos médicos para avaliar a presença, desenvolvimento e supressão de hipertrofia de célula muscular ventricular em pacientes humanos são conhecidos e incluem, por exemplo, medições de parâmetros diastólicos e sistólicos, estimativas de massa ventricular e fluxos de veia pulmonar.
A hipertrofia pode ser de qualquer causa que seja responsiva ao ácido retinóico, incluindo causas virais congênitas, idiopáticas, cardiotróficas ou miotróficas ou como um resultado de isquemia ou insultos isquêmicos tais como infartação do miocárdio. Tipicamente, o tratamento é realizado para deter ou retardar a progressão de hipertrofia, especialmente depois que o dano cardíaco, tal como da isquemia, tenha ocorrido. Preferivelmente, para o tratamento de infartações miocárdicas, o(s) agente(s) é(são) dado(s) imediatamente depois da infartação do miocárdio, para prevenir ou diminuir a hipertrofia.
Como aqui usado, "unidade de atividade" ou "IU" significa a quantidade de produto padrão que pode induzir 50 % de reação máxima. Em outras palavras, para determinar a unidade de atividade para um dado agente ativo, a EC50 deve ser medida. Por exemplo, se a EC50 para um lote de produto foi 0,067 μ£/ηι1 então esta seria uma unidade. Além disso, se 1 μg deste produto está sendo usado então 14,93U (1 / 0,067) está sendo usada. A EC50 pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo o método utilizado pelos inventores nos Exemplos abaixo; Esta determinação da unidade de atividade é importante para o controle de qualidade de produtos geneticamente engendrados e medicamentos clinicamente usados, permite produzir a partir de produtos farmacêuticos diferentes e/ou números de lote diferentes sejam quantificados com critérios uniformes.
Em certas formas de realização, a unidade de neuregulina é determinada medindo-se a atividade de neuregulina através do ensaio imunossorvente ligado a enzima pela ativação de receptor da quinase (KIRA- ELISA) como descrito em detalhes no Exemplo 6 abaixo e na WO 03/099300 e Sadick et al., 1996, Analytical Biochemistry, 235: 207-14, os conteúdos dos quais são incorporados por referência em suas totalidades. Em resumo, o ensaio mede a ativação de ErbB2 induzida pela neuregulina e fosforilação na linhagem de célula de carcinoma mamário aderente, MCF-7. As proteínas de membrana são solubilizadas por intermédio da Iise por Triton X-100 e o receptor é capturado em reservatórios de ELISA revestidos com anticorpos específicos de ErbB2 (por exemplo, F14) sem nenhuma reação cruzada para ErbB3 ou ErbB4. O grau de fosforilação de receptor é depois quantificado pelo ELISA antifosfotirosina.
B. Neuregulina A presente invenção fornece métodos para tratar ou prevenir a insuficiência cardíaca ou hipertrofia cardíaca em um mamífero pela liberação prolongada de uma quantidade prolongada ou variada de NRG. Qualquer proteína, peptídeo ou fragmento de NRG (por exemplo, NRG-1, NRG-2, NRG-3 e NRG-4 e isoformas destes), podem ser usados na prática desta invenção.
A neuregulina ou NRG referem-se às proteínas ou peptídeos que podem ligar e ativar ErbB2, ErbB3, ErbB4 ou combinações deste, incluindo mas não limitado a todas as isoformas de neuregulina, apenas o domínio EGF de neuregulina, polipeptídeos que compreendem domínio de neuregulina equivalente a EGF, mutantes ou derivados de neuregulina e qualquer tipo de produtos de gene equivalentes a neuregulina que também ativam os receptores acima como descrito em detalhes abaixo. Em formas de realização preferidas, a neuregulina usada na presente invenção liga-se a e ativa heterodímeros de ErbB2/ErbB4 ou ErbB2/ErbB3. A neuregulina usada na presente invenção pode ativar os receptores de ErbB acima e modulam as suas reações biológicas, por exemplo, estimulam a diferenciação de célula do câncer de mama e a secreção de proteína do leite; induzem a diferenciação de célula da crista neural em célula de Schwann; estimulam a síntese de receptor de acetilcolina em célula de músculo esqueletal; e/ou melhoram a diferenciação, sobrevivência e síntese de DNA de cardiócito. Os ensaios para medir a atividade de ligação de receptor são conhecidos na técnica. Por exemplo, as células transfectadas com receptor de ErbB-2 e ErbB-4 podem ser usadas. Depois as células que expressam receptor são incubadas com quantidade em excesso de neuregulina radiorrotulada, as células são pelotizadas e a solução contendo neuregulina radiorrotulada não ligada é removida antes que a solução de neuregulina não ligada seja adicionada para competir com a neuregulina radiorrotulada. A EC50 é medida pelos métodos conhecidos na técnica. A EC50 é a concentração de ligandos que podem competir com 50 % de ligandos radiorrotulados ligados fora do complexo receptor. Quanto mais alto o for o valor EC50, mais baixa é a afinidade de ligação do receptor.
A neuregulina usada na presente invenção inclui qualquer neuregulina e isoformas destas conhecidas na técnica, incluindo mas não limitado a todas as isoformas de neuregulina-1 ("NRG-1"), neuregulina-1 ("NRG-2"), neuregulina-1 ("NRG-3") e neuregulina-4 ("NRG-43"). NRG-I é descrito, por exemplo, nas Pats. U.S. N25 5.530.109, 5.716.930 e 7.037.888; Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 1996, 7: 247-262; Peles e Yarden, 1993, BioEssays 15: 815-824, 1993; Peles et ai, 1992, Cell 69, 205-216; Wen et al., 1992, Cell 69, 559-572, 1992, Holmes et ai, 1992, Science 256: 1205-1210, Falls et al., 1993, Cell 72: 801-815, Marchionni et al. 1993, Nature 362: 312- 8, os conteúdos dos quais são incorporados por referência em suas totalidades. NRG-2 é descrito, por exemplo, em Chang et al., 1997, Nature 387: 509-512; Carraway et al., 1997, Nature 387: 512-516; Higashiyama et al., 1997, J. Biochem. 122: 675-680, Busfield et al., 1997, Mol. Cell. Biol. 17: 4007-4014 e Pub. De Pat. Internacional N2 WO 97/09425), os conteúdos dos quais são incorporados por referência em suas totalidades. NRG-3 é descrito, por exemplo, em Hijazi et al., 1998, Int. J. Oncol. 13: 1061-1067, os conteúdos dos quais são incorporados por referência em suas totalidades. NRG-4 é descrito, por exemplo, em Harari et al., 1999 Oncogene. 18: 2681-89, os conteúdos dos quais são incorporados por referência em suas totalidades.
A neuregulina usada na presente invenção inclui mutantes ou derivados de neuregulina que compreendem uma ou mais substituições, deleções, e/ou adições de aminoácido que não estão presentes na neuregulina que ocorre naturalmente. Preferivelmente, o número de aminoácidos substituídos, deletados ou adicionados é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em uma forma de realização, um tal derivado contêm uma ou mais deleções, substituições ou adições de aminoácido na extremidade de terminal amino e/ou carbóxi do peptídeo. Em uma outra forma de realização, um tal derivado contêm uma ou mais deleções, substituições ou adições de aminoácido em qualquer resíduo dentro do comprimento do peptídeo.
Em certas formas de realização, as substituições de aminoácido podem ser substituições de aminoácido conservativas ou não conservativas. As substituições de aminoácido conservativas são fabricadas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos de aminoácido envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Além disso, glicina e prolina são resíduos que podem influenciar a orientação de cadeia. As substituições não conservativas acarretarão necessariamente a mudança de um membro de uma destas classes no lugar de uma outra classe.
Em certas formas de realização, a neuregulina usada na presente invenção é um derivado de neuregulina com substituições de aminoácido conservativas que não alteram substancialmente a sua atividade biológica. As substituições conservativas adequadas de aminoácidos são conhecidas por aqueles de habilidade nesta técnica e podem ser feitas no geral sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Aqueles de habilidade nesta técnica reconhecerão que, no geral, as substituições de aminoácido único em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et ai. Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, 1987; The Bejacmin/Cummings Pub. co., p. 224).
Em certas formas de realização, a neuregulina usada na presente invenção inclui mutantes ou derivados de neuregulina tendo uma substituição de aminoácido com um aminoácido não clássico ou análogo de aminoácido químico. Os aminoácidos não clássicos incluem, mas não são limitados aos isômeros D dos aminoácidos comuns, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, 7-Abu, a- Ahx, ácido 6-amino hexanóico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, cicloexilalanina, β-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos planejadores tais como n-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos e análogos de aminoácido no geral.
A neuregulina usada na presente invenção inclui homólogo de neuregulina, isto é, um polipeptídeo que exibe uma homologia de seqüência de aminoácido e/ou semelhança estrutural com a neuregulina ou com um dos domínios influenciadores de neuregulina tal que a mesma seja capaz de ligar e ativar heterodímeros de ErbB2/ErbB4 ou ErbB2/ErbB3 proteína quinases. Tipicamente, um homólogo de proteína de uma proteína nativa pode ter uma seqüência de aminoácido que seja pelo menos 50 %, preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % ou 89 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 % ou 94 % e o mais preferivelmente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticas à proteína nativa.
A homologia percentual neste contexto significa a porcentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que são idênticas (isto é, os resíduos de aminoácido em uma dada posição no alinhamento são o mesmo resíduo) ou similar (isto é, a substituição de aminoácido em uma dada posição no alinhamento é uma substituição conservativa, como debatido acima), ao resíduo de aminoácido correspondente no peptídeo depois de alinhar as seqüências e introduzir intervalos, se necessário, para se obter a homologia de seqüência percentual máxima. Em certas formas de realização, o homólogo de neuregulina é caracterizado pela sua identidade de seqüência percentual ou similaridade de seqüência percentual com a seqüência de neuregulina que ocorre naturalmente. A homologia de seqüência, incluindo porcentagens de identidade e similaridade de seqüência, são determinados usando técnicas de alinhamento de seqüência bem conhecidos na técnica, preferivelmente algoritmos de computador planejados para este propósito, usando os parâmetros padrão dos ditos algoritmos de computador ou os pacotes de software que os contenham.
Os exemplos não limitantes de algoritmos de computador e pacotes de software que incorporam tais algoritmos incluem os seguintes. A família BLAST de programas exemplificam um exemplo preferido, não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas seqüências (por exemplo, Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268 (modificado como em Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5877), Altschul et ai, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410, (que descrevem NBLAST e XBLAST), Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (que descrevem Gapped BLAST e PSI- Blast). Um outro exemplo preferido é o algoritmo de Myers e Miller (1988 CABIOS 4: 11-17) que é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) e está disponível como parte do pacote de software de alinhamento de seqüência GCG. Também preferido é o programa FASTA (Pearson W. R. e Lipman D. J., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 85: 2444-2448, 1988), disponíveis como parte do Wisconsin Sequence Analysis Package. Exemplos adicionais incluem BESTFIT, que usa o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489, 1981) para encontrar a melhor região única de similaridade entre duas seqüências e que é preferível onde as duas seqüências que são comparadas são dissimilares no comprimento; e GAP, que alinha duas seqüências pela descoberta de uma "similaridade máxima" de acordo com o algoritmo de Neddleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443-354, 1970) e é preferível. Aqui que as duas seqüências tenham aproximadamente o mesmo comprimento e um alinhamento é esperado no comprimento inteiro.
Os exemplos de homólogos podem ser as proteínas ortólogas de outra espécie incluindo animais, plantas, levedura, bactérias e outros. Homólogos também podem ser selecionados, e.g., pela mutagênese em uma proteína nativa. Por exemplo, homólogos podem ser identificados pela mutagênese específica de gene em combinação com ensaios para detectar as interações de proteína-proteína. Os métodos adicionais, e.g., cromatografia de afinidade de proteína, manchamento de afinidade, ensaios de ligação in vitro e outros, estarão evidentes aos técnicos habilitados informados da presente invenção.
Para o propósito de comparar dois ácidos nucléicos diferentes ou seqüências de polipeptídeo, uma seqüência (seqüência de teste) pode ser descrita ser uma "porcentagem idêntica a" específica a uma outra seqüência (seqüência de referência) na presente divulgação. Neste ponto de vista, quando o comprimento da seqüência de teste é menor do que 90 % do comprimento da seqüência de referência, a identidade percentual é determinada pelo algoritmo de Myers e Miller, Buli. Math. Biol., 51: 5-37 (1989) e Myers e Miller, Comput. Appl. Biosci., 4(1): 11-17 (1988). Especificamente, a identidade é determinada pelo programa ALIGN. Os parâmetros padrão podem ser usados.
Onde o comprimento da seqüência de teste é pelo menos 90 % do comprimento da seqüência de referência, a identidade percentual é determinada pelo algoritmo de Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-77 (1993), que é incorporado em vários programas BLAST. Especificamente, a identidade percentual é determinada pela ferramenta "BLAST 2 Sequences". Ver Tatusova e Madden, FEMS MicrobioL Lett., 174(2): 247-250 (1999). Para a comparação de DNA-DNA aos pares, o programa BLASTN 2.1.2 é usado com parâmetros padrão (Emparelhamento: 1; Desemparelhamento: -2; Intervalo de abertura: 5 penalidades; intervalo de extensão: 2 penalidades; intervalo x_dropoff: 50; expectativa: 10; e tamanho da palavra: 11, com filtro). Para a comparação de seqüência de proteína- proteína aos pares, o programa BLASTP 2.12 é utilizado usando parâmetros padrão (Matriz: BLOSUM62; abertura de intervalo: 11; extensão de intervalo: 1; x_dropoff: 15; expectativa: 10,0; e tamanho da palavra: 3, com filtro).
A neuregulina usada na presente invenção também inclui apenas o domínio de neuregulina EGF, polipeptídeos que compreendem o domínio de neuregulina EGF ou produtos de gene equivalentes a neuregulina que imitam as atividades de neuregulina e ligam e ativam ErbB2, ErbB3, ErbB4 ou combinações destes. Como aqui usado, "domínio equivalente ao fator de crescimento epidérmico" ou "domínio equivalente a EGF" referem-se a um motivo de polipeptídeo codificado pelo gene de neuregulina que se liga a e ativa ErbB2, ErbB3, ErbB4 ou combinações destes e carrega uma similaridade estrutural ao domínio de ligação de receptor EGF como divulgado na WO 00/64400, Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992);
Patentes U.S. N- 5.530.109 e 5.716.930; Hijazi etal., Int. J. Oncol., 13: 1061- 1067 (1998); Chang et al., Nature, 387: 509-512 (1997); Carraway et al., Nature, 387: 512-516 (1997); Higashiyama et al., J. Biochem., 122: 675-680 (1997); e WO 97/09425, os conteúdos dos quais são todos aqui incorporados por referência.
Em certas formas de realização, a neuregulina usada na presente invenção compreende o domínio equivalente a EGF codificado pela NRG-1. Em algumas formas de realização, o domínio equivalente a EGF compreende a seqüência de aminoácido do domínio de ligação de receptor de NRG-1. Em algumas formas de realização, o domínio equivalente a EGF compreende a seqüência de aminoácido que corresponde aos resíduos de aminoácido 177 a 226, 177 a 237 ou 177 a 240 de NRG-1.
Em formas de realização preferidas, a neuregulina usada na presente invenção compreende a seqüência de aminoácido de:
Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln (SEQ ID NO: 1), que corresponde aos aminoácidos 177 a 237 de NRG-1 humano. A seqüência de ácido nucléico humana que codifica o fragmento é:
agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac cag (SEQ ID NO:2).
Em certas formas de realização, a neuregulina usada na presente invenção compreende o domínio equivalente a EGF codificado pela NRG-2. Em certas formas de realização, a neuregulina usada na presente invenção compreende o domínio equivalente a EGF codificado pela NRG-3. Em certas formas de realização, a neuregulina usada na presente invenção compreende o domínio equivalente a EGF codificado pela NRG-4. Em certas formas de realização, a neuregulina usada na presente invenção compreende a seqüência de aminoácido de Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro, como descrita na Pat. U.S. N2 5.834.229.
C. Tecnologia de liberação prolongada no geral
A presente invenção fornece composições para a liberação prolongada de neuregulina e métodos para prevenir, tratar ou retardar várias doenças, tais como insuficiência cardíaca usando tal liberação prolongada de neuregulina permite a simplificação do esquema de administração, melhora a eficácia clínica e atenua eventos adversos, por exemplo, relacionado com níveis sangüíneo altos de neuregulina. E considerado que a liberação prolongada de neuregulina em um certo período pode induzir ou manter a expressão de certos genes para o crescimento e/ou diferenciação de cardiomiócito, remodelagem de estruturas sarcoméricas e de citoesqueleto de célula muscular ou adesões de célula-célula.
A liberação prolongada de neuregulina pode ser administrada por qualquer via de acordo com o julgamento daqueles habilitados na técnica, incluindo mas não limitado a oral, por inalação, parenteralmente (por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intradermicamente). Em certas formas de realização, a neuregulina é administrada oralmente. Em certas formas de realização, a neuregulina é administrada intravenosamente. Em certas formas de realização, a neuregulina é administrada intramuscularmente. Em formas de realização preferidas, a neuregulina é prolongadamente liberada à corrente sangüínea de um mamífero.
A neuregulina pode ser administrada por qualquer meio de liberação prolongada ou por quaisquer dispositivos de liberação que são conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Especificamente, qualquer meio prolongado ou dispositivos de liberação para a liberação de peptídeos conhecidos na técnica podem ser usados na presente invenção. Os exemplos incluem, mas não são limitados àqueles descritos nas Patentes U.S. N-: 3.845.770, 3.916.899, 3.536.809, 3.598.123, e 4.008.719, 5.674,533, 5.059.595, 5.591.767, 5.120.548, 5.073.543, 5.639.476, 5.354.556, 5.639.480, 5.733.566, 5.739.108, 5.891.474, 5.922.356, 5.972.891, 5.980.945, 5.993.855, 6.045.830, 6.087.324, 6.113.943, 6.197.350, 6.248.363, 6.264.970, 6.267.981, 6.376.461.6.419,961, 6.589.548, 6.613.358, 6.699.500, 6.740.634, 6.838.076, 6.866.866, 7.087.246; cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Tais formas de dosagem podem ser usadas para fornecer liberação prolongada de neuregulina usando, por exemplo, hidropropilmetil celulose, outras matrizes poliméricas, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos, revestimentos de camada múltipla, micropartículas, lipossomas, microesferas ou uma combinação destas para fornecer o perfil de liberação desejado em proporções variáveis. A invenção também abrange as formas de dosagem unitária única adequadas para a administração oral tais como, mas não limitado a, tabletes, cápsulas, cápsulas de gel e pílulas que são adaptadas para a liberação controlada.
A liberação prolongada de neuregulina fornece nível terapêutico contínuo de neuregulina em um período de tempo. Em algumas formas de realização, a neuregulina é liberada em um período de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 20 horas, 24 horas ou mais longo. Em algumas formas de realização, a neuregulina é liberada em um período de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias ou mais longo. Já em uma outra forma de realização, a neuregulina é liberada em um período de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas ou mais longo. Em uma outra forma de realização, a neuregulina é liberada em um período de 1 mês, 2 meses, 4 meses, 8 meses, 12 meses ou mais longo. Já em uma outra forma de realização, a neuregulina é liberada em um período de 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos ou mais longo. Em algumas formas de realização, a neuregulina é liberada em um período entre 1 hora e 2 semana, entre 2 horas e 2 semana, entre 4 horas a 24 horas, entre 4 dias e 10 dias. A quantidade de tempo em que a neuregulina é liberada pode depender de vários fatores tais como a tecnologia ou tecnologias de liberação prolongada usadas.
A liberação prolongada de neuregulina mantém a neuregulina no sangue dentro de uma faixa desejada, particularmente em um nível que está no nível eficaz mínimo õu acima dele e está abaixo do nível tóxico mínimo em um período de tempo. A concentração sérica de neuregulina em pacientes que receberam uma composição de neuregulina de liberação prolongada pode ser comparada com as concentrações séricas de pacientes que recebem uma composição de neuregulina que não de liberação prolongada (por exemplo, administração intravenosa) em um tempo quando a concentração de nível de sangüíneo máxima ocorre (Cmax). Em uma forma de realização preferida, os pacientes que recebem uma composição de neuregulina de liberação prolongada têm uma concentração sérica máxima (Cmax) mais baixa de neuregulina do que os pacientes que recebem uma composição de neuregulina não prolongada. Preferivelmente, os pacientes que recebem uma composição de neuregulina de liberação prolongada têm um Cmax menor do que cerca de 90 %, 80 %, 70 % ou 60 % da Cmax. Em pacientes que recebem uma composição de neuregulina de liberação não prolongada. Mais preferivelmente, os pacientes que recebem uma composição de neuregulina de liberação prolongada têm um Cmax menor do que cerca de 50 %, 40 % ou 30 % da Cmax em pacientes que recebem uma composição de neuregulina de liberação não prolongada. Preferivelmente, a maioria dos pacientes que recebem uma composição de neuregulina de liberação prolongada têm um Cmax menor do que cerca de 20 %, 10 % ou menos da Cmax em pacientes que recebem uma composição de neuregulina de liberação não prolongada. Os métodos para medir a concentração de neuregulina no soro são conhecidos na técnica. Por exemplo, as células que expressam receptores de ErbB-2 e ErbB-3, tais como a linhagem de célula de câncer de mama SKBR-3, podem ser usadas. 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,312, 0,156, 0,078, 0,039, 0,019 e 0,0079 ng de neuregulina são adicionados aos tubos diferentes contendo células separadamente em gelo, depois neuregulina radiorrotulada (50.000 cpm) é adicionada. A solução de amostra é misturada e deixada a 4o C durante a noite. Na manhã seguinte, as células são pelotizadas e o sobrenadante é sugado para fora antes que a radioatividade seja contada. Uma curva padrão é desenhada pela radioatividade versus a quantidade de neuregulina não rotulada. Quando da medição da concentração de neuregulina no soro, certa quantidade de soro é adicionada ao tubo contendo as células em gelo, a neuregulina radiorrotulada (50.000 cpm) é depois adicionada e a solução de amostra é misturada e deixada a 4o C durante a noite. Na manhã seguinte, as células são pelotizadas e o sobrenadante é sugada fora antes que a radioatividade seja contada. A radioatividade é contada e a quantidade de neuregulina no soro pode ser calculada de acordo com a curva padrão.
Vários perfis de liberação prolongada podem ser fornecidos de acordo com a presente invenção. "Perfil de liberação prolongada" significa um perfil de liberação em que menos do que 50 % da liberação total de neuregulina que ocorre no curso de implantação/inserção ou outro método de administrar neuregulina no corpo ocorre dentro das primeiras 24 horas de administração. Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o perfil de liberação prolongada é selecionado do grupo que consiste de: (a) o ponto de liberação de 50% que ocorre no tempo que está entre 24 e 48 horas depois da implantação/ inserção ou outro método de administração, (b) o ponto de liberação de 50% que ocorre em um tempo que está entre 48 e 96 horas depois da implantação/inserção ou outro método de administração, (c) o ponto de liberação de 50% que ocorre em um tempo que está entre 96 e 168 horas (1 semana) depois da implantação/inserção ou outro método de administração, (d) o ponto de liberação de 50 % que ocorre em um tempo que está entre 1 e 2 semanas depois da implantação/inserção ou outro método de administração, (e) o ponto de liberação de 50 % que ocorre em um tempo que está entre 2 e 4 semanas depois da implantação/ inserção ou outro método de administração, (f) o ponto de liberação de 50 % que ocorre em um tempo que está entre 4 e 8 semanas depois da implantação/inserção ou outro método de administração, (g) o ponto de liberação de 50 % que ocorre em um tempo que está entre 8 e 16 semanas depois da implantação/inserção ou outro método de administração, (h) o ponto de liberação de 50 % que ocorre em um tempo que está entre 16 e 52 semanas (1 ano) depois da implantação/ inserção ou outro método de administração e (i) o ponto de liberação de 50 % que ocorre em um tempo que está entre 52 e 104 semanas depois da implantação/inserção ou outro método de administração.
Adicionalmente, o uso da presente invenção pode reduzir o grau de flutuação ("DFL") de uma concentração plasmática do agente. DFL é uma medida de quanto os níveis plasmáticos de um medicamento variam no curso de um intervalo de dosagem. Quanto mais próximo o DFL está de zero (0), menor variação existe durante o curso de um período de dosagem. Assim um DFL reduzido significa que a diferença no pico e através dos níveis plasmáticos foi reduzida. Preferivelmente, os pacientes que recebem uma composição de liberação prolongada têm um DFL de aproximadamente 90 %, 80 %, 70 % ou 60 % do DFL em pacientes que recebem uma composição de liberação não prolongada. Mais preferivelmente, os pacientes que recebem uma composição de liberação prolongada têm um DFL de aproximadamente 50 %, 40 % ou 30 % do DFL em pacientes que recebem uma composição de liberação não prolongada. Mais preferivelmente, os pacientes que recebem uma composição de neuregulina de liberação prolongada têm um DFL de aproximadamente 20 %, 10 % ou menos do DFL em pacientes que recebem uma composição de neuregulina de liberação não prolongada.
Quaisquer tecnologias conhecidas na técnica para a liberação prolongada de uma biomolécula podem ser usadas na presente invenção. No geral, o tamanho e freqüência de dosagem é determinada pelas propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas do agente ativo. Quanto mais baixa a taxa de absorção, menos as concentrações sangüíneas flutuam dentro de um intervalo de dosagem. Isto permite que doses mais altas sejam dadas menos freqüentemente. Entretanto, muitos agentes ativos que são facilmente solúveis no corpo são usualmente absorvidos rapidamente e fornecem um estouro súbito de medicamento disponível. Um exemplo é pacientes de hipotensão que tomam produtos de nifedipina de liberação rápida. O uso de um produto de liberação prolongada evita que as concentrações sangüíneas iniciais altas que causam a redução súbita na pressão sangüínea e outras mudanças hemodinâmicas significantes tais como taquicardia reflexiva.
Adicionalmente, alguns agentes ativos são alvejados e removidos ou destruídos pelo corpo, por exemplo, sistema imune, proteases. Medicamentos com meia-vidas curtas por esta e outras razões freqüentemente necessitam ser administrados com o agente ativo em intervalos freqüentes para manter as concentrações sangüíneas dentro da faixa terapêutica. Existe uma correlação inversa entre a freqüência de dosagem e a aceitação do paciente. Para tais agentes com meia-vidas relativamente curtas, o uso de produtos de liberação prolongada pode manter concentrações terapêuticas em períodos prolongados. Assim, uma redução no número de doses diárias oferecidas pelos produtos de liberação prolongada tem o potencial para melhorar a aceitação. Embora as tecnologias de liberação prolongada específicas sejam aqui divulgadas, a invenção é mais geral do que qualquer tecnologia de liberação prolongada específica. Isto inclui a descoberta de que a liberação prolongada de NRG em doses baixas inesperadamente melhora a função do coração enfartado. Além disso, existem numerosas tecnologias de liberação de medicamento de liberação prolongada correntemente conhecidas na técnica. Diversas são no geral debatidas abaixo como tecnologias de liberação prolongada preferidas, mas elas são oferecidas unicamente para propósitos de ilustração e não de limitação. Muitas outras tecnologias relacionadas e não relacionadas são bem conhecidas na técnica e podem ser utilizadas na prática da invenção aqui divulgada. Adicionalmente, as combinações das tecnologias de liberação prolongada aqui debatidas e/ou outras tecnologias de liberação prolongada conhecidas na técnica podem ser utilizadas na prática desta invenção. Por exemplo, muitas companhias com habilidades específicas nas tecnologias de liberação de medicamento de liberação prolongada - por exemplo, Alza Corp., Durect Corp., Gilead Sciences, Baxter Pharmaceuticals, Brookwood Pharmaceuticals e OctoPlus - oferecem produtos e serviços que podem ser utilizados na prática desta invenção. Adicionalmente, uma pesquisa de patentes, pedidos de patente publicados e publicações relacionadas proverão aqueles de habilidade na técnica que lerem esta divulgação com tecnologias de liberação prolongada possíveis significantes. Assim, uma pessoa habilitada na técnica será capaz de selecionar a tecnologia ou tecnologias de liberação prolongada desejadas para o uso na prática desta invenção. C. 1. Bombas Osmóticas
Em uma forma de realização da presente invenção, a liberação prolongada de NRG no sangue compreende o uso de uma bomba osmótica. Os dispositivos osmóticos têm demonstrado utilidade na liberação de agente ativos benéficos a uma área alvo em uma maneira controlada em períodos prolongados de tempo. Os Dispositivos conhecidos incluem tabletes, pílulas, cápsulas e dispositivos implantáveis. Tabletes e pílulas podem ser tomados oralmente, ao passo que outras bombas são implantadas subcutânea ou intraperitonealmente ou ligadas a um cateter para a infusão intravenosa, intracerebral ou intra-arterial.
No geral, em um sistema de bomba osmótica, um núcleo é envolvido por uma membrana semipermeável tendo pelo menos um orifício. A membrana semipermeável é permeável à água, mas impermeável ao agente ativo. Quando o sistema é exposto aos fluídos corporais, a água penetra através da membrana semipermeável no núcleo contendo excipientes osmóticos e o agente ativo. A pressão osmótica aumenta dentro do núcleo e o agente é deslocado através do orifício em uma taxa controlada; pré determinada.
Em muitas bombas osmóticas, o núcleo contém mais do que um compartimento interno. Por exemplo, um primeiro compartimento pode conter o agente ativo. Um segundo compartimento contém um agente osmótico e/ou "membro acionador." Ver, por exemplo, a Pat. U.S. N° 5.573.776, os conteúdos da qual são aqui incorporados por referência. Este compartimento pode ter uma alta osmolalidade, que faz com que a água flua na bomba através da membrana semipermeável. O influxo de água comprime o primeiro compartimento. Isto pode ser realizado, por exemplo, usando-se um polímero no segundo compartimento, que intumesça no contato com o fluido. Conseqüentemente, o agente é deslocado a uma taxa pré determinada.
Em uma outra forma de realização, a bomba osmótica pode compreender mais do que um compartimento contendo agente ativo, com cada compartimento contendo o mesmo agente ou um agente diferente. As concentrações do agente em cada compartimento, assim como a taxa de liberação, também podem ser as mesmas ou diferentes.
A taxa de liberação é no geral controlada pela permeabilidade á água da membrana semipermeável. Assim, o perfil de liberação da bomba é independente do agente dispensado e do peso molecular de um agente ou as suas propriedades físicas e químicas, no geral não têm nenhuma ligação com a sua taxa de liberação. Debate adicional com respeito ao princípio de operação, aos critérios de planejamento e à taxa de liberação para bombas osmóticas é fornecido em Theeuwes e Yum, Annals of Biomedical Engineering, Vol. 4, No. 4 (1976) e Urquhart et ai., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984), os conteúdos dos quais são incorporados por referência.
As bombas osmóticas são bem conhecidas na técnica e facilmente disponíveis a uma pessoa de habilidade comum na técnica de empresas experimentadas no fornecimento de bombas osmóticas para a liberação de medicamento pela liberação prolongada. Por exemplo, a tecnologia DUROS® da ALZA é um sistema implantável, não biodegradável, osmoticamente acionado que permite a liberação de medicamentos pequenos, peptídeos, proteínas, DNA e outras macromoléculas bioativas por até um ano; a tecnologia OROS® da ALZA contém tabletes que utilizam a osmose para fornecer a liberação de medicamento precisa, controlada por até 24 horas; O sistema Osmodex® da Osmotica Pharmaceutical inclui um tablete, que pode ter mais do que uma camada do(s) medicamento(s) com o mesmo ou diferente perfil de liberação; o sistema EnSoTrol® da Shire Laboratories solubiliza os medicamentos dentro do núcleo e libera o medicamento solubilizado através de um furo perfurado por laser pela osmose; e as bombas osmóticas Alzet ® são bombas em miniatura, implantáveis usadas para a pesquisa em camundongos, ratos e outros animais de laboratório.
Uma pesquisa de patentes, pedidos de patente publicados e publicações relacionadas também proverão aqueles habilitados na técnica na leitura desta divulgação com tecnologias de bomba osmótica possíveis significantes. Por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 6.890.918, 6.838.093, 6.814.979, 6.713.086, 6.534.090, 6.514.532, 6.361.796, 6.352.721, 6.294.201, 6.284.276, 6.110.498, 5.573.776, 4.200.0984, e 4.088.864, os conteúdos das quais são aqui incorporados por referência, descrevem bombas osmóticas e métodos para a sua fabricação. Uma pessoa habilitada na técnica, considerando tanto a divulgação desta invenção quanto as divulgações destas outras patentes poderia produzir uma bomba osmótica para a liberação prolongada de NRG.
Os materiais típicos para a membrana semipermeável incluem polímeros semipermeáveis conhecidos na técnica como membranas de osmose e osmose reversa, tais como acilato de celulose, diacilato de celulose, triacilato de celulose, acetato de celulose, diacetato de celulose, triacetato de celulose, acetato de ágar, triacetato de amilase, acetato de beta glicano, acetaldeído dimetil acetato, acetato etil carbamato de celulose, poliamidas, poliuretanos, poliestirenos sulfonados, acetato ftalato de celulose, acetato metil carbamato de celulose, acetato succinato de celulose, acetato dimetil aminoacetato de celulose, acetato etil carbamato de celulose, acetato cloracetato de celulose, dipalmitato de celulose, dioctanoato de celulose, dicaprilato de celulose, dipentanlato de celulose, acetato valerato de celulose, acetato succinato de celulose, propionato de celulose, metil succinato de celulose, acetato p-tolueno sulfonato de celulose, acetato butirato de celulose, polímeros reticulados seletivamente semipermeáveis formados pela coprecipitação de um poliânion e um policátion, polímeros semipermeáveis, derivados de poliestireno levemente reticulados, poli(estireno sulfonato de sódio) reticulado, poli(cloreto de vinilbenziltrimetil amônio), acetato de celulose tendo um grau de substituição até 1 e um teor de acetila até 50 %, diacetato de celulose tendo um grau de substituição de 1 a 2 e um teor de acetila de 21 a 35 %, triacetato de celulose tendo um grau de substituição de 2 a 3 e um teor de acetila de 35 a 44,8 %, como divulgado na Pat. U.S. N2 6.713.086, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência.
O(s) agente(s) osmótico(s) presente(s) na bomba pode(m) compreender qualquer composto(s) osmoticamente eficaz(es) que exiba(m) um gradiente de pressão osmótica através da parede semipermeável contra o fluido exterior. Os agentes eficazes incluem, sem limitação, sulfato de magnésio, sulfato de cálcio, cloreto de magnésio, cloreto de sódio, cloreto de lítio, sulfato de potássio, carbonato de sódio, sulfito de sódio, sulfato de lítio, cloreto de potássio, sulfato de sódio, d-manitol, uréia, sorbitol, inositol, rafinose, sacarose, flucose, polímeros hidrofílicos tais como polímeros de celulose, misturas destes e outros, como divulgados na Pat. U.S. N° 6.713.086, os conteúdos da qual são aqui incorporados por referência.
O "membro acionador" é tipicamente um polímero hidrofílico que interage com fluidos biológicos e intumesce ou expande. O polímero exibe a capacidade para intumescer em água e reter uma porção significante da água embebida dentro da estrutura polimérica. Os polímeros intumescem ou expandem a um grau muito alto, usualmente exibindo um aumento de volume de 2 a 50 vezes. Os polímeros podem ser não reticulados ou reticulados. Os polímeros hidrofílicos adequados para o presente propósito são bem conhecidos na técnica.
O orifício pode compreender quaisquer meios e métodos adequados para a liberação do agente ativo do sistema. A bomba osmótica pode incluir uma ou mais aberturas ou orifícios que foram furados através da membrana semipermeável por procedimentos mecânicos conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado ao uso de laseres como divulgado na Pat. U.S. Ne 4.088.864. Alternativamente, o mesmo pode ser formado pela incorporação de um elemento erodível, tal como um tampão de gelatina, na membrana semipermeável.
Embora formas de realização específicas de bombas osmóticas sejam debatidas acima, a invenção é mais geral do que qualquer tecnologia de liberação prolongada específica. Isto inclui a descoberta de que a liberação prolongada de NRG melhora a função do coração enfartado e reduz o 15 diâmetro interno do ventrículo esquerdo. Existem numerosas variações e tipos diferentes de bombas osmóticas correntemente conhecidos na técnica e podem ser utilizados na prática da invenção aqui divulgada. C. 2. Ligação de Poli(etileno glicol)
Em uma forma de realização da presente invenção, a liberação prolongada de NRG no sangue compreende a ligação do agente ativo a um polímero, tal como Poli(etileno glicol) (daqui em diante aludido como "PEG"). A ligação de PEG a agentes biologicamente ativos tem demonstrado utilidade na liberação de agente ativos a uma área alvo em um maneira controlada em períodos prolongados de tempo. Particularmente, a modificação de proteínas com PEG tem sido extensivamente usada dentro da indústria da biotecnologia para reduzir a antigenicidade de agentes terapeuticamente ativos e para prolongar a sua disponibilidade in vivo. Por exemplo, a ligação de PEG à adenosina desaminase bovina usando cloreto cianúrico resulta em uma perda de imunogenicidade. Similarmente, o aduto de PEG tanto do hormônio do crescimento humano quanto da L-asparaginase de E. coli mostrou ter uma meia-vida circulatória prolongada.
A ligação de PEG a um agente ativo ou outras moléculas, por exemplo, a superfície externa de lipossomas, pode melhorar a eficácia e meia- vida do agente ativo ou outra molécula e também reduzir a sua toxicidade. Particularmente, em um meio aquoso, a molécula de PEG é hidratada e em movimento rápido. Este movimento rápido faz com que o PEG arraste um grande volume e previne a aproximação e interferência de outras moléculas, por exemplo, células imune ou proteases. Assim, quando ligada a PEG, as cadeias poliméricas de PEG podem proteger a molécula ligada da resposta imune e outros mecanismos de depuração, prolongando a disponibilidade do agente ativo.
No geral, as moléculas de polietileno glicol são conectadas à proteína por intermédio de um grupo reativo encontrado na proteína. Habitualmente os grupos amino, tais como aqueles nos resíduos de lisina ou no terminal N, são usados para a ligação. As Pat. U.S. Nos 5.824.784 e 4.002.531 divulgam tais métodos para ligar PEG a uma enzima pela alquilação redutiva. Os resíduos de lisina podem ser estrategicamente substituídos no lugar de outros aminoácidos ou inseridos em uma seqüência de polipeptídeo para fornecer pontos adicionais de ligação como divulgado na Pat. U.S. N° 4.904.584. Métodos adicionais são conhecidos na técnica para ligar derivados de PEG ramificados ou "multi-armados" às proteínas como divulgados na Pat. U.S. N° 5.932.462. Existem muitos outros métodos de ligação conhecido na técnica para ligar polímeros aos resíduos de cisteína, grupos carbóxi, carboidratos e outras porções. Por exemplo, a Pat. U.S. N° 5.900.461 divulga derivados de PEG e outros polímeros tendo uma ou mais porções de sulfona ativas que são altamente seletivas quanto à ligação com porções de tiol ao invés de porções de amino nas moléculas.
Os PEGs também podem ser usados para ligar macromoléculas a um ligando ou porção alvej adores, que direcionam as macromoléculas às áreas particulares de interesse. A Pat. U.S. Ns 6.436.386 divulga conjugados de agente ativo-polímero ligados a uma porção que alveja hidroxiapatita para a liberação do agente ativo, tal como fatores de crescimento ósseo, às superfícies de hidroxiapatita, tais como o osso.
Uma ampla variedade de derivados de PEG são ambos disponíveis e adequados para o uso na preparação de conjugados de PEG. Por exemplo, a Série SUNBRIGHT® da NOF Corp. fornece numerosos derivados de PEG, incluindo metoxipolietileno glicóis e derivados de PEG ativados, tais como metóxi-PEG aminas, maleimidas e ácidos carboxílicos, para a ligação por vários métodos a medicamentos; enzimas, fosfolipídeos e outros biomateriais e a Nektar Therapeutics' Advanced PEGilation também oferece diversas tecnologias de ligação de PEG para melhorar a segurança e eficácia dos produtos terapêuticos.
Um pesquisa de patentes, pedidos de patente publicada e publicações relacionadas também proverão aqueles habilitados na técnica que lêem esta divulgação com tecnologias de ligação de PEG e derivados de PEG possíveis significantes. Por exemplo, as Pat. U.S. ISF 6.436.386, 5.932.462, 5.900.461, 5.824.784, 4.904.584 e 4.002.531, os conteúdos das quais são incorporados por referência em sua totalidade, descrevem tais tecnologias e derivados e métodos para a sua fabricação. Assim, uma pessoa habilitada na técnica, considerando tanto a divulgação desta invenção quanto as divulgações destas outras patentes poderia ligar PEG, um derivado de PEG ou algum outro polímero a NRG para a sua liberação prolongada.
PEG é um polímero bem conhecido tendo as propriedades de solubilidade em água e em muitos solventes orgânicos, carece de toxicidade, carece de imunogenicidade e também é claro, incolor, inodoro e estável. Um uso de PEG é ligar covalentemente o polímero às moléculas insolúveis para tornar o conjugado PEG-molécula resultante solúvel. Por estas razões e outras, PEG foi selecionado como o polímero preferido para a ligação, mas o mesmo foi utilizado unicamente para propósitos de ilustração e não de limitação. Produtos similares podem ser obtidos com outros polímeros solúveis em água, incluindo sem limitação; poli(álcool vinílico), outros poli(óxidos de alquileno) tais como poli(propileno glicol) e outros, poli(polióis oxietilados) tais como poli(glicerol oxietilado) e outros, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli- 1,3-dioxolano, poli-l,3,6-trioxano, etileno/anidrido maleico e poliaminoácidos. Uma pessoa habilitada na técnica será capaz de selecionar o polímero desejado com base na dosagem, tempo de circulação, resistência à proteólise e outras considerações desejadas. C. 3. Empacotamento de Lipossoma
Em uma outra forma de realização da presente invenção, a liberação prolongada de NRG no sangue compreende empacotar NRG em um lipossoma, que tem demonstrado utilidade na liberação de agentes ativos benéficos em uma maneira controlada em períodos prolongados de tempo. Os lipossomas são membranas de bicamada completamente fechadas contendo um volume aquoso aprisionado. Os lipossomas podem ser vesículas unilamelares que possuem uma bicamada de membrana única ou vesículas multilamelares com bicamadas de membrana múltipla, cada uma separada da seguinte por uma camada aquosa. A estrutura da bicamada de membrana resultante é tal que as caudas hidrofóbicas (não polares) do lipídeo orientam na direção do centro da bicamada enquanto que as cabeças hidrofílicas (polares) orientam na direção da fase aquosa.
No geral, em um sistema de liberação de medicamento lipossoma, o agente ativo é aprisionado no lipossoma e depois administrado ao paciente a ser tratado. Entretanto, se o agente ativo é lipofílico, o mesmo pode associar-se com a bicamada lipídica.
O sistema imune pode reconhecer lipossomas convencionais como corpos estranhos e destruí-los antes que quantidades significantes do agente ativo atinjam o sítio de doença pretendido. Assim, em uma forma de realização, o lipossoma pode ser revestido com um polímero flexível solúvel em água que evita a captação pelos órgãos do sistema fagocítico mononuclear, primariamente no fígado e baço. Os polímeros hidrofílicos adequados para circundar os lipossomas incluem, sem limitação, PEG, polivinilpirrolidona, éter polivinilmetílico, polimetil-oxazolina, polietiloxazolina, poliidroxipropiloxazolina, poliidroxipropil-metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, poliidróxi-propilmetacrilato, poliidroxetilacrilato, hidroximetilcelulose, hidroxietil-celulose, polietileno glicol, poliaspartamida e seqüências de peptídeo hidrofílicas como descrito nas Pat. U.S. Nfi5 6.316.024, 6.126.966, 6.056.973, 6.043.094, os conteúdos dos quais são incorporados por referência em sua totalidade.
Lipossomas podem ser compreendidos de qualquer lipídeo ou combinação de lipídeo conhecidos na técnica. Por exemplo, os lipídeos que formam vesícula podem ser lipídeos que ocorrem naturalmente ou sintéticos; incluindo fosfolipídeos, tais como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol e esfingomielina como divulgado nas Patentes U.S. Nas 6.056.973 e 5.874.104. os lipídeos que formam vesícula também podem ser glicolipídeos, cerebrosídeos ou lipídeos catiônicos, tais como 1,2-dioleilóxi-3- (trimetilamino) propano (DOTAP); brometo de N-[1-(2,3- ditetradecilóxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamônio (DMRIE); brometo de N-[1-[(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidróxi etilamônio (DOME); cloreto de N-[1-(2,3-dioleilóxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA); 3 [N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol); ou dimetil- dioctadecilamônio (DDAB) também como divulgado na Patente U.S. N- 6.056.973. Colesterol também pode estar presente na faixa apropriada para comunicar estabilidade à vesícula como divulgado nas Pat. U.S. N~ 5.916.588 e 5.874.104.
Em uma outra forma de realização, o lipossoma é alvejado aos sítios específicos dentro do corpo de um mamífero pela ligação de um ligando ou porção alvejadores. Acredita-se que os ligandos alvejadores sejam reconhecidos pelos receptores ou outros compostos na superfície de células alvo. Os ligandos alvo típicos incluem anticorpos ou fragmentos de anticorpo, ligandos receptores de célula, lectinas e outros. Para debate adicional ver as Pat. U.S. Nes 6.316.024 e 6.294.191, os conteúdos dos quais são incorporados por referência em sua totalidade.
Tais ligandos alvejadores podem ser ligados a lipossomas por qualquer meio conhecido na técnica para a ligação covalente ou não covalente de tais ligandos aos lipossomas. Por exemplo, lipossomas revestidos com polímero, foram modificados para se obter a liberação específica de sítio de agentes ativos, pela ligação de um ligando alvejador aos resíduos de grupo de cabeça polar de componentes lipídicos lipossômicos ou às extremidades livres das cadeias poliméricas que formam o revestimento de superfície nos lipossomas como descrito na Patente U.S. N2 6.316.024 e 6.043.094, os conteúdos dos quais são incorporados por referência em sua totalidade. Tais ligações podem ser realizadas, por exemplo, pela ligação de proteínas aos lipossomas através do uso de um agente de reticulação tendo pelo menos um grupo maleimido e uma função redutiva de amina como descrito na Pat. U.S. N- 5.399.331; a ligação de proteínas aos lipossomas através do uso da glicoproteína estreptavidina como descrito nas Patentes U.S. N— 4.885.172, 5.059.421 e 5.171.578; o revestimento de lipossomas alvejados com polissacarídeos; ou um lipídeo que forma vesícula podem ser derivados com uma cadeia polimérica hidrofílica, que é funcionalizada na extremidade para ligar anticorpos através do uso de um grupo hidrazida ou hidrazina que é reativo contra grupos aldeídos como descrito na Pat. U.S. N2 6.126.966. O grupo funcionalizado na extremidade também pode ser 2-piridilditio- propionamida, para ligar um anticorpo ou outra molécula ao lipossoma através de uma ligação de dissulfeto.
Os lipossomas desta invenção podem ser fabricadas por técnicas padrão conhecidas por aqueles de habilidade na técnica. Por exemplo, em uma forma de realização, como divulgado na Pat. U.S. N° 5.916.588, uma solução tampão do agente ativo é preparada. Depois um lipídeo adequado, tal como fosfatidilcolina de soja hidrogenada e colesterol, a forma em pó biotina, é dissolvido em clorofórmio ou semelhante e secado pela rotoevaporação. A película lipídica assim formada é recolocada em suspensão em éter dietílico ou semelhante e colocado em um frasco e sonificado em um banho de água durante a adição da solução tamponada do agente ativo. Uma vez que o éter tenha evaporado, a sonificação é descontinuada e uma corrente de nitrogênio é aplicada até que éter residual seja removido. Outros procedimentos de fabricação padrão são descritos nas Pat. U.S. N° 6.352.716, 6.294.191, 6.126.966, 6.056.973, 5.965.156, e 5.874.104. Os lipossomas desta invenção podem ser produzidos por qualquer método no geral aceito na técnica para fabricar lipossomas, incluindo, sem limitação, os métodos dos documentos citados acima (os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência).
Os lipossomas também são bem conhecidos na técnica e facilmente disponíveis de empresas experimentadas no fornecimento de lipossomas para a liberação de medicamento pela liberação prolongada. Por exemplo, a tecnologia lipossômica STEALTH® da ALZA (antigamente Sequus Pharmaceuticals') para a liberação de medicamento intravenosa o uso de um revestimento de polietileno glicol em lipossomas para fugir do reconhecimento pelo sistema imune; a tecnologia lipossômica da Gilead Sciences (antigamente Nexstar) foi incorporada em AmBisome® e o tratamento aprovado pelo FDA para infecções fungicas; e a NOF Corp. oferece uma ampla variedade de fosfolipídeos de grau GMP, derivados de fosfolipídeo e PEG-fosfolipídeos sob as marcas COATSOME® e SUNBRIGHT®.
Uma pesquisa de patentes, pedidos de patente publicados e publicações relacionadas também proverá aqueles habilitados na técnica que lêem esta divulgação com tecnologias de lipossoma possíveis significantes. As Pat. U.S. N°s 6.759.057, 6.406.713, 6.352.716, 6.316.024, 6.294.191, 6.126.966, 6.056.973, 6.043.094, 5.965.156, 5.916.588, 5.874.104, 5.215.680, e 4.684.479, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência, descrevem lipossomas e microbolhas revestidas de lipídeo e métodos para a sua fabricação. Assim, uma pessoa habilitada na técnica, considerando tanto a divulgação desta invenção quanto as divulgações destas outras patentes poderia produzir um lipossoma para a liberação prolongada de NRG.
Embora formas de realização específicas de lipossomas sejam debatidas acima, a invenção é mais geral do que qualquer tecnologia de liberação prolongada específica. Isto inclui a descoberta de que a liberação prolongada de NRG melhora a função do coração enfartado e reduz o diâmetro interno do ventrículo esquerdo. Existem numerosas variações e tipos diferentes de lipossomas correntemente conhecidos na técnica e podem ser utilizados na prática da invenção aqui divulgada. C.4. Empacotamento de Microesfera
Em uma outra forma de realização da presente invenção, a liberação prolongada de NRG no sangue compreende empacotar NRG em uma microesfera. As microesferas têm demonstrado utilidade na liberação de agente ativos benéficos a uma área alvo em uma maneira controlada em períodos prolongados de tempo. As microesferas são no geral biodegradáveis e podem ser usadas para a administração subcutânea, intramuscular e intravenosa.
No geral, cada microesfera é composta de um agente ativo e moléculas poliméricas. Como divulgado na Pat. U.S. N° 6.268.053, o agente ativo pode ser centralmente localizado dentro de uma membrana formada pelas moléculas poliméricas, ou, alternativamente dispersadas por toda a microesfera porque a estrutura interna compreende uma matriz do agente ativo e um excipiente polimérico. Tipicamente, a superfície externa da microesfera é permeável à água, que permite que fluidos aquosos entrem na microesfera, assim como agente ativo solubilizado e polímero saiam da microesfera.
Em uma forma de realização, a membrana polimérica compreende polímeros reticulados como divulgado na Patente U.S. N2 6.395.302. Quando os tamanhos de poro do polímero reticulado são iguais ou menores do que o diâmetro hidrodinâmico do agente ativo, o agente ativo é essencialmente liberado quando o polímero é degradado. Por outro lado, se o tamanho de poro dos polímeros reticulados são maiores do que o tamanho do agente ativo; o agente ativo é pelo menos parcialmente liberado pela difusão.
Métodos adicionais para fabricar membranas de microesfera são conhecidos e usados na técnica e podem ser usados na prática da invenção aqui divulgada. Os materiais típicos para a membrana externa incluem as seguintes categorias de polímeros: (1) polímeros com base em carboidrato, tais como metilcelulose, polímeros com base em carboximetil celulose, dextrano, polidextrose, quitinas, quitosano e amido (incluindo hetaamido) e derivados destes; (2) álcoois polialifáticos tais como óxido de polietileno e derivados deste incluindo polietileno glicol (PEG), PEG-acrilatos, polietilenoimina, acetato de polivinila e derivados deste; (3) polímeros de poli(vinila) tais como álcool poli(vinílico), poli(vinil)pirrolidona, poli(vinil)fosfato, ácido poli(vinil)-fosfônico e derivados destes; (4) ácidos poliacrílicos e derivados destes; (5) ácidos poliorgânicos, tais como o ácido polimaleico e derivados destes; (6) poliaminoácidos, tais como polilisina e ácidos de poliimino, tais como poliimino tirosina e derivados destes; (7) co- polímeros e co-polímeros de bloco, tais como poloxâmero 407 ou polímero Pluronic L-101"4 e derivados deste; (8) terc-polímeros e derivados deste; (9) poliéteres, tais como poli(tetrametileno éter glicol) e derivados deste; (10) polímeros que ocorrem naturalmente, tais como zeína, quitosano e pululano e derivados deste; (11) poliimidas, tais como poli n-tris(hidroximetil) metilmetacrilato e derivados deste; (12) tensoativos, tais como polioxietileno sorbitano e derivados deste; (13) poliésteres tais como poli(etileno glicol) éter (n)monometílico mono(succinimidil succinato)éster e derivados deste; (14) polímeros ramificados e cíclicos, tais como PEG ramificado e ciclodextrinas e derivados destes; e (15) polialdeídos, tais como poli(perfluoropropileno óxido-b-perfiuoro-formaldeído) e derivados deste como divulgado na Pat. U.S. N° 6.268.053, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência. Outros polímeros típicos conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica incluem poli(lactídeo-co-glicolídeo, homopolímero de polilactídeo; homopolímero de poliglicolídeo; copolímero de policaprolactona; poliidroxibutirato-poliidroxivalerato; poli(lactídeo-co- caprolactona); poliesteramidas; poliortoésteres; ácido poli 13-hidroxibutírico; e polianidridos como divulgado na Pat. U.S. N° 6.517.859, os conteúdos da qual são aqui incorporados por referência.
Em uma forma de realização, a microesfera da presente invenção é ligada a ou revestida com moléculas adicionais. Tais moléculas podem facilitar o alvejamento, realçar a mediação de receptor e fornecer a fuga da endocitose ou destruição. As moléculas típicas incluem fosfolipídeos, receptores, anticorpos, hormônios e polissacarídeos. Adicionalmente, uma ou mais moléculas cliváveis podem ser ligadas à superfície externa de microesferas para alvejá-las a um sítio pré determinado. Depois, sob condições biológicas apropriadas, a molécula é clivada causando a liberação da microesfera do alvo.
As microesferas desta invenção são fabricadas por técnicas padrão. Por exemplo, em uma forma de realização, a exclusão por volume é realizada misturando-se o agente ativo em solução com um polímero ou mistura de polímeros em solução na presença de uma fonte de energia por uma quantidade de tempo suficiente para formar partículas como divulgado na Pat. U.S. N2 6.268.053. O pH da solução é ajustado a um pH próximo do ponto isoelétrico (pi) da macromolécula. Em seguida, a solução é exposta a uma fonte de energia, tal como calor, radiação ou ionização, sozinha ou em combinação com sonificação; turbilhonamento, mistura ou agitação, para formar micropartícuias. As micropartícuias resultantes são depois separadas de quaisquer componentes não incorporados presentes na solução pelos métodos de separação física bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e pode ser depois lavados. Outros procedimentos de fabricação padrão são descritos nas Pat. U.S. Na^ 6.669.961, 6.517.859, 6.458.387, 6.395.302, 6.303.148, 6.268.053, 6.090.925, 6.024.983, 5.942.252, 5.981.719, 5.578.709, 5.554.730, 5.407.609, 4.897.268, e 4.542.025, os conteúdos dos quais são incorporados por referência em sua totalidade.
As microesferas são bem conhecidas e facilmente disponíveis para uma pessoa de habilidade comum na técnica de empresas experimentadas no fornecimento de tais tecnologias para a liberação de medicamento pela liberação prolongada. Por exemplo, Epic Therapeutics, uma subsidiária da Baxter Healthcare Corp., desenvolveu PROMAXX®, um sistema de liberação de medicamento de matriz de proteína que produz microesferas de proteína bioerodíveis em um processo totalmente com base em água; a OctoPlus desenvolveu OctoDEX®, microesferas de dextrano reticuladas que liberam ingredientes ativos com base na degradação volumétrica de matriz ao invés da com base na erosão de superfície; e a Brookwood Pharmaceuticals faz propaganda da disponibilidade de suas tecnologias de micropartícula para a liberação de medicamento.
Uma pesquisa de patentes, pedidos de patente publicados e publicações relacionadas também proverá aqueles habilitados na técnica que lêem esta divulgação com tecnologias de microesfera possíveis significantes. Por exemplo, as Pat. U.S. N°s 6.669.961, 6.517.859, 6.458.387, 6.395.302, 6.303.148, 6.268.053, 6.090.925, 6.024.983, 5.942.252, 5.981.719, 5.578.709, 5,554.730, 5.407.609, 4.897.268, e 4.542.025, os conteúdos das quais são incorporados por referência em sua totalidade, descrevem microesferas e métodos para a sua fabricação. Uma pessoa habilitada na técnica, considerando tanto a divulgação desta invenção quanto as divulgações destas outras patentes poderia fabricar e usar microesferas para a liberação prolongada de NRG.
D. Dosagem e Freqüência de Administração
A quantidade de neuregulina usada na presente invenção variará com a natureza e severidade da doença ou condição e da via pela qual o ingrediente ativo é administrado. A freqüência e dosagem também variarão de acordo com fatores específicos para cada paciente dependendo da terapia específica (por exemplo, agentes terapêuticos ou profiláticos) administrada, da gravidade do distúrbio, doença ou condição, da via de administração, assim como da idade, corpo, peso, resposta e da história médica passada do paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir das curvas de resposta de dose derivadas de sistemas de teste in vitro ou modelo animal.
As doses exemplares de neuregulina incluem quantidades em miligrama ou micrograma de neuregulina por quilograma de peso do paciente ou da amostra (por exemplo, cerca de 1 micrograma por quilograma a cerca de 500 miligramas por quilograma, cerca de 100 microgramas por quilograma a cerca de 5 miligramas por quilograma ou cerca de 1 micrograma por quilograma a cerca de 50 microgramas por quilograma). Para a liberação prolongada de neuregulina usada na invenção, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente de 0,001 mg/kg a 15 mg/kg do peso corporal do paciente, com base no peso do peptídeo ativo. Preferivelmente, a dosagem administrada a um paciente está entre 0,001 mg/kg e 15 mg/kg, 0,005 mg/kg e 10 mg/kg, 0,01 mg/kg e 5 mg/kg, 0,001 mg/kg e 4 mg/kg, 0,005 mg/kg e 3 mg/kg, 0,01 mg/kg e 2 mg/kg, 0,001 mg/kg e 1 mg/kg, 0,005 mg/kg e 0,5 mg/kg, 0,010 mg/kg e 0,2 mg/kg, 0,005 mg/kg e 0,050 mg/kg do peso corporal do paciente.
As doses exemplares de neuregulina também incluem unidade (U) ou quantidades de unidade de neuregulina por quilograma do paciente ou peso da amostra (por exemplo, cerca de 1 U por quilograma a cerca de 5000 U por quilograma, cerca de 10 U microgramas por quilograma a cerca de 1000 por quilograma ou cerca de 100 U por quilograma a cerca de 500 U por quilograma). Para a liberação prolongada de neuregulina usada na invenção, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente 10 U/kg a 1000 U/kg do peso corporal do paciente, com base no peso do peptídeo ativo. Preferivelmente, a dosagem administrada a um paciente está entre 1 U/kg e 10.000 U/kg, 1 U/kg e 5000 U/kg, 10 U/kg e 5000 U/kg, 10 U/kg e 1000 U/kg, 50 U/kg e 2000 U/kg, 50 U/kg e 1000/kg, 50 U/kg e 500 U/kg, 100 U/kg e 1000 U/kg, 100 U/kg e 500 U/kg, 100 U/kg e 200 U/kg, do peso corporal do paciente.
No geral, a faixa de dose diária recomendada de neuregulina nos métodos da invenção para as condições aqui descritas residem dentro da faixa de cerca de 0,001 mg a cerca de 1000 mg por dia. Especificamente, uma faixa de dose diária total deve estar entre 0,001 mg por dia e 15 mg por dia, 0,005 mg por dia e 10 mg por dia, 0,01 mg por dia e 5 mg por dia, 0,001 mg por dia e 4 mg por dia, 0,005 mg por dia e 3 mg por dia, 0,01 mg por dia e 2 mg por dia, 0,001 mg por dia e 1 mg por dia, 0,005 mg por dia e 0,5 mg por dia, 0,010 mg por dia e 0,2 mg por dia. No controle do paciente, a terapia pode ser iniciada a uma dose mais baixa, talvez de cerca de 0,1 μg a cerca de 1 μg e aumentada se necessário até cerca de 20 μg mg a cerca de 1000 μg por dia como uma dose única ou doses divididas, dependendo da resposta global do paciente. Pode ser necessário usar dosagens do ingrediente ativo fora das faixas aqui divulgadas em alguns casos, como estará evidente àqueles de habilidade comum na técnica. Além disso, é mencionado que o clínico ou médico do tratamento saberá como e quando interromper, ajustar ou terminar a terapia em conjunção com a resposta do paciente individual. Em certas formas de realização, a neuregulina é administrada em uma quantidade de cerca de 1 U/dia a cerca de 10.000 U/dia. Em algumas formas de realização, a mesma é administrada em uma quantidade de cerca de 1 U/dia a cerca de 5000 U/dia. Em algumas formas de realização, a mesma é administrada em uma quantidade de cerca de 1 OU/dia a cerca de 2000 U/dia. Em algumas formas de realização, a mesma é administrada em uma quantidade de cerca de 10 U/dia a cerca de 1000 U/dia. Em algumas formas de realização, a mesma é administrada em uma quantidade de cerca de 100 U/dia a cerca de 200 U/dia.
A neuregulina também pode ser administrada em um programa de dosagem ou "ciclo terapêutico." A dosagem diária de neuregulina no ciclo terapêutico é descrita em detalhes acima. O ciclo terapêutico pode durar 2 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, duas semanas, três semanas, quatro semanas, cinco semanas ou seis semanas.
Em certas formas de realização, a neuregulina é administrada diariamente para cada dia do ciclo terapêutico. Em certas formas de realização, a neuregulina é administrada consecutivamente por três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze dias em um ciclo terapêutico.
Em certas formas de realização, em um ciclo terapêutico a neuregulina é administrada no dia 1 do ciclo e o ciclo acaba com um ou mais dias de nenhuma administração de neuregulina. Em algumas formas de realização, a neuregulina é administrada diariamente por 3, 5, 7 ou 10 dias seguidos por um período de repouso em um ciclo terapêutico.
E. Terapia de Combinação
Em uma forma de realização, a presente invenção é útil em prevenir a insuficiência cardíaca e a cardiomiopatia em pacientes que são tratados com um medicamento que causa a hipertrofia cardíaca ou a insuficiência cardíaca, por exemplo, acetato de fludrocortisona ou herceptina. NRG pode ser administrado antes de, simultaneamente com ou subseqüente a um medicamento que cause tais doenças cardíacas.
Em uma outra forma de realização da invenção, NRG é administrado em combinação com uma quantidade eficaz de um composto que atue para suprimir uma via de indução da hipertrofia diferente do que NRG. Em uma forma de realização alternativa, NRG é administrado com tais supressores da hipertrofia e/ou componentes adicionais, sem limitação, um inibidor cardiotrófico tal como um antagonista de Ct-I (cardiotrofina-1), um inibidor de ACE, tal como captopril (Capoten®), e/ou hormônio do crescimento humano e/ou IGF-I (fator do crescimento equivalente à insulina I) no caso de insuficiência cardíaca congestiva ou com um outro anti- hipertrófico, fator miocardiotrófico, fator anti-arrítmico ou inotrópico no caso de outros tipos de insuficiência cardíaca ou distúrbio cardíaco.
Em uma outra forma de realização da invenção, NRG é administrado em combinação com métodos terapêuticos correntes para o tratamento da insuficiência cardíaca, incluindo, sem limitação, inibidores de ACE e outros vasodilatadores, diuréticos, preparações de digitalina, beta bloqueadores, afinadores de sangue, bloqueadores do receptor de angiotensina II, bloqueadores do canal de cálcio ou potássio.
Os inibidores de ACE, que impedem a conversão de angiotensina I em angiotensina II, são vasodilatadores que fazem com que os vasos sangüíneos expandam, diminuindo a pressão sangüínea e reduzindo a carga de trabalho do coração. Os vasodilatadores adequados para o uso nas formas de realização da presente invenção incluem, sem limitação, os seguintes medicamentos: quinapril (Accupril®), ramipril (Altace®), captopril (Capoten®), benazepril (Lotensin®), fosinopril (Monopril®), lisinopril (Prinivil® ou Zestril®), enalapril (Vasotec®), moexipril (Univasc®), trandolapril e perindopril. Os vasodilatadores adicionais úteis na presente invenção, incluem, sem limitação, dinitrato de isossorbida (Isordil®), nesiritide (Natrecor®), hidralazina (Apresoline®), nitratos e minoxidil.
Diuréticos fazem com que os rins removam sódio e água da corrente sangüínea, reduzindo a carga de trabalho do coração e incluem, sem limitação, os seguintes medicamentos: hidroclorotiazida (HidroDIURIL®), clorotiazida (Diuril®), furosemida (Lasix®), bumetanida (Bumex®), espironolactona (Aldactone®), triantereno (Dyrenium®), metolazona (Zaroxolyn®), torsemida, indapamida, politiazida, amilorida e agentes de combinação (Dyazida®).
As preparações de digitalina aumentam a força das contrações do coração e incluem, sem limitação, digoxina (Lanoxin®) e digitoxina.
Os beta bloqueadores reduzem a tendência do coração para bater mais rápido e incluem, sem limitação, os seguintes medicamentos: carvedilol (Coreg®) metoprolol (Lopressor® ou Toprol XL®, atenolol, bisoprolol, labetalol, propranolol, sotalol, pindolol, penbutolol, acebutolol, timolol, nadolol e betaxolol.
Os afinadores do sangue para o uso nas formas de realização da presente invenção, incluem, sem limitação, warfarin (Coumadin®) e heparina.
As formas de realização da presente invenção também podem usar bloqueadores do receptor de angiotensina II, que, ao invés de diminuir os níveis de angiotensina II (como os inibidores de ACE fazem), previnem a angiotensina II de influenciar o coração e os vasos sangüíneos. Os bloqueadores do receptor de Angiotensina II adequados para o uso na presente invenção, incluem, sem limitação, iosartan (Cozaar®), valsartan (Diovan®), irbesartan (Avapro®), candesartan, eprosartan, telmisartan e olmesartan.
Os bloqueadores do canal de cálcio são no geral usados para tratar a pressão sangüínea alta freqüentemente associada com a insuficiência cardíaca. Os bloqueadores do canal de cálcio adequados para o uso na presente invenção incluem, sem limitação, anlodipina (Norvasc®).
Em formas de realização alternativas da presente invenção, a liberação prolongada de NRG também pode ser combinada com a administração de terapias de medicamento para o tratamento de doenças cardíacas, tais como hipertensão. Por exemplo, NRG pode ser administrado com antagonistas do receptor de endotelina, tais como anticorpos para o receptor de endotelina e peptídeos ou outros tais antagonistas de molécula pequena; antagonistas do 3-adrenoreceptor tais como carvedilol; antagonistas do x,-adrenorreceptor; anti-oxidantes; compostos tendo atividades múltiplas (por exemplo, 3-bloqueador/a-bloqueador/anti-oxidante); compostos equivalentes ao carvedilol ou combinações de compostos que fornecem funções múltiplas encontradas no carvedilol; hormônio do crescimento, etc.
Os agonistas de neuregulina sozinho ou em combinação com outros agonistas da via supressora da hipertrofia ou com moléculas que antagonizam vias da indução de hipertrofia conhecidos, são úteis como medicamentos para o tratamento in vivo de mamíferos que experimentam insuficiência cardíaca, de modo a prevenir ou diminuir os efeitos da insuficiência cardíaca.
As formulações terapêuticas de agonista(s) para tratar distúrbios cardíacos são preparadas para a armazenagem misturando-se o(s) agonista(s) tendo o grau desejado de pureza com carregadores, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington7S Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed., 1980), na forma de torta liofilizada ou soluções aquosas. Os carregadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobinas; polímeros hidrofílicos tais como olivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes queladores tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contraíons que formam sal tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos tais como Tween, Pluronics ou polietileno glicol (PEG). 0(s) antagonista(s) também são adequadamente ligados a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol ou polialquilenos, na maneira apresentada nas Patentes US Nas 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou 4.179.337. A quantidade do carregador usado em uma formulação pode variar de cerca de 1 a 99 %, preferivelmente de cerca de 80 a 99 %, otimamente entre 90 e 99 % em peso.
O(s) agonista(s) a serem usados para a administração in vivo deve(m) ser estéreis. Isto é facilmente realizado pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, pela filtração através de membranas de filtração estéril, antes ou a seguir da liofilização e reconstituição. O(s) agonista(s) ordinariamente serão armazenados na forma liofilizada ou em solução.
As composições agonistas terapêuticas no geral são colocadas em um recipiente tendo um orifício de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica. A administração de agonista(s) é apenas em uma maneira crônica, por exemplo, uma das seguintes vias: injeção ou infusão pelas vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial ou intralesional, oralmente ou usando sistemas de liberação prolongada como mencionado acima.
Como debatido acima, os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo a proteína, matrizes estas que estão na forma de artigos formados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) como descrito por Langer et al. (1981) J.
Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 e Langer (1982) Chem. Tech. 12: 98-105 ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Patente US N2 3.773.919, EP 58.481), copolímeros do ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et ai. (1983) Biopolymers 22: 547-556), etileno-acetato de vinila não degradável (Langer et al. (1981) supra), copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradável tal como o Lupron Depot® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988).
O(s) agonista(s) também pode(m) ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, pelas técnicas de coacervação ou pela polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de polifmetilmetacrilato], respectivamente), em sistemas de liberação de medicamento coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano- partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Embora polímeros tais como etileno-acetato de vinila e ácido lático-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certas moléculas de liberação de hidrogéis por períodos de tempo mais curtos. Quando as moléculas encapsuladas permanecem no corpo por um tempo longo, elas podem desnaturar ou agregar como um resultado da exposição à umidade a 37° C, resultando em uma perda de atividade biológica e mudanças possíveis na imunogenicidade. As estratégias racionais podem ser planejadas quanto a estabilização dependendo do mecanismo envolvido, por exemplo, usando aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz polimérica específicas.
As composições de agonista(s) de liberação prolongada também incluem agonista(s) lipossomicamente aprisionado(s). Lipossomas contendo agonista(s) são preparados pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles divulgados na DE 3.218.121; Epstein et ai. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3688-3692; Hwang et al (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4030-4034: EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Pedido de patente japonês 83-118008; Patentes US N25 4.485.045 e 4.544.545; e EP 102.324. Um exemplo específico de formulação de liberação prolongada adequada está na EP 647.449.
Em uma outra forma de realização da presente invenção, NRG é combinado com ou administrado em combinação com outros agentes para tratar a insuficiência cardíaca congestiva, incluindo inibidores de ACE (como debatido acima), inibidores de CT-1, hormônio do crescimento humano, e/ou IGF-I. As quantidades eficazes de tais agentes, se utilizados estará no discernimento do clínico. A dosagem de administração e ajuste são determinados pelos métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica para se obter o melhor controle da insuficiência cardíaca congestiva e idealmente leva em conta o uso de diuréticos ou digitalina e condições tais como hipotensão e deterioração renal. A dose adicionalmente dependerá de fatores tais como o tipo de medicamento usado e do paciente específico que é tratado. Tipicamente a quantidade utilizada será a mesma dose como aquela usada se o medicamento fosse ser administrado sem agonista; entretanto, doses mais baixas podem ser utilizadas dependendo de fatores tais como a presença de efeitos colaterais e da condição que é tratada, do tipo de paciente e do tipo de agonistas e medicamento, contanto que a quantidade total de agentes forneça uma dose eficaz para a condição que é tratada.
Será avaliado pelas pessoas habilitadas na técnica que numerosas variações e/ou modificações podem ser feitas à invenção como mostrado nas formas de realização específicas sem divergir do espírito ou escopo da invenção como amplamente descritos. As presentes formas de realização, portanto, devem ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.
F. Kits
A invenção também fornece kits para realizar os regimes terapêuticos da invenção. Tais kits compreendem em um ou mais recipientes as quantidades terapeuticamente eficazes de NRG aqui descritas, sozinhas ou em combinação com outros agentes, na forma farmaceuticamente aceitável e em combinação com uma tecnologia de liberação prolongada como aqui descrita. Instruções são opcionalmente incluídas para a administração da composição de NRG de liberação prolongada por um médico ou pelo paciente.
G. Exemplos
Como mostrado nos Exemplos, a invenção reside na descoberta de que a liberação prolongada de NRG ativa a via de sinalização de AKT ou ERK tão eficazmente quanto a NRG liberada por outros métodos e melhora a função do coração enfartado muito mais do que a NRG liberada por outros métodos. Entretanto, a invenção também tem aplicação mais ampla para outras doenças e distúrbios dado que as interações de NRG com receptores de ErbB foram implicadas em outras doenças e distúrbios, por exemplo, doenças do sistema nervoso central e periférico. Os exemplos de outras doenças e distúrbios, incluem, várias doenças cardiovasculares, câncer, doença do sistema neural e/ou doenças musculares, incluindo distrofia muscular (por exemplo, de Duchenne, das cinturas dos membros) e esclerose múltipla, lesão espinhal, doenças oculares e otológicas, diabetes, esquizofrenia e Alzheimer.
A invenção será ilustrada ainda por referência aos seguintes Exemplos não limitantes. Os exemplos são apresentados de modo a suprir aqueles de habilidade comum na técnica com uma divulgação e descrição completas de como fabricar e usar a presente invenção e não são intencionados a limitar o escopo do que os inventores consideram como a sua invenção nem são intencionados a aparentar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Esforços foram feitos para garantir a precisão com respeito aos números usados mas alguns erros experimentais e desvios devem ser levados em conta.
EXEMPLO 1
Fosforilação de AKT e ERK no ventrículo esquerdo de ratos normais depois que a NRG é infundida por diferentes métodos.
Para comparar o efeito de NRG com vários métodos de tratamento na transdução de sinal dentro dos miócitos cardíacos no ventrículo esquerdo, nós infundimos NR.G pela injeção intravenosa (daqui em diante aludida como "IV"), intramuscular (daqui em diante aludida como "IM") e teste de tolerância à glicose IV (daqui em diante aludido como "IVGTT").
Ratos machos Wistar (Shanghai Animal Center of Chinese Academy of Science), que pesaram 180 + 20 gramas, foram numerados, pesados e divididos em grupos. Cada grupo conteve três ratos. Um grupo recebeu injeção IV de 4 ml/kg (volume/peso corporal) de Veículo (10 mM de Na2HPO4-NaH2PO4, 150 mM de NaCl, 0,2 % de albumina sérica humana (HSA), 5 % de manitol, pH 6,0) como um controle. Quatro outros grupos de ratos receberam injeção IM de 4 ml/kg (volume/peso corporal) de NRG (37,3 U/ml de fragmento de NRG humana recombinante (da 177a até a 237a seqüência de aminoácido de NRGl β2 humana produzida pela Zensun Science & Technology - número de lote 200503002)) dissolvido em veículo (como descrito acima). Outros quatro grupos de ratos receberam injeção IV de 4 ml/kg (volume/peso corporal) de NRG (como descrito acima). Outros cinco grupos de ratos receberam 20 μ/min de infusão de teste de tolerância à glicose de NRG (como descrito acima) pela injeção IV (IVGTT) por duas horas. Assim, a quantidade total de NRG administrada a cada rato (exceto quanto ao grupo de veículo) foi 149,3 U/kg de peso corporal.
Os ratos foram mortos separadamente em 20 min, 1 hora, 2 horas, 4 horas e 6 horas. Os ventrículos esquerdos de cada grupo de ratos foram cortados em pedaços em tampão de Iise frio (50 mM de Tris pH 7.4, 5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 2 mM de Na2VO4, 50 mM de NaF, 2 mM de PMSF, coquetel de inibidor de protease (nenhum EDTA, Roche)) depois agrupados e lavados com PBS frio. Os ventrículos foram depois homogeneizados em água gelada e centrifugados (Kendro Biofuge) a 12.000 rpm por 5 min a 4o C em tubos Eppendorf de 1,5 ml. O sobrenadante foi coletado e girado mais uma vez, depois armazenado a -80° C. As amostras foram descongeladas e giradas mais uma vez antes do uso. A concentração de proteína de cada amostra foi determinada pelo ensaio de proteína BCA (Pierce BCA protein assay kit). Uma certa quantidade de cada amostra foi misturada com 2X tampão de amostra (0,125 M de Tris pH 6,8, 20 % de glicerol, 4 % de SDS, 0,2 M de DTT, 0,012 % de azul de bromofenol) e fervido pela eletroforese antes de transferir para uma membrana de PVDF (Millipore). A fosforilação de AKT e ERK, assim como a quantidade de AKT e ERK, em cada amostra foram detectadas com anticorpos (anticorpo ERK e anticorpo ERK fosforilado (Santa Cruz Biotechnology); anticorpo AKT e anticorpo AKT fosforilado (Cell Signaling)).
O curso de tempo de fosforilação de AKT e ERK no ventrículo esquerdo de ratos normais quando NRG foi infundida por cada um destes métodos diferentes é mostrado na Fig 1. Comparado com o veículo, a NRG infundida por IM, IV e IVGTT todas ativaram a fosforilação prolongada de ERK. A fosforilação de AKT induzida por cada método teve pico em 20 min e diminuiu em 1 hora, mas aumentou novamente em 2 horas, onde manteve um nível alto de 4 horas a 6 horas. Assim, não existe nenhuma diferença óbvia entre os diferentes métodos de injetar NRG com respeito à sua capacidade para prolongar a fosforilação de ERK e AKT. Isto indicou que a NRG infundida constantemente é tão eficaz quanto a injeção de NRG. Assim, a infusão IVGTT é um método potencial para tratar as condições cardíacas deficientes.
EXEMPLO 2
A função de coração de rato com a artéria coronária do ventrículo esquerdo ligada depois do tratamento com neuregulina pelos diferentes métodos
Visto que a bomba osmótica é uma via para liberar NRG constantemente (como IVGTT), nós examinamos se a NRG infundida pela bomba osmótica foi tão eficaz quanto a injeção IV convencional, na restauração da função do coração no infarto do miocárdio (MI).
A. Ligação da artéria coronária do ventrículo esquerdo de rato e ecocardiografia
Os ratos machos Wistar (Shanghai Animal Center of Chinese
Academy of Science), que pesaram 200 ± 20 g, foram anestesiados injetando- se intraperitonealmente 100 mg/kg (medicamento/peso corporal) de cetamina. O pescoço e o peito foram depilados e sanitizados. Uma incisão foi feita no pescoço frontal intermediário para expor a traquéia. Um cateter 18G encimado por agulha foi inserido na traquéia entre a 3a e 5a cartilagens da traquéia. Depois a agulha foi puxada para fora, uma cânula plástica foi empurrada na traquéia 1 a 2 cm e fixada para conectar o Ventilador de Roedor (ventilador SAR-830/P - taxa de fluxo inspiratório, 1 ml/100 g/ respiração; Taxa respiratória, 60 respirações/min). Uma outra incisão foi feita no peito frontal esquerdo. A pele foi dissecada abruptamente para expor a quarta e quinta costelas, depois a quarta costela foi cortada por fórceps mosquito de canto. O ventilador (como descrito acima) foi unido à cânula e ligado e o coração foi exposto para checar a situação do pulmão e coração. O pericárdio foi aberto para identificar o átrio esquerdo e o cone da artéria pulmonar depois que o coração foi exteriorizado através da incisão. A artéria coronária descendente ao ventrículo esquerdo anterior entre eles foi ligada firmemente com sutura médica 6/0 antes do coração ser recolocado no tórax. A parede toráxica foi costurada. O ventilador foi bloqueado para encher o pulmão. O músculo e a pele do peito foram costurados depois que o ar na cavidade toráxica foi suavemente espremido. Os ventiladores foram removidos dos ratos até respiração espontânea constante reassumida.
A função cardíaca dos ratos foi depois examinada pela ecocardiografia (sonda Philips Sonos 7500 S4) no 14° dia depois da ligação.
Os ratos com valores de fração de ejeção (daqui em diante "EF") de 30 a 50 por cento foram separados e agrupados (15 ratos por grupo).
B. Tratamento dos ratos ligados com neuregulina.
Os ratos foram pesados no 15° dia depois da ligação da coronária do ventrículo esquerdo para determinar a quantidade de NRG necessária. Os ratos no grupo de veículo receberam 0,4 ml/100 g (volume/peso corporal) de veículo pela injeção IV. O veículo foi injetado uma vez ao dia por cinco dias, interrompido por dois dias e depois injetado por mais cinco dias.
Os grupos IM e IV de ratos receberam injeção IM e IV de NRG, respectivamente (a quantidade de NRG foi de 149,3 U/kg (proteína/peso corporal), o volume foi de 0,4 ml/lOOg).
A NRG foi injetada uma vez ao dia por cinco dias, interrompida por dois dias e depois injetada por mais cinco dias.
Como debatido mais abaixo, o grupo IVGTT teve bombas osmóticas (bomba osmótica ALZET 2ML1) implantadas no quinto dia depois o agrupamento. Cada bomba conteve 2 ml de solução de NRG, que conteve 933,1 U de NRG (visto que um rato pesou agora cerca de 250 g) e a velocidade de infusão foi cerca de 18,7 U/kg/h. Assim, a concentração de medicamento máxima comparada a cerca de 2,67 U/kg pela injeção IV. Depois de 7 dias, a função cardíaca de todos os ratos foi checada mais uma vez pela ecocardiografia (sonda Philips Sonos 7500 S4). No dia seguinte, a checagem de parâmetro hemodinâmico e checagem de anatomia também foram empreendidas para confirmar ainda mais a função cardíaca dos ratos.
Β. 1. Transplante da bomba osmótica em ratos (todas as etapas devem ser estéreis)
1 ml de água estéril e 1 ml de solução salina a 0,9 % estéril foram injetados em um frasco de NRG (993,1 U, 62,5 μg) na capela sucessivamente. A solução de NRG foi puxada em uma seringa estéril. Uma agulha de ponta rombuda foi trocada na seringa e a bolha na seringa foi removida. A bomba foi mantida vertical e a agulha foi inserida através da abertura pequena no topo da bomba vertical até que a mesma não pudesse ir adiante. O êmbolo foi empurrado lentamente para adicionar a solução de NRG na bomba até que a solução começasse transbordar da bomba. A agulha foi removida e a bomba foi limpada. A tampa transparente do moderador de fluxo foi tirada para expor um tubo de aço inoxidável curto. O tubo de aço foi então inserido em uma extremidade de um tubo de PE60 de 5 cm. A agulha da seringa foi inserida na outra extremidade do tubo PE60. O êmbolo da seringa foi empurrado para adicionar solução de NRG ao moderador de fluxo até que ele estivesse cheio. O tubo longo do moderador de fluxo foi depois inserido na bomba até que a sua flange branca ligasse à bomba. A agulha foi retirada do moderador de fluxo antes de embeber a bomba em solução salina a 0,9 % estéril a 37° C durante a noite.
Os ratos foram anestesiados por Cetamina (como descrito acima). A área entre o pescoço e os ombros dos ratos foi depilada e sanitizada. O corpo foi coberto com um pedaço de pano úmido estéril. Uma incisão foi depois cuidadosamente feita na pele entre os omoplatas para localizar e separar a veia jugular externa. A extremidade distai da veia do coração foi ligada. Um furo pequeno foi feito por tesouras oculares na parede da veia jugular externa e aumentada por microfórceps. O tubo de PE60 conectado à bomba osmótica foi inserido 2 cm na veia através do furo. A extremidade proximal da veia do coração foi depois ligada com tubo PE60 para fixar o tubo. A extremidade distai da veia que circunda o tubo PE60 foi firmemente amarrada para fixar ainda mais o tubo. Usando um hemostato, um túnel foi formado pela separação abrupta da pele da incisão no omoplata. Uma bolsa foi finalmente feita no dorso do rato na região escapular central espalhando-se mais a pele. A bomba foi deslizada através do túnel na bolsa com o moderador de fluxo apontando para fora da incisão. A incisão da pele foi depois fechada com uma sutura. Os ratos foram colocados de volta na sala de animal depois despertados e foram alimentados como usual.
C. Resultados Experimentais
A função do coração MI a seguir da infusão de NRG por IVGTT e IV é mostrada na Tabela 1 abaixo. Na Tabela 1 "IVS", "LVEDD", "PW", "LVESD", "EF", "FS" e "CC" significam septo interventricular, dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo, espessura da parede posterior, dimensão sistólica final do ventrículo esquerdo, fração de ejeção, encurtamento fracionário e ciclo cardíaco, respectivamente. Aqui EF e FS refletem a contratibilidade do coração, especialmente quanto ao ventrículo esquerdo.
EF = (volume diastólico final - volume sistólico final)/volume diastólico final
FS = (dimensão diastólica final - dimensão sistólica final)/dimensão diastólica final
Na Tabela 1, P < 0,01 para LVEDD, LVESD, EF e FS nos grupos IVGTT ou IV comparado com as suas contrapartes no grupo de veículo, indicando diferença altamente significante.
Tabela 1, função cardíaca de ratos MI depois da infusão de NRG por IVGTT e IV
<table>table see original document page 68</column></row><table>
A NRG infundida pela bomba osmótica dramaticamente aumentou a função cardíaca de ratos MI comparada com o grupo IV. Particularmente, o valor EF — uma medida da eficiência de bombeamento do sangue do coração que pode ser usada para estimar a função do ventrículo esquerdo - no grupo IVGTT foi 59,18 % mais alto do que aquele do grupo de veículo e 34,81 % mais alto do que do grupo IV. Adicionalmente, o valor FS - também um modo de medir o desempenho do ventrículo esquerdo - do grupo IVGTT foi 73,79 % mais alto do que aquele do grupo de veículo e 44,0 % mais alto do que do grupo IV. Estes resultados mostram que a liberação prolongada de NRG é mais eficaz do que a injeção IV convencional para melhorar a função cardíaca.
Surpreendentemente, a NRG infundida pela bomba osmótica não apenas aumentou enormemente a função cardíaca de ratos MI comparada com o grupo IV, mas também reduziu o diâmetro interno do ventrículo esquerdo. Especificamente, a dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo média (daqui em diante aludida como "LVEDD") do grupo IVGTT foi 9,98 % menor do que aquela do grupo de veículo e 6,03 % menor do que o grupo IV. Adicionalmente, a dimensão sistólica final do ventrículo esquerdo (daqui em diante aludida como "LVESD") do grupo IVGTT foi 21,37 % menor do que aquela do grupo de veículo e 15,15 % menor do que o grupo IV. Estes resultados mostram que administrar NRG constantemente pode reduzir o volume e a massa ventricular esquerdo, melhorando deste modo a saúde e desempenho ventricular esquerdo.
EXEMPLO 3
Função cardíaca de ratos enfartados no miocárdio depois que a neuregulina foi intravenosamente infundida de modo constante por bomba de seringa /Zhejiang University Medical Instrument Co. LTD, WZS 50-F2)
Neste exemplo, a bomba de seringa é usada para a liberação prolongada de neuregulina em pacientes humanos. A bomba de seringa pode bombear a solução de modo contínuo em certa velocidade na corrente sangüínea através de uma agulha injetada na veia em cauda de rato. Para a bomba de seringa, é fácil controlar o tempo e a velocidade de infusão. A neuregulina foi intravenosamente infundida pela bomba de seringa em velocidades diferentes por tempos diferentes por dia em ratos MI para melhorar o período de tempo e a velocidade do tratamento.
Os ratos MI agrupados foram tratados por injeção intravenosa de 4 ml/kg (volume/peso corporal) de veículo diariamente por 10 dias (grupo A); ou injeção intravenosa de 10 μηι/kg de neuregulina (2,5 μg/ml) diariamente por 10 dias (grupo B); ou infusão de neuregulina por bomba de seringa intravenosa (0,625 μg/ml) a 1,25 μg/kg/h com 4 horas por dia por 10 dias (grupo C); ou infusão de neuregulina por bomba de seringa intravenosa (1,25 μg/ml) a 2,5 μg/kg/h com 4 horas por dia por 10 dias (grupo D); ou infusão de neuregulina por bomba de seringa intravenosa (0,625 μg/ml) a 0,625 μg/kg/h com 8 horas por dia por 10 dias (grupo E); ou infusão de neuregulina por bomba de seringa intravenosa (1,25 μg/ml) a 1,25 μg/kg/h com 8 horas por dia por 10 dias (grupo F). A ecocardiografia foi depois realizada para todos os grupos para examinar a função do coração.
Tabela 2, Dados de ecocardiografia para ratos MI depois da infusão pela bomba de seringa intravenosa (ISPI) ou injeção IV de NRG
<table>table see original document page 69</column></row><table> P < 0,01 para LVEDD, LVESD, EF e FS em qualquer um dos grupos ISPI ou IV comparados com as suas contrapartes no grupo de veículo, indicando diferença altamente significante. HR significa freqüência cardíaca.
Como mostrado na tabela 2, comparada com o grupo de veículo, a neuregulina por IV (grupo B) realçou o valor EF de ratos MI em 20,29 %, a infusão por bomba de seringa intravenosa por 4 h/dia (grupos C, D) foi apenas tão eficaz quanto IV, enquanto que a neuregulina pela infusão por bomba de seringa intravenosa por 8 h/dia (grupos E, F) realçou o valor EF em torno de 37,10 %. Ao mesmo tempo, comparado com o grupo de veículo, a neuregulina pela injeção IV (grupo B) realçou o valor FS de ratos MI em 23,61 %, a infusão por bomba de seringa intravenosa por 4 h/dia (grupos C, D) foi tão eficaz quanto IV, enquanto que a neuregulina pela infusão por bomba de seringa intravenosa por 8 h/dia (grupos E, F) realçou o valor FS em torno de 45,49 %. Surpreendentemente, embora ratos MI no grupo E recebessem apenas metade da quantidade de neuregulina para o grupo F, os valores EF ou FS são quase os mesmos. Os resultados mostraram que depois que a neuregulina foi intravenosamente infundida de modo contínuo pela bomba de seringa por 8 ou mais horas por dia a mesma pôde realçar a função cardíaca.
EXEMPLO 4
A função cardíaca de ratos MI depois da infusão hipodérmica prolongada de NRG pela bomba osmótica
A ligação da artéria coronária do ventrículo esquerdo e o transplante da bomba osmótica em ratos foi realizada do mesmo modo como no exemplo 2, exceto que a quantidade de NRG injetada na bomba foi de 1791,3 U (125 μg) e a bomba foi embutida sem um tubo conectado à veia para tornar a infusão de NRG hipodérmica. A velocidade de infusão é de 37,33 U/kg/h.
A infusão de IV foi iniciada ao mesmo tempo como a infusão hipodérmica prolongada de modo que o grupo IV foi tratado com NRG por 7 dias. A quantidade de NRG para o grupo IV também foi mudada para 223,95 U/kg.
A função do coração MI a seguir da infusão de NRG pela hipodérmica prolongada e IV é mostrada na Tabela 3. Na Tabela 3, P < 0,01 para LVEDD, LVESD, EF e FS nos grupos IVGTT e IV comparados com as suas contrapartes no grupo de veículo, indicando uma diferença altamente significante.
Tabela 3, função cardíaca de ratos MI depois da infusão hipodérmica prolongada (FM) e IV de NRG _
<table>table see original document page 71</column></row><table>
A Tabela 3 mostra que a infusão hipodérmica prolongada de
NRG significantemente aumentou a função cardíaca de ratos MI comparada com os grupos IV e de veículo. Comparada com o grupo de veículo, a infusão hipodérmica prolongada de NRG realçou o valor EF de corações MI 42,77 %, o valor FS 51,75 %. Como debatido acima, os valores EF e FS são modos de medir a eficiência de bombeamento de sangue do coração e podem ser usados para estimar a função do ventrículo esquerdo. Assim, estes resultados mostram que a liberação prolongada de NRG é muito mais eficaz do que a injeção IV convencional para fornecer a função cardíaca.
A infusão hipodérmica prolongada de NRG também reduziu o diâmetro interno do ventrículo esquerdo. Especificamente, o LVEDD de corações MI diminuiu 10,98 % e o LVESD diminuiu 18,72 % comparado com o grupo de veículo. A injeção IV de NRG neste experimento não teve um efeito óbvio sobre a função cardíaca de coração MI comparada com veículo. Os resultados mostram que a infusão hipodérmica prolongada de NRG pode reduzir o volume e a massa ventricular esquerda, melhorando deste modo a saúde e desempenho ventricular esquerdo, que sugere que a mesma também pode ser usada como um tratamento para a insuficiência cardíaca.
EXEMPLO 5
Função cardíaca de ratos enfartados no miocárdio depois que a neuregulina foi hipodermicamente infundida de modo constante pela bomba de seringa
A neuregulina foi ainda infundida por bomba de seringa em velocidades diferentes por tempos diferentes por dia em ratos MI.
Os ratos MI agrupados foram tratados pela injeção intravenosa de 4 ml/kg (volume/peso corporal) de veículo diariamente por 10 dias (grupo A); ou injeção intravenosa de 10 μg/kg de neuregulina (2,54 ml) diariamente por 10 dias (grupo B); ou injeção hipodérmica (HI) de 10 μg/kg de neuregulina (2,5 μg/ml) diariamente por 10 dias (grupo C); infusão hipodérmica por bomba de seringa de neuregulina (1,25 μ£/πι1) a 2,5 μg/kg/h com 4 horas por dia por 10 dias (grupo D); ou infusão hipodérmica por bomba de seringa de neuregulina (1,11 μg/ml) a 1,67 μg/kg/h com 6 horas por dia por 10 dias (grupo E); ou infusão hipodérmica por bomba de seringa de neuregulina (1,25 μg/ml) a 1,25 μg/kg/h com 8 horas por dia por 10 dias (grupo F). A ecocardiografia foi depois realizada para todos os grupos para examinar a função do coração.
Tabela 4, dados de ecocardiografia para ratos MI depois da infusão hipodérmica por bomba de seringa (HSPI) ou injeção IV de NRG
<table>table see original document page 72</column></row><table> P < 0,01 para LVEDD, LVESD, EF e FS em qualquer um dos grupos HSPI, HI ou IV comparados com as suas contrapartes no grupo de veículo, indicando diferença altamente significante. FIR significa freqüência cardíaca.
Como mostrado na tabela 4, comparada com o grupo de veículo, a neuregulina por IV (B grupo) realçou o valor EF de ratos MI em 10,43 %, a neuregulina pela injeção hipodérmica (grupo C) realçou o valor EF de ratos MI em 7,12 %, enquanto que a neuregulina pela infusão hipodérmica por bomba de seringa por 4 h/dia (grupo D) realçou o valor EF em 12,47 %, a neuregulina pela infusão hipodérmica por bomba de seringa por 6 h/dia (grupo E) fez o valor EF pular para 22,90 %, a neuregulina pela infusão hipodérmica por bomba de seringa por 8 h/dia (grupo E) também elevou o valor EF em 20,10 %. Ao mesmo tempo, comparado com o grupo de veículo, a neuregulina pela IV (grupo B) realçou o valor FS de ratos MI em 11,24 %, a neuregulina pela injeção hipodérmica (grupo C) realçou o valor FS de ratos MI em 7,10 %, enquanto que a neuregulina pela infusão hipodérmica por bomba de seringa por 4 h/dia (grupo D) realçou o valor FS em 14,20 %, a neuregulina pela infusão hipodérmica por bomba de seringa por 6 h/dia (grupo E) fez o valor FS pular para 26,63 %, a neuregulina pela infusão hipodérmica por bomba de seringa por 8 h/dia (grupo E) também elevou o valor FS em 26,04 %. Os resultados mostraram que depois que a neuregulina foi de modo contínuo hipodermicamente infundida pela bomba de seringa por 6 ou mais horas por dia a mesma aumentou a função cardíaca dramaticamente.
EXEMPLO 6
Ligação por PEG de NRG e atividade da NRG ligada ao PEG A. Ligação ao PEG e isolação de NRG ligada ao PEG
PEG (mPEG-SPA-5000, NEKTAR) foi adicionado em 10 ml de PBS 20 mM (pH 8,0) contendo 1 mg/ml de NRG (PEG:NRG =1:1, razão molar) e rapidamente misturada e a mistura foi suavemente agitada na temperatura ambiente por 30 min, depois certa quantidade de ácido acético glacial foi adicionada para interromper a reação de ligação. A mistura foi depois carregada em uma coluna de filtração em gel (SI00, Pharmacia) para separar os componentes. Cada fração de pico foi coletada e a sua amostra foi preparada para SDS-PAGE. Depois da eletroforese, o gel foi tingido por BaI2 e Azul Brilhante de Coomassie seqüencialmente para detectar PEG e NRG separadamente.
Como mostrado na figura 2 para o gel tingido com BaI2, a mistura conteve monômero de PEG, NRG-monoPEG, NRG-diPEG e NRG- poliPEG. Depois a mistura foi carregada em uma coluna de filtração e gel S100, os componentes foram bem separados em NRG-poliPEG e NRG- diPEG (pico 1), NRG-monoPEG e PEG (pico 2).
O gel tingido com Coomassie na figura 3 confirmou que o pico 1 e pico 2 ainda continham NRG que foi ligado ao PEG, enquanto que o pico 3 conteve apenas NRG.
B. medição da atividade de NRG ligado ao PEG
As células MCF-7 foram colhidas, contadas, pelotizadas e recolocadas em suspensão em DMEM (com 10 % de soro e 9 μg/ml de insulina) a 5 x 104 células/ml. 100 μl de suspensão de célula foram adicionados a cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios e a placa foi incubada a 37°C durante a noite. As células foram depois lavadas 3 vezes com PBS e cultivadas em DMEM isento de soro por mais 24 horas.
O anticorpo H4 de ErbB2 (Zensun, anticorpo monoclonal anti- ErbB2) foi diluído a 6 μg/ml pelo tampão de revestimento (50 mM de Na2CO3-NaHCO3, pH 9,6) e adicionado à placa de 96 reservatórios a 50 μl/reservatório. A placa foi deixada a 4°C durante a noite para revestir com anticorpo.
O DMEM foi sugado para fora das células MCF-7 jejuadas e 100 μl de diluições em série de NRG, NRG-monoPEG ou NRG-diPEG em DMEM foi adicionado a cada reservatório separadamente. DMEM foi adicionado aos dois reservatórios como branco. A placa foi incubada a 37° C por 20 min. As células foram lavadas uma vez com PBS antes de adicionar tampão de lise a 100 μl/reservatório (50 mM de Hepes, pH 8,0, 150 mM de NaCl5 2 mM de ortovanadato de sódio, 0,01 % de timerosal, 1 % de Triton Χ- 100 e um tablete de coquetel inibidor da protease por 25 ml de solução) e lisando a 4°C por 30 min. A placa foi depois agitada suavemente para lisar completamente e remover as células da placa e centrifugada a 15000 rpm por 15 min.
A placa com anticorpo de revestimento foi lavada cinco vezes com tampão de lavagem (10 mM de PBS, pH 7,4, 0,05 % de Tween 20) antes de adicionar 200 μl/reservatório de leite desnatado a 5 % em tampão de lavagem. A placa foi incubada a 37° C por 2 horas antes de lavada mais uma vez 3 vezes com tampão de lavagem.
Uma solução a 90 μl de células lisadas foi puxada de cada reservatório em placa de cultura e transferida ao reservatório correspondente na placa revestida. A seguir da incubação a 37° C por 1 hora, a placa revestida com lise de célula foi lavada mais uma vez 5 vezes com tampão de lavagem e tratada com 100 μl de concentração adequada de anticorpo monoclonal anti- fosfotirosina conjugada com rábano peroxidase (HRP) (Santa Cruz Biotechnology) a 37° C por 1 hora. Depois a placa foi lavada mais uma vez 5 vezes com tampão de lavagem, 100 μl de solução de substrato de HRP recém preparada [50 mM de ácido cítrico, 100 mM de Na2PO4, pH 5,0, 0,2 mg/ml de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), 0,003 % de H2O2] foi adicionado a cada reservatório antes que a placa fosse foi incubada a 37° C por 10 min. Finalmente 5 μl de H2SO4 2 N foram adicionados a cada reservatório para destruir a atividade de HRP. O valor de OD a 450 nm para cada reservatório foi lido em uma leitora de microplaca (BIORAD Modelo 550) e a EC50 foi a concentração de NRG que obteve 50 % de valor OD máximo. Quanto mais baixa a EC50, mais alta a atividade.
A EC50 de NRG, NRG-monoPEG e NRG-diPEG foi mostrada na Tabela 5.
Tabela 5, a EC50 de NRG, NRG-monoPEG e NRG-diPEG
<table>table see original document page 76</column></row><table>
A partir da tabela 5, nós podemos observar claramente que a EC50 de NRG-monoPEG é a mesma como aquela de NRG, enquanto que a EC50 de NRG-diPEG é 40 % mais alta. Isto significa que a NRG-monoPEG tem a mesma atividade como a NRG in vitro, mas a atividade de NRG-diPEG é 40 % mais baixa.
EXEMPLO 7
A liberação prolongada de neuregulina reduz os efeitos colaterais da administração de neuregulina
Estes exemplos mostram que comparado com a administração de longa duração ou alta dose, a liberação prolongada de neuregulina pode reduzir os efeitos colaterais, tais como distúrbio gastrointestinal ou a efusão pericárdica, associados com a administração de neuregulina.
NRG-I β foi administrada intravenosamente pela bomba de seringa a dois grupos de macacos, cada um consistindo de vinte e quatro macacos rhesus saudáveis (doze machos e doze fêmeas, pesando cerca de 5 a 7kg). O Grupo I foi infundido com NRG-IO por doze horas por dia por catorze dias, na velocidade de 1 μg/k:g/hora. Nenhum efeito colateral foi observado neste grupo. O Grupo II foi infundido por vinte e quatro horas por dia por catorze dias, na velocidade de 1 μg/kg/hora. No Grupo II, cerca de 3 a 5 ml de efusão pericárdica no coração dos macacos foi observada.
Dois grupos de indivíduos saudáveis foram administrados com a mesma quantidade de NRG-I β por dia por 10 dias. Oito indivíduos no Grupo I, foram infundidos com NRG-β por quatro horas por dia por dez dias na velocidade de 0,3 Neste grupo, cada indivíduo em média experienciou distúrbio gastrointestinal em cerca de duas vezes durante o período de dez dias. Seis indivíduos foram infundidos com NRG-I β por duas horas a cada dia por dez dias na velocidade de 0,6 μg/kg/hora. No Grupo II, cada indivíduo em média experienciou distúrbio gastrointestinal em cerca de cinco vezes durante o período de dez dias.
Estes resultados mostram que a liberação prolongada de neuregulina pode reduzir efeitos colaterais adversos associados com a administração de neuregulina de longa duração ou alta dose. Estes resultados sugerem que a infusão intravenosa ou hipodermicamente por tempo hsoert ou dosagem mais baixa por dia pôde reduzir os efeitos colaterais da infusão de neuregulina por 24 horas.
EXEMPLO 8
Expressão de gene pela NRG liberada de modo prolongado no ventrículo esquerdo de rato enfartado no miocárdio
Neste exemplo, ratos enfartados no miocárdio foram infundidos com NRG-I β e o padrão de expressão de gene no ventrículo esquerdo destes ratos foi analisado pela microssérie. A comparação com ratos enfartados no miocárdio infundido com veículo, os ratos infundidos com NRG tiveram padrão de expressão de gene diferente. Depois da liberação prolongada de NRG, o nível de mRNA de proteína equivalente à timosina beta aumentou 3,10 vezes; o nível de mRNA de defensina beta 1 aumentou 2,87 vezes; o nível de mRNA da proteína associada com o crescimento aumentou 2,16 vezes; o nível de mRNA de timosina beta 4, Laminina gama 1, miocardina, subunidade reguladora PI3K gama quase todas dobraram, enquanto o nível de mRNA de Elastina e PI3K gama foi quase o mesmo como antes. Isto mostra que a neuregulina muda o nível de expressão de várias proteínas no coração. O escopo da invenção não é limitado pela descrição dos exemplos. As modificações e alterações da presente invenção estarão evidentes àqueles habilitados na técnica sem divergir do escopo e espírito da presente invenção. Portanto, será avaliado que o escopo desta invenção deve ser definido pelas reivindicações anexas, ao invés do que pelos exemplos específicos que foram apresentados por via de exemplo. LITAGEM DE SEQUENCIA
<110> Zensun (Shanghai) Science and Technology Inc. Zhou, Mingdong
<12Ó> "LIBERAÇÃO PROLONGADA DE NEUREGULINA PARA FUNÇÃO CARDÍACA MELHORADA".
<130> 11748-009-228
<140> A ser designada
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<160>2
<170> FastSEQ for Windows versão 4.0
<210> I <211> 61 <212>PRT <213> Homo Mpleiis
<400> 1
Ser His Leu VaI Lys CjiS Álâ Glu Lys GIu Lys Thr Phe Cys VaJ Asn
1 5 IO 15
Gly Gly Glu Cys Phe Niet Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Sef Alg Tyr 20 25 30
Leu Cys Lys Cys Pto Asn Glu Phe Uir Gly Asp Arg Cys Glll Asn Tyr
35 40 45
Vâl Mei Ak Ser Phe Tyr Lys Ala Giu GIu Lm Tjtt Gta 50 55 60
<210> 2 <211> 183 <2I2> DNA <213> Homo sapiens <400>2
agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg agggggagtgc 60 ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt 120 actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac 180 cag 183

Claims (30)

1. Uso de uma neuregulina (NRG) de liberação prolongada, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou retardar uma doença ou distúrbio em um mamífero.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença é insuficiência cardíaca.
3. Uso de uma NRG de liberação prolongada, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para ativar a via de sinalização de AKT no coração.
4. Uso de uma NRG de liberação prolongada, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para ativar a via de sinalização de ERK no coração.
5. Uso de uma NRG de liberação prolongada, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para aumentar o valor EF de um mamífero.
6. Uso de uma NRG de liberação prolongada, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para aumentar o valor FS de um mamífero.
7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, ou 6, caracterizado pelo fato de que a liberação prolongada de NRG em um mamífero previne a hipertrofia cardíaca.
8. Uso de uma NRG de liberação prolongada em uma dosagem baixa constante, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para prevenir a hipertrofia cardíaca.
9. Uso de uma NRG de liberação prolongada, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para reduzir o diâmetro interno do ventrículo esquerdo.
10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3, -5, 6, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a liberação prolongada de NRG em um mamífero induz a ativação prolongada da via de sinalização de ERK em células cardíacas.
11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4, -5, 6, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a liberação prolongada de Neuregulina em um mamífero induz a ativação prolongada da via de sinalização de AKT em células cardíacas.
12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, -4, 5, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a liberação prolongada de NRG em um mamífero aumenta o valor FS do mamífero.
13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, -4, 6, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a liberação prolongada de NRG em um mamífero aumenta o valor EF do mamífero.
14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3 a -6, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a NRG é adequada para ser administrada por uma bomba osmótica ou bomba de seringa.
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3 a -6, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que um polímero é ligado à neuregulina.
16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito polímero é poli(etileno glicol) ou um derivado de poli(etileno glicol).
17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3 a -6, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a neuregulina é empacotada em lipossomas ou microesferas.
18. NRG em uma liberação prolongada de uma dosagem baixa constante, caracterizada pelo fato de ser para causar crescimento e diferenciação de cardiomiócitos, ativando, assim, a via da MAP quinase, a via da ERK ou a via da AKT em células cardíacas e causando crescimento e/ou diferenciação do cardiomiócito.
19. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste de doenças cardiovasculares, câncer, doença do sistema neural, doença muscular, distrofia muscular (por exemplo, de Duchenne, das cinturas dos membros), escleroses múltiplas, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, doenças oculares e otológicas, diabetes, esquizofrenia, e Alzheimer.
20. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a neuregulina é selecionada do grupo que compreende NRG1, NRG2, NRG3 e NRG4.
21. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a neuregulina compreende o domínio equivalente ao fator de crescimento epidérmico (equivalente a EGF), em que o domínio equivalente a EGF é codificado pelo gene da neuregulina 1.
22. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a neuregulina é adequada para ser continuamente administrada por injeção ou infusão por 1 minuto a 24 horas por dia.
23. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a neuregulina é adequada para ser continuamente administrada por infusão intravenosa ou injeção de neuregulina por 4 ou mais horas por dia ou -6 ou mais horas por dia.
24. Composição de liberação prolongada para prevenir, tratar ou retardar uma doença ou distúrbio em um mamífero, caracterizada pelo fato de compreender uma bomba osmótica, PEG, um lipossoma, ou uma microesfera e uma quantidade terapeuticamente eficaz de neuregulina.
25. Uso de uma NRG de liberação prolongada, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou retardar a insuficiência cardíaca em um mamífero.
26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a NRG aumenta os valores EF ou FS do mamífero, ou reduz o diâmetro interior do ventrículo esquerdo (LVEDD ou LVESD).
27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o valor EF ou o valor FS do mamífero é aumentado por uma porcentagem selecionada do grupo que consiste de mais que cerca de 20%, mais que cerca de 30%, mais que cerca de 40%, mais que cerca de 50% e mais que cerca de 60%.
28. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o valor LVEDD é reduzido por uma porcentagem selecionada do grupo que consiste de mais que cerca de 2%, mais que cerca de 5%, mais que cerca de 10% e mais que cerca de 15%, ou em que o valor LVESD é reduzido por uma porcentagem selecionada do grupo que consiste de mais que cerca de -2%, mais que cerca de 5%, mais que cerca de 10%, mais que cerca de 15% e mais que cerca de 20%.
29. Uso de uma NRG de liberação prolongada, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para reduzir o efeito colateral em um mamífero submetido ao tratamento por neuregulina.
30. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o efeito colateral é distúrbio gastrointestinal ou efusão pericárdica.
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