BRPI0622298A2 - oligorribonucleotìdeo para estimular a produção de uma citocina pró-inflamatória, uso do mesmo e composição contendo tal oligorribonucleotìdeo - Google Patents

Abstract

OLIGORRIBONUCLEOTìDEO PARA ESTIMULAR A PRODUçãO DE UMA CITOCINA PRó-INFLAMATóRIA, USO DO MESMO E COMPOSIçãO CONTENDO TAL OLIGORRIBONUCLEOìIDEO. A invenção fornece composições imunoestimuladoras e o uso desses compostos na preparação de medicamentos para o tratamento de doenças assim como para usos in vitro. Em particular, as composições da invenção incluem oligorribonucleotídeos imunoestimuladores que incorporam um motivo de seqüência imunoestimulador dependente da seqúência. São fornecidas modificações específicas envolvendo ligações fosfato, análogos de nucleotídeos, adutos, e combinações dos mesmos. As composições da invenção, que opcionalmente podem incluir um antígeno, podem ser usadas isoladas ou junto com outros tratamentos para estimular ou intensificar uma resposta imune. Também são fornecidas composições e métodos úteis para tratar um indivíduo que tem uma infecção, um câncer, uma condição alérgica, asma, remodelagem das vias aéreas, ou imunodeficiência. Acredita-se que os oligorribonucleotídeos da invenção estimular o receptor 8 semelhante a um "tolI" (TLR8).

Description

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "OLIGORRI- BONUCLEOTÍDEO PARA ESTIMULAR A PRODUÇÃO DE UMA CITOCINA PRÓ-INFLAMATÓRIA, USO DO MESMO E COMPOSIÇÃO CONTENDO TAL OLIGORRIBONUCLEOTÍDEO".

Pedido dividido do Pl 0618857-5, depositado em 22.11.2006.

Campo da Invenção

A invenção refere-se de um modo geral ao campo da imunologi- a, e mais particularmente a moléculas imunoestimuladoras. Mais especifi- camente a invenção refere-se a moléculas de ácido ribonucléico (RNA), in- clusíve oligorribonucleotídeos, com atividade imunoestimuladora. Antecedentess da Invenção

Receptores tipo a toll (TLR) são uma família de polipeptídeos receptores de reconhecimento de padrões (PRR) altamente conservados que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e desempenham um papel crítico na imunidade inata nos mamíferos. Atual- mente já foram identificados pelo menos dez membros da família, designa- dos TLR1 - TLR10. Os domínios citoplasmáticos dos vários TLRs caracteri- zam-se por um domínio do receptor toll de interleucina 1 (TIR). Medzhitov R et al. (1998) Mol. Cell 2:253-8. O reconhecimento de invasão microbiana por TLRs desencadeia a ativação de uma cascata de sinalização que é evolu- cionalmente conservada na Drosophila e nos mamíferos. Foi relatado que a proteína adaptadora contendo o domínio MyD88 se associa a TLRs e recru- ta a cinase associada ao receptor de interleucina 1 (IRAK) e o fator 6 asso- ciado ao receptor de fator de necrose tumoral (TNF) (TRAF6) para os TLRs. Acredita-se que a via de sinalização dependente de MyD88 leva à ativação de fatores de transcrição de NF-κΒ e a proteínas cinases ativadas por mitó- genos de cinase com terminal NH2 c-Jun (Jnk) (MAPKs), etapas críticas na ativação imune e na produção de citocinas inflamatórias. Para recapitula- ções, vide Aderem A et al. (2000) Nature 406:782-87, e Akira S et al. (2004) Nat Rev Immunol 4:499-511.

Inúmeros Iigandos de TLR específicos já foram identificados. Ligandos para TLR2 incluem peptidoglicano e lipopeptídeos. Yoshimura A et ai. (1999) J Immunol 163:1-5; Yoshimura A et al. (1999) J Immunol 163:1- 5;Aliprantis AO et al. (1999) Science 285:736-9. Lipopolissacarídeo (LPS) é um ligando para TLR4. Poltorak A et al. (1998) Science 282:2085-8; Hoshino K et al. (1999) J Immunol 162:3749-52. Flagelina bacteriana é um ligando para TLR5. Hayashi F et al. (2001) Nature 410:1099-1103. Peptidoglicano foi apresentado como sendo um ligando não só para TLR2, mas também para TLR6. Ozinsky A et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:13766-71; Takeuchi O et al. (2001) Int Immunol 13:933-40. Recentemente certos com- postos sintéticos de baixo peso molecular, as imidazoquinolinas imiquimod (R-837) e resiquimod (R-848) foram apresentadas como sendo Iigandos de TLR7 e TLR8. Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al. (2002) Nat Immunol 3:499.

A partir da recente descoberta de que DNA bacteriano não meti- Iado e análogos sintéticos do mesmo (CpG DNA) são Iigandos para TLR9 (Hemmi H et al. (2000) Nature 408:740-5; Bauer S et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 9237-42), foi relatado que Iigandos para certos TLRs in- cluem certas moléculas de ácido nucléico. Recentemente, foi relatado que certos tipos de RNA são imunoestimuladores de maneira independente da seqüência ou de maneira dependente da seqüência. Além disso, foi relatado que esses vários RNAs imunoestimuladores estimulam TLR3, TLR7, ou TLR8.

Sumário da Invenção

A invenção refere-se de um modo geral a oligorribonucleotídeos imunoestimuladores (ORN) que contêm certos motivos de RNA imunoesti- muladores, assim como a composições imunoestimuladoras relacionadas contendo tais ORN imunoestimuladores, e métodos para o uso de tais ORN e composições imunoestimuladores. Os ORN imunoestimuladores da inven- ção são úteis em qualquer situação ou aplicação que requer estimulação ou aumento de uma resposta imune. Como descrito abaixo, os ORN imunoes- timuladores da invenção são de uso particular na preparação de composi- ções farmacêuticas, incluindo adjuvantes, vacinas, e outros medicamentos, para uso no tratamento de várias condições, que incluem infecções, câncer, ) 3/105

alergia, e asma. A invenção em certos aspectos refere-se, portanto a com- posições imunoestimuladoras que incluem ORN imunoestimuladores da in- venção, assim como a métodos de uso das mesmas. Também como descri- to abaixo, os ORN imunoestimuladores e as composições imunoestimulado- ras da invenção são de uso particular em métodos para ativar uma célula imune, vacinar um indivíduo, tratar um indivíduo que tenha uma deficiência do sistema imunológico, tratar um indivíduo que tenha uma infecção, tratar um indivíduo que tenha uma doença auto-imune, tratar um indivíduo que tenha câncer, tratar um indivíduo que tenha uma condição alérgica, tratar um indivíduo que tenha asma, remodelagem das vias aéreas, promover a disseminação de epítopos, e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

Como descrito abaixo em maiores detalhes, os ORN imunoesti- muladores da invenção caracterizam-se por sua inclusão de pelo menos um motivo de RNA imunoestimulador dependente da seqüência. O motivo de RNA imunoestimulador dependente da seqüência geralmente é uma se- qüência de RNA curta, embora em certas modalidades o motivo também possa incluir uma modificação tal como uma ligação fosfato internucleotí- deos modificada, uma nucleobase modificada, um açúcar modificado, um análogo de nucleotídeo, ou qualquer combinação dos mesmos. Como des- crito abaixo em detalhes, em uma modalidade o motivo de RNA imunoesti- mulador ocorre no contexto de um ORN imunoestimulador mais extenso da invenção. Também o motivo de RNA imunoestimulador pode ocorrer no con- texto de uma molécula de ácido nucléico de DNA:RNA quimérica. Os motivos de RNA imunoestimuladores dependentes da se-

qüência e os ORN imunoestimuladores incorporando tais motivos são des- critos como sendo agonistas para TLR8. Mais particularmente, pelo menos alguns dos motivos de RNA imunoestimuladores dependentes da seqüên- cia, ORN imunoestimuladores, e moléculas de ácido nucléico de DNA:RNA quiméricas imunoestimuladoras estão descritos como sendo agonistas de TLR8, porém não agonistas de TLR7.

O motivo de RNA imunoestimulador de acordo com alguns as- pectos da invenção é N-U-R1-R2.

N é um ribonucleotídeo e N não inclui um U. Em algumas moda- lidades, N é adenosina ou citosina (C) ou derivados das mesmas.

U é uracila ou um derivado do mesmo.

R é um ribonucleotídeo onde pelo menos um de Ri e R2 é ade-

nosina (A) ou citosina ou derivados das mesmas. R não é U a menos que N- U-RrR2 inclua pelo menos dois A.

o ORN da invenção inclui pelo menos um e em algumas modali- dades mais de um (isto é, 2, 3, ou 4) motivos imunoestimuladores, N-U-Rr R2-O ORN não inclui um motivo TLR7/8. O ORN tem de preferência 4-100 de comprimento e opcionalmente inclui pelo menos uma modificação de es- trutura principal.

N-U-Ri-R2 pode em algumas modalidades incluir pelo menos 3 As ou pelo menos 2 Cs. Opcionalmente, N-U-Ri-R2 inclui pelo menos um G ou C.

Em algumas modalidades, o ORN não é ACCCAUCUAUUAUA UAACUC (SEQ ID N°: 89).

Em outras modalidades, o motivo de ORN é separado de um ribonucleotídeo 5' por um Iigante não-nucleotídico. Em ainda outras modali- dades, o motivo de ORN é separado de um ribonucleotídeo 3' por um Iigante não-nucleotídico. Opcionalmente, o motivo de ORN é separado de um ribo- nucleotídeo 5' e 3' por um Iigante não-nucleotídico.

O ORN pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável que opcionalmente é um veículo lipídico tal como N-[1-(2,3- Dioleoilóxi)propil]-N,N,Ntrimetilamoniometil-sulfato (DOTAP). Em outras mo- dalidades, o ORN não é complexado com DOTAP.

O ORN pode ser de filamento simples ou de filamento duplo.

Em outras modalidades, o ORN inclui pelo menos um AU. Em ainda outras modalidades o ORN inclui pelo menos um CU. Em algumas modalidades, o ORN é um dos seguintes:

A*U*A*G*G*C*A*C (SEQ ID N°: 4),

G*C*C*A*C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*U*A*C*C (SEQ ID N0: 11), A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U (SEQ ID N°: 12), U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U (SEQ ID N°: 13), A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A (SEQ ID N°: 16), A*A*A* U * A*A*A* U * A*A*A* U * A* A*A* U * A* A*A* U (SEQ ID N°: 17), A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U (SEQ ID N°: 18), C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U (SEQ ID N°: 24), U*U*A*U*U*A*U (SEQ ID N°: 30), U*A*U*A*U*A*U (SEQ ID N°: 33), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*U*A*C*C*C (SEQ ID N°: 48), C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C (SEQ ID N°: 76), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*C*C*C*C (SEQ ID N°: 42), C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*A*U*C (SEQ ID N°: 39), C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*A*U*U*A*C*C (SEQ ID N°: 65), C*C*GWG*C*C*G*A*A*U*C*C*C*C*C (SEQ ID N°: 44), C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C (SEQ ID N°: 47), C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*C*C*C (SEQ ID N°: 38), C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*A*C*C*C (SEQ ID N°: 37), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*A*C*C*C (SEQ ID N°: 40), C*C*GWG*C*C*G*C*U*A*U*C*C*C*C (SEQ ID N°: 55), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C (SEQ ID N°: 82), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*A*U*A*C*C (SEQ ID N°: 85), C*C*GWG*C*C*GWA*U*G*U*A*C*C (SEQ ID N°: 63), C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*A*C*C*C (SEQ ID N°: 43), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*U*C*C*C (SEQ ID N°: 36), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*UWC*C (SEQ ID N°: 87), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*C*C*C*C (SEQ ID N°: 45), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*A*C*C*C (SEQ ID N°: 41), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*G*C*C (SEQ ID N°: 83), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*C*C*C*C*C (SEQ ID N°: 46), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C (SEQ ID N°: 88), C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*G*C*C*C*C*C (SEQ ID N0: 35), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*C*C*C (SEQ ID N°: 84), ou C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C (SEQ ID N°: 56). O ORN exclui especificamente os motivos TLR7/8. Um motivo TLR7/8 pode incluir por exemplo, uma seqüência de ribonucleotídeo sele- cionada de

(i) 5-C/U-U-G/U-U-3', (ii) 5-R-U-R-G-Y-3',

(iii) 5'-G~U-U-G-B-3\

(iv) 5'-G-U-G-U-G/U-3', e

(v) Si-GZC-U-AZC-G-G-C-A-C-S',

onde CZU é citosina (C) ou uracila (U), G/U é guanina (G) ou U, R é purina, Y é pirimidina, B é U, G1 ou C, G/C é G ou C, e A/C é adenina (A) ou C.

Em várias modalidades, 5'-C/U-U-G/U-U-3' é CUGU, CUUU1 UUGU, ou UUUU.

Em várias modalidades, 5'-R-U-R-G-Y-3' é GUAGU, GUAGC, GUGGU, GUGGC, AUAGU1 AUAGC1 AUGGU, ou AUGGC. Em uma moda- Iidade a seqüência de base é GUAGUGU.

Em várias modalidades, õ^G-U-U-G-B-S' é GUUGU1 GUUGG1

ou GUUGC.

Em várias modalidades, 5'-G-U-G-U-G/U-3' é GUGUG ou GUGUU. Em uma modalidade a seqüência de base é GUGUUUAC. Em várias modalidades, õ-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-S' é

GUAGGCAC, GUCGGCAC, CUAGGCAC, ou CUCGGCAC.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição imunoes- timuladora incluindo um ORN imunoestimulador da invenção e um adjuvan- te. Em várias modalidades o adjuvante é um adjuvante que cria um efeito de depósito, um adjuvante imunoestimulador, ou um adjuvante que cria um e- feito de depósito e estimula o sistema imunológico. Em uma modalidade, a composição imunoestimuladora de acordo com este aspecto da invenção é um conjugado do ORN imunoestimulador e do adjuvante. Em uma modali- dade de acordo com este aspecto da invenção, o ORN imunoestimulador é covalentemente ligado ao adjuvante. Em outras modalidades, eles não são conjugados. Em uma modalidade, o adjuvante é um agonista de TLR9. Em uma modalidade, o adjuvante é um ácido nucléico CpG imunoestimulador. 7/105

As composições da invenção podem opcionalmente incluir um antígeno. Portanto, em um aspecto, a invenção fornece uma vacina, onde a vacina inclui um ORN imunoestimulador da invenção e um antígeno. Em um aspecto a invenção fornece uma vacina que inclui um conjugado de um ORN imunoestimulador da invenção e um antígeno. Em uma modalidade, o conjugado de acordo com este aspecto da invenção inclui o ORN imunoes- timulador covalentemente ligado ao antígeno. Em outras modalidades, eles não são conjugados. Em várias modalidades, o antígeno pode ser um antí- geno per se. O antígeno pode ser qualquer antígeno, incluindo um antígeno de câncer, um antígeno microbiano ou um alérgeno.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição imunoes- timuladora incluindo um conjugado de um ORN imunoestimulador da inven- ção e uma porção lipofílica. Em uma modalidade o ORN imunoestimulador é covalentemente ligado à porção lipofílica. Em uma modalidade, a porção lipofílica é selecionada do grupo que consiste em colesterila, palmitila, e aci- Ia graxa. Em uma modalidade, a porção lipofílica é um derivado de coleste- rol, por exemplo, colesterila.

Em uma modalidade, o ORN imunoestimulador inclui pelo me- nos um desoxirribonucleotídeo. Pelo menos um desoxirribonucleotídeo ge- ralmente pode ocorrer em qualquer lugar fora do motivo de RNA imunoesti- mulador. Em várias modalidades, pelo menos um desoxirribonucleotídeo é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 desoxirribonucleotídeos consecutivos. ORN imunoestimuladores inclu- indo desoxirribonucleotídeos não consecutivos também são contemplados pela presente invenção. Em várias modalidades o pelo menos um desoxirri- bonucleotídeo é uma extremidade 5', uma extremidade 3', ou tanto uma ex- tremidade 5' como uma extremidade 3' do ORN imunoestimulador. O pelo menos um desoxirribonucleotídeo também corresponde a uma porção de DNA de uma molécula de DNA:RNA quimérica. Em uma modalidade um componente de DNA da molécula de DNA:RNA quimérica inclui um ácido nucléico CpG1 isto é, um agonista de TLR9. Em uma modalidade as porções de DNA e RNA da molécula de DNA:RNA quimérica são covalentemente 8/105

ligadas através de uma ligação fosfato internucleotídeos. Em uma outra mo- dalidade as porções de DNA e RNA da molécula de DNArRNA quimérica são covalentemente ligadas através de um ligante, por exemplo, um Iigante não-nucleotídico.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição imunoes-

timuladora que inclui uma molécula de ácido nucléico em forma de haltere, parcialmente de filamento único, covalentemente fechada, onde pelo menos uma porção de filamento simples da molécula inclui um motivo de RNA imu- noestimulador da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêu-

tica inclui a composição de qualquer um dos aspectos precedentes da in- venção, em associação com um veículo de distribuição escolhido de um lipí- dio catiônico, um lipossoma, um cocleato, um virossoma, um complexo imu- noestimulador (ISCOM), uma micropartícula, uma microesfera, uma nanoes- fera, uma vesícula unilamelar (LUV), uma vesícula multilamelar, uma emul- são de óleo em água, uma emulsão de água em óleo, uma emulsoma, e um peptídeo policatiônico, e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente a- ceitável. Em uma modalidade de acordo com este aspecto da invenção a composição farmacêutica inclui um antígeno. O ORN pode ser formulado em um nebulizador ou em um inala-

dor, tal como um inalador de dose regulada ou um inalador de pó. Em algu- mas modalidades, o ORN inclui ainda uma composição adicional tal como um agente quimioterapêutico, um agente antiviral ou um veículo farmaceuti- camente aceitável. O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser formu- lado para injeção ou para administração mucosa.

Ainda de acordo com estes e outros aspectos da invenção, em várias modalidades o ORN imunoestimulador pode opcionalmente incluir pelo menos uma ligação internucleotídica 5-5', pelo menos uma ligação in- ternucleotídica 3-3', pelo menos uma ligação internucleotídica 5'-5' que in- clui uma porção Iigadora1 pelo menos uma ligação internucleotídica 3-3' que inclui uma porção ligadora, ou qualquer combinação das mesmas. A porção Iigadora em uma modalidade é uma porção ligadora não-nucleotídica. Ainda de acordo com estes e outros aspectos da invenção, em várias modalidades o ORN imunoestimulador pode opcionalmente incluir pelo menos uma ligação internucleotídica 2-2', pelo menos uma ligação in- ternucleotídica 2-3', pelo menos uma ligação internucleotídica 2-5', ou qual- quer combinação das mesmas. Em uma modalidade preferida pelo menos uma ligação internucleotídica 2-2', pelo menos uma ligação internucleotídica 2-3', ou pelo menos uma ligação internucleotídica 2-5' ocorre fora do motivo de RNA imunoestimulador.

Também de acordo com estes e outros aspectos da invenção, o ORN imunoestimulador em uma modalidade inclui pelo menos uma unidade multiplicadora. Por conseguinte, em certas modalidades o ORN imunoesti- mulador da invenção pode ter uma estrutura ramificada. Composições rami- ficadas podem incluir ligações internucleotídicas 3-5', 5-5', 3-3', 2'-2', 2-3', ou 2'-5\ em qualquer combinação. Em uma modalidade, o ORN imunoesti- mulador inclui pelo menos duas unidades multiplicadoras, resultando no chamado dendrímero. Além disso, em certas modalidades o ORN imunoes- timulador da invenção pode incluir dois ou mais motivos de RNA imunoesti- mulador, dispostos por exemplo em série ao longo de um ORN linear, em braços diferentes de uma estrutura ramificada, ou ao mesmo tempo em sé- rie ao longo de um ORN linear e em braços diferentes de uma estrutura ra- mificada. Estruturas ramificadas, inclusive dendrímeros, podem opcional- mente incluir pelo menos um ácido nucléico CpG imunoestimulador, por e- xemplo, como um braço separado de uma estrutura ramificada.

Ainda de acordo com estes e outros aspectos da invenção, em uma modalidade o ORN imunoestimulador não inclui um dinucleotídeo CG DNA ou RNA.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para infra- regular células reguladoras (Treg) CD4+ imunossupressoras. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de contatar uma célula Treg CD4+ com uma composição contendo um ORN imunoestimulador es- pecífico para TLR8 da invenção em uma quantidade eficaz para reduzir o efeito inibitória da célula Treg CD4+. Em uma modalidade, a composição 10/105

inclui um ORN específico para TLR8 e um ácido nucléico CpG imunoestimu- lador, onde o ORN específico para TLR8 e o ácido nucléico CpG imunoes- timulador não são ligados. Em uma modalidade a composição inclui um ORN específico para LTR8 e um ácido nucléico CpG imunoestimulador, on- de o ORN específico para TLR8 e o ácido nucléico CpG imunoestimulador estão presentes como um conjugado.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para mo- dular uma resposta imune em um indivíduo. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar a um indivíduo uma quan- tidade eficaz de uma composição da invenção. Em algumas modalidades o ORN pode ser distribuído para o indivíduo para tratar uma doença auto- imune ou remodelagem das vias aéreas no indivíduo. O ORN pode ser ad- ministrado com ou sem antígeno ao indivíduo. Opcionalmente o ORN é dis- tribuído por uma via tal como oral, nasal, sublingual, intravenosa, subcutâ- nea, mucosa, respiratória, injeção direta, e dérmica. O ORN pode ser distri- buído para o indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir a expressão de citocinas, tais como TNFa1 IL-10, IL-6, IFN-γ, MCP1, e IL-12.

Em um aspecto a invenção fornece um método para vacinar um indivíduo. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar ao indivíduo um antígeno e um ORN imunoestimulador da invenção.

Em um aspecto a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha ou corra o risco de ter uma doença infecciosa. O méto- do de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição da invenção. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quan- tidade eficaz de um ORN imunoestimulador da invenção. Em uma modali- dade, o indivíduo tem uma infecção viral. A infecção viral pode ser, por e- xemplo, hepatite B ou hepatite C. Um agente antiviral também pode ser ad- ministrado ao indivíduo. Opcionalmente, o agente antiviral é ligado ao ORN.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha ou corra o risco de ter um câncer. O método de acordo 11/105

com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição da invenção. Em uma modali- dade, o método inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um ORN imunoestimulador da invenção. Em uma modalidade, um quimioterápico ou radiação também é administrada ao indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha ou corra o risco de ter um câncer. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição contendo um ORN imunoesti- mulador específico para TLR8 da invenção para reduzir o efeito inibitório de Células Treg CD4+. Em uma modalidade, a composição inclui um ORN es- pecífico para TLR8 e um ácido nucléico CpG imunoestimulador, onde o ORN específico para TLR8 e o ácido nucléico CpG imunoestimulador não são ligados. Em uma modalidade, a composição inclui um ORN específico para TLR8 e um ácido nucléico CpG imunoestimulador, onde o ORN especí- fico para TLR8 e o ácido nucléico CpG imunoestimulador estão presentes como um conjugado.

Em um aspecto a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha ou corra o risco de ter uma condição alérgica. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição da invenção. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quan- tidade eficaz de um ORN imunoestimulador da invenção. Em uma modali- dade, o indivíduo tem rinite alérgica. Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um

indivíduo que tenha ou corra o risco de ter asma. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição da invenção. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um ORN imunoestimulador da invenção. Em uma modalidade, a asma é asma exacerbada por uma infecção viral. O ORN pode ser administrado com ou sem alérgeno. Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha remodelagem das vias aéreas. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um ORN imunoestimulador da invenção.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para aumentar

a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). O método de a- cordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar a um indi- víduo com necessidade de ADCC aumentada uma quantidade eficaz de um ORN imunoestimulador da invenção e um anticorpo para aumentar a ADCC. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo específico para um antíge- no de câncer ou outro antígeno expresso por uma célula cancerosa. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG.

A invenção em um aspecto fornece um método para melhorar a disseminação de epítopos. 0 método de acordo com este aspecto da inven- ção inclui as etapas seqüenciais de contatar uma célula do sistema imuno- lógico com um antígeno e subseqüentemente contatar a célula com pelo menos duas doses de um ORN imunoestimulador da invenção. Em uma modalidade, o método é realizado in vivo. O método em uma modalidade, inclui as etapas de administrar a um indivíduo uma vacina que inclui um an- tígeno e um adjuvante e subseqüentemente administrar ao indivíduo pelo menos duas doses de um ORN imunoestimulador da invenção, em uma quantidade eficaz para induzir múltiplas respostas imunes específicas para epítopo. O método em uma modalidade, envolve aplicar um protocolo tera- pêutico que resulta na exposição do sistema imunológico a um antígeno em um indivíduo, seguido da administração de pelo menos duas doses de um ORN imunoestimulador da invenção, em uma quantidade eficaz para induzir múltiplas respostas imunes específicas para epítopo. Em várias modalida- des o protocolo terapêutico é cirurgia, radiação, quimioterapia, outros medi- camentos para câncer, uma vacina, ou uma vacina contra câncer. Em uma modalidade, as pelo menos duas doses do ORN imunoestimulador são ad- ministradas em um intervalo de pelo menos um dia a uma semana uma da outra. Em uma modalidade, as pelo menos duas doses do ORN imunoesti- tf 13/105

mulador são administradas em um intervalo de pelo menos uma semana a um mês uma da outra. Em uma modalidade, as pelo menos duas doses do ORN imunoestimulador são administradas em um intervalo de pelo menos um mês a seis meses uma da outra.

Em um aspecto, a invenção constitui um método para estimular

a produção de uma citocina pró-inflamatória, pelo contato de uma célula ex- pressando TLR8 com um RNA oligonucleotídeo (ORN) compreendendo: N- U-R1-R2, onde N é um ribonucleotídeo e N não inclui um U, U é uracila ou um derivado do mesmo, e R é um ribonucleotídeo onde pelo menos um de Ri e R2 é adenosina (A) ou citosina ou derivados das mesmas e onde R não é U a menos que N-U-R1-R2 inclua pelo menos dois A, onde o ORN não in- clui um motivo TLR7/8 e onde o ORN tem 4-100 de comprimento, em uma quantidade eficaz para estimular a produção de citocinas pró-inflamatórias e onde a produção de IFN-α em resposta ao ORN não é induzida de forma significativa em relação ao valor de referência. Em algumas modalidades, a produção de IFN-α em resposta ao ORN é menor que 300 pg/ml. Em uma modalidade, o ORN não é ACCCAUCUAUUAUAUAACUC (SEQ ID N°: 89). O ORN pode ser complexado ou não com N-[1-(2,3-Dioleoilóxi)propil]- N,N,Ntrimetilamoniometil-sulfato (DOTAP). Em algumas modalidades a célula expressando TLR8 é um mo-

nócito ou um mDC. Em ainda outras modalidades, a célula expressando TLR8 é in vitro ou in vivo.

Estes e outros aspectos da invenção serão descritos em maio- res detalhes junto com a descrição detalhada da invenção. Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um conjunto de gráficos representando a produção de citocinas induzida por ORN mediante estimulação de PBMC. Medindo-se a produção de citocinas IFN-alfa e TNF-alfa foram observadas diferenças entre os motivos TLR8 e TLR7/8. PBMC humanos foram estimulados com o ORN indicado (2 μΜ com diluição de 1/3) complexado com DOTAP (25 μg/ ml diluição de 1/3) ou com R-848 (2 μΜ com diluição de 1/3) em uma curva de titulação completa. Depois de 16 horas os sobrenadantes foram colhidos ψ 14/105

e IFN-alfa (Figura 1a) e TNF-alfa (Figura 1b) foram medidos por ELISA. Os dados mostram a média de três doadores de sangue de pelo menos três experiências independentes. DOTAP isolado não apresentou efeito. Os ORN são complexados com DOTAP1 o R-848 não é complexado. DOTAP isolado é um controle. Na figura 1c, PBMC humanos foram estimulados com 0,2 μΜ do ORN indicado complexo com DOTAP (2,2 μg/ml) ou com R-848 (2 μΜ). Depois de 16 horas os sobrenadantes foram colhidos e IFN-alfa (painel esquerdo) e TNF-alfa (painel direito) foram medidos por ELISA. Os dados mostram a média (±SEM) de 3 doadores. A figura 2 é um conjunto de gráficos de barras representando a

produção de citocinas induzida por ORN mediante estimulação de pDC iso- lado (Figura 2a), monócitos (Figura 2b) e mDC (Figura 2c). As células foram estimuladas com 0,5 μΜ de ORN complexado com 10 μg/ml de DOTAP, 0,5 μΜ de CpG ODN ou DOTAP ou meio isolado e o IFN-alfa (Figura 2a), TNF- alfa (Figura 2c) e IL-12p40 (Figura 2c) foram medidos.

A figura 3 é um conjunto de gráficos de barras representando a produção de citocinas induzida por ORN mediante estimulação de PBMC. PBMC humanos foram estimulados com o ORN indicado (0,5 μΜ de ORN) complexado com 10 μg/ml de DOTAP e o IFN-alfa (Figura 3A) e TNF-alfa (Figura 3B) foram medidos e a produção de citocinas foi medida pela técnica de ELISA e pela técnica de Luminex comparadas.

A figura 4 é um gráfico de barras demonstrando uma compara- ção das atividades máxima de IFN-alfa (Figura 4a) e TNF-alfa (Figura 4b) do ORN indicado. PBMC humanos foram estimulados com ORN (7 concentra- ções, partindo de 2 μΜ com diluição de 1/3) complexado com DOTAP (par- tindo de 25 μg/ml com diluições de 1/3) e as atividades máximas médias a 0,6 μΜ de 3 - 6 doadores de sangue em duas experiências individuais foram avaliadas.

A figura 5 é um gráfico de barras demonstrando uma compara- ção de atividade máxima de IFN-alfa (Figura 5a) com IFN-alfa EC50 (Figura 5b). PBMC humanos foram estimulados com ORN complexado com DOTAP e o IFN-alfa foi medido. A figura 6 é um conjunto de gráficos comparando curvas de titu- lação para ORN com TLR8 (SEQ ID N0: 13) ou TLR7/8 (SEQ ID N°: 21) com PBMC, pDC isolado ou monócitos isolados de 3 doadores de sangue. As células foram estimuladas com ORN (4 concentrações, partindo de 1μΜ com diluição de 1/4) complexado com DOTAP (partindo de 25 μg/ml com diluições de 1/4). Depois de 16 horas, os sobrenadantes foram colhidos e a produção de citocinas foi medida por tecnologias Luminex. Os gráficos mos- tram a percentagem de produção de citocinas de SEQ ID N°: 21 (a 0,3 μΜ).

As figuras 7-1 a 7-4 mostram um conjunto de gráficos de barras demonstrando as atividades máximas médias em qualquer concentração de 3 doadores de sangue para PBMC, monócitos isolados e pDC isolado e CD14-CD123- PBMC. As células foram estimuladas com ORN (4 concentra- ções, partindo de 1 μΜ com diluição de 1/4) complexado com DOTAP (par- tindo de 25 μ9/ηιΙ com diluições de 1/4). Depois de 16 horas os sobrenadan- tes foram colhidos e a produção de citocinas foi medida pela tecnologia Lu- minex. Quadrados vermelhos indicaram reações positivas em relação ao valor de referência de DOTAP e do meio.

A figura 8 é um conjunto de gráficos de barras mostrando as diferenças entre TLR8 (SEQ ID N°: 13) e TLR7/8 (SEQ ID N°: 21) ORN. As células foram estimuladas com ORN (4 concentrações, partindo de 1 μΜ com diluição de 1/4) complexado com DOTAP (partindo de 25 μg/ml com diluições de 1/4). Depois de 16 horas, os sobrenadantes foram colhidos e a produção de citocinas foi medida pela tecnologia Luminex. O gráfico mos- trou a produção máxima média medida de citocinas em qualquer concentra- ção ("measured mean max at any concentration cytokine production") como a percentagem do TLR8 ORN (SEQ ID N°: 13) para o TLR7/8 ORN (SEQ ID N0: 21). Isto está mostrado para pDC isolado, PBMC, monócitos isolados e CD123-CD14- PBMC.

A figura 9 é um conjunto de gráficos de barras e curvas que mostra a reação de TLR8 ORN (SEQ ID N°: 13) e TLR7/8 ORN (SEQ ID N°: 21) agindo via TLR8 em células HEK-293 transfectadas estáveis. Células K- 293 transfectadas estáveis com repórter de leitura de NFKB-Iuciferase e 16/105

TLR8 humano foram estimuladas por 16 horas com o ORN indicado. Depois de 16 horas os sobrenadantes foram removidos, as células Iisadas e a ativi- dade de Iuciferase ou o nível de citocina foram medidos. As figuras 9a e 9b mostram a indução de dobras de Iuciferase NFKB-Iuciferase depois de estí- mulo. A figura 9c mostra a indução de dobras de Iuciferase NFKB-Iueiferase depois de estímulo na presença de inibidores. A figura 9d mostra a estímu- lação de IP-10 depois de estímulo medida pelo ensaio de luciferase.

A figura 10 é uma série de gráficos mostrando a expressão de marcador de superfície mediante estimulação de pDC humano com ORN rico em AU ou rico em GU. pDC purificado com CD123+ (Figuras 10a e 10b) ou monócitos isolados (Figura 10c) foram incubados com 1 μΜ de ORN complexado com 25 μg/ml de DOTAP ou DOTAP isolado (Figura 10a) ou com as quantidades indicadas de ORN complexado com DOTAP ou DOTAP isolado (Figuras 10b-10c). Depois de 16 horas as células foram colhidas e coloridas com os anticorpos CD123, CD11c e HLA-DR (Figuras 10a e 10b) ou CD14 e CD19 (Figura 10c). A ativação do marcador de superfície celular foi medida pela expressão de CD86 (Figuras 10a e 10b) ou CD80 (Figura 10c). A figura 10a mostra a análise por FACS demonstrando que o ORN rico em AU (SEQ ID N°: 13) e o ORN rico em GU (SEQ ID N°: 21) apresentam diferenças na expressão de marcador de superfície de CD86. A figura 10b é um gráfico ilustrando que a expressão de marcador de superfície de CD86 mediante estimulação de pDC humano é dependente da dose. A figura 10c é um gráfico mostrando que ORN rico em AU (SEQ ID N°: 13) e ORN rico em GU (SEQ ID N°: 21) não apresentam diferenças na expressão de mar- cador de superfície de CD80 mediante estimulação com PBMC humano (dados não mostrados) e com células positivas para CD14.

A figura 11 é um conjunto de gráficos de barras mostrando dife- renças entre TLR8 ORN (SEQ ID N°: 13) e TLR7/8 ORN (SEQ ID N°: 21). SEQ ID N0: 5 ORN foi usado como controle. PBMC bovinos foram incuba- dos com 10 μ9/ιτιΙ de ORN (HD) ou 2,5 μ9/ηιΙ de ORN (LD) por 48 horas. Os sobrenadantes foram colhidos e analisados por ELISA. As figuras 11a-c mostram o nível de IL-12, IFN-γ, e TNF-alfa, respectivamente. 17/105

A figura 12 é uma série de gráficos demonstrando que células murinas não respondem ao ORN rico em AU SEQ ID N°: 13 in vivo ou in vitro. As células usadas foram células Raw264.7 da linhagem celular macró- fago de camundongo (Figura 12a), células J774 (Figura 12b), células CD11c+ purificadas de camundongo (camundongos sv129) (figuras 12c- 12g) e células de camundongo in vivo. A concentração de citocinas foi avali- ada por ELISA.

A figura 13 é um gráfico demonstrando que esplenócitos de rato não respondem ao ORN rico em AU SEQ ID N°: 13. Esplenócitos de 3 ratos Sprague-Dawley foram reunidos e estimulados com as concentrações indi- cadas de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 13 (ambos complexados com 62,5 μ9/ιηΙ de DOTAP com diluição de 1/5), R-848 ou DOTAP isolado (62,5 ng/ml -> diluição de 1/5). Os sobrenadantes foram colhidos depois de 20 horas e os níveis de TNF-alfa foram medidos por ELISA. Descrição Detalhada da Invenção

A invenção refere-se em parte à descoberta pelos inventores de inúmeros motivos de RNA imunoestimuladores específicos para seqüência. Foi agora descoberto que moléculas contendo um motivo de RNA imunoes- timulador são, isoladas ou em combinação com certos outros componentes, compostos imunoestimuladores importantes que encontram utilidade em inúmeros métodos para tratar indivíduos que têm ou correm o risco de ter uma condição na qual seria vantajoso induzir, aumentar ou redirecionar uma resposta imune. Conforme usado neste relatório, em uma modalidade, uma composição imunoestimuladora da invenção é um ORN imunoestimulador da invenção.

Foi descoberto que certos de RNA específicos para seqüência são imunoestimuladores, agindo através do TLR8, ao contrário de outros motivos (ricos em GU e ricos em CU) que agem sobre TLR 7 e TLR8. RNA oligonucleotídeos (ORN)1 de preferência contendo seqüências ricas em AU1 estimulam uma resposta imune através de TLR8. Diferenças entre a produ- ção de IFN-alfa, TNF-alfa, IFN-gama e IL-12 foram observadas nestas clas- ses distintas de ORN1 por exemplo, ORN contendo repetições de AU e de 18/105

GU. O interessante é que foi descoberto que o ORN imunoestimulador da invenção produz uma forte resposta a citocinas pró-inflamatórias, com exce- ção das moléculas relacionadas ao IFN-alfa e ao IFN-alfa. A produção de IFN-alfa é diminuída ou não existe mediante estimulação com estes novos ORN.

O motivo de RNA imunoestimulador de acordo com alguns as- pectos da invenção é N-U-Ri-R2.

N é um ribonucleotídeo e N não inclui um U. Em algumas moda- lidades N é adenosina ou citosina (C) ou derivados das mesmas. U é uracila ou um derivado do mesmo.

R é um ribonucleotídeo onde pelo menos um de Ri e R2 é ade- nosina (A) ou citosina ou derivados das mesmas. R não é U a menos que N- U-R1-R2 inclua pelo menos dois A.

O ORN da invenção inclui pelo menos um e em algumas moda- Iidades mais de um (isto é, 2, 3, ou 4) motivos imunoestimuladores, N-U-Ri- R2. O ORN não inclui um motivo TLR7/8.

O ORN é um oligonucleotídeo. Opcionalmente, o oligonucleotí- deo tem 4-100 de comprimento. O ORN também pode ter, por exemplo, 8- 40, 15-25 ou 20-30 nucleotídeos de comprimento. Opcionalmente o ORN inclui pelo menos uma modificação de estrutura principal.

N-U-R1-R2 pode em algumas modalidades incluir pelo menos 3 As ou pelo menos 2 Cs. Opcionalmente, N-U-Ri-R2 inclui pelo menos um G ou C.

Em algumas modalidades o ORN não é ACCCAUCUAUUAU AUAACUC (SEQ ID N°: 89).

O ORN pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável que opcionalmente é um veículo lipídico tal como N-[1-(2,3- Dioleoilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamôniometil-sulfato (DOTAP). Em outras modalidades, o ORN não é complexado com DOTAP. Em outras modalida- des o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um peptídeo tal como um peptídeo policatiônico. Peptídeos policatiônicos incluem, por exemplo, múltiplas polilisinas, poliargininas e polipeptídeos contendo mais de 50% de M 19/105

aminoácidos básicos, especialmente resíduos arginina ou Iisinaf em uma faixa de mais de 5, especialmente mais de 8 resíduos de aminoácidos ou misturas dos mesmos e podem, por exemplo, incluir derivados de proteínas antimicrobianas naturais de inseto.

Em outras modalidades, o ORN inclui pelo menos um AU.

Além de serem específicos para seqüência, os motivos de RNA imunoestimuladores são eficazes como RNA de filamento simples, RNA de filamento parcialmente duplo, ou RNA de filamento integralmente duplo.

Foram observadas diferenças nítidas entre a produção de moíé- cuias relacionadas ao IFN-alfa e ao IFN-alfa e outras citocinas pró- inflamatórias tais como TNF-alfa, IFN-gama, IL-10, IL-6 e IL-12 para os ORN da invenção e para ORN tendo um motivo TLR7/8, isto é, repetições con- tendo GU. O ORN da invenção tendo um motivo N-U-Ri-R2, por exemplo, aqueles contendo repetições AU ou AUU (SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13) não revelaram produção da citocina IFN-alfa mediante estimulação com PBMC e pDC. Ao contrário, ORN tendo três ou mais U em uma fileira (SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15) induziram a produção de IFN-alfa, apesar da pre- sença de As. De forma interessante, usando o mesmo conjunto de ORN, porém com G substituído por A foi observada uma forte produção de IFN- alfa mediante estimulação com PBMC. Os dados apresentados neste relató- rio sugerem fortemente a existências de duas classes diferentes de ORN: uma agindo sobre células expressando TLR8 tais como monócitos e mDCs (SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 16-SEQ ID N°: 18), o ORN con- tendo motivos N-U-Ri-R2 da invenção e uma outra agindo sobre células ex- pressando TLR7/8 tais como monócitos, mDCs e pDCs (SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 19-SEQ ID N°: 23) contendo as seqüências CU, GUeGUU.

Portanto, os ORN da invenção têm a capacidade de induzir uma resposta imune sem induzir quantidades significativas de IFN-alfa ou de mo- léculas relacionadas ao IFN-alfa em relação ao valor de referência. Uma quantidade significativa de IFN-alfa ou de moléculas relacionadas ao IFN- alfa em relação aos valores de referência é de preferência menor que 20% 35" 20/105

de alteração nos níveis de IFN-alfa ou de moléculas relacionadas ao IFN- alfa em relação ao valor de referência. Em algumas modalidades, ela é me- nor que 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1%. Em outras modalidades, a quantidade de IFN-alfa ou de moléculas relacionadas ao IFN-alfa que é induzida é equivalente ao valor de referência ou menor que os níveis de referência. Em ainda outras modalidades, a quantidade de IFN- alfa induzida pelo ORN da invenção é menor ou igual a 20% do IFN-alfa in- duzido por um TLR7/8 ORN. A quantidade de IFN-alfa induzida pelo ORN da invenção pode opcionalmente ser menor que 300 pg/ml em um ensaio in vitro ou pode ter um EC50 maior que 1,5 μΜ.

Uma molécula relacionada ao IFN-alfa, conforme usado neste relatório, é uma citocina ou um fator que é relacionado à expressão de IFN- alfa. Estas moléculas incluem, porém sem limitação MIP1-beta, IP-10 e MIP1- alfa.

Foi recentemente relatado que células Treg CD4+ expressam

TLR8 e que a sinalização de TLR8 nestas células reduz ou reverte sua fun- ção imunoinibitória. Peng G et al. (2005) Science 309:1380-4. Foram obser- vadas populações aumentadas de células Treg CD4+ em pacientes com vários tipos de cânceres, onde a imunossupressão pode contribuir para o "escape" imune e o crescimento desregulado desses cânceres. É de se es- perar que a supressão mediada por Treg seja benéfica no tratamento de câncer.

O ORN especificamente exclui os motivos TLR7/8. Foi desco- berto que os motivos TLR7/8 podem produzir resultados dominantes que mascaram as propriedades imunoestimuladoras singulares do ORN da in- venção. Um motivo TLR7/8 pode incluir, por exemplo, uma seqüência de ribonucleotídeos tal como 5'-C/U-U-G/U-U-3', 5'-R-U-R-G-Y-3\ 5'-G-U-U-G- B-3\ 5'-G-U-G-U-G/U-3\ ou 5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'. C/U é citosina (C) ou uracila (U)1 G/U é guanina (G) ou U, R é purina, Y é pirimidina, B é U, G, ou C, G/C é G ou C1 e A/C é adenina (A) ou C. O 5-C/U-U-G/U-U-3' pode ser CUGU, CUUU1 UUGU1 ou UUUU. Em várias modalidades 5'-R-U-R-G-Y- 3' é GUAGU1 GUAGC1 GUGGU1 GUGGC1 AUAGU1 AUAGC1 AUGGU1 ou 21/105

AUGGC. Em uma modalidade, a seqüência de base é GUAGUGU. Em vá- rias modalidades 5'-G-U-U-G-B-3' é GUUGU1 GUUGG, ou GUUGC. Em vá- rias modalidades 5-G-U-G-U-G/U-3' é GUGUG ou GUGUU. Em uma moda- lidade, a seqüência de base é GUGUUUAC. Em várias outras modalidades 5-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3' é GUAGGCAC, GUCGGCAC, CUAGGCAC, ou C U CG GCAC.

A invenção refere-se de um modo geral a oligorribonucleotídeos imunoestimuladores que incluem um ou mais motivos de RNA imunoestimu- Iadores1 composições imunoestimuladoras contendo um ou mais ORN imu- noestimuladores da invenção, e métodos para uso dos ORN imunoestimula- dores e das composições imunoestimuladoras da invenção.

Conforme usado neste relatório, os termos "RNA" e de forma equivalente "RNA natural" referem-se a dois ou mais ribonucleotídeos (isto é, moléculas compreendendo cada uma um açúcar ribose ligado a um grupo fosfato e a uma nucleobase purina ou pirimidina (por exemplo, guanina, a- denina, citosina, ou uracil)) covalentemente ligados por ligações 3-5' fosfo- diéster.

O motivo de RNA imunoestimulador pode ocorrer em uma ex- tremidade do ORN imunoestimulador (quando o ORN imunoestimulador tiver extremidades livres). Por exemplo, um ORN imunoestimulador com extremi- dades livres e o motivo de RNA imunoestimulador posicionado em uma ex- tremidade do ORN imunoestimulador pode ser representado como XaM ou como MXb, onde M representa o motivo de RNA imunoestimulador e cada um de Xa e Xb independentemente representa um ou mais nucleotídeos i- guais ou diferentes do ORN imunoestimulador exclusivo do motivo de RNA imunoestimulador.

Alternativamente, o motivo de RNA imunoestimulador pode ser flanqueado nas suas duas extremidades por pelo menos um nucleotídeo adicional do ORN imunoestimulador, independente de o ORN imunoestimu- Iador ter extremidades livres ou não. Por exemplo, um ORN imunoestimula- dor com extremidades livres e nucleotídeos flanqueando o motivo de RNA imunoestimulador pode ser representado como XaMXb, onde M representa o 22/105

motivo de RNA imunoestimulador e cada um de Xa e Xb independentemente representa um ou mais nucleotídeos iguais ou diferentes do ORN imunoes- timulador exclusivo do motivo de RNA imunoestimulador.

Em diferentes modalidades o ORN imunoestimulador incluindo o motivo de RNA imunoestimulador pode incluir um único motivo ou mais de um motivo de RNA imunoestimulador. Acredita-se que pode ser vantajoso ter dois ou mais motivos de RNA imunoestimuladores em um único ORN imunoestimulador, por exemplo se os motivos forem espaçados de modo que o ORN imunoestimulador possa engatar dois ou mais TLRs. Por exem- pio, o ORN imunoestimulador poderia engatar dois ou mais receptores de TLR8 dessa forma amplificando ou modificando o efeito imunoestimulador resultante.

Quando o ORN imunoestimulador inclui mais de um motivo de RNA imunoestimulador, o ORN imunoestimulador pode ser representado em uma modalidade, como MiXM2, onde M1 e M2 cada um independentemente representam um motivo de RNA imunoestimulador e X representa um ou mais nucleotídeos iguais ou diferentes do ORN imunoestimulador exclusivo dos motivos de RNA imunoestimuladores. Em uma modalidade, X inclui um Iigante não-nucleotídico conforme descrito neste relatório. Em uma modali- dade, X inclui uma unidade ramificadora conforme descrito neste relatório.

Quando há mais de um motivo de RNA imunoestimulador no ORN imunoestimulador, os motivos geralmente podem ocorrer em qualquer posição no ORN imunoestimulador. Por exemplo, quando existem dois moti- vos, cada um deles pode ocorrer em uma extremidade do ORN imunoesti- mulador. Alternativamente, um motivo pode ocorrer em uma extremidade e um motivo pode ser flanqueado em suas duas extremidades por pelo menos um nucleotídeo adicional do ORN imunoestimulador. Em ainda uma outra modalidade, cada motivo pode ser flanqueado em suas duas extremidades por pelo menos um nucleotídeo adicional do ORN imunoestimulador. ORN imunoestimuladores incluem, porém sem limitação, os se-

guintes, mostrando leitura 5' para 3' da esquerda para a direita:

Em algumas modalidades, o ORN é um dos ORN ativos mostra- dos nas Tabelas 1 e 2 abaixo, tais como os seguintes: U*U*A*G*G*C*A*C (SEQ ID N°: 2), A*U*A*G*G*C*A*C (SEQ ID N0: 4), G*C*C*A*C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*U*A*C*C (SEQ ID N°: 11), A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U*A*U (SEQ ID N°: 12), U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U (SEQ ID N°: 13), A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A*U*A*A (SEQ ID N°: 16), A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U*A*A*A*U (SEQ ID N°: 17), A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U*A*A*A*A*U (SEQ ID N°: 18), C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U (SEQ ID N°: 24), U*U*A*U*U*A*U (SEQ ID N°: 30), U*A*U*A*U*A*U (SEQ ID N°: 33), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*U*A*C*C*C (SEQ ID N°: 48), C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C (SEQ ID N0: 76), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*C*C*C*C (SEQ ID N°: 42), C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*A*U*C (SEQ ID N°: 39), C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*A*U*U*A*C*C (SEQ ID N°: 65), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*C*C*C*C*C (SEQ ID N°: 44), C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C (SEQ ID N°: 47), C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*C*C*C (SEQ ID N°: 38), C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*A*C*C*C (SEQ ID N°: 37), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*A*C*C*C (SEQ ID N°: 40), C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*C*C*C*C (SEQ ID N°: 55), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C (SEQ ID N°: 82), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*A*U*A*C*C (SEQ ID N°: 85), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*G*U*A*C*C (SEQ ID N°: 63), C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*A*C*C*C (SEQ ID N°: 43), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*U*C*C*C (SEQ ID N°: 36), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*A*C*C (SEQ ID N°: 87), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*C*C*C*C (SEQ ID N°: 45), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*A*C*C*C (SEQ ID N°: 41), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*G*C*C (SEQ ID N°: 83), C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*C*C*C*C*C (SEQ ID N°: 46), C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C (SEQ ID N°: 88), C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*G*C*C*C*C*C (SEQ ID N°: 35), C*C*GWG*C*C*G7WV*G*C*U*C*C*C (SEQ ID N°: 84), ou C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C (SEQ ID N°: 56).

Como mencionado acima, RNA é um polímero de ribonucleotí- deos unidos através de ligações 3-5' fosfodiéster. Em certas modalidades, os ORN imunoestimuladores da invenção são RNA. No entanto, os ORN imunoestimuladores da invenção não estão limitados a RNA, como será descrito abaixo.

Um ORN imunoestimulador da invenção pode em uma modali- dade, incluir uma ou mais nucleobases modificadas, isto é, derivados de A1 C, G, e U. Modalidades específicas destas nucleobases modificadas inclu- em porém, sem limitação citosinas 5-substituídas (por exemplo, 5-metil- citosina, 5-flúor-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-iodo-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-cítosina, 5-difluormetil-citosina, e 5-alquinil· citosina não-substituída ou substituída), citosinas 6-substituídas, citosinas N4-substituídas (por exemplo, N4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto- citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina com sistemas de anel condensados (por exemplo, Ν,Ν'-propileno citosina ou fenoxazina), e uracila e seus derivados (por exemplo, 5-flúor-uracila, 5-bromo-uracila, 5- bromovinil-uracila, 4-tio-uracila, 5-hidróxi-uracila, 5-propinil-uracil), derivados de timina (por exemplo, 2-tiotimina, 4-tiotimina, timinas 6-substituídas), deri- vados de guanosina (7-deazaguanina, guanina 7-deaza-7-substituída (tal como 7-deaza-7-(C2-C6)alquinilguanina), guanina 7-deaza-8-substituída, hi- poxantina, guaninas N2-substituídas (por exemplo, N2-metil-guanina), gua- nina 8-substituída (por exemplo, 8-hidroxiguanina e 8-bromoguanina), e 6- tioguanina), ou derivados de adenosina (5-amino-3-metil-3H,6H-tiazol[4,5- d]pirimidina-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, ade- nina, adeninas substituídas (por exemplo, N6-metil-adenina, 8-oxo-ade- nina)). A base também pode ser substituída por uma base universal (por exemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol, 3-nitropirrol, P-base, e K-base), um sis- tema de anel aromático (por exemplo, benzimidazol ou dicloro- benzimida- zol, amida de ácido 1-metil-1H-[1,2,4]triazol-3-carboxílico), um sistema de Ao 25/105

anel aromático (por exemplo, fluorbenzeno ou difluorbenzeno) ou um átomo de hidrogênio (dSpacer). Modificações de base preferidas são uracila e 7- deaza-guanina. As nucleobases U modificadas e seus ribonucleosídeos cor- respondentes encontram-se disponíveis em fornecedores comerciais.

Modalidades específicas de nucleobases G modificadas incluem

N2-dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8-azaguanina, guanina 7-deaza-7- substituída, 7-deaza-7-(C2-C6)alquinilguanina, guanina 7-deaza-8-substituí- da, 8-hidroxiguanina, 6-tioguanina, e 8-oxoguanina. Em uma modalidade, a nucleobase G modificada é 8-hidroxiguanina. Estas nucleobases G modifi- cadas e seus ribonucleosídeos correspondentes encontram-se disponíveis em fornecedores comerciais.

Em certas modalidades, pelo menos uma unidade β-ribose pode ser substituída por β-D-desoxirribose ou uma unidade de açúcar modificado, onde a unidade de açúcar modificado é por exemplo, selecionada de β-D- ribose, a-D-ribose, β-L-ribose (como em 1SpiegeImers'), a-L-ribose, 2'- amino-2'-desoxirribose, 2'-flúor-2'-desoxirribose, 2'-0-(C1-C6)alquil-ribose, de preferência 2'-0-(C1-C6)alquil-ribose é 2'-0-metilribose, 2'-0-(C2-C6) alquenil-ribose, 2'-[0-(C1-C6)alquil-0-(C1-C6)alquil]-ribose, LNA e a-LNA (Nielsen P et al. (2002) Chemistry-A European Journal 8:712-22), β-D-xilo- furanose, α-arabinofuranose, 2'-flúor arabinofuranose, e análogos de açúcar de cadeia carbocíclica e/ou aberta (descritos, por exemplo, em Vandendri- essche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) e/ou análogos de bicicloaçúcar (descritos, por exemplo, em Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481).

Os ribonucleotídeos e ribonucleosídeos individuais dos ORN imunoestimuladores da invenção podem ser alternativamente ligados por ligados não-nucleotídicos, em particular ligados abásicos (dSpacers), unida- des trietileno glicol, ou unidades hexaetileno glicol. Ligantes adicionais são Iigantes do tipo alquilamino, tais como C3, C6, e C12 aminoligantes, e tam- bém do tipo alquiltiol, tais como Iigantes tipo C3 ou C6 tiol. Os nucleotídeos e ribonucleosídeos individuais dos ORN imunoestimuladores da invenção podem ser alternativamente ligados por resíduos aromáticos que podem ser ainda substituídos com grupos alquila ou alquila substituída. Al 26/105

RNA é um polímero de ribonucleotídeos unidos através de liga- ções 3-5' fosfodiéster. Os nucleotídeos dos ORN imunoestimuladores da invenção também podem ser unidos através de ligações 3'-5' fosfodiéster. No entanto, a invenção também abrande ORN imunoestimuladores com Ii- gações internucleotídicas incomuns, incluindo especificamente as ligações internucleotídicas 5-5', 2-2', 2-3', e 2-5\ Em uma modalidade, tais li- gações incomuns são excluídas do motivo de RNA imunoestimulador, embo- ra uma ou mais destas ligações possam ocorrer em uma alguma parte do ORN imunoestimulador. Para ORN imunoestimuladores com extremidades livres, a inclusão de uma ligação internucleotídica 3'-3' pode resultar em um ORN imunoestimulador com duas extremidades 5' livres. Ao contrário, para ORN imunoestimuladores com extremidades livres, a inclusão de uma liga- ção internucleotídica 5-5' pode resultar em um ORN imunoestimulador com duas extremidades 3' livres. Uma composição imunoestimuladora desta invenção pode con-

ter dois ou mais motivos de RNA imunoestimuladores que podem ser liga- dos através de uma unidade ramificadora. As ligações internucleotídicas podem ser ligações 3'-5\ 5'-5\ 3-3', 2-2', 2-3', ou 2-5'. Dessa forma, a no- menclatura 2'-5' é escolhida de acordo com o átomo de carbono da ribose. A ligação internucleotídica incomum pode ser uma ligação fosfodiéster, mas ela pode ser alternativamente modificada como fosforotioato ou qualquer outra ligação modificada conforme descrito neste relatório. A fórmula abaixo mostra uma estrutura geral para os ORN imunoestimuladores ramificados da invenção via uma unidade ramificadora nucleotídica. Dessa forma Nui, Nu2, e Nu3 podem ser ligados através de ligações 3-5', 5'-5\ 3-3", 2-2', 2'-Z', ou 2-5'. A ramificação de ORN imunoestimuladores também pode envolver o uso de Iigantes não-nucleotídicos e espaçadores abásicos. Em uma mo- dalidade, Nui, Nu2, e Nu3 representam motivos de RNA imunoestimuladores iguais ou diferentes. Em uma outra modalidade, Nui, Nu2, e Nu3 compreen- dem pelo menos um motivo de RNA imunoestimulador e pelo menos um motivo de DNA de CpG imunoestimulador.

Os ORN imunoestimuladores podem conter uma unidade dupli- cadora ou triplicadora (Glen Research, Sterling, VA), em particular os ORN imunoestimuladores com uma ligação 3'-3\ Uma unidade duplicadora em uma modalidade, pode ser à base de 1,3-bis-[5-(4,4'-dimetoxitritilóxi) penti- lamido]propil-2-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidito. Uma unidade triplicadora em uma modalidade, pode ser à base de incorporação de Tris- 2,2,2-[3-(4,4'-dimetoxitritilóxi)propiloximetil]etil-[(2-cianoeti pil)]-fosforamidito. Ramificação dos ORN imunoestimuladores por múltiplas unidades duplicadoras, triplicadoras, ou outras unidades multiplicadoras leva a dendrímeros que constituem uma outra modalidade, desta invenção. ORN imunoestimuladores ramificados podem levar à reticulação de receptores para RNA imunoestimulador tal como TLR3, TLR7, e TLR8, com efeitos imu- nes distintos em comparação com formas não ramificadas dos ORN imuno- estimuladores. Além disso, a síntese de ORN imunoestimuladores ramifica- dos ou então multiméricos pode estabilizar o RNA contra degradação e po- de permitir que seqüências de RNA fracas ou parcialmente eficazes exer- çam um nível terapeuticamente útil de atividade imune. Os ORN imunoesti- muladores também podem conter unidades Iigadoras resultantes de reagen- tes modificadores de peptídeo ou de reagentes modificadores de oligonu- cleotídeo (Glen Research). Além disso, os ORN imunoestimuladores podem conter um ou mais resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais que Jil· 28/105

são ligados ao polímeros por ligações peptídicas (amídicas).

As ligações internucleotídicas 3'-5\ 5'-5', 3'-3\ 2'-2\ 2'-3\ e 2'-5' podem ser diretas ou indiretas. Ligações diretas neste contexto refere-se a uma ligação fosfato ou fosfato modificado como descrito neste relatório, sem uma porção Iigadora intermediária. Uma porção Iigadora intermediária é uma porção orgânica distinta de uma ligação fosfato ou fosfato modificado como descrito neste relatório, que pode incluir, por exemplo, polietileno glicol, trie- tileno glicol, hexaetileno glicol, dSpacer (isto é, um desoxinucleotídeo abási- co), uma unidade duplicadora, ou uma unidade triplicadora. Em certas modalidades, o ORN imunoestimulador é conjugado a

uma outra entidade para fornecer um conjugado. Conforme usado neste relatório um conjugado refere-se a uma combinação de quaisquer duas ou mais entidades ligadas uma à outra por qualquer meio físico-químico, que inclui interação hidrofóbica e acoplamento covalente. Em uma outra modalidade, o ORN imunoestimulador pode ser

conjugado a um ligando de baixo peso molecular que é reconhecido por um receptor imunomodulador. Este receptor é de preferência um membro da família TLR, tal como TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, ou TLR9. Os Iigan- dos de baixo peso molecular são cópias dos Iigandos naturais para esses receptores. Exemplos incluem, porém sem limitação R-848 (Resiquimod), R- 837 (Imíquimod; ALDARA®, 3M Pharmaceuticals), 7-deaza-guanosina, 7-tia- 8-oxo-guansosina, e 7-alil-8-oxo-guansosina (Loxoribine) que estimulam o TLR7 ou o TLR8. Derivados de D-glicopiranose, tais como 3D-MPL (ligando para TLR4), também podem ser conjugados aos ORN imunoestimuladores. Pam3-Cys é um exemplo de um ligando para TLR2 que pode ser conjugado aos ORN imunoestimuladores. Oligodesoxinucleotídeos contendo motivos CpG são Iigandos para TLR9, e estes também podem ser conjugados aos ORN imunoestimuladores da invenção. Em uma modalidade, pelo menos um oligodesoxinucleotídeo compreendendo um motivo CpG eficaz para es- timular a sinalização de TLR9 é conjugado a um ORN imunoestimulador da invenção. A conjugação de Iigandos para diferentes TLRs em uma molécula pode levar à multimerização de receptores o que resulta em estimulação imune aumentada ou em um perfil imunoestimulador diferente daquele re- sultante de qualquer tal ligando simples.

Em um aspecto, a invenção fornece um conjugado de um ORN imunoestimulador da invenção e uma porção lipofílica. Em certas modalida- des, o ORN imunoestimulador é covalentemente ligado a uma porção lipofí- lica. A porção lipofílica geralmente vai ocorrer em uma ou mais extremida- des de um ORN imunoestimulador com extremidades livres, embora em cer- tas modalidades a porção lipofílica possa ocorrer em outra parte no ORN imunoestimulador e portanto não requerer que o ORN imunoestimulador tenha uma extremidade livre. Em uma modalidade, o ORN imunoestimula- dor tem uma extremidade 3' e a porção lipofílica é covalentemente ligada à extremidade 3'. 0 grupo lipofílico de um modo geral pode ser um colesteril, um colesteril modificado, um derivado de colesterol, um colesterol reduzido, um colesterol substituído, um colestano, uma cadeia C16 alquila, um ácido biliar, ácido cólico, ácido taurocólico, ácido oleil litocólico, ácido oleoil colêni- co, um glicolipídio, um fosfolipídio, um esfingolipídio, um isoprenóide, tal como esteróides, vitaminas, tais como vitamina E, ácidos graxos saturados, ácidos graxos insaturados, ésteres de ácidos graxos, tais como triglicerí- deos, pirenos, porfirinas, texafirina, adamantano, acridinas, biotina, cumari- na, fluoresceína, rodamina, Texas-Red1 digoxigenina, dimetoxitritil, t-butil- dimetilsilil, t-butildifenilsilil, corantes à base de cianina (por exemplo, Cy3 ou Cy5), corante 33258 da Hoechst, psoraleno, ou íbuprofeno. Em certas mo- dalidades a porção lipofílica é escolhida de colesteril, palmitil, e ácido graxo. Em uma modalidade, a porção lipofílica é colesteril. Acredita-se que a inclu- são de uma ou mais destas porções lipofílicas nos ORN imunoestimuladores da invenção confere aos mesmos ainda uma estabilidade adicional contra a degradação por nucleases. Onde existem duas ou porções lipofílicas em um único ORN imunoestimulador da invenção, cada porção lipofílica pode ser selecionada independentemente de qualquer outra. Em uma modalidade, o grupo lipofílico é preso a uma posição 2'

de um nucleotídeo do ORN imunoestimulador. Um grupo lipofílico pode al- ternativamente ou adicionalmente ser ligado à nucleobase heterocíclica de um nucleotídeo do ORN imunoestimulador. A porção lipofílica pode ser co- valentemente ligada ao ORN imunoestimulador via qualquer ligação direta ou indireta adequada. Em uma modalidade, a ligação é direta e é um éster ou uma amida. Em uma modalidade, a ligação é indireta e inclui uma porção espaçadora, por exemplo, um ou mais resíduos de nucleotídeos abásicos, oligoetilenoglicol, tal como trietilenoglicol (espaçador 9) ou hexaetiIenogIicol (espaçador 18), ou um alcano-diol, tal como butanodiol.

Em uma modalidade, o ORN imunoestimulador da invenção é vantajosamente combinado com um lipídio catiônico ou um peptídeo catiôni- co. Acredita-se que lipídios catiônicos e peptídeos catiônicos auxiliam o trá- fego do ORN imunoestimulador no compartimento endossômico, onde o TLR8 é encontrado. Em uma modalidade, o lipídio catiônico é DOTAP (me- til-sulfato N-[1-(2,3-dioleoilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio). Acredita-se que o DOTAP transporta RNA oligômero para as células e especificamente tra- fegam para o compartimento endossômico, onde ele pode liberar o RNA oligômero de maneira dependente do pH. Uma vez no compartimento en- dossômico, o RNA pode interagir com certos TLRs intracelular, desencade- ando vias de transdução de sinal mediadas por TLR envolvidas na geração de uma resposta imune. Outros agentes com propriedades semelhantes que incluem o tráfego para o compartimento endossômico podem ser usados no lugar do DOTAP ou junto com ele. Outras formulações lipídicas incluem, por exemplo, EFFECTENE® (um lipídio não-lipossômico com um intensificador da condensação de DNA especial) e SUPERFECT® (uma nova tecnologia dendrimérica atuante). Lipossomas encontram-se comercialmente disponí- veis na Gibco BRL, por exemplo, como LIPOFECTIN® e LIPOFECTACE®, que são formados de lipídios catiônicos tais como cloreto de N-[1-(2, 3 dio- leilóxi)-propil]-N, N, N-trimetilamônio (DOTMA) e brometo de dimetil diocta- decilamônio (DDAB). Métodos para fazer Iipossomas são bastante conheci- dos na literatura e foram descritos em muitas publicações. Lipossomas tam- bém foram revistos por Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241.

Em uma modalidade, os ORN imunoestimuladores da invenção estão na forma de moléculas em forma de haltere covalentemente fechadas H 31/105

com estrutura primária e secundária. Como descrito, em uma modalidade, tais oligorribonucleotídeos cíclicos incluem duas alças de filamento simples conectadas por um segmento de filamento duplo intermediário. Em uma modalidade, pelo menos uma alça de filamento simples inclui um motivo de RNA imunoestimulador da invenção. Outras moléculas em forma de haltere covalentemente fechadas da invenção incluem moléculas de DNA:RNA quiméricas nas quais, por exemplo, o segmento de filamento duplo é pelo menos parcialmente DNA (por exemplo, dsDNA homodimérico ou DNA:RNA heterodimérico) e pelo menos uma alça de filamento simples inclui um moti- vo de RNA imunoestimulador da invenção. Alternativamente, o segmento de filamento duplo da molécula quimérica é RNA.

Em certas modalidades, ORN imunoestimulador é isolado. Uma molécula isolada é uma molécula que é substancialmente pura e é livre de outras substâncias com as quais ela é normalmente encontrada na natureza ou em sistemas in vivo em uma extensão prática e apropriada para o uso pretendido. Em particular, os ORN imunoestimuladores são suficientemente puros e são suficientemente livres de outros constituintes biológicos de célu- las de modo a serem úteis, por exemplo, na produção de preparações far- macêuticas. Como um ORN imunoestimulador isolado da invenção pode ser misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável em uma preparação farmacêutica, o ORN imunoestimulador pode compreende somente uma pequena percentagem em peso da preparação. O ORN imunoestimulador, é todavia, substancialmente puro no sentido de que ele foram substancialmen- te separado das substâncias com as quais ele pode estar associado em sis- temas vivos.

Para uso na presente invenção os ORN imunoestimuladores da invenção podem ser sintetizados de novo usando ou adaptado de qualquer um de inúmeros procedimentos bastante conhecidos na literatura. Por e- xemplo, o método de β-cianoetil fosforamidito (Beaucage SL et al. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); o método de nucleosídeo H-fosfonato (Garegg P et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler BC et al. (1986) NucIAcid Res 14:5399-407; Garegg P et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaff- ney BL et al. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22). Estas químicas podem ser realizadas por uma variedade de sintetizadores de ácidos nucléicos au- tomáticos disponíveis no mercado. Métodos de síntese adicionais úteis de acordo com a presente invenção estão descritos em Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544-84, e Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165.

A síntese de oligorribonucleotídeos pode ser efetuada em solu- ção ou em um suporte de fase sólida. Em solução, reações de acoplamento em blocos (dímeros, trímeros, tetrâmeros etc.) são preferidas, ao passo que a síntese em fase sólida é de preferência realizada em um processo de eta- pas usando blocos de construção monoméricos. Químicas diferentes, tais como o método de fosfotriéster, o método de H-fosfonato, e o método de fosforamidito, foram descritas (Eckstein F (1991) Oligonucleotides and Ana- logues, A Practical Approach, IRL Press, Oxford). Enquanto que no método de fosfotriéster o grupo fósforo reativo está no estado de oxidação +V, os derivados de fósforo +Ill mais reativos são usados nas reações de acopla- mento de acordo com as abordagens de fosforamidito e H-fosfonato. Nestas duas últimas abordagens, o fósforo é oxidado depois da etapa de acopla- mento para produzir derivados de P(V) estáveis. Se o oxidante for io- do/água/base, então fosfodiésteres são obtidos depois da desproteção. Ao contrário, se o oxidante for um agente sulfurizante, tal como reagente de Beaucage1 então fosforotioatos são obtidos depois da desproteção.

Um método eficiente para a síntese de oligorribonucleotídeos é a combinação da síntese em suporte sólido usando a química de fosforami- dito originalmente descrita para oligodesoxinucleotídeos por Matteucci & Ca- ruthers. Matteucci MD etal. (1981) J Am ChemSoe 103:3185.

A síntese de oligorribonucleotídeos é semelhante à de oligode- soxinucleotídeos, com a diferença de que o grupo 2'-hidróxi nos oligorribo- nucleotídeos deve ser protegido por um grupo protetor de hidróxi adequado. Os monômeros podem ser protegidos por exemplo, pelo grupo 2-O-t- butildimetilsilil (TBDMS) nos blocos de construção monoméricos do RNA. No entanto, foi relatado que a síntese de RNA usando monômeros contendo o grupo 2'-0~triisopropilsililoximetil (TOM) (TOM-Protecting-Group®) resulta At 33/105

em maior eficiência de acoplamento, porque o grupo protetor TOM apresen- ta bloqueio estérico mais baixo que o grupo TBDMS. Embora o grupo prote- tor TBDMS seja removido usando fluoreto, obtém-se uma desproteção rápi- da para o grupo TOM usando metilamina em etanol/água à temperatura ambiente. Na síntese de oligo(ribo)nucleotídeos, alongamento da cadeia da extremidade 3' para 5' é preferido, o que é obtido por acoplamento de uma unidade ribonucleotídeo tendo um grupo 3'-fósforo (III) ou seu derivado ati- vado a um grupo 5'-hidróxi livre de uma outra unidade nucleotídeo.

A síntese pode ser convenientemente realizada usando um sin- tetizador de DNA/RNA automático. Dessa forma, podem ser usados ciclos de síntese conforme recomendado pelos fabricantes dos sintetizadores. Pa- ra monômeros de ribonucleosídeo fosforamidito, os tempos de acoplamento são mais longos (por exemplo, 400 s) em comparação com monômeros de desoxinucleosídeo. Como suporte sólido, pode ser usado um suporte de vidro de poro controlado (CpG) de 500 a 1000 Â ou um suporte de polímero orgânico, tal como o suporte iniciador PS200 (Amersham). O suporte sólido normalmente contém o primeiro nucleosídeo, tal como 5'-0-Dimetoxitritil-N- 6-benzoiladenosina, preso via sua extremidade 3'. Depois da clivagem do grupo 5'-0-Dimetoxitritil com ácido tricloroacético, o alongamento da cadeia é obtido usando por exemplo, S-O-Dimetoxitritil-N-protegido^-O-terc butil- dimetilsilil-nucleosídeo-3'-0-fosforamiditos. Depois de sucessivos ciclos re- petitivos, o olígorribonucleotídeo completado é clivado do suporte e despro- tegido por tratamento com amônia concentrada/etanol (3:1, v:v) por 24 horas a 30°C. O grupo bloqueador TBDMS é finalmente removido por clivagem usando trietilamina/HF. Os oligorribonucleotídeos brutos podem ser purifica- dos por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com troca iônica, HPLC de fase reversa de par de íons, ou eletroforese em gel de poliacrila- mida (PAGE) e caracterizados por espectrometria de massa.

A síntese de 5'-conjugados é realizada por acoplamento de um fosforamidito da molécula a ser ligado ao grupo 5'-hidróxi do nucleotídeo terminal na síntese em fase sólida. Uma variedade de derivados de fosfora- midito de tais ligandos, tais como colesterol, acridina, biotina, psoraleno, eti- Ieno glicol, ou resíduos aminoalquila encontram-se comercialmente disponí- veis. Alternativamente, funções aminoalquila podem ser introduzidas durante a síntese em fase sólida que permite derivatização pós-síntese por molécu- las de conjugados ativadas, tais como ésteres, isotiocianatos ou iodo- acetamidas ativas.

A síntese de conjugados de extremidade 3' geralmente é obtida usando os suportes sólidos modificados de forma correspondente, tais como por exemplo, os suportes sólidos derivatizados de colesterol comercialmente disponíveis. No entanto, a conjugação também pode ser feita em ligações internucleotídicas, nucleobases ou nos resíduos ribose, tal como na posição 2' da ribose.

Para oligorribonucleotídeos cíclicos, o alongamento da cadeia de oligonucleotídeo pode ser efetuado no suporte sólido Nucleotídeo PS (Glen Research) usando química de fosforamidito tradicional. A reação de ciclização é então efetuada no suporte sólido usando um procedimento de acoplamento de fosfotriéster (Alazzouzi et al. (1997) Nucleosides Nucleoti- des 16:1513-14). Na desproteção final com hidróxido de amônio, virtualmen- te o único produto que entra em solução é o oligonucleotídeo cíclico deseja- do.

Os oligorribonucleotídeos cíclicos da invenção incluem formas

circulares fechadas de RNA e podem incluir RNA de filamento simples com ou sem RNA de filamento duplo. Por exemplo, em uma modalidade, o oligor- ribonucleotídeo cíclico inclui RNA de filamento duplo e tem a conformação de um haltere com duas alças de filamento simples conectadas por um segmento de filamento duplo intermediário. Oligodesoxinucleotídeos CpG em forma de haltere covalentemente fechados foram descritos na Patente US N0 6.849.725. Em uma outra modalidade, o oligorribonucleotídeo cíclico inclui RNA de filamento duplo e tem uma conformação com três ou mais alças de filamento simples conectadas por segmentos de filamento duplo intermediários. Em uma modalidade, um motivo de RNA imunoestimulador está localizado em um ou mais segmentos de filamento simples.

Os ORN imunoestimuladores da invenção são úteis, isolados ou 35/105

em combinação com outros agentes, como adjuvantes. Um adjuvante con- forme usado neste relatório refere-se a uma substância que não um antíge- no que aumenta a ativação da célula imune em resposta a um antígeno, por exemplo, uma resposta imune humoral e/ou celular. Adjuvantes promovem a acumulação e/ou a ativação de células acessórias para aumentar respostas imunes específicas para antígeno. Adjuvantes são usados para aumentar a eficácia de vacinas, isto é, composições contendo antígeno usadas para induzir imunidade protetora contra o antígeno.

Adjuvantes em geral incluem adjuvantes que criam um efeito de depósito, adjuvantes imunoestimuladores, e adjuvantes que criam um efeito de depósito e estimulam o sistema imunológico. Um adjuvante que cria um efeito de depósito conforme usado neste relatório é um adjuvante que faz com que o antígeno seja liberado lentamente no corpo, dessa forma prolon- gando a exposição das células imunes ao antígeno. Esta classe de adjuvan- tes inclui, porém sem limitação alúmen (por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio); formulações à base de emulsão incluindo emulsão de óleo mineral, de óleo não mineral, de água em óleo ou de óleo em água em óleo, emulsões de óleo em água tais como a série Seppic ISA de adjuvantes Montanide (por exemplo, Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, França); MF- 59 (uma emulsão de esqualeno em água estabilizada com Span 85 e Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, Calif.); e PROVAX (uma emulsão de ó- Ieo em água contendo um detergente estabilizante e um agente formador de micelas; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego1 Calif.).

Um adjuvante imunoestimulador é um adjuvante que causa a ativação de uma célula do sistema imunológico. Ele pode, por exemplo, fa- zer com que uma célula imune produza e secrete citocinas. Esta classe de adjuvantes inclui, porém sem limitação saponinas purificadas a partir da casca da árvore Q. saponaría, tal como QS21 (um glicolipídio que elui no 21° pico com fracionamento por HPLC; Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, Mass.); poli[di(carboxilatofenóxi)fosfazeno (polímero de PCPP; Vírus Research Institute, EUA); derivados de lipopolissacarídeos tais como monofosforil lipídio A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Si 36/105

Mont.), muramil dipeptídeo (MDP; Ribi) e treonil-muramil dipeptídeo (t-MDP; Ríbi); OM-174 (um glicosamina dissacarídeo relacionado ao lipídio A; OM Pharma SA, Meyrin, Suíça); e fator de alongamento de Leishmania (uma proteína de Leishmania purificada; Corixa Corporation, Seattle, Wash.). Esta classe de adjuvantes também inclui CpG DNA.

Adjuvantes que criam um efeito de depósito e estimulam o sis- tema imunológico são os compostos que têm ambas as funções identifica- das acima. Esta classe de adjuvantes inclui, porém sem limitação ISCOMS (complexos imunoestimuladores que contêm saponinas mistas, lipídios e formam partículas do tamanho de vírus com poros que podem reter o antí- geno; CSL, Melbourne1 Austrália); SB-AS2 (sistema adjuvante #2 da Smith- Kline Beecham que é uma emulsão de óleo em água contendo MPL e QS21: SmithKIine Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Bélgica); SB-AS4 (sistema adjuvante #4 da SmithKIine Beecham que contém alúmen e MPL; SBB, Bélgica); copolímeros em blocos não iônicos que formam micelas tais como CRL 1005 (estes contêm uma cadeia linear de polioxipropileno hidró- fobo flanqueada por cadeias de polioxietileno; Vaxcel, Inc., Norcross, Ga.); e a formulação de adjuvante Syntex (SAF, uma emulsão de óleo em água contendo Tween 80 e um copolímero em blocos não iônico; Syntex Chemi- cais, Inc., Boulder, Colo.).

A invenção em um aspecto fornece um adjuvante que inclui um ORN imunoestimulador da invenção, por si só. Em uma outra modalidade, a invenção fornece um adjuvante que inclui um ORN imunoestimulador da invenção e pelo menos um outro adjuvante (um adjuvante de combinação). O outro adjuvante pode incluir um adjuvante que cria um efeito de depósito, um adjuvante imunoestimulador, um adjuvante que cria um efeito de depósi- to e estimula o sistema imunológico, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o ORN imunoestimulador da invenção e pelo menos um outro adjuvante são covalentemente ligados um ao outro. Um adjuvante de combinação de acordo com a invenção pode exibir um efeito imunoesti- mulador sinergístico comparado à soma dos efeitos do ORN imunoestimula- dor isolado e do pelo menos um outro adjuvante isolado. Adicionalmente ou SSL 37/105

alternativamente, um adjuvante de combinação de acordo com a invenção pode exibir um perfil imunoestimulador alterado comparado àquele do ORN imunoestimulador isolado ou do pelo menos um outro adjuvante isolado. Por exemplo, o adjuvante de combinação pode oferecer uma forma mais equili- brada de imunoestimulação de Th1/Th2 em uma modalidade, ou ele pode oferecer uma forma mais desviada de imunoestimulação de Th1/Th2 em uma outra modalidade. Os especialistas na técnica vão saber como selecio- nar os componentes individuais para promover um tipo desejado de imuno- estimulação, por exemplo, mais equilibrada ou mais desviada em relação ao caráter de Th1 e Th2. Th1 e Th2 estão descritos mais adiante.

Também é fornecida uma composição que inclui um ORN imu- noestimulador da invenção mais um outro adjuvante, onde o outro adjuvante é uma citocina. Em uma modalidade, a composição é um conjugado do ORN imunoestimulador da invenção e da citocina. Citocinas são proteínas solúveis e glicoproteínas produzidas por

muitos tipos de células que medeiam reações inflamatórias e imunes. As citocinas medeiam a comunicação entre as células do sistema imunológico, agindo localmente assim como sistemicamente para recrutar células e regu- lar sua função e proliferação. As categorias de citocinas incluem mediadores e reguladores da imunidade inata, mediadores e reguladores da imunidade adaptativa, e estimuladores de hematopoiese. Incluídas entre as citocinas encontram-se interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, e as interleucinas 19-32 (IL-19 - IL-32), entre outras), quimiocinas (por exemplo, IP-10, RANTES, MIP-Ia1 MIP-Ib1 MIP-3a, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxina, l-TAC, e BCA-1, entre outras), assim como outras citocinas inclu- indo interferons tipo 1 (por exemplo, IFN-α e IFN-β), interferon tipo 2 (por exemplo, IFN-γ), fator-alfa de necrose tumoral (TNF-α), fator-beta do cres- cimento de transformação ("transforming growth factor-beta") (TGF-β), e vá- rios fatores estimuladores de colônias (CSFs), incluindo GM-CSF1 G-CSF, e M-CSF.

Também é fornecida uma composição que inclui um ORN imu- noestimulador da invenção mais um ácido nucléico CpG imunoestimulador. Em uma modalidade, a composição é um conjugado do ORN imunoestimu- lador da invenção e do ácido nucléico CpG, por exemplo, um conjugado RNA:DNA. Em uma modalidade, a composição é uma mistura do ORN imu- noestimulador da invenção e do ácido nucléico CpG1 isto é, não é um conju- gado RNA:DNA.

Um ácido nucléico CpG imunoestimulador conforme usado nes- te relatório refere-se a uma seqüência de DNA natural ou sintética que inclui um motivo CpG e que estimula a ativação ou a proliferação de células do sistema imunológico. Ácidos nucléicos CpG imunoestimuladores foram des- critos em inúmeras patentes expedidas, pedidos de patente publicados, e outras publicações, incluindo as Patentes US N°s 6.194.388, 6.207.646, 6.214.806, 6.218.371, 6.239.116, e 6.339.068. Em uma modalidade, ao áci- do nucléico CpG imunoestimulador é um oligodesoxinucleotídeo CpG (CpG ODN) de 6 - 100 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, o áci- do nucléico CpG imunoestimulador é um oligodesoxinucleotídeo CpG (CpG ODN) de 8-40 nucleotídeos de comprimento.

Ácidos nucléicos CpG imunoestimuladores incluem diferentes classes de ácidos nucléicos CpG. Uma classe é potente para ativar células B, mas é relativamente fraca para induzir a ativação de IFN-α e de células NK; esta classe foi denominada classe B. Os ácidos nucléicos CpG da clas- se B tipicamente são totalmente estabilizados e incluem um dinucleotídeo CpG não metilado em certos contextos básicos preferidos. Vide, por exem- plo, as Patentes US N°s 6.194.388, 6.207.646, 6.214.806, 6.218.371, 6.239.116, e 6.339.068. Uma outra classe é potente para induzir a ativação de IFN-α e de células NK mas é relativamente fraca para estimular células B; esta classe foi denominada classe A. Os ácidos nucléicos CpG da classe A tipicamente possuem uma seqüência contendo o dinucleotídeo fosfodiés- ter CpG palindrômico de pelo menos 6 nucleotídeos e uma seqüência poli-G estabilizada em uma das extremidades 5' e 3' ou em ambas. Vide, por e- xemplo, o pedido de patente internacional publicado WO 01/22990. Ainda uma outra classe de ácidos nucléicos, CpG ativa as células B e as células SJ\ ' *

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NK e induz o IFN-α; esta classe foi denominada classe C. Os ácidos nucléi- cos CpG da classe C, como caracterizados pela primeira vez, tipicamente são completamente estabilizados, incluem uma seqüência tipo classe B e um palíndromo ou quase palíndromo rico em GC. Esta classe foi descrita no pedido de patente US publicado 2003/0148976, cujo conteúdo está aqui in- corporado a título de referência.

Ácidos nucléicos CpG imunoestimuladores também incluem os chamados ácidos nucléicos CpG macios e semimacios, descritos no pedido de Patente US publicado 2003/0148976, cujo conteúdo está aqui incorpora- do a título de referência. Tais ácidos nucléicos CpG imunoestimuladores macios e semi-macios incorporam uma combinação de ligações internucleo- tídicas resistentes à nuclease e sensíveis à nuclease, onde os diferentes tipos de ligação são posicionadas de acordo com certas regras.

Também é fornecida uma composição que inclui um ORN imu- noestimulador da invenção mais um outro adjuvante, onde o outro adjuvante é um lipopeptídeo tal como Pam3Cys, um polissacarídeo catiônico tal como quitosano, ou um peptídeo catiônico tal como protamina. Em uma modalida- de, a composição é um conjugado do ORN imunoestimulador da invenção e do outro adjuvante.

A invenção em um aspecto fornece uma vacina que inclui um

ORN imunoestimulador da invenção e um antígeno. Um "antígeno" confor- me usado neste relatório refere-se a qualquer molécula capaz de reconheci- da por um receptor de antígeno de células T ou por um receptor de antígeno de células Β. O termo inclui amplamente qualquer tipo de molécula que é reconhecida por um sistema imunológico hospedeiro como sendo estranha. Antígenos geralmente incluem porém sem limitação células, extratos celula- res, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, polissacarídeos, conjugados de polissacarídeos, imitações peptídicas e não-peptídicas de polissacarídeos e outras moléculas, moléculas pequenas, lipídios, glicolipídios, polissacarí- deos, carboidratos, vírus e extratos virais, e organismo multilcelulares tais como parasitas, e alérgenos. Quanto aos antígenos que são proteínas, poli- peptídeos, ou peptídeos, tais antígeno podem incluir moléculas de ácidos 40/105

nucléicos codificando tais antígenos. Antígenos mais especificamente inclu- em, porém sem limitação, antígenos de câncer, que incluem células cance- rosas e moléculas expressas em ou sobre células cancerosas; antígenos microbianos, que incluem micróbios e moléculas expressas em ou sobre micróbios; e alérgenos. Por conseguinte, a invenção em certas modalidades fornece vacinas para cânceres, agentes infecciosos, e alérgenos.

A invenção em um aspecto fornece um uso de um ORN imuno- estimulador da invenção para a preparação de um medicamento para vaci- nar um indivíduo.

A invenção em um aspecto fornece um método para preparar

uma vacina. O método inclui a etapa de colocar um ORN imunoestimulador da invenção em associação íntima com um antígeno e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em várias modalidades, o antígeno é um antígeno microbiano, um antígeno de câncer, ou um alérgeno. Um "antígeno microbiano" confor- me usado neste relatório é um antígeno de um microorganismo e inclui po- rém sem limitação vírus, bactérias, parasitas, e fungos. Tais antígenos in- cluem o microorganismo intacto assim como isolados e fragmentos naturais ou derivados do mesmo e também compostos sintéticos que são idênticos ou similares a antígenos de microorganismo natural e induzem uma respos- ta imune específica para aquele microorganismo. Um composto é similar a um antígeno de microorganismo natural se ele induzir uma resposta imune (humoral e/ou celular) para um antígeno de microorganismo natural. Tais antígenos são rotineiramente usados na literatura e são bastante conheci- dos pelos especialistas na técnica.

Vírus são agentes infecciosos pequenos que geralmente contêm um núcleo de ácido nucléico e um revestimento de proteína, mas não são organismos vivos independentes. Os vírus também podem assumir a forma de ácidos nucléicos infecciosos faltando uma proteína. Um vírus não pode sobreviver na ausência de uma célula viva onde ele possa se replicar. Os vírus entram em células vivas específicas seja por endocitose ou por injeção de DNA (fago) e se multiplicam, causando doença. O vírus multiplicado pode £6 >

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então ser liberado e infectar células adicionais. Alguns vírus são vírus con- tendo DNA e outros são vírus contendo RNA. Em alguns aspectos, a inven- ção também se destina a tratar doenças nas quais prions estão envolvidos na progressão da doença tais como por exemplo, encefalopatia espongifor- me bovina (isto é, doença da vaca louca, BSE) ou infecção priônica ("scra- pie infection") em animais, ou doença de Creutzfeldt-Jakob em seres huma- nos.

Vírus incluem, porém sem limitação, enterovírus (incluindo, po- rém sem limitação, vírus da família picornaviridae, tais como vírus da polio- mielite, vírus Coxsackie, echovírus), rotavírus, adenovírus, vírus da hepatite. Exemplos específicos de vírus que foram encontrados em seresn humanos incluem porém sem limitação: Retroviridae (por exemplo, vírus da imunode- ficiência humana, tais como HIV-1 (também chamado HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV, ou HIV-III; e outros isolados, tais como HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, vírus da políomielite, vírus da hepatite A; enterovírus, vírus Coxsackie humanos, rinovírus, echovírus); Caiciviridae (por exemplo, cepas que causam gastroenterite); Togaviridae (por exemplo, vírus da encefalo- mielite eqüina, vírus da rubéola); Flaviviridae (por exemplo, vírus da dengue, vírus da encefalite, vírus da febre amarela); Coronaviridae (por exemplo, coronavírus); Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, vírus Ebola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírus parainfluenza, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus influenza); Bun- yaviridae (por exemplo, vírus Hantaan, vírus Bunyamwera, flebovírus e vírus Nairo); Arenaviridae (vírus da febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbívíurs e rotavírus); Birnaviridaem, Hepadnaviridae (vírus da hepati- te B); Parvoviridae (parvovírus); Papovaviridae (papilomavírus, vírus do poli- oma); Adenoviridae (a maioria dos adenovirus); Herpesviridae (vírus do her- pes simples (HSV) 1 e 2, vírus varicela-zoster, citomegalovírus (CMV)); Pox- viridae (vírus da varíola, vírus da vacínia, poxvírus); Iridoviridae (por exem- plo, vírus da febre suína africana); e vírus não classificados (por exemplo, os agentes etiológicos de encefalopatias espongiformes, o agente da hepatite delta (que se acredita ser um satélite defeituoso do vírus da hepatite B), os agentes da hepatite não-A, não-B (classe 1 = transmitida internalmente; classe 2 = transmitida parenteralmente (isto é, hepatite C); e vírus Norwalk e vírus relacionados, e astrovírus).

Bactérias são organismos unicelulares que se multiplicam asse-

xuadamente por fissão binária. Elas são classificadas e denominadas se- gundo sua morfologia, reações de coloração, exigências nutricionais e me- tabólicas, estrutura antigênica, composição química, e homologia genética. As bactérias podem ser classificadas em três grupos segundo suas formas morfológicas, bastonete esférico (coco), bastonete reto (bacilo) e bastonete encurvado ou espiral (vibrião, Campylobacter, espirito, e espiroqueta). As bactérias são mais comumente caracterizadas segundo suas reações de coloração em duas classes de organismos, gram-positivos e gram- negativos. Gram refere-se ao método de coloração que é comumente reali- zado nos laboratórios de microbiologia. Os organismos gram-positivos retêm o corante depois do procedimento de coloração e aparece uma cor violeta- escuro. Os organismos gram-negativos não retêm o corante, mas absorvem o contracorante e portanto aparece uma cor rosa.

Bactérias infecciosas incluem, porém sem limitação, bactérias gram-negativas e bactérias gram-positivas. Bactérias gram-positivas inclu- em, porém sem limitação, a espécie Pasteurella, a espécie Staphylococci, e a espécie Streptococcus. Bactérias gram-negativas incluem, porém sem li- mitação, Escherichia coli, a espécie Pseudomonas, e a espécie Salmonella. Exemplos específicos de bactérias infecciosas incluem porém sem Iimita- ção: Helicobacter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legioneila pneumophilia, My- cobacteria sps (por exemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intraceilulare, M. kansasii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A), Streptococcus agaiactiae (Streptococcus Grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (espécie anaeróbica), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patogênico, Enterococcus sp., Haemophilus infIuenzae, Sf 43/105

Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Ery- sipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Entero- bacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nueleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pai- lidum, Treponema pertenue, Leptospira, Riekettsiar e Aetinomyees israelli.

Parasitas são organismos que dependem de outros organismos para sobreviver e portanto devem penetrar, ou infectar, um outro organismo para continuar seu ciclo de vida. O organismo infectado, isto é, o hospedei- ro, oferece nutrição e habitat para o parasita. Embora em seu sentido mais amplo o termo parasita possa incluir todos os agentes infecciosos (isto é, bactérias, vírus, fungos, protozoários e helmintos), de um modo geral, o ter- mo é usado para se referir apenas a protozoários, helmintos, e artrópodes ectoparasitários (por exemplo, carrapatos, ácaros etc.). Protozoários são organismos unicelulares que podem se replicar tanto intracelularmente quanto extracelularmente, em particular no sangue, no trato intestinal ou na matriz extracelular dos tecidos. Helmintos são organismos multicelulares que quase sempre são extracelulares (TriehineIIa spp. sendo uma exceção). Os helmintos normalmente requerem saída de um hospedeiro primário e transmissão para um segundo hospedeiro para replicar. Ao contrário destas classes acima mencionadas, os artrópodes ectoparasitários formam uma relação parasitária com a superfície externa do corpo do hospedeiro.

Parasitas incluem parasitas intracelulares e parasitas intracelula- res obrigatórios. Exemplos de parasitas incluem, porém sem limitação Plas- modium faleiparum, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmdodium vivax, Plasmodium knowlesi, Babesia mieroti, Babesia divergens, Trypano- soma eruzi, Toxoplasma gondii, Triehinella spiralis, Leishmania major, Lei- shmania donovani, Leishmania braziliensis, Leishmania tropica, Trypanoso- ma gambiense, Trypanosoma rhodesiense e Sehistosoma mansoni.

Fungos são organismos eucarióticos, dos quais apenas alguns causam infecção em mamíferos vertebrados. Como os fungos são organis- mos eucarióticos, eles diferem significativamente das bactérias procarióticas em termos de tamanho, organização estrutural, ciclo de vida e mecanismo de multiplicação. Os fungos geralmente são classificados segundo aspectos morfológicos, modos de reprodução e características de cultura. Embora os fungos causem diferentes tipos de doenças nos indivíduos, tais como alergi- as respiratórias subsequente à inalação de antígenos fúngicos, intoxicação fúngica devido à ingestão de substâncias tóxicas, tais como a toxina e a fa- Iotoxina de Amanita phalloides produzidas por cogumelos venenosos e afia- toxinas, produzidas por espécies de aspergillus, nem todos os fungos cau- sam doenças infecciosas.

Fungos infecciosos podem causar infecções sistêmicas ou su- perficiais. Infecção sistêmica primária pode ocorrer em indivíduos sadios normais, e infecções oportunísticas são encontradas com mais freqüência em indivíduos imunocomprometidos. Os agentes fúngicos mais comuns que causam infecção sistêmica primária incluem Blastomyces, Coccidioides, e Histoplasma. Os fungos comuns que causam infecção oportunística em indi- víduos imunocomprometidos ou imunossuprimidos incluem, porém sem limi- tação, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, e várias espécies de Aspergillus. Infecções fúngicas sistêmicas são infecções invasivas dos ór- gãos internos. O organismo geralmente penetra no corpo através dos pul- mões, do trato gastrointestinal, ou de cateteres intravenosos. Estes tipos de infecções podem ser causadas por fungos patogênicos primários ou por fungos oportunísticos.

Infecções fúngicas superficiais envolvem o crescimento de fun- gos em uma superfície externa sem invasão dos tecidos internos. Infecções fúngicas superficiais típicas incluem infecções fúngicas cutâneas envolvendo a pele, o cabelo, ou as unhas.

Doenças associadas à infecção fúngica incluem aspergilose, blastomicose, candidíase, cromoblastomicose, coccidioidomicose, criptoco- cose, infecções fúngicas dos olhos, infecções fúngicas do cabelo, das u- nhas, e da pele, histoplasmose, lobomicose, micetoma, otomicose, paracoc- cidioidomicose, PenieiHium marneffei disseminado, feoifomicose, rinosporidi- ose, esporotricose, e zigomicose.

Outros microorganismos relevantes em termos médicos foram <οΟ 45/105

extensivamente descritos na literatura, por exemplo, vide C.G.A Thomas, Medicai Microbiology, Bailliere Tindall1 Grã-Bretanha 1983, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência. Cada uma das listas acima é ilustrativa e não pretende ser limitativa.

Conforme usado neste relatório, os termos "antígeno de câncer"

e "antígeno tumoral" são usados alternadamente para se referir a um com- posto, tal como um peptídeo, uma proteína, ou uma glicoproteína, que é as- sociado a uma célula tumorosa ou cancerosa e que é capaz de provocar uma resposta imune quando expresso na superfície de uma célula apresen- tando o antígeno no contexto de uma molécula de complexo de histocompa- tibilidade maior (MHC). Antígenos de câncer que são diferencialmente ex- pressos por células cancerosas e portanto podem ser explorados para ata- car células cancerosas. Antígenos de câncer são antígenos que podem po- tencialmente estimular respostas imunes aparentemente específicas para tumor. Alguns destes antígenos são codificados, embora não necessaria- mente expressos, por células normais. Estes antígenos podem ser caracte- rizados como aqueles que são normalmente silenciosos (isto é, não expres- sos) em células normais, aqueles que são expressos apenas em certos es- tágios de diferenciação, e aqueles que são temporalmente expressos tais como antígenos embriônicos e fetais. Outros antígenos de câncer são codi- ficados por genes celulares mutantes, tais como oncogenes (por exemplo, oncogene ras ativado), genes supressores (por exemplo, p53 mutante), pro- teínas de fusão resultantes de deleções internas ou de translocações cro- mossômicas. Ainda outros antígenos de câncer podem ser codificados por genes virais tais como aqueles transportados em vírus tumorais de RNA e de DNA.

Antígenos de câncer podem ser preparados a partir de células cancerosas seja por preparação de extratos brutos de células cancerosas, por exemplo, como descrito em Cohen PA et al. (1994) Câncer Res 54:1055-8, por purificação parcial dos antígenos, por tecnologia recombinan- te, ou por síntese de novo de antígenos conhecidos. Antígenos de câncer incluem porém sem limitação antígenos que são expressos recombinante- mente, uma porção imunogênica de, ou um tumor ou câncer inteiro ou uma célula do mesmo. Tais antígenos podem ser isolados ou preparados de for- ma recombinante ou por qualquer outro meio conhecido na literatura.

Exemplos de antígenos tumorais incluem MAGE, MART- 1/Melano-A, gp100, dipeptidil peptidase IV (DPPIV), proteína fixadora de adenosina desaminase (ADAbp), ciclofilina b, antígeno associado colorretal (CRC)-COI7-1A/GA733, antígeno carcinoembriônico (CEA) e seus epítopos imunogênicos CAP-1 e CAP-2, etv6, aml1, antígeno específico para próstata (PSA) e seus epítos imunogênicos PSA-1, PSA-2, e PSA-3, antígeno mem- branoso específico para próstata (PSMA), receptor de células T/cadeia CD3- zeta, família MAGE de antígenos tumorais (por exemplo, MAGE-A1, MAGE- A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), família GAGE de antígenos tumorais (por exemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE- 7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG1 GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC1 HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-fetoproteína, E- caderina, a-catenina, β-catenina e γ-catenina, p120ctn, gp1 OOpmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína coli de polipose adenomatosa (APC), fodrina, Connexin 37, Ig-idiotipo, p15, gp75, gangliosídeos GM2 e GD2, pro- dutos virais tais como proteínas do papilomavírus humano, família Smad de antígenos tumorais, lmp-1, P1A, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-I, glicogênio fosforilase cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 e CT-7, e c-erbB-2. Esta lista não pretende ser limitativa.

Um "alérgeno" conforme usado neste relatório é uma molécula capaz de provocar uma resposta imune caracterizada pela produção de IgE. Um alérgeno também é uma substância que pode induzir uma resposta a- lérgica ou asmática em um indivíduo suscetível. Portanto, no contexto desta invenção, o termo alérgeno significa um tipo específico de antígeno que po- de desencadear uma resposta alérgica que é mediada pelo anticorpo IgE. 47/105

A lista de alérgenos é enorme e pode incluir pólens, venenos de inseto, pequenas escamas de animais, esporos fúngicos e fármacos (por exemplo, penicilina). Exemplos de alérgenos animais e vegetais naturais incluem proteínas específicas para os seguintes gêneros: Canis (Canis fami- liaris); Dermatophagoides (por exemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemisiifolia); Lolium (por exemplo, Lolium perenne e Loiium multifiorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata)·, Alder; Alnus (Alnus guitinosa); Betula (Betu- Ia verrucosa); Quercus (Quercus alba)·, Olea (O/ea europa); Artemisia (Arte- misia vulgaris); Plantago (por exemplo, Plantago lanceolata); Parietaria (por exemplo, Parietaría officinalis e Parietaria judaica); Blattella (por exemplo, Biattella germanica); Apis (por exemplo, Apis multifiorum); Cupressus (por exemplo, Cupressus sempetvirens, Cupressus arizonica e Cupressus ma- crocarpa); Juniperus (por exemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginia- na, Juniperus communis, e Juniperus ashei); Thuya (por exemplo, Thuya orientalisy, Chamaecyparis (por exemplo, Chamaecyparis obtusa); Periplane- ta (por exemplo, Periplaneta americana); Agropyron (por exemplo, Agrop- yron repens); Secale (por exemplo, Secale cereale); Triticum (por exemplo, Triticum aestivum); Dactylis (por exemplo, Dactylis glomerata); Festuca (por exemplo, Festuca e/atfo/); Poa (por exemplo, Poa pratensis and Poa com- pressa); Avena (por exemplo, Avena sativa); Holcus (por exemplo, Holcus Ianatus); Anthoxanthum (por exemplo, Anthoxanthum odoratum); Arrhena- therum (por exemplo, Arrhenatherum eIatius)] Agrostis (por exemplo, Agros- tis alba); Phleum (por exemplo, Phleum pratense); Phalaris (por exemplo, Phalaris arundinacea); Paspalum (por exemplo, Paspalum notatum); Sor- ghum (por exemplo, Sorghum halepensis); e Bromus (por exemplo, Bromus inermis).

A invenção em um aspecto fornece um conjugado de um ORN imunoestimulador da invenção e de um antígeno. Em uma modalidade, o ORN imunoestimulador da invenção é covalentemente ligado ao antígeno. A ligação covalente entre o ORN imunoestimulador e o antígeno pode ser qualquer tipo adequado de ligação covalente, contanto que o ORN imunoes- 48/105

tímulador e o antígeno quando ligados desta maneira retenham atividade funcional mensurável de cada componente individual. Em uma modalidade, a ligação covalente é direta. Em uma outra modalidade, a ligação covalente é indireta, por exemplo, através de uma porção ligadora. O ORN imunoesti- mulador e o antígeno ligados covalentemente podem ser processados em uma célula para se soltarem. Desta maneira, a distribuição para uma célula de qualquer dos componentes pode ser aumentada se comparada com sua distribuição quando administrados como uma preparação separada ou como um componente separado. Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno per se, isto é, ele é um antígeno pré-formado.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêu- tica que inclui uma composição da invenção, em associação com um veículo de distribuição. Em várias modalidades, o veículo de distribuição pode ser escolhido de um lipídio catiônico, um lipossoma, um cocleato, um virosso- ma, um complexo imunoestimulador (ISCOM), uma micropartícula, uma mi- croesfera, uma nanoesfera, uma vesícula unilamelar (LUV), uma vesícula multilamelar, uma emulsão de óleo em água, uma emulsão de água em ó- leo, uma emulsoma, e um peptídeo policatiônico, e, opcionalmente, um veí- culo farmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveis estão discutidos abaixo. A composição farmacêutica da invenção opcional- mente pode incluir ainda um antígeno. A composição da invenção, junto com o antígeno quando presente, é colocado em associação física com o veículo de distribuição usando qualquer método adequado. A composição imunoestimuladora pode estar contida no veículo de distribuição, ou pode estar presente em uma superfície do veículo de distribuição exposta a um solvente ou pode estar associado a tal superfície. Em uma modalidade, o ORN imunoestimulador está presente em uma superfície do veículo de dis- tribuição exposta a um solvente ou está associado a tal superfície, e o antí- geno, se presente, está contido no veículo de distribuição. Em uma outra modalidade, tanto o ORN imunoestimulador como o antígeno estão presen- tes em uma superfície do veículo de distribuição exposta a um solvente ou estão associados a tal superfície. Em ainda uma outra modalidade, o antí- o>h 49/105

geno em uma superfície do veículo de distribuição exposta a um solvente ou está associado a tal superfície, e o ORN imunoestimulador está contido no veículo de distribuição. Em ainda uma outra modalidade, tanto o ORN imu- noestimulador como o antígeno, se algum antígeno estiver incluído, estão contidos no veículo de distribuição.

A invenção também fornece métodos para uso das composições imunoestimuladoras da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece um método para ativar uma célula imune. O método de acordo com este aspec- to da invenção inclui a etapa de contatar uma célula imune, in vitro ou in vi- vo, com uma quantidade eficaz de uma composição da invenção, para ativar a célula imune. A composição da invenção pode opcionalmente incluir um antígeno. Uma "célula imune" conforme usado neste relatório refere-se a qualquer célula derivada da medula óssea que pode participar em uma res- posta imune inata ou adaptativa. Células do sistema imunológico incluem, sem limitação, células dendríticas (DC)1 células exterminadoras naturais (NK), monócitos, macrófagos, granulócitos, linfócitos B, células plasmáticas, linfócitos T, e células precursoras dos mesmos.

Conforme usado neste relatório, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de uma substância que é necessária ou suficiente para provocar um efeito biológico desejado. Uma quantidade eficaz pode mas não precisa ser limitada a uma quantidade administrada em uma única administração.

Conforme usado neste relatório, o termo "ativar uma célula imu- ne" refere-se a induzir uma célula imune a entrar em um estado ativado que é associado a uma resposta imune. O termo "ativar uma célula imune" refe- re-se tanto a induzir como a aumentar uma resposta imune. Conforme usa- do neste relatório, o termo "resposta imune" refere-se a qualquer aspecto de uma resposta imune inata ou adaptativa que reflete a ativação de célula i- mune para proliferar, realizar uma função imune efetora, ou produzir um produto gênico envolvido em uma resposta imune. Produtos gênicos envol- vidos em uma resposta imune podem incluir produtos secretados (por e- xemplo, anticorpos, citocinas, e quimiocinas) assim como moléculas da su- és 50/105

perfície intracelular e celular características de função imune (por exemplo, certos antígenos de agrupamento de diferenciação (CD), fatores de transcri- ção, e transcritos gênicos). O termo "resposta imune" pode ser aplicado a uma célula individual ou a uma população de células.

A produção de citocinas pode ser avaliada por qualquer um de

vários métodos bastante conhecidos na literatura, que incluem ensaios de resposta biológica, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), análi- se por classificação de células ativadas pressão reduzida fluorescência in- tracelular (FACS), e reação de cadeia de transcriptase reversa/polimerase (RT-PCR).

Em uma modalidade, a resposta imune envolve a produção de uma resposta imune de citocina pró-inflamatória. Uma resposta imune de citocina pró-inflamatória pode incluir a expressão de qualquer uma de de- terminas citocinas e quimiocinas, que incluem IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-10, IL- 6, e qualquer combinação das mesmas. Ela exclui especificamente IFN-a para os propósitos da invenção.

Em uma modalidade, a resposta imune envolve a supra-regu- lação de marcadores de superfície celular da ativação de células imunes, tais como CD25, CD80, CD86, e CD154. Métodos para medir a expressão de superfície celular de tais marcadores são bastante conhecidos na literatu- ra e incluem análise por FACS.

Para medir a resposta imune em uma célula ou população de células, em uma modalidade, a célula ou população de células expressa TLR8. A célula pode expressar o TLR naturalmente, ou ela pode ser mani- pulada para expressar o TLR através da introdução na célula de um vetor de expressão adequado para o TLR. Em uma modalidade, a célula ou popula- ção de células é obtida como células mononucleares de sangue periférico (PBMC). Em uma modalidade, a célula ou população de células é obtida como uma linhagem celular expressando o TLR. Em uma modalidade, a cé- lula ou população de células é obtida como um transfectante transitório ex- pressando o TLR. Em uma modalidade, a célula ou população de células é obtida como um transfectante estável expressando o TLR. 51/105

Também para uso na medição de uma resposta imune em uma célula ou população de células, pode ser conveniente introduzir na célula ou população de células uma construção repórter que é sensível à sinalização intracelular por um TLR. Em uma modalidade, tal repórter é um gene colo- cado sob o controle de um promotor para NF-kB. Em uma modalidade, gene colocado sob controle do promotor é luciferase. Em condições de ativação adequadas, a construção repórter de luciferase é expressa e emite um sinal luminoso detectável que pode ser medido quantitativamente usando um Iu- minômetro. Tais construções repórteres e outros constructos repórteres a- dequados encontram-se comercialmente disponíveis.

A invenção também contempla o uso de métodos livres de célu- las para detectar a ativação de TLR.

A invenção em certos aspectos refere-se a composições e mé- todos para uso em terapia. As composições imunoestimuladoras da inven- ção podem ser usadas isoladas ou combinadas com outros agentes tera- pêuticos. A composição imunoestimuladora e o outro agente terapêutico po- dem ser administrados simultaneamente ou seqüencialmente. Quando a composição imunoestimuladora da invenção e o outro agente terapêutico são administrados simultaneamente, eles podem ser administrados na mesma formulação ou em formulações separadas, mas eles são adminis- trados ao mesmo tempo. Além disso, quando a composição imunoestimula- dora da invenção e o outro agente terapêutico são administrados simultane- amente, eles podem ser administrados pela mesma via de administração ou por vias de administração separadas, mas eles são administrados ao mes- mo tempo. A composição imunoestimuladora da invenção e um outro agente terapêutico da invenção são administrados seqüencialmente quando a ad- ministração da composição imunoestimuladora da invenção é temporalmen- te separada da administração do outro agente terapêutico. A separação no tempo entre a administração destes compostos pode ser uma questão de minutos ou pode ser mais longa. Em uma modalidade, a composição imu- noestimuladora da invenção é administrada antes da administração do outro agente terapêutico. Em uma modalidade, a composição imunoestimuladora Gf 52/105

da invenção é administrada depois da administração do outro agente tera- pêutico. Além disso, quando a composição imunoestimuladora da invenção e o outro agente terapêutico são administrados seqüencialmente, eles po- dem ser administrados pela mesma via de administração ou por vias de ad- ministração separadas. Outros agentes terapêuticos incluem, porém sem limitação adjuvantes, antígenos, vacinas, e medicamentos úteis para o tra- tamento de infecção, câncer, alergia, e asma.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para vacinar uma indivíduo. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar ao indivíduo um antígeno e uma composição da inven- ção. Em uma modalidade, a administração do antígeno incluir administrar um ácido nucléico codificando o antígeno.

Um "indivíduo" conforme usado neste relatório refere-se a um animal vertebrado. Em várias modalidades o indivíduo é um ser humano, um primata não humano, ou outro mamífero. Em certas modalidades o indivíduo é um camundongo, rato, porquinho-da-índia, coelho, gato, cachorro, porco, carneiro, cabra, vaca, ou cavalo.

Para uso no método de vacinação de um indivíduo, a composi- ção da invenção em uma modalidade, inclui um antígeno. O antígeno pode ser separado a um ORN da invenção ou covalentemente ligado ao mesmo. Em uma modalidade, a composição da invenção não inclui o antígeno. Nes- ta modalidade, o antígeno pode ser administrado ao indivíduo seja separa- damente da composição da invenção, ou junto com a composição da inven- ção. A administração que é separada inclui separada no tempo, separada em localização ou via de administração, ou separada tanto no tempo como em localização ou via de administração. Quando a composição da invenção e o antígeno são administrados separados no tempo, o antígeno pode ser administrado antes ou depois da composição. Em uma modalidade, o antí- geno é administrados 48 horas a 4 semanas depois da administração da composição da invenção. O método também contempla a administração de uma ou mais doses de reforço do antígeno isolado, da composição isolada, ou do antígeno e da composição, subseqüente a uma administração inicial 6<Γ 53/105

de antígeno e composição.

A invenção também contempla que um indivíduo pode ser pre- parado para um futuro encontro com um antígeno desconhecido adminis- trando ao indivíduo uma composição da invenção, onde a composição não inclui um antígeno. De acordo com esta modalidade, o sistema imunológico do indivíduo é preparado para produzir uma resposta mais vigorosa a um antígeno que será posteriormente enfrentado pelo indivíduo, por exemplo, através de exposição ambiental ou ocupacional. Tal método pode ser usado, por exemplo, por viajantes, profissionais da área médica, e soldados que provavelmente venham a ser expostos a agentes microbianos.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha uma deficiência do sistema imunológico. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar ao indi- víduo uma quantidade eficaz de uma composição da invenção para tratar o indivíduo. Uma "deficiência do sistema imunológico" conforme usado neste relatório refere-se a uma capacidade anormalmente reduzida de um sistema imunológico para produzir uma resposta imune a um antígeno. Em uma mo- dalidade, uma deficiência do sistema imunológico é uma doença ou distúrbio no qual o sistema imunológico do indivíduo não está funcionando com sua capacidade normal ou no qual seria útil reforçar a resposta imune do indiví- duo, por exemplo, para eliminar um tumor ou câncer ou uma infecção no indivíduo. Um "indivíduo tendo uma deficiência imunológica" conforme usa- do neste relatório refere-se a um indivíduo no qual existe uma capacidade reduzida do sistema imunológico do indivíduo para produzir uma resposta imune a um antígeno. Indivíduos com uma deficiência imunológica incluem indivíduos com uma deficiência imunológica adquirida assim como indiví- duos com uma deficiência congênita do sistema imunológico. Indivíduos com deficiência imunológica adquirida incluem, sem limitação, indivíduos com uma condição inflamatória crônica, indivíduos com insuficiência renal crônica ou insuficiência renal, indivíduos com infecção, indivíduos com cân- cer, indivíduos recebendo fármacos imunossupressores, indivíduos rece- bendo outro tratamento imunossupressor, e indivíduos com desnutrição. Em 54/105

uma modalidade, o indivíduo tem uma população reduzida de células T CD4+. Em uma modalidade, o indivíduo tem uma infeção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou tem síndrome da imunodeficiência adqui- rida (AIDS). O método de acordo com este aspecto da invenção fornece por- tanto um método para reforçar uma resposta imune ou reforçar a capacida- de de produzir uma resposta imune em um indivíduo com necessidade de uma resposta imune mais vigorosa.

As composições e os métodos da invenção podem ser usados isolados ou junto com outros agentes e métodos úteis no tratamento de in- fecções. Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um in- divíduo que tenha uma infecção. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar a um indivíduo tendo uma infecção uma quantidade eficaz da composição da invenção para tratar o indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha uma infecção. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar a um indivíduo tendo uma infecção uma quantidade eficaz da composição da invenção e um medicamento con- tra infecção para tratar o indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um ORN imunoes- timulador da invenção para a preparação de um medicamento para tratar uma infecção em um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição útil para o tratamento de infeção. A composição de acordo com este aspecto inclui um ORN imunoestimulador da invenção e um medicamento contra infecção. Conforme usado neste relatório, o termo "tratar" conforme usado

em relação a um indivíduo tendo uma doença ou condição significa prevenir, melhorar, ou eliminar pelo menos um sinal ou sintoma da doença ou condi- ção no indivíduo.

Um "indivíduo com uma infecção" é um indivíduo que tem um distúrbio proveniente da invasão do indivíduo, superficialmente, topicamen- te, ou sistemicamente, por um microorganismo infeccioso. O organismo in- feccioso pode ser um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita, como φ 55/105

descrito acima.

Medicamentos contra infecção incluem, porém sem limitação agentes antibacterianos, agentes antivirais, agentes antifúngicos e agentes antiparasitários. Expressões tais como "agente antiinfeccioso", "antibiótico", "agente antibacteriano", "agente antiviral", "agente antifúngico", "agente an- tiparasitário" e "parasiticida" possuem significados bem estabelecidos para os especialistas na técnica e encontram-se definidos em livros médicos. Em resumo, agentes antibacterianos eliminam ou inibem bactérias, e incluem antibióticos assim como outros compostos sintéticos ou naturais com fun- ções similares. Agentes antivirais podem ser isolados de fontes naturais ou podem ser sintetizados e são úteis para eliminar ou inibir vírus. Agentes anti- fúngicos são usados para tratar infecções fúngicas superficiais assim como infecções fúngicas oportunísticas e sistêmicas primárias. Agentes antiparasi- tários eliminam ou inibem parasitas. Muitos antibióticos são moléculas de baixo peso molecular que são produzidas como metabólitos secundários por células, tais como microorganismos. Em geral, os antibióticos interferem em uma ou mais funções ou estruturas que são específicas para o microorga- nismo e que não estão presentes nas células hospedeiras.

Um dos problemas com as terapias antiinfecciosas é os proble- mas colaterais que ocorrem no hospedeiro que é tratado com o agente anti- infeccioso. Por exemplo, muitos agentes antiinfecciosos podem eliminar ou inibir um amplo espectro de microorganismos e não são específicos para um tipo particular de espécie. O tratamento com estes tipos de agentes antiin- fecciosos resulta na eliminação da flora microbiana normal que vive no hos- pedeiro, assim como do microorganismo infeccioso. A perda da flora micro- biana pode levar a complicações patológicas e predispor o hospedeiro à in- fecção por outros patógenos, uma vez que a flora microbiana compete com patógenos infecciosos e funciona como barreiras para patógenos infeccio- sos. Podem surgir outros efeitos colaterais como resultado dos efeitos espe- cíficos ou inespecíficos destas entidades químicas nas células ou tecidos não microbianos do hospedeiro.

Um outro problema com o uso difundido de antiinfecciosos é o desenvolvimento de cepas resistentes a antibióticos dos microorganismos. Cepas de enterococos resistentes à vancomicina, pneumococos resistentes à penicilina, S. aureus multirresistentes, e tuberculose multirresistentes já se desenvolveram e estão se tornando problemas clínicos importantes. O uso difundido de antiinfecciosos certamente vai produzir muitas cepas de bacté- rias resistentes a antibióticos. Como resultando, serão necessárias novas estratégias antiinfecciosas para combater estes microorganismos.

Antibióticos antibacterianos que são eficazes para eliminar ou inibir uma ampla gama de bactérias são denominados antibióticos de amplo espectro. Outros tipos de antibióticos antibacterianos são predominantemen- te eficazes contra as bactérias da classe gram-positiva ou gram-negativa. Estes tipos de antibióticos são denominados antibióticos de pequeno espec- tro. Outros antibióticos que são eficazes contra um único organismo ou do- ença e não contra outros tipos de bactérias são denominados antibióticos de espectro limitado.

Os agentes antibacterianos às vezes são classificados segundo seu modo primário de ação. Em geral, os agentes antibacterianos são inibi- dores da síntese da parede celular, inibidores da membrana celular, inibido- res da síntese de proteínas, inibidores da síntese de ácidos nucléicos ou inibidores funcionais de ácidos nucléicos, e inibidores competitivos. Inibido- res da síntese da parede celular inibem uma etapa no processo de síntese da parede celular, e em geral na síntese de peptidoglicano bacteriano. Inibi- dores da síntese da parede celular incluem antibióticos do tipo β-lactama, penicilinas naturais, penicilinas semi-sintéticas, ampicilina, ácido clavulânico, cefalosporinas, e bacitracina.

As β-lactamas são antibióticos contendo um anel β-lactama de quatro membros que inibe a última etapa da síntese de peptidoglicano. Anti- bióticos do tipo β-lactama podem ser sintetizados ou naturais. Os antibióti- cos do tipo β-lactama produzidos pelo penicillium são penicilinas naturais, tais como penicilina G ou penicilina V. Estes são produzidos por fermenta- ção de Penicillium chrysogenum. As penicilinas naturais possuem um espec- tro de atividade pequeno e geralmente são eficazes contra Streptococcusi Gonococcus, e Staphylococcus. Outros tipos de penicilinas naturais, que também são eficazes contra bactérias gram-positivas, incluem as penicilinas F, X, K, e O.

penicilinas semi-sintéticas geralmente são modificações da mo- lécula ácido 6-aminopenicilânico produzida por um bolor. O ácido 6-ami- nopenicilânico pode ser modificado pela adição de cadeias laterais que pro- duzem penicilinas com espectros de atividade mais amplos que as penicili- nas naturais ou várias outras propriedades vantajosas. Alguns tipos de peni- cilinas semi-sintéticas possuem amplos espectros contra bactérias gram- positivas e gram-negativas, mas são inativadas pela penicilinase. Estas pe- nicilinas semi-sintéticas incluem ampicilina, carbenicilina, oxacilina, azlocili- na, mezlocilina, e piperacilina. Outros tipos de penicilinas semi-sintéticas possuem atividades menores contra bactérias gram-positivas, mas desen- volveram propriedades tais que elas não são inativadas pela penicilinase. Estas incluem, por exemplo, meticilina, dicloxacilina, e nafcilina. Algumas das penicilinas semi-sintéticas de amplo espectro podem ser usadas em combinação com inibidores de β-lactamase, tais como ácidos clavulânicos e sulbactama. Os inibidores de β-lactamase não possuem ação antimicrobia- na mas eles funcionam para inibir a penicilinase, dessa forma protegendo a penicilina semi-sintética contra degradação.

Um outro tipo de antibiótico do tipo β-lactama são as cefalospo- rinas. Elas são sensíveis à degradação por β-lactamases bacterianas, e por- tanto, nem sempre são eficazes isoladas. As cefalosporinas, no entanto, são resistentes à penicilinase. Elas são eficazes contra uma variedade de bacté- rias gram-positivas e gram-negativas. Cefalosporinas incluem, porém sem limitação, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefamandol, cefaclor, cefazolina, cefuroxina, cefoxitina, cefotaxima, cefsulodina, cefetamet, cefixima, ceftria- xona, cefoperazona, ceftazidina e moxalactama.

Bacitracina é uma outra classe de antibióticos que inibem a sín- tese da parede celular, inibindo a liberação de subunidades muropeptídicas ou de peptidoglicano da molécula que distribui a subunidade para o exterior da membrana. Embora a bacitracina seja eficaz contra bactérias gram- positivas, seu uso em geral é limitado à administração tópica por causa de sua alta toxicidade.

Carbapenemas são um outro antibiótico do tipo β-lactama de amplo espectro, que é capaz de inibir a síntese da parede celular. Exemplos de carbapenemas incluem, porém sem limitação, imipenemas. Monobacta- mas também são antibióticos do tipo β-lactama de amplo espectro, e inclu- em euztreonam. Um antibiótico produzido por Streptomyces, vancomicina, também é eficaz contra bactérias gram-positivas inibindo a síntese da pare- de celular.

Uma outra classe de agentes antibacterianos são os agentes

antibacterianos que são inibidores da membrana celular. Estes compostos desorganizam a estrutura ou inibem a função de membranas bacterianas. Um problema com os agentes antibacterianos que são inibidores de mem- brana celular é que eles podem produzir efeitos em células eucarióticas as- sim como em bactérias por causa das semelhanças em fosfolipídíos nas membranas bacterianas e eucarióticas. Portanto estes compostos raramen- te são suficientemente específicos para permitir que estes compostos sejam usados sistemicamente e prevenir o uso de doses altas para administração local.

Um inibidor de membrana celular clinicamente útil é Polymyxin.

O Polymyxin interfere na função da membrana fixando fosfolipídíos à mem- brana. O Polymyxin é eficaz principalmente contra bactérias gram-negativas e geralmente é usado em infecções severas por Pseudomonas ou em infec- ções por Pseudomonas que são resistentes a antibióticos menos tóxicos. Os severos efeitos colaterais associados à administração sistêmica deste com- posto incluem lesões no rim e em outros órgãos.

Outros inibidores de membrana celular incluem anfotericina B e nistatina que são agentes antifúngicos usados predominantemente no tra- tamento de infecções fúngicas sistêmicas e infecções pela levedura Candi- da. Imidazóis são uma outra classe de antibiótico que é um inibidor de membrana celular. Os imidazóis são usados como agentes antibacterianos e também como agentes antifúngicos, por exemplo, usados para o trata- * 59/105

mento de infecções por levedura, infecções dermatofíticas, e infecções fún- gicas sistêmicas. Imidazóis incluem porém sem limitação clotrimazol, mico- nazol, cetoconazol, itraconazol, efluconazol.

Muitos agentes antibacterianos são inibidores da síntese de pro- teínas. Estes compostos impedem que as bactérias sintetizem proteínas e enzimas estruturais e dessa formam causam a inibição do crescimento ou da função de células bacterianos ou morte celular. Em geral, estes compos- tos interferem nos processos de transcrição ou translação. Agentes antibac- terianos que bloqueiam a transcrição incluem, porém sem limitação rifampi- nas e etambutol. Rifampinas, que inibem a enzima RNA polimerase, possu- em um amplo espectro de atividade e são eficazes contra bactérias gram- positivas e gram-negativas e também contra Mycobacterium tuberculosis. Etambutol é eficaz contra Mycobacterium tuberculosis.

Agentes antibacterianos que bloqueiam a translação interferem nos ribossomas bacterianos para impedir que mRNA seja transladado para proteínas. Em geral, esta classe de compostos inclui porém sem limitação tetraciclinas, cloranfenicol, os macrolídeos (por exemplo, eritromicina) e os aminoglicosídeos (por exemplo, estreptomicina).

Os aminoglicosídeos são uma classe de antibióticos que são produzidos pela bactéria Streptomyces, tais como, por exemplo, estroptomi- cina, canamicina, trobamicina, amicacina, e gentamicina. Aminoglicosídeos vêm sendo usados contra uma ampla variedade de infecções bacterianas causadas por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. A estreptomicina vem sendo bastante usada como um fármaco primário no tratamento de tu- berculose. A gentamicina é usada contra muitas cepas de bactérias Gram- positivas e Gram-negativas, que incluem infecções por Pseudomonas, es- pecialmente em combinação com tobramicina. A canamicina é usada contra muitas bactérias gram-positivas, inclusive Staphylococci resistentes à penici- lina. Um efeito colateral dos aminoglicosídeos que limitou seu uso clínico e que nas dosagens que são essenciais para eficácia, o uso prolongado mos- trou prejudicar a função hepática e causar danos aos nervos auditivos le- vando à surdez. Um outro tipo de agente antibacteríano inibidor da translação são as tetraciclinas. As tetraciclinas são uma classe de antibióticos que são de amplo espectro e são eficazes contra uma variedade de bactérias gram- positivas e gram-negativas. Exemplos de tetraciclinas incluem tetraciclina, minociclina, doxiciclina, e clortetraciclina. Elas são importantes para o trata- mento de muitos tipos de bactérias mas são particularmente importantes no tratamento da doença de Lyme. Como resultado de sua baixa toxicidade e efeitos colaterais diretos mínimos, as tetraciclinas vêm sendo usadas com exagero e de forma errada pela comunidade médica, levando a problemas. Por exemplo, seu uso abusivo levou a um grande desenvolvimento de resis- tência.

Agentes antibacterianos tais como os macrolídeos se ligam de forma irreversível à subunidade ribossômica 50 S e inibem o alongamento da proteína pela peptidil transferase ou impedem a liberação da tRNA não carregado do ribossoma bacteriano ou ambos. Estes compostos incluem eritromicina, roxitromicina, oleandomicina, e azitromicina. A eritromicina é ativa contra a maioria das bactérias Gram-positivas, Neisseria, Legionella e Haemophilus, mas não contra as Enterobacteriaceae. Lincomicina e clinda- micina, que bloqueiam a formação de ligação peptídica durante a síntese de proteínas, são usadas contra bactérias gram-positivas.

Um outro tipo de inibidor de translação é cloranfenicol. O cloran- fenicol se liga ao ribossoma 70 S inibindo a enzima bacteriana peptidil trans- ferase dessa forma impedindo o crescimento da cadeia polipeptídica duran- te a síntese de proteínas. Um grave efeito colateral associado ao cloranfeni- col é a anemia aplásica. A anemia aplásica desenvolve-se a doses de clo- ranfenicol que são eficazes para tratar bactérias em uma pequena propor- ção (1/50.000) de pacientes. O cloranfenicol que já foi um antibiótico bastan- te prescrito é agora usado raramente como resultado das mortes por anemi- a. Devido a sua eficácia ele ainda é usado em situações de risco de vida (por exemplo, febre tifóide).

Alguns agentes antibacterianos interrompem a síntese ou a fun- ção de ácidos nucléicos, por exemplo, se ligam ao DNA ou RNA de modo que suas mensagens não podem ser lidas. Estes incluem, porém sem limi- tação quinolonas e co-trimoxazol, ambos produtos químicos sintéticos, e rífamicinas, um produto químico natural ou semi-sintético. As quinolonas bloqueiam a replicação de DNA bacteriano inibindo a DNA girase, a enzima necessária por bactérias para produzir seu DNA circular. Elas são de amplo espectro e exemplos incluem norfloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, ácido nalidíco e temafloxacina. O ácido nalidíxico é um agente bactericida que se liga à enzima DNA girase (topoisomerase) que é essencial para a replicação de DNA e permite que permite que as superespirais sejam relaxadas e re- formadas, inibindo a atividade de DNA girase. O principal uso do ácido nali- díxico é no tratamento de infecções do trato urinário inferior (UTI) porque ele é eficaz contra vários tipos de bactérias gram-negativas tais como as espé- cies E. coli, Enterobacter aerogenes, K. pneumoniae Proteus que são cau- sas comuns de UTI. O co-trimoxazol é uma combinação de sulfametoxazol e trimetoprima, que bloqueia a síntese bacteriana do ácido fólico necessário para fazer DNA nucleotídeos. Rifampicina é um derivado de rifamicina que é ativo contra bactérias gram-positivas (incluindo Mycobacterium tuberculosis e meningite causada por Neisseria meningitidis) e algumas bactérias gram- negativas. A rifampicina se liga à subunidade beta da polimerase e bloqueia a adição do primeiro nucleotídeo que é necessário para ativar a polimerase, dessa forma bloqueando a síntese de mRNA.

Uma outra classe de agentes antibacterianos são compostos que funcionam como inibidores competitivos de enzimas bacterianas. Os inibidores competitivos são quase todos estruturalmente similares a um fator de crescimento bacteriano e competem pela ligação mas não desempe- nham a função metabólica na célula. Estes compostos incluem sulfonami- das e formas quimicamente modificadas de sulfanilamida que possuem ati- vidade antibacteriana ainda mais alta e mais ampla. As sulfonamidas (por exemplo, gantrisina e trimetoprima) são úteis para o tratamento de Strepto- coccus pneumoniae, streptococci beta-hemolíticos e E. coli, e são usados no tratamento de UTI sem complicações causadas por E. coli, e no tratamento de meningite meningocócica. k 62/105

Agentes antivirais são compostos que previnem a infecção de células por vírus ou a replicação do vírus dentro da células. Existem muito menos fármacos antivirais do que fármacos antibacterianos porque o pro- cesso de replicação viral é tão relacionado à replicação de DNA no interior da célula hospedeira, que agentes antivirais inespecíficos geralmente seriam tóxicos para o hospedeiro. Há vários estágios no processo de infecção viral que podem ser bloqueados ou inibidos por agentes antivirais. Estes ensaios incluem fixação do vírus à célula hospedeira (imunoglobulina ou peptídeos fixadores), remoção do revestimento do vírus (por exemplo, amantadina), síntese ou translação do mRNA viral (por exemplo, interferon), replicação do RNA ou DNA viral (por exemplo, análogos nucleosídicos), maturação de no- vas proteínas do vírus (por exemplo, inibidores de protease), e germinação e liberação do vírus.

Uma outra categoria de agentes antivirais são análogos nucleo- sídicos. Análogos nucleosídicos são compostos sintéticos que são similares a nucleosídeos, mas que têm um grupo desoxirribose ou ribose incompleto ou anormal. Depois que os análogos nucleosídicos estão na célula, eles são fosforilados, produzindo a forma trifosfato que compete com nucleotídeos normais pela incorporação no DNA ou RNA viral. Depois que a forma trifos- fato do análogo nucleosídico é incorporada na cadeia de ácidos nucléicos em desenvolvimento, ela causa associação irreversível com a polimerase viral e assim terminação de cadeia. Análogos nucleosídicos incluem, porém sem limitação, acyclovir (usado para o tratamento do vírus do herpes sim- ples e do vírus varicela-zoster), gancyclovir (útil para o tratamento do cito- megalovírus), idoxuridina, ribavirina (útil para o tratamento do vírus sincicial respiratório), didesoxiinosina, didesoxicitidina, e zidovudina (azidotimidina).

Uma outra classe de agentes antivirais inclui citocinas tais como interferons. Os interferons são citocinas que são secretadas por células in- fectadas por vírus assim como por células imunes. Os interferons funcionam ligando-se a receptores específicos nas células adjacentes às células infec- tadas, causando a alteração na célula que a protege contra infecção pelo vírus, α e β-interferons também induzem a expressão de moléculas MHC > A 63/105

Classe I e Classe Ii na superfície de células infectadas, resultando em apre- sentação aumentada de antígeno para reconhecimento da célula imune hospedeira, α e β-interferons estão disponíveis como formas recombinantes e são usados para o tratamento de infecção crônica por hepatite B e C, Nas dosagens que são eficazes para terapia antiviral, os interferons têm efeitos colaterais severos tais como febre, mal-estar e perda de peso.

A terapia com imunoglobulina é usada para a prevenção de in- fecção viral. A terapia com imunoglobulina para infecções virais é diferente daquela para infecções bacterianas, porque em vez de ser específica para antígeno, a terapia com imunoglobulina funciona ligando-se a vírions extra- celulares e impedindo-os de se fixarem e entrarem nas células que são sus- cetíveis à infecção viral. A terapia é útil para a prevenção de infecção viral pelo período de tempo em que os anticorpos estiverem presentes no hospe- deiro. Em geral, existem dois tipos de terapias com imunoglobulina, a terapia com imunoglobulina normal e a terapia com hiperimunoglobulina. A terapia com imunoglobulina normal utiliza um produto de anticorpo que é preparado a partir do soro de doadores de sangue normal e reunidos. Este produto re- unido contém dois títulos de anticorpo para uma ampla gama de vírus hu- manos, tais como hepatite A, parvovírus, enterovírus (especialmente em re- cém-nascídos). A terapia com hiper-imunoglobulina utiliza anticorpos que são preparados a partir do soro de indivíduos que têm títulos altos de um anticorpo para um vírus particular. Esses anticorpos são então usados con- tra um vírus específico. Exemplos de hiper-imunoglobulinas incluem imuno- globulina do zoster (útil para a prevenção de varicela em crianças e recém- nascidos imunocomprometidos), imunoglobulina da raiva humana (útil na profilaxia pós-exposição de um indivíduo mordido por um animal raivoso), imunoglobulina da hepatite B (útil na prevenção do vírus da hepatite B, es- pecialmente em um indivíduo exposto ao vírus), e imunoglobulina de RSV (útil no tratamento de infecções pelo vírus sincicial respiratório). Agentes antifúngicos são úteis para o tratamento e a prevenção

de fungos infecciosos. Os agentes antifúngicos às vezes são classificados por seu mecanismo de ação. Alguns agentes antifúngicos funcional como t 64/105

inibidores da parede celular inibindo a glicose sintase. Estes incluem, porém sem limitação, basiungina/ECB. Outros agentes antifúngicos funcionam de- sestabiIizando a integridade da membrana. Estes incluem, porém sem limi- tação, imidazóis, tais como clotrimazol, sertaconzol, fluconazol, itraconazol, cetoconazol, miconazol, e voriconacol, assim como FK 463, anfotericina B1 BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina, e terbinafina. Ou- tros agentes antifúngicos funcionam destruindo a quitina (por exemplo, quiti- nase) ou a imunossupressão (creme 501).

Parasiticidas são agentes que eliminam parasitas diretamente. Tais compostos são conhecidos na literatura e geralmente encontram-se comercialmente disponíveis. Exemplos de parasiticidas úteis para adminis- tração humana incluem, porém sem limitação albendazol, anfotericina B1 benznidazol, bitionol, cloroquina HCI, fosfato de cloroquina, clindamicina, desidroemetina, dietilcarbamazina, furoato de diloxanida, eflornitina, furazo- lidaona, glucocorticóides, halofantrina, iodoquinol, ivermectina, mebendazol, mefloquina, antimoniato de meglumina, melarsoprol, metrifonato, metronida- zol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, isetionato de pen- tamidina, piperazina, praziquantel, fosfato de primaquina, proguanil, pamoa- to de pirantel, pirimetanmina-sulfonamidas, pirimetanmina-sulfadoxina, qui- nacrina HCI, sulfato de quinino, gliconato de quinidina, espiramicina, estibo- gliconato sódico (gliconato misto de sódio e antimônio), suramina, tetracicli- na, doxiciclina, tiabendazol, tinidazol, trimetroprima-sulfametoxazol, e tripar- samida.

Os ORNs também são úteis para tratar e prevenir doenças auto- imunes. Doença auto-imune é uma classe de doenças nas quais os anticor- pos do próprio indivíduo reagem com o tecido hospedeiro ou nas quais as células T efetoras imunes são auto-reativas a auto-peptídeos endógenos e causam destruição do tecido. Portanto, é produzida uma resposta imune contra os antígenos do próprio indivíduo, denominados auto-antígenos. Do- enças auto-imunes incluem, porém sem limitação artrite reumatóide, doença de Crohn, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), encefalo- mietilite auto-imune, miastenia grave (MG), tireoidite de Hashimoto, síndro- t 65/105

me de Goodpasture, pênfigo (por exemplo, pênfigo vulgar), doença de Gra- ve, anemia hemolítica auto-imune, púrpura trombocitopênica auto-imune, escleroderma com anticorpos anticolágeno, doença de tecido conjuntivo misto, polimiosite, anemia perniciosa, doença de Addison idiopática, infertili- dade associada à autoimunidade, glomerulonefrite (por exemplo, glomerulo- nefrite crescente, glomerulonefrite proliferativa), penfigóide bolhoso, síndro- me de Sjogren1 resistência à insulina, e diabetes melito auto-imune.

Um "auto-antígeno" conforme usado neste relatório refere-se a um antígeno de um tecido hospedeiro normal. Tecido hospedeiro normal não inclui células cancerosas. Portanto uma resposta imune produzida con- tra um auto-antígeno, no contexto de uma doença auto-imune, é uma res- posta imune indesejável e contribui para a destruição e dano de tecido nor- mal, ao passo que uma resposta imune produzida contra um antígeno de câncer é uma resposta imune desejável e contribui para a destruição do tu- mor ou câncer. Portanto, em alguns aspectos da invenção voltados para o tratamento de distúrbios auto-imunes não é recomendado que o ORN sôja administrado com auto-antígenos, particularmente aqueles que são ós alvos do distúrbio auto-imune.

Em outros casos, o ORN pode ser distribuído com doses baixas de auto-antígenos. Inúmeros estudos em animais demonstraram que a ad- ministração mucosa de doses baixas de antígeno pode resultar em um es- tado de hipossensibilidade imune ou "tolerância". O mecanismo ativo parece ser um desvio imune mediado por cítocina de uma resposta de Th1 para uma resposta predominantemente Th2 e Th3 (isto é, dominada por TGF-β). A supressão ativa com a distribuição de doses baixas de antígeno também pode suprimir uma resposta imune não relacionada (supressão inespecífica) que é de interesse considerável na terapia de doenças auto-imunes, por e- xemplo, artrite reumatóide e SLE. A supressão de inespecífica envolve a secreção de citocinas supressoras contra-reguIadoras de Th1 no ambiente local onde citocinas pró-inflamatórias e citocinas Th 1 são liberadas de ma- neira específica para antígeno ou de maneira inespecífica para antígeno. "Tolerância" conforme usado neste relatório é usado para se referir a este I » 66/105

fenômeno. De fato, a tolerância oral é eficaz no tratamento de inúmeras do- enças auto-imunes em animais incluindo: encefalomielite auto-imune expe- rimental (EAE)1 miastenia grave auto-imune experimental, artrite induzida por colágeno (CIA), e diabetes melito dependente de insulina. Nestes mode- Ios1 a prevenção e a supressão da doença auto-imune estão associadas a um desvio nas respostas humorais e celulares específicas para antígeno de uma resposta de Th1 para uma resposta Th2/Th3.

As composições e os métodos da invenção podem ser usados isolados ou junto com outros agentes e métodos úteis para o tratamento de câncer. Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indi- víduo que tenha um câncer. O método de acordo com este aspecto da in- venção inclui a etapa de administrar a um indivíduo tendo um câncer uma quantidade eficaz de uma composição da invenção para tratar o indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha um câncer. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar a um indivíduo tendo um câncer uma quantidade eficaz da composição da invenção e uma terapia anticâncer para tratar o indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um ORN imunoes- timulador da invenção para a preparação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição útil para o tratamento de câncer. A composição de acordo com este aspecto inclui um ORN imunoestimulador da invenção e um medicamento contra câncer. Um indivíduo tendo um câncer é um indivíduo que tem células

cancerosas detectáveis. O câncer pode ser um câncer maligno ou não ma- ligno. "Câncer" conforme usado neste relatório refere-se a um crescimento descontrolado de células que interfere no funcionamento normal dos órgãos e sistemas do corpo. Cânceres que migram de seu local original e semeiam órgão vitais podem eventualmente levar à morte do indivíduo através da de- terioração funcional dos órgãos afetados. Cânceres hemopoiéticos, tais co- mo leucemia, são capazes de competir e vencer os compartimentos hemo- A ι »

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poiéticos normais em um indivíduo, dessa forma levando à insuficiência he- mopoiética (na forma de anemia, trombocitopenia e neutropenia) finalmente causando morte.

Uma metástase é uma região de células cancerosas, distinta da localização original do tumor, resultando da disseminação de células cance- rosas a partir do tumor original para outras partes do corpo. Quando do di- agnóstico da massa tumoral original, o indivíduo pode ser monitorado quan- to à presença de metástases. As metástases são detectadas com mais fre- qüência através do uso isolado ou combinado de imagens de ressonância magnética (MRI), imagens de tomografia computadorizada (CT), contagens sangüíneas e contagens de plaquetas, estudos da função hepática, raios X do tórax e imagens ósseas além do monitoramento de sintomas específicos.

Cânceres incluem, porém sem limitação, carcinoma de células basais, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer ósseo; câncer cere- bral e câncer do sistema nervoso central (SNC); câncer de mama; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon e câncer retal; câncer do tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer endometrial; câncer de esô- fago; câncer do olho; câncer de cabeça e pescoço; neoplasma intra-epitelial; câncer renal; câncer de laringe; leucemia; câncer de fígado; câncer de pul- mão (por exemplo, células pequenas e não-pequenas células); Iinfoma inclu- indo Iinfoma de Hodgkin e não-Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblasto- ma; câncer da cavidade oral (por exemplo, lábio, língua, boca e faringe); câncer de ovário; câncer de pâncreas; câncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; sarcoma; câncer de pele; câncer de estômago; câncer testicular; câncer da tireóide; câncer de útero; câncer do sistema urinário, assim como outros carcinomas, adenocarcinomas, e sarcomas.

A composição imunoestimuladora da invenção também pode ser administrada em conjunto com uma terapia anticâncer. Terapias anticâncer incluem medicamentos contra câncer, radiação, e procedimentos cirúrgicos. Conforme usado neste relatório, um "medicamento contra câncer" refere-se a um agente que é administrado a um indivíduo com o propósito de tratar T 68/105

um câncer. Conforme usado neste relatório, "tratar câncer" inclui prevenir o desenvolvimento de um câncer, reduzir os sintomas do câncer, e/ou inibir o crescimento de um câncer estabelecido, Em outros aspectos, o medicamen- to contra câncer é administrado a um indivíduo com risco de desenvolver um câncer com o propósito de reduzir o risco de desenvolver o câncer. Vários tipos de medicamentos para o tratamento de câncer estão descritos nesta invenção. Para os fins deste relatório, os medicamentos contra câncer são classificados como agentes quimioterapêuticos, agentes imunoterapêuticos, vacinas contra câncer, terapia hormonal, e modificadores da resposta bioló- gica.

O agente quimioterapêutico pode ser selecionado do grupo que consiste em metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatina, cloroetilnitro- souréias não contendo açúcar, 5-fluoruracila, mitomicina C, bleomicina, do- xorrubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, meglamina GLA, valrubicina, car- mustaina e poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inibidor de RAS famesil transferase, inibidor de famesul transferase, MMP1 MTA/LY231514, LY264618/ Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hicamtina/Topotecano, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrona/Mitroxantrona, Metaret/Suramina, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX- 710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/ Mar- mistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicina, Metastron/derivado de estrôncio, Te- modal/Temozolomida, Evacet/liposomal doxorrubicina, Yewtaxan/Paclitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabina, Furtulon/Doxifluridina, Cyclopax/ pa- clitaxel oral, Taxóide Oral, SPU-077/Cisplatina, HMR 1275/Flavopiridol, CP- 358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inibidor de RAS oncogene, BMS- 182751/platina oral, UFT(Tegafur/Uracil), Ergamisol/Levamisol, intensifica- dor de Eniluracil/776C85/5FU, Campto/Levamisol, Camptosar/lrinotecano, Tumodex/Ralitrexed, Leustati na/Clad ri bina, Paxex/Paclitaxel, Doxil/ doxorru- bicina lipossômica, Caelyx/doxorrubicina lipossômica, Fludara/Fludarabina, Farmarubicina/Epirubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naftalimida, LU 103793/Dolastaína, Caetyx/doxorrubicina lipossômica, Gemzar/ Gemcitabi- na, ZD 0473/Anormed, YM 116, sementes de iodo, inibidores de CDK4 e CDK2, inibidores de PARP1 D4809/Dexifosamida, Ifes/Mesnex/lfosamida, Vumon/Teniposida, Paraplatina/Carboplatina, Plantinol/cisplatina, Vepesi- da/Etoposida, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, pró-fármaco de guanina arabi- nosida, análogo de Taxano, nitrosouréias, agentes alquilantes tais como melfelano e ciclofosfamida, Aminoglutetimida, Asparaginase, Busulfan1 Car- boplatina, Clorombucil, Citarabina HCI, Dactinomicina1 Daunorrubicina HCI, fosfato sódico de estramustina, Etoposidae (VP16-213), Floxuridinae1 Fluo- ruracila (5-FU), Flutamidae, Hidroxiuréia (hidroxicarbamidea, Ifosfamida1 In- terferon Alfa-2a, Alfa-2b, acetato de Ieuprolida (análogo do fator Iiberador de LHRH), Lomustina (CCNU), Mecloretamina HCI (mostarda nitrogenada), Mercaptopurina, Mesna1 Mitotane (ο.ρ'-DDD), Mitoxantrona HCI, Octreotida, Plieamieina1 Procarbazina HCI1 estreptozocina, citrato de tamoxifeno, Tio- guanina, Tiotepa, sulfato de vimblastina, Amsacrina (m-AMSA), Azacitidina1 Ertropoietina, Hexametilmelamina (HMM), Interleucina 2, Mitoguazona (me- til-GAG; metil glioxal bis-guanil hidrazona; MGBG), Pentostatina (2'desoxi- coformicina), Semustina (metil-CCNU), Teniposida (VM-26) e sulfato de vin- desina, porém sem limitação aos mesmos.

O agente imunoterapêutico pode ser selecionado do grupo que consiste em 3622W94, 4B5, ANA Ab, anti-FLK-2, anti-VEGF, ATRAGEN1 AVASTIN (bevacizumab; Genentech), BABS1 BEC2, BEXXAR (tositumo- mab; GIaxoSmithKIine), C225, CAMPATH (alemtuzumab; Genzyme Corp.), CEACIDE, CMA 676, EMD-72000, ERBITUX (cetuximab; ImCIone Systems, Inc.), Gliomab-H1 GNI-250, HERCEPTIN (trastuzumab; Genentech), IDEC- Y2B8, ImmuRAIT-CEA, ior c5, ior egf.r3, iort6, LDP-03, LymphoCide, MDX- 11, MDX-22, MDX-210, MDX-220, MDX-260, MDX-447, MELIMMUNE-1, MELIMMUNE-2, Monopharm-C, NovoMAb-G2, Oncolym, OV103, Ovarex1 Panorex, Pretarget, Quadramet, Ributaxin, RITUXAN (rituximab; Genente- ch), SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab,, SMART M195, TNT, e ZENAPAX (daclizumab; Roche), porém sem limitação aos mesmos.

A vacina contra câncer pode ser selecionada do grupo que con- siste em EGF, vacinas contra câncer antiidiotípicas, antígeno Gp75, vacina > »

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contra GMK melanoma, vacina de conjugado MGV gangliosídeo, Her2/neu, Ovarex1 M-Vax1 O-Vax1 L-Vax1 STn-KHL theratope, BLP25 (MUC-1), vacina idiotípica lipossômica, Melacina, vacinas de antígeno peptídico, vacinas de toxina/antígeno, vacinas à base de MVA1 PACIS, vacina BCG, TA-HPV, TA- CIN1 DISC-vírus e ImmuCyst/TheraCys, porém sem limitação às mesmas.

As composições e os métodos da invenção podem ser usados isolados ou em conjunto com outros agentes e métodos úteis para o trata- mento de alergia. Em um aspecto a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha uma condição alérgica. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar a um indivíduo tendo uma condição alérgica uma quantidade eficaz de uma composição da in- venção para tratar o indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha uma condição alérgica. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar a um indivíduo tendo uma condição alérgica uma quantidade eficaz da composição da invenção e uma terapia antialérgica para tratar o indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um ORN ímunoes- timulador da invenção para a preparação de um medicamento para tratar uma condição alérgica em um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição útil para o tratamento de uma condição alérgica. A composição de acordo com este aspecto inclui um ORN imunoestimulador da invenção e um medicamento para alergia.

Um "indivíduo tendo uma condição alérgica" refere-se a um indi-

víduo que esteja sofrendo ou já tenha sofrido de uma reação alérgica em resposta a um alérgeno.

Uma "condição alérgica" ou "alergia" refere-se à hipersensibili- dade adquirida a uma substância (alérgeno). Condições alérgicas incluem porém sem limitação eczema, rinite alérgica ou coriza, febre do feno, con- juntivite alérgica, asma brônquica, urticária (hives) e alergias alimentares, outras condições atópicas incluindo dermatite atópica; anafilaxia; alergia a (ffô I I

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fármacos, e angioedema.

Alergia é tipicamente uma condição episódica associada à pro- dução de anticorpos a partir de uma classe particular de imunoglobulinas, IgE, contra alérgenos. O desenvolvimento de uma resposta mediada por IgE a aeroalérgenos também é um fator que indica predisposição em relação ao desenvolvimento de asma. Se um alérgeno encontra uma IgE específica que é ligada a um receptor Fc de IgE (FceR) na superfície de um basófilo (circulando no sangue) ou mastócito (disperso pelo tecido sólido), a célula fica ativada, resultando na produção e liberação de mediadores tais como histamina, serotonina, e mediadores lipídicos.

Uma reação alérgica ocorre quando imunoglobulina sensibiliza- dora de tecidos do tipo IgE reage com um alérgeno estranho. O anticorpo IgE é ligado a mastócitos e/ou basófilos, e estas células específicas liberam mediadores químicos (aminas vasoativas) da reação alérgica quando esti- muladas a agir dessa forma por alérgenos que fazem pontes com as extre- midades da molécula do anticorpo. Histamina, fator de ativação plaquetária, metabólitos do ácido araquidônico, e serotonina estão entre os mediadores mais conhecidos de reações alérgicas no homem. A histamina e as outras aminas vasoativas normalmente são armazenadas em mastócitos e leucóci- tos basófilos. Os mastócitos encontram-se dispersados em todo o tecido animal e os basófilos circulam no sistema vascular. Estas células produzem e armazenam histamina no interior da célula a menos que a seqüência es- pecífica de eventos envolvendo a ligação de IgE ocorra para desencadear sua liberação.

Os sintomas de uma reação alérgica variam, dependendo do

local no corpo em que a IgE reage com o antígeno. Se a reação ocorre ao longo do epitélio respiratório, os sintomas geralmente são espirros, tosse e reações asmáticas. Se a interação ocorre no trato digestivo, como no caso de alergias a alimentos, dor abdominal e diarréia são comuns. As reações alérgicas sistêmicas, por exemplo, subsequente à picada de abelha ou à administração de penicilina a um indivíduo alérgico, podem ser severas e freqüentemente com risco de vida. rr 72/105

A alergia está associada a um tipo Th2 de resposta imune, que é caracterizada pelo menos em parte por citocinas IL-4 e IL-5 Th2, assim como isótipo de anticorpo desviando para IgE, As respostas imunes Th 1 e Th2 são mutuamente contra-reguladoras, de modo que o desvio da resposta imune para um tipo Th1 de resposta imune pode prevenir ou melhorar uma tipo Th2 de resposta imune, inclusive alergia. Os ORN imunoestimuladores da invenção são portanto úteis por si sós para tratar um indivíduo tendo uma condição alérgica, porque os ORN imunoestimuladores podem desviar a resposta imune para um tipo Th 1 de resposta imune. Alternativamente ou adicionalmente, os ORN imunoestimuladores da invenção podem ser usa- dos em combinação com um alérgeno para tratar um indivíduo tendo uma condição alérgica.

A composição imunoestimuladora da invenção também pode ser administrada em conjunto com uma terapia antialérgica. Métodos conven- cionais para tratar ou prevenir alergia envolvem o uso de medicamentos contra alergia ou terapias de dessensibilização. Algumas terapias em de- senvolvimento para tratar ou prevenir alergia incluem o uso de anticorpos anti-IgE neutralizantes. Anti-histaminas e outros fármacos que bloqueiam os efeitos de mediadores químicos da reação alérgica ajudam a regular a seve- ridade dos sintomas alérgicos mas não previnem a reação alérgica e não têm qualquer efeito sobre as respostas alérgicas subsequentes. As terapias de dessensibilização são efetuadas dando-se pequenas doses de um alér- geno, geralmente por injeção sob a pele, com a finalidade de induzir uma resposta tipo IgG contra o alérgeno. A presença do anticorpo IgG ajuda a neutralizar a produção de mediadores resultantes da indução de anticorpos IgE, acredita-se. Inicialmente, o indivíduo é tratado com uma dose muito baixa do alérgeno para evitar a indução de uma reação severa e a dose é aumentada lentamente. Este tipo de terapia é perigosa, porque o indivíduo na verdade está recebendo os compostos que causam a resposta alérgica e podem resultar reações alérgicas severas.

Medicamentos contra alergia incluem, porém sem limitação, an- ti-histaminas, corticosteróides, e indutores de prostaglandina. Anti-histami- 73/105

nas são compostos que neutralizam a histamina liberada por mastócitos ou basófilos. Estes compostos são bastante conhecidos na literatura e normal- mente usados para o tratamento de alergia, Anti-histaminas incluem, porém sem limitação, acrivastina, astemizol, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclizina, cetirizina, análogos de cetirizina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproeptadina, desloratadina, dexclorpheniramina, e- bastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxizína, Ievocabastina, Iora- tidina, metscopolamina, mizolastina, norastemizol, fenindamina, prometazi- na, pirílamina, terfenadina, etranilast. Corticosteróides incluem, porém sem limitação, metilprednisolo-

na, prednisolona, prednisona, beclometasona, budesonida, dexametasona, flunisolida, propionato de fluticasona, e triamcinolona. Embora a dexameta- sona seja um corticosteróide com ação antiinflamatória, ele não é regular- mente usado para o tratamento de alergia ou asma em uma forma inalada porque ele é altamente absorvido e possui efeitos colaterais supressores prolongados em uma dose eficaz. A dexametasona, no entanto, pode ser usada de acordo com a invenção para tratar alergia ou asma porque quando administrada em combinação com uma composição da invenção ela pode ser administrada em doses baixas para reduzir os efeitos colaterais. Alguns dos efeitos colaterais associados ao uso de corticosteróide incluem tosse, disfonia, sapinhos orais (candidíase), e em doses mais altas, efeitos sistê- micos, tais como supressão adrenal, intolerância à glicose, osteoporose, necrose asséptica dos ossos, formação de catarata, supressão de cresci- mento, hipertensão, fraqueza muscular, afinamento da pele, e fácil contu- são. Barnes & Peterson (1993) Am Rev RespirDis 148:S1-S26; e Kamada AK et al. (1996) Am J Respir Crit Care Med 153:1739-48.

As composições e os métodos da invenção podem ser usados isolados ou em conjunto com outros agentes e métodos úteis para o trata- mento de asma. Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha asma. O método de acordo com este aspecto da invenção inclui a etapa de administrar a um indivíduo tendo asma uma quantidade eficaz de uma composição da invenção para tratar o indivíduo. Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que tenha asma. O método de acordo com este aspecto da inven- ção inclui a etapa de administrar a um indivíduo tendo asma uma quantida- de eficaz da composição da invenção e uma terapia antiasma para tratar o indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um ORN imunoes- timulador da invenção para a preparação de um medicamento para tratar asma em um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição útil para o tratamento de asma. A composição de acordo com este aspecto inclui um ORN imunoestimuladorda invenção e um medicamento contra asma.

"Asma" conforme usado neste relatório refere-se a um distúrbio do sistema respiratório caracterizado por inflamação e estreitamento das vias aéreas, e reatividade aumentada das vias aéreas a agentes inalados. A asma é freqüentemente, embora não exclusivamente, associada a uma condição atópica ou alérgica. Os sintomas de asma incluem episódios recor- rentes de chiado, falta de ar, pressão no peito, e tosse, resultantes de obs- trução do fluxo de ar. Inflamação das vias aéreas associada à asma pode ser detectada através de inúmeras alterações fisiológicas, tais como, des- nudação do epítélio das vias aéreas, deposição de colágeno abaixo da membrana basal, edema, ativação de mastócitos, infiltração de células in- flamatórias, incluindo neutrófilos, eosinófilos, e linfócitos. Como um resulta- do da inflamação das vias aéreas, pacientes com asma experimentam hi- persensibilidade das vias aéreas, limitação do fluxo de ar, sintomas respira- tórios, e cronicidade da doença. Limitações do fluxo de ar incluem bronco- constricção aguda, edema das vias aéreas, formação de tampão mucoso, e remodelagem das vias aéreas, aspectos que freqüentemente levam à obs- trução brônquica. Em alguns casos de asma, pode ocorrer fibrose da mem- brana sub-basal, levando a anormalidades persistentes na função pulmonar. Ao longo dos últimos anos as pesquisas revelaram que a asma

provavelmente resulta de interações complexas entre células inflamatórias, mediadores, e outras células e tecidos residentes nas vias aéreas. Mostóci- ο>ο 75/105

tos, eosinófilos, células epiteliais, macrófagos, e células T ativadas desem- penham todas um papel importante no processo inflamatório associado à asma. Djukanovic R et al. (1990) Am Rev RespirDis 142:434-457. Acredita- se que estas células podem influenciar a função das vias aéreas através da secreção de mediadores preformados e recentemente sintetizados que po- dem agir diretamente ou indiretamente sobre o tecido local. Também foi re- conhecido que subpopulações de linfócitos T (Th2) desempenham um papel importante na regulação de inflamação alérgica nas vias aéreas liberando citocinas seletivas e estabelecendo a cronicidade da doença. Robinson DS et al. (1992) N Engl J Med 326:298-304.

Asma é um distúrbio complexo que surge em diferentes estágios do desenvolvimento e pode ser classificada segundo o grau de sintomas como aguda, subaguda, ou crônica. Uma resposta inflamatória aguda é as- sociada a um primeiro estágio de recrutamento de células nas vias aéreas. A resposta inflamatória subaguda envolve o recrutamento de células assim como a ativação de células residentes causando um padrão de inflamação mais persistente. A resposta inflamatória crônica é caracterizada por um ní- vel persistente de danos celulares e um processo de reparação contínuo, que pode resultar em anormalidades permanentes das vias áreas. Um "indivíduo tendo asma" é um indivíduo que tem um distúrbio

do sistema respiratório caracterizado por inflamação e estreitamento das vias aéreas e reatividade aumentada das vias aéreas a agentes inalados. Fatores associados ao início da asma incluem, porém sem limitação, alér- genos, baixa temperatura, exercícios, infecções virais, e SO2. Como mencionado acima, a asma pode ser associada a um tipo

Th2 de resposta imune, que é caracterizado pelo menos em parte por citoci- nas IL-4 e IL-5 Th2, assim como isótipo de anticorpo desviando para IgE. As respostas imunes Th1 e Th2 são mutuamente contra-reguladoras, de modo que o desvio da resposta imune para um tipo Th1 de resposta imune pode prevenir ou melhorar um tipo Th2 de resposta imune, inclusive alergia. Os análogos de oligorribonucleotídeos modificados da invenção são portanto úteis por si sós para tratar um indivíduo tendo asma, porque os análogos 3Í 76/105

podem desviar a resposta imune para um tipo Th1 de resposta imune. Alter- nativamente ou adicionalmente, os análogos de oligorribonucleotídeos modi- ficados da invenção podem ser usados em combinação com um alérgeno para tratar um indivíduo tendo asma.

A composição imunoestimuladora da invenção também pode ser

administrada em conjunto com uma terapia contra asma. Métodos conven- cionais para tratar ou prevenir a asma envolvem o uso de terapias contra alergia (descritas acima) e inúmeros outros agentes, inclusive agentes ina- lados.

Os medicamentos para o tratamento de asma geralmente são

separados em duas categorias, medicamentos de alívio rápido e medica- mentos para controle prolongado. Os pacientes com asma tomam medica- mentos para controle prolongado em uma base diária para obter e manter controle da asma persistente. Os medicamentos para controle prolongado incluem agentes antiinflamatórios tais como corticosteróides, cromolina só- dica e nedocromil; broncodilatadores de ação prolongada, tais como p2- agonistas de ação prolongada e metilxantinas; e modificadores de Ieucotrie- no. Os medicamentos de alívio rápido incluem β2 agonistas de curta ação, anticolinérgicos, e corticosteróides sistêmicos. Existem muitos efeitos colate- rais associados a cada um desses fármacos e nenhum dos fármacos isola- dos ou combinados é capaz de prevenir ou tratar completamente a asma.

Medicamentos contra asma incluem, porém sem limitação, inibi- dores de PDE-4, broncodilatadores/beta-2 agonistas, abridores do canal de K+, antagonistas de VLA-4, antagonistas de neurocina, inibidores da síntese de tromboxano A2 (TXA2), xantinas, antagonistas do ácido araquidônico, inibidores de Iipoxigenase 5, antagonistas do receptor de TXA2, antagonis- tas de TXA2, inibidor de proteínas de ativação de 5-lipox, e inibidores de protease.

Broncodilatadores/p2 agonistas constituem uma classe de com- postos que causam broncodilatação e relaxamento do músculo liso. Bronco- dilatadores/p2 agonistas incluem, porém sem limitação, salmeterol, salbu- tamol, albuterol, terbutalina, D2522/formoterol, fenoterol, bitolterol, pirbuerol Sol 77/105

metilxantrinas e orciprenalina. P2-agonistas e broncodilatadores de ação pro- longada são compostos que são usados para prevenção prolongada dos sintomas além das terapias antiinflamatórias. p2-agonistas de ação prolon- gada incluem, porém sem limitação, salmeterol e albuterol. Estes compostos normalmente são usados em combinação com corticosteróides e geralmen- te não são usados sem alguma terapia inflamatória. Eles foram associados a efeitos colaterais tais como taquicardia, tremor de músculos esqueléticos, hipocalemia, e prolongamento do intervalo QTc em superdosagem.

Metilxantinas, incluindo por exemplo, teofilina, são usadas para controlado e prevenção prolongados de sintomas. Estes compostos causam broncodilatação resultante da inibição de fosfodiesterase e provavelmente de antagonismo de adenosina. Toxicidades agudas relacionadas à dose constituem um problema particular com esses tipos de compostos. Como resultante, concentração sérica regular deve ser monitorada para se estimar a toxicidade e a restrita faixa terapêutica resultantes de diferenças individu- ais na depuração metabólica. Os efeitos colaterais incluem taquicardia, ta- quiarritmias, náusea e vômito, estimulação do sistema nervoso central, dor de cabeça, convulsões, hematemese, hiperglicemia e hipocalemia. p2- agosnistas de curta ação incluem, porém sem limitação, albuterol, bitolterol, pirbuterol, a terbutalina. Alguns dos efeitos adversos associados à adminis- tração de p2-agonistas de curta ação incluem taquicardia, tremor dos múscu- los esqueléticos, hipocalemia, ácido láctico aumentado, dor de cabeça, e hiperglicemia.

Cromolina sódica e nedocromil são usados como medicamentos de controle prolongado para prevenir principalmente os sintomas de asma decorrentes de exercícios ou os sintomas alérgicos decorrentes de alérge- nos. Acredita-se que esses compostos bloqueiam as reações precoces e tardias a alérgenos interferindo na função dos canais de cloreto. Eles tam- bém estabilizam as membranas dos mastócitos e inibem a ativação e a Iibe- ração de mediadores de inosinófilos e células epiteliais. Geralmente, é ne- cessário um período de quatro a seis semanas de administração para obter benefício máximo. 78/105

Anticolinérgicos geralmente são usados para o alívio de bronco- espasmo agudo. Acredita-se que estes compostos funcionam por inibição competitiva de receptores colinérgicos muscarínicos. Anticolinérgicos inclu- em, por exemplo, brometo de ibratrópio. Estes compostos revertem apenas o broncoespasmo mediado de forma colinérgica e não modificam qualquer reação a antígeno. Os efeitos colaterais incluem boca seca e secreções respiratórias, chiado aumentado em alguns indivíduos, e visão turva se as- pergidos nos olhos.

Os ORN imunoestimuladores da invenção também podem ser úteis para tratar remodelagem das vias aéreas. Remodelagem das vias aé- reas resulta da proliferação de células do músculo liso e/ou de espessamen- to submucoso nas vias aéreas, e por fim causa estreitamento das vias aé- reas levando a um fluxo de ar limitado. Os ORN imunoestimuladores da in- venção podem ainda prevenir a remodelagem e possivelmente até mesmo reduzir o acúmulo resultante do processo de remodelagem.

Os ORN imunoestimuladores da invenção também são úteis para aumentar a sobrevivência, a diferenciação, a ativação e a maturação das células dendríticas. Os oligorribonucleotídeos imunoestimuladores pos- suem a singular capacidade de promover a sobrevivência celular, a diferen- ciação, a ativação e a maturação de células dendríticas.

Os ORN imunoestimuladores da invenção também aumentar a atividade lítica das células exterminadoras naturais e a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). A ADCC pode ser efetuada usando um ORN imunoestimulador em combinação com um anticorpo específico para um alvo celular, tal como uma célula cancerosa. Quando o ORN imunoesti- mulador é administrado a um indivíduo junto com o anticorpo, o sistema i- munológico do indivíduo é induzido a exterminar a célula tumorosa. Os anti- corpos úteis no procedimento de ADCC incluem anticorpos que interagem com uma célula no corpo. Muitos destes anticorpos específicos para alvos celulares já foram descritos na literatura e muitos encontram-se comercial- mente disponíveis. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG.

Em certos aspectos, a invenção fornece um método para melho- 79/105

rar a disseminação do epítopo. "Disseminação de epítopo" conforme usado neste relatório refere-se à diversificação de especificidade para epítopo a partir de uma resposta imune inicial enfocada específica para um epítopo dominante, direcionada contra uma auto-proteína ou uma proteína estranha, a epítopos subdominantes e/ou crípticos naquela proteína (dispersão intra- molecular) ou outras proteínas (dispersão intermolecular). A disseminação de epítopo resulta em múltiplas respostas imunes específicas para epítopo.

A resposta imune consiste em uma fase inicial de amplificação, que pode ser prejudicial, como na doença auto-imune, ou benéfica, como em vacinações, e uma fase posterior infra-reguladora para o sistema imune retornar à homeostasia e gerar memória. A disseminação de epítopo pode ser um componente importantes em ambas as fases. O aumento da disper- são de epítopo no cenário de um tumor permite que o sistema imunológico do indivíduo determine epítopos alvos adicionais, não inicialmente reconhe- cidos pelo sistema imunológico em resposta a um protocolo terapêutico ori- ginal, ao mesmo tempo em que reduz a possibilidade de variantes de esca- pe na população do tumor e assim afeta a progressão da doença.

Os oligorribonucleotídeos da invenção podem ser úteis para promover a disseminação de epítopos em indicações terapeuticamente be- néficas tais como câncer, infecções virais e bacterianas, e alergia. O método em uma modalidade, inclui as etapas de administrar uma vacina que inclui um antígeno e um adjuvante a um indivíduo e subseqüentemente adminis- trar ao indivíduo pelo menos duas doses do ORN imunoestimulador da in- venção em uma quantidade eficaz para induzir múltiplas respostas imunes específicas para epítopo. O método em uma modalidade, inclui as etapas de administrar uma vacina que inclui um antígeno de tumor e um adjuvante a um indivíduo e subseqüentemente administrar ao indivíduo pelo menos duas doses do ORN imunoestimulador da invenção em uma quantidade eficaz para induzir múltiplas respostas imunes específicas para epítopo. O método em uma modalidade, envolve aplicar um protocolo terapêutico que resulta em exposição a antígeno do sistema imunológico em um indivíduo, seguida de pelo menos duas administrações de um oligorribonucleotídeo imunoesti- 9* 80/105

mulador da invenção, para induzir múltiplas respostas imunes específicas para epítopo, isto é, para promover a disseminação de epítopos. Em várias modalidades o protocolo terapêutico é cirurgia, radiação, quimioterapia, ou- tros medicamentos contra câncer, uma vacina, ou uma vacina contra cân- cer.

O protocolo terapêutico pode ser implementado junto com um imunoestimulante, além da subseqüente terapia com imunoestimulante. Por exemplo, quando o protocolo terapêutico é uma vacina, ele pode ser admi- nistrado junto com um adjuvante. A combinação da vacina e do adjuvante pode ser uma mistura ou administrações separadas, isto é, injeções (isto é, o mesmo campo de drenagem). A administração não é necessariamente simultânea. Se for usada injeção não simultânea, o programa pode envolver pré-injeção do adjuvante seguida da formulação de vacina.

Depois de implementado o protocolo terapêutico, tem início a monoterapia imunoestimulante. A freqüência otimizada, a duração, e o local de administração vão depender do alvo e de outros fatores, mas a adminis- tração pode ser por exemplo, mensal ou bimensal por um período de seis meses a dois anos. Alternativamente a administração pode ser diária, se- manal, ou quinzenal, ou a administração pode ser feita várias vezes durante o dia, semana ou mês. Em alguns casos, a duração de administração pode depender do tempo da terapia, por exemplo, ela pode acabar depois de uma semana, depois de um mês, depois de um anos, ou depois de vários anos. Em outros casos, a monoterapia pode ser contínua como por gotejamento intravenoso. O imunoestimulante pode ser administrado a um campo de drenagem comum ao alvo.

Para uso em terapia, podem ser necessárias diferentes doses para tratamento de um indivíduo, dependendo da atividade do composto, do modo de administração, da finalidade da imunização (isto é, profilática ou terapêutica), da natureza e da severidade do distúrbio, da idade e do peso corporal do indivíduo. A administração de uma dada dose pode ser efetuada por uma única administração na forma de uma unidade de dose individual ou ainda várias unidades de dose menores. A administração múltipla de do- ses em intervalos específicos de semanas ou meses é comum para reforçar as respostas imunes específicas para antígeno.

Em combinação com os ensinamentos previstos nesta invenção, escolhendo entre os vários compostos ativos e fatores importantes tais co- mo potência, biodisponibilidade relativa, peso do paciente, severidade dos efeitos colaterais adversos e modo de administração preferido, é possível programar um regime de tratamento profilático ou terapêutico eficaz que não cause toxicidade substancial e que ainda seja totalmente eficaz para tratar o indivíduo particular. A quantidade eficaz para qualquer aplicação particular pode variar dependendo de fatores tais como a doença ou condição sendo tratada, o agente terapêutico particular sendo administrado, o tamanho do indivíduo, ou a severidade da doença ou condição. O especialista na técnica pode determinar empiricamente a quantidade eficaz de um ácido nucléico particular e/ou de outro agente terapêutico sem necessidade de experimen- tação desnecessária.

As doses individuais dos compostos descritos nesta invenção tipicamente variam de cerca de 0,1 μg a 10.000 mg, mais tipicamente de cerca de 1 μg/dia a 8000 mg, e ainda mais tipicamente de cerca de 10 μg a 100 μg. Em termos do peso do indivíduo, as dosagens típicas variam de cerca de 0,1 μ9 a 20 mg/kg/dia, mais tipicamente de cerca de 1 a 10 mg/kg/dia, e ainda mais tipicamente de cerca de 1 a 5 mg/kg/dia.

As composições farmacêuticas contendo ácidos nucléicos e/ou outros compostos podem ser administradas por qualquer via adequada para administrar medicamentos. Encontram-se disponíveis diversas vias. O modo particular selecionado vai depender, naturalmente, do agente ou agentes particulares selecionados, da condição particular sendo tratada, e da dosa- gem necessária para eficácia terapêutica. Os métodos desta invenção, de um modo geral, podem ser praticados usando qualquer modo de adminis- tração que seja aceitável em termos médicos, o que significa qualquer modo que produza níveis eficazes de uma resposta imune sem causar efeitos ad- versos clinicamente inaceitáveis. Os modos de administração preferidos es- tão discutidos neste relatório. Para uso em terapia, uma quantidade eficaz βί 82/105

do ácido nucléico e/ou outro agente terapêutico pode ser administrada a um indivíduo por qualquer modo que distribua o agente para a superfície dese- jada, por exemplo, mucosa, sistêmica.

A administração da composição farmacêutica da presente in- venção pode ser efetuada por qualquer meio conhecido pelo especialista na técnica. As vias de administração incluem, porém sem limitação as vias oral, parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, sublingual, intratraqueal, inalação, subcutânea, ocular, vaginal, e retal. Para tratamento ou prevenção da asma ou alergia, tais compostos são de preferência inala- dos, ingeridos ou administrados por vias sistêmicas. Vias sistêmicas incluem oral e parenteral. Medicamentos inalados são preferidos em algumas moda- lidades por causa da distribuição direta para o pulmão, o sítio de inflamação, principalmente em pacientes asmáticos. Vários tipos de dispositivos são re- gularmente usados para administração por inalação. Estes tipos de disposi- tivos incluem inaladores de dose regulada (MDI), MDI acionados pela respi- ração, inaladores de pó seco (DPI), câmaras espaçadoras/ retentoras em combinação com MDI, e nebulizadores.

Os agentes terapêuticos da invenção podem ser distribuídos para um tecido particular, um tipo de célula, ou para o sistema imunológico, ou ambos, com a ajuda de um vetor. Em seu sentido mais amplo, um "vetor" é qualquer veículo capaz de facilitar a transferência das composições para as células alvos. O vetor geralmente transporta o ácido nucléico imunoesti- mulador, o ant, o antígeno, e/ou o medicamento específico para o distúrbio para as células alvos com degradação reduzida em relação à extensão de degradação que resultaria na ausência do vetor.

Em geral, os vetores úteis na invenção são divididos em duas classes: vetores biológicos e vetores químicos/físicos. Vetores biológicos e vetores químicos/físicos são úteis na distribuição e/ou absorção dos agentes terapêuticos da invenção. A maioria dos vetores biológicos são usados para a distribuição

de ácidos nucléicos e estes seriam mais apropriados na distribuição de a- gentes terapêuticos que são ou que incluem ácidos nucléicos imunoestimu- 3t 83/105

ladores.

Além dos vetores biológicos discutidos nesta invenção, é possí- vel vetores químicos/físicos para distribuir agentes terapêuticos que incluem ácidos nucléicos imunoestimuladores, anticorpos, antígenos, e medicamen- tos específicos para o distúrbio. Conforme usado neste relatório, um "vetor químico/físico" refere-se a uma molécula natural ou sintética, que não aque- las derivadas de fontes bacteriológicas ou virais, capazes de distribuir o áci- do nucléico e/ou outro medicamento.

Um vetor químico/físico preferido é um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidal incluem sistemas à base de lipídios incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas, e lipossomas. Um sistema coloidal preferido da invenção é um lipossoma. Lipossomas são vasos de membrana artificiais que são úteis como um vetor de distribuição in vivo ou in vitro. Foi mostrado que vesículas unilamelares grandes (LUVs)1 cujo tamanho varia de 0,2 - 0,4 μπι, podem encapsular macromoléculas grandes. RNA, DNA e vírions intactos podem ser encapsulados no interior aquoso e distribuídos para células em uma forma biologicamente ativa. Fra- Iey et al. (1981) Trends Biochem Sci 6:77.

Os lipossomas podem ser vetorizados para um tecido particular por acoplamento do lipossoma a um ligando específico tal como um anticor- po monoclonal, açúcar, glicolipídio, ou proteína. Ligandos que podem ser úteis para vetorizar um lipossoma para uma célula imune incluem, porém sem limitação, moléculas intactas ou fragmentos de moléculas que intera- gem com receptores e moléculas específicos para células imunes, tais como anticorpos, que interagem com marcadores da superfície celular de células imunes. Tais Iigandos podem ser facilmente identificados por ensaios de ligação bastante conhecidos pelos especialistas na técnica. Em ainda outras modalidades, o lipossoma pode ser vetorizado para o câncer por acopla- mento do mesmo a um dos anticorpos imunoterapêuticos discutidos acima. Adicionalmente, o vetor pode ser acoplado a um peptídeo vetorizador nucle- ar, que vai direcionar o vetor para o núcleo da célula hospedeira.

Formulações lipídicas para transfecção encontram-se comerci- 84/105

almente disponíveis na QIAGEN, por exemplo, como EFFECTENE® (um lipídio não-lipossômica com um intensificador de condensação de DNA es- pecial) e SUPERFECT® (uma nova tecnologia dendrimérica atuante).

Lipossomas encontram-se comercialmente disponíveis na Gibco BRL, por exemplo, como LIPOFECTIN® e LIPOFECTACE®, que são for- mados de lipídios catiônicos tais como cloreto de N-[1-(2, 3 dioleilóxi)-propil]- N1 N, N-trimetilamônio (DOTMA) e brometo de dimetil dioctadecilamônio (DDAB). Métodos para fazer Iipossomas são bastante conhecidos na litera- tura e foram descritos em muitas publicações. Lipossomas também foram recapitulados por Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241.

Certos lipídios catiônicos, incluindo em particular N-[1-(2, 3 dio- leoilóxi)-propil]-N,N, N-trimetilamônio metil-sulfato (DOTAP), parecem ser especialmente vantajosos quando combinados com os análogos de oligorri- bonucleotídeos modificados da invenção. Em uma modalidade, o veículo é uma micropartícula ou implante

biocompatível que é adequado para implantação ou administração ao recep- tor mamífero. Implantes bioerodíveis exemplificativos que são úteis de acor- do com este método estão descritos no pedido internacional PCT n° PCT/US/03307 (Publicação N0 W095/24929, intitulado "Polymeric Gene Delivery System". O PCT/US/0307 descreve uma matriz polimérica biocom- patível, de preferência biodegradável, para conter um gene exógeno sob o controle de um promotor apropriado. A matriz polimérica pode ser usada para obter uma liberação sistemática do agente terapêutico no indivíduo.

A matriz polimérica de preferência está na forma de uma micro- partícula tal como uma microesfera (onde o ácido nucléico e/ou outro agente terapêutico é dispersado em toda a matriz polimérica sólida) ou uma micro- cápsula (onde o ácido nucléico e/ou o outro agente terapêutico fica armaze- nado no núcleo de um envoltório polimérico). Outras formas da matriz poli- mérica para conter o agente terapêutico incluem filmes, revestimentos, géis, implantes, e stents. O tamanho e a composição da matriz polimérica são selecionados de modo a resultar em uma cinética de liberação favorável no tecido no qual a matriz é introduzida. O tamanho da matriz polimérica ainda é selecionado de acordo com o método de distribuição que será usado, tipi- camente injeção em um tecido ou administração de uma suspensão por ae- rossol nas áreas nasais e/ou pulmonares. De preferência quando se usa uma via aerossol a matriz polimérica e o ácido nucléico e/ou o outro agente terapêutico estão incluídos em um veículo tensoativo. A composição da ma- triz polimérica pode ser selecionada de modo a ter taxas de degradação fa- voráveis e também de modo a ser formada de um material que seja bioade- sivo, para aumentar ainda mais a eficácia de transferência quando a matriz for administrada a uma superfície nasal e/ou pulmonar que tenha uma lesão. A composição da matriz também pode ser selecionada de modo a não ser degradada, e sim ser liberada por difusão durante um período de tempo pro- longado. Em algumas modalidades preferidas, o ácido nucléico é adminis- trado ao indivíduo via um implante ao passo que o outro agente terapêutico é administrado de forma aguda. Microesferas biocompatíveis que são ade- quadas para distribuição, tal como distribuição oral ou mucosa, estão descri- tas em Chickering et al. (1996) Biotech Bioeng 52:96-101 e Mathiowitz E et al. (1997) Nature 386:410-414 e Pedido de Patente PCT W097/03702.

Matrizes poliméricas não-biodegradáveis e biodegradáveis po- dem ser usadas para distribuir o ácido nucléico e/ou o outro agente terapêu- tico para o indivíduo. Matrizes biodegradáveis são preferidas. Tais polímeros podem ser polímeros naturais ou sintéticos. O polímero é selecionado com base no período de tempo durante o qual a liberação é desejada, geralmen- te da ordem de algumas horas a um ano ou mais. Tipicamente, a liberação durante um período variando entre algumas horas e três a doze meses é mais desejável, particularmente para os agentes tipo ácido nucléico. O polí- mero opcionalmente está na forma de um hidrogel que pode absorver até cerca de 90% de seu peso em água e ainda, opcionalmente é reticulado com íons multivalentes ou outros polímeros.

Polímeros bioadesivos de particular interesse incluem hídrogéis bioerodíveis descritos por H.S. Sawhney, C.P. Pathak & J.A. Hubell em Ma- cromolecules, (1993) 26:581-587, cujos ensinamentos estão aqui incorpora- dos a título de referência. Estes incluem ácidos polihialurônicos, caseína, SOi 86/105

gelatina, glutina, polianidridos, ácido poliacrílico, alginato, quitosano, po- li(metil metacrilatos), poli(etil metacrilatos), poli(butilmetacrilato), poli(isobutil metacrilato), poli(hexilmetacrilato), poli(isodecil metacrilato), poli(lauril meta- crilato), poli(fenil metacrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), po- li(isobutil acrilato), e poli(octadecil acrilato).

Se o agente terapêutico for um ácido nucléico, o uso de agentes de compactação também pode ser desejável. Os agentes de compactação também podem ser usados isolados, ou em combinação com um vetor bio- lógico ou químico/físico. Um "agente de compactação", conforme usado neste relatório, refere-se a um agente, tal como uma histona, que neutraliza as cargas negativas no ácido nucléico e dessa forma permite a compacta- ção do ácido nucléico na forma de um grânulo fino. A compactação do ácido nucléico facilita a absorção do ácido nucléico pela célula alvo. Os agentes de compactação podem ser usados isolados, isto é, para distribuir um ácido nucléico em uma forma que seja absorvida de maneira mais eficiente pela célula ou, mais preferivelmente, em combinação com um ou mais dos veto- res descritos acima.

Outras composições exemρIificativas que podem ser usadas para facilitar a absorção de um ácido nucléico incluem fosfato de cálcio e outros mediadores químicos do transporte intracelular, composições microin- jetáveis, composições de eletroporação e de recombinação homóloga (por exemplo, para integrar um ácido nucléico em um local pré-selecionado no cromossoma da célula alvo).

Os compostos podem ser administrados isolados (por exemplo, em solução salina ou tampão) ou usando qualquer veículo de distribuição conhecido na literatura. Por exemplo, já foram descritos os seguintes veícu- los de distribuição: cocleatos (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); Emulso- mas (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMs (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); Iipossomas (Chil- ders et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); veto- res bacterianos vivos (por exemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guérin, Shigelia, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et ai., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); vetores virais vivos (por exemplo, vacínia, adenovírus, Herpes Simples) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); microesferas (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, 0'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); vacinas de ácido nucléico (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sa- saki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); polímeros (por exem- plo, carboximetilcelulose, quitosano) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); anéis de polímeros (Wyatt et al., 1998); proteossomas (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); fluoreto de sódio (Hashi et al., 1998); plantas transgênicas (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); virossomas (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); e partículas semelhantes a vírus (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998).

As formulações da invenção são administradas em soluções

farmaceuticamente aceitáveis, que de praxe podem conter concentrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes tamponantes, preservativos, veículos compatíveis, adjuvantes, e opcionalmente outros componentes te- rapêuticos.

O termo veículo farmaceuticamente aceitável significa uma ou

mais cargas sólidas ou líquidas compatíveis, diluentes ou substâncias en- capsulantes que são adequadas para administração a um ser humano ou outro animal vertebrado. O termo veículo significa um componente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual o componente ativo é combi- nado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farma- cêuticas também são capazes de ser misturados com os compostos da pre- sente invenção, e entre si, de tal maneira que não ocorra nenhuma intera- ção que prejudique substancialmente a eficiência farmacêutica desejada.

Para administração oral, os compostos (isto é, ácidos nucléicos, antígenos, anticorpos, e outros agentes terapêuticos) podem ser facilmente formulados por combinação dos compostos ativos com veículos farmaceuti- camente aceitáveis bastante conhecidos na literatura. Tais veículos permi- íoò « ι

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tem que os compostos da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e outras formas, para ingestão oral por um indivíduo a ser tratado. Prepara- ções farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas como excipiente sólido, opcionalmente triturando a mistura resultante, e processamento a mistura de grânulos, depois da adição de auxiliares adequados, se necessário, para obter núcleos de comprimidos ou drágeas. Excipientes adequados são, em particular, cargas tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de mi- lho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de tra- gacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil celulose, carboximetilcelulose só- dica, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrantes, tais como polivinil pirrolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um sal do mesmo tal como alginato de sódio. Opcional- mente, as formulações orais também podem ser formuladas em solução salina ou tampões para neutralizar as condições ácidas internas ou podem ser administradas sem quaisquer veículos.

Núcleos de drágea são fornecidos com revestimentos adequa- dos. Para tanto, podem-se usar soluções de açúcar concentradas, que po- dem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, carbopol gel, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos po- dem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágeas para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses do com- posto ativo.

Preparações farmacêuticas que podem ser usadas por via oral incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, como cápsulas vedadas ma- cias feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os componentes ativos em mistura com uma carga tal como lactose, aglutinantes tais como amidos, e/ou lubrifican- tes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizan- te. Nas cápsulas macias, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou Iok 89/105

suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, estabilizantes podem ser adicio- nados. Também é possível usar microesferas formuladas para administra- ção oral. Estas microesferas já foram bem definidas na literatura. Todas as formulações para administração oral devem estar em dosagens adequadas para este tipo de administração.

Para administração bucal, as composições podem estar na for- ma de comprimidos ou pastilhas formulados de maneira convencional.

Para administração por inalação, os compostos para uso de Β- ΙΟ cordo com a presente invenção podem ser convenientemente distribuídos na forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de pacotes pres- surizados ou de um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoreta- no, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada oferecendo uma válvula para distribuir uma quantidade regulada. Cápsulas e cartuchos por exemplo, de gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser for- mulados contendo uma mistura em pó do composto e de uma base de pó adequada tal como Iactose ou amido. Os compostos, quando é desejável distribui-los sistemicamente,

podem ser formulados para administração parenteral por injeção, por exem- plo, por injeção de bolo ou por infusão contínua. As formulações para inje- ção podem ser apresentadas em uma forma de dosagem unitária, por e- xemplo, em ampolas ou em recipientes com múltiplas doses, com um con- servante adicionado. As composições podem adquirir formas tais como sus- pensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes suspensores, estabilizan- tes e/ou dispersantes.

As formulações farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos em uma forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser prepa- radas como suspensões injetáveis oleosas apropriadas. Solventes ou veícu- íjo6 90/105

Ios lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerí- deos, ou lipossomas. As suspensões injetáveis aquosas podem conter subs- tâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose sódica, sorbitol, ou dextrana. Opcionalmente, a suspensão também pode conter solubilizantes adequados ou agentes que aumentam a solubili- dade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente con- centradas.

Alternativamente, os compostos ativos podem estar na forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênio, antes do uso.

Os compostos também podem ser formulados como composi- ções retais ou vaginais tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases convencionais para supositório tais como mantei- ga de cacau ou outros glicerídeos.

Além das formulações descritas anteriormente, os compostos também podem ser formulados como uma preparação de depósito. Estas formulações de ação prolongada podem ser formuladas com materiais poli- méricos ou hidrófobos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas trocadoras de íons, ou derivados moderadamente solúveis, por exemplo, um sal moderadamente solúvel.

As composições farmacêuticas também podem compreender veículos ou excipientes adequados em fase sólida ou em gel. Exemplos de tais veículos ou excipientes incluem, porém sem limitação carbonato de cál- cio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelati- na, e polímeros tais como polietileno glicóis.

Formas líquidas ou sólidas adequadas de preparação farmacêu- tica são, por exemplo, soluções aquosas ou salinas para inalação, microen- capsuladas, encocleadas, aplicadas como revestimento a partículas de ouro microscópicas, contidas em lipossomas, nebulizadas, aerosóis, péletes para implantação na pele, ou secadas sobre um objeto agudo para serem intro- duzidas por esfregação. As composições farmacêuticas também incluem Í0& 91/105

grânulos, pós, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supo- sitórios, xaropes, emulsões, suspensões, cremes, gotas ou preparações com liberação demorada dos compostos ativos, em cujas preparações exci- pientes e aditivos e/ou auxiliares tais como desintegrantes, aglutinantes, a- gentes de revestimento, agentes de intumescimento, lubrificantes, flavori- zantes, adoçantes ou solubilizantes são usualmente usados da maneira descrita acima. As composições farmacêuticas são adequadas para uso em uma variedade de sistemas de distribuição de fármacos. Para uma rápida recapítulação de métodos para distribuição de fármacos vide Langer R (1990) Science 249:1527-1533, que está aqui incorporado a título de refe- rência.

Os ácidos nucléicos e opcionalmente outros terápicos e/ou antí- genos podem ser administrados per se (como tais) ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Quando usados em medicina os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais não farmaceuticamente aceitá- veis podem ser convenientemente usados para preparar sais farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos. Tais sais incluem, porém sem limitação, a- queles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sul- fúrico, nítrico, fosfórico, maléico, acético, salicílico, p-toluenossulfônico, tar- tárico, cítrico, metanossulfônico, fórmico, malônico, succínico, naftaleno-2- sulfônico, e benzenossulfônico. Também, estes sais podem ser preparados como sais de metal alcalino ou de metal alcalino-terroso, tais como sais só- dicos, potássicos ou cálcicos do grupo ácido carboxílico.

Agentes tamponantes adequados incluem: ácido acético e um sal (1-2% p/v); ácido cítrico e um sal (1-3% p/v); ácido bórico e um sal (0,5- 2,5% p/v); e ácido fosfórico e um sal (0,8-2% p/v). Conservantes adequados incluem cloreto de benzalcônio (0,003-0,03% p/v); clorobutanol (0,3-0,9% p/v); parabenos (0,01-0,25% p/v) e timerosal (0,004-0,02% p/v).

As composições podem ser convenientemente apresentados em uma forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bastante conhecidos na literatura farmacêutica. Todos os mé- todos incluem a etapa de associar os compostos a um veículo que constitui P 92/105

um ou mais componentes acessórios. Em geral, as composições são prepa- radas pela associação uniforme e íntima dos compostos a um veículo líqui- do, um veículo sólido finamente dividido, ou ambos, e em seguida, se ne- cessário, moldagem do produto. Unidades de dose líquida são frascos ou ampolas. Unidades de dose sólida são comprimidos, cápsulas e supositó- rios.

Outros sistemas de distribuição podem incluir sistemas de distri- buição de liberação lenta, de liberação retardada ou de liberação sistemáti- ca. Tais sistemas podem evitar repetidas administrações dos compostos, aumentando a conveniência para o indivíduo e para o médico. Muitos tipos de sistemas de distribuição de liberação estão disponíveis e são conhecidos pelos especialistas na técnica. Eles incluem sistemas à base de polímero tais como poli(lactídeo-glicolídeo), copolioxalatos, policaprolactonas, polies- teramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico, e polianidridos. Micro- cápsulas dos polímeros precedentes contendo fármacos estão descritas, por exemplo, na Patente US N0 5.075.19. Sistemas de distribuição também in- cluem sistemas não-poliméricos que são: lipídios incluindo esteróis tais co- mo colesterol, ésteres de colesterol e ácidos graxos ou gorduras neutras tais como mono-, di- e triglicerídeos; sistemas de liberação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas à base de peptídeo; revestimentos de cera; comprimidos prensados usando aglutinantes e excipientes convencionais; implantes par- cialmente fundidos; e outros. Exemplos específicos incluem, porém sem li- mitação, (a) sistemas de erosão nos quais um agente da invenção está con- tido em uma forma no interior de uma matriz tais como aquelas descritas nas Patentes US NoS 4.452.775, 4.675.189, e 5.736.152, e (b) sistemas de difusão nos quais um componente ativo difunde a uma taxa controlada a partir de um polímero tal como descrito nas Patentes US N°s 3.854.480, 5.133.974 e 5.407.686. Além disso, podem ser usados sistemas de distribui- ção à base de bomba, alguns dos quais são adaptados para implantação. A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir,

que não devem de modo algum ser interpretados como limitativos.

EXEMPLOS Exemplo 1

Sensibilidade de PBMC humano a oligorribonucleotídeos con- tendo N-U-R1-R2,

Métodos: Tecnologia Luminex Códigos de cor Luminex separam minúsculos glóbulos, denomi-

nados microesferas, em 100 grupos distintos. Cada grupo de glóbulos pode ser revestido com um reagente específico para um bioensaio particular, permitindo a captura e a detecção de analitos específicos provenientes de uma amostra. No analisador compacto Luminex, Iasers excitam os corantes internos que identificam cada partícula de microesfera, e também qualquer corante repórter capturado durante o ensaio. São feitas muitas leituras em cada grupo de glóbulos, validando ainda os resultados. Desta maneira, a tecnologia Luminex permite repetir até 100 ensaios únicos em uma mesma amostra, de forma rápida e precisa. Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs)

foram isoladas de doadores saudáveis, plaqueadas, e estimuladas in vitro com vários agentes imunoestimuladores de teste e de controle por 16 horas. Depois de 16 horas, os sobrenadantes foram recolhidos e em seguida anali- sados pelo ensaio ELISA. Oligorribonucleotídeos contendo N-U-Ri-R2, tes- tados complexados com DOTAP e com curvas de titulação completas (7 concentrações), partindo de 2 μΜ de ORN complexado com 25 μg/ml DOTAP e com etapas de diluição de 1/3. Também foram incluídos certos controles negativos, inclusive meio isolado e DOTAP (25 mg/ml de cavidade de cultura; "lipossomas") isolado. Os agentes imunoestimuladores de contro- Ie incluíram a imidazoquinolina R-848 (2 μΜ com etapas de diluição de 1/3 e 7 concentrações) o ligando reportado para TLR7, ORN com motivos TLR8 tais como as seqüências AU e AUU (SEQ ID N°: 13- SEQ ID N°: 15) ORN com motivos TLR7/8 tais como as seqüências CU, GU e GUU (SEQ ID N°: 19- SEQ ID N°: 23). Os resultados estão mostrados nas figuras 1 e 3. Foi realizado um ensaio similar testando diferentes seqüências

de ORN usando pDC isolado, monócitos e estimulação com mDC. As célu- las foram estimuladas com 0,5 μΜ ORN complexado com 10 μg/ml de I 94/105

DOTAP, 0,5 μΜ de CpG ODN ou DOTAP ou meio isolado. Depois de 16 horas, os sobrenadantes foram colhidos e os níveis de IFN-alfa, TNF-alfa e IL-12p40 foram medidos por ELISA. Os resultados estão mostrados na figu- ra 2.

A figura 1 mostra uma nítida diferença entre a produção de TNF-

alfa e IFN-alfa com a estimulação com PBMC para a SEQ ID N°: 12 conten- do uma seqüência AU e para a seqüência SEQ ID N°: 21 contendo uma se- qüência GU. Nova análise de seqüências revelou que uma repetição CUA (SEQ ID N°: 24) é um ORN indutor de TNF-alfa adicional sem produção de IFN-alfa. ORN mais curtos contendo repetições AU e GU (SEQ ID N°: 29- SEQ ID N°: 34) mostraram resultados similares quando comparados com os mais compridos (SEQ ID N°: 12- SEQ ID N°: 23), porém com uma queda na eficácia e na potência.

As figuras 2 e 6 mostram a análise de AU-ORN (SEQ ID N°: 13) e GU-ORN (SEQ ID N°: 21) em monócitos isolados, pDCs e mDCs refletindo uma produção de IFN-alfa bastante reduzida para AU-ORN (SEQ ID N°: 13) e uma nítida produção de TNF-alfa e IL~12p40 para ambos os ORN. A pro- dução de IFN-alfa com a estimulação com ORN a partir de pDC parece ser mediada por TLR7 ao passo que a produção de TNF-alfa e IL-12p40 a partir de monócitos isolados e mDC parece ser mediada por TLR8.

Os resultados de Luminex refletiram resultados equiparáveis para os dados de ELISA e provaram que a principal diferença entre GU- ORN e AU-ORN deve-se à produção de IFN-alfa e de genes/citocinas rela- cionadas ao IFN-alfa (figuras 3 e 8a). Além disso, outros dados de Luminex mostraram que ao contrário do IFN-alfa e dos genes/citocinas relacionadas ao IFN-alfa as outras citocinas/quimiocinas permanecem inafetadas (figuras 7 e 8a-d) com uma IL-6 separada das células CD123-CD14. Esta produção de IL-6 pode ser devida à ativação de células B mediadas por TLR7. Exemplo 2

Comparação das atividades máximas de IFN-alfa e TNF-alfa de

oligorríbonucleotídeos

PBMC humanos foram estimulados com ORN complexado com DOTAP. Depois de 16 horas, os sobrenadantes foram recolhidos e os níveis de TNF-alfa e IFN-alfa foram medidos. Foram determinadas as atividades média/máxima a 0,6 μΜ de 3 - 6 doadores de sangue e duas experiências individuais. Os resultados estão mostrados na figura 4. Esses dados dife- renciam nitidamente entre os motivos TLR8 e TLR7/8: ORN com o motivo N- U-R1-R2 apresentou produção de IFN-alfa inferior a 300 pg/ml ao passo que TLR7/8 ORN apresentou maior produção de IFN-alfa mediante estimulação com PBMC (figura 4a). TLR8 e TLR7/8 ORN estão divididos por uma linha vermelha. Em contraste, as medidas dos níveis de TNF-alfa indicaram que tanto o ORN com o motivo TLR8 e o ORN com o motivo TLR7/8 estimulam a produção de TNF-alfa. Exemplo 3

Comparação da atividade máxima de IFN-alfa com o EC50 de IFN-alfa EC50 de oligorríbonucleotídeos PBMC humanos foram estimulados com ORN complexado com

DOTAP. Depois de 16 horas, os sobrenadantes foram recolhidos e os níveis de IFN-alfa foram medidos. Foram determinadas as atividades mé- dia/máxima a 0,6 μΜ e o EC50 de curvas de titulação completa (faixa: 2 μΜ a 0,9 nM) de 3 - 6 doadores de sangue e duas experiências individuais. Os resultados estão mostrados na figura 5. O EC50 e as atividades máximas mostraram resultados equiparáveis no que diz respeito aos motivos TLR8 e aos motivos TLR7/8. EC50 baixo/atividade máxima alta representa TLR7/8 ORN (Figura 5a) ao passo que EC50 alto e atividade máxima baixa repre- senta TLR8 ORN (Figura 5b). As seqüências de ORN listadas na Tabela 1 foram testadas

quanto à produção de IFN-alfa e TNF-alfa mediante estimulação com PBMC humanas. PBMC humanas foram estimuladas durante 16 horas com o ORN indicado, e os sobrenadantes foram recolhidos e a produção de citocinas foi medida por ELISA. A Tabela 2 resume a atividade min/max e o EC50 de ORN para a produção de IFN-alfa e TNF-alfa. Tabela 1:

IFN- alfa TNF- alfa SEQ ID N°: 1 G*U*A*G*G*C*A*C - + SEQ ID N°: 2 U*U*A*G*G*C*A*C - + SEQ ID N°: 3 C*U*A*G*G*C*A*C - + SEQ ID N°: 4 A*U*A*G*G*C*A*C - + SEQ ID N°: 7 dN*dN*dN*dN*dN*N*A*U*A*U*N*N*dN*dN*dN*dN* dN*dN - + SEQ ID N°: 9 dN*dN*dN*dN*dN*A*U*A*U*A*U*A*U*dN*dN*dN*d N*dN*dN - + SEQIDN0: 11 G*C*C*A*C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*U*A*C*C - + SEQ ID N°: 12 A* U * A* U * A* U *A* U*A* U*A* U *A* U *A*U *A* U*A* U - + SEQ ID N°: 13 U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U - + SEQ ID N°: 14 U*U*U*A*U*U*U*A*U*U*U*A*U*U*U*A*U*U*U*A + + SEQ ID N°: 15 U*U*U*U*A*U*U*U*U*A*U*U*U*U*A*U*U*U*U*A + + SEQIDN0: 16 A*A* U * A*A* U*A*A* U *A* A* U *A*A* U *A*A* U * A* A - + SEQ ID N°: 17 A*A*A*U *A*A*A* U * A*A* A*U*A*A*A* U* A*A*A* U - + SEQ ID N°: 18 A* A* A*A* U *A*A* A*A* U*A* A*A*A* U *A*A*A*A* U - + SEQ ID N°: 19 c*u*c*u*c*u*c*u*c*u*c*u*c*u*c*u*c*u*c*u + + SEQ ID N°: 20 G*U*G*U*G*U*G*U*G*U*G*U*G*U*G*U*G*U*G*U + + SEQ ID N°: 21 U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U + + SEQ ID N°: 22 U*U*U*G*U*U*U*G*U*U*U*G*U*U*U*G*U*U*U*G + + SEQ ID N°: 23 U*U*U*U*G*U*U*U*U*G*U*U*U*U*G*U*U*U*U*G + + SEQ ID N°: 24 C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U - + SEQ ID N°: 25 G*U*A*G*U*A*G*U*A*G*U*A*G*U*A*G*U*A*G*U + + SEQ ID N°: 26 G*U*C*G*U*C*G*U*C*G*U*C*G*U*C*G*U*C*G*U + + IFN- alfa TNF- alfa SEQ ID N°: 27 ru*A*rU*A*rU*A*rU*A*rU*A*rU*A*l*U + + SEQ ID N°: 28 + + SEQ ID N°: 29 U*U*G*U*U*G*U + + SEQ ID N°: 30 U*U*A*U*U*A*U - + SEQ ID N°: 31 U*G*U*G*U*G*U + + SEQ ID N°: 32 u*c*u*c*u*c*u + + SEQ ID N°: 33 U*A*U*A*U*A*U - + SEQ ID N°: 34 G*U*A*G*U*A*G + +

+: produção de citocina. -: sem produção de citocina. ο LO O o O O O LO σ> o O O M- O O N- CO O O 00 c> CO O σ> CM O o CO CO O σ> CO CM N O CO O LU o O O O O O O O o O O CO 2 — si CO — Li. Z h- 0,35 0,952 0,125 0,564 0,257 0,895 0,079 0,343 0,146 0,217 0,203 0,224 0,15 0,16 : 0,051 0,241 0,213 0,187 O LO O UJ ^ o o o o LO o o CD CM O σ> o o N M O CO CO O IO CO O CO CM O CO CM CO CM O O m- CO O CO CO O O o O O O O O O O O CO 2 a= n CO Z io N. CO M- m- CNJ CNJ CO io CM CO IO LO CO O IO CO O CO N CM io N- O CO O CO CO O M- N- O CM CO X— ν- ΙΟ O CO LO LO CO O O N- N O Gi O o o O O O O O O O O O O O O O O O O Atvidade max TNF-alfa [pg/mi] 5982 2088 3378 5133 8316 5654 O 4597 11366 O 9350 691,6 10972 13344 3722 4342 1507 2374 18039 14623 23325 11141 21820 11920 40729 37334 38811 29647 ! 36627 26762 44904 45164 43098 20126 33624 36562 χ co t (D ' "S ro CO M— 710,4 1028 893,9 599,2 336,9 744,8 o 503,8 476,1 o 423,3 473,8 554,3 629,7 "sa- co" 00 805,1 54,8 192,9 "D OJ I ^ < u_ 3367 3091 2615 2614 2519 2263 2094 1945 1896 1821 1760 1714 1702 ■ 1626 1616 1609 1499 1463 O * O O * O o * o O * O O * O O * O O * O O * O O * O O * O O * O O * O O * O o « o O * O O -K O O -K O O ■K O O * < -K 3 * 3 O -K O -K < * 3 * 3 O * 3 * 3 k * 3 O * 3 * 3 * < *< O * 3 * 3 « CD O * 3 * 3 * <- < « O * 3 * 3 * CD < * 3 * CD -κ 3 -K I- < * I- * 3 * 3 * 3 < -K O * 3 « 3 * H 3 * 3 * 3 * CD 3 -K 3 * 3 -K I- k * f- * 3 * I- * 3 < * O * 3 * 3 * 3 < -K 3 -K 3 -K CD -K 3 < * O * 3 * 3 * I- < * 3 * 3 * 3 * O < « 3 -K 3 -K 3 -K <c ORN O * CD * O * O -K CD O * CD * O * O * CD O * CD * O * O # CD O * CD * O * O * CD < * CD * O * O * CD O * CD * O * O * CD < * CD * O * O * CD CD * O * O -K CD ? CD * O * O * CD Sc CD * O * O * CD < * CD « O •K O « CD < * CD * O * O * CD ? CD * O * O * CD CD * O * O « CD ? CD * O * O -K CD < -K CD -K O -K O * CD Sc CD -K O -K O # CD < -K CD -K O -K O -K CD f· <c < fC <C <■ <C fC <: <= < $ < < < < <C < CD * O * O CD * O * O CD * O * O CD * O * O CD * O * O CD * O * O CD * O * O CD * O * O CD * O * O CD * O * O CD * O -K O CD * O * O CD -K O -K O CD -K O * O CD * O ■K O CD * O * O CD * O * O CD -K O -K O σ> ** CO IO \— LO o LO LL CM LO N- CO CN CO ZL CO CO 00 io <35 LO O N- N- CO CO OO N- N LO O CO 0 Z 0 Z 0 Z o Z 0 Z 0 Z 9 Z 0 Z 0 Z 0 Z 0 Z 0 Z 0 Z O Z O Z O Z 0 Z 0 Z Q Q Q Q Q D Q Q Q Q Q Q Q Q a D Q Q O LU CO O LU CO O LU CO σ UJ CO O LU CO σ UJ CO O UJ CO O UJ CO σ UJ CO O UJ CO O UJ CO O UJ CO σ UJ CO σ UJ CO o UJ CO O UJ CO O UJ CO σ UJ CO TNF-alfa EC50 [μΜ] o 0,024 O 0,022 0,138 0,174 0,071 O 0,093 0,067 0,077 o 0,017 o o 0,002 o O cd co cn o" co cd o" G) co co o" r- cm o" m· co co o" co co CD cd cn o" io 00 ο" cn O co ο" cd cm co ο" 5 ο" δ 00 ο" cd O ο" ιο cd co ο" -tf cm co ο" n- h- O ο" cm co ο" cd cd lo ο" IFN-alfa EC50 [μΜ] O co δ o" O cm O o" cm O o" cn oo io o" co co M- o" O co co O ο" 00 O Μ" ο" cd O O ο" O Γ- ιο Μ" ο" O O co O ο" O O h- h- io o" lo lo O o" 00 Γ- o" co co O o" io co O o" (J) δ o" h- σ> cn h- cd h- ο~ h- cd cd ο" cd Μ" ο" cd co Γ- ο~ lo ο" co Μ" LO τ— IO lo δ τ- lo lo_ Atvidade max TNF-alfa [pg/ml] O 00 lo σ> o oj r- cm IO co 00 io" m- io 00 co cnl r- m- co co Csl io cd cd co io Í-- cn co o m o cm oo cd co γ- ιο o o co co δ cm m- r- cd co co io γ- γ- o oo o μ" csl r- o co o) S cõ lo cd lo cm 00 o T— 00 cm 00 cm r- r- T-* LO cd cd cm cd h- lo h- cm 00 r*- m- cd IO Tf co io cd O co O co cm m- co 00 cd cd h- co cd cn co m- r- co lo cm cd h- Is- co Gi co co γ- m- cd lo cd cm m- Atvidade max IFN-alfa [pg/ml] o o K cd co m" cn h- J-- cd co~ 00 m- r- cn O m- oo Mr co lo r- co~ o m- cd cn cm O cd M- γ- co" cm cm oo io μ" cd οο" cm co cd h- cn co cn cd cn γ- οο co cd co co~ cd M- O cm Csl M- io σ> co co co cm lo cm cm cm lo co O σ> σ> cn cd io cd" io co cd cn μ" oo σ>~ ο cd h- r*-"" co lo μ" co μ- lo cd οο" μ" μ" μ* CsT cd co h- co~ ιο co cm lo" co co cd lo~ O co cn ORN O * O * < * 3 * 3 « O * 3 * < « O « O * O * O * < * CD « o * O O * O * < * < * 3 * D * D * < * O * O * O * (D # CD * O * O o * o * o * o * 3 * 3 * < * o * CD * o * o * O * < * O * o * o O * O * < * O * 3 * 3 * < * *< CD * O * O * O * < * O * O * O O -K O * O * 3 * 3 * I- * < * O * O * O * CD * *< CD * O * O O * O * < * O * 3 * O * 3 * CD * O * O * CD * < * CD * O « O O ■κ O ■χ * I- * O * 3 * 3 * < * CD * O * O * CD * < * CD * O * O O * O * O * 3 * CD -Ic CD * < * < * CD * O * o * CD * ? CD * O * O O * O * < * O * 3 * O * CD * CD * O * O * CD * CD * O * O O * O * < * O * CD * 3 * 3 * CD * O * O * CD * ? CD * O * O O * O * < * 3 * CD * 3 * O * < * CD * O * O * CD « Sc CD « O « O O * O * O * < * 3 * 3 * Sc ο * CD * O * O * CD * *< CD * O * O O * O * < * CD * 3 * 3 * < * CD * O * O * CD * < * CD * O * O o * O * O * O * ? 3 * < * < * CD « O * O * CD * < * CD * O * O O * 3 * ? 3 * * 3 * < * 3 * O * O * CD * *< CD * O * O O * o * < * 3 * 3 * < * 3 « ? CD * o * o * CD * CD * o * o o ■k o * O * O * O * 3 * < * < * CD * O * O * CD * < * CD * O * O O * O * O * O * < * 3 * O * O « CD * O * O * CD * < * CD * O * O m- cd o z q O LU co co h- O z q O Lll co m- io 0 z 9 σ uj co o co 0 z q O uj co O) r- 0 z 9 σ Lli co cd cd 0 Z 9 σ uj co io r- O Z q σ uj co cd oo ο z q O uj co oo ο z q σ lu co m- Γ- O z D σ uj CO δ 0 z 9 σ uj CO 00 m- ο' z q σ lu CO cd r- O z g σ lu CO cm m- 0 z 9 σ uj co cd co β z Q σ uj co ιο cd ο z 9 σ uj co m- m- ο z 9 σ uj co γ- m- β z 9 ο uj co TNF-alfa EC50 [μΜ] o O O O O O 0,151 O O O O O O O O o O O G) 00 o" IO h- ο" CNI IO CO ο" h- CO CO ο" σ> CSJ ο" LO Csj ο" σ> ο CO ο" LO CD ο" IO 00 ο" CD Tf CO ο" LO r- ο" h- CD CO ο" LO Csl o" IO CD r- cT CSJ CN h- r- CO o" CN IFN-alfa EC50 [μΜ] O O O O ο O Ti- CD O ο" ο O O ο O O o O O o O LO LO_ LO CSI CN CSJ CD CO 00 CSl LO_ CSJ Is- τ— CN CN CN CSI CN CN CN Atvidade max TNF-alfa [pg/ml] Tf CD 10 CO CD Γ-. CO CD τ- O Csi r-- CSJ LO CO h- CO Tf Tf CD CD h- CO CD IO IO CO 00 00 CNI CD O CD CD h- CD CD LO CD ^ CD h- CD CO CN x— CD r- CD r- CD CD CD CD IO O LO CN CD IO CO Tf CN Tf CD O Tf τ- O O 00 CN CNJ CO 00 O 00 LO IO LO σ> LO CSJ CD Γ-. CD Csl CO S CNI O CO CD O 00 Ο) h- CD Csj CD Tf O CD IO h- O h- O CN CN — CD CD o r- CD CD CD ^f IO 00 CN IO "tf ιο 00 O CO Tf Tf Atvidade max IFN-alfa [pg/ml] ω CO Tf CSJ τ— CD CO -Sf CSJ τ- Tf CSj" r- r- CSJ CD CO CSJ LO h-~ CO CO Tf Tf CD ιο Γ-- ^ IO CN CO Tf CO CO" Γ- CO CsT ττ CO CN CNl" -Sfr CO O) CO CN CNl Oi CN CO CN CO CO r- X— Γ- ιο" CD O O oo" LO ^ CSJ LO ο" CSl Ο ιο" CO CSl ^ Mr CNl Csl ^ O CSJ h- co" σ> CO h-" h- CO Tf Tf Tf ο" ΙΟ ο" O τ- Tf Tf C0~ CD h- CD r--~ CD CN CN CQ Gi CO h- Tf r- O •τ— co" h- CD o" h- CD r- h-" CD TI- CO CD~ LO ORN O * O * O * 3 * < * 3 * < ■κ 3 * < * O * O * CD * *< CD * O * O O « O * O * ? 3 * < « 3 * O * CD * O M O * CD * < # CD # O « O O * O * O * < -Jt 3 * < * Sc CD * O * O * CD * CD * O * O O * O * O * O * 3 * < * 3 * O * CD * O * O * CD * < * CD * O * O O * O * < * * CD * CD * < * CD * O * O * O * CD * O * O O # O * ÍC * CD * < * CD * O * O * CD * ί CD * O * O O * O * < * 3 « CD * 3 * < * CD * O * O * CD * ί CD * O * O O * O * O * < * < * 3 * O * O * CD * O * O * CD * O * O * O O * O * O * 3 * < * 3 * O * CD * O * O * CD * CD * O * O O * O * < * 3 * O * CD * < * CD * O * O * CD * < * CD * O * O O * O * O * O * < « 3 * O * CD * O * O * CD « CD * O * O O * O * O * < * < * 3 * < * O * CD * O * O * CD íc * CD * O * O O * O * CD * 3 * CD * CD * < * CD * O * O * CD * < * CD * O * O O * O * O * O * O * 3 * < * O -K CD * O * O * CD * < * CD * O * O O * O * CD * 3 * O * CD * < * < * CD * O * O * CD * < * CD * O * O O * O * O * O * O * CD * O * O * CD * O * O * CD * < * CD * O * O O * O * O * 3 * O * CD * < * CD * O * O * CD * CD * O * O O * O * < * O * CD -κ CD * < * CD * O * O * CD * CD * O * O 00 CO ο Z Q σ LU CO h- CO ο Z Q σ UJ CO ο Tf 0 ζ ο σ LlJ CO ιο ιο 0 Z 9 σ LJJ CO CSJ 00 ο Z Q σ LU CO ιο 00 ο Z Q σ LU CO CO CD ο Z 9 σ LU CO CO Tf ο Z 9 σ UJ CO CD CO O Z D σ LU CO h- CO ο Z D O LU CO LO Tf ο Z Q O LU CO V Tf 0 Z Q σ UJ CO CO 00 0 Z g O LU CO CD Tf o Z g a UJ CO 00 00 o Z 9 σ UJ CO ιο CO O Z 9 o UJ CO TJ- CO o Z Q O UJ CO CD LO O Z Q σ UJ CO Exemplo 4

ORN sintéticos diferenciam entre a liberação de IFN-alfa e TNF- alfa mediante estimulação com PBMC humanas

pDC purificado com CD123+ (Figuras 10a e 10b) ou monócitos isolados (Figura 10c) foram incubados com 1 μΜ de ORN complexado com ng/ml de DOTAP ou DOTAP isolado (Figura 10a) ou indicaram quantida- des de ORN complexado com DOTAP ou DOTAP isolado (Figuras 10b-10c). Depois de 16 horas, as células foram recolhidas e coloridas com os anticor- pos CD123, CD11ce HLA-DR (Figuras 10a e 10b) ou CD14 e CD19 (Figura 10c). Análise por FACS quanto à presença de CD86 mostra que ORN rico em AU (SEQ ID N°: 13) e ORN rico em GU (SEQ ID N°: 21) apresentam di- ferenças na supressão do marcador de superfície de CD86 mediante esti- mulação com pDC (Figura 10a). A estimulação com ORN rico em AU SEQ ID N°: 13 resultou em muito pouca ativação de CD86, ao passo que a esti- mulação com ORN rico em GU ORN SEQ ID N°: 21 resultou em significativa ativação de CD86. Foi determinado que esta ativação era dependente da dose (figura 10b). ORN rico em AU (SEQ ID N°: 13) e ORN rico em GU (SEQ ID N°: 21) não apresentaram diferenças na supressão do marcador de superfície de CD80 mediante estimulação com PBMC humanas (dados não mostrados) e com células positivas para CD14 (Figura 10c). Exemplo 5

ORN rico em AU (SEQ ID N°: 13) e ORN rico em GU (SEQ ID N°: 21) estimulatam a sinalização de TLR8 humano específico de maneira dependente da dose

Células HEK-293 insensíveis foram estavelmente transfectadas

com o plasmídio de expressão TLR3 ou TLR8 humano e com a construção do gene repórter de NFicB-Iuciferase. As células foram incubadas com as seqüências de ORN indicadas (10 μΜ complexados com 50 μg/mí de DOTAP) ou estímulos de controle (10 μΜ de R-848, 50 μ9/ηιΙ de polilC, 3,3 μΜ de ODN 10103 ou 50 μg/ml de DOTAP) por 16 horas. A ativação de NFkB foi medida analisando-se a atividade de luciferase. Os resultados es- tão dados como indução de dobras acima do valor de referência (meio). A- a? 102/105

presentamos uma experiência representativa de 6 repetições independentes (Figura 9a).

Células HEK-293 estavelmente transfectadas expressando TLR8 humano foram estimuladas com as concentrações indicadas de ORN complexado com DOTAP (50 }ig/ml -> diluição de 1/3) ou DOTAP isolado (50 iig/ml -> diluição de 1/3) por 16 horas. A ativação de NFkB foi medida analisando-se a atividade de luciferase. Os resultados estão dados como indução de dobras acima do valor de referência (meio). Apresentamos uma experiência representativa de 3 repetições independentes(Figura 9b). Células HEK-293 insensíveis foram estavelmente transfectadas

com o plasmídio de expressão TLR8 humano e com a construção do gene repórter de NFicB-Iuciferase. As células foram incubadas com as seqüências de ORN indicadas (15 μΜ complexados com 75 iig/ml de DOTAP) ou estí- mulos de controle (15 μΜ de R-848 ou 75 μ9/ηιΙ de DOTAP) e com meio (à esquerda), 200 nM de bafilomicina (Baf., no centro) ou 1 mM de cloroquina (CQ1 à direita) por 16 horas. A ativação de NFkB foi medida analisando-se a atividade de luciferase. Os resultados estão dados como indução de dobras acima do valor de referência (meio). Apresentamos uma experiência repre- sentativa de 4 repetições independentes (Figura 9c). Células RPMI 8226 foram pré-incubadas com 1000 U/ml de In-

tron A por 3 horas, lavadas duas vezes com meio e então estimuladas por 16 horas com as concentrações indicadas de ORN complexado com DOTAP (50 μ9/ηιΙ -> diluição de 1/3). A liberação de citocina de IP-10 foi medida por ELISA. Os resultados estão dados como pg/ml. Apresentamos uma experiência representativa de 3 repetições Índependentes(Figura 9d).

Estes dados demonstram a especificidade da SEQ ID N°: 13 e da SEQ ID N°: 21 para TLR8.

O ensaio foi repetido com um TLR8 ORN (SEQ ID N°: 13), um TLR 7/8 ORN (SEQ ID N°: 21) e um ORN de controle (SEQ ID N°: 5) (Tabe- Ia 3) tanto em uma dose alta (H.D., 10 μ^/ηιΙ) como em uma dose baixa (L.D., 2,5 ^ig/ml). Só o tratamento com a SEQ ID N°: 21 resultou em produ- ção significativa de IL-12 e TNF-alfa (Figura 11a e 11b, respectivamente). Slt 103/105

Todos os ORN estimularam a produção de IFN-γ (Figura 11c).

SEQ ID N° ORN SEQ ID N°: 5 C*C*G*U*C*U*G*U*U*G*U*G*U*G*A*C*U*C SEQ IDN°: 13 U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U SEQ fD N°: 21 U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U*G*U*U

Exemplo 6

Macrófagos de camundongo não respondem a ORN rico em AU (SEQ ID 13) in vitro ou in vivo Células Raw264.7 (Figura 12a), células J774 (Figura 12b) e cé-

lulas CD11c+ purificadas (Milteny, marcadas com glóbulos magnéticos) fo- ram isoladas de esplenócitos de camundongos sv129 (figuras 12c-12e) e foram estimuladas com as concentrações indicadas de ORN complexado com DOTAP (50 μ9/ιηΙ e diluído com ORN), R-848 ou DOTAP isolado (50 Hg/ml). Depois de 16 horas (figuras 12a e 12b) ou 20 horas (figuras 12c-12e) os sobrenadantes foram recolhidos e usados para ELISA de TNF-alfa (figu- ras 12a e 12b), IL-12p40 (Figura 12c), IFN-alfa (Figura 12d) e IP-10 (Figura 12e), Os dados representam um indivíduo de pelo menos três experiências (figuras 12a e 12b) e a média de 3 camundongos (figuras 12c-12e). Para medir a capacidade do ORN rico em AU para estimular células de camun- dongo in vivo, camundongos sv129 (n = 5/grupo) foram injetados com as quantidades indicadas de ORN formulado com DOTAP (60, 20 ou 6 μg/ml), e exsudados depois de 3 horas. A produção de IL-12p40 (Figura 12f), IFN- alfa (Figura 12g) e IP-10 (Figura 12h) foi medida em sangue total por ELISA. Exemplo 7

Esplenócitos de rato purificados não respondem a ORN rico em AU SEQ ID N°: 13

Esplenócitos de 3 ratos Sprague-Dawley foram reunidos e esti- mulados com as concentrações indicadas de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 13 (tanto complexada com 62,5 μg/ml de DOTAP com diluição de 1/5), R-848 ou DOTAP isolado (62,5 μg/ml -> diluição de 1/5). Os sobrenadantes foram recolhidos depois de 20 horas e os níveis de TNF-alfa foram medidos por ELISA. Como mostrado na figura 13, a estimulação com ORN rico em GU SEQ ID Ν°: 21 resultou na produção de TNF-alfa, ao passo que a estimula- ção com ORN rico em AU SEQ ID N°: 13 não resultou em produção de TNF- alfa.

Exemplo 8

O fracasso de células de roedores em responder a ORN rico

em AU SEQ ID N0: 13 pode resultar de polimorfismo de TLR8 entre es- pécies

A estimulação de células humanas e bovinas com ORN rico em AU resultou na produção de citocinas, ao passo que a estimulação de célu- Ias de camundongo e de rato não. Foi feito alinhamento e análise da se- qüência de TLR8. A comparação de seqüências de proteínas de TLR8 entre diferentes vertebrados (homem, macaco, chimpanzé, cachorro, vaca, porco, camundongo e rato) mostrou fortes diferenças na repetição rica em Ieucina (LRR) 3 do domínio 1. Enquanto o homem, o chimpanzé e o macaco são altamente conservados, o rato, o camundongo e o porco demonstraram de- leções de 4 AA na posição 106 (camundongo), 103 (rato) ou 102 (porco), e a vaca demonstrou uma inserção de 2 AA (105-106) comparada com huma- nos. O interessante é que o porco e o gado revelaram uma outra deleção de 2 AA na mesma região (posição 97). É possível que a deleção na região de repetição rica em Ieucina do domínio interfira na ligação de ORN rico em AU.

EQUIVALENTES

O relatório descritivo acima exposto é considerado suficiente para tornar possível que o especialista na técnica pratique a invenção. A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelos exemplos forne- cidos, visto que os exemplos são apenas ilustrativos de um aspecto da in- venção e outras modalidades equivalentes em termos funcionais estão den- tro do escopo da invenção. Várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritos tornar-se-ão aparentes para os especialistas na técni- ca a partir da descrição dada acima e se enquadram no escopo das reivindi- cações anexas. As vantagens da invenção não são necessariamente abran- gidas por cada modalidade, da invenção. Todas as referências, patentes e publicações de patente que estão mencionadas neste relatório estão aqui aqui incorporadas em sua in- tegridade a título de referência.

Claims (8)

1. Oligorribonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que apre- senta a SEQ ID N0 21.

2. Uso de um oligorribonucleotídeo de SEQ ID N0 21, caracteri- zado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para modular uma resposta imune em um paciente, compreendendo administrar ao paci- ente em necessidade de tal um oligorribonucleotídeo de SEQ ID N0 21 em uma quantidade eficaz para modular uma resposta imune.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o oligoribonucleotídeo é administrado ao paciente em uma dose efi- caz para induzir a expressão de citocina.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a citocina é selecionada de IL-6, IL-10, IL-12, TNF-alfa e IFN- gamma.

5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um oligorribonucleotídeo de SEQ ID N0 21 em um veículo farmaceuticamente aceitável.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antígeno em que tal antígeno é op- cionalmente conjugado ao oligorribunucleotídeo.

7. Composição de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteri- zada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável é formulado para injeção.

8. Composição de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteri- zada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável é formulado para administração oral, nasal, sublingual, por mucosa, respiratória, e dér- mica.