ME00010B

ME00010B - Kompozicije i postupci za upotrebu antitijela dickkopf-1 i-ili -4

Info

Publication number: ME00010B
Application number: MEP-2008-13A
Authority: ME
Inventors: Janine Shulok; Feng Cong; Mark Fishman; Seth Ettenberg; Michael Bardroff; Mariel Donzeau; Stefanie Urlinger
Original assignee: Novartis Ag; Novartis Pharma Gmbh
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2010-06-10
Also published as: AU2007207787A1; US20120023600A1; EP1976594B1; SMP200800042B; UA101944C2; TNSN08297A1; JP5552233B2; TWI432450B; KR20080085908A; CU23871B1; MA30158B1; EP1976594A2; US9296813B2; SV2008002980A; AU2007207787B2; EA015538B1; WO2007084344A2; EA200801679A1; MEP1308A; IL192631A0

Abstract

Dobijena su antitijela i fragmenti koji se vezuju za ciljni proteinski Dickkopf (DKK1), kao i postupci za upotrebu kitova, za lečenje ciljne ćelije, ćelije koje je povezana sa stanjima u kojima dolazi osteolize.

Description

OBLAST PRIMENE

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja i postupke za primenu antitijela Dickkopf-1 ("DKK1"), Dickkopf-4 ("DKK4"), ili oba, u lečenju abnormalnosti gustine kostiju, metabolizma, zatim dijabeta, malignih tumora i sličnih oboljenja vezanih za DKK.

ISTORIJA PRONALASKA

U kontroli embrionalnog razvića i procesa kancerogeneze učestvuju Wnt signalni putevi. Ekstracelularni Wnt proteini su odgovorni rast i diferencijaciju različitih ćelijskih tipova, uključujući naročito rast, diferencijaciju i regulaciju osteoblasta, osteoklasta i adipociota.

Mnogo je malignih tumora povezano sa koštanim tkivom koji mogu da dovedu do pojave osteoklastnih lezija, kao što su lezije kod karcinoma prostate, ili osteolitičkih lezija, kao što su one koje poostoje kod karcinoma pluća, karcinoma dojke i multiplog mileloma (npr., Tian i sar.,2003 New England J. Med. 349:2483-2494).

Članovi Wnt genske familije kodiraju sekretovane glikoproteine koji su neophodni u različitim procesima razvića (Fedi i sar., 1999 J. Bio. Chem. 274:19465-19472). Protein, član Wnt familije započinje signalni put koji je značajan za rast i diferencijaciju osteoblasta, koji su odgovorni za izgradnju kostiju. Uporedo sa procesom izgradnje kostiju dešava se proces razgradnje-resorpcije, koji je normalan i za koji su odgovorne ćelije poznate kao osteoklasti. Za razliku od njih, receptor aktivator za nuklearni faktor –kappa B ligand (RANKL) je konačni medijator resorpcije kostiju preko osteoklasta, i kao takav ima glavnu ulogu u patogenezi osteoporoze u menopauzi, kao i kod gubitka koštane mase kod reumatoidnog artritisa, metastatskog karcinoma, multiplog mijeloma, terapije sa inhibitorima aromataze i terapije lišavanjem androgena. (videti, npr., Lewiecki (2006) Expert opin Biol Ther. 6: 1041-50). Osteoprotegrin (OPG), koji ispoljavaju osteoklasti, inhibira RANKL, i tako smanjuje aktivnost i formiranje osteoklasta. Ravnoteža izmedju anaboličkog procesa izgradnje kostiju i analitičkog procesa razgradnje, reguliše normalnu gustinu kostiju, dok povećanje jedne strane dovodi do povećane gustine kostiju, a druge do povećanog gubitka koštane mase.

Wnt se vezuje i deluje preko drugih membranskih proteina, a signalizcija preko Wnt može da doprinese procesu kancerogeneze. Pored toga, genetske alteracije mogu da deluju na ćelijski proteinski kompleks, poznat kao adenomatozna polyposis coli, koji sadrži protein β-katenin, i prisustvo ovih kompleksa je primećeno u ćelijama pacijenata obolellih od karcinoma debelog creva, melanoma i hepatocelularnog karcinoma, što pokazuje da su aberacije u Wnt signalnim putevima od značaja za razviće ovih i moguće drugih humanih malignih tumora (Fedi i sar.,1999 J. Bio. Chem. 274:19465-19472).

Moguće je navesti najmanje dve familije proteina koje inhibiraju signalizaciju preko Wnt, kao što su sekretovani „proteini srodni frizzled proteinu“ (frizzled-related proteini) i Dickkopf (DKK) familija. DKK familija po sadašnjim saznanjima obuhvata četiri člana i to su DKK1 (human DNA accno. NMJ)12242; PRT accno.094907), DKK2 (human accno. NM_014421; PRT accno. NP_055236), DKK3 (human accno. NM_015881; PRT accno. AAQ88744), i DKK4 (human accno.NM_014420; PRT accno. NP_055235).

Dickkopf-1 (DKK1) je sekretovani inhiibitor Wnt/β-katenin signalnog puta.Videti, npr., američku prijavu patenta 2005-0079173 od Niehrs-a; američku prijavu patenta 2004-0234515 od McCarthy-a. DKK1 poseduje sposobnost da inhibira udvostručavanje ose idukovano preko Wnt, a genska analiza ukazuje na to da DKK1 deluje uzvodno kako bi inhibirao provodjenje signala preko Wnt. DKK1 ima takodje važnu ulogu u razviću skeletnih mišića, na šta ukazuje delovanje na gubitak koštanih struktura kod pilića i mišjih embriona posle izlaganja povećanom nivou DKK1 (Tian i sar., 2003 New England J. Med. 349:24836-2494). Povećani nivo DKK1 u serumu se povezuje sa karcinomom prostate, a povećani nivo DKK1 i RANKL u plazmi kostne srži i perifernoj krvi kod pacijenata sa multipllim mijelomom se povezuju sa prisustvom fokalnih koštanih lezija. Videti , npr., Tian 2003, OMIM accno. 605189. DKK1 učestvuje takodje u adipogenezi, hondrogenezi, proliferaciji epitelnih ćelija gastrointestinalnog trakta, gubitku koštane mase koja je povezana različitim oblicima reumatizma i inicijaciji formiranja plakode folikula dlake. OMIM accno. 605189.

Dickkopf-4 (DKK4) je manje detaljno okarakterisan, ali i za njega se može reći da je sekretovani inhibitor Wnt signalnog puta. Pokazano je da se DKK4 deponuje u plakovima kod pacijenata sa Alzheimer-ovom bolešću i da se ispoljava u mišićima. Nije poznata uloga Wnt u razviću mišića, zbog toga je ovde postulirano da DKK4 ima inhibitorno delovanje u procesu razvića mišića. Postoji potreba za supstancama i postupcima za lečenje malignih tumora i abnormalnosti gustine kostiju, uključujući i takve agense koji interferiraju ili neutrališu DKK1 i/ili DKK4 posredovani antagonizam Wnt signalnog puta.

SKRAĆENI OPIS PRONALASKA

Jedno izvodjenje ovog pronalaska odnosi se na antitijelo ili na njegov antigen-vezujući deo koji se selektivno vezuje i na taj način neutrališe DKK1 i/ili DKK4 polipeptid ili njegov jedan fragment.U poželjnom izvodjenju, antitijelo je neutrališuće antitijelo prema DKK1/4. U drugim izvodjenjima ovog pronalaska antigen-vezujući deo DKK1/4 neutrališućeg antitijela ne vezuje se za DKK2 ili DKK3. U jednom izvodjenju antitijelo ili njegov antigen-vezujući deo je rasporedjen unutar imunoglobilinske strukturne matrice, kao što je potporna strukturna osnova koja može biti, npr., humana, humanizovana, "humaneered", ajkulina ili Camelidae matrica, i/ili može biti dodatno rekombinantna, himerizovana, ili CDR kalemljeno antitijelo. Na primer, tehnologija koja je dizajnirana da minimizuje imunski odgovor na humano anti-mišje antitijelo (humaneering tehnologija koju je razivila Kalobios laboratorija; to je postupak za konvertovanje ne-humanih antitijela u inženjerisana humana antitijela. Humaneered antitijela su povećanog afiniteta u odnosu na mišja od kojih su nastala, a imaju preko 90% homologije sa humanim antitijelima; ili tehnologija humanizacije PDL-a) su razmatrane u okviru pronalaska.Osim toga, antigen-vezujući delovi koji su specifični za DKK1 ili DKK4 mogu takodje da budu unutar ponovaka koji potiču od adnektina, fibrinogena, ankirina, itd., različitih tipova matrica.

U jednom oderdjenom izvodjenju, DKK1 antitijelo je okarakterisano posedovanjem antigen-vezujućeg regiona koji je specifičan za ciljni protein DKK1, i antitijelo ili njegov funkcionalni fragment se vezuje za DKK1 ili jedan njegov deo. U srodnom izvodjenju, DKK4 antitijelo je okarakterisano posedovanjem antigen vezujućeg regiona koji je specifičan za ciljni protein DKK4, i antitijelo ili njegov funkcionalni fragment se vezuje za DKK4 ili jedan njegov deo. U drugom srodnom izvodjenju, Dkk4 antitijelo je okarakterisano posedovanjem antigen-vezujućeg regiona koji je specifičan za ciljni protein DKK4, i antitijelo ili njegov funkcionalni fragment se vezuje za DKK4 ili jedan njegov deo. U poželjnom izvodjenju, antitijelo ili antigen-vezujući deo antitijela, se vezuje za DKK1 i DKK4 polipeptide, ali ne i za DKK2 i DKK3 polipeptide. U drugom izvodjenju antitijelo ili jedan njegov deo je monoklonski. U drugom izvodjenju antigen-vezujući deo antitijela je pliklonski. U više razlličitih izvodjenja antitijelo ili njegov antigen-vezujući deo se vezuje za peptid koji se sastoji od 30 aminokiselina iz DKK1 ili iz DKK4 polipeptida.

U sličnom izvodjenju, vezivanje za DKK1 ili DKK4 je odredjeno najmanje jednom od sledećih metoda: test inhibicije DKK1 ili DKK4 antagonizma transkripcije prekoWnt signalnog puta; test odredjivanja afiniteta površinskom plasmon rezonancom; ELISA test (enzim-zavisni test imunosorpcije; enzyme-linked immunosorbent assay); test merenja vezivanja pomoću elektrohemiluminescence; FMAT, SET, SPR, ALP, Topflash, koncentracija biomarkera u serumu kao što su osteokalcin (OCN), prokolagen tipa i azotni propeptid (procollagen type I nitrogenus propeptide-PINP) i osteoprotegrin (OPG) i vezivanje za membranske receptore kao što su Frizzled (Fz), LRP (LRP5/6) ili Kremen (Krm). U nekim odredjenim izvodjenjima, DKK1 antitijelo ili antigen-vezujući deo, poseduje najmanje jednu od sledećih osobina: selektivnost za DKK1 koja je najmanje 103 puta, 104 puta ili 105 puta veća nego za humani DKK2 ili DKK3; vezuje se za DKK1 ili za DKK4 sa KOn manjom od 100nM, 50 nM, 10 nM, 1,0 nM, 500 pM, 100 pM, 50 pM ili 10 pM; i ima brzinu disocijacije za DKK1 manju od 10''2 u sekundi, 10''3 u sekundi, 10''4 u sekundi ili 10''5 u sekundi. U sličnom izvodjenju, antitijelo iz pronalaska kompetira sa DKK1 i/ili DKK4 u vezivanju za LRP5/6. U sličnom izvodjenju, antitijelo iz pronalaska kompetira sa DKK1 i/ili DKK4 u vezivanju za Krm.

U jednom drugom izvodjenju, u pronalasku su opisani izolovani antigen-vezujući regioni svih navedenih antitijela ili funkcionalnih fragmenata ovih antitijela, kao i njihove aminikiselinske sekvence. Dakle u odredjenim izvodjenjima, pronalazak navodi izolovane aminokiselinske sekvence koje su izabrane iz grupe SEQ ID NOs: 2-20 i SEQ ID Nos: 40-72 i konzervirane ili humaneered (humaneering tehmologijom generisana antitijela) varijante ovih sekvenci.

Dalje, u odredjenim drugim izvodjenjima, u pronalasku su opisane aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 2-20, 65-72, i konzervisane ili humaneered varijante ovih sekvenci, koje predstavljaju izolovane antigen-vezujuće regione takve da je svaki H-CDR3.

U sličnom izvodjenju, izolovani antigen-vezujući region je H-CDR2 region koji ima jednu od sledećih aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 2-20, 57-64, i konzervisane ili humaneered varijante ovih sekvenci. U jednom drugom sličnom izvodjenju, izolovani antigen-vezujući region je konsenzus H-CDR2 region čija sekvenca potiče iz grupe sekvenci SEQ ID NO: 40 koja ima aminokiselinsku sekvencu GISGSGSYTYYADSVKF, SEQ ID NO:41 koja ima aminokiselinsku sekvencu GISYYGGNTYYADSVKF, i SEQ ID NO: 42 koja ima ima aminokiselinsku sekvencu GISYYGGSTYYADSVKF, i konzervisane ili humaneered varijante aminokiselinskih ostataka ovih sekvenci.

U odredjenim izvodjenjima, opisane su nove sekvence i to su SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56, i njihove konzervisane ili humaneered varijante, koje grade antigen-vezujući region koji je H-CDRI region. U sličnom izvodjenju, izolovani antigen-vezujući region je konsenzus H-CDRI region koji ima aminokiselinsku sekvencu (koristi se jednoslovna oznaka za aminokiseline) koja je jedna od sledećih GFTFSSYGMT (SEQ ID NO: 43), GFTFNSYGMT (SEQ ID NO: 44), GFTFSNYGMT (SEQ ID NO: 45), GFTFSSYWMT (SEQ ID NO:46), GFTFSSYAMT (SEQ ID NO: 47), GFTFSSYGMS (SEQ ID NO: 48) i konzervisane ili humaneered varijante svake od ovih sekvenci.

U jednom drugom izvodjenju, u pronalasku su opisane aminokiselinske sekvence koje predstavljaju izolovane antigen-vezujuće regione koji imaju L-CDR3 region, kao što su aminokiselinske sekvence izabrane iz SEQ ID NOs: 21-39, 89-96, i konzervisane ili humaneered varijante ovih sekvenci. U još jednom sličnom izvodjenju, izolovani antigen-vezujući regioni imaju L-CDRI region, i imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz SEQ ID NOs: 21-39, 73-80, i konzervisane ili humaneered varijante ovih sekvenci. U drugom sličnom izvodjenju, izolovani antigen-vezujući regioni imaju L-CDR2 region, i imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz SEQ ID NOs: 21-39, 81-88, i konzervisane ili humaneered varijante ovih sekvenci.

U odredjenim izvodjenjima, izolovani antigen-vezujući region je variabilni laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NOs: 21-39, i konzervisane ili humaneered varijante ovih sekvenci.

U drugom izvodjenju, u pronalsku je opisana nukleotidna sekvenca izabrana iz grupe SEQ ID NOs: 97-103. U srodnom izvodjenju, svaka od ovih nukleotidnih sekvenci kodira jednu aminokiselinsku sekvencu, koje zajedno sa konzervisanim ili humaneered varijantama ovih kodiranih aminokiselinskih sekvenci takodje pripadaju oblasti ovog pronalaska. U drugom srodnom izvodjenju, nukleotidna sekvenca svake od SEQ ID NOs: 97-100 kodira antigen-vezujući laki lanac.Dalje, u drugom srodnom izvodjenju, nukleotidna sekvenca svake od SEQ ID NOs: 101-103 kodira antigen-vezujući teški lanac. U još jednom srodnom izvodjenju, svaka od ovih nukleotidnih sekvenci je dodatno optimizovana da bi bila eksprimirana u ćeliji. U poželjne ćelije se ubrajaju, pored ostalih, npr., ćelije kineskog hrčka (Chinese hamster cells- npr. CHO), bakulovirus, kvasci, bakterije, mijelomske ćelije, i/ili H. sapiens.

Poželjno je da se sekvence optimizuju za ekspresiju i produkciju, kao i za kliničku primenu. Pod karakteristikama za optimizaciju za klininičku primenu se podrazumevaju, pored ostalog, npr., poluživot, farmakokinetika (PK), antigenost, efektorska funkcija, FcRn klirens, i odgovor pacijenta uključujući aktivnosti kao što su ćelijska citotoksičnost zavisna od antitijela (ADCC) ili citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).

U daljem izvodjenju, pronalazak opisuje izolovani antigen-vezujući region koji obuhvata teški lanac, koji je kodiran nukleotidnom sekvencom iz grupe SEQ ID NOs: 101-103. U sličnom izvodjenju, pronalazak navodi izololovani antigen-vezujući region koji obuhvata laki lanac koji je kodiran nukleotidnom sekvencom iz grupe SEQ ID NOs: 97-100. U još jednom srodnom izvodjenju, pronalazak navodi izolovani antigen-vezujući region koji obuhvata laki lanac koji je kodiran nukleotidnom sekvencom iz grupe SEQ ID NOs: 97-100, i teški lanac koji jekodiran nukleotidnom sekvencom iz grupe SEQ ID NOs: 101-103.

U odredjenim izvodjenjima, u pronalasku je opisana nukleotidna sekvenca koja je odabrana iz grupe SEQ ID NOs: 104-110. U srodnom izvodjenju, svaka od ovih nukleotidnih sekvenci kodira jednu aminokiselinsku sekvencu, koje zajedno sa konzervisanim ili humaneered varijantama ovih kodiranih aminokiselinskih sekvenci takodje pripadaju oblasti ovog pronalaska. U jednom drugom srodnom izvodjenju, nukleotidna sekvenca svake od SEQ ID NOs: 104-107 kodira antigen-vezujući laki lanac. Dalje, u jednom drugom srodnom izvodjenju, nukleotidna sekvenca svake od SEQ ID NOs: 108-110 kodira antigen-vezujući teški lanac. U drugom sličnom izvodjenju, svaka od ovih nuklotidnih sekvenci je opitimizovana za ekspresiju i/ili kliničku primenu.

Dalje, u drugom izvodjenju, prolazak navodi jedan izolovan antigen-vezujući region koji obuhvata teški lanac koji je kodiran nukleotidnom sekvencom iz grupe SEQ ID NOs: 108-110. U drugom sličnom sličnom izvodjenju, u pronalasku je opisan jedan izolovan antigen-vezujući region koji obuhvata laki lanac koji je kodiran nukleotidnom sekvencom iz grupe SEQ ID NOs: 104-107. U jednom drugom srodnom izvodjenju, u pronalasku je opisan jedan izolovan antigen-vezujući region koji obuhvata laki lanac koji je kodiran nukleotidnom sekvencom iz grupe SEQ ID NOs: 104-107, kao i teški lanac koji je kodiran nukleotidnom sekvencom iz grupe SEQ ID NOs108-110.

U drugim izvodjenjima, pronalazak navodi aminokiselinsku sekvencu iz grupe SEQ ID NOs: 111-117, pri tom podrazumeva i konzervisane varijante ovih sekvenci. U sličnom izvodjenju, svaka od SEQ ID NOs: 111-114 predstavlja jeda antigen-vezujući laki lanac. U drugom izvodjenju, svaka od SEQ ID NOs: 115-117 predstavlja jedan antigen vezujući teški lanac. U jošjednom srodnom izvodjenju, aminokiselinska sekvenca je opitmizovana za ekspresiju i/ili kliničku primenu.

U sledećem izvodjenju, u pronalasku je opisan izolovani antigen-vezujući region koji obuhvata teški lanac koji je predstavljen jednom od aminokiselinskih sekvenci iz grupe SEQ ID NOs: 115-117, i odnosi se i na konzervisane varijante ovih sekvenci. U sličnom izvodjenju, pronalazak navodi jedan izolovani antigen-vezujući region koji obuhvata laki lanac koji je predstavljen jednom od aminokiselinskih sekvenci iz grupe SEQ ID NOs: 111-114, i odnosi se takodje na konzervisane varijante ovih sekvenci. U jednom drugom srodnom izvodjenu, u pronalasku je opisan izolovani antigen-vezujući region koji obuhvata teški lanac koji je predstavljen jednom od aminokiselinskih sekvenci iz grupe SEQ ID NOs: 115-117, i odnosi se takodje na konzervisane varijante ovih sekvenci, i laki lanac koji je predstavljen jednom od aminokiselinskih sekvenci iz grupe SEQ ID NOs: 111-114, i odnosi se takodje na konzervisane varijante ovih sekvenci.

U drugom izvodjenju, u pronalasku je opisana nukleotidna sekvenca iz grupe SEQ ID NOs: 120-121, i/ili izolovani antigen-vezujući region sa varijabilnim regionom na lakom lancu ili na teškom lancu koji je kodiran pomenutim nukleotidnim sekvencama. U drugom sličnom izvodjenju, svaka od ovih nukleotidnih sekvenci kodira po jednu aminokiselinsku sekvencu, koje zajedno sa konzervisanim ili humaneered varijantama ovih kodiranih aminokiselinskih sekvenci takodje pripadaju oblasti ovog pronalaska. U jednom drugom srodnom izvodjenju, nukleotidna sekvenca sa oznakom SEQ ID NO: 120 kodira antigen-vezujući laki lanac. U drugom srodnom izvodjenju, nukleotidna sekvenca sa oznakom SEQ ID NO: 121 kodira antigen-vezujući teški lanac. U jednom drugom sličnom izvodjenju, svaka odovih nukleotidnih sekvenci je dalje optimizovana da bi bila eksprimirana u ćelijama i/ili za kliničku primenu.

U odredjenim izvodjenjima, u pronalasku je opisana po jedna aminokiselinska sekvenca iz grupe SEQ ID NOs: 118-119, kao i konzervisane ili humaneered varijante ovih sekvenci. U srodnom izvodjenju, SEQ ID NO: 118 predstavlja antigen-vezujući varijabilni region lakog lanca. U jednom drugom sličnom izvodjenju, SEQ ID NO:119 predstavlja antigen-vezujući varijabilni region teškog lanca. Zatim u jednom drugom srodnom izvodjenju, aminokiselinska sekvenca je optimizovana da bi bila eksprimirana i/ili za kliničku primenu.

U drugim izvodjenjima, pronalazak navodi amonokiselinske sekvence koje imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % homologije sa CDR regionima koji su opisani u SEQ ID NOs: 2-39. U srodnom izvodjenju, pronalazak navodi, aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % homologije sa sekvencama koje pripadaju grupi SEQ ID NOs: 111-120. U jednom drugom srodnom izvodjenju, pronalazak navodi nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % homologije sa sekvencama koje pripadaju grupi SEQ ID NOs: 97-110 i sa 120-121. U jednom odredjenom izvodjenju, svako od gore navedenih izolovanih antitijela je IgG. U srodnom izvodjenju, svako od gore navedenih izolovanih antitijela je IgG1, odnosno IgG2, odnosno IgG2, odnosno IgG3, odnosno IgG4. U jednom drugom izvodjenju antitijelo je IgE, odnosno IgM, odnosno IgD, odnosno IgA. U srodnom izvodjenju, antitijelo iz pronalaska je odabrano kao kompozicija monoklonskog antitijela ili poliklonskog antitijela. U daljim izvodjenjima, antitijelo je himerno, humanizovano, humaneered, rekombinantno itd. U jednom drugom izvodjenju, pronalazak navodi izolovano humano ili humanizovano antitijelo ili pak njegov funkcionalni fragment, koji poseduje antigen-vezujući region koji je specifičan prema epitopu DKK1, i antitijelo ili funkcionalni fragment koji se vezuje za DKK1 ili za DKK4, ili pak blokira vezivanje DKK1 ili DKK4 za membranski receptor (npr., receptori kao što su LRP5/6, Kremen, Frizzled). U odredjenim izvodjenjima antitijelo ili fragment antitijela, sprečava, leči, ili ublažava razvoj i napredovanje osteolitičkih lezija. U drugim izvodjenjima, anti-DKK kompozicija iz pronalaska sprečava, leči, ili ublažava razvoj i napredovanje karcinoma ili drugih bolesti koje su vezane za DKK1 ili DKK4.

U srodnom izvodjenju, u pronalasku je opisano izolovano humano i li humanizovano antitijelo ili funkcionalni fragment antitijela, koje poseduje antigen-vezujući region koji je specifičan prema epitopu ciljnih molekula DKK1 ili DKK4, i epitop sadrži šest ili više aminokiselinskih ostataka iz polipeptidnog fragmenta koji se sastoji od CYSI-linker-CYS2 domena iz DKK1i/ili DKK4. U srodnom izvodjenju, epitop je konformacioni epitop. U poželjnom izvodjenju, epitom je smešten unutar CYS2 domena. U jednom posebnom izvodjenju, epitop se sastojiod modifikovanih aminokiselinskih ostataka. U srodnom izvodjenju, epitop sadrži najmanje jedan glikozilovan aminokiselinskiostatak.

U funkcionalne fragmente se ubrajaju Fv i Fab fragmenti (uključujući i jednolančane verzije kao što je scFv), kao i drugi antigen-vezujući regioni antitijela, uključujući i one koji su vezani za ne-imunoglobulinsku strukturnu osnovu i antitijela sa teškim lancem kao što je Ig kamile i antitijela ajkule, kao i nanotela. U srodnom izvodjenju, izolovano antitijelo kako je goreopisano je IgG. U drugom sličnom izvodjenju, antitijelo kako je gore opisano je IgG1, odnosno IgG2, odnosno IgG3,odnosno IgG4.U drugom izvodjenju, antitijelo je IgE, odnosno IgM ili IgA. U srodnom izvodjenju, kompozicija iz pronalaska je poliklonsko antitijelo.

U jednom drugom izvodjenju, u pronalasku je opisana farmaceutska kompozicija koja pouzdano sadrži najmanje jedno od gore opisanih antitijela ili funkcionalni fragment antitijela ili konzervisane varijante, i zajedno sa supstancom koja je farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.

U jednom drugom izvodjenju, pronalazak podrazumeva transgeničnu životinju koja nosi gen koji kodira ma koje od navedenih antitijela ili funkcionalni fragment antitijela.

U odredjenim izvodjenjima, u pronalasku je opisan postipak lečenja poremećaja ili bolesti koja je vezana za ispoljavanje DKK1 ili DKK4. Kao što se koristi u ovom tekstu, pod "DKK1-zavisnim bolestima" ili "DKK4-zavisnim bolestima" se podrazumevaju, izmedju ostalog, osteolitičke lezije-naročito osteolitičke lezije kod mijeloma, a pogotovo kod multiplog mijeloma, ili karcinom kostiju, dojke, debelog creva, melanocita, hepatocita, epitela, jednjaka, mozga pluća, prostate ili pankreasa, kao i posledične metastatske bolesti; gubitak koštane mase, vezano za transplantaciju. Još neke bolesti koje se podrazumevaju, pored ostalog su, npr., osteosarkom, karcinom prostate, hepatocelularni karcinom (HCC), mijelom, uključujući multipli mijelom, dijabet, gojaznost, gubitak mišićne mase, Alchajmerovu bolest, osteoporozu, osteopeniju, reumatizam, kolitis i/ili neželjeni gubitak kose. Postupak podrazumeva primenu kod pojedinca kod kog je potrebno davanje efektivne količine ma koje od gore pomenutih farmaceutskih kompozicija.

U srodnom izvodjenju, poremećaj ili stanje koje treba da se leči je abnormalnost u gustini kostiju. U jednom drugom sličnom izvodjenju, pod abnormalnošću u gustini kostiju koju treba lečiti podrazumeva se prisustvo osteolitičke lezije kod pacijenta. U drugom izvodjenju, bolest ili stanje koje treba lečiti je osteoporoza koja se javlja u vidu osteolitičkih lezija kod karcinoma. U sličnom izvodjenju, karcinom koji treba lečiti je mijelom, kao što jemultipli mijelom, ili karcinom kostiju, dojke, debelog creva, melanocita, hepatocita, epitela, jednjaka, mozga, pluća, prostate ili pankreasa ili metastatske bolesti koje prate ova oboljenja. U drugim izvodjenjima, osteoporoza se odnosi na osteoporozu ili osteopeniju ili osteosarkom.

U odredjenim izvodjenjima, svi pomenuti postupci dalje podrazumevaju primenu hemoterapije. U srodnom izvodjenju, sredstvo za hemoterapiju je citostatik, anti-tumorsko sredstvo. U drugom srodnom izvodjenju, sredstvo za hemoterapiju je sredstvo protiv osteoporoze.

U jednom drugom izvodjenju, u pronalasku je opisan postipak za tretiranje ciljnih ćelija, postupak koji podrazumeva blokiranje interakcije izmedju DKK1 ili DKK4 i ćelija sa ma kojim od gore opisanih antitijela ili funkcionalnim fragmentom antitijela. Uopšteno, ciljna ćelija na svojoj površini nosi receptor koji vezuje DKK1 ili DKK4. U jednom izvodjenju ciljna ćelija je osteoblast, prema kom će tretman sa kompozicijom iz pronalaska koja sadrži neutrališuća anti-DKK1/4 antitijela, povećati proliferaciju i stimulisati izgradnju kostiju. U jednom izvodjenju, ciljna ćelija je mišićna ćelija, gde će tretiranje sprečavati gubitak mišićne mase.

U srodnom izvodjenju, postupak dalje obuhvata terapiju pacijenata sa ciljnom ćelijom, sredstvima za hemoterapiju ili zračenje. U srodnom izvodjenju, nakon primene ili kontakta, svaki postupak gore naveden, dalje podrazumeva primetno poboljšanje ili usporeno širenje osteolitičkih lezija.

U drugom pak izvodjenju, pronalazak navodi postupak za identifikaciju DKK1 ili DKK4 u serumu. Ovaj postupak obuhvata detekciju DKK1 ili DKK4 uz pomoć/sa nekim od gore opisanih antitijela ili fragmentom antitijela koji ima detektabilnu probu. Proba je radioaktivna, fluorescentna, ima magnetne ili paramagnetne osobine, ili je hemiluminiscentna.

U drugom izvodjenju, ma koje od gore opisanih humanih ili humanizovanih antitijela ili fragmenata antitijela su sintetička.

U drugom izvodjenju, u pronalasku je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži ma koje od gore navedenih antitijela ili funkcionalne fragmente ovih antitijela i još jedno dodatno terapeutsko sredstvo. Dodatno terapeutsko sredstvo može da bude ma koje iz grupe koja obuhvata anti-tumorska sredstva; sredstva koja zaustavljaju osteoporozu; antibiotike; antimetabolička sredstva; antidijabetska sredstva; anti-inflamatorna srdstva; anti-angiogenetska sredstva; faktore rasta; i citokine.

Pronalazak dalje opisuje postupak za prevenciju ili lečenje proliferativnih bolesti ili bolesti kao što su maligni tumori, kod sisara, a naročito kod čoveka, u kombinaciji sa farmaceutskim sredstvima koja sadrže:

(a) DKK1/4 neutrališuće sredstvo iz pronalaska; i

(b) jedno ili više farmaceutski aktivnih sredstava; gde je najmanje jedno farmaceutski aktivno sredstvo citostatik-antitumorsko sredstvo. Pronalazak se dalje bavi farmaceutskim kompozicijama koje se sastoje od:

(a) DKK1/4 neutrališućeg antitijela;

(b) farmaceutski aktivnog sredstva; i

(c) farmaceutski prihvatljivog nosača; gde je najmanje jedno farmaceutski aktivno sredstvo anti-tumorsko terapijskosredstvo.

Ovaj pronalazak dalje opisuje komercijalno dostupno pakovanje ili proizvod koji se sastoji od: (a) farmaceutske formulacije DKK1/4 neutrališućeg antitijela; (b) farmaceutske formulacije farmaceutski aktivnog sredstva za istovremenu, kasniju, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu; gde je najmanje jedno farmaceutski aktivno sredstvo anti-tumorsko sredstvo tj., citostatik.

U odredjenom izvodjenju, pronalazak navodi antitijelo sa prvom aminokiselinskom sekvencom koja pripada teškom lancu, iz grupe SEQ ID NOs: 2-20, i da sekvenca ima najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % homologije u CDR regionu sa CDR regionima iz grupe SEQ ID NOs: 2-20; i drugu aminokiselinsku sekvencu koja pripada lakomlancu, iz grupe SEQ ID NOs: 21-39, i da sekvenca ima najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 procenata homologije u CDR regionu sa CDR regionima koji su prikazani u grupi SEQ ID NOs: 21-39.

U jednom drugom izvodjenju pak, u pronalasku se opisuje imunokonjugat napravljen od prve komponente koja je antitijelo ili fragment prema gore opisanom i druge komponente koja ima drugu amunikiselinsku sekvencu. Na primer, imunokonjugat je citotoksin, ili imunokonjugat je vezujući protein ili antitijelo koji specifično vezuje ciljni epitop koji je različit od DKK1 ili DKK4. Na primer, ciljni epitop za specifično vezivanje različito od DKK1 ili DKK4 je tumorski antigen ili protein koji prati prisustvo tumora na povrčini tumorske ćelije. U odredjenim izvodjenjima, u pronalasku su sva navedena antitijela opisana kao bispecifična.

U drugom izvodjenju, pronalazak navodi kit koji ssdrži ma koje od navedenih antitijela ili fragmente antitijela. U nekim izvodjenjima, kit još sadrži i odgovarajući farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent. U drugim srodnim izvodjenjima, sva antitijela iz kita su prisutna u doznim jedinicama. U jednom drugom izvodjenju pak, kit je ELISA kit namenjen za dijagnostiku. U slličnom izvodjenju, kit podrazumeva uputstvo za upotrebu u primeni svakog od gore opisanih antitijela.

KRATAK OPIS PRIKAZANIH SLIKA

SL. 1 je grafik koji ilustruje da nema značajanog gubitka His-Strep-obeleženih DKK1 na Strep-Taktin-obloženim kuglicama, kada se uporedjuju kuglice koje nisu isprane sa kuglicama koje su isprane sa različitim HuCAL kriterijumima.

SL. 2 je stubičasti grafikon koji ilustruje rezultate testa aktivnosti Wnt sa 100 μl Bright-Glo luciferaza reagensom, kao što je opisano u Primeru 3.

SL. 3 je grafikon u kom su predstavljeni rezultati ELISA testa. Fluorescenca je merena na TECAN Spektrafluor čitaču za ploče i prikazane su krive vezivanja.

SL. 4 je grafikonkoji prikazuje standardni Wnt3a-zavisni TCF/LEF luc reporter test, kao što je to opisano u Primeru 6.

SL. 5 je grafik koji ilustruje poboljšanu verziju TCF/LEF luc reporter testa, prikazujući veoma poboljšanu osetljivost na DKK1 posredovanu ko-ekspresiju Kremen ko-receptorskog proteina.

SL. 6A je grafik koji ilustruje rezultate merenja vezivanja anti-DKK1/4 antitijela za DKK1 metodom rezonance na površini ispoljenog plazmina.

SL. 7A je šematski prikaz kompletnog niza i trimovanog molekula DKK1 za mapiranje epitopa. SL. 7B prikazuje vezivanje antitijela iz pronalasaka za DKK1 proteine i fragmente sa SL. 7A.

SL. 8 je grafik koji ilustruje vezivanjeDKK1/4 antitijela u kompetitivnom ELISA testu.

SL. 9 je grafik koji ilustruje DKK1/4-zavisnu reaktivaciju nizvodne transkripcije gena koji je Wnt regulisan.

SL. 10 je grafik koji ilustruje blokiranje DKK1/4 antitijelom inhibicije sa DKK1 sekrecije ALP-a.

SL. 11 je grafik koji ilustruje delovanje DKK1/4 antitijela na in vivo ksenokalem.

SL. 12 je grafik koji ilustruje DKK1/4 zavisno povećanje gustine kostiju u in vivo uslovima.

SL. 13 je grafička ilustracija uporedjivanja anti-osteolitičke efikasnosti Zometa sa DKK1/4 antitijelom.

SL. 14 je grafička ilustracija dozno zavisne efikasnosti delovanja DKK1/4 antitijela na anaboličke procese u kositma.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na izolovana DKK1/4 antitijela, naročito humana antitijela, koja se specifično vezuju za DKK1 ili DKK4 i koja inhibitorno deluju na funkcionalnle osobine DKK1 ili DKK4. U poželjnom izvodjenju, DKK1/4 antitijelo se ne vezuje specifično za DKK2 ili DKK3. U odredjenim izvodjenjima, antitijela iz pronalaska su izvedena iz sekvence odredjenog teškokg i lakog lanca i/ili poseduju odredjene strukturne osobine kao što su CDR regioni koji sadrže odredjene aminokiselinske sekvence. U pronalasku su opisana izolovana antitijela, postupci za dobijanje ovakvih antitijela, imunokonjugati i bispecifični molekuli koji u svojoj strukturi sadrže ovakva antitijela, kao i farmaceutske kompozicije koje sadrže ovakva antitijela, izvedene imunokonjugate i bispecifične molekule koji su navedeni u pronalasku. Pronalazak se takodje bavi postupcima za upotrebu antitijela u cilju inhibisanja poremećaja ili bolesti, vezanih za DKK1 ili DKK4. Bolesti, poremećaji i stanja na koje se odnosi pronalazak pored ostalih su: osteolitičke lezije - naročito osteolitičke lezije koje su vezane za mijelom, naročito multipli mijelom, ili za maligne tumore kostiju, dojke, debelog creva, melanocita, hepatocita, epitela, jednjaka, mozga, pluća, prostate ili pankreasa ili metastatske bolesti koje prate ove tumore; gubitak koštane mase koji se javlja kod transplantacije. Pored ostalih toj grupi pripadaju i bolesti kao što su npr., osteosarkom, karcinom prostate, hepatocelularni karcinom (HCC), mijelom koji podrazumeava multipli mijelom, dijabet, gojaznost, mičićnu istrošenost, Alzheimer-vu bolest, osteoporozu, osteopeniju, reumatske bolesti, kolitis i/ili neželjeni gubitak kose.

Iz razloga lakšeg razumevanja ovog pronalaska, prvo su definisani odredjeni pojmovi. Dodatne definicije su date kroz detaljne opise.

Izraz "imunski odgovor" se odnosi na aktivnost, na primer, limfocita, antigen-prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita i solubilnih makromolekula koje produkuju gore pomenute ćelije ili ćelije jetre (ukljuičujući antitijela, citokine i komplement) koja dovodi do selektivnog oštećenja, destrukcije ili eliminacije patogena iz ljudskog organizama, ćelija ili tkiva koja su inficirana patogenom, tumorskih ćelija, ili u slučajevima sa autoiminskim poremećajem ili patološkom inflamacijom, normalne humane ćelije ili tkiva.

"Signalni put" se odnosi na biohemijsku zavisnost izmedju različitih signalnih molekula koji učestvuju u procesu prenosa signala, iz jednog dela u drugi deo ćelije. U ovom tekstu izraz "membranski receptori" podrazumeva, na primer, molekule i molekulske klomplekse koji su sposobni da prime signal i koji su sposobni za provodjenje takvog signala kroz citoplazmatsku membranu ćelije. Jedan primer za "membranski receptor" u ovom pronalasku je receptor za koji se vezuju proteinski molekuli DKK1 i DKK4. U ove proteinske molekule se pored ostalih ubrajaju, Frizzled (Fz), LRP (LRP5 i LRP6) i Kremen (Krm).

U ovom tekstu se izraz "antitijelo" odnosi na poliklonska antitijela, monoklonska antitijela, humanizovana antitijela, antitijela sa bočnim lancem i njihovi fragmenti kao što su Fab, F(ab)2, Fv i drugi fragmenti koji zadržavaju antigen-vezujuću funkciju roditeljskog antitijela (antitijela og koga su nastali). Kao takvo, antitijelo može da označava imunoglobulin ili glikoprotein, ili njegov fragment ili deo, ili konstrukt koji se sastoji od antigen-vezujućeg dela koji je smešten unutar modifikovane osnove sa imunoglobulinskom strukturom, ili unutar antigen-vezujućeg dela koji se nalazi unutar konstrukta koji nema imunoglobulinsku strukturnu osnovu ili matricu.

U ovom tekstu, termin "monoklonsko antitijelo" označava kompoziciju sa antitijelom koja sadrži homogenu populaciju antitijela. Termin nije ograničen u odnosu na vrste ili izvor antitijela, niti je namera bila da bude ograničen načinom dobijanja. Termin prevazilazi kompletne imunoglobuline kao i fragmente kao što su Fab, F(ab)2, Fv, i druge fragmente koji zadržavaju antigen-vezujuću funkciju antitijela. Monoklonska antitijela bilo koje vrste sisara mogu da se koriste u ovom pronalasku. U praksi, medjutim, antitijela su najčešće pacovska ili mišja, zbog dostupnosti pacovskih i mišjih ćelijskih linija za dobijanje hibridomskih ćelijskih linija ili hibridoma za produkciju monoklonskih antitijela.

U ovom tekstu, termin "poliklonsko antitijelo" označava kompoziciju sa antitijelom koja sadrži heterogenu populaciju antitijela. Poliklonska antitijela se često pripremaju iz pomešanih seruma koji su prikupljeni iz imunizovanih životinja ili iz odabranih humanih jedinki.

U ovom tekstu, termin "jednolančano antitijelo" označava antitijela koja su pripremljena odredjivanjem vezujućih domena (i teškog i lakog laca) vezujućeg antitijela i dodavanjem povezujućeg dela koji omogućava zadržavanje funkcije vezivanja. Na ovaj način dobijen je u osnovi radikalno skraćen oblik antitijela, koje poseduje samo one delove varijabilnog domena koji su neophodni za vezivanje antigena. Odredjivanje i izgradnja jednolančanih antitijela je opisano u američkom patentu broj 4,946,778 od Ladner i sar.

"Prirodno antitijelo" je glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koji su medjusobno povezani disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sesastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (dalje skraćenica VH) i konstantni region teškog lanca. Kostantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (dalje skraćenica VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VH i VL regioni mogu dalje da se dele na hipervariajbilne regione, koji se nazivaju regioni koij odredjuju komplementarnost (Complimetarity determining regions-CDR), koji su pomešani sa mnogo više konzervisanim regionima, nazvani "framework"-okvirni ili potporni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR koji su postavljeni od amino-terminusa prema karboksi-terminusu po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Variajbilni regioni lakog i teškog lanca sadrže vezujuće domene koji interaguju sa antigenom. Preko konstantnog regiona antitijela, imunoglobulini se vezuju za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa.

Termin "antigen-vezujući deo" antitijela (ili prosto "antigenski deo") označava, u ovom tekstu, proteinsku sekvencu koja se vezuje za ciljnu vrstu, npr., jedan ili više CDR-a. On obuhvata npr., kompletna antitijela, jedan ili više fragmenata antitijela, i/ili CDR-e postavljene na osnovu koja nema strukturne sličnosti sa imunoglobulinima i koji imaju očuvanu sposobnost da specifično vezuju antigen (npr., DKK1). Antigen-vezujuća funkcija antitijela može da se ostvari preko različitih vrsta fragmenata kompletnog antitijela. U primere vezujućih fragmenata koji su obuhvaćeni terminom "antigen-vezujući deo" antitijela ubrajaju se Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; F(ab)2 fragment, divalentni fragment koji se sastoji od dva Fab fragmenta koji su medjusobno povezani disulfidnim mostom u regionu šarki; Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena pojedinačnog kraka antitijela; dAb fragment (Ward i sar., 1989 Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; i jedan izolovani region koji odredjuje komplementarnost (CDR).

U ovom tekstu, terminom "antigen" ili "epitop" jednako se označava polipeptidna sekvenca ciljnog proteina koju specifično prepoznaje antigen-vezujući deo antitijela, fragment antitijela, ili njihovi ekvivalenti. Antigen ili epitop sadrži najmanje šest aminokiselina, koje mogu biti uzastopne u okviru ciljne sekvence, ili diskontinuirane. Konformacioni epitop može da sadrži diskontinuirane ostatke, i može da sadrži prirodne ili sintetičke modifikovane aninokiselinske ostatke. U modifikacije na ostatcima, se pored ostalog ubrajaju: fosforilacija, glikozilacija, PEG-ilacija, ubikvitinizacija, furanilizacija i tome slično.

Šta više, iako dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodiraju odvojeni, različiti geni, moguće je spojiti ih, korišćenjem rekombinantnih metoda, ubacivanjem sintetičkog linkera koji omogućava da ova dva domena budu jedinstven proteinski lanac u kome upareni VL i VH regioni formiraju monovalentni molekul (poznat kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird i sar., 1988 Science 242:423-426; i Huston i sar., 1988 Proc. Natl. Sci: 85:5879-5883). Predvidjeno je da ovakva jednolančana antitijela budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući deo" antitijela. Ovi fragmenti antitijela se dobijaju korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su poznate stručnjacima iz oblasti, i fragmenti se pregledaju i traže se oni koji imaju korisne osobine, kao i intaktna antitijela.

U ovom tekstu, konzervisane varijante uključuju aminokiselinske ostatke u svakoj identifikovanoj aminokiselinskoj sekvenci, naročito konzervisane promene koje su poznate stručnjacima u oblasti proteinskog inženjeringa.

U ovom tekstu, termin "izolovano antitijelo" označava antitijelo koje je u velikoj meri oslobodjeno od drugih antitijela koje imaju različitu antigensku specifičnost (npr., izolovano antitijelo koje specifično vezuje DKK1 je u značajnoj meri oslobodjeno od antitijela koje specifično vezuje druge antigene koji nisu DKK1). Izolovano antitijelo koje specifično vezuje DKK1 može, medjutim, da bude unakrsno reaktivno prema drugim antigenima, kao što su DKK1 molekuli iz drugih vrsta, ili za druge članove ove familije proteina, kao što su DKK4 ili srodne molekule. Šta više, izolovano antitijelo može da bude u značajnoj meri oslobodjeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

U ovom tekstu, namera je da termin "humano antitijelo" obuhvata antitijela koja imaju varijabilne regione u kojima su framework i CDR regioni izvedeni iz sekvenci humanog porekla. Dalje, ako antitijelo sadrži konstantni region, konstantni region je takodje izveden iz ovakvih humanih sekvenci, npr., humane germinativne sekvence, ili mutirane verzije humanih germinativnih sekvenci. Humana antitijela iz pronalaska mogu da obuhvataju aminokiselinske sekvence koje nisu kodirane humanim sekvencama (npr., mutacije koje su uvedene nasumičnom ili za mesto specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskim mutacijama in vivo). Medjutim, u ovom teksu nije predvidjeno da se termin "humano antitijelo" odnosi na antitijela u kojima su CDR sekvence, koje su izvedene iz germinativnih sekvenci sisara, kao što je miš, kalemljene na humane framework sekvence.

Izraz "humano monoklonsko antitijelo" se odnosi na antitijela koja poseduju jedinstvenu specifičnost vezivanja, i imaju varijabilne regione u kojima su kako framework tako i CDR regioni izvedeni iz humanih sekvenci. U jednom izvodjenju, humana monoklonska antitijela produkuju hibridome, koje su dobijene fuzionisanjem B ćelija koje su dobijene iz transgeničnih "non-human" životinja, npr., iz transgenog miša, čiji genom ima transgen za humani teški lananc i transgen za laki lanac, sa imortalizovanim ćelijama.

U ovom tekstu, se pod terminom "humanizovana antitijela" misli na imunoglobuline u kojima je makar deo framework regiona izveden iz humanih imunologlobulinskih sekvenci. "Humanizovana antitijela" kao što su antitijela sa CDR sekvencama koje su izvedene iz sekvenci germinativnih ćelija drugih vrsta, naročito sisara, npr., miša, koje su bile kalemljene na humane framework sekvence. Kao primer za tehnologiju dobijanja "humanizovanih antitijela" može se navesti PDL tehnologija.

U ovom tekstu termin "humaneered antitijela" označava antitijela koja se vezuju za isti epitop ali se razlikuju po sekvenci. Kao primer tehnologije za dobijanje "humaneered antitijela" može se navesti humaneering tehnologija Kalobios-a, gde je sekvenca antigen-vezujućih regiona izvedena, pomoću npr., mutiranja, pre nego zamenom konzervisanih aminokiselina.

Termin "rekombinantno humano antitijelo" u ovom tekstu obuhvata sva antitijela koja su pripremljena, eksprimirana, napravljena ili izolovana rekombinantnim tehnikama, kao što su antitijela izolovana iz životinje (npr., iz miša) koja je transgenična ili transhromozomalna za humane imunoglobulinske gene ili hibridomska ćelija napravljena od ovakve životinje, antitijela izolovana iz ćelija domaćina koje su transformisane da eksprimiraju humana antitijela, npr., transfektomske ćelije, antitijela izolovana iz rekombinantnih, kombinatorijalnih biblioteka humanih antitijela, kao i antitijela pripremljena, eksprimirana, napravljena ili izolovana nekim drugim postupkom koji uključuje splicing svih ili dela humanih imunoglobulinskih gena, sekvenci u druge DNK sekvence. Ovakva humana rekombinantna antitijela imaju variajbilne regione sa framework i CDR regionima koji su izvedeni iz germinativnih humanih imunoglobulinskih sekvenci. U odredjenim izvodjenjima, medjutim, ovakva rekombinantna humana antitijela mogu da budu podvrgnuta mutagenezi in vitro (ili, kada se koristi životinja koja je transgenična za humane Ig sekvence, somatskom mutagenezom in vivo), stoga aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitijela, ne moraju, iako izvedene iz i srodne humanim germinativnim VH i VL sekvencama, da prirodno postoje u germinativnom humanom repertoaru antitijela in vivo.

U ovom tekstu "izotip" se odnosi na klasu antitijela (npr., IgA, IgD, IgM, IgE, od IgG klase IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koju odredjuju geni koji kodiraju konstantni region teško glanca.

U ovom tekstu se izrazi "antitijelo koje prepoznaje antigen" i "antitijelo specifično za antigen" koriste podjednako sa izrazom "antitijelo koje se specifično vezuje za antigen". U ovom tekstu antitijelo koje se "specifično vezuje za humani DKK1" treba da se odnosi na antitijelo koje se vezuje za humani DKK1 sa KD ≤ 5 x 10-9 M, KD ≤ 2 x 10-9 M, KD ≤ 1 x 10-10 M. Antitijelo koje "je unakrsno reaktivno sa antigenima koji nisu humani DKK1" se odnosi na antitijela koja vezuju taj antigen sa KD ≤ 0,5 x 10-8, KD ≤ 5 x 10-9, KD ≤ 2 x 10-9. Antitijelo koje "nije unakrsno reaktivno sa odredjenim antigenom" treba da se odnosi na antitijelokoje se vezuje za taj antigen sa KD ≥ 1,5 x 10-8, KD ≥ 5-10 x 10-8 ili KD ≥ 1 x 10-7. U odredjenim izvodjenjima, takva antitijela koja nisu unakrsno reaktivna sa antigenom pokazuju u osnovi nedetektabilno vezivanje prema ovim proteinima u standardnim testovima vezivanja.

U ovom tekstu, antitijelo koje "inhibira vezivanje DKK1 za membranski ćelijski receptor" kao što je LRP, Fz ili Krm, se odnosi na antitijelo koje inhibira vezivanje DKK1 molekula za receptor sa K od 1 nM ili manje, 0,75 nM ili manje, 0,5 nM ili manje, ili 0,25 nM ili manje.

U ovom tekstu, "osteoliza" se odnosi na smanjenje gustine kostiju, koje može biti posledica delovanja različitih mehanizama uključujući, npr., smanjenu aktivnost osteoblasta, povećanu aktivnost osteoklasta. Dakle, osteoliza obuhvata mehanizme koji na bilo koji način štetno deluju na mineralnu gustinu kostiju. U ovom tekstu antitijelo koje "inhibira osteolitičku aktivnost" treba da označava antitijelo koje inhibira gubitak koštane mase, bilo da povećava izgradnju kostiju, ili da blokira razgradnju kostiju.

Termin "Kassoc" ili "Ka", u ovom tekstu treba da označava brzinu asocijacije odredjene interakcije antitijelo-antigen, dok termin "Kdis" ili "Kd" treba da označava brzinu disocijacije odredjene interakcije antitijelo-antigen. U ovom tekstu termin "KD" treba da označava konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa Kd i Ka (tj., Kd/Ka ) i izražava se kao molarna koncentracija (M). Vrednosti KD za antitijela se mogu odrediti metodama koje su poznate u oblasti. Za odredjivanje KD antitijela korišćen je metod površinske plasmon rezonance, FMAT, ili biosenzorski sistem kao što je Biacore® sistem.

U ovom tekstu izraz "afinitet" odnosi se na jačinu interakcije izmedju antitijela i antigena na pojedinačnim antigenskim mestima. U okviru svakog antigenskog mesta varijabilni region jednog "kraka" antitijela ostvaruje brojne ali slabe nekovalentne interakcije sa antigenom; što više interakcija ostvari to je veći afinitet.

U ovom tekstu se izraz "aviditet" odnosi na informativnu meru ukupne stabilnosti ili jačine kompleksa antigen-antitijelo. Aviditet kontrolišu tri glavna faktora: afinitet antitijela prema epitopu; valenca kako antitijela, tako i antigena; i strukturni raspored interagujućih delova. Konačno, ovi faktori definišu specifičnost antitijela, to jest, verovatnoću da će odredjeno antitijelo da se veže za tačno odredjen epitop na antigenu.

U cilju dobijanja probe sa većim aviditetom, moguće je konstruisati dimerni konjugat (dva molekula JWJ-1 kuplovana sa FACS markerom), omogućavajući na taj način da se interakcije sa malim afinitetom ( kao što su one sa germinativnim antitijelom) lakše se detektuju na FACS-u. Postoji još jedan način da se poveća aviditet vezivanja za antigen, koji podrazumeva generisanje dimera ili multimera nekog od fibronektinskih konstrukta, koji su ovde opisani, sa DKK1 ili DKK4 antitijelima. Ove multimere je moguće generisati kovalentnim vezivanjem pojedinačnih antitijela, na primer, imitiranjem prirodnog vezivanja C-N-terminus ili imitirajući dimer antitijela koja se drže zajedno preko svojih konstantnih regiona. Veze koje se ugradjuju u delu Fc/Fc kontaktne površine mogu da budu kovalentne ili nekovalentne. Osim toga, moguće je da se dimerizacijom ili multimerizacijom uključuju i drugi partneri pored Fc u generisanju DKK1 i DKK4 hibrida, kao struktura višeg reda.

U ovom tekstu se "unakrsna reaktivnost" odnosi na antitijelo ili populaciju antitijela koja se vezuju za epitope na drugim antigenima. Ovo može biti posledica ili niskog aviditeta ili specifičnosti antitijela ili slučaja da više različitih antigena ima identične ili veoma slične epitope. Unakrsna reaktivnost je ponekad i poželjna, kada je potrebno ukupno vezivanje u grupi srodnih antigena ili kada je cilj detekcija antigena kod različitih životinjskih vrsta, a sekvenca antigenskog epitopa nije visoko evolutivno konzervisana.

U ovom tekstu se izraz "veliki afinitet" ili "velika specifičnost " IgG antitijela odnosi na antitijelo koje ima KD ≤ 10-8 M, KD ≤ 10-9 M, KD ≤ 10-10 M vezivanja za ciljni antigen. Medjutim, vezivanje sa "velikim afinitetom" može da varira za druge izotipove anatitela. Na primer, vezivanje sa "velikim afinitetom" IgM izotipa se odnosi na natitelo koje ima KD ≤ 10-7 M ili ≤ 10-8 M .

U ovom tekstu se izraz "subjekat" odnosi na ma kog čoveka ili ne-humanu životinju. Izraz "ne-humana životinja" obuhvata sve kičmenjake, npr., sisare ili ne-sisare, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, pilići, vodozemci, reptili, itd.

U ovom tekstu se "optimizovanje" odnosi na nukleotidne sekvence koje su promenjene tako da kodiraju aminokiselinsku sekvencu, koristeći kodone koji su podesni odredjenoj ćeliji ili organizmu za produkciju, i/ili je nukleotidna sekvenca promenjena tako da ukloni latentnog donora splajsing mesta ili akceptora splajsing mesta. Tabele kodona za optimizaciju su dobro poznate u oblasti, za veliki broj različitih vrsta. Sekvence splajsing mesta akceptora i donora su takodje poznate u oblasti i moguće je definisati latentna splajsing mesta, npr., analizom transkripta ili na osnovu podataka o ekspresiji. U ćeliji za produkciju se ubrajaju, pored ostalih, prokariotske ćelije kao što su npr., bakulovirus ili bakterije (E. coli), ili eukariotske ćelije, na primer, kvasci (npr., Pichia), ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO), mijelomske ćelije ili humane ćelije. Optimizovana nukleotidna sekvenca je napravljena tako da u potpunosti zadrži ili u najvećoj mogućoj meri, aminokiselinsku sekvencu i broj ostataka koji su originalno kodirani polaztnom, matičnom nukleotidnom sekvencom, koja se takodje naziva i "roditeljska" sekvenca. Optimizovane sekvence o kojima je reč u ovom tekstu su napravljene tako da sadrže kodone koji su odgovarajući za produkcione ćelije, medjutim optimizovana ekspresija ovih sekvenci u drugim eukariotskim i prokariotskim ćelijama za produkciju je obuhvaćena ovim tekstom. Aminokiselinske sekvence koje su kodirane optimizovanim nukleotidnim sekvencama mogu da se navode kao optimizovane.

U sličnim izvodjenjima, polipeptidne sekvence neutrališućih anti-DKK1/4 kompozicija iz pronalaska i nukleotidi koji ih kodiraju su najpre optimizovani za produkciju i kliničku primenu. U karakteristike bitne za optimizaciju za kliničku primenu se ubrajaju, pored ostalog, npr., poluživot, farmakokinetika (PK), antigenost, efektorska funkcija, FcRn klirens i iodgovor pacijenta, uključujući antitijelo zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) ili komplement zavisnu citotoksičnost (CDC).

U ovom tekstu se u "DKK1 zavisne bolesti" ili "DKK4 zavisne bolesti" ubrajaju, pored ostalih, osteolitičke lezije-posebno osteolitičke lezije vezane za mijelom, a pogotovo multipli mijelom, ili sa tumorima kostiju, dojke, debelog creva, melanocita hepatocita, epitela, jednjaka, mozga, pluća, prostate ili pankreasa ili metastatske bolesti koje prate ove karcinome; gubitak koštane mase vezano za transplantaciju. Dalje, bolesti ili poremećaji, pored ostalih, su npr., osteosarkom, karcinom prostate, hepatocelularnii karcinom (HCC), mijelom uključujući multipli mijelom, dijabet, gojaznost, gubitak mišićne mase, Alzhimer-ova bolest, osteoporoza, osteopenija, reumatske bolesti, kolitis i/ili neželjeni gubitak kose.

U ovom tekstu se pod "lečenjem" podrazumeva intervencija uradjena sa namerom da se spreči širenje ili da se promeni patologija poremećaja. Prema tome, "lečenje" se odnosi kako na terapijsko tretiranje, tako na preduzimanje profilaktičkih ili preventivnih mera. Medju one kojima je terapija potrebna, se ubrajaju oni koji već imaju poremećaj, kao i oni kod kojih poremećaj može da se spreči. U lečenju tumora (npr., karcinoma) terapijsko sredstvo može da direktno smanji patologiju tumorskih ćelija, ili da tumorske ćelije učini osetljivijim na tretman drugim terapijskim sredstvima, kao što su radioterapija i/ili hemoterapija. "Patologija" karcinoma uključuje sve fenomene koji kompromituju dobrobit pacijenta. Ovde se ubrajaju, bez ograničenja, abnormalni ili nekontrolisani ćelijski rast, metastaze, ometanje normalnog funkcionisanja susednih ćelija, oslobadjanje citokina ili drugih sekretornih produkata u nenormalnim koncentracijama, supresija ili pogoršanje inflamatornog ili imunološkog odgovora, itd.

Lečenje pacijenata koji pate od kliničkih, biohemijskih, radioloških ili subjektivnih simptoma bolesti, kao što je osteoliza, može da podrazumeva ublažavanje nekih ili svih pomenutih simptoma ili smanjivanje predispozicije za odredjenu bolest.

Generalno, neutrališuća anti-DKK1/4 kompozicija iz pronalaska, sprečava, leči ili ublažava Wnt-zavisne bolesti koje su povezane sa DKK1 ili DKK4 ili sa oba, ali ne i bolesti koje su povezane sa DKK2, DKK3 ili sa drugim modulatorima Wnt signalnog puta.

U poglavljima koja slede, detaljno su opisani različiti aspekti ovog pronalaska.

Wnt signalni put je glavni regulator diferencijacije mezenhimalnih matičnih ćelija (MSC) u osteoblaste. To je takodje značajan faktor za preživljavanje aktivnih osteoblasta. Dickkopf-1 (DKK1) je antagonistWnt signalnog puta, koji je dominantno isppoljen u kostima kod odraslih jedinki i povećan je kod pacijenata koji su oboleli od mijeloma sa osteolizičkim lezijama. Neutrališuća anti-DKK1/4 antitijelo je u osnovi anabolički agens, koji deluje prekopovećanaja aktivnosti osteoblasta, dok istovremeno smanjuje aktivnost osteoklasta. S druge strane, nasuprot tome, lekovi kojise trenutno koriste, kao što je PTH, koji se na tržištu prodaju kao anabolički agensi, ustvari povećavaju markere kojima se prate i osteoblasti i osteoklasti.

U pronalasku su opisana poliklonska i monoklonska antitijela koja su pri pretraživanju izdvojena zbog vezivanja za DKK1. Poželjno antitijelo ima afinitet manji od 10 pM prema humanom DKK1. U nekim izvodjenjima, anti-DKK1 antitijelo unakrsno reaguje sa DKK4 (KD~300 pM) ali ne i sa DKK2 (analiza afiniteta je u toku).

Poželjni epitop za koji se vezuje anti-DKK1 ili anti-DKK4 antitijelo je mapirano u Cys-2 domenu (AK-e 189-263), za koji je poznato da posreduje vezivanje za receptore LRP6 i Kremen. U jednom izvodjenju, epitop obuhvata najmanje šest, a najviše trideset aminikiselinskih ostataka iz Cys-2 domena u poolipeptidu DKK1 ili DKK4. U odredjenom izvodjenju, epitop uključuje segment od šest aminokiselina u kontinuitetu. U drugim izvodjenjima, poželjno vezivno mesto nije linearno, tj., sadrži diskontinurane aminokiselinske ostatke. U nekim izvodjenjima, vezivanje zavisi od N-glikozilovanosti. Anticipirano je samo jedno mesto za N-glikozilovanje, na ostatku 256 u Cys-2 domenu.

U ovom pronalasku neutrališuće anti-DKK1 blokira interakciju DKK1 sa LRP6, što je pokazano ELISA testom i testom vezivanja za površinu ćelije. Kao što je očekivano, ovo efikasno neutrališe supresivno delovanje DKK1 na Wnt sa EC50 manjom od 1 nM in vitro.

U in vitro modelu diferencijacije osteoblasta, mišje 10T1/2 ćelije su tretirane sa Wnt3A da bi stimulisali sekreciju alkalne fosfataze (AP), koja je marker aktivnosti osteoblasta. U ovom modelu DKK1 blokira produkciju AP i antitijela iz pronalaska u potpunosti ukidaju ovu inhibiciju.

U odredjenim izvodjenjima, antitijelo iz pronalaska pokazuje dozno linearnu kinetiku (AUC) kod miša, sa dozno zavisnim terminalnim poluživotom 35-96 sati kodmiša za doze u opsegu od 20-200 μg/mišu.

Korišćenjem intratibijalnog modela osteolitičke metastaze tumora prostate, antitijela iz pronalaska inhibiraju oštećenja kortikalne kosti indukovana tumorom. Efekti na trabekularnu kost se osnovano pripisuju ovom modelu, zapažanjem da i tumorski implanti i sham implanti dovode do mehaničkog oštećenja kosti, što dovodi do početnog povećanja vlaknaste (fibrozne) kosti, koja je posle remodelovana, tako dovodeći do smanjenja prividnog volumena kosti. U odredjenom izvodjenju, antitijelo iz pronalaska povećava produkciju vlaknaste kosti kako u tumorom implantiranim, tako i u sham implantiranim tibijama i inhibira smanjenje volumena kosti koje se javlja kod remodelovanja.

U sličnim izvodjenjima, korišćene su promene u markerima kostiju (osteokalcin, sRANKL, OPG, AP, TRAP) da bi pokazali kliničke efekte antitijela iz pronalaska na bolesti vezane za kosti i za predvidjanje kliničkog ishoda terapije sa farmaceutski efikasnim koncentracijama neutrališućeg anti-DKK1 antitijela, kao štoje opisano u ovom tekstu. Krm vezuje DKK u približno istom regionu kao i LRP. Krm je potreban za inhibiciju Wnt signalnog puta preko inetrakcije DKK sa LRP. Tek u kompleks Krm-DKK-LRP povezani, mogu da budu internalizovani, da bi intracelularno inaktivirali Wnt signalni put.

Neutrališuća anti-DKK1/4 kompozicija iz pronalaska poželjno je da se vezuje za DKK1 ili DKK4, blokirajući njihovu interakciju sa LRP i/ili Krm, tako neutralizujući DKK1 ili DKK4 efekte na Wnt signalni put. Do reaktivacije Wnt signalnog puta dolazi samo tamo gde su DKK1 i/ili DKK4 ograničavajući.

Standardni test za odredjivanje sposobnosti vezivanja antitijela za DKK1 različitih vrsta su poznate u oblasti, uključujući na primer, ELISA testove, Western Blot i RIA testove.Odgovarajući testovi su detaljno opisani u Primerima. Kinetika vezivanja (npr., afinitet vezivanja) antitijela takodje može da se odredi standardnim testovima poznatim u oblasti, kao što je Biacore analiza, BioVeris SET test, FMAT, hemiluminescenca, i/ili SPR testovi-testovi inhibicije ili oslobadjanja signala. Testovi za odredjivanje efekata antitijela na funkcionalne osobine DKK1 su opisani u detalje u poglavlju Primeri.

Prema tome, kada se u tekstu pominje antitijelo koje "inhibira" jednu ili više ovih DKK1 funkcionalnih osobiona (npr., biohemijske, imunohemijske, ćelijske, fiziološke ili druge biološke aktivnosti, ili tome slično) kao što je odredjeno metodologijama koje su poznate u oblasti i ovde opisane, treba razumeti da se odnose na statistički značajno smanjenje odredjene aktivnosti u odnosu na onu koja se beleži u odsustvu antitijela (npr., ili kada je prisutno kontrolno antitijelo irelevantne specifičnosti). Antitijelo koje inhibira aktivnost DKK1 dovodi do statistički značajnog smanjenja od najmanje 10% od izmerenog parametra, od najmanje 50%, 80% ili 90%, i u odredjenim izvodjenjima antitijelo iz pronalaska može da inhibira i više od 95%, 98%, ili 99% DKK1 funkcionalne aktivnosti.

Članovi porodice Dickkopf

Metabolizam kostiju obuhvata kompleksnu mrežu regulatornih puteva i medjusobnih odnosa izmedju osteoblasta, osteoklasta i strome koja ih okružuje. Svaki poremećaj uravnoteženog odnosa regulatornih mehanizama igra značajnu ulogu u osteolitičkim bolestima kao što su: osteoporoza, tumorski indukovane osteolitičke lezije, gubitak koštane mase kod transplantacije bubrega i jetre, kao i gubitak koštane mase koji se javlja kod anti-hormonske hemoterapije. Ove bolesti mogu da imaju ozbiljne simptome kao što su bol u kostima, frakture, kompresija pršljenova, i smanjena pokretljivost. Većina tretmana koji imaju dozvolu , kao i onih kloji su još fazi kliničkog ispitivanja, deluju prevashodno inhibirajući funkciju osteoklasta. Na primer, bisfosfonati, kao što je zoledronišna kiselina (Zometa) su tretnutno standardna nega i zbrinjavanje i deluju inhibišući funkcije osteoklasta i njihovo preživljavanje. Dok su bisfosfonati uglavnom efikasni, neki pacijenti ne odgovaraju na ovu terapiju robusno ili prekidaju upotrebu zbog renalne toksičnosti ili osteonekroze [Markowitz 2003] [ruggiero 2004]. Osim toga postoje brojne supstance koje su u procesu ispitivanja, a koje za cilj imaju delovanje na razviće osteoklasta, kao što su neutrališuća antitijela usmerena prema RANKL i M-CSF, ili na osteoklastnu funkciju kao što su inhibitori katepsina K.

Stimulacija aktivnosti osteoblasta bi bila novi mehanizan za lečenje osteolitičke bolesti.Wnt signalni put ima glavnu ulogu u diferencijaciji i aktivnosti osteoblasta, dok Dickkoppf (DKK) familija antagonista su posebno identifikovani kao ključni regulatori ovog procesa in vitro (videti [Kirshman 2006] za pregled). Wnt je esencijalan faktor preživljavanja i diferencijacije osteoblasta in vitro. Klinička validacija uloge Wnt signalnog puta izvršena je uvodjenjem mutacija u Wnt koreceptor, LRP5. Inaktiviranje mutacija u LRP5 dovodi do osteoporoze-pseudogliom sindrom (OPPG) [Ai 2005], dok aktiviranje mutacija može da rezultuje u velikoj koštanoj masi [Boyden 2002]. Ove mutacije koje dovode do aktivacije, smeštene su u ekstraćelijskom domenu i pokazano je da umanjuju vezivanje članova Dickkopf (DKK) familije za antgoniste Wnt signalnog puta.

Postoje podaci da mijelomske ćelije kod pacijenata sa lezijama kostiju pojačano eksprimiraju DKK1, ali da nije prisutan u normalnim plazma ćelijama, kao i u plazma ćelijama pacijenata kod kojih se nisu pojavile lezije na kostima [tian 2004] [Politou 2006]. Ovo pojačano ispoljavanje DKK1 na mijelomskim ćelijama može da poremeti ravnotežu izmedju osteoblasta i osteoklasta, blokirajući diferencijaciju osteoblasta, tako promovišući razgradnju kositju. Štaviše, za neke od anti-tumorskih tretmana koji se koriste u lečenju mijeloma, kao što je deksametazon, navodi se da povećavaju (up-regulišu) DKK1 [Ohnaka 2004]. Zbog toga, anti-DKK1 neutrališuće antitijelo bi trebalo da omogući reaktivaciju signalnog puta Wnt u osteolitičkim lezijama, a da istovremeno ne poremeti signalizaciu preko Wnt u drugim tkivima, gde su nivoi DKK1 relativno niski ili gde predominiraju neki antagonisti. Postoje podaci, da je DKK1 jako ispoljen jedinou kostima kod odraslih [Li 2006], što navodi na pomisao o trajnoj ulozi DKK1 u regulisanju metabolizma kostiju kod odraslih.

Transgenični miševi kod kojih postoji pojačana ekspresija Wnt1 u tkivu dojki, razvijaju karcinome mlečnih žlezda [Tsukamoto 1988] i ~90% humanih kolorektalnih karcinoma imaju mutacije ili u APC ili u β-kateninu, dve citoplazmatske komponente Wnt puta [Morin 1997] [Rowan 2000]. Ovaj tip dokaza otvara zabrinjavajuću mogućnost da bi aktivacija Wnt puta mogla da bude rizik za povećano nastajanje tumora ili progresiju. Osim toga, DKK su smanjeni (down-regulisani) u kolorektalnim tumorima i melanomima, što upućuje na njihovu supresivnu ulogu u odnosu na tumore.

DKK polipeptid iz pronalaska obuhvata DKK1 (SEQ ID NO: 1) i DKK4 (SEQ ID NO: 124), kao i DKK2 (SE ID NO: 122) i DKK3 (SEQ ID NO: 123). Članovi DKK familije imaju dva CYS domena (CYS1 i CYS2), kao što je prikazano u tabeli A – grupa članova DKK1 familije. DKK proteini sadrže jedan kiseli N-terminalni signalni peptid, dva CYS domena koji sadrže klastere cisteinskih ostataka, koji sui razdvojeni raznovrsnim linker regionom i potencijalno mesto za N-glikozilaciju na C-teriminusu. Kod DKK4 CYS2 domen ima funkciju da vezuje lipide koji bi mogli da olakšaju WNT/DKK interakciju na citoplazmatskoj membrani. OMIM pozivni broj 605417.

Antitijela usmerena prema DKK1 i DKK4

U poželjnom izvodjenju, antitijelo iz pronalaska je specifično prema humanom DKK proteinu. U poželjnijem izvodjenju antitijelo iz pronalaska

DKK1 ili DKK4 neutrallišuće antitijelo je različito od modifikacija Wnt signalnog puta koje su povezane sa napredovanjem tumora. Wnt signalni put je regulisan preko složene mreže ekstracelularnih liganada, receptora i antagonista, od kojih je samo jedan DKK1. Zbog ograničene ekspresije DKK1 kod odraslih i njegove funkcionalne redundantnosti sa drugim Wtn antagonistima, postoji mala verovatnoća da će neutrališuće DKK1 antitijelo izazvati opštu aktivaciju prenosa siganla preko Wnt ili zbog toga tumorogenezu. Ovome u prilog govore dva zapažanja: aktivirajuće mutacije LRP5 (koje inhibiraju vezivanje DKK) indukuju fenotip sa vellikom koštanom masom, ali nemaju neki očigledan rizik od malignog tumora [Moon 2004], dok heterozigoti za DKK1 nula ili Doubleridge miševi imaju smanjen nivo DKK1, fenotip sa velikom koštanom masom, ali nije primećena povećana stopa formiranja tumora [MacDonald 2004].

Anti-DKK1 antitijelo treba da pozitivno deluje na osteolitičku bolest izazvanu mijelomom, a da pri tom ne povećava rizik od tumorogeneze de novo. Očekivano je da se takvo antitijelo koristi u kombinaciji sa anti-tumorskom hemoterapijom i verovatno sa lekovima protiv razgradnje kostiju koji inhibiraju funkciju osteoklasta.

Poliklonska antitijela

Antitijela iz pronalaska mogu da budu poliklonska antitijela, pogotovo humana poliklonska antitijela. Poliklkonci se dobijaju iz pomešanih seruma koji su prikupljeni iz imunizovanih životinja ili odredjenih humanih jedinki.

Monoklonska antitijela

Poželjno je da su antitijela iz pronalaska humana monoklonska antitijela, kao što su izolovana i strukturno okarakterisana, npr., u Primerima 1-8. Specifične VH aminokiselinske sekvence antitijela su prikazane, npr., u SEQ ID NOs: 2-20. Specifične VL aminokiselinske sekvence antitijela su prikazane, npr., u SEQ ID NOs: 21-39.

VH aminokiselinska sekvenca antitijela može da se optimizuje za ekspresiju u ćelijama sisara, npr., kao štoje sekvenca aprikazana u SEQ ID NO: 119. VL aminokiselinska sekvenca antitijela može da se optimizuje za ekspresiju u ćelijama sisara, npr., kao štoje sekvenca aprikazana u SEQ ID NO: 118. Isto tako sekvenca može da bude optimizovana za ekspresiju u ćelijama, npr., kvasca, bakterija, hrčka i drugim ćelijama, u zavisnosti od toga koji sistem za ekspresiju je najviše odgovarajući za karakteristiku u odnosu na koju se opitmizuje. Druga antitijela iz pronalaska sadrže aminokiseline koje su mutirane, ali da imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 procenata homologije u CDR regionima sa CDR regionima koji su prikazani u gore opisanim sekvencama.

Dalje, roditeljske kompletne nukleotidne sekvence lakog lanca su prikazane u SEQ ID NOs: 101-103. Kompletne nukleotidne sekvence lakog lanca koje su optimizovane za ekspresiju u ćelijama sisara su prikazane u SEQ ID NOs: 104-107. Kompletne nukleotidne sekvence teškog lanca koje su optimizovane za ekspresiju u ćelijama sisara su prikazane u SEQ ID NOs: 108-110. Kompletne aminokiselinske sekvence lakog lanca kodirane kompletnim nukleotidnim sekvencama lakog lanca su prikazane u SEQ ID NOs: 111-114. Kompletne aminokiselinske sekvence teškog lanca kodirane kompletnim nukleotidnim sekvencama teškog lanca su prikazane u SEQ ID NOs: 115-117. Druga antitijela iz pronalaska uključuju aminokiseline ili nukleinske kiseline koje su bile mutirane, ali da imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 procenata homologije sa sekvencama koje su gore opisane.

Budući da se svako od ovih antitijela vezuje za DKK1, VH, VL, kompletna sekvenca lakog lanca i kompletna sekvenca teškog lanca (nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence) mogu da se "pomešaju i upare prema slaganju" kako bi napravili nove anti-DKK1 vezujuće molekule, a koji su iz pronalaska. Vezivanje takvih "pomešanih i uparenih prema slaganju" antitijela može da se testira koristeći testove vezivanja koji su opisani u gornjem tekstu i u Primerima (npr., ELISA-e). Kada se ovi lanci pomešaju i upare, VH sekvenca iz odredjenog VH/VL para treba da se zameni sa strukturno sličnom VH sekvencom. Isto tako, kompletna sekvenca teškog lanca koja potiče iz para kompletne skvence teškog lanca /kompletne sekvence lakog lanca treba zameniti sa strukturno sličnom kompletnom sekvencom teškog lanca. Slično tome, VL sekvenca iz odredjenog VH/VL para treba da se zameni sa strukturno sličnom VL sekvencom. Isto tako, kompletnu sekvencu lakog lanca koja potiče iz para kompletne skvence teškog lanca/kompletne sekvence lakog lanca treba zameniti sa strukturno sličnom kompletnom sekvencom lakog lanca. VH, VL, kompletne sekvence teškog lanca i kompletne sekvence lakog lanca, koje ulaze u sastav antitijela iz ovog pronalaska, su naročito podesne za mešanje i uparivanje prema slaganju, budući da ova antitijela koriste VH, VL, kompletne sekvence teškog lanca i kompletne sekvence lakog lanca koje potiču iz istih germinativnih sekvenci, zbog čega imaju potrebnu strukturnu sličnost.

Shodno tome, po jednom aspektu, pronalazak opisuje izolovano monoklonsko antitijelo ili antigen vezujući deo koji ima: VH region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 2-20 i 119; i VL region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe SQE ID NOs: 21-39 i 118; gde se antitijelo specifično vezuje za DKK1.

Primeri kombinacije teškog i lakog lanca: VH region koji se sastoji od aminikiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2 i VL region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO:21; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO:3 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 22; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO: 4 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 23; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO : 5 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 24; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO: 6 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 25; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO: 7 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 28; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO:8 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 29; ili VH region koji se sastoji SEQ ID NO: 9 i VL region koji se sastoji SEQ ID NO: 30; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO: 10 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 31; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO: 11 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 32; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO: 12 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 33; ili VH region koji se sastoji od SEQ ID NO: 119 i VL region koji se sastoji od SEQ ID NO: 118.

Po drugom aspektu, pronalazak opisuje izolovano monoklonsko antitijelo ili antigen-vezujući deo koji ima: kompletnu sekvencu teškog lanca koja se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 115-117 i 119; i kompletnu sekvencu lakog lanca koja se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe SQE ID NOs: 111-114.

Primeri kombinacije kompletne sekvence teškog, odnosno kompletne sekvence lakog lanca: SEQ ID NO: 115 sa SEQ ID NO: 111; ili SEQ ID NO: 116 sa SEQ ID NO:112; ili SEQ ID NO: 117 sa SEQ ID NO: 113; ili SEQ ID NO: 117 sa SEQ ID NO: 114.

Po jednom drugom aspektu, pronalazak opisuje izolovano monoklonsko antitijelo ili antigen-vezujući deo koji se sastoji od kompetnog teškog lanca, koji kodira nukleotidna sekvenca iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 101-103; i kompletnog lakog lanca koji kodira nukleotidna sekvenca iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 97-100.

Dakle, primeri nukleotida koji kodiraju kompletni teški, odnosno laki lanac, a koje je moguće kombinovati su: SEQ ID NO:101 i 97; ili SEQ ID NO: 102 i 98; ili SEQ ID NO: 103 i 99; ili SEQ ID NO. 103 i 100.

Po jednom drugom aspektu, pronalazak opisuje izolovano monoklonsko antitijelo ili antigen-vezujući deo koji je optimizovan za ekpresiju u ćeliji i koji ima: kompletan teški lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 108-110; i kompletan laki lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 104-107.

Po jednom drugom aspektu, pronalazak opisuje antitijela koja se sastoje od CDR1, CDR2, CDR3 regiona teškog i lakog lanca antitijela, ili njihovih kombinacija. Aminokiselinske sekvence VH CDR1 regiona antitijela su prikazana u SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, i 49-56. Aminokiselinske sekvence VH CDR2 regiona antitijela su prikazana u SEQ ID NOs: 2-20 i 57-64. Aminokiselinske sekvence VH CDR3 regiona antitijela su prikazana u SEQ ID NOs: 2-20 i 65-72. Aminokiselinske sekvence VL CDR1 regiona antitijela su prikazana u SEQ ID NOs: 21-39 i 73-80. Aminokiselinske sekvence VL CDR2 regiona antitijela su prikazana u SEQ ID NOs: 21-39 i 81-88. Aminokiselinske sekvence VL CDR3 regiona antitijela su prikazana u SEQ ID NOs: 21-39 i 89-96. CDR regioni du definisani korišćenjem Kabat sistema (Kabat, E. A., i sar., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

Budući da se svako od ovih antitijela vezuje za DKK1 i da je antigen-vezujuća specifičnost primarno zavisna od CDR1, 2 i 3 regiona, VH CDR1, 2 i 3 sekvence i VLCDR1, 2 i 3 sekvence mogu da se "mešaju i upare da pristaju jedan drugom" (tj., CDR regioni iz različitih antitijela mogu da se pomešaju i upare da se uklapaju, iako svako antitijelo mora da sadrži VH CDR1, 2 i 3 i VL CDR1, 2 i 3 kako bi naprvili druge anti-DKK1 vezujuće molekule, opisane u pronalasku. Vezivanje za DKK1 ovakvih antitijela, pomešanih i uklopljenih da se slažu, može da se testira korišćenjem testova vezivanja koji su opisani u gornjrm tekstu i u Primerima (npr., ELISA testovi). Kada se VH CDR sekvence pomešaju i uklope da se slažu, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvence iz odredjene VH sekvence treba zameniti sa strukturno sličnim CDR sekvencom/sekvencama. Isto tako, kada se VL CDR sekvence pomešaju i uklope da se slažu, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvence iz odredjene VL sekvence treba zameniti sa strukturno sličnim CDR sekvencom/sekvencama. Štaviše, sekvence CDR1, CDR2 i/ili CDR3 iz odredjene VH ili VL sekvence moguće je specifično ili nasumično mutirati kako bi napravili antitijela, koja se mogu testirati prema afinitetu ili vezujućim karakteristikama. Stučnjaku iz oblasti će biti lako da primeti da je moguće kreirati nove VH i VL sekvence supstituisanjem jedne ili više VH i/ili VL sekvenci CDR regiona sa strukturno sličnim sekvencama iz CDR koja su ovde prikazana za monoklonska antitijela iz ovog pronalaska.

Izolovano antitijelo ili njegov antigen vezujući deo ima: VH CDR1 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20 I 49-56; VH CDR2 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 2-20 i 57-64; VH CDR3 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 2-20 i 65-72; VL CDR1 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39 i 73-80; VL CDR2 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39 i 81-88; i VL CDR3 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39 i 89-96; gde ase antitijelo specifično vezuje za DKK1.

U odredjenom izvodjenju, antitijelo se sastoji od VH CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 2; VH CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 6; VH CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 7; VL CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 21; VL CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 22 i VL CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 23.

U drugom izvodjenju, antitijelo se sastoji od VH CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 3; VH CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 12; VH CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 13; VL CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 24; VL CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 25 i VL CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 26.

U jednom rugom izvodjenju, antitijelo se sastoji od VH CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 4; VH CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 14; VH CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 15; VL CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 27; VL CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 28 i VL CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 29.

U drugom izvodjenju, antitijelo se sastoji od VH CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 5; VH CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 16; VH CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 17; VL CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 30; VL CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 31 i VL CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 32.

U odredjenom izvodjenju, antitijelo se sastoji od VH CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 8; VH CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 18; VH CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 19; VL CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 33; VL CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 34 i VL CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 35.

U jednom drugom izvodjenju, antitijelo se sastoji od VH CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 9; VH CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 10; VH CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 11; VL CDR1 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 36; VL CDR2 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 37 i VL CDR3 regiona koji sadrži SEQ ID NO: 38.

Kako se u ovom tekstu podrazumeva, antitijelo se sastoji od teškog ili VL regiona ili kompletnog teškog ili lakog lanca koji "potiču iz" ili su "izvedeni iz" odredjene germinativne sekvence ako su varijabilni regioni ili kompletni lanci antitijela dobijeni iz sistema koji koristi kao polazne humane germinativne imunoglobulinske gene. Ovakvi sistemi uključuju imunizaciju transgeničnog miša koji nosi humane gene za imunoglobuline sa antigenom od interesa ili skrining biblioteke humanih imunoglobulinskih gena prikazanih na fagu sa antigenom od interesa.Humano antitijelo koje potiče od ili je izvedeno iz humane germinativne imunoglobulinske sekvence može se identifikovati kao takvo uporedjivanjem aminokiselinske sekvence humanog antitijela sa aminokiselinskim sekvencama humanih germinativnih imunoglobulina i selektovanje humane germinativne imunoglobulinske sekvence koja je najbiliža po sekvenci (tj., ima najveći % homologije) sekvenci humanog antitijela. Humano antitijelo koje" potiče od" ili je "izvedeno iz" odredjene humane germinativne imunoglobulinske sekvence može da sadrži razlike u aminokisellinama u poredjenju sa germinativnom sekvencom, zbog, na primer, somatskih mutacija koje su normalne ili namernog uvodjenja na mesto usmerene mutacije. Medjutim, selektovano humano antitijelo ima tipično najmanje 90% homologije sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira humani germinativni imunoglobullinski gen i sadrži aminokiselinske ostatke koji identifikuju humano antitijelo kao humano kada se uporedjuje sa germinativnim imunogluobulinskim aminikiselinskim sekvencama drugih vrsta (npr., mišjim germinativnim sekvencama). U odredjenim slučajevima, humano antitijelo može da ima najmanje 60%. 70%, 80%, 90%, ili najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98% ili 99% homologije sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira germinativni imunoglobulinski gen. Najčešće, humano antitijelo izvedeno iz odredjene humane germinativne sekvence će pokazati ne više od 10 razlika u aminokiselinama u odnosu na aminoikiselinsku sekvencu koju kodira humani germiantivni gen za imunoglobuline. U odredjenim slučajevima, humano antitijelo može da priakže ne više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2 ili 1 različiitu aminikiselinu u odnosu na aminikiselinsku sekvencu koju kodira germiantivni gen za imunoglobuline.

Homologa antitijela

U pak jednom drugom izvodjenju, antitijelo iz pronalaska ima kompletnu aminokiselinsku sekvencu teškog i lakog lanca; kompletne nukleotidne sekvence teškog i lakog lanca, nukleotidne sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, ili aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, koje su homologne sa aminokiselinskim i nukleotidnim sekvencama antitijela ovde opisanih, gde anatitela zadržavaju željene funkcionalne osobine neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije iz Pronalaska.

Na primer, u pronalasku je opisano izolovano monoklonsko antitijelo, ili antigen-vezujući deo antitijela, koje obuhvata VH region i VL region, gde je: VH region se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% homologije sa aminikiselinskom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 2-20 i 119; VL region se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% homologije sa aminikiselinskom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39 i 118; antitijelo se specifično vezuje za DKK1 i/ili DKK1/4 i antitijelo pokazuje najmanje jednu od sledećih funkcionalnih osobina: antitijelo neutralizuje vezivanje DKK1 proteina za LRP6, Fz i/ili Krm ili antitijelo neutrazuje vezivanje DKK4 proteina za LRP, Fz i/ili Krm.

U daljem primeru, pronalazak opisuje izolovano monoklonsko antitijelo ili antigen-vezujući deo antitijela, koje se sastoji od kompletnog teškog lanca i kompletnog lakog lanca, gde se kompletan teški lanac sastoji od aminokisellinske sekvence koja ima najmanje 80% homologije sa aminokiselinskom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 115-117; kompletan laki lanac se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% homologije sa aminokiselinskom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 111-114; antitijelo se specifično vezuje za DKK1 i antitijelo pokazuje najmanje jednu od sledećih funkcionalnih osobina: antitijelo inhibira vezivanje proteina DKK1 za receptor DKK1 ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava osteolizu ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava osteolitičke lezije ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava maligni tumor.

U drugom primeru, pronalazak opisuje izolovano monoklonsko antitijelo ili antigen-vezujući deo antitijela, koje se sastoji od kompletnog teškog lanca i kompletnog lakog lanca, gde se kompletan teški lanac sastoji od nukleotidne sekvence koja je najmanje 80% homologna sa nukleotidnom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 101-103; kompletan laki lanac se sastoje od nukleotidne sekvence koja je najmanje 80% homologna sa nukleotidnom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 97-100; antitijelo se specifično vezuje za DKK1 i antitijelo pokazuje najmanje jednu od sledećih osobina: antitijelo inhibira vezivanje proteina DKK1 za receptor DKK1 ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava osteolizu ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava osteolitičke lezije ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava maligni tumor.

U drugom primeru, pronalazak opisuje izolovano monoklonsko antitijelo ili antigen-vezujući deo antitijela koje je optimizovano za ekspresiju u ćeliji, koje se sastoji od kompletnog teškog lanca i kompletnog lakog lanca, gde se: kompletan teški lanac sastoji od nukleotidne sekvence koja ima najmanje 80% homologije sa nukleotidnom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 108-110; kompletan laki lanac sastoji od nukleotidne sekvence koja ima najmanje 80% homologije sa nukleotidnom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 104-107; antitijelo se specifično vezuje za DKK1 i antitijelo pokazuje najmanje jednu od sledećih osobina: antitijelo inhibira vezivanje proteina DKK1 za receptor DKK1 ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava osteolizu ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava osteolitičke lezije ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava maligni tumor.

U drugom primeru, pronalazak opisuje izolovano monoklonsko antitijelo ili antigen-vezujući deo antitijela koje je optimizovano za ekspresiju u ćeliji, koje se sastoji od VH regiona i VL regiona, gde se: kompletan teški lanac sastoji od nukleotidne sekvence koja ima najmanje 80% homologije sa nukleotidnom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 121; kompletan laki lanac sastoji od nukleotidne sekvence koja ima najmanje 80% homologije sa nukleotidnom sekvencom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 120; antitijelo se specifično vezuje za DKK1 i antitijelo pokazuje najmanje jednu od sledećih osobina: antitijelo inhibira vezivanje proteina DKK1 za receptor DKK1 ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava osteolizu ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava osteolitičke lezije ili antitijelo inhibira vezivanje za receptor DKK1 i tako sprečava ili ublažava maligni tumor.

U različitim izvodjenjima, antitijelo može da pokazuje jednu illi više, dve ili više ili tri od funkcionalnih osobina o kojima je diskutovanmo u gornjem tekstu. Antitijelo može da bude na primer, humano antitijelo, humanizovano antitijelo ili himerno antitijelo.

U ovom tekstu, procenat homologije izmedju dve aminokiselinske ili nukleotidne sekvence označava isto što i procenat identičnosti izmedju dve sekvence. Procenat identičnosti izmedju dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele dve sekvence (tj., % homologije = # identičnih pozicija/ ukupan # pozicija x 100), uzimajući u obzir broj neuklopljenih segmenata i dužine svakog neuklopljenog segmenta, koje se moraju uvesti za optimalno poravnavanje dve sekvence. Poredjenje sekvenci i odredjivanje procenta homologije izmedju dve sekvence je moguće postići korišćenjem matematičkih algoritama, kao što je to jednim delom opisano u primerima u tekstu ispod.

Procenat homologije izmedju dve aminokiselinske sekvence može da se odredi koristeći algoritam E. Meyers i W. Miller (Comput. Appl. Biosc., 4:11-17, 1988) koji je ugradjen u program ALIGN (verzija 2.0), uz pomoć PAM120 tabele težine ostatka, sa penalom dužine neuklopljenog segmenta od 12 i od 14. Osim toga, procenat homoloogije izmedju dve aminokiselinske sekvence moguće je odrediti pomoću Needleman i Wunsch (J. Mol; Biol. 48:444.453, 1970) algoritma koji je ugradjen u program GAP u okviru GCG softverskog paketa (dostupno na http://www.gcg.com), koristeći ili Blossom 62 matricu, ili PAM250 matricu i težinu neuklopljenog segmenta 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i težinu dužine 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.

Osim toga ili s druge strane, proteinska sekvenca ovog pronalaska može se koristiti i dalje kao "sekvenca za traženje" (quiery sequence) kako bi obavili pretraživanje javnih baza podataka, da bi, na primer, identifikovali srodne sekvence. Ovakva pretraživanja je moguće obaviti pomoću programa XBLAST (verzija 2.0) autora Altschul, i sar., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10. BLAST proteinska pretraživanja moguće je uraditi sa programom XBLAST, "skore" = 50, "worldlength" = 3 kako bi dobili aminokiselinske sekvence koje su homologne sa molekulima antitijela iz pronalaska. Da bi dobili poravnanvanje neuklopljenih segmenata u svrhe uporedjivanja, može se koristiti Gapped BLAST, kao što je to opisano kod Altschul i sar., 1997 Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402. Kada se koriste programi BLAST i Gapped BLAST , moguće je koristit default parametre (npr., XBLAST i NBLAST). Videti http://www.ncbi.nhn.nih.gov.

Antitijela sa konzervisanim modifikacijama

U odredjenim izvodjenjima, antitijelo iz pronalaska ima VH region koji se sastoji od CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence i VL region koji se sastoji od CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence gde jedna ili više ovih CDR sekvenci imaju tačno odrdjene aminokiselinske sekvence bazirane na osnovu antitijela opisanih u ovom pronalasku ili konzervisanih modifikacija ovih antitijela i gde antitijela zadržavaju željene funkcionalne osobine neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije iz pronalaska. Prema tome, pronalazak opisuje izolovano monoklonsko antitijelo, ili antigen-vezujući deo antitijela, koji se sastoji od VH regiona koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, gde se: VH region u CDR1 predstavlja sekvence koje se sastoje od aminokiselinskih sekvenci iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56 i njihove konzervisane modifikacije; VH region u CDR2 predstavlja sekvence koje se sastoje od aminokiselinskih sekvenci iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NOs: 2-20, 57-64 i njihove konzervisane modifikacije; VH region u CDR3 predstavlja sekvence koje se sastoje od aminokiselinskih sekvenci iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NOs: 2-20, 65-72 i njihove konzervisane modifikacije; VL region u CDR1 predstavlja sekvence koje se sastoje od aminokiselinskih sekvenci iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NOs: 21-39, 73-80 i njihove konzervisane modifikacije; VL region u CDR2 predstavlja sekvence koje se sastoje od aminokiselinskih sekvenci iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NOs: 21-39, 81-88 i njihove konzervisane modifikacije; VL region u CDR3 predstavlja sekvence koje se sastoje od aminokiselinskih sekvenci iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NOs: 21-39, 89-96 i njihove konzervisane modifikacije; antitijelo se specifično vezuje za DKK1; i antitijelo ispoljava najmanje jednu od sledećih funkcionalnih osobina: antitijelo inhibira vezivanje proteina DKK1 za receptor DKK1 ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući osteolizu ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući osteolitičke lezije ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući maligni tumor.

U različitim izvodjenjima, antitijelo može da ispoljava jednu ili više, dve ili više ili tri ili više funkcionalnih osobina koje su gore nabrojane. Ovakva antitijela mogu, na primer, da budu humana antitijela, humanizovana antitijela ili himerna antitijela.

U drugim izvodjenjima, antitijelo iz pronalaska ima kompletnu sekvencu teškog lanca i kompletnu sekvencu lakog lanca, gde jedna ili više ovih sekvenci imaju tačno odrdjene aminokiselinske sekvence bazirane na osnovu antitijela opisanih u ovom pronalasku ili konzervisanih modifikacija ovih antitijela i gde antitijela zadržavaju željene funkcionalne osobine neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije iz pronalaska. Shodno tome, u pronalasku je opisano izolovano monoklonsko antitijelo ili njjegov antigen-vezujući deo, koji se sastoji od kompletnog teškog lanca i kompletnog lakog lanca, gde: kompletan teški lanac ima aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 115-117 i njihove konzervisane modifikacije; i kompletni laki lanac ima aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 111-114 i nihove konzervisane modifikacije; antitijelo se specifično vezuje za DKK1; i antitijelo ispoljava najmanje jednu od sledećih funkcionalnih osobina: antitijelo inhibira vezivanje proteina DKK1 za receptor DKK1 ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući osteolizu ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući osteolitičke lezije ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući maligni tumor.

U drugim izvodjenjima, antitijelo iz pronalaska optimizovano za ekspresiju u ćeliji ima sekvencu VH regiona i sekvencu VL regiona, gde jedna ili više ovih sekvenci imaju tačno odrdjene aminokiselinske sekvence bazirane na osnovu antitijela opisanih u ovom pronalasku ili konzervisanih modifikacija ovih antitijela i gde antitijela zadržavaju željene funkcionalne osobine neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije iz pronalaska. Shodno tome, u pronalasku je opisano izolovano monoklonsko antitijelo ili njjegov antigen-vezujući deo, koji se sastoji od VH regiona i VL regiona, gde: VH region ima aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NO: 119 i njihove konzervisane modifikacije; VL region ima aminokiselinske sekvence iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 118 i nihove konzervisane modifikacije; antitijelo se specifično vezuje za DKK1; i antitijelo ispoljava najmanje jednu od sledećih funkcionalnih osobina: antitijelo inhibira vezivanje proteina DKK1 za receptor DKK1 ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući osteolizu ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući osteolitičke lezije ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući maligni tumor.

U ovom tekstu se terminom "konzervisane modifikacije sekvence" označavaju aminokiselinske modifikacije koje ne utiču na ili ne menjaju značajno vezivne osobine anititela koje sadrži ove aminokiselinske sekvence. Ovakve konzervisane modifikacije uključuju supstituciju aminokiselina, adicije i delecije. Modifikacije mogu d se uvedu u antitijelo o kojem piše pronalazak primenom standardnih tehnika koje su poznate u oblasti, kao što su usmerena mutageneza i PCR-om posredovana mutageneza.

Konzervisane aminokiselinske supstitucije su one kod kojih je aminokiselinski ostatak zamenjen sa aminikiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koje imaju slične bočne lance su definisane u oblasti. U ove aminokiselinske familije se ubrajaju aminokiseline sa baznim bočnim lancem (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancem (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), sa nenaelektrisanim polarnim bočnim lancem (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), sa nepolarnim bočnim lancem (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), sa beta-razgranatim bočnim lancem (npr., treonin, valin, izoleucin) i sa aromatičnim bočnim lancem (npr., tirozin, fenilalnin, triptofan, histidin). Dakle, jedan ili više aminokiselinskih ostataka u okviru CDR regiona antitijela koje navodi pronalazak, moguće je zameniti sa drugim aminokiselinskim ostacima iz iste familije bočnog lanca i izmenjeno antitijelo može da se testira da li je zadržalo funkciju koristeći funkcionalne testove koji su ovde opisani.

Antitijela koja se vezuju za isti epitop kao i neutrališuća anti-DKK1/4 kompozicija iz pronalaska

U drugom izvodjenju u pronalasku je opisano antitijelo koje se vezuje za isti epitop kao što se vezuju različita neutrališuća anti-DKK1/4 kompozicije iz pronalaska ovde opisana. Ovakva dodatana antitijela je moguće identifikovati na osnovu njihove sposobnosti da unakrsno kompetiraju (npr., da kompetitivno inhibiraju vezivanje, sa statističkom značajnošću) sa drugim antitijelima iz pronalaska u standardnim DKK1 testovima kojima se meri vezivanje. Sposobnost test antitijela da inhibira vezivanje antitijela iz ovog pronalazaka za humani DKK1 pokazuje da test antitijelo može da kompetira sa tim antitijelom za vezivanje sa humanim DKK1; takvo antitijelo može da, prema mogućoj hipotezi, se vezuje za isti ili srodan (npr., strukturno sličan ili prostorno blizak) epitop na humanom DKK1 kao antitijelo sa kojim kompetira. U odredjenom izvodjenju, antitijelo koje se vezuje za isti epitop na humanom DKK1 kao antitijela iz ovog pronalaska je humano antitijelo. Takva humana monoklonska antitijela se mogu dobiti i izolovati kao što je opisano u Primerima.

Antitijela s teškim lancem, antitijela kod familije kamelida

Proteini antitijela koji se dobijaju od pripadnika familije kamila i dromedarije (Camelus bactrianus i Camelus dromaderius), uključujući i prpadnike iz Novog sveta kao što su razne vrste lama (Lama paccos, Lama glama i Lama vicugna) su okarakterisani u odnosu na veličinu, strukturnu složenost i antigenost kod ljudi. Neka IgG antitijela iz ove familije sisara, prirodno nemaju laki lanac, te su prema tome strukturno različita od tipičnog četvorolančanog tetramera, strukture koja ima dva teška i dva laka lanca, karakteristična za antitijela iz drugih životinja. Videti PCT/EP93/02214 (WO94/04678 puklikovano 3.maja 1994).

Region antitijela kod kamelida koji je mali jednostruki varijabilni region identifikovan kao VHH je moguće dobiti manipulacijama genskog inženjerstva da bi dobili mali protein koji ima veliki afinitet prema ciljnom molekulu, što daje protein male molekulske mase poreklom od antitijela poznat kao "nanotelo kamelide". Videti američku prijavu patenta broj 5,759,808 izdatu 2.juna 1998; videti takodje Stillemans, B. i sar., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. i sar. 2003 Nature 424: 783-788; Pleshberger, M. i sar. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. i sar. 2002 Int J Cancer 89:456-62; i Lauwereys, M. i sar. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Genskim inženjeringom konstruisane biblioteke kamelide antitijela i fragmenata antitijela su dostupne na tržištu, na primer, kod Ablynx, Ghent, Belgium. Kao što je to moguće sa drugim antitijelima ne-humanog porekla, aminikiselinska sekvenca kamelide antitijela moguće je rekombinantno izmeniti u cilju dobijanja sekvence koja najbliže predstavlja humanu sekvencu, tj., nanotela je moguće humanizovati. Dakle, prirodno niska antigenost kamelide anatitela prema ljudima se može dodatno smanjiti.

Molekulska masa kamelide antitijela je približno deset puta manja od molekula humanog IgG i protein ima fizički poluprečnik od tek nekoliko nanometara. Jedna posledica malih dimenzija je sposobnost kamelide nanotela da se vezuju za mesta koja poakzuju antigenost, a koja su funkcionalno nevidljiva za veće proteine antitijela, tj., kamelide nanotela su korisna kao reagensi za detekciju antigena koja su inače skrivena kada se primenju klasične imunološke tehnike i kao potencijalna terapijska sredstva. Mada, još jedna posledica male dimenzije je da kamelide nanotelo može da deluje inhibitorno kao rezultat vezivanja za specifično mesto u žljebu ili u uskoj pukotini ciljnog proteina, te zbog toga može da posluži u svojstvu kojim bliže predstavlja funkciju klasičnog leka male molekulske mase u odnosu na klasično antitijelo.

Mala molekulska masa i kompaktna veličina dalje rezultuje velikom termostabilnošću kamelide nanotela, koja su stabilna u ekstremnim pH uslovima i uslovima proteolitičke digestije, a pritom imaju slabu antigenost. Druga je posledica da se kamelide nanotela lako uklanjaju iz cirkulacije u tkiva, pa čak prolaze krvno-moždanu barijeru i moguće je tretrirati bolesti koje zahvataju nervno tkivo. Nanotela mogu dodatno da olakšaju transport lekova kroz krvno-moždanu barijeru. Videti američku patentnu prijavu 20040161738 koja je objavljena 19. avgusta 2004. Ove osobine u kombinaciji sa malom antigenošću kod ljudi ukazuju na veliki terapijski potencijal. Dalje, ove molekule je moguće u potpunosti eksprimirati u prokariotskim ćelijama kao što je E. coli i eksprimiraju se kao fuzionisani proteini sa bakteriofagima i potpuno su funkcionalni.

Prema tome, protagonista ovog pronalaska je kamelide antitijelo ili nanotelo koje ima veliki afinitei prema DKK1. U odredjenim izvodjenjima iz pronalaska, kamelide antitijelo ili nanotelo je prirodno produkovano u telu životinje (kamelide), tj., produkuje ga kamelida nakon imunizacije sa DKK1 ili peptidnim fragmentom ovog molekula, korišćenjem tehnika koje su ovde opisane za druga antitijela. Druga mogućnost je da se inženjeringom dobije neutrališuće anti-DKK1/4 kamelide nanotelo, tj., da se produkuje selekcijom iz, na primer, fagne biblioteke koja prikazuje na odgovarajući način mutagenezom modifikovane proteine koji potiču od kamelide nanotela korišćenjem procedure panninga sa ciljnim molekulom DKK1 i/ili DKK4, kao što je to opisano u daljem tekstu. Inženjeringom konstruisana nanotela mogu se dalje prilagoditi potrebama genskim inženjeringom tako, da imaju poluživot u telu recipijenta od 45 minuta do dve nedelje.

Osim kod antitijela kamelida, antitijela koja imaju samo teški lanac se prirodno javljaju i kod drugih životinja, uključujući i, pored ostalih, npr., neke vrste ajkula i "pufferfish" (videti, npr., PCT izdanje WO 03/014161). Iako varijabilni domeni koji se dobijaju od takvih antitijela koja imaju samo teški lanac, mogu da se koriste u pronalasku, poželjna upotreba antitijela koja imaju teški lanac obijena iz kamelida i/ili njihove sekvence variajbilnog domena je ipak optimizacija, humanizacija, humaneering i tome slično i/ili za kliničku upotrebu kod ljudi.

Inženjeringom konstruisana i modifikovana antitijela

Antitijelo iz pronalaska se može dalje dobijati korišćenjem antitijela koje ima jednu ili više VH i/ili VL sekvenci koje su ovde prikazane kao početni materijal kako bi konstruisali modifikovano antitijelo, gde modifkovano antitijelo može imati promenjene osobine u odnosu na polazno antitijelo. Antitijelo je moguće konstruisati modifikovanjem jednog ili više ostataka unutar jednog ili oba vezujuća regiona (npr., VH i/ili VL), na primer, u okviru jednog ili više CDR regiona i/ili u okviru jednog ili više framework regiona. Pored toga ili nasuprot tome, antitijelo je moguće konstruisati modifikacijom ostataka u okviru konstantnog regiona, na primer da bi promernili efektorsku funkciju(e) antitijela.

Jedna vrsta inženjeringa variajbilnog regiona koju je moguće sprovesti je kalemljenje CDR-a. Antitijela interaguju sa ciljnim antigenima predominantno preko aminokiselinskih ostataka koji su smešteni u šest regiona koji odredjuju komplementarnost (CDR-i) teškog i lakog lanca. Iz ovog razloga, aminokiselinske sekvence u CDR regionima imaju veći diversitet kad se medjusobno uporedjuju pojedinačna antitijela u odnosu na sekvence van CDR-a. Kako su sekvence u CDR odgovorne za većinu interakcija antitijelo-antigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitijela koja imitiraju osobine specifičnih prirodnih antitijela konstruisanjem vektora za ekspresiju koji obuhvataju CDR sekvence koje potiču iz specifičnog prirodnog antitijela koje su pridodate-nakalemljene na framework sekvence iz drugog antitijela sa različitim osobinama (videti, npr., Riechmann, L. i sar., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. i sar., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. i sar., 1989 Proc. Natl. Acad. Videti U.S.A. 86:10029-10033; američki patent broj 5,225,539 "to winter" i američki patenti broj 5,530,101; 5,585, 089; 5,693,762 i 6,180,370 od Queen i sar.)

Prema tome, u drugom izvodjenju pronalazak se primenjuje na izolovano monoklonsko antitijelo ili antigen-vezujući deo antitijela, koji se sastoji od VH regiona koji se sastoji od CDR1 sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56; CDR2 sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 2-20 i 57-64; CDR3 sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 2- 20 i 65-72; i od VL regiona koji ima CDR1 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39 i 73-80; CDR2 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39 i 81-88; i CDR3 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39 i 89-96. Dakle, ovakva antitijela sadrže VH i VL CDR sekvence monoklonskih antitijela, mada mogu da sadrže i različite framework sekvence koje potiču iz ovih antitijela.

Ove framework regione moguće je dobiti iz javnih DNK baza podataka ili iz objavljenih referenci koje sadrže sekvence germinativnog gena za antitijelo. Na primer, germinativne DNK sekvence gena za humani teški i VL region se mogu naći u "VBase" bazi podataka humane germinativne sekvence (dostupna preko Interneta na www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), kao i kod Kabat, E. A., i sar., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M. i sar., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; i Cox, J. P. L. i sar., 1994 Eur.J. Immunol. 24:827-836; sadržaj svake od njih je uključen u ovaj tekst navedenom referencom.

Primer za framework sekvence koje se koriste za inženjering antitijela iz pornalaska su one koje su strukturno slične framework sekvencama koje dele odabrana antitijela iz pronalaska, npr., konsenzus sekvence i/ili framework sekvence koje imaju monoklonska antitijela iz pronalaska. VH CDR1, 2 i 3 sekvence i VL CDR1, 2 i 3 sekvence, je moguće nakalemiti na framework regione koji imaju identičnu sekvencu kao ona u germinativnom genu za imunoglobuline iz kog framework sekvenca potiče ili CDR sekvence je moguće nakalemiti na framework regione koji sadrže jednu ili više mutacija u poredjenju sa germinativnim sekvencama. Na primer, nadjeno je da je u odredjenim slučajevima povoljno mutacijom izmeniti ostatke unutar framework regiona kako bi zadržali ili povećali antigen-vezujuću sposobnost antitijela (videti npr., američke patente broj: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 od Queen i sar.).

Druga vrsta inženjeringa variajbilnog regiona, je da se uvodjenjem mutacija promene aminokiselinski ostaci unutar VH i/ili VL CDR1, CDR2 i/ili CDR3 regiona i na taj način poboljša jedna ili više osobina koje su važne za vezivanje (npr., afinitet antitijela) antitijela od interesa, poznatije kao "afinitetno sazrevanje". Moguće je uraditi usmerenu mutagenezu ili PCR-posredovanu mutagenezu i tako uvesti mutacije (jednu ili više) i uticati na vezivanje antitijela, ili druge funkcionalne osobine od interesa, koje je moguće odredjivati u in vitro ili in vivo testovima kao što je to ovde opisano i detaljnije u Primerima. Moguće je uvesti konzervisane modifkacije (kao što je diskutovano u gornjem tekstu). Mutacije mogu da budu supstituisane aminokiseline, adicije i delecije. Šta više, najčešće se promeni ne više od jednog , dva, tri, četiri ili pet ostataka unutar CDR regiona.

Shodno tome, u drugom izvodjenju, pronalazak opisuje izolovanu neutrališuću anti-DKK1/4 kompoziciju ili antigen-vezujuće delove kompozicije, koja se sastoji od VH regiona koji ima: VH CDR1 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56 ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u odnosu na SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56; VH CDR2 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 2-20 i 57-64; VH CDR3 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 2-20 i 65-72 ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u odnosu na SEQ ID NOs: 2-20 i 64-72; VL CDR1 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 21-39 i 73-80 ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u odnosu na SEQ ID NOs: 21-39 i 73-80; VL CDR2 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 21-39 i 81-88 72 ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u odnosu na SEQ ID NOs: 21-39 i 81-88 i VL CDR3 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 21-39 i 89-96 ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u odnosu na SEQ ID NOs: 21-39 i 89-96;

U inženjeringom konstruisana antitijela iz pronalaska se ubrajaju i antitijela kod kojih su modifikovani framework ostaci koji pripadaju VH i/ili VL, npr., da bi poboljšali svojstva antitijela. Najčešće, takve framework modifikacije imaju za cilj da umanje antigenost antitijela. Na primer, jedna mogućnost je da se jedan ili više framework ostataka "unazad mutiraju" (back mutate) u odgovarajuću germinativnu sekvencu. Tačnije, antitijelo koje je podleglo somatskoj mutaciji može da sadrži framework ostatke koji se razlikuju od germinativne sekvence iz koje je antitijelo izvedeno. Ove ostatke je moguće identifikovati uporedjivanjem framework sekvenci antitijela sa germinativnim sekvencama iz kojih je izvedeno antitijelo.Da bi vratili unazad sekvence iz framework regiona u njihovu germinativnu konfiguraciju, somatske mutacije je moguće unazad mutirati tako da izmenama budu što sličnije germinativnoj sekvenci, putem usmerene mutageneze ili PCR-posredovane mutageneze. Predvidjeno je da ova "unazad mutirana" antitijela takodje budu obuhvaćena pronalaskom.

Jedna druga moguća vrsta modifikacije framework regiona podrazumeva mutiranje jednog ili više ostataka iz sastava framework regiona ili čak iz sastava CDR regiona, da bi uklonili epitope koje prepoznaju T-ćelije i na taj način umanjili potencijalnu imunogenost antitijela. Ovaj pristup se navodi kao "deimunizacija" i detaljno je opisan u američkom patentu broj 20030153043 od Carr i sar.

Osim pomenutih modifikacija unutar framework ili CDR regiona, može da ih zameni ili da se pridoda i inženjerig antitijela iz pronalaska koji podrazumeva modifikacije u Fc regionu, najčešće da bi promenili jednu ili više funkcionalnih osobina antitijela, kao što je poluživot u serumu, fiksiranje komplementa, vezivanje preko Fc-receptora i/ili antigen-zavisnu ćelijsku citotoksičnost. Osim toga, antitijelo iz pronalaska je moguće i hemijski modifikovati (npr., jednu ili više hemijskih vrsta je moguće vezati za antitijelo) ili da bude modifikovano menjanjem glikozilovanosti, ponovo da bi promenili jednu ili više funkcionalnih osobina antitijela. Svako od ovih izvodjenja je detaljnije opisano u tekstu ispod. Prebrojavanje ostataka u Fc regionu je prema EU indeksu od Kabat-a.

U jednom izvodjenju, region zgloba u CH1 je modifikovan tako da se promeni broj cisteinskih ostataka u regionu zgloba, npr., da se smanji poveća. Ovaj pristup je detaljno opisan u američkom patentu broj 5,677,425 od Bodmer-a i sar. Broj cisteinskih ostataka u regionu zgloba CH1 je moguće promeniti tako da, npr., olakšava udruživanje lakih i teših lanaca ili da povećava ili smanjuje stabilnost antitijela.

U jednom drugom izvodjenju, Fc region zgloba u antitelu je mutiran tako da smanjuje biološki poluživot antitijela. Tačnije, uvedene su jedna ili više mutacija aminokiselina u regionu dodirnih površina CH2-CH3 domena u fragmentu Fc-zgloba tako da antitijelo ima oštećeno vezivanje za stafilokokni protein A (SpA) u odnosu na vezivanje nativnog domena Fc-zgloba. Ovaj pristup je detaljnije opisan u američkom patentu broj 6,165,745 od Ward-a i sar.

U drugom izvodjenju, antitijelo je modifikkovano tako mu je povećan biološki poluživot. Mogući su različiti pristupi. Na primer, jedna ili više od sledećih se može uvesti: T252L, T254S, T256F, kao što je to opisano u američkom patentu broj 6,277,375 od Ward-a. Druga mogućnost da se poveća bioški poluživot antitijela jeste uvodjenje promena unutar CH1 ili CL regiona tako da sadrže epitop za vezivnanje ("salvage") receptora čistača, koji je preuzet iz dve petlje iz CH2 domena u Fc regionu IgG, kao što je to opisano u američkim patentima broj 5,869,046 i 6,121,022 od Presta i sar.

U pak, drugim izvodjenjima, Fc region je promenjen zamenom najmanje jednog aminokisellinskog ostatka sa drugim različitim aminokiselinskim ostatkom kako bi promenili efektorske funkcije antitijela. Na primer, moguće je zameniti jednu ili više aminokiselina sa različitim aminokiselinskim ostacima tako da antitijelo ima izmenjen afinitet za efektorski ligand, ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost matičnog antitijela. Efektorski ligand prema kom je afinitet izmenjen, može da bude, naprimer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je detaljnije opisan u američkim patentima broj 5,624,821 i 5,648,260 oba od Winter-a i sar.

U drugom izvodjenju, jedna ili više aminokiselina koje su selektovane iz aminokiselinksih ostataka može da se zameni sa drugim različitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitijelo ima izmenjen C1q vezujući region i/ili smanjenu ili ukinutu komplement zavisnu citotoksičnost (complement dependent cytotoxicity-CDC). Ovaj pristup je detaljnije pisan u američkom patentu broj 6,194,551 od Idusogie i sar.

U drugom izvodjenju, jedna ili više aminokiselinskih ostataka su promenjeni tako da izmene sposobnost antitijela da fiksiraju komplement. Ovaj pristup je opisan detaljnije u patentnoj prijavi WO 94/29351 od Bodimer-a i sar.

U drugom izvodjenju, Fc region je modifikovan tako da poveća sposobnost antitijela da posreduje antitijelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) i/ili da poveća afinitet antitijela prema Fcγ receptoru modifikacijom jedne ili više aminokiselina. Ovaj pristup je dalje opisan u patentnoj prijavi WO 00/42072 od Presta-e. Štaviše, vezivna mesta za FcγRI, FcγRII, FcγRIII i FcγRn, na IgG1 su mapirana i već su opisane varijante sa poboljšanim vezivanjem (videti Shields, R.L i sar., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604).

U drugom pak izvodjenju, modifikovana je glikozilacija antitijela. Na primer, moguće je napraviti aglikozilovano antitijelo (npr., antitijelo kome nedostaje glikozilacija). Glikozilaciju je moguće promeniti, tako da, na primer, povećava afinitet antitijela prema "antigenu". Ovakve ugljenohidratne modifikacje je moguće napraviti na više načina; uvodjenjem promena u sekvencu antitijela na jednom ili više mesta glikozilacije. Na primer, moguće je uraditi jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje imaju za rezultat eliminisanje jednog ili više framework mesta za glikozilaciju u varijabilnom regionu da bi na taj način eliminisali glikozilaciju na tom mestu. Ovakva aglikolizacija može da poveća afinitet anititela prema antigenu. Ovaj pristup je detaljnije opisan u američkim patentima broj 5,714,350 i 6,350,861 od Co-a i sar.

Osim toga, ali i zajedno s tim, moguće dobiti antitijelo sa promenjenim tipom glikozilacije, tako da hipofukozilovana antitijela koja imaju smanjen broj fukozil-ostataka ili antitijelo koje ima povećane bisektujuće GlcNac strukture. Pokazano je da ovakvi promenjeni obrasci glikozilovanja povećavaju ADCC sposobnost antitijela. Ovakve ugljenohidratne modifikacije je moguće napraviti, na primer, ekspresijom antitijela u ćeliji domaćina koja ima izmenjenu glikozilacionu mašineriju. U oblasti su već opisani tipovi ćelija sa izmenjenom glikozilacionom mašinerijom i mogu da se koriste kao ćelija domaćin za ekspresiju rekombinantnih antitijela iz pronalaska i da na taj način produkuju antitijela sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, EP 1,176,195 od Hang-a i sar. su opisali ćelijsku liniju sa funkcionalno onemogućenim FUT8 genom, koji kodira fukozil-transferazu, tako da antitijela eksprimirana u takvoj ćeliji imaju hipofukozilaciju. U patentnoj prijavi WO 03/035835 od Presta-e, su opisali varijantu ćelijske linije CHO, Lecl3 ćelije, sa smanjenom sposobnošću da vezuju fukozu za Asn(297)-vezane ugljene hidrate, i takodje dovodi do hipofukozilacije antitijela eksprimiranih u toj ćeliji domaćinu (videti takodej Shields, R.L. i sar., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). U patentnoj prijavi WO 99/54342 od Umana-e i sar. su opisane ćelijske linije koje su modifikovane da eksprimiraju glikoprotein-modifikujuće glikozil-transferaze (npr., beta(1,4)-N acetilglukozaminiltransferaza III (GnTIII)) tako da antitijela koja su eksprimirana u inženjeringom modifikovanim ćelijskim linijama pokazuju povećane bisektujuće GlcNac strukture koje za posledicu povećavaju ADCC aktivnost ovih antitijela (videti takodje Umana i sar., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

Druga vrsta modifikacija antitijela koja se ovde navode, a koja se razmatra u pronalasku je pegilacija. Moguće je pegilovati antitijela, da bi, na primer, povećali biološki (npr., u serumu) poluživot antitijela. Da bi uradili pegilaciju antitijela, potrebno je da antitijelo ili fragment antitijela, reaguje sa polietilenglikolom (PEG), i da se dobije reaktivni estarski ili aldehidni derivat PEG-a, pod uslovima koji omogućavaju da se jedna ili više PEG grupa veže za antitijelo ili fragment antitijela. Pegilaciju je moguće izvesti reakcijom acilovanja ili reakcijom alkilovanja sa reaktivnim molekulom PEG-a (ili analogni rekativni polimer rastvorljiv u vodi). U ovom tekstu naziv "polietilenglikol" označava sve oblike PEG-a koji se koriste za derivatizaciju drugih proteina, kao što su mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi polietilenglikol ili polietilenglikol-maleimid. U odredjenim izvodjenjima, antitijelo koje treba da se pegiluje je aglikozilovano antitijelo. Postupci za pegilovanje proteina su poznati u oblasti i moguće ih je primeniti na antitijela iz pronalaska. Videti na primer, EP 0 154 316 od Nishimura-e i sar. i EP 0 401 384 od Ishikawa-e i sar.

Neimunoglobulinska platforma (scaffold)

Na raspolaganju je širok spektar imunoglobulinskih strukturnih platformi i potpornih okvira koji se mogu upotrebiti za generisanje antitijela sve dok rezultujući polipeptid poseduje najmanje jedan vezujući region koji je specifičan prema ciljnom proteinu. U ove imunoglobulinske strukturne platforme i potporne okvire se ubrajaju pet osnovnih idiotipova humanih imunoglobulina, ili fragmenti ovih imunoglobulina (kao što su oni o kojima je bilo reči u ovom tekstu na drugom mestu), kao i imunoglobulini drugih životinjskih vrsta, koji su poželjno je, na neki način humanizovani. Antitijela sa jednim teškim lancem, kao što su ona koja su identifikkovana kod familje kamelida i/ili ajkula su od posebnog interesa u ovom smislu. Stručnjaci u oblasti stalno otkrivaju nove imunoglobulinske strukturne platforme i potporne okvire, kao i od njih izvedene fragmente.

U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na generisanje neimunoglobulinskih antitijela koja nemaju imunoglobulinsku strukturnu platformu, a na koju je moguće nakalemiti CDR regione iz pronalaska. Predvidjeno je korišćenje poznatih i budućih neimunoglobulinskih strukturnih platformi, sve dok rezultujući molekul poseduje najmanje jedan vezujući region koji je specifičan prema ciljnom proteinu sa SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 122. Ovakva jedinjenja su u ovom tekstu poznata kao "polipeptid koji sadrži region specifičan za ciljno mesto". U neimunoglobulinske strukturne platforme i potporne okvire se pored ostalih ubrajaju: adnektini (fibronektin) (Compound Therapeutics, INC., Waltham, MA), ankirin (Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland), domenska antitijela (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) i Ablynx nv (Zwijnaarde, Belgium)), lipokalin (Antikalin) (Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), mali modularni imuno-farmaceutici (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA); maxybodies (Avidia, Inc. (Mountain View, CA)), Protein A (Affibody AG, Sweden) i affilin (gama-kristalin ili ubikvitin) (Scil Proteins GmbH, Halle, Germany).

(i) Adnektini-Compound Therapeutics

Adnektinske potporne platforme imaju za osnovu domen fibronektina tipa III (npr., deseti modul fibronektina tipa III (10 Fn3 domen). Fibronektin tipa III ima 7 ili 8 beta traka koje su rasporedjene u dve beta nabrane ploče, koje se medjusobno tako pakuju da grade jezgro proteina i sadrže još i petlje (analogno CDR regionima) koje povezuju beta trake jednu sa drugom i izložene su rastvaraču. Postoje najmanje tri takve petlje na svakoj ivici sendviča beta nabranih ploča, gde je ivica granica proteina upravna na pravac prostiranja beta traka. (američki 6,818,418).

Ove strukturne platforme na bazi fibronektina nisu imunoglobulini, iako je cela struktura veoma bliska po na činu uvijanja polipeptidnog niza najmanjem funkcionalnom fragmentu antitijela, varijabilnom regionu teškog lanca, koji u IgG molekulu kamila i lama čini kompletnu jedinicu za prepoznavane antigena. Zbog ovakve strukture, neimunoglobulinska antitijela imitiraju antigen-vezujuće osobine, koje su po svojoj prirodi i afinitetu slične osobinama kod antitijela. Ove strukturne paltforme su pogodne za strategiju "loop" randomizacije i "shuffling"-a, u in vitro uslovima, što je veoma slično procesu afinitetne maturacije antitijela in vivo. Ovi molekuli na bazi fibronektina mogu da se koriste kao strukturne platforme tamo gde je moguće zameniti regione petlje sa CDR regionima iz pronalaska, korišćenjem standardnih tehnika kloniranja.

(ii) Ankirin-Molecular Partners

Tehnologija se zasniva na korišćenju proteina sa ponavljajućim modulima izvedenim iz ankirina za dobijanje strukturne paltforme koja treba da nosi variajbilne regione koji mogu da se koriste u vezivanju za različita ciljna mesta. Ankirinski ponavljajući modul je polipeptid koji sadrži 33 aminokiseline i sastoji se od dva anti-paralelna α-heliksa i β ukosnice. Vezivanje varijabilnih regiona je najčešće optimizovana korišćenjem rimbozomske biblioteke.

(iii )Maxybodies/Avimers-Avidia

Avimeri su izvedeni iz proteina koji prirodno sadrže A-domene kao što je LRP-1. Ovi domeni i u prirodi posreduju protein-protein interakcije i kod čoveka je preko 250 proteina strukturno bzirano na A-domenima. Avimeri se sastoje od velikog broja različitih "A-domenskih" monomera (2-10) medjusobno povezanih preko aminokiselinskih linkera. Moguće je napraviti avimere koji se vezuju za ciljni antigen koristeći metodologiju koja je opisana u, na primer, 20040175756; 20050053973; 20050048512; i 20060008844.

(iv) Protein A-Affibody

Ligandi za koje se vezuje Affibody® su mali, jednostavni proteini koji se sastoje od klupka od tri heliksa, koje ima za osnovu strukturnu platformu jedan od IgG-vezujućih domena Proteina A. Protein A je molekul koji se nalazi na površini, izolovan iz bakterije Staphylococcus aureus. Ovaj domen koji je poslužio za strukturnu platformu, ima 58 aminokiselina, od kojih je 13 randomizovano i napravljene su Affibody® biblioteke sa velikim brojem varijanti liganada (videti npr., američki patent 5,831,012). Affibody® molekuli imitiraju antitijela, imaju molekulsku masu od 6kDa, u poredejnju sa molekulskom masom antitijela, koja iznosi 150 kDa. Uprkos svojim malim dimenzijama vezivno mesto molekula Affibody® je slično vezivnom mestu antitijela.

(v) Antikalini-Pieris

Anticalins® su produkti koje je razvila kompanija Pieris ProteoLab AG. Oni su izvedeni iz lipokalina, široko rasprostrranjene grupe malih i robusnih proteina koji su uglavnom uključeni u fiziološki transport i deponovanje hemijski osetljivih ili nerastvornih supstanci. Više prirodnih lipokalina se nalaze u humanim tkivima ili telesnim tečnostima.

Po proteinskoj arhitekturi podsećaju na imunoglobuline, sa hipervariajbilnim petljanma smeštenim povrh rigidnog framework regiona. medjutim, za razliku od antitijela ili rekombinantnih fragmenata antitijela, lipokalini su sastavljenji od jednog polipeptidnog lanca, sa 160 do 180 aminokiselinskih ostataka, što zanči da su tek malo veći od jednog domena imunoglobulina.

Četiri petlje zajedno, koje grade vezivni džep, pokazuju naglašenu strukturnu plastičnost i tolerantne su prema raznolikosti bočnih lanaca. Vezivno mesto je dakle moguće preoblikovati procesima koji su zaštićeni, da bi omogućili prepoznavanje propisanih ciljnih molekula različitih oblika sa velikim afinitetom i specifičnošću.

Jedan protein iz familije lipokalina, bilin-vezujući protein (BBP) od Pieris Brassicae, je upotrebljen za razvijanje antikalina mutagenezom ostataka u regionu četiri petlje. Jedan primer za patentnu priajvu koja opisuje "antikaline" je PCT WO 199916873.

(vi) Affilin-Scil Proteins

Molekuli Affilin™ su mali neimunoglobulinski proteini koji su dizajnirani da imaju specifične afinitete prema proteinima i malim molekulima. Nove molekule Affilin™ je moguće veoma brzo selektovati iz dve biblioteke, od kojih je svaka bazirana na različitim proteinima koi su izvedeni iz strukturnih platformi humanih proteinskih molekula.

Molekuli Affilin™ nemaju nikakvu strukturnu homologiju sa proteinima imuniglobulina. "Scil Proteins" koristi dve strukturne platforme za molekule Affilin™, od kojih je jedna gama kristalin, humani strukturni protein očnog sočiva, a drugi su proteini iz superfamilije "ubikvitina". Obe humane strukturne platforme su veoma mali molekuli, imaju velliku temperaturnu stabilnost i skoro su otporni na promene PH i delovanje supstanci koje denaturišu proetine. Ovako veliku stabilnost imaju najviše zahvaljujući raširenoj strukturi beta nabrane ploče. Primeri za proteine koji su izvedeni iz gama kristalina su opisani u WO200104144 i primeri za proteine srodne "ubikvitinima" su opisani u WO2004106368.

Postupci za konstruisanje antitijela

Kao što je diskutovano u gornjem takstu, anti-DKK1 antitijela sa sekvencama VH i VL ili sa kompletnim sekvencama za teški i laki lanac, mogu se koristiti za dobijanje novih anti-DKK1/4 antitijela modifikovanjem kompletne sekvence teškog lanca i/ili lakog lanca, sekvenci VH i/ili VL ili konstantnih regiona (jednog ili više) koji su za njih vezani. Dakle, u drugom aspektu pronalaska, strukturne osobine anti-DKK1 antitijela iz pronalska su korišćene za dobijanje strukturno srodnih anti-DKK1/4 antitijela koja su zadražala najmanje jednu strukturnu osobinu antitijela iz pronalaska, kao što je vezivanje za humani DKK1 ili DKK4 ili za oba molekula i takodje inhibicija jedne ili više funkcionalnih osobina DKK1 ili DKK4 ili oba molekula.

Na primer, jedan ili više CDR regiona antitijela iz ovog pronalaska, ili varijante dobijene uvodjenejm mutacija, moguće je rekombinantnim kombinacijama sa poznatim framework regionima i/ili drugim CDR regionima napraviti nova, dobijena rekombinantnim inženjeringom, anti-DKK1 antitijela iz pronalaska, kako je to gore diskutovano. Druge vrste modifikacija, uključuju one koje su opisane u prethodnom delu. Početni materijal za primenu postupka inženjeringa su jedna ili više sekvenci VH i/ili VL ovde navedene, ili jedan ili više CDR regiona koji su u njihovom sastavu. Da bi napravili inženjerisano antitijelo, nije neophodno da se stvarno dobije (npr., ekspresijom proteina) antitijelo koje ima jednu ili više sekvenci VH i/ili VL koje poizilaze iz ovog teksta ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Pre bi se moglo reći da je informacija koja je sadržana unutar sekvence iskorišćena kao početni materijal za dobijanje sekvenci "druge generacije", koje su izvedene iz matične sekvence (sekvenci), a onda se naprave "sekvence druge" generacije i eksprimiraju se kao protein.

Prema tome, u jednom drugom izvodjenju, u pronalasku je opisan metod za dobijanje anti-DKK1 antitijela koje se sastoji od: sekvence VH regiona antitijela koja sadrži CDR1 sekvencu iz grupe koju čine: SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56, CDR2 sekvencu iz grupe koju čine: SEQ ID NOs: 2- 20 i 57-64 i/ili CDR3 sekvencu iz grupe koju čine: SEQ ID NOs: 2-20 i 65-72; i sekvence VL regiona antitijela koja sadrži CDR1 sekvencu iz grupe koju čine: SEQ ID NOs: 21-39 i 73-80, CDR2 sekvencu iz grupe koju čine: SEQ ID NOs: 21-39 i 81-88 i/ili CDR3 sekvencu iz grupe koju čine: SEQ ID NOs: 21-39 i 89-96; menjajući najmanje jedan aminokiselinski ostatak iz sekvence VH regiona antitijela i/ili iz sekvence VL regiona antitijela, da bi napravili najmanje jednu izmenjenu sekvencu antitijela ; i ekspresija izmenjene sekvence antitijela u obliku proteina.

Prema tome, u drugom izvodjenju,pronlazak opisuje metod za dobijanje antitijela anti-DKK1 koje se sastoji od: kompletne sekvence teškog lanca antitijela koji ima sekvencu izabranu iz grupe SEQ ID NOs: 115-117; i kompletne sekvence lakog lanca antitijela koji ima sekvencu izabranu iz grupe SEQ ID NOs: 111-114; pritom menjajući najmanje jedan aminokiselinski ostatak iz kompletne sekvence teškog lanca antitijelai/ili kompletne sekvence lakog lanca kako bi napravili najmanje jednu izmenjenu sekvencu antitijela; i ekspresija izmenjene sekvence antitijela u obliku proteina.

U drugom izvodjenju, u pronalasku je opisan postupak za dobijanje neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije koja je optimizovana za ekspresiju u ćelijama sisara i sastoji se od : sekvence VH regiona antitijela koji ima sekvencu iz grupe koju čine SEQ ID NO:119; i sekvencu VL regiona antitijela koji ima sekvencu iz gupe koju čine SEQ ID NO: 118; pri čemu je promenjen najmanje jedan aminokiselinski ostatak iz sekvence VH regiona antitijela i/ili sekvence VL regiona antitijela kako bi napravili najmanje jednu izmenjenu sekvencu antitijela; i ekspresija izmenjenih sekvenci antitijela u obliku proteina.

Za dobijanje i ekspresiju izmenjene sekvence antitijela mogu se koristiti standardne tehnike molekularne biologije. Antitijelo koje je kodirano izmenjenim sekvencama antitijela je ono koje zadržava jednu, neke ili sve funkcionalne osobine neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije koja je ovde opisana, a u te fukcionalne osobine se pored ostalog ubraja, specifično vezivanje za humani DKK1; i antitijelo pokazuje najmanje jednu od sledećih funkcionalniih osobina: antitijelo inhibira vezivanje proteina DKK1 za receptor DKK1 ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući osteolizu ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući osteolitičke lezije ili antitijelo inhibira vezivanje za DKK1 receptor sprečavajući ili ublažavajući maligni tumor.

Izmenjeno antitijelo može da ispoljava jednu ili više, dve ili više, ili tri ili više funkcionalnih osobina koje su u gornjem tekstu opisane.

Funkcionalne osobine izmenjenih antitijela moguće je odrediti primenom standardnih testova koji se koriste u oblasti i/ili su ovde opisani, kao oni koji su opisani u Primerima (npr., ELISA testovi).

U odredjenim izvodjenjima postupci za dobijanje inženjerisanih antitijela iz ppronalaska, moguće jeuvesti mutacije nasumično ili selektivno duž čitavog ili u samo odredjenom delu kodirajuće sekvence anti-DKK1 antitijela i rezltujući dobijeno modifikovano antitijelo može da se podvrgne screening-u, pretraživanju po kriterijumu aktivnosti vezivanja i/ili drugim funkcionalnim osobinama koje su ovde opidane. Postupci za uvodejnje mutacija su već opisani u oblasti. Na primer, u objavljenoj PCT WO 02/092780 od Short-a, opisan je postupak za dobijanje i screening antitijela korišćenjem saturacione mutageneze, sklapanje sintetskom ligacijom ili njihovom kombinacijom. Nasuprot tome, objavljena PCT WO 03/074679 od Lazar-a i sar., opisuje postupke za korišćenje metode računskog screening-a kako bi optimizovali fiziko-hemijske osobine antitijela.

Fc konstantni region antitijela je kritičan za odredjivanje poluživota u serumu i efektorske funkcije, tj., antitijelo-zavisna ćelijska citotksičnost (ADCC) ili komplement-zavisna citotoksičnost (CDC) delovanje. Moguće je konstruisati specifične mutante Fc fragmenta kako bi promenili efektorsku funkciju i/ili poluživot u serumu (videti, npr., Xencor technology, takodje videti, npr., WO2004029207).

Jedan metod za menjanje efektorske funkcije i poluživota u serumu antitijela jeste kalemljenje varijabilnog regiona fragmenta antitijela sa Fc fragmentom koji ima odgovarajuću efektorsku funkciju. Moguć je odabir IgG1 ili IgG4 izotipova na osnovu aktivnosti ubijanja ćelija, dok je IgG2 izotip moguće koristiti za utišavanje ili neutralisanje antitijela (bez aktivnosti ubijanja ćellija).

Utišana antitijela sa produženim poluživotom u serumu je moguće dobiti pravljenjem himernih fuzionisanja varijabilnih regiona antitijela sa serumskim proteinima kao što je HSA ili sa vezujućim proteinom za jedan takav serumski protein, kao što je HSA-vezujući protein.

Efektorske funkcije je takodje moguće promeniti modulisanjem obrasca glikozilovanja antitijela. Glycart (npr., US6,602,684), Biowa (npr., US6,946,292) i Genentech (npr., WO03/035835) inženjeringom su dobili ćelijske linije sisara koje proizvode antitijela sa povećanom ili smanjenom efektorskom funkcijom. Pogotovo, nefukozilovana antitijela će imati poboljšanu ADCC aktivnost. Glycofi je takodje razvila ćelijske linije kvasca koje su u stanju da proizvode specifične glikoforme antitijela.

Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju antitijela iz pronalaska

Jedan drugi aspekt pronalaska se odnosi na molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju antitijela iz pronalska. Primeri za kompletne matične nukleotidne sekvence lakog lanca su prikazani u SEQ ID NOs: 97-100. Primeri za kompletne matične nukleotidne sekvence teškog lanca su prikazani u SEQ ID NOs: 101-103. Primeri za kompletne nukleotidne sekvence lakog lanca koje su optimizovane za ekspresiju u ćeliji prikazani u SEQ ID NOs: 104-107. Primeri za kompletne nukleotidne sekvence teškog lanca koje su optimizovane za ekspresiju u ćeliji prikazani u SEQ ID NOs: 108-110.

Nukleinske kiseline mogu da budu prisutne i u suspenziji celih ćelija, ćelijskim lizatima ili mogu da budu nukleinske kiseline u delimično prečišćenom obliku ili u značajnoj meri prečišćene. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjena zančajno prečišćenom" kada se prečišćavanjem oslobodi od drugih ćelijskih komponenti ili kontaminanta, kao što su npr., druge ćelijske nukleinske kiseline ili proteini, primenom standardnih tehnika, uključujući alkalni/SDS treman, CsCl frakcionisanje, hromatografija na koloni, elektroforeza na agaroznom gelu i druge dobro poznate tehnike koje su poznate u oblasti. Videti kod F. Ausubel, i sar., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Bilogy, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Nukleinska kiselina iz pronalaska može da bude, na primer, DNK ili RNK i može, ali i ne mora da sadrži intronske sekvence. U jednom izvodjenju, nukleinska kiselina je cDNK molekul. Nukleinska kiselina može da bude prisutna u okviru vektora, kao što je fagni vektor iz fagne biblioteke (a phage display vectror) ili u rekombinantnom plazmidnom vektoru.

Dobijanje nukleinskih kiselina iz pronalaska je moguće primenom standardnih tehnika molekularne biologije. Što se tiče antitijela koja produkuju hibridome (npr., hibridome dobijene iz transgenih miševa koji nose gene za humane imunoglobuline, više reči o tome u daljem tekstu), cDNK koje kodiraju laki i teški lanac antitijela, a koje produkuju hibridomske ćellije moguće je dobiti standardnom PCR amplifikacijom ili cDNK tehnikama kloniranja. Za antitijela koja se dobijaju iz imunoglobulinskih genskih biblioteka (npr., korišćenjem tehnika fagnog prikazivanja), nukleinska kiselina koja kodira antitijelo može se pročitati iz različitih fagnih klonova koji pripadaju biblioteci.

Jednom pošto se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju VH i VL segment, sa ovim fragmentima DNK je moguće dalje manipulisati korišćenjem standardnih rekombinantnih DNK tehnika, na primer za konverziju gena za varijabilni region u gene za kompletni lanac antitijela, u gene za Fab fragment ili u gen za scFv. U ovim manipulacijama, DNK fragment koji kodira VL- ili VH- je operativno povezan sa drugim DNK molekulom ili za fragment koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitijela ili fleksibilni linker. Izraz "operativno povezani" kao što se koristi u ovom kontekstu treba da označava dva DNK fragmenta koji su spojeni na funkcionalan način, na primer, tako da aminikiselinske sekvence kodirane od dva DNK molekula ostanu u okviru, ili tako da je protein eksprimiran pod kontrolom željenog promotora.

Izolovana DNK koja kodira VH region može da se konvertuje u gen za kompletni teški lanac operativnim povezivanjem DNK koja kodira VH sa drugim molekulom DNK koja kodira konstantni region teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena za konstatne regione hunanog teškog lanca su poznate u oblasti (videti npr., Kabat, E. A., i sar., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i fragmente DNK koji prevazilaze ove regione moguće je dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može da bude IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, ili IgD konstantni region. Kad je u pitanju gen koji kodira Fab fragment teškog lanca, DNK koja kodira VH može da se operativno poveže sa drugim molekulom DNK koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.

Izolovana DNK koja kodira VL region može da se konvertuje u gen za kompletni laki lanac (kao i za gen za Fab laki lanac) operativnim povezivanjem DNK koja kodira VL sa drugim molekulom DNK koja kodira konstantni region lakog lanca CL. Sekvence gena za konstatne regione hunanog lakog lanca su poznate u oblasti (videti npr., Kabat, E. A., i sar., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i fragmente DNK koji prevazilaze ove regione moguće je dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može da bude kapa ili lambda konstantni region.

Da bi dobili scFv gen, DNK fragmenti koji kodiraju VH- i VL- su operativno povezani sa drugim DNK fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr., kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)3, tako da VH i VL sekvence mogu da budu eksprimirane kao kontinuirani jednolančani protein, sa VL i VH regionima povezanim preko fleksibilnog linkera (videti npr., Bird i sar., 1988 Science 242:423-426; Huston i sar., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty i sar., 1990 Nature 348:552-554).

Produkcija monoklonskih antitijela iz pronalaska

Postoje brojne tehnike za produkciju monoklonskih antitijela (mAbs), uključuući i konvecionalnu metodologiju monoklonskih antitijela npr., standardna tehnika hibridizacije somatskih ćellija, Kohler-a i Milstein-a, 1975 Nature 256: 495. Moguće je upotrebiti mnoge tehnike za produkciju monoklonskih antitijela npr., viralna ili onkogena transformacija B limfocita. Animalni sistem za rast hibridoma je mišji sistem. Produkcija sistema u miša je dobro ustanovljena procedura. Protokoli za imunizaciju i tehnike za izolaciju splenocita iz imunizovane životinje, za fuziju su dobro poznate u oblasti. Partnerske ćelije za fuziju (npr., mišje mijelomske ćelije) i procedeure za fuzionisanje su dobro poznate.

Himerna ili humanizovana antitijela iz ovog pronalaska je moguće napraviti na osnovu sekvence mišjeg monoklonskog antitijela koje je dobijeno na način koji je gore opisan. DNK koja kodira teški i laki lanac imunoglobulina može da se dobije iz mišje hibridome od interesa i da se konstruiše tako da inženjerisano antitijelo sadrži ne-mišje (npr., humane) imunoglobulinske sekvence primenom standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer za pravljenje himernog antitijela, mišji varijabilni regioni mogu da se povežu sa humanin konstantnim regionima primenom metoda koje su poznate u oblasti (videti npr., američki patent broj 4,816,567 od Cabilly i sar.). Da bi napravilli humaizovano antitijelo, moguće je insertovati mišje CDR regione u humani framework korišćenjem metoda koje su poznate u oblasti. Videti npr., američki patent broj 5225539 od Winter-a i američke patente broj 5530101; 5585089; 5693762 i 6180370 od Queen-a i sar.

U odredjenom izvodjenju, antitijela iz pronalaska su humana monoklonska antitijela; Ovakva humana monoklonska antitijela usmerena prema DKK1 moguće je produkovati korišćenjem transgenog ili transhromozomskog miša koji nosi delove humanog imunog sistema pre nego mišjeg sistema. U ove transgene i transhromozomske miševe ubrajaju se miševi koji se u ovom tekstu navode kao HuMab miševi, odnosno KM miševi, i zajedno se podrazumevaju pod terminom "miševi sa humanim Ig".

HuMab miš® (Medarex, Inc.) sadrži minilokuse humanog gena za imunoglobuline koji kodira ne-rearanžirane imunoglobulinske sekvence humanog teškog (μ i γ) i κ lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene μ i κ lokuse lakog lanca (videti Lonberg i sar., 1994 Nature 368(6476): 856-859). Shodno tome, miševi imaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ i u odgovoru na imunizaciju, ubačeni humani transgeni za humani teški i laki lanac podležu preključivanju klase i somatskim mutacijama i na taj način se dobija humani IgGκ monoklonac visokog afiniteta (Lonberg, N. I sar., 1994 supra; navedeno u pregledu kod Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. I Huszar, D., 1995 Intern Rev. Immunol. 13:65-93 i Harding, F. I Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). Dobijanje i primena HuMab miševa i genomskih modifikacija koje nose ovakvi miševi, je dalje opisano kod Taylor, L. i sar., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. i sar., 1993 International Immunology 5:647-656; Tuaillon i sar., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi i sar., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. i sar.,1993 EMBO J. 12:821-830; Tuaillon i sar., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. i sar., 1994 International Immunology 579-591; i Fishwild, D. i sar., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851, čiji je sadržaj priključen ovom tekstu specifično kompletnim referncama. Videti dalje, američki patent broj 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; sve od Lonberg-a i Kay-a; američki patent broj 5,545,807 od Surani-a i sar.; broj patentnih prijava WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852 i WO 99/45962, sve od Lonberg-a i Kay-a; i broj patentne prijave WO 01/14424 od Korman-a i sar.

U jednom drugom izvodjenju, humana antitijela iz pronalaska moguće je napraviti u mišu koji nosi sekvence za humane imunoglobuline u transgenima i transhromozomima kao što je miš koji nosi transgen za humani teški lanac i transhromozom za humani laki lanac. Takvi miševi, koji se ovde navode kao "KM miševi", su detaljno opisani u broju patentne prijave WO 02/43478 od ishida-e i sar.

Dalje, dostupni su i alternativni animalni sistemi za ekspresiju gena za humane imunoglobuline za koje se zna u oblasti i koji se mogu koristiti za dobijanje anti-DKK1 antitijela iz pronalaska. Na primer, može da se koristi alterantivni transgeni sistem, poznat kao Xenomiš (Abgenix, Inc.). Ovi miševi su opisani u, npr., američkim patentima broj 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 i 6,162,963 od Kucherlapati i sar.

Štaviše, dostupni su i alternativni transhromozomski animalni sistemi za ekspresiju gena za humane imunoglobuline za koje se zna u oblasti i koji se mogu koristiti za dobijanje anti-DKK1 antitijela iz pronalaska. Na primer, mogu da se koriste miševi koji nose i humani transhromozom sa teškim lancem i humani transhromozom sa lakim lancem, poznati kao "TC miševi"; Ovi miševi su opisani kod Tomizuka i sar., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. Usa97:722-727. Dalje, u oblasti su poznate i opisane krave koje nose transhromozome sa humanim teškim i lakim lancem (Kuroiwa i sar., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) i mogu da se koriste za dobijanje anti-DKK1 antitijela iz pronalaska.

Humana monoklonska antitijela iz pronalaska mogu takodje da se naprave koristeći metode fagne postavke/izlaganja za screening biblioteka humanih imunoglobuliskih gena. Ovakve metode fagnih postavki za izolovanje humanih antitijela su uspostavljene u oblasti. Videti na primer: broj američkog patena 5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698 od Ladne-a i sar.; brojevi američkog patenta 5,427,908 i 5,580,717 od Dower-a i sar.; brojevi američkog patenta 5,969,108 i 6,172,197 od McCafferty -a i sar.; i brojevi američkog patenta 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081 od Griffiths-a i sar.

Humana nonoklonska antitijela iz pronalaska je takodje moguće napraviti koristeći SCID miševe u kojima su humane imunske ćelije rekonstituisane tako da se može indukovati humoralni odgovor u kome dolazi do produkcije humanih antitijela nakon imunizacije. Ovakvi miševi su opisani u, na primer, brojevima američkog patenta 5,476,996 i 5,698,767 od Wilson-a i sar.

Pozitivno selekcionisani članovi biblioteka humanih antitijela se mogu koristiti za identifikaciju antitijela iz pronalaska. Izbor tehnike odabira pozitivnih faga zavisi od više faktora koji uključuju, pored ostalog, npr., fagnu postavku (Morphosys), tip biblioteke (npr., HuCal biblioteka od Morphosys), tehnologija afinitetnog sazrevanja i dalja sekvenca za optimizaciju kodona.

Produkcija humanih monoklonskih antitijela specifičnih prema DKK1

Purifikovani rekombinantni humani DKK1 izolovan iz E. coli, bakulovirusa ili HEK-EBNA ćelija ili purifikovani rekombinantni humani DKK1 konjugovan sa "keyhole limpet hemocyanin" (KLH, protein izolovan iz jedne vrste mekušaca-Megathura crenulata, koji se zbog svoje velike mase i kompleksnosti koristi kao protein nosač za konjugaciju sa haptenima i drugim antigenima, da bi im se povećala imunogenost i tako ostvarila uspešna produkcija antitijela kada se sa konjugatom imunizuje životinja), se koristi kao antigen.

Potpuno humana monoklonska antitijela specifična prema DKK1 se dobijaju korišćenjem HCo7, HCo12 i HCo17 sojeva HuMab transgenih miševa i KM sojeva transgenih transhromozomskih miševa, od kojih svaki eksprimira gene za humana antitijela. U svakom od ovih mišjih sojeva, gen za endogeni mišji kapa laki lanac može da bude homozigotno disfunkcionalan kao što je opisano kod Chen i sar., 1993 EMBO J.12:811-820 i gen za endogeni mišji teški lanac može da bude homozigotno disfunkcionalan kao što je opisano u Primeru 1 patentne prijave WO 01109187. Svaki od ovih mišjih sojeva nosi transgen sa humanim kapa lakim lancem, KCo5, kao što je to opisano kod Fishwild i sar., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851. HCo7 soj nosi HCo7 transgen sa humanim teškim lancem kao što je to opiano u brojevima američkog patenta 5,545,806; 5,625,825; i 5,545,807. HCo12 soj nosi HCo12 transgen sa humanim teškim lancem. KNM soj sadrži SC20 transhromozom kao što je to opisano u patentnoj prijavi WO 02/43478.

Za podukciju potpuno humanih monoklonskih antitijela prema DKK1, HuMab miševi i KM miševi su imunizovani sa purifikovanim rekombinantnim DKK1 izolovanim iz E. coli ili sa DKK1-KLH konjugatom kao antigenom. Opšte šeme za imunizaciju za HuMab miševe su opisane kod Lonberg, N. i sar., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. i sar., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851 i patentna prijava WO 98/24884. Miševi su starosti 6 do 16 nedelja, kada se ubrizgava antigen prvi put. Purifikovani rekombinantni preparat (5-50 μg) DKK1 antigena (npr., purifikovano iz transfektovanih E. coli ćelija koje eksprimiraju DKK1) se koristi za imunizaciju HuMab miševa i KM miševa intraperitonealno, subkutano (Sc) ili injekcijom u šapicu.

Transgeni miševi su imunizovani dva puta sa antigenom u kompletnom Freund-ovom adjuvansu ili u Ribi adjuvansu inrtaperitonealno (IP), subkutano (Sc) ili u šapicu (FP), zatim nakon 3-21 dan životinje su ponovo imunizovane (sve zajedno ukupno 11 imunizacija) sa antigenom u nekompletnom Freund-ovom ili Ribi adjuvansu, IP, Sc ili FP. Praćenje imunskog odgovora je vršeno retroorbitalnim krvarenjem. Prisustvo antitijela je praćeno u plazmi ELISA testom i miševi koji su imali dovoljno visok titar anti-DKK1 humanih imunoglobulina su korišćeni za potrebe fuzije. Miševi su bustirani intravenski sa antigenom 3 i 2 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine. Najčešće je uradjeno 10-35 fuzija za svaki antigen. Više desetina miševa je imunizovano sa svakim antigenom. Ukupno je sa DKK1 imunizovano 82 miša i to HCo7, HCo12, HCo17 i KM sojevi.

Za selekciju HuMab ili KM miševa koji produkuju antitijela odgovarajuće specifičnosti, koja vezuju DKK1, testiraju se serumi imunizovanih miševa ELISA testom kako su to opisali Fishwild, D. i sar.,1996. Ukratko, mikrotitarske ploče su obložene sa purifikovanim rekombinantnim DKK1 iz E. coli u koncentraciji 1-2 μg/ml u PBS-u, 50 μl/bunaru inkubirane su na 4 °C preko noći, zatim su blokirane sa 200 μl/bunaru 5 % pilećim serumom u PBS/Tween (0,05%). Razblaženja plazme DKK1-imunizovanih miševa su dodata u svaki bunarić i inkubirana 1-2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBS/Tween i zatim inkubirane sa kozjim anti-humanim IgG Fc poliklonskim antitijelom konjugovanim sa peroksidazom iz rena (HRP) 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, reakcija u pločama je vizuelizovana sa ABTS supstratom (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) i analizirane na spektrofotometru na OD 415-495. Miševi koji su razvili najveće titre anti-DKK1 antitijela su korišćeni za fuziju. Fuzije su uradjene i supernatanti hibridoma su testirani na anti-DKK1 aktivnost ELISA testom.

Mišji splenociti, izolovani iz HuMab miševa i KM miševa, su fuzionisani sa mišjom mijelomskom ćelijskom linijom dodavanjem PEG-a, na osnovu standardnih protokola. Izvršen je pregled i odabir medju nastalim hibridomskim ćelijama po kriterijumu produkcije antigen-specifičnog antitijela. Ćelijske suspenzije limfocita oslobodjenih iz slezine imunizovanih miševa su fuzionisane sa jednom četvrtinom broja SP2/0 nesekretujuččih mišjih mijelomskih ćelija (ATCC, CRL 1581) dodavanjem 50% PEG (Sigma). Ćelije su postavljene u mikrotitarske ploče sa ravnim dnom približno 1x105/bunaru. Zatim su inkubirane oko dve nedelje u selektivnom medijumu koji sadrži 10% fetalni govedji serum, 10% P388D 1 (ATCC, CRL TIB-63) kondicionirani medijum, 3-5% origen (IGEN) u DMEM (Mediatech, CRL 10013, sa visokom glukozom, L-glutaminom i natrijum piruvatom) plus 5mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 mg/ml gentamicin i 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Nakon 1-2 nedelje, ćelije se kultivišu u medijumu u kojem je HAT zamenjen sa HT. Pojedinačni bunarići su zatim pretraženi za humana anti-DKK1 monoklonska IgG antitijela korišćenjem ELISA testa. Pošto je jednom došlo do ekstenzivnog rasta hibridoma, medijum se prati najčešće posle 10-14 dana. Hibridome koje sekretuju antitijela se ponovo zasadjuju, ponovo se testiraju na prisustvo antiela, i ako su opet pozitivne za humani IgG, anti-DKK1 monoklonska antitijela se subkloniraju najmanje dva puta metodom graničnog razblaženja. Stabilni subklonovi se zatim kultivišu in vitro kako bi produkovali male količine antitijela u medjumu za kuturu tkiva za dalju karakterizaciju.

Imunizacija humani Ig-miševa

Kada se za pravljenje humanih antitijela iz pronalska koriste humani Ig-miševi, ove miševe je moguće imunizovati sa purifikovanim ili obogaćenim preparatom koji sadrži DKK1 antigen i/ili rekombinantni DKK1 ili DKK fuzionisani protein, kao što je to opisano kod Lonberg, N. i sar., 1994 Nature 368 (6474):856-869; Fishwild, D. i sar., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851; i patentna prijava WO 98124884 i WO 01/14424. Miševi mogu da budu starosti 6-16 nedelja za prvo ubrizgavanje. Na primer, za intraperitonealnu imunizaciju humani Ig-miša može da se koristi purifikovani ili rekombinantni preparat (5-50 μg) DKK1 antigena.

Detaljne procedure za produkciju potpuno humanih monoklonskih antitijela specifičnih prema DKK1 su gore opisane. Kumulativno iskustvo sa različitim antigenima je pokazalo da su transgeni miševi responsivni kada se prvobitno imunizuju intraperitonealno (IP) sa antigenom u kompletnom Freund-ovom adjuvansu, a zatim se svake druge nedelje IP imunizuju (zajedno ukupno 6) sa antigenom u nekompletnom Freun-ovom adjuvansu. Medjutim, ispostavilo se da su i drugi adjuvansi, osim Freund-ovog, takodje efikasni. Štaviše, pokazalo se da su cele ćelije u odsustvu adjuvansa veoma imunogene. Imunski odgovor je moguće pratiti u toku sprovodjenja protokola za imunizaciju, preko uzoraka plazme koji se uzimaju retroorbitalnim krvarenjem. Plazme je moguće testirati ELISA testom i miševi sa dovoljno velikim titrom anti-DKK1 humanih imunoglobulina se mogu koristiti za fuziju. Miševe je moguće bustovati intravenski sa antigenom 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine. Očekuje se da je potrbno uraditi 2-3 fuzije za svaku imunizaciju. Najčešće se imunizuje izmedju 6 i 24 miša za svaki antigen. Uglavnom, se koriste i HCo7 soj kao i HCo12 soj. Pored toga, moguće je zajedno gajiti HCo7 i HCo12 transgene u istom mišu koji ima dva različita transgena za teški lanac (HCo7/HCo12).

Dobijanje hibridoma koje produkuju humana monoklonska antitijela

Za produkciju hibridoma koje produkuju humana monoklonska antitijela iz pronalaska, splenociti i/ili ćelije iz limfnog čvora uzetog iz imunizovanog miša mogu da se izoluju i fuzionišu sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je mišja mijelomska ćelijska linija. Medju nastalim hibridomama moguće izvršiti odabir onih koje produkuju antigen-specifična antitijela. Na primer, suspenzija pojedinačnih limfocita slezine uzete iz imunizovanog miša može da se fuzioniše sa jednom šestinom od broja P3X63-Ag8.653 nesekretujućih mišjih mijelomskih ćelija (ATCC, CRL 1580) sa 50% PEG-a. Ćelije su postavljene u mikrotitarsku ploču sa ravnim dnom u koncentraciji približno 2 x 105, i inkubirane dve nedelje u selektivnom medijumu koji sadrži 20% fetalni Clone serum, 18% "653" kondicionirani medijum, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM natrijum-piruvat, 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i 1X HAT (Sigma; HAT je dodat 24h posle fuzije). Nakon približno dve nedelje, ćelije se mogu kultivisati u medijumu u kojem je HAT zamenjen sa HT. Tada je moguće izvršiti testiranje ELISA testom i odabir pojedinačnih bunara u kojima rastu ćelije koje produkuju humana monoklonska IgM i IgG antitijela. Pošto jednom dodje do ekstenzivnog rasta hibridoma, medijum je moguće pregladati najčešće posle 10-14 dana. Hibridome koje sekretuju antitijela je moguće presaditi, izvršiti odabir ponovo i ukolikosu opet pozitivne na humani IgG, monoklonska antitijela je moguće subklonirati najmanje dva puta korišćenjem graničnog razblaženje. Stabilne subklonove je moguće dalje gajiti in vitro kako bi produkovale male količine antitijela u medijum za tkivne kulture za karakterizaciju.

Za prečišćavanje humanih monoklonskih antitijela, odabrane hibridome je moguće umnožavati u dvolitarskim spinner-bocama za kulturu za prečišćavanje monoklonskih antitijela. Supernatante je moguće filtrirati i ukoncentrovati pre afinitetne hromatografije sa protein A-sefarozom (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluirani IgG može da se proveri gel elektroforezom i tečnom hromatografijom velike performanse kako bi osigurali čistoću. Puferski rastvor je moguće promeniti u PBS, a koncentraciju je moguće orediti preko OD280 računajući sa 1,43 ekstinkcionim koeficijentom. Monoklonska antitijela se mogu dalje alikvotirati i čuvati na -80 °C.

Produkcija transfektoma koje produkuju monoklonska antitijela

Antitijela iz pronalaska je takodje moguće proizvesti u transfektomskoj ćeliji domaćina koristeći, npr., kombinaciju rekombinantnih DNK tehnika i metoda za transfekciju gena kao što je to dobro poznato u oblasti (npr., Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Na primer, da bi eksprimirali antitijela ili fragmente antitijela, DNK koje kodiraju delimični ili kompletni laki i teški lanac, moguće je dobiti primenom standardnih tehnika molekularne biologije (PCR amplifikacija ili cDNK kloniranje koristeći hibridomu koja eksprimira antitijelo od interesa) i DNK je moguće insertovati u vektor za ekspresiju tako da su geni operativno povezani sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U ovom kontekstu izraz "operativno povezani" treba da označava da je gen za antitijelo ligiran u vektor takav da transkripcione i translacione kontrolne sekvence unutar vektora posluže za namenjenu im funkciju regulacije transkripcije i translacije gena za antitijelo.Vektor za ekspresiju i sekvence za kontrolu ekspresije su izabrane tako da budu kompatibilne sa tipom ekspresije koju koristi ćelija domaćin. Gen za laki lanac antitijela i gen za teški lanac antitijela se može insertovati u različite vektore ili, što je mnogo češće, oba gena se mogu insertovati u isti vektor. Geni za antitijela se insertuju u vektor za ekspresiju primenom standardnih metoda (npr., ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena za antitijelo i vektora, ili ligacijom "blunt" (ravnih) krajeva ako nema prisutnih restrikcionih mesta). Laki i VH regioni antitijela koja su ovde opisana mogu da se koriste za dobijanje gena za kompletna antitijela svakog izotipa antitijela, tako što se insertuju u vektore za ekspresiju koji već kodiraju konstantne regione teškog lanca i konstantne regione lakog lanca željenog izotipa tako da je VH segment operativno povezan sa CH segmentom (ili segmentima) unutar vektora i VL segment da je operativno povezan sa CL segmentom u sklopu vektora. Osim toga ili nasuprot tome, rekombinantni vektor za ekspresiju može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitijela iz ćelije domaćina. Gen za lanac antitijela može da bude kloniran u vektor tako da signalni peptid bude povezan u okviru čitanja za amino kraj gena za lanac antitijela. Signalni peptid može da bude imunoglobulinski signalni peptid ili heterologi signalni peptid (tj., signalni peptid iz neimunoglobulinskog proteina).

Osim gena za lanac antitijela, rekombinantni vektori za ekspresiju iz pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena za lanac antitijela u ćeliji domaćinu. Izraz "regulatorna sekvenca" ima za cilj da pokrije i obuhvati promotore, enhancere-pojačivače i druge elemente za kontrolu ekspresije (npr., signali za poliadenilaciju) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena za lanac antitijela. Ove regulatorne sekvenc esu opisane, na primer, kod Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Stručnjaci u oblasti će zapaziti da dizajn ekspresionih vektora, uključujući i selekciju regulatornih sekvenci, može da zavisi od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja treba da bude podvrgnuta transformaciji, nivo željenog proteina, itd. Regulatorne sekvence za ekspresiju u sisarskim domaćinskim ćelijama uključuju viralne elemente koji usmeravaju visok nivo ekspresije proteina u sisarskim želijama, kao što su promotori i/ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV), Simian virusa 40 (SV40), adenovirusa, (npr., glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)), i polioma. Nasuprot tome, mogu da se koriste neviralne regulatorne sekvence, kao što je promotor za ubikvitin ili promotor za P-globin. Pored toga, regulatorni elementi koji se sastoje od sekvenci iz različitih izvora, kao što je SRa promotor sistem, koji sadrži sekvence iz ranog pomotora za SV40 i dugačkog terminalnog ponovka humanog virusa T ćelijske leukemije tipa 1 (Takebe, Z. i sar., 1988 Mol.Cell. Biol. 8:466-472).

Osim gena za lance antitijela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori iz pronalaska mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćeliji domaćinu (npr., oridžin replikacije) i marker geni prema izboru. Marker gen koji se može odabrati olakšava selekciju onih domaćinskih ćelijia u koje je ušao vektor (videti, npr., brojeve američkog patenta 4,3994216; 4,634,665 i 5,179,017, svi od Axel-a i sar.). Na primer, najčešće izabrani marker gen prenosi rezistenciju na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliju domaćina u koju je uveden vektor. U ove marker gene se ubrajaju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu kod dhfr- domaćinskih ćellija u selekciji na metotreksat/amplifikaciji) i neo gen (za selekciju na G418).

Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodiraju teški i laki lanac je transfektovan u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Razlličiti oblici izraza "transfekcija" su upotrebljeni sa namerom da prevazidju veliki broj različitih tehnika koje se najščešće koriste za uvodjenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina primenom npr., elektroporacije, precipitacije sa kalcijum-fosfatom, transfekcija na DEAE-dekstranu i tome slično. Teoretski je moguće da se antitijela iz pronalaska eksprimiraju u bilo prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji. Ekspresija antitijela u eukariotskim ćelijama, naročito u domaćinskim ćelijama sisara, je posebno diskutovana jer takve eukariotske ćelije, i pogotovo ćelije sisara, imaju veće izglede da sklope i sekretuju pravilno uvijeno antitijelo, antitijelo koje će se vezivati za antigen u odnosu na prokariotske ćelije. Za prokariotsku ekspresiju gena za antitijelo je pokazano da je neefikasna za produkciju velikih prinosa aktivnog antitijela (Boss, M.A. i Wood, C.R., 1985 Immunology Today 6:12-13).

Sisarske ćelije domaćina za ekspresiju rekombinantnih antitijela iz pronalaska obuhvataju ovarijumske ćelije kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisano kod Urllaub i Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 korišćene sa DH FR izabranim markerom, npr., kao što je opisano kod R.J. Kaufman i P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159.601-621, NSO mijelomske ćelije, COS ćelije i SP2 ćelije). Naročito za upotrebu sa NSO mijelomskim ćelijama, drugi mogući ekspresioni sistem je sistem za ekspresiju GS gena što je pokazano u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338,841. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene za antitijelo uvedu u sisarsku ćeliju domaćina, antitijela su produkovana kultivacijom ćelija domaćina za vremenski period dovoljan za ekspresiju antitijela u ćeliji domaćinu ili za sekreciju antitijela u medijum za kultivaciju u kojem se ćelije domaćini gaje. Antitijela je moguće izolovati iz medijuma za gajenje ćelijskih kultura primenom standardnih metoda za purifikaciju proteina.

Farmaceutske kompozicije

U drugom aspektu, ovaj pronalazak navodi kompoziciju, npr., farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jednu ili kombinaciju više neutrališućih anti-DKK1/4 kompozicija, ili antigen-vezujuće delove ove kompozicije, u ovom pronalasku, uobličene zajedno u formulaciju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Ovakve kompozicije mogu da obuhvataju jednu ili kombinaciju više (npr., dva ili više različitih) antitijela, ili imunokonjugata ili bispecifičnih molekula iz pronalaska. Na primer, farmaceutska kompozicija iz pronalaska može da obuhvata kombinaciju antitijela (ili imunokonjugata ili bispecifičnjaka) koja se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili koja imaju komplementarno delovanje.

Farmaceutske kompozicije iz pronalaska takodje mogu da se primenjuju u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovano sa drugim agensima.

Na primer, kombinovana terapija može da uključuje jedno anti-DKK1 antitijelo iz ovog pronalaska kombinovano sa najmanje jednim, nekim različitim, anti-inflmatornim ili anti-osteoporotskim sredstvom. Primeri anti-terapijskih sredstava koja se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji, su opisani detaljnije u donjem tekstu, u odeljku koji govori o upotrebama antitijela iz pronalaska.

U ovom tekstu, farmaceutski prihvatljiv nosač podrazumeva svaki i sve rastvarače, disperzione medijume, sredstva za oblaganje, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva koja odlažu apsorpciju, i tome slično, sredstva koja su fiziološki kompatibilna. Nosač bi trebao biti pogodan za intravensko, intramuskularno, subkutano, parenteralno, spinalno ili epidermalnu primenu (npr., preko injekcije ili infuzije). U zavisnosti od načina primene, aktivna supstanca, tj., antitijelo, imunokonjugat ili bispecifični molekul, može da bude prevučen sa materijalom kako bi zaštitili supstancu od delovanja kiselina i dugih prirodnih uslova koji bi mogli da inaktiviraju supstancu.

Farmaceutske supstance iz pronalaska mogu da obuhvataju jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na so koja zadržava željenu biološku aktivnost ove supstance i ne dodeljuje joj nikakve neželjene toksične efekte (videti npr., Berge, S.M. isar., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19). U primere za takve soli se ubrajaju soli nastale dodavnjem kiseline i soli nastale dodavanjem baze. Soli nastale dodavanjem kiseline uključuju one koje potiču od netoksičnih neorganskih kiselina, kao što je hlorovodonična, azotna kiselina, sumporna kiselina, bromovodonična, jodovodonična, fofsforasta i tome slično, kao i od netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil supstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanske kiseline, aromatične kiseline, aromatične i alifatične sumporne kiseline i tome slično. Soli nastale dodavanjem baze uključuju one koje potiču od alkalnih metala kao što je natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i tome slično, kao i od netoksičnih organskih amina, kao što je N,N’-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i tome slično.

Farmaceutska kompozicija iz pronalaska takodje može da obuhvata farmaceutski prihvatljiv antioksidans. U farmaceutski prihvatljive antioksidanse se ubrajaju: antioksidansi rastvorljivi u vodi, kao što je askorbinska kiselina, cisteinhidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i tome slično; antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što je askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksi toluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa tokferol i tome slično; agensi koji grade helatna jedinjenja sa metalima, kao što je limunska kiselina, etilen diamin tetraacetatna kiselina (EDTA), sorbitol, tartarna kiselina, fosforna kiselina i tome slično.

Primeri za odgovarajuće vodene i nevodene nosače koji mogu da se koriste u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen gllikol, polietilen glikol i tome slično), kao i odgovarajuće smeše ovih supstanci, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Moguće je održavati odgovarajuču fluidnost, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestice u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.

Ove kompozicije mogu takodje da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, sredstva za kvašenje, emulgatori i disperziona sredstva. Sprečavanje prisustva mikroorganizama moguće je obezbediti procedurama za sterilizaciju, supra, i dodavanjem različitih antibakterijskih sredstava i antimikotika, na primer, paraben, hlorobutanol, fenol sorbna kiselina, i tome slično. Takodje, može da bude poželjno da se u kompoziciju uvrste i izotonična sredstva, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i tome slično. Osim toga, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika se može uvesti dodavanjem sredstava koja odlažu apsorpciju kao što su, aluminijum monostearat i želatin.

Farmaceutski prihvatljivi nosači podrazumevaju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za pripremanje ex tempore sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba ovakvih medijuma isredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblaasti. Razmatrana je upotreba aktivne supstance u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska, osim sa ma kojim od svih konvencionalnih medijuma ili sredstava, a koja su se pokazala inkompatibilnim sa aktivnom supstancom. Dopunske aktivne supstance je takodje moguće uvrstiti u kompozicije.

Terapijske kompozicije po pravilu moraju da budu sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicije mogu da budu formulisane kao rastvor, mikroemulzija, lipozomi, ili u obliku druge uredjene strukture pogodne za velike koncentracije leka. Nosač može da bude rastvarač ili neki drugi disperzioni medijum koji sadrži na primer vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polipropilen glikol i tome slično) i odgovarajuče smeše ovih supstanci. Potrebna fluidnost se može održavati, na primer, korišćenjem sredstva za oblaganje kao što je lecitin, zatim održavanjem propisane veličine čestica u slučaju disperzije, kao i korišćenjem surfaktanata. U mnogim slučajevima moguće je uključiti i izotonična sredstva, na primer šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid u kompoziciji. Da bi se uvela jedna nova osobina kao što je produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija, potrebno je uvesti sredstvo koje odlaže apsorpciju na primer, monostearatne soli i želatin.

Sterilne injektabilne rastvore moguće je pripremati ugradjivanjem potrebne količine aktivne supstance, u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom više sastojaka koji su pobrojani u ranijem tekstu, kao što je propisano, praćeno sterilizacijom mikrofiltriranjem. Generalno, disperzije se dobijaju inkorporiranjem aktivnih supstanci u sterilni vehikul koji sadrži osnovni disperzioni medijum i neophodne druge sastojke od onih koji su ranije nabrojani. Što se tiče sterilnog praška koji je namenjen za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora, postupci za dobijanje su sušenje na vakumu i liofilizacija, koji daju aktivnu spstancu u obliku praška plus ma koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora aktivne supstance sa dodacima.

Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa nosačem za dobijanje pojedinačnog doznog oblika, variraće u zavisnosti od ispitanika koji se tretira i od konkretnog načina primene. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa nosačem za dobijanje pojedinačnog doznog oblika će najčešće biti ona količina kompozicije koja postiže terapeutsko delovanje. Uopšteno, od sto posto, ova količina će varirati od oko 0,01 procenat do oko devedest devet procenata aktivnog sastojaka, od oko 0,1 procenat do oko 70 posto, od oko 1 posto do oko 30 procenata aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Režmi doziranja su prilagodjeni tako da obezbede optimalni željeni odgovor (npr., terapijski ogovor). Na primer, moguće je primeniti jednokratnu bolus dozu, više podeljenih doza je moguće primeniti u toku nekog vremena ili doza može biti srazmerno umanjena ili povećana onako kako diktiraju uslovi terapijske situacije. Posebno je dobro da se formuliše parenteralna kompozicija u obliku doznih jedinica da bi primena bila što lakša i radi uniformnosti doziranja. Oblik dozne jedinice u ovom tekstu se odnosi na fizički zasebne jedinice koje su prilagodjenje jediničnim dozama za ispitanike koje treba tretirati; svaka jedinica sadrži preodredjenu količinu aktivne supstance, za koju se očekuje da će imati terapijsko delovanje uz potrebni farmaceutski nosač. Specifikaciju za različite oblike jediničnog doziranja iz pronalaska diktiraju i ona direktno zavisi od, jedinstvenih karakteristika aktivne supstance i odredjenog terapijskog delovanja koje se želi postići, kao i od ograničenja koja su inherentna ovoj farmaceutskoj oblasti dobijanja takve jedne aktivne supstance za tretiranje osetljivosti kod pojedinaca.

Za primenu antitijela, doza varira od 0.0001 do 200 mg/kg išto je više uobičajeno 0,01 do 50 mg/kg telesne mase domaćina. Na primer, doziranje može da bude 0,3 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine, ili iz opsega od 1-20 mg/kg. Jedan dozni režim za primer podrazumeva primenu jedno nedeljno, jedanput na svake dve nedelje, jedanput na svake tri nedelje, jedanput na svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom u tri meseca ili jedanput na svaka tri do šest meseci. U režime doziranja za anti-DKK1 antitijelo iz pronalaska se ubrajaju 1 mg/kf telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine intravenskom primenom, a antitijelo se daje po jednom od sledećih rasporeda za primenu: na svake četiri nedelje 6 doziranja, zatim na svaka trimeseca; svake tri nedelje; 3 mg/kg telesne težine jedanput, a posle 1 mg/kg telesne težine na svake tri nedelje.

Po nekim postupcima, istovremeno se primenjuju po dva monoklonska antitijela istovremeno, sa različitim specifičnostima za vezivanje, i u tom slučaju doziranje svakog antitijela koje se primenjuje ulazi u navedene opsege. Antitijelo se najčešće primenjuje u različitim prilikama. Vremenski intervali u kojima se primenjuje doza, moguda budu, na primer, nedeljno, mesečno, na svaka tri meseca ili godišnje. Intervali mogu takodje da budu i nepravilni na šta je ukazalo merenje nivoa antitijela prema ciljnom antigenu u krvi pacijenata ili nivoa nekih biomarkera kao što su OCN, OPG ili PINP. Po nekim postupcima doziranje je prilagodjeno tako da se dostigne koncentracija antitijela u plazmi od oko 1-1000 µg/ml i prema nekim postupcima oko 25-300 µg/ml.

Alternativno, antitijelo je moguće primenjivati kao formulacija sa zadržanim oslobadjanjem i tom slučaju je dovoljna manje česta primena. Doziranje i učestalost primene variraju u zavisnosti od vremena poluživota antitijela u pacijentu. Generalno, humana antitijela pokazuju najduže vreme poluživota, zatim humanizovana antitijela, himerna antitijela i ne-humana antitijela. Doziranje i učestalost primene može da varira u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapijski. Za profilaktičke aplikacije, primenjuje se relativno mala doza u relativno neučestalim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju terapiju do kraja života. Za terapijske aplikacije, primenjuje se relativno velika doza u relativno kratkim intervalima sve dok se progresija bolesti ne uspori ili okonča ili dok pacijent ne počne da pokazuje delimično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Zbog toga pacijent može da se tretira u profilaktičkom režimu.

Stvarne dozne nivoe aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska moguće je varirati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je dovoljna da postigne željeni odgovor na datu terapiju kod odredjenog pacijenta, kao i kompoziciju i način primene, a da ne bude toksična za pacijenta. Izabrani dozni nivo zavisiće od različitih prisutnih farmakokinetičkih faktora, uključujući i aktivnost odredjenih primenjenih kompozicija, ili od njih izvedenih estara, soli ili amida, načina primene, vremena primene, brzine ekskrecije odredjenih supstanci koje su korišćene, trajanje terapije, drugih lekova, supstanci i/ili materijala korišćenih u kombinaciji zajedno sa odredjenim primenjenim kompozicijama, starosti, pola, telesne težine, stanja, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se tretira, kao i svih drugih faktora koji se inače uzimaju u obzir u takvim prilikama iz oblasti medicine.

"Terapijski efikasna doza" anti-DKK1 antitijela iz pronalaska može da dovede do smanjenja ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanja učestalosti i trajanja perioda bez simtoma, ili do prevencije oštećenja ili nastanka hendikepa usled napredovanja bolesti.

Kompozicija iz ovog pronalaska može da se primeni na jedan ili više načina koristeći jedan ili više brojnih metoda za koje se zna oblasti. dobar stručnjak će i sam prepozanti, način i/ili modus primene će varirati u zavisnosti od rezultata koji se ćele postići. Nači za primenu antitijela iz pronalaska podrazumeva intravensko, intramuskularno, intradermalno,intraperitonealno, subkutano, spinalno ili drugi parenteralni načini primene, kao što su na primer injekcijom ili infuzijom. Izraz parenteralna administracija u ovom tekstu ozančava načine primene različite u odnosu na enteralnu i topikalnu primenu, uglavnom injekcijama i uključuje pored ostalog, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu, i intrasternalnu injekciju ili infuziju.

Alternativno, antitijelo iz pronalaska može da bude primenjeno na neparenteralni način, kao što je topikalni, epidermalni ili preko mukoze način primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.

Aktivne supstance se mogu prpremiti udruženi sa nosačima, koji imaju ulogu da zaštite supstancu od brzog oslobadjanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobadjanjem, uključujući implante, transdermalne "zakrpe" i mikroinkapsulirane sisteme za trasport. Mogu se koristiti biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri polilaktatna kiselina. Mnoge metode za pripremanje ovakvih formulacija su patentirane ili opšte poznate stručnjacima u oblasti. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, INC., New York, 1978.

Primena terapijskih kompozicija je moguća pomoću medicinskih aparata koji su poznati u oblasti. Na primer, u jednom izvodjenju, terapijska kompozicija iz pronalaska se može primeniti upotrebom sprave za bezigalno injektovanje, kao što su sprave opisane u brojevima američkih patenta 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 ili 4,596,556. U primere dobro poznatih implanta i modula, a da mogu da se koriste u ovom pronalasku ubrajaju se: broj američkog patenta 4,487,603, koji pokazuje implantabilnu mikroinfuzionu pumpu koja priprema i raspodeljuje lekove kontrolisanom brzinom; broj američkog patenta 4,486,194, koji je pokazao terapijsku spravu za primenu lekova preko kože; broj američkog patenta 4,447,233, koji je pokazao infuzionu pumpu za lekove koja omogućava davanje leka tačno odredjenom brzinom infuzije; broj američkog patenta 4,447,224, koji opisuje implantabilni infuzioni aparat sa variajbilnim protokom za kontinuirano davanje leka; broj američkog patenta 4,439,196, u kome je opisan osmotski sistem za davanje leka sa višekomornim odeljcima; broj američkog patenta 4,475,196 u kojem je opisan sistem za davanje osmotskog leka . Ovi patenti su u ovaj tekst uvršćeni putem kompletne reference. Mnogi drugi takvi implanti, sistemi za davanje leka i moduli su poznati stručnjacima u oblasti.

U odredjenim izvodjenjima, humana monoklonska antitijela iz pronalaska, mogu da se uobliče tako da postignu odgovarajuću distribuciju in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) ne propušta većinu veoma hidrofilnih supstanci. Da bi omogućili terapijskim supstancama iz pronalaska da prolaze krvno-moždanu barijeru (ako je to poželjno), moguće je da se one formulišu, na primer, u obliku lipozoma. Što se tiče metoda za proizvodnju lipozoma, videti, npr., američke patente 4,5222,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi se sastoje od jedne ili više vrsta koje mogu selektivno da se transportuju u specifične ćelije ili organe, te tako da poboljšaju usmereni transport supstance (videti, npr., V.V. Ranade, 1989 J. ClinePharmacol. 29:685). Usmeravajuće vrste, komponente liposoma, koj mogu da se navedu kao primer su folat ili biotin (videti, npr., broj američkog patenta 5,416,016 od Low-a i sar.); manozidi (Umezawa i sar., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antitijela (P.G. Bloeman isar., 1995 FEBS lett. 357:140; M. Owais isar., 1995 Antimicrob. Agents Chrenother. 39:180); receptor za surfaktant proteinA (Briscoe isar., 1995 Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier i sar., 1994 J. Biol. Chem.269:9090); videti takodje K.Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273.

Kombinacije

Pronalazak se dalje odnosi na postupak za sprečavanje ili lečenje proliferativnih bolesti ili bolesti kao što je maligni tumor kod sisara, naročito kod čoveka, u kombinciji zajedno sa farmaceutskim sredstvima, u koja se ubrajaju

a) neutrališuća anti-DKK1/4 kompozicija; i

b) jedno ili više farmaceutski aktivnih sredstava.

Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od:

a) neutrališuća anti-DKK1/4 kompozicija;

b) farmaceutski aktivno sredstvo; i

c) farmaceutski prihvatljiv nosač.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na tržišno pakovanje ili proizvod koji se sastoji od:

a) farmaceutske formulacije neutrališućeg anti-DKK1/4 kompozicije; i

b) farmaceutske formulacije farmaceutski aktivnog sredstva za istovremenu, uklopljenu zajedničku, odvojenu ili uzastopnu primenu.

Farmaceutski aktivna sredstva

Izraz "farmaceutski aktivna sredstva" ima širok spektar značenja i pokriva mnoga farmaceutski aktivna sredstva koja imaju različite mehanizme delovanja. Kombinacija nekih od ovih, sa DKK1/4 neutrališućim antitijelima/kompozicijom može da deluje na terapiju kancera da se poboljša. Farmaceutski aktivna sredstva su klasifikovana prema mehanizmu delovanja. Mnogi od dostupnih sredstava su anti-metaboliti razvojnog puta za različite tumore ili reaguju sa DNK tumorskih ćelija. Postoje takodje sredstva koja inhibiraju enzime, kao što su topoizomeraza I i topoizomeraza II, ili kao što su anti-mitotička sredstva.

Pod izrazom "farmaceutski aktivno sredstvo" podrazumeva se specijalno svako farmaceutski aktivno sredstvo različito u odnosu na neutrališuću anti-DKK1/4 kompoziciju ili njen derivat. Sadrži, pored ostalog:

i. inhibitor aromataze;

ii. anti-estrogen, anti-androgen ili agonistu gonadorelina;

iii. inhibitor topoizomeraze I ili inhibitor topoizomeraze II;

iv. aktivno sredstvo za mikrotubule, alkilirajuće sredstvo, anti-neoplastično sredstvo anti-metabolitskog mehanizma delovanja ili platinsko jedinjenje

v. supstanca koja je specifično usmerena prema/koja smanjuje aktivnost proteinske ili lipidne kinaze; ili aktivnost proteinske ili lipidne fosfataze, dalje supstanca koja sprečava angiogenezu ili supstanca koja indukuje procese ćelijske diferencijacije;

vi. monoklonska antitijela;

vii. inhibitor ciklooksigenaze, bisfosfonat, inhibitor heparinaze, modifikator biološkog odgovora;

viii. inhibitor Ras onkogenih izoformi;

ix. inhibitor telomeraze;

x. inhibitor proteaze, inhibitor matriksne metaloproteinaze, inhibitor metionin aminopeptidaze, ili inhibitor proteozoma;

xi. sredstva koja se koriste u lečenju hematoloških maligniteta ili supstanci koje usmeravaju, umanjuju ili inhibiraju aktivnost Flt-3;

xii. inhibitor HSP90;

xiii. antiproliferativna antitijela;

xiv. inhibitor histon deacetilaze (HDAC);

xv. supstanca koja usmerava, umanjuje ili inhibira aktivnost/funkciju serin/treonin mTOR kinaze;

xvi. antagonista somatostatinskog receptora;

xvii. supstance sa anti-leukemijskim delovanjem;

xviii. pristupi koji u osnovi imaju štetno delovanje na tumorske ćelije;

xix. vezivni elemenat za EDG;

xx. inhibitor ribonukleotid reduktaze;

xxi. inhibitor S-adenozilmetionin dekarboksilaze;

xxii. monoklonsko antitijelo prema VEGF ili VEGFR;

xxiii. fotodinamska terapija;

xxiv. steroid sa angiostatskim delovanjem;

xxv. implant koji sadrži kortikosteroide;

xxvi. antagonista ATI receptora; i

xxvii. inhibitor ACE.

Izraz "inhibitor aromataze", u ovom tekstu odnosi se na suptancu koja inhibiraprodukciju estrogena, tj., konverziju supstrata androstendiona i testosterona, u estron, odnosno estradiol. Pod ovim izrazom se podrazumevaju, pored ostalog, steroidi, a naročito atamestan, eksemestan i formestan; i pogotovo nesteroidna jedinjenja, naročito aminoglutetimid, rogletimid, piridoglutetimid, trilostan, testolakton, ketokonazol, vorozol, fadrozol, anastrozol i letrozol. Eksemstan je označen kao AROMASIN; formestan kao LENTARON; fadrozol kao AFEMA; anastrozol kao ARIMIDEX; letrozol kao FEMARA ili FEMAR; i aminoglutetimid kao ORIMETEN. Kombinacija iz pornalaska koja se sastoji od farmaceutski aktivnog sredstva koje je inhibitor aromataze, je posebno delotvorna u lečenju tumora koji su pozitivni na receptor za hormon, kao npr., tumori dojke.

Izraz "anti-estrogen" u ovom tekstu, se odnosi na supstancu koja antagonizuje delovanje estrogena na nivou estrogenskog receptora. Izraz podrazumeva, pored ostalog, tamoksifen, fulvestrant, raloksifen, i raloksifen hidrohlorid. Tamoksifen može da se primenjuje u obliku u kom se pojavio na tržištu, npr., NOLVADEX; i raloksifen hidrohlorid je na tržištu prisutan kao EVISTA. Fulvestrant može da se formuliše kao što je to navedeno u broju američkog patenta 4,659,516 i na tržištu se nalazi pod imenom FASLODEX. Kombinacija iz pronalaska koja obuhvata farmaceutski aktivno sredstvo, koje je anti-estrogen, je naročito korisno u lečenju tumora koji su pozitivni za estrogenski receptor, npr.,tumori dojke.

Izraz "anti-androgen" u ovom tekstu, se odnosi na supstancu koja je sposobna da inhibira biološko delovanje androgenih hormona i podrazumeva, pored ostalog, bikalutamid (CASODEX), koji može da se formuliše, kao što je to navedeno u broju američkog patenta 4,636,505.

Izraz "agonista gonadorelina", u ovom tekstu obuhvata, pored ostalog, abareliks, goserelin i goserelin acetat. Goserelin je pokazan u broju američkog patenta 4,100,274 i obeležen je kao ZOLADEX. Abareliks je moguće formulisati, npr., kako je to pokazano u broju američkog patenta 5,843,901.

Izraz "inhibitor topoizomeraze I", u ovom tekstu obuhvata, pored ostalog, topotekan, gimatekan, irinotekan,kamptotecian i njegovi analozi, 9-nitrokamptotecin i makromolekularni konjugat kamptotecina PNU-166148 (supstanca A1 u WO99/17804). Irinotekan može da se primenjuje, npr., u obliku u kom je prisutan na tržištu, npr., pod zaštitnim imenom CAMPTOSAR. Topotekan može da se primenjuje, npr., u obliku u kom je prisutan na tržištu, npr., pod zaštitnim imenom HYCAMTIN.

Izraz "inhibitor topoizomeraze II" u ovom tekstu obuhvata, pored ostalog, antracikline, kao što je doksorubicin, uključujući i lipozomalnu formulaciju,npr., CAELYX, daunorubicin, uključujući i lipozomalnu formulaciju, npr., DAUNOSOME, epirubicin, idarubicin i nemorubicin; antrahinoni mitoksantron i lozoksantron; i podofilotoksini etopozid i tenipozid. Etopozid je na tržištu prisutan kao ETOPOPHOS; tenipozid kao VM 26-BRISTOL; doksorubicin kao ADRIBLASTIN ili ADRIAMYCIN; epirubicin kao FARMORUBICIN; idarubicin kao ZAVEDOS; i mitoksantron kao NOVANTRON.

Izraz "aktivno sredstvo za mikrotubule ", u ovom tekstu se odnosi na sredstvo koje stabilizuje mikrotubule, destabilizuje mikrotubule i inhibitore polimerizacije mikrotubulina, uključujući, pored ostalog, taksane, npr., paklitaksel i docetaksel; vinča alkaloide, npr., vinblastin, posebno vinblastin sulfat; vinkristin, posebno vinkristin sulfat i vinorelbin; diskodermolide; kohicin i njegovi epotilonesand derivati, npr., epotilon B ili njegovi derivati. Paklitaksel je na tržištu prisutan kao TAXOL; docetaksel kao TAXOTERE; vinblastin sulfat kao VINBLASTIN R.P; i vinkristin sulfat kao FARMISTIN. Takodje su obuhvaćeni generički oblici paklitaksela kao i različiti dozni oblici paklitaksela. Generički oblici paklitaksela obuhvataju, pored ostalog, betaksolol hidrohlorid. Različiti dozni oblici paklitaksela uključuju, pored ostalog albumin nanočestice paklitaksela na tržištu prisutne kao ABRAXANE; ONXOL, CYTOTAX. Diskodermolid je moguće dobiti, npr., kako je pokazano u broju američkog patenta 5,010,099. Takodje su uključeni i derivati Epotolina koji su pokazani u broju američkog patenta 6,194,181 WO 98/10121, WO 98/25929, WO98/08849, WO 99/43653, WO 98/22461 i WO 00/31247. Naročito su poželjni Epotolin A i/ili B.

Izraz "alikilirajući agens", u ovom tekstu obuhvata, pored ostalog ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan ili nitrozourea (BCNU ili Gliadel), ili temozolamid (TEMODAR). Ciklofosfamid može da se primenjuje, npr., u obliku u kom se pojavljuje na tržištu, npr., pod zaštitnim imenom CYCLOSTIN; i ifosfamid kao HOLOXAN.

Izraz "anti-neoplastični antimetabolit", u ovom tekstu obuhvata, pored ostalog, 5-fluorouracil (5-FU); kapecitabin; gemcitabin;DNK demetilirajući agensi, kaošto su 5-azacitidin i decitabin; metotrksat; edatreksat; i antagonisti folne kiseline kao što su, izmedju ostalog, pemetreksed. Kapecitabin može da se primenjuje, npr., u obliku koji dostupan na atržištu, npr., pod zaštitnim imenom XELODA; i gemcitabin kao GEMZAR.

Izraz "jedinjenja platine", u ovom tekstu obuhvata, pored ostalog karboplatin, cisplatin, cisplatinum, oksaliplatin, Satrplatin, sredstva na bazi platine kao što je ZD0473. Karboplatin se može primenjivati, npr., u obliku koji je prisutan na tržištu, npr., CARBOPLAT; i oksaliplatin kao ELOXATIN.

Izraz "supstanca koja je specifično usmerena prema/koja smanjuje aktivnost proteinske ili lipidne kinaze; ili aktivnost proteinske ili lipidne fosfataze, dalje supstanca koja sprečava angiogenezu", u ovom tekstu obuhvata, pored ostalog, protein tirozin kinazu i/ili inhibitore serin i/ili treonin kinaze ili inhibitore lipidne kinaze, na primer:

i. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost receptora za faktor rasta endotela (VEGF), kao što su supstance koje usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost VEGF-a, posebno supstance koje inhibiraju VEGF receptor, kao što su pored ostalih, derivati 7H-pirolo[2,3-d]pirimidina (AEE788); BAY 43-9006; izolholin supstance pokazane u WO 00/09495 kao što su (4-terc-butil-fenil)-94-piridin-4-ilimetil-izohinolin-1-il)-amin (AAL881); i

ii. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost receptora za faktor rasta izveden iz trombocita (platelet derived growth factor receptor, PDGFR), kao što su supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost PDGFR, posebno supstanci koje inhibiraju PDGF receptor, npr., derivat N-fenil-2-pirimidin-amina, npr., imatinib, SU101, SU6668 i GFB 111;

iii. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost receptora za faktor rasta fibroblasta (fibroblast growth factor receptor, FGFR);

iv. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost receptora 1 za faktor rasta sličan insulinu (insuline like growth factor receptor 1, IGF-1R), kao što su supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost IGF-1R, posebno supstance koje inhibiraju IGF-1R receptor. Ove supstance obuhvataju, pored ostalih, i supstance pokazane u WO 02/092599 i njihove derivate, kao i derivate 4-amino-5-fenil-7-ciklobutil-pirolo[2,3-d]pirimidina (AEW541);

v. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost familije Trk receptor tirozin kinaza;

vi. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost familije Axl receptor tirozin kinaza;

vii. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost C-Met receptora;

viii. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost Ret receptor tirozin kinaze;

ix. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost Kit/SCFR receptor tirozin kinaze;

x. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost C-kit receptor tirozin kinaza (član PDGFR famillije), kao što su supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost familije c-Kit receptor kinaza, posebno supstanci koje inhibiraju c-Kit receptor, npr., imatinib;

xi. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost članova c Abl familije i produkata fuzionisanja njihovih gena, npr., BCR-Abl kinaza, kao što su supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost članova familije c-Abl i produkata fuzionisanja njihovih gena, npr., derivati N-fenil-2-pirimidin-amina, npr., imatinib, PD 180970, AG957, NSC 680410 iliPD 173955 od ParkeDavis; BMS354825

xii. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost članova protein kinaza C i Raf familije serin/treonin kinaza, članovi MEK, SRC, JAK, FAK, PDK i članovi Ras/MAPK familje, ili familija PI(3) kinaze, ili famillija kinaza srodnih PI(3) kinazi, i/iličlanovi familije ciklin zavisnih kinaza (CDK) i posebno su oni derivati staurosporina pokazani u broju američkoga patenta 5,093,330, npr., midostaurin; primeri za dalje supstance uključuju, npr., UCN-01; safingol; BAY 43-9006; Briostatin 1; Perifozin; Limfozin; RO 318220 i RO 320432; GO 6976; Isis 3521; LY 333531/LY 379196; izohinolin supstance, kao što su one pokazane u WO 00/09495; FTI; PD184352 ili QAN697, inhibitor PI3K ;

xiii. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost protein tirozin kinaze, kao što je imatinib mezilat (GLEEVEC); tirfostin ili pirimidilaminobenzamid i njegovi derivati (AMN107). Poželjno je da je tirfostin supstanca male molekulske mase (Mr<1500), ili izvedena farmaceutski prihvatljiva so, posebno supstanca odabrana iz klase benzilidenmalonitrila ili S arilbenzenmalonitrila ili bisupstrat hinollin klase jedinjenja, a posebno ma koja supstanca odabrana iz grupe koja se sastoji od tirfostina A23/RG-50810, AG 99, Tirfostina AG 213, Tirfostina AG 1748, Tirfostina AG 490, Tirfostina B44, Tirfostina B44 (+) enantiomer, tirfostian AG 555, AG494, Tirfostina AG 556; AG957 i adafostin (4-{[(2,5-dihidroksifenil)metil]amino}-benzoeva kiselina adamantil estar, NSC 680410, adafostin);

xiv. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost familije receptora tirozin kinaza za faktor rasta epiderma (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 kao homo- ili heterodimeri), kao što su supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost familije receptora za epidermalni faktor rasta su posebno supstance, proteini ili antitijela koja inhibiraju članove EGF receptor famillije tirozin kinaza, npr., EGF receptor, ErbB2, ErbB3 i ErbB4 ili se vezuju za EGF ili za EGF srodne ligande, a naročito su to one supstance, proteini ili monoklonska antitijela, generički i specifično pokaana u WO 97/02266, npr., supstanca iz Primera 39, ili u EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0566 226,EP 0 787 722, EP 0 837 063, broj američkog patenta5,747,498, WO 98/10767, WO 97/49688, WO 97/38983 i naročito, WO96/30347, npr., supstanca poznata kao CP358774, WO96/33980, npr., supstanca ZD 1839; i WO 95/03283, npr., supstanca ZM105180, npr., trastuzumab (HERCEPTIN®), cetuksimab, Iresa, OSI-774, CI 1033, EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 ili E7.6.3 i derivati 7H-pirolo-[2,3-d]pirimidina koji su pokazani u WO 03/013541, erlotinib gefitinib. Erlotinib može da se primenjuje u obliku koji postoji na tržištu, npr., TARCEVA i gefitinib kao IRESSA, humana monoklonska antitijela prema receptoru za epidermalni faktor rasta uključujući i ABX-EGFR; i

xv. supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost/funkciju serin/treonin mTOR kinaze su pogotovo supstance, proteini ili antitijela koja su usmerena/inhibiraju članove familije TOR kinaza, npr., RAD, RAD001, CCI-779, ABT578, SAR543, rapamicin i njegovi derivati/analozi, AP23573 i AP23841 od Ariad, everolimus (CERTICAN) i sirolimus. CERTICAN (everolimus, RAD) novi inhibitor signala za proliferaciju, još se ispituje, koji sprečava proliferaciju T-ćelija i ćelija glatke muskulature krvnih sudova.

Što se tiče antitijela, treba uključiti intaktna monoklonska antitijela, nanotela, poliklonska antitijela, multi-specifična antitijela formirana od najmanje 2 intaktna antitijela i fragmenta antitijela dok god pokazuju biološku aktivnost.

Izraz "supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost proteinske ili lipidne fosfataze" obuhvata, pored ostalog, inhibitore fosfataze 1, fosfataze 2A, PTEN ili CD25, npr., okadaičnu kiselinu ili njihove derivate.

Izraz "monoklonsko antitijelo", u ovom tekstu obuhvata, pored ostalog, bevacizumab, cetuksimab, trastuzumab, Ibritumomabtiuksetan, denosumab, anti-CD40, anti-GM-CSF i tositumomab i jod I131. Bevacizumab može da se primenjuje u obliku koji je dostupan na tržištu, npr., AVASTIN; cetuksimab kao ERBITUX; trastuzumab kao HERCEPTIN; Rituksimab kao MABTHERA; Ibritumomab tiuksetan kao ZEVULIN; anti-RNKL kao denosumab (AMG 162), anti-CD40 kao HCD122 (američka patentna prijava 2002-0106371) i tositumomab i jod I131 kao BEXXAR.

Izraz "supstance koje sprečavaju angiogenezu" obuhvata, izmedju ostalog, supstance koje iamju jedan drugi mehanizam delovanja, npr., nezavisno od inhibicije proteinske ili lipidne kinaze, npr., talidomid (THALIDOMID) i TNP-470.

Izraz "supstance koje indukuju procese ćelijske diferncijacije" u ovom tekstu, obuhvataju, pored ostalog, retinoičnu kiselinu, α-, γ- ili δ-tokoferol ili α-, γ- ili δ-tokotrienol.

Izraz "inhibitor ciklooksigenaze", u ovom tekstu obuhvata, pored ostalog, npr., Cox-2 inhibitore, 5-alkil supstituisane 2-arilaminofenilacetatna kiselina i njihovi derivati, kao što su celekoksib (CELEBREX), rofekoksib (VIOXX), etorikoksib, valdekoksib ili 5-alkil-2-arilaminoacetatna kiselina, npr., 5-metil-2-(2'-hloro-6'-fluoroanilino)fenil acetatna kiselina, lumirakoksib.

Izraz "bisfosfonati", u ovom tekstu, obuhvata, pored ostalog, etridonsku, klodronsku, tiludronsku, pamidronsku, alendronsku, ibandronsku, risedronsku i zoledronsku kiselinu. "Etidronska kiselina" može da se primenjuje, npr., u obliku koji je prisutan na tržištu, npr., DIDRONEL; "Klodrinska kiselina" kao BONEFOS; "tiludronska kiselina" kao SKELID; "pamidronska kiselina" kao AREDIA; "alendronska kiselina" kao FOSAMAX; "ibandronska kiselina" kao BONDRANAT; "risedronska kiselina" kao ACTONEL; i "zoledronska kiselina" kao ZOMETA.

Izraz "inhibitor heparinaze", u ovom tekstu, se odnosi na supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju degradaciju heparin sulafata. Ovaj izraz podrazumeva, pored ostalog, PI 88.

Izraz "modifikator biološkog odgovora", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, limfokin ili interferone, npr., interferon γ.

Izraz "inhibitor Ras okogenih izoformi", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, H-Ras, K-Ras ili N-Ras, u ovom tekstu, se odnosi na supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju onkogenu aktivnost Ras-a, npr., inhibitro farnezil transferaze (farnezyl transferase inhibitor, FTI), npr., L-744832, DK8G557 ili R115777 (ZARNESTRA).

Izraz "inhibitor telomeraze", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost telomeraze. Supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost telomeraze su posebno supstance koje inhibiraju receptor za telomerazu, npr., telomestatin.

Izraz "inhibitor matriksne metaloproteinaze" ili (MMP inhibitor), u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, kolagenski peptidomimetik i nepeptidomimetske inhibitore; derivati tetraciklina, npr., hidroksamat peptidomimetski inhibitor batimastat; i njegov oralni biodostupni analog marimastat (BB-2516), prinomastat (AG3340), metastat (NSC 683551) BMS 279251, BAY 12-9566, TAA211, MMI270B ili AAJ996.

Izraz "inhibitor metionin aminiopeptidaze", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost metionin aminopeptidaze. Supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost metionin aminopeptidaze su, npr., bengamid ili njegovi derivati.

Izraz "inhibitori proteozoma", u ovom tekstu, obuhvata supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost proteozoma. Supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost proteozoma obuhvataju pored ostalog, PS-341; MLN 341.bortezomib ili Velkad.

Izraz "sredstvo koje se koristi u lečenju hematoloških maligniteta", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, inhibitore FMS-sličnih tirozin kinaza, npr., supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost FMS-sličnih tirozin kinaznih receptora (Flt-3R); interferon, 1-b-D-arabinofuranzilcitozin (ara-c) i bisulfan; i ALK inhibitore, npr., supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju kinaze anplastičnih limfoma.

Izraz "supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju aktivnost Flt-3" u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, supstance, proteine ili antitijela koja inhibirajuFlt-3, npr., N-benzoil staurosporin, midostaurin, derivat staurosporina, SU11248 i MLN518.

Izraz "HSP90 inhibitori", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju intrisičnu ATPaznu aktivnost HSP90; degradacija, usmeravanje, smanjenje ili inhibicija partnerskih proteina HSP90 preko ubikvitin proteozomskog puta. Supstance koje specifično usmeravaju, smanjuju ili inhibiraju intrinzičnu ATPaznu aktivnost HSP90 su posebno supstance, proteini i antitijela koja inhibiraju ATPaznu aktivnost HSP90, npr., 17-alilamino, 17-demetoksigeldanamicin (17AAG), derivat geldanamicina; druge supstance slične geldanamicinu; radicikol i HDAC inhibitori.

Izraz "antiproliferativno antitijelo", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, trastuzumab (HERCEPTIN), trastuzumab-DM1, erlotinib (TARCEVA), bevacizumab (AVASTIN), rituksimab (RITUXAN), PRO64553 (anti-CD40) i 2C4 Antitijelo. Pod antitijelom se podrazumevaju npr., intaktna antitijela, poliklonska antitijela, multispecifična antitijela nastala od najmanje 2 intaktna antitijela i fragmenti antitijela dok god pokazuju željenu biološku aktivnost.

Izraz "HDAC inhibitor" u ovom tekstu se odnosi na supstance koje inhibiraju histon deacetilazu i koje poseduju anti-proliferativnu aktivnost. Ovo obuhvata, pored ostalog, supstance pokazane u WO 02/22577, naročito N-hidroksi-3-[4-[[(2-hidroksietil)[2-(1H-indol-3-il)etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamid i N-hidroksi-3-[4-[[[2-(2-metil-1H-indol-3-il)-etil]-amino]metil]fenil]-2E-2-propenamid i farmaceutski prihvatljive: njihove soli (LBH589). Dalje, tu posebno pripada Suberoilanilid hidroksaminska kiselina (SAHA); [4-(2-amino-fenilkarbamoil)-benzil]-karbaminska kiselina piridin-3-ilmetil estar i njihovi derivati; butirična kiselina, piroksamid, trihostatin A, Oksamflatin, apicidin, Depsipeptid; depudecin i trapoksin.

Izraz "antagonista somatostatinskog receptora", u ovom tekstu, obuhvata, pored ostalog, sredstva koja specifično obeležavaju, tretiraju ili inhibiraju somatostatinski receptor, kao što je oktreorid i SOM230.

Izraz "supstance sa anti-leukemijskim delovanjem", u ovom tekstu, obuhvataju pored ostalog, Ara-C, pirimidinski analog, koji je 2'-α-hidroksi ribozni (arabinozid) derivat deoksicitidina. Takodje je uključen purinski analog hipksantina, 6-merkaptopurin (6-MP) i fludarabin fosfat.

Izraz " pristupi koji u osnovi imaju štetno delovanje na tumorske ćelije" odnosi se na pristupe kao što je jonizujuće zračenje. Izraz „jonizujuće zračenje“ odnosi se na ranije pomenuto i kasnije pomenuto u ovom tekstu, označava jonizujuće zračenje u vidu elektromagnetnih zraka, kao što su X-zraci i gama zraci; ili čestice kao što su alfa, beta i gama čestice. Jonizujuće zračenje se primenjuje u, pored ostalog, radijacionoj terapiji i poznato je u oblasti. Videti Hellman, Cancer, 4th Edition, Vol. 1, Devita i sar., Eds., pp.248-275 (1993).

Izraz " vezivni elemenat za EDG ", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, klasu imunosupresanata koji modulišu limfocitnu recirkulaciju, kao što je FTY720.

Izraz "inhibitor ribonukleotid reduktaze", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, analoge pirimidinskih ili purinskih nukleozida, uključujući, pored ostalog, fludarabin i/ili ara-C; 6-tioguanin; 5-FU; kladribin; 6-merkaptopurin, naročito u kombinaciji zajedno sa ara-Cprotiv ALL;i/ili pentostatin. Inhibitori ribonukleotid reduktaze su naročito derivati hidroksiuree ili 2-hidroksi-1H-izoindol-1,3-diona, ako što su PL-1, PL-2, PL-3, PL-4, PL-5, PL-6, PL-7 ili PL-8. Videti Nandy isar., Acta Oncologica, Vol. 33, No. 8, pp. 953-961 (1994).

Izraz "inhibitori S-adenozilmetionin dekarboksilaze", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, supstance pokazane u broju američkog patenta 5,461,076.

Izraz "monoklonska antitijela prema VEGF ili VEGFR",u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, supstance pokazane u WO 98/35958, npr., 1-(4-hloroanilino)-4-(4-piridilmetil)ftalazin ili farmanceutski prihvatljiva so ovog jedinjenja, npr., sukcinat, ili u WO00/09495, WO 00/27820, WO 00/59509, WO 98/11223, WO 00/27819 i EP 0 769 947; zatim one opisane kod Prewett i sar., Cancer Res. Vol. 59, pp. 5209-5218 (1999); Yuan i sar., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 93, pp. 14765-14770 (1996); Zhu i sar., Cancer Res, Vol. 58, pp. 3209-3214 (1998); i Mordenti isar., Toxicol Pathol, Vol. 27, No. 1, pp.14-21 (1999) u WO 00/37502 i WO 94/10202; ANGIOSTATIN, opisan kod O' Reilly i sar.,Cell Vol. 79, pp. 315-328 (1994); ENDOSTATIN, opisan kod O' Reilly i sar., Cell Vol. 88, pp. 277-285 (1997); amidi antranilne kiseline; ZD4190; ZD6474, SU5416; SU6668; bevacizumab; ili anti-VEGF antitijela ili anti-VEGF receptor antitijela, npr., rhuMAb i rhuFab; VEGF aptamer, npr., Makugomn; FLT-4 inhibitori; FLT-3 inhibitori; VEGFR-2 IgG1 antitijelo; Angiozim (RPI 4610); i Avastan.

Izraz "fotodinamska terapija", u ovom tekstu, se odnosi na jednu vrstu terapije koja koristi odredjene vrste hemikalija poznatih kao sredstva za fotosenzitizaciju u cilju lečenja i prevencije malignih tumora. Kao primer fotodinamske terapije navodi se, pored ostalog, tretiranje sa sredstvima kao što su, npr., VISUDYNE i porfimer natrijum.

Izraz "steroid sa angiostatskim delovanjem", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, sredstva koja blokiraju ili inhibiraju angiogenezu, kao što su, npr., anekortav, triamcinolon, hidrokortizon, 11-α-epihidrokortizol, korteksolon, 17α-hidroksiprogesteron, kortikosteron, dezoksikortikosteron, testosteron, estron i deksametazon.

Izraz "implant koji sadrži kortikosteoide", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, sredstva kao što su, npr., fluocinolon i deksametazon.

Izraz "antagonista AT1 receptora", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, sredstva kao što je DIOVAN.

Izraz "ACE inhibitor", u ovom tekstu, obuhvata pored ostalog, CIBACEN, benazepril, enazepril, (LOTENSIN), kaptopril, enalpril, fosinopril, lisinopril, moeksipril, kinapril, ramipril, perindopril i trandolapril.

Druga farmaceutski aktivna sredstva obuhvataju, pred ostalog, biljne alkaloide, hormonska sredstva i antagoniste, modifikatore biološkog odgovora, poželjno je da to budu limfokini ili interferoni, antisens oligonukleotidi ili derivati oligonukleotida; ili mešovita sredstva ili sredstva sa drugim ili nepoznatim mehnizmom delovanja.

Gde god su citirane patentnte prijave ili naučne publikacije, naročito u odnosu na odgovarajuće patentne zahteve u vezi sa supstancom i na finalne proizvode iz radnih primera koji su tamo opisani, suština finalnih proizvoda, farmaceutski preparati i zahtevi su ovim putem uključeni u ovu aplikaciju preko reference na ove publikacije. Na isti način se sastoje od odgovarajućih stereoizomera, kao i odgovarajuće kristalne modifikacije, npr., rastvorene supstance i polimorfi, koji su pokazani u njima. Supstance koje se koriste kao aktivni sastojci u kombinacijama koje su ovde pokazane, mogu se dobijati i primenjivati kao što je to opisano u citiranim dokumenrtima.

Struktura aktivnih sredstava koje su identifikovane preko broja koda, generičkog ili zaštićenog imena mogu se uzeti iz aktuelnog izdanja kompendium „the Mercl Index“ ili iz baza podataka, npr., Patents International, npr., iMS World Publications ili iz pblikacija koje su pomenute u ranijem ili kasnijem tekstu.Odgovarajući sadržaj pomenutih dokumenata je ovde uključen preko reference.

Treba računati da reference koje se odnose na komponenete (a) i (b) takodje obuhvataju farmaceutski prihvatljive soli svake od aktivnih supstanci. Ako aktivne supstance koje se ssastoje od komponenata (a) i/ili (b) imaju, na primer, najmanje jedan bazni centar, mogu da grade kisele soli dodatno. Odgovarajuće dodatne kisele soli mogu takodje nastati, postojanjem ako je to poželjno, još jednog dodatnog baznog centra. Aktivne supstance kojue imaju jednu kiselu grupu, npr., COOH, mogu da grade soli sa bazama. Aktivne supstance koje se sastoje od komponenata (a) i/ili (b) ili farmaceutski prihvatljive soli mogu se takodje koristiti u obliku hidrata ili da sadrže druge rastvarače koji se koriste za kristalizaciju.

Dakle, u prvom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za prevenciju lečenja proliferativnih bolesti ili bolesti koje su uzrokovane perzistentnom angiogenezom kod sisara, poželjno je kod humanog pacijenta, koji se sastoji od tretiranja pacijenta istovremeno, zajednički ili uzastopno sa farmaceutski efikasnim količinama kombinacija:

a) neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije; i

b) faramceutski aktivnog sredstva.

U poželjnom izvodjenju, ovaj pronalazak opisuje farmaceutski preparat koji se sastoji od:

a) neutrališuće anti-DKK1/4 komozicije; i

b) jednog ili više farmaceutski aktivnih sredstava odabranih iz grupe koja se sastoji od inhibitora aromataze; antiestrogena; anti-androgena; agoniste gonadorelina; inhibitora topoizomeraze I; inhibitora topoizomeraze II; aktivnog sredstva za mikrotubule; alkilirajućeg sredstva; anti-neoplastičnog sredstva anti-metabolitskog mehanizma delovanja; platinskog jedinjenja; supstance koja je specifično usmerena prema/koja smanjuje aktivnost proteinske ili lipidne kinaze; ili aktivnost proteinske ili lipidne fosfataze, supstance koja sprečava angiogenezu; supstance koja indukuje procese ćelijske diferencijacije; monoklonskih antitijela; inhibitora ciklooksigenaze; bisfosfonata; inhibitora heparinaze; modifikatora biološkog odgovora; inhibitora Ras onkogenih izoformi; inhibitora telomeraze; inhibitora proteaze; inhibitora matriksne metaloproteinaze; inhibitora metionin aminopeptidaze; inhibitora proteozoma; sredstva koja se koriste u lečenju hematoloških maligniteta ili supstanci koje usmeravaju, umanjuju ili inhibiraju aktivnost Flt-3; inhibitora HSP90; antiproliferativnih antitijela; inhibitora histon deacetilaze (HDAC); supstance koja usmerava, umanjuje ili inhibira aktivnost/funkciju serin/treonin mTOR kinaze; antagoniste somatostatinskog receptora; supstanci sa anti-leukemijskim delovanjem; pristupa koji u osnovi imaju štetno delovanje na tumorske ćelije; vezivnog elementa za EDG; inhibitora ribonukleotid reduktaze; inhibitora S-adenozilmetionin dekarboksilaze; monoklonskog antitijela prema VEGF ili VEGFR; fotodinamske terapije; steroida sa angiostatskim delovanjem; implanta koji sadrži kortikosteroide; antagoniste ATI receptora; i ACE inhibitora.

Kombinacija komponenata (a) i (b), postupak lečenja toplokrvnih žiotinja koji se sastoji od primene ove dve komponente, farmaceutska kompozicija koja se sastoji od ove dve komponente za istovremenu, odvojenu ili uzastopnu upotrebu, upotreba kombinacije u cilju odlaganja progresije ili lečenja proliferativne bolesti ili za proizvodnju farmaceutskog preparata u ove svrhe ili tržišni proizvod koji sadrži takvu kombinaciju komponenti (a) i (b), sve pomenute ili definisane u ranijem tekstu, kasnije će biti navedene takodje kao kombinacija iz pronalaska (tako da se ovaj izraz odnosi na svako od ovih izvodjenja koji dakle mogu da zamene ovaj izraz gde se to nadje za shodno).

Istovremena primena može, npr., da bude u bliku jedne fiksirane kombinacije sa dva ili više aktivnih sastojaka, ili istovremenim davanjem dva ili više aktivna sastojka koji su formulisani nezavisno. Uzastopna upotreba (primena) poželjno je da označava primenu jedne (ili više) komponenti iz udružene kombinacije u jednom momentu, druge komponente u drugom momentu, odnosno, na hronološki stepenast način, poželjno je takav da kombinacija komponenti pokazuje veću efikasnost delovanja u odnosu na pojedinačne supstance kada se daju odvojeno (posebno kada imaju sinergističko delovanje). Odvojena upotreba (primena) najviše znači primenu komponenata iz ombinacije nezavisno jedna od druge u različitim vremenskim momentima, poželjno je da to znači da su komponente (a) i (b) primenjene tako da merljive količine obe supstance u krvi nisu prisutne na preklapajući način (istovremeno).

Takodje su moguće kombinacije dve ili više uzastopnih, zasebnih i simultanih primena, poželjno je takvih, da kombinacija sastavnih lekova ima udruženo terapijsko delovanje koje prevazilazi efikasnost koja se dobija kada se sastavne komponente iz kombinacije koriste nezavisno, u vremenskim intervalima tako dugačkim da nije moguće naći nikakvo uzajamno delovanje na njihovu terapijsku efikasnost, s tim što je sinergistički efekat naročito poželjan.

Izraz „da se odloži progresija“ u ovom tekstu označava primenu kombinacije na pacijente koji su u predstanju ili u ranoj fazi, prve manifestacije ili relapsa bolesti koju lečimo, u kojoj je pacijentu, npr., predforma odgovarajuće bolesti dijagnostikovana ili u kojoj su pacijenti u stanju, npr., tokom medicinskog lečenja ili u stanju koje je nastalo kao posledica nesreće, u kojem je verovatno da će se odgovarajuća bolest razviti.

„Udruženo terapijski aktivni“ ili „udruženo terapijsko delovanje“ znači da se supstance mogu davati odvojeno (na hronološki stepenast način, a naročito na način sa specifičnim redosledom) u takvim vremenskim intervalima da, poželjno je, kod toplokrvnih životinja, naročito ljudi, kojima je potrebno lečenje, još uvek pokazuju (poželjno je sinergističku) interakciju (udruženo terapijsko delovanje). Bez obzira da li je ovo slučaj, ako je moguće iter alia odrediti prateći nivoe u krvi, pokazujući da su obe supstance prisutne u krvi pojedinca koji se leči, bar tokom odredjenih vremenskih intervala.

„Farmaceutski efikasna“ poželjno je da se odnosi na količinu koja je terapeutski ili u širem smislu takodje profilaktički efikasna u sprečavanju progresije proliferativne boesti.

Izraz „komercijalno pakovanje“ ili „proizvod“, u ovom tekstu definiše naročito „kit sastavljen iz delova“ u smislu da je komponente (a) i (b) kao što su definisane ranije, moguće dozirati svaku nezavisno ili upotrebom različitih fiksiranih kombinacija sa različitim odredjenim količinama komponenata (a) i (b), tj., istovremeno ili u različitim vremenskim tačkama. Štaviše, ovi izrazi označavaju ono što ulazi u sastav komercijalnog pakovanja koje sadrži (posebno kombinujući) kao aktivne sastojke komponente (a) i (b), zajedno sa uputstvima za istovremenu, uzastopnu (hronološki stepenasto, po vremenski odredjenom redosledu, poželjno je) ili (manje je poželjno) odvojenu upotrebu kod odlaganja progresije ili lečenja proliferativne bolesti. Delovi kita sastavljenog iz delova se mogu onda, npr., primenjivati istovremeno ili hronolški stepenasto, to jest u različitim vremenskim tačkama, i sa jednakim ili različitim vremenskim intervalima za ma koji deo kita. Veoma je poželjno, da su vremenski intervali izabrani tako da je delovanje na bolest koja se leči sa kombinovanom upotrebom veće od delovanja koje bi se dobilo upotrebom samo jednog, bilo kog, partnera iz kombinacije (a) i (b) (što se može odrediti pomoću standardnih metoda). Odnos ukupnih količina partnera (a) iz kombinacije prema partneru (b) koji će biti primenjen zajedno u kombinovanom preparatu može da se varira, npr., da bi zadovoljili potrebe svakog pojedinačnog pacijenta sa različitim potrebama, usled toga što boluje od odredjene bolesti, starosti, pola, telesne težine, itd. pacijenta. Poželjno je da ima makar jedno povoljno i korisno delovanje, npr., uzajamno pojačavanje delovanja kombinacije partnera (a) i (b), pogotovo ako je efekat veći od aditivnog, koji bi onda mogao da se postigne sa manjim dozama svakog od lekova iz kombinacije, da se bolje toleriše nego u slučaju lečenja sa pojedinačnim lekovima bez kombinovanja jednog sa drugim, obezbedjujući na taj način dodatno povoljno delovanje, npr., manje sporednih efekata ili kombinovano terapijsko delovanje u neefikasnoj dozi jednog ili oba partnera iz kombinacije (komponenti) (a) i (b) i veoma je poželjno jako sinergističko delovanje partnera iz kombinacije (a) i (b).

U oba slučaja, kako kod upotrebe kombinacije komponenti (a) i (b), tako i kod upotrebe na tržištu dostupnog pakovanja, svaka kombinacija istovremenog, uzastopnog i odvojenog davanja je takodje moguća, što znači da komponente (a) i (b) mogu da se primenjuju u jednom momentu istovremeno, a da se posle toga primenjuje samo jedna komponenta sa manjim toksičnim delovanjem prema domaćinu bilo hronično, npr., više od 3-4 nedelje dnevnog unošenja doze, u nekom vremenu kasnije i sledeća druga kmponenta ili kombinacija obe komponente u vremenu još kasnije (u sledećoj kombinaciji lekova tretman juri za optimalnim anti-tumorskim delovanjem) ili tome slično.

KOMBINACIJA IZ PRONALASKA takodje može da se primenjuje u kombinaciji sa drugim tretmanima, npr., hirurška intervencija, hipertermija i/ili zračenje.

Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu se pripremiti na konvencionalni način i to su one koje se primenjuju enteralnim putem, kao što je oralno ili rektalno, i parenteralnim putem kod sisara uključujući i čoveka, koje se sastoje od terapeutski efikasnih količina inhibitora VEGF i najmanje jednog farmaceutski aktivnog sredstva, samog ili u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, pogotovo onih koji su pogodni za enteralnu ili parenteralnu upotrebu.

Farmaceutske kompozicije se sastoje od oko 0,00002 do oko 100%, posebno, npr., infuzioni rastvori koji su spremni za upotrebu, od 0,0001 do 0,02%, ili, npr.,u slučaju koncentrata za injekcije ili infuzije ili naročito za parenteralne formulacije, od približno 0,1% do približno 95%, poželjno je od oko 1% do oko 90%, još više poželjno od oko 20% do oko 60% aktivnog sastojka (w/w procenata u svakom navedenom slučaju). Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu da budu, npr., u oblku jedinice doziranja, kao što su ampule, vajle, dražeje, tablete, infuzione kese ili kapsule.

Efikasno doziranje svakog od partnera iz kombinacije koji je uvršten u formulaciju iz ovog pronalaska može da varira u zavisnosti od odredjene supstance ili farmaceutskih kompozicija koje su upotrebljene, načina primene, stanja koje se leči i ozboljnosti stanja koje se leči. Lekar opšte prakse, specijalista ili veterinar uobičajenih sposobnosti, može lako da odredi efikasnu količinu svakog od aktivnih sastojaka koji su neophodni za sprečavanje, lečenje ili zaustavljanje pogoršanja stanja.

Tirfostini, naročito Adafostin, poželjno je da se primenjuju kod toplokrvnih životinja, naročito kod ljudi u dozi iz opsega od oko 1-6000 mg/dnevno, još poželjnije 25-5000 mg/dnevno, a najpoželjnije 50-4000 mg/dnevno. Ukoliko nije drugačije rečeno, supstanca se primenjuje poželjno je, od jedan do 5, naročito od 1-4 puta dnevno.

Farmaceutski preparati za kombinacionu terapiju za entralnu ili parenteralnu primenu su, npr., oni koji su u jediničnom doznom obliku, kao što su šećerom prevučene tablete, kapsule ili supozitorije, i još ampule. Ako nije naznačeno drugačije, ove formulacije su pripremljene na tradicionalan način, npr., konvencionalnim mešanjem, granulacijom, oblaganjem šećerom, rastvaranjem ili procesima liofilizacije. Smatraće se da je jedinični sadržaj partnera koji je prisutan u kombinaciji koji se nalazi u pojedinačnoj dozi svakog oblika za doziranje, ne mora sam po sebi da čini efikasnu količinu jer neophodna efikasna količina može da se dostigne primenom višestrukih doznih jedinica. Tako da onaj koji odlučuje o terapiji i stručnjak je u oblasti, ima mogućnost da odredi odgovarajuću farmaceutski efikasnu količinu svake od komponenata kombinacije.

Poželjno je da, supstance ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, se primenjuju kao oralne farmaceutske formulacije, u obliku tableta, kapsula ili sirupa ili kao parenteralne injekcije ako je odgovarajuće.

Za pripremanje kompozicija koje su namenjene za oralnu primenu, svaka farmaceutski prihvatljiva podloga može da se koristi kao što su voda, glikoli, ulja, alkoholi, arome, konzervansi, sredstva koja daju boju. U farmaceutski prihvatljive nosače ubrajaju se skrob, šećeri, mikrokristalne celuloze, diluenti, sredstva za granulaciju, sredstva za podmazivanje, vezujuća sredstva, sredstva za usitnjavanje.

Rastvori aktivnog sastojka, kao i suspenzije, a pogotovo izotonični vodeni rastvori ili suspenzije, su pogodni za parenteralnu primenu aktivnog sastojka, što je omogućeno, npr., u slučaju liofilizovanih kompozicija koje se sastoje samo od aktivnog sastojka ili se koriste zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, npr., manitol, za pripremanje takvih rastvora ili suspenzija pre upotrebe. Farmaceutske kompozicije se mogu sterilisati i/ili mogu da sadrže ekscipijente, npr., konzervanse, stabilizator, sredstva za kvašenje i/ili emulgaciju, za rastvaranje, soli za regulisanje osmotskog pritiska i/ili pufere, i pripremljeni su na način koji je poznat per se, npr., tradicionalnim procesima rastvaranja ili liofilizacije. Rastvori ili suspenzije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost, kao što je natrijum karboksimetilceluloza, karboksimetilceluloza, dekstran, polivinilpirolidon ili želatin. Suspenzije u uljima sadrže kao uljanu komponentu biljno, sintetičko ili polu-sintetičko ulje koje se uobičajeno koristi za pripremanje injekcija.

Izotono sredstvo može da se odabere medju svim onim koji se koriste u ovoj oblasti, npr., manitol, dekstroza, glukoza, i natrijum hlorid. Formulacija za infuziju može da se razblaži sa vodenom podlogom. Količina vodene podloge koja je potrebna kao diluent, se procenjuje prema željenoj koncentraciji aktivnog sastojka u finalnom rastvoru za infuziju. Rastvori za infuziju mogu da sadrže i druge ekscipijente koji se uobičajeno upotrebljavaju u formulacijama koje se primenju intravenski kao što su antioksidansi.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na „kombinovani preparat“, koji, u ovom tekstu, definiše posebno „kit sastavljen od delova“ u smislu da partneri u kombinaciji (a) i (b), kao što je to ranije definisano, mogu da se doziraju nezavisno ili korišćenjem različitih fiksiranih kombinacija sa istaknutim količinama kombinacionih partnera (a) i (b), tj., istovremeno ili u različitim vremenskim trenucima. Delovi kita se mogu onda primenjivati, npr., istovremeno ili hronološki stepenasto, to jest, u razlličitim vremenskim trenucima i sa istim ili različitim vremenskim intervalima izmedju primena svakog dela koji pripada kitu. Razmera ukupnih količina partnera (a) iz kombinacije i parnera (b) iz kombinacije za primenu u kombinovanom preparatu može da se varira, npr., kako bi se zadovoljile potrebe populacije pacijenata ili potrebe pojedinačnog pacijenta na osnovu ozbiljnosti bilo kakvog sporednog efekta koji može da se pojavi kod pacijenta.

Upotrebe i postupci iz pronalaska

Antitijela (i imunokonjugati i bispecifični molekuli) iz ovog pronalaska imaju in vitro i in vivo dijagnostičku i terapijsku primenu. Na primer, ovi molekuli se mogu davati ćelijama u kulturi, npr., in vitro ili in vivo, ili ispitaniku, npr., in vivo, u cilju lečenja, prevencije ili postavljanja dijagnoze za brojne poremećaje i bolesti. Pojam „ispitanik“ treba da ozančava humane i ne-humane životinje. U ne-humane životinje se ubrajaju svi kičmenjaci, npr., sisari i ne-sisari, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, krave, konji, pilići, vodozemci i reptili. Postupci su naročiro pogodni za lečenje humanih pacijenata koji imaju poremećaj povezan sa ispoljavanjem DKK1. Kada se anti-DKK1 antitijela primenjuju zajedno sa drugim sredstvom, oni se mogu primenjivati bilo po redosledu jedno po jedno bilo istovremeno.

U jednom izvodjenju, antitijela (i imunokonjugati i bispecifični molekuli) iz ovog pronalaska mogu da se koriste za detekciju nivoa DKK1, ili nivoa ćelija koje sadrže DKK1. Ovo je moguće postići, na primer, dovodjenjem u dodir uzorka (kao što je uzorak in vitro) i kontrolnog uzorka sa anti-DKK1 antitijelom pod uslovima koji omogućavaju stvaranje kompleksa izmedju antitijela i DKK1. Svi kompleksi koji se formiraju izmedju antitijela i DKK1 se detektuju i uporedjuju izmedju uzorka i kontrole. Na primeru koji ne ograničava, moguće je koristiti standardne metode za detekciju koje su dobro poznate u oblasti, kao što su, npr., ELISA, MALDI i protočna citometrija, upotrebom kompozicija iz pronalaska.

Prema tome, u jednom aspektu pronalazak dalje opisuje metode za detekciju prisustva DKK1 (npr., humanog DKK1 antigena) u uzorku, ili merenje količine DKK1, gde se podrazumeva kontakt uzorka i kontrolnog uzorka, sa antitijelom iz pronalaska, ili sa antigen-vezujućim delom antitijela, koji se specifično vezuje za DKK1, pod uslovima koji omogućavaju gradjenje kompleksa izmedju antitijela ili njegovog dela i DKK1. Zatim se gradjenje kompleksa detektuje, pa je razlika u gradjenju kompleksa izmedju uzorka i kontrolnog uzorka indikativna za prisustvo DKK1 u uzorku.

U domenu pronalska su i kitovi koji se sastoje od kompozicija (npr., antitijela, humanih antitijela, imunokonjugata i bispecifičnih molekula) iz pronalaska i uputstva za upotrebu. Kit može dalje da sadrži najmanje jedan dodatni reagens, ili jedno ili više dodatnih antitijela iz pronalaska (npr., antitijelo koje ima komplementarišuće delovanje i koje se vezuje za epitop na ciljnom antigenu, a različito je u ondosu na prvo antitijelo). Kitovi najčešće poseduju etiketu na kojoj je naznačena upotrebna namena sadržaja kita. Izraz etiketa označava ma kakvu napismeno datu informaciju ili na drugi način zabeleženu-snimljenu, koja se nalazi na ili u sastavu kita, ili na neki drugi način dolazi sa kitom.

Pošto je pronalazak u potpunosti opisan, u daljem tekstu je još dopunjen i ilustrovan primerima i patentnim zahtevima koji slede, koji su ilustrativni i nisu ograničavajući. Stručnjaci u oblasti će moći da prepoznaju ili će biti u stanju da utvrde, koristeći ne više od rutinske eksperimentalne prakse, brojne ekvivalente specifičnim procedurama koje su ovde opisane. Ovi ekvivalenti su takodje iz oblasti ovog pronalaska i patentnih zahteva. Sadržaj svih referenci, uključujući i ozvaničene patente i objavljene patentne prijave, a koji su citirani kroz čitav ovaj tekst su u ovaj tekst uvršćene referencama.

PRIMERI

Primer 1: Produkcija humanih DKK-1 - specifičnih antitijela iz biblioteke HuCAL GOLD®

Terapijska antitijela koja specifično prepoznaju humani protein DKK1 generisana su selekcijom klonova koji ispoljavaju visok afinitet vezivanja, korišćenjem komercijalno dostupne fagne biblioteke MorphoSys HuCAL GOLD® kao izvora varijanti proteina antitijela. HuCAL GOLD® je biblioteka Fab fragmenata antitijela (Knappik i sar., 2000 J.Mol.Biol. 296:57-86; Krebs i sar., 2001 J Immunol.Methods 254: 64-84; Rauchenberger i sar., 2003 J Biol Chem. 278 (40): 38194-38205) u kojoj su svih 6 CDR regiona mutacijama učinjeni različitim i koja primenjuje CysDisplayTM tehnologiju za povezivanje Fab fragmenata sa površinom faga (WO 01/05950 Lohning 2001).

Opšte procedure: prikupljanje fagmida, umnožavanje faga i prečišćavanje

Biblioteka faga HuCAL GOLD® se umnožava u standardnom medijumu koji je obogaćen bakterijama (2xYT) i sadrži 34 μg/ml hloramfenikol i 1% glukozu (2xYT-CG). Nakon infekcije ćelija na OD600nm od O.5 sa VSAM13 fagima pomagačima (inkubacijom mešavine ćelija i faga 30 min na 37oC najpre bez mućkanja a potom 30 min mućkanjem na 250 rpm), ćelije su centrifugirane (5120g; 5 min; 4oC), resuspendovane u medijumu 2xYT koji sadrži 34 μg/ml hloramfenikol, 50 μg/ml kanamicin, 0,25mM IPTG i ostavljene da rastu preko noći na 22oC. Na kraju ovog perioda ćelije su uklonjene centrifugiranjem a fagi su dva puta precipitirani iz supernatanta korišćenjem PEG-a, resuspendovani u 20% glicerolu u PBS i uskladišteni na -80oC.

Umnožavanje faga izmedju dva kruga paninga je sprovedena na sledeći način: Ćelije srednje-log faze soja E. coli TG1 su inficirane fagima i eluirane, selekcionisane korišćenjem DKK1 proteina i zasadjene na LB agar dopunjen dodatkom 1% glukoze i 34 μg/ml hloramfenikola (LB-CG ploče). Nakon prekonoćne inkubacije ploča na 30oC, kolonije bakterija su sastrugane sa površine agara i korišćene za inokulaciju 2xYT-CG bujona i dobijanje OD600nm od 05 a potom su u

cilju dobijanja produktivne infekcije dodati VCSM13 fagi pomagači kao što je gore opisano.

Pred eksperimenti za panning u rastvoru korišćenjem Strep-Tactin magnetskih kuglica

Za strep-tag II je saopšteno da poseduje nizak afinitet za Strep-Tactin matriks (KD ~ 1μM) (prema Voss i Skerra, 1997 Protein Eng. 10: 975-982) i zbog toga su pred-eksperimenti izvedeni da procene podesnost korišćenja Strep-Tactin prevučenih MagStrep kuglica za "hvatanje" antigena tokom selekcije antitijela , kao i izbegavanje gubitka antigena tokom paninga.

U tom cilju je 8 mg MagStrep kuglica inkubirano sa 46 μg His-Strep-obeleženog DKK1 i inkubirano 1h na sobnoj temperaturi nakon čega je uzorak raspodeljen u četiri pre-blokirane Eppendorf epruvetice. Jedna epruvetica je služila kao pozitivna kontrola (bez ispiranja) a preostala tri uzorka su isprana različitom jačinom prema uputstvu za paning u proskripciji HuCAL GOLD®. Detekcija vezivanja His-Strep-obeleženog DKK1 za MagStrep kuglice (Strep-Tactin prevučene magnetne kuglice dobijene od IBA, Gotingen, Nemačka) je izvršeno u sistemu BioVeris korišćenjem kozijeg anti-DKK1 antitijela i rubidijumom obeleženog anti-kozijeg antitijela za detekciju.

Kao što je prikazano na slici 1, nije detektovan značajan gubitak His-Strep-obeleženog DKK1 iz Strep-Tactin prevučenih kuglica, kada se porede kuglice koje nisu ispirane sa onima koje su ispirane različitim HuCAL® jačinama ispiranja. Tako, His-Strep-obeleženo DKK1 je izgleda prikladno za korišćenje u soluciji za paning sa Strep-Tactin prevučenim magnetnim kuglicama (MagStrep kuglice).

Selekcija paningom DKK1 specifičnih antitijela iz biblioteke

Za selekciju antitijela koja prepoznaju humani DKK1 primenjena su dva paning protokola.

Ukratko, HuCAL GOLD® fagna antitijela su podeljena u četiri grupe (pula) koje su obuhvatale različite kombinacije VH master gena (grupa 1 je sadržavala VH1/5lk; grupa 2 je sadržavala VH3lk; grupa 3 je sadržavala VH2/4/6lk; i grupa 4 je sadržavala VH1-6lk). Ove grupe su pojedinačno prošle kroz dva kruga paninga u rastvoru sa His-Strep-obeleženim DKK1 zakačenim za StrepTactin magnetne kuglice (Mega Strep kuglice; IBA), a u trećem krugu selekcije ili sa His-Strep-obeleženim DKK1 zakačenim za StrepTactin magnetne kuglice ili sa APP-obeleženim DKK1 proteinom zakačenim za streptavidin kuglice (Dynabeads® M-280 Streptavidin; Dynal) i biotinom obeleženim anti-APP antitijelom.

Detaljnije, za paning u rastvoru korišćenjem His-Strep-obeleženog DKK1 vezanog za StrepTactin magnetne kuglice, primenjen je sledeći protokol: pripremljene su pre-blokirane epruvetice (Eppendorf epruvetice od 1.5 ml) tretiranjem sa 1.5 ml 2x ChemiBLOCKER razblaženog 1:1 sa PBS preko noći na 4oC. Preblokirane kuglice su pripremljene sledećim tretmanom: 580 μl (28 mg kuglica) StrepTactin magnetnih kuglica je isprano jednom sa 580 μl PBS i resuspendovano u 580 μl 1x ChemiBLOCKER (razblaženog u jednom volumenu sa 1xPBS). Blokiranje kuglica je izvršeno u pre-blokiranim epruveticama preko noći na 4oC.

Partikule faga su razblažene u PBS do finalne zapremine od 500 μl i za svaku paning proceduru su mešane sa 500 μl 2x ChemiBLOCKER/ 0.1% Tween i držane jedan čas na sobnoj temperaturi na rotacionoj mešalici. Preadsorpcija partikula faga za uklanjanje StrepTactina ili fagova koji su vezali kuglice je izvršena dva puta: 160 μl blokiranih StrepTactin magnetnih kuglica (4 mg) je dodato blokiranim partikulama faga i inkubirano 30 min na sobnoj temperaturi na rotacionoj mešalici. Nakon separacije kuglica primenom magneta (Dynal MPC-E), fagni supernatant (~ 1.1 ml) je premešten u sveže, blokirane reakcione epruvete i ponovljena je pre-adsorpcija korišćenjem 160 μl blokiranih kuglica tokom 30 min. Nakon toga je His-Strep-obeleženi DKK1, ili 400 nM ili 100 nm, dodat u blokirane partikule faga u svežim, blokiranim 1.5 ml reakcionim epruveticama i mešavina je inkubirana 60 min na sobnoj temperaturi na rotacionoj mešalici.

Kompleks fag-antigen je "hvatan" dodatkom 320 μl blokiranih StrepTactin magnetnih kuglica u 400 nm fagnu paning frakciju odnosno dodatkom 160 μl blokiranih StrepTactin magnetnih kuglica u 100 nm fagnu paning frakciju koje su onda inkubirane 20 min na sobnoj temperaturi na rotacionoj mešalici. Partikule faga vezane za StrepTactin magnetne kuglice su ponovo sakupljane pomoću separatora za magnetne partikule.

Potom su kuglice isprane sedam puta najpre PBS/ 0.05% Tween (PBST) a onda još tri puta samo PBS. Elucija partikula faga sa StrepTactin magnetnih kuglica je izvršena dodatkom 200 μl 20 mM DTT u 10 mM TRIS-HCl, pH 8.0 u svaku epruvetu u trajanju od 10 min. Eluat je sakupljen a kuglice su isprane jednom sa 200 μl PBS i PBS eluat je dodat DTT eluatu. Ovi uzorci eluata su korišćeni za infekciju 14 ml E. coli TG-1 kultura koje su rasle na OD600nm od 0.6-0.8.

Nakon infekcije i sledstvenog centrifugiranja 10 min na 5000 rpm, svaki talog (pelet) bakterija je resuspendovan u 500 μl 2xYT medijuma, zasadjen u 2xYT-CG agar pločama i inkubiran preko noći na 30oC. Sledećeg jutra su klonovi koji su se razvili sastrugani i pripreman je fag izolacijom i umnožavanjem kao što je gore opisano.

Drugi krug paninga u rastvoru na His-Strep-obeleženom DKK1 je izveden prema protokolu za prvi krug, osim što je u ovom krugu korišćena opadajuća količina antigena (50 nM i 10 nM) i promenjena adekvatna procedura za ispiranje.

Za treći krug selekcije primenjene su dve različite procedure paninga: umnoženi fagni produkt nastao u drugom krugu paninga je podeljen na dva dela i podvrgnut različitim uslovima paninga. Prva polovina fagnog produkta je korišćena za standardnu strategiju paninga na humanim His-Strep-obeleženim DKK1 zakačenim na StrepTactin kuglice kao što je opisano ranije (količine antigena su 10 nM ili 1nM).

Druga varijacija paninga za treći krug selekcije je izvedena na APP-obeleženom DKK1. APP-obeleženi DKK1 protein u finalnoj koncentraciji od 50 nM ili 10 nM je pomešan sa 1 ml prethodno prečišćenih partikulama faga iz drugog kruga, i mešavina je inkubirana na sobnoj temperaturi 1h na rotacionoj mešalici. Paralelno, 8 mg pre-blokiranog Dynabeads M-280 streptavidina (Dynal) je inkubirano sa 40 μg biotinom obeleženog mišijeg anti-APP antitijela 30 min na sobnoj temperaturi na rotacionoj mešalici nakon čega su sledila dva ispiranja sa PBST. Preformirani kompleksi koji se sastoje iz faga-antitijela vezanih za APP-obeleženi DKK1 se "hvataju" anti-APP prevučenim M-280 streptavidinskim magnetnim kuglicama 30 min na sobnoj temperaturi. Eluacija faga i umnožavanje se izvode kao što je napred opisano.

Subkloniranje i ekspresija solubilnih Fab fragmenata

Fab-kodirajući inserti selektovanih HuCAL GOLD® fagmidi su subklonirani u vektor za ekspresiju pMORPH®X9_Fab_FH u cilju omogućavanja brze i efikasne ekspresije solubilnih Fab fragmenata. U tu svrhu je plazmidna DNA selekcionisanih klonova razložena delovanjem enzima restrikcionih endonukleaza XbaI i EcoRI što je omogućilo isecanje Fab-kodirajućih inserata (ompA-VLCL i phoA-Fd). Ovi inserti su potom klonirani u XbaI /EcoRI -razloženi vektor za ekspresiju pMORPH®X9_Fab_FH.

Ekspresijom ovih vektora dobijaju se Fab proteini koji nose dva C-terminalna obeležja (FLAGTM i 6xHis) za detekciju i purifikaciju.

Mikroekspresija HuCAL GOLD® Fab antitijela u E.coli

Za dobijanje dovoljne količine proteina koga kodiraju gore opisani produkovani klonovi, selekcionisane su hloramfenikol-rezistentne pojedinačne kolonije bakterija, nakon subkloniranja selektovanihFab fragmenata u vektor za ekspresiju pMORPH®X9_Fab_FH. Svaka od ovih kolonija je potom zasadjena u sterilne mikrotitarske ploče od 96 mesta u koncentraciji 100 μl 2xYT-CG medijuma po polju ploče, i bakterije su rasle tokom noći na 37oC. Uzorak (5 μl) svake E.coli TG-1 kulture je prenet u nove sterilne mikrotitarske ploče od 96 mesta u koje je prethodno sipano po 100 μl / polju ploče 2xYT medijuma sa dodacima 34 μg/ml hloramfenikola i 0.1% glukoze. Ploče su inkubirane na 30oC uz mućkanje na 400 rpm na šejkeru sve dok kulture nisu postale blago zamućene (~2-4 časa) na OD600nm od 0.5.

Za ekspresiju u formatu ovih ploča, 20 μl 2xYT medijum sa dodatkom 34 μg/ml hloramfenikola i 3mM IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid) je naliveno u svako polje ploče (finalna koncentracija 0.5 mM IPTG), ploče su zapečaćene trakom koja je propustljiva za gasove i inkubirane preko noći na 30oC uz mućkanje na 400 rpm.

Produkcija ukupnog ćelijskog lizata (BEL ekstrakti)

U svako polje ploče je dodato 40 μl BEL pufera (2xPBS/EDTA: 24.7 g/l borne kiseline, 18.7 g NaCl/l, 1.49 g EDTA/l, pH 8.0) koji u koji je dodato 2.5 mg/ml lizozima, i ploče su inkubirane 1h na 22oC na šejkeru za ploče (400 rpm). BEL ekstrakti su korišćeni za analizu vezivanja pomoću FMAT (videti primer 2).

Ekspresija mikrogramskih količina HuCAL GOLD® Fab antitijela u E.coli i prečišćavanje

Ekspresija Fab fragmenata kodiranih pMORPH®X9_Fab_FH u ćelijama E.coli TG1 F je izvedena u plastičnim epruvetama zapremine 50 ml. U tom cilju su pre-kulture inokulirane pojedinačnim klonovima rasle u 2xYT-CG medijumu preko noći na 30oC. Sledećeg jutra 50 μl svake pre-kulture je korišćeno za inukulaciju 25 ml 2xYT medijuma obogaćenog dodatkom 34 μg/ml hloramfenikola, 1mM IPTG i 0.1% glukoze i inkubirano preko noći na 30oC u sterilnim plastičnim epruvetama. E.coli ćelije su pokupljene, ćelijski talog je smrznut i finalno "razbijen" sa Bug Buster (Novagen). Fab fragmenti su izolovani primenom Ni-NTA agaroze (Qiagen, Hilden, Nemačka).

Ekspresija miligramskih količina HuCAL GOLD® Fab antitijela u E.coli i prečišćavanje

Ekspresija Fab fragmenata kodiranih pMORPH®X9_Fab_FH u ćelijama TG1 F je izvedena u bocama za kultivaciju, na šejkeru, korišćenjem 750 ml 2xYT medijuma sa dodatkom 34 μg/ml hloramfenikola. Kulture su mućkane na 30oC dok OD600nm nije dosegla 0.5. Ekspresija je indukovana dodatkom 0.75 mM IPTG i sledstvenom inkubacijom na 30oC tokom 20h. Ćelije su razorene dodatkom lizozima a Fab fragmenti su izolovani pomoću Ni-NTA hromatografije (Qiagen, Hilden, Nemačka). Koncentracija proteina je određena pomoću UV spektrofotometrije (Krebs i sar., 2001).

Primer 2: Identifikacija DKK-1 specifičnih HuCAL GOLD® antitijela

BEL ekstrakti pojedinačnih klonova E.coli selektovani na gore pomenutim strategijama paninga su analizirani fluorometrijskom esej tehnologijom za mikrovolumene (FMATTM, 8200 Cellular Detection System analizator, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija) u cilju identifikacije klonova koji kodiraju DKK1-specifične Fab fragmente. FMATTM 8100 HTS sistem je fluorescentni makro-konfokalni, visoko produktivni instrument za detekciju koji automatizuje detekciju »pomešaj i čitaj«, neradioaktivni esej sa živim ćelijama ili kuglicama (Miraglia, J.Biomol.Screening (1999), 4(4) 193-204).

Na fluorometrijskoj mikrovolumen esej tehnologiji bazirana analiza vezivanja (FMAT) za detekciju DKK1-vezujućih Fab fragmenata iz bakterijskih lizata

Za detekciju DKK1-vezujućih Fab antitijela iz lizata E.coli (BEL ekstrakti), vezivanje je analizirano pomoću FMAT 8200 sistema za ćelijsku detekciju (Applied Biosystems). Za spajanje His-Strep-obeleženog DKK1 sa M-450 Expoxy kuglicama (Dynal), uzorak zapremine 300 μl M-450 Expoxy kuglica (1.2x108 kuglica) je prenesen u reakcione epruvete i propušten kroz magnetni separator za partikule. Supernatant je uklonjen i kuglice us isprane četiri puta u 1 ml 100 mM natrijum fosfatnog pufera, pH 7.4. Za oblaganje antigena, 60 μg His-Strep-obeleženog DKK1 je dodato u suspenziju kuglica u 150 μl 100 mM natrijum fosfatnog pufera, pH 7.4. Suspenzija antigen-kuglice je inkubirana 16h na sobnoj temperaturi na rotacionoj mešalici. Obložene kuglice su potom isprane tri puta sa PBS i resuspendovane u finalnoj zapremini od 250 μl PBS.

Za svaku ploču od 384 mesta pripremljena je mešavina od 20 ml PBS koji sadrži 3% BSA, 0.005% Tween-20, 4 μl DKK1-obloženih kuglica (1.9x106 kuglica) i 4 μl Cy5TM detekcionog antitijela. Iz ove solucije je u svako polje ploče FMAT crne/providne sa ravnim dnom od 384 mesta razliveno 45 μl (Applied Biosystems). Fab-sadržavajući BEL ekstrakti (5 μl) su dodati u svako polje. FMAT ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi preko noći. Sledećeg jutra ploče su analizirane na sistemu za ćelijsku detekciju 8200 (Applied Biosystems).

Dobijeni su pozitivni klonovi a sekvence teških i lakih lanaca klonova koji su imali pozitivan specifični signal u FMAT su analizirani. Zapaženo je da 57 jedinstvenih (neredundantnih) identifikovanih anti-DKK1 klonova pokazuju dovoljno jako vezivanje za humani DKK1. Ovi klonovi su eksprimirani, prečišćeni i afinitet im je testiran u funkcionalnim esejima.

Odredjivanje nanomolarnih afiniteta primenom površinske plasmon rezonance

Koristeći ove klonove, kinetička SPR analiza je izvedena na CM5 čipu (Biacore, Švedska) koji je prevučen ili rekombinantnim humanim DKK1, mišijim DKK1 (R&D system) ili cynomolgus DKK1 u gustini ~ 400 RU u 10 mM Na-acetat pH 4.5 korišćenjem standardnih EDC-NHS hemijskih reakcija koje su vezane za kuplovanje preko amina. Komparabilna količina humanog serum albumina (HSA) je imobilisana na referentnim protočnim ćelijama. PBS (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4 pH 7.4) je korišćen kao reakcioni pufer. Pripremanje Fab fragmenata je uradjeno u serijama koncentracija od 16-500 nM protokom od 20 μl/min. Faza asocijacije je postavljena na 60 s a faza disocijacije na 120 s. Sažetak afiniteta izraženog u nM ya svaki humani, mišiji i cynomolgus DKK1 odredjena ovim metodom je prikazana na Tabeli 1.

Tabela 1. Afiniteti selektovanih Fab fragmenata humanih, mišijih i cynomolgus

Antitijelo

KD [nM]

humani

DKK1

KD [nM]

mišiji

DKK1*

KD [nM]

cyno

DKK1*

MOR04470

3.2 ± 2.0

3.6

1.7

MOR04516

2.6 ± 0.7

2.4

1.9

MOR04454

3.2 ± 0.4

6

2.7

MOR04456

7.9 ± 0.9

11.6

8.1

MOR04461

7.6 ± 3.3

12.8

7.3

MOR04455

1.6 ± 0.3

n.o.

1.5

* jedno merenje

n.o. nije odredjivano

Primer 3: Identifikacija anti-humanih DKK1 Fab kandidata koji inhibiraju Wnt antagonističku aktivnost DKK1

Produkovanih 57 različitih DKK1 specifičnih antitijela selektovanih iz HuCAL GOLD® biblioteke je korišćeno za dobijanje purifikovanih antitijela, čija je potentnost inhibicije Wnt antagonističke aktivnosti humanog DKK1 potom testirana. Medju njima, 17 antitijela kandidata su funkcionalno aktivni, kao što je prikazano na slikama 2 i 4.

Funkcionalna aktivnost svakog od HuCAL® Fab fragmenata je proveravana korišćenjem luciferaza reporter genskog eseja. Dvanaest TCF/Lef vezujućih mesta je klonirano ushodno od luciferaza reporter gena čineći luciferaza gen TCF/Lef responsivnim. Propisani Wnt proteini doveli su do stabilizacije beta katenina, aktivacije transkripcije TCF/Lef i produkcije luciferaza proteina. Dodatak DKK1 proteina blokira Wnt aktivnost a samim tim i transkripciju luciferaza gena. Kao posledica ovoga, očekuje se da nivo luciferaze koji produkuju odgovarajuće ćelije bude u korelaciji sa potentnošću selektovanih Fab fragmenata da blokiraju delovanje DKK1.

Stabilna TCF/Lef responsivna reporter ćelijska linija HEK293T/17-12xSTF

Bioeseji su izvedeni korišćenjem stabilne reporter ćelijske linije humanih embrionskih ćelija bubrega HEK293T/17-12xSTF. Ćelije su kultivisane u DMEM medijumu sa visokim sadržajem glukoze (Invitrogen), 10% FCS (PAN ili BioWhittaker) i 1 μg/ml puromicina (BD Biosciences), do dostizanja 90% konfluentnog sloja ćelija. Ćelije su potom tripsinizirane, izbrojane i razblažene u medijumu za kultivaciju bez puromicina do koncentracije od 4x105 ćelija po ml. Posle toga su ćelije zasejane u bele ploče od 96 mesta sa ravnim dnom (Corning; 100 μl ćelijske suspenzije po mestu) i inkubirane na 37oC i 5% CO2 preko noći. Sledećeg dana je pripremljen esej medijum: 500 ng/ml DKK1-APP je dodato u Wnt3 kondicionirani medijum (CM).

Iz svakog polja ploče u kojoj je postavljen esej je uklonjeno 60 μl medijuma tako da adherentne ćelije ostanu netaknute i zamenjeno sa novih 60 μl antitijela koja se testiraju ili kontrole, rastvorenim u CM. Ćelije su inkubirane dodatnih 24h i 100 μl Bright-Glo luciferaza reagensa je dodato u svako polje. Nakon 5 min inkubacije, očitana je luminiscenca na luminometru (GenioPro, Tecan). Rezultati dobijeni sa 20 od 57 Fab fragmenata su prikazani na slici 2. Opseg ispoljenosti luciferaze je mera stepena prisustva antitijela.

Primer 4: Kvantitativna analiza afiniteta vezivanja: odredjivanje anti-humanih DKK1 Fab kandidata koji inhibiraju Wnt antagonističku aktivnost DKK1

Odredjivanje afiniteta

U cilju dodatne karakterizacije anti-DKK1 antitijela odredjivan je njihov afinitet za humani, cynomolgus i mišiji DKK1. Rekombinantni DKK1 protein je imobilisan na CM5 Biacore čipu i Fab fragmenti su primenjeni u mobilnoj fazo u različitim koncentracijama. Za Bioscore merenja i pouzdano odredjivanje monovalentnih afiniteta jedino su korišćene Fab grupe koje su pokazale ≥ 90% monomernih frakcija u hromatografiji baziranoj na detekciji razlika u veličini.

Sumirane vrednosti afiniteta humanog, mišijeg i cynomolgus DKK1 su prikazane na Tabeli 2. Svih 17 testiranih Fab fragmenata imaju afinitet za humani DKK1 ispod 100 nM. Dalje, devet klonova produkuje antitijela čiji je afinitet manji od 10 nM. U svim testiranim slučajevima, afinitet za cynomolgus i mišiji DKK1 su skoro identični onom za humani DKK1.

Tabela 2. Podaci o afinitetu za selekcionisane humane, mišije i cynomolgus Fab fragmente

Antitijelo

KD [nM]

humani

DKK1

KD [nM]

mišiji

DKK1*

KD [nM]

cyno

DKK1*

MOR04480

1.0 ± 0.0

2

n.o.

MOR04455

1.6 ± 0.3

n.o.

1.5

MOR04516

2.6± 0.7

2.4

1.9

MOR04470

3.2 ± 2.0

3.6

1.7

MOR04454

3.2 ± 0.4

6

2.7

MOR04483

5.5 ± 0.7

n.o.

MOR04466

6.5 ± 2.1

n.o.

MOR04461

7.6 ± 2.1

12.8

7.3

MOR04456

7.9 ± 2.1

11.6

8.1

MOR04462

16.5 ± 2.1

n.o.

MOR04447

22*

n.o.

MOR04469

36± 2.1

n.o.

MOR04482

36 ± 2.1

n.o.

MOR04468

41.5 ± 2.1

n.o.

MOR04476

44*

n.o.

MOR04481

65*

n.o.

MOR04503

93*

n.o.

* jedno merenje

n.o. nije odredjivano

Odredjivanje EC50

Na tabeli 3 su prikazani podaci koji pokazuju efektivnu koncentraciju za 50% inhibiciju za klonove antitijela koja imaju najveći afinitet za DKK1. Podaci prikazuju efektivne koncentracije EC50 koje su u opsegu od 39-95 nM, sa srednjom vrednošću izmedju 58 i 83 nM.

Tabela 3. Efektivne koncentracije za 50% inhibiciju selekcionisanih Fab fragmenata

Antitijelo

Luciferaza reporter esej;

EC50 [nM]

MOR04470

58

MOR04516

42

MOR04454

83

MOR04456

95

MOR04461

57

MOR04455

39

Primer 5: Afinitetno sazrevanje selekcionisanih anti-DKK1 Fab fragmenata paralelnom izmenom LCDR3 i HCDR2 kaseta

Za optimizovanje afiniteta ovde opisanih antitijela specifičnih prema DKK1 iz svakog od matičnih Fab, je uklonjen LCDR3, framework 4 i konstantni region lakog lanca (405 bp) korišćenjem BpiI i SphI i zamenjeni su repetoarom izmenjenih LCDR3 regiona zajedno sa framework 4 i konstantnim domenom. Uzorak od 0.5 mg vektora iz pula spojnih elemenata je ligiran sa trostrukim molarnim viškom insercionog fragmenta koji nosi izmenjene LCDR3.

Na sličan način, HCDR2 je izmenjen primenom XhoI i BssHII mesta, a spojni framework regioni su ostali konstantni. U cilju povećanja efikasnosti kloniranja, matični HCDR2 je zamenjen punilac sekvencom od 590 bp pre insercije izmenjene HCDR2 kasete.

Smeše za ligaciju koje se sastoje od 11 različitih biblioteka su elektroporacijom dodate u 4 ml E.coli TOP10F¢ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), što je proizvelo od 2x107 do 2x108 nezavisnih kolonija. Umnožavanje biblioteka je izvršeno kao što je ranije opisano (Rauchenberger i sar., 2003 J Biol Chem. 270 (40): 38194-38205). Radi kontrole kvaliteta, nasumično je uzeto i sekvencirano nekoliko klonova po biblioteci (SequiServe, Vaterstetten, Germany) primenom prajmera CFR84 (VL) i OCAL_Seq_Hp (VH).

Selekcija kandidata za afinitetno sazrevanje

Šest selekcionisanih maturacionih kandidata (roditeljskih Fab fragmenata) su selekcionisani na osnovu posedovanja sledećih osobina: afinitet prema humanom DKK1 manji od 10 nM, sa značajnom unakrsnom reaktivnošću prema cynomolgus i mišijem DKK1, EC50 manja od 100 nM, dobar do umeren nivo ekspresije Fab u E.coli i izostanak agregacije nakon purifikacije Fab fragmenta.

Tokom merenja afiniteta, postalo je evidentno da je MOR04480 veoma nestabilan pri velikim razblaženjima. Iz ovog razloga MOR04480 je izostavljen sa liste maturacionih kandidata mada je imao najveći afinitet (1 nM) i najbolji EC50 (7 nM) u svim testiranim Fab. MOR04480 je imao veliki afinitet od 5.5 nM prema humanom DKK1 ali se pokazalo da je unakrsno reaktivan prema mišijem DKK1, dok je MOR04453 imao veliki udeo Fab agregata nakon purifikacije.

Nakon pažljive procene svih raspoloživih podataka, selektovano je šest maturacionh kandidata (MOR04454, MOR04455, MOR04456, MOR04461, MOR04470 i MOR04516). Osobine ovih kandidata su prikazane na tabeli 4.

Tabela 4. Osobine selekcionisanih Fab fragmenata

Antitijela

KD [nM]

humani DKK1

KD [nM]

mišiji DKK1*

KD [nM]

cyno DKK1*

EC50 [nM]

Unakrsna reaktivnost

miš

Fab ekspresija

[mg/l]

Hromatografija

- molekulskim prosejavanjem

MOR04470

3.2 ± 2.0

3.6

1.7

58

++

32.8

#

MOR04516

2.6 ± 0.7

2.4

1.9

42

++

1.5

#

MOR04454

3.2 ± 0.4

6

2.7

83

++

17.8

#

MOR04456

7.9 ± 0.9

11.6

8.1

95

++

10.7

#

MOR04461

7.6 ± 3.3

12.8

7.3

57

++

12

#

MOR04455

1.6 ± 0.3

n.o.

1.5

39

++

9

#

* jedno merenje

n.o. nije odredjivano

# udeo monomera > 90%

Generisanje selekcionisanih Fab biblioteka za afinitetno sazrevanje

U cilju dobijanja klonova anti-DKK1 antitijela koji imaju povećan afinitet i inhibitornu aktivnost, selekcionisani Fab klonovi MOR04454, MOR04455, MOR04456, MOR04461, MOR04470 i MOR4516 prikazani u prethodnom primeru su podvrgnuti daljim ciklusima promene i selekcije, proces poznat kao sazrevanje afiniteta.

U tu svrhu, CDR regioni su izmenjeni korišćenjem odgovarajućih LCDR3 i HCDR2 maturacionih kaseta prethodno izgradjenih trinukleotidnom mutagenezom (Virnekas i sar., 1994 Nucleic Acids Res. 22: 5600-5607; Nagy i sar., 2002 Nature Medicine 8: 801-807). Ovde prikazana tabela 5 pokazuje LCDR3 sekvence roditeljskih klonova MOR04454, MOR04455, MOR04456, MOR04461, MOR04470 i MOR4516.

Tabela 5. LCDR3 sekvence selekcionisanih Fab fragmenata

Antitijelo

VL

LCDR3

sekvence

SEQ ID NO:

MOR04454

K1

LQYYGMPP

21

MOR04455

K1

QQYDSIPM

22

MOR04456

K3

QQYGDEPI

23

MOR04470

L2

QSYASGNTKV

25

MOR04461

L2

STWDMTVDF

24

MOR4516

L1

ASFDMGSPNV

26

Tabela 6 prikazuje HCDR2 sekvence roditeljskih klonova MOR04454, MOR04455, MOR04456, MOR04461, MOR04470 i MOR4516.

Antitijelo

VH

HCDR2 sekvence

SEQ ID NO:

MOR04454

H3

DGSHMDKPPGYVFAF

2

MOR04455

H3

HYMDH

3

MOR04456

H3

TIYMDY

4

MOR04461

H3

MGIDLDY

5

MOR04470

H3

HGIDFDH

6

MOR4516

H5

GIPFRMRGFDY

7

Fab fragmenti iz vektora za ekspresiju pMORPH®X9_Fab_FH su subklonirani u fagmidni vektor pMORPH®25 (videti US patent broj 6,753,136). Ovaj vektor kodira fagni protein pIII koji je fuzionisan N terminalno sa cisteinskim ostatkom, kao i C terminalni cistein na Fd fragmentu lanca antitijela i takle dozvoljava izlaganje disulfidno vezanih odgovarajućih Fab fragmenata na površini faga. Primenjene su dve različite strategije paralelno, kako bi optimizovali i afinitet i efikasnost roditeljskih Fab fragmenata.

Generisano je pet fagnih biblioteka Fab fragmenata antitijela u kojima je LCDR3 u pet od šest roditeljskih klonova zamenjen repertoarom pojedinačnih CDR3 sekvenci lakog lanca. LCDR3 sazrevanje MOR04454 nije izvedeno, jer ovaj klon ima dodatno BpiI restrikciono mesto u jednom od CDR regiona i BpiI restrikcioni enzim je korišćen za proceduru kloniranja biblioteke.

Paralelno, HCDR2 region svakog roditeljskog klona je zamenjen repertoarom pojedinačnih CDR2 sekvenci teškog lanca. Svaki roditeljski Fab je isečen i zamenjen sa puniocem (stuffer) od 590 bp. Ovaj DNK punilac olakšava separaciju jednostruko enzimski razloženih od dvostruko razloženih traka vektora i redukuje nespecifično vezivanje visoko-afinitetnih roditeljskih Fab fragmenata tokom maturacionog paninga. U sledstvenom koraku, punilac je isecan iz Fab-kodirajućih plazmida svakog roditeljskog klona i zamenjen visoko raznolikom HCDR2 maturacionom kasetom.

Standardnim procedurama kloniranja generisane su velike biblioteke afinitetnog sazrevanja sa više od 2x107 članova, a klonovi sa povećanim repertoarom raznolikosti su transformisani u elektro-kompetentne E.coli TOP10F' ćelije (Invitrogen). Fab-prezentujući fagi su pripremljeni kao što je opisano u primeru1.

U cilju poboljšanja selekcionog procesa napravljene su četiri frakcije sazrevanja: frakciju 1a su činile MOR04470 i MOR04516 LCDR3 biblioteke; frakciju 1b su činile MOR04470 i MOR04516 HCDR2 biblioteke; frakciju 2a su činile MOR04454, MOR04455, MOR04456 i MOR04461 LCDR3 biblioteke; dok su frakciju 2b činile MOR04454, MOR04455, MOR04456 i MOR04461 HCDR2 biblioteke,

Za svaku frakciju uradjen je paning u rastvoru primenom opadajućih količina His-Strep obeleženog DKK1 i Strep-Tactin kuglica za "hvatanje" kompleksa fag-antigen. Paralelno, svaka frakcija je primenjena u paningu korišćenjem opadajuće količine biotinom obeleženog DKK1 koji je vezan za Neutravidin-obložene ploče. Da bi se povećala jačina paninga i da bi se selektovali po kriterijumu za povećane brzine disocijacije, izvedena je kompeticija sa purifikovanim roditeljskim Fab fragmentima kao i neobeleženim antigenom tokom produženog vremena inkubacije.

Neposredno nakon paninga, obogaćena frakcija fagmida je subklonirana u vektor za pMORPH®X9_FH. Odabrano je oko 2300 pojedinačnih klonova i Fab fragmenti su indukovani sa IPTG.

Strategije maturacije paninga

Paning procedure u kojima su korišćene frakcije četiri antitijela su izvedene sa His-Strep obeleženim DKK1 i sa His-Strep biotinom obeleženim DKK1 u rastvoru tokom dva ili tri kruga. Za svaku od strategija paninga su korišćeni kompeticija sa purifikovanim roditeljskim Fab proteinima ili sa neobojenim APP-obeleženim DKK1, kao i mala koncentracija antigena i masivno ispiranje su korišćeni da bi se povećao kvalitet selekcije.

Paning u rastvoru na neobojenim His-Strep-obeleženim DKK1 je izveden tokom dva kruga selekcije uglavnom prema standardnom protokolu opisanom u primeru 1. Izuzetak od opisane procedure je primena redukovane količine antigena (smanjivanje od 5 nM sve do 1 nM), velika jačina procedure ispiranja sa kompetitorom ili bez njega i produžen period inkubacije antitijelo-fag kompleksa sa antigenom.

Za prvi krug selekcije primenom biotinilovanog DKK1, polja Neutravidin ploče su dva puta isprana sa 300 μl PBS. Polja su blokirana dodatkom 2x ChemiBLOCKER (Chemicon, Temecula, CA) razblaženog 1:1 u PBS (pufer za blokiranje). Pre selekcija, HuCAL GOLD® fagi su takodje blokirani dodatkom jednog volumena pufera za blokiranje koji sadrži 0.1% Tween-20 tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Blokirani preparati faga su preneti u alikvotima od po 100 μl u polja Neutravidin-prevučene ploče i inkubirani 30 min na sobnoj temperaturi. Korak prethodne adsorpcije je ponovljen jednom. Blokirani i prethodno prečišćeni preparati faga su inkubirani sa 5 nM biotinilovanim DKK1 tokom 2h na 22oC na rotacionoj mešalici. Roditeljski Fab, APP-DKK1 ili ne kompetitor su dodavani nakon čega su uzorci inkubirani tokom noći na 4oC na rotacionoj mešalici.

Antigen-fagni kompleksi su vezivani u poljima Neutravidin ploče 20 min na sobnoj temperaturi. Nakon masivnog ispiranja, vezane partikule faga su eluirane dodavanjem 200 ml 20 mM DTT u 10 mM Tris pH 8.0 po polju tokom 10 min na sobnoj temperaturi. Eluat je uklonjen i dodat u 14 ml E.coli TG1 ćelija koje su rasle na OD600nm od 0.6-0.8. Polja su jednom isprana sa 200 ml PBS i ovaj rastvor je takodje dodat u E.coli TG1 ćelije. E.coli su inficirane fagima u trajanju od 45 min na 37oC bez mućkanja. Nakon 10 min centrifugiranja na 5000 rpm, talozi bakterija su resuspendovani u 500 ml 2xYT medijuma svaki uzorak, zasadjeni na 2xYT-CG agar pločama i inkubirane preko noći na 30oC. Kolonije su pokupljenje struganjem sa površine ploča i partikule faga su dobijene i umnožene kao što je napred opisano.

Drugi i treći krug selekcije je izveden kao što je opisano za prvi krug selekcije, osim što je ispiranje bilo jače, a koncentracije antigena su bile 1 i 0.1 nM.

Analiza vezivanja vezujućih Fab fragmenata DKK1 elektrohemiluminiscencom (BioVeris)

Za detekciju afinitetno-poboljšanih DKK1-specifičnih fragmenata antitijela u lizatima E.coli (BEL ekstrakti) korišćen je BioVeris M-384 SERIES® Workstation (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK). Esej je izveden u polipropilenskim mikrotitarskim pločama od 96 mesta a PBS sa dodacima 0.5% BSA i 0.02% Tween-20 je korišćen kao esej pufer. Biotinilovani humani DKK1 je imobilisan na M-280 streptavidin paramagnetskim kuglicama (Dynal) prema uputstvu proizvodjača. U svako polje je dodata solucija štoka kuglica u razblaženju 1:25. Uzorci od 100 ml razblaženog BEL ekstrakta i kuglica su inkubirani preko noći na sobnoj temperaturi na šejkeru. Za detekciju je korišćen anti humani (Fab)¢2 (Dianova) obeležen BV-tag TM prema uputstvu proizvodjača (Bio Veris Europe, Witney, Oxfordshire, UK).

Set od približno 2300 nasumično odabranih klonova je analiziran napred opisanom metodom. Za dalju analizu, metodom ravnotežne titracije rastvora, je odabran subset od 160 klonova koji su dali najveće vrednosti.

Odredjivanje pikomolarnih afiniteta primenom metode ravnotežne titracije rastvora (SET)

Za odredjivanje KD monomerna frakcija (najmanje 90% prisustva monomera, analizirana analitičkom SEC; Superdex75, Amersham Pharmacia) Fab je korišćena. Odredjivanje afiniteta u soluciji pomoću elektrohemiluminiscence, kao i evaluacija rezultata, su u osnovi izvedeni kao što su opisali Haenel i sar., 2005. Konstantna količina Fab je ekvilibrisana različitim koncentracijama (serijska 3n razblaženja) humanog DKK1 (4 nM početna koncentracija) u rastvoru. Biotinilovani humani DKK1 kuplovan za paramagnetske kuglice (M-280 Streptavidin, Dynal), i BV-tagTM (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK) obeleženi anti-humani (Fab)¢2 (Dianova) su dodati i mešavina je inkubirana 30 min. Nakon toga, kvantifikovana je koncentracija nevezanog Fab pomoću ECL detekcije korišćenjem M-SERIES® 384 analizatora (BioVerisEurope).

U tu svrhu je 160 klonova selekcionisano i prečišćeno pomoću Ni-NTA agaroze u μg skali. Preliminarni afiniteti su odredjeni četvorostepenom ravnotežnom titracijom rastvora (SET) u BioVeris. Na osnovu tih rezultata selekcionisano je 20 klonova koji su imali afinitet. Ovi Fab fragmenti su prečišćeni u mg skali. MOR04950 je isključen iz procedure odredjivanja afiniteta i dalje procene zbog delimične agregacije Fab koja je detektovana hromatografijom - molekulskim prosejavanjem. Finalni afiniteti su odredjeni iz dve nezavisne grupe svakog Fab klona primenom osmostepenog SET merenja i humanog, mišijeg i cynomolgus DKK1.

Odredjivanje afiniteta za mišiji i cynomolgus DKK1 je uradjeno primarno kao što je opisano ranije, korišćenjem mišijeg DKK1 (R&D Systems) i cynomolgus DKK1 kao analit u rastvoru umesto humanog DKK1. Za detekciju slobodnog Fab, korišćen je biotinilovani humani DKK1 kuplovan za paramagnetne kuglice. Afiniteti su izračunati prema Haenel i sar., 2005 Anal Biochem 339.1:182-184.

Primenom uslova eseja koji su gore opisani, odredivan je afinitet za afinitet-optimizovane anti-DKK1 Fab fragmente u rastvoru. Odredjen je afinitet za MOR04910 i MOR04946 sa KDs ispod 30 pM za humani DKK1 i izmedju 36 i 42 pM za mišiji i cynomolgus DKK1. Sedam dodatnih antitijela je ispoljilo afinitet ispod 100 pM za sva tri antigena. Klon MOR04950 se nije vezivao za biotinilovani DKK1. Afiniteti su sumirani u tabeli 7.

Tabela 7. Afiniteti Fab fragmenata

Afinitet [pM]: ravnotežna titracija rastvora*

Antitijelo

Humani DKK1

Cyno DKK1

Mišiji DKK1

MOR04913

38 ± 8

51 ± 10

44 ± 48

MOR04946

25 ± 9

36 ± 9

41 ± 15

MOR04907

114 ± 7

170 ± 35

167 ± 68

MOR04945

69 ± 18

80 ± 31

74 ± 21

MOR04914

94 ± 5

140 ± 3

200 ± 261

MOR04920

53 ± 37

50 ± 20

40 ± 30

MOR04954

110 ± 54

112 ± 25

36 ± 4

MOR04952

100 ± 12

58 ± 17

71 ± 34

MOR04948

57 ± 8

67 ± 17

65 ± 25

MOR04910

24 ± 3

37 ± 11

42 ± 38

MOR04921

velika varijacija od grupe do grupe

MOR04947

32 ± 19

58 ± 35

30 ± 17

MOR04951

136 ± 120

62 ± 2

132 ± 90

MOR04918

110 ± 690

236 ± 23

550-3144

MOR04919

64 #

132 #

111 #

MOR04949

30 ± 23

55 ± 35

65 ± 8

MOR04922

90 #

70 #

50 #

MOR04911

140 #

190 #

650 #

MOR04950

ne vezuje se

* izvedena su najmanje dva nezavisna merenja iz dve različite grupe Fab

# izvedeno jedno merenje

Primer 6: Karakterizacija afinitetno-optimizovanih anti-humanih DKK1 Fab fragmenata

Tehnike bazirane na enzim-zavisnim testovima imunosorbcije (ELISA)

Odredjivana je specifičnost vezivanja zrelih Fab fragmenata u prisustvu 50% humanog seruma (HS). Neutravidin mikrotitarska ploča je obložena serijskim razblaženjima humanog rekombinantnog biotinilovanog DKK1 u TBS, u koncentracijama od 8 ng DKK1 po polju ploče do 125 ng DKK1 po polu ploče, 2 h na sobnoj temperaturi. Nakon oblaganja antigena, polja su blokirana dodatkom TBS/0.05% Tween (TBS-T) sa dodatkom 1% BSA 1h na sobnoj temperaturi. Prečišćeni Fab fragmenti, opisani ranije, su razblaženi ili u TBS / 4% BSA ili u TBS / 50% HS u finalnoj koncentraciji od 1 mg/ml, dodati obloženim i blokiranim poljima i inkubirani 1h na sobnoj temperaturi. Za detekciju su korišćeni anti-FLAG alkalnom fosfatazom (AP) konjugovano antitijelo (razblaženo 1:5000 u TBST) i fluorogeni substrat AttoPhos (Roche). Posle svake inkubacije polja mikrotitarske ploče su isprana pet puta TBST, osim nakon koraka finalne inkubacije sa obeleženim sekundarnim antitijelom, kada su polja isprana tri puta.

Fluorescenca je merena na TECAN Spectrafluor čitaču za ploče. Reprezentativne krive vezivanja su prikazane na slici 3. Tabela 8 daje zbirni prikaz vezujuće aktivnosti optimizovanih anti-DKK1 Fab fragmenata u prisustvu 50% humanog seruma u poredjenju sa vezujućom aktivnošću u 4% BSA, koji se nalazi u opsegu od 83% do 100%. Srednja vrednost je 93% što znači da se anti-DKK1 Fab fragmenti u potpunosti vezuju za ciljna mesta u prisustvu humanog seruma.

Tabela 8. Vezujuća aktivnost Fab fragmenata

Antitijelo

Vezujuća aktivnost w/ 50%

Humani serum vs 4% BSA (%)

MOR04945

89 ± 6

MOR04910

84 ± 4

MOR04946

93 ± 2

MOR04913

89 ± 9

MOR04920

90 ± 7

MOR04948

100 ± 15

MOR04952

100 ± 5

MOR04921

93*

MOR04914

83*

MOR04907

> 83*

MOR04954

> 83*

MOR04937

95*

* pojedinačno merenje

Luciferaza reporter ćelijski esej u prisustvu humanog seruma primenom U2OS ćelijske linije

Za dalje odredjivanje specifičnosti vezivanja optimizovanih anti-DKK1 Fab fragmenata, luciferaza reporter ćelijski esej je ponavljan u prisustvu 15% humanog seruma korišćenjem U2OS ćelijske linije osteosarkoma. U2OS ćelije (ATCC No. HTB-96) su gajene prema protokolu proizvodjača (ATCC, Manassas, VA, USA). Ćelije su tripsinizirane, izbrojane i razblažene u medijumu za kultivaciju (McCoy¢s 5a/10% FCS) do koncnetracije 2x103 ćelija/ml. Za svakih 2x104 ćelija, pripremljen je rastvor mešavine 0.075 mg pTA-LUC-12xSuperTopFlash i 0.004 mg phRL-SV40. Oni su pomešani u finalnom volumenu od 9.8 ml OPTI-MEM. Onda je dodato 0.2 ml FuGENE 6 reagensa za transfekciju (Roche, Mannheim, Nemačka). Ova transfektovana mešavina je kratko inkubirana i pomešana sa prethodno pripremljenim ćelijama. Zatim su ćelije zasadjene 100 ml po polju bele ploče za kultivaciju ćelija sa ravnim dnom od 96 mesta i inkubirane na 37oC i 5% CO2 preko noći. Sledećeg dana je iz svakog polja ploče uzeto 75 ml medijuma i zamenjeno sa 10 ml HuCAL® Fab razblaženog antitijela (10 do 0.01 mg/ml razblaženog u medijumu za kulturu bez seruma), 15 ml ili 70% FCS ili humanog seruma i 50 ml Wnt3a kondicioniranog medijuma koji sadrži 600 ng/ml DKK1-APP.

Negativna kontrola je bio medijum bez seruma koji je dodavan umesto različitih razblaženja antitijela. U cilju dobijanja maksimalnog luciferaza signala, dodavane su kontrole koje su sadržavale 10 ml medijuma bez seruma umesto razblaženja antitijela i 50 ml Wnt3a CM bez DKK1-APP. Nakon 24h inkubacije na 37oC, 5% CO2, merena je luminiscenca primenom Dual-Glo luciferaza esesj sistemom (Promega, Madison, WI, USA) prema inskrukcijama proizvodjača.

Tabela 9 prikazuje inhibitornu aktivnost optimizovanih DKK1 Fab fragmenata u prisustvu 15% humanog seruma (u poredjenju sa inhibitornom aktivnošću u 15% FCS). Podaci pokazuju da se aktivnost dobijena u prisustvu seruma nalazi u opsegu od 26% do 90%, sa srednjom vrednošću of 70-74%. Ovi podaci pokazuju da su dobijeni klonovi anti-DKK1 Fab fragmenata koji funkcionišu u prisustvu humanog seruma.

Tabela 9. Inhibitorna aktivnost Fab fragmenata

Antitijelo

Luciferaza reporter esesj w/o Kremen; Aktivnost u 15% humanom serumu (%)

MOR04945

74 %

MOR04910

90 %

MOR04946

60 %

MOR04913

88 %

MOR04920

75 %

MOR04948

70 %

MOR04952

60 %

MOR04921

26 %

MOR04914

80 %

MOR04907

54 %

MOR04954

55 %

MOR04937

84 %

Odredjivanje EC50 afinitetno optimizovanih anti-DKK1 Fab primenom luciferaza reporter ćelijskog eseja

Za dalje testiranje Fab, sa poboljšanim afifnitetom, u standardnom Wnt3a-zavisnom TCF/LEF luc reporter eseju korišćen je 10 nM DKK1 da bi dobili inhibiciju ekspresije luciferaze. Primećeno je da nije moguće dobiti EC50 vrednosti korišćenjem ovog metoda, jer je osetljivost eseja previše niska. Na ovo ukazuju veoma strme krive inhibicije i slične EC50 vrednosti za sve testirane Fab, kao što je očigledno iz Slike 4, ovde priložene.

Napravljena je poboljšana verzija TCF/LEF luc reporter eseja. DKK1 se vezuje za Kremen-1 i -2 transmembranske proteine i ova interakcija dovodi do snažne sinergističke inhibicije Wnt signalizacije (Mao i sar., 2002 Nature 417: 664-67). Zbog toga je cDNK ko-transfektovana sa TCF/LEF luc reporter esejom. Nastali Wnt3a-zavisni reporter esej je pokazao veoma povećanu osetljivost prema DKK1, posredovanu sa ko-ekspresijom Kremen ko-receptorskog proteina. U ovom eseju, 0,33 nM DKK1, je dovoljna da indukuje punu inhibiciju Wnt signalizacije. Titracije Fab (u deset koncentracija) su ponovljene sa 0,33 nM DKK1 i dobijene je sigmoidne krive inhibicije (Slika 5. ovde) sa kojih je bilo moguće izračunati EC50. Anti-DKK1 Fab sa optimizovanim afinitetom su analizirani u odnosu na EC50 kao što je gore opisano. Kako je prikazano u tabeli 10, EC50 vrednosti dobijene ovim metodom nalaze se u opsegu od 0,2 nM do 5,6 nM.

Tabela 10. EC50 vrednosti za Fab

Antitijelo

TCF/LEF luc esej

w/Kremen: EC50

[nM]

MOR04913

0,5

MOR04946

0,2

MOR04907

0,9

MOR04945

0,5

MOR04914

1,1

MOR04920

1,8

MOR04954

1,3

MOR04952

0,6

MOR04948

0,5

MOR04910

0,3

MOR04921

0,7

MOR04947

1,7

MOR04951

2,2

MOR04919

2,7

MOR04949

5,3

MOR04922

2

MOR04911

5,6

Analiza sekvence afinitetno optimizovanih Fab

Nukleotidne sekvence teškog i VL regiona (VH i VL) za svih dvadeset Fab su odredjene. Aminokiselinske sekvence regiona koji odredjuju komplementarnost (CDR) su izlistane u tabeli 11A i tabeli 11B.

Tabela 11A. Aminokiselinske sekvence CDR teškog lanca

Analiza sekvence je pokazala da pet od šest parentalnih (P) Fab je iznedrilo naslednike sa poboljšanim afinitetom. MOR04461 i MOR04470 su mogli da se optimizuju u HCDR2 kao i u LCDR3. Nisu dobijeni optimizovani naslednici za MOR04454. Osim toga, velika homologija se pojavljuje izmedju roditeljskih antitijela, kao što je to pokazano u konsenzus1 i konsenzus2 sekvencama za razlličite CDR regione u tabeli 11B. Slične konsenzus sekvence je moguće dobiti za roditeljske sekvence prikazane u tabeli 10A korišćenjem metoda dobro poznatih stručnjaku iz oblasti.

Povrh toga, odredjeno je da MOR04920 ima mutaciju u HCDR2 regionu (Ser ostatak promenjen u Gly na poziciji 73 prema šemi za brojanje objavljenoj kod Honegger i Pluckthun, 2001 J Mol Biol 309.3:657-670 dakle otklon od HuCAL® dizajna.

Pokazano je da MOR04913 ima tačkastu mutaciju u framework 4 kapa lakog lanca (zamena Lys u Asn na poziciji 148). Kako za ovu poziciju nije očekivano da ima efekat na vezivanje antitijela, mutacija je revertovana nazad u germinativnu / HuCAL® kompoziciju u toku IgG konverzije, i tako je nastalo antitijelo MOR05145.

MOR04947 ima potencijalno mesto za glikozilaciju u LCDR2. Ovo mesto nije uklonjeno, jer je MOR04947 odabran kao jedan od rezervnih kandidata.

Primer 7: Produkcija HuCAL® imunoglobulina

Konverzija u IgG format

Da bi proizveli kompletan imunoglobulin (Ig), fragmenti sa varijabilnim regionom teškog (VH) i lakog lanca (VL) su subklonirani iz pMORPH®X9_FH Fab ekpresionih vektora bilo u pMORPH®_h_Ig ili pMORPH®2_h_Ig serije vektora za humani IgG1 i humani IgG4. Alternativni vektori se koriste za humani IgG2. Restrikcioni enzimi EcoRI, MfeI i BlpI se koriste za subkloniranje fragmenta saVH domenom u pMORPH®_h_IgG1 i pMORPH®_h_IgG4. Restrikcioni enzimi MfeI i BlpI se koriste za subkloniranje fragmenta sa VH domenom u pMORPH®2_h_IgG1f i pMORPH®2_h_IgG4. Subkloniranje fragmenta sa VL domenom u pMORPH®_h_Igκ i pMORPH®2_h_Igκ je uradjeno korišćenjem EcoRV i BsiW1 mesta, dok je subkloniranje u pMORPH®_h_Igλ i pMORPH®2_h_Igλ2 uradjeno korišćenjem EcoRV i HpaI.

Kratkotrajna ekspresija i prečišćavanje humanog IgG

HEK293 ćelije su transfektovane sa ekvimolarnom količinom ekspresionih vektora za teški lanac i laki lanac IgG. Četvrtog ili petog dana nakon transfekcije, prikupljen je supernatant iz ćelijske kulture. Nakon podešavanja pH supernatanta na 8,0 i sterilizacije filtriranjem, rastvor je podvrgnut standardnoj hromatografiji na koloni sa proteinom A (Poros 20A, PE Biosystems).

Konverzija parentalnih Fab u IgG formate

Paralelno sa početkom afinitetnog sazrevanja, MOR04454, MOR04456 i MOR04470 su klonirani u ekspresione vektore pMORPH®_h_IgG1 i pMORPH®_h_IgG4. Alternativnikonstrukti mogu da se koriste za pravljenje ekspresionih vektora zaigG2. Ekspresija na malo je uradjena kratkotrajnom transfekcijom HEK293 ćelija i kompletni imunoglobulini su prečišćeni iz supernatanta ćelijskih kultura.

Rezultati hromatografije molekulskog prosejavanja pokazuju da su antitijela u monomernom obliku. Testiranje u Wnt3a-zavisnom reporter eseju je pokazalo je da su proteini funkcionalni.

Primer 8: Aminokiselinske sekvence i nukleotidne sekvence gena optimizovanih za ekspresiju

Kako bi povećali ekspresiju u ćelijama sisara, uvedene su izmene u teški i laki lanac Fab u cilju optimizacije korišćenja kodona za ekspresiju u ćeliji. Poznato je da prisustvo više negativno cis-delujućih mesta smanjuju ekspresiju kod sisara. Optimizacioni proces u ovom slučaju uklanja negativno cis-delujuća mesta (kao što su splajs mesta ili poly(A) signali) koja negativno utiču na ekspresiju. U procesu optimizacije dalje se povećava sadržaj GC što produžava poluživot mRNK.

Varijabilni regioni lakog i teškog lanca su optimizovani korišćenjem klona Fab, MOR04945 (kompletna nukleotidna sekvenca roditeljskog lakog lanca je SEQ ID NO: 98 i kompletna nukleotidna sekvenca roditeljskog teškog lanca je SEQ ID NO: 102), ovde izolovanog selekcijom uz pomoć fagne biblioteke. Onda su sve nukleotidne sekvence koje kodiraju svaki od kompletnih lakih i teških lanaca ovog i drugih klonova, optimizovane korišćenjem ovih procedura.

Proces optimizacije za VH i VL lance od MOR04945

Za optimizaciju nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence svakog od VH i VL lanaca za ekspresiju u sisarskim ćelijama, korišćenje kodona je adaptirano za kodon u skladu sa sisarskim genima. Osim toga, regioni sa veoma velikim (>80%) ili jako malim (<30%) sadržajem GC su redukovani ili eliminisani gde je to moguće. S druge strane, optimizacija za ekspresiju u bakterijama, kvascima ili bakulovirusu, bi bi opredelila adaptiranje korišćenje kodona odgovarajuće u skladu sa njihovim genima.

U toku procesa optimizacije za ekspresiju u siarima, izbegavani su sledeči cis delujući motivi sekvenci: unutrašnji TATA-boksovi, ki (chi)-mesta i mesta za ulazak ribozoma, delovi sekvence bogate AT ili bogate GC, motiv nestabilnosti RNK (ARE) elementi u sekvenci, inhibitorni RNK elementi sekvence (INS), cAMP-responsivni (CRS) elementi sekvence, ponovljene sekvence i sekundarne strukture RNK, splajs donorska i akceptorska mesta uključujući i skrivena mesta i tačke grananja. Osim ako nije naglašeno, uvodjenje MluI i HindIII mesta je izbegavano u procesu optimizacije nukleotidne sekvence VL lanca. Osim ako nije naglašeno, uvodjenje MlyI i BstEII mesta je izbegavano u procesu ptimizacije nukleotidne sekvence VH lanca.

Aminokiselinske sekvence VH i VL lanaca za MOR04945 optimizovanog za ekspresiju

Korišćenje kodona je adaptirano za sisare kako bi omogućili veću i stabilniji tempo ekspresije u ćelijama sisara za dobijene optimizovane aminokiselinske sekvence VH i VL lanca klona MOR04945 gore opisanog. Videti primer 5.

Tabela 12A dole, pokazuje sens i anti-sens (AS) nukleotidne sekvence varijabilnog lakog lanca (SEQ ID NO:120) i rezultujuću aminokiselinsku (označeno sa AA) sekvencu variajbilnog lakog lanca (SEQ ID NO: 118) kao što je optimizovano za ekspresiju.

Tabela 12A. Nukleotidne sens i anti-sens sekvence i aminokiselinske sekvence VL lanca optimizovanog za ekspresiju

Sa liste pre i posle optimizacije mogu se pročitati procenti sekvenci kodona za svaku roditeljsku sekvencu, odnosno optimizovani gen, kao i analize kvaliteta klase odgovarajuće nukleotidne sekvence koja kodira VH i VL lance. Vrednost kvaliteta kako je ovde korišćeno znači da kodon sa najvećom učestalošću koji je korišćen za datu aminokiselinu u željenom sistemu za ekspresiju, je postavljen kao 100, a preostali kodoni su rangirani shodno prema učestalosti korišćenja. (Sharp, P.M., Li, W.H. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1987).

Dalje, indeks adaptacije kodona (CAT) je broj koji označava koliko se dobro kodoni nukleotidne sekvence uklapaju sa preferencom upotrebe kodona za odredjeni ciljni organizam. Maksimalna vrednost za CAT je postavljena na 1,0, dakle za CAT >0,9 se smatra da će omogućiti veliku ekspresiju. CAT za VL lanac pre optimizacije je procenjen na 0,73, a posle optimizacije odredjen je CATod 0,95. Slično tome, CAT za VH lanac pre optimizacije je procenjen na 0,74, a posle optimizacije je odredjen i bio je 0,98 u optimizovanim konstruktima, GC sadržaj u VL lancu je povećan sa 51% za roditeljsku sekvencu MOR04945, na 62% za optimizovanu sekvencu izvedenu iz MOR04945. Kao što je prikazano na SL. 9A i 9B GC sadržaj u VH lancu je povećan sa 54% za roditeljsku sekvencu MOR04945 na 64% za optimizovni derivat poreklom od MOR04945.

Optimizacija za ekspresiju kompletnih lakih lanaca i kompletnih teških lanaca od MOR04910, MOR04945, MOR04946 i MOR05145

Proces optimizacije je primenjen na svaku roditeljsku kompletnu nukleotidnu sekvencu lakih lanaca na MOR04910 (SEQ ID NO: 97), MOR04945 (SEQ ID NO: 98), MOR04946 (SEQ ID NO: 99) i MOR05145 (SEQ ID NO: 100) i roditeljsku kompletnu nukleotidnu sekvencu teških lanaca na MOR04910 (SEQ ID NO: 101), MOR04945 (SEQ ID NO: 102), MOR04946 (SEQ ID NO: 103) i MOR05145 (SEQ ID NO: 103).

Proces optimizacije se koristi za konstruisanje svakog od sledećih nukleotidnih sekvenci lakog lanca koji je povezan sa brojem roditeljskog klona: za klon MOR04910 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 104; za klon MOR04945 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 105; za klon MOR04946 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 106 i za klon MOR05145 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 107. Dalje proces optimizacije je korišćen za konstruisanje svakog od sledećih nukleotidnih sekvenci teškog lanca koji je povezan sa brojem roditeljskog klona: za klon MOR04910 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 108; za klon MOR04945 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 109; za klon MOR04946 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 110 i za klon MOR05145 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 110.

Optimizovane nukleotidne sekvence lakog lanca su povezane sa sledećim optimizovanim aminokiselinskim sekvencama za laki lanac: za klon MOR04910 optimizovana aminokiselinska sekvenca je SEQ ID NO: 111; za klon MOR04945 optimizovana aminokiselinska sekvenca je SEQ ID NO: 112; za klon MOR04946 optimizovana aminokiselinska sekvenca je SEQ ID NO: 113 i za klon MOR05145 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 114. Optimizovane nukleotidne sekvence teškog lanca su povezane sa sledećim optimizovanim aminokiselinskim sekvencama za teški lanac: za klon MOR04910 optimizovana aminokiselinska sekvenca je SEQ ID NO: 115; za klon MOR04945 optimizovana aminokiselinska sekvenca je SEQ ID NO: 116; za klon MOR04946 optimizovana aminokiselinska sekvenca je SEQ ID NO: 117 i za klon MOR05145 optimizovana nukleotidna sekvenca je SEQ ID NO: 117.

Spiskovi nukleotidnih i polipeptidnih sekvenci od razmatranih kompletnih sekvenci lakih i teških lanaca su navedeni u tabeli 13A i tabeli 13B. Tabela 13A prikazuje optimizovane nukleotidne sekvence i polipeptide koji su njima kodirani. Ove nukleotidne sekvence su optimizovane kako bi uklonili latentna splajs mesta koja su prepoznata u sisarskim sistemima za ekspresiju. Tabela 13B izlistava roditeljske nukleotidne sekvence za klonove koji su navedeni u tabeli 13A.

Tabela 13A: Laki lanac (LC) i teški lanac (HC) sekvence - optimizovane

Primer 9: Eseji bioaktivnosti

Biološka aktivnost neutrališućeg anti-DKK1/4 antitijela je merena u reporter gen eseju, korišćenjem genski modifikovane ćelijske linije HEK293 T/17 STF_70IRES_Krm_(17) koji je nazvan SuperTopflash Krm17. Ova ćelijska linija je nastala poreklom od humane embrionske ćelije bubrega HEK293 i stabilno je transfektovana sa i) reporter konstruktom u kojem je TCF promotor fuzionisan uzvodno od gena za luciferazu iz svica i ii) konstruktom koji vodi povećanoj ekspresiji Krm na površini ove ćelije. U ovoj ćelijskoj liniji, izlaganje Wnt proteinu stimuliše ekspresiju luciferaze na dozno zavisan način. Dodavanje graduisanih količina anti-DKK1/4 antitijela u fiksiranu, sub-maksimalnu dozu DKK1 u prisustvu Wnt dovodi do povećanja u ekspresiji luciferaze u toku perioda inkubacije od šesnaest sati. Na kraju ovog perioda, količina luciferaze se kvantifikuje na osnovu njene enzimske aktivnosti u ćelijskom lizatu. Luciferaza katalizuje konverziju supstrata luciferina u oksi-luciferin, hemiluminescentni proizvod. Dobijena hemiluminescenca, tipa sijanja, je zatim odredjena na odgovarajućem luminometru.

Biološka moć neutrališućeg anti-DKK1/4 antitijela u ispitivanom uzorku je odredjena preko uporedjivanja sposobnosti uzorka da poveća ekspresiju luciferaze sa referentnim standardom. Uzorci i standard su normalizovani preko saadržaja proteina. Relativna potencija je izračunata koristeći paralelni esej prema evropskoj Phamaco-poeial. Konačni rezultat je izražen kao relativna potencija (u procentima) uzorka u odnosu na referentni standard.

Na osnovu postojećih saznanja, tabela 18 prikazuje predložene potencijalne Biomarkere za anti-DKK1/4 antitijelo.

Primer 10: In vitro aktivnost na relevantnim biološkim ciljnim molekulima

Selekcionisani su vodeći Fab fragmenti koji imaju afinitete u nanomolarnom opsegu i potentnu aktivnost u ćelijskim esejima. U fiziološkim uslovima za DKK1 se vezuju LRP5/6 (Kd~340pM) i Kremen 1 i 2 (Kd~280pM) [Mao 2001] [Mao 2002]. Imajući na umu ove visokoafinitetne interakcije poželjno je dodatno poboljšanje afiniteta u cilju bolje kompeticije sa fiziološkim interakcijama DKK1. Da bi se povećao afinitet i biološka aktivnost selekcionisanih Fab fragmenata, CDR-L3 i CDR-H2 regioni su optimizovani paralelno mutagenezom kaseta primenom trinukleotid usmerene mutageneze [Virnekas 1994] [Knappik 2000] [Nagy 2002].

Nakon afinitetnog sazrevanja, selekcionisan je Fab koji ima mali pikomolarni afinitet, reaktiviše DKK1 inhibirani wnt signal sa EC50 ispod 1 nM i unakrsno reaguje sa cynomolgus, majmunskim, mišijim i pacovskim DKK1. Varijabilni regioni ovog Fab fragmenta su onda ugradjeni u dva različita frameworka humanog IgG1.

Anti-DKK1/4 antitijelo ima visok afinitet za humani DKK1 (2 pM) sa kinetikom vezivanja tipičnom za antitijelo ovakvog afiniteta. Videti sliku 6.

Slika 6. METODE: Afinitet vezivanja i kinetika vodećih kandidata i rhDKK1 (rekombinantni humani DKK1) (Batch BTP7757) su mereni primenom površinske plasmon rezonance pomoću Biacore T100 (Biacore, Uppsala, Švedska) instrumenta koji poseduje CM5 (S) senzorski čip (Cat#BR-1006-68). Anti-humani IgG1 Fc (Jackson Immuno Research, cat#109-006-098) je imobilisan na svaku protočnu komoru, što je bilo praćeno "hvatanjem" vodećeg kandidata na očekivanom nivou od oko 100 RU. Konačno, šest koncentracija DKK1 (ranga 0.195 - 6. 25 nM), sa jednom ponovljenom koncentracijom, su prošle preko čipa. Protočne komore su aktivirane za vezivanje DKK1 tokom 240 sekundi, nakon čega je sledila 30 min disocijacija. Obrađeni podaci (od kojih je oduzeta bazna linija) su podešeni na 1:1 vezivanje pomoću modela transporta mase, korišćenjem analize kinetike u BIA 1.0 softveru. Ovaj eksperiment je izveden u triplikatu a prikazani rezultati su srednje vrednosti sa standardnom devijacijom tri eksperimenta.

Primer 11: Mapiranje epitopa

Zreli DKK1 je protein od 266 amino kiselina sa dva cisteinom bogata regiona (Cys-1 i Cys-2). Domen Cys-2 je odgovoran za vezivanje i LRP proteina i Kremen proteina i neophodan je i dovoljan za inhibiciju Wnt signala [Li 2002] [Brott 2002]: Imunoprecipitacioni eksperimenti (slike 7A, 7B) pokazuju da se anti-DKK1/4 antitijelo specifično vezuje za Cys-2 domen ali ne i Cys-1 domen. Anti-DKK1/4 antitijelo je slabo aktivno u Western blotu sa denaturisanim DKK1 a u eksperimentima mapiranja peptida nije nadjeno da se spescifično vezuje za bilo koji od preklapajućih peptida od 15 amino kiselina koji pokrivaju dužinu proteina (JTP), što ukazuje da anti-DKK1/4 antitijelo verovatno prepoznaje nelinearni epitop unutar Cys-2.

Slika 7 (A) pokazuje shematski prikaz kompletnog i skraćenog DKK1. Ceo (FL, sadrži rezidue 1-266), skraćen na karboksiterminalnom kraju (ΔC, sadrži rezidue 1-185) i skraćen na aminoterminalnom kraju (ΔN, sadrži rezidue 1-60 i rezidue 157-266) su fuzionisani sa HA epitopom na njihovom C terminalnom delu i klonirani u vektor sisara za ekspresiju pod kontrolom citomegalovirusa (CMV) kao promotora. Slika 7(B) prikazuje vezivanje neutrališućeg anti-DKK1/4 antitijela i DKK1 proteina. Kondicionirani medijum kratkotrajno transfektovanih Hek293 ćelija koje ispoljavaju cele, amino skraćene, karboksi terminalno skraćene DKK1 proteine su inkubirani sa anti-lizozim IgG1 kontrolnim ili anti-DKK1/4 antitijelima 2h na sobnoj temperaturi i imunikompleksi su sakupljeni na protein G kuglicama, razdvojeni SDS-PAGE, preneti i blotovani sa anti HA-antitijelom. 1/10 ukupno unetog uzorka je naneta kao kontrola.

Primer 11: Mapiranje epitopa - N-glikozilacija

Brojni proteini unutar Wnt signalnog puta su kovalentno modifikovani post-translacionim enzimima koji regulišu njihovu celularnu aktivnost. Članovi DKK familije, uključujući DKK1, su modifikovani N-glikozilacijom [Krupnik 1999]. Teorijski, DKK1 ima jedno mesto za N-vezanu glikozilaciju na mestu 256 amino kiseline unutar Cys-2 domena. Imajući na umu visoko konzerviranu prirodu Cys-2 domena i potencijalno vezno mesto i DKK1 za LRP6 i anti-DKK1/4 antitijela za DKK1, želeli smo da odredimo da li anti-DKK1/4 antitijelo prepoznaje N-glikoziliranu formu DKK1. ELISA je pokazala da anti-DKK1/4 antitijelo prepoznaje N-glikoziliranu formu rhDKK1 mnogo bolje nego specifičnu N-vezanu deglikoziliranu formu rhDKK1 tabela 14A. Mada, isti se proteini prepoznaju jednako dobro i sa sekundarnim antitijelom (anti-HIS) usmerenim prema fuzionisanom epitopu tag regiona rekombinantnog proteina. Ova razlika u afinitetu je kvantifikovana primenom površinske plasmon rezonance i pokazano je da anti-DKK1/4 antitijelo ima 100 puta veću KD prema glikoziliranom rhDKK1 nego prema deglikoziliranom proteinu, videti tabelu 14B.

Tabela 14A. Procenat vezivanja - Vezivanje anti-DKK1/4 antitijela za DKK1 u zavisnosti od glikozilacije

Antitijelo

WT DKK1

DKK1 (diglikozilirano)

anti-HIS tag

100 %

anti-DKK1/4

100%

12-18%

Tabela 14B površinska plasmon rezonanca

Protein

Ka (1/Ms)

Kd (1/s)

KD (M)

WT DKK1

7.449E+6

2.319E-5

3.113E-12

DKK1 (N-degli)

1.424E+6

3.071E-4

2.157E-10

Vezivanje anti-DKK1/4 antitijela za "divlji" tip (WT) rhDKK1 (HEK HIS epitop obeležen Batch#BTP7757) i N-vezani deglikozilirani (N-DEGLY, N-vezana deglikozilacija sa enzimom PNGazom F (Sigma, Cat#E-DEGLY) rhDKK1 je meren ELISA metodom. Ukratko, ELISA ploče sa visokim stepenom vezivanja ( Nunc#442404) su obložene sa 1 μg/ml WT ili N-DEGLY DKK1. Prikazan je odnos vezivanja i anti-DKK1/4 antitijela i anti-HIS antitijela za WT DKK1 u poredjenju sa njihovim odgovarajućim vezivanjem za N-DEGLY. Ovaj eksperiment je izveden sa tri različite koncentracije (prikazani su podaci za jednu reprezentativnu koncentraciju), sve koncentracije su imale slične rezultate. B. Afinitet vezivanja i kinetika anti-DKK1/4 antitijela za WT i N-DEGLY DKK1 (HEK293 Batch#BTP7757) su mereni korišćenjem Biacore T100. Anti-DKK1/4 antitijelo je konzistentno imalo 100 puta manji afinitet za N-DEGLY DKK1 nego za WT DKK1.

Primer 12: Procenat homologije izmedju članova DKK familije

Humana Dickkopf familija se sastoji iz četiri paralelna analoga (videti tabelu 15), od kojih se tri (DKK1, 2 & 4) vezuju za LRP6 i Kremen proteine, indukuju internalizaciju LRP5/6 i inhibiraju kanonsku Wnt signalizaciju [Mao 2001] [Mao 2003]. DKK2 i povećana ekspresija LRP6 sinergistički pojačavaju Wnt signale, dok koekspresija LRP6 i Kremen2 obnavlja DKK2 indukovanu inhibiciju puta [Mao 2003]. Tako da DKK2 može delovati i kao agonista i kao antagonista u zavisnosti od ćelijskog miljea. DKK3 je najmanje konzerviran medju članovima familije, uključujući Cys-2 domen koji je odgovoran za LRP5/6 i Kremen interakcije i različit je od drugih članova DKK familije jer ne vezuje LRP ili Kremen i ne blokira Wnt signale [Mao 2001] [Mao 2003].

Tabela 15. Procenat identičnosti članova familije DKK na nivou čitavog proteina i unutar Cys-2 domena.

Ukupni protein

DKK2

DKK3

DKK4

DKK1

38.7

15.5

32.5

DKK2

-

13.4

34.6

DKK3

-

15.1

Cys-2 domen

DKK2

DKK3

DKK4

DKK1

69.3

23.0

56.6

DKK2

-

24.1

54.7

DKK3

-

20.8

Homologija medju članovima DKK familije je procenjivana (Vector NT1 Advanced 9.1.0) primenom AlignX algoritma poravnavanjem sekvenci u parovima gde se porede odnosi aminokiselinskih homologija. Primenjeni su penali od 10 i 0.1 za otvaranje neuparenih delova sekvence, odnosno za proširivanje neuparenih delova sekvence. Ova procena je uključivala poredjenja celih proteina kao i poredjenja Cys-2 domena. Kao što ukazuju podaci na gore prikazanoj tabeli, DKK 1, 2 i 4 dele 30-40% homologije u sekvencama amino kiselina posmatrano na nivou čitavog proteina. Poredjenje samih Cys-2 domena pokazuje da DKK 1 i 2 dele 69% homologije unutar ovog regiona, dok DKK4 deli približno 57% homologije sa istim domenom DKK1 i 2. DKK3 pokazuje najmanji nivo homologije sa ostalim članovim familije. Medju svim članovima je najveća homologija unutar Cys-2 domena.

Primer 13: Afinitet anti-DKK1/4 antitijela prema članovima familije humanog DKK

Antitijelo anti-DKK1/4 se vezuje i za DKK1 i za DKK4, videti tabelu 16. Iako je afinitet za DKK4 približno 100 puta manji nego za DKK1, još uvek je u subnanomolarnim vrednostima i zbog toga verovatno biološki i klinički relevantan. Medjutim, ni DKK2 ni DKK4 nemaju konzervisan asparaginski ostatak koji se smatra ciljnim mestom za glikozilaciju u Cys-2 domenu DKK1. Preliminarni imunoprecipitacioni eksperimenti ukazuju da se anti-DKK1/4 antitijelo ne vezuje specifično za DKK2. Afinitet vezivanja anti-DKK1/4 antitijela za DKK2 biće odredjen nakon uspešnog prečišćavanja DKK2. Anti-DKK1/4 antitijelo se ne vezuje za DKK3 što je u skladu sa različitom funkcijom i osobinama vezivanja DKK3.

Tabela 16. Afinitet anti-DKK1/4 antitijela za članove familije humanog DKK

Članovi familije DKK

KD

DKK1

2.0 x 10-12 M (±0.7)

DKK2

ND

DKK3

NSB

DKK4

2.97 x 10-10 M (±1.5)

Afinitet vezivanja i kinetika anti-DKK1/4 antitijela za ostale članove familije humanog DKK proteina je merena primenom Biacore T100. Kao i prethodni, eksperimenti su izvedeni u triplikatima za proteine koji su se značajnije vezivali za anti-DKK1/4 antitijelo i prikazani su kao prosečna srednja vrednost sa standardnim devijacijama. DKK3 koji ima najmanju homologiju sa članovima familije nije ispoljio detektabilno vezivanje iznad baznog nivoa i stoga je označen NSB (bez značajnog vezivanja). Isto tako, nedavni podaci ukazuju da se anti-DKK1/4 antitijelo iz pronalaska takodje ne vezuje značajno za DKK2.

Primer 14: Anti-DKK1/4 antitijelo blokira vezivanje DKK1 za LRP6

DKK1 deluje antagonistički na Wnt aktivnost interreagujući sa LRP5/6 i Kremen, indukujući onternalizaciju i blokirajući Wnt indukovanu interakciju LRP5/6 sa Frizzled receptorima. Anti-DKK1/4 antitijelo kompetitivno inhibira vezivanje DKK1 za LRP6 što je pokazano u kompeticionom ELISA eseju (slika 8).

HEK293T ćelije ne ispoljavaju dovoljan nivo endogenog LRP5 ili 6 da bi vezivanje DKK1 moglo da se vizualizuje.Medjutim, nakon ko-transfektovanja LRP6 sa površinskim proteinom nosačem uključenim u ćelijski ²saobraćaj², MESD, GFP-obeleženi DKK1 se detektuje na površini ćelije, što ilustruje specifičnu prirodu DKK1/LRP6 interakcije. MOR04910, koji ima iste varijabilne regione kao i anti-DKK1/4 antitijelo, specifično blokira ovu interakciju.

Sposobnost anti-DKK1/4 antitijela da inhibira vezivanje DKK1 za LRP6 je mereno ELISA metodom. Ukratko, netretirane ploče (Fisher, Cat#12565501) su obložene sa 1 mg/ml rekombinantnog LRP6 (R&D Systems Cat# 1505-LR), onda su 500 ng/ml rhDKK1 i koncentracije standarda ili anti-DKK1/4 antitijela ili hIgG1 (anti-lizozim MOR3207, ACE10915) preinkubirani na ledu 30 min nakon čega su postavljeni na LRP6 obložene ploče tokom 2h. Ploče su isprane i nivo DKK1 vezivanja je detektovan pomoću anti-DKK1 antitijela (R&D Systems AF1096). Prikazane su neobradjene OD vrednosti (oduzeta bazna linija). Povećanje koncentracije anti-DKK1/4 antitijela inhibira direktno vezivanje DKK1 za LRP6 na dozno zavisan način, dok povećanje koncentracije hIgG1 ne blokira vezivanje DKK1 za LRP6.

Sposobnost MOR04910 da inhibira DKK1/LRP6 vezivanje na površini ćelije je mereno pomoću fluorescentne mikroskopije. HEK293T ćelije su ili lažno (mock) transfektovane ili prolazno transfektovane plazmidima koji kodiraku LRP6 i MESD. Ćelije su inkubirane sa DKK1-GFP kondicioniranim medijumom zajedno sa anti-lizozim Fab ili anti-DKK1 Fab MOR04910 tokom 1h na 37oC i ispitane fluorescentnom mikroskopijom. GFP fluorescenca odražava DKK1-GFP vezivanje za pojačano ispoljen LRP6 na plazma membrani. Anti-DKK1/4 antitijelo blokira DKK1 interakciju sa LRP6 na ćelijskoj površini.

Primer 14: Reporter esej – reaktivacija DKK1 inhibirane transkripcije TCF/LEF gena

Kanonski Wnt signalni put kulminira translokacijom beta-katenina u jedro gde se dešava vezivanje beta-katenina za transkripcione faktore TCF/LEF familije što dovodi do povećane transkripcije Wnt-responsivnih gena. Reporter esej je uspostavljen korišćenjem TCF/LEF responsivnog promotora koji kontroliše transkripciju gena za luciferazu, omogućavajući detekciju modulacije Wnt puta. DKK1 efikasno blokira aktivnost luciferaze indukovanu Wnt3A kondicioniranim medijumom (CM), u ovom eseju. Anti-DKK1/4 antitijelo reaktivira DKK1 suprimiran Wnt signalni put sa jasnom EC50 od 0.16 nM, slika 9. S obzirom da esej zahteva oko 1nM DKK1 za kompletnu supresiju a afinitet antitijela je 2 pM, verovatno je da ovaj EC50 reflektuje senzitivnsot eseja i relativnu količinu svakog proteina pre nego apsolutni limit kompeticije anti-DKK1/4 antitijela.

293T ćelije stabilno transfektovane SuperTopflash reporterom i Kremen su tretirane sa 10 ng/ml rhDKK1, 50% Wnt3a kondicioniranim medijumom i različitim količinama anti-DKK1/4 antitijela. Osamnaest sati kasnije, merena je aktivnost luciferaze primenom Bright-Glo luciferaza esej kita (Promega).

Primer 15: Reporter esej – reverzija DKK1 inhibirane sekrecije alkalne fosfataze u pre-osteoblast like ćelijama

Da bi odredili da li anti-DKK1/4 antitijelo blokira funkcije DKK1 u fiziološki relevantnijim uslovima, uspostavljen je in vitro esej za merenje Wnt-posredovane osteoblastne diferencijacije pluripotentne mišije ćelijske linije C3H10T1/2 (10T1/2), videti sliku 10. Tokom osteoblastne diferencijacije 10T1/2 ćelije sekretuju alkalnu fosfatazu (AP), fenomen koji može biti inhibiran delovanjem DKK1. Anti-DKK1/4 antitijelo, ali ne i IgG kontrola, blokira DKK1 indukovanu supresiju diferencijacije 10T1/2 u prisustvu Wnt3A kondicioniranog medijuma.

Wnt indukuje proliferaciju i inhibira apoptozu u brojnim ćelijskim miljeima, a aktivacija Wnt puta, pokazana stabilizacijom beta-katenina ili lokalizacijom u jedru, je često povezana sa progresijom tumora. Dalje, smanjeno prisustvo DKK1 u nekim kancerima (karcinom debelog creva i melanom) [Gonzalez-Sancho 2005] [Kuphal 2006] navelo je pojedine istraživače da ukažu da DKK1 može biti tumor supresor za neke kancere. Da bi testirali da li DKK1 ima efekat na proliferaciju i preživljavanje tumora, ćelijske linije tumora su tretirane anti-DKK1/4 antitijelom i analiziran je njegov uticaj na rast ovih ćelija. Nije nadjeno da anti-DKK1/4 antitijelo značajno utiče ni na jednu testiranu tumorsku ćelijksu liniju.

Efekat anti-DKK1/4 antitijela na preživljavanje i proliferaciju nekoliko kancerskih ćelijskih linija je procenjivan in vitro. U ovom eseju anti-DKK1/4 antitijelo (100 μg/ml) je inkubirano sa tumorskom ćelijskom linijom, nakon tri dana broj ćelija je procenjen kvantifikacijom ATP (Promega, cell Titer Glo Assa®), kao mera metabolički aktivnih ćelija u linearnoj zavisnosti od broja ćelija. Ovaj esej je izvodjen u tri različite koncentracije seruma (bez seruma, minimalni rast i kompletan rast). Nisu nadjene značajne razlike u poredjenju sa netretiranim ili hIgG1 tretiranim ćelijama. ELISA metodom je analizirana ekspresija DKK1 u supernatantima ćelijskih linija.

Primer 16: Species specifična unakrsna reaktivnost i neutralizacija DKK1

Neutrališuće anti-DKK1/4 antitijelo je selekcionisano ne samo prema svom visokom afinitetu prema humanom DKK1 i neutrališućim sposobnostima, već i na osnovu unakrsne reaktivnosti sa drugim vrstama što može biti od koristi za efikasnost i bezbednost istraživanja. Anti-DKK1/4 antitijelo unakrsno reaguje sa mišijim, pacovskim i cynomolgus majmunskim (cyno, Macaca fascicularis) DKK1 sličnim afinitetom kao prema humanim DKK1, videti tabelu 17. Osim toga, anti-DKK1/4 antitijelo neutrališe DKK1-posredovanu Wnt supresivnu aktivnost (tabela 17) u sve četiri vrste, što ukazuje da bi ove vrste mogle biti relevantne i za bezbednost i za efikasnost modela.

Tabela 17 Species specifična unakrsna reaktivnost i neutralizacija DKK1

DKK1 protein

KD [pM]

Reaktivacija wnt3a signala (TOPFlash)

EC50 (pM)

čovek

17

80.6

cynomolgus

7

54.2

miš

10

60.5

pacov

16

255

Odredjivanje afiniteta za humani, cynomolgus, mišiji i pacovski DKK1 su odredjivani metodom ravnotežne titracije rastvora (SET) na M-384 SERIES® analizatoru (BioVeris, Evropa). Za odredjivanje KD metodom ravnotežne titracije rastvora (SET), korišćena je monomerna frakcija (najmanje 90% sadržaja monomera, analizirano pomoću analitičke SEC; Superdex75, Amersham Pharmacia) IgG proteina. Odredjivanje afiniteta u rastvoru bazirano na elektrohemiluminiscenci (ECL) i procena rezultata su u osnovi izvedeni kao što su opisali Haenal i sar., 2005, primenjen je model fitovanja vezivanja modifikovan prema Piehler i sar., 1997. Konstantna količina MOR4910 IgG je ekvilibrisana različitim koncentracijama (trostruka serijska razblaženja) humanog DKK1 (početna koncentracija 4 nM) u rastvoru. Biotinilovano humano DKK1 kuplovano za paramagnetne kuglice (M-280 Streptavidin, Dynal) i BV-tagTM (BioVeris Evropa, Witney, Oxfordshire, UK) obeleženo kozije anti-humano (Fab)'2 poliklonsko antitijelo su dodati i inkubirani 30 min. Nakon toga je određivana koncentracija nevezanog IgG pomoću ECL detekcije korišćenjem M-384 SERIES® analizatora (BioVeris, Evropa). Odredjivanje afiniteta prema pacovskom, mišijem i cynomolgus DKK1 je u osnovi izvedeno kao što je opisano ranije korišćenjem mišijeg, pacovskog i cynomolgus DKK1 kao analit u rastvoru umesto humanog DKK1. Za detekciju slobodnih IgG molekula, korišćeno je biotinilovano humano DKK1 kuplovano za paramagnetne kuglice. MOR4910 i anti-DKK1/4 antitijelo neutrališu humani DKK1 (Novartis) ekvivalentnim ED50, anti-DKK1/4 antitijelo takodje neutrališe majmunski (Novartis), mišiji (R&D Systems 1765-DK-010) i pacovski (Novartis) DKK1. TOPFLASH reporter esej za humani, pacovski, mišiji i cynomolgus DKK1 je u osnovi izveden kao što je ranije opisano (slika 9) korišćenjem rekombinantnog DKK svake vrste kao inhibitora Wnt kondicioniranog medijuma, umesto humanog DKK1. Pacovski rekombinantni DKK1 je zahtevao veću koncentraciju proteina za postizanje značajne inhibicije u TOPFLASH eseju.

Primer 17: Efekat anti-DKK1/4 antitijela na intratibijalni rast PC3M2AC6 ksenografta

Metastaze tumora prostate su jedinstvene medju metastazama kostiju po tome što su pre osteoblastne nego osteolitične [Keller 2001]. Medjutim, čak i predominnatno osteoblastne metastaze kostiju imaju jasno izražene regione osteolize i često su praćene malom gustinom koštane mase (BMD) naročito kada su pacijenti na ablacionoj terapiji androgenima [Saad 2006]. Nedavno je pokazano da DKK1 može delovati kao regulator, jer ekspresija DKK1 pojačava osteolitičke osobine mešane osteoblastne/osteolitičke ćelijske linije tumora prostate (C4-2B). Osim toga, shRNA supresija DKK1 inhibira osteolitičku aktivnost predominantno osteolitičke tumorske linije ćelija prostate (PC3) [Hall 2005] [Hall 2006]. Funkcionalna inaktivacija DKK1 takodje inhibira intratibijalni rast tumorskog ksenografta, što je navelo autore da pretpostave da osteolitička aktivnost može biti važna za uspostavljanje metastatskih niša, ali sledstveni gubitak DKK1 u metastazama prostate konvertuje tumor u osteoblastični fenotip.

Model osteolitičkog tumora prostate je adaptiran po metodi koju je opisao Kim 2003. Varijanta ćelijske linije osteolitičkog tumora prostate (PC3M) koja stabilno ispoljava luciferazu (PC3M2AC6) je ubrizgana u tibiju miša. Rast tumora je praćen pomoću luciferaze dok su promene u kosti praćene mikro-kompjuterizovanom tomografijom (mikro-CT) i histologijom. Anti-DKK1/4 antitijelo je pre uticalo na inhibiciju rasta tumora nego na povećanje rasta tumora. Iako inhibicija nije bila značajna ni u jednoj studiji, ona se konzistetntno dešavala u 5/5 studija do danas sprovedenih, reprezentativna studija koja pokazuje efekat 3 doze anti-DKK1/4 antitijela na rast tumora je prikazana na slici 11. Sličan, neznačajan inhibitorni trend dešavao se i kada su miševi sa subkutanim PC3M2AC6 ksenograftovima tretirani anti-DKK1/4 antitijelom.

Tretmani su započinjani petog dana nakon implantacije (0.2 miliona ćelija/životinji). Anti-DKK1/4 antitijelo je aplikovano i.v., u dozama od 20, 60 i 200 μg/mišu/dnevno q.d., 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje. Kontrolni IgG je aplikovan i.v., 200 μg/mišu/dnevno q.d., 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje. Vehicle kontrola (PBS) je aplikovana i.v., q.d., 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje. Podaci o finalnoj efikasnosti i promenama telesne mase su izračunavani nakon tretmana.

Koristeći ovaj model, pokazali smo da anti-DKK1/4 antitijelo inhibira tumorom indukovano kortikalno oštećenje kostiju. Efekti na trabekularnu kost su u ovom modelu zbunjujući jer je zapaženo da i implantati tumora i sham implantati uzrokuju mehaničko oštećenje kosti koje dovodi do početnog povećanja fibrilarne kosti i kasnijeg remodelovana koje uzrokuje očigledno smanjenje volumena kosti. Relativni efekat novoformirane fubrilarne kosti i trabekula na ukupni odnos volumen kosti/volumen trabekula (BV/TV) je zbog toga nejasan. Medjutim, jasno je da anti-DKK1/4 antitijelo povećava produkciju kosti i u tumorskim i u sham implantatima tibije i inhibira ili odlaže smanjenje volumena kosti koje se dešava remodelovanjem. Koristeći isti tumor-indukujući osteolitički model, anti-DKK1/4 antitijelo pokazuje ekvivalentnu anti-osteolitičku aktivnost kao Zometa, videti sliku 12. Koštano metabolički efekti anti-DKK1/4 antitijela su dozno zavisni i nalaze se u opsegu od 20-200 μg/mišu, sa minimalnom efikasnom dozom izmedju 20 i 60 μg/mišu, videti sliku 13. Sve ukupno, ovi rezultati ukazuju da anti-DKK1/4 antitijelo može imati uticaj u tumor-inukujućoj osteolitičkoj bolesti, ali može takodje biti efikasno u ne-tumorskim bolestima kostiju kao što su osteoporoza ili unrzano zarastanje fraktura kostiju.

Primer 18: anti-DKK1/4 antitijelo održava povećanu gustinu kosti i u tumorskim i u sham implantatima tibija

U pokušaju procene farmakodinamskih markera efikasnosti, u miša su analizirana tri serumska markera metabolizma kostiju: osteokalcin (OC), osteoprotegerin (OPG) i sekretovani receptor aktivator nuklearnog faktora kB ligand (sRANKL). Ovi osteoblastni markeri su korišćeni pre nego tipični osteoklastni markeri zbog očekivanog mehanizma delovanja antitijela. Medjutim, nisu detektovane konzistentne promene u životinjama sa tumorom naspram naivnih životinja. Nije zabeležena konzistentna korelacija izmedju gubitka kostiju, mereno mikro-CT ili IHC, sa bilo kojim od ovih markera.

Reprezentativni primeri MicroCT rekonstrukcija tibija tretiranih miševa su prikazani na slici 12A. Oštećenja kortikalne kosti su vrednovana od 0 = bez oštećenja do 3 = ozbiljna oštećenja (slika 12 B). Kortikalno oštećenje u tumor-implantiranim tibijama je manuelno skoriran pomoću microCT analiza, koje su “blinded“ u odnosu na ispitivanu grupu. Nije zapaženo kortikalno oštećenje u bilo kojoj od sham implantiranih nožica.

Metode: Atimusnim ženkama miševa starosti 12 nedelja je u levu tibiju implantirano 2x105 ćelija PC-3M2AC6 a u desnu sham-injekcija. Tretmani su počeli petog dana nakon implantacije. NVP-anti-DKK1/4 antitijelo-NX (anti-DKK1/4 antitijelo) i IgG kontrola su aplikovani i.v., u dozama 200 μg/mišu/dnevno q.d., 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje. Vehikul kontrola (PBS) je aplikovana i.v., q.d., 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje. Životinje su snimane 7, 14 i 18 dana nakon implantacije tumora koristeći μ-CT VivaCT40 skener (SCANCO, Švajcarska). Gustina trabekularne kosti (BV/TV) je analizirana kao što je opisano u metodama. Zvezdica (*) označava statistički značajnu razliku i za vehikul i za IgG kontrole (n=12) testiranih u istom vremenskom periodu za nivo značajnosti p<0.05.

Da bi odredili koštanu masu, sekundarna spongiozna tibije, primenom Giemsa bojenja, je posmatrana na Zeiss Imager Z.1 i Axiovision softveru (slika 13). Očitavanje je bazirano na procentu kalcifikovane kosti u celom polju. Svaka kolona predstavlja srednju vrednost i standardnu devijaciju navedenog broja životinja. U grupama tretiranim PBS, IgG i anti-DKK1/4 antitijelom analizirane su jedino životinje sa tumorom. Desne nožice nisu imale sham injekcije a leve nožice su imale tumor. Statistika: Dunnet Multiple Comparisons Test One-Way ANOVA. Leve nožice ili desne nožice u poredjenju sa odgovarajućom nogom u grupi PBS p<0.05*, p<0.01**, p>0.05 n.s.

Anaboličko delovanje anti-DKK1/4 antitijela je dozno zavisno sa minimalnom efikasnom dozom izmedju 20 i 60 μg/mišu 3x/nedeljno (slika 14). Atimusnim ženkama miševa starosti 12 nedelja je u levu tibiju implantirano 2x105 ćelija PC-3M2AC6 a u desnu sham-injekcija. Tretmani su počeli šestog dana nakon implantacije. NVP-anti-DKK1/4 antitijelo-NX (anti-DKK1/4 antitijelo) je primenjeno i.v., u dozama od 20, 60 i 200 μg/mišu/dnevno q.d., 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje. Kontrolni IgG aplikovana i.v., 200 μg/mišu/dnevno q.d., 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje. Vehikul kontrola (PBS) je aplikovana i.v., q.d., 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje. Životinje su snimane 7 i 20 dana nakon implantacije tumora koristeći μ-CT VivaCT40 skener (SCANCO, Švajcarska). Gustina trabekularne kosti (BV/TV) je analizirana kao što je opisano u metodama. Zvezdica (*) označava statistički značajnu razliku svih kontrola uključujući vehikul, IgG, samo bušenje i naivne životinje, testiranih u istom vremenskom periodu, za nivo značajnosti p<0.05.

Primer 18: Status biomarkera

DKK1 biomarkeri

Obrazac ekspresije RNA DKK1 je opisan. Krupnik (1999) je pokazao ekspresiju u placenti pomoću Northern Blot analize, dok u srcu, mozgu, plućima, jetri, skeletnim mišićima i pankreasu ekspresija nije bila detektabilna. Wirths (2003) je pokazao nedostatak RNA ekspresije u jetri, bubregu i dojci, mada je RNA ekspresija vidjena u subsetu hepatoblastoma i Wilms-ovom tumoru. Istraživači koji su ispitivali ekspresiju DKK1 u gastrointestinalnom traktu metodom in situ hibridizacije RNA nisu pokazali ekspresiju u želudcu i debelom crevu, bilo normalnom ili maligno transformisanom (Byun 2006).

Analiza RNA ekspresije u miša je pokazala visok nivo DKK1 ekspresije u kostima, umeren nivo u fetusu i placenti i slabu ekspresiju u tamnom adipoznom tkivu, timusu i dvanaestopalačnom crevu [Li 2006].

Ekspresija DKK1 proteina je procenjivana u uzorcima mijeloma korišćenjem istog kozijeg antitijela koje je primenjeno u tekućoj studiji (Tian, 2003). U ovom radu, ekspresija je detektovana u mijelomskim ćelijama pacijenata sa morfologijom niskog stepena razvijenosti; ekspresija DKK1 proteina nije detektovana u bioptičkim uzorcima kostne srži pet kontrolnih osoba.

Uporednom analizom serije normalnih humanih i majmunskih tkiva uradjena je analiza tkivne distribucije i unakrsna reaktivnost medju različitim vrstama terapijskog antitijela anti-DKK1/4. Procenjivani su i ukupni preseci tkiva i tkivni mikroereji (microarrays). Pozitivne kontrole su uključivale komercijalno antitijelo za DKK1 koje je procenjivano na istim setovima tkiva.

DKK1_15 (FITC konjugovano anti-DKK1/4 antitijelo) i DKK1_8 (FITC konjugovano kozije anti DKK1, R&D Systems, # AF1096, lotovi GBL013101 i GBL14111).

Ostali biomarkeri

S obzirom da se malo zna o patofiziološkoj ulozi DKK1, značajan napor je bio uložen, i dalje se ulaže na spoznaju in vivo efekata anti-DKK1/4 antitijela,primenom biomarker studija, kao i kako se dobijena saznanja mogu koristiti za dalji razvoj.

Ključna područja fokusa uključuju:

1) Razumevanje efekta anti-DKK1/4 antitijela na metabolizam normalne i metastatski izmenjene kosti merenjem cirkulišućih markera osteoklastične i osteolitičke aktivnosti.

2) Komparativni nivo ekspresije DKK1 u multiplom mijelomu i drugim tumorima u cilju potvrde i proširenja ciljnih indikacija.

3) Efekte na nivou ekspresije gena u ključnim tkivima kao što su debelo crevo, kostna srž, pluća, koža i dojka da bi se ustanovila aktivacija beta-katenina.

Preliminarne studije molekularne epidemiologije su potvrdile povećanje nivoa DKK1 u serumu pacijenata sa multiplim mijelomom i podržali su POC u ovoj indikaciji.

Tabela 18 Biomarkeri za DKK1 i DKK4 ciljne molekule

Kategorije

Tumor

Krv

Surogat tkivo

Farmakodinamički (PD)

-Ciljni molekul

-Nizvodno

Mehanizam delovanja

N/A

Slobodni i anti-DKK1/4 At vezano

DKK-1 nivoi

Aktivacija beta-katenina

NTx, CTx, PINP, Osteokalcin, RANKL, OPG, PTH, Vitamin D3, kalcitonin

Adipozno/koža

Efikasnost

M protein u serumsu, Mprotein u urinu,

b2 globin, LDH

NTx, CTx, PINP, Osteokalcin, RANKL, OPG, PTH, kalcitoninKost-ALP, CICP, CTx, NTx, itd.

Prediktivni markeri

Stratifikacija

Preselekcija

Ekspresija DKK1

DKK-1, CTx, PINP, Osteokalcin, RANKL, OPG, PTH, Vitamin D3, kalcitonin

Nivoi DKK1 u serumu

Bezbednost

Imunogenost

Farmakokinetički

Anti-DKK1/4 At

Primer 19: Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca anti-DKK1 antitijela

Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca anti-DKK1 antitijela, čiji su CDR regioni prikazani u tabelama 5, 6, 11A i 11B, su navedeni u kompletnom sklopu u tabeli 19.

Tabela 19. Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca anti-DKK1 antitijela (SEQ ID NOs: 2-39)

CDR i FR sekcije varijabilnih regiona u tabeli 19 su poravnate u tabeli 20A za teške lance (SEQ ID NOS: 2-20; VH3 je SEQ ID NO: 125, VH5 je SEQ ID NO: 126), u tabeli 20B za kapa lake lance (SEQ ID NOS: 21, 22, 23, 27, 28 i 29,VK1 je SEQ ID NO: 127 i VK3 je SEQ ID NO: 128), i u tabeli 20C za lambda lake lance (SEQ ID NOS: 24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 i 37; VL2 je SEQ ID NO: 129 i VL1je SEQ ID NO: 130).

Konsenzus CDR sekvence se nalaze sigurno bar u SEQ ID NOS:40-48 i u tabeli 11B. Dodatne konsenzus CDR sekvence se mogu odrediti od strane stručnjaka iz oblasti, iz poretka u tabeli 20A-20C koristeći standardne metode i metode koje su ovde navedene.

EKVIVALENTI

Na osnovu detaljnih opisa specifičnih izvodjenja iz pronalaska, trebalo bi da je očigledno da su opisana nova antitijela i imunološki fragmenti koji od njih potiču. Iako su pojedina izvodjenja ovde pokazana, opisana do detalja, ovo je učinjeno na način da se pokaže primerom, samo u cilju ilustracije. Pogotovo, razmatrano je od strane prnalazača da različite supstitucije, izmene i modifikacije mogu da se urade u pronalasku bez odvajanja od koncepta i domena pronalaska.

Claims

1.Kompozicija koja se sastoji od antigen-vezujućeg regiona koji se specifično vezuje za epitop na polipeptidu DKK1 (SEQ ID NO: 1) i/ili na polipeptidu DKK4 (SEQ ID NO: 122), gde se antitijelo ili funkcionalni fragment antitijela vezuje za najmanje jedan epitop na DKK1 ili DKK4, ili na oba molekula.

2.Antitijelo prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je vezivanje za DKK1 ili DKK4 odredjeno najmanje jednim testom izabranim medju: antagonizam transkripcije preko Wnt signalnog puta; analiza vezivanja na osnovu elektrohemiluminescence; za enzim-vezani imunosorbentni test vezivanja; FMAT; SET; SPR; koncentracija osteokalcina (OCN) u serumu; koncentracija osteoprotegrina (OPG) u serumu; koncentracija prokolagen tipa I azotnog propeptida (PINP) u serumu; produkcija ALP; TopFlash ili ublažavanje osteolize.

3.Izolovana aminokiselinska sekvenca izabrana iz grupe koju čine SEQ ID Nos: 2-20 i SEQ ID NOs: 40-72 i konzervisane ili "humaneered" varijante ove sekvence.

4.Izolovane aminokiselinske sekvence prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što su aminokiselinske sekvence izabrane iz: a)grupe koju čine SEQ ID NOs: 2-20, 65-72, od kojih svaka sadrži antigen vezujući deo koji se sastoji od H-CDR3 regiona; b)grupe koju čine SEQ ID NOs: 2-20, 57-64 od kojih svaka sadrži h-CDR2 region; c)grupe koju čine SEQ ID NO: 40 koja sadrži sekvencu GISGSGSYTYYADSVKF, SEQ ID NO: 41 koja sadrži sekvencu GISYYGGNTYYADSVKF i SEQ ID NO: 42 koja sadrži sekvencu GISYYGGSTYYADSVKF, od kojih svaka sadrži konsenzus H-CDR2 region; d)grupe koju čine SEQ ID NOs: 2-5, 8-11, 20, 49-56 od kojih svaka sadrži jedan H-CDR1 region; i e)grupe koju čine SEQ ID NO: 43 koja ima aminokiselinsku sekvencu GFTFSSYGMT, SEQ ID NO: 44 koja ima aminokiselinsku sekvencu GFTFNSYGMT, SEQ ID NO: 45 koja ima aminokiselinsku sekvencu GFTFSNYGMT, SEQ ID NO: 46 koja ima aminokiselinsku sekvencu GFTFSSYWMT, SEQ ID NO: 47 koja ima aminokiselinsku sekvencu GFTFSSYAMTF i SEQ ID NO: 48 koja ima aminokiselinsku sekvencu GFTFSSYGMS od kojih svaka sadrži konsenzus H-CDR1 region; ili f)SEQ ID NOs: 21-39 i 73-88; i g)njihove konzervisane ili humaneered varijante.

5.Izolovani antigen-vezuući region prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ iD NOs: 21-39 od kojih svaka sadrži jedan L-CDR3 region; aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39, 73-80 od kojih svaka sadrži jedan L-CDR1 region, aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39, 81-88 od kojih svaka sadrži jedan L-CDR2 region, aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 21-39 od kojih svaka sadrži varijabilni region lakog lanca.

6.Izolovana nukleotidna sekvenca izolovana iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 97-103.

7.Izolovana aminokiseelinska sekvenca koju kodira nukleotidna sekvenca prema patentnom zahtevu 6, i konzervisane ili humaneered varijante ove aminokiselinske sekvence, naznačen time što a)svaka od SEQ ID NOs: 97-100 kodira antigen-vezujući laki lanac; i b)svaka od SEQ ID NOs: 101-103 kodira antigen-vezujući teški lanac.

8.Izolovana nukleotidna sekvenca prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što je nukleotidna sekvenca dalje optimizovana za ekspresiju i/ili za kliničku upotrebu.

9.Izolovana nukleotidna sekvenca izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 104-110.

10.Izolovana aminokiselinska sekvenca koju kodira nukleotidna sekvenca prema patentnom zahtevu 9, i konzervisane i humaneered varijante aminokiselinske sekvence, naznačen time što: a)Svaka od SEQ ID NOs: 104-107 kodira antigen-vezujući laki lanac, i b)Svaka od SEQ ID NOs: 108-110 kodira antigen-vezujući teški lanac.

11.Izolovana nukleotidna sekvenca prema patentnom zaahtevu 9, naznačen time što je nukleotidna sekvenca optimizovana za ekspresiju i/ili za kliničku upotrebu.

12.Izolovana aminokiselinska sekvenca izabrana iz grupe koju čine 111-117 i njihove konzervisane ili humaneered varijante, naznačen time što a)Svaka od SEQ ID NOs: 111-114 kodira antigen-vezujući laki lanac, i b)Svaka od SEQ ID NOs: 108-110 kodira antigen-vezujući teški lanac.

13.Izolovana nukleotidna sekvenca prema patentnom zaahtevu 12, naznačen time što je nukleotidna sekvenca optimizovana za ekspresiju i/ili za kliničku upotrebu.

14.Izolovana nukleotidna sekvenca izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 120-121.

15.Izolovana aminokiselinska sekvenca koju kodira nukleotidna sekvenca prema patentnom zahtevu 14, i konzervisane ili humaneered varijante aminokiselinske sekvence, naznačen time što: a)SEQ ID NO: 120 kodira varijabilni region lakog lanca, i b)SEQ ID NO: 121 kodira varijabilni region teškog lanca

16.Izolovana nukleotidna sekvenca prema patentnom zahtevu 14, naznačen time što je nukleotidna sekvenca optimizovana za ekspresiju i/ili za kliničku upotrebu.

17.Izolovani antigen-vezujući region koji se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca koji je kodiran nukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 120, i varijabilnog regiona teškog lanca koji je kodiran nukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 121.

18.Izolovana aminokiselinska sekvenca izabrana iz grupe od 118-119 i njihove konzrvisane i humaneered varijante.

19.Izolovana aminokiselinska sekvenca prema patetnom zahtevu 18, naznačen time što SEQ ID NO: 118 prikazuje antigen-vezujući varijabilni region lakog lanca.

20.Izolovana aminokiselinska sekvenca prema patetnom zahtevu 18, naznačen time što SEQ ID NO: 119 prikazuje antigen-vezujući varijabilni region teškog lanca.

21.Izolovana aminokiselinska sekvenca prema patetnom zahtevu 18, naznačen time što je aminokiselinska sekvenca optimizovana za ekspresiju i/ili kliničku uptrebu.

22.Izolovana aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje 95 procenata homologije sa najmanje jednim CDR regionom izabranim iz regiona prikazanog u SEQ ID NOs: 2-121.

23.Izolovana aminokiselinska sekvenca koja ima konsenzus sekvencu CDR regiona kao što je opisano u tabelama 11A i 11B.

24.Izolovano antitijelo prema patentnom zahtevu 1, koje poseduje strukturnu platformu izabranu iz IgM IgG, naznačen time što je IgG izabran iz IgG1, IgG2 i IgG3 ili IgG4.

25.Izolovano antitijelo prema patentnom zahtevu 24, nazančen time što su IgM ili IgG izabrani iz poliklonskih ili monolonskih antitijela.

26.Izolovano antitijelo ili funkcionalni fragment antitijela, koji se sastoji od antigen-vezujućeg regiona koji je specifičan prema epitopu na DKK1, naznačen time što se antitijelo ili njegov funkcionalni fragment vezuje za DKK1 ili DKK4 i sprečava ili ublažava napredovanje DKK1-zavisne bolesti ili DKK4-zavisne boleati.

27.Izolovan antigen-vezujući region antitijela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema patentnom zahtevu 26.

28.Izolovano antitijelo ili njegov funkcionalni fragment koji se sastoji od antigen-vezujućeg regiona koje je specifično prema epitopu na ciljnom molekulu DKK1 ili DKK4 ili na oba, naznačen time što se epitop sastoji od najmanje šest ili više aminokiselinskih ostataka iz CYS2 domena ciljnog molekula DKK1 ili DKK4.

29.Izolovano antitijelo ili funkcionalni fragment prema ma kom od prethodnih patentnih zahteva 1-28, koji je izabran iz kompletnog imunoglobulina ili Fab fragmenta ili scFv fragmenta antitijela iz njega izvedenog, teškog lanca antitijela i antigen-vezujućeg regionaiz njega izvedenog, na neimunoglobulinskoj strukturnoj platformi.

30.Izolovano antitijelo ili njegov funkcionalni fragment prema patentnom zahtevu 29 naznačen time što je epitop konformacioni epitop.

31.Farmaceutska kompozicija koja se sastoji od najmanje jednog antitijela ili funkcionalnog fragmenta antitijela prema patentnom zahtevu 29 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent shodno tome.

32.Transgena životinja koja nosi gen koji kodira antitijelo ili njegov funkcionalni fragment prema ma kom od patentnih zahteva 29.

33.Postupak lečenja poremećaja ili stanja koje je povezano sa prisustvom DKK1 ili DKK4, koje podrazumeva primenu na ispitaniku kojem je to potrebno, efikasne količine farmaceutske kompozicije prema patentnom zahtevu 31.

34.Postupak prema patentnom zahtevu 33, naznačen time što je poremećaj ili stanje odabrano izmedju osteolitičkih lezija-posebno osteolitičkih lezija koje su povezane sa mijelomom, naročito sa multiplim mijelomom, ili sa malignim tumorom kostiju, dojke, kolona, melanocita, hepatocita, epitela, ždrela, mozga, pluća, prostate, ili pankreasa ili iz njih proisteklih metastatskih bolesti; gubitak koštane mase koji je povezan sa transplantacijom; ili osteosarkom, karcinom prostate, hepatocelularni karcinom (HCC), mijelom uključujući multipli mijelom, dijabet, gojaznost, propadanje mičićnog tkiva, Alchajmerova bolest, osteoporoza, osteopenija, reumatizam, kolitis i/ili neželjeni gubitak kose.

35.Postupak prema patentnom zahtevu 33, naznačen tiem što postupak dalje obuhvata primenu drugog terapijskog sredstva.

36.Postupak prema patentnom zahtevu 35, naznačen time što je hemoterapijsko sredstvo Zometa.

37.Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 35, naznačen time što je dodatno terapijsko sredstvo izabrano iz grupe koju čini anti-tumorsko sredstvo; sredstvo sa anti-metaboličkim delovanjem, antidijabetsko sredstvo, sredstvo protiv osteoporoze; antibiotik; anti-inflamatorno sredstvo; faktor rasta i citokin.

38.Izolovano antitijelo koje se sastoji od prve aminokiselinske sekvence koja je teški lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 2-20 i sekvence koja ima najmanje 95 procenata homologije u CDR regionima sa CDR regionima koi su prikazani u SEQ ID NOs: 2-20; i druge aminokiselinske sekvence koja je laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 21-39 i sekvence koja ima najmanje 95 procenata homologije u CDR regionima sa CDR regionima koji su prikazani u SEQ ID NOs: 21-39.

39. Imunokonjugat koji se sastoji od prve komponente koja je antitijelo ili njegov fragment prema ma kom od prethodnih patentnih zahteva.

40.Kit u kome se nalazi antitijelo ili njegov fragment prema ma kom od prethodnih patentnih zahteva.

41.Kit prema patentnom zahtevu 40, u kome se dalje nalazi farmaceutski prihvatljiv nosač ili shodno tome ekscipijent.

42.Kit prema patentnom zahtevu 40, naznačen time što je antitijelo prisutno u doznoj jedinici.

43.Kit prema patentnom zahtevu 40, u kome se dalje nalaze uputsva za upotrebu, kada treba da se primenjuje na ispitaniku.

44.Kompozicija koja sadrži neutrališuće anti-DKK1/4 antitijelo.

45.Antitijelo iz patentnog zahteva 40, nazančen time što se antitijelo vezuje za DKK1 sa Kon (Kvezivanja) manjom od 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1,0 nM, 500 pM ili 100 pM; i ima off brzinu (disocijacije) za DKK1 manju od 10-2 u sekundi, 10-3 u sekundi, 10-4 u sekundi i 10-5 u sekundi.

46.Antitijelo iz patentnog zahteva 40, naznačen time što antitijelo ima 102 - 106 veći afinitet prema DKK1 ili DKK4 u poredjenju sa DKK2 ili DKK3.

47.Antitijelo iz patentnog zahteva 40, nazančen time što antitijelo kompetira sa neutrališićim anti-DKK1/4 u vezivanju za DKK1 ili DKK4.

48.Postupak lečenja bolesti sa kompozicijom koja sadrži najmanje polipeptidnu sekvencu sa SEQ ID NO: 118 i polipeptidnu sekvencu sa SEQ ID NO:119, ili proizvod konzrvisane ili humaneered modifikacije ovih sekvenci; gde je kompozicija neutrališuće anti-DKK1/DKK4 antitijelo.

49.Postupak za prevenciju ili lečenja proliferativnih bolesti ili bolesti, kao što je maligni tumor, kod sisara, naročito kod ljudi, sa kombiancijom faramaceutskuh sredstava koja se sastoji od : a)neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije; i b)jednog ili viče farmaceutski aktivnih sredstava. Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske kompozicije koje se sastoje od: c)neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije; d)farmaceutski aktivnog sredstva; i e)farmaceutski prihvatljivog nosača. Ovaj pronalazaak se dalje odnosi na tržišno pakovanje ili proizvod koji se sastoji od: f)farmaceutske formulacije neutrališuće anti-DKK1/4 kompozicije; i g)farmaceutske formulacije farmaceutski aktivnog sredstva za istovremenu, odvojenu ili uzastopnu primenu.

50.Postupak iz patentnog zahteva 49, nazančen time što je farmaceutski aktivno sredstvo, podrazumeva se, specijalno svako farmaceutski aktivno sredstvo različito u odnosu na neutrališuću anti-DKK1/4 kompoziciju ili njene derivate, gde je sredstvo izdvojeno iz: i.inhibitor aromataze; ii.anti-estrogen, anti-androgen ili agonistu gonadorelina; iii.inhibitor topoizomeraze I ili inhibitor topoizomeraze II; iv.aktivno sredstvo za mikrotubule, alkilirajuće sredstvo, anti-neoplastično sredstvo anti-metabolitskog mehanizma delovanja ili platinsko jedinjenje v.supstanca koja je specifično usmerena prema/koja smanjuje aktivnost proteinske ili lipidne kinaze; ili aktivnost proteinske ili lipidne fosfataze, dalje supstanca koja sprečava angiogenezu ili supstanca koja indukuje procese ćelijske diferencijacije; vi.monoklonska antitijela; vii.inhibitor ciklooksigenaze, bisfosfonat, inhibitor heparinaze, modifikator biološkog odgovora; viii.inhibitor Ras onkogenih izoformi; ix.inhibitor telomeraze; x.inhibitor proteaze, inhibitor matriksne metaloproteinaze, inhibitor metionin aminopeptidaze, ili inhibitor proteozoma; xi.sredstva koja se koriste u lečenju hematoloških maligniteta ili supstanci koje usmeravaju, umanjuju ili inhibiraju aktivnost Flt-3; xii.inhibitor HSP90; xiii.antiproliferativna antitijela; xiv.inhibitor histon deacetilaze (HDAC); xv.supstanca koja usmerava, umanjuje ili inhibira aktivnost/funkciju serin/treonin mTOR kinaze; xvi.antagonista somatostatinskog receptora; xvii.supstance sa anti-leukemijskim delovanjem; xviii.pristupi koji u osnovi imaju štetno delovanje na tumorske ćelije; xix.vezivni elemenat za EDG; xx.inhibitor ribonukleotid reduktaze; xxi.inhibitor S-adenozilmetionin dekarboksilaze; xxii.monoklonsko antitijelo prema VEGF ili VEGFR; xxiii.fotodinamska terapija; xxiv.steroid sa angiostatskim delovanjem; xxv.implant koji sadrži kortikosteroide; xxvi.antagonista ATI receptora; i xxvii.inhibitor ACE.

51. Antitijelo koje se vezuje za DKK-1 sa afinitetom od (KD) ili 10-8 ili manje i kompetira sa svakim antitijelom iz patentnog zahteva 1.

52. Antitijelo prema patentnom zahtevu 51 čije vezivanje za DKK2 ili DKK3 nije detektabilno.

53. Antitijelo iz patentnog zahteva 52, naznačen time što se antitijelo vezuje za DKK1 ili DKK4 sa (KD) od 10-3 ili više.