BRPI0622254A2 - anticorpo isolado, conjugado de droga e anticorpo, formulação farmacêutica, método de inibição da proliferação celular, método de tratamento de cáncer, teste de detecção de células cancerosas, artigo industrializado, uso de um composto conjugado de droga e anticorpo e uso de uma formulação farmacêutica - Google Patents

anticorpo isolado, conjugado de droga e anticorpo, formulação farmacêutica, método de inibição da proliferação celular, método de tratamento de cáncer, teste de detecção de células cancerosas, artigo industrializado, uso de um composto conjugado de droga e anticorpo e uso de uma formulação farmacêutica Download PDF

Info

Publication number
BRPI0622254A2
BRPI0622254A2 BRPI0622254-4A BRPI0622254A BRPI0622254A2 BR PI0622254 A2 BRPI0622254 A2 BR PI0622254A2 BR PI0622254 A BRPI0622254 A BR PI0622254A BR PI0622254 A2 BRPI0622254 A2 BR PI0622254A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
cancer
polypeptide
seq
tat
Prior art date
Application number
BRPI0622254-4A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Dennis
William Mallet
Paul Polakis
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of BRPI0622254A2 publication Critical patent/BRPI0622254A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/13—Hollow or container type article [e.g., tube, vase, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

ANTICORPO ISOLADO, CONJUGADO DE DROGA E ANTICORPO, FORMULAçãO FARMACêUTICA, METODO DE INIBIçãO DA PROLIFERAçãO CELULAR, MéTODO DE TRATAMENTO DE CáNCER, TESTE DE DETECçãO DE CéLULAS CANCEROSAS, ARTIGO INDUSTRIALIZADO, USO DE UM COMPOSTO CONJUGADO DE DROGA E ANTICORPO E USO DE UMA FORMULAçãO FARMACêUTICA. A presente invenção refere-se a composições de matéria úteis para o diagnóstico e tratamento de tumores em mamíferos e a métodos de uso dessas composições de matéria para o mesmo.

Description

"ANTICORPO ISOLADO, CONJUGADO DE DROGA E ANTICORPO,FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE INIBIÇÃO DAPROLIFERAÇÃO CELULAR, MÉTODO DE TRATAMENTO DE CÂNCER,TESTE DE DETECÇÃO DE CÉLULAS CANCEROSAS, ARTIGOINDUSTRIALIZADO, USO DE UM COMPOSTO CONJUGADO DE DROGA EANTICORPO E USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA"Dividido do Pl 0613382-7, depositado em 14 de Junho de 2006.
Pedidos Relacionados
O presente pedido é pedido não provisório depositado com baseem 37 C. F. R. § 1.53 (b) (1), que reivindica prioridade com base em 35 U.S.C.§ 119 (e) para os pedidos provisórios com números de série 60/692.092,depositado em vinte de junho de 2005, e 60/793.951, depositado em 21 de abrilde 2006, cujo teor é integralmente incorporado à presente invenção comoreferência.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a composições de matéria úteispara o diagnóstico e tratamento de tumor em mamíferos e a métodos de usodessas composições de matéria para o mesmo.
Antecedentes da Invenção
Tumores malignos (cânceres) são a segunda principal causa demorte nos Estados Unidos, depois das doenças cardíacas (Boring et al, CACancel J. Clin. 43: 7 (1993)). O câncer é caracterizado pelo aumento daquantidade de células anormais, ou neoplásicas, derivadas de tecido normalque se proliferam para formar uma massa tumoral, invasão de tecidosadjacentes por essas células de tumores neoplásicas e geração de célulasmalignas que eventualmente se difundem por meio do sangue ou sistemalinfático para nódulos linfáticos regionais e para sítios distantes por meio de umprocesso denominado metástase. Em um estado canceroso, uma célulaprolifera-se sob condições em que as células normais não cresceriam. Ocâncer manifesta-se em ampla variedade de formas, caracterizadas pordiferentes graus de invasividade e agressividade.
Em tentativas de descobrir alvos celulares eficazes para terapia ediagnóstico de câncer, os pesquisadores buscaram identificar polipeptídeosassociados à transmembrana ou de outra maneira à membrana que sãoexpressos especificamente sobre a superfície de um ou mais tipos específicosde célula cancerosa em comparação com uma ou mais células não cancerosasnormais. Freqüentemente, esses polipeptídeos associados a membranas sãoexpressos de forma mais abundante sobre a superfície das células cancerosasem comparação com a superfície das células não cancerosas. A identificaçãodesses polipeptídeos de antígenos da superfície celular associados a tumoresgerou a capacidade de dirigir-se especificamente às células cancerosas paradestruição por meio de terapias com base em anticorpos. N esse aspecto,observa-se que a terapia com base em anticorpos comprovou ser muito eficazno tratamento de certos cânceres. HERCEPTIN® e RITUXAN®, por exemplo(ambos da Genentech Inc., South San Francisco, Califórnia), são anticorposque vêm sendo utilizados com sucesso no tratamento de câncer de mama elinfoma não de Hodgkin, respectivamente. Mais especificamente, HERCEPTIN®é anticorpo monoclonal humanizado derivado de DNA recombinante que se ligaseletivamente ao domínio extracelular do proto-oncogene receptor 2 de fator decrescimento epidérmico humano (HER2). Observa-se superexpressão deproteína HER2 em 25 a 30% de cânceres de mama primários. RITUXAN® é umanticorpo monoclonal humano/murino quimérico geneticamente elaboradodirigido contra o antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitos Bnormais e malignos. Estes dois anticorpos são produzidos de formarecombinante em células de CHO.
Apesar dos avanços identificados acima na terapia de câncer demamíferos, existe grande necessidade de agentes terapêuticos e dediagnóstico adicionais capazes de detectar a presença de tumor em mamíferose de inibir efetivamente o crescimento de células neoplásicas, respectivamente.Conseqüentemente, é um objeto da presente invenção identificar polipeptídeosassociados a membranas celulares que sejam expressos de forma maisabundante sobre um ou mais tipos de células cancerosas em comparação comcélulas normais ou sobre outras células de câncer diferentes e o uso dessespolipeptídeos e seus ácidos nucléicos codificadores para a produção decomposições de matéria úteis no tratamento terapêutico e detecção pordiagnóstico de câncer em mamíferos.
Descrição Resumida da Invenção
A. Realizações
No presente relatório descritivo, as Depositantes descrevem pelaprimeira vez a identificação de polipeptídeos celulares (e seus ácidos nucléicosou fragmentos codificadores) que são expressos até um grau mais alto sobre asuperfície de um ou mais tipos de células cancerosas em comparação com asuperfície de um ou mais tipos de células não cancerosas normais. Essespolipeptídeos são indicados na presente invenção como polipeptídeosantigênicos alvos associados a tumores (polipeptídeos "TAT") e espera-se quesirvam de alvos eficazes para a terapia e diagnóstico de câncer em mamíferos.
Conseqüentemente, em uma realização da presente invenção éfornecido uma molécula de ácido nucléico isolada que contém uma seqüênciade nucleotídeos que codifica um polipeptídeo antigênico alvo associado atumores ou seu fragmento (polipeptídeo "TAT").
Em certos aspectos, a molécula de ácido nucléico isoladacompreende uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos cerca de80% de identidade de seqüência de ácido nucléico, alternativamente pelomenos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade deseqüência de ácido nucléico em relação a (a) uma molécula de DNA quecodifica um polipeptídeo TAT de comprimento total que contém uma seqüênciade aminoácidos conforme descrita na presente invenção, uma seqüência deaminoácidos de polipeptídeo TAT que não contém o peptídeo sinal conformedescrito na presente invenção, um domínio extracelular de um polipeptídeoTAT de transmembrana, com ou sem o peptídeo sinal, conforme descrito napresente invenção, ou qualquer outro fragmento especificamente definido deuma seqüência de aminoácidos de polipeptídeo TAT de comprimento totalconforme descrita na presente invenção; ou (b) o complemento da molécula deDNA de (a).
Em outros aspectos, a molécula de ácido nucléico isoladacompreende uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos cerca de80% de identidade de seqüência de ácido nucléico, alternativamente pelomenos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade deseqüência de ácido nucléico em relação a (a) uma molécula de DNA quecompreende a seqüência codificadora de um cDNA de polipeptídeo TAT decomprimento total conforme descrito na presente invenção, a seqüênciacodificadora de um polipeptídeo TAT que não contém o peptídeo sinalconforme descrito na presente invenção, a seqüência codificadora de umdomínio extracelular de um polipeptídeo TAT de transmembrana, com ou semo peptídeo sinal, conforme descrita na presente invenção, ou a seqüênciacodificadora de qualquer outro fragmento especificamente definido daseqüência de aminoácidos de polipeptídeo TAT de comprimento total conformedescrita na presente invenção; ou (b) o complemento da molécula de DNA de(a).
Em aspectos adicionais, a presente invenção refere-se a umamolécula de ácido nucléico isolada que compreende uma seqüência denucleotídeos que possui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüênciade ácido nucléico, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência de ácido nucléico emrelação a (a) uma molécula de DNA que codifica o mesmo polipeptídeo madurocodificado pela região codificadora de comprimento total de qualquer um doscDNAs de proteína humana depositados junto à ATCC conforme descrito napresente invenção; ou (b) o complemento da molécula de DNA de (a).
Outro aspecto da presente invenção fornece uma molécula deácido nucléico isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos quecodifica um polipeptídeo TAT que possui um domínio de transmembranaexcluído ou um domínio de transmembrana desativado, ou é complementar aessa seqüência de nucleotídeos codificadora, em que o(s) domínio(s) detransmembrana desse(s) polipeptídeo(s) é(são) descrito(s) na presenteinvenção. São contemplados, portanto, domínios extracelulares solúveis dospolipeptídeos TAT descritos na presente invenção.
Em outros aspectos, a presente invenção refere-se às moléculasde ácido nucléico isolado que se hibridizam em (a) uma seqüência denucleotídeos que codifica um polipeptídeo TAT que contém uma seqüência deaminoácidos de comprimento total conforme descrito na presente invenção,uma seqüência de aminoácidos de polipeptídeo TAT que não contém opeptídeo sinal conforme descrito na presente invenção, um domínioextracelular de polipeptídeo TAT de transmembrana, com ou sem o peptídeosinal, conforme descrito na presente invenção, ou qualquer outro fragmentoespecificamente definido de uma seqüência de aminoácidos de polipeptídeoTAT de comprimento total conforme descrita na presente invenção; ou (b) ocomplemento da seqüência de nucleotídeos de (a). Nesse aspecto, umarealização da presente invenção refere-se a fragmentos de uma seqüênciacodificadora de polipeptídeo TAT de comprimento total ou seu complemento,conforme descritos na presente invenção, que podem encontrar um uso, porexemplo, como sondas de hibridização úteis, por exemplo, como sondas de diagnóstico, primers de PCR1 sondas de oiigonucieotídeo antisense, ou para acodificação de fragmentos de polipeptídeo TAT de comprimento total quepodem opcionalmente codificar polipeptídeo que compreende sítio de ligaçãopara anticorpo de polipeptídeo anti-TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT ououtra molécula orgânica pequena que se liga a polipeptídeo TAT. Essesfragmentos de ácidos nucléicos normalmente possuem pelo menos de cerca decinco nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15; 16, 17, 18, 19, 20; 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 35, 40; 45, 50, 55, 60; 65, 6, 7, 8; 9, 10, 11, 12; 13, 14, 115, 16; 17, 18,19, 20; 21, 22, 155, 160; 165, 170, 175, 180; 185, 190, 195, 200; 210, 220, 230, 240, 250; 260, 270, 280, 290, 300; 310, 320, 330, 340, 350; 360, 370, 380, 390,400; 410, 420, 430, 440, 450; 460, 470, 480, 490, 500; 510, 520, 530, 540, 550;560, 570, 580, 590, 600; 610, 620, 630, 640, 650; 660, 670, 680, 690, 700; 710,720, 730, 740, 750; 760, 770, 780, 790, 800; 810, 820, 830, 840, 850; 860, 870,880, 890, 900; 910, 920, 930, 940, 950; 960, 970, 980, 990 ou 1000 nucleotídeos de comprimento, em que, neste contexto, a expressão "cerca de"indica o comprimento de seqüência de nucleotídeos de referência mais oumenos 10% daquele comprimento indicado. Além disso, esses fragmentos deácidos nucléicos são normalmente compreendidos de nucleotídeosconsecutivos derivados da uma seqüência codificadora de comprimento total de polipeptídeo TAT ou seu complemento. Observa-se que fragmentosinovadores de uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeoTAT ou seu complemento podem ser determinados de forma rotineira por meiodo alinhamento da seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeoTAT com outras seqüências de nucleotídeos conhecidas, utilizando qualquerdentre uma série de programas de alinhamento de seqüências bem conhecidose determinando qual(is) fragmento(s) de seqüências de nucleotídeoscodificadoras de polipeptídeos TAT é(são) inovador(es). Todos essesfragmentos inovadores de seqüências de nucleotídeos codificadoras depolipeptídeos TAT1 ou seu complemento, são contemplados na presenteinvenção. Também são contemplados os fragmentos de polipeptídeos TATcodificados por estes fragmentos de moléculas de nucleotídeos,preferencialmente os fragmentos de polipeptídeos TAT que compreendem umsítio de ligação para um anticorpo anti-TAT, um oligopeptídeo de ligação deTAT ou uma outra molécula orgânica pequena que se liga a um polipeptídeoTAT.
Em outra realização, a presente invenção fornece polipeptídeosTAT isolados codificados por qualquer uma das seqüências de ácido nucléicoisoladas identificadas acima na presente invenção.
Em um dado aspecto, a presente invenção refere-se a umpolipeptídeo TAT isolado, que compreende uma seqüência de aminoácidos quepossui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácidos,alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%de identidade de seqüência de aminoácidos em relação a um polipeptídeo TATque contém uma seqüência de aminoácidos de comprimento total conformedescrito na presente invenção, uma seqüência de aminoácidos de polipeptídeoTAT que não contém o peptídeo sinal descrito na presente invenção, umdomínio extracelular de uma proteína de transmembrana de polipeptídeo TAT,com ou sem o peptídeo sinal, conforme descrito na presente invenção, umaseqüência de aminoácidos codificada por qualquer uma das seqüências deácido nucléico descritas na presente invenção ou qualquer outro fragmentoespecificamente definido de uma seqüência de aminoácidos de polipeptídeoTAT de comprimento total conforme descrita na presente invenção.
Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se a umpolipeptídeo TAT isolado que compreende uma seqüência de aminoácidos quepossui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácidos,alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% deidentidade de seqüência de aminoácidos em relação a uma seqüência deaminoácidos codificada por qualquer um dos cDNAs de proteína humanadepositados junto à ATCC conforme descrito na presente invenção.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a umpolipeptídeo TAT isolado que compreende uma seqüência de aminoácidos queé codificada por uma seqüência de nucleotídeos que se hibridiza nocomplemento de uma molécula de DNA que codifica (a) um polipeptídeo TATque contém uma seqüência de aminoácidos de comprimento total conformedescrito na presente invenção, (b) uma seqüência de aminoácidos depolipeptídeo TAT que não contém o peptídeo sinal conforme descrito napresente invenção, (c) um domínio extracelular de polipeptídeo TAT detransmembrana, com ou sem o peptídeo sinal, conforme descrito na presenteinvenção, (d) uma seqüência de aminoácidos codificada por qualquer uma dasseqüências de ácidos nucléicos descritas na presente invenção ou (e) qualqueroutro fragmento especificamente definido de uma seqüência de aminoácidosde polipeptídeo TAT de comprimento total conforme descrito na presenteinvenção.
Em um aspecto específico, a presente invenção fornece umpolipeptídeo TAT isolado sem a seqüência sinal N-terminal e/ou sem a metioninainicial e é codificado por uma seqüência de nucleotídeos que codifica essaseqüência de aminoácidos conforme descrito acima na presente invenção.Processos de sua produção também são descritos na presente invenção, em queesses processos compreendem a cultura de uma célula hospedeira quecompreende um vetor que compreende a molécula de ácido nucléico codificadoraapropriada sob condições adequadas para a expressão do polipeptídeo TAT erecuperação do polipeptídeo TAT da cultura ceiuíar.
Outro aspecto da presente invenção fornece um polipeptídeo TATisolado que possui um domínio de transmembrana excluído ou um domínio detransmembrana desativado. Processos de sua produção também são descritosna presente invenção, em que esses processos compreendem a cultura de umacélula hospedeira que compreende um vetor que compreende a molécula deácido nucléico codificadora apropriada sob condições adequadas para aexpressão do polipeptídeo TAT e recuperação do polipeptídeo TAT da culturacelular.
Em outras realizações, a presente invenção fornece vetores quecompreendem um DNA que codifica qualquer um dos polipeptídeos descritosna presente invenção. Também são fornecidas células hospedeiras quecompreendem qualquer um desses vetores. Como forma de exemplo, ascélulas hospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli ou células delevedura. Processo de produção de qualquer um dos polipeptídeos descritos napresente invenção é adicionalmente fornecido e compreende a cultura decélulas hospedeiras sob condições apropriadas para expressão do polipeptídeodesejado e recuperação do polipeptídeo desejado da cultura celular.
Em outras realizações, a presente invenção fornece polipeptídeosquiméricos isolados que compreendem qualquer um dos polipeptídeos TATdescritos na presente invenção, fundidos a polipeptídeo heterólogo (não deTAT). Exemplo dessas moléculas quiméricas compreende qualquer um dospolipeptídeos TAT descritos na presente invenção, fundidos a polipeptídeoheterólogo, tal como seqüência marcadora de epítopos ou região Fc deimunoglobulina.
Em outra realização, a presente invenção fornece um anticorpoque se liga, preferencialmente de forma específica, a qualquer um dospolipeptídeos descritos acima ou abaixo. Opcionalmente, o anticorpo é umanticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpohumanizado, anticorpo de fita simples ou anticorpo que inibe competitivamentea ligação de um anticorpo anti-polipeptídeo TAT ao seu epítopo antigênicocorrespondente. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem seropcionalmente conjugados a um agente inibidor do crescimento ou agentecitotóxico tal como uma toxina que inclui, por exemplo, um maitansinóide oucaliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, um enzima nucleolíticaou similares. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem seropcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e inibempreferencialmente o crescimento ou a proliferação de célula à qual se ligam, ouinduzem sua morte. Para fins de diagnóstico, os anticorpos de acordo com apresente invenção podem ser marcados de forma detectável, fixados a suportesólido ou similar.
Em outras realizações, a presente invenção fornece vetores quecompreendem um DNA que codifica qualquer um dos anticorpos descritos napresente invenção. Também são fornecidas células hospedeiras quecompreendem qualquer um desses vetores. Como forma de exemplo, ascélulas hospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli ou células delevedura. Um processo de produção de qualquer um dos anticorpos descritosna presente invenção é adicionalmente fornecido e compreende a cultura decélulas hospedeiras sob condições apropriadas para expressão do anticorpodesejado e recuperação do anticorpo desejado da cultura celular.
Em outra realização, a presente invenção fornece oligopeptídeos("oligopeptídeos de ligação de TAT") que se ligam, preferencialmente de formaespecífica, a qualquer um dos polipeptídeos TAT descritos acima ou abaixo.Opcionalmente, os oligopeptídeos de ligação de TAT de acordo com a presenteinvenção podem ser conjugados a um agente inibidor do crescimento ouagente citotóxico tal como uma toxina, que inclui, por exemplo, um maitansinóide ou caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, umaenzima nucleolítica ou similares. Os oligopeptídeos de ligação de TAT deacordo com a presente invenção podem ser opcionalmente produzidos emcélulas CHO ou células bacterianas e inibem preferencialmente o crescimentoou a proliferação de célula à qual se ligam, ou induzem sua morte. Para fins de diagnóstico, os oligopeptídeos de ligação de TAT de acordo com a presenteinvenção podem ser marcados de forma detectável, fixados a suporte sólido ousimilar.
Em outras realizações, a presente invenção fornece vetores quecompreendem DNA que codifica qualquer um dos oligopolipeptídeos de ligação de TAT descritos na presente invenção. Também são fornecidas célulashospedeiras que compreendem qualquer um desses vetores. Como forma deexemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli oucélulas de levedura. Processo de produção de qualquer um dosoligopolipeptídeos de ligação de TAT descritos na presente invenção é adicionalmente fornecido e compreende a cultura de células hospedeiras sobcondições apropriadas para expressão do oligopolipeptídeo desejado erecuperação do oligopolipeptídeo desejado da cultura celular.
Em outra realização, a presente invenção fornece moléculasorgânicas pequenas ("moléculas orgânicas de ligação de TAT") que se ligam, preferencialmente de forma específica, a qualquer um dos polipeptídeos TATdescritos acima ou abaixo. Opcionalmente, as moléculas orgânicas de ligaçãode TAT de acordo com a presente invenção podem ser conjugadas a umagente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, queinclui, por exemplo, um maitansinóide ou caliqueamicina, um antibiótico, umisótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similares. As moléculasorgânicas de ligação de TAT de acordo com a presente invenção inibempreferencialmente o crescimento ou a proliferação de célula à qual se ligam, ouinduzem a sua morte. Para fins de diagnóstico, as moléculas orgânicas deligação de TAT de acordo com a presente invenção podem ser marcadas deforma detectável, fixadas a suporte sólido ou similar.
Em ainda outra realização, a presente invenção refere-se àcomposição de matéria que compreende um polipeptídeo TAT conformedescrito na presente invenção, um polipeptídeo TAT quimérico conformedescrito na presente invenção, um anticorpo anti-TAT conforme descrito napresente invenção, um oligopeptídeo de ligação de TAT conforme descrito napresente invenção ou uma molécula orgânica de ligação de TAT conformedescrito na presente invenção, em combinação com um veículo.Opcionalmente, o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em ainda outra realização, a presente invenção refere-se a umartigo de manufatura que compreende um recipiente e uma composição dematéria contida no interior do recipiente, em que a composição de matéria podecompreender um polipeptídeo TAT conforme descrito na presente invenção,um polipeptídeo TAT quimérico conforme descrito na presente invenção, umanticorpo anti-TAT conforme descrito na presente invenção, um oligopeptídeode ligação de TAT conforme descrito na presente invenção ou uma moléculaorgânica de ligação de TAT conforme descrito na presente invenção. O artigopode ainda compreender opcionalmente um rótulo afixado ao recipiente ouuma bula incluída com o recipiente, referente ao uso da composição de matériapara o tratamento terapêutico ou a detecção diagnostica de um tumor.
Outra realização da presente invenção refere-se ao uso de umpolipeptídeo TAT conforme descrito na presente invenção, um polipeptídeoTAT quimérico conforme descrito na presente invenção, um anticorpo anti-polipeptídeo TAT conforme descrito na presente invenção, um oligopeptídeo deligação de TAT conforme descrito na presente invenção ou uma moléculaorgânica de ligação de TAT conforme descrito na presente invenção, para apreparação de um medicamento útil no tratamento de uma condição que reageao polipeptídeo TAT, polipeptídeo TAT quimérico, anticorpo anti-polipeptídeoTAT1 oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica de ligação de TAT.
Outras realizações da presente invenção referem-se a qualqueranticorpo isolado que compreende uma ou mais dentre as seqüências HVR-L1,HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 ou HVR-H3 descritas na presente invençãoou qualquer anticorpo que se ligue ao mesmo epítopo de qualquer um dessesanticorpos.
B. Realizações Adicionais
Outra realização da presente invenção refere-se a um método deinibição do crescimento de uma célula que expressa um polipeptídeo TAT, emque o método compreende o contato da célula com um anticorpo, umoligopeptídeo ou uma molécula orgânica pequena que se liga ao polipeptídeoTAT, em que a ligação do anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica aopolipeptídeo TAT causa inibição do crescimento da célula que expressa opolipeptídeo TAT. Em realizações preferidas, a célula é uma célula cancerosa ea ligação do anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica ao polipeptídeo TATcausa a morte da célula que expressa o polipeptídeo TAT. Opcionalmente, oanticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpoquimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo de fita simples. Os anticorpos,oligopeptídeos de ligação de TAT e moléculas orgânicas de ligação de TATempregados nos métodos de acordo com a presente invenção podem seropcionalmente conjugados a um agente inibidor do crescimento ou agentecitotóxico tal como uma toxina, que inclui, por exemplo, um maitansinóide oucaliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolíticaou similares. Os anticorpos e oligopeptídeos de ligação de TAT empregadosnos métodos de acordo com a presente invenção podem ser opcionalmenteproduzidos em células CHO ou células bacterianas.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a um
método de tratamento terapêutico de um mamífero que possui um tumorcanceroso que compreende células que expressam um polipeptídeo TAT, emque o método compreende a administração ao mamífero de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo, um oligopeptídeo ou uma moléculaorgânica pequena que se liga ao polipeptídeo TAT, de forma a resultar notratamento terapêutico eficaz do tumor. Opcionalmente, o anticorpo é umanticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpohumanizado ou anticorpo de fita simples. Os anticorpos, oligopeptídeos deligação de TAT e moléculas orgânicas de ligação de TAT empregados nosmétodos de acordo com a presente invenção podem ser opcionalmenteconjugados a um agente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal comouma toxina, que inclui, por exemplo, um maitansinóide ou caliqueamicina, umantibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similares. Osanticorpos e oligopeptídeos empregados nos métodos de acordo com apresente invenção podem ser opcionalmente produzidos em células CHO oucélulas bacterianas.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a ummétodo de determinação da presença de um polipeptídeo TAT em umaamostra suspeita de conter o polipeptídeo TAT, em que o método compreendea exposição da amostra a um anticorpo, um oligopeptídeo ou uma moléculaorgânica pequena que se liga ao polipeptídeo TAT e a determinação da ligaçãodo anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica ao polipeptídeo TAT naamostra, em que a presença dessa ligação é um indicativo da presença dopolipeptídeo TAT na amostra. Opcionalmente, a amostra pode conter células(que podem ser células cancerosas) suspeitas de expressarem o polipeptídeoTAT. O anticorpo, oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica deligação de TAT empregada no método pode ser opcionalmente rotulada deuma forma detectável, fixada a suporte sólido ou similar.
Uma realização adicional da presente invenção refere-se a ummétodo de diagnóstico da presença de um tumor em um mamífero, em que ométodo compreende a detecção do nível de expressão de um gene quecodifica um polipeptídeo TAT (a) em uma amostra de teste de células de tecidoobtidas a partir do mencionado mamífero e (b) em uma amostra de controle decélulas não cancerosas normais conhecidas da mesma origem ou tipo detecido, em que um nível de expressão mais alto do polipeptídeo TAT naamostra de teste, em comparação com a amostra controle, é um indicativo dapresença de tumor no mamífero do qual a amostra de teste foi obtida.
Outra realização da presente invenção refere-se a um método dediagnóstico da presença de um tumor em um mamífero, em que o métodocompreende (a) o contato de uma amostra de teste que compreende células detecido obtidas do mamífero com um anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica pequena que se liga a um polipeptídeo TAT e (b) a detecção daformação de um complexo entre o anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica pequena e o polipeptídeo TAT na amostra de teste, em que aformação de complexo é um indicativo da presença de tumor no mamífero.Opcionalmente, o anticorpo, oligopeptídeo de ligação de TAT ou moléculaorgânica de ligação de TAT empregada é opcionalmente marcado de formadetectável, fixado a um suporte sólido ou similar e/ou a amostra de teste decélulas de tecido é obtida a partir de um indivíduo suspeito de ter um tumorcanceroso.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a ummétodo de tratamento ou prevenção de uma disfunção proliferativa celularassociada à expressão ou atividade alterada, preferencialmente aumentada, deum polipeptídeo TAT1 em que o método compreende a administração a umpaciente necessitado desse tratamento de uma quantidade eficaz de umantagonista de polipeptídeo TAT. Preferencialmente, a disfunção proliferativacelular é um câncer e o antagonista do polipeptídeo TAT é um anticorpo anti-polipeptídeo TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT, molécula orgânica deligação de TAT ou oligonucleotídeo antisense. Tratamento ou prevenção eficazda disfunção proliferativa celular pode ser um resultado de morte direta ouinibição do crescimento de células que expressam um polipeptídeo TAT ou pormeio de antagonização da atividade potencializadora do crescimento celular deum polipeptídeo TAT.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a ummétodo de ligação de um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânicapequena a uma célula que expressa um polipeptídeo TAT, em que o métodocompreende o contato de uma célula que expressa um polipeptídeo TAT com omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena sobcondições que são apropriadas para a ligação do anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica pequena ao mencionado polipeptídeo TAT e que permitem aligação entre eles. Em realizações preferidas, o anticorpo é marcado com umamolécula ou composto que é útil para determinar qualitativa e/ouquantitativamente a localização e/ou a quantidade de ligação do anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena à célula.
Outras realizações da presente invenção referem-se ao uso de (a)um polipeptídeo TAT, (b) um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo TATou um vetor ou célula hospedeira que compreende aquele ácido nucléico, (c)um anticorpo anti-polipeptídeo TAT, (d) um oligopeptídeo de ligação de TAT ou(e) uma molécula orgânica pequena de ligação de TAT na preparação de ummedicamento útil para (i) o tratamento terapêutico ou detecção por diagnósticode um câncer ou tumor; ou (ii) o tratamento terapêutico ou prevenção de umadisfunção proliferativa celular.
Outra realização da presente invenção refere-se a um método deinibição do crescimento de uma célula cancerosa, em que o crescimento damencionada célula cancerosa depende ao menos em parte do(s) efeito(s)potencializador(es) do crescimento de um polipeptídeo TAT (em que opolipeptídeo TAT pode ser expresso pela própria célula cancerosa ou por umacélula que produz polipeptídeo(s) que possui(em) um efeito potencializador docrescimento sobre células cancerosas), em que o método compreende ocontato do polipeptídeo TAT com um anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica pequena que se liga ao polipeptídeo TAT1 de forma a antagonizar aatividade potencializadora do crescimento do polipeptídeo TAT e, por sua vez,inibir o crescimento da célula cancerosa. Preferencialmente, o crescimento dacélula cancerosa é completamente inibido. De preferência ainda maior, aligação do anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena aopolipeptídeo TAT induz a morte da célula cancerosa. Opcionalmente, oanticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpoquimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo de fita simples. Os anticorpos,oligopeptídeos de ligação de TAT e moléculas orgânicas de ligação de TATempregados nos métodos de acordo com a presente invenção podem seropcionalmente conjugados a um agente inibidor do crescimento ou agentecitotóxico tal como uma toxina, que inclui, por exemplo, um maitansinóide oucaliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolíticaou similares. Os anticorpos e oligopeptídeos de ligação de TAT empregadosnos métodos de acordo com a presente invenção podem ser opcionalmenteproduzidos em células CHO ou células bacterianas.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a ummétodo de tratamento terapêutico de um tumor em mamífero, em que ocrescimento do mencionado tumor depende ao menos em parte do(s) efeito(s)potencializador(es) do crescimento de um polipeptídeo TAT1 em que o métodocompreende a administração ao mamífero de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânicapequena que se liga ao polipeptídeo TAT, de forma a antagonizar a atividadepotencializadora do crescimento do mencionado polipeptídeo TAT1 resultandono tratamento terapêutico eficaz do tumor. Opcionalmente, o anticorpo é umanticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpohumanizado ou anticorpo de fita simples. Os anticorpos, oligopeptídeos deligação de TAT e moléculas orgânicas de ligação de TAT empregados nosmétodos de acordo com a presente invenção podem ser opcionalmenteconjugados a um agente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal comouma toxina, que inclui, por exemplo, um maitansinóide ou caliqueamicina, umantibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similares. Osanticorpos e oligopeptídeos empregados nos métodos de acordo com apresente invenção podem ser opcionalmente produzidos em células CHO oucélulas bacterianas.
C. Outras Realizações Adicionais
Em ainda outras realizações, a presente invenção refere-se aoconjunto de potenciais reivindicações a seguir para o presente pedido:
1. Ácido nucléico isolado que contém uma seqüência denucleotídeos que possui pelo menos 80% de identidade de seqüência de ácidonucléico em relação a:
(a) uma molécula de DNA que codifica a seqüência deaminoácidos exibida como SEQ ID N°2;
(b) uma molécula de DNA que codifica a seqüência deaminoácidos exibida como SEQ ID N° 2, sem o seu peptídeo sinal associado;(c) uma molécula de DNA que codifica um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) uma molécula de DNA que codifica um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) a seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1;
(f) a seqüência codificadora de comprimento total daseqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f).
2. Ácido nucléico isolado que contém:
(a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüênciade aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüência deaminoácidos exibida como SEQ ID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um domínioextracelular do polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com o seu peptídeosinal associado;
(d) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um domínioextracelular do polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seu peptídeosinal associado;
(e) a seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1;
(f) a região codificadora de comprimento total da seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f).
3. Ácido nucléico isolado que se hibridiza em:
(a) um ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidosexibida como SEQ ID N0 2;
(b) um ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidosexibida como SEQ ID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;(c) um ácido nucléico que codifica um domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um ácido nucléico que codifica um domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) a seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1;
(f) a região codificadora de comprimento total da seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f).
4. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 3, em que ahibridização ocorre sob condições estringentes.
5. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 3, que possuipelo menos cerca de cinco nucleotídeos de comprimento.
6. Vetor de expressão que compreende o ácido nucléicoconforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3.
7. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 6, emque o mencionado ácido nucléico é ligado operativamente a seqüências decontrole reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vetor.
8. Célula hospedeira que compreende o vetor de expressãoconforme descrito na reivindicação 7.
9. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 8, que éuma célula de CHO1 uma célula de E. coli ou uma célula de levedura.
10. Processo de produção de um polipeptídeo que compreendea cultura da célula hospedeira conforme descrita na reivindicação 8 sobcondições apropriadas para expressão do mencionado polipeptídeo erecuperação do mencionado polipeptídeo da cultura celular.
11. Polipeptídeo isolado que possui pelo menos 80% deidentidade de seqüência de aminoácidos em relação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1.
12. Polipeptídeo isolado que contém:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2sem a sua seqüência de peptídeo sinal associada;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQIDN0I.
13. Polipeptídeo quimérico que compreende o polipeptídeoconforme descrito em qualquer uma das reivindicações 11 ou 12 fundido a umpolipeptídeo heterólogo.14. Polipeptídeo quimérico de acordo com a reivindicação 13,em que o mencionado polipeptídeo heterólogo é uma seqüência marcadora doepítopo ou uma região Fc de imunoglobulina.
15. Anticorpo isolado que se liga a um polipeptídeo que possuipelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos em relação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1.
16. Anticorpo isolado que se liga a um polipeptídeo que possui:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2sem o seu peptídeo sinal associado;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N0 1.
17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações15 ou 16, que é um anticorpo monoclonal.
18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações15 ou 16, que é um fragmento de anticorpo.
19. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações15 ou 16, que é um anticorpo humanizado ou quimérico.
20. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações15 ou 16, que é conjugado a um agente inibidor do crescimento.
21. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações15 ou 16, que é conjugado a um agente citotóxico.
22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21, em que oagente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste de toxinas,antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
23. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21, em que oagente citotóxico é uma toxina.
24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 23, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
25. Anticorpo de acordo com a reivindicação 23, em que atoxina é um maitansinóide.
26. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações15 ou 16, que é produzido em bactérias.
27. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações15 ou 16, que é produzido em células de CHO.
28. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações15 ou 16, que induz a morte de uma célula à qual se liga.
29. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações15 ou 16, que é marcado de forma detectável.
30. Ácido nucléico isolado que contém uma seqüência denucleotídeos que codifica o anticorpo conforme descrito em qualquer uma dasreivindicações 15 ou 16.
31. Vetor de expressão que compreende o ácido nucléicoconforme descrito na reivindicação 30, ligado operativamente a seqüências decontrole reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vetor.
32. Célula hospedeira que compreende o vetor de expressãoconforme descrito na reivindicação 31.
33. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 32, que éuma célula de CHO1 uma célula de E. coli ou uma célula de levedura.
34. Processo de produção de um anticorpo que compreende acultura da célula hospedeira conforme descrita na reivindicação 32 sobcondições apropriadas para expressão do mencionado anticorpo e recuperaçãodo mencionado anticorpo da cultura celular.
35. Oligopeptídeo isolado que se liga a um polipeptídeo quepossui pelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos emrelação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1.
36. Oligopeptideo isolado que se liga a um polipeptídeo quepossui:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2sem o seu peptídeo sinal associado;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N0 1.
37. Oligopeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 ou 36, que é conjugado a um agente inibidor do crescimento.
38. Oligopeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 ou 36, que é conjugado a um agente citotóxico.
39. Oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 38, em que oagente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste de toxinas,antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
40. Oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 38, em que oagente citotóxico é uma toxina.41. Oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 40, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
42. Oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 40, em que atoxina é um maitansinóide.
43. Oligopeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 ou 36, que induz a morte de uma célula à qual se liga.
44. Oligopeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 ou 36, que é marcado de forma detectável.
45. Molécula orgânica de ligação de TAT que se liga a umpolipeptídeo que possui pelo menos 80% de identidade de seqüência deaminoácidos em relação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1.
46. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 45, quese liga a um polipeptídeo que contém:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2sem o seu peptídeo sinal associado;(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N0 1.
47. Molécula orgânica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 45 ou 46, que é conjugada a um agente inibidor do crescimento.
48. Molécula orgânica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 45 ou 46, que é conjugada a um agente citotóxico.
49. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 48, emque o agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste de toxinas,antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
50. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 48, emque o agente citotóxico é uma toxina.
51. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 50, emque a toxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
52. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 50, emque a toxina é um maitansinóide.
53. Molécula orgânica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 45 ou 46, que induz a morte de uma célula à qual se liga.
54. Molécula orgânica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 45 ou 46, que é marcada de forma detectável.
55. Composição de matéria que compreende:
(a) o polipeptídeo conforme descrito na reivindicação 11;
(b) o polipeptídeo conforme descrito na reivindicação 12;
(c) o polipeptídeo quimérico conforme descrito nareivindicação 13;
(d) o anticorpo conforme descrito na reivindicação 15;
(e) o anticorpo conforme descrito na reivindicação 16;
(f) o oligopeptídeo conforme descrito na reivindicação 35;
(g) o oligopeptídeo conforme descrito na reivindicação 36;
(h) a molécula orgânica de ligação de TAT conforme descritana reivindicação 45; ou
(i) a molécula orgânica de ligação de TAT conforme descritana reivindicação 46; em combinação com um veículo.
56. Composição de matéria de acordo com a reivindicação 55,em que o mencionado veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.
57. Artigo de manufatura que compreende:
(a) um recipiente; e
(b) a composição de matéria conforme descrita nareivindicação 55 contida no interior do mencionado recipiente.
58. Artigo de manufatura de acordo com a reivindicação 57,que compreende adicionalmente um rótulo afixado ao mencionado recipienteou uma bula incluída com o mencionado recipiente, referente ao uso damencionada composição de matéria para o tratamento terapêutico ou adetecção diagnostica de um câncer.
59. Método de inibição do crescimento de uma célula queexpressa uma proteína que possui pelo menos 80% de identidade deseqüência de aminoácidos em relação a:(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinai associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N° 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1,em que o mencionado método compreende o contato da mencionada célulacom um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se liga àmencionada proteína, de forma que a ligação do mencionado anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica à mencionada proteína cause inibição docrescimento da mencionada célula.
60. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é um anticorpo monoclonal.
61. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é um fragmento de anticorpo.
62. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.
63. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente inibidor do crescimento.
64. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente citotóxico.65. Método de acordo com a reivindicação 64, em que omencionado agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
66. Método de acordo com a reivindicação 64, em que oagente citotóxico é uma toxina.
67. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a toxinaé selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
68. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a toxinaé um maitansinóide.
69. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
70. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.
71. Método de acordo com a reivindicação 59, em que amencionada célula é uma célula cancerosa.
72. Método de acordo com a reivindicação 71, em que amencionada célula cancerosa é adicionalmente exposta a tratamento comradiação ou um agente quimioterapêutico.
73. Método de acordo com a reivindicação 71, em que amencionada célula cancerosa é selecionada a partir do grupo que consiste de umacélula de câncer de mama, uma célula de câncer colo-retal, uma célula de câncerdo pulmão, uma célula de câncer de ovário, uma célula de câncer do sistemanervoso central, uma célula de câncer do fígado, uma célula de câncer da bexiga,uma célula de câncer pancreático, uma célula de câncer da cervical, uma célula demelanoma e uma célula de leucemia.
74. Método de acordo com a reivindicação 71, em que amencionada proteína é expressa mais abundantemente pela mencionada célulacancerosa em comparação com uma célula normal da mesma origem de tecido.
75. Método de acordo com a reivindicação 59, que causa amorte da mencionada célula.
76. Método de acordo com a reivindicação 59, em que amencionada proteína contém:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2sem o seu peptídeo sinal associado;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N0 1.
77. Método de tratamento terapêutico de um mamífero quepossui um tumor canceroso que compreende células que expressam umaproteína que possui pelo menos 80% de identidade de seqüência deaminoácidos em relação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1,em que o mencionado método compreende a administração ao mencionadomamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica que se liga à mencionada proteína, deforma a tratar eficientemente o mencionado mamífero.
78. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é um anticorpo monoclonal.
79. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é um fragmento de anticorpo.
80. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.
81. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente inibidor do crescimento.
82. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente citotóxico.
83. Método de acordo com a reivindicação 82, em que omencionado agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
84. Método de acordo com a reivindicação 82, em que oagente citotóxico é uma toxina.
85. Método de acordo com a reivindicação 84, em que a toxinaé selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
86. Método de acordo com a reivindicação 84, em que a toxinaé um maitansinóide.
87. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
88. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.
89. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado tumor é adicionalmente exposto a tratamento com radiação ou umagente quimioterapêutico.
90. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado tumor é um tumor de mama, um tumor colo-retal, um tumor dopulmão, um tumor de ovário, um tumor do sistema nervoso central, um tumordo fígado, um tumor da bexiga, um tumor pancreático ou um tumor cervical.
91. Método de acordo com a reivindicação 77, em que amencionada proteína é expressa mais abundantemente pelas célulascancerosas do mencionado tumor em comparação com uma célula normal damesma origem de tecido.
92. Método de acordo com a reivindicação 77, em que amencionada proteína contém:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2sem o seu peptídeo sinal associado;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N0 1.
93. Método de determinação da presença de uma proteína emuma amostra suspeita de conter a mencionada proteína, em que a mencionadaproteína possui pelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos emrelação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1,em que o mencionado método compreende a exposição da mencionadaamostra a um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se liga àmencionada proteína e determinação da ligação do mencionado anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica à mencionada proteína na mencionadaamostra, em que a ligação do anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica àmencionada proteína é um indicativo da presença da mencionada proteína namencionada amostra.
94. Método de acordo com a reivindicação 93, em que amencionada amostra compreende uma célula suspeita de expressar amencionada proteína.
95. Método de acordo com a reivindicação 94, em que amencionada célula é uma célula cancerosa.
96. Método de acordo com a reivindicação 93, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é marcado de formadetectável.
97. Método de acordo com a reivindicação 93, em que amencionada proteína contém:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2sem a sua seqüência de peptídeo sinal associada;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como
SEQIDN°1.
98. Método de diagnóstico da presença de um tumor em ummamífero, em que o mencionado método compreende a determinação do nívelde expressão de um gene que codifica uma proteína que possui pelo menos80% de identidade de seqüência de aminoácidos em relação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) μm polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1 emuma amostra de teste de células de tecido obtidas do mencionado mamífero eem uma amostra de controle de células normais conhecidas da mesma origemde tecido, em que um nível mais alto de expressão da mencionada proteína naamostra de teste, em comparação com a amostra controle, é um indicativo dapresença de um tumor no mamífero do qual a amostra de teste foi obtida.
99. Método de acordo com a reivindicação 98, em que a etapade determinação do nível de expressão de um gene que codifica a mencionadaproteína compreende o emprego de um oligonucleotídeo em uma hibridizaçãoin situ ou análise RT-PCR.
100. Método de acordo com a reivindicação 98, em que a etapade determinação do nível de expressão de um gene que codifica a mencionadaproteína compreende o emprego de um anticorpo em uma análise deimunohistoquímica ou Western Blot.
101. Método de acordo com a reivindicação 98, em que amencionada proteína contém:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID Nº 2sem o seu peptídeo sinal associado;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID Nº 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID Nº 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID Nº 1; ou
(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID Nº 1.
102. Método de diagnóstico da presença de um tumor em ummamífero, em que o mencionado método compreende o contato de umaamostra de teste de células de tecido obtidas do mencionado mamífero comum anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se liga a uma proteínaque possui pelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos emrelação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID Nº 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID Nº 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID Nº 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID Nº 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID Nº 1; ou(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1 edetecção da formação de um complexo entre o mencionado anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica e a mencionada proteína na amostra deteste, em que a formação de um complexo é um indicativo da presença de umtumor no mencionado mamífero.
103. Método de acordo com a reivindicação 102, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é marcado de formadetectável.
104. Método de acordo com a reivindicação 102, em que amencionada amostra de teste de células de tecido é obtida a partir de umindivíduo suspeito de ter um tumor canceroso.
105. Método de acordo com a reivindicação 102, em que amencionada proteína contém: (a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2sem o seu peptídeo sinal associado;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N0 1.106. Método de tratamento ou prevenção de uma disfunçãoproliferativa celular associada ao aumento da expressão ou atividade de umaproteína que possui pelo menos 80% de identidade de seqüência deaminoácidos em relação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1,
em que o mencionado método compreende a administração a um pacientenecessitado desse tratamento de uma quantidade eficaz de um antagonista damencionada proteína, de forma a tratar ou evitar eficientemente a mencionadadisfunção proliferativa celular.
107. Método de acordo com a reivindicação 106, em que amencionada disfunção proliferativa celular é um câncer.
108. Método de acordo com a reivindicação 106, em que omencionado antagonista é um anticorpo anti-polipeptídeo TAT, oligopeptídeo deligação de TAT, molécula orgânica de ligação de TAT ou oligonucleotídeoantisense.
109. Método de ligação de um anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica a uma célula que expressa uma proteína que possui pelomenos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos em relação a:(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N°2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N°2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinai associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1,em que o mencionado método compreende o contato da mencionada célulacom um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se liga àmencionada proteína, de forma a permitir a ocorrência da ligação do anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica à mencionada proteína e ligar omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à mencionadacélula.
110. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo é um anticorpo monoclonal.
111. Método de acordo com a reivindicação 109, em que o
mencionado anticorpo é um fragmento de anticorpo.
112. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.
113. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente inibidor do crescimento.
114. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente citotóxico.
115. Método de acordo com a reivindicação 114, em que omencionado agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
116. Método de acordo com a reivindicação 114, em que oagente citotóxico é uma toxina.
117. Método de acordo com a reivindicação 116, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
118. Método de acordo com a reivindicação 116, em que atoxina é um maitansinóide.
119. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
120. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.
121. Método de acordo com a reivindicação 109, em que amencionada célula é uma célula cancerosa.
122. Método de acordo com a reivindicação 121, em que amencionada célula cancerosa é adicionalmente exposta a tratamento comradiação ou um agente quimioterapêutico.
123. Método de acordo com a reivindicação 121, em que amencionada célula cancerosa é selecionada a partir do grupo que consiste de umacélula de câncer de mama, uma célula de câncer colo-retal, uma célula de câncerdo pulmão, uma célula de câncer de ovário, uma célula de câncer do sistemanervoso central, uma célula de câncer do fígado, uma célula de câncer da bexiga,uma célula de câncer pancreático, uma célula de câncer da cervical, uma célula demelanoma e uma célula de leucemia.
124. Método de acordo com a reivindicação 123, em que amencionada proteína é expressa mais abundantemente pela mencionada célulacancerosa em comparação com uma célula normal da mesma origem de tecido.
125. Método de acordo com a reivindicação 109, que causa amorte da mencionada célula,
126. Uso de um ácido nucléico conforme descrito em qualqueruma das reivindicações 1 a 5 ou 30 na preparação de um medicamento para otratamento terapêutico ou detecção de diagnóstico de um câncer.
127. Uso de um ácido nucléico conforme descrito em qualqueruma das reivindicações 1 a 5 ou 30 na preparação de um medicamento para otratamento de um tumor.
128. Uso de um ácido nucléico conforme descrito em qualqueruma das reivindicações 1 a 5 ou 30 na preparação de um medicamento para otratamento ou prevenção de uma disfunção proliferativa celular.
129. Uso de um vetor de expressão conforme descrito emqualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 31 na preparação de um medicamentopara o tratamento terapêutico ou detecção de diagnóstico de um câncer.
130. Uso de um vetor de expressão conforme descrito emqualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 31 na preparação de um medicamentopara o tratamento de um tumor.
131. Uso de um vetor de expressão conforme descrito emqualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 31 na preparação de um medicamentopara o tratamento ou prevenção de uma disfunção proliferativa celular.
132. Uso de uma célula hospedeira conforme descrita emqualquer uma das reivindicações 8, 9, 32 ou 33 na preparação de ummedicamento para o tratamento terapêutico ou detecção de diagnóstico de umcâncer.
133. Uso de uma célula hospedeira conforme descrita emqualquer uma das reivindicações 8, 9, 32 ou 33 na preparação de ummedicamento para o tratamento de um tumor.
134. Uso de uma célula hospedeira conforme descrita emqualquer uma das reivindicações 8, 9, 32 ou 33 na preparação de ummedicamento para o tratamento ou prevenção de uma disfunção proliferativacelular.
135. Uso de um polipeptídeo conforme descrito em qualqueruma das reivindicações 11 a 14 na preparação de um medicamento para otratamento terapêutico ou detecção de diagnóstico de um câncer.
136. Uso de um polipeptídeo conforme descrito em qualquer umadas reivindicações 11 a 14 na preparação de um medicamento para o tratamentode um tumor.
137. Uso de um polipeptídeo conforme descrito em qualqueruma das reivindicações 11 a 14 na preparação de um medicamento paratratamento ou prevenção de uma disfunção proliferativa celular.
138. Uso de um anticorpo conforme descrito em qualquer umadas reivindicações 15 a 29 na preparação de um medicamento para otratamento terapêutico ou detecção de diagnóstico de um câncer.
139. Uso de um anticorpo conforme descrito em qualquer umadas reivindicações 15 a 29 na preparação de um medicamento para o tratamentode um tumor.
140. Uso de um anticorpo conforme descrito em qualquer umadas reivindicações 15 a 29 na preparação de um medicamento para otratamento ou prevenção de uma disfunção proliferativa celular.
141. Uso de um oligopeptídeo conforme descrito em qualqueruma das reivindicações 35 a 44 na preparação de um medicamento para otratamento terapêutico ou detecção de diagnóstico de um câncer.
142. Uso de um oligopeptídeo conforme descrito em qualqueruma das r eivindicações 35 a 44 na preparação de um medicamento para otratamento de um tumor.
143. Uso de um oligopeptídeo conforme descrito em qualqueruma das reivindicações 35 a 44 na preparação de um medicamento para otratamento ou prevenção de uma disfunção proliferativa celular.
144. Uso de uma molécula orgânica de iigação de TATconforme descrita em qualquer uma das reivindicações 45 a 54 na preparaçãode um medicamento para o tratamento terapêutico ou detecção de diagnósticode um câncer.
145. Uso de uma molécula orgânica de ligação de TATconforme descrita em qualquer uma das reivindicações 45 a 54 na preparaçãode um medicamento para o tratamento de um tumor.
146. Uso de uma molécula orgânica de ligação de TATconforme descrita em qualquer uma das reivindicações 45 a 54 na preparaçãode um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma disfunçãoproliferativa celular.
147.Uso de uma composição de matéria conforme descrita emqualquer uma das reivindicações 55 ou 56 na preparação de um medicamentopara o tratamento terapêutico ou detecção de diagnóstico de um câncer.
148. Uso de uma composição de matéria conforme descrita emqualquer uma das reivindicações 55 ou 56 na preparação de um medicamentopara o tratamento de um tumor.
149. Uso de uma composição de matéria conforme descrita emqualquer uma das reivindicações 55 ou 56 na preparação de um medicamentopara o tratamento ou prevenção de uma disfunção proliferativa celular.
150. Uso de um artigo de manufatura conforme descrito emqualquer uma das reivindicações 57 ou 58 na preparação de um medicamentopara o tratamento terapêutico ou detecção de diagnóstico de um câncer.
151. Uso de um artigo de manufatura conforme descrito emqualquer uma das reivindicações 57 ou 58 na preparação de um medicamentopara o tratamento de um tumor.
152. Uso de um artigo de manufatura conforme descrito emqualquer uma das reivindicações 57 ou 58 na preparação de um medicamentopara o tratamento ou prevenção de uma disfunção proliferativa celular.
153. Método de inibição do crescimento de uma célula, em queo crescimento da mencionada célula depende ao menos em parte de um efeitode potencialização do crescimento de uma proteína que possui pelo menos80% de identidade de seqüência de aminoácidos em relação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem o seupeptídeo sinal associado;
(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1,em que o mencionado método compreende o contato da mencionada proteínacom um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se liga àmencionada proteína, de forma a inibir o crescimento da mencionada célula.
154. Método de acordo com a reivindicação 153, em que amencionada célula é uma célula cancerosa.
155. Método de acordo com a reivindicação 153, em que amencionada proteína é expressa pela mencionada célula.
156. Método de acordo com a reivindicação 153, em que aligação do mencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica àmencionada proteína antagoniza atividade potencializadora do crescimentocelular da mencionada proteína.
157. Método de acordo com a reivindicação 153, em que aligação do mencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica àmencionada proteína induz a morte da mencionada célula.
158. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é um anticorpo monoclonal.
159. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é um fragmento de anticorpo.
160. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.
161. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente inibidor do crescimento.
162. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente citotóxico.
163. Método de acordo com a reivindicação 162, em que omencionado agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
164. Método de acordo com a reivindicação 162, em que oagente citotóxico é uma toxina.
165. Método de acordo com a reivindicação 164, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
166. Método de acordo com a reivindicação 164, em que atoxina é um maitansinóide.
167. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
168. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.
169. Método de acordo com a reivindicação 153, em que amencionada proteína contém:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2sem o seu peptídeo sinal associado;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N° 1.
170. Método de tratamento terapêutico de um tumor em ummamífero, em que o crescimento do mencionado tumor depende ao menos emparte de um efeito de potencialização do crescimento de uma proteína quepossui pelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos emrelação a:
(a) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) o polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo sinal associado;(c) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, com o seu peptídeo sinal associado;
(d) um domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQID N0 2, sem o seu peptídeo sinal associado;
(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N0 1; ou
(f) um polipeptídeo codificado pela região codificadora decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1,em que o mencionado método compreende o contato da mencionada proteínacom um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se liga àmencionada proteína, de forma a tratar efetivamente o mencionado tumor.
171. Método de acordo com a reivindicação 170, em que amencionada proteína é expressa pelas células do mencionado tumor.
172. Método de acordo com a reivindicação 170, em que aligação do mencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica àmencionada proteína antagoniza atividade potencializadora do crescimentocelular da mencionada proteína.
173. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é um anticorpo monoclonal.
174. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é um fragmento de anticorpo.
175. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.
176. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente inibidor do crescimento.
177. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado a umagente citotóxico.
178. Método de acordo com a reivindicação 177, em que omencionado agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
179. Método de acordo com a reivindicação 177, em que oagente citotóxico é uma toxina.
180. Método de acordo com a reivindicação 179, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
181. Método de acordo com a reivindicação 179, em que atoxina é um maitansinóide.
182. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
183. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.
184. Método de acordo com a reivindicação 170, em que amencionada proteína contém:
(a) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2;
(b) a seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N0 2sem a sua seqüência de peptídeo sinal associada;
(c) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, com a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(d) uma seqüência de aminoácidos de um domínio extracelulardo polipeptídeo exibido como SEQ ID N0 2, sem a sua seqüência de peptídeosinal associada;
(e) uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N0 1; ou(f) uma seqüência de aminoácidos codificada pela regiãocodificadora de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N0 1.
186. Anticorpo isolado que se liga ao mesmo epítopo ligado porum anticorpo produzido por qualquer uma das linhagens celulares de hibridomaexibidas na Tabela 11.
187. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que é umanticorpo monoclonal.
188. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que é umfragmento de anticorpo.
189. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que é umanticorpo humanizado ou quimérico.
190. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éconjugado a um agente inibidor do crescimento.
191. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éconjugado a um agente citotóxico.
192. Anticorpo de acordo com a reivindicação 191, em que oagente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste de toxinas,antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
193. Anticorpo de acordo com a reivindicação 191, em que oagente citotóxico é uma toxina.
194. Anticorpo de acordo com a reivindicação 193, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
195. Anticorpo de acordo com a reivindicação 193, em que atoxina é um maitansinóide.
196. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éproduzido em bactéria.
197. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éproduzido em células de CHO.
198. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que induz amorte de célula à qual se liga.
199. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que émarcado de forma detectável.
200. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, quecompreende pelo menos uma das regiões de determinação decomplementaridade de qualquer anticorpo produzido por qualquer uma daslinhagens celulares de hibridoma exibidas na Tabela 11.
201. Anticorpo monoclonal produzido por qualquer uma dascélulas de hibridoma exibidas na Tabela 11.
202. Célula de hibridoma que produz um anticorpo monoclonalque se liga a um polipeptídeo TAT.
203. Método de identificação de um anticorpo que se liga a umepítopo ligado por um anticorpo produzido por qualquer uma das linhagenscelulares de hibridoma exibidas na Tabela 11, em que o mencionado métodocompreende a determinação da capacidade de um primeiro anticorpo debloquear a ligação de um segundo anticorpo produzido por qualquer uma daslinhagens celulares de hibridoma exibidas na Tabela 11 a um polipeptídeo TAT,em que a capacidade do mencionado primeiro anticorpo de bloquear a ligaçãodo mencionado segundo anticorpo ao mencionado polipeptídeo TAT em pelomenos 40% e em concentrações iguais de anticorpo é um indicativo de que omencionado primeiro anticorpo é capaz de ligar-se a um epítopo ligado pelomencionado segundo anticorpo.
Outras realizações adicionais da presente invenção serãoevidentes para os técnicos no assunto mediante leitura do presente relatóriodescritivo.Breve Descrição das Figuras
As Figuras 1A-E exibem seqüência de nucleotídeos (SEQ ID N0 1)de cDNA de TAT10772, em que SEQ ID N0 1 é um clone denominado napresente invenção como "DNA772".
As Figuras 2A-B exibem a seqüência de aminoácidos (SEQ ID N02) derivada da seqüência codificadora de SEQ ID N0 1 exibida na Figura 1.
A Figura 3 ilustra alinhamento de seqüências de aminoácidos dascadeias variáveis leves para o seguinte: seqüência de consenso de subgrupo Ihumano de cadeia leve (huKI; SEQ ID N0 3); anticorpo anti-TAT10772 11D10murino (mu11D10-L; SEQ ID N0 4) e anticorpo "humanizado" enxertado anti-TAT10772 11D10 (enxerto de 11D10; SEQ ID N0 5).
A Figura 4 ilustra alinhamento de seqüências de aminoácidos dascadeias variáveis pesadas para o seguinte: seqüência de consenso desubgrupo Ill humano de cadeia pesada (hum III; SEQ ID N0 6); anticorpo anti-TAT10772 11D10 murino (mu11D10-H; SEQ ID N0 7) e anticorpo "humanizado"enxertado anti-TAT10772 11D10 (enxerto de 11D10; SEQ ID N0 8).
A Figura 5 ilustra alinhamento de seqüências de aminoácidos dascadeias variáveis leves para o seguinte: seqüência de consenso de subgrupohumano I de cadeia leve (huKI; SEQ ID N0 3); anticorpo anti-TAT10772 3A5murino (mu3A5-L; SEQ ID N0 9) e anticorpo "humanizado" enxertado anti-TAT10772 3A5 (enxerto de 3A5; SEQ ID N0 10).
As Figuras 6A-B ilustra alinhamento de seqüências deaminoácidos das cadeias variáveis pesadas para o seguinte: seqüência deconsenso de subgrupo Ill humano de cadeia pesada (hum III; SEQ ID N0 6);anticorpo anti-TAT10772 3A5 murino (mu3A5-H; SEQ ID N0 11); anticorpo"humanizado" enxertado anti-TAT10772 3A5 "variante L" (enxerto 3A5.L; SEQID N0 12); e anticorpo "humanizado" enxertado anti-TAT10772 3A5 "variante F"(enxerto 3A5.F; SEQ ID N0 13).A Figura 7 exibe várias seqüências de HVR-L1 (SEQ ID N0 14-34)de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 8 exibe várias seqüências de HVR-L2 (SEQ ID N0 35-58)de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 9 exibe várias seqüências de HVR-L3 (SEQ ID N0 59-73)de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 10 exibe várias seqüências de HVR-H1 (SEQ ID N0 74-93)de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 11 exibe várias seqüências de HVR-H2 (SEQ ID N0 94-112) de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidadeselecionados.
A Figura 12 exibe várias seqüências de HVR-H3 (SEQ ID N0 113-118) de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidadeselecionados.
A Figura 13 exibe seqüência de HVR-L1 (SEQ ID N0 119) deanticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 14 exibe várias seqüências de HVR-L2 (SEQ ID N0 120-121) de anticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 15 exibe seqüência de HVR-L3 (SEQ ID N0 122) deanticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 16 exibe seqüências de HVR-H1 (SEQ ID N0 123) deanticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 17 exibe seqüências de HVR-H2 (SEQ ID N0 124-127)de anticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
As Figuras 18A-B exibem seqüências de HVR-H3 (SEQ ID N0128-183) de anticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidadeselecionados.
A Figura 19 ilustra exemplos de seqüências de estrutura deconsenso humanas aceptoras para uso na prática da presente invenção comidentificadores de seqüências conforme segue: estrutura de consenso VH desubgrupo I humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N0 184), estrutura deconsenso VH de subgrupo I humano menos regiões hipervariáveis estendidas(SEQ ID N0 185 a 187), estrutura de consenso VH de subgrupo Ii humanomenos CDRs de Kabat (SEQ ID N0 188), estrutura de consenso VH desubgrupo Il humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N0 189 a191), estrutura de consenso VH de subgrupo Ill humano menos CDRs deKabat "variante L" (SEQ ID N0 192) e estrutura de consenso VH de subgrupo Illhumano menos CDRs de Kabat "variante F" (SEQ ID N0 193).
A Figura 20 ilustra exemplos de seqüências de estrutura deconsenso humanas aceptoras para uso na prática da presente invenção comidentificadores de seqüências conforme segue: estrutura de consenso VL desubgrupo I kappa humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N0 194), estruturade consenso VL de subgrupo Il kappa humano menos CDRs de Kabat (SEQ IDN0 195), estrutura de consenso VL de subgrupo Ill kappa humano menos CDRsde Kabat (SEQ ID N0 196) e estrutura de consenso VL de subgrupo IV kappahumano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N0 197).
As Figuras 21A e B exibem as seqüências de cadeia variável pesada completas para os anticorpos a seguir: 3A5v1 (SEQ ID N0 198), 3A5v2(SEQ ID N0 199), 3A5v3 (SEQ ID N0 200), 3A5v4 (SEQ ID N0 201), 3A5v5(SEQ ID N0 202), 3A5v6 (SEQ ID N0 203), 3A5v7 (SEQ ID N0 204), 3A5v8(SEQ ID N0 205), 3A5v1b.52 (SEQ ID N0 206), 3A5v1b.54 (SEQ ID N0 207),3A5v4b.52 (SEQ ID N0 208) e 3A5v4b.54 (SEQ ID N0 209). Todos estesanticorpos contêm a seqüência de aminoácidos de cadeia variável leve huKI deSEQ ID N0 3.
A Figura 22 exibe as seqüências de cadeia variável levecompletas (SEQ ID N0 210-211) empregadas para certos anticorpos anti-ΤΑΤ10772 descritos na presente invenção.
A Figura 23 exibe a capacidade de vários anticorpos 3A5humanizados de inibir a ligação de 3A5 quimérico marcado com rutênio apolipeptídeo alvo TAT10772 com domínio 5' biotinilado. "h2H7 ctr" é anticorpocontrole negativo que não se liga especificamente a TAT10772.
A Figura 24 exibe a capacidade de vários anticorpos 3A5humanizados de inibir a ligação de 3A5 quimérico marcado com rutênio apolipeptídeo CA125 biotinilado. "h2H7 ctr" é anticorpo controle negativo quenão se liga especificamente a TAT10772.
A Figura 25 exibe os resultados de análise ELISA utilizando váriosanticorpos 3A5 humanizados para medir a ligação a células OVCAR-3. "h2H7ctr" é anticorpo controle negativo que não se liga especificamente a TAT10772.
A Figura 26 exibe proliferação in vitro de células OVCAR-3 (queexpressam de forma endógena polipeptídeo TAT10772) após tratamento comanticorpos 11D10-vc-MMAF quiméricos ou 3A5-vc-MMAF quiméricos.
A Figura 27 exibe proliferação in vitro de células OVCAR-3 (queexpressam de forma endógena polipeptídeo TAT10772) após tratamento comanticorpos 11D10-vc-MMAE quiméricos ou 3A5-vc-MMAE quiméricos.
A Figura 28 exibe proliferação in vitro de células OVCAR-3 (queexpressam de forma endógena polipeptídeo TAT10772) após tratamento comanticorpo 11D10-MC-MMAF quiméricos ou 3A5-MC-MMAF quiméricos.
A Figura 29 exibe proliferação in vitro de células PC3transfectadas com vetor que permite a expressão por essas células depolipeptídeo TAT10772 (PC3/A5.3B2) ou células PC3 que não expressampolipeptídeo TAT10772 (PC3/neo) após tratamento com anticorpos 11D10-vc-MMAF quiméricos ou 3A5-vc-MMAF quiméricos.
A Figura 30 exibe proliferação in vitro de células PC3transfectadas com vetor que permite a expressão por essas células depolipeptídeo TAT10772 (PC3/A5.3B2) ou células PC3 que não expressampolipeptídeo TAT10772 (PC3/neo) após tratamento com anticorpos 11D10-vc-PAB-MMAE quiméricos ou 3A5-vc-PAB-MMAE quiméricos.
A Figura 31 exibe proliferação in vitro de células PC3transfectadas com vetor que permite a expressão por essas células depolipeptídeo TAT10772 (PC3/A5.3B2) ou células PC3 que não expressampolipeptídeo TAT10772 (PC3/neo) após tratamento com anticorpos 11D10-MC-MMAF quimérico ou 3A5-MC-MMAÍ quiméricos.
A Figura 32 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de injeção subcutânea) em tumores derivados de PC3-A5.3B2 apóstratamento com vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas,anticorpos de controle ou veículo isolado.
A Figura 33 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de transplante em almofada de gordura de mamíferos emcamundongo bege SCID) em tumores derivados de OVCAR-3 após tratamentocom vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos decontrole ou veículo isolado.
A Figura 34 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de transplante em almofada de gordura de mamíferos emcamundongo bege SCID) em tumores derivados de OVCAR-3 após tratamentocom vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos decontrole ou veículo isolado.
A Figura 35 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de transplante em almofada de gordura de mamíferos emcamundongo bege SCID) em tumores derivados de OVCAR-3 após tratamentocom vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos decontrole ou veículo isolado.
A Figura 36 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(tumores de xenoenxerto em camundongos brutos, dez milhões de células porcamundongo) em tumores derivados de PC3/A5.3B2 após tratamento comvários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos de controleou veículo isolado.
A Figura 37 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de transplante em almofada de gordura de mamíferos emcamundongo bege SCID) em tumores derivados de OVCAR-3 após tratamentocom vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos decontrole ou veículo isolado.
Descrição Detalhada da Invenção
I. Definições
As expressões "polipeptídeo TAT" e "TAT", da forma utilizada napresente invenção e quando imediatamente seguidas por designaçãonumérica, designam diversos polipeptídeos, em que a designação completa (ou seja, TAT/número) designa seqüências de polipeptídeos específicas conformedescrito na presente invenção. As expressões "TAT/polipeptídeo número" e"TAT/número", em que o termo "número" é fornecido na forma de designaçãonumérica real da forma utilizada na presente invenção, engloba polipeptídeosde seqüência nativa, variantes de polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeos de seqüência nativa e variantes de polipeptídeos (que são adicionalmentedefinidos na presente invenção). Os polipeptídeos TAT descritos na presenteinvenção podem ser isolados a partir de uma série de fontes, tais como a partirde tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados por meio demétodos sintéticos e/ou recombinantes. A expressão "polipeptídeo TAT" designa cada polipeptídeo TAT/número individual descrito na presenteinvenção. Todas as descrições no presente relatório descritivo referentes ao"polipeptídeo TAT" designam cada um dos polipeptídeos individual ecoletivamente. Descrições, por exemplo, da preparação, purificação, derivação,formação de anticorpos para ou contra, formação de oligopeptídeos de ligaçãode TAT para ou contra, formação de moléculas orgânicas de ligação de TATpara ou contra, administração de, composições que contêm, tratamento dedoença com etc. referem-se a cada polipeptídeo de acordo com a presenteinvenção individualmente. A expressão "polipeptídeo TAT" também incluivariantes dos polipeptídeos TAT/número descritos na presente invenção.
"Polipeptídeo TAT de seqüência nativa" compreende polipeptídeoque contém a mesma seqüência de aminoácidos do polipeptídeo TATcorrespondente derivado da natureza. Esses polipeptídeos TAT de seqüêncianativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meiossintéticos ou recombinantes. A expressão "polipeptídeo TAT de seqüêncianativa" engloba especificamente formas secretadas ou truncadas de ocorrêncianatural do polipeptídeo TAT específico (tais como seqüência de domínioextracelular), formas variantes de ocorrência natural (tais como formasalternativamente divididas) e variantes alélicas de ocorrência natural dopolipeptídeo. Em certas realizações da presente invenção, os polipeptídeosTAT de seqüência nativa descritos na presente invenção são polipeptídeos deseqüência nativa maduros ou de comprimento total que compreendem asseqüências de aminoácidos de comprimento total exibidas nas figuras anexas.Códons de início e de parada (se indicados) são exibidos em negrito esublinhados nas figuras. Os resíduos de ácido nucléico indicados como "N" ou"X" nas figuras anexas são quaisquer resíduos de ácido nucléico. Embora sedemonstre que os polipeptídeos TAT descritos nas figuras anexas começamcom resíduos de metionina denominados na presente invenção como posiçãode aminoácido 1 nas figuras, é possível e concebível que outros resíduos demetionina localizados acima ou abaixo no fluxo a partir da posição deaminoácido 1 nas figuras possam ser empregados como o resíduo deaminoácido inicial para os polipeptídeos TAT.O "domínio extracelular" ou "ECD" de polipeptídeo TAT designauma forma do polipeptídeo TAT que é essencialmente livre dos domínioscitoplasmáticos e de transmembrana. Normalmente, ECD de polipeptídeo TATconterá menos de 1% desses domínios citoplasmáticos e/ou detransmembrana e, preferencialmente, conterá menos de cerca de 0,5% dessesdomínios. Compreender-se-á que quaisquer domínios de transmembranaidentificados para os polipeptídeos TAT de acordo com a presente invençãosão identificados de acordo com critérios rotineiramente empregados natécnica para identificar aquele tipo de domínio hidrofóbico. As fronteiras exatasde domínio de transmembrana podem variar, mas, muito provavelmente, emnão mais de cerca de cinco aminoácidos em cada extremidade do domínio,conforme identificado inicialmente na presente invenção. Opcionalmente,portanto, domínio extracelular de polipeptídeo TAT pode conter cerca de cincoou menos aminoácidos sobre cada lado da fronteira entre domínio detransmembrana e domínio extracelular, conforme identificado nos Exemplos ouno relatório descritivo e esses polipeptídeos, com ou sem o peptídeo sinalassociado e ácido nucléico que os codifica, são contemplados pela presenteinvenção.
A localização aproximada dos "peptídeos sinal" dos diversospolipeptídeos TAT descritos na presente invenção pode ser exibida no presenterelatório descritivo e/ou nas figuras anexas. Observa-se, entretanto, que afronteira C-terminal de peptídeo sinal pode variar, mas mais provavelmente emnão mais de cerca de cinco aminoácidos sobre cada lado da fronteira C-terminal de peptídeo sinal conforme identificado inicialmente na presenteinvenção, em que a fronteira C-terminal do peptídeo sinal pode ser identificadade acordo com critérios empregados rotineiramente na técnica para identificaraquele tipo de elemento de seqüência de aminoácidos (tal como Nielsen et al,Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) e von Heinje et al, Nuci Acids. Res. 14: 4683-4690(1986)). Além disso, também se reconhece que, em alguns casos, a divisão deseqüência sinal de polipeptídeo secretado não é totalmente uniforme, o queresulta em mais de uma substância secretada. Estes polipeptídeos maduros,em que o peptídeo sinal é dividido em não mais de cerca de cinco aminoácidossobre cada lado da fronteira C-terminal do peptídeo sinal conforme identificadona presente invenção, e os polinucleotídeos que os codificam sãocontemplados pela presente invenção.
"Variante de polipeptídeo TAT" indica polipeptídeo TAT1preferencialmente polipeptídeo TAT ativo, conforme definido na presenteinvenção, que possui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência deaminoácidos com uma seqüência de polipeptídeos TAT de seqüência nativa decomprimento total conforme descrito na presente invenção, seqüência depolipeptídeos TAT que não contém o peptídeo sinal conforme descrito napresente invenção, domínio extracelular de polipeptídeo TAT, com ou sem opeptídeo sinal conforme descrito na presente invenção ou qualquer outrofragmento de seqüência de polipeptídeos TAT de comprimento total conformedescrito na presente invenção (tal como os codificados por ácido nucléico querepresenta somente uma parte da seqüência codificadora completa parapolipeptídeo TAT de comprimento total). Essas variantes de polipeptídeos TATincluem, por exemplo, polipeptídeos TAT em que são adicionados ou excluídosum ou mais resíduos de aminoácidos no terminal N ou C da seqüência deaminoácidos nativa de comprimento total. Normalmente, variante depolipeptídeo TAT possuirá pelo menos cerca de 80% de identidade deseqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%,83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência de aminoácidos emrelação a uma seqüência de polipeptídeos TAT de seqüência nativa decomprimento total conforme descrito na presente invenção, seqüência depolipeptídeos TAT que não contém o peptídeo sinal conforme descrito napresente invenção, domínio extracelular de polipeptídeo TAT com ou sem opeptídeo sinal conforme descrito na presente invenção ou qualquer outrofragmento especificamente definido de s eqüência de polipeptídeos TAT decomprimento total conforme descrito na presente invenção. Normalmente,polipeptídeos variantes de TAT normalmente possuem pelo menos cerca dedez aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 20,30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160; 170, 180, 190,200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320; 330, 340, 350,360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480; 490, 500, 510,520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590 ou 600 aminoácidos de comprimento oumais. Opcionalmente, os polipeptídeos variantes TAT possuirão não mais deuma substituição de aminoácido conservadora em comparação com aseqüência de polipeptídeos TAT nativa, alternativamente não mais de duas,três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidosconservadoras em comparação com a seqüência de polipeptídeos TAT nativa.
"Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos", comrelação às seqüências de polipeptídeos TAT identificadas na presenteinvenção, é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos empossível seqüência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos naseqüência de polipeptídeos TAT específica, após o alinhamento dasseqüências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir o percentualmáximo de identidade de seqüências, sem considerar nenhuma substituiçãoconservadora como parte da identidade de seqüências. O alinhamento parapropósitos de determinação do percentual de identidade de seqüência deaminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro doconhecimento da técnica, utilizando, por exemplo, software de computadordisponível ao público, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign(DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetrosapropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmosnecessários para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento totaldas seqüências sendo comparadas. Para os propósitos do presente,entretanto, valores de percentual de identidade de seqüência de aminoácidossão gerados utilizando o programa de computador de comparação deseqüências ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa de computador de comparaçãode seqüências ALIGN-2 foi elaborado pela Genentech, Inc. e o código fonteexibido na Tabela 1 abaixo foi depositado com documentação de usuário noEscritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559,Estados Unidos, onde está registrado com o n° de Registro de Direitos AutoraisNorte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público pormeio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode sercompilado a partir do código fonte fornecido na Tabela 1 abaixo. O programaALIGN-2 deverá ser compilado para uso em sistema operativo UNIX,preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação deseqüências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparaçõesde seqüências de aminoácidos, o percentual de identidade de seqüência deaminoácidos de uma dada seqüência de aminoácidos A em relação a, com oucontra uma dada seqüência de aminoácidos B (que pode ser alternativamenteexpressa como dada seqüência de aminoácidos A que possui ou compreendecerto percentual de identidade de seqüência de aminoácidos em relação a,com ou contra uma dada seqüência de aminoácidos B) é calculado conformesegue:
10O vezes a fração X/Y
em que X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliadoscomo coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de seqüênciasALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e em que Y é aquantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quandoo comprimento da seqüência de aminoácidos A não for igual ao comprimentoda seqüência de aminoácidos B1 o percentual de identidade de seqüência deaminoácidos de A para B não será igual ao percentual de identidade deseqüência de aminoácidos de B em relação a A. Como exemplos de cálculosde percentuais de identidade de seqüência de aminoácidos utilizando estemétodo, as Tabelas 2 e 3 demonstram como calcular o percentual deidentidade de seqüência de aminoácidos da seqüência de aminoácidosdenominada "Proteína de Comparação" e a seqüência de aminoácidosdenominada "TAT", em que "TAT" representa a seqüência de aminoácidos depolipeptídeo TAT hipotético de interesse, "Proteína de Comparação" representaa seqüência de aminoácidos de polipeptídeo com o qual o polipeptídeo "TAT"de interesse está sendo comparado e cada um dentre "X", "Y" e "Z" representadiferentes resíduos de aminoácidos hipotéticos. A menos que especificadoespecificamente em contrário, todos os valores percentuais de identidade deseqüência de aminoácidos utilizados na presente invenção são obtidosconforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, utilizando o programade computador ALIGN-2.
"Polipeptídeo variante TAT" ou "seqüência de ácido nucléicovariante TAT" indica molécula de ácido nucléico que codifica polipeptídeo TAT,preferencialmente polipeptídeo TAT ativo, conforme definido na presenteinvenção, que possui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência deácido nucléico com seqüência de ácido nucléico que codifica seqüência depolipeptídeos TAT de seqüência nativa e comprimento total conforme descritona presente invenção, seqüência de polipeptídeos TAT de seqüência nativa ecomprimento total que não contém o peptídeo sinal conforme descrito napresente invenção, domínio extracelular de polipeptídeo TAT1 com ou sem opeptídeo sinal conforme descrito na presente invenção ou qualquer outrofragmento de seqüência de polipeptídeos TAT de comprimento total conformedescrito na presente invenção (tal como os codificados por ácido nucléico querepresenta somente uma parte da seqüência codificadora completa parapolipeptídeo TAT de comprimento total). Normalmente, polipeptídeo varianteTAT possuirá pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de ácidosnucléicos, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade de seqüência de ácidos nucléicos em relação a umaseqüência de ácidos nucléicos que codifica seqüência de polipeptídeos TAT deseqüência nativa e comprimento total conforme descrito na presente invenção,seqüência de polipeptídeos TAT de seqüência nativa e comprimento total quenão contém o peptídeo sinal conforme descrito na presente invenção, domínioextracelular de polipeptídeo TAT com ou sem a seqüência sinal conformedescrito na presente invenção ou qualquer outro fragmento de seqüência depolipeptídeos TAT de comprimento total conforme descrito na presenteinvenção. As variantes não englobam a seqüência de nucleotídeos nativa.
Normalmente, os polinucleotídeos variantes de TAT possuem pelomenos cerca de cinco nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelomenos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15; 16, 17, 18, 19, 20; 21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40; 45, 50, 55, 60; 65, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12; 13,14, 115, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22; 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195,200; 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300; 310, 320, 330, 340, 350,360, 370, 380, 390, 400; 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500; 510,520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600; 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670,680, 690, 700; 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800; 810, 820, 830,840, 850, 860, 870, 880, 890, 900; 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990ou 1000 nucleotídeos de comprimento, em que, neste contexto, a expressão"cerca de" indica o comprimento de seqüência de nucleotídeos de referênciamais ou menos 10% daquele comprimento indicado.
"Percentual (%) de identidade da seqüência de ácidos nucléicos",com relação às seqüências de ácidos nucléicos codificadoras de TATidentificadas na presente invenção, é definido como o percentual denucleotídeos em possível seqüência que são idênticos aos nucleotídeos naseqüência de ácidos nucléicos de TAT de interesse, após o alinhamento dasseqüências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir o percentualmáximo de identidade de seqüências. O alinhamento para propósitos dedeterminação do percentual de identidade de seqüência de ácido nucléico podeser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento datécnica, utilizando, por exemplo, software de computador disponível ao público,tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Para ospropósitos do presente, entretanto, valores de percentual de identidade deseqüência de ácidos nucléicos são gerados utilizando o programa decomputador de comparação de seqüências ALIGN-2, em que o código fontecompleto para o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. Oprograma de computador de comparação de seqüências ALIGN-2 foi elaboradopela Genentech, Inc. e o código fonte exibido na Tabela 1 abaixo foi depositadocom documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de DireitosAutorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n°de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programaALIGN-2 é disponível ao público por meio da Genentech, Inc., South SanFrancisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecidona Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para uso emsistema operativo UNIX, preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos osparâmetros de comparação de seqüências são estabelecidos pelo programaALIGN-2 e não variam.
Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparaçõesde seqüências de ácidos nucléicos, o percentual de identidade de seqüência deácidos nucléicos de uma dada seqüência de ácidos nucléicos C em relação a,com ou contra uma dada seqüência de ácidos nucléicos D (que pode seralternativamente expressa como dada seqüência de ácidos nucléicos C quepossui ou compreende certo percentual de identidade de seqüência de ácidosnucléicos em relação a, com ou contra uma dada seqüência de ácidosnucléicos D) é calculado conforme segue:
100 vezes a fração W/Zem que W é a quantidade de nucleotídeos avaliados comocoincidências idênticas pelo programa de alinhamento de seqüências ALIGN-2no alinhamento de C e D naquele programa e em que Z é a quantidade total denucleotídeos em D. Apreciar-se-á que, quando o comprimento da seqüência deácidos nucléicos C não for igual ao comprimento da seqüência de ácidosnucléicos D, o percentual de identidade de seqüência de ácidos nucléicos de Cem relação a D não será igual ao percentual de identidade de seqüência deácidos nucléicos de D em relação a C. Como exemplos de cálculos depercentuais de identidade de seqüência de ácidos nucléicos, as Tabelas 4 e 5demonstram como calcular o percentual de identidade de seqüência de ácidosnucléicos da seqüência de ácidos nucléicos denominada "DNA deComparação" em relação a uma seqüência de ácidos nucléicos denominada"TAT-DNA", em que "TAT-DNA" representa seqüência de ácidos nucléicoscodificadora de TAT hipotética de interesse, "DNA de Comparação" representaa seqüência de nucleotídeos de molécula de ácido nucléico com a qual amolécula de ácido nucléico "TAT-DNA" de interesse está sendo comparada ecada um dentre "N", "L" e "V" representa nucleotídeos hipotéticos diferentes. Amenos que especificado especificamente em contrário, todos os valorespercentuais de identidade de seqüência de ácidos nucléicos utilizados napresente invenção são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamenteanterior, utilizando o programa de computador ALIGN-2.
Em outras realizações, polinucleotídeos variantes de TAT sãomoléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeo TAT e que sãocapazes de hibridização, preferencialmente sob condições de lavagem ehibridização estringentes, em seqüências de nucleotídeos que codificampolipeptídeo TAT de comprimento total conforme descrito na presenteinvenção. Polipeptídeos variantes de TAT podem ser aqueles que sãocodificados por polinucleotídeo variante de TAT.
A expressão "região codificadora de comprimento total", da formautilizada com referência a ácido nucléico que codifica polipeptídeo TAT1designa a seqüência de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo TAT decomprimento total de acordo com a presente invenção (que freqüentemente éexibida entre códons de início e de parada, inclusive, nas figuras anexas). Aexpressão "região codificadora de comprimento total", da forma utilizada comreferência a ácido nucléico depositado na ATCC, designa a parte do cDNA quecodifica polipeptídeo TAT que é inserida no vetor depositado na ATCC (quefreqüentemente é exibida entre códons de início e de parada, inclusive, nasfiguras anexas).
"Isolado", quando utilizado para descrever os vários polipeptídeosTAT descritos na presente invenção, indica um polipeptídeo que foi identificadoe separado e/ou recuperado a partir de componente do seu ambiente natural.Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais quetipicamente interfeririam com utilizações diagnosticas ou terapêuticas para opolilpeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceosou não proteináceos. Em realizações preferidas, o polipeptídeo será purificado(1) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos deseqüência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando seqüenciador dexícaras de centrifugação; ou (2) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE1 sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul deCoomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. O polipeptídeo isoladoinclui o polipeptídeo in situ em células recombinantes, já que pelo menos umcomponente do ambiente natural do polipeptídeo TAT não estará presente.Normalmente, entretanto, o polipeptídeo isolado será preparado por meio depelo menos uma etapa de purificação.
Ácido nucléico codificador de polipeptídeo TAT "isolado" ou outroácido nucléico codificador de polipeptídeo é molécula de ácido nucléico que éidentificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucléicocontaminante com a qual normalmente é associada na fonte natural do ácidonucléico codificador de polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucléicocodificadora de polipeptídeo isolada é diferente na forma ou ambiente em que éencontrada na natureza. As moléculas de ácido nucléico codificadoras depolipeptídeos isoladas são diferenciadas, portanto, da molécula de ácidonucléico codificadora de polipeptídeo específica que existe em células naturais.Molécula de ácido nucléico codificadora de polipeptídeo isolada inclui,entretanto, moléculas de ácido nucléico codificadoras de polipeptídeo contidasem células que normalmente expressam o polipeptídeo no qual, por exemplo, amolécula de ácido nucléico encontra-se em sítio cromossômico diferente decélulas naturais.
A expressão "seqüências de controle" designa seqüências deDNA necessárias para a expressão de seqüência codificadora ligadaoperativamente em organismo hospedeiro específico. As seqüências decontrole que são apropriadas para procariotes, por exemplo, incluem promotor,opcionalmente seqüência de operadores, e sítio de ligação de ribossomos. Ascélulas eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais depoliadenilação e amplificadores.
Ácido nucléico é "ligado operativamente" quando é colocado emrelação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. DNA para seqüênciaprévia ou líder de secreção, por exemplo, é ligado operativamente a DNA parapolipeptídeo caso seja expresso na forma de proteína prévia que participa dasecreção do polipeptídeo; promotor ou amplificador é ligado operativamente aseqüência codificadora caso afete a transcrição da seqüência; ou sítio deligação de ribossomos é ligado operativamente a seqüência codificadora casoseja posicionado de forma a possibilitar a tradução. Geralmente, "ligadooperativamente" indica que as seqüências de DNA que são ligadas sãocontíguas e, no caso de líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. Osaprimoradores, entretanto, não necessitam ser contíguos. A ligação é obtidapor meio de ligação em sítios de restrição convenientes. Caso estes sítios nãoexistam, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Iigantes sãoutilizados de acordo com a prática convencional.
A "estringência" das reações de hibridização pode ser facilmentedeterminada pelos técnicos no assunto e geralmente é cálculo empíricodependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem econcentração de sal. De forma geral, sondas mais compridas necessitam detemperaturas mais altas para combinação apropriada, enquanto sondas maiscurtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridização geralmentedepende da capacidade de recombinação de DNA desnaturado quandolinhagens complementares estiverem presentes em ambiente abaixo da suatemperatura de fusão. Quanto mais alto o grau de homologia desejado entre asonda e a seqüência hibridizável, mais alta a temperatura correspondente quepode ser utilizada. Como resultado, segue-se que temperaturascorrespondentes mais altas tenderiam a tornar as condições de reação maisestringentes, enquanto temperaturas mais baixas o fazem em menorproporção. Para detalhes adicionais e explicações sobre a estringência dasreações de hibridização, vide Ausubel et al, Current Protocols in MolecularBiology, Wiley Interscience Publishers (1995).
"Condições estringentes" ou "condições de alta estringência", daforma definida na presente invenção, podem ser identificadas por aquelas que:(1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavagem, talcomo 0,015 M cloreto de sódio/0,0015 M citrato de sódio/0,1% dodecil sulfatode sódio a 50 °C; (2) empregam durante a hibridização agente desnaturante, talcomo formamida, por exemplo 50% (v/v) formamida com albumina de sorobovino a 0,1%/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato desódio sob pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a42 °C; ou (3) hibridização por uma noite em solução que emprega 50%formamida, 5 χ SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM defosfato de sódio (pH 6.8), 0,1% pirofosfato de sódio, 5 χ solução de Denhardt,DNA de esperma de salmão sonicado (50 μg/ml), 0,1% SDS e 10% sulfato dedextran a 42 °C, com lavagem por dez minutos a 42 °C em 0,2 χ SSC (cloretode sódio/citrato de sódio), seguidos por lavagem em alta estringência por dezminutos que consiste de 0,1 χ SSC contendo EDTA a 55 °C.
"Condições moderadamente estringentes" podem ser identificadasconforme descrito por Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solução delavagem e condições de hibridização (tais como temperatura, resistência iônicae % SDS) menos estringentes que as descritas acima. Um exemplo decondições moderadamente estringentes é a incubação por uma noite a 37 °Cem solução que compreende: 20% formamida, 5 χ SSC (150 mM de NaCl, 15mM de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 χ solução deDernhardt, 10% sulfato de dextran e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmãodividido desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1 χ SSC a cerca de37-50 °C. Os técnicos no assunto reconhecerão como ajustar a temperatura,resistência iônica etc. conforme o necessário para acomodar fatores tais comocomprimento de sonda e similares.
A expressão "epítopo marcado" utilizada na presente invençãodesigna polipeptídeo quimérico que compreende polipeptídeo TAT ou anticorpoanti-TAT fundido a "polipeptídeo marcador". O polipeptídeo marcador contémresíduos suficientes para fornecer epítopo contra o qual pode ser fabricadoanticorpo, mas ainda é suficientemente curto para não interferir com a atividadedo polipeptídeo ao qual é fundido. O polipeptídeo marcador também é, depreferência, razoavelmente exclusivo, de forma que o anticorpo não apresentereação cruzada substancial com outros epítopos. Os polipeptídeos marcadoresapropriados contêm pelo menos seis resíduos de aminoácidos e, normalmente,cerca de oito a cinqüenta resíduos de aminoácidos (preferencialmente, cercade dez a vinte resíduos de aminoácidos).
"Ativo" ou "atividade" para os propósitos do presente indicaforma(s) de polipeptídeo TAT que retém(êm) atividade biológica e/ouimunológica de TAT nativo ou de ocorrência natural, em que atividade"biológica" indica função biológica (seja inibidora ou estimulante) causada porTAT nativo ou de ocorrência natural diferente da capacidade de induzir aprodução de anticorpo contra epítopo antigênico possuído por TAT nativo ou deocorrência natural e atividade "imunológica" designa a capacidade de induçãoda produção de anticorpo contra epítopo antigênico possuído por TAT nativo oude ocorrência natural.
O termo "antagonista" é utilizado no sentido mais amplo e incluiqualquer molécula que bloqueie, iniba ou neutralize, total ou parcialmente, aatividade biológica de polipeptídeo TAT nativo descrito na presente invenção.De forma similar, o termo "agonista" é utilizado no sentido mais amplo e incluiqualquer molécula que imite atividade biológica de polipeptídeo TAT nativodescrito na presente invenção. Moléculas agonistas ou antagonistasapropriadas incluem especificamente anticorpos agonistas ou antagonistas oufragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de seqüências deaminoácidos de polipeptídeos TAT nativos, peptídeos, oligonucleotídeosantisense, moléculas orgânicas pequenas etc. Métodos de identificação deagonistas ou antagonistas de polipeptídeo TAT podem compreender o contatode polipeptídeo TAT com possível molécula agonista ou antagonista e mediçãode mudança detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmenteassociadas ao polipeptídeo TAT.
"Tratar", "tratamento" ou "melhoria" designa o tratamento terapêutico emedidas profiláticas ou preventivas, em que o objeto é o de evitar ou reduzir avelocidade (diminuir) da condição ou disfunção patológica desejada. Osnecessitados de tratamento incluem os que já possuem a disfunção, bem como ospropensos a ter a disfunção ou aqueles em que a disfunção deva ser evitada.Paciente ou mamífero é "tratado" com sucesso de câncer que expressepolipeptídeo TAT se, após receber quantidade terapêutica de anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica de ligação de TAT segundoos métodos de acordo com a presente invenção, o paciente observar reduçãoobservável e/ou mensurável ou ausência de um ou mais dos seguintes: redução daquantidade de células cancerosas ou ausência das células cancerosas, redução dotamanho do tumor, inibição (ou seja, redução da velocidade até certo ponto e,preferencialmente, suspensão) da infiltração de células cancerosas em órgãosperiféricos, incluindo a difusão de câncer em tecido mole e ossos; inibição (ou seja,redução até certo ponto e, preferencialmente, suspensão) da metástase tumorosa;inibição, até certo ponto, do crescimento de tumores; e/ou melhoria, até certo ponto,de um ou mais dos sintomas associados ao câncer específico, redução da morbideze mortalidade e melhoria de questões de qualidade de vida. Desde que possa evitaro crescimento de células cancerosas existentes e/ou matá-las, o anticorpo anti-TATou oiigopeptídeo de ligação de TAT pode ser citostático e/ou citotóxico. A reduçãodesses sinais ou sintomas pode também ser sentida pelo paciente.
Os parâmetros acima para a determinação do tratamento bemsucedido e melhoria da doença são facilmente mensuráveis por meio deprocedimentos rotineiros familiares dos médicos. Para a terapia de câncer,pode-se medir a eficácia determinando-se, por exemplo, o tempo para oprogresso da doença (TTP) e/ou determinando-se a velocidade de reação(RR). Pode-se determinar a metástase por meio de testes de estágio, varredurade ossos e testes para a determinação do nível de cálcio e outras enzimas paradeterminar a difusão para os ossos. Podem também ser realizados varreduraCT para verificar a difusão para a pélvis e nódulos linfáticos na área. Raios Xdo tórax e medição dos níveis de enzimas no fígado por meio de métodosconhecidos são utilizados para determinar metástase para os pulmões efígado, respectivamente. Outros métodos rotineiros de monitoramento dadoença incluem ultrassonografia transretal (TRUS) e biópsia por agulhastransretais (TRNB).
Administração "crônica" indica a administração do(s) agente(s) emmodo contínuo, ao contrário de modo agudo, de forma a manter o efeitoterapêutico inicial (atividade) por maior período de tempo. Administração"intermitente" é o tratamento que não é efetuado consecutivamente seminterrupção, mas sim de natureza cíclica.
"Mamífero", para os propósitos de tratamento, redução dossintomas ou de diagnóstico de câncer, designa qualquer animal classificadocomo mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda,bem como animais domésticos, de esportes ou zoológico, tais como cães,gatos, bois, cavalos, carneiros, porcos, cabras, coelhos etc. Preferencialmente,o mamífero é um ser humano.
A administração "em combinação com" um ou mais agentesterapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) econsecutiva em qualquer ordem.
"Veículos", da forma utilizada na presente invenção, incluemveículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que sãoatóxicos para a célula ou mamífero a eles sendo expostos nas dosagens econcentrações empregadas. Freqüentemente, o veículo fisiologicamenteaceitável é solução tamponada com pH aquoso. Exemplos de veículosfisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outrosácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo debaixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais comoalbumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, taiscomo polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina,asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outroscarboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, taiscomo EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra-íonsformadores de sais, tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos, tais comoTWEEN®, polietileno glicol (PEG) e PLURONICS®.
Por "fase sólida" ou "suporte sólido", indica-se matriz não aquosaà qual anticorpo, oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica deligação de TAT de acordo com a presente invenção pode aderir-se ou fixar-se.Exemplos de fases sólidas englobadas na presente invenção incluem asformadas total ou parcialmente de vidro (tal como vidro de poros controlados),polissacarídeos (tais como agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcoolpolivinílico e silicones. Em certas realizações, dependendo do contexto, a fasesólida pode compreender a cavidade de placa de teste; em outras, é coluna depurificação (tal como coluna de cromatografia de afinidade). Esta expressãotambém inclui fase sólida descontínua de partículas discretas, tais como asdescritas na Patente US 4.275.149."Lipossomo" é pequena bolha composta de diversos tipos delipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útil para o fornecimento de fármacos(tais como polipeptídeo TAT1 seu anticorpo ou oligopeptídeo de ligação deTAT) a mamíferos. Os componentes do lipossomo são normalmente dispostosem formação bicamadas, similar à disposição de lipídios de membranasbiológicas.
Molécula "pequena" ou molécula orgânica "pequena" é definida napresente invenção como tendo peso molecular de menos de cerca de 500Daltons.
"Quantidade eficaz" de polipeptídeo, anticorpo, oligopeptídeo deligação de TAT1 molécula orgânica de ligação de TAT ou seu agonista ouantagonista, da forma descrita na presente invenção, é quantidade suficiente paraconduzir propósito especificamente indicado. "Quantidade eficaz" pode serdeterminada empiricamente e de maneira rotineira, com relação ao propósitoindicado.
A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" designa aquantidade de anticorpo, polipeptídeo, polipeptídeo de ligação de TAT1molécula orgânica de ligação de TAT ou outro fármaco eficaz para o"tratamento" de doença ou disfunção em paciente ou mamífero. No caso decâncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir onúmero de células cancerosas, reduzir o tamanho do tumor, inibir (ou seja,reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, suspender) ainfiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduziraté certo ponto e, preferencialmente, suspender) a metástase tumorosa; inibir,até certo ponto, o crescimento de tumores; e/ou melhorar, até certo ponto, umou mais dos sintomas associados ao câncer. Vide a definição de "tratamento"na presente invenção. Desde que possa evitar o crescimento de célulascancerosas existentes e/ou matá-las, o fármaco pode ser citostática e/oucitotóxica.
"Quantidade inibidora do crescimento" de anticorpo anti-TAT,polipeptídeo TAT1 oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica deligação de TAT é quantidade capaz de inibir o crescimento de células,especialmente tumorosas, tais como células de câncer, in vitro ou in vivo."Quantidade inibidora do crescimento" de anticorpo anti-TAT, polipeptídeo TAT1oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica de ligação de TAT paraos propósitos de inibição do crescimento de células neoplásicas pode serdeterminada empiricamente e de forma rotineira.
"Quantidade citotóxica" de anticorpo anti-TAT, polipeptídeo TAT,oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica de ligação de TAT équantidade capaz de causar a destruição de células, especialmente tumorosas,tais como células de câncer, in vitro ou in vivo. "Quantidade citotóxica" deanticorpo anti-TAT, polipeptídeo TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT oumolécula orgânica de ligação de TAT para os propósitos de inibição docrescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e deforma rotineira.
O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobreespecificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-TAT isolados(incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e neutralizantes), composições deanticorpos anti-TAT com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais,anticorpos anti-TAT de fita simples e fragmentos de anticorpos anti-TAT (videabaixo), desde que exibam a atividade biológica ou imunológica desejada. Otermo "imunoglobulina" (Ig) é utilizado de forma intercambiável com anticorpona presente invenção.
"Anticorpo isolado" é aquele que tenha sido identificado, separadoe/ou recuperado a partir de componente do seu ambiente natural. Oscomponentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais queinterfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo epodem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) atémais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado por meio do métodoLowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficientepara a obtenção de pelo menos quinze resíduos de seqüência de aminoácidosinterna ou N-terminal, utilizando seqüenciador de xícaras de centrifugação(spinning cup sequenator)\ ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul deCoomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. Anticorpo isolado inclui oanticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos umcomponente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente.Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por meio de pelomenos uma etapa de purificação.
A unidade básica de anticorpo de quatro cadeias é glicoproteínaheterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeiaspesadas (H) idênticas (um anticorpo de IgM consiste de cinco das unidadesheterotetraméricas básicas, juntamente com um polipeptídeo adicionaldenominado cadeia J, contendo, portanto, dez sítios de ligação de antígenos,enquanto os anticorpos de IgA secretados podem polimerizar-se para formarconjuntos polivalentes que compreendem de duas a cinco das unidadesbásicas de quatro cadeias juntamente com a cadeia J). No caso de IgGs1 aunidade de quatro cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cadacadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente,enquanto as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais ligações dedissulfeto, dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia HeL tambémcontém pontes de dissulfeto intracadeias em espaços regulares. Cada cadeia Hcontém, no terminal N, um domínio variável (Vh) seguido por três domíniosconstantes (Cr) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios Ch para osisotipos μ e ε. Cada cadeia L contém, no terminal N1 um domínio variável (Vl)seguido por domínio constante (Cl) na sua outra extremidade. O Vl é alinhadoao Vh e o Cl é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada (Ch1).Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem superfícieintermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. Opareamento de Vh e Vl entre si forma um único sítio de ligação de antígenos.Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, porexemplo, Basic and Clinicai Immunology, oitava edição, Daniel P. Stites, AbbaI. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk CT, 1994, pág.71 e Capítulo 6.
A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode serclassificada em um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappae lambda, com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domíniosconstantes. Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constantedas suas cadeias pesadas (Ch), as imunoglobulinas podem ser atribuídas adiferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA,IgD, IgE, IgG e IgM1 que contêm cadeias pesadas denominadas α, δ, ε, γ, e μ,respectivamente. As classes γ and α são adicionalmente divididas emsubclasses com base em diferenças relativamente menores de função eseqüência Ch; seres humanos, por exemplo, expressam as subclasses aseguir: IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2.
O termo "variável" designa o fato de que certos segmentos dosdomínios variáveis diferem extensamente de seqüência entre os anticorpos. Odomínio V media a ligação de antígenos e define a especificidade de anticorpoespecífico para o seu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade não édistribuída regularmente ao longo da série de 110 aminoácidos dos domíniosvariáveis. Ao contrário, as regiões V consistem de estiramentos relativamenteinvariáveis denominados regiões de estrutura (FRs) de quinze a trintaaminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade,denominadas "regiões hipervariáveis" que contêm de nove a doze aminoácidosde comprimento cada uma. Os domínios variáveis de cadeias leve e pesadanativas compreendem quatro FRs cada um, adotando em grande parteconfiguração de folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, queformam laços que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura defolha β. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boaproximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia,contribuem para a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos(vide Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quintaedição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD(1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligaçãode anticorpo a antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como aparticipação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos(ADCC).
A expressão "anticorpo monoclonal", da forma utilizada napresente invenção, designa anticorpo obtido a partir de população deanticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuaisque compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutaçõesde ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Osanticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos para umúnico sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpospoliclonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentesdeterminantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado a um únicodeterminante sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorposmonoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados de forma nãocontaminada por outros anticorpos. O adjetivo "monoclonal" não deve serconsiderado exigindo a produção do anticorpo por meio de qualquer métodoespecífico. Os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem serpreparados, por exemplo, por meio da metodologia de hibridoma descrita emprimeiro lugar por Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), ou pode ser fabricadautilizando métodos de DNA recombinante em células vegetais, animais,eucarióticas ou bacterianas (vide, por exemplo, a Patente US 4.816.567). Os"anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas deanticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas, por exemplo, emClackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. Moi Biol., 222:581-597 (1991).
Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamenteanticorpos "quiméricos" (imunoglobuíinas), em que uma parte da cadeia levee/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes emanticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classeou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) éidêntico ou homólogo a seqüências correspondentes de anticorpos derivadosde outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos,bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividadebiológica desejada (vide Patente US 4.816.567; e Morrison et al, Proc. NatiAcad. Sei. U. S. A., 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos deinteresse na presente invenção incluem anticorpos "primatizados", quecompreendem seqüências de ligação de antígenos de domínio variávelderivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo,Chimpanzé etc.) e seqüências de regiões constantes humanas.
Anticorpo "intacto" é aquele que compreende um sítio de ligaçãode antígenos, bem como um CL e pelo menos domínios constantes de cadeiapesada, Ch1, Ch2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domíniosconstantes de seqüência nativa (por exemplo, domínios constantes deseqüências nativas humanas) ou suas variantes de seqüências deaminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo intacto possui uma ou maisfunções efetoras.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma parte de anticorpointacto, preferencialmente a região variável ou de ligação de antígenos doanticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentosde Fab1 Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos, anticorpos lineares (vide Patente US5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al, Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995));moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multiespecíficosformados a partir de fragmentos de anticorpos.
A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentosidênticos de ligação de antígenos, denominados fragmentos "Fab", e umfragmento "Fc" residual, cuja designação reflete a capacidade de cristalizaçãorápida. O fragmento de Fab consiste de uma cadeia L inteira, juntamente com odomínio de região variável da cadeia H (Vr)1 e o primeiro domínio constante deuma cadeia pesada (Ch1)· Cada fragmento de Fab é monovalente com relaçãoà ligação de antígenos, ou seja, contém um único sítio de ligação de antígenos.O tratamento com pepsina de um anticorpo gera um único fragmento F(ab')2grande, que corresponde aproximadamente a dois fragmentos de Fab ligadospor dissulfeto que possuem atividade de ligação de antígenos bivalentes eainda são capazes de reticular antígenos. Os fragmentos de Fab' diferem dosfragmentos de Fab por conterem alguns resíduos adicionais no terminal carbóxido domínio Ch1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação doanticorpo. Fab'-SH é a designação do presente para Fab' em que o(s)resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes apresenta(m) um grupo tiollivre. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos naforma de pares de fragmentos de Fab' que contêm cisteínas de articulaçãoentre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpostambém são conhecidos.
O fragmento de Fc compreende as partes carbóxi-terminais dasduas cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras deanticorpos são determinadas por seqüências na região Fc1 que também é aparte reconhecida por receptores de Fc (FcR) encontrados em certos tipos decélulas.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio dereconhecimento e de ligação de antígenos completo. Esse fragmento consistede um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e de cadeiapesada em associação firme e não covalente. Da dobra desses dois domínios,emanam seis laços hipervariáveis (três laços da cadeia HeL cada) quecontribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação de antígenos econferem especificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto,mesmo um domínio variável isolado (ou metade de um Fv que compreendeapenas três CDRs específicos para um antígeno) possui a capacidade dereconhecer e ligar antígeno, embora em afinidade menor que todo o sítio deligação.
"Fv de cadeia isolada", também abreviado como "sFv" ou "scFv",são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpos Vhe Vl conectados a uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, opolipeptídeo de sFv compreende adicionalmente uma ligação de polipeptídeoentre os domínios Vh e VL, o que permite que o sFv forme a estrutura desejadapara ligação de antígenos. Para análise de sFv, vide Pluckthun, ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, abaixo.
O termo "diacorpos" designa fragmentos de anticorpos pequenospreparados por meio da construção de fragmentos de sFv (vide parágrafoanterior) com ligações curtas (cerca de cinco a dez resíduos) entre os domíniosVh e VL, de forma a atingir-se o pareamento intercadeias mas não intracadeiasdos domínios V, resultando em fragmento bivalente, ou seja, fragmentocontendo dois sítios de ligação de antígenos. Os diacorpos biespecíficos sãoheterodímeros de dois fragmentos de sFv "cruzados", em que os domínios Vh eVl dos dois anticorpos estão presentes sobre diferentes cadeias depolipeptídeos. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo,em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A,90: 6444-6448 (1993).
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (porexemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüênciamínima derivada do anticorpo não humano. Em sua maioria, os anticorposhumanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), em queresíduos de região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos deregião hipervariável de espécie não humana (anticorpo doador), tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano que apresente acapacidade, afinidade e especificidade de anticorpo desejada. Em algunscasos, os resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana sãosubstituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, osanticorpos humanizados podem compreender resíduos que não sãoencontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essasmodificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo.Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todosdentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ousubstancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos deimunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são asde seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado tambémcompreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de região constante deimunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Para detalhesadicionais, vide Jones et aí, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et aí,Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
"Anticorpo dependente de espécie", tal como anticorpo anti-IgEhumano de mamífero, é anticorpo que possui afinidade de ligação mais fortepara antígeno de primeira espécie de mamífero que para homólogo daqueleantígeno de segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpodependente de espécie "liga-se especificamente" a um antígeno humano (ouseja, possui valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais de cerca de 1 χ 10"7Μ, preferencialmente não mais de cerca de 1 χ 10"8 e, de maior preferência,não mais de cerca de 1 χ 10"9 Μ), mas possui afinidade de ligação parahomólogo do antígeno de segunda espécie de mamífero não humano que épelo menos cerca de cinqüenta vezes, pelo menos cerca de quinhentas vezesou pelo menos cerca de mil vezes mais fraca que a sua afinidade de ligaçãopara o antígeno humano. O anticorpo dependente de espécie pode ser dequalquer um dos diversos tipos de anticorpos definidos acima, mas épreferencialmente anticorpo humano ou humanizado.
A expressão "numeração de resíduos de domínio variável comoem Kabat" ou "numeração de posição de aminoácidos como em Kabat" e suasvariações designa o sistema de numeração utilizado para domínios variáveisde cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação deanticorpos em Kabat et aí, Sequences of Proteins of Immunological Interest,quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD(1991). Utilizando este sistema de numeração, a seqüência de aminoácidoslinear real pode conter menos aminoácidos ou adicionais correspondentes àredução ou inserção em FR ou CDR do domínio variável. Domínio variável decadeia pesada pode incluir, por exemplo, um único inserto de aminoácido(resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduosinseridos (tais como resíduos 82a, 82b, 82c etc. de acordo com Kabat) após oresíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração de resíduos de Kabat podeser determinada para um dado anticorpo por meio de alinhamento em regiõesde homologia da seqüência do anticorpo com seqüência numerada de Kabat"padrão".
A expressão "substancialmente similar" ou "substancialmenteidêntico", da forma utilizada na presente invenção, indica grau suficientementealto de similaridade entre dois valores numéricos (geralmente um associado aanticorpo de acordo com a presente invenção e o outro associado a anticorpode referência/comparativo), de tal forma que os técnicos no assuntoconsiderariam a diferença entre os dois valores como sendo de pouco ounenhum significado biológico e/ou estatístico dentro do contexto dacaracterística biológica medida pelos mencionados valores (tais como valoresKd). A diferença entre os mencionados dois valores é preferencialmente demenos de cerca de 50%, preferencialmente menos de cerca de 40%,preferencialmente menos de cerca de 30%, preferencialmente menos de cercade 20%, preferencialmente menos de cerca de 10% em função do valor para oanticorpo comparativo/de referência.
"Afinidade de ligação" geralmente designa a resistência da somatotal de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de molécula(tal como anticorpo) e seu parceiro de ligação (tal como antígeno). A menosque indicado em contrário, da forma utilizada na presente invenção, "afinidadede ligação" designa afinidade de ligação intrínseca que reflete interação 1:1entre membros de par de ligações (tais como anticorpo e antígeno). A afinidadede uma molécula X pelo seu parceiro Y pode geralmente ser representada pelaconstante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por meio demétodos comuns na técnica, que incluem os descritos na presente invenção.Anticorpos de baixa afinidade geralmente ligam antígeno lentamente e tendema dissociar-se rapidamente, enquanto anticorpos de alta afinidade geralmenteligam antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligados por maistempo. Uma série de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecidana técnica, qualquer um dos quais pode ser utilizado para os propósitos dapresente invenção. Realizações ilustrativas específicas são descritas a seguir.
Em uma realização, "Kd" ou "valor Kd" de acordo com a presenteinvenção é medido por meio de teste de ligação de antígenos radiomarcados(RIA) realizado com a versão Fab de anticorpo de interesse e o seu antígenoconforme descrito por meio do teste a seguir, que mede a afinidade de ligaçãode solução de Fabs para antígeno por meio de equilíbrio de Fab comconcentração mínima de antígeno marcado com 125I na presença de série detitulação de antígeno não marcado e captura em seguida de antígeno ligadocom placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen et a! (1999), J. MoL Biol.293: 865-881). Para estabelecer condições para o teste, placas de microtítulos(Dynex) são revestidas por uma noite com 5 μg/ml de anticorpo anti-Fab decaptura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e bloqueadasem seguida com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cincohoras à temperatura ambiente (cerca de 23 0C). Em placa não adsorvente(Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de [125l]-antígeno são misturados comdiluições em série de Fab de interesse (tal como consistente com adeterminação de anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et ai (1997), CâncerRes. 57: 4593-4599). O Fab de interesse é incubado em seguida por umanoite; entretanto, a incubação pode prosseguir por período mais longo (talcomo 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, asmisturas são transferidas para a placa de captura para incubação àtemperatura ambiente (tal como por uma hora). A solução é removida emseguida e a placa é lavada por oito vezes com 0,1% Tween 20 em PBS. Após asecagem das placas, adiciona-se 150 μΙ/cavidade de cintilante (MicroScint-20;Packard) e as placas são contadas em contador gama Topcount (Packard) pordez minutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de ligaçãomáxima são selecionadas para uso em testes de ligação competitiva. Deacordo com outra realização, o Kd ou valor Kd é medido utilizando testes deressonância plasmática de superfície utilizando BlAcore® 2000 ou BlAcore®3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de antígeno CM5imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascasde biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) são ativadascom cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor.Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cercade 0,2 μΜ) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingircerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeçãode antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos.Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sobvelocidade de fluxo de cerca de 25 μΙ/min. Taxas de associação (kon) e taxasde dissociação (k0ff) são calculadas utilizando modelo de ligação Langmuir uma um simples (Software de Avaliação BlAcore versão 3.2) por meio deconfiguração simultânea do sensograma de associação e dissociação. Aconstante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão Wkon-Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881. Caso ataxa de associação exceda 106 M"1 S1 por meio do teste de ressonânciaplasmática de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada emseguida utilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumentoou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm;emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM deanticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença deconcentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, talcomo espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ouespectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com cubetavermelha de agitação.
"Taxa de associação", "taxa ligado" ou "kon" de acordo com apresente invenção pode também ser determinada com o mesmo método deressonância plasmática de superfície descrito acima utilizando BlAcore® 2000ou BlAcore® 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 0C com lascas deantígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU).Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5,BlAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) deacordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM deacetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cerca de 0,2 μΜ) antes da injeção emvelocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir cerca de dez unidades deresposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção, 1 M de etanolamina éinjetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluiçõesseriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com0,05% Tween 20 (PBST) a 25 0C sob velocidade de fluxo de cerca de 25μΙ/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (k0ff) são calculadasutilizando modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software deAvaliação BlAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea dosensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação deequilíbrio (Kd) foi calculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen, Y.et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881. Caso a taxa de associação exceda 106M"1 S"1 por meio do teste de ressonância plasmática de superfície acima, a taxade associação é preferencialmente determinada em seguida utilizando métodode resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidadede emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm,passagem de faixa de 16 nm) a 25 0C de 20 nM de anticorpo anti-antígeno(forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes deantígeno conforme medido em espectrômetro, tal como espectrômetroequipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-Aminco série 800 (ThermoSpectronic) com cubeta agitada. "Kd" ou "valor Kd"de acordo com a presente invenção é medido em uma realização por meio deteste de ligação de antígenos radiomarcados (RIA) realizado com a versão Fabde anticorpo e molécula de antígeno, conforme descrito por meio do teste aseguir, que mede a afinidade de ligação de solução de Fabs para antígeno pormeio de equilíbrio de Fab com concentração mínima de antígeno marcado com125I na presença de série de titulação de antígeno não marcado e captura emseguida de antígeno ligado com placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chenet al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881). Para estabelecer condições para oteste, placas de microtítulos (Dynex) são revestidas por uma noite com 5 μg/mlde anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato desódio (pH 9,6) e bloqueadas em seguida com albumina de soro bovino a 2%(p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 0C).Em placa não adsorvente (Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de [125I]-antígeno são misturados com diluições em série de Fab de interesse(consistente com a determinação de anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta etal (1997), Câncer Res. 57: 4593-4599). O Fab de interesse é incubado emseguida por uma noite; entretanto, a incubação pode prosseguir por períodomais longo (tal como 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Emseguida, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação àtemperatura ambiente por uma hora. A solução é removida em seguida e aplaca é lavada por oito vezes com 0,1% Tween 20 em PBS. Após a secagemdas placas, adiciona-se 150 μΙ/cavidade de cintilante (MicroScint-20; Packard)e as placas são contadas em contador gama Topcount (Packard) por dezminutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de ligaçãomáxima são selecionadas para uso em testes de ligação competitiva. Deacordo com outra realização, o Kd ou valor Kd é medido utilizando testes deressonância plasmática de superfície empregando BlAcore® 2000 ou BlAcore®3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de antígeno CM5imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascasde biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) são ativadascom cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor.Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cercade 0,2 μΜ) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingircerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeçãode antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos.Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sobvelocidade de fluxo de cerca de 25 μΙ/min. Taxas de associação (kon) e taxasde dissociação (koff) são calculadas utilizando modelo de ligação Langmuir uma um simples (Software de Avaliação BlAcore versão 3.2) por meio deconfiguração simultânea do sensograma de associação e dissociação. Aconstante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão koff/kon·Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Bioi 293: 865-881. Caso ataxa de associação exceda 106 M1 S"1 por meio do teste de ressonânciaplasmática de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada emseguida utilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumentoou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm;emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM deanticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença deconcentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, talcomo espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ouespectrofotômetro SLM-Aminco série 800 (ThermoSpectronic) com cubetavermelha de agitação.
Em uma realização, "taxa de associação", "taxa ligado" ou "kon"de acordo com a presente invenção é determinada com o mesmo método deressonância plasmática de superfície descrito acima utilizando BlAcore® 2000ou BlAcore® 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 0C com lascas deantígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU).Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5,BlAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) deacordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM deacetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cerca de 0,2 μΜ) antes da injeção emvelocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir cerca de dez unidades deresposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, 1 M deetanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para mediçõescinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) sãoinjetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 0C sob velocidade defluxo de cerca de 25 μΙ/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (k0ff)são calculadas utilizando modelo de ligação Langmuir um a um simples (Softwarede Avaliação BlAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea dosensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio(Kd) foi calculada como razão IWkon- Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J.Mol. Biol. 293: 865-881. Caso a taxa de associação exceda 106 M1 S1 por meio doteste de ressonância plasmática de superfície acima, a taxa de associação épreferencialmente determinada em seguida utilizando método de resfriamentofluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão defluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16nm) a 25 °C de 20 nM de anticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS1 pH 7,2,na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido emespectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo de parada (AvivInstruments) ou espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic)com cubeta agitada.
A expressão "substancialmente reduzido" ou "substancialmentediferente", da forma utilizada na presente invenção, indica grau suficientementealto de diferença entre dois valores numéricos (geralmente um associado aanticorpo de acordo com a presente invenção e o outro associado a anticorpocomparativo/de referência), de tal forma que os técnicos no assuntoconsiderariam a diferença entre os dois valores como sendo de significaçãoestatística dentro do contexto da característica biológica medida pelosmencionados valores (tais como valores Kd e reação HAMA). A diferença entreos mencionados dois valores é preferencialmente de mais de cerca de 10%,preferencialmente mais de cerca de 20%, preferencialmente mais de cerca de30%, preferencialmente mais de cerca de 40%, preferencialmente mais decerca de 50% em função do valor para o anticorpo comparativo/de referência.
"Antígeno" é antígeno previamente determinado ao qual podeligar-se seletivamente um anticorpo. O antígeno alvo pode ser polipeptídeo,carboidrato, ácido nucléico, lipídio, hapteno ou outro composto sintético ou deocorrência natural. Preferencialmente, o antígeno alvo é polipeptídeo."Estrutura humana receptora" para os propósitos do presente é estrutura quecompreende a seqüência de aminoácidos de estrutura VL ou VH derivada deestrutura de imunoglobulina humana, ou de estrutura de consenso humana.Estrutura humana receptora "derivada de" estrutura de imunoglobulina humanaou estrutura de consenso humana pode compreender a sua mesma seqüênciade aminoácidos ou pode conter alterações de seqüência de aminoácidospreviamente existentes. Quando alterações de aminoácidos previamenteexistentes estiverem presentes, preferencialmente não mais de cinco epreferencialmente quatro ou menos, ou três ou menos alterações deaminoácidos previamente existentes estão presentes. Quando alterações deaminoácidos previamente existentes estiverem presentes em VH1 estasalterações encontram-se preferencialmente em apenas três, duas ou uma dasposições 71 Η, 73H e 78H; os resíduos de aminoácidos nestas posições podemser, por exemplo, 71A, 73T e/ou 78A. Em uma realização, a estrutura humanareceptora VL possui seqüência idêntica à seqüência de estrutura deimunoglobulina humana VL ou seqüência de estrutura de consenso humana.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem sercapazes de ligar-se ao mesmo epítopo que é ligado por segundo anticorpo. Osanticorpos monoclonais são considerados compartilhando o "mesmo epítopo"caso cada um bloqueie a ligação do outro em 40% ou mais na mesmaconcentração de anticorpo em análise de ligação de competição de anticorposin vivo padrão.
"Estrutura de consenso humana" é estrutura que representa oresíduo de aminoácido de ocorrência mais comum em seleção de seqüênciasde estrutura VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção deseqüências VL ou VH de imunoglobulina humana é de subgrupo de seqüênciasde domínio variável. Geralmente, o subgrupo de seqüências é subgrupo comoem Kabat et al. Em uma realização, para o VL, o subgrupo é subgrupo kappa Icomo em Kabat et al. Em uma realização, para o VH, o subgrupo é subgrupo Illcomo em Kabat et al.
"Estrutura de consenso de subgrupo Ill VH" compreende aseqüência de consenso obtida a partir das seqüências de aminoácidos emsubgrupo Ill variável pesado de Kabat etal.
"Estrutura de consenso de subgrupo I VL" compreende aseqüência de consenso obtida a partir das seqüências de aminoácidos emsubgrupo I kappa variável leve de Kabat et al.
"Estrutura humana não modificada" é estrutura humana quecontém a mesma seqüência de aminoácidos da estrutura humana receptora, talcomo que não contém substituição(ões) de aminoácido(s) humano(s) para nãohumano(s) na estrutura humana receptora.
"Região hipervariável alterada" para os propósitos do presente éregião hipervariável que compreende uma ou mais (tal como uma a cerca dedezesseis) substituições de aminoácidos no seu interior.
"Região hipervariável não modificada" para os propósitos dopresente é região hipervariável que contém a mesma seqüência deaminoácidos de anticorpo não humano do qual foi derivada, ou seja, que nãocontenha uma ou mais substituições de aminoácidos no seu interior.
A expressão "região hipervariável", "HVR" ou "HV", da formautilizada na presente invenção, indica as regiões de domínio variável deanticorpo que são de seqüência hipervariável e/ou formam circuitos definidosestruturalmente. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiõeshipervariáveis; três em VH (H1, H2 e H3) e três em VL (L1, L2, L3). Uma sériede delineações de regiões hipervariáveis encontra-se em uso e é englobada napresente invenção. As Regiões de Determinação de Complementaridade(CDRs) de Kabat baseiam-se na variabilidade de seqüências e são as maiscomumente utilizadas (Kabat et al, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda MD (1991)). Chothia refere-se, por sua vez, ao sítio dos circuitosestruturais (Chothia e Lesk1 J. Moi Bioi 196: 901-917 (1987)). As regiõeshipervariáveis de "contato" baseiam-se em análise das estruturas de cristaiscomplexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveissão indicados abaixo. A menos que indicado em contrário, será empregada anumeração de Kabat. Sítios de regiões hipervariáveis são geralmente osseguintes: aminoácidos 24-34 (HVR-L1), aminoácidos 49-56 (HVR-L2),aminoácidos 89-97 (HVR-L3), aminoácidos 26-35A (HVR-H1), aminoácidos 49-65 (HVR-H2) e aminoácidos 93-102 (HVR-H3).
As regiões hipervariáveis podem também compreender "regiõeshipervariáveis estendidas" conforme segue: aminoácidos 24-36 (L1) eaminoácidos 46-56 (L2) no VL. Os resíduos de domínios variáveis sãonumerados de acordo com Kabat et al, acima, para cada uma dessasdefinições.
Resíduos de "estrutura" ou "FR" são os resíduos de domíniosvariáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido napresente invenção.
"Anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência deaminoácidos que corresponde à de anticorpo produzido por ser humano e/oufoi fabricado utilizando qualquer uma das técnicas de fabricação de anticorposhumanos descritas na presente invenção. Esta definição de anticorpo humanoexclui especificamente anticorpo humanizado que compreende resíduos deligação de antígenos não humanos.
Anticorpo "amadurecido por afinidade" é aquele com uma ou maisalterações em uma ou mais de suas CDRs1 o que resulta em aumento daafinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com anticorpo parentalque não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorpos amadurecidos porafinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares parao antígeno alvo. Os anticorpos amadurecidos por afinidade são produzidos pormeio de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992) descrevem amadurecimento por afinidade por meio de troca dedomínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de cadeia principale/ou CDR é descrita por: Barbas et al, Proc. Nati Acad. Sci., U. S. A. 91: 3809-3813 (1994); Schier et al, Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al, J. Immunol.155: 1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); eHawkins et al, J. Moi Biol. 226: 889-896 (1992).
Anticorpo "bloqueador" ou anticorpo "antagonista" é aquele queinibe ou reduz a atividade biológica do antígeno que liga. Anticorpos debloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancial oucompletamente a atividade biológica do antígeno.
"Oligopeptídeo de ligação de TAT" é oligopeptídeo que se liga,preferencialmente de forma específica, a polipeptídeo TAT conforme descritona presente invenção. Oligopeptídeos de ligação de TAT podem sersintetizados quimicamente utilizando metodologia de síntese de oligopeptídeosconhecida ou podem ser preparados e purificados utilizando tecnologiarecombinante. Os oligopeptídeos de ligação de TAT normalmente possuempelo menos cerca de cinco aminoácidos de comprimento, alternativamente pelomenos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20; 21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 5, 6, 7, 8; 9, 10, 11, 12, 13, 14,47, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 55, 56, 57, 58, 59, 60; 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80; 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 aminoácidos de comprimentoou mais, em que esses oligopeptídeos são capazes de ligar-se,preferencialmente de forma específica, a polipeptídeo TAT conforme descritona presente invenção. Os oligopeptídeos de ligação de TAT podem seridentificados sem experimentação indevida, utilizando métodos bemconhecidos. Nesse aspecto, observa-se que os métodos de seleção debibliotecas de oligopeptídeos em busca de oligopeptídeos que sejam capazesde ligar-se especificamente a um polipeptídeo alvo são bem conhecidos natécnica (vide, por exemplo, Patentes US 5.556.762, US 5.750.373, US4.708.871, US 4.833.092, US 5.223.409, US 5.403.484, US 5.571.689 e US5.663.173; Patentes PCT n0 WO 84/03506 e WO 84/03564; Geysen et al, Proc.Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al, Proc. NatL Acad.Sei. U. S. A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al, Synthetic Peptides as Antigens1130-149 (1986); Geysen et al, J. ImmunoL Meth., 102: 259-274 (1987); Schoofset al, J. Immunol., 140: 611-616 (1988), Cwirla1 S. E. et al (1990), Proc. NatLAcad. Sei. U. S. A., 87: 6378; Lowman1 Η. B. et al (1991), Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et a/(1991), Nature, 352: 624; Marks1 J. D. et al (1991), J.Mol. Biol., 222: 581; Kang, A. S. et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 88:8363 e Smith1 G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2: 668).
"Molécula orgânica de ligação de TAT" é molécula orgânicadiferente de oligopeptídeo ou anticorpo conforme definido na presente invençãoque se Iiga1 preferencialmente de forma específica, a polipeptídeo TATconforme descrito na presente invenção. Moléculas orgânicas de ligação deTAT podem ser identificadas e sintetizadas quimicamente utilizandometodologia conhecida (vide, por exemplo, as Patentes PCT n0 WO 00/00823 eWO 00/39585). As moléculas orgânicas de ligação de TAT normalmentepossuem tamanho de menos de cerca de 2000 daltons, alternativamentetamanho de menos de cerca de 1500, 750, 500, 250 ou 200 daltons, em queessas moléculas orgânicas que são capazes de ligação, preferencialmente deforma específica, a polipeptídeo TAT conforme descrito na presente invençãopodem ser identificadas sem experimentação indevida utilizando métodos bemconhecidos. Nesse aspecto, observa-se que os métodos de seleção debibliotecas de moléculas orgânicas em busca de moléculas que sejam capazesde ligar-se a um polipeptídeo alvo são bem conhecidos na técnica (vide, porexemplo, Patentes PCT n0 WO 00/00823 e WO 00/39585).
Anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "que liga"antígeno de interesse, tal como antígeno alvo de polipeptídeo associado atumor, é aquele que liga o antígeno com afinidade suficiente para que oanticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica seja útil como agenteterapêutico e/ou de diagnóstico para dirigir célula ou tecido que expresse oantígeno e não apresente reação cruzada significativa com outras proteínas.Nessas realizações, a extensão da ligação do anticorpo, oligopeptídeo ou outramolécula orgânica a proteína "não alvo" será de menos de cerca de 10% daligação do anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica à sua proteínaalvo específica, conforme determinado por meio de análise de ordenamento decélulas ativadas por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA).Com relação à ligação de anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânicaa molécula alvo, a expressão "ligação específica", "liga-se especificamente a"ou "é específica para" polipeptídeo específico ou epítopo sobre polipeptídeoalvo específico indica ligação que é mensuravelmente diferente de interaçãonão específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por meioda determinação da ligação de molécula em comparação com a ligação demolécula controle, que geralmente é molécula com estrutura similar que nãopossui atividade de ligação. A ligação específica pode ser determinada, porexemplo, por meio de competição com molécula controle que é similar ao alvo,tal como excesso de alvo não marcado. Neste caso, indica-se ligaçãoespecífica caso a ligação do alvo marcado a uma sonda seja competitivamenteinibida por alvo não marcado em excesso. A expressão "ligação específica","liga-se especificamente a" ou "é específico para" polipeptídeo específico ouepítopo sobre polipeptídeo alvo específico, da forma utilizada na presenteinvenção, pode ser exibida, por exemplo, por molécula que possui Kd para oalvo de pelo menos cerca de 10"4 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"5M, alternativamente pelo menos cerca de 10"6 M, alternativamente pelo menoscerca de 10"7 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"8 M,alternativamente pelo menos cerca de 10"9 M, alternativamente pelo menoscerca de 10~10 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"11 M1alternativamente pelo menos cerca de 10"12 M ou mais. Em uma realização, aexpressão "ligação específica" indica ligação em que uma molécula liga-se apolipeptídeo específico ou epítopo sobre polipeptídeo específico sem ligaçãosubstancial a nenhum outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
Anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que "inibe ocrescimento de células tumorosas que expressam polipeptídeo TAT" ouanticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "inibidora do crescimento"é aquele que resulta na inibição mensurável do crescimento de célulascancerosas que expressem ou superexpressem o polipeptídeo TAT apropriado.O polipeptídeo TAT pode ser polipeptídeo de transmembrana expresso sobre asuperfície de célula cancerosa ou pode ser polipeptídeo que é produzido esecretado por célula cancerosa. Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos oumoléculas orgânicas inibidoras do crescimento preferidas inibem o crescimentode células tumorosas que expressam TAT em mais de 20%, preferencialmentecerca de 20% a cerca de 50% e, de preferência ainda maior, mais de 50% (porexemplo, cerca de 50% a cerca de 100%) em comparação com o controleapropriado, em que o controle é tipicamente de células tumorosas não tratadascom o anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica sendo testada. Emuma realização, a inibição do crescimento pode ser medida em concentraçãode anticorpos de cerca de 0,1 a 30 μg/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM emcultura celular, em que a inibição do crescimento é determinada em um a dezdias após a exposição das células tumorosas ao anticorpo. A inibição docrescimento de células tumorosas in vivo pode ser determinada de diversasformas, conforme descrito no capítulo de Exemplos Experimentais abaixo. Oanticorpo é inibidor do crescimento in vivo caso a administração do anticorpoanti-TAT a cerca de 1 μg/kg até cerca de 100 mg/kg de peso do corpo resultena redução do tamanho do tumor ou proliferação de células tumorosas em atécerca de cinco dias a três meses a partir da primeira administração doanticorpo, preferencialmente em até cerca de cinco a trinta dias.Anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que "induz aapoptose" é aquele que induz a morte celular programada, conformedeterminado por meio da ligação de anexina V, fragmentação de DNA1contração celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celulare/ou formação de bolhas de membrana (denominadas corpos apoptóticos). Acélula é normalmente aquela que superexpressa polipeptídeo TAT.Preferencialmente, a célula é célula tumorosa, tal como célula da próstata,mama, ovário, estômago, endométrio, pulmão, rim, cólon e bexiga. Diversosmétodos são disponíveis para avaliação dos eventos celulares associados àapoptose. A translocação de fosfatidil serina (PS), por exemplo, pode sermedida pela ligação de anexina; a fragmentação de DNA pode ser avaliada pormeio de escalas de DNA; e condensação nuclear/de cromatina juntamente comfragmentação de DNA pode ser avaliada por meio de qualquer aumento dascélulas hipodiplóides. Preferencialmente, o anticorpo, oligopeptídeo ou outramolécula orgânica que induz a apoptose é aquele que resulta em cerca deduas a 50 vezes, preferencialmente cerca de cinco a 50 vezes e, de maiorpreferência, cerca de dez a 50 vezes, a indução de ligação de anexina comrelação à célula não tratada em teste de ligação de anexina.
As "funções efetoras" de anticorpos designam as atividadesbiológicas atribuíveis à região Fc (região Fc de seqüência nativa ou região Fccom variação de seqüência de aminoácidos) de anticorpo e variam de acordocom o isotipo do anticorpo. Exemplos das funções efetoras de anticorposincluem: citotoxicidade dependente de complemento e ligação de C1q; ligaçãode receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos(ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular(tais como receptores de células B); e ativação de células B.
"Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos"ou "ADCC" indica forma de citotoxicidade na qual Ig secretado ligado areceptores Fc (FcRs) presentes sobre certas células citotóxicas (tais comocélulas Matadoras Naturais (NK)1 neutrófilos e macrófagos) permitem queessas células efetoras citotóxicas unam-se especificamente a uma célula alvoque contenha antígenos e subseqüentemente matem a célula desejada comcitotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamentenecessários para essa matança. As células primárias para a mediação deADCC1 células NK1 expressam unicamente FcyRIII, enquanto monócitosexpressam FcyRI1 FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre célulashematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para determinar a atividade de ADCCde molécula de interesse, pode ser realizado teste ADCC in vitro, tal como odescrito na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 ou 5.821.337. Célulasefetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sangüíneasperiféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ouadicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode serdeterminada in vivo, tal como em modelo animal como o descrito em Clynes etai, (U. S. A.) 95: 652-656 (1998).
"Receptor de Fe" ou "FcR" descreve receptor que se liga à regiãoFc de anticorpo. O FcR preferido é FcR humano de seqüência nativa. Alémdisso, FcR preferido é aquele que liga anticorpo IgG (receptor gama) e incluireceptores das subclasses FeyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicase, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores FeyRIIincluem FcyRIIA ("receptor de ativação") e FcyRIIB ("receptor de inibição"), quepossuem seqüências de aminoácidos similares que diferem principalmente nosseus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém motivode ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domíniocitoplasmático. O receptor de inibição FeyRIIB contém motivo de inibição combase em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático. (videanálise Μ. em Daeron1 Annu. Reν. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs sãoanalisados em Ravetch e Kinet1 Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capeiet al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a serem identificados no futuro,são englobados pelo termo "FcR" na presente invenção. O termo também incluio receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGsmaternos para o feto (Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al, J.Immunol. 24: 249 (1994)).
"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as célulasexpressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplosde leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononuclearessangüíneas periféricas (PBMC)1 células matadoras naturais (NK)1 monócitos,células T citotóxicas e neutrófilos; em que PBMCs e células NK são preferidas.As células efetoras podem ser isoladas a partir de fonte nativa, tal comosangue.
"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" designa aIise de célula alvo na presença de complemento. A ativação do processoclássico de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente dosistema de complemento (C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada) que sãoligados ao seu antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento,pode ser realizado teste de CDC1 conforme descrito, por exemplo, emGazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Os termos "câncer" e "canceroso" designam ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelocrescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas semlimitar-se a carcinoma, Iinfoma1 blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidadeslinfóides. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer decélulas escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais),câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de células pequenas, câncer dopulmão não de células pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinomaescamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncergástrico ou estomacal, incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático,glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer do fígado, câncer dabexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon,câncer retal, câncer colo-retal, carcinoma uterino ou endométrico, carcinomadas glândulas salivares, câncer renal ou dos rins, câncer da próstata, câncer davulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinomapeniano, melanoma, mieloma múltiplo e Iinfoma de células B, câncer docérebro, bem como da cabeça e do pescoço, e metástases associadas.
As expressões "disfunção proliferativa celular" e "disfunçãoproliferativa" designam disfunções que são associadas a algum grau deproliferação celular anormal. Em uma realização, a disfunção proliferativacelular é câncer.
"Tumor", da forma utilizada na presente invenção, indica todaproliferação e crescimento de células neoplásicas, seja maligna ou benigna, etodas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.
Anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que "induz amorte celular" é aquela que faz com que uma célula viável torne-se inviável. Acélula é aquela que expressa polipeptídeo TAT1 preferencialmente célula quesuperexpressa polipeptídeo TAT em comparação com célula normal do mesmotipo de tecido. O polipeptídeo TAT pode ser polipeptídeo de transmembranaexpresso sobre a superfície de célula cancerosa ou pode ser polipeptídeo queé produzido e secretado por célula cancerosa. Preferencialmente, a célula écélula cancerosa, tal como célula da mama, ovário, estômago, endométrio,glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireóide, pancreática ou da bexiga. A mortecelular in vitro pode ser determinada na ausência de células efetoras imunes ecomplementares para distinguir a morte celular induzida por citotoxicidademediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) ou citotoxicidadedependente de complemento (CDC). Desta forma, o teste de morte celularpode ser realizado utilizando soro desativado por calor (ou seja, na ausência decomplemento) e na ausência de células efetoras imunes. Para determinar se oanticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica é capaz de induzir a mortecelular, a perda da integridade da membrana conforme avaliado por meio daabsorção de iodeto de propídio (PI), azul de tripano (vide Moore et al,Cytotechnology 17: 1-11 (1995)) ou 7AAD pode ser avaliada com relação acélulas não tratadas. Os anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculasorgânicas indutoras da morte celular preferidas são as que induzem a absorçãode Pl no teste de absorção de Pl em células BT474.
"Células que expressam TAT" são células que expressampolipeptídeo TAT endógeno ou transfectado sobre a superfície celular ou emforma secretada. "Câncer que expressa TAT" é câncer que compreende célulasque contêm polipeptídeo TAT presente sobre a superfície celular ou queproduzem e secretam polipeptídeo TAT. "Câncer que expressa TAT" produzopcionalmente níveis suficientes de polipeptídeo TAT sobre a superfície dassuas células, de forma que anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou outra moléculaorgânica possa ligar-se a elas e apresentar efeito terapêutico com relação aocâncer. Em outra realização, "câncer que expressa TAT" opcionalmente produze secreta níveis suficientes de polipeptídeo TAT, de forma que anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou outro antagonista de molécula orgânica possa ligar-se aelas e apresentar efeito terapêutico com relação ao câncer. Com relação a esteúltimo, o antagonista pode ser oligonucleotídeo antisense que reduz, inibe ouevita a produção e secreção do polipeptídeo TAT secretado por célulastumorosas. Câncer que "superexpressa" polipeptídeo TAT é aquele queapresenta níveis significativamente mais altos de polipeptídeo TAT na suasuperfície celular, ou o produz e secreta, em comparação com célula nãocancerosa do mesmo tipo de tecido. Essa superexpressão pode ser causadapor amplificação genética ou por maior transcrição ou tradução. Asuperexpressão de polipeptídeo TAT pode ser determinada em teste dediagnóstico ou prognóstico por meio da avaliação dos níveis mais altos daproteína TAT presente sobre a superfície de uma célula ou por ela secretada(tal como por meio de teste de imunohistoquímica utilizando anticorpos anti-TAT preparados contra polipeptídeo TAT isolado que pode ser preparadoutilizando tecnologia de DNA recombinante de ácido nucléico isolado quecodifica o polipeptídeo TAT; análise FACS etc.). Alternativa, ou adicionalmente,pode-se medir os níveis de mRNA ou ácido nucléico codificador depolipeptídeo TAT na célula, por meio, por exemplo, de hibridização in situfluorescente utilizando sonda com base em ácido nucléico correspondente aácido nucléico que codifica TAT ou seu complemento (FISH; vide WO 98/45479publicada em outubro de 1998), Southern Blot1 Northern Blot ou técnicas dereação em cadeia de polimerase (PCR), tais como PCR quantitativa em temporeal (RT-PCR). Pode-se também estudar a superexpressão de polipeptídeoTAT, medindo-se o antígeno retirado em fluido biológico tal como soro,utilizando, por exemplo, testes com base em anticorpos (vide também, porexemplo, a Patente US 4.933.294 emitida em doze de junho de 1990; WO91/05264 publicada em 18 de abril de 1991; Patente US 5.401.638 emitida em28 de março de 1995; e Sias et al, J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)).Além dos testes acima, diversos outros testes in vivo são disponíveis para ostécnicos no assunto. Pode-se, por exemplo, expor as células no corpo dopaciente a anticorpo que seja opcionalmente marcado com marcadordetectável, tal como isótopo radioativo, e pode-se avaliar a ligação do anticorpoa células do paciente, por exemplo, por meio de varredura externo paraavaliação da radioatividade ou de análise de biópsia retirada de pacienteexposto anteriormente ao anticorpo.
Da forma utilizada na presente invenção, o termo "imunoadesina"designa moléculas similares a anticorpos que combinam a especificidade deligação de proteína heteróloga ("adesina") com as funções efetoras dedomínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinascompreendem fusão de seqüência de aminoácidos com a especificidade deligação desejada, que é diferente do sítio de ligação e reconhecimento deantígenos de anticorpo (ou seja, é "heteróloga") e seqüência de domínioconstante de imunoglobulina. A parte de adesina de molécula de imunoadesinaé tipicamente seqüência de aminoácidos contígua que compreende pelo menoso sítio de ligação de receptor ou ligante. A seqüência de domínio constante deimunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquerimunoglobulina, tal como os subtipos lgG-1, lgG-2, lgG-3 ou lgG-4, IgA(incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE1 IgD ou IgM.
A palavra "marcador", da forma utilizada na presente invenção,designa composto ou composição detectável que é conjugado direta ouindiretamente ao anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica, de formaa gerar anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "marcada". Omarcador pode ser detectável por si próprio (tais como marcadoresradioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de marcadoresenzimáticos, pode catalisar a alteração química de composto ou composiçãode substrato que seja detectável.
A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada na presenteinvenção, indica substância que inibe ou evita o funcionamento das célulase/ou causa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótoposradioativos (tais como 211At, 131I1 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P eisótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, suas enzimas efragmentos tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas tais comotoxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origembacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ouvariantes e os diversos agentes antitumores ou anticâncer descritos abaixo.Outros agentes citotóxicos são descritos abaixo. Agente tumoricida causa adestruição de células tumorosas.
"Agente quimioterapêutico" é composto químico útil no tratamentode câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentesalquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos dealquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais comobenzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas emetilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina,trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina;acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta- lapachona; lapachol;colchicinas; ácido betulínico; camptotecin (incluindo o análogo sintéticotopotecan (HYCAMTIN®*, CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetilcamptotecin, escopolectin e 9-aminocamptotecin); briostatina; calistatina;CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesin, carzelesin ebizelesin); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas(particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina(incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobin;pancratistatina; sarcodictiin; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais comoclorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida,mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembichin,fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosuréias taiscomo carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina eranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (por exemplo,caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicinaômega 11 (vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186(1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; esperamicina; bem comoneocarzinostatina cromoforo e cromoforos antibióticos de enediinacromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina,azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilin,cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicin,cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e desoxidoxorubicin),epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tais comomitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina,potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrin,estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos,tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, taiscomo denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina,tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos depirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina,dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais comocalusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano,testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano;reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona;aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina;bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona;elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucida; nitrato de gálio;hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina eansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina;pentostatina; fenamet; pirarubicin; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina;complexo de polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene OR);razoxano; rizoxin; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona;2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A,roridin A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®· FILDESIN®);dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina;arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, tais como paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton NJ), ABRAXANE® livre de Cremophor1formulação de nanopartículas de paclitaxel elaborada com albumina (AmericanPharmaceutical Partners1 Schaumberg1 Illinois) e doxetaxel TAXOTERE®(Rhône-Poulenc Rorer, Antony1 França); clorambucil; gemcitabina (GEMZAR®);6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais comocisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposida (VP-16);ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplarin; leucovovin;vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterin;ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina(DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); sais,ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima;bem como combinações de dois ou mais dos acima tais como CHOP,abreviação para terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicin, vincristina eprednisolona, e FOLFOX1 abreviação de regime de tratamento com oxaliplatin(ELOXATINTIM) combinada com 5-FU e leucovovin.
Também são incluídos nesta definição agentes anti-hormonaisque agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios quepodem promover o crescimento do câncer e apresentam-se freqüentemente naforma de tratamento sistêmico ou do corpo todo. Eles podem ser os próprioshormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos e moduladores de receptores deestrógenos seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifen (incluindotamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen,trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; anti-progesteronas; reguladores de receptores de estrógenos (ERDs); agentes quefuncionam para suprimir ou desconectar os ovários, tais como agonistas dehormônios Iiberadores de hormônios Iuteinizantes (LHRH) tais como acetato deleuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelin, acetato de buserelin etripterelin; outros anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; einibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção deestrógenos nas glândulas adrenais, tais como 4 (5)-imidazóis, aminoglutetimida,acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol,vorozol RIVISOR®, Ietrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX® Além disso, essadefinição de agentes quimioterapêuticos inclui bifosfonatos tais como clodronato(por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095,zoledronato/ácido zoledrônico ZOMETA®, alendronato FOSAMAZ®, pamidronatoAREDIA®, tiludronato SKELID® ou risedronato ACTONEL®; bem como troxacitabina(análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo cistosina); oligonucleotídeos antisense,particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em processos desinalização implicados em proliferação de células aberrantes, tais como PKC-alfa,Raf1 H-Ras e receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas taiscomo vacina THERATOPE® e vacinas de terapia genética, tais como vacinaALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor da topoisomerase 1LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (inibidor de moléculaspequenas tirosino quinase duplo EGFR e ErbB-2 também conhecido comoGW572016); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dequaisquer dos acima.
"Agente inibidor de crescimento", da forma utilizada na presenteinvenção, designa composto ou composição que inibe o crescimento de umacélula, especialmente célula cancerosa que expressa TAT, seja in vitro ou invivo. Desta forma, o agente inibidor do crescimento pode ser aquele que reduzsignificativamente o percentual de células que expressam TAT em fase S.Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes quebloqueiam o progresso do ciclo celular (em sítio diferente da fase S), tais comoagentes que induzem a suspensão de Gl e a suspensão da fase M.Bloqueadores clássicos de fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina),taxanos e inibidores da topoisomerase II, tais como doxorubicin, epirubicin,daunorubicin, etoposida e bleomicina. Os agentes que prendem G1 tambéminvadem a prisão da fase S1 por exemplo, agentes alquilantes de DNA1 taiscomo tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina,metotrexato, 5-fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podem serencontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds.,Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and AntineoplasticDrugs de Murakami et al (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág.13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anticancerígenos, ambosderivados da árvore de teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer),derivado do teixo europeu, é análogo semi-sintético de paclitaxel (TAXOL®,Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a reunião demicrotubos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam microtubos aoevitarem a despolimerização, o que resulta na inibição de mitose em células.
"Doxorubicin" é antibiótico de antraciclina. O nome químicocompleto de doxorubicin é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideóxi-a-L-lixo-hexapiranosil)óxi]-7,8,9,10-tetraidro-6,8,11 -tri-hidróxi-8-(hidroxiacetil)-1 -metóxi-5,12-naftacenodiona.
O termo "citoquina" é termo genérico para proteínas liberadas porpopulação celular que agem sobre outra célula como mediadoresintercelulares. Exemplos dessas citoquinas são linfoquinas, monoquinas ehormônios de polipeptídeos tradicionais. Encontram-se incluídos entre ascitoquinas hormônios do crescimento, tais como hormônio do crescimentohumano, hormônio do crescimento humano N-metionila e hormônio docrescimento bovino; hormônio paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina;relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteínas tais como hormônioestimulante dos folículos (FSH)1 hormônio estimulante da tireóide (TSH) ehormônio Iuteinizante (LH); fator do crescimento hepático; fator de crescimento dos fibroblastos; prolactina; lactogênio da placenta; fator de necrose tumorosaa e β; substância inibidora mulleriana; peptídeo associado a gonadotropina decamundongos; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular;integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento dos nervos tais comoNGF-β; fator de crescimento das plaquetas, fatores de crescimento detransformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento similar àinsulina I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferonas, taiscomo interferona-α, β e γ; fatores estimulantes de colônias (CSFs) tais comomacrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); egranulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; fator de necrose tumorosa talcomo TNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeos que incluem LIF eIigante de kits (KL). Da forma utilizada na presente invenção, o termo citoquinainclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante eequivalentes biologicamente ativos das citoquinas de seqüência nativa.
O termo "bula" é utilizado para indicar instruçõescostumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtosterapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem,administração, contra-indicações e/ou avisos com referência ao uso dessesprodutos terapêuticos.
Tabela 1
/*
*
* C-C increased from 12 to 15* Z is average of EQ
* B is average of ND
* match with stop is _M; stop-stop = 0; J (joker) match = 07
#define _M -8 Γ value of a match with a stop 7
int _day[26][26] = {
/*ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ*/
/* A 7 2, 0,-2, 0, 0,-4, 1,-1,-1,0,-1,-2,-1,0, _M, 1,0,-2, 1,1,0, 0,-6, 0,-3, 0},/* B 7 0, 3,-4, 3, 2,-5, 0, 1,-2,0, 0,-3,-2, 2,_ _M,-1,1,0, 0, 0, 0,-2,-5, 0,-3,1},/* C 7 -2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2, 0,-5,-6,-5,-4 ,_M,-3,-5,-4, 0,-2, 0,-2,-8, 0, 0,-5}/* D 7 0, 3,-5,4, 3,-6, 1, 1,-2, 0, 0,-4,-3, 2,_ _M,-1,2,-1,0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 2},/* E 7 0,2,-5, 3,4,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 1,_ _M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 3},/* F 7 -4,-5,-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1,0,-5, 2, 0,-4, _M,-5,-5,-4,-3,-3, 0,-1,0, 0, 7,-5},/* G 7 1,0,-3,1,0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, 0, _M,-1,-1,-3, 1,0, 0,-1,-7, 0,-5, 0},/* H 7 -1, 1,-3, 1, 1,-2,-2,6,-2,0, 0,-2,-2, 2, _M, 0, 3, 2,-1,-1,0,-2,-3, 0, 0, 2},/* I * / -1,-2,-2,-2,-2, 1,-3,-2, 5, 0,-2, 2, 2,-2, _M,-2,-2,-2,-1,0, 0,4,-5, 0,-1,-2},/* J 7 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_ M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0},/* K 7 -1,0,-5, 0, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1,_ _M,-1, 1, 3, 0, 0, 0,-2,-3, 0,-4, 0},/* L 7 -2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, 4,-3, _M,-3,-2,-3,-3,-1,0, 2,-2, 0,-1,-2},/* M 7 -1,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2,2,0, 0,4, 6,-2, _M,-2,-1,0,-2,-1,0, 2,-4, 0,-2,-1},/* N 7 0,2,-4, 2, 1,-4, 0,2,-2,0, 1,-3,-2, 2,_ M,-1,1,0, 1,0, 0,-2,-4, 0,-2,1},
/* O 7 {_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,0 ,_M ,_M ,_M ,_M ,_M ,_M ,_M ,_M ,_M ,_M ,_M},/* P 7 { 1,-1,-3,-1,-1,-5,-1, 0,-2, 0,-1,-3,-2,-1,_M, 6- 0, 0, 1, 0, 0,-1,-6, 0,-5, 0},/* Q 7 { 0, 1 ,-5, 2, 2,-5,-1, 3,-2, 0, 1 ,-2,-1, 1 ,_M, 0, 4, 1 ,-1 ,-1, 0,-2,-5, 0,-4, 3},/* R 7 {-2, 0,-4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, 0,_M, 0, 1, 6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, 0},r S 7 {1,0,0, 0, 0,-3, 1 ,-1 ,-1, 0, 0,-3,-2, 1 ,_M, 1 ,-1,0,2,1, 0,-1 ,-2, 0,-3, 0},/* T 7 { 1, 0,-2, 0, 0,-3, 0,-1, 0, 0, 0,-1 ,-1, 0,_Μ, 0,-1 ,-1,1, 3, 0, 0,-5, 0,-3, 0},
/* U 7 { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_Μ, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0},
/* V 7 { 0,-2,-2,-2,-2,-1 ,-1 ,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_Μ,-1 ,-2,-2,-1, 0, 0, 4,-6, 0,-2,-2},
/* W 7 {-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_Μ,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, 0, 0,-6},
/* X 7 { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_Μ, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0},
/* Y 7 {-3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1, 0,-4,-1,-2,-2,_Μ,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, 0, 0,10,-4},
/* Z 7 { 0, 1,-5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1,_Μ, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4}
#include <stdio.h>
#include <ctype.h>
#define MAXJMP 16 /* max jumps in a diag */
#define MAXGAP 24 /* don't continue to penalize gaps Iarger than this */
#define JMPS 1024 /* max jmps in an path */
#define MX 4 /* save if there's at Ieast MX-1 bases since Iast jmp */
#define DMAT 3 /* value of matching bases */
#define DMIS 0 /* penalty for mismatched bases */
#define DINS0 8 /* penalty for a gap */
#define DINS1 1 /* penalty per base */
#define PINS0 8 /* penalty per gap */
#define PINS1 4 /* penalty per residue */
struct jmp {
short n[MAXJMP]; /* size of jmp (neg for dely) */unsigned short x[MAXJMP]; Γ base no. of jmp in seq χ 7
};
struct diag {int score;
Iong offset;
short ijmp;
structjmp jp;
/* Iimits seq to 2Λ16-1 7
/* score at Iast jmp 7/* offset of prev block 7/* current jmp index 7/* Iist of jmps */
struct path {
int spc; /* number of Ieading spaces 7
short n[JMPS]; /* size of jmp (gap) */
int x[JMPS]; /* Ioc of jmp (last elem before gap) */};
char *ofile; /* output file name 7char *namex[2]; /* seq names: getseqs() 7char *prog; /* prog name for err msgs 7char *seqx[2]; /* seqs: getseqs() */int dmax; /* best diag: nwQ 7int dmaxO; /* final diag 7int dna; /* set if dna: main() 7int endgaps; /* set if penalizing end gaps 7int gapx, gapy; /* total gaps in seqs 7int IenO1 Ien1; Γ seq Iens 7int ngapx, ngapy; /* total size of gaps 7int smax; /* max score: nw() 7int *xbm; /* bitmap for matching 7long offset;
structdiag *dx;structpath pp[2];
/* current offset in jmp file *//* holds diagonais *//* holds path for seqs */
char *calloc(), *malloc(), *index(), *strcpy();
char *getseq(), *g_calloc();
/* Needleman-Wunsch alignment program
* usage: progs filei file2
* where filei and file2 are two dna or two protein sequences.
* The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity
* Any Iines beginning with ';'. or '<' are ignored
* Max file Iength is 65535 (limited by unsigned short χ in the jmp struct)
* A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
* Output is in the file "align.out"
* The program may create a tmp file in /tmp to hold info about traceback.
* Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650
#include "nw.h"#include "day.h"
static_dbval[26] = {
1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,025 };
static_pbval[26] = {
1, 2|(1«(,D,-,A,))|(1«(,N,-,A,))1 4, 8, 16, 32, 64,128, 256, OxFFFFFFF, 1«10, 1«11, 1«12, 1«13, 1«14,1«15, 1 <<16, 1 «17, 1 <<18, 1«19, 1«20, 1«21, 1«22,
1«23, 1«24, 1 «25|(1 «(Έ'-Ά'^ΚΙ «('Q'-'A'))};
main(ac, av) main
int ac;
char *av[];{
prog = av[0];if (ac != 3) {
fprintf(stderr,"usage: %s filei file2\n", prog);
fprintf(stderr,"where filei and file2 are two dna or two protein sequencesAn");fprintf(stderr,"The sequences can be in upper- or lower-case\n");fprintf(stderr,"Any Iines beginning with or '<' are ignored\n");fprintf(stderr,"Output is in the file V'align.out\"\n");
exit(1);>
namex[0] = av[1];namex[1] = av[2];
seqx[0] = getseq(namex[0], &len0);seqx[1] = getseq(namex[1], &len1);xbm = (dna)? dbval : pbval;
endgaps = 0; /* 1 to penalize endgaps 7ofile = "align.out"; /* output file 7
nw(); Γ fill in the matrix, get the possible jmps 7readjmps(); Γ get the actual jmps */print(); /* print stats, alignment */cleanup(O); /* unlink any tmp files */}
I* do the alignment, return best score: main()
* dna: values in Fitch and Smith1 PNAS1 80, 1382-1386, 1983
* pro: PAM 250 values
* When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer
* a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx* to a gap in seq y.
*/
nw() nw
{
char *px, *py; Γ seqs and ptrs 7
int *ndely, *dely;/* keep track of dely 7
int ndelx, delx; /* keep track of delx 7
int *tmp; /* for swapping rowO, rowl 7
int mis; /* score for each type 7
int insO, ins1; /* insertion penalties */register id; /* diagonal index 7
register ij; /*jmp index*/
register *col0, *col1; /* score for curr, Iast row */
register xx, yy; /* index into seqs */
dx = (struct diag *)g_calloc("to get diags", Ien0+len1+1, sizeof(struct diag));ndely = (int *)g_calloc("to get ndely", Ien1+1, sizeof(int));dely = (int *)g_calloc("to get dely", Ien1+1, sizeof(int));colO = (int *)g_calloc("to get colO", Ien1+1, sizeof(int));col1 = (int *)g_calloc("to get col1", Ien1+1, sizeof(int));
insO = (dna)? DINSO : PINSO;
ins1 = (dna)? DINS1 : PINS1;
smax = -10000;
if (endgaps) {
for (col0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= Ien1; yy++) {
colO[yy] = dely[yy] = col0[yy-1] - ins1;
ndelyfyy] = yy;
}
col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */
}
else
for (yy = 1; yy <= Ien 1; yy++)delyfyy] = -insO;/* fill in match matrixV
for (px = seqx[0], xx = 1; xx <= IenO; px++, xx++) {/* initialize first entry in col
Ί
if (endgaps) {
if (xx == 1)
col1[0] = delx = -(ins0+ins1);else
col1[0] = delx = col0[0] - ins1;
ndelx = xx;
}
else {
col1[0] = 0;delx = -ins0;ndelx = 0;
}
...nw
for (py = seqx[1], yy = 1; yy <= len1; py++, yy++) {mis = col0[yy-1];if (dna)
mis += (xbm[*px-'A']&xbm[*py-'A'])? DMAT : DMIS;
else
mis += _day[*px-'A'][*py-'A'];
/*update penalty for del in x seq;
* favor new del over ongong del
* ignore MAXGAP if weighting endgaps*/
if (endgaps || ndely[yy] < MAXGAP) {if (col0[yy] - insO >= delyfyy]) {
dely[yy] = colOfyy] - (ins0+ins1);ndely[yy] = 1; } else {
dely[yy] -= ins1;ndely[yy]++;
}
} else {
if (col0[yy] - (ins0+ins1) >= dely[yy]) {
dely[yy] = col0[yy] - (ins0+ins1);ndely[yy] = 1;
} elsendely[yy]++;
}
Γ update penalty for dei in y seq;
* favor new dei over ongong dei7
if (endgaps || ndelx < MAXGAP) {if (col1[yy-1] - insO >= delx) {
delx = col1[yy-1] - (ins0+ins1);ndelx = 1;
} else {
delx -= ins1;ndelx++;
}
} else {
if (col1[yy-1] - (ins0+ins1) >= delx) {
delx = col1[yy-1] - (ins0+ins1);ndelx = 1;
} else
ndelx++;
}
Γ pick the maximum score; we're favoring
* mis over any dei and delx over dely
7
...nw
id = xx - yy + Ienl -1;if (mis >= delx && mis >= delyfyy])col1[yy] = mis;else if (delx >= dely[yy]) {
col1[yy] = delx;ij = dx[id].ijmp;
if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) {dx[id].ijmp++;if (++ij >= MAXJMP) {writejmps(id);ij = dx[id].ijmp = 0;dx[id].offset = offset;
offset += sizeof(structjmp) + sizeof (offset);
}
}
dx[id].jp.n[ij] = ndelx;dx[id].jp.x[ij] = xx;dx[id].score = delx;
}
else {
col1[yy] = delyfyy];ij = dx[id].ijmp;if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndely[yy] >= MAXJMP
&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) {dx[id].ijmp++;if (++ij >= MAXJMP) {writejmps(id);ij = dx[id].ijmp = 0;dx[id]. offset = offset;
offset += sizeof(structjmp) + sizeof(offset)}
>
dx[id].jp.n[ij] = -ndelyfyy];dx[id].jp.x[ij] = xx;dx[id].score = dely[yy];
>
if (xx == IenO && yy < Ien 1) {/* Iast col
7
if (endgaps)
col1[yy] -= Íns0+ins1*(len1-yy);if (col 1 [yy] > smax) {
smax = col1[yy];dmax = id;
>
}
}
if (endgaps && xx < IenO)
col1[yy-1] -= insO+ins1*(lenO-xx);if (col1[yy-1] > smax) {smax = col1[yy-1];
dmax = id;}
tmp = colO; colO = coM; col1 = tmp;(void) free((char *)ndely);(void) free((char *)dely);(void) free((char *)colO);(void) free((char *)col1); }*
*
*print() - only routine visible outside this module
*
* static:
*getmat() -- trace back best path, count matches: print()
*pr_align() -- print alignment of described in array p[]: print()
*dumpblock() - dump a block of Iines with numbers, stars: pr_align()
*nums() - put out a number line: dumpblock()
* putline() - put out a Iine (name, [num], seq, [num]): dumpblock()
*stars() - -put a Iine of stars: dumpblock()
*stripname() - strip any path and prefix from a seqname
*/
#include "nw.h"
#define SPC 3
#define P_LINE 256 /* maximum output Iine 7
#define P SPC 3 Γ space between name or num and seq 7
extern _day[26][26];
ínt olen; /* set output Iine Iength */
FILE *fx; /* output file */
print()
{
int Ix1 Iy1 firstgap, lastgap; /* overlap */if ((fx = fopen(ofile, "w")) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: can't write %s\n", prog, ofile);cleanup(1);
}
fprintf(fx, "<first sequence: %s (length = %d)\n", namex[0], IenO);fprintf(fx, "<second sequence: %s (length = %d)\n", namex[1], Ien1)olen = 60;
Ix = IenO;
Iy = Ien1;
firstgap = Iastgap = 0;
if (dmax < Ien 1 -1) { Γ Ieading gap in χ 7
pp[0].spc = firstgap = Ienl - dmax -1;
Iy -= pp[0].spc;
}
else if (dmax > Ien 1 -1) { Γ Ieading gap in y 7
pp[1].spc = firstgap = dmax - (Ien1 -1);
Ix -= pp[1].spc;
}
if (dmaxO < IenO -1) { /* trailing gap in χ 7
Iastgap = IenO - dmaxO -1;
Ix -= lastgap;
}
else if (dmaxO > IenO -1) { Γ trailing gap in y 7
lastgap = dmaxO - (IenO - 1);
Iy -= lastgap;
}
getmat(lx, Iy1 firstgap, lastgap);
pr_align(); }/*
*trace back the best path, count matches
*/
static
getmat(lx, Iy1 firstgap, lastgap)int Ix1 ly;int firstgap, lastgap;
getmat
{
/* "core" (minus endgaps) *//* Ieading trailing overlap */
int nm, iO, i1, sizO, sizl;
char outx[32];
double pct;
register nO, n1;
registerchar *p0, *p1;/* get total matches, score*/
iO = i1 = sizO = sizl = 0;pO = seqx[0] + pp[1].spc;p1 = seqx[1] + pp[0].spc;nO = pp[1].spc + 1;n1 = pp[0].spc + 1;nm = 0;
while (*p0 && *p1 ) {if (sizO) {
p1++;n1++;sizO--;else if (sizl) {
pO++;nO++;sizl-;
}
else {
if (xbm[*pO-'A']&xbm[*p1 -Ά'])
nm++;if (no++ == pp[0].x[i0])
sizO = pp[0].n[i0++];if (n1++ == pp[1]-x[i1])
sizl = pp[1].n[i1++];
pO++;p1++;
}
}
/* pct homology:
* if penalizing endgaps, base is the shorter seq
* else, knock off overhangs and take shorter core7
if (endgaps)
Ix = (IenO < lenl)? IenO : Ien1;
else
Ix = (Ix < ly)? Ix : ly;pct = 100.*(double)nm/(double)lx;fprintf(fx, "\n");fprintf(fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n",nm, (nm == 1)? "": "es", Ix1 pct);
fprintf(fx, "<gaps in first sequence: %d", gapx); ...getmat
if (gapx) {
(void) sprintf(outx, " (%d %s%s)",
ngapx, (dna)? "base":"residue", (ngapx == 1)? "":"s");fprintf(fx,"%s", outx);fprintf(fx, ", gaps in second sequence: %d", gapy);
f (gapy) {
(void) sprintf(outx," (%d %s%s)",
ngapy, (dna)? "base":"residue", (ngapy == 1)? "":"s");fprintf(fx,"%s", outx);
}
if (dna)
fprintf(fx,
"\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d perbase)\n",
smax, DMAT1 DMIS1 DINSO1 DINS1);
else
fprintf(fx,
"\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d perresidue)\n",smax, PINSO, PINS1);if (endgaps)
fprintf(fx,
"<endgaps penalized. Ieft endgap: %d %s%s, right endgap: %d%s%s\n",firstgap, (dna)? "base": "residue", (firstgap == 1)? "": "s",lastgap, (dna)? "base": "residue", (lastgap == 1)? "": "s");
else
fprintf(fx, "<endgaps not penalized\n");
}
static nm; /* matches in core - for checking */
static Imax; /* lengths of stripped file names 7
static ij[2]; /* jmp index for a path 7
static nc[2]; /* number at start of current Iine 7
static ni[2]; /* current elem number - for gapping 7
static siz[2];
static char *ps[2]; /* ptr to current element 7static char *po[2]; /* ptr to next output char slot 7staticchar out[2][P_LINE]; /* output Iine */static char star[P_LINE]; /* set by stars() 7/*
* print alignment of described in struct path pp[]7
static
pr_align() pr_align
{
int nn; /* char count */
int more;
register i;
for (i = 0, Imax = 0; i < 2; i++) {nn = stripname(namex[i]);if (nn > Imax)Imax = nn;
nc[i] = 1;
ni[i] = 1;
siz[i] = ij[i] = 0;
ps[i] = seqx[i];
po[i] = out[i]; }
for (nn = nm = 0, more = 1; more;) { ...pr_alignfor (i = more = 0; i < 2; i++) {/*
* do we have more of this sequence?*/
if(!*ps[i])
continue;
more++;
if (pp[i].spc) { /* Ieading space */
*po[i]++ = '';
pp[i].spc~;
}
else if (siz[i]) { /* in a gap */
*po[i]++ = '-';siz[i]-;
}
else { /* we're putting a seq element
*/
*po[i] = *ps[i];
if (islower(*ps[i]))*ps[i] = toupper(*ps[i]);
...pr_alignpo[i]++;
ps[i]++;
/*
* are we at next gap for this seq?
*/
if (ni[i] == pp[i].x[ij[i]]) {
/*
*we need to merge ali gaps
*at this Iocation
*/
siz[i] = pp[i]-n[ij[i]++];
while (ni[i] == pp[i].x[ij[i]])
siz[i] += pp[i].n[ij[i]++];
}
ni[i]++;
}
}
if (++nn == olen || !more && nn) {
dumpblock();
for (i = 0; i < 2; i++)
po[i] = out[i];
nn = 0;
}
}
}
*dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align()
*/static
dumpblock(){
register i;
for (i = 0; i < 2; i++)
*po[i]- = '\0';
(void) putc('\n', fx);
for (i = 0; i < 2; i++) {
if (*out[i] && (*out[i] != '' Il *(po[i]) != '')) {
if (i == 0)
nums(i);
if (i == 0 && *out[1])
stars();
putline(i);
if (i == 0 && *out[1])
fprintf(fx, star);
if(i ==1)
nums(i);
}
>
dumpblock
.dumpblock
*put out a number line: dumpblock()
*/
static
nums(ix)
int ix; /* index in out[] holding seq line */
nums133
char nline[P_LINE];
register i, j;
register char *pn, *px, *py;
for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn++)
*pn =''; for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++, pn++) {
if (*py == '' d *py == '-') *pn = '';
else {
if (i%10 == 0|| (i == 1 && nc[ix] != 1)) { j = (i < 0)? -i : i;
for(px = pn; j; j/= 10, px-) *px = j%10 + Ό';
if (i < 0)
*px ='-';
}
else
*pn =' ';
i++;
}
}
*pn = '\0';
nc[ix] = i;
for (pn = nline; *pn; pn++)
(void) putc(*pn, fx);
(void) putc('\n\ fx);
}134
/*
* put out a Iine (name, [num], seq, [num]): dumpblockQ7
static
putline(ix) putline
int ix; {
...putline
int i;
registerchar *px;
for (px = namex[ix], i = 0; *px && *px != ':'; px++, i++)
(void) putc(*px, fx);for (; i < Imax+PSPC; i++)(void) putc('fx);
/* these count from 1:
* ni[] is current element (from 1)
* nc[] is number at start of current Iine
*/
for (px = out[ix]; *px; px++)
(void) putc(*px&0x7F, fx);(void) putc('\n', fx);
}
/*
* put a Iine of stars (seqs always in out[0], out[1]): dumpblockQ*/
static
stars() stars
{
int i;
register char *ρΟ, *ρ1, cx, *ρχ;
if (!*out[0] D (*out[0] =='·&& *(ρο[0]) == ") D!*out[1] Il (*out[1] =="&& *(po[1]) == ''))return;
px = star;
for (i = lmax+P_SPC; i; i-)*px++ = '';
for (pO = out[0], p1 = out[1]; *p0 && *p1; p0++, p1++) {if (isalpha(*pO) && isalpha(*p1)) {
if (χόηιΓρΟ-ΆΊ&χόιτιΓρΙ-Ά']) {cx = '*';
nm++;
}
else if (!dna && _day[*p0-'A'][*p1-'A'] > 0)
cx = '.';
else
cx = '';
}
else
cx ='*ρχ++ = cx;
}
*ρχ++ = '\η';*ρχ = ·\0·;
}
/*
* strip path or prefix from pn, return len: pr_align()* /
static
stripname(pn) stripname
char *pn; /* file name (may be path) */
{
register char *px, *py;
py = 0;
for (px = pn; *px; px++)
if (*ρχ == '/')
py = px + 1;
if (py)
(void) strcpy(pn, py);return(strlen(pn));
}
/*
* cleanup() -- cleanup any tmp file
* getseq() -- read in seq, set dna, len, maxlen
* g_calloc() -- calloc() with error checkin* readjmps() -- get the good jmps, from tmp file if necessary
* writejmps() - write a filled array of jmps to a tmp file: nw()
*/
#include "nw.h"
#include <sys/file.h>
char *jname = "/tmp/homgXXXXXX"; /* tmp file for jmps 7
FILE *fj;
int cleanupO; Γ cleanup tmp file 7
long lseek();
* remove any tmp file if we blow
*/
cleanup(i) cleanup
int i;
{
ifffi)
(void) unlink(jname);
exit(i);
>/*
* read, return ptr to seq, set dna, Ien1 maxlen
* skip Iines starting with ';', or '>'
* seq in upper or Iower case7
char *
getseq(file, len) getseq
char *file; Γ file name 7int *len; Γ seq Ien */
{
char line[1024], *pseq;
register char *px, *py;int natgc, tlen;
FILE *fp;
if ((fp = fopen(file,"r")) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n", prog, file);exit(1);
}
tlen = natgc = 0;
while (fgetsfline, 1024, fp)) {
if (*line == || *line == '<' || *line == '>')
continue;for (px = line; *px != '\n'; px++)
if (isupper(*px) || islower(*px))tlen++;
}
if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: malloc() failed to get %d bytes for %s\n", prog, tlen+6,
file);
exit(1);
>
pseq[0] = pseq[1] = pseq[2] = pseq[3] = '\0';
...getseq
py = pseq + 4;*len = tlen;rewind(fp);while (fgetsfline, 1024, fp» {
if (*line == || *line == '<' || *line == '>')
continue;for (px = line; *px != 1Xn'; px++) {if (isupper(*px))
*py++ = *px;else if (islower(*px))
*py++ = toupper(*px);if (index("ATGCU",*(py-1)))
natgc++;
>
}
*py++ = '\0';*py = '\0';
(void) fclose(fp);
dna = natgc > (tlen/3);
return(pseq+4);}
char *
g_calloc(msg, nx, sz) g_calloc
char *msg;int nx, sz;
{
char *px, *calloc();
if ((px = calloc((unsigned)nx, (unsigned)sz)) == 0) {if (*msg) {
fprintf(stderr, "%s: g_calloc() failed %s (n=%d, sz=%d)\n", prog,msg, nx, sz);
/* program, calling routine *//* number and size of elements */exit(1);}
return(px);}
/*
* get final jmps from dx[] or tmp file, set pp[], reset dmax: main()*/
readjmpsQ readjmps
{
int
fd = -1;
int
siz, iO, i1;
register i, j, xx;
if (fj) {
(void) fclose(fj);
if ((fd = open(jname, O RDONLY, 0)) < 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't open() %s\n", prog, jname);
cleanup(1);
}
>
for (i = iO = i1 = 0, dmaxO = dmax, xx = IenO; ; i++) {while (1){
for 0 = dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax].jp.x[j] >= xx; j~)
...readjmps
if o < o && dx[dmax].offset && fj) {
(void) lseek(fd, dx[dmax].offset, 0);(void) read(fd, (char *)&dx[dmax].jp, sizeof(struct jmp));
(void) read(fd, (char *)&dx[dmax].offset, sizeof(dx[dmax].offset))
dx[dmax].ijmp = MAXJMP-1; }else
break; }if (i >= JMPS) {
fprintf(stderr, "%s: too many gaps in alignment\n", prog);cleanup(1);
}
if(j>= 0){
siz = dx[dmax].jp.n[j];
xx = dx[dmax].jp.x[j];
dmax += siz;
if (siz < 0) { /* gap in second seq */
pp[1].n[i1] = -siz;
xx += siz;
/* id = xx - yy + Ienl -1 */
pp[1].x[i1] = xx - dmax + Ienl - 1;
gapy++;
ngapy -= siz;/* ignore MAXGAP when doing endgaps */
siz = (-siz < MAXGAP || endgaps)? -siz : MAXGAP;i1++;
}
else if (siz > 0) { /* gap in first seq */
pp[0].n[i0] = siz;
pp[0].x[i0] = xx;
gapx++;ngapx += siz;/* ignore MAXGAP when doing endgaps 7siz = (siz < MAXGAP || endgaps)? siz : MAXGAP;i0++;
}
}
else
break;
}
/* reverse the order of jmps */for (j = 0, i0-; j < i0; j++, i0--) {
i = pp[0].n[j]; pp[0].n[j] = pp[0].n[i0]; pp[0].n[i0] = i;i = pp[0].x[j]; pp[0].x[j] = pp[0].x[i0]; pp[0].x[i0] = i;
}
for (J = 0, i1-; j<i1 ij++, i1--){
i = PP[1]-n[j]; pp[1].n[j] = pp[1].n[i1]; pp[1].n[i1] = i;i = pp[i].x[j]; pp[i].x[j] = pp[1].x[í1]; pp[1].x[í1] = i;
}
if (fd >= 0)
(void) close(fd);
if (fj) {
(void) unlink(jname);fj = 0;
offset = 0;}}
/*
* write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw()7
writejmps(ix) writejmps
int ix;
{
char *mktemp();
if (Ifl) {
if (mktemp(jname) < 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't mktemp() %s\n", prog, jname);cleanup(1);
>
if CCtJ = fopen(jname, V)) == 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't write %s\n", prog, jname);exit(1);
}
>
(void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, fj);(void) fwrite((char *)&dx[ix].offset, sizeof(dx[ix].offset), 1, fj);
}
Tabela 2
TAT XXXXXXXXXXXXXXX (comprimento = 15
aminoácidos)
Proteína comparativa XXXXXYYYYYYY (comprimento = 12
aminoácidos)
% de identidade de seqüência de aminoácidos =(número de resíduos de aminoácidos com coincidências idênticas entre asduas seqüências de polipeptídeos conforme determinado por meio de ALIGN-2) dividido por (número total de resíduos de aminoácidos do polipeptídeo TAT)5 dividido por 15 = 33,3%
Tabela 3
<table>table see original document page 145</column></row><table>
% de identidade de seqüência de aminoácidos =
(número de resíduos de aminoácidos com coincidências idênticas entre asduas seqüências de polipeptídeos conforme determinado por meio de ALIGN-2) dividido por (número total de resíduos de aminoácidos do polipeptídeo TAT)
5 dividido por 10 = 50%
Tabela 4
<table>table see original document page 145</column></row><table>
% de identidade de seqüência de ácidos nucléicos =(número de nucleotídeos com coincidências idênticas entre as duas seqüênciasde ácidos nucléicos conforme determinado por meio de ALIGN-2) dividido por(número total de nucleotídeos da seqüência de ácido nucléico TAT-DNA) =
6 dividido por 14 = 42,9%
Tabela 5
<table>table see original document page 145</column></row><table>% de identidade de seqüência de ácidos nucléicos =(número de nucleotídeos com coincidências idênticas entre as duas seqüênciasde ácidos nucléicos conforme determinado por meio de ALIGN-2) dividido por(número total de nucleotídeos da seqüência de ácido nucléico TAT-DNA) =4 dividido por 12 = 33,3%
II. Composições ε Métodos de Acordo com a Presente Invenção
A. Anticorpos anti-TAT
Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-TAT que podem encontrar uso na presente invenção como agentesterapêuticos e/ou de diagnóstico. Exemplos de anticorpos incluem anticorpospoliclonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados.
1. Anticorpos Policlonais
Os anticorpos policlonais são preferencialmente aumentados emanimais por meio de diversas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip)do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígenorelevante (especialmente ao utilizar-se peptídeos sintéticos) a uma proteínaque seja imunogênica na espécie a ser imunizada. O antígeno pode serconjugado, por exemplo, a hemocianina de conchas (KLH)1 albumina de soro,tiroglobulina bovina Ou inibidor de tripsina de soja, utilizando agente bifuncionalou derivatizante, tal como éster maleimídobenzoil sufossuccinimida(conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (atravésde resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR,em que R e R1 são grupos alquilas diferentes.
Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugadosimunogênicos ou derivados por meio da combinação, por exemplo, de 100 μgou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos,respectivamente) com três volumes de adjuvante completo de Freund e injeçãoda solução por via intradérmica em diversos sítios. Um mês mais tarde, osanimais são estimulados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ouconjugado em adjuvante completo de Freund, por meio de injeção subcutâneaem diversos sítios. Sete a quatorze dias mais tarde, os animais são sangradose o soro é testado para determinar a titulagem de anticorpos. Os animais sãoincentivados até a estabilização do título. Os conjugados podem também serelaborados em cultura celular recombinante, na forma de fusões de proteínas.Além disso, agentes agregantes tais como alúmen são adequadamenteutilizados para aumentar a reação imunológica.
2. Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais podem ser elaborados utilizando ométodo de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), ou podem ser elaborados por meio de métodos de DNArecombinante (Patente US 4.816.567).
No método de hibridoma, camundongo ou outro animalhospedeiro apropriado, tal como hamster, é imunizado conforme descrito acimapara gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos quese ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização.Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após aimunização, os linfócitos são isolados e fundidos em seguida com linhagemcelulares de mieloma utilizando agente de fusão apropriado, tal comopolietileno glicol, para formar célula de hibridoma (Goding, MonoclonalAntibodies: Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas ecultivadas em meio de cultura apropriado, que contém preferencialmente umaou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das célulasde mieloma parentais não fundidas (também denominadas parceiro de fusão).Caso as células de mieloma parentais, por exemplo, não possuam a enzimahipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio decultura selecionado para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina,aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento decélulas com deficiência de HGPRT.
Células de mieloma parceiras de fusão preferidas são aquelasque se fundem eficientemente, sustentam a produção estável em alto nível deanticorpo pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveisa meio seletivo que seleciona contra as células parentais não fundidas. Aslinhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens de mieloma murino,tais como as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11disponíveis por meio do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego,Califórnia, Estados Unidos, e SP-2 e derivados, tais como células X63-Ag8-653disponíveis por meio da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos,Manassas, Virgínia, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humanoe heteromieloma de humano-camundongo também foram descritas para aprodução de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001(1984); e Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).
O meio de cultura no qual as células de hibridoma estãocrescendo é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonaisdirigidos contra o antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação deanticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada pormeio de imunoprecipitação ou por teste de ligação in vitro, tal comoradioimunoensaio (RIA) ou teste imunossorvente ligado por enzimas (ELISA).
A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode serdeterminada, por exemplo, por meio da análise de Scatchard descrita emMunson et al, Anal. Bioehem., 107: 220 (1980).
Após a identificação das células de hibridoma que produzemanticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clonespodem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição ecultivados por métodos padrão (Goding1 Monoclonal Antibodies: Principies andPractice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de culturaapropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo naforma de tumores de ascite em animal, por exemplo, por meio de injeçãointraperitoneal das células em camundongos.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones sãoadequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro pormeio de procedimentos convencionais de purificação de anticorpos, tais comocromatografia de afinidade (utilizando, por exemplo, proteína A ou proteína G-Sepharose) ou cromatografia de troca iônica, cromatografia de hidroxilapatita,eletroforese em gel, diálise etc.
DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado eseqüenciado utilizando procedimentos convencionais (empregando, por exemplo,sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente agenes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorpos murinos). As célulasde hibridoma servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA podeser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida emcélulas hospedeiras tais como células de E. coli, células de COS de símios, célulasde Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma,não produzem proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorposmonoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre aexpressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo incluemSkerra et al, Cum Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Plückthun, Immunol.Revs. 130: 151-188 (1992).
Em realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentosde anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorposgeradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al, Nature, 348: 552-554 (1990), Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. MoiBiol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos humanos emurinos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicaçõessubseqüentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade(faixa de nM) por meio de mistura de cadeias (Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo,como estratégia de construção de bibliotecas de fagos muito grandes(Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res. 21: 2265-2266 (1993)). Desta forma, estastécnicas são alternativas viáveis para as técnicas de hibridoma de anticorposmonoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.
O DNA que codifica o anticorpo pode ser modificado para produzirpolipeptídeos de anticorpos de fusão ou quiméricos, por meio de substituição,por exemplo, de seqüências de domínio constante de cadeia pesada e cadeialeve (Ch e Cl) pelas seqüências murinas homólogas (Patente US 4.816.567; eMorrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 6851 (1984)), ou por meio defusão da seqüência codificadora de imunoglobulina com a seqüênciacodificadora para polipeptídeo não de imunoglobulina (polipeptídeo heterólogo),no todo ou em parte. As seqüências de polipeptídeos não de imunoglobulinapodem substituir os domínios constantes de anticorpo, ou são substituídaspelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígenos de anticorpopara criar anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio decombinação de antígenos que possui especificidade para um antígeno e outrosítio de combinação de antígenos que possui especificidade para antígenodiferente.
3. Anticorpos humanizados e humanos
Os anticorpos anti-TAT de acordo com a presente invençãopodem compreender adicionalmente anticorpos humanizados ou anticorposhumanos. Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (tais comomurinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seusfragmentos (tais como Fv1 Fab1 Fab', F(ab')2 ou outras subseqüências deligação de antígenos de anticorpos) que contêm seqüência mínima derivada deimunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluemimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de regiãode determinação complementar (CDR) do paciente são substituídos porresíduos de CDR de espécie não humana (anticorpo doador), tal comocamundongo, rato ou coelho que possui a especificidade, afinidade ecapacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura Fvda imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanoscorrespondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreenderresíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas seqüênciasde estrutura ou CDR importadas. Geralmente, o anticorpo humanizadocompreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente doisdomínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDRcorrespondem às de imunoglobulina não humana e todas ou substancialmentetodas as regiões FR são as de seqüência de consenso de imunoglobulinahumana. O anticorpo humanizado também compreenderá idealmente pelomenos uma porção de região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente ade imunoglobulina humana (Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986);Riechmann et al, Nature, 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,2: 593-596 (1992)).
Métodos de humanização de anticorpos não humanos são bemconhecidos na técnica. Geralmente, anticorpo humanizado contém um ou maisresíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de fonte que não é humana.Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentementedenominados resíduos "importados", que são tomados tipicamente a partir dedomínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenterealizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al,Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et aí, Nature, 332: 323-327 (1988);Verhoeyen et aí, Science, 239: 1534-1536 (1988)), por meio de substituição deCDRs ou seqüências de CDR de roedores pelas seqüências correspondentesde anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados"são anticorpos quiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmentemenos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pelaseqüência correspondente de espécie não humana. Na prática, os anticorposhumanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos deCDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos desítios análogos em anticorpos de roedores.
A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quantopesados, a serem utilizados na elaboração dos anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir a antigenicidade e reação de HAMA (anticorpo anti-camundongo humano) quando o anticorpo destinar-se a uso terapêutico humano.De acordo com o chamado método de "melhor adequação", a seqüência dodomínio variável de anticorpo roedor é selecionada contra toda a biblioteca deseqüências de domínio variável humanas conhecidas. A seqüência de domínio Vhumano que é mais próxima da do roedor é identificada e a sua região de estrutura(FR) humana é aceita para o anticorpo humanizado (Sims et aí, J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utilizaregião de estrutura específica derivada da seqüência de consenso de todos osanticorpos humanos de subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. Amesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes(Carter et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 89: 4285 (1992); Presta et al, J.Immunol. 151: 2623 (1993)).
É adicionalmente importante que os anticorpos sejamhumanizados com retenção de alta afinidade de ligação para o antígeno eoutras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordocom método preferido, anticorpos humanizados são preparados por meio deprocesso de análise das seqüências parentais e diversos produtoshumanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüênciasparental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais sãocomumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. Sãodisponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturasconformacionais tridimensionais prováveis de possíveis seqüências deimunoglobulina selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise dopapel provável dos resíduos no funcionamento da possível seqüência deimunoglobulina, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidadeda possível imunoglobulina de ligar o seu antígeno. Desta forma, os resíduosde FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüênciasreceptora e importada para atingir a característica de anticorpo desejada, talcomo maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo. Geralmente, os resíduos daregião hipervariável são direta e mais substancialmente envolvidos nainfluência da ligação de antígenos.
São contempladas diversas formas de anticorpo anti-TAThumanizado. O anticorpo humanizado pode ser, por exemplo, fragmento deanticorpo, tal como Fab, que é opcionalmente conjugado a um ou mais agentescitotóxicos, a fim de gerar imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpohumanizado pode ser anticorpo intacto, tal como anticorpo IgGI intacto.
Como alternativa para a humanização, podem ser geradosanticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animaistransgênicos (tais como camundongos) que são capazes, medianteimunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos naausência da produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, porexemplo, que a exclusão homozigótica do gene da região de ligação de cadeiapesada de anticorpos (Jh) em camundongos quiméricos e mutantes delinhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorposendógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina dalinhagem germinativa humana nesses camundongos com mutação dalinhagens germinativas resultará na produção de anticorpos humanos mediantedesafio com antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad.Sei. U. S. A. 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature 362: 255-258 (1993);Bruggemann et al, Year in Immuno. 7: 33 (1993); Patentes US 5.545.806, US5.569.825, US 5.591.669 (todas da GenPharm); US 5,545,807; e WO 97/17852.
Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição de fagos(McCafferty et al, Nature 348: 552-553 (1990)) para produzir anticorposhumanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes dedomínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. Deacordo com esta técnica, os genes de domínio V de anticorpos são clonadosem quadro em gene de proteína de revestimento maior ou menor debacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma defragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago.Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples dogenoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais doanticorpo também resultam na seleção do gene codificador do anticorpo queexibe essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades dacélula Β. A exibição de fago pode ser realizada em uma série de formatos,analisados, por exemplo, em Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., CurrentOpinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Diversas fontes de segmentosde gene V podem ser utilizadas para exibição do fago. Clackson et al, Nature,352: 624-628 (1991) isolaram conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona apartir de pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados debaços de camundongos imunizados. Repertório de genes V de doadoreshumanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para conjuntodiverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al, J. Moi Biol. 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al, EMBO J. 12: 725-734 (1993). Vide também asPatentes US 5.565.332 e US 5.573.905.
Conforme discutido acima, anticorpos humanos podem tambémser gerados por células B ativadas in vitro (vide as Patentes US 5.567.610 e US5.229.275).
4. Fragmentos de anticorpos
Em certas circunstâncias, existem vantagens na utilização defragmentos de anticorpos, e não anticorpos inteiros. O menor tamanho dosfragmentos permite liberação rápida e pode gerar maior acesso aostumores sólidos.
Foram desenvolvidas diversas técnicas de produção de fragmentosde anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio dedigestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo, Morimoto et al,Joumal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan etal, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agoraproduzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos deanticorpos Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos em E. colie dele secretados,de forma a permitir a produção fluente de grandes quantidades desses fragmentos.Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas de fagosde anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab1-SH podemser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formarfragmentos de F(ab')2 (Carter et al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordocom outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente apartir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de Fab eF(ab')2 com maior meia-vida in vivo que compreendem resíduos de epítopos deligação de receptores de recuperação são descritos na Patente US 5.869.046.Outras técnicas de produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para ostécnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é fragmento deFv de fita simples (scFv). Vide WO 93/16185; Patente US 5.571.894; e Patente US5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos quesão desprovidas de regiões constantes; por isso, elas são apropriadas parareduzida ligação não específica durante a utilização in vivo. Proteínas de fusão desFv podem ser construídas para gerar a fusão de proteína efetora no terminal aminoou carbóxi de sFv. Vide Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, acima. O fragmentode anticorpo pode também ser "anticorpo linear", conforme descrito, por exemplo,na Patente Norte-Americana n° 5.641.870. Esses fragmentos de anticorpos linearespodem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
5. Anticorpos biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuemespecificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Exemplosde anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois epítopos diferentes deproteína TAT conforme descrito na presente invenção. Outros dessesanticorpos podem combinar sítio de ligação de TAT com sítio de ligação paraoutra proteína. Alternativamente, braço anti-TAT pode ser combinado combraço que se liga a molécula acionadora sobre leucócito, tal como moléculareceptora de células T (por exemplo, CD3), ou receptores de Fc para IgG(FcyR)1 tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma adirigir e localizar mecanismos de defesa celular para a célula que expressaTAT. Anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizaragentes citotóxicos para células que expressem TAT. Esses anticorpospossuem braço de ligação de TAT e braço que liga o agente citotóxico (talcomo saporina, anti-interferona-α, vinca alcalóide, cadeia A rícina, metotrexatoou hapteno de isótopo radioativo). Os anticorpos biespecíficos podem serpreparados na forma de anticorpos de comprimento total ou fragmentos deanticorpos (tais como anticorpos biespecíficos F(ab')2).
WO 96/16673 descreve anticorpo anti-ErbB2/anti-FcyRIIIbiespecífico e a Patente US 5.837.234 descreve anticorpo anti-ErbB2/anti-FcyRI biespecífico. Anticorpo anti-ErbB2/Fca biespecífico é exibido em WO98/02463. A Patente US 5.821.337 ensina anticorpo anti-ErbB2/anti-CD3biespecífico.
Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos sãoconhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos decomprimento total baseia-se na coexpressão de dois pares de cadeia leve ecadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuemespecificidades diferentes (Millstein et al, Nature, 305: 537-539 (1983)). Devidoà disposição aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esseshibridomas (quadromas) produzem mistura potencial de dez moléculas deanticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecíficacorreta. A purificação da molécula correta, que normalmente é realizada pormeio de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática e osrendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos emWO 93/08829 e em Traunecker et al, 1991, EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).
De acordo com abordagem diferente, domínios variáveis deanticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinaçãode anticorpos e antígenos) são fundidos a seqüências de domínio constante deimunoglobulina. Preferencialmente, a fusão efetua-se com domínio constantede cadeia pesada de Ig, que compreende pelo menos parte das regiões dearticulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeiapesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeias levespresente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs codificadores das fusõesde cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve deimunoglobulina são inseridos em vetores de expressão separados ecotransfectados em célula hospedeira apropriada. Isso proporciona maiorflexibilidade de ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos depolipeptídeos em realizações em que razões desiguais das três cadeias depolipeptídeos utilizadas na construção proporcionam rendimento ideal doanticorpo biespecífico desejado. É possível, entretanto, inserir as seqüênciascodificadoras de duas ou de todas as três cadeias de polipeptídeos em umúnico vetor de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias depolipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando asrazões não apresentarem efeito significativo sobre o rendimento dacombinação de cadeia desejada.
Em realização preferida desta abordagem, os anticorposbiespecíficos são compostos de cadeia pesada de imunoglobulina híbrida comprimeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeias leve ecadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece segunda especificidadede ligação) no outro braço. Concluiu-se que esta estrutura assimétricapossibilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações decadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de cadeia leve deimunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica proporcionaforma fácil de separação. Esta abordagem é descrita em WO 94/04690. Paradetalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos, consulte, porexemplo, Suresh et al, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
De acordo com outra abordagem descrita na Patente US5.731.168, a superfície intermediária entre um par de moléculas de anticorpospode ser construída de forma a maximizar o percentual de heterodímeros que érecuperado da cultura de células recombinantes. A superfície intermediáriapreferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3. Neste método,uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenas da superfícieintermediária da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeiaslaterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatóriasde tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadassobre a superfície intermediária da segunda molécula de anticorpo por meio dasubstituição de cadeias laterais de aminoácidos grandes com menores (porexemplo, alanina ou treonina). Isso proporciona mecanismo de aumento dorendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, taiscomo homodímeros.
Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado,por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos,por exemplo, para dirigir as células do sistema imunológico às célulasindesejadas (Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV(WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Anticorpos heteroconjugadospodem ser fabricados utilizando qualquer método reticulante conveniente. Osagentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnica e descritos naPatente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas reticulantes.
As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorposbiespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligaçõesquímicas. Brennan etal, 229:81, Science, 229: 81 descrevem um procedimentoem que anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerarfragmentos de F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agenteformador de complexo de ditiol arsenito de sódio, para estabilizar ditióisvizinhos e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos deFab' gerados são convertidos em seguida em derivados de tionitrobenzoato(TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então novamente convertido no Fab'-tiol por meio de redução com mercaptoetilamina e é misturado com quantidadeeqüimolar do outro derivado de Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico.Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentespara a imobilização seletiva de enzimas.
Progressos recentes possibilitaram a recuperação direta defragmentos de Fab-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente paraformar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)descrevem a produção de molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmentehumanizado. Cada fragmento de Fab1 foi secretado separadamente de E. coli esubmetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpobiespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar-se a célulasque superexpressam o receptor de ErbB2 e células T humanas normais, bem comoacionar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra tumores de mamaalvo humanos. Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos deanticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinantetambém foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, por exemplo,utilizando zíperes de leucina. Kostelny etal, J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992).Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às partesFab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusão genética. Os homodímeros deanticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e, emseguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Estemétodo pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos.A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A, 90: 6444-6448 (1993) forneceu mecanismo alternativo de fabricação defragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem Vhconectado a Vl por Iigante que é curto demais para permitir o pareamento entre osdois domínios sobre a mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios Vh e Vl deum fragmento são forçados a parear-se com os domínios Vl e Vh complementaresde outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de ligação de antígenos. Outraestratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos utilizandodímeros Fv de fita simples (sFv) também foi relatada. Vide Gruber etal, J. Immunol.,152: 5368(1994).
São contemplados anticorpos com mais de duas valências.Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al, J.Immunol. 147: 60 (1991).
6. Anticorpos heteroconjugados
Os anticorpos heteroconjugados também se encontram dentro doescopo da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostosde dois anticorpos ligados covalentemente. Esses anticorpos foram propostos,por exemplo, para dirigir células do sistema imunológico a células indesejadas(Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV (WO91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Contempla-se que os anticorpos podemser preparados in vitro, utilizando métodos conhecidos na química de proteínassintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentes reticulantes. Imunotoxinas,por exemplo, podem ser construídas utilizando reação de troca de dissulfeto oupor meio da formação de ligação tioéter. Exemplos de reagentes apropriadoscom este propósito incluem iminotiolato e 4-mercaptobutirimidato de metila e osdescritos, por exemplo, na Patente US 4.676.980.
7. Anticorpos multivalentes
Anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado)mais rapidamente que anticorpo bivalente por célula que expresse antígeno aoqual se ligam os anticorpos. Os anticorpos de acordo com a presente invençãopodem ser anticorpos multivalentes (que são diferentes da classe IgM) comtrês ou mais sítios de ligação de antígenos (por exemplo, anticorpostetravalentes) que podem ser facilmente produzidos por meio de expressãorecombinante de ácido nucléico que codifica as cadeias de polipeptídeos doanticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender domínio de dimerizaçãoe três ou mais sítios de ligação de antígenos. O domínio de dimerizaçãopreferido compreende (ou consiste de) região Fc ou região de articulação.Neste cenário, o anticorpo compreenderá região Fc e três ou mais sítios deligação de antígenos amino-terminais para a região Fe. O anticorpomultivalente preferido do presente compreende (ou consiste de) três a cerca deoito, mas preferencialmente quatro sítios de ligação de antígenos. O anticorpomultivalente compreende pelo menos uma cadeia de polipeptídeo (e,preferencialmente, duas cadeias de polipeptídeos), em que a(s) cadeia(s) depolipeptídeo(s) compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. A(s) cadeia(s)de polipeptídeo(s) pode(m) compreender, por exemplo, VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é primeiro domínio variável, VD2 é segundo domínio variável,Fc é uma cadeia de polipeptídeos de região Fc, X1 e X2 representamaminoácido ou polipeptídeo e η é O ou 1. A(s) cadeia(s) de polipeptídeo(s)pode(m) compreender, por exemplo: cadeia de VH-CH1-ligação flexível-VH-CH1-região Fc; ou cadeia de VH-CH1-VH-CH1-região Fe. O anticorpomultivalente do presente compreende ainda, preferencialmente, pelo menosdois (preferencialmente quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeialeve. O anticorpo multivalente do presente pode compreender, por exemplo,cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve.Os polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve contemplados na presenteinvenção compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente,compreendem ainda um domínio CL.
8. Elaboração de função efetora
Pode ser desejável modificar o anticorpo de acordo com apresente invenção com relação à função efetora, por exemplo, de forma aaumentar a citotoxicidade mediada por células dependente de antígenos(ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo.Isso pode ser atingido por meio da introdução de uma ou mais substituições deaminoácidos em região Fc do anticorpo. Alternativa ou adicionalmente,resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc1 de forma apermitir a formação de ligações de dissulfeto intercadeias nessa região. Oanticorpo homodimérico gerado desta forma pode possuir capacidade deinternalização aprimorada e/ou morte celular mediada por complementoaprimorada e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). VideCaron et al, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B., J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumorosaaprimorada podem também ser preparados utilizando reticulantesheterobifuncionais conforme descrito em Wolff et al, Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser elaborado anticorpo que contémregiões Fc duplas e, portanto, pode possuir capacidades de ADCC e Iisecomplementar aprimoradas. Vide Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para aumentar a meia vida do anticorpo em soro, pode-seincorporar um epítopo de ligação de receptor de salvados ao anticorpo(especialmente fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, naPatente US 5.739.277. Da forma utilizada na presente invenção, a expressão"epítopo de ligação de receptor de salvados" designa epítopo da região Fc demolécula de IgG (tal como IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável peloaumento da meia vida em soro in vivo da molécula de IgG.
9. Imunoconjugados
A presente invenção também se refere a imunoconjugados quecompreendem um anticorpo conjugado a agente citotóxico tal como agentequimioterapêutico, agente inibidor do crescimento, toxina (tal como toxinaenzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ouseus fragmentos) ou isótopo radioativo (ou seja, radioconjugado).
Os agentes quimioterapêuticos úteis na geração dessesimunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas eseus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia de difteria A,fragmentos ativos não de ligação da toxina de difteria, cadeia de exotoxina A(de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia demodeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina,proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordicacharantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina,restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma série deradionucletos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados.Exemplos incluem 212Bi, 131I1 131In, 90Y e 186Re. Os conjugados do anticorpo eagente citotóxico são fabricados utilizando uma série de agentes acopladoresde proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres(tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato dedi-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (taiscomo bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais comobis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo,conforme descrito em Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilerio triaminopentaacético marcado com carbono14 (MX-DTPA) é exemplo de agente quelante para conjugação deradionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026.
Os conjugados de anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculaspequenas, tais como caliqueamicina, maitansinóides, tricoteno e CC1065 e osderivados dessas toxinas que apresentam atividade de toxina também sãocontemplados na presente invenção.
Maitansina e maitansinóidesEm realização preferida, anticorpo anti-TAT (comprimento total oufragmentos) de acordo com a presente invenção é conjugado a uma ou maismoléculas de maitansinóide.
Maitansinóides são inibidores mitotóticos que agem inibindo apolimerização de tubulina. M aitansina foi isolada pela primeira vez a partir doarbusto do leste africano Maytenus serrata (Patente US 3.896.111). Descobriu-seem seguida que certos micróbios também produzem maitansinóides, tais comomaitansinol e ésteres C-3 maitansinol (Patente US 4.151.042). Maitansinol sintético,seus derivados e análogos são descritos, por exemplo, nas Patentes US 4.137.230,US 4.248.870, US 4.256.746, US 4.260.608, US 4.265.814, US 4.294.757, US4.307.016, US 4.308.268, US 4,308,269, US 4.309.428, US 4.313.946, US4.315.929, US 4.317.821, US 4.322.348, US 4.331.598, US 4.361.650, US4.364.866, US 4.424.219, US 4.450.254, US 4.362.663 e US 4.371.533, cujosrelatórios descritivos são expressamente incorporados ao presente como referência.
Conjugados de anticorpo e maitansinóide
Em tentativa de aumento do seu índice terapêutico, maitansina emaitansinóides foram conjugados a anticorpos que se ligam especificamente aantígenos de células tumorosas. Imunoconjugados contendo maitansinóides esua utilização terapêutica são descritos, por exemplo, nas Patentes US5.208.020, US 5.416.064 e Patente Européia n0 EP 0.425.235 B1, cujosrelatórios descritivos são expressamente incorporados ao presente comoreferência. Liu et ai, Proc. NatL Acad. Sei. U. S. A. 93: 8618-8623 (1996)descreveram imunoconjugados que compreendem maitansinóide denominadoDM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido a câncer colo-retal humano.Concluiu-se que o conjugado é altamente citotóxico com direção a célulascancerosas do cólon cultivadas e exibiu atividade antitumorosa em teste decrescimento tumoroso in vivo. Chari et al, Câncer Research 52: 127-131 (1992)descrevem imunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado, por meiode ligação de dissulfeto, ao anticorpo A7 murino que se liga a um antígenosobre linhagens celulares de câncer do cólon humano ou a outro anticorpomonoclonal murino TA.1 que liga o oncogene HER-2/new. A citotoxicidade doconjugado de TA.1 e maitansinóide foi testada in vitro sobre a linhagemcelulares de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 χ 105antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugado de fármacos atingiugrau de citotoxicidade similar ao fármaco de maitansinóide livre, que poderá seraumentada por meio do aumento da quantidade de moléculas de maitansinóidepor molécula de anticorpo. O conjugado de A7 e maitansinóide exibiu baixacitotoxicidade sistêmica em camundongos.
Conjugados de maitansinóide e anticorpo anti-polipeptídeo TAT(imunoconjugados)
Os conjugados de maitansinóide e anticorpo anti-TAT sãopreparados por meio de ligação química de anticorpo anti-TAT a molécula demaitansinóide sem reduzir significativamente a atividade biológica do anticorpoou da molécula de maitansinóide. Em média, três a quatro moléculas demaitansinóide conjugadas por molécula de anticorpo exibiram eficácia noaumento da citotoxicidade de células alvo sem prejudicar função ousolubilidade do anticorpo, embora se esperasse que até uma molécula detoxina/anticorpo aumentasse a citotoxicidade sobre o uso de anticorpo bruto.Maitansinóides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados pormeio de técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais.Maitansinóides apropriados são descritos, por exemplo, na Patente US5.208.020 e nas outras patentes e publicações não patenteadas descritasacima na presente invenção. Os maitansinóides preferidos são maitansinol eanálogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posiçõesda molécula de maitansinol, tais como diversos ésteres de maitansinol.
Existem vários grupos de ligação conhecidos na técnica para afabricação de conjugados de anticorpo e maitansinóide, que incluem, porexemplo, os descritos na Patente US 5.208.020 ou Patente EP 0425235B1,Chari et al, Câncer Research 52: 127-131 (1992) e Pedido de Patente Norte-Americano n° 10/960.602, depositado em oito de outubro de 2004, cujosrelatórios descritivos são expressamente incorporados ao presente comoreferência. Conjugados de anticorpo e maitansinóide que compreendem ocomponente Iigante SMCC podem ser preparados conforme descrito no Pedidode Patente Norte-Americano n° 10/960.602, depositado em oito de outubro de2004. Os grupos de ligação incluem grupos de dissulfeto, grupos de tioéter,grupos instáveis ácidos, grupos fotoinstáveis, grupos instáveis de peptidase ougrupos instáveis de esterase, conforme descrito nas patentes identificadasacima, com grupos de dissulfeto e tioéter sendo preferidos. Grupos de ligaçãoadicionais são descritos e exemplificados na presente invenção.
Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem serfabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínasbifuncionais, tais como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (SPDP),ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano(IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilaHCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (taiscomo glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Osagentes acopladores particularmente preferidos incluem propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et al, Biochem. J. 173: 723-737(1978)) e pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP) para fornecerligação de dissulfeto.
O Iigante pode ser ligado à molécula de maitansinóide emdiversas posições, dependendo do tipo da ligação. Ligação éster pode serformada, por exemplo, por meio de reação com grupo hidroxila, utilizandotécnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3que contém um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila,na posição C-15 modificada com grupo hidroxila e na posição C-20 que contémgrupo hidroxila. Em realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 demaitansinol ou análogo de maitansinol.
Auristatinas e Dolostatinas
Em algumas realizações, o imunoconjugado compreendeanticorpo de acordo com a presente invenção conjugado a dolastatinas ouderivados e análogos peptídicos de dolostatina, as auristatinas (Patentes US5.635.483 e US 5.780.588). Demonstrou-se que dolastatinas e auristatinasinterferem com dinâmicas de microtúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear ecelular (Woyke et al (2001), Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584) e possuem atividade anticâncer (US 5.663.149) e antifúngica (Pettit et al(1998), Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965). A porção de fármacodolastatina ou auristatina pode ser ligada ao anticorpo por meio do terminal N(amino) ou do terminal C (carboxila) da porção peptídica do fármaco (WO02/088172).
Exemplos de realizações de auristatina incluem as porções dofármaco monometilauristatina ligadas por terminal N DE e DF (ou seja, MMAEe MMAF), descritas em Senter et al, Proceedings of the American Associationfor Câncer Research, Volume 45, Resumo n° 623, apresentado em 28 demarço de 2004, cujo relatório descritivo é expressamente incorporadointegralmente como referência.
Tipicamente, porções dos fármacos com base em peptídeopodem ser preparadas por meio da formação de ligação de peptídeo entre doisou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeos. Estas ligações depeptídeos podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método desíntese de fases líquidas (vide E. Schrõder e K. Lübke, The Peptides, volume 1,págs. 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo dequímica de peptídeos. As porções do fármaco auristatina/dolastatina podem serpreparadas de acordo com os métodos de: US 5.635.483: US 5.780.588; Pettitet al (1989), J. Am. Chem. Soe. 111: 5463-5465; Pettit eía/(1998), Anti-CancerDrug Design 13: 243-277; Pettit1 G. R. et al, Synthesis, 1996, 719-725; Pettit etal (1996), J. Chem. Soe. Perkin Trans. 15: 859-863; e Doronina (2003), Nat.Biotechnol. 21 (7): 778-784.
Caliqueamicina
Outro imunoconjugado de interesse compreende anticorpo anti-TAT conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A famíliacaliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir rupturas de DNA de fitadupla em concentrações subpicomolares. Para a preparação de conjugados dafamília de caliqueamicina, vide as Patentes US 5.712.374, US 5.714.586, US5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 e US5.877.296 (todas da American Cyanamid Company). Análogos estruturais decaliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas sem limitar-se a γ/, α2',Ot31, N-acetil-γ-1, PSAG e O11 (Hinman et al. Câncer Research, 53: 3336-3342(1993), Lode et al, Câncer Research, 58: 2925-2928 (1998) e as PatentesNorte-Americanas da American Cyanamid mencionadas acima). Outro fármacoantitumororal à qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é antifolato.Tanto caliqueamicina quanto QFA contêm sítios intracelulares de ação e nãocruzam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a absorção celulardesses agentes por meio de internalização mediada por anticorpos aumentagrandemente os seus efeitos citotóxicos.
Outros agentes citotóxicos
Outros agentes antitumorosos que podem ser conjugados aosanticorpos anti-TAT de acordo com a presente invenção incluem BCNU,estreptozoicina, vincristina e 5-fluorouracil, família de agentes conhecidacoletivamente como complexo LL-E33288, descrito nas Patentes US 5.053.394e US 5.770.710, bem como esperamicinas (Patente US 5.877.296).
Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem serutilizados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de ligação da toxinade difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosá), cadeia rícina A,cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurítesfordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis,gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide,por exemplo, WO 93/21232, publicada em 28 de outubro de 1993.
A presente invenção contempla ainda imunoconjugado formadoentre anticorpo e composto com atividade nucleolítica (por exemplo,ribonuclease ou endonuclease de DNA, tal como desoxirribonuclease; DNase).
Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreenderum átomo altamente radioativo. Uma série de isótopos radioativos é disponívelpara a produção de anticorpos anti-TAT rádio-conjugados. Exemplos incluemAt211, I1311 I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P321 Pb212 e isótopos radioativosde Lu. Quando o conjugado for utilizado para diagnóstico, ele podecompreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, tal como tc99m ou1123, ou uma marcação de centrifugação para formação de imagens por deressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação deimagens por ressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio,manganês ou ferro.
Os rádio-marcadores ou outros podem ser incorporados aoconjugado de formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo,biossintetizado ou pode ser sintetizado por meio de síntese química deaminoácidos, utilizando precursores de aminoácidos apropriados, envolvendo,por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores tais como tc99m, I1231Re186, Re188 e In111 podem ser ligadas por meio de resíduo de cisteína nopeptídeo. ítrio-90 pode ser ligado por meio de resíduo de lisina. O métodoIODOGEN (Fraker et al (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57pode ser utilizado para incorporar iodo-123. Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy (Chatal, CRC Press1 1989) descreve outros métodos emdetalhes.
Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem serfabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínasbifuncionais, tais como 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidila (SPDP)1ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano(IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilaHCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (taiscomo glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito emVitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacétíco marcado com carbono 14 (MX-DTPA) éexemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo.Vide WO 94/11026. O Iigante pode ser "ligante divisível" que possibilita aliberação do fármaco citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, liganteinstável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotoinstável, ligante dedimetila ou ligante que contém dissulfeto (Chari et al, Câncer Research 52:127-131 (1992); Patente US 5.208.020).Os compostos de acordo com a presente invenção contemplamexpressamente, mas sem limitar-se a ADC preparado com reagentesreticulantes: BMPS1 EMCS, GMBS, HBVS1 LC-SMCC1 MBS1 MPBH1 SBAP1SIA1 SIAB1 SMCC1 SMPB1 SMPH1 sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS,sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato desuccinimidil-(4-vinilsulfona)) que são disponíveis comercialmente (tal como pormeio da Pierce Biotechnology1 Inc., Rockford1 IL1 E. U. A.). Vide páginas 467 a498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
Alternativamente, pode ser fabricada proteína de fusão quecompreende o anticorpo anti-TAT e agente citotóxico, por exemplo, por meio detécnicas recombinantes ou síntese de peptídeos. O comprimento de DNA podecompreender regiões correspondentes codificadoras das duas partes do conjugado,sejam elas adjacentes entre si ou separadas por região codificadora de peptídeo deligação que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a"receptor" (tal como estreptavidina) para uso em direcionamento prévio detumores, em que o conjugado de anticorpo e receptor é administrado aopaciente, seguido pela remoção de conjugado não ligado da circulação,utilizando agente Iimpante e, em seguida, administração de "ligante" (tal comoavidina) que é conjugado a agente citotóxico (tal como radionucleotídeo).
10. Imunolipossomos
Os anticorpos anti-TAT descritos na presente invenção tambémpodem ser formulados como imunolipossomos. "Lipossomo" é uma pequenabolha composta de diversos tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que éútil para o fornecimento de fármacos a mamíferos. Os componentes dolipossomo são normalmente dispostos em formação bicamadas, similar àdisposição de lipídios de membranas biológicas. Os Iipossomos que contêm oanticorpo são preparados por meio de métodos conhecidos na técnica,conforme descrito em Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 82: 3688(1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 77: 4030 (1980); PatentesUS 4.485.045 e US 4.544.545; e WO 97/38731 publicada em 23 de outubro de1997. Lipossomos com maior tempo de circulação são descritos na Patente US5.013.556.
Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados por meio dométodo de evaporação de fase reversa com composição de lipídios quecompreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG(PEG-PE). Os Iipossomos são extrudados por meio de filtros com tamanho deporo definido para gerar Iipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentosde Fab' do anticorpo de acordo com a presente invenção podem serconjugados aos Iipossomos descritos em Martin et al, J. Bioi Chem. 257: 286-288 (1982) por meio de reação de intercâmbio de dissulfetos. Agentequimioterapêutico é opcionalmente contido no interior do lipossomo. VideGabizon et al, J. National Câncer Inst 81 (19): 1484 (1989).
B. Oliqopeptídeos de ligação de TAT
Os oligopeptídeos de ligação de TAT de acordo com a presenteinvenção são oligopeptídeos que se ligam, preferencialmente de formaespecífica, a polipeptídeo TAT conforme descrito na presente invenção.Oligopeptídeos de ligação de TAT podem ser sintetizados quimicamenteutilizando metodologia de síntese de oligopeptídeos conhecida ou podem serpreparados e purificados utilizando tecnologia recombinante. Os oligopeptídeosde ligação de TAT normalmente possuem pelo menos cerca de cincoaminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9,10; 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20; 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30;31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40; 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50; 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60; 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70; 71, 72,73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80; 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90; 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 aminoácidos de comprimento ou mais, em queesses oligopeptídeos são capazes de ligar-se, preferencialmente de formaespecífica, a polipeptídeo TAT conforme descrito na presente invenção. Osoligopeptídeos de ligação de TAT podem ser identificados sem experimentaçãoindevida, utilizando métodos bem conhecidos. Nesse aspecto, observa-se queos métodos de seleção de bibliotecas de oligopeptídeos em busca deoligopeptídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a polipeptídeoalvo são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patentes US5.556.762, US 5.750.373, US 4.708.871, US 4.833.092, US 5.223.409, US5.403.484, US 5.571.689 e US 5.663.173; Patentes PCT n0 WO 84/03506 eWO 84/03564; Geysen et a/, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 3998-4002(1984); Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 82: 178-182 (1985);Geysen et al, Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al, J.Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); Schoofs et al, J. Immunol., 140: 611-616(1988), Cwirla, S. E. et al (1990), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 87: 6378;Lowman1 Η. B. et a/(1991), Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al (1991),Nature, 352: 624; Marks, J. D. ef a/(1991), J. Moi Biol., 222: 581; Kang, A. S.et al (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 88: 8363 e Smith, G. P. (1991),Current Opin. Biotechnol., 2: 668).
Nesse aspecto, exibição de bacteriófagos (fagos) é método bemconhecido que permite a seleção de grandes bibliotecas de oligopeptídeos paraidentificar membro(s) dessas bibliotecas que seja(m) capaz(es) de ligar-seespecificamente a polipeptídeo alvo. Exibição de fagos é método por meio doqual polipeptídeos variantes são exibidos na forma de proteínas de fusão paraa proteína de revestimento sobre a superfície de partículas de bacteriófagos(Scott, J. K. e Smith, G. P. (1990), Science 249: 386). A utilidade de exibição defagos reside no fato de que grandes bibliotecas de variantes de proteínasaleatorizadas seletivamente (ou cDNAs clonados aleatoriamente) podem serordenadas rápida e eficientemente para as seqüências que ligam molécula alvocom alta afinidade. A exibição de bibliotecas de peptídeos (Cwirla1 S. E. et al(1990), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 87: 6378) ou de proteínas (Lowman, H.B. et al (1991), Biochemistry1 30: 10832; Clackson, T. et al (1991), Nature, 352:624; Marks, J. D. et al (1991), J. Mol. Bioil 222: 581; Kang, A. S. et al (1991),Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 88: 8363) sobre fagos vem sendo utilizada paraselecionar milhões de polipeptídeos ou oligopeptídeos para determinar aquelescom propriedades de ligação específicas (Smith, G. P. (1991), Current Opin.Biotechnol., 2: 668). A seleção de bibliotecas de fagos de mutantes aleatóriosrequer estratégia de construção e propagação de grande quantidade devariantes, procedimento de purificação por afinidade utilizando o receptor alvoe meio de avaliação dos resultados de enriquecimentos de ligação. PatentesUS 5.223.409, US 5.403.484, US 5.571.689 e US 5.663.143.
Embora a maior parte dos métodos de exibição de fagos tenhautilizado fago filamentoso, sistemas de exibição de fago lambdóide (WO95/34683; US 5.627.024), sistemas de exibição de fagos T4 (Ren et al, Gene,215: 439 (1998); Zhu et al, Câncer Research, 58 (15): 3209-3214 (1998); Jianget ai Infection & Immunity, 65 (11): 4770-4777 (1997); Ren et al, Gene, 195 (2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al, Virus Genes,10: 173 (1995)) e sistemas de exibição de fagos T7 (Smith e Scott, Methods inEnzymology, 217: 228-257 (1993); US 5.766.905) também são conhecidos.
Muitos outros aprimoramentos e variações do conceito básico deexibição de fagos já foram desenvolvidos. Estes aprimoramentos aumentam acapacidade dos sistemas de exibição de selecionar bibliotecas de peptídeospara ligação a moléculas alvo selecionadas e exibir proteínas funcionais com opotencial de seleção dessas proteínas em busca de propriedades desejadas.Dispositivos de reação combinatória para reações de exibição de fagos foramdesenvolvidos (WO 98/14277) e bibliotecas de exibição de fagos foramutilizadas para analisar e controlar interações bimoleculares (WO 98/20169;WO 98/20159) e propriedades de peptídeos helicoidais restritos (WO98/20036). WO 97/35196 descreve método de isolamento de Iigante deafinidade no qual biblioteca de exibição de fagos é colocada em contato comsolução na qual o Iigante irá se ligar a uma molécula alvo e uma segundasolução na qual o Iigante de afinidade não se ligará à molécula alvo, para isolarseletivamente Iigantes de ligação. WO 97/46251 descreve método debiocombinação de biblioteca de exibição de fagos aleatória com anticorpopurificado por afinidade e isolamento em seguida do fago de ligação, seguidopor processo de microcombinação utilizando recipientes de microplacas paraisolar fago de ligação com alta afinidade. O uso de proteína A deStaphylococcus aureus como marcador de afinidade também foi relatado (Li etal (1998), Mol. Bioteeh., 9: 187). WO 97/47314 descreve o uso de bibliotecasde subtração de substrato para diferenciar especificidades de enzimasutilizando biblioteca combinatória que pode ser biblioteca de exibição de fagos.Método de seleção de enzimas apropriadas para uso em detergentes utilizandoexibição de fagos é descrito em WO 97/09446. Métodos adicionais de seleçãode proteínas de ligação específicas são descritos nas Patentes US 5.498.538,US 5.432.018 e WO 98/15833.
Métodos de geração de bibliotecas de peptídeos e seleçãodessas bibliotecas também são descritos nas Patentes US 5.723.286, US5.432.018, US 5.580.717, US 5.427.908, US 5.498.530, US 5.770.434, US5.734.018, US 5.698.426, US 5.763.192 e US 5.723.323.
C. Moléculas orgânicas de ligação de TAT
Moléculas orgânicas de ligação de TAT são moléculas orgânicasdiferentes de oligopeptídeos ou anticorpos conforme definido na presente invençãoque se ligam, preferencialmente de forma específica, a polipeptídeo TAT conformedescrito na presente invenção. Moléculas orgânicas de ligação de TAT podem seridentificadas e sintetizadas quimicamente utilizando metodologia conhecida (vide,por exemplo, as Patentes PCT n0 WO 00/00823 e WO 00/39585). As moléculasorgânicas de ligação de TAT normalmente possuem tamanho de menos de cercade 2000 daltons, alternativamente tamanho de menos de cerca de 1500, 750, 500,250 ou 200 daltons, em que essas moléculas orgânicas que são capazes deligação, preferencialmente de forma específica, a polipeptídeo TAT conformedescrito na presente invenção podem ser identificadas sem experimentaçãoindevida utilizando métodos bem conhecidos. Nesse aspecto, observa-se que osmétodos de seleção de bibliotecas de moléculas orgânicas em busca de moléculasque sejam capazes de ligar-se a polipeptídeo alvo são bem conhecidos na técnica(vide, por exemplo, Patentes PCT n0 WO 00/00823 e WO 00/39585). As moléculasorgânicas de ligação de TAT podem ser, por exemplo, aldeídos, cetonas, oximas,hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primárias, aminas secundárias,aminas terciárias, hidrazinas N-substituídas, hidrazidas, álcoois, éteres, tióis,tioéteres, dissulfetos, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, uréias, carbamatos,carbonatos, cetais, tiocetais, acetais, tioacetais, haletos de arila, sulfonatos de arila,haletos de alquila, sulfonatos de alquila, compostos aromáticos, compostosheterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinas, dióis, aminoálcoois, oxazolidinas,oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas,isocianatos, cloretos de sulfonila, compostos diazo, cloretos ácidos ou similares.
D. Seleção de anticorpos anti-TAT. oligopeptídeos de ligaçãode TAT e moléculas orgânicas de ligação de TAT com as propriedadesdesejadas
Foram descritos acima métodos de geração de anticorpos,oligopeptídeos e moléculas orgânicas que se ligam a polipeptídeos TAT. Pode-se selecionar adicionalmente anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculasorgânicas com certas características biológicas, conforme o desejado.
Os efeitos inibidores do crescimento de anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo ou outra molécula orgânica de acordo com a presente invençãopodem ser determinados por meio de métodos conhecidos na técnica,utilizando, por exemplo, células que expressem polipeptídeo TAT de formaendógena ou após transfecção com o gene TAT. Linhagens celularestumorosas e transfectadas com TAT apropriadas, por exemplo, podem sertratadas com anticorpo monoclonal anti-TAT, oligopeptídeo ou outra moléculaorgânica de acordo com a presente invenção em concentrações diversas poralguns (por exemplo, dois a sete) dias e manchadas com violeta de cristal ouMTT ou analisadas por meio de algum outro teste colorimétrico. Outro métodode medição da proliferação seria por meio da comparação da absorção de 3H-timidina pelas células tratadas na presença ou ausência de anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica de ligação de TAT deacordo com a presente invenção. Após o tratamento, as células são colhidas ea quantidade de radioatividade incorporada no DNA é quantificada em contadorde cintilação. Controles positivos apropriados incluem o tratamento delinhagem celular selecionada com anticorpo inibidor do crescimento conhecido,para inibir o crescimento daquela linhagem celular. A inibição do crescimentode células tumorosas in vivo pode ser determinada de várias formasconhecidas na técnica. Preferencialmente, a célula tumorosa é aquela quesuperexpressa polipeptídeo TAT. Preferencialmente, o anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica de ligação de TATinibirá a proliferação celular de célula tumorosa que expresse TAT in vitro ou invivo em cerca de 25 a 100%, em comparação com a célula tumorosa nãotratada, de maior preferência cerca de 30 a 100% e, de preferência aindamaior, cerca de 50 a 100% ou 70 a 100%, em uma realização, emconcentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 μg/ml. A inibição docrescimento pode ser medida em concentração de anticorpos de cerca de 0,5 a30 μg/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, em que a inibição docrescimento é determinada em um a dez dias após a exposição das célulastumorosas ao anticorpo. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo caso aadministração do anticorpo anti-TAT a cerca de 1 μο/Κς até cerca de 100 mg/kgde peso do corpo resulte na redução do tamanho do tumor ou redução daproliferação de células tumorosas em até cerca de cinco dias a três meses apartir da primeira administração do anticorpo, preferencialmente em até cercade cinco a trinta dias.
Para selecionar anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo de ligação deTAT ou molécula orgânica de ligação de TAT que induza a morte celular,pode-se determinar a perda de integridade da membrana, conformeindicado, por exemplo, pela absorção de iodeto de propídio (PI), azul detripano ou 7AAD com relação ao controle. Pode-se realizar teste deabsorção de Pl na ausência de complemento e células efetoras imunes. Ascélulas tumorosas que expressam polipeptídeo TAT são incubadas commeio isolado ou meio que contenha o anticorpo anti-TAT apropriado (talcomo a cerca de 10 μg/ml), oligopeptídeo de ligação de TAT ou moléculaorgânica de ligação de TAT. As células são incubadas por período de trêsdias. Após cada tratamento, as células são lavadas e divididas em 12 χ 75tubos de 35 mm com tampa de coador (1 ml por tubo, três tubos por grupode tratamento) para a remoção de massas celulares. Os tubos recebementão Pl (10 μg/ml). As amostras podem ser analisadas utilizando citômetrode fluxo FACSCAN® e software FACSCONVERT® CeIIQuest (BectonDickinson). Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos de ligação de TAT oumoléculas orgânicas de ligação de TAT que induzem níveis estatisticamentesignificativos de morte celular, conforme determinado por meio da absorçãode PI, podem ser selecionados como anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos deligação de TAT ou moléculas orgânicas de ligação de TAT que induzem amorte celular.Para selecionar anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculasorgânicas que se unam a epítopo sobre polipeptídeo TAT ligado por anticorpode interesse, pode-se realizar teste bloqueador cruzado de rotina, tal como odescrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Ed. Harlow e David Lane (1988). Esse teste pode ser utilizado para determinarse anticorpo de teste, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica liga o mesmosítio ou epítopo na forma de anticorpo anti-TAT conhecido. Alternativa ouadicionalmente, pode-se realizar mapeamento de epítopos por meio demétodos conhecidos na técnica. A seqüência de anticorpos pode sofrermutagênese, por exemplo, por meio de varredura de alanina, para identificarresíduos de contato. O anticorpo mutante é testado inicialmente paradeterminar a ligação com anticorpo policlonal, para garantir dobra apropriada.Em método diferente, peptídeos correspondentes a regiões diferentes depolipeptídeo TAT podem ser utilizados em testes de competição com osanticorpos de teste ou com anticorpo de teste e anticorpo com epítopoconhecido ou caracterizado.
E. Terapia de Pró-fármacos Mediada por EnzimasDependentes de Anticorpos (ADEPT)
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem tambémser utilizados em ADEPT, por meio de conjugação do anticorpo a enzima ativadorade pró-fármacos, que converte pró-fármaco (tal como agente quimioterapêutico depeptidila, vide WO 81/01145) em fármaco anti-cancerígeno ativo. Vide, por exemplo,WO 88/07378 e a Patente US 4.975.278.
O componente de enzima do imunoconjugado útil para ADEPTinclui qualquer enzima capaz de agir sobre pró-fármaco, de forma a convertê-laem sua forma citotóxica mais ativa.
Enzimas que são úteis no método de acordo com a presenteinvenção incluem, mas sem limitar-se a fosfatase alcalina útil para aconversão de pró-fármacos contendo fosfato em fármacos livres;arilsulfatase útil para a conversão de pró-fármacos contendo sulfato emfármacos livres; citosina desaminase útil para a conversão de 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anti-cancerígeno, 5-fluorouracil;proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilisina,carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas BeL) que são úteispara a conversão de pró-fármacos contendo peptídeos em fármacos livres;D-alanilcarboxipeptidases, úteis para a conversão de pró-fármacos quecontêm substituintes D-aminoácidos; enzimas divisoras de carboidratos, taiscomo β-galactosidase e neuraminidase úteis para a conversão de pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase útil para a conversãode fármacos derivados com β-lactamas em fármacos livres; e penicilinoamidases, tais como penicilino V amidase ou penicilino G amidase, úteispara a conversão de fármacos derivados nos seus nitrogênios aminacom grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacolivres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, tambémconhecidos na técnica como "abzimas", podem ser utilizados para converteros pró-fármacos de acordo com a presente invenção em fármacos ativoslivres (vide, por exemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)).Conjugados de anticorpo e abzima podem ser preparados conformedescrito na presente invenção para fornecimento da abzima a populaçãode células tumorosas.
As enzimas de acordo com a presente invenção podem serligadas covalentemente aos anticorpos anti-TAT por meio de métodos bemconhecidos na técnica, tais como a utilização dos reagentes reticulantesheterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, as proteínas de fusãoque compreendem pelo menos a região de ligação de antígenos deanticorpo de acordo com a presente invenção, ligado a pelo menos umaparte funcionalmente ativa de enzima de acordo com a presente invenção,podem ser construídas utilizando métodos de DNA recombinantes bemconhecidos na técnica (vide, por exemplo, Neuberger et al, Naturel 312:604-608 (1984).
F. Polipeptídeos TAT de comprimento totalA presente invenção também fornece seqüências de nucleotídeosrecém identificadas e isoladas que codificam polipeptídeos indicados no presentepedido como polipeptídeos TAT. Particularmente, cDNAs (parciais e decomprimento total) que codificam diversos polipeptídeos TAT foram identificados eisolados, conforme descrito em mais detalhes nos Exemplos abaixo.
Conforme descrito nos Exemplos abaixo, diversos clones decDNA foram depositados na ATCC. As seqüências de nucleotídeos reaisdestes clones podem ser facilmente determinadas pelos técnicos no assuntopor meio de seqüenciamento do clone depositado utilizando métodosrotineiros na técnica. A seqüência de aminoácidos prevista pode serdeterminada a partir da seqüência de nucleotídeos utilizando conhecimentosde rotina. Para os polipeptídeos TAT e ácidos nucléicos codificadoresdescritos na presente invenção, em alguns casos, os Depositantesidentificaram o que se acredita ser o quadro de leitura mais identificável comas informações de seqüências disponíveis no momento.
G. Variantes de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT
Além dos anticorpos anti-TAT e polipeptídeos TAT de seqüêncianativa e comprimento total descritos na presente invenção, contempla-se apreparação de variantes de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT. Variantesde polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT podem ser preparadas por meio daintrodução de mudanças de nucleotídeos apropriadas no DNA codificador e/oupor meio de síntese do polipeptídeo ou anticorpo desejado. Os técnicos noassunto apreciarão que as mudanças de aminoácidos podem alterar processospós-tradução do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT1 tais como a mudançado número ou posição de sítios de glicosilação ou alteração das característicasde ancoramento de membranas.
Variações dos anticorpos anti-TAT e polipeptídeos TAT descritosna presente invenção podem ser elaboradas, por exemplo, utilizandoquaisquer dos métodos e orientações para mutações conservadoras e nãoconservadoras descritas, por exemplo, na Patente US 5.364.934. Variaçõespodem ser substituição, exclusão ou inserção de um ou mais códons quecodificam o anticorpo ou polipeptídeo que resulta em alteração da seqüênciade aminoácidos em comparação com o polipeptídeo ou anticorpo deseqüência nativa. Opcionalmente, a variação é realizada por meio dasubstituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácidoem um ou mais dos domínios do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT.Orientação na determinação de qual resíduo de aminoácido pode ser inserido,substituído ou excluído sem prejudicar a atividade desejada pode serencontrada por meio de comparação da seqüência do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT com a de moléculas de proteína conhecidas homólogas eminimização da quantidade de alterações de seqüências de aminoácidosrealizadas em regiões de alta homologia. Substituições de aminoácidospodem ser o resultado da substituição de um aminoácido com outroaminoácido que possui propriedades químicas e/ou estruturais similares, taiscomo a substituição de Ieucina com serina, ou seja, substituições deaminoácidos conservadoras. Inserções ou exclusões podem estaropcionalmente na faixa de cerca de um a cinco aminoácidos. A variaçãopermitida pode ser determinada realizando-se sistematicamente inserções,exclusões ou substituições de aminoácidos na seqüência e testando-se asvariantes resultantes para determinar a atividade exibida pela seqüêncianativa madura ou de comprimento total.Fragmentos de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT sãofornecidos na presente invenção. Esses fragmentos podem ser truncados noterminal N ou terminal C, ou podem não conter resíduos internos, porexemplo, em comparação com proteína ou anticorpo nativo de comprimentototal. Certos fragmentos não contêm resíduos de aminoácidos que não sãoessenciais para atividade biológica desejada do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT.
Fragmentos de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT podemser preparados por meio de qualquer dentre uma série de métodosconvencionais. Fragmentos de peptídeos desejados podem ser quimicamentesintetizados. Abordagem alternativa envolve a geração de fragmentos depolipeptídeos ou anticorpos por meio de digestão enzimática, tal como por meiode tratamento da proteína com enzima conhecida por dividir proteínas em sítiosdefinidos por resíduos de aminoácidos específicos, ou por meio de digestão doDNA com enzimas de restrição apropriadas e isolamento do fragmentodesejado. Ainda outro método apropriado envolve o isolamento e aamplificação de fragmento de DNA que codifica fragmento de polipeptídeo ouanticorpo desejado, por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR).Oligonucleotídeos que definem os terminais desejados do fragmento de DNAsão empregados nos primers 5' e 3' na PCR. Preferencialmente, fragmentos depolipeptídeos TAT e anticorpo anti-TAT compartilham pelo menos umaatividade biológica e/ou imunológica com o polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT nativo descrito na presente invenção.
Em realizações específicas, substituições conservadoras deinteresse são exibidas na Tabela 6 sob o título substituições preferidas.Caso essas substituições resultem em mudança da atividade biológica,mudanças mais substanciais, denominadas "exemplos desubstituições" na Tabela 6 ou conforme descrito adicionalmente abaixocom referência a classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtosselecionados.
Tabela 6
<table>table see original document page 185</column></row><table>ala; norleucina
Modificações substanciais da função ou identidade imunológicado anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT são atingidas por meio da seleçãode substituições que difiram significativamente de efeito sobre a manutenção(a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, talcomo na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ouhidrofobicidade da molécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeialateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com basenas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: Cys1 Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeias: gly, pro; e
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Substituições não conservadoras causarão a substituição de ummembro de uma dessas classes por outra classe. Esses resíduos substituídospodem também ser introduzidos nos sítios de substituição conservadores ou,de maior preferência, nos sítios restantes (não conservados).
As variações podem ser elaboradas utilizando métodosconhecidos na técnica, tais como mutagênese mediada por oligonucleotídeos(dirigida a sítio), varredura de alanina e mutagênese de PCR. Mutagênesedirigida a sítio (Carter et al, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al, NuciAcids Res., 10: 6487 (1987)), mutagênese de conjunto (Wells et al, Gene, 34:315 (1985)), mutagênese de seleção de restrição (Wells et al, Philos. Trans. R.Soe. London SerA, 317: 415 (1986)) ou outros métodos conhecidos podem serrealizados sobre o DNA clonado para produzir o DNA variante de anticorpoanti-TAT ou polipeptídeo TAT.Pode-se também empregar análise de aminoácidos de varredurapara identificar um ou mais aminoácidos ao longo de seqüência contígua.Dentre os aminoácidos de varredura pre feridos, encontram-se aminoácidosneutros relativamente pequenos. Esses aminoácidos incluem alanina, glicina,serina e cisteína. Alanina é tipicamente aminoácido de varredura preferidodentre este grupo porque elimina a cadeia lateral além do beta-carbono e émenos propensa a alterar a conformação de cadeia principal da variante(Cunningham e Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)). Alanina também étipicamente preferida por ser o aminoácido mais comum. Além disso, ela éfreqüentemente encontrada em posições enterrada e exposta (Creighton, TheProteins (W. H. Freeman & Co., Nova Iorque); Chothia1 J. Moi Biol., 150: 11(1976)). Caso a substituição de alanina não gere quantidades adequadas devariante, pode-se utilizar aminoácido isotérico.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção daconformação adequada do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT podetambém ser substituído, geralmente com serina, para aprimorar a estabilidadeoxidativa da molécula e evitar retícula aberrante. Por outro lado, ligação(ões)de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo anti-TAT ou polipeptídeoTAT para aumentar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo forfragmento de anticorpo, tal como fragmento de Fv).
Um tipo particularmente preferido de variante de substituiçãoenvolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável deanticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano ou humanizado).Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimentoadicional terá(ão) propriedades biológicas aprimoradas com relação aoanticorpo parental do qual é (são) gerada(s). Uma forma conveniente degeração dessas variantes de substituição envolve a maturação de afinidadeutilizando exibição de fagos. Resumidamente, vários sítios de regiãohipervariável (tais como seis a sete sítios) sofrem mutações para gerar todasas substituições amino possíveis em cada sítio. As variantes de anticorposgeradas desta forma são exibidas de maneira monovalente a partir departículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto de gene Illde M13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas por fago sãoselecionadas em seguida de acordo com a sua atividade biológica (tal comoafinidade de ligação), da forma descrita na presente invenção. A fim deidentificar possíveis sítios de regiões hipervariáveis para modificação,mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificarresíduos de regiões hipervariáveis que contribuem significativamente para aligação de antígenos. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisarestrutura de cristal do complexo de antígeno e anticorpo para identificar pontosde contato entre o anticorpo e polipeptídeo TAT humano. Esses resíduos decontato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com astécnicas elaboradas na presente invenção. Após a geração dessas variantes, oquadro de variantes é submetido a seleção conforme descrito na presenteinvenção e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais testesrelevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.
Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes deseqüência de aminoácidos do anticorpo anti-TAT são preparadas por meio deuma série de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, massem limitar-se ao isolamento a partir de fonte natural (no caso de variantes deseqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meio demutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou dirigida para sítio), mutagênesede PCR e mutagênese de conjunto de variante preparada anteriormente ouversão não variante do anticorpo anti-TAT.
H. Modificações de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT
Modificações covalentes de anticorpos anti-TAT e polipeptídeosTAT também são incluídas no escopo da presente invenção. Um tipo demodificação covalente inclui a reação de resíduos de aminoácidos desejadosde anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT com agente derivante orgânico queseja capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N ou C-terminais do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT. A derivação com agentesbifuncionais é útil, por exemplo, para reticular anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT em superfície ou matriz de suporte insolúvel em água parauso no método de purificação de anticorpos anti-TAT e vice versa. Os agentesreticulantes comumente utilizados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, N-hidroxissuccinimido ésteres, tais como ésteres comácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindodissuccinimidil ésteres tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano, e agentes taiscomo 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metila.
Outras modificações incluem a desamidação de resíduosglutaminila e asparaginila nos resíduos de glutamila e aspartilacorrespondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilaçãode grupos hidroxila de resíduos serila ou treonila, metilação dos grupos ex-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (Τ. E. Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., SãoFrancisco, págs. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal e amidação dequalquer grupo carboxila C-terminal.
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT incluído no escopo da presente invenção compreende a alteraçãodo padrão de glicosilação nativa do anticorpo ou polipeptídeo. "Alteração do padrãode glicosilação nativa" destina-se, para os propósitos do presente, a indicar aexclusão de uma ou mais porções carboidrato encontradas em polipeptídeo TAT ouanticorpo anti-TAT de seqüência nativa (seja por meio de remoção do sítio deglicosilação subjacente ou de exclusão da glicosilação por meios químicos e/ouenzimáticos) e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estejampresentes no polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT de seqüência nativa. Alémdisso, a expressão inclui alterações qualitativas na glicosilação das proteínasnativas, que envolvem alteração da natureza e das proporções das diversasporções carboidrato presentes.
A glicosilação de anticorpos e outros polipeptídeos é tipicamenteN-Iigada ou O-ligada. N-Iigado designa a ligação da porção de carboidrato àcadeia lateral de resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeosasparagino-X-serina e asparagino-X-treonina, em que X é qualqueraminoácido, com exceção de prolina, são as seqüências de reconhecimentopara a ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina.Desta forma, a presença de qualquer dessas seqüências de tripeptídeos empolipeptídeo cria potencial sítio de glicosilação. Glicosilação O-Iigada designa aligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a ácidohidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora também possam serutilizadas 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina.
A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT é convenientemente conseguida por meio da alteração daseqüência de aminoácidos, de forma que contenha uma ou mais dasseqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita por meio da adição de um ou maisresíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT original, ou substituição por ele (para sítios de glicosilação O-ligados). A seqüência de aminoácidos do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeoTAT pode ser opcionalmente alterada por meio de mudanças em nível de DNA,particularmente por meio de mutação do DNA que codifica o anticorpo anti-TATou polipeptídeo TAT em bases previamente selecionadas, de forma que sejamgerados códons que se traduzirão nos aminoácidos desejados.
Outro meio de aumentar a quantidade de porções de carboidratosobre o anticorpo anti-TAT ou o polipeptídeo TAT é por meio de acoplamentoquímico ou enzimático de glicosídeos ao polipeptídeo. Estes métodos sãodescritos na técnica, tal como em WO 87/05330, publicada em 11 de setembrode 1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981).
A remoção de carboidratos presentes sobre o anticorpo anti-TATou polipeptídeo TAT pode ser realizada química ou enzimaticamente, ou pormeio de substituição mutacional de códons que codificam resíduos deaminoácidos que servem de alvos para a glicosilação. Métodos dedesglicosilação química são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo,por Hakimuddin et al, Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) e por Edge et ai,Anal. Biochem., 118: 131 (1981). A divisão enzimática de porções decarboidrato sobre polipeptídeos pode ser atingida por meio do uso de umasérie de endo e exo-glicosidases, conforme descrito por Thotakura et al, Meth.Enzymoi., 138: 350 (1987).
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT compreende a ligação do anticorpo ou polipeptídeo a um dentreuma série de polímeros não proteináceos, tais como polietileno glicol (PEG),polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da forma descrita nas Patentes US4.640.835, U S4 .496.689, U S4 .301.144, US 4.670.417, US4.791.192 ou US4.179.337. O anticorpo ou polipeptídeo pode também ser capturado emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de acumulação oupolimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ougelatina e microcápsulas de póli(metilmetácrilato), respectivamente) em sistemas defornecimento de fármacos coloidais (por exemplo, lipossõmos, microesferas dealbumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões.Estas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceuticai Sciences, 16a edição,Oslo, Α., Ed. (1980).
O anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT de acordo com apresente invenção pode também ser modificado de maneira a formar moléculasquiméricas que compreendem anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT fundidoa outra seqüência de aminoácidos ou polipeptídeo heteróloga.
Em uma realização, essa molécula quimérica compreende fusãodo anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT com polipeptídeo marcadores quefornecem epítopo ao qual pode ligar-se seletivamente anticorpo anti-marcador.O marcador do epítopo geralmente é colocado no terminal amino ou carboxilado anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT. A presença dessas formasmarcadas com epítopo do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT pode serdetectada utilizando anticorpo contra o polipeptídeo marcador. Além disso, ofornecimento do marcador do epítopo permite que o anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT seja facilmente purificado por meio de purificação deafinidade utilizando anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidadeque se ligue ao marcador do epítopo. Diversos polipeptídeos marcadores eseus anticorpos correspondentes são bem conhecidos na técnica. Exemplosincluem marcadores de póli-histidina (póli-his) ou póli-histidina-glicina (póli-his-gli); o polipeptídeo marcador flu HA e seu anticorpo 12CA5 (Field et al, Mol.Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)); o marcador c-myc e seus anticorpos 8F9,3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan et al, Molecularand CelIuIarBioIogy, 5: 3610-3616 (1985)) e o marcador glicoproteína D (gD) do vírus simplex da herpes eseu anticorpo (Paborsky et al, Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)).Outros polipeptídeos marcadores incluem o peptídeo Flag (Hopp et al,BioTechnoIogy, 6: 1204-1210 (1988)); o peptídeo epítopo KT3 (Martin et al,Science, 255: 192-194 (1992)); peptídeo epítopo α-tubulina (Skinner et al, J.Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)); e o marcador de peptídeo de proteína10 de gene T7 (Lutz-Freyermuth et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 87: 6393-6397(1990)).
Em realização alternativa, a molécula quimérica podecompreender fusão do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT comimunoglobulina ou região específica de imunoglobulina. Para forma bivalenteda molécula quimérica (também denominada "imunoadesina"), essa fusãopoderá ser para a região Fc de molécula IgG. As fusões Ig incluempreferencialmente a substituição de forma solúvel (com domínio detransmembrana excluído ou desativado) de anticorpo anti-TAT ou polipeptídeoTAT no lugar de pelo menos uma região variável em molécula lg. Emrealização particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui asregiões de articulação, CH2 e CH3 ou de articulação, CHi, CH2 e CH3 demolécula IgGI. Para a produção de fusões de imunoglobulina, vide também aPatente US 5.428.130, emitida em 27 de junho de 1995.
I. Preparação de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT
A descrição abaixo refere-se principalmente à produção deanticorpos anti-TAT e polipeptídeos TAT por meio da cultura de célulastransformadas ou transfectadas com vetor que contém ácido nucléico quecodifica anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TAT. Contempla-se, naturalmente,que métodos alternativos, que são bem conhecidos na técnica, podem serempregados para preparar anticorpos anti-TAT e polipeptídeos TAT. Aseqüência de aminoácidos apropriada, ou partes dela, pode ser produzida, porexemplo, por meio de síntese direta de peptídeos utilizando métodos de fasesólida (vide, por exemplo, Stewart et al, Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H.Freeman Co., São Francisco CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 149-2154 (1963)). A síntese de proteínas in vitro pode ser realizada utilizandométodos manuais ou automaticamente. Pode-se atingir síntese automatizadautilizando, por exemplo, Sintetizador de Peptídeos da Applied Biosystems(Foster City CA) utilizando instruções do fabricante. Diversas partes doanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT podem ser quimicamente sintetizadasseparadamente e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticospara produzir o anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT desejado.
1. Isolamento de DNA que codifica polipeptídeo TAT ouanticorpo anti-TAT
DNA que codifica anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT podeser obtido a partir de biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido que seacredita possuir o mRNA de polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT e oexpressa em nível detectável. Conseqüentemente, DNA de polipeptídeo TATou anticorpo anti-TAT humano pode ser convenientemente obtido a partir debiblioteca de cDNA preparada a partir de tecido humano. O gene que codificapolipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT pode também ser obtido a partir debiblioteca genômica ou por meio de procedimentos sintéticos conhecidos (taiscomo síntese de ácidos nucléicos automatizada).
Bibliotecas podem ser selecionadas com sondas (tais comooligonucleotídeos com pelo menos cerca de vinte a oitenta bases) projetadaspara identificar o gene de interesse ou a proteína por ele codificada. A seleçãodo cDNA ou biblioteca genômica com a sonda selecionada pode ser conduzidautilizando procedimentos padrão, tais como os descritos em Sambrook et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova Iorque: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989). Meio alternativo de isolar o gene que codificaanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT é o uso de metodologia PCR(Sambrook et al, acima; Dieffenbach et al, PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)).
Métodos de seleção de biblioteca de cDNA são bem conhecidosna técnica. As seqüências de oligonucleotídeos selecionadas como sondasdeverão possuir comprimento suficiente e ser suficientemente não ambíguaspara minimizar falsos positivos. O oligonucleotídeo é preferencialmentemarcado de forma a poder ser detectado mediante hibridização em DNA nabiblioteca sendo selecionada. Métodos de marcação são bem conhecidos natécnica e incluem o uso de radiomarcadores como ATP marcado com 32P1biotinilação ou marcação com enzimas. As condições de hibridização, queincluem estringência moderada e alta estringência, são fornecidas emSambrook et al, acima.
As seqüências identificadas nesses métodos de seleção debibliotecas podem ser comparadas e alinhadas com outras seqüências conhecidasdepositadas e disponíveis em bancos de dados públicos tais como GenBank eoutros bancos de dados de seqüências particulares. A identidade de seqüência(em nível de aminoácidos ou nucleotídeos) em regiões definidas da molécula ou aolongo da seqüência de comprimento total pode ser determinada utilizando métodosconhecidos na técnica e conforme descrito na presente invenção.
Ácido nucléico que contém seqüência codificadora de proteínaspode ser obtido selecionando-se cDNA selecionado ou bibliotecas genômicas,utilizando a seqüência de aminoácidos deduzida descrita na presente invençãopela primeira vez e, se necessário, utilizando procedimentos de extensão deprimers convencionais conforme descrito em Sambrook et al, acima, paradetectar precursores e intermediários de processamento de mRNA que possamnão haver sofrido transcrição reversa em cDNA.
2. Seleção e transformação de células hospedeirasAs células hospedeiras são transfectadas ou transformadas comvetores de clonagem ou expressão descritos na presente invenção para aprodução de polipeptídeos TAT ou anticorpos anti-TAT e cultivadas em meiosnutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução depromotores, seleção de transformadores ou amplificação dos genes quecodificam as seqüências desejadas. As condições de cultivo, tais como meios,temperatura, pH e similares, podem ser selecionadas pelos técnicos noassunto sem experimentação indevida. De forma geral, princípios, protocolos emétodos práticos para maximizar a produtividade de cultivos celulares podemser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. J.Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook etal, acima.
Métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação decélulas procarióticas são conhecidos dos técnicos comuns no assunto, tais comoCaCh, CaPO4, mediada por Iipossomos e eletroporação. Dependendo da célulahospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando métodos padrãoapropriados para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto decálcio, conforme descrito em Sambrook et al, acima, ou eletroporação, é geralmenteutilizado para procariotes. Infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada paraa transformação de certas células vegetais, conforme descrito por Shaw etal, Gene,23: 315 (1983) e WO 89/05859, publicada em 29 de junho de 1989. Para células demamíferos sem essas paredes celulares, pode ser empregado o método deprecipitação de fosfato de cálcio de Graham e van der Eb1 Virology, 52: 456-457(1978). Aspectos gerais de transfecções de sistemas hospedeiros de células demamíferos foram descritos na Patente US 4.399.216. Transformações em levedurasão tipicamente conduzidas de acordo com o método de Van Solingen et al, J.Bact., 130: 946 (1977) e Hsiao et al, Proc. Natl. Acad. Sei. (U. S. A.), 76: 3829(1979). Podem também ser utilizados, entretanto, outros métodos de introdução deDNA em células, tais como por meio de microinjeção nuclear, eletroporação, fusãode protoplastas bacterianos com células intactas, ou policátions, tais como polibrenoe poliornitina. Para diversos métodos de transformação de células de mamíferos,vide Keown et al, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) e Mansour et al,Nature, 336: 348-352 (1988).
Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão doDNA nos vetores do presente incluem células procarióticas, de levedura oueucarióticas superiores. Os procariotes apropriados incluem, mas sem limitar-se a eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos,como Enterobactérias, tais como E. coli. Várias linhagens de E. coli sãodisponíveis ao público, tais como E. coli K12 linhagem MM294 (ATCC 31.446);E. coliX1776 (ATCC 31.537); E. coli linhagem W3110 (ATCC 27.325) e K5 772(ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticas apropriadas incluementerobactérias tais como Escherichia, por exemplo E. coli, Enterobacter,Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo Salmonella typhimurium,Serratia, por exemplo Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli taiscomo B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iicheniformis 41P descritoem DD 266.710, publicada em doze de abril de 1989), Pseudomonas tais comoP. aeruginosa e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos e nãolimitadores. A linhagem W3110 é hospedeiro parental ou hospedeiroparticularmente preferido porque é linhagem hospedeira comum parafermentações de produtos de DNA recombinante. Preferencialmente, a célulahospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. A linhagemW3110, por exemplo, pode ser modificada para efetuar mutação genética nosgenes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, com exemplosdesses hospedeiros incluindo E. coli W3110 linhagem 1A2, que contém ogenótipo completo tonA; E. coli W3110 linhagem 9E4, que contém o genótipocompleto tonA ptr3; E. coli W3110 linhagem 27C7 (ATCC 55.244), que contémo genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; E. coliW3110 linhagem 37D6, que contém o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15(argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG karf; E. coli W3110 linhagem 40B4, que éa linhagem 37D6 com mutação de exclusão degP não resistente a canamicina;e linhagem de E. coli que contém protease periplasmática mutante descrita naPatente US 4.946.783, emitida em sete de agosto de 1990. Alternativamente,métodos de clonagem in vitro tais como PCR ou outras reações de polimerasede ácido nucléico são apropriados.Anticorpo de comprimento total, fragmentos de anticorpos eproteínas de fusão de anticorpos podem ser produzidos em bactérias,particularmente quando a função efetora de Fc e glicosilação não foremnecessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico for conjugado a agentecitotóxico (tal como toxina) e o imunoconjugado demonstrar por si próprioeficácia na destruição das células tumorosas. Anticorpos de comprimento totalapresentam maior meia vida em circulação. A produção em E. coli é maisrápida e mais eficiente com relação ao custo. Para a expressão de fragmentosde anticorpos e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, US 5.648.237(Carter et al), US 5.789.199 (Joly et al) e US 5.840.523 (Simmons et aí), quedescrevem a região de início de tradução (TIR) e seqüências sinal paraotimizar a expressão e secreção, e estas patentes são incorporadas aopresente como referência. Após a expressão, o anticorpo é isolado da pasta decélulas de E. coli em fração solúvel e pode ser purificado, por exemplo, atravésde coluna de proteína A ou G, dependendo do isotipo. A purificação final podeser conduzida de forma similar ao processo de purificação de anticorpoexpresso, por exemplo, em células de CHO.
Além dos procariotes, micróbios eucarióticos tais como fungosfilamentosos ou levedura são hospedeiros de expressão ou clonagemapropriados para vetores codificadores de anticorpos anti-TAT ou polipeptídeosTAT. Saccharomyces cerevisiae é microorganismo hospedeiro eucarióticoinferior comumente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe(Beach e Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139.383, publicada em dois demaio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente US 4.943.529; Fleer et al,Bio/Teehnology, 9: 968-975 (1991)), tais como K. laetis (MW98-8C, CBS683,CBS4574; Louvencourt et al, J. Baeteriol., 154 (2): 737-742 (1983)), K. fragilis(ATCC 12.424), K. bulgarieus (ATCC 16.045), K. wiekeramii (ATCC 24.178), K.waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al,Bio/Technology, 8: 135 (1990)), Κ. thermotolerans e Κ. marxianus; yarrowia (EP402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et ai, J. Basic Microbiol.,28: 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurosporacrassa (Case et al, Proc. NatI. Acad. Sei. U. S. A., 76: 5259-5263 (1979));Schwanniomyces tal como Schwanniomyces oeeidentalis (EP 394.538,publicada em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentosos, tais comoNeurospora, Penieiilium, Tolypoeiadium (WO 91/00357, publicada em dez dejaneiro de 1991) e hospedeiros Aspergilius, tais como A. nidulans (Ballance etal, Bioehem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn et al, Gene,26: 205-221 (1983); Yelton et al, Proc. Λ/aí/. Acad. Sei. U. S. A., 81: 1470-1474(1984)) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)). Levedurasmetilotrópicas são apropriadas na presente invenção e incluem, mas semlimitar-se a levedura capaz de crescimento sobre metanol selecionada a partirdos gêneros que consistem de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia,Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicasque são exemplos desta classe de leveduras pode ser encontrada em C.Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
As células hospedeiras apropriadas para a expressão deanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT glicosilado são derivadas deorganismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluemcélulas d e insetos tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem comocélulas vegetais, tais como culturas celulares de algodão, milho, batata, soja,petúnia, tomate e fumo. Foram identificadas numerosas linhagens bacilovirais,variantes e células hospedeiras de insetos permissivos correspondentes dehospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca dafruta) e Bombyx mori. Uma série de linhagens virais para transfecção édisponível ao público, tais como a variante L-1 de Autographa californica NPV ea linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV e esses vírus podem ser utilizadoscomo o vírus do presente, de acordo com a presente invenção, particularmentepara transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
O interesse foi maior, entretanto, em células de vertebrados e apropagação de células de vertebrados na cultura (cultura de tecidos) tornou-seprocedimento rotineiro. Exemplos de linhagens celulares de hospedeirosmamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40(COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al,J. Gen. Viroi 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCCCCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc.Natl. Acad. Sei. U. S. A. 77: 4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4,Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCCCRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2),células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo(BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário decamundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al, ArmaisΝ. Y. Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e linhagem dehepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores declonagem ou expressão descritos acima para a produção de anticorpos anti-TAT oupolipeptídeos TAT e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificadosconforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformadores ouamplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas.3. Seleção e uso de vetor reproduzívelO ácido nucléico (tal como cDNA ou DNA genômico) que codificaanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT pode ser inserido em vetor reproduzívelpara clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Diversos vetores sãodisponíveis ao público. O vetor pode estar, por exemplo, na forma deplasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A seqüência de ácido nucléicoapropriada pode ser inserida no vetor por meio de uma série de procedimentos.De forma geral, DNA é inserido em sítio(is) de endonuclease de restriçãoapropriado(s) utilizando métodos conhecidos na técnica. Os componentes devetor geralmente incluem, mas sem limitar-se a um ou mais dentre seqüênciade sinal, origem de reprodução, um ou mais genes marcadores, elementoamplificador, promotor e seqüência de término de transcrição. A construção devetores apropriados que contêm um ou mais destes componentes empregatécnicas de ligação padrão que são conhecidas dos técnicos no assunto.
O TAT pode ser produzido de forma recombinante não apenasdiretamente, mas também como polipeptídeo de fusão com polipeptídeoheterólogo, que pode ser seqüência sinal ou outro polipeptídeo que possui sítiode divisão específico no terminal N do polipeptídeo ou proteína madura. Deforma geral, a seqüência sinal pode ser componente do vetor ou pode ser umaparte do DNA que codifica polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT que éinserido no vetor. A seqüência sinal pode ser seqüência sinal procarióticoselecionada, por exemplo, a partir do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase,Ipp ou líderes de enterotoxina Il estáveis ao calor. Para secreção de leveduras,a seqüência sinal pode ser, por exemplo, o líder de invertase de levedura, líderfator alfa (que inclui líderes fatores α de Saccharomyces e Kluyveromyces),este último descrito na Patente US 5.010.182) ou líder de fosfatase ácida, olíder de glucoamilase de C. albicans (EP 362.179, publicada em quatro de abrilde 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646, publicada em quinze denovembro de 1990. Em expressão de células de mamíferos, seqüências sinalde mamíferos podem ser utilizadas para dirigir a secreção da proteína, taiscomo seqüências sinal de polipeptídeos secretados da mesma espécie ou deespécies relacionadas, bem como líderes de secreção viral.
Tanto os vetores de expressão quanto de clonagem contêm umaseqüência de ácido nucléico que permite que o vetor se reproduza em uma oumais células hospedeiras selecionadas. Essas seqüências são bem conhecidaspara uma série de bactérias, levedura e vírus. A origem de reprodução doplasmídeo pBR322 é apropriada para a maior parte das bactérias gram-negativas, a origem de plasmídeo 2μ é apropriada para levedura e diversasorigens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetoresde clonagem em células de mamíferos.
Os vetores de clonagem e de expressão conterão tipicamentegene de seleção, também denominado marcador selecionável. Os genes deseleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticosou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina;(b) complementam deficiências auxotróficas; ou (c) fornecem nutrientesfundamentais não disponíveis a partir de meios complexos, tais como o genecodificador de D-alanino racemase para Bacilli.
Exemplo de marcadores selecionáveis apropriados para célulasde mamíferos são os que permitem a identificação de células competentespara absorção do ácido nucléico codificador de polipeptídeo TAT ou anticorpoanti-TAT, tal como DHFR ou timidino quinase. Célula hospedeira apropriada,ao empregar-se DHFR do tipo selvagem, é a linhagem celulares de CHO comdeficiência na atividade de DHFR, preparada e propagada conforme descritopor Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 77: 4216 (1980). Gene deseleção apropriado para uso em levedura é o gene trpl presente no plasmídeode levedura YRp7 (Stinchcomb et al, Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et a/,Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al, Gene, 10: 157 (1980)). O gene trplfornece marcador de seleção para linhagem mutante de levedura que nãopossui a capacidade de crescimento em triptofano, tal como ATCC n° 44076 ouPEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)).
Os vetores de expressão e de clonagem normalmente contêmpromotor ligado operativamente à seqüência de ácido nucléico codificadora depolipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT para dirigir a síntese de mRNA. Sãobem conhecidos promotores reconhecidos por uma série de célulashospedeiras potenciais. Promotores apropriados para uso com hospedeirosprocarióticos incluem os sistemas promotores de β-lactamase e Iactose (Changet al, Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al, Nature, 281: 544 (1979)),fosfatase alcalina, sistema promotor de triptofano a (trp) (Goeddel, NucleicAcids Res., 8: 4057 (1980); EP 36.776) e promotores híbridos tais como opromotor tac (deBoer et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 80: 21-25 (1983)).Os promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão seqüênciaShine-Dalgarno (S. D.) ligada operativamente ao DNA codificador do anticorpoanti-TAT ou polipeptídeo TAT.
Exemplos de seqüências promotoras apropriadas para uso comhospedeiros de leveduras incluem os promotores para 3-fosfogIicerato quinase(Hitzeman et al, J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas(Hess et al, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase,hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfatoisomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase,fosfoglicose isomerase e glucoquinase.
Outros promotores de leveduras, que são promotores indutíveisque apresentam a vantagem adicional de transcrição controlada por condiçõesde crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2,isocitocroma C, fosfatase ácida, enzimas degradadoras associadas aometabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose.Os vetores apropriados e promotores para uso na expressão de levedura sãoadicionalmente descritos em EP 73.657.
A transcrição de polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT a partir devetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, porpromotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma, vírusda catapora (UK 2.211.504 publicada em cinco de julho de 1989), adenovírus (talcomo Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário,citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40), depromotores de mamíferos heterólogos, tais como o promotor de actina ou promotorde imunoglobulina, e de promotores de choque de calor, desde que essespromotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
A transcrição de DNA codificador do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT por eucariotes superiores pode ser aumentada por meio dainserção de seqüência amplificadora no vetor. Os amplificadores sãoelementos de DNA com ação eis, normalmente cerca de 10 a 300 bp, queagem sobre promotor para aumentar a sua transcrição. Muitas seqüênciasamplificadoras são agora conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina,elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, entretanto, utilizar-se-á amplificador de vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem oamplificador SV40 do lado posterior da origem de reprodução (bp 100-270), oamplificador promotor precoce de citomegalovírus, o amplificador de poliomado lado posterior da origem de reprodução e amplificadores de adenovírus. Oamplificador pode ser dividido no vetor em posição 5' ou 3' para a seqüênciacodificadora de polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT, mas encontra-selocalizado preferencialmente em sítio a 5' do promotor.
Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiraseucarióticas (células de leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, sereshumanos ou nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterãoas seqüências necessárias para o término da transcrição e estabilização domRNA. Essas seqüências são normalmente disponíveis a partir das regiõesnão traduzidas 5' e, ocasionalmente, 3' dos DNAs ou cDNAs virais oueucarióticos. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos naforma de fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do mRNAcodificador de anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT.
Ainda outros métodos, vetores e células hospedeiras apropriadaspara adaptação à síntese de anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT em culturade células de vertebrados recombinantes são descritos em Gething et al,Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al, Nature, 281: 40-46 (1979); EP117.060; e EP 117.058.
4. Cultura das células hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para a produção do anticorpoanti-TAT ou polipeptídeo TAT de acordo com a presente invenção podem sercultivadas em uma série de meios. Meios disponíveis comercialmente, taiscomo F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640(Sigma) e Meio de Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) sãoapropriados para a cultura das células hospedeiras. Além disso, qualquer umdos meios descritos em Ham et al, Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al, Anal.Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US 4.767.704, US 4.657.866, US4.927.762, US 4.560.655 ou US 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ouPatente Norte-Americana Ref. 30.985, podem ser utilizados como meios decultura ρ ara as células hospedeiras. Qu alquer um desses meios pode sersuplementado conforme o necessário com hormônios e/ou outros fatores decrescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimentoepidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato),tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina),antibióticos (tais como fármaco GENTAMYCIN®), elementos de traço (definidoscomo compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finaisna faixa micromolar) e glicose ou fonte de energia equivalente. Qualquer outrosuplemento necessário pode também ser incluído em concentraçõesapropriadas que seriam conhecidas dos técnicos no assunto. As condições decultura, tais como temperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormentecom a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para ostécnicos comuns no assunto.
5. Detecção da expressão/amplificação genética
A expressão e/ou amplificação genética pode ser medida em amostradiretamente, por exemplo, por meio de Southem Blot, Northem Blot convencionalpara quantificar a transcrição de mRNA (Thomas, Pmc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 77:5201-5205 (1980)), dot blot (análise de DNA) ou hibridização in situ, utilizandosonda adequadamente marcada, com base nas seqüências fornecidas na presenteinvenção. Alternativamente, podem ser empregados anticorpos que podemreconhecer duplex específicos, incluindo duplex de DNA, duplex de RNA e duplexhíbridos de DNA-RNA ou duplex de DNA e proteína. Os anticorpos, por sua vez,podem ser marcados e o teste pode ser conduzido com o duplex ligado a superfície,de forma que, mediante a formação de duplex sobre a superfície, a presença deanticorpo ligado ao duplex possa ser detectada.
A expressão genética, alternativamente, pode ser medida pormeio de métodos imunológicos, tais como manchas imunohistoquímicas decélulas ou seções de tecidos e teste de cultura celular ou fluidos do corpo, paraquantificar diretamente a expressão de produto genético. Os anticorpos úteispara manchas imunohistoquímicas e/ou teste de fluidos de amostra podem sermonoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero.Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra polipeptídeoTAT de seqüência nativa ou contra peptídeo sintético com base nasseqüências de DNA fornecidas na presente invenção ou contra seqüênciaexógena fundida a DNA de TAT e que codifica epítopo de anticorpo específico.6. Purificação de anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TATFormas de anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TAT podem serrecuperadas de meio de cultura ou de Iisatos de células hospedeiras. Se ligadopor membrana, ele pode ser liberado da membrana utilizando solução dedetergente apropriada (tal como Triton-X 100) ou por meio de divisãoenzimática. Células empregadas na expressão de anticorpo anti-TAT epolipeptídeo TAT podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos,tais como ciclo de congelamento e descongelamento, sonicação, rompimentomecânico ou agentes Iisantes celulares.
Pode-se desejar purificar anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TAT apartir de proteínas de células recombinantes ou polipeptídeos. Os procedimentos aseguir são exemplos de procedimentos de purificação apropriados: fracionamentosobre coluna de troca iônica; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa;cromatografia sobre sílica ou sobre resina de troca de cátions, tal como DEAE;cromatoconcentração; SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio; filtragem degel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose pararemover contaminantes tais como IgG; e colunas quelantes metálicas para ligarformas marcadas por epítopo do anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TAT. Váriosmétodos de purificação de proteínas podem ser empregados e esses métodos sãoconhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods inEnzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and PracticelSpringer-Verlag, Nova Iorque (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s)dependerá(ão), por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e doanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT específico produzido.
Ao utilizar-se técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido de forma intracelular, no espaço periplasmático ou secretadodiretamente para o meio. Caso o anticorpo seja produzido de forma intracelular,como primeira etapa, os fragmentos particulados, sejam eles célulashospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por meio decentrifugação ou ultrafiltragem. Carter et al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)descrevem procedimento de isolamento de anticorpos que são secretados parao espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é derretidana presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonila(PMSF) ao longo de cerca de trinta minutos. Fragmentos celulares podem serremovidos por meio de centrifugação. Quando o anticorpo for secretado para omeio, sobrenadantes desses sistemas de expressão são geralmenteconcentrados em primeiro lugar utilizando filtro de concentração de proteínasdisponível comercialmente, tal como unidade de ultrafiltragem Amicon ouMillipore Pellicon. Inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído emqualquer uma das etapas acima para inibir a proteólise e podem ser incluídosantibióticos para evitar o crescimento de contaminantes imprevistos.
A composição de anticorpo preparada a partir das células pode serpurificada utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese emgel, diálise e cromatografia de afinidade, em que cromatografia de afinidade é atécnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como Iigante deafinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc deimunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína A pode ser utilizadapara purificar anticorpos que se baseiem em cadeias pesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas(Lindmark et aí, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Recomenda-se Proteína G paratodos os isotipos de camundongos e para γ3 humano (Guss et al, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual é ligado o Iigante de afinidade é mais freqüentementeagarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis,tais como vidro de poros controlados ou póli(estirenodivinil)benzeno, permitemvelocidades de fluxo mais altas e tempos de processamento mais curtos que o quepode ser atingido com agarose. Quando o anticorpo compreender domínio Ch3, aresina Bakerbond ABX® (J. T. Baker1 Phillipsburg NJ) é útil para purificação. Outrastécnicas de purificação de proteínas, tais como o fracionamento sobre coluna detroca iônica, precipitação em etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia sobresílica, cromatografia sobre heparina SEPHAROSE®, cromatografia sobre resina detroca de ânions ou cátions (tal como coluna de ácido poliaspártico),cromatoconcentração, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônia, tambémsão disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.
Após qual(is)quer etapa(s) de purificação preliminar(es), a misturaque compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetidaa cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH, utilizando tampão deeluição sob pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixasconcentrações de sais (por exemplo, cerca de 0 a 0,25 M de sal).
J. Formulações Farmacêuticas
Formulações terapêuticas dos anticorpos anti-TAT, oligopeptídeosde ligação de TAT, moléculas orgânicas de ligação de TAT e/ou polipeptídeosTAT utilizados de acordo com a presente invenção são preparadas paraarmazenagem por meio de mistura de anticorpo, polipeptídeo, oligopeptídeo oumolécula orgânica que possui o grau desejado de pureza com veículos,excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), naforma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientesou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nas dosagens econcentrações empregadas e incluem tampões tais como acetato, Tris1 fosfato,citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluem ácido ascórbico emetionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio,cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcoolfenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-cresol);polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos);proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeroshidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina,glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos,dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas;agentes quelantes tais como EDTA; tonificantes, tais como trealose e cloretode sódio; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;tensoativo, tal como polissorbato; contra-íons formadores de sais tais comosódio; complexos metálicos (tais como complexos de proteína e Zn); e/outensoativos não tônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol(PEG). O anticorpo compreende preferencialmente o anticorpo emconcentração de 5 a 200 mg/ml, preferencialmente 10 a 100 mg/ml.
As formulações do presente podem também conter mais de umcomposto ativo, conforme o necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não seprejudiquem entre si. Além de anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo de ligação deTAT ou molécula orgânica de ligação de TAT, por exemplo, pode ser desejávelincluir na formulação anticorpo adicional, tal como segundo anticorpo anti-TATque liga epítopo diferente sobre o polipeptídeo TAT ou anticorpo para algumoutro alvo, tal como fator de crescimento que afete o crescimento do câncerespecífico. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode compreenderainda agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citoquina, agente inibidor docrescimento, agente anti-hormonal e/ou cardioprotetor. Essas moléculasencontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades quesão eficazes para o propósito pretendido.
Os ingredientes ativos podem também ser capturados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por métodos de aglutinação ou porpolimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ougelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, emsistemas de fornecimento de fármacos coloidais (tais como lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington'sPharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed. (1980).
Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada.Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham oanticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes oumicrocápsulas. Exemplos de matrizes com liberação prolongada incluempoliésteres, hidrogéis (tais como póli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool(poli)vinílico, polilactidas (Patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de γ-etila, etileno vinil acetato não degradável,copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tais como LUPRONDEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico eácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido póli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a serem utilizadas para administração in vivodevem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através demembranas de filtragem estéreis.
K. Diagnóstico e tratamento com anticorpos anti-TAT,oliqopeptídeos de ligação de TAT e moléculas orgânicas de ligação de TAT
Para determinar a expressão de TAT no câncer, são disponíveisdiversos testes de diagnóstico. Em uma realização, a superexpressão depolipeptídeo TAT pode ser analisada por meio de imunohistoquímica (IHC).Seções de tecidos embutidas em parafina de biópsia de tumor podem sersubmetidas ao teste de IHC de acordo com critérios de intensidade demanchas de proteína TAT a seguir:Nota 0: não se observa nenhuma mancha ou a mancha demembranas é observada em menos de 10% de células tumorosas.
Nota 1+: é detectada mancha de membrana fraca/poucoperceptível em mais de 10% das células tumorosas. As células somente sãomanchadas em parte da sua membrana.
Nota 2+: é observada mancha de membrana completa fraca amoderada em mais de 10% das células tumorosas.
Nota 3+: é observada mancha de membrana completa moderadaa forte em mais de 10% das células tumorosas.
Os tumores com notas 0 ou 1+ para expressão de polipeptídeoTAT podem ser caracterizados como não superexpressando TAT1 enquanto ostumores com notas 2+ ou 3+ podem ser caracterizados comosuperexpressando TAT.
Alternativa ou adicionalmente, testes FISH tais como INFORM®(vendido pela Ventana1 Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois) podem serconduzidos sobre tecido tumoroso embutido em parafina e fixo por formalina,para determinar a extensão (se houver) da superexpressão de TAT no tumor.
A amplificação ou superexpressão de TAT pode ser avaliadautilizando teste de diagnóstico in vivo, por exemplo, por meio da administraçãode molécula (tal como anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica) que liguea molécula a ser detectada e seja marcada com marcador detectável (tal comoisótopo radioativo ou marcador fluorescente) e varredura externa do pacientepara localização do marcador.
Conforme descrito acima, os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeose moléculas orgânicas de acordo com a presente invenção possuem diversasaplicações não terapêuticas. Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos emoléculas orgânicas de acordo com a presente invenção podem ser úteis parao diagnóstico e avaliação de cânceres que expressam polipeptídeo TAT (talcomo em formação de radioimagens). Os anticorpos, oligopeptídeos emoléculas orgânicas também são úteis para a purificação ou imunoprecipitaçãode polipeptídeo TAT de células, para detecção e quantificação de polipeptídeoTAT in vitro, por exemplo em ELISA ou Western Blot, para matar e eliminarcélulas que expressam TAT a partir de população de mistura de células comoetapa na purificação de outras células.
Atualmente, dependendo do estágio do câncer, o tratamento docâncer envolve uma ou uma combinação das terapias a seguir: cirurgia pararemover o tecido canceroso, terapia de radiação e quimioterapia. A terapia comanticorpos anti-TAT, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas pode serespecialmente desejável em pacientes mais idosos que não tolerem bem atoxicidade e os efeitos colaterais da quimioterapia e em doenças metastáticasem que a terapia de radiação apresenta utilidade limitada. Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos e moléculas orgânicas direcionadoras de tumores deacordo com a presente invenção são úteis para reduzir cânceres queexpressem TAT mediante diagnóstico inicial da doença ou durantereincidência. Para aplicações terapêuticas, o anticorpo anti-TAT, oligopeptídeoou molécula orgânica pode ser utilizado isoladamente ou em terapia decombinação, por exemplo, com hormônios, antiangiogenes ou compostosradiomarcados, ou com cirurgia, crioterapia e/ou radioterapia. Pode-seadministrar tratamento com anticorpos anti-TAT, oligopeptídeo ou moléculaorgânica em conjunto com outras formas de terapia convencional, sejaconsecutivamente com a terapia convencional, antes ou depois desta.Fármacos quimioterapêuticas tais como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL®(palictaxel), estramustina e mitoxantrona são utilizadas no tratamento decâncer, particularmente em pacientes com bons riscos. Neste método deacordo com a presente invenção para o tratamento ou redução de câncer,pode-se administrar anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica aopaciente com câncer em conjunto com tratamento com um ou mais dosagentes quimioterapêuticos acima. Contempla-se, particularmente, terapia decombinação com palictaxel e derivados modificados (vide, por exemplo, EP0600517). O anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica seráadministrado com dose terapeuticamente eficaz do agente quimioterapêutico.
Em outra realização, o anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânicaé administrado em conjunto com quimioterapia, para aumentar a atividade eeficácia do agente quimioterapêutico, tal como paclitaxel. Phy sician's DeskReference (PDR) descreve dosagens desses agentes que foram utilizadas notratamento de diversos cânceres. O regime de dosagem e as dosagens dessesfármacos quimioterapêuticos mencionados acima que são terapeuticamenteeficazes dependerão do câncer específico sendo tratado, da extensão dadoença e de outros fatores familiares para o médico especializado e podem serdeterminados pelo médico.
Em realização específica, é administrado ao paciente umconjugado que compreende anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou moléculaorgânica conjugada a agente citotóxico. Preferencialmente, o imunoconjugadoligado à proteína TAT é internalizado pela célula, resultando em maior eficáciaterapêutica do imunoconjugado para matar a célula cancerosa à qual se liga.
Em realização preferida, o agente citotóxico dirige-se ou interfere com o ácidonucléico na célula cancerosa. Exemplos desses agentes citotóxicos sãodescritos acima e incluem maitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases eendonucleases de DNA.
Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos, moléculas orgânicas ouseus conjugados de toxina são administrados a pacientes humanos, de acordocom métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo,na forma de mistura ou de infusão contínua ao longo de período de tempo, porvia intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea,intraarticular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou inalatória. Prefere-seadministração intravenosa ou subcutânea do anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica.
Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com aadministração do anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica. Aadministração combinada inclui coadministração, utilizando formulaçõesseparadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutivaem qualquer ordem, em que há preferencialmente período de tempo em queambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividadesbiológicas. Preferencialmente, essa terapia combinada resulta em efeitoterapêutico sinérgico.
Pode também ser desejável combinar a administração do(s)anticorpo(s) anti-TAT, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas com aadministração de anticorpo dirigido a outro antígeno tumoroso associado aocâncer específico.
Em outra realização, o método de tratamento terapêutico deacordo com a presente invenção envolve a administração combinada deanticorpo(s) anti-TAT, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas e um ou maisagentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores do crescimento, incluindo acoadministração de coquetéis de agentes quimioterapêuticos diferentes. Osagentes quimioterapêuticos incluem fosfato de estramustina, prednimustina,cisplatina, 5-fluoroacil, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiuréia e hidroxiuréiataxanos (tais como paclitaxel e doxetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina.Cronogramas de preparação e dosagem para esses agentesquimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções dosfabricantes ou conforme determinado empiricamente pelos técnicos noassunto. Cronogramas de preparação e dosagem para essa quimioterapiatambém são descritos em Chemotherapy Service, Ed. M. C. Perry, Williams &Wilkins, Baltimore MD (1992).
O anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pode sercombinado com composto anti-hormonal; por exemplo, composto anti-estrógeno tal como tamoxifen; anti-progesterona tal como onapristona (vide EP616.812); ou anti-andrógeno, tal como flutamida, em dosagens conhecidaspara essas moléculas. Quando o câncer a ser tratado for câncer independentede andrógenos, o paciente pode haver sido submetido anteriormente a terapiaanti-andrógenos e, depois que o câncer tornar-se independente deandrógenos, o anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica (e,opcionalmente, outros agentes, conforme descrito na presente invenção) podeser administrado ao paciente.
Às vezes, pode ser benéfico também coadministrar cardioprotetor(para evitar ou reduzir disfunções miocardianas associadas à terapia) ou umaou mais citoquinas ao paciente. Além dos regimes terapêuticos acima, opaciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células cancerosas e/outerapia de radiação simultaneamente com a terapia de anticorpos,oligopeptídeos ou moléculas orgânicas, antes ou depois dela. Dosagensapropriadas para qualquer um dos agentes coadministrados acima são asutilizadas na presente invenção e podem ser reduzidas devido à açãocombinada (sinergia) do agente e anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo oumolécula orgânica.
Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem e omodo de administração serão selecionados pelos médicos de acordo comcritérios conhecidos. A dosagem apropriada de anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica dependerá do tipo de doença a ser tratado, conformedefinido acima, severidade e curso da doença, se o anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapiaanterior, histórico clínico do paciente e reação ao anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica e critério do médico atendente. O anticorpo, oligopeptídeoou molécula orgânica é administrado adequadamente ao paciente uma vez ouao longo de uma série de tratamentos. Preferencialmente, o anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica é administrado por meio de infusãointravenosa ou de injeções subcutâneas. Dependendo do tipo e da severidadeda doença, cerca de 1 μg/kg a cerca de 50 mg/kg de peso do corpo (porexemplo, cerca de 0,1 a 15 mg/kg/dose) de anticorpo pode ser dosagem inicialpossível para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de umaou mais administrações separadas ou de infusão contínua. Regime dedosagem pode compreender a administração de dose de carregamento inicialde cerca de 4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cerca de 2mg/kg do anticorpo anti-TAT. Entretanto, outros regimes de dosagem podemser úteis. Dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kgou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administraçõesrepetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, otratamento é mantido até que ocorra supressão desejada de sintomas dadoença. O progresso dessa terapia pode ser facilmente monitorado por meiode testes e métodos convencionais, com base em critérios conhecidos domédico ou outros técnicos no assunto.
Além da administração da proteína de anticorpo ao paciente, opresente pedido contempla a administração do anticorpo por meio de terapiagenética. Essa administração de ácido nucléico codificador do anticorpo éenglobada pela expressão "administração de quantidade terapeuticamente eficazde anticorpo". Vide, por exemplo, WO 96/07321 publicada em 14 de março de 1996,referente à utilização de terapia genética, para gerar anticorpos intracelulares.
Existem duas abordagens principais para a colocação do ácidonucléico (opcionalmente contido em vetor) nas células do paciente: in vivo e exvivo. Para fornecimento in vivo, o ácido nucléico é injetado diretamente nopaciente, normalmente no sítio em que é necessário o anticorpo. Paratratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucléico éintroduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradasao paciente diretamente ou, por exemplo, encapsuladas em membranasporosas que são implantadas no paciente (vide, por exemplo, Patentes US4.892.538 e US 5.238.187). Existe uma série de técnicas disponíveis para aintrodução de ácidos nucléicos em células viáveis. As técnicas variamdependendo da transferência ou não do ácido nucléico para células cultivadasin vitro ou in vivo nas células do hospedeiro desejado. Técnicas apropriadas detransferência de ácido nucléico para células de mamíferos in vitro incluem ouso de lipossomos, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextran,método de precipitação de fosfato de cálcio etc. Vetor comumente utilizadopara fornecimento ex vivo do gene é vetor retroviral.
As técnicas de transferência de ácido nucléico in vivo atualmentepreferidas incluem transfecção com vetores virais (tais como adenovírus, vírus Isimplex da Herpes ou vírus adenoassociado) e sistemas com base em lipídios(lipídios úteis para transferência mediada por lipídios do gene são, por exemplo,DOTMA, DOPE e DC-Chol). Para análise dos protocolos de terapia genética emarcação genética atualmente conhecidos, vide Anderson et al, Science 256: 808-813 (1992). Vide também WO 93/25673 e as referências ali mencionadas.
Os anticorpos anti-TAT de acordo com a presente invençãopodem apresentar-se nas diferentes formas englobadas pela definição de"anticorpo" do presente. Portanto, os anticorpos incluem anticorpo intacto ou decomprimento total, fragmentos de anticorpos, anticorpos de seqüência nativaou variantes de aminoácidos, anticorpos de fusão, quiméricos ou humanizados,imunoconjugados e seus fragmentos funcionais. Em anticorpos de fusão,seqüência de anticorpo é fundida a seqüência de polipeptídeos heterólogos. Osanticorpos podem ser modificados na região Fc para fornecer funções efetorasdesejadas. Conforme discutido em mais detalhes nas seções abaixo, com asregiões Fc apropriadas, o anticorpo original ligado sobre a superfície celularpode induzir a citotoxicidade, por exemplo, por meio de citotoxicidade celulardependente de anticorpos (ADCC), do recrutamento de complemento emcitotoxicidade dependente de complemento ou algum outro mecanismo.Alternativamente, quando for desejável eliminar ou reduzir a função efetora, deforma a minimizar os efeitos colaterais ou complicações terapêuticas, podemser utilizadas outras regiões de Fc.
Em uma realização, o anticorpo concorre para ligar-se ou ligar-sesubstancialmente ao mesmo epítopo dos anticorpos de acordo com a presenteinvenção. Também são contemplados anticorpos que possuem ascaracterísticas biológicas dos anticorpos anti-TAT de acordo com a presenteinvenção, incluindo especificamente o direcionamento de tumores in vivo equalquer inibição da proliferação celular ou características citotóxicas.
Os métodos de produção dos anticorpos acima são descritos emdetalhes na presente invenção.
Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos e moléculas orgânicas dopresente são úteis para o tratamento de câncer que expresse TAT ou reduçãode um ou mais sintomas do câncer em mamíferos. Esse câncer inclui câncerda próstata, câncer do trato urinário, câncer do pulmão, câncer de mama,câncer do cólon e câncer de ovário, mais especificamente adenocarcinoma dapróstata, carcinomas das células renais, adenocarcinomas colo-retais,adenocarcinomas do pulmão, carcinomas de células escamosas do pulmão emesotelioma plêurica. Os cânceres englobam cânceres metastáticos de acordocom qualquer um dos anteriores. O anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica é capaz de ligar-se a pelo menos uma parte das células cancerosasque expressam polipeptídeo TAT no mamífero. Em realização preferida, oanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é eficaz para destruir ou matarcélulas tumorosas que expressem TAT ou inibir o crescimento dessas célulastumorosas, in vitro ou in vivo, mediante ligação a polipeptídeo TAT sobre acélula. Esse anticorpo inclui anticorpo anti-TAT original (não conjugado anenhum agente). Os anticorpos originais que apresentam propriedadescitotóxicas ou de inibição do crescimento celular podem ser adicionalmentearmados com agente citotóxico para torná-los ainda mais potentes nadestruição das células tumorosas. Podem ser conferidas propriedadescitotóxicas a anticorpo anti-TAT, por exemplo, por meio de conjugação doanticorpo com agente citotóxico, para formar imunoconjugado conformedescrito na presente invenção. O agente citotóxico ou agente inibidor docrescimento é preferencialmente molécula pequena. São preferíveis toxinas,tais como caliqueamicina ou maitansinóide e seus análogos ou derivados.
A presente invenção fornece composição que compreendeanticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica de acordo com apresente invenção e veículo. Para os propósitos do tratamento de câncer,podem ser administradas composições ao paciente necessitado dessetratamento, em que a composição pode compreender um ou mais anticorposanti-TAT presentes na forma de imunoconjugado ou como anticorpo original.Em realização adicional, as composições podem compreender essesanticorpos, olígopeptídeos ou moléculas orgânicas em combinação com outrosagentes terapêuticos, tais como agentes citotóxicos ou inibidores docrescimento, incluindo agentes quimioterapêuticos. A presente invençãotambém fornece formulações que compreendem anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo ou molécula orgânica de acordo com a presente invenção eveículo. Em uma realização, a formulação é formulação terapêutica quecompreende veículo farmaceuticamente aceitável.
Outro aspecto da presente invenção é ácido nucléico isoladocodificador dos anticorpos anti-TAT. São englobados os ácidos nucléicoscodificadores das duas cadeias H e L e, especialmente, os resíduos de regiãohipervariável, cadeias que codificam o anticorpo de seqüência nativa, bemcomo variantes, modificações e versões humanizadas do anticorpo.
A presente invenção também fornece métodos úteis de tratamento decâncer que expressa polipeptídeo TAT ou redução de um ou mais sintomas docâncer em mamíferos, que compreende a administração de quantidadeterapeuticamente eficaz de anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânicaao mamífero. As composições terapêuticas de anticorpos, oligopeptídeos oumoléculas orgânicas podem ser administradas em curto prazo (agudas), crônicasou intermitentes, conforme receitado pelo médico. Também são fornecidos métodosde inibição do crescimento e morte de célula que expresse TAT.
A presente invenção também fornece kits e artigos de manufaturaque compreendem pelo menos um anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo oumolécula orgânica. Kits que contêm anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos oumoléculas orgânicas apresentam uso, por exemplo, para testes de mortecelular de TAT, purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo TAT dascélulas. Para isolamento e purificação de TAT, por exemplo, o kit pode conteranticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica acoplada a esferas(tais como esferas de sepharose). Podem ser fornecidos kits que contêm osanticorpos, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas para detecção equantificação de TAT in vitro, por exemplo em ELISA ou Western Blot. Esseanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica útil para detecção pode recebermarcador, tal como fluorescente ou rádio-marcador.
L. Artigos de manufatura e Kits
Outra realização da presente invenção é um artigo de manufaturaque contém materiais úteis para o tratamento de câncer que expressa anti-TAT. O artigo de manufatura compreende recipiente e rótulo ou bula sobre orecipiente ou a ele associado. Os recipientes apropriados incluem, porexemplo, garrafas, ampolas, seringas etc. Os recipientes podem ser formadosa partir de uma série de materiais tais como vidro ou plástico. O recipientecontém composição que é eficaz para o tratamento da condição cancerosa epode ter porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, saco desolução intravenosa ou ampola que contém tampa perfurável por agulha deinjeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo da composição é anticorpoanti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica de acordo com a presenteinvenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para otratamento de câncer. O rótulo ou bula compreenderá adicionalmenteinstruções de administração da composição de anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica ao paciente com câncer. Além disso, o artigo de manufaturapode compreender adicionalmente segundo recipiente que compreendetampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática parainjeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer esolução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis doponto de vista comercial e do usuário, que incluem outros tampões, diluentes,filtros, agulhas e seringas.
Também são fornecidos kits que são úteis para diversospropósitos, tais como para testes de morte de células que expressam TAT1purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo TAT a partir de células. Paraisolamento e purificação de polipeptídeo TAT, por exemplo, o kit pode conteranticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica acoplada a esferas(tais como esferas de sepharose). Podem ser fornecidos kits que contêm osanticorpos, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas para detecção equantificação de polipeptídeo TAT in vitro, por exemplo, em ELISA ou WesternBlot. Da mesma forma que com o artigo de manufatura, o kit compreenderecipiente e rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. O recipientecontém composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo ou molécula orgânica de acordo com a presente invenção.Podem ser incluídos recipientes adicionais que contenham, por exemplo,diluentes, tampões e anticorpos controle. O rótulo ou bula pode fornecerdescrição da composição, bem como instruções para o uso in vitro ou emdiagnóstico desejado.
M. Usos para polipeptídeos TAT e ácidos nucléicos quecodificam polipeptídeos TAT
Seqüências de nucleotídeos (ou seu complemento) que codificampolipeptídeos TAT possuem diversas aplicações na técnica de biologiamolecular, incluindo usos como sondas de hibridização, em mapeamentogenético e cromossômico e na geração de sondas de RNA e DNA antisense.Ácido nucléico codificador de TAT também será útil para a preparação depolipeptídeos TAT por meio dos métodos recombinantes descritos na presenteinvenção, em que esses polipeptídeos TAT podem encontrar uso, por exemplo,na preparação de anticorpos anti-TAT conforme descrito na presente invenção.
O gene TAT de seqüência nativa de comprimento total, ou suaspartes, pode ser utilizado como sonda de hibridização para que biblioteca decDNA isole o cDNA de TAT de comprimento total ou isole ainda outros cDNAs(tais como os que codificam variantes de TAT de ocorrência natural ou TAT deoutras espécies) que possuem identidade de seqüência desejada em relação àseqüência de TAT nativa descrita na presente invenção. Opcionalmente, ocomprimento das sondas será de cerca de vinte a cerca de cinqüenta bases.As sondas de hibridização podem ser derivadas de regiões ao menosparcialmente inovadoras da seqüência de nucleotídeos nativa de comprimentototal, em que essas regiões podem ser determinadas sem experimentaçãoindevida ou a partir de seqüências genômicas que incluem promotores,elementos amplificadores e íntrons de TAT de seqüência nativa. Como formade exemplo, método de seleção compreenderá o isolamento da regiãocodificadora do gene TAT utilizando a seqüência de DNA conhecida parasintetizar sonda selecionada de cerca de quarenta bases. Sondas dehibridização podem ser marcadas por uma série de marcadores, que incluemradionucleotídeos tais como 32P ou 32S1 ou marcadores enzimáticos tais comofosfatase alcalina acoplada à sonda por meio de sistemas de acoplamento deavidina/biotina. Sondas marcadas que possuem seqüência complementar à dogene TAT de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas paraselecionar bibliotecas de cDNA humano, DNA genômico ou mRNA paradeterminar a quais membros dessas bibliotecas a sonda se hibridiza. Métodosde hibridização são descritos com mais detalhes nos Exemplos abaixo.Quaisquer seqüências de EST descritas no presente pedido podem serempregadas de forma similar como sondas, utilizando os métodos descritos napresente invenção.
Outros fragmentos úteis dos ácidos nucléicos codificadores deTAT incluem oligonucleotídeos sense ou antisense que compreendemseqüência de ácido nucléico de fita simples (RNA ou DNA) capaz de ligar-se aseqüências de mRNA de TAT alvo (sense) ou DNA de TAT (antisense).Oligonucleotídeos sense ou antisense, de acordo com a presente invenção,compreendem fragmento da região codificadora de DNA de TAT. Essefragmento geralmente compreende pelo menos cerca de quatorzenucleotídeos, preferencialmente cerca de quatorze a trinta nucleotídeos. Acapacidade de derivação de oligonucleotídeo sense ou antisense, com baseem seqüência de cDNA codificadora de uma dada proteína é descrita, porexemplo, em Stein e Cohen (Câncer Res. 48: 2659, 1988) e van der Krol et al(BioTechniques 6: 958, 1988).
A ligação de oligonucleotídeos sense ou antisense a seqüênciasde ácido nucléico alvo resulta na formação de duplex que bloqueia atranscrição de bloco ou tradução da seqüência alvo por um dentre váriosmeios, que incluem maior degradação dos duplex, término prematuro datranscrição ou tradução ou por outros meios. Esses métodos são englobadospela presente invenção. Os oligonucleotídeos antisense podem ser utilizados,portanto, para bloquear a expressão de proteínas TAT1 em que essas proteínasTAT podem desempenhar papel na indução de câncer em mamíferos.Oligonucleotídeos sense ou antisense compreendem adicionalmenteoligonucleotídeos que possuem cadeias principais de açúcar-fosfodiéstermodificadas (ou outras ligações de açúcar, tais como as descritas em WO91/06629) e em que essas ligações de açúcar são resistentes a nucleasesendógenas. Esses oligonucleotídeos com ligações de açúcar resistentes sãoestáveis in vivo (ou seja, capazes de resistir à degradação enzimática), masretêm especificidade de seqüências para que sejam capazes de ligar-se aseqüências de nucleotídeos alvo.
Sítios intragênicos preferidos para ligação antisense incluem aregião que incorpora o códon de início/início de tradução (5'-AUG/5'-ATG) oucódon de parada/término (5'-UAA, 5'-UAG e 5-UGA/5'-TAA, 5'-TAG e 5'-TGA)do quadro de leitura aberta (ORF) do gene. Estas regiões designam parte domRNA ou gene que engloba cerca de 25 a cerca de cinqüenta nucleotídeoscontíguos em qualquer direção (ou seja, 5' ou 3') a partir de códon de início outérmino de tradução. Outras regiões preferidas para ligação antisense incluem:íntrons; éxons; junções de íntron e éxon; quadro de leitura aberta (ORF) ou"região codificadora", que é a região entre o códon de início de tradução e ocódon de término de tradução; a tampa 5' de mRNA que compreende resíduode guanosina N7-metilado ligado ao resíduo mais 5' do mRNA por meio deligação de 5'-5' trifosfato e inclui a própria estrutura de tampa 5', bem como oscinqüenta primeiros nucleotídeos ao lado da tampa; a região não traduzida 5'(5' UTR), a parte de mRNA na direção 5' a partir do códon de início de traduçãoe, desta forma, que inclui nucleotídeos entre o sítio de tampa 5' e o códon deinício de tradução de mRNA ou nucleotídeos correspondentes sobre o gene; ea região não traduzida 3' (3'UTR), a parte de mRNA na direção 3' a partir docódon de término de tradução e, desta forma, que inclui nucleotídeos entre ocódon de término de tradução e a extremidade 3' de mRNA ou nucleotídeoscorrespondentes sobre o gene.
Exemplos específicos de compostos antisense preferidos úteis parainibir a expressão de proteínas TAT incluem oligonucleotídeos que contenhamcadeias principais modificadas ou ligações internucleotídeos não naturais.Oligonucleotídeos que contêm cadeias principais modificadas incluem aqueles queretêm um átomo de fósforo na cadeia principal e os que não contêm átomo defósforo na cadeia principal. Para os fins do presente relatório descritivo e conformeindicado às vezes na técnica, oligonucleotídeos modificados que não possuemátomo de fósforo na sua cadeia principal internucleotídeos podem também serconsiderados oligonucleotídeos. Cadeias principais de oligonucleotídeosmodificados preferidas incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais,fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metila eoutros alquila que incluem fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno efosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3 '-amino fosforamidato eaminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos,tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos e boranofosfatos que contêm ligações 3-5'normais, seus análogos 2'-5' ligados e os que possuem polaridade invertida, emque uma ou mais ligações internucleotídeos é ligação 3' a 3', 5' a 5' ou 2' a 2'.Oligonucleotídeos preferidos que possuem polaridade invertida compreendem umaúnica ligação 3' a 3' na ligação internucleotídeos mais 3', ou seja, um único resíduode nucleotídeo invertido que pode ser abásico (a nucleobase está faltando oucontém grupo hidroxila no seu lugar). Também são incluídas vários sais, saismisturados e formas de ácido livre. Patentes norte-americanas representativas queensinam a preparação de ligações que contêm fósforo incluem, mas sem limitar-seàs Patentes US 3.687.808; US 4.469.863; US 4.476.301; US 5.023.243; US5.177.196; US 5.188.897; US 5.264.423; US 5.276.019; US 5.278.302; US5.286.717; US 5.321.131; US 5.399.676; US 5.405.939; US 5.453.496; US5.455.233; US 5.466.677; US 5.476.925; US 5.519.126; US 5.536.821; US5.541.306; US 5.550.111; US 5.563.253; US 5.571.799; US 5.587.361; US5.194.599; US 5.565.555; US 5.527.899; US 5.721.218; US 5.672.697 e US5.625.050, cada uma das quais é incorporada ao presente como referência.
Cadeias principais de oligonucleotídeos modificadas preparadas quenão incluem átomo de fósforo no seu interior possuem cadeias principais que sãoformadas por ligações internucleotídeos alquila ou cicloalquila de cadeia curta,ligações internucleotídeos de heteroátomos e alquila ou cicloalquila misturadas ouuma ou mais ligações internucleotídeos heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeiacurta. Estas incluem as que possuem ligações morfolino (formadas em parte a partirda porção de açúcar de nucleotídeo); cadeias principais de siloxano; cadeiasprincipais de sulfeto, sulfóxido e sulfona; cadeias principais de formacetila etioformacetila; cadeias principais de metileno formacetila e tioformacetila; cadeiasprincipais de riboacetila; cadeias principais que contêm alqueno; cadeias principaisde sulfamato; cadeias principais de metilenoimino e metileno hidrazino; cadeiasprincipais de sulfonato e sulfonamida; cadeias principais de amida; e outras quecontêm partes componentes de N, O, S e CH2 misturadas. Patentes norte-americanas representativas que ensinam a preparação desses oligonucleotídeosincluem, mas sem limitar-se às Patentes US 5.034.506; US 5.166.315; US5.185.444; US 5.214.134; US 5.216.141; US 5.235.033; US 5.264.562; US5,264,564; US 5.405.938; US 5.434.257; US 5.466.677; US 5.470.967; US5.489.677; US 5.541.307; US 5.561.225; US 5.596.086; US 5.602.240; US5.610.289; US 5,602,240; US 5.608.046; US 5,610,289; US 5.618.704; US5.623.070; US 5.663.312; US 5.633.360; US 5.677.437; US 5.792.608; US5.646.269 e US 5,677,439, cada uma das quais é incorporada ao presente comoreferência.
Em outros oligonucleotídeos antisense preferidos, tanto a ligaçãode açúcar quanto a internucleotideos, ou seja a cadeia principal, das unidadesde nucleotídeos são substituídas com grupos inovadores. As unidades de basesão mantidas para hibridização com composto alvo de ácido nucléicoapropriado. Um desses compostos oligoméricos, mimético de oligonucleotídeoque se demonstrou possuir excelentes propriedades de hibridização, édenominado ácido nucléico de peptídeo (PNA). Em compostos de PNA, acadeia principal de açúcar de oligonucleotídeo é substituída com cadeiaprincipal que contém amida, particularmente cadeia principal deaminoetilglicina. As nucleobases são retidas e ligadas direta ou indiretamente aátomos de nitrogênio aza da porção de amida da cadeia principal. Patentesnorte-americanas representativas que ensinam a preparação de compostos dePNA incluem, mas sem limitar-se às Patentes US 5.539.082; US 5.714.331 eUS 5.719.262, cada uma das quais é incorporada ao presente como referência.Ensinamentos adicionais de compostos de PNA podem ser encontrados emNielsen etal, Science, 1991, 254, 1497-1500.
Oligonucleotídeos antisense preferidos incorporam cadeias principaisde fosforotioato e/ou cadeias principais de heteroátomos, particularmente-CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (conhecida como cadeia principal demetileno (metilimino) ou MMI), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- e-O-N(CH3)-CH2-CH2- (em que a cadeia principal de fosfodiéster nativa érepresentada como -O-P-O-CH2-), descritas na Patente US 5.489.677 indicadaacima, e as cadeias principais de amida da Patente US 5.602.240 indicada acima.Também são preferidos oligonucleotídeos antisense que contêm estruturas decadeia principal de morfolino da Patente US 5.034.506 indicada acima.
Oligonucleotídeos modificados podem também conter uma oumais porções de açúcar substituídas. Oligonucleotídeos preferidoscompreendem um dentre os seguintes na posição 2': OH; F; O-alquila, S-alquila ou N-alquila; O-alquenila, S-alquenila ou N-alquenila; O-alquinila,S-alquinila ou N-alquinila; ou O-alquil-O-alquila, em que o alquila, alquenila ealquinila podem ser alquila Ci a Cio substituído ou não substituído ou alquenilaC2 a C10 e alquinila. São particularmente preferidos O[(CH2)nO]mCH3,O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 eO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, em que nem são de 1 a cerca de 10. Outrosoligonucleotídeos antisense preferidos compreendem um dos seguintes naposição 2': alquila inferior Ci a C10, alquenila, alquinila, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH1 SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila,aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituído, grupo divisor de RNA1grupo relator, intercalante, grupo para aprimorar as propriedadesfarmacocinéticas de oligonucleotídeo ou grupo para aprimorar as propriedadesfarmacodinâmicas de oligonucleotídeo, bem como outros substituintes quepossuem propriedades similares. Modificação preferida inclui 2'-metoxietóxi(2'-O-CH2CH20CH3, também conhecido como 2'-O-(2-metoxietila) ou 2'-MOE)(Martin et al, He/v. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), ou seja, grupo alcoxialcóxi.Modificação preferida adicional inclui 2'-dimetilaminooxietóxi, ou seja, grupoO(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2'-DMAOE, conforme descrito nosexemplos abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietóxi (também conhecido na técnicacomo 2'-0-dimetilaminoetoxietila ou 2'-DMAEOE), ou seja,2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2).
Modificação preferida adicional inclui ácidos nucléicos travados(LNAs), nos quais o grupo 2'-hidroxila é ligado ao átomo de carbono 3' ou 4' doanel de açúcar, de maneira a formar porção de açúcar bicíclica. A ligação épreferencialmente grupo metileno (-CH2-)n que liga o átomo de oxigênio 2' e oátomo de carbono 4', em que η é 1 ou 2. LNAs e sua preparação são descritosem WO 98/39352 e WO 99/14226.
Outras modificações preferidas incluem 2'-metóxi (2'-0-CH3),2'-aminopropóxi (2'-OCH2CH2CH2 NH2), 2'-alila (2'-CH2-CH=CH2), 2"-0-alila(2'-0-CH2-CH=CH2) e 2'-fluoro (2'-F). A modificação 2' pode estar na posiçãoarabino (superior) ou na posição ribo (inferior). Modificação 2'-arabino preferidaé 2'-F. Modificações similares podem também ser realizadas em outrasposições sobre o oligonucleotídeo, particularmente a posição 3' do açúcarsobre o nucleotídeo 3'-terminal ou em oligonucleotídeos 2'-5' ligados'e aposição 5' do nucleotídeo 5' terminal. Os oligonucleotídeos podem tambémpossuir imitações de açúcar tais como porções ciclobutila no lugar de açúcarpentofuranosila. Patentes norte-americanas representativas que ensinam apreparação dessas estruturas de açúcar modificadas incluem, mas sem limitar-se às Patentes US 4.981.957; US 5.118.800; US 5.319.080; US 5.359.044; US5.393.878; US 5.446.137; US 5.466.786; US 5.514.785; US 5.519.134; US5.567.811; US 5.576.427; US 5.591.722; US 5.597.909; US 5.610.300; US5.627.053; US 5.639.873; US 5.646.265; US 5.658.873; US 5.670.633; US5.792.747; e US 5.700.920, cada uma das quais é integralmente incorporadacomo referência.
Os oligonucleotídeos podem também incluir substituições oumodificações de nucleobases (freqüentemente indicadas na técnicasimplesmente como "bases"). Da forma utilizada na presente invenção,nucleobases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purinaadenina (A) e guanina (G) e as bases de pirimidina timina (T)1 citosina (C) euracil (U). Nucleobases modificadas incluem outras nucleobases naturais esintéticas, tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina,hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados 6-metila e outros alquila de adenina eguanina, derivados 2-propila e outros alquila de adenina e guanina, 2-tiouracil,2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracil e citosina, 5-propinila (-C^C-CH3 ou -CH2-CeCH), uracil e citosina e outros derivados alquinila de bases depirimidina, 6-azo uracil, citosina e timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil,8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilase citosinas 5-substituídos, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, 3-deazaguanina e 3-deazaadenina. Nucleobases modificadasadicionais incluem pirimidinas tricíclicas, tais como fenoxazino citidino (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2 (3H)-ona), fenotiazino citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2 (3H)-ona), grampos G tais como fenoxazino citidinasubstituída (por exemplo, 9-(2-aminoetóxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidino (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidino(H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Nucleobases modificadaspodem também incluir aquelas em que a base de purina ou pirimidina ésubstituída com outros heterociclos, tais como 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Nucleobases adicionais incluemas descritas na Patente US 3.687.808, as descritas em The ConciseEncyclopedia of Poiymer Science and Engineering, págs. 858-859, Kroschwitz,J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, e as descritas por Englisch et ai,Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, 30, 613. Certas destasnucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligaçãodos compostos oligoméricos de acordo com a presente invenção. Estasincluem pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6substituídas, que incluem 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracil e 5-propinilcitosina. Demonstrou-se que substituições de 5-metilcitosina aumentama estabilidade de duplex de ácido nucléico em 0,6 a 1,2 0 C. (Sanghvi et ai,Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs.276-278) e são substituições de bases preferidas, ainda mais especificamentequando combinadas com modificações de açúcar 2'-0-metoxietila. Patentesnorte-americanas representativas que ensinam a preparação dessasnucleobases modificadas incluem, mas sem limitar-se a: Patente US 3.687.808,bem como Patentes US 4.845.205; US 5.130.302; US 5.134.066; US 5.175.273;US 5.367.066; US 5.432.272; US 5.457.187; US 5.459.255; US 5.484.908; US5.502.177; U S 5.525.711; U S 5.552.540; US 5.587.469; U S 5.594.121, U S5.596.091; US 5.614.617; US 5.645.985; US 5.830.653; US 5.763.588; US6.005.096; US 5.681.941 e US 5.750.692, cada uma das quais é incorporadaao presente como referência.
Outra modificação de oligonucleotídeos antisense que ligamquimicamente ao oligonucleotídeo uma ou mais porções ou conjugados queaumentam a atividade, distribuição celular ou absorção celular dooligonucleotídeo. Os compostos de acordo com a presente invenção podemincluir grupos conjugados ligados covalentemente a grupos funcionais taiscomo grupos hidroxila primários ou secundários. Os grupos conjugados deacordo com a presente invenção incluem intercaladores, moléculas relatoras,poliaminas, poliamidas, polietileno glicóis, poliéteres, grupos que aumentam aspropriedades farmacodinâmicas de oligômeros e grupos que aumentam aspropriedades farmacocinéticas de oligômeros. Grupos conjugados típicosincluem colesteróis, lipídios, lipídios de cátions, fosfolipídios, fosfolipídioscatiônicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina,fluoresceínas, rodaminas, coumarinas e tinturas. Grup os que melhoram aspropriedades farmacodinâmicas, no contexto da presente invenção, incluemgrupos que aumentam a absorção de oligômeros, aumentam a resistência deoligômeros à degradação e/ou fortalecem a hibridização específica deseqüências com RNA. Os grupos que melhoram as propriedadesfarmacocinéticas, no contexto da presente invenção, incluem grupos queaumentam a absorção, distribuição, metabolismo ou excreção de oligômeros.Porções conjugadas incluem, mas sem limitar-se a porções de lipídios, taiscomo porção de colesterol (Letsinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A, 1989,89, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994,4, 1053-1060), tioéter, tal como hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al, Arrn. Ν. Y.Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let.,1993, 3, 2765-2770), tiocolesterol (Oberhauser et al, Nuci Acids Res., 1992,20, 533-538), cadeia alifática, tal como dodecandiol ou resíduos undecila(Saison-Behmoaras et al, EMBOJ., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al, FEBSLett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75, 49-54),fosfolipídio, tal como di-hexadecil-rac-glicerol ou1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amônio (Manoharan et al,Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al, Nuel. Aeids Res., 1990, 18,3777-3783), poliamina ou cadeia de polietileno glícol (Manoharan et al,Nucleosides & Nueleotides, 1995, 14, 969-973) ou adamantano ácido acético(Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), porção palmitila(Mishra et al, Bioehim. Biophys. Aeta, 1995, 1264, 229-237) ou porçãooctadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Os oligonucleotídeos deacordo com a presente invenção podem também ser conjugados a substânciasde fármacos ativas, tais como aspirina, varfarina, fenilbutazona, ibuprofen,suprofen, fenbufen, cetoprofen, (S)-(+)-pranoprofen, carprofen, dansilsarcosina,ácido 2,3,5-triiodobenzóico, ácido flufenâmico, ácido folínico, benzotiadiazida,clorotiazida, diazepina, indometicin, barbiturato, cefalosporin, fármaco sulfa,antidiabético, antibacteriano ou antibiótico. Conjugados de oligonucleotídeo efármaco e sua preparação são descritos no pedido de patente norte-americanocom número de série 09/334.130 (depositado em quinze de junho de 1999) eas Patentes US 4.828.979; US 4.948.882; US 5.218.105; US 5.525.465; US5.541.313; US 5.545.730; US 5.552.538; US 5.578.717, US 5.580.731; US5,580,731; US 5.591.584; US 5.109.124; US 5.118.802; US 5.138.045; US5.414.077; US 5.486.603; US 5.512.439; US 5,578,718; US 5.608.046; US4.587.044; US 4.605.735; US 4.667.025; US 4.762.779; US 4.789.737; US4.824.941; US 4.835.263; US 4.876.335; US 4.904.582; US 4.958.013; US5.082.830; U S 5.112.963; U S 5.214.136; US 4,828,979; U S 4,948,882; U S5,218,105; U S 5,525,465; U S 5,541,313; US 5,545,730; U S 5,552,538; U S5,578,717; US 5,580,731; US 5,580,731; US 5,591,584, US 5,109,124; US5,118,802, US 5,138,045; US 5,414,077; US 5,486,603; US 5,512,439; US5,578,718; US 5.567.810; US 5.574.142; US 5.585.481; US 5.587.371; US5.595.726; US 5.597.696; US 5.599.923; US 5.599.928 e US 5.688.941, cadauma das quais é incorporada ao presente como referência.
Não é necessário que todas as posições em um dado compostosejam modificadas uniformemente e, de fato, mais de uma das modificaçõesmencionadas acima pode ser incorporada em um único composto ou mesmoem um único nucleosídeo em um oligonucleotídeo. A presente invençãotambém inclui compostos antisense que são compostos quiméricos.Compostos antisense "quiméricos" ou "quimeras", no contexto da presenteinvenção, são compostos antisense, particularmente oligonucleotídeos, quecontêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada qual composta depelo menos uma unidade monomérica, ou seja, nucleotídeo no caso decomposto de oligonucleotídeo. Estes oligonucleotídeos contêm tipicamentepelo menos uma região em que o oligonucleotídeo é modificado de forma aconferir ao oligonucleotídeo maior resistência à degradação por nuclease,maior absorção celular e/ou maior afinidade de ligação para o ácido nucléicoalvo. Região adicional do oligonucleotídeo pode servir de substrato paraenzimas capazes de dividir híbridos de RNA:DNA ou RNA:RNA. Como formade exemplo, RNase H é endonuclease celular que divide o cordão de RNA deduplex RNA:DNA. A ativação de RNase H resulta, portanto, na divisão do RNAalvo, de forma a aumentar grandemente a eficiência da inibição deoligonucleotídeos de expressão genética. Conseqüentemente, resultadoscomparáveis podem freqüentemente ser obtidos com oligonucleotídeos maiscurtos ao utilizar-se oligonucleotídeos quiméricos, em comparação comdesoxioligonucleotídeos de fosforotioato que se hibridizam na mesma regiãoalvo. Compostos antisense quiméricos de acordo com a presente invençãopodem ser formados como estruturas compostas de dois ou maisoligonucleotídeos, oligonucleotídeos modificados, oligonucleosídeos e/oumiméticos de oligonucleotídeos, conforme descrito acima. Os oligonucleotídeosantisense quiméricos preferidos incorporam pelo menos um açúcar modificado2' (preferencialmente 2'-0-(CH2)2-0-CH3) no terminal 3' para conferirresistência a nuclease e região com pelo menos quatro açúcares 2'-Hcontíguos para conferir atividade de RNase H. Esses compostos também foramdenominados na técnica híbridos ou gapmers. Os gapmers preferidos contêmregião de açúcares modificados 2' (preferencialmente 2'-0-(CH2)2-0-CH3) noterminal 3' e no terminal 5' separados por pelo menos uma região que contémpelo menos quatro açúcares 2'-H contíguos e preferencialmente incorporamligações de cadeia principal de fosforotioato. Patentes norte-americanasrepresentativas que ensinam a preparação dessas estruturas híbridas incluem,mas sem limitar-se às Patentes US 5.013.830; US 5.149.797; US 5.220.007; US5.256.775; US 5.366.878; US 5.403.711; US 5.491.133; US 5.565.350; US5.623.065; US 5.652.355; US 5,652,356 e US 5.700.922, cada uma das quais éintegralmente incorporada ao presente como referência.
Os compostos antisense u tilizados de acordo com a presenteinvenção podem ser conveniente e rotineiramente fabricados por meio dométodo bem conhecido de síntese de fases sólidas. Equipamento para essassínteses é vendido por diversos fornecedores que incluem, por exemplo,Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). Quaisquer outros meios para essasíntese conhecidos na técnica podem ser adicional ou alternativamenteempregados. Sabe-se bem como utilizar métodos similares para prepararoligonucleotídeos tais como os fosforotioatos e derivados alquilados. Oscompostos de acordo com a presente invenção podem também ser misturados,encapsulados, conjugados ou associados de outra forma com outrasmoléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos, tais comolipossomos, moléculas dirigidas a receptores, formulações orais, retais, sítiosou outras, para assistir na tomada, distribuição e/ou absorção. Patentes norte-americanas representativas que ensinam a preparação dessas formulaçõesque assistem na tomada, distribuição e/ou absorção incluem, mas sem limitar-se às Patentes US 5.108.921; US 5.354.844; US 5.416.016; US 5.459.127; US5.521.291; US 5.543.158; US 5.547.932; US 5.583.020; US 5.591.721; US4.426.330; US 4.534.899; US 5.013.556; US 5,108,921; US 5.213.804; US5.227.170; US 5.264.221; US 5.356.633; US 5.395.619; US 5,416,016; US5.417.978; US 5.462.854; US 5.469.854; US 5.512.295; US 5.527.528; US5.534.259; US 5,543,152; US 5.556.948; US 5.580.575; e US 5.595.756, cadauma das quais é incorporada ao presente como referência.
Outros exemplos de oligonucleotídeos sense ou antisenseincluem os oligonucleotídeos que são ligados covalentemente a porçõesorgânicas, tais como as descritas em WO 90/10048 e outras porções queaumentam a afinidade do oligonucleotídeo para seqüência de ácido nucléicoalvo, tal como poli-(L-lisina). Adicionalmente, agentes intercalantes, tais comoelipticina, e agentes alquilantes ou complexos metálicos podem ser ligados aoligonucleotídeos sense ou antisense para modificar as especificidades deligação do oligonucleotídeo sense ou antisense para a seqüência denucleotídeos alvo.
Oligonucleotídeos sense ou antisense podem ser introduzidos emcélula que contém a seqüência de ácido nucléico alvo por meio de qualquermétodo de transferência genética, incluindo, por exemplo, transfecção de DNAmediada por CaPO4, eletroporação ou utilizando vetores de transferênciagenética tais como vírus Epstein-Barr. Em procedimento preferido,oligonucleotídeo sense ou antisense é inserido em vetor retroviral apropriado.Célula que contém a seqüência de ácido nucléico alvo é colocada em contatocom o vetor retroviral recombinante, seja in vivo ou ex vivo. Vetores retroviraisapropriados incluem, mas sem limitar-se aos derivados do retrovírus murino M-MuLV1 N2 (retrovírus derivado de M-MuLV), ou os vetores de cópia dupladenominados DCT5A, DCT5B e DCT5C (vide WO 90/13641).
Oligonucleotídeos sense ou antisense podem também serintroduzidos em célula que contém a seqüência de nucleotídeos alvo por meiode formação de conjugado com molécula de ligação de ligantes, conformedescrito em WO 91/04753. As moléculas de ligação de ligantes apropriadasincluem, mas sem limitar-se a receptores da superfície celular, fatores decrescimento, outras citoquinas ou outros ligantes que se ligam a receptores dasuperfície celular. Preferencialmente, a conjugação da molécula de ligação deligantes não interfere substancialmente com a capacidade da molécula deligação de ligantes de ligar-se à sua molécula ou receptor correspondente, oubloquear a entrada do oligonucleotídeo sense ou antisense ou sua versãoconjugada na célula.
Alternativamente, oligonucleotídeo sense ou antisense pode serintroduzido em célula que contém a seqüência de ácido nucléico alvo por meioda formação de complexo de oligonucleotídeo e lipídio, conforme descrito emWO 90/10448. O complexo de lipídio e oligonucleotídeo sense ou antisense épreferencialmente dissociado na célula por Iipase endógena.
As moléculas de DNA ou RNA sense ou antisense geralmentepossuem menos de cerca de cinco nucleotídeos de comprimento,alternativamente pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10; 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20; 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30; 35, 40, 45, 50; 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 100; 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150; 155,160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200; 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270,280, 290, 300; 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400; 410, 420, 430,440, 450, 460, 470, 480, 490, 500; 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590,600; 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700; 710, 720, 730, 740, 750,760, 770, 780, 790, 800; 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900; 910,920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ou 1000 nucleotídeos de comprimento,em que, neste contexto, a expressão "cerca de" indica o comprimento deseqüência de nucleotídeos de referência mais ou menos 10% daquele comprimento indicado.
As sondas podem também ser empregadas em métodos de PCRpara gerar um conjunto de seqüências para identificação de seqüênciascodificadoras de TAT intimamente relacionadas.
Seqüências de nucleotídeos que codificam TAT podem também ser utilizadas para construir sondas de hibridização para mapeamento do gene quecodifica aquele TAT e para análise genética de indivíduos com disfunçõesgenéticas. As seqüências de nucleotídeos fornecidas na presente invenção podemser mapeadas para cromossomo e regiões específicas de cromossomo utilizandométodos conhecidos, tais como hibridização in situ, análise de ligações contra marcadores cromossômicos conhecidos e seleção de hibridização com bibliotecas.
Quando as seqüências codificadoras para TAT codificaremproteína que se liga a outra proteína (tal como quando o TAT for receptor), TATpode ser utilizado em testes para identificar as outras proteínas ou moléculasenvolvidas na interação de ligação. Por meio destes métodos, podem ser identificados inibidores da interação de ligação de Iigante e receptor. Asproteínas envolvidas nessas interações de ligação podem também serutilizadas para selecionar inibidores de moléculas pequenas ou peptídeos ouagonistas da interação de ligação. Além disso, o TAT receptor pode serutilizado para isolar ligante(s) correlativo(s). Testes de seleção podem serprojetados para encontrar compostos de chumbo que imitem a atividadebiológica de TAT nativo ou receptor para TAT. Esses testes de seleçãoincluirão testes apropriados para seleção de alto rendimento de bibliotecasquímicas, tornando-as particularmente apropriadas para a identificação depossíveis fármacos de moléculas pequenas. As moléculas pequenascontempladas incluem compostos orgânicos ou inorgânicos sintéticos. Ostestes podem ser realizados em uma série de formatos, que incluem testes deligação entre proteínas, testes de seleção bioquímica, imunoensaios e testescom base em células, que são bem caracterizados na técnica.
Ácidos nucléicos que codificam TAT ou suas formas modificadaspodem também ser utilizados para gerar animais transgênicos ou animais"knock out" que, por sua vez, são úteis no desenvolvimento e seleção dereagentes terapeuticamente úteis. Animal transgênico (tal como camundongoou rato) é animal que possui células que contêm transgene, que foi introduzidono animal ou ancestral do animal em estado pré-natal, tal como embrionário.Transgene é DNA que é integrado ao genoma de célula da qual desenvolve-seanimal transgênico. E m uma realização, cDNA que codifica TAT pode serutilizado para clonar DNA genômico que codifica TAT de acordo com métodosestabelecidos e as seqüências genômicas utilizadas para gerar animaistransgênicos que contêm células que expressam DNA que codifica TAT.Métodos de geração de animais transgênicos, particularmente animais taiscomo camundongos ou ratos, tornaram-se convencionais na técnica e sãodescritos, por exemplo, nas Patentes US 4.736.866 e US 4.870.009.Tipicamente, células específicas seriam dirigidas para incorporação detransgene TAT com amplificadores específicos de tecido. Animais transgênicosque incluem uma cópia de transgene que codifica TAT introduzido na linhagemgerminativa do animal em estágio embrionário podem ser utilizados paraexaminar o efeito da maior expressão de DNA que codifica TAT. Esses animaispodem ser utilizados como animais de teste para reagentes que se acreditaconferirem proteção, por exemplo, contra condições patológicas associadas àsua superexpressão. Segundo esta faceta da presente invenção, animal étratado com o reagente e incidência reduzida da condição patológica, emcomparação com animais não tratados que possuem o transgene, indicariapotencial intervenção terapêutica para a condição patológica.
Alternativamente, podem ser construídos homólogos de TAT nãohumanos para construir animal "knock out" TAT que contém gene alterado oudefeituoso que codifica TAT como resultado da recombinação homóloga entreo gene endógeno que codifica TAT e DNA genômico alterado que codifica TATintroduzido em célula haste embriônica do animal. cDNA que codifica TAT podeser utilizado, por exemplo, para clonar DNA genômico que codifica TAT deacordo com métodos estabelecidos. Uma porção do DNA genômico quecodifica TAT pode ser excluída ou substituída com outro gene, tal como geneque codifica marcador selecionável que pode ser utilizado para monitorar aintegração. Tipicamente, várias quilobases de DNA lateral inalterado (nas duasextremidades 5' e 3') são incluídas no vetor (vide, por exemplo, Thomas eCapecchi, Cell, 51: 503 (1987) para descrição de vetores de recombinaçãohomólogos). O vetor é introduzido em linhagem celulares de haste embriônicas(tal como por meio de eletroporação) e são selecionadas as células em que oDNA introduzido recombinou-se de forma homóloga com o DNA endógeno(vide, por exemplo, Li et al, Cell, 69: 915 (1992)). As células selecionadas sãoinjetadas em seguida em blastocisto de animal (tal como camundongo ou rato)para formar quimeras de agregação (vide, por exemplo, Bradley,Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approaeh, E. J.Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), págs. 113-152). Pode ser implantado emseguida embrião quimérico em feto de animal fêmea pseudoprenha apropriadoe o embrião é trazido a termo para criar animal knock out. A prole que abriga oDNA recombinado de forma homóloga nas suas células gérmen pode seridentificada por meio de técnicas padrão e utilizada para criar animais em quetodas as células do animal contêm o DNA recombinado de forma homóloga. Osanimais knockout podem ser caracterizados, por exemplo, pela sua capacidadede defesa contra certas condições patológicas e pelo seu desenvolvimento decondições patológicas devido à ausência do polipeptídeo TAT.
Ácido nucléico que codifica os polipeptídeos TAT pode tambémser utilizado em terapia genética. Em aplicações de terapia genética, genes sãointroduzidos em células a fim de atingir a síntese in vivo de produto genéticoterapeuticamente eficaz, tal como para substituição de gene defeituoso."Terapia genética" inclui tanto terapia genética convencional, na qual se atingeefeito duradouro com um único tratamento, quanto a administração de agentesterapêuticos genéticos, que envolve a administração única ou repetida demRNA ou DNA terapeuticamente eficaz. DNAs e RNAs antisense podem serutilizados como agentes terapêuticos para bloquear a expressão de certosgenes in vivo. Já se observou que oligonucleotídeos antisense curtos podemser importados em células onde agem como inibidores, apesar das suas baixasconcentrações intracelulares causadas pela sua absorção restrita pelamembrana celular. (Zamecnik et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 83: 4143-4146 (1986)). Os oligonucleotídeos podem ser modificados para aumentar asua absorção, tal como por meio de substituição dos seus grupos fosfodiéstercarregados negativamente por grupos não carregados.
Existe uma série de métodos disponíveis para a introdução deácidos nucléicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo datransferência ou não do ácido nucléico para células cultivadas in vitro ou in vivonas células do hospedeiro desejado. Técnicas apropriadas de transferência deácido nucléico para células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomos,eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextran, método deprecipitação de fosfato de cálcio etc. Os métodos de transferência genética invivo atualmente preferidos incluem a transfecção com vetores virais(tipicamente retrovirais) e transfecção mediada por Iipossomos e proteínas derevestimento viral (Dzau et al, Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). Emalgumas situações, é desejável fornecer à fonte de ácido nucléico agente quese dirija às células alvo, tal como anticorpo específico para proteína demembrana da superfície celular ou a célula alvo, Iigante para receptor sobre acélula alvo etc. Ao empregar-se lipossomos, proteínas que se ligam a proteínade membrana da superfície celular associada a endocitose podem serutilizadas para dirigir e/ou facilitar a absorção, por exemplo, de proteínas decapsídeo ou seus fragmentos trópicos para um tipo de célula específico,anticorpos para proteínas que sofrem internalização na ciclização e proteínasque dirigem localização intracelular e aumentam a meia vida intracelular. Ométodo de endocitose mediada por receptor é descrito, por exemplo, por Wu etal, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); e Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sei.U. S. A. 87, 3410-3414 (1990). Para análise de protocolos de terapia genética emarcação de genes, vide Anderson et al, Science 256, 808-813 (1992).
As moléculas de ácido nucléico que codificam os polipeptídeosTAT ou seus fragmentos descritos na presente invenção são úteis para aidentificação de cromossomos. Nesse aspecto, existe necessidade contínua deidentificação de novos marcadores de cromossomos, pois relativamentepoucos reagentes marcadores de cromossomos, com base nos dados deseqüência real, são disponíveis atualmente. Cada molécula de ácido nucléicode TAT de acordo com a presente invenção pode ser utilizada como marcadorde cromossomos.
Os polipeptídeos TAT e moléculas de ácido nucléico de acordocom a presente invenção podem também ser utilizados em diagnóstico paratipificação de tecidos, em que os polipeptídeos TAT de acordo com a presenteinvenção podem ser expressos de forma diferente em um tecido emcomparação com outro, preferencialmente em tecido doente em comparaçãocom tecido normal do mesmo tipo de tecido. Moléculas de ácido nucléico deTAT encontrarão uso para a geração de sondas para PCR1 análise Northern,análise Southern e análise Western.
A presente invenção engloba métodos de seleção de compostospara identificar os que imitam o polipeptídeo TAT (agonistas) ou evitam o efeitodo polipeptídeo TAT (antagonistas). Testes de seleção para possíveis fármacosantagonistas são projetados para identificar compostos que se unam ouformem complexo com polipeptídeos TAT codificados pelos genes identificadosna presente invenção ou interfiram de outra forma com a interação dospolipeptídeos codificados com outras proteínas celulares, incluindo, porexemplo, a inibição da expressão de polipeptídeo TAT de células. Esses testesde seleção incluirão testes apropriados para seleção de alto rendimento debibliotecas químicas, tornando-as particularmente apropriadas para aidentificação de possíveis fármacos de moléculas pequenas.
Os testes podem ser realizados em uma série de formatos, queincluem testes de ligação entre proteínas, testes de seleção bioquímica,imunoensaios e testes com base em células, que são bem caracterizados natécnica.
Todos os testes para antagonistas são comuns pelo fato de queconvocam o contato do possível fármaco com polipeptídeo TAT codificado porácido nucléico identificado na presente invenção sob condições e por temposuficiente para permitir a interação entre esses dois componentes.
Nos testes de ligação, a interação é ligação e o complexo formadopode ser isolado ou detectado na mistura de reação. Em realização específica, opolipeptídeo TAT codificado pelo gene identificado na presente invenção ou opossível fármaco é imobilizado sobre fase sólida, tal como placa de microtítulos, pormeio de ligações covalentes ou não covalentes. A ligação não covalente geralmenteé realizada por meio de revestimento da superfície sólida com solução dopolipeptídeo TAT e secagem. Alternativamente, anticorpo imobilizado, tal comoanticorpo monoclonal, específico para o polipeptídeo TAT a ser imobilizado, podeser utilizado para ancorá-lo a superfície sólida. O teste é realizado por meio daadição do componente não imobilizado, que pode ser marcado com marcadordetectável, ao componente imobilizado, tal como a superfície revestida que contémo componente ancorado. Após o término da reação, os componentes não reagidossão removidos, tal como por meio de lavagem, e os complexos ancorados sobre asuperfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente nãoimobilizado conduzir marcador detectável, a detecção de marcador imobilizadosobre a superfície indica que ocorreu a formação de complexos. Quando ocomponente originalmente não imobilizado não conduzir marcador, a formação decomplexos pode ser detectada, por exemplo, utilizando anticorpo marcado que ligaespecificamente o complexo imobilizado.
Caso o possível composto interaja com polipeptídeo TATespecífico codificado por gene identificado na presente invenção mas não seligue a ele, a sua interação com aquele polipeptídeo pode ser testada por meiode métodos bem conhecidos de detecção de interações entre proteínas. Essestestes incluem abordagens tradicionais, tais como retícula, coimunoprecipitaçãoe copurificação por meio de gradientes ou colunas cromatográficas. Alémdisso, interações entre proteínas podem ser monitoradas utilizando sistemagenético com base em leveduras descrito por Fields e colaboradores (Fields eSong, Nature (London) 340: 245-246 (1989); Chien et al, Proc. Nati Acad. Sei.U. S. A. 88: 9578-9582 (1991)), conforme descrito por Chevray e Nathans,Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 89: 5789-5793 (1991). Muitos ativadores detranscrição, tais como GAL4 de levedura, consistem de dois domíniosmodulares fisicamente discretos, um que age como domínio de ligação de DNAe o outro que funciona como domínio de ativação de transcrição. O sistema deexpressão de levedura descrito nas publicações acima (geralmentedenominado "sistema bi-híbrido") utiliza esta propriedade e emprega duasproteínas híbridas, uma em que a proteína alvo é fundida ao domínio deligação de DNA de GAL4 e outra em que as possíveis proteínas ativadoras sãofundidas ao domínio de ativação. A expressão de gene relator GAL1-/acZ sob ocontrole de promotor ativado por GAL4 depende da reconstituição da atividadede GAL4 por meio de interação entre proteínas. As colônias que contêmpolipeptídeos em interação são detectadas com substrato cromogênico para β-galactosidase. Kit completo (MATCHMAKER®) para a identificação deinterações entre proteínas entre duas proteínas específicas utilizando o métodobi-híbrido é disponível comercialmente por meio da Clontech. Este sistemapode também ser estendido para mapear domínios de proteínas envolvidos eminterações de proteínas específicas, bem como para indicar resíduos deaminoácidos que são fundamentais para estas interações.
Os compostos que interferem com a interação de gene quecodifica polipeptídeo TAT identificado na presente invenção e outroscomponentes intra ou extracelulares podem ser testados conforme segue:normalmente é preparada mistura de reação que contém o produto do gene e ocomponente intra ou extracelular sob condições e por tempo que permitam ainteração e a ligação dos dois produtos. Para testar a capacidade de possívelcomposto de inibir a ligação, a reação é conduzida na ausência e na presençado composto de teste. Além disso, pode-se adicionar placebo a terceira misturade reação, para que sirva de controle positivo. A ligação (formação decomplexos) entre o composto de teste e o componente intra ou extracelularpresente na mistura é monitorada conforme descrito acima. A formação decomplexo na(s) reação(ões) de controle, mas não na mistura de reação quecontém o composto de teste, é um indicativo de que o composto de testeinterfere com a interação do composto de teste e seu parceiro de ligação.
Para testar antagonistas, o polipeptídeo TAT pode ser adicionadoa célula junto com o composto a ser selecionado em busca de atividadeespecífica e a capacidade do composto de inibir a atividade de interesse napresença do polipeptídeo TAT é um indicativo de que o composto é umantagonista para o polipeptídeo TAT. Alternativamente, antagonistas podemser detectados combinando-se o polipeptídeo TAT e antagonista potencial comreceptores de polipeptídeos TAT ligados por membrana ou receptoresrecombinantes sob condições apropriadas para teste de inibição competitiva. Opolipeptídeo TAT pode ser marcado, tal como por meio de radioatividade, de talforma que a quantidade de moléculas de polipeptídeo TAT ligadas ao receptorpossa ser utilizada para determinar a eficácia do potencial antagonista. O geneque codifica o receptor pode ser identificado por meio de numerosos métodosconhecidos dos técnicos no assunto, tais como extração de Iigante eordenamento de FACS. Coligan et al, Current Protocols in Immun., 1 (2):Capítulo 5 (1991). Preferencialmente, emprega-se clonagem de expressão emque RNA poliadenilado é preparado a partir de célula que reage aopolipeptídeo TAT e biblioteca de cDNAs criada a partir desse RNA é divididaem conjuntos e utilizada para a transfecção de células COS ou outras célulasque não reagem ao polipeptídeo TAT. Células transfectadas que são cultivadassobre lâminas de vidro são expostas a polipeptídeo TAT marcado. Opolipeptídeo TAT pode ser marcado com uma série de meios, que incluem aiodação ou inclusão de sítio de reconhecimento para quinase de proteínaespecífica de sítio. Após a fixação e a incubação, as lâminas são submetidas aanálise auto-radiográfica. Conjuntos positivos são identificados e subconjuntossão preparados e novamente transfectados utilizando processo de re-seleção eformação de subconjuntos interativo, gerando eventualmente um único cloneque codifica o suposto receptor.
Como abordagem alternativa para a identificação de receptores, opolipeptídeo TAT marcado pode ser ligado por fotoafinidade com membranacelular ou preparações de extrato que expressam a molécula receptora.Material reticulado é resolvido por PAGE e exposto a filme de raio X. Ocomplexo marcado que contém o receptor pode ser extirpado, resolvido emfragmentos de peptídeos e submetido a microsseqüenciamento de proteínas. Aseqüência de aminoácidos obtida por meio do microsseqüenciamento seriautilizada para projetar um conjunto de sondas de oligonucleotídeosdegeneradas para selecionar biblioteca de cDNA para identificar o gene quecodifica o suposto receptor.
Em outro teste de antagonistas, células de mamíferos oupreparação de membrana que expressa o receptor seriam incubadas compolipeptídeo TAT marcado na presença do possível composto. A capacidadedo composto de aumentar ou bloquear esta interação poderá então ser medida.
Exemplos mais específicos de potenciais antagonistas incluemoligonucleotídeo que se liga às fusões de imunoglobulina com polipeptídeo TATe, particularmente, anticorpos que incluem, sem limitação, anticorpos poli emonoclonais e fragmentos de anticorpos, anticorpos de fita simples, anticorposanti-idiotípicos e versões quiméricas ou humanizadas desses anticorpos oufragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos.Alternativamente, antagonista potencial pode ser proteína relacionada de perto,tal como forma do polipeptídeo TAT que sofreu mutação e reconhece oreceptor mas não proporciona nenhum efeito, de forma a inibircompetitivamente a ação do polipeptídeo TAT.
Outro potencial antagonista de polipeptídeo TAT é construção deDNA ou RNA antisense preparada utilizando tecnologia antisense, em que, porexemplo, molécula de DNA ou RNA antisense age para bloquear diretamente atradução de mRNA por meio de hibridização em mRNA alvo e evitando atradução de proteína. Tecnologia antisense pode ser utilizada para controlar aexpressão genética por meio de formação de hélice tripla ou RNA ou DNAantisense, em que os dois métodos baseiam-se na ligação de polinucleotídeo aDNA ou RNA. A parte codificadora 5' da seqüência de polinucleotídeos quecodifica os polipeptídeos TAT maduros do presente é utilizada, por exemplo,para projetar oligonucleotídeo de RNA antisense com comprimento de cerca dedez a quarenta pares de bases. Oligonucleotídeo de DNA é projetado para sercomplementar a região do gene envolvida na transcrição (hélice tripla - vide Lee et al, Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al, Science, 241: 456(1988); Dervan et al, Science, 251: 1360 (1991)), de forma a evitar atranscrição e a produção do polipeptídeo TAT. O oligonucleotídeo de RNAantisense hibridiza-se no mRNA in vivo e bloqueia a tradução da molécula demRNA no polipeptídeo TAT (antisense - Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press:Boca Raton FL, 1988). Os oligonucleotídeos descritos acima podem tambémser fornecidos para células de tal forma que o RNA ou DNA antisense possaser expresso in vivo para inibir a produção do polipeptídeo TAT. Ao utilizar-seDNA antisense, oligodesoxirribonucleotídeos derivados do sítio de início de tradução, tal como cerca de -10 a +10 posições da seqüência de nucleotídeosdo gene alvo, são preferidos.
Potenciais antagonistas incluem moléculas pequenas que seligam ao sítio ativo, ao sítio de ligação do receptor, fator de crescimento ououtro sítio de ligação relevante do polipeptídeo TAT, de forma a bloquear a atividade biológica normal do polipeptídeo TAT. Exemplos de moléculaspequenas incluem, mas sem limitar-se a peptídeos pequenos ou moléculassimilares a peptídeos, preferencialmente peptídeos solúveis, e compostosorgânicos ou inorgânicos não de peptidila sintéticos.Ribozimas são moléculas de RNA enzimáticas capazes decatalisar a divisão específica de RNA. Ribozimas agem por meio dehibridização específica de seqüências para o RNA alvo complementar, seguidapor divisão endonucleolítica. Sítios de divisão de ribozima específicos dentro dealvo de RNA potencial podem ser identificados por meio de métodosconhecidos. Para detalhes adicionais, vide, por exemplo, Rossi1 CurrentBiology 4: 469-471 (1994) e a Patente PCT n0 WO 97/33551 (publicada emdezoito de setembro de 1997).
Moléculas de ácido nucléico em formação de hélice triplautilizadas para inibir a transcrição deverão possuir fita simples e ser compostasde desoxinucleotídeos. A composição base desses oligonucleotídeos éprojetada de forma a promover a formação de hélice tripla por meio de regrasde pareamento de bases Hoogsteen, que geralmente necessitam deestiramentos dimensionáveis de purinas ou pirimidinas em uma fita de duplex.Para mais detalhes, vide, por exemplo, a Patente PCT n0 WO 97/33551, acima.
Estas moléculas pequenas podem ser identificadas por qualquerum ou mais dos testes de seleção discutidos acima e/ou por qualquer outrométodo de seleção bem conhecido dos técnicos no assunto.
Ácido nucléico codificador de polipeptídeo TAT isolado pode serutilizado na presente invenção para a produção recombinante de polipeptídeoTAT empregando métodos bem conhecidos na técnica e conforme descrito napresente invenção. Por sua vez, os polipeptídeos TAT produzidos podem serempregados para gerar anticorpos anti-TAT utilizando métodos bemconhecidos na técnica e conforme descrito na presente invenção.
Os anticorpos que ligam especificamente polipeptídeo TATidentificado na presente invenção, bem como outras moléculas identificadaspelos testes de seleção descritos acima, podem ser administrados para otratamento de várias disfunções, incluindo câncer, na forma de composiçõesfarmacêuticas.
Caso o polipeptídeo TAT seja intracelular e anticorpos inteiros sejamutilizados como inibidores, são preferidos anticorpos internalizantes. Entretanto,lipofecções ou Iipossomos também podem ser utilizados para fornecer o anticorpo,ou fragmento de anticorpo, para células. Ao utilizar-se fragmentos de anticorpos, omenor fragmento inibidor que se liga especificamente ao domínio de ligação daproteína alvo é preferido. Com base nas seqüências de região variável de anticorpo,por exemplo, podem ser projetadas moléculas de peptídeos que retenham acapacidade de ligação da seqüência de proteínas alvo. Esses peptídeos podem sersintetizados quimicamente e/ou produzidos por meio de tecnologia de DNArecombinante. Vide, por exemplo, Marasco etal, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A, 90:7889-7893 (1993).
A formulação do presente pode também conter mais de umcomposto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não seprejudiquem entre si. Alternativa ou adicionalmente, a composição podecompreender um agente que aprimore a sua função, tal como agentecitotóxico, citoquina, agente quimioterapêutico ou agente inibidor docrescimento. Essas moléculas encontram-se adequadamente presentes emcombinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
Os Exemplos a seguir são oferecidos unicamente para fins deilustração e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção denenhuma forma.
Todas as referências de patentes e literatura mencionadas nopresente relatório descritivo são integralmente incorporadas ao presente comoreferência.
Exemplos
Os reagentes disponíveis comercialmente indicados nosExemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, a menosque indicado em contrário. A fonte dessas células identificadas nos exemplos aseguir e em todo o relatório descritivo por números de acesso ATCC é aColeção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Manassas VA.
Exemplo 1
Formação de Perfis de Expressão de Tecidos Utilizando GeneExpress®
Banco de dados particular contendo informações sobre expressãogenética (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg MD) foi analisado emtentativa de identificar polipeptídeos (e seus ácidos nucléicos codificadores) cujaexpressão é significativamente regulada para cima de forma detectável emtecido(s) tumoroso(s) específico(s) de interesse em comparação com outro(s)tumor(es) e/ou tecidos humanos normais. Especificamente, a análise do banco dedados GeneExpress® foi conduzida utilizando software disponível por meio daGene Logic Inc., Gaithersburg MD, para uso com o banco de dadosGeneExpress® ou com software particular escrito e desenvolvido pela Genentech,Inc. para uso com o banco de dados GeneExpress® A avaliação de coincidênciaspositivas na análise baseia-se em diversos critérios que incluem, por exemplo,especificidade de tecido, especificidade de tumor e nível de expressão em tecidosessenciais normais e/ou em proliferação normal. A(s) molécula(s) a seguirexibe(m) perfil de expressão de tecidos que evidencia alta expressão de tecidos eregulagem para cima detectável significativa e reproduzível da expressão emtumor(es) específico(s) em comparação com outro(s) tumor(es) humano(s) e/outecidos humanos normais e opcionalmente expressão relativamente baixa emtecidos essenciais normais e/ou em proliferação normais.
Utilizando a análise de expressão descrita acima, determinou-seque mRNA que codifica o polipeptídeo TAT10772 é significativamente expressode forma reproduzível e detectável em certos tipos de tumores cancerosos depâncreas, mama e ovário humanos em comparação com os tecidospancreáticos, de mama e ovário humanos normais correspondentes,respectivamente.
A. Ovário
Em primeiro experimento, a expressão de TAT10772 foi analisadaem grupo de 89 amostras de tecido de ovário humano normais independentes.Os resultados destas análises demonstraram que o nível de expressão demRNA TAT10772 em todas as amostras de tecido de ovário humano normalanalisadas foi notadamente consistente e encontrou-se dentro de distribuiçãomuito firme, em que nenhuma amostra de tecido de ovário humano normalevidenciou aumento de mais de seis vezes na expressão de TAT10772 emcomparação com o nível médio de expressão de TAT10772 para o grupo deamostras como um todo.
Para fins de comparação quantitativa, uma série de tiposdiferentes e independentes de amostras de tecido de ovário humano cancerosotambém foi analisada para determinar a expressão de TAT10772. Osresultados obtidos destas análises demonstraram que o nível de expressão deTAT10772 nas amostras cancerosas foi bastante variável, em que quantidadesignificativa das amostras cancerosas exibiu aumento de pelo menos seisvezes (até cerca de 580 vezes) da expressão de TAT10772 em comparaçãocom o nível médio de expressão de TAT10772 para o grupo de amostras detecido de ovário normal analisado. Mais especificamente, observou-sesuperexpressão de TAT10772 detectável e reproduzível para os tipos decâncer de ovário a seguir em comparação com ovário normal (em que osalgarismos exibidos entre parênteses para cada tipo de câncer representam aquantidade de amostras independentes que exibiram aumento de pelo menosseis vezes da expressão de TAT10772 em comparação com o nível médio deexpressão de TAT10772 para o grupo de amostras de tecido de ovário normalanalisado/o número total de amostras de tumor independentes analisado):adenocarcinoma endometrióide (13/17), cistadenocarcinoma do soro, incluindopapilar (52/57) e adenocarcinoma de células limpas (7/10). Foram conduzidosexperimentos adicionais que confirmaram estes resultados.
B. Mama
Em outro experimento, a expressão de TAT10772 foi analisada emgrupo de 22 amostras de tecido de mama humano normais independentes. Osresultados destas análises demonstraram que o nível de expressão de mRNATAT10772 em todas as amostras de tecido de mama humano normal analisadas foinotadamente consistente e encontrou-se dentro de distribuição muito firme, em quenenhuma amostra de tecido de mama humano normal evidenciou aumento de maisde duas vezes na expressão de TAT10772 em comparação com o nível médio deexpressão de TAT10772 para o grupo de amostras como um todo.
Para fins de comparação quantitativa, 209 carcinomas dos dutosinfiltrantes HER-2 negativos humanos independentes das amostras de tecidode mama foram também analisados para determinar a expressão deTAT10772. Os resultados obtidos destas análises demonstraram que o nível deexpressão de TAT10772 nas amostras cancerosas foi bastante variável, emque 76 das 209 amostras testadas exibiram aumento de pelo menos duasvezes (até cerca de quinze vezes) da expressão de TAT10772 em comparaçãocom o nível médio de expressão de TAT10772 para o grupo de amostras detecido de mama normal analisado.
C. Pâncreas
Em outro experimento, a expressão de TAT10772 foi analisadaem grupo de 51 amostras de tecido de pâncreas humano normaisindependentes. Os resultados destas análises demonstraram que o nível deexpressão de mRNA TAT10772 em todas as amostras de tecido de pâncreashumano normal analisadas foi notadamente consistente e encontrou-se dentrode distribuição muito firme, em que nenhuma amostra de tecido de pâncreashumano normal evidenciou aumento de mais de duas vezes na expressão deTAT10772 em comparação com o nível médio de expressão de TAT10772 parao grupo de amostras como um todo.
Para fins de comparação quantitativa, 65 amostras de tecido deadenocarcinoma pancreático humano independentes foram também analisadospara determinar a expressão de TAT10772. Os resultados obtidos destasanálises demonstraram que o nível de expressão de TAT10772 nas amostrascancerosas foi bastante variável, em que 33 das 65 amostras testadas exibiramaumento de pelo menos duas vezes (até cerca de 21 vezes) da expressão deTAT10772 em comparação com o nível médio de expressão de TAT10772 parao grupo de amostras de tecido de pâncreas normal analisado.
Dado o acima, o polipeptídeo TAT10772 e o ácido nucléico quecodifica aquele polipeptídeo são excelentes alvos que podem ser exploradospara a determinação quantitativa e qualitativa do nível de expressão dopolipeptídeo TAT10772 e o mRNA que o codifica, em várias amostras de tecidode mamíferos, de forma a permitir que se tome comparações quantitativas equalitativas entre eles. Portanto, o polipeptídeo TAT10772 e o ácido nucléicoque codifica esse polipeptídeo são moléculas cujo perfil de expressão exclusivopode ser explorado para o diagnóstico de certos tipos de tumores cancerososem mamíferos, conforme descrito acima. Além disso, como esta análisedemonstra que o polipeptídeo TAT10772 é superexpresso de formasignificativa, reproduzível e detectável em certos tumores humanos emcomparação com os seus tecidos humanos normais correspondentes, opolipeptídeo TAT10772 serve de excelente alvo que pode ser explorado para otratamento terapêutico desses tumores em mamíferos.
Exemplo 2
Análise de Microconjuntos para Detectar a Regulagem para Cima depolipeptídeos TAT em tumores cancerososMicroconjuntos de ácido nucléico, que contêm freqüentementemilhares de seqüências genéticas, são úteis para a identificação de genesexpressos de forma diferencial em tecidos doentes, em comparação com osseus parceiros normais. Utilizando microconjuntos de ácido nucléico, amostrasde mRNA de teste e de controle de amostras de tecido de teste e de controlesofrem transcrição reversa e são marcadas para gerar sondas de cDNA. Assondas de cDNA são hibridizadas em seguida em um conjunto de ácidosnucléicos imobilizados sobre suporte sólido. O conjunto é configurado de talforma que a seqüência e a posição de cada membro do conjunto sejamconhecidas. Seleção de genes que conhecidamente são expressos em certosestados de doenças, por exemplo, pode ser reunida sobre suporte sólido. Ahibridização de sonda marcada com membro de conjunto específico indica quea amostra, da qual a sonda foi derivada, expressa aquele gene. Caso o sinal dehibridização de sonda de amostra de teste (tecido doente) seja maior que osinal de hibridização de sonda de amostra controle (tecido normal), o(s)gene(s) superexpresso(s) no tecido doente é(são) identificado(s). A implicaçãodeste resultado é que proteína superexpressa em tecido doente é útil nãoapenas como marcador de diagnóstico para determinar a presença dacondição de doença, mas também como alvo terapêutico para tratamento dacondição de doença.
A metodologia de hibridização de ácidos nucléicos e tecnologia demicroconjuntos é bem conhecida na técnica. No presente exemplo, apreparação específica de ácidos nucléicos para hibridização e sondas, lâminase condições de hibridização são todas detalhadas no Pedido de Patente PCTcom número de série PCT/US 01/10482; depositado em trinta de março de2001 e que é incorporado ao presente como referência.
No presente exemplo, tumores cancerosos derivados de váriostecidos humanos foram estudados para determinar a expressão genéticaregulada para cima com relação a tumores cancerosos de diferentes tipos detecidos e/ou tecidos humanos não cancerosos em tentativa de identificar ospolipeptídeos que são superexpressos em tumor(es) canceroso(s)específico(s). Em certos experimentos, tecido de tumor humano canceroso etecido de tumor humano não canceroso do mesmo tipo de tecido(freqüentemente do mesmo paciente) foram obtidos e analisados paradeterminar a expressão de polipeptídeo TAT. Além disso, tecido de tumorhumano canceroso de qualquer dentre uma série de diferentes tumoreshumanos foi obtido e comparado com amostra controle epitelial "universal" quefoi preparada por meio da reunião de tecidos humanos não cancerosos comorigem epitelial, que incluem fígado, rim e pulmão. mRNA isolado dos tecidosreunidos representa mistura de produtos genéticos expressos dessesdiferentes tecidos epiteliais, de forma a fornecer excelente controle negativocom o qual são comparados quantitativamente os níveis de expressão genéticaem tumores de origem epitelial. Experimentos de hibridização demicroconjuntos utilizando as amostras controle reunidas geraram plotagemlinear em análise bicolor. A inclinação da linha gerada em análise bicolor foiutilizada em seguida para normalizar as razões de (detecção de teste: controle)em cada experimento. As razões normalizadas de vários experimentos foramcomparadas em seguida e utilizadas para identificar a formação de conjuntosde expressão genética. Desta forma, a amostra "controle universal" reunida nãoapenas permitiu determinações da expressão genética relativa efetivas emcomparação simples de duas amostras, mas também permitiu comparaçõesentre múltiplas amostras ao longo de vários experimentos.
Nos experimentos do presente, sondas de ácido nucléico derivadasdas seqüências de ácido nucléico que codificam polipeptídeo TAT descritas napresente invenção foram utilizadas na criação do microconjunto e RNA de diversostecidos tumorosos foi empregado para a sua hibridização. Valor baseado na razãonormalizada:razão experimental foi denominado "razão de corte". Somente valoresacima desta razão de corte foram determinados como sendo significativos. Osignificado de razões foi estimado a partir da quantidade de ruído ou difusãoassociada a cada experimento, mas utilizou-se tipicamente razão de corte de 1,8 aduas vezes ou mais para identificar possíveis genes relativamente superexpressosem amostras de tumores, em comparação com o tecido normal correspondentee/ou o controle universal epitelial normal reunido. As razões para os genesidentificados desta forma como sendo relativamente superexpressos em amostrasde tumores variaram de duas a quarenta vezes, ou até mais. Comparativamente,em experimento controle em que o mesmo RNA foi marcado em cada cor ehibridizado contra si próprio, para virtualmente todos os genes com sinais acima dofundo, a razão observada é de significativamente menos de 1,8 vezes. Isso indicaque o ruído experimental acima de razão de 1,8 vezes é extremamente baixo e quealteração observada de 1,8 vezes ou mais é significativa e espera-se querepresente diferença real, detectável e reproduzível da expressão entre as amostrasanalisadas e comparadas.
Os resultados destes experimentos demonstraram que mRNA quecodifica o polipeptídeo TAT10772 é significativamente superexpresso (ou seja,pelo menos duas vezes) em oito dentre dez amostras de tumor de ováriohumano independentes testadas em comparação com tecido de ovário humanonormal e a amostra controle epitelial reunida. Estes dados tambémdemonstram que a superexpressão observada é significativa, detectável ereproduzível ao longo de várias amostras de tumor de ovário humano emcomparação com amostras de ovário humano correspondentes normais e aamostra controle epitelial humana reunida. Conforme descrito acima, estesdados demonstram que os polipeptídeos TAT10772 de acordo com a presenteinvenção e o ácido nucléico codificador são úteis não apenas comomarcadores de diagnóstico para determinar a presença de um ou mais tumoresde ovário humano, mas também servem de potenciais alvos terapêuticos parao tratamento desses tumores em seres humanos.
Exemplo 3
Análise Quantitativa da Expressão de mRNA de TAT
Neste teste, teste de 5'-nuclease (tal como TaqMan®) e PCRquantitativo em tempo real (tal como Sistema de Detecção de Seqüências ABIPrizm 7700® (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City CA))foram utilizados para encontrar genes que são significativamentesuperexpressos em tumor(es) canceroso(s) em comparação com outrostumores cancerosos ou tecido não canceroso normal. A reação de teste 5'nuclease é técnica baseada em PCR fluorescente, que faz uso da atividade de5'-exonuclease de enzima de polimerase de DNA Taq para monitorar aexpressão genética em tempo real. Dois primers de oligonucleotídeos (cujasseqüências são baseadas no gene ou seqüência de EST de interesse) sãoutilizados para gerar amplicon típico de reação de PCR. Terceirooligonucleotídeo, ou sonda, é projetado para detectar seqüência denucleotídeos localizada entre os dois primers de PCR. A sonda não éextensível por enzima polimerase de DNA Taq e é marcada com tinturafluorescente relatora e tintura fluorescente refrescante. Qualquer emissãoinduzida por laser da tintura relatora é resfriada pela tintura refrescante quandoas duas tinturas estiverem em posição próxima quando sobre a sonda. Durantea reação de amplificação por PCR, a enzima polimerase de DNA Taq divide asonda de maneira dependente de modelo. Os fragmentos de sonda resultantesdissociam-se em solução e o sinal da tintura relatora liberada é livre do efeitode resfriamento do segundo fluoroforo. Uma molécula de tintura relatora éliberada para cada nova molécula sintetizada e a detecção da tintura relatoranão resfriada fornece a base de interpretação quantitativa dos dados. Esteteste é bem conhecido e utilizado rotineiramente na técnica para identificarquantitativamente as diferenças de expressão genética entre duas amostras detecido humano diferentes; vide, por exemplo, Higuchi et al, Biotechnology 10:413-417 (1992); Livak et al, PCR Methods Appl., 4: 357-362 (1995); Heid et al,Genome Res. 6: 986-994 (1996); Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A.95 (25): 14717-14722 (1998); Pitti et al, Nature 396 (6712): 699-703 (1998) eBieche etal, Int. J. Câncer 78: 661-666 (1998).
O procedimento de 5' nuclease é conduzido em dispositivo PCRquantitativo em tempo real tal como a Detecção de Seqüências ABI Prism7700®. O sistema consiste de termociclador, laser, câmera de dispositivoacoplado a carga (CCD) e computador. O sistema amplifica amostras emformato de 96 cavidades sobre termociclador. Durante a amplificação, sinalfluorescente induzido por laser é recolhido em tempo real por meio de cabos defibra ótica para todas as 96 cavidades e detectado no CCD. O sistema incluisoftware para condução do instrumento e para análise dos dados.
O material de partida para a tela foi mRNA isolado de uma sériede diferentes tecidos cancerosos. O mRNA é quantificado precisamente, talcomo fluorometricamente. Como controle negativo, RNA foi isolado de váriostecidos normais do mesmo tipo de tecido dos tecidos cancerosos sendotestados. Freqüentemente, amostra(s) de tumor(es) é(são) comparada(s)diretamente com amostra(s) normal(is) "coincidente(s)" do mesmo tipo detecido, o que significa que o tumor e a(s) amostra(s) normal(is) são obtidos domesmo indivíduo.
Dados de teste de 5' nuclease são inicialmente expressos comoCt, ou o ciclo limite. Este é definido como o ciclo no qual o sinal relatoracumula-se acima do nível de fundo de fluorescência. Os valores ACt sãoutilizados como medida quantitativa do número relativo de cópias iniciais deseqüência alvo específica em amostra de ácido nucléico ao comparar-seresultados de mRNA de câncer com resultados de mRNA humano normal.Como uma unidade Ct corresponde a um ciclo PCR ou aumento relativo decerca de duas vezes com relação ao normal, duas unidades correspondem aaumento relativo de quatro vezes, três unidades correspondem a aumentorelativo de oito vezes e assim por diante, pode-se medir quantitativamente oaumento dobrado relativo da expressão de mRNA entre dois ou mais tecidosdiferentes. Nesse aspecto, é bem aceito na técnica que este teste ésuficientemente sensível tecnicamente para detectar de forma reproduzívelaumento de pelo menos duas vezes na expressão de mRNA em amostra detumor humano com relação a controle normal.
Utilizando esta técnica, determinou-se que mRNA que codifica opolipeptídeo TAT10772 é significativamente superexpresso (ou seja, pelomenos duas vezes) em nove dentre dez amostras de tumor de ovário humanotestadas em comparação com amostras de tecido de ovário humano normal dediferentes doadores de tecido, bem como várias amostras de tumor de ováriohumano normal "coincidentes", derivadas do mesmo doador de tecido humanodo qual a(s) amostra(s) de tumor(es) foi(ram) derivada(s). Conforme descritoacima, estes dados demonstram que os polipeptídeos TAT10772 de acordocom a presente invenção e o ácido nucléico codificador são úteis não apenascomo marcadores de diagnóstico para determinar a presença de tumores deovário humanos, mas também servem de potenciais alvos terapêuticos para otratamento desses tumores em seres humanos.
Exemplo 4Hibridação In situA hibridização in situ é método potente e versátil de detecção elocalização de seqüências de ácido nucléico em preparações de tecidos oucélulas. Pode ser útil, por exemplo, identificar sítios de expressão genética,analisar a distribuição de transcrição no tecido, identificar e localizar infecçõesvirais, seguir alterações na síntese específica de mRNA e auxiliar nomapeamento de cromossomos.
Realizou-se hibridização in situ seguindo versão otimizada doprotocolo de Lu e Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994), utilizando ribossondas33P-marcadas geradas por PCR. Resumidamente, tecidos humanos embutidosem parafina fixados com formalina foram seccionados, desparafinados,desproteinados em proteinase K (20 g/ml) por quinze minutos a 37 0C eprocessados adicionalmente para hibridização in situ conforme descrito por Lue Gillett, acima. Ribossonda antisense [33-P] UTP-marcada foi gerada a partirde produto de PCR e hibridizada a 55 0C por uma noite. As lâminas forammergulhadas em emulsão de rastreamento nuclear Kodak NTB2 e expostas porquatro semanas.
Síntese de ribossonda 33P
6,0 μΙ (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000Ci/mmol) foram secos a vácuo em velocidade. A cada tubo contendo 33P-UTP1foram adicionados os ingredientes a seguir:
-2,0 μΙ de 5x tampão de transcrição
-1,0 ^deDTT (100mM)
-2,0 μΙ de mistura NTP (2,5 mM: 10 μ; 10 mM de GTP, CTPe ATP cada + 10 μΙ de H2O)
- 1,0 μΜβ UTP (50 μΜ)
-1,0 μΙ de Rnasin
-1,0 μΙ de modelo de DNA (1 μg)
-1,0 μΙ de H2O
-1,0 μΙ de RNA polimerase (para produtos de PCR T3 = AS,T7 = S, normalmente)
Os tubos foram incubados a 37 0C por uma hora. 1,0 μΙ de RQ1DNase foram adicionados, seguidos por incubação a 37 0C por quinze minutos.Adicionou-se 90 μΙ de TE (10 mM de Tris, pH 7,6/1 mM de EDTA, pH 8,0) e amistura foi colocada com pipeta sobre papel DE81. A solução restante foi carregadaem unidade de ultrafiltragem Microcon 50 e centrifugada utilizando o programa 10(seis minutos). A unidade de filtragem foi invertida sobre segundo tubo ecentrifugada utilizando o programa 2 (três minutos). Após a centrifugação derecuperação final, adicionou-se 100 μΙ de TE. 1 μΙ do produto final foi colocado compipeta sobre papel DE81 e contado em 6 ml de Bioflúor II.
A sonda foi conduzida sobre gel de TBE e uréia. 1 a 3 μΙ da sondaou 5 μl de RNA Mrk Ill foram adicionados a 3 μl de tampão de carga. Apósaquecimento sobre bloco de aquecimento a 95 °C por três minutos, a sonda foiimediatamente colocada sobre gelo. As cavidades de gel receberam fluxo, aamostra foi carregada e conduzida a 180-250 volts por 45 minutos. O gel foiembalado em embalagem saran e exposto a filme XAR com tela deintensificação em congelador a -70 °C por uma hora a uma noite.
33P Hibridizacão
A. Tratamento prévio de seções congeladasAs lâminas foram removidas do congelador, colocadas sobrebandejas de alumínio e descongeladas à temperatura ambiente por cincominutos. As bandejas foram colocadas em incubador a 55 °C por cinco minutospara reduzir a condensação. As lâminas foram fixadas por dez minutos emparaformaldeído a 4% sobre gelo na capela de defumação e lavadas em 0,5 χSSC por cinco minutos à temperatura ambiente (25 ml 20 χ SSC + 975 ml SQH2O). Após desproteinação em 0,5 μg/ml de proteinase K por dez minutos a 37°C (12,5 μl de 10 mg/ml de padrão em 250 ml de tampão de RNAse livre deRNase previamente aquecido), as seções foram lavadas em 0,5 χ SSC por dezminutos à temperatura ambiente. As seções foram desidratadas em 70%, 95%,100% etanol, por dois minutos cada.
B. Tratamento prévio de seções embutidas em parafina
As lâminas foram desparafinadas, colocadas em SQ H2O eenxaguadas por duas vezes em 2 x SSC à temperatura ambiente, por cincominutos a cada vez. As seções foram desproteinadas em 20 μg/ml de proteinase K(500 μl de 10 mg/ml em 250 ml de tampão RNase livre de RNase; 37 0C1 quinzeminutos) - embrião humano, ou 8 x proteinase K (100 μl em 250 ml de tampãoRNase, 37 0C1 trinta minutos) - tecidos de formalina. Enxágüe subseqüente em 0,5 xSSC e desidratação foram realizados conforme descrito acima.
C. Hibridização prévia
As lâminas foram depositadas em caixa de plástico forrada comtampão de caixa (4 x SSC1 50% formamida) - papel filtro saturado.
D. Hibridização
1,0 x 106 cpm sonda e 1,0 μl de tRNA (50 mg/ml de padrão) porlâmina foram aquecidos a 95 0C por três minutos. As lâminas foram resfriadassobre gelo e adicionou-se 48 μl de tampão de hibridização por lâmina. Apósturbilhonamento, 50 μl de mistura 33P foram adicionados a 50 μl de hibridizaçãoprévia sobre a lâmina. As lâminas foram incubadas por uma noite a 55 0C.
E. Lavagens
A lavagem foi realizada 2x10 minutos com 2 x SSC, EDTA àtemperatura ambiente (400 ml 20 x SSC + 16 ml 0,25 M EDTA, Vf = 4L),seguida por tratamento com RNase A a 37 0C por trinta minutos (500 μl de 10mg/ml em 250 ml de tampão Rnase = 20 μg/ml). As lâminas foram lavadas 2 x10 minutos com 2 x SSC, EDTA à temperatura ambiente. As condições delavagem de estringência foram as seguintes: duas horas a 55 0C1 0,1 x SSC,EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml EDTA, Vf = 4L).
F. Oligonucleotídeos
Realizou-se análise in situ sobre uma série de seqüências deDNA descritas na presente invenção. Os oligonucleotídeos empregados paraestas análises foram obtidos de forma que sejam complementares aosácidos nucléicos (ou aos seus complementos) conforme exibido nas figurasanexas.
G. Resultados
Com relação à expressão de TAT10772 em tecidos humanosnormais, observa-se forte expressão da mucosa brônquica e glândulassubmucosas. Entretanto, todos os outros tecidos humanos normais testados sãonegativos para a expressão de TAT10772. Por outro lado, observa-se forteexpressão de TAT10772 em treze dentre quinze tumores de ovário (tumoresepiteliais da superfície e adenocarcinoma) testados. Também se observa forteexpressão de TAT10772 em oito dentre nove adenocarcinomas uterinos humanos.
Exemplo 5
Preparação de Anticorpos que Ligam TAT10772
Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais quepodem IigarTATI 0772 especificamente.
Métodos de produção dos anticorpos monoclonais sãoconhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Goding, acima.Imunogenes que podem ser empregados incluem TAT purificado, proteínas defusão que contêm TAT e células que expressam TAT recombinante sobre asuperfície celular. A seleção do imunogene pode ser realizada pelos técnicosno assunto sem experimentação indevida.
Camundongos, tais como Balb/c, são imunizados com o imunogeneTAT emulsificado em adjuvante de Freund completo e injetados por via subcutâneaou intraperitoneal em quantidade de 1 a 100 microgramas. Alternativamente, oimunogene é emulsificado em adjuvante MPL-TDM (Ribi ImmunochemicalResearch, Hamilton MT) e injetado nas almofadas das patas traseiras do animal. Oscamundongos imunizados são incentivados em seguida após dez a doze dias comimunogene adicional emulsificado no adjuvante selecionado. Em seguida, por váriassemanas, os camundongos podem também ser incentivados com i njeções deimunização adicionais. Amostras de soro podem ser obtidas periodicamente doscamundongos por meio de sangramento retroorbital para teste em ensaios ELISApara detectar anticorpos anti-TAT.
Após a detecção de título de anticorpo apropriado, os animais"positivos" para anticorpos podem ser injetados com injeção intravenosa final deTAT. Três a quatro dias mais tarde, os camundongos são sacrificados e as célulasdo baço são colhidas. As células do baço são fundidas em seguida (utilizandopolietileno glicol a 35%) a uma linha de células de mieloma murino selecionadas talcomo P3X63AgU.1, disponível por meio da ATCC1 n0 CRL 1597. As fusões geramcélulas de hibridoma que podem ser colocadas em placas em seguida em placasde cultura de tecidos com 96 cavidades que contêm meio HAT (hipoxantina,aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridosde mieloma e híbridos de células do baço.
As células de hibridoma serão selecionadas em ELISA paradeterminar a reatividade contra TAT. A determinação de células de hibridoma"positivas" que secretam os anticorpos monoclonais desejados contra TATencontra-se dentro do conhecimento da técnica.
As células de hibridoma positivas podem ser injetadas por viaintraperitoneal em camundongos Balb/c singeneicos para produzir ascite quecontém os anticorpos monoclonais anti-TAT. Alternativamente, as células dehibridoma podem ser cultivadas em frascos de cultura de tecidos ou garrafascilíndricas. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos na ascite pode serrealizada utilizando precipitação com sulfato de amônio, seguida por cromatografiade exclusão de géis. Alternativamente, pode-se empregar cromatografia deafinidade com base na ligação de anticorpo a proteína A ou proteína G.
Utilizando o método descrito acima, onze linhagens celulares dehibridoma separadas e distintas foram geradas, cada uma das quais produzanticorpos monoclonais que se ligam ao polipeptídeo TAT10772. Estas onzelinhagens celulares de hibridomas são denominadas a seguir 16F7.1.15 (queproduz o anticorpo monoclonal 16F7),17A8.1.3 (que produz o anticorpomonoclonal 17A8), 9F3.1.3 (que produz o anticorpo monoclonal 9F3),16E12.2.15 (que produz o anticorpo monoclonal 16E12), 16A7.1.3 (que produzo anticorpo monoclonal 16A7), 10G11.1.1 (que produz o anticorpo monoclonal10G11), 5B10 (que produz o anticorpo monoclonal 5B10), 11D10.1.14 (queproduz o anticorpo monoclonal 11D10), 5F6.1.24 (que produz o anticorpomonoclonal 5F6), 7G6.2.6 (que produz o anticorpo monoclonal 7G6) e 3A5.3(que produz o anticorpo monoclonal 3A5.3). Demonstrou-se que os anticorposmonoclonais produzidos por estas onze linhagens de hibridoma ligam-se aopolipeptídeo TAT10772 utilizando métodos bem conhecidos e rotineiramenteempregados tais como Western Blot1 análise ELISA, análise de ordenamentoFACS de células que expressam o polipeptídeo TAT10772 e/ou análiseimunohistoquímica. Dentre as onze linhagens de hibridoma que produzemanticorpos monoclonais anti-TAT10772 funcionais, duas (clones de hibridoma11D10.1.14e 3A5.3) foram depositadas com base nos termos do Tratado deBudapeste junto à Coleção Norte-Americana de Tipos de Tecidos, Manassas,VA, conforme descrito em detalhes adicionais abaixo.
Exemplo 6
Análises de Ligação Competitiva ε Mapeamento de Epítopos
Os epítopos de TAT10772 ligados pelos anticorpos monoclonaisdescritos foram determinados por meio de análise de ligação competitivapadrão (Fendly et al, Câncer Research 50: 1550-1558 (1990)). Estudos debloqueio cruzado foram elaborados sobre anticorpos por meio de fluorescênciadireta sobre células PC3 intactas elaboradas para expressar TAT10772utilizando a Máquina de Seleção PANDEX® para quantificar a fluorescência.Cada anticorpo monoclonal foi conjugado com isotiocianato de fluoresceína(FITC), utilizando procedimentos estabelecidos (Wofsy et al, Selected Methodsin Cellular Immunology, pág. 287, Mishel e Schiigi (eds.), São Francisco: W. J.Freeman Co. (1980)). Monocamadas confluentes de células PC3 queexpressam TAT10772 foram tripsinizadas, lavadas por uma vez e novamentesuspensas em 1,75 χ 106 células por mililitro em PBS frio contendo 0,5% dealbumina de soro bovino (BSA) e 0,1% NaN3. Concentração final de partículasde látex a 1% (IDC, Portland OR) foi adicionada para reduzir a obstrução dasmembranas de placas PANDEX®. Células em suspensão, 20 μl, e 20 μl deanticorpos monoclonais purificados (100 μg/ml a 0,1 μg/ml) foram adicionadosàs cavidades de placas PANDEX® e incubadas sobre gelo por trinta minutos.Diluição previamente determinada de anticorpos monoclonais marcados comFITC em 20 μl foi adicionada a cada cavidade, incubada por trinta minutos,lavada e a fluorescência foi quantificada pela Máquina de Seleção PANDEX®.Os anticorpos monoclonais foram considerados compartilhando epítopo casocada um bloqueasse a ligação do outro em 40% ou mais em comparação comanticorpo monoclonal irrelevante controle e à mesma concentração deanticorpo. Neste experimento, os anticorpos monoclonais 16F7, 17A8, 9F3,16E12, 16A7, 10G11, 5B10, 11D10, 5F6, 7G6 e 3A5 receberam os epítoposTAT10772 Β, Β, Β, Β, Β, Β, A, Β, B, C e D, respectivamente. Utilizando esteteste, os técnicos comuns no assunto podem identificar outros anticorposmonoclonais que se ligam ao mesmo epítopo descrito acima.
Também foi conduzida análise de exclusão para identificar o sítioaproximado na seqüência de polipeptídeos exibida como SEQ ID N0 2 dosepítopos antigênicos descritos acima. Estas análises demonstraram que oepítopo antigênico TAT10772 A é encontrado entre os aminoácidos 6471 e6560 de SEQ ID N0 2, epítopo antigênico TAT10772 B é encontrado entre osaminoácidos 6389 e 6470 de SEQ ID N0 2, epítopo antigênico TAT10772 C éencontrado entre os aminoácidos 6663 e 6806 de SEQ ID N0 2 e epítopoantigênico TAT10772 D é encontrado entre os aminoácidos 3765 e 6397 deSEQ ID N0 2 (que compreende cerca de dezessete seqüências de repetiçãosimilares a mucina com 150 aminoácidos e, portanto, compreende maisprovavelmente diversos sítios de epítopos antigênicos similares). Polipeptídeosque compreendem qualquer destes sítios de epítopos antigênicosespecificamente identificados (e moléculas de ácido nucléico que codificamestes polipeptídeos) são englobados na presente invenção.
Em experimento separado, demonstrou-se que a ligação deanticorpo monoclonal para 3A5 a células OVCAR-3, OVCA-432 e SK-OV-3conforme determinado por meio de análises de citometria de fluxo padrão,encontra-se em paralelo com o nível de expressão de mRNA TAT10772expresso em cada uma destas três linhagens celulares específicas, conformedeterminado por meio de análises de PCR quantitativas padrão. Maisespecificamente, conforme determinado por meio de análise de PCRquantitativa padrão, células OVCAR-3, OVCA-432 e SK-OV-3 expressam nívelalto, moderado e baixo de mRNA TAT10772, respectivamente. Ao empregar-seo anticorpo monoclonal 3A5 em análises de citometria de fluxo padrão paraquantificar a capacidade de 3A5 de ligar-se a estas células, observou-se que aligação de 3A5 fica em paralelo quantitativamente com a quantidade relativa demRNA TAT10772 presente nestas linhagens celulares. Estes dados sugeremque a quantidade de mRNA TAT10772 em qualquer tipo de célula específicodetermina quantitativamente a quantidade de polipeptídeo TAT10772 expressapor aquele tipo de célula e, por sua vez, determina a capacidade de qualqueranticorpo anti-TAT10772 de ligar-se àquele tipo de célula.
Exemplo 7
Análise Imunohistoquíiviica
Anticorpos contra TATI0772 foram preparados conforme descritoacima e realizou-se análise imunohistoquímica utilizando os anticorpos monoclonais3A5 e 11D10 conforme segue. Seções de tecido foram fixadas em primeiro lugarpor cinco minutos em acetona/etanol (congelado ou embutido em parafina). Asseções foram lavadas em seguida em PBS e depois bloqueadas com avidina ebiotina (kit Vector) por dez minutos, cada qual seguido por lavagem em PBS. Asseções foram bloqueadas em seguida com soro a 10% por vinte minutos e depoismanchadas para remover o excesso. Adicionou-se anticorpo primário em seguidaàs seções em concentração de 10 μg/ml por uma hora e depois as seções foramlavadas em PBS. Adicionou-se anticorpo secundário biotinilado (anti-anticorpoprimário) em seguida às seções por trinta minutos e depois as seções foramlavadas com PBS. As seções foram expostas em seguida aos reagentes do kitVector ABC por trinta minutos e as seções foram depois lavadas em PBS. Asseções foram expostas em seguida a Diaminobenzidina (Pierce) por cinco minutose depois lavadas em PBS. As seções foram contramanchadas em seguida comhematoxilina Mayers1 cobertas com tampa e visualizadas. Análiseimunohistoquímica pode também ser realizada conforme descrito em Sambrook etal, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press,1989, e Ausubel et al, Current Protocols of Molecular Biology, Unidade 3.16, JohnWiley & Sons (1997).
Os resultados destas análises demonstram que o anticorpomonoclonal 11D10 não se liga de forma detectável a nenhum dos tecidoshumanos normais a seguir: aorta, cérebro, cólon, fígado, rim, intestino delgado,estômago, pulmão (tanto tecido alveolar quanto brônquico). Entretanto, seisdentre treze amostras de adenocarcinoma de ovário humano independentes euma dentre sete amostras de adenocarcinoma endométrico humanoindependentes exibem forte ligação ao anticorpo 11D10. Além disso, emexperimento separado, o anticorpo 11D10 liga-se fortemente a uma dentrenove amostras de tumor de adenocarcinoma mucinoso humano, treze dentre22 amostras de tumor de adenocarcinoma endometrióide humano, dezessetedentre 26 amostras de tumor de cistoadenocarcinoma do soro humano e trêsdentre oito amostras de tumor de células limpas humano.Os resultados destas análises demonstram que o anticorpomonoclonal 3A5, como o anticorpo monoclonal 11D10, não se liga de formadetectável a nenhum dos tecidos humanos normais relacionados acima.Entretanto, o anticorpo 3A5 liga-se fortemente a dois dentre doisadenocarcinomas de ovário humano independentes (manchas membranosas),dezesseis dentre vinte amostras de tumores de adenocarcinomaendometrióides, 24 dentre 25 amostras de tumor de cistadenocarcinoma dosoro humano e cinco dentre dez amostras de tumor de células limpas.
Exemplo 8
Anticorpo Monoclonal 3A5 é Internalizado Mediante ligação ao
Polipeptídeo TAT10772 Sobre Células
Este experimento demonstra que o anticorpo monoclonal 3A5torna-se internalizado em células às quais liga polipeptídeo TAT10772 sobre asuperfície celular. Especificamente, células OVCAR-3 foram incubadas pordezoito horas com o anticorpo monoclonal 3A5 e dextrano fluorescente e, emseguida 3A5 associado a células foi detectado quantitativamente com anticorpoanti-3A5 marcado com fluoresceína. Estas análises demonstraram que oanticorpo 3A5 colocaliza-se com dextran, o que indica o tráfico do anticorpo3A5 para componentes subcelulares das células incubadas, que incluem oscompartimentos lisossômicos destas células.
Exemplo 9
Humanização de Anticorpos Monoclonais Murinos
Este exemplo demonstra a aplicabilidade do método de reparo deCDRs para humanização de anticorpos murinos 11D10 e 3Α5 dirigidos contraΤΑΤ10772.
Foram utilizadas três formas de ΤΑΤ10772 durante o processo dehumanização. O antígeno oculto TAT10772 humano, CA125, engloba oantígeno oculto completo e foi adquirido da US Biological C0050-10. A hasteΤΑΤ10772 consiste do último domínio de mucina mais C-terminal e aseqüência C-terminal a seguir gerando a região de transmembrana prevista(aminoácidos 6282 a 6979 de SEQ ID N0 2). TAT10772 de cinco domínios(aminoácidos 4471 a 5171 de SEQ ID N0 2) é parte recombinante do domínioextracelular que codifica cinco domínios de mucina mais a seqüência C-terminal que gera a região de transmembrana prevista. A haste MUC16 e odomínio de 5-mucina foram expressos em células CHO e purificados por meiosconvencionais.
Os números de resíduos são de acordo com Kabat (Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). São utilizadasabreviações de aminoácidos de uma letra. Degenerações de DNA sãorepresentadas utilizando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B=C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
Clonagem de domínios variáveis 11D10 e 3A5 murinos egeração de anticorpos 11D10 e 3A5 quiméricos
RNA total foi extraído de células de hibridoma produtoras de11D10 ou 3A5 utilizando métodos padrão. Os domínios variáveis leve (VL) epesado (VH) foram amplificados utilizando RT PCR com primers degeneradospara as cadeias leve e pesada. Os primers frontais foram específicos para aseqüência de aminoácidos N-termínal das regiões VL e VH. Respectivamente,os primers reversos LC e HC foram projetados para combinar-se a região nodomínio leve constante (CL) e pesado constante 1 (CH1), que são altamenteconservados entre as espécies. VL e VH amplificados foram clonados emvetores de expressão de mamíferos. A seqüência de polinucleotídeos dosinsertos foi determinada utilizando métodos de seqüenciamento de rotina. Asseqüências de aminoácidos VL (mui 1D10-L) e VH (mui 1D10-H) de 11D10 sãoexibidas nas Figuras 3 e 4, respectivamente (SEQ ID N0 4 e 7,respectivamente); as seqüências de aminoácidos VL (mu3A5-L) e VH (mu3A5-H) de 3A5 são exibidas nas Figuras 5 e 6, respectivamente (SEQ ID N0 9 e 11,respectivamente). As regiões de HVR de acordo com a numeração de Kabatsão exibidas em negrito nas Figuras 3 a 6.
Região hipervariável direta enxerta-se à estrutura deconsenso humana aceptora
O fagomídeo utilizado para este trabalho é vetor de exibição deFab-g3 monovalente e consiste de dois quadros de leitura abertos sob ocontrole do promotor phoA. O primeiro quadro de leitura aberta consiste daseqüência sinal stll fundido aos domínios VL e CH1 da cadeia leve receptora eo segundo consiste da seqüência sinal stll fundida aos domínios VH e CH1 dacadeia pesada receptora seguida pela proteína de revestimento de fago menorP3.
Os domínios VL e VH dos anticorpos 11D10 e 3A5 murinos foramalinhados com as seqüências de consenso VL d subgrupo I kappa humano(huKI; SEQ ID N0 3) e VH de subgrupo Ill humano (hulll; SEQ ID N0 6). Paraelaborar os enxertos de HVR1 regiões hipervariáveis dos anticorpos murinosforam enxertadas nas estruturas aceptoras huKI e hulll. Para 3A5, foramtestadas duas estruturas de VH aceptoras (denominadas na presente invenção3A5.L e 3A5.F, respectivamente), que diferem somente na posição deaminoácido 78 (vide as Figuras 6A e B).
Regiões hipervariáveis de anticorpos 11D10 e 3A5 murinos foramelaboradas na estrutura de consenso humana aceptora para gerar os enxertosde HVR diretos, enxerto de 11D10, enxerto de 3A5.L e enxerto de 3A5.F. Nodomínio VL1 as regiões a seguir foram enxertadas no aceptor de consensohumano: posições 24 a 34 (HVR-L1), 49 a 56 (HVR-L2) e 89 a 97 (HVR-L3). Nodomínio VH1 as posições 26 a 35A (HVR-H1), 49 a 65 (HVR-H2) e 93 a 102(HVR-H3) foram enxertadas (Figuras 3 a 6). MacCaIIum et al (MacCaIIum et al,J. Mol. Bioi 262: 732-745 (1996)) analisaram estruturas de cristal de complexode antígeno e anticorpo e encontraram a posição 49 da cadeia leve e asposições 49, 93 e 94 da cadeia pesada são parte da região de contato deantígeno e, desta forma, parece razoável incluir estas posições nas definiçõesde HVR-L2, HVR-H2 e HVR-H3 ao humanizar anticorpos.
As variantes de enxerto direto foram geradas por meio demutagênese de Kunkel, utilizando oligonucleotídeo separado para cada regiãohipervariável. Os clones corretos foram determinados por meio deseqüenciamento de DNA.
Aleatorização das regiões hipervariáveis
Para cada anticorpo enxertado, diversidade de seqüências foiintroduzida separadamente em cada região hipervariável utilizando estratégiade aleatorização mole (bibliotecas SR) que mantém orientação em direção àseqüência de região hipervariável murina. Isso foi obtido utilizando estratégiade síntese de oligonucleotídeos envenenados descrita em primeiro lugar porGallop et al, J. Med. Chem. 37: 1233-1251 (1994). Para dada posição emregião hipervariável a sofrer mutação, o códon que codifica o aminoácido dotipo selvagem é envenenado com mistura 70-10-10-10 de nucleotídeos,resultando em taxa de mutação média de 50% em cada posição.
Oligonucleotídeos aleatorizados moles podem ser padronizadosapós as seqüências de região hipervariável murina e englobaram as mesmasregiões definidas pelos enxertos de região hipervariável direta. A posição deaminoácido no início de H2 (posição 49) no domínio VH teve a diversidade deseqüências limitada a A1 G, S ou T, utilizando o códon RGC.
Além das bibliotecas de aleatorização moles descritas acima, cadaposição em cada região hipervariável de enxerto de 3A5.L e enxerto de 3A5.F foitotalmente aleatorizada em todos os vinte aminoácidos possíveis utilizandooligonucleotídeos que codificam NNS. Isso foi conseguido em dois tipos debibliotecas. No primeiro, foram elaboradas diversas bibliotecas, cada qualconsistindo de vinte membros que possuem uma única posição localizada em umadas regiões hipervariáveis de 3A5 totalmente aleatorizadas. Para cobrir cadaposição nas regiões hipervariáveis, 63 bibliotecas deste tipo foram geradas ecombinadas em uma "biblioteca de posição única" (biblioteca SP) reunida queengloba mutações isoladas localizadas ao longo de cada posição hipervariável. Asegunda biblioteca introduziu todos os vinte aminoácidos em todas as posições(biblioteca FR) em uma única região hipervariável ao mesmo tempo. Para estesdois tipos de bibliotecas, havia seis bibliotecas, cada qual englobando uma regiãohipervariável separada do enxerto de 3A5.L ou enxerto de 3A5.F.
Para evitar a nova seleção da seqüência enxertada de CDR dotipo selvagem, introduziu-se códon de parada (TAA) no meio de cada HVR pormeio de mutagênese de Kunkel, resultando em seis modelos diferentes paracada enxerto (enxerto de 11D10, enxerto de 3A5.L e enxerto de 3A5.F), cadaqual com códon de parada introduzido em HVR diferente. Ao gerar asbibliotecas SR, FR e SP, oligonucleotídeos aleatorizados foram utilizados paraintroduzir diversidade, bem como para reparar o códon de parada no modelocorrespondente. Para bibliotecas 3A5, utilizou-se mistura de modelos 3A5.L e3A5.F durante a construção de cada biblioteca. Todos os três tipos debibliotecas foram gerados para humanização de 3A5, enquanto somente abiblioteca SR foi gerada para humanização de 11D10.
Geração de bibliotecas de fagos
Conjuntos de oligonucleotídeos aleatorizados projetados paracada região hipervariável conforme descrito acima foram fosforiladosseparadamente em reações de 20 μl contendo 660 ng de oligonucleotídeo, 50mM de Tris pH 7,5, 10 mM de MgCI2, 1 mM de ATP, 20 mM de DTT e 5 U depolinucleotídeo quinase por uma hora a 37 °C.
Para gerar as bibliotecas SR e FR, cada conjunto deoligonucleotídeo fosforilado dirigido para introduzir diversidade em uma únicaHVR foi combinado com 20 μg de modelo Kunkel que contém o códon deparada correspondente. A reação foi realizada em 50 mM de Tris pH 7,5, 10mM de MgCI2 em volume final de 500 μΙ, resultando em razão entreoligonucleotídeo e modelo de 3. A mistura foi combinada a 90 0C por quatrominutos, 50 0C por cinco minutos e resfriada sobre gelo em seguida. O modelocombinado (250 μΙ) foi preenchido em seguida por meio da adição de 1 μΙ de100 mM ATP, 10 μΙ de 25 mM d NTPs (25 mM de d ATP, dCTP, dGTP e dTTPcada), 15 μΙ de 100 mM DTT, 25 μΙ de 10X tampão TM (0,5 M Tris1 pH 7,5, 0,1M MgCI2), 2400 U de T4 Iigase e 30 U de T7 polimerase por três horas àtemperatura ambiente. O produto cheio foi limpo e eletroporado em seguida emcélulas SS320 e propagado na presença de fago auxiliar M13/K07 conformedescrito por Sidhu et al, Methods in Enzymology 328: 333-363 (2000). Ostamanhos das bibliotecas variaram de 1 a 2 χ 109 clones independentes.
Clones aleatórios das bibliotecas iniciais foram seqüenciados para determinar aqualidade da biblioteca.
Diversas (63) reações de mutagênese de Kunkel padrão foramrealizadas em placa de PCR de 96 cavidades para gerar as bibliotecas de 3A5SP. A partir das reações de oligonucleotídeos fosforilados (acima), adicionou-se 2 μl a 300 ng de modelo de Kunkel que contém o códon de paradacorrespondente em 50 mM de Tris pH 7,5, 10 mM de MgCI2 em volume final de10 μl. A mistura foi combinada a 90°C por dois minutos, 50°C por cincominutos e resfriada em seguida sobre gelo. O modelo combinado foipreenchido em seguida por meio da adição de 0,5 μl de 10 mM ATP, 0,5 μl de10 mM dNTPs (10 mM de d ATP, dCTP, dGTP e dTTP cada), 1 μl de 100 mMDTT1 1 μl de 10X tampão TM (0,5 M Tris, pH 7,5, 0,1 M MgCl2), 80 U de T4ligase e 4 U de T7 polimerase em volume total de 20 μl por duas horas àtemperatura ambiente. Estes produtos preenchidos e ligados foramtransformados em células XL1-azuis, cultivados em 0,5 ml de 2YT que contém5 μg/ml de tetraciclina e fago auxiliar M13/K07 (MOI 10) por duas horas a 37°C, reunidos em seguida e transferidos para 500 ml de 2YT que contém 50μg/ml de carbenacilina e cultivados por dezesseis horas a 37 °C.
Seleção de fagos
Para as seleções de fagos descritas abaixo, haste TAT10772 (2μg/ml), CA125 (17 μg/ml), TAT10772 de cinco domínios (2 μg/ml) ou neutravidin (2μg/ml) foram imobilizados em PBS sobre placas de microtítulos MaxiSorp (Nunc)por uma noite a 4 0C. As placas foram bloqueadas por pelo menos uma horautilizando Bloqueador de Caseína (Pierce). Fago foi colhido do sobrenadante decultura e suspenso em PBS contendo 1% BSA e 0,05% TWEEN® 20 (PBSBT).Após a seleção de fagos, conforme descrito abaixo, placas de microtítulos foramextensamente lavadas com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) e fagoligado foi eluído incubando-se as cavidades com 100 mM de HCI por trinta minutos.Fagos foram neutralizados com 1 M Tris, pH 8, e amplificados utilizando célulasXLI-Azuis e fago auxiliar M13/K07 e cultivados por uma noite a 37 0C em 2YT, 50μg/ml de carbenacilina. Os títulos de fagos eluídos de cavidade retentora alvo foramcomparados com títulos de fago recuperados de cavidade retentora não alvo paradeterminar o enriquecimento.
O método de ordenamento de soluções foi descrito (Fuh et al, J.Mol. Biol. (2004)) e permite a seleção de velocidades ligadas mais altas pormeio de controle de concentração alvo biotinilada e velocidades desligadasmais baixas resultantes de concorrência com alvo não marcado. HasteTAT10772 e TAT10772 com cinco domínios foram biotinilados utilizando Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce).
A haste TAT10772 foi utilizada como fago alvo para ahumanização de 11D10. A haste TAT10772 foi imobilizada diretamente sobreplacas de microtítulos MaxiSorp (Nunc) a 2 μg/ml em PBS para a primeirarodada de seleção de fagos. Rodadas sucessivas de seleção utilizaram métodode seleção solúvel (Fuh et al, J. MoL Biol. (2004)). Haste TAT10772 biotiniladafoi incubada em primeiro lugar com a biblioteca de fagos por uma hora, seguidapor captura por cinco minutos do fago ligado sobre placa revestida comneutravidina. Adicionou-se excesso de haste TAT10772 não marcada (mais de100 nM) antes da etapa de captura para períodos de tempo crescentes paraaumentar a estringência de seleção. A tabela a seguir resume as condiçõesque foram utilizadas para combinação de solução das bibliotecas 11D10.
Rodada de Seleção [Haste TAT10772 biotiniladal Incubação com hasteTAT10772 em excesso
2 10nM 20 min a 25°C
3 10nM 6,5 ha 25°C
4 10nM 88,5 ha 25°C
5 1 nM 48 h a 25 0C1 depois 52 h a 37°C
CA125 e TAT10772 com cinco domínios foram utilizados como alvos de fagospara humanização de 3A5. Bibliotecas foram ordenadas individualmente para aprimeira rodada de seleção contra TAT10772 com cinco domínios imobilizado(2 μg/ml em PBS) ou CA125 (17 μg/ml em PBS) que foi revestido sobre placasde microtítulos Nunc MaxiSorp. Após a amplificação, as bibliotecas foramreunidas de acordo com o seu tipo de biblioteca (FR/SR/SP) e se foramcombinadas contra CA125 ou TAT10772 com cinco domínios e ordenadas porduas rodadas adicionais contra os seus alvos imobilizados correspondentes.Três rodadas sucessivas de seleção foram realizadas por meio de combinaçãocontínua contra os alvos imobilizados ou por meio de seleção contra TAT10772com cinco domínios biotinilado solúvel utilizando estratégia de ordenamento desolução (Fuh et al, J. Mol. Biol. (2004)). Para o método de ordenamento desolução, bibliotecas de fagos foram incubadas com 1 nM de TAT10772 comcinco domínios biotinilado por uma hora, seguido pela adição de TAT10772com cinco domínios não marcado em excesso (mais de 100 nM) por até 22horas para aumentar a estringência de seleção. Fago ligado ao TAT10772 comcinco domínios biotinilado foi capturado rapidamente (cinco minutos), utilizandoplaca revestida com neutravidina.
ELISA de Fago de Haste TAT10772
Placas de microtítulos MaxiSorp foram revestidas com hasteTAT10772 a 2 μg/ml em PBS por uma noite e, em seguida, bloqueadas comBloqueador de Caseína. Fago de sobrenadantes de cultura foi incubado comhaste TAT10772 diluída em série em PBST contendo 1% BSA em placa demicrotítulos de cultura de tecidos por uma hora, após o quê, 80 μΙ da misturaforam transferidos para as cavidades revestidas alvo por quinze minutos paracapturar fago não ligado. A placa foi lavada com PBST e adicionou-se anti-M13conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (1:5000 em PBSBT) porquarenta minutos. A placa foi lavada com PBST e desenvolvida por meio daadição de substrato Tetrametilbenzidina (Kirkegaard e Perry Laboratories,Gaithersburg MD). A absorção a 450 nm foi plotada em função daconcentração alvo em solução para determinar IC50. Este foi utilizado comoestimativa de afinidade para o clone de Fab exibido sobre a superfície do fago.
Determinação da Afinidade e Produção de Fab e IgG
Para expressar proteína de Fab para medições de afinidade,códon de parada foi introduzido entre a cadeia pesada e g3 no vetor deexibição de fagos. Clones foram transformados em células 34B8 de E. coli ecultivadas em meios C. R. A. P. completos a 30 0C (Presta et al, Câncer Res.57: 4593-4599 (100997)). Células foram cultivadas por meio de centrifugação,suspensas em PBS, 100 μΜ de PMSF1 100 μΜ de benzamidina, 2,5 mM deEDTA e rompidas abertas utilizando microfluidificador. Fab foi purificado comcromatografia de afinidade de Proteína G.
Determinações de afinidade foram realizadas por meio deressonância plasmática de superfície utilizando BIAcore TM-2000. Cerca de500 RU de TAT10772 com cinco domínios ou cerca de 300 RU de IgG foramimobilizados em 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, sobre chip sensor CM5 ediluições por duas vezes em série do parceiro de ligação correspondente (1 a1000 nM) em PBST receberam injeção em velocidade de fluxo de 20 μΙ/min.Cada amostra foi analisada com associação de cinco minutos e dissociação dedez minutos. Após cada injeção, o chip foi regenerado utilizando 10 mM deglicina, pH 1,5. A resposta de ligação foi corrigida subtraindo-se o RU de célulade fluxo padrão. Modelo Languir 1:1 de definição simultânea de kon e k0ft foiutilizado para análise cinética.
Humanização de 11D10
A estrutura aceptora humana utilizada para humanização de 11D10consiste no domínio VL de consenso kappa I humano e variante do domínio VH deconsenso de subgrupo Ill humano. Os domínios VL e VH de 11D10 murino foramalinhados com os domínios kappa I e subgrupo Ill humanos; cada região dedeterminação de complementaridade (CDR) foi identificada e enxertada na estruturaaceptora humana para gerar enxerto de HVR que poderá ser exibido na forma deFab sobre fago (Figs. 3 e 4). Ao testar-se fago que exibe o enxerto 11D10 HVR paradeterminar a ligação a CA125 imobilizado, observou-se ligação de fagos. Quando aseqüência de enxerto de 11D10 HVR foi expressa na forma de Fab, análise Biacoretambém demonstrou ligação a CA125.
Foi gerada bibilioteca de SR para 11D10, na qual cada HVR foialeatorizada mole individualmente. As seis bibliotecas SR foram combinadasseparadamente contra haste TAT10772 imobilizada por cinco rodadas deseleção. Observou-se o início do enriquecimento após a terceira rodada e, emseguida á quinta rodada, os clones foram tomados para análise de seqüênciasde DNA. Foram observadas alterações de seqüências dirigidas a cada uma dasHVRs. Clones foram selecionados utilizando ELISA anti-fago TAT10772.Clones selecionados foram expressos como Fab para análise adicional pormeio de Biacore. Vários clones foram reformatados como IgG para análise deScatchard. Análise de FACS utilizando células OVCAR-3 demonstrou quetodos os anticorpos humanizados 11D10 testados foram capazes de ordenarpor FACS efetivamente as mencionadas células. A partir destes resultados, ficaclaro que existem diversas alterações de seqüências que podem reparar aafinidade de 11D10 enxertado sobre estrutura humana e que este anticorpopode ser humanizado por meio de reparo de CDRs para gerar afinidades queatendem ou excedem a do anticorpo murino inicial.
Humanização de 3A5
Duas estruturas aceptoras humanas, 3A5.L e 3A5.F, foram utilizadaspara humanização de 3A5 e são baseadas no domínio VL de consenso kappa Ihumano e no domínio VH de consenso de subgrupo Ill humano. Os domínios VL eVH de 3A5 murino foram alinhados com os domínios kappa I e subgrupo Illhumanos; cada região de determinação de complementaridade (CDR) foiidentificada e enxertada na estrutura aceptora humana para gerar enxerto de HVRque poderá ser exibido na forma de Fab sobre fago (Figs. 5 e 6). Ao testar-se fagoque exibe o enxerto 3A5 HVR para determinar a ligação a CA125 imobilizado,observou-se ligação de fagos. Quando expresso na forma de Fab, análise Biacoretambém demonstrou ligação a TAT10772 com cinco domínios.
Foram geradas bibliotecas de SR1 FR e SP, nas quais introduziu-se diversidade separadamente em cada HVR do enxerto de 3A5 HVR. Asbibliotecas foram reunidas contra CA125 e TAT10772 com cinco domíniosutilizando estratégias de ordenamento de solução e de fase sólida. O métodode ordenamento de solução permite a seleção de clones com alta afinidade pormeio de manipulação da concentração alvo biotinilada e tempo de captura defagos enquanto a adição de alvo não marcado pode ser utilizado para eliminarclones com velocidades de desligamento mais altas (Fuh et aí, J. Mol. Bioi340, 1073-1093 (2004)). Observou-se enriquecimento após a segunda rodadaem todas as bibliotecas. Análise de FACS utilizando células OVCAR-3demonstrou que todos os anticorpos humanizados 3A5 testados foram capazesde ordenar por FACS efetivamente as mencionadas células.
Após a quinta rodada, clones foram tomados para análise deseqüências de DNA de cada biblioteca e revelaram alterações de seqüênciasdirigidas a HVR-H3, o que sugere que o novo projeto desta CDR foi importantepara a restauração da ligação de antígenos.
Análise de seqüências de clones humanizados
Foram obtidas as seqüências de aminoácidos para todas asregiões de HVR de cadeia leve e de cadeia pesada de todos os cloneshumanizados. Para anticorpos 11D10 humanizados, as seqüências de HVRobtidas são exibidas nas Figuras 7 a 12. Para anticorpos 3A5 humanizados, asseqüências de HVR obtidas são exibidas nas Figuras 13 a 18. As Figuras 19 e20 exibem exemplos de seqüências de estrutura de consenso humanasaceptoras para cadeias variáveis pesadas e leves, respectivamente. Apresente invenção engloba anticorpos que compreendem pelo menos umadas seqüências de estrutura de consenso humanas aceptoras descritas emcombinação com pelo menos uma das seqüências de HVR descritas.
Análises de ligação para clones de anticorpo 3A5humanizados selecionados
Vários clones 3A5 humanizados foram selecionados paraexpressão como IgG e caracterizados para ligação a TAT10772 por meiode Biacore, ELISA de ligação competitiva e análises de ligação de célulasOVCAR-3. Resultados das análises ELISA padrão são exibidos na Tabela7 abaixo. Resultados das análises Biacore padrão que medem a ligação aodomínio 5' TAT10772 a anticorpos IgG variantes 3A5 imobilizados sãoexibidos na Tabela 8 abaixo. Observe-se que todos os anticorpos testadosforam IgG e continham a seqüência de cadeia variável leve exibida napresente invenção como SEQ ID N0 211. Concluiu-se que mutação para trásde S49Y em VL não apresenta efeito sobre a ligação e foi incorporada àsvariantes humanizadas finais, pois tirosina é mais comumente encontradanesta posição. A seqüência de cadeia variável pesada do anticorpo éindicada nas Tabelas 7 e 8. Conforme exibido nas Tabelas 7 e 8, váriosclones atenderam ou excederam a afinidade monomérica do anticorpoquimérico conforme resumido.
Tabela 7
<table>table see original document page 282</column></row><table>
Tabela 8
<table>table see original document page 282</column></row><table>
Vários anticorpos 3A5 humanizados também foram testados emELISA de ligação competitiva (que mede a ligação a TAT10772 com domínio 5'e CA125 imobilizados) e análises de ligação de células OVCAR-3, em que osresultados destas análises são exibidos nas Figuras 23 a 25. Conforme exibido nasFiguras 23 a 25, todos os anticorpos 3A5 humanizados testados são capazes deligar-se fortemente ao polipeptídeo alvo TAT10772 e competir eficientemente pelaligação em sítios antigênicos sobre aquele polipeptídeo alvo.
Remoção de potencial sítio de glicosilação em CDR-H2 devariantes 3A5 humanizadas
Para evitar potenciais questões de fabricação, sítio de glicosilaçãopotencial em CDR-H2 das variantes de 3A5 humanizadas foi eliminadoutilizando métodos de seleção de fagos para identificar alterações deseqüências apropriadas. Separadamente, N52 e S54 foram ambos totalmentealeatorizadas utilizando o NNS de códon para permitir todas as substituiçõesde aminoácidos possíveis. Estas bibliotecas de fagos com vinte membrospequenas foram selecionadas para ligação a TAT10772 com domínio 5'.Embora ambos N52 e S54 fossem encontrados, outras substituições foramfreqüentemente observadas nas duas posições, em que as alterações N52S eS54A são as mais abundantes. Certos dados de análises Scatchard padrãosão exibidos na Tabela 9 abaixo, em que os anticorpos são expressos comoIgGs que possuem seqüência de cadeia variável leve exibida na presenteinvenção co mo SEQ ID N0 211 e a seqüência de cadeia variável pesadaexibida na Tabela 9. Quando qualquer uma das alterações descritas foramincorporada às variantes humanizadas 3A5.v1 ou 3A5.v4 (vide SEQ ID N0 206a 209), elas não afetaram a afinidade de ligação para TAT10772.
Tabela 9
<table>table see original document page 283</column></row><table>
Exemplo 10
Preparação de Anticorpos Conjugados a Toxinas que se Ligam a TAT10772O uso de conjugados de fármaco e anticorpo (ADC), ou sejaimunoconjugados, para fornecimento sítio de agentes citotóxicos oucitostáticos, ou seja, fármacos para matar ou inibir células tumorosas notratamento de câncer (Payne (2003), Câncer Cell 3: 207-212; Syrigos eEpenetos (2003), Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz eSpringer (1997), Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4.975.278) permite ofornecimento dirigido da porção de fármaco a tumores e seu acúmulointracelular, em que a administração sistêmica desses agentes de fármacosnão conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para célulasnormais, bem como para as células tumorosas que se busca eliminar (Baldwinet al (1986), Lancet, quinze de março de 1986), págs. 603-05; Thorpe (1985),Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review emMonoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Applications, Pinchera et al(eds), págs. 475-506). Busca-se por este intermédio eficácia máxima comtoxicidade mínima. Os esforços para projetar e refinar ADC concentraram-se naseletividade de anticorpos monoclonais (mAbs), bem como propriedades deligação a fármacos e liberação de fármacos. Tanto anticorpos policlonaisquanto anticorpos monoclonais foram relatados como sendo úteis nestasestratégias (Rowland et al (1986), Câncer Immunol. Immunother. 21: 183-87).Os fármacos utilizados nestes métodos incluem daunomicina, doxorubicina,metotrexato e vindesina (Rowland et al (1986), acima). As toxinas utilizadas emconjugados de anticorpo e toxina incluem toxinas bacterianas tais como toxinade difteria, toxinas vegetais tais como rícino, toxinas de moléculas pequenastais como geldanamicina (Mandler et al (2000), J. of the Nat. Câncer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000), Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002), Bioconjugate Chem. 13: 786-791),maitansinóides (EP 1391213; Liu eía/(1996), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 93:8618-8623) e caliqueamicina (Lode et a/(1998), CancerRes. 58: 2928; Hinmanet al (1993), CancerRes. 53: 3336-3342).
Nos conjugados de anticorpo e fármaco (ADC) de acordo com apresente invenção, anticorpo (Ab) é conjugado a uma ou mais porções defármaco (D), tal como cerca de uma a cerca de vinte moléculas de fármaco poranticorpo, por meio de Iigante (L). O ADC possui a fórmula:
<formula>formula see original document page 285</formula>
pode ser preparado por vários caminhos, empregando reações de químicaorgânica, condições e reagentes conhecidos dos técnicos no assunto, queincluem: (1) reação de grupo nucleofílico de anticorpo com reagente de Iigantebivalente, para formar Ab-L, por meio de ligação covalente, seguida por reaçãocom porção de fármaco D; e (2) reação de grupo nucleofílico de porção defármaco com reagente Iigante bivalente, para formar D-L, por meio de ligaçãocovalente, seguida por reação com o grupo nucleofílico de anticorpo. Métodosadicionais de preparação de ADC são descritos na presente invenção.
O ligante pode ser composto de um ou mais componentesligantes. Exemplos de componentes Iigantes incluem 6-maleimidocaproíla("MC"), maleimidopropanoíla ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"),alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonila ("PAB"), 4-(2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidila ("SPP"), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 carboxilato de N-succinimidla ("SMCC") e (4-iodo-acetil)aminobenzoato de N-succinimidila ("SIAB"). Componentes ligantes adicionaissão conhecidos na técnica e alguns são descritos na presente invenção.
Em algumas realizações, o Iigante pode compreender resíduos deaminoácidos. Exemplos de componentes ligantes de aminoácidos incluemdipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo ou pentapeptídeo. Exemplos dedipeptídeos incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ouala-phe). Exemplos de tripeptídeos incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) eglicina-glicina-glicina (gly-gly-gly)· Resíduos de aminoácidos que compreendemcomponente Iigante de aminoácido incluem os de ocorrência natural, bemcomo aminoácidos menores e análogos de aminoácidos não de ocorrêncianatural, tais como citrulina. Componentes Iigantes de aminoácidos podem serprojetados e otimizados em sua seletividade para divisão enzimática porenzimas específicas, tais como protease associada a tumor, catepsina B, C e Dou protease de plasmina.
Os grupos nucleofílicos sobre anticorpos incluem, mas semlimitar-se a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral,tais como lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, tais como cisteína, e (iv)grupos amino ou hidroxil açúcar em que o anticorpo é glicosilado. Amina, tiol,hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato dehidrazina e grupos aril hidrazida são nucleofílicos e capazes de reagir paraformar ligações covalentes com grupos eletrofílicos sobre porções Iigantes ereagentes ligantes, que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS,ésteres HOBt, haloformatos e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzilatais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida.Certos anticorpos possuem dissulfetos intercadeias redutíveis, ou seja, pontesde cisteína. Os anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação comreagentes ligantes por meio de tratamento com agente redutor tal como DTT(ditiotreitol). Cada ponte de cisteína formará, portanto, teoricamente, doisnucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem serintroduzidos em anticorpos por meio da reação de Iisinas com 2-iminotiolano(reagente de Traut), o que resulta em conversão de amina em tiol. Grupos tiolreativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou seu fragmento) por meio daintrodução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (tal comopreparando anticorpos mutantes que compreendem um ou mais resíduos deaminoácidos de cisteína não nativos).
Os conjugados de fármacos e anticorpos de acordo com apresente invenção podem também ser produzidos por meio de modificação doanticorpo para introduzir porções eletrofílicas, que podem reagir comsubstituintes nucleofílicos sobre o reagente Iigante ou fármaco. Os açúcares deanticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentesoxidantes de periodato, para formar grupos cetona ou aldeído que podemreagir com o grupo amina de reagentes Iigantes ou porções de fármacos. Osgrupos base Schiff imina resultantes podem formar ligação estável ou podemser reduzidos, por exemplo, por reagentes de boroidreto para formar ligaçõesde amina estáveis. Em uma realização, a reação da porção carboidrato deanticorpo glicosilado com galactose oxidase ou metaperiodato de sódio podegerar grupos carbonila (aldeído e cetona) na proteína que podem reagir comgrupos apropriados sobre o fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques).Em outra realização, as proteínas que contêm resíduos de serina ou treoninaN-terminais podem reagir com metaperiodato de sódio, resultando na produçãode aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan e Stroh (1992),Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US 5.362.852). Esse aldeído pode ser reagidocom porção de fármaco ou nucleófilo ligante.
Alternativamente, pode ser fabricada proteína de fusão quecompreende o anticorpo e agente citotóxico, por exemplo, por meio de técnicasrecombinantes ou síntese de peptídeos. O comprimento de DNA podecompreender regiões correspondentes codificadoras das duas partes do conjugado,sejam elas adjacentes entre si ou separadas por região codificadora de peptídeo deligação que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a"receptor" (tal como estreptavidina) para uso em direcionamento prévio detumores, em que o conjugado de anticorpo e receptor é administrado aopaciente, seguido pela remoção de conjugado não-ligado da circulação,utilizando agente Iimpante e, em seguida, administração de "ligante" (tal comoavidina) que é conjugado a agente citotóxico (tal como radionucleotídeo).
Métodos específicos de produção de conjugados de anticorpo efármaco ligando toxinas a anticorpos purificados são bem conhecidos eempregados rotineiramente na técnica. Conjugação de anticorpo monoclonalpurificado à toxina DM1, por exemplo, pode ser obtida conforme segue.Anticorpo purificado é derivado com 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidila para introduzir grupos ditiopiridila. Anticorpo (376,0 mg, 8 mg/ml)em 44,7 ml de 50 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,5) contendo NaCI(50 mM) e EDTA (1 mM) é tratado com SPP (5,3 equivalentes molares em 2,3ml de etanol). Após incubação por noventa minutos sob argônio à temperaturaambiente, a mistura de reação é filtrada em gel através de coluna SephadexG25 equilibrada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCI e 2 mM deEDTA. Frações contendo anticorpos foram reunidas e testadas em seguida.Anticorpo-SPP-Py (337,0 mg com grupos 2-tiopiridina liberáveis) é diluído como tampão de 35 mM de citrato de sódio acima, pH 6,5, até concentração finalde 2,5 mg/ml. DM1 (1,7 equivalentes, 16,1 mol) em 3,0 mM dedimetilacetamida (DMA, 3% v/v na mistura final de reação) é adicionado emseguida à solução de anticorpo. A reação é mantida em processamento àtemperatura ambiente sob argônio por vinte horas. A reação é carregada sobrecoluna de filtragem de gel Sephacryl S300 (5,0 cm χ 90,0 cm, 1,77 I)equilibrada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCI1 pH 6,5. Avelocidade de fluxo é de 5,0 ml/min e são recolhidas 65 frações (20,0 ml cada).As frações são reunidas e testadas, em que o número de moléculas defármaco DM1 ligadas por molécula de anticorpo (p') é determinado por meio demedição da absorção a 252 nm e 280 nm.
Para fins ilustrativos, conjugação de anticorpo monoclonalpurificado à toxina DM1 pode também ser obtida conforme segue. Anticorpopurificado é derivado com 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato desuccinimidila (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc.) para introduzir o IiganteSMCC. O anticorpo é tratado a 20 mg/ml em 50 mM fosfato de potássio/50 mMcloreto de sódio/2 mM EDTA1 pH 6,5 com 7,5 equivalentes molares de SMCC(20 mM em DMSO, 6,7 mg/ml). Após agitação por duas horas sob argônio àtemperatura ambiente, a mistura de reação é filtrada através de colunaSephadex G25 equilibrada com 50 mM de fosfato de potássio/50 mM de cloretode sódio/2 mM de EDTA, pH 6,5. Frações que contêm anticorpos são reunidase testadas. An ticorpo-SMCC é diluído em seguida com 50 mM fosfato depotássio/50 mM cloreto de sódio/2 mM EDTA, pH 6,5, até concentração final de10 mg/ml, e reagido com 10 mM solução de DM1 (1,7 equivalentes,considerando 5 SMCC/anticorpo, 7,37 mg/ml) em dimetilacetamida. A reação éagitada à temperatura ambiente sob argônio por 16,5 horas. A mistura dereação de conjugação é filtrada em seguida através de coluna de filtragem degel Sephadex G25 (1,5 χ 4,9 cm) com 1 χ PBS sob pH 6,5. A razão entre DM1e anticorpo (p) é medida em seguida pela absorção a 252 nm e 280 nm.
Além disso, cisteína livre sobre anticorpo selecionado pede sermodificada pelo reagente de bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical),deixando grupo maleimido não reagido sobre a superfície do anticorpo. Issopode ser conseguido por meio de dissolução de BM(PEO)4 em mistura de 50%etanol/água até concentração de 10 mM e adição de excesso molar de dezvezes a uma solução que contém o anticorpo em solução salina tamponadacom fosfato sob concentração de cerca de 1,6 mg/ml (10 micromolar),mantendo-a em reação por uma hora. BM(PEO)4 em excesso é removido pormeio de filtragem com gel em 30 mM de citrato, pH 6 com 150 mM de tampãoNaCl. Excesso molar de cerca de dez vezes DM1 é dissolvido em dimetilacetamida (DMA) e adicionado ao intermediário de anticorpo-BMPEO.Dimetilformamida (DMF) pode também ser empregada para dissolver oreagente de porção de fármaco. A mistura de reação é mantida em reação poruma noite antes da filtragem de gel ou diálise em PBS para remover fármaconão reagido. Filtragem de gel sobre colunas S200 em PBS é utilizada pararemover agregados com alto peso molecular e fornecer conjugado deanticorpo-BMPEO-DM1 purificado.
Fármacos citotóxicos foram tipicamente conjugados a anticorpospor meio dos freqüentemente numerosos resíduos de Iisina do anticorpo.Conjugação através de grupos tiol presentes ou elaborados no anticorpo deinteresse também foi realizada. Resíduos de cisteína, por exemplo, foramintroduzidos em proteínas por meio de métodos de elaboração genética paraformar sítios de ligação covalentes para Iigantes (Better et al (1994), J. Biol.Chem. 13: 9644-9650; Bernhard eía/(1994), Bioconjugate Chem. 5: 126-132;Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1: 247-255; Tu et al (1999),Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 96:4862-4867; Kanno et al (2000), J. ofBiotechnology, 76: 207-214; Chmura et al (2001), Proc. Nat. Acad. Sei. U. S. A.98 (15): 8480-8484; Patente US 6.2 48.564). Desde que exista resíduo decisteína livre no anticorpo de interesse, toxinas podem ser ligadas àquele sítio.Os reagentes Iigantes de fármacos, tais como maleimidocaproil-monometilauristatina E (MMAE), ou seja, MC-MMAE1 maleimidocaproil-monometilauristatina F (MMAF), ou seja MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE ouMC-val-cit-PAB-MMAF, dissolvidos em DMSO, são diluídos em acetonitrila eágua em concentração conhecida e adicionados a anticorpo derivado decisteína resfriado em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após cercade uma hora, maleimida em excesso é adicionada para resfriar a reação etampar quaisquer grupos tiol de anticorpos não reagidos. A mistura de reação éconcentrada por meio de ultrafiltragem centrífuga e o anticorpo conjugado atoxina é purificado, dessalinizado por meio de eluição através de resina G25em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 m sob condições estéreis e congeladopara armazenagem.Além disso, anticorpos anti-TAT de acordo com a presenteinvenção podem ser conjugados a toxinas auristatina e dolostatina (tais comoMMAE e MMAF) utilizando o método a seguir. Anticorpo, dissolvido em 500mM de borato de sódio e 500 mM de cloreto de sódio sob pH 8,0, é tratadocom 100 mM de ditiotreitol (DTT) em excesso. Após incubação a 37 0C porcerca de trinta minutos, o tampão é substituído por meio de eluição sobreresina Sephadex G25 e eluído com PBS com 1 mM de DTPA. O valor detiol/Ab é verificado por meio de determinação da concentração de anticorposreduzida da absorção a 280 nm da solução e da concentração de tiol por meiode reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee Wl) e determinação da absorção a412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS é resfriado sobre gelo.
O reagente Iigante de fármaco (1) maleimidocaproil-monometilauristatina E (MMAE), ou seja, MC-MMAE, (2) MC-MMAF, (3) MC-val-cit-PAB-MMAE ou (4) MC-val-cit-PAB-MMAF dissolvido em DMSO é diluído emacetonitrila e água sob concentração conhecida e adicionado ao anticorporeduzido resfriado em PBS. Após cerca de uma hora, maleimida em excesso éadicionada para resfriar a reação e tampar quaisquer grupos tiol de anticorposnão reagidos. A mistura de reação é concentrada por meio de ultrafiltragemcentrífuga e o anticorpo conjugado a toxina é purificado, dessalinizado por meiode eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 msob condições estéreis e congelado para armazenagem.
Exemplo 11
Teste de Morte de Células Tumorosas In Vitro
Células de mamíferos que expressam o polipeptídeo TAT deinteresse podem ser obtidas utilizando métodos de clonagem e vetor deexpressão padrão. Alternativamente, muitas linhagens celulares de tumoresque expressam polipeptídeos TAT de interesse são disponíveis ao público, porexemplo, por meio da ATCC e podem ser identificadas rotineiramenteutilizando análise ELISA ou FACS padrão. Anticorpos monoclonais anti-polipeptídeo TAT (e seus derivados conjugados de toxina) podem serempregados em seguida em testes para determinar a capacidade do anticorpode matar células que expressam polipeptídeo TAT in vitro.
Células que expressam o polipeptídeo TAT de interesse, porexemplo, são obtidas conforme descrito acima e colocadas em placas com 96cavidades. Em uma análise, o conjugado de anticorpo e toxina (ou anticorpobruto) é incluído ao longo de toda a incubação celular por período de quatrodias. Em segunda análise independente, as células são incubadas por umahora com o conjugado de anticorpo e toxina (ou anticorpo bruto) e lavadas eincubadas em seguida na ausência de conjugado de anticorpo e toxina porperíodo de quatro dias. A viabilidade celular é medida em seguida utilizando oTeste de Viabilidade de Células Luminescentes CeIITiter-GIo da Promega (Cat.N0 G7571). Células não tratadas servem de controle negativo.
Em primeiro experimento e com relação específica à presenteinvenção, várias concentrações de conjugados de MMAF e MMAE dosanticorpos 3A5 quiméricos e 11D10 quiméricos foram testadas para determinara capacidade de matar (1) a linhagem celulares que expressam polipeptídeoTAT10772 OVCAR-3, (2) linhagem celulares derivadas de PC3 elaboradaspara expressar de forma estável o polipeptídeo TAT10772 sobre a suasuperfície celular (PC3/A5.3B2) e (3) linhagem celulares de PC3 que nãoexpressa polipeptídeo TAT10772 (PC3/neo). Os anticorpos 3A5 quiméricosempregados nestas análises continham a seqüência de aminoácidos de cadeiavariável leve exibida na presente invenção como SEQ ID N0 211 e a seqüênciade aminoácidos de cadeia variável pesada exibida na presente invenção comoSEQ ID N0 11. Os anticorpos 11D10 quiméricos empregados nestas análisescontinham a seqüência de aminoácidos de cadeia variável leve exibida napresente invenção como SEQ ID N0 4 e a seqüência de aminoácidos de cadeiavariável pesada exibida na presente invenção como SEQ ID N0 7. Resultadosdestes experimentos são exibidos nas Figuras 26 a 31 e demonstraram quecada um dos anticorpos conjugados a toxinas causou níveis significativos demorte celular nas células OVCAR-3 e PC3/A5.3B2 (ou seja, células queexpressam polipeptídeo TAT10772 sobre a superfície celular), em quenenhuma morte celular significativa foi observada para nenhum dos anticorposnas células PC3/neo (que não expressam polipeptídeo TAT10772 sobre asuperfície celular). Estes dados demonstram que os anticorpos testados sãocapazes de ligar-se ao polipeptídeo TAT10772 sobre a superfície de célulasque expressam aquele polipeptídeo e causam a morte destas células in vitro.
Exemplo 12
Teste de Morte de Células Tumorosas In VivoModelo de tumor intraperítoneal
Para testar a eficácia dos anticorpos anti-polipeptídeo TAT1077211D10 e 3A5 quiméricos in vivo, 2 χ 107 células OVCAR-3/luc por 110camundongos SCID foram injetadas na cavidade peritoneal e mantidas emcrescimento por vinte dias após a injeção. No vigésimo dia após a injeção, oscamundongos foram secretados em nove grupos diferentes de nove a dezcamundongos por grupo e o volume do tumor foi determinado em cadacamundongo. Nos dias 23, 30, 37 e 44 após a injeção, os camundongos foramtratados conforme segue:
Grupo A - veículo isolado
Grupo B - 2,5 mg/kg de 11D10-MC-vc-PAB-MMAE quiméricoGrupo C - 2,5 mg/kg de 11D10-MC-vc-PAB-MMAF quiméricoGrupo D - 2,5 mg/kg de 11D10-MC-MMAF quiméricoGrupo E - 2,5 mg/kg de 3A5-MC-vc-PAB-MMAE quiméricoGrupo F - 2,5 mg/kg de 3A5-MC-vc-PAB-MMAF quiméricoGrupo G - 2,5 mg/kg de 3A5-MC-MMAF quiméricoGrupo H - 2,5 mg/kg de anti-MC-vc-PAB-MMAE-erva de SantiagoGrupo I - 2,5 mg/kg de anti-MC-vc-PAB-MMAF-erva de santiagoO volume do tumor foi medido em cada camundongo nos dias 27,34, 41, 48, 55 e 69 após a injeção para determinar a eficácia de cadatratamento na redução do volume do tumor. Além disso, o percentual desobrevivência dos animais foi determinado diariamente ao longo de 250 diasapós o tratamento.
Os resultados destas análises in vivo demonstraram quecamundongos que foram tratados somente com veículo (Grupo A) ou com oanticorpo anti-erva de santiago não específico de TAT10772 (Grupos Hei) nãoexibiram redução observável no volume do tumor após o tratamento. De fato,os tumores nestes animais simplesmente continuam a aumentar de tamanhoao longo do tempo. Estes resultados demonstram que anticorpos que sãoincapazes de ligar-se a polipeptídeo TAT10772, mesmo se conjugados atoxina, não fornecem efeito terapêutico específico (ou mesmo não específico).Por outro lado, a maior parte dos animais nos Grupos BaG evidenciouredução significativa e reproduzível após o tratamento do volume de tumor, oque demonstra que 11D10 e 3A5 quiméricos fornecem efeito terapêutico in vivoespecífico. De fato, vários dos animais nos Grupos BaG evidenciaramcompleta necrose tumorosa. Estes dados demonstram claramente que os doisanticorpos quiméricos 11D10 e 3A5 fornecem efeito terapêutico in vivosignificativo e reproduzível para o tratamento de tumores que expressam opolipeptídeo TAT10772.
Com relação ao percentual de sobrevivência, todos os animais nosGrupos A, H e I pereceram no dia 125 após o implante. No mesmo momento,entretanto, 90% dos animais no Grupo B1 80% dos animais nos Grupos EeFe55% dos animais nos Grupos C, D e G permaneceram vivos, o que evidencia queos dois anticorpos quiméricos 11D10 e 3A5 fornecem efeito terapêutico in vivoespecífico, significativo e reproduzível para o tratamento de tumores que expressamo polipeptídeo TAT10772. Resultados de modelo de risco proporcional Cox padrãosão exibidos na Tabela 10 abaixo, em que foi determinada razão de risco separada(HR) para cada um dos oito subgrupos não veículos (o Grupo A somente de veículorecebeu arbitrariamente razão de risco de 1,0).
Tabela 10
<formula>formula see original document page 295</formula>
Modelo de injeção subcutânea, modelo de transporte dealmofadas de gordura de mamíferos e modelos de transplante dexenoenxertos
Os resultados de experimentos in vivo adicionais que medem aeficácia terapêutica de anticorpos quiméricos 3A5 são exibidos nas Figuras 32a 37. Mais especificamente, anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinaforam testados para determinar a sua capacidade de reduzir o tamanho dotumor in vivo em uma série de diferentes formatos in vivo que incluem aformação de tumores por meio de injeção subcutânea de células PC3/C5.3B2seguida por vários tratamentos com anticorpos (Figura 32), transplante decélulas OVCAR-3 na almofada de gordura mamária de camundongos begeSCID seguido por vários tratamentos com anticorpos (Figuras 33 a 35 e 37) etransplante de xenoenxertos de dez milhões de células PC3/A5.3B2 porcamundongo bruto, seguido por vários tratamentos com anticorpos (Figura 36).Os resultados destes experimentos demonstram que os vários anticorpos anti-TAT10772 testados são eficazes no tratamento terapêutico de tumores queexpressam TAT10772 in vivo.Exemplo 13Uso de TAT como Sonda de Hibridização
O método a seguir descreve o uso de seqüência de nucleotídeosque codifica TAT como sonda de hibridização, por exemplo, para o diagnósticoda presença de tumor em mamífero.
DNA que compreende a seqüência codificadora de TAT maduroou de comprimento total conforme descrito na presente invenção pode tambémser empregado como sonda para a seleção de DNAs homólogos (tais como oscodificadores de variantes de TAT de ocorrência natural) em bibliotecas decDNA de tecido humano ou bibliotecas genômicas de tecido humano.
A hibridização e lavagem de filtros que contêm DNAs de qualquerbiblioteca é realizada sob as condições de alta estringência a seguir. Ahibridização de sondas derivadas de TAT rádio-marcadas para os filtros érealizada em solução de 50% formamida, 5x SSC, 0,1% SDS1 0,1% pirofosfatode sódio, 50 mM de fosfato de sódio, pH 6,8, 2x solução de Denhardt e 10%sulfato de dextran a 42 0C por vinte horas. A lavagem dos filtros é realizada emsolução aquosa de 0,1 χ SSC e 0,1% SDS a 42 °C.
DNAs que possuem identidade de seqüência desejada com oDNA que codifica TAT de seqüência nativa de comprimento total podem seridentificados em seguida utilizando métodos padrão conhecidos na técnica.
Exemplo 14Expressão de TAT em e. coli
Este exemplo ilustra a preparação de forma não glicosilada deTAT por meio de expressão recombinante em E. coli.
A seqüência de DNA que codifica TAT é inicialmente amplificadautilizando primers de PCR selecionados. Os primers deverão conter sítios deenzimas de restrição que correspondem aos sítios de enzimas de restriçãosobre o vetor de expressão selecionado. Pode -se empregar uma série devetores de expressão. Exemplo de vetor apropriado é pBR322 (derivado de E.coli; vide Bolívar et al, Gene, 2: 95 (1977)), que contém genes para resistênciaà ampicilina e tetraciclina. O vetor é digerido com enzima de restrição edesfosforilado. As seqüências amplificadas por PCR são ligadas em seguida aovetor. O vetor incluirá preferencialmente seqüências que codificam gene deresistência a antibióticos, promotor trp, líder póli-his (que inclui os seisprimeiros códons STII1 seqüência póli-his e sítio de divisão de enteroquinase),a região codificadora de TAT1 terminal de transcrição Iambda e gene argU.
A mistura de ligação é utilizada em seguida para transformarlinhagem de E. coli selecionada utilizando os métodos descritos em Sambrooket al, acima. Transformadores são identificados pela sua capacidade decrescimento sobre placas LB e são selecionadas em seguida colôniasresistentes a antibióticos. DNA de plasmídeo pode ser isolado e confirmado pormeio de análise de restrição e seqüenciamento de DNA.
Clones selecionados podem ser cultivados por uma noite em meiode cultura líquido tal como caldo LB suplementado com antibióticos. A culturapor uma noite pode ser utilizado em seguida para inocular cultura em maiorescala. As células são cultivadas em seguida até densidade ótica desejada,durante o quê é ligado o promotor de expressão.
Após a cultura das células por mais várias horas, as células podemser colhidas por meio de centrifugação. O pellet celular obtido por meio dacentrifugação pode ser solubilizado utilizando vários agentes conhecidos na técnicae a proteína TAT solubilizada pode ser purificada em seguida utilizando colunaquelante metálica sob condições que permitam a firme ligação da proteína.
TAT pode ser expresso em E.coli em forma marcada por poli-His,utilizando o procedimento a seguir. O DNA que codifica TAT é inicialmenteamplificado utilizando primers de PCR selecionados. Os primers conterão sítiosde enzimas de restrição que correspondem aos sítios de enzimas de restriçãosobre o vetor de expressão selecionado e outras seqüências úteis quefornecem início de tradução confiável e eficiente, rápida purificação sobrecoluna de quelação metálica e remoção proteolítica com enteroquinase. Asseqüências marcadas com poli-His e amplificadas por PCR são ligadas emseguida a vetor de expressão, que é utilizado para transformar hospedeiro E.coli com base na linhagem 52 (W3110 fuhA (tonA) Ion galE rpoHts (htpRts)clpP (laclq). Os transformadores são cultivados em primeiro lugar em LBcontendo 50 mg/ml de carbenicilina a 30 0C com agitação até atingir-se OD 600de 3 a 5. Os cultivos são diluídos em seguida por cinqüenta a cem vezes emmeios CRAP (preparados por meio de mistura de 3,57 g de (NH4^SO4, 0,71 gde citrato de sódio-2H20, 1,07 g de KCI, 5,36 g de extrato de levedura Difco,5,36 g de hicase Sheffield SF em 500 ml de água, bem como 110 mM deMPOS, pH 7,3, 0,55% (p/v) glicose e 7 mM de MgSO4) e cultivados por cercade vinte a trinta horas a 30 0C com agitação. Amostras são removidas paraverificar a expressão por meio de análise de SDS-PAGE e a cultura a granel écentrifugado para peletizar as células. Os pellets celulares são congeladas atépurificação e redobra.
Pasta de E. coli de 0,5 a 1 I de fermentações (pellets de 6 a 10 g)é novamente suspensa em dez volumes (p/v) em 7 M de guanidina, 20 mM de Tris,tampão a pH 8. Adiciona-se sulfito de sódio sólido e tetrationato de sódio parafabricar concentrações finais de 0,1 M e 0,02 M, respectivamente, e a solução éagitada por uma noite a 4 °C. Esta etapa resulta em proteína desnaturada comtodos os resíduos de cisteína bloqueados por meio de sulfitolização. A solução écentrifugada a 40.000 rpm em Ultracentrifugador Beckman por trinta minutos. O sobrenadante é diluído com três a cinco volumes de tampão de coluna de quelatometálico (6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) e filtrado através de filtros de0,22 mícron para clarificação. O extrato clarificado é carregado sobre coluna de 5 mlde quelato metálico Qiagen Ni-NTA equilibrada no tampão de coluna de quelatometálico. A coluna é lavada com tampão adicional contendo 50 mM de imidazol(Calbiochem, grau Ultrol), pH 7,4. A proteína é eluída com tampão contendo 250mM de imidazol. Frações que contêm a proteína desejada são reunidas earmazenadas a 4 °C. Estimou-se a concentração de proteína por meio da suaabsorção a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção calculado com base na suaseqüência de aminoácidos.
As proteínas são redobradas por meio de lenta diluição daamostra em tampão de redobra recém preparado, que consiste de: 20 mM deTris, pH 8,6, 0,3 M de NaCI1 2,5 M de uréia, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicinae 1 mM de EDTA. Os volumes de redobra são selecionados de forma que aconcentração final de proteína seja de 50 a 100 microgramas/ml. A solução deredobra é suavemente agitada a 4 0C por 12 a 36 horas. A reação de redobra éresfriada por meio da adição de TFA até concentração final de 0,4% (pH decerca de 3). Antes da purificação adicional da proteína, a solução é filtradaatravés de filtro de 0,22 mícron e acetonitrila é adicionada até concentraçãofinal de 2 a 10%. A proteína redobrada é cromatografada sobre coluna de fasereversa Poros R1/H, utilizando tampão móvel de TFA a 0,1% com eluição comgrau de acetonitrila de 10 a 80%. Parcelas de frações com absorção de A280são analisadas sobre géis de SDS poliacrilamida e são reunidas fraçõescontendo proteína redobrada homogênea. Geralmente, as espéciesadequadamente redobradas da maior parte das proteínas são eluídas sobconcentrações mais baixas de acetonitrila, pois essas espécies são as maiscompactas com seus interiores hidrofóbicos protegidos da interação com aresina de fase reversa. As espécies agregadas são normalmente eluídas sobconcentrações mais altas de acetonitrila. Além da resolução de formas maldobradas de proteínas a partir da forma desejada, a etapa de fase reversatambém remove endotoxina das amostras.
Frações que contêm o polipeptídeo TAT dobrado desejado sãoreunidas e a acetonitrila é removida utilizando suave fluxo de nitrogênio dirigidoà solução. As proteínas são formuladas em 20 mM de Hepes, pH 6,8 com 0,14M de cloreto de sódio e manitol a 4% por meio de diálise ou de filtragem degéis, utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas no tampão deformulação e filtradas estéreis.
Certos polipeptídeos TAT descritos na presente invenção foramexpressos e purificados com sucesso utilizando esta(s) técnica(s).
Exemplo 15
Expressão de TAT em Células de Mamíferos
Este exemplo ilustra a preparação de forma potencialmenteglicosilada de TAT por meio de expressão recombinante em células de mamíferos.
O vetor, pRK5 (vide EP 307.247, publicada em quinze de marçode 1989), é empregado como vetor de expressão. Opcionalmente, o DNA deTAT é ligado a pRK5 com enzimas de restrição selecionadas para permitir ainserção do DNA de TAT utilizando métodos de ligação tais como os descritosem Sambrook et al, acima. O vetor resultante é denominado pRK5-TAT.
Em uma realização, as células hospedeiras selecionadas podemser células 293. Células 293 humanas (ATCC CCL 1573) são cultivadas até aconfluência em placas de cultura de tecidos em meio tal como DMEMsuplementado com soro de feto de bezerro e, opcionalmente, componentesnutrientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 μg de DNA de pRK5-TAT sãomisturados com cerca de 1 μg de DNA que codifica o gene VA RNA(Thimmappaya et al, Cell, 31, 543 (1982)) e dissolvidos em 500 μl de 1 mM deTris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCI2. A esta mistura adiciona-se, emgotas, 500 μl de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCI, 1,5 mM deNaPO4 e permite-se a formação de precipitado por dez minutos a 25 °C. Oprecipitado é suspenso e adicionado às células 293 e mantido em deposiçãopor cerca de quatro horas a 37 °C. O meio de cultura é retirado por meio deaspiração e são adicionados 2 ml de glicerol a 20% em PBS por trintasegundos. As células 293 são lavadas em seguida com meio livre de soro,adiciona-se meio novo e as células são incubadas por cerca de cinco dias.
Cerca de 24 horas após as transfecções, o meio de cultura éremovido e substituído com meio de cultura (isolado) ou meio de cultura quecontém 200 μCί/ml de 35S-Cisteina e 200 μCi/ml de 35S-metionina. Apósincubação por doze horas, o meio condicionado é recolhido, concentrado sobrefiltro de centrifugação e carregado sobre gel de SDS a 15%. O gel processadopode ser seco e exposto a filme por período de tempo selecionado para revelar a presença de polipeptídeo TAT. Os cultivos que contêm células transfectadaspodem sofrer incubação adicional (em meio livre de soro) e o meio é testadoem biotestes selecionados.
Em método alternativo, TAT pode ser introduzido em células 293transitoriamente utilizando o método de sulfato de dextran descrito por Somparyrac et al, Proc. Nati Acad. Sci., 12: 7275 (1981). Células 293 são cultivadas atédensidade máxima em frasco centrifugador e adiciona-se 700 μg de pRK5-TATDNA. As células são concentradas em primeiro lugar a partir do frasco centrifugadorpor meio de centrifugação e lavadas com PBS. O precipitado de DNA e dextran éincubado sobre o pellet celular por quatro horas. As células são tratadas com glicerol a 20%, por noventa segundos, lavadas com meio de cultura de tecidos ereintroduzidas no frasco centrifugador que contém meio de cultura de tecidos, 5μg/ml de insulina bovina e 0,1 μg/ml de transferrina bovina. Após cerca de quatrodias, os meios condicionados são centrifugados e filtrados para remover células efragmentos. A amostra que contém TAT expresso pode ser concentrada e purificada em seguida por meio de qualquer método selecionado, tal como diálisee/ou cromatografia de coluna.
Em outra realização, TAT pode ser expresso em células CHO. OpRK5-TAT pode ser transfectado em células CHO utilizando reagentesconhecidos tais como CaPO4 ou DEAE-dextran. Conforme descrito acima, oscultivos celulares podem ser incubados e o meio substituído com meio decultura (isolado) ou meio que contém radiomarcador, tal como 35S-metionina.Após a determinação da presença de polipeptídeo TAT1 o meio de cultura podeser substituído com meio livre de soro. Preferencialmente, os cultivos sãoincubados por cerca de seis dias e, em seguida, o meio condicionado é colhido.O meio que contém o TAT expresso pode ser concentrado em seguida epurificado por meio de qualquer método selecionado.
TAT marcado com epítopos pode também ser expresso em célulasCHO hospedeiras. O TAT pode ser subclonado fora do vetor pRK5. O inserto desubclone pode sofrer PCR para fusão em quadro com marcador do epítoposelecionada tal como marcador poli-his em vetor de expressão de bacilovírus. Oinserto de TAT marcado com póli-his pode ser subclonado em seguida em vetordirigido por SV40 que contém marcador de seleção tal como DHFR para a seleçãode clones estáveis. Por fim, as células CHO podem ser transfectadas (conformedescrito acima) com o vetor dirigido por SV40. Pode-se realizar a marcação,conforme descrito acima, para verificar a expressão. O meio de cultura que contémo TAT póli-His marcado expresso pode ser concentrado em seguida e purificado pormeio de qualquer método selecionado, tal como por meio de cromatografia deafinidade de quelato de Ni2+.
TAT pode também ser expresso em células CHO e/ou COS pormeio de procedimento de expressão transitória ou em células CHO por meio deoutro procedimento de expressão estável.
A expressão estável em células de CHO é realizada utilizando oprocedimento a seguir. As proteínas são expressas na forma de construção deIgG (imunoadesina), em que as seqüências codificadoras para as formassolúveis (tais como os domínios extracelulares) das proteínas correspondentessão fundidas a seqüência de região constante de IgGI que contém os domíniosde articulação, CH2 e CH2 e/ou é forma póli-His marcada.
Após a amplificação por PCR1 os DNAs correspondentes sãosubclonados em vetor de expressão de CHO utilizando métodos padrãoconforme descrito em Ausubel et al, Current Protocols of Molecular Biology,Unidade 3.16, John Wiley and Sons (1997). Vetores de expressão de CHO sãoconstruídos de forma a conterem sítios de restrição compatíveis 5' e 3' do DNAde interesse para permitir o impulsionamento conveniente de cDNAs. O vetorutilizado na expressão em células CHO é descrito em Lucas et al, Nuci AcidsRes. 24: 9 (1774-1779 (1996)) e utiliza o promotor/amplificador precoce SV40para dirigir a expressão do cDNA de interesse e di-hidrofolato redutase(DHFR). A expressão de DHFR permite a seleção para manutenção estável doplasmídeo após a transfecção.
Doze microgramas do DNA de plasmídeo desejado sãointroduzidos em cerca de dez milhões de células de CHO utilizando reagentesde transfecção disponíveis comercialmente SUPERFECT® (Quiagen),DOSPER® ou FUGENE® (Boehringer Mannheim). As células são cultivadasconforme descrito em Lucas et al, acima. Cerca de 3 χ 107 células sãocongeladas em ampola para crescimento e produção adicional, conformedescrito abaixo.
As ampolas que contêm o DNA de plasmídeo são descongeladaspor meio de colocação em banho de água e misturadas por turbilhonamento. Oconteúdo é pipetado em tubo de centrifugação que contém 10 ml de meios ecentrifugado a 1000 rpm por cinco minutos. O sobrenadante é aspirado e ascélulas são novamente suspensas em 10 ml de meios seletivos (0,2 μιη dePS20 filtrado com soro de feto bovino diafiltrado de 0,2 μηη a 5%). As célulassão parceladas em seguida em centrifugador de 100 ml que contém 90 ml demeios seletivos. Após um a dois dias, as células são transferidas paracentrifugador de 250 ml cheio com 150 ml de meio de cultura seletivo eincubadas a 37 0C. Após mais dois a três dias, centrifugadoras de 250 ml, 500ml e 2000 ml são semeadas com 3 χ 105 células/ml. O meio celular é trocadocom meio novo por centrifugação e re-suspensão em meio de produção.Embora qualquer meio de CHO apropriado possa ser empregado, meio deprodução descrito na Patente US 5.122.469, emitida em 16 de junho de 1992,pode realmente ser utilizado. Centrifugador de produção de três litros ésemeado a 1,2 χ 106 células/ml. No dia 0, é determinado o número de pH dascélulas. No dia 1, o centrifugador é amostrado e inicia-se a aspersão com arfiltrado. No dia 2, o centrifugador é amostrado, a temperatura alterou-se para33 °C e são tomados 30 ml de 500 g/l de glicose e 0,6 ml de 10%antiespumante (tal como emulsão de polidimetilsiloxano a 35%, Emulsão GrauMédico Dow Corning 365). Ao longo de toda a produção, o pH é ajustadoconforme o necessário para mantê-lo em cerca de 7,2. Após dez dias, ou até aqueda da viabilidade abaixo de 70% a cultura celular é colhido por meio decentrifugação e filtragem através de filtro de 0.22 μm. O filtrado foi armazenadoa 4 °C ou carregado imediatamente sobre colunas para purificação.
Para as construções marcadas com poli-His, as proteínas sãopurificadas utilizando coluna Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação, adiciona-se imidazol aos meios condicionados até concentração de 5 mM. O meiocondicionado é bombeado a uma coluna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada em 20mM de Hepes, pH 7,4, tampão contendo 0,3 M de NaCI e 5 mM de imidazol emvelocidade de fluxo de 4 a 5 ml/min a 4 °C. Após o carregamento, a coluna élavada com tampão de equilíbrio adicional e a proteína eluída com tampão deequilíbrio que contém 0,25 M de imidazol. A proteína altamente purificada ésubseqüentemente dessalinizada em tampão de armazenagem que contém 10mM de Hepes1 0,14 M de NaCI e manitol a 4%, pH 6,8, com coluna de 25 ml deG25 Superfine (Pharmacia) e armazenada a -80 0C.
Construções de imunoadesina (que contém Fc) são purificadas apartir dos meios condicionados conforme segue. O meio condicionado ébombeado sobre coluna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) que havia sidoequilibrada em 20 mM de tampão fosfato de Na1 pH 6,8. Após o carregamento,a coluna é extensivamente lavada com tampão de equilíbrio antes da eluiçãocom 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamenteneutralizada recolhendo-se frações de 1 ml em tubos que contêm 275 μΙ de 1 Mtampão Tris1 pH 9. A proteína altamente purificada é subseqüentementedessalinizada em tampão de armazenagem conforme descrito acima para asproteínas marcadas com póli-His. A homogeneidade é determinada por géis deSDS poliacrilamida e por seqüenciamento de aminoácidos N-terminais pormeio de degradação de Edman.
Certos polipeptídeos TAT descritos na presente invenção foramexpressos e purificados com sucesso utilizando esta(s) técnica(s).
Exemplo 16Expressão de TAT em Levedura
O método a seguir descreve a expressão recombinante de TAT
em levedura.
Em primeiro lugar, vetores de expressão de leveduras sãoconstruídos para a produção intracelular ou secreção de TAT a partir dopromotor ADH2/GAPDH. DNA que codifica TAT e o promotor é inserido emsítios de enzimas de restrição apropriados no plasmídeo selecionado paradirigir a expressão intracelular de TAT. Para secreção, DNA que codifica TATpode ser clonado no plasmídeo selecionado, junto com DNA que codifica opromotor ADH2/GAPDH, peptídeo sinal TAT nativo ou outro peptídeo sinal demamífero ou, por exemplo, fator alfa de levedura ou seqüência líder/sinal desecreção de intervase e seqüências Iigantes (se necessário) para a expressãode TAT.
Células de leveduras, tais como linhagem de levedura AB110,podem ser transformadas em seguida com os plasmídeos de expressãodescritos acima e cultivados em meios de fermentação selecionados. Ossobrenadantes de levedura transformados podem ser analisados por meio deprecipitação com ácido tricloroacético a 10% e separação por SDS-PAGE,seguidos por manchas dos géis com manchas de Azul de Coomassie.
TAT recombinante pode ser isolado em seguida e purificado pormeio de remoção das células de leveduras do meio de fermentação porcentrifugação e concentração do meio em seguida utilizando filtros de cartuchoselecionados. O concentrado que contém TAT pode ser adicionalmentepurificado utilizando resinas de cromatografia de coluna selecionadas.
Certos polipeptídeos TAT descritos na presente invenção foramexpressos e purificados com sucesso utilizando esta(s) técnica(s).
Exemplo 17
Expressão de TAT em Células de Insetos Infectadas com Bacilovírus
O método a seguir descreve a expressão recombinante de TATem células de insetos infectadas com bacilovírus.
A codificação de seqüências para TAT é fundida acima no fluxode marcador do epítopo contida em vetor de expressão de bacilovírus. Essesmarcadores de epítopos incluem marcadores de poli-his e marcadores deimunoglobulina (como regiões Fc de IgG). Pode-se empregar uma série deplasmídeos, que incluem plasmídeos derivados de plasmídeos disponíveiscomercialmente tais como pVL1393 (Novagen). Resumidamente, a seqüênciaque codifica TAT ou a parte desejada da seqüência codificadora de TAT talcomo a seqüência que codifica domínio extracelular de proteína detransmembrana ou a seqüência que codifica a proteína madura caso a proteínaseja extracelular é amplificada por PCR com primers complementares àsregiões 5' e 3'. O primer 5' pode incorporar sítios de enzimas de restriçãoIadeadores (selecionados). O produto é digerido em seguida com as enzimasde restrição selecionadas e subclonado no vetor de expressão.
Bacilovírus recombinante é gerado por meio de cotransfecção doplasmídeo acima e DNA de vírus BaculoGold® (Pharmingen) em células deSpodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando Iipofectina(disponíveis comercialmente por meio da GIBCO-BRL). Após quatro a cincodias de incubação a 28 0C, os vírus liberados são colhidos e utilizados paraamplificações adicionais. Expressão de proteínas e infecções virais sãorealizadas conforme descrito por 0'Reilley et al, Baculovirus ExpressionVectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
TAT marcado com póli-his expresso pode ser purificado emseguida, por exemplo, por meio de cromatografía de afinidade de quelato deNi2+ conforme segue. Extratos são preparados a partir de células Sf9 infectadaspor vírus recombinante conforme descrito por Rupert et al, Nature, 362: 175-179 (1993). Resumidamente, células Sf9 são lavadas, novamente suspensasem tampão de sonicação (25 ml de Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCI2; 0,1 mMde EDTA; 10% glicerol; 0,4% NP-40; 0,4 M de KCI) e sonicados por duas vezespor vinte segundos sobre gelo. Os sonicados são liberados por meio decentrifugação e o sobrenadante é diluído por cinqüenta vezes em tampão decarregamento (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCI, 10% glicerol, pH 7,8) efiltrados através de filtro de 0,45 μιτι. Coluna de Ni2+-NTA agarose (disponívelcomercialmente por meio da Qiagen) é preparada com volume de leito de 5 ml,lavada com 25 ml de água e equilibrada com 25 ml de tampão decarregamento. O extrato celular filtrado é carregado sobre a coluna a 0,5 ml porminuto. A coluna é lavada até a linha base A2so com tampão de carga, pontoem que se inicia a coleta de frações. Em seguida, a coluna é lavada comtampão de lavagem secundário (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCI1 10%glicerol, pH 6,0), que elui proteína ligada não especificamente. Após atingir-senovamente a linha base A280, a coluna é desenvolvida com gradiente de 0 a500 mM de imidazol no tampão de lavagem secundário. Frações de 1 ml sãorecolhidas e analisadas por meio de SDS-PAGE e manchas de prata ouWestern Blot com Ni2+-NTA conjugado a fosfatase alcalina (Qiagen). Fraçõesque contêm o TAT marcado com Hisio eluído são reunidas e dialisadas contratampão de carregamento.
Alternativamente, a purificação do TAT marcado com IgG (oumarcado com Fc) pode ser realizada utilizando técnicas de cromatografiaconhecidas, que incluem, por exemplo, cromatografia de coluna de Proteína Aou Proteína G.
Certos polipeptídeos TAT descritos na presente invenção foramexpressos e purificados com sucesso utilizando esta(s) técnica(s).
Exemplo 18
Publicação de Polipeptídeos TAT Utilizando Anticorpos Específicos
Polipeptídeos TAT nativos ou recombinantes podem serpurificados por meio de uma série de métodos padrão na técnica de purificaçãode proteínas. Polipeptídeo pro-TAT, polipeptídeo TAT maduro ou polipeptídeopré-TAT, por exemplo, é purificado por meio de cromatografia deimunoafinidade utilizando anticorpos específicos para o polipeptídeo TAT deinteresse. De forma geral, coluna de imunoafinidade é construída por meio deacoplamento covalente do anticorpo anti-polipeptídeo TAT a resinacromatográfica ativada.
Imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soro imunepor meio de precipitação com sulfato de amônio ou por meio de purificaçãosobre Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway NJ).De forma similar, anticorpos monoclonais são preparados a partir de fluido deascite de camundongo por meio de precipitação com sulfato de amônio oucromatografia sobre Proteína A imobilizada. Imunoglobulina parcialmentepurificada é ligada covalentemente a resina cromatográfica tal comoSEPHAROSE® ativada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpoé acoplado à resina, a resina é bloqueada e a resina derivada é lavada deacordo com as instruções do fabricante.
Essa coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação depolipeptídeo TAT por meio da preparação de fração de células que contêmpolipeptídeo TAT em forma solúvel. Esta preparação é derivada por meio desolubilização da célula inteira ou de fração subcelular obtida por meio decentrifugação diferencial por adição de detergente ou outros métodos bemconhecidos na técnica. Alternativamente, polipeptídeo TAT solúvel que contémseqüência sinal pode ser secretado em quantidade útil para o meio no qual ascélulas são cultivadas.
Preparação que contém polipeptídeo TAT solúvel é passadasobre a coluna de imunoafinidade e a coluna é lavada sob condições quepermitem a absorção preferencial de polipeptídeo TAT (tal como tampões comalta resistência iônica na presença de detergente). Em seguida, a coluna éeluída sob condições que rompem a ligação de anticorpo e polipeptídeo TAT(tal como tampão com baixo pH como cerca de pH 2 a 3 ou alta concentraçãode caotropo tal como uréia ou íon de tiocianato) e é recolhido polipeptídeo TAT.
Depósito de Material
Os materiais a seguir foram depositados na Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, 10801 University Blvd., Manassas VA 20110-2209, Estados Unidos (ATCC):
Tabela 11
<table>table see original document page 309</column></row><table>
Estes depósitos foram feitos com base nas disposições doTratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito deMicroorganismos para Fins de Procedimento de Patentes e suasRegulamentações (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção decultura viável do depósito por trinta anos a partir da data do depósito. Odepósito será disponibilizado pela ATCC com base nos termos do Tratado deBudapeste e sujeito a acordo entre a Genentech1 Inc. e a ATCC1 que garante adisponibilidade permanente e irrestrita da prole da cultura do depósito aopúblico mediante emissão da patente norte-americana correspondente oumediante a abertura ao público de qualquer pedido de patente norte-americanoou estrangeiro, o que ocorrer primeiro, e garante a disponibilidade da prole àspartes determinadas pelo Comissário Norte-Americano de Patentes e MarcasComerciais como autorizado a tal, de acordo com 35 USC § 122 e as normasrelativas do Comissário (incluindo 37 CFR § 1.14, com referência específica a886 OG 638).
O cessionário do presente pedido concordou que, se um culturados materiais em depósito morrer ou for perdido ou destruído quando cultivadosob condições apropriadas, os materiais serão imediatamente substituídosmediante notificação com outro idêntico. A disponibilidade do materialdepositado não deve ser considerada licença para a prática da presenteinvenção em contravenção aos direitos concedidos com base na autoridade dequalquer governo de acordo com as suas leis de patentes.
O relatório descritivo acima é considerado suficiente para permitirque os técnicos no assunto pratiquem a presente invenção. A presenteinvenção não deve ter seu escopo limitado pela construção depositada, pois arealização depositada destina-se a ilustração isolada de certos aspectos dapresente invenção e quaisquer construções que são funcionalmenteequivalentes encontram-se dentro do escopo da presente invenção. O depósitode material do presente pedido não constitui aceitação de que o relatóriodescritivo contido na presente invenção é inadequado para permitir a prática dequalquer aspecto da presente invenção, incluindo o seu melhor modo, nemdeve ser considerado limitador do escopo das reivindicações às ilustraçõesespecíficas que representa. Na realidade, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas na presente invenção, tornar-se-ãoevidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e seencontrarão dentro do escopo das reivindicações anexas.Listagem de Seqüência
<110> Genentech, Inc.Mark S. DennisWilliam MalletPaul Polakis
<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE TUMORES
<130> P5040R1-PCT
<140> PCT/US2006/023099<141> 14-06-2006
<150> US 60/793,951<151> 21-04-2006
<150> US 60/692,092<151> 20-06-2005
<160> 211
<210> 1<211> 21112<212> DNA
<213> Homo sapiens<400> 1
cctgtgactt ctcttctcac ccctggcctg gtgataacca cagacaggat 50
gggcataagc agagaacctg gaaccagttc cacttcaaat ttgagcagca 100
cctcccatga gagactgacc actttggaag acactgtaga tacagaagcc 150
atgcagcctt ccacacacac agcagtgacc aacgtgagga cctccatttc 200
tggacatgaa tcacaatctt ctgtcctatc tgactcagag acacccaaag 250
ccacatctcc aatgggtacc acctacacca tgggggaaac gagtgtttcc 300
atatccactt ctgacttctt tgagaccagc agaattcaga tagaaccaac 350
atcctccctg acttctggat tgagggagac cagcagctct gagaggatca 400
gctcagccac agagggaagc actgtccttt ctgaagtgcc cagtggtgct 450
accactgagg tctccaggac agaagtgata tcctctaggg gaacatccat 500
gtcagggcct gatcagttca ccatatcacc agacatctct actgaagcga 550
tcaccaggct ttctacttcc cccattatga cagaatcagc agaaagtgcc 600
atcactattg agacaggttc tcctggggct acatcagagg gtaccctcac 650
cttggacacc tcaacaacaa ccttttggtc agggacccac tcaactgcat 700
ctccaggatt ttcacactca gagatgacca ctcttatgag tagaactcct 750
ggagatgtgc catggccgag ccttccctct gtggaagaag ccagctctgt 800ctcttcctca ctgtcttcac ctgccatgaccattaccaga gagcatctcc tcctctcctcacccttggcc cagtgaagac cacagacatgtgaaaccagt tcacctccaa atttgagcagccacgtctga agtcaccaaa gatagagagaacacctgtag tcaatgtagg gactgtgattctctgttttg gctgacttag tgacaacaaaccacctccac tctggggaat acaagtgtttccagaaacta tgatgacaca gccaacttccggagatcagt acctctcaag agaccagctcctctttctgg aatgcccact ggtgctactagccctctcct taggcagaac atccaccccaatcaccagaa atctccacgg aaaccatcacccacgacagg atcagcagaa atgaccatcaggggcatcct cacaaggtac ctttaccttgctggccagga actcactcag ctgcaactcatgaccactcc tatgagcaga ggtcctgaggccatcagtgg aaaaaactag ccctccatctagtaacctca ccttcgccac tttattccaccgtctcctct ccgggtgact tctcttttcaacagacatgt tggacacaag cttggaaccttatgaatatc acctcagatg agagtctggcagacagaggc aattcagctt tcagaaaacaaccatcagtg ctagacaaga attctattccgccatccaaa gtgacatctc cagtggtcacttgtttctac aaccatacct gcttcctctggagtcaacat ccaccctgac ccccacaccaggagatccac tcagccacaa agccaagcacctagtgccac gattgaggac tccatgacacggacctagcc ctgatcagtc cacaatgtca
ctcaacttct tttttctcca 850
atcctgtgac tgcacttctc 900ttgcgcacaa gctcagaacc 950cacctcagct gaaatattag 1000aaattcatcc ctcctcaaac 1050tataaacatc tatccccttc 1100acccacatct ccaatggcta 1150ccacatcaac tcctgccttc 1200tccctgactt ctggattaag 1250agcaacagag agaagtgctt 1300ctaaggtctc cagaacagaa 1350ggtcctgctc aatccacaat 1400tagaatttct actcccctca 1450cccccaaaac aggtcattct 1500gacacatcaa gcagagcctc 1550cagatctcca cactcaggga 1600atgtgtcatg gccaagccgc 1650tccctggtgt ctttatctgc 1700accatctgag agtagccact 1750cccctgtcat gatgaagacc 1800gtgaccactt cacctcccag 1850cacttctaaa gccaccatgg 1900cagctgtgac tcagatgggc 1950tcttatccag gcctcccaga 2000ctcttccacc ataaaagaca 2050agataacaag aattgagatg 2100agggagacca gcacctccca 2150tgttccttac aaggcactca 2200aagtcatgtc ctctagcaga 2250caagacatat ccactgaagt 2300gatcaccagg ctctctacct cccccatcaaccattaccac ccaaacaggt tctcctggggaccttggaca cttcaacaac ttttatgtcatcaaggattt tcacactcac agatgaccgcgagaggtgcc atggctaagc catccctctgtctttctcac tgtcttcacc tgtcatgacccacattacca gacagcatcc actcttcttctcacctcagg gctggtgaag accacagagccctgaaacca gttcaccccc aaatttgagcggccaccact gaagtcacta cagatacagatggtaacctc aggttataca catgaatctctcagtgacaa caaaggccac atcttcaatgagatacaaat gttctcacat caacccctgcttcaaacaaa gtcaaagctc tcactgactcatctctgaag agaccagctc tgccacagaatgtgcccact ggtgctacta ctgaggtctcctagcagaac atccatccca ggccctgctcacctccatgg aaaccatcac tagaatttctatcaacagac atggccatca cccccaaaaccgcagggtac ctttaccttg gactcatcaaactcactcag ctacaactca gagatttccatatgagcaga ggtcctgagg atgtgtcatgaaaaaaacag ccctccatct tccctggtatccttcgccac tttattccac accatctgggccctgtcact tctcttttca cctctatcattggatgcaag tttggaacct gagaccacttacctcagatg agagtctggc cgcttctaaaaattcacgtt tttgaaaata cagcagcgtcctacagagga actctattcc tcttccccaggtgatatctc cagtggtcac ctcttcctct
gacagaatct acagaaatga 2350ctacatcaag gggtaccctt 2400gggacccatt caactgcatc 2450tcttatgagt agaactcctg 2500tggaagaagc cagctctgcc 2550tcatcttctc ccgtttcttc 2600gcttcctgtg acatcacttc 2650tgttgggcac aagctcagaa 2700agcacctcag ctgaaatact 2750gaaactggag atgaccaatg 2800cttcctctgt cctagctgac 2850ggtatcacct accccacagg 2900cttctctgac accagtagga 2950ctgggttgat ggagaccagc 3000aaaagcactg tcctttctag 3050caggacagaa gccatctctt 3100aatccacaat gtcatcagac 3150acccccctca caaggaaaga 3200aggtccttct ggggctacct 3250gcacagcctc ctggccagga 3300cggtcagtgg tgacaactcc 3350gccaagcccg ctgtctgtgg 3400cttcatcttc agtaacctca 3450agtagccact cctctcctgt 3500gatgaaggcc acagacatgt 3550cagctcccaa tatgaatatc 3600gccaccacgg agacagaggc 3650ccatgtggaa accaccagtg 3700gcttctcaga gccaacaaaa 3750ataagagaca acatggtttc 3800cacaacaatg cctggctcct ctggcattactgtcatctct gacccctgga ctgagggagaacctcatcca cagagacaag cactgtccttcactcctgag gtctccagga cagaagttatttcctggccc tgctcagtcc acaatgtcacgtcaccaggc tgtctacctc tcccatcatgcatcaccacc caaacaggtt attctctggcccttgggcac ctcaatgacc tttttgtcagcaaggacttt cacactcaga gatgaccaataagtctgtca tggacgagcc ctcgctttgtcttctctgac atcattacct ctcacgacctacattactag acagtagccc ctcctctcctcctcccaggc ctggtgaaga ctacagaagtctaaaaccag ttcatctcca aatttgagcagccacctctg aaatcatgac agatacagagcacagcggtg gccaaagtga ggacctccagcctctgtcct agctgactca gaaacaaccaatcacctccg ctgtggagga taccactgttctctgagact aggaggattc cgacagagccgattcaggga gactagcacc tctgaagagaagtgcagtcc tttttggagt gcccactagtgacagaaata atgtcctcta atagaacacaccacgatgtc tccagacatc atcactgaagtcatccatga tgtcagaatc aacacaaatgttctcctggg gctacagcac agagtactctcccccttggc aaggacccac tcaactgttcgagatgacaa ctcttatgag taggagtcctctctcccttt gtggaaaaaa ctagctcttcctgtcacgac ctcaccttct gtttcttccatcctcctctt tttctgtgac ttcactcctc
aaggattgag atagagtcaa 3850ccagaacctc ccaggacatc 3900tacaagatgc cctctggtgc 3950gccctctagc agaacatcca 4000tagacatctc cgatgaagtt 4050acagaatctg cagaaataac 4100tacatcccag gttacccttc 4150ggacccactc aactatgtct 4200cttatgagca ggggtcctga 4250ggaaacaact agatcttcct 4300cactttctcc tgtgtcctcc 4350cttcctgtga cttcacttat 4400gttggataca agctcagagc 4450gcacctcagt tgaaataccg 4500aaaattcatc cttcctcaaa 4550ttctgttcat gaatctcatt 4600taaccatacc ttcaatgggt 4 650ttcacatcaa atcctgcctt 4700aacattctca ttgactcctg 4750ccacctcaat cacagaaaca 4800gctactactg aagtctccat 4850catccctgac tctgatcagt 4900tgatcaccag gctctcttcc 4950accatcacca cccaaaaaag 5000taccttggcc acaacaacag 5050ctcctagatt tttacactca 5100gaaaatccat catggaagag 5150atcttctctg ttgtccttac 5200cattaccgca gagtatccct 5250accccaggca tggtgaagac 5300tacagacaca agcacagaac ctggaaccaggcacctcagt tgaaatactg gctgcctctgaaaattcatc cttcttcaag catggcagtgttctggacat gaactatatt cctctgtttcaggctacata cccagtgggt actccctctttccacatcaa tgcctgctaa ttttgagaccattttctcat ttgacttctg gacttaggaaccagctcagt cacaccaaca aatacaccttcttttacaga gttccaagac tgatttcacccccagactgg cctccagcct cacagtatactcaccccctt taatgcttct ccatctattatccttcccag aatccaggtt tactatgtcttctgagtaca gatttgctgc cttcagctgatgatgccttc tctatcagag gccatgacttccacgagcca tctcaggttc aggtagtccaccctggggat gctactctgt ccaccattgcctcctgtgcc attctcctct tcaaccttcaatcccagccc tccatgagat aacttcctctggacaccagt cttgggacag agagcagcactggtcagtac tttggacact tcaagccaaccccattttgg ataccagaat gacagagagcaagtgcttat caagttcctt cactctcaacgcattatgga acacatcaca aaaatacccaaccataagac cagtcaaagg ccctcagacataaaggacta cacacaggag ggacaaaaagctctgaagac caccaccaca gctctgaagaaccaccagtg tctatactcc cactttgggaatcaatgcaa atggccagca caatccccaccatatgtttt ccctgatgtt ccagaaacgactgggagcag aaaccagcac agctcttccc
tttatctcca aatctgagtg 5350aagtcaccac agatacagag 5400accaatgtgg gaaccaccag 5450aatccactcg gagccatcca 5500ccatggctga aacctctatt 5550acaggatttg aggctgagcc 5600gaccaacatg tccctggaca 5650cttctcctgg gtccactcac 5700tcttctgcaa aaacatcatc 5750tgaaattcca gtggacataa 5800cggagtccac tgggataacc 5850gtaacagaaa gtactcatca 5900gactatttcc actggcacag 5950catttgccac cactggagtt 6000ttctctagga cagagtcagg 6050agagagcctg ccttcatcca 6100ctaccactga ttcttcaacc 6150tcagctaccc catatagagt 6200tactgaagga cgcttggtta 6250caggcaggac atcttcatca 6300gttgagctgg gaacagtgac 6350acggttgaca agaactgatg 6400atgaagcagc acacagaggt 6450tccacttcgc ctgccagtcc 6500aatggagacc accaccacag 6550ccacttccag agccaccttg 6600acactgactc ccctcaatgc 6650agaaatgatg atcacaaccc 6700catcctcatt ggctaccagc 6750aggacaaccc catctgtttt 6800caatagagaa tcagagacca cagcctcactagagaagtcc ggttattcaa actctagatgacaacagctt catgggttat ccatcctgcacaagacaacc cccaattttt tccacagtgacagccaccag tcatggggca gacgtcagcttcacctagtg aactagatgc actgaccccaagatactagt acaacattcc caacactgacagacaagaac cacatggctc actcatcctgcccagaacaa tccccaattt ttctcatcataatagccacc agtcctgggg cagaaaccagctgtctcacc tggtgcagaa gatctggtgaggcacagaca gaaatatgac tattccaactaccaaagacc atagcctcat tagtcacccacggccattcc aacttcaact atctcgcctgtcaatggtca ccagtttggc ggcaaagacagacaaactcc cctggtgaac cagctacaacctgcacagac cagcccaaca gttccctggaagtaaatcag acaccacacc ttcaatgacccagttcagct gttccaactc caactgtttctgaccccttt ggtcaccagt tctagggcagattctgactc tttctcctgg tgaaccagagcagtcatggg gaagaagcca gttctgctatctggggtacc aggagtggtg acctctctggactagtacaa ctattccaat tctgacttttcacaccttca atggccacca gtcatgggaccaactgtttt acctgaggta ccaggaatggtctagggcag taaccagtac aactcttccatgaaccagag accacacctt caatggccacgctcaactgt tccaactgtt tcacctgaggctggtcacta gttctagtgg agtaaacagt
ggtctctcgt tctggggcag 6850tttcttctag tgagccagat 6900gagaccatcc caactgtttc 6950attagacact gtatcttcca 7000cagccattcc aacaaatatc 7050ctggtcacta tttcggggac 7100taagtcccca catgaaacag 7150cagagaccag ctcaactatt 7200gaatcagatg ccacaccttc 7250ttcagctatt ccaattatga 7300cctcacaggt cactagttct 7350ttgactcttt ctcctggtga 7400tcctgaagca cagacaagtt 7450ctgtatcacg gttggtgacc 7500agtacaacta atcgagctct 7550agtttcattg gtcacgcatt 7600caacttccat ttttttccat 7650accagtcatg gggcagaatc 7700aactgaggta ccaggagtag 7750tgatcagtac aactattcca 7800accacacctt caatggccac 7850tccaactcca actgtttcac 7900tcactagttc tagggcagtg 7950tctcttggtg aaccagagac 8000agaagctggc tcagctgttc 8050tgacctctct ggttgctagt 8100actctgactc tttctcctgg 8150cagtcatggg gcagaagcca 8200taccaggagt ggtgacctct 8250acaagtattc caactctgat 8300tctttctcct ggtgaactag aaaccacaccgggcagaagc cagctcagct gttccaactctcaggagtgg tgacccctct ggtcactagtaactattcca attctaactc tttcttctagcaatggccac cagtcatggg gtagaagccatcacctgagg taccaggaat ggtgacctttagtaaccagt acaactattc caactctgacagaccacaac ttcattggtc acccattctgattccaactt taggtgtctc ccctactgtaggtcactagt tctgggtcag agaccagtgccctcaagtca accagagacc atagactcatgaagcaagtt ctgttgttcc aactttgacttacaaatatc tcattggtca cccatcctgcccaggacaac ctcaaggttt tcccacagtgacagtcacca gtcctgaggc agaatccagcttcacctggt ataccaggtg tgctgacatcgagacatcag tgcaactttt ccaacagtgcgaggcaacag cctcatgggt tactcatccttcccaggaca acccctaatt attctcatagcaatagccac cagtcctggg gcagaagccaactgtctcac ctgatgtacc agatatggtatgggacagac accagtataa ctattccaacagccagagac cacaacctca tttatcaccttcagccattc caactctccc tgtctcccctctcactggtc atcagttctg ggacagacagtgacggagac cccatatgaa ccagagacaacctgcagaga ccaacacaat ggttcccaggtagtaagtca gacaccacac tcccagtagcaagccagttc agctgtttca acgacaactactggtgacct cactggtccc tagttctggg
ttcaatggcc accagtcatg 8350caactgtttc acctggggta 8400tccagggcag tgaccagtac 8450tgagccagag accacacctt 8500gctcagctgt tctaactgtt 8550ctggtcacta gttctagagc 8600tatttcttct gatgaaccag 8650aggcaaagat gatttcagcc 8700caagggctgg tgacttcact 8750gttttcaaat ctaactgttg 8800gggtcgctca tcctgggaca 8850gtctccactg gtgagccgtt 8900agagagtagc tcaactcttc 8950aattagacac tatgccttct 9000tcagccattt caacaactat 9050actggtcact agctctggga 9100ctgagtcccc acatgaatca 9150gcagtcacca gcacaacagt 9200tgaaccagac accacaccat 9250cttcagattt tccaacaata 9300acctcacagg tcactagttc 9350tctgactctt tcttctggtg 9400attctgagac acatacaagt 9450gatgcatcaa agatgctgac 9500cactacaact ttcccaacac 9550cagccataca gctcattcat 9600acaactccca agttttccca 9650catcaccagt cctgggccag 9700tctcacctga tatgtcagat 9750acagacacca gtacaacctt 9800cccaacattg agtgagaccc catatgaacc agagactaca gccacgtggc 9850
tcactcatcc tgcagaaacc agcacaacgg tttctgggac aattcccaac 9900
ttttcccata ggggatcaga cactgcaccc tcaatggtca ccagtcctgg 9950
agtagacacg aggtcaggtg ttccaactac aaccatccca cccagtatac 10000
caggggtagt gacctcacag gtcactagtt ctgcaacaga cactagtaca 10050
gctattccaa ctttgactcc ttctcctggt gaaccagaga ccacagcctc 10100
atcagctacc catcctggga cacagactgg cttcactgtt ccaattcgga 10150
ctgttccctc tagtgagcca gatacaatgg cttcctgggt cactcatcct 10200
ccacagacca gcacacctgt ttccagaaca acctccagtt tttcccatag 10250
tagtccagat gccacacctg taatggccac cagtcctagg acagaagcca 10300
gttcagctgt actgacaaca atctcacctg gtgcaccaga gatggtgact 10350
tcacagatca ctagttctgg ggcagcaacc agtacaactg ttccaacttt 10400
gactcattct cctggtatgc cagagaccac agccttattg agcacccatc 10450
ccagaacaga gacaagtaaa acatttcctg cttcaactgt gtttcctcaa 10500
gtatcagaga ccacagcctc actcaccatt agacctggtg cagagactag 10550
cacagctctc ccaactcaga caacatcctc tctcttcacc ctacttgtaa 10600
ctggaaccag cagagttgat ctaagtccaa ctgcttcacc tggtgtttct 10650
gcaaaaacag ccccactttc cacccatcca gggacagaaa ccagcacaat 10700
gattccaact tcaactcttt cccttggttt actagagact acaggcttac 10750
tggccaccag ctcttcagca gagaccagca cgagtactct aactctgact 10800
gtttcccctg ctgtctctgg gctttccagt gcctctataa caactgataa 10850
gccccaaact gtgacctcct ggaacacaga aacctcacca tctgtaactt 10900
cagttggacc cccagaattt tccaggactg tcacaggcac cactatgacc 10950
ttgataccat cagagatgcc aacaccacct aaaaccagtc atggagaagg 11000
agtgagtcca accactatct tgagaactac aatggttgaa gccactaatt 11050
tagctaccac aggttccagt cccactgtgg ccaagacaac aaccaccttc 11100
aatacactgg ctggaagcct ctttactcct ctgaccacac ctgggatgtc 11150
caccttggcc tctgagagtg tgacctcaag aacaagttat aaccatcggt 11200
cctggatctc caccaccagc agttataacc gtcggtactg gacccctgcc 11250
accagcactc cagtgacttc tacattctcc ccagggattt ccacatcctc 11300catccccagc tccacagcag ccacagtccc attcatggtg ccattcaccc 11350tcaacttcac catcaccaac ctgcagtacg aggaggacat gcggcaccct 11400ggttcaagga agttcaacgc cacagagaga gaactgcagg gtctgctcaa 11450acccttgttc aggaatagca gtctggaata cctctattca ggctgcagac 11500tagcctcact caggccagag aaggatagct cagccacggc agtggatgcc 11550atctgcacac atcgccctga ccctgaagac ctcggactgg acagagagcg 11600actgtactgg gagctgagca atctgacaaa tggcatccag gagctgggcc 11650cttacaccct ggaccggaac agtctctatg tcaatggttt cacccatcga 11700agctctatgc ccaccaccag cactcctggg acctccacag tggatgtggg 11750aacctcaggg actccatcct ccagccccag ccccacgact gctggccctc 11800tcctgatgcc gttcaccctc aacttcacca tcaccaacct gcagtacgag 11850gaggacatgc gtcgcactgg ctccaggaag ttcaacacca tggagagtgt 11900cctgcagggt ctgctcaagc cattgttcaa gaacaccagt gttggccctt 11950tgtactctgg ctgcagattg accttgctca ggcccgagaa agatggggca 12000gccactggag tggatgccat ctgcacccac cgccttgacc ccaaaagccc 12050tggactcaac agggagcagc tgtactggga gctaagcaaa ctgaccaatg 12100acattgaaga gctgggcccc tacaccctgg acaggaacag tctctatgtc 12150aatggtttca cccatcagag ctctgtgtcc accaccagca ctcctgggac 12200ctccacagtg gatctcagaa cctcagggac tccatcctcc ctctccagcc 12250ccacaattat ggctgctggc cctctcctgg taccattcac cctcaacttc 12300accatcacca acctgcagta tggggaggac atgggtcacc ctggctccag 12350gaagttcaac accacagaga gggtcctgca gggtctgctt ggtcccatat 12400tcaagaacac cagtgttggc cctctgtact ctggctgcag actgacctct 12450ctcaggtccg agaaggatgg agcagccact ggagtggatg ccatctgcat 12500ccatcatctt gaccccaaaa gccctggact caacagagag cggctgtact 12550gggagctgag ccaactgacc aatggcatca aagagctggg cccctacacc 12600ctggacagga acagtctcta tgtcaatggt ttcacccatc ggacctctgt 12650gcccaccacc agcactcctg ggacctccac agtggacctt ggaacctcag 12700ggactccatt ctccctccca agccccgcaa ctgctggccc tctcctggtg 12750ctgttcaccc tcaacttcac catcaccaac ctgaagtatg aggaggacat 12800gcatcgccct ggctccagga agttcaacacccctggttgg tcctatgttc aagaacaccaggctgcagac tgaccttgct caggtccgagagtggatgcc atctgcaccc accgtcttgaacagggagca gctatactgg gagctgagccgagctgggcc cctacaccct ggacaggaaccacccattgg atccctgtgc ccaccagcagtggaccttgg gtcagggact ccatcctcccactgctggcc ctctcctggt gccgttcacccctgaagtac gaggaggaca tgcattgcccccacagagag agtcctgcag agtctgcttgagtgttggcc ctctgtactc tggctgcagagaaggatgga gcagccactg gagtggatgcaccccaaaag ccctggagtg gacagggagccagctgacca atggcatcaa agagctgggtcagtctctat gtcaatggtt tcacccatcagcactcctgg gacctccaca gtggaccttgtccctcccca gccctacatc tgctggccctcaacttcacc atcaccaacc tgcagtacgagctccaggaa gttcaacacc acggagcgggcccatgttca agaacaccag tgtcggccttgaccttgctc aggcctgaga agaatggggctctgcagcca ccgtcttgac cccaaaagccctgtactggg agctgagcca gctgacccatctacaccctg gacaggaaca gtctctatgtgctctgtggc ccccaccagc actcctgggaacctcaggga ctccatcctc cctccccagccctggtgccg ttcaccctca actttaccataggacatgcg tcaccctggc tccaggaagtctgcagggtc tgcttggtcc cttgttcaag
cactgagagg gtcctgcaga 12850gtgttggcct tctgtactct 12900aaggatggag cagccactgg 12950ccccaaaagc cctggagtgg 13000aactgaccaa tggcatcaaa 13050agtctctatg tcaatggttt 13100cacccctggg acctccacag 13150tccccagccc cacaagtgct 13200ctcaacttca ccatcaccaa 13250tggctccagg aagttcaaca 13300gtcccatgtt caagaacacc 13350ctgaccttgc tcaggtccga 13400catctgcacc caccgtcttg 13450agctatactg ggagctgagc 13500ccctacaccc tggacagaaa 13550gacctctgcg cccaacacca 13600ggacctcagg gactccatcc 13650ctcctggtgc cattcaccct 13700ggaggacatg catcacccag 13750tcctgcaggg tctgcttggt 13800ctgtactctg gctgcagact 13850agccactgga atggatgcca 13900ctggactcaa cagagagcag 13950ggcatcaaag agctgggccc 14000caatggtttc acccatcgga 14050cctccacagt ggaccttggg 14100cccacaacag ctgttcctct 14150caccaatctg cagtatgggg 14200tcaacaccac agagagggtc 14250aactccagtg tcggccctct 14300gtactctggc tgcagactga tctctctcagccactggagt ggatgccatc tgcacccaccggactggaca gggagcagct gtactggcagcatcaaagag ctgggcccct acaccctggaatggtttcac ccatcggagc tctgggctcatccacagttg accttggaac ctcagggactcacaactgct ggccctctcc tggtgccattccaacctgca gtatgaggag gacatgcatcaacgccacag agagggtcct gcagggtctgctccagtgtt ggccctctgt actctggctgccgagaagga tggggcagca actggaatggcctaatccca aaagacctgg gctggacagaaagccagctg acccacaaca tcactgagctgggacagtct ctatgtcaat ggtttcacccaccagtactc ctgggacctc cacagtgtacatcctccttc cccggccaca cagagcctggctttcaactt taccatcacc aacctgcattcctggttcca ggaagttcaa caccacggagcaagcccttg ttcaagaaca ccagtgttgggactgacctt gctcagacct gagaagcaggaccatctgta cccaccgcgt tgatcccatcgcggctatac tgggagctga gccagctgacgaccctacac cctggatagg gacagtctcttggagctctg tgccaaccac cagcactcctggcaacctct gggactccat cctccctgccctctcttgat accattcacc ctcaactttagaagaaaaca tgcaacaccc tggttccaggggttctgcag ggtctgctca agcccttgttctctgtactc tggctgcaga ctgaccttgcgcagccactg gagtggacgc catctgcacc
gtctgagaag gatggggcag 14350accttaaccc tcaaagccct 14400ctgagccaga tgaccaatgg 14450ccggaacagt ctctacgtca 14500ccaccagcac tccttggact 14550ccatcccccg tccccagccc 14600caccctaaac ttcaccatca 14650gccctggatc taggaagttc 14700cttagtccca tattcaagaa 14750cagactgacc tctctcaggc 14800atgctgtctg cctctaccac 14850gagcagctgt actgggagct 14900gggcccctac agcctggaca 14950atcagaactc tgtgcccacc 15000tgggcaacca ctgggactcc 15050ccctctcctg ataccattca 15100atgaggaaaa catgcaacac 15150agggttctgc agggtctgct 15200ccctctgtac tctggctgca 15250aggcagccac tggagtggac 15300ggacctggac tggacagaga 15350caacagcatc acagagctgg 15400atgtcaatgg cttcaaccct 15450gggacctcca cagtgcacct 15500tggccacaca gcccctgtcc 15550ccatcaccaa cctgcattat 15600aagttcaaca ccacggagag 15650caagagcacc agcgttggcc 15700tcagacctga gaaacatggg 15750ctccgccttg atcccactgg 15800tcctggactg gacagagagc ggctatactgacagcgttac agagctgggc ccctacacccgtcaatggct tcacccatcg gagctctgtggacctctgca gtgcacctgg aaacctctgggccacacagc ccctggccct ctcctggtgcatcaccaacc tgcagtatga ggaggacatggttcaacacc acggagagag tcctgcagggagagcaccag tgttggccct ctgtactctgaggcctgaaa aacgtggggc agccaccggcccgccttgac cctctaaacc ctggactggaagctgagcaa actgacccgt ggcatcatcggacagaggca gtctctatgt caatggtttccatcaccagc actcctggga cctccacagtctccatcctc cctacctaga cccatagtgcttcaccctca acttcaccat caccaacttgacaccctggc tccaggaagt tcaataccactgctcaggcc cttgttcaag aataccagtatgcagactga ccttgctcag gccagagaagggatgccatc tgtacccacc accctgacccgagagcagct gtactgggag ctgagccagcctgggcccct acaccctgga cagggacagttcattggagc cccataccaa ccaccagcacacctgggaac ctctgggatc ccaccttcccggccctctcc tggtgccatt cacactcaacgtatgaggag aacatgggtc accctggctcagagtgttct gcagggtctg ctcaagccctggccctctgt attctggctg cagactgacccggagtagcc accagagtgg acgccatctgaaatccctgg gctagacaga cagcagctatacccacagca tcactgagct gggaccctac
ggagctgagc cagctgacca 15850tggacaggga cagtctctat 15900ccaaccacca gtattcctgg 15950gactccagcc tccctccctg 16000cattcaccct caacttcact 16050cgtcaccctg gttccaggaa 16100tctgctcaag cccttgttca 16150gctgcagact gaccttgctc 16200gtggacacca tctgcactca 16250cagagagcag ctatactggg 16300agctgggccc ctacctcctg 16350acccatcgga actttgtgcc 16400acacctagga acctctgaaa 16450ctggccctct cctggtgcca 16500cagtatgagg aggccatgcg 16550ggagagggtc ctacagggtc 16600tcggccctct gtactccagc 16650gacaaggcag ccaccagagt 16700tcaaagccct ggactgaaca 16750tgacccacgg catcactgag 16800ctctatgtcg atggtttcac 16850tcctgggacc tccatagtga 16900tccctgaaac tacagccacc 16950ttcaccatca ctaacctaca 17000caggaagttc aacatcacgg 17050tgttcaagag caccagtgtt 17100ttgctcaggc ctgagaagga 17150cacccaccgc cctgacccca 17200actgggagct gagccagctg 17250accctggata gggacagtct 17300ctatgtcaat ggtttcaccc agcggagctcctgggacttt cacagtacag ccggaaacctcctggcccca cagccactgg ccctgtcctgtaccatcatt aacctgcagt atgaggaggaggaagttcaa caccacggag agggtccttcttcaagaaca ccagtgtcag ctctctgtacgctcaggcct gagaaggatg gggcagccaccccatcgtcc tgaccccaaa agccctggactggaagctga gccagctgac ccacggcatccctggacagg cacagtctct atgtcaatggtgacgaccac cagaactcct gatacctccaagaactccag cctccctgtc tggacctacggctattcaca attaacttca ccatcactaatgcatcaccc tggctctaga aagtttaacaggtctgctca ggcctgtgtt caagaacacctggctgcaga ctgaccttgc tcaggcccaaaagtggatgc catctgcacc taccgccctggacagagagc agctatactg ggagctgagctgagctgggc ccctacaccc tggacagggatcacacagcg gagctctgtg cccaccactagtggacctgg gaacatctgg gactccagtttgccagccct ctcctggtgc tattcactcttgcggtatga ggagaacatg cagcaccctgacggagaggg tccttcaggg cctgctcaggtgttggccct ctgtactctg gctgcagactaggatgggac agccactgga gtggatgccacccaaaagcc ctaggctgga cagagagcaggctgacccac aatatcactg agctgggcccgcctctttgt caatggtttc actcatcggaactcctggga cccccacagt gtatctggga
tgtgcccacc accagcactc 17350ctgagactcc atcatccctc 17400ctgccattca ccctcaattt 17450catgcatcgc cctggctcca 17500agggtctgct tatgcccttg 17550tctggttgca gactgacctt 17600cagagtggat gctgtctgca 17650tggacagaga gcggctgtac 17700actgagctgg gcccctacac 17750tttcacccat cagagctcta 17800caatgcacct ggcaacctcg 17850accgccagcc ctctcctggt 17900cctgcggtat gaggagaaca 17950ccacggagag agtccttcag 18000agtgttggcc ctctgtactc 18050gaaggatggg gcagccacca 18100atcccaaaag ccctggactg 18150cagctaaccc acagcatcac 18200cagtctctat gtcaatggtt 18250gcattcctgg gacccccaca 18300tctaaacctg gtccctcggc 18350caacttcacc atcaccaacc 18400gctccaggaa gttcaacacc 18450tccctgttca agagcaccag 18500gactttgctc aggcctgaaa 18550tctgcaccca ccaccctgac 18600ctgtattggg agctgagcca 18650ctatgccctg gacaacgaca 18700gctctgtgtc caccaccagc 18750gcatctaaga ctccagcctc 18800gatatttggc ccttcagctg ccagccatctacttcaccat cactaacctg cggtatgaggaggaagttca acactacaga gagggtccttgttcaagaac accagtgttg gccctctgtatgctcaggcc agagaaagat ggggaagccaacccaccgcc ctgaccccac aggccctgggtttggagctg agccagctga cccacagcatcactggacag ggacagtctc tatgtcaatggtacccacca ccagcaccgg ggtggtcagccttcaccatc aacaacctgc gctacatggcccctcaagtt caacatcaca gacaacgtcattgttccaga ggagcagcct gggtgcacggcgcactaagg tctgtgaaga acggtgctgagcacctacct gcagcccctc agcggcccagttccatgagc tgagccagca gacccatggcctctctggac aaagacagcc tctaccttaacagatgagcc tcctacaact cccaagccagctgtcagaag ccacaacagc catggggtaccaacttcacc atctccaatc tccagtattccagctacatt caactccacc gagggggtccttgttccaga agagcagcat gggccccttcctccctcagg cctgagaagg atggggcagcgcacctacca ccctgaccct gtgggccccgtactgggagc tgagtcagct gacccatggttgtcctggac agggatagcc tcttcatcaatatcaatccg gggcgagtac cagataaattctcagtaatc cagaccccac atcctcagagcatccaggac aaggtcacca cactctacaacattccgctt ctgcctggtc accaacttgaactgtcaagg cattgttctc ctccaatttg
cctgatacta ttcaccctca 18850agaacatgtg gcctggctcc 18900cagggcctgc taaggccctt 18950ctctggctgc aggctgacct 19000ccggagtgga tgccatctgc 19050ctggacagag agcagctgta 19100cactgagctg ggcccctaca 19150gtttcaccca tcggagctct 19200gaggagccat tcacactgaa 19250ggacatgggc caacccggct 19300tgcagcacct gctcagtcct 19350tacacaggct gcagggtcat 19400gacacgggtg gacctcctct 19450gtctgcctat caagcaggtg 19500atcacccggc tgggccccta 19550cggttacaat gaacctggtc 19600ccaccacatt cctgcctcct 19650cacctgaaga ccctcacact 19700accagatatg ggcaagggct 19750ttcagcacct gctcagaccc 19800tacttgggtt gccaactgat 19850cactggtgtg gacaccacct 19900ggctggacat acagcagctt 19950gtcacccaac tgggcttcta 20000tggctatgca ccccagaatt 20050tccacattgt caactggaac 20100tacatcaccc tgctgaggga 20150aggcagtcaa ctacatgaca 20200cgatggactc cgtgttggtc 20250gaccccagcc tggtggagca 20300agtctttcta gataagaccc tgaatgcctc attccattgg ctgggctcca 20350cctaccagtt ggtggacatc catgtgacag aaatggagtc atcagtttat 20400caaccaacaa gcagctccag cacccagcac ttctacctga atttcaccat 20450caccaaccta ccatattccc aggacaaagc ccagccaggc accaccaatt 20500accagaggaa caaaaggaat attgaggatg cgctcaacca actcttccga 20550aacagcagca tcaagagtta tttttctgac tgtcaagttt caacattcag 20600gtctgtcccc aacaggcacc acaccggggt ggactccctg tgtaacttct 20650cgccactggc tcggagagta gacagagttg ccatctatga ggaatttctg 20700cggatgaccc ggaatggtac ccagctgcag aacttcaccc tggacaggag 20750cagtgtcctt gtggatgggt attctcccaa cagaaatgag cccttaactg 20800ggaattctga ccttcccttc tgggctgtca tcctcatcgg cttggcagga 20850ctcctgggac tcatcacatg cctgatctgc ggtgtcctgg tgaccacccg 20900ccggcggaag aaggaaggag aatacaacgt ccagcaacag tgcccaggct 20950actaccagtc acacctagac ctggaggatc tgcaatgact ggaacttgcc 21000ggtgcctggg gtgcctttcc cccagccagg gtccaaagaa gcttggctgg 21050ggcagaaata aaccatattg gtcggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 21100aaaaaaaaaa aa 21112
<210> 2<211> 6995<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 2
Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro Gly Leu Val Ile Thr Thr Asp
1 5 10 15
Arg Met Gly Ile Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr
35 40 45
Val Asp Thr Glu Ala Met Gln Pro Ser Thr His Thr Ala Val Thr
50 55 60
Asn Val Arg Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln Ser Ser Val
65 70 75
Leu Ser Asp Ser Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr80 85 90Thr Tyr Thr Met Gly Glu Thr Ser Val Ser Ile Ser Thr Ser Asp95 100 105
Phe Phe Glu Thr Ser Arg Ile Gln Ile Glu Pro Thr Ser Ser Leu110 115 120
Thr Ser Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Ile Ser Ser125 130 135
Ala Thr Glu Gly Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Ser Gly Ala140 145 150
Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Ile Ser Ser Arg Gly Thr155 160 165
Ser Met Ser Gly Pro Asp Gln Phe Thr Ile Ser Pro Asp Ile Ser170 175 180
Thr Glu Ala Ile Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu185 190 195
Ser Ala Glu Ser Ala Ile Thr Ile Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala200 205 210
Thr Ser Glu Gly Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe215 220 225
Trp Ser Gly Thr His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser230 235 240
Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp245 250 255
Pro Ser Leu Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser260 265 270
Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu275 280 285
Pro Glu Ser Ile Ser Ser Ser Pro His Pro Val Thr Ala Leu Leu290 295 300
Thr Leu Gly Pro Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Arg Thr Ser Ser305 310 315
Glu Pro Glu Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala320 325 330
Glu Ile Leu Ala Thr Ser Glu Val Thr Lys Asp Arg Glu Lys Ile335 340 345
His Pro Ser Ser Asn Thr Pro Val Val Asn Val Gly Thr Val Ile350 355 360
Tyr Lys His Leu Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala Asp Leu Val Thr365 370 375
Thr Lys Pro Thr Ser Pro Met Ala Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asn380 385 390Thr Ser Val Ser Thr Ser Thr Pro Ala Phe Pro Glu Thr Met Met395 400 405
Thr Gln Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser410 415 420
Thr Ser Gln Glu Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu425 430 435
Ser Gly Met Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Val Ser Arg Thr Glu440 445 450
Ala Leu Ser Leu Gly Arg Thr Ser Thr Pro Gly Pro Ala Gln Ser455 460 465
Thr Ile Ser Pro Glu Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser470 475 480
Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly Ser Ala Glu Met Thr Ile Thr Pro485 490 495
Lys Thr Gly His Ser Gly Ala Ser Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu500 505 510
Asp Thr Ser Ser Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala515 520 525
Thr His Arg Ser Pro His Ser Gly Met Thr Thr Pro Met Ser Arg530 535 540
Gly Pro Glu Asp Val Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Val Glu Lys545 550 555
Thr Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Ser560 565 570
Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser Glu Ser Ser His Ser Ser575 580 585
Pro Leu Arg Val Thr Ser Leu Phe Thr Pro Val Met Met Lys Thr590 595 600
Thr Asp Met Leu Asp Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Thr Ser Pro605 610 615
Pro Ser Met Asn Ile Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Thr Ser Lys620 625 630
Ala Thr Met Glu Thr Glu Ala Ile Gln Leu Ser Glu Asn Thr Ala635 640 645
Val Thr Gln Met Gly Thr Ile Ser Ala Arg Gln Glu Phe Tyr Ser650 655 660
Ser Tyr Pro Gly Leu Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Val665 670 675
Val Thr Ser Ser Thr Ile Lys Asp Ile Val Ser Thr Thr Ile Pro680 685 690Ala Ser Ser Glu Ile Thr Arg Ile Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr695 700 705
Leu Thr Pro Thr Pro Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ile His710 715 720
Ser Ala Thr Lys Pro Ser Thr Val Pro Tyr Lys Ala Leu Thr Ser725 730 735
Ala Thr Ile Glu Asp Ser Met Thr Gln Val Met Ser Ser Ser Arg740 745 750
Gly Pro Ser Pro Asp Gln Ser Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Thr755 760 765
Glu Val Ile Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Lys Thr Glu Ser770 775 780
Thr Glu Met Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr785 790 795
Ser Arg Gly Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser800 805 810
Gly Thr His Ser Thr Ala Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met815 820 825
Thr Ala Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Glu Val Pro Trp Leu Ser830 835 840
His Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser845 850 855
Ser Pro Val Met Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro860 865 870
Asp Ser Ile His Ser Ser Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr875 880 885
Ser Gly Leu Val Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu890 895 900
Pro Glu Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu905 910 915
Ile Leu Ala Thr Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu920 925 930
Met Thr Asn Val Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser935 940 945
Ser Val Leu Ala Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met950 955 960
Gly Ile Thr Tyr Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr965 970 975
Pro Ala Phe Ser Asp Thr Ser Arg Ile Gln Thr Lys Ser Lys Leu980 985 990Ser Leu Thr Pro Gly Leu Met Glu Thr Ser Ile Ser Glu Glu Thr995 1000 1005
Ser Ser Ala Thr Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr1010 1015 1020
Gly Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala Ile Ser Ser Ser1025 1030 1035
Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Ser Asp1040 1045 1050
Thr Ser Met Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr Arg1055 1060 1065
Lys Glu Ser Thr Asp Met Ala Ile Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser1070 1075 1080
Gly Ala Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr1085 1090 1095
Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Thr Thr Gln Arg Phe Pro1100 1105 1110
Arg Ser Val Val Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp Val1115 1120 1125
Ser Trp Pro Ser Pro Leu Ser Val Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser1130 1135 1140
Ser Leu Val Ser Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr1145 1150 1155
Ser Thr Pro Ser Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Val Pro Val Thr1160 1165 1170
Ser Leu Phe Thr Ser Ile Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp1175 1180 1185
Ala Ser Leu Glu Pro Glu Thr Thr Ser Ala Pro Asn Met Asn Ile1190 1195 1200
Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr1205 1210 1215
Glu Ala Ile His Val Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Val Glu1220 1225 1230
Thr Thr Ser Ala Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe1235 1240 1245
Ser Glu Pro Thr Lys Val Ile Ser Pro Val Val Thr Ser Ser Ser1250 1255 1260
Ile Arg Asp Asn Met Val Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly1265 1270 1275
Ile Thr Arg Ile Glu Ile Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly1280 1285 1290Leu Arg Glu Thr Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Ser Ser Thr Glu
1295 1300 1305
Thr Ser Thr Val Leu Tyr Lys Met Pro Ser Gly Ala Thr Pro Glu
1310 1315 1320
Val Ser Arg Thr Glu Val Met Pro Ser Ser Arg Thr Ser Ile Pro
1325 1330 1335
Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Leu Asp Ile Ser Asp Glu Val
1340 1345 1350
Val Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu
1355 1360 1365
Ile Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gln
1370 1375 1380
Val Thr Leu Pro Leu Gly Thr Ser Met Thr Phe Leu Ser Gly Thr
1385 1390 1395
His Ser Thr Met Ser Gln Gly Leu Ser His Ser Glu Met Thr Asn
1400 1405 1410
Leu Met Ser Arg Gly Pro Glu Ser Leu Ser Trp Thr Ser Pro Arg
1415 1420 1425
Phe Val Glu Thr Thr Arg Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro
1430 1435 1440
Leu Thr Thr Ser Leu Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Leu Asp Ser
1445 1450 1455
Ser Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Ile Leu Pro Gly
1460 1465 1470
Leu Val Lys Thr Thr Glu Val Leu Asp Thr Ser Ser Glu Pro Lys
1475 1480 1485
Thr Ser Ser Ser Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Pro
1490 1495 1500
Ala Thr Ser Glu Ile Met Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro Ser
1505 1510 1515
Ser Asn Thr Ala Val Ala Lys Val Arg Thr Ser Ser Ser Val His
1520 1525 1530
Glu Ser His Ser Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr Ile Thr
1535 1540 1545
Ile Pro Ser Met Gly Ile Thr Ser Ala Val Glu Asp Thr Thr Val
1550 1555 1560
Phe Thr Ser Asn Pro Ala Phe Ser Glu Thr Arg Arg Ile Pro Thr
1565 1570 1575
Glu Pro Thr Phe Ser Leu Thr Pro Gly Phe Arg Glu Thr Ser Thr1580 1585 1590Ser Glu Glu Thr Thr Ser Ile Thr Glu Thr Ser Ala Val Leu Phe1595 1600 1605
Gly Val Pro Thr Ser Ala Thr Thr Glu Val Ser Met Thr Glu Ile1610 1615 1620
Met Ser Ser Asn Arg Thr His Ile Pro Asp Ser Asp Gln Ser Thr1625 1630 1635
Met Ser Pro Asp Ile Ile Thr Glu Val Ile Thr Arg Leu Ser Ser1640 1645 1650
Ser Ser Met Met Ser Glu Ser Thr Gln Met Thr Ile Thr Thr Gln1655 1660 1665
Lys Ser Ser Pro Gly Ala Thr Ala Gln Ser Thr Leu Thr Leu Ala1670 1675 1680
Thr Thr Thr Ala Pro Leu Ala Arg Thr His Ser Thr Val Pro Pro1685 1690 1695
Arg Phe Leu His Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Ser Pro1700 1705 1710
Glu Asn Pro Ser Trp Lys Ser Ser Pro Phe Val Glu Lys Thr Ser1715 1720 1725
Ser Ser Ser Ser Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Thr Ser Pro Ser1730 1735 1740
Val Ser Ser Thr Leu Pro Gln Ser Ile Pro Ser Ser Ser Phe Ser1745 1750 1755
Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro Gly Met Val Lys Thr Thr Asp Thr1760 1765 1770
Ser Thr Glu Pro Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Leu Ser Gly Thr1775 1780 1785
Ser Val Glu Ile Leu Ala Ala Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu1790 1795 1800
Lys Ile His Pro Ser Ser Ser Met Ala Val Thr Asn Val Gly Thr1805 1810 1815
Thr Ser Ser Gly His Glu Leu Tyr Ser Ser Val Ser Ile His Ser1820 1825 1830
Glu Pro Ser Lys Ala Thr Tyr Pro Val Gly Thr Pro Ser Ser Met1835 1840 1845
Ala Glu Thr Ser Ile Ser Thr Ser Met Pro Ala Asn Phe Glu Thr1850 1855 1860
Thr Gly Phe Glu Ala Glu Pro Phe Ser His Leu Thr Ser Gly Leu1865 1870 1875
Arg Lys Thr Asn Met Ser Leu Asp Thr Ser Ser Val Thr Pro Thr1880 1885 1890Asn Thr Pro Ser Ser Pro Gly Ser Thr His Leu Leu Gln Ser Ser1895 1900 1905
Lys Thr Asp Phe Thr Ser Ser Ala Lys Thr Ser Ser Pro Asp Trp1910 1915 1920
Pro Pro Ala Ser Gln Tyr Thr Glu Ile Pro Val Asp Ile Ile Thr1925 1930 1935
Pro Phe Asn Ala Ser Pro Ser Ile Thr Glu Ser Thr Gly Ile Thr1940 1945 1950
Ser Phe Pro Glu Ser Arg Phe Thr Met Ser Val Thr Glu Ser Thr1955 1960 1965
His His Leu Ser Thr Asp Leu Leu Pro Ser Ala Glu Thr Ile Ser1970 1975 1980
Thr Gly Thr Val Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Met Thr Ser Phe1985 1990 1995
Ala Thr Thr Gly Val Pro Arg Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Pro2000 2005 2010
Phe Ser Arg Thr Glu Ser Gly Pro Gly Asp Ala Thr Leu Ser Thr2015 2020 2025
Ile Ala Glu Ser Leu Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Phe Ser Ser2030 2035 2040
Ser Thr Phe Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr Ile Pro Ala Leu His2045 2050 2055
Glu Ile Thr Ser Ser Ser Ala Thr Pro Tyr Arg Val Asp Thr Ser2060 2065 2070
Leu Gly Thr Glu Ser Ser Thr Thr Glu Gly Arg Leu Val Met Val2075 2080 2085
Ser Thr Leu Asp Thr Ser Ser Gln Pro Gly Arg Thr Ser Ser Ser2090 2095 2100
Pro Ile Leu Asp Thr Arg Met Thr Glu Ser Val Glu Leu Gly Thr2105 2110 2115
Val Thr Ser Ala Tyr Gln Val Pro Ser Leu Ser Thr Arg Leu Thr2120 2125 2130
Arg Thr Asp Gly Ile Met Glu His Ile Thr Lys Ile Pro Asn Glu2135 2140 2145
Ala Ala His Arg Gly Thr Ile Arg Pro Val Lys Gly Pro Gln Thr2150 2155 2160
Ser Thr Ser Pro Ala Ser Pro Lys Gly Leu His Thr Gly Gly Thr2165 2170 2175
Lys Arg Met Glu Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr Thr Thr Thr2180 2185 2190Ala Leu Lys Thr Thr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Thr Ser Val Tyr2195 2200 2205
Thr Pro Thr Leu Gly Thr Leu Thr Pro Leu Asn Ala Ser Met Gln2210 2215 2220
Met Ala Ser Thr Ile Pro Thr Glu Met Met Ile Thr Thr Pro Tyr2225 2230 2235
Val Phe Pro Asp Val Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ala Thr Ser2240 2245 2250
Leu Gly Ala Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Arg Thr Thr Pro Ser2255 2260 2265
Val Phe Asn Arg Glu Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg2270 2275 2280
Ser Gly Ala Glu Arg Ser Pro Val Ile Gln Thr Leu Asp Val Ser2285 2290 2295
Ser Ser Glu Pro Asp Thr Thr Ala Ser Trp Val Ile His Pro Ala2300 2305 2310
Glu Thr Ile Pro Thr Val Ser Lys Thr Thr Pro Asn Phe Phe His2315 2320 2325
Ser Glu Leu Asp Thr Val Ser Ser Thr Ala Thr Ser His Gly Ala2330 2335 2340
Asp Val Ser Ser Ala Ile Pro Thr Asn Ile Ser Pro Ser Glu Leu2345 2350 2355
Asp Ala Leu Thr Pro Leu Val Thr Ile Ser Gly Thr Asp Thr Ser2360 2365 2370
Thr Thr Phe Pro Thr Leu Thr Lys Ser Pro His Glu Thr Glu Thr2375 2380 2385
Arg Thr Thr Trp Leu Thr His Pro Ala Glu Thr Ser Ser Thr Ile2390 2395 2400
Pro Arg Thr Ile Pro Asn Phe Ser His His Glu Ser Asp Ala Thr2405 2410 2415
Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly Ala Glu Thr Ser Ser Ala Ile2420 2425 2430
Pro Ile Met Thr Val Ser Pro Gly Ala Glu Asp Leu Val Thr Ser2435 2440 2445
Gln Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp Arg Asn Met Thr Ile Pro Thr2450 2455 2460
Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Lys Thr Ile Ala Ser Leu Val2465 2470 2475
Thr His Pro Glu Ala Gln Thr Ser Ser Ala Ile Pro Thr Ser Thr2480 2485 2490Ile Ser Pro Ala Val Ser Arg Leu Val Thr Ser Met Val Thr Ser2495 2500 2505
Leu Ala Ala Lys Thr Ser Thr Thr Asn Arg Ala Leu Thr Asn Ser2510 2515 2520
Pro Gly Glu Pro Ala Thr Thr Val Ser Leu Val Thr His Ser Ala2525 2530 2535
Gln Thr Ser Pro Thr Val Pro Trp Thr Thr Ser Ile Phe Phe His2540 2545 2550
Ser Lys Ser Asp Thr Thr Pro Ser Met Thr Thr Ser His Gly Ala2555 2560 2565
Glu Ser Ser Ser Ala Val Pro Thr Pro Thr Val Ser Thr Glu Val2570 2575 2580
Pro Gly Val Val Thr Pro Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Ile2585 2590 2595
Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Glu2600 2605 2610
Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Glu Glu Ala Ser Ser2615 2620 2625
Ala Ile Pro Thr Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Val Val2630 2635 2640
Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile2645 2650 2655
Pro Ile Leu Thr Phe Ser Leu Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser2660 2665 2670
Met Ala Thr Ser His Gly Thr Glu Ala Gly Ser Ala Val Pro Thr2675 2680 2685
Val Leu Pro Glu Val Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Ala Ser2690 2695 2700
Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser2705 2710 2715
Pro Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly2720 2725 2730
Ala Glu Ala Ser Ser Thr Val Pro Thr Val Ser Pro Glu Val Pro2735 2740 2745
Gly Val Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Ser Gly Val Asn Ser2750 2755 2760
Thr Ser Ile Pro Thr Leu Ile Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Thr2765 2770 2775
Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ala2780 2785 2790Val Pro Thr Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Ser Gly Val Val Thr2795 2800 2805
Pro Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro2810 2815 2820
Ile Leu Thr Leu Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met2825 2830 2835
Ala Thr Ser His Gly Val Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr Val2840 2845 2850
Ser Pro Glu Val Pro Gly Met Val Thr Phe Leu Val Thr Ser Ser2855 2860 2865
Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser2870 2875 2880
Asp Glu Pro Glu Thr Thr Thr Ser Leu Val Thr His Ser Glu Ala2885 2890 2895
Lys Met Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu Gly Val Ser Pro Thr Val2900 2905 2910
Gln Gly Leu Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr2915 2920 2925
Ser Ala Phe Ser Asn Leu Thr Val Ala Ser Ser Gln Pro Glu Thr2930 2935 2940
Ile Asp Ser Trp Val Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Val2945 2950 2955
Val Pro Thr Leu Thr Val Ser Thr Gly Glu Pro Phe Thr Asn Ile2960 2965 2970
Ser Leu Val Thr His Pro Ala Glu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg2975 2980 2985
Thr Thr Ser Arg Phe Ser His Ser Glu Leu Asp Thr Met Pro Ser2990 2995 3000
Thr Val Thr Ser Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ile Ser Thr3005 3010 3015
Thr Ile Ser Pro Gly Ile Pro Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Thr3020 3025 3030
Ser Ser Gly Arg Asp Ile Ser Ala Thr Phe Pro Thr Val Pro Glu3035 3040 3045
Ser Pro His Glu Ser Glu Ala Thr Ala Ser Trp Val Thr His Pro3050 3055 3060
Ala Val Thr Ser Thr Thr Val Pro Arg Thr Thr Pro Asn Tyr Ser3065 3070 3075
His Ser Glu Pro Asp Thr Thr Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly3080 3085 3090Ala Glu Ala Thr Ser Asp Phe Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro Asp3095 3100 3105
Val Pro Asp Met Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp3110 3115 3120
Thr Ser Ile Thr Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser Ser Gly Glu Pro3125 3130 3135
Glu Thr Thr Thr Ser Phe Ile Thr Tyr Ser Glu Thr His Thr Ser3140 3145 3150
Ser Ala Ile Pro Thr Leu Pro Val Ser Pro Asp Ala Ser Lys Met3155 3160 3165
Leu Thr Ser Leu Val Ile Ser Ser Gly Thr Asp Ser Thr Thr Thr3170 3175 3180
Phe Pro Thr Leu Thr Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala3185 3190 3195
Ile Gln Leu Ile His Pro Ala Glu Thr Asn Thr Met Val Pro Arg3200 3205 3210
Thr Thr Pro Lys Phe Ser His Ser Lys Ser Asp Thr Thr Leu Pro3215 3220 3225
Val Ala Ile Thr Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Ser Ala Val Ser3230 3235 3240
Thr Thr Thr Ile Ser Pro Asp Met Ser Asp Leu Val Thr Ser Leu3245 3250 3255
Val Pro Ser Ser Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro Thr Leu3260 3265 3270
Ser Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Trp Leu Thr3275 3280 3285
His Pro Ala Glu Thr Ser Thr Thr Val Ser Gly Thr Ile Pro Asn3290 3295 3300
Phe Ser His Arg Gly Ser Asp Thr Ala Pro Ser Met Val Thr Ser3305 3310 3315
Pro Gly Val Asp Thr Arg Ser Gly Val Pro Thr Thr Thr Ile Pro3320 3325 3330
Pro Ser Ile Pro Gly Val Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Ala3335 3340 3345
Thr Asp Thr Ser Thr Ala Ile Pro Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gly3350 3355 3360
Glu Pro Glu Thr Thr Ala Ser Ser Ala Thr His Pro Gly Thr Gln3365 3370 3375
Thr Gly Phe Thr Val Pro Ile Arg Thr Val Pro Ser Ser Glu Pro3380 3385 3390Asp Thr Met Ala Ser Trp Val Thr His Pro Pro Gln Thr Ser Thr3395 3400 3405
Pro Val Ser Arg Thr Thr Ser Ser Phe Ser His Ser Ser Pro Asp3410 3415 3420
Ala Thr Pro Val Met Ala Thr Ser Pro Arg Thr Glu Ala Ser Ser3425 3430 3435
Ala Val Leu Thr Thr Ile Ser Pro Gly Ala Pro Glu Met Val Thr3440 3445 3450
Ser Gln Ile Thr Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Thr Thr Val Pro3455 3460 3465
Thr Leu Thr His Ser Pro Gly Met Pro Glu Thr Thr Ala Leu Leu3470 3475 3480
Ser Thr His Pro Arg Thr Glu Thr Ser Lys Thr Phe Pro Ala Ser3485 3490 3495
Thr Val Phe Pro Gln Val Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile3500 3505 3510
Arg Pro Gly Ala Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Thr Gln Thr Thr3515 3520 3525
Ser Ser Leu Phe Thr Leu Leu Val Thr Gly Thr Ser Arg Val Asp3530 3535 3540
Leu Ser Pro Thr Ala Ser Pro Gly Val Ser Ala Lys Thr Ala Pro3545 3550 3555
Leu Ser Thr His Pro Gly Thr Glu Thr Ser Thr Met Ile Pro Thr3560 3565 3570
Ser Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala3575 3580 3585
Thr Ser Ser Ser Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Leu Thr3590 3595 3600
Val Ser Pro Ala Val Ser Gly Leu Ser Ser Ala Ser Ile Thr Thr3605 3610 3615
Asp Lys Pro Gln Thr Val Thr Ser Trp Asn Thr Glu Thr Ser Pro3620 3625 3630
Ser Val Thr Ser Val Gly Pro Pro Glu Phe Ser Arg Thr Val Thr3635 3640 3645
Gly Thr Thr Met Thr Leu Ile Pro Ser Glu Met Pro Thr Pro Pro3650 3655 3660
Lys Thr Ser His Gly Glu Gly Val Ser Pro Thr Thr Ile Leu Arg3665 3670 3675
Thr Thr Met Val Glu Ala Thr Asn Leu Ala Thr Thr Gly Ser Ser3680 3685 3690Pro Thr Val Ala Lys Thr Thr Thr Thr Phe Asn Thr Leu Ala Gly3695 3700 3705
Ser Leu Phe Thr Pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Ser Thr Leu Ala3710 3715 3720
Ser Glu Ser Val Thr Ser Arg Thr Ser Tyr Asn His Arg Ser Trp3725 3730 3735
Ile Ser Thr Thr Ser Ser Tyr Asn Arg Arg Tyr Trp Thr Pro Ala3740 3745 3750
Thr Ser Thr Pro Val Thr Ser Thr Phe Ser Pro Gly Ile Ser Thr3755 3760 3765
Ser Ser Ile Pro Ser Ser Thr Ala Ala Thr Val Pro Phe Met Val3770 3775 3780
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu3785 3790 3795
Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg3800 3805 3810
Glu Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu3815 3820 3825
Glu Tyr Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu3830 3835 3840
Lys Asp Ser Ser Ala Thr Ala Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg3845 3850 3855
Pro Asp Pro Glu Asp Leu Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp3860 3865 3870
Glu Leu Ser Asn Leu Thr Asn Gly Ile Gln Glu Leu Gly Pro Tyr3875 3880 3885
Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg3890 3895 3900
Ser Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp3905 3910 3915
Val Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Thr Thr3920 3925 3930
Ala Gly Pro Leu Leu Met Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr3935 3940 3945
Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg Arg Thr Gly Ser Arg Lys3950 3955 3960
Phe Asn Thr Met Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu3965 3970 3975
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu3980 3985 3990Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp3995 4000 4005
Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn4010 4015 4020
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Asp Ile4025 4030 4035
Glu Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val4040 4045 4050
Asn Gly Phe Thr His Gln Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro4055 4060 4065
Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser4070 4075 4080
Leu Ser Ser Pro Thr Ile Met Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro4085 4090 4095
Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Glu Asp4100 4105 4110
Met Gly His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val4115 4120 4125
Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro Ile Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly4130 4135 4140
Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys4145 4150 4155
Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Ile His His Leu4160 4165 4170
Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu4175 4180 4185
Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr4190 4195 4200
Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr4205 4210 4215
Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu4220 4225 4230
Gly Thr Ser Gly Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala4235 4240 4245
Gly Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn4250 4255 4260
Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe4265 4270 4275
Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Thr Leu Val Gly Pro Met Phe4280 4285 4290Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr4295 4300 4305
Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala4310 4315 4320
Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg4325 4330 4335
Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys4340 4345 4350
Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn4355 4360 4365
Gly Phe Thr His Trp Ile Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly4370 4375 4380
Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro4385 4390 4395
Ser Pro Thr Ser Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr4400 4405 4410
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His4415 4420 4425
Cys Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln4430 4435 4440
Ser Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu4445 4450 4455
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly4460 4465 4470
Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro4475 4480 4485
Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser4490 4495 4500
Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp4505 4510 4515
Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln Thr Ser Ala4520 4525 4530
Pro Asn Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr4535 4540 4545
Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gly Pro4550 4555 4560
Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln4565 4570 4575
Tyr Glu Glu Asp Met His His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr4580 4585 4590Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn4595 4600 4605
Thr Ser Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu4610 4615 4620
Arg Pro Glu Lys Asn Gly Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Ile Cys4625 4630 4635
Ser His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln4640 4645 4650
Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Ile Lys Glu Leu4655 4660 4665
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe4670 4675 4680
Thr His Arg Ser Ser Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser4685 4690 4695
Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser4700 4705 4710
Pro Thr Thr Ala Val Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe4715 4720 4725
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Glu Asp Met Arg His Pro Gly4730 4735 4740
Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu4745 4750 4755
Gly Pro Leu Phe Lys Asn Ser Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly4760 4765 4770
Cys Arg Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr4775 4780 4785
Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His His Leu Asn Pro Gln Ser Pro4790 4795 4800
Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Gln Leu Ser Gln Met Thr4805 4810 4815
Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser4820 4825 4830
Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Gly Leu Thr Thr4835 4840 4845
Ser Thr Pro Trp Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr4850 4855 4860
Pro Ser Pro Val Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu Leu Val4865 4870 4875
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu4880 4885 4890Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg4895 4900 4905
Val Leu Gln Gly Leu Leu Ser Pro Ile Phe Lys Asn Ser Ser Val4910 4915 4920
Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Pro Glu4925 4930 4935
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Val Cys Leu Tyr His4940 4945 4950
Pro Asn Pro Lys Arg Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp4955 4960 4965
Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr4970 4975 4980
Ser Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln4985 4990 4995
Asn Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Tyr5000 5005 5010
Trp Ala Thr Thr Gly Thr Pro Ser Ser Phe Pro Gly His Thr Glu5015 5020 5025
Pro Gly Pro Leu Leu Ile Pro Phe Thr Phe Asn Phe Thr Ile Thr5030 5035 5040
Asn Leu His Tyr Glu Glu Asn Met Gln His Pro Gly Ser Arg Lys5045 5050 5055
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu5060 5065 5070
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu5075 5080 5085
Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Gln Glu Ala Ala Thr Gly Val Asp5090 5095 5100
Thr Ile Cys Thr His Arg Val Asp Pro Ile Gly Pro Gly Leu Asp5105 5110 5115
Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Ser Ile5120 5125 5130
Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val5135 5140 5145
Asn Gly Phe Asn Pro Trp Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro5150 5155 5160
Gly Thr Ser Thr Val His Leu Ala Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser5165 5170 5175
Leu Pro Gly His Thr Ala Pro Val Pro Leu Leu Ile Pro Phe Thr5180 5185 5190Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu His Tyr Glu Glu Asn Met Gln5195 5200 5205
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln5210 5215 5220
Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu5225 5230 5235
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys His Gly5240 5245 5250
Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr Leu Arg Leu Asp Pro5255 5260 5265
Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser5270 5275 5280
Gln Leu Thr Asn Ser Val Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp5285 5290 5295
Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val5300 5305 5310
Pro Thr Thr Ser Ile Pro Gly Thr Ser Ala Val His Leu Glu Thr5315 5320 5325
Ser Gly Thr Pro Ala Ser Leu Pro Gly His Thr Ala Pro Gly Pro5330 5335 5340
Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln5345 5350 5355
Tyr Glu Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr5360 5365 5370
Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser5375 5380 5385
Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu5390 5395 5400
Arg Pro Glu Lys Arg Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Ile Cys5405 5410 5415
Thr His Arg Leu Asp Pro Leu Asn Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln5420 5425 5430
Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Arg Gly Ile Ile Glu Leu5435 5440 5445
Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Arg Gly Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe5450 5455 5460
Thr His Arg Asn Phe Val Pro Ile Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser5465 5470 5475
Thr Val His Leu Gly Thr Ser Glu Thr Pro Ser Ser Leu Pro Arg5480 5485 5490Pro Ile Val Pro Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe5495 5500 5505
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Ala Met Arg His Pro Gly5510 5515 5520
Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu5525 5530 5535
Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Ile Gly Pro Leu Tyr Ser Ser5540 5545 5550
Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Lys Ala Ala Thr5555 5560 5565
Arg Val Asp Ala Ile Cys Thr His His Pro Asp Pro Gln Ser Pro5570 5575 5580
Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr5585 5590 5595
His Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser5600 5605 5610
Leu Tyr Val Asp Gly Phe Thr His Trp Ser Pro Ile Pro Thr Thr5615 5620 5625
Ser Thr Pro Gly Thr Ser Ile Val Asn Leu Gly Thr Ser Gly Ile5630 5635 5640
Pro Pro Ser Leu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Gly Pro Leu Leu Val5645 5650 5655
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu5660 5665 5670
Asn Met Gly His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ile Thr Glu Ser5675 5680 5685
Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val5690 5695 5700
Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu5705 5710 5715
Lys Asp Gly Val Ala Thr Arg Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg5720 5725 5730
Pro Asp Pro Lys Ile Pro Gly Leu Asp Arg Gln Gln Leu Tyr Trp5735 5740 5745
Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr5750 5755 5760
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gln Arg5765 5770 5775
Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Phe Thr Val Gln5780 5785 5790Pro Glu Thr Ser Glu Thr Pro Ser Ser Leu Pro Gly Pro Thr Ala5795 5800 5805
Thr Gly Pro Val Leu Leu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ile5810 5815 5820
Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys5825 5830 5835
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Met Pro Leu5840 5845 5850
Phe Lys Asn Thr Ser Val Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu5855 5860 5865
Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val Asp5870 5875 5880
Ala Val Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp5885 5890 5895
Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Lys Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Ile5900 5905 5910
Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg His Ser Leu Tyr Val5915 5920 5925
Asn Gly Phe Thr His Gln Ser Ser Met Thr Thr Thr Arg Thr Pro5930 5935 5940
Asp Thr Ser Thr Met His Leu Ala Thr Ser Arg Thr Pro Ala Ser5945 5950 5955
Leu Ser Gly Pro Thr Thr Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr5960 5965 5970
Ile Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met His5975 5980 5985
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln5990 5995 6000
Gly Leu Leu Arg Pro Val Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu6005 6010 6015
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly6020 6025 6030
Ala Ala Thr Lys Val Asp Ala Ile Cys Thr Tyr Arg Pro Asp Pro6035 6040 6045
Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser6050 6055 6060
Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp6065 6070 6075
Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val6080 6085 6090Pro Thr Thr Ser Ile Pro Gly Thr Pro Thr Val Asp Leu Gly Thr6095 6100 6105
Ser Gly Thr Pro Val Ser Lys Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ser Pro6110 6115 6120
Leu Leu Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg6125 6130 6135
Tyr Glu Glu Asn Met Gln His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr6140 6145 6150
Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Ser Leu Phe Lys Ser6155 6160 6165
Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu6170 6175 6180
Arg Pro Glu Lys Asp Gly Thr Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys6185 6190 6195
Thr His His Pro Asp Pro Lys Ser Pro Arg Leu Asp Arg Glu Gln6200 6205 6210
Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu6215 6220 6225
Gly Pro Tyr Ala Leu Asp Asn Asp Ser Leu Phe Val Asn Gly Phe6230 6235 6240
Thr His Arg Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Pro6245 6250 6255
Thr Val Tyr Leu Gly Ala Ser Lys Thr Pro Ala Ser Ile Phe Gly6260 6265 6270
Pro Ser Ala Ala Ser His Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe6275 6280 6285
Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser6290 6295 6300
Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg6305 6310 6315
Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys6320 6325 6330
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly6335 6340 6345
Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly6350 6355 6360
Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His6365 6370 6375
Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu6380 6385 6390Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser6395 6400 6405
Thr Gly.Val Val Ser Glu Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile6410 6415 6420
Asn Asn Leu Arg Tyr Met Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu6425 6430 6435
Lys Phe Asn Ile Thr Asp Asn Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro6440 6445 6450
Leu Phe Gln Arg Ser Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg6455 6460 6465
Val Ile Ala Leu Arg Ser Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val6470 6475 6480
Asp Leu Leu Cys Thr Tyr Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu6485 6490 6495
Pro Ile Lys Gln Val Phe His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly6500 6505 6510
Ile Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr6515 6520 6525
Leu Asn Gly Tyr Asn Glu Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr6530 6535 6540
Pro Lys Pro Ala Thr Thr Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr6545 6550 6555
Thr Ala Met Gly Tyr His Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr6560 6565 6570
Ile Ser Asn Leu Gln Tyr Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala6575 6580 6585
Thr Phe Asn Ser Thr Glu Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro6590 6595 6600
Leu Phe Gln Lys Ser Ser Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln6605 6610 6615
Leu Ile Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val6620 6625 6630
Asp Thr Thr Cys Thr Tyr His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu6635 6640 6645
Asp Ile Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly6650 6655 6660
Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe6665 6670 6675
Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr6680 6685 6690Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp6695 6700 6705
Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp6710 6715 6720
Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr Phe6725 6730 6735
Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser Val Leu Val6740 6745 6750
Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val6755 6760 6765
Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His Trp6770 6775 6780
Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met6785 6790 6795
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His6800 6805 6810
Phe Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp6815 6820 6825
Lys Ala Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn6830 6835 6840
Ile Glu Asp Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys6845 6850 6855
Ser Tyr Phe Ser Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro6860 6865 6870
Asn Arg His His Thr Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro6875 6880 6885
Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu6890 6895 6900
Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp6905 6910 6915
Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu6920 6925 6930
Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu6935 6940 6945
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys6950 6955 6960
Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr6965 6970 6975
Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp6980 6985 6990Leu Glu Asp Leu Gln6995
<210> 3<211> 108<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 4<211> 109<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 4
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr
65 70 75
Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His
80 85 90
Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
95 100 105Glu Ile Lys Arg
<210> 5<211> 109<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His
80 85 90
Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
95 100 105
Glu Ile Lys Arg
<210> 6<211> 113<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
95 100 105Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110
<210> 7<211> 120<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly
15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
20 25 30
Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr
50 55 60
Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr
95 100 105
Gly Phe Ala Phe Cys Asp Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ala
110 115 120
<210> 8<211> 120<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
20 25 30
Asp Thr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr
50 55 60
Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr95 100 105Gly Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
<210> 9<211> 107<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Phe Leu Ser Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu Ile His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Ser Ile
65 70 75
Ala Ser Leu Gln Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys
<210> 10<211> 108<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu Ile His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105Ile Lys Arg
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser1 5 10 15
Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys35 40 45
Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Gln Phe Phe Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp80 85 90
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala110 115
<210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr95 100 105Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His
5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Thr Gln Arg Thr Ser Val Lys Arg Ser Tyr Ile Ser
5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Thr Pro Arg Gly Arg Val Arg Ser Ser Tyr Leu Ser
5 10<210> 17<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> Incerto<222> 4
<223> Amino ácido desconhecido<4 00> 17
Pro Glu Cys Xaa Ser Leu Gly Thr Ile Tyr Leu His
5 10
<210> 18<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 18
Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Ser Thr Tyr Leu His
5 10
<210> 19<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 19
Thr Ala Ser Thr Ala Val Gly Ser Ser Tyr Leu His
5 10
<210> 20<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 20
Asn Ser Arg Ser Val Ser Thr Arg Tyr Leu His
5 10
<210> 21<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 21
Asn Thr Thr Arg Ser Val Ser Thr Gly Tyr Leu His
5 10
<210> 22<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Thr Ala Ser Ser Arg Val Thr Ser Thr Tyr Leu His
5 10<210> 23<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 23
Asn Thr Prο Thr Gly Val Asn Pro Val Tyr Leu His
5 10
<210> 24<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 24
Ala Ala Ser Ser Asp Val Ile Gly Ser Tyr Val His
5 10
<210> 25<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 25
Gly Leu Ser Thr Ser Val Asn Ser Ser Tyr Met His
5 10
<210> 26<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> Incerto<222> 10
<223> Amino ácido desconhecido<400> 26
Asn Ala Lys Ser Gly Val Arg Ser Ser Xaa Val His
5 10
<210> 27<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 27
Asn Ser Asn Gly Ser Val Ser Ser Lys Tyr Ile His
5 10
<210> 28<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 28
Thr Pro Ser Arg Ile Val Ser Gly Ser Tyr Leu Ser
5 10<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Asn Pro Ser Arg Arg Val Thr Gly His Tyr Val Ser
5 10
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Thr Ser Ser Ser Ala Val Ser Gly Ser Tyr Val Ser
5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Thr Ser Thr Thr Ile Val Arg Gly Arg Tyr Val Ser
5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Thr Ala Ser Ser Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Leu Thr
5 10
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Arg Arg Tyr Leu Ser
5 10
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Thr Ala Gly Ser Lys Ala Asn Ser Ser Tyr Ile His
5 10
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 35Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
5
<210> 36<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36Tyr Ser Thr Ser His Phe Ala Ser
5
<210> 37<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 37
Tyr Ser Ala Ser Asn Val Pro Ser
5
<210> 38<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 38
Tyr Ser Thr Ile Asn Leu Ala Thr
5
<210> 39<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 39
Tyr Ser Thr Ser Lys Val Ala Asn
5
<210> 40<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 40
Tyr Ser Thr Thr Asn Leu Ala Ser
5
<210> 41<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 41
Tyr Ser Thr Asn His Leu Ala Ser
5
<210> 42<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 42
Tyr Ser Thr Asn Asn Leu Ala Ser
5
<210> 43<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 43
Tyr Ser Thr Ile His Pro Ala Ser
5
<210> 44<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 44
Tyr Ser Thr Ser His Leu Ser Tyr
5
<210> 45<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 45
Tyr Ser Thr Arg Thr Met Ala Ser
5
<210> 46<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> Incerto<222> 5
<223> Amino ácido desconhecido<400> 46
Tyr Ser Thr Ser Xaa Leu Phe Ser
5
<210> 47<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 47
Tyr Asn Thr Ser Asn Arg Ala Ser
5
<210> 48<211> 8<212> PRT
<213> Rana catesbeiana
<400> 48Tyr Gly Thr Ser His Leu Ala Ser
5
<210> 49<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49Tyr Gly Thr Gly Ser Pro Ala Ser
5
<210> 50<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50Tyr Ser Thr Asn Lys Leu Ala Arg
5
<210> 51<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51Tyr Ser Thr Ser Gln Leu Gly Arg
5
<210> 52<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52Tyr Ser Thr Ser Asn Val Pro Gln
5
<210> 53<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53Tyr Gly Thr Tyr Asn Leu Pro Ile
5
<210> 54<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54Tyr Gly Ser Asn Asn Arg Ala Tyr5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> Incerto
<222> 7
<223> Amino ácido desconhecido
<400> 55Tyr Ser Ser Ser Asn Thr Xaa Ser
5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Tyr Ser Ala Asn Lys Leu Ala Ser
5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Tyr Ser Ala Thr Arg Arg Ala Ser
5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Ala Arg
5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr
5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Lys
<210> 61<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 61
His Gln Tyr His Arg Thr Pro Tyr Lys5
<210> 62<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 62
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Gly5
<210> 63<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 63
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Asn5
<210> 64<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 64
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Ser5
<210> 65<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 65
His Gln Tyr Tyr Arg Ser Pro Tyr Thr5
<210> 66<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 66
His Gln Tyr Tyr Arg Thr Pro Tyr Ser5
<210> 67<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 67
His Gln Tyr Gln Arg Ser Pro Tyr Thr
5
<210> 68<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 68
His Gln Tyr Gln Arg Ser Pro Tyr Arg
5
<210> 69<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 69
His Gln Tyr Asn Arg Ser Pro Tyr Ala
5
<210> 70<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 70
His Gln-Tyr His Arg Thr Pro Tyr Thr
5
<210> 71<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 71
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Ile
5
<210> 72<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 72
His Gln Tyr His Arg Arg Pro Tyr Arg
5
<210> 73<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73His Gln Tyr His Arg Asn Pro Tyr Ile
5
<210> 74<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 74
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His
5 10
<210> 75<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 75
Ala Phe Asn Ile Ala Asp Thr Tyr Ile His
5 10
<210> 76<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 76
Arg Phe Arg Ile Lys Asp Thr Tyr Val His
5 10
<210> 77<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 77
Arg Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
5 10
<210> 78<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 78
Ser Phe Gln Ile Asn Asp Thr Tyr Ile His
5 10
<210> 79<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 79
Ser Phe Gln Met Ser Asp Thr Tyr Val His
5 10
<210> 80<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 80Asp Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His5 10
<210> 81<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 81Gly Phe Asn Ile Ile Asp Thr Tyr Ile His5 10
<210> 82<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 82Gly Leu Gln Ile Val Asp Thr Tyr Ile His5 10
<210> 83<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 83Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Leu His5 10
<210> 84<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 84Gly Phe Asn Ile Gln Asp Leu Tyr Leu His5 10
<210> 85<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 85Gly Phe Asn Ile Ile Asp Thr Tyr Met His5 10
<210> 86<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 86Gly Trp Lys Met Thr Asp Thr Tyr Met His5 10
<210> 87<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87Glu Phe Lys Ile Lys Asp Thr Tyr Val His5 10
<210> 88<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 88Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Val His5 10
<210> 89<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 89Gly Phe Tyr Ile Ser Asn Thr Tyr Ile His5 10
<210> 90<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 90Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr Tyr Leu His5 10
<210> 91<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 91Gly Phe Ser Ile Glu Asn Thr Tyr Met His5 10
<210> 92<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 92Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr Tyr Met His5 10
<210> 93<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 93
Asp Phe Lys Ile Glu Asn Thr Tyr Val His
5 10
<210> 94<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 94
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 95<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 95
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Pro Lys15 10 15
Val Arg Gly
<210> 96<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 96
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Leu Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 97<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 97
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Glu Ile Lys Ser His Pro Ile15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 98<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 98
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Glu Asp Arg Gln15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 99<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 99
Gly Arg Val Asp Pro Glu Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 100<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 100
Gly Arg Leu Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 101<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 101
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 102<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 102
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 103<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 103
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Lys1 5 10 15
Phe Gln Gly
<210> 104<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 104
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Pro Lys1 5 10 15
Phe Gln Gly
<210> 105<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 105
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys1 5 10 15
Phe Gln Gly
<210> 106<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 106
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Tyr Lys Tyr Asp Pro Lys1 5 10 15
Phe Gln Gly
<210> 107<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 107
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Asp Pro Lys1 5 10 15
Phe Gln Gly
<210> 108<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 108Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp His Arg15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 109<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 109
Gly Arg Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Arg Gly
<210> 110<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 110
Gly Arg Val Asp Pro Ser Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Gly Lys1 5 10 15
Phe Asn Gly
<210> 111<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 111
Gly Arg Val Asp Pro Val Asp Gly Lys Thr Lys Tyr Asn Pro Gln1 5 10 15
Ile Gln Gly
<210> 112<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Gly Arg Val Asp Pro Ala His Gly Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Gln1 5 10 15
Ile Met Gly
<210> 113<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 113
Val Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Ala Phe
10
<210> 114<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 114
Val Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Gln Pro
5 10
<210> 115<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 115
Ala Arg Asp Asn Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Gly Phe
5 10
<210> 116<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 116
Val Arg Asp Thr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Ala Tyr
5 10
<210> 117<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 117
Val Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Gly Tyr
5 10
<210> 118<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 118
Val Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Gly Val
5 10
<210> 119<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 119
Lys Ala Ser Asp Leu Ile His Asn Trp Leu Ala
5 10
<210> 120<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
5
<210> 121<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
5
<210> 122<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 122
Gln Gln Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr
5
<210> 123<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 123
Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Asp Tyr Ala Trp Asn
5 10
<210> 124<211> 17<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 124
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu15 10 15
Lys Ser
<210> 125<211> 17<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 125
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu15 10 15
Lys Ser
<210> 126<211> 17<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 126
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu15 10 15
Lys Ser
<210> 127<211> 17<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 127
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu15 10 15
Lys Ser
<210> 128<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 128
Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 129<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 129Ala Arg Trp Ala Ala Gly Leu Thr Asn
5
<210> 130<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 130
Ala Arg Trp Asp Ala Gly Leu Ser Tyr
5
<210> 131<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 131
Ala Arg Trp Asp Ala Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 132<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 132
Ala Arg Trp Glu Ala Gly Leu Asn His
5
<210> 133<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 133Ala Arg Trp Glu Ala Gly Leu Asn Tyr
5
<210> 134<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 134
Ala Arg Trp Met Ala Gly Leu Ser Asp
5
<210> 135<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 135
Ala Arg Trp Ser Ala Gly Leu Asp His
5
<210> 136<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 136
Ala Arg Trp Thr Ala Gly Leu Asp Tyr
5
<210> 137<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 137
Ala Arg Trp Thr Ala Gly Leu Thr His
5
<210> 138<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138Ala Arg Trp Val Ala Gly Leu Thr Asn
5
<210> 139<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 139Ala Arg Trp Ala Gly Gly Leu Glu Asn
5
<210> 140<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Ser Tyr
5
<210> 141<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 141
Ala Arg Trp Asp Arg Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 142<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 142Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser His
5
<210> 143<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 143Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser Asn
5
<210> 144<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 144
Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser Tyr
5
<210> 145<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Thr His
5
<210> 146<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Thr Asn
5
<210> 147<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 147
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Lys Tyr
5
<210> 148<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 148
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Asn Tyr
5
<210> 149<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 149
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Ser Ser
5
<210> 150<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 150
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Ser Val
5
<210> 151<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Ser Tyr
5
<210> 152<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 152
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 153<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 153Ala Arg Trp Glu Ser Gly Leu Ser His
5
<210> 154<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 154
Ala Arg Trp Glu Ser Gly Leu Ser Val
5
<210> 155<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Asp Ser
5
<210> 156<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 156Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Glu Tyr
5
<210> 157<211> 9<212> PRT
<213> Rana catesbeiana
<4 00> 157Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Asp Phe
5
<210> 158<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 158
Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Asp Ser5
<210> 159<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 159
Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Glu Ser5
<210> 160<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 160
Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Ser Asp5
<210> 161<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 161
Ala Arg Trp Arg Ser Gly Leu Glu His5
<210> 162<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 162
Ala Arg Trp Ser Ser Gly Leu Asn Tyr5
<210> 163<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 163
Ala Arg Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr5
<210> 164<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 164Ala Arg Trp Thr Ser Gly Met Asp Ser
5
<210> 165<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 165Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 166<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 166Ala Arg Trp Asp Thr Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 167<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 167Ala Arg Trp Ala Ala Gly Leu Asp His
5
<210> 168<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 168
Ala Arg Trp Ala Ala Gly Leu Asp Ser
5
<210> 169<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 169Ala Arg Trp Leu Ala Gly Leu Ser Asn
5
<210> 170<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 170Ala Arg Trp Thr Ala Gly Leu Asp Gln
5
<210> 171<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 171Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp His
5
<210> 172<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 172Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Asn
5
<210> 173<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 173Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Ser
5
<210> 174<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 174
Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr
5
<210> 175<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 175Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Asp Thr
5
<210> 176<211> 9<212> PRT
<213> Rana catesbeiana
<400> 176Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Gly Pro
5
<210> 177<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 177Ala Arg Trp Met Ser Gly Leu Asp Ser
5
<210> 178<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 178Ala Arg Trp Arg Ser Gly Leu Glu Ser
5
<210> 179<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 179Ala Arg Trp Arg Ser Gly Leu Glu Tyr
5
<210> 180<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 180Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Ser
5
<210> 181<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 181
Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Thr
5
<210> 182<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 182
Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Val
5
<210> 183<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 183
Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr
5
<210> 184<211> 87<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 184
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg35 40 45
Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu50 55 60
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser80 85
<210> 185<211> 81<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 185
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser80
<210> 186<211> 80<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 186
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu
65 70 75
Val Thr Val Ser Ser80
<210> 187<211> 79<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 187
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 188<211> 87<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 188
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser20 25 30
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg35 40 45
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys50 55 60
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser80 85<210> 189<211> 81<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 189
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser80
<210> 190<211> 80<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 190
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu65 70 75
Val Thr Val Ser Ser80
<210> 191<211> 79<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 191
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro20 25 30Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 192<211> 79<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 192
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 193<211> 79<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val65 70 75
Thr Val Ser Ser<210> 194<211> 80<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 00> 194
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly20 25 30
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly35 40 45
Ser Gly Ser Gly Thr50
Pro Glu Asp Phe Ala65
Asp Phe Thr Leu Thr55
Thr Tyr Tyr Cys Phe70
Ile Ser Ser Leu Gln60
Gly Gln Gly Thr Lys75
Val Glu Ile Lys Arg80
<210> 195<211> 80<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 195
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro15 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly20 25 30
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val50 55 60
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys80
<210> 196<211> 80<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 196
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro15 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly20 25 30Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu50 55 60
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys80
<210> 197<211> 80<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 197
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly20 25 30
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu50 55 60
Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys80
<210> 198<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 198
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115
<210> 199
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 199
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser His95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115
<210> 200
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 200
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115
<210> 201<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 201
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115
<210> 202<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 202
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Ala Gly Leu Thr Tyr
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 203
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 203
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Thr Tyr
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 204
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 204
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Asp Ser
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 205
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 205
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Ser
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 206
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 206
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 207
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 207
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 208
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 208
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 209<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 209
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 210<211> 108<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 210
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu Ile His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 211<211> 108<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 211
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu Ile His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg

Claims (47)

1. ANTICORPO ISOLADO, caracterizado pelo fato de quecompreende três regiões hipervariáveis de cadeia leve (HVR-L1, HVR-L2 eHVR-L3) e três regiões hipervariáveis de cadeia pesada (HVR-H1, HVR-H2 eHVR-H3), em que:(a) HVR-L1 compreende a seqüência de aminoácidos de SEQID N0 119;(b) HVR-L2 compreende a seqüência de aminoácidos de umadas SEQ ID N0 120 a 121;(c) HVR-L3 compreende a seqüência de aminoácidos de SEQID N0 122;(d) HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos de SEQID N0 123;(e) HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácidos de umadas SEQ ID N0 124 a 127; e(f) HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos de umadas SEQ ID N0 128 a 183.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma seqüência deestrutura de consenso humano aceptora de VH de acordo com uma das SEQID N0 184 a 193.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma seqüência deestrutura de consenso humano aceptora de VL de acordo com uma das SEQID N0 194 a 197.
4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma seqüência deestrutura de consenso humano aceptora de VH de acordo com uma das SEQID N0 184 a 193 e uma seqüência de estrutura de consenso humano aceptorade VL de acordo com uma das SEQ ID N0 194 a 197.
5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo.
6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humanizado ou quimérico.
7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é conjugado a um agente inibidor docrescimento.
8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é conjugado a um agente citotóxico.
9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é selecionado a partir dogrupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimasnucleolíticas.
10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é uma toxina.
11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a toxina é selecionada a partir do grupo queconsiste de maitansinoide e caliqueamicina.
12. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a toxina é maitansinoide.
13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é produzido em bactéria.
14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é produzido em células de CHO.
15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que induz a morte de uma célula à qual se liga.
16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que que a mencionada célula é uma célula decâncer do ovário.
17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é marcado de forma detectável.
18. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de VH de SEQ ID N0-208.
19. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de VL de SEQ ID N0-211.
20. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de VH de SEQ ID N0-208 e a seqüência de VL de SEQ ID N0 211.
21. CONJUGADO DE DROGA E ANTICORPO, caracterizadopelo fato de que compreende um anticorpo ligado covalentemente por umIigante a uma ou mais porções de droga toxina, em que o composto possui afórmula:<formula>formula see original document page 398</formula>ou um de seus sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis, emque:Ab é um anticorpo conforme definido na reivindicação 1;L é um ligante;D é uma porção de droga toxina selecionada a partir de; eρ é 1 a cerca de 20.
22. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que Ab é 3A5 ou 11D10.
23. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que D é maitansinoide.
24. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que o maitansinoide é DM1.
25. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que D é uma auristatina.
26. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que a auristatina é MMAE ou MMAF.
27. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que L é MC-val-cit-PAB ou MC.
28. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que L é SMCC, SPP ou BMPEO.
29. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir da fórmula: Ab-MC-val-cit-PAB-MMAE, Ab-MC-val-cit-PAB-MMAF, Ab-MC-MMAE, Ab-MC-MMAF, Ab-SPP-DM1 e Ab-SMCC-DMI.
30. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que Ab é 3A5 ou 11D10.
31. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é ligado ao Iigante por meio de umacisteína tiol do anticorpo.
32. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fatode que compreende o conjugado de droga e anticorpo conforme descrito nareivindicação 21 e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamenteaceitável.
33. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um agente quimioterátipo selecionado a partir deletrozol, oxaliplatin, doxetaxel, 5-FU, leucovorin, lapatinib e gencitabina.
34. MÉTODO DE INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR,caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento de células de tumoresde mamíferos em um meio de cultivo celular com um composto conjugado dedroga e anticorpo conforme descrito na reivindicação 21, em que a proliferaçãodas células tumorosas é inibida.
35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que que as células de tumores de mamíferos são células de tumordo ovário.
36. MÉTODO DE TRATAMENTO DE CÂNCER, caracterizadopelo fato de que compreende a administração ao paciente de uma formulaçãofarmacêutica conforme descrita na reivindicação 32.
37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste decâncer da próstata, câncer do trato urinário, câncer pancreático, câncer dopulmão, câncer de mama, câncer do cólon e câncer do ovário.
38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o paciente recebe administração de um agente quimioterápicoem combinação com o composto conjugado de droga e anticorpo, em que oagente quimioterápico é selecionado a partir de letrozol, oxaliplatin, doxetaxel,-5-FU, leucovorin, Iapatinib e gencitabina.
39. TESTE DE DETECÇÃO DE CÉLULAS CANCEROSAS,caracterizado pelo fato de que compreende:(a) exposição de células a um composto conjugado de droga eanticorpo conforme descrito na reivindicação 21; e(b) determinação da extensão da ligação do compostoconjugado de droga e anticorpo às células.
40. TESTE, de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que as células são células de tumor da próstata, pâncreas,pulmão, mama, cólon ou ovário.
41. ARTIGO INDUSTRIALIZADO, caracterizado pelo fato deque compreende:um composto conjugado de droga e anticorpo conformedescrito na reivindicação 21;um recipiente; euma bula ou rótulo que indique que o composto pode serutilizado para o tratamento de câncer que sobre-expresse um polipeptideoassociado a tumor que compreende uma seqüência de aminoácidos que é 80%idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0 2.
42. ARTIGO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que o câncer é câncer da próstata, câncer do trato urinário, câncerpancreático, câncer do pulmão, câncer de mama, câncer do cólon ou câncer doovário.
43. USO DE UM COMPOSTO CONJUGADO DE DROGA EANTICORPO conforme descrito em uma das reivindicações 21 a 31,caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para inibir aproliferação de células de tumores de mamíferos.
44. USO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelofato de que as células de tumores de mamíferos são células de tumores doovário.
45. USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA conformedescrita na reivindicação 32, caracterizado pelo fato de ser na fabricação deum medicamento para tratar câncer.
46. USO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelofato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de câncer dapróstata, câncer do trato urinário, câncer pancreático, câncer do pulmão,câncer de mama, câncer do cólon e câncer do ovário.
47. USO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelofato de que se encontra em combinação com um agente quimioterapêuticoselecionado a partir de letrozol, oxaliplatin, doxetaxel, 5-FU, leucovorin,lapatinib e gencitabina.
BRPI0622254-4A 2005-06-20 2006-06-14 anticorpo isolado, conjugado de droga e anticorpo, formulação farmacêutica, método de inibição da proliferação celular, método de tratamento de cáncer, teste de detecção de células cancerosas, artigo industrializado, uso de um composto conjugado de droga e anticorpo e uso de uma formulação farmacêutica BRPI0622254A2 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69209205P 2005-06-20 2005-06-20
US79395106P 2006-04-21 2006-04-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0622254A2 true BRPI0622254A2 (pt) 2011-08-09

Family

ID=37595671

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0622254-4A BRPI0622254A2 (pt) 2005-06-20 2006-06-14 anticorpo isolado, conjugado de droga e anticorpo, formulação farmacêutica, método de inibição da proliferação celular, método de tratamento de cáncer, teste de detecção de células cancerosas, artigo industrializado, uso de um composto conjugado de droga e anticorpo e uso de uma formulação farmacêutica
BRPI0613382A BRPI0613382A8 (pt) 2005-06-20 2006-06-14 anticorpos isolados, anticorpo monoclonal, célula de hibridoma, método de identificação, método de inibição do crescimento de uma célula, método de tratamento terapêutico, método de determinação da presença de uma proteína, métodos de diagnósticos da presença de tumor

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0613382A BRPI0613382A8 (pt) 2005-06-20 2006-06-14 anticorpos isolados, anticorpo monoclonal, célula de hibridoma, método de identificação, método de inibição do crescimento de uma célula, método de tratamento terapêutico, método de determinação da presença de uma proteína, métodos de diagnósticos da presença de tumor

Country Status (23)

Country Link
US (8) US7989595B2 (pt)
EP (2) EP1910419A2 (pt)
JP (2) JP5196654B2 (pt)
KR (3) KR100970824B1 (pt)
CN (1) CN101948541B (pt)
AT (1) ATE523525T1 (pt)
AU (2) AU2006262603B2 (pt)
BR (2) BRPI0622254A2 (pt)
CA (1) CA2611778C (pt)
CR (2) CR9672A (pt)
DK (1) DK2135881T3 (pt)
EC (1) ECSP088122A (pt)
ES (1) ES2373080T3 (pt)
IL (1) IL187343A (pt)
MA (1) MA29615B1 (pt)
MX (1) MX2007016322A (pt)
NO (1) NO20080361L (pt)
NZ (2) NZ563370A (pt)
PL (1) PL2135881T3 (pt)
PT (1) PT2135881E (pt)
RU (2) RU2430112C2 (pt)
SG (1) SG155947A1 (pt)
WO (1) WO2007001851A2 (pt)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
US8288352B2 (en) 2004-11-12 2012-10-16 Seattle Genetics, Inc. Auristatins having an aminobenzoic acid unit at the N terminus
USRE47223E1 (en) 2005-06-20 2019-02-05 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
ES2708763T3 (es) 2005-07-07 2019-04-11 Seattle Genetics Inc Compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
NZ580043A (en) * 2007-03-02 2012-04-27 Boehringer Ingelheim Pharma Improvement of protein production through increased expression of mutated start domain protein cert
CL2008001334A1 (es) 2007-05-08 2008-09-22 Genentech Inc Anticuerpo anti-muc16 disenado con cisteina; conjugado que lo comprende; metodo de produccion; formulacion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar el cancer.
EP2176295B1 (en) 2007-07-16 2014-11-19 Genentech, Inc. Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
PE20090943A1 (es) 2007-07-16 2009-08-05 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados
KR101607346B1 (ko) 2008-01-31 2016-03-29 제넨테크, 인크. 항-ｃｄ７９ｂ 항체 및 면역접합체 및 사용 방법
PL2307458T3 (pl) * 2008-06-25 2018-08-31 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Humanizacja przeciwciał króliczych z zastosowaniem uniwersalnego zrębu przeciwciała
KR20210097819A (ko) * 2008-06-25 2021-08-09 노바르티스 아게 보편적 항체 프레임워크를 사용한 래빗 항체의 인간화
KR102050040B1 (ko) 2008-06-25 2019-11-28 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 ＴＮＦα를 저해하는 안정한 가용성 항체
AU2013203004C1 (en) * 2008-06-25 2022-01-20 Novartis Ag Humanization of rabbit antibodies using a universal antibody framework
AU2020201002B2 (en) * 2008-06-25 2022-04-07 Novartis Ag Humanization of rabbit antibodies using a universal antibody framework
CN103599541A (zh) 2008-09-10 2014-02-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于防止蛋白质氧化降解的组合物和方法
MA33208B1 (fr) 2009-03-25 2012-04-02 Genentech Inc Anticorps anti-fgfr3 et procédés d'utilisation de ceux-ci
RU2583270C2 (ru) * 2009-04-01 2016-05-10 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛА К FcRH5, ИХ ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
WO2010128032A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cho / cert cell lines
RU2559533C2 (ru) 2009-10-22 2015-08-10 Дженентек, Инк. Антитела против гепсина и способы их применения
CA3061784C (en) * 2009-11-13 2023-09-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions, kits, and methods for the diagnosis, prognosis, monitoring, treatment and modulation of post-transplant lymphoproliferative disorders and hypoxia associated angiogenesis disorders using galectin-1
PH12012500982A1 (en) * 2009-11-30 2019-07-10 Genentech Inc Antibodies for treating and diagnosing tumors expressing slc34a2 (tat211=seqid2)
EP2550018B1 (en) 2010-03-22 2019-02-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods useful for stabilizing protein-containing formulations
CA3255551A1 (en) * 2010-03-26 2025-04-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center MUC16 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
BR112012027828A2 (pt) 2010-05-03 2016-08-09 Genentech Inc composição de matéria, artigo de fabricação e método de redução da viscosidade de uma formulação contendo proteína e de preparação de uma formulação aquosa contendo proteína
SG186783A1 (en) 2010-06-24 2013-02-28 Genentech Inc Compositions and methods containing alkylgycosides for stabilizing protein- containing formulations
UY33679A (es) 2010-10-22 2012-03-30 Esbatech Anticuerpos estables y solubles
CN102585010A (zh) * 2011-01-16 2012-07-18 董贵俊 一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
WO2014089177A2 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines
JP6847388B2 (ja) * 2013-03-15 2021-03-31 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド 生物活性分子、そのコンジュゲート、及び治療用途
KR101502680B1 (ko) * 2013-04-01 2015-03-17 중앙대학교 산학협력단 난소과립종양세포 진단용 펩타이드 및 이의 용도
TWI725931B (zh) 2013-06-24 2021-05-01 美商建南德克公司 抗ｆｃｒｈ５抗體
BR112016002829A2 (pt) 2013-08-12 2017-09-19 Genentech Inc Composto e processo para preparar o composto de conjugado anticorpo-¿droga, composição farmacêutica, método de tratamento do câncer, kit para o tratamento do câncer, intermediário ligante¿-droga, porção e composto de porção droga de dímero cbi
EP3082876B1 (en) 2013-12-16 2018-01-17 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
JP6671292B2 (ja) 2013-12-16 2020-03-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
WO2015095227A2 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
IL263466B2 (en) 2013-12-17 2023-10-01 Genentech Inc Anti-CD3 antibodies and methods of using them
HUE049175T2 (hu) 2014-09-23 2020-09-28 Hoffmann La Roche Eljárás anti-CD79b immunkonjugátumok alkalmazására
CA2961439A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-fgfr2/3 antibodies and methods using same
CN105675735B (zh) * 2014-11-19 2018-07-17 上海市第六人民医院 乳腺癌诊断标记物组合、应用及其测定方法
AU2015358532C1 (en) 2014-12-03 2020-10-29 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
BR112017020149A8 (pt) 2015-03-27 2023-05-02 Regeneron Pharma Derivados de maitansinoide, conjugados dos mesmos e métodos de uso
CN108064246A (zh) 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物
DK3310814T5 (da) 2015-06-16 2024-10-07 Hoffmann La Roche Humaniserede og affinitetsmodnede antistoffer mod FcRH5 og fremgangsmåder til anvendelse
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
BR112018014759B1 (pt) 2016-01-25 2024-02-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Compostos derivados de maitasinoide e seus conjugados, composição compreendendo os mesmos, seus métodos de fabricação e uso
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
CN118436801A (zh) 2016-05-20 2024-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
JP2019524706A (ja) 2016-07-08 2019-09-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｍｕｃ１６陽性癌治療の応答性を評価するためのヒト精巣上体タンパク質４（ｈｅ４）の使用
AU2018217720A1 (en) * 2017-02-10 2019-09-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-factor D antibodies and uses thereof
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
WO2018237287A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Apexigen, Inc. Anti-vista antibodies and methods of use
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
WO2019084030A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Genentech, Inc. (4-HYDROXYPYRROLIDIN-2-YL) -HYDROXAMATE COMPOUNDS AND METHODS OF USE
WO2019084026A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Genentech, Inc. (4-HYDROXYPYRROLIDIN-2-YL) -HETEROCYCLIC COMPOUNDS AND METHODS OF USE
CN108181214B (zh) * 2018-02-09 2020-06-30 北京爱泰浦生物医药科技有限责任公司 使用atap肽治疗疾病的方法和组合物
WO2019183523A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Genentech, Inc. Hetero-bifunctional degrader compounds and their use as modulators of targeted ubiquination (vhl)
US11319380B2 (en) 2018-06-04 2022-05-03 Precigen, Inc. MUC16 specific chimeric antigen receptors and uses thereof
KR20210069048A (ko) 2018-08-30 2021-06-10 티씨알2 테라퓨틱스 인크. 융합 단백질을 이용하는 tcr 재프로그래밍을 위한 조성물 및 방법
WO2020055976A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Genentech, Inc. Tert-butyl (s)-2-(4-(phenyl)-6h-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a] [1,4]diazepin-6-yl) acetate derivatives and related compounds as bromodomain brd4 inhibitors for treating cancer
TWI856084B (zh) 2019-04-01 2024-09-21 美商建南德克公司 用於穩定含有蛋白質之配方之組合物及方法
CN109988086B (zh) * 2019-04-04 2021-06-18 三峡大学 一种小分子抑制剂azin30及其在制药中的应用
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
WO2022182415A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof
US12060148B2 (en) 2022-08-16 2024-08-13 Honeywell International Inc. Ground resonance detection and warning system and method
EP4615874A1 (en) 2022-11-10 2025-09-17 Immuvia Inc Cytotoxic bispecific antibodies binding to dr5 and muc16 and uses thereof
IL326412A (en) 2023-08-11 2026-04-01 Wuxi Biologics Ireland Ltd Anti-muc16 antibodies and uses thereof
TW202523694A (zh) 2023-11-17 2025-06-16 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司 抗muc16抗體及其用途

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9424449D0 (en) 1994-12-02 1995-01-18 Wellcome Found Antibodies
US6037454A (en) * 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
ATE297219T1 (de) * 1997-02-12 2005-06-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antikörper als arzneimittel gegen lymphocytische tumore (ausschliesslich myelome)
KR100816621B1 (ko) * 1997-04-07 2008-03-24 제넨테크, 인크. 항-ｖｅｇｆ 항체
US7083950B2 (en) 1998-09-25 2006-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity fusion proteins and therapeutic and diagnostic methods for use
US20020119158A1 (en) * 1998-12-17 2002-08-29 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030078399A1 (en) * 2001-05-11 2003-04-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, CA125, and uses thereof
US7803915B2 (en) * 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
CA2491017A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Immunogen, Inc. Antibodies to non-shed muc1 and muc16, and uses thereof
WO2004035537A2 (en) * 2002-10-16 2004-04-29 Euro-Celtique S.A. Antibodies that bind cell-associated ca 125/o772p and methods of use thereof
WO2004045553A2 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions
US7563869B2 (en) 2003-01-23 2009-07-21 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to human PD-1
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
AU2005214382B2 (en) 2004-02-19 2011-08-04 Genentech, Inc. CDR-repaired antibodies
JP4987698B2 (ja) 2005-03-31 2012-07-25 中外製薬株式会社 癌関連抗原アナログペプチド、およびその利用
AR059900A1 (es) 2006-03-17 2008-05-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados

Also Published As

Publication number Publication date
RU2009136946A (ru) 2011-04-20
IL187343A0 (en) 2008-04-13
CN101948541A (zh) 2011-01-19
RU2423382C1 (ru) 2011-07-10
US8449883B2 (en) 2013-05-28
US20160296634A1 (en) 2016-10-13
CN101948541B (zh) 2014-08-06
JP2012188449A (ja) 2012-10-04
KR101103108B1 (ko) 2012-01-04
BRPI0613382A2 (pt) 2010-06-29
SG155947A1 (en) 2009-10-29
AU2010251794A1 (en) 2011-01-13
MX2007016322A (es) 2008-04-07
CA2611778C (en) 2012-11-27
KR20090101980A (ko) 2009-09-29
CR20130455A (es) 2013-10-22
AU2006262603A1 (en) 2007-01-04
JP2008546780A (ja) 2008-12-25
US20140205616A1 (en) 2014-07-24
NO20080361L (no) 2008-03-25
CA2611778A1 (en) 2007-01-04
AU2006262603B2 (en) 2011-01-06
US20090041749A1 (en) 2009-02-12
ATE523525T1 (de) 2011-09-15
DK2135881T3 (da) 2011-12-05
JP5196654B2 (ja) 2013-05-15
US20120114673A1 (en) 2012-05-10
MA29615B1 (fr) 2008-07-01
IL187343A (en) 2012-02-29
KR20100084706A (ko) 2010-07-27
PL2135881T3 (pl) 2012-02-29
EP2135881B1 (en) 2011-09-07
EP1910419A2 (en) 2008-04-16
ES2373080T3 (es) 2012-01-31
PT2135881E (pt) 2011-12-21
RU2430112C2 (ru) 2011-09-27
US20140050744A1 (en) 2014-02-20
US20140314794A1 (en) 2014-10-23
WO2007001851A2 (en) 2007-01-04
KR20080017104A (ko) 2008-02-25
WO2007001851A3 (en) 2007-03-22
HK1134098A1 (en) 2010-04-16
EP2135881A1 (en) 2009-12-23
RU2008101365A (ru) 2009-07-27
US20110177103A1 (en) 2011-07-21
ECSP088122A (es) 2008-02-20
NZ563370A (en) 2010-10-29
KR100970824B1 (ko) 2010-07-16
CR9672A (es) 2008-07-31
US20180344864A1 (en) 2018-12-06
US7989595B2 (en) 2011-08-02
BRPI0613382A8 (pt) 2018-01-02
NZ583206A (en) 2011-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2611778C (en) Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US12583937B2 (en) Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20170129963A1 (en) Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
USRE47223E1 (en) Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
BRPI0609729A2 (pt) ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptìdeo, anticorpo, célula de hibridoma, e método de identificação de um anticorpo
CN101595130A (zh) 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
B03A Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B11B Dismissal acc. art. 36, par 1 of ipl - no reply within 90 days to fullfil the necessary requirements