BRPI0706524A2

BRPI0706524A2 - composições e métodos de uso para anticorpos de dickkopf-1

Info

Publication number: BRPI0706524A2
Application number: BRPI0706524-8A
Authority: BR
Inventors: Janine Shulok; Feng Cong; Mark Fishman; Seth Ettenberg; Michael Bardroff; Mariel Donzeau; Stefanie Urlinger
Original assignee: Novatis Ag
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2011-03-29
Also published as: AU2007207787A1; US20120023600A1; EP1976594B1; SMP200800042B; UA101944C2; TNSN08297A1; JP5552233B2; TWI432450B; KR20080085908A; CU23871B1; MA30158B1; EP1976594A2; US9296813B2; SV2008002980A; AU2007207787B2; EA015538B1; WO2007084344A2; EA200801679A1; MEP1308A; IL192631A0

Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS DE USO PARA ANTICORPOS DE DICKKOPF-1 . A presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos que ligam ao alvo de proteína Dickkopf (DKK1) são fornecidos, como os métodos de uso e kits, para tratar uma célula alvo, em particular, uma célula associa- da a uma condição osteolítica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES E MÉTODOS DE USO PARA ANTICORPOS DE DICKKOPF-1".

CAMPO DE USO

A presente invenção refere-se a composições e métodos de usopara anticorpos de Dickkopf-1 (nDKKIn)f Dickkopf-4 ("DKK4"), ou ambos,para tratar anormalidades relacionadas a DKK de densidade óssea, metabo-lismo, diabetes, cânceres e outros.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A via de sinalização de Wnt está envolvida no controle de de-senvolvimento embrionário e processos neoplásticos. Proteínas de Wnt ex-tracelulares são responsáveis pelo crescimento e diferenciação de muitostipos de células, incluindo em particular o crescimento, diferenciação e regu-lação de osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Muitos cânceres são associados aos tecidos de osso e podemresultar em lesões osteoblásticas tais como aquelas encontradas em câncerde próstata, ou em lesões osteolítiças tais como aquelas encontradas emcâncer do pulmão, câncer de mama, e mieloma múltiplo (por exemplo, Tianet al., 2003 New England J. Med. 349:2483-2494).

Membros da família de gene de Wnt codificam glicoproteínassegregadas que são requeridas para uma variedade de processos de de-senvolvimento (Fedi et al., 1999 J. Bio. Chem. 274:19465-19472). Uma pro-teína dos membros da família de Wnt inicia uma via de sinalização que éimportante para o crescimento e diferenciação de osteoblastos, que causamdeposição óssea. Além de formação de osso, ressorção óssea é um proces-so normal contínuo conduzido por células conhecidas como osteoclastos.Em contraste, ativador de receptor de ligando de fator-capa B nuclear(RANKL) é o mediador final de ressorção óssea osteoclastóico, onde de-sempenha um papel principal na patogênese de osteoporose pós-menopausa, como também em perda óssea associada à artrite reumatóide,câncer metastático, mieloma múltiplo, terapia de inibidor de aromatase e te-rapia de privação de andrógeno (vide, por exemplo, Lewiecki (2006) ExpertOpin Biol Ther. 6: 1041-50). Osteoprotegrina (OPG) que é expressa atravésde osteoblastos inibe RANKL, assim diminuindo a atividade e formação deosteoclastos. O equilíbrio entre a formação óssea anabólica e ressorção ós-sea analítica regula a densidade óssea normal, enquanto um aumento emuma ou nas outras leva à densidade óssea aumentada ou perda óssea au-mentada, respectivamente.

Wnt liga e age através de outras proteínas de superfície celular esinalização de Wnt pode contribuir para o processo neoplástico. Além disso,alterações genéticas podem afetar um complexo de proteína celular conhe-cido como coli de polipose adenomatosa envolvendo uma proteína β-catenina, e estes complexos foram observados em células de pacientes comdoenças tais como câncer de cólon humano, melanomas, e carcinomas he-patocelulares, indicando que as aberrações da via de sinalização de Wntssão relevantes para o desenvolvimento destes e possivelmente outros cân-ceres humanos (Fedi et al., 1999 J. Bio. Chem. 274:19465-19472).

Há pelo menos duas famílias de proteínas que inibem sinaliza-ção de Wnt, a saber a família frizzled-relacionada segregada e a família deDickkopf (DKK). A família de DKK correntemente contém quatro membros defamília, a saber DKK1 (no. de ac. de DNA humano NM_012242; no. de ac.de PRT 094907), DKK2 (n°. de ac. humano NM_014421; no. de ac. de PRTNP_055236), DKK3 (n°. de ac. humano NM_015881; no. de ac. de PRT A-AQ88744), e DKK4 (n°. de ac. humano NM_014420; no. de ac. de PRTNP_055235).

Dickkopf-1 (DKK1) é um inibidor segregado da via de sinalizaçãode Wnt^-catenina. Vide, por exemplo, Pedido de patente U. S. 2005-0079173 para Niehrs; pedido de patente U. S. 2004 0234515 para McCarthy.DKK1 possui a habilidade para inibir duplicação de eixo geométrico induzidapor Wnt, e análise genética indica que DKK1 age a montante para inibir sina-lização de Wnt. DKK1 é também importante no desenvolvimento do esquele-to como demonstrado mediante efeitos na perda das estruturas de osso emgalinha e embriões de camundongo após exposição a níveis elevados deDKK1 (Tian et al., 2003 New England J. Med. 349:2483-2494). Níveis eleva-dos de DKK1 no soro foram associados a câncer de próstata, e níveis eleva-dos de DKK1 e RANKL no plasma de medula óssea e sangue periférico empacientes com mieloma múltiplo são associados à presença de lesões deosso focais. Vide, por exemplo, Tian 2003, no. de ac. de OMIM 605189.DKK1 também desempenha um papel em adipogênese, condrogênese, pro-liferação da proliferação epitelial gastrintestinal, perda de osso associada areumatismos, e iniciação de formação placode de folículo capilar. No. de ac.de OMIM. 605189.

Dickkopf-4 (DKK4) é menos bem caracterizado mas é igualmen-te um inibidor segregado da via de Wnt. DKK4 foi mostrado ser depositadoem placas em pacientes com doença de Alzheimer e foi expressado emmúsculo. Wnt não tem nenhum papel conhecido em desenvolvimento mus-cular, portanto é postulado aqui que DKK4 tenha um papel inibidor sobre odesenvolvimento dos músculos.

Há uma necessidade por composições e métodos para tratarcânceres e anormalidades de densidade óssea, incluindo tais agentes queinterferem ou neutralizam antagonismo mediado por DKK1 e/ou DKK4 dasinalização de Wnt.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma modalidade da invenção aqui fornece um anticorpo ou umaporção de ligação de antígeno do mesmo que seletivamente liga e neutralizaum polipeptídeo de DKK1 e/ou DKK4 ou um fragmento do mesmo. Em umamodalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo de neutralização deDKK1/4. Em várias modalidades, a porção de ligação de antígeno do anti-corpo de neutralização de DKK1/4 não liga um DKK2 ou um DKK3.

Em uma modalidade o anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo é disposto dentro de um andaime semelhante a imuno-globulina, tal como uma estrutura selecionada de, por exemplo, um andaimehumano, humanizado, humano-modificado, de tubarão ou de camelídeo,e/ou pode ser adicionalmente anticorpos recombinantes, quiméricos, ou en-xertados na CDR. Por exemplo, tecnologia projetada para minimizar a res-posta de Anticorpo Anti-murino Humano (tecnologia de engenharia humanade Kalobios ou tecnologia de humanização de PDL) é contemplada dentroda invenção. Também, porções de ligação de antígeno específicas paraDKK1 ou DKK4 podem também estar dentro do andaime não semelhante àimunoglobulina, incluindo, por exemplo, dispostas dentro de um tipo de es-trutura de adnectina, fibrinogênio, repetições derivadas de anquirina, etç.

Em uma modalidade particular, o anticorpo de Dkkl é caracteri-zado como tendo uma região de ligação de antígeno que é específica paraproteína alvo DKK1, e o anticorpo ou fragmento funcional liga a DKK1 ou umfragmento do mesmo. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo deDKK4 é caracterizado como tendo uma região de ligação de antígeno que éespecífica para proteína alvo DKK4, e o anticorpo ou fragmento funcionalliga a DKK4 ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade relacionada,o anticorpo de Dkk4 é caracterizado como tendo uma região de ligação deantígeno que é específica para proteína alvo DKK4, e o anticorpo ou frag-mento funcional liga a DKK4 ou um fragmento do mesmo. Em uma modali-dade preferida, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo ligaa um polipeptídeo de DKK1 e um de DKK4, mas não a um polipeptídeo deDKK2 ou de DKK3.

Em outra modalidade o anticorpo ou uma porção de ligação de an-tígeno do mesmo é monoclonal. Em outra modalidade, a porção de ligação deantígeno é policlonal. Em várias modalidades, o anticorpo de DKK1 ou umaporção de ligação de antígeno do mesmo liga um peptídeo que consiste em 30aminoácidos contíguos de um Polipeptídeo de DKK1 ou um de DKK4.

Em uma modalidade relacionada, a ligação a DKK1 ou DKK4 édeterminada por pelo menos um dos ensaios a seguir: inibição de DKK1 ouantagonismo de DKK4 de transcrição de sinalizada por Wnt; determinaçãoda afinidade da ressonância de plasmon de superfície, ensaio de ligaçãoimunoabsorvente ligado a enzima; análise de ligação com base em eletro-quimiluminescência; FMAT, SET, SPR, ALP, TopFIash, concentração desoro de sangue dos biomarcadores tais como osteocalcina (OCN), propeptí-deo azotado do tipo 1 de procolágeno (P1NP) e osteoprotegrina (OPG), eligando a receptor(es) de superfície celular tais como Frizzled (Fz), LRP (L-RP5/6) ou Kremen (Krm). Em certas modalidades, o anticorpo de Dkkl ouporção de ligação de antígeno possui pelo menos uma das propriedades aseguir: seletividade para DKK1 que é pelo menos 103 vezes, 104 vezes ou105 vezes maiores que para DKK2 ou DKK3 humanos; liga a DKK1 ouDKK4 com um Kon de menos que 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1,0 nM, 500 pM,100 pM, 50 pM ou 10 pM; e tem uma taxa fora para DKK1 de menos que 10"2 por seg, 10"3 por seg, 10"4 por seg, ou 10'5 por seg.

Em uma modalidade relacionada, um anticorpo da invençãocompete com DKK1 e/ou DKK4 para ligar a LRP5/6. Em uma modalidaderelacionada, um anticorpo da invenção compete com DKK1 e/ou DKK4 paraligaraKrm.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma região deligação de antígeno isolada de qualquer um dos anticorpos acima ou frag-mentos funcionais destes anticorpos, e seqüências de aminoácido destes.Desse modo, em certas modalidades, a invenção fornece seqüências deaminoácido isoladas selecionadas do grupo de SEQ ID NOs: 2-20 e SEQ IDNOs: 40-72 e variantes conservadoras ou convertidas em variantes huma-nas engenheiradas ("humaneered") destas seqüências.

Também, em certas modalidades adicionais, a invenção forneceseqüências de aminoácido SEQ ID NOs: 2-20, 65-72, e variantes conserva-doras ou convertidas em variantes humanas engenheiradas ("humaneered")destas seqüências que fornecem regiões de ligação de antígeno isoladas,cada uma desta é uma H-CDR-3.

Em uma modalidade relacionada, a região de ligação de antíge-no isolada é uma região de H-CDR2 que tem uma seqüência de aminoácidoselecionada de SEQ ID NOs: 2-20, 57-64, e variantes conservadoras ouconvertidas em variantes humanas engenheiradas ("humaneered") destas.Em ainda outra modalidade relacionada, a região de ligação de antígenoisolada é uma região de H-CDR2 de consenso descrita selecionada do gru-po de seqüências de SEQ ID NO: 40 seqüência de aminoácido tendoGISGSGSYTYYADSVKF, SEQ ID NO: 41 seqüência de aminoácido tendoGISYYGGNTYYADSVKF, e SEQ ID NO: 42 seqüência de aminoácido tendoGISYYGGSTYYADSVKF, e variantes conservadoras ou convertidas em va-riantes humanas engenheiradas ("humaneered") de resíduos de aminoácidodestas seqüências.

Em certas modalidades, á seqüência nova fornecida é SEQ IDNOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56, e variantes conservadoras ou convertidas em va-riantes humanas engenheiradas ("humaneered") destas que fornece umaregião de ligação de antígeno isolada que é uma região de H-CDR1.

Em uma modalidade relacionada, a região de ligação de antígenoisolada é uma região de H-CDR1 de consenso que tem uma seqüência de a -minoácido (usando um código de aminoácido uma carta) selecionada das se-qüências de aminoácido GFTFSSYGMT (SEQ ID NO: 43), GFTFNSYGMT(SEQ ID NO: 44), GFTFSNYGMT (SEQ ID NO: 45), GFTFSSYWMT (SEQ IDNO: 46), GFTFSSYAMT (SEQ ID NO: 47), GFTFSSYGMS (SEQ ID NO: 48) evariantes conservadoras ou convertidas em variantes humanas engenheiradas("humaneered") de qualquer destas seqüências.

Em outra modalidade, a invenção fornece seqüências de amino-ácido que são regiões de ligação de antígeno isoladas tendo uma região deL-CDR3, tal como seqüências de aminoácido selecionadas de SEQ ID NOs:21-39, 89-96, e variantes conservadoras ou convertidas em variantes huma-nas engenheiradas ("humaneered") destas seqüências. Em ainda outra mo-dalidade relacionada, a região de ligação de antígeno isolada é uma regiãode L-CDR1 que tem uma seqüência de aminoácido selecionada de SEQ IDNOs: 21-39, 73-80, e variantes conservadoras ou convertidas em varianteshumanas engenheiradas ("humaneered") destas seqüências. Em ainda outramodalidade relacionada, a região de ligação de antígeno isolada é uma regi-ão de L-CDR2 que tem uma seqüência de aminoácido selecionada de SEQID NOs: 21-39, 81-88, e variantes conservadoras ou convertidas em varian-tes humanas engenheiradas ("humaneered") destas seqüências.

Em certas modalidades, a região de ligação de antígeno isoladaé uma cadeia leve variável que tem uma seqüência de aminoácido selecio-nada de SEQ ID NOs: 21-39, e variantes conservadoras ou convertidas emvariantes humanas engenheiradas ("humaneered") destas seqüências.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma seqüência denucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NOs; 97-103. Em uma modali-dade relacionada, cada uma destas seqüências de nucleotídeo codifica umaseqüência de aminoácido e variantes conservadoras ou convertidas em vari-antes humanas engenheiradas ("humaneered") destas seqüências de ami-noácido codificadas estão também dentro do escopo da invenção aqui. Emoutra modalidade relacionada, a seqüência de nucleotídeo de cada uma deSEQ ID NOs: 97-100 codifica uma cadeia leve de ligação de antígeno. Emuma outra modalidade relacionada, a seqüência de nucleotídeo de cada umade SEQ ID NOs: 101-103 codifica uma cadeia pesada de ligação de antíge-no. Em ainda outra modalidade relacionada, cada uma destas seqüências denucleotídeo é também otimizada para expressão em uma célula. Célulaspreferidas incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, células de Hams-ter chinês (por exemplo, CHO), baculovírus, levedura, bactérias, células demieloma, e/ou H. sapiens.

Preferivelmente, as seqüências são otimizadas para expressão epara produção e uso clínico. Características para otimização para uso clínicoincluem, mas não são limitadas a, por exemplo, meia-vida, farmacocinética(PK), antigenicidade, função efetora, liberação de FcRn, e resposta de paci-ente incluindo citotoxicidade de célula dependente de anticorpo (ADCC) ouatividades de complemento citotoxicidade dependente (CDC).

Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma região deligação de antígeno isolada tendo uma cadeia pesada codificada por umaseqüência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 101-103.Em uma modalidade relacionada, a invenção fornece uma região de ligaçãode antígeno isolada que tem uma cadeia leve codificada por uma seqüênciade nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 97-100. Em ainda ou-tra modalidade relacionada, a invenção fornece uma região de ligação deantígeno isolada que tem uma cadeia leve codificada por uma seqüência denucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 97-100, e uma cadeiapesada codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupode SEQ ID NOs: 101-103.

Em certas modalidades, a invenção fornece uma seqüência denucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 104-110. Em uma moda-lidade relacionada, cada uma destas seqüências de nucleotídeo ,codificauma seqüência de aminoácido e variantes conservadoras ou convertidas emvariantes humanas engenheiradas ("humaneered") destas seqüências deaminoácido estão também dentro do escopo da invenção aqui. Em outramodalidade relacionada, a seqüência de nucleotídeo de cada uma de SEQID NOs: 104-107 codifica uma cadeia leve de ligação de antígeno. Em umaoutra modalidade relacionada, a seqüência de nucleotídeo de cada uma deSEQ ID NOs: 108-110 codifica uma cadeia pesada de ligação de antígeno.Em ainda outra modalidade relacionada, cada uma destas seqüências denucleotídeo são otimizadas para expressão e/ou para uso clínico.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma região deligação de antígeno isolada que tem uma cadeia pesada codificada por umaseqüência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 108-110.Em outra modalidade relacionada, a invenção fornece uma região de ligaçãode antígeno isolada que tem uma cadeia leve codificada por uma seqüênciade nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 104-107. Em aindaoutra modalidade relacionada, a invenção fornece uma região de ligação deantígeno isolada que tem uma cadeia leve codificada por uma seqüência denucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 104-107, e uma cadeiapesada codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupode SEQ ID NOs: 108-110.

Em outras modalidades, a invenção fornece uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 111-117, e fornece vari-antes conservadoras destas seqüências. Em uma modalidade relacionada,cada uma de SEQ ID NOs: 111-114 descreve uma cadeia leve de ligação deantígeno. Em outra modalidade, cada uma de SEQ ID NOs: 115-117 descre-ve uma cadeia pesada de ligação de antígeno. Em ainda outra modalidaderelacionada, a seqüência de aminoácido é otimizada para expressão e/oupara uso clínico.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma região deligação de antígeno isolada que tem uma cadeia pesada descrita em umaseqüência de aminoácido selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 115-117, efornece variantes conservadoras destas seqüências. Em uma modalidaderelacionada, a invenção fornece uma região de ligação de antígeno isoladaque tem uma cadeia leve descrita em uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo de SEQ ID NOs: 111 -114, e fornece variantes conservado-ras destas seqüências. Em ainda outra modalidade relacionada, a invençãofornece uma região de ligação de antígeno isolada que tem uma cadeia pe-sada descrita em uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo deSEQ ID NOs: 115-117, e fornece variantes conservadoras destas seqüên-cias, e uma cadeia leve descrita em uma seqüência de aminoácido selecio-nada do grupo de SEQ ID NOs: 111 -114, e fornece variantes conservadorasdestas seqüências.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma seqüência denucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 120-121, e/ou uma regi-ão de ligação de antígeno isolada que tem uma região variável de uma ca-deia leve ou uma cadeia pesada codificada pelas respectivas seqüências denucleotídeo. Em uma modalidade relacionada, cada uma destas seqüênciasde nuctèotídeo codifica uma seqüência de aminoácido, e variantes conser-vadoras ou convertidas em variantes humanas engenheiradas ("humanee-red") destas seqüências de aminoácido estão também dentro do escopo dainvenção. Em outra modalidade relacionada, a seqüência de nucleotídeo deSEQ ID NO: 120 codifica uma cadeia leve de ligação de antígeno. Em umaoutra modalidade relacionada, a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOs:121 codifica uma cadeia pesada de ligação de antígeno. Em ainda outramodalidade relacionada, cada uma destas seqüências de nucleotídeo étambém otimizada para expressão e/ou para uso clínico.

Em certas modalidades, a invenção fornece uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo de 118-119 e variantes conservadoras ouconvertidas em variantes humanas engenheiradas ("humaneered") destasseqüências. Em uma modalidade relacionada, SEQ ID NO: 118 descreveuma região variável de ligação de antígeno de uma cadeia leve. Em outramodalidade relacionada, SEQ ID NO: 119 descreve uma região variável deligação de antígeno de uma cadeia pesada. Em ainda outra modalidade re-lacionada, a seqüência de aminoácido é otimizada para expressão e/ou parauso clínico.

Em outras modalidades, a invenção fornece uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% deidentidade com as regiões de CDR descritas em SEQ ID NOs: 2-39. Em umamodalidade relacionada, a invenção fornece uma seqüência de aminoácidoque tem pelo menos 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade comuma seqüência descrita em SEQ ID NOs: 111-120. Em ainda outra modali-dade relacionada, a invenção fornece uma seqüência de nucleotídeo quetem pelo menos 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade comuma seqüência descrita em SEQ ID NOs: 97-110 e 120-121.

Em uma certa modalidade, qualquer um dos anticorpos isoladosacima é uma IgG. Em uma modalidade relacionada, qualquer um dos anti-corpos isolados acima é uma IgGI, uma lgG2, uma lgG3 ou uma lgG4. Emoutra modalidade, o anticorpo é uma IgE, uma IgM1 uma IgD ou uma IgA.Em uma modalidade relacionada, a invenção é selecionada de uma compo-sição de anticorpo monoclonal ou policlonal. Em outras modalidades, o anti-corpo é quimérico, humanizado, convertido em anticorpo humano engenhei-rado ("humaneered"), recombinante, etc. Em ainda outra modalidade, a in-venção fornece um anticorpo humano ou humanizado isolado ou fragmentofuncional deste, tendo uma região de ligação de antígeno que é específicapara um epítopo de DKK1., e o anticorpo ou fragmento funcional liga a DKK1ou DKK4, ou do contrário bloqueia a ligação de DKK1 ou DKK4 a um recep-tor de superfície celular (por exemplo, receptores tais como LRP5/6, Kre-men, Frizzled). Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste im-pedem, tratam, ou melhoram o desenvolvimento de lesões osteolíticas. Emoutras modalidades, a composição anti-DKK da invenção impede, trata, oumelhora um câncer ou doença associados a DKK1 ou DKK4.

Em uma modalidade relacionada, a invenção fornece um anticorpohumano isolado ou humanizado ou fragmento funcional deste, tendo uma regi-ão de ligação de antígeno que é específica para um epítopo de DKK1 ou DKK4alvo, e o epítopo contém seis ou mais resíduos de aminoácido um fragmento depolipeptídeo que compreende os domínios CYS1-ligador-CYS2 de DKK1 e/ouDKK4. Em uma modalidade relacionada, o epítopo é um epítopo conformacio-nal. Em uma modalidade preferida, o epítopo reside dentro do domínio deCYS2. Em uma modalidade particular, o epítopo compreende um resíduo deaminoácido modificado. Em uma modalidade relacionada, o epítopo contémpelo menos um resíduo de aminoácido glicosilado.

Fragmentos funcionais incluem fragmentos de Fv e Fab (incluindoversões de cadeia simples tais como scFv), como também outras regiões deligação de antígeno de um anticorpo, incluindo aquelas que estão ligadas aum andaime de não-imunoglobulina e anticorpos de cadeia pesada tais co-mo anticorpos e nanocorpos de camelídeo e de tubarão. Em uma modalida-de relacionada, o anticorpo isolado como descrito acima é uma IgG. Em ou-tra modalidade relacionada, o anticorpo isolado como descrito acima é umalgG1, uma lgG2, lgG3 ou uma lgG4. Em outra modalidade, o anticorpo éuma IgE, uma IgM ou uma IgA. Em uma modalidade relacionada, a invençãoé uma composição de anticorpo policlonal.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição far-macêutica que tem pelo menos um de qualquer um dos anticorpos acima oufragmentos funcionais ou variantes conservadoras, e um veículo ou excipien-te farmaceuticamente aceitável destes.

Em ainda outra modalidade, a invenção prove um animal trans-gênico que carrega um gene que codifica qualquer um dos anticorpos acimaou fragmentos funcionais deles.

Em certas modalidades, a invenção provê um método para tratarum distúrbio ou condição associado à expressão de DKK1 ou DKK4. Comoaqui usado, "doenças associadas a DKK1" ou "doenças associadas a DKK4"incluem, mas não são limitadas a, lesões osteolíticas - especialmente lesõesosteolíticas associadas a um mieloma, especialmente um mieloma múltiplo,ou com cânceres de osso, mama, cólon, melanócitos, hepatócitos, epitélio,esôfago, cérebro, pulmão, próstata ou pâncreas ou metástase dos mesmos;perda óssea associada à transplantação. Outras doenças ou distúrbios in-cluem mas não são limitados, por exemplo, osteossarcoma, câncer de prós-tata, carcinoma hepatocelular (HCC)1 mieloma incluindo mieloma múltiplo,diabetes, obesidade, definhamento muscular, doença de Alzheimer, osteo-porose, osteopenia, reumatismo, colite e/ou perda de cabelo indesejada. Ométodo envolve administrar a um sujeito em necessidade do mesmo umaquantidade eficaz de qualquer das composições farmacêuticas acima.

Em uma modalidade relacionada, o distúrbio ou condição a sertratada é uma anormalidade de densidade óssea. Em outra modalidade rela-cionada, a anormalidade de densidade óssea a ser tratada é a presença deuma lesão osteolítica no sujeito.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratada éuma condição osteoporótica, tal como uma lesão osteolítica associada a umcâncer. Em uma modalidade relacionada, o câncer a ser tratado é um mie-loma, tal como mieloma múltiplo, ou um câncer do osso, mama, cólon, mela-nócitos, hepatócitos, epitélio, esôfago, cérebro, pulmão, próstata ou pân-creas ou metástase dos mesmos. Em outras modalidades, a condição oste-oporótica é osteoporose ou osteopenia ou osteossarcoma.

Em certas modalidades, qualquer um dos métodos acima tambémenvolvem administrar um agente quimioterapêutico. Em uma modalidade rela-cionada, o agente quimioterapêutico é um agente anticâncer. Em outra modali-dade relacionada, o agente quimioterapêutico é um agente antiosteoporótico.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um método paratratar uma célula alvo, o método envolvendo bloquear interação de DKK1 ouDKK4 com a célula com qualquer um dos anticorpos acima ou fragmentosfuncionais deles. Em geral, a célula alvo carrega um receptor que liga DKK1ou DKK4. Em uma modalidade, a célula alvo é um osteoblasto, em que tra-tamento com a composição de anti-DKK1/4 de neutralização da invençãointensificará a proliferação e estimulará a formação de osso. Em uma moda-lidade, a célula alvo é uma célula muscular, em que o tratamento contrariarádefinhamento muscular.

Em uma modalidade relacionada, o método também envolvetratar um paciente com a célula alvo com um agente quimioterapêutico ouradiação. Em uma modalidade relacionada, seguindo administração ou con-tato, quaisquer dos métodos acima também envolvem observar a melhoraou retardamento de desenvolvimento de uma lesão osteolítica.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um método paraidentificar DKK1 ou DKK4 em soro. Este método envolve detectar DKK1 ouDKK4 com qualquer um dos anticorpos acima ou fragmentos de anticorpotendo também uma marcação detectável. A marcação é radioativa, fluores-cente, magnética, paramagnética, ou quimiluminescente.

Em outra modalidade, qualquer um dos anticorpos humanos ouhumanizados oü fragmentos de anticorpo são sintéticos.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição far-macêutica de qualquer um dos anticorpos acima ou fragmentos funcionaisdestes anticorpos e um agente terapêutico adicional. O agente terapêuticoadicional pode ser selecionado do grupo que consiste em um agente anti-câncer; um agente antiosteoporótico; um antibiótico; um agente de antimeta-bólico; um agente antidiabético; um agente anti-inflamatório; um agente anti-angiogênico; um fator de crescimento; e uma citocina.

A invenção também refere-se a um método de impedir ou tratardoenças proliferativas ou doenças, tais como um câncer, em um mamífero,particularmente um humano, com uma combinação de agentes farmacêuti-cos que compreende:

(a) um agente de neutralização de DKK1/4 da invenção; e

(b) um ou mais agentes farmaceuticamente ativos;

em que pelo menos um agente farmaceuticamente ativo é umanticâncer terapêutico.

A invenção também refere-se às composições farmacêuticascompreendendo:

(a) um anticorpo de neutralização de DKK1/4;

(b) um agente farmaceuticamente ativo; e

(c) um veículo farmaceuticamente aceitável;

em que pelo menos um agente farmaceuticamente ativo é umanticâncer terapêutico.A presente invenção também refere-se a um pacote comercialou produto compreendendo:

(a) uma formulação farmacêutica de um anticorpo de neutraliza-ção de DKK1/4; e

(b) uma formulação farmacêutica de um agente farmaceutica-mente ativo para uso simultâneo, simultâneo, separado ou seqüencial;

Em uma certa modalidade, a invenção fornece um anticorpo quetem uma primeira seqüência de aminoácido que é uma cadeia pesada sele-cionada de SEQ ID NOs: 2-20, e uma seqüência que tem pelo menos 60, 70,80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade de seqüência nas regi-ões de CDR com as regiões de CDR tendo SEQ ID NOs: 2-20; e uma se-gunda seqüência de aminoácido que é uma cadeia leve selecionada de SEQID NOs: 21-39, e uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 95, 96,97, 98 ou 99 por cento de identidade de seqüência nas regiões de CDR comas regiões de CDR mostradas em SEQ ID NOs: 21 -39.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um imunoconju-gado feito de um primeiro componente que é um anticorpo ou fragmentocomo descrito acima e um segundo componente tendo uma segunda se-qüência de aminoácido. Por exemplo, o imunoconjugado é uma citotoxina,ou o imunoconjugado é uma proteína Iigadora ou anticorpo que tem umaespecificidade de ligação para um alvo que é diferente de DKK1 ou DKK4.Por exemplo, o alvo da especificidade de ligação diferente de DKK1 ouDKK4 é um antígeno de tumor ou proteína associada ao tumor em uma su-perfície de uma célula de câncer.

Em certas modalidades, a invenção provê qualquer um dos anti-corpos acima para ser um anticorpo biespecífico.

Em outra modalidade, a invenção fornece um kit que tem qual-quer um dos anticorpos acima ou fragmentos de anticorpo. Em algumas mo-dalidades, o kit também contém um veículo ou excipiente farmaceuticamenteaceitável deste. Em outras modalidades relacionadas, qualquer um dos anti-corpos acima no kit está presente em uma dose de unidade. Em ainda outramodalidade, o kit é um kit de diagnóstico ELISA. Em uma modalidade rela-cionada, o kit inclui instruções para uso em administrar qualquer um dos an-ticorpos acima a um sujeito.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 é um gráfico que ilustra nenhuma perda significativa deDKK1 marcado com His-Strep das contas revestidas com Strep-Tactinquando as contas não-lavadas são comparadas com aquelas contas lavadascom severidades de HuCAL® diferentes.

Figura 2 é um gráfico de barras que ilustra os resultados de umEnsaio de atividade de Wnt com 100 μί de reagente de Bright-Glo luciferase,como fornecido no Exemplo 3.

Figura 3 é um gráfico de um Ensaio Imunoabsorvente Ligado aEnzima (ELISA). A fluorescência é medida em uma leitora placa TECANSpectrafluor e as curvas de ligação são mostradas.

Figura 4 é um gráfico que ilustra o ensaio de TCF/LEF Iuc de-pendente de Wnt3a padrão, como fornecido no Exemplo 6.

Figura 5 é um gráfico que ilustra uma versão melhorada do en-saio de repórter de TCF/LEF Iuc que mostra sensibilidade altamente melho-rada para DKK1 mediado pela co-expressão da proteína de co-receptor deKremen.

Figura 6A é uma ilustração gráfica da medição de ressonânciade plasmina de superfície de um anticorpo de anti-DKK1/4 que liga a DKK1'.Figura 6B é uma tabulação de afinidade de ligação calculada e valores ciné-ticos.

Figura 7A é uma representação esquemática de DKK1 de com-primento total e truncado para uso em mapeamento de epítopo. Figura 7Bdescreve a ligação de um anticorpo da invenção às proteínas de DKK1 efragmentos da Figura 7A.

Figura 8 é uma ilustração gráfica de anticorpo de DKK1/4 queliga em um ensaio de ELISA de competição.

Figura 9 é uma ilustração gráfica de reativação associada aoanticorpo de DKK1/4 da transcrição de gene regulada por Wnt a jusante.

Figura 10 é uma ilustração gráfica de DKK1 de reversão de anti-corpo de DKK1/4 inibido da secreção de ALP.

Figura 11 é uma ilustração gráfica dos efeitos do anticorpo deDKK1/4 em xenoenxertos in vivo.

Figura 12 é uma ilustração gráfica da elevação associada aoanticorpo de DKK1/4 de densidade óssea in vivo.

Figura 13 é uma ilustração gráfica que compara eficácia antios-teolítica de Zometa com um anticorpo de DKK1/4.

Figura 14 é uma ilustração gráfica dá eficácia dose-dependentede um anticorpo de DKK1/4 em osso anabólíco.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos anticorpos de DKK1/4 isola-dos, particularmente anticorpos humanos que especificamente ligam a DKK1ou DKK4 e que inibem as propriedades funcionais de DKK1 ou DKK4. Emuma modalidade preferida, o anticorpo de DKK1/4 não liga especificamentea DKK2 ou DKK3. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção sãoderivados de seqüências de cadeia pesada e leve particular e/ou compreen-dem características estruturais particulares tais como regiões de CDR com-preendendo seqüências de aminoácido particulares. A invenção fornece an-ticorpos isolados, métodos de fazer tais anticorpos, imunoconjugados e mo-léculas biespecíficas que compreendem tais anticorpos e composições far-macêuticas que contêm os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas bies-pecíficas da invenção. A invenção também refere-se aos métodos de usar osanticorpos para inibir um distúrbio ou condição associada a DKK1 ou DKK4.Doenças e distúrbios contemplados incluem, mas não são limitadas a, le-sões osteolíticas - especialmente lesões osteolíticas associadas a um mie-loma, especialmente um mieloma múltiplo, ou com cânceres de osso, mama,cólon, melanócitos, hepatócitos, epitélio, esôfago, cérebro, pulmão, próstataou pâncreas ou metástase dos mesmos; perda óssea associada à transplan-tação. Outras doenças ou distúrbios incluem mas não são limitados a, porexemplo, osteossarcoma, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular(HCC), mieloma incluindo mieloma múltiplo, diabetes, obesidade, definha-mento muscular, doença de Alzheimer, osteoporose, osteopenia, reumatis-mo, colite e/ou perda de cabelo indesejada.

Para que a presente invenção possa ser entendida mais facil-mente, certos termos são definidos primeiro. Definições adicionais estão ex-postas ao longo da descrição detalhada.

O termo "resposta imune" refere-se à ação de, por exemplo, Iin-fócitos, células de apresentação de antígeno, células fagocitárias, granulóci-tos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fíga-do (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) que resulta em dano se-letivo para, destruição de, ou eliminação do corpo humano de patógenosinvasores, células ou tecidos infetados com patógenos, células cancerosas,ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidoshumanos normais.

Uma "via de transdução de sinal" refere-se à relação bioquímicaentre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que representam umpapel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra por-ção de üma célula. Como aqui usado, a frase "receptor de superfície celular"inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receberum sinal e capazes da transmissão de um tal sinal ao longo da membranaplasmática de uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfície celular"da presente invenção é um receptor ao qual a molécula de proteína de DKK1ou DKK4 se liga. Tais receptores de superfície celular incluem, mas não sãolimitadas a, Frizzled (Fz), LRP (LRP5 e LRP6), e Kremen (Krm).

Como aqui usado, o termo "anticorpo" refere-se aos anticorpospoliclonais, anticorpos monoclonais, anticorpos humanizados, anticorpos decadeia simples, e fragmentos dos mesmos tais como Fab. F(ab')2. Fv, e outrosfragmentos que retêm a função de ligação de antígeno do anticorpo de ori-gem. Como tal, um anticorpo pode referir-se a uma imunoglobulina ou glico-proteína, ou fragmento ou porção das mesmas, ou a uma construção quecompreende uma porção de ligação de antígeno compreendida dentro deuma estrutura semelhante à imunoglobulina modificada, ou a uma porção deligação de antígeno compreendida dentro de uma construção que compre-ende uma estrutura ou andaime não semelhante à imunoglobulina.

Como aqui usado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se auma composição de anticorpo que tem uma população de anticorpo homo-gênea. O termo não é limitado com relação às espécies ou fonte do anticor-po, nem é intencionado ser limitado pela maneira em que é feito. O termoabrange imunoglõbulinas inteiras como também fragmentos tais como Fab,F(ab')2> Fv, e similares que retêm a função de ligação de antígeno do anticor-po. Anticorpos monoclonais de qualquer espécie mamífera podem ser usa-dos nesta invenção. Em prática, porém, os anticorpos tipicamente serão derato ou de origem murina por causa da disponibilidade das linhagens celula-res de rato ou murinas para uso em fazer as linhagens celulares híbridasrequeridas ou hibridomas para produzir anticorpos monoclonais.

Como aqui usado, o termo "anticorpo policlonal" refere-se a umacomposição de anticorpo que tem uma população de anticorpo heterogênea.Anticorpos policlonais são freqüentemente derivados do soro agrupado deanimais imunizados ou de humanos selecionados.

Como aqui usado, a frase "anticorpos de cadeia simples" refere-se aos anticorpos preparados determinando os domínios de ligação (tantode cadeia pesada como leve) de um anticorpo de ligação, e provendo umametade de ligação que permite preservação da função de ligação. Isto for-ma, em essência, um anticorpo radicalmente abreviado, tendo apenas aque-la parte do domínio variável necessária para ligar ao antígeno. Determinaçãoe construção de anticorpos de cadeia simples são descritas na Patente U. S.N°. 4.946.778 para Ladner et al.

Um "anticorpo de ocorrência natural" é uma glicoproteína quecompreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L)interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compre-endida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como Vh) euma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pe-sada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leveé compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui comoVL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeialeve é compreendida de um domínio, CL. As regiões Vh e Vl podem ser tam-bém subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões dedeterminação de complementaridade (CDR), entremeadas com regiões quesão mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada Vh eVl é composta de três CDRs e quatro FRs dispostas do término amino aotérmino carbóxi na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3,FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio deligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpospodem mediar á ligação da imunoglobulina para tecidos ou fatores hospedei-ros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efeto-ras) e o primeiro componente (CIq) do sistema de complemento clássico.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou sim-plesmente "porção de antígeno"), como aqui usado, refere-se à seqüência deproteína que liga o alvo, por exemplo, uma ou mais CDRs. Ela inclui, por exem-plo, anticorpos de comprimento total, um ou mais fragmentos de um anticorpo,e/ou CDRs em um andaime relacionado à não-imunoglobulina que retém a ha-bilidade para especificamente ligar a um antígeno (por exemplo, DKK1). A fun-ção de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser executada por fragmen-tos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligaçãoabrangidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpoincluem um fragmento de Fab, um fragmento monovalente que consiste nosdomínios de VL, Vh, Cl e de CH1; um fragmento de F(ab)2, um fragmento biva-lente que compreende dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissul-feto na região de dobradiça; um fragmento de Fd que consiste nos domínios deVh e CH1; um fragmento de Fv que consiste nos domínios de Vl e Vh de umbraço simples de um anticorpo; um fragmento de dAb (Ward et al., 1989 Nature341:544-546) que consiste em um domínio de VH; e uma região de determina-ção de complementaridade isolada (CDR).

Como aqui usado, um "antígeno" ou um "epítopo" alternadamen-te refere-se a uma seqüência de polipeptídeo em uma proteína alvo especifi-camente reconhecida por uma porção de ligação de antígeno de um anticor-po, fragmento de anticorpo, ou seus equivalentes. Um antígeno ou epítopocompreende pelo menos 6 aminoácidos que podem ser contíguos dentro deuma seqüência alvo ou não-contígua. Um epítopo conformacional podecompreender resíduos não-contíguos, e opcionalmente pode conter resíduosde aminoácido natural ou sinteticamente modificados. Modificações pararesíduos incluem, mas não são limitadas a: fosforilação, glicosilação, PEGi-lação, ubiquitinização, furanilização e outros.

Além disso, embora os dois domínios do fragmento de Fv, Vl eVh sejam codificados através de genes separados, eles podem ser unidos,usando métodos recombinantes, por um Iigador sintético que os permite se-rem feitos como uma cadeia de proteína simples em que as regiões Vl e Vhemparelham-se para formar moléculas monovalentes (conhecidas como ca-deia simples Fv (scFv); vide por exemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; e Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 5879-5883). Tais anti-corpos de cadeia simples são também intencionados ser abrangidos dentrodo termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentosde anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas aquelesde habilidade na técnica, e os fragmentos são triados para utilidade damesma maneira como são os anticorpos intactos.

Como descrito aqui, as variantes conservadoras incluem resí-duos de aminoácido em quaisquer das seqüências de aminoácido identifica-das, particularmente alterações conservadoras que são bem conhecidas aalguém de habilidade usual na técnica de engenharia de proteína.

Um "anticorpo isolado", como aqui usado, refere-se a um anti-corpo que está substancialmente livre de outros anticorpos tendo especifici-dades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que especi-ficamente liga a DKK1 está substancialmente livre de anticorpos que especi-ficamente ligam antígenos diferentes de DKK1). Um anticorpo isolado queespecificamente liga a DKK1 pode, porém, ter reatividade cruzada com ou-tros antígenos, tais como moléculas de DKK1 de outras espécies, Ou outrosmembros da família tais como DKK4 ou parólogo relacionados. Além disso,um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celu-lar e/ou químicas.

O termo "anticorpo humano", como aqui usado, é intencionadoincluir anticorpos tendo regiões variáveis em que a estrutura e regiões deCDR são derivadas de seqüências de origem humana. Além disso, se o an-ticorpo contiver uma região constante, a região constante também é deriva-da de tais seqüências humanas, por exemplo, seqüências de linha germina-tiva humana, ou versões mutadas de seqüências de linha germinativa hu-mana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de ami-noácido não codificados por seqüências humanas (por exemplo, mutaçõesintroduzidas por mutagênese aleatória ou específica in vitro ou através demutação somática in vivo). Porém, o termo "anticorpo humano", como aquiusado, não é intencionado incluir anticorpos em que as seqüências de CDRderivadas da linha germinativa de outras espécies mamíferas, tais como umcamundongo, foram enxertadas nas seqüências de estrutura humana.

O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se aos anticor-pos que exibem uma especificidade de ligação simples que tem regiões va-riáveis em que a estrutura e regiões de CDR são derivadas das seqüênciashumanas. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos sãoproduzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animalnão-humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendoum genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humano e umtransgene de cadeia leve fundido com uma célula imortalizada.

Como aqui usado, o termo "anticorpos humanizados" significamque pelo menos uma porção das regiões de estrutura de uma imunoglobuli-na é derivada das seqüências de imunoglobulina humana. Uns anticorpos"humanizados" tais como anticorpos com seqüências de CDR derivadas dalinha germinativa de outras espécies, especialmente uma espécie mamífera,por exemplo, um camundongo que foi enxertado sobre as seqüências deestrutura humana. Tecnologias exemplares incluem tecnologia de humani-zação de PD L.

Como aqui usado, o termo "anticorpos convertidos em anticor-pos humanos engenheirados ("humaneered")" significa anticorpos que ligamo mesmo epítopo mas diferem em seqüência. Tecnologias exemplares in-cluem anticorpos convertidos em anticorpos humanos engenheirados ("hu-maneered") produzidos por tecnologia de humaneering de Kalobios1 em quea seqüência da região de ligação de antígeno é derivada, por exemplo, pormutação, ao invés devido às substituições de aminoácido conservadoras.

O termo "anticorpo humano recombinante", como aqui usado,inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, modifi-cados ou isolados através de meios recombinantes, tais como anticorposisolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que são transgênicosou transcromossômicos para os genes de imunoglobulina humana ou umhibridoma preparado deles, anticorpos isolados de uma célula hospedeiratransformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um trans-fectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humana recom-binante, combinatória, e anticorpos preparados, expressos, modificados ouisolados por quaisquer outros meios que envolvam corte de toda ou umaporção de um gene de imunoglobulina humana, seqüências para outras se-qüências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões va-riáveis em que a estrutura e regiões de CDR são derivadas de seqüênciasde imunoglobulina de linha germinativa humana. Em certas modalidades,porém, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos àmutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para as seqüênciasde Ig humana for usado, mutagênese somática in vivo) e desse modo asseqüências de aminoácido das regiões Vh e Vl dos anticorpos recombinan-tes são seqüências que, embora derivadas e relacionadas às seqüências Vhe Vl de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro dorepertório da linha germinativa do anticorpo humano in vivo.

Como aqui usado, "isótipo" refere-se à classe de anticorpo (porexemplo, IgA, IgD1 IgM, IgE, IgG tais como IgGt1 lgG2, lgG3 ou lgG4) que éfornecido pelos genes da região constante de cadeia pesada.

As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anti-corpo específico para um antígeno" são usadas alternadamente aqui com otermo "um anticorpo que especificamente liga a um antígeno". Como aquiusado, um anticorpo que "especificamente liga a DKK1 humano" é intencio-nado referir-se a um anticorpo que liga a DKK1 humano com uma Kd de 5 χ10"9 M ou menos, 2 χ 10"9 M ou menos, ou 1 χ 10"10 M ou menos. Um anti-corpo que "reage cruzado com um antígeno diferente de DKK1 humano" éintencionado a referir-se a um anticorpo que liga àquele antígeno com umaKd de 0,5 χ 10"8 M ou menos, 5 χ 10'9 M ou menos, ou 2 χ 10'9 M ou menos.Um anticorpo que "não reage cruzado com um antígeno particular" é inten-cionado a referir-se a um anticorpo que liga àquele antígeno, com uma Kd de1,5 χ 10"8 M ou mais, ou uma K0 de 5'10 χ 10"8 M ou 1 χ 10'7 M ou mais. Emcertas modalidades, tais anticorpos que não reagem cruzado com o antígenoexibem essencialmente ligação indetectável contra estas proteínas em en-saios de ligação padrões.

Como aqui usado, um anticorpo que "inibe ligação de DKK1 paraum receptor de superfície celular" tal como LRP, Fz ou Krm, refere-se a umanticorpo que inibe ligação de DKK1 ao receptor com uma K de 1 nM oumenos, 0,75 nM ou menos, 0,5 nM ou menos, ou 0,25 nM ou menos.

Como aqui usado, "osteólise" refere-se a uma diminuição emdensidade óssea que pode ser devido a vários mecanismos de ação incluin-do, por exemplo, atividade de osteoblasto diminuída, atividade de osteoclas-to aumentada. Osteólise, portanto, abrange mecanismos que genericamenteafetam densidade óssea mineral. Como aqui usado, um anticorpo que "inibeatividade osteolítica" é intencionado â referir-se a um anticorpo que inibeperda de densidade óssea aumentando a formação de osso ou bloqueandouma ressorção óssea.

O termo "C" ou "C", como aqui usado, é intencionado a referir-seà taxa de associação de uma interação de anticorpo-antígeno particular, en-quanto que o termo "Kdis" ou "KD," como aqui usado, é intencionado a referir-se à taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular.

O termo "Kd", como aqui usado, é intencionado a referir-se à constante dedissociação que é obtida da razão de Kd para C (isto é Kd/C) e é expressadacomo uma concentração molar (M). Valores de Kd para anticorpos podemser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um méto-do para determinar a Kd de um anticorpo é usar a ressonância de plasmonde superfície, por FMAT, ou usar um sistema de biossensor tal como umsistema de Biacore®.

Como aqui usado, o termo "afinidade" refere-se à resistência deinteração entre o anticorpo e o antígeno nos sítios antigênicos simples. Den-tro de cada sítio antigênico, a região variável do "braço" de anticorpo intera-ge através de forças não-covalentes fracas com antígeno em numerosossítios; quanto mais interações, mais forte a afinidade.

Como aqui usado, o termo "avidez" refere-se a uma medida in-formativa da estabilidade geral ou resistência do complexo de anticorpo-antígeno. É controlado através de três fatores principais: afinidade de epíto-po de anticorpo; a valência do antígeno e anticorpo; e o arranjo estruturaldas partes interagentes. Por fim estes fatores definem a especificidade doanticorpo que é a probabilidade que o anticorpo particular está ligando a umepítopo de antígeno preciso.

Para adquirir uma sonda de avidez mais alta, um conjugado di-mérico (duas moléculas de JWJ-1 acopladas a um marcador de FACS) podeser construído, desse modo fazendo interações de afinidade baixa (tais co-mo com o anticorpo de linha germinativa) mais facilmente detectado porFACS. Além disso, outros meios para aumentar a avidez da ligação de antí-geno envolvem gerar dímeros ou multímeros de quaisquer das construçõesde fibronectina descritas aqui dos anticorpos de DKK1 ou DKK4. Tais multí-meros podem ser gerados através de ligação covalente entre módulos indi-viduais, por exemplo, imitando a ligação do término C ao N natural ou imi-tando os dímeros de anticorpo que são unidos através de suas regiões cons-tantes. As ligações modificadas na interface de Fc/Fc podem ser covalentesou não-covalentes. Além disso, pares de dimerização ou multimerização di-ferentes de Fc podem ser usados em DKK1 ou híbridos de DKK4 para criartais estruturas de ordem mais alta.

Como aqui usado, o termo "reatividade cruzada" refere-se a umanticorpo ou população de anticorpos que ligam a epítopos em outros antí-genos. Isto pode ser causado por avidez ou especificidade baixas do anti-corpo ou por antígenos distintos múltiplos tendo epítopos idênticos ou bemparecidos. Reatividade cruzada às vezes é desejável quando um quiser liga-ção geral a um grupo relacionado de antígenos ou ao tentar marcação deespécies cruzadas quando a seqüência de epítopo de antígeno não for alta-mente conservada em evolução.

Como aqui usado, o termo "afinidade alta" ou "especificidade alta"para um anticorpo de IgG refere-se a um anticorpo que tem uma Kd de 10"8 Mou menos, 10'9 M ou menos, ou 10"10 M ou menos para um antígeno alvo. Po-rém, ligação de "afinidade alta" pode variar para outros isótipos de anticorpo.

Por exemplo, ligação de "afinidade alta" para um isótipo de IgM refere-se a umanticorpo tendo uma Kd de 10"7 M ou menos, ou 10"8 M ou menos.

Como aqui usado, o termo "sujeito" inclui qualquer humano ouanimal não-humano.

O termo "animal não-humano" inclui todos os vertebrados, porexemplo, mamíferos e não-mamíferos, tais como primatas não-humanõs,ovelhas, cachorros, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

Como aqui usado, o termo, "otimizado" significa que uma se-qüência de nucleotídeo foi alterada para codificar uma seqüência de amino-ácido usando códons que são preferidos na célula ou organismo de produ-ção, e/ou a seqüência de nucleotídeo foi alterada para remover os sítios do-adores de corte ou aceitantes de corte latentes. Tabelas de códon otimiza-das são bem conhecidas na técnica por uma ampla variedade de espécies.

Seqüências para os sítios doadores e aceitantes de corte são também co-nhecidos na técnica e podem ser identificados sítios de corte latentes, porexemplo, por análise de transcrição ou dados de expressão. Células de pro-dução incluem, mas não são limitadas a, uma célula procariótica tal comopor exemplo, uma célula procariótica tal como um baculovírus ou uma bacté-ria (E. coli), ou uma célula eucariótica, por exemplo, levedura (por exemplo,Píchia), uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula de mie-Ioma ou uma célula humana. A seqüência de nucleotídeo otimizada é modi-ficada para reter completamente ou tanto quanto possível a seqüência deaminoácido e o número de resíduo originalmente codificado pela seqüênciade nucleotídeo de partida, que é também conhecida como a seqüência "pa-rental". As seqüências otimizadas aqui foram modificadas para ter códonsque são preferidos nas células de produção, porém a expressão otimizadadestas seqüências em outras células eucarióticas e procarióticas é tambémintencionada aqui. As seqüências de aminoácido codificadas por seqüênciasde nucleotídeo otimizadas são opcionalmente referidas como otimizadas.

Em modalidades relacionadas, as seqüências de polipeptídeodas composições neutralizantes de anti-DKK1/4 da invenção, e os nucleotí-deos que as codificam, são preferivelmente otimizadas para produção e usoclínico. Características que podem ser otimizadas para uso clínico incluem,mas não são limitadas a, por exemplo, meia-vida, farmacocinética (PK), an-tigenicidade, função efetora, liberação de FcRnl e resposta do paciente in-cluindo atividades da citotoxicidade de célula dependente de anticorpo(ADCC) ou da citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

Como aqui usado, "doenças associadas a DKK1" ou "doençasassociadas a DKK4" incluem, mas não são limitadas a, lesões osteolíticasespecialmente lesões osteolíticas associadas a um mieloma, especialmenteum mieloma múltiplo, ou com cânceres de osso, mama, cólon, melanõcitos,hepatócitos, epitélio, esôfago, cérebro, pulmão, próstata ou pâncreas ou me-tástase dos mesmos; perda óssea associada à transplantação. Outras doen-ças ou distúrbios incluem mas não são limitados a, por exemplo, osteossar-coma, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular (HCC), mieloma incluin-do mieloma múltiplo, diabetes, obesidade, definhamento muscular, doençade Alzheimer, osteoporose, osteopenia, reumatismo, colite e/ou perda decabelo indesejada.

Como aqui usado, um "tratamento" é uma intervenção executa-da com a intenção de impedir o desenvolvimento ou alterar a patologia deum distúrbio. Conseqüentemente, "tratamento" refere-se a tratamento tera-pêutico e medidas profilácticas ou preventivas. Aqueles em necessidade detratamento incluem aqueles já com o distúrbio como também aqueles emque o distúrbio é para ser prevenido. Em tratamento de tumor (por exemplo,câncer), um agente terapêutico pode diretamente diminuir a patologia decélulas tumorais, ou tornar as células tumorais mais suscetível ao tratamentoatravés de outros agentes terapêuticos, por exemplo, radiação e/ou quimio-terapia. A "patologia" de câncer inclui todos os fenômenos que comprome-tem o bem-estar do paciente. Esta inclui, sem limitação, crescimento anor-mal ou incontrolável de células, metástase, interferência com o funcionamen-to normal de células vizinhas, liberação de citocinas ou outros produtos se-cretários em níveis anormais, supressão ou agravação de resposta inflama-tória ou imunológica, etc.

Tratamento de pacientes que sofrem de sintomas clínicos, bioquími-cos, radiológicos ou subjetivos da doença, tais como osteólise, pode incluir aliviaralguns ou todos tais sintomas ou reduzir a predisposição à doença.

Em geral, uma composição neutralizante de anti-DKK1/4 da in-venção impede/trata, ou melhora as doenças relacionadas a Wnt associa-das a DKK1 ou DKK4 ou ambos, mas não doenças associadas a DKK2,DKK3 ou com outros moduladores da via de Wnt.

Vários aspectos da invenção são descritos em mais detalhesnas subseções a seguir.

A via de Wnt é um regulador principal da diferenciação de célu-las-tronco mesenquimais (MSC) em osteoblastos. É também um fator desobrevivência importante para osteoblastos ativos. Dickkopf-1 (DKK1) é umantagonista da via de Wnt expresso predominantemente em osso em adul-tos e é sobre-regulado em pacientes de mieloma com lesões osteolíticas.Um anticorpo de anti-DKK1/4 de neutralização é um agente verdadeiramenteanabólico que age através do aumento da atividade osteoblástica enquantosimultaneamente reduz a atividade osteoclastóica. Em contraste, fármacosatuais tais como PTH, que são comercializados como agentes anabólicos,de fato aumentam os marcadores associados tanto ao osteoblasto comoosteoblastos.

Fornecido na invenção são anticorpos policlonais e monoclonaisselecionados para ligar a DKK1. Um anticorpo preferido tem uma afinidadede menos de 10 pM contra DKK1 humano. Em algumas modalidades, asreações cruzadas de anticorpo de anti-DKK1 com DKK4 (Kd~300 pM) masnão DKK2 (análise de afinidade contínua).

Um epítopo preferido para um anticorpo de anti-DKK1 ou anti-DKK4 é mapeado no domínio de Cys-2 (AAs 189-263) que é conhecido serresponsável pela ligação de LRP6 e Kremen. Em uma modalidade, o epítopoinclui pelo menos seis, e no máximo trinta, resíduos de aminoácido do domí-nio de Cys-2 de um Polipeptídeo de DKK1 ou um de DKK4. Em uma certamodalidade, o epítopo inclui uma extensão de pelo menos seis aminoácidoscontíguos. Em outras modalidades, o sítio de ligação preferido é não-linear,isto é, inclui resíduos de aminoácido não-contíguos. Em algumas modalida-des, ligação depende da N-glicosilação. Apenas um sítio de N-glicosilação éprognosticado, no resíduo 256 no domínio de Cys-2.

Na presente invenção, um anticorpo de anti-DKK1 de neutraliza-ção bloqueia a interação de DKK1 com LRP6 em ELISA e ensaios de liga-ção de superfície celular. Como esperado este eficazmente neutraliza a ati-vidade supressiva de Wntde DKK1 a EC5o's abaixo de 1 nM in vitro.

Em um modelo in vitro de diferenciação de osteoblasto, célulasde 10T1/2 de camundongo são tratadas com Wnt3A para estimular a secre-ção de fosfatase alcalina (AP), um marcador para atividade de osteoblasto.DKK1 bloqueia a produção de AP neste modelo e os anticorpos da invençãorevertem completamente esta inibição.

Em certas modalidades, um anticorpo da invenção exibe farma-cocinética linear de dose (AUC) em camundongos, com uma meia-vida ter-minal dependente de dose de 35-96 horas em camundongos em uma dosede 20-200 pg/camundongo.

Usando o modelo intratibial de metástase de tumor de próstataosteolítico, os anticorpos da invenção inibem dano de osso cortical induzidopor tumor. Efeitos no osso trabecular são perplexos neste modelo pela ob-servação que implantes de tumor e implantes imitados causam dano mecâ-nico ao osso, que resulta em um aumento inicial no osso tecido que é remo-delado depois, desse modo causando uma diminuição evidente no volumede osso. Em uma certa modalidade, um anticorpo da invenção aumenta aprodução de osso tecido em tumor e simula tíbias implantadas e inibe a di-minuição no volume de osso acompanhando remodelagem.

Em modalidades relacionadas, alterações nos marcadores deosso (osteocalcina, sRANKL, OPG1 AP, TRAP) são usadas para demonstrarefeitos clínicos de anticorpos da invenção em doenças relacionadas a osso eprognosticar resultados clínicos de tratamentos com níveis farmaceutica-mente eficazes de um anticorpo de anti-DKK1 de neutralização como forne-cido aqui. Krm liga-se a DKK aproximadamente na mesma região como L-RP. Krm necessário para inibição de sinal de Wnt por meio de interação deDKK com LRP. Krm-DKK-LRP complexado para ser interiorizado para desa-tivação da via dé Wnt.

Uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização da invençãopreferivelmente liga DKK1 ou DKK4, bloqueando sua interação com LRPe/ou Krm1 assim neutralizando os efeitos de DKK1 ou DKK4 na via de sinali-zação de Wnt. Reativação da via de Wnt ocorre apenas onde DKK1 e/ouDKK4 estão limitados.

Ensaios padrões para avaliar a habilidade de ligação dos anticor-pos para DKK1 de várias espécies são conhecidos na técnica, incluindo porexemplo, ELISAs, western blot e RIAs. Ensaios adequados são descritos emdetalhes nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de liga-ção) dos anticorpos também pode ser avaliada por ensaios padrões conhecidosna técnica, tais como por análise de Biacore, ensaio de BioVeris SET, FMAT,quimiluminescência, e/ou ensaios de inibição ou ensaios de liberação de sinalde SPR. Ensaios são descritos para avaliar os efeitos dos anticorpos nas pro-priedades funcionais de DKK1 em mais detalhes nos Exemplos.

Conseqüentemente, um anticorpo que "inibe" uma ou mais des-tas propriedades funcionais de DKK1 (por exemplo, bioquímicas, imunoquí-micas, atividades biológicas celulares, fisiológicas ou outras, ou outras) co-mo determinado de acordo com as metodologias conhecidas na técnica edescritas aqui, será entendido referir-se a uma diminuição estatisticamentesignificativa na atividade particular com relação àquela vista na ausência doanticorpo (por exemplo, ou quando um anticorpo de controle de especificida-de irrelevante estiver presente). Um anticorpo que inibe a atividade dos efei-tos de DKK1 tais como diminuição estatisticamente significativa em pelo me-nos 10% do parâmetro medido, por pelo menos 50%, 80% ou 90%, e emcertas modalidades um anticorpo da invenção pode inibir mais que 95%,98% ou 99% da atividade funcional de DKK1.

MEMBROS da FAMÍLIA Dickkopf

Metabolismo de osso apropriado envolve uma rede complexa devias reguladoras e interconexões entre osteoblastos, osteoclastos e o estro-ma circunvizinho. Desequilíbrios nestes mecanismos reguladores são envol-vidos em condições osteolíticas tais como osteoporose, lesões osteolíticasinduzidas por tumor, transplante renal e hepático induzido por perda de os-so, e perda óssea induzida por terapia anti-hormonal. Estas condições po-dem ter sintomas severos incluindo dor de osso, fraturas, compressão verte-bral, e mobilidade reduzida. A maioria dos tratamentos aprovados ou corren-temente sob avaliação clínica atua predominantemente inibindo a função dososteoclastos. Por exemplo, bisfosfonatos tais como ácido zoldrônico (Zome-ta) são o padrão atual de cuidado e atuam inibindo a função dos osteoclas-tos e sobrevivência. Enquanto os bisfosfonatos sejam em geral eficazes,alguns pacientes não respondem robustamente ou descontinuam o uso de-vido à toxicidade renal ou osteonecrose [Markowitz 2003] [Ruggiero 2004].Além disso há fármacos investigatórios múltiplos que alvejam desenvolvi-mento de osteoclastos tal como anticorpos de neutralização de RANKL e M-CSF, ou função dos osteoclastos tal como inibidores de Catepsina K.

Estimulação da atividade de osteoblasto forneceria um meca-nismo novo para tratar doença osteolítica. A via de Wnt representa um papelprincipal na diferenciação e atividade de osteoblasto, enquanto a família deDickkopf (DKK) de antagonistas foi identificada em particular como regulado-res fundamentais deste processo in vitro (vide [Krishnan 2006] para revisão).In vitro, Wnt é um fator de sobrevivência e diferenciação de osteoblastosessencial. Validação clínica para o papel da via de Wnt é fornecida atravésde mutações no co-receptor de Wnt, LRP5. Mutações de inativação em L-RP5 resultam em síndrome de osteOporose-pseudoglioma (OPPG) [Ai 2005],enquanto mutações de ativação resultam em massa de osso alta [Boyden2002]. Estes mutações de ativação são encontradas no domínio extracelulare foram demonstradas prejudicar a ligação à família de Dickkopf (DKK) dosantagonistas de Wnt.

DKK1 foi relatado ser sobre-expressado em células de mielomade pacientes com lesões de osso mas ausente em células plasmáticas nor-mais ou em células plasmáticas de pacientes sem lesões de osso [Tian2004][Politou 2006]. Uma tal sobre-expressão de DKK1 através de célulasde mieloma pode transtornar o equilíbrio normal entre os osteoblastos e os-teoclastos bloqueando a diferenciação dos osteoblastos, e desse modo pro-movendo ressoíção óssea. Além disso, alguns dos tratamentos antitumorusados para mieloma, tais como dexametasona, foram relatados sobre-regular DKK1 [Ohnaka 2004]. Portanto, um anticorpo de neutralização deanti-DKK1 deveria permitir reativação da via de Wnt em lesões osteolíticas,ao mesmo tempo não afetando a sinalização de Wnt em outros tecidos ondeos níveis de DKK1 são relativamente baixos ou onde os outros antagonistaspredominam. Em adultos, DKK1 foi relatado ser altamente expresso apenasem osso [Li 2006], sugerindo um papel contínuo para DKK1 na regulação dometabolismo de osso em adultos.

Camundongos transgênicos que sobre-expressam Wntl em te-cido de mama desenvolvem carcinomas mamários [Tsukamoto 1988] e-90% dos cânceres colorretais humanos têm mutações em APC ou β-catenina, dois componentes citoplásmicos da via de Wnt [Morin1997][Rowan 2000]. Este tipo de evidência aumenta as preocupações queativação da via de Wnt pudesse ser um risco para iniciação ou progressãode tumor aumentada. Além disso, DKKs são sub-reguladas em tumores co-lorretais e melanomas, sugerindo um papel supressivo potencial de tumor.

Um polipeptídeo de DKK da invenção inclui DKK1 (SEQ IDNO:1) e DKK4 (SEQ ID NO:124), como também DKK2 (SEQ ID NO: 122) eDKK3 (SEQ ID NO:123). Membros da família de DKK têm dois domínios deCYS (CYS1 e CYS2) como mostrados na Tabela A - Membro da família deDKK1 PiIeUp. Proteínas de DKK contêm um ácido peptídeo sinal N-terminal,dois domínios de CYS contendo agrupamentos de resíduos de cisteína se-parados por uma região de Iigador divergente, e um sítio de N-glicosilaçãoC-terminal potencial. O domínio de CYS2 em DKK4 tem uma função, de liga-ção de lipídio que pode facilitar as interações de WNT/DKK com a membra-na plasmática. N°. de ac. de OMIM. 605417.

Tabela A: Membro da Família de DKK1 PileUp

<table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table>

ANTICORPOS CONTRA DKK1 E DKK4

Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção é espe-cífico a uma proteína de DKK humana. Em uma modalidade mais preferida,o anticorpo da invenção.

Um anticorpo de neutralização de DKK1 ou DKK4 é distinto dasmodificações da via de Wnt que foram ligadas à promoção de tumor. A viade Wnt é regulada por uma rede complexa de Iigandos extracelulares, recep-tores e antagonistas dos quais DKK1 é apenas um. Devido à expressão res-trita de DKK1 nos adultos e sua redundância funcional com outros antago-nistas de Wnt, um anticorpo de DKK1 de neutralização é improvável de cau-sar ativação difundida da sinalização de Wnt ou portanto, tumorigênese. Istoé também suportado por duas observações: primeiro, ativando mutações deLRP5 (inibindo ligação de DKK) induz um fenótipo de massa de osso altamas não tem nenhum risco de câncer aumentado evidente [Moon 2004], en-quanto camundongos nulos de DKK1 heterozigoto ou de Doubleridge temníveis de DKK1 diminuídos, fenótipo de massa de osso alta, mas nenhumataxa aumentada relatada de formação de tumor [MacDonaId 2004].

Um anticorpo de anti-DKK1 deveria positivamente impactar adoença osteolítica induzida por mieloma ao mesmo tempo não aumentandoo risco de tumorigênese de novo. É esperado que um tal anticorpo fosse u-sado em combinação com quimioterapias antitumorais e possivelmente comfármacos de antirressorção de osso que inibem função dos osteoclastos.

ANTICORPOS POLICLONAIS

Anticorpos da invenção podem ser anticorpos policlonais, anti-corpos policlonais especialmente humanos. Policlonais são derivados dosoro agrupado de animais imunizados ou de humanos selecionados.

ANTICORPOS MONOCLONAIS

Anticorpos da invenção são preferivelmente os anticorpos mo-noclònais humanos, tais como os isolados e estruturalmente caracterizados,e,g., nos Exemplos 1-8. Seqüências de aminoácido de Vh específicas dosanticorpos são mostradas, por exemplo, em SEQ ID NOs: 2-20. Seqüênciasde aminoácido de Vl específicas dos anticorpos são mostradas, por exem-plo, em SEQ ID NOs: 21-39.

Uma seqüência de aminoácido de Vh do anticorpo pode ser oti-mizada para expressão em uma célula mamífera, por exemplo, tal como aseqüência mostrada em SEQ ID NO: 119. Uma seqüência de aminoácido deVl dos anticorpos pode ser otimizada para expressão em uma célula mamí-fera, por exemplo, tal como a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 118. I-gualmente, as seqüências podem ser otimizadas para expressão, por exem-plo, em levedura, bactérias, hamster e outras células, dependendo de quesistema de expressão é preferido para a característica sendo otimizada. Ou-tros anticorpos da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, aindatêm pelo menos 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidadenas regiões de CDR com as regiões de CDR descritas nas seqüências des-critas acima,

Também, seqüências de nucleotídeo parentais de cadeia leve decomprimento total são mostradas em SEQ ID NOs: 97-100. Seqüências denucleotídeo parentais de cadeia pesada de comprimento total são mostradasem SEQ ID NOs: 101-103. Seqüências de nucleotídeo de cadeia leve decomprimento total otimizadas para expressão em uma célula mamífera sãomostradas em SEQ ID NOs: 104-107. Seqüências de nucleotídeo de cadeiapesada de comprimento total otimizadas para expressão são mostradas emuma célula mamífera em SEQ ID NOs: 108-110. Seqüências de aminoácidode cadeia leve de comprimento total codificadas por seqüências de nucleotí-deo de cadeia leve otimizadas são mostradas em SEQ ID NOs: 111-114.Seqüências de aminoácido de cadeia pesada de comprimento total codifica-das por seqüências de nucleotídeo de cadeia pesada otimizadas são mos-tradas em SEQ ID NOs: 115-117. Outros anticorpos da invenção incluemaminoácidos ou ácidos nucléicos que foram mutados, ainda têm pelo menos60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade às seqüênciasdescritas acima.

Uma vez que cada um destes anticorpos pode ligar a DKK1, asseqüências de cadeia leve de comprimento total, de cadeia pesada de com-primento total Vh, Vl e (seqüências de nucleotídeo e seqüências de aminoáci-do) podem ser "misturadas e emparelhadas" para criar outras moléculas deligação de anti-DKK1 da invenção. Ligação de DKK1 de tais anticorpos "mistu-rados e emparelhados" pode ser testada usando os ensaios de ligação descri-tos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando estas cadeias fo-rem misturadas e emparelhadas, uma seqüência de Vh de um emparelhamen-to de Vh/Vl particular deveria ser substituída com uma seqüência de Vh estru-turalmente similar. Igualmente uma seqüência de cadeia pesada comprimentototal de um emparelhamento de cadeia pesada de comprimento total particu-lar/de cadeia leve de comprimento total deveria ser substituído com uma se-qüência de cadeia pesada de comprimento total estruturalmente similar. I-gualmente, uma seqüência de Vl de um emparelhamento de Vh/Vl particulardeveria ser substituída com uma seqüência de Vl estruturalmente similar. I-gualmente uma seqüência de cadeia leve de seqüência de cadeia leve decomprimento total de um emparelhamento de cadeia pesada de comprimentototal particular/de cadeia leve de comprimento total deveria ser substituídacom uma seqüência de cadeia leve de comprimento total estruturalmente si-milar. As seqüências de cadeia leve de comprimento total e de cadeia pesadade comprimento total, Vh, Vl dos anticorpos da presente invenção são particu-Iarmente tratáveis mediante mistura e emparelhamento, uma vez que estesanticorpos usam seqüências de cadeia leve de comprimento total e de cadeiapesada de comprimento total, Vh, Vl derivadas das mesmas seqüências delinha germinativa e desse modo exibem similaridade estrutural.

Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção fornece um an-ticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo ten-do: uma região de Vh que compreende uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-20 e 119; e uma regiãode Vl que compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupoque consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 118; em que o anticorpo especifica-mente liga a DKK1.

Exemplos de combinações de cadeia pesada e leve incluem:uma região de Vh que compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID NO:2 e uma região de Vl que compreende a seqüência de aminoácido SEQ IDNO: 21; ou uma região de Vh que compreende a SEQ ID NO: 3 e uma regiãode Vl que compreende a SEQ ID NO: 22; ou uma região de Vh que compre-ende a SEQ ID NO: 4 e uma região de Vl que compreende a SEQ ID NO:23; ou uma região de Vh que compreende a SEQ ID NO: 5 e uma região deVl que compreende a SEQ ID NO: 24; ou uma região de Vh que compreen-de a SEQ ID NO: 6 e uma região de Vl que compreende a SEQ ID NO: 25;ou uma região de Vh que compreende a SEQ ID NO: 7 e uma região de Vlque compreende a SEQ ID NO: 28; ou uma região de Vh que compreende aSEQ ID NO: 8 e uma região de Vl que compreende a SEQ ID NO: 29; ouuma região de Vh que compreende a SEQ ID NO: 9 e uma região de Vl quecompreende a SEQ ID NO: 30; ou uma região de Vh que compreende aSEQ ID NO: 10 e uma região de Vl que compreende a SEQ ID NO: 31; ouuma região de Vh que compreende a SEQ ID NO: 11 e uma região de Vlque compreende a SEQ ID NO: 32; ou uma região de Vh que compreende aSEQ ID NO: 12 e uma região de Vl que compreende a SEQ ID NO: 33; ouuma região de Vh que compreende a SEQ ID NO: 119 e uma região de Vlque compreende a SEQ ID NO: 118.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonalisolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo tendo: uma cadeia pe-sada de comprimento total que compreende uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 115-117; e uma cadeialeve de comprimento total que compreende uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111-114.

Desse modo, exemplos de combinações de cadeia pesada decomprimento total e de cadeia leve de comprimento total, respectivamente,incluem: SEQ ID NO: 115 com SEQ ID NO: 111; ou SEQ ID NO: 116 comSEQ ID NO: 112; ou SEQ ID NO: 117 com SEQ ID NO: 113; ou SEQ ID NO:117 com SEQ ID NO: 114.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonalisolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo compreendendo umacadeia pesada de comprimento total codificada por uma seqüência de nu-cleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 101-103; euma cadeia leve de comprimento total codificada por uma seqüência de nu-cleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 97-100.

Desse modo, exemplos de nucleotídeos que codificam cadeiaspesadas e leves de comprimento total, respectivamente, que podem sercombinadas incluem: SEQ ID NO: 101 e 97; ou SEQ ID NO: 102 e 98; ouuma SEQ ID NO: 103 e 99; ou SEQ ID NO: 103 e 100.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo mono-clonal isolado ou porção de ligação de antígeno que foi otimizada para ex-pressão na célula tendo: uma cadeia pesada de comprimento total que com-preende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consisteem SEQ ID NOs: 108-110; e uma cadeia leve de comprimento total quecompreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que con-siste em SEQ ID NOs: 104-107.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece anticorpos quecompreendem a cadeia pesada e cadeia leve CDRIs, CDR2s e CDR3s dosanticorpos, ou combinações das mesmas. As seqüências de aminoácido dasCDRIs de Vh dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20,e 49-56. As seqüências de aminoácido das CDR2s de Vh dos anticorpos sãomostradas em SEQ ID NOs: 2-20 e 57-64. As seqüências de aminoácido dasCDR3s de Vh dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 2-20 e 65-72.As seqüências dè aminoácido das CDRIs de Vl dos anticorpos são mostra-das em SEQ ID NOs: 21-39 e 73-80. As seqüências de aminoácido das C-DR2s de Vl dos anticorpos são mostradas em SEQ ID NOs: 21-39 e 81-88.

As seqüências de aminoácido das CDR3s de Vl dos anticorpos são mostra-das em SEQ ID NOs: 21-39 e 89-96. As regiões de CDR são delineadas u-sando o sistema de Kabat (Kabat, Ε. A., et al., 1991 Sequences of Proteinsof Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health andHuman Services, Publicação de NIH No. 91-3242).

Dado que cada um destes anticorpos pode ligar a DKK1 e queespecificidade de ligação de antígeno é fornecida primariamente pelas regi-ões de CDR1, 2 e 3, as seqüências de CDR1, 2 e 3 de Vh e as seqüênciasde CDR1, 2 e 3 de Vl podem ser "misturadas e emparelhadas" (isto é, CDRsde anticorpos diferentes pode ser misturadas e emparelhadas, embora cadaanticorpo tenha que conter uma CDR1, 2 e 3 de Vh e uma CDRI1 2 e 3 deVl para criar outras moléculas de ligação de anti-DKK1 da invenção. Ligaçãode DKK1 de tais anticorpos "misturados e emparelhados" pde ser testadausando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo,ELISAs). Quando seqüências de CDR de Vh são misturadas e emparelha-das, as seqüência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência de Vhparticular deveriam ser substituídas com uma(s) seqüência(s) de CDR estru-turalmente similar(es). Igualmente, quando as seqüências de CDR de Vl sãomisturadas e emparelhadas, a seqüência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 deuma seqüência de Vl particular deveria ser substituída com uma(s) seqüên-cia(s) de CDR estruturalmente similar(es). Além disso, seqüência de CDR1,CDR2 e/ou de CDR3 de uma seqüência de Vh ou de Vl particular específicaou fortuitamente pode ser mutada para criar anticorpos que podem ser tes-tados para características de afinidade ou ligação. Será facilmente evidenteao artesão normalmente versado que novas seqüências de Vh e Vl podemser modificadas substituindo uma ou mais seqüências da região de CDR deVh e/ou Vl com seqüências estruturalmente similares das seqüências deCDR mostradas aqui para anticorpos monoclonais da presente invenção.

Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antí-geno do mesmo tem: uma região de CDR1 de Vh que compreende uma se-qüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:2-5, 8-11, 20 e 49-56; uma região de CDR2 de Vh que compreende uma se-qüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:2-20 e 5.7-64; uma região de CDR3 de Vh que compreende uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-20 e65-72; uma região de CDR1 de Vl que compreende uma seqüência de ami-noácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 73-80;uma região de CDR2 de Vl que compreende uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 81-88; e umaregião de CDR3 de Vl que compreende uma seqüência de aminoácido sele-ciúnada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 89-96; em que oanticorpo especificamente liga a DKK1.

Em uma certa modalidade, o anticorpo consiste em: uma regiãode CDR1 de Vh que compreende a SEQ ID NO: 2; uma região de CDR2 deVh que compreende a SEQ ID NO: 6; uma região de CDR3 de Vh que com-preende a SEQ ID NO: 7; uma região de CDR1 de Vl que compreende aSEQ ID NO: 21; uma região de CDR2 de Vl que compreende a SEQ ID NO:22; e uma região de CDR3 de Vl que compreende a SEQ ID NO: 23.

Em outra modalidade, o anticorpo consiste em: uma região deCDR1 de Vh què compreende a SEQ ID NO: 3; uma região de CDR2 de Vhque compreende a SEQ ID NO: 12; uma região de CDR3 de Vh que com-preende a SEQ ID NO: 13; uma região de CDR1 de Vl que compreende aSEQ ID NO: 24; uma região de CDR2 de Vl que compreende a SEQ ID NO:25; e uma região de CDR3 de Vl que compreende a SEQ ID NO: 26.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo consiste em: uma regiãode CDR1 de Vh que compreende a SEQ ID NO: 4; uma região de CDR2 deVh que compreende a SEQ ID NO: 14; uma região de CDR3 de Vh quecompreende a SEQ ID NO: 15; uma região de CDR1 de Vl que compreendea SEQ ID NO: 27; uma região de CDR2 de Vl que compreende a SEQ IDNO: 28; e uma região de CDR3 de Vl que compreende a SEQ ID NO: 29.

Em outra modalidade, o anticorpo consiste em: uma região deCDR1 de Vh que compreende a SEQ ID NO: 5; uma região de CDR2 de Vhque compreende a SEQ ID NO: 16; uma região de CDR3 de Vh que com-preende a SEQ ID NO: 17; uma região de CDR1 de Vl que compreende aSEQ ID NO: 30; uma região de CDR2 de Vl que compreende a SEQ ID NO:31; e uma região de CDR3 de Vl que compreende a SEQ ID NO: 32.

Em uma certa modalidade, o anticorpo consiste em: uma regiãode CDR1 de Vh que compreende a SEQ ID NO: 8; uma região de CDR2 deVh que compreende a SEQ ID NO: 18; uma região de CDR3 de Vh quecompreende a SEQ ID NO: 19; uma região de CDR1 de Vl que compreendea SEQ ID NO: 33; uma região de CDR2 de Vl que compreende a SEQ IDNO: 34; e uma região de CDR3 de Vl que compreende a SEQ ID NO: 35.Em outra modalidade, o anticorpo consiste em: uma região deCDR1 de Vh que compreende a SEQ ID NO: 9; uma região de CDR2 de Vhque compreende a SEQ ID NO: 10; uma região de CDR3 de Vh que com-preende a SEQ ID NO: 11; uma região de CDR1 de Vl que compreende aSEQ ID NO: Vh 36; uma região de CDR2 de Vl que compreende a SEQ IDNO: 37; e uma região de CDR3 de Vl que compreende a SEQ ID NO: 38.

Como aqui usado, um anticorpo humano compreende regiões pe-sadas ou de Vl ou cadeias pesadas ou leves de comprimento total que são "oproduto de" ou "derivadas de" uma seqüência de linha germinativa particular seas regiões variáveis ou cadeias de comprimento total do anticorpo forem obti-das de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linha germinativa hu-mana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico carregandogenes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou triar umabiblioteca de genes de imunoglobulina humana exibida no fago com o antígenode interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" umaseqüência de imunoglobulina de linha germinativa humana pode ser identifica-do como tal comparando a seqüência de aminoácido do anticorpo humano àsseqüências de aminoácido de imunoglobulinas de linha germinativa humanas eselecionando a seqüência de imunoglobulina de linha germinativa humana queestá na seqüência mais próxima (isto é, maior% de identidade) à seqüência doanticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de"uma seqüência de imunoglobulina de linha germinativa humana particular podeconter diferenças de aminoácido quando comparado à seqüência de linha ger-minativa, por exemplo, devido às mutações somáticas de ocorrência natural ouintrodução intencional de mutação loco-direcionada. Porém, um anticorpo hu-mano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico em seqüência deaminoácidos a uma seqüência de aminoácido codificada por um gene de imu-noglobulina de linha germinativa humana e contém resíduos de aminoácido queidentificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparou às se-qüências de aminoácido de imunoglobulina de linha germinativa de outras es-pécies (por exemplo, seqüências de linha germinativa murinas). Em certos ca-sos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, ou pelomenos 95%, ou até mesmo pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico emseqüência de aminoácido à seqüência de aminoácido codificada pelo gene deimunoglobulina de linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano deri-vado de uma seqüência de linha germinativa humana particular exibirá nãomais que 10 diferenças de aminoácido da seqüência de aminoácido codificadapelo gene de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em certos casos, oanticorpo humano pode exibir não mais que 5, ou até mesmo não mais que 4,3, 2, ou 1 diferença de aminoácido da seqüência de aminoácido codificada pelogene de imunoglobulina de linha germinativa.

ANTICORPOS HOMÓLOGOS

Em ainda outra modalidade, um anticorpo da invenção tem se-qüências de aminoácido de cadeia pesada e leve de comprimento total; se-qüências de nucleotídeo de cadeia pesada e leve de comprimento total, se-qüências de nucleotídeo de cadeia pesada e leve de região variável, ou se-qüências de aminoácido de cadeia pesada e leve de região variável que sãohomólogas às seqüências de aminoácido e de nucleotídeo dos anticorposdescritos aqui, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais de-sejadas da composição de anti-DKK1/4 de neutralização da invenção.

Por exemplo, a invenção fornece um anticorpo monoclonal iso-lado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo umaregião de Vh e uma região de VL, em que: a região de Vh compreende umaseqüência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga a uma seqüên-cia de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-20e 119; a região de Vl compreende uma seqüência de aminoácido que é pelomenos 80% homóloga a uma seqüência de aminoácido selecionada do gru-po que consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 118; o anticorpo especificamenteliga a DKK1 e/ou DKK4, e o anticorpo apresenta pelo menos uma das pro-priedades funcionais a seguir: o anticorpo neutraliza ligação de uma proteínade DKK1 a LRP6, Fz e/ou Krm, ou o anticorpo neutraliza ligação de uma pro-teína de DKK4 a LRP, Pz e/ou Krm.

Em um outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo mono-clonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendouma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimentototal, em que: a cadeia pesada de comprimento total compreende uma se-qüência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga a uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 115-117; a cadeia leve de comprimento total compreende uma seqüência de a -minoácido que é pelo menos 80% homóloga a uma seqüência de aminoáci-do selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111-114; o anticorpoespecificamente liga a DKK1, e o anticorpo apresenta pelo menos uma daspropriedades funcionais a seguir: o anticorpo inibe ligação da proteína deDKK1 ao receptor de DKK1 ou o anticorpo inibe ligação do receptor deDKK1 prevenindo ou melhorando osteólise ou o anticorpo inibe ligação dereceptor de DKKQ impedindo ou melhorado lesões osteolíticas ou o anticor-po inibe ligação de receptor de DKKQ prevenindo ou melhorando câncer.

Em outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo monoclonalisolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo umacadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento to-tal, em que: a cadeia pesada de comprimento total compreende uma se-qüência de nucleotídeo que é pelo menos 80% homóloga a uma seqüênciade nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 101-103; a cadeia leve de comprimento total compreende uma seqüência de nu-cleotídeo que é pelo menos 80% homóloga a uma seqüência de nucleotídeoselecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 97-100; o anticorpoespecificamente liga a DKK1, e o anticorpo apresenta pelo menos uma daspropriedades funcionais a seguir: o anticorpo inibe ligação da proteína deDKK1 ao receptor de DKK1 ou o anticorpo inibe ligação de receptor deDKKQ prevenindo ou melhorando osteólise ou o anticorpo inibe ligação dereceptor de DKKQ prevenindo ou melhorando lesões osteolíticas ou o anti-corpo inibe ligação de receptor de DKKQ prevenindo ou melhorando câncer.

Em outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo monoclonalisolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, que foi otimizado paraexpressão em uma célula, compreendendo uma cadeia pesada de compri-mento total e uma cadeia leve de comprimento total, em que: a cadeia pesa-da de comprimento total compreende uma seqüência de nucleotídeo que épelo menos 80% homóloga a uma seqüência de nucleotídeo selecionada dogrupo que consiste em SEQ ID NOs: 108-110; a cadeia leve de comprimentototal compreende uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 80%homóloga a uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que con-siste em SEQ ID NOs: 104-107; o anticorpo especificamente liga a DKK1, eo anticorpo apresenta pelo menos uma das propriedades funcionais a seguir:o anticorpo inibe ligação da proteína de DKK1 ao receptor de DKK1 ou oanticorpo inibe ligação de receptor de DKKQ prevenindo ou melhorando os-teólise ou o anticorpo inibe ligação de receptor de DKKQ prevenindo ou me-lhorando lesões osteolíticas ou o anticorpo inibe ligação de receptor deDKKQ prevenindo ou melhorando câncer.

Em outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo monoclonalisolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, que foi otimizado paraexpressão em uma célula, compreendendo uma região de Vh e uma regiãode VL, em que: a cadeia pesada de comprimento total compreende uma se-qüência de nucleotídeo que é pelo menos 80% homóloga a uma seqüênciade nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 121; acadeia leve de comprimento total compreende uma seqüência de nucleotí-deo que é pelo menos 80% homóloga a uma seqüência de nucleotídeo sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 120; o anticorpo especifica-mente liga a DKK1, e o anticorpo apresenta pelo menos uma das proprieda-des funcionais a seguir: o anticorpo inibe ligação da proteína de DKK1 aoreceptor de DKK1 ou o anticorpo inibe ligação de receptor de DKKQ preve-nindo ou melhorando osteólise ou o anticorpo inibe ligação de receptor deDKKQ prevenindo ou melhorando lesões osteolíticas ou o anticorpo inibeligação de receptor de DKKQ prevenindo ou melhorando câncer.

Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais,duas ou mais, ou três das propriedades funcionais debatidas acima. O anti-corpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humani-zado ou um anticorpo quimérico.

Como aqui usado, a porcentagem de homologia entre as duasseqüências de aminoácido ou duas seqüências de nucleotídeo é equivalenteà porcentagem de identidade entre as duas seqüências. A porcentagem deidentidade entre as duas seqüências é uma função do número de posiçõesidênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é,% homologia = # de posi-ções idênticas/# total de posições x 100), levando em conta o número deintervalos, e o comprimento de cada intervalo que necessita ser introduzidopara alinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação das seqüên-cias e determinação da porcentagem de identidade entre as duas seqüên-cias pode ser realizada usando um algoritmo matemático, como descrito nosexemplos não-limitativos abaixo.

A porcentagem de identidade entre duas seqüências de aminoá-cido pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que foi incorporado no programa A-LIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, umapenalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalode 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre as duas seqüências deaminoácido pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman eWunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) que foi incorporado no programa deGAP no pacote de software de GCG (disponível em http://www.gcg.com),usando ou uma matriz de Blossom 62 ou uma matriz de PAM250, e um pesode intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2,3, 4, 5, ou 6.

Adicional ou alternativamente, as seqüências de proteína dapresente invenção podem também ser usadas como uma "seqüência deconsulta" para executar uma pesquisa junto às bases de dados públicas pa-ra, por exemplo, identificar as seqüências relacionadas. Tais pesquisas po-dem ser executadas usando o programa de XBLAST (versão 2.0) de Alts-chul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de proteína deBLAST podem ser executadas com o programa de XBLAST, contagem = 50,comprimento de palavra = 3 para obter as seqüências de aminoácido homó-logas às moléculas de anticorpo da invenção. Para obter alinhamentos inter-valados para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizadocomo descrito em Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402.Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros predefini-dos dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podemser usados. Vide http:www.nebi.nhn.nih.gov.

ANTICORPOS COM MODIFICAÇÕES CONSERVADORAS

Em certas modalidades, um anticorpo da invenção tem uma re-gião de Vh que consiste em seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 e umaregião de Vl que consistem em seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3, emque uma ou mais destas seqüências de CDR têm seqüências de aminoácidoespecificadas com base nos anticorpos descritos aqui ou modificações con-servadoras das mesmas, e em que os anticorpos retêm as propriedadesfuncionais desejadas da composição de anti-DKK1/4 de neutralização dainvenção. Conseqüentemente, a invenção fornece um anticorpo monoclonalisolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, consistindo em umaregião de Vh que consiste em seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 e umaregião de Vl que consistem em seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3, emque: as regiões de Vh de CDR1 são seqüências que consistem em seqüên-cias de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em seqüências deaminoácido SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56, e modificações conservado-ras das mesmas; a região de Vh de CDR2 são seqüências que consistemem seqüências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em se-qüências de aminoácido SEQ ID NOs: 2-20, 57-64, e modificações conser-vadoras das mesmas; a região de Vh de CDR3 são seqüências que consis-tem em seqüências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste emseqüências de aminoácido SEQ ID NOs: 2-20, 65-72, e modificações con-servadoras das mesmas; as regiões de Vl de CDR1 são seqüências queconsistem em seqüências de aminoácido selecionadas do grupo que consis-te em seqüências de aminoácido SEQ ID NOs: 21-39, 73-80, e modificaçõesconservadoras das mesmas; as regiões de Vl de CDR2 são seqüências queconsistem em seqüências de aminoácido selecionadas do grupo que consis-te em seqüências de aminoácido SEQ ID NOs: 21-39, 81-88, e modificaçõesconservadoras das mesmas; as regiões de Vl de CDR3 são seqüências queconsistem em seqüências de aminoácido selecionadas do grupo que consis-te em seqüências de aminoácido SEQ ID NOs: 21-39, 89-96, e modificaçõesconservadoras das mesmas; o anticorpo especificamente liga a DKK1; e oanticorpo apresenta pelo menos uma das propriedades funcionais a seguir: oanticorpo inibe ligação da proteína de DKK1 ao receptor de DKK1 ou o anti-corpo inibe ligação de receptor de DKKQ prevenindo ou melhorando osteóli-se ou o anticorpo inibe ligação de receptor de DKKQ prevenindo ou melho-rando lesões osteolíticas ou o anticorpo inibe ligação de receptor de DKKQprevenindo ou melhorando câncer.

Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais,duas ou mais, ou três ou mais das propriedades funcionais listadas debati-das acima. Tais anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos,anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.

Em outras modalidades, um anticorpo da invenção tem uma se-qüência de cadeia pesada de comprimento total e uma seqüência de cadeialeve de comprimento total, em que uma ou mais destas seqüências têm se-qüências de aminoácido especificadas com base nos anticorpos descritosaqui ou modificações conservadoras das mesmas, e em que os anticorposretêm as propriedades funcionais desejadas da composição de anti-DKK1/4de neutralização da invenção. Conseqüentemente, a invenção fornece umanticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo,consistindo em uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia levede comprimento total em que: a cadeia pesada de comprimento total temseqüências de aminoácido selecionadas do grupo de SEQ ID NOs: 115-117,e modificações conservadoras das mesmas; e a cadeia leve de comprimentototal tem seqüências de aminoácido selecionadas do grupo de SEQ ID NOs:111-114, e modificações conservadoras das mesmas; o anticorpo especifi-camente liga a DKK1; e o anticorpo apresenta pelo menos uma das proprie-dades funcionais a seguir: o anticorpo inibe ligação da proteína de DKK1 aoreceptor de DKK1 ou o anticorpo inibe ligação de receptor de DKKQ preve-nindo ou melhorando osteólise ou o anticorpo inibe ligação de receptor deDKKQ prevenindo ou melhorando lesões osteolíticas ou o anticorpo inibeligação de receptor de DKKQ prevenindo ou melhorando câncer.

Em outras modalidades, um anticorpo da invenção otimizadopara expressão em uma célula tem uma seqüência de região de Vh e umaseqüência de região de Vl, em que uma ou mais destas seqüências têm se-qüências de aminoácido especificadas com base nos anticorpos descritosaqui ou modificações conservadoras das mesmas, e em que os anticorposretêm as propriedades funcionais desejadas da composição de anti-DKK1/4de neutralização da invenção. Conseqüentemente, a invenção fornece umanticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo,consistindo em uma região de Vh e uma região de Vl em que: a região de Vhtem seqüências de aminoácido selecionadas do grupo de SEQ ID NO: 119,e modificações conservadoras das mesmas; e â região de Vl tem seqüên-cias de aminoácido selecionadas do grupo de SEQ ID NOs: 118, e modifica-ções conservadoras das mesmas; o anticorpo especificamente liga a DKK1 ;e o anticorpo apresenta pelo menos uma das propriedades funcionais a se-guir: o anticorpo inibe ligação da proteína de DKK1 ao receptor de DKK1 ouo anticorpo inibe ligação de receptor de DKKQ prevenindo ou melhorandoosteólise ou o anticorpo inibe ligação de receptor de DKKQ prevenindo oumelhorando lesões osteolíticas ou o anticorpo inibe ligação de receptor deDKKQ prevenindo ou melhorando câncer.

Como aqui usado, o termo "modificações de seqüência conser-vadoras" é intencionado a referir-se às modificações de aminoácido que nãoafetam ou alteram significativamente as características de ligação do anti-corpo que contém a seqüência de aminoácido. Tais modificações conserva-doras incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. Modifica-ções podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção por técnicas pa-drões conhecidas na técnica, tais como mutagênese dirigida e mutagênesemediada por PCR.

Substituições de aminoácido conservadoras são as em que oresíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que temuma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadei-as laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem ami-noácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidi-na), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmi-co), cadeias laterais polares descarregadas (pôr exemplo, glicina, asparagi-na, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias lateraisnão-polares (por exemplo, alanina, valina, léucina, isoleucina, prolina, fenila-lanina, metionina), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina,valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, feni-lalanina, triptofano, histidina). Desse modo, um ou mais resíduos de aminoá-cido podem ser substituídos dentro das regiões de CDR de um anticorpo dainvenção com outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeialateral, e o anticorpo alterado pode ser testado para função retida usando osensaios funcionais descritos aqui.

ANTICORPOS QUE LIGAM AO MESMO EPÍTOPO QUE A COMPOSIÇÃODE ANTI-DKK1/4 DE NEUTRALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos que ligamao mesmo epítopo como as várias composições de anti-DKK1/4 de neutrali-zação da invenção fornecidas aqui ligam. Tais anticorpos adicionais podemser identificados com base em sua habilidade para competição cruzada (porexemplo, para competitivamente inibir a ligação de, em uma maneira estatis-ticamente significativa) com outros anticorpos da invenção em Ensaios deligação de DKK1 padrões. A habilidade de um anticorpo de teste para inibir aligação de anticorpos da presente invenção a DKK1 humano demonstra queo anticorpo de teste pode competir com aquele anticorpo para ligar a DKK1humano; um tal anticorpo pode, de acordo com hipóteses não-limitativas,ligar ao epítopo mesmo ou um relacionado (por exemplo, um estruturalmentesimilar ou espacialmente proximal) em DKK1 humano como o anticorpo como qual ele compete. Em uma certa modalidade, o anticorpo que liga aomesmo epítopo em DKK1 humano como os anticorpos da presente invençãoé um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanospodem ser preparados e isolados como descrito nos Exemplos.

CAMELÍDEO E OUTROS ANTICORPOS DE CADEIA PESADA

Proteínas de anticorpo obtidas de membros da família de cameloe dromedário (Camelus bactrianus e Calelus dromaderius) a incluindo mem-bros mundiais novos tais como espécies de Ihama (Lama paccos, Lamaglama e Lama vicugna) foram caracterizadas com respeito ao tamanho,complexidade estrutural e antigenicidade para sujeitos humanos. Certos an-ticorpos de IgG desta família de mamíferos como encontrado na Nature ca-recem de cadeias leves, e são desse modo estruturalmente distintos da es-trutura quaternária de quatro cadeias típica que tem duas cadeias pesadas eduas leves, para anticorpos de outros animais. Vide PCT/EP93/02214 (WO94/04678 publicado em 3 de março de 1994).

Uma região do anticorpo de camelídeo que é o domínio de vari-ável simples pequeno identificada como Vhh pode ser obtida através de en-genharia genética para render uma proteína pequena tendo afinidade altapor um alvo, resultando em uma proteína derivada de anticorpo de peso mo-lecular baixo conhecida como um "nanocorpo de camelídeo". Vide patenteU. S. número 5.759,808 emitida em 2 de junho de 1998; vide também Stijle-mans, B., et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M., et al.,2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M., et al. 2003 Bioconjugate Chem14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Câncer 89: 456-62; eLauwereys, M., et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Bibliotecas modificadasde anticorpos de camelídeo e fragmentos de anticorpo estão comercialmentedisponíveis, por exemplo, de Ablynx, Ghent, Bélgica. Como com outros anti-corpos de origem não-humana, uma seqüência de aminoácido de um anti-corpo de camelídeo pode ser recombinantemente alterada para obter-seuma seqüência que mais estritamente se assemelha a uma seqüência hu-mana, isto é, o nanocorpo pode ser "humanizado". Desse modo a antigenici-dade natural baixa dos anticorpos de camelídeo para humanos pode sertambém reduzida.

O nanocorpo de camelídeo tem um peso molecular aproxirnada-mente de um décimo do de uma molécula de IgG humana, e a proteína temum diâmetro físico de apenas alguns nanômetros. Uma conseqüência do ta-manho pequeno é a habilidade dos nanocorpos de camelídeo de ligarem aossítios antigênicos que são funcionalmente invisíveis às proteínas de anticorpomaiores, isto é, nanocorpos de camelídeo são úteis como reagentes para de-tectar antígenos que são do contrário secretos usando técnicas imunológicasclássicas, e como possíveis agentes terapêuticos. Desse modo ainda outraconseqüência do tamanho pequeno é que um nanocorpo de camelídeo podeinibir como resultado de ligar-se a um sítio específico em um sulco ou fendaestreita de uma proteína alvo, e conseqüentemente pode servir em uma ca-pacidade que mais estritamente se assemelha à função de um fármaco clás-sico de peso molecular baixo que à de um anticorpo clássico.

O peso molecular baixo e tamanho compacto também resultamem nanocorpos de camelídeo que são extremamente termoestáveis, está-veis em pH extremo e à digestão proteolítica, e fracamente antigênicos. Ou-tra conseqüência é que os nanocorpos de camelídeo passam facilmente dosistema circulatório para tecidos, e até mesmo cruzam a barreira hematoen-cefálica e podem tratar distúrbios que afetam o tecido nervoso. Nanocorpospodem também facilitar o transporte de fármaco ao longo da barreira hema-toencefálica. Vide pedido de patente U. S. 20040161738 publicado em 19 deagosto de 2004. Estas características combinadas com a antigenicidade bai-xa em humanos indicam grande potencial terapêutico. Também, estas molé-culas podem ser expressadas completamente em células procarióticas taiscomo E. colie podem ser expressadas como proteínas de fusão com bacte-riófago e são funcionais.

Conseqüentemente, uma característica da presente invenção éum anticorpo de camelídeo ou nanocorpo tendo afinidade alta por DKK1. Emcertas modalidades aqui, o anticorpo de camelídeo ou nanocorpo é produzi-do naturalmente no animal de camelídeo, isto é, é produzido pelo camelídeoseguindo imunização com DKK1 ou um fragmento de peptídeo do mesmo,usando técnicas descritas aqui para outros anticorpos. Alternativamente, onanocorpo de camelídeo de anti-DKK1/4 de neutralização é modificado, istoé, produzido por seleção por exemplo de uma biblioteca de fago que exibeproteínas de nanocorpo de camelídeo apropriadamente mutageneizadasusando procedimentos de seleção com DKK1 e/ou DKK4 como um alvo co-mo descrito nos exemplos aqui. Nanocorpos modificados podem também serpersonalizados através de engenharia genética para ter uma meia-vida emum sujeito recipiente de 45 minutos a duas semanas.

Além dos anticorpos de Camelídeo, anticorpos de cadeia pesadaocorrem naturalmente em outro animal incluindo mas não limitado, por e-xemplo, certas espécies de tubarão e baiacu (vide, por exemplo, Publicaçãode PCT WO 03/014161). Embora domínios variáveis derivados de tais anti-corpos de cadeia pesada possam ser usados na invenção, o uso de anticor-pos de cadeia pesada derivados de Camelídeo e/ou das seqüências de do-mínio variáveis dos mesmos é preferido otimização, humanizaçao, humane-ering, e outros e/ou para uso clínico em humanos.

ANTICORPOS CRIADOS E MODIFICADOS

Um anticorpo da invenção também pode ser preparado usandoum anticorpo que tem uma ou mais das seqüências de Vh e/ou Vl mostradasaqui como material de partida para criar um anticorpo modificado, cujo anti-corpo modificado pode ter propriedades alteradas do anticorpo de partidaUm anticorpo pode ser modificado modificando um ou mais resíduos dentrode uma ou ambas regiões variáveis (i. e., Vh e/ou VL), por exemplo dentro deuma ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estru-tura. Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser modificado modi-ficando resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo paraalterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.

Um tipo de engenharia de região variável que pode ser executadaé enxerto de CDR. Anticorpos interagem predominantemente com antígenosalvos através de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regi-ões de determinação de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs).Por este motivo, ás seqüências de aminoácido dentro das CDRs são mais di-versas entre anticorpos individuais que nas seqüências fora das CDRs. Porqueas seqüências de CDR são responsáveis pela maioria das interações de anti-corpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem aspropriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos construindo veto-res de expressão que incluem as seqüências de CDR do anticorpo de ocorrên-cia natural específico enxertado nas seqüências de estrutura de um anticorpodiferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al.,1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen,C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Patente U. S. N°.5.225.539 para Winter, e Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e6.180.370 para Queen et al.)

Conseqüentemente, outra modalidade da invenção refere-se aum anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno domesmo, compreendendo uma região de Vh que compreende as seqüênciasde CDR1 tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo queconsiste em SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56; seqüências de CDR2 tendouma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQID NOs: 2-20 e 57-64; seqüências de CDR3 tendo uma seqüência de ami-noácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-20 e 65-72,respectivamente; e uma região de Vl que tem seqüências de CDR1 tendouma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQID NOs: 21-39 e 73-80; seqüências de CDR2 tendo uma seqüência de ami-noácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 81-88;e seqüências de CDR3 que consistem em uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 89-96, respec-tivamente. Desse modo, tais anticorpos contêm as seqüências de CDR deVh e Vl de anticorpos monoclonais, ainda podem conter seqüências de es-trutura diferentes destes anticorpos.

Tais seqüências de estrutura podem ser obtidas de bases dedados de DNA públicas ou referências publicadas que incluem seqüênciasde gene de anticorpo de linha germinativa. Por exemplo, seqüências de DNAde linha germinativa para genes humanos de cadeia pesada e região de Vlpodem ser encontrados na base de dados "VBase" de seqüência de linhagerminativa humana (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam. ac.uk/vbase), como também em Kabat, Ε. A., et ai., 1991 Sequences of Prote-ins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health andHuman Services, Publicação de NIH No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al.,1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol.24:827-836; os conteúdos de cada uma destas são expressamente incorpo-rados aqui por referência.

Um exemplo de seqüências de estrutura para o uso nos anticorposda invenção são aquelas que são estruturalmente similares às seqüências deestrutura usadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, se-qüências de consenso e/ou seqüências de estrutura usadas por anticorpos mo-noclonais da invenção. As seqüências de CDR1, 2 e 3 de Vh, e as seqüênciasde CDR1, 2 e 3 de Vl podem ser enxertadas nas regiões de estrutura que têma seqüência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina de linhagerminativa da qual a seqüência de estrutura deriva, ou as seqüências de CDRpodem ser enxertadas nas regiões de estrutura que contêm uma ou mais mu-tações quando comparadas às seqüências de linha germinativa. Por exemplo,foi observado que em certas circunstâncias é benéfico mutar os resíduos dentrodas regiões de estrutura para manter ou intensificar o antígeno que liga a habi-lidade do anticorpo (vide por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089;5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al).

Outro tipo de modificação de região variável é mutar os resíduosde aminoácido dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou de CDR3 de Vh e/ouVL, para assim melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo,afinidade) do anticorpo de interesse, conhecido como "maturação de afini-dade". Mutagênese loco-direcionada ou mutagênese mediada por PCR podeser executada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito na ligação de an-ticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado emensaios in vitro ou in vivo como descritos aqui e fornecidos nos Exemplos.Modificações conservadoras (como debatidas acima) podem ser introduzi-das. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoá-cidos. Além disso, tipicamente não mais que um, dois, três, quatro ou cincoresíduos são alterados dentro de uma região de CDR.

Conseqüentemente, em outra modalidade, a invenção fornececomposição de anti-DKK1/4 de neutralização isolada, ou porções de ligaçãode antígeno da mesma, consistindo em uma região de Vh que tem: uma re-gião de CDR1 de Vh que consiste em uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que tem SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56 ou uma se-qüência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições,deleções ou adições de aminoácidos quando comparadas às SEQ ID NOs:2-5, 8-11, 20, 49-56; uma região de CDR2 de Vh que tem uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-20 e 57-64, ou uma seqüência de aminoácido que tem uma, duas, três, quatro oucinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos quando comparadaàs SEQ ID NOs: 2-20 e 57-64; uma região de CDR3 de Vh que tem uma se-qüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:2-20 e 65-72, ou uma seqüência de aminoácido que tem uma, duas, três,quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos quandocomparada às SEQ ID NOs: 2-20 e 65-72; uma região de CDR1 de Vl quetem uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste emSEQ ID NOs: 21-39 e 73-80, ou uma seqüência de aminoácido que tem u-ma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de ami-noácidos quando comparada às SEQ ID NOs: 21-39 e 73-80; uma região deCDR2 de Vl que tem uma seqüência de aminoácido selecionada do grupoque consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 81-88, ou uma seqüência de aminoá-cido que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ouadições de aminoácidos quando comparada às SEQ ID NOs: 21-39 e 81-88;e uma região de CDR3 de Vl que tem uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 89-96, ou uma se-qüência de aminoácido que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substitui-ções, deleções ou adições de aminoácidos quando comparada às SEQ IDNOs: 21-39 e 89-96.

Anticorpos modificados da invenção incluem aqueles em que modi-ficações foram feitas nos resíduos de estrutura dentro de Vh e/ou Vl, por exem-plo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificaçõesde estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por e-xemplo, um método é para "re-mutar" um ou mais resíduos de estrutura para aseqüência de linha germinativa correspondente. Mais especificamente, um anti-corpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura que dife-rem da seqüência de linha germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais re-síduos podem sér identificados comparando as seqüências de estrutura de an-ticorpo às seqüências de linha germinativa das quais o anticorpo é derivado.Para devolver as seqüências de região de estrutura em sua configuração delinha germinativa, as mutações somáticas podem ser "re-mutadas" para a se-qüência de linha germinativa, por exemplo, por mutagênese dirigida ou muta-gênese mediada por PCR. Tais anticorpos "re-mutados" são também intencio-nados a serem abrangidos pela invenção.

Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutar um oumais resíduos dentro da região de estrutura, ou até mesmo dentro de umaou mais regiões de CDR1 para remover os epítopos de célula T para assimreduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Este método é tambémreferido como "desimunização" e é descrito em mais detalhes na publicaçãode Patente U. S. N°. 20030153043 por Carr et al.

Além disso ou como alternativa para modificações feitas dentroda estrutura ou regiões de CDR1 anticorpos da invenção podem ser modifi-cados para incluir modificações dentro da região de'Fc, tipicamente paraalterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia-vida de soro, fixação de complemento, ligação de receptor de Fc, e/ou cito-toxicidade celular antígeno-dependente. Além disso, um anticorpo da inven-ção pode ser modificado quimicamente (por exemplo, uma ou mais metadesquímicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar suaglicosilação, novamente alterar uma ou mais propriedades funcionais do an-ticorpo. Cada uma de estas modalidades é descrita em mais detalhes abai-χο. A numeração de resíduos na região de Fc é à do índice EU de Kabat.

Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modifica-da de modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça éalterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Este método é descritotambém na Patente U. S. N°. 5.677.425 por Bodmer et al. O número de resí-duos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado, por exemplo,para facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar oudiminuir a estabilidade do anticorpo.

Em outra modalidade, a região de dobradiça de FC de um anti-corpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais espe-cificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na regi-ão de interface de domínio de CH2-CH3 do fragmento de dobradiça de Fc demodo que o anticorpo tem ligação de proteína de Staphylococcyl A prejudi-cada (SpA) com relação à ligação de SpA de domínio de dobradiça de Fcnativo. Este método é descrito em mais detalhes na Patente U. S. N°.6.165.745 através de Ward et al.

Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentarsua meia-vida biológica. Vários métodos são possíveis. Por exemplo, umaou mais das mutações a seguir podem ser introduzidas: T252L, T254S,T256F, como descritas na Patente U. S. N°. 6.277.375 para Ward. Alternati-vamente, para aumentar a metade vida biológica, o anticorpo pode ser alte-rado dentro da região de CH1 ou de Cl para conter um receptor de aprovei-tamento que liga o epítopo tirado das duas alças de um domínio de CH2 deuma região de Fc de uma IgG1 como descrito nas Patentes U.S, Nos.5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al.

Em ainda outra modalidades, a região de Fc é alterada substitu-indo pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácidodiferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um oumais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácidodiferente de modo que o anticorpo tem uma afinidade alterada por um efetorde ligando mas retém a habilidade de ligação de antígeno do anticorpo deorigem. O efetor de ligando ao qual afinidade é alterada pode ser, por exem-pio, um receptor de Fc ou o componente de C1 de complemento. Este méto-do é descrito em mais detalhes nas patentes U.S. Nos. 5.624.821 e5.648.260, ambos por Winter et al.

Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados deresíduos de aminoácido podem ser substituídos com um resíduo de aminoá-cido diferente de modo que o anticorpo tem ligação de C1q alterada e/oucitotoxicidade dependente complemento (CDC) reduzida ou abolida. Estemétodo é descrito em mais detalhes nas Patentes U.S. Nos. 6.194.551 atra-vés de Idusogie et al.

Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido sãoalterados para assim alterar a habilidade do anticorpo para fixar o comple-mento. Este método é descrito também na Publicação de PCT WO 94/29351pro Bodmer et al.

Em ainda outra modalidade, a região de Fc é modificada paraaumentar a habilidade do anticorpo para mediar citotoxicidade celular de-pendente de anticorpo (ADCC) e/ou aumentar â afinidade do anticorpo porum receptor de Fcy modificando um ou mais aminoácidos. Este método édescrito também na Publicação de PCT WO 00/42072 por Presta. Além dis-so, os sítios de ligação em IgGI humana para FcyRI, FcyRII, Fcy?RIII e F-cRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas(vide Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).

Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é mo-dificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anti-corpo carece de glicosilação). Glicosilação pode ser alterada, por exemplo,para aumentar a afinidade do anticorpo por um "antígeno". Tais modificaçõesde carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, alterando um ou mais sí-tios de glicosilação dentro da seqüência de anticorpo. Por exemplo, uma oumais substituições de aminoácido podem ser feitas resultando na eliminaçãode um ou mais sítios de glicosilação de estrutura de região variável para as-sim eliminar glicosilação naquele sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afi-nidade do anticorpo por antígeno. Um tal método é descrito em mais detalhesnas Patentes U.S. Nos. 5.714.350 e 6.350.861 por Co et al.Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito tendoum tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendoquantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estrutu-ras de bifurcação aumentadas de GIcNac. Tais padrões de glicosilação altera-dos foram demonstrados aumentar a habilidade de ADCC dos anticorpos. Taismodificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, expressando oanticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada.As células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica epodem ser usadas como células hospedeiras em que para expressar anticor-pos recombinantes da invenção para assim produzir um anticorpo com glicosi-lação alterada. Por exemplo, EP 1.176.195 por Hang et al. descreve uma linha-gem celular com um gene de FUT8 funcionalmente rompido, que codifica umafucosil transferase de modo que os anticorpos expressos em uma tal linhagemcelular exibem hipofucosilação. Publicação de PCT WO 03/035835 por Prestadescreve uma linhagem celular de CHO variante, células de Lecl3, com habili-dade reduzida para ligar fucose aos carboidratos ligados a Asn(297), tambémresultando em hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospe-deira (vide também Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740).Publicação de PCT WO 99/54342 por Umana et al. descreve linhagens celula-res modificadas para expressar glicosil transferases modificadoreas de glicopro-teína (por exemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferase Ill (GnTIII)) demodo que os anticorpos expressos nas linhagens celulares modificadas exibemestruturas de GIcNac de bifurcação aumentada que resulta em atividade deADCC aumentada dos anticorpos (vide também Umana et al., 1999 Nat. Biote-ch. 17:176-180).

Outra modificação dos anticorpos aqui que é contemplada pelainvenção é pegilação. Um anticorpo pode ser pegilado para, por exemplo,aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para pegi-Iar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, tipicamente é reagidocom polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeí-do de PEG, sob condições em que um ou mais grupos de PEG são ligadosao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A pegilação pode ser realizada poruma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula dePEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Como aquiusado, o termo "polietileno glicol" é intencionado abranger quaisquer dasformas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais co-mo mono (C1-C10)alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo para ser pegilado é um anti-corpo aglicosilado. Métodos para proteínas de pegilação são conhecidos natécnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Vide por exem-plo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

ANDAIMES DE NÃO-IMUNOGLOBULINA

Uma ampla variedade de anticorpo/estruturas ou andaimes deimunoglobulina pode ser empregada desde que o polipeptídeo resultanteinclua pelo menos uma região de ligação que é específica para a proteínaalvo. Tais estruturas ou andaimes incluem os cinco idiotipos principais deimunoglobulinas humanas, ou fragmentos dos mesmos (tais como aquelesrevelados em outro lugar aqui), e incluem imunoglobulinas de outras espé-cies animais, preferivelmente tendo aspectos humanizados. Anticorpos decadeia pesada simples tais como aqueles identificados em camelídeos e/outubarão são de interesse particular nesta consideração. Estruturas, andai-mes e fragmentos novos continuam sendo descobertos e desenvolvidos poraqueles versados na técnica.

Em um aspecto, a invenção refere-se a gerar anticorpos combase em não-imunoglobulina usando andaimes de não-imunoglobulina sobreos quais CDRs da invenção podem ser enxertadas. Estruturas e andaimesde não-imunoglobulina conhecidas ou futuras podem ser empregados, con-tanto que eles compreendam uma região de ligação específica para a prote-ína alvo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 122. Tais compostos são conheci-dos aqui como "polipeptídeos que compreendem uma região de ligação es-pecífica ao alvo". Estruturas ou andaimes de não-imunoglobulina conhecidasincluem, mas não são limitados a, Adnectinas (fibronectina) (Compound The-rapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurique,Suíça), anticorpos de domínio (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) e Ablynx nv(Zwijnaarde, Bélgica)), Iipocalina (AnticaIin) (Pieris Proteolab AG, Freising,Alemanhã), imuno-farmacêuticos modulares pequenos (Trubion Pharmaceu-ticals Inc., Seattle, WA), maxicorpos (Avidia, Inc. (Mountain View, CA)), Pro-teína A (Affibody AG, Sweden) e afilina (gama-cristalina ou ubiquitina) (ScilProteins GmbH, Halle, Alemanha).

(i) ADNECTINAS - TERAPÊUTICAS DE COMPOSTOS

Os andaimes de adnectina são com base no domínio de fibro-nectina do tipo Ill (por exemplo, o décimo módulo do domínio de fibronectinado tipo Ill (domínio 10 de Fn3). O domínio de fibronectina do tipo Ill tem 7 ou8 filamentos betas que são distribuídos entre as duas folhas betas, que porsi só embalam uma à outra para formar o núcleo da proteína, e também con-tendo alças (análogas às CDRs) que conecta os filamentos betas entre si esão expostos a solvente. Há pelo menos três tais alças em cada borda dosanduíche de folha beta onde a borda é o limite da proteína perpendicularpara a direção dos filamentos betas. (US 6.818.418).

Estes andaimes com base em fibronectina não são uma imuno-globulina, embora a dobra geral esteja estritamente relacionada à do frag-mento de anticorpo funcional menor, a região variável da cadeia pesadacompreendendo a unidade de reconhecimento de antígeno inteira em IgG decamelo e lhama. Por causa desta estrutura, o anticorpo de não-imunoglobulina imita as propriedades de ligação de antígeno que são simila-res em Nature e afinidade às dos anticorpos. Estes andaimes podem serusados em uma randomização de alça e estratégia de embaralhamento invitro que é similar ao processo de maturação de afinidade dos anticorpos invivo. Estas moléculas com base em fibronectina podem ser usadas comoandaimes onde as regiões de alça da molécula podem ser substituídas comCDRs da invenção usando técnicas de clonagem padrões.

(ii) ANQUIRINA - PARES MOLECULARES

A tecnologia é com base em usar proteínas com módulos de re-petição derivados de anquirina como andaimes para carregar regiões variá-veis que podem ser usadas para ligar a alvos diferentes. O módulo de repe-tição de anquirina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos que consiste emduas hélices α antiparalelas e uma volta β. Ligação das regiões variáveis éprincipalmente otimizada usando exibição de ribossoma.

(iii) MAXICORPOS/AVÍMEROS - AVIDIA

Avímeros são derivados de proteína contendo domínio A naturaltal como LRP-1. Estes domínios são por Nature usados para interações deproteína-proteína e em humano mais de 250 proteínas são estruturalmentecom base nos domínios A. Avímeros consistem em vários monômeros dife-rentes de "domínio A" (2-10) ligados por meio de Iigadores de aminoácido.Avímeros podem ser criados que podem ligar ao antígeno alvo usando ametodologia descrita em, por exemplo, 20040175756; 20050053973;20050048512; e 20060008844.

(vi) PROTEÍNA A - AFFIBODY

Ligandos de afinidade de Affibody® são proteínas pequenas,simples compostas de um pacote de três hélices com base no andaime deum dos domínios de ligação de IgG da Proteína A. Proteína A é uma proteí-na de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Este domínio de an-daime consiste em 58 aminoácidos destes 13 são randomizados para gerarbibliotecas de Affibody® com um número grande de variantes de ligando(Vide por exemplo, US 5.831.012). Moléculas de Affibody® imitam anticor-pos, elas têm um peso molecular de 6 kDa, comparadas ao peso molecularde anticorpos que são de 150 kDa. Apesar de seu tamanho pequeno, o sítiode ligação das moléculas de Affibody® é similar ao de um anticorpo.

(v) ANTICALINAS - PIERIS

Anticalins® são produtos desenvolvidos pela companhia PierisProteoLab AG. Eles são derivados de lipocalinas, um grupo difundido de pro-teínas pequenas e robustas que estão usualmente envolvidos no transportefisiológico ou armazenamento de compostos quimicamente sensíveis ou in-solúveis. Várias lipocalinas naturais ocorrem em tecidos humanos ou líqui-dos do corpo.

A arquitetura da proteína são imunoglobulinas rememorativas,com alças hipervariáveis em cima de uma estrutura rígida. Porém, em con-traste com anticorpos ou seus fragmentos recombinantes, lipocalinas sãocompostos de uma cadeia de polipeptídeo simples com 160 a 180 resíduosde aminoácido, apenas sendo marginalmente maior que um domínio de i-munoglobulina simples.

O conjunto de quatro alças que compõem a bolsa de ligaçãomostra plasticidade estrutural pronunciada e tolera uma variedade de cadei-as laterais. O sítio de ligação pode desse modo ser reformado em um pro-cesso proprietário para reconhecer moléculas alvos prescritas de forma dife-rentes com afinidade alta e especificidade.

Uma proteína de família de lipocalina, a proteína de ligação debilina (BBP) de Pieris Brassicae foi usada para desenvolver anticalinas atra-vés de mutageneização do conjunto de quatro alças. Um exemplo de umpedido de patente que descreve "anticalinas" é PCT WO 199916873.

(vi) AFFIUN - PROTEÍNAS DE SCIL.

Moléculas de Affilin™ são proteínas de não-imunoglobulina pe-quenas que são projetadas para afinidades específicas para proteínas e mo-léculas pequenas. Novas moléculas de Affilin™ podem ser muito rapidamen-te selecionadas de duas bibliotecas, cada uma destas é com base em umaproteína de andaime derivada humano diferente.

Moléculas de Affilin™ não mostram nenhuma homologia estrutu-ral às proteínas de imunoglobulina. Proteínas de Scil empregam dois andai-mes de Affilin™, um destes é uma proteína da lente dos olhos gama cristali-na, estrutural, humana e o outro é proteínas da superfamília de "ubiquitina".Ambos os andaimes humanos são muito pequenos, mostram estabilidade detemperatura alta e são quase resistentes às alterações de pH e agentesdesnaturantes. Esta estabilidade alta é principalmente devido à estrutura defolha beta expandida das proteínas. Exemplos de proteínas derivadas crista-linas gama são descritos em W0200104144 e exemplos de proteínas "se-melhantes à ubiquitina" são descritos em W02004106368.

MÉTODOS DE CRIAR ANTICORPOS

Como debatido acima, os anticorpos de anti-DKK1 tendo se-qüências de Vh e de Vl ou seqüências de cadeia pesada e leve de compri-mento total mostradas aqui podem ser usadas para criar novos anticorposde anti-DKK1/4 modificando as seqüências de cadeia pesada e/ou de cadeialeve de comprimento total, seqüências de Vh e/ou Vl, ou a(s) região(ões)constante(s) ligada(s) a estas. Desse modo, em outro aspecto da invenção,as características estruturais de um anticorpo de anti-DKK1 da invenção sãousadas para criar anticorpos de anti-DKK1/4 estruturalmente relacionadosretendo pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção,tal como ligar a DKK1 ou DKK4 humanos ou ambos e também inibindo umaou mais propriedades funcionais de DKK1 ou DKK4 ou ambos.

Por exemplo, uma ou mais regiões de CDR dos anticorpos dapresente invenção, ou mutações dos mesmos, podem ser combinados re-combinantemente com regiões de estrutura conhecidas e/ou outras CDRspara criar anticorpos de anti-DKK1 adicionais, recombinantemente modifica-dos, da invenção, como debatido acima. Outros tipos de modificações inclu-em aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o métodode engenharia é uma ou mais das seqüências de Vh e/ou Vl fornecidas aqui,ou uma ou mais regiões de CDR das mesmas. Para criar o anticorpo modifi-cado, não é necessário preparar de fato (isto é, expressar como uma proteí-na) um anticorpo que tem uma ou mais das seqüências de Vh e/ou Vl forne-cidas aqui, ou uma ou mais regiões de CDR das mesmas. Do contrário, ainformação contida na(s) seqüência(s) é usada como o material de partidapara criar uma(s) seqüência(s) de "segunda geração" derivada(s) da(s) se-qüência^) original(is) e depois a seqüência(s) de "segunda geração" é pre-parada e expressada como uma proteína.

Conseqüentemente, em outra modalidade, a invenção provê ummétodo para preparar um anticorpo de anti-DKK1 que consiste em: uma se-qüência de anticorpo de região de Vh tendo uma seqüência de CDR1 sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56, umaseqüência de CDR2 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-20 e 57-64 e/ou uma seqüência de CDR3 selecionada do grupo que consisteem SEQ ID NOs: 2-20 e 65-72; e uma seqüência de anticorpo de região deVl que tem uma seqüência de CDR1 selecionada do grupo que consiste emSEQ ID NOs: 21-39 e 73-80, uma seqüência de CDR2 selecionada do grupoque consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 81-88 e/ou uma seqüência de CDR3selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21-39 e 89-96; alterarpelo menos um resíduo de aminoácido dentro da seqüência de anticorpo deregião de Vh e/ou a seqüência de anticorpo de região de Vl para criar pelomenos uma seqüência de anticorpo alterada; e expressar a seqüência deanticorpo alterada como uma proteína.

Conseqüentemente, em outra modalidade, a invenção provê ummétodo para preparar um anticorpo de anti-DKK1 que consiste em: uma se-qüência de anticorpo de cadeia pesada de comprimento total que tem umaseqüência selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 115-117; e uma seqüênciade anticorpo de cadeia leve de comprimento total que tem uma seqüênciaselecionada do grupo de SEQ ID NOs: 111-114; alterar pelo menos um resí-duo de aminoácido dentro da seqüência de anticorpo de cadeia pesada decomprimento total e/ou da seqüência de anticorpo de cadeia leve de com-primento total para criar pelo menos uma seqüência de anticorpo alterada; eexpressar a seqüência de anticorpo alterada como uma proteína.

Em outra modalidade, a invenção provê um método para prepararuma composição de anti-DKK1/4 de neutralização otimizada para expressãomamífera que consiste em: uma seqüência de anticorpo de região de Vh quetem uma seqüência selecionada do grupo de SEQ ID NO: 119; e uma seqüên-cia de anticorpo de região de Vl que tem uma seqüência selecionada do grupode SEQ ID NO: 118; alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro daseqüência de anticorpo de região de Vh e/ou da seqüência de anticorpo de re-gião de Vl para criar pelo menos uma seqüência de anticorpo alterada; e ex-pressar a seqüência de anticorpo alterada como uma proteína.

Técnicas de biologia molecular padrões podem ser usadas parapreparar e expressar a seqüência de anticorpo alterada. O anticorpo codifi-cado pela(s) seqüência(s) de anticorpo alterada(s) é um que retém uma, al-gumas ou todas as propriedades funcionais das composições de anti-DKK1/4 de neutralização descritas aqui cujas propriedades funcionais inclu-em, mas não são limitadas a, especificamente ligar a DKK1 humano; e oanticorpo apresenta pelo menos uma das propriedades funcionais a seguir: oanticorpo inibe ligação de proteína de DKK1 ao receptor de DKK1, ou o anti-corpo inibe ligação de receptor de DKKQ prevenindo ou melhorando osteóli-se, ou o anticorpo inibe ligação de receptor de DKKQ assim prevenindo oumelhorando lesões osteolíticas, ou o anticorpo inibe ligação de receptor deDKKQ prevenindo ou melhorando câncer.

O anticorpo alterado pode exibir uma ou mais, duas ou mais, outrês ou mais das propriedades funcionais debatidas acima.

As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem seravaliadas usando ensaios padrões disponíveis na técnica e/ou descritos a-qui, tais como aqueles expostos nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).

Em certas modalidades dos métodos de criar anticorpos da in-venção, mutações podem ser introduzidas fortuita ou seletivamente ao longode toda ou parte de uma seqüência de codificação de anticorpo de anti-DKK1 e os anticorpos de anti-DKK1 modificados resultantes podem ser tria-dos para ligar atividade e/ou outras propriedades funcionais como descritasaqui. Os métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo, Pu-blicação de PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos para criar etriar mutações de anticorpo usando mutagênese de saturação, montagem deligação sintética, ou uma combinação das mesmas. Alternativamente, Publi-cação de PCT WO 03/074679 por Lazar et al. descreve métodos de usarmétodos de triagem computacionais para otimizar propriedades físico-químicas dos anticorpos.

A região constante de Fc de um anticorpo é crítica para determi-nar a meia-vida de soro e funções efetoras, isto é, as atividades citotoxicida-de de célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependentede complemento (CDC). Pode-se criar mutantes específicos do fragmento deFc para alterar a função efetora e/ou meia-vida de soro (vide, por exemplo,Xencor Technology, vide também, por exemplo, W02004029207).

Um método para alterar a função efetora e meia-vida de soro deum anticorpo é enxertar a região variável de um fragmento de anticorpo comum fragmento de Fc tendo a função efetora apropriada. Isótipos de IgGI oude lgG4 podem ser selecionados para célula atividade mortal, enquanto queisótipo de lgG2 pode ser usado para anticorpos silenciosos ou neutralizantes(sem atividade mortal de célula).

Anticorpos silenciosos com meia-vida de soro longa podem serobtidos fazendo fusão quimérica de regiões variáveis de um anticorpo comuma proteína de soro tal como HSA ou uma ligação de proteína a tal proteí-na de soro, tal como proteína de ligação de HSA.

Funções efetoras podem também ser alteradas modulando opadrão de glicosilação do anticorpo. Glycart (por exemplo, US6.602.684),Biowa (por exemplo, US6.946.292) e Genentech (por exemploW003/035835) criou linhagens celulares mamíferas para produzir anticorposcom função efetora aumentada ou diminuída. Especialmente, anticorpos nãofucosilados terão atividades de ADCC intensificadas. Glycofi também desen-volveu linhagens celulares de levedura capazes de produzir glicoformas es-pecíficas de anticorpos.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO QUE CODIFICAM ANTICORPOS DAINVENÇÃO

Outro aspecto da invenção refere-se às moléculas de ácido nu-cléicò que codificam os anticorpos da invenção. Exemplos de seqüências denucleotídeo de cadeia leve de comprimento total parentais são mostradasnas SEQ ID NOs: 97-100. Exemplos de seqüências de nucleotídeo de ca-deia pesada de comprimento total parentais são mostradas nas SEQ IDNOs: 101-103. Exemplos de seqüências de nucleotídeo de cadeia leve decomprimento total otimizadas para expressão em uma célula são mostradosnas SEQ ID NOs: 104-107. Exemplos de seqüências de nucleotídeo de ca-deia pesada de comprimento total otimizadas para expressão em uma célulasão mostrados nas SEQ ID NOs: 108-110.

Os ácidos nucléicos podem estar presentes em células inteiras,em um Iisado de célula, ou ácidos nucléicos podem ser em uma forma parci-almente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucléico é "isolado"ou "tornado substancialmente puro" quando purificado longe de outros com-ponentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nu-cléicos celulares ou proteínas, através de técnicas padrões, incluindo trata-mento alcalino/SDS, bandagem de CsCI, cromatografia de coluna, eletrofo-rese em gel de agarose e similares bem conhecidos na técnica. Vide, F. Au-subel, et al., ed. 1987 Curent Protocols in Molcecular Biology1 Greene Publi-shing e Wiley Interscience1 Nova Iorque. Um ácido nucléico da invenção po-de ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou nao conter seqüências intrôni-cas. Em uma modalidade, o ácido nucléico é uma molécula de cDNA. O áci-do nucléico pode estar presente em um vetor tal como um vetor de exibiçãode fago, ou em um vetor de plasmídeo recombinante.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser obtidos usando téc-nicas de biologia moleculares padrões. Para anticorpos expressos por hibri-domas (por exemplo, hibridomas preparados de camundongos transgênicosque carregam genes de imunoglobulina humana como descritos mais abai-xo), cDNAs que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo feito pelohibridoma podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão ou técnicasde clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de uma biblioteca de genesde imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibição de fago), ácidonucléico que codifica o anticorpo pode restabelecer de vários clones de fagoque são os membros da biblioteca.

Uma vez fragmentos de DNA que codificam os segmentos de Vh eVl são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser também manipulados portécnicas de DNA recombinantes padrões, por exemplo para converter os genesde região variáveis para genes de cadeia de anticorpo de comprimento total,para genes de fragmento de Fab ou para um gene de scFv. Nestas manipula-ções, um fragmento de DNA de codificação de Vl ou Vh é operativamente Iiga-do a outra molécula de DNA, ou a um fragmento que codifica outra proteína, talcomo uma região constante de anticorpo ou um Iigador flexível. O termo "opera-tivamente ligado", como usado neste contexto, é intencionado significar que osdois fragmentos de DNA são unidos de uma maneira funcional, por exemplo,de modo que as seqüências de aminoácido codificadas pelos dois fragmentosde DNA permaneçam dentro da estrutura, ou de modo que a proteína seja ex-pressa sob controle de um promotor desejado.

O DNA isolado que codifica a região de Vh pode ser convertido aum gene de cadeia pesada de comprimento total operativamente ligando oDNA de codificação de Vh a outra molécula de DNA que codifica regiõesconstantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As seqüências de genesde região constante de cadeia pesada humanos são conhecidas na técnica(vide por exemplo, Kabatl E. A., al de el., 1991 Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Hu-rnan Services, Publicação de NIH No. 91-3242) e fragmentos de DNA queabrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão.A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante deIgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. A um fragmento de gene decadeia pesada de Fab, o DNA de codificação de Vh pode ser operativamenteligado a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante deCH1 de cadeia pesada.

O DNA isolado que codifica a região de Vl pode ser convertidoem um gene de cadeia leve de comprimento total (como também em um ge-ne de cadeia leve de Fab) operativamente ligando o DNA de codificação deVl a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve,Cl- As seqüências dos genes de região constante de cadeia leve humanossão conhecidas na técnica (vide por exemplo, Kabat, Ε. A., et al., 1991 Se-quences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Depart-ment of Health and Human Services, Publicação de NIH No. 91-3242) efragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidas por am-plificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser umaregião constante capa ou uma lambda.

Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA de codifica-ção de Vh e Vl são operativamente ligados a outro fragmento que codificaum Iigador flexível, por exemplo, codificando a seqüência de aminoácido(Gly4 - Ser)3, de modo que as seqüências de Vh e Vl podem ser expressascomo uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões de Vl e Vhunidas pelo Iigador flexível (vide por exemplo, Bird et al., 1988 Science242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883;McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554).PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DA INVENÇÃO

Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por umavariedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal con-vencional por exemplo, a técnica de hibridação de célula somática padrão deKohler e Milstein, 1975 Nature 256: 495. Muitas técnicas para produzir anti-corpo monoclonal podem ser empregadas por exemplo, transformação viralou oncogênica de linfócitos B.

Um sistema animal para preparar hibridomas é o sistema murino.Produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido.Protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imuniza-dos para fusão são conhecidos na técnica. Pares de fusão (por exemplo, célu-las de mieloma murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção po-dem ser preparados com base na seqüência de um anticorpo monoclonal mu-rino preparado como descrito acima. DNA que codifica as imunoglobulinas decadeia pesada e leve pode ser obtido do hibridoma murino de interesse e mo-dificado para conter seqüências de imunoglobulina não-murinas (por exemplo,humanas) usando técnicas de biologia moleculares padrões. Por exemplo,para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinas podem serligadas às regiões constantes humanas usando métodos conhecidos na técni-ca (vide por exemplo, Patente U. S. N0. 4.816.567 para Cabilly et al.). Paracriar um anticorpo humanizado, as regiões de CDR murinas podem ser inseri-das em uma estrutura humana usando métodos conhecidos na técnica. Videpor exemplo, Patente U. S. N0. 5225539 para Winter, e Patentes U.S. Nos.5530101; 5585089; 5693762 e 6180370 para Queen et al.

Em uma certa modalidade, os anticorpos da invenção são anti-corpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dire-cionados contra DKK1 podem ser gerados usando camundongos transgêni-cos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imune humanoao invés do sistema de camundongo. Estes camundongos transgênicos etranscromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundon-gos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente refe-ridos aqui como "camundongos de Ig humana".

O camundongo HuMAb® (Medarex, Inc.) contém miniloci de genede imunoglobulina humana que codificam as seqüências de imunoglobulinade cadeia pesada (μ e γ) e cadeia leve κ humanas não-rearranjadas, junta-mente com mutações alvejadas que inativam os Ioci endógenos de cadeia μ eκ (vide por exemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859). Con-seqüentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM de ca-mundongo ou κ, e em resposta à imunização, os transgenes de humano decadeia pesada e leve introduzidos sofrem troca de classe e mutação somáticapara gerar IgGK humana de afinidade alta monoclonal (Lonberg, N-. et al.,1994 supra; revisado em Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Phar-macology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D., 1995 lntern. Rev. Immu-nol.13: 65-93, e Harding, F. E Lonberg, N., 1995 Ann. Ν. Y. Acad. Sei.764:536-546). A preparação e uso de camundongos HuMAb, e as modifica-ções genômicas carregadas por tais camundongos, é também descrita emTaylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at.,1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl.Acad. Sei. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123;Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol.152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; eFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, os conteúdos detodas estas são aqui especificamente incorporados por referência em sua to-talidade. Vide também, Patentes U.S. Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126;5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e5.770.429; todas para Lonberg e Kay; Patente U. S. N0. 5.545.807 para Suraniet al.; Publicação de PCT Nos. WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585,WO 97113852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; ePublicação de PCT No. WO 01/14424 para Korman et al.

Em outra modalidade, anticorpos humanos da invenção podemser suscitados usando um camundongo que carrega seqüências de imuno-globulina humana em transgenes e transcromossomos tais como um ca-mundongo que carrega um transgene de cadeia pesada humano e umtranscromossomo de cadeia leve humana. Tais camundongos, referidos aquicomo "camundongos KM", são descritos em detalhes na Publicação de PCTWO 02/43478 para Ishida et al.

Ainda também, sistemas de animal transgênicos alternativos queexpressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica epodem ser usados para suscitar anticorpos de anti-DKK1 da invenção. Porexemplo, um sistema transgênico alternativo referido como o Xenomouse(Abgenix, Inc.) pode ser usado. Tais camundongos são descritos, por exem-plo, nas Patentes U.S. Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6. 150.584 e6.162.963 para Kucherlapati et al.

Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos queexpressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica epodem ser usados para suscitar anticorpos de anti-DKK1 da invenção. Por e-xemplo, camundongos que carregam um transcromossomo de cadeia pesadahumano e um trancromossomo de cadeia leve humano, referidos como "ca-mundongos de TC", pode ser usados; tais camundongos são descritos em To-mizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:722-727. Além disso, vacasque carregam os transcromossomos de cadeia pesada e leve humanos foramdescritos na técnica (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) epodem ser usados para sucitar anticorpos de anti-DKK1 da invenção.

Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem tambémser preparado usando métodos de exibição de fago para triar bibliotecas degenes de imunoglobulina humana. Tais métodos de exibição de fago paraisolar anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Vide por exemplo:patentes U.S. Nos. 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 para Ladner et al.; Pa-tentes U.S. Nos. 5.427.908 e 5.580.717 Dotar et al.; Patentes U.S. Nos.5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty et al.; e Patentes U.S. Nos.5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 paraGriffiths et al.

Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem tambémser preparados usando camundongos de SCID dentro dos quais células i-munes humanas foram reconstituídas de modo que uma resposta de anti-corpo humana possa ser gerada sob imunização. Tais camundongos sãodescritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.476.996 e 5.698.767 paraWilson et al.

Triagens de bibliotecas de anticorpo humano podem ser usadaspara identificar um anticorpo da invenção. Escolha de tecnologias de triageminclui, mas não é limitada, por exemplo exibição de fago (Morphosys), o tipode bibliotecas (por exemplo, Biblioteca de HuCaI de Morphosys), tecnologiade maturação de afinidade e seqüência de otimização de códon também.

GERAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS CONTRA DKK1.

DKK1 humano recombinante purificado derivado de E. coli, ba-culovírus ou células de HEK-EBNA, ou DKK1 humano recombinante purifi-cado conjugado com hemocianina de lapa (KLH), é usado como o antígeno.

Anticorpos monoclonais completamente humanos para DKK1são preparados usando cepas de HCo7, HCo12 e HCo17 de camundongostransgênicos de HuMab e a cepa de KM de camundongos transcromossômi-cos transgênicos, cada um destes expressam genes de anticorpo humano.Em cada uma destas cepas de camundongo, o gene de cadeia leve capa decamundongo endógeno pode ser de forma homozigota rompido como descri-to em Chen et al., 1993 EMBO J. 12:811-820 e o gene de cadeia pesada decamundongo endógeno pode ser de forma homozigota rompido como descri-to no Exemplo 1 da Publicação de PCT WO 01109187. Cada uma destascepas de camundongo carregam um transgene capa de cadeia leve huma-no, KCo5, como descrito em Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology14:845-851. A cepa de HCo7 carrega o transgene de cadeia pesada humanoHCo7 como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.545.806; 5.625.825; e5.545.807. A cepa de HCo12 carrega o transgene de cadeia pesada humanoHCo12 como descrito no Exemplo 2 da Publicação de PCT WO 01/09187. Acoloração de HCo17 carrega o transgene de cadeia pesada humano HCo17.A cepa KNM contém o transcromossomo SC20 como descrito na Publicaçãode PCT WO 02/43478.

Para gerar anticorpos monoclonais completamente humanospara DKK1, camundongos HuMab e camundongos KM são imunizados comDKK1 recombinante purificado derivado de £ coli ou conjugado de DKK1-KLH como antígeno. Esquemas de imunização geral para camundongosHuMab são descritos em Lonberg, N., et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D., etal., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851 e Publicaçãode PCT WO 98/24884. Os camundongos são 6-16 semanas de idade naprimeira infusão de antígeno. Uma preparação recombinante purificada (5-50pg) de antígeno de DKK1 (por exemplo, purificado de células de E. colitransfeccionadas que expressam DKK1) é usada para imunizar os camun-dongos HuMab e camundongos KM intraperitoneal, subcutaneamente (Sc)ou através de injeção nas patas.

Camundongos transgênicos são imunizados duas vezes comantígeno em adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Ribi ou intrape-ritoneal (IP), subcutaneamente (Sc) ou através das patas (FP), seguido por3-21 dias de imunização IP, Sc ou FP (até um total de 11 imunizações) como antígeno em adjuvante de Freund incompleto ou Ribi. A resposta imune émonitorada através de sangria retro-orbital. O plasma é triado por ELISA, ecamundongos com titulações suficientes de imunoglobulina humana de anti-DKK1 são usados para fusões. Camundongos são reforçados intravenosa-mente com antígeno 3 e 2 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Tipi-camente, 10-35 fusões são executadas para cada antígeno. Vários dozecamundongos são imunizados para cada antígeno. Um total de 82 camun-dongos das cepas de camundongos HCo7, HCo12, HCo17 e KM são imuni-zados com DKK1.

Para selecionar anticorpos produtores de camundongos HuMab ouKM que ligou a DKK1, soros de camundongos imunizados podem ser testadospor ELISA como descrito por Fishwild, D., et al., 1996. Brevemente, as placasde microtitulação são revestidas com DKK1 recombinante purificado de E coli a1-2 pg/ml em PBS, 50 μΙ/poços incubados a 4SC durante a noite depois bloque-ados com 200 μΙ/poço de 5% de soro de galinha em PBS/Tween (0,05%). Dilui-ções de plasma de camundongos imunizados com DKK1 são adicionadas acada poço e incubadas durante 1 -2 horas em temperatura ambiente. As placassão lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com um anticorpo policlonalde Fc de IgG anti-humana de cabra conjugado com peroxidase de raiz-forte(HRP) durante 1 hora em temperatura ambiente. Após lavar, as placas.são de-senvolvidas com substrato de ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) e analisadasatravés de espectrofotômetro a OD 415-495. Camundongos que desenvolve-ram as titulações mais altas de anticorpos de anti-DKK1 são usados para fu-sões. As fusões são executadas e sobrenadantes de hibridoma são testadospara atividade de anti-DKK1 por ELISA.

Os esplenócitos de camundongo, isolados dos camundongos Hu-Mab e camundongos KM, são fundidos com PEG para uma linhagem celular demieloma de camundongo com base em protocolos padrões. Os hibridomas re-sultantes são depois triados para a produção de anticorpos antígeno-específicos. As suspensões de célula simples de linfócitos esplênicos de ca-mundongos imunizados são fundidas em um quarto do número de células demieloma de camundongo de SP2/0 não-segregantes (ATCC, CRL 1581) com50% de PEG (Sigma). Células são banhadas em aproximadamente 1x105/poçoem placa de microtitulação de fundo chato, seguido por incubação de cerca deduas semanas em meio seletivo contendo 10% de soro bovino fetal, 10% demeio de P388D 1 (ATCC, CRL TIB-63) condicionado, 3-5% de origen (IGEN)em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com glicose alta, L glutamina e piruvato desódio) mais 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mglnni degentamicina e 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Após 1-2 semanas, as célulasforam cultivadas em meio em que HAT é substituído com HT. Poços individuaissão depois triados por ELISA para anticorpos de IgG monoclonâl humana deanti-DKK1. Uma vez crescimento de hibridoma extensivo ocorreu, o meio é u-sualmente monitorado após 10-14 dias. Os hibridomas de segregação de anti-corpo são recolocados na placa, triados novamente e, se ainda positivos paraIgG humana, anticorpos monoclonais de anti-DKK1 são subclonados pelo me-nos duas vezes limitando a diluição. Os subclones estáveis são depois cultiva-dos in vitro para gerar quantidades pequenas de anticorpo em meio de culturade tecido para outra caracterização.

IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS DE IG HUMANA

Quando camundongos de Ig humana forem usados para sucitaranticorpos humanos da invenção, tais camundongos podem ser imunizadoscom uma preparação purificada ou enriquecidos de antígeno de DKK1 e/ouDKK1 recombinante, ou uma proteína de fusão de DKK1, como descrito porLonberg, N., et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D., et al.,1996 Nature Biotechnology 14: 845-851; e Publicação de PCT WO98124884 e WO 01/14424. Os camundongos podem ser 6-16 semanas deidade na primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou re-combinante (5-50 pg) de antígeno de DKK1 pode ser usada para imunizar oscamundongos de Ig humana intraperitonealmente.

Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonaiscompletamente humanos para DKK1 são descritos acima. Experiência cu-mulativa com vários antígenos mostrou que os camundongos transgênicosrespondem quando inicialmente imunizados de modo intraperitoneal (IP)com antígeno no adjuvante de Freund completo, seguido por imunizações IPa cada duas semanas (até um total de 6) com antígeno no adjuvante de Fre-und incompleto. Porém, adjuvantes diferentes de Freund são também obser-vados ser eficazes. Além disso, células inteiras na ausência de adjuvantesão observadas ser altamente imunogênicas. A resposta imune pode sermonitorada no curso do protocolo de imunização com amostras de plasmaque são obtidas através de sangria retro-orbital. O plasma pode ser triadopor ELISA, e os camundongos com titulações suficientes de imunoglobulinahumana de anti-DKK1 poden ser usados para fusões. Os camundongos po-dem ser reforçados intravenosamente com antígeno 3 dias antes do sacrifí-cio e remoção do baço. É esperado que 2-3 fusões para cada imunizaçãopossam necessitar ser executadas. Entre 6 e 24 camundongos são tipica-mente imunizados para cada antígeno. Usualmente cepas de HCo7 eHCo12 são usadas. Além disso, 12 transgenes de HCo7 e HCo podem serprocriados juntos em um camundongo simples tendo dois transgenes de ca-deia pesada humanos diferentes (HCo7/HCo12).

GERAÇÃO DE HIBRIDOMAS QUE PRODUZ ANTICORPOS MONOCLO-NAIS HUMANOS

Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais hu-manos da invenção, esplenócitos e/ou células de Iinfonodo podem ser isoladosde camundongos imunizados e fundidos com uma linhagem celular imortaliza-da apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Oshibridomas resultantes podem ser triados para a produção de anticorpos antí-geno-específicos. Por exemplo, suspensões de célula simples de linfócitos es-plênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas com um sexto donúmero de células de mieloma de camundongo não-segregantes P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com 50% de PEG. Células são banhadas em a-proximadamente 2 χ 145 em placas de microtitulação de fundo chato, seguidopor uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo 20% de Sorode Clone Fetal, 18% de meios condicionados "653", 5% de origen (IGEN)1 4mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 5 mM de HEPES, 0:055 mM de2 mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50mg/ml de gentamicina e 1X HAT (Sigma; HAT é adicionado 24 horas após afusão). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadasem meio em que HAT é substituído com HT. Poços individuais podem depoisser triados por ELISA para anticorpos de IgM e de IgG monoclonais humanas.Uma vez crescimento de hibridoma extensivo ocorre, o meio pode ser usual-mente observado após 10-14 dias. Os hibridomas de segregação de anticorpopodem ser recolocados em placa, triados novamente, e se ainda positivos paraIgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menosduas vezes limitando a diluição. Os subclones estáveis podem depois ser culti-vados in vitro para gerar quantidades pequenas de anticorpo em meio de cultu-ra de tecido para caracterização.

Para purificar anticorpos monoclonais humanos, os hibridomasselecionados podem ser crescidos em frascos agitadores de dois litros parapurificação do anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados econcentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose(Pharmacia, Piscataway, N.J.). IgG eluída pode ser verificada por eletroforeseem gel e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar pureza. Asolução de tampão pode ser trocada em PBS, e a concentração pode ser de-terminada por OD2So usando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorposmonoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80° C.

GERAÇÃO DE TRANSFECTOMAS PRODUZINDO ANTICORPOS MONOCLONAIS

Anticorpos da invenção também podem ser produzidos em umtransfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinaçãode técnicas de DNA recombinantes e métodos de transfecção de gene comosão bem conhecidos na técnica (por exemplo, Morrison, S., (1985) Science229:1202).

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos deanticorpo dos mesmos, DNAs que codificam cadeias leves e pesadas decomprimento parcial ou total podem ser obtidos através de técnicas de bio-logia molecular padrões (por exemplo, amplificação de PCR ou clonagem decDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e osDNAs podem ser inseridos nos vetores de expressão de modo que os genessão operativamente ligados às seqüências de controle transcricionais etranslacionais. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" é intencio-nado significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de modo queas seqüências de controle transcricionais e translacionais dentro do vetorsirvam sua função intencionada de regular a transcrição e translação do ge-ne de anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de ex-pressão são escolhidos para ser compatíveis com a célula hospedeira deexpressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeiapesada de anticorpo podem ser inseridos em vetor separado ou, mais tipi-camente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Osgenes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodospadrões (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares nofragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade cega senenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões leves e de Vh dosanticorpos descritos aqui podem ser usadas para criar genes de anticorpo decomprimento total de qualquer isótipo de anticorpo os inserindo em vetoresde expressão que já codificam regiões constantes de cadeia pesada e decadeia leve do isótipo desejado de modo que o segmento de Vh é operati-vãmente ligado ao(s) segmento(s) de CH dentro do vetor e o segmento deVl é operativamente ligado ao segmento de Cl dentro do vetor. Adicional oualternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um pep-tídeo sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hos-pedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de modoque o peptídeo sinal é ligado dentro da estrutura ao término amino do genede cadeia de anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imu-noglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal deuma proteína de não-imunoglobulina).

Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expres-são recombinantes da invenção carregam seqüências reguladoras que con-trolam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospe-deira. O termo "seqüência reguladora" é intencionado incluir promotores,intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo,sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação dos ge-nes de cadeia de anticorpo. Tais seqüências reguladoras são descritas, porexemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymo-logy 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). É para ser apreciado poraqueles versados na técnica que o projeto do vetor de expressão, incluindoa seleção de seqüências reguladoras, pode depender de tais fatores como aescolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão deproteína desejado, etc. Seqüências reguladoras para expressão de célulahospedeira mamífera incluem elementos virais que direcionam níveis altosde expressão de proteína em células mamíferas, tais como promotores e/ouintensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), Símio Vírus 40 (SV40),adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (Ad-MLP)), e polioma. Alternativamente, seqüências reguladoras não-virais po-dem ser usadas, tais como o promotor de ubiquitina ou promotor de P-globina. Ainda também, elementos reguladores compostos de seqüências defontes diferentes, tais como o sistema de promotor de SRa contendo se-qüências do promotor prematuro de SV40 e a repetição terminal longa devírus de leucemia de célula T humano tipo 1 (Takebe, Y., et al., 1988 Mol.Cell. Biol. 8:466-472).

Além dos genes de cadeia de anticorpo e seqüências regulado-ras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregarseqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação dovetor nas células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genesmarcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleçãodas células hospedeiras às quais o vetor foi introduzido (vide, por exemplo,Patentes U.S. Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel et al.).Por exemplo, tipicamente o gene de marcador selecionável confere resistên-cia a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célulahospedeira à qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveisincluem o gene de diidrofolato reductase (DHFR) (para uso em células hos-pedeiras de dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo(para seleção de G418).

Para expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor(es) deexpressão codificando as cadeias pesadas e leves são transfeccionados emuma célula hospedeira através de técnicas padrões. As várias formas do termo"transfecção" são intencionada a abranger uma ampla variedade de técnicascomumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospe-deira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação defosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrana e outros. É teoricamente pos-sível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticasou eucarióticas. Expressão de anticorpos em células eucarióticas, em particularcélulas hospedeiras mamíferas, é debatida porque tais células eucarióticas, eem particular células mamíferas, são mais prováveis que as células procarióti-cas de montar e segregar um anticorpo corretamente dobrado e de ligação deantígeno. Expressão procariótica dos genes de anticorpo foi relatada ser inefi-caz para a produção de rendimentos altos de anticorpo ativo (Chefe, M. A. eWood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13).

Células hospedeiras mamíferas para expressar os anticorposrecombinantes da invenção incluem Ovário de Hamster chinês (célulasCHO) (incluindo células de CHO de dhfr, descrito por Urlaub e Chasin, 1980Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 usado com um marcador de FR deDH selecionável, por exemplo, como descrito em R. J. Kaufman e P. A.Sharp 1982 Mol Biol. 159:601-621, células de mieloma de NSO1 células COSe células SP2. Em particular, para uso com células de mieloma de NSO, ou-tro sistema de expressão é o sistema de expressão de gene de GS mostra-do em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando vetores de ex-pressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidosnas células hospedeira mamíferas, os anticorpos são produzidos cultivandoas células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitirexpressão do anticorpo nas células hospedeiras ou secreção do anticorpono meio de cultura onde as células hospedeiras são crescidas. Os anticor-pos podem restabelecer-se do meio de cultura usando métodos de purifica-ção de proteína padrões.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composi-ção, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo uma ou umacombinação de uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização, ou deporção(ões) de ligação de antígeno da mesma, da presente invenção, formu-ladas juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais compo-sições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou maisdiferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas dainvenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção podecompreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou bis-pecíficos) que ligam a epítopos diferentes no antígeno alvo ou que têm ativi-dades complementares.

Composições farmacêuticas da invenção também podem ser ad-ministradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes.

Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpode anti-DKK1 da presente invenção combinado com pelo menos um outroagente anti-inflamatório ou antiosteoprótico. Exemplos de agentes terapêuti-cos que podem ser usados em terapia de combinação são descritos emmaior detalhe abaixo na seção sobre usos dos anticorpos da invenção.Como aqui usado, "o veículo farmaceuticamente aceitável" incluiquaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentesantibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absor-ção, e outros que são fisiologicamente compatíveis. O veículo deveria seradequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, pa-renteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). De-pendendo da rota de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imu-noconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um materialpara proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturaisque podem inativar o composto.

Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um oumais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitá-vel" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do compos-to de origem e não dá efeito toxicológico indesejado (vide por exemplo, Ber-ge, S. M., et ai., 1977 J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluemsais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácidoincluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não-tóxicos, tais como clo-rídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidroiódico, fosforoso e ou-tros, como também de ácidos orgânicos não-tóxicos tais como ácidos alifáti-cos mono e di-carboxílicos, ácidos alcanóicos fenil-substituídos, ácidos alca-nóicos de hidróxi, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáti-cos e outros. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metaisalcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e outros, co-mo também de aminas orgânicas não-tóxicas, tais como Ν,Ν'-dibenziletileno-diamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodia-mina, procaína e outros.

Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluirum antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantesfarmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em água, taiscomo ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissul-feto de sódio, sulfito de sódio e outros; antioxidantes solúveis em óleo, taiscomo palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno bu-tilado (BHT)j Iecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol, e outros; e agentesquelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético(EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e outros.

Exemplos de veículos aquosos e não-aquosos adequados quepodem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção inclu-em água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol,e outros), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como a-zeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Flui-dez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de re-vestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícularequerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

Estas composições podem· também conter adjuvantes tais comoconservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dis-persantes. Prevenção da presença de microorganismos pode ser assegura-da tanto por procedimentos de esterilização, supra, como pela inclusão devários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, cloro-butanol, ácido sórbico de fenol, e outros. Pode também ser desejável incluiragentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e outros nas com-posições. Além disso, absorção prolongada da forma farmacêutica injetávelpode ser provocada pela inclusão de agentes tais como os que tardam aabsorção, monoestearato de alumínio e gelatina.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquo-sas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporâneade soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentespara substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Excetodesde que quaisquer meios convencionais ou agente sejam incompatíveiscom o composto ativo, uso dos mesmos nas composições farmacêuticas dainvenção é contemplado. Compostos ativos adicionais podem também serincorporados nas composições.

Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e es-táveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição po-de ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outraestrutura ordenada adequada para concentração de fármaco alta. O veículopode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água,etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líqui-do, e outros), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada podeser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina,pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão epelo uso de tensoativos. Em muitos casos, pode-se incluir agentes isotôni-cos, por exemplo, açúcares, polialcoóis tais como manitol, sorbitol, ou cloretode sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveispode ser provocada incluindo na composição um agente que tarda a absor-ção por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporandoo composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado comum ou uma combinação de componentes enumerados acima, conforme re-querido, seguido por microfiltração de esterilização. Em geral/dispersõessão preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril con-tendo um meio de dispersão básico e os outros componentes requeridosdaqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação desoluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são secagem a vá-cuo e secagem por congelação (liofilização) que rende um pó do componen-te ativo mais qualquer componente desejado adicional de uma solução pre-viamente filtrada estéril deste.

A quantidade de componente ativo que pode ser combinado comum material de veículo para produzir uma forma de dosagem simples varia-rá, dependendo do sujeito sendo tratado, e do modo particular de adminis-tração. A quantidade de componente ativo que pode ser combinado com ummaterial de veículo para produzir uma forma de dosagem simples em geralserá aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico.Em geral, fora cem por cento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 porcento a cerca de noventa e nove por cento de componente ativo, de cercade 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, ou de cerca de 1 por cento a cercade 30 por cento de componente ativo em combinação com um veículo far-maceuticamente aceitável.

Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a respostadesejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, umbolo simples pode ser administrado, várias doses divididas podem ser admi-nistradas com o passar do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente re-duzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêuti-ca. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em formade unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade dedosagem. Forma de unidade de dosagem como aqui usada refere-se às uni-dades fisicamente distintas adaptadas como dosagens unitárias para os su-jeitos a ser tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminadade composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado emassociação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para aunidade de dosagem forma da invenção é ditada e diretamente dependentedas características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particu-lar a ser alcançado, e as limitações inerentes na técnica de compor um talcomposto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Para administração do anticorpo, a dosagem varia de cerca de0,0001 a 200 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 50 mg/kg, do peso do corpodo hospedeiro. Por exemplo dosagens podem ser 0,3 mg/kg do peso do cor-po, 1 mg/kg do peso do corpo, 3 mg/kg do peso do corpo, 5 mg/kg do pesodo corpo ou 10 mg/kg do peso do corpo ou dentro da faixa de 1-20 mg/kg.Um regime de tratamento exemplar requer administração uma vez por se-mana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, umavez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ouuma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem para um anticorpo deanti-DKK1 da invenção incluem 1 mg/kg do peso do corpo ou 3 mg/kg dopeso do corpo por administração intravenosa, com o anticorpo sendo dadousando um dos programas de doseamento a seguir: a cada quatro semanaspara seis dosagens, depois a cada três meses; a cada três semanas; 3mg/kg do peso do corpo uma vez seguidos por 1 mg/kg do peso do corpo acada três semanas.Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais comespecificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente,em cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro das fai-xas indicadas. Anticorpo é usualmente administrado em ocasiões múltiplas.Intervalos entre dosagens simples podem ser, por exemplo, semanal, men-sal, a cada três meses ou anualmente. Intervalos podem também ser irregu-lares como indicado medindo os níveis de anticorpo no sangue do pacientepara o antígeno alvo ou de algum biomarcador tal como OCN, OPG ouP1NP. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma con-centração de anticorpo de plasma de cerca de 1-1000 pg/ml e em algunsmétodos cerca de 25-300 pg/mí.

Alternativamente, anticorpo pode ser administrado como umaformulação de liberação contínua em cujo caso administração menos fre-qüente é requerida. Dosagem e freqüência variam, dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram ameia-vida mais longa, seguidos por anticorpos humanizados, anticorposquiméricos, e anticorpos não-humanos. A dosagem e freqüência de adminis-tração pòdem variar, dependendo se o tratamento é profilático ou terapêuti-co. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é adminis-trada em intervalos relativamente infreqüentes em um período longo de tem-po. Alguns pacientes continuam recebendo tratamento para o resto de suasvidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em in-tervalos relativamente curtos é às vezes requerida até progressão da doençaser reduzida ou terminada ou até que o paciente mostre melhora parcial oucompleta dos sintomas da doença. Depois disso, o paciente pode ser admi-nistrado com um regime profilático.

Níveis de dosagem atuais dos componentes ativos nas composi-ções farmacêuticas da presente invenção podem ser variados para obter umaquantidade do componente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta tera-pêutica desejada para um paciente, composição, e modo de administração par-ticulares, sem ser tóxicos ao paciente. O nível de dosagem selecionado depen-derá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade dascomposições particulares da presente invenção empregada, ou do éster, sal ouamida das mesmas, da rota de administração, do tempo de administração, dataxa de excreção do composto particular sendo empregado, da duração do tra-tamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinaçãocom as composições particulares empregadas, da idade, sexo, peso, condição,saúde geral e história médica anterior do paciente sendo tratado, e também defatores conhecidos nas técnicas médicas.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo deanti-DKK1 da invenção pode resultar em uma diminuição na severidade dossintomas da doença, um aumento na freqüência e duração dos períodossem sintomas da doença, ou uma prevenção do prejuízo ou inaptidão devidoà aflição da doença.

Uma composição da presente invenção pode ser administradapor uma ou mais rotas de administração usando um ou mais de uma varie-dade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelo artesãoversado, a rota e/ou modo de administração variará, dependendo dos resul-tados desejados. Rotas de administração para anticorpos da invenção inclu-em rotas de administração intravenosas, intramusculares, intradérmicas, in-traperitoneais, parenterais, subcutâneas, espinhais ou outras, por exemplopor injeção ou infusão. A frase "administração parenteral" como aqui usadasignifica modos de administração diferentes de administração enteral e tópi-ca, usualmente através de injeção, e incluem, sem limitação, injeção intrave-nosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intra-cardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueana, subcutânea, subcuti-cular, intrarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, epidural e in-traesternal e infusão.

Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser adminis-trado por uma rota não-parenteral, tal como uma rota de administração tópi-ca, epidérmica ou mucosa, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sub-Iingual ou topicamente.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que pro-tegerão o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de Iibe-ração controlada, incluindo implantes, emplastos transdérmicos, e sistemas deliberação microencapsulado. Polímeros biodegradáveis, biocompatívéis, taiscomo acetato de vinila de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno,poliortoésteres, e ácido poliláctico podem ser usados. Muitos métodos para apreparação de tais formulações são patenteados ou em geral conhecidos àque-les versados na técnica. Vide, por exemplo, sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery, J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.

As composições terapêuticas podem ser administradas com dis-positivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade,uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com umdispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivosmostrados nas Patentes U.S. Nos. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335;5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes emódulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U. S.N°. 4.487.603, que mostra uma bomba de micro-infusão implantável paradispensar medicação a uma taxa controlada; Patente U. S. N°. 4.486.194,que mostra um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos atra-vés da pele; Patente U. S. N0. 4.447.233, que mostra uma bomba de infusãode medicação para liberar medicação a uma taxa de infusão precisa; Paten-te U. S. N°. 4.447.224, que mostra um aparelho de infusão implantável defluxo variável para liberação de fármaco contínua; Patente U. S. N0.4.439.196, que mostra um sistema dê liberação de fármaco osmótico tendocompartimentos de multi-câmara; e Patente U. S. N°. 4.475.196, que mostraum sistema de liberação de fármaco osmótico. Estas patentes são incorpo-radas aqui por referência. Muitos outros tais implantes, sistemas de libera-ção, e módulos são conhecidos àqueles versados na técnica.

Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos dainvenção podem ser formulados para assegurar distribuição apropriada invivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compos-tos altamente hidrófilos. Para assegurar que os compostos terapêuticos dainvenção cruzem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por e-xemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas, vide,por exemplo, Patentes U.S. 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os Iiposso-mas podem compreender uma ou mais metades que são seletivamentetransportadas para as células ou órgãos específicos, desse modo intensifi-cam a liberação de fármaco alvejada (vide, por exemplo, V. V. Ranade, 1989J. Cline Pharmacol. 29:685). Metades de alvejmento exemplares incluemfolato ou biotina (vide, por exemplo, Patente U. S. 5.416.016 para Low et al.);manosídeos (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun.153:1038); anticorpos (P. G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M.Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de pro-teína A de tensoativo (Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol. 1233:134); p120(Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090); vide também K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler, 1994 Immu-nomethods 4:273.

AS COMBINAÇÕES

(a) uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização; e

(b) um ou mais agentes farmaceuticamente ativos..

A invenção também refere-se às composições farmacêuticascompreendendo:

(a) uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização;

(b) um agente farmaceuticamente ativo; e

(c) um veículo farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também refere-se a um pacote comercialou produto compreendendo:

(a) uma formulação farmacêutica de uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização; e

(b) uma formulação farmacêutica de um agente farmaceutica-mente ativo para uso simultâneo, simultâneo, separado ou seqüencial.

OS AGENTES FARMACEUTICAMENTE ATIVOSO termo "agentes farmaceuticamente ativos" é um vasto abran-gendo muitos agentes farmaceuticamente ativos tendo mecanismos diferen-tes de ação. Combinações de alguns destes com anticorpos/composições deDKK1/4 de neutralização podem resultar em melhorias na terapia de câncer.Em geral, agentes farmaceuticamente ativos são classificados de acordocom o mecanismo de ação. Muitos dos agentes disponíveis são antimetabó-litos das vias de desenvolvimento de vários tumores, ou reagem com o DNAdas células tumorais. Há também agentes que inibem enzimas, tais comotopoisomerase I e topoisomerase II, ou que são agentes antimitóticos.

Pelo termo "agente farmaceuticamente ativo" é especialmentesignificado qualquer agente farmaceuticamente ativo diferente de uma com-posição de anti-DKK1/4 de neutralização ou um derivado da mesma. Eleinclui, mas não é limitado:

i. um inibidor de aromatase;

ii. um antiestrogênio, um antiandrógeno ou um agonista de go-nadorrelina;

iii. um inibidor de topoisomerase I ou um inibidor de topoisome-rase II;

iv. um agente ativo de microtúbulo, um agente de alquilação, umantimetabólito antineoplástico ou um composto de platina;

v. um composto alvejando/diminuindo uma proteína ou atividadede cinase lipídicâ ou uma proteína ou atividade de fosfatase lipídica, um ou-tro composto antiangiogênico ou um composto que induze processos de di-ferenciação de célula;

vi. anticorpos monoclonais;

vii. um inibidor de ciclooxigenase, um bisfosfonato, um inibidorde heparanase, um modificador de resposta biológica;

viii. um inibidor de isoformas oncogênicas de Ras;

ix. um inibidor de telomerase;

x. um inibidor de protease, um inibidor de metaloproteinase dematriz, um inibidor de metionina aminopeptidase, ou um inibidor de proteas-soma;xi. agentes usados no tratamento de malignidades hematológi-cas ou compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de Flt-3;

xii. um inibidor de HSP90;

xiii. anticorpos antiproliferativos;

xiv. um inibidor de histona desacetilase (HDAC);

xv. um composto que alveja, diminui ou inibe a atividade/funçãode serina/treonina mTOR cinase;

xvi. um antagonista de receptor de somatostatina;

xvii. um composto antileucêmico;

xviii. métodos de dano de células tumorais;

xix. um aglutinante de EDG;

xx. um inibidor de ribonucleotídeo reductase;

xxi. um inibidor de S-adenosilametionina descarboxilase;

xxii. um anticorpo monoclonal de VEGF ou VEGFR;

xxiii. terapia fotodinâmica;

xxiv. um esteróide angiostático;

xxv. um implante contendo corticosteróides;

xxvi. um antagonista de receptor de AT1; e

xxvii. um inibidor de ACE.

O termo "inibidor de aromatase", como aqui usado, refere-se aum composto que inibe a produção de estrogênio, isto é, a conversão dossubstratos de androstenediona e testosterona para estrona e estradiol, res-pectivamente. O termo inclui, mas não é limitado a, esteróides, especialmen-te atamestana, exemestana e formestana; e, em particular, não-esteróides,especialmente aminoglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano,testolactona, cetoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol e letrozol. Exemesta-no é comercializado como AROMASIN; formestano como LENTARON; fa-drozol como AFEMA; anastrozol como ARIMIDEX; letrozol como FEMARAou FEMAR; e aminoglutetimida como ORIMETEN. Uma combinação da in-venção compreendendo um agente farmaceuticamente ativo que é um inibi-dor de aromatase é particularmente útil para o tratamento de tumores positi-vos de receptor hormonal, por exemplo, tumores de mama.O termo "antiestrogênio", como aqui usado, refere-se a um com-posto que antagoniza o efeito dos estrogênios no nível de receptor de estrogê-nio. O termo inclui, mas não é limitado a, tamoxifeno, fulvestrant, raloxifeno ecloridrato de raloxifeno. Tamoxifeno pode ser administrado na forma como écomercializado, por exemplo, NOLVADEX; e cloridrato de raloxifeno é comerci-alizado como EVISTA. Fulvestrant pode ser formulado como revelado na Pa-tente U. S. N0. 4.659.516 e é comercializado como FASLODEX. Uma combina-ção da invenção que compreende um agente farmaceuticamente ativo que éum antiestrogênio é particularmente útil para o tratamento de tumores positivosde receptor de estrogênio, por exemplo, tumores de mama.

O termo "antiandrógeno", como aqui usado, refere-se a qualquersubstância que é capaz de inibir os efeitos biológicos de hormônios andro-gênicos e inclui, mas não é limitado a, bicalutamida (CASODEX) que podeser formulada por exemplo, como revelado na Patente U. S. N0. 4.636.505.

O termo "agonista de gonadorrelina", como aqui usado, inclui,mas não é limitado a, abarelix, goserrelina e acetato de goserrelina. Goser-relina é revelada na Patente U. S. N°. 4.100.274 e é comercializada comoZOLADEX. Abarelix pode ser formulado, por exemplo, como revelado naPatente U. S. N0. 5.843.901.

O termo "inibidor de topoisomerase I", como aqui usado, inclui,mas não é limitado a, topotecan, gimatecan, irinotecan, camptotecina e seusanálogos, 9-nitrocamptotecina e a camptotecina macromolecular PNU-166148 conjugada (composto A1 em WO 99/17804). Irinotecan pode seradministrado, por exemplo, na forma como é comercializado, por exemplo,sob a marca registrada CAMPTOSAR. Topotecan pode ser administrado,por exemplo, na forma que é comercializado, por exemplo, sob a marca re-gistrada HYCAMTIN.

O termo "inibidor de topoisomerase M", como aqui usado, inclui,mas não é limitado a, o antraciclinas, tais como doxorrubicina, incluindo for-mulação lipossomal, por exemplo, CAELYX, daunorrubicina, incluindo formu-lação lipossomal, por exemplo, DAUNOSOME, epirrubicina, idarrubicina enemorrubicina; as antraquinonas mitoxantrona e losoxantrona; e as podofilo-toxinas etoposide e teniposide. Etoposide é comercializado como ETOPO-PHOS; teniposide como VM 26-BRISTOL; doxorrubicina como ADRIBLAS-TIN ou ADRIAMYCIN; epirrubicina como FARMORUBICIN; idarrubicina co-mo ZAVEDOS; e mitoxantrona como NOVANTRON.

O termo "agente ativo de microtúbulo" como aqui usado, refere-se aos agentes estabilizantes de microtúbulo, desestabilizantes de microtú-bulo e inibidores de polimerização de microtublina incluindo, mas não limita-dos, taxanos, por exemplo, paciltaxel e docetaxel; alcalóides de vinca, porexemplo, vinblastina, especialmente sulfato de vinblastina; vincristina, espe-cialmente sulfato de vincristina e vinorelbina; discodermolídas; colquicina eepotilonas e derivados das mesmas, por exemplo, epotilona B ou um deriva-do desta. Paclitaxel é comercializado como TAXOL; docetaxel como TAXO-TERE; sulfato de vinblastina como VINBLASTIN R.P; e sulfato de vincristinacomo FARMISTIN. Também inclusas estão as formas genéricas de paclita-xel como também várias formas de dosagem de paclitaxel. Formas genéri-cas de paclitaxel incluem, mas não são limitadas a, cloridrato de betaxolol.Várias formas de dosagem de paclitaxel incluem, mas não são limitadas a,paclitaxel de nanopartícula de albumina comercializado como ABRAXANE;ONXOL, CYTOTAX. Discodermolida pode ser obtida, por exemplo, comorevelado na Patente U. S. N°. 5.010.099. Também inclusos estão os deriva-dos de Epotolina que são revelados na Patente U. S. N°. 6.194.181, WO98/10121, WO 98/25929, WO 98/08849, WO 99/43653, WO 98/22461 e WO00/31247. Especialmente preferido é Epotolina A e/ou B.

O termo "agente de alquilação", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan ou nitrosouréia (BCNUou Gliadel), ou temozolamida (TEMODAR). Ciclofosfamida pode ser admi-nistrada, por exemplo, na forma como é comercializado, por exemplo, sob amarca registrada CYCLOSTIN; e ifosfamida como HOLOXAN.

O termo "antimetabólito antineoplástico" inclui, mas não é limitadoa, 5-fluorouracila (5-FU); capecitabina; gencitabina; agentes de desmetilação deDNA, tais como 5-azacitidina e decitabina; metotrexato; edatrexato; e antago-nistas de ácido fólico tais como, mas não limitados, pemetrexed. Capecitabinapode ser administrada, por exemplo, na forma como é comercializada, por e-xemplo, sob a marca registrada XELODA; e gencitabina como GEMZAR.

O termo "composto de platina", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a, carboplatina, cis-platina, cisplatina, oxaliplatina, Satraplati-na e agentes de platina tais como ZD0473. Carboplatina pode ser adminis-trada, por exemplo, na forma como é comercializada, por exemplo, CARBO-PLAT; e oxaliplatina como ELOXATIN.

O termo "compostos para alvejar/diminui uma proteína ou ativi-dade de lipídio cinase; ou uma proteína ou atividade de lipídio fosfatase; ououtros compostos antiangiogênicos", como aqui usado, inclui, mas não élimitado a, inibidores de proteína tirosina cinase e/ou serina e/ou teroina ci-nase ou inibidores de lipídio cinase, por exemplo:

i) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade dosreceptores de fator de crescimento endoteliais vasculares (VEGF), tais comocompostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de VEGF, especi-almente compostos que inibem o receptor de VEGF, tais como, mas nãolimitados, derivados de 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (AEE788); BAY 43-9006;compostos de isolcolina revelados em WO 00/09495 tais como (4-terc-butil-fenil)-94-piridin-4-ilmetil-isoquinolin-1-il)-amina (AAL881); e

ii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade dosreceptores de fator de crescimento derivados de plaqueta (PDGFR), taiscomo compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de PDGFR,especialmente compostos que inibem o receptor de PDGF, por exemplo, umderivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, por exemplo, imatinib, SU101,SU6668 e GFB-111;

iii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade dosreceptores de fator de crescimento de fibroblasto (FGFR);

iv) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade doreceptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1R), tal comocompostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de IGF-IR, especi-almente compostos que inibem o receptor de IGF-1R. Compostos incluemmas não são limitados aos compostos revelados em WO 02/092599 e deri-vados destes dos derivados de 4-amino-5-fenil-7-ciclobutil-pirrolo[2,3-d]pirimidina (AEW541);

v) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade dafamília de tirosina cinase de receptor de Trk;

vi) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade dafamília de tirosina cinase de receptor de Axl;

vii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade doreceptor c-Met;

viii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade datirosina cinase de receptor Ret;

ix) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade datirosina cinase de receptor Kit/SCFR;

x) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade dastirosina cinases de receptor C-kit (parte da família de PDGFR), tais comocompostos que alvejam, diminuem ou inibemm a atividade da família de tiro-sina cinase de receptor c-kit, especialmente compostos que inibem o recep-tor c-kit, por exemplo, imatinib;

xi) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade demembros da família de c Abl e seus produtos de fusão de genes, por exemplo,BCR-AbI cinase, tais como compostos que alvejam, diminuem ou inibe a ativi-dade dos membros da família c-Abl e seus produtos de fusão de gene, por e-xemplo, um derivado de N-fenil-2-pirimidina-amina, por exemplo, imatinib,PD180970, AG957, NSC 680410 ou PD173955 de ParkeDavis; BMS354825

xii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade demembros da família proteína cinase C (PKC) e Raf das serina/treonina cinases,membros dos membros da família MEK, SRC, JAK, FAK, PDK e Ras/MAPK, oufamília de Pl(3) cinase, ou da família de cinase relacionada a Pl(3) cinase, e/ouos membros da família de cinase ciclina-dependente (CDK) e são especialmen-te aqueles derivados de estaurosporina revelados na Patente U. S. N°.5.093.330, por exemplo, midostaurina; exemplos de compostos também inclu-em, por exemplo, UCN-01; safingol; BAY 43-9006; Briostatina 1; Perifosina;llmofosina; RO 318220 e RO 320432; GO 6976; Isis 3521;LY333531/LY379196; compostos de isoquinolina, tais como aqueles reveladosem WO 00/09495; FTIs; PD184352 ou QAN697, um inibidor de P13K;

xiii) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade deproteína-tirosina cinase, tais como mesilato de imatinib (GLEEVEC); thyr-phostin ou pirimidilaminobenzamida e derivados destes (AMN107). Um thyr-phostin é preferivelmente um composto de peso molecular baixo (Mw <1500), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, especialmente umcomposto selecionado da classe de benzilidenomalonitrila ou o S arilbenze-nomalonirila ou classe de quinolina de bissubstrato dos compostos, maisespecialmente qualquer composto selecionado do grupo que consiste emTyrphostin A23/RG-50810, AG 99, Tyrphostin AG 213, Tyrphostin AG 1748,Tyrphostin AG 490, Tyrphostin B44, (+) enantiômero de Tyrphostin B44, Tyr-phostin AG 555, AG 494, Tyrphostin AG 556; AG957 e adaphostin (éster deadamantila de ácido 4-{[(2,5-dihidroxifenil)metil]amino}-benzóico, NSC680410, adaphostin);

xiv) compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade dafamília de receptor de fator de crescimento epidérmico de tirosina cinases(EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo ou heterodímeros), tais comocompostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade da família de recep-tor de fator de crescimento epidérmico são especialmente compostos, prote-ínas ou anticorpos que inibem os membros da família de tirosina cinase dereceptor EGF, por exemplo, Receptor de EGF, ErbB2, ErbB3 e ErbB4 ou ligaa EGF ou Iigandos relacionados a EGF, e são em particular aqueles com-postos, proteínas ou anticorpos monoclonais genérica e especificamenterevelados em WO 97/02266, por exemplo, o composto do Exemplo 39, ou naEP O 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP O 566 226, EP O 787 722, EPO 837 063, Patente U. S. N°. 5.747.498, WO 98/10767, WO 97/30034, WO97/49688, WO 97/38983 e, especialmente, WO 96/30347, por exemplo, ocomposto conhecido como CP 358774, WO 96/33980, por exemplo, com-posto ZD 1839; e WO 95/03283, por exemplo, composto ZM105180, por e-xemplo, trastuzumab (HERCEPTIN®), cetuximab, Iressa, OSI-774, Cl 1033,EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 ou E7.6.3, ederivados de 7H-pirrolo-[2,3-d]pirimidina que são revelados em WO03/013541, erlotinib e gefitinib. Erlotinib pode ser administrado na forma co-mo é comercializado, por exemplo TARCEVA, e gefitinib como IRESSA, an-ticorpos monoclonais humanos contra o receptor de fator de crescimentoepidérmico incluindo ABX-EGFR; e

xv) Compostos que alvejam, diminuem ou inibem a ativida-de/função de serina/treonina mTOR cinase são especialmente compostos,proteínas ou anticorpos que alvejam/inibem membros da família de mTORcinase, por exemplo, RAD, RAD001, CCI-779, ABT578, SAR543, rapamicinae derivados/análogos dos mesmos, AP23573 e AP23841 de Ariad, everoli-mus (CERTICAN) e sirolimus. CERTICAN (everolimus, RAD) um inibidor desinal de proliferação investigatória novo que impede proliferação de células Te células vasculares do músculo liso.

Ao referir ao anticorpo, é para incluir anticorpos monoclonaisintactos, nanocorpos, anticorpos policlonais, anticorpos multi-específicosformados de pelo menos 2 anticorpos intactos, e fragmentos de anticorposdesde que eles exibam a atividade biológica desejada.

A frase "composto que alveja, diminui ou inibe a atividade deuma proteína ou Iipfcfio fosfatase" como aqui usada inclui mas não é limitadaa inibidores de fosfatase 1, fosfatase 2A, PTEN ou CDC25, por exemplo,ácido ocadáico ou um derivado dos mesmos.

O termo "anticorpos monoclonais", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a bevacizumab, cetuximab, trastuzumab, Ibritumomab tiuxe-tan, denosumab, anti-CD40, anti-GM-CSF, e tositumomab e iodo I 131. Be-vacizumab pode ser administrado na forma como é comercializado, por e-xemplo AVASTIN; cetuximab como ERBITUX; trastuzumab como HERCEP-TIN; Rituximab como MABTHERA; Ibritumomab tiuxetan como ZEVULIN;anti-RANKL como denosumab (AMG 162), anti-CD40 como HCD122 (pedidode patente U. S. 2002-0106371), e tositumomab e iodo 1131 como BEXXAR.

A frase "outros compostos antiangiogênicos" inclui mas não élimitada a compostos tendo outro mecanismo para sua atividade, por exem-plo, não relacionada à inibição de proteína ou lipídio cinase, por exemplo,talidomida (THALOMID) e ΤΝΡ-470.

A frase "compostos que induzem processos de diferenciação decélula" como aqui usado, incluem mas não são limitados a ácido retinóico, a-, γ- ou δ-tocoferol ou a- ou, γ- ou δ-tocotrienol.

O termo "inibidor de ciclooxigenase" como aqui usado inclui,mas não é limitado a, por exemplo, inibidores de Cox-2, ácido 5-alquil 2-arilaminofenilacético substituído e derivados, tais como celecoxib (CELE-BREX), rofecoxib (VIOXX), etoricoxib, valdecoxib ou um ácido 5-alquil-2-arilaminofenilacético, por exemplo, ácido 5-metil-2-(2'-cloro-6'-fluoroanili-no)fenil acético, lumiracoxib.

O termo "bisfosfonatos", como aqui usado, inclui, mas não é limi-tado a, ácido etridônico, clodrônico, tiludrônico, pamidrônico, alendrônico,ibandrônico, risedrônico e zoldrônico. "Ácido etridônico" pode ser adminis-trado, por exemplo, na forma como é comercializado, por exemplo, DIDRO-NEL; "ácido clodrônico" como BONEFOS; "ácido tiludrônico" como SKELID;"ácido pamidrônico" como AREDIA; "ácido alendrônico" como FOSAMAX;"ácido ibandrônico" como BONDRANAT; "ácido risedrônico" como ACTO-NEL; e "ácido zoldrônico" como ZOMETA.

O termo "inibidor de heparanase", como aqui usado, refere-se acompostos que alvejam, diminuem ou inibem degradação de sulfato de he-parina. O termo inclui, mas não é limitado a, Pl 88.

O termo "modificador de resposta biológica", como aqui usado,inclui, mas não é limitado a Iinfocina ou interferonas, por exemplo, interferona γ.

O termo "inibidor de isoformas oncogênicas de Ras", como aquiusado, inclui, mas não é limitado a, H-Ras1 K-Ras ou N-Ras, como aqui usa-do, refere-se aos compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividadeoncògênica de Ras, por exemplo, um inibidor de farnesil transferase (FTI),por exemplo, L-744832, DK8G557 ou R115777 (ZARNESTRA).

O termo "inibidor de telomerase", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a, compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade detelomerase. Compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade detelomerase são especialmente compostos que inibem o receptor de telome-rase, por exemplo, telomestatina.

O termo "inibidor de metaloproteinase de matriz" ou (inibidor deMMP), como aqui usado, inclui, mas não é limitado a, inibidores peptidomiméti-co e não-peptidomimético de colágeno; derivados de tetraciclina, por exemplo,inibidor peptidomimético de hidroxamato batimastat; e seus análogo oralmentebiodisponível marimastat (BB-2516), prinomastat (AG3340), metastat (NSC683551) BMS 279251, LADRE 12-9566, TAA211, MMI270B Ou AAJ996.

O termo "inibidor de aminopeptidase metionina", como aqui usa-do, inclui, mas não é limitado a, compostos que alvejam, diminuem ou ini-bem a atividade de metionina aminopeptidase. Compostos que alvejam, di-minuem ou inibem a atividade de metionina aminopeptidase são, por exem-plo, bengamida ou um derivado deste.

O termo "inibidores de proteassoma", como aqui usado, incluicompostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade do proteassoma.Compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade da proteassoma in-cluem, mas não são limitados a, PS-341; MLN 341. bortezomib ou Velcade.

A frase "agente usado no tratamento de malignidades hematoló-gicas", como aqui usada, inclui, mas não é limitada a, inibidores de tirosinacinase semelhantes a FMS, por exemplo, compostos alvejando, diminuindoou inibindo a atividade de receptores de tirosina cinase semelhantes a FMS(Flt-3R); interferona, 1-b-D-arabinofuransilacitosina (ara-c) e bissulfano; einibidores de ALK, por exemplo, compostos que alvejam, diminuem ou ini-bem cinase de Iinfoma anaplástico.

A frase "compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividadede Flt-3" como aqui usada, inclui, mas não é limitada a, compostos, proteí-nas ou anticorpos que inibem Flt-3, por exemplo, N-benzoil-estaurosporina,midoestaurina, um derivado de estaurosporina, SU11248 e MLN518.

O termo "inibidores de HSP90", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a, compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade deATPase intrínseca de HSP90; degradando, alvejando, diminuindo ou inibindoas proteínas de HSP90 clientes por meio da via de proteassoma de ubiquiti-na. Compostos alvejando, diminuindo ou inibindo a atividade de ATPase in-trínseca de HSP90 são especialmente compostos, proteínas ou anticorposque inibem a atividade de HSP90 ATPase, por exemplo, 17-alilamino,17-demetoxigeldanamicina (17AAG), um derivado de geldanamicina; outroscompostos relacionados à geldanamicina; inibidores de radicicol e de HDAC.

O termo "um anticorpo antíproliferativo" como aqui usado, inclui,mas não é limitado a, trastuzumab (HERCEPTIN), trastuzumab-DM1, èrloti-nib (TARCEVA), bevacizumab (AVASTIN), rituximab (RITUXAN), PR064553(anti-CD40) e Anticorpo de 2C4. Por anticorpos é significado por exemploanticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multies-pecíficos formados de pelo menos 2 anticorpos intactos, e fragmentos deanticorpos desde que eles exibam a atividade biológica desejada.

O termo "inibidor de HDAC", como aqui usado refere-se aoscompostos que inibem a histona desacetilase e que possuem atividade anti-proliferativa. Estes incluem, mas não são limitados a, compostos reveladosem WO 02/22577, especialmente N-hidróxi-3-[4-[[(2-hidroxietil)[2-(1 H-indol-3-il)etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida, e N-hidróxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1 H-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamida e sais farmaceutica-mente aceitáveis dos mesmos (LBH589). Este também especialmente incluiácido hidroxâmico de suberoilanilida (SAHA); éster de piridino-3-ilmetila deácido [4-(2-amino-fenilcarbamoil)-benzilJ-carbâmico e derivados dos mes-mos; ácido butírico, piroxamida, tricostatina A, Oxamflatina, apicidina, Depsi-peptídeo; depudecina e trapoxina.

A frase "composto que alveja, diminui ou inibe a atividade/funçãode serina/teronina mTOR cinase" como aqui usada, inclui mas não é limitadaa, compostos, proteínas ou anticorpos que alvejam/inibem os membros dafamília de mTOR cinase, por exemplo, RAD1 RAD001, CCI-779, ABT578,SAR543, rapamicina e derivados/análogoss dos mesmos, AP23573 eAP23841 de Ariad, everolimus (CERTICAN) e sirolimus (RAPAMUNE), CCI-779 e ABT578. CERTICAN (everolimus, RAD) um inibidor de sinal de prolife-ração investigacional novo que impede proliferação de células T e célulasvasculares do músculo liso.

O termo "antagonista de receptor de somatostatina", como aquiusado, inclui, mas não é limitado a, agentes que alvejam, tratam ou inibem oreceptor de somatostatina, tal como octreoride e SOM230.

O termo "composto antileucêmico" como aqui usado, inclui, masnão é limitado a, Ara-C, um análogo de pirimidina que é o derivado de 2'-a-hidróxi ribose (arabinoside) de deoxicitidina. Também incluso estão o análogode purina de hipoxantina, 6-mercaptopurina (6-MP) e fosfato de fludarabina.

A frase "método de dano de células tumorais" refere-se aos méto-dos, tais como radiação de ionização. O termo "radiação de ionização", referidoacima e doravante, significa que a radiação de ionização que ocorre comoquaisquer raios eletromagnéticos, tais como Raios X e raios gama; ou partícu-las, tais como partículas alfa, beta e gama. Radiação de ionização é fornecida,mas não limitada, em terapia de radiação e é conhecida na técnica. Vide Hell-man, Câncer, 4- Edição, Vol. 1, Devita et al., Eds., págs. 248-275 (1993).

O termo "aglutinante de EDG" como aqui usado, inclui, mas nãoé limitado a, uma classe de imunossupressores que modulam a recirculaçãode linfócito, tal como FTY720.

O termo "inibidor de ribonucleotídeo reductase" como aqui usa-do, inclui, mas não é limitado a, análogos de nucleosídeo de pirimidina ou depurina incluindo, mas não limitados a, fludarabina e/ou ara-C; 6-tioguanina;5-FU; cladribina; 6-mercaptopurina, especialmente em combinação com ara-C contra ALL; e/ou pentostatina. Inibidores de ribonucleotídeo reductase sãoespecialmente hidroxiuréia ou derivados de 2-hidróxi-1H-isoindol-1,3-diona,tais como PL-1, PL-2, PL-3, PL-4, PL-5, PL-6, PL-7 ou PL 8. Vide Nandy etal., Acta Oncologica, Vol. 33, No. 8, págs. 953-961 (1994).

O termo "inibidores de S-adenosilametionina descarboxilase",como aqui usado, inclui, mas não é limitado a, os compostos revelados naPatente U. S. N°. 5.461.076.

A frase "anticorpos monoclonais de VEGF ou VEGFR", comoaqui usada, inclui, mas não é limitada a, compostos revelados em WO98/35958, por exemplo, 1-(4-cloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazina ou um salfarmaceuticamente aceitável deste, por exemplo, o succinato, ou em WO00/09495, WO 00/27820, WO 00/59509, WO 98/11223, WO 00/27819 e EP0 769 947; aqueles como descritos por Prewett et al., Câncer Res1 Vol. 59,págs. 5209-5218 (1999); Yuan et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 93, págs.14765-14770 (1996); Zhu et al., Câncer Res, Vol. 58, págs. 3209-3214(1998); e Mordenti et al., Toxicol Pathol, Vol. 27, No. 1, págs. 14-21 (1999)em WO 00/37502 e WO 94/10202; ANGIOSTATIN, descrita por 0'Reilly étal., Celll Vol. 79, págs. 315-328 (1994); ENDOSTATIN, descrita por O1ReiIIyet al., Cell, Vol. 88, págs. 277-285 (1997); amidas de ácido antranílico;ZD4190; ZD6474; SU5416; SU6668; bevacizumab; ou anticorpos anti-VEGFou anticorpos de receptor anti-VEGF, por exemplo, rhuMAb e RHUFab; ap-tâmero de VEGF, por exemplo, Macugon; inibidores de FLT-4; inibidores deFLT-3; anticorpo de IgGI de VEGFR-2; Angiozyme (RPI 4610); e Avastan.

O termo "terapia fotodinâmica", como aqui usado, refere-se àterapia que usa certas químicas conhecidas como agentes de fotossensibili-zação para tratar ou impedir cânceres. Exemplos de terapia fotodinâmicaincluem, mas não são limitadas a, tratamento com agentes, tais como, porexemplo, VISUDYNE e porfímero de sódio.

O termo "esteróide angiostático", como aqui usado, inclui, masnão é limitado a, agentes que bloqueiam ou inibem angiogênese, tal como,por exemplo, anecortave, triancinolona, hidrocortisona, 11-a-epiidrocotisol,cortexolona, 17a-hidroxiprogesterona, corticosterona, desoxicorticosterona,testosterona, estrona e dexametasona.

A frase "corticosteróides contendo implante" como aqui usada,inclui, mas não é limitada a, agentes, tais como, por exemplo, fluocinolona edexametasona.

O termo "antagonista de receptor AT1" como aqui usado, inclui,mas não é limitado a, agentes, tais como DIOVAN.

O termo "inibidor de ACE" como aqui usado, inclui, mas não élimitado a, CIBACEN, benazepril, enazepril (LOTENSIN), captopril, enalapril,fosinopril, lisinopril, moexipril, quinapril, ramipril, perindopril e trandolapril.

Outros agentes farmaceuticamente ativos incluem, mas não sãolimitados a, alcalóides de planta, agentes e antagonistas hormonais, modifi-cadores de resposta biológica, preferivelmente Iinfocinas ou interferonas,oligonucleotídeos antissenses ou derivados de oligonucleotídeos; ou agen-tes diversos ou agentes com outro mecanismo de ação ou desconhecido.

Em cada caso onde citações de pedidos de patente ou publica-ções científicas forrem dadas, em particular com respeito às respectivas rei-vindicações dos compostos e aos produtos finais dos exemplos de funcio-namento nelas, o assunto dos produtos finais, as preparações farmacêuticase as reivindicações são por este meio incorporado no presente pedido depatente por referência para estas publicações. Compreendidos são igual-mente os estereoisômeros correspondentes, como também as modificaçõesde cristal correspondentes, por exemplo, solvatos e polimorfos que são reve-lados nelas. Os compostos usados como componentes ativos nas combina-ções reveladas aqui podem ser preparados e administrados como descritonós documentos citados, respectivamente.

A estrutura dos agentes ativos identificados por números de có-digo, nomes genéricos ou comerciais pode ser tirada da edição atual docompêndio padrão "The Merck Index" ou das bases de dados, por exemplo,Patentes Internacionais, por exemplo, Publicações Mundiais IMS, ou as pu-blicações mencionadas acima e abaixo. O conteúdo correspondente dosmesmos é por este meio incorporado por referência.

Será entendido que referências aos componentes (a) e (b) sãosignificadas também incluir os sais farmaceuticamente aceitáveis de quais-quer das substâncias ativas. Se as substâncias ativas compreendidas doscomponentes (a) e/ou (b) tiverem, por exemplo, pelo menos um centro bási-co, elas podem formar sais de adição de ácido. Sais de adição de ácido cor-respondentes podem também ser formados tendo, se desejado, um centrobásico adicionalmente presente. Substâncias ativas tendo um grupo de áci-do, por exemplo, COOH, podem formar sais com bases. As substâncias ati-vas compreendidas dos componentes (a) e/ou (b) ou uns sais farmaceutica-mente aceitáveis dos mesmos podem também ser usadas em forma de umhidrato ou incluem outros solventes usados para cristalização.

Desse modo, em um primeiro aspecto, a presente invenção refe-re-se a um método para a prevenção de tratamento de doenças proliferati-vas ou doenças que são desencadeadas através de angiogênese persisten-te em um mamífero, preferivelmente um paciente humano que compreendetratar o paciente simultânea ou seqüencialmente com quantidades farmaceu-ticamente eficazes de uma combinação de:

(a) uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização; e

(b) um agente farmaceuticamente ativo.

Em modalidade preferida, a presente invenção fornece uma pre-paração farmacêutica compreendendo:

(a) uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização; e

(b) üm ou mais agentes farmaceuticamente ativos selecionadosdo grupo que consiste em um inibidor de aromatase; um antiestrogênio; umantiandrógeno; um agonista de gonadorrelina; um inibidor de topoisomeraseI; um inibidor de topoisomerase II; um agente ativo de microtúbulo; um agen-te de alquilação; um antimetabólito antineoplástico; um composto de platina;um composto de alvejamento/diminuição de uma atividade de proteína oulipídio cinase ou uma atividade de proteína ou lipídio fosfatase, um compostoantiangiogênico; um composto que induz processos de diferenciação de cé-lulas; anticorpos monoclonais; um inibidor de ciclooxigenase; um bisfosfona-to; um inibidor de heparanase; um modificador de resposta biológica; uminibidor de isoformas oncogênicas de Ras; um inibidor de telomerase; uminibidor de protease, um inibidor de metaloproteinase de matriz, um inibidorde metionina aminopeptidase; um inibidor de proteassoma; agentes que al-vejam, diminuem ou inibem a atividade de Flt-3; um inibidor de HSP90; anti-corpos antiproliferativos; um inibidor de HDAC; um composto que alveja, di-minui ou inibe a atividade/função de mTOR cinase de serina/teronina; anta-gonista de receptor de somatostatina; um composto antileucêmico; métodode dano de células tumorais; um aglutinante de EDG; um inibidor de ribonu-cleotídeo reductase; um inibidor de S-adenosilametionina descarboxilase;um anticorpo monoclonal de VEGF ou VEGFR; terapia fotodinâmica; um es-teróide angiostático; um implante contendo corticosteróides; antagonista dereceptor de AT1; e um inibidor de ACE.

Qualquer da combinação de componentes (a) e (b), o método detratar um animal de sangue quente compreendendo administrar estes doiscomponentes, uma composição farmacêutica compreendendo estes doiscomponentes para uso simultâneo, separado ou seqüencial, o uso da com-binação para a demora de progressão ou o tratamento de uma doença proli-ferativa ou para a fabricação de uma preparação farmacêutica para estespropósitos ou um produto comercial que compreendem um tal combinaçãode componentes (a) e (b), tudo como mencionado ou definido acima, seráreferido subseqüentemente também como combinação da invenção (de for-ma que este termo refere-se a cada uma destas modalidades que dessemodo podem substituir este termo onde apropriado).

Administração simultânea pode, por exemplo, ocorrer na formade uma combinação fixa com dois ou mais componentes ativos, ou adminis-trando dois ou mais componentes ativos que são formulados simultanea-mente de modo independente. Uso seqüencial (administração) preferivel-mente significa administração de um (ou mais) componente(s) de uma com-binação em um ponto de tempo, outros componentes em um ponto de tempodiferente que é em uma maneira cronicamente escalonada, preferivelmentede modo que a combinação mostra mais eficiência que os compostos sim-ples administrados de forma independente (especialmente mostrando siner-gismo). Uso separado (administração) preferivelmente significa administra-ção dos componentes da combinação independentemente um do outro empontos de tempo diferentes, preferivelmente significando que os componen-tes (a) e (b) são administrados de modo que nenhuma sobreposição de ní-veis de sangue mensuráveis de ambos os compostos esteja presente deuma maneira sobreposta (ao mesmo tempo).

Também combinações de duas ou mais de administração se-qüencial, separada e simultânea são possíveis, preferivelmente de modoque os fármacos de componente de combinação mostrem um efeito terapêu-tico conjunto que excede o efeito encontrado quando os fármacos de com-ponente de combinação forem usados independentemente em intervalos detempo tão grandes que nenhum efeito mútuo em sua eficiência terapêuticapode ser encontrado, um efeito sinergístico sendo especialmente preferido.O termo "demora de progressão" como aqui usado significa admi-nistração da combinação em pacientes que estão em um pré-estágio ou emuma fase prematura, da primeira manifestação ou uma recaída da doença a sertratada, em quais pacientes, por exemplo, uma pré-forma da doença corres-pondente é diagnosticada ou quais pacientes estão em uma condição, por e-xemplo, durante um tratamento médico ou uma condição resultante de um aci-dente sob a qual é provável que uma doença correspondente desenvolverá.

"Juntamente terapeuticamente ativo" ou "efeito terapêutico con-junto" significam que os compostos podem ser dados separadamente (emuma forma croriicamente escalonada, especialmente uma maneira seqüên-cia-específica) em tais intervalos de tempo que eles preferivelmente, no a-nimal de sangue quente, especialmente humano, a ser tratado, ainda mos-trem uma interação (preferivelmente sinergística) (efeito terapêutico conjun-to). Se este for o caso, podem inter alia ser determinados seguindo os níveisde sangue, mostrando que ambos os compostos estão presentes no sanguedo humano a ser tratado pelo menos durante certos intervalos de tempo.

" Farmaceuticamente eficaz" preferivelmente refere-se a umaquantidade que é terapeuticamente ou em um sentido mais vasto tambémprofilaticamente eficaz contra a progressão de uma doença proliferativa.

O termo "um pacote comercial" ou "um produto", como aqui usa-do especialmente define um "kit de partes" no sentido que os componentes(a) e (b) como definidos acima podem ser dosados independentemente oupelo uso de combinações fixas diferentes com quantidades distinguidas doscomponentes (a) e (b), isto é, simultaneamente ou em pontos de tempo dife-rentes. Além disso, estes termos compreendem um pacote comercial quecompreende (especialmente combinando) como componentes de compo-nentes ativos (a) e (b), juntamente com instruções para uso simultâneo, se-qüencial (cronicamente escalonados, em seqüência tempo-específica, prefe-rencialmente) ou (menos preferivelmente) separados dos mesmos na demo-ra de progressão ou tratamento de uma doença proliferativa. As partes do kitde partes podem depois, por exemplo, ser administradas simultânea ou cro-nologicamente escalonadas, que é em pontos de tempo diferentes e comintervalos de tempo iguais ou diferentes para qualquer parte do kit de partes.Muito preferivelmente, os intervalos de tempo são escolhidos de modo que oefeito na doença tratada no uso combinado das partes é maior que o efeitoque seria obtido através de uso apenas de qualquer um dos pares de com-binação (a) e (b) (como pode ser determinado de acordo com os métodospadrões. A razão das quantidades totais do par de combinação (a) para opar de combinação (b) a serem administrados na preparação combinadapode ser variada, por exemplo, para atender as necessidades de uma sub-população de paciente a ser tratada ou as necessidades do paciente isoladocujas necessidades diferentes podem ser devido à doença particular, idade,sexo, peso do corpo, etc. dos pacientes. Preferivelmente, há pelo menos umefeito benéfico, por exemplo, uma intensificação mútua do efeito dos paresde combinação (a) e (b), em particular um efeito mais que efeito que conse-qüentemente poderia ser alcançado com doses mais baixas de cada um dosfármacos combinados, respectivamente, que toleráveis no caso de tratamen-to com os fármacos individuais apenas sem combinação, produzindo efeitosvantajosos adicionais, por exemplo, menos efeitos colaterais ou um efeitoterapêutico combinado em uma dosagem não-eficaz de um ou ambos dospares de combinação (componentes) (a) e (b), e muito preferivelmente umsinergismo forte dos pares de combinação (a) e (b).

Ambos no caso do uso da combinação de componentes (a) e (b)e do pacote comercial, qualquer combinação de uso simultâneo, seqüenciale separado é também possível, significando que os componentes (a) e (b)podem ser administrados em um ponto de tempo simultaneamente, seguidopor administração de apenas um componente com toxicidade de hospedeiromais baixa ou cronicamente, por exemplo, mais de 3-4 semanas de dosea-mento diário, e em ponto de tempo posterior e subseqüentemente o outrocomponente ou a combinação de ambos os componentes em um ponto detempo mais posterior (em cursos de tratamento de combinação de fármacosubseqüentes para um efeito antitumor ótimo) ou outros.

A COMBINAÇÃO DA INVENÇÃO pode também ser aplicada emcombinação com outros tratamentos, por exemplo, intervenção cirúrgica,hipertermia e/ou terapia de irradiação.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente inven-ção podem ser preparadas através de meios convencionais e podem seraquelas adequadas para administração enteral, tal como oral ou retal, e pa-renteral para mamíferos incluindo o homem, compreendendo uma quantida-de terapeuticamente eficaz de um inibidor de VEGF e pelo menos um agentefarmaceuticamente ativo sozinho ou em combinação com um ou mais veícu-los farmaceuticamente aceitáveis, especialmente aqueles adequados paraaplicação enteral ou parenteral.

As composições farmacêuticas compreendem de cerca de0,00002 a cerca de 100%, especialmente, por exemplo, no caso de diluiçõesde infusão que estão prontas para usar, de 0,0001 a 0,02%, ou, por exem-plo, no caso de concentrados ou formulações de injeção ou infusão especi-almente parenterais, de cerca de 0,1% a cerca de 95%, preferívelmente decerca de 1% a cerca de 90%, mais preferívelmente de cerca de 20% a cercade 60% de componente ativo (em peso de peso, em cada caso). Composi-ções farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser, por exemplo, emforma de dose de unidade, tal como na forma de ampolas, frascos, drágeas,tabletes, sacos de infusão ou cápsulas.

A dosagem eficaz de cada um dos pares de combinação empre-gados em uma formulação da presente invenção podem variar, dependendodo composto particular ou composições farmacêuticas empregadas, o modode administração, a condição sendo tratada e a severidade da condiçãosendo tratada. Médico, clínico ou veterinário de habilidade usual pode facil-mente determinar a quantidade eficaz de cada um dos componentes ativosnecessários para impedir, tratar ou inibir o progresso da condição.

Tyrphostins, especialmente Adaphostin, são preferívelmenteadministrados a um animal de sangue quente, especialmente um humanoem uma dosagem na faixa de cerca de 1-6000 mg/dia, mais preferívelmente25-5000 mg/dia, o mais preferívelmente 50-4000 mg/dia. A menos que docontrário declarado aqui, o composto é preferívelmente administrado de uma 5, especialmente de 1-4 vezes por dia.Preparações farmacêuticas para a terapia de combinação paraadministração enteral ou parenteral são, por exemplo, aquelas em formas dedosagem de unidade, tais como tabletes revestidos com açúcar, cápsulas ousupositórios, e além disso ampolas. Se não indicadas do contrário, estasformulações são preparadas através de meios convencionais, por exemplo,por meio de processos convecionais de mistura, granulação, revê de açúcar,dissolução ou liofilização. Será apreciado que o conteúdo unitário de um parde combinação contido em uma dose individual de cada forma de dosagemnão necessita em si mesmo constituir uma quantidade eficaz uma vez que aquantidade eficaz necessária pode ser alcançada por administração de umapluralidade de unidades de dosagem. Alguém de habilidade na técnica tem ahabilidade para determinar quantidades farmaceuticamente eficazes apro-priadas dos componentes de combinação.

Preferivelmente, os compostos ou os sais farmaceuticamenteaceitáveis dos mesmos, são administrados como uma formulação farmacêu-tica oral na forma de um tablete, cápsula ou xarope; ou como injeções pa-renterais se apropriado.

Na preparação das composições para administração oral, quais-quer meios farmaceuticamente aceitáveis podem ser empregados tais comoágua, glicóis, óleos, alcoóis, agentes aromatizantes, conservantes, agentesde coloração. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem amidos, açú-cares, celuloses microcristalinas, diluentes, agentes de granulação, lubrifi-cantes, aglutinantes, agentes desintegrantes.

Soluções do componente ativo, e também suspensões, e solu-ções ou suspensões aquosas especialmente isotônicas, são úteis para ad-ministração parenteral do componente ativo, isto sendo possível, por exem-plo, no caso de composições Iiofilizadas compreendendo o componente ati-vo sozinho ou junto com um veículo farmaceuticamente aceitável, por exem-plo, manitol, para tais soluções ou suspensões serem produzidas antes douso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou compre-ender excipientes, por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes intu-mescentes e/ou emulsificantes, solubilizantes, sais para regular a pressãoosmótica e/ou tampões, e são preparadas de uma maneira conhecida perse, por exemplo, por meio de processos convencionais de dissolução ou Iio-filização. As soluções ou suspensões podem compreender substâncias deaumento de viscosidade, tais como carboximetilcelulose de sódio, carboxi-metilcelulose, dextrana, polivinilpirrolidona ou gelatina. Suspensões em óleocompreendem, como o componente de óleo, os óleos vegetal, sintéticos ousemi-sintéticos habituais para propósitos de injeção.

O agente isotônico pode ser selecionado de qualquer um daque-les conhecidos na técnica, por exemplo manitol, dextrose, glicose e cloretode sódio. A formulação de infusão pode ser diluída com o meio aquoso. Aquantidade de meio aquoso empregada como um diluente é escolhida deacordo com a concentração desejada de componente ativo na solução deinfusão. Soluções de infusão podem conter outros excipientes comumenteempregados nas formulações a serem administradas intravenosamente taiscomo antioxidantes.

A presente invenção também refere-se a "uma preparação com-binada" que, como aqui usado, especialmente define um "kit de partes" nosentido que as pares de combinação (a) e (b) como definidas acima podemser dosadas independentemente ou pelo uso de combinações fixas diferen-tes com quantidades distintas dos pares de combinação (a) e (b), isto é, si-multaneamente ou em pontos de tempo diferentes. As partes do kit de partespodem depois, por exemplo, ser administradas simultânea ou cronologica-mente escalonadas, que é em pontos de tempo diferentes e com intervalosde tempo iguais ou diferentes para qualquer parte do kit de partes. A razãodas quantidades totais do par de combinação (a) para o par de combinação(b) a serem administradas na preparação combinada pode ser variada, porexemplo, para atender as necessidades de uma sub-população de pacientea ser tratada ou as necessidades do paciente isolado com base na severida-de de qualquer efeito colateral que o paciente sofra.

USOS E MÉTODOS DA INVENÇÃO

Os anticorpos (e imunoconjugados e moléculas biespecíficas) dapresente invenção têm terapêuticas e utilidades de diagnóstico in vitro e invivo. Por exemplo, estes moléculas podem ser administradas às células emcultura, por exemplo in vitro ou in vivo, ou em um sujeito, por exemplo, invivo, para tratar, impedir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. Otermo "sujeito" como aqui usado é intencionado a incluir os animais huma-nos e não-humanos. Animais não-humanos incluem todos os vertebrados,por exemplo, mamíferos e não-mamíferos, tais como primatas não-humanos,ovelhas, cachorros, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios, e répteis. Osmétodos são particularmente adequados para tratar pacientes humanos ten-do um distúrbio associado à expressão de DKK1. Quando anticorpos paraDKK1 forem administrados juntamente com outro agente, os dois podem seradministrados em ordem ou simultaneamente.

Em uma modalidade, os anticorpos (e imunoconjugados e molécu-las biespecíficas) da invenção podem ser usados para detectar níveis de DKK1,ou níveis de células contendo DKK1. Isto pode ser alcançado, por exemplo,contatando uma amostra (tal como uma amostra in vitro) e uma amostra decontrole com o anticorpo de anti-DKK1 sob condições que permitam a forma-ção de um complexo entre o anticorpo e DKK1. Qualquer complexo formadoentre o anticorpo e DKK1 é detectado e comparado na amostra e no controle.Por exemplo não-limitativo, métodos de detecção padrões são bem conhecidosna técnica, tal como por exemplo, ELISA, MALDI e ensaios citométricos de flu-xo, podem ser executados usando as composições da invenção.

Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção também provêmétodos para detectar a presença de DKK1 (por exemplo, antígeno deDKK1 humano) em uma amostra, ou medir a quantidade de DKK1, compre-endendo contatar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpoda invenção, ou uma porção de ligação de antígeno dos mesmos que espe-cificamente liga a DKK1 sob condições que permitam a formação de umcomplexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e DKK1. A formação de umcomplexo é depois detectada, em que uma diferença na formação complexaentre a amostra comparada à amostra de controle é indicativa da presençade DKK1 na amostra.

Também dentro do escopo da invenção estão kits que consistemnas composições (por exemplo, anticorpos, anticorpos humanos, imunoconju-gados e moléculas biespecíficas) da invenção e instruções para uso. O kit podetambém conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorposadicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo tendo uma atividade com-plementar que liga a um epítopo no antígeno alvo distinto do primeiro anticor-po). Kits tipicamente incluem um rótulo que indica o uso intencionado dos con-teúdos do kit. O termo rótulo inclui qualquer material escrito ou gravado providodentro ou com o kit, ou que do contrário acompanha o kit.

A invenção tendo sido descrita completamente, é também ilus-trada pelos exemplos a seguir e reivindicações que são ilustrativos e nãosão significados ser Iimitativos também. Aqueles versados na técnica reco-nhecerão ou serão capazes de apurar usando experimentação mais rotinei-ra, numerosos equivalentes para os procedimentos específicos descritosaqui. Tais equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção e dasreivindicações. Os conteúdos de todas as referências, incluindo patentesemitidas e pedidos de patente publicados, citados ao longo desta aplicaçãosão por este meio incorporados por referência.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ANTICORPOS DKK1-ESPECÍFICOS HUMANOS DA BIBLIOTECA DE HuCAL GOLD®

Anticorpos terapêuticos contra proteína de DKK1 humana sãogerados por seleção de clones tendo afinidades de ligação altas, usandocomo a fonte de proteínas variantes de anticorpo uma biblioteca de exibiçãode fago comercialmente disponível, a biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®.HuCAL GOLD® é uma biblioteca de Fab (Knappik et al., 2000 J. Mol. Biol.296:57-86; Krebs et al., 2001 J lmmunol. Mehtods 254:67-84; Rauchenber-ger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205) em que todas as seisCDRs são diversificadas através de mutação apropriada, e empregando atecnologia de CysDispIayTM para ligar fragmentos dé Fab à superfície defago (WO 01/05950 Lóhning 2001).

PROCEDIMENTOS GERAIS: SALVAMENTO DE FAGEMÍDEO, AMPLIFICACÃO DE FAGO. E PURIFICAÇÃOA biblioteca HuCAL GOLD® é amplificada em meio bacterianorico padrão (2xYT) contendo 34 pg/ml de cloranfenicol e 1 % de glicose(2xYT-CG). Após infecção das células a uma ODeoonm de 0,5 com fagos auxi-Iiares de VCSM13 (incubando a mistura de células e fago por 30 min a 37QCsem agitar seguido por 30 min a 379C agitando a 250 rpm), as células sãocentrifugadas (4120 g; 5 min; 4eC), ressuspensas em 2xYT/34 μg/ml de clo-ranfenicol/50 pg/ml de canamicina/0,25 mM de IPTG, e crescidas durante anoite a 22eC. Ao término deste período, as células são removidas através decentrifugação, e os fagos PEG-precipitados duas vezes do sobrenadante,ressuspensos em PBS/20% de glicerol e armazenadas a 80SC.

Amplificação de fago entre dois ciclos de procedimento de sele-ção é conduzida como segue: células de TG1 de cepa de E. colide fase demeio-log são infetadas com fagos, são eluídas seguindo a seleção com pro-teína de DKK1, e são banhadas sobre LB-ágar suplementado com 1% deglicose e 34 pg/ml de cloranfenicol (placas de LB-CG). Após incubação du-rante a noite das placas a 309C, as colônias bacterianas são raspadas dasuperfície de ágar, e usadas para inocular meio de cultura de 2xYT-CG paraobter uma OD6oonm de 0,5, depois fagos auxiliares de VCSM13 são adiciona-dos para obter uma infecção produtiva como descrito acima.

PRÉ-EXPERIMENTOS PARA PROCEDIMENTO DE SELEÇÃO DE SOLUÇÃO USANDO CONTAS MAGNÉTICAS DE STREP-TACTIN

O marcador Strep-Il foi relatado ter baixa afinidade para a matrizde Strep-Tactin (K0 ~1 μΜ de acordo com (Voss e Skerra, 1997 Protein Eng.10:975-982), portanto, um pré-experimento é executado para avaliar a con-veniência de usar contas de MagStrep revestidas com Strep-Tactin para acaptura do antígeno durante as seleções de anticorpo, e evitar perda de an-tígeno durante os procedimentos de seleção.

Para aquele propósito, 8 mg de contas de MagStrep são incuba-dos com 46 pg de DKK1 marcado com His-Strep durante 1 h em temperatu-ra ambiente e a amostra é dividida em quatro tubos de Eppendorf pré-bloqueados. Um tubo serviu como o controle positivo (nenhuma lavagem) eas outras três amostras são lavadas com severidades diferentes de acordocom a seção de procedimento de seleção manual HuCAL GOLD®. Detecçãoda ligação do DKK1 marcado com His-Strep para as contas de MagStrep(contas magnéticas revestidas com Strep-Tactin obtidas de IBA1 Góttingen,Alemanha) é executada em BioVeris usando um anticorpo de anti-DKK1 decabra e um anticorpo de detecção de anticabra marcado com Rubídio.

Como mostrado na Figura 1 aqui, nenhuma perda significativade DKK1 marcado com His-Strep das contas revestidas com Strep-Tactin édetectável quando as contas não-lavadas forem comparadas com aquelascontas lavadas com severidades de HuCAL® diferentes. Desse modo, oDKK1 marcado com His-Strep parecia ser adequado para o uso nos proce-dimentos de seleção de solução com contas magnéticas revestidas com S-trep-Tactin (contas de MagStrep).

SELEÇÃO PARA PROCEDIMENTO DE SELEÇÃO DE ANTICORPOSDKK1-ESPECÍFICOS DA BIBLIOTECA

Para a seleção de anticorpos que reconhecem DKK1 humano,duas estratégias de procedimento de seleção são aplicadas.

Em resumo, anticorpos de fato de HuCAL de GOLD® são divididosem quatro fundos gerais compreendendo combinações diferentes de genesprincipais de Vh (fundo geral 1 continha VH1/5 λκ; fundo geral 2 continha VH3λκ; fundo geral 3 continha VH2/4/6 λκ; e fundo geral 4 continha Vh 1 -6 λκ). Estesfundos gerais são individualmente submetidos a dois ciclos de DKK1 marcadocom His-Strep de procedimento de seleção de solução capturado sobre contasmagnéticas de StrepTactin (contas de Mega Strep; IBA), e para o terceiro ciclode seleção apenas, ou em DKK1 marcado com His-Strep capturado sobre con-tas magnéticas de StrepTaetin ou em proteína de DKK1 humano marcado comAPP capturado por contas de Estreptavidina (Dynabeads® M-280 Estreptavidi-na; Dynal) com um anticorpo de anti-APP biotinilado.

Em detalhes, para o procedimento de seleção de solução usan-do DKK1 marcado com His-Strep acoplado às contas magnéticas de Strep-Tactin, o protocolo a seguir é aplicado: tubos pré-bloqueados são prepara-dos (tubos de Eppendorf de 1,5 ml) por tratamento com 1,5 ml de 2x Chemi-BLOCKER diluído 1:1 com PBS durante a noite a 49C. Contas pré-bloqueadas são preparadas através de tratamento como segue: 580 μΙ (28mg de contas) de contas magnéticas de StrepTactin são lavados uma vezcom 580 μΙ de PBS e ressuspensos em 580 μl de 1x ChemiBLOCKER (diluí-do em um volume 1x PBS). Bloqueio das contas é executado nos tubos pré-bloqueados durante a noite a 49C.

Partículas de fago diluídas em PBS a um volume final de 500 μΙpara cada condição de procedimento de seleção são misturadas com 500 μΙde 2x ChemiBLOCKER/0,1% de Tween e mantidas durante uma hora emtemperatura ambiente em uma roda giratória. Pré-adsorção das partículasde fago para remoção de StrepTactin ou fagos de ligação de conta é execu-tada duas vezes: 160 μΙ de contas magnéticas StrepTactin bloqueadas (4mg) são adicionados às partículas de fago bloqueadas, e são incubadas por30 min em temperatura ambiente em uma roda giratória. Após separaçãodas contas por um dispositivo magnético (Dynal MPC-E), o sobrenadante defago (~1,1 ml) é transferido para um tubo de reação fresco, bloqueado e pré-adsorção é repetida usando 160 μΙ de contas bloqueadas por 30 min. De-pois, DKK1 marcado com His-Strep, ou 400 nM ou 100 nM, é adicionado àspartículas de fago bloqueadas em um tubo de reação de 1,5 ml fresco, blo-queado e a mistura é incubada por 60 min em temperatura ambiente emuma roda giratória.

Os complexos de fago-antígéno são capturados usando ou 320 μΙou 160 μΙ de contas magnéticas de StrepTactin bloqueadas adicionados aosfundos gerais de procedimento de seleção de fago de 400 nM ou de 100 nM,respectivamente que são depois incubados por 20 min em temperatura ambien-te em uma roda giratória. Partículas de fago ligadas às contas magnéticas deStrepTactin são colhidas novamente com o separador de partícula magnético.

Contas são depois lavadas sete vezes com PBS/0,05% deTween (PBST), seguido lavando outras três vezes com PBS apenas. Eluçãodas partículas de fago das contas magnéticas de StrepTactin é executadapor adição de 200 μΙ de 20 mM de DTT em 10 mM de Tris-HCI, pH 8,0 paracada tubo durante 10 min. O eluato é colhido, e as contas são lavadas umavez com 200 μΙ de PBS e o eluato de PBS é adicionado ao eluato de DTT.Esta amostra de eluato é usada para infetar 14 ml de uma cultura de E. colide TG-1 que tinha sido crescida a uma OD6oonm de 0,6-0,8.

Após infecção e centrifugação subseqüente por 10 min a 5000rpm cada pelota bacteriana foi ressuspensa em 500 μΙ de meio de 2xYT, ba-nhada sobre placas de ágar de 2xYT-CG e incubadas durante a noite a30eC. A manhã seguinte, as colônias resultantes são raspadas das placas eo fago é preparado por salvamento e amplificação como descrito acima.

O segundo ciclo de procedimentos de seleção de solução emDKK1 marcado com His-Strep é executado de acordo com o protocolo doprimeiro ciclo, exceto que quantidades decrescentes de antígeno são usadas(50 nM, e 10 nM) e a severidade do procedimento de lavagem é alteradaapropriadamente.

Duas estratégias de procedimento de seleção diferentes são a-plicadas ao terceiro ciclo de seleção: a saída de fago amplificada do segun-do ciclo de procedimento de seleção é fendida e submetida a duas condi-ções de procedimento de seleção diferentes. A primeira metade da saída defago é usada para a estratégia de procedimento de seleção padrão emDKK1 marcado com His-Strep humano capturado sobre contas de StrepTac-tin como descrito acima (quantidades de antígeno são 10 nM ou 1 nM, res-pectivamente).

A segunda variação de procedimento de seleção para o terceirociclo de seleção é executada em DKK1 humano marcado com APP. Proteínade DKK1 marcada com APP a uma concentração final de 50 nM ou 10 nM émisturada com 1 ml de partículas de fago pré-clareadas, do segundo ciclo, ea mistura é incubada em temperatura ambiente durante 1 hora em uma rodagiratória. Em paralelo, 8 mg de Estreptavidina pré-bloqueadas de DynabeadsM-280 (DynaI) são incubados com 40 pg de anticorpo de anti-APP de ca-mundongo biotinilado por 30 min em temperatura ambiente em uma rodagiratória seguido por duas etapas de lavagem com PBST. Os complexospré-formados que consistem em fago-anticorpos ligados a DKK1 marcadocom APP são capturados pelas contas magnéticas de M-280 Streptavidinrevestidas com anti-APP durante 30 min em temperatura ambiente. Eluçãode fago e amplificação são executadas como descrito acima.

SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO DE FRAGMENTOS DE Fab SOLÚVEIS

As inserções de codificação de Fab dos fagemídeos de HuCALGOLD® selecionados são subclonados em vetor de expressão pMOR-PH®X9_Fab_FH para facilitar a expressão rápida e eficiente de Fab solú-veis. Para este propósito, o DNA de plasmídeo dos clones selecionados édigerido com enzima de restrição endonucleases Xba\ e EcoR\, assim exci-sando a inserção de codificação de Fab (ompA-VLCL e phoA-Fd). Esta in-serção é depois clonada em vetor de expressão pMORPH®X9_Fab_FH di-gerido com XbaUEcoRl.

Proteínas de Fab são expressas deste vetor, e como resultadocarregam dois marcadores C-terminais (FLAG™ e 6xHis, respectivamente)para detecção e purificação.

MICROEXPRESSÃO DE HuCAL GOLD® ANTICORPOS DE Fab EM E. COLI

Para obter quantidades suficientes de proteína codificada porcada um dos clones obtidos acima, colônias bacterianas simples resistentesa cloranfenicol são selecionadas após subclonagem dos Fabs selecionadosno vetor de expressão pMORPH®X9_Fab_FH. Cada uma destas colôniassão depois usadas para inocular os poços de uma placa de microtitulação de96 poços estéril, cada poço contendo 100 μΙ de meio de 2xYT-CG por poço,e as bactérias são crescidas durante a noite a 37gC. Uma amostra (5 μΙ) decada cultura de TG-1 de E. coli é transferida para uma placa de microtitula-ção de 96 poços fresca, estéril pré-enchida com 100 μΙ de meio de 2xYT su-plementado com 34 μg/ml de cloranfenicol e 0,1% de glicose por poço. Asplacas de microtitulação são incubadas a 30SC com agitação a 400 rpm emum agitador de microplaca até que as culturas tornem-se ligeiramente turvas(-2-4 h) com uma OD6Oonm de cerca de 0,5.

Para expressão no formato destas placas, 20 μΙ meio de 2xYTsuplementado com 34 μg/ml de cloranfenicol e 3 mM de IPTG (isopropil-P-D-tiogalactopiranoside) são adicionados por poço (concentração final de 0,5mM de IPTG), as placas de microtitulação vedadas com uma fita permeávelpor gás, e incubadas durante a noite a 309C agitando a 400 rpm.GERAÇÃO DE LISADOS DE CÉLULAS INTEIRAS (EXTRATOS DE BEL)

Para cada poço das placas de expressão, 40 μΙ de tampão deBEL (2xBBS/EDTA: 24,7 g/l de ácido bórico, 18,7 g de NaCI/l, 1,49 g de ED-TA/I, pH 8,0) contendo 2,5 mg/ml Iisozima são adicionados, e as placas sãoincubadas por 1 ha 22SC em um agitador de placa de microtitulação(400 rpm). Os extratos de BEL são usados para análise de ligação por FMAT(vide Exemplo 2).

EXPRESSÃO DE QUANTIDADES DE MICROGRAMA DE ANTICORPOSHuCAL GOLD® Fab EM E COLIE PURIFICAÇÃO

Expressão de fragmentos de Fab codificada por pMOR-PH®X9_Fab_FH em células F de TG1 de E coli é realizada em tubos deplástico de 50 ml. Para este propósito, pré-culturas inoculadas com clonessimples são crescidas em meio de 2xYT-CG durante a noite a 309C. A ma-nhã seguinte, 50 μΙ de cada pré-cultura são usados para inocular 25 ml demeio de 2xYT suplementado com 34 μg/ml de Cloranfenicol, 1 mM de IPTG,e 0,1% de glicose em tubos de plástico estéreis de 50 ml, e incubados du-rante a noite a 30QC. Células de E coli são colhidas, as pelotas de célulasgeladas e por fim rompidas com Bicho Buster (Novagen). Os fragmentos deFab são isolados usando Ni-NTA Agarose (Qiagen, Hilden, Alemanha).

EXPRESSÃO DE QUANTIDADES EM MILIGRAMA DE ANTICORPOS DEFAB HuCAL GOLD® EM E COLI E PURIFICAÇÃO

Expressão de fragmentos de Fab codificados por pMOR-PH®X9_Fab_FH em células F de TG1 é realizada em culturas de frascosagitadores usando 750 ml de meio de 2xYT suplementado com 34 μg/ml decloranfenicol. Culturas são agitadas a 309C até que a OD6oonm alcançasse0,5. Expressão é induzida por adição de 0,75 mM de IPTG seguido por ineu-bação por 20 h a 30QC. Células são rompidas usando lisozima, e os frag-mentos de Fab são isolados através de cromatografia de Ni-NTA (Qiagen,Hilden, Alemanha). Concentrações de proteína são determinadas através deespectrofotometria UV (Krebs et al., 2001).

EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS DE HuCAL® DKK1-ESPECÍFICOSExtratos de BEL de clones de E. coli individuais selecionadospelas estratégias de procedimento de seleção supracitadas são analisadaspor Tecnologia de Ensaio de Microvolume Fluorométrico (FMAT™, analiza-dor 8200 Cellular Detection System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.),para identificar clones codificando Fabs DKK1-específicos. O sistema deHTS de FMAT™ 8100 é um instrumento de triagem de rendimento alto, ma-cro-confocal de fluorescência que automatiza a detecção de ensaios não-radioativos de mistura-e-leitura com células vivas ou contas (Miraglia, J. Bi-omol. Screening (1999), 4(4) 193-204).

ANÁLISE DE LIGAÇÃO COM BASE EM TECNOLOGIA DE ENSAIO DEMICROVOLUME FLUOROMÉTRICO (FMAT) PARA DETECÇÃO DE FabsDE LIGAÇÃO DE DKK1 DE LISADOS BACTERIANOS

Para a detecção de ligação de anticorpos de Fab de DKK1 deIisados de E. coli (BEL extrai), ligação é analisada com o sistema de detec-ção celular FMAT 8200 (Applied Biosystems). Para acoplar DKK1 marcadocom His-Strep sobre contas de Expóxi M-450 (Dynal), uma amostra de 300μl de contas de Epóxi M-450 (1,2x108 contas) é transferida para um tubo dereação e capturada com um separador de partícula magnético. O sobrena-dante é removido e as contas são lavadas quatro vezes em 1 ml de 100 mMde tampão de fosfato de sódio, pH 7,4. Para revestimento de antígeno, 60pg de DKK1 marcado com His-Strep são adicionados à suspensão de contaem 150 μl de 100 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,4. A suspensãode antígeno-conta é incubada por 16 h em temperatura ambiente em umaroda giratória. As contas revestidas são depois lavadas três vezes com PBSe ressuspensas em um volume final de 250 μΙ de PBS.

Para cada placa de 384 poços, uma mistura de 20 ml de PBS con-tendo 3% de BSA, 0,005% de Tween-20, 4 μΙ de contas revestidas com DKK1(1,9x106 contas) e 4 μl de anticorpo de detecção de Cy5™ são preparados.Uma amostra de 45 μl desta solução é dispensada por poço em uma placa defundo preto/claro de 384 poços de FMAT (Applied Biosystems). Extrato de BELcontendo Fab (5 μΙ) é adicionado a cada poço. As placas de FMAT são incuba-das em temperatura ambiente durante a noite. A manhã seguinte, placas sãoanalisadas no Sistema de Detecção Celular 8200 (Applied Biosystems).

Clones positivos são obtidos, e as seqüências de cadeia pesadae leve dos clones rendendo sinais positivos, específicos em FMAT são anali-sadas. É observado que, 57 clones de anti-DKK1 únicos (não-redundantes)são identificados que mostraram ligação forte suficiente a DKK1 humano.Estes clones são expressados, purificados e testados para afinidade e emensaios funcionais.

DETERMINAÇÃO DAS AFINIDADES NANOMOLARES USANDO RESSONÂNCIA DE PLASMON DE SUPERFÍCIE

Usando estes clones, análise de SPR de cinética é executadaem uma fatia de CM5 (Biacore, Suécia) que tinha sido revestida com umadensidade de -400 RU de qualquer DKK1 humano recombinante, DKK1 decamundongo (R&D System), ou DKK1 cinomolgo em 10 mM de acetato deNa pH 4,5 usando química de acoplamento de amína de EDC-NHS padrão.Uma quantidade comparável de albumina de soro humana (HSA) é imobili-zada na célula de fluxo de referência. PBS (136 mM de NaCI, 2,7 mM deKCI, 10 mM de Na2HPO4, 1,76 mM de KH2PO4 pH 7,4) é usado como o tam-pão corrente. As preparações de Fab são aplicadas em série de concentra-ção de 16 - 500 nM a uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min. Fase de associação éajustada a 60 s e fase de dissociação a 120 s. Um sumário das afinidadesem nM para cada um do DKK1 humano, de camundongo, e cinomolgo de-terminadas por aquele método é mostrado na Tabela 1 aqui.

Tabela 1. Afinidades de Fabs selecionados para cada um de humano, ca-mundongo, e cinomolgo

<table>table see original document page 120</column></row><table>

* medição simples

n.d.: não determinadoEXEMPLO 3: IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS DE Fab DE DKK1 ANTI-HUMANOS INIBINDO A ATIVIDADE ANTAGONÍSTICA DE DKK1 DE WNT

Os 57 anticorpos DKK1-específicos diferentes resultantes sele-cionados da biblioteca HuCAL GOLD® são usados para obter anticorpo puri-ficado que são depois testados quanto à potência para inibir a atividade an-tagonística de Wnt de DKK1 humano. Destes, 17 candidatos de anticorposão funcionalmente ativos, como mostrados nas FIGS. 2 e 4.

A atividade funcional de cada um dos Fabs de HuCAL® é verifi-cada usando um ensaio de gene repórter de luciferase. Doze sítios de liga-ção de TCF/Lef são clonados a montante do gene repórter de luciferase quetorna o gene de luciferase responsivo a TCF/Lef. As proteínas de Wnt canô-nicas levam a uma estabilização de beta-catenina, assim ativando a transcri-ção de TCF/Lef e produzindo a proteína de luciferase. Adição de proteína deDKK1 bloqueia a atividade de Wnt e portanto também a transcrição do genede luciferase. Por conseguinte, os níveis de luciferase produzidos pelas res-pectivas células são esperados correlatar com a potência dos Fabs selecio-nados para bloquear a ação de DKK1.

LINHAGEM CELULAR DE REPÓRTER RESPONSIVA A TCF/LEF ESTÁVEL HEK293T/17-12xSTF

Bioensaios são executados usando a linhagem celular repórterde células renais embriônicas humanas estáveis HEK293T/17-12xSTF. Ascélulas são cultivadas em meio de glicose alta de DMEM (Invitrogen), con-tendo 10% de FCS (PAN ou BioWhittaker) e 1 pg/ml de depuromicina (BDBiosciences), até que 90% de confluência fossem alcançados. As célulassão depois tripsinizadas, contadas, e diluídas em meio de cultura sem puro-micina para uma concentração de 4x105 células por ml. Subseqüentemente,as células são semeadas em uma placa branca, de 96 poços de fundo chato(Corning; 100 μl de suspensão de célula por poço) e incubadas a 37-C e 5%de CO2 durante a noite. No próximo dia, o meio de ensaio é preparado: 500ng/ml de DKK1-APP são adicionados ao Meio Condicionado de Wnt3a (CM).Os Fabs de anti-DKK1 de HuCAL® (concentração final 20 pg/ml) e o anti-corpo de DKK1 anti-humano de cabra (R&D Systems) usado como um con-trole positivo (concentração final 1,5 pg/ml) é diluído em CM.

Um volume de 60 μl de meio é removido de cada poço da placade ensaio sem perturbar as células aderentes, e substituído por 60 μΙ do an-ticorpo de teste ou controle, diluído em CM. As células são incubadas pormais 24 h e 100 μl de reagente de Iuciferase de Bright-Glo são adicionadosa cada poço. Após tempo de incubação de 5 min, a luminescência é lida emum luminômetro (GenioPro, Tecan). Os resultados obtidos com 20 dos 57Fabs são mostrados na Figura 2 aqui. A extensão de Iuciferase expressa éuma medida da extensão de anticorpo presente.

EXEMPLO 4: ANÁLISE QUANTITATIVA DE AFINIDADES DE LIGAÇÃO:DETERMINAÇÃO DE CANDIDATOS DE FAB DE DKK1 ANTI-HUMANOQUE INIBEM A ATIVIDADE ANTAGONÍSTICA DE WNT DE DKK1DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE

A fim de também caracterizar os anticorpos de anti-DKK1, a afi-nidade para DKK1 humano, cinomolgo, e de camundongo é determinada. Aproteína de DKK1 recombinante é imobilizada em uma fatia de CM5 Biacoree os Fabs são aplicados na fase móvel em concentrações diferentes. Parauma determinação segura das afinidades monovalentes apenas tais batela-das de Fab são usadas para medições de Biacore que mostraram fraçãomonomérica £ 90% em uma cromatografia de exclusão de tamanho.

Os dados de afinidade resumidos em DKK1 humano, de camun-dongo, e cinomolgo são mostrados na Tabela 2. Todos os 17 Fabs testadossão observados ter afinidade a DKK1 humano abaixo de 100 nM. Também,nove dos clones produziram anticorpos com afinidades menores que 10 nM.Em todos os casos testados, as afinidades para DKK1 cinomolgo e de ca-mundongo são quase idênticas àquelas para DKK1 humano.

Tabela 2. Dados de afinidade de Fabs selecionados em humano, camun-dongo, e cinomolgo

<table>table see original document page 122</column></row><table><table>table see original document page 123</column></row><table>

* medição simples

n.d.: não determinado

DETERMINAÇÃO DE EC50

Os dados mostrando a concentração eficaz para 50% de inibiçãopara os clones de anticorpos tendo a maior afinidade por DKK1 são mostra-dos na Tabela 3 aqui. Os dados mostram que concentrações eficazes deEC50 variam de 39-95 nM, com um valor mediano entre 58 e 83 nM.

Tabela 3. Concentração eficaz para 50% de inibição de Fabs selecionados

<table>table see original document page 123</column></row><table>

EXEMPLO 5: MATURAÇÃO DE AFINIDADE DE FABS DE ANTI-DKK1 SELECIONA-DOS POR PERMUTA PARALELA DE CASSETES DE LCDR3 E HCDR2

Para otimizar as afinidades dos anticorpos descritos aqui paraDKK1 para um fundo geral de fragmentos de Fab parentais, o LCDR3, estrutura4 e a região constante das cadeias leves (405 bp) de cada Fab parental é re-movido usando BpiI e Sphl, e é substituído por um repertório de LCDR3s diver-sificados juntamente com a estrutura 4 e o domínio constante. Uma amostra de0,5 pg do vetor de fundo geral de aglutinante é ligada com um excesso molarde 3 vezes do fragmento inserido carregando os LCDR3s diversificados.

Em um método similar, o HCDR2 é diversificado usando os sí-tios de Xho\ e SssHII, e as regiões de estrutura de conexão são mantidasconstantes. Para aumentar a eficiência da clonagem, o HCDR2 parental ésubstituído por uma seqüência de fragmento central de 590 bp antes da in-serção do cassete de HCDR2 diversificado.

Misturas de ligação de 11 bibliotecas diferentes são eletropora-das em 4 ml de células de TOPIO F' de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA1USA), rendendo de 2x107 a 2x108 colônias independentes. Amplificação dasbibliotecas é previamente executada como descrito (Rauchenberger et al.,2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205). Para controle de qualidade, váriosclones por biblioteca são fortuitamente escolhidos e seqüenciados (Sequi-Serve, Vaterstetten, Alemanha) usando preparadores CFR84 (Vl) e O-CAL_Seq_Hp (VH).

SELECÂQ DE CANDIDATOS PARA MATURAÇÃO DE AFINIDADE

Seis candidatos de maturação selecionados ("Fabs parental")são selecionados por terem sido caracterizados como tendo as propriedadesa seguir: afinidades para DKK1 humano menor que 10 nM, com reatividadecruzada significativa para DKK1 cinomolgo e de camundongo, EC50 menorque 100 nM, e níveis de expressão de Fab bom a moderado em E. coli efalta de agregação após purificação de Fab.

Durante o curso das medições de afinidade, ficou evidente queMOR04480 é altamente instável em diluições altas. Por este motivo,MOR04480 é omitido da lista de candidatos de maturação embora tivesse aafinidade mais alta (1 nM) e o melhor EC5O (7 nM) de todos Fabs testados.MOR04483 teve uma afinidade alta de 5,5 nM para DKK1 humano mas émostrado ser reativo cruzado com DKK1 de camundongo, e MOR04453 con-tinha uma proporção alta de agregados de Fab após purificação. Portanto,estes dois anticorpos são também excluídos da maturação.

Após avaliação cuidadosa de todos os dados disponíveis, seiscandidatos de maturação (MORQ4454, MQR04455, MQR04456, MORQ4461,MOR04470, e MOR04516) são selecionados. As propriedades destes candi-datos estão listadas na Tabela 4 aqui.

Tabela 4. Propriedades de Fabs selecionados

<table>table see original document page 125</column></row><table>

* medição simples

n.d.: não determinado

# porção monomérica > 90%

GERAÇÃO DE BIBLIOTECAS DE Fab SELECIONADAS PARA MATURAÇÃO DE AFINIDADE

Para obter clones tendo afinidade aumentada e atividade inibido-ra dos anticorpos de anti-DKK1, os clones de Fab selecionados MOR04454,MOR04455, MOR04456, MOR04461, MOR04470, e MOR4516 mostradosno exemplo anterior são submetidos a outros ciclos de diversificação e sele-ção, um processo conhecido como maturação de afinidade.

Para este propósito, regiões de CDR são diversificadas usandocassetes de maturação pré-construídos de LCDR3 e HCDR2 corresponden-tes por mutagênese de trinucleotídeo (Virnekãs et al., 1994 Acids NucleicRes. 22:5600-5607; Nagy et al., 2002 Nature Medicine 8:801-807). Tabela 5aqui mostra as seqüências de LCDR3 para os clones parentais MOR04454,MORQ4455, MORQ4456, MQR061, MQR04470 e MOR4516.

Tabela 5. Seqüências de LCDR3 para Fabsselecionados

<table>table see original document page 125</column></row><table>Tabela 6 aqui mostra as seqüências de HCDR2 para os clonesparentais MOR04454, MOR04455, MOR04456, MOR061, MOR04470 eMOR4516.

Tabela 6. Seqüências de HCDR2 para Fabs selecionados

<table>table see original document page 126</column></row><table>

Fragmentos de Fab de vetor de expressão pMOR-PH®X9_Fab_FH são subclonados no vetor de fagemídeo pMORPH®25 (vi-de Patente U. S. N°. 6.753.136). Este vetor fornece a proteína de fago plllfundida N-terminalmente em um resíduo de cisteína como também uma cis-teína C-terminal na cadeia de anticorpo de Fd e desse modo permite exibi-ção ligada a dissulfeto dos respectivos fragmentos de Fab na superfície defago. Duas estratégias diferentes são aplicadas em paralelo para otimizar aafinidade e a eficácia dos Fabs parentais.

Cinco bibliotecas de Fab de anticorpo de fago são geradas emque o LCDR3 de cinco dos seis clones parentais é substituído por um reper-tório de seqüências de CDR3 de cadeia leve individuais. A maturação deLCDR3 de MOR04454 não é executada, como este clone tem um sítio derestrição de Bpi1 adicional em uma das regiões de CDR e a enzima de restri-ção de Bpft é usada para o procedimento de clonagem de biblioteca.

Em paralelo, a região de HCDR2 de cada clone parental é subs-tituída por um repertório de seqüências de CDR2 de cadeia pesada individu-ais. Cada Fab parental é excisado e substituído para um fragmento centralde 590 bp. Este fragmento central de DNA facilita a separação de bandas devetor digerido simples de digerido duplo e reduz a base dos Fabs parentaisde afinidade alta durante os procedimentos de seleção dé maturação. Emuma etapa subseqüente, o fragmento central é excisado dos plasmídeos decodificação de Fab de cada clone parental e substituído pelo cassete de ma-turação de HCDR2 altamente diversificado.Bibliotecas de maturação de afinidade grandes de mais de 2x107membros são geradas através de procedimentos de clonagem padrões, e osclones diversificados são transformados em células de TOPIOF eletrocom-petentes de E. coli (Invitrogen). Fagos apresentando Fab são preparadoscomo descritos acima no Exemplo 1.

Quatro fundos gerais de maturação são construídos para facilitaro processo de seleção subseqüente: fundo geral 1 a consistido das bibliote-cas de LCDR3 de MOR04470, e MOR04516; fundo geral 1b consistido dasbibliotecas de HCDR2 de MOR04470, e MOR04516; fundo geral 2a consisti-do das bibliotecas de LCDR3 de MOR04454, MOR04455, MOR04456, eMOR04461; e fundo geral 2b consistido das bibliotecas de HCDR2 deMOR04454, MOR04455, MOR04456, e MOR04461.

Para cada fundo geral o procedimento de seleção é executadoem solução usando quantidades decrescentes de DKK1 marcado com His-Strep e captura de fago-antígeno através de contas de Strep-Tactin. Em pa-ralelo, cada fundo geral é aplicado nos procedimentos de seleção usandoquantidades decrescentes de DKK1 biotinilado, que é capturado sobre asplacas revestidas com Neutravidina. A fim de aumentar a severidade do pro-cedimento de seleção e selecionar taxas externas melhoradas, competiçãocom Fabs parentais purificados como também antígeno não-marcado é exe-cutada durante períodos de incubação prolongados.

Imediatamente após os procedimentos de seleção os fundosgerais de fagemídeo enriquecidos são subclonados no vetor de expressãode pMORPH®X9_FH. São escolhidos cerca de 2300 clones simples, e osFabs são induzidos com IPTG.

ESTRATÉGIAS DE PROCEDIMENTO DE SELEÇÃO DE MATURAÇÃO

Procedimentos de seleção usando os quatro fundos gerais deanticorpo são executados com DKK1 marcado com His-Strep e com DKK1biotinilado marcado com His-Strep em solução para dois ou três ciclos, res-pectivamente. Para cada uma das estratégias de procedimento de seleção,competição com as proteínas de Fab parentais purificadas ou com DKK1marcado com APP não-marcado, como também baixas concentrações deantígeno e lavagem extensiva, é usada para aumentar a severidade.

O procedimento de seleção de solução em DKK1 marcado comHis-Strep não-rotulado é executado mais de dois ciclos de seleção princi-palmente de acordo com o protocolo padrão descrito no Exemplo 1. Exce-ções para estes procedimentos são a aplicação de quantidades reduzidas deantígeno (diminuindo de 5 nM para 1 nM), a severidade alta do procedimentode lavagem ou com ou sem competidor, e períodos de incubação prolonga-dos de anticorpo-fagos juntamente com o antígeno.

Para o primeiro ciclo de seleção usando DKK1 biotinilado, ospoços de uma placa de Neutravidin são lavados duas vezes com 300 μΙ dePBS. Os poços são bloqueados com 2x ChemiBLOCKER (Chemicon, Te-mecula, CA) diluídos 1:1 em PBS (Tampão de Bloqueio). Antes das sele-ções, os fagos de HuCAL GOLD® são também bloqueados com um volumede Tampão de Bloqueio contendo 0,1% de Tween-20 por 30 min em tempe-ratura ambiente. As preparações de fago bloqueado são transferidas em alí-quotas de 100 μΙ para os poços de uma placa revestida com Neutravidinapor 30 min em temperatura ambiente. Esta etapa de pré-adsorção é repetidauma vez. Preparações de fago bloqueadas e pré-clareadas são incubadascom 5 nM de DKK1 biotinilado por 2 h a 22SC em uma roda giratória. Fabparental, APP-DKK1 ou nenhum competidor são adicionados e as amostrassão incubadas durante a noite a 49C em uma roda giratória.

Complexos de antígeno-fago são capturados nos poços de umaplaca de Neutravidina por 20 min em temperatura ambiente. Após etapas delavagem extensivas, partículas de fago ligadas são eluídas por adição de200 μl de 20 mM de DTT em 10 mM de Tris pH 8,0 por poço durante 10 minem temperatura ambiente. O eluato é removido e acrescentado a 14 ml decélulas de TG1 de E. coli crescidas a uma OD6oonm de 0,6-0,8. Os poços sãoenxaguados uma vez com 200 μΙ de PBS e esta solução é também adicio-nada às células de TG1 de E. coli. Infecção de fago de E. colié permitida por45 min a 37-C sem agitação. Após centrifugação por 10 min a 5000 rpm, aspelotas bacterianas foram cada uma ressuspensas em 500 μΙ de meio de2xYT, banhadas sobre placas de ágar de 2xYT-CG e incubadas durante anoite a 30-C. As colônias são colhidas raspando da superfície das placas eas partículas de fago são salvadas e amplificadas como descrito acima.

O segundo e terceiro ciclo da seleção são executados comodescrito acima para o primeiro ciclo de seleção, exceto que as condições delavagem são mais rigorosas e concentrações de antígeno são 1 e 0,1 nM,respectivamente.

ANÁLISE DE LIGAÇÃO COM BASE EM ELETROQUIOMILUMINESCÊNCIA(BIOVERIS) DE Fabs DE LIGAÇÃO DE DKK1

Para a detecção de fragmentos de anticorpo DKK1-específicosde afinidade melhorada em Iisados de E. coli (extratos de BEL), uma Esta-ção de Trabalho de BioVeris M-384 SERIES® (BioVeris Europe1 Witney, Ox-fordshire, UK), é usada. O ensaio é realizado em placas de microtitulação depolipropileno de 96 poços e PBS suplementado com 0,5% de BSA e 0,02%de Tween-20 como o tampão de ensaio. DKK1 humano biotinilado é imobili-zado em contas paramagnéticas de estreptavidina M-280 (DynaI) de acordocom as instruções do fornecedor. Uma diluição 1:25 da solução de matéria-prima de conta é adicionada por poço. Amostras de 100 μΙ de extratos deBEL diluídos e contas são incubadas durante a noite em temperatura ambi-ente em um agitador. Para detecção, (Fab)'2 anti-humano (Dianova) marca-do com BV-tag™ de acordo com as instruções do fornecedor (BioVeris Eu-rope, Witney, Oxfordshire, UK) é usado.

Um conjunto de cerca de 2300 clones fortuitamente escolhidos éanalisado pelo método descrito acima. Um subconjunto de 160 clones quedão os valores mais altos é escolhido para análise adicional na titulação deequilíbrio de solução.

DETERMINAÇÃO DE AFINIDADES PICOMOLARES USANDO TITULAÇÃODE EQUILÍBRIO DE SOLUÇÃO (SET)

Para determinação de Kd, as frações de monômero (pelo menos90% de teor de monômero, analisados por SEC analítico; Superdex75, Amer-sham Pharmacia) de Fab são usadas. Determinação de afinidade com base emeletroquimiluminescência (ECL) na solução e avaliação de dados são executa-das basicamente como descrito por Haenel et al., 2005. Uma quantidade cons-tante de Fab é equilibrada com concentrações diferentes (diluições 3n seriais)de DKK1 humano (4 nM de concentração de partida) na solução. DKK1 huma-no biotinilado acoplado às contas paramagnéticas (M-280 Streptavidin1 Dynal),e (Fab)'2 anti-humano marcado (Dianova) com BV-tag™ (BioVeris Europe,Witney, Oxfordshire, UK) é adicionado e a mistura incubada por 30 min. Subse-qüentemente, a concentração de Fab não-ligado é quantificada por detecçãode ECL usando o analisador M-SERIES® 384 (BioVeris Europe).

Para este propósito, 160 clones simples e purificados por Ni-NTA Agarose são selecionados na escala pg. Afinidades preliminares sãodeterminadas através de titulação de equilíbrio de solução de 4 pontos (SET)em BioVeris. Destes dados, 20 clones mostrando afinidades são seleciona-dos. Estes Fabs são purificados na escala mg. MOR04950 é excluído dadeterminação de afinidade e avaliação também devido à agregação parcialdo Fab, que é detectada na cromatografia de exclusão de tamanho. Afinida-des finais são determinadas de duas bateladas independentes de cada clonede Fab usando uma medição de SET de 8 pontos para DKK1 humano, ca-mundongo, e cinomolgo.

Determinação da afinidade para DKK1 de camundongo e cino-molgo é feita essencialmente como descrito acima usando DKK1 de camun-dongo (R&D Systems) e DKK1 cinomolgo como analito na solução em vezde DKK1 humano. Para detecção de Fab livre, DKK1 humano biotiniladoacoplado às contas paramagnéticas é usado. As afinidades são calculadasde acordo com Haenel et al., 2005 Anal Biochem 339.1:182-184.

Usando as condições de ensaio descritas acima, as afinidadespara os Fabs de anti-DKK1 otimizados para afinidade são determinadas emsolução. Afinidades são determinadas para MOR04910 e MOR04946, comKDs abaixo de 30 pM para DKK1 humano e entre 36 e 42 pM para DKK1 decamundongo e cinomolgo. Sete anticorpos também mostraram afinidadesabaixo de 100 pM para todos os três antígenos. Clone MOR04950 não mos-trou ligação ao DKK1 biotinilado. As afinidades estão resumidas na Tabela 7aqui.

Tabela 7. Afinidades de Fabs<table>table see original document page 131</column></row><table> *: pelo menos duas medições independentes executadas de duasbateladas de Fab diferente

#: medição simples apenas

EXEMPLO 6: CARACTERIZAÇÃO DE Fabs DE DKK1 DE ANTI-HUMANOOTIMIZADO PARA AFINIDADE

TÉCNICAS DE ENSAIO IMUNOABSORVENTE LIGADO A ENZIMA (ELISA)

Especificidade de ligação dos Fabs maduros na presença de 50%de soro humano (HS) é determinada. Diluições seriais de DKK1 humano re-combinante, biotinilado são revestidas em TBS sobre placas de microtitulaçãode Neutravidina por 2 h em temperatura ambiente, de 8 ng DKK1 por poço parauma concentração de 125 ng DKK1 por poço. Após revestimento do antígeno,poços são bloqueados com TBS/0,05% de Tween (TBS-T) suplementado com1 % de BSA por 1 h em temperatura ambiente. Fabs purificados descritos acimaou são diluídos em TBS/4% de BSA ou TBS/50% de HS a uma concentraçãofinal de 1 pg/ml, adicionados aos poços revestidos e bloqueados e as placassão incubadas para 1 h em temperatura ambiente. Para detecção, um anticorpoconjugado com (AP) de fosfatase alcalina de anti-FLAG (diluição de 1:5000 emTBST) e o substrato fluorogênico AttoPhos (Roche) são usados. Após cadaincubação, os poços das placas de microtitulação são lavados com TBST cincovezes, exceto após a etapa de incubação final com o anticorpo secundáriomarcado quando os poços são lavados três vezes.

A fluorescência é medida em uma leitora de placa de TECANSpectrafluor. Curvas de ligação exemplares são mostradas na Figura 3 aqui.Tabela 8 resume a atividade de ligação dos Fabs de anti-DKKI otimizadosna presença de 50% de soro humano comparada à atividade de ligação em4% de BSA variando de 83% a 100%. O valor mediano é observado ser93%, desse modo os Fabs de anti-DKK1 são observados completamenteligarem-se ao alvo na presença de soro humano.

Tabela 8. Atividade de ligação de Fabs

<table>table see original document page 132</column></row><table>

* medição simples

ENSAIO DE CÉLULA REPÓRTER DE LUCIFERASE NA PRESENÇA DESORO HUMANO USANDO A LINHAGEM CELULAR DE U20S

Para uma outra determinação de especificidade de ligação dosFabs de anti-DKK1 otimizados, o ensaio de célula repórter de Iuciferase érepetido na presença de 15% de soro humano usando a linhagem celular deosteossarcoma U20S. As células de U20S (ATCC No. HTB-96) são cresci-das de acordo com o protocolo do fornecedor (ATCC, Manassas, VA, USA).As células são tripsinadas, contadas, e diluídas em meio de cultura (McCoy5a/10% de FCS) para uma concentração de 2x105 células/ml. Para cada2x104 células, uma solução é preparada que é uma mistura de 0,075 pg depTA-LUC-12xSuperTopFlash e 0,004 μς de phRL-SV40. Estes são mistura-dos em um volume final de 9,8 μΙ de OPTI-MEM. Depois 0,2 μΙ de Reagentede Transfecção FuGENE 6 (Roche, Mannheim, Alemanha) é adicionado.Esta mistura de transfecção é incubada brevemente e depois misturada comas células previamente preparadas. Subseqüentemente, as células são se-meadas em 100 μΙ por poço de um prato de cultura de célula de 96 poços defundo chato branco e incubadas a 37SC e 5% de CO2 durante a noite. O pró-ximo dia, 75 μΙ de meio são removidos de cada poço da placa de ensaio esubstituídos por 10 μΙ de diluições de anticorpos de Fab HuGAL® (10 a 0,01μg/ml diluído em meio de cultura livre de soro), 15 μΙ de 70% de FCS ou So-ro Humano, e 50 μΙ do Meio Condicionado de Wnt3a, contendo 600 ng/ml deDKK1-APP são adicionados a cada poço.

Para um controle negativo, meio livre de soro é adicionado emvez das diluições de anticorpo. Para obter um sinal de Iuciferase máximo,controles contendo 10 μΙ de meio livre de soro em vez de diluições de anti-corpo e 50 μΙ de CM de Wnt3a CM sem DKK1-APP são adicionados. Apósincubação de 24 h a 379C, 5% de CO2, a luminescência é medida com o Sis-tema de Ensaio de Luciferase Dual-Glo (Promega, Madison, Wl, USA) deacordo com as instruções do fabricante.

Tabela 9 mostra a atividade inibidora dos Fabs de anti-DKK1otimizados na presença de 15% de soro humano (comparada à atividadeinibidora em 15% de FCS). Os dados mostram que a atividade obtida napresença de soro variou de 26% a 90%, com um valor mediano de 70-74%.Estes dados mostram que clones dos Fabs de anti-DKK1 são obtidos Fabsque função na presença de soro humano.

Tabela 9. Atividade inibidor de Fabs

<table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table>

DETERMINAÇÃO DE ECfin DE Fabs DE ANTI-DKK1 OTIMIZADOS PARA AFINIDADE POR ENSAIO DE CÉLULA DE REPÓRTER DE LUCIFERASE

O teste do Fabs melhorados para afinidade no ensaio de repór-ter de Iuc TCF/LEF Wnt3a-dependente padrão usou 10 nM de DKK1 paraobter inibição da expressão de luciferase. É visto que valores de EC5O nãopuderam ser gerados por este método visto que a sensibilidade do ensaio émuito baixa. Isto é indicado por curvas de inibição muito íngremes e valoresde EC50 similares para todos os Fabs testados como visto na Figura 4 aqui.

Uma versão melhorada do ensaio de repórter de Iuc de TCF/LEFé desenvolvida. DKK1 liga às proteínas de transmembrana Kremen-1 e -2 eesta interação leva a uma inibição sinergística forte da sinalização de Wnt(Mao et al. 2002 Nature: 417: 664-67). Portanto, cDNA de Kremen é co-transfeccionado com o ensaio de repórter de Iuc de TCF/LEF, O ensaio derepórter Wnt3a-dependente resultante mostrou sensibilidade altamente me-lhorada a DKK1, mediado por co-expressão da proteína de co-receptor deKremen. Neste ensaio, 0,33 nM de DKK1 é suficiente para induzir inibiçãototal de sinalização de Wnt. As titulações de Fab (a dez concentrações) sãorepetidas usando 0,33 nM de DKK1, e renderam curvas de inibição sigmói-des (Figura 5 aqui) das quais os valores de EC50 poderiam ser calculados.

Os Fabs de anti-DKK1 otimizados por afinidade são assim analisa-dos com respeito ao EC50 como descrito acima. Como mostrado na Tabela 10aqui, os valores de EC50 obtidos por este método variaram de 0,2 nM a 5,6 nM.Tabela 10. EC50 DOS Fabs

<table>table see original document page 135</column></row><table>

ANÁLISE DE SEQÜÊNCIA DOS Fabs OTIMIZADOS PARA AFINIDADE

As seqüências de nucleotídeo das regiões pesadas e de Vl (Vhe VL) de todos os vinte Fabs é determinada. Seqüências de aminoácido dasregiões de determinação de complementaridade (CDRs) são listadas na Ta-bela 11A e Tabela 11B aqui.<table>table see original document page 136</column></row><table><table>table see original document page 137</column></row><table>A análise de seqüência mostrou que cinco dos seis Fabs paren-tais (P) renderam os sucessores melhorados para afinidade. MOR04461 eMOR04470 poderiam ser otimizados em HCDR2 como também em LCDR3.Nenhum sucessor otimizado é obtido de MOR04454. Além disso, homologiaalta aparece entre anticorpos de origem distintos, como mostrado nas se-qüências consensol e consenso2 para as várias CDRs na Tabela 11B. Se-qüências de consenso similares podem ser fornecidos para seqüências deorigem mostradas na Tabela 10A usando métodos bem conhecidos a al-guém versado na técnica.

Além disso, é determinado que MOR04920 tem uma mutação naregião de HCDR2 (um resíduo de Ser para um Gly na pos. 73 de acordocom o esquema de numeração publicado por Honegger e Pluckthun, 2001 JMol Biol 309.3:657-670) desse modo divergindo do projeto de HuCAL®.

MOR04913 é mostrado ter uma mutação de ponto na estrutura 4da cadeia leve de capa (troca de Lys por Asn na posição 148). Como nestaposição não é esperado ter um efeito nas propriedades de ligação do anti-corpo, a mutação é revertida para a composição de linha germinativa/deHuCAL® durante a conversão de IgG, rendendo o anticorpo MOR05145.

MOR04947 tem um sítio de glicosilação potencial em LCDR2.Este sítio não é removido quando MOR04947 é selecionado apenas comoum dos canditados de assistência.

EXEMPLO 7: PRODUÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS DE HuCAL®CONVERSÃO PARA O FORMATO DE IqG

Para expressar imunoglobulina de comprimento total (Ig), frag-mentos de domínio variável de cadeias pesadas (Vh) e leves (Vl) ou sãosubclonados dos vetores de expressão de Fab pMORPH®X9_FH na sériede vetor pMORPH®_h_lg ou pMORPH®2_h_lg para IgGI humana e lgG4humana. Vetores alternativos podem ser usados para lgG2 humana. Enzi-mas de restrição EcoRI, MfeI, e Blp\ são usados para subclonagem do frag-mento de domínio de Vh em pMORPH®_h_lgG1 e pMORPH®_h_lgG4. En-zimas de restrição Mel e Blpl são usadas para subclonagem do fragmentode domínio de Vh em pMORPH®2_h_lgG1f e pMORPH®2_h_lgG4. Subclo-nagem do fragmento de domínio de Vl em pMORPH®_h_lgK e pMOR-PH®2_h_lgK é executada usando os sítios de EcoRV e BsiWI, enquanto quesubclonagem em pMORPH®_h_lgA e pMORPH®2_h_lgA2 é feita usandoEcoRV e Hpal

EXPRESSÃO TRANSIENTE E PURIFICAÇÃO DE IgG HUMANA

Células de HEK293 são transfeccionadas com uma quantidadeequimolar de vetores de expressão de IgG de cadeia pesada e leve. Nos dias 4ou 5 após transfecção, o sobrenadante de cultura de célula é colhido. Após a-justar o pH do sobrenadante em 8,0 e filtração estéril, a solução é submetida àcromatografia de coluna de proteína padrão A (Poros 20A, PE Biosystems).

CONVERSÃO DE Fabs PARENTAIS NOS FORMATOS DE IqG

Em paralelo ao começo da maturação de afinidade, MOR04454,MQR04456, e MOR04470 são clonados nos vetores de expressão pMOR-PH®_h_lgG1 e pM0RPH®_h_lgG4. Podem ser usadas construções alterna-tivas para criação de vetores de expressão de lgG2. Expressão de escalapequena é executada por transfecção transiente de células de HEK293 e asimunoglobulinas de comprimento total são purificadas do sobrenadante decultura de célula.

Os dados mostram através de cromatografia de exclusão de ta-manho que os anticorpos estão em forma monomérica. Testagem no ensaiode repórter Wnt3a-dependente provou que as proteínas são funcionais.

EXEMPLO 8: SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDO E SEQÜÊNCIAS DE NU-CLEOTÍDEO DE GENES OTIMIZADOS PARA EXPRESSÃO

Para aumentar expressão mamífera, alterações são introduzidasnas cadeias pesadas e leves de Fabs aqui para otimização de uso de códonpara expressão em uma célula. É conhecido que vários motivos de ação ne-gativamente eis diminuem a expressão em mamíferos. O processo de otimi-zação aqui remove sítios de ação eis negativa (tais como sítios de corte ousinais de poli(A)) que negativamente influenciam a expressão. O processode otimização aqui também enriquece o conteúdo de GC1 para prolongar ameia-vida de mRNA.

Regiões de cadeia leve e pesada variáveis são otimizadas usandoum clone de um Fab, MORCI4945 (seqüência de nucleotídeo parental de cadeialeve de comprimento total é SEQ ID NO: 98 e seqüência de nucleotídeo paren-tal de cadeia pesada de comprimento total é SEQ ID NO: 102), isolado aqui porseleção com exibição de fago. Depois as seqüências de nucleotídeo que codifi-cam cada uma das cadeias leves e pesadas inteiras destes e outros clones sãocada uma otimizadas usando estes procedimentos.

PROCESSO DE OTIMIZAÇÃO PARA CADEIAS DE Vh E Vi DE MORQ4945Para otimizar a seqüência de nucleotídeo e seqüência de ami-noácido de cada uma das cadeias de Vl e Vh para expressão em célulasmamíferas, o uso de códon é adaptado à impulsão de códon de genes ma-míferos. Além disso, as regiões de conteúdo de GC muito alto (> 80%) oumuito baixo (< 30%) são reduzidas ou eliminadas onde possível. Alternati-vamente, otimização para expressão em bactérias, levedura ou baculovírusrequereria adaptar o uso de códon reforçado para seus respectivos genes.

Durante o processo de otimização para expressão mamífera, osmotivos de seqüência de ação eis a seguir são evitados: caixas TATA internas,qui-sítios e sítios de entrada ribossômica, extensões de seqüência rica em ATou rica em GC, elementos de seqüência de motivo de instabilidade de RNA(ARE), elementos inibidores de seqüência RNA (INS)1 elementos de seqüênciaresponsivos a cAMP (CRS), seqüências repetidas e estruturas secundárias deRNA, sítios doadores e aceitantes de corte incluindo sítios secretos, e pontosde ramificação. Exceto como indicado, introdução de Mlul e sítios de Hindlll éevitada no processo de otimizar a seqüência de nucleotídeo da cadeia de Vl.Exceto como indicado, introdução de sítios de Mlyl e BstEII é evitada no pro-cesso de otimizar a seqüência de nucleotídeo da cadeia de VH.

SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDO DE CADEIAS DE Vh E Vi DE MQR04945OTIMIZADO PARA EXPRESSÃO

Uso de códon é adaptado pra aqueles mamíferos descritos parapermitir as taxas de expressão mais altas e mais estáveis em uma célulamamífera para as seqüências de aminoácido otimizadas resultantes para ascadeias de Vh e Vl do clone MOR04945 acima. Vide Exemplo 5.

Tabela 12A abaixo mostra as seqüências de nucleotídeo da ca-deia leve variável senses e antissenses (AS) (SEQ ID NO: 120) e a seqüên-,cia de aminoácido de cadeia leve variável resultante (designada AA) (SEQID NO: 118) como otimizado para expressão.

TABELA 12A. Seqüências de nucleotídeo senses e antissenses, e seqüên-cias de aminoácido de cadeia de Vh otimizadas para expressão

<table>table see original document page 141</column></row><table><table>table see original document page 142</column></row><table>

Tabela 12B abaixo mostra seqüências de nucleotídeo de cadeiapesada senses e antissenses variáveis (SEQ ID NO: 121) e a seqüência deaminoácido de cadeia pesada variável resultante (designada AA) (SEQ IDNO: 119) como otimizadas para expressão.

TABELA 12B. Seqüências de nucleotídeo senses e antissenses,e seqüências de aminoácido de cadeia de Vh otimizadas para expressão

<table>table see original document page 142</column></row><table><table>table see original document page 143</column></row><table><table>table see original document page 144</column></row><table>

Quadros de pré e pós-otimização podem fornecer as porcentagensde códons de seqüência para cada uma das seqüências parentais e genes oti-mizados respectivamente, e analisar a classe de qualidade das respectivas se-qüências de nucleotídeo que codificam as cadeias de Vh e VL. Valor de quali-dade como aqui usado significa que o códon mais freqüente usado para umaminoácido dado no sistema de expressão desejado são fixos como 100, e oscódons restantes são escalados conseqüentemente para freqüência de uso.(Sharp, P. M., Li, W. H., Nucleic Acids Res. 15 (3), 1987).

Também, o índice de adaptação de códon (CAI) é um númeroque descreve quão bem os códons da seqüência de nucleotídeo empare-lham com a preferência de uso dos códons do organismo alvo. O valor má-ximo de CAI é ajustado em 1,0, desse modo um CAI de > 0,9 é consideradocomo permitindo expressão alta. O CAI para a cadeia de Vl antes da otimi-zação é observado ser 0,73, e após otimização, o CAI é determinado ser0,95. Similarmente, o CAI para a cadeia de Vh antes da otimização é obser-vado ser 0,74, e após otimização, é determinado ser 0,98 em construçõesotimizadas, o conteúdo de GC é aumentado na cadeia de Vl de 51% para aseqüência de origem de MOR04945 para 62% para a seqüência otimizadaderivada de MOR04945. Como mostrado nas FIGS. 9A e 9B, o conteúdo deGC na cadeia de Vh é aumentado de 54% para a seqüência de origem deMOR04945 para 64% para o derivado otimizado de MOR04945.

OTIMIZAÇÃO PARA EXPRESSÃO DE CADEIAS LEVES E CADEIAS PE-SADAS DE COMPRIMENTO TOTAL DE MQR04910. MORQ4945.MORQ4946. E MORQ5145

O processo de otimização é aplicado a cada uma das seqüên-cias de nucleotídeo de comprimento total parenterais das cadeias leves deMOR04910 (SEQ ID NO: 97), MOR04945 (SEQ ID NO: 98), MOR04946(SEQ ID NO: 99), e MOR05145 (SEQ ID NO: 100) e as seqüências de nu-cleotídeo de comprimento total de origem das cadeias pesadas deMOR04910 (SEQ ID NO: 101), MOR04945 (SEQ ID NO: 102), MOR04946(SEQ ID NO: 103), e MOR05145 (SEQ ID NO: 103).

O processo de otimização é usado para a construção de cadauma das seqüências de nucleotídeo de cadeia leve a seguir associadas aosnúmeros de clone de origem: para o clone MOR04910 a seqüência de nu-cleotídeo otimizada é SEQ ID NO: 104; pára o clone MOR04945 a seqüênciade nucleotídeo otimizada é SEQ ID NO: 105; para o clone MOR04946 a se-qüência de nucleotídeo otimizada é SEQ ID NO: 106, e para o cloneMOR05145 a seqüência de nucleotídeo otimizada é SEQ ID NO: 107. Tam-bém, o processo de otimização é usado para a construção de cada uma dasseqüências de nucleotídeo de cadeia pesada a seguir associadas aos núme-ros de clone de origem: para o clone MOR04910 a seqüência de nucleotídeootimizada é SEQ ID NO: 108; para o clone MOR04945 a seqüência de nu-cleotídeo otimizada é SEQ ID NO: 109; para o clone MORQ4946 a seqüênciade nucleotídeo otimizada é SEQ ID NO: 110; e para o clone MOR05145 aseqüência de nucleotídeo otimizada é SEQ ID NO: 110.

As seqüências de nucleotídeo de cadeia leve otimizadas são asso-ciadas às seqüências de aminoácido de cadeia leve otimizadas a seguir: para oclone MOR04910 a seqüência de aminoácido otimizada é SEQ ID NO: 111;para o clone MOR04945 a seqüência de aminoácido otimizada é SEQ ID NO:112; para o clone MOR04946 a seqüência de aminoácido otimizada é SEQ IDNO: 113; e para o clone MOR05145 a seqüência de aminoácido otimizada éSEQ ID NO: 114. As seqüências de nucleotídeo de cadeia pesada otimizadassão associadas às seqüências de aminoácido de cadeia pesada otimizadas aseguir: para o clone MOR04910 a seqüência de aminoácido otimizada é SEQID NO: 115; para o clone MOR04945 a seqüência de aminoácido otimizada éSEQ ID NO: 116; para o clone MOR04946 a seqüência de aminoácido otimiza-da é SEQ ID NO: 117; e para o clone MOR05145 a seqüência de aminoácidootimizada é SEQ ID NO: 117.

Uma listagem de seqüências de nucleotídeo e polipeptídeo de se-qüências de cadeia leve e pesada de comprimento total contempladas é forne-cida na Tabela 13A e Tabela 13B. Tabela 13A fornece seqüências de nucleotí-deo otimizadas e os polipeptídeos codificados por elas. Estas seqüências denucleotídeo são otimizadas para remover os sítios de corte latentes que sãoreconhecidos nos sistemas de expressão mamíferos. Tabela 13B fornece asseqüências de nucleotídeo parentais para os clones listados na Tabela 13A.

Tabela 13A: Seqüências de cadeia leve (LC) e de cadeia pesada (HC) - oti-mizadas

<table>table see original document page 146</column></row><table><table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table><table>table see original document page 149</column></row><table><table>table see original document page 150</column></row><table><table>table see original document page 151</column></row><table>

Exemplo 9: Ensaios de Bioatividade

A atividade biológica de um anticorpo de anti-DKK1/4 de neutra-lização é medida em um ensaio de gene repórter, usando a linhagem celulargeneticamente modificada HEK293 T/17 STF_70IRES_Krm_(17) chamadaSuperTopfIash Krm17. Esta linhagem celular é derivada da célula renal em-brionária humana HEK293 e é estavelmente transfeccionada com i) umaconstrução de repórter em que o promotor TCF está a montante fundido dogene de Iuciferase de vaga-lume e ii) uma construção que conduz à sobre-expressão de Krm na superfície desta célula. Nesta linhagem celular, expo-sição à proteína de Wnt estimula a expressão de Iuciferase de uma maneiradose-dependente. Adição de quantidades classificadas de anticorpo de anti-DKK1/4 a uma dose fixa, sub-máxima de DKK1 na presença de Wnt causaum aumento na expressão de Iuciferase durante um período de incubaçãode dezesseis horas. Ao término deste período, a quantidade de Iuciferase équantificada com base em sua atividade enzimática no lisado de célula. Luci-ferase catalisa a conversão do substrato luciferina para oxiluciferina, umproduto quimiluminescente. A quimiluminescência do tipo brilho resultante édepois determinada com um luminômetro apropriado.

A potência biológica de uma amostra de teste de anticorpo de anti-DKK1/4 de neutralização é determinada comparando sua habilidade para au-mentar a expressão de Iuciferase à de um padrão de referência. As amostras epadrão são normalizados em base de conteúdo de proteína. Potência relativa édepois calculada usando um ensaio de linha paralela de acordo com a Farma-copéia européia. O resultado final é expressado como potência relativa (emporcentagem) de uma amostra comparada ao padrão de referência.

Exemplo 10: Atividade in vitroem alvos biológicos relevantes

FAbs de chumbo são selecionados que tem afinidades na faixananomolar baixa e atividade potente no ensaio celular. Os pares de ligaçãofisiológica para DKK1 são LRP5/6 (Kd -340 pM) e Kremen 1 e 2 (Kd -280pM) [Mao 2001][Mao 2002]. Dadas estas interações de afinidade alta, é de-sejável também melhorar a afinidade para melhorar a competição com asinterações de DKK1 fisiológicas. Para aumentar afinidade e atividade bioló-gica dos FAbs selecionados, regiões de CDR-L3 e CDR-H2 são otimizadasem paralelo através de mutagênese de cassete usando mutagênese direcio-nada de trinucleotídeo [Virnekas 1994][Knappik 2000][Nagy 2002].

Seguindo maturação de afinidade, um Fab é selecionado tendobaixa afinidade picomolar, reativa sinalização de wnt inibida por DKK1 comum EC50 abaixo de 1 nM, e reage cruzado com DKK1 de macaco cínomolgo,camundongo, e rato. As regiões variáveis deste Fab são depois criadas emduas estruturas de IgGI humana diferentes.

Anticorpo de anti-DKK1/4 tem afinidade alta por DKK1 humano(2 pM) com cinética de ligação típica para um anticorpo desta afinidade. VideFigura 6.

Figura 6. MÉTODOS: A afinidade e cinética de ligação dos can-didatos de chumbo e rhDKKI (DKK1 humano recombinante) (BateladaBTP7757) são medidas usando ressonância de plasmon de superfície comum instrumento Biacore T100 (Biacore, Uppsala, Suécia) contendo uma fatiade CM5 (S) de sensor (Cat#BR-1006-68). Fc de IgGI anti-humano (JacksonImmuno Research, Cat# 109-006-098) é imobilizado sobre cada célula defluxo, seguido por captura de um candidato de chumbo a uma captura espe-rada de cerca de 100 RU. Por fim, seis concentrações de DKK1 (faixa 0,195- 6,25 nM), com uma concentração repetida, são passadas na fatia. As célu-las de fluxo são ativadas para ligação de DKK1 durante 240 segundos, edesassociação é seguida durante 30 minutos. Os dados normalizados (basesubtraída) são ajustados em uma ligação 1:1 com modelo de transporte demassa usando análise de Cinética em software de avaliação BIA 1.0. Esteexperimento é realizado em triplicata, e os dados apresentados são a médiadestes três experimentos com desvio-padrão.

Exemplo 11: Mapeamento de epítopoDKK1 maduro é uma proteína de 266 aminoácidos com duasregiões ricas de cisteína (Cys-1 e Cys-2). O domínio de Cys-2 é responsávelpara ligar LRPs e proteínas de Kremen e é necessário e suficiente para ini-bição da sinalização de Wnt [Li 2002][Brott 2002]. Experimentos de imuno-precipitação (Figura 7A, 7B) demonstram que anticorpo de anti-DKK1/4 es-pecificamente liga ao domínio de Cys-2, mas não ao domínio de Cys-1. Anti-corpo de anti-DKK1/4 é apenas fragilmente ativo em westem blot com DKK1desnaturado e em um peptídeo experimento de mapeamento não é obser-vado especificamente ligar qualquer um dos peptídeos de sobreposição de15 aminoácidos que cobrem o comprimento da proteína (JTP), sugerindoque o anticorpo de anti-DKK1/4 provavelmente reconhece um epítopo não-Iinear dentro de Cys-2.

Figura 7(A) mostra uma representação esquemática de DKK1 decomprimento total e truncado. De comprimento total (FL, contendo resíduos1-266), carboxila terminal truncada (AC, resíduos contendo 1-185), e aminoterminal truncada (ΔΝ, contendo resíduos 1-60 mais resíduos 157-266), éfundida com um epítopo de HA em seus términos C, e clonada em um vetorde expressão mamífero sob o controle do promotor de citomegalovírus(CMV). Figura 7(B) descreve ligação de um anticorpo de anti-DKK1/4 deneutralização e proteínas de DKK1. Meio condicionado de células Hek293transientemente transfeccionadas expressando contendo comprimento total,proteínas de DKK1 carboxil terminal truncadas, amino truncadas, são incu-badas com controle antilisozima IgGI ou os anticorpos de anti-DKK1/4 por 2h em temperatura ambiente, e imunocomplexos são colhidos em contas deproteína G, solucionadas por SDS-PAGE, transferidas, e manchadas comum anticorpo de anti-HA. 1/10 de entrada total é carregado como controle.

EXEMPLO 11: MAPEAMENTO DE EPÍTOPO - N-GLICOSILACÁO

Várias proteínas dentro da via de sinalização de Wnt são cova-lentemente modificadas por enzimas pós-translacionais que regulam suaatividade celular. Membros da família de DKK, incluindo DKK1, são modifi-cados através de N-glicosilação [Krupnik 1999]. DKK1 tem um sítio de glico-silação N-Iigado teórico no aminoácido 256 dentro do domínio de Cys-2. Da-da a natureza altamente conservada do domínio de Cys-2, e o sítio de liga-ção potencial tanto de DKK1 para LRP6 como de anticorpo de anti-DKK1/4para DKK1, buscamos determinar se o anticorpo de anti-DKK1/4 reconheceua forma N-glicosilada de DKK1. Um ELISA demonstra que anticorpo de anti-DKK1/4 reconhece a forma N-glicosilada de rhDKKI muito melhor que a for-ma desglicosilada especificamente N-Iigada de rhDKKI TABELA 14A. Em-bora as mesmas proteínas sejam igualmente bem reconhecidas com umsegundo anticorpo (anti-His), direcionadas para a região de marcador deepítopo fundida da proteína recombinante. Esta diferença em afinidade équantificada usando ressonância de plasmon de superfície e anticorpo deanti-DKK1/4 Met para ter K0 de 100 vezes mais alto para rhDKKI glicosila-do, depois para a proteína desglicosilada, vide TABELA 14B.

Tabela 14A Por cento de ligação - Glicosilação dependente de anticorpo deanti-DKK1/4 que liga a DKK1

<table>table see original document page 154</column></row><table>

Tabela 14B ressonância de plasmon de superfície

<table>table see original document page 154</column></row><table>

A ligação de anticorpo de anti-DKK1/4 a rhDKKI do tipo selva-gem (WT) (batelada marcada com epítodo His HEK1 #BTP7757) e rhDKKIN-ligado desglicosilado (N-DEGLI, desglicosilado N-Iigado com a enzimaPNGase F (Sigma, cat #E-DEGLI) é medido por ELISA. Brevemente, umaplaca de ELISA de ligação alta (Nunc#442404) é revestida com 1 pg/mlDKK1 de WT ou N-DEGLI. A razão de anticorpo de anti-DKK1/4 e anticorpode anti-His ligando a DKK1 de WT quando comparado a seu respectivo Ii-gando de N-DEGLI é mostrada. Este experimento é realizado com três con-centrações diferentes (dados para uma concentração representativa sãomostrados), todas as concentrações tiveram resultados similares. Β. A afini-dade de ligação e cinética de anticorpo de anti-DKK1/4 para WT e DKK1 deN-DEGLI (Batelada de HEK293 #BTP7757) é medida usando um BiacoreT100. Anticorpo de anti-DKK1/4 teve uma afinidade consistentemente inferi-or de 100 vezes por DKK1 de N-DEGLI que para DKK1 de WT.

EXEMPLO 12: POR CENTO DE IDENTIDADE DE MEMBROS DA FAMÍLIADE DKK

A família de Dickkopf humana consiste em quatro parólogos (vi-de Tabela 15) trés destes (DKK1, 2, & 4) ligam às proteínas LRP6 e de Kre-men, induzem intemalização de LRP5/6 e inibem sinalização de Wnt canôni-ca [Mao 2001][Mao 2003]. DKK2 também sinergiza-se com sobre-expressãode LRP6 para intensificar sinalização de Wnt, mas co-expressão de LRP6 eKremen2 restabelece inibição de DKK2 da via [Mao 2003]. Desse modoDKK2 pode agir como um agonista e um antagonista dependendo do contex-to celular. DKK3 é menos conservado dos membros de família, incluindodentro do domínio de Cys-2 responsável pelas interações de LRP5/6 e deKremen e é distinto dos outros membros da família de DKK como não liga aLRPs ou Kremens e não bloqueia sinalização de Wnt [Mao 2001][Mao 2003].Tabela 15 - Por cento de identidade dos membros da família de DKK ao lon-go da proteína inteira e dentro dos domínios de Cys-2.

<table>table see original document page 155</column></row><table>

Homologia entre os membros da família de DKK é avaliada(Vector NTI Advanced 9.1.0) usando algoritmo de AIignX para alinhamentosde seqüência em pares comparando as razões de identidades de aminoáci-do. Abertura de intervalo e penalidades de extensão de intervalo de 10 e 0,1são respectivamente aplicadas. Esta avaliação incluiu comparações de pro-teínas integrais, como também comparações de domínios de Cys-2 apenas.Como indicado acima na tabela, DKKs 1, 2 e 4 compartilham 30-40% dehomologia de seqüência de aminoácido ao longo da proteína inteira. Compa-ração dos domínios de Cys-2 sozinhos mostra que DKKs 1 e 2 compartilham69% de homologia dentro desta região, enquanto DKK4 rudemente compar-tilha 57% com o mesmo domínio de DKKs 1 e 2. DKK3 mostra o nível dehomologia mais baixo em outros membros da família. Entre todos os mem-bros, a homologia de do domínio de Cys-2 é maior.

EXEMPLO 13: AFINIDADE DE ANTICORPO DE ANTI-DKK1/4 PARAMEMBROS DA FAMÍLIA DE DKK HUMANO

Além de ligar a DKK1, anticorpo de anti-DKK1/4 também liga aDKK4, vide Tabela 16. Embora a afinidade para DKK4 seja aproximadamen-te 100 vezes menor que para DKK1, é ainda subnanomolar e portanto pro-vável biológica e clinicamente relevante. De nota, nem DKK2 nem DKK4conservam o resíduo de Asparagina que é prognosticado ser alvejado paraglicosilação no domínio de Cys-2 de DKK1. Experimentos de imunoprecipi-tação preliminares sugerem que anticorpo de anti-DKK1/4 especificamentenão liga a DKK2. A afinidade de ligação de anticorpo de anti-DKK1/4 que ligaa DKK2 será determinada seguindo purificação com sucesso de DKK2. Con-sistente com a função distinta e propriedades de ligação de DKK3, anticorpode anti-DKK1/4 não liga a DKK3.

Tabela 16 Afinidade de anticorpo de anti-DKK1/4 aos membros da famíliade DKK humano

<table>table see original document page 156</column></row><table>

A afinidade e cinéticas de ligação do anticorpo de anti-DKK1/4 aoutros membros da família de DKK humano das proteínas são medidas usandoum Biacore T100. Como antes, experimentos são realizados em triplicata paraproteínas com ligação significativa para anticorpo de anti-DKK1/4 e é relatadacomo a média de três experimentos com desvio-padrão. DKK3 que é o membrode família menos homólogo, não tem ligação que seja detectável acima dosníveis de base e assim é considerado NSB (Nenhuma ligação Significativa).Igualmente, recentes dados sugerem que um anticorpo de anti-DKK1/4 da in-venção também não tem nenhuma ligação significativa a DKK2.EXEMPLO 14: ANTICORPO DE ANTI-DKK1/4 BLOQUEIA LIGAÇÃO DEDKK1 A LRP6

DKK1 medeia sua atividade de antagonista de Wnt através deinterações com LRP5/6 e Kremen1 induzindo internalização e bloqueio deinteração induzida por Wnt de LRP5/6 com receptores Frizzled. Anticorpo deanti-DKK1/4 competitivamente inibe ligação de DKK1 a LRP6 em um ensaiode ELISA de competição na Figura 8.

Células de HEK293T não expressam níveis suficientes de LRP5endógeno ou 6 para permitir visualização de ligação de DKK1. Porém, sobco-transfecção de LRP6 com uma proteína chaperona de tráfego de superfí-cie, MESD, DKK1 marcado GFP pode ser detectado na superfície celular,ilustrando a natureza específica da interação de DKK1/LRP6. MOR04910que compartilha as mesmas regiões variáveis que o anticorpo de anti-DKK1/4 especificamente bloqueia esta interação.

A habilidade de anticorpo de anti-DKK1/4 para inibir ligação deDKK1 diretamente a LRP6 é medida por ELISA. Brevemente, placas não-tratadas (Fisher, Cat #12565501) são revestidas com 1 pg/ml de LRP6 re-combinante (R&D Systems Cat#1505-LR), depois 500 ng/ml de rhDKKI euma curva de concentração de anticorpo de anti-DKK1/4 ou hlgG1 (antiliso-zima MOR3207, ACE10915) é pré-incubada em gelo durante 30 minutosapós os quais eles são colocados sobre placas revestidas com LRP6 duran-te 2 horas. As placas são lavadas e o nível de ligação de DKK1 é detectadocom anticorpo de anti-DKK1 (R&D Systems AF1096). Mostrados são os va-lores de OD brutos (base subtraída). Concentrações crescentes de anticorpode anti-DKK1/4 inibem a ligação de DKK1 diretamente a LRP6 em uma ma-neira dose-dependente, enquanto concentrações crescentes de hlgG1 nãobloqueiam a ligação de DKK1 a LRP6.

A habilidade de MOR04910 para inibir ligação de DKK1/LRP6em superfície celular é medida através de microscopia de fluorescência. Cé-lulas de HEK293T ou são falso transfeccionadas e transientemente transfec-cionadas com plasmídeos que codificam LRP6 e MESD. Células são incu-badas com meio condicionado com DKK1-GFP juntamente com Fab de anti-lisozima ou Fab de anti-DKK1 MOR04910 durante 1 hora a 379C, e exami-nadas através dé microscopia de fluorescência. Fluorescência de GFP refle-te ligação de DKK1-GFP a LRP6 sobre-expressa na membrana plasmática.O anticorpo de anti-DKK1/4 bloqueia interações de DKK1 com LRP6 nassuperfícies das células.

EXEMPLO 14: ENSAIOS DE REPÓRTER - REATIVAÇÃO DE TRANSCRI-ÇÃO DE GENE DE TCF/LEF INIBIDA POR DKK1

Sinalização de Wnt canônica culmina em translocação de beta-catenina para o núcleo onde se associa com fatores de transcrição da famí-lia de TCF/LEF que resulta em transcrição intensificada de genes responsi-vos a Wnt. Um ensaio de repórter é estabelecido usando um promotor res-ponsivo a TCF/LEF direcionando transcrição de gene de luciferase, facilitan-do a detecção da modulação da via de Wnt. DKK1 eficazmente bloqueia ati-vidade de luciferase induzida por meios condicionados de Wnt3A (CM) nesteensaio. Anticorpo de Anti-DKK1/4 reativa sinalização suprimida por DKK1 deWnt com um EC50 evidente de 0,16 nM Figura 9. Uma vez que o ensaio re-quer aproximadamente 1 nM de DKK1 para supressão completa e a afinida-de do anticorpo é 2 pM, é provável que este EC50 reflita a sensibilidade doensaio e quantidades relativas de cada proteína ao invés de um limite abso-luto de competição de anticorpo de anti-DKK1/4.

Células 293T estavelmente transfeccionadas com o repórter deSuperTopfIash e Kremen são tratadas com 10 ng/ml de rhDKKI, 50% demeio condicionado de Wnt3a, e várias quantidades de anticorpo de anticorpode anti-DKK1/4. Dezoito horas depois, a atividade de luciferase é medidapelo kit de ensaio de luciferase Bright-Glo (Promega).

EXEMPLO 15: ENSAIOS DE REPÓRTER - REVERSÃO DE SECREÇÃOINIBIDA POR DKK1 DE FOSFATASE ALCALINA EM CÉLULAS SEME-LHANTES A PRÉ-OSTEOBLASTO

Para determinar se anticorpo de anti-DKK1/4 bloqueia as fun-ções de DKK1 em um cenário relevante mais fisiológico, um ensaio in vitro éestabelecido para medir a diferenciação de osteoblasto mediada por Wnt dalinhagem celular de camundongo pluripotente C3H10T1/2 (10T1/2), vide Fi-gura 10. Sob diferenciação de osteoblasto as células 10T1/2 segregam fos-fatase alcalina (AP), um fenômeno que pode ser inibido por DKK1. Anticorpode anti-DKK1/4, mas não controle de IgG, bloqueia a supressão de DKK1 dediferenciação de 10T1/2 na presença de meio condicionado de Wnt3A.

Wnt foi relatado induzir proliferação e inibir apoptose em várioscontextos de célula e a ativação da via de Wnt, como indicado por estabilizaçãoou localização nuclear de beta-catenina, é freqüentemente associada à pro-gressão de tumor. Além disso, sub-regulação de DKK1 em alguns cânceres(por exemplo carcinoma de cólon e melanoma) [González-Sancho 2005] [Ku-phal 2006], tem levado alguns investigadores a sugerir que DKK1 possa ser umsupressor de tumor para alguns cânceres. Para testar se DKK1 tem efeito naproliferação ou sobrevivência de tumor, linhagens de células tumorais são tra-tadas com anticorpo de anti-DKK1/4 e analisadas para alterações no cresci-mento. Nenhuma linhagem de célula tumoral testada é observada ser afetadasignificativamente pela adição de anticorpo de anti-DKK1/4.

O efeito de anticorpo de anti-DKK1/4 na sobrevivência e prolife-ração de várias linhagens celulares de câncer são avaliadas in vitro. Nesteensaio, anticorpo de anti-DKKI/4 (100 pg/ml) é incubado com uma linhagemde célula tumoral, após três dias, o número de células é avaliado por quanti-ficação de ATP (Promega, Cell Titer Glo Assay®), como uma medida de cé-lulas metabolicamente ativas com uma relação linear para o número de célu-la. Este ensaio é realizado em três concentrações de soro diferentes (cres-cimento livre de soro, mínimo, e crescimento completo). Nenhuma alteraçãosignificativa, quando comparadas as células de hlgG1 sem tratar e tratadasé encontrada. Sobrenadantes de linhagem celular são analizados para ex-pressão de DKK1 por ELISA.

EXEMPLO 16: REATIVIDADE CRUZADA DE ESPÉCIES E NEUTRALIZAÇÃO DE DKK1

Um anticorpo de anti-DKK1/4 de neutralização não é seleciona-do para sua afinidade alta contra DKK1 humano e habilidade de neutraliza-ção, mas também com base em sua reatividade cruzada com outras espé-cies que poderiam ser usadas para estudos de eficácia e de segurança. Re-ações cruzadas de anticorpo de anti-DKK1/4 com DKK1 de camundongo,rato, e macaco cinomolgo (cino, Macaca fascicularis) com afinidade similarcomo para DKK1 humano, vide Tabela 17. Além disso, anticorpo de anti-DKK1/4 neutraliza atividade supressiva de Wnt mediada por DKK1 de todasas quatro espécies (Tabela 17), sugerindo que estes espécies deveriam serrelevantes para modelos de segurança e eficácia.

Tabela 17 Reatividade cruzada de espécies e neutralização de DKK1

<table>table see original document page 160</column></row><table>

Determinação de afinidade para DKK1 Humano, Cinomolgo, Ca-mundongo, e Rato é ensaiada através de Titulação de Equilíbrio de Solução(SET) usando o analisador de M-384 SERIES® (BioVeris, Europa). Para de-terminação de KD através de Titulação de Equilíbrio de Solução (SET), fraçõesde monômero (pelo menos 90% de conteúdo de monômero, analisado antes deSEC analítico; Superdex75, Amersham Pharmacia) de proteína de IgG são u-sadas. Determinação de afinidade com base em eletroquimiluminescência (E-CL) na solução e avaliação dos dados é executada basicamente como descritopor [Haenel et al., 2005], o modelo de ajuste de ligação é aplicado como modifi-cado de acordo com [Piehler et al., 1997]). Uma quantidade constante de IgGde MOR4910 é equilibrada com concentrações diferentes (diluições 3n seriais)de DKK1 humano (4 nM de concentração de partida) na solução. DKK1 huma-no biotinilado acoplado às contas paramagnéticas (M-280 Streptavidin, Dynal) eanticorpo policlonal de (Fab)'2 anti-humano de cabra marcado com BV-tag™(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK) é adicionado e incubado para 30min. Subseqüentemente, a concentração de IgG não-ligada é quantificada pormeio de detecção de ECL usando o analisador de M-384 SERIES® (BioVeris,Europe). Determinação de afinidade para DKK1 de rato, camundongo, e cino-molgo é executada essencialmente como descrita acima usando DKK1 de ca-mundongo, rato, e cinomolgo como analito em solução em vez de DKK1 huma-no. Para detecção das moléculas de IgG livres, DKK1 humano biotinilado aco-piado às contas paramagnéticas é usado. MOR4910 e anticorpo de anti-DKK1/4 neutralizam DKK1 humano (Novartis) com EC5O equivalente, anticorpode anti-DKK1/4 também neutraliza DKK1 de macaco (Novartis), de camundon-go (R&D Systems 1765-DK-010) e de rato (Novartis). O ensaio de repórterTOPFLASH para DKK1 humano, de rato, camundongo, e cinomolgo é execu-tado essencialmente como descrito acima (Figura 9) usando cada espécie deDKK1 recombinante como o inibidor de meios condicionados de Wnt, em vezde DKK1 humano. DKK1 recombinante de rato requereu concentrações maisaltas de proteína para alcançar inibição significativa do ensaio de TOPFLASH.

EXEMPLO 17: EFEITO DE ANTICORPO DE ANTI-DKK1/4 EM CRESCI-MENTO INTRATIBIAL DE XENOENXERTOS PE PC3M2AC6

Metástases de tumor de próstata são únicos entre metástasesde osso em que eles são opressivamente osteoblásticos ao invés de osteolí-ticos [Keller 2001]. Porém, metástases de osso mesmo predominantementeosteoblásticos têm regiões subjacentes de osteólise e freqüentemente têmbaixas densidades de massa de osso (BMD) especialmente quando os paci-entes estão em terapia de separação andrógena [Saad 2006]. Recentemen-te, é demonstrado que DKK1 pode atuar como um permutador, por meio doqual a expressão de DKK1 intensifica as propriedades osteolíticas de umalinhagem tumoral de célula de próstata osteoblástica/osteolítica misturada(C4-2B). Além disso, supressão de shRNA de DKK1 inibiu atividade osteolí-tica de uma linhagem tumoral de célula de próstata predominantemente os-teolítica (PC3) [Hall 2005] [Hall 2006]. Choque de DKK1 também inibiu cres-cimento intratibial do xenoenxerto de tumor, levando os autores a especularque atividade osteolítica possa ser importante para estabelecer um nichometastático, mas perda subseqüente de DKK1 em metástases prostáticasconverta o tumor em um fenótipo osteoblástico.

Um modelo de tumor de próstata osteolítico é adaptado de ummétodo por [Kim 2003]. Uma variante da linhagem tumoral de célula de prós-tata osteolítica (PC3M) que estavelmente expressa Iuciferase (PC3M2AC6)é injetada na tíbia de camundongos. O crescimento do tumor é monitoradoatravés de Iuciferase enquanto alterações em osso são monitoradas atravésde tomografia micro-computadorizada (micro-CT) e histologia. Ao invés deintensificar o crescimento de tumor, o anticorpo de anti-DKK1/4 tendeu parainibição do crescimento de tumor. Embora a inibição não fosse significativaem qualquer um estudo, ocorreu consistentemente em 5/5 estudos conduzi-dos até agora, um estudo representativo mostrando os efeitos de 3 doses deanticorpo de anti-DKK1/4 em crescimento de tumor é mostrado na Figura 11.

Uma tendência não-significativa similar para inibição ocorreu com camun-dongos tratados com anticorpo de anti-DKK1/4 com xenoenxertos subcutâ-neos de PC3M2AC6.

Tratamentos são iniciados no dia 5 pós implantação (0,2 milhõesde células/animal). Anticorpo de anti-DKK1/4 é administrado i.v., em dosesde 20, 60, e 200 pg/camundongo/dia, q.d., 3 vezes por semana durante 2semanas. IgG de controle é administrada i.v., a 200 pg /camundongo/dia,q.d., 3 vezes por semana durante 2 semanas. Controle de veículo (PBS) éadministrado i.v., q.d., 3 vezes por semana durante 2 semanas. Dados deeficácia final e alteração de peso do corpo são calculados após tratamento.

Usando este modelo, descobrimos que um anticorpo de anti-DKK1/4 inibe dano de osso cortical induzido por tumor. Efeitos em osso tra-becular são confusos neste modelo pela observação ambos implantes detumor e pseudo implantes causam dano mecânico ao osso que resulta emum aumento inicial no osso tecido que é remodelado causando uma diminui-ção depois no volume evidente de osso. Efeitos relativos de osso tecido re-centemente formado e trabéculas em razões de volume de osso/volume tra-becular geral (BWTV) são portanto obscuros. Porém, está claro que anticor-po de anti-DKK1/4 aumenta a produção de osso em tumor e tíbias pseudo-implantadas e inibe ou tarda a diminuição de volume de osso acompanhan-do remodelagem. Usando o mesmo modelo osteolítico induzido por tumor,anticorpo de anti-DKK1/4 demonstra atividade antiosteolítica equivalentecomo Zometa, vide Figura 12. Os efeitos metabólicos de osso do anticorpode anti-DKK1/4 são responsivos à dose na faixa de 20-200 μg/camundongo,com uma dose minimamente eficaz entre 20 e 60 pg/camundongo, vide Fi-gura 13. Juntos estes dados sugerem que anticorpo de anti-DKK1/4 pudesseter um impacto na doença osteolítica induzida por tumor, mas pudesse tam-bém ser eficaz em doenças de osso não-tumorais tais como osteoporose ouintensificando o reparo de fraturas de osso.

EXEMPLO 18: ANTICORPO DE ANTI-DKK1/4 MANTÉM DENSIDADE ÓS-SEA ELEVADA EM TUMOR E TÍBIAS PSEUDO IMPLANTADAS

Em um esforço para avaliar os marcadores farmocodinâmicos deeficácia nos camundongos três marcadores de soro de metabolismo de ossosão analisados: osteocalcina (OC), osteoprotegerina (OPG)1 e ativador de re-ceptor segregado de ligando de fator κΒ nuclear (sRANKL). Estes marcadoresde osteoblasto são usados ao invés dos marcadores de osteoclasto mais típi-cos devido ao mecanismo esperado de ação do anticorpo. Porém, nenhumaalteração consistente é detectada em animais com tumor versus animais ilesos.Nenhuma correlação de perda de osso, conforme medida por micro-CT ou IHC,com qualquer destes marcadores é consistentemente observada.

Exemplos representativos de reconstruções de MicroCT das tí-bias de camundongos tratados são mostrados ha Figura 12A. Dano corticalé classificado de 0=nenhum dano a 3=dano severo. Figura 12B. Dano corti-cal em tíbias implantadas com tumor é registrado manualmente por análisede microCT que é cega com respeito aos grupos de estudo. Nenhum danocortical é observado em qualquer das pernas pseudo implantadas.

Métodos: Camungondos desprotegidos fêmeas na idade de 12semanas são implantados intatibialmente com 2x105 células de PC-3M2AC6na tíbia esquerda e pseudo-injeção na tíbia direita. Tratamentos iniciaram nodia 5 pós implantação. NVP-anticorpo anti-DKK1/4-NX (anticorpo de anti-DKK1/4) e controle de IgG são administrados i.v., em doses de 200pg/camundongo/dia, q.d., 3 vezes por semana durante 2 semanas. Controlede veículo (PBS) é também administrado i.v., q.d., 3 vezes por semana du-rante 2 semanas. Os animais são varridos no dia 7, 14, e 18 pós implanta-ção do tumor usando o μ-CT VivaCT40 Scanner (SCANCO, Suíça). Densi-dade de osso trabecular (BWTV) é analisada como descrito nos métodos.Um asterisco (*) indica diferença significativa estatística tanto dos controlesde veículo como de IgG (n=12) no mesmo ponto de tempo em ρ < 0,05.Na Figura 13, para determinar a massa de osso, a espongiosasecundária da tíbia é imageada com o software Zeiss Imager Z.1 e Axiovisi-on com base na coloração de Giemsa. O estágio de leitura é com base naporcentagem de osso calcificado no campo inteiro. Toda coluna representa amédia e desvio-padrão do número declarado de animais. Nos grupos trata-dos com anticorpo de PBS1 IgG, e anti-DKK1/4, apenas os animais com tu-mor são analisados. Pernas direitas não tiveram pseudo injeções e as per-nas de esquerda tiveram tumor. Estatística: Dimmett Multiple ComparisonsTest One-Way ANOVA. Pernas esquerdas ou pernas direitas comparadas àrespectiva perna no grupo de PBS ρ < 0,05*, ρ < 0,01**, ρ > 0,05 n.s.

Figura 14 mostra a eficácia de osso anabólica de um anticorpode anti-DKK1/4 é dose-dependente com dose eficaz mínima entre 20 e 60pg/camundongo 3x/semana. Camungondos desprotegidos fêmeas na idadede 12 semanas são implantados intratibialmente com 2x105 células de PC-3M2AC6 na tíbia esquerda e pseudo-injeção na tíbia direita. Tratamentosiniciaram no dia 6 pós implantação. NVP-anticorpo de anti-DKK1/4-NX (anti-corpo de anti-DKK1/4) é administrado i.v., em doses de 20, 60, e 200pg/camundongo/dia, q.d., 3 vezes por semana durante 2 semanas. ControleIgG é administrado i.v., a 200 pg/camundongo/dia, q.d., 3 vezes por durante 2 semanas. Controle de veículo (PBS) é administrado i.v., q.d., 3vezes por semana durante 2 semanas. Os animais são varridos no dia 7 epós implantação de tumor usando o μ-CT VivaCT40 Scanner (SCANCO,Suíça). Densidade óssea trabecular (BV/TV) é analisada como descrito nosmétodos. * indica diferença significativa estatística de todos os controles in-cluindo, veículo, IgG, perfuração apenas, e animais ilesos no mesmo pontode tempo a ρ < 0,05.

EXEMPLO 18: ESTADO DO BIOMARCADORBIOMARCADORES DE DKK1

O padrão de expressão de RNA de DKK1 foi descrito. Krupnik(1999) mostrou expressão em placenta por análise de Northern blot, semexpressão detectada em coração, cérebro, pulmão, fígado, músculo do es-queleto ou pâncreas. Wirths (2003) mostrou falta de expressão de RNA emfígado, rim, e mama, embora a expressão de RNA seja vista em um subcon-junto de hepatoblastomas e tumores de Wilms. Colaboradores examinando aexpressão no trato gastrintestinal de DKK1 por hibridação de RNÀ in situ nãomostrou nenhuma expressão no estômago e cólon, quer normal quer malig-na (Byun 2006).

Análise de expressão de RNA em camundongos revelou níveisaltos de expressão de DKK1 em osso, expressão média em feto e placenta,e expressão fraca em tecido adiposo marrom, timo e duodeno [Li 2006].

Expressão de proteína de DKK1 é avaliada em espécimes de mie-loma usando o mesmo anticorpo de cabra empregado no estudo atual (Tian,2003). Neste papel, expressão é vista em células de mieloma de pacientes commorfologia de tipo baixo; expressão de proteína de DKK1 não é detectada nosespécimes de biópsia de medula óssea de cinco sujeitos de controle.

Distribuição de tecido e reatividade cruzada de espécies do anti-corpo terapêutico de anticorpo de anti-DKK1/4 são estudadas triando-as jun-to a uma série de tecidos humanos normais e dê macaco. As seções de te-cido inteiras e microarranjo de tecido são avaliados. Controles positivos in-cluíram um anticorpo comercial para DKK1 que é avaliado no mesmo con-junto de tecido.

DKK1_15 (anticorpo de anti-DKK1/4 conjugado com FITC) eDKK1_8 (anti-DKK1 de Cabra Conjugado com FITC, R&D Systems,#AF1096, lotes GBL013101 e GBL14111).OUTRO BIOMARCADORES

Considerando que pouco é conhecido acerca do papel patofisio-lógico de DKK1, uma quantidade significativa de esforço é e foi focalizada naformação da base de conhecimento acerca dos efeitos in vivo de anticorpode anti-DKK1/4 através de estudos de biomarcador e como este poderia serexplorado para mais desenvolvimento. Áreas fundamentais de foco incluíram

1) Entendendo o efeito de anticorpo de anti-DKK1/4 em metabo-lismo normal e de osso metastático pela medição de marcadores circulantesosteoclastóicos e atividade osteoblástica.

2) Níveis de expressão comparativos de DKK1 em mieloma múl-tiplo e outros tumores para confirmar e expandir indicações alvos.

3) Efeitos em um nível de expressão de gene em tecidos funda-mentais como cólon, medula óssea, pulmão, pele e mama para avaliar ativa-ção de beta-catenina.

Estudos de epidemiologia molecular preliminares confirmaramníveis aumentados de DKK1 no soro em pacientes com mieloma múltiplo esuportaram um POC nesta indicação.

Com base em conhecimento existente, a Tabela 18 fornece osBiomarcadores potenciais propostos para um anticorpo de anti-DKK1/4.

Tabela 18 Biomarcadores para alvos DKK1 e DKK4

<table>table see original document page 166</column></row><table>

EXEMPLO 19: SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDO DE REGIÕES VARIÁVEISDE CADEIA PESADA E LEVE DE ANTICORPOS DE ANTI-DKK1

As seqüências de aminoácido das regiões variáveis das cadeiasleves e pesadas de anticorpos de anti-DKK1 cujas regiões de CDR são mos-tradas nas Tabelas 5, 6,11A e 11B, são fornecidas por completo na Tabela 19.TABELA 19. Seqüências de Aminoácido de Regiões Variáveis de CadeiaPesada e Leve de Anticorpos de Anti-DKKI (SEQ ID NOS: 2-39)

MOR04454 VH: (SEQ ID NO: 2)

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISYYGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAR DGSHMDKPPGWFAFWGQGTL VTVSS _

MORCI4454 VL: (SEQ ID NO: 21)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIKNYLNWYQQKPGKAPKLLIGAASSLQSGVPSRFS<table>table see original document page 167</column></row><table><table>table see original document page 168</column></row><table>

As seções de CDR e FR das regiões variáveis na Tabela 19 es-tão alinhadas na Tabela 20A para cadeias pesadas (SEQ ID NQS:2-20; VH3é SEQ ID NO:125, VH5 é SEQ ID NO:126), Tabela 20B para cadeias levecapa (SEQ ID NOS: 21, 22, 23, 27, 28 e 29; VK1 é SEQ ID NO:127 e VK3 éSEQ ID NO: 128), e na Tabela 20C para cadeias leve Iambda (SEQ ID NOS:24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e 37; VL2 é SEQ ID NO: 129 e VL1 é SEQID NO: 130).

TABELA 20A. Alinhamento das Seqüências de Aminoácido de Regiões Vari-áveis de Cadeia Pesada de Anticorpos de Anti-DKKI (SEQ ID N0s:2-20,125-126)

<table>table see original document page 169</column></row><table>

- aglutinantes de DKK1 de seqüências de VL capa - posição - estrutura

Tabela 20C. Alinhamento das Seqüências de Aminoácido de Regiões Variá-veis de Cadeia Leve Lambda de Anticorpos de Anti-DKKI (SEQ ID NOs:)<table>table see original document page 170</column></row><table>

- aglutinantes de DKKI de seqüências de VL Iambda - posição - estrutura

Seqüências de CDR de consenso são fornecidas pelo menos emSEQ ID NOS: 40-48 e na Tabela 11B. Seqüências de CDR de consenso adi-cionais podem ser determinadas por alguém versado na técnica dos alinha-mentos nas Tabelas 20A-20C usando métodos padrões e os métodos forne-cidos aqui.

EQUIVALENTES

Da descrição detalhada anterior das modalidades específicas dainvenção, deveria ser evidente que novos anticorpos e fragmentos imunoló-gicos dos mesmos foram descritos. Embora as modalidades particulares te-nham sido reveladas aqui em detalhes, isto foi feito por via de exemplo parapropósitos de ilustração apenas. Em particular, é contemplado pelo inventorque várias substituições, alterações, e modificações podem ser feitas à in-venção sem divergir do espírito e escopo da invenção.Listagem de Seqüência

<table>table see original document page 171</column></row><table>Asp His âex íhr Leu Asp Gly Tyr Ser Arg Mg Tlsr th* heu Ser Ser165 170 175

Lys Mot Tyf Kis Tftr Lys Sly Gln Olu Giy Smt Vol Cyo leu Arg Ser180 185 190

Sex Asp Cye Λ1» Ser Gly Leu Cys Cya Ale Aig Etis PKe Trp Sez I>y«195 268 205

Ile Cys Lys fio Val uru Lys Glu Gly Glrt Vsi Cys Thr Lys h±è Arg210 215 220

Arfl Iya Cly Ser HAs Cly leu Glu .,Ile Phc Gln Kra jCye Tyr Cys Giy125 230 335 240

Glu Qiy Leu Ser Cys Xrq Ile Cln Ly* Aap Hls Kis Gljn Ala Ser Aan145 250 255

Ser Se* Arf Uo His Thr Cyo Gin Aig Hii

260 265

<210> 3 <211> 184

<212> PRT

<213> Hamo sapiens;.

<400> 2

Gln Val Sln U,ju Vpl Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Cly Cly1 5 10 15

Sec teu Aiij te» Ser Cy» Ala Aln Ser Gly Phe Utx Phe ser Asn Tyi20 25 30

Cly teu Bi» Vel Pctp Gln Ala Fro Gly Lys Gly Leu Clu Trp Val35 40 45

Ser Ser lie Ser Tyr Tyr Gly Ser Ser TKr TVi tyr Ala Asp S«r Vsl50 55 60

LyS Gly Arg Phe "?hr lie Ser Afg Asp Asn Sar Lys Asn lüt Leu ^yr65 70 75 80

Leu Cln Mot Asn Ser Lea Arg Ala Glu Aep ^hr Ala Val tyr Tyr Cya85 90

Ala Arg JUsp Gly Sar Mis Het Asp Lys Pre Pro Qly Tyx Val Phe Ala100 105 110<table>table see original document page 173</column></row><table>Sei Gly IIe 3«Γ Ciy Ser Oly Se Tyr Thsr Tye Tyr Bla Asp Ser Val

50 55 60

iys Gly Acg Pite ITiir Ile Ser Ατς Aap Ssn Bor hy* Asn Jfer teu Tyr6S 10 ?S - &0

Leu Clr. Met -Asn Sar leu Arg Ala. Giu Aep Thf Ma VaJl Tyr fyx Cys1' 0S 90 9S

Bla Arg Thr Iie Tyr Mwt íap Tyt Ttp GLy Gin Gly TJir teu Val «ir1ÔÕ · .103 110

Vai, Sat Ser' 115

<210> J<K11> -116

v.<8JÍ>.- -PRT ■ : .■■:■"■. "■:■..■■

■::<213> - Jtàisò étipieas;.; ::·,- :. -

<400> 5

'<3-1« vai Gln leu ValGXu Ser Qly Gly Gly tesi-Afei Olis Pro Gly Cly

Vi ■·■·■ . ::-··: ·5.:·:.;>·· .::..-'■ 10 --. - --V-" 15..V :

Ser.teis Arg.Lsu Ser Cya Ala AXa Ser Gly Ptus Thr Mie Ser Sei Tyr30 3» 30

Trp Set Ser Trp Val Arg Slp Alo Pro Gly Lya Gly Leu Glu Trp Val3-5 40 43

Ser Gly Ile Ser Tyr ser Gly Sec Mn Thr His Tyr Me Aap ser Val

-SO ■ - ■ " 55 " - 60 -

IyS Gly Aig Piie Eihr Ila Bar ftrg Asp Asn Ser Lys !Vsn Khr Leu Ty*«S . 70 ■ 75 ■ 80

Leu Gln Met Asn 3er Leu Arg Aia <31» Asp Thr Ale Vei Iyz Tyr Cye85 SO- .: m

Ale Ar^ Met Giy Xle Asp Leu Asp -Ty.r Trp Gly Gln 61y Thr leu Val100 . 105 .... 110 :·"

Ttur Val Ser Ser

■ - : 11$: .

«210» 6<table>table see original document page 175</column></row><table><table>table see original document page 176</column></row><table><table>table see original document page 177</column></row><table><table>table see original document page 178</column></row><table>Ttp Met Ser Vrp Vai Arg Gin Rla Sxo Cly Lya Gly ftete Cl» Trp Val35 40 45

Sor Gly Xie Ser Tyr Ser Giy Ser Aeii Thr His Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

tys GIy'JVcg Phe Tbr Ue 5«r Arg Asp Asn Ses Lye Asn Thr tos Tyr

Leu. Glii Met Asn Ser Leu Arg Aia Clu Asp Thr Ma Vsl Tyr fyr Cys

Ala Axg Mst Rly Ile Asp teu Asp Tyx Tip Cly Gln <Uy Thi Leu Val,100 IOS 110

Ihr Val Ser SerIlS

<211» 13

<211» 116 .·-..,

<212>. PHT .".'· Λ "

<?13> Homo sapiens

<401» 13

Gla vai Gla Leu Val Glu Sex Gly Cly Gly, Leu Val CIa Pro Gly Gly

1 . ■',■ 5 ... 10 ·■ : ,.. . 15.

Ser Imv Ang t«u Ser Cya Sla Ala Ser Gly Phe Thr th« Ser Ser Tyr20 2S '.SO ·..

Trp Ser Trp Vel Arg Gln Ala Pro Giy Lye Giy Lett Gla Trp Val

...ν" :· 35'. ' 40 ^ 45.' "" :..!;;■■:■.·..:'.'!

Ser Giy lie Ser Tyr ser. Gly Ser Asn Tbr Ells Tyr Ala Asp Ser Val50 £5 eo·

Lys GJty Mrf Ptie Thr Ilo Ser Ari; Asp Λ-an 3-er tys Asn Thr leu Tyr65 70 75 80

Iieu Gln Ket Ain Ser teu Azv M* Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cy*

' o:esvv. «a -.-es. ,

Ala Atq Bet Giy Ile Asp Leu Asp Tyr Trp Gty Gls Gly Thr Leu Val100 IOS 110

Thr Val Ser êerIlS<table>table see original document page 180</column></row><table><table>table see original document page 181</column></row><table><table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table>Sor leu Arg teu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Hie Thr ?he Asn Aw Tyr20 25 30

GIy Het Shr ?cp Vei Arg GXtt Ale Pto Gly Lys Giy toa Glu Trp Vai

35 40 45

Sé* Gly lia Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ale Asp Set Val50 55 60

lys Gly Arg ebe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Stys Asn Thr Oeu TyrSS W " 75 80

l<es» Glp Met Ser Leu Rrg Ala 01» Asp Thr AlalVol Tyi Tys Cys. . 85 9® 95

Ala Arg- Kir Ile Tyr Het Aap Tyr Tip Giy Gln Gly Ihr Iou Val Thc100 . 105 . · 110

Val Ser ser

; IiS-:

. <2i.<5> 21 ■<21i>- 109

<2ll> PRT ' ■■■■:· ....,·■

<213> UaniO aapiens

<*©0> 21 ■■ · ■ .

Aap Iie Gln Met Thr Gln Ser Pro Sor Ser :Mu- Sbc Ala Ser v«l Gly

Λ 5 : ■ 10 '-'-IS

Aep Arg Val TtMr Ile Thrr Cye Arg Ale Ser Sln Gly 11« tys «an Tyr20 JS 30

Lbo Art) Trp Tyr Gln Gln Lya Pro Gly Lya Aia Pre i,ya Ieeu. leu Ile3S '-40. 45

Gly Aia Alá Ser Ser Lfru Glit Set Gly VsI Pro Set Arg PJia Ser GlySO 55 «0

Sex Oly Ser Gly Ehr Aap Pfce Thr Insu Thr 11« Ser Set Leu Gln Sro

65- ■ : 70 ... .. 75. 60

Giu Asp PIte Ala Thr tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Tyr Gly Bet Pro Sro85 90 95

Thr Phe Sly Gln Gly THr Lya Val Glu Ile Lya Arg ThiSOO 105<table>table see original document page 185</column></row><table><table>table see original document page 186</column></row><table><table>table see original document page 187</column></row><table><table>table see original document page 188</column></row><table><table>table see original document page 189</column></row><table><table>table see original document page 190</column></row><table><table>table see original document page 191</column></row><table><table>table see original document page 192</column></row><table><table>table see original document page 0</column></row><table><2l2> ERf

<213> Mcseie aapiens

«306?· 37

Aep TU Alo W T7»r Cin ?ζο Ma Ser.Vfti Ser Gly'Ser PfO Giy Oln1 5 19 15

Sé*·- Ile The Ile W Cye Tftr Gly Thr Ser Set Aap Viu 'Gly Cly Tyr20 25 30

JlStt Tyr-Val Sar Trp Tyr Gln Gln Hia Pto Qly Lys Ala Ρίο Lys Leu35 . 40 .-IS

! ' '. t

1

Het Ilt TyjC Aap Val Asn Acn Arg Pre Ser Gly Vei Scr Asn A*g Phe

.-■:■■ 5Í» : ' ·: SS ' ' 60

Ser Sly Ser l<?s Ser 61/ Aan Tht Ala Ser teu Tbr-Xle Ser Gly Leu

.:'·':·:;':·;■■■ "Mv' ' ■ - V: 'S aoV;·:

Gl» Ale Giu Asp Clv Ala Asp Tyi Tyr Cys 61a Ser Tyr Ala der Giy

85 ■ 90 ■■.■.·.■ 95

Asn tfcr Iym VAl Val Phe Oly Gly Gly Shr í<ys ieu TOr V»t Lvit Sly100 105 110

Çln

38

<2U> 112

<2l3> flano sepAerm

<4D0> 36

Asp Sln V9I Leu Mir Cln Pro Pro Set Val Ser Gly Al» Pro Cly Gln

■ :!■:■■■ ■ ■ ■:■ S ■ ■ . 10 . .15 ■: '

Acg Vel' Thr Ile Sef Cys Scr Giy Ser-Ser Ser Asn II» Cly Ser Ser

20 .... . 25 ■ ■■ 30 ·

Phe Vel Aan Trp Yyr flln Glti Leu Pro Sly Thr Ala Pto Lys Leu Leu

35 -..' « . 4:S

Ile Cly Asn Aen Ser As» Aiti Pco Ser Gly Val Pto Mp Ar? Fhe Ser

■ ■ ■ -50 SS ■.■■.■■■■ 60 ■

Gly Ser Lys ser Cly .Thr Sec Ala Ser Les Ala Ile Thr Gly Leu Glit65 70 15 BO<table>table see original document page 195</column></row><table><table>table see original document page 196</column></row><table><table>table see original document page 197</column></row><table><table>table see original document page 198</column></row><table>Trp vai Ser Gly IJle Ser Slu Atg Gly Val Tyr Ile Phe Tyr Ala Rsp

15

Ifl

Se* VeJL Lya Gly

UiO 59

<m> ao

<212> PRT

<213> Hcma sapiens

<4«0> 58

Tia vai ser Giy Ile Ser Gly Ser Cly Bet Tyt Th* Tyi Tyr Ala Aep

· 5 10 15

Ser Val Lye Gly

se.·.

<2ia> 59<211> 23<212> me:<213> How<4θδ> 59

Trp Val Ser Aap Ile Glu Kie Lys Arg Ar? Aia Cly Ciy Ale Thf Ser

1 5 ID IS

Tyf Ala Ala Ser Val Lys Gly

. 20/:·:

<210> SO■:<211> : .22<212> ' PKT<213> Hosftosapiejíá

<40#> €0

Trp Val Ser Mei Ile Glsi Hie Lys ThE Arfl 6Ay Gly Tbr Thr Aop tyx

X :-5 10 . . IS ■ .

Ala Ala Pre Val Lya Gly

■ 28 ' ■

<210> 61

<21í> 2©

<212> PKT

<213> Beato. MpletM

<400>. 61 .Irp Vai Ser Gly Ile Ser Tyr Ser Giy Sei Rsn «tr His Tyr Ala Asp-I .5 10 15

S«r Viil Iys Sly16

<2lO> «2

<211> ÍO

<M3>· -PRT .

<2t3> Homo sapiítn»·

.<«QO> ■ 62 - '

Trp Vel Sct Val Oe Sec Sei Asp Sei Sec Ser Shjr Tyr Tyj: M= Asp1 ■ $■ ' IO- IS

Sor Vai Iys Sly20

<sa&> 63 ... ' ■■■■■·■■■:■

«P .20 - * ■

■<Z12>'"-PItr

<213> -HffiBO sepiens :"*,· "-

<««0> 63 . .

Vtp Vel Ser Vsl Jle Sftr Scr Kap See Ser Ser Thr Tyi Tyr Ma Aep

. I "■»: . , JO , : IS :

Ser Vel kya Cly2«

<2*0> 64<211 > ''22' ' . ■. ii>· mt -

<213> Homo aapíens

«oo> et

Ipp Vel Ser Val Ile Glu Hls Lyi Ser Pho Gly 8« *1« Vhr Eha fyc

1- ' ■ .5 ' ' IO ■ 15 '."

Sle Ma Ser Vnl Lya Gly

<210> 65 .

<2U> - -"

<21Z> PRÍ

<213> Kotea:-mtpiémà ;

<4ϋ0>: S5

Hla Tyr Ket Asp Hle<table>table see original document page 201</column></row><table><table>table see original document page 202</column></row><table><2ΐ«> η

<2Π> 14

<Ζ%2> PRT

<213> Ηύήο e&piétis

<4(W»t 77

Thr Gly Thr Ser ser ftsp Val Gly Gly Piie ftsn Tyr vai Ser1- 10 ·

<210> 78"

<211> 14

<212> ■ WKf ' ■ ,

<213> Horoosapiens

<«D0> 7B ' 1

TJir Gly Thr Ser Sar Aap Lesi Gly Gly Tyr Asn Iyr Vel Ser1 5 10

<21 Ó> 79

<211> 14 "

<2U? m

<213> Horio aopiena ·

<400> 79

-Tbr Gly Tltr Ser Ser ftep leu Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser1 . " 5 10

<210> 80<2U> 14

<212> .-I1RT. ■'·.'·....·«ZJ.3*·:-Boroo:

<400> 80

Shr Gly Thr Ser Ser Ajp Ieu Gly Gly Tyr Tyr Val Ser1 S · 10

<2io> ai<211» 11<?«>· m

»<í213> Jíorao aajJlena<4tM3> .81

Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn leu Cln Ser1 5 . 10.

<Í10> ®2

<211> 11

<212> PHT

<213> Mcao sapiens

<400> Í2<table>table see original document page 204</column></row><table><table>table see original document page 205</column></row><table><table>table see original document page 206</column></row><table><table>table see original document page 0</column></row><table><21í> S4»<212> DHA

<213> Hcno aapiens <4Ó0> 109

çatatcgt^e tgsaeceagag cocggcgacc eígagectgc ctccgggcgo acgtgcgacc 60

ctgagetgca jaigcçagscá gaatoittct tctccttatc tggc^tggta ecagceçaaa 120

ccaagtcaag caccgcgtct attaatttat ggígçttçta atagtgcaac tggggtcccg 180"

gcgegtttta gcggcfcctgg ateeggeaeg gattttaccc tgaecattag eagcetgçaa 240

ccfcgaagacfc Cigcggtgta tfcattçccag cagtatatga ctüEtectet tacctttggc 300

cagggtaega aagtcgagat caaacga«ct gtggefcgcae catctgtctt catctteeeg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcceagag aggeeaaaflt acagtggaag gtggataaçg cçctccaatc gggtaoctcc ' 480

eaggs^açtg tcacagagc» ggacagcaag gaeagcacct açagccteag cagcaccccg . 5<0

acgctgagco aagcaçacta cgagaaacac eeagtctacg cctgeçaagt cacccatcag SOO

gçcctgagct cgcccgtcsc aaagaçcttc aacaggggag agtgttag S48

<210> 101<21í» .1347<212> KW ...

<213> Hcwq Mpiens ...'.·

<400> 101 " "■' ■■■_.·...■'

CAgecacagg tgesattijgt 99»aageggc çgcgg«ctgg tgcaaccggg cggc/igeetg SO

ogtctgaget ççqcçgcctc cggatttacc ttttctkctt attggatecc ttgggtgcg^c 129

caa^cccotg ggeagggtct cgagtgçgtg. agcggtatct cttattetgg tagcaatacc 180

cattatgcgg atagegtgaa açgccgtttt accattteae gtgataittc gaaaaacaae 240

ctgtatctgc e*atgaacag cctgc<5tijcg gaagotacgg cogtgtatta ttgrajcgcgt 300

atgggtattg atcttgact·» ttggggceaa ggeaccctgg Ccaccgtccc ctcagcctca 35t}

accaagggcc categgtett ccccctgçce ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

geggcoctgg gcegcctggt oaaggaetae ttccccgaac oggtgaeggt gtegtçqaac 489

tcaggegccç tçaeeagogg cgtgoaeaca tteeeçectç ecetacagtc ctcaggaete .$40

tactccctca gcagegtcgt qaccçtgccc tccagcagct, tgggcaecea gacciacatc 600

C^caacgfcga'eteacaagcc cag&sacice aaçgtggaíe agagaçttga gccc*««tct 660

LgtQacaaaa ctcacncatg eecaccgtgc cc»gcaccfcg aactcctggç gçg&ecqtca 720

gtcttcctot tccccccaaa »ccc»aggae aecctcatga tctcccçgac ccctgeggte 180

acatgcgtgg tggtggacgt gagccaegaa gaccctgag^ tcaagttcaa etegrtáegtf 840gaeggçgtgg Aqgtqeataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagt» cascagcacg 900

Caccgtgtqq tcagcçtcct caccgtcccg caccagg»ct ggctg-aatgg caaggogtac 9SO

aagtgcajgg tctccaacia agccctecca gc-eetcâtcg agaaaaecãt etceaaa-gpo 1020

aaagggcago cccgagaacc aeaggtçtac accctgccec catcccg<|g» ggag-atgacc 2080

aagaaccagg tçísgcctgac ctgcctggtc aasggcttct stcccagcga catcgccgtg 1140

gogtgggagagoaatgggca $cag$»gaac aactacaaga ccacgcctce.cqtgctggac 1200

tecçaegçct ccttcEtcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag- 1260

ggçascgtct tcfccatgctc egtgatgcat gaggctetgo acaeocacte çacgeagaag 1320

ágcetctece tgteeceggg taaacga ' t 134?

<210> 102

«ll> 134? , - .*.. ....,·.

.;.«»£> um. .· ·'

<213> Somo sapietis «' ' ■

<«00> 102

CaggeaeaQg tgeeattggt ggaaagcggc ggcggcctgg tgcaaccggg cggcagcctg 60

cgtctgagct gcgoggcctc cggafcttaoc ttttottett attggetgtc fctgggigóge 120

eaagceectg gçaagggtct cgagtgggtg agcçttafcct cttctgmctc tagctctacc 190

tattatgcg-g atagcgcgaa aggccgtttt accatttcac gt^ataaetc gaa&aacace 240

, ctgtatctgc eaatgaacag cctgcgtgcg gaagatacgg eogtgtatta ttgcgcgcgt Ϊ00

e&iççtáttg attttçstea tígggfccaa ggcsccctgg tcaccgtctc etcagcctoC 36© ■

a.ccaagggcc catcggtctt occcotggoa cceteeteca agagcaccee tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac Cggtgac^gt gtogtggaac 4Í0 -

tcaggcgocc, tgaceagegg cgtgcaeacc ■ttcccggetg tectatagtc eteagqactc MO- '

tactccctco gc-agcgtcgt gacogtgccc tccagcagct tgggcaccca gBCCtacatc 600

tgcaacgtga otceceagcc cagceecacç «eggtggace agagagctga gcçca««fcçt . {$<7

• tgtgaeaa-aa eteacaeatg cccecogtgc ccagcacctg sactcctggg gggaeegtea 120

gtcttcctct tocccccaaa acccaatggac accctoatga tetcccg^ac ccctgaggtc 760

acatgegtgg tggtggaogt ?agceecg»a çaccctgagg tcaagtteaa etçgeacgtg 840

gacgçicgtgg aggtgcataa tgceaagaca aagccgcggg aggaçcagta ceacagcacg 900

taccgtgtgg ecagegtccfc eeeeçteeig eaeeagqact ggctgaatgg Cae^gagtae 960

aagtgeaagg tctccaacaa agccctccc» gcccceatcg agaaaaocaé ctccaaagcc 1020

aaagggcagc ceçgagaacc aeaggtgtac «ccctgcccc catcccggça ggagatgacc 1080

. aagaaccagg tcagcctgae ctgcctggtc aaaggcttct ateccagega catcgccgtg 1140<table>table see original document page 210</column></row><table><2 Η» 104<2U> 65<l

<Ζ12> OiKft

<213> Raao aapiens

<400> 104

gatatcgeec tgaeccagcc cgccagcçtg teeggcagcc cçggceagag cateaecate 60

- agctgtaccg gcoccagcag egatgtgggc ggcttcaact açgtgtectg gtatcageag 120

caccccggca aggcccccaa gctgatgstc cacgacggea geaatagacc cagcggcgtg 180

teeaatagat toagcggcag caogagoggc aaeaccfjeca gcctgoccafc cageggcctg 240

ès^gcSgagg .aegaggcega etactactgc cagagctggg atgtgagccc caccaccgcc 300

ι

gtgtttggcg gcggaocaaa gcttacegtc etaggteagc qcaíggctgç cooctcggtc 360

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagceaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tciacecggg agcogtgaca gtggccigga aggcagatag eagccecgec 480

aaggcgggag Cggagacaac c»c»cqctcc aaacaaagca acaacaagtai cgcggccegc $40

agcfcatctg» gcctgaogee tgageageg? aagtcccaca goagctacag ctgeeaggtc 600

ac-gcatgaag g^agcaccgt ggaaaagaca gtçgccect^ cagaacgttc a taq 654

<21Ü> 105 - ■

<2U> . &S4

<212> 0W*

<213> Bom>- A*piens

<460> 105 ·,

gatategccc tgscccagcc cgecagegtg tccçgcagcc ctçgosagag catcaccatc 60

agctgtaeeg geaeeageag egacctgg>gc ggctacaaet acgtgtcctg geaCcagcag 120

caccccggca aggeeçccaa gctgacgatc Cacgaogtga acaacagacc tagcggegtg " 180

tecaãcagat tcagcggcag caaçageçge aacaecgcca gectgaccat çtctggcctg 240

caggctgagg aego/jgeíjga ctactactgc cagacctacg aee&gatoaa gctgtccgcc 300

gtgtttqgce gcggaacaaa gctcacogtc ctaggtcagc ccaaggccgc ccccfccggtc 360

'àctctgcfcee, ogeecfceete Ççaggagctt caagccaaca aggceaeaet. ggtgegtotc 410

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggectgga aggcagatag cagécccgte 460

aaggegggaq,tggagacaac cacaccctce aaaeaaagca acaacaaçta cgcggccagc 540

agctatctfs gcctgaçgcç tgagcagtgg: aagtcccaca gaagctacag ccgccaggcc 600

«cgcatgMg ggagcacegt ggaaaagaca gtggccccta c«ga«tgttc atag 654

<210> ,106<2U> 64«<21 z> om<213> Kono sapieas<400> 186

gacatcgtgc tgacccágag eceegceacc ccgagcctgia gccctggcga gagagccacc 60

ctgtcttgts gggceageea gaacctgttc ageccttacc tggcctggíis tcagcagaag 120

eecggccagg cccccagact gctgatctac ggcgccagca «casgagccac çggcgtgccG J90

gccagattca gcggo»gegg ctccggcacc gacttcacçc Kgaccatcag eageetggag ZlO

cctgaggstt tcgcegtgta etaetgeeag cagLacctga ccctgcccct gaccttcgtjc 300

eegggcaeea· aggtcgagat caaacgaact gtggctgcac catetgtett cetcctcccg 360

ccatctgatg agcagttg&a átetggaaet gcotetgttg tgtgcctgct gaatAaetto 420

tatcccagag.aggccosagc acagtgcaag etggacaacg ccccccaatc eegtaactcc 480

caggagagtg tcaeagagea ggaeageaag gaeageaeet acagectcag eageaecetg 540

acgctqagca aagcagacta cgagaeacac aaagtctaeg cctgcgaogt cacccatcag $00

ggcetgaget egeeegteae aaegagetíe aaeaggçgag agtgttag 648

<210> 107 .

au> «48 . ' - ·'·.■.

<212> ■ DNA

■ <213> ■ Hoao Mpiens . ' ■ \ ■ ■

<4oo> io7 .-■■■·■

gaeategtgc tgacccagag ecccgccaçc ctgagcccg* gcectggcga gagagccacc íC

ctgtcttgto gggccagcco gaiioctgttc «gçcettãee tggcetggta teagcagaag 120

cccggccagfl cccccagact gctgatctac ggcgcMtgc* acsgagccac cggcgtgccc 190

. gccagottea gcggcegcgg eteeggcaee gecttcaccc tgaecatcag eageetggag 240

cctg*gç«tt te&eetçt*úUetgce»? «9»e»t«í eoetgectet SfBeettCgfe 300

cagggcâcca aggtcgagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcecg 360

ccatctgatg ageagttgaa atctggaact gcccctgttg tgtgccCgct gaataacttc 420

titoqcagag aggccaaagt acogtggaag geggateacg eccfceeaatc gggtaactec 480

caggagagtg tcacagegca ggacagcaag geoagcecct acogcctcag cegcaccctq 540

«cgetgagcà aagcagaota cgageaacac aaagtctaeg cctgcgaagt eacccateag SOO:

ggcetgagct egeeegteae aaagagcttc .aacaggggag agtgttag 643

<210> 108<211» 1347<21Z> DRift<213> Jioroo sapieno

<400> 108caggcccagg cgcogstgçt ggagageggc ggaggactgg tgcigcotgg cggcagcctg 60

agactgagct gtgccgccag cggottcacc ttcagcagct actggatgag ctgçgtgagg IZQ

caqqcccetq gciagggcct ggagtgggtç tccggeateá get&cagcgg cageaetacc IfO

cactacgccg tseagcgtgaa gggcaggttc aceateagcc gggeeaaeag caegaaeaec 240

etgtecctgc a^atgaacag cctçngAgee gaggacaccg ecgtgtecta ctgtgcccgg 300

atgggcaíçtj acctg^atte ctggggceag çgcaccetgg têaeegtetc, ctcagcetec 360

aeaaaççgcc cstcggtctt eeccetggca ccçtccteca ajagcicctc tgggggcaea 420

gcggecetgg gctgecCggt caaggactac Ctcceogaac eggtgaeggt gtcgtgg»#e íBO

tca<fgcgcoc tgaceaçcggi cgtgcacacc ttcccggctg tccçacogtç cteaqqàctc 549

taetecetea gcagegtcgt gaeeçtgccc"tccagcaget tgggcaceca gacctecfttc 600

tgcaácgtga etcáca&gcd cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcceaaatct 660

tçtgacaaaa etcacieatg eeeaeegtgc ceagcacetg «sctectfgg gggaccgtea 720

gtcctcctct tecceecaaa aoeoejggac acceteatga tctcccggáe cectgaggtc ?8β

açatgcgtgg tggtggáçgt gagceacgaa gsceetgagg tcaagttcaa ctggtac^tg 940

gecggcgtgg aggtgcat*· tgccaagaea aagccgcggg aggngeagta caacagcacg 900

raccçtgtgg tcagcgtcct caccgtccfcg caecaggaet ggctgaatgg caaggagtac 960

Aagtgcaigg. Cct-ccaac«a «gecçtoeca gcceccatcg agaaaaccat ctccaaígcc 1020

«aagggcagc cccgagaacc acaggtgtoc «ecotçceec catcccggga ggagatgace Í080aagaaeeagg tcagcctgee etgcccggcc aaaggcttct atcccagcge cetcg-ecgtg . 1H0

gagtgggaga ge«atgggc» gecggagaac eactacaags ceacgcetcc cgtgctggác 1200

tcçgacggct ccttctteet ctatagcaag occacegtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtet tctcetgçte cgfagatgeat gaggecctgc aeaaccacca cacgc*gaag 1320

agcctctcce tgtecccggg iaaotga 1347

<210> 109<21t> 1.34?<212v DHA

<213* Xom sapifcns ■

<400» loã

caggocCagg tgcagctggt ggegagcgge ggaggactgg tgcagcctgg sggeagcctg SO

agactgagct gtgccgcceg cggctteaec t Cesgesget aetggatgag ctgggtgagg 120

eaçíjc>scetg gcaagggcct ggagtgggt^ tecgtgatca gcagcgatag eegeegeeee IftO

taetacgccg atagegtgaa gggecçgtbc accateagcc ggg&eaacag caagaacace 240

ctgtecetgc agatgaaeag cctgegagoe gaggacaceg qcgtgtacta 'otgtgocagg 309ceaggêàíôg acttcgaoca etggggeea<j ggcaccctgg tçaccgtctc ctcaijcctccacceaggçec catcggtett cccccCgstca ccctcçfccça agagcacctc tgggggcacégcçgccctgg gctgectggt caaggaçtac ttecccgaac crrgcgacggc qtcqtqq&astceggetfcce tçiccagcgg cgtgcacacc ttcccçgctg tcctaeagtc cicaggactctaeccectca geagcgtcgt gacegtgccc tecagcaget tgqgcaccca gaecfcacatetgçaacgtga etcacaagcc cagcftaeacc aaggtggaca agagegttga gcccaaatcttgtgaca.aaa etcacacatg cccaeegtgc ccagcacctg aácteetggç gggaocgtca• ^tcttcctct tccccccaaa ac&taaiggac accctcafcga tcteee^gac ccctgaggtc. acatçcgtgg iggtggacgt ^agccacgsa gaceetgagg Ecaagttc«a ctggtaegcggecggegtgf aggtgcacaa tgeeaagaea aagccgcggg aggageagta caacaneacgtaccgtgtçg teagcgccct caccgtcctg eaceaggact ggetgaatgg Caaggaíjíacaagtgoaag^ tctccaacaa agocctecca çcccccotcg agaaaaoeat ctccaaagceaaafggcsge ccegagaacc acaggtgtac accctgcccc coicccggga ggagafcgaeeaagaaecagg tcagccrtgae etçeetggtc aaaggcttec atcccagcga catcgccgtggagtgggaga çcaatgggca gçcggagaae Mccacaaga ooaogcctco cgtgctggactccgjcggct eettcStcct ctatageaag ctcaccgtgg acangageag gt^gcagcagggigaacgtct tcfccatgctc cqtgatgcat 'geggctctgc acaaccecta ceegcagaagagcctetctx tgtccccggg taoatga -

<2io> na '

<2U> 1338. <212> DNA<213> tfúiwj sapiens

. : «oo> " tio

caggtgeaat bggtggnoag eggcggcgg-í; ctggtgcaac egggtggeag ectgogtctgagctgcgcgg ccfceeggatt tacçttfcaat aatíatggts tgaettgggt gc-gccaagcccctgggaagg gtctcgaçtg gftgagscggt atctctggtt OE.^gtagct« tacccattatgcgg-acaçcg tgaaaggccg ttteaecatt tcacgtçata attceaaaáa cacectgtatctgcaaatça acagcctgcg tgcgçraaçat acggecgtgt attattgege gcgtactactMtsstggatt actggggcca aggcaccetg ^tcaccgtct ccecagcctC Caccaagggc

• . τ ·

ccateçjtct tccccctggc acceccctcc aagagcaoct ctgggggeac agcggccctgggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ecggtgaicgg tgtcgtegaa ctcaggcgccCtgaccagcç gcgtgcac-Sc cttcccggct gtcctscagt cctcaggaet ctactccctc

■3«0«O480 ΛS«0 '60.0 .««07?0180,440900 ,, 5601Q2D

114012001260 ·;.UÍO . ·.J3«7

SO

1802403003604 SO4955«0<table>table see original document page 215</column></row><table>CXn Pré Lys Ale Ala Psfo Ser. Vai Thr Leu Pibe Pro Pro Ser Sez Gln1ÍS 120 12S

Clu teu Gln Ale Λ*π tya Ala Tbr Leu Val Cys Leu Ile Ser Aep Bie130 135 140

.Tyr- Fco Gly Ala Val Thr Val AJLa Trp Lys Als A*p Ser Scc Pro V»1Κψ 150 ISS HO

X>ya Ala Gly Val Glu Thr 7Kr Thr Pro Ser tys Cln S«r Asn Aim Lys165 170 175

Tyr Ale Aia Ser Ser Tyr Leu Ser teu Tftr Prg 61« Gin Trp Lys Ser180 195 190

JUa Arg Ser Tyr ser Cys Cln Val Thr Kis Gla Sly Ser Thr Giu195 · 2Õ0 265

IiyB Thr Val Aia Fro Thr «li» Cys Ser210 215

·■■ <2ÍC> 112

*211> 217

<212> PRT . v. .

<213> Kewo eapieas

. <400> 112

Aap Xle Ala Leu Thr Cln Pro AlaScr Vel Ser Gly Sfei Pra Sly Glnl S · . : 10 .,15

Ser Ile Tbr Ile Ser Cys Ttir Gly Thr Ser Sar Asp Leu Giy Giy Tyx .

20 " 25 30 .

λ'βη Iyr VaI Ser Trp Tyr Sln Cln Hls Pró Gly tys Ala Pro Ly* tee35 40 45

Het Ile Tyr Agp Val Aan Aea Arq eco Ser Sly Val Sec Astt Arg Phe50 55 «0

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ale Ser Leu Thr Ile Ser Cly teu65 70 75 BO

GlQ Ala Gla Asp Glu Ale Aap Tyx Tyr Cys Gla Thr Tyr Asp Cia IleSS 90 95

Lya Iea Ser . Ate Val Pbe Sly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vil Lan Gly<table>table see original document page 217</column></row><table>Lsu Thr Phe Gly Gln Uly thr Lys Vat Glu Ile Lya Arg thx Val Alaioo los 'iio-

Ma Pro Ser Val Phe 11« PDft Pre Pro Ser Asp Olo Gln tóo Lya Sei»5 120 125

Cly Tht IUi Ser Val Val Cys Leu teu Atn Asn Wie Tyr Pjro Ar? Slu130 135 140

Ala Lye Val Gin Trp fty» Val Aap Asn Ala Leo Qln Ser Sly Asn SerH5 ISO 15S . 160

Gln Glu Ser Val Thr Ola Gin Aap Ser Lya Aap Ser Thr Tyr Sei Ley

165 - no ns

Set Ser Tfcr teu Thr Leu Ser Lya Ale Aip Tyt Glu Uys Hi» Lya Vál180 ISS 198

Syr Alo Cye Glu Val Thir ais Slti Cly Leu Ser Ser Sro Val Tht Lye195 200 203

Ser Phe Asn Artf Gly Glu Cya210 ZlS

<210> 114

<211> 215 . / ,·

<212» PRT . . .

<Í13> Homosaptens .

<400> Ui

Aep Ile Vai teu Thr Cln Ser Pro Sla Tfez Ma SBx fce.a Ser PtO Gly.1 ■ "5 . ■ : 10 15

βίβ Arg Ala Thr Leu ser Cys Arq Ala Ssr Oln Aso» Leu Phe Ser Pro20 2S 30

Tyx Leu Al* Trp Tyr ttln Giii Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg teu teu35" ' ■ 40 .45

11« Tyr Ely Als Sor Asn Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

'·■ so. ■ SS .SO

Ciy Sir Gly Ser CAy Thr Asp 'PHp 1Shr LeU Thr Ile Ser Ser Leiu Glu65. 70 ■ 75 80

Pto Ctlu Asp Plse Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Sln Vit Ket Thr Msu Pes

SS 90 ■._.■·.■ 95<table>table see original document page 219</column></row><table><table>table see original document page 220</column></row><table>Lye Μ» Xya GXy Gin Pire Ar? Glu Pro Sln Vat Tyr Thr Leu Pro Bro340 345 350

Sar Ang GJv Gia H»t Thr Lya 'Raa Gln Val Ser leu Thr Cyi Jieu vai

353 360 ' ·■·.·, . '36S ·

Lys Gly Phe Tyr Ser Xip Xle Ala Val Clu Trp .Giu Ser Asn Gly310 ' 375 " 3Θ0

Sift Pto Gla Asn Asn Tyr Lys 11« Tlir Pro Prc Vat teu Aap Ser Asp185 390 355 400

Gly Phé PCie Le<u Tyr Ser Lya Leu Thr Val Rsp1Lys Scr Arg TXp405 410 415

Glri CLn Gly Aen Val Ptie 3er Cya 3at Val Het HLs Slu Ala Leu Kie420 425 430

Asrt His Tyr TJuc Gliv Lys Ser Leu Ser Lea Ser fro Cly Ly»435 440 · 445

<210> IlS<2U> 446

<«a» ,eu·)?'

<zií> Koraa sapiens

<400> 116 .

Gln Val Qln Leti Val Glu Ser Sly Gly Gly Leu Val Gin Frc Gly Oly-1 S · 10 " 15

Sef Leu Ar? Leu Ser Cys Ala Ala' Ser Cly Phe Thr fha 3or Ser Tyr20 ZS 30

Trp Ket Ser Trp vai Arg Sln ftl» Pro Sly Iiys Sly te» Glu Trp Vrt-35 40 45

■ Ser Vel 11» Scr Ser Aap Scr Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala ASp Ser VllSO' SS 60

Lys Cly Arg Fha Thr Ilc Sar Arg Aap A&ti Sar Lys Aan Thr Lqu Tyr

es ... η ■ 7$ «o

Leu Cln Met Asii Ser Leu Arg Ale Giu Asp THr M·» Val Tyr Tyr Cyi85 90 95

Al» Ar-g HIb Sly Ila Aep Phe Asp His Trp Sly 61« Gly Fhr Leu Val100 105 110<table>table see original document page 222</column></row><table>3S5 360 365

Lys Cly Pha IyrJto Set Rap Ile Ala Val Gla Trp Clu Ser Mn Cly

370 . . i7i " JBQ

Gln Pto Etu Rsn Hsn Tyc t-y* Thr Thr Pro Pno Val Leu Asp Set Ssp'385 ,' " Ϊ90 395 <00

Gly Soi Ptta Phe Leo Iyz Ser Lys teu Thr Val Aip Lya Ser Arg Trp405 410 415

Glri Sln Sly Ajn Vat Fbe Ser Cys Ser vai flet Mis Ala Icu Hie«0 425 , 430

Asii His íyr Tbir Gla Lye Ser Leu Sex Lea Sec ?ro Sly Lys, 435 ' «0 445

<210> . 117

<2U> 445

<212> ERT

<213> Haao sapiene '

<«00> 117

51« Val Gln' Leu Vel- Ottu Stor Sly Sly Gly Leu Val Glei Pro Gly Giy

1 . " · - »· 10 ·. ;15 .

Serley Arg Leu Ser Cys Alo Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr20 , 25 30

Giy Mtt Thr Trp Val Arg Glri Ala Pró Gly Lys Gly Lenj Glu Trp Val35 40 43

Ser Gly lie Sec Gly SM Gly Ser Tyr Thr Tyi Tyr Ala Asp Ser ValSO ' 55 60

Ly» Gly Aig Phe Thr Ile Ser Arg Ajp Aan- Ser Ly* Asn Stw Leu Tyr• 65 70 75 »0.

Lea Glo Miet Asn Ser Leu Ary Als Glu Aap Thc Ala Val íyr Syi Cya

SS 90 . 95

Ala Arg Thr Ile ?yr Met Asy Tyr Txp Gly Oln Gly Thr Lou V»1 Tbr100 105 110

Val Sex Soc Ala Ser Ehr Lye Sly Prp Ser Val Phe Pro Leu Als115 120 125Sec Ser Lys Ser Thr Ser Êly· Gly Thr SXe Ala Lea Gly Cys teu Val

130 135 MO

Lys Aap Tyr Phe ?ro 'Glu Piro Val Thr Val Ser Trp Asn Sflir 61y AKs14* 150 155 1«0

LeU the. Ser Sly Val Hla Thr Phe Pro Ala, Val Leu Gln Ser Sar Ôly165 ITO "5

Leu Tyr Ser Lsu Se: Sei Vsl Vel T3»r Val Pro Ser Ser Ser Leu Cly180 195 ' 190

Ihr Gin Thr fyr tí« Cye JMtft Val Aaei Hie Lya Pro Sec Aan Hjr Lye195 ' 200 205 "

Vat Asp Lys Aicg Val Slu Pre Lya Ser Cye Aep Lys The Kl» Thr Cy** ■ 210 . 215 220 ■

Pre Pro Cy= Pró Ala Pro Slu Leu Ceu Giy Cly Pro Sw Va-I Phe Lcu22S 230 . - 234 ··» 210

Pha Pro Pro Lya Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Seir Arg «ir Pro Glu2*5 ZSO . ■ . - 255

vai Thr Cys Val Val Val Asp Vel Ser Hls Oilu Asp Pro Gltt Vel Lys

260. . - "'.. . , 270

Fhe Aen Trp Tyr Vel Asp Qly Val Glu Val Bls Aen Ala Lye Tbr Lya27» . . 280 ' 285

Pro Asg Clu Clo Gln Syr Aan Ser Thr Tyr Arg Vai Val Ser Val Lau290 295 300

Thr Val Leu Hia Glrt Aap Trp Lee Aen Oly'Lye GIm Tyr Lys Cys Lye305 3L0 31S 320

Vai Ser Rsn Lya Ala Leu Pro AU Pro Ilo Slu Lys Thr Ile Ser LyS.325 330 33S .

Rla Lya Gly Bla Pre Are Glu Pco Gln Val Tyr Ttir Leu Pro Pro Ser340 -MS- 350

Arg Gltt ,Glu MeL· Tikr Lys Ami <»n Val Scr teu Thr Cys Lsu Val Lys355 . 360 36S

Gly Ph= ?yr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Aan Gly Gln370 : 37S 380Fco Glu Asn Rsn Tyr Xy* S!uf Jftt Pto Pro Val Ifiu Asp Ser Aep Gly36S , 390 395 < . <00

ser Phe Phe teu Tyr Ser Lys ϊλο ?iir Val Asp Lya Ser Atg Trp Sln405 410 4Í3

Gln Giy Asa Val Sec Cys Sec Val Kec Hls Olu Ala Leu Ols Asn<20 025 430

ais Tyc Tbr Oln Lya Swi leu Scr Leu Ser Pro Giy Lya435 440 - 445

<210> 119

<2ll> 111

<212> PRT .

<21?> »psw aepiens ■ ·'

<400> 118 ■ '.;' '

fiir Ars Cy4t Aep II» Ala Lett Ihr Gln Pxo Ala Ser Val Ser Bly Ssc1 5 10 IS

Ptõ Gly GliS Ser Ile Ttir Xle der Cys Tbr Cly Thr Ser Sor Aep Uiu•20 2S 30

Giy Gly fyr Aen Tyx VjX Ser Trp Tyr Cln Cln Hí-t Pro Gly JLys Ale35 40 . 45

Pro Lys Leu Met XXe Tyx Asp vai Asrt Aim Acg Pro Ser Gly Val Ser

" SO ■ ■ ■ ' SS «O . ■ .

Aan Argi Pte Ser Gly Sec Lye Ser Gly Asn TJir Ali Ser Lee. Tftr Xie«a 70 75 BO

Ser Gly teu Gln Ala Slu Aep Glu Ala Asp Tyr Tyr Cya Gln Thr Tyr85 90 95

Aap Gln II» L^a teu Ser Ala Val Phe Qly Gly Gly Thr Lya Leu100 IOS 110

<210> 119<2Í 1> 117BRT

<31Beoo Mpiens<4í>0> 119

Gly Vei Gln Ala Gln Val Cln Lcu Val Gln Ser Gly Gly Sly Leu Vai1 S IO 15<table>table see original document page 226</column></row><table>eaaeageaag aacacccCgt acetgcegat gnncagcctg agaçtxgaçtg acaccgccgt 300■jtactactgt gccaçgeac$ geategaott egac&aetgg ggccagggea qccegoitcac 360c " ' . ' -■ 361

<210> 122

<íll> 259

<212> PBT

<213~> Soáa aapiens . '

<400> UZ

Het Ala Ala Leu Met Arg Ser Iys -Asp Ser Sqc Cys Cya leu Leu Leu

l . . 5 I» " ,, 15 '

ieu Ala Ala Vai Leu Met Val Glu ser Sec CXn Ile Sly Sti Stsir Arg

Í0. ''".", ■ 2S . 3«

Ala Lys Mu Aro Ser Iie Lys Sei Ser toe Sly Gly Clu Thr Sto Gly.35 40 45

Sln Ala Ala Asri Acg See Sla Oly Ket Iyr Gln Giy Leu ala Wie GtySO "55 60:

Gly Sec Lys Lys Gly Lya Asn* Leu Qly Clp Ala Tyr Pro Cy* Ser Sec65 70 ,75 BO

Aap Lys Glu Cye Glu Vial Cly Srfl-Tyr Cys Bls Sar Pro Rls Cln Cly«5 ·.·■ SÕ ■ '95

Ser Ser Ala Cyi Het Vai cy» Arg Art Lye Lya Arç Cyβ Má Arg

100.' 105 IlQ ■ ■

Avp Sly Met Cya Cya Pm Sar Thr Arg Cya Aart ftan Gly Ile Cys Ile

. .Uf Í20 ' ' 125

. Bro Val Thc Glu Ser lie Leu 7hr Pro Bls tia Pro Ala Leu Asp Cly

130 ' 135 140

Thr Arg Us Aog Asp Axg Asn HXs Gly Hia JVr Sex Ascv fUs Aep te»145 150 ISS 160.

Sly Trp Gln Asd Leu Gly Acg Pro Bls Tht Lys Slet Ser ais Cle Lys165 170 175

GIy His Glu Sly Asp Wxo Cys Lea Ar? Ser Ser Asp Cys Ile Glu Sly180 185 190<table>table see original document page 228</column></row><table>His Glu Cya Iie Ile Asp Glu Asp Cyε, Oiy Prp Set Hat Tyt Cys Gln145 ISO 1*5 · , . 160

Phe fila Ser Ebe Gin Tys Tht Cys Gln Pso Cya Arg Sly Cln Arfl Mat165 110 175

Leu Cyo Thr Arg Aap Sef Glu Cya Cya Gly Asp Oln Lou Cya Val trp180 IBS 190

Qly HiS Cys TItr hys BeC Ala Tbr Arg Gly Ser Ajti Qly Tnr II* QyS195 200 ,205

Atjp Kab 61» Arg Asp Cys Gla Pro Gly LeQ Cys Cys Ala Fhe Cln Arg210 ' ■ " ■ 215 230

Sly leu. 1eu Pbe Fro Val Cys TJir- Pro l<eu Pro Va l Qlu Oly Qlu teu225 230 23$ ' 240

Cys Bis. Aap Pro Al» Ssc Arg Iau Lcu Asp leu tle Thc Trp Clu Ley

' i*s. 250 ■ 855 .

Clo Pro Aap Gly Ala leu Atp Arg Cya Pr-α Cye Ain Sar Gly teu Leu

260 265 .,·■·. , ■"· ' 270

Cys Gln Pro Hia Sftr Ria Ser Leu Vhl Tyr Val Cya Lys Pro Ihr Phe2Ϊ5 2®0 285

vai Gly soe Arg Asp Gin Aso Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val290 29S 300

Pro Aap Slji Tyr Clu Vel Gly Ser Phe Met Glu Slti Val Arg COn Siu305 310 ' 31$ J2Ô

Leii Glu Aap Lsu Glv Arg Ser Leu Ihr Glu Gle Het *Xa Lea Sly Glv325 330 335

Pro Ala AXa Ala. Aia Ala Ala Leil Leu Gly Gly Glu Glu tle.340. 345 JSO

<21Õ> 124

<2J1> 224

<2.I2> FRT

<213» lictno aiplens

<400> 124Met Viii Ala Ala Vai teu Leu Gly Lau S«r Trp Leu Cys' Ser. Pro Leu1, S 10 IS

Giy Ala Uu Val Leu Ssp Pba Mn Rsn Ile ftig S»# Ser Me Asp teu20 25 JO

Bla Gly Ala Arg Lye Giy Ser Gln CyS Iett Sec Asp Thr Aap Cys Jan35 ÍO 45

Thr Arg Lys Phe CyS Leu Gln Pro Sr? ft*p Glo Lys ,Pro Pbe Cyi Aie30 55 ÍO

Mw Cy* Acg Siy Utv Awg Arg Arç Cys Gin Arg Asp Ala Ket Cya Cye65 70 15 80

Pto Gly Thr Cys Val Aan Aep Val Cya Stur Thr K«e Glu Aep Ala8S 90 . 95

Thr Pro 11« I-CIi Giu Acg Gln Leci Aap Ciu Cin Aip Gly IMf Sla Als100 105 110

Giá Gly Tht Thr Giy Ki; Pto VaL Gln Glu Asn Gin Pro hye Atg Lye1J5 ' . . ■ 120 125

?ro Seir Ile iys tys Ser G-l-n Giy Kcq Lys Gly Gln Glu Gly Klu Sec130 ' 135 '. 1«

Cys Leu Arg Thf Phe Aap Cya Gly Pro ely teu Cy* Cya Aia Aeg HlaHS ' 150 ■■ 155 160

Phe Trp Thr I>ye Ile Cye Lye Pro Val Leu La» Glu Gly Gin Vil Cya165 ■ - ItO ■.·. 175

Sar Arg Arg Gly Hi β Iys Asp Thr Ai» Olá Aia Pro Glu IX» Fhe Gln ■-" 180 ■ . iíí . , 190 ■

Arg Cye Asp Cys ttl.y VS».Giy Lw :tm Cye Arg Ser Gln Leu Tlir ser•195 200 205

Asn Arg Gln His Als Arg Léu Arg Val Cys Gln Iya Iie Gict tys teu

210 m 220

<210> 125

<211> Uí'

<212> PRT

<213> Hono sapiens<220>

<221> MISC_FEATURfi

<222> (9?)..(116)

<223> vheroio X n&y be any mino acid

«00> 125 . · .

Gln Vai Gln lati Val Glu Se* Gly CLy Gly l=u Val Glft Pxo Gly Gly

1 ■ S · IO 15

ser Leu Atq Leu Ser Zya Ala Aia See Gly fSw Thr W>e Ser Sst Tyr

20 25 30.

Ma Mst Ser Tcp Val Arq Gln Ala Ero Gly tya Gly Lea Glu Trp Val33 «0 " ,«5

Sec Alá Ile der BJy Ser Gly Sly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 3er Vai50 · ' .SS «0

í»y« «Ly Asg .th* TStt Tte 99*· IWg As» A»n -Sw.Iaw Aan Ttac Hyres 70 ís " θο

Mi Gltt 'Ket Mft Sei Leu A*S Ale Glu Aap Tht Ale Vei Tys Tyr Cye85 ' 90 JS

-Ala. Arg Xaa Xoa Xaa Xaa Xsa Xas Xea Xea Xea Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

100 , 105 < 110

Xm X*a X*a Xaa Trp Oly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser' ■ 115. .120 ■ Ί25" ..

<210> 126

<211> 1?7

<212» PRT

<213> Bomo aapíena

<22-0>

<22 L> «XSC_rí;ATURB ·.

-<ZZ2> (M).. (116»

<223» wheceln X nay be ény amLno acid

<400> 12«

GIn Val Gln Leu Vsl Gln Ser Gly Ala Glu Val Lye Lys Ppe ftly Clu1 5 10 IS

Ser. Leu Lys lie Ser Cya Lys Gly Ser Gly Tyr Sec Phe ttir S«r Tyr20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lyi Gly Leu Glu Ttp Het35 40 45<table>table see original document page 232</column></row><table><219> «tf

<211> Ili

«2Í2> PRT

<213> Hwo saplena

<220>

<221> MISC.mtUK

<222> (91)..<99)

<223> whtirein χ. xay be any aalno acid

«00> 128

Aap Iie VaX Wu CTee Gia Ser ira JUa Tnr Leu ser Leu ser Pro GIy

t 5 ' 10 . 15

em Atg Ala Tttt Iao Set Cys Arg Rle Ser Gln ser Val Ser s«t Ses20 ÍS 30

tyjr teu Me ?çp 'fyr Sln Gln Xjy= Pto Sly Gln Ala Pro Rtg 6e« t/OU

. JS. · 10 ■ 49

Xle Tyz Cly Al* Ser Ser Arg AXa Thx Gly Vil Pro Ale Arg Phe Ser50 55 60

Giy Ser Gly Ser Gly- Tht ASp Phe Sir Léu Tbr Ile Sef Ser leu Olu65 ·. 70 7b BO

Pxo Slu Aep Pite Ala Thr Vai Tyr Tyr Cya Xea Xae Xaa Xae XAe XeaB9 90 9b

Koa Xea fhr pjie Gly Sin eiy Thr Ly* Vai Glu Ile Lye Arg Thr100 < 105 110

<210* 129

<2ll> 113

<212> PHT

<2l3> Kamo saplena

<220> ■

<221» SISC FBATORB

<222:» <91)7- (100)

<223> wheteln χ may be any aslnp acid<40dS» . 129 ■

Asp He Aia teu Thr Oln ftõ Ala Ser Val Ser Giy Ser Pro Gly Gln1 . ' 10 .■ 15

Ser íie Thr íle Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr20 JS ·. 30Asn Çyr Vai Ser Trp Tyr GXn Sln Hia PiO Gly Lys Aln Sro- Lye Lea35 «Ô iS

Ker Iie Tyr Asp Val Sec Asn Arg Fro Sei CXy Val Sec Asrt Axç Phe50 SS «0 "

Se; Sly Sez Lys Sex Gly Asn Thr Ale Sez Leu Tlur Ile Ser Cly t«u65 7Q . 7S 80

Sln Ala Clu Aap Glu M« Asp Tyc TyT Cyi Xaa Xaa Xsa Xm Xaa Xaa85 · 90 95

Xaa Xaa Xm Xaa Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ttir Vsl Le-J GIy

100 IOJ tio

Gin

<n«> »33<211> 112<212> PBÍ

<213> HoiK) ?»pien3

<220> '

<2Zl> MISC FEAIQRE

'«Μ» f90)7» {99) '

<223> wherelri X may be sny amiao acid *

«OS» .130 .

Aep í le Val Leu TKc Gln Pro Pso 3et Vai Sesc GIy Ala ?ro Gly Qin

1 S 20 15

Aig Val Thr Ilé Ser Cya Set Gly 3er Sef 'Ser Asn Ile Cly Sez Ssro20 2S 30

Tyr Val Ser Γηρ Tyr Cln Gla leu ?io Gly Thr Ala pró Lye Lee ΙαυJS 40 Ai

Ile Tyr Asp A» Ma EIr Ari Peo Sat Cly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 ' .55 60 ■

Sly Ser Lye Êér Gly Thr Ser Ala Ser fcee Bla Ile Thr Cly Leu GlnSS- 70 15 90

&er Glu Asrp Glu Ala Asp Tyr Tyt Cys Xes Xaa Xa* Xaa Xoa Xaa Xaa85 90 95Xaa Xaa Kaa Val ?h« Gly Giy Gly Thr Lys Iaa IJir Vsi Leu Sy GinIOO 105 no

<a«> i3i

<211> 11

<:Z12> PRT

<2i3> Bano sepiene

<320>

<221> HSSC^mfORE

<22Z> <&>,. (líí

<223> Wherein X wy b« Wy amino acid

<400> 131

Arg ALe Ser Gln XAa Xaa Xm -Xa* Xaa Tyr Xaa

ι s ίο

<210> 132

<211> Il

<212> ?RT '

<2J3> Bcao aapLans

<22d»

<221> HISC_i3»TOTE<222> (9). · (111<4QÚ> : /

Leu Leu Ile Tyc Gly Ala Ser Aan XaA Xm Xaat , S 10

<21d> 133

<211> ft

<212> PRT .·'

<213> Boa» saplens

<220>

<221> KISC FEATURE

<222> (4>.T[8)

.<Í23> wb»r«irt X aay be any amino acid

<400> 133

Gin Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Pro Xea

1 5

<210> 134

<211> 14

<2t2> mr

' <213»' Beeio sepiens

<400 134<table>table see original document page 236</column></row><table>

Claims

1. Composição compreendendo uma região de ligação de antí-geno que especificamente liga um epítopo em um polipeptídeo de DKK1(SEQ ID NO: 1) e/ou em um polipeptídeo de DKK4 (SEQ ID NO: 122), emque o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo liga a pelo menos um epí-topo em DKK1 ou DKK4, ou ambos.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que ligação aDKK1 ou DKK4 é determinada em pelo menos um ensaio selecionado de:antagonismo de transcrição sinalizada por Wnt; análise de ligação com baseem eletroquimiluminescência; ligação de ensaio imunoabsorvente ligado aenzima; FMAT; SET; SPR; concentração no soro de osteocalcina (OCN);concentração no soro de osteoprotegrina (OPG); concentração no soro depropetídeo azotado do tipo 1 de procolágeno (P1 NP), produção de ALP;TopFIash ou melhorando osteólise.

3. Seqüência de aminoácido isolada selecionada do grupo deSEQ ID NOs: 2-20 e SEQ ID NOs: 40-72 e variantes conservadoras ou con-vertidas em variantes humanas engenheiradas ("humaneered") das mesmas.

4. Seqüências de aminoácido isoladas de acordo com a reivindi-cação 3, em que as seqüências de aminoácido são selecionadas de:a) o grupo de SEQ ID NOs: 2-20, 65-72, cada compreendendouma região de ligação de antígeno que compreende uma região de H-CDR3;b) o grupo de SEQ ID NOs: 2-20, 57-64 cada compreendendouma região de H-CDR2;c) o grupo de SEQ ID NO: 40 compreendendo a seqüênciaGISGSGSYTYYADSVKF, SEQ ID NO: 41 compreendendo a seqüênciaGISYYGGNTYYADSVKF, e SEQ ID NO: 42 compreendendo a seqüênciaGISYYGGSTYYADSVKF, cada compreendendo uma região de H-CDR2 deconsenso;d) o grupo de SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56 cada compre-endendo uma região de H-CDR1; e,e) o grupo de SEQ ID NO: 43 tendo a seqüência de aminoácidoGFTFSSYGMT, SEQ ID NO: 44 tendo a seqüência de aminoácidoGFTFNSYGMT, SEQ ID NO: 45 tendo a seqüência de aminoácidoGFTFSNYGMT, SEQ ID NO: 46 tendo a seqüência de aminoácidoGFTFSSYWMT, SEQ ID NO: 47 tendo a seqüência de aminoácidoGFTFSSYAMTF, e SEQ ID NO: 48 tendo a seqüência de aminoácidoGFTFSSYGMS de cada compreendendo uma região de H-CDR1 de con-senso; ouf) SEQ ID NOs: 21-39 e 73-88; evariantes conservadoras ou convertidas em variantes humanas engenheira-das ("humaneered") das mesmas.

5. Região de ligação de antígeno isolada de acordo com a rei-vindicação 4, em que as seqüências de aminoácido selecionadas do grupode SEQ ID NOs: 21-39 cada uma compreende uma região de L-CDR3, asseqüências de aminoácido selecionadas do grupo de SEQ ID NOs: 21-39,- 73-80 cada uma compreende uma região de L-CDR1, as seqüências de a-minoácido selecionadas do grupo de SEQ ID NOs: 21-39, 81-88 cada umacompreende uma região de L-CDR2, as seqüências de aminoácido selecio-nadas do grupo de SEQ ID NOs: 21-39 cada uma compreende uma regiãovariável de uma cadeia leve.

6. Seqüência de nucleotídeo isolada selecionada do grupo deSEQ ID NOs: 97-103.

7. Seqüência de aminoácido isolada codificada por uma seqüên-cia de nucleotídeo de acordo com a reivindicação 6, e variantes conservado-ras ou convertidas em variantes humanas engenheiradas ("humaneered") daseqüência de aminoácido, em quea) cada uma de SEQ ID NOs: 97-100 codifica uma cadeia levede ligação de antígeno; eb) cada uma de SEQ ID NOs: 101-103 codifica uma cadeia pe-sada de ligação de antígeno.

8. Seqüência de nucleotídeo isolada de acordo com a reivindica-ção 6, em que a seqüência de nucleotídeo é também otimizada para expres-são e/ou para uso clínico.

9. Seqüência de nucleotídeo isolada selecionada do grupo deSEQ ID NOs: 104-110.

10. Seqüência de aminoácido isolada codificada por uma se-qüência de nucleotídeo de acordo com a reivindicação 9, e variantes conser-vadoras ou convertidas em variantes humanas engenheiradas ("humanee-red") da seqüência de aminoácido, em que:a) cada uma de SEQ ID NOs: 104-107 codifica uma cadeia levede ligação de antígeno, eb) cada uma de SEQ ID NOs: 108-110 codifica uma cadeia pe-sada de ligação de antígeno.

11. Seqüência de nucleotídeo isolada de acordo com a reivindi-cação 9, em que a seqüência de nucleotídeo é otimizada para expressãoe/ou para uso clínico.

12. Seqüência de aminoácido isolada selecionada do grupo de-111-117 e variantes conservadoras ou convertidas em variantes humanasengenheiradas ("humaneered") das mesmas, em quea) cada uma de SEQ ID NOs: 111-114 codifica uma cadeia levede ligação de antígeno, eb) cada uma de SEQ ID NOs: 115-117 codifica uma cadeia pe-sada de ligação de antígeno.

13. Seqüência de aminoácido isolada de acordo com a reivindi-cação 12, em que a seqüência de aminoácido é otimizada para expressãoe/ou para uso clínico.

14. Seqüência de nucleotídeo isolada selecionada do grupo deSEQ ID NOs: 120-121.

15. Seqüência de aminoácido isolada codificada por uma se-qüência de nucleotídeo de acordo com a reivindicação 14, e variantes con-servadoras ou convertidas em variantes humanas engenheiradas ("humane-ered") da seqüência de aminoácido, em quea) SEQ ID NO: 120 codifica uma região variável de ligação deantígeno de uma cadeia leve, eb) SEQ ID NO: 121 codifica uma região variável de ligação deantígeno de uma cadeia pesada.

16. Seqüência de nucleotídeo isolada de acordo com a reivindi-cação 14, em que a seqüência de nucleotídeo é otimizada para expressãoe/ou para uso clínico.

17. Região de ligação de antígeno isolada que compreende umaregião variável de uma cadeia leve codificada por uma seqüência de nucleo-tídeo selecionada do grupo de SEQ ID NO: 120, e uma região variável deuma cadeia pesada codificada por uma seqüência de nucleotídeo seleciona-da do grupo de SEQ ID NO: 121.

18. Seqüência de aminoácido isolada selecionada do grupo de- 118-119 e variantes conservadoras ou convertidas em variantes humanasengenheiradas ("humaneered") das mesmas.

19. Seqüência de aminoácido isolada de acordo com a reivindi-cação 18, em que a SEQ ID NO: 118 descreve uma região variável de Iiga-ção de antígeno de uma cadeia leve.

20. Seqüência de aminoácido isolada de acordo com a reivindi-cação 18, em que a SEQ ID NO: 119 descreve uma região variável de liga-ção de antígeno de uma cadeia pesada.

21. Seqüência de aminoácido isolada de acordo com a reivindi-cação 18, em que a seqüência de aminoácido é otimizada para expressãoe/ou para uso clínico.

22. Seqüência de aminoácido isolada tendo pelo menos 95 porcento de identidade com pelo menos uma região de CDR selecionada dasregiões descritas em SEQ ID NOs: 2-121.

23. Seqüência de aminoácido isolada tendo uma seqüência deconsenso das regiões de CDR como mostradas nas Tabelas 11A e 11B.

24. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1 que com-preende um andaime selecionado de uma IgM e uma IgG, em que a IgG éselecionada de uma IgGI, uma lgG2, e lgG3 ou uma lgG4.

25. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 24, em quea IgM ou a IgG são selecionadas de uma policlonal ou monoclonal.

26. Anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo, com-preendendo uma região de ligação de antígeno que é específica para umepítopo de DKK1, em que o anticorpo ou fragmento funcional liga a DKK1 ouDKK4, e impede ou melhora o desenvolvimento de uma doença associada aDKK1 ou uma doença associada a DKK4.

27. Região de ligação de antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 26.

28. Anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo compre-endendo uma região de ligação de antígeno que é específica para um epíto-po de DKK1 ou DKK4 alvo ou ambos, em que o epítopo compreende pelomenos seis ou mais resíduos de aminoácido de um domínio de CYS2 deDKK1 ou DKK4 alvo.

29. Anticorpo isolado ou fragmento funcional de acordo comquaisquer das reivindicações precedentes 1-28, que é selecionado de umaimunoglobulina inteira ou fragmento de Fab ou fragmento de anticorpo descFv desta, um anticorpo de cadeia pesada, e uma região de ligação de an-tígeno desta em um andaime de não-imunoglobulina.

30. Anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo de acor-do com a reivindicação 29 em que o epítopo é um epítopo conformacional.

31. Composição farmacêutica compreendendo pelo menos umanticorpo ou fragmento funcional de acordo com a reivindicação 29 e umveículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável para1 este.

32. Animal transgênico que carrega um gene que codifica um anti-corpo ou fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 29.

33. Método para tratar um distúrbio ou condição associada àpresença de DKK1 ou DKK4, compreendendo administrar a um sujeito emnecessidade do mesmo uma quantidade eficaz da composição farmacêuticade acordo com a reivindicação 31.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o distúr-bio ou condição é selecionada de lesões osteolíticas -especialmente lesõesosteolíticas associadas a um mieloma, especialmente um mieloma múltiplo,ou a cânceres de osso, mama, cólon, melanócitos, hepatócitos, epitélio, esô-fago, cérebro, pulmão, próstata ou pâncreas ou metástase dos mesmos;perda óssea associada à transplantação; ou é um osteossarcoma, câncer depróstata, carcinoma hepatocelular (HCC), mieloma incluindo mieloma múlti-plo, diabetes, obesidade, definhamento muscular, doença de Alzheimer, os-teoporose, osteopenia, reumatismo, colite e/ou perda de cabelo indesejada.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o métodotambém compreende administrar um segundo agente terapêutico.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o agentequimioterapêutico é Zometa.

37. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 35,em que o agente terapêutico adicional é selecionado do grupo que consisteem um agente anticâncer; um agente antimetabólico, um agente antidiabétí-co, um agente antiosteoporótico; um antibiótico; um agente anti-inflamatórió;um fator de crescimento; e uma citocina.

38. Anticorpo isolado compreendendo uma primeira seqüênciade aminoácido que é uma cadeia pesada selecionada do grupo que consisteem SEQ ID NOs: 2-20, e uma seqüência tendo pelo menos 95 por cento deidentidade de seqüência nas regiões de CDR com as regiões de CDR des-critas em SEQ ID NOs: 2-20; e uma segunda seqüência de aminoácido queé uma cadeia leve selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21-- 39, e uma seqüência tendo pelo menos 95 por cento de identidade de se-qüência nas regiões de CDR com as regiões de CDR descritas em SEQ IDNOs: 21-39.

39. Imunoconjugado compreendendo um primeiro componenteque é um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com quaisquer dasreivindicações precedentes.

40. Kit que compreende um anticorpo ou fragmento do mesmode acordo com quaisquer das reivindicações precedentes.

41. Kit de acordo com a reivindicação 40, portanto também com-preendendo um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

42. Kit de acordo com a reivindicação 40, em que o anticorpoestá presente em uma dose de unidade.

43. Kit de acordo com a reivindicação 40, também compreen-dendo instruções para uso na administração a um sujeito.

44. Composição compreendendo um anticorpo de anti-DKK1/4de neutralização.

45. Anticorpo da reivindicação 0, em que o anticorpo liga a DKK1com um Kon de menos que 100 nM, 50 nM, 10nM, 1,0 nM, 500 pM ou 100pM; e tem uma taxa fora para DKK1 de menos que 10"2 por seg, 10"3 porseg, 10"4 por seg, ou 10'5 por seg.

46. Anticorpo da reivindicação 0, em que o anticorpo tem afini-dade mais alta de 102 - 106 para DKK1 ou DKK4 comparado a DKK2 ou DKK3.

47. Anticorpo da reivindicação 0, em que o anticorpo competecom um antÍ-DKK1/4 de neutralização para ligar a DKK1 ou DKK4.

48. Método de tratar doenças com uma composição compreen-dendo pelo menos uma seqüência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 118 euma seqüência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 119, ou alterações conser-vadoras ou convertidas em variantes humanas engenheiradas ("humanee-red") das mesmas; em que a composição é um anticorpo de anti-DKK1/DKK4 de neutralização.

49. Método de impedir ou tratar doenças proliferativas ou doen-ças, tais como um câncer, em um mamífero, particularmente um humano,com uma combinação de agentes farmacêuticos que compreende(a) uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização; e(b) um ou mais agentes farmaceuticamente ativos.A invenção também refere-se às composições farmacêuticascompreendendo:(a) uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização;(b) um agente farmaceuticamente ativo; e(c) um veículo farmaceuticamente aceitável.A presente invenção também refere-se a um pacote ou produtocomercial compreendendo:(a) uma formulação farmacêutica de uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização; e(b) uma formulação farmacêutica de um agente farmaceutica-mente ativo para uso simultâneo, concorrente, separado ou seqüencial.

50. Método da reivindicação 49, em que o agente farmaceutica-mente ativo é significado especialmente qualquer agente farmaceuticamenteativo diferente de uma composição de anti-DKK1/4 de neutralização ou umderivado da mesma, cujo agente é selecionado de:i. um inibidor de aromatase;ii. um antiestrogênio, um antiandrógeno ou um agonista degonadorrelina;iii. um inibidor de topoisomerase I ou um inibidor de topoi-somerase II;iv. um agente ativo de microtúbulo, um agente de alquila-ção, um antimetabólito antineoplástico ou um composto de platina;v. um composto de alvejamento/diminuição de uma ativi-dade de proteína ou Iipidio cinase ou uma atividade de proteína ou lipídiofosfatase, um composto antiangiogênico também ou um composto que induzprocessos de diferenciação de célula;vi. anticorpos monoclonais;vii. um inibidor de ciclooxigenase, um bisfosfonato, um ini-bidor de heparanase, um modificador de resposta biológica;viii. um inibidor de isoformas oncogênicas de Ras;ix. um inibidor de telomerase;x. um inibidor de protease, um inibidor de metaloproteinasede matriz, um inibidor de metionina aminopeptidase, ou um inibidor de prote-assoma;xi. agentes usados no tratamento de malignidades hemato-lógicas ou compostos que alvejam, diminuem ou inibem a atividade de Flt-3;xii. um inibidor de HSP90;xiii. anticorpos antiproliferativos;xiv. um inibidor de histona desacetilase (HDAC);xv. um composto que alveja, diminui ou inibe a ativida-de/função de serina/treonina mTOR cinase;xvi. antagonista de receptor de somatostatina;xvii. um composto antileucêmico;xviii. método de dano de células tumorais;xix. um aglutinante de EDG;xx. um inibidor de ribonucleotídeo reductase;xxi. um inibidor de S-adenosilametionina descarboxilase;xxii. um anticorpo monoclonal de VEGF ou VEGFR;xxiii. terapia fotodinâmica;xxiv. um esteróide angiostático;xxv. um implante contendo corticosteróides;xxvi. antagonista de receptor de AT1; exxvii. um inibidor de ACE.

51. Anticorpo que liga a DKK-1 com uma afinidade (K0) de 10ou menos e compete com quaisquer dos anticorpos da reivindicação 1.

52. Anticorpo de acordo com a reivindicação 51 que não detec-tavelmente liga a DKK2 ou DKK3.

53. Anticorpo da reivindicação 52, em que o anticorpo liga aDKK1 ou DKK4 com uma (KD) de 10"3 ou mais alta.