BRPI0621613A2

BRPI0621613A2 - processo para a produção de estereoisÈmeros de monatina e seus precursores e composição compreendendo os mesmos

Info

Publication number: BRPI0621613A2
Application number: BRPI0621613-7A
Authority: BR
Inventors: Brian J Brazeau; Ellen Burke; Souza Mervyn L De; Steven J Gort; Paula M Hicks; Sherry R Kollman; Peter Luginbuhl; Sara C Mcfarlan; Toby Richardson; Fernando A Sanchez-Riera; Christopher Solheid; David Weiner; Lishan Zhao
Original assignee: Cargill Inc
Priority date: 2006-04-26
Filing date: 2006-04-27
Publication date: 2011-12-13
Also published as: CA2649939A1; EP2010650A4; WO2007133183A3; CN101466830A; WO2007133183A2; AU2006343640A1; JP2009535028A; EP2010650A2; US20060252135A1; US7582455B2

Abstract

PROCESSO PARA A PRODUçãO DE ESTEREOISÈMEROS DE MONATINA E SEUS PRECURSORES E COMPOSIçãO COMPREENDENDO OS MESMOS. A monatina e certos estereolsómeroS da monatina, tais como R,R monatina e S,R monatina, assim como sais dos mesmos, são produzidos utilizando polipeptídeos e vias biossintéticas. Estes polipeptídeos e vias biossintéticas são também úteis na produção do ácido R-2-hidróxi-2-(indoli-3-ilmetil)-4-ceto glutárico, um intermediário que é formado em certas vias de síntese da monatina, incluindo algumas vias biossintéticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ESTEREOISÔMEROS DE MONATINA E SEUS PRECURSORES E COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS".

Fundamento da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao fornecimento de polipeptídeos e vias biossintéticas que são úteis na produção de D-triptofano, indol-3-piru- vato, ácido R-2-hidróxi-2-(indol-3ilmetil)-4-ceto glutárico (R-MP) e certos es- tereoisômeros da monatina, tais como R,R e S1R monatina e sais dos mes- mos.

Técnica Antecedente

A monatina é um adoçante de alta intensidade que possui a fór- mula química:

A monatina inclui dois centros quirais que levam a quatro confi- gurações estereoisoméricas potenciais. A configuração R,R (o "estereoisô- mero R,R" ou "R,R monatina"); a configuração S1S (o "estereoisômero S,S" ou "S,S monatina"); a configuração R,S (o "estereoisômero R,S" ou "R,S monatina"); e a configuração S1R (o "estereoisômero S,R" ou "S1R monati- na"). Como utilizado aqui, a não ser que seja citado de outra maneira, o ter- mo "monatina" é utilizado para se referir a composições que incluem todos os quatro estereoisômeros da monatina, composições que incluem qualquer combinação de estereoisômeros da monatina, (por exemplo, uma composi- ção que inclui apenas os estereoisômeros R1R e S1S da monatina), assim como uma única forma isomérica.

Para as finalidades desta descrição, a estrutura de carbono da monatina será numerada como ilustrado anteriormente, com o carbono liga- do de forma covalente diretamente ao grupo álcool sendo identificado como ao grupo amino sendo identificado como o carbono da posição 4. Conse- qüentemente, as referências contidas aqui para R1R monatina, S,S monati- na, R,S monatina e S,R monatina sigificam: 2R,4R monatina, 2S,4S monati- na, 2R,4S monatina e 2S,4R monatina, respectivamente, a não ser que seja indicado de outra maneira.

Deve ser observado que na literatura, a estrutura de carbono da monatina também foi numerada utilizando uma convenção alternativa, com o carbono ligado ao grupo álcool sendo o carbono da posição 4 e o carbono ligado ao grupo amino sendo o carbono da posição 2. Conseqüentemente, por exemplo, as referências à 2S,4R monatina nesta descrição seriam as mesmas que as referências à 2R,4S monatina na literatura utilizando a con- veção de numeração alternativa.

Além disso, devido às várias convenções de nomenclatura, a monatina é conhecida por um número de nomes químicos alternativos, inclu- indo: ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-aminoglutárico; ácido 4-amino-2- hidróxi-2-(1 H-indol-3-ilmetil)-pentanedióico; ácido 4-hidróxi-4-(3-indolilmetil) glutâmico; e, 3-(1-amino-1,3-dicarbóxi-3-hidróxi-but-4-il)indol.

Certas formas isoméricas da monatina podem ser encontradas na casca de raízes da planta Schlerochiton ilicifolius localizada na Região Transvaal da África do Sul. Os Pedidos de Patentes U.S. Nes 10/422.366 ("o pedido de patente '366"), 10/979.821 ("o Pedido de Patente '821") e 11/114.922 ("o pedido de patente '922"), que são incorporados aqui como referência, divulgam, inter alia, polipeptídeos, vias e microorganismos para a produção in vitro e in vivo da monatina.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta descrição fornece, entre outras coisas, polipeptídeos e vias biossintéticas que são úteis na produção de D-triptofano, indol-3-piruvato, ácido R-2-hidróxi 2-(indol-3ilmetil)-4-ceto glutárico (também referido como monatida R-alfa ceto ácida, precursor de R-monatina, R-MP e a forma ceto alfa da monatina) e certos estereoisômeros da monatina, tais como R,R e S,R monatina e sais das mesmas. Os métodos incluem o uso de um ou mais polipeptídeos e, em particular, enzimas, tais como racemases (por exemplo, glutamato racemases, aspartato racemases e alanina racemases), D-amino- transferases de especificidade ampla (também chamadas de D-alanina ami- notransferases, D-aminoácido aminotransferases e D-aspartato aminotrans- ferases), L-aminotransferases (incluindo L-triptofano-aminotransferases, amino- transferases L-aromáticas, L-aspartato aminotransferases e L-alanina-ami- notransferases), aldolases (por exemplo, aldolases específicas a R), D-fenil- glicina aminotransferases (também chamadas de D-4-hidroxifenilglicina ami- notransferase), D-metionina aminotransferases, glutamato descarboxilases, aspartato descarboxilases e aspartato-4-descarboxilases para produzir com- posições de monatina enriquecidas com as formas do isômero 4-R e/ou para produzir R1R monatina sem ter que utilizar quantidades estequiométricas do substrato de D-aminoácido como o doador de aminoácido para a aminação de MP.

Em um esforço para ser conciso, sempre que intermediários/pro- dutos forem identificados no relatório descritivo e nas reivindicações (por exemplo, monatina ou precursor de monatina) como sendo formados, o ter- mo "e/ou sais dos mesmos" deve ser entendido como sendo incluído quando aplicável. Em outras palavras, por exemplo, a expressão "indol-3-piruvato é convertido em MP" deve ser entendida como lida "o ácido indol-3-pirúvico é convertido em MP e/ou sais do mesmo". Um versado na técnica, na verda- de, apreciará que sob as condições de reação mostradas os sais dos inter- mediários/produtos estão na verdade presentes ou também presentes.

De acordo com algumas modalidades, o método produz uma composição de monatina em que o componente de monatina da composição inclui apenas as formas R,R e S,R da monatina. O termo "somente", quando utilizado para indicar que somente certos isômeros são formados, a não ser que seja citado de outra maneira, significa que a via produziria somente os isômeros identificados se a racemização não ocorresse. Conseqüentemente, o termo "somente" não seria tomado para significar a ausência de outros isômeros, mas ao invés disso, um versado na técnica entenderia que outras formas isoméricas podem estar presentes em uma quantidade relativamente pequena devido à racemização que pode ocorrer. De acordo com algumas modalidades, o método produz uma com posição da monatina em que o componente de monatina da composição inclui apenas a forma R1R da mo- natina (significando assim exceto até a extensão em que a racemização o- corre resultando em outras formas isoméricas).

Como utilizado aqui, a expressão "composição de monatina" significa uma composição que inclui um ou mais isômeros de monatina; o termo pode ainda significar uma composição que inclui somente uma única forma isomérica de monatina e nenhuma outra, dependendo do contexto.

Em algumas modalidades, de acordo com a presente invenção, é fornecido um processo para a produção de uma composição de monatina, que inclui a produção de indol-3-piruvato partindo de L-triptofano, a produção de ácido 2-hidróxi 2-(indol-3ilmetil)-4-ceto glutárico ("precursor de monatina" ou "MP") partindo de indol-3-piruvato e a produção de monatina partindo de MP. A reação de L-triptofano para produzir indol-3-piruvato é facilitada por uma enzima que possui maior especificidade, maior atividade ou ambas em relação ao L-triptofano como um substrato que em relação a R-MP, R1R mo- natina ou ambos. De acordo com certas modalidades, a reação de indol-3- piruvato é facilitada por uma enzima que possui atividade de aldolase espe- cífica a R e conseqüentemente produz R-MP. De acordo com certas modali- dades, é fornecida uma enzima racemase que pode facilitar a epimerização do aminoácido que é formado na forma de um subproduto da reação de transaminação de L-triptofano (ou que é formado partindo de um outro ami- noácido que é um subproduto da reação de triptofano) partindo de uma for- ma isomérica em uma outra forma isomérica.

Em algumas modalidades de acordo com a invenção, é forneci- do um processo para a produção de uma composição de monatina, que in- clui a produção de indol-3-piruvato partindo de L-triptofano, a produção de ácido 2-hidróxi 2-(indol-3ilmetil)-4-ceto glutárico ("precursor de monatina" ou "MP") partindo de indol-3-piruvato e a produção de monatina partindo de MP. A reação de L-triptofano para produzir indol-3-piruvato é facilitada por uma enzima que possui maior especificidade, maior atividade ou ambas em rela- ção ao L-triptofano como um substrato que em relação a R-MP, R,R monati- na ou ambos e a reação de MP para formar monatina é facilitada por uma enzima, que é estereosseletiva em relação a R-MP.

Deve ser observado que, quando são feitas referências a uma série de reações tais como aquelas nos parágrafos anteriores, a invenção não requer que cada etapa seja explicitamente realizada; é suficiente que as etapas podem ser realizadas de forma implícita. Em outras palavras, por e- xemplo, o processo para a produção de uma composição de monatina, que inclui a produção de indol-3-piruvato partindo de L-triptofano, a produção de ácido 2-hidróxi 2-(indol-3ilmetil)-4-ceto glutárico ("precursor de monatina" ou "MP") partindo de indol-3-piruvato e a produção de monatina partindo de MP, em que cada reação é facilitada por uma enzima apropriada, pode ser reali- zado através da combinação de L-triptofano com as enzimas e o ajuste das condições de forma que as reações enumeradas pudessem ocorrer. Em tal caso, o L-triptofano poderia reagir para produzir indol-3-piruvato, o indol-3- piruvato produzido partindo da reação de L-triptofano poderia reagira para formar MP e o MP produzido partindo da reação de indol-3-piruvato poderia reagir para formar monatina. O processo poderia também ser realizado, com a finalidade de exemplo, através do fornecimento de um composto que pode produzir L-triptofano, sob condições adequadas para que a produção de L- triptofano ocorra e através da combinação de tal composto com enzimas capazes de facilitar a série de reações apresentadas sob condições que se- riam adequadas para que tais reações ocorressem. Ainda como um outro exemplo, o processo poderia ser realizado através do fornecimento de um microorganismo engenheirado geneticamente produzir monatina de acordo com a via descrita e fornecendo condições apropriadas para que o processo de fermentação ocorra. Por exemplo, um microorganismo, que produz natu- ralmente grandes quantidades de L-triptofano (ou D-triptofano) poderia ser engenheirado geneticamente para produzir ou superproduzir uma ou mais das enzimas utilizadas para facilitar as reações na via para monatina e con- dições apropriadas poderiam ser fornecidas de forma que o microorganismo produziria assim monatina.

Em outras modalidades de acordo com a invenção, é fornecido um processo para a produção de monatina, em que um substrato α-ceto á- cido forma um L-aminoácido quando o L-triptofano é convertido em indol-3- piruvato, o indol-3-piruvato reage para formar MP (que pode incluir tanto R- MP quanto S-MP, embora inclua preferencialmente apenas ou predominan- temente R-MP) e o L-aminoácido reage para regenerar (também referido como "reciclar") o substrato α-ceto ácido quando o R-MP é convertido em R,R monatina. A reação de R-MP para formar R,R monatina é facilitada por uma aminotransferase de estereoinversão tal com D-metionina aminotrans- ferase (EC 2.6.1.41) ou uma enzima derivada de uma D-fenilglicina amino- transferase.

Em outras modalidades de acordo com a invenção, é fornecido um processo para a produção de uma composição de monatina, que inclui a produção de D-triptofano partindo de L-triptofano, a produção de indol-3- piruvato partindo de D-triptofano, a produção de R-MP partindo de indol-3- piruvato e a produção de R,R monatina partindo de R-MP. A produção do D- triptofano partindo do L-triptofano é facilitada por uma triptofano racemase e equivalentes funcionais da mesma. Em certas modalidades adicionais, as reações de D-triptofano para formar indol-3-piruvato e de MP para formar monatina são facilitadas pela mesma enzima. Ainda em outras modalidades adicionais, a reação de indol-3-piruvato é facilitada por uma enzima que possui atividade de aldolase específica a R e conseqüentemente o R-MP é formado e as reações de D-triptofano para formar indol-3-piruvato e de R-MP para formar R,R monatina são facilitadas pela mesma enzima.

Em outras modalidades de acordo com a invenção, é descrito aqui um método para a produção de R,R-monatina ou de um sal da mesma, que compreende ou que consiste essencialmente da, (a) produção de D- triptofano partindo de L-triptofano utilizando uma triptofano racemase (a ra- cemase teria atividade limitada ou nenhuma sobre a monatina), (b) produção de indol-3-piruvato partindo de D-triptofano, (c) produção do precursor R da monatina partindo de indol-3-piruvato e (d) produção de R,R-monatina par- tindo do precursor R da monatina.

Embora várias modalidades sejam divulgadas, ainda outras mo- dalidades da presente invenção podem se tornar evidentes aos versados na técnica partindo do relatório descritivo. Como seria entendido partindo da descrição contida aqui, a invenção é capaz de sofrer modificações em vários aspectos, todas sem sair do espírito e do âmbito da presente invenção. Con- seqüentemente, as figuras e a descrição detalhada devem ser consideradas como tendo natureza ilustrativa e não de restrição.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 é um fluxograma que mostra um exemplo de um pro- cesso enzimático para a produção de R,R monatina partindo de L-triptofano de acordo com a invenção. Neste exemplo, o processo inclui uma L-amino- transferase (cujos exemplos incluem uma L-triptofano aminotransferase, uma aminotransferase L-aromática, uma L-aspartato aminotransferase e uma L-alanina aminotransferase) na reação de L-triptofano que possui maior especificidade e/ou seletividade em relação ao L-triptofano como um subs- trato que em relação ao R-MP e/ou uma L-aminoácido oxidase com ativida- de e/ou especificidade limitada em relação à R1R monatina como um subs- trato.

A figura 2 é um fluxograma que mostra um exemplo de um outro processo para a produção de R1R monatina de acordo com a invenção. Nes- te exemplo, o processo inclui a utilização de uma enzima para converter R- MP em monatina que é estereosseletiva em relação ao R-MP.

A figura 3 é um fluxograma que mostra um exemplo de ainda um outro processo para a produção de R1R monatina partindo de L-triptofano de acordo com a invenção. Neste exemplo, o processo inclui a conversão de L- triptofano em D-triptofano utilizando uma triptofano racemase e utilizando um produto de D-aminoácido na reação acoplada à reação que forma indol-3- piruvato como um substrato na reação acoplada à reação que forma R,R monatina.

A figura 4 é um fluxograma que mostra um exemplo de ainda um outro processo para a produção de R,R monatina partindo de L-triptofano de acordo com a invenção. Neste exemplo, o processo inclui a conversão do L- aminoácido formado na reação acoplada à reação do L-triptofano em um D- aminoácido; este D-aminoácido atua como um doador de amino para a rea- ção em que R-MP é convertido em R,R monatina.

A figura 5 é um fluxograma que mostra um exemplo de ainda um outro processo para a produção de R,R monatina partindo de L-triptofano de acordo com a invenção. Neste exemplo, o processo inclui a facilitação de forma enzimática da conversão de R-MP em R,R monatina utilizando uma enzima de estereoinversão de forma que o L-aminoácido formado através da reação acoplada à reação de L-triptofano pode ser utilizado como um subs- trato para a reação acoplada à reação de R-MP em R,R monatina.

A figura 6 é um fluxograma que mostra um exemplo de ainda um outro processo para a produção de R1R monatina de acordo com a presente invenção. Neste exemplo, o processo inclui a reciclagem do L-aminoácido produzido na reação que forma indol-3-piruvato com o D-aminoácido utiliza- do como um reagente com R-MP na reação que forma R,R monatina através de uma série de reações de conversão.

A figura 7 é um fluxograma que mostra um exemplo de ainda um outro processo para a produção de R1R monatina de acordo com a presente invenção. Neste exemplo, o processo inclui empurrar a reação de L- triptofano adiante (isto é, conduzir a reação em direação à produção de in- dol-3-piruvato) através da conversão do subproduto de L-aminoácido de tal reação em um outro produto. Neste exemplo, o subproduto de L-aminoácido L-aspartato é convertido em L-alanina em uma reação irreversível utilizando uma descarboxilase.

A figura 8 é um fluxograma que mostra um exemplo de ainda um outro processo para a produção de R,R monatina de acordo com a presente invenção. Neste exemplo, o processo inclui a reciclagem do subproduto de aminoácido da reação de L-triptofano com o reagente de aminoácido da rea- ção de R-MP através de uma série de reações de conversão.

As figuras 9(A e B) mostram o alinhamento de seqüências de aminoácidos de várias D-aminoácido aminotransferases publicadas de Bacillus ("DAATs"). Os aminoácidos sublinhados indicam as regiões de homologia. Cin- co iniciadores da PCR foram planejados com base nas regiões conservadas. Os iniciadores da PCR são os seguintes: õ^GAAGACCGTGGTTATCAATTT-S' (SEQ ID NO:65) (iniciador para frente, F1 como indicado na figura 9A), 5'-GATGGTATTTACGAAGTAATC-3' (SEQ ID NO:66) (iniciador para frente, F2 como indicado na figura 9A), õ^AGATTTAATATCACAACGTAAC-S' (SEQ ID NO:67) (iniciador para trás, R1 como indicado na figura 9A), 5'- GCCAAGTAAAATTTAAGATTTA-3' (SEQ ID NO:68) (iniciador para trás, R2 como indicado na figura 9A), 5'-ATTTGCTGGGTGCGTATAAAG-3' (SEQ ID NO:69) (iniciador para trás, R3 como indicado na figura 9B).

As figuras 10(A e B) mostram o alinhamento de seqüências de aminoácidos das duas novas DAATs da ATCC 4978 e da ATCC 7063 com a DAAT de B. sphaericus (clonada no Exemplo 18). Os aminoácidos não- homólogos estão sublinhados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Abreviações e Termos

As explicações a seguir dos termos e dos métodos são forneci- das para melhor descrever a presente descrição e para guiar os peritos co- muns na arte na prática da presente descrição. Como utilizado aqui, "inclu- indo" significa "compreendendo". Sempre que o termo "inclui" for utilizado, deve ser entendido que "inclui, mas não está limitado a" é pretendido, seja ou não "é limitado a" explicitamente citado. Em adição, as formas no singular "um" ou "uma" ou "o" ou "a" incluem referências no plural a não ser que o contexto determine claramente de outra forma. Por exemplo, a referência a "compreendendo uma proteína" inclui uma ou um grande número de tais proteínas e a referência a "compreendendo a célula" inclui referência a uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidas pelos versados na técnica e assim por diante. O termo "aproximadamente" abrange uma faixa de erro experimental que ocorre em qualquer medida. A não ser que seja citado de outra maneira, todos os números de medida são presumidos como possuindo a palavra "aproximadamente" na frente dos mesmos mesmo se a palavra "aproximadamente" não for explicitamente utilizada.

Substituição conservativa: uma substituição de um aminoácido por um outro aminoácido em um polipeptídeo, cuja substituição possui pouco até nenhum impacto sobre a atividade do polipeptídeo. A substituição é con- siderada conservativa independente do fato dos aminoácidos alterados pa- recerem estruturalmente ou funcionalmente similares. Por exemplo, de forma ideal, um polipeptídeo de triptofano aminotransferase que inclui uma ou mais substituições conservativas mantém a atividade de triptofano aminotransfe- rase. Um polipeptídeo pode ser produzido para conter uma ou mais substitu- ições conservativas através da manipulação da seqüência de nucleotídeos que codifica tal polipeptídeo utilizando, por exemplo, procedimentos padroni- zados tal como mutagênese direcionada ao sítio ou PCR outros métodos conhecidos pelos versados na técnica.

Os exemplos não-limitantes de aminoácidos que podem ser substituídos por um aminoácido original em uma proteína e que podem ser considerados como substituições conservativas se houver pouco até ne- nhum impacto sobre a atividade do polipeptídeo incluem: Ala substituída por ser ou thr; arg substituída por gln, his ou lys; asn substituída por glu, gln, lys, his, asp; asp substituída por asn, glu ou gln; cys substituída por ser ou ala; gln substituída por asn, glu, lys, his, asp ou arg; glu substituído por asn, gln Iys ou asp; gly substituída por pro; his substituída por asn, lys, gln, arg, tyr; ile substituída por leu, met, vai, phe; leu substituída por ile, met, vai, phe; Iys substituída por asn, glu, gln, his, arg; met substituída por ile, leu, vai, phe; phe substituída por trp, tyr, met, ile ou leu; ser substituída por thr, ala; thr substituída por ser ou ala; trp substituído por phe, tyr; tyr substituída por his, phe ou trp; e vai substituída por met, ile, leu.

Informações adicionais em relação a substituições conservativas podem ser encontradas, entre outros locais, em Ben-Bassat e outros, J. Bacte- ríol. 765:751-757, (1987); O'Regan e outros, Gene 77:237-251, (1989); Sahin- Toth e outros, Protein Sei. 3:240-247, (1994); Hochuli e outros, BiofTechno- logy 6\ 1321-1325, (1988); WO 00/67796 (Curd e outros) e em livros textos padronizados de genética e biologia molecular.

Derivado(a): para as finalidades do relatório descritivo e das rei- vindicações, uma substância é "derivada" do organismo ou da fonte se qual- quer um ou mais dos seguintes for verdadeiro: 1) a substância está presente no organismo/fonte; 2) a substância é removida do hospedeiro nativo; ou, 3) a substância é removida do hospedeiro nativo e é desenvolvida, por exem- plo, por mutagênese.

Isolado(a): o termo "isolada" como utilizado aqui refere-se a qualquer substância removida de seu hospedeiro nativo; a substância não precisa exibir qualquer grau específico de pureza. Por exemplo, "ácido nu- cléico isolado" refere-se a um ácido nucléico que ocorre naturalmente que não está imediatamente contíguo a ambas as seqüências às quais fica ime- diamente contíguo (uma na extremidade a 5' e uma na extremidade a 3') no genoma que ocorre naturalmente do organismo do qual é derivado. Por e- xemplo, um ácido nucléico isolado pode ser, sem limitação, uma molécula de DNA recombinante de qualquer comprimento, contanto que uma das se- qüências de ácidos nucléicos normalmente encontradas imediatamente flan- queando tal molécula de DNA recombinante em um genoma que ocorre na- turalmente seja removida ou esteja ausente. Assim, um ácido nucléico isola- do inclui, sem limitação, um DNA recombinante que existe na forma de uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA ge- nômico produzido através da PCR ou do tratamento com endonuclease de restrição) independente de outras seqüências assim como o DNA recombi- nante que é incorporado em um vetor, um plasmídeo de replicação autôno- ma, um vírus (por exemplo, um retrovírus, um adenovírus ou um herpes ví- rus) ou no DNA genômico de um procarioto ou de um eucarioto. Em adição, um ácido nucléico isolado pode incluir uma molécula de DNA recombinante que faz parte de uma seqüência de ácido nucléico híbrida ou de fusão.

O termo "isolado" como utilizado aqui com referência ao ácido nucléico inclui ainda qualquer ácido nucléico que não ocorre naturalmente porque seqüências de ácidos nucléicos que não ocorrem naturalmente não são encontradas na natureza e não possuem seqüências imediatamente contíguas em um genoma que ocorre naturalmente. Por exemplo, um ácido nucléico que não ocorre naturalmente tal como um ácido nucléico engenhei- rado é considerado como sendo um ácido nucléico isolado. O ácido nucléico engenheirado pode ser produzido utilizando técnicas de clonagem molecular ou de síntese química de ácidos nucléicos comuns. O ácido nucléico que não ocorre naturalmente isolado pode ser independente de outras seqüên- cias ou pode estar incorporado em um vetor, um plasmídeo de replicação autônoma, um vírus (por exemplo, um retrovírus, um adenovírus ou um her- pes vírus) ou no DNA genômico de um procarioto ou de um eucarioto. Em adição, um ácido nucléico que não ocorre naturalmente pode incluir uma molécula de ácido nucléico que faz parte de uma seqüência de ácido nucléi- co híbrida ou de fusão.

Um ácido nucléico que existe entre centenas até milhões de ou- tras moléculas de ácidos nucléicos, por exemplo, dentro de cDNA ou biblio- tecas genômicas ou pedaços de gel contendo um produto da digestão de DNA genômico não deve ser considerado como um ácido nucléico isolado.

Purificado(a): o termo "purificado" como utilizado aqui indica que contaminantes foram removidos da amostra de interesse. O termo "purifica- do" não requer pureza absoluta, mas ao invés disso, é pretendido como um termo relativo, a não ser que seja indicado de outra maneira pelo contexto. Assim, por exemplo, um polipeptídeo ou uma preparação de ácido nucléico purificado pode ser uma em que o polipeptídeo ou o ácido nucléico em ques- tão está em uma concentração maior que aquela em que o polipeptídeo ou o ácido nucléico estaria em seu ambiente natural dentro de um organismo ou em uma concentração maior que no ambiente do qual foi removido.

Aminotransferase de estereoinversão: uma "aminotransferase de estereoinversão" é um polipeptídeo capaz de produzir preferencialmente ou seletivamente um produto de aminoácido quiral (tal como a monatina) en- quanto é utilizado um substrato de quiralidade oposta como o doador de a- mino. Por exemplo, uma aminotransferase de estereoinversão pode ser uma D-fenilglicina aminotransferase (também chamada de D-4-hidroxifenilglicina aminotransferase) que preferencialmente ou seletivamente utiliza L- glutamato como um substrato para produzir R,R monatina. Os exemplos não-limitantes de aminotransferases de estereoinversão incluem D- metionina aminotransferase (EC 2.6.1.41) e enzimas que possuem atividade de D-fenilglicina aminotransferase ou atividade de D-4-hidroxifenilglicina a- minotransferase.

Gene de Complementacão: um "gene de complementação" é um gene que, quando expresso, anula uma mutação em um organismo. Por e- xemplo, se um organismo tiver uma mutação nula em um dos genes para síntese de triptofano pela célula, um gene de complementação poderia ser um que, quando expresso, permite que a cepa cresça em meio mínimo (isto é, sem triptofano).

Enzima Estereosseletiva: Uma "enzima estereosseletiva" é uma enzima que possui maior especificidade e/ou maior atividade em relação a um isômero, quando comparada com a especificidade e/ou atividade em re- lação a um outro isômero. Por exemplo, uma enzima estereosseletiva é uma que possui maior especificidade e/ou atividade em relação a R-MP que em relação a S-MP. Em modalidades preferidas, uma enzima estereosseletiva possui atividade limitada em relação a um isômero quando comparada àque- la em relação a um outro. Atividade "limitada" significa atividade que é míni- ma ou não é percebida, por exemplo, como é determinado de acordo com os experimentos fornecidos aqui. O Exemplo 6, por exemplo, identifica HE- XAspCP9T/R122G como uma enzima com atividade limitada sobre a S,S monatina. O Exemplo 8 identifica a TatA de S. meliloti com uma outra enzi- ma com atividade limitada em relação a S-MP. No Exemplo 18, a D- aminotransferase de B. halodurans tinha maior seletividade em relação a R- MP quando comparada àquela em relação a S-MP, resultando em uma este- reopureza maior da R,R monatina. Ainda, o Exemplo 19 indica que a DAT híbrida possui atividade limitada sobre S-MP quando comparada àquela so- bre R-MP.

Homóloqo(a): o termo "homólogo(a)" como utilizado aqui indica que uma proteína ou um ácido nucléico exibe um grau relativamente alto de identidade de seqüência com uma seqüência de uma outra proteína ou ácido nucléico quando as duas seqüências são alinhadas utilizando métodos pa- dronizados. Por exemplo, uma aldolase específica a R é homóloga à aldola- se da SEQ ID NO: 22 se a aldolase específica a R contiver pelo menos a- proximadamente 50% de identidade de seqüência com a aldolase da SEQ ID NO: 22 quando as duas seqüências são alinhadas utilizando métodos padronizados.

Número EC: o número de classificação de enzima que é desig- nado pela International Union of Biochemistry and Molecular Biology.

Vias Biossintéticas para Produzir R.R e Outros Estereoisômeros da Monatina

Como descrito, inter alia, no WO 03/091396 A2 (vide, por exem- plo, as Figuras 1-3 e 11-13), a monatina pode ser produzida partindo do trip- tofano através de uma via de várias etapas que envolve conversões biológi- cas (isto é, facilitando a reação de um substrato em um produto com um po- lipeptídeo). Uma via descrita envolve a conversão biológica de triptofano em indol-3-piruvato, a conversão biológica de indol-3-piruvato em ácido 2-hidróxi 2-(indol-3-ilmetil)-4-ceto glutárico ("MP") e a conversão biológica de MP em monatina. A via biossintética da presente invenção que é utilizada para pro- duzir monatina pode compreender ou consistir essencialmente em, uma ou mais das etapas, mecanismos e/ou vias a seguir. As etapas, mecanismos e/ou vias descritas abaixo são simplesmente pretendidas como sendo e- xemplos.

Um método de produção de monatina ou de um sal da mesma, compreende (a) a produção de indol-3-piruvato partindo de L-triptofano, (b) a produção de precursor de monatina partindo do indol-3-piruvato e (c) a pro- dução de monatina partindo do precursor de monatina.

As enzimas úteis para a conversão de triptofano em indol-3- piruvato incluem os membros das classificações de enzimas ("EC") 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1, 2.6.1.21 e 3.5.1.-. Estas classes incluem polipeptídeos tais como: triptofano amino- transferase, que converte L-triptofano e α-KG (isto é, a-cetoglutarato, tam- bém chamado de 2-oxoglutarato) em indol-3-piruvato e L-glutamato; D- triptofano aminotransferase, que converte D-triptofano e um 2-oxo-ácido em indol-3-piruvato e um aminoácido; triptofano desidrogenase, que converte L- triptofano e NAD(P) em indol-3-piruvato e NH3 e NAD(P)H; D-aminoácido desidrogenase, que converte D-aminoácidos e FAD em indol-3-piruvato e NH3 e FADH2; triptofano-fenilpiruvato transaminase, que converte L- triptofano e fenilpiruvato em indol-3-piruvato e L-fenilalanina; L-aminoácido oxidase, que converte um L-aminoácido e H2O e O2 em um 2-oxo-ácido e NH3 e H2O2; D-aminoácido oxidase, que converte um D-aminoácido e H2O e O2 em um 2-oxo-ácido e NH3 e H2O2; e triptofano oxidase, que converte L- triptofano e H2O e O2 em indol-3-piruvato e NH3 e H2O2. Estas classes con- têm ainda tirosina (aromática) aminotransferase, aspartato aminotransferase, D-aminoácido (ou D-alanina) aminotransferase e aminotransferase ampla (vários substratos) que possui atividades de várias aminotransferases, das quais algumas podem converter triptofano e um 2-oxo-ácido em indol-3- piruvato e um aminoácido. Em adição, estas classes incluem fenilalanina desaminases, que podem converter triptofano em indol-3-piruvato e amônio na presença de água.

A produção de indol-3-piruvato partindo de L-triptofano pode também ser facilitada por uma ou mais enzimas que possuem maior ativida- de, maior especificidade ou ambas, em relação ao L-triptofano como um substrato que em relação a MP ou à monatina. Os exemplos de enzimas que possuem maior atividade e/ou maior especificidade em relação ao L- triptofano como um substrato que em relação a MP ou à monatina incluem, mas não estão limitados a L-triptofano aminotransferases, aminotransferases L-aromáticas, L-aspartato aminotransferases e L-aminoácido oxidases.

As enzimas úteis para a conversão de indol-3-piruvato em MP incluem membros das classes de enzimas EC 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 e 4.1.2.-. Estas classes incluem carbono-carbono sintases/liases, tais como aldolases que catalisam a condensação de dois substratos de ácido carboxí- lico. A classe de enzimas EC 4.1.3.- é constituída pelas sintases/liases que formam ligações carbono-carbono utilizando substratos oxo-ácidos (tal como indol-3-piruvato) como o eletrófilo, enquanto que a EC 4.1.2.- é constituída pelas sintases/liases que formam ligações carbono-carbono utilizando subs- tratos de aldeído (tal como benzaldeído) como o eletrófilo. Por exemplo, a KHG aldolase (EC 4.1.3.16) e a ProA aldolase (EC 4.1.3.17), são conheci- das por converterem indol-3-piruvato e piruvato em MP. Embora se possa acreditar que a ProA aldolase identifica apenas a 4-hidróxi-4-metil-2- oxoglutarato aldolase derivada de Comamonas testosteroni, aqui o termo ProA aldolase é utilizado para significar qualquer polipeptídeo com atividade de 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolase a não ser que seja citado de ou- tra maneira. Os exemplos adequados de Pro aldolases incluem ProA de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 1 (seqüência de ácido nucléico), SEQ ID NO: 2 (seqüência de aminoácidos)) e ProA de Sinorhizobium meIiIoti (N- de Acesso do NCBI: CAC46344) ou enzimas que exibem homologia com ProA de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 1 (seqüência de ácido nu- cléico), SEQ ID NO: 2 (seqüência de aminoácidos)) e/ou ProA de Sinorhizo- bium meliloti(NQ de Acesso do NCBI: CAC46344). Por exemplo, as enzimas adequadas pode ter pelo menos aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e/ou 99% de identidade de seqüência de aminoácidos com ProA de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 2) e/ou com ProA de Sino- rhizobium meliloti (N- de Acesso do NCBI: CAC46344). O MP também pode ser gerado utilizando reações químicas, tais como as condensações de al- dol.

As enzimas úteis para a conversão de MP em monatina incluem membros das classes de enzimas (EC): triptofano aminotransferases (2.6.1.27), triptofano desidrogenases (1.4.1.19), D-aminoácido desidrogena- ses (1.4.99.1), glutamato desidrogenases (1.4.1.2-4), fenilalanina desidroge- nase (1.4.1.20), triptofano-fenilpiruvato transaminases (2.6.1.28) ou de forma mais geral os membros da família das aminotransferases (2.6.1.-) tal como aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), tirosina (aromática) aminotransfe- rase (2.6.1.5), D-triptofano aminotransferase ou D-alanina (2.6.1.21) amino- transferase (vide a Figura 2 do WO 03/091396 A2). Esta reação também pode ser realizada utilizando reações químicas. A aminação do ceto ácido (MP) é realizada através da aminação redutora utilizando amônia e cianobo- rohidreto de sódio. As Figuras 11-13 do WO 03/091396 A2 mostram polipep- tídeos adicionais que podem ser utilizados para converter MP em monatina, assim como os que fornecem maiores rendimentos de monatina partindo de indol-3-piruvato ou triptofano. O perfil de sabor de uma composição de monatina pode ser alte- rado através do controle da quantidade relativa dos vários estereoisômeros de monatina na composição. A presente descrição fornece vias e substân- cias para a produção de composições de monatina com uma porcentagem desejada de R,R monatina e/ou S1R monatina.

A quiralidade dos compostos de monatina que são produzidos através das vias tais como as exemplificadas aqui pode ser alterada tanto através do pH quanto através dos polipeptídeos utilizados para as conver- sões biológicas. Quando a monatina é formada utilizando uma via biossinté- tica, pode ser considerado o que é apresentado a seguir. Em uma reação biocatalítica, a quiralidade do carbono 2 da monatina (vide a estrutura quími- ca acima) é determinada pela enzima que converte indol-3-piruvato em MP. Várias enzimas (por exemplo, das EC 4.1.2.-, 4.1.3.-) podem converter indol- 3-piruvato em MP. Assim, pode-se escolher a enzima que forma o isômero desejado. Alternativamente, a especificidade enanciomérica da enzima que converte indol-3-piruvato em MP pode ser modificada através do uso de evo- lução direcionada ou anticorpos catalíticos podem ser engenheirados para catalisar a região desejada. Uma vez que o MP é produzido (enzimaticamen- te ou através de condensação química), o grupo amino pode ser adicionado de forma estereoespecífica. A configuração R ou S do carbono 4 (vide a es- trutura química anterior) pode ser gerada dependendo do fato de uma ami- notransferase ácida D- ou L-aromática ser utilizada. Muitas aminotransfera- ses são específicas para o L-isômero, entretanto, existem D-triptofano ami- notransferases em certas plantas (Kohiba e Mito, Proceedings of the 8th In- ternational Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japão 1990). Além disso, as D-alanina aminotransferases (EC 2.6.1.21), as D- metionina-piruvato aminotransferases (EC 2.6.1.41) e ambas as (R)-3- amino-2-metilpropanoato aminotransferase (EC 2.6.1.61), (S)-3-amino-2- metilpropanoato aminotransferase (EC 2.6.1.22) e D-fenilglicina aminotrans- ferase foram identificadas. Certas aminotransferases podem aceitar apenas o substrato para esta reação com uma configuração particular no carbono C2. Portanto, mesmo se a conversão em MP não for estereotípica, a estere- oquímica do produto final pode ser controlada através da seleção apropriada de uma aminotransferase. Devido ao fato da reação ser reversível, o MP não reagido (isômero não desejado) pode ser reciclado de volta em seus consti- tuintes e uma mistura racêmica de MP pode ser formada novamente.

Fazendo agora referência às figuras, pode ser citado o seguinte. Os fluxogramas identificam exemplos de vias para a produção de monatina, mas as vias mostradas nas figuras e os métodos da invenção, não estão limitados a qualquer método particular para a prática das vias, a não ser que seja citado de outra maneira. Por exemplo, as vias podem ser praticadas in vivo, in vitro ou uma combinação dos mesmos.

Além disso, a prática de um método da invenção que utiliza uma ou mais das vias divulgadas aqui não requer que cada um dos componentes identificados (por exemplo, reagentes e enzimas) seja explicitamente forne- cido pelo versado na técnica; ao invés disso, é suficiente que os componen- tes, (ou fontes de componentes) e as condições de reação estejam presen- tes na composição (ou célula hospedeira) ou disponíveis de outra maneira de forma que a via pode potencialmente ocorrer. Em outras palavras, por exemplo, se uma figura representar um processo para a produção de uma composição de monatina, que inclui a produção de indol-3-piruvato partindo de L-triptofano, a produção de ácido 2-hidróxi 2-(indol-3ilmetil)-4-ceto glutári- co ("precursor de monatina" ou "MP") partindo de indol-3-piruvato e a produ- ção de monatina partindo de MP, em que cada reação é facilitada por uma enzima apropriada, é considerado que a prática de tal via inclui a combina- ção de L-triptofano com α-cetoglutarato e enzimas consideradas para facili- tar as reações identificadas e sob condições adequadas para que cada uma das reações ocorra sem fornecer também explicitamente indol-3-piruvato ou MP. Em tal caso, o L-triptofano poderia reagir com α-cetoglutarato para pro- duzir indol-3-piruvato. Dependendo das condições e da enzima fornecida, o indol-3-piruvato produzido partindo da reação com L-triptofano pode reagir para formar MP e então, dependendo das condições e da enzima fornecida, o MP produzido partindo da reação de indol-3-piruvato pode reagir para for- mar monatina. Também deve ser citado que a prática de um método da inven- ção utilizando uma ou mais das vias divulgadas aqui não requer que o ver- sado na técnica fornece explicitamente os materiais de partida ou as enzi- mas identificadas, se tais materiais ou enzimas já estiverem de outra manei- ra presentes ou disponíveis ou se forem capazes de ser sintetizados partin- do de uma substância que já está presente ou disponível no meio de reação. Em outras palavras, é considerado que a prática de qualquer uma das vias que identificam o L-triptofano como um material de partida incluiria o forne- cimento de um composto que pode produzir L-triptofano, sob condições a- dequadas para que a produção de L-triptofano ocorra e a combinação de tal composto com enzimas capazes de facilitar a série de reações ajustadas sob condições que seriam adequadas para que estas reações ocorram. Co- mo um outro exemplo, é considerado que a prática da via identificada inclui o fornecimento de um microorganismo engenheirado geneticamente para pro- duzir monatina de acordo com a via descrita e o fornecimento de condições apropriadas para que o processo de fermentação ocorra. Por exemplo, um microorganismo, que produz naturalmente grandes quantidades de L- triptofano ou de D-triptofano (vide a Patente U.S. N2 5.728.555) pode ser engenheirado geneticamente para produzir ou superproduzir uma ou mais das enzimas utilizadas para facilitar (catalisar) reações na via para monatina e podem ser fornecidas condições apropriadas de forma que o microorga- nismo produziria assim monatina.

Dirigindo-se agora à figura 1, o fluxograma mostrado de forma esquemática representa um processo de acordo com a invenção para pro- 25 duzir uma composição de monatina que inclui R,R monatina. Como mostra- do na figura 1, a via geral envolve uma reação de triptofano para formar in- dol-3-piruvato, uma reação de indol-3-piruvato para produzir MP e uma rea- ção de MP para produzir monatina, incluindo R1R monatina.

A figura 1 ilustra ainda substituições específicas desta via geral, planejadas para aumentar a produção da forma R,R da monatina à custa das formas S,S, R1S e S1R da monatina. Em particular, a figura 1 ilustra a modalidade em que: a enzima aminotransferase utilizada na reação do L- triptofano possui maior atividade e/ou especificidade em relação a tal reação versus as reações de MP e 4S monatina ou a oxidase possui maior atividade e/ou especificidade em relação ao L-triptofano que em relação à 4R monati- na; a enzima que facilita a reação de indol-3-piruvato é uma aldolase especí- fica a R; e, a enzima que facilita a reação de MP é uma D-enzima de especi- ficidade ampla, preferencialmente processada para funcionar mais eficiente com o isômero R de MP.

A figura 1 ilustra ainda substituições particulares planejadas para tornar a produção de R,R monatina mais econômica. Por exemplo, na figura 1 o L-triptofano - ao contrado do D-triptofano ou combinações de L- e D- triptofano - é identificado como o material de partida. Embora a escolha da forma específica do triptofano não tenha impacto sobre a quiralidade dos compostos de monatina finais na composição de monatina (devido ao fato de que a reação do triptofano foram indol-3-piruvato, que não possui quirali- dade), alguns podem preferir utilizar o L-triptofano como um material de par- tida pelo menos porque o L-triptofano é atualmente mais econômico e pode ser mais facilmente obtido que o D-triptofano.

Dirigindo-se agora à primeira reação mostrada na figura 1, quando o triptofano é convertido em indol-3-piruvato qualquer um ou mais de alfa-cetoglutarato, oxaloacetato e/ou piruvato reage com o triptofano para formar um aminoácido (glutamato, aspartato e alanina, respectivamente) e indol-3-piruvato. A figura 1 representa a modalidade em que o material de partida de triptofano é L-triptofano e o alfa-cetoglutarato, oxaloacetato e/ou piruvato produz a forma do isômero L do aminoácido (por exemplo, L- glutamato, L-aspartato e/ou L-alanina, respectivamente).

Como mostrado na figura 1, uma abordagem para aumentar a produção de R,R monatina envolve facilitar a reação de L-triptofano com uma enzima que possui maior especificidade, maior atividade ou ambas em relação ao triptofano ao contrário do MP ou da monatina e facilitar a reação de MP com uma enzima específica a D. Como é descrito no WO 03/091396 A2, certas enzimas podem facilitar a reação de triptofano para produzir indol- 3-piruvato, assim como a reação de aminação de MP para produzir monati- na. O uso de uma L-aminotransferase na etapa de aminação cria um centro quiral S na posição C-4 da monatina, enquanto que o uso de uma D-enzima cria um centro quiral D na posição C-4 da monatina. Assim, no caso em que uma L-aminotransferase, que facilita a reação de triptofano, é também ativa na reação de MP, podem ser formadas as R,S e S1S monatinas, dependen- do da forma de MP presente. Em adição, certas outras enzimas - as L- aminoácido oxidases - podem não apenas facilitar a reação de triptofano em indol-3-piruvato, mas também podem ter uma co-atividade para a degrada- ção de R,R monatina. De acordo com algumas modalidades, esta co- atividade 4R é minimizada ou eliminada. Uma co-atividade de oxidase sobre as formas 4S da monatina diminuiria ou minimizaria as mesmas do produto final e poderia ser desejável dependendo da composição final desejada. Conseqüentemente, quanto maior a especificidade e/ou a atividade da L- enzima escolhida em relação ao triptofano versus o MP ou a monatina, mai- or é a quantidade de R,R e S,R produzida versus S,S e R,S monatina.

As enzimas adequadas para a reação do triptofano, de acordo com a modalidade ilustrada na figura 1, incluem: L-aminotransferases capa- zes de facilitar uma reação de L-triptofano para formar indol-3-piruvato e que possuem maior especificidade por tal reação em relação à reação de R-MP para formar isômeros 4S da monatina; e, L-aminoácido oxidases capazes de facilitar uma reação de L-triptofano para formar indol-3-piruvato e que pos- suem maior especificidade e/ou atividade em relação a tal reação versus a reação de isômeros 4R da monatina para formar MP e equivalentes funcio- nais de qualquer um dos anteriores. Mais especificamente, os exemplos não-limitantes de enzimas adequadas podem ser escolhidos de L-triptofano aminotransferases (EC 2.6.1.27) e tirosina (aromática) aminotransferases (EC 2.6.1.5) e L-aminoácido oxidases (EC 1.4.3.2) e mutantes derivados de enzimas que possuem atividade de aspartato aminotransferase.

O Exemplo 6 identifica uma enzima específica, um polipeptídeo mutante de HEXaspC que inclui uma substituição de Pro 9 por Tyr e uma substituição de Arg 122 por Gly útil para facilitar as reações de L-triptofano e a-KG, oxaloacetato, piruvato ou combinações dos mesmos para formar in- dol-3-piruvato e L-glutamato, L-aspartato e L-alanina, respectivamente. Uma outra enzima específica que possui atividade "limitada" é TatA, a L-triptofano aminotransferase de S. meliloti. Outras enzimas adequadas para a reação de triptofano de acordo com modalidades preferidas da via mostrada na figura 1 incluem aquelas com as características a seguir: uma enzima que transa- mina MP na proporção de 1/10 ou menor que a proporção de L-triptofano como no Exemplo 6 ou uma enzima quando utilizada com uma racemase, como no Exemplo 9, que produz mais de 90% dos isômeros 4R da monatina.

Os exemplos de enzimas que não possuem um alto grau de es- pecificidade em relação à conversão de L-triptofano em indol-3-piruvato comparada com a conversão de MP em monatina incluem: HEXAspC (Exem- plo 6), a aminotransferase de especificidade ampla de Leishmania major (WO 03/091396 A2), a aminotransferase suína (WO 03/091396 A2) e a TatA de Rhodobacter sphaeroides (Exemplo 9). Estas enzimas podem, entretanto, ser desenvolvidas, por exemplo, através de mutagênese para possuírem ati- vidade limitada em relação ao R-MP e/ou à R,R monatina versus triptofano.

Dirigindo-se agora à segunda reação identificada na figura 1, a escolha da enzima para facilitar (ou catalisar) a reação de indol-3-piruvato em MP influencia na quantidade relativa de R,R monatina versus S,R mona- tina produzida. Em geral, quanto maior a quantidade relativa de R-MP versus S-MP produzida, maior é a quantidade relativa de R,R monatina versus S,R monatina produzida (quando uma D-enzima facilita a reação de MP em mo- natina). As enzimas úteis sob este aspecto incluem quaisquer enzimas que produzem uma maior proporção de R-MP:S-MP que a produzida pela reação de indol-3-piruvato e piruvato quando facilitada por qualquer uma de KHG aldolase de E. coli (N° de Acesso do Genbank AAC74920.1), KHG aldolase de Bacillus (N° de Acesso do Genbank CAB14127.1) ou ProA aldolase de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 1 (seqüência de ácido nucléico), SEQ ID NO: 2 (seqüência de aminoácidos)). Assim, se for desejado produzir pre- ferencialmente R-MP1 uma ou mais enzimas capazes de produzir maiores quantidades de R-MP em relação a S-MP podem ser utilizadas. Quando uma composição de monatina que possui a forma R,R de monatina na forma de seu único componente de monatina for desejada, uma enzima que pro- duz seletivamente R-MP ao contrário de S-MP (uma "enzima específica a R") deve ser utilizada. Os exemplos de enzimas específicas a R que podem ser utilizadas para produzir seletivamente R-MP ao contrário de S-MP são a aldolase da SEQ ID NO: 22 e a HMG aldolase de Sinorhizobium meliloti, como mostrado no Exemplo 3.

A figura 1 identifica a modalidade particular em que uma aldola- se específica a R facilita a reação de indol-3-piruvato e piruvato para formar R-MP. É também considerado, entretanto, o uso de aldolases para a reação de indol-3-piruvato e piruvato que produzem preferencialmente R-MP, assim como aldolases que produzem uma maior proporção de R-MP:S-MP do que é produzida por qualquer uma de KHG aldolase de E. coli (N- de Acesso do Genbank AAC74920.1), KHG aldolase de Bacillus (Ns de Acesso do Gen- bank CAB14127.1) ou ProA aldolase de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 1 (seqüência de ácido nucléico), SEQ ID NO: 2 (seqüência de aminoá- cidos)). Em adição, é também considerado que o indol-3-piruvato pode rea- gir com uma fonte de C3 diferente (por exemplo, serina ou cisteína) para formar R-MP e conseqüentemente outras enzimas (por exemplo, outras Iia- ses ou sintases) podem facilitar tal reação. Outros substratos que são facil- mente convertidos em piruvato (tal como oxaloacetato) também podem ser utilizados. O Exemplo 3 fornece fontes de enzimas aldolases que podem preferencialmente ou seletivamente produzir R-MP ou produzir uma maior proporção de R-MP:S-MP do que é produzida pela reação de indol-3- piruvato e piruvato quando facilitada por qualquer uma de KHG aldolase de E. coli (N- de Acesso do Genbank AAC74920.1), KHG aldolase de Bacillus (N- de Acesso do Genbank CAB14127.1) ou ProA aldolase de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 1 (seqüência de ácido nucléico), SEQ ID NO: 2 (seqüência de aminoácidos)), tal como a aldolase da SEQ ID NO: 22. O E- xemplo 5 fornece ainda métodos de seleção para a identificação de tais en- zimas. É também considerado que enzimas, que produzem preferencialmen- te ou seletivamente R-MP ou produzem mais R-MP que qualquer uma de KHG aldolase de E. coli (N- de Acesso do Genbank AAC74920.1), KHG al- dolase de Bacillus (N° de Acesso do Genbank CAB14127.1) ou ProA aldola- se de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 1 (seqüência de ácido nucléi- co), SEQ ID NO: 2 (seqüência de aminoácidos)) pode ser desenvolvida par- tindo de aldolases conhecidas ou encontradas na natureza. Quaisquer técni- cas conhecidas na arte para o desenvolvimento de enzimas, por exemplo, para melhorar uma característica desejada - tal como para aumentar a ativi- dade de uma enzima em relação a um substrato - quando comparada com a enzima do tipo selvagem podem ser utilizadas. Os Exemplos 4, 5, 6, 7, 9, 10 e 11 fornecem algumas técnicas para o desenvolvimento de enzimas.

Dirigindo-se agora à última etapa da via identificada na figura 1, a reação de R-MP para formar R,R monatina é mostrada como sendo facilitada por uma D-aminotransferase de especificidade ampla, por exemplo, D-alani- na aminotransferase (EC 2.6.1.21, também conhecida como D-aminoácido aminotransferase ou D-aspartato aminotransferase) ou uma D-aminoácido desidrogenase. Como discutido anteriormente, a conversão de MP em mo- natina é uma reação de aminação, que cria um centro quiral no carbono C-4 da monatina. Quando a forma R-quiral for desejada na posição C-4, devem ser utilizadas as enzimas que produzem centros quirais "R" nos aminoácidos. Os exemplos não-limitantes de enzimas incluem: uma D-alanina -aminotransferase derivada de Bacillus (Exemplos 15-18), incluindo a D-ala- nina-aminotransferase derivada de Bacillus halodurans (Exemplo 18) e uma aminotransferase de cadeia ramificada mutada que possui estereoespecifici- dade modificada (Exemplo 7).

Um outro exemplo de enzima inclui uma D-aminotransferase hí- brida. A D-aminotransferase híbrida pode conter elementos estruturais pro- venientes de duas aminoácido aminotransferases diferentes. A D-amino- transferase híbrida pode então ser adicionalmente desenvolvida (por exem- plo, através de mutagênese ou de engenharia recombinante) em relação ao maior desempenho na conversão de MP em monatina. Um exemplo de D-aminotransferase híbrida é mostrado no Exemplo 19. A D-aminotransfe- rase híbrida ilustrada no Exemplo 19 incluía elementos provenientes de uma D-aminotransferase de B. spaericus e uma D-aminotransferase de G. stearo- thermophilus. A R,R-monatina foi produzida utilizando esta D-aminotrans- ferase (Exemplo 19).

O Exemplo 2 ilustra ainda a produção de R1R monatina utilizan- do várias D-aminotransferases.

De acordo com algumas modalidades, a D-aminotransferase possui maior especificidade, maior atividade ou ambas em relação ao R-MP como um substrato do que em relação ao indol-3-piruvato. Em certas outras modalidades, a D-aminotransferase possui atividade limitada em relação ao indol-3-piruvato como um substrato. As enzimas com tais características po- dem ser desenvolvidas ou mutadas partindo de enzimas existentes, por e- xemplo, como mostrado no Exemplo 6.

Ainda, em algumas modalidades, a reação de R-MP para formar R,R monatina pode ser faciltiada por uma D-aminoácido desidrogenase. O Exemplo 20 ilustra a produção de R,R monatina partindo de R-MP utilizando uma D-aminoácido desidrogenase (D-AADH-101 até 108, BioCataIytics). Estas D-aminoácido desidrogenases podem ser adicionalmente desenvolvi- das (por exemplo, através de mutagênese ou de engenharia recombinante) para maior desempenho.

A figura 2 representa uma outra estratégia para direcionar a pro- dução de R,R monatina. Enquanto que na modalidade da figura 1, a aldolase utilizada na reação de indol-3-piruvato para formar R-MP influencia a propor- ção de R,R:S,R formada, na modalidade da figura 2, a D-enzima que facilita a conversão de MP em monatina influencia a proporção de R,R:S,R forma- da. De acordo com a modalidade da figura 2, uma enzima não- estereoespecífica pode ser utilizada para facilitar a conversão de indol-3- piruvato em MP e conseqüentemente tanto S-MP quanto R-MP podem ser formados. Para a obtenção de uma proporção desejada de R,R monatina em relação à S1R monatina, uma D-enzima é escolhida (ou desenvolvida) com estereosseletividade apropriada em relação a R-MP versus S-MP. Quando uma composição de monatina que possui a forma R,R de monatina na forma de seu único componente de monatina for desejada, uma enzima que facilita seletivamente a reação de R-MP em monatina ao contrário de S-MP em mo- natina seria preferida. Por exemplo, a D-aminotransferase de Bacillus halo- durans (Exemplo 18) e a D-aminotransferase híbrida contendo elementos estruturais de tanto Bacillus sphaericus quanto de Geobacillus stearother- mophilus (Exemplo 19) podem ser utilizadas como a enzima que facilita sele- tivamente a reação de R-MP em monatina.

A figura 3 ilustra uma outra via alternativa para a produção de composições enriquecidas em R1R monatina. A via da figura 3 é uma modifica- ção da via da figura 1. Na via mostrada na figura 3, o indol-3-piruvato é produ- zido indiretamente, ao invés de diretamente, partindo de L-triptofano. Mais especificamente, o L-triptofano é convertido em D-triptofano e o D-triptofano é então convertido em indol-3-piruvato. O Exemplo 4 ilustra a produção de R,R monatina partindo de L-triptofano utilizando uma triptofano racemase.

A conversão de L-triptofano em D-triptofano pode ser facilitada por uma triptofano racemase ou um equivalente funcional da mesma. O E- xemplo 4 fornece fontes potenciais de triptofano racemases e métodos de seleção para a identificação de tais enzimas. O Exemplo 4 descreve exem- plos de triptofano racemases que são capazes de converter L-triptofano em D-triptofano. Estas triptofano racemases podem ser adicionalmente desen- volvidas (por exemplo, através de mutagênese ou de engenharia recombi- nante) para maior desempenho.

Os exemplos não-limitantes de triptofano racemases incluem homólogos ou mutantes de aminoácido racemases (EC 5.1.1.-), por exem- plo, serina racemase, em que os homólogos ou mutantes são capazes de converter L-triptofano em D-triptofano. Os exemplos não-limitantes de fontes das quais a aminoácido racemase pode ser derivada incluem microorganis- mos tais como Salmonella typhimurium, Eseheriehia eoli, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus halodurans, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus lieheniformis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Sehizo- saeearoyees pombe, Bacillus eereus, Enteroeoeeus gallinarum, Pedioeoeeus pentosaeeus, Bacillus pumilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, Aquifex pyrophilus, Laetobaeilli, Streptoeoeeus, Anabaena sp., Pseudomonas striata, Lentinus edodes, Seapharea brouhtonii Desulfuroeoceus sp., Ther- mococcus sp. e Pseudomonas striata. Os exemplos não-limitantes adicionais de fontes das quais a aminoácido racemase pode ser derivada incluem bi- cho-da-seda, cérebro de rato ou cérebro de camundongo. Estas aminoácido racemases podem ser desenvolvidas (por exemplo, através de mutagênese ou de engenharia recombinante) para maior desempenho na conversão de L-triptofano em D-triptofano.

Os exemplos não-limitantes de fontes potenciais das quais as triptofano racemases adequadas podem ser derivadas incluem: microorga- nismos tais como Pseudomonas, por exemplo, Pseudomonas chlororaphis (Pseudomonas aurereofaciens) (ATCC15926) e Burkholderia pyrrocina (ATCC15958). Os exemplos não-limitantes adicionais de fontes potenciais das quais as triptofano racemases adequadas podem ser derivadas incluem plantas, por exemplo, plantas de tabaco, tal como Nicotiana tabacum, plan- tas de trigo, tal como Triticum aestivum, beterrabas, tomates e Sclerochiton ilieifolius.

A via mostrada na figura 3 possui certos benefícios, incluindo que mesmo quando a R,R monatina é o produto desejado, pode ser utilizada a mesma enzima para a reação que produz indol-3-piruvato que aquela para a reação que produz monatina como um produto. Ou seja, na via ilustrada na figura 1, uma L-aminotransferase (ou L-enzima adequada) facilita a rea- ção de produção de indol-3-piruvato, mas uma D-aminotransferase facilita a reação de produção de monatina. Em contraste, na via da figura 3, uma cer- ta D-aminotransferase que facilita a reação de produção de indol-3-piruvato, também pode facilitar a reação de produção de monatina. Conseqüentemen- te, nas vias de acordo com a figura 3, as D-aminotransferases de especifici- dade ampla podem ser preferidas quando houver um desejo de utilizar a mesma enzima para a reação que forma indol-3-piruvato que para a reação que forma monatina. Em contraste, nas vias de acordo com as figuras 1, 2, 4, 6, 7 e 8 a produção de monatina pode ser mais eficiente quando for esco- Ihida uma D-aminotransferase que possui atividade e/ou especificidade limi- tada em relação ao indol-3-piruvato quando comparada àquela em relação ao R-MP. Um outro benefício da via representada esquematicamente na figura 3 é que o produto de aminoácido da reação acoplada à reação de produção de indol-3-piruvato pode ser agora utilizado como um substrato na reação acoplada à reação de produção de monatina. Ou seja, na via ilustra- da na figura 1, o L-triptofano reage para produzir indol-3-piruvato e, ao mes- mo tempo, oxaloacetato, alfa-cetoglutarato e/ou piruvato reage para produzir um L-aminoácido. Devido ao fato de que a reação de R-MP para formar mo- natina é acoplada a uma reação utilizando um D-aminoácido como um subs- trato, o L-aminoácido da reação que forma indol-3-piruvato não é, sob as condições mostradas, reciclado para uso na reação acoplada à reação de R- MP. Em contraste, na via ilustrada na figura 3, a reação de D-triptofano para formar indol-3-piruvato é acoplada a uma reação que forma um produto de D-aminoácido, cujo D-aminoácido pode ser reciclado para uso na reação acoplada à reação de R-MP. Isto permite que sejam utilizadas quantidades não estequiométricas de receptor de amino na etapa um e o doador de ami- no para a etapa 3 é produzido na etapa 1.

As figuras 4 e 5 ilustram modificações adicionais da via mostra- da na figura 1. Estas modificações são direcionadas para reciclar o produto de aminoácido formado através da reação acoplada à reação de transami- nação de L-triptofano com o reagente de aminoácido da reação acoplada à reação de MP em monatina.

Dirigindo-se à figura 4, a reciclagem é realizada através do for- necimento de uma enzima que pode facilitar a conversão de um L- aminoácido em um D-aminoácido e vice-versa. Mais especificamente, quan- do, como é mostrado na figura 4, o α-KG reage para formar L-glutamato quando o L-triptofano reage para formar indol-3-piruvato, pode ser fornecida uma glutamato racemase (EC 5.1.1.3) ou um equivalente funcional que pode facilitar a conversão de L-glutamato em D-glutamato e vice versa. Em tal caso, o L-glutamato formado como um produto junto com a produção de produção de indol-3-piruvato é parcialmente removido em virtude de sua conversão em D-glutamato e o D-glutamato formado partindo da conversão de L-glutamato fica então disponível como um substrato para a reação aco- piada à reação de MP em monatina. Similarmente, o α-KG formado na rea- ção de D-glutamato fica disponível como um substrato para a reação aco- plada à reação de L-triptofano em indol-3-piruvato.

Os exemplos não-limitados de fontes potenciais das quais uma glutamato racemase pode ser derivada incluem Pediococcus pentosaceus, Bacillus pumilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, E. eoli, Aquifex pyrophilus e Bacillus subtilis. Mais especificamente (também não-limitante), a glutamato racemase pode ser expressa partindo de um ácido nucléico tal como o gene murl de Pediocoeeus pentaosaeeus (N- de Acesso do Gen- bank L22789) ou a glutamato racemase de Lactobacillus brevis.

Quando o oxaloacetato reage para formar L-aspartato quando o L-triptofano reage para formar indol-3-piruvato, uma aspartato racemase (EC 5.1.1.13) ou um equivalente funcional pode ser fornecido para converter L-aspartato em D-aspartato. Em tal caso, o L-aspartato que é formado na mesma reação que produz indol-3-piruvato é parcialmente removido em vir- tude de sua conversão em D-aspartato e o D-aspartato fica então disponível como um substrato para a reação acoplada à reação de MP em monatina. Similarmente, o oxaloacetato formado na reação de D-aspartato fica dispo- nível para atuar como um substrato para a reação acoplada à reação de L-triptofano em indol-3-piruvato.

Os exemplos não-limitantes de enzimas adequadas que possu- em atividade de aspartato racemase incluem ASPR-101 (BioCatalytics, Inc., 129 N. Hill Ave1 Suite 103, Pasadena, CA 91106-1955) e homólogos ou mu- tantes de uma aminoácido racemase (EC 5.1.1.-) que são capazes de facili- tar a conversão de L-aspartato em D-aspartato.

Os exemplos não-limitantes de fontes potenciais das quais as aspartato racemases podem ser derivadas incluem: Desulfuroeoecus, Ther- moeoeeus, molusco bivalve Seapharea brouhtonii, Aeinetobaeter, Agrobaete- rium, Arehaeoglobus, Baeillus, Bordetella, Bradyrhizobium, Brevibaeterium, Burkholderia, Campilobaeter, Candida, Caulobaeter, Clostridium, Desulfito- baeterium, Desulfotalea, Enteroeoceus, Erwinia, Eseheriehia, Ferroplasma, Helicobaeter, Klebsiella, Laetobaeillus, Mannheimia, Medieago, Mesorhizobi- um, Methanococcus, Methanosarcina, Oceanobacillus, Oenococcus, Pedio- coccus, Polaribacter, Pseudomonas, Pyrococcus, Ralsonia, Shigella, Sino- rhizobium, Salmonella, Sphingomonas, Streptococcus, Thermoanaerobacter, Vibrio, Wolinella, Xanthomonas, Xanthobacter, Yersinia e Zymomonas.

Quando o piruvato reage para formar L-alanina quando o L-tripto- fano reage para formar indol-3-piruvato, uma alanina racemase ou um equi- valente funcional pode ser fornecido para converter L-alanina em D-alanina. Em tal caso, a L-alanina que é formada na mesma reação que produz indol- 3-piruvato é removida em virtude de sua conversão em D-alanina e a D-ala- nina formada partindo da conversão de L-alanina fica então disponível para atuar como um substrato para a reação acoplada à reação de MP em mona- tina. Similarmente, o piruvato formado na reação de D-alanina fica disponível para atuar como um substrato para a reação acoplada à reação de L-tripto- fano em indol-3-piruvato.

Os exemplos não-limitantes de alanina racemases adequadas incluem A8936 (Sigma, PO Box 14508, St. Louis, MO, 63178) e a alanina racemase de Geobacillus stearothermophilus como descrito no Exemplo 4.

Os exemplos não-limitantes de fontes potenciais das quais a a- Ianina racemase pode ser dericada incluem: Brucella abortus, Streptococcus faecalis, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudo- monas aeruginosa, Vibrio cholerae, Schizosaccaroyces pombe, Bacillus ce- reus e Lentinus edodes.

Os Exemplos 9 e 12 ilustram o uso das racemases anteriores, o impacto das mesmas sobre o aumento da proporção do produto de monatina desejado e fornecem fontes potenciais para as enzimas racemases.

Dirigindo-se à figura 5, uma aminotransferase de estereoinver- são é utilizada para facilitar a reação de R-MP em monatina. Embora tipica- mente a reação de R-MP (ou S-MP) para formar R,R monatina (ou S1R mo- natina) esteja acoplada à reação de um D-aminoácido, uma aminotransfera- se de estereoinversão pode facilitar as reações acopladas de R-MP (ou S- MP) para formar R,R monatina (ou S,R monatina) utilizando um L- aminoácido. Desta maneira, o produto de L-aminoácido da reação de L- triptofano aminotransferase pode ser utilizado como um substrato para a transaminação de MP em monatina e o produto (isto é oxaloacetato, piruvato e/ou oc-KG) da reação acoplada à reação de MP em monatina pode ser utiliza- do como um material de partida para a reação acoplada à reação de L-tripto- fano em indol-3-piruvato. Os exemplos não-limitantes de aminotransferases de estereoinversão que podem ser utilizados incluem mutantes derivados de D-fenilglicina aminotransferase (EC 2.6.1.72, também conhecida como D-4- hidroxifenilglicina aminotransferase), D-metionina aminotransferase (EC 2.6.1.41, também conhecida como D-met-aminotransferase e D-metionina- piruvato aminotransferase) e homólogos das mesmas. Os exemplos não- limitantes de fontes potenciais das quais os mutantes de D-fenilglicina ami- notransferase podem ser derivados incluem Pseudomonas, tais com Pseu- domonas putida LW-4 e Pseudomonas stutzeri ST-201. Os exemplos não- limitantes de fontes potenciais das quais a D-metionina aminotransferase pode ser derivada incluem couve-flor e amendoim.

Os Exemplos 10 e 11 juntos fornecem fontes potenciais de en- zimas de estereoinversão e métodos de produção de tais enzimas. Os e- xemplos fornecem ainda métodos de seleção para a identificação de tais enzimas. É também considerado que tais enzimas podem ser desenvolvidas partindo de enzimas de estereoinversão conhecidas ou encontradas na natu- reza. Como um exemplo não-limitante, a aminotransferase de estereoinver- são pode ser um homólogo ou um mutante de uma D-aminoácido amino- transferase ou um homólogo ou um mutante de uma aminoácido racemase (EC 5.1.1.-).

As figuras 6 e 7 ilustram ainda modificações na via da figura 1. As vias ilustradas nas figuras 6 e 7 fornecem métodos para empurrar as rea- ções em equilíbrio a diante (isto é, em direção à produção de monatina) a- través da remoção do subproduto da reação de triptofano com uma reação irreversível e, em alguns casos, através do forencimento de substrato para a reação de MP.

Dirigindo-se à figura 6, a via mostrada remove o produto de L- aminoácido da reação acoplada à reação de triptofano através da conversão do mesmo em um L-aminoácido diferente e CO2 e fornece então um substra- to para a reação acoplada à reação de MP através da conversão do L- aminoácido recém-formado em um D-aminoácido. Especificamente, é mos- trado que o L-triptofano reage junto com o oxaloacetato para formar indol-3- piruvato e L-aspartato. Uma aspartato 4-descarboxilase (EC 4.1.1.12) ou um equivalente funcional é utilizado para facilitar a conversão de L-aspartato em L-alanina e dióxido de carbono e uma enzima com atividade de alanina ra- cemase é utilizada para facilitar a conversão de L-alanina em D-alanina, cuja D-alanina pode servir como um doador de amino para a conversão de R-MP em monatina.

Dirigindo-se à figura 7, a via mostrada ilustra métodos adicionais para a remoção do produto de L-aminoácido da reação acoplada à reação de triptofano. As modalidades que são apresentadas na figura produzem um subproduto(s) que fica(m) indisponível(eis) para reagir na direção inversa, por exemplo, devido à volatilidade (por exemplo, dióxido de carbono) ou a- través da conversão espontânea em um produto final não reativo. Um exem- plo de tal abordagem inclui modalidades em que o α-KG reage junto com o L-triptofano para produzir L-glutamato e, se desejado, uma glutamato des- carboxilase (EC 4.1.1.15) ou um equivalente funcional pode ser fornecido para facilitar a conversão de L-glutamato em 4-aminobutanoato (com dióxido de carbono como um subproduto). Os exemplos não-limitantes de fontes potenciais das quais a L-glutamato descarboxilase pode ser derivada inclu- em: Clostridium perfringens, C. welchii ou E. coli.

Um outro exemplo de tal abordagem para conduzir a reação do triptofano à diante (na direação da produção de monatina) inclui reações em que o oxaloacetato é utilizado como um co-substrato na reação que utiliza L- triptofano e em que o oxaloacetato é convertido em L-aspartato; se deseja- do, uma aspartato descarboxilase (EC 4.1.1.11) ou um equivalente funcional pode ser fornecido para facilitar a conversão de L-aspartato em β-alanina (com dióxido de carbono como um subproduto).

Dirigindo-se à figura 8, a via mostrada ilustra ainda métodos adi- cionais para a conversão do produto de L-aminoácido da reação acoplada à reação de triptofano em um substrato para a reação acoplada à reação de MP. Especificamente, quando o α-KG for utilizado na mesma reação que o L-triptofano e em que o α-KG forma L-glutamato, uma enzima com atividade de L-alanina aminotransferase e piruvato podem ser fornecidos, em que a enzima L-alanina aminotransferase facilita a reação de piruvato e L- glutamato para formar L-alanina. Uma alanina racemase ou um equivalente funcional também pode ser fornecido com a finalidade de facilitar a conver- são da L-alanina em D-alanina, cuja D-alanina pode ser utilizada como um substrato junto com MP para formar monatina e piruvato. Vide o Exemplo 12.

São descritas de forma implícita nas vias biossintéticas anterio- res e nas reações descritas nos Exemplos abaixo as misturas que contêm um ou mais compostos e/ou enzimas requeridas nas vias biossintéticas para a produção de monatina, incluindo R,R monatina ou precursor de monatina, incluindo o precursor de R monatina.

Para a produção in vitro, qualquer uma ou todas as vias biossin- téticas descritas aqui ou etapas individuais nas vias descritas aqui podem ser realizadas em solução in vitro ou in vivo, em uma célula hospedeira, em série ou em paralelo. Quando o método da invenção utiliza uma ou mais re- ações que são realizadas in vitro, a reação biossintéticas que é realizada in vitro pode ser realizada pela combinação dos ingredientes desejados para a(s) reação(ões) através da mistura em um meio ou em uma solução de rea- ção aquosa. A mistura de reação formada dessa maneira é mantida durante um período de tempo suficiente para que o(s) produto(s) desejado(s) seja(m) sintetizado(s).

Adicionalmente, a atividade de uma ou mais enzimas pode ser aumentada através do uso contínuo de co-fatores durante a purificação de uma ou mais enzimas. Por exemplo, incluindo piridoxal-5'-fosfato quando a purificação da D-alanina aminotransferase de B. sphaericus resulta em uma atividade maior (Exemplo 14).

Quando uma ou mais das reações nas vias da invenção tiverem que ser realizadas in vitro, qualquer uma ou todas as enzimas utilizadas nas vias de biossíntese descritas aqui podem ser opcionalmente imobilizadas sobre um suporte sóldio. Os exemplos de tais suportes sólidos incluem a- queles que contêm epóxi, aldeído, quelantes ou grupos amina primários. Os exemplos específicos de suportes sólidos adequados incluem, mas não es- tão limitados a esferas de resina Eupergit® C (Rohm and Haas Company, Philadelphia1 PA) e SEPABEADS® EC-EP (Resindion). O Exemplo 21 ilustra a imobilização da D-alanina aminotransferase de B. sphaericus sobre esfe- ras de resina Eupergit® C. O Exemplo 22 ilustra a imobilização da ProA aldo- lase de Sinorhizobium meliloti sobre esferas de resina Eupergit® C. A produ- ção de R,R monatina utilizando estas enzimas imobilizadas é mostrada no Exemplo 23.

As reações individuais mostradas nas vias biossintéticas descri- tas aqui podem ser facilitadas (catalisadas) por uma única enzima ou por uma mistura de várias enzimas que atuam de forma concorrente.

Os métodos da invenção podem ser utilizados para produzir uma composição de monatina que contém uma porcentagem desejada de R1R- monatina ou uma porcentagem desejada mínima de R,R-monatina. Em adi- ção às etapas de reação descritas anteriormente, uma etapa de reação es- pecífica pode ser catalisada por mais de uma enzima, por exemplo, uma mistura de enzimas, de forma que a composição ou a preparação resultante contenha uma porcentagem desejada de R,R-monatina, incluindo, por e- xemplo, uma porcentagem desejada mínima de R,R-monatina ou uma por- centagem desejada máxima de R,R-monatina. Alternativamente, a monatina produzida através de duas vias engenheiradas separadas de acordo com os métodos da invenção pode ser combinada para produzir uma composição ou uma preparação que contém tal porcentagem desejada de R,R-monatina.

Quando uma enzima de uma classe designada de enzimas for utilizada como um exemplo, é esperado que uma enzima com pelo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de homologia também poderia ser utilizada em tal reação. Por exemplo, uma aldolase es- pecífica a R com pelo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de homologia à aldolase da SEQ ID NO: 22 poderia ser utilizada em qualquer uma das vias descritas anteriormente para produzir R1R mona- tina.

Adicionalmente, quando uma enzima de uma classe designada de enzimas for utilizada como um exemplo, é esperado que um fragmento de tal enzima que possui a mesma atividade poderia também ser utilizado em tal reação. Por exemplo, um fragmento da aldolase da SEQ ID NO: 22 que também funciona como uma aldolase poderia ser utilizado em qualquer uma das vias descritas anteriormente para produzir R,R monatina.

A monatina que é produzida utilizando um ou mais dos polipep- tídeos ou das vias biossintéticas divulgadas aqui, é constituída geralmente de pelo menos aproximadamente 0,5-30% de R,R-monatina, em peso da monatina total produzida. Em outras modalidades, a monatina produzida uti- lizando um ou mais dos polipeptídeos ou das vias biossintéticas divulgadas aqui, é constituída de mais de 30% de R,R-monatina, em peso da monatina total produzida; por exemplo, a R,R-monatina constitui 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% da monatina total produzida. Alternativamente, várias quantidades de duas ou mais preparações de mo- natina podem ser combinadas de forma que resultam em uma preparação que é constituída por uma porcentagem desejada de R,R-monatina. Por e- xemplo, uma preparação de monatina que é constituída de 30% de R,R- monatina pode ser combinada com uma preparação de monatina que é constituída de 90% de R,R-monatina; se quantidades equivalentes de 30% e 90% de preparações de R,R-monatina forem combinadas, a preparação de monatina resultante seria constituída de 60% de R,R-monatina.

A monatina ou um intermediário (incluindo o precursor de mona- tina), produzido utilizando um ou mais dos polipeptídeos ou das vias biossin- téticas divulgadas aqui, pode ser purificado partindo dos componentes da reação. Em uma modalidade, a monatina ou o intermediário, tal como o pre- cursor de monatina, pode ser purificado simplesmente através da remoção da substância que deve ser purificada da preparação de enzima em que foi sintetizado. Em outras modalidades, o intermediário, o precursor de monati- na ou a monatina é purificada de uma preparação em que foi sintetizada de forma que a composição ou a preparação "purificada" resultante seja consti- tuída de pelo menos aproximadamente 5-60% de monatina em peso dos compostos orgânicos totais. Em uma outra modalidade, a monatina ou o in- termediário, tal como o precursor de monatina, pode ser purificado até um grau de pureza de pelo menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em peso dos compostos orgânicos totais.

A monatina ou o intermediário (incluindo o precursor de monatina), produzido utilizando um ou mais dos polipeptídeos ou das vias biossintéticas divulgadas aqui, pode ser purificado dos componentes da reação através de qualquer método conhecido por um versado na técnica. Em uma modalidade, a monatina ou o intermediário pode ser purificado como descrito no Exemplo 13. De forma ótima, a monatina ou o intermediário purificado pode ser recris- talizado repetidamente até que o grau de pureza desejado seja atingido. EXEMPLOS Exemplo 1

Detecção de Monatina. Triptofano, Alanina e Glutamato

Este exemplo descreve métodos utilizados para detectar a pre- sença de monatina, triptofano e glutamato. Descreve ainda um método para a separação e para a detecção dos quatro estereoisômeros de monatina. Análise de Monitoramento de Várias Reações ΓMRM") por LC/MS/MS de Monatina e Triptofano

As análises de misturas em relação à monatina e ao triptofano derivados de reações bioquímicas in vitro ou in vivo foram realizadas utili- zando um instrumento de espectrometria de massa em tandem com croma- tografia líquida (LC/MS/MS) Waters/Micromass incluindo um cromatógrago líquido Waters 2795 com um monitor de absorbância Waters 996 Photo- Diode Array (PDA) colocado em série entre o cromatógrafo e um espectrô- metro de massa de quadripolar triplo Micromass Quattro Ultima. As separa- ções por LC foram feitas utilizando uma coluna de cromatografia em fase inversa Xterra MS C8, 2,1 mm x 250 mm a 40°C. A fase móvel de LC consis- tia em A) água contendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoroacético e B) metanol contendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoroacético.

O gradiente de eluição era linear de 5% de B até 35% de B, 0-4 min., linear de 35% de B até 60% de B1 4-6,5 min., linear de 60% de B até 90% de B, 6,5-7 min., isocrático a 90% de B 7-11 min., linear de 90% de B até 95% de B, 11-12 min., linear de 95% de B até 5% de B, 12-13 min., com um período de reequilíbrio de 2 min. entre as corridas. A vazão era de 0,25 mL/min. e a absorbância PDA era monitorada de 200 nm até 400 nm. Todos os parâmetros da ESI-MS foram otimizados e selecionados com base na produção de íons moleculares protonados ([M + H]+) dos analitos de interes- se e na produção de íons de fragmentos característicos. Os parâmetros ins- trumentais a seguir foram utilizados para a análise de Monitoramento de Vá- rias Reações (MRM) por LC/MS/MS da monatina e do triptofano: Capilar: 3,5 kV; Cone: 40 V; Hex 1: 20 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura da fon- te: 100°C; Temperatura de dessolvatação: 350 °C; Gás de dessolvatação: 500 L/h; Gás do cone: 50 L/h; Resolução baixa de massa (Q1): 12,0; Reso- lução alta de massa (Q1): 12,0; Energia iônica: 0,2; Entrada: -5 V; Energia de colisão: 8; Saída: 1V; Resolução baixa de massa (Q2): 15; Resolução alta de massa (Q2): 15; Energia iônica (Q2): 3,5; Multiplicador: 650. Cinco transi- ções de MRM de parental para filha específicas à monatina são utilizadas para detectar especificamente a monatina em reações in vitro e in vivo. As transições monitoradas são 293,1 até 158,3, 293,1 até 168,2, 293,1 até 211,2, 293,1 até 230,2 e 293,1 até 257,2. O triptofano é monitorado com a transição de MRM 204,7 até 146,4. Para a quantificação do padrão interno da monatina e do triptofano, quatro padrões de calibração contendo quatro porporções diferentes de cada analito em relação ao d5-triptofano e à d5- monatina, são analisados. Estes dados são submetidos a uma análise de mínimos quadrados linear para produzir uma curva de calibração para mona- tina e triptofano. A cada amostra é adicionada uma quantidade fixa de d5- triptofano e d5-monatina (a d5-monatina foi sintetizada partindo do d5- triptofano de acordo com os métodos de W003/091396 A2) e as proporções de resposta (monatina/d5-monatina; triptofano/d5-triptofano) foram utilizadas em associação com as curvas de calibração descritas anteriormente para calcular a quantidade de cada analito nas misturas. Medida Acurada da Massa de Monatina.

A análise de MS de alta resolução foi realizada utilizando um espectrômetro de massa híbrido quadripolar/tempo de vôo Applied Biosys- tems-Perkin Elmer Q-Star. A massa medida para a monatina protonada utili- zava o triptofano como um padrão de calibração de massa interna. A massa calculada da monatina protonada, com base na composição de elementos Ci4H17N2O5 é de 293,1137. A monatina produzida utilizando o processo bio- catalítico descrito nos Exemplos 2 e 3 mostrava uma massa medida de 293,1144. Este é um erro de medida da massa menor que 2 partes por mi- lhão (ppm), fornecendo evidência conclusiva da composição de elementos da monatina produzida enzimaticamente.

Medida da Monatina por LC/MS/MS Quiral ("MRM")

A determinação da distribuição de estereoisômeros da monatina em reações in vitro e in vivo foi realizada através da derivatização com 1 - flúor-2-4-dinitrofenil-5-L-alanina amida ("FDAA"), seguida pela medida MRM por LC/MS/MS em fase inversa.

Derivatização da Monatina com FDAA

A 50 μL de amostra ou de padrão foram adicionados 200 μL de uma solução a 1% de FDAA em acetona. Quarenta μL de bicarbonato de sódio a 1,0 M foram adicionados e a mistura foi incubada durante 1 h a 40 0C com mistura ocasional. A amostra foi removida e resfriada e neutralizada com 20 μL de HCI a 2,0 M (mais HCI pode ser necessário para realizar a neutralização de uma mistura biológica tamponada). Após a degaseificação ser completada, as amostras estavam prontas para análise por LC/MS/MS.

Monitoramento de Várias Reações por LC/MS/MS para a Determinação da Distribuição de Estereoisômeros de Monatina em Reações in vitro e in vivo.

As análises foram realizadas utilizando a instrumentação de LC/MS/MS descrita anteriormente. As separações de LC capazes de separar todos os quatro estereoisômeros de monatina (especificamente FDAA- monatina) foram realizadas em uma coluna para cromatografia em fase in- versa Fenomenex Luna 2,0 χ 250 mm (3 μm) C18 a 40 °C. A fase móvel consistia de A) água contendo 0,05% (massa/volume) de amônio acetato e B) acetonitrila. A eluição era isocrática a 13% de B, 0-2 min., linear de 13% de B até 30% de B1 2-15 min., linear de 30% de B até 80% de B, 15-16 min., isocrática a 80% de B 16-21 min. e linear de 80% de B até 13% de B, 21-22 min., com um período de reequilíbrio de 8 min. entre as corridas. A vazão era de 0,23 mL/min. e a absorbância PDA foi monitorada de 200 nm até 400 nm. Todos os parâmetros da ESI-MS foram otimizados e selecionados com base na produção de íons moleculares desprotonados ([M - H]-) de FDAA- monatina e na produção de íons de fragmentos característicos.

Os parâmetros instrumentais a seguir foram utilizados para a análise de LC/MS da monatina no modo de ESI/MS de íon negativo: Capilar: 2,0 kV; Cone: 25 V; Hex 1: 10 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura da fonte: 100°C; Temperatura de dessolvatação: 350 °C; Gás de dessolvata- ção: 500 L/h; Gás do cone: 50 L7h; Resolução baixa de massa (Q1): 12,0; Resolução alta de massa (Q1): 12,0; Energia tônica: 0,2; Entrada: -5V; Ener- gia de colisão: 20; Saída: 1V; Resolução baixa de massa (Q2): 12; Resolu- ção alta de massa (Q2): 12; Energia iônica (Q2): 3,0; Multiplicador: 650. Três transições de parental para filha específicas à FDAA-monatina são utilizadas para detectar especificamente a FDAA-monatina em reações in vitro e in vivo. As transições são 543,6 até 268,2, 543,6 até 499,2 e 543,6 até 525,2. A identificação de estereoisômeros de FDAA-monatina se baseia no tempo de retenção cromatográfica quando comparado com os estereoisômeros de monatina sintéticos purificados e os dados de espectro de massa.

Detecção de Aminoácidos Incluindo Glutamato e Alanina por Fluorescência em Coluna Pós-Cromatografia Líquida

A cromatografia líquida com pós-detecção por fluorescência em coluna para a determinação de glutamato em reações in vitro e in vivo foi realizada em um sistema de LC Waters 2690 ou equivalente combinado com um detector de fluorescência por varredura Waters 474 e um módulo de rea- ção pós-coluna da Waters. As separações por LC foram realizadas em uma coluna de troca iônica carregada com Interaction-Sodium a 60°C. A fase móvel A era o tampão Pickering Na 328 (Pickering Laboratories, Inc.; Moun- tain View, CA). A fase móvel B era o tampão Pickering Na 740. O gradiente de eluição era de 0% de B até 100% de B, 0-20 min., isocrático a 100% de B, 20-36 min. e linear de 100% de B até 0% de B, 36-37 min., com pelo me- nos um período de reequilíbrio de 8 min. durante as corridas, dependendo da matriz de amostra. A vazão para a fase móvel era de 0,5 mL/min.. A va- zão para a solução de derivatização pós-coluna OPA era de 0,5 mL/min.. Os ajustes do detector de fluorescência eram EX 338 nm e Em 425 nm. A Nor- eucina foi empregada como um padrão interno para a análise. A identifica- ção de aminoácidos se baseava nos dados de tempo de retenção cromato- gráfica para os padrões purificados.

Detecção de L- e D-Aminoácidos por LC/MS/MS

As amostras contendo uma mistura de L- e D-aminoácidos tais como triptofano, glutamato e aspartato provenientes de reações bioquímicas foram primeiramente tratadas com ácido fórmico para desnaturar a proteína. A amostra foi então centrifugada e filtrada através de um filtro em seringa de nylon de 0,45 pm antes da análise de LC/MS/MS. A identificação de L- e D- aminoácidos se baseava no tempo de retenção e na detecção seletiva de massa. A separação por LC foi realizada através da utilização do sistema de cromatografia líquida Waters 2690 e uma coluna para cromatografia Chirobi- otic TAG ASTEC de 2,1 mm χ 250 mm com temperatura de coluna ajustada a 45° C. As fases móveis A e B da LC eram 0,25% de ácido acético e 0,25% de ácido acético em metanol, respectivamente. A eluição isocrática de 60% da fase móvel A e 40% da B com vazão de 0,25 mL/min. foi ajustada para o glutamato; enquanto 30% da fase móvel A e 70% da B com vazão de 0,3 mL/min. foi ajustada para o aspartato e o triptofano.

O sistema de detecção para análise de L- e D-aminoácidos in- cluía um detector Waters 996 Photo-Diode Array (PDA) e um espectrômetro de massa quadripolar triplo Micromass Quattro Ultima. O PDA, fazendo a varredura de 195 até 350 nm, foi colocado em série entre o sistema de cro- matografia e o espectrômetro de massa. Os parâmetros para o espectrôme- tro de massa quadripolar triplo Micromass Quattro Ultima operando no modo de ionização por eletrospray positivo (+ESI) foram ajustados como a seguir: Capilar: 3,0 kV; Cone: 20 V; Hex 1: 15 V; Abertura: 1 V; Hex 2: 0 V; Tempe- ratura da fonte: 100°C; Temperatura de dessolvatação: 350 °C; Gás de des- solvatação: 530 L/h; Gás do cone: 30 L/h; Resolução baixa de massa Q1: 12,5; Resolução alta de massa Q1: 12,5; Energia iônica 1: 0,2; Entrada: -5; Colisão: 8; Saída 1:10; Resolução baixa de massa Q2: 12,5; Resolução alta de massa Q2: 12,5; Energia iônica 2: 0,5; Multiplicador: 650 V. Os experi- mentos de MS/MS com o modo de Monitoramento de Várias Reações (MRM) foram ajustados para monitorar seletivamente as transições de rea- ções de 204,70 até 146,50, 147,8 até 84,2, 147,8 até 102,1, 134,00 até 74,30 e 134,00 até 88,2. A quantificação dos ácidos de triptofano, glutamato e aspartato se baseava nas respostas de sinal de m/z= 146,5, m/z= 102,1 e m/z= 88,2, respectivamente.

Produção de Monatina e de Precursor de monatina ("MP") para Padrões e para Ensaios

Produção de Monatina

Uma mistura racêmica de R1Re S1S monatina foi produzida sin- teticamente como descrito na Patente U.S. Ns 5.128.482.

As R,R e S,S monatinas foram separadas através de uma etapa de derivatização e hidrólise. Sucintamente, a mistura racêmica de monatina foi esterificada, o grupo amino livre foi bloqueado com Cbz, uma Iactona foi formada e a S,S Iactona foi seletivamente hidrolisada utilizando uma enzima protease imobilizada. A monatina também pode ser separada como descrito em Bassoli, A. e outros, Eur. J. Org. Chem., 0:1652-1658, (2005).

Produção de MP

O R-MP foi produzido através da transaminação de R,R monati- na utilizando a D-aminotransferase de faixa ampla AT-103 (BioCataIytics) em tampão fosfato de potássio a 0,1 M, utilizando piruvato de sódio como o re- ceptor de amino. O S-MP foi produzido através da transaminação de S,S monatina utilizando a L-aminotransferase AT-102 (BioCataIytics) em tampão fosfato de potássio a 0,1 M, utilizando piruvato de sódio como o receptor de amino. Ambas as reações foram realizadas a 30°C e em um pH de aproxi- madamente 8,0-8,3, durante aproximadamente 20 horas. Ambos os compos- tos foram purificados utilizando HPLC em escala preparatória com uma resi- na hidrofóbica Rohm e Haas (Philadelphia, PA) (XAD™1600), eluindo em água. As amostras contendo mais de 90% de pureza do precursor de mona- tina foram congeladas e secas por congelamento.

Exemplo 2

Produção de Monatina partindo de lndol-3-Piruvato

A transaminase AT-103 fazia parte de uma biblioteca de transa- minases obtida na BioCataIytics (Pasadena, CA) e a enzima foi testada para a produção de monatina em reações acopladas utilizando a ProA aldolase de C. testosteroni. A aldolase foi preparada como descrito em WO 03/091396 A2. A AT-103 é uma D-transaminase de especificidade ampla (EC 2.6.1.21) de uma espécie de Bacillus que requer um D-aminoácido (tal como D-gluta- mato, D-aspartato ou D-alanina) como o doador de aminoácido. As enzimas e os componentes/substratos adicionais foram adicionados diretamente em um tampão de reação fornecido no kit, que continha 100 mM de tampão fos- fato de potássio pH 7,5, 100 mM de doador de amino e 0,1 mM de piridoxal- 5'-fosfato ("PLP"). A um mL de tampão de reação foram adicionados: 4 mg de indol-3-piruvato, 20 mg de piruvato, aproximadamente 50 pg de ProA fo- rencídos em um extrato celular, 1 μL de MgCl2 a 2 M e 2 mg de enzima ami- notransferase. As reações foram realizadas em duplicata. As reações foram incubadas durante a noite a 30°C com agitação suave (100 rpm). As amos- tras foram filtradas e submetidas à análise de LC/MS/MS em fase inversa como descrito no Exemplo 1. Os resultados indicavam que aproximadamen- te 370 pg/mL de monatina eram produzidos utilizando a enzima AT-103. Os resultados foram adicionalmente analisados para determinar as proporções de S,R/R,S versus R,R/S,S monatina, com base nas áreas de pico dos dois conjuntos de estereoisômeros que são resolvidos durante a separação cro- matográfica. Da monatina total produzida por AT-103, 69% eram constituí- dos de R,R/S,S monatina em comparação com os isômeros misturados. Es- ta enzima é homóloga à enzima DAT de Bacillus subtilis descrita em WO 03/091396 A2, que é conhecida por possuir uma especificidade ampla por D- aminoácidos. A análise quiral foi realizada utilizando a metodologia de FDAA descrita no Exemplo 1, que verificou se a D-aminotransferase estava produ- zindo predominantemente R1R monatina e alguma S,R monatina como espe- rado. Os experimentos de transaminação adicionais com S1S monatina ou R,R monatina e α-cetoglutarato como substratos verificaram se a enzima da BioCatalytics era altamente seletiva em relação à configuração D no carbono 4, como esperado. Nestes experimentos, não foi detectado glutamato na reação com S1S monatina e α-cetoglutarato como substratos.

Para diminuir a quantidade de S1S monatina ou de R1S monatina produzida com subprodutos em reações acopladas à AT-103 (a D-transa- minase de faixa ampla) e à ProA aldolase, a aldolase foi purificada utilizando cartuchos His-Bind1 seguindo os protocolos do fabricante (Novagen1 Madi- son, Wl). A enzima purificada preferencialmente não deve conter atividades de L-aminotransferase do tipo selvagem que podem estar presentes nos ex- tratos celulares (tais como as atividades de AspC ou de TyrB de E. coli nati- va). O eluente de His-Bind foi dessalinizado para remover imidazol utilizando colunas PD-10 (G25 Sephadex1 Amersham-Pharmacia) e foi eluído em 50 mM de Tris-Cl1 pH 7. Os experimentos foram realizados em duplicata em um volume de 1 mL e continham 100 mM de tampão Tris-Cl1 pH 7,8, 50 pg de ProA aldolase, 4 mg de indol-3-piruvato, 1 ou 2 mg de D-aminotransferase, 200 mM de piruvato de sódio, 2 mM de MgCl2, 3 mM de fosfato de potássio, 0,1 mM de PLP e 14,7 mg de D-glutamato. Os tubos foram incubados a 30°C com agitação suave. Pontos de tempo de duas horas foram tirados e congelados imediatamente a -20°C. O pH foi ajustado em duas horas de 5 até entre 7-8 utilizando NaOH e os ensaios foram incubados durante a noite. As amostras foram filtradas e analisadas em relação à monatina como des- crito no Exemplo 1. As amostras de duas horas não tinham quantidades de- tectáveis de monatina, provavelmente devido ao pH baixo. As amostras do período durante a noite continham aproximadamente 190 ng/mL de monatina quando 1 mg de D-aminotransferase foi utilizado e aproximadamente 84% e- ram R,R monatina e 16% eram S,R monatina. Quando 2 mg de D-amino- transferase foram utilizados, foram produzidos 540 ng/mL de monatina, a- proximadamente 71% eram R1R monatina.

Experimentos similares foram realizados utilizando o tampão de Aminotransferase da Biocatalytics, que continha 100 mM de fosfato de po- tássio pH 7,5, 0,1 mM de PLP e 100 mM de D-glutamato. O indol-3-piruvato sólido e a D-aminotransferase foram adicionados com acima. A ProA aldolase (50 pg), MgCfe e 50 mM de piruvato foram adicionados partindo das soluções estoque. Os ensaios foram tratados como acima, embora nenhum ajuste de pH tenha sido necessário neste caso. Um controle negativo foi feito apenas com a enzima e o tampão fornecidos pela BioCataIytics, que não continham monatina. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1: Produção de Monatina partindo de lndol-3-Piruvato em Tampão Fosfato

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A produção de monatina em tampão fosfato é claramente maior que em sistemas tamponados com Tris.

Para comparar as atividades da DAT de B. subtilis clonada do WO 03/091396 A2 com a enzima (AT-103) da BioCataIytics foram realizados ensaios adicionais. O gene dat de B. subtilis também foi subclonado em pET30a para remover a marcação His-6. A enzima não marcada e marcada foram produzidas em BL21(DE3), como descrito no WO 03/091396 A2. Os extratos celulares foram produzidos e os ensaios de proteína total foram rea- lizados para estimar a concentração de proteína como descrito anteriormen- te. Foram realizadas reações de um ml_ em duplicata que continham: 500 pg de D-aminotransferase, 50 pg de ProA aldolase, 100 mM de fosfato de po- tássio pH 7,5, 3 mM de MgCI2, 4 mg de indol-3-piruvato, 200 mM de piruvato de sódio, 7,35 mg (50 mM) de D-glutamato e 0,1 mM de PLP. As amostras foram incubadas a 30°C durante 1 hora, 2 horas e durante a noite e foram filtradas para a análise de LC/MS/MS. As amostras continham apenas os estereoisômeros S1R e R,R de monatina, como determinado através do pro- tocolo de derivatização por FDAA descrito no Exemplo 1. Os resultados es- tão resumidos na Tabela 2 abaixo. A % de RR foi determinada pelas áreas de pico que foram separados por cromatografia em fase inversa.

Tabela 2: Comparação de Enzimas D-Aminotransferases

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A remoção da marcação HIS-6 parece ter aumentado a atividade da D-aminotransferase de B. subtilis; entretanto, o homólogo da D-amino- transferase da BioCataIytics tinha claramente a atividade mais alta. É tam- bém mostrada a maior preferência ao substrato para o R-precursor de mona- tina. Tempos de incubação maiores parecem reduzir o excesso enanciomé- rico da R,R monatina que é produzido.

Devido ao fato de que as enzimas D-aminotransferases de Bacil- lus possuem uma preferência pelo piruvato como um receptor de amino e D- alanina como um doador de amino, era esperado que a D-alanina pudesse ser utilizada como o doador de amino para a conversão de MP em monatina com resultados similares ou melhores. Foram realizadas reações de um mL em dupli- cata que continham: 500 pg de D-aminotransferase, 50 pg de ProA aldolase puri- ficada, 100 mM de fosfato de potássio pH 7,5, 3 mM de MgCI2, 4 mg de indol-3- piruvato, 100 mM de piruvato de sódio, 25 mM de D-glutamato ou de D-alanina e 0,1 de mM PLP. As amostras foram incubadas durante 2 horas e tratadas como acima antes da análise. Quando a D-alanina foi utilizada como o doa- dor de amino, níveis ligeiramente maiores de monatina eram produzidos (23 versus 21 ppm) como esperado. Adicionalmente, é esperado que altas con- centrações de piruvato podem inibir a etapa de transaminação, assim a do- sagem em quantidades menores de piruvato em relação ao tempo pode au- mentar a taxa geral de produção de monatina. Pode-se observar partindo dos dados acima que muito embora metade do piruvato tenha sido utilizada neste caso comparado com a tabela acima, significativamente mais monati- na foi produzida. Muito embora as ProA aldolases na literatura tenham sido relatadas para a produção de primariamente enanciômeros S de produtos da condensação de aldol, a ProA aldolase utilizada neste estudo produz clara- mente uma alta porcentagem de R-MP e em ensaios acoplados produz até 92% de R,R monatina. A alta porcentagem de R,R monatina não é devida à seletividade da D-aminotransferase, como foi mostrado no Exemplo 19. Exemplo 3

Produção de R.R Monatina partindo de D-Triptofano

Os seguintes foram adicionados por 1 mL de mistura de reação: aproximadamente 60 pg de ProA aldolase de C. testosteroni (fornecida em extratos celulares, como descrito no WO 03/091396 A2), 4 mM de MgCI2, 50 mM de D-triptofano, 0,5 mg de D-aminotransferase (AT-103) da BioCataIy- tics, 100 mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5 ou 100 mM de tampão acetato de sódio pH 8, 0,05 mM de PLP, 3 mM de fosfato de potássio (apenas para as reações com acetato) e 10 mM de α-cetoglutarato. Os experimentos foram corridos em duplicata, com con- troles negativos em que a aldolase não foi adicionada. As amostras foram incubadas durante a noite (20 horas) a 30°C com agitação suave. O pH real das amostras com acetato de sódio era de aproximadamente 5, enquanto o pH final para as amostras tamponadas com fosfato fosse de aproximada- mente 7. Nenhuma das aldolases parecia ter atividade significativa em pH 5; a amostra contendo ProA aldolase estava ligeiramente acima do controle negativo, mas provavelmente não acima do erro experimental. Em fosfato de potássio, a ProA aldolase produzia 73,4 ppm de monatina com uma propor- ção de R,R:S,R de 1,7:1 (-63% de R1R partindo de D-triptofano).

Devido ao fato de que as enzimas D-aminotransferases de Bacillus possuem uma preferência pelo piruvato como um receptor de amino e D-alanina como um doador de amino, era esperado que a adição de alfa-cetoglutarato seria desnecessária quando era produzida R,R ou S,R monatina partindo de D-triptofano. O experimento acima foi repetido (em 100 mM de tampão fosfa- to de potássio) utilizando ProA aldolase purificada (50-60 μg) e um tempo de incubação de 2,5 horas. Foram corridos experimentos em duplicata, com e sem alfa-cetoglutarato. Quando 10 mM de alfa-cetoglutarato eram adicionados, 56,1 ppm de monatina foram produzidos utilizando D-triptofano como o subs- trato (79,5 % de R,R, 20,5% S,R). Quando o alfa-cetoglutarato foi omitido, 102,5 ppm de monatina foram produzidos (79% de R,R, 21% de S,R).

Comparação da produção de monatina total e distribuição iso- mérica para HMG aldolases de Sinorhizobium meliloti, C. testosteroni e a aldolase da SEQID NO: 22.

A transaminase AT-103 (uma D-aminotransferase de especifici- dade ampla) foi obtida na BioCataIytics (Pasadena, CA) e esta enzima ou a enzima recombinante de B. sphaericus produzida no Exemplo 18 foi utilizada em reações acopladas às HMG aldolases para produzir monatina partindo de D-triptofano e piruvato como descrito no Pedido de Patente U.S. Publica- do N2 2005282260.

As HMG aldolases de C. testosteroni (ProA) e S. meliloti foram preparadas e purificadas como descrito na Publicação U.S. N- 20040063175 e no WO 03091396 A2. Para produzir quantidades teste da aldolase da SEQ ID NO:22, uma cultura de 50 mL foi crescida em meio Luria-Bertani ("LB") contendo ampicilina (100 μg/mL), até uma OD6oo de aproximadamente 0,5. A cepa contendo a construção da SEQ ID NO: 21 foi induzida com 200 μg/L de anidrotetraciclina. As células foram crescidas 5 horas após a indução e os extratos celulares foram preparados de acordo com os protocolos do fabri- cante (Novagen, reagente Bugbuster). Foram também adicionados benzo- nuclease e inibidor de protease. As proteínas solúveis nos extratos celulares foram separadas em uma BioRad Laboratories Experion Automated Electro- phoresis Station e analisadas em relação à concentração e à porcentagem de expressão utilizando o Experion Software versão 1.1.98.0. A aldolase da SEQ ID NO: 22 foi utilizada na forma de uma enzima bruta (não purificadas) para as reações abaixo.

Os seguintes foram adicionados por 1 mL de mistura de reação: aproximadamente 50 pg de aldolase, 4 mM de MgCI2, 50 mM de D-tripto- fano, 0,5 mg de D-aminotransferase de B. sphaericus purificada, 200 mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5 e 0,05 mM de PLP. Os experimentos foram corridos em duplicata, com controles nega- tivos em que a aldolase não foi adicionada. As amostras foram incubadas 1 hora e durante a noite (18 horas) a 30°C com agitação suave. Pequenas quantidades de monatina (< 0,5 ppm) são produzidas sem aldolase nas rea- ções ocorridas durante a noite, devido às reações não enzimáticas catalisa- das por magnésio e fosfato. Tais valores foram subtraídos dos números mostrados abaixo e são mostradas as médias dos resultados. Os únicos es- tereoisômeros detectados quando a monatina era produzida utilizando estes métodos são R1R e S1R. A procentagem de R,R é listada abaixo e foi deter- minda pela área de pico por LC em fase inversa.

Tabela 3: Monatina Total produzida partindo de D-Triptofano e % de R,R

<table>table see original document page 49</column></row><table>

A amostra de 18 horas para a aldolase da SEQ ID NO: 22 tam- bém foi analisada em relação à distribuição de estereoisômeróicos através do método de derivatização por FDAA listado no Exemplo 1, que forneceu um resultado de 94,9% de R,R e 5,1% de S1R monatina. A aldolase da SEQ ID NO: 22 tinha uma especificidade enanciomérica maior para a produção de R-MP quando comparada com as HMG aldolases de C. testosteroni e S. meliloti.

Os mesmos experimentos foram realizados, lado a lado, utili- zando L-triptofano como o substrato de partida e acoplado as aldolases à L-aminotransferase de especificidade ampla HexAspC produzida e purificada como descrito no Pedido de Patente U.S. Publicado N° 2005282260. Estas reações devem produzir primariamente S,S monatina e R,S monatina. As reações foram também suplementadas com 10 mM de alfa-cetoglutarato como o receptor de amino para a transaminação de L-triptofano. Novamente, foi tirada a média dos resultados em duplicata abaixo para a monatina total (subtraindo os níveis de fundo sem aldolase presente) e a porcentagem de S,S monatina é mostrada com base na área de pico por LC em fase inversa. Em alguns casos, devido ao fato de que as aldolases são bastante específi- cas a R e produzem pouca monatina total, as estimativas por fase inversa da distribuição de estereoisômeros são menos acuradas por causa de algum rastro do pico de triptofano que pode ser co-eluído com o pico de S,S/R,R. As tendências ainda são informativas na comparação da especificidade a R das aldolases. Os resultados de uma análise adicional utilizando o método de derivatização por FDAA são mostrados entre parêntese para várias a- mostras e são mais acurados. Os números de monatina total acima de apro- ximadamente 400 ppm são maiores que a faixa linear da escala dos padrões utilizados para quantificar os resultados, então são resultados qualitativos. A ProA aldolase de C. testosteroni produz tipicamente 95-100% de S1S mona- tina, como mostrado na Pedido de Patente U.S. Publicado N° 2005282260. Tabela 4: Monatina Total Produzida Partindo de L-Triptofano e % de S,S

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Pode-se observar que a especificidade a R da aldolase da SEQ ID NO: 22 é bastante alta comparada com a enzima ProA comercial. Esta especificidade a R é também refletida na baixa % de S1S monatina produzi- da, apesar do alto grau de especificidade da aminotransferase HexAspC em relação a S-MP nestas reações. Novamente, a HMG aldolase de S. meliloti está entre a ProA aldolase de C. testosteroni e a aldolase da SEQ ID NO: 22 em termos de especificidade a R1 com base nos níveis de S1S monatina pro- duzida. Os números de monatina total, quando é comparada a produção de S,S monatina versus a produção de R,R monatina, não são indicativos da atividade de aldolase. A D-aminotransferase é menos ativa que a HexAspC em relação às reações de transaminação de MP, particularmente nas con- centrações de MP que estão presentes nestas reações.

Para a comparação adicional da aldolase da SEQ ID NO: 22 com a enzima ProA de C. testosteroni, proporções variáveis de D- aminotransferase em relação à aldolase foram utilizadas nas reações partin- do de D-triptofano (sem amostras em duplicata para estes experimentos). As reações foram realizadas como descrito anteriormente. Para as reações em que a concentração de aldolase foi mantida constante, foram utilizados a - proximadamente 50 pg de aldolase. Para as reações em que a quantidade de D-aminotransferase foi mantida constante, foi utilizado 0,5 mg. Para as concentrações de 2 e 10 mg/mL de D-aminotransferase, foi utilizada a enzi- ma liofilizada. Para as 2 concentrações mais altas de D-aminotransferase, foram corridas duplicatas. Tabela 5. Efeito da Concentração de D-Aminotransferase sobre a Produção de R,R Monatina

<table>table see original document page 52</column></row><table> Tabela 5. -continuação-

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Para os níveis de monatina acima de 400 ppm, os resultados não estão na faixa linear da curva padrão e são apenas valores aproxima- dos. A quantidade máxima de R1R monatina produzida, quando diluída apro- priadamente, era de aproximadamente 1100 ppm. A análise estereoisoméri- ca por FDAA foi feita para a aldolase da SEQ ID NO: 22 com amostras de 10 mg/mL de D-aminotransferase. Em duas horas, a amostra continha 98,5% de R,R monatina. Em 17 horas, a amostra continha 95,9% de R,R monatina. A aldolase da SEQ ID NO: 22 produziu altas porcentagens de R1R monatina, mesmo após períodos de incubação longos e utilizando grandes quantida- des de aminotransferase. Se a D-aminotransferase adequada for fornecida, a aldolase da SEQ ID NO: 22 produz tanta monatina total que a ProA aldola- se de C. testosteroni, indicando uma atividade específica similar.

Tabela 6. Efeito da Concentração de Aldolase sobre a Produção de R1R Mo- natina

<table>table see original document page 53</column></row><table> <table>table see original document page 54</column></row><table> Quando a concentração de aldolase é variada, não ocorre muito

aumento na monatina total. A porcentagem de R1R diminui com o tempo e também com a concentração de aldolase, particularmente quando a D- aminotransferase é limitante.

Para verificar adicionalmente a especificidade a R das aldolases testadas, foram feitos experimentos partindo de L-triptofano e aminotransfe- rase HexAspC1 que foi produzida e purificada como descrito no Pedido de Patente U.S. Publicado N2 2005282260. A HexAspC mostra uma grande se- Ietividade em relação à transaminação de S-MP versus R-MP, assim as por- centagens acima de 50% de R1S monatina indicam uma aldolase altamente estereoespecífica. Dez mM de alfa-cetoglutarato foram fornecidos como um receptor de amino; entretanto, em altas concentrações, o piruvato é também utilizado pela L-aminotransferase. Nestas reações, tipicamente somente S,S e R,S monatinas são produzidas dentro dos limites de detecção do protocolo de derivatização por FDAA.

Tabela 7. Efeito da Concentração de L-Aminotransferase sobre a Produção de S1S Monatina

<table>table see original document page 55</column></row><table> Tabela 8. Efeito da Concentração de Aldolase sobre a Produção de S1S Mo- natina

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Para as aldolases que são altamente específicas a R, tal como a SEQ ID NO: 22, menos monatina total é produzida e o aumento da quanti- dade de aldolase não aumenta a monatina total (assim como a % de S1S). Estas aldolases produzem menos substrato de S-MP, o substrato preferido para a L-aminotransferase utilizada. Para as enzimas que são menos espe- cíficas a R1 tal como a ProA1 o aumento da aldolase não melhora significati- vamente a produção de monatina total produção ou a % de S1S monatina. O aumento da quantidade de L-aminotransferase adicionada diminui a porcen- tagem de S1S monatina produzida.

A atividade e a especificidade da aldolase da SEQ ID NO: 22 foram adicionalmente estudadas em dois sistemas de tampão - 100 mM de fosfato de potássio, como acima e 100 mM de ácido 3-(N-morfolino) propa- nossulfônico ("MOPS") (com 3 mM de fosfato de potássio). Os ensaios foram realizadas com acima, utilizando 1 mg/mL de D-aminotransferase AT-103 e 50 mM de D-triptofano. Os experimentos foram corridos em duplicata duran- te 4,5 horas. A aldolase da SEQ ID NO: 22 produziu 116 ppm de monatina e 99,1 % de R,R monatina em fosfato de potássio (método de derivatização por FDAA). Em MOPS, a aldolase da SEQ ID NO: 22 produziu 75,5 ppm de monatina e 96,2% eram R,R monatina. Os níveis de fundo da monatina pro- duzida em MOPS, em a aldolase da SEQ ID NO: 22, eram significativamente maiores e a porcentagem de R,R era menor com MOPS, mesmo nos contro- les. É possível que a seletividade e atividade da D-aminotransferase sejam afetadas pela presença do MOPS.

Subclonaaem da SEQID NO: 21

O gene da aldolase da SEQ ID NO: 21 foi recebido da Diversa Corp. A SEQ ID NO: 21 fazia parte de uma biblioteca ambiental que foi veri- ficada pela Diversa Corp. em relação aos genes da aldolase. Entretanto, o gene da aldolase da SEQ ID NO: 21 pode ser reconstruído através de qual- quer método conhecido por um versado na técnica. Por exemplo, o gene da aldolase da SEQ ID NO: 21 pode ser reconstruído utilizando métodos de PCR de montagem, como descrito nos Exemplos 10, 18 e 19.

Os iniciadores a seguir foram utilizados para a amplificação atra- vés da PCR do gene da aldolase (SEQ ID NO: 21):

5'-gaggagctcgagtcagacgtatttcagtcctttttc-3' (SEQ ID NO:23) e 5'-agaagacatatgatttatcagccggggac-3' (SEQ ID NO:24). O produto da PCR resultante foi digerido com Xhol e Ndel para cortar nos sítios que foram en- genheirados dentro dos iniciadores. O fragmento foi purificado em gel (QIA- quick Gel extraction Kit (Qiagen, Velencia, CA)) e ligado (utilizando T4 DNA ligase) com pET28b que foi digerido com Xhol e NdeI e purificado em gel. A ligação foi transformada em células quimicamente competentes TOP1OF'. As colônias que cresceram nas placas foram verificadas em relação aos inser- tos e vários isolados com os insertos foram submetidos à análise de se- qüência do DNA (Agencourt, Beverly, MA).

Purificação da Aldolase da SEQID NO: 22

Os clones de aldolase confirmados foram transformados em BL21 (DE3) ou BL21 (DE3) pLysS. As cultivadas durante a noite com o anti- biótico apropriado foram diluídas em meio fresco (tipicamente 1:100) e cres- cidas até uma OD6oo -0,6 com aeração a 37°C. As culturas foram então in- duzidas com 1 mM de isopropil tiogalacatosídeo ("IPTG") e transferidas para °C (com aeração) e a incubação foi mantida durante a noite. As células foram coletadas por centrifugação. O pélete de células foi tipicamente sub- metida a um ciclo de congelamento descongelamento para ajudar na lise celular. O pélete de células foi lisada em BugBuster e Benzoase (Novagen, Madison, Wl) (de acordo com o protocolo do fabricante). Os restos celulares foram removidos por centrifugação. O extrato de proteína bruta foi aplicado em uma coluna HisBind (Novagen, Madison, Wl) que foi preparada de acor- do com o protocolo do fabricante. A coluna foi lavada e a proteína foi eluída de acordo com o protocolo do fabricante. A proteína purificada foi dessalini- zada com colunas PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). O tampão utili- zado para a troca era 50 mM de fosfato de potássio pH 7,5, 100 mM de Na- Cl, 4 mM de MgCI2. A proteína purificada foi concentrada com concentrado- res por centrifugação Amicon (Millipore, Billerica, MA).

Exemplo 4

(1) Triptofano Racemase

A R,R-monatina foi produzida utilizando D-aminotransferase e uma aldolase quando o D-triptofano foi utilizado como o material de partida (Exemplo 3). No entanto, o L-triptofano pode ser um material de partida pre- ferido por várias razões. Por exemplo, o L-triptofano pode ser menos onero- so e mais facilmente disponível que o D-triptofano. Esta descrição descreve vários métodos para a obtenção de uma triptofano racemase ativa. Os ren- dimentos de R,R monatina são melhorados através da utilização de uma aldolase específica a R, isto é, uma aldolase que preferencialmente ou sele- tivamente produz R-MP. As figuras 1 e 2 ilustram métodos para a produção de R,R monatina enriquecida de forma enanciomérica partindo de L- triptofano utilizando uma triptofano racemase, uma D-aminotrarisferase e uma aldolase específica a R.

Uma seleção de uma triptofano racemase foi criada através da construção de uma cepa que requer uma racemase ativa para crescer. Um organismo auxotrófico em relação ao triptofano precisa de uma fonte de L- triptofano quando cultivado em meio mínimo. A suplementação do meio com D-triptofano é uma maneira de selecionar uma racemase que converte D- triptofano em L-triptofano. Os organismos auxotróficos em relação ao tripto- fano foram testados em relação ao crescimento em meio mínimo suplemen- tado com D-triptofano. As cepas, CAG18455 e CAG18579 do Coli Genetic Stock Center e NRRL12264 (também lipA~, ADE3 Iisogenisada e curada de seu plasmídeo), não cresciam quando suplementadas com D-triptofano, mas cresciam quando suplementadas com L-triptofano. E. coli pode ser utilizada como um organismo hospedeiro, mas outros organismos hospedeiros tam- bém podem ser utilizados, tal como levedura, outras bactérias ou outros or- ganismos eucarióticos. Um organismo auxotrófico em relação ao triptofano (especificamente NRRL12264 (também lipA~, ADE3 Iisogenisada e curada de seu plasmídeo)) crescerá em D-triptofano quando este for transformado com uma D-aminotransferase. Isto confirma a capacidade de E. coli de transportar D-triptofano para dentro da célula.

Salcher e Lingens descreveram a presença de uma triptofano racemase em Pseudomonas aurereofaciens (ATCC15926). Salcher, O. e Lingens, F., J. Gen. Microbiol. 727:465-471 (1980). A triptofano racemase também foi descrita em várias plantas incluindo tabaco, beterrabas, tomate e trigo e a enzima parece ser induzida por condições de estresse osmótico ou seca. A triptofano racemase pode desempenhar uma função em Sclerochi- ton Hicifolius na via de produção de monatina nativa. Para isolar esta ativida- de de racemase, uma biblioteca de expressão é construída partindo de ATCC15926 (ou um outro organismo com atividade de triptofano racemase) e a biblioteca é transformada no organismo auxotrófico em relação ao tripto- fano. É selecionada uma cepa que crescerá utilizando o D-triptofano como a fonte de triptofano. Um método similar também é utilizado para selecionar muitas cepas com racemases conhecidas para procurar uma racemase com atividade sobre o D-triptofano. Os exemplos de racemases que podem ter atividade sobre o D-triptofano incluem alanina, serina e glutamato racema- ses. Yoshimura T. e Esaki, N., "Amino Acid Racemases: Functions and Me- chanisms", Journal of Bioscience and Bioengineering 96, 103-109, (2003).

A alanina racemase é dependente de PLP e foi clonada partindo de Salmonella typhimurium (gene dadB). Outras fontes de alanina racema- ses são Escherichia coli, BaciHus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio eholerae, Schizosaccaroyces pombe e Bacillus eereus. Um cogumelo basi- deomiceto, Lentinus edodes, também contém uma alanina racemase de ati- vidade ampla.

A serina racemase também é dependente de PLP e é encontra- da em Eucariotos (por exemplo, cDNA de bicho-da-seda, de cérebro de rato, de cérebro de camundongo), assim como em bactérias (Enteroeoeeus galli- narum).

A glutamato racemase é independente de PLP e foi clonada par- tindo de Pedioeoceus pentosaeeus, Bacillus pumilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, E. coli, Aquifex pyrophilus e Bacillus subtilis. Algumas glutamato racemases são muito específicas e, conseqüentemente, mesmo os aminoácidos aspartato, asparagina e glutamine estruturalmente similares podem não ser substratos para a enzima.

As aspartato racemases também existem e são independentes de PLP. As aspartato racemases são encontradas em cepas de LaetobaeHli, Streptoeoeeus e algumas Archaea tais como cepas de Desulfuroeoceus e Thermocoeeus. O molusco bivalve Seapharea brouhtonii também contém uma aspartato racemase.

Outras racemases encontradas na literatura incluem aminoácido racemase (EC 5.1.1.10) de Anabaena sp. e Pseudomonas striata, prolina racemase e fenilalanina racemase multifuncional. Epimerases ou racemases relacionadas também estão sendo testadas. As racemases potenciais são testadas para ter certeza que não são D-triptofano aminotransferases. A se- leção de racemases potenciais é feita através da análise de seqüência e/ou um ensaio enzimático. Este método de verificação para a seleção de uma triptofano racemase é também utilizado para outras bactérias ou Archaeas para as quais a triptofano racemase foi descrita, assim como para bibliotecas de cDNA de eucariotos que foram construídas de maneira a permitir a ex- pressão.

As enzimas que passam no teste como uma triptofano racemase são verificadas em relação à atividade sobre a monatina como descrito no Exemplo 8. De forma ideal, pode-se obter uma enzima que é muito específi- ca em relação ao triptofano e possui pouca ou nenhuma atividade de race- mase sobre a monatina.

Uma triptofano racemase também pode ser desenvolvida e/ou melhorada (através de mutagênese ou de engenharia recombinante) partin- do de uma racemase, uma transaminase ou uma epimerase existente. Adi- cionalmente, devido ao fato de que as estruturas em cristal para as alanina aminotransferases (e outras aminotransferases) são conhecidas, estas po- dem ser utilizadas como uma base para a mutagênese racional baseada na estrutura. O processo descrito anteriormente é utilizado como uma seleção inicial em relação à atividade de triptofano racemase e como uma seleção em relação à atividade melhorada.

(2 Bibliotecas de Triptofano Racemase

Construção de Bibliotecas:

Burkholderia pyrrocina (ATCC15958) e Pseudomonas chlorora- phis (ATCC15926) foram obtidas na American Type Culture Collection. Fo- ram cultivadas como recomendado pela ATCC e o DNA genômico foi prepa- rado de acordo com o método descrito em Mekalanos, J.J., "Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae", Cell 35:253-263, (1983). O DNA genômico foi digerido parcialmente com a enzima de restrição Sau3A\. Fragmentos de 1-3 Kpb foram purificados em gel utilizando um Qiagen QIA- quick Gel Extraction Kit (Valencia, CA). O DNA purificado foi ligado em p- Trc99a (Amersham, Piscataway, NJ) que foi digerido com BamYW e purifica- do como acima. A ligação foi feita à temperatura ambiente com incubação durante a noite utilizando uma proporção molar de 3:1 de inserto em relação ao vetor. A biblioteca ligada foi transformada em células quimicamente com- petentes TOPIOF' (Invitrogen, Carlsbad, CA) e plaqueadas em meio LB com 100 pg/mL ampicilina. Após a incubação durante a noite das placas de trans- formação, as colônias foram raspadas das placas, lavadas com meio LB Ii- quido e um pélete de células de tamanho apropriado foi submetido a uma miniprep utilizando um Qiagen QIAquick miniprep kit (Valencia, CA). Aproxi- madamente 30.000 colônias fora agrupadas e submetidas à miniprep.

O plasmídeo agrupado foi transformado em CAG18455 (trpC83\: Tn 10, rph-1) ou CAG18579 (trpC::Tn1 Okan1 rph-1). Ambas as cepas são au- xotróficas em relação ao triptofano de forma que não crescerão em meio mínimo M9 (Difco) a não ser que o meio seja suplementado com triptofano. Os transformantes foram plaqueados em meio mínimo M9 suplementado com D-triptofano. Este seleciona uma cepa que pode converter D-triptofano em L-triptofano.

Antes da transformação da biblioteca, as cepas foram testadas em relação ao crescimento em meio mínimo com L- ou D-triptofano. As ce- pas foram testadas em relação ao crescimento em meio mínimo suplemen- tado com D-triptofano e não foi observado qualquer crescimento. Ambas as cepas cresceram em meio idêntico suplementado com L-triptofano ao invés de D-triptofano. Adicionalmente, um derivado de NRRL12264 (a cepa utiliza- da foi curada do plasmídeo de óperon de triptofano, Iisogenizada com ADE3 e deletada em relação a IipA, em adição a outras mutações codificadas pelo cromossomo (serB, àtrpED, tnaA2, aroP)) foi transformado com uma amino- transferase específica a D de Bacillus subtilis (WO 03/091396). A cepa NRRL12264 não podia crescer em meio mínimo suplementado com D- triptofano, mas cresceu em meio idêntico suplementado com L-triptofano ao invés de D-triptofano. A expressão da D-aminotransferase foi controlada pelo promotor T7. A cepa transformada era capaz de crescer em meio mínimo M9 suplementado com D-triptofano.

As colônias que crescem no meio com D-triptofano são selecio- nadas. O plasmídeo é isolado e transformado novamente na cepa original (CAG18455 ou CAG18579) para confirmar que o crescimento em meio com D-triptofano é dependente do plasmídeo e na de uma mutação do hospedei- ro. A seqüência de nucleotídeos dos plasmídeos que complementam a auxo- trofia em relação ao triptofano é analisada. Os clones que são determinados como contendo um gene de triptofano racemase são adicionalmente anali- sados.

A triptofano racemase de outras fontes de tecido é isolada de uma maneira similar. Estão na literatura relatos da atividade de triptofano racemase tanto em células de cultura de tecido de tabaco (Nicotiana taba- cum L. var. Wisconsin 38) (Miura, G.A. e Mills, S.E., "The conversion of D- tryptophan to L-tryptophan in cell cultures of tobacco", Plant Physiol. 47:483- 487, (1974)) quanto em extratos de proteína bruta de trigo (Triticum aesti- vum) (Rekoslavskaya, N.l. e outros, "Synthesis and physiological function of D-tryptophan during wheat germination", Russian J. Plant Physiol. 44:196- 203, (1997)). Uma biblioteca de expressão de cDNA é feita partindo de teci- do, como descrito na literatura e a biblioteca de expressão é utilizada para transformar um organismo auxotrófico como descrito anteriormente.

Seria esperado que se as mesmas cepas forem utilizadas e as mesmas condições de crescimento forem reproduzidas como descrito na literatura, a enzima com atividade de triptofano racemase poderia ser isolada ou o mRNA poderia ser isolado e poderia ser preparada uma biblioteca de expressão de cDNA que contivesse uma seqüência codificadora de uma en- zima com atividade de triptofano racemase. Por exemplo, certos estágios de crescimento ou certos componentes do meio podem ser requeridos para in- duzir a produção celular de uma enzima com atividade de triptofano racemase. (3) Ensaio da Triptofano Racemase

Os clones que são identificados com possuindo potencialmente uma triptofano racemase são transformados em uma cepa de E. coli comu- mente utilizada para a expressão de proteínas recombinantes, tal como BL21. As células são cultivadas em caldo LB até uma densidade óptica em 600 nm de 0,4-0,6. O promotor que controla a expressão da racemase é in- duzido com IPTG (concentração final de 0,1 mM). Após a indução, é permiti- do que as células expressem a proteína durante 1-3 horas a 37°C (com ae- ração). As células são coletadas e Iisadas por uma prensa de French, ultras- som ou através de meios químicos (tal como BugBuster (Novagen)). As célu- las lisadas são centrifugadas para remover os restos celulares. O extrato clarificado é utilizado diretamente nos ensaios.

Quantidades variáveis de extrato são adicionadas em uma solu-

ção de forma que a concentração final seja de 50 mM de fosfato de potássio (pH 7,0) e 2 mM de L-triptofano. O piridoxal-5'-fosfato é adicionado a uma concentração final de 10 μΜ. As amostras são incubadas e então analisadas por LC/MS. A presença de um pico de D-triptofano quando apenas L-tripto- fano é utilizado como um substrato indica um resultado positivo. A concen- tração de D-triptofano deve aumentar com o aumento do tempo até que o equilíbrio seja atingido e a taxa deve também aumentar com a concentração de proteína até que a concentração de enzima seja alta o suficiente que não é mais saturada com o substrato. O D-triptofano também pode ser converti- do em L-triptofano como acima.

Um gene de complementação pode codificar uma D-aminotrans- ferase. Esta reação de transaminação requer um alfa-ceto ácido tal como a- cetoglutarato, oxaloacetato ou piruvato como um receptor de amino. Estes compostos provavelmente estarão presentes em um extrato de células, ge- ralmente em pequenas quantidades. Estes compostos podem ser removidos utilizando uma coluna de dessalinização PD-10 e o ensaio pode ainda ser realizado em um extrato bruto. Similarmente, um gene de complementação também pode codificar uma D-aminoácido oxidase ou uma D-aminoácido desidrogenase. Estas enzimas também requerem co-fatores e co-substratos que podem ser removidos por uma coluna de dessalinização PD-10. A ativi- dade de triptofano racemase é purificada utilizando cromatografia em coluna convencional. Finalmente, o quadro aberto de leitura identificado como uma triptofano racemase potencial é clonado em um vetor de expressão com uma marcação de afinidade. A triptofano racemase potencial é então purificada por cromatografia por afinidade. Em qualquer um dos casos uma proteína purificada é utilizada em ensaios enzimáticos essencialmente como descrito anteriormente. (4) Engenharia Genética Inversa de Triptofano Racemase

A triptofano racemase pode ser purificada de fontes vegetais ou microbiandas através de técnicas convencionais de purificação de proteínas, incluindo o fracionamento com sulfato de amônio e cromatografia em coluna convencional. Uma vez que a proteína foi purificada de forma que um ponto pode ser isolado em um gel de 2-D, são utilizadas técnicas de microsse- qüenciamento de peptídeos ou o seqüenciamento de aminoácidos do tipo Edman convencional (na internet, vide "golgi.harvard.edu/microchem/" para descrições dos protocolos e do equipamento tipicamente utilizados para este tipo de trabalho). Em alguns casos, entretanto, a seqüência do genoma do organismo não pode ser utilizada como uma fonte da proteína para a purifi- cação de proteína porque tal seqüência ainda não foi determinada. Em tal situação, o primeiro conjunto de iniciadores degenerados pode ser planejado com base na seqüência disponível do relativo conhecido mais próximo da fonte de proteína. A PCR degenerada e o "genome walking" são então reali- zados de acordo com protocolos estabelecidos para isolar a seqüência codi- ficadora da triptofano racemase.

(5) Clonagem da Alanina Racemase de Geobacillus stearothermophillus

A alanina racemase (SEQ ID NO: 41) de Geobacillus stearothermo- phillus foi clonada. O DNA genômico de G. stearothermophilus (ATCC 12980D) foi obtido na ATCC (Manassas, VA). Os iniciadores a seguir foram utilizados para amplificar o gene da alanina racemase de G. stearothermophilus: 5'- atggacgagtttcaccgcga-3' (SEQ ID NO: 25) e 5'-ttatgcatcgcttcatccgc-3' (SEQ ID NO: 26). O produto da PCR foi ligado com pCR-Blunt-TOPO utilizando o kit de clonagem Zero Blunt TOPO PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os clones corretos foram confirmados através do seqüenciamento (Agencourt, Beverly, MA). Um clone correto foi utilizado como molde em uma reação de PCR subseqüente.

Os iniciadores a seguir foram utilizados para amplificar a alanina racemase: 5'-ataataggatcctcatccgcggccaacggcg-3' (SEQ ID NO: 27) e 5'-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3' (SEQ ID NO: 28). O produto da PCR foi digerido com as enzimas de restrição KpnI e BamH\. Es- tas enzimas cortam em sítios que foram engenheirados dentro dos iniciado- res. O produto da PCR digerido foi purificado em gel e ligado com pTrc99a que foi digerido com Kpnl e BamYW e subseqüentemente purificado em gel. A ligação foi transformada em células quimicamente competentes TOPIOF' e plaqueada em LB em placas suplementado com 50 pg/mL de canamicina. Os isolados foram verificados em relação aos insertos e vários isolados com um inserto foram confirmados como possuindo a seqüência correta (SEQ ID NO: 40) através da análise de seqüência (Agencourt, Beverly, MA).

A construção de pTrc99a/alanina racemase foi submetida à Mu- tagênese Direcionada ao Sítio ("SDM") utilizando o Stratagene (La Jolla, CA) Quick-Change Multi Site-Directed Mutagenesis kit. Os iniciadores mutagêni- cos eram os seguintes:

5'-gccggacgacacgcacattnnkgcggtcgtgaaggcgaacgcc-3' (SEQ ID NO: 29), 5'-gtgaaggcgaacgcctatggannkggggatgtgcaggtggcaagg-3' (SEQ ID N0:30), 5'-cctcccgcctggcggttgccnnkttggatgaggcgctcgctttaa-3' (SEQ ID NO:31), 5'-caaccaggcgaaaaggtgagcnnkggtgcgacgtacactgcgcag-3' (SEQ ID NO:32), 5'-gatcgggacgattccgatcggcnnkgcggacggctggctccgccg-3' (SEQ ID NO:33), 5'-gccatttggaaacgatcaacnnkgaagtgccttgcacgatcag-3' (SEQ ID NO:34) (n = qualquer nucleotídeo e k = g ou t).

Os resíduos para mutagênese foram selecionados através da análise da estrutura de cristal existente de alanina racemase de G. stearo- thermophilus. Resíduos de aminoácidos grandes localizados entre 5 e 10 Á do sítio ativo foram escolhidos.

Todos os seis iniciadores foram utilizados na reação de SDM que é ensinada no protocolo do fabricante. A reação de SDM foi transforma- da em XL-10 Gold de acordo com o protocolo do fabricante. A reação de transformação foi plaqueada em meio LB suplementado com 100 pg/mL de ampicilina. O caldo LB foi adicionado nas placas e as colônias foram raspa- das das placas. Foi permitido que as células ressuspensas crescessem a 37°C durante várias horas e os plasmídeos foram submetidos à miniprep utilizando o QIAquick miniprep. A biblioteca que sofreu mutagênese resultan- te foi então utilizada para transformar o organismo auxotrófico em relação ao triptofano CAG18455. A transformação foi plaqueada em meio mínimo M9 que foi suplementado com glicose, elementos traços, vitaminas, 100 μg/mL de ampicilina, 100 μΜ de IPTG e 3 mM de D-triptofano. Após vários dias de incubação a 37°C, as colônias cresceram. Estas colônias foram estriadas em LB (100 μg/mL de ampicilina). Os plasmídeos foram isolados destes isolados e forma transformados novamente em CAG18455. As células transformadas foram plaqueadas em LB contendo 100 μg/mL de ampicilina. Após as colô- nias isoladas formadas, estas foram estriadas em meio M9 com D-triptofano como descrito anteriormente. Todas as colônias pareciam crescer novamen- te, indicando que o crescimento era causado pela versão da racemase que sofre mutagênese. Não foi observado crescimento das células de controle.

Vários dos isolados foram analisados em relação à atividade in vitro. As células foram crescidas até uma OD6oo de aproximadamente 0,6 e induzidas com 100 μΜ de IPTG. As células foram incubadas a 37°C durante duas horas adicionais e foram coletadas por centrifugação. Os péletes de células foram armazenados a -80°C até o uso no dia seguinte. Os péletes de células foram descongeladas em gelo. As células foram rompidas com o reagente de Iise celular BugBuster (isento de amina primária) e Benzoase (Novagen). Os restos celulares foram removidos por centrifugação (-10.000 20 χ g durante 30 minutos a 4°C). O sobrenadante foi guardado como o extrato de células bruto.

O tampão de ensaio continha 50 mM de fosfato de potássio (pH 8,0), 10 μΜ de fosfato piridoxal, 0,01% de β-mercaptoetanol e 50 mM de D- ou L-triptofano. 200 μl de extrato foram adicinados por mL de ensaio. As amostras foram congeladas representando um ponto de tempo 0, assim co- mo, pontos de tempo de 30 minutos e durante a noite. As amostras foram centrifugadas, filtradas e transferidas para SRC para análise.

Tabela 9: Resultados de Ensaio Partindo de L-Triptofano

<table>table see original document page 67</column></row><table> Tabela 10: Resultados de Ensaio Partindo de D-Triptofano

<table>table see original document page 68</column></row><table>

A seqüência de DNA do gene da racemase neste isolado foi de- terminada (SEQ ID NO: 42) e foi observado que o isolado tinha três muta- ções. As mutações no isolado de proteína correspondente são as seguintes: M35C, F66E e Y354A (SEQ ID NO: 43). Uma mutação adicional (P197L) foi observada neste mutante. Esta é uma mutação espontânea e não fazia parte da mutagênese direcionada ao sítio.

A racemase submetida à mutagênese foi clonada em pET30 pa- ra expressão e purificação. Os iniciadores a seguir foram utilizados para a amplificação através da PCR do gene da racemase partindo da construção pTrc99a: 5'-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3 (SEQ ID NO: 35) e 5'-gcggcgccatggacgagtttcaccgcg-3' (SEQ ID NO: 36). O produto da PCR foi digerido com Nco\ e BamH\, purificado em gel e ligado com pET30 que foi digerido com Nco\ e SamHI e subseqüentemente purificado em gel. A ligação foi transformada em células quimicamente competentes TOP10 (Invi- trogen, Carlsbad, CA). Os isolados provenientes da transformação foram verificados em relação aos insertos. Os plasmídeos com um inserto foram submetidos ao seqüenciamento (Agencourt, Beverly, MA). Os isolados com a seqüência correta foram transformados em BL21 ADE3 ou BL21 ADE3 pLysS para expressão e purificação. A nova construção é denominada pET30Trp racemase.

(6) Purificação da Triptofano Racemase

Uma cultura obtida durante a noite com a construção pET30Trp racemase foi subcultivada em meio LB fresco com os antibióticos apropria- dos (50 pg/mL de canamicina e 20 pg/mL de cloramfenicol) e crescida até uma OD6OO -0,6 (37 0C com aeração). A expressão foi induzida com 100 μΜ de IPTG e a incubação foi continuada a 37 0C com aeração durante 2 horas. As células foram coletadas por centrifugação e armazenadas a -80 0C até o uso. O pélete de células foi descongelada em gelo e as células foram Iisadas utilizando o BugBuster Primary Amine Free Cell Lysis Reagent e Benzoase Nuclease (Novagen, Madison, Wl). Os restos celulares foram removidos por centrifugação e o sobrenadante foi utilizado como o extrato de proteína bru- ta. O extrato de proteína bruta foi filtrado utilizando um filtro de seringa de 0,45 μιτι e aplicado em uma coluna HisBind (Novagen, Madison, Wl) que foi pré-equilibrada de acordo com as instruções do fabricante. A coluna foi lava- da e a proteína foi eluída como ensinado no protocolo do fabricante. A prote- ína purificada foi dessalinizada com uma coluna PD-10 (GE Healthcare, Pis- cataway, NJ) utilizando 50 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 μΜ de piri- doxal-5'-fosfato ("PLP") como o eluente. A proteína dessalinizada foi concen- trada utilizando concentradores por centrifugação Amicon (Millipore, Billerica, MA). A alanina racemase do tipo selvagem foi purificada como descrito ante- riormente.

(7) Ensaio da Triptofano Racemase

A racemase purificada foi testada em vários ensaios. Em um en- saio, a produção de peróxido de hidrogênio por uma D-aminoácido oxidase foi utilizada como um sistema de detecção. O substrato D-triptofano para a oxidase foi produzido partindo de L-triptofano através da enzima racemase isolada como descrito neste exemplo. O ensaio incluía 0, 1, 10, 25, 50, 100, 200 pg de enzima por ensaio, 50 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 μΜ de PLP, 50 mM de L-triptofano. Os ensaios foram incubados 1 hora a 37 °C. Após a incubação, 100 mg/mL de D-aminoácido oxidase (AOD-101 BioCa- talytics, Pasadena, CA) e 0,5 mM de FAD foram adicionados a uma mistura de reação. A produção de peróxido de hidrogênio foi medida utilizando o kit de reagentes Amplex Red (Molecular Probes, Eugene, OR) e um Perkin El- mer HTS 7000 Plus BioAssay Reader Fluorometer (Wellesley, MA). Os da- dos do ensaio são resumidos nas Tabelas 11 e 12 abaixo: Tabela 11: Curva Padrão

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Tabela 12: Resultados do Ensaio

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Os resultados do ensaio indicam que a racemase mutante é ne- cessária para a produção de peróxido de hidrogênio. A quantidade de peró- xido de hidrogênio produzida aumentou quando a quantidade da racemase mutante adicionada era maior.

A atividade da racemase (do tipo selvagem e mutante) sobre a alanina foi analisada. O tampão de reação continha: 100 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 μΜ de PLP1 50 mM de L-alanina, 12 µg/mL de racemase do tipo selvagem ou 94 pg/mL de racemase mutante. As reações foram in- terrompidas com 1 volume de 0,5 M de ácido fórmico e analisadas por LC/MS/MS utilizando uma coluna Chirobiotic como descrito no Exemplo 1.

Os dados do ensaio são resumidos na Tabela 13 abaixo. Tabela 13

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A racemase que sofreu mutação parece manter a atividade so-

bre o substrato original, alanina.

A atividade da racemase que sofreu mutação foi testada utili- zando um de L-triptofano, D-triptofano, L-alanina e D-alanina como o subs- trato. O tampão de reação continha: 100 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 μΜ de PLP1 50 mM de substrato, 94 pg/mL de racemase mutante. As re- ações foram interrompidas com 1 volume de 0,5 M de ácido fórmico e anali- sadas como descrito no Exemplo 1. Os ensaios com alanina como o substra- to foram incubados à temperatura ambiente (-22 °C) e os ensaios com trip- tofano como o substrato foram incubados a 37 °C. Os resultados estão re- sumidos na Tabela 14 abaixo.

Tabela 14

<table>table see original document page 71</column></row><table> <table>table see original document page 72</column></row><table>

A enzima racemase funciona em ambas as direções e mantém a atividade do tipo selvagem.

A racemase mutante foi testada em vários substratos. A enzima utilizada no ensaio foi purificada como discutido anteriormente. As condições de ensaio eram as seguintes:

50 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 μΜ de PLP, 25 mM de substrato, 40 pg/mL de racemase mutante. As reações foram interrompidas com 1 volume de 2 M de ácido fórmico e analisadas como descrito no E- xemplo 1. Os ensaios foram incubados a 37°C. Os resultados (em ppm de D-isômero produzido partindo do L-isômero) estão resumidos na Tabela 15 abaixo (nd = nenhum detectado).

Tabela 15

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É provável que esta racemase racemise outros aminoácidos em adição aos testados aqui.

Embora a racemase que sofreu mutação pareça ter atividade sobre uma ampla variedade de aminoácidos, não parece ser qualquer ativi- dade de racemase sobre a monatina. A enzima utilizada no ensaio foi purifi- cada como discutido anteriormente. As condições de ensaio eram as seguin- tes: 100 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 μΜ de PLP1 50 mM de mona- tina, 1 mg/mL de racemase mutante. Os ensaios foram incubados a 37 0C. Os ensaios foram analisados através da derivatização por FDAA como des- crito no Exemplo 1. Os resultados do ensaio são mostrados na Tabela 16 abaixo.

Tabela 16

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Mesmo após 18 horas não havia conversão evidente de S1S monatina em S1R monatina ou de R,R monatina em R,S monatina utilizando a racemase mutante.

A enzima ideal tem atividade sobre o triptofano, mas pouca ou nenhuma atividade sobre outros aminoácidos ou compostos similares a ami- noácidos, particularmente monatina. Se a enzima tiver atividade significativa sobre a monatina, a enzima pode ser submetida à mutagênese para diminuir a atividade sobre a monatina e/ou sobre o glutamato, enquanto a atividade sobre o triptofano é mantida inalterada ou em um nível alto o suficiente para que a enzima seja útil na produção de monatina. As técnicas que podem ser utilizadas para a mutagênese incluem, mas não estão limitadas à PCR pro- pensa a erros, à mutagênese direcionada ao sítio, à modelagem para identi- ficar alvos de mutagênese direcionada ao sítio (sítios que podem estar en- volvidos na ligação ao substrato), à passagem através de cepas mutagêni- cas e ao embaralhamento do DNA.

(8) Produção de Monatina pela Triptofano Racemase

Os seguintes foram adicionados por 1 mL de mistura de reação: aproximadamente 50 pg de aldolase da SEQ ID NO: 22, 16 mg/ml_ de tripto- fano racemase purificada, 4 mM de MgCI2, 50 mM de L-triptofano, 0,5 mg de D-aminotransferase (purificada de Bacillus sphaericus como descrito no E- xemplo 14), 100 mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5 e 0,05 mM de PLP. Devido ao fato de que o piruvato é um receptor de amino aceitável para a D-aminotransferase de especificidade ampla, o α-cetoglutarato não foi utilizado. Foi incluído um controle em que o D-triptofano era o substrato de partida e não foi incluída a racemase. As a- mostras foram incubadas 2 horas ou durante a noite (20 horas) a 30°C com agitação suave. As amostras foram analisadas como descrito no Exemplo 1.

Os resultados do ensaio são mostrados abaixo na Tabela 17 (nd = nenhum detectado).

Tabela 17

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A Tabela 17 mostra a produção de R,R monatina utilizando uma triptofano racemase para converter o substrato de L-triptofano em D- triptofano. A produção de R,R monatina partindo de D-triptofano, sem utilizar a triptofano racemase, foi utilizada como um controle. A porcentagem de R,R monatina produzida é quase a mesma com L- ou D-triptofano como o mate- rial de partida. Este resultado indica que a racemase não possui atividade detectável na catálise da racemização da R,R monatina. (9) Isolamento das Alterações de Aminoácidos Chaves

Foram criados vários produtos da reversão da alanina racemase que sofreu mutagênese. Os produtos da reversão foram produzidos através da mutagênese direcionada ao sítio utilizando o QuikChange Multi Site- Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) como descrito anterior- mente utilizando os iniciadores a seguir: 5'-gccatttggaaacgatcaactatgaagtgccttgcacgatcag-3' (SEQ ID NO: 37)

5'-ctcccgcctggcggttgccttcttggatgaggcgctcgctttaag-3' (SEQ ID NO: 38)

5'gccggacgacacgcacattatggcggtcgtgaaggcgaacgcc-3' (SEQ ID NO: 39)

Os iniciadores foram utilizados individualmente e em combina- ção, em uma tentativa de produzir as seis combinações possíveis das três mutações nas posições 35, 66 e 354 (numeração baseada na seqüência de aminoácidos derivada de ATCC 12980). Várias combinações das mutações foram criadas e testadas em relação à atividade de triptofano racemase. As condições de ensaio eram as seguintes: 50 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 μΜ DE PLP, 30 mM DE L-Triptofano, 100 pg/mL de enzima. Os en- saios foram incubados a 37 0C durante o período de tempo especificado. As amostras foram analisadas como descrito no Exemplo 1.

Os resultados dos ensaios estão resumidos na Tabela 18 abaixo (nd = nenhum detectado).

Tabela 18

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Lista de mutações:

MF1: N41S (mutação espontânea), P197L, Y354A

MF2: F66E, P197L, Y354A

MY1: M35C, F66E, P197L

Racemase que sofreu mutagênese: M35C, F66E, P197L, Y354A

Os resultados indicam que a mutação Y354A é necessária para a atividade sobre o triptofano. Quando esta mutação era ausente não havia atividade detectável sobre o triptofano.

Uma alanina racemase pode ser adicionalmente convertida em uma racemase de especificidade mais ampla através de métodos aleatórios tal como a PCR mutagênica, a passagem através de cepas mutagênicas ou outros métodos conhecidos pelos versados na técnica. Uma evolução mais centralizada da alanina racemase pode ser focalizada nos resíduos do sítio ativo, incluindo Lys129, Met134 e os resíduos que incluem e entre Gly283 e Trp288 (numeração de Geobacillus stearothermophilus).

Exemplo 5

Método de Seleção para a Verificação de Piruvato Aldolases em E. coli Re- combinante

Muitos dos processos descritos nos Exemplos 4(5), 9 e 10(3j e mostrados nas figuras 1-9, funcionarão de forma ótima com uma aldolase que produz preferencialmente R-MP partindo de indol-3-piruvato e piruvato. Portanto, são descritos métodos para isolar e testar clones que contêm ácido nucléico que codifica uma aldolase que produz preferencialmente R-MP. As cepas de Escherichia coli que requerem suplementação com piruvato quan- do cultivadas em meio mínimo M9 com ribose como a fonte de carbono fo- ram descritas anteriormente. Ponce, E. e outros, "Cloning of the two pyruva- te kinase isoenzymes structural genes from Escherichia coli.: The relative roles of these enzymes in pyruvate biosynthesis", J. Bacteriol. 177:5719- 5722, (1995). O genótipo relevante da cepa é: LpykA ApykF. O "nocaute" duplo foi produzido através do método de Datsenko e Wanner, Proceed. Na- tl. Acad. Sei. USA 97:6640-6645, (2000). Estas cepas podem formar uma base para uma verificação de aldolase que produz piruvato e para selacionar aldolases que são mais ativas sobre um estereoisômero específico de mona- tina, um estereoisômero particular de precursor de monatina ou um análogo de monatina ou um precursor de monatina. Um análogo de precursor de monatina inclui compostos que foram identificados como substratos para ProA aldolases ou KHG aldolases, tal como 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato, 4-carbóxi-4-hidróxi-2-oxoadipato, 4-hidróxi-4-metil-2-oxoadipato ou outros compostos ricos em carboxila que são convertidos em piruvato em uma rea- ção de aldol. Um exemplo de um análogo de monatina que pode ser utiliza- do é o ácido 4-hidróxi-4-metil glutâmico, que pode ser facilmente transami- nado em 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato (um substrato de ProA) por amtno- transferases nativas em uma célula de teste.

Clonagem

Os iniciadores a seguir foram utilizados para gerar o "nocaute" de pykA:

5'-ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACAAAAATCGTTACCACGTT AGGTGTA GGCTGGAGCTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 3) e

5'-CTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACCATA TGA- ATATCCTCCTTAG-3' (SEQ ID NO: 4).

Os iniciadores a seguir foram utilizados para gerar o "nocaute" de pykF:

5'-AGGACGTGAACAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCGCTCGGTACCAGCATA TGAATATCCTCCTTAG-3' (SEQ ID NO: 5) e

5'-ATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGACCGAAAACCGGTGTA GGCTGGAGCTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 6).

Uma reação de PCR foi realizada com pKD3 ou pKD4 como molde utilizando protolocos padronizados. O produto da PCR foi submetido à eletroporação para dentro de uma cepa de E. coli que expressa o sistema de recombinação homóloga Iambda red. O produto da PCR tinha homologia com pykA ou pykF e se recombinava dentro do cromossomo nestes sítios. Quando ocorria o "crossover" duplo, a progênie resultante carregava um ge- ne pykA ou pykF deletado e um marcador de resistência a antibiótico. Os genes deletados com os marcadores de resistência a antibiótico foram transduzidos para dentro de uma cepa de E. coli (MG 1655) técnicas de transdução P1 padronizadas. Análises das Cepas

O "nocaute" duplo foi testado em relação ao crescimento em meio mínimo (sais M9) (Difco) suplementado com solução de vitaminas de Balch1 solução de elementos traços modificados de Balch (Balch, W.E. e outros, "Metanogens: reevaluation of a unique biological group", Microbiol. Rev. 43:260-296, (1979)) e 0,4% de D-ribose. Não foi observado crescimen- to para o mutante duplo a não ser que 5 mM de piruvato também fossem incluídos no meio. MG1655 do tipo selvagem cresceu no meio acima tanto na presença quanto na ausência de piruvato. O "nocaute" duplo foi testado em relação ao crescimento no meio mínimo descrito anteriormente suple- mentado com 0,4% de glicose ao invés de ribose. O crescimento neste meio era similar ao observado com a cepa do tipo selvagem. Com este meio, o piruvato pode ser produzido partindo de glicose através do produto do gene ptsl (a enzima do sistema de fosfotransferase que produz piruvato partindo de fosfoenolpiruvato e transfere o fosfato para glicose). A cepa com "nocau- te" duplo foi também testada em relação ao crescimento utilizando o meio que é descrito anteriormente suplementado com 0,4% de L-arabinose ou 0,4% de D-xilose ao invés de ribose. O piruvato não é produzido partindo do crescimento nestes substratos contendo carbono 5 (sem PTS). O "nocaute" duplo não crescia sob estas condições a não ser que fosse suplementado com 5 mM de piruvato, enquanto que a cepa do tipo selvagem crescia nor- malmente tanto na presença quanto na ausência de piruvato.

O gene da proA aldolase de Comamonas testosteroni descrito no Exemplo 2 do WO 03/091396 A2 (clonado em pET30 Xa/LIC) e o óperon dos genes aspC/proA descrito no Exemplo 3 do WO 03/091396 A2 (clonado em pET30 Xa/LIC e pET32) foram subclonados em pBAD-TOPO utilizando o kit de expressão pBAD TOPO TA (Invitrogen).

A expressão dos(s) gene(s), nestas construções, é regulada pelo promotor que pode ser induzido araBAD. Na presença de arabinose (por exemplo, 0,4%) e IPTG, o(s) gene(s) é(são) expresso(s). A não ser que seja suplementada com piruvato ou uma fonte de piruvato, a cepa não crescerá em meio mínimo. O meio pode ser suplementado com monatina, precursor de monatina ou um análogo de monatina ou precursor de monatina. As fai- xas típicas de substrato utilizadas na literatura são de 0,5-5 mM. A ProA al- dolase pode, por exemplo, converter o precursor de monatina em piruvato e indol-3-piruvato fornecendo à cepa uma fonte de piruvato e permitindo o crescimento em meio mínimo com 0,4% de arabinose. A construção que ex- pressa ambos os genes proA e aspC pode converter a monatina no precur- sor de monatina e o precursor de monatina em piruvato e indol-3-piruvato. Adicionalmente, a aminotransferase pode converter indol-3-piruvato em L- triptofano e complementar uma auxotrofia em relação ao triptofano. Este sis- tema é utilizado para selecionar aldolases e para verificar aldolases que são mais ativas sobre um estereoisômero de monatina específico, um estereoi- sômero específico de precursor de monatina ou um análogo de monatina ou precursor de monatina. Por exemplo, se a evolução direcionada foi realizada em qualquer uma das aldolases divulgadas no Exemplo 2 do WO 03/091396 A2, um ensaio de placas utilizando meio contendo o precursor R ou S de monatina é utilizado para comparar a especificidade enanciomérica da enzi- ma mutante resultante. Se o crescimento ocorrer nas placas contendo o pre- cursor R de monatina e pouco ou nenhum crescimento ocorrer na placa con- tendo o precursor S de monatina, a aldolase tem uma especificidade por substratos que contêm a quiralidade R no sítio de reação.

Foram feitas placas com meio mínimo M9 contendo 1x solução de vitaminas de Balch e solução de elementos traços modificados de Balch. Balch, W.E. e outros, "Metanogens: reevaluation of a unique biological group". Microbioi Rev. 43:260-296, (1979). A glicose ou a arabinose foi in- cluída como a fonte de carbono (0,4% p/v) e as placas foram suplementadas com 5 mM de monatina (mistura racêmica de R,R; S,S) que foram dissolvi- dos em 20 mM de tampão fosfato de potássio (pH 8,0) ou um volume equi- valente de tampão fosfato de potássio sem monatina. O crescimento é re- sumido na Tabela 20 abaixo. Tabela 20

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É esperado que a seleção possa ser otimizada através do con- trole dos níveis de ProA e AspC, do aumento da captação de monatina, da utilização do precursor de monatina no lugar da monatina (neste caso a ami- notransferase não precisaria estar presente) ou da utilização de um análogo menos hidrofóbico da monatina tal como os descritos anteriormente. Os mé- todos para aumentar a captação da monatina incluem a adição de misturas de aminoácidos, a adição de aminoácidos específicos e o uso de detergen- tes, antibióticos, análogos de antibióticos ou enzimas que ajudam a permea- bilizar a parede celular e a adição de uma pequena quantidade de piruvato para permitir o crescimento no caso da aldolase não poder fornecer piruvato suficiente para sustentar o crescimento. O nonapeptídeo Polymyxin B (Dixon e Chopra, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29.781-788 (1986)) e microcystin RR (Dixon e outros, FEMS Microbiology Letters 250:167-170 (2004)) foram descritos como agentes que permeabilizam a membrana ex- terna de E. coli.

É esperado que outros sistemas de promotores/plasmídeos pos- sam ser utilizados neste sistema de seleção com resultados equivalentes. Os exemplos incluem os sistemas de promotor T7 e promotores que podem ser induzidos por IPTG tais como tace lac.

Os genes aspC e proA foram clonados no vetor de expressão pTrc99a (Amersham, Piscataway, NJ). O vetor resultante foi transformado nos organismos auxotróficos em relação ao triptofano CAG18455 ou CAG18579 (vide o Exemplo 4 para as descrições das cepas). Os transfor- mantes foram plaqueados em meio mínimo M9 com 0,1 mM de IPTG e 5 mM de monatina. Após 3 dias a 37 °C, as cepas com os plasmídeos contendo o óperon formaram colônias, enquanto que as cepas parentais não pareciam crescer. Adicionalmente, o crescimento era dependente da presença de IPTG indicando que a expressão do óperon era necessária para o crescimento. Neste estudo de complementação, o óperon aspC/proA produzia MP partin- do de monatina e indol-3-piruvato partindo de MP. O indol-3-piruvato podia então ser convertido em L-triptofano permitindo que os organismos auxotró- ficos em relação ao triptofano crescessem em meio mínimo M9.

Vários organismos potenciais podem ter a aldolase específica a R e podem ser testados como descrito anteriormente. A presença de R1R- monatina foi detectada nos sobrenadantes de cultura de Corynebacterium glutamicum. Isto sugere a presença de uma enzima que é capaz de produzir o precursor R da monatina. Adicionalmente, a presença de vários isômeros de monatina foi detectada em extratos isentos de células de Sinorhizobium meloti utilizando cromatografia em fase inversa, indicando novamente a pre- sença possível de uma aldolase ou uma aminotransferase capaz de produzir um estereoisômero R de precursor de monatina.

Pseudomonas straminea (Pseudomonas ochraceae NGJI), Sino- rhizobium meliloti, Sphingomonas sp. LB126, Arthrobacter keyseri 12B, Yer- sinia pestis cepa C092, Bradyrhizobium japonicum str. USDA 110, Sphin- gomonas (Pseudomonas) paucimobiiis, Yersinia pestis KIM, Ralstonia metal- lidurans CH34, Yersinia pseudotuberculosis IP 32953, Rhizobium legumino- sarum biovar viciae rhiz23g02-p1k_1009_341 (Sanger lnstitute), Novosphingo- bium aromaticaivorans DSM 12444, Pseudomonas putida KT2440, Magne- tospirillum magnetotacticum MS-1, Rhodopseudomonas palustris CGA009, Xanthomonas campestris ATCC-33913, Xanthomonas axonopodis citri 306 e Streptomyces avermitilis MA-4680 possuem homólogos que foram descober- tos através da análise de BLAST utilizando proA (Comamonas testosteroni) como o molde. Vide o Pedido de Patente U.S. N° 20050282260. Estes orga- nismos podem ser utilizados como uma fonte de DNA e podem ser testados na seleção mencionada anteriormente.

Os organismos capazes de crescer em ácido gálico, ácido sirín- gico, protocatechuato, ftalato, parahidroxibenzoato e fluoreno podem ter uma aldolase que pode produzir monatina e possuem potencial para a seleção mencionada anteriormente. Os organismos a seguir metabolizam o protoca- techuato através da via da 4,5-dioxigenase e podem ter uma aldolase que pode ter utilidade: Bordetella bronchiseptica RB50, Bordetella parapertussis 12822, Klebsiella pneumoniae MGH78578, Magnetospirillum magnetotacti- cum MS-1, Rhodopseudomonas palustris CGA009, Sphingomonas aromati- caivorans F199, Xanthomonas axonopodis citri 306, Xanthomonas campes- tris ATCC 33913. E os organismos a seguir degradam o protocatechuato através da via da 3,4 dioxigenase e possuem uma aldolase que pode ter utilidade: Acinetobacter calcoaceticus ADP1, Acinetobacter species ATCC 33305, ADP1, Agrobaeterium tumefaeiens C58, Azotobaeter vinelandii AvOP, Brady- rhizobium japonieum str. USDA 110, Bradyrhizobium japonieum tr. USDA 438, Brueella abortus, Brueella melitensis 16M, Brueella melitensis suis 1330, Burkholderia eepacia J2315, Burkholderia fungorum LB400, Burkhol- deria pseudomallei K96243, Corynebaeterium effieiens YS-314, Corynebac- terium glutamicum ATCC-13032, Mesorhizobium Ioti MAFF303099, Myco- bacterium avium subsp. paratuberculosis str. k10, Pseudomonas aeruginosa PA01, Pseudomonas fluoreseens PfO-1, Pseudomonas fIuorescens SBW25, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas syringae pv. tomate str. DC3000, Ralstonia solanaeearum, Rhodoeoeeus sp. cepa I24 (IG-15), Sino- rhizobium meliloti 1021, Streptomyees avermitilis MA-4680, Streptomyees coelicolor A3 (2), Xanthomonas axonopodis citri 306, Xanthomonas campes- tris ATCC-33913.

Exemplo 6

Mutaqênese Direcioada ao Sítio de HEXAspC Resumo Experimental

Foi observado que um hexamutante de E. eoli AspC (HEXaspC) tem melhor atividade quando comparado com AspC para a produção de S,S monatina, como descrito no Exemplo 6 do WO 03/091396 A2. HEX (número de acesso:/AHFA gi: 127190) contém as mutações a seguir de AspC (nume- ração de E. eoli): V35L, K37Y, T43I, N64L, T104S e N285S. Com base na análise estrutural e nos relatos da literatura (Rothman, S. e Kirsch, J., J. MoL BioL 327:593-608, (2003); Rothman, S. e outros, Protein Science 13:763- 772, (2004)), foram criados mais 5 mutantes que eram esperados que au- mentassem a atividade cinética em relação aos substratos utilizados na via de produção de monatina: L-triptofano, S-MP ou ambos. Dois dos mutantes aumentavam as taxas de transaminação tanto em relação ao triptofano quanto à S,S monatina. Dois dos mutantes exibiam uma maior estereossele- tividade para a formação de S,S monatina enquanto um era menos estere- osseletivo. Com base nisso, é esperado que uma D-aminotransferase de especificidade ampla de Bacillus sp. com mutações similares seria útil como a D-aminotransferase nas vias de R1R monatina mostradas na figura 3 e descritas no Exemplo 4(4). Um dos mutantes (HEXaspCP9T/R122G) tinha maior atividade em relação à transaminação do L-triptofano, mas a atividade na produção de S1S monatina ou na transaminação de S,S monatina era significativamente menor. Assim, é esperado que esta enzima seja útil na primeira etapa das vias de produção de R,R monatina mostradas nas figuras 1, 2, 4, 5, 6, 7 e 8 e descritas nos Exemplos 9 e 10(3). Em geral, uma amino- transferase que possui atividade similar àquela de AspC sobre o L-triptofano e atividade limitada sobre R-MP e S-MP, seria útil para os processos descri- tos nas figuras 1, 2, 4, 5, 6, 7 e 8.

Métodos e Materiais

O gene HEX clonado em pUC19 foi fornecido pelo Professor J. F. Kirsch (Department of Molecular and Cell Biology, University of Califórnia, Berkeley, Berkeley, CA 94720-3206) e utilizado como o molde para a clona- gem do gene em pET23a. Vide Onuffer, J.J. e Kirsch, J.F., "Redesign of the substrate specificity of Escherichia eoli aspartate aminotransferase to that of Eseheriehia eoli tyrosine aminotransferase by homology modeling and site- directed mutagenesis", Protein Science 4:1750-1757 (1995). Vide também o número de acesso do NCBI 1AHF_A Gl:1127190 (seqüência de aminoáci- dos de HEX). Os iniciadores a seguir foram planejados para a clonagem do gene HEX no vetor pET23a (Novagen, Madison, WI):

Iniciadores de HEXaspO. N term: 5'-GCGGAACATATGTTTGAGAACATTACCGCC-3'(SEQ ID NO: 7); C term: 5'-ATAACCGGATCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (SEQ ID NO: 8).

O protocolo de PCR a seguir foi utilizado para a amplificação do gene: Em uma reação de 100 μL, 50 ng de DNA molde, 1,0 μΜ de cada ini- ciador, 0,2 mM de cada dNTP, 1 U de Pfu Turbo Polimerase (Stratagene; LaJoIIa, CA) e 1X tampão de Cloned Pfu foram adicionados. O programa do termociclador utilizava um início a quente de 94°C durante 5 minutos; se- guidos por 25 ciclos de uma etapa de desnaturação a 94 0C (30 s), uma eta- pa de anelamento a 55°C (1 min.), uma etapa de extensão a 72°C (2 min.) e finalmente uma etapa de término a 72°C (7 min.). O produto da PCR puri- ficado foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e NdeI (New England Biolabs). O produto da PCR foi ligado em pET23a que também foi digerido com NdeI e BamHI, utilizando o Roche Rapid DNA Ligation kit. As ligações dessalinizadas foram submetidas à eletroporação para dentro de células DH10B de E. coli utilizando um sistema Bio-Rad Gene Pulser II, de acordo com os protocolos do fabricante. O DNA Miniprep foi preparado utilizando um Qiagen Spin Miniprep kit e foi utilizado como um molde para as reações de mutagênese. O plasmídeo foi transformado em células BL21 de E coli (DE3) de acordo com os protocolos do fabricante (Novagen).

Acredita-se que o resíduo de triptofano na posição 130 é impor- tante para as interações de empilhamento com o anel de piridoxila, mas pa- rece ainda ser uma fonte de impedimento estérico com o substrato do pre- cursor S da monatina ("S-MP"), com base nas observações de modelagem de proteína. Portanto, um aminoácido com uma cadeia lateral hidrofóbica menor (fenilalanina) foi utilizado para substituir o triptofano. O resto das mu- tações se baseava nos dados de cinética na literatura, embora novas combi- nações de mutações desejáveis fossem criadas. Todas as mutações em HEXaspC, com a exceção de W130F, foram feitas utilizando o Stratagene Multi-Change kit seguindo as instruções do fabricante. A mutação W130F foi produzida utilizando o Stratagene QuikChange kit de acordo com as instru- ções do fabricante com a única exceção sendo que a temperatura de exten- são para a reação de PCR foi diminuída para 66°C. Os iniciadores para o multichange kit foram planejados utilizando a ferramenta de projeto de inici- adores do QuikChange multikit na <www.stratagene.com>, exceto para os iniciadores para a mutação isolada W130F.

As seqüências dos iniciadores são listadas na Tabela 21 abaixo: Tabela 21

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a Significa um iniciador que foi modificado através de fosforilação a 5' Expressão de Genes Mutantes HEXaspC e Análise da Atividade Enzimática

Culturas líquidas (5 mL) do Novagen Overnight Express™ Auto- induction System 2 (Ns de Catálogo 71366-3; soluções 1-6) foram inoculadas partindo de placas frescas ou de estoques em glicerol congelados das cepas a seguir:

E. coli BL21(DE3)::HEXaspCpET23a E. coli BL21 (DE3)::HEXaspCW130FpET23a E. coli BL21(DE3)::HEXaspCT156ApET23a E. coli BL21 (DE3)::HEXaspCP9T/T156ApET23a E. coli BL21 (DE3)::HEXaspCP9T/R122GpET23a E. coli BL21 (DE3)::HEXaspCR122G/T156ApET23a

As culturas foram incubadas a 37°C a 230 rpm durante 6 - 8 h. A OD60O de cada cultura foi determinada e o volume de cultura necessário para a obtenção de uma OD6oo de 0,03-0,05 em 25 mL foi calculado. Os vo- lumes calculados de cada Iiquid cultura foram transferidos para frascos con- tendo 25 mL do mesmo meio. O Overnight Express™ Autoinduction System 2 é um meio quimicamente definido completo para a expressão em altos ní- veis com sistemas de expressão que podem ser induzidos por IPTG que uti- liza Iactose como o agente indutor e não requer o monitoramento do cresci- mento celular. As culturas do Overnight Express foram incubadas a 30°C com agitação a 230 rpm durante 18 h. As células foram coletadas por centri- fugação e lavadas uma vez com 50 mM de MOPS gelado, pH 7,0. As células foram então Iisadas utilizando o Bugbuster™ Extraction Reagent (isento de amina primária) (N2 de Catálogo da Novagen 70923-3) contendo 1 pL/mL de nuclease benzonase (N2 de Catálogo da Novagen 70746-3), 5 pL/mL de Pro- tease Inhibitor Cocktail Set Il (Ns de Catálogo da Novagen 539132) e 0,33 μL/10 mL de r-Lysozyme (Ns de Catálogo da Novagen 71110-3) seguindo o protocolo recomendado pela Novagen. Após a incubação a 25 0C durante 15 min. com agitação suave, os restos celulares de cada suspensão foram pele- tizados por centrifugação a 21 .OOOg durante 15 min. a 4 °C. O sobrenadante foi decantado cuidadosamente e analisado como o extrato isento de células. As frações de corpos de inclusão foram isoladas através da suspensão das frações de restos celulares em 30% de Bugbuster™ Extraction Reagent (i- sento de amina primária), da centrifugação a 21.000 χ g durante 10 min.; da suspensão dos péletes centrifugadas em 10% de Bugbuster™ Extraction Reagent (isento de amina primária), da centrifugação novamente para isolar os péletes lavados.

Os extratos isentos de células e as frações de corpos de inclu- são foram analisados em relação à expressão de proteína por SDS-PAGE em géis com gradiente de 4-15% (Bio-Rad N2 161-1104). Para as amostras de extrato celular, vinte microgramas de proteína solúvel foram carregados em cada faixa do gel (pré-misturados com 1X tampão de carga de proteína e aquecidos a 95°C durante 5 min.). As frações de corpos de inclusão foram dissolvidas em 1X tampão de carga de proteína (0,2 mL), aquecidas durante 10 min. a 95°C e 5 μΙ_ de cada solução foram carregados por faixa do gel. A quantidade de cada mutante HEX em comparação com a proteína solúvel total carregada em cada faixa foi calculada através da análise de intensidade da banda utilizando a ferramenta Labworks Biolmaging 1D-gel (UVP, Inc. Upland, CA) e é relatada na Tabela 22 abaixo: Tabela 22

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A análise dos géis mostrou que o mutante HEXaspCRI 22A/T156A era a única proteína que era encontrada em quantidades substanciais na forma de corpos de inclusão. A proteína HEXaspCP9T/T156A forneceu o nível mais alto de expressão, aproximadamente 90% melhor que o da proteína HEXaspC. Em contraste, as proteínas W130F, T156A e P9T/R122G eram expressas em concentrações menores que a HEXaspC.

A atividade das proteínas mutantes HEXaspC para a produção de S,S-monatina foi medida utilizando as condições de reação a seguir: Ca- da reação de 1 mL continha 50 mM de TAPS, pH 8,2, 4 mM de MgCI2, 3 mM de fosfato de sódio, pH 8,0, 200 mM de piruvato de sódio (pH ajustado em 8), 5 mM de α-cetoglutarato (pH ajustado em 8), 50 mM de triptofano, 0,05 mM de 3-fosfato piridoxal, 50 pg/mL de ProA aldolase (adicionada na forma de um extrato isento de células) e concentrações variáveis (aproximadamen- te 50 e 500 pg/mL) de aminotransferase (adicionada na forma de um extrato isento de células). A água desaerada foi utilizada para preparar as soluções estoque e para ajustar o volume das misturas de reação em 1,0 mL. O fosfa- to piridoxal foi ajustado logo antes da adição das enzimas. Os tubos de rea- ção foram incubados a 309 C com agitação suave durante 4 h. As amostras (0,01 mL) foram retiradas 1, 2 e 4 h após a adição das enzimas, filtradas e analisadas por LC/MS/MS, como descrito no Exemplo 1. A produção de mo- natina foi normalizada com base na quantidade de aminotransferase presen- te nas reações.

Sob as condições destes ensaios, a HEXaspC e a HE- XaspCTI 56Α produziram a maior quantidade de monatina total por mg de aminotransferase enquanto que a proteína P9T/R122G produziu a menor, seguida pela HEXaspCWI30F. As enzimas HEXaspCWI30F e P9T/R122G exibiam a maior estereosseletividade em relação ao S-MP (mais de 98% de S,S-monatina), mesmo quando altas concentrações de enzima foram utiliza- das (mais de 300 pg/mL). A porcentagem de produto de S,S-monatina dimi- nui até menos que 90% nas reações enzimáticas contendo a enzima P9T/T156A em alta concentração. Os outros mutantes exibiam uma estere- osseletividade ao produto muito similar à do mutante HEXaspC original (a- proximadamente 95% de S,S-monatina). A análise do produto da reação contendo a enzima HEXaspC utilizando o reagente de derivatização FDAA descrito no Exemplo 1 mostrou que o segundo estereoisômero formado e R,S-monatina.

Análise da Atividade de Triptofano e Monatina Aminotransferases

Os mutantes foram testados em relação à atividade de transa- minação utilizando S,S monatina e L-triptofano como os substratos. A ativi- dade da aminotransferase foi medida através do acompanhamento da for- mação do co-produto da reação, o glutamato, por HPLC com derivatização em coluna pós-OPA como descrito no Exemplo 1. A mistura de reação con- tinha, em 1,0 mL, 100 mM de tampão HEPPS, pH 8,0, 20 mM de alfa- cetoglutarato, 0,08 mM de fosfato piridoxal, 25 mM de triptofano ou S,S mo- natina e enzima (fornecida como 2,5 mg de proteína em extratos celulares). Todos os componentes exceto a enzima foram misturados juntos. A enzima foi adicionada para iniciar a reação e a solução de reação foi incubada a 30 °C (agitação suave) durante 90 min.. As reações foram feitas em duplicata, com controles negativos em que não era adicionada enzima. A reação foi interrompida através da adição de 10% de ácido fórmico (concentração fi- nal), a mistura foi centrifugada a 21.000 rpm e o sobrenadante foi removido cuidadosamente e filtrado. Os dados foram corrigidos em relação aos níveis de fundo de glutamato e em relação à diluição da adição de ácido para pre- cipitar as proteínas, então normalizados pela quantidade de aminotransfera- se mutante adicionada. Quando o triptofano foi utilizado como um substrato, a HEXaspC produziu 13,0 mM de glutamato por mg de aminotransferase por hora. A atividade relativa, expressa na forma de uma porcentagem, dos mu- tantes é como a seguir: HEXaspCWI30F (156%), HEXaspCTI56A (151%), HEXaspCP9T/T156A (63,7%), HEXaspCP9T/R122G (116%) e HEXasp- CR122G/T156A (107%). Quando a S,S monatina foi utilizada como um subs- trato, a HEXaspC produziu 7,43 mM de glutamato por mg de aminotransfe- rase por hora. A atividade relativa, expressa na forma de uma porcentagem, dos mutantes é como a seguir: HEXaspCWI 30F (113%), HEXaspCTI56A (87,7%), HEXaspCP9T/T156A (67,3%), HEXaspCP9T/R122G (11,2%) e HEXaspCRI22G/T156A (114%).

O mutante HEXaspCP9T/R122G tinha maior atividade em rela- ção à conversão de triptofano em indol-3-piruvato, mas menor atividade em relação à transaminação da S,S monatina. A proporção de atividade de trip- tofano em relação à monatina era de 18,2 em comparação com 1,75 para HEXaspC, tornando-a um candidato desejável para a produção de R,R mo- natina utilizando vias que requerem uma L-aminotransferase, tal como a descrita nos Exemplos 9 e 10(2). Como tal, a HEXaspCP9T/R122G é um exemplo de uma aminotransferase com atividade limitada sobre a S1S mona- tina, assim como sobre o MP.

A maioria das mutações aumentava a atividade de L-triptofano, mas apenas dois mutantes aumentam a atividade em direção tanto ao L- triptofano quanto à S1S monatina (HEXaspCW130F e HEXasp- CR122G/T156A). Devido ao fato de que 25 mM de substrato foram utilizados nestes ensaios, as enzimas eram mais provavelmente saturadas e a ativida- de é um reflexo da kcatdas enzimas. Entretanto, sob as condições em que os ensaios para a produção de S,S monatina foram realizados, descritas anteri- ormente, é improvável que a concentração de S-MP seja suficiente para sa- turar a enzima, assim não há um aumento geral na produção de S,S monati- na porque o aumento na kcat é compensado por um aumento na Km. Foi rela- tado, para substratos similares, que parte das mutações produzidas aumenta a kcat, mas também aumenta a Km aparente para o substrato de aminoácido. Se concentrações crescentes de substratos forem utilizadas, é esperado que estes dois mutantes fornecessem um benefício nas taxas de produção de S1S monatina em comparação com HEXaspC. A mutação HEXaspCTI56A parece ter maiores taxas de transaminação do triptofano sem ter um efeito significativo sobre a taxa de transaminação de MP sob as condições anterio- res para a produção de S1S monatina.

Através da comparação das estruturas de HEXaspC e uma das enzimas D-aminotransferases de Bacillus sp. (vide, por exemplo, Sugio, S e outros, Biochemistry 34:9661-9669, (1995)), as mutações W130F, R122G, T156A e HEX de AspC poderiam ser mapeadas aos resíduos corresponden- tes na estrutura da D-aminotransferase. É esperado que mutações similares na D-aminotransferase de especificidade ampla melhorariam a produção geral de R,R monatina, como descrito no Exemplo 3. Por exemplo, a funcio- nalidade fornecida pelo triptofano 130 na AspC é substituída nas D- aminotransferases de Bacillus pela ligação de hidrogênio entre as cadeias laterais das serinas 179-181 e do glutamato 166 (esquema de numeração de YM-1). Para diminuir o impedimento estérico, o glutamato poderia ser muta- do para um resíduo de aspartato. Algumas D-aminotransferases possuem um resíduo de treonina na posição 179, que aumentaria o impedimento esté- rico e deve ser evitado. A enzima de B. sphaericus possui uma alanina no lugar da serina na posição 181, que também pode reduzir o impedimento estérico.

Informação adicional proveniente de estudos de aspartato ami- notransferase pode ser aplicada também à D-aminotransferase. Embora a enzima AspC tenha uma arginina no sítio ativo que interage com a cadeia lateral de substratos dicarboxilados, a D-aminotransferase possui uma alça da Ser240 até a Ser243. As cadeias laterais de Ser240, Thr242 e Ser243 ficam voltadas para a mesma direção e formam uma bolsa com o grupo hi- droxila da Ser180 que fornece uma superfície para que substratos tanto não polares quanto polares possam interagir. A Ser180 está envolvida na ligação de PLP; entretanto, para aumentar a atividade de uma D-aminotransferase com R-MP, podem ser modificados os resíduos de Ser240, Thr242 ou Ser243 para aceitar substratos maiores ou para favorecer substratos negati- vãmente carregados. Por exemplo, a Thr242 pode ser mutada para Ser para reduzir o comprimento da cadeia. Um dos resíduos pode ser mutado para Iisina ou arginina, tal como Ser243. Os resíduos (numeração de YM-1) Val30-Val36 ficam localizados em um filamento beta ao longo do sítio ativo da D-aminotransferase e são também importantes para a atividade. Acredita- se que Tyr31, Val33, Glu32 e Lys35 ficam voltadas para o sítio ativo. Tyr31, Glu32 e Val33 são invariáveis em todos os homólogos de Bacillus. Ro e ou- tros, FEBS Lett 398\ 141-145, (1996)) mutagenizaram Val33 para Ala e des- cobriram uma eficiência catalítica ligeiramente maior para a transaminação de alfa-cetoglutarato e uma eficiência catalítica significativamente maior para substratos mais volumosos (menos impedimento estérico). Em alguns homó- logos a Lys35 é substituída por Arg, mas se o impedimento estérico for uma preocupação o resíduo de Lys pode ser preferível. As valinas 34 e 36 são também preferíveis em relação às substituições conservativas tal como iso- leucina, novamente devido ao menor impedimento estérico para moléculas maiores tal como MP. Devido ao fato de que a nova D-aminotransferase ("4978") descrita nos Exemplos 15 e 16 possuía maior atividade que a enzi- ma de B. sphaericus e a DAT híbrida descrita no Exemplo 19 é óbvia a esco- lha de reações de mutagênese adicionais. As idéias acima, baseadas na análise de estrutura de cristal da D-aminotransferase YM-1, podem ser apli- cadas à D-aminotransferase da cepa 4978 da ATCC. A numeração acima tem um aminoácido a menos que o aminoácido correspondente na seqüên- cia da proteína 4978. Exemplo 7

Uso de Aminotransferases de Cadeia Ramificada ("BCAT") na Produção de Monatina

AT-102 e AT-104 são L-transaminases de cadeia ramificada (EC 2.6.1.42) que foram obtidas na BioCataIytics (Pasadena, CA). As enzimas foram testadas em relação à atividade de transaminação utilizando substra- tos de S,S e R,R monatina que foram produzidos quimicamente. As reações foram realizadas em um volume total de 0,5 mL e corridas em duplicata. Os ensaios continham 50 mM de Tris pH 7,8, 0,08 mM de PLP, 10 mM de a- cetoglutarato ("α-KG"), 5 mM de monatina e 1 mg/mL de enzima aminotrans- ferase. Os controles negativos não continham enzima aminotransferase e- xógena. As amostras foram incubadas durante 2 horas a 30°C com agitação a 100 rpm. As amostras foram filtradas e a análise de LC/MS/MS, que é descrita no Exemplo 1, foi corrida para determinar os níveis de glutamato. Os níveis de glutamato devem se correlacionar de forma estequiométrica com a produção de MP. Quando a R,R foi utilizada como o substrato de rea- ção, níveis muito baixos de glutamato estavam presentes nos controles ne- gativos. A AT-104 produziu ligeiramente mais glutamato que os controles negativos, indicando um baixo nível de atividade com o substrato de R,R monatina (um D-aminoácido). Ambas as L-aminotransferases de cadeia ra- mificada exibiram atividade sobre a S,S monatina. A AT-102 produziu 102 μg/mL de glutamato e a AT-104 produziu 64 pg/mL de glutamato. Para com- paração, uma aminotransferase de especificidade ampla (AT-101, também da BioCatalytics) produziu 75 Mg/mL sob estas condições. A alta atividade com uma aminotransferase de cadeia ramificada é de alguma maneira ines- perada porque a monatina tem mais similaridades estruturais aos aminoáci- dos dicarboxílicos e aos aminoácidos aromáticos que servem normalmente como substratos para as aminotransferases de especificidade ampla ou as aspartato aminotransferases. Entretanto, devido à estrutura de ácido gluta- mático da monatina, muitas das aminotransferases que podem utilizar o glu- tamato como um doador de amino também podem ter atividade sobre a mo- natina.

Produção de Monatina Partindo de lndol-3-Piruvato utilizando BCAT

AT-102 e AT-104 foram testadas em relação à produção de mo- natina em reações acopladas utilizando a ProA aldolase de C. testosteroni (produzida como descrito no WO 03091396 A2). As enzimas e os compo- nentes/substratos adicionais foram adicionados diretamente no tampão de reação fornecido no kit, que continha 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5, 100 mM de L-glutamato e 0,1 mM de PLP. A um mL de tampão de reação foram adicionados: 4 mg de indol-3-piruvato, 20 mg de piruvato, a- proximadamente 50 pg de ProA fornecida em um, 1 μL de MgCI2 a 2 M e 2 mg de enzima aminotransferase que seria testada. Todas as reações foram realizadas em duplicata e uma reação de controle negativo foi feita sem a- minotransferase adicional adicionada. Um controle positivo (AT-101) foi utili- zado para comparação; esta enzima é uma L-aminotransferase de especifi- cidade ampla. A produção de fundo de monatina é devida às aminotransfe- rases de E. coli nativas presentes no extrato celular da proteína ProA re- combinante. As reações foram incubadas durante a noite a 30°C com agita- ção suave (100 rpm). As amostras foram filtradas e submetidas à análise de LC/MS/MS em fase inversa como descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na Tabela 23 abaixo.

Tabela 23

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As aminotransferases AT-102 e AT-104 produziram claramente mais monatina que o controle negativo e eram aproximadamente 50-60% tão ativas que o controle positivo.

A enzima aminotransferase de cadeia ramificada de E. coli foi bem estudada e as estruturas de cristal foram analisadas em detalhes. Oka- da, K. e outros, (1997) J. Biochem (Tóquio) 121:637-641, (1997). A enzima tinha um dobramento geral similar e homologia de seqüência significativa com as enzimas D-aminotransferases de Bacillus tais como as mencionadas nos Exemplos 2, 3 e 6. Em adição, as enzimas BCAT e as D- aminotransferases de Bacillus são os únicos dois tipos de aminotransferases dependentes de PLP que exibem estereoespecificidade em relação à adição na face re de hidrogênio em PLP. Yoshimura, T. e outros, J. Am. Chem. Soe. 115:3897-3900, (1993). Acredita-se que a BCAT seja a única enzima em que o substrato de alfa-aminoácido fica ligado com seu grupo carboxila do mes- mo lado que o grupo fosfato, permitindo que a enzima tenha um dobramento similar e um mecanismo para as D-aminotransferases enquanto mantém a especificidade em relação aos L-aminoácidos. Peisach, D. e outros, Bioche- mistry 37:4958-4967, (1998). Acredita-se que a L-especificidade de BCAT seja oriunda do fato de que as cadeias laterais de aminoácidos polares da D- aminotransferase que posicionam o grupo alfa-carboxila do substrato são substituídas por resíduos não polares na BCAT. É esperado que se todos ou alguns destes resíduos forem mutados nos aminoácidos correspondentes da D-aminotransferase de Bacillus, é possível converter a BCAT em uma ami- notransferase específica a D. As mutações a seguir podem ser feitas na BCAT de E. coli (numeração baseada no número de acesso gi:14719463): Phe37 para Tyr, VaM 10 para His, Met108 para Arg. Outras substituições de aminoácidos polares poderiam também ser feitas nestes sítios, para adaptar o sítio ativo da enzima para aceitar substratos de ácido dicarboxílico grandes como descrito no Exemplo 6. A Tyrl 65 pode também precisar ser convertida em Leu, para espelhar a interação de PLP da D-aminotransferase; Tyr96 (para Phe), Arg41 e Arg98 também podem precisar ser mutadas para preve- nir a ligação do grupo alfa carboxila na orientação incorreta na enzima BCAT. O Trp127 também pode ser mutado para Tyr para diminuir a probabi- lidade das cadeias laterais hidrofóbicas se ligarem em uma configuração pro-S; Tyr32 e Tyr130 podem interagir com L-glutamato no sítio ativo de BCAT e podem ser mutados para aminoácidos carregados negativamente para minimizar esta interação. Goto, M. e outros, Biochemistry 42.3725- 3733, (2003); Okada, K., Biochemistry 40:7453-7463, (2001).

Devido ao fato de que tanto as enzimas D-aminotransferases quanto a aminotransferase de cadeia ramificada possuem atividade na pro- dução de monatina, é esperado que a BCAT possa ser convertida em uma D-aminotransferase com atividade na produção de R,R monatina, enquanto fornece uma outra enzima D-aminotransferase possível que será utilizada nos esquemas de reação descritos em muitos dos Exemplos. Com base nos resultados anteriores, é possível que a enzima AT-104 já exiba alguma ativi- dade em direção às configurações de D-amino da monatina. Clonagem e Mutagênese de Aminotransferase de Cadeia Ramificada de Ba- cillus

Bacillus Iicheniformis contém uma suposta aminotransferase de cadeia ramificada que é mais intimamente relacionada às D-aminotransfe- rases que a aminotransferase de cadeia ramificada de E. coli. Esta foi anali- sada em relação à atividade de D-transaminação e foi submetida à mutagê- nese com base nos resíduos previstos do sítio ativo mencionados anterior- mente para a BCAT de E. coli. Ceoa

B. Iicheniformis (número da ATCC 14580) foi cultivada em Nutri- ent Ágar a 30 0C durante a noite. Os grupos de colônias foram colocados em 100 μL de água esterilizada e aquecidos durante 10 minutos a 95 °C, para romper as células. Três μΙ_ foram utilizados nas amplificações subseqüentes através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

Protocolo da Reação em Cadeia da Polimerase

Os iniciadores foram planejados para o gene de B. Iicheniformis (915 bp) para a clonagem nos vetores pET 28b e pET 30a (Novagen, Madi- son, Wl) e pTRC99a (GE Healthcare Life Sciences), utilizando os sítios Ncol e Sall. A construção de pET30 contém uma marcação His e uma marcação S N-terminal, enquanto que a construção de pET 28 não é marcada.

Iniciadores de bcat de B. licheniformis: N term 5'-GGTTAAGGCCATGGGGGACCAGAAAGACCA-3' (SEQ ID NO: 44); e C term: 5'-GGCCTTCCGTCGACTCAGCTGACACTTAAGCT -3' (SEQ ID NO: 45)

A região codificadora foi amplificada utilizando o protocolo de PCR a seguir. Em uma reação de 50 μΐ_, 3 μι. molde, 1 μΜ de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Expand High Fidelity Polimerase e 1X tam- pão Expand™ (Roche, Indianapolis, IN) com Mg foram utilizados. O progra- ma do termociclador utilizado incluía um início a quente a 96 0C durante 5 minutos, seguidos por 30 repetições das etapas a seguir: 94 0C durante 30 segundos, 50 0C durante 1 minuto e 45 segundos e 72 0C durante 2 minutos e 15 segundos. Após 30 ciclos, a amostra foi mantida a 72 0C durante 7 mi- nutos e então armazenada a 4 °C. Foram obtidos produtos da PCR limpos do tamanho correto (aproximadamente 900 bp).

Clonagem

O produto da PCR foi purificado e digerido com Sall e Ncol em tampão Sall (New England Biolabs, Ipswich, MA). Os vetores digeridos (pET28, pET30 e pTRC99a) e o inserto foram purificados utilizando o Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit. As ligações foram feitas utilizando o Roche Ra- pid DNA Ligation Kit (Roche) e purificadas. As ligações foram transformadas em Escherichia coli DH10B utilizando uma cubeta de 0,2 cm e um sistema Bio-Rad Gene Pulser II, como descrito no manual de eletroporação da Bio- Rad. Foi permitido que as células se recuperassem em 900 μ!_ de meio SOC durante 30 minutos a 37 °C a 225 rpm. As células foram plaqueadas em pla- cas de LB-ágar contendo canamicina (25 pg/mL). O DNA plasmideal foi puri- ficado utilizando o Qiagen spin miniprep kit e verificado em relação aos in- sertos corretos através da digestão por restrição com Sall e Ncol. As se- qüências dos plasmídeos que pareciam ter o inserto correto foram verifica- das através do seqüenciamento de DNA por término de cadeia didesóxi na Agencourt BioScience Corporation (Beverly, MA). O seqüenciamento verifi- cou a seqüência codificadora encontrada no número de acesso do NCBI CP000002 Gl 56160984 2851268..2850354, que produz uma proteína com seqüência de aminoácidos que é listada no número de acesso AAU24468 Gl:52004526.

Expressão Gênica e Ensaios

O DNA plasmideal (vetores pET) foi transformado no hospedeiro de expressão E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison, Wl) para construções nos vetores pET. As culturas foram crescidas e os plasmídeos foram isola- dos utilizando o Qiagen miniprep kit e analisados através da digestão por restrição para confirmar a identidade. A indução era tipicamente realizada em meio LB contendo canamicina (50 pg/mL). As células foram crescidas até uma OD60O de 0,4-0,8 a 37°C e induzidas com 0,1 mM de IPTG (isopropil tiogalacatosídeo) e foram tiradas amostras 3-4 horas após a indução. Os extratos de células foram preparados de acordo com o protocolo que acom- panha o reagente Novagen BugBuster™ (com benzonase nuclease e o co- quetel de inibidor de protease completo da Roche adicionados). Altos níveis de proteína solúvel foram obtidos no peso molecular previsto, que é julgado por SDS-PAGE. As proteínas solúveis nos extratos celulares foram separa- das por SDS-PAGE.

Os extratos de células foram analisados em relação à atividade de D-aminotransferase através do acompanhamento da produção de alanina partindo do piruvato (ou glutamato partindo de alfa-cetoglutarato) e D- triptofano utilizando o protocolo a seguir. As reações de um mL em duplicata foram tipicamente realizadas em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5), 50 μΜ de fosfato piridoxal, 25 mM de piruvato de sódio e 50 mM de D- triptofano. As reações foram iniciadas através da adição de extratos isentos de células ou enzima purificada e foram incubadas 15 minutos durante a noi- te a 30°C, com agitação suave. Aproximadamente o mesmo nível de D- aminotransferase foi adicionado (tipicamente em torno de 0,5 mg) em cada ensaio com finalidades de comparação e a AT-103 (BioCataIytics) foi utiliza- da freqüentemente como a enzima comercial. O ácido fórmico foi adicionado em uma concentração final de dois por cento para interromper a reação e a proteína precipitada foi removida por centrifugação. As reações de controle sem proteína adicionada também foram realizadas. Os pontos de tempo ze- ro também foram utilizados como controles negativos. A alanina e o glutama- to foram detectados utilizando derivatização OPA como descrito no Exemplo 1. A aminotransferase de cadeia ramificada tinha baixos níveis de atividade de D-aminotransferase em comparação com as enzimas AT-103 e de B. s- phaericus.

A aminotransferase de cadeia ramificada também foi testada em relação à capacidade de produzir monatina partindo de D-triptofano (como no Exemplo 3), mas não parecia ter atividade sob as condições testadas.

A construção pTRC99a foi transformada em células E. coli CAG18455 eletrocompetentes, que são auxotróficas em relação à produção de triptofano. As células foram crescidas em meio mínimo M9 com vitaminas de Balch com 100 mg/L de L-triptofano, 0,4 % de glicose e cloreto de cálcio. As células não eram capazes de crescer sem L-triptofano. A indução foi tes- tada em 10, 100 e 1000 μΜ de IPTG1 a uma OD600 de 0,4 durante 4,5 horas. As bandas no peso molecular correto eram visíveis em SDS-PAGE. O plas- mídeo foi submetido à mutagênese utilizando o QuikChange® Multi Site- Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Os iniciadores na Tabela 24 abaixo foram planejados como descrito pelo fabricante.

Tabela 24

<table>table see original document page 98</column></row><table> <table>table see original document page 99</column></row><table>

As mutações de aminoácido se baseavam na estrutura de cristal da BCAT de E coli e a numeração na tabela acima é para a proteína de E coli. A numeração para as mutações de DNA se baseia no gene bcat de B. licheniformis.

Os iniciadores foram diluídos até 0,1 mg/mL e aproximadamente 100 ng de cada iniciador de oligonucleotídeo foram tipicamente utilizados em uma reação de mutagênese de 50 μL, concentrações proporcionalmente maiores foram utilizadas para iniciadores maiores. Para os iniciadores de oligonucleotídeo que estavam competindo essencialmente pelo anelamento na mesma região molde, algumas vezes uma soma de 100 ng foi utilizada para o conjunto todo de iniciadores na região. Duzentos nanogramas de molde (bcat de B. Iich em pTRC99a) foram utilizados na reação, com 5 μΙ_ de 10X tampão QuikChange, 2 μL de dNTPs e 2 μL da mistura de enzimas. Os produtos da amplificação foram tratados com a endonuclease de restri- ção Dpn\ (Stratagene) (2 μL) durante 2 horas a 37°C e transferidos para um tubo de 1,5 mL de parede grossa para a precipitação com etanol. A mistura de reação ressuspensa (concentrada) foi transformada (2,5 μL) em células XLIO-GoId Ultracomp incluídas no kit QuikChange. Várias colônias foram submetidas à miniprep e seqüenciadas para garantir que as mutações eram aleatórias e para estimar o nível de mutagênese atingido. As colônias foram ressuspensas partindo da placa e foram realizadas minipreps em massa. O DNA da miniprep foi então transformado na cepa auxotrófica em relação ao triptofano e que foi plaqueada em meio mínimo (com IPTG) descrito anteri- ormente ou utilizando meio mínimo contendo D-triptofano como a única fonte de nitrogênio. Uma segunda e uma terceira rodadas de mutagênese foram realizadas nas minipreps em massa utilizando os iniciadores que não pare- ciam se incorporar bem nas rodadas anteriores. Em cada estágio, as colô- nias que cresceram rapidamente no meio mínimo (colônias maiores) foram mantidas para análise adicional. Os mutantes mostrados na Tabela 25 abai- xo foram isolados das placas de seleção. Em alguns casos estes mesmos mutantes apareciam no meio de seleção mais de uma vez. Tabela 25

<table>table see original document page 100</column></row><table>

As construções mutantes foram induzidas para produzir proteína recombinante em meio LB e os extratos de células foram preparados como anteriormente. As proteínas solúveis nos extratos celulares foram separadas em uma BioRad Laboratories Experion Automated Electrophoresis Station e analisadas em relação à concentração e à porcentagem de expressão utili- zando o Experion Software versão 1.1.98.0. Foram observados níveis muito baixos de proteína recombinante solúvel; assim a quantificação da banda de interesse não era possível. Foram feitos ensaios para testar a transaminação de D-triptofano como acima utilizando 50-250 μί de extratos celulares. Os clones 4, 6, 28 e 32 foram analisados utilizando tanto alfa-cetoglutarato quanto piruvato como o receptor de amino e foram incubados durante 2 ho- ras e durante a noite a 30 °C. Os níveis de fundo de alanina/glutamato pre- sentes provenientes dos extratos celulares foram subtraídos. Para os ensai- os com 5-1 e 5-2, as concentrações de proteína estimadas pelo Experion software para as BCATs eram de 275,1 ng/pL para a enzima do tipo selva- gem, de 409,3 ng/pL para BCAT 5-1 e de 148,2 ng/μί. para BCAT 5-2. Os resultados dos ensaios são mostrados nas Tabelas 26-28 abaixo.

Tabela 26

<table>table see original document page 101</column></row><table>

Tabela 27

<table>table see original document page 101</column></row><table> Tabela 29

<table>table see original document page 102</column></row><table>

É evidente que como a maior parte das L-aminotransferases, as enzimas possuem uma preferência pelo alfa-cetoglutarato comparado com o piruvato em relação ao receptor de amino. Todos os mutantes tinham ativi- dade de D-aminotransferase, assim como tinha o parental do tipo selvagem. Não é claro se a enzima do tipo selvagem tinha mais ou menos atividade de D-aminotransferase, porque a quantificação exata da proteína BCAT partin- do dos extratos celulares não era possível. Entretanto, é esperado que as enzimas mutantes tenham menos atividade de L-aminotransferase que as do tipo selvagem; assim, a proporção da taxa de transaminação de D em L está sendo melhorada. Uma mutagênese continuada poderia fornecer uma enzi- ma alternativa nas vias para monatina.

Exemplo 8

Clonagem, Expressão e Teste de Glutamato e Aspartato Racemases

Este exemplo descreve métodos utilizados para clonar e testar enzimas aminoácido racemases, que podem ser utilizadas para fazer a in- terconversão entre L-glutamato e D-glutamato (ou L- e D-aspartato ou L- e D-alanina). As glutamato, aspartato ou alanina racemases são úteis em uma via biossintética para produzir R,R monatina quando uma etapa em tal via produz um L-aminoácido (por exemplo, L-glutamato, L-aspartato ou L-alanina) e uma outra etapa na via consome um D-aminoácido (por exemplo, D-gluta- mato, D-aspartato ou D-alanina). A figura 4 ilustra uma via biossintética para a produção de R,R monatina partindo de L-triptofano utilizando uma amino- transferase específica ao L-triptofano, uma aldolase específica a R, uma D-aminotransferase e uma glutamato (ou aspartato ou aíanina) racemase.

Os genes foram clonados nos vetores pET28 e pET30 para ge- rar tanto proteínas não marcadas quanto proteínas de fusão com HIS6- Tag/T7-Tags N-terminais que podem ser clivadas. As proteínas resultantes foram purificadas utilizando cromatografia por afinidade com imobilização em metal.

Resumo Experimental

Os genes que codificam as glutamato racemases (EC 5.1.1.3) de Lactobacillus brevis (N- de Acesso do Genbank D29627, seqüência de ácido nucléico) e Pediococcus pentosaeeus (gene murl) (N- de Acesso do Genbank L22789) foram clonados e expressos em E. eoli. Os extratos foram testados em relação à atividade na conversão de L-glutamato em D- glutamato e de D-glutamato em L-glutamato. A enzima aspartato racemase da BioCataIytics (EC 5.1.1.13) também foi testada em relação à interconver- são entre L- e D-aspartato.

Isolamento de DNA Genômieo para Clonagem

O DNA genômieo de L. brevis (ATCC 8287D) foi obtido na Ame- rican Type Culture Collection. P. pentosaeeus (ATCC 25745) foi crescida a 37 0C em caldo MRS de lactobaeillie 2 mL foram utilizados para o isolamen- to do DNA genômieo utilizando o método de Mekalanos, J.J., "Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio eholerae", Cell 35:253-263, (1983). Protocolo da Reação em Cadeia da Polimerase

Os iniciadores foram planejados com sítios de restrição e pontas coesivas a 5' para clonagem nos vetores pET 28 e pET30 (Novagen, Madi- son, Wl).

Iniciadores para glutamato racemase de L. brevis:

N term: 5'-GCGGCGCCATGGAAAATGATCCGATTGGTCTAATG -3' (SEQ ID NO: 15) e

c term: Si-Gcggcggtcgacgcaattacaattgtgtttgtc-S' (seq id NO: 16).

Iniciadores para glutamato racemase de P. pentosaeeus: N term: 5'- GCGGCGCCATGGATGTATGTATAATTTTATTTAG -3' (SEQ ID NO: 17) e

C term: 5'-GCGGCGGTCGACAAATTTCATTATTCATTCTAATTT -3' (SEQ ID NO: 18).

O gene derivado de L. brevis foi amplificado utilizando o protoco- lo de PCR a seguir. Em uma reação de 50 μL, 0,150 pg de molde, 1,6 pM de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 2,8 U de Expand High Fidelity™ Po- limerase (Roche, Indianapolis, IN), 0,5 U de Pfu polimerase (Stratagene, La Jolla, CA) e 1X tampão Expand™ com Mg foram utilizados. O programa do termociclador utilizado incluía um início a quente a 96°C durante 3 minutos, 8 repetições das etapas a seguir: 94°C durante 30 segundos, 52 0C durante 45 segundos e 72°C durante 2 minutos, seguidos por 22 repetições das e- tapas a seguir: 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 45 segundos e 72 °C durante 2 minutos. Após as 22 repetições, a amostra foi mantida a 72°C durante 7 minutos e então armazenada a 4°C. Este protocolo de PCR obte- ve um produto de -830 bp, como julgado através da comparação com mar- cadores de tamanho de DNA.

O gene derivado de P. pentosaceus foi amplificado utilizando o protocolo de PCR a seguir. Em uma reação de 50 µL, 0,15 pg de molde, 1,6 μΜ de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 2,8 U de Expand High Fide- lity™ Polimerase, 0,5 U de Pfu polimerase e 1X tampão Expand™ com Mg foram utilizados. O programa do termociclador utilizado incluía um início a quente a 96°C durante 3 minutos, seguidos por 8 repetições das etapas a seguir: 94°C durante 30 segundos, 37°C durante 45 segundos e 72°C du- rante 2 minutos, seguidos por 8 repetições das etapas a seguir: 94°C duran- te 30 segundos, 45°C durante 45 segundos e 72°C durante 2 minutos, se- guidos por 14 repetições das etapas a seguir: 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 45 segundos e 72°C durante 2 minutos. Após as 14 repeti- ções, a amostra foi mantida a 72 °C durante 7 minutos e então armazenada a 4 °C. Este protocolo de PCR obteve um produto de -840 bp, como julgado através da comparação com marcadores de tamanho de DNA. Clonagem

Os produtos da PCR foram purificados em gel partindo de géis de 0,8% de TAE-agarose utilizando o kit de extração de gel da Qiagen (Va- lencia, CA). Os produtos da PCR foram quantificados utilizando um espec- trômetro SmartSpec 3000™. Os produtos foram digeridos com as enzimas de restrição Ncol e Sall seguindo os protocolos recomendados pelo fabrican- te (New England Biolabs, Beverly, MA) e purificados em gel partindo de géis de 0,8% de TAE-agarose o kit de extração de gel da Qiagen. Os vetores pET28 e pET30 foram preparados através da digestão com as enzimas de restrição Ncol e Sall, seguida pelo tratamento com fosfatase alcalina de ca- marão e pela purificação partindo de géis de 0,8% de TAE-agarose utilizan- do o kit de extração de gel da Qiagen.

Os vetores e os insertos digeridos foram ligados utilizando o Ra- pid™ DNA Ligation Kit (Roche, Indianapolis, IN). Aproximadamente 50 ng de inserto tratado, 100 ng de vetor tratado (porporção molar de 3 para 1 de in- serto em relação ao vetor), 5 U de T4 DNA Iigase (incluída no Rapid™ DNA Ligation Kit e 1X tampão de ligação foram incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. As reações de ligação foram purificadas utilizando o High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) e foram utilizadas para transformar células eletrocompetentes de E. coli DH10B (Invitrogen, Carls- bad, CA). Dez pL de cada reação de ligação foram adicionados em 40 pL de células DH10B e foram transformados através de eletroporação utilizando o BioRad Gene Pulser Il sob as condições ã seguir: 2,5 kV, 25 pF, 200 ohm em uma cubeta de 0,2 cm. Foi permitido que as células se recuperassem em 1 mL de SOC à temperatura ambiente durante 1 hora a 37 °C com agitação a 225 rpm. As células foram plaqueados em placas de LB contendo canami- cina (50 pg/mL).

O DNA plasmideal foi purificado dos transformantes resultantes utilizando o Qiagen spin miniprep kit e verificado em relação aos insertos corretos através da digestão por restrição com Nco\ e Sall. As seqüências de plasmídeos que pareciam ter o inserto correto foram verificadas através do seqüenciamento de DNA por término de cadeia didesóxi. Expressão Gênica e Ensaios

O DNA plasmideal, verificado através da análise de seqüência, foi subclonado no hospedeiro de expressão de E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison, Wl). As culturas foram crescidas e os plasmídeos foram isolados utilizando o Qiagen miniprep kit e analisados através da digestão por restri- ção para confirmar a identidade.

A indução em BL21 (DE3) foi inicialmente realizada com glutama- to racemases de L. brevis e P pentosaceus em ambos os vetores pET28 (não marcado) e pET 30 (marcado com histidina). Um estudo de curso de tempo foi realizado com as culturas crescidas em 250 mL de LB contendo canamicina (50 mg/L) até uma DO 6oo de 0,5 - 0,6 e induzidas com 100 mM de IPTG (isopropil tiogalacatosídeo) e foram tiradas amostras 0 e 3 horas após a indução. As células de 600 μί (0 hora) e 275 pL (3 horas) foram res- suspensas em 40 μί de tampão dodecil sulfato de sódio contendo 2- mercaptoetanol e aquecidas a 95 °C durante 10 minutos e resfriadas. As alí- quotas destas amostras de proteínas celulares totais foram analisadas por SDS-PAGE utilizando um gel com gradiente de 4-15%.

Os extratos de células também foram preparados partindo das culturas de 3 horas através da suspensão dos péletes de células partindo de 5 mL de cultura em 0,625 mL de reagente Novagen BugBuster™ contendo 0,625 pL de benzonase nuclease e 3 μί de conjunto N2 3 de coquetel de inibidor de protease (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) à temperatura ambiente durante 20 minutos com agitação suave e centrifu- gando a 16.000 χ g para remover os restos celulares. Os sobrenadantes (ex- tratos de células) foram carregados em géis com gradiente de 4-15% para a análise das proteínas celulares solúveis.

As amostras de 3 horas da glutamato racemase de L. brevis e da glutamato racemase de P. pentosaceus clonadas mostrava tanto a prote- ína total quanto a solúvel que correspondia ao tamanho correto (aproxima- damente 31 kDa). O produto gênico de pET30 de L. brevis (marcado com histidina) era superexpresso em um nível maior e também era mais solúvel (>20% de proteína solúvel) que o produto gênico de pET 28 de L. brevis (não marcado), assim como os produtos gênicos de P. pentosaceus em am- bos os vetores. O produto gênico de P pentosaceus exibia superexpressão e solubilidade equivalentes nos vetores pET28 e pET30, que eram significa- tivamente menores que as observadas para o produto gênico de pET30 de L. brevis.

As células das culturas induzidas (250 mL) foram centrifugadas e lavadas uma vez com 0,85 % de NaCI. Os péletes de células foram res- suspensas em 5 mL/g de peso úmido de células de reagente BugBuster™ (Novagen) contendo 5 pL/mL do conjunto N2 3 de coquetel de inibidor de protease (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) e 1 pL/mL de benzonase nuclease. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 20 minutos em um agitador orbital. Os restos celulares insolúveis foram removidos por centrifugação a 16.000 X g durante 20 minutos a 4 "C.

Os extratos de células foram analisados em relação à atividade de glutamato racemase utilizando o protocolo a seguir. Reações de 400 pL foram realizadas em 10 mM de fosfato de potássio (pH 8,0), 0,2 mM de ditio- treitol ("DTT") e 10 mM de L-glutamato ou D-glutamato. As reações foram iniciadas pela adição de 20-100 pL de extratos isentos de células e foram incubadas à temperatura ambiente. Foram tiradas alíquotas das amostras ao longo de um curso de tempo de 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos e 1 hora (as amostras de zero minuto serviam como reações de controle). O ácido fórmico a 2 M (25 pL) foi adicionado a cada alíquota de amostra de 40 pL para interromper a reação e a proteína precipitada foi removida por cen- trifugação. Os sobrenadantes foram removidos e congelados a -80 0C até serem analisados por LC/MS/MS.

Os resultados de ensaios de extratos de células da indução de pET30 com 100 mM de IPTG (3 horas) demonstram que as enzimas de L brevis (N- de Acesso do Genbank BAA06106.1 Gl:468450) e de P. pentosa- ceus (N- de Acesso do Genbank AAA16761,1 Gl:349029) possuem níveis significativos de atividade de racemase sobre ambos os isômeros de gluta- mato. A racemase de P. pentosaceus (20 pL de extratos celulares) atingiu o equilíbrio entre L- e D-glutamato em 10-20 minutos partindo de cada um dos substratos. A enzima de L. brevis (20 pL de extratos celulares) também atin- giu o equilíbrio em aproximadamente 20 minutos. Uma enzima aspartato enzima parcialmente purificada (N- de Catálogo ASPR-101) obtida na BioCataIytics, Inc. (Pasadena, CA) foi anali- sada em relação à atividade sobre L-aspartato e D-aspartato utilizando um protocolo similar a um anterior. A enzima comercial exiba atividade sobre ambos os isômeros. Utilizando 0,5-1 mg de enzima, o equilíbrio foi atingido em 20-60 minutos.

Todas as três racemases (glutamato racemase de L. brevis, glu- tamato racemase de P. pentosaceus e aspartato racemase da BioCataIytics) foram também analisadas em relação à atividade sobre S,S monatina utili- zando o protocolo a seguir. Reações de 400 μΙ_ foram realizadas em 10 mM de fosfato de potássio (pH 8,0), 0,2 mM de DTT e 10 mM de S,S monatina. As reações foram iniciadas através da adição de extratos isentos de células (L. brevis e P. pentosaceus) ou da enzima purificada (aspartato racemase da BioCataIytics) e foram incubadas à temperatura ambiente. Foram tiradas alíquotas das amostras ao longo de um curso de tempo de 1 minuto, 5 minu- tos, 10 minutos, 20 minutos e 1 hora (as amostras de zero minuto serviam como reações de controle assim como as amostras sem enzima). O ácido fórmico a 2 M (25 μL) foi adicionado em cada alíquota de amostra de 40 μΙ_ para interromper a reação e a proteína precipitada foi removida por centrifu- gação. Os sobrenadantes foram removidos e congelados a -80 "C até serem analisados por LC/MS/MS (Exemplo 1). Não foi observado qualquer diminui- ção na concentração de S,S monatina ao longo do tempo, nem havia qual- quer aumento na S,R monatina (presente inicialmente como <5% de sub- produto contaminante, mesmo no controle sem enzima). Portanto, nenhuma das racemases analisadas exibia atividade em relação à monatina.

Exemplo 9

Produção de R1R Monatina partindo de L-Triptofano Utilizando Alanina, Glu- tamato ou Aspartato Racemases

Este exemplo descreve métodos de produção de R,R monatina enriquecida de forma enanciomérica partindo de L-triptofano utilizando uma L-triptofano (L-tirosina ou aromática) aminotransferase, uma ProA aldolase, uma alanina, glutamato ou aspartato racemase e uma D-aminoácido amino- transferase de especificidade ampla. A figura 5 é um diagrama que ilustra a via. Esta abordagem para produzir R,R monatina enriquecida de forma este- reoisomérica requer uma enzima para a etapa 1 que possui baixa atividade na produção de monatina partindo do precursor de monatina (MP). Com ba- se nos estudos anteriores, foram utilizados os produtos gênicos de tatA de Sinorhizobium meliloti e Rhodobacter sphaeroides descritos no Exemplo 1 do WO 03/091396 A2.

Materiais e Métodos

As glutamato racemases de L. brevis e P. pentosaceus foram produzidas em E. coli como descrito no Exemplo 8. Em alguns casos, a ver- são marcada como HíS6 destas enzimas foi purificada utilizando cartuchos His-Bind 900 de acordo com os protocolos do fabricante (Novagen, Madison, WI) e foi dessalinizada para remover imidazol utilizando colunas PD-10 (G25 Sephadex, Amersham-Pharmacia). As enzimas foram eluídas em 25 mM de fosfato de potássio pH 8,0. A aspartato racemase (ASPR-101) e a D- aminotransferase (AT-103) foram obtidas na BioCatalytics, Inc., a alanina racemase foi obtida na Sigma (St. Louis, MO) (número de catálogo A8936).

As tirosina (aromática) aminotransferases de S. meliloti e R. sphaeroides foram preparadas como descrito no Exemplo 1 do WO 03/091396 A2. A ProA aldolase de Comamonas testosteroni foi preparada como descrito no Exemplo 4 do WO 03/091396 A2. Os ensaios de proteína total foram reali- zados utilizando o Bio-Rad Protein Assay de acordo com os protocolos do fabricante (Hercules, CA).

Redução na Quantidade de S,S Monatina Produzida utilizando Racemases

As misturas de reação (volume de 1 mL, corrido em duplicata) continham 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 8), 2 mM de MgCl2, 0,05 mM de 5'-fosfato piridoxal ("PLP"), 200 mM de piruvato de sódio, 5 mM de α-cetoglutarato ou oxaloacetato de sódio, aproximadamente 280 ug/mL de TatA de S. meliloti fornecidos em um extrato celular, 1 mg/mL de D- aminotransferase (AT-103) da BioCatalytics, 100 uL/mL de extrato celular de glutamato racemase ou 1 mg/mL de aspartato racemase e aproximadamente 100 ug/mL de ProA aldolase fornecidos na forma de um extrato celular. O triptofano sólido foi adicionado a uma concentração de 10,2 mg/mL. Os con- troles negativos não continham racemase. As amostras foram incubadas a 30°C (agitação a 250 rpm) durante 1 hora, 2 horas ou durante a noite. As amostras foram centrifugadas para remover o precipitado, filtradas com se- ringa e armazenadas a -80°C antes da análise em relação à monatina utili- zando o método de LC/MS/MS descrito no Exemplo 1.

A maior parte das amostras continha >95% de S,S monatina, devido às quantidades de L-aminotransferase nativa presentes nos extratos celulares. Entretanto, as amostras que continham racemase tinham uma quantidade reduzida de monatina total como um resultado das enzimas ra- cemases tornando o L-glutamato menos disponível para a transaminação de MP. Sem racemase, 1545-2355 ppm de monatina (predominantemente S,S) foram produzidas ao longo do curso de tempo. Com as racemases presen- tes, apenas 340-879 ppm (enzima de L. brevis), 444-531 ppm (enzima de P. pentosaceus) e 506-1460 ppm de monatina (aspartato racemase) eram pro- duzidas. Estes dados indicam que as racemases são ativas nas condições de reação requeridas para produzir monatina. Para minimizar a formação de S,S monatina partindo das enzimas do extrato celular, tais como aspartato aminotransferases, foram realizados experimentos adicionais com enzimas purificadas e uma proporção mais alta de enzima D-aminotransferase em relação à L-aminotransferase.

Conversão de L-triotofano em Isômeros de Monatina Contendo 4-R

Os experimentos anteriores foram repetidos utilizando aproxi- madamente 54 pg de L-aminotransferase purificada (TatA de S. meliloti ou de R. sphaeroides), 1 mg de aspartato aminotransferase (BioCataIytics), 1 mg de D-aminotransferase, 5 mM de oxaloacetato como o receptor de amino e 75 pg de aldolase purificada. As reações foram corridas em duplicata com um tempo de amostragem de 2 horas e um tempo de incubação durante a noite. Os controles negativos foram feitos com L-aminotransferase de S. me- liloti, mas sem racemase. Em adição à quantificação do pico de R,R/S,S e S,R/R,S monatinas com base na cromatografia em fase inversa, a porcenta- gem de cada estereoisômero foi determinada utilizando a técnica de deriva- tização por FDAA descrita no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 29 abaixo.

Tabela 29

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Claramente, a presença da racemase aumentou a quantidade total de monatina produzida quando a TatA de S. meliloti foi utilizada como a enzima para a transaminação de L-triptofano. Os níveis de monatina aumen- taram de uma média de 6,4 até 16,5 ppm no ensaio de duas horas e de 41- 73 ppm no ensaio durante a noite. Adicionalmente, a porcentagem de R,R formada aumentou de aproximadamente 1 % até tanto quanto 58% utilizando a enzima racemase. O estereoisômero S,R de monatina, um outro adoçante potente, era outro componente em maior quantidade, aumentando de apro- ximadamente O nos controles negativos para 31%. A TatA de R. sphaeroides possuía claramente mais atividade sobre S-MP que a L-transaminase de S. meliloti, demonstrando a importância de ter uma enzima que possui uma maior especificidade ao substrato pelo L-triptofano quando comparado com MP quando isômeros 4-R da monatina são os produtos desejados. Com a- proximadamente 10% da monatina total sendo constituídos por 4S no ponto de tempo de duas horas, a TatA de S. meliloti poderia ser considerada como possuindo atividade limitada sobre MP.

Os experimentos foram repetidos com a TatA de S. meliloti (54 10 pg) e a glutamato racemase de L. brevis purificadas. Quando a glutamato racemase purificada foi utilizada, aproximadamente 64 pg foram utilizados por reação de 1 mL. Os extratos celulares contendo a glutamato racemase também foram testados e 1,4 mg de proteína solúvel foi utilizado. Um contro- le negativo sem racemase foi utilizado novamente e todas as amostras fo- ram corridas em duplicata. Os resultados são mostrados na Tabela 30 abai- xo.

Tabela 30

<table>table see original document page 112</column></row><table> <table>table see original document page 113</column></row><table>

Novamente, é evidente que a adição da racemase aumenta a

monatina total produzida partindo de L-triptofano, assim como aumenta as quantidades relativas de isômeros de monatina contendo 4R quando compa- rada com S1S monatina. O uso de aldolase, racemase e L-aminotransferase purificadas aumenta enormemente a capacidade de controlar a formação do estereoisômero desejado. A proporção de L em relação a D aminotransfera- se também é uma maneira de manipular a estereoquímica do produto final.

Quando são comparados os resultados mostrados nas Tabelas 1 e 2 no Exemplo 2 aos resutlados com condições de reação similares às condições anteriores, pode ser observado que aproximadamente 7-29 ppm de monatina foram formadas partindo de indol-3-piruvato e as porcentagens de R1R monatina formada eram de aproximadamente 51-90%. A utilização da aspartato racemase aumentou a quantidade total de monatina produzida para 16-78 ppm de monatina, com a % de R1R de aproximadamente 40- 58%. Adicionalmente, uma matéria bruta mais estável e menos cara (L- triptofano) foi utilizada. No Exemplo 3, aproximadamente 73 ppm de monati- na foram produzidas partindo de D-triptofano em uma proporção de R,R:S,R de aproximadamente 1,7:1. A quantidade total de isômeros 4R era >80% da monatina total. Devido ao fato de que tanto a R,R-monatina quanto a R,S- monatina são adoçantes potentes (>1000 mais doces que a sacarose), a capacidade de enriquecimento em relação a estes isômeros, sem a necessi- dade de substratos de D-aminoácido caros, é crítica. É esperado que a disponibilidade de uma aldolase inespecífica ou específica a R aumetaria a taxa de reação assim como aumentaria a por- centagem de R,R monatina formada. Vide o Exemplo 5. Embora A ProA al- dolase de C. testosteroni utilizada nestes ensaios seja relatada como favore- cendo predominantemente os substratos na configuração S para reações de fissão, esta Pro A aldolase produz claramente R-MP. Assim, as aldolases que produzem mais preferencialmente MP na configuração R podem ajudar a gerar porcentagens ainda maiores de R,R monatina. Adicionalmente, é esperado que a descoberta de uma L-triptofano aminotransferase com ativi- dade ainda menor em relação à produção de monatina também diminuiria a quantidade de S,S e R1S monatinas formada. Por último, podem ser feitas melhorias na enzima D-aminotransferase ou podem ser utilizadas enzimas D-aminotransferases alternativas, que aumentariam a especificidade pelo substrato para R-MP versus S-MP. Isto também aumentaria a formação do produto R,R, se fosse assim desejado.

Os experimentos com a aspartato racemase foram repetidos pa- ra comparar a atividade da aldolase seletiva a R da SEQ ID NO: 22 com a atividade da ProA aldolase de C. testosteroni. Aproximadamente 50 pg de L- aminotransferase purificada (TatA de S. meliloti), 1 mg de aspartato racema- se (BioCataIytics), 1 mg de D-aminotransferase (AT-103, BioCataIytics), 5 mM de oxaloacetato como o receptor de amino e 50 pg da aldolase purifica- da apropriada. As reações foram corridas em duplicata e incubadas durante a noite a 30 °C. A porcentagem de cada estereoisômero foi determinada uti- lizando a técnica de derivatização por FDAA descrita no Exemplo 1. Os re- sultados são mostrados abaixo na Tabela 31. Tabela 31

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A distribuição de isômeros produzidos pela ProA de C. testoste- roni é coerente com os experimentos anteriores acima, enquanto que quan- do a aldolase seletiva a R da SEQ ID NO: 22 é utilizada, a porcentagem R,R é muito maior, quantidades que não podem ser detectadas de S,S são for- madas e a quantidade de S,R monatina é menor.

Como descrito nos Exemplos 2 e 3, a D-alanina pode servir co- mo o doador de amino para a transaminação de MP em monatina. Muitas L- aminotransferases possuem a capacidade de utilizar o piruvato como um receptor de amino até alguma extensão e de produzir L-alanina. Devido ao fato de que as reações mencionadas anteriormente utilizam altas concentra- ções de piruvato, é provável que parte do piruvato seja convertida em L- alanina. Por exemplo, durante a transaminação do L-triptofano, foi observa- do que a enzima HexAspC descrita no Exemplo 6 convertia 10-18% de piru- vato (concentrações iniciais de 50-200 mM) em L-alanina em 2 horas se o alfa-cetoglutarato estivesse ausente. A enzima exibia uma preferencialmente de 10 vezes pelo alfa-cetoglutarato quando ambos os receptores de amino estavam presentes em altas concentrações (>50 mM). A AspC (descrita no WO 03/091396 A2) também produzia alguma L-alanina partindo de piruvato. Portanto, seria esperado se pudesse omitir a adição de alfa-cetoglutarato ou de oxaloacetato nas reações anteriores e utilizar uma alanina racemase (EC 5.1.1.1) no Iugarde glutamato ou aspartato racemase.

As enzimas alanina racemases foram primeiramente identifica- das em Brucella abortus e Streptococcus faecalis. Marr, AG. e Wilson, P.W., Arch. Biochem. Biophys., 49.424-433, (1954); Wood, W.A. e Gunsalus, I.C., J. Biol. Chem. 790:403-416, (1951). O gene dadB em Salmonella typhimuri- um foi identificado como a fonte de atividade de alanina racemase e várias centenas de homólogos podem ser encontradas em bancos de dados ge- nômicos. Outras fontes conhecidas de atividade de alanina racemase são Escherichia eoli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio eholerae, Schizosacearoyees pombe e Bacillus eereus. Um cogumelo basideomiceto, Lentinus edodes, também contém uma alanina racemase de atividade am- pla. Um homólogo termostável de Bacillus stearothermophilus está disponí- vel para obtenção na Sigma-Aldrich (N- de Catálogo A8936) e foi imobilizado para aplicações comerciais. Inagaki, K., Biochemistry 25: 3268 (1986). Produção de Monatina com Alanina Racemase

A produção de monatina foi testada utilizando a ProA aldolase de C. testosteroni. Aproximadamente 50 pg de L-aminotransferase purificada (TatA de S. meliloti), 1 mg de D-aminotransferase (AT-103, BioCataIytics), piruvato como o receptor de amino, 50 pg de aldolase purificada e 70 pg de alanina racemase obtida na Sigma (St. Louis, MO) (número de catálogo A8936). As reações foram corridas em duplicata e incubadas durante a noi- te. A porcentagem de cada estereoisômero foi determinada utilizando a téc- nica de derivatização por FDAA descrita no Exemplo 1. Os controles sem racemase foram incluídos. Os resultados são mostrados na Tabela 32 abai- xo.

Tabela 32

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Havia três vezes mais R,R monatina no ponto de tempo de uma hora quando a alanina racemase estava presente comparado com a amostra sem alanina racemase. Este resultado mostra que é possível produzir R,R monatina utilizando alanina racemase. A porcentagem de R,R monatina pro- duzida poderia ser aumentada utilizando uma aldolase que produz seletiva- mente o precursor R de monatina, uma L-aminotransferase que não funciona ou que possui atividade sobre o precursor R de monatina e uma D- aminotransferase que não funciona ou possui atividade limitada sobre o in- dol-3-piruvato. Exemplo 10

D-fenilqlicina Aminotransferase (D-4-Hidroxifenilqlicina Aminotransferase)

Como mostrado na figura 3, uma aminotransferase de estereoin- versão é útil em uma via biossintética para a produção de monatina. Por e- xemplo, uma D-fenilglicina aminotransferase ou um mutante da mesma po- deria produzir R,R monatina partindo de R-MP com o L-glutamato como o doador de amino.

(1) Síntese Através da PCR de 4 D-hidroxifenilglicina Aminotransferase de P. stutzeri partindo de Iniciadores de Oligonucleotídeo

Este exemplo descreve métodos que foram utilizados para sinte- tizar 4 D-hidroxifenilglicina aminotransferase, uma enzima de estereoinver- são que pode ser utilizada para converter o precursor R da monatina em R,R monatina utilizando L-glutamato como o doador de amino.

Projeto dos Iniciadores

A seqüência publicada (N- de Acesso do Genbank AY319935, seqüência de ácido nucléico; N2 de Acesso do Genbank AAQ8290, seqüên- cia de proteína) para 4 D-hidroxifenilglicina aminotransferase de Pseudomo- nas stutzeri (4 D-HPG AT) foi utilizada como um molde para o projeto de ini- ciadores da PCR. Alternativamente, a 4-D-hidroxifenilglicina aminotransfera- se de Pseudomonas putida, (CAD42450 (proteína), AX467211 (nucleotídeo)) é utilizada como um molde de seqüência. Foi planejado um total de 34 inici- adores para frente e 35 iniciadores para trás foram; os iniciadores para fren- te e para trás eram 40-meros compartilhando 20 pares de bases sobrepos- tos. Em adição, 2 iniciadores externos foram planejados com sítios de restri- ção e pontas coesivas a 5' para clonagem nos vetores pET 28 e pET30 (No- vagen, Madison, Wl).

Iniciadores externos de 4 D-HPG AT de P. stutzeri: N term (com Sítio de Ndel):

5'-GGCCGGCATATGTCGATCCTTAACGACTACAAACGT -3" (SEQ ID NO: 19) e C term (com sítio Xhol):

5'-GGAAGGCTCGAGTCATGATTGGTTTCCAGACAAATT -3' (SEQ ID NO: 20). Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase A seqüência gênica de P. stutzeri foi amplificada utilizando os protocolos a seguir. A reação primária da PCR de 100 μΙ_ incluía 0,05 μΜ de cada um dos 69 iniciadores internos, 0,4 mM de cada dNTP, 10 U de rTth Polimerase XL (Roche, Indianapolis, IN), 0,625 U de Pfu polimerase (Strata- gene, La Jolla, CA), 1X de tampão XL e 1 mM de Mg(OAc)2- O programa do termociclador utilizado incluía um início a quente a 94 0C durante 3 minutos, 15 repetições das etapas a seguir: 94 0C durante 30 segundos, 42 0C duran- te 30 segundos e 68 0C durante 15 segundos, seguidos por 10 repetições das etapas a seguir: 94 0C durante 30 segundos, 52 0C durante 30 segundos e 68 0C durante 30 segundos, seguidos por 10 repetições das etapas a se- guir: 94 0C durante 30 segundos, 60 0C durante 30 segundos e 68 0C duran- te 1 minuto e 15 segundos. Após os 10 ciclos finais, a amostra foi mantida a 68 0C durante 7 minutos e então armazenada a 4 °C. Este protocolo de PCR produziu um esfregaço de produto em -0,5 kb em um gel de 0,8% de TAE- agarose.

A reação secundária da PCR foi ajustada utilizando a reação primária da PCR como molde. A reação secundária de PCR de 100 μί inclu- ía 2,5 pL da reação primária da PCR, 0,5 μΜ de cada um dos 2 iniciadores externos (com os sítios de restrição de NdeI e Xho\), 0,4 mM de cada dNTP, 10 U de rTth Polimerase XL, 0,625 U de Pfu polimerase, 1X de tampão XL e 1 mM de Mg(OAc)2. O programa do termociclador utilizado incluía um início a quente a 94 0C durante 3 minutos, 10 repetições das etapas a seguir: 94 0C durante 30 segundos, 52 0C durante 30 segundos e 68 0C durante 1 mi- nuto e 30 segundos, seguidos por 15 repetições das etapas a seguir: 94 0C durante 30 segundos, 60 0C durante 30 segundos e 68 0C durante 1 minuto e 30 segundos. Após as 15 repetições, a amostra foi mantida a 68 0C duran- te 7 minutos e então armazenada a 4 °C. Este protocolo de PCR produziu uma banda de produto distinta em -1,4 kb em um gel de 0,8% de TAE- agarose.

O produto da PCR foi purificado em gel partindo do gel de 0,8% de TAE-agarose utilizando o kit de extração de gel da Qiagen (Valencia, CA). O produto foi clonado em TOPO e transformado em células TOP 10 de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). O DNA plasmideal foi purificado dos transformantes resultantes utilizando o Qiagen spin miniprep kit e verificados em relação aos insertos corretos através da digestão por restrição com NdeI e Xho\. As seqüências de plasmídeos que pareciam ter o inserto correto foram verificadas através do seqüencia de DNA com término de cadeia didesóxi com os iniciadores Μ13 para frente e M13 para trás universais. Dos 10 clones seqüenciados, todos tinham pelo menos uma mutação da seqüência desejada. O melhor clone tinha uma mu- tação em um único par de bases que resultou em uma alteração de aminoá- cido. A seqüência deste clone foi corrigida utilizando o protocolo de Quick- Change Mutagenesis de acordo com as recomentações do fabricante (Stra- tagene, La Joila, CA).

O clone TOPO corrigido foi digerido com as enzimas de restrição NdeI e Xho\ seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante (New En- gland Biolabs, Beverly, MA) e purificados em gel partindo de géis de 0,8% de TAE-agarose utilizando o kit de extração de gel da Qiagen. Os vetores pET 28 e pET 30 foram preparados através da digestão com as enzimas de res- trição Nde 1 e Xho1, seguida pelo tratamento com fosfatase alcalina de ca- marão e pela purificação dos géis de 0,8% de TAE-agarose utilizando o kit de extração de gel da Qiagen.

Os vetores e o inserto digeridos foram ligados utilizando o NEB Quick Ligation Kit (Beverly, MA). Aproximadamente 50 ng do inserto tratado, 100 ng do vetor tratado (porporção molar de 3 para 1 de inserto em relação ao vetor), 5 U de T4 DNA Iigase e 1X tampão de ligação foram incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. A mistura de ligação foi trans- formada em células quimicamente competentes TOPIOF' (Invitrogen). Foi permitido que as células se recuperassem em 0,25 mL de SOC à temperatu- ra ambiente durante 1 hora a 37 0C com agitação a 225 rpm. As células fo- ram plaqueadas em placas de LB contendo canamicina (50 pg/mL). O DNA plasmideal foi purificado dos transformantes resultantes utilizando o Qiagen spin miniprep kit e verificado em relação aos insertos corretos através da digestão por restrição com NdeI e Xho\. Expressão Gênica e Ensaios

O DNA plasmideal foi transformado no hospedeiro de expressão de E. coli BL21 (DE3) (Novagen, Madison, Wl). As culturas foram crescidas e os plasmídeos foram isolados utilizando o Qiagen miniprep kit e analisados através da digestão por restrição para confirmar a identidade.

A indução em BL21(DE3) foi realizada com a D-4-hidroxifenil- glicina aminotransferase de P. stutzeriem ambos os vetores pET 28 (marca- do com histidina) e pET 30 (não marcado). Foi realizado um estudo de curso de tempo com culturas crescidas em 250 mL de LB contendo canamicina (50 mg/L) até uma OD6oo de 0,5 - 0,6, induzidas com 100 mM de isopropil tioga- lacatosídeo ("IPTG") e foram tiradas amostras 0 e 3 horas após a indução. Um volume apropriado de células de 0 hora e 3 horas foi ressuspenso em 40 μι de tampão dodecil sulfato de sódio contendo 2-mercaptoetanol, aquecido a 95°C durante 10 min. e resfriado. Alíquotas destas amostras de proteínas celulares totais foram analisadas por SDS-PAGE utilizando um gel com gra- diente de 4-15%.

Também foram preparados extratos de células de culturas de 3 horas através da suspensão dos péletes de células de 5 mL de cultura em 0,625 mL de reagente Novagen BugBuster™ contendo 0,625 μί de benzo- nase nuclease e 3 μί do conjunto N2 3 de coquetel de inibidor de protease (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) à temperatura ambiente durante 20 minutos com agitação suave e centrifugação a 16.000 χ g para remover os restos celulares. Os sobrenadantes (extratos de células) foram carregados em géis com gradiente de 4-15% para a análise das proteínas celulares solúveis. Quando citado, a proteína foi purificada utilizando cartu- chos His-Bind 900 de acordo com os protocolos do fabricante (Novagen, Madison, Wl) e foram dessalinizadas para remover imidazol utilizando colu- nas PD-10 (G25 Sephadex, Amersham-Pharmacia). (2) Isolamento de Organismos com D-Fenilglicina Aminotransferase ("DPGAT")

Os organismos do gênero Pseudomonas e gêneros similares, com uma D-fenilglicina aminotransferase de estereoinversão (também cha- mada de D-4-hidroxifenilglicina aminotransferase) são isolados da maneira a seguir. As amostras de solo são incubadas em placas de Petri com o meio a seguir: (por litro) 15 g de ágar, 3,4 g de KH2PO4, 3,55 g de Na2HPO4, 0,2 g de MgS04-7H20, 8 mg de CaCI2-2H20, 10 mg de extrato de levedura, 1 mL de solução 1000x de elementos traços (Balch, W.E. e outros, "Metanogens: reevaluation of a unique biological group", Microbiol. Rev. 43:260-296, (1979)) e 1 g de D-fenilglicina (D-4-hidroxifenilglicina).

Os isolados são testados através da PCR em relação à presen- ça de uma aminotransferase de estereoinversão (os iniciadores são planeja- dos partindo de D-fenilglicina aminotransferases conhecidas) ou são adicio- nalmente enriquecidos em relação à presença de uma aminotransferase de estereoinversão como a seguir: os isolados das placas poderiam ser cresci- dos em meio líquido como acima, sem o ágar, a 30 0C com agitação até uma OD6Oo de aproximadamente 1,0. As células são coletadas por centrifugação e lavadas duas vezes com 0,85% de NaCI. Uma amostra de 10 mg (peso úmido) é suspensa em 1 mL de tampão fosfato de potássio (pH 7,0) e 5 mM de D-fenilglicina ou D-4-hidroxifenilglicina. O ácido (aminoóxi)acético a 15 mM neutralizado é adicionado em amostras em duplicata preparadas como descrito anteriormente. O consumo de D-fenilglicina (ou de D-4-hidroxigli- cina) é medido por HPLC.

Os isolados capazes de degradar a D-fenlyglicina (ou a D-4-hidro- xifenilglicina), mas o fazem em uma taxa mais lenta na presença do ácido (aminoóxi)acético, são selecionados para análise adicional. Os isolados são testados, por POR, em relação à presença de uma aminotransferase de es- tereoinversão (os iniciadores são planejados partindo de D-fenilglicina ami- notransferases conhecidas).

A presença da aminotransferase de estereoinversão é confirma- da através do crescimento de uma cultura em um meio líquido como descrito anteriormente, coletando as células e produzindo um extrato bruto isento de células ("CFE") e testanto em relação à atividade enzimática de D-fenilglicina aminotransferase ou de D-4-hidroxifenilglicina aminotransferase. O CFE é adicionado em uma mistura de reação com as concentrações finais a seguir: 0,1 M de ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanossulfônico ("CAPS") (pH 9,5), 60 mM de L-glutamato (sal de sódio), 5 mM de benzoilformiato ou de 4- hidroxibenzoato e 50 μΜ de PLP.

A reação inversa é medida através da adição de CFE em uma mistura de reação com as concentrações a seguir: 50 mM de fosfato de po- tássio (pH 7,0), 60 mM de D-fenilglicina ou de D-4-hidroxifenilglicina, 5 mM de α-cetoglutarato e 50 μΜ de PLP. Os ensaios são incubados a 35°C e são tiradas alíquotas em pontos de tempo e interrompidas através da fervura durante 2 minutos. O produto será quantificado através do método de HLPC de Gil-Av, E. e outros, "Resolution of underivatized amino acids by reversed phase chromatography", J. Am. Chem. Soc., 102.5115-5117, (1980) ou atra- vés dos métodos descritos no Exemplo 1 direcionados para a medida da formação de glutamato.

Como uma alternativa para os métodos baseados na PCR, a D-fenil- glicina aminotransferase de estereoinversão é purificada das bactérias isoladas através de técnicas convencionais de purificação de proteínas, incluindo o fracio- namento com sulfato de amônio e a cromatografia em coluna convencional. Uma vez que a proteína foi purificada até um grau razoável, são utilizadas técnicas de microsseqüenciamento de peptídeos ou o seqüenciamento convencional de a- minoácidos do tipo Edman (vide http://golgi.harvard.edu/microchem/ para descrições dos protocolos e do equipamento utilizado para este tipo de tra- balho). Os iniciadores degenerados são planejados com base na seqüência disponível do relativo conhecido mais próximo da fonte de proteína. A PCR degenerada e o "genome walking" são então realizados de acordo com pro- tocolos estabelecidos para isolar a seqüência codificadora da D-fenilglicina aminotransferase de estereoinversão. (3) Produção de DPGATMonatina

As D-hidroxifenilglicina aminotransferases, como descrito em (1) e (2) acima, são utilizadas em extratos de proteínas brutos isentos de células ou purificadas como descrito em (1) acima. As tirosina (aromática) amino- transferases de S. meliloti e R. sphaeroides são preparadas como descrito no Exemplo 1 do WO 03/091396 A2. A ProA aldolase de Comamonas tes- tosteronié preparada como descrito no Exemplo 4 do WO 03/091396 A2. Os ensaios de proteínas totais são feitos utilizando o Bio-Rad Protein Assay de acordo com os protocolos do fabricante (Hercules, CA).

As misturas de reação (volume de 1 ml_, corrido em duplicata) contêm 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 8), 2 mM de MgCI2, 0,05 mM de 5-fosfato piridoxal ("PLP"), 200 mM de piruvato de sódio, 5 mM a- cetoglutarato de sódio, aproximadamente 280 Mg/mL de TatA de S. meliloti fornecidos em um extrato celular, 100 pL/mL de extrato celular de D-hidroxi- fenilglicina aminotransferase ou 1 mg/mL de D-hidroxifenilglicina aminotrans- ferase purificada e aproximadamente 100 Mg/mL de ProA aldolase forneci- dos na forma de um extrato celular. O triptofano sólido é adicionado em uma concentração de 10,2 mg/mL. Os controles negativos são montados sem D- hidroxifenilglicina aminotransferase. As amostras são incubadas a 30°C com agitação suave durante ~1 hora ou durante a noite. As amostras são centri- fugadas para remover o precipitado, filtradas com seringa e armazendas a -80°C antes da análise em relação à monatina utilizando o método de LC/MS/MS descrito no Exemplo 1.

As D-hidroxifenilglicina aminotransferases com maior atividade em relação à produção de monatina são obtidas utilizando técnicas de mu- tagênese conhecidas pelos versados na técnica, incluindo: PCR mutagênica, passagem através de cepas mutagênicas, mutagênese direcionada ao sítio, PCR propensa a erros ou através de métodos tal como o embaralhamento de DNA ou outras tecnologias de evolução direcionada. As D- hidroxifenilglicina aminotransferases melhoradas são selecionadas através do crescimento em meio mínimo com R.R-monatina como a fonte de nitro- gênio. Inicialmente, a seleção se baseia no crescimento, mas as aminotrans- ferases melhoradas são selecionadas e a verificação se baseia na taxa de crescimento. Ou seja, as células com versões mutadas do gene são cultiva- das e o gene é expresso em meio mínimo com R,R-monatina como a fonte de nitrogênio. As taxas de crescimento das células com as versões mutadas do gene são comparadas com as daquelas com a versão não mutada. Tais células com uma taxa de crescimento mais rápido são selecionadas e a a- minotransferase é analisada adicionalmente. A D-hidroxifenilglicina amino- transferase pode ser adicionalmente mutagenizada até que a atividade dese- jada seja obtida. (4) Ensaio de DPGAT

A versão não marcada com His da DPGAT foi expressa como descrito em (1) acima e os extratos foram utilizados nos ensaios. Os ensaios foram montados e incluíam 100 mM de fosfato de potássio pH 7,0, 60 mM de D-fenilglicina, 5 mM de α-cetoglutarato e 50 μΜ de piridoxal-5'-fosfato. Os ensaios foram iniciados através da adição de 100 μΙ_ de extrato, preparado como descrito anteriormente neste exemplo, por mL de volume de ensaio. Foram tiradas amostras em vários pontos de tempo (0, 1, 2, 5, 10, 30, 60 e 120 minutos) e foram interrompidas com um volume equivalente de ácido fórmico a 2 M. Também foi tirada uma amostra após a incubação durante a noite (-1200 minutos). As amostras foram analisadas em relação à produção de glutamato através do método de OPA descrito no Exemplo 1. Os resulta- dos estão resumidos na Tabela 33 abaixo.

Tabela 33

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A enzima claramente possui alguma atividade sobre a D- fenilglicina. A atividade enzimática também foi testada sobre R1R monatina. O ensaio foi montado como descrito anteriormente e a R,R monatina foi in- cluída em uma concentração de 60 mM. Os resultados são indicados abaixo na Tabela 34.

Tabela 34

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Não parecia haver qualquer atividade detectável sobre a R1R monatina. Entretanto, era esperado que os métodos aleatórios ou de SDM descritos nesta parte (3) deste exemplo pudessem ser utilizados para au- mentar a atividade de transaminação sobre a R1R monatina ou o R-MP. Por exemplo, foram feitas as análises de cristalização e preliminar da enzima de P. stutzerí. Kongsaeree, P. e outros, Acta Cryst. D59:953-954, (2003). Uma vez que a estrutura está publicada, podem ser feitos experimentos de anco- ragem utilizando um software tal como Accelrys, para determinar quando impedimentos esféricos ou repulsão iônica pode ser um fator de proibição da R,R monatina de se ligar com o sítio de ligação ao substrato da D- hidroxifenilglicina. A D-hidroxifenilglicina é um aminoácido de alguma manei- ra grande, assim como a R1R monatina. Ambos os compostos possuem re- giões hidrofílicas e grupos hidroxila. Podem ser feitas modificações na bolsa de ligação, como descrito no Exemplo 6, para tornar a enzima mais suscep- tível aos substratos de ácido dicarboxílico. Por exemplo, um resíduo próximo ao segundo grupo carboxila pode ser modificado para uma base tal como arginina. Adicionalmente, o gene de P. putida descrito na parte (1) e os ge- nes adicionais que podem ser isolados como descrito em (2) podem ser utili- zados como moldes para o embaralhamento gênico. Adicionalmente, o gene de P. stutzerí montado neste exemplo pode sofrer mutagênese utilizando o embaralhamento de oligonucleotídeos ou outros métodos de mutagênese aleatória e verificado como descrito em (3) acima.

Exemplo 11

Descoberta de um Gene de D-Metionina Aminotransferase Fundamento

Acredita-se que a D-metionina—piruvato aminotransferase (EC 2.6.1.41) seja um outro exemplo, embora raro, de uma transaminase de es- tereoconversão. Esta enzima catalisa a conversão reversível de D-metionina e piruvato em L-alanina e 4-metiltio-2-oxobutanoato. Oxaloacetato, fenilpiru- vato, 2-oxobutirato, 2-oxovalerato, 2-oxoheptanoato, glioxilato e oxoglutarato também podem servir como receptores de amino.

Acredita-se que a transaminação de D ou L metionina faça parte de uma via para a produção de etileno em plantas superiores (couve-flor, tomate, maçã, caule de ervilha, banana, amendoim), assim como em micro- organismos do solo (Escherichia coli, Pseudomonas pisi, Pseudomonas ae- ruginosa, Bacillus mycoides, Acinetobacter calcoaceticus, Aeromonas hidro- phila B12E, Rhizobium trifolii N2P7, Penieillium digitatum, Saccharomyees cerevisiae, Corynebaeterium D7F). Billington, D.C. e outros, Bioehem J. 752:827-836, (1978). Nas bactérias, a L-metionina é tipicamente utilizada como o substrato nos estudos de produção de etileno e acredita-se que as enzimas de especificidade tal como TyrB ou AspC de E. coli são responsá- veis pela transaminação. Entretanto, Primrose, S.B., J. Gen. Mierobiol 95:159-65, (1976) e Primrose, SB., J. Geri. Microbiol. 98:519-528, (1977) mostraram que a cepa SPA O de E. coli (University of Warwick culture col- lection) produzia quase tanto etileno partindo de D-metionina quanto partindo de L-metionina em culturas em batelada. Devido ao fato de que nenhuma D-aminotransferase de especificidade ampla foi identificada em E. coli, uma explicação possível poderia ser que a D-aminoácido desidrogenase de E. coli (codificada pelo gene dadA) converte a D-metionina em 4-metiltio-2- oxobutanoato. É também possível que haja uma metionina racemase em E colr, entretanto, nenhuma tal enzima foi descrita na litroatura.

Em contraste a E. coli, nos flósculos de couve-flor (preparações de extrato mitocondrial) e sementes de amendoim em germinação, a produção de etileno era maior quando a D-metionina e o piruvato foram fornecidos ao ex- trato enzimático quando comparada com L-metionina e piruvato. Mapson, L.W. e outros, Biochem J. 7 75:653-661, (1969); Durham, J.l. e outros, Phyto- chemistry 72:2123-2126, (1973). Portanto, a possibilidade de uma combi- nação de metionina racemase e uma L-aminotransferase não é sustentada pelos dados. A atividade de desidrogenase foi impedida pela diálise de ex- tratos celulares de couve-flor; nenhum NAD estava presente nas misturas de ensaio. A atividade de oxidase foi impedida uma vez que não foi observado consumo de oxigênio e não havia requerimento de FAD. A D-metionina ami- notransferase de tecidos de amendoim foi purificada, mostrada como sendo dependente de PLP e mostrada como sendo independente da atividade de L-metionina aminotransferase. Havia uma possibilidade de que estas D- metionina—piruvato aminotransferases realmente produzem D-alanina como um subproduto (similarmente às enzimas de Bacillus descritas nos Exemplos 2 e 3) e que as células contêm alanina racemase para reciclar a D-alanina de volta em L-alanina (ou um doador de amino análogo). Em qualquer um dos casos, a descoberta da D-aminotransferase de especificidade ampla de plantas superiores é vantajosa para o desenvolvimento de processos que produzem R,R monatina ou S,R monatina. Resumo Experimental

A D-metionina aminotransferase é parcialmente purificada de flósculos de couve-flor e de embriões de amendoim em germinação utilizan- do protocolos padronizados de cromatografia e um sistema Pharmacia AKTA Explorer. As seqüências de proteínas de proteínas homólogas são determi- nadas por técnicas de fingerprinting por LC/MS/MS e buscas em bancos de dados realizadas pela Harvard Microchemistry facility (Unidade de Micro- química de Harvard). As regiões codificadoras dos genes vegetais são clo- nadas partindo de uma biblioteca de cDNA utilizando protocolos padroniza- dos de PCR ou através da síntese do gene como descrito no Exemplo 10(7).

Alternativamente, as bibliotecas de expressão de cDNA são construídas (Stratagene, La Jolla, CA) partindo de tecido de couve-flor ou de sementes de amendoim cultivadas na presença de D-metionina (e produzin- do etileno). As bibliotecas são transformadas em E. coli auxotrófica em rela- ção à metionina provenientes do E. coli Genetic Stock Center (YaIe) tais co- mo as cepas RC519 ou AB1931. Os plasmídeos de cepas capazes de cres- cer em meio mínimo contendo D-metionina contêm a região codificadora de interesse (vide o Exemplo 4( 1), uma técnica de seleção análoga).

Uma vez que as regiões codificadoras de interesse são obtidas e são expressas em uma cepa de laboratório padronizada de E. coli, os produ- tos gênicos resultantes podem ser utilizados em ensaios para produzir R,R monatina, como descrito no Exemplo 10(3), no lugar da D-hidroxifenilglicina aminotransferase, com a exceção do pH sendo de 7,5 (o pH ótimo para a aminotransferase). Se a D-metionina aminotransferase tiver um requerimen- to estrito por substratos doadores de D-aminoácidos, a enzima pode ser uti- lizada para produzir R,R monatina como descrito nos Exemplos 2 e 3. O ge- ne pode sofrer mutagênese e ser verificado em relação à maior atividade como descrito no Exemplo 10(3). Métodos

Isolalamento partindo de Couve-flor

Quatrocentos gramas de flósculos de couve-flor recém picados são extraídos com 400 mL de uma solução de sacarose/tampão a 4°C (0,4 M de sucrose e 0,1 M de tampão fosfato de sódio pH 7,4) alternado a imer- são e a mistura utilizando uma misturadora. Os restos celulares são removi- dos por filtração com gaze de algodão e a solução resultante é centrifugada a 40.000 x g durante 30 minutos a 4°C. O material sólido (contendo organe- las mitocondriais) é ressuspenso em 20 mL de 10 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,4 e as enzimas são extraídas com 200 mL de acetona gelada (- 30°C). A suspensão é centifugada novamente e o precipitado é seco utili- zando um Savant Speed Vac. O material sólido é dissolvido em 10 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,4 e a acetona residual é removida utilizando uma coluna PD-10.

A atividade de aminotransferase é analisada através da incuba- ção da preparação enzimática com 5 mM de D-metionina, 1 mM de piruvato, 0,05 mM de PLP e 2 mM de EDTA em 0,1 M de tampão fosfato de sódio pH 7,4. Os ensaios são realizados a 25°C durante 16 horas. O 4-metiltio-2- oxobutanoato é medido através da formação do derivado de 2,4- dinitrofenilhidrazona, utilizando LC/MS (m/z de 328) e metodologia similar descrita no Exemplo 1. Uma solução a 0,4% (p/v) de 2,4-dinitrofenilhidrazina em 2 M de ácido sulfúrico é preparada e a metade do volume é adicionada na mistura de ensaio após a incubação. A mistura é realizada com agitação suave a 30°C durante 30 minutos e o precipitado é coletado por centrifuga- ção e analisado por LC/MS. As frações de proteína separadas através de técnicas padronizadas de cromatografia são analisadas em relação à ativi- dade de uma maneira similar, mas o co-produto alanina é medido através da técnica de derivatização pós-coluna de OPA descrita no Exemplo 1.

Isolamento do Amendoim (Arachia hvpogea L. cv. Starr)

A enzima D-metionina aminotransferase proveniente do homo- genado de embrião de amendoim em germinação (sem os cotilédones) é purificada de acordo com o método de Durham, J.I. e outros, Phytochemistry 12:2123-2126, (1973). Os agentes redutores são utilizados durante a prepa- ração de extratos brutos para estabilizar as enzimas e os restos celulares são removidos por centrifugação a 33.000 x g. Uma fração de 35-50% de sulfato de amônio é adicionalmente purificada através da incubação à tem- peratura baixa e através da remoção das proteínas no precipitado. O sobre- nadante é adicionalmente fracionado utilizando acetona. Os conjuntos ativos são então adicionalmente purificados através de cromatografia por filtração em gel (Sephadex 200 G.E. Healthcare, Piscataway1 NJ).

As frações de proteína ficam enriquecidas com a proteína tran- saminase, a eletroforese em 2D-gel é utilizada para separar a enzima de interesse para o microsseqüenciamento. Após elucidar as regiões codifica- doras homólogas nas seqüências de plantas depositadas no NCBI, a proteí- na D-aminotransferase é produzida de forma recombinante em Escherichia coli utilizando técnicas padronizadas de biologia molecular. É esperado que os extratos celulares de flósculos de couve-flor ou de sementes de amendo- im ou enzimas homólogas produzidas de forma recombinante possam ser utilizadas na produção de R,R monatina como descrito no Exemplo 10(3) (se uma transaminase de estereoconversão) ou nos Exemplos 2 e 3 (se uma D- aminotransferase de especificidade ampla).

Exemplo 12

L-Alanina Aminotransferase/Alanina Racemase/D-Alanina Aminotransferase

A Figura 8 ilustra a via biossintética para a produção de R,R mo- natina enriquecida de forma enanciomérica partindo de L-triptofano utilizan- do L-aminoácido aminotransferases (tais como aminotransferases L-aromá- ticas, L-alanina-aminotransferases e/ou L-triptofano-aminotransferases), uma aldolase específica a R, uma alanina racemase e uma D-alanina aminotrans- ferase.

Uma aminotransferase específica ao triptofano é descrita no E- xemplo 6. Alternativamente, as tirosina (aromática) aminotransferases de S. meliloti e R. sphaeroides são preparadas como descrito no Exemplo 1 do WO 03/091396 A2. A ProA aldolase de Comamonas testosteroni é prepara- da como descrito no Exemplo 4 do WO 03/091396 A2. Os ensaios de proteí- na total são realizados utilizando o Bio-Rad Protein Assay de acordo com os protocolos do fabricante (Hercules, CA). A alanina racemase é obtida na Sigma (St. Louis, MO) (número de catálogo A8936). A D-alanina aminotrans- ferase é obtida na BioCataIytics (Pasadena, CA) (número de catálogo AT- 103).

As L-alanina aminotransferases estão amplamente distribuídas em eucariotos, bactérias e archaeas. Os organismos a seguir foram identifi- cados (com base na homologia de seqüência) como contendo uma L-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.2): Arabidopsis thaliana, Ashbya gossypii, Azo- tobacter vinelandii, Bifidobacterium longum, Caenorhabditis elegans, Candi- da albicans, Candida glabrata, Chlamydomonas reinhardtii, Cryptococcus neoformans, Debaryomyees hansenii, Homo sapiens, Hordeum vulgare, Kluyveromyces laetis, Magnaporthe grisea, Medieago truneatula, Mus mus- eulus, Neurospora crassa, Oryza sativa, Phaneroehaete ehrysosporium, Pi- nus taeda, Pseudomonas putida, Pyroeoceus abyssi, Pyroeoeeus furiosus, Pyroeoeeus horikoshii, Rattus norvegieus, Saccharomyees eerevisiae, Schi- zosaeeharomyees pombe, Takifugu rubripes, Trypanosoma eruzi, Vibrio eho- lerae, Vibrio parahaemolytieus, Vibrio vulnifieus, Yarrowia Iipolitiea e Zea mays. Adicionalmente, muitas aminotransferases possuem atividade de ala- nina aminotransferase em baixos níveis e quando recebem altos níveis de L- glutamato e piruvato podem convertê-los em L-alanina e a-cetoglutarato. Uma enzima com baixa atividade é melhorada com técnicas padronizadas de mutagênese, tais como PCR propensa a erros e passagem através de cepas mutagênicas ou através de técnicas de evolução direcionada. O gene para uma L-alanina aminotransferase é clonado utilizando seqüências dis- poníveis publicamente para planejar iniciadores e utilizando técnicas padro- nizadas para amplificar, clonar, expressar e purificar o gene/enzima.

As misturas de reação (volume de 1 mL, corridas em duplicata) contêm 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 8), 2 mM de MgCI2, 0,05 mM de 5-fosfato piridoxal ("PLP"), 200 mM de piruvato de sódio, 5 mM de α-cetoglutarato de sódio, aproximadamente 280 Mg/mL de TatA de S. meiiloti fornecidos em um extrato celular (ou outra aminotransferase específica ao L- triptofano) (como no Exemplo 4 seção (5)), 100 pg de uma L-alanina amino- transferase, 100 MLVmL de extrato celular de alanina racemase ou 1 mg/mL de alanina racemase purificada (Sigma), aproximadamente 280 pg/mL de uma D-alanina aminotransferase de especificidade ampla fornecidos em um extrato celular (os Exemplos 15 e 18 possuem exemplos de D- aminotransferases que poderiam funcionar nesta reação) e aproximadamen- te 100 Mg/mL de ProA aldolase fornecidos em um extrato celular. Sólido trip- tofano é adicionado à concentração de 10,2 mg/mL. Os controles negativos são montados com alanina racemase. As amostras são incubadas a 30°C com agitação suave durante ~1 hora ou durante a noite. As amostras são centrifugadas para remover o precipitado, filtradas com seringa e armazena- das a -80°C antes da análise em relação à monatina utilizando o método de LC/MS/MS descrito no Exemplo 1. Exemplo 13

Purificação de R.R-Monatina partindo de uma Mistura de Reação Enzimática

O produto, R,R-monatina, foi purificado partindo da mistura de reação a seguir. Em 0,33 litro, 50 mM de bicarbonato de amônio, pH 8,2, 4 mM de MgCI2, 0,05 mM de fosfato piridoxal ("PLP"), 200 mM de piruvato de sódio e 50 mM de D-triptofano foram misturados à temperatura ambiente em uma garrafa de vidro de 500 ml_ até que o triptofano dissolvesse. O líquido foi purgado com nitrogênio durante vários minutos e então 3,0 mg/mL de D- transaminase de faixa ampla da Biocatalytics, Inc. (Pasadena, CA) (N- de Catálogo AT-103) e 0,1 mg/mL de aldolase purificada da SEQ ID NO: 22 foram adicionados. A mistura de reação foi agitada suavemente à temperatu- ra ambiente. A aldolase foi purificada como descrito no Exemplo 3. Alíquotas adicionais de 50 mM de D-triptofano foram adicionadas na forma de um sóli- do 15 horas e 22 horas após a mistura ter sido inicialmente preparada. O espaço superior foi purgado com nitrogênio após cada adição. Todo o tripto- fano adicionado não se dissolveu, mas a concentração foi mantida em apro- ximadamente 50 mM. Após 40 horas, o restante do triptofano sólido foi extra- ido por filtração. A análise da mistura de reação através de cromatografia líquida com detecção por fluorescência pós-coluna (vide o Exemplo 1) mos- trou que a concentração de triptofano na solução era de 49 mM e a concen- tração de monatina era de 3,9 mM.

O produto monatina foi purificado utilizando duas etapas de cro- matografia de troca iônica. A solução de reação filtrada foi primeiro aplicada em uma coluna de resina BioRad AG50W-X8 (140 mL; capacidade de liga- ção de 1,7 meq/mL). A coluna foi lavado com 2 χ 150 mL de H2O e então eluída com 1 M de NH4OH (1 χ 450 mL, seguido por 3 χ 150 mL). As frações de NH4OH foram combinadas, neutralizadas com HCI e filtradas sucessiva- mente através de filtros de microfibra de vidro da Whatman (Maidstone, In- glaterra) e filtros de 0,45 μΜ da Gelman Sciences (Ann Arbor, Ml). A solução clarificada foi então ultrafiltrada utilizando uma célula agitada de ultrafiltração da Amicon (Millipore; Billerica, MA) (Model 8200) com um YM100 (MWCO 100 kDa). O filtrado proveniente da ultrafiltração foi evaporado até aproxima- damente 160 mL utilizando um roto-evaporador com um banho de água morna. O líquido foi novamente clarificado por filtração através de filtros de microfibra de vidro.

A solução resultante foi aplicada em uma coluna Fast Flow DE- AE Sepharose de 1 L (Amersham Biosciences) convertida anteriormente para a forma de bicarbonato através da lavagem com 0,5 L de 1 M de Na- OH, H2O, e 1,0 M de bicarbonato de amônio, pH 8,3, seguida por uma Iava- gem adicional utilizando H2O. A solução foi carregada a <2 mL/min. e a co- luna foi lavada com água a 3-4 mL/min. até a absorbância em 280 nm ser <1. A R,R-monatina foi eluída com 50 mM de bicarbonato de amônio, pH 8,3 (2,5 L). Esta fração foi evaporada utilizando um roto-evaporador com um banho de água morna. O xarope resultante foi incubado a 4°C durante vários dias até os cristais serem formados. Os cristais foram congelados, lavados com etanol a 100% gelado e secos em um dessecador a vácuo (0,38 g).

A análise do produto sólido em relação à pureza isomérica utili- zando derivatização por FDAA, seguida pelo monitoramento de várias rea- ções por LC/MS/MS, (vide o Exemplo 1) mostrou que a amostra era constítu- ida de 96,3% de R,R monatina e 3,7% de S,R-monatina.

A amostra também foi analisada em relação à pureza conside- rando outros compostos orgânicos utilizando o método de monatina total (vide o Exemplo 1). A absorbância de UV foi verificada de 200-500 nm utili- zando um detector Photodiode Array. Com base nas áreas de picos integra- dos, a monatina correspondia a 96,1% da área (incluindo ambos os picos de R1ReS1R).

A análise da amostra através de cromatografia líquida com de- tecção por fluorescência pós-coluna mostrou que a composição de aminoá- cidos da amostra era de 98,8% de monatina com quantidades traço de tripto- fano (1,2%) e alanina (0,02%).

A análise dos elementos foi realizada no Midwest Microlab, LLC (Indianapolis, IN). Esta análise indicava que a amostra continha 1% de mate- rial não combustível (inorgânico) em peso e resíduos de amônio e bicarbo- nato.

Exemplo 14

Aumento da Retenção da Atividade da D-aminotransferase Durante a Purifi- cação

Procedimento Padronizado para a Purificação de HISe-D-alanina Amino- transferase de B. sphaericus

Partindo de uma placa de cultura fresca (LB ágar com 50 pg/mL de canamicina) de BL21(DE3)::S. sphaericus dat pET30a (Exemplo 18), as células foram crescidas em 5 mL de meio Luria-Bertani ("LB") com 50 pg/mL de canamicina, a 37 0C e 225 rpm durante 3 - 5 horas. Subseqüentemente, a cultura foi transferida a 0,25% (v/v) para frascos contendo as soluções 1-6 do Novagen Overnight Express System Il (EMD Bioscience, Madison, Wl) mais 50 pg/mL de canamicina. As células foram crescidas a 37°C e 225 rpm durante a noite (16-18 horas). Quando a OD6oo era de aproximadamente 8,0, as células foram coletadas por centrifugação em uma centrífuga Beckman (Fullerton, CA) J25II com um rotor JS-16.25 a 10.000 rpm durante 10 minu- tos. O pélete de células foi lavado uma vez com 50 mM de tampão EPPS gelado (pH 8,2) e as células foram centrifugadas novamente. O pélete de células lavado foi coletado e utilizado imediatamente ou congelado a -80°C até a necessidade de purificação.

Para preparar o extrato isento de células contendo a proteína HIS6-D-alanina aminotransferase de B. sphaericus (HISe-BsphDAT), as célu- las foram suspensas em 3-4 volumes de 50 mM de EPPS, pH 8,2 e então rompidas utilizando um homogeneizador Microfluidics (Newton, MA) (3 pas- sagens a 137,89 MPa (20.000 psi)), mantendo a temperatura da suspensão abaixo de 15°C. Todas as etapas de purificação subseqüentes foram reali- zadas a 4°C. O extrato de células foi centrifugado durante 15 minutos a 15.000 χ g para remover os restos celulares. O sobrenadante foi decantado e utilizado imediatamente ou congelado a -80°C. Uma alíquota do extrato isento de células foi aplicada em colunas Novagen HIS-Bind (Ns de Catálogo 70971-4) ou em uma coluna de resina GE Healthcare (Piscataway, NJ) Che- Iating Sepharose™ Fast Flow (forma de níquel(ll)) (em uma proporção de 1,2 - 1,5 v/v) que tinha sido equilibrada anteriormente com 50 mM de EPPS, pH 8,2, contendo 200 mM de cloreto de sódio. Após carregar a amostra, a coluna foi lavada/eluída sucessivamente com 3 - 5 volumes do tampão de equilíbrio, 3-5 volumes do tampão de equilíbrio contendo 25 mM de imida- zol, 3-5 volumes do tampão de equilíbrio contendo 100 mM de imidazol e 3 - 5 volumes do tampão de equilíbrio contendo 500 mM de imidazol. A prote- ína HIS6-BsphDAT foi eluída na última lavagem. A lavagem com 500 mM de imidazol foi concentrada 2 - 10X com dispositivos de filtração por centrifuga- ção Amicon (Billerica, MA) Centricon-70 ou Ultra-15 (MWCO 10 kDa). O imi- dazol e o cloreto de sódio foram removidos através da passagem por colu- nas de dessalinização GE Healthcare PD10 descartáveis equilibradas ante- riormente com 50 mM de EPPS, pH 8,2, contendo 50 μΜ de PLP.

A concentração de proteína da solução dessalinizada foi deter- minada utilizando o kit de ensaio de BCA da Pierce (Rockford, IL). A pureza de cada fração e o nível de expressão na fração de extrato isento de células foram determinados utilizando um sistema de chip em microcapilares Bi- o-Rad (Hercules, CA) Experion Pro260 ou através de SDS-PAGE com géis de gradiente de 4-15%. Tipicamente, este procedimento produz mais de 300 mg de enzima (partindo de 600 mL da cultura Overnight Express II) que é -90% pura quando julgada pelo software Experion. As alíquotas (1-5 mL) da enzima purificada foram armazenadas a -80 0C até o uso. Procedimento Melhorado

O extrato isento de células foi preparado como descrito anteri- ormente. A proteína His6-BsphDAT foi purificada similarmente com as altera- ções a seguir: todos os tampões utilizados para o rompimento das células e para a purificação de proteína continham 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8. com 50 μΜ de PLP. A proteína foi purificada exclusivamente com a resi- na GE Healthcare Chelating Sepharose™ Fast Flow (forma de níquel(ll)). Ensaio da Atividade

A formação de indol-3-piruvato e alanina partindo de triptofano e piruvato foi analisada utilizando a enzima preparada através de ambos os procedimentos de purificação. As misturas de reação continham 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8, 0,05 mM de fosfato piridoxal, 100 mM de piruva- to de sódio, 40 mM de D-triptofano e 0,03 - 0,1 mg/mL de enzima purificada. O triptofano foi adicionado na forma de um sólido. Todos os componentes exceto a enzima foram misturados juntos e incubados a 30 0C até que o trip- tofano dissolvesse. A enzima foi então adicionada e a solução de reação foi incubada à temperatura ambiente. Em pontos de tempo pré-determinados, foram tiradas amostras das reações e as amostras foram armazenadas ime- diatamente em gelo e diluídas para a análise de alanina através do método de cromatografia líquida com detecção por fluorescência pós-coluna descrito no Exemplo 1. A Tabela 34 abaixo lista a atividade específica das prepara- ções de enzimas na forma da concentração de alanina formada por mg de enzima por minuto.

Tabela 34: Efeito do Procedimento de Purificação Melhorado sobre a Ativi- dade da Enzima

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Os resultados mostrados na Tabela 34 indicam que o uso de fosfato piridoxal durante o processo de purificação resultou em uma maior atividade.

Exemplo 15

Clonagem de Duas Novas D-Aminoácido Aminotransferases de Bacillus Várias D-aminoácido aminotransferases de Bacillus (EC 2.6.1.21, também conhecida como D-alanina aminotransferase ou D-aspartato amino- transferase) foram produzidas de forma recombinante para uso em ensaios acoplados para a produção de R1R monatina, como descrito no Exemplo 18. Estas enzimas são homólogas às D-aminotransferases descritas anterior- mente para a produção de monatina (Publicação U.S. N- 20040063175 e Publicação U.S. N- 2005282260). Uma abordagem utilizada para a seleção de cepas que poderiam ser candidatas contendo novas D-aminoácido ami- notransferases ("DAATs") era para revisar a lista de cepas de B. sphaericus depositadas na ATCC e analisar algumas que foram depositadas anterior- mente sob nomes de espécies diferentes. Os organismos a seguir foram en- comendandos da ATCC: ATCC 4978 -- Bacillus sphaericus depositado origi- nalmente como Bacillus rotans e ATCC 7063 - Bacillus sphaericus deposi- tado originalmente como Bacillus serositidis e ATCC 21538 - Bacillus sphae- ricus depositado originalmente como Bacillus circulans. As seqüências de proteína de DAAT conhecidas provenientes de Bacillus sphaericus, Bacillus halodurans, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis e Bacillus Iicheniformis foram alinhadas para a obtenção de regiões de se- qüência que eram conservadas em várias proteínas DAAT. Os iniciadores foram planejados nas regiões de conservação de seqüências de proteína e utilizados para a amplificação através de reações em cadeia da polimerase ("PCR") de seqüências gênicas de DAAT das cepas da ATCC mencionadas anteriormente.

Cinco iniciadores da PCR foram planejados com base nas regi- ões conservadas no alinhamento de seqüências de DAAT de Bacillus publi- cadas (vide o alinhamento na figura 9).

Protocolo da Reação em Cadeia da Polimerase

Os iniciadores foram projetadps como mencionado anteriormen- te com base nas regiões conservadas em um alinhamento de DAATs. As Seqüências dos Iniciadores de Oligonucleotídeo estão indicadas abaixo: 5' GAAGACCGTGGTTATCAATTT 3' (SEQ ID NO: 65) (iniciador para frente), 5' GATGGTATTTACGAAGTAATC 3' (SEQ ID NO: 66) (iniciador para frente), 5' AGATTTAATATCACAACGTAAC 3' (SEQ ID NO: 67) (iniciador para trás), 5' GCCAAGTAAAATTTAAGATTTA 3'(SEQ ID NO: 68) (iniciador para trás), 5' ATTTGCTGGGTGCGTATAAAG 3' (SEQ ID NO: 69) (iniciador para trás). Tamanhos esperados de fragmentos de PCR com base no alinhamento de combinações de iniciadores com DAATs conhecidas: SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 67 - aprox. 380 bp, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 68 - aprox. 395 bp, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 69 - aprox. 534 bp, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 67 - aprox. 336 bp, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 68 - aprox. 346 bp, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 69 - aprox. 510 bp.

As combinações dos iniciadores acima foram utilizadas para a POR de colônia partindo das cepas da ATCC a seguir: ATCC 4978 -- Bacil- Ius sphaericus, originalmente depositado como Bacillus rotans; ATCC 7063 - - Bacillus sphaericus, originalmente depositado como Bacillus serositidis; e ATCC 21538 - Baeillus sphaericus, originalmente depositado como Bacillus circulans.

As três cepas mencionadas anteriormente foram crescidas em ágar nutriente a 30°C. Uma colônia isolada foi raspada das placas e ressus- pensa em 25 μL de água destilada esterilizada. As células foram Iisadas a 96°C durante 10 minutos. A PCR foi realizada como a seguir: por reação de 50 μL, 5 μl de células lisadas, 0,8 μLde cada iniciador, 2 μL de dNTPs, 0,8 20 μL de Expand High Fidelity Polimerase (Roche, Indianapolis, IN) e 1X tam- pão Expand™ foram adicionados. Um início a quente de 3 minutos foi reali- zado a 94°C, seguido por 15 ciclos de 94 0C durante 30 segundos, 40°C durante 45 segundos e 72°C durante 2 minutos. Mais quinze ciclos foram realizados com uma temperatura de alinhamento maior de 45 °C. Por último, uma etapa de extensão de cadeia foi realizada durante sete minutos a 72 °C. Várias combinações de iniciadores forneceram os tamanhos esperados dos produtos da PCR para as cepas acima. Os produtos da PCR foram clo- nados utilizando o kit de clonagem Zero Blunt TOPO® como pelos protocolos dos fabricantes (Invitrogen) e seqüenciados através do seqüenciamento de DNA com término de cadeia didesóxi na Agencourt BioScience Corporation (Beverly, MA). As seqüências tanto no nível de DNA quanto de aminoácidos foram alinhadas com a seqüência DAAT de B. sphaericus DAAT. As se- qüências de DAAT/DAT válidas foram obtidas partindo de todas as três ce- pas, ATCC 4978, ATCC 7063 e ATCC 21538. Duas cepas específicas, ATCC 4978 e ATCC 7063 forneceram produtos da PCR que quando traduzi- dos forneceram seqüências de proteínas com alterações de resíduos de a - minoácidos diferentes quando comparadas com a seqüência de D- aminotransferase de B. sphaerícus.

O "genome walking" foi realizado para a obtenção das seqüên- cias gênicas completas para as cepas ATCC 4978 e ATCC 7063. A cepa ATCC 4978 foi crescida em caldo nutriente a 30 °C. A cepa ATCC 7063 foi crescida em ágar nutriente. O DNA genômico foi preparado partindo de cada cepa utilizando o Gentra Kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN) como pelos protocolos do fabricante. Quatro bibliotecas foram construídas para cada cepa como pelos protocolos do fabricante (BD GenomeWalker™ Universal Kit, Clontech, www.Clontech.com). Os iniciadores específicos ao gene foram planejados como pelos protocolos do fabricante do GenomeWalker™ com base nas seqüências obtidas utilizando combinações de iniciadores conser- vados (vide acima), permitindo que algumas centenas de pares de bases homólogos se sobrepusessem com o produto original. Estes iniciadores es- pecíficos ao gene foram subseqüentemente utilizados com os iniciadores adaptadores do GenomeWalker™ para a PCR de seqüências a montante e a jusante para completar os ORFS de DAT.

As seqüências de iniciadores de oligonucleotídeo específicos ao gene são indicadas abaixo:

4978 DAT GSP1 A montante 5' GACATGCTCCTCCGCTGTAAATAATTCACC 3' (SEQ ID NO: 70)

4978 DAT GSP1 A jusante 5' CCCTGGTGATGAAGTGAAGCCAGTATTAAC 3' (SEQ ID NO: 71)

4978 DAT GSP2 A montante 5' ATCGCCAAATTGATAACCACGGTCTTC 3' (SEQ ID NO: 72)

4978 DAT GSP2 A jusante 5' ACGTCCCGTAGCAAACTTTGAAAAAGGTGT 3' (SEQ ID NO: 73)

7063 DAT GSP1 A montante 5' TGCATAGAATCGGTCGATATGTTCAGTAGC 3' (SEQ ID NO: 74)

7063 DAT GSP1 A jusante 5' GCGGAGAAACGATTACAGAAGGTTCTTCAA 3' (SEQ ID NO: 75)

7063 DAT GSP2 A montante 5' GTCACCAAATTGATAACCACGGTCTTC 3' (SEQ ID NO: 76)

7063 DAT GSP2 A jusante 5' GGTGTACTTTATACGCACCCAGCAAAT 3' (SEQ ID NO: 77)

Seqüências dos iniciadores de oligonucleotídeo adaptadores:

AP1 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3' (SEQ ID NO: 78)

AP2 5' ACTATAGGGCACGCGTGGT 3' (SEQ ID NO: 79)

As PCRs primárias do GenomeWalker™ foram realizadas como a seguir: por reação de 50 μL, 2,5 μL de biblioteca de DNA, 2 μL de cada iniciador (AP1 (SEQ ID NO: 78) e o GSP1 apropriado), 1,5 μL de dNTPs, 1X de tampão XL PCR, 1 mM de acetato de magnésio e 1 μL de RTth polimera- se (Roche, Indianapolis, IN) foram adicionados. Um início a quente de 3 mi- nutos foi realizado a 94°C, seguido por 10 ciclos de 94°C durante 30 segun- dos, 55°C durante 30 segundos e 68°C durante 1 minuto. Mais vinte ciclos foram realizados com uma temperatura de anelamento menor de 48 °C. Por último, uma etapa de extensão de cadeia foi realizada durante sete minutos a 68°C. As PCRs secundárias do Genome Walker™ foram realizadas como a seguir: por reação de 50 μL, 1,0 μL (de uma diluição 1:50) da reação pri- mária da PCR, 2 μL de cada iniciador (AP2 (SEQ ID NO: 79) e o GSP2 a- propriado), 1,5 μL de dNTPs, 1X tampão XL PCR, 1 mM de cloreto de mag- nésio e 1 μL de RTth polimerase foram adicionados. Um início a quente de 3 minutos foi realizado a 94°C, seguido por 10 ciclos de 94°C durante 30 se- gundos, 55°C durante 30 segundos e 68 0C durante 1 minuto. Mais quinze ciclos foram realizados com uma temperatura de anelamento menor de 48 °C. Por último, uma etapa de extensão de cadeia foi realizada durante sete minutos a 68 °C.

Várias bibliotecas forneceram produtos da PCR que variavam em tamanho de -200 bp até -1,5 Kb. Os produtos da PCR foram clonados em TOPO (como acima) e seqüenciados através do seqüenciamento de DNA com término de cadeia de didesóxi na Agencourt BioScience Corpora- tion (Beverly, MA); estas novas seqüências foram alinhadas com as seqüên- cias iniciais obtidas utilizando combinações de iniciadores conservados e códons de início e de término foram identificados. Desta maneira foram obti- dos os ORFs completos de DAAT. Novos pares de iniciadores foram plane- jados (com sítios de restrição para clonagem) com base nas seqüências de DAAT completas específicas para a PCR do gene DAAT inteiro das cepas ATCC 4978 e 7063 individualmente.

As Seqüências de Iniciadores de Oligonucleotídeo são indicadas abaixo:

ATCC4978DAATNde1 F 5' GGCCTTGGCATATGAGTTATAGCTTATGGAATGACC 3' (SEQ ID NO: 80)

ATCC4978DAATBam H1R 5' GGCCTTAAGGATCCTTATGCGCGAATACCTTTTGGG 3' (SEQ ID NO: 81)

ATCC7063DAATNde1 F 5' GGCCTTGGCATATGAGCTACACTTTATGGAATGA 3' (SEQ ID NO: 82)

ATCC7063DAATBamH1 R2a 5' GGCCAAGGATCCGCTACCCACTAATCATTAGA 3' (SEQ ID NO: 83)

As regiões codificadoras dos genes DAAT de ATCC 4978 e ATCC 7063 foram amplificadas utilizando o protocolo de PCR a seguir. Em uma reação de 50 pL, foram adicionados 3 pL de DNA genômico, 0,8 pL de cada iniciador, 2 pL de dNTPs, 0,8 pL de Expand High Fidelity Polimerase (Roche, Indianapolis, IN), 1X tampão Expand™ com Mg e 0,2 pL de Pfu po- limerase (Stratagene, La Jolla, CA). O programa do termociclador utilizado incluía um início a quente a 94 °C durante 3 minutos, seguido por 8 repeti- ções das seguintes etapas: 94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 90 segundos. Vinte e dois ciclos subseqüentes foram realizados com uma temperatura de anelamento de 58 °C. Por último foi realizada uma etapa de extensão de cadeia durante sete minutos a 72 °C. Produtos da PCR limpos de tamanho correto (aproximadamente 850 bp) foram obtidos para ambas as cepas.

Os produtos da PCR para os genes DAAT de ATCC 4978 e ATCC 7063 foram purificados utilizando-se o kit de purificação Qiagen QIA- quick PCR (Valencia, CA) e digeridos com NdeI e BamHI em tampão de BamHI (New England Biolabs, Ipswich, MA). Os vetores digeridos com NdeI e BamHl (pET28 e pET30) e inserto foram purificados utilizando o Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit. As ligações foram feitas utilizando o Roche Ra- pid DNA Ligation Kit (Roche) e purificadas utilizando o kit para purificação de PCR QIAquick. As ligações foram transformadas em Escherichia coli DH10B utilizando uma cubeta de 0,2 cm e um sistema Bio-Rad Gene Pulser Il como descrito no manual de eletroporação da Bio-Rad. Foi permitido que as célu- Ias se recuperassem em 900 μΐ_ de meio SOC durante 30 minutos a 37 0C a 225 rpm. As células foram plaqueadas em placas de LB-ágar contendo ca- namicina (50 pg/mL). O DNA plasmideal foi purificado utilizando o Qiagen spin miniprep kit e verificado em relação aos insertos corretos através da PCR e da digestão de restrição com NdeI e SamHI. As seqüências de plas- mídeos que pareciam ter o inserto correto foram verificadas através do se- qüenciamento de DNA com término de cadeia didesóxi na Agencourt BioS- cience Corporation (Beverly, MA). As análises de seqüência verificaram a seqüência codificadora para os genes DAAT provenientes de ATCC 4978 e ATCC 7063, que produziram as seqüências de DNA da SEQ ID NO: 84 (se- qüência de DNA de DAAT de ATCC 4978) e SEQ ID NO: 85 (seqüência de DNA de DAAT de ATCC 7063) e a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 86 (seqüência de aminoácidos de DAAT de ATCC 4978) e SEQ ID NO: 87 (seqüência de aminoácidos de DAAT de ATCC 7063).

Os alinhamentos das duas novas DAATs provenientes de ATCC 4978 e ATCC 7063 com a DAAT de B. sphaericus (clonada no Exemplo 18) são mostrados na figura 10.

Foram obtidas novas D-aminotransferases de cepas ATCC 4978 e ATCC 7063 com seqüências de proteína que têm variações distintas de resíduos de aminoácidos quando comparadas à D-aminotransferase de B. sphaericus. As DAATs de ATCC 4978 e ATCC 7063 possuem somente 72 % e 67 % de identidade com a DAAT de B. sphaericus (ATCC 10208). Embora ambas estas cepas estejam atualmente listadas como B. sphaericus na ATCC, elas foram depositadas como B. rotans e B. serositidis. Com base nos alinhamentos de seqüência e nas diferenças sublinhadas entre estas duas novas DAATs e a DAAT de B. sphaericus, são identificados alguns re- síduos candidatos que podem ser avaliados em relação a sua função (indivi- dualmente ou em combinação) no aumento da atividade de DAAT para bios- síntese da R1 R monatina, nestas, assim como em outras seqüências de DAAT.

Exemplo 16

Expressão Gênica e Ensaios para Proteínas DAAT de ATCC 4978 e ATCC 7063

As novas DAATs de ATCC 4987 e ATCC 7063, como descrito no Exemplo 15, (em vetores pET) foram transformadas no hospedeiro de expressão de E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison1 Wl). As culturas foram crescidas utilizando os protocolos descritos acima e os plasmídeos foram isolados utilizando o Qiagen miniprep kit e analisados através da digestão de restrição, como descrito anteriormente, para confirmar a identidade do plas- mídeo.

A indução do gene DAAT foi tipicamente realizada em meio LB contendo canamicina (50 pg/mL). As células foram cultivadas até uma OD6oo de 0,4-0,8 a 37°C, induzidas com 0,1 mM de IPTG (isopropil tiogalacatosí- deo) e foram tiradas amostras 3-4 horas após a indução. Os extratos de cé- lulas foram preparados de acordo com o protocolo que acompanha o rea- gente Novagen BugBuster™ (com adição de benzonase nuclease e coquetel inibidor completo de protease da Roche). As proteínas solúveis foram obti- das no peso molecular previsto, como julgado por SDS-PAGE, para ambos os produtos gênicos de ATCC 4978 e ATCC 7063 em vetores pET. Foram observados níveis mais altos de proteína solúvel utilizando construções sem marcações com His (pET 30). As proteínas solúveis nos extratos celulares foram separadas em uma BioRad Laboratories Experion Automated Electro- phoresis Station (Hercules, CA) e analisadas em relação à concentração e à porcentagem de expressão utilizando o Experion Software versão 1.1.98.0. Os extratos de proteína provenientes de células com construções (pET30) não marcadas foram analisados em relação à atividade de D- aminotransferase acompanhando a produção de alanina partindo de piruvato e D-triptofano (ou R,R monatina) utilizando o protocolo a seguir. Foram reali- zadas reações de 500 μΙ_ em duplicata, a não que seja especificado abaixo, em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5), 80 μΜ de fosfato pirido- xal, 25 mM de piruvato de sódio e 50 mM de D-triptofano ou de R,R monati- na. As reações foram iniciadas através da adição de extratos isentos de cé- lula (4978 ou 7063) ou de enzima purificada (B. sphaericus) e foram incuba- das 15 minutos-2 horas a 30°C, com agitação suave. Aproximadamente o mesmo nível de proteína total foi adicionado (1,0 mg), a não ser que seja especificado abaixo, em cada ensaio com finalidade de comparação. Uma aminotransferase purificada de B. sphaericus (ATCC número 10208) foi utili- zada como uma enzima comercial. O ácido fórmico foi adicionado em uma concentração final de dois por cento para interromper a reação e a proteína precipitada foi removida por centrifugação. Também foram realizadas rea- ções de controle sem proteína adicionada. A alanina foi detectada utilizando a derivatização OPA como descrito no Exemplo 1. A média dos resultados das reações em duplicata é mostrada nas Tabelas 35 e 36 a seguir.

Tabela 35: Atividade de Transaminação das D-Aminotransferases de ATCC 4978 e ATCC 7063 (15 minutos)

<table>table see original document page 144</column></row><table> Tabela 36: Atividade de Transaminação das D-Aminotransferases de ATCC 4978 e de ATCC 7063 (2 Horas)

<table>table see original document page 145</column></row><table>

Desse modo, foi demonstrado que as D-aminoácido aminotrans- ferases de ATCC 4978 e ATCC 7063 na verdade possuíam atividade de D- aminotransferase e tinham a capacidade de produzir R1R monatina. A ativi- dade da DAAT de ATCC 4978 era maior do que a observada para a DAAT de ATCC 7063. Não podia ser feita uma comparação quantitativa entre 4978 e B. sphaericus uma vez que 4978 não estava purificado. Exemplo 17

Produção de R.R Monatina utilizando a DAAT de ATCC 4978

A aminotransferase de ATCC 4978 também foi testada em rela- ção à capacidade de produzir monatina partindo de D-triptofano (como no Exemplo 3). Os seguintes foram adicionados por 1 mL de mistura de reação: aproximadamente 50 pg de aldolase (ProA aldolase de C. testosteroni ou a aldolase da SEQ ID NO: 22, purificadas), 4 mM de MgCI2, 50 mM de D- triptofano (fornecido como um sólido), 1,0 mg de D-aminotransferase, 100 mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5 e 0,05 mM de PLP. Os experimentos foram corridos em duplicata, com contro- les negativos em que não foi adicionada aminotransferase. As amostras fo- ram incubadas durante vários períodos de tempo a 30°C com agitação sua- ve. Os únicos estereoisômeros detectados quando a monatina era produzida utilizando estes métodos são R1ReS1R. A monatina total e a percentagem de R,R monatina foram detectadas como descrito no Exemplo 1 e estão lis- tadas nas Tabelas 37-39 a seguir. Os resultados apresentados em cada uma das Tabelas 37-39 consistem do valor médio das reações em duplicata. Tabela 37: Comparação das D-Aminotransferases de B. sphaericus e ATCC 4978 para a Produção de Monatina utilizando Aproximadamente 50 μς de ProA de C. testosteroni

<table>table see original document page 146</column></row><table>

Tabela 38: Comparação das D-Aminotransferases de B. sphaericus e ATCC 4978 para a Produção de Monatina utilizando Aproximadamente 50 μς de

ProA de C. testosteroni

<table>table see original document page 146</column></row><table>

Tabela 39: Comparação das D-Aminotransferases de B. sphaericus e ATCC 4978 para a Produção de Monatina utilizando Aproximadamente 50 μς da

Aldolase da SEQ ID NO: 22

<table>table see original document page 146</column></row><table>

Assim, foi demonstrado que a D-aminoácido aminotransferase de ATCC 4978 tem a capacidade de produzir R,R monatina. A atividade da DAAT de ATCC 4978, quando a produção de monatina total é comparada em termos de mg de monatina por grama de proteína, era mais alta do que a observada para a DAAT de B. sphaericus. O uso de uma aldolase específica a R da SEQ ID NO: 22 obteve claramente uma melhoria na porcentagem de R1R monatina formada em comparação com a quantidade de monatina total produzida.

Exemplo 18

Clonagem de D-Aminoácido Aminotransferases de Bacillus Publicadas

Diversas D-aminoácido aminotransferases de Bacillus (EC 2.6.1.21, também conhecida como D-alanina aminotransferase ou D-aspartato amino- transferase) foram produzidas de forma recombinante para uso em ensaios acoplados para a produção de R,R monatina. Estas enzimas são homólogas às D-aminotransferases descritas anteriormente para a produção de monati- na (Publicação U.S. N2 20040063175 e Publicação U.S. N2 2005282260). Cepas

B. sphaericus (número da ATCC 10208) e B. Iicheniformis (ATCC 10716) foram cultivados em Nutrient Ágar a 30 0C durante a noite. Grupos de colônias foram colocados em 100 μ!_ de água esterilizada e a- quecidos durante 5 minutos a 95 °C, para romper as células. Três μΙ_ foram utilizados em amplificações subseqüentes da Reação em Cadeia da Polime- rase ("PCR"). Foi obtido o DNA genômico para B. halodurans (ATCC número BAA-125D) e ressuspenso em água a uma concentração de 100 ng/pL. Foi obtido o DNA genômico de BaeiHus eereus (números da ATCC 1-987D e 14579D) para clonagem da mesma forma.

Protocolo da Reação em Cadeia da Polimerase

Os iniciadores foram planejados para o gene dat de B. sphaeri- cus para a clonagem em vetores pET 28b e pET 30a (Novagen, Madison, Wl), utilizando os sítios Ncol e BamHl. O constructo pET30 contém uma marcação His e uma marcação S N-terminal, enquanto que o constructo pET 28 não é marcado.

Iniciadores de dat de Bacillus sphaericus:

N term: 5'-GATATACCATGGCATACTCATTATGGAATG-3' (SEQ ID NO: 88) e C term: Õ^GTTATCGGATCCTTAGGCATTAATTGAAATTG-S' (SEQ ID NO: 89).

Os iniciadores de B. Iicheniformis e os iniciadores de B. halodu- rans foram planejados para a clonagem em vetores pET 28b e pET 30a utili- zando os sítios NdeI e SamHI. Os constructos pET30 não eram marcados neste caso, enquanto que os constructos pET 28 contêm uma pequena mar- cação his N-terminal. Iniciadores de dat de B. licheniformis:

N term 5'-GGCCGGTTCATATGAAAGTTC I I I I IAACGGC (SEQ ID NO: 90) e C term:

5'- CCTTCCGGATCCTTAAACCGTTTTGGCTGTCT-3' (SEQ ID NO: 91) Iniciadores de B. halodurans:

N term 5'-GATATACATATGGATTATTGCCTTTACCAA-3' (SEQ ID NO: 92) e C term: 5'-GAATCCGGATCCTCACTGCTTCATCGCTGTTTG- 3'(SEQ ID NO: 93)

Os iniciadores foram planejados para as seqüências codificado- ras de B. cereus. Um conjunto de iniciadores produziu a seqüência listada em NCBI como o número de acesso AE016877 gi:29899096 5138634,.. 5139506 (873 bp). Um conjunto de iniciadores forneceu um produto com 12 bp adicionais a montante, similar ao número de acesso da NCBI previsto para dat de B. thuringiensis AE017355 gi:49328240 4965653,.. 4966537 (885 bp). Ambos os conjuntos de iniciadores foram planejados com NdeI para a região N-terminal e o sítio de restrição BamHl para a região C-terminal. Os inicia- dores foram planejados para a clonagem em clonagem de pBAD-TOPO TA. Iniciadores de B. cereus:

N term 5'-TAAGAGGAATAACATATGGCATACGAAAGATTT-3' (SEQ ID NO: 94) e C-term

5'-GAATTCGGATCCTTAAGAAGATGACATATTGG-3' (produto mais curto da PCR) (SEQ ID NO: 95)

N term 5-TAAGAGGAATAACATATGGGATCGAAATTGGCA-3' (produto mais longo da PCR) (SEQ ID NO: 96)

As regiões codificadoras dos dat de genes B. sphaericus, B. ha- lodurans e Β. Hcheniformis foram amplificadas utilizando o protocolo de PCR a seguir. Em uma reação de 50 μL, foram utilizados 3 μL de molde (2 μL pa- ra o DNA genômico), 1,6 μΜ de cada iniciador, 0,25 mM de cada dNTP, 3,5 U de Expand High Fidelity Polimerase (Roche, Indianapolis, IN) e 1X tampão Expand™ com Mg. O programa do termociclador utilizado incluía um início a quente a 94°C durante 3 minutos, seguido por 8 repetitições das seguintes etapas: 94°C durante 30 segundos, 52°C durante 30 segundos e 72°C du- rante 2 minutos. Forem realizados vinte e dois ciclos subseqüentes com uma temperatura de anelamento de 58°C. Depois de 30 ciclos a amostra foi mantida a 72°C durante 7 minutos e então armazenada a 4°C. Foram obti- dos os produtos de PCR limpos do tamanho correto (aproximadamente 850 bp para o gene dat).

O dat de Geobacillus stearothermophilus (número de acesso J04460 gi: 142541), que codifica a proteína do número de acesso AAA22252 (gi: 142542) foi construído utilizando técnicas de PCR de montagem. A fonte deste gene/proteína é muitas vezes descrita como Bacillus sp., espécie ter- moestável de Baeillus ou Bacillus YM-1. O processo de montagem é como a seguir: 43 oligonucleotídeos (40 meros) foram solicitados da IDT com base na seqüência gênica acima e sua seqüência de DNA complementar, com sobreposições de 20 de pares de bases entre os filamentos senso e anti- senso. Os iniciadores foram diluídos até 250 μΜ em água e 5 μL de cada iniciador foram misturados em um tubo de microcentrífuga. A PCR foi reali- zada como a seguir: para reação de 100 μL, foram adicionados 1,5 μL do conjunto de iniciadores, 4 μL de dNTPs, 1X tampão XL PCR, 1 mM de ace- tato de magnésio, 2 μL de rTth polimerase (Roche, Indianapolis, IN) e 0,25 pL de Pfu polimerase (Stratagene, La Jolla, CA). Foi realizado um início par- tida a quente de 3 minutos a 94°C, seguido por 15 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 40°C durante 30 segundos e 68°C durante 15 segundos. Fo- ram realizados mais dez ciclos a uma temperatura de anelamento mais alta de 44°C e um tempo de extensão de 30 segundos (a 68 °C). Mais dez ciclos foram realizados a uma temperatura de anelamento mais alta de 48°C e um tempo de extensão de 75 segundos. Finalmente, foi feita uma etapa de ex- tensão de cadeia durante sete minutos a 68 0C. Foi realizada uma PCR se- cundária utilizando os iniciadores a seguir, planejados para a clonagem com NdeI (N-term) e SamHI (C-term):

N-term-5'- G GCCTTG G CATATG G G ATACACTTTATG G AAT- GACC-3' (SEQ ID NO: 97) e C-term-5'- TTGGAACCGGATCCTTATATAT- GAAGCGGTTTTGG-3' (SEQ ID NO: 98)

A PCR continha por 100 pL, 2,5 pL da reação primária, 0,4 pL de cada iniciador, 3 pL de dNTPs, 1X tampão XL PCR, 1 mM de acetato de magnésio, 2 pL de rTth polimerase e 0,25 pL de Pfu polimerase. Foi realiza- do um início a quente de 3 minutos a 94°C, seguido por 10 ciclos de 94 0C durante 30 segundos, 42 0C durante 30 segundos e 68 0C durante 90 se- gundos. Foram feitos mais quinze ciclos a uma temperatura de anelamento mais alta de 48 0C e finalmente foi feita uma etapa de extensão de cadeia durante sete minutos a 68 °C. Foi feita uma terceira reação da PCR utilizan- do molde proveniente da segunda PCR e utilizando as mesmas condições que as da segunda reação da PCR. Um produto de aproximadamente 900 bp era visível em um gel de agarose. Clonagem

O produto da PCR para DAT de B. sphaerícus foi purificado utili- zando o Qiagen QIAquick PCR purification kit (Valencia, CA) e digerido com SamHI e Nco\ em tampão de BamHI (New England Biolabs, Ipswich, MA). Os vetores (pET28 e pET30) e o inserto digeridos foram purificados utilizan- do o Qiagen QIAquick Gel Extration Kit. As ligações foram feitas utilizando o Roche Rapid DNA Ligation Kit (Roche) e purificadas utilizando o QIAquick PCR purification kit. As ligações foram transformadas em Escherichia coli DH10B utilizando uma cubeta de 0,2 cm e um sistema Bio-Rad Gene Pulser II como descrito no manual de eletroporação da Bio-Rad. Foi permitido que as células se recuperassem em 900 pL de meio SOC durante 30 minutos a 37 °C a 225 rpm. As células foram plaqueadas em placas de LB-ágar con- tendo canamicina (25 pg/mL). O DNA plasmideal foi purificado utilizando o Qiagen spin miniprep kit e verificado em relação aos insertos corretos atra- vés da digestão de restrição com SamHI e Nco\. As seqüências de plasmí- deos que pareciam ter o inserto correto foram verificadas através do se- qüenciamento de DNA com término de cadeia didesóxi na Agencourt BioS- cience Corporation (Beverly, MA). O seqüenciamento verificou a seqüência codificadora encontrada na Região do número de acesso do NCBI AF081278: 134..985 (gi: 3513754), que produz uma proteína com seqüência de aminoácidos como listado no número de acesso AAC33964 (gi: 3513755).

Os produtos da PCR para DAT de B. Iicheniformis (-850 bp) e G. stearothermophilus foram purificados em gel e clonados utilizando o kit de clonagem Zero Blunt TOPO® como pelos protocolos dos fabricantes (Invitro- gen). Os plasmídeos foram transformados em células quimicamente compe- tentes TOPIO para a seleção inicial. O DNA plasmideal foi verificado através da digestão de restrição e as seqüências foram verificadas para combinar com a seqüência codificadora encontrada no NCBI. Para B. licheniformis, a seqüência combinava com a região do número de acesso U26947 247..1098 (gi:857560), que produz a proteína com uma seqüência de aminoácidos que é listada no número de acesso P54692 (gi: 1706292), com a exceção de uma mutação silenciosa na posição 429 de A para G. Para G. stearothermophi- lus, a seqüência combinava com o número de acesso relacionado acima. As regiões codificadoras foram subclonadas através de digestão de restrição (NdeUBamH\), ligadas nos vetores pET e transformadas em células DH10B eletrocompetentes para amplificação.

O produto da PCR para DAT de B. halodurans foi purificado em gel e digerido com NdeI e SamHI e ligado aos vetores pET 28 e pET 30 co- mo acima. A amplificação do vetor foi feita em células DH10B. O DNA da miniprep foi selecionado por PCR e a seqüência foi verificada. A seqüência do gene pode ser encontrada no número de acesso NC_002570 (gi:57596592) 2934903..2935754 que codifica uma proteína com a seqüên- cia de aminoácidos listada no número de acesso NP_243677 (gi: 15615374).

As seqüências codificadoras de B. cereus foram amplificadas utilizando um protocolo de PCR típico e clonadas de acordo com os protoco- los do fabricante (Invitrogen). Expressão Gênica e Ensaios

O DNA plasmideal foi subclonado no hospedeiro de expressão de E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI) para os constructos nos veto- res pET. As culturas foram crescidas e os plasmídeos foram isolados utili- zando o Qiagen miniprep kit e analisados através da digestão de restrição para confirmar a identidade. A indução era tipicamente realizada em meio LB contendo canamicina (50 µg/mL). As células foram cultivadas até uma Οϋβοο de 0,4-0,8 a 37°C, induzidas com 0,1 mM de IPTG (isopropil tiogalacatosí- deo) e eram tiradas amostras 3-4 horas após a indução. Os extratos de célu- las foram preparados de acordo com o protocolo que acompanha o reagente Novagen BugBuster™ (com a adição de benzoase nuclease e do coquetel de inibidores de protease completos da Roche). Altos níveis de proteína so- lúvel foram obtidos no peso molecular previsto, que é julgado por SDS- PAGE, para ambos os produtos gênicos de B. halodurans, ambos os produ- tos gênicos de B. sphaericus, ambos os produtos gênicos de G. stearother- mophilus e o produto gênico não marcado de B. licheniformis. Para as rea- ções em que foi utilizada a proteína purificada, os produtos gênicos marca- dos com His foram purificados utilizando cartuchos His-Bind seguindo os protocolos do fabricante (Novagen, Madison, WI). As frações de eluente fo- ram dessalinizadas em colunas PD-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e eluídas em 25-100 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,5. Os en- saios de proteína total foram realizados utilizando o kit de BCA da Pierce e foi estimada a porcentagem de expressão partindo de SDS-PAGE. Alternati- vamente, as proteínas solúveis nos extratos celulares foram separadas em uma BioRad Laboratories Experion Automated Electrophoresis Station e analisadas em relação à concentração e à porcentagem de expressão utili- zando o Experion Software versão 1.1.98.0. As construções de pBAD-TOPO contendo os genes de B. cereus foram expressas como recomendando pela Invitrogen, mas os níveis de expressão das DAATs era tal que a proteína recombinante não podia ser distinguida das outras proteínas durante a análi- se de SDS-PAGE.

Os extratos de células foram analisados em relação à atividade de D-aminotransferase através do acompanhamento da produção de alanina partindo de piruvato e D-triptofano (ou R,R monatina) utilizando o protocolo a seguir. Reações de um mL em duplicata foram tipicamente realizadas em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5), 50 μΜ de fosfato piridoxal, 25 mM de piruvato de sódio e 50 mM de D-triptofano ou R,R monatina. As reações foram iniciadas através da adição de extratos isentos de células ou de enzima purificada e foram incubadas 15 minutos-durante a noite a 30°C, com agitação suave. Aproximadamente o mesmo nível de D- aminotransferase foi adicionado (tipicamente em torno de 0,5 mg) em cada ensaio com a finalidade de comparação. A AT-103 (BioCataIytics) foi utiliza- da como um controle positivo (ou comercial). O ácido fórmico foi adicionado em uma concentração final de dois por cento para interromper a reação e a proteína precipitada foi removida por centrifugação. As reações de controle, sem proteína adicionada, também foram realizadas. Os pontos de tempo zero foram também utilizados como controles negativos. A alanina foi detec- tada utilizando derivatização OPA como descrito no Exemplo 1.

As aminotransferases também foram testadas em relação a sua capacidade de produzir monatina partindo de D-triptofano (como no Exemplo 3). Os seguintes foram adicionados por 1 mL de mistura de reação: aproxi- madamente 50-100 pg de aldolase (tipicamente ProA aldolase de C. testos- teroni, purificada), 4 mM de MgCI2, 50 mM de D-triptofano (fornecido como um sólido), 0,5-2 mg de D-aminotransferase, 200 mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5 e 0,05 mM de PLP. Os expe- rimentos foram corridos em duplicata, com controles negativos em que não foi adicionada aminotransferase. As amostras foram incubadas 1 hora, 2 ho- ras e durante a noite (17-20 horas) a 30°C com agitação suave. Os únicos estereoisômeros detectados quando a monatina era produzida utilizando estes métodos são R,R e S,R. A porcentagem de R,R é listada a seguir e foi determinada através da área do pico de LC em fase inversa. Os resultados da atividade de transaminação das D-aminotransferases de B. sphaericus, B. licheniformis e B. halodurans após 1 hora são mostrados na Tabela 40 abaixo. Os dados foram normalizados para 0,5 mg da D-aminotransferase por mL.

Tabela 40: Atividade de Transaminação das D-Aminotransferases de B. s- phaericus, B. Iicheniformis e B. halodurans

<table>table see original document page 154</column></row><table>

A produção de monatina utilizando as D-aminotransferases de B. sphaericus, B. Iicheniformis e B. halodurans é mostrada na Tabela 41 abai- xo. Cada reação continha aproximadamente 90 μς de Pro A de C. testoste- roni. Os dados para a monatina total produzida foram normalizados para o uso de 0,5 mg da D-aminotransferase.

Tabela 41: Comparação das D-Aminotransferases de B. sphaericus, B. Ii- cheniformis e B. halodurans para a Produção de Monatina

<table>table see original document page 154</column></row><table>

A D-aminotransferase de B. sphaericus (não marcada) tinha a atividade mais alta para a produção de monatina partindo de D-triptofano, mas a enzima de B. halodurans tinha seletividade muito maior em relação a R-MP versus S-MP que outras enzimas, resultando em uma estereopureza maior de R1R monatina. Os extratos de células de B. cereus não tinham quantidades detectáveis de atividade sob as condições testadas, embora os genes não pudessem ser expressos nos hospedeiros escolhidos.

A DAT de G. stearothermophilus (não marcada, que era melhor expressa) foi analisada como acima e comparada com a DAT de B. sphaerí- cus purificada e a AT-103 (BioCataIytics). Os resultados são mostrados nas Tabelas 42 e 43 a seguir. A atividade de transaminação das D- aminotransferases de G. stearothermophilus, AT-103 e B. sphaericus foi tes- tada utilizando 0,5 mg de D-aminotransferase por mL (Tabela 42).

Tabela 42: Atividade de Transaminação das D-Aminotransferases de G. ste- arothermophilus, AT-103 e B. sphaericus (Purificada)

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Tabela 43: Comparação de G. stearothermophilus, AT-103, e B. sphaericus (purificada) em Relação à Produção de Monatina Total

<table>table see original document page 155</column></row><table> A enzima de G. stearothermophilus nativa é claramente menos ativa em relação à transaminação da monatina que as enzimas AT-103 e de B. sphaericus.

Exemplo 19

Criação de uma D-aminotransferase Híbrida

Várias D-aminoácido aminotransferases de Bacillus foram des- critas nos Exemplos 18 e 15. Embora a enzima de G. stearothermophilus tivesse baixa atividade de transaminação sobre a monatina, fazendo com que menos monatina total fosse produzida partindo de D-triptofano, ainda possuía elementos estruturais de interesse e é uma enzima termostável. Portanto, foi criada uma proteína híbrida entre a enzima de maior atividade (B. sphaericus) e a enzima de Geobacillus. Montagem da seqüência codificadora de DAThibrida

A seqüência de proteína alvo que foi planejada é a SEQ ID NO: 99. A SEQ ID NO: 100, a seqüência codificadora correspondendo à SEQ ID NO: 99, foi planejada com base no uso de códons de E. coli.

A DAT híbrida foi construída utilizando técnicas de PCR de mon- tagem. O processo de montagem é como a seguir: 43 oligonucleotídeos (40 meros) foram encomendados da IDT com base na seqüência gênica anterior e sua seqüência de DNA complementar, com sobreposições de 20 pares de bases entre os filamentos sentido e anti-sentido. Os iniciadores foram diluí- dos até 250 μΜ em água e 5 μL de cada iniciador foram misturados juntos em um tubo de microcentrífuga. A PCR foi realizada como a seguir: por rea- ção de 100 μL,5 μL do conjunto de iniciadores, 4 μL de dNTPs, 1X tampão XL PCR, 1 mM de acetato de magnésio, 2 μL de xTth polimerase (Roche, Indianapolis, IN) e 0,25 μL de Pfu polimerase (Stratagene, La Jolla, CA) fo- ram adicionados. Um início a quente de 3 minutos foi realizado a 94°C, se- guido por 15 ciclos de 94 0C durante 30 segundos, 40 0C durante 15 segun- dos e 68°C durante 30 segundos. Foram realizados mais dez ciclos com uma temperatura de anelamento mais alta de 44°C e um maior tempo de anelamento de 30 segundos. Foram realizados mais dez ciclos a uma tem- peratura de anelamento de 48 0C e um tempo de extensão de 75 segundos. Por último, uma etapa de extensão de cadeia foi realizada durante sete mi- nutos a 68 °C. Uma PCR secundária foi realizada utilizando os iniciadores a seguir, planejados para a clonagem com Ndel (N-term) e BamHl (C-term): N-term-5'-GGCCTTGGCATATGGGATACACTTTATGGAATGACCA -3' (SEQ ID NO: 101)

e C-term-5'-TTGGAACCGGATCCTTAGCTGTTAAGGCTCAGTGGAA -3' (SEQ ID NO: 102)

A PCR continha por 100 μΐ_, 2,5 μΙ_ da reação primária, 3 μΙ_ de dNTPs, 1X tampão XL PCR, 1 mM de acetato de magnésio, 2 μΙ_ de rTth e 0,25 μί de Pfu polimerase. Um início a quente de 3 minutos foi realizado a 94°C, seguido por 10 ciclos de 94 0C durante 30 segundos, 42 0C durante 30 segundos e 68 0C durante 75 segundos. Mais quinze ciclos foram realizados com uma temperatura de anelamento mais alta de 48 0C e por último foi rea- lizada uma etapa de extensão de cadeia durante sete minutos a 68 °C. Um produto de aproximadamente 850 bp era visível em um gel de agarose.

Clonagem

O produto da PCR foi purificado em gel utilizando o Qiagen QIA- quick Gel Extraction Kit (Valencia, CA) e clonado utilizando o kit de clona- gem Zero Blunt TOPO® como pelos protocolos dos fabricantes (Invitrogen). Os plasmídeos foram transformados em células quimicamente competentes TOPIO para a verificação inicial através da PCR. O DNA plasmideal foi sele- cionado através de digestão de restrição e a seqüência de DNA foi verificada.

As minipreps de plasmídeo foram digeridas com BamHl e NdeI (New England Biolabs, Ipswich, MA). Os vetores (pET28 e pET30) e o inser- to digeridos foram ligados utilizando o Roche Rapid DNA Ligation Kit (Ro- che) e purificados utilizando o Roche High-Pure PCR Product Purification Kit. As ligações foram transformadas em Escherichia coli DH10B utilizando uma cubeta de 0,2 cm e um sistema Bio-Rad Gene Pulser Il como descrito no manual de eletroporação da Bio-Rad. Foi permitido que as células se recu- perassem em 900 μί de meio SOC durante 30 minutos a 37 0C at 225 rpm. As células foram plaqueadas em placas de LB-ágar contendo canamicina (25 μg/mL). O DNA plasmideal foi purificado utilizando o Qiagen spin mini- prep kit e verificado em relação aos insertos corretos através de digestão por restrição com SamHI e NdeI. Expressão Gênica e Ensaios

O DNA plasmideal foi transformado no hospedeiro de expressão de E. coli BL21(DE3) de acordo com os protocolos dos fabricantes (Nova- gen, Madison, Wl). As culturas foram crescidas e os plasmídeos foram isola- dos utilizando o Qiagen miniprep kit e analisados através da PCR para con- firmar a identidade. A indução foi realizada em meio LB contendo canamici- na (50 pg/mL). As células foram cultivadas até uma OD6oo de 0,5 a 37°C, induzidas com 0,1 mM de IPTG (isopropil tiogalacatosídeo) e foram tiradas amostras 3 horas após a indução. Os extratos de células foram preparados de acordo com o protocolo que acompanha o reagente Novagen BugBus- ter™ (com a adição de benzoase nuclease e do coquetel de inibidores de protease completos da Roche). Altos níveis de proteína total foram obtidos no peso molecular previsto, que é julgado por SDS-PAGE, para ambos os produtos gênicos. Entretanto, os níveis de proteínas solúveis eram mais bai- xos. A versão não marcada do produto gênico era melhor expressa e foi analisada na forma de um extrato de células. As proteínas solúveis nos ex- tratos celulares foram separadas em uma BioRad Laboratories Experion Au- tomated Electrophoresis Station e analisadas em relação à concentração e à porcentagem de expressão utilizando o Experion Software versão 1.1.98.0, para normalizar a quantidade de D-aminotransferase utilizada nos ensaios comparativos.

Os extratos de células foram analisados em relação à atividade de D-aminotransferase acompanhando a produção de alanina partindo de piruvato e D-triptofano (ou R,R monatina) utilizando o protocolo a seguir. As reações de um mL em duplicata foram realizadas em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5), 50 μΜ de fosfato piridoxal, 25 mM de piruvato de sódio e 50 mM de D-triptofano ou R,R monatina (a não ser que seja cita- do de outra forma). As reações foram iniciadas através da adição de extratos isentos de células ou de enzima purificada e foram incubadas 15 minutos- durante a noite a 30°C, com agitação suave. Aproximadamente o mesmo nível de D-aminotransferase foi adicionado (0,5 mg) em cada ensaio com a finalidade de comparação (a não ser que seja citado de outra maneira). A AT-103 (BioCataIytics) ou a D-aminotransferase de B. sphaericus (Exemplo 18) foi utilizada como uma enzima de padrão. O ácido fórmico foi adicionado em uma concentração final de dois por cento para interromper a reação e a proteína precipitada foi removida por centrifugação. Foram também realiza- das reações de controle sem proteína adicionada. Os pontos de tempo zero também foram utilizados como controles negativos. A alanina foi detectada utilizando derivatização pós-coluna OPA como descrito no Exemplo 1. Os resultados das reações utilizando 0,5 mg de D-aminotransferase por volume de reação de 1 mL são mostrados na Tabela 44 a seguir.

Tabela 44: Atividade de Transaminação das D-aminotransferases de B. s- phaericus (purificada), G. stearothermophilus e Híbridas

<table>table see original document page 159</column></row><table>

As aminotransferases também foram testadas em relação a sua capacidade de produzir monatina partindo de D-triptofano (como no Exemplo 3). Os seguintes foram adicionados por 1 mL de mistura da reação: aproxi- madamente 50-100 pg de ProA aldolase de C. testosteroni purificada, 4 mM de MgCb, 50 mM de D-triptofano (fornecido como um sólido), 0,5-2 mg de D- aminotransferase, 200 mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfato de potássio com pH 7,5 e 0,05 mM de PLP. Os experimentos foram proces- sados em duplicata, com controles negativos em que não foi adicionada a- minotransferase. As amostras foram incubadas 1 hora, 2 horas e durante a noite (17-20 horas) a 30°C com agitação suave. Os únicos estereoisômeros detectados quando a monatina era produzida utilizando estes métodos eram R, R e S,R. A porcentagem de R1R está relacionada na Tabela 45 a seguir e foi determinada por área do pico de LC em fase inversa. A baixas concentra- ções de monatina, a porcentagem de R,R não é tão precisa como julgado pela área do pico de RPLC. Portanto, algumas das amostras foram adicio- nalmente analisadas através do método de derivatização de FDAA descrito no Exemplo 1. Os números de tais resultados são apresentados na tabela entre parênteses.

Tabela 45: Comparação de G. stearothermophilus, DAT Híbrida e B. sphae- rícus (purificada) para a Produção de Monatina Total

<table>table see original document page 160</column></row><table>

A DAT híbrida produz mais monatina do que a enzima do G. stearothermophilus, embora a taxa de transaminação de monatina da DAT híbrida seja menor. É possível que sob as condições para a produção de monatina (em que há baixas concentrações de MP), a Híbrida funcione me- lhor possivelmente devido a uma menor Km. Além disso, a DAT híbrida pro- duz uma porcentagem mais alta de R,R do que uma das enzimas originais. Esta enzima parece ter uma enanciosseletividade mais alta em relação ao R-MP do que as enzimas originais. Foram realizados os mesmos ensaios (tempo de incubação de 4 horas) utilizando uma aldolase de Sinorhizobium descrita no Exemplo 3 com a DAT híbrida. A DAT híbrida produziu quantida- des similares de monatina como acima, porém utilizando a aldolase alterna- tiva, produziu 95 % de R,R (de acordo com derivatização de FDAA), em o- posição a 80 % com a ProA aldolase de C. testosteroni.

A DAT híbrida também foi testada em relação à atividade de transaminação de R-MP versus S-MP (produzido como descrito no Exemplo 1). Ensaios de duas horas e durante a noite foram conduzidos a 30°C utili- zando 10 mM de R-MP ou de S-MP, 50 mM de D-alanina, 100 mM de fosfato de potássio com pH 7,5, 0,5 mg/mL de D-aminotransferase e 50 μΜ de PLP. Foram realizados experimentos em duplicata e os níveis de fundo de mona- tina provenientes das amostras de MP foram subtraídos. As proporções de monatina produzida de cada substrato são apresentadas para ambas as D- aminotransferases na Tabela 46 a seguir. Foram observadas tendências si- milares quando as proporções de piruvato (produzido) foram comparadas graficamente. É evidente que a DAT híbrida é mais seletiva em relação ao R-MP do que a D-aminotransferase AT-103, que não parece ser seletiva.

Tabela 46: Comparação de DAT híbrida e AT-103 em relação à Transamina- ção de S-MP e de R-MP

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Em um esforço para melhorar ainda mais a atividade da DAT híbrida, foi realizada uma mutagênese sítio dirigida. Foram planejados inici- adores como sugerido no QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Foram criados dois mutantes diferentes: DAT Híbrida 2 e DAT Híbrida 3. A DAT Híbrida 2 inclui uma mutação na posição de aminoácido 153 de alanina para arginina e uma deleção de serina 181. A mutação de alanina para arginina foi projetada para ajudar a coordenar o segundo grupo carboxila no substrato precursor de monatina, como foi mostrado como es- tando presente na L-aminotransferase AspC. A deleção de serina foi uma tentativa de remover algum impedimento estérico de forma que a maior mo- lécula de precursor de monatina pudesse chegar mais facilmente ao sítio ativo. A DAT Híbrida 3 contém uma deleção das serinas 180-182, substituí- das por uma arginina. Foram criados dois mutantes adicionais, que têm ape- nas a mutação 153 ala para arg ou a deleção da serina, respectivamente.

Todos os três mutantes que continham deleções não produziam proteína solúvel, embora fossem superexpressos em concentrações muito altas. Evi- dentemente é importante não remover estruturalmente os aminoácidos nesta região. O mutante ala153arg não produzia monatina sob as condições testa- das (como acima). Há uma quantidade moderada de impedimento estérico próximo à posição 153 o que tornaria mais difícil adaptar o precursor de 15 substrato monatina sem as deleções na região de 180-182. É esperado que a mutação das serinas para aminoácidos menores, tal como glicina ou alani- na, melhoraria a atividade em relação ao precursor de monatina, particular- mente quando combinada com a mutação ala153arg.

EXEMPLO 20

Uso de Enzimas D-Aminoácido Desidroqenases Disponíveis Comercialmente As D-aminoácido desidrogenases faziam parte de uma biblioteca adquirida da BioCataIytics (Pasadena, CA). Interconversão entre MP e Monatina

A aminação de MP para formar monatina pode ser catalisada por aminotransferases ou por desidrogenases que requerem um co-fator redutor tal como NADH ou NADPH. Estas reações são reversíveis e podem ser medidas em qualquer direção. A direcionalidade quando uma enzima desidrogenase é utilizada pode ser amplamente controlada pela concentra- ção de sais de amônio.

Conversão de Monatina em MP (precursor de monatina) Utilizando Desidro- genases Disponíveis Comercialmente

A desaminação oxidativa de monatina foi monitorada acompa- nhando o aumento a 340 nm à medida que NAD+ era convertido em NADH mais cromofórico.

A mistura do ensaio continha 100 mM de bicarbonato de sódio, pH 9, 10 mM de NAD+, 20 mg/mL de D-aminoácido desidrogenase (D- AADH-101 até 108, BioCatalytics) e 50 mM de R,R monatina (sal monopo- tássico) em 0,2 mL. O ensaio foi realizado, em duplicata, em uma placa para microtitulação transparente a UV, com incubação a 30°C. Foram medidas as absorbâncias no ponto final utilizando uma leitora de placa Molecular Devi- ces SpectraMax Plus. Foram realizados controles negativos sem a adição de enzima. A variação na absorbância para reações durante a noite era como a seguir: sem controle de enzima, 0,05; D-AADH-101, 0,865; D-AADH-102, 1,075; D-AADH-103, 0,94; D-AADH-104, 0,335; D-AADH-105, 0,78; D- AADH-106, 0,745; D-AADH-107, 0,925; e D-AADH-108, 1,06. Produção de Monatina partindo de MP Utilizando Desidrogenases

O R-MP utilizado como um substrato para este ensaio foi produ- zido através da transaminação de R,R monatina utilizando a D-aminotrans- ferase AT-103 de faixa ampla (BioCatalytics) em tampão fosfato de potássio, utilizando piruvato como o receptor de amino. O S-MP foi produzido através da transaminação de S,S monatina utilizando a L-aminotransferase AT-102 (BioCatalytics) em tampão fosfato de potássio, utilizando 2-oxoglutarato co- mo o receptor de amino. Ambos os compostos foram purificados utilizando HPLC em escala preparatória.

A mistura do ensaio continha 200 mM de formiato de amônio, 50 mM de fosfato de potássio pH 7,5, 5 mM de NADH, 20 mg/mL de D-amino- ácido desidrogenase (D-AADH-101 até 108, BioCatalytics) e 10 mM de MP (sal de potássio) em 0,25 mL. À metade dos ensaios, foram adicionados 2 mg/mL de formiato desidrogenase ("FDH") (FDH-101, BioCatalytics, 4,8 U/mg). As amostras foram incubadas durante 16 horas a 30°C. As amostras foram ana- lisadas em relação à monatina utilizando LC/MS/MS e a distribuição isoméri- ca foi determinada utilizando o método de FDAA descrito no Exemplo 1. Os níveis de fundo do controle sem D-aminoácido desidrogenase foram subtraí- dos para considerar a contaminação de monatina presente no MP. Para a produção de R1R monatina partindo de R-MP, a atividade da enzima era como a seguir: D-AADH-103 > D-AADH-101 > D-AADH-107 > D-AADH 106 > D-AADH-108 > D-AADH-105, a quantidade de monatina ge- rada partindo de D-AADH 102 era bastante baixa e D-AADH-104 não pare- cia produzir monatina partindo de R-MP. Aproximadamente 43 ppm de R,R monatina foram produzidas pela D-AADH-103 durante a reação na ausência da formiato desidrogenase. A adição de FDH aumentou a produção de mo- natina para todas as enzimas que tinham atividade. Os aumentos estavam na faixa de desde 2,4 vezes mais altas de monatina para 10,1 vezes mais altas de monatina (D-AADH-103). D-AADH-103 produziu aproximadamente 434 ppm de R1R monatina.

Quando o S-MP foi utilizado como um substrato da reação e a produção de S1R monatina foi acompanhada, a atividade da enzima era co- mo a seguir: D-AADH-106 > D-AADH-107 > D-AADH-105 > D-AADH-101 > D-AADH-102 > D-AADH-103 > D-AADH-108. A D-AADH-104 não parecia produzir a S,R monatina nos ensaios. Aproximadamente 15 ppm de S1R mo- natina foram geradas pela D-AADH-106, 26 ppm quando também foi utiliza- da a enzima FDH.

Produção de Monatina partindo de lndol-3-Piruvato

A produção de monatina partindo de indol-3-piruvato e piruvato, utilizando as enzimas aminoácido desidrogenases da BioCataIytics acopla- das com a aldolase da SEQ ID NO: 22, foi testada sob as seguintes condi- ções: 1 mg/mL de enzima desidrogenase, 10 mM de NADH, 500 Mg/mL de aldolase (purificada), 50 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5, 4 mM de MgCI2, 20 mg/mL de indol-3-piruvato, 200 mM de formiato de amônio e 200 mM de piruvato foram incubados a 30°C a 100 rpm durante 20 horas. Os controles negativos não continham enzima aminoácido desidrogenase. Os experimentos foram realizados em duplicata. Nenhuma das desidrogenases parecia produzir quantidades que pudessem ser quantificadas de monatina partindo de indol piruvato e piruvato (como medido por LC/MS/MS como descrito no Exemplo 1) em comparação com os controles negativos. Entre- tanto, eram produzidas grandes quantidades de alanina e triptofano. É espe- rado que o aumento da proporção de aldolase em relação à desidrogenase melhore a produção de monatina. Também é esperado que as abordagens de evolução direcionada possam ser utilizadas para melhorar a proporção de atividade de aminação redutora sobre MP versus piruvato e indol-3-piruvato.

Exemplo 21

mobilização da D-Alanina Aminotransferase de B. sphaericus

A D-alanina aminotransferase de Bacillus sphaericus foi purifica- da na forma da proteína marcada com HIS6 como descrito no Exemplo 14.

A enzima foi imobilizada sobre esferas de resina Eupergit® C de acordo com o procedimento de Mateo, C e outros, Biotechnology Progress 18\ 629-634, (2002). A enzima purificada (4 mL a 6,0 mg/mL) foi submetida à diálise em 0,4 L de 0,5 M de fosfato de potássio, pH 7,8 utilizando um Pierce Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (7K MWCO; N2 de catálogo 66370; Rock- ford, IL) durante 1 hora à temperatura ambiente. O tampão foi trocado e a diálise continuou durante 1 hora. Foi adicionado fosfato piridoxal ("PLP") em uma concentração final de 0,05 mM e a solução resultante foi misturada com 0,2 g de resina Eupergit® C adquirida da Sigma-Aldrich (Fluka N2 de catálo- go 46115; St. Louis, MO). A suspensão de enzima-resina foi incubada à temperatura ambiente com mistura suave durante a noite. As esferas de re- sina foram separadas da solução da enzima por centrifugação a 4000 χ g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e a resina foi lavada com 3 χ 3 mL de 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8 contendo 0,05 mM de PLP. A mistura foi centrifugada a 3000 χ g durante 5 minutos entre as lavagens. A quantidade de proteína ligada à resina foi determinada medindo-se a quanti- dade de proteína em cada sobrenadante e subtraindo-se a soma da quanti- dade original de proteína a ser imobilizada. As concentrações de proteína foram medidas utilizando um Pierce BCA™ Protein Assay Kit com albumina de soro bovino como o padrão (N2 de catálogo 23225; Rockford, IL). As esfe- ras com enzima imobilizada lavadas foram finalmente suspensas em 4 mL de 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8 contendo 0,05 mM de PLP. Os grupos epóxi que não reagiram das esferas com enzima imobilizada foram bloqueados por incubação com 1,9 M de alanina à temperatura ambiente com mistura suave. Depois de 24 horas, as esferas foram lavadas, como descrito acima, para remover o excesso de alanina e finalmente ressuspen- sas em 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8 contendo 0,05 mM de PLP. A concentração final de enzima imobilizada era de 118 mg de proteína por g de esfera de resina.

Exemplo 22

Imobilização de ProA Aldolase de S. meliloti

Uma HMG aldolase de Sinorhizobium meliloti ("proA") foi purifi- cada na forma da proteína marcada com HIS6 utilizando um procedimento similar a um descrito no Exemplo 14 para a D-alanina aminotransferase de B. sphaericus marcada com HIS6.

Partindo de uma placa de cultura fresca (LB ágar com 50 pg/mL de canamicina) de BL21(DE3)::S. meliloti proA pET30(Xa/LIC), as células foram cultivadas em 5 mL de caldo Luria-Bertani ("LB") com 50 μg/mL de canamicina, a 37 °C e 225 rpm durante a noite. Subseqüentemente, a cultu- ra foi transferida a 0,5-0,6 % (v/v) para frascos contendo 800 mL de caldo LB com 50 μg/mL de canamicina. As células foram cultivadas a 37°C e 225 rpm até a OD600 atingisse 0,6-0,7. A expressão gênica foi induzida através da adição de 0,2 mM de IPTG. As culturas foram adicionalmente incubadas a 30°C durante 4 horas a 225 rpm e então coletadas por centrifugação em uma centrífuga J25II Beckman (Fullerton, CA) com um rotor JS-16.25 a 10.000 rpm durante 10 minutos. O pélete de células foi lavada uma vez com tampão EPPS a 50 mM gelado, pH 8,2 e as células foram novamente centri- fugadas. O pélete de células lavada foi coletada e utilizada imediatamente. Para preparar o extrato isento de células contendo a proteína HIS6-proA al- dolase de S. meliloti (HIS6-SmelproA), as células foram suspensas em 3-4 volumes de 50 mM de EPPS, pH 8,2, contendo 100 mM de NaCI e então rompidas utilizando um homogeneizador Microfluidics (Newton, MA) (3 pas- sagens 137,89 MPa (20.000 psi)), mantendo a temperatura da suspensão abaixo de 15°C. Todas as etapas de purificação subseqüentes foram reali- zadas a 4°C. O extrato de células foi centrifugado durante 15 minutos a 15.000 x g para remover os restos celulares. Alíquotas do extrato isento de células, cada uma contendo entre 15 e 20 mg de proteína solúvel, foram a- plicadas em colunas Novagen HIS-Bind (N2 de catálogo 70971-4) que ti- nham sido equilibradas anteriormente com o tampão Novagen Bind. As co- lunas foram lavadas com 2 x 10 mL do tampão Novagen Bind e 1 x 10 mL do tampão Novagen Wash diluído 1:1 com o tampão Bind. A HISe-SmeIproA foi eluída com 5 mL do tampão Novagen Elute de cada coluna. As frações de eluição de cada coluna foram combinadas e concentradas 2X com dispositi- vos de filtração por centrifugação Ultra-15 Amicon (Billerica, MA) (MWCO 10 kDa). O tampão foi trocado por passagem através de colunas descartáveis para dessalinização GE Healthcare PD10 (N2 de catálogo 17-0851-01) equi- libradas previamente com 50 mM de EPPS, pH 8,2, contendo 100 mM de NaCI.

A concentração de proteína da solução dessalinizada foi deter- minada utilizando o Pierce BCA™ Protein Assay Kit (N2 de catálogo 23225; Rockford, IL). A pureza de cada fração e o nível de expressão na fração de extrato isento de células foram determinados por SDS-PAGE com um siste- ma de minigel Protean Il da Bio-Rad (Hercules, CA) e géis com gradiente de 4-15%. Tipicamente, este procedimento produziu aproximadamente 60-70 mg de enzima partindo de 3200 mL de cultura em LB com uma pureza de -90 %. Alíquotas (1-5 mL) da enzima purificada foram armazenadas a -80-C até o uso.

A enzima foi imobilizada sobre esferas de resina Eupergit® C de acordo com o procedimento de Mateo, C. e outros, (2002) Biotechnology Progress 18:629-634, (2002) e como descrito no Exemplo 21 para a D- alanina aminotransferase de B. sphaericus, exceto que 4 mM de cloreto de magnésio estavam presentes no tampão durante a imobilização em vez de 0,05 mM de PLP. Depois do bloqueio com glicina, a enzima imobilizada la- vada foi suspensa em 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8 contendo 4 mM de cloreto de magnésio. A concentração final de proA aldolase de S. meliloti era de 52 mg de proteína por grama de esfera de resina. Exemplo 23

Produção de R1R-Monatina Utilizando Enzimas Imobilizadas

A D-alanina aminotransferase de B. sphaericus marcada com HIS6 e a proA aldolase de R. meliloti marcada com HIS6 foram purificadas e imobilizadas como descrito nos Exemplos 21 e 22.

Soluções de 50 mM de piruvato de sódio* 40 mM de D-triptofano, 4 mM de MgCI2 e 50 μΜ de PLP em 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8 foram preparadas em tubos de polipropileno de 15 ml_ com tampas rosquea- das. A cada uma destas soluções foram adicionadas ambas as enzimas i- mobilizadas até um volume final de 4 mL. As suspensões resultantes foram incubadas à temperatura ambiente com mistura suave durante até 24 horas. O progresso de cada reação foi seguido por análises de HPLC e/ou de LC- MS, medindo o D-triptofano, a D-alanina, a R,R-monatina e o ácido pirúvico. A pureza isomérica do produto de monatina foi determinada utilizando LC/MS/MS quiral. Todos os métodos analíticos são descritos no Exemplo 1. Os resultados típicos de experimentos que utilizam enzimas imobilizadas são apresentados na Tabela 47 abaixo. A análise da pureza isomérica da monatina formada durante a reação demonstrou que o produto das reações enzimáticas estava entre 74 e 80 % de R,R.

Tabela 47: Produção de R1R-Monatina Utilizando Enzimas Imobilizadas

<table>table see original document page 168</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Cargill, Incorporated

<120> Polipeptídeos e Vias Biossintéticas para a Produção de Estereoisômeros de Monatina e seus Precursores

<130> 19608-030W03 <150> <151> 11/714,279 2007-03-06 <150> <151> 11/584,016 2006-10-20 <160> 213 <170> PatentIn versão 3.3 <210> <211> <212> <213> 1 684 DNA Comamonas testosterone <400> 1 atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac 60 ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc 120 aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg 180 ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc 240 gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg 300 gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac 360 gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc 420 acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc 480 acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt 540 gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc 600 aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag 660 gccggcctga aatatattga ctaa 684

<210> 2 <211> 227 <212> PRT

<213> Comamonas testosterone <400> 2

Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gln Arg Ala Asp Arg 1 5 10 15

Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu 20 25 30

Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr 35 40 45

Ala Gly Lys Gln Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gln Pro 50 55 60

Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gln Ile Gln Pro Gly 65 70 75 80

Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe 85 90 95

Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu 100 105 110

Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg J^sp Val Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp 115 "" 120 ~ 125 ""

Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala 130 135 140

Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val 145 150 155 160

Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val 165 170 175

Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu 180 185 190

Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly 195 200 205

Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys 210 215 220

Iniciador 1 de Nocaute de pykA

Tyr Ile Asp 225

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223>

<400> 3

atgtccagaa ggcttcgcag aacaaaaatc ttc

gttaccacgt taggtgtagg ctggagctgc

<210> 4 <211> 64 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 2 de Nocaute de pykA

<400> 4

ctctaccgtt aaaatacgcg tggtattagt agaacccacg gtaccatatg aatatcctcc 60

ttag 64

<210> 5

<211> 64

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 1 de Nocaute de

<400> 5

aggacgtgaa cagatgcggt gttagtagtg ttag

pykF

ccgctcggta ccagcatatg aatatcctcc 60

64

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 2 de Nocaute de pykF

<400> 6

atgaaaaaga ccaaaattgt ttgcaccatc ggaccgaaaa ccggtgtagg ctggagctgc 60

ttc 63

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 1 de HEXaspC

<400> 7

gcggaacata tgtttgagaa cattaccgcc 30

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 2 de HEXaspC

<400> 8

ataaccggat ccttacagca ctgccacaat cg 32

<210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador para trás de aspCWl30F <400> 9

cgctcttatg gttcggtttg cttgggttgc tcaccc

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador para frente de aspCW130F

<400> 10

gggtgagcaa cccaagcttt ccgaaccata agagcg

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de R122G-1

<400> 11

caaaaaatac cagcgttaag ggagtgtggg tgagcaacc

<210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de P9T.

<400> 12

cattaccgcc gctactgccg acccgattc

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de I68V-1

<400> 13

caccaaaaat tacctcggcg tagacggcat ccctgaatt

<210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de T156A

<400> 14 tgatgcggaa aatcacgctc ttgacttcga tgcac 35

<210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador 1 de ' <400> 15

gcggcgccat ggaaaatgat ccgattggtc taatg 35

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador 2 de Glutamato racemase de L. brevis

<400> 16

gcggcggtcg acgcaattac aattgtgttt gtc 33

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 1 de Glutamato racemase de P. pentosaceus

<400> 17

gcggcgccat ggatgtatgt ataattttat ttag 34

<210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Inieiador 2 de < <400> 18

gcggcggtcg acaaatttca ttattcattc taattt 36

<210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Seqüência artificial <22 0> <223> Inieiador 1 externo <400> 19

ggccggcata tgtcgatcct taacgactac aaacgt 36

<210> 20 <211> 36 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> ρ Iniciador 2 externo de 4 D-HPG AT de Ρ. stutzeri

<400> 20

ggaaggctcg agtcatgatt ggtttccaga caaatt 36

<210> 21

<211> 693

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> Aldolase

<400> 21 atgatttatc agccggggac aacaggcatc gtcgtgcagg atattgcacg cgctgatcaa 60. gccattatcg atggcctagc agaatgtggt gtggcgacgg tgcatgaggc acaggggcgc 120 aagggcctgt tggcggatta tatgacgccg atttactcgg gcgcgcgcat cgctggatct 180 gcggtgacca ttctggcacc gccgtgtgac aattggatga tccatgtggc ggtagaacag 240 ttgcaaaagg gcgatgtgtt gctgctgggc acgatcacac cgtccaatgc tggctatttc 300 ggtgacttgc tggccacgtc agccatggcg cacggttgtc gcggattgat cattgatggc 360 ggtgtgcgcg atgtgcaaga gctgacggat atgggctttc cggtttggtc caaggccgta 420 catgcccaag gcacaatcaa agaaacgctg ggatcggtca acgtgccagt tgtctgcggc 480 caagagttgg taaaccccgg tgatattgtg gtggccgacg atgacggggt gtgcgttgtg 540 cgccgcgaag aagctgctga tgtgctggct aaggcgcggg cgcgcgagag caatgaagcg 600 gccaagcgcg cgcgttttga ggccggtgag ctggggctgg atatctatga catgcgcgcg 660 cggctggccg aaaaaggact gaaatacgtc tga 693

<210> 22 <211> 230 <212> PRT

<213> Bacillus subtilis <220>

<223> Aldolase <400> 22

Met Ile Tyr Gln Pro Gly Thr Thr Gly Ile Val Val Gln Asp Ile Ala 15 10 15

Arg Ala Asp Gln Ala Ile Ile Asp Gly Leu Ala Glu Cys Gly Val Ala 20 25 30

Thr Val His Glu Ala Gln Gly Arg Lys Gly Leu Leu Ala Asp Tyr Met 35 40 45 Thr Pro Ile Tyr Ser Gly Ala Arg Ile Ala Gly Ser Ala Val Thr Ile 50 55 60

Leu Ala Pro Pro Cys Asp Asn Trp Met Ile His Val Ala Val Glu Gln 65 70 75 80

Leu Gln Lys Gly Asp Val Leu Leu Leu Gly Thr Ile Thr Pro Ser Asn 85 90 95

Ala Gly Tyr Phe Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Ala Met Ala His Gly 100 105 110

Cys Arg Gly Leu Ile Ile Asp Gly Gly Val Arg Asp Val Gln Glu Leu 115 120 125

Thr Asp Met Gly Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Val His Ala Gln Gly 130 135 140

Thr Ile Lys Glu Thr Leu Gly Ser Val Asn Val Pro Val Val Cys Gly 145 150 155 160

Gln Glu Leu Val Asn Pro Gly Asp Ile Val Val Ala Asp Asp Asp Gly 165 170 175

Val Cys Val Val Arg Arg Glu Glu Ala Ala Asp Val Leu Ala Lys Ala 180 185 190

Arg Ala Arg Glu Ser Asn Glu Ala Ala Lys Arg Ala Arg Phe Glu Ala 195 200 205

Gly Glu Leu Gly Leu Asp Ile Tyr Asp Met Arg Ala Arg Leu Ala Glu 210 215 220

Lys Gly Leu Lys Tyr Val 225 230

<210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de Aldolase <400> 23

gaggagctcg agtcagacgt atttcagtcc tttttc

<210> 24 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223> Iniciador de Aldolase <400> 24

agaagacata tgatttatca gccggggac

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Alanina racemase

<400> 25

atggacgagt ttcaccgcga

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Alanina racemase

<400> 26

ttatgcatcg cttcatccgc

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Alanina racemase

<400> 27

ataataggat cctcatccgc ggccaacggc g

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Alanina racemase

<400> 28

gggaaaggta ccgaggaata ataaatggac gagtttcacc gcg

<210> 29

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<220>

<221> característica misc.

<222> (20)..(20)

<223> néa, c, g, out <220>

<221> característica misc.

<222> (21)..(21)

<223> néa, c, g, out

<220>

<221> característica misc.

<222> (22).. (22)

<223> kégout

<400> 29

gccggacgac acgcacattn nkgcggtcgt gaaggcgaac gcc

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223>__„ Jniçiador Mutagênico _____________

<220>

<221> característica misc.

<222> (22).. (23)

<223> néa, c, g, out

<220>

<221> característica misc.

<222> (24)..(24)

<223> k é g ou t

<400> 30

gtgaaggcga acgcctatgg annkggggat gtgcaggtgg caagg

<210> 31

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência

<220>

<223> Iniciador

artificial

Mutagênico

<220>

<221> característica misc.

<222> (21)..(22)

<223> néa, c, g, ou t

<220>

<221> característica misc.

<222> (23) .. (23)

<223> k é g ou t

<400> 31

cctcccgcct ggcggttgcc nnkttggatg aggcgctcgc tttaa

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220>

<223> Inicia:dor Mutagênico <220>

<221> característica misc.

<222> (22).. (23)

<223> η é a, c, g, ou t

<220>

<221> característica misc.

<222> (24)..(24)

<223> kégout

<400> 32

caaccaggcg aaaaggtgag cnnkggtgcg acgtacactg cgcag

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<22 0>

<221> característica misc.

<222> (23).. (24)

<223> néa,c,g,out

<22 0>

<221> característica misc.

<222> (25)..(25)

<223> kégout

<400> 33

gatcgggacg attccgatcg gcnnkgcgga cggctggctc cgccg

<210> 34

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<220>

<221> característica misc.

<222> (21)..(22)

<223> néa, c,g, out

<220>

<221> característica misc.

<222> (23) . . (23)

<223> k é g ou t

<400> 34

gccatttgga aacgatcaac nnkgaagtgc cttgcacgat cag

<210> 35

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220> <223> Racemase Iniciador <400> 35

gggaaaggta ccgaggaata ataaatggac gagtttcacc gcg

43

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Racemase Iniciador

<400> 36

gcggcgccat ggacgagttt caccgcg 27

<210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Alanina racemase

<210> 38

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciador de Alanina racemase

<400> 38

ctcccgcctg gcggttgcct tcttggatga ggcgctcgct ttaag 45

<210> 39

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Alanina racemase

<210> 40 <211> 1152 <212> DNA

<213> Geobacillus stearothermophilus <220>

<223> Alanina Racemase <400> 40

atggacgagt ttcaccgcga tacgtgggcg gaagtggatt tggacgccat ttacgacaat 60

<400> 37

gccatttgga aacgatcaac tatgaagtgc cttgcacgat cag

43

<400> 39

gccggacgac acgcacatta tggcggtcgt gaaggcgaac gcc

43

gtggagaatt tgcgccgttt gctgccggac gacacgcaca ttatggcggt cgtgaaggcg 120 aacgcctatg gacatgggga tgtgcaggtg gcaaggacag cgctcgaagc gggggcctcc 180

cgcctggcgg ttgccttttt ggatgaggcg ctcgctttaa gggaaaaagg aatcgaagcg 240

ccgattctag ttctcggggc ttcccgtcca gctgatgcgg cgctggccgc ccagcagcgc 300

attgccctga ccgtgttccg ctccgactgg ttggaagaag cgtccgccct ttacagcggc 360

ccttttccta ttcatttcca tttgaaaatg gacaccggca tgggacggct tggagtgaaa 420

gacgaggaag agacgaaacg aatcgtagcg ctgattgagc gccatccgca ttttgtgctt 480

gaaggggtgt acacgcattt tgcgactgcg gatgaggtga acaccgatta tttttcctat 540

cagtataccc gttttttgca catgctcgaa tggctgccgt cgcgcccgcc gctcgtccat 600

tgcgccaaca gcgcagcgtc gctccgtttc cctgaccgga cgttcaatat ggtccgcttc 660

ggcattgcca tgtatgggct tgccccgtcg cccggcatca agccgctgct gccgtatcca 720

ttaaaagaag cattttcgct ccatagccgc ctcgtacacg tcaaaaaact gcaaccaggc 780

gaaaaggtga gctatggtgc gacgtacact gcgcagacgg aggagtggat cgggacgatt 840

ccgatcggct atgcggacgg ctggctccgc cgcctgcagc actttcatgt ccttgttgac 900

ggacaaaagg cgccgattgt cggccgcatt tgcatggacc agtgcatgat ccgcctgcct 960

ggtccgctgc cggtcggcac gaaggtgaca ctgattggtc gccaagggga cgaggtaatt 1020

tccattgatg atgtcgctcg ccatttggaa acgatcaact acgaagtgcc ttgcacgatc 1080

agttatcgag tgccccgtat ttttttccgc cataagcgta taatggaagt gagaaacgcc 1140

gttggccgcg ga 1152

<210> 41 <211> 384 <212> PRT

<213> Geobacillus stearothermophilus <220>

<223> Alanina Racemase <400> 41

Met Asp Glu Phe His Arg Asp Thr Trp Ala Glu Val Asp Leu Asp Ala 1 5 10 15

Ile Tyr Asp Asn Val Glu Asn Leu Arg Arg Leu Leu Pro Asp Asp Thr 20 25 30

His Ile Met Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Asp Val 35 40 45

Gln Val Ala Arg Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ala Ser Arg Leu Ala Val 50 55 60

Ala Phe Leu Asp Glu Ala Leu Ala Leu Arg Glu Lys Gly Ile Glu Ala 65 70 75 80 Pro Ile Leu Val Leu Gly Ala Ser Arg Pro Ala Asp Ala Ala Leu Ala 85 90 95

Ala Gln Gln Arg Ile Ala Leu Thr Val Phe Arg Ser Asp Trp Leu Glu 100 105 110

Glu Ala Ser Ala Leu Tyr Ser Gly Pro Phe Pro Ile His Phe His Leu 115 120 125

Lys Met Asp Thr Gly Met Gly Arg Leu Gly Val Lys Asp Glu Glu Glu 130 135 140

Thr Lys Arg Ile Val Ala Leu Ile Glu Arg His Pro His Phe Val Leu 145 150 155 160

Glu Gly Val Tyr Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Glu Val Asn Thr Asp 165 170 175

Tyr Phe Ser Tyr Gln Tyr Thr Arg Phe Leu His Met Leu Glu Trp Leu 180 185 190

Pro Ser Arg Pro Pro Leu Val His Cys Ala Asn Ser Ala Ala Ser Leu 195 200 205

Arg Phe Pro Asp Arg Thr Phe Asn Met Val Arg Phe Gly Ile Ala Met 210 215 220

Tyr Gly Leu Ala Pro Ser Pro Gly Ile Lys Pro Leu Leu Pro Tyr Pro 225 230 235 240

Leu Lys Glu Ala Phe Ser Leu His Ser Arg Leu Val His Val Lys Lys 245 250 255

Leu Gln Pro Gly Glu Lys Val Ser Tyr Gly Ala Thr Tyr Thr Ala Gln 260 265 270

Thr Glu Glu Trp Ile Gly Thr Ile Pro Ile Gly Tyr Ala Asp Gly Trp 275 280 285

Leu Arg Arg Leu Gln His Phe His Val Leu Val Asp Gly Gln Lys Ala 290 295 300

Pro Ile Val Gly Arg Ile Cys Met Asp Gln Cys Met Ile Arg Leu Pro 305 310 315 320

Gly Pro Leu Pro Val Gly Thr Lys Val Thr Leu Ile Gly Arg Gln Gly 325 330 335

Asp Glu Val Ile Ser Ile Asp Asp Val Ala Arg His Leu Glu Thr Ile 340 345 350 Asn Tyr Glu Val Pro Cys Thr Ile Ser Tyr Arg Val Pro Arg Ile Phe 355 360 365

Phe Arg His Lys Arg Ile Met Glu Val Arg Asn Ala Val Gly Arg Gly 370 375 380

<210> 42 <211> 1152 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Ala Racemase que sofreu mutagênese <400> 42

atggacgagt ttcaccgcga tacgtgggcg gaagtggatt tggacgccat ttacgacaat 60

gtggagaatt tgcgccgttt gctgccggac gacacgcaca tttgtgcggt cgtgaaggcg 120

aacgcctatg gacatgggga tgtgcaggtg gcaaggacag cgctcgaagc gggggcctcc 180

cgcctggcgg ttgccgagtt ggatgaggcg ctcgctttaa gggaaaaagg aatcgaagcg 240

ccgattctag ttctcggggc ttcccgtcca gctgatgcgg cgctggccgc ccagcagcgc 300

attgccctga ccgtgttccg ctccgactgg ttggaagaag cgtccgccct ttacagcggc 3 60

ccttttccta ttcatttcca tttgaaaatg gacaccggca tgggacggct tggagtgaaa 420

gacgaggaag agacgaaacg aatcgtagcg ctgattgagc gccatccgca ttttgtgctt 480

gaaggggtgt acacgcattt tgcgactgcg gatgaggtga acaccgatta tttttcctat 540

cagtataccc gttttttgca catgctcgaa tggctgccgt cgcgcccgct gctcgtccat 600

tgcgccaaca gcgcagcgtc gctccgtttc cctgaccgga cgttcaatat ggtccgcttc 660

ggcattgcca tgtatgggct tgccccgtcg cccggcatca agccgctgct gccgtatcca 720

ttaaaagaag cattttcgct ccatagccgc ctcgtacacg tcaaaaaact gcaaccaggc 780

gaaaaggtga gctatggtgc gacgtacact gcgcagacgg aggagtggat cgggacgatt 840

ccgatcggct atgcggacgg ctggctccgc cgcctgcagc actttcatgt ccttgttgac 900

ggacaaaagg cgccgattgt cggccgcatt tgcatggacc agtgcatgat ccgcctgcct 960

ggtccgctgc cggtcggcac gaaggtgaca ctgattggtc gccaagggga cgaggtaatt 1020

tccattgatg atgtcgctcg ccatttggaa acgatcaacg cggaagtgcc ttgcacgatc 1080

agttatcgag tgccccgtat ttttttccgc cataagcgta taatggaagt gagaaacgcc 1140

gttggccgcg ga 1152

<210> 43

<211> 384

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Ala Racemase que sofreu mutagênese <400> 43

Met Asp Glu Phe His Arg Asp Thr Trp Ala Glu Val Asp Leu Asp Ala 1 5 10 15

Ile Tyr Asp Asn Val Glu Asn Leu Arg Arg Leu Leu Pro Asp Asp Thr 20 25 30

His Ile Cys Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Asp Val 35 40 45

Gln Val Ala Arg Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ala Ser Arg Leu Ala Val 50 55 60

Ala Glu Leu Asp Glu Ala Leu Ala Leu Arg Glu Lys Gly Ile Glu Ala 65 70 75 80

Pro Ile Leu Val Leu Gly Ala Ser Arg Pro Ala Asp Ala Ala Leu Ala 85 90 95

Ala Gln Gln Arg Ile Ala Leu Thr Val Phe Arg Ser Asp Trp Leu Glu 100 105 110

Glu Ala Ser Ala Leu Tyr Ser Gly Pro Phe Pro Ile His Phe His Leu 115 120 125

Lys Met Asp Thr Gly Met Gly Arg Leu Gly Val Lys Asp Glu Glu Glu 130 135 140

Thr Lys Arg Ile Val Ala Leu Ile Glu Arg His Pro His Phe Val Leu 145 150 155 160

Glu Gly Val Tyr Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Glu Val Asn Thr Asp 165 170 175

Tyr Phe Ser Tyr Gln Tyr Thr Arg Phe Leu His Met Leu Glu Trp Leu 180 185 190

Pro Ser Arg Pro Leu Leu Val His Cys Ala Asn Ser Ala Ala Ser Leu 195 200 205

Arg Phe Pro Asp Arg Thr Phe Asn Met Val Arg Phe Gly Ile Ala Met 210 215 220

Tyr Gly Leu Ala Pro Ser Pro Gly Ile Lys Pro Leu Leu Pro Tyr Pro 225 230 235 240

Leu Lys Glu Ala Phe Ser Leu His Ser Arg Leu Val His Val Lys Lys 245 250 255

Leu Gln Pro Gly Glu Lys Val Ser Tyr Gly Ala Thr Tyr Thr Ala Gln Thr Glu Glu Trp Ile Gly Thr Ile Pro Ile Gly Tyr Ala Asp Gly Trp 275 280 285

Leu Arg Arg Leu Gln His Phe His Val Leu Val Asp Gly Gln Lys Ala 290 295 300

Pro Ile Val Gly Arg Ile Cys Met Asp Gln Cys Met Ile Arg Leu Pro 305 310 315 320

Gly Pro Leu Pro Val Gly Thr Lys Val Thr Leu Ile Gly Arg Gln Gly 325 330 335

Asp Glu Val Ile Ser Ile Asp Asp Val Ala Arg His Leu Glu Thr Ile 340 345 350

Asn Ala Glu Val Pro Cys Thr Ile Ser Tyr Arg Val Pro Arg Ile Phe 355 360 365

Phe Arg His Lys Arg Ile Met Glu Val Arg Asn Ala Val Gly Arg Gly 370 375 380

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de BCAT de B. Iicheniformis

<400> 44

ggttaaggcc atgggggacc agaaagacca

<210> 45

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de BCAT de B. Iicheniformis

<400> 45

ggccttccgt cgactcagct gacacttaag et

<210> 46 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador Mutagênico <400> 46

atcacggatt tttattcggg gacggcgtg <210> 47

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 47

atcacggatt tttagacggg gacggcgtg

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 48

ggacggcgtg tatgaaggga tcaggg

<210> 49

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 49

tgtttgaagg gatcaaggta tacgacggca ac

<210> 50

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 50

gacggcgtgt atgaagggat caaggtatac gacg

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 51

gctgaaagac gctttcatcc gcttggtcg

<210> 52

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

184

29

26

32

34

<220>

<223> Iniciador Mutagênico <400> 52

gctgaaagac gctcacatcc gcttggtc

28

<210> 53

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 53

ctgaaagacg cttacatcta cttggtcgtt tcaagagg 38

<210> 54 <211> 40

<212 >___DNA___________

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador Mutagênico <400> 54

ggctgaaaga cgctttcatc tacttggtcg tttcaagagg 40

<210> 55

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<210> 56

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 56

gcaggtgacc gcggactcga tccaaac 27

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 55

gctgaaagac gctcacatct acttggtcgt ttcaagagg

39

<400> 57

gcaggtgacc tcggacacga tccaaac

27

<210> 58 <211> 32 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico <400> 58

gcaggtgacc gcggacacga tccaaacaat tg

<210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador Mutagênico <400> 59

gtcatcataa ttgtcgaacc atacgcaata ttcccgaaac

<210> 60 <211> 40 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador Mutagênico <400> 60

gtcatcataa ttgtcgaacc aaaggcaata ttcccgaaac

<210> 61

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 61

gtcatcataa ttgtcgaacc attggcagaa ttcccgaaac

<210> 62 <211> 45 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador Mutagênico <400> 62

cgagtgtcat cataattgtc gaaccatacg cagaattccc gaaac

<210> 63

<211> 46

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 63 ccgagtgtca tcataattgt cgaaccaaag gcagaattcc cgaaac

<210> 64

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 64

aatcgctgaa cttgttaaac aatattcttg tccggatcga gg

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Oligo

<400> 65

gaagaccgtg gttatcaatt t

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Oligo

<400> 66

gatggtattt acgaagtaat c

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Inieiador de Oligo

<400> 67

agatttaata tcacaacgta ac

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Oligo

<400> 68

gccaagtaaa atttaagatt ta

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Oligo

<400> 69

atttgctggg tgcgtataaa g

21

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador a montante de 4978 DAT GSPl

<400> 70

gacatgctcc tccgctgtaa ataattcacc 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador a jusante de 4978 DAT GSPl

<210> 72

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> 4978 DAT GSP2 Upstrm Inieiador

<400> 72

atcgccaaat tgataaccac ggtcttc 27

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Inieiador a montante de 4978 DAT GSP2

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Inieiador a montante de 7063 DAT GSPl

<400> 71

ccctggtgat gaagtgaagc cagtattaac

30

<400> 73

acgtcccgta gcaaactttg aaaaaggtgt

30

<400> 74

tgcatagaat cggtcgatat gttcagtagc

30 <210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador a jusante de 7063 DAT GSPl

<400> 75

gcggagaaac gattacagaa ggttcttcaa

<210> 76

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador a montante de 7063 DAT GSP2

<400> 76

gtcaccaaat tgataaccac ggtcttc

<210> 77

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador a jusante de 7063 DAT GSP2

<400> 77

ggtgtacttt atacgcaccc agcaaat

<210> 78

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Adaptor Iniciador de Oligo 1

<400> 78

gtaatacgac tcactatagg gc

<210> 79

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Adaptor Iniciador de Oligo 2 <400> 79

actatagggc acgcgtggt

<210> 80

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223> Iniciador de Oligo de ATCC4978DAATNdelF <400> 80

ggccttggca tatgagttat agcttatgga atgacc 36

<210> 81

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Oligo de ATCC4978DAATBamHlR

<400> 81

ggccttaagg atccttatgc gcgaatacct tttggg 36

<210> 82

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Oligo de ATCC7063DAATNdelF

<400> 82

ggccttggca tatgagctac actttatgga atga 34

<210> 83

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Oligo de ATCC7063DAATBamH1R2a

<400> 83

ggccaaggat ccgctaccca ctaatcatta ga 32

<210> 84 <211> 852 <212> DNA

<213> Bacillus rotans <400> 84

atgagttata gcttatggaa tgaccaaatt gtgaatgatg aagaagtagt agttgataag 60

gaggaccgtg gctatcaatt tggcgatggt gtttatgaag ttgtaaaagt atataacggt 120

gaattattta cagcggagga gcatgtcgat cgtttttacg cgagtgctga aaaaattcgc 180

gttacgatcc cttatacaaa agacaaattg catcaattat tgcatcagtt agttgaaatg 240

aataaagttc aaacaggaca tatttatttc caaattacgc gtggtgcagg ccctcgtaat 300

catattttcc ctggtgatga agtgaagcca gtattaacag gtaataccaa ggaaaatcca 360

cgtcccgtag caaactttga aaaaggtgtg aaagcaacat ttgtagaaga cattcgttgg 420

ttacgctgtg acattaaatc attaaattta cttggtgcgg tacttgctaa acaagaagca 480

catgaaaaag gatgctatga agcggtttta catcgtgatg aaatcgtaac agaaggctct 540

tcttcaaata tttatggaat taaagatggc gtattataca cacatccagc gaataacttc 600 atcttaaatg gtattacacg tcaagtaatc attaaatgtg ctgctgaaat tggcttacca 660

gtgaaggaag aagcaatgac aaaaactcag cttcttgcaa tggatgaagt gattgtttca 720

tcaacgactt cagaagtaac gccaattatc gacatagatg gaacagtaat tggtgcgggt 780

aaaccgggtg actggacacg taaattacaa gcacaatttg atacgaaaat cccaaaaggt 840

attcgcgcat aa 852

<210> 85 <211> 870 <212> DNA

<213> Bacillus serositidis <400> 85

atgagctaca ctttatggaa tgacaaaatt gtggatgata accaagtatt cattaataaa 60

gaagacagag gctatcaatt tggtgacggc gtttatgaag ttataaaagt atatgatggg 120

gaaatgttta ctgctactga acatatcgac cgattctatg caagtgcaga gaagattaaa 180

ttgactgtac cctatacaaa gcataaactg catcaattac tgcatgaatt agtggaagca 240

aacgagctga aaactggaaa cttatacttt cagataacac gcggtgcgtc tccgcgtaat 300

catctatttc caggagacga tgtacttccg gtattaacgg gaaatgtaaa agaagcacca 360

cgctccatcg aaaatgcgca aaaaggtgta aaagccacat ttgcagaaga tattcgctgg 420

ctgcgctgcg atattaaatc gctaaatctt ttaggggctg ttttagcgaa acaagaggca 480

catgaaaagg gctgctacga agcaatttta catcgcggag aaacgattac agaaggttct 540

tcaacaaacg ttttcggtat aaaaaatggt gtactctata cacatccagc tgataatttc 600

atcttaagcg gcattacacg cggtgttgtt ttggcatgtg cgaacgaaat tggacttcct 660

gtaaaacaag aagcatttac aaaagacaaa gcactgcaaa tggacgaaat gttcgtatcc 720

tctactactt ctgaaataac accagttatc gatcttgatg gagtggccat taatggtgga 780

gaaattggcg aatggacgcg caagctgcaa aagcaatttg caacgaagct tccgggaagc 840

ccagcatata atttaacaga atataaatag 870

<210> 86 <211> 283 <212> PRT

<213> Bacillus rotans <400> 86

Met Ser Tyr Ser Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Asn Asp Glu Glu Val 15 10 15

Val Val Asp Lys Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr 20 25 30

Glu Val Val Lys Val Tyr Asn Gly Glu Leu Phe Thr Ala Glu Glu His 35 40 45 Val Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Val Thr Ile Pro 50 55 60

Tyr Thr Lys Asp Lys Leu His Gln Leu Leu His Gln Leu Val Glu Met 65 70 75 80

Asn Lys Val Gln Thr Gly His Ile Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Ala 85 90 95

Gly Pro Arg Asn His Ile Phe Pro Gly Asp Glu Val Lys Pro Val Leu 100 105 110

Thr Gly Asn Thr Lys Glu Asn Pro Arg Pro Val Ala Asn Phe Glu Lys 115 120 125

Gly Val Lys Ala Thr Phe Val Glu Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp 130 135 140

Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala 145 150 155 160

His Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Val Leu His Arg Asp Glu Ile Val 165 170 175

Thr Glu Gly Ser Ser Ser Asn Ile Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Val Leu 180 185 190

Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Phe Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln 195 200 205

Val Ile Ile Lys Cys Ala Ala Glu Ile Gly Leu Pro Val Lys Glu Glu 210 215 220

Ala Met Thr Lys Thr Gln Leu Leu Ala Met Asp Glu Val Ile Val Ser 225 230 235 240

Ser Thr Thr Ser Glu Val Thr Pro Ile Ile Asp Ile Asp Gly Thr Val 245 250 255

Ile Gly Ala Gly Lys Pro Gly Asp Trp Thr Arg Lys Leu Gln Ala Gln 260 265 270

Phe Asp Thr Lys Ile Pro Lys Gly Ile Arg Ala 275 280

<210> 87

<211> 289

<212> PRT

<213> Bacillus serositidis

<400> 87 Met Ser Tyr Thr Leu Trp Asn Asp Lys Ile Val Asp Asp Asn Gln Val 15 10 15

Phe Ile Asn Lys Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr 20 25 30

Glu Val Ile Lys Val Tyr Asp Gly Glu Met Phe Thr Ala Thr Glu His 35 40 45

Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Lys Leu Thr Val Pro 50 55 60

Tyr Thr Lys His Lys Leu His Gln Leu Leu His Glu Leu Val Glu Ala 65 70 75 80

Asn Glu Leu Lys Thr Gly Asn Leu Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Ala 85 90 95

Ser Pro Arg Asn His Leu Phe Pro Gly Asp Asp Val Leu Pro Val Leu 100 105 110

Thr Gly Asn Val Lys Glu Ala Pro Arg Ser Ile Glu Asn Ala Gln Lys 115 120 125

Gly Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp 130 135 140

Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala 145 150 155 160

His Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Glu Thr Ile 165 170 175

Thr Glu Gly Ser Ser Thr Asn Val Phe Gly Ile Lys Asn Gly Val Leu 180 185 190

Tyr Thr His Pro Ala Asp Asn Phe Ile Leu Ser Gly Ile Thr Arg Gly 195 200 205

Val Val Leu Ala Cys Ala Asn Glu Ile Gly Leu Pro Val Lys Gln Glu 210 215 220

Ala Phe Thr Lys Asp Lys Ala Leu Gln Met Asp Glu Met Phe Val Ser 225 230 235 240

Ser Thr Thr Ser Glu Ile Thr Pro Val Ile Asp Leu Asp Gly Val Ala 245 250 255

Ile Asn Gly Gly Glu Ile Gly Glu Trp Thr Arg Lys Leu Gln Lys Gln 260 265 270 Phe Ala Thr Lys Leu Pro Gly Ser Pro Ala Tyr Asn Leu Thr Glu Tyr 275 280 285

Lys

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 1 de DAT de B. sphaericus

<400> 88

gatataccat ggcatactca ttatggaatg

<210> 89

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 2 de DAT de B. sphaericus

<400> 89

gttatcggat ccttaggcat taattgaaat tg

<210> 90

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 1 de DAT de B. Iicheniformis

<400> 90

ggecggttca tatgaaagtt ctttttaacg gc

<210> 91

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 2 de DAT de B. Iicheniformis

<400> 91

ccttccggat ccttaaaccg ttttggctgt et

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 1 de B. halodurans

<400> 92 gatatacata tggattattg cctttaccaa

<210> 93

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 2 de Β. halodurans

<400> 93

gaatccggat cctcactgct tcatcgctgt ttg

<210> 94

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 1 de B. cereus

<400> 94

taagaggaat aacatatggc atacgaaaga ttt

<210> 95

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 2 de B. cereus

<400> 95

gaattcggat ccttaagaag atgacatatt gg

<210> 96

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 3 de B. cereus

<400> 96

taagaggaat aacatatggg atcgaaattg gca

<210> 97

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 97

ggccttggca tatgggatac actttatgga atgacc <210> 98

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador <400> 98

ttggaaccgg atccttatat atgaagcggt tttgg

<210> 99

<211> 283

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> DAT Híbrida

<400> 99

Met Gly Tyr Thr Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Glu Asp Gly Ser Val 1 5 10 15

Ser Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr 20 25 30

Glu Val Val Lys Val Tyr Asn Gly Asn Met Phe Thr Val Asn Glu His 35 40 45

Ile Asp Arg Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Ile Val Ile Pro 50 55 60

Tyr Thr Lys Asp Val Phe His Lys Leu Leu His Glu Leu Val Glu Lys 65 70 75 80

Asn Asn Leu Asn Thr Gly His Ile Tyr Phe Gln Val Thr Arg Gly Thr 85 90 95

Ser Ser Arg Ala His Val Phe Pro Glu Ala Thr Val Pro Ala Val Ile 100 105 110

Thr Gly Asn Val Lys Ser Gly Glu Arg Ala Leu Glu Asn Leu Glu Lys 115 120 125

Gly Val Lys Ala Thr Phe Val Glu Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp 130 135 140

Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala 145 150 155 160

Ser Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Asp Ile Val 165 170 175

Thr Glu Cys Ser Ser Ser Asn Val Phe Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu 180 185 190

Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Leu Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln 195 200 205

Val Val Ile Lys Cys Ala Glu Glu Ile Asn Ile Pro Val Val Glu Glu 210 215 220

Pro Phe Thr Lys Gly Glu Ile Leu Thr Met Asp Glu Leu Phe Val Thr 225 230 235 240

Ser Val Thr Ser Glu Ile Thr Pro Val Ile Glu Ile Asp Gly Asn Gln 245 250 255

Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Thr Arg Lys Leu Gln Lys Ala 260 265 270

Phe Glu Ala Lys Ile Pro Leu Ser Leu Asn Ser 275 280

<210> 100

<211> 852

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> DAT Híbrida

<400> 100 atgggataca ctttatggaa tgaccaaatc gtggaagatg gtagcgtcag tattagcccg 60 gaagatcgcg gttatcaatt cggtgatggc gtatatgaag ttgtgaaagt atataacggt 120 aacatgttta ctgtaaatga acatattgac cgcttatatg catcagctga aaaaatccgt 180 attgttattc catatacaaa ggatgtgttt cataagttgc tgcatgaatt agtggaaaaa 240 aataacttaa acactgggca tatttatttt caagttactc gcggaacttc gagtcgtgcg 300 catgttttcc ctgaggccac tgtaccagcg gtaatcaccg gtaacgtgaa aagcggcgag 360 cgtgcgttag aaaatcttga aaaaggtgta aaagctacct ttgtggaaga tatccgttgg 420 ttacgctgtg atattaaatc tttgaacttg cttggtgcag tattagcaaa acaagaagct 480 agcgaaaaag gctgctatga agcgattctg catcgaggcg acatcgtaac agaatgctct 540 tcttcaaatg tatttggaat caaagatggt aagttgtata cccatcctgc aaacaatctg 600 attttaaatg gaatcactcg ccaggttgtc attaaatgtg cagaggaaat taatatccct 660 gtagtggaag agccatttac aaaaggcgaa atcttgacga tggatgaatt atttgtaaca 720 agtgttactt ctgaaattac gccggttatt gaaatcgatg gtaatcagat tggtgcagga 780 gtgccaggag aatggactcg taaattacaa aaagcttttg aagccaaaat tccactgagc 840 cttaacagct aa 852

<210> 101

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador <400> 101

ggccttggca tatgggatac actttatgga atgacca 37

<210> 102

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 102

ttggaaccgg atccttagct gttaaggctc agtggaa 37

<210> 103

<211> 690

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> R-specific aldolase

<400> 103 atgcctatcg ttgttacgaa gatcgaccga cccagcgcgg cggacgtcga aaggatcgcc 60 gcctatggtg tcgcgacctt gcatgaagcg caaggacgaa ccgggttgat ggcgtccaat 120 atgcgcccaa tctatcgccc tgcgcacatt gccgggcccg cggtgacctg ccttgtggcg 180 cctggcgaca attggatgat ccatgtcgcc gtcgaacagt gccagccggg agatgtcctg 240 gtcgtggtac cgaccagccc ctgcgaagac ggctatttcg gcgatctgct ggcgacctcg 300 ctgcggtcgc gcggggtcaa aggtctgatc atcgaggccg gcgtacgcga tatcgcgaca 360 ttgaccgaga tgaaattccc ggtctggtcc aaggcggtgt tcgcgcaagg aacggtcaag 420 gagaccatcg ccagcgtcaa tgtgcccctc gtctgcgcgg gcgcccgcat cgtgccgggc 480 gatctgatcg ttgccgacga cgacggggtc gtcgtgattc caagacgttc cgttccggcg 540 gtcctttcca gcgccgaggc ccgcgaagag aaggaagccc gcaaccgcgc ccgcttcgaa 600 gctggcgagc tgggcctcga cgtctacaac atgcgccagc gcctggccga caagggcttg 660 cgctatgtcg agcggctgcc cgaggaatag 690

<210> 104

<211> 229

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> R-specific Aldolase

<400> 104

Met Pro Ile Val Val Thr Lys Ile Asp Arg Pro Ser Ala Ala Asp Val 15 10 15 Glu Arg Ile Ala Ala Tyr Gly Val Ala Thr Leu His Glu Ala Gln Gly 20 25 30

Arg Thr Gly Leu Met Ala Ser Asn Met Arg Pro Ile Tyr Arg Pro Ala 35 40 45

His Ile Ala Gly Pro Ala Val Thr Cys Leu Val Ala Pro Gly Asp Asn 50 55 60

Trp Met Ile His Val Ala Val Glu Gln Cys Gln Pro Gly Asp Val Leu 65 70 75 80

Val Val Val Pro Thr Ser Pro Cys Glu Asp Gly Tyr Phe Gly Asp Leu 85 90 95

Leu Ala Thr Ser Leu Arg Ser Arg Gly Val Lys Gly Leu Ile Ile Glu 100 105 110

Ala Gly Val Arg Asp Ile Ala Thr Leu Thr Glu Met Lys Phe Pro Val 115 120 125

Trp Ser Lys Ala Val Phe Ala Gln Gly Thr Val Lys Glu Thr Ile Ala 130 135 140

Ser Val Asn Val Pro Leu Val Cys Ala Gly Ala Arg Ile Val Pro Gly 145 150 155 160

Asp Leu Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Val Ile Pro Arg Arg 165 170 175

Ser Val Pro Ala Val Leu Ser Ser Ala Glu Ala Arg Glu Glu Lys Glu 180 185 190

Ala Arg Asn Arg Ala Arg Phe Glu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Asp Val 195 200 205

Tyr Asn Met Arg Gln Arg Leu Ala Asp Lys Gly Leu Arg Tyr Val Glu 210 215 220

Arg Leu Pro Glu Glu 225

<210> 105 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência <220> <223> Iniciador <400> 105

ataagacata tgcctatcgt tgttacgaag <210> 106

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência

<220>

<223> Iniciador

artificial

<400> 106

ataagaggat ccttattcct cgggcagccg ctc

<210> 107 <211> 43 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador Mutagênico <400> 107

gccatttgga aacgatcaac gcggaagtgc cttgcacgat cag

<210> 108

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência

<220>

<223> Iniciador

artificial Mutagênico

<220>

<221> característica misc.

<222> (21)..(22)

<223> néa, c,g, out

<220>

<221> característica misc.

<222> (23) . . (23)

<223> k é g ou t

<400> 108

gccatttgga aacgatcaac nnkgaagtgc cttgcacgat cag

<210> 109

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência

<220>

<223> Iniciador

artificial

<400> 109

ccatttggaa acgatcaaca acgaagtgcc ttgcacgatc ag

<210> 110

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220> <223> Iniciador <400> 110

gccatttgga aacgatcaac ggcgaagtgc cttgcacgat cag

<210> 111

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 111

tcgccatttg gaaacgatca actgcgaagt gccttgcacg

<210> 112

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 112

ggaaacgatc aacacggaag tgccttgcac g

<210> 113

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<220>

<221> característica misc.

<222> (22)..(23)

<223> néa, c, g, out

<220>

<221> característica misc.

<222> (24)..(24)

<223> k é g ou t

<400> 113

caaccaggcg aaaaggtgag cnnkggtgcg acgtacactg cgcag

<210> 114

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<220>

<221> característica misc.

<222> (20)..(21)

<223> n é a, c, g, ou t <220>

<221> característica misc.

<222> (22)..(22)

<223> Ic é g ou t

<400> 114

gccggacgac acgcacattn nkgcggtcgt gaaggcgaac gcc

<210> 115

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 115

aggcgaaaag gtgagcgcgg gtgcgacgta cactg

<210> 116

<211> 16

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> P. striata

<22 0>

<221> característica misc. <222> (12).. (12)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 116

Leu Thr Ala Val Leu Lys Ala Asp Ala Tyr Gly Xaa Gly Ile Gly Leu 15 10 15

<210> 117

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 117

agaagacata tgccctttcg ccgtaggg

<210> 118

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 118

agaagaggat cctcagtcga cgagtatctt cg

<210> 119 <211> 1230 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> ΚΤ2440 BAR <400> 119

atgccctttc gccgtaccct tctggctgca tccctggcac ttctgatcac cggacaggcc 60

cccctgtatg cggcaccacc gttgtcgatg gacaacggca ccaacaccct gaccgtgcaa 120

aacagcaatg cctgggtcga agtcagcgcc agcgccctgc agcacaacat ccgcacgctg 180

caggccgagc tggccggcaa gtccaagctg tgcgccgtgc tcaaggccga tgcctatggc 240

cacggtatcg gcctggtaat gccatcgatc atcgcccaag gcgtgccctg cgtggcggtg 300

gccagcaacg aggaggcccg cgtggtccgc gccagtggct tcaccgggca actggtgcgg 360

gtacgcctgg ccagcctcag cgagctggaa gatggcttgc agtacgacat ggaagagctg 420

gtgggcagcg cggaatttgc ccgccaggcc gatgccatcg ccgcgcgcca tggcaagacc 480

ttgcgcattc acatggcgct caactccagc ggcatgagcc gcaacggggt ggagatggcc 540

acctggtccg gccgtggcga agcgctgcag atcaccgacc agaagcacct caagctggtc 600

gcgctgatga cccacttcgc cgtggaagac aaggacgatg tacgcaaggg cctggcggca 660

ttcaacgagc agaccgactg gttgatcaag cacgccaggc tggaccgcag caagctcacc 720

ctgcacgccg ccaactcgtt cgctacgctg gaagtgccgg aagcgcgcct ggacatggta 780

cgaacgggtg gcgcgctgtt cggcgacacc gtgccggcgc gcaccgagta caaacgtgcg 840

atgcagttca aatcgcacgt ggcggcggtg cacagctatc cggccggcaa caccgtgggc 900

tatgaccgca ccttcaccct ggcccgtgat tcgcggctgg ccaacattac ggtcgggtac 960

tccgatggct accgccgggt attcaccaac aagggccatg tgctgatcaa cggccaccgt 1020

gtgccggtcg tgggcaaggt gtcgatgaac acgctgatgg tcgatgtcac cgacttccct 1080

gatgtgaagg ggggtaacga agtggtgctg ttcggcaagc aggccggggg cgaaatcacc 1140

caggccgaga tggaagaaat caacggcgcg ttgctcgccg atttgtacac cgtatggggc 1200

aattccaacc cgaagatact cgtcgactga 1230

<210> 120

<211> 409

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> KT2440 BAR

<400> 120

Met Pro Phe Arg Arg Thr Leu Leu Ala Ala Ser Leu Ala Leu Leu Ile 1 5 10 15

Thr Gly Gln Ala Pro Leu Tyr Ala Ala Pro Pro Leu Ser Met Asp Asn 20 25 30 Gly Thr Asn Thr Leu Thr Val Gln Asn Ser Asn Ala Trp Val Glu Val 35 40 45

Ser Ala Ser Ala Leu Gln His Asn Ile Arg Thr Leu Gln Ala Glu Leu 50 55 60

Ala Gly Lys Ser Lys Leu Cys Ala Val Leu Lys Ala Asp Ala Tyr Gly 65 70 75 80

His Gly Ile Gly Leu Val Met Pro Ser Ile Ile Ala Gln Gly Val Pro 85 90 95

Cys Val Ala Val Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Val Arg Ala Ser 100 105 110

Gly Phe Thr Gly Gln Leu Val Arg Val Arg Leu Ala Ser Leu Ser Glu 115 120 125

Leu Glu Asp Gly Leu Gln Tyr Asp Met Glu Glu Leu Val Gly Ser Ala 130 135 140

Glu Phe Ala Arg Gln Ala Asp Ala Ile Ala Ala Arg His Gly Lys Thr 145 150 155 160

Leu Arg Ile His Met Ala Leu Asn Ser Ser Gly Met Ser Arg Asn Gly 165 170 175

Val Glu Met Ala Thr Trp Ser Gly Arg Gly Glu Ala Leu Gln Ile Thr 180 185 190

Asp Gln Lys His Leu Lys Leu Val Ala Leu Met Thr His Phe Ala Val 195 200 205

Glu Asp Lys Asp Asp Val Arg Lys Gly Leu Ala Ala Phe Asn Glu Gln 210 215 220

Thr Asp Trp Leu Ile Lys His Ala Arg Leu Asp Arg Ser Lys Leu Thr 225 230 235 240

Leu His Ala Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Glu Val Pro Glu Ala Arg 245 250 255

Leu Asp Met Val Arg Thr Gly Gly Ala Leu Phe Gly Asp Thr Val Pro 260 265 270

Ala Arg Thr Glu Tyr Lys Arg Ala Met Gln Phe Lys Ser His Val Ala 275 280 285

Ala Val His Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr 290 295 300 Phe Thr Leu Ala Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Ile Thr Val Gly Tyr 305 310 315 320

Ser Asp Gly Tyr Arg Arg Val Phe Thr Asn Lys Gly His Val Leu Ile 325 330 335

Asn Gly His Arg Val Pro Val Val Gly Lys Val Ser Met Asn Thr Leu 340 345 350

Met Val Asp Val Thr Asp Phe Pro Asp Val Lys Gly Gly Asn Glu Val 355 360 365

Val Leu Phe Gly Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ile Thr Gln Ala Glu Met 370 375 380

Glu Glu Ile Asn Gly Ala Leu Leu Ala Asp Leu Tyr Thr Val Trp Gly 385 390 395 400

Asn Ser Asn Pro Lys Ile Leu Val Asp 405

<210> 121 <211> 35 <212> DNA <213> Seqüência <220> <223> Iniciador <400> 121

ttgctcgccg atttgtgcac cgtatggggc aattc 35

<210> 122 <211> 31 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> pET30 C term-XhoI Iniciador <400> 122 aagtcgctcg aggtcgacga gtatcttcgg g <210> 123 <211> 32 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> pASK N teria Iniciador <400> 123

31

acggtaggtc tcaaatgccc tttcgccgta cc 32

<210> 124 <211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> pASK C term Iniciador

<400> 124

aaccgtggtc tcagcgctgt cgaggagtat cttcggg 37

<210> 125

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> pET 22 N term Iniciador

<400> 125

gctccacatg tctccctttc gccgtaccct tctggctgca tc 42

<210> 126

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> pET22 C term Iniciador

<400> 126

ccgccggatc ctcagtcgac gagtatcttc gggttggaat tgc 43

<210> 127 <211> 1230 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> NBRC12996 BAR <400> 127

atgccctttc gccgtaccct cctggctgca tccctcgctc tgctgatcac tggccaggcc 60

ccgctgtacg ccgcaccgcc cctgtcgatg gacaacggca ccaccgccct gaccgcgcag 120 aacagcaacg cctgggtcga aatcagtgcc ggcgcactgc aacacaacat ccgtaccttg 180 caggccgagt tgggcggcaa gtccaagctg tgcgccgtgc tcaaggccga cgcctatggc 240 cacggtatcg gcctggtgat gccgtcgatc atcgcccagg gcgtgccctg cgtggcggtg 300 gccagcaacg aggaggcacg cgtggtccgc gccagtggct tcaccgggca actggtgcgg 360 gtacgcctgg ccagcctcgg cgaagtggaa gatgccttgc agtacgacat ggaagagctg 420 gttggcagcg ccgagttcgc ccgccagctc gatgccatcg ccgaacgcca cggcaagacc 480 ctgcgcattc acatggcgct caattccagc ggcatgagcc gcaacggcgt ggaaatgacc 540 acctggtccg gccggggtga agcgctgcag atcactgacc agaagcacct ccagctggtc 600 gcgctgatga ctcacttcgc cgtggaagac aaggacgatg tgcgcaaagg cctggcagcg 660 ttcaacgaac agaccgactg gctgatcaag cacgcgaagc ttgatcgcag caagctcacc 720 ctgcatgccg ccaactcctt cgctacgctg gaagtgccgg aagcgcacct ggacatggtg 780

cgtaccggtg gcgcgctgtt cggcgacacc gtgccgacgc gcaccgaata ccaacgtgtc 840

atgcagttca agtcgcacgt ggcggcggtg cacagctacc cggcaggcaa caccgtcggc 900

tacgaccgca ccttcaccct ggcgcgtgat tcgcgcctgg ccaacatcac cgtgggttac 960

tccgatggct accgccgggt gttcaccaac aagggccatg tgctgatcaa cggccaccga 1020

gtgccagtgg tgggcaaggt gtcgatgaac accttgatgg tcgatgtcac cgatttcccc 1080

gatgtgaagg ggggcaacga agtggtgctg ttcggcaaac aggccgggag ggagatcacc 1140

caggccgaga tagaagaaat caacggcgcg ctgctcgccg acctctacac cgtatggggc 1200

agttccaacc cgaagatact cgtcgactga 1230

<210> 128 <211> 409 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> NBRC12 996 BAR <400> 128

Met Pro Phe Arg Arg Thr Leu Leu Ala Ala Ser Leu Ala Leu Leu Ile 15 10 15

Thr Gly Gln Ala Pro Leu Tyr Ala Ala Pro Pro Leu Ser Met Asp Asn 20 25 30

Gly Thr Thr Ala Leu Thr Ala Gln Asn Ser Asn Ala Trp Val Glu Ile 35 40 45

Ser Ala Gly Ala Leu Gln His Asn Ile Arg Thr Leu Gln Ala Glu Leu 50 55 60

Gly Gly Lys Ser Lys Leu Cys Ala Val Leu Lys Ala Asp Ala Tyr Gly 65 70 75 80

His Gly Ile Gly Leu Val Met Pro Ser Ile Ile Ala Gln Gly Val Pro 85 90 95

Cys Val Ala Val Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Val Arg Ala Ser 100 105 110

Gly Phe Thr Gly Gln Leu Val Arg Val Arg Leu Ala Ser Leu Gly Glu 115 120 125

Val Glu Asp Ala Leu Gln Tyr Asp Met Glu Glu Leu Val Gly Ser Ala 130 135 140

Glu Phe Ala Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ala Glu Arg His Gly Lys Thr 145 150 155 160

Leu Arg Ile His Met Ala Leu Asn Ser Ser Gly Met Ser Arg Asn Gly 165 170 175

Val Glu Met Thr Thr Trp Ser Gly Arg Gly Glu Ala Leu Gln Ile Thr 180 185 190

Asp Gln Lys His Leu Gln Leu Val Ala Leu Met Thr His Phe Ala Val 195 200 205

Glu Asp Lys Asp Asp Val Arg Lys Gly Leu Ala Ala Phe Asn Glu Gln 210 215 220

Thr Asp Trp Leu Ile Lys His Ala Lys Leu Asp Arg Ser Lys Leu Thr 225 230 235 240

Leu His Ala Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Glu Val Pro Glu Ala His 245 250 255

Leu Asp Met Val Arg Thr Gly Gly Ala Leu Phe Gly Asp Thr Val Pro 260 265 270

Thr Arg Thr Glu Tyr Gln Arg Val Met Gln Phe Lys Ser His Val Ala 275 280 285

Ala Val His Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr 290 295 300

Phe Thr Leu Ala Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Ile Thr Val Gly Tyr 305 310 315 320

Ser Asp Gly Tyr Arg Arg Val Phe Thr Asn Lys Gly His Val Leu Ile 325 330 335

Asn Gly His Arg Val Pro Val Val Gly Lys Val Ser Met Asn Thr Leu 340 345 350

Met Val Asp Val Thr Asp Phe Pro Asp Val Lys Gly Gly Asn Glu Val 355 360 365

Val Leu Phe Gly Lys Gln Ala Gly Arg Glu Ile Thr Gln Ala Glu Ile 370 375 380

Glu Glu Ile Asn Gly Ala Leu Leu Ala Asp Leu Tyr Thr Val Trp Gly 385 390 395 400

Ser Ser Asn Pro Lys Ile Leu Val Asp 405 <210> 129

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 129

acccaggccg agatggaaga aatcaacg

<210> 130

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 130

gcggcccata tgaagtttac taaatgtgca t

2831

<210> 131

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 131

ggccgcggat ccctatttgt agatcttagg atttg 35

<210> 132 <211> 1215 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> CR378673 Racemase <400> 132

atgaagctga agctgagcct ggtcgccctg gcactgatgg gtcagactac tgctaatgcc 60

gcaccactgc tggtggactt cgataacaat gagcgtgagg aacgtgtgca aagctctaat 120 gcgtggctgg agattgatac ccaagcattc agtggcaata ttcagttact gcagaaccaa 180 ctgaaagccg acaccaagat ctgtgcgatt atgaaggcgg atgcatacgg taatggcatt 240 gccggcttga tgcctagtat cattgctaac caagtgcctt gtgttggtat caccagcaat 300 gaggaagcgc gggtggttcg taaacatggc tttattggga agatcatgcg tgtccgtgca 360 gcctcgaaga atgaaattga gggtggcttg cagtaccaga tggaagaatt gatcggtacg 420 aaggctcaag ccgatcaaat catcgaaatt gcacgcgcaa atggcacgac gattccggtt 480 catttagcct tgaatacaag cggcatgggc cgcaacggtc tggacctgac gacctacgaa 540 ggccaagttg aaggtgtaga gattgctggc gatccaaacc tggagattgt cggcatgatg 600 actcatttcc cgaacgaggg actggacgaa atcaaacgga aagtcaaacg tttcaaagta 660 gaaacgaaat ggttaatgga ttccactgac ttgaagcgca aagatgtgac gctccacgtc gcaaacagct atatcacctt gaatctgcct gaagcgcatc tggatatggt acgcccaggt ggcatgctgt atggcgacta tccggcgaca gcgccgtatc agcgtatcgt aagcttcaag acccacgttg cctctttgca ccactttccg gctggctcaa ccattgggta cggatctacc gctgttctgg aacgtgattc agttctggct aatctgccga ttggctattc ggatggcttc gcgcgctcgt taggaaataa agccgaagtc ctgattaacg gccagcgtgc gcgcgtcatg ggtatggtca gtatgaacac gacgatggtc gatgtaacgg atattgtgga tgttcagacc aatgaagaag tcgtgatctt tggccgccag ggtttcgaag agattacggg cgaggagacg gaagagaagt ctaatcgtat tcttccggaa cattacactg tgtggggcgc cacaaacccg cgtatttatc gctaa

<210> 133

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 133

agaagacata tgaagctgaa gctgagcc

<210> 134

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 134

agaagaggat ccttagcgat aaatacgcgg g

<210> 135

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 135

ggccttggca tatgaacttt aagatgactc tg

<210> 136

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 136

ttccaattgg atccttactt caggtagtaa cgcggattc <210> 137 <211> 1218 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> CR378681 Racemase <400> 137

atgaacttta agatgactct gttaagcctg gccattacat

agcgcgccac tggtcattga tcagaacctg ccaagcgaac

agctggctgg aagttagcct gggccagttt aaatccaata

attaaagccg atactaagat ttgtgccgtt atgaaagccg

ttcggtctga tgccgacaat tctggaacag caaatcccat

gcggaagctc gcgctgtgcg tgaaagcggg tttaagggcc

gcgagcttag gcgagattaa acagtcactg gacctgaaca

catcagcagg cgaagttcat tgcagagctg ggtgtagaac

catttagctc tgaacgacgg agggatgggt cgcaatggga

ggcaaagccg aggccctcga catcgcgacc caggcaaatc

actcacttcc cgaactataa tgcggataaa gtgcgtgtga

aactccagct ggctgatcaa gcaggcggat ctgaagcgcg

gccaacagct atgtgtccat taatgttcca gaagcgcaac

ggcgtgctgt atggcgatct tccgaccaat ccggaatatc

acgcggattg cgtcaattca ccagctgcca gcatcccaga

tatattacga aacgtgatag cgttctggca aacctgccag

ccgcgccgta tgggtaatca ggctgatgtg attatcaacg

ggtgtgacca gcatgaatac tagtatcgtc gatattaccg

ggtcaagaag ttaccctgtt tggcaagcag aagaatgtgc

gaggattatt cgaagttaat cttcccggaa ctgtacacca cgttactacc tgaagtaa

<210> 138

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 138

ataatacata tgcccttctc ccgtaccc

tcccgagctt cagcatctat 60

agtcgattca gcaaagcaac 120

ttgaacaatt taaatctcat 180

atgcatacgg caatggcatc 240

gcgtggcgat tgcaagtaac 300

agctgctgcg tgtccgcagc 360

ttgaagaact gatcggctca 420

gtaatcagaa gattaacgtt 480

tcgatatgtc taccgaacaa 540

tgaacattgt tggtattatg 600

agctgaaaga cttccagaca 660

atgaactcac gctccacgtg 720

tggatatggt tcgcccgggc 780

cgagcatcgt atcgttcaag 840

ccgtgggcta cgattcgacc 900

tcggctacag tgatggctat 960

gacaacgcgc caaagtggtg 1020

atattaaagg cgttaaacag 1080

agattagcgt ggccgaaatg 1140

tgtggggtca ggcgaatccg 1200

1218

<210> 139 <211> 31 <212> DNA <213> Seqüência artificial

<220> <223> Iniciador

<400> 139

gcggcgggat ccttactgat ctttcaggat t 31

<210> 140 <211> 1230 <212> DNA <213> Seqüência artificial

<220> <223> P. taetrolens arginine racemase

<400> 140

atgcccttct cccgtaccct gctcgccctt tcccttggca tggcattgct gcaaaacccg 60 gcctttgctg cgccacccct gtcgatgacc gacggcgtag ctcaagtgaa tacccaggac 120 agcaatgcct gggtcgaaat caataaagcc gcgttcgagc acaacatacg gactctgcaa 180 accgccctcg ccggcaagtc gcagatctgc gccgtactca aggcggatgc ctatggccac 240 ggtatcggct tgttgatgcc ctcggtgatc gccatgggtg ttccctgtgt cggtgtcgcc 300 agcaacgaag aagcccgcgt cgtgcgcgag agcggtttca agggtcaact gatacgcgtg 360 cgcaccgctg ccctgagcga actggaagct gcactgccgt acaacatgga agagctggtg 420 ggcaacctgg acttcgcggt caaggccagc ctgattgccg aggatcacgg tcgcccgctg 480 gtggtgcacc tgggtctgaa ttccagcggc atgagccgta acggagtgga catgaccacc 540 gctcagggcc gtcgtgatgc ggtagctatc accaaggtgc caaacctgga agtgcgggcg 600 atcatgaccc acttcgcggt cgaagatgct gccgacgtgc gtgccgggct caaggccttc 660 aatcagcaag cccaatggct gatgaacgtg gcccagcttg atcgcagcaa gatcaccctg 720 cacgcggcca actcgttcgc cacactggag gtgcccgaat cgcatctgga catggtccgc 780 cccggcggcg cgctgttcgg cgacaccgta ccgtcccaca ccgagtacaa gcgggtcatg 840 cagttcaagt cccacgtggc gtcggtcaac agctacccca agggcaacac cgtcggttat 900 gaccgcacgt acaccctggg ccgcgactcg cggctggcca acatcaccgt cggctactct 960 gacggctacc gccgcgcgtt taccaataaa gggattgtgc tgatcaacgg ccatcgcgtg 1020 ccagtggtgg gcaaagtctc gatgaacacc ctgatggtgg acgtcactga cgcgccggat 1080 gtgaaaagcg gcgatgaagt ggtgctgttc gggcaccagg gcaaggccga gattacccag 1140 gctgagatcg aagacatcaa cggtgcactg cttgcggatc tgtataccgt gtggggcaat 1200 tccaacccta aaatcctgaa agatcagtaa 1230

<210> 141 <211> 29 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico <400> 141

tacccaggct gagatggaag acatcaacg 29

<210> 142

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial . <220>

<223> Iniciador

<400> 142

gcggcgcata tgcacgttcg ttttcgtc 28

<210> 143

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciador

<400> 143

ggcggcggga tcccggtgaa ataacttaat ctac 34

<210> 144 <211> 1230 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Y. pseudotuberculosis YPIII BAR homolog <400> 144

atgcacgttc gttttcatca tttattctta ttaccattaa taactttggt cgcttgtagc 60

caacccgtat caaaaaacca tcttagcctg acctcactat ctgccaacgc ccagcaacct 120 gtagtaaata atgcgtggct tgaaatctct caaggtgcgc tggatttcaa tactaaaaag 180 atgcttacac tgctggataa taaatccaca ctttgtgcaa tattaaaagg tgatgcctat 240 ggacatgacc tgaccttagt cacaccggtg atgctaaaaa acaatgtgca atgtattggg 300 gttgccagca atcaggaact aaaaacggta cgtgatctag gatttacggg gcagttgata 360 cgggtcagaa gtgcaacatt aaaagaaatg caacaagcta tggcttacga tgttgaagaa 420 cttattggcg ataaaaccgt cgctgagcag ttaaataata ttgcaaaact gaatggaaaa 480 gttctgcgta tccatctggc actgaactcc gcagggatgt ctcgtaatgg gctggaggtc 540 agtaaggccc gcggtttaaa tgacgcaaag acaattgtag gtttaaaaaa tctgacaatc 600 gttggcatca tgtcgcacta cccggtggaa gatgctagcg aaatcaaagc agacttggct 660 cgattccagc aacaagccaa agatgttatc gcggtcacgg ggctaaaacg tgaaaagatt 720 aagctccacg tcgccaatac attcgcgacc ttagcggtgc ctgattcatg gttggatatg 780 gtccgtgtgg gaggggtgtt ttatggtgac accatcgcca gcacagagta taagcgggtc 840

atgaccttca aatctaacat cgcatcgctg aacaactacc ctaagggcgg tactgttggc 900

tatgaccgga cctatacatt gaaacgtgat tccctgctgg cgaatatccc cgtgggttat 960

gccgatgggt atcgccgagt atttagtaat gcggggcatg tgattattca aggtcagcgc 1020

ctgcccgtat taggcaaaac atcaatgaat acggtcatgg tagacgtcac cgatctgaaa 1080

aaagtgagtt taggtgatga agttgtcttg ttcggtaagc aaggcaatgc ggaaattcag 1140

gcagaagaaa ttgaagatct cagtggcgca ctctttaccg aaatgtcaat tctgtggggc 1200

gcaaccaata agcgtattct ggtagattaa 1230

<210> 145 <211> 409 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Y. pseudotuberculosis <400> 145

Met His Val Arg Phe His His Leu Phe Leu Leu Pro Leu Ile Thr Leu 15 10 15

Val Ala Cys Ser Gln Pro Val Ser Lys Asn His Leu Ser Leu Thr Ser 20 25 30

Leu Ser Ala Asn Ala Gln Gln Pro Val Val Asn Asn Ala Trp Leu Glu 35 40 45

Ile Ser Gln Gly Ala Leu Asp Phe Asn Thr Lys Lys Met Leu Thr Leu 50 55 60

Leu Asp Asn Lys Ser Thr Leu Cys Ala Ile Leu Lys Gly Asp Ala Tyr 65 70 75 80

Gly His Asp Leu Thr Leu Val Thr Pro Val Met Leu Lys Asn Asn Val 85 90 95

Gln Cys Ile Gly Val Ala Ser Asn Gln Glu Leu Lys Thr Val Arg Asp 100 105 110

Leu Gly Phe Thr Gly Gln Leu Ile Arg Val Arg Ser Ala Thr Leu Lys 115 120 125

Glu Met Gln Gln Ala Met Ala Tyr Asp Val Glu Glu Leu Ile Gly Asp 130 135 140

Lys Thr Val Ala Glu Gln Leu Asn Asn Ile Ala Lys Leu Asn Gly Lys 145 150 155 160 Val Leu Arg Ile His Leu Ala Leu Asn Ser Ala Gly Met Ser Arg Asn 165 170 175

Gly Leu Glu Val Ser Lys Ala Arg Gly Leu Asn Asp Ala Lys Thr Ile 180 185 190

Val Gly Leu Lys Asn Leu Thr Ile Val Gly Ile Met Ser His Tyr Pro 195 200 205

Val Glu Asp Ala Ser Glu Ile Lys Ala Asp Leu Ala Arg Phe Gln Gln 210 215 220

Gln Ala Lys Asp Val Ile Ala . Val Thr Gly Leu Lys Arg Glu Lys Ile 225 230 235 240

Lys Leu His Val Ala Asn Thr Phe Ala Thr Leu Ala Val Pro Asp Ser 245 250 255

Trp Leu Asp Met Val Arg Val Gly Gly Val Phe Tyr Gly Asp Thr Ile 260 265 270

Ala Ser Thr Glu Tyr Lys Arg Val Met Thr Phe Lys Ser Asn Ile Ala 275 280 285

Ser Leu Asn Asn Tyr Pro Lys Gly Gly Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr 290 295 300

Tyr Thr Leu Lys Arg Asp Ser Leu Leu Ala Asn Ile Pro Val Gly Tyr 305 310 315 320

Ala Asp Gly Tyr Arg Arg Val Phe Ser Asn Ala Gly His Val Ile Ile 325 330 335

Gln Gly Gln Arg Leu Pro Val Leu Gly Lys Thr Ser Met Asn Thr Val 340 345 350

Met Val Asp Val Thr Asp Leu Lys Lys Val Ser Leu Gly Asp Glu Val 355 360 365

Val Leu Phe Gly Lys Gln Gly Asn Ala Glu Ile Gln Ala Glu Glu Ile 370 375 380

Glu Asp Leu Ser Gly Ala Leu Phe Thr Glu Met Ser Ile Leu Trp Gly 385 390 395 400

Ala Thr Asn Lys Arg Ile Leu Val Asp 405

<210> 146 <211> 389 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> Protein I <400> 146

Ala Val Ala Ala Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Ser Asp His Arg Asn Gly 1 5 10 15

Glu Val Gln Thr Ala Ser Asn Ala Trp Leu Glu Val Asp Leu Gly Ala 20 25 30

Phe Glu His Asn Ile Gln Thr Leu Lys Asp Arg Leu Gly Asp Lys Gly 35 40 45

Pro Lys Ile Cys Ala Ile Met Lys Ala Asp Ala Tyr Gly His Gly Ile 50 55 60

Asp Leu Leu Val Pro Ser Val Val Lys Ala Gly Ile Pro Cys Ile Gly 65 70 75 80

Ile Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Ala Arg Glu Lys Gly Phe Thr 85 90 95

Gly Arg Leu Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Pro Ala Glu Val Glu Gln 100 105 110

Ala Leu Pro Tyr Lys Met Glu Glu Leu Ile Gly Ser Leu Val Ser Ala 115 120 125

Gln Gly Ile Ala Asp Ile Ala Gln Arg His His Thr Asn Ile Pro Val 130 135 140

His Ile Ala Leu Asn Ser Ala Gly Met Ser Arg Asn Gly Ile Asp Leu 145 150 155 160

Arg Leu Ala Asp Ser Lys Glu Asp Ala Leu Ala Met Leu Lys Leu Lys 165 170 175

Gly Ile Thr Pro Val Gly Ile Met Thr His Phe Pro Val Glu Glu Lys 180 185 190

Glu Asp Val Lys Met Gly Leu Ala Gln Phe Lys Leu Asp Ser Gln Trp 195 200 205

Leu Leu Glu Ala Gly Lys Leu Asp Arg Ser Lys Ile Thr Ile His Ala 210 215 220

Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Glu Val Pro Asp Ala Tyr Phe Asp Met 225 230 235 240 Val Arg Pro Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Ser Ile Pro Ser Tyr Thr 245 250 255

Glu Tyr Lys Arg Val Met Ala Phe Lys Thr Gln Val Ala Ser Val Asn 260 265 270

His Tyr Pro Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr Phe Thr Leu 275 280 285

Lys Arg Asp Ser Trp Leu Ala Asn Leu Pro Leu Gly Tyr Ser Asp Gly 290 295 300

Tyr Arg Arg Ala Leu Ser Asn Lys Ala Tyr Val Leu Ile Gln Gly Gln 305 310 315 320

Lys Val Pro Val Val Gly Lys Thr Ser Met Asn Thr Ile Met Val Asp 325 330 335

Val Thr Asp Leu Lys Gly Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Val Leu Phe 340 345 350

Gly Arg Gln Gly Glu Ala Glu Val Lys Gln Ala Asp Leu Glu Glu Tyr 355 360 365

Asn Gly Ala Leu Leu Ala Asp Met Tyr Thr Ile Trp Gly Tyr Thr Asn 370 375 380

Pro Lys Lys Ile Lys 385

<210> 147 <211> 1201 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> A. hydrophila <400> 147

tcttggggtt ggtgtagccc cagatggtgt acatgtccgc cagcagggcg ccgttgtact 60 cttccagatc cgcctgtttc acctcagcct caccctggcg gccgaacagc accacctcgt 120 caccgggttt gacccctttc agatcggtca cgtccaccat gatggtgttc atggaggtct 180 tgcccaccac cggcaccttc tggccctgga tcagcacata ggccttgttg ctcagcgccc 240 ggcgatagcc gtcggagtag cccagcggca ggttggcgag ccaggagtcg cgcttgaggg 300 tgaaggtgcg gtcataaccg acggtgttgc cggccgggta gtggttgacg gaggcaacct 360 gggtcttgaa cgccatcacc cgcttgtact cggtgtagga ggggatggag tcaccgtaca 420 gcaggccgcc cgggcgcacc atgtcgaagt aggcgtccgg cacttccagg gtggcgaagg 480 agttggcggc gtggatggtg atcttgctgc gatccagctt gcccgcttcc agcagccact 540 gggagtccag tttgaactgg gccagcccca tcttgacgtc ctctttctcc tccaccggga 600

agtgggtcat gatgccgacc ggggtgatcc ccttgagctt gagcatggcc agcgcgtctt 660

ccttggagtc agccaggcgc agatcgatgc cgttgcggct catgccggcg gagttgagcg 720

cgatgtgcac cgggatattg gtgtggtggc gctgggcgat gtcggcgatg ccctgagcac 780

tcaccaggct gccgatgagc tcttccatct tgtagggcag ggcctgttcc acttcggccg 840

gggtggcggc acgtacccgc atcaggcggc cggtgaagcc cttctcacgg gccacgcggg 900

cctcttcgtt gctggcgatg ccgatgcagg ggatgccggc cttgaccacc gagggcacca 960

gcaggtcgat gccgtggccg taggcgtcgg ccttcatgat ggcgcagatc ttcggccctt 1020

tgtcaccgag gcgatccttg agggtctgga tgttgtgctc gaaggcgccg agatcgactt 1080

ccagccaggc attgctggcg gtctgcactt cgccgttgcg atgatcgctg gccagcggca 1140

ggtaaggggc cgcgacggcc tgaccggcca gcaggcccag gatcagcgtg gccagcagtg 1200

t 1201

<210> 148

<211> 49

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 148

ttccaaggca tatgcccttc tcccgtacac tgctggccac gctgatcct 49

<210> 149

<211> 54

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 149

ggaaccttgg atcctcaatc tttgattttc ttggggttgg tgtagcccca gatg 54

<210> 150 <211> 1230 <212> DNA

<213> A. hydrophila Chimeric Protein <400> 150

atgcccttct cccgtacact gctggccacg ctgatcctgg gcctgctggc cggtcaagcc 60 gtcgcagccc cctatctgcc tctggcaagc gatcatcgca acggcgaagt acaaaccgcc 120 agcaacgcct ggctggaagt agatctgacc gcgtttgaac agaatctgca gaccctcaag 180 acccgcctcg gcgacaaggg cccgcagatc tgcgccatca tgaaggcgga cgcctacggt 240 cacggtatcg atctgctggt tccctccgtc atcaaggccg agatcccctg tatcggcatc 300 gccagcaacg aagaggcccg cgtcgcccgc gagaaggggt tcagcggccg cctgatgcgg 360 gtacgggccg ccacacctat cgaagtggaa caggccctgc cctacaagct ggaagagctg 420 gttggcagcc tggtgagtgc tcaggggatc tccgacatcg ccctgcgcca ccacaccacc 480 attccggtgc atgtcgccct caactccgcc ggtatgagcc gcaacggcat cgacctgcgt 540 ctggccgatg ccaagcaaga tgcgctggcc atgctcaagc tcaaggggat caccccggtc 600 ggcatcatga cccacttccc ggtggaggag aaagaggacg tcaagctggg gctggctcag 660 ttcaagctgg actcccagtg gctgctggaa gcaggcaagc tggatcgcag caagatcacc 720 atccatgccg ccaactcctt cgccaccctg gcagtgccgg acgcctactt tgacatggtg 780 cgcccgggcg gcctgctcta cggcgactcc atcccctcct acaccgaata caagcgggtg 840 atggcattca agacccaggt cgcctcggtc aaccactatg cggcgggcaa cacagtcggt 900 tatgaccgca cctttactct caaacgtgac tcctggctcg ccaacctgcc gctcggttac 960 tccgacggct atcgccgtgc gctcagcaac aaggcctatg tgctgatcca gggtcagaag 1020 gtgccggtgg tcggcaagac ctccatgaac accatcatgg tggacgtgac cgatctcaaa 1080 ggggtaaagc ccggtgatga agtggtgctg tttggccgtc agggtgaggc agaagtgaaa 1140 caggctgatc tggaggagta caacggcgcc ctgttggcgg acatgtacac catctggggc 1200

tacaccaacc ccaagaaaat caaagattga 1230

<210> 151 <211> 408 <212> PRT

<213> Α. hydrophila Chimeric Protein <400> 151

Met Pro Phe Ser Arg Thr Leu Leu Ala Thr Leu Ile Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15

Ala Gly Gln Ala Val Ala Ala Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Ser Asp His 20 25 30

Arg Asn Gly Glu Val Gln Thr Ala Ser Asn Ala Trp Leu Glu Val Asp 35 40 45

Leu Thr Ala Phe Glu Gln Asn Leu Gln Thr Lys Thr Arg Leu Gly Asp 50 55 60

Lys Gly Pro Gln Ile Cys Ala Ile Met Lys Ala Asp Ala Tyr Gly His 65 70 75 80

Gly Ile Asp Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Lys Ala Glu Ile Pro Cys 85 90 95

Ile Gly Ile Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Ala Arg Glu Lys Gly 100 105 110

Phe Ser Gly Arg Leu Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Pro Ile Glu Val 115 120 125 Glu Gln Ala Leu Pro Tyr Lys Leu Glu Glu Leu Val Gly Ser Leu Val 130 135 140

Ser Ala Gln Gly Ile Ser Asp Ile Ala Leu Arg His His Thr Thr Ile 145 150 155 160

Pro Val His Val Ala Leu Asn Ser Ala Gly Met Ser Arg Asn Gly Ile 165 170 175

Asp Leu Arg Leu Ala Asp Ala Lys Gln Asp Ala Leu Ala Met Leu Lys 180 185 190

Leu Lys Gly Ile Thr Pro Val Gly Ile Met Thr His Phe Pro Val Glu 195 200 205

Glu Lys Glu Asp Val Lys Leu Gly Leu Ala Gln Phe Lys Leu Asp Ser 210 215 220

Gln Trp Leu Leu Glu Ala Gly Lys Leu Asp Arg Ser Lys Ile Thr Ile 225 230 235 240

His Ala Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Ala Val Pro Asp Ala Tyr Phe 245 250 255

Asp Met Val Arg Pro Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Ser Ile Pro Ser 260 265 270

Tyr Thr Glu Tyr Lys Arg Val Met Ala Phe Lys Thr Gln Val Ala Ser 275 280 285

Val Asn His Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr Phe 290 295 300

Thr Leu Lys Arg Asp Ser Trp Leu Ala Asn Leu Pro Leu Gly Tyr Ser 305 310 315 320

Asp Gly Tyr Arg Arg Ala Leu Ser Asn Lys Ala Tyr Val Leu Ile Gln 325 330 335

Gly Gln Lys Val Pro Val Val Gly Lys Thr Ser Met Asn Thr Ile Met 340 345 350

Val Asp Val Thr Asp Leu Lys Gly Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Val 355 360 365

Leu Phe Gly Arg Gln Gly Glu Ala Glu Val Lys Gln Ala Asp Leu Glu 370 375 380

Glu Tyr Asn Gly Ala Leu Leu Ala Asp Met Tyr Thr Ile Trp Gly Tyr 385 390

Thr Asn Pro Lys Lys Ile Lys Asp 405

<210> 152

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> característica misc.

<222> (12)..(15)

<223> réaoug

<220>

<221> característica misc.

<222> (18)..(18)

<223> méaouc

<400> 152

gccagcaacg argargcmcg cgt

<210> 153

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador <220>

<221> característica misc.

<222> (6)..(6)

<223> s é c ou g

<220>

<221> característica misc.

<222> (8)..(8)

<223> k é g ou t

<400> 153 tggccstkga tcagcaca

<210> 154

<211> 716

<212> DNA

<213> A. caviae

<220>

<221> característica misc.

<222> (18)..(709)

<223> méaouc

<220>

<221> característica misc.

<222> (12)..(15)

<223> r é a ou g <220>

<221> característica misc. <222> (711).. (711) <223> s é c ou g

<400> 154

gccagcaacg argargcmcg cgttgcccgc gagaagggct tcgaaggtcg cctgatgcgg 60

gtacgtgccg ccaccccgga tgaagtggag caggccctgc cctacaagct ggaggagctc 120

atcggcagcc tggagagcgc caaggggatc gccgacatcg cccagcgcca tcacaccaac 180

atcccggtgc acatcggcct gaactccgcc ggcatgagcc gcaacggcat cgatctgcgc 240

caggacgatg ccaaggccga tgccctggcc atgctcaagc tcaaggggat caccccggtc 300

ggcatcatga cccacttccc ggtggaggag aaagaggacg tcaagctggg gctggcccag 360

ttcaagctgg actaccagtg gctcatcgac gccggcaagc tggatcgcag caagctcacc 420

atccacgccg ccaactcctt cgccaccctg gaagtaccgg aagcctactt tgacatggtg 480

cgcccgggcg gcatcatcta tggcgacacc attccctcct acaccgagta caagaaggtg 540

atggcgttca agacccaggt cgcctccgtc aaccactacc cggcgggcaa caccgtcggc 600

tatgaccgca ccttcaccct caagcgcgac tccctgctgg ccaacctgcc gatgggctac 660

tccgacggct accgccgcgc catgagcaac aaggcctatg tgctgatcma sggcca 716

<210> 155

<211> 238

<212> PRT

<213> A. caviae

<220>

<221> característica misc.

<222> (237)..(237)

<223> Xaa é His, Gln, Asn, ou Lys

<400> 155

Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Ala Arg Glu Lys Gly Phe Glu Gly 15 10 15

Arg Leu Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Pro Asp Glu Val Glu Gln Ala

20

25

30

Leu Pro Tyr Lys 35

Leu Glu Glu Leu 40

Ile Gly Ser Leu Glu Ser Ala Lys 45

Gly Ile Ala Asp 50

Ile Ala Gln Arg 55

His His Thr Asn Ile Pro Val His 60

Ile Gly Leu Asn 65

Ser Ala Gly Met 70

Ser Arg Asn Gly Ile Asp Leu Arg

75

80

Gln Asp Asp Ala Lys Ala Asp Ala 85

Leu Ala Met Leu Lys Leu Lys Gly

90

95 Ile Thr Pro Val Gly Ile Met Thr His Phe Pro Val Glu Glu Lys Glu 100 105 110

Asp Val Lys Leu Gly Leu Ala Gln Phe Lys Leu Asp Tyr Gln Trp Leu 115 120 125

Ile Asp Ala Gly Lys Leu Asp Arg Ser Lys Leu Thr Ile His Ala Ala 130 135 140

Asn Ser Phe Ala Thr Leu Glu Val Pro Glu Ala Tyr Phe Asp Met Val 145 150 155 160

Arg Pro Gly Gly Ile Ile Tyr Gly Asp Thr Ile Pro Ser Tyr Thr Glu 165 170 175

Tyr Lys Lys Val Met Ala Phe Lys Thr Gln Val Ala Ser Val Asn His 180 185 190

Tyr Pro Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr Phe Thr Leu Lys 195 200 205

Arg Asp Ser Leu Leu Ala Asn Leu Pro Met Gly Tyr Ser Asp Gly Tyr 210 215 220

235

Arg Arg Ala Met Ser Asn Lys Ala Tyr Val 225 230 <210> 156 <211> 35 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador Mutagênico <400> 156 gtgattgttt catcaacgaa ttcagaagta acgcc <210> 157 <211> 35 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador Mutagênico <400> 157 gtgattgttt catcaacgcg ttcagaagta acgcc <210> 158 <211> 35 <212> DNA <213> Seqüência artificial

35

<220> <223> Iniciador Mutagênico <400> 158

gtgattgttt catcaacgag ttcagaagta acgcc 35

<210> 159

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 159

gtgattgttt catcaacggc ttcagaagta acgcc 35

<210> 160

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 160

gtgcaggccc tcgtgctcat attttccctg g 31

<210> 161

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 161

gaagtgattg tttcatcaac gcagtcagaa gtaacgccaa ttatc 45

<210> 162

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 162

catatgagtt atagcttatg gaatgaccaa attgtgaatg 40

<210> 163

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador

<400> 163

ctcgagtgcg gccgcaagct tgtcgacgga gctc 34

<210> 164 <211> 95 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador <400> 164

aatatttatg gaattaaaga tggcgtatta tacacacatc cagcgaataa catgatctta 60

aatggtatta cacgtcaagt aatcattaaa tgtgc 95

<210> 165

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador <400> 165

ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggc

34

<210> 166

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial

<220>

<223> Iniciador <400> 166

cgccatcttt aattccataa atatttgaag aagagccttc tg 42

<210> 167 <211> 66 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador Mutagênico <400> 167

gcaacatttg tagaagacat tcgttgggaa tactgttaca ttaaatcatt aaatttactt 60

ggtgcg 66

<210> 168 <211> 55 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador Mutagênico

<400> 168

gtattataca cacatccagc gaataactac atcttaaatg gtattacacg tcaag 55

<210> 169

<211> 64

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico <400> 169

gcaatggatg aagtgattgt ttcatcaacg actaaagaag taacgccaat tatcgacata 60

gatg 64

<210> 170

<211> 64

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 170

gcaatggatg aagtgattgt ttcatcaacg aataaagaag taacgccaat tatcgacata 60

gatg 64

<210> 171

<211> 64

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador Mutagênico

<400> 171

gcaatggatg aagtgattgt ttcatcaacg aatcgtgaag taacgccaat tatcgacata 60

gatg 64

<210> 172

<211> 675

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> R-specific aldolase <400> 172

atgaagccgg tggtggtgca gactatcgag cgggccgacc gagcgatcat cgagggtctg 60

gccgcgtgtg gcgttgccac cgtccatgag gcgcaggggc gccgggggct gcttgcgtcc 120

tacatgcgcc cgatctattc gggcgctgcg gttgcggcct cggccgtcac catcctctct 180

ccaccctgcg acaactggat gctgcacgtc gccatcgagc agatccagcc gggcgacatt 240

ctcgttctcg gcacgacctc tccgtccgat gccggctatt tcggtgatct gctggcgact 300

tcggccaagg cgcgcggttg cgtcgggttg gtcatcgatg ccggcgtacg cgatatccgc 360

gacctgacag cgatgcagtt tccggtctgg tccaaggccg tttcggccca gggcacgatc 420

aaggagacgc tgggttcggt caacgtcccc gtcgtctgcg ccggtgctct ggtcaatccc 480

ggcgacgtcg tcgtggccga tgacgacggt gtctgcgtgg tgcgccgcga ggaagccgcg 540

gaaacgctgg aaaaggcccg ggcgcggatc gccaatgagg aggaaaagcg ccagcgcttt 600 gccgctggcg aactcgggct cgacatctac aagatgcgcg aacgcctcgc tgccctgggg 660 ctcacctatg tctga 675

<210> 173

<211> 224

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> R-specific aldolase <400> 173

Met Lys Pro Val Val Val Gln Thr Ile Glu Arg Ala Asp Arg Ala Ile 1 5 10 15

Ile Glu Gly Leu Ala Ala Cys Gly Val Ala Thr Val His Glu Ala Gln 20 25 30

Gly Arg Arg Gly Leu Leu Ala Ser Tyr Met Arg Pro Ile Tyr Ser Gly 35 40 45

Ala Ala Val Ala Ala Ser Ala Val Thr Ile Leu Ser Pro Pro Cys Asp 50 55 60

Asn Trp Met Leu His Val Ala Ile Glu Gln Ile Gln Pro Gly Asp Ile 65 70 75 80

Leu Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Ser Asp Ala Gly Tyr Phe Gly Asp 85 90 95

Leu Leu Ala Thr Ser Ala Lys Ala Arg Gly Cys Val Gly Leu Val Ile 100 105 110

Asp Ala Gly Val Arg Asp Ile Arg Asp Leu Thr Ala Met Gln Phe Pro 115 120 125

Val Trp Ser Lys Ala Val Ser Ala Gln Gly Thr Ile Lys Glu Thr Leu 130 135 140

Gly Ser Val Asn Val Pro Val Val Cys Ala Gly Ala Leu Val Asn Pro 145 150 155 160

Gly Asp Val Val Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Cys Val Val Arg Arg 165 170 175

Glu Glu Ala Ala Glu Thr Leu Glu Lys Ala Arg Ala Arg Ile Ala Asn 180 185 190

Glu Glu Glu Lys Arg Gln Arg Phe Ala Ala Gly Glu Leu Gly Leu Asp 195 200 205 Ile Tyr Lys Met Arg Glu Arg Leu Ala Ala Leu Gly Leu Thr Tyr Val 210 215 220

<210> 174

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> AldolaseFpstIrbs Iniciador

<220>

<223> AldolaseRxbaI Iniciador <400> 175

ggccaaggtc tagattagac ataggtgagc cc

48

32

<400> 174

ggccggaact gcagaagaag gagatatata atgaagccgg tggtggtg

<210> 175

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<210> 176 <211> 1227 <212> DNA

<213> Aeromonas hydrophila <400> 176

atgcacaaga agacactgct ggccaccttg atcctgggcc tgctggccgg tcaagccgtc 60

gcagccccct atctgcctct ggcaagcgat catcgcaacg gcgaagtaca aaccgccagc 120

aacgcctggc tggaagtaga tctgaccgcg tttgaacaga atctgcagac cctcaagacc 180

cgcctcggcg acaagggccc gcagatctgc gccatcatga aggcggacgc ctacggtcac 240

ggtatcgatc tgctggttcc ctccgtcatc aaggccgaga tcccctgtat cggcatcgcc 300

agcaacgaag aggcccgcgt cgcccgcgag aaggggttca gcggccgcct gatgcgggta 360

cgggccgcca cacctatcga agtggaacag gccctgccct acaagctgga agagctggtt 420

ggcagcctgg tgagtgctca ggggatctcc gacatcgccc tgcgccacca caccaccatt 480

ccggtgcatg tcgccctcaa ctccgccggt atgagccgca acggcatcga cctgcgtctg 540

gccgatgcca agcaagatgc gctggccatg ctcaagctca aggggatcac cccggtcggc 600

atcatgaccc acttcccggt ggaggagaaa gaggacgtca agctggggct ggctcagttc 660

aagctggact cccagtggct gctggaagca ggcaagctgg atcgcagcaa gatcaccatc 720

catgccgcca actccttcgc caccctggca gtgccggacg cctactttga catggtgcgc 780

ccgggcggcc tgctctacgg cgactccatc ccctcctaca ccgaatacaa gcgggtgatg 840

gcattcaaga cccaggtcgc ctcggtcaac cactatgcgg cgggcaacac agtcggttat 900

gaccgcacct ttactctcaa acgtgactcc tggctcgcca acctgccgct cggttactcc 960

gacggctatc gccgtgcgct cagcaacaag gcctatgtgc tgatccaggg tcagaaggtg 1020 ccggtggtcg gcaagacctc catgaacacc atcatggtgg acgtgaccga tctcaaaggg 1080

gtaaagcccg gtgatgaagt ggtgctgttt ggccgtcagg gtgaggcaga agtgaaacag 1140

gctgatctgg aggagtacaa cggcgccctg ttggcggaca tgtacaccat ctggggctac 1200

accaacccca agaagatcaa acgctga 1227

<210> 177 <211> 408 <212> PRT

<213> Aeromonas hydrophila <400> 177

Met His Lys Lys Thr Leu Leu Ala Thr Leu Ile Leu Gly Leu Leu Ala 1 5 10 15

Gly Gln Ala Val Ala Ala Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Ser Asp His Arg 20 25 30

Asn Gly Glu Val Gln Thr Ala Ser Asn Ala Trp Leu Glu Val Asp Leu 35 40 45

Thr Ala Phe Glu Gln Asn Leu Gln Thr Leu Lys Thr Arg Leu Gly Asp 50 55 60

Lys Gly Pro Gln Ile Cys Ala Ile Met Lys Ala Asp Ala Tyr Gly His 65 70 75 80

Gly Ile Asp Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Lys Ala Glu Ile Pro Cys 85 90 95

Ile Gly Ile Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Ala Arg Glu Lys Gly 100 105 110

Phe Ser Gly Arg Leu Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Pro Ile Glu Val 115 120 125

Glu Gln Ala Leu Pro Tyr Lys Leu Glu Glu Leu Val Gly Ser Leu Val 130 135 140

Ser Ala Gln Gly Ile Ser Asp Ile Ala Leu Arg His His Thr Thr Ile 145 150 155 160

Pro Val His Val Ala Leu Asn Ser Ala Gly Met Ser Arg Asn Gly Ile 165 170 175

Asp Leu Arg Leu Ala Asp Ala Lys Gln Asp Ala Leu Ala Met Leu Lys 180 185 190

Leu Lys Gly Ile Thr Pro Val Gly Ile Met Thr His Phe Pro Val Glu 195 200 205 Glu Lys Glu Asp Val Lys Leu Gly Leu Ala Gln Phe Lys Leu Asp Ser 210 215 220

Gln Trp Leu Leu Glu Ala Gly Lys Leu Asp Arg Ser Lys Ile Thr Ile 225 230 235 240

His Ala Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Ala Val Pro Asp Ala Tyr Phe 245 250 255

Asp Met Val Arg Pro Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Ser Ile Pro Ser 260 265 270

Tyr Thr Glu Tyr Lys Arg Val Met Ala Phe Lys Thr Gln Val Ala Ser 275 280 285

Val Asn His Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr Phe 290 295 300

Thr Leu Lys Arg Asp Ser Trp Leu Ala Asn Leu Pro Leu Gly Tyr Ser 305 310 315 320

Asp Gly Tyr Arg Arg Ala Leu Ser Asn Lys Ala Tyr Val Leu Ile Gln 325 330 335

Gly Gln Lys Val Pro Val Val Gly Lys Thr Ser Met Asn Thr Ile Met 340 345 350

Val Asp Val Thr Asp Leu Lys Gly Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Val 355 360 365

Leu Phe Gly Arg Gln Gly Glu Ala Glu Val Lys Gln Ala Asp Leu Glu 370 375 380

Glu Tyr Asn Gly Ala Leu Leu Ala Asp Met Tyr Thr Ile Trp Gly Tyr 385 390 395 400

Thr Asn Pro Lys Lys Ile Lys Arg 405

<210> 178

<211> 1227

<212> DNA

<213> Aeromonas caviae

<400> 178

atgcacaaga aaacactgct cgcgaccctg atctttggcc tgctggccgg ccaggcagtc 60 gccgccccct atctgccgct cgccgacgac caccgcaacg gtcaggaaca gaccgccgcc 120 aacgcctggc tggaagtgga tctcggcgcc ttcgagcaca acatccagac cctgaagaat 180 cgcctcggtg acaagggccc gcagatctgc gccatcatga aggcggacgc ctacggtcac 240 ggcatcgacc tgctggtccc ttccgtggtc aaggcaggca tcccctgcat cggcatcgcc 300 agcaacgaag aagcacgtgt tgcccgcgag aagggcttcg aaggtcgcct gatgcgggta 360 cgtgccgcca ccccggatga agtggagcag gccctgccct acaagctgga ggagctcatc 420 ggcagcctgg agagcgccaa ggggatcgcc gacatcgccc agcgccatca caccaacatc 480 ccggtgcaca tcggcctgaa ctccgccggc atgagccgca acggcatcga tctgcgccag 540 gacgatgcca aggccgatgc cctggccatg ctcaagctca aggggatcac cccggtcggc 600 atcatgaccc acttcccggt ggaggagaaa gaggacgtca agctggggct ggcccagttc 660 aagctggact accagtggct catcgacgcc ggcaagctgg atcgcagcaa gctcaccatc 720 cacgccgcca actccttcgc caccctggaa gtaccggaag cctactttga catggtgcgc 780 ccgggcggca tcatctatgg cgacaccatt ccctcctaca ccgagtacaa gaaggtgatg 840 gcgttcaaga cccaggtcgc ctccgtcaac cactacccgg cgggcaacac cgtcggctat 900 gaccgcacct tcaccctcaa gcgcgactcc ctgctggcca acctgccgat gggctactcc 960 gacggctacc gccgcgccat gagcaacaag gcctatgtgc tgatccatgg ccagaaggcc 1020 cccgtcgtgg gcaagacttc catgaacacc accatggtgg acgtcaccga catcaagggg 1080 atcaaacccg gtgacgaggt ggtcctgttc ggacgccagg gtgatgccga ggtgaaacaa 1140 tctgatctgg aggagtacaa cggtgccctc ttggcggaca tgtacaccgt ctggggctat 1200 accaacccca agaagatcaa gcgctaa 1227 <210> 179 <211> 408 <212> PRT <213> Aeromonas caviae <400> 179 Met His Lys 1 Lys Thr Leu Leu Ala Thr Leu Ile 5 10 Phe Gly Leu . Leu Ala 15 Gly Gln Ala Val Ala Ala Pro Tyr Leu Pro Leu 20 25 Ala Asp Asp 30 ι His Arg Asn Gly Gln 35 Glu Gln Thr Ala Ala Asn Ala Trp 40 Leu Glu Val 45 Asp Leu Gly Ala Phe 50 Glu His Asn Ile Gln Thr Leu Lys 55 Asn Arg Leu Gly Asp 60 Lys Gly Pro 65 Gln Ile Cys Ala Ile Met Lys Ala 70 75 Asp Ala Tyr Gly His 80 Gly Ile Asp Leu Leu Val Pro Ser Val Val Lys 85 90 Ala Gly Ile Pro Cys 95 Ile Gly Ile Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Ala Arg Glu Lys Gly 100 105 110

Phe Glu Gly Arg Leu Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Pro Asp Glu Val 115 120 125

Glu Gln Ala Leu Pro Tyr Lys Leu Glu Glu Leu Ile Gly Ser Leu Glu 130 135 140

Ser Ala Lys Gly Ile Ala Asp Ile Ala Gln Arg His His Thr Asn Ile 145 150 155 160

Pro Val His Ile Gly Leu Asn Ser Ala Gly Met Ser Arg Asn Gly Ile 165 170 175

Asp Leu Arg Gln Asp Asp Ala Lys Ala Asp Ala Leu Ala Met Leu Lys 180 185 190

Leu Lys Gly Ile Thr Pro Val Gly Ile Met Thr His Phe Pro Val Glu 195 200 205

Glu Lys Glu Asp Val Lys Leu Gly Leu Ala Gln Phe Lys Leu Asp Tyr 210 215 220

Gln Trp Leu Ile Asp Ala Gly Lys Leu Asp Arg Ser Lys Leu Thr Ile 225 230 235 240

His Ala Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Glu Val Pro Glu Ala Tyr Phe 245 250 255

Asp Met Val Arg Pro Gly Gly Ile Ile Tyr Gly Asp Thr Ile Pro Ser 260 265 270

Tyr Thr Glu Tyr Lys Lys Val Met Ala Phe Lys Thr Gln Val Ala Ser 275 280 285

Val Asn His Tyr Pro Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr Phe 290 295 300

Thr Leu Lys Arg Asp Ser Leu Leu Ala Asn Leu Pro Met Gly Tyr Ser 305 310 315 320

Asp Gly Tyr Arg Arg Ala Met Ser Asn Lys Ala Tyr Val Leu Ile His 325 330 335

Gly Gln Lys Ala Pro Val Val Gly Lys Thr Ser Met Asn Thr Thr Met 340 345 350

Val Asp Val Thr Asp Ile Lys Gly Ile Lys Pro Gly Asp Glu Val Val 355 360 365 Leu Phe 370

Gly Arg Gln Gly Asp Ala Glu Val Lys Gln Ser Asp Leu Glu

375

380

Glu Tyr Asn Gly Ala 385

Leu Leu Ala Asp Met Tyr Thr Val Trp Gly Tyr

390

395

400

Thr Asn Pro Lys Lys Ile Lys Arg 405

<210> 180

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 180

ggttaattca tatggcgcca cccctgtcga t 31

<210> 181

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 181

aagtcgctcg agctgatctt tcaggatttt ag 32

<210> 182

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 182

ggaaccttca tatgcacaag aagacactgc tgg 33

<210> 183

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 183

ggttccaagg atcctcagcg tttgatcttc ttggg 35

<210> 184

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223> Synthetic Iniciador <400> 184

ggccaattct cgaggcgttt gatcttcttg gggt

<210> 185

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 185

ggaaccttca tatgcacaag aaaacactgc tcgcgacc

<210> 186

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 186

ggttccaagg atccttagcg cttgatcttc ttggggttg

<210> 187

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 187

ttceaaggct cgaggcgctt gatcttcttg gggttggta

<210> 188

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 188

ccttggaaca tatggccccc tatctgccgc t

<210> 189

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<220>

<221> característica misc.

<222> (6).. (6)

<223> S é C ou G <220>

<221> característica misc.

<222> (9)..(9)

<223> Y é C ou T

<220>

<221> característica misc.

<222> (15)..(15)

<223> Y é C ou T

<220>

<221> característica misc.

<222> (18)..(18)

<223> Y é C ou T

<400> 189

aaggcsgayg cctayggyca cgg

23

<210> 190

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<220>

<221> característica misc.

<222> (6)..(6)

<223> R é A ou G

<220>

<221> característica misc.

<222> (12).. (12)

<223> R é A ou G

<220>

<221> característica misc.

<222> (15)..(15)

<223> R é A ou G

<400> 190

cggcgrtagc crtcrgagta

20

<210> 191 <211> 1227 <212> DNA

<213> Aeromonas sóbria <400> 191

atgcacaaga aaacgctatt ggccaccctg atcttcggcc tgctcgcggg ccaagccgtt 60

gcggctccct atctgcccct tgcgacggat catcgcaacg gtcaggagca aaccgccagc 120 aacgcctggt tggaagtgga tctgggcgcc ttcgaacaca atatccagac cctcaaggat 180

cgcctcggtg acaagggtcc gcagatctgc gccatcatga aggccgacgc ctatggtcat 240

ggcatcgacc tgctggtccc ctccgtggtc aaggccaata tcccctgcat cggcatcgcc 300

agcaacgaag aggcccgcgt cgcccgcgag aagggcttta ccggccgtct gatgcgggtg 360

cgtgccgcca caccggccga agtggagcag gcgctgccct acaagatgga agagctgatc 420 ggcagtctgg tgagtgctca ggggatcgcc gacatcgccc agcgccacca caccaatatt 480 ccggtacaca ttggtctcaa ctctgctggc atgagccgca acggtatcga cctgcgtctg 540

gccgatgcca agcaggatgc gctggccatg ctcaagctca aggggatcac cccggtcggc 600

atcatgaccc acttcccggt ggaggagaaa gaggacgtca agatggggct ggcccagttc 660

aaactggact ctcagtggct gctggaagcg ggcaagctgg atcgcagcaa gatcaccatc 720

cacgccgcca actccttcgc caccctggaa gtgccggatg cctacttcga catggtgcgt 780

ccgggtggcc tgctctacgg cgactccatc ccctcctaca ccgaatacaa gcgggtgatg 840

gcattcaaga cccaggtcgc ctcggtcaac cactacccgg cgggcaatac cgttggctat 900

gaccgtacct ttaccctcaa gcgtgaatcc tggctcgcca acctgccgct gggctactcc 960

gatggctacc gccgtgcgct cagcaacaag gcctatgtgc tgatccaggg tcagaaggtg 1020

ccggtggtcg gcaagacctc catgaacacc atcatggtgg acgtcactga tctcaaaggg 1080

gtgaaacccg gtgatgaggt ggtgctgttt ggccgtcagg gcgaggccga ggtgaaacãg 1140

gctgatctgg aagagtacaa cggcgccctg ttagcggaca tgtacaccat ctggggctac 1200

accaacccca agaagatcaa acgctga 1227

<210> 192 <211> 408 <212> PRT

<213> Aeromonas sóbria <400> 192

Met His Lys Lys Thr Leu Leu Ala Thr Leu Ile Phe Gly Leu Leu Ala 15 10 15

Gly Gln Ala Val Ala Ala Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Thr Asp His Arg 20 25 30

Asn Gly Gln Glu Gln Thr Ala Ser Asn Ala Trp Leu Glu Val Asp Leu 35 40 45

Gly Ala Phe Glu His Asn Ile Gln Thr Leu Lys Asp Arg Leu Gly Asp 50 55 60

Lys Gly Pro Gln Ile Cys Ala Ile Met Lys Ala Asp Ala Tyr Gly His 65 70 75 80

Gly Ile Asp Leu Leu Val Pro Ser Val Val Lys Ala Asn Ile Pro Cys 85 90 95

Ile Gly Ile Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Ala Arg Glu Lys Gly 100 105 110

Phe Thr Gly Arg Leu Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Pro Ala Glu Val 115 120 125 Glu Gln Ala Leu Pro Tyr Lys Met Glu Glu Leu Ile Gly Ser Leu Val 130 135 140

Ser Ala Gln Gly Ile Ala Asp Ile Ala Gln Arg His His Thr Asn Ile 145 150 155 160

Pro Val His Ile Gly Leu Asn Ser Ala Gly Met Ser Arg Asn Gly Ile 165 170 175

Asp Leu Arg Leu Ala Asp Ala Lys Gln Asp Ala Leu Ala Met Leu Lys 180 185 190

Leu Lys Gly Ile Thr Pro Val Gly Ile Met Thr His Phe Pro Val Glu

195 200 205

Glu Lys Glu Asp Val Lys Met Gly Leu Ala Gln Phe Lys Leu Asp Ser 210 215 220

Gln Trp Leu Leu Glu Ala Gly Lys Leu Asp Arg Ser Lys Ile Thr Ile 225 230 235 240

His Ala Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Glu Val Pro Asp Ala Tyr Phe 245 250 255

Asp Met Val Arg Pro Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Ser Ile Pro Ser 260 265 270

Tyr Thr Glu Tyr Lys Arg Val Met Ala Phe Lys Thr Gln Val Ala Ser 275 280 285

Val Asn His Tyr Pro Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr Phe 290 295 300

Thr Leu Lys Arg Glu Ser Trp Leu Ala Asn Leu Pro Leu Gly Tyr Ser 305 310 315 320

Asp Gly Tyr Arg Arg Ala Leu Ser Asn Lys Ala Tyr Val Leu Ile Gln 325 330 335

Gly Gln Lys Val Pro Val Val Gly Lys Thr Ser Met Asn Thr Ile Met 340 345 350

Val Asp Val Thr Asp Leu Lys Gly Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Val 355 360 365

Leu Phe Gly Arg Gln Gly Glu Ala Glu Val Lys Gln Ala Asp Leu Glu 370 375 380

Glu Tyr Asn Gly Ala Leu Leu Ala Asp Met Tyr Thr Ile Trp Gly Tyr 385 390 395 400

Thr Asn Pro Lys Lys Ile Lys Arg 405

<210> 193 <211> 1227 <212> DNA

<213> Aeromonas jandei <400> 193

atgcacaaga aaacactgct ggccaccctg atcctcggcc tgctggccgg gcaagcggtt 60

gcagccccct acctgccgct ggccagcgat caccgcaacg gcgaagtcca gaccgccagc 120

aatgcctggc tggaagtcga tctcggcgcc ttcgagcaca atatccagac cctcaaggat 180

cgtctcggtg acaaggggcc gaagatctgc gccatcatga aggcggatgc ctatggccac 240

ggtatcgatc tgctggttcc ctcggtggtg aaagcgggta tcccctgcat cggtatcgcc 300

agcaatgaag aagctcgtgt cgcccgcgag aagggcttca ccggtcgtct gatgcgggta 360

cgtgctgcca ccccggacga agtggagcag gccctgccct acaagatgga ggagctgatc 420

ggcagtctgg tgagtgctca gggcatcgcc gatatcgccc agcgccacca caccaccatt 480

ccggtgcata tcgccctcaa ctccgccggc atgagccgca acggcatcga tctgcggctg 540

gccgactcca agcaggatgc gctggccatg ctcaagctca aggggatcac cccggtcggc 600

atcatgaccc acttcccggt ggaggagaaa gaggacgtca agatgggtct ggcccagttc 660

aaactggact cccagtggct gctggaagcg ggcaagctgg atcgcagcaa gatcaccatc 720

cacgccgcca actccttcgc aacacttgaa gtgccggatg cctacttcga catggtgcgc 780

ccgggtggcc tgctctacgg tgactccatc ccctcctaca ccgagtacaa gcgggtgatg 840

gcgttcaaga cccaggttgc ctccgtcaac cactacccgg ccggcaacac cgtcggttat 900

gaccgcacct tcaccctcaa gcgcgactcc tggctcgcca acctgccgct cggttactcc 960

gatggctatc gccgctccct gagcaacaag gcctatgtgc tgatccaggg ccagaaggtg 1020

ccggtggtcg gcaagacctc catgaacacc atcatggtgg atgtgaccga cctgaaaggg 1080

gtgaaacccg gtgacgaagt ggtgctgttc ggccgtcagg gaaatgccga ggtgaagcag 1140

gcggatctgg aggagtacaa cggcgccctg ctggcggaca tgtacaccat ctggggctac 1200

accaacccca agaagatcaa gcactaa 1227

<210> 194

<211> 408

<212> PRT

<213> Aeromonas jandei

<400> 194

Met His Lys Lys Thr Leu Leu Ala Thr Leu Ile 15 10

Leu Gly Leu Leu Ala 15 Gly Gln Ala Val Ala Ala Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Ser Asp His Arg 20 25 30

Asn Gly Glu Val Gln Thr Ala Ser Asn Ala Trp Leu Glu Val Asp Leu 35 40 45

Gly Ala Phe Glu His Asn Ile Gln Thr Leu Lys Asp Arg Leu Gly Asp 50 55 60

Lys Gly Pro Lys Ile Cys Ala Ile Met Lys Ala Asp Ala Tyr Gly His 65 70 75 80

Gly Ile Asp Leu Leu Val Pro Ser Val Val Lys Ala Gly Ile Pro Cys 85 90 95

Ile Gly Ile Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Ala Arg Glu Lys Gly 100 105 110

Phe Thr Gly Arg Leu Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Pro Asp Glu Val 115 120 125

Glu Gln Ala Leu Pro Tyr Lys Met Glu Glu Leu Ile Gly Ser Leu Val 130 135 140

Ser Ala Gln Gly Ile Ala Asp Ile Ala Gln Arg His His Thr Thr Ile 145 150 155 160

Pro Val His Ile Ala Leu Asn Ser Ala Gly Met Ser Arg Asn Gly Ile 165 170 175

Asp Leu Arg Leu Ala Asp Ser Lys Gln Asp Ala Leu Ala Met Leu Lys 180 185 190

Leu Lys Gly Ile Thr Pro Val Gly Ile Met Thr His Phe Pro Val Glu 195 200 205

Glu Lys Glu Asp Val Lys Met Gly Leu Ala Gln Phe Lys Leu Asp Ser 210 215 220

Gln Trp Leu Leu Glu Ala Gly Lys Leu Asp Arg Ser Lys Ile Thr Ile 225 230 235 240

His Ala Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Glu Val Pro Asp Ala Tyr Phe 245 250 255

Asp Met Val Arg Pro Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Ser Ile Pro Ser 260 265 270

Tyr Thr Glu Tyr Lys Arg Val Met Ala Phe Lys Thr Gln Val Ala Ser 275 280 285 Val Asn His Tyr Pro Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr Phe 290 295 300

Thr Leu Lys Arg Asp Ser Trp Leu Ala Asn Leu Pro Leu Gly Tyr Ser 305 310 315 320

Asp Gly Tyr Arg Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ala Tyr Val Leu Ile Gln 325 330 335

Gly Gln Lys Val Pro Val Val Gly Lys Thr Ser Met Asn Thr Ile Met 340 345 350

Val Asp Val Thr Asp Leu Lys Gly Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Val 355 360 365

Leu Phe Gly Arg Gln Gly Asn Ala Glu Val Lys Gln Ala Asp Leu Glu 370 375 380

Glu Tyr Asn Gly Ala Leu Leu Ala Asp Met Tyr Thr Ile Trp Gly Tyr 385 390 395 400

Thr Asn Pro Lys Lys Ile Lys His 405

<210> 195

<211> 755

<212> DNA

<213> Aeromonas salmonicida

<220>

<221> característica misc.

<222> (6)..(6)

<223> S é C ou G

<220>

<221> característica misc.

<222> (15)..(15)

<223> Y é C ou T

<220>

<221> característica misc.

<222> (744)..(744)

<223> Y é C ou T

<220>

<221> característica misc.

<222> (750)..(750)

<223> Y é C ou T

<400> 195

aaggcsgatg cctayggtca cggtatcgac ctgctggtcc cctccgtggt caaggccaat 60

atcccctgta tcggcatcgc cagcaacgaa gaggcccgcg tggcgcgcga gaaggggttc 120 agcggccgcc tgatgcgggt acgggccgcc acaccgatcg aagtggaaca ggccctgccc 180

tacaagctgg aagagctggt tggcagcctg gtgagtgctc aggggatctc cgacatcgcc 240 ctgcgccacc acaccaccat tccggtgcat gtcgccctca actccgccgg catgagccgc 300

aacggcatcg acctgcgtct ggccgatgcc aagcaagatg cgctggccat gctcaagctc 360

aaggggatca ccccggtcgg catcatgacc cacttcccgg tggaggagaa agaggacgtc 420

aagctggggc tggcccagtt caagctggac tcccagtggc tgctggaagc aggcaagctg 480

gatcgcagca agatcaccat ccatgccgcc aactccttcg ccaccctggc agtgccggac 540

gcctactttg acatggtgcg cccgggcggc ctgctctacg gcgactccat cccctcctac 600

accgaataca agcgggtgat ggcattcaag acccaggtcg cctcggtcaa ccactatgcg 660

gcgggcaaca cagtcggtta tgaccgcacc tttactctca aacgtgactc ctggctcgcc 720

aacctgcctc tcggttactc cgayggctay cgccg 755

<210> 196 <211> 1008 <212> DNA

<213> Aeromonas schubertii <400> 196

aaggcggatg cctatggtca cggcatcgat ctgctggtcc cctccgtgat caaggccggc 60

attccttgca tcggcatcgc cagcaacgaa gaggctcgcg tcgcccgtga gaagggcttc 120

gaaggccgtc tgatgcgggt gcgcgccgcc accccgcaag aggtggaagc cgccctcccc 180

tacaagatgg aggagctggt cggcagcctg gagagcgccc gtctgatgtc ggagattgcc 240

ctgcgtcacc acaccaccat tgcgtaccat ctggggctca actccgccgg catgagccgc 300

aacggcctgg atctgcgcct ctccgacgcc aagcgcgacg cactcgacct gatgaagctc 360

aaggggctgc aggtggtcgg catcatgacc cacttcccgg tcgaggagaa agaggacgtg 420

aagatgggct tcgcccagtt tcagctcgac acccagtggc tcatcgaagc cgctcgtctg 480

gatcgcagca agttgaccct gcactgtgcc aactccttta ccaccctgga ggtgcccgag 540

gcctatctgg acatggtccg cccgggcggc atcatctatg gcgacaccat tccctcctac 600

accgaataca agaaggtgat ggccttcaag acccgggtcg cctcggtcaa tcactacccg 660

aagggaaata gcgtcggcta tgaccgcacc ttcaccctgg cacgcgactc ctggctcgcc 720

aacctgccgc tgggctactc cgacggctac cgccgggcgc tgagcaacaa ggcctatgtg 780

ctggtgaatg gccagaaggc ccccgtggtg ggcaagacat ccatgaacac catcatggtg 840

gacgtgaccg acatcaaggg ggtcaaaccg ggtgacgagg tggtgctgtt tggccgccag 900

ggcaacgccg aggtgaagca gtccgatctc gaggagtaca acggcgccct cctggcggac 960

atgtacacca tctggggcta caccaatcca cgtatcatca agcgctga 1008

<210> 197 <211> 39 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220> <223> Synthetic Iniciador <400> 197

ccggaacctt catatgcaca agaaaacact gctggccac

<210> 198

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 198

ttccaaggct cgaggtgctt gatcttcttg gggttggt

<210> 199 <211> 39 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Synthetic Iniciador <400> 199

ccggaacctt catatgcaca agaaaacgct attggccac

<210> 200 <211> 38 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Synthetic Iniciador <400> 200

ttccaaggct cgaggcgttt gatcttcttg gggttggt

<210> 201 <211> 9

<212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Synthetic motif <400> 201 Lys Ala Asp Ala Tyr Gly His 1 5 <210> 202 <211> 9 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Synthetic motif <400> 202

Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Ile 1 5

<210> 203

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic Iniciador

<400> 203

cgccatcatg aaggcgaacg cctacggtca cg

<210> 204 <211> 409 <212> PRT

<213> Pseudomonas taetrolens <400> 204

Met Pro Phe Ser Arg Thr Leu Leu Ala Leu Ser Leu Gly Met Ala Leu 15 10 15

Leu Gln Asn Pro Ala Phe Ala Ala Pro Pro Leu Ser Met Thr Asp Gly 20 25 30

Val Ala Gln Val Asn Thr Gln Asp Ser Asn Ala Trp Val Glu Ile Asn 35 40 45

Lys Ala Ala Phe Glu His Asn Ile Arg Thr Leu Gln Thr Ala Leu Ala 50 55 60

Gly Lys Ser Gln Ile Cys Ala Val Leu Lys Ala Asp Ala Tyr Gly His 65 70 75 80

Gly Ile Gly Leu Leu Met Pro Ser Val Ile Ala Met Gly Val Pro Cys 85 90 95

Val Gly Val Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Val Arg Glu Ser Gly 100 105 110

Phe Lys Gly Gln Leu Ile Arg Val Arg Thr Ala Ala Leu Ser Glu Leu 115 120 125

Glu Ala Ala Leu Pro Tyr Asn Met Glu Glu Leu Val Gly Asn Leu Asp 130 135 140

Phe Ala Val Lys Ala Ser Leu Ile Ala Glu Asp His Gly Arg Pro Leu 145 150 155 160

Val Val His Leu Gly Leu Asn Ser Ser Gly Met Ser Arg Asn Gly Val 165 170 175

Asp Met Thr Thr Ala Gln Gly Arg Arg Asp Ala Val Ala Ile Thr Lys 180 185 190

Val Pro Asn Leu Glu Val Arg Ala Ile Met Thr His Phe Ala Val Glu 195 200 205

Asp Ala Ala Asp Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Phe Asn Gln Gln Ala 210 215 220

Gln Trp Leu Met Asn Val Ala Gln Leu Asp Arg Ser Lys Ile Thr Leu 225 230 235 240

His Ala Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Glu Val Pro Glu Ser His Leu 245 250 255

Asp Met Val Arg Pro Gly Gly Ala Leu Phe Gly Asp Thr Val Pro Ser 260 265 270

His Thr Glu Tyr Lys Arg Val Met Gln Phe Lys Ser His Val Ala Ser 275 280 285

Val Asn Ser Tyr Pro Lys Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr Tyr 290 295 300

Thr Leu Gly Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Ile Thr Val Gly Tyr Ser 305 310 315 320

Asp Gly Tyr Arg Arg Ala Phe Thr Asn Lys Gly Ile Val Leu Ile Asn 325 330 335

Gly His Arg Val Pro Val Val Gly Lys Val Ser Met Asn Thr Leu Met 340 345 350

Val Asp Val Thr Asp Ala Pro Asp Val Lys Ser Gly Asp Glu Val Val 355 360 365

Leu Phe Gly His Gln Gly Lys Ala Glu Ile Thr Gln Ala Glu Ile Glu 370 375 380

Asp Ile Asn Gly Ala Leu Leu Ala Asp Leu Tyr Thr Val Trp Gly Asn 385 390 395 400

Ser Asn Pro Lys Ile Leu Lys Asp Gln 405

<210> 205

<211> 283

<212> PRT

<213> Seqüência

artificial

<220> <223>

BsphDATgene DAAT <400> 205

Met Ala Tyr Ser Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Glu Glu Gly Ser Ile 15 10 15

Thr Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Ile Tyr 20 25 30

Glu Val Ile Lys Val Tyr Asn Gly His Met Phe Thr Ala Gln Glu His 35 40 45

Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Leu Val Ile Pro 50 55 60

Tyr Thr Lys Asp Val Leu His Lys Leu Leu His Asp Leu Ile Glu Lys 65 70 75 80

Asn Asn Leu Asn Thr Gly His Val Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Thr 85 90 95

Thr Ser Arg Asn His Ile Phe Pro Asp Ala Ser Val Pro Ala Val Leu 100 105 110

Thr Gly Asn Val Lys Thr Gly Glu Arg Ser Ile Glu Asn Phe Glu Lys 115 120 125

Gly Val Lys Ala Thr Leu Val Glu Asp Val Arg Trp Leu Arg Cys Asp 130 135 140

Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala 145 150 155 160

Ser Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Asp Ile Ile 165 170 175

Thr Glu Cys Ser Ser Ala Asn Val Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu 180 185 190

Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Tyr Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln 195 200 205

Val Ile Leu Lys Cys Ala Ala Glu Ile Asn Leu Pro Val Ile Glu Glu 210 215 220

Pro Met Thr Lys Gly Asp Leu Leu Thr Met Asp Glu Ile Ile Val Ser 225 230 235 240

Ser Val Ser Ser Glu Val Thr Pro Val Ile Asp Val Asp Gly Gln Gln 245 250 255

Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Thr Arg Lys Leu Gln Lys Ala 260

265

270

Phe Glu Ala Lys Leu Pro Ile Ser Ile Asn Ala 275 280

<210> 206 <211> 283 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> B. halodurans DAAT <400> 206

Met Asp Tyr Cys Leu Tyr Gln Asp Gln Leu Val Pro Arg Glu Gln Leu 15 10 15

Lys Ile Asp Pro Glu Asp Arg Gly Tyr His Phe Gly Asp Gly Ile Tyr 20 25 30

Glu Val Val His Val Tyr His Gly Lys Ala Phe Ala Leu Ser Asp His 35 40 45

Leu Thr Arg Phe Lys Glu Ser Ala Glu Lys Leu Asp Leu Pro Met Leu 50 55 60

Tyr Ser Thr Asp Lys Leu Gly Glu Leu Val Gln Gln Leu Ile Glu Lys 65 70 75 80

Asn Lys Leu Glu His Gly Met Val Tyr Phe Gln Met Thr Arg Gly Ile 85 90 95

Ser Pro Arg Asn His Leu Tyr Thr Arg Asn Glu Thr Pro Val Leu Thr 100 105 110

Gly Phe Ser Lys Pro Leu Pro Asp Glu Lys Arg Glu Ser Val Arg Leu 115 120 125

Tyr Leu Thr Asp Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp Ile Lys Thr Ile 130 135 140

Asn Leu Leu Gly Asn Val Leu Ala Lys Arg Glu Ala Thr Asp His Gln 145 150 155 160

Cys Asp Glu Ala Leu Leu His Arg Asp Gly Thr Val Thr Glu Gly Ser 165 170 175

Ser Ser Asn Val Phe Leu Ile Lys Asn Glu Thr Leu Tyr Thr His Pro 180 185 190

Ala Thr Asn Leu Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln Ile Thr Ile Arg 195 200 205 Leu Ala Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Val Val Glu Glu Pro Phe Pro Lys 210 215 220

Glu Val Xle Lys Asp Ala Asp Glu Ala Phe Ile Thr Ser Thr Ile His 225 230 235 240

Glu Ile Thr Pro Val Thr Glu Val Ile Gly Asp Glu Thr Ala His Phe 245 250 255

Pro Val Gly Pro Val Thr Lys Met Leu Gln Gln Ala Phe Ala Glu Glu 260 265 270

Ile Ala Lys His Ser Gln Thr Ala Met Lys Gln 275 280

<210> 207 <211> 283 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> GsteDATgene DAAT <400> 207 Met Gly Tyr Thr Leu Trp Asn 1 5 10 15

Lys Ile Asp Lys Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr 20 25 30

Glu Val Val Lys Val Tyr Asn Gly Glu Met Phe Thr Val Asn Glu His 35 40 45

Ile Asp Arg Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Ile Thr Ile Pro 50 55 60

Tyr Thr Lys Asp Lys Phe His Gln Leu Leu His Glu Leu Val Glu Lys 65 70 75 80

Asn Glu Leu Asn Thr Gly His Ile Tyr Phe Gln Val Thr Arg Gly Thr 85 90 95

Ser Pro Arg Ala His Gln Phe Pro Glu Asn Thr Val Lys Pro Val Ile 100 105 110

Ile Gly Tyr Thr Lys Glu Asn Pro Arg Pro Leu Glu Asn Leu Glu Lys 115 120 125

Gly Val Lys Ala Thr Phe Val Glu Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp 130 135 140 Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala 145 150 155 160

His Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Asn Asn Thr Val 165 170 175

Thr Glu Gly Ser Ser Ser Asn Val Phe Gly Ile Lys Asp Gly Ile Leu 180 185 190

Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Met Ile Leu Lys Gly Ile Thr Arg Asp 195 200 205

Val Val Ile Ala Cys Ala Asn Glu Ile Asn Met Pro Val Lys Glu Ile 210 215 220

Pro Phe Thr Thr His Glu Ala Leu Lys Met Asp Glu Leu Phe Val Thr 225 230 235 240

Ser Thr Thr Ser Glu Ile Thr Pro Val Ile Glu Ile Asp Gly Lys Leu 245 250 255

Ile Arg Asp Gly Lys Val Gly Glu Trp Thr Arg Lys Leu Gln Lys Gln 260 265 270

Phe Glu Thr Lys Ile Pro Lys Pro Leu His Ile 275 280

<210> 208 <211> 290 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> B.cereus 145 DAAT <400> 208

Leu Ala Tyr Glu Lys Phe Val Leu Trp Asn Asp Glu Val Ile Asp Thr 15 10 15

Thr Lys Gln Gln Thr Tyr Ile Glu Leu Glu Glu Arg Gly Ser Gln Phe 20 25 30

Gly Asp Gly Val Tyr Glu Val Ile Arg Leu Tyr Lys Gly Asn Phe His 35 40 45

Leu Leu Asp Pro His Ile Thr Arg Leu Tyr Arg Ser Met Glu Glu Val 50 55 60

Glu Leu Ser Leu Pro Phe Ser Lys Ala Glu Leu Ile Thr Leu Leu Tyr 65 70 75 80 Lys Leu Ile Glu Arg Asn His Phe His Glu Asp Gly Thr Ile Tyr Leu 85 90 95

Gln Val Ser Arg Gly Val Gln Ala Arg Thr His Val Phe Ser Tyr Asp 100 105 110

Thr Pro Pro Thr Ile Tyr Ala Tyr Ile Thr Lys Lys Glu Arg Pro Ala 115 120 125

Leu Trp Ile Glu Tyr Gly Ile Arg Ala Ile Ser Glu Pro Asp Thr Arg 130 135 140

Trp Leu Arg Cys Asp Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Pro Asn Val Leu 145 150 155 160

Ala Ala Thr Lys Ala Glu Arg Lys Gly Cys Lys Glu Ala Leu Leu Val 165 170 175

Arg Asn Gly Ile Val Thr Glu Gly Ser His Ser Asn Phe Phe Leu Ile 180 185 190

Lys Asn Gly Thr Leu Tyr Thr His Pro Ala Asn His Leu Ile Leu Asn 195 200 205

Gly Ile Ile Arg Gln Tyr Val Leu Ser Leu Ala Asn Thr Leu His Ile 210 215 220

Pro Val Gln Glu Glu Leu Phe Ser Val Arg Asp Val Tyr Gln Ala Asp 225 230 235 240

Glu Cys Phe Phe Thr Gly Thr Thr Ile Glu Ile Leu Pro Met Thr His 245 250 255

Leu Asp Gly Thr Ala Ile Gln Asp Gly Gln Val Gly Ala Ile Thr Lys 260 265 270

Lys Leu Gln Lys Ser Phe Asn Lys Ile Leu Leu Gln Ser Asn Met Ser 275 280 285

Ser Ser 290

<210> 209 <211> 282 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> BsubDAT DAAT

<400> 209

Met Lys Val Leu Val Asn Gly Arg Leu Ile Gly Arg Ser Glu Ala Ser 1 5 10 15

Ile Asp Leu Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Ile Tyr Glu 20 25 30

Val Ile Arg Val Tyr Lys Gly Val Leu Phe Gly Leu Arg Glu His Ala 35 40 45

Glu Arg Phe Phe Arg Ser Ala Ala Glu Ile Gly Ile Ser Leu Pro Phe 50 55 60

Ser Ile Glu Asp Leu Glu Trp Asp Leu Gln Lys Leu Val Gln Glu Asn 65 70 75 80

Ala Val Ser Glu Gly Ala Val Tyr Ile Gln Thr Thr Arg Gly Val Ala 85 90 95

Pro Arg Lys His Gln Tyr Glu Ala Gly Leu Glu Pro Gln Thr Thr Ala 100 105 110

Tyr Thr Phe Thr Val Lys Lys Pro Glu Gln Glu Gln Ala Tyr Gly Val 115 120 125

Ala Ala Ile Thr Asp Glu Asp Leu Arg Trp Leu Arg Cys Asp Ile Lys 130 135 140

Ser Leu Asn Leu Leu Tyr Asn Val Met Thr Lys Gln Arg Ala Tyr Glu 145 150 155 160

Ala Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu Leu Arg Asp Gly Val Val Thr Glu 165 170 175

Gly Thr Ser Ser Asn Val Tyr Ala Val Ile Asn Gly Thr Val Arg Thr 180 185 190

His Pro Ala Asn Arg Leu Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Met Asn Ile 195 200 205

Leu Gly Leu Ile Glu Lys Asn Gly Ile Lys Leu Asp Glu Thr Pro Val 210 215 220

Ser Glu Glu Glu Leu Lys Gln Ala Glu Glu Ile Phe Ile Ser Ser Thr 225 230 235 240

Thr Ala Glu Ile Ile Pro Val Val Thr Leu Asp Gly Gln Ser Ile Gly 245 250 255

Ser Gly Lys Pro Gly Pro Val Thr Lys Gln Leu Gln Ala Ala Phe Gln 260 265 270 Glu Ser Ile Gln Gln Ala Ala Ser Ile Ser 275 280

<210> 210 <211> 283 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Bacillus lichenifomis <400> 210

Met Lys Val Leu Phe Asn Gly Arg Leu Met Glu Arg Ser Glu Cys Ala 15 10 15

Val Asp Ile Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr Glu 20 25 30

Val Ile Arg Ile Tyr Asn Gly Ile Leu Phe Thr Leu Asp Glu His Ile 35 40 45

Ala Arg Leu Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Ile Gly Ile Asp Leu Ser Phe 50 55 60

Ser Glu Ala Glu Leu Lys Ser Gln Leu Lys Glu Leu Val Asp Ile Asn 65 70 75 80

Gln Arg Arg Asp Gly Gly Leu Tyr Leu Gln Val Thr Arg Gly Lys Ala 85 90 95

Pro Arg Lys His Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Thr Pro Gln Val Thr Ala 100 105 110

Tyr Thr Phe Pro Ile Gln Lys Pro Glu Lys Glu Gln Gln Asn Gly Val 115 120 125

Ser Ala Ile Thr Ala Asp Asp Met Arg Trp Leu Arg Cys Asp Ile Lys 130 135 140

Ser Leu Asn Leu Leu Tyr Asn Val Met Ile Lys Gln Lys Ala Gln Glu 145 150 155 160

Ala Ser Ala Phe Glu Ala Ile Leu Ile Arg Asp Gly Leu Val Thr Glu 165 170 175

Gly Thr Ser Ser Asn Val Tyr Val Ala Lys Gln Asn Val Ile Tyr Thr 180 185 190

His Pro Val Thr Thr Leu Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Met Lys Val 195 200 205

Leu Gln Leu Cys Glu Glu Asn Gly Leu Asn Tyr Glu Glu Lys Ala Val 210 215 220

Thr Lys Asp Glu Leu Leu Asn Ala Asp Glu Val Phe Ile Thr Ser Thr 225 230 235 240

Thr Ala Glu Val Ile Pro Val Thr Ser Ile Asp Gly Gln Thr Ile Gly 245 250 255

Ser Gly Ala Pro Gly Pro Leu Thr Lys Asn Val Gln Thr Ala Leu Gln 260 265 270

Asn Ser Ile Leu Ser Glu Thr Ala Lys Thr Val 275 280

<210> 211 <211> 283 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Bacillus rotans DAAT <400> 211

Met Ser Tyr Ser Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Asn Asp Glu Glu Val 15 10 15

Val Val Asp Lys Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr 20 25 30

Glu Val Val Lys Val Tyr Asn Gly Glu Leu Phe Thr Ala Glu Glu His 35 40 45

Val Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Val Thr Ile Pro 50 55 60

Tyr Thr Lys Asp Lys Leu His Gln Leu Leu His Gln Leu Val Glu Met 65 70 75 80

Asn Lys Val Gln Thr Gly His Ile Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Ala 85 90 95

Gly Pro Arg Asn His Ile Phe Pro Gly Asp Glu Val Lys Pro Val Leu 100 105 110

Thr Gly Asn Thr Lys Glu Asn Pro Arg Pro Val Ala Asn Phe Glu Lys 115 120 125

Gly Val Lys Ala Thr Phe Val Glu Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp 130 135 140

Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala 145 150 155 160 His Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Val Leu His Arg Asp Glu Ile Val 165 170 175

Thr Glu Gly Ser Ser Ser Asn Ile Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Val Leu 180 185 190

Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Phe Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln 195 200 205

Val Ile Ile Lys Cys Ala Ala Glu Ile Gly Leu Pro Val Lys Glu Glu 210 215 220

Ala Met Thr Lys Thr Gln Leu Leu Ala Met Asp Glu Val Ile Val Ser 225 230 235 240

Ser Thr Thr Ser Glu Val Thr Pro Ile Ile Asp Ile Asp Gly Thr Val 245 250 255

Ile Gly Ala Gly Lys Pro Gly Asp Trp Thr Arg Lys Leu Gln Ala Gln 260 265 270

Phe Asp Thr Lys Ile Pro Lys Gly Ile Arg Ala 275 280

<210> 212 <211> 289 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Bacillus serositidis DAAT <400> 212

Met Ser Tyr Thr Leu Trp Asn Asp Lys Ile Val Asp Asp Asn Gln Val 15 10 15

Phe Ile Asn Lys Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr 20 25 30

Glu Val Ile Lys Val Tyr Asp Gly Glu Met Phe Thr Ala Thr Glu His 35 40 45

Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Lys Leu Thr Val Pro 50 55 60

Tyr Thr Lys His Lys Leu His Gln Leu Leu His Glu Leu Val Glu Ala 65 70 75 80

Asn Glu Leu

Lys

Thr 85

Gly Asn Leu Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Ala 90 95 Ser Pro Arg Asn His Leu Phe Pro Gly Asp Asp Val Leu Pro Val Leu 100 105 110

Thr Gly Asn Val Lys Glu Ala Pro Arg Ser Ile Glu Asn Ala Gln Lys 115 120 125

Gly Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp 130 135 140

Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala 145 150 155 160

His Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Glu Thr Ile 165 170 175

Thr Glu Gly Ser Ser Thr Asn Val Phe Gly Ile Lys Asn Gly Val Leu 180 185 190

Tyr Thr His Pro Ala Asp Asn Phe Ile Leu Ser Gly Ile Thr Arg Gly 195 200 205

Val Val Leu Ala Cys Ala Asn Glu Ile Gly Leu Pro Val Lys Gln Glu 210 215 220

Ala Phe Thr Lys Asp Lys Ala Leu Gln Met Asp Glu Met Phe Val Ser 225 230 235 240

Ser Thr Thr Ser Glu Ile Thr Pro Val Ile Asp Leu Asp Gly Val Ala 245 250 255

Ile Asn Gly Gly Glu Ile Gly Glu Trp Thr Arg Lys Leu Gln Lys Gln 260 265 270

Phe Ala Thr Lys Leu Pro Gly Ser Pro Ala Tyr Asn Leu Thr Glu Tyr 275 280 285

Lys

<210> 213

<211> 283

<212> PRT

<213> Artifcial Sequence <220>

<223> Bacillus sphaericus DAAT

<400> 213

Met Ala Tyr Ser Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Glu Glu Gly Ser Ile 15 10 15 Thr Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Ile Tyr 20 25 30

Glu Val Ile Lys Val Tyr Asn Gly His Met Phe Thr Ala Gln Glu His 35 40 45

Ile Asp Axçf PtiG Tyx Alci Ssjt Aid. Glu. Lys Ιΐθ Airg Leu Vcil Xle Pro 50 55 60

Tyr Thr Lys Asp Val Leu His Lys Leu Leu His Asp Leu Ile Glu Lys 65 70 75 80

Asn Asn Leu Asn Thr Gly His Val Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Thr 85 90 95

Thr Ser Arg Asn His Ile Phe Pro Asp Ala Ser Val Pro Ala Val Leu 100 105 110

Thr Gly Asn Val Lys Thr Gly Glu Arg Ser Ile Glu Asn Phe Glu Lys 115 120 125

Gly Val Lys Ala Thr Leu Val Glu Asp Val Arg Trp Leu Arg Cys Asp 130 135 140

Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala 145 150 155 160

Ser Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Asp Ile Ile 165 170 175

Thr Glu Cys Ser Ser Ala Asn Val Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu 180 185 190

Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Tyr Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln 195 200 205

Val Ile Leu Lys Cys Ala Ala Glu Ile Asn Leu Pro Val Ile Glu Glu 210 215 220

Pro Met Thr Lys Gly Asp Leu Leu Thr Met Asp Glu Ile Ile Val Ser 225 230 235 240

Ser Val Ser Ser Glu Val Thr Pro Val Ile Asp Val Asp Gly Gln Gln 245 250 255

Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Thr Arg Lys Leu Gln Lys Ala 260 265 270

Phe Glu Ala Lys Leu Pro Ile Ser Ile Asn Ala 275 280

Claims

1. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende: produ- zir monatina ou um sal da mesma através de uma via compreendendo pro- duzir indol-3-piruvato a partir de L-triptofano, produzir um precursor de mo- natina ("MP") incluindo pelo menos um precursor de R-monatina ("R-MP") a partir de indol-3-piruvato, e produzir monatina a partir do precursor de mona- tina, em que a monatina inclui pelo menos R1R monatina, e em que a produ- ção do indol-3-piruvato a partir do L-triptofano é facilitada por uma ou mais enzimas que possuem maior atividade, maior especificidade, ou ambas, para L-triptofano do que para o precursor de monatina, a monatina ou ambos.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais enzimas são escolhidas a partir de uma L- triptofano aminotransferase, uma aminotransferase L-aromática, uma L- aspartato aminotransferase, uma L-aminoácido oxidase, TatA de Sinorhizo- bium meliloti, HEXAspCP9T/R122G e combinações das mesmas.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais enzimas possuem atividade limitada, especifici- dade limitada, ou ambas, para o precursor de monatina, a monatina, ou am- bos.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita produção de R,R monatina a partir do dito precursor de R- monatina é facilitada por uma ou mais enzimas escolhidas a partir de uma D- aminotransferase e uma D-aminoácido desidrogenase.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita D-aminotransferase é escolhida a partir de uma D-amino- transferase de Bacillus halodurans, uma D-aminotransferase híbrida, uma D-aminotransferase de Geobacillus stearothermophilus, uma D-aminotrans- ferase de Bacillus licheniformis, uma D-aminotransferase de ATCC 4978, uma D-aminotransferase de ATCC 7063, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis apresentando atividade de D-aminotrans- ferase e homólogos das mesmas.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita D-aminotransferase de Bacillus halodurans compreende uma seqüência de aminoácidos listada no número de acesso NP-243677 ou um homólogo da mesma, e a dita aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus Iicheniformis apresentando atividade de D-aminotransferase é esco- Ihida a partir de uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus Ii- cheniformis com uma mutação correspondendo a E. coli F37Y, uma amino- transferase de cadeia ramificada de Bacillus Iieheniformis com uma mutação correspondendo a E coli Y96F, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus Iieheniformis com uma mutação correspondendo a E. coli Y165L, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus Iicheniformis com uma mutação correspondendo a E. coli L127K, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus Iieheniformis com uma mutação corresponden- do a E. coli R98Y, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus Iicheniformis com uma mutação correspondendo a E coli L108R, uma ami- notransferase de cadeia ramificada de Bacillus Iicheniformis com uma muta- ção correspondendo a E coli L110H, uma aminotransferase de cadeia rami- ficada de Bacillus Iicheniformis com uma mutação correspondendo a E. coli L127Y, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus Iicheniformis com uma mutação correspondendo a E. coli R41K e homólogos das mes- mas.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita D-aminotransferase híbrida é a SEQ ID NO:99 ou um ho- mólogo da mesma, a dita D-aminotransferase de ATCC 4978 é a SEQ ID NO:86 ou um homólogo da mesma, e a dita D-aminotransferase de ATCC 7063 é a SEQ ID NO:87 ou um homólogo da mesma.

8. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita D-aminotransferase é purificada na presença de piridoxal- -5'-fosfato.

9. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita D-aminoácido desidrogenase é escolhida a partir de D-AADH-101, D-AADH-102, D-AADH-103, D-AADH-105, D-AADH-106, D-AADH-107, D-AADH-108 e homólogos das mesmas.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção do dito precursor de monatina a partir de indol-3 -piruvato é facilitada por uma ou mais enzimas apresentando atividade de aldolase R-específica.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo compreende ainda pelo menos uma etapa de purificação, em que a dita R1R monatina é purificada a um grau de pureza de pelo menos aproximadamente 60%, em peso, dos compostos orgânicos to- tais.

12. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende: pro- duzir R,R monatina ou de um sal da mesma através de uma via compreen- dendo produzir D-triptofano a partir de L-triptofano, produzir indol-3-piruvato a partir de D-triptofano, produzir um precursor de R-monatina a partir de in- dol-3-piruvato e produzir R,R- monatina a partir do precursor de R-monatina; em que a produção do D-triptofano a partir do L-triptofano é facilitada por uma ou mais enzimas escolhidas a partir de uma triptofano racemase, uma racemase apresentando a atividade de uma triptofano racemase e combina- ções das mesmas.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a dita racemase apresentando a atividade de uma triptofano racemase é derivada de uma alanina racemase, uma glutamato racemase ou uma aspartato racemase.

14. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a produção do indol-3-piruvato a partir do D-triptofano é fa- cilitada por uma ou mais enzimas e a produção da R1R monatina a partir do precursor de R-monatina é facilitada pela mesma uma ou mais enzimas que facilitam a produção da R1R monatina a partir do precursor de R-monatina.

15. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo compreende ainda uma reação acoplada ao L- triptofano em que um substrato alfa-ceto ácido é convertido a um D-amino- ácido correspondente.

16. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção da R,R monatina a partir do precursor de R- monatina é facilitada por uma aminotransferase de estereoinversão.

17. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um de: produzir L-glutamato a partir de alfa-cetoglutarato quando L-tripto- fano reage para formar indol-3-piruvato, e produzir 4-aminobutanoato a partir de L-glutamato usando uma glutamato descarboxilase; produzir L-aspartato a partir de oxaloacetato quando L-triptofano reage para formar indol-3-piruvato e produzir beta-alanina a partir de L-aspar- tato usando uma aspartato descarboxilase; e produzir L-aspartato a partir de oxaloacetato quando o L-tripto- fano reage para formar indol-3-piruvato, produzir L-alanina a partir de L-aspar- tato usando uma aspartato 4-descarboxilase, e produzir D-alanina a partir de L-alanina usando uma alanina racemase.

18. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: a. produzir L-glutamato através da reação de alfa-cetoglutarato, em que a dita reação do alfa-cetoglutarato é acoplada à reação do L-tripto- fano; b. produzir L-alanina através da reação do dito L-glutamato com piruvato usando uma L-alanina aminotransferase; e c. produzir D-alanina a partir de L-alanina usando uma alanina racemase, em que a dita R1R monatina é produzida a partir do dito precursor de R-monatina através de uma reação de transaminação do dito precursor de R-monatina com a dita D-alanina.

19. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 12, caracteri- zado pelo fato de que a dita uma ou mais enzimas é imobilizada sobre um suporte sólido.

20. Processo para a produção de monatina, ou de um sal da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende reagir o D-triptofano e uma ou mais D-aminotransferases escolhidas a partir de uma D-aminotrans- ferase de Bacillus halodurans, uma D-aminotransferase híbrida, uma D-amino- transferase de Geobacillus stearothermophilus, uma D-aminotransferase de Bacillus licheniformis, uma D-aminotransferase de ATCC 4978, uma D-ami- notransferase de ATCC 7063, e homólogos das mesmas.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que pelo menos aproximadamente 75% da monatina produzida é R,R monatina.

22. Processo para a produção de monatina, ou de um sal da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende reagir o precursor de monatina e uma ou mais D-aminotransferases escolhidas a partir de uma D-ami- notransferase de Bacillus halodurans, uma D-aminotransferase híbrida, uma D-aminotransferase de Geobacillus stearothermophilus, uma D-aminotrans- ferase de Bacillus licheniformis, uma D-aminotransferase de ATCC 4978, uma D-aminotransferase de ATCC 7063, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis apresentando atividade de D-aminotrans- ferase e homólogos das mesmas.

23. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende precursor de R-monatina, L-triptofano, um D-aminoácido e uma ou mais en- zimas apresentando maior atividade, maior especificidade ou ambas, para o L-triptofano do que para o precursor de monatina ou para a monatina.

24. Composição de acordo com a reivindicação 23, caracteriza- da pelo fato de que a dita uma ou mais enzimas é escolhida a partir de uma L-triptofano aminotransferase, uma aminotransferase L-aromática, uma L-as- partato aminotransferase, uma L-aminoácido oxidase, e uma aminotransfe- rase de estereoinversão.

25. Composição de acordo com a reivindicação 23, caracteriza- da pelo fato de que a dita composição compreende ainda pelo meno uma de uma enzima escolhida a partir de uma D-aminotransferase e uma D-amino- ácido desidrogenase, uma ou mais enzimas apresentando atividade de aldo- lase R-específica, e uma ou mais enzimas escolhidas a partir de uma alani- na racemase, uma glutamato racemase e uma aspartato racemase.