ES2549769T3

ES2549769T3 - Anticuerpos anti-FGFR3 y métodos que emplean los mismos

Info

Publication number: ES2549769T3
Application number: ES10722819.9T
Authority: ES
Inventors: Avi Ashkenazi; Jing QING; Christian Wiesmann; Yan Wu
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2009-03-25
Filing date: 2010-03-24
Publication date: 2015-11-02
Anticipated expiration: 2030-03-24
Also published as: CA2754163C; EP2679600A1; US9161977B2; ES2932874T3; US10287356B2; BRPI1006448A2; HRP20221471T1; EP2411414B1; US8410250B2; JP5757534B2; LT3702371T; US20130046078A1; ZA201105574B; UA104459C2; CA2754163A1; US20100291114A1; SI3702371T1; DK2411414T3; DK3702371T5; IL250624A0

Abstract

Un anticuerpo anti-FGFR3 antagonista aislado, en donde el anticuerpo comprende HVR-L1 que comprende la secuencia RASQDVDTSLA (SEQ ID NO: 87), HVR-L2 que comprende la secuencia SASFLYS (SEQ ID NO: 88), HVR-L3 que comprende la secuencia QQSTGHPQT (SEQ ID NO: 89), HVR-H1 que comprende la secuencia GFTFTSTGIS (SEQ ID NO: 84), HVR-H2 que comprende la secuencia GRIYPTSGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 85), y HVR-H3 que comprende la secuencia ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY (SEQ ID NO: 86).

Description

Anticuerpos anti-FGFR3 y métodos que emplean los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos anti-FGFR3 y a usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) y sus receptores (FGFR) tienen funciones críticas durante el desarrollo embrionario, homeostasia de tejidos y metabolismo (1-3). En seres humanos, hay 22 FGF (FGF1-14, FGF16-23) y cuatro receptores de FGF con dominio de tirosina quinasa (FGFR1-4). Los FGFR consisten en una región de unión de ligando extracelular, con dos o tres dominios de tipo inmunoglobulina (IgD1-3), una región de transmembrana de paso único, y un dominio de tirosina quinasa dividido, citoplasmático. Los FGFR 1, 2 y 3 tienen cada uno dos isoformas principales empalmadas de forma alternativa, denominadas IIIb y IIIc. Estas isoformas difieren en aproximadamente 50 aminoácidos en la segunda mitad de IgD3 y tienen distinta distribución tisular y especificidad de ligando. En general, la isoforma IIIb se encuentra en células epiteliales, mientras que IIIc se expresa en células mesenquimales. Tras la unión del FGF coordinado con proteoglicanos de heparán sulfato, los FGFR dimerizan y quedan fosforilados en restos de tirosina específicos. Esto facilita el reclutamiento de proteínas adaptadoras críticas, tales como el sustrato 2 α de FGFR (FRS2α), que conduce a la activación de múltiples cascadas de señalización, incluyendo la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y rutas PI3K-AKT (1, 3, 4). Por consiguiente, los FGF y sus receptores cognados regulan una amplia variedad de procesos celulares, incluyendo la proliferación, diferenciación, migración y supervivencia, de una forma dependiente del contexto.

Los FGFR activados de forma aberrante se han implicado en tumores malignos humanos específicos. En particular, se producen translocaciones cromosómicas t(4;14) (p16.3;q32) en aproximadamente 15-20% de los pacientes de mieloma múltiple, que conducen a la expresión en exceso de FGFR3 y se correlaciona con la supervivencia en general más corta (6-9). El FGFR3 está implicado también en conferir quimiorresistencia a líneas celulares de mieloma en cultivo (10), consistente con la poca respuesta clínica de pacientes t(4;14)+ a la quimioterapia convencional (8). La expresión en exceso de FGFR3 activado mutacionalmente es suficiente para inducir la transformación oncogénica en células hematopoyéticas y fibroblastos (11-14, 15), modelos de ratón transgénico (16) y modelos de trasplante murino de médula ósea (16, 17). Por consiguiente, se ha propuesto el FGFR3 como una potencial diana terapéutica en el mieloma múltiple. De hecho, varias moléculas pequeñas inhibidoras que se dirigen a los FGFR, aunque no selectivas para FGFR3 y que tienen actividad inhibidora cruzada hacia otras quinasas, han demostrado citotoxicidad contra células de mieloma positivas para FGFR3 en cultivo y en modelos de ratón (18, 22).

El exceso de expresión de FGFR3 se ha documentado también en una fracción alta de cánceres de vejiga (23, 24). Además, se han identificado mutaciones activantes somáticas en FGFR3 en 60-70% de los carcinomas papilares y 26-20% de carcinomas de vejiga músculo invasivo (24, 25). En experimentos de cultivo celular, el ARN de interferencia (11, 26) o un fragmento de anticuerpo Fv de cadena sencilla de FGFR3, inhibían la proliferación celular en el cáncer de vejiga (27). Un estudio reciente demostró que un conjugado de anticuerpo de FGFR3-toxina atenúa el crecimiento de xenoinjerto de una línea celular de cáncer de vejiga a través de suministro de toxina mediado por FGFR3 en tumores (28). Sin embargo, no queda claro si la señalización de FGFR3 es realmente un director oncogénico de crecimiento de tumores de vejiga in vivo. Además, el potencial terapéutico para dirigirse a FGFR3 en el cáncer de vejiga todavía no se ha definido en una base de modelos vivos. Las publicaciones que se refieren a FGFR3 y anticuerpos anti-FGFR3 incluyen la publicación de patente de EE.UU. nº 2005/0147612; Rauchenberger et al., J Biol Chem 278 (40):38194-38205 (2003); documento WO2006/048877; Martinez-Torrecuadrada et al., (2008) Mol Cancer Ther 7(4): 862-873; documento WO2007/144893; Trudel et al. (2006) 107(10): 4039-4046; Martinez-Torrecuadrada et al (2005) Clin Cancer Res 11 (17): 6280-6290; Gomez-Roman et al (2005) Clin Cancer Res 11:459-465; Direnzo, R et al. (2007) Proceedings of AACR Annual Meeting, Abstract No. 2080; documento WO2010/002862, Trudel et al (2004), Blood, vol.204, NO.11. parte 1. Página 680A.

Está claro que siguen siendo necesarios agentes que tengan atributos clínicos que sean óptimos para el desarrollo como agentes terapéuticos. La invención descrita en la presente memoria cumple esta necesidad y proporciona otros beneficios.

Resumen de lainvención

La invención se basa en parte en la identificación de una variedad de agentes de unión al FGFR3 (tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos). El FGFR3 presenta un diana terapéutica importante y ventajosa, y la invención proporciona composiciones y métodos basados en la unión de los agentes al FGFR3. Los agentes de unión al FGFR3 de la invención, como se describe en la presente memoria, proporcionan importantes agentes terapéuticos y de diagnóstico para usar para dirigirse a afecciones patológicas asociadas con la expresión y/o actividad de las rutas de señalización de FGFR3. Por consiguiente, la invención se refiere a métodos, composiciones, kits y artículos de fabricación relacionados con la unión al FGFR3.

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen al FGFR3, como se define en las reivindicaciones. En un aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado que se une a un FGFR3. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a una isoforma IIIb de FGFR3 y/o una isoforma IIIc de FGFR3. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un FGFR3 mutado (p. ej., uno o más de FGFR3 IIIb R248C, S249C, G372C, Y375C, K652E, y/o uno o más de FGFR3 IIIc R248C, S249C, G370C, Y373C, K650E). En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a FGFR3 monómero (p. ej., isoformas monómeras IIIb y/o IIIc de FGFR3). En algunas realizaciones, el anticuerpo promueve la formación de FGFR3 monómero, tal como estabilizando la forma monómera de FGFR3 con respecto a la forma dímera de FGFR3.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR3 aislado, en donde una forma de IgG de longitud entera del anticuerpo se une al FGFR3 humano con una Kd de 1 x 10-7 o más fuerte. Como está bien establecido en la técnica, la afinidad de unión de un ligando a su receptor se puede determinar usando una variedad de ensayos, y expresar en términos de una variedad de valores cuantitativos. Por consiguiente, la afinidad de unión se puede expresar como valores Kd que reflejan la afinidad de unión intrínseca (p. ej., con efectos de avidez minimizados). En general y preferiblemente, la afinidad de unión se mide in vitro, sea en un contexto exento de células o asociado a células. Se puede usar cualquiera de una serie de ensayos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la presente memoria, para obtener mediciones de afinidad de unión, incluyendo, por ejemplo, Biacore, radioinmunoensayo (RIA), y ELISA. En algunas realizaciones, la forma de IgG de longitud entera del anticuerpo se une al FGFR3 humano con una Kd de 1 x 10-8 o más fuerte, con una Kd de 1 x 10-9 o más fuerte, o con una Kd de 1 x 10-10 o más fuerte.

Los anticuerpos anti-FGFR3 de la presente invención son anticuerpos antagonistas. Por lo tanto, en un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben la actividad de FGFR3 (p. ej., la actividad de FGFR3-IIIb y/o FGFR3-IIIc). El anticuerpo anti-FGFR3 (en general en forma bivalente) no tiene función agonista de FGFR3 sustancial.

El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista (en general en forma bivalente) tiene poca o no tiene función de agonista de FGFR3. El anticuerpo de la invención (en general en forma bivalente) no presenta un nivel de actividad agonista de FGFR3 por encima del nivel base que tenga significación estadística.

En un aspecto, la unión del anticuerpo a un FGFR3 inhibe la dimerización del receptor con otra unidad del receptor, de modo que se inhibe la activación del receptor (debida al menos en parte, a la falta de dimerización del receptor). La inhibición puede ser directa o indirecta.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-FGFR3 que no tienen actividad apoptótica sustancial (p. ej., no inducen la apoptosis de una célula, p. ej., una célula de carcinoma de células transicionales, o una célula de mieloma múltiple, tal como una célula de mieloma múltiple que comprende una translocación de FGFR3, tal como una translocación t(4;14)). En algunas realizaciones, los anticuerpos de FGFR3 no presentan función apoptótica que esté por encima del nivel base, es decir, de significación estadística.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-FGFR3 que no inducen regulación por disminución de FGFR3 sustancial. El anticuerpo anti-FGFR3 induce poca o no induce regulación por disminución del receptor. Los anticuerpos anti-FGFR3 no inducen regulación por disminución del receptor que esté por encima del nivel base, es decir, de significación estadística.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-FGFR3 que tienen función efectora. En una realización, la función efectora comprende citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC). En una realización, el anticuerpo anti-FGFR3 (un anticuerpo anti-FGFR3 desnudo) es capaz de matar una célula, en algunas realizaciones, una célula de mieloma múltiple (p. ej., células de mieloma múltiple que comprenden una translocación,

p. ej., una translocación t(4;14)). El anticuerpo anti-FGFR3 es capaz de matar una célula que expresa aproximadamente 10.000 moléculas de FGFR3 por célula o más (tal como aproximadamente 11.000, aproximadamente 12.000, aproximadamente 13.000, aproximadamente 14.000, aproximadamente 15.000, aproximadamente 16.000, aproximadamente 17.000, aproximadamente 18.000 o más moléculas de FGFR3 por célula). Alternativamente, la célula puede expresar aproximadamente 2000, aproximadamente 3000, aproximadamente 4000, aproximadamente 5000, aproximadamente 6000, aproximadamente 7000, aproximadamente 8000, o más moléculas de FGFR3 por célula.

En un aspecto, el anticuerpo anti-FGFR3 de la invención inhibe la actividad de FGFR3 constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad de FGFR3 constitutiva es la actividad constitutiva de FGFR3 dependiente de ligando. En algunas realizaciones, la actividad de FGFR3 constitutiva es actividad de FGFR3 constitutiva independiente de ligando.

En un aspecto, al anticuerpo anti-FGFR3 inhibe el FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-

IIIbR248C

. Como se usa en la presente memoria, la expresión "que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbR248C" se entiende que abarca FGFR3-IIIbR248C y FGFR3-IIIcR248C, así como formas adicionales de FGFR3 que comprenden una mutación de R a C en una posición que corresponde a R248 de FGFR3-IIIb. Un experto en la técnica entiende cómo alinear secuencias de FGFR3 con el fin de identificar los restos correspondientes entre las respectivas secuencias de FGFR3, p. ej., alineando una secuencia de FGFR3-IIIc con una secuencia de FGFR3-IIIb

para identificar la posición en FGFR3 que corresponde a la posición R248 en FGFR3-IIIb.

El anticuerpo anti-FGFR3 puede inhibir FGFR3-IIIbR248C y/o FGFR3-IIIcR248C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbK652E. Por conveniencia, la expresión "que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbK652E" se entiende que abarca FGFR3-IIIbK652E y FGFR3-IIIcK650E, así como formas adicionales de FGFR3 que comprenden una mutación de K a E en una posición que corresponde a K652 de FGFR3-IIIb. Un experto en la técnica entiende cómo alinear secuencias de FGFR3 con el fin de identificar los restos correspondientes entre las respectivas secuencias de FGFR3, p. ej., alineando una secuencia de FGFR3-IIIc con una secuencia de FGFR3-IIIb para identificar la posición en FGFR3 que corresponde a la posición K652 en FGFR3-IIIb.

El anticuerpo anti-FGFR3 puede inhibir FGFR3-IIIbK652E y/o FGFR3-IIIcK650E.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbS249C. Por conveniencia, la expresión "que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbS249c" se entiende que abarca FGFR3-IIIbS249C y FGFR3-IIIcS249C, así como formas adicionales de FGFR3 que comprenden una mutación de S a C en una posición que corresponde a S249 de FGFR3-IIIb. El anticuerpo anti-FGFR3 puede inhibir FGFR3-IIIbS249C y/o FGFR3-IIIcS249C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbG372C. Por conveniencia, la expresión "que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbG372C" se entiende que abarca FGFR3-IIIbG372C y FGFR3-IIIcG370C, así como formas adicionales de FGFR3 que comprenden una mutación de G a C en una posición que corresponde a G372 de FGFR3-IIIb. El anticuerpo anti-FGFR3 puede inhibir FGFR3-IIIbG372C y/o FGFR3-IIIcG370C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbY375C. Por conveniencia, la expresión "que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbY375C" se entiende que abarca FGFR3-IIIY375C y FGFR3-IIIcY373C, así como formas adicionales de FGFR3 que comprenden una mutación de S a C en una posición que corresponde a S249 de FGFR3-IIIb. El anticuerpo anti-FGFR3 puede inhibir FGFR3-IIIbY375C y/o FGFR3-IIIcY373C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben (a) FGFR3-IIIbK652E y (b) uno o más de FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3 -IIIbS249C, y FGFR3IIIbG372C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben (a) FGFR3-IIIcK650E y (b) uno o más de FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, y FGFR3IIIcG370C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben (a) FGFR3-IIIbR248C y (b) uno o más de FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, y FGFR3-IIIbG372C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben (a) FGFR3-IIIcR248C y (b) uno o más de FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, y FGFR3-IIIcG370C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben (a) FGFR3-IIIbG372C y (b) uno o más de FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, y FGFR3-IIIbR248C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben (a) FGFR3-IIIcG370C y (b) uno o más de FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, y FGFR3-IIIcR248C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, y FGFR3-IIIbG372C.

En un aspecto, los anticuerpos anti-FGFR3 inhiben FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIY373C, FGFR3-IIIcS249C, y FGFR3-IIIcG370C.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR3 que comprende las secuencias de la región hipervariable (HVR):

(i): HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A11, en donde A1-A11 es RASQDVDTSLA (SEQ ID NO: 87),

(ii): HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, en donde B1-B7 es SASFLYS (SEQ ID NO: 88),

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, en donde C1-C9 es QQSTGHPQT (SEQ ID NO: 89),

(iv): HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, en donde D1-D10 es GFTFTSTGIS (SEQ ID NO: 84),

(v): HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, en donde E1-E18 es GRIYPTSGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 85), y

(vi) HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F20, en donde F1-F20 es ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY (SEQ ID NO: 86).

Un anticuerpo anti-FGFR3 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, donde cada una, en orden, comprende la SEQ ID NO: 84, 85, 86, y/o una región variable de la cadena 5 ligera que comprende HVR-L1, HVR-L2, y HVR-L3, donde cada una, en orden, comprende la SEQ ID NO: 87, 88,

89.

Las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-18, 48-131 y 140-145 están numeradas con respecto a la HVR individual (es decir, H1, H2 o H3) como se indica en la figura 1, estando de acuerdo la numeración con el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante.

10 En otro aspecto, un anticuerpo anti-FGFR3 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 132 y una región variable de la cadena ligera

En otro aspecto, un anticuerpo anti-FGFR3 comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 133, y una región variable de la cadena pesada.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-FGFR3 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la 15 SEQ ID NO: 132 y una región variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 133.

Algunos anticuerpos descritos en la presente memoria comprenden un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 4D5 humanizado (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE.UU.) (al que también se refiere la patente de EE.UU. nº 6.407.213 y Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093) como se representa en la SEQ ID NO: 173 a continuación.

(los restos de HVR están subrayados)

La secuencia del dominio variable de la cadena ligera de huMAb4D5 se puede modificar en una o más de las posiciones 30, 66, y 91 (Asn, Arg, e His como se indica antes en negrilla/itálica, respectivamente). En un ejemplo particular, la secuencia de huMAb4D5-8 modificada comprende Ser en la posición 30, Gly en la posición 66, y/o Ser

25 en la posición 91. Por consiguiente, en una realización un anticuerpo puede comprender un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada en la SEQ ID NO: 174 a continuación:

(los restos de HVR están subrayados) Los restos sustituidos con respecto a huMAb4D5 están indicados en negrilla/itálica. 30 Los anticuerpos pueden comprender cualquier secuencia de dominio variable de región armazón adecuada, con la condición de que se retenga sustancialmente la actividad del FGFR3. Por ejemplo, los anticuerpos pueden

comprender una secuencia consenso de la región armazón de la cadena pesada del subgrupo III humano. En un ejemplo de estos anticuerpos, la secuencia consenso de la región armazón comprende una sustitución en la posición 71, 73 y/o 78. En algunos ejemplos de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En un ejemplo, estos anticuerpos comprenden secuencias de la región armazón del dominio variable de la cadena pesada de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE.UU.) (también se hace referencia en las patentes de EE.UU. nº 6.407.213 y 5.821.337, y Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093). En un ejemplo, estos anticuerpos comprenden además una secuencia consenso de la región armazón de la cadena ligera κI humana. En un ejemplo particular, estos anticuerpos comprenden las secuencias HVR de la cadena ligera de huMAb4D5-8 como se describe en las patente de EE.UU. nº 6.407.213 y 5.821.337). En un ejemplo, esos anticuerpos comprenden secuencias del dominio variable de la cadena ligera de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE.UU.) también se hace referencia en las patentes de EE.UU. nº

6.407.213 y 5.821.337, y Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093).

Un anticuerpo puede comprender un dominio variable de la cadena pesada, donde la secuencia de la región armazón comprende las secuencias de SEQ ID NO: 19 y 203-205, 20 y 206-208, 21 y 209-211, 22 y 212-214 , 23 y 215-217, 24 y 218-220, 25 y 221-223, 26 y 224-226, 27 y 227-229, 28 y 230-232, 29 y 233-235, 30 y 236-238, 31 y 239-241, 32 y 242-244, 33 y 245-247, 34 y 248-250, 35 y 251-253, 36 y 254-256, y/o 37 y 257-259, y las secuencias de la HVR H1, H2, y H3 tienen las SEQ ID NO: 13, 14 y/o 15, respectivamente. En otro ejemplo, la secuencia armazón comprende las secuencias de SEQ ID NO: 19 y 203-205, 20 y 206-208, 21 y 209-211, 22 y 212-214, 23 y 215-217, 24 y 218-220, 25 y 221-223, 26 y 224-226, 27 y 227-229, 28 y 230-232, 29 y 233-235, 30 y 236-238, 31 y 239-241, 32 y 242-244, 33 y 245-247, 34 y 248-250, 35 y 251-253, 36 y 254-256, y/o 37 y 257-259, y las secuencias de la HVR H1, H2, y H3 tienen las SEQ ID NO: 48, 49 y/o 50, respectivamente. En otro ejemplo más, la secuencia armazón comprende las secuencias de SEQ ID NO: 19 y 203-205, 20 y 206-208, 21 y 209-211, 22 y 212-214 , 23 y 215-217, 24 y 218-220, 25 y 221-223, 26 y 224-226, 27 y 227-229, 28 y 230-232, 29 y 233-235, 30 y 236-238, 31 y 239-241, 32 y 242-244, 33 y 245-247, 34 y 248-250, 35 y 251-253, 36 y 254-256, y/o 37 y 257-259, y las secuencias de HVR H1, H2, y H3 tienen las SEQ ID NO: 84, 85, y/o 86, respectivamente. En un ejemplo adicional, la secuencia armazón comprende las secuencias de SEQ ID NO: 19 y 203-205, 20 y 206-208, 21 y 209-211, 22 y 212-214 , 23 y 215-217, 24 y 218-220, 25 y 221-223, 26 y 224-226, 27 y 227-229, 28 y 230-232, 29 y 233-235, 30 y 236-238, 31 y 239-241, 32 y 242-244, 33 y 245-247, 34 y 248-250, 35 y 251-253, 36 y 254-256, y/o 37 y 257-259, y las secuencias de la HVR H1, H2, y H3 tienen las SEQ ID NO: 108, 109, y/o 110, respectivamente.

En un ejemplo particular, un anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera, en donde la secuencia armazón comprende las secuencias de SEQ ID NO: 38 y 260-262, 39 y 263-265, 40 y 266-268, y/o 41 y 269-271, y las secuencias de la HVR L1, L2, y L3 tienen las SEQ ID NO: 16, 17, y/o 18, respectivamente. En otro ejemplo, un anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera, en donde la secuencia armazón comprende las secuencias de SEQ ID NO: 38 y 260-262, 39 y 263-265, 40 y 266-268, y/o 41 y 269-271, y las secuencias de la HVR L1, L2, y L3 tienen las SEQ ID NO: 51, 52 y/o 53, respectivamente. En un ejemplo adicional, un anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera, en donde la secuencia armazón comprende las secuencias de SEQ ID NO: 38 y 260-262, 39 y 263-265, 40 y 266-268, y/o 41 y 269-271, y las secuencias de la HVR L1, L2, y L3 tienen las SEQ ID NO: 87, 88 y/o 89, respectivamente. En otro ejemplo más, un anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera, en donde la secuencia armazón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 38 y 260-262, 39 y 263-265, 40 y 266-268, y/o 41 y 269-271, y las secuencias de la HVR L1, L2, y L3 tienen las SEQ ID NO: 111, 112, y/o 113, respectivamente.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 132 y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 133.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR3 que se une a un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos: LAVPAANTVRFRCPA (SEQ ID NO: 179) y/o SDVEFHCKVYSDAQP (SEQ ID NO: 180).

El anticuerpo se puede unir a un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en los números de aminoácidos 164-178 y/o 269-283 de la secuencia de aminoácidos de FGFR3 humano madura.

En una realización, un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención se une específicamente a una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidad de secuencia o similitud con la secuencia LAVPAANTVRFRCPA (SEQ ID NO: 179) y/o SDVEFHCKVYSDAQP (SEQ ID NO: 180).

En un aspecto, al anticuerpo anti-FGFR3 de la presente invención se une a al menos 1, 2, 3, 4 o cualquier número de hasta todos los restos 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 y/o 318 del polipéptido de FGFR3 IIIb, o restos equivalentes del polipéptido de FGFR3 IIIc. Un experto en la técnica entiende cómo alinear secuencias de FGFR3 con el fin de identificar los restos correspondientes entre las respectivas secuencias de FGFR3. Las combinaciones de dos o más restos pueden incluir cualquiera de los restos 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 y/o 318 del

polipéptido de FGFR3 IIIb, o restos equivalentes del polipéptido de FGFR3 IIIc. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFR3 se une a al menos 1, 2, 3, 4 o cualquier número de hasta todos los restos 158, 159, 169, 170, 171, 173, 175, 205, 207, y/o 315 del polipéptido de FGFR3 IIIb, o restos equivalentes del polipéptido de FGFR3 IIIc. En algunas realizaciones, al anticuerpo anti-FGFR3 se une a al menos 1, 2, 3, 4 o cualquier número de hasta todos los restos 158, 170, 171, 173, 175, y/o 315 del polipéptido de FGFR3 IIIb, o restos equivalentes del polipéptido de FGFR3 IIIc.

Como se conoce en la técnica, y se describe con mayor detalle en lo sucesivo, la posición/límite del aminoácido que delinea una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y de varias definiciones conocidas en la técnica (como se describen más adelante). Algunas posiciones dentro de un dominio variable se pueden ver como posiciones hipervariables híbridas, en cuanto que se puede considerar que estas posiciones están dentro de una región hipervariable bajo un conjunto de criterios, mientras que se considera que están fuera de una región hipervariable bajo un conjunto diferente de criterios. Una o más de estas posiciones también se pueden encontrar en regiones hipervariables extendidas (como se define con más detalle más adelante).

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de afinidad madurada, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo puede ser Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, o scFv.

El anticuerpo de FGFR3 puede ser un anticuerpo de un solo brazo (es decir, el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera forman un solo brazo de unión al antígeno) que comprende una región Fc, en donde la región Fc comprende un primer y un segundo polipéptido de Fc, en donde el primer y segundo polipéptidos de Fc están presentes en un complejo y forman una región Fc que aumenta la estabilidad de dicho fragmento de anticuerpo comparado con una molécula Fab que comprende dicho brazo de unión al antígeno. Véase, p. ej., el documento WO2006/015371.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, por ejemplo, un anticuerpo que comprende secuencias de unión al antígeno de un donador no humano injertadas en una secuencia no humana, humana o humanizada heteróloga (p. ej., secuencias de región armazón y/o dominio constante). En una realización, el donador no humano es un ratón. En una realización adicional, la secuencia de unión al antígeno es sintética, p. ej., obtenida por mutagénesis (p. ej., cribado por presentación en fagos, etc.). En una realización particular, un anticuerpo quimérico de la invención tiene regiones V murinas y una región C humana. En una realización, la región V de la cadena ligera murina está fusionada con una cadena ligera kappa humana. En otra realización, la región V de la cadena pesada murina está fusionara con una región C de IgG1 humana.

Los anticuerpos humanizados de la invención incluyen los que tienen sustituciones de aminoácidos en la región armazón (FR) y variantes de maduración de la afinidad con cambios en las CDR injertadas. Los aminoácidos sustituidos en la CDR o FR no están limitados a los presentes en el anticuerpo donador o receptor. Los anticuerpos pueden comprender además cambios en restos de aminoácidos en la región Fc que conducen a una función efectora mejorada incluyendo función de CDC y/o ADCC y muerte de linfocitos B potenciadas. Otros anticuerpos de la invención incluyen los que tienen cambios específicos que mejoran la estabilidad. Los anticuerpos pueden comprender cambios en los restos de aminoácidos en la región Fc que conducen a una función efectora disminuida,

p. ej., función de CDC y/o ADCC y muerte de linfocitos B potenciadas. Los anticuerpos se pueden caracterizar por la unión disminuida (tal como ausencia de unión) al factor de complemento humano C1q y/o receptor de Fc humano en linfocitos citolíticos naturales (NK). El anticuerpo se puede caracterizar por la unión disminuida (tal como la ausencia de unión) a FcγRI, FcγRIIA, y/o FcγRIIIA. Los anticuerpos pueden ser de clase de IgG (p. ej., IgG1 o IgG4) y comprenden al menos una mutación en E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331, y/o P329 (numeración de acuerdo con índice EU). Los anticuerpos pueden comprender las mutaciones L234A/L235A o D265A/N297A.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el hidrato de carbono unido al mismo se puede alterar. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura madura de hidrato de carbono que carecen de fucosa unida a una región Fc del anticuerpo, se describen en la solicitud de patente de EE.UU. nº US 2003/0157108 (Presta, L.). Véase también el documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GlcNAc) que biseca en el hidrato de carbono unido a una región Fc del anticuerpo se citan en el documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. y la patente de EE.UU. nº 6.602.684, Umana et al. Los anticuerpos con al menos un resto de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fc del anticuerpo se describen en el documento WO 1997/30087, Patel et al. Véase, también los documentos WO 1998/58964 (Raju, S.) y WO 1999/22764 (Raju, S.) en relación con anticuerpos con el hidrato de carbono alterado unido a su región Fc. Véase también, el documento US 2005/0123546 (Umana et al.) sobre moléculas que se unen al antígeno con glicosilación modificada. En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos que se unen al FGFR3 que comprenden cualquiera de las secuencias de unión al antígeno proporcionadas en la presente memoria, en donde, los polipéptidos que se unen al FGFR3 se unen específicamente a un FGFR3, p. ej., un FGFR3 humano y/o de mono y/o de ratón.

Los anticuerpos de la invención se unen (tal como unidos específicamente) al FGFR3 (p. ej., FGFR3-IIIb y/o FGFR3

IIIc), y modulan (p. ej., inhiben) uno o más aspectos de la señalización del FGFR3 (tal como la fosforilación de FGFR3) y/o la alteración de cualquier ruta biológica del FGFR3 y/o ligando del FGFR3 biológicamente relevante, y/o el tratamiento y/o la prevención de un tumor, trastorno proliferativo celular o un cáncer, y/o el tratamiento o prevención de un trastorno asociado con la expresión y/o actividad del FGFR3 (tal como expresión y/o actividad del FGFR3 aumentada), como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo de FGFR3 se une específicamente a un polipéptido que consiste o consiste esencialmente en un FGFR3 (p. ej., un FGFR3 humano o de ratón). En algunas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente al FGFR3 con una Kd de 1 x 10-7 M o más fuerte.

El anticuerpo anti-FGFR3 de la invención no es un anticuerpo anti-FGFR3 descrito en la publicación de patente de EE.UU. nº 2005/0147612 (p. ej., anticuerpo MSPRO2, MSPRO12 MSPRO59, MSPRO11, MSPRO21, MSPRO24, MSPRO26, MSPRO28, MSPRO29, MSPRO43, MSPRO55), anticuerpo descrito en Rauchenberger et al., J Biol Chem 278 (40):38194-38205 (2003); un anticuerpo descrito en la publicación PCR nº WO2006/048877 (p. ej., anticuerpo PRO-001), un anticuerpo descrito en Martinez-Torrecuadrada et al., Mol Cancer Ther (2008) 7(4): 862873 (p. ej., scFvαFGFR3 3C), un anticuerpo descrito en Direnzo, R et al (2007) Proceedings of AACR Annual Meeting, Abstract Nº 2080 (p. ej., D11), o un anticuerpo descrito en el documento WO 2010/002862 (p. ej., anticuerpos 15D8, 27H2, 4E7, 2G4, 20B4).

En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de la invención y un vehículo como se define en las reivindicaciones. En una realización, el vehículo es farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de FGFR3 de la invención como se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto más, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención como se define en las reivindicaciones.

También se describen en la presente memoria, composiciones que comprenden uno o más ácidos nucleicos de la invención y un vehículo. El vehículo puede ser farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la invención proporciona células hospedantes que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención, como se define en las reivindicaciones. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, un vector recombinante tal como un vector de expresión. Se puede usar cualquiera de una variedad de células hospedantes. En un ejemplo, una célula hospedantes es una célula procariota, por ejemplo, E. coli. En otro ejemplo, una célula hospedante es una célula eucariota, por ejemplo una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO).

En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para hacer un anticuerpo de la invención, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para hacer un anticuerpo anti-FGFR3 (que, como se define en la presente memoria, incluye el anticuerpo de longitud completa y fragmentos del mismo), comprendiendo dicho método expresar en una célula hospedante adecuada un vector recombinante de la invención que codifica el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo. En algunas realizaciones, el método comprende cultivar una célula hospedante que comprende el ácido nucleico que codifica el anticuerpo, de modo que el ácido nucleico sea expresado. En algunas realizaciones, el método comprende además combinar el anticuerpo recuperado con un vehículo, excipiente, o vehículo para preparar una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado.

También se describe en la presente memoria un artículo de fabricación que comprende un envase; y una composición contenida en el envase, en donde la composición comprende uno o más anticuerpos de FGFR3 de la invención. La composición puede comprender un ácido nucleico de la invención. Una composición que comprende un anticuerpo puede comprender además un vehículo, que en algunos casos es farmacéuticamente aceptable. Un artículo de fabricación comprende además instrucciones para administrar la composición (p. ej., el anticuerpo) a un individuo (tal como instrucciones para cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria).

También se describe en la presente memoria un kit que comprende un primer envase que comprende una composición que comprende uno o más anticuerpos anti-FGFR3 de la invención; y un segundo envase que contiene un tampón. El tampón puede ser farmacéuticamente aceptable. Una composición que comprende un anticuerpo puede comprender además un vehículo, que en algunas realizaciones es farmacéuticamente aceptable. Un kit puede comprender además instrucciones para administra la composición (p. ej., el anticuerpo) a un individuo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención para usar como un medicamento como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención para usar en el tratamiento o prevención de un trastorno, tal como una afección patológica asociada con la activación y/o expresión de FGFR3 (en algunas realizaciones, la expresión en exceso como se define en las reivindicaciones). En algunas realizaciones, el trastorno es un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular es el mieloma

múltiple o cáncer de vejiga (p. ej. carcinoma de células transicionales), cáncer de mama o cáncer de hígado.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención para usar en el tratamiento o prevención de un trastorno tal como un trastorno esquelético, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el trastorno es acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica (TD; formas clínicas TDI y TDII), o síndrome de craneosinostosis.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención para usar para reducir la proliferación celular como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención para usar para matar una célula. En algunas realizaciones, la célula es una célula de mieloma múltiple. En algunas realizaciones, la célula muere por ADCC. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo desnudo. En algunas realizaciones, la célula expresa en exceso el FGFR3.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención para usar para reducir drásticamente células, tales como células de mieloma múltiple, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la célula muere por ADCC. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo desnudo. En algunas realizaciones, la célula expresa en exceso el FGFR3.

Se describe en la presente memoria el uso de un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como una afección patológica asociada con la activación y/o expresión de FGFR3 (en algunas realizaciones, expresión en exceso). En algunos casos, el trastorno es un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunos casos, el cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular es mieloma múltiple o cáncer de vejiga (p. ej. carcinoma de células transicionales), cáncer de mama o cáncer de hígado. En algunos casos, el trastorno es un trastorno esquelético, p. ej., acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica (TD; formas clínicas TDI y TDII), o síndrome de craneosinostosis.

Se describe en la presente memoria el uso de un ácido nucleico de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como una afección patológica asociada con la activación y/o expresión de FGFR3 (en algunas realizaciones, expresión en exceso). En algunos casos, el trastorno es un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunos casos, el cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular es mieloma múltiple o cáncer de vejiga (p. ej. carcinoma de células transicionales), cáncer de mama o cáncer de hígado. En algunos casos, el trastorno es un trastorno esquelético, p. ej., acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica (TD; formas clínicas TDI y TDII), o síndrome de craneosinostosis.

Se describe en la presente memoria el uso de un vector de expresión de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como una afección patológica asociada con la activación y/o expresión de FGFR3 (en algunas realizaciones, expresión en exceso). En algunos casos, el trastorno es un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunos casos, el cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular es mieloma múltiple o cáncer de vejiga (p. ej. carcinoma de células transicionales), cáncer de mama o cáncer de hígado. En algunos casos, el trastorno es un trastorno esquelético, p. ej., acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica (TD; formas clínicas TDI y TDII), o síndrome de craneosinostosis.

Se describe en la presente memoria el uso de una célula hospedante de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como una afección patológica asociada con la activación y/o expresión de FGFR3 (en algunas realizaciones, expresión en exceso). En algunos casos, el trastorno es un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunos casos, el cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular es mieloma múltiple o cáncer de vejiga (p. ej. carcinoma de células transicionales), cáncer de mama o cáncer de hígado. En algunos casos, el trastorno es un trastorno esquelético, p. ej., acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica (TD; formas clínicas TDI y TDII), o síndrome de craneosinostosis.

Se describe en la presente memoria, el uso de un artículo de fabricación de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como una afección patológica asociada con la activación y/o expresión de FGFR3 (en algunas realizaciones, expresión en exceso). En algunos casos, el trastorno es un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunos casos, el cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular es mieloma múltiple o cáncer de vejiga (p. ej. carcinoma de células transicionales), cáncer de mama o cáncer de hígado. En algunos casos, el trastorno es un trastorno esquelético, p. ej., acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica (TD; formas clínicas TDI y TDII), o síndrome de craneosinostosis.

Se describe en la presente memoria el uso de un kit de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, tal como una afección patológica asociada con la activación y/o expresión de FGFR3 (en algunas realizaciones, expresión en exceso). En algunos casos, el trastorno es un

cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunos casos, el cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular es mieloma múltiple o cáncer de vejiga (p. ej. carcinoma de células transicionales), cáncer de mama o cáncer de hígado. En algunos casos, el trastorno es un trastorno esquelético, p. ej., acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica (TD; formas clínicas TDI y TDII), o síndrome de craneosinostosis.

También se describe en la presente memoria el uso de un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención en la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación celular; y el uso de un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención en la preparación de un medicamento para matar células. En algunos casos, la célula es una célula de mieloma múltiple. En algunos casos, la célula muere por ADCC. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo desnudo. En algunos casos, la célula expresa en exceso el FGFR3.

También se describe en la presente memoria el uso de un anticuerpo anti-FGFR3 de la invención en la preparación de un medicamento para reducir drásticamente las células, tales como las células de mieloma múltiple. En algunos casos, la célula muere por ADCC. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo desnudo. En algunos casos, la célula expresa en exceso el FGFR3.

La invención se refiere a métodos y composiciones útiles para modular trastornos asociados con la expresión y/o señalización del FGFR3, tal como la expresión y/o señalización aumentada o expresión y/o señalización no deseada.

Los usos médicos de la invención se pueden usar para afectar a cualquier estado patológico adecuado.

Se describen trastornos de ejemplo en la presente memoria, e incluyen un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro (p. ej., el neuroblastoma o meningioma), cáncer de piel

(p. ej., melanoma, carcinoma de células basales, o carcinoma de células escamosas), cáncer de vejiga (p. ej., carcinoma de células transicionales), carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CRC), carcinoma hepatocelular, cáncer cervical, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, neoplasias malignas hematológicas y (p. ej., leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (LLA-T), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (B-ALL), leucemia mieloide aguda (LMA), neoplasias de linfocitos B, linfoma de Hodgkin, y mieloma múltiple). En algunas realizaciones, el trastorno es carcinoma de células transicionales invasivo. En algunas realizaciones, el trastorno es mieloma múltiple. Los trastornos de ejemplo adicionales incluyen trastornos esqueléticos, tales como acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica (TD; formas clínicas TDI y TDII), o síndrome de craneosinostosis.

En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3, FGFR3 amplificado, FGFR3 translocado y/o FGFR3 mutado. En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3 activado. En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3 translocado (p. ej., una translocación t(4;14)). En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3 constitutivo. En algunas realizaciones, el FGFR3 constitutivo comprende una mutación en el dominio de tirosina quinasa y/o el dominio de yuxtamembrana y/o un dominio de unión a ligando. En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3 independiente de ligando. En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3 dependiente de ligando.

En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbS248C. En algunas realizaciones, el cáncer expresaba el FGFR3-IIIb S248C y/o FGFR3-IIIcS248C.

En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbK652E. En algunas realizaciones, el cáncer expresaba el FGFR3-IIIb K652E y/o FGFR3-IIIcK650E.

FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbS249C. En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3-IIIbS249C y/o FGFR3-IIIcS249C.

En un aspecto, el cáncer expresa el FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbG372C. En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3-IIIbG372C y/o FGFR3-IIIcG370C.

En un aspecto, el cáncer expresa el FGFR3 que comprende una mutación que corresponde a FGFR3-IIIbY375C. En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3-IIIbY375C y/o FGFR3-IIIcY373C.

En algunas realizaciones, el cáncer expresa el (a) FGFR3-IIIbK652E y (b) uno o más de FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, y FGFR3IIIbG372C.

En algunas realizaciones, el cáncer expresa el (a) FGFR3-IIIbR248C y (b) uno o más de FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, y FGFR3-IIIbG372C.

En algunas realizaciones, el cáncer expresa el (a) FGFR3-IIIbG372C y (b) uno o más de FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, y FGFR3-IIIbR248C.

En algunas realizaciones, el cáncer expresa el FGFR3-IIIbK248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, y FGFR3-IIIbG372C.

En algunas realizaciones, el cáncer expresa niveles aumentados de fosfo-FGFR3, fosfo-FRS2 y/o fosfo-MAPK con respecto a una muestra o nivel de control (p. ej., una muestra de tejido normal).

En algunas realizaciones, el cáncer expresa (p. ej., en la superficie celular) aproximadamente 10.000 moléculas de FGFR3 por célula o más (tal como 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000 o más receptores FGFR3). En algunas realizaciones, el cáncer expresa aproximadamente 13000 moléculas de FGFR3. En otras realizaciones, el cáncer expresa aproximadamente 5000, 6000, 7000, 8000, o más moléculas de FGFR3. En algunas realizaciones, el cáncer expresa menos de aproximadamente 4000, 3000, 2000, 1000, o menos moléculas de FGFR3. En algunas realizaciones, el cáncer expresa menos de aproximadamente 1000 moléculas de FGFR3.

En una realización, una célula a la que se dirige un uso médico de la invención es una célula de cáncer. Por ejemplo, una célula de cáncer puede ser una seleccionada del grupo que consiste en una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de pulmón (p. ej., una célula de cáncer de pulmón de células no pequeñas), una célula de cáncer de tiroides, una célula de mieloma múltiple, una célula de cáncer testicular, una célula de carcinoma papilar, una células de cáncer de colon, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer cervical, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de sarcoma osteogénico, una célula de carcinoma renal, una célula de carcinoma hepatocelular, una célula de cáncer de vejiga (p. ej., una célula de carcinoma de células transicionales), una célula de carcinoma gástrico, una célula de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, una célula de melanoma, una célula de leucemia, una célula de mieloma múltiple (p. ej. una célula de mieloma múltiple que comprende una translocación t(4:14) de FGFR3) y una célula de adenoma de colon. En una realización, una célula a la que se dirige un método de la invención es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica. En otra realización, una célula a la que se dirige un método de la invención es una célula metastásica. En un aspecto, la invención se refiere a métodos para inhibir la proliferación celular en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGFR3 para reducir la proliferación celular.

En un aspecto, la invención se refiere a métodos para matar una célula en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGFR3 para matar a una célula. La célula puede sr una célula de mieloma múltiple. La célula puede morir por ADCC. El anticuerpo puede ser un anticuerpo desnudo. La célula puede expresar en exceso el FGFR3.

En un aspecto, la invención se refiere a métodos para reducir drásticamente células (tales como células de mieloma múltiple) en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGFR3 para matar a una célula. La célula puede ser una célula de mieloma múltiple. La célula puede morir por ADCC. El anticuerpo puede ser un anticuerpo desnudo. La célula puede expresar en exceso el FGFR3.

En un aspecto, la invención se refiere a métodos para tratar o prevenir un trastorno esquelético. En algunos métodos, el trastorno es acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica (TD; formas clínicas TDI y TDII), o síndrome de craneosinostosis.

Los usos médicos de la invención pueden comprender además etapas adicionales de tratamiento en los métodos. Por ejemplo, un método puede comprender además una etapa en la que una célula y/o tejido diana (p. ej., una célula de cáncer) se expone a tratamiento de radiación o de un agente quimioterapéutico.

En un aspecto, la invención se refiere a métodos que comprenden administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGFR3 en combinación con una cantidad eficaz de otro agente terapéutico (tal como un agente antiangiogénesis, otro anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citoquina, radioterapia citotóxica, un corticosteroide, un antiemético, una vacuna para el cáncer, un analgésico o un agente inhibidor del crecimiento). Por ejemplo, los anticuerpos anti-FGFR3 se usan en combinaciones con un agente anticáncer o un agente antiangiogénico para tratar diferentes afecciones neoplásicas

o no neoplásicas. En ejemplos particulares, los anticuerpos anti-FGFR3 se usan en combinación con velcade, revlimid, tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecán, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, bevacizumab, vincristina, cisplatino, gemcitabina, metotrexato, vinblastina, carboplatino, paclitaxel, docetaxel, pemetrexed, 5fluorouracilo, doxorrubicina, bortezomib, lenalidomida, dexametasona, melfalán, prednisona, vincristina, y/o talidomida.

Dependiendo de la indicación de cáncer específica que se va a tratar, la terapia de combinación de la invención se puede combinar con agentes terapéuticos adicionales, tales como agentes quimioterapéuticos, o terapias adicionales tales como radioterapia o cirugía. Se pueden usar muchos agentes quimioterapéuticos conocidos en la terapia de combinación de la invención. Preferiblemente, se usarán los agentes quimioterapéuticos que son estándar para el tratamiento de las indicaciones específicas. La dosis o frecuencia de cada agente terapéutico que se va a usar en combinación preferiblemente es la misma o menos que la dosis o frecuencia del agente correspondiente cuando se usa sin otro u otros agentes.

También se describen en la presente memoria, cualquiera de los anticuerpos anti-FGFR3 descritos en la presente memoria, en donde el anticuerpo anti-FGFR3 comprende una etiqueta detectable.

También se describen en la presente memoria, un complejo de cualquiera de los anticuerpos anti-FGFR3 descrito en

la presente memoria y el FGFR3. El complejo puede ser in vivo o in vitro. El complejo puede comprender una célula de cáncer. El anticuerpo anti-FGFR3 puede estar marcado de forma detectable.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A, 1B y 1C: Secuencias de bucles de HVR de la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpos anti-FGFR3. Las figuras muestran las secuencias de HVR de la cadena pesada, H1, H2 y H3, y las secuencias de HVR de la cadena ligera L1, L2 y L3. La numeración de secuencias es como sigue:

Clon 184.6 (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 1; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 2; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 3; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 4; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 5; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 6);

Clon 184.6.1 (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 7; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 8; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 9; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 10; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 11; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 12)

Clon 184.6.58 (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 13; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 14; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 15; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 16; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 17; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 18)

Clon 184.6.62 (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 48; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 49; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 50; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 51; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 52; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 53)

Clon 184.6.21 (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 54; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 55; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 56; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 57; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 58; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 59)

Clon 184.6.49 (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 60; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 61; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 62; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 63; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 64; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 65)

Clon 184.6.51 (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 66; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 67; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 68; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 69; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 70; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 71)

Clon 184.6.52 (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 72; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 73; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 74; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 75; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 76; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 77)

Clon 184.6.92 (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 78; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 79; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 80; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 81; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 82; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 83)

Clon 184.6.1.N54S (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 84; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 85; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 86; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 87; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 88; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 89)

Clon 184.6.1.N54G (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 90; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 91; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 92; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 93; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 94; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 95)

Clon 184.6.1.N54A (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 96; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 97; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 98; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 99; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 100; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 101)

Clon 184.6.1.N54Q (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 102; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 103; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 104; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 105; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 106; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 107)

Clon 184.6.58.N54S (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 108; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 109; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 110; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 111; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 12; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 113)

Clon 184.6.58.N54G (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 114; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 115; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 116; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 117; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 118; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 119)

Clon 184.6.58.N54A (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 120; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 121; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 122; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 123; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 124; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 125)

Clon 184.6.58.N54Q (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 126; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 127; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 128; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 129; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 130; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 131).

Clon 184.6.1.NS D30E (HVR-H1 es la SEQ ID NO: 143; HVR-H2 es la SEQ ID NO: 144; HVR-H3 es la SEQ ID NO: 145; HVR-L1 es la SEQ ID NO: 140; HVR-L2 es la SEQ ID NO: 141; HVR-L3 es la SEQ ID NO: 142).

Las posiciones de aminoácidos están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat como se describe a continuación.

Figura 2A y 2B: representan (A) las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y las regiones variables de la cadena ligera de los anticuerpos anti-FGFR3 184.6.1.N54S, 184.6.58, y 184.6.62; y (B) las regiones hipervariables de los anticuerpos anti-FGFR3 1G6, 6G1, y 15B2.

Figuras 3A, 3B y 4: representan secuencias de la región armazón consenso humana aceptoras de ejemplo para usar en la práctica de la presente invención con identificadores de secuencia como sigue:

Regiones armazón consenso de la cadena pesada variable (VH) (figuras 3A, 3B)

región armazón consenso del subgrupo I de VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 19 y 203-205)

región armazón consenso del subgrupo I de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 20 y 206-208, 21 y 209-211, 22 y 212-214)

región armazón consenso del subgrupo II de VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 23 y 215-217)

región armazón consenso del subgrupo II de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 24 y 218-220, 25 y 221-223, 26 y 224-226)

región armazón consenso del subgrupo II de VH humano menos extendida

región armazón consenso del subgrupo III de VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 27 y 227-229)

región armazón consenso del subgrupo III de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 28 y 230-232, 29 y 233-235, 30 y 236-238)

región armazón aceptora de VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 31 y 239-241)

región armazón aceptora de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 32 y 242-244, 33 y 2245-247)

región armazón aceptora 2 de VH humano menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 34 y 248-250)

región armazón aceptora 2 de VH humano menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 35 y 251-253, 36 y 254-256, 37 y 257-259)

Regiones armazón consenso de la cadena ligera variable (VL) (FIG. 4 )

región armazón consenso de subgrupo I de VL kappa humano (SEQ ID NO: 38 y 260-262)

región armazón consenso de subgrupo II de VL kappa humano (SEQ ID NO: 39 y 263-265)

región armazón consenso de subgrupo III de VL kappa humano (SEQ ID NO: 40 y 266-268)

región armazón consenso de subgrupo IV de VL kappa humano (SEQ ID NO: 41 y 269-271)

Figura 5: representa secuencias de la región armazón de las cadenas ligera (SEQ ID NO: 42-45) y pesada (SEQ ID NO: 46, 47, 175, 176) de huMAb4D5-8. Los números en superíndice/negrilla indican posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat.

Figura 6: representa secuencias de la región armazón modificadas/variantes de las cadenas ligera (SEQ ID NO: 42, 43, 177, 45) y pesada (SEQ ID NO: 46, 47, 178, y 176) de huMAb4D5-8. Los números en superíndice/negrilla indican posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat.

Figura 7: la inactivación de FGFR3 en células de cáncer de vejiga RT112 inhibe la proliferación e induce la detención del ciclo celular en G1 in vitro, y suprime el crecimiento tumoral in vivo. Se clonaron tres ARNhc de FGFR3 diferentes en un vector de expresión inducible por Tet. Las células RT112 que expresaban de forma estable los ARNhc de FGFR3 o un ARNhc de control se establecieron con selección con puromicina. (A) Transferencias representativas que muestran la expresión de FGFR3 en clones seleccionados tratados con o sin doxiciclina (Dox, 0, 0,1 y 1 µg/ml, de izquierda a derecha). (B) Incorporación de [3H]-timidina por las células RT112 estables. Se cultivaron clones estables de RT112 con o sin doxiciclina 1 µg/ml durante 3 días antes de incubación de 16 h con [3H]-timidina (1 µCi por pocillo). Los recuentos de [3H]-timidina incorporada se normalizaron respecto a los de células sin inducción de doxiciclina. Las barras de error representan el EEM. (C) Histogramas de citometría de flujo fluorescente de células RT112 estables. Se cultivaron clones de RT112 que expresaban ARNhc de control o ARNhc4 de FGFR3 con o sin doxiciclina 1 µg/ml durante 72 horas, y los núcleos se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Se obtuvieron resultados similares con ARNhc 2 y 6 de FGFR3 (figura 16). (D) El crecimiento de células RT112 que expresan el ARNhc de control (n=9 por grupo de tratamiento) o ARNhc4 de FGFR3 (n=11 por grupo de tratamiento) en ratones. Se dio a los ratones sacarosa al 5% sola o complementada con doxiciclina 1 mg/ml, y se midió el tamaño del tumor dos veces por semana. Las barras de error representan el EEM. Se obtuvieron resultados similares para ARNhc2 y 6 de FGFR3 (figura 16). Panel inferior: Expresión de la proteína FGFR3 en lisatos tumorales extraídos de tejidos de xenoinjerto de células estables para ARNhc de control o ARNhc4 de FGFR3.

Figura 8: R3Mab bloquea la interacción FGF/FGFR3. (A) Unión selectiva de FGFR3 humano por R3Mab. Proteínas quiméricas Fc FGFR 1-4 humanas se inmovilizaron e incubaron con cantidades crecientes de R3Mab. La unión

específica se detectó usando un anticuerpo anti-Fab humano. (B-C) Bloqueo de la unión de FGF1 a FGFR3-IIIb (B)

: o IIIc (C) humano por R3MAb. La unión específica se detectó usando un anticuerpo policlonal específico para FGF1 biotinilado. Las barras de error representan el error estándar de la media (EEM) y a veces son menores que los símbolos.

Figura 9: R3MAb inhibe la proliferación de células Ba/F3 dirigida por FGFR3 mutado y de tipo natural. (A) Efecto inhibidor de R3Mab en la viabilidad de células Ba/F3 que expresan FGFR3-IIIb humano de tipo natural. Las células se cultivaron en medio sin FGF1 (no FGF1) o en presencia de FGF1 10 ng/ml más heparina 10 µg/ml solo (FGF1) o en combinación con un anticuerpo de control (control) o R3Mab. La viabilidad celular se evaluó con CellTiter-Glo (Promega) después de 72 h de incubación con anticuerpo. (B) Inhibición de fosforilación de FGFR3 y MAPK por R3MAb en células estables Ba/F3-FGFR3-IIIbWT. Las células se trataron con FGF1 15 ng/ml y heparina 10 µg/ml (+)

: o heparina sola (-) durante 10 minutos, y después se preincubaron con un Ab de control (Ctrl), cantidad decreciente de R3Mab (1, 0,2, 0,04 µg/ml respectivamente) en PBS, o PBS solo (simulado) durante 3 horas. Los lisatos se inmunotransfirieron para evaluar la fosforilación de FGFR3 y MAPK p44/42 con anticuerpo contra pFGFRY653/654 y pMAPKThr202/Tyr204 respectivamente. (C) Representación esquemática de puntos calientes de mutaciones de FGFR3 y frecuencia en el cáncer de vejiga (la numeración de secuencia representada se basa en la secuencia de aminoácidos de la isoforma FGFR3 IIIb) basado en los datos publicados (32). TM, dominio transmembrana; TK1 y TK2, dominio 1 y 2 de tirosina quinasa. (D-H) Efecto inhibidor de R3Mab en la viabilidad de células Ba/F3 que expresan mutantes de FGFR3 asociados con el cáncer. G372C deriva de la isoforma IIIc, y el resto derivan de la isoforma IIIb. La numeración de secuencias para todos los mutantes se basa en la secuencia de aminoácidos de la isoforma FGFR3 IIIb (incluyendo el mutante G372C, que se numeraría G370C basado en la secuencia de aminoácidos de la isoforma FGFR3 IIIc). La viabilidad celular se evaluó después de 72 h de incubación con anticuerpos como se ha descrito en (A). Las barras de error representan el EEM.

Figura 10: Mapa de epítopos para R3Mab y estructura cristalina del complejo entre el fragmento Fab de R3Mab y IgD2-D3 de FGFR3-IIIb humano. (A) Epítopo determinado por la unión de 13 péptidos que abarcan IgD2-D3 de FGFR3 humano contra R3Mab. Cada péptido biotinilado se capturó en pocillo de microvaloración recubierto de estreptavidina y se incubó con R3Mab. El R3Mab unido específicamente se detectó usando un anticuerpo de cabra anti-IgG humana. (B) Alineamiento de secuencias del péptido 3 de FGFR3 humano (LAVPAANTVRFRCPA (SEQ ID NO: 179) y 11 (SDVEFHCKVYSDAQP (SEQ ID NO: 180) con segmentos extracelulares de FGFR1 humano (péptido

3: HAVPAAKTVKFKCPS (SEQ ID NO: 181); péptido 11: SNVEFMCKVYSDPQP (SEQ ID NO: 182)). Los restos de FGFR1 implicados en la interacción primaria de FGF2-FGFR1, unión de heparina, y asociación de receptor-receptor se muestran en negrilla, itálica y subrayados, respectivamente. La asignación funcional de los restos de FGFR1 se basa en Plotnikov et al. (34). (C) Estructura de Fab de R3Mab (mostrado en hélice de cinta, cadena ligera gris, cadena pesada negra) en complejo con IgD2-D3 de FGFR3 humano (mostrado en la superficie molecular, blanco). Los restos receptores implicados en la unión del ligando y dimerización están coloreados en gris/sombreada y gris oscuro, respectivamente, basado en Plotnikov et al. (34). (D) El acercamiento de la estructura cristalina muestra que CDR-H3 y -H2 de Fab constituyen los sitios de interacción principales de IgD2 y IgD3 de FGFR3: (E) Superposición del complejo FGFR3-IIIc-FGF1 (código PDB 1RY7) con el complejo FGFR3-IIIb-Fab. FGFR3-IIIc y FGF1 están coloreados en gris y gris oscuro respectivamente. FGFR3-IIIb se muestra en blanco, y Fab se muestra en gris claro para la cadena ligera, gris oscuro para la cadena pesada. IgD2 se usó como anclaje para la superposición. Obsérvese la buena superposición de IgD2 de ambas estructuras y la nueva conformación adoptada por IgD3 de FGFR3-IIIb cuando es unido por R3Mab. (F) Otra representación de la superposición del complejo FGFR3-IIIc-FGF1 (código PDB 1 RY7) con el complejo FGFR3-IIIb-Fab. FGFR3-IIIc y FGF1 se muestra como superficies moleculares que tienen textura gris/entramado y gris oscuro/punteado, respectivamente. FGFR3-IIIb se muestra en blanco y el Fab se muestra en gris para la cadena ligera, negro para la cadena pesada. IgD2 se usó como anclaje para la superposición. Obsérvese la buena superposición de IgD2 de ambas estructuras y la nueva conformación adoptada por IgD3 de FGFR3-IIIb cuando es unido por R3Mab.

Figura 11: R3Mab inhibe la proliferación, crecimiento clonal y señalización de FGFR3 en células de cáncer de vejiga que expresan FGFR3 de tipo natural o FGFR3S249C mutado. (A) Inhibición de la incorporación de [3H]-timidina por R3Mab en la línea de células de cáncer de vejiga RT112. Las barras de error representan el EEM. (B) Bloqueo de la señalización de FGFR3 activada por FGF1, por R3Mab (15 µg/ml) en la línea de células de cáncer de vejiga RT112 comparado con el medio de tratamiento solo (simulado) o un anticuerpo de control (Ctrl). Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-FGFR3 y se evaluó la fosforilación de FGFR3 con un anticuerpo antifosfotirosina (4G10). Los lisados se inmunotransfirieron para detectar la fosforilación de AKT (pAKTS473) y p44/42 MAPK (pMAPKThr202/Tyr204). (C) Inhibición del crecimiento clonal por R3Mab (10 µg/ml) en la línea de células de cáncer de vejiga UMUC-14 (que albergan FGFR3S249C) comparado con el tratamiento con medio solo (simulado) o un anticuerpo de control (Ctrl). (D) Cuantificación del estudio en (C) que da el número de colonias mayores de 120 µm de diámetro por pocillos de una replicación de 12 pocillos. Las barras de error representan el EEM. P < 3,4 X 10-9 frente a simulado o control. (E) Inhibición de la fosforilación de FGFR3 en células UMUC-14 por R3Mab (15 µg/ml). La fosforilación de FGFR3 se analizó como en (B). Obsérvese la fosforilación constitutiva de FGFR3 en esta línea celular.

Figura 12: R3Mab disminuye el nivel en el estado de equilibrio del dímero de FGFR3S249C unido por disulfuro, al dirigir el equilibrio de dímero-monómero hacia el estado de monómero. (A) Efecto de R3Mab en el dímero de FGFR3S249C en células UMUC-14. Las células se incubaron con R3Mab (15 µg/ml) o anticuerpo de control (Ctrl)

durante 3 horas, y los lisados celulares enteros se analizaron por inmunotransferencia en condiciones no reductoras y reductoras. (B) Efecto de DTNB bloqueador de sulfhidrilo libre en el equilibrio de dímero-monómero de FGFR3S249C en células UMUC-14. Las células UMUC-14 se trataron con una concentración creciente de DTNB durante 3 horas, y los lisados celulares se analizaron como en (A). (C) Efecto de R3Mab en el dímero de FGFR3S249C recombinante purificado in vitro. El dímero de FGFR3S249C compuesto de IgD2-D3 se purificó por columna por exclusión de tamaños, y se incubó con PBS (simulado), un anticuerpo de control (Ctrl) o R3Mab a 37ºC. Las muestras se recogieron en los tiempos indicados para el análisis por inmunotransferencia en condiciones no reductoras. El dímero-monómero de FGFR3S249C se detectó usando un anticuerpo de hibridoma anti-FGFR3 6G1 (A-C).

Figura 13: R3Mab inhibe el crecimiento de xenoinjerto de células de cáncer de vejiga y el crecimiento de aloinjeto de Ba/F3-FGFR3S249C. (A) Efecto de R3Mab en el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de vejiga de RT112 previamente establecidos con vehículo de control. n=10 por grupo. (B) Inhibición de la señalización de FGFR3 en tejidos tumorales de RT112 por R3Mab. En un experimento separado, se recogieron tumores de xenoinjeto de RT112 que se habían tratado con 15 mg/kg de un anticuerpo de control (Ctrl) o R3Mab durante 48 horas o 72 horas (n = 3 por grupo), se homogeneizaron y se analizó FRS2α y la activación de MAPK por inmunotransferencia. (C) Efecto de R3Mab en el crecimiento de aloinjertos de Ba/F3-FGFR3S249C previamente establecidos. n=10 por grupo.

(D): Efecto de R3Mab en el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de vejiga de UMUC-14 previamente establecidos, n=10 por grupo. (E) Efecto de R3Mab en el dímero de FGFR3S249C y señalización en tejidos tumorales de UMUC-14. Los tumores de xenoinjerto de UMUC-14 que se trataron con 30 mg/kg de un anticuerpo de control (Ctrl) o R3Mab durante 24 horas o 72 horas se recogieron (n =3 por grupo), se homogeneizaron, y se analizó el dímero-monómero de FGFR3S249C así como la activación de MAPK por inmunotransferencia. El dímero-monómero de FGFR3 se detectó usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-FGFR3 sc9007 para evitar la interferencia de la IgG de ratón en los lisados tumorales. Las barras de error representan el EEM.

Figura 14: La ADCC contribuye a la eficacia antitumoral de R3Mab en modelos de mieloma múltiple positivos para t(4;14). (A-B) Efecto de R3Mab en el crecimiento de xenoinjertos de mieloma de OPM2 (A) y KMS11 (B) previamente establecidos. n =10 por grupo. (C-F) Citolisis de líneas de células de mieloma OPM2 (C) y KMS11 (D),

: o líneas de células de cáncer de vejiga RT112 (E) y UMUC-14 (F) inducida por R3Mab en cultivo celular. Las células de mieloma o de cáncer de vejiga se incubaron con PBMC humanos recién aislados en presencia de R3Mab o anticuerpo de control. La citotoxicidad se determinó midiendo la liberación de LDH en el líquido sobrenadante. (G-H) Efecto de R3Mab o su mutante DANA en el crecimiento de xenoinjertos de mieloma de OPM2 (G) y KMS11 (H) previamente establecidos. n=10 por grupo. Las barras de error representan el EEM y a veces son más pequeños que los símbolos.

Figura 15: La inactivación de FGFR3 con ARNip inhibe la proliferación celular de las líneas de células de cáncer de vejiga. Se diseñaron y sintetizaron en Genentech de 6 a 7 ARNip de FGFR3 diferentes y 3 ARNip de control no específicos. Líneas de células de cáncer de vejiga RT112 (A), SW780 (B), RT4 (C) y UMUC-14 (D) se cultivaron en placa de 96 pocillos (3000 células por pocillo y se dejó que se fijaran durante la noche, y se transfectaron transitoriamente con ARNip 25 nM en complejo con RNAiMax (Invitrogen). 72 h después de transfección, se añadió [3H]-timidina (1µCi por pocillo) al cultivo (A, C, y D) para otras 16 horas de incubación. La [3H]-timidina incorporada se cuantificó con TopCount. Los datos se normalizaron a los de las células transfectadas con RNAiMax solo (Simulado). Las barras de error representan el EEM. Panel inferior: Transferencias representativas que muestran la expresión de FGFR3 en células transfectadas con ARNip. (B) La viabilidad celular se midió con CellTiter-Glo (Promega) 96 horas después de transfección. Las barras de error representan el EEM.

Figura 16: La inactivación de FGFR3 en la línea de células de cáncer de vejiga RT112 induce la detención del ciclo celular en G1 in vitro y suprime el crecimiento tumoral in vivo. Se diseñaron 3 ARN de FGFR3 diferentes y se clonaron en un vector retrovírico de expresión de ARNhc inducible por Tet. Los clones estables de RT112 que expresan los ARNhc de FGFR3 o ARNhc de control se establecieron con selección con puromicina. (A) Histogramas de citometría de flujo de fluorescencia de ADN de núcleos teñidos con yoduro de propidio (PI) de células estables RT112 que expresan ARNhc2 o ARNhc6 de FGFR3 después de tratamiento con o sin doxiciclina 1 µg/ml durante 72 horas. (B) Crecimiento de células RT112 estables que expresan ARNhc2-4 de FGFR3 (n = 11 por grupo de tratamiento) o ARNhc6-16 de FGFR3 (n = 10 por grupo de tratamiento) en ratones nu/nu. Los ratones que llevan tumor recibieron solo sacarosa al 5% (círculo negro) o sacarosa al 5% más doxiciclina 1 mg/ml (cuadrado negro) y los tumores se midieron con calibres dos veces por semana. Las barras de error representan el EEM.

Figura 17: Efecto de los anticuerpos de hibridoma anti-FGFR3 16G, 6G1 y 15B2 en la proliferación de células Ba/F3 dirigida por FGFR3 de tipo natural y mutado. Los anticuerpos de hibridoma anti-FGFR3 se generaron mediante inmunización de ratones BALB/c con FGFR3-IIIb/Fc humano o FGFR3-IIIc humano/Fc quimérico. Las células de hibridoma fusionadas se seleccionaron usando selección con hipoxantina-aminopterina-timidina en Medio D del kit de selección de hibridoma de ClonaCell® (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canadá). Los anticuerpos de hibridoma se seleccionaron según su capacidad para unirse a FGFR3-IIIb y FGFR3-IIIc por ELISA y para reconocer FGFR3 de superficie celular por FACS. Después, los hibridomas seleccionados se clonaron por dilución límite. 16G, 6G1 y 15B2 son clones usados para evaluar el efecto en la proliferación de células Ba/F3 que expresan FGFR3 de tipo natural o mutado de forma similar a como se describe en la figura 9A. Las barras de error representan el EEM.

Figura 18: Comparación de epítopos de R3Mab determinados por cartografía de péptidos y análisis de estructura cristalina. (A) Epítopo puesto de manifiesto por la estructura del fragmento Fab de R3Mab en complejo con el segmento IgD2-D3 extracelular de FGFR3 humano. Los restos de FGFR3 que se ponen en contacto con la cadena pesada y la cadena ligera de Fab están coloreados en negro y gris, respectivamente. (B) Situación de los péptidos 3 y 11 en FGFR3.

Figura 19: R3Mab inhibe la proliferación y señalización de FGFR3 en células de cáncer de vejiga que contienen de FGFR3 tipo natural o FGFR3S249C mutado. (A) Inhibición de la viabilidad celular por R3Mab en la línea de células de cáncer de vejiga RT4. La viabilidad celular se evaluó con CellTiter-Glo (Promega) después de 96 horas de incubación con el anticuerpo. Las barras de error representan el EEM. (B) Bloqueo de la señalización de FGFR3 activada por FGF1, por R3Mab (15 ug/ml) en la línea de células de cáncer de vejiga RT4. (C) Inhibición de la incorporación de [3H]-timidina por R3Mab en la línea de células de cáncer de vejiga RCC-97-7 (que contienen FGFR3S249C). Las barras de error representan el EEM. (D) Inhibición de la fosforilación de FGFR3 en células TCC97-7 por R3Mab (15 ug/ml). (E) Disminución del dímero de FGFR3S249C en células TCC-97-7 después de 3 horas de incubación con R3Mab (15 ug/ml) comparado con un anticuerpo de control (Ctrl).

Figura 20: Efecto de inhibidores de endocitosis en la internalización de R3Mab y dímero de FGFR3S249C en células UMUC-14. (A) Efecto de inhibidores de endocitosis en la internalización de R3Mab. Células UMUC-14, pretratadas con diferentes inhibidores de endocitosis o DMSO durante 1 hora a 37°C, se incubaron con R3Mab (15 ug/ml) durante 3 horas a 37°C para permitir la internalización. Se usó un lavado a pH bajo para eliminar R3Mab de la superficie celular para visualizar la internalización del anticuerpo. Las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpo anti-IgG humana marcado con Alexa 488. La imagen se tomó usando microscopía confocal. (B) Efecto de inhibidores de endocitosis en el dímero de FGFR3S249C en células UMUC-14 tratadas con R3Mab. Células UMUC14, pretratadas con diferentes inhibidores de endocitosis o DMSO durante 1 hora a 37°C, se incubaron con simulación (banda 1), un anticuerpo de control (banda 2), o R3Mab (15 ug/ml, banda 3) durante 3 horas a 37°C. Se analizó la proteína FGFR3 en los lisados celulares en condiciones no reductoras o reductoras por inmunotransferencia. Obsérvese que la clorpromazina (inhibidora de endocitosis mediada por clatrina) y genisteína (inhibidora Pan de endocitosis) bloqueaban la internalización de R3Mab, pero no tenían efecto en la disminución inducida por R3Mab del dímero de FGFR3S249C.

Figura 21: Sensibilidad de la detección de diferentes anticuerpos anti-FGFR3 contra FGFR3S249C monómero y dímero en condiciones no reductoras. Células UMUC-14 se lisaron después de tratamiento con R3Mab (banda 1), una IgG 1 de control (banda 2), o PBS (banda 3) durante 3 horas, y los lisados celulares se sometieron a análisis de inmunotransferencia en condiciones reductoras o no reductoras. Obsérvese que 6G1 (anticuerpo de hibridoma murino generado en Genentech) detectaba tanto el dímero como el monómero de FGFR3S249C, mientras que sc9007 (anticuerpo policlonal de conejo, Santa Cruz Biotechnology) o sc13121 (anticuerpo de hibridoma murino, Santa Cruz Biotechnology) detectaba con preferencia FGFR3S249C dímero.

Figura 22: Efecto de R3Mab en la proliferación de células de mieloma múltiple t(4;14)+. (A) Efecto inhibidor de R3Mab en la incorporación de [3H]-timidina por células UTMC-2. Se cultivaron células UTMC-2 en medio que contenía R3Mab o un anticuerpo de control en presencia de FGF9 25 ng/ml y heparina 5 ug/ml o heparina sola (No FGF9). Después de 6 días de incubación, se añadió [3H]-timidina para 16 h de incubación. Los datos se normalizaron respecto a las células cultivadas en ausencia de FGF9 y anticuerpo. (B-C) Efecto de R3Mab en la incorporación de [3H]-timidina por células OPM2 (B) y KMS 11 (C). Las células cultivadas en medio FBS al 1,5% se trataron con R3Mab o un anticuerpo de control. Los datos se normalizaron con respecto a los de las células no tratadas. Las barras de error representan el EEM.

Figura 23: Niveles de expresión de FGFR3 en la superficie celular en células de mieloma y de cáncer de vejiga. (A) Expresión de FGFR3 en la superficie celular en células de mieloma y de cáncer de vejiga evaluado por análisis FACS. Las células se tiñeron con mAb de ratón conjugado con ficoeritrina contra FGFR3 humano (FAB766P, R&D Systems) o IgG1 de ratón de control de isotipo conjugado con ficoeritrina (BD Pharmingen). (B) Análisis de Scatchard de la densidad de FGFR3 en células de mieloma y células de cáncer de vejiga. R3Mab se radioyodó y se incubó con células en suspensión con anticuerpo no marcado en exceso. Después de incubación a t.a. durante 2 horas, las células se sedimentaron por centrifugación y se lavaron dos veces. Se determinó el 125I unido específicamente. La densidad de receptores y la afinidad de unión (Kd) representan la media de dos experimentos de unión.

Figura 24: Efecto de R3Mab o su mutante DANA en el crecimiento de xenoinjerto de células de carcinoma de vejiga.

(A) Efecto de R3Mab y su mutante DANA (50 mg/kg cada uno) en el crecimiento de tumores de RT112 previamente establecidos. (B) Efecto de R3Mab y su mutante DANA (50 mg/kg cada uno) en el crecimiento de tumores de UMUC-14 previamente establecidos. Las barras de error representan el EEM.

Descripción detallada de la invención

La invención de la presente memoria proporciona anticuerpos anti-FGFR3 que son útiles, p. ej., en el tratamiento o prevención de estados patológicos asociados con la expresión y/o actividad de FGFR3, tal como la expresión y/o actividad aumentada o expresión y/o actividad no deseada como se define en las reivindicaciones. En algunas

realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para tratar un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular.

Los anticuerpos anti-FGFR3 de la invención pueden ser útiles como reactivos para detectar y/o aislar el FGFR3, tal como la detección de FGFR3 en diferentes tejidos y tipos de células.

La invención proporciona además métodos para hacer y usar anticuerpos anti-FGFR3, y polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti-FGFR3, como se define en las reivindicaciones.

Técnicas generales

Las técnicas y procedimientos descritos o citados en la presente memoria en general están bien comprendidos y son usados habitualmente usando metodología convencional por los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, las metodologías ampliamente usadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie de Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harrow y Lane, eds. (1988). Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)).

Definiciones

Un “anticuerpo aislado” es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos de diagnóstico y terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En realizaciones preferidas, se purificará el anticuerpo (1) en más de 95% en peso del anticuerpo determinado por el método de Lowry, y lo más preferiblemente en más de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico “aislada” es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada normalmente en el entorno natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o marco en el que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo) donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una situación cromosómica diferente del de las células naturales.

La expresión “numeración de restos de dominio variable como en Kabat” o “numeración de posiciones de aminoácidos como en Kabat”, y variaciones de las mismas, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de la cadena pesada o los dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins de Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un recorte o una inserción en una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una inserción de un único aminoácido (resto 52a según Kabat) después del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, los restos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del resto 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de restos se puede determinar para un anticuerpo determinado mediante la alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada por Kabat “estándar”.

La frase “sustancialmente similar” o “sustancialmente el mismo”, como se usa en la presente memoria, indica un grado de similitud suficientemente alto entre dos valores numéricos (en general uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparación) de modo que el experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores es pequeña o no tiene significancia biológica y/o estadística dentro del contexto de las características biológicas medias por dichos valores (p. ej., valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es preferiblemente menor que aproximadamente 50%, preferiblemente menor que aproximadamente 40%, preferiblemente menor que aproximadamente 30%, preferiblemente menor que aproximadamente 20%, preferiblemente menor que aproximadamente 10% en función del valor para el anticuerpo de referencia/comparación.

"Afinidad de unión" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (p. ej., un anticuerpo) y su pareja de unión (p. ej., un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en la presente memoria, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de una pareja de unión (p. ej., anticuerpo y antígeno). La

afinidad de una molécula X por su pareja Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). De forma conveniente, la Kd es 1 x 10-7, 1 x 10-8, 5 x 10-8, 1 x 10-9, 3 x 10-9, 5 x 10-9, o incluso 1 x 10-10 o más fuerte. La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la presente memoria. Los anticuerpos de baja afinidad se unen en general a antígenos lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de afinidad alta se unen en general a antígenos más rápidamente y tienden a permanecer unidos más tiempo. En la técnica se conocen diversos métodos de medición de la afinidad de unión, cualquiera de los cuales se puede usar para los objetivos de la presente invención A continuación se describen realizaciones ilustrativas específicas.

En una realización, "Kd" o "el valor de Kd" según la presente invención se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con una versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno, como se describe en el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno mediante el equilibrio de Fab con una concentración mínima de antígeno marcado (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, y después captura del antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microvaloración (Dynex) se recubren toda la noche con 5 g/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquean con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc nº 269620), se mezclan [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones seriadas un Fab de interés (p. ej., consistentes con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:45934599). El Fab de interés después se incuba durante toda la noche; sin embargo la incubación puede continuar durante un periodo de tiempo más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (p. ej., durante una hora). Después, se separa la solución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1% en PBS. Cuando se han secado las placas, se añaden 150 l/pocillo de agente de centelleo (MicroScint-20; Packard), y se hace el recuento de las placas en un contador gamma Topcount (Packard) durante 10 minutos. Las concentraciones de cada Fab que producen menos o igual a 20% de la unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva. Según otra realización, Kd o el valor de Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón de superficie usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25ºC con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con hidrocloruro de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y Nhidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH4,8, en 5 g/ml (~0,2 M) antes de la inyección con un caudal de 5 l/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas de dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25°C con un caudal de aproximadamente 25 l/min. En algunas realizaciones, se usan las siguientes modificaciones para el método de ensayo de resonancia de plasmón de superficie: el anticuerpo se inmoviliza en los chips biosensores CM5 para lograr aproximadamente 400 RU, y para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas de dos veces de proteína diana (p. ej., FGFR3-IIIb o -IIIc) (empezando en 67 nM) en tampón de PBST a 25°C con un caudal de aproximadamente 30 ul/minuto. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante el ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la velocidad de asociación supera 106 M-1S-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar usando una técnica de amortiguación de fluorescencia que mide el incremento o disminución en la intensidad de emisión por fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) con una cubeta de agitación.

Una “velocidad de asociación” o “kon” según esta invención, también se puede determinar por la misma técnica de resonancia de plasmón de superficie descrita anteriormente usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25ºC con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con hidrocloruro de Netil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 g/ml (~0,2 M) antes de la inyección con un caudal de 5 l/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas de dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBST) a 25°C con un caudal de aproximadamente 25 l/min. En algunas realizaciones, se usan las siguientes modificaciones para el método de ensayo de resonancia de plasmón de superficie: el anticuerpo se inmoviliza en los chips biosensores CM5 para lograr aproximadamente 400 RU, y para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas de dos veces de proteína diana (p. ej., FGFR3-IIIb o -IIIc) (empezando en 67 nM) en tampón de PBST a 25°C con un caudal de aproximadamente 30 ul/minuto. Las velocidades de asociación (kon) y

velocidades de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante el ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calculó como la relación koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Sin embargo, si la velocidad de asociación supera 106 M-1S-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la velocidad de asociación se determina preferiblemente usando una técnica de amortiguación de fluorescencia que mide el incremento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) con una cubeta de agitación.

El término “vector”, como se usa en la presente memoria, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular al que se pueden unir segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector fago. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden unir segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedante en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedante tras la introducción en la célula hospedante y, de este modo, se replican junto con el genoma del hospedante. Además, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente, “vectores recombinantes”). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” se pueden usar de forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector más usada habitualmente.

"Polinucleótidos” o “ácido nucleico”, se usan de forma intercambiable en la presente memoria, para referirse a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar en un polímero mediante ADN o ARN polimerasa, o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación en la estructura de nucleótidos se puede realizar antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir mediante componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse además después de la síntesis, tal como mediante la conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, grupos terminales, sustitución de uno o más nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleótidos, tales como, por ejemplo, aquellas con uniones no cargadas (p. ej., metil-fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con uniones cargadas (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen restos colgando, tales como, por ejemplo, proteínas (p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen agentes quelantes (p. ej., metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen agentes alquilantes, aquellas con uniones modificadas (p. ej., ácidos nucleicos anómeros alfa, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido o polinucleótidos. Además, se puede sustituir cualquier grupo hidroxilo presente normalmente en los azúcares, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar o activados para preparar uniones adicionales a nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5’ y 3’ terminales se pueden fosforilar o sustituir con aminas o restos de grupos terminales orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivatizar otros hidroxilos en grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son conocidas generalmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2’-O-metil-, 2’-O-alil-, 2’-fluoro o 2’-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos básicos, tales como metil-ribósido. Se pueden sustituir uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de unión alternativos. Estos grupos de unión alternativos incluyen, pero sin limitación, realizaciones en donde el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR’, CO o CH2 ("formacetal"), en que cada R o R’ es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que opcionalmente contiene una unión éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todas las uniones en un polinucleótido sean idénticas. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos citados en la presente memoria, incluyendo ARN y ADN.

"Oligonucleótido," tal como se usa en la presente memoria, se refiere en general a polinucleótidos cortos generalmente sintéticos y generalmente de una cadena que en general, pero no necesariamente, tienen una longitud inferior a aproximadamente 200 nucleótidos. Los términos “oligonucleótido” y “polinucleótido” no se excluyen mutuamente. La descripción anterior para polinucleótidos es igualmente y totalmente aplicable a oligonucleótidos.

El “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia de péptido o polipéptido, se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los restos de aminoácidos en la secuencia de péptido o polipéptido específica, después de la alineación de las secuencias y la introducción de huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de

secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente, tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la máxima alineación a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los objetivos de la presente memoria, los valores en % de la identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla A a continuación. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 era propiedad de Genentech, Inc. y el código fuente se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado, p. ej., en el documento WO2007/001851. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones en las que se usa ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, con, o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a, con, o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de restos de aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A.

En algunas realizaciones, dos o más secuencias de aminoácidos son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% idénticas. En algunas realizaciones, dos o más secuencias de aminoácidos son al menos 95%, 97%, 98%, 99%, o incluso 100% idénticas. Salvo que específicamente se exponga lo contrario, los valores de los % de identidad de secuencias de aminoácidos usados en la presente memoria, se obtienen como se ha descrito en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.

El término “FGFR3” como se usa en la presente memoria, se refiere, salvo que se especifique o el contexto indique otra cosa, a cualquier polipéptido FGFR3 natural o variante (sea natural o sintético) (p. ej., isoforma FGFR3-IIIb o isoforma FGFR3-IIIc). La expresión “secuencia nativa” abarca específicamente formas truncadas naturales (p. ej., una secuencia de dominio extracelular o una secuencia de la subunidad transmembrana), formas variantes naturales

(p. ej., formas de corte y empalme alternativo) y variantes alélicas naturales. La expresión “FGFR3 de tipo natural” en general se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína FGFR3 natural. La expresión “secuencia de FGFR3 de tipo natural” se refiere en general a una secuencia de aminoácidos encontrada en un FGFR3 natural.

La expresión “ligando de FGFR3” (término intercambiable con “FGF”) como se usa en la presente memoria, se refiere, salvo que se especifique o el contexto indique otra cosa, a cualquier polipéptido ligando de FGFR3 natural o variante (sea natural o sintético) (por ejemplo, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17, FGF18, FGF23). La expresión “secuencia nativa” abarca específicamente formas truncadas naturales (p. ej., una secuencia de dominio extracelular o una secuencia de la subunidad transmembrana), formas variantes naturales (p. ej., formas de corte y empalme alternativo) y variantes alélicas naturales. La expresión “ligando de FGFR3 de tipo natural” en general se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína de ligando de FGFR3 natural. La expresión “secuencia de ligando de FGFR3 de tipo natural” se refiere en general a una secuencia de aminoácidos encontrada en un ligando de FGFR3 natural.

La “activación de FGFR3” se refiere a activación o fosforilación del receptor FGFR3. En general, la activación de FGFR3 produce la transducción de señales (p. ej., la producida por un dominio de quinasa intracelular de un receptor FGFR3 que fosforila restos de tirosina en FGFR3 o un polipéptido sustrato. La activación de FGFR3 puede ser mediada por la unión del ligando de FGFR a un receptor FGFR3 de interés. El ligando de FGFR3 (p. ej., tal como FGF1 o FGF9) que se une a FGFR3 puede activar un dominio de quinasa de FGFR3 y así producir la fosforilación de restos de tirosina en el FGFR3 y/o la fosforilación de restos de tirosina en polipéptido(s) sustrato(s) adicional(es).

El término “constitutivo” como se usa en la presente memoria, por ejemplo aplicado a la actividad de quinasa del receptor, se refiere a la actividad de señalización continua de un receptor que no depende de la presencia de un ligando o de otras moléculas activantes. Dependiendo de la naturaleza del receptor, toda la actividad puede ser constitutiva o la actividad del receptor se puede activar más por la unión de otras moléculas (p. ej., ligandos). Los sucesos celulares que conducen a la activación de receptores son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Por ejemplo la activación puede incluir oligomerización, p. ej., dimerización, trimerización etc. a complejos de receptores de orden superior. Los complejos pueden comprender una sola especie de proteína, es decir, un complejo homomérico. Alternativamente, los complejos pueden comprender al menos dos especies de proteínas diferentes, es decir, un complejo heteromérico. La formación de complejo puede ser producida, por ejemplo por el exceso de expresión de formas normales o mutantes del receptor en la superficie celular de una célula. La formación de complejo también puede ser producida por una mutación o mutaciones específicas en un receptor.

La expresión “independiente de ligando” como se usa en la presente memoria, aplicado por ejemplo a la actividad de señalización del receptor, se refiere a la actividad de señalización que no depende de la presencia de un ligando. Una actividad de quinasa independiente de ligando no excluirá necesariamente la unión del ligando a ese receptor para producir activación adicional de la actividad de quinasa.

La expresión “dependiente de ligando” como se usa en la presente memoria, aplicado por ejemplo a la actividad de señalización del receptor, se refiere a la actividad de señalización que depende de la presencia de un ligando.

La frase “amplificación de genes” se refiere a un procedimiento por el cual se forman múltiples copias de un gen o fragmento de gen en una célula o línea celular particular. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se denomina a menudo “amplicón”. Normalmente, la cantidad de ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión del gen, también aumenta en la proporción del número de copias hechas de un gen particular expresado.

Un “inhibidor de tirosina quinasa” es una molécula que inhibe en cierta medida la actividad de tirosina quinasa de un tirosina quinasa tal como un receptor FGFR3.

Un cáncer o muestra biológica que “presenta expresión, amplificación o activación de FGFR3” es uno que, en una prueba de diagnóstico expresa (incluyendo expresión en exceso) el FGFR3, ha amplificado el gen de FGFR3, y/o demuestra de otra forma la activación o fosforilación de un FGFR3.

Un cáncer o muestra biológica que “presenta activación de FGFR3” es uno que, en una prueba de diagnóstico demuestra activación o fosforilación de FGFR3. Dicha activación se puede determinar directamente (p.ej., midiendo la fosforilación de FGFR3 por ELISA) o indirectamente.

Un cáncer o muestra biológica que “presenta activación constitutiva de FGFR3” es uno que, en una prueba de diagnóstico, demuestra activación o fosforilación constitutiva de un FGFR3. Dicha activación se puede determinar directamente (p. ej., midiendo la fosforilación de c-FGFR3 por ELISA) o indirectamente.

Un cáncer o muestra biológica que “presenta amplificación de FGFR3” es uno que, en una prueba de diagnóstico, tiene el gen de FGFR3 amplificado.

Un cáncer o muestra biológica que “presenta translocación de FGFR3” es uno que, en una prueba de diagnóstico, tiene el gen de FGFR3 translocado. Un ejemplo de una translocación de FGFR3 es la translocación t(4;14), que ocurre en algunos tumores de mieloma múltiple.

Un “ensayo de fosfo-ELISA” en la presente memoria es un ensayo en el que se evalúa la fosforilación de uno o más de FGFR3, sustrato o moléculas de señalización corriente abajo, en un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) usando un reactivo, normalmente un anticuerpo, para detectar el FGFR3, sustrato o moléculas de señalización corriente abajo fosforilado. En algunas realizaciones, se usa un anticuerpo que detecta FGFR3 o pMAPK fosforilado. El ensayo se puede llevar a cabo en lisados celulares, preferiblemente de muestras biológicas recientes o congeladas.

Un cáncer o muestra biológica que “presenta activación de FGFR3 independiente de ligando” es uno que, en una prueba de diagnóstico, demuestra activación o fosforilación independiente de ligando de un FGFR3. Dicha activación se puede determinar directamente (p. ej., midiendo la fosforilación de FGFR3 por ELISA) o indirectamente.

Un cáncer o muestra biológica que “presenta activación de FGFR3 dependiente de ligando” es uno que, en una prueba de diagnóstico, demuestra activación o fosforilación dependiente de ligando de un FGFR3. Dicha activación se puede determinar directamente (p. ej., midiendo la fosforilación de FGFR3 por ELISA) o indirectamente.

Una célula cancerosa con “expresión en exceso o amplificación de FGFR3” es una que tiene niveles significativamente más altos de una proteína o gen de FGFR3 comparado con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Dicha expresión en exceso puede ser producida por la amplificación de genes o por transcripción o traducción aumentada. El exceso de expresión o amplificación de FGFR3 se puede determinar en un ensayo de diagnóstico o pronóstico evaluando niveles aumentados de la proteína FGFR3 presentes en la superficie de una célula (p. ej., por ensayo inmunohistoquímico; IHC). Alternativa o adicionalmente, se pueden medir los niveles de

ácido nucleico que codifica el FGFR3 en la célula, p. ej., por técnicas de hibridación in situ de fluorescencia (FISH; véase el documento WO98/45479 publicado en octubre, 1998), transferencia Southern, o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Por ejemplo, se pueden exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que está opcionalmente marcado con un marcador detectable, p. ej., un isótopo radiactivo, y se puede evaluar la unión del anticuerpo a las células en el paciente, p. ej., por cribado externo de la radiactividad o analizando una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo.

El término “mutación”, como se usa en la presente memoria, significa una diferencia en la secuencia de aminoácidos

o ácido nucleico de una proteína o ácido nucleico particular (gen, ARN) con respecto a la proteína o ácido nucleico de tipo natural, respectivamente. Una proteína o ácido nucleico mutado se puede expresar a partir de o encontrar en un alelo (heterocigoto) o ambos alelos (homocigoto) de un gen, y puede ser somático o de la línea germinal. En la presente invención, las mutaciones en general son somáticas. Las mutaciones incluyen reordenaciones de secuencia tales como inserciones, eliminaciones y mutaciones puntuales (incluyendo polimorfismos de un sólo nucleótido/aminoácido).

“Inhibir” es disminuir o reducir la actividad, función y/o cantidad comparado con una referencia.

Un agente tiene “actividad o función agonista” cuando un agente imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés (p. ej., ligando de FGFR, tal como FGF1 o FGF9).

Un “anticuerpo agonista”, como se usa en la presente memoria, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés (p. ej., ligando de FGFR, tal como FGF1 o FGF9).

La “expresión” de proteína se refiere a la conversión de la información codificada en un gen en ARN mensajero (ARNm) y después en proteína.

En la presente memoria, una muestra o célula que “expresa” una proteína de interés (tal como un receptor de FGF o ligando de receptor de FGF) es una en la que se determina que está presente en la muestra o célula el ARNm que codifica la proteína, o la proteína, incluyendo fragmentos de los mismos.

Un “inmunoconjugado” (denominado de forma intercambiable “conjugado de anticuerpo-fármaco” o “ADC”) significa un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (p. ej., una proteína de toxina, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

La expresión “región Fc”, como se usa en la presente memoria, se refiere en general a un complejo dímero que comprende secuencias de polipéptido C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde una secuencia de polipéptido C terminal es la que se puede obtener por digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fc puede comprender secuencias de Fc naturales o variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la secuencia de Fc de la cadena pesada de IgG humana normalmente se define por extenderse desde un resto de aminoácido alrededor de la posición Cys226, o desde aproximadamente la posición Pro230, al extremo carboxilo de la secuencia de Fc. La secuencia de Fc de una inmunoglobulina en general comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. La lisina C terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc se puede eliminar, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo, o por la modificación recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Por consiguiente, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región Fc de acuerdo con esta invención, puede comprender un anticuerpo con K447, con todos los K447 eliminados, o una mezcla de anticuerpos con o sin el resto K447.

Por “polipéptido de Fc” en la presente memoria se entiende uno de los polipéptidos que componen una región Fc. Un polipéptido de Fc se puede obtener de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 , IgA, IgE, IgD o IgM. En algunas realizaciones, un polipéptido de Fc comprende parte o todos de una secuencia bisagra de tipo natural (en general su extremo N). En algunas realizaciones, un polipéptido de Fc no comprende una secuencia bisagra funcional o de tipo natural.

Un anticuerpo “bloqueador” o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos bloqueadores o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben completamente la actividad biológica del antígeno.

Un “anticuerpo desnudo” es un anticuerpo que no está conjugado con una molécula heteróloga, tal como un resto citotóxico o radiomarcador.

Un anticuerpo que tiene una “característica biológica” de un anticuerpo designado, es uno que tiene una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno.

Con el fin de cribar anticuerpos que se unen a un epítopo o un antígeno unido por un anticuerpo de interés, se

puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado rutinario, como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988).

Para aumentar la semivida de los anticuerpos o secuencias de aminoácidos que contienen el polipéptido de esta invención, se puede unir un epítopo de unión al receptor de rescate al anticuerpo (en especial un fragmento de anticuerpo), como se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. 5.739.277. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un epítopo de unión al receptor de rescate se puede unir en el marco a un ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido de esta invención, de modo que la proteína de fusión expresada por la molécula de ácido nucleico genéticamente modificada comprende el epítopo de unión al receptor de rescate y una secuencia de polipéptido de esta invención. Como se usa en la presente memoria, la frase “epítopo de unión al receptor de rescate” se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable del aumento de la semivida en el suero in vivo de la molécula de IgG (p. ej., Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), Tabla 1). Anticuerpos con sustituciones en una región Fc de los mismos y mayores semividas, se describen también en los documentos WO00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)). En otra realización, la semivida en el suero también se puede aumentar, por ejemplo, uniendo otras secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, se pueden unir anticuerpos u otros polipéptidos útiles en los métodos de la invención a albúmina de suero o una parte de la albúmina de suero que se une al receptor FcRn o un péptido de unión a albúmina del suero de modo que la albúmina de suero se une al anticuerpo o polipéptido, p. ej., dichas secuencias de polipéptido se describen en el documento WO01/45746. En una realización preferida, el péptido que se va a unir a la albúmina de suero comprende la secuencia de aminoácidos DIGLPRWGCLW (SEQ ID NO: 183). En otra realización, la semivida de un Fab se aumenta por estos métodos. Véase también, Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002), para las secuencias de péptidos que se unen a albúmina de suero.

Por “fragmento” se entiende una parte de un polipéptido o molécula de ácido nucleico que contiene, preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o más, de la longitud entera de la molécula de ácido nucleico o polipéptido de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100, 200, 300, 400, 500, 600, o más nucleótidos, o 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 aminoácidos o más.

La frase “función poco agonista o no agonista” con respecto a un anticuerpo de la invención, como se usa en la presente memoria, significa que el anticuerpo no produce una cantidad biológicamente significativa de actividad agonista, p. ej., tras la administración a un sujeto. Como se entenderá en la técnica, la cantidad de una actividad se puede determinar cuantitativa o cualitativamente, siempre que se pueda hacer una comparación entre un anticuerpo de la invención y un homólogo de referencia. La actividad se puede medir o detectar de acuerdo con cualquier ensayo o técnica conocida en la materia, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la presente memoria. La cantidad de actividad para un anticuerpo de la invención y su homólogo de referencia se puede determinar en paralelo o en experimentos separados. En algunas realizaciones, un anticuerpo bivalente no tiene función agonista sustancial.

Los términos “apoptosis” y “actividad apoptótica” se usan en un sentido amplio y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que normalmente va acompañada de uno o más cambios celulares característicos, incluyendo condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de función mitocondrial. Esta actividad se puede determinar y medir usando técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, por ensayos de viabilidad celular, análisis por FACS o electroforesis de ADN, y más específicamente por unión de anexina V, fragmentación de ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamados cuerpos apoptóticos).

Los términos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” se usan de forma intercambiable en el sentido más amplio, e incluyen anticuerpos monoclonales (p. ej., anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos siempre que presenten la actividad biológica deseada) y también pueden incluir algunos fragmentos de anticuerpos (como se describe con mayor detalle en la presente memoria). Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o de afinidad madurada.

El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos, y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida por todo el dominio variable de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se llaman la región armazón (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno 4 regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina ß, conectadas por 3 CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina ß. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas muy cerca por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un

antígeno, pero presentan varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja la capacidad de cristalizar rápidamente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y todavía es capaz de reacción cruzada con el antígeno.

“Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión al antígeno completo. En una especie de Fv de dos cadenas, esta región consiste en un dímero del dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En una especie Fv de una sola cadena, el dominio variable de una cadena pesada y de una cadena ligera pueden estar unidos covalentemente mediante un conector peptídico flexible, de modo que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en un análogo de estructura “dímera” a una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero de VH-VL. De forma colectiva, las 6 CDR confieren especificidad de unión del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo 3 CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión entero.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos restos al extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada, que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la designación en la presente memoria para Fab’ en el que el o los restos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab`)2 se producían originalmente como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las “cadenas ligeras” de anticuerpos (inmunoglobulinas) de muchas especies de vertebrados se pueden asignar a uno o dos tipos claramente distintos, llamados kappa (κ) y lambda (), basándose en la secuencia de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay 5 tipos principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman α, δ, ε, γ, y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden solo una parte de un anticuerpo intacto, en donde la parte preferiblemente retiene al menos una, preferiblemente la mayor parte o todas las funciones normalmente asociadas con la parte cuando está presente en un anticuerpo intacto. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; fragmentos bivalentes; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una cadena; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En una realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo intacto, y por lo tanto retiene la capacidad de unirse al antígeno. En otra realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región Fc, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como unión a FcRn, modulación de la semivida del anticuerpo, función de ADCC y unión del complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto, Dicho fragmento de anticuerpo puede comprender, por ejemplo un brazo de unión al antígeno unido a una secuencia de Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.

La expresión "región hipervariable", “HVR” o “HV”, cuando se usa en la presente memoria, se refiere a las regiones de un dominio variable del anticuerpo que tienen secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). Se usan una serie de definiciones de región hipervariable y están abarcadas en la presente memoria. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las más frecuentemente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en cambio a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan en el programa de modelación de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. A continuación se indican los restos de cada una de estas regiones hipervariables.

Bucle: Kabat AbM Chothia Contacto

L1: L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2: L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3: L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1: H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(Numeración de Kabat)

H1: H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(Numeración de Chothia)

H2: H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3: H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Las regiones hipervariables pueden comprender las "regiones hipervariables extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en la VH. Los restos del dominio variable se numeran según Kabat et al., citado anteriormente, para cada una de estas definiciones.

Los restos de la “región armazón" o "FR" son los restos del dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se reemplazan restos de una región hipervariable del receptor por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan restos de la región armazón (FR) de la inmunoglobulina humana por restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, los anticuerpos humanizados comprenderán sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428433 (1994).

Los anticuerpos (inmunoglobulinas) “quiméricos” tienen una parte de la cadena pesada y/o ligera idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la o las cadenas son idénticas u homólogas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presentan la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). El anticuerpo humanizado, como se usa en la presente memoria, es un subconjunto de los anticuerpos quiméricos.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios de VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido scFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun enThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).

Un “antígeno” es un antígeno predeterminado al que se puede unir selectivamente un anticuerpo. El antígeno diana puede ser polipéptido, hidrato de carbono, ácido nucleico, hapteno u otro compuesto natural o sintético. Preferiblemente, el antígeno diana es un polipéptido.

La expresión “fragmentos bivalentes" se refiere a fragmentos pequeños de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH -VL). Mediante el uso de un conector que es

demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los fragmentos bivalentes se describen con más detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).

Un “anticuerpo humano” es uno que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha hecho usando cualquiera de las técnicas para hacer anticuerpos humanos como se describe en la presente memoria. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión al antígeno no humanos.

Un anticuerpo de “afinidad madurada” es uno con una o más alteraciones en una o más de sus CDR que dan como resultado la mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, comparado con un anticuerpo original que no tiene esa o esas alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madurada preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos de afinidad madurada se producen por procedimientos bien conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración de afinidad mediante el barajado de dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o restos de la región armazón se describe en: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al.,

J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Las “funciones efectoras” del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia natural o región Fc de secuencia de aminoácidos variante) de un anticuerpo, y varía con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; unión a receptores del Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.

“Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo” o “ADCC” se refieren a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretada unida a receptores del Fc (FcR) presentes en algunas células citotóxicas (p. ej., linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que lleva antígeno y posteriormente maten la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos “arman” a las células citotóxicas y son absolutamente necesarias para dicha muerte. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan FcγRIII solo, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de Estados Unidos nº

5.500.362 o 5.821.337, o Presta, patente de EE.UU. nº 6.737.056. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Alternativamente,

o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

Las “células efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos FcγRIII y realizan la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; prefiriéndose las células PBMC y NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente natural, por ejemplo, de sangre.

Los términos "receptor de Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII, y FcγRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un "receptor activante") y FcγRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de las mismas. El receptor activante FcγRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático (véase la revisión en Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 55 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se van a identificar en el futuro, están comprendidos por el término “FcR” en la presente memoria. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol.

24:249 (1994)) y regula la homeostasia de inmunoglobulinas. El documento WO 00/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcR. Véase también, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

Los métodos para medir la unión a FcRn se conocen (véase, p. ej., Ghetie 1997, Hinton 2004). Se puede evaluar la unión al FcRn humano in vivo y la semivida en el suero de polipéptidos que se unen con alta afinidad al FcRn humano, p. ej. en ratones transgénicos o en líneas celulares humanas transfectadas que expresan el FcRn humano,

o en primates a los que se ha administrado polipéptidos variantes de Fc.

La “citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refieren a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase adecuada) que están unidos a su antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC, p. ej., como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Se describen variantes de polipéptidos con las secuencias de aminoácidos de la región Fc alteradas y mayor o menor capacidad de unión a C1q, en la patente de EE.UU. nº 6.194.551B1 y WO 99/51642. Véase también, Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).

La expresión “polipéptido que comprende la región Fc” se refiere a un polipéptido, tal como un anticuerpo o inmunoadhesina, que comprende la región Fc. La lisina C terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc se puede eliminar, por ejemplo, durante la purificación del polipéptido, o por la modificación recombinante del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Por consiguiente, una composición que comprende un polipéptido que tiene una región Fc de acuerdo con esta invención, puede comprender un polipéptidos con K447, con todos los K447 eliminados, o una mezcla de polipéptidos con o sin el resto K447.

Una “región armazón humana aceptora” para los propósitos de la presente memoria es una región armazón que comprende la secuencia de aminoácidos de una región armazón de VL o VH derivada de una región armazón de inmunoglobulina humana, o de una región armazón consenso humana. Una región armazón humana aceptora “derivada de” una región armazón de inmunoglobulina humana, o de una región armazón consenso humana puede comprender su misma secuencia de aminoácidos, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos preexistente. Cuando hay cambios de los aminoácidos preexistentes, preferiblemente no hay más de 5 y preferiblemente 4 o menos, o 3 o menos, cambios de aminoácidos preexistentes. Cuando hay cambios de los aminoácidos preexistentes en una VH, preferiblemente esos cambios son solo en 3, 2 o 1 de las posiciones 71H, 73H, y 78H; por ejemplo, los restos de aminoácidos en estas posiciones pueden ser 71A, 73T, y/o 78A. En una realización, la región armazón humana aceptora de VL es de secuencia idéntica a la secuencia de la región armazón de inmunoglobulina humana de VL, o la secuencia de la región armazón consenso humana.

Una "región armazón consenso humana" es una región armazón que representa el resto de aminoácido que se encuentra con más frecuencia en una selección de secuencias de la región armazón de VH o VL de inmunoglobulina humana. En general, la selección de las secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al. En una realización, para la VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I como en Kabat et al. En una realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al.

Una "región armazón consenso de subgrupo III de VH" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III de la cadena pesada variable de Kabat et al. En una realización, la secuencia de aminoácidos de la región armazón consenso de subgrupo III de VH comprende al menos una parte o todas de cada una de las siguientes secuencias:

Una "región armazón consenso de subgrupo I de VL" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo I de kappa de la cadena ligera variable de Kabat et al. En una realización, la secuencia de aminoácidos de la región armazón consenso de subgrupo I de VH comprende al menos una parte o todas de cada una de las siguientes secuencias:

Como se usa en la presente memoria, “mutante de anticuerpo” o “variante de anticuerpo” se refiere a una variante de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo en donde se han modificado uno o más de los restos de aminoácidos del anticuerpo dependiente de la especie. Dichos mutantes necesariamente tienen una identidad o similitud de secuencia menor de 100% con el anticuerpo dependiente de la especie. En una realización, el mutante de anticuerpo tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo

dependiente de la especie, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95%. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en la presente memoria como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia candidata que es idéntico (es decir, mismos restos) o similar (es decir, restos de aminoácidos del mismo grupo basado en las propiedades de la cadena lateral, véase más adelante) a los restos del anticuerpo dependiente de la especie, después de alineación de las secuencias e introducción de huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones N terminales, C terminales o internas, eliminaciones o inserciones en la secuencia del anticuerpo fuera del dominio variable se considerará que afecte a la identidad o similitud de secuencia.

Un “trastorno” o “enfermedad” es cualquier afección que podría beneficiarse del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se tratan en la presente memoria incluyen tumores malignos y benignos; carcinoma, blastoma y sarcoma.

“Tratamiento” se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen un tumor benigno, precanceroso o no metastásico, así como en los que se va a prevenir la aparición o reaparición de cáncer.

La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso de cánceres, la cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor principal; inhibir (es decir, ralentizar en alguna medida y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en alguna medida y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en alguna medida, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en alguna medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o matar las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia in vivo se puede medir, por ejemplo evaluando la duración de la supervivencia, el tiempo de evolución de la enfermedad (TTP), las tasas de respuesta (RR), duración de la respuesta y/o calidad de vida.

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento celular no regulado. Están incluidos en esta definición los cánceres benignos y malignos. Por “cáncer en etapa temprana” o “tumor en etapa temprana” se entiende un cáncer que no es invasivo o metastásico o se clasifica como cáncer en etapa 0, I o II. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma (incluyendo meduloblastoma y retinoblastoma), sarcoma (incluyendo liposarcoma y sarcoma de células sinoviales), tumores neuroendocrinos (incluyendo tumores carcinoides, gastrinoma y cáncer de células de los islotes), mesotelioma, schwannoma (incluyendo neuroma acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma, y leucemia o tumores malignos linfoides. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (p. ej. cáncer epitelial de células escamosas), cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama (incluyendo cáncer de mama metastásico), cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer renal o de riñón, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer testicular, cáncer esofágico, tumores del tracto biliar, así como cáncer de cabeza y cuello y mieloma múltiple.

El término “precanceroso” se refiere a una afección o un crecimiento que típicamente precede o que evoluciona a un cáncer. Un crecimiento “precanceroso” tendrá células que se caracterizan por la regulación del ciclo, proliferación o diferenciación celulares anómalos, que se pueden determinar mediante marcadores de regulación del ciclo celular, proliferación celular o diferenciación.

Por “displasia” se entiende cualquier crecimiento anómalo o desarrollo de tejido, órgano o células. Preferiblemente, la displasia es un grado alto o precanceroso.

Por “metástasis” se entiende la extensión del cáncer desde su sitio primario a otros sitios en el cuerpo. Las células de cáncer se pueden romper del tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, circular por el torrente sanguíneo, y crecer en un centro distante (metastatizar) en tejidos normales en cualquier parte del cuerpo. La metástasis puede ser local o distante. La metástasis es un proceso secuencial, dependiente de células tumorales que se rompen del tumor primario, viajan por el torrente sanguíneo y se detienen en un sitio distante. En el nuevo sitio, las células establecen un suministro de sangre y pueden crecer para formar una masa potencialmente mortal.

Tanto las rutas moleculares estimuladoras como inhibidoras dentro de la célula del tumor regulan este comportamiento, y también son importantes las interacciones entre la célula del tumor y las células hospedantes en el sitio distante.

Por “no metastásico” se entiende un cáncer que es benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema linfático o de vasos sanguíneos o los tejidos distintos del sitio primario. En general, un cáncer no metastásico es cualquier cáncer que es un cáncer en la etapa 0, I o II y ocasionalmente un cáncer en la etapa III.

Por “tumor primario” o “cáncer primario” se entiende el cáncer original y no una lesión metastásica localizada en otro tejido, órgano o ubicación en el cuerpo del sujeto.

Por “tumor benigno” o “cáncer benigno” se entiende un tumor que permanece localizado en el sitio de origen y no tiene la capacidad de infiltrarse, invadir o metastatizar en un sitio distante.

Por “carga tumoral” se entiende el número de células cancerosas, el tamaño del tumor o la cantidad de cáncer en el cuerpo. La carga tumoral también se denomina “carga de tumor”.

Por “número tumoral” se entiende el número de tumores.

Por “sujeto” se entiende un mamífero, incluyendo, pero no limitado a un mamífero humano o no humano, tal como bovino, equino, canino, ovino o felino. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

La expresión “terapia anticancerosa” se refiere a una terapia útil para el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes terapéuticos anticancerosos incluyen, pero no se limitan a, p. ej., agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en terapia de radiación, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, agentes antitubulina, y otros agentes para tratar el cáncer, anticuerpos anti-CD20, inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (p. ej., Gleevec™ (Imatinib Mesylate)), un inhibidor de COX-2 (p. ej., celecoxib), interferones, citoquinas, antagonistas (p. ej., anticuerpos neutralizantes) que se unen a uno o más de las siguientes dianas receptor(s) de ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA o VEGF, TRAIL/Apo2, y otros agentes químicos orgánicos y bioactivos, etc. Las combinaciones de los mismos también están incluidas en la invención.

La expresión “agente citotóxico” como se usa en la presente memoria se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o produce la destrucción de las células. La expresión pretende incluir isótopos radiactivos (p. ej., I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos.

Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepá y ciclofosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; acetogeninas (en especial bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; esponjistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro del óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enodiino (p. ej., calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma II y la calicheamicina omega II (véase p. ej., Agnew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y antibióticos enodiino cromoproteínas cromóforos), aclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, cromomicinas, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, cinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; restablecedores del ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaciquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaciquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbacina; manomustina;

mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepá; taxoides, p. ej. paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE™ (sin cremóforos), formulaciones de nanopartículas diseñadas con albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y docetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina Gemzar®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina, NAVELBINE® (vinorelbina); novantrona; tenipósido, edatrexato, daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar, CPT-11) (incluyendo el tratamiento de irinotecán con 5-FU y leucovorin); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como el ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; bortezomib VELCADE; lenalidomida REVLIMID; leucovorin (LV); oxaliplatino, incluyendo el régimen de tratamiento con oxaliplatino (FOLFOX); inhibidores de PKCalfa, Raf, H-Ras, EGFR (p. ej., erlotinib (Tarceva™)) y VEGF-A, que reducen la proliferación celular y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

En esta definición también están incluidos agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM) incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno FARESTON®; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano de nucleósido de citosina); oligonucleótidos de sentido contrario, en particular los que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicados en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Ralf y H-Ras; ribozimas, tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (por ejemplo, ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas, tales como vacunas para terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; un inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; vinorelbina y esperamicinas (véase la patente de EE.UU. nº 4.675.187) y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

El término “profármaco” como se usa en esta solicitud se refiere a una forma de precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica contra las células tumorales comparado con el fármaco original y es capaz de ser activado enzimáticamente o ser convertido en la forma original más activa. Véase, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pág. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986), y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pág. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero no se limitan a profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para usar en esta invención incluyen, pero no se limitan a los agentes quimioterapéuticos descritos antes.

Por “terapia de radiación” se entiende el uso de rayos gamma o rayos beta dirigidos para inducir suficiente daño en una célula para así limitar su capacidad para funcionar de forma normal o para destruir la célula entera. Se observará que habrá muchas formas conocidas en la técnica para determinar la dosis y duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se dan como una administración de una vez y el intervalo de dosis típico es de 10 a 200 unidades (Grays) por día.

Una “muestra biológica” (denominada de forma intercambiable “muestra” o “muestra de tejido o célula”) abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un individuo y se pueden usar en un ensayo de diagnóstico o de seguimiento. La definición abarca muestras de sangre y de otros líquidos de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos, y la progenie de los mismos. La definición también incluye muestras que se han manipulado de cualquier forma después de obtenerlas, tal como por tratamiento con reactivos, solubilización, o enriquecimiento para algunos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos, o insertadas en una matriz semisólida o sólida con fines de seccionamiento. La expresión “muestra biológica” abarca una muestra clínica, y también incluye células en cultivo, líquidos sobrenadantes de células, lisatos celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejidos. La fuente de la muestra biológica puede ser tejido sólido, tal como de un órgano reciente, congelado y/o conservado o muestra de tejido o biopsia o aspirado; sangre o cualquier constituyente de la sangre; líquidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial; células de cualquier momento de la gestación o el desarrollo del individuo. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un tumor primario o metastásico. La muestra biológica puede contener compuestos que no se entremezclan de forma natural con el tejido en la naturaleza tal como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos, o similares.

Para los fines de la presente memoria, por una “sección” de una muestra de tejido se entiende una sola parte o trozo

de una muestra de tejido, p. ej., un corte fino de tejido o células cortado de una muestra de tejido. Se entiende que se pueden tomar múltiples secciones de muestras de tejidos y someterlas a análisis de acuerdo con la presente invención. En algunas realizaciones, la misma sección de la muestra de tejido se analiza tanto a nivel morfológico como molecular, o se analiza con respecto tanto a las proteínas como ácidos nucleicos.

La palabra “marcador” cuando se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto o composición que está conjugado o fusionado directa o indirectamente con un reactivo tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo y facilita la detección del reactivo al que está conjugado o fusionado. El marcador puede ser el mismo detectable (p. ej., marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto sustrato o composición que es detectable.

Composiciones y métodos de la invención

La invención abarca composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo anti-FGFR3; y polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican un anticuerpo anti-FGFR3 como se define en las reivindicaciones. Como se usa en la presente memoria, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen al FGFR3, y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos que se unen al FGFR3. Estas composiciones pueden comprender además vehículos adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables incluyendo tampones, que son bien conocidos en la técnica.

La invención también abarca realizaciones de anticuerpo y polinucleótido aislado, como se define en las reivindicaciones. La invención también abarca realizaciones de anticuerpo y polinucleótido sustancialmente puro, como se define en las reivindicaciones.

La invención también abarca un anticuerpo anti-FGFR3 (como se describe en la presente memoria) para usar en un método de tratamiento de un trastorno, p. ej., mieloma múltiple o carcinoma de etapa transicional (p. ej., carcinoma de etapa transicional invasiva), como se define en las reivindicaciones.

Composiciones

Los anticuerpos anti-FGFR3 preferiblemente son monoclonales. También están abarcados los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH y F(ab')2 de los anticuerpos anti-FGFR3 proporcionados en la presente memoria. Estos fragmentos de anticuerpos se pueden crear por medios tradicionales, tales como digestión enzimática, o se pueden generar por técnicas recombinantes. Dichos fragmentos de anticuerpos pueden ser quiméricos o humanizados. Estos fragmentos son útiles para fines de diagnóstico y terapéutico, expuestos más adelante.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las mutaciones naturales posibles que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Por lo tanto, el modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos.

Los anticuerpos monoclonales anti-FGFR3 se pueden hacer usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden hacer por métodos de ADN recombinantes (patente de EE.UU. nº 4.816.567).

En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedante adecuado, tal como un hámster, se inmuniza para producir linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Los anticuerpos contra el FGFR3 se pueden generar en animales por inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de FGFR3 y un adyuvante. El FGFR3 se puede preparar usando métodos bien conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen con más detalle en la presente memoria. Por ejemplo, se describe más adelante la producción recombinante de FGFR3 humano y de ratón. En una realización, los animales se inmunizan con un FGFR3 fusionado con la parte Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización preferida, los animales se inmunizan con una proteína de fusión FGFR3-IgG1. Los animales normalmente se inmunizan contra conjugados inmunógenos o derivados de FGFR3 con monofosforil-lípido A (MPL)/dicrinomicolato de trealosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) y la solución se inyecta por vía intradérmica en múltiples sitios. Dos semanas después se lleva a cabo el refuerzo de los animales. De 7 a 14 días más tarde los animales se desangran y se ensaya en el suero la valoración anti-FGFR3. Se lleva a cabo el refuerzo en los animales hasta valoración estable.

Alternativamente, se pueden inmunizar linfocitos in vitro. Los linfocitos después se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en

HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan nivel de producción alto estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estos, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE.UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EE.UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratónhumano, para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Se evalúa en el medio de cultivo en el que se desarrollan las células de hibridoma la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra FGFR3. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución límite y desarrollo por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado para este objetivo incluye, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores con ascitis en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos anti-FGFR3 se pueden hacer usando bibliotecas combinatorias para cribar los clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o actividades deseadas. En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan por cribado de bibliotecas de fagos que contienen fagos que presentan diferentes fragmentos de la región variable (Fv) del anticuerpo fusionada a la proteína de recubrimiento de fago. Dichas bibliotecas de fagos se criban por cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Los clones que expresan los fragmentos Fv capaces de unirse al antígeno deseado son adsorbidos en el antígeno y por lo tanto separados de los clones que no se unen en la biblioteca. Los clones unidos después se eluyen del antígeno, y se pueden enriquecer además por ciclos adicionales de adsorción de antígeno/elución. Cualquiera de los anticuerpos anti-FGFR3 de la invención se puede obtener diseñando un procedimiento de cribado con antígeno adecuado para seleccionar el clon de fago de interés, seguido de la construcción de un clon de anticuerpo anti-FGFR3 de longitud completa usando las secuencias de Fv del clon de fago de interés y las secuencias de la región constante (Fc) adecuadas descritas en Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

El dominio de unión al antígeno de un anticuerpo se forma a partir de dos regiones variables (V) de aproximadamente 110 aminoácidos, cada una de ellas de la cadena ligera (VL) y pesada (VH), que presentan ambas tres bucles hipervariables o regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Los dominios variables se pueden presentar funcionalmente en fagos, sea como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) en los que VH y VL están unidas covalentemente por un péptido flexible corto, o como fragmentos Fab, en los que están fusionada a un dominio constante e interaccionan de forma no covalente, como describen Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Como se usa en la presente memoria, los clones de fago que codifican el scFv y los clones de fago que codifican el Fab se denominan colectivamente “clones de fago de Fv” o “clones de Fv”.

Se pueden clonar por separado repertorios de genes de VH y VL por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar aleatoriamente en bibliotecas de fagos, en las que después se pueden buscar clones de unión al antígeno, como describen Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad contra el inmunógeno sin requerir la construcción de hibridomas. Alternativamente, el repertorio virgen se puede clonar para proporcionar una sola fuente de anticuerpos humanos contra una amplia variedad de antígenos no autoantígenos y también de autoantígenos sin ninguna inmunización como describen Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas vírgenes también se pueden hacer de forma sintética por clonación de segmentos de gen-V no reorganizado de citoblastos, y usando cebadores de PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y llevar a cabo la reorganización in vitro como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

El fago filamentoso se usa para presentar fragmentos de anticuerpo por fusión con la proteína de recubrimiento

menor pIII. Los fragmentos de anticuerpos se pueden presentar como fragmentos Fv monocatenarios, en los que los dominios VH y VL están conectados en la misma cadena de polipéptido por un espaciador polipeptídico flexible, p. ej., como describen Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en los que una cadena está fusionada con pIII y la otra es secretada en el periplasma de la célula hospedante bacteriana donde se forma la estructura de Fab-proteína de recubrimiento que se presenta en la superficie del fago desplazando algunas de las proteínas de recubrimiento de tipo natural, p. ej., como describen Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 41334137 (1991).

En general, los ácidos nucleicos que codifican los fragmentos génicos de anticuerpos se obtienen de células inmunes recogidas de seres humanos o animales. Si se desea una biblioteca sesgada en favor de los clones anti-FGFR3, el individuo se inmuniza con FGFR3 para generar una respuesta de anticuerpos, y las células del bazo y/o linfocitos B de la circulación distintos de los linfocitos de la sangre periférica (PBL) son recuperados de la construcción de la biblioteca. En una realización preferida, una biblioteca de fragmentos de genes de anticuerpo humano sesgada en favor de clones anti-FGF3 se obtiene generando una respuesta de anticuerpos anti-FGFR3 en ratones transgénicos que llevan una matriz de genes de inmunoglobulina humana funcionales (y que carecen de un sistema de producción de anticuerpos endógeno funcional) de modo que la inmunización con FGFR3 produce linfocitos B que producen anticuerpos humanos contra FGFR3. La generación de ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos se describe más adelante.

El enriquecimiento adicional de poblaciones de células reactivas anti-FGFR3 se puede obtener usando un procedimiento de cribado adecuado para aislar linfocitos B que expresan anticuerpos unidos a membrana específicos de FGFR3, p. ej., por separación de células con cromatografía de afinidad de FGFR3 o adsorción de células a FGFR3 marcado con fluorocromo, seguido de separación de células activada por flujo (FACS).

Alternativamente, el uso de células de bazo y/o linfocitos B u otros PBL de un donador inmunizado proporciona una mejor representación del repertorio de anticuerpos posible, y también permite la construcción de una biblioteca de anticuerpos usando cualquier especie animal (humano o no humano) en el que el FGFR3 no sea antigénico. Para las bibliotecas que incorporan construcción de gen de anticuerpo in vitro, se recogen citoblastos del individuo para proporcionar ácidos nucleicos que codifican segmentos de genes de anticuerpo no reorganizados. Las células inmunes de interés se pueden obtener de una variedad de especies animales, tales como ser humano, ratón, rata, lagomorfo, especies lupina, canina, felina, porcina, bovina, equina, y aviar, etc.

El ácido nucleico que codifica los segmentos de genes variables del anticuerpo (incluyendo los segmentos VH y VL) se recupera de las células de interés y se amplifica. En el caso de bibliotecas de genes de VH y VL reorganizados, el ADN deseado se puede obtener aislando el ADN genómico o ARNm de linfocitos seguido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que corresponden a los extremos 5’ y 3’ de los genes de VH y VL reorganizados como describen Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), haciendo así repertorios diversos del gen de V para la expresión. Los genes de V se pueden amplificar a partir del ADNc y ADN genómico, con cebadores inversos en el extremo 5’ del exón que codifica el dominio V maduro y cebadores directos basados en los segmentos J como describen Orlandi et al. (1989) y Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Sin embargo, para amplificar a partir del ADNc, los cebadores inversos también se pueden basar en el exón líder como describen Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), y los cebadores directos dentro de la región constante como describen Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)). Para maximizar la complementariedad, se puede incorporar degeneración en los cebadores como describen Orlandi et al. (1989) o Sastry et al. (1989). Preferiblemente, la diversidad de la biblioteca se maximiza usando cebadores de PCR dirigidos a cada uno de la familia de genes de V con el fin de amplificar todas las organizaciones de VH y VL disponibles presentes en la muestra de ácido nucleico de la célula inmune, p. ej., como se describe en el método de Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) o como se describe en el método de Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, se pueden introducir sitios de restricción raros dentro del cebador de la PCR como un marcador en un extremo como describen Orlandi et al. (1989), o por amplificación por PCR adicional con un cebador marcado como describen Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Los repertorios de genes de V sintéticamente reorganizados se pueden obtener de segmentos de genes de V. La mayoría de los segmentos de genes de VH humanos se han clonado y secuenciado (descrito en Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), y cartografiado (descrito en Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluyendo todos las conformaciones principales del bucle H1 y H2) se pueden usar para generar repertorios de genes de VH diversos con cebadores de PCR que codifican los bucles H3 de secuencia y longitud diversa como describen Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Los repertorios de VH también se pueden hacer con toda la diversidad de secuencias centrada en un bucle H3 largo de una sola longitud como describen Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Los segmentos de Vκ y Vλ han sido clonados y secuenciados (descrito por Williams y Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) y se pueden usar para hacer repertorios de cadena ligera sintéticos. Los repertorios de genes de V sintéticos, basados en una variedad de plegados de VH y VL, y longitudes de L3 y H3, codificarán anticuerpos de diversidad estructural considerable. Después de amplificación de los ADN que codifican el gen de V, los segmentos del gen de V de la línea germinal se pueden reorganizar in vitro de acuerdo con los métodos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol.,

227: 381-388 (1992).

Se pueden construir repertorios de fragmentos de anticuerpos combinando los repertorios de genes de VH y VL de varias formas. Cada repertorio se puede crear en diferentes vectores, y los vectores recombinados in vitro, p. ej., como describen Hogrefe et al., Gene, 128:119-126 (1993), o in vivo por infección combinatoria, p. ej., el sistema loxP descrito en Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993). El procedimiento de recombinación in vivo explota la naturaleza de dos cadenas de los fragmentos Fab para superar el límite en el tamaño de la biblioteca impuesto por la eficacia de transformación de E. coli. Los repertorios de VH y VL vírgenes se clonan por separado, uno en un fagémido y el otro en un vector de fago. Después, las dos bibliotecas se combinan por infección por fagos de bacterias que contienen fagémido, de modo que cada célula contiene una combinación diferente, y el tamaño de la biblioteca está limitado solo por el número de células presentes (aproximadamente 1012 clones). Ambos vectores contienen señales de recombinación in vivo, de modo que los genes de VH y VL se recombinan en un solo replicón y son empaquetados simultáneamente en viriones de fagos. Estas grandes bibliotecas proporcionan un gran número de anticuerpos diversos de buena afinidad (Kd -1 de aproximadamente 10-8 M).

Alternativamente, los repertorios se pueden clonar secuencialmente en el mismo vector, p. ej., como describen Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991), o ensamblar juntos por PCR y después clonar, p. ej. como describen Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). El ensamblaje por la PCR también se puede usar para juntar los ADN de VH y VL con el ADN que codifica un espaciador peptídico flexible para formar los repertorios de Fv monocatenarios (scFv). En otra técnica más, el “ensamblado por PCR en la célula” se usa para combinar los genes de VH y VL dentro de los linfocitos por PCR y después clonar los repertorios de los genes unidos, como describen Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20:3831-3837 (1992).

Los anticuerpos producidos por bibliotecas vírgenes (sean naturales o sintéticas) pueden ser de afinidad moderada (Kd -1 de aproximadamente 106 a 107 M-1), pero la maduración de afinidad también se puede imitar in vitro construyendo y reseleccionando a partir de bibliotecas secundarias como describen Winter et al. (1994), véase antes. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente in vitro usando polimerasa propensa a error (descrita en Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989)) en el método de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) o en el método de Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Además, la maduración de afinidad se puede llevar a cabo por mutación aleatoria de una o más CDR, p. ej., usando la PCR con cebadores que llevan secuencia aleatoria que expande la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y cribado de los clones de mayor afinidad. El documento WO 96/07754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describía un método para inducir la mutagénesis en una región determinante de la complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una biblioteca de genes de cadena ligera. Otro procedimiento eficaz es recombinar los dominios VH y VL seleccionados por presentación en fago con repertorios de variantes del domino V naturales obtenidos de donantes inmunizados y cribados por la mayor afinidad en varios ciclos de reintercambio de cadenas, como describen Marks et al., Biotechnol., 10:779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo de10-9 M.

El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos del FGFR3 son conocidos en la técnica. La secuencia de ácido nucleico que codifica el FGFR3 se puede diseñar usando la secuencia de aminoácidos de la región deseada del FGFR3. Como se sabe bien en la técnica, hay dos isoformas de empalme principales de FGFR3, FGFR3 IIIb y FGFR3 IIIc. Las secuencias del FGFR3 son bien conocidas en la técnica y pueden incluir la secuencia de UniProKB/Swiss-Prot de número de acceso P22607 (FGFR3 IIIc) o P22607_2 (FGFR3 IIIb). Las mutaciones de FGFR3 se han identificado y son bien conocidas en la técnica e incluyen las siguientes mutaciones (con referencia a las secuencias mostradas en UniProKB/Swiss-Prot número de acceso P22607 (FGFR3 IIIc) o P22607_2 (FGFR3

IIIb):

FGFR3-IIIb: FGFR3 IIIc

R248C
R248C

S249C
S249C

G372C: G370C

Y375C: Y373C

G382R: G380R

K652E: K650E

Los ácidos nucleicos que codifican el FGFR3 se pueden preparar por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a síntesis química por cualquiera de los métodos descritos en Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989), tal como los métodos de triéster, fosfito, fosfoamidita y H-fosfonato. En una realización, se usan los codones preferidos por la célula hospedante de expresión en el diseño del ADN que codifica el FGFR3. Alternativamente, el ADN que codifica FGFR3 se puede aislar de una biblioteca genómica o de ADNc.

Después de la construcción de la molécula de ADN que codifica el FGFR3, la molécula de ADN se une

operativamente a una secuencia de control de la expresión en un vector de expresión, tal como un plásmido, en donde la secuencia de control es reconocida por una célula hospedante transformada con el vector. En general, los vectores plasmídicos contienen secuencias de replicación y de control que se obtienen de especies compatibles con la célula hospedante. El vector normalmente lleva un sitio de replicación así como secuencias que codifican proteínas que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Los vectores adecuados para la expresión en células hospedantes procariotas y eucariotas se conocen en la técnica y algunas se describen con más detalle en la presente memoria. Se pueden usar organismos eucariotas, tales como levaduras, o células derivadas de organismos multicelulares, tales como mamíferos.

Opcionalmente, el ADN que codifica el FGFR3 se une operativamente a una secuencia líder secretora que produce la secreción del producto de expresión por la célula hospedante en el medio de cultivo. Los ejemplos de secuencias líder secretoras incluyen stII, ecotin, lamB, herpes GD, lpp, fosfatasa alcalina, invertasa, y factor alfa. También es adecuada para usar en la presente memoria la secuencia líder de 36 aminoácidos de la proteína A (Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985)).

Las células hospedantes se transfectan y preferiblemente se transforman con los vectores de expresión o clonación de esta invención descritos antes y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para inducir promotores, transformantes de selección o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la absorción de un vector de expresión por una célula hospedante sean expresadas o no de hecho secuencias codificantes. Los expertos en la técnica conocen numerosos métodos de transfección, por ejemplo, precipitación con CaPO4 y electroporación. La transfección satisfactoria se reconoce en general cuando se produce cualquier indicación de la operación de este vector en la célula hospedante. Los métodos de transfección son bien conocidos en la técnica y algunos se describen con más detalle en la presente memoria.

Transformación significa introducir ADN en un organismo de modo que el ADN es replicable, sea como un elemento extracromosómico o por integración cromosómica. Dependiendo de la célula hospedante usada, la transformación se hace usando técnicas convencionales adecuadas para dichas células. Los métodos para la transformación son bien conocidos en la técnica, y algunos se describen con más detalle en la presente memoria.

Las células hospedantes procariotas usadas para producir el FGFR3, se pueden cultivar como se describe en general en Sambrook et al., véase antes.

Las células hospedantes de mamífero usadas para producir el FGFR3 se pueden cultivar en una variedad de medios, los cuales son bien conocidos en la técnica y algunos se describen con más detalle en la presente memoria.

Las células hospedantes a las que se hace referencia en esta descripción abarcan células en cultivo in vitro así como células que están dentro de un animal hospedante.

La purificación de FGFR3 se puede llevar a cabo usando métodos reconocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen con más detalle en la presente memoria.

El FGFR3 purificado se puede unir a una matriz adecuada tal como perlas de agarosa, perlas de acrilamida, perlas de vidrio, celulosa, diferentes copolímeros acrílicos, geles de hidroxil-metacrilato, copolímeros poliacrílicos y polimetacrílicos, nailon, vehículos neutros e iónicos, y similares, para usar en la separación cromatográfica de afinidad de clones de presentación en fagos. La unión de la proteína FGFR3 a la matriz se puede llevar a cabo por métodos descritos en Methods in Enzymology, vol. 44 (1976). Una técnica habitualmente usada para unir ligandos proteínicos a matrices de polisacáridos, p. ej., agarosa, dextrano o celulosa, implica la activación del vehículo con haluros de cianógeno y el posterior acoplamiento de las aminas primarias alifáticas o aromáticas del ligando peptídico a la matriz activada.

Alternativamente, el FGFR3 se puede usar para recubrir los pocillos de placas de adsorción, expresar en células hospedantes fijadas en placas de adsorción o usar en separación de células, o conjugar con biotina para la captura con perlas recubiertas con estreptavidina, o usar en cualquier otro método conocido en la técnica para el cribado de bibliotecas de presentación en fagos.

Las muestras de bibliotecas de fagos se ponen en contacto con FGFR3 inmovilizado en condiciones adecuadas para la unión de al menos una parte de las partículas de fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, que incluyen pH, fuerza iónica, temperatura y similares, se seleccionan para imitar las condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y después se eluyen mediante ácido, p. ej., como describen Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), o por álcali, p. ej., como describen Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o por competición con el antígeno FGFR3, p. ej. en un procedimiento similar al método de competición de antígeno de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Los fagos se pueden enriquecer 20-1.000 veces en un solo ciclo de selección. Además, los fagos enriquecidos se pueden desarrollar en cultivo bacteriano y someter a otros ciclos de selección.

La eficacia de la selección depende de muchos factores, incluyendo la cinética de disociación durante el lavado, y si

múltiples fragmentos de anticuerpos en un solo fago pueden conectar simultáneamente con antígeno. Los anticuerpos con cinéticas de disociación rápidas (y afinidades de unión bajas) se pueden retener usando lavados cortos, presentación en fagos multivalente y densidad de recubrimiento alta del antígeno en fase sólida. La alta densidad no solo estabiliza el fago por interacciones multivalentes, sino que favorece que el fago que se ha disociado se vuelva a unir. La selección de anticuerpos con cinéticas de disociación lentas (y buenas afinidades de unión) se puede promover mediante el uso de lavados largos y presentación en fagos monovalente como describen Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) y en el documento WO 92/09690, y una densidad de recubrimiento baja del antígeno, como describen Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Se puede seleccionar entre anticuerpos y fagos de diferentes afinidades, incluso con afinidades que difieren ligeramente para FGFR3. Sin embargo, la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (p. ej., como se lleva a cabo en algunas de las técnicas de maduración de la afinidad descritas antes) es probable que dé lugar a muchos mutantes, la mayoría que se unen al antígeno, y unos pocos con mayor afinidad. Limitando el FGFR3, podrían quedar fuera de competición fagos de alta afinidad raros. Para retener todos los mutantes de afinidad más alta, los fagos se pueden incubar con FGFR3 biotinilado en exceso, pero con el FGFR3 biotinilado en una concentración de menor molaridad que la constante de afinidad molar diana para FGFR3. Los fagos que se unen con alta afinidad después se pueden capturar con perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina. Dicho “equilibrio de captura” permite seleccionar los anticuerpos de acuerdo con sus afinidades de unión, con una sensibilidad que permite aislar clones de mutantes con tan poco como una afinidad dos veces mayor de un gran exceso de fagos con menor afinidad. Las condiciones usadas en el lavado de fagos unidos a una fase sólida también se pueden manipular para discriminar basándose en las cinéticas de disociación.

Los clones de FGFR3 se pueden seleccionar por la actividad. En una realización, la invención proporciona anticuerpos de FGFR3 que bloquean la unión entre un receptor FGFR3 con su ligando (tal como FGF1 y/o FGF9). Se pueden seleccionar clones de Fv correspondientes a dichos anticuerpos de FGFR3 (1) aislando los clones de FGFR3 de una biblioteca de fagos como se ha descrito antes, y opcionalmente amplificando la población de clones de fagos aislada, desarrollando la población en un hospedante bacteriano adecuado; (2) seleccionando el FGFR3 y una segunda proteína contra la cual se desea la actividad de bloqueo y no bloqueo, respectivamente; (3) adsorbiendo los clones de fagos anti-FGFR3 para inmovilizar el FGFR3; (4) usando un exceso de la segunda proteína para eluir los clones no deseados que reconocen determinantes de unión a FGFR3 que se superponen o comparten con determinantes de unión de la segunda proteína; y (5) eluyendo los clones que quedan adsorbidos después de la etapa (4). Opcionalmente, los clones con las propiedades de bloqueo/no bloqueo deseadas se pueden enriquecer adicionalmente repitiendo los procedimientos de selección descritos en la presente memoria una

o más veces.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma o los clones de Fv de presentación en fagos de la invención, se aísla rápidamente y se secuencia usando procedimientos convencionales (p. ej., usando cebadores oligonucleótidos diseñados para amplificar específicamente las regiones codificantes de la cadena pesada y ligera de interés a partir del molde de ADN del hibridoma o fago). Una vez aislado, el ADN se puede poner en vectores de expresión que después son transferidos a una célula hospedante tal como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma, que de lo contrario no producirían proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células hospedantes recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias, de ADN que codifica anticuerpos, incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs,

130:151 (1992).

El ADN que codifica los clones de Fv de la invención se puede combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican las regiones constantes de la cadena pesada y/o cadena ligera (p. ej., las secuencias de ADN adecuadas se pueden obtener de Kabat et al., véase antes) para formar clones que codifican las cadenas pesada y/o ligera de longitud completa o parcial. Se apreciará que se pueden usar para este fin las regiones constantes de cualquier isotipo, incluyendo las regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie humana o animal. Un clon de Fv derivado del ADN del dominio variable de una especie animal (tal como humana) y después fusionado con el ADN de la región constante de otra especie animal para formar secuencia o secuencias que codifican la cadena pesada y/o la cadena ligera de longitud completa “híbrida”, está incluido en la definición de anticuerpo “quimérico” e “híbrido” como se usa en la presente memoria. En una realización preferida, un clon de Fv derivado del ADN variable humano se fusiona con el ADN de la región constante humana para formar la secuencia o secuencias que codifican las cadenas pesada y/o ligera de longitud total o parcial todo humanas.

El ADN que codifica el anticuerpo anti-FGFR3 derivado de un hibridoma de la invención también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia que codifica los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humana por las secuencias murinas homólogas, derivadas del clon de hibridoma (p. ej., como en el método de Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). El ADN que codifica un anticuerpo o fragmento derivado de hibridoma o clon de Fv, se puede modificar más mediante la unión covalente a la secuencia que codifica la inmunoglobulina de todo o parte de la secuencia que codifica un polipéptido que no es de inmunoglobulina. De esta forma, se preparan anticuerpos “quiméricos” o “híbridos” que tienen la especificidad de unión de los anticuerpos derivados del clon de Fv o clon de hibridoma de la invención.

Fragmentos de anticuerpos

La presente descripción abarca fragmentos de anticuerpos. En determinadas circunstancias hay ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, en lugar de los anticuerpos enteros. El menor tamaño de los fragmentos permite la rápida eliminación, y puede conducir a un acceso mejorado a tumores sólidos.

Para la producción de fragmentos de anticuerpo se han desarrollado diversas técnicas. Tradicionalmente, estos fragmentos eran obtenidos a través de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, p. ej., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir mediante células hospedantes recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv se pueden expresar y secretar todos en E. coli, permitiendo así la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, se pueden recuperar directamente fragmentos Fab’-SH a partir de E. coli y acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technoloy 10: 163-167 (1992)). Según otro procedimiento, se pueden aislar directamente fragmentos F(ab’)2 de cultivos de células hospedantes recombinantes. El fragmento Fab y F(ab’)2 con mayor semivida in vivo que comprende restos de un epítopo de unión al receptor de rescate se describen en la patente de EE.UU. nº 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán evidentes para los expertos en la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véase los documentos WO 93/16185; patentes de EE.UU. nº 5.571.894 y 5.587.458). Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes, por lo tanto, son adecuados para la unión no específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión con sFv se pueden construir para dar fusión de una proteína efectora en el extremo amino o el carboxi de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, véase antes. El fragmento de anticuerpo también puede ser un “anticuerpo lineal”, p. ej., como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.641.870. Dichos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecífcos o biespecíficos.

Anticuerpos humanizados

La presente descripción abarca anticuerpos humanizados. Se conocen en la técnica diferentes métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más restos de aminoácidos introducidos en el mismo, de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se denominan a menudo restos “importados”, y típicamente se toman de un dominio variable “importado”. La humanización se puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), sustituyendo secuencias de la región hipervariable por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. nº 4.816.567) en donde se ha sustituido sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos restos de la región hipervariable y posiblemente restos de la FR se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de los dominios variables humanos, tanto de cadena ligera como pesada, para usar para hacer los anticuerpos humanizados, es muy importante para reducid la antigenicidad. De acuerdo con el método llamado del “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a la biblioteca entera de secuencias de dominio variable humanas enteras. La secuencia humana que es la más cercana a la del roedor se acepta entonces como la región armazón humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:90)). Otro método usa una región armazón particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las cadenas ligera o pesada. La misma región armazón se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623).

Es importante además que los anticuerpos sean humanizados con retención de la afinidad alta por el anticuerpo y de otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método, los anticuerpos humanizados se preparan por un procedimiento de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles habitualmente y son conocidos para los expertos en la técnica. Están disponibles programas de ordenador que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis de la función probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, se pueden seleccionar restos de la FR y combinar secuencias del receptor e importadas de modo que se consiga la característica de anticuerpo deseada, tal como mayor afinidad por el o los antígenos diana. En general, los restos de la región hipervariable están directamente y la mayoría sustancialmente implicados en la influencia de la unión al antígeno.

Anticuerpos humanos

Los anticuerpos anti-FGFR3 se pueden construir combinando la o las secuencias del dominio variable del clon de Fv seleccionadas de bibliotecas de presentación en fago derivadas de especie humana, con secuencia o secuencias del dominio constante humanas conocidas, como se ha descrito antes. Alternativamente, los anticuerpos anti-FGFR3 monoclonales de la invención se pueden hacer por el método del hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales las han descrito, por ejemplo, Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991).

Ahora se pueden producir animales transgénicos (p. ej., ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión (JH) de la cadena pesada del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de la línea germinal, produce la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana a dichos ratones mutantes de la línea germinal, provocará la producción de anticuerpos humanos tras estimulación con antígeno. Véase, p. ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature,

362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993).

También se puede usar el barajado de genes para obtener anticuerpos humanos a partir de anticuerpos no humanos, p. ej., de roedor, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares a las del anticuerpo no humano de partida. De acuerdo con esto método, que se llama “huella del epítopo”, la región variable de la cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido por las técnicas de presentación en fagos descritas antes, se sustituye por un repertorio de genes del dominio V humano, creando una población de quimeras de scFV o Fab de cadena no humana/cadena humana. La selección con antígeno da como resultado el aislamiento de un scFV o Fab quimérico de cadena no humana/cadena humana, en donde la cadena humana restablece el sitio de unión al antígeno destruido tras la eliminación de la correspondiente cadena no humana en el clon de presentación en fago primario, es decir, el epítopo gobierna (huella) la elección de la pareja de la cadena humana. Cuando se repite el procedimiento con el fin de sustituir el resto de la cadena no humana, se obtiene un anticuerpo humano (véase el documento PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril, 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no humanos por injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen restos de FR o CDR de origen no humano.

Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de unión es para el FGFR3 y la otra es para cualquier otro antígeno. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplos se pueden unir a dos epítopos diferentes del FGFR3. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan el FGFR3. Estos anticuerpos tienen un brazo de unión a FGFR3 y un brazo que se une al agente citotóxico (p. ej., saporina, anti-interferón α, alcaloide de la vinca, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo). Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (p. ej., anticuerpos biespecíficos F(ab’)2).

Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada-ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales una tiene la estructura biespecífica adecuada. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se hace por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante trabajosa, y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829 publicado el 13 de mayo, 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991).

De acuerdo con un procedimiento diferente y más preferido, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Preferiblemente, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo hospedante adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones en que proporciones diferentes de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, se pueden insertar las secuencias que codifican dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión, cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en igual proporción produce rendimientos altos o cuando las proporciones no tienen importancia particular.

En una realización preferida de este procedimiento, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha encontrado que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma de separación fácil. Este procedimiento se describe en el documento WO 94/04690. Para más detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otro procedimiento, la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpo se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo de células recombinantes. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales mayores (p. ej., tirosina o triptófano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo sustituyendo las cadenas laterales de los aminoácidos grandes por unas más pequeñas (p. ej., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados como los homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de EE.UU. nº 4.676.980) y para el tratamiento de infección por el VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/00373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden hacer usando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación son bien conocidos en la técnica, y se describen en la patente de EE.UU. nº 4.676.980, junto con una serie de técnicas de entrecruzamiento.

También se han descrito en la bibliografía técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando unión química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2 . Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de complejación de ditiol arsenito sódico para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab’ generados después se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB después se puede vuelve a convertir en el Fab’-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

El avance reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab’-SH de E. coli que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')2 completamente humanizada. Cada fragmento Fab’ era secretado por separado de E. coli y sometido a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado podía unirse a células que expresaban en exceso el receptor HER2 y linfocitos T humanos normales, así como provocar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.

También se han descrito diferentes técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las parte Fab’ de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se volvieron a oxidar para formar heterodímeros de anticuerpos. Este método también se puede usar para producir homodímeros de anticuerpos. La tecnología del “fragmento bivalente” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a emparejar con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando así dos sitios de unión al antígeno. Otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv monocatenario (sFv) también se ha descrito. Véase, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Están contemplados los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticuerpos multivalentes

Un anticuerpo multivalente se puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápidamente que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo. Los anticuerpos de la presente

invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de los de la clase IgM) con tres o más sitios de unión al antígeno (p. ej., anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir rápidamente por expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión al antígeno amino terminales respecto a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido de la presente memoria comprende (o consiste en) de tres a aproximadamente ocho, pero preferiblemente cuatro sitios de unión al antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptido (y preferiblemente dos cadenas de polipéptidos), en donde la o las cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominio variables. Por ejemplo, la o las cadenas de polipéptidos pueden comprender VD1(X1)n -VD2-(X2)n -Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena de polipéptido de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la o las cadenas de polipéptidos pueden comprender: cadena de región VH-CH1-conector flexible-VH-CH1-Fc; o cadena de región VH-CH1-VH-CH1-Fc. El anticuerpo multivalente de la presente memoria preferiblemente comprende al menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente memoria puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente 8 polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en la presente memoria comprenden un dominio variable de cadena ligera, y opcionalmente comprenden además un dominio CL.

Variantes de anticuerpos

En algunas realizaciones, están contempladas la o las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se puede desear mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan introduciendo los cambios de nucleótidos adecuados en el ácido nucleico del anticuerpo, o por síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones, y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final tenga las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo objeto en el momento en el que se hace esta secuencia.

Un método útil para identificar ciertos restos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se llama “mutagénesis por barrido con alanina” como describen Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aquí, se identifica un resto o grupo de restos objetivo (p. ej., restos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o con carga negativa (lo más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Estas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones, después se refinan introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación por sí misma no tiene que estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo el barrido con ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y se criban las inmunoglobulinas expresadas con la actividad deseada.

Las inserciones en las secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varían de longitud desde un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de uno

o múltiples restos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen las fusiones en el extremo N o C del anticuerpos con una enzima (p. ej., para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida del anticuerpo.

La glicosilación de polipéptidos típicamente es unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas de asparagina-Xserina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un potencial sitio de glicosilación. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más habitualmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se lleva a cabo de forma conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas antes (para los sitios de glicosilación unida a N). La adición también se puede hacer por adición, o sustitución de uno o más restos de serina

o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación unida a O).

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el hidrato de carbono unido al mismo se puede alterar. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de hidrato de carbono madura carecen de fucosa unida a una región Fc del

anticuerpo, como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0157108 (Presta, L.). Véase también el documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GlcNAc) que biseca en el hidrato de carbono unido a una región Fc del anticuerpo se citan en el documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et a. y la patente de EE.UU. nº 6.602.684, Umana et a. Los anticuerpos con al menos un resto de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fc del anticuerpo se describen en el documento WO 1997/30087, Patel et al. Véase, también los documentos WO 1998/58964 (Raju, S.) y WO 1999/22764 (Raju, S.) en relación con anticuerpos con el hidrato de carbono alterado unido a su región Fc. Véase también el documento US 2005/0123546 (Umana et al.) sobre moléculas de unión al antígeno con glicosilación modificada.

La variante de glicosilación preferida en la presente memoria comprende una región Fc, en donde una estructura de hidrato de carbono unida a la región Fc carece de fucosa. Dichas variantes tienen función de ADCC mejorada. Opcionalmente, la región Fc además comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la misma que mejoran más la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración Eu de los restos). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con anticuerpos “defucosilados” o “deficientes en fucosa” incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que producen anticuerpo defucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en fucosilación de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); solicitud de patente de EE.UU. nº US 2003/0157108 A1, Presta, L; y WO 2004/056312 A1, Adams et al., en especial en el ejemplo 11), y líneas celulares desactivadas, tales como gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO desactivadas (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un resto de aminoácido (al menos 2, al menos 3, al menos 4 o más) en la molécula de anticuerpo sustituidos por un resto diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también están contempladas las alteraciones en FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla 1 con el encabezado “sustituciones preferidas”. Si dichas sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir más cambios sustanciales, denominados “sustituciones de ejemplo” en la tabla 1, o como se describe con más detalle más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y cribar los productos.

Tabla 1

Resto original: Sustituciones de ejemplo Sustituciones preferidas

Ala (A): Val; Leu; Ile Val

Arg (R): Lys; Gln; Asn Lys

Asn (N): Gln; His; Asp, Lys; Arg Gin

Asp (D): Glu; Asn Glu

Cys (C): Ser; Ala Ser

Gin (Q): Asn; Glu Asn

Glu (E): Asp; Gln Asp

Gly (G): Ala Ala

His (H): Asn; Gln; Lys; Arg Arg

Ile (I): Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu

Leu (L): Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile

Lys (K): Arg; Gln; Asn Arg

Met (M): Leu; Phe; Ile Leu

Phe (F): Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr

Pro (P): Ala Ala

Ser (S): Thr Thr

Thr (T): Val; Ser Ser

Trp (W): Tyr; Phe Tyr

Tyr (Y): Trp; Phe; Thr; Ser Phe

Val (V): Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

Se llevan a cabo modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana; o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos naturales se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1): hidrófoba: norleucina, met, ala, val, leu, Ile;

(2): neutra hidrófila: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3): ácida: asp, glu;

(4): básica: his, lys, arg;

(5): restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; and

(6): aromática: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo original (p. ej., anticuerpo humanizado o humano). En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para el posterior desarrollo tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo original a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar dichas variantes de sustitución implica la maduración de la afinidad usando la presentación en fagos. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (p. ej., 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos así generados se presentan en partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen de II de M13 empaquetados dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos después se criban según su actividad biológica (p. ej., afinidad de unión) como se describe en la presente memoria. Con el fin de identificar sitios de la región hipervariable candidatas para la modificación, se puede llevar a cabo la mutagénesis por barrido con alanina para identificar los restos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente memoria. Una vez generadas dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en la presente memoria y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para el desarrollo posterior.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de la secuencia de aminoácidos naturales) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de casete de una variante preparada previamente o una versión no variante del anticuerpo.

Puede ser conveniente introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región Fc de los polipéptidos de inmunoglobulina de la invención, generando así una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (p. ej., una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que comprende una modificación de aminoácidos (p. ej., una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos incluyendo la de una cisteína de la región bisagra.

De acuerdo con esta descripción y las enseñanzas de la técnica, está contemplado que en algunas realizaciones, un anticuerpo usado en los métodos de la invención puede comprender una o más alteraciones comparado con el anticuerpo homólogo de tipo natural, p. ej., en la región Fc. Estos anticuerpos pueden, no obstante, retener sustancialmente las mismas características requeridas para la utilidad terapéutica comparado con su homólogo de tipo natural. Por ejemplo, se cree que se pueden hacer algunas alteraciones en la región Fc que producen la unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, sean mejoradas o disminuidas), p. ej., como se describe en el documento WO99/51642. Véase también Duncan y Winter Nature 322:738-40 (1988); patente de EE.UU. nº 5.648.260; patente de EE.UU. nº 5.624.821; y WO94/29351 relativas a otros ejemplos de variantes de la región Fc. Los documentos WO00/42072 (Presta) y WO 2004/056312 (Lowman) describen variantes de anticuerpos con unión mejorada o disminuida a los FcR. Véase también, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591

6604 (2001). Los anticuerpos con semividas mejoradas y mejor unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guycr ct al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc al FcRn. Las variantes de polipéptidos con secuencias de aminoácidos de la región Fc alterada y capacidad de unión a C1q aumentada o disminuida, se describen en la patente de EE.UU. nº 6.194.551B1, WO99/51642. Véase también, Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Derivados de anticuerpos

Los anticuerpos se pueden modificar más para contener restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Preferiblemente, los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico) polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (sean homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol de propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se pueden determinar basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se va a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.

Cribado de anticuerpos con propiedades deseadas

Los anticuerpos se pueden caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y funciones biológicas mediante varios ensayos conocidos en la técnica (algunos de los cuales se describen en la presente memoria). En algunas realizaciones, los anticuerpos se caracterizan por uno o más de reducción o bloqueo de la unión de FGF (tal como FGF1 y/o FGF9), reducción o bloqueo de la activación de FGFR3, reducción o bloqueo de la señalización molecular corriente abajo de FGFR3, alteración o bloqueo de la unión de FGFR3 a un ligando (p. ej., FGF1, FGF9), reducción

o bloqueo de la dimerización de FGFR3, promoción de la formación de FGFR3 monómero, unión a FGFR3 monómero, y/o tratamiento y/o prevención de un tumor, trastorno proliferativo celular o un cáncer; y/o tratamiento o prevención de un trastorno asociado con la expresión y/o actividad de FGFR3 (tal como expresión y/o actividad aumentada de FGFR3). En algunas realizaciones, los anticuerpos se criban según su activación de FGFR3 aumentada, señalización molecular corriente abajo de FGFR3 aumentada, actividad apoptótica, regulación por disminución de FGFR3 y función efectora (p. ej., actividad de ADCC).

Los anticuerpos purificados se pueden caracterizar mejor por una serie de ensayos que incluyen, pero no se limitan a secuenciación N-terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de exclusión por tamaños no desnaturalizante, espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína.

En algunas realizaciones de la invención, se analiza la actividad biológica de los anticuerpos producidos en la presente memoria. En algunas realizaciones, se ensaya la actividad de unión al antígeno de los anticuerpos de la presente invención. Los ensayos de unión al antígeno que son conocidos en la técnica y que se pueden usar en la presente memoria incluyen, sin limitación, cualquier ensayo de unión directa o competitiva usando técnicas de transferencia western, radioinmunoensayos, ELISA (inmunoensayo de adsorción ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A. Se proporcionan más adelante en la sección de ejemplos ensayos de unión al antígeno y otros ilustrativos.

Si se desea un anticuerpo anti-FGFR3 que inhiba el crecimiento celular, el anticuerpo candidato se puede ensayar en ensayos in vitro y/o in vivo para medir la inhibición del crecimiento celular. Si se desea un anticuerpo anti-FGFR3 que promueva o no promueva la apoptosis, el anticuerpo candidato se puede ensayar en ensayos que miden la apoptosis. Los métodos para examinar el crecimiento y/o proliferación de una célula cancerosa, o para determinar la apoptosis de una célula cancerosa son bien conocidos en la técnica, y algunos se describen e ilustran en la presente memoria. Los métodos de ejemplo para determinar el crecimiento y/o la proliferación y/o apoptosis celular incluyen, por ejemplo, ensayo de incorporación de BrdU, MTT, incorporación de [3H]-timidina (p. ej., ensayo TopCount (PerkinElmer)), ensayos de viabilidad celular (p. ej., CellTiter-Glo (Promega)), ensayos de fragmentación de ADN, ensayos de activación de caspasa, exclusión con azul de tripano, ensayos de morfología de cromatina y similares.

En una realización, la presente invención contempla que un anticuerpo tenga funciones efectoras. En algunas realizaciones, se miden las actividades de Fc del anticuerpo. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/reducción drástica de las actividades de CDC/ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcγR (por lo tanto probablemente carece de actividad de ADCC), pero retiene la capacidad de unión al FcRn. Las

células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan solo FcγIII solo, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.500.362 o 5.821.337. También se ilustra en la presente memoria un ensayo para detectar la actividad de ADCC. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) linfocitos citolíticos naturales (NK). Alternativa o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, p. ej., en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no es capaz de unirse a C1q y por lo tanto carece de actividad de CDC. Para evaluar la activación del complemento, se puede llevar a cabo un ensayo de CDC, p. ej., como describen Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Las determinaciones de la unión a FcRn y la eliminación/semivida in vivo también se pueden llevar a cabo usando métodos conocidos en la técnica, p. ej., los descritos en la sección de ejemplos.

Si se desea un anticuerpo anti-FGFR3 que se una al FGFR3 monómero, el anticuerpo candidato se puede ensayar en ensayos (tal como en ensayos in vitro) que miden la unión al FGFR3 monómero y promueven la formación de FGFR3 monómero. Dichos ensayos se conocen en la técnica y algunos ensayos se describen e ilustran en la presente memoria.

Si se desea un anticuerpo anti-FGFR3 que inhiba la dimerización del FGFR3, el anticuerpo candidato se puede ensayar en ensayos de dimerización, p. ej., como se describen e ilustran en la presente memoria.

En algunas realizaciones, se determina la función agonista del FGFR3 del anticuerpo candidato. Los métodos para evaluar la función o actividad agonista de anticuerpos de FGFR3 se conocen en la técnica y algunos también se describen e ilustran en la presente memoria.

En algunas realizaciones, se determina la capacidad de un anticuerpo de FGFR3 para promover la regulación por disminución del receptor FGFR3, p. ej., usando métodos descritos e ilustrados en la presente memoria. En una realización, el anticuerpo de FGFR3 se incuba con células de ensayo adecuadas, p. ej., líneas de células de cáncer de vejiga (p. ej., RT112), y después de un periodo de tiempo adecuado, los lisatos celulares se recogen y se examinan los niveles totales de FGFR3. También se pueden usar análisis de FACS para examinar los niveles de receptor FGFR3 en la superficie después de incubación con anticuerpos de FGFR3 candidatos.

Vectores, células hospedantes y métodos recombinantes

Para la producción recombinante de un anticuerpo, el ácido nucleico que los codifica se aísla e inserta en un vector replicable para la posterior clonación (amplificación del ADN) para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. La elección del vector depende en parte de la célula hospedante que se va a usar. En general, las células hospedantes preferidas son de origen procariota o eucariota (en general de mamífero). Se apreciará que se pueden usar las regiones constantes de cualquier isotipo para este propósito, incluyendo las regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD, y IgE, y que dichas regiones constante se pueden obtener de cualquier especie humana o animal.

a.: Generación de anticuerpos usando células hospedantes procariotas

i.: Construcción de vectores

Las secuencias de polinucleótidos que codifican componentes polipéptidos del anticuerpo de la invención se pueden obtener usando técnicas recombinantes convencionales. Las secuencias de polinucleótidos deseadas se pueden aislar y secuenciar de células que producen anticuerpos tales como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden sintetizar usando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidos, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en hospedantes procariotas. Muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la técnica, se pueden usar para el objetivo de la presente invención. La selección de un vector adecuado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se van a insertar en el vector y la célula hospedante particular que se va a trasformar con el vector. Cada vector contiene diferentes componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión del polinucleótido heterólogo, o ambos) y su compatibilidad con la célula hospedante particular en la que reside. Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a: un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión al ribosoma (RBS), una secuencia señal, el inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción.

En general, se usan vectores plasmídicos que contienen secuencias replicón y de control que derivan de especies compatibles con la célula hospedante, en relación con estos hospedantes. El vector normalmente lleva un sitio de replicación, así como secuencias de marcaje que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli típicamente se transforma usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a la ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet), y

por lo tanto proporciona medios para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados, u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos también pueden contener, o se pueden modificar para que contengan, promotores que puedan ser usados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógena. Los ejemplos de derivados de pBR322 usados para la expresión de anticuerpos particulares se describen con detalle en Carter el a., patente de EE.UU. nº 5.648.237.

Además, se pueden usar vectores de fagos que contienen secuencias replicón y de control que son compatibles con el microorganismo hospedante, como vectores de transformación en relación con estos hospedantes. Por ejemplo, bacteriófagos tales como λGEM.TM.-11 se puede usar para hacer un vector recombinante que se puede usar para transformar células hospedantes susceptibles tales como E. coli LE392.

El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más parejas de promotor-cistrón, que codifica cada una los componentes del polipéptido. Un promotor es una secuencia reguladora no traducida situada en la dirección 5’ respecto al cistrón que modula su expresión. Los promotores procariotas típicamente están en dos clases, inducibles y constitutivos. El promotor inducible es un promotor que inicia niveles mayores de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en las condiciones de cultivo, p. ej., la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.

Un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células hospedantes potenciales son bien conocidos. El promotor seleccionado se puede unir operativamente al ADN cistrón que codifica la cadena ligera o pesada eliminando el promotor del ADN fuente por digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de la invención. Tanto la secuencia promotora natural como muchos promotores heterólogos se pueden usar para la amplificación y/o expresión directa de los genes diana. En algunas realizaciones, se usan promotores heterólogos ya que en general permiten una mayor transcripción y rendimientos mayores del gen diana expresado, comparado con el promotor del polipéptido diana natural.

Los promotores adecuados para usar con hospedantes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores de ß-galactamasa y lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac o el trc. Sin embargo, también son adecuados otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos). Su secuencia de nucleótidos se ha publicado, permitiendo así que un trabajador los usa operativamente a cistrones que codifican las cadenas ligera y pesada diana (Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) usando conectores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.

En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de la secuencia señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para el objetivo de esta invención debería ser uno que fuera reconocido y procesado (es decir, escindido por una peptidasa señal) por la célula hospedante. Para células hospedantes procariotas que no reconocen y procesan las secuencias señal naturales respecto a los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o líderes enterotoxinas estables al calor II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA, y MBP. En una realización de la invención, las secuencias señal usadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias señal de STII o variantes de las mismas.

En otro aspecto, la producción de inmunoglobulinas de acuerdo con la invención, se pueden producir en el citoplasma de la célula hospedante, y por lo tanto requiere la presencia de las secuencias señal de secreción dentro de cada cistrón. En relación con esto, las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina son expresadas, plegadas y ensambladas para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Algunas cepas hospedantes (p. ej., las cepas de E. coli trxB-) proporcionan condiciones en el citoplasma que son favorables para la formación de enlaces disulfuro, permitiendo de esta forma el plegado adecuado y ensamblado de subunidades de proteína expresadas. Proba y Pluckthun, Gene, 159:203 (1995).

Las células hospedantes procariotas adecuadas para expresar anticuerpos de la invención incluyen arqueobacterias y eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (p. ej., E. coli), Bacilli (p. ej., B. subtilis), enterobacterias, especies de Pseudomonas (p. ej., P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus. En una realización, se usan células Gram negativas. En una realización, se usan células de E. coli como hospedantes para la invención. Los ejemplos de cepas de E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pág. 1190-1219; nº de depósito en ATCC 27.325) y derivados de las mismas, incluyendo la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (patente de EE.UU. nº 5.639.635). También son adecuadas otras cepas y derivadas de las mismas tales como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coliλ 1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308(ATCC 31.608). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Los métodos para construir derivados de cualquiera de las bacterias mencionadas antes que tienen genotipos definidos, se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). En general, es necesario seleccionar la bacteria adecuada teniendo en cuenta la capacidad de replicación del replicón en las

células de una bacteria. Por ejemplo, las especies E. coli, Serratia, o Salmonella se pueden usar de forma adecuada como el hospedante cuando se usan plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para suministrar el replicón. Típicamente, la célula hospedante debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas, y se pueden incorporar inhibidores de proteasa adicionales de forma conveniente en el cultivo celular.

ii. Producción de anticuerpos

Las células hospedantes se transforman con los vectores de expresión descritos antes y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea adecuado para la inducción de promotores, transformantes de selección o amplificación de genes que codifican las secuencias deseadas.

Transformación significa introducir ADN en el hospedante procariota de modo que el ADN es replicable, sea como un elemento extracromosómico o por integración cromosómica. Dependiendo de la célula hospedante usada, la transformación se hace usando técnicas convencionales adecuadas para dichas células. En general se usa el tratamiento con calcio que usa cloruro de calcio para las células bacterianas que contienen barreras de pared celular sustanciales. Otro método para la transformación usa polietilenglicol/DMSO. Otra técnica que se usa es la electroporación.

Las células procariotas usadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medio conocido en la técnica y adecuado para el cultivo de las células hospedantes seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen caldo de Luria (LB) más complementos nutrientes necesarios. En algunas realizaciones, el medio también contiene un agente de selección, elegido basándose en la construcción del vector de expresión, para permitir el crecimiento selectivo de células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina al medio para el crecimiento de células que expresan el gen de resistencia a la ampicilina.

También se pueden incluir cualesquiera complementos necesarios además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico, en las concentraciones adecuadas, introducidos solos o como una mezcla con otro complemento

o medio tal como una fuente de nitrógeno complejo. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes de reducción seleccionados del grupo que consiste en glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.

Las células hospedantes procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Por ejemplo, para el desarrollo de E. coli se prefieren intervalos de temperatura de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 39ºC, más preferiblemente de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 37ºC, incluso más preferiblemente a aproximadamente 30ºC. El pH del medio puede ser cualquier pH en el intervalo de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, y más preferiblemente aproximadamente 7,0.

Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteína es inducida en condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, se usan promotores PhoA para controlar la transcripción de los polipéptidos. Por consiguiente, las células hospedantes transformadas se cultivan en un medio limitante de fosfato, para la inducción. Preferiblemente, el medio limitante de fosfato es el medio C.R.A.P (véase, p. ej., Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Se puede usar una variedad de otros inductores, de acuerdo con la construcción de vector usada, como se conoce en la técnica.

En una realización, los polipéptidos expresados de la presente invención son secretados y recuperados del periplasma de las células hospedantes. La recuperación de proteína típicamente implica la alteración de los microorganismos, en general por medios tales como choque osmótico, tratamiento con ultrasonidos o lisis. Una vez alteradas las células, se pueden separar los desechos celulares o las células enteras por centrifugación o filtración. Las proteínas se pueden purificar más, por ejemplo, por cromatografía en resina de afinidad. Alternativamente, las proteínas se pueden transportar en el medio de cultivo y aislar del mismo. Las células se pueden separar del cultivo y filtrar y concentrar el líquidos sobrenadante para la posterior purificación de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados se pueden aislar además e identificar usando métodos normalmente conocidos tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia Western.

En un aspecto de la invención, la producción de anticuerpos se lleva a cabo en una cantidad grande por un procedimiento de fermentación. Están disponibles diferentes procedimientos de fermentación semicontinua a gran escala, para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, preferiblemente aproximadamente de 1.000 a 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores usan paletas agitadoras para distribuir el oxígeno y los nutrientes, en especial la glucosa (la fuente de carbono/energía preferida). La fermentación a escala pequeña se refiere en general a la fermentación en un fermentador que tiene una capacidad en volumen de no más de aproximadamente 100 litros, y puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.

En un procedimiento de fermentación, la inducción de la expresión de proteínas típicamente se inicia después de que las células se han desarrollado en condiciones adecuadas hasta una densidad deseada, p. ej., una DO550 de aproximadamente 180-220, en cuya etapa las células están en la fase estacionaria temprana. Se puede usar una variedad de inductores, según la construcción de vector usada, como se conoce en la técnica y se ha descrito antes. Las células se pueden desarrollar durante periodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen

normalmente durante aproximadamente 12-50 horas, aunque se pueden usar tiempos de inducción más largos o más cortos.

Para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención, se pueden modificar diferentes condiciones de fermentación. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y plegado adecuados de los polipéptidos de anticuerpo secretados, se pueden usar proteínas chaperonas que expresan en exceso vectores adicionales, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, y/o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis,transisomerasa con actividad de chaperona) para la cotransformación de las células procariotas hospedantes. Las proteínas chaperonas han demostrado que facilitan el plegado adecuado y la solubilidad de las proteínas heterólogas producidas en las células hospedantes bacterianas. Chen et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., patente de EE.UU. nº 6.083.715; Georgiou et al., patente de EE.UU. nº 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm y Pluckthun, (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al., (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

Para minimizar la proteolisis de las proteínas heterólogas expresadas (en especial las que son sensibles a la proteolisis), se pueden usar para la presente invención determinadas cepas de hospedantes deficientes en enzimas proteolíticas. Por ejemplo, las cepas de células hospedantes se pueden modificar para realizar mutación o mutaciones en los genes que codifican las proteasas bacterianas tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Protease V, Proteasa VI, y combinaciones de las mismas. Algunas cepas deficientes en proteasa de E. coli están disponibles y se describen, por ejemplo, en, Joly et al., (1998), véase antes; Georgiou et al., patente de EE.UU. nº 5.264.365; Georgiou et al., patente de EE.UU. nº 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

En una realización, las cepas de E. coli deficientes en enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que expresan en exceso una o más proteínas chaperonas, se usan como células hospedantes en el sistema de expresión de la invención.

iii. Purificación de anticuerpos

Se pueden usar métodos de purificación de proteínas convencionales conocidos en la técnica. Los siguientes procedimientos son ilustrativos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato amónico, y filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

En un aspecto, se usa la proteína A inmovilizada en una fase sólida para la purificación por inmunoafinidad de los productos de anticuerpos de longitud completa de la invención. La proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se une con una afinidad alta a la región Fc de los anticuerpos. Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. La fase sólida en la que se inmoviliza la proteína A preferiblemente es una columna que comprende superficie de vidrio o sílice, más preferiblemente una columna de vidrio de poro controlado

o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se ha recubierto con un reactivo, tal como glicerol, en un intento de prevenir la adherencia no específica de contaminantes.

Como primera etapa de purificación, la preparación derivada del cultivo de células como se ha descrito antes, se aplica sobre la fase sólida con proteína A inmovilizada para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la proteína A. La fase sólida después se lava para separar los contaminantes que no se unen específicamente a la fase sólida. Finalmente, el anticuerpo de interés se recupera de la fase sólida por elución.

b. Generación de anticuerpos usando células hospedantes eucariotas:

Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

(i) Componente de la secuencia señal

Un vector para usar en una célula hospedante eucariota puede contener también una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura o el polipéptido de interés. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedante. En la expresión de células de mamífero, están disponibles secuencias señal de mamíferos así como las secuencias líder secretoras víricas, por ejemplo, señal del herpes simple gD.

El ADN para dicha región precursora está ligado en el marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo.

(ii) Origen de replicación

En general, un componente del origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos.

Por ejemplo, típicamente se puede usar el origen de SV40 solo porque contiene el promotor temprano.

(iii) Selección del componente génico

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, denominado también un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, donde sea relevante, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo.

Un ejemplo de un esquema de selección usa un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedante. Estas células que son transformadas con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante de fármacos usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamíferos son las que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico del anticuerpo, tales como DHFR, timidina quinasa, metalotioneína I y II, preferiblemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR son identificadas primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedantes adecuada cuando se usa la DHFR de tipo natural es la línea de células de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR (p. ej., ATCC CRL-9096).

Alternativamente, las células hospedantes (en particular células hospedantes de tipo natural que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, la proteína DHFR de tipo natural, y otro marcador seleccionable tal como la aminoglucósido 3’-fosfotransferasa (APH), se pueden seleccionar por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, p. ej., kanamicina, neomicina o G418. Véase, la patente de EE.UU.

4.965.199.

(iv) Componente del promotor

Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedante y está operativamente unido al ácido nucleico del polipéptido del anticuerpo. Las secuencias de promotor son conocidas para los eucariotas. Prácticamente todos los genes de eucariotas tienen una región rica en AT situada a aproximadamente de 25 a 30 bases en la dirección 5’ desde el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada a 70 a 80 bases en la dirección 5’ desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3’ de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poliA al extremo 3’ de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en los vectores de expresión de eucariotas.

La transcripción del polipéptido del anticuerpo a partir de vectores en células hospedantes de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B, y virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, p. ej., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque término, con la condición de que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospedantes.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma conveniente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión de ADN en hospedantes de mamífero usando el virus del papiloma bovino como vector, se describe en la patente de EE.UU. nº 4.419.446. Se describe una modificación de este sistema en la patente de EE.UU. nº 4.601.978. Alternativamente, se puede usar como promotor la repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous.

(v) Componente del elemento potenciador

La trascripción del ADN que codifica el polipéptido de anticuerpo de esta invención por eucariotas superiores, a mendo se aumentan mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadores de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, α-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente, se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5’ o 3’ respecto a la secuencia que

codifica el polipéptido del anticuerpo, pero preferiblemente se sitúa en un lado 5’ del promotor.

(vi) Componente de la terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células hospedantes eucariotas típicamente contendrán también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están habitualmente disponibles desde las regiones 5’, y algunas veces 3’, no traducidas de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión descrito en el mismo.

(vii) Selección y transformación de células hospedantes

Las células hospedantes adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente memoria incluyen células eucariotas superiores descritas en la presente memoria, incluyendo células hospedantes de vertebrados. La propagación de las células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Los ejemplos de líneas de células hospedantes de mamífero son la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 clonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster recién nacido (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) ); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células hospedantes se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos antes para la producción de anticuerpos y cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para la inducción de promotores, transformantes de selección o amplificación de genes que codifican las secuencias adecuadas.

(viii) Cultivo de las células hospedantes

Las células hospedantes usadas para producir un anticuerpo de esta invención, se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles en el comercio tales como medio Ham F10 (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar células hospedantes. Además, se puede usar cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barncs et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentes de EE.UU. nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de EE.UU. nº Re. 30.985, como medio de cultivo para las células hospedantes. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir cualesquiera otros complementos necesarios en concentraciones adecuadas que serían conocidas para los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula hospedante seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.

(ix) Purificación de anticuerpos

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir de forma intracelular, o directamente secretado al medio. Si el anticuerpo se produce de forma intracelular, como una primera etapa, se eliminan los desechos en partículas, sean células hospedantes o fragmentos lisados, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los líquidos sobrenadantes de dichos sistemas de expresión en general se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el comercio, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes inesperados.

La composición de anticuerpos preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas γ1, γ2 o γ4 (Lindmark et

al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad la mayoría de las veces es agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y menores tiempos de procesamiento de lo que se puede lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende el dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. También están disponibles otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento o una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina-SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de poli(ácido aspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato amónico, dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

Después de cualquier etapa o etapas de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes, se puede someter a cromatografía de interacción hidrófoba a pH bajo, usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferiblemente llevada a cabo a bajas concentraciones salinas (p. ej., de aproximadamente 0-0,25 M de sal).

Inmunoconjugados

La descripción también proporciona inmunoconjugados (término intercambiable con “conjugados de anticuerpofármaco” o “ADC”), que comprende cualquiera de los anticuerpos anti-FGFR3 descritos en la presente memoria conjugados con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (p. ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

El uso de conjugados anticuerpo-fármaco para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir fármacos que matan o inhiben células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; documento US 4975278) permite el suministro dirigido del fármaco a tumores, y a la acumulación intracelular en los mismos, donde la administración sistémica de estos fármacos no conjugados puede dar lugar a niveles inaceptables de toxicidad en células normales, así como en las células tumorales a eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 45 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pág. 475-506). De esta forma se busca la máxima eficacia y la mínima toxicidad. Tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales se han descrito como útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Los fármacos usados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986), véase antes). Las toxinas usadas en los conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina de la difteria, toxinas de plantas, tales como ricina, toxinas moléculas pequeñas tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19); 1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-55 8623), y calicheamicina (Lode et al., (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos que incluyen unión a tubulina, unión a ADN o inhibición de topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores proteínicos.

ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa IgG1 murino dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de linfocitos B normales y malignos y el radioisótopo 111In o 90Y unido a un conector de tiourea-quelador (Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al., (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Aunque ZEVALIN tiene actividad contra el linfoma de no Hodgkin de linfocitos B (NHL), la administración produce citopenas graves y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto de un anticuerpo hu CD33 unido a calicheamicina, fue aprobado en el 2000 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda por inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; patentes de EE.UU. nº 4.970.198; 5.079.233; 5.585.089; 5.606.040; 5.6937.62; 5.739.116; 5.767.285; 5.773.001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto del anticuerpo huC242 unido mediante el conector de disulfuro SPP al resto farmacológico maitansinoide, DM1, está avanzando en ensayos en fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como de colon, pancreático, gástrico y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto del anticuerpo monoclonal anti-antígeno de membrana específico prostático (PSMA) unido al resto farmacológico maitansinoide, DM1, se está desarrollando para el potencial tratamiento de tumores de próstata. Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específico para Lewis Y en carcinomas) y cAC10 (específico para CD30 en tumores malignos hematológicos) (Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784), y están en desarrollo terapéutico.

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados se describen en la presente memoria

(p. ej., antes). Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A diftérica, fragmentos activos no enlazantes de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Véase, p. ej., el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre, 1993. Están disponibles una variedad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se fabrican usando una variedad de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como 3-(2-piridilditiol)propionato de Nsuccinimidilo (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(pdiazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026.

Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas moléculas pequeñas, tales como caloqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, aurostatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también están contemplados en la presente memoria.

i. Maitansina y maitansinoides

En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (longitud completa o fragmentos) de la invención conjugado con una o más moléculas de maitansinoide.

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez de los arbustos africanos Maytenus serrata (patente de EE.UU. nº 3.896.111). Posteriormente, se descubrió que algunos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente de EE.UU. nº 4.151.042). Se describen maitansinol sintético y derivados y análogos de los mismos, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.

Los restos de los fármacos de maitansinoides son restos de fármacos atractivos en los conjugados de anticuerpofármaco porque son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química, derivatización de productos de fermentación, (ii) se pueden llevar a la derivatización con grupos funcionales adecuados para la conjugación por conectores no disulfuro con los anticuerpos, (iii) estables en el plasma, y (iv) eficaces contra una variedad de líneas de células tumorales.

Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, los métodos para hacerlos y su uso terapéutico se describen por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 5.208.020, 5.416.064 y patente europea EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describen inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico contra células de cáncer de colon cultivadas, y mostraba actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento de tumor in vivo. Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjugaba por un conector disulfuro con el anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o con otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado de TA.1-maitansinoide se ensayó in vitro en la línea de células de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado del fármaco lograba un grado de citotoxicidad similar al fármaco de maitansinoide libre, que se podía aumentar aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostraba citotoxicidad sistémica baja en ratones.

Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se prearan uniendo químicamente un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminución significativa de la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº 5.208.020. Se ha mostrado que una media de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo son eficaces en la potenciación de la citotoxicidad de células diana sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo potenciara la toxicidad frente al uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica y se pueden sintetizar por técnicas conocidas o aislar de fuentes naturales. Los maitansinoides adecuados se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.208.020 y en otras patente y publicaciones de no patentes citadas en lo que antecede. Los maitansinoide preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tal como diferentes ésteres de maitansinol.

Hay muchos grupos conectores conocidos en la técnica para hacer los conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la patente de EE.UU. nº 5.208.020 o patente EP 0425235 B1, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992), y solicitud de patente de EE.UU. US 20050169933, presentada el 8 de octubre, 2004. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente conector SMCC se pueden preparar como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. nº 10/960.602, presentada el 8 de octubre, 2004. Los grupos conectores incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles frente a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles frente a peptidasa, o grupos lábiles frente a esterasa, como se describe en las patentes identificadas antes, siendo preferidos los grupos disulfuro y tioéter. Grupos conectores adicionales se describen e ilustran en la presente memoria.

Los conjugados de anticuerpo y maitansinoide se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditiol)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen-2,6diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen de 3-(2-piridilditiol)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.

El conector se puede unir a la molécula de maitansinoide en diferentes posiciones, dependiendo del tipo de unión. Por ejemplo, un enlace éster se puede formar por reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción se puede producir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 del maitansinol o un análogo de maitansinol.

ii. Auristatinas y dolastatinas

En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas

o análogos y derivados peptídicos de dolastatinas, las auristatinas (patentes de EE.UU. nº 5.635.483 y 5.780.588). Se ha mostrado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis del GTP y la división nuclear y celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividad anticancerígena (patente de EE.UU. nº 5.663.149) y actividad antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). El resto farmacológico de dolastatina o auristatina puede estar unido al anticuerpo a través del extremo N (amino) o del extremo C (carboxilo) del resto farmacológico peptídico (documento WO 02/088172).

Entre los ejemplos de realizaciones con auristatina se incluyen restos farmacológicos DE y DF de monometilauristatina unidos al extremo N, descritos en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands” documento US 2005-0238649, presentado el 5 de noviembre, 2004.

Típicamente, pueden prepararse restos farmacológicos basados en péptidos mediante la formación de un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, según el método de síntesis en fase líquida (véase E. Schröder y K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, pág 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Los restos farmacológicos de auristatina/dolastatina se pueden preparar según los métodos de: patentes de EE.UU. nº

5.635.483 y 5.780.588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R, et al. Synthesis, 1996, 719-725 y Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863. Véase también Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands” documento nº de serie US 10/983.340, presentado el 5 de noviembre, 2004 (que describe, por ejemplo, enlazadores y métodos de preparación de compuestos de monometilvalina, tales como MMAE y MMAF conjugados a conectores).

iii. Calicheamicina

En otras realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. Los antibióticos de la familia de la calicheamicina son capaces de producir roturas del ADN bicatenario en concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de la calicheamicina, véanse las patentes de EE.UU. nº 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Entre los análogos estructurales de calicheamicinas que se pueden usar se incluyen, pero no se limitan a γ1I, α2I, α3I, N-acetil-γ1I, PSAG y θI1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos de American Cyanamid mencionadas previamente). Otro fármaco antitumoral al que puede conjugarse el anticuerpo es el QFA que es un antifolato. Tanto la calicheamicina como el QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por tanto, la absorción celular de estos agentes a

través de internalización mediada por anticuerpos potencia mucho sus efectos citotóxicos.

iv. Otros agentes citotóxicos

Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos de la invención, incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las patentes de EE.UU. nº 5.053.394 y 5.770.710 así como esperamicinas (patente de EE.UU. nº 5.877.296).

Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de la toxina diftérica, fragmentos activos no enlazantes de la toxina diftérica, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de la abrina, cadena A de la modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.

La presente invención contempla además un inmunoconjugado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (p. ej., una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como una desoxirribonucleasa; ADNasa).

Para la destrucción selectiva de un tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Están disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para diagnóstico, puede comprender un átomo radiactivo para estudios de centelleo, por ejemplo tc99m o I123,

o un marcador de spin para la adquisición de imagen por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como adquisición de imagen por resonancia magnética, mri), tales como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los radiomarcadores u otros marcadores pueden incorporarse en el inmunoconjugado de formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que incluyen, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores, tales como tc99m o I123, Re186, Re188 y InIII pueden unirse por un resto de cisteína en el péptido. El Itrio-90 puede unirse por un resto de lisina. Se puede usar el procedimiento de IODOGEN (Fraker y col. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 para incorporar yodo-123. En “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal. CRC Press 1989) se describen otros métodos detallados.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditiol)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen-2,6diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar como describen Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un “conector escindible” que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil frente a ácidos, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); patente de EE.UU. nº 5.208.020).

Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero no se limitan a ADC preparados con reactivos de reticulación: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB ((4vinilsulfona)benzoato de succinimidilo) que están disponibles en el comercio (p. ej., de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE.UU.). Véanse las páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

v. Preparación de conjugados de anticuerpo y fármaco

En los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) se conjuga con uno o más restos de fármaco (D), p. ej., de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos de fármaco por anticuerpo, por un conector (L). El ADC de la fórmula I se puede preparar por varias rutas, usando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos para los expertos en la técnica, que incluyen: (1) reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un reactivo conector bivalente, para formar Ab-L, por un enlace covalente, seguido de reacción con un resto de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleófilo de un resto de fármaco con un reactivo conector bivalente, para formar D-L, por un enlace covalente, seguido de reacción con el grupo nucleófilo de un anticuerpo. Se describen métodos adicionales para preparar el ADN en la presente memoria.

Ab-(L-D)p I

El conector puede estar compuestos por uno o más componentes conectores. Los componentes conectores de ejemplo incluyen 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo ("MP"), valina-citrulina ("valcit"), alaninafenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo ("SPP"), 4(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidilo ("SMCC”), y (4-yodo-acetil)aminobenzoato de Nsuccinimidilo ("SIAB"). En la técnica se conocen más componentes conectores y algunos se describen en la presente memoria.

En algunas realizaciones, el conector puede comprender restos de aminoácidos. Entre los componentes conectores con aminoácidos de ejemplo se incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Entre los dipéptidos de ejemplo se incluyen: valine-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe). Ente los tripéptidos de ejemplo se incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Los restos de aminoácidos que comprende un componente conector con aminoácido incluyen los aminoácidos naturales, así como aminoácidos minoritarios y análogos de aminoácidos no naturales, tales como la citrulina. Los componentes conectores con aminoácidos se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para la escisión enzimática mediante una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D o una proteasa de plasmina.

Los grupos nucleófilos en los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos amina N-terminal, 5 (ii) grupos amina de cadena lateral, p. ej., lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, p. ej., cisteína, y (iv) grupos hidroxilo o amina de azúcares donde el anticuerpo está glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo, son nucleófilos y son capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilo en los restos de conector y reactivos conectores que incluyen: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, halogenoformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como halogenoacetamidas; (iii) grupos aldehídos, cetonas, carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen puentes disulfuros intercatenarios reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos se pueden volver reactivos para la conjugación con reactivos conectores mediante el tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente de cisteína formará por lo tanto, teóricamente, dos nucleófilos tiol reactivos. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en anticuerpos mediante la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando lugar a la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos se pueden introducir en el anticuerpo mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o más restos cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprende uno o más restos de aminoácido cisteína no naturales).

Los conjugados anticuerpo-fármaco también se pueden producir mediante la modificación del anticuerpo para introducir grupos electrófilos, los cuales pueden reaccionar con los sustituyentes nucleófilos en el reactivo conector o fármaco. Los azúcares de anticuerpos glicosilados se pueden oxidar, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos conectores

o restos de fármaco. Los grupos imina base de Schiff resultantes de pueden formar una unión estable, o se pueden reducir, p. ej., mediante reactivos de borohidruro para formar uniones de amina estables. En una realización, la reacción de la parte de hidrato de carbono de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o meta-peryodato sódico puede producir grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra realización, las proteínas que contienen restos serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con metaperyodato sódico dando lugar a la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan y Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; patente de EE.UU. nº 5.362.852). Dicho aldehído puede reaccionar con un nucleófilo del resto de fármaco o conector.

Igualmente, los grupos nucleófilos de un resto de fármaco incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, hidracina, carboxilato y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en los restos conectores y reactivos conectores, incluyendo: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, halogenoformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como halogenoacetamidas; (iii) grupos aldehídos, cetonas, carboxilo y maleimida.

Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y el agente citotóxico se puede hacer, p. ej., por técnicas recombinantes o de síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos partes del conjugado adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido conector que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En otra realización más, el anticuerpo se puede conjugar con un “receptor” (tal como estreptavidina) para usar en el pretratamiento de tumores en donde se administra a un individuo el conjugado de anticuerpo-receptor, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación usando un agente de depuración y después administración de un “ligando” (p. ej., avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (p. ej., un radionucleótido).

Métodos de uso de anticuerpos anti-FGFR3

La presente descripción presenta además el uso de un anticuerpo de FGFR3 como parte de un régimen de tratamiento específico dirigido a proporcionar un efecto beneficioso a partir de la actividad de este agente terapéutico. La presente descripción es particularmente útil en el tratamiento de cánceres de diferentes tipos en diferentes fases.

El término cáncer abarca un grupo de trastornos proliferativos, incluyendo, pero no limitado a crecimiento precancerosos, tumores benignos y tumores malignos. Los tumores benignos permanecen localizados en el sitio de origen y no tienen la capacidad de infiltrarse, invadir o metastatizar en un sitio distante. Los tumores malignos invadirán y dañarán otros tejidos alrededor de ellos. También pueden tener la capacidad romperse del sitio original y extenderse a otras partes del cuerpo (metastatizar), normalmente a través del torrente sanguíneo o a través del sistema linfático donde están localizados los nódulos linfáticos. Los tumores primarios se clasifican por el tipo de tejido del que proceden; los tumores metastásicos se clasifican por el tipo de tejido del que derivan las células cancerosas. A lo largo del tiempo, las células de un tumor maligno se vuelven más anómalas y parecen menos células normales. Este cambio en el aspecto de las células cancerosas se llama grado del tumor, y las células cancerosas se describen como que están bien diferenciadas (grado bajo), moderadamente diferenciadas, poco diferenciadas o indiferenciadas (grado alto). Las células bien diferenciadas tienen aspecto bastante normal y se parecen a las células normales a partir de las cuales se han originado. Las células indiferenciadas son células que se han convertido en tan anómalas que ya no se puede determinar el origen de las células.

Los sistemas de estadificación del cáncer describen cómo de lejos se ha extendido el cáncer anatómicamente e intentan poner pacientes con pronóstico y tratamiento similares en el mismo grupo de estadificación. Se pueden llevar a cabo varias pruebas para ayudar a estadificar el cáncer, incluyendo biopsia y algunas pruebas de imágenes tales como rayos X de pecho, mamografía, escáner óseo, escáner CT y escáner MRI. También se usan análisis de sangre y evaluación clínica para evaluar la salud general de un paciente y detectar si el cáncer se ha extendido a determinados órganos.

Para la estadificación del cáncer el American Joint Committee on Cancer, primero pone en cáncer, en particular los tumores sólidos, en una categoría de letra usando el sistema de clasificación TNM. Los cánceres se designan con la letra T (tamaño tumoral), N (ganglios palpables) y/o M (metástasis). T1, T2, T3 y T4 describen el tamaño creciente de la lesión primaria; N0, N1, N2, N3 indican la implicación de nódulos que avanzan progresivamente; y M0 y M1 reflejan la ausencia o presencia de metástasis distante.

En el segundo método de estadificación, también conocido como el agrupamiento de estadios global o estadificación por números romanos, los cánceres se dividen en estadios de 0 a iV, incorporando el tamaño de las lesiones primarias así como la presencia de extensión nodal y de metástasis distante. En este sistema, los casos se agrupan en cuatro estadios denominados por números romanos de I a IV, o se clasifican como “recurrente”. Para algunos cánceres, el estadio 0 se refiere a un “in situ” o “Tis”, tal como el carcinoma ductal in situ o carcinoma lobular in situ para los cánceres de mama. Los adenomas de grado alto también se pueden clasificar como estadio 0. En general, los cánceres de estadio I son cánceres localizados pequeños que normalmente son curables, mientras que el estadio IV normalmente representa cáncer inoperable o metastásico. Los cánceres en estadio II y III normalmente están avanzados localmente y/o presentan implicación de ganglios linfáticos locales.

En general, cuanto más alto es el número de estadio más extendida está la enfermedad, incluyendo tamaño tumoral mayor y/o extensión del cáncer a los ganglios linfáticos cercanos y/o órganos adyacentes al tumor primario. Estos estadios se definen de forma precisa, pero la definición es diferente para cada tipo de cáncer y es conocido para los expertos en la técnica.

Muchos registros de cáncer, tales como el NCI's Surveillance, Epidemiology, y End Results Program (SEER), usan la estadificación abreviada. Este sistema se usa para todos los tipos de cáncer, Agrupa tipos de cánceres en cinco categorías principales.

In situ, es cáncer temprano que está presente solo en la capa de células en la que empieza.

Localizado, es el cáncer que está limitado al órgano en el que empieza, sin prueba de extensión.

Regional, es el cáncer que se ha extendido más allá del sitio original (primario) a los ganglios linfáticos cercanos u órganos y tejidos.

Distante, es el cáncer que se ha extendido desde el sitio primario a órganos distantes o ganglios linfáticos distantes.

Desconocido, se usa para describir casos para los que no hay suficiente información para indicar el estadio.

Además, es habitual que el cáncer vuelva después de meses o años de haber eliminado el tumor primario. El cáncer que recurre después de haber erradicado todo el tumor visible, se llama enfermedad recurrente. La enfermedad que es recurrente en la zona del tumor primario es localmente recurrente, y la enfermedad que es recurrente como metástasis se denomina recurrente distante.

El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor de tejido blando o no sólido. Los ejemplos de tumores de tejidos blandos incluyen leucemia (p. ej., leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, adulto leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica, leucemia polinfocítica, o leucemia de células peludas) o linfoma (p. ej., linfoma no Hodgkin, linfoma cutáneo de linfocitos T, o enfermedad de Hodgkin). Un tumor sólido incluye cualquier cáncer de los tejidos corporales distintos de sangre, médula ósea o el sistema linfático. Los tumores sólidos pueden dividirse además en

los de origen de células epiteliales y los de origen de células no epiteliales. Ejemplos de tumores sólidos de células epiteliales incluyen tumores del tracto gastrointestinal, colon, mama, próstata, pulmón, riñón, hígado, páncreas, ovario, cabeza y cuello, cavidad oral, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, ano, vesícula biliar, labio, nasofaringe, piel, útero, órgano genital masculino, órganos urinarios, vejiga, y piel. Los tumores sólidos de origen no epitelial incluyen sarcomas, tumores cerebrales y tumores óseos. Se describen otros ejemplos de tumores en la sección de definiciones.

En algunas realizaciones, el paciente de la presente memoria se somete a una prueba de diagnóstico, p. ej., antes y/o durante y/o después de la terapia. En general, si se lleva a cabo una prueba de diagnóstico, se puede obtener una muestra de un paciente que necesite terapia. Cuando el sujeto tiene cáncer, la muestra puede ser una muestra de tumor y otra muestra biológica, tal como un fluido biológico, incluyendo, sin limitación, sangre, orina, saliva, fluido ascítico, o derivados tales como suero sanguíneo y plasma sanguíneo, y similares.

La muestra biológica de la presente memoria puede ser una muestra fijada, p. ej., una muestra fijada en formalina, muestra insertada en parafina (FFPE) o una muestra congelada.

Los diferentes métodos para determinar la expresión del ARNm o proteína incluyen, pero no se limitan a perfil de expresión génica, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) incluyendo PCR en tiempo real (qRT-PCR), análisis de micromatrices, análisis seriado de expresión de genes (SAGE), MassARRAY, Análisis de expresión de genes por secuenciación masiva en paralelo (MPSS), proteómica, inmunohistoquímica (IHC), etc. Preferiblemente se cuantifica el ARNm. Dicho análisis de ARNm preferiblemente se lleva a cabo usando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por análisis de micromatrices. Cuando se usa la PCR, una forma preferida de PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). En una realización, la expresión de uno o más de los genes indicados antes se considera expresión positiva si está en la mediana o por encima, p. ej. comparado con otras muestras del mismo tipo de tumor. La mediana del nivel de expresión se puede determinar esencialmente contemporáneamente con la medición de la expresión génica o se puede haber determinado previamente.

Las etapas de un protocolo representativo para el perfil de la expresión génica usando tejidos fijados, insertados en parafina como la fuente de ARN, que incluyen el aislamiento del ARNm, purificación, extensión del cebador y amplificación se dan en diferentes artículos de revista publicados (por ejemplo: Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics

2: 84-91 (2000); Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Brevemente, un procedimiento representativo empieza cortando secciones gruesas de aproximadamente 10 microgramos de muestras de tejido tumoral insertado en parafina, Después, se extrae el ARN, y se eliminan las proteínas y ADN. Después de análisis de la concentración de ARN, se pueden incluir etapas de reparación de ARN y/o de amplificación, si es necesario, y se lleva a cabo la transcripción inversa del ARN usando promotores específicos de gen, seguido de PCR. Finalmente, se analizan los datos para identificar la o las mejores opciones de tratamiento para el paciente, basándose en el patrón de expresión génica característico, identificado en la muestra de tumor examinada.

La detección de la expresión del gen o proteína se puede determinar directa o indirectamente. Se puede determinar la expresión o translocación o amplificación del FGFR3 en el cáncer (directa o indirectamente). Para esto están disponibles diferentes ensayos de diagnóstico/pronóstico. En una realización, el exceso de expresión de FGFR3 se puede analizar por IHC. Las secciones de tejido insertadas en parafina de una biopsia de tumor se pueden someter al ensayo IHC, de acuerdo con un criterio de intensidad de tinción de proteína FGFR3 como sigue:

Puntuación 0, no se observa tinción o se observa tinción de membrana en menos de 10% de las células tumorales.

Puntuación 1+, se detecta una tinción de membrana débil/apenas perceptible en más de 10% de las células tumorales. Las células se tiñen en solo parte de su membrana.

Puntuación 2+, se observa una tinción de membrana completa de débil a moderada en más de 10% de las células tumorales.

Puntuación 3+, se observa una tinción de membrana completa de moderada a fuerte en más de 10% de las células tumorales.

En algunas realizaciones, los tumores con puntuaciones 0 o 1+ para la evaluación del exceso de expresión de FGFR3 se pueden caracterizar como que no expresan en exceso el FGFR3, mientras que los tumores con puntuaciones 2+ o 3+ se pueden caracterizar como que expresan en exceso el FGFR3.

En algunas realizaciones, los tumores que expresan en exceso FGFR3 se pueden clasificar por puntuaciones inmunohistoquímicas que corresponden al número de copias de moléculas de FGFR3 expresadas por célula, y se pueden determinar bioquímicamente:

0 = 0-90 copias/célula,

1+ = al menos aproximadamente 100 copias/célula,

2+ = al menos aproximadamente 1000 copias/célula,

3+ = al menos aproximadamente 10,000 copias/célula

Alternativa o adicionalmente, se puede llevar a cabo el ensayo FISH en tejido tumoral fijado en formalina, insertado en parafina para determinar la presencia y/o extensión (si hay) de la amplificación o translocación de FGFR3 en el tumor.

La activación de FGFR3 se puede determinar directamente (p. ej., por ensayo de fosfo-ELISA, o por otros medios de detección del receptor fosforilado) o indirectamente (p. ej., por detección de los componentes de la ruta de señalización corriente abajo activada), detección de dímeros del receptor (p. ej., homodímeros, heterodímeros), detección de perfiles de expresión de genes y similares.

De forma similar, se puede detectar el FGFR3 constitutivo y/o el FGFR3 independiente de ligando o dependiente de ligando, directa o indirectamente (p. ej., por detección de mutaciones del recetor correlacionadas con la actividad constitutiva, por detección de amplificación del receptor correlacionadas con la actividad constitutiva y similares).

Los métodos para detectar mutaciones de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. A menudo, aunque no necesariamente, un ácido nucleico diana en una muestra se amplifica para proporcionar la cantidad deseada del material para determinar si una mutación está presente. Las técnicas de amplificación son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, el producto amplificado puede abarcar o no toda la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés, con la condición de que el producto amplificado comprenda la posición de la secuencia de aminoácidos/ácido nucleico particular, donde se sospecha que está la mutación.

En un ejemplo, la presencia de la mutación se puede determinar poniendo en contacto el ácido nucleico de una muestra con una sonda de ácido nucleico que es capaz de hibridar específicamente con el ácido nucleico que codifica un ácido nucleico mutado, y detectar dicha hibridación. En una realización, la sonda está marcada de forma detectable, por ejemplo con un radioisótopo (3H, 32P, 33P etc), un agente fluorescente (rodamina, fluorescencia etc.)

o un agente cromógeno. En algunas realizaciones, la sonda es un oligómero de sentido contrario, por ejemplo PNA, morfolino-fosforamidatos, LNA o 2'-alcoxialcoxi. La sonda puede tener de aproximadamente 8 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 75, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30. En otro aspecto, las sondas de ácido nucleico de la invención se proporcionan en un kit para identificar mutaciones del FGFR3 en una muestra, comprendiendo dicho kit un oligonucleótido que hibrida específicamente con un sitio, o adyacente a un sitio de mutación en el ácido nucleico que codifica el FGFR3. El kit puede comprender además instrucciones para tratar pacientes que tienen tumores que contienen mutaciones de FGFR3 con un antagonista basado en el resultado de una prueba de hibridación usando el kit.

Las mutaciones también se pueden detectar comparando la movilidad electroforética de un ácido nucleico amplificado con la movilidad electroforética del ácido nucleico correspondiente que codifica el FGFR3 de tipo natural. Una diferencia en la movilidad indica la presencia de una mutación en la secuencia de ácido nucleico amplificada. La movilidad electroforética se puede determinar por cualquier técnica de separación molecular adecuada, por ejemplo, en un gel de poliacrilamida.

Los ácidos nucleicos también se pueden analizar para detectar mutaciones usando la Detección de mutación enzimática (EMD) (Del Tito et al, Clinical Chemistry 44:731-739, 1998). La EMD usa la resolvasa endonucleasa VII del bacteriófago VII, que hace un barrido a lo largo del ADN bicatenario hasta que detecta y escinde distorsiones estructurales causadas por apareamientos erróneos de pares de bases que dan lugar a alteraciones del ácido nucleico tales como mutaciones puntuales, inserciones y eliminaciones. La detección de dos fragmentos cortos formados por escisión de la resolvasa, por ejemplo, por electroforesis en gel, indica la presencia de una mutación. Los beneficios del método de EMD son un protocolo solo para identificar mutaciones puntuales, eliminaciones e inserciones ensayadas directamente a partir de reacciones de amplificación, eliminando la necesidad de la purificación de la muestra, acortando el tiempo de hibridación, y aumentando la relación señal a ruido. Se pueden ensayar muestras mixtas que contienen hasta un exceso de 20 veces de ácidos nucleicos normales y fragmentos de hasta 4 kb. Sin embargo, el barrido de EMD no identifica cambios de bases particulares que se producen en muestras de mutaciones positivas, por lo tanto, a menudo requiere procedimientos de secuenciación adicionales para identificar la mutación, si es necesario. La enzima CEL I se puede usar de forma similar a la resolvasa endonucleasa VII, como se demuestra en la patente de EE.UU. nº 5.869.245.

Otro kit de muestra para detectar mutaciones es una tira de ensayo de hibridación inversa similar al Haemochromatosis Strip Assay™ (Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf) para detectar mutaciones múltiples en los genes HFE, TFR2 y FPN1 que producen hemocromatosis. Dicho ensayo se basa en la hibridación específica de secuencia después de amplificación por PCR. Para ensayos de mutaciones individuales, se puede aplicar un sistema de detección basado en microplaca, mientras que para ensayos de mutaciones múltiples, se pueden usar tiras de ensayo como “macromatrices”. Los kits pueden incluir reactivos listos para usar para preparación, amplificación y detección de mutaciones de la muestra. Los protocolos de amplificación Multiplex son convenientes y permiten ensayar muestras con volúmenes muy limitados. Usando el formato de StripAssay directo, se puede completar el ensayo de 20 mutaciones o más en menos de 5 horas sin equipamiento costoso. Se aísla el ADN de una muestra y el ácido nucleico diana se amplifica in vitro (p. ej., por PCR) y se marca con biotina,

en general en una reacción de amplificación (“Multiplex”) individual. Los productos de amplificación después se hibridan selectivamente con sondas de oligonucleótidos (de tipo natural y específico mutante) inmovilizadas en un soporte sólido tal como una tira de ensayo en la que las sondas se inmovilizan en líneas paralelas o bandas. Los ampliciones biotinilados unidos se detectan usando la estreptavidina-fosfatasa alcalina y sustratos de color. Dicho ensayo puede detectar todas o cualquier subconjunto de las mutaciones de la invención. Con respecto a una banda de sonda de mutante particular, son posibles uno de tres patrones de señalización: (i) una banda solo para la sonda de tipo natural que indica la secuencia de ácido nucleico normal, (ii) bandas para la sonda tanto de tipo natural como un mutante, que indica el genotipo heterocigoto, y (iii) banda solo para la sonda mutante que indica genotipo mutante homocigoto. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un método de detección de mutaciones de la invención, que comprende aislar y/o amplificar una secuencia de ácido nucleico de FGFR3 diana de una muestra, de modo que el producto de amplificación comprende un ligando, poner en contacto el producto de amplificación con una sonda que comprende un patrón de unión detectable para el ligando y la sonda es capaz de hibridar específicamente una mutación de la invención, y después detectar la hibridación de dicha sonda con dicho producto de amplificación. En una realización, el ligando es biotina y la pareja de unión comprende avidina o estreptavidina. En una realización, la pareja de unión comprende estreptavidina-alcalina que es detectable con sustratos de color. En una realización, las sondas se inmovilizan, por ejemplo, en una tira de ensayo en donde las sondas complementarias con diferentes mutaciones se separan unas de otras. Alternativamente, el ácido nucleico amplificado se marca con un radioisótopo, en cuyo caso la sonda no necesita comprender un marcador detectable.

Las alteraciones de un gen de tipo natural abarcan todas las formas de mutaciones tales como inserciones, inversiones, eliminaciones y/o mutaciones puntuales. En una realización, las mutaciones son somáticas. Las mutaciones somáticas son aquellas que ocurren en determinados tejidos, p. ej., en el tejido tumoral, y no son heredadas en la línea germinal. Las mutaciones de la línea germinal se pueden encontrar en cualquiera de los tejidos del cuerpo.

Una muestra que comprende un ácido nucleico se puede obtener por métodos bien conocidos en la técnica, y que son adecuados para el tipo particular y localización del tumor. A menudo se usa la biopsia tisular para obtener un trozo representativo del tejido tumoral. Alternativamente, las células tumorales se pueden obtener indirectamente en forma de tejidos/fluidos que se sabe o se cree que contienen las células tumorales de interés. Por ejemplo, las muestras de lesiones de cáncer de pulmón se pueden obtener por resección, broncoscopia, aspiración con aguja fina, cepillados bronquiales o de esputo, líquido pleural o sangre. Las células de cáncer se desprenden de tumores y aparecen en dichas muestras corporales. Mediante el cribado de dichas muestras corporales, se puede lograr un diagnóstico temprano sencillo para enfermedades tales como el cáncer. Además, el progreso de la terapia se puede vigilar más fácilmente mediante el ensayo en dichas muestras corporales de genes diana mutantes o productos génicos.

Los medios para enriquecer una preparación tisular para células tumorales son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el tejido se puede aislar de secciones de parafina o criostato. Las células de cáncer se pueden separar de las células normales por citometría de flujo o captura por microdisección láser. Estas, así como otras técnicas para separar células tumorales de las normales, son bien conocidas en la técnica. Si el tejido tumoral está muy contaminado con células normales, la detección de las mutaciones puede ser más difícil, aunque se conocen técnicas para minimizar la contaminación y/o resultados positivos/negativos falsos, algunos de los cuales se describen en lo sucesivo. Por ejemplo, también se puede evaluar en una muestra la presencia de un biomarcador (incluyendo una mutación) que se sabe que está asociado con una célula tumoral de interés, pero no una célula normal correspondiente, o viceversa.

La detección de mutaciones puntuales en los ácidos nucleicos diana se puede llevar a cabo por clonación molecular de los ácidos nucleicos diana y secuenciación de los ácidos nucleicos usando técnicas bien conocidas en la materia. Alternativamente, se pueden usar técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de ácidos nucleicos a partir de una preparación de ADN genómico a partir del tejido tumoral. Después se puede determinar la secuencia de ácido nucleico de las secuencias amplificadas e identificar las mutaciones en las mismas. Las técnicas de amplificación son bien conocidas en la materia, p. ej., la reacción en cadena de la polimerasa como describen Saiki et al., Science 239:487, 1988; patentes de EE.UU.

4.683.203 y 4.683.195.

Debe observarse que el diseño y la selección de cebadores adecuados, son técnicas establecidas en la técnica.

La reacción en cadena de la ligasa, que se conoce en la técnica, también se puede usar para amplificar secuencias de ácido nucleico diana, Véase, Wu et al., Genomics, Vol. 4, pág. 560-569 (1989). Además, también se puede usar una técnica conocida como PCR específica de alelo. Véase, p. ej., Ruano y Kidd, Nucleic Acids Research, Vol. 17, pág. 8392, 1989. De acuerdo con esta técnica, se usan cebadores que hibridan en sus extremos 3’ con una mutación de ácido nucleico diana particular. Si la mutación particular no está presente, no se observa un producto de amplificación. También se puede usar la Amplificación Refractaria de Sistema de Mutaciones (ARMS), como se describe en la publicación de la solicitud de patente europea nº 0332435, y en Newton et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, p.7, 1989. Las inserciones y eliminaciones de genes también se pueden detectar por clonación, secuenciación y amplificación. Además, se pueden usar sondas de polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLP) para los genes o genes marcadores de alrededor para puntuar la alteración de un alelo o una inserción en

un fragmento polimórfico. También se puede usar el análisis de conformación de cadena sencilla (SSCP) para detectar variantes de cambios de base en un alelo. Véase, p. ej. Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pág. 2766-2770, 1989, y Genomics, Vol. 5, pág. 874-879, 1989. También se pueden usar otras técnicas para detectar inserciones y eliminaciones que son conocidas en la técnica.

La alteración de los genes de tipo natural también se puede detectar basándose en la alteración de un producto de expresión del gen de tipo natural. Dichos productos de expresión incluyen tanto ARNm como el producto proteína. Las mutaciones puntuales se pueden detectar amplificando y secuenciando el ARNm o por clonación molecular de ADNc hecho a partir del ARNm. La secuencia del ADNc se puede determinar usando técnicas de secuenciación de ADN que son bien conocidas en la técnica. El ADNc también se puede secuenciar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Los apareamientos erróneos son dúplex de ácidos nucleicos hibridados que no son 100% complementarios. La falta de complementariedad total puede deberse a eliminaciones, inserciones, inversiones, sustituciones o mutaciones de desplazamiento del marco. La detección de apareamientos erróneos se puede usar para detectar mutaciones puntuales en el ácido nucleico diana. Aunque estas técnicas pueden ser menos sensibles que la secuenciación, son más sencillas de llevar a cabo en un gran número de muestras de tejido. Un ejemplo de una técnica de escisión de apareamiento erróneo es el método de protección de RNasa, que se describe con detalle en Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 7575, 1985, y Meyers et al., Science, Vol. 230, p. 1242, 1985. Por ejemplo, un método de la invención puede implicar el uso de una ribosonda marcada que es complementaria del ácido nucleico diana de tipo natural. La ribosonda y el ácido nucleico diana procedentes de la misma muestra de tejido se reasocian (hibridan) entre sí y posteriormente se digieren con la enzima RNasa A que es capaz de detectar algunos apareamientos erróneos en una estructura de ARN dúplex. Si La RNasa A detecta un apareamiento erróneo, escinde en el sitio del apareamiento erróneo. Por lo tanto, cuando la preparación de ARN reasociada se separa en una matriz de gel electroforético, si la RNasa A ha detectado y escindido un apareamiento erróneo, se verá un producto de ARN que es más pequeño que el ARN dúplex de longitud completa para la ribosonda del ARNm o ADN. No es necesario que la ribosonda sea de la longitud completa del ARNm o gen del ácido nucleico diana, sino una parte del ácido nucleico diana, con la condición de que abarque la posición que se sospecha que está mutada. Si la ribosonda comprende solo un segmento del ARNm o gen del ácido nucleico diana, puede ser conveniente usar una serie de estas sondas para cribar la secuencia del ácido nucleico diana entera para los apareamientos erróneos, si se desea.

De una forma similar, las sondas de ADN se pueden usar para detectar apareamientos erróneos, por ejemplo, por escisión enzimática o química. Véase, p. ej., Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, 4397, 1988; y Shenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 989, 1975. Alternativamente, los apareamientos erróneos se pueden detectar por desplazamientos en la movilidad electroforética de los dúplex con apareamientos erróneos respecto a los dúplex bien apareados. Véase, p. ej., Cariello, Human Genetics, Vol. 42, p. 726, 1988. Con ribosondas o sondas de ADN, el ARNm o ADN del ácido nucleico diana que puede contener una mutación se puede amplificar antes de la hibridación. Los cambios en el ADN del ácido nucleico diana también se pueden detectar usando hibridación Southern, en especial si los cambios son reorganizaciones brutas, tales como eliminaciones e inserciones.

Las secuencias de ADN del ácido nucleico diana que se ha amplificado también se pueden cribar usando sondas específicas de alelo. Estas sondas son oligómeros de ácidos nucleicos, cada una de las cuales contiene una región del gen del ácido nucleico diana que alberga una mutación conocida. Por ejemplo, un oligómero puede tener aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, que corresponde a una parte de la secuencia del gen diana. Usando una batería de dichas sondas específicas de alelo, se pueden cribar productos de amplificación del ácido nucleico diana para identificar la presencia de una mutación previamente identificada en el gen diana. La hibridación de las sondas específicas de alelo con secuencias de ácido nucleico diana amplificadas se puede llevar a cabo, por ejemplo en un filtro de nailon. La hibridación con una sonda particular en condiciones de hibridación restrictivas indica la presencia de la misma mutación en el tejido tumoral como en la sonda específica de alelo.

La alteración de los genes diana de tipo natural también se puede detectar mediante cribado de la alteración de la correspondiente proteína de tipo natural. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con un producto del gen diana para cribar un tejido, por ejemplo, un anticuerpo que se sabe que se une a una posición mutada particular del producto génico (proteína). Por ejemplo, un anticuerpo que se usa puede ser uno que se une a un exón eliminado o que se une a una epítopo conformacional que comprende una parte eliminada de la proteína diana. La falta del antígeno cognado indicaría una mutación. También se podrían usar anticuerpos específicos para productos de alelos mutados para detectar productos génicos mutados. Los anticuerpos se pueden identificar mediante bibliotecas de presentación en fagos. Dichos ensayos inmunológicos se pueden hacer en cualquier formato conveniente conocido en la técnica. Estos incluyen transferencias Western, ensayos inmunohistoquímicos y ensayos ELISA. Se puede usar cualquier medio para detectar una proteína alterada para detectar la alteración de genes diana de tipo natural.

Las parejas de cebadores son útiles para determinar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico diana usando técnicas de amplificación de ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la polimerasa. Las parejas de cebadores de ADN monocatenario se pueden reasociar con secuencias dentro o alrededor de la secuencia de ácido nucleico diana con el fin de cebar la amplificación de la secuencia diana. También se pueden usar cebadores

específicos de alelo. Dichos cebadores se reasocian solo con una secuencia diana mutante, y por lo tanto solo amplificarán un producto en presencia de la secuencia diana mutante como molde. Con el fin de facilitar la posterior clonación de las secuencias amplificadas, los cebadores pueden tener secuencias con sitios de enzimas de restricción unidas a sus extremos. Dichas enzimas y sitios son bien conocidos en la técnica. En general, los cebadores se pueden hacer usando máquinas sintetizadoras de oligonucleótidos que están disponibles en el comercio. El diseño de cebadores particulares es bien conocido para los expertos en la técnica.

Las sondas de ácido nucleico son útiles para una serie de propósitos. Se pueden usar en la hibridación Southern con ADN genómico y en el método de protección de RNasa para detectar mutaciones puntuales descrito ya anteriormente. Las sondas se pueden usar para detectar productos de amplificación de ácidos nucleicos diana. También se pueden usar para detectar apareamientos erróneos con el gen o ARNm de tipo natural usando otras técnicas. Los apareamientos erróneos se pueden detectar usando enzimas (p. ej., nucleasa S1), productos químicos (p. ej., hidroxilamina o tetraóxido de osmio y piperidina), o cambios en la movilidad electroforética de híbridos con apareamientos erróneos comparado con los híbridos totalmente bien apareados. Estas técnicas se conocen en la materia. Véase, Novack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, p. 586, 1986. En general, las sondas son complementarias de secuencias fuera del dominio de quinasa. Se puede usar una batería entera de sondas de ácidos nucleicos para componer un kit para detectar mutaciones en ácidos nucleicos diana. El kit permite la hibridación con una región grande de una secuencia diana de interés. Las sondas pueden superponerse unas con otras o ser contiguas.

Si se usa una ribosonda para detectar apareamientos erróneos con ARNm, en general es complementaria al ARNm del gen diana. Por lo tanto, la ribosonda es una sonda de sentido contrario en cuanto que no codifica el correspondiente producto génico, porque es complementaria de la cadena codificante. La ribosonda en general se marcará con un material radiactivo, colorimétrico o fluorométrico, lo cual puede hacerse con medios conocidos en la técnica. Si la ribosonda se usa para detectar apareamientos erróneos con ADN, puede ser de cualquier polaridad, codificante o de sentido inverso. Igualmente, las sondas de ADN también se pueden usar para detectar apareamientos erróneos.

En algunos casos, el cáncer expresa en exceso o no el FGFR3. El exceso de expresión del receptor se puede determinar en un ensayo de diagnóstico o pronóstico evaluando niveles aumentados de la proteína receptora presentes en la superficie de una célula (p. ej., mediante un ensayo inmunohistoquímico, IHC). Alternativa o adicionalmente, se pueden medir los niveles del ácido nucleico que codifica el receptor en la célula, por ejemplo, por hibridación in situ fluorescente (FISH; véase el documento WO98/45479 publicado en octubre de 1998), transferencia Southern, o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tales como PCR cuantitativa en tiempo real PCR (RT-PCR). A parte de los ensayos anteriores, están disponibles diferentes ensayos in vivo para el experto en la técnica. Por ejemplo, se pueden exponer las células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que opcionalmente está marcado con un marcador detectable, p. ej., un isótopo radiactivo, y se puede evaluar la unión del anticuerpo a células en el paciente, p. ej., por barrido externo de la radiactividad o analizando una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo.

Agentes quimioterapéuticos

La terapia de combinación puede comprender además uno o más agentes quimioterapéuticos. La administración combinada incluye la coadministración o administración simultánea, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.

El agente quimioterapéutico, si se administra, normalmente se administra con dosis conocidas para el mismo, u opcionalmente reducidas debido a la acción combinada de los fármacos o efectos laterales negativos atribuibles a la administración del agente quimioterapéutico antimetabolito. La preparación y pautas posológicas para dichos agentes quimioterapéuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como determine empíricamente el experto en la técnica.

Se describen en la presente memoria varios agentes quimioterapéuticos que se pueden combinar.

En algunas realizaciones, los agentes quimioterapéuticos que se combinan se seleccionan del grupo que consiste en lenalidomida (REVLIMID), inhibidores de proteosoma (tales como bortezomib (Velcade) y PS342), taxoide bora (incluyendo docetaxel y paclitaxel), vinca (tales como vinorelbina o vinblastina), compuesto de platino (tales como carboplatino o cisplatino), inhibidor de la aromatasa (tales como letrozol, anastrozol o exemestano), anti-estrógenos

(p. ej. fulvestrant o tamoxifeno), etopósido, tiotepá, ciclofosfamida, pemetrexed, metotrexato, doxorrubicina liposomal, doxorubicina liposomal pegilada, capecitabina, gemcitabina, melthalin, doxorrubicina, vincristina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), o esteroides (p. ej., dexametasona y prednisona). En algunas realizaciones (p. ej, realizaciones que implican el tratamiento del mieloma múltiple t(4;14)+), se combinan dexametasona y lenalidomida, o dexametasona, o bortezomib, o vincristina, doxorubicina y dexametasona, o la talidomida y dexametasona, o doxorrubicina liposomal, vincristina y dexametasona, o lenalidomida y dexametasona, o bortezomib y dexametasona, o bortezomib, doxorrubicina, y dexametasona. En algunas realizaciones (p. ej.,

realizaciones que implican cáncer de vejiga), se combinan gemcitabina y cisplatino, o un taxano (p. ej., paclitaxel, docetaxel), o pemetrexed, o metotrexato, vinblastina, doxorubicina y cisplatino, o carboplatino, o mitomicina C en combinación con 5-fluorouracilo, o cisplatino, o cisplatino y 5-fluorouracilo

Formulaciones, dosificaciones y administraciones

Los agentes terapéuticos usados en la invención se formularán, dosificarán y administrarán de una forma de acuerdo con la buena práctica médica. Los factores que hay que considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se va a tratar, el sujeto particular que se va a tratar, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la pauta posológica, la interacción fármaco-fármaco de los agentes que se combinan y otros factores conocidos para los médicos.

Las formulaciones terapéuticas se preparan usando métodos convencionales conocidos en la técnica, mezclando el ingrediente activo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences (20ª edición), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Los vehículos adecuados incluyen solución salina, o tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa,

o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o PEG.

Opcionalmente, pero preferiblemente, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferiblemente cloruro sódico, y preferiblemente a concentraciones aproximadamente fisiológicas. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la concentración del conservante está en el intervalo de 0,1 a 2,0%, típicamente en v/v. Los conservantes adecuados incluyen los conocidos en la técnica farmacéutica. El alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metilparabeno y propilperabeno son conservantes preferidos. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden incluir un tensioactivo farmacéutico en una concentración de 0,005 a 0,02%.

La formulación de la presente memoria también puede contener más de un compuesto activo, según sea necesario para la indicación particular que se va a tratar, preferiblemente, estos con actividades complementarias que no se afecten de forma adversa unos a otros. Dichas moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para los objetivos previstos.

Los principios activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli(metacrilato de metilo), respetivamente, en sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas o nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, véase antes.

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.919) copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de γ-etilo, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOTTM (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico). Mientras que los polímeros tales como de etileno-acetato de vinilo y de ácido láctico-ácido glicólico permiten liberar moléculas a lo largo de más de 100 días, algunos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo de tiempo largo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlace S-S intermolecular por intercambio de tiodisulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los restos sulfhidrilo, liofilización de las soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polímero específicas.

Los agentes terapéuticos de la invención se administran a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa en forma de bolo o por infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalación. También se puede usar una estrategia ex vivo para aplicaciones terapéuticas. Las estrategias ex vivo implican transfectar o transducir células obtenidas del sujeto con un polinucleótido que codifica un antagonista de FGFR3. Las células transfectadas o transducidas después se devuelven al sujeto. Las células pueden ser cualesquiera de una amplia variedad de tipos incluyendo sin limitación, células hematopoyéticas (p. ej.,

células de la médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, linfocitos T o linfocitos B), fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos o células musculares.

Por ejemplo, si el antagonista de FGFR3 es un anticuerpo, el anticuerpo se administra por cualquier medio adecuado, incluyendo por vía parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, por administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra adecuadamente por infusión de pulsos, en particular con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferiblemente, la dosis se da mediante inyecciones, lo más preferiblemente inyecciones intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

En otro ejemplo, el compuesto antagonista de FGFR3 se administra localmente, p. ej., por inyecciones directas, cuando el trastorno o la ubicación del tumor lo permite, y las inyecciones se pueden repetir periódicamente. El antagonista de FGFR3 también se puede suministrar sistémicamente al sujeto o directamente a las células tumorales, p. ej., a un tumor o un lecho tumoral después de extirpación quirúrgica del tumor, con el fin de evitar o reducir la recurrencia o metástasis.

La administración de los agentes terapéuticos en combinación se lleva a cabo típicamente a lo largo de un periodo de tiempo definido (normalmente minutos, horas, días o semanas, dependiendo de la combinación seleccionada). La terapia de combinación se pretende que abarque la administración de estos agentes terapéuticos de una forma secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en un tiempo diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una forma sustancialmente simultánea.

El agente terapéutico se puede administrar por la misma vía o por diferentes vías. Por ejemplo, el anticuerpo anti-FGFR3 en la combinación se puede administrar por inyección intravenosa, mientras que un agente quimioterapéutico en la combinación se puede administrar por vía oral. Alternativamente, por ejemplo, ambos agentes terapéuticos se pueden administrar por vía oral, o ambos agentes terapéuticos se pueden administrar por inyección intravenosa, dependiendo de los agentes terapéuticos específicos. La secuencia en la que se administran los agentes terapéuticos también varía dependiendo de los agentes específicos.

Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis candidata inicial para administrar al paciente es de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg de cada agente terapéutico, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, dependiendo de los factores mencionados antes. Para las administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que el cáncer se ha tratado, medido por los métodos descritos anteriormente. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación.

La presente solicitud contempla la administración del anticuerpo de FGFR3 por terapia génica. Véase, por ejemplo, el documento WO96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996, relativo al uso de terapia génica para generar anticuerpos intracelulares.

Artículos de fabricación

En otro aspecto de la descripción, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de trastornos descritos antes. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto en o asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que está sola o combinada con otra u otras composiciones eficaces para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indican que la composición se usa para tratar la afección de elección tal como el cáncer. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente citotóxico adicional. El artículo de fabricación en esta realización de la invención puede comprender además un prospecto indicando que la primera y segunda composiciones de anticuerpos se pueden usar para tratar una afección particular, p. ej., cáncer. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Los siguientes son ejemplos de los métodos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica diferentes realizaciones, dada la descripción general proporcionada antes.

Ejemplos

Materiales y métodos

Líneas celulares y cultivo celular

La línea celular RT4 se obtuvo de la American Type Cell Culture Collection. Las líneas celulares RT112, OPM2 y Ba/F3 se adquirieron en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, (Alemania)). La línea celular de mieloma múltiple KMS11 la proporcionó generosamente el Dr. Takemi Otsuki en Kawasaki Medical School (Japón). La línea de células de cáncer de vejiga TCC-97-7 fue un regalo generoso de la Dr. Margaret Knowles en St James's University Hospital (Leeds, Reino Unido). La línea celular UMUC-14 se obtuvo del Dr. H.B. Grossman (actualmente en la University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, TX). Las células se mantuvieron en medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Sigma), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml y L-glutamina en condiciones de 5% de CO2 a 37°C.

Estudios de dimerización de FGFR3S249C

Las células UMUC-14 se desarrollaron en medio exento de cisteína, se trataron con R3Mab o DTNB durante 3 h, y los lisados celulares se sometieron a análisis de inmunotransferencia en condiciones reductoras o no reductoras. Para los estudios de dimerización in vitro, se clonó el FGFR3-IIIbS249C (restos 143-374) en el vector pAcGP67A y se expresó en células T.ni Pro. La proteína recombinante se purificó en columna de Ni-NTA seguido de columna Superdex S200. El dímero de FGFR3S249C se eluyó en Tris 25 mM (pH 7,5) y NaCl 300 mM. Se incubó R3Mab (1 µM) con el dímero de FGFR3S249C (0,1 µM) a 37°C en las siguientes condiciones: KH2PO4 100 mM (pH 7,5), DTT 25 µM, EDTA 1 mM y BSA 0,75 mg/ml. Se tomaron partes alícuotas de la reacción en los tiempos de medición indicados y la reacción se detuvo por adición de tampón de muestra sin β-mercaptoetanol. Se analizó el dímeromonómero por inmunotransferencia.

Estudios de xenoinjerto

Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Genentech. Se adquirieron ratones hembra nu/nu o ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) CB17, de 6-8 semanas de edad, en Charles River Laboratory (Hollister, CA). Se obtuvieron ratones sin pelo atímicos hembra del National Cancer Institute-Frederick Cancer Center. Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas exentas de patógenos. Células RT112 estables para el ARNhc (7 x 106), RT112 (7 x 106), Ba/F3-FGFR3S249C (5 x 106), OPM2 (15 x 106), o células KMS11 (20 x 106) se implantaron por vía subcutánea en el flanco de ratones en un volumen de 0,2 ml en HBSS/matrigel (1:1 v/v, BD Biosciences). Se implantaron células UMUC-14 (5 x 106) sin matrigel. Los tumores se midieron dos veces por semana usando un calibre y el volumen tumoral se calculó usando la fórmula: V=0,5 a x b2, donde a y b son la longitud y anchura del tumor, respectivamente. Cuando el volumen medio tumoral alcanzó 150-200 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 10 y se trataron dos veces por semana con inyección intraperitoneal (i.p.) de R3Mab (0,3-50 mg/kg), o una IgG1 humana de control diluida en HBSS. A los animales de control se les dio solo vehículo (HBSS).

Análisis estadístico

Los datos reunidos se expresan como la media +/-ESM. Se usaron ensayos t de Student para datos no pareados (2 colas) para la comparación entre dos grupos. Un valor de P<0,05 se consideró estadísticamente significativo en todos los experimentos.

Generación de células estables para ARNhc de FGFR3

Se clonaron tres ARNhc de FGFR3 independientes en el vector pHUSH como se describe en (1). La secuencia para el ARNhc de FGFR3 usado en los estudios es como sigue: ARNhc2: 5'GATCCCCGCATCAAGCTGCGGCATCATTCAAGAGATGATGCCGCAGCTTGATGCTTTTTTGGAAA (SEQ ID NO: 192); ARNhc4: 5'-GATCCCCTGCACAACCTCGACTACTA TTCAAGAGATAGTAGTCGAGGTTGTGCATTTTTTGGAAA-3' (SEQ ID NO: 193); ARNhc6: 5'-GATCCCCAACCTCGACTACTACAAGATTCAAGAGATCTTGTAGTAGTCGAGGTTTTTT TTGGAAA-3' (SEQ ID NO: 194). Todas las construcciones se confirmaron por secuenciación. El ARNhc de control de la EGFP se describió en el estudio previo de los autores de la invención (50). El ARNhc que contenía retrovirus se producjo por cotransfección de células de empaquetamiento GP2-293 (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) con contrucciones de VSV-G (Clontech Laboratories) y pHUSH-ARNhc de FGFR3, y los líquidos sobrenadantes víricos se recogieron 72 h después de transfección, y se limpiaron de desechos celulares por centrifugación para el experimento de transducción.

Las células RT112 se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía FBS exento de tetraciclina (Clontech Laboratories), y se transdujeron con líquidos sobrenadantes retrovíricos en presencia de polibreno 4 µg/ml. 72 horas después de infección, se añadió puromicina 2 µg/ml (Clontech Laboratories) al medio para seleccionar clones estables que expresaban el ARNhc. Se aislaron células estables, se trataron con doxociclina 0,1 o 1 µg/ml (Clontech Laboratories) durante 4 días, y la inactivación inducible de la expresión de la proteína FGFR3 se evaluó por análisis de transferencia Western. Los análisis del ciclo celular se realizaron como se describe en (51).

Selección de anticuerpos en fagos específicos para FGFR3

Se usaron bibliotecas de anticuerpos humanos en fagos con diversidades sintéticas en las regiones determinantes de la complementariedad seleccionadas (H1, H2, H3, L3), que imitaban la diversidad natural del repertorio de IgG 5 humana para la selección por pasos. Los fragmentos Fab se presentaron de forma bivalente en la superficie de partículas de bacteriófago M13 (52). Se usó como antígeno IgD2-D3 marcada con His de FGFR3-IIIb y IIIc. Inmunoplacas MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc) se recubrieron durante la noche a 4°C con proteína FGFR3-IIIb-His o proteína FGFR3-IIIC-His (10 µg/ml) y se bloquearon durante 1 hora con tampón PBST (PBS con Tween 20 al 0,05%) complementado con BSA al 1%. Se añadieron las bibliotecas de anticuerpos en fagos y se incubaron durante la 10 noche a temperatura ambiente (t.a.). Las placas se lavaron con tampón de PBST y se eluyeron los fagos unidos con HCl 50 mM y NaCl 500 mM durante 30 minutos y se neutralizaron con un volumen igual de base Tris 1 M. Los fagos recuperados se amplificaron en células de E. coli XL-1-Blue. Durante los siguientes ciclos de selección, el tiempo de incubación de los anticuerpos en fagos se disminuyó a 2 horas y se aumentaron gradualmente las condiciones de restricción de lavado de la placa (53). Los anticuerpos en fagos únicos y específicos que se unían tanto a la isoforma

15 IIIb como a la IIIc de FGFR3 se identificaron por ELISA de fagos y secuenciación de ADN. De los 400 clones cribados se seleccionaron cuatro para el reformado a las IgG de longitud entera clonando las regiones VL y VH de clones individuales en vectores LPG3 y LPG4, respectivamente, se expresaron transitoriamente en células de mamífero, y se purificaron con columna de proteína A (54). Se seleccionó el clon 184.6 para la maduración de la afinidad.

20 Para la maduración de la afinidad, el fagémido que presentaba el Fab monovalente en la superficie del bacteriófago M13 (52) servía como el molde de biblioteca para injertar los dominios variables de la cadena ligera (VL) y la cadena pesada del Ab en fago. Los codones de parada se incorporaron en la CDR-L3. Se adoptó una estrategia de aleatorización suave para la maduración de la afinidad como se ha descrito (53). Se seleccionaron dos combinaciones diferentes de bucles de CDR, H1/H2/L3, H3/L3, o L1/L2/L3 para la aleatorización. Para seleccionar

25 los clones de afinidad madurada, se separaron bibliotecas de fagos contra la proteína FGFR3 IIIb o IIIc-His, sometidas a separación en placa para el primer ciclo y seguido de cuatro ciclos de separación en fase de solución como se ha descrito (52). Después de cinco ciclos de separación, se usó un ELISA para fagos competitivo de punto único de alto rendimiento para el cribado rápido de clones de alta afinidad como se ha descrito (55). Los clones con una relación baja de absorbancia a 450 nm en presencia de FGFR3-His 10 nM respecto a esta en ausencia de

30 FGFR3-His se eligieron para la posterior caracterización.

Los clones 184.6.1, 184.6.21, 184.6.49, 184.6.51, 184.6.58, 184.6.62 y 184.6.92 redujeron significativamente la viabilidad de las líneas celular Ba/F3-FGFR3-IIIb, Ba/F3-FGFR3-IIIc y Ba/F3-FGFR3-S249C, y el clon 184.6.52 redujo significativamente la viabilidad de la línea celular Ba/F3-FGFR3-S249C. La mayor actividad inhibidora estaba en el intervalo de aproximadamente 50 veces (clon 184.6.52) a aproximadamente 100veces (clones 184.6.1,

35 184.6.21, 184.6.49, 184.6.51, 184.6.58, 184.6.62 y 184.6.92) mayor que el clon original 184.6, dependiendo de la línea celular ensayada. Las cinéticas de unión de los clones 184.6.1, 184.6.58, y 184.6.62 a FGFR3-IIIb y FGFR3-IIIc se determinaron usando BIAcore como sigue:

FGFR3-IIIb KD (M) FGFR3-IIIc KD (M)

184.6 3,80E-08 1,10E-07

184.6.1 2,64E-10 1,44E-09

184.6.58 1,90E-10 8,80E-10

184.6.62 1,20E-10 2,24E-09

Los clones 184.6.1, 184.6.58, y 184.6.62 también mostraron una inhibición mejorada de la señalización corriente abajo de FGFR3 en células Ba/F3-FGFR3, células RT112 y células OPM2.

40 Se seleccionó el clon 184.6.1. Se introdujo una modificación de la secuencia, N54S, en HVR H2 en el resto 54, para mejorar la fabricación, creando el clon 184.6.1N54S. Los clones 184.6.1 y 184.6.1N54S presentaron cinéticas de unión comparables (medido por ensayo de Biacore) y actividad comparable en el ensayo de viabilidad de células Ba/F3. Se generaron variantes de HVR H2 adicionales: se introdujo N54S en el clon 184.6.58, y N54G, N54A, o se introdujo N54Q en el clon 184.6.1 y 184.6.58. Estos clones mostraron actividad comparable en el ensayo de

45 viabilidad de células Ba/F3 respecto a los clones originales 184.6.1 o 184.6.58.

Se introdujo otra modificación de la secuencia, D30E, en HVR L1 del clon 184.6.1N54S, creando el clon 184.6.1NSD30E. El clon 184.6.1NSD30E y el clon 184.6.1N54S mostraron cinéticas de unión comparables y actividad comparable en el ensayo de viabilidad de células BA/F3 respecto a los clones originales 184.6.1 o

184.6.58.

50 Como se usa en la presente memoria, “R3 Mab” se refiere a los clones de anticuerpos anti-FGFR3 184.6.1 N54S, 184.6.1, o 184.6. El clon 184.6.1N54S se usó en las figuras y experimentos nombrado como "R3Mab", excepto los experimentos que conducían a los resultados mostrados en las siguientes figuras (para las que el anticuerpo usado se muestra entre paréntesis): Figuras 9B (clon 184.6.1), 10 (clon 184.6), 11A y B (clon 184.6), 13 (clon 184.6.1), 14A (clon 184.6.1), 14B, G, y H (clon 184.6), 19 (clon 184.6.1), y 22B y C (clon 184.6.1).

Análisis por BIAcore/resonancia de plasmón de superficie (SRP) para determinar las afinidades de unión del anticuerpo

Las afinidades de unión de R3Mab a FGFR3 se midieron por Biacore/SRP usando un instrumento BIAcore™-3000 como se ha descrito (52) con las siguientes modificaciones. El R3Mab se aplicó directamente como recubrimiento sobre chips biosensores CM5 para lograr aproximadamente 400 unidades de respuesta (RU). Para la medición cinética, se inyectaron diluciones seriadas de dos veces de proteína FGFR3-IIIb o IIIc-His (empezando en 67 nM) en tampón de PBST a 25°C con un caudal de 30 µl/minuto. Las velocidades de asociación (Kon, por mol/s) y las velocidades de disociación (Koff, por s) se calcularon usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (Programa BIAcore Evaluation versión 3.2). La constante de disociación en el equilibrio (Kd, por mol) se calculó como la relación de Koff/Kon.

Se midieron las afinidades de unión de anticuerpos de hibridoma de ratón a FGFR3 por Biacore/SRP como sigue. Se acopló FGFR3-IIIb o IIIc humano en tres celdas de flujo diferentes (FC), FC2, FC3 y FC4, de un chip sensor CM5 BIACORETM para lograr la unidad de respuesta (RU) de aproximadamente 50 RU. La inmovilización se consiguió mediante acoplamiento aleatorio por grupos amino usando un protocolo proporcionado por el fabricante. Se registraron los sensogramas para la unión de la IgG murina anti-FGFR3 o el fragmento Fab a estas superficies a 25°C por inyección de una serie de soluciones en el intervalo de 250 nM a 0,48 nM en incrementos de 2 veces con un caudal de 30 µl/min. Entre cada inyección, se sirvió glicina-HCl 10mM a pH 1,7 como el tampón para regenerar el chip sensor. La señal de la celda de referencia (FC3.1) se restó del sensograma observado de FC2, FC3 y FC4. Las constantes cinéticas se calcularon por ajuste de regresión no lineal de los datos de acuerdo con el modelo de Langmuir 1:1 usando el programa BIAcore Evaluation (versión 3.2) proporcionado por el fabricante.

Estudios de unión por ELISA

Los ADNc que codifican los dominios extracelulares (ECD) de FGFR1-IIIb, IIIc, FGFR2-IIIb y IIIc, FGFR3-IIIb y IIIc, y FGFR4 humanos, se clonaron en el vector basado en pRK para generar proteínas quiméricas de FGFR humano-Fc humano. Las proteínas recombinantes se produjeron por transfección transitoria de células de ovario de hámster chino (CHO) y se purificaron por cromatografía de afinidad de proteína A. Para ensayar la unión de los anticuerpos de los FGFR humanos, se recubrieron placas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc) durante la noche a 4°C con 50 µl de proteínas quiméricas de FGFR ECD-Fc humano 2 µg/ml. Después de bloqueo con solución salina tamponada con fosfato (PBS)/3% BSA, se añadió el anticuerpo FGFR3 y se incubó a t.a. durante 2 horas. El anticuerpo unido a FGFR3 específicamente se detectó usando un Fab anti-humano conjugado con HRP (KPL, Gaithersburg, MD).

Para ensayar el efecto de los anticuerpos contra FGFR3 en la interacción FGF/FGFR3, se capturaron proteínas quiméricas FGFR3-Fc en la placa Maxisorp recubierta con el anticuerpo específico anti-fragmento Fcγ de inmunoglobulina humana (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Después de lavado se añadió una cantidad creciente de anticuerpo de FGFR3 a la placa y se incubó durante 30 minutos. Después se añadieron FGF1 o FGF9 y heparina para incubación a t.a. durante 2 horas. Las placas se lavaron e incubaron durante 1 hora con anticuerpo policlonal específico de FGF1 biotinilado (BAF232) o anticuerpo de FGF9 biotinilado (BAF273, R&D Systems), seguido de detección con estreptavidina-HRP y TMB.

Generación de células estables Ba/F3-FGFR3

El ADNc que codifica FGFR3 IIIb o IIIc humano se clonó en el vector pQCXIP (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) para generar pQCXIP-FGFR3-IIIb o IIIc. Se introdujeron mutaciones específicas, es decir, R248C, S249C, G372C, Y375C y K652E, en el ADNc mediante QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA). Para generar células Ba/F3 estables que expresen FGFR3 de tipo natural o mutante, se cotransfectaron varias construcciones pQCXIP-FGFR3 en las células de empaquetamiento GP2-293 con el plásmido VSV-G (Clontech Laboratories). Después de selección con puromicina 2 µg/ml durante dos semanas, las células que expresaban el FGFR3 de tipo natural o mutante se tiñeron con mAb anti-FGFR3 humano conjugado con ficoeritrina (FAB766P, R&D Systems), y se seleccionaron mediante selección celular activada por fluorescencia (FACS) para los ensayos funcionales. Para el ensayo de proliferación celular en microplacas de valoración de 96 pocillos, se usó la siguiente densidad celular: para células que expresaban FGFR3-IIIb de tipo natural y FGFR3-K652E: 5.000 células/pocillo, para el resto: 10.000 células/pocillo. Las células se sembraron en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10%, FGF1 10 ng/ml más heparina 10 µg/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El R3Mab se añadió a la concentración indicada y los anticuerpos de FGFR3 de hibridoma de ratón se añadieron en concentración de 2000 a 0,49 ng/ml (en diluciones seriadas de 4 veces) en el experimento de FGFR3-IIIb y concentración de 5000 a 1,2 ng/ml (en diluciones seriadas de 4 veces) en el experimento de FGFR3-IIIc. Después de incubación durante 72 horas, la viabilidad celular se ensayó con CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI).

Ensayo de proliferación celular

Para los ensayos de proliferación para las células RT112, RT4 y TCC-97-7, se sembraron 3000 células/pocillo en microplacas de valoración de 96 pocillos y se dejó que se adhirieran durante la noche. Después el medio se sustituyó por medio bajo en suero (FBS al 0,5%) con control o R3Mab en las concentraciones indicadas. Después de 4 días de incubación, se añadió a cada pocillo [Metil-3H]timidina 1µCi (PerkinElmer, Waltham, MA) y se incubaron durante 16 horas adicionales. Las células se transfirieron a UniFilters usando el Packard Filtermate Harvester, y la [3H]-timidina incorporada en el ADN genómico de las células en crecimiento se midió usando TopCount (PerkiriElmer). En algunos casos, la viabilidad celular se ensayó con CellTiter-Glo (Promega) después de incubación con anticuerpos durante 4 días. Los valores se representan como medias +/-EE de cuádruplos.

Ensayo de crecimiento clonal

El efecto del R3Mab en la clonogenicidad de la célula se evaluó siguiendo un protocolo previamente descrito (50). En resumen, se sembraron 400 células UMUC-14 en una placa de 6 pocillos en medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10% para permitir la adhesión durante la noche. Después, se añadió el R3Mab o anticuerpo de control diluido en medio BSA al 0,1% hasta una concentración final de 10 µg/ml. Se usó un volumen igual de medio BSA al 0,1% solo (Simulado) como otro control. Las células se incubaron durante aproximadamente 12 días hasta que las células en los grupos de control formaron colonias suficientemente grandes. Las colonias se tiñeron con violeta cristal al 0,5%, y se cuantificó el número y tamaño de las colonias usando GelCount (Oxford, Reino Unido). El número de colonias mayores de 120 µm de diámetro se presentó como la media +/-EEM (n=12).

Análisis por inmunoprecipitación e inmunotransferencia

Para estudiar el efecto de los anticuerpos en la señalización de FGFR3, las células se privaron de alimento en medio exento de suero durante la noche antes de empezar el tratamiento. Las células se incubaron con anticuerpos diluidos en BSA al 0,1% (p/p), medio RPMI 1640 o con medio BSA al 0,1% solo (simulado). Después de 3 horas a 37ºC, se añadieron FGF1 (concentración final de 15 ng/ml) y heparina (concentración final de 5-10 µg/ml) a la mitad de las muestras. Como controles, se añadió un volumen similar de heparina a la otra mitad de las muestras. La incubación se continuó durante 10 min. Los líquidos sobrenadantes se separaron por aspiración y las células se lavaron con PBS helado, después se lisaron en tampón RIPA (Upstate, Charlottesville, VA) complementado con ortovanadato sódico 1 mM y cóctel de inhibidor de proteasa completo (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Los lisados se depuraron de materiales insolubles por centrifugación.

El FGFR3 se inmunoprecipitó usando un anticuerpo policlonal de conejo (sc-123, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y se analizó por electroforesis en gel de dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferencia Western. Se evaluó el FGFR3 fosforilado con un anticuerpo monoclonal contra la fosfotirosina (4G10, Upstate). El FGFR3 total se detectó con un anticuerpo monoclonal contra FGFR3 (sc-13121, Santa Cruz Biotechnology). La fosforilación y activación de la ruta de señalización de FGFR3 se detectaron usando los siguientes anticuerpos: anti-FGFRY653/654, anti-FRS2αY196, anti-fosfo-p44/42 MAPKT202/Y204, anti-p44/42 MAPK total y anti-AKTS473 se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA); y anti-FRS2α total (sc-8318) se adquirió en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Las transferencias se visualizaron usando un sustrato quimioluminiscente (ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Cartografía de epítopos del anticuerpo

Para determinar el epítopo de R3Mab, se sintetizaron 13 péptidos que se superponían, cada uno de 15 aminoácidos de longitud, para cubrir el dominio extracelular del FGFR3 humano de los restos 138 a 310. Los péptidos se biotinilaron en el extremo C y se capturaron en placas de estreptavidina (Pierce, Rockford, IL) durante la noche. Después de bloqueo con PBS/BSA al 3%, las placas se incubaron con R3Mab y se detectaron usando anticuerpo anti-IgG humana conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch) y el sustrato colorigénico de peroxidasa TMB (KPL, Gaithersburg, MD).

Se ensayaron los anticuerpos anti-FGFR3 de hibridoma de ratón 1G6, 6G1 y 15B2 en ensayo ELISA para identificar los epítopos. 1G6, 6G1 y 15B2 se unen a IgD2-IgD3 de FGFR3 humana (tanto la isoforma IIIb como IIIc), mientras que 5B8 solo se une a IgD2-IgD3 de FGFR3-IIIb humano. En un ensayo de competición, 1G6, 6G1 y 15B2 compitieron entre sí por la unión al FGFR3 humano, sugiriendo que 1G6, 6G1 y tienen epítopos que se superponen. Ninguno de los anticuerpos de hibridoma competía con el anticuerpo en fago 184.6, sugiriendo que los anticuerpos de hibridoma tienen distinto o distintos epítopos que 184.6.

Preparación y clonación molecular de los anticuerpos de ratón anti-FGFR3 1G6, 6G1 y 15B2

Ratones BALB/c se inmunizaron 12 veces con 2,0 µg de híbrido FGFR3-IIIb (rhFGFR3 (IIIB)/Fc, de R&D Systems, nº de catálogo 1264-FR, lote nº CYH025011, o con 2,0 µg de híbrido FGFR3-IIIc (rhFGFR3 (IIIc)/Fc, de R&D Systems, nº de catálogo 766-FR, lote nº CWZ055041, resuspendidos en adyuvante monofosforil lípido A/dicorinomicolato de trehalosa (Corixa, Hamilton, MT) en cada almohadilla de pata dos veces por semana. Tres días después del refuerzo final, se fusionaron ganglios linfáticos poplíteos con la línea celular de mieloma de ratón P3X63Ag.U.I, por electrofusión (Hybrimune, Cyto Pulse Sciences, Glen Burnic, Maryland). Las células de hibridoma fusionadas se seleccionaron de los ganglios poplíteos o células de mieloma no fusionados usando selección con hipoxantinaaminopterina-timidina (HAT) en medio D del kit de selección de hibridoma ClonaCell® (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canadá). Los líquidos sobrenadantes se cribaron inicialmente por la capacidad para unirse a FGFR3-IIIb y FGFR3-IIIc por ELISA, y los hibridomas de interés posteriormente se cribaron por su capacidad para teñirse por FACS en células transfectadas Ba/F con FGFR3-IIIb y células Ba/F de control, así como por su actividad de bloqueo de anticuerpo. Después los hibridomas seleccionados se clonaron por dilución límite.

Se extrajo el ARN total de las células de hibridoma productoras de anticuerpo monoclonal anti-FGFR3 humano 1G6 y 15B2, usando el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemania). Los dominios variable ligero (VL) y variable pesado (VH) se amplificaron usando la RT-PCR conlos siguientes cebadores degenerados:

1G6:

Cadena ligera (LC) directa: 5'-GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3' (SEQ ID NO: 195)

Cadena pesada (HC) directa:

5'-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3' (SEQ ID NO: 196)

6G1:

Cadena ligera (LC) directa: 5'-GTCAGATATCGTGCTGACMCARTCTCC-3' (SEQ ID NO: 197)

Cadena pesada(HC) directa: 5'-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3' (SEQ ID NO: 198)

15B2:

Cadena ligera (LC) directa: 5'-GTACGATATCCAGATGACMCARTCTCC-3' (SEQ ID NO: 199)

Cadena pesada (HC) directa: 5'-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3' (SEQ ID NO: 200)

Los cebadores inversos de a cadena ligera y la cadena pesada ara los tres clones son como sigue:

Cadena ligera inversa: 5'-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3' (SEQ ID NO: 201)

Cadena pesada inversa: 5'-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3' (SEQ ID NO: 202).

Los cebadores directos eran específicos para la secuencia de aminoácidos N-terminal de la región VL y VH. Los cebadores inversos de LC y HC se diseñaron para reasociarse con una región en el dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominio constante 1 de la cadena pesada (CH1), respectivamente, que son altamente conservados entre especies.

La VL amplificada se clonó en un vector de expresión de células de mamífero pRK (Shields et al, (2000) J. Biol. Chem. 276:659) que contenía el dominio constante kappa humano. La VH se insertó en un vector de expresión de células de mamífero pRK que codificaba el dominio constante de la IgG1 humana de longitud completa. La secuencia de las cadenas pesada y ligera se determinó usando métodos convencionales.

Cristalización, determinación de la estructura y refinado

El ECD de FGFR3-IIIb (restos 143-374) se clonó en el vector pAcGP67A (BD Bioscience, San Jose, CA), producido en células T.ni Pro y purificado usando columna de Ni-NTA seguido de cromatografía de exclusión por tamaños. El Fab de R3Mab se expresó en E. coli y se purificó secuencialmente en una columna de afinidad de proteína G, una columna de Sepharose SP y una columna Superdex 75. El complejo de Fab-FGFR3 se generó incubando un exceso de ECD de FGFR3, y el complejo después se desglicosiló y se purificó en una columna por tamaños Superdex-200 en tampón de TrisCl 20 mM a pH 7,5 y NaCl 200 mM. Las fracciones que contenían complejo se agruparon y se concentraron hasta 20 mg/ml y se usaron en ensayos de cristalización. Los cristales usados en la determinación de la estructura se desarrollaron a 4ºC en las siguientes condiciones: cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,5, MPD al 40% y PEG8000 al 5% usando un método de difusión de vapor. Los datos se procesaron usando HKL2000 y Scalepack (56). La estructura se resolvió con sustitución molecular usando el programa Phaser (57) y las coordenadas de 1RY3 (FGFR3) y 1N8Z (fragmento Fab). El modelo se completó usando el programa Coot (58) y la estructura se refinó a R/Rlibre de 20,4%/24,3% con el programa Refmac (59). Las coordenadas y factores de la estructura se depositaron en el Protein Data Bank con código de acceso 3GRW y también se describen en el documento USSN 61/163.222, presentado el 25 de marzo, 2009.

Ensayo de ADCC

Se aislaron PBMC humanos por centrifugación con gradiente de Ficoll de sangre heparinizada, y se midió la ADCC usando las líneas de células de mieloma múltiple OPM2 o KMS11 o líneas de células de cáncer de vejiga RT112 o UMUC-14 como diana y las PBMC como células efectoras con una relación de diana:efectora 1:100. Las células diana (10.000 células/pocillo) se trataron con R3Mab o con IgG1 humana de control durante 4 horas a 37ºC. La citotoxicidad se determinó midiendo la liberación de LDH usando el ensayo de integridad de membrana homogéneo CytoTox-ONE siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). Los resultados se expresan como porcentaje de citolisis especifica usando la fórmula: Citotoxicidad (%) = [(Lisis experimental -Lisis espontánea

5 experimental)/ (Lisis máxima objetivo -Lisis espontánea objetivo)] x 100, don la lisis espontánea es la citolisis no específica en ausencia de anticuerpo, y la lisis máxima objetivo es inducida por Triton X-100 al 1%.

Resultados

La inactivación del ARNhc inducible de FGFR3 atenúa el crecimiento de cáncer de vejiga in vivo

Como preludio para evaluar la importancia del FGFR3 en el crecimiento de tumor de vejiga in vivo, los autores de la

10 invención examinaron el efecto de la inactivación de FGFR3 in vivo. Varios ARN interferentes pequeños (ip) de FGFR3 regularon por disminución de forma eficaz el FGFR3 en líneas de células de cáncer de vejiga que expresaban FGFR3 de tipo natural (RT112, RT4, SW780) o mutante (UMUC-14, mutación S249C). La inactivación de FGFR3 en las 4 líneas celulares suprimía notablemente la proliferación en cultivo (figura 15). Después, generaron líneas celulares RT112 estables que expresaban el ARNhc de FGFR3 inducible por doxociclina. La inducción de 3

15 ARNhc de FGFR3 independientes por la doxociclina disminuía la expresión de FGFR3, mientras que la inducción de un ARNhc de control que se dirigía a la EGFP no tenía efecto (figura 7A). En ausencia de FGF exógeno, el tratamiento con doxociclina reducía la incorporación de [3H]-timidina por las células que expresaban diferentes ARNhc de FGFR3, pero no el ARNhc de control (figura 7B) confirmando que la inactivación del FGFR3 inhibe la proliferación. El análisis posterior de las células RT112 en crecimiento exponencial puso de manifiesto que la

20 inactivación de FGFR3 a lo largo de un tratamiento de 72 h con doxociclina reducía notable y específicamente el porcentaje de células en las fases S y G2, con un aumento concomitante de células en fase G1 (figura 7C). Se observaron efectos similares con otros dos ARNhc de FGFR3 (figura 16A). No se detectó un número significativo de células con un contenido de ADN subdiploide, sugiriendo que no había cambio en los niveles de apoptosis. Por lo tanto, el efecto inhibidor de la inactivación de FGFR3 en la proliferación de células RT112 se debe principalmente a

25 la atenuación del progreso del ciclo celular.

Después los autores de la invención evaluaron el efecto de la inactivación de FGFR3 en el crecimiento de xenoinjertos de tumor de RT112 preestablecidos en ratones. La inactivación de FGFR3 suprimió sustancial y específicamente el crecimiento tumoral (figura 7D, paneles superiores y figura 16B). El análisis de muestras de tumores de 45 días confirmó la inactivación eficaz de FGFR3 tras la inducción por doxociclina de ARNhc de FGFR3

30 comparado con el ARNhc de control (figura 7D, paneles inferiores). Estos resultados demuestran que el FGFR3 es críticamente importante tanto in vitro como in vivo en el crecimiento de células de cáncer de vejiga RT112.

Generación de un anticuerpo monoclonal anti-FGFR3 de bloqueo

Para examinar mejor la importancia del FGFR3 en el crecimiento tumoral y explorar el potencial de este receptor como una diana terapéutica, los autores de la invención desarrollaron un anticuerpo monoclonal anti-FGFR3 35 antagonista (R3Mab) usando un procedimiento de presentación en fagos. Seleccionaron este anticuerpo particular basándose en su capacidad para bloquear tanto la unión al ligando como la dimerización por FGFR3, y su capacidad única para inhibir no solo el FGFR3 de tipo natural sino también los mutantes asociados al cáncer más prevalentes de este receptor (véase más adelante). El R3Mab se dirige a los dominios extracelulares de IgD2 e IgD3 de FGFR3, que son necesarios y suficientes para la unión del FGF (4). El R3Mab se unía tanto a la isoforma IIIb como a la IIIc

40 del FGFR3 humano, pero no mostraba unión detectable a FGFR1, FGFR2 o FGFR4 (figura 8A). El análisis por Biacore indicaba que el R3Mab tenía una afinidad aparente similar por el FGFR3-IIIc murino, de macaco cangrejero y humano (no se muestran los datos). La afinidad del R3Mab por el FGFR3 humano se muestra en la tabla 2.

Tabla 2. Afinidad del R3Mab por el FGFR3 humano determinado por análisis de BIAcore

ECD de FGFR3 humano: R3 Mab capturado sobre chips

kon/(1/Ms): koff(1/s) Kd(M)

IIIb: 1,80E+06 2,00E-04 1,11E-10

IIIc: 9,10E+04 3,20E-04 3,52E-09

45 Después los autores de la invención ensayaron la capacidad de R3Mab para bloquear la unión al FGFR3 de FGF1 y FGF9. El R3Mab inhibía fuertemente la unión de FGF1 a FGFR3-IIIb y IIIc, con concentraciones inhibidoras mitad del máximo (CI50) de 0,3 nM y 1,7 nM, respectivamente (figura 8B, C). Igualmente, R3Mab bloqueaba eficazmente la unión de FGF9 al FGFR3-IIIb y IIIc, con una CI50 de 1,1 nM y 1,3 nM, respectivamente (figura 8D, E).

R3Mab inhibe el FGFR3 de tipo natural y sus variantes mutantes asociadas al cáncer más prevalentes Para examinar si el R3Mab inhibe la proliferación celular dirigida por FGFR3 de tipo natural o mutante, los autores de la invención aprovecharon la observación de que el FGFR3 ectópico en células Ba/F3 pro-B conferían proliferación y supervivencia independiente de interleuquina (IL) 3, dependiente de FGF1 (29). En ausencia de FGF1 e IL-3, las células Ba/F3 que expresaban de forma estable el FGFR3 de tipo natural no eran viables, mientras que el

5 FGF1 potenciaba mucho su proliferación (figura 9A). El R3Mab bloqueaba específicamente la proliferación de células Ba/F3-FGFR3 estimulada por FGF1 de una forma dependiente de la dosis (figura 9A). Después evaluaron el impacto del R3Mab en la señalización de FGFR3 en estas células. FGF1 inducía la fosforilación y activación de FGFR3 y la activación concomitante de p44/42 MAPK, mientras que el R3Mab suprimía eficazmente la activación de ambas moléculas (figura 9B).

10 En el cáncer de vejiga, las mutaciones activantes somáticas en FGFR3 se agrupan dentro de la región conectora entre IgF2 e IgD3, el dominio de yuxtamembrana extracelular o el dominio de quinasa (figura 9C). Las sustituciones de sentido alterado extracelulares dan lugar los más a menudo a una cisteína desemparejada, conduciendo a la dimerización de FGFR3 independiente de ligando. Las mutaciones producen niveles notablemente diferentes de activación de FGFR3 constitutiva, posiblemente debido a un impacto diferente en la orientación del dominio de

15 quinasa citoplasmático (30, 31). Las mutaciones más frecuentes son S249C, Y375C, R248C, G372C, y K652E, que juntas dan cuenta de 98% de todas las mutaciones de FGFR3 en el cáncer de vejiga (32). Los autores de la invención concluyeron que un agente terapéutico óptimo debería bloquear no solo la proteína FGFR3 de tipo natural, que es expresada en exceso en determinados cánceres, sino también los mutantes de FGFR3 asociados al tumor más prevalentes. Para evaluar mejor el R3Mab, generaron líneas celulares de Ba/F3 que expresaban establemente

20 cada una de las cinco variantes de mutantes de FGFR3 más comunes. Todos los mutantes se expresaron en niveles similares en la superficie celular, y los mutantes de cisteína dimerizaron espontáneamente son ligando (no se muestran los datos). Las líneas celulares que expresaban diferentes mutantes de cisteína presentaban una respuesta de crecimiento variable frente a FGF1, de acuerdo con los descubrimientos anteriores (30, 31). Como se ha descrito previamente (33), las células que expresaban FGFR3R248C presentaban proliferación constitutiva,

25 independiente de ligando, y no eran sensibles al FGF1 (figura 9D). Igualmente, la mutación más frecuente, FGFR3S249C, confería proliferación independiente de ligando (figura 9E). Hay que destacar que R3Mab suprimía la proliferación constitutiva dirigida por cualquiera de los mutantes (figura 9 D, E). Las células que expresaban las mutaciones del dominio de yuxtamembrana FGFR3G372C (figura 9F) o FGFR3Y375C (figura 9G) requerían FGF1 para la proliferación, y su crecimiento era bloqueado completamente por R3Mab. Las células que expresaban

30 FGFR3K652E mostraban proliferación independiente de ligando débil y crecimiento significativo en respuesta de FGF1 (33). El R3Mab no afectaba a la actividad basal débil de FGFR3K652E (no se muestran los datos), pero abolía prácticamente la proliferación inducida por ligando mediada por este mutante (figura 9H). Por lo tanto, el R3Mab tenía una capacidad única para inhibir tanto FGFR3 de tipo natural como los mutantes asociados al cáncer prevalentes. Además, el R3Mab no presentaba actividad agonista detectable.

35 En un esfuerzo separado, se generaron y caracterizaron múltiples anticuerpo de hibridoma de ratón anti-FGFR3 humano. Ninguno de los anticuerpos de hibridoma podía inhibir los mutantes de FGFR3 asociados al cáncer que ensayaron los autores de la invención (figura 17), no compartían epítopos que se superponían con R3Mab.

Además, todos los anticuerpos de hibridoma mostraron actividad agonista, estimulando fuertemente la proliferación de los mutantes de R3Mab asociados con el cáncer R248C y S249C, y mostrando alguna estimulación de la

40 proliferación de los mutantes Y375C y G370C. Los anticuerpos de hibridoma mostraron niveles diferenciales de antagonismo y agonismo, dependiendo del mutante de FGFR3 que se ensayara, como sigue:

1G6: 6G1 15B2

FGFR3-IIIb tipo natural: inhibición inhibición inhibición

FGFR3-IIIb R248C: estimulación 2X estimulación 4-5X estimulación 3-4X

FGFR3-IIIbS249C: estimulación 2X estimulación 4-5X estimulación 4-5X

FGFR3-IIIb Y375C: estimulación 1,2-1,5X estimulación 1,2-1,5X estimulación 1,2-1,5X

FGFR3-IIIb K652E: inhibición 50% inhibición 60-70% inhibición

FGFR3-IIIc: inhibición inhibición inhibición

FGFR3-IIIc G370C: Sin efecto inhibición 20-30% inhibición 10-2-%

Por lo tanto, los anticuerpos de hibridoma mostraron efecto diferencial impredecible en la proliferación celular de células Ba/F3 dirigida por diferentes mutantes de FGFR3.

Caracterización de anticuerpos de hibridoma de ratón anti-FGFR3 humano

Los anticuerpos de hibridoma de ratón anti-FGFR3 humano se caracterizaron además como sigue:

(1) En un ensayo para ensayar la capacidad de los anticuerpos de hibridoma anti-FGFR3 murino para inhibir la unión de FGF1 a las isoformas FGFR3-IIIb y IIIc humanas, los anticuerpos 1G6, 6G1 y 15B2 eran capaces de bloquear la 5 unión de FGF1 a las isoformas FGFR3-IIIb y IIIc humanas de una forma dependiente de la dosis. Cuando se ensayó a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 2000 a 0,49 ng/ml, los anticuerpos 1 G6, 6G1 y 15B2 bloquearon la unión de FGF1 a FGFR3-IIIb con valores de CI50 de 0,69, 0,87 y 0,72 nM. Cuando se ensayó a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 5000 a 1,2 ng/ml, los anticuerpos 1G6, 6G1 y 15B2 bloquearon la unión de FGF1 a FGFR3-IIIc con valores de CI50 de 0,57, 3,4 y 0,7 nM,

10 respectivamente.

(2) En un ensayo para ensayar la capacidad de los anticuerpos de hibridoma anti-FGFR3 murino para inhibir la unión de FGF9 a las isoformas FGFR3-IIIb y IIIc humanas, los anticuerpos 1G6, 6G1 y 15B2 bloquearon eficazmente la unión de FGF1 a las isoformas FGFR3-IIIb y IIIc humanas de una forma dependiente de la dosis. Cuando se ensayó a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 2000 a 0,49 ng/ml, los anticuerpos

15 1 G6, 6G1 y 15B2 bloquearon la unión de FGF9 a FGFR3-IIIb con valores de CI50 de 0,13, 0,16 y 0,07 nM. Cuando se ensayó a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 5000 a 1,2 ng/ml, los anticuerpos 1G6, 6G1 y 15B2 bloquearon la unión de FGF9 a FGFR3-IIIc con valores de CI50 de 0,13, 0,11 y 0,07 nM, respectivamente.

(3) La afinidad de unión de los anticuerpos de hibridoma anti-FGFR3 murino de longitud completa 1G6, 6G1 y 15B2 20 se determinó usando el análisis de Biacore. Los resultados de este análisis se muestran en la tabla 3.

Tabla 3

Anticuerpo: FGFR3-IIIB FGFR3-IIIC

kon (105M-1s -1): koff(10-4s -1) Kd (nM) kon (105M-1s -1) koff(10-4s -1) Kd (nM)

mIgG 1G6: 2,2 3,1 1,4 2,2 2,8 1,3

mIgG 6G1: 2,7 3,8 1,4 2,6 3,2 1,2

mIgG 15B2: 4,1 29 7,1 3,5 39 11,1

(4) En un ensayo para ensayar la capacidad de los anticuerpos de hibridoma anti-FGFR3 murino para inhibir la proliferación celular de Ba/F3 dirigida por FGFR3-IIIb o IIIc humano, los anticuerpos 1G6, 6G1 y 15B2 eran capaces

25 de bloquear la proliferación celular de Ba/F3 dirigida por FGFR3-IIIb o IIIc humano de una forma dependiente de la dosis. Cuando se ensayó a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 0,01 a 100 ug/ml, los anticuerpos 1 G6, 6G1 y 15B2 bloquearon la proliferación celular de Ba/F3 dirigida por FGFR3-IIIb con valores de CI50 de 3-5 nM, 3 nM y 6-8 nM, respectivamente, y bloquearon la proliferación celular de Ba/F3 dirigida por FGFR3-IIIc con valores de CI50 de 10-35 nM, 24 nM y 60 nM, respectivamente.

30 (5) En un ensayo para ensayar la capacidad de los anticuerpos de hibridoma anti-FGFR3 murino para inhibir la señalización inducida por FGF1 en células de Ba/F3 que expresan el FGFR3-IIIb humano, los anticuerpos 1G6, 6G1 y 15B2 eran capaces de bloquear la señalización inducida por FGF1 en células de Ba/F3 que expresan el FGFR3-IIIb humano de una forma dependiente de la dosis, cuando se ensayó a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 0,25 a 6,75 ug/ml. En este experimento se usaron 25 ng/ml de FGF1. En

35 ausencia de FGF1, el tratamiento con anticuerpo no tenía efecto en la activación del FGFR3.

(6) En un ensayo para ensayar la capacidad de los anticuerpos de hibridoma anti-FGFR3 murino para inhibir la señalización inducida por FGF1 en células de Ba/F3 que expresan el FGFR3-IIIc humano, los anticuerpos 1G6, 6G1 y 15B2 eran capaces de bloquear la señalización inducida por FGF1 en células de Ba/F3 que expresan el FGFR3-IIIc humano de una forma dependiente de la dosis, cuando se ensayó a lo largo de un intervalo de concentraciones

40 de anticuerpo de aproximadamente 0,25 a 6,75 ug/ml. En este experimento se usaron 25 ng/ml de FGF1. En ausencia de FGF1, el tratamiento con anticuerpo no tenía efecto en la activación del FGFR3.

Base estructural para la interacción de R3Mab con el FGFR3

Para comprender mejor el modo de interacción del R3Mab con el FGFR3, los autores de la invención sintetizaron un panel de 13 péptidos que se superponían que abarcaban las regiones IgD2 y D3 de FGFR3-IIIb, y se ensayó su 45 unión al R3Mab. Los péptidos 3 (restos 164-178) y 11 (restos 269-283) mostraron unión específica al R3Mab, teniendo el péptido 3 una interacción más fuerte (figura 10A), lo que indicaba que las correspondientes regiones en el FGFR3 son críticas para el reconocimiento por el R3Mab. Estudios cristalográficos previos de FGFR1 en complejo con FGF2 identificaron restos del receptor críticos implicados en la unión directa al FGF y heparina, así como en la

dimerización del receptor (34). El alineamiento de los péptidos 3 y 11 de FGFR3 con sitios funcionalmente importantes en FGFR1, puso de manifiesto que estos péptidos abarcan los restos correspondientes de FGFR1 esenciales para la unión directa de FGF2, dimerización del receptor, así como la interacción con heparina (figura 10B). Estos datos indican que el epítopo de R3Mab en FGFR3 se superpone con los restos del receptor implicados

5 en la asociación del ligando y la interacción de receptor-receptor.

Después los autores de la invención cristalizaron el complejo entre el fragmento Fb de R3Mab y la región IgD2-D3 extracelular de FGFR3-IIIb humano, y determinaron la estructura de rayos X con resolución de 2,1 Å (figura 10 C, D; tabla 4). En este complejo, aproximadamente 1400 Å2 y 1500 Å2 of de área superficial accesible al disolvente está oculta en FGFR3 y el Fab, respectivamente. Aproximadamente 80% of de la interfase oculta implica IgD2, mientras 10 que el resto implica las regiones del conector y de IgD3. En el lado de Fab del complejo, aproximadamente 40% de la interfase oculta implica la región determinante de la complementariedad (CDR)-H3, 20% CDR-H2, 20% CDR-L2, y contribuciones minoritarias son de otras CDR y restos de la región armazón. Es de destacar que los aminoácidos (AA) de CDR-H3 forman dos cadenas β, que extienden la lámina ß de IgD2 (figura 10D). El Fab interacciona con los AA que constituyen el sitio de unión a FGF de FGFR3, así como restos que forman la interfase de dimerización del 15 receptor, como se ha identificado previamente en diferentes complejos diméricos de FGF:FGFR (p. ej., código PDB 1CVS, (34); y figura 10C, áreas en gris/sombreadas y gris oscuro). Las interfases de interacción identificadas por cristalografía eran totalmente consistentes con los datos basados en péptidos (figura 18 A, B). Juntos estos resultados ponen de manifiesto cómo inhibe el R3Mab la unión del ligando, y además sugieren que la unión del R3Mab a FGFR3 puede prevenir la dimerización del receptor. Los aminoácidos del FGFR3 que se ponen en

20 contacto con el R3Mab se muestran en la tabla 5. Las coordenadas cristalográficas para esta estructura están depositadas en el Banco de datos de proteínas con código de acceso 3GRW.

Tabla 4: Resumen del análisis cristalográfico

Colección de datos FGFR3-IIIb: R3Mab Fab

Grupo espacial P212121

Parámetros de cela a=58,5, b=99,3,c=143,7

Resolución (Å) 25-2,1

Rsyma 0,098 (0,663)b

Número de observaciones 288498

Reflexiones únicas 49851

Completitud (%) 99,9 (100,0)b

Refinamiento

Resolución (Å) 20-2,1

Número de reflexiones 46714

Final Rc , Rlibre (F>0) 0,187, 0,224

Número de átomos no H 5270

Número de aminoácidos 650

Sulfato 1

Azúcar 1

Átomos de disolvente 274

Enlaces Rmsd (Å) 0,011

Ángulos Rmsd (°) 1,4

aRsym = Σ|I-<I>| / Σ I. <I> es la intensidad media de las observaciones relacionadas con simetría de una reflexión única. b Los números entre paréntesis se refieren a la capa de mayor resolución. c R = Σ|Fo-Fc| / ΣFo. Rlibre se calcula como R, salvo para 5% de las reflexiones excluidas de todo el refinamiento.

Tabla 5: Restos en FGFR3 que están en contacto con restos de R3Mab en superficie ocultos de restos en la

interfase THR 154 0,10 ARG 155 16,50 ARG 158 105,40 MET 159 6,00 LYS 161 52,50 LYS 162 1,70 LEU 163 12,30 LEU 164 55,10 ALA 165 10,10 VAL 166 10,60 PRO 167 45,50 ALA 168 22,60 ALA 169 63,60 ASN 170 75,40 THR 171 83,00 VAL 172 1,70 ARG 173 91,70 PHE 174 1,50 ARG 175 95,60 PRO 177 15,90 GLY 202 2,10 LYS 205 63,40 ARG 207 67,60 GLN 210 31,60 SER 212 0,40 VAL 214 26,40 GLU 216 48,90 SER 217 1,80 TYR 241 15,90 LEU 246 3,10 GLU 247 1,80 ARG 248 46,90 TYR 278 32,20 SER 279 1,80 ASP 280 19,80 ALA 281 3,00

GLN 282 24,80

PRO 283 0,50

SER 314 1,20

GLU 315 82,60

SER 316 33,20

VAL 317 56,60

GLU 318 51,50

Los autores de la invención compararon la estructura de R3Mab-FGFR3 con una estructura previamente publicada de FGFR3-IIIc en complejo con FGF1 (4, 35) (figura 10E, 10F). La superposición de los complejos de anticuerporeceptor y ligando-receptor, puso de manifiesto que no hay diferencias conformacionales importantes dentro de los dominios del receptor individuales, excepto en la región que distingue FGFR3-IIIc de FGFR3-IIIb; sin embargo, la

5 orientación de IgD3 respecto a IgD2 era drásticamente diferente (figura 10E, blanco y gris; figura 10F, blanco y malla gris). Puesto que las posiciones relativas de IgD2 e IgD3 son críticas para la unión al ligando, la conformación alternativa adoptada por IgD3 tras la unión del R3Mab puede proporcionar un mecanismo adicional para prevenir la interacción del ligando con el FGFR3.

R3Mab inhibe el FGFR3 endógeno de tipo natural y mutante en células de cáncer de vejiga

10 Para evaluar si el R3Mab podía suprimir la función del FGFR3 en células de cáncer de vejiga, primero se examinaron las líneas celulares RT112 y RT4, que expresan FGFR3 de tipo natural. El R3Mab inhibía fuertemente la incorporación de [3H]-timidina por las células RT112 (figura 11A) y ejercía una supresión significativa, aunque más moderada de la proliferación de células RT4 (figura 19A). Para investigar el efecto del R3Mab en la activación del FGFR3, se examinó la fosforilación de FGFR3 en células RT112. De acuerdo con los resultados en células Ba/F3

15 FGFR3 (figura 9B), el R3Mab atenuaba notablemente la fosforilación del FGFR3 inducida por FGF1 (figura 11B). Después se examinó la fosforilación de FRS2α, AKT y p44/42 MAPK, tres mediadores corriente abajo de la señalización de FGFR3. FGF1 activaba fuertemente estas moléculas en células RT112, mientras que el R3Mab disminuía significativamente esta activación (figura 11B). Igualmente, el R3Mab suprimía la fosforilación inducida por FGF1 de FGFR3 y MAPK en células RT4 (figura 19B).

20 Después se investigó si R3Mab podía inhibir la activación del FGFR3 mutante endógeno en las células de cáncer de vejiga humanas. S249C es la mutación más frecuente del FGFR3 en el cáncer de vejiga (figura 9C). Dos líneas celulares disponibles, UMUC-14 y TCC-97-7, llevan el alelo mutado FGFR3S249C (Ref. 36 y no se muestran los datos). Aunque el R3Mab no afectaba al crecimiento exponencial de las células UMUC-14 en cultivo (no se muestran los datos), se reduce significativamente el crecimiento clonal de estas células (figura 11C).

25 Específicamente, el R3Mab disminuía el número de colonas mayores de 120 µm de diámetro aproximadamente en 77% comparado con el anticuerpo de control (figura 11D). Además, el R3Mab inhibía la incorporación de [3H]timidina por las células TCC-97-7 en cultivo (figura 19C).

Se describe que la mutación S249C da lugar a la activación de FGFR3 independiente de ligando (26, 30). Realmente, FGFR3S249C era fosforilado constitutivamente independientemente del tratamiento con FGF1 en células

30 UMUC-14 y células TCC-97-7, mientras que el R3Mab reducía la fosforilación constitutiva de FGFR3S249C comparado con el anticuerpo de control en ambas líneas celulares (figuras 11E, 19D).

R3Mab inhibe la formación de dímero por FGFR3S249C

La capacidad del R3Mab para inhibir la señalización de FGFR3S249C constitutiva y proliferación en células de cáncer de vejiga era sorprendente, considerando que este mutante puede sufrir dimerización independiente de ligando, 35 unida por disulfuro (26,30). Para explorar como inhibe el R3Mab a FGFR3S249C, se examinó el efecto del R3Mab en el estado oligómero de este mutante en células UMUC-14. En condiciones reductoras, FGFR3S249C migraba como una sola banda de ~97 kDa, de acuerdo con el tamaño de monómero (figura 12A). En condiciones no reductoras, en las células tratadas con anticuerpo de control, una fracción grande de FGFR3S249C aparecía como una banda de ~200 kDa, independientemente de la adición de FGF1, indicando un estado de dímero constitutivo (figura 12A). El

40 tratamiento con R3Mab disminuyó sustancialmente la cantidad de dímeros, con un aumento concomitante de monómeros (figura 12A). De acuerdo con esto, el R3Mab disminuía el nivel de dímeros de FGFR3S249C en células TCC-97-7, independientemente del tratamiento con FGF1 (figura 19E).

¿Cómo disminuye el R3Mab los niveles de dímero de FGFR3S249C en células de cáncer de vejiga? Una potencial explicación es que alteran el dímero de FGFR3S249C mediante la internalización de FGFR3 inducida por el anticuerpo 45 y el tráfico a través de endosomas o lisosomas. Los autores de la invención ensayaron esta posibilidad interviniendo farmacológicamente con la endocitosis. No obstante, el R3Mab disminuía la cantidad de dímero en células UMUC

14 previamente tratadas con diferentes inhibidores de endocitosis, a pesar del bloqueo sustancial de la internalización de células UMUC-14 (figuras 20 A, B). Por lo tanto, la alteración del dímero por el R3Mab es independiente de la endocitosis. Otra posible explicación es que el FGFR3S249C celular puede existir en un equilibrio dinámico de monómero-dímero; por consiguiente, la unión del R3Mab al FGFR3S249C monómero podría prevenir la formación de dímero y por lo tanto desplazar el equilibrio hacia el estado de monómero. Para examinar esta posibilidad, usaron el agente ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) no permeable en célula, que reacciona selectivamente y bloquea grupos sulfhidrilo libres de cisteína desemparejadas (37). El tratamiento de células UMUC14 con DTNB llevaba a la acumulación de monómeros de FGFR3S249C a expensas de los dímeros (figura 12B), indicando que FGFR3S249C existe en un equilibrio dinámico entre monómeros y dímeros.

Para ensayar si el R3Mab afecta a este equilibrio, se generó una proteína recombinante soluble que comprendía los dominios IgD2-D3 de FGFR3S249C y se aislaron los dímeros por cromatografía de exclusión por tamaños. Se incubaron los dímeros con tampón o anticuerpos en presencia de una concentración muy baja de agente de reducción (DTT 25 µM), y se analizó el estado de oligómeros del receptor por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. El R3Mab aceleraba significativamente la aparición de una banda de ~25 kDa que representaba FGFR3S249C monómero a expensas del dímero de ~50 kDa, comparado con los controles de simulación o de anticuerpo (figura 12C); realmente, en 2 h, la disminución de los dímeros era sustancialmente más completa en presencia del R3Mab. Estos resultados indican que el R3Mab desplaza el equilibrio entre los estados monómeros y dímeros de FGFR3S249C en favor del monómero.

R3Mab no promueve la regulación por disminución de FGFR3

Los autores de la invención examinaron el efecto del R3Mab (clon 184.6.1) y los anticuerpos de hibridoma anti-GFGR3 en la regulación por defecto del FGFR3, analizando la internalización de FGFR3 y la degradación en células tratadas con anticuerpos de FGFR3. Se trataron líneas de células de cáncer de vejiga que expresaban el FGFR3 de tipo natural (RT112) o FGFR3 mutado (S249C en TCC-97-7) con el R3Mab o anticuerpos de hibridoma 1G6 y 6G1 durante 4 a 24 horas, después se recogieron los lisados celulares para el análisis por transferencia Western de los niveles totales de FGFR3. El tratamiento con R3Mab no reducía los niveles de FGFR3, mientras que el tratamiento con los mAb de hibridoma 1G6 y 6G1 reducía significativamente los niveles de FGFR3. Estos resultados sugerían que el R3Mab no promueve la regulación por disminución de FGFR3, mientras que los mAb 1G6 y 6G1 si promueven la internalización del receptor FGFR3 y regulación por disminución. En un experimento separado, se examinaron los niveles de FGFR3 en la superficie usando análisis de FACS. Después de 24 horas de tratamiento con R3Mab (clon 184.6.1) de células UMUC-14 (que contenían la mutación S249C de FGFR3), aumentaron ligeramente los niveles de FGFR3 en la superficie celular. Estos resultados demuestran que el tratamiento con R3Mab no promovía la regulación por disminución de FGFR3.

R3Mab inhibe el crecimiento y la señalización de FGFR3 en múltiples modelos de tumor

A continuación, los autores de la invención examinaron el efecto del R3Mab en el crecimiento de células de vejiga in vivo. Se inyectó a ratones nu/nu células RT112 (que expresaban el FGFR3 de tipo natural), se dejó que los tumores crecieran hasta un volumen medio de ~150 mm3, y se administró a los animales dos veces por semana vehículo o R3Mab. Comparado con el control de vehículo, el día 27, el tratamiento con 5 o 50 mg/kg de R3Mab suprimía el crecimiento tumoral en aproximadamente 41% o 73%, respectivamente (figura 13A). El análisis de los lisados tumorales recogidos 48 h o 72 h después del tratamiento, mostraba que el R3Mab disminuía notablemente el nivel de FRS2α fosforilado (figura 13B). Curiosamente, los niveles de proteína FRS2α totales también eran menores en los tumores tratados con R3Mab, sugiriendo que la inhibición del FGFR3 puede conducir además a la regulación por disminución de FRS2α. El R3Mab también disminuía la cantidad de MAPK fosforilado en tumores, sin afectar a los niveles de MAPK totales (figura 13B). Por lo tanto, el R3Mab inhibe el crecimiento de xenoinjertos tumorales de RT112 junto con el bloqueo de la señalización por el FGFR3 de tipo natural.

Después se investigó el efecto del R3Mab en el crecimiento de xenoinjertos que expresaban el FGFR3 mutante. El tratamiento con R3Mab atenuó profundamente el avance de tumores Ba/F3-FGFR3S249C (figura 13C). Además, el R3Mab inhibía significativamente el crecimiento de xenoinjertos de carcinoma de vejiga de UMUC-14 (figura 13D). Para evaluar si el R3Mab tiene impacto en la activación de FGFR3S249C in vivo, se evaluó el nivel de dímero de FGFR3S249C en lisados tumorales recogidos 24 h o 2 h después de tratamiento. En condiciones no reductoras, la cantidad de dímero de FGFR3S249C era sustancialmente menor en los tumores tratados con R3Mab comparados con el grupo de control, mientras que los niveles totales de FGFR3S249C, considerado como la cantidad detectada en condiciones reductoras, mostró cambio pequeño (figura 13E). No se observó acumulación aparente del monómero de FGFR3S249C en los lisados tumorales, a diferencia de los resultados en cultivo celular (figura 13E frente a 12A). Esto podía deberse a la baja sensibilidad de detección para el FGFR3 monómero en condiciones no reductoras por el anticuerpo de conejo anti-FGFR3 policlonal usado en este estudio (figura 21). Es importante que el R3Mab también inhibía significativamente la fosforilación de MAPK en tumores de UMUC-14 (figura 13E), sugiriendo que el R3Mab inhibe la actividad de FGFR3S249C in vivo. No se observó pérdida de peso significativo ni otras anomalías grandes en ninguno de los estudios in vivo. Además, en un estudio de seguridad realizado en ratones, el R3Mab que se une con afinidad similar tanto al FGFR3 humano como al murino, no ejercía ninguna toxicidad discernible en ninguno de los órganos, incluyendo la vejiga (no se muestran los datos). Juntos, estos datos indican que exposiciones múltiples al R3Mab son bien toleradas en ratones.

La actividad antitumoral del R3Mab en modelos de xenoinjerto de mieloma múltiple implica ADCC

Para evaluar si el R3Mab puede albergar el potencial terapéutico para el mieloma múltiple, se ensayó primero el efecto del R3Mab en la proliferación y supervivencia de tres líneas celulares t(4;14)+ en cultivo. Las células UTMC-2 llevan FGFR3 de tipo natural, mientras que OPM2 y KMS11 albergan una sustitución K650E y Y373C, respectivamente (7). En cultivo, el R3Mab anulaba la proliferación inducida por FGF9 de células UTMC-2 completamente (figura 22A). El R3Mab inhibía modestamente el crecimiento de células OPM2, pero no tenía efecto aparente en la proliferación de células KMS11 (figura 22 B, C). Puesto que las células UTMC-2 no forman tumores en ratones, se evaluó la eficacia del R3Mab contra tumores de OPM2 y KMS11. El R3Mab abolía casi completamente el crecimiento de tumor de xenoinjerto en ambas líneas celulares (figura 14 A, B).

La notable diferencia en actividad del R3Mab contra células tumorales OPM2 y KMS11 in vitro e in vivo sugería la posibilidad de que el R3Mab pudiera ser capaz de soportar funciones efectoras inmunitarias mediadas por Fc contra estos tumores que expresan en exceso el FGFR3. Ambas líneas celulares expresan niveles altos de CD55 y CD59 (no se muestran los datos) dos inhibidores de la ruta del complemento; por consiguiente, no se observó citotoxicidad dependiente del complemento (no se muestran los datos). Después los autores de la invención se centraron en la ADCC. La ADCC se produce cuando un anticuerpo se une a su antígeno en una célula diana, y a través de su región Fc, implica receptores de Fcγ (FcγR) expresados en células efectoras inmunitarias (38). Para ensayar la ADCC in vitro, se incubaron células KMS11 u OPMS2 con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) recién aisladas, en presencia de R3Mab o anticuerpo de control. El R3Mab mediaba la actividad citolítica de PBMC significativa contra ambas líneas celulares de mieloma (figura 14 C, D). En cambio, el R3Mab no soportaba la citolisis de células RT112 o UMUC-14 de cáncer de vejiga (figura 14 E, F). Como se midió por análisis de Scatchard, las células de mieloma múltiple expresan sustancialmente más FGFR3 de superficie celular que las líneas de células de carcinoma de vejiga (~5-6 veces más receptores por célula, figura 23 A, B).

Para abordar la contribución de la ADCC en la actividad del R3Mab in vivo, se introdujo la mutación D265A/N297A (DANA) previamente caracterizada en el dominio Fc del anticuerpo. Esta sustitución doble en el dominio Fc de un anticuerpo, anula su unión a los FcγR (39), previniendo el reclutamiento de células efectoras inmunitarias. La mutación DANA no alteraba la unión del R3Mab al FGFR3 o la inhibición de la actividad del FGFR3 in vitro, ni cambiaba la farmacocinética del R3Mab en ratones (no se muestran los datos); sin embargo, anulaba sustancialmente la actividad in vivo contra xenoinjertos de OPM2 o KMS11 (figura 14 G, H). En cambio, la mutación DANA no alteraba la actividad antitumoral del R3Mab hacia los xenoinjertos de cáncer de vejiga de RT112 y UMUC14 (figura 24 A, B). Juntos, estos resultados sugieren que la ADCC dependiente de Fc tiene una función importante en la eficacia del R3Mab contra xenoinjertos de mieloma múltiple de OPM2 y KMS11.

Estudios adicionales de xenoinjertos

El R3Mab (clon 184.6.1 N54S) se caracterizó más como sigue:

(a): Se ensayó la eficacia in vivo del R3Mab usando un modelo de xenoinjerto tumoral basado en una línea de células de cáncer de hígado (Huh7) esencialmente como se ha descrito antes. Cuando se ensayó con una concentración de anticuerpo de 5 mg/kg y 30 mg/kg, el R3Mab inhibía significativamente el crecimiento tumoral in vivo. El crecimiento tumoral se inhibió en aproximadamente 50% comparado con el crecimiento tumoral en animales de control.

(b): Se ensayó la eficacia in vivo del R3Mab usando un modelo de xenoinjerto tumoral basado en una línea de células de cáncer de mama (Cal-51) que expresaba el FGFR3 esencialmente como se ha descrito antes. Los resultados de este estudio de eficacia mostraban que el anticuerpo R3Mab era capaz de inhibir tumores in vivo, cuando se ensayaba con una concentración de anticuerpo en el intervalo de aproximadamente 1 mg/kg a 100 mg/kg. El crecimiento tumoral se inhibió aproximadamente un 30% comparado con el crecimiento tumoral en animales de control.

Discusión

La asociación del exceso de expresión del FGFR3 con un mal pronóstico en pacientes con mieloma múltiple t(4;14)+ y la actividad de transformación del FGFR3 en varios modelos experimentales, han establecido el FGFR3 como un conductor oncogénico importante y por lo tanto como un potencial agente terapéutico en este tumor maligno hematológico. En cambio, a pesar de las descripciones de una alta frecuencia de la mutación y/o el exceso de expresión de FGFR3 en el carcinoma de vejiga (24, 25, 40), no se ha establecido in vivo una función crítica de la señalización del FGFR3 en este tumor maligno epitelial. Además, el potencial terapéutico de la inhibición del FGFR3 en el cáncer de vejiga todavía no se ha definido. Aquí se muestra que la intervención genética o farmacológica con FGFR3 inhibe el crecimiento de varios xenoinjertos de cáncer de vejiga humano en ratones. Estos resultados demuestran que la función del FGFR3 es crítica para el crecimiento tumoral en este marco, subrayando la potencial importancia de este receptor como un conductor oncogénico y diana terapéutica en el cáncer de vejiga. El bloqueo de la función del FGFR3 inhibía el crecimiento de xenoinjertos que expresaban el FGFR3 de tipo natural o igualmente el mutante, sugiriendo que ambas formas del receptor pueden contribuir significativamente al avance del tumor de vejiga. Aunque con mucha menos frecuencia que en el cáncer de vejiga, las mutaciones o el exceso de expresión del FGFR3 se ha identificado en otros tumores malignos sólidos, incluyendo el carcinoma de cuello uterino (40), carcinoma hepatocelular (41) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (42, 43), sugiriendo una potencial contribución del FGFR3 a tipos adicionales del cáncer epitelial.

La aparente implicación del FGFR3 en diversos tumores malignos identifica este receptor como un candidato interesante para la terapia dirigida. Aunque se han descrito compuestos moléculas pequeñas que inhiben la actividad de quinasa del FGFR3 (18-22, 44), la cercana homología de los dominios de quinasa con la familia de FGFR, ha obstaculizado el desarrollo de inhibidores selectivos de FGFR3. La falta de selectividad de los inhibidores descritos hace difícil discernir la contribución relativa del FGFR3 a la biología de los tipos de cáncer específicos; además, puede conllevar problemas de seguridad, restringiendo los niveles de dosis máxima y por lo tanto limitando la inhibición óptima del FGFR3. Por lo tanto, para lograr la dirección selectiva y específica del FGFR3, los autores de la invención buscaron una estrategia basada en anticuerpo. Pensaron que un anticuerpo terapéutico óptimo sería capaz de bloquear no solo el FGFR3 de tipo natural sino también los mutantes ligados al cáncer prevalentes. Además, dado que la dimerización del FGFR3 es crítica para su activación, un anticuerpo que no solo bloquea la unión del ligando sino que también interfiere con la dimerización del receptor podría ser superior. Propiedades adicionales convenientes incluirían la capacidad de soportar la función efectora mediada por Fc y la semivida en el suero larga conferida por la región armazón natural de un anticuerpo de longitud completa. Centraron los esfuerzos en el cribado y diseño para identificar una molécula de anticuerpo que combinara todas estas características, conduciendo a la generación del R3Mab. Los estudios de unión demostraron la capacidad del R3Mab para competir con los ligandos FGF por la interacción con las isoformas tanto IIIb como IIIc del FGFR3. Experimentos adicionales con líneas celulares BaF/3 confirmaron la capacidad notable del R3Mab para bloquear tanto el FGFR3 de tipo natural como los mutantes asociados a cánceres prevalentes. Además, el R3Mab ejercía una actividad antitumoral significativa en varios modelos de xenoinjerto de cáncer de vejiga que expresan FGFR3 de tipo natural o FGFR3S249C, que es el mutante más común del receptor en esta enfermedad. Los estudios farmacodinámicos sugerían que la actividad antitumoral del R3Mab en estos modelos se basa en la inhibición de la señalización del FGFR3, evidente por la menor fosforilación de sus mediadores corriente abajo FRS2α y MAPK. Estos datos refuerzan además la conclusión de que el FGFR3 es necesario para el avance del tumor de vejiga, como demuestran los estudios de ARNhc de FGFR3 de los autores de la invención.

Las mutaciones del FGFR3 en el cáncer de vejiga representan una de las alteraciones oncogénicas más frecuentes de una proteína quinasa en tumores malignos sólidos, que recuerdan la mutación común de B-Raf en el mieloma (45). La mayoría de las mutaciones activantes en FGFR3 dan lugar a una cisteína desemparejada, conduciendo a la dimerización del receptor independiente del ligando y a diferentes grados de activación constitutiva. Un estudio previo usando un fragmento Fab anti-FGFR3 monovalente, indicaba actividad inhibidora diferencial contra los mutantes de FGFR3 específicos (46); sin embargo, no se investigó la base molecular de este efecto variable. Comparado con los fragmentos de anticuerpos monovalentes, los anticuerpos bivalentes tienen la capacidad de inducir la agrupación de antígenos, y en el caso de las tirosinas quinasas receptoras, puede producir oligomerización y activación del receptor. A pesar de su configuración bivalente de longitud completa, el R3Mab presentaba inhibición universal del FGFR3 de tipo natural en un amplio espectro de mutantes de FGFR3, incluyendo variantes que dependen del ligando (FGFR3G372C, FGFR3Y375C), constitutivamente activas (FGFR3R248C, FGFR3S249C), o ambas (FGFR3K652E). Estos resultados plantean la pregunta: ¿Cómo antagoniza el R3Mab tanto el FGFR3 de tipo natural como los mutantes, incluyendo variantes unidas por disulfuro?

Basándose en la alineación de secuencias con el FGFR1, el epítopo peptídico reconocido por el R3Mab se superpone con restos del FGFR3 implicados en la unión al ligando y a heparina, así como en la dimerización del receptor. Esta conclusión se confirmó por estudios cristalográficos del complejo entre el R3Mab y las regiones extracelulares del FGFR3. La estructura de rayos X puso de manifiesto que el anticuerpo se une a las regiones de IgD2 e IgD3 que son críticas para la interacción de ligando-receptor así como para el contacto de receptor-receptor. Por lo tanto, el R3Mab puede bloquear el FGFR3 de tipo natural tanto por competición por la unión del ligando como previniendo la dimerización del receptor. El R3Mab puede usar un mecanismo similar para inhibir FGFR3S249C, que tienen actividad constitutiva baja, pero requiere el ligando para la activación completa. Además, la unión del R3Mab cambia la configuración relativa del IgD3 de FGFR3 con respecto a IgD2. Este descubrimiento plantea la posibilidad formal de que el anticuerpo pudiera inhibir también la activación del receptor forzando una conformación que no conduce a la transducción de señales, una idea que requiere estudio adicional.

Para comprender mejor cómo bloquea el R3Mab las variantes del FGFR3 que tienen una cisteína desemparejada, los autores de la invención analizaron el mutante más común, FGFR3S249C, con mayor detalle. Los experimentos con el bloqueador de sulfhidrilo libre DTNB indicaban un equilibrio dinámico entre los estados monómero y dímero de FGFR3S249C. Se ha descrito un equilibrio similar entre los estados oxidado y reducido modulados por reguladores rédox endógenos, para los receptores de NMDA (46). La incubación de células de cáncer de vejiga que expresan el FGFR3S249C con el R3Mab conduce a una disminución de la cantidad de dímeros del receptor y un aumento simultáneo del nivel de monómeros. Además, el fragmento IgD2-D3 del FGFR3S249C formaba dímeros en solución; cuando se incubaron con el R3Mab, los dímeros desaparecieron continuamente mientras que se acumulaba FGFR3S249C monómero. Considerado junto con el análisis estructural, estos resultados sugieren que el R3Mab captura FGFR3S249C monómeros y dificulta su dimerización. A lo largo del tiempo, el R3Mab desplaza el equilibrio hacia el estado de monómero, bloqueando la actividad del receptor constitutiva. Este mecanismo también puede explicar cómo inhibe el R3Mab otros mutantes de cisteína del FGFR3.

Otro descubrimiento importante de este estudio era la potente actividad antitumoral del R3Mab contra las líneas celulares de mieloma múltiple t(4;14)+ OPM2 y KMS11, in vivo. En cambio, el R3Mab tenía un impacto de modesto a mínimo en la proliferación y supervivencia de estas células en cultivo. Las células OPM2 y KMS11 expresan niveles relativamente altos de FGFR3 en la superficie celular (5-6 veces mayores que células de carcinoma de vejiga RT112 y UMUC-14). Estas densidades mayores de antígenos pueden permitir que el R3Mab soporte el reclutamiento eficaz de células efectoras inmunitarias que llevan el FcγR y la activación de la ADCC. De hecho, en presencia de PBMC humanos, el R3Mab media la citolisis de células OPM2 y KMS11, pero no de células cáncer de vejiga RT112 y UMUC-14. Además, la versión del mutante DANA del R3Mab, que es incapaz de unirse al FcγR, no tiene efecto en el crecimiento de OPM2 o KMS11 in vivo, pero todavía suprime el crecimiento de tumores de RT112 y UMUC-14 de forma similar al R3Mab. Juntos, estos datos indican que el R3Mab tiene un mecanismo doble de actividad antitumoral: (a) en células que expresan niveles inferiores en la superficie del FGFR3 de tipo natural o mutante, bloquea la señalización dependiente de ligando o constitutiva; (b) en células que expresan niveles relativamente altos en la superficie de FGFR3, induce ADCC.

Los resultados también plantean nuevas preguntas. Primero, no se sabe por qué las líneas de células de cáncer de vejiga ensayadas en este estudio presentan sensibilidades variables al R3Mab. Dicha respuesta diferencial que es común para la terapia dirigida, puede ser un reflejo de la diferente constitución genética de los tumores individuales. De hecho, las células de cáncer de mama positivas para Her2 muestras sensibilidad variable al anticuerpo anti-Her2 (48), así como lo hacer diferentes células de cáncer en respuesta al anticuerpo anti-EGFR (49). En este contexto, se necesita urgentemente el desarrollo de modelos adicionales in vivo para el cáncer de vejiga con FGFR3 de tipo natural y mutante, para evaluar la sensibilidad de moléculas de FGFR3 en animales. Además, la elucidación de biomarcadores predictivos puede ayudar a identificar pacientes que se puedan beneficiar de forma óptima de la terapia dirigida de FGFR3. En segundo lugar, debido a que el R3Mab no induce regresión tumoral en los modelos que se han examinado, estudios futuros deberían explorar si el R3Mab puede cooperar con agentes terapéuticos establecidos,

En conclusión, los descubrimientos de los autores de la invención implican al FGFR3 tanto de tipo natural como mutante como importantes para el crecimiento de tumores, expandiendo así la implicación oncogénica in vivo de este receptor de tumores malignos hematológicos a epiteliales. Además, los resultados demuestran que el FGFR3 tanto de tipo natural como mutante pueden ser el objetivo eficaz en tumores de anticuerpos de longitud completa que combinan la capacidad de bloquear la unión del ligando, la dimerización y señalización del receptor, así como para promover la lisis tumoral por ADCC. Estos resultados proporcionan un fundamento sólido para la investigación de terapias dirigidas a FGFR3, basadas en anticuerpos en diversos tumores malignos asociados con este receptor.

Lista de referencias parcial

Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad y comprensión, las descripciones y ejemplos no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención.

Lista de secuencias

<110> GENENTECH INC. ASHKENAZI, Avi QING, Jing WIESMANN, Christian WU, Yan 5 <120> Anticuerpos anti-FGFR3 y métodos que emplean los mismos

<130> P4294R1 WO

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<150> 61/163.222

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<170> PatentIn versión 3.5

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<220>

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<220>

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<220>

<221> fuente

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<220>

<221> fuente

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<221> fuente

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<221> fuente

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<212> PRT

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<220>

<221> fuente

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<220>

<221> fuente

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<221> fuente

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<220>

<221> fuente

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<220>

<221> fuente

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15 <220>

<221> fuente

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<221> fuente

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<220>

<221> fuente

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 142

<210> 143

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 143

<210> 144

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 144

<210> 145

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

25 <400> 145

<210> 146

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5) .. (5)

<223> /reemplazar="Asp"

<220>

<221> VARIANTE

<222>: (6) .. (6) 45 <223> /reemplazar="Ile"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7) .. (7)

<223> /reemplazar="Glu" o "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222>: (8) .. (8) 55 <223> /reemplazar="Ile"

<220> 119

<221> VARIANTE

<222> (9) .. (9)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10)..(10)

<223> /reemplazar="Leu"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (5) .. (10)

<223> /nota="Los residuos dados en la secuencia no tienen preferencia respecto a los de las anotaciones para dichas posiciones"

<400> 146

<210> 147

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1) .. (1)

<223> /reemplazar="Gly"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1) .. (1)

<223> /nota="El residuo dado en la secuencia no tiene preferencia respecto a la anotación para dicha posición"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6) .. (6)

<223> /reemplazar="Tyr"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (6) .. (6)

<400> 147

<210> 148

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3) .. (3)

<223> /reemplazar="Ser" o "Thr" <220>

<221> VARIANTE

<222> (4) .. (4)

<223> /reemplazar="Tyr" o "Ala"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5)..(5)

<223> /reemplazar="Ser" o "Thr" o "Ala"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6)..(6)

<223> /reemplazar="His" o "Asp" o "Thr" o "Asn"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7) .. (7)

<223> /reemplazar="Pro" o "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8) .. (8)

<223> /reemplazar="Tyr" o "Leu" o "Pro" o "Gln"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (3) .. (8)

<400> 148

<210> 149

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3) .. (3)

<223> /reemplazar="Thr"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (3) .. (3)

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5) .. (5)

<223> /reemplazar="Tyr" o "Ser" o "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6) .. (6)

<223> /reemplazar="Gly" o "Thr"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (5) .. (6)

<400> 149

<210> 150

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6).. (6)

<223> /reemplazar="Ala" o "Leu" o "Ser" o "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7) .. (7)

<223> /reemplazar="Gln" o "Asp" o "Gly" o "Tyr" o "Ser" o "Asn" o "Phe"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8) .. (8)

<223> /reemplazar="Asp" o "Gly"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (9) .. (9)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10)..(10)

<223> /reemplazar="Phe" o "Thr" o "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> /reemplazar="His" o "Asn" o "Ile"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (6) .. (11)

<400> 150

<210> 151

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> <221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 151

<210> 152

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5) .. (5)

<223> /reemplazar="Asp"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (5) .. (5)

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7) .. (7)

<223> /reemplazar="Glu" o "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8) .. (8)

<223> /reemplazar="Ile"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (9) .. (9)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (7) .. (9)

<400> 152

<210> 153

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<220>

<221> VARIANTE <222> (3) .. (3)

<223> /reemplazar="Gly" o "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (4)..(4)

<223> /reemplazar="Thr" o "Ala"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5)..(5)

<223> /reemplazar="Gly"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6) .. (6)

<223> /reemplazar="His" o "Asn"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7) .. (7)

<223> /reemplazar="Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8) .. (8)

<223> /reemplazar="Gln" o "Tyr" o "Leu"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (3) .. (8)

<400> 153

<210> 154

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6) .. (6)

<223> /reemplazar="Leu"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7) .. (7)

<223> /reemplazar="Tyr" o "Ser" o "Gly" o "Ala" o "Gln"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (6) .. (7)

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> /reemplazar="His"

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (11) .. (11)

<400> 154

<210> 155

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 155

<210> 156

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 156

<210> 157

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 157

<210> 158

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 158

<210> 159

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 159

<210> 160

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 160

<210> 161

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 161

<210> 162

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 162

<210> 163

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 163

<210> 164

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 164

<210> 165

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 165

<210> 166

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 166

<210> 167

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 167

<210> 168

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 168

10

<210> 169

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

15

<400> 169

<210> 170 20 <211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<210> 171

<211> 10

<212> PRT 30 <213> Mus musculus

<400> 171

35 <210> 172

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

40 <400> 172

45 <210> 173

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 173

<210> 174 10 <211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <221> fuente

<400> 174

<210> 175 <211> 30

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 175

<210> 176

<211> 11

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 176

<210> 177 25 <211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 177

<210> 178

<211> 30

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente 45 <223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Polipéptido sintético”

<400> 178

<210> 179

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 179

<210> 180

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 180

<210> 181

<211> 15

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 181

<210> 182

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 182

<210> 183

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<400> 183

<210> 184

<211> 25

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

45 <220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 184

<210> 185

<211> 13

<212> PRT 55 <213> Secuencia Artificial

<220> <221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<210> 186

<211> 30

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 186

<210> 187

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 187

<210> 188

<211> 23

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 188

<210> 189

<211> 15 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 189

<210> 190

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 190

<210> 191

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 191

<210> 192

<211> 65

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> > /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético”

<400> 192

<210> 193

<211> 65

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 193

<210> 194

<211> 65

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 194

<210> 195

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> > /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético”

<400> 195 gtcagatatc gtkctsacmc artctccwgc 30

<210> 196

<211> 37

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> > /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético”

<400> 196 gatcgacgta cgctgagatc carytgcarc artctgg 37

<210> 197

<211> 27

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> > /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético”

<400> 197 gtcagatatc gtgctgacmc artctcc 27

<210> 198

<211> 37

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> > /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético”

<400> 198 gatcgacgta cgctgagatc carytgcarc artctgg 37

<210> 199

<211> 27

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> > /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético”

<400> 199 gtacgatatc cagatgacmc artctcc 27

<210> 200

<211> 37

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

5 <220>

<221> fuente

<223> > /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético”

<400> 200 gatcgacgta cgctgagatc carytgcarc artctgg 37

<210> 201

<211> 21

<212> DNA 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> > /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético”

<400> 201 tttdakytcc agcttggtac c 21

<210> 202 25 <211> 43

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> > /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético”

<400> 202

acagtgggcc cttggtggag gctgmrgaga cdgtgashrd rgt 43 35

<210> 203

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

45 <400> 203

<210> 204

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente 55 <223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Polipéptido sintético”

<400> 204

<210> 205

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 205

<210> 206

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 206

<210> 207

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 207

<210> 208

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 208

<210> 209

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 209 <210> 210

<211> 31

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 210

<210> 211 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 211

<210> 212

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

35 <400> 212

<210> 213

<211> 30

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<400> 213

<210> 214

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

55 <220> <221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<210> 215

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 215

<210> 216

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <221> fuente

<400> 216

<210> 217

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 217

<210> 218

<211> 13 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 218

55 <210> 219

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 219

<210> 220

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota=“Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético”

<400> 220

<210> 221

<211> 13 25 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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35 <210> 222

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<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

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<212> PRT

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15 <210> 239

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<400> 244

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<400> 246 <210> 247

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<400> 248

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<400> 253

<210> 254

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<400> 254

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

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<211> 13

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<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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Claims

REIVINDICACIONES

1.-Un anticuerpo anti-FGFR3 antagonista aislado, en donde el anticuerpo comprende HVR-L1 que comprende la secuencia RASQDVDTSLA (SEQ ID NO: 87), HVR-L2 que comprende la secuencia SASFLYS (SEQ ID NO: 88), HVR-L3 que comprende la secuencia QQSTGHPQT (SEQ ID NO: 89), HVR-H1 que comprende la secuencia GFTFTSTGIS (SEQ ID NO: 84), HVR-H2 que comprende la secuencia GRIYPTSGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 85), y HVR-H3 que comprende la secuencia ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY (SEQ ID NO: 86).
2.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 132 y una región variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 133.
3.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo no induce regulación por disminución sustancial del FGFR3 y/o una forma bivalente del anticuerpo no tiene función agonista sustancial.
4.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos LAVPAANTVRFRCPA (SEQ ID NO: 179) y/o SDVEFHCKVYSDAQP (SEQ ID NO: 180).
5.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo se une a al menos 1, 2, 3, 4 o cualquier número de hasta todos los restos 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 y/o 318 del FGFR3 IIIb.
6.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo inhibe la actividad constitutiva del FGFR3, en particular la actividad constitutiva del FGFR3 dependiente de ligando y/o la actividad constitutiva del FGFR3 independiente de ligando, y/o inhibe (a) FGFR3-IIIbR248C y (b) uno

o más de FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249c, y FGFR3-IIIbG372C.
7.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de la región armazón y al menos una parte de la secuencia de la región armazón es una secuencia de la región armazón consenso humana, en particular la secuencia de la región armazón consenso del subgrupo κ humano y/o la secuencia de la región armazón consenso del subgrupo III de cadena pesada humana.
8.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de afinidad madurada, un anticuerpo humano y un anticuerpo biespecífico.
9.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
10.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde al anticuerpo tiene actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo.
11.-Un polinucleótido que codifica un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
12.-Una célula hospedante que comprende un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 11.
13.-Un método para hacer un anticuerpo anti-FGFR3, comprendiendo dicho método cultivar una célula hospedante que comprende el polinucleótido que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de modo que el polinucleótido es expresado, y opcionalmente recuperar el anticuerpo del cultivo.
14.-Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usar para tratar el cáncer.
16.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usar para inhibir la proliferación celular y/o reducir drásticamente las células de mieloma múltiple.
17.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usar según la reivindicación 15 o 16, en donde el cáncer es un tumor sólido, en particular cáncer de vejiga o mieloma múltiple.
18.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde el cáncer se asocia con la activación y/o exceso de expresión del FGFR3.
19.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en donde el uso comprende además un agente terapéutico adicional.
20.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usar para tratar un trastorno esquelético.
21.-El anticuerpo anti-FGFR3 antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para usar según la reivindicación 20, en donde el trastorno esquelético se selecciona del grupo que consiste en acondroplasia, hipocondroplasia, enanismo, displasia tanatofórica, y síndrome de craneosinostosis.