BRPI0706625A2 - ligando quem tem especificidade de ligação para o fator de crescimento endotelial vascular e receptor do fator epidérmico, uso do ligando, composição, e, dispositivo de dispensão de droga - Google Patents

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Abstract

LIGANDO QUE TEM ESPECIFICIDADE DE LIGAçãO PARA O FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR E RECEPTOR DO FATOR EPIDéRMICO, USO DO LIGANDO, COMPOSIçãO, E, DISPOSITIVO DE DISPENSAçAO DE DROGA. São divulgados ligandos que têm especificidade de ligação para o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), ou para VEGF e EGFR. Também são divulgados métodos de usar estes ligandos. Em particular, o uso destes ligandos para a terapia contra o câncer é descrita.

Description

"LIGANDO QUE TEM ESPECIFICIDADE DE LIGAÇÃO PARA OFATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR E RECEPTORDO FATOR EPIDÉRMICO, USO DO LIGANDO, COMPOSIÇÃO, E,DISPOSITIVO DE DISPENSAÇÃO DE DROGA"
PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido é uma continuação do Pedido U.S. N- 11/331.415,depositado em 11 de janeiro de 2006, que é uma continuação-em-parte doPedido U.S. N2 11/098.758, depositado em 4 de abril de 2005, que é umacontinuação-em-parte do Pedido U.S. N- 10/925.366, depositado em 24 deagosto de 2004. As divulgações inteiras dos pedidos acima são aquiincorporados por referência.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
O câncer é uma causa principal de mortalidade e morbidez. Osmétodos para tratar o câncer incluem intervenção cirúrgica para removertumores e quimioterapia. Estes métodos podem curar com êxito algunspacientes. Entretanto, mesmo os pacientes que parecem ter sido curadosfreqüentemente sofrem de um retorno do câncer necessitando de mais terapia.Os agentes quimioterapêuticos no geral não são agentes seletivos que sãotóxicos para as células, tais como as células proliferantes. Conseqüentemente,tais agentes podem eficazmente matar as células cancerosas mas tambémmatam as células saudáveis produzindo diversos efeitos colaterais nocivos.
Certas células cancerosas expressam ou superexpressam certoscomponentes celulares tais como proteínas de superfície da célula ouexpressam componentes celulares diferentes quando comparadas com ascélulas normais. Um método para tratar as deficiências dos métodoscirúrgicos e quimioterapêuticos para a terapia contra o câncer e diagnósticoenvolve alvejar células cancerosas, por exemplo usando anticorpos oufragmentos de anticorpo que se ligam às proteínas que são expressadas ousuperexpressadas nas células cancerosas. Várias de tais proteínas alvo foramidentificadas. Entre tais proteínas está o receptor do fator de crescimentoepidérmico (EGFR).
O EGFR é um membro da família ErbB 1 e transduz sinais quelevam à proliferação e sobrevivência celulares e à elaboração de fatores demortalidade, crescimento e angiogênico na ligação ao fator de crescimentoepidérmico (EGF) e ou fator alfa de crescimento transformador (TGF alfa).
Conseqüentemente, o EGFR foi demonstrado estar envolvido no crescimento,metástase e angiogênese de tumor. Além disso, muitos cânceres expressamEGFR, tais como o câncer da bexiga, câncer ovariano, câncer colo-retal,câncer mamário, câncer pulmonar (por exemplo, carcinoma pulmonar decélula não pequena), câncer gástrico, câncer pancreático, câncer prostático,câncer da cabeça e pescoço, câncer renal e câncer da vesícula biliar.ERBITUX (cetuximab; Imclone Systems Inc) é um anticorpo decamundongo/iiurnaiio quirnérico que liga EGFR humano que foi aprovadopara tratar certos cânceres que expressam EGFR em combinação comirinotecan.
Um processo fisiopatológico importante que facilita aformação, metástase e retorno de tumor é a angiogênese de tumor. Esteprocesso é mediado pela elaboração de fatores angiogênicos pelo tumor, taiscomo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que induz aformação de vasos sangüíneos que liberam nutrientes ao tumor.
Conseqüentemente, um outro método para tratar certos cânceres é inibir aangiogênese de tumor mediada pelo VEGF, subalimentando deste modo otumor. AVASTIN (bevacizumab; Genetech, Inc.) é um anticorpo humanizadoque se liga ao VEGF humano que foi aprovado para tratar o câncer colo-retal.
Um anticorpo aludido como anticorpo 2C3 (Acesso do ATCC N- PTA 1595)é relatado ligar o VEGF e inibir a ligação de VEGF ao receptor do fator decrescimento epidérmico 2.
O alvejamento de EGFR ou VEGF com produtos terapêuticoscorrentemente disponíveis não é eficaz em todos os pacientes ou para todos oscânceres (por exemplo, cânceres que expressam EGFR). Assim, umnecessidade existe quanto aos agentes melhorados para tratar câncer e outrascondições patológicas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção diz respeito a ligandos que têm especificidade deligação para VEGF (por exemplo, VEGF humano), ligandos que têmespecificidade de ligação para EGFR (por exemplo, EGFR humano) e aligandos que têm especificidade de ligação para VEGF e EGFR (por exemplo,VEGF humano e EGFR humano). Por exemplo, o ligando pode compreenderum domínio de polipeptídeo tendo um sítio de ligação com especificidade deligação para VEGF, um domínio de polipeptídeo tendo um sítio de ligaçãocom especificidade de ligação de EGFR ou compreende um domínio depolipeptídeo tendo um sítio de ligação com especificidade de ligação paraVEGF e um domínio de polipeptídeo tendo um sítio de ligação comespecificidade de ligação de EGFR.
Em um aspecto, a invenção diz respeito a um ligando quetenha especificidade de ligação para VEGF e para EGFR. Tais ligandoscompreendem pelo menos uma porção de proteína que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para VEGF e pelo menos uma porçãode proteína que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação paraEGFR. A porção de proteína que tem um sítio de ligação com especificidadede ligação para VEGF e a porção de proteína que tem um sítio de ligação comespecificidade de ligação para EGFR podem cada um ser qualquer porção de ligação adequada. As porções de proteína podem ser uma porção de peptídeo,porção de polipeptídeo ou porção de proteína. Por exemplo, as porções deproteína podem ser fornecidas por um fragmento de anticorpo que tenha umsítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF ou EGFR, tal comoum domínio variável único de imunoglobulina que tenha especificidade deligação para VEGF ou EGFR.
O ligando pode compreender uma porção de proteína que temum sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF que competequanto à ligação ao VEGF com AVASTIN (bevacizumab; Genentech, Inc.)e/ou anticorpo 2C3 (Acesso do ATCC N2 PTA 1595). O ligando podecompreender uma porção de proteína que tem um sítio de ligação comespecificidade de ligação para EGFR que compete quanto à ligação ao EGFRcom ERBITUX (cetuximab; Imclone Systems, Inc.). Em algumas formas derealização, o ligando compreende uma porção de proteína que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para VEGF que compete quanto àligação ao VEGF com bevacizumab e/ou anticorpo 2C3 (Acesso do ATCC N°PTA 1595) e compreende ainda uma porção de proteína que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para EGFR que compete quanto àligação ao EGFR com cetuximab.
Em algumas formas de realização, o ligando compreende umaporção de proteína que tem um sítio de ligação com especificidade de ligaçãopara VEGF (por exemplo, um domínio variável único de imunoglobulina) quecompete quanto à ligação ao VEGF com um anticorpo de domínio anti-VEGF(dAb) selecionado do grupo que consiste de TARl 5-1 (SEQ ID NO: 100),TARl 5-3 (SEQ ID NO: 101), TARl5-4 (SEQ ID NO: 102), TARl5-9 (SEQID NO: 103), TAR15-10 (SEQ ID NO: 104), TARl 5-11 (SEQ ID NO: 105),TAR15-12 (SEQ ID NO: 106), TAR15-13 (SEQ ID NO: 107), TAR15-14(SEQ ID NO: 108), TAR15-15 (SEQ ID NO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO:110), TARl5-17 (SEQ ID NO: 111), TARl 5-18 (SEQ ID NO: 112), TAR15-19 (SEQ ID NO: 113), TAR15-20 (SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ IDNO: 115), TARl5-5 (SEQ ID NO: 116), TAR15-6 (SEQ ID NO: 117),TARl 5-7 (SEQ ID NO: 118), TARl 5-8 (SEQ ID NO: 119), TARl 5-23 (SEQID NO: 120), TAR15-24 (SEQ ID NO: 121), TAR15-25 (SEQ ID NO: 122),TAR15-26 (SEQ ID NO: 123), TAR15-27 (SEQ ID NO: 124), TAR15-29(SEQ ID NO: 125), TAR15-30 (SEQ ID NO: 126), TAR15-6-500 (SEQ IDNO: 127), TARl5-6-501 (SEQ ID NO: 128), TAR15-6-502 (SEQ ID NO:129), TARl5-6-503 (SEQ ID NO: 130), TAR15-6-504 (SEQ ID NO: 131),TARl5-6-505 (SEQ ID NO: 132), TAR15-6-506 (SEQ ID NO: 133), TAR15-6-507 (SEQ ID NO: 134), TAR15-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509(SEQ ID NO: 136), TAR15-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQID NO: 138), TAR15-8-501 (SEQ ID NO: 139), TAR15-8-502 (SEQ ID NO:140), TARl5-8-503 (SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142),TARl5-8-506 (SEQ ID NO: 143), TARl5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TARl5-8-508 (SEQ ID NO: 145), TARl5-8-509 (SEQ ID NO: 146), TARl 5-8-510(SEQ ID NO: 147), TAR15-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQID NO: 149), TAR15-26-501 (SEQ ID NO: 150), TAR15-26-502 (SEQ IDNO: 151), TARl5-26-503 (SEQ ID NO: 152), TARl5-26-504 (SEQ ID NO153), TARl 5-26-505 (SEQ ID NO: 154), TARl 5-26-506 (SEQ ID NO: 155)TARl5-26-537 (SEQ ID NO: 186), TARl5-26-538 (SEQ ID NO: 187),TARl5-26-539 (SEQ ID NO: 188), TARl5-26-540 (SEQ ID NO: 189),TARl5-26-541 (SEQ ID NO: 190), TAR15-26-542 (SEQ ID NO: 191),TARl5-26-543 (SEQ ID NO: 192), TAR15-26-544 (SEQ ID NO: 193),TARl5-26-545 (SEQ ID NO: 194), TAR15-26-546 (SEQ ID NO: 195),TARl5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TARl5-26-548 (SEQ ID NO: 197),TARl5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TARI5-26-550 (SEQ ID NO: 539) eTARl 5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
Adicionalmente ou em outras formas de realização, o ligandopode compreender uma porção de proteína que tem um sítio de ligação comespecificidade de ligação para EGFR (por exemplo, um domínio variávelúnico de imunoglobulina) que compete quanto à ligação ao EGFR com umanticorpo de domínio anti-EGFR (dAb) selecionado do grupo que consiste deDOM 16-17 (SEQ ID NO: 325), DOMl ó-18 (SEQ ID NO: 326), DOM16-19(SEQ ID NO: 327), DOM16-20 (SEQ ID NO: 328), DOM16-21 (SEQ IDNO: 329), DOM16-22 (SEQ ID NO: 330), DOM16-23 (SEQ ID NO: 331),DOMl6-24 (SEQ ID NO: 332), DOM16-25 (SEQ ID NO: 333), DOM16-26(SEQ ID NO: 334), DOM16-27 (SEQ ID NO: 335), DOM16-28 (SEQ IDNO: 336), DOM16-29 (SEQ ID NO: 337), DOM16-30 (SEQ ID NO: 338),DOMl6-31 (SEQ ID NO: 339), DOM16-32 (SEQ ID NO: 340), DOM16-33(SEQ ID NO: 341), DOM16-35 (SEQ ID NO: 342), DOM16-37 (SEQ IDNO: 343), DOMl6-38 (SEQ ID NO: 344), DOMl6-39 (SEQ ID NO: 345),DOMl6-40 (SEQ ID NO: 346), DOM16-41 (SEQ ID NO: 347), DOM16-42(SEQ ID NO: 348), DOM16-43 (SEQ ID NO: 349), DOM16-44 (SEQ IDNO: 350), DOM16-45 (SEQ ID NO: 351), DOMI6-46 (SEQ ID NO: 352),DOMl6-47 (SEQ ID NO: 353), DOM16-48 (SEQ ID NO: 354), DOM16-49(SEQ ID NO: 355), DOMl6-50 (SEQ ID NO: 356), DOMl6-59 (SEQ IDNO: 357), DOMI6-6O (SEQ ID NO: 358), DOM16-61 (SEQ ID NO: 359),DOMl6-62 (SEQ ID NO: 360), DOM16-63 (SEQ ID NO: 361), DOM16-64(SEQ ID NO: 362), DOM16-65 (SEQ ID NO: 363), DOM16-66 (SEQ IDNO: 364), DOM16-67 (SEQ ID NO: 365), DOM16-68 (SEQ ID NO: 366),DOM 16-69 (SEQ ID NO: 367), DOM16-7Í) (SEQ ID NO: 368), DOM16-71(SEQ ID NO: 369), DOMl6-72 (SEQ ID NO: 370), DOMl6-73 (SEQ IDNO: 371), DOM16-74 (SEQ ID NO: 372), DOM16-75 (SEQ ID NO: 373),DOM 16-76 (SEQ ID NO: 374), DOM16-77 (SEQ ID NO: 375), DOM16-78(SEQ ID NO: 376), DOM16-79 (SEQ ID NO: 377), DOMI6-8O (SEQ IDNO: 378), DOM16-81 (SEQ ID NO: 379), DOM16-82 (SEQ ID NO: 380),DOMl6-83 (SEQ ID NO: 381), DOM16-84 (SEQ ID NO: 382), DOM16-85(SEQ ID NO: 383), DOM16-87 (SEQ ID NO: 384), DOM16-88 (SEQ IDNO: 385), DOM16-89 (SEQ ID NO: 386), DOM16-90 (SEQ ID NO: 387),DOM 16-91 (SEQ ID NO: 388), DOM16-92 (SEQ ID NO: 389), DOM16-94(SEQ ID NO: 390), DOM16-95 (SEQ ID NO: 391), DOM16-96 (SEQ IDNO: 392), DOMl6-97 (SEQ ID NO: 393), DOMl6-98 (SEQ ID NO: 394),DOM 16-99 (SEQ ID NO: 395), DOMIÓ-IOO (SEQ ID NO: 396), DOM16-101 (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398), DOM16-103 (SEQID NO: 399), DOMl6-104 (SEQ ID NO: 400), DOMl6-105 (SEQ ID NO:401), DOMl6-106 (SEQ ID NO: 402), DOMl6-107 (SEQ ID NO: 403),DOMI6-IO8 (SEQ ID NO: 404), DOM16-109 (SEQ ID NO: 405), DOM16-110 (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407), DOM16-112 (SEQID NO: 408), DOM16-113 (SEQ ID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO:410),"DOM16-115 (SEQ ID NO: 411), DOM16-116 (SEQ ID NO: 412),DOMl6-117 (SEQ ID NO: 413), DOM16-118 (SEQ ID NO: 414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416), DOM16-39-8(SEQ ID NO: 417), DOMl6-39-34 (SEQ ID NO: 418), DOMl6-39-48 (SEQID NO: 419), DOM16-39-87 (SEQ ID NO: 420), DOM16-39-90 (SEQ IDNO: 421), DOM 16-39-96 (SEQ ID NO: 422), DOM16-39-100 (SEQ ID NO423), DOM16-39-101 (SEQ ID NO: 424), DOM16-39-102 (SEQ ID NO425), DOMl6-39-103 (SEQ ID NO: 426), DOM16-39-1Q4 (SEQ ID NO<table>table see original document page 9</column></row><table>consiste de DOMl6-39 (SEQ ID NO: 345), DOMl6-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM 16-39-100 (SEQ ID NO: 423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO: 432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) e DOMl6-39-200 (SEQ ID NO: 441).
Em formas de realização mais particulares, o ligando temespecificidade de ligação para VEGF e para EGFR e compreende pelo menosum domínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligaçãopara VEGF e pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR, em que um domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF compete quanto àligação ao VEGF com um anticorpo de domínio anti-VEGF (dAb)selecionado do grupo que consiste de TARl5-1 (SEQ ID NO: 100), TARl5-3(SEQ ID NO: 101), TAR15-4 (SEQ ID NO: 102), TAR15-9 (SEQ ID NO:103), TARl5-10 (SEQ ID NO: 104), TARI5-11 (SEQ ID NO: 105), TARl5-12 (SEQ ID NO: 106), TAR15-13 (SEQ ID NO: 107), TAR15-14 (SEQ IDNO: 108), TARl 5-15 (SEQ ID NO: 109), TARl5-16 (SEQ ID NO: 110),TARl5-17 (SEQ ID NO: 111), TAR15-18 (SEQ ID NO: 112), TAR15-19(SEQ ID NO: 113), TAR15-20 (SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ ID NO:115), TARl5-5 (SEQ ID NO: 1 16), TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-7(SEQ ID NO: 118), TARl5-8 (SEQ ID NO: 119), TARl5-23 (SEQ ID NO:I 120), TAR15-24 (SEQ ID NO: 121), TAR15-25 (SEQ ID NO: 122), TAR15-26 (SEQ ID NO: 123), TAR15-27 (SEQ ID NO: 124), TAR15-29 (SEQ IDNO: 125), TAR15-30 (SEQ ID NO: 126), TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 127),TARl 5-6-501 (SEQ ID NO: 128), TARl5-6-502 (SEQ ID NO: 129), TARl5-6-503 (SEQ ID NO: 130), TARl5-6-504 (SEQ ID NO: 131), TARl5-6-505(SEQ ID NO: 132), TAR15-6-506 (SEQ ID NO: 133), TAR15-6-507 (SEQID NO: 134), TARI5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO:136), TARl5-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQ ID NO: 138),TARl 5-8-501 (SEQ ID NO: 139), TAR15-8-502 (SEQ ID NO: 140), TAR15-8-503 (SEQ ID NO: 141), TARl5-8-505 (SEQ ID NO: 142), TARl 5-8-506(SEQ ID NO: 143), TARl5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TARl5-8-508 (SEQID NO: 145), TAR15-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO:147), TARl5-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQ ID NO: 149)TARl5-26-501 (SEQ ID NO: 150) TARl 5-26-502 (SEQ ID NO: I5l),TARl5-26-503 (SEQ ID NO: 152) TARl 5-26-504 (SEQ ID NO: 153),TARl5-26-505 (SEQ ID NO: 154) TARl 5-26-506 (SEQ ID NO: 155),TARl5-26-507 (SEQ ID NO: 156) TARl 5-26-508 (SEQ ID NO: 157),TARl5-26-509 (SEQ ID NO: 158) TARl 5-26-510 (SEQ ID NO: 159),TARl5-26-511 (SEQ ID NO: 160) TARl 5-26-512 (SEQ ID NO: I6l),TARl5-26-513 (SEQ ID NO: 162) TARl 5-26-514 (SEQ ID NO: 163),TARl5-26-515 (SEQ ID NO: 164) TARl 5-26-516 (SEQ ID NO: 165),TARl5-26-517 (SEQ ID NO: 166) TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167),TARl5-26-519 (SEQ ID NO: 168) TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169),TARl5-26-521 (SEQ ID NO: 170) TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171),TARl5-26-523 (SEQ ID NO: 172) TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173),TARl5-26-525 (SEQ ID NO: 174) TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175),TARl5-26-527 (SEQ ID NO: 176) TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177),TARl5-26-529 (SEQ ID NO: 178) TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179),TARl5-26-531 (SEQ ID NO: 180) TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181),TARl5-26-533 (SEQ ID NO: 182) TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183),TARl5-26-535 (SEQ ID NO: 184) TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185),TARl5-26-537 (SEQ ID NO: 186) TARl 5-26-538 (SEQ ID NO: 187),TARl5-26-539 (SEQ ID NO: 188) TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189),TARl5-26-541 (SEQ ID NO: 190) TARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191),TARl5-26-543 (SEQ ID NO: 192) TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 193),TARl5-26-545 (SEQ ID NO: 194) TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195),TARl5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TARl 5-26-548 (SEQ ID NO: 197),TARl5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TARl5-26-550 (SEQ ID NO: 539) eTARl5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
Por exemplo, o domínio variável único de imunoglobulinacom especificidade de ligação para VEGF pode compreender uma seqüênciade aminoácido que tem pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüênciade aminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado dogrupo que consiste de TARl 5-1 (SEQ ID NO: 100), TAR15-3 (SEQ ID NO:101), TARl 5-4 (SEQ ID NO: 102), TARl 5-9 (SEQ ID NO: 103), TARl 5-10(SEQ ID NO: 104), TAR15-11 (SEQ ID NO: 105), TAR15-12 (SEQ ID NO:106), TARl5-13 (SEQ ID NO: 107), TARl5-14 (SEQ ID NO: 108), TARl 5-15 (SEQ ID NO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO: 110), TAR15-17 (SEQ IDNO: 111), TARl5-18 (SEQ ID NO: 112), TARI5-19 (SEQ ID NO: 113),TARl 5-20 (SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ ID NO: 115), TAR15-5(SEQ ID NO: 116), TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-7 (SEQ ID NO:118), TARl 5-8 (SEQ ID NO: 119), TAR15-23 (SEQ ID NO: 120), TAR15-24 (SEQ ID NO: 121), TAR15-25 (SEQ ID NO: 122), TAR15-26 (SEQ IDNO: 123), TARl 5-27 (SEQ ID NO: 124), TAR15-29 (SEQ ID NO: 125),TAR15-30 (SEQ ID NO: 126), TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 127), TAR15-6-501 (SEQ ID NO: 128), TAR15-6-502 (SEQ ID NO: 129), TAR15-6-503(SEQ ID NO: 130), TARl5-6-504 (SEQ ID NO: 131), TARl5-6-505 (SEQ,20 ID NO: 132), TARl5-6-506 (SEQ ID NO: 133), TARl5-6-507 (SEQ ID NO:134), TARl5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO: 136),TARl5-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQ ID NO: 138), TAR15-8-501 (SEQ ID NO: 139), TAR15-8-502 (SEQ ID NO: 140), TAR15-8-503(SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506 (SEQID NO: 143), TARl5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TARl5-8-508 (SEQ ID NO:145), TARl5-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO: 147),TARl5-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQ ID NO: 149),TAR15-26-501 (SEQ ID NO: 150), TAR15-26-502 (SEQ ID NO: 151),TARl5-26-503 (SEQ ID NO: 152), TARl5-26-504 (SEQ ID NO: 153),<table>table see original document page 13</column></row><table>imunoglobulina com especificidade de ligação para EGFR compete quanto àligação ao EGFR com um anticorpo de domínio anti-EGFR (dAb)selecionado do grupo que consiste de DOMl6-17 (SEQ ID NO: 325),DOMl6-18 (SEQ ID NO: 326), DOM16-19 (SEQ ID NO: 327), DOM16-20(SEQ ID NO: 328), DOM16-21 (SEQ ID NO: 329), DOMl6-22 (SEQ IDNO: 330), DOMl6-23 (SEQ ID NO: 331), DOM16-24 (SEQ ID NO: 332),DOM 16-25 (SEQ ID NO: 333), DOM16-26 (SEQ ID NO: 334), DOM16-27(SEQ ID NO: 335), DOM16-28 (SEQ ID NO: 336), DOM16-29 (SEQ IDNO: 337), DOMl6-30 (SEQ ID NO: 338), DOMl6-31 (SEQ ID NO: 339),DOMl6-32 (SEQ ID NO: 340), DOM16-33 (SEQ ID NO: 341), DOM16-35(SEQ ID NO: 342), DOM16-37 (SEQ ID NO: 343), DOM16-38 (SEQ IDNO: 344), DOM16-39 (SEQ ID NO: 345), DOM16-40 (SEQ ID NO: 346),DOM 16-41 (SEQ ID NO: 347), DOM16-42 (SEQ ID NO: 348), DOM16-43(SEQ ID NO: 349), DOM 16-44 (SEQ ID NO: 350), DOM16-45 (SEQ IDNO: 351), DOM16-46 (SEQ ID NO: 352), DOM16-47 (SEQ ID NO: 353),DOM 16-48 (SEQ ID NO: 354), DOM16-49 (SEQ ID NO: 355), DOM16-50(SEQ ID NO: 356), DOM16-59 (SEQ ID NO: 357), DOMI6-6O (SEQ IDNO: 358), DOM16-61 (SEQ ID NO: 359), DOM16-62 (SEQ ID NO: 360),DOMl6-63 (SEQ ID NO: 361), DOM16-64 (SEQ ID NO: 362), DOM16-65(SEQ ID NO: 363), DOM16-66 (SEQ ID NO: 364), DOM16-67 (SEQ IDNO: 365), DOMl6-68 (SEQ ID NO: 366), DOMl6-69 (SEQ ID NO: 367),DOM 16-70 (SEQ ID NO: 368), DOM16-71 (SEQ ID NO: 369), DOM16-72(SEQ ID NO: 370), DOM16-73 (SEQ ID NO: 371), DOM16-74 (SEQ IDNO: 372), DOM16-75 (SEQ ID NO: 373), DOM16-76 (SEQ ID NO: 374),DOM 16-77 (SEQ ID NO: 375), DOM16-78 (SEQ ID NO: 376), DOM16-79(SEQ ID NO: 377), DOMI6-8O (SEQ ID NO: 378), DOM16-81 (SEQ IDNO: 379), DOM16-82 (SEQ ID NO: 380), DOM16-83 (SEQ ID NO: 381),DOM 16-84 (SEQ ID NO: 382), DOM16-85 (SEQ ID NO: 383), DOM16-87(SEQ ID NO: 384), DOM16-88 (SEQ ID NO: 385), DOM16-89 (SEQ IDNO: 386), DOMl6-90 (SEQ ID NO: 387), DOMl6-91 (SEQ ID NO: 388),DOM 16-92 (SEQ ID NO: 389), DOM16-94 (SEQ ID NO: 390), DOM16-95(SEQ ID NO: 391), DOM16-96 (SEQ ID NO: 392), DOM16-97 (SEQ IDNO: 393), DOM16-98 (SEQ ID NO: 394), DOM16-99 (SEQ ID NO: 395),DOM 16-100 (SEQ ID NO: 396), DOMIó-lOl (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398), DOM16-103 (SEQ ID NO: 399), DOM16-104 (SEQID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO: 401), DOMl 6-106 (SEQ ID NO:402), DOM 16-107 (SEQ ID NO: 403), DOMI6-IO8 (SEQ ID NO: 404),DOM 16-109 (SEQ ID NO: 405), DOM16-HO (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407), DOM16-112 (SEQ ID NO: 408), DOM16-113 (SEQID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO: 410), DOM16-115 (SEQ ID NO:411), DOM16-116 (SEQ ID NO: 412), DOM16-117 (SEQ ID NO: 413),DOM16-118 (SEQ ID NO: 414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416), DOMlÓ-39-8 (SEQ ID NO: 417), DOM1Ó-39-34(SEQ ID NO: 418), DOM16-39-48 (SEQ ID NO: 419), DOM16-39-87 (SEQID NO: 420), DOM16-39-90 (SEQ ID NO: 421), DOM16-39-96 (SEQ IDNO: 422), DOM16-39-1QO (SEQ ID NO: 423), DQM16-39-101 (SEQ ID
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DOM16-39-103 (SEQ IDDOM 16-39-105 (SEQ IDDOM 16-39-107 (SEQ IDDOM 16-39-109 (SEQ IDDOM16-39-111 (SEQ IDDOM16-39-113 (SEQ IDDOM16-39-115 (SEQ IDDOMl6-39-117 (SEQ IDDOMl6-39-201 (SEQ IDDOM 16-39-203 (SEQ IDDOM 16-39-205 (SEQ IDDOMl 6-39-207 (SEQ IDNO: 448), DOM16-39-209 (SEQ ID NO: 449), DOMl6-52 (SEQ ID NO:450), NBl (SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQ ID NO:453), NB4 (SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ ID NO: 455), NB6 (SEQ ID NO:456), NB7 (SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQ ID NO:459), NBlO (SEQ ID NO: 460), NBll (SEQ ID NO: 461), NB12 (SEQ IDNO: 462), NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14 (SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQID NO: 465), NB16 (SEQ ID NO: 466), NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18(SEQ ID NO: 468), NB19 (SEQ ID NO: 469), NB20 (SEQ ID NO: 470),NB21 (SEQ ID NO: 471) e NB22 (SEQ ID NO: 472).
Por exemplo, o domínio variável único de imunoglobulinacom especificidade de ligação para EGFR pode compreender uma seqüênciade aminoácido que tem pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüênciade aminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado dogrupo que consiste de DOivII6-17 (SEQ ID NO: 325), DOIvIi6-18 (SEQ IDNO: 326), DOM16-19 (SEQ ID NO: 327), DOM16-20 (SEQ ID NO: 328),DOM 16-21 (SEQ ID NO: 329), DOM16-22 (SEQ ID NO: 330), DOM16-23(SEQ ID NO: 331), DOM16-24 (SEQ ID NO: 332), DOM16-25 (SEQ IDNO: 333), DOMl6-26 (SEQ ID NO: 334), DOMl6-27 (SEQ ID NO: 335),DOMl6-28 (SEQ ID NO: 336), DOM16-29 (SEQ ID NO: 337), DOM16-30(SEQ ID NO: 338), DOM16-31 (SEQ ID NO: 339), DOM16-32 (SEQ ID™ NO: 340), DOMl6-33 (SEQ ID NO: 341), DOM16-35 (SEQ ID NO: 342),DOM 16-37 (SEQ ID NO: 343), DOM16-38 (SEQ ID NO: 344), DOM16-39(SEQ ID NO: 345), DOM16-40 (SEQ ID NO: 346), DOM16-41 (SEQ IDNO: 347), DOMl6-42 (SEQ ID NO: 348), DOMl6-43 (SEQ ID NO: 349),DOMl6-44 (SEQ ID NO: 350), DOM16-45 (SEQ ID NO: 351), DOM16-46(SEQ ID NO: 352), DOM16-47 (SEQ ID NO: 353), DOM16-48 (SEQ IDNO: 354), DOM16-49 (SEQ ID NO: 355), DOM16-50 (SEQ ID NO: 356),DOMI6-59 (SEQ ID NO: 357), DOMI6-6O (SEQ ID NO: 358), DOM16-61(SEQ ID NO: 359), DOM16-62 (SEQ ID NO: 360), DOM16-63 (SEQ IDNO: 361), DOM 16-64 (SEQ ID NO: 362), DOM16-65 (SEQ ID NO: 363),DOMl6-66 (SEQ ID NO: 364), DOMl6-67 (SEQ ID NO: 365), DOM16-68(SEQ ID NO: 366), DOM16-69 (SEQ ID NO: 367), DOM16-70 (SEQ IDNO: 368), DOM16-71 (SEQ ID NO: 369), DOM16-72 (SEQ ID NO: 370),DOM 16-73 (SEQ ID NO: 371), DOM16-74 (SEQ ID NO: 372), DOM16-75(SEQ ID NO: 373), DOM16-76 (SEQ ID NO: 374), DOM16-77 (SEQ IDNO: 375), DOMl6-78 (SEQ ID NO: 376), DOMl6-79 (SEQ ID NO: 377),DOM 16-80 (SEQ ID NO: 378), DOM16-81 (SEQ ID NO: 379), DOM16-82(SEQ ID NO: 380), DOM 16-83 (SEQ ID NO: 381), DOMl6-84 (SEQ IDNO: 382), DOM16-85 (SEQ ID NO: 383), DOM16-87 (SEQ ID NO: 384),DOMl6-88 (SEQ ID NO: 385), DOM16-89 (SEQ ID NO: 386), DOM16-90(SEQ ID NO: 387), DOM16-91 (SEQ ID NO: 388), DOM16-92 (SEQ IDNO: 389), DOM16-94 (SEQ ID NO: 390), DOM16-95 (SEQ ID NO: 391),DOM 16-96 (SEQ ID NO: 392), DOM16-97 (SEQ ID NO: 393), DOM1Ó-98(SEQ ID NO: 394), DOM16-99 (SEQ ID NO: 395), DOMI6-IOO (SEQ IDNO: 396), DOMI6-IOI (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398),DOM 16-103 (SEQ ID NO: 399), DOM16-104 (SEQ ID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO: 401), DOMI6-IO6 (SEQ ID NO: 402), DOM16-107 (SEQID NO: 403), DOMl6-108 (SEQ ID NO: 404), DOMl6-109 (SEQ ID NO:405), DOM16-HO (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407),DOM16-112 (SEQ ID NO: 408), DOM16-113 (SEQ ID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO: 410), DOMl6-115 (SEQ ID NO: 411), DOMl6-116 (SEQID NO: 412), DOM16-117 (SEQ ID NO: 413), DOM16-118 (SEQ ID NO:414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416),DOMl6-39-8 (SEQ ID NO: 417), DOM16-39-34 (SEQ ID NO: 418),DOMl6-39-48 (SEQ ID NO: 419), DOM16-39-87 (SEQ ID NO: 420),DOMl6-39-90 (SEQ ID NO: 421), DOM16-39-96 (SEQ ID NO: 422),DOM 16-39-100 (SEQ ID NO: 423), DOM16-39-101 (SEQ ID NO: 424),DOM 16-39-102 (SEQ ID NO: 425), DQM16-39-103 (SEQ ID NO: 426),(SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQ ID NO: 453), NB4(SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ ID NO: 455), NBo (SEQ ID NO: 456), NB7(SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQ ID NO: 459), NBlO(SEQ ID NO: 460), NBll (SEQ ID NO: 461), NB12 (SEQ ID NO: 462),NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14 (SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQ ID NO:465), NB16 (SEQ ID NO: 466), NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18 (SEQ IDNO: 468), NB19 (SEQ ID NO: 469), NB20 (SEQ ID NO: 470), NB21 (SEQID NO: 471) eNB22 (SEQ ID NO: 472).
Em algumas formas de realização, o ligando temespecificidade de ligação para VEGF e para EGFR e compreende pelo menosum domínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligaçãopara VEGF e pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR, em que um domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF compete quanto àligação ao VEGF com um anticorpo de domínio anti-VEGF (dAb)selecionado do grupo que consiste de TARl5-1 (SEQ ID NO: 100), TARl5-3(SEQ ID NO: 101), TARl 5-4 (SEQ ID NO: 102), TARl 5-9 (SEQ ID NO:(SEQ ID NO: 427), DOM16-39-105 (SEQ ID NO: 428),(SEQ ID NO: 429), DOMl6-39-107 (SEQ ID NO: 430),(SEQ ID NO: 431), DOM16-39-109 (SEQ ID NO: 432),(SEQ ID NO: 433), DOM16-39-111 (SEQ ID NO: 434),(SEQ ID NO: 435), DOM16-39-113 (SEQ ID NO: 436),(SEQ ID NO: 437), DOM16-39-115 (SEQ ID NO: 438),(SEQ ID NO: 439), DOM16-39-117 (SEQ ID NO: 440),(SEQ ID NO: 441), DOM16-39-201 (SEQ ID NO: 442),(SEQ ID NO: 443), DOMl6-39-203 (SEQ ID NO: 444),(SEQ ID NO: 445), DOM16-39-205 (SEQ ID NO: 446),(SEQ ID NO: 447), DOMl6-39-207 (SEQ ID NO: 448),(SEQ ID NO: 449), DOMl6-52 (SEQ ID NO: 450), NBl103), TARl5-10 (SEQ ID NO: 104), TARl5-11 (SEQ ID NO: 105), TARl 5-12 (SEQ ID NO: 106), TAR15-13 (SEQ ID NO: 107), TARl5-14 (SEQ IDNO: 108), TAR15-15 (SEQ ID NO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO: 110),TARl5-17 (SEQ ID NO: 111), TAR15-18 (SEQ ID NO: 112), TAR15-19(SEQ ID NO: 113), TARl5-20 (SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ ID NO:115), TARl5-5 (SEQ ID NO: 116), TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-7(SEQ ID NO: 118), TAR15-8 (SEQ ID NO: 119), TAR15-23 (SEQ ID NO:120), TAR15-24 (SEQ ID NO: 121), TAR15-25 (SEQ ID NO: 122), TAR15-26 (SEQ ID NO: 123), TARl 5-27 (SEQ ID NO: 124), TARl 5-29 (SEQ IDNO: 125), TAR15-30 (SEQ ID NO: 126), TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 127),TARl 5-6-501 (SEQ ID NO: 128), TAR15-6-502 (SEQ ID NO: 129), TAR15-6-503 (SEQ ID NO: 130), TARl5-6-504 (SEQ ID NO: 131), TARl 5-6-505(SEQ ID NO: 132), TAR15-6-506 (SEQ ID NO: 133), TAR15-6-507 (SEQTD NO: 134), TAR15-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO:136), TARl5-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQ ID NO: 138),TAR15-8-501 (SEQ ID NO: 139), TARl 5-8-502 (SEQ ID NO: 140), TARl5-8-503 (SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506(SEQ ID NO: 143), TARl5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TARl5-8-508 (SEQID NO: 145), TAR15-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO:147), TARl 5-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQ ID NO: 149),TARl 5-26-501 (SEQ ID NO: 150), TARl 5-26-502 (SEQ ID NO: 151),TARl 5-26-503 (SEQ ID NO: 152), TARl 5-26-504 (SEQ ID NO: 153),TARl 5-26-505 (SEQ ID NO: 154), TARl 5-26-506 (SEQ ID NO: 155),TARl 5-26-507 (SEQ ID NO: 156), TARl 5-26-508 (SEQ ID NO: 157),TARl 5-26-509 (SEQ ID NO: 158), TARl 5-26-510 (SEQ ID NO: 159),TARl 5-26-511 (SEQ ID NO: 160), TARl 5-26-512 (SEQ ID NO: 161),TARl 5-26-513 (SEQ ID NO: 162), TARl 5-26-514 (SEQ ID NO: 163),TARl 5-26-515 (SEQ ID NO: 164), TARl 5-26-516 (SEQ ID NO: 165),TARl 5-26-517 (SEQ ID NO: 166), TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167),TARl 5-26-519 (SEQ ID NO: 168), TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169) TARl 5-26-521 (SEQ ID NO: 170), TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171) TARl 5-26-523 (SEQ ID NO: 172), TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173) TARl 5-26-525 (SEQ ID NO: 174), TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175) TARl 5-26-527 (SEQ ID NO: 176), TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177) TARl 5-26-529 (SEQ ID NO: 178), TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179) TARl 5-26-531 (SEQ ID NO: 180), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181) TARl 5-26-533 (SEQ ID NO: 182), TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183) TARl 5-26-535 (SEQ ID NO: 184), TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185) TARl 5-26-537 (SEQ ID NO: 186), TARl 5-26-538 (SEQ ID NO: 187) TARl 5-26-539 (SEQ ID NO: 188), TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189) TARl 5-26-541 (SEQ ID NO: 190), TARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191) TARl 5-26-543 (SEQ ID NO: 192), TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 193) TARl 5-26-545 (SEQ ID NO: 194), TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195) TARl 5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TARl 5-26-548 (SEQ ID NO: 197) TARl5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TAR15-26-550 (SEQ ID NO: 539) e TARl 5-26-551 (SEQ ID NO: 540); e em que um domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para EGFR compete quanto àligação ao EGFR com um anticorpo de domínio anti-EGFR (dAb)selecionado do grupo que consiste de DOM16-17 (SEQ ID NO: 325),DOMl6-18 (SEQ ID NO: 326), DOM16-19 (SEQ ID NO: 327), DOM16-20(SEQ ID NO: 328), DOM16-21 (SEQ ID NO: 329), DOM16-22 (SEQ IDNO: 330), DOM 16-23 (SEQ ID NO: 331), DOM16-24 (SEQ ID NO: 332),DOMl6-25 (SEQ ID NO: 333), DOMl6-26 (SEQ ID NO: 334), DOMl6-2725 (SEQ ID NO: 335), DOM16-28 (SEQ ID NO: 336), DOM16-29 (SEQ IDNO: 337), DOM16-30 (SEQ ID NO: 338), DOM16-31 (SEQ ID NO: 339),DOMl6-32 (SEQ ID NO: 340), DOMl6-33 (SEQ ID NO: 341), DOMl6-35(SEQ ID NO: 342), DOM16-37 (SEQ ID NO: 343), DOM16-38 (SEQ IDNO: 344), DOMl6-39 (SEQ ID NO: 345), DOMl6-40 (SEQ ID NO: 346),DOM 16-41 (SEQ ID NO: 347), DOM16-42 (SEQ ID NO: 348), DOM16-43(SEQ ID NO: 349), DOM16-44 (SEQ ID NO: 350), DOM16-45 (SEQ IDNO: 351), DOM 16-46 (SEQ ID NO: 352), DOM16-47 (SEQ ID NO: 353),DOM 16-48 (SEQ ID NO: 354), DOM16-49 (SEQ ID NO: 355), DOM16-50(SEQ ID NO: 356), DOM16-59 (SEQ ID NO: 357), DOMI6-6O (SEQ IDNO: 358), DOM16-61 (SEQ ID NO: 359), DOM16-62 (SEQ ID NO: 360),DOM 16-63 (SEQ ID NO: 361), DOM16-64 (SEQ ID NO: 362), DOM16-65(SEQ ID NO: 363), DOM16-66 (SEQ ID NO: 364), DOM16-67 (SEQ IDNO: 365), DOMl6-68 (SEQ ID NO: 366), DOMl6-69 (SEQ ID NO: 367),DOMl6-70 (SEQ ID NO: 368), DOM16-71 (SEQ ID NO: 369), DOM16-72I (SEQ ID NO: 370), DOM16-73 (SEQ ID NO: 371), DOM16-74 (SEQ IDNO: 372), DOM16-75 (SEQ ID NO: 373), DOM16-76 (SEQ ID NO: 374),DOM 16-77 (SEQ ID NO: 375), DOM16-78 (SEQ ID NO: 376), DOM16-79(SEQ ID NO: 377), DOMl6=80 (SEQ ID NO: 378), DOMl6-81 (SEQ IDNO: 379), DOM16-82 (SEQ ID NO: 380), DOM16-83 (SEQ ID NO: 381),DOM 16-84 (SEQ ID NO: 382), DOM16-85 (SEQ ID NO: 383), DOM16-87(SEQ ID NO: 384), DOM16-88 (SEQ ID NO: 385), DOM16-89 (SEQ IDNO: 386), DOM16-90 (SEQ ID NO: 387), DOM16-91 (SEQ ID NO: 388),DOM 16-92 (SEQ ID NO: 389), DOM16-94 (SEQ ID NO: 390), DOM16-95(SEQ ID NO: 391), DOM16-96 (SEQ ID NO: 392), DOM16-97 (SEQ IDNO: 393), DOM16-98 (SEQ ID NO: 394), DOM16-99 (SEQ ID NO: 395),DOM 16-100 (SEQ ID NO: 396), DOMIÓ-lOl (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398), DOM16-103 (SEQ ID NO: 399), DOM16-104 (SEQID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO: 401), DOMI6-IO6 (SEQ ID NO:402), DOM 16-107 (SEQ ID NO: 403), DOMI6-IO8 (SEQ ID NO: 404),DOM 16-109 (SEQ ID NO: 405), DOM16-HO (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407), DOM16-112 (SEQ ID NO: 408), DOM16-113 (SEQID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO: 410), DOM16-115 (SEQ ID NO:411), DOMl6-116 (SEQ ID NO: 412), DOM16-117 (SEQ ID NO: 413),DOM16-118 (SEQ ID NO: 414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416), DOM16-39-8 (SEQ ID NO: 417), DOM16-39-34(SEQ ID NO: 418), DOMl6-39-48 (SEQ ID NO: 419), DOMl6-39-87 (SEQID NO: 420), DOM16-39-90 (SEQ ID NO: 421), DOM16-39-96 (SEQ IDNO: 422), DOM16-39-100 (SEQ ID NO: 423), DOM16-39-101 (SEQ IDNO: 424), DOM16-39-102 (SEQ ID NO: 425)NO: 426), DOM16-39-104 (SEQ ID NO: 427)NO: 428), DOMl6-39-106 (SEQ ID NO: 429)NO: 430), DOM 16-39-108 (SEQ ID NO: 431)NO: 432), DOM16-39-HO (SEQ ID NO: 433)NO: 434), DOM16-39-112 (SEQ ID NO: 435)NO: 436), DOM16-39-114 (SEQ ID NO: 437)NO: 438), DOM16-39-116 (SEQ ID NO: 439)NO: 440), DOM 16-39-200 (SEQ ID NO: 441)DOM 16-39-103 (SEQ IDDOM 16-39-105 (SEQ IDDOMl6-39-107 (SEQ IDDOMl6-39-109 (SEQ IDDOM 16-3 9-111 (SEQ IDDOM16-39-113 (SEQ IDDOM16-39-115 (SEQ IDDOM 16-3 9-117 (SEQ IDDOM 16-3 9-201 (SEQ IDDOMl6-39-203 (SEQ IDDOM 16-39-205 (SEQ IDDOMl6-39-207 (SEQ IDNO: 442), DOM16-39-202 (SEQ ID NO: 443)NO: 444), DOM16-39-204 (SEQ ID NO: 445)NO: 446), DOM16-39-206 (SEQ ID NO: 447)NO: 448), DOMl6-39-209 (SEQ ID NO: 449), DOMl6-52 (SEQ ID NO450), NBl (SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQ ID NO453), NB4 (SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ ID NO: 455), NB6 (SEQ ID NO456), NB7 (SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQ ID NO459), NBlO (SEQ ID NO: 460), NBll (SEQ ID NO: 461), NB12 (SEQ IDNO: 462), NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14 (SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQID NO: 465), NB16 (SEQ ID NO: 466), NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18(SEQ ID NO: 468), NB19 (SEQ ID NO: 469), NB20 (SEQ ID NO: 470),NB21 (SEQ ID NO: 471) e NB22 (SEQ ID NO: 472).
Por exemplo, o ligando pode compreender um domíniovariável único de imunoglobulina com especificidade de ligação para VEGFque compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos cerca de85% de identidade de seqüência de aminoácido com a seqüência deaminoácido de um dAb selecionado do grupo que consiste de TARl5-1 (SEQID NO: 100), TAR15-3 (SEQ ID NO: 101), TAR15-4 (SEQ ID NO: 102),TARl5-9 (SEQ ID NO: 103), TAR15-10 (SEQ ID NO: 104), TAR15-11(SEQ ID NO: 105), TAR15-12 (SEQ ID NO: 106), TAR15-13 (SEQ ID NO:107), TARl5-14 (SEQ ID NO: 108), TARl 5-15 (SEQ ID NO: 109), TARl 5-16 (SEQ ID NO: 110), TARl 5-17 (SEQ ID NO: 111), TARI5-18 (SEQ IDNO: 112), TAR15-19 (SEQ ID NO: 113), TAR15-20 (SEQ ID NO: 114),TAR 15-22 (SEQ ID NO: 115), TARl5-5 (SEQ ID NO: 116), TARl5-6(SEQ ID NO: 117), TARl 5-7 (SEQ ID NO: 118), TARl 5-8 (SEQ ID NO: 1) 19), TAR15-23 (SEQ ID NO: 120), TAR15-24 (SEQ ID NO: 121), TAR15-(SEQ ID NO: 122), TARI5-26 (SEQ ID NO: 123), TAR15-27 (SEQ IDNO: 124), TARl 5-29 (SEQ ID NO: 125), TARl 5-30 (SEQ ID NO: 126),TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 127), TAR15-6-501 (SEQ ID NO: 128), TARl 5-6-502 (SEQ ID NO: 129), TAR15-6-503 (SEQ ID NO: 130), TAR15-6-504(SEQ ID NO: 131), TAR15-6-505 (SEQ ID NO: 132), TAR15-6-506 (SEQID NO: 133), TAR15-6-507 (SEQ ID NO: 134), TAR15-6-508 (SEQ ID NO:135), TARl5-6-509 (SEQ ID NO: 136), TAR15-6-510 (SEQ ID NO: 137),TARl5-8-500 (SEQ ID NO: 138), TAR15-8-501 (SEQ ID NO: 139), TAR15-8-502 (SEQ ID NO: 140), TAR15-8-503 (SEQ ID NO: 141), TARI5-8-505(SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506 (SEQ ID NO: 143), TAR15-8-507 (SEQID NO: 144), TAR15-8-508 (SEQ ID NO: 145), TAR15-8-509 (SEQ ID NO:146), TARl5-8-510 (SEQ ID NO: 147), TAR15-8-511 (SEQ ID NO: 148),TARl5-26-500 (SEQ ID NO: 149), TARI5-26-501 (SEQ ID NO: 150),TARl5-26-502 (SEQ ID NO: 151), TARl5-26-503 (SEQ ID NO: 152),TARl5-26-504 (SEQ ID NO: 153), TARl5-26-505 (SEQ ID NO: 154),TARl5-26-506 (SEQ ID NO: 155), TARl5-26-507 (SEQ ID NO: 156),TARl5-26-508 (SEQ ID NO: 157), TAR15-26-509 (SEQ ID NO: 158),TARl5-26-510 (SEQ ID NO: 159), TARI5-26-511 (SEQ ID NO: 160),TARl 5-26-512 (SEQ ID NO: 161), TARl5-26-513 (SEQ ID NO: 162),TARl 5-26-514 (SEQ ID NO: 163), TARl5-26-515 (SEQ ID NO: 164),TARI5-26-516 (SEQ ID NO: 165), TARl 5-26-517 (SEQ ID NO: 166),TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167), TARl5-26-519 (SEQ ID NO: 168),TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169), TARl 5-26-521 (SEQ ID NO: 170),TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171), TARl 5-26-523 (SEQ ID NO: 172),TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173), TARl5-26-525 (SEQ ID NO: 174),TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175), TARl5-26-527 (SEQ ID NO: 176),TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177), TARl5-26-529 (SEQ ID NO: 178),TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179), TARl5-26-531 (SEQ ID NO: 180),TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181), TARI5-26-533 (SEQ ID NO: 182),TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183), TARl5-26-535 (SEQ ID NO: 184),TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185), TAR15-26-537 (SEQ ID NO: 186),TAR15-26-538 (SEQ ID \ιη· 187), TAR.15-26-539 /ΌΤ7/Λ Tirv IJL/ X T/~v . inw: 1 o o \ iôõ),TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189), TARl 5-26-541 (SEQ ID NO: 190),TARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191), TARl 5-26-543 (SEQ ID NO: 192),TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 193), TARl 5-26-545 (SEQ ID NO: 194),TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195), TARl 5-26-547 (SEQ ID NO: 196),TARl 5-26-548 (SEQ ID NO: 197), TARl 5-26-549 (SEQ ID NO: 198),TARl 5-26-550 (SEQ ID NO: 539) e TARl5-26-551 (SEQ ID NO: 540); e
compreende ainda um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR que compreende uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência deaminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado do grupoque consiste de DOMl6-17 (SEQ ID NO: 325), DOMl6-18 (SEQ ID NO:326), DOMl6-19 (SEQ ID NO: 327), DOM16-20 (SEQ ID NO: 328),DOM 16-21 (SEQ ID NO: 329), DOM16-22 (SEQ ID NO: 330), DOM16-23(SEQ ID NO: 331), DOM16-24 (SEQ ID NO: 332), DOM16-25 (SEQ IDNO: 333), DOM16-26 (SEQ ID NO: 334), DOM16-27 (SEQ ID NO: 335),DOM16-28 (SEQ ID NO: 336), DOM16-29 (SEQ ID NO: 337), DOM16-30(SEQ ID NO: 338), DOM16-31 (SEQ ID NO: 339), DOM16-32 (SEQ IDNO: 340), DOM 16-33 (SEQ ID NO: 341), DOM16-35 (SEQ ID NO: 342),DOM 16-37 (SEQ ID NO: 343), DOM16-38 (SEQ ID NO: 344), DOM16-39(SEQ ID NO: 345), DOM16-4Í) (SEQ ID NO: 346), DOM16-41 (SEQ IDNO: 347), DOM16-42 (SEQ ID NO: 348), DOM16-43 (SEQ ID NO: 349),DOM 16-44 (SEQ ID NO: 350), DOM16-45 (SEQ ID NO: 351), DOM16-46(SEQ ID NO: 352), DOM16-47 (SEQ ID NO: 353), DOM16-48 (SEQ IDNO: 354), DOM16-49 (SEQ ID NO: 355), DOM16-50 (SEQ ID NO: 356),DOMl6-59 (SEQ ID NO: 357), DOMI6-6O (SEQ ID NO: 358), DOM16-61(SEQ ID NO: 359), DOM16-62 (SEQ ID NO: 360), DOM16-63 (SEQ IDNO: 361), DOM 16-64 (SEQ ID NO: 362), DOM16-65 (SEQ ID NO: 363),DOMl6-66 (SEQ ID NO: 364), DOMl6-67 (SEQ ID NO: 365), DOMl6-68(SEQ TD NO: 366), DOM16-69 (SEQ ID NO: 367), DOM16-7Í) (SEQ IDNO: 368), DOM16-71 (SEQ ID NO: 369), DOM16-72 (SEQ ID NO: 370),DOM 16-73 (SEQ ID NO: 371), DOM16-74 (SEQ ID NO: 372), DOM16-75(SEQ ID NO: 373), DOM16-76 (SEQ ID NO: 374), DOM16-77 (SEQ IDNO: 375), DOM16-78 (SEQ ID NO: 376), DOM16-79 (SEQ ID NO: 377),DOMl6-80 (SEQ ID NO: 378), DOM16-81 (SEQ ID NO: 379), DOM16-82(SEQ ID NO: 380), DOM16-83 (SEQ ID NO: 381), DOM16-84 (SEQ IDNO: 382), DOM16-85 (SEQ ID NO: 383), DOM16-87 (SEQ ID NO: 384),DOMl6-88 (SEQ ID NO: 385), DOM16-89 (SEQ ID NO: 386), DOM16-90(SEQ ID NO: 387), DOM16-91 (SEQ ID NO: 388), DOM16-92 (SEQ IDNO: 389), DOM16-94 (SEQ ID NO: 390), DOM16-95 (SEQ ID NO: 391),DOM 16-96 (SEQ ID NO: 392), DOM16-97 (SEQ ID NO: 393), DOM16-98(SEQ ID NO: 394), DOM16-99 (SEQ ID NO: 395), DOMló-lOO (SEQ IDNO: 396), DOMI6-IOI (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398),DOM 16-103 (SEQ ID NO: 399), DOM16-104 (SEQ ID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO: 401), DQM16-106 (SEQ ID NO: 402), DOM16-1Q7 (SEQID NO: 403), DOMl6-108 (SEQ ID NO: 404), DOMl6-109 (SEQ ID NO:405), DOMló-llO (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407),DOMl6-112 (SEQ ID NO: 408), DOM16-113 (SEQ ID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO: 410), DOM 16-115 (SEQ ID NO: 411), DOM 16-116 (SEQID NO: 412), DOM16-117 (SEQ ID NO: 413), DOMI6-118 (SEQ ID NO414), DOMl6-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416)DOMl6-39-8 (SEQ ID NO: 417), DOMl6-39-34 (SEQ ID NO: 418)DOMl6-39-48 (SEQ ID NO: 419), DOM16-39-87 (SEQ ID NO: 420)DOMl6-39-90 (SEQ ID NO: 421), DOM16-39-96 (SEQ ID NO: 422)DOMl6-39-100 (SEQ ID NO: 423)DOMl6-39-102 (SEQ ID NO: 425)DOMl6-39-104 (SEQ ID NO: 427)DOMl6-39-106 (SEQ ID NO: 429)DOMl6-39-108 (SEQ ID NO: 431)DOMl6-39-110 (SEQ ID NO: 433)DOM16-39-112 (SEQ ID NO: 435)DOMl6-39-114 (SEQ ID NO: 437)DOM 16-39-116 (SEQ ID NO: 439)DOM 16-39-200 (SEQ ID NO: 441)DOMl 6-39-202 (SEQ ID NO: 443)DOMl6-39-204 (SEQ ID NO: 445)DOMl6-39-206 (SEQ ID NO: 447)DOMl6-39-1 Ol (SEQ ID NO: 424)DOM 16-39-103 (SEQ ID NO: 426)DOMl6-39-105 (SEQ ID NO: 428)DOMl6-39-107 (SEQ ID NO: 430)DOM16-39-109 (SEQ ID NO: 432)DOM16-39-111 (SEQ ID NO: 434)DOM16-39-113 (SEQ ID NO: 436)DOMl6-39-115 (SEQ ID NO: 438)DOM16-39-117 (SEQ ID NO: 440)DOMl6-39-201 (SEQ ID NO: 442)DOM 16-39-203 (SEQ ID NO: 444)DOM 16-39-205 (SEQ ID NO: 446)DOM 16-39-207 (SEQ ID NO: 448)DOMl6-39-209 (SEQ ID NO: 449), DOM16-52 (SEQ ID NO: 450), NBl(SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQ ID NO: 453), NB4(SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ ID NO: 455), NB6 (SEQ ID NO: 456), NB7(SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQ ID NO: 459), NBlO(SEQ ID NO: 460), NBll (SEQ ID NO: 461), NB12 (SEQ ID NO: 462),NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14 (SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQ ID NO:465), NB16 (SEQ ID NO: 466), NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18 (SEQ IDNO: 468), NB19 (SEQ ID NO: 469), NB20 (SEQ ID NO: 470), NB21 (SEQID NO: 471) e NB22 (SEQ ID NO: 472).
Em algumas formas de realização, o ligando temespecificidade de ligação para VEGF e para EGFR e compreende pelo menosum domínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligaçãopara VEGF e pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR, em que um domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF compete quanto àligação ao VEGF com um anticorpo de domínio anti-VEGF (dAb)selecionado do grupo que consiste de TARl 5-1 (SEQ ID NO: 100), TARl5-3(SEQ ID NO: 101), TAR15-4 (SEQ ID NO: 102), TAR15-9 (SEQ ID NO:103), TARl5-10 (SEQ ID NO: 104), TARl5-11 (SEQ ID NO: 105), TARl5-12 (SEQ ID NO: 106), TAR15-13 (SEQ ID NO: 107), TAR15-14 (SEQ IDNO: 108), TARl5-15 (SEQ ID NO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO: 110),TARl5-17 (SEQ ID NO: 111), TAR15-18 (SEQ ID NO: 112), TAR15-19(SEQ ID NO: 113), TARl 5-20 (SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ ID NO:115), TARl5-5 (SEQ ID NO: 116), TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-7(SEQ ID NO: 118), TAR15-8 (SEQ ID NO: 119), TAR15-23 (SEQ ID NO:120), TAR15-24 (SEQ ID NO: 121), TAR15-25 (SEQ ID NO: 122), TAR15-26 (SEQ ID NO: 123), TAR15-27 (SEQ ID NO: 124), TAR15-29 (SEQ IDNO: 125), TARl5-30 (SEQ ID NO: 126), TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 127),TARl5-6-501 (SEQ ID NO: 128), TARl5-6-502 (SEQ ID NO: 129), TARl 5-6-503 (SEQ ID NO: 130), TARl5-6-504 (SEQ ID NO: 131), TARl5-6-505(SEQ ID NO: 132), TARl 5-6-506 (SEQ ID NO: 133), TARl5-6-507 (SEQID NO: 134), TAR15-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO:136), TAR15-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQ ID NO: 138),TAR15-8-501 (SEQ ID NO: 139), TAR15-8-502 (SEQ ID NO: 140), TAR15-8-503 (SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506(SEQ ID NO: 143), TARl5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TARl5-8-508 (SEQID NO: 145), TAR15-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO:147), TARl5-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQ ID NO: 149),
TARl5-26-501 (SEQ ID NO: 150), TARl 5-26-502 (SEQ ID NO: 151) TARl5-26-503 (SEQ ID NO: 152), TARl 5-26-504 (SEQ ID NO: 153) TARl5-26-505 (SEQ ID NO: 154), TARl 5-26-506 (SEQ ID NO: 155) TARl5-26-507 (SEQ ID NO: 156), TARl 5-26-508 (SEQ ID NO: 157) TARl5-26-509 (SEQ ID NO: 158), TARl 5-26-510 (SEQ ID NO: 159) TARl5-26-511 (SEQ ID NO: 160), TARl 5-26-512 (SEQ ID NO: 161) TARl5-26-513 (SEQ ID NO: 162), TARl 5-26-514 (SEQ ID NO: 163) TARl5-26-515 (SEQ ID NO: 164), TARl 5-26-516 (SEQ ID NO: 165) TARl5-26-517 (SEQ ID NO: 166), TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167) TARl5-26-519 (SEQ ID NO: 168), TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169) TARl5-26-521 (SEQ ID NO: 170), TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171) TARl5-26-523 (SEQ ID NO: 172) TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173) TARl5-26-525 (SEQ ID NO: 174),, TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175) TARl5-26-527 (SEQ ID NO: 176), TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177) TARl5-26-529 (SEQ ID NO: 178), TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179) TARl5-26-531 (SEQ ID NO: 180), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181) TARl5-26-533 (SEQ ID NO: 182), TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183) TARl5-26-535 (SEQ ID NO: 184), TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185) TARl5-26-537 (SEQ ID NO: 186), TARl 5-26-538 (SEQ ID NO: 187) TARl5-26-539 (SEQ ID NO: 188), TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189) TARl5-26-541 (SEQ ID NO: 190), TARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191) TARl5-26-543 (SEQ ID NO: 192), TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 193) TARl5-26-545 (SEQ ID NO: 194), TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195) TARl5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TARl 5-26-548 (SEQ ID NO: 197)
TARl5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TAR15-26-550 (SEQ ID NO: 539) eTARl5-26-551 (SEQ ID NO: 540); e um domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para EGFR compete quanto àligação ao EGFR com cetuximab.
Por exemplo, o domínio variável único de imunoglobulinacom especificidade de ligação para VEGF pode compreender uma seqüênciade aminoácido que tem pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüênciade aminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado dogrupo que consiste de TARl 5-1 (SEQ ID NO: 100), TARl 5-3 (SEQ ID NO:101), TARl 5-4 (SEQ ID NO: 102), TAR15-9 (SEQ ID NO: 103), TAR15-10(SEQ ID NO: 104), TARl5-11 (SEQ ID NO: 105), TAR15-12 (SEQ ID NO:106), TAR15-13 (SEQ ID NO: 107), TAR15-14 (SEQ ID NO: 108), TAR15-15 (SEQ ID NO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO: 110), TAR15-17 (SEQ IDNO: 111), TAR15-18 (SEQ ID NO: 112), TAR15-19 (SEQ ID NO: 113),TAR15-20 (SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ ID NO: 115), TAR15-5(SEQ ID NO: 116), TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-7 (SEQ ID NO:118), TARl5-8 (SEQ ID NO: 119), TARl5-23 (SEQ ID NO: 120), TARI5-24 (SEQ ID NO: 121), TAR15-25 (SEQ ID NO: 122), TAR15-26 (SEQ IDNO: 123), TARl5-27 (SEQ ID NO: 124), TARl5-29 (SEQ ID NO: 125),TARl5-30 (SEQ ID NO: 126), TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 127), TAR15-6-501 (SEQ ID NO: 128), TAR15-6-502 (SEQ ID NO: 129), TAR15-6-503(SEQ ID NO: 130), TAR15-6-504 (SEQ ID NO: 131), TAR15-6-505 (SEQID NO: 132), TARl5-6-506 (SEQ ID NO: 133), TARl5-6-507 (SEQ ID NO:134), TARl5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO: 136),TARl 5-6-510 (SEQ ID NO: 137), TARl 5-8-500 (SEQ ID NO: 138), TARl 5-8-501 (SEQ ID NO: 139), TARl5-8-502 (SEQ ID NO: 140), TARl5-8-503(SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506 (SEQID NO: 143), TAR15-8-507 (SEQ ID NO: 144), TAR15-8-508 (SEQ ID NO:145), TAR15-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO: 147),TARl5-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQ ID NO: 149),TARl5-26-501 (SEQ ID NO: 150), TARl5-26-502 (SEQ ID NO: 151),TARl 5-26-503 (SEQ ID NO: 152), TARl5-26-504 (SEQ ID NO: 153),TARl 5-26-505 (SEQ ID NO: 154), TARl 5-26-506 (SEQ ID NO: 155),TARl 5-26-507 (SEQ ID NO: 156), TARl 5-26-508 (SEQ ID NO: 157),TARl 5-26-509 (SEQ ID NO: 158), TARl 5-26-510 (SEQ ID NO: 159),TARl 5-26-511 (SEQ ID NO: 160), TARl 5-26-512 (SEQ ID NO: 161),TARl 5-26-513 (SEQ ID NO: 162), TARl 5-26-514 (SEQ ID NO: 163),TARl 5-26-515 (SEQ ID NO: 164), TARl 5-26-516 (SEQ ID NO: 165),TARl 5-26-517 (SEQ ID NO: 166), TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167),TARl 5-26-519 (SEQ ID NO: 168), TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169),TARl 5-26-521 (SEQ ID NO: 170), TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171),TARl 5-26-523 (SEQ ID NO: 172), TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173),TARl 5-26-525 (SEQ ID NO: 174), TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175),TARl 5-26-527 (SEQ ID NO: 176), TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177),TARl 5-26-529 (SEQ ID NO: 178), TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179),TARl 5-26-531 CQpn ι ID vrrv JL > V>». 1 ΟΛ\ 1 O\J ), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181),TARl 5-26-533 (SEQ ID NO: 182), TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183),TARl 5-26-535 (SEQ ID NO: 184), TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185),TARl 5-26-537 (SEQ ID NO: 186), TARl 5-26-538 (SEQ ID NO: 187),TARl 5-26-539 (SEQ ID NO: 188), TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189),TARl 5-26-541 (SEQ ID NO: 190), TARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191),TARl 5-26-543 (SEQ ID NO: 192), TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 193),TARl 5-26-545 (SEQ ID NO: 194), TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195),TARl 5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TARI5-26-548 (SEQ ID NO: 197),TARl 5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TARl5-26-550 (SEQ ID NO: 539) e TARl5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
Em outras formas de realização, o ligando tem especificidadede ligação para VEGF e para EGFR e compreende pelo menos um domíniovariável único de imunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF epelo menos um domínio variável único de imunoglobulina com especificidadede ligação para EGFR, em que um domínio variável único de imunoglobulinacom especificidade de ligação para VEGF compete quanto à ligação ao VEGFcom bevacizumab e/ou anticorpo 2C3 (Acesso do ATCC Ns PTA 1595); e umdomínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação paraEGFR compete quanto à ligação ao EGFR com um anticorpo de domínio anti-EGFR (dAb) selecionado do grupo que consiste de DOM 16-17 (SEQ ID NO:325), DOMl6-18 (SEQ ID NO: 326), DOM16-19 (SEQ ID NO: 327),DOM 16-20 (SEQ ID NO: 328), DOM16-21 (SEQ ID NO: 329), DOM16-22(SEQ ID NO: 330), DOM16-23 (SEQ ID NO: 331), DOM16-24 (SEQ IDNO: 332), DOM16-25 (SEQ ID NO: 333), DOM16-26 (SEQ ID NO: 334),DOM 16-27 (SEQ ID NO: 335), DOM16-28 (SEQ ID NO: 336), DOM16-29(SEQ ID NO: 337), DOM16-30 (SEQ ID NO: 338), DOM16-31 (SEQ IDNO: 339), DOM16-32 (SEQ ID NO: 340), DOM16-33 (SEQ ID NO: 341),DOM 16-35 (SEQ ID NO: 342), DOM16-37 (SEQ ID NO: 343), DOM16-38(SEQ ID NO: 344), DOMl6-39 (SEQ ID NO: 345), DOMl6-40 (SEQ IDNO: 346), DOM16-41 (SEQ ID NO: 347), DOM16-42 (SEQ ID NO: 348),DOM 16-43 (SEQ ID NO: 349), DOM16-44 (SEQ ID NO: 350), DOM16-45(SEQ ID NO: 351), DOMl6-46 (SEQ ID NO: 352), DOMl6-47 (SEQ IDNO: 353), DOM16-48 (SEQ ID NO: 354), DOM16-49 (SEQ ID NO: 355),DOM 16-50 (SEQ ID NO: 356), DOM16-59 (SEQ ID NO: 357), DOMI6-6O(SEQ ID NO: 358), DOM16-61 (SEQ ID NO: 359), DOM16-62 (SEQ IDNO: 360), DOMl6-63 (SEQ ID NO: 361), DOM16-64 (SEQ ID NO: 362),DOMl6-65 (SEQ ID NO: 363), DOM16-66 (SEQ ID NO: 364), DOM16-67(SEQ ID NO: 365), DOM16-68 (SEQ ID NO: 366), DOM16-69 (SEQ IDNO: 367), DOM16-70 (SEQ ID NO: 368), DOM16-71 (SEQ ID NO: 369),DOMl6-72 (SEQ ID NO: 370), DOM16-73 (SEQ ID NO: 371), DOM16-74(SEQ ID NO: 372), DOMl6-75 (SEQ ID NO: 373), DOM16-76 (SEQ IDNO: 374), DOM16-77 (SEQ ID NO: 375), DOM16-78 (SEQ ID NO: 376),DOMl6-79 (SEQ ID NO: 377), DOMl6-80 (SEQ ID NO: 378), DOMl6-81(SEQ ID NO: 379), DOM16-82 (SEQ ID NO: 380), DOM16-83 (SEQ IDNO: 381), DOMl6-84 (SEQ ID NO: 382), DOM16-85 (SEQ ID NO: 383),DOM 16-87 (SEQ ID NO: 384), DOMl6-88 (SEQ ID NO: 385), DOM16-89(SEQ ID NO: 386), DOM16-9Í) (SEQ ID NO: 387), DOM16-91 (SEQ IDNO: 388), DOMl6-92 (SEQ ID NO: 389), DOMl6-94 (SEQ ID NO: 390),DOM 16-95 (SEQ ID NO: 391), DOM16-96 (SEQ ID NO: 392), DOM16-97(SEQ ID NO: 393), DOM16-98 (SEQ ID NO: 394), DOM16-99 (SEQ IDNO: 395), DOMI6-IOO (SEQ ID NO: 396), DOM16-KH (SEQ ID NO: 397),DOM 16-102 (SEQ ID NO: 398), DOM16-103 (SEQ ID NO: 399), DOM16-104 (SEQ ID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO: 401), DOMI6-IO6 (SEQID NO: 402), DOM16-107 (SEQ ID NO: 403), DOMI6-IO8 (SEQ ID NO:404), DOM 16-109 (SEQ ID NO: 405), DOM16-HO (SEQ ID NO: 406),DOMl6-111 (SEQ ID NO: 407), DOM16-112 (SEQ ID NO: 408), DOM16-113 (SEQ ID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO: 410), DOM16-115 (SEQID NO: 411), DOMl6-116 (SEQ ID NO: 412), DOM16-117 (SEQ ID NO:413), DOM16-118 (SEQ ID NO: 414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415),DOM 16-39-6 (SEQ ID NO: 416), DOM16-39-8 (SEQ ID NO: 417), DOM16-39-34 (SEQ ID NO: 418), DOM16-39-48 (SEQ ID NO: 419), DOM16-39-87(SEQ ID NO: 420), DOMl6-39-90 (SEQ ID NO: 421), DOMl6-39-96 (SEQID NO: 422), DOM16-39-100 (SEQ ID NO: 423), DOM16-39-101 (SEQ IDNO: 424), DOM16-39-102 (SEQ ID NO: 425), DOM16-39-103 (SEQ IDNO: 426), DOMl6-39-104 (SEQ ID NO: 427), DOMl6-39-105 (SEQ IDNO: 428), DOM16-39-106 (SEQ ID NO: 429), DOM16-39-107 (SEQ IDNO: 430), DOMl6-39-108 (SEQ ID NO: 431), DOM16-39-109 (SEQ IDNO: 432), DOM16-39-HO (SEQ ID NO: 433), DOM16-39-111 (SEQ IDNO: 434), DOM16-39-112 (SEQ ID NO: 435), DOM16-39-113 (SEQ IDNO: 436), DOM16-39-114 (SEQ ID NO: 437), DOM16-39-115 (SEQ IDNO: 438), DOM16-39-116 (SEQ ID NO: 439), DOM16-39-117 (SEQ IDNO: 440), DOM16-39-200 (SEQ ID NO: 441), DOM16-39-201 (SEQ IDNO: 442), DOM16-39-2Q2 (SEQ ID NO: 443), DQM16-39-203 (SEQ IDNO: 444), DOM16-39-204 (SEQ ID NO: 445), DOM16-39-205 (SEQ IDNO: 446), DOMl6-39-206 (SEQ ID NO: 447), DOMl6-39-207 (SEQ IDNO: 448), DOMl6-39-209 (SEQ ID NO: 449), DOMl6-52 (SEQ ID NO:450), NBl (SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQ ID NO:453), NB4 (SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ ID NO: 455), NB6 (SEQ ID NO:456), NB7 (SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQ ID NO:459), NBlO (SEQ ID NO: 460), NBll (SEQ ID NO: 461), NB12 (SEQ IDNO: 462), NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14 (SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQID NO: 465), NB16 (SEQ ID NO: 466), NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18(SEQ ID NO: 468), NB19 (SEQ ID NO: 469), NB20 (SEQ ID NO: 470),NB21 (SEQ ID NO: 471) e NB22 (SEQ ID NO: 472).
Por exemplo, o domínio variável único de imunoglobulinacom especificidade de ligação para EGFR pode compreender uma seqüênciade aminoácido que tem pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüênciade aminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado dogrupo que consiste de DOMl6-17 (SEQ ID NO: 325), DOMl6-18 (SEQ IDNO: 326), DOM16-19 (SEQ ID NO: 327), DOM16-20 (SEQ ID NO: 328),DOM 16-21 (SEQ ID NO: 329), DOM16-22 (SEQ ID NO: 330), DOM16-23(SEQ ID NO: 331), DOM16-24 (SEQ ID NO: 332), DOM16-25 (SEQ IDNO: 333), DOM16-26 (SEQ ID NO: 334), DOM16-27 (SEQ ID NO: 335),DOMl6-28 (SEQ ID NO: 336), DOM16-29 (SEQ ID NO: 337), DOM16-30(SEQ ID NO: 338), DOMl6-31 (SEQ ID NO: 339), DOMI6-32 (SEQ ID NO:340), DOMl6-33 (SEQ ID NO: 341), DOMl6-35 (SEQ ID NO: 342),DOM 16-37 (SEQ ID NO: 343), DOM16-38 (SEQ ID NO: 344), DOM16-39(SEQ ID NO: 345), DOM16-40 (SEQ ID NO: 346), DOM16-41 (SEQ IDNO: 347), DOM16-42 (SEQ ID NO: 348), DOM16-43 (SEQ ID NO: 349),DOM 16-44 (SEQ ID NO: 350), DOM16-45 (SEQ ID NO: 351), DOM16-46(SEQ ID NO: 352), DOM16-47 (SEQ ID NO: 353), DOM16-48 (SEQ IDNO: 354), DOM16-49 (SEQ ID NO: 355), DQM16-50 (SEQ ID NO: 356),DOMl6-59 (SEQ ID NO: 357), DOMI6-6O (SEQ ID NO: 358), DOM16-61(SEQ ID NO: 359), DOM16-62 (SEQ ID NO: 360), DOM16-63 (SEQ IDNO: 361), DOMl6-64 (SEQ ID NO: 362), DOM16-65 (SEQ ID NO: 363),DOMl6-66 (SEQ ID NO: 364), DOM16-67 (SEQ ID NO: 365), DOM16-68(SEQ ID NO: 366), DOMI6-69 (SEQ ID NO: 367), DOMl6-70 (SEQ ID NO:368), DOMl6-71 (SEQ ID NO: 369), DOM16-72 (SEQ ID NO: 370),DOM 16-73 (SEQ ID NO: 371), DOM16-74 (SEQ ID NO: 372), DOM16-75(SEQ ID NO: 373), DOM16-76 (SEQ ID NO: 374), DOM16-77 (SEQ IDNO: 375), DOM16-78 (SEQ ID "NO: 376), DOM16-79 (SEQ ID NO: 377),DOM 16-80 (SEQ ID NO: 378), DOM16-81 (SEQ ID NO: 379), DOM16-82(SEQ ID NO: 380), DOM16-83 (SEQ ID NO: 381), DOM16-84 (SEQ IDNO: 382), DOMI6-85 (SEQ ID NO: 383), DOM16-87 (SEQ ID NO: 384),DOM 16-88 (SEQ ID NO: 385), DOM16-89 (SEQ ID NO: 386), DOM16-90(SEQ ID NO: 387), DOM16-9I (SEQ ID NO: 388), DOM16-92 (SEQ IDNO: 389), DOM16-94 (SEQ ID NO: 390), DOM16-95 (SEQ ID NO: 391),DOMl6-96 (SEQ ID NO: 392), DOM16-97 (SEQ ID NO: 393), DOM16-98(SEQ ID NO: 394), DOMl6-99 (SEQ ID NO: 395), DOMl6-100 (SEQ IDNO: 396), DOMIó-lOl (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398),DOM 16-103 (SEQ ID NO: 399), DOM16-104 (SEQ ID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO: 401), DOMI6-IO6 (SEQ ID NO: 402), DOM16-107 (SEQID NO: 403), DOMl6-108 (SEQ ID NO: 404), DOMl6-109 (SEQ ID NO:405), DOM16-HO (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407),DOM16-112 (SEQ ID NO: 408), DOM16-113 (SEQ ID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO: 410), DOM16-115 (SEQ ID NO: 411), DOM16-116 (SEQID NO: 412), DOM16-117 (SEQ ID NO: 413), DOM16-118 (SEQ ID NO:414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416),DOM 16-39-8 (SEQ ID NO: 417), DOM16-39-34 (SEQ ID NO: 418),DOM 16-39-48 (SEQ ID NO: 419), DOM16-39-87 (SEQ ID NO: 420),DOM16-39-90 (SEQ ID NO: 421), DOMl 6-39-96 (SEQ ID NO: 422),DOMl6-39-100 (SEQ ID NO: 423)DOMl6-39-102 (SEQ ID NO: 425)DOM16-39-104 (SEQ ID NO: 427)DOMl6-39-106 (SEQ ID NO: 429)DOMl6-39-108 (SEQ ID NO: 431)DOMl6-39-110 (SEQ ID NO: 433)DOM16-39-112 (SEQ ID NO: 435)DOM16-39-114 (SEQ ID NO: 437)DOMl6-39-116 (SEQ ID NO: 439)DOMl6-39-200 (SEQ ID NO: 441)DOMl6-39-202 (SEQ ID NO: 443)DOMl6-39-204 (SEQ ID NO: 445)DOM16-39-206 (SEQ ID NO: 447)
DOMl6-39-101 (SEQ ID NO: 424)DOMl6-39-103 (SEQ ID NO: 426)DOM16-39-105 (SEQ ID NO: 428)DOM16-39-107 (SEQ ID NO: 430)DOMl6-39-109 (SEQ ID NO: 432)DOM16-39-111 (SEQ ID NO: 434)DOMl6-39-113 (SEQ ID NO: 436)DOM16-39-115 (SEQ ID NO: 438)DOM16-39-117 (SEQ ID NO: 440)DOM16-39-201 (SEQ ID NO: 442)DOMl6-39-203 (SEQ ID NO: 444)DOMl6-39-205 (SEQ ID NO: 446)DOMl6-39-207 (SEQ ID NO: 448)
DOMl6-39-209 (SEQ ID NO: 449), DOMl6-52 (SEQ ID NO: 450), NBl(SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQ ID NO: 453), NB4(SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ ID NO: 455), NB6 (SEQ ID NO: 456), NB7(SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQ ID NO: 459), NBlO(SEQ ID NO: 460), NBll (SEQ ID NO: 461), NB12 (SEQ ID NO: 462),NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14 (SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQ ID NO:465), NB16 (SEQ ID NO: 466), NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18 (SEQ IDNO: 468), NB19 (SEQ ID NO: 469), NB20 (SEQ ID NO: 470), NB21 (SEQID NO: 471) e NB22 (SEQ ID NO: 472).
Em outras formas de realização, o ligando que tenhaespecificidade de ligação para VEGF e para EGFR compreende um primeirodomínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação paraVEGF e um segundo domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR, em que o dito primeiro domíniovariável único de imunoglobulina compete quanto à ligação ao VEGF combevacizumab e/ou anticorpo 2C3 (Acesso do ATCC Ns PTA 1595); e o ditosegundo domínio variável único de imunoglobulina compete quanto à ligaçãoao EGFR com cetuximab.
Em formas de realização particulares, o ligando temespecificidade de ligação para VEGF e para EGFR e compreende pelo menosum domínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligaçãopara VEGF e pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR, em que o ligando compreende umdomínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação paraVEGF que compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos90% de identidade de seqüência de aminoácido com a seqüência deaminoácido de um dAb anti-VEGF selecionado do grupo que consiste deTARl5-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-8 (SEQ ID NO: 119) e TAR15-26(SEQ ID NO: 123) e compreende ainda um domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para EGFR que compreendeuma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 90% de identidade deseqüência de aminoácido com uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo que consiste de DOM16-39 (SEQ ID NO: 345), DOM16-39-87 (SEQID NO: 420), DOMló-39-lOO (SEQ ID NO: 423), DOM16-39-107 (SEQ IDNO: 430), DOM 16-39-109 (SEQ ID NO: 432), DOM16-39-115 (SEQ IDNO: 438) ou DOM16-39-200 (SEQ ID NO: 441).
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF epara EGFR pode inibir a ligação de fator de crescimento epidérmico (EGF)e/ou fator alfa de crescimento transformador (TGFalfa) ao EGFR, inibir aatividade de EGFR, e/ou inibir a atividade de EGFR sem inibirsubstancialmente a ligação de fator de crescimento epidérmico (EGF) e/oufator alfa de crescimento transformador (TGFalfa) ao EGFR. Além disso oualternativamente, o ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF epara EGFR pode inibir a ligação de VEGF ao receptor do fator decrescimento endotelial vascular 1 (VEGFRl) e/ou receptor do fator decrescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), inibir a atividade de VEGF e/ouinibir a atividade de VEGF sem inibir substancialmente ligação de VEGF aoVEGFRl e/ou VEGFR2.
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF epara EGFR pode conter uma porção de ligação de proteína (por exemplo,domínio variável único de imunoglobulina) com especificidade de ligaçãopara VEGF que liga VEGF com uma afinidade (KD) que está entre cerca de100 nM e cerca de 1 pM, como determinado pela ressonância de plasma desuperfície.
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF epara EGFR pode conter uma porção de ligação de proteína (por exemplo,domínio variável único de imunoglobulina) com especificidade de ligaçãopara EGFR que liga EGFR com uma afinidade (KD) que está entre cerca de100 nM e cerca de 1 pM ou de cerca de 10 nM a cerca de 100 pM, comodeterminado pela ressonância de plasma de superfície.
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF epara EGFR pode ligar VEGF com uma afinidade (KD) que está entre cerca de100 nM e cerca de 1 pM, como determinado pela ressonância de plasma desuperfície.
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF epara EGFR pode ligar EGFR com uma afinidade (KD) que está entre cerca de100 nM e cerca de 1 pM ou de cerca de 10 nM a cerca de 100 pM, comodeterminado pela ressonância de plasma de superfície.
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF epara EGFR pode compreender um domínio variável único de imunoglobulinacom especificidade de ligação para VEGF que é um Vhh e/ou um domíniovariável único de imunoglobulina com especificidade de ligação para EGFRque é um Vhh-
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF epara EGFR pode compreender um domínio variável único de imunoglobulinacom especificidade de ligação para VEGF e um domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para EGFR, em que osdomínios únicos de imunoglobulina são selecionados do grupo que consistede um VH humano e um VL humano
Em algumas formas de realização, o ligando que tenhaespecificidade de ligação para VEGF e para EGFR pode ser um formatoequivalente a IgG que compreende dois domínios variáveis únicos deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF e dois domíniosvariáveis únicos de imunoglobulina com especificidade de ligação paraEGFR.
Em algumas formas de realização, o ligando que tenhaespecificidade de ligação para VEGF e para EGFR pode compreender umaregião de Fc de anticorpo.
A invenção também diz respeito a um ligando que tenhaespecificidade de ligação para VEGF, que compreende pelo menos umdomínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação paraVEGF, em que um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para VEGF compete quanto à ligação ao VEGF comum anticorpo de domínio anti-VEGF (dAb) selecionado do grupo que consistede TARl5-1 (SEQ ID NO: 100), TAR15-3 (SEQ ID NO: 101), TAR15-4(SEQ ID NO: 102), TAR15-9 (SEQ ID NO: 103), TAR15-10 (SEQ ID NO:104), TAR15-11 (SEQ ID NO: 105), TAR15-12 (SEQ ID NO: 106), TAR15-13 (SEQ ID NO: 107), TARl 5-14 (SEQ ID NO: 108), TARl 5-15 (SEQ IDNO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO: 110), TAR15-17 (SEQ ID NO: 111),TARl5-18 (SEQ ID NO: 112), TAR15-19 (SEQ ID NO: 113), TAR15-20(SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ ID NO: 115), TAR15-5 (SEQ ID NO:116), TARl5-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-7 (SEQ ID NO: 118), TAR15-8(SEQ ID NO: 119), TAR15-23 (SEQ ID NO: 120), TAR15-24 (SEQ ID NO:121), TARl5-25 (SEQ ID NO: 122), TAR15-26 (SEQ ID NO: 123), TAR15-27 (SEQ ID NO: 124), TAR15-29 (SEQ ID NO: 125), TAR15-30 (SEQ IDNO: 126), TARl5-6-500 (SEQ ID NO: 127), TAR15-6-501 (SEQ ID NO:128), TARl5-6-502 (SEQ ID NO: 129), TAR15-6-503 (SEQ ID NO: 130),TARl5-6-504 (SEQ ID NO: 131), TAR15-6-505 (SEQ ID NO: 132), TAR15-6-506 (SEQ ID NO: 133), TARI5-6-507 (SEQ ID NO: 134), TAR15-6-508(SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO: 136), TAR15-6-510 (SEQID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQ ID NO: 138), TAR15-8-501 (SEQ ID NO:139), TARl5-8-502 (SEQ ID NO: 140), TAR15-8-503 (SEQ ID NO: 141),TARl5-8-505 (SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506 (SEQ ID NO: 143), TAR15-8-507 (SEQ ID NO: 144), TARl5-8-508 (SEQ ID NO: 145), TARl5-8-509(SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO: 147), TAR15-8-511 (SEQID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQ ID NO: 149), TAR15-26-501 (SEQ IDNO: 150), TARl5-26-502 (SEQ ID NO: 151), TARl5-26-503 (SEQ ID NO:152), TARl5-26-504 (SEQ ID NO: 153), TAR15-26-505 (SEQ ID NO: 154)TAR15-26-506 (SEQ ID NO: 155), TARl 5-26-507 (SEQ ID NO: 156)TARl5-26-508 (SEQ ID NO: 157), TARl 5-26-509 (SEQ ID NO: 158)TARl5-26-510 (SEQ ID NO: 159), TARl 5-26-511 (SEQ ID NO: 160)TARl5-26-512 (SEQ ID NO: 161), TARl 5-26-513 (SEQ ID NO: 162)TARl5-26-514 (SEQ ID NO: 163), TARl 5-26-515 (SEQ ID NO: 164)TARl5-26-516 (SEQ ID NO: 165), TARl 5-26-517 (SEQ ID NO: 166)TARl5-26-518 (SEQ ID NO: 167), TARl 5-26-519 (SEQ ID NO: 168)TARl5-26-520 (SEQ ID NO: 169), TARl 5-26-521 (SEQ ID NO: 170)TARl5-26-522 (SEQ ID NO: 171), TARl 5-26-523 (SEQ ID NO: 172)TARl5-26-524 (SEQ ID NO: 173), TARl 5-26-525 (SEQ ID NO: 174)TARl5-26-526 (SEQ ID NO: 175), TARl 5-26-527 (SEQ ID NO: 176)TARl5-26-528 (SEQ ID NO: 177), TARl 5-26-529 (SEQ ID NO: 178)TARl5-26-530 (SEQ ID NO: 179), TARl 5-26-531 (SEQ ID NO: 180)TARl5-26-532 (SEQ ID NO: 181), TARl 5-26-533 (SEQ ID NO: 182)TARl5-26-534 (SEQ ID NO: 183), TARl5-26-535 (SEQ ID NOTARl5-26-536 (SEQ ID NO: 185), TARl5-26-537 (SEQ ID NOTAR15-26-538 (SEQ ID NO: 187), TAR15-26-539 (SEQ ID NOTARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189), TARl 5-26-541 (SEQ ID NOTARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191), TARl 5-26-543 (SEQ ID NOTARl5-26-544 (SEQ ID NO: 193), TARl5-26-545 (SEQ ID NOTARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195), TARl 5-26-547 (SEQ ID NOTARl 5-26-548 (SEQ ID NO: 197), TARl 5-26-549 (SEQ ID NOTARl5-26-550 (SEQ ID NO: 539) e TARl5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
Por exemplo, um domínio variável único de imunoglobulinacom especificidade de ligação para VEGF pode compreender uma seqüênciade aminoácido que tem pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüênciade aminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado dogrupo que consiste de TARl5-1 (SEQ ID NO: 100), TARl 5-3 (SEQ ID NO:101), TARl5-4 (SEQ ID NO: 102), TAR15-9 (SEQ ID NO: 103), TAR15-10(SEQ ID NO: 104), TARl 5-11 (SEQ ID NO: 105), TARl 5-12 (SEQ ID NO:106), TARl5-13 (SEQ ID NO: 107), TAR15-14 (SEQ ID NO: 108), TAR15-15 (SEQ ID NO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO: 110), TAR15-17 (SEQ IDNO: 111), TARl 5-18 (SEQ ID NO: 112), TAR15-19 (SEQ ID NO: 113),TARl5-20 (SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ ID NO: 115), TARl5-5(SEQ ID NO: 116), TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-7 (SEQ ID NO:118), TARl5-8 (SEQ ID NO: 119), TAR15-23 (SEQ ID NO: 120), TAR15-24 (SEQ ID NO: 121), TARl 5-25 (SEQ ID NO: 122), TARl 5-26 (SEQ IDNO: 123), TARl5-27 (SEQ ID NO: 124), TARl5-29 (SEQ ID NO: 125),TAR15-30 (SEQ ID NO: 126), TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 127), TAR15-6-501 (SEQ ID NO: 128), TARl5-6-502 (SEQ ID NO: 129), TARl5-6-503(SEQ ID NO: 130), TAR15-6-504 (SEQ ID NO: 131), TAR15-6-505 (SEQID NO: 132), TAR15-6-506 (SEQ ID NO: 133), TAR15-6-507 (SEQ ID NO:134), TARl5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO: 136),TARl5-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQ ID NO: 138), TAR15-8-501 (SEQ ID NO: 139), TARl5-8-502 (SEQ ID NO: 140), TARl5-8-503(SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506 (SEQID NO: 143), TAR15-8-507 (SEQ ID NO: 144), TAR15-8-508 (SEQ ID NO:145), TARl5-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO: 147)TARl5-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQ ID NO: 149)
TARl 5-26-501TARl 5-26-503TARl 5-26-505TARl 5-26-507TARl 5-26-509TARl 5-26-511TARl 5-26-513
TARl 5-26-515 (SEQ ID NO
TARl 5-26-517TARl 5-26-519TARl 5-26-521TARl 5-26-523TARl 5-26-525TARl 5-26-527TARl 5-26-529TARl 5-26-531TARl 5-26-533TARl 5-26-535TARl 5-26-537TARl 5-26-539TARl 5-26-541TARl 5-26-543TARl 5-26-545
SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO
SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO
150), TARl5-26-502 (SEQ ID NO152), TARl5-26-504 (SEQ ID NO154), TARl5-26-506 (SEQ ID NO156), TARl5-26-508 (SEQ ID NO158), TARl5-26-510 (SEQ ID NO160), TARl 5-26-512 (SEQ ID NO162), TARl 5-26-514 (SEQ ID NO164), TARl 5-26-516 (SEQ ID NO166), TARl 5-26-518 (SEQ ID NO168), TARl 5-26-520 (SEQ ID NO170), TARl 5-26-522 (SEQ ID NO172), TARl 5-26-524 (SEQ ID NO174), TARl 5-26-526 (SEQ ID NO176), TARl 5-26-528 (SEQ ID NO178), TARl5-26-530 (SEQ ID NO180), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO182), TARl 5-26-534 (SEQ ID NO184), TARl5-26-536 (SEQ ID NO186), TARl5-26-538 (SEQ ID NO188), TARl 5-26-540 (SEQ ID NO190), TARl 5-26-542 (SEQ ID NO192), TAR15-26-544 (SEQ ID NO194), TARl 5-26-546 (SEQ ID NOTARl5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TARl 5-26-548 (SEQ ID NO: 197),TARI5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TARl5-26-550 (SEQ ID NO: 539) eTARI5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGFpode inibir a ligação de VEGF ao receptor do fator de crescimento endotelialvascular 1 (VEGFRI) e/ou receptor do fator de crescimento endotelialvascular 2 (VEGFR2), inibir a atividade de VEGF e/ou inibir a atividade deVEGF sem inibir substancialmente a ligação de VEGF ao VEGFRI e/ouVEGFR2.
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGFpode conter um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para VEGF que liga VEGF com uma afinidade(KD) que está entre cerca de 100 nM e cerca de 1 pM, como determinado pelaressonância de plasma de superfície.
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGFpode ligar VEGF com uma afinidade (KD) que está entre cerca de 100 nM ecerca de 1 pM, como determinado pela ressonância de plasma de superfície.
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGFpode compreender um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para VEGF que é um Viffl-
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGFpode compreender um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para VEGF que é selecionado do grupo que consistede um Vh humano e um Vl humano.
Em algumas formas de realização, o ligando que tenhaespecificidade de ligação para VEGF é um formato equivalente a IgG quecompreende pelo menos dois domínios variáveis únicos de imunoglobulinacom especificidade de ligação para VEGF.
Em algumas formas de realização, o ligando que tenhaespecificidade de ligação para VEGF compreende uma região de anticorpo Fc.
A invenção também diz respeito a um ligando que tenhaespecificidade de ligação para EGFR que compreende pelo menos umdomínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação paraEGFR, em que um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR compete quanto à ligação ao EGFR comum anticorpo de domínio anti-EGFR (dAb) selecionado do grupo que consistede DOM 16-17 (SEQ ID NO: 325), DOM16-18 (SEQ ID NO: 326), DOM16-19 (SEQ ID NO: 327), DOM16-20 (SEQ ID NO: 328), DOM16-21 (SEQ IDf NO: 329), DOMl6-22 (SEQ ID NO: 330), DOMl6-23 (SEQ ID NO: 331),DOM 16-24 (SEQ ID NO: 332), DOM16-25 (SEQ ID NO: 333), DOM16-26(SEQ ID NO: 334), DOM16-27 (SEQ ID NO: 335), DOM16-28 (SEQ IDNO: 336), DOMl6-29 (SEQ ID NO: 337), DOM16-30 (SEQ ID NO: 338),DOMl6-31 (SEQ ID NO: 339), DOM16-32 (SEQ ID NO: 340), DOM16-33(SEQ ID NO: 341), DOM16-35 (SEQ ED NO: 342), DOM16-37 (SEQ IDNO: 343), DOM16-38 (SEQ ID NO: 344), DOM16-39 (SEQ ID NO: 345),DOM 16-40 (SEQ ID NO: 346), DOM16-41 (SEQ ID NO: 347), DOM16-42(SEQ ID NO: 348), DOM16-43 (SEQ ID NO: 349), DOM16-44 (SEQ IDNO: 350), DOM16-45 (SEQ ID NO: 351), DOM16-46 (SEQ ID NO: 352),DOM 16-47 (SEQ ID NO: 353), DOM16-48 (SEQ ID NO: 354), DOM16-49(SEQ ID NO: 355), DOM16-50 (SEQ ID NO: 356), DOM16-59 (SEQ IDNO: 357), DOMI6-6O (SEQ ID NO: 358), DOM16-61 (SEQ ID NO: 359),DOM 16-62 (SEQ ID NO: 360), DOM16-63 (SEQ ID NO: 361), DOM16-64(SEQ ID NO: 362), DOM16-65 (SEQ ID NO: 363), DOM16-66 (SEQ IDNO: 364), DOMl6-67 (SEQ ID NO: 365), DOMl6-68 (SEQ ID NO: 366),DOMl6-69 (SEQ ID NO: 367), DOM16-70 (SEQ ID NO: 368), DOM16-71(SEQ ID NO: 369), DOM16-72 (SEQ ID NO: 370), DOM16-73 (SEQ IDNO: 371), DOMl6-74 (SEQ ID NO: 372), DOM16-75 (SEQ ID NO: 373),DOM 16-76 (SEQ ID NO: 374), DOM16-77 (SEQ ID NO: 375), DOM16-78(SEQ ID NO: 376), DOM16-79 (SEQ ID NO: 377), DOMI6-8O (SEQ IDNO: 378), DOM16-81 (SEQ ID NO: 379), DOM16-82 (SEQ ID NO: 380),DOM 16-83 (SEQ ID NO: 381), DOM16-84 (SEQ ID NO: 382), DOM16-85(SEQ ID NO: 383), DOM16-87 (SEQ ID NO: 384), DOM16-88 (SEQ IDNO: 385), DOM16-89 (SEQ ID NO: 386), DOM16-90 (SEQ ID NO: 387),DOM 16-91 (SEQ ID NO: 388), DOM16-92 (SEQ ID NO: 389), DOM16-94(SEQ ID NO: 390), DOM16-95 (SEQ ID NO: 391), DOM16-96 (SEQ IDNO: 392), DOMl6-97 (SEQ ID NO: 393), DOMl6-98 (SEQ ID NO: 394),DOM 16-99 (SEQ ID NO: 395), DOMI6-IOO (SEQ ID NO: 396), DOM16-101 (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398), DOM16-103 (SEQID NO: 399), DOM16-104 (SEQ ID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO:401), DOM 16-106 (SEQ ID NO: 402), DOM16-107 (SEQ ID NO: 403),DOM 16-108 (SEQ ID NO: 404), DOM 16-109 (SEQ ID NO: 405), DOMl 6-110 (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407), DOM16-112 (SEQID NO: 408), DOM16-113 (SEQ ID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO:410), DOMl6-115 (SEQ ID NO: 411), DOM16-116 (SEQ ID NO: 412),DOM16-117 (SEQ ID NO: 413), DOM16-118 (SEQ ID NO: 414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416), DOM16-39-8(SEQ ID NO: 417), DOMl6-39-34 (SEQ ID NO: 418), DOMl6-39-48 (SEQID NO: 419), DOM16-39-87 (SEQ ID NO: 420), DOM16-39-90 (SEQ IDNO: 421), DOM 16-39-96 (SEQ ID NO: 422), DOM16-39-100 (SEQ ID NO423), DOM16-39-101 (SEQ ID NO: 424), DOM16-39-102 (SEQ ID NO425), DOM16-39-103 (SEQ ID NO: 426), DOM16-39-104 (SEQ ID NO427), DOM16-39-105 (SEQ ID NO: 428), DOM16-39-106 (SEQ ID NO429), DOMl6-39-107 (SEQ ID NO: 430), DOMl6-39-108 (SEQ ID NO431), DOMl6-39-109 (SEQ ID NO: 432), DOM16-39-HO (SEQ ID NO433), DOM16-39-111 (SEQ ID NO: 434), DOM16-39-112 (SEQ ID NO435), DOM16-39-113 (SEQ ID NO: 436), DOM16-39-114 (SEQ ID NO437), DOMl6-39-115 (SEQ ID NO: 438), DOM16-39-116 (SEQ ID NO439), DOMl6-39-117 (SEQ ID NO: 440), DOM16-39-200 (SEQ ID NO441), DOMl6-39-201 (SEQ ID NO: 442), DOM16-39-202 (SEQ ID NO443), DOMl6-39-203 (SEQ ID NO: 444), DOMl6-39-204 (SEQ ID NO445), DOMl6-39-205 (SEQ ID NO: 446), DOMl6-39-206 (SEQ ID NO447), DOMl6-39-207 (SEQ ID NO: 448), DOM16-39-209 (SEQ ID NO449), DOMl6-52 (SEQ ID NO: 450), NBl (SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ IDNO: 452), NB3 (SEQ ID NO: 453), NB4 (SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ IDNO: 455), NB6 (SEQ ID NO: 456), NB7 (SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ IDNO: 458), NB9 (SEQ ID NO: 459), NBlO (SEQ ID NO: 460), NBll (SEQID NO: 461), NB12 (SEQ ID NO: 462), NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14(SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQ ID NO: 465), NB16 (SEQ ID NO: 466),NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18 (SEQ ID NO: 468), NB19 (SEQ ID NO:469), NB20 (SEQ ID NO: 470), NB21 (SEQ ID NO: 471) e NB22 (SEQ IDNO: 472).
Por exemplo, o domínio variável único de imunoglobulinacom especificidade de ligação para EGFR pode compreender uma seqüênciade aminoácido que tem pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüênciade aminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado dogrupo que consiste de DOM16-17 (SEQ ID NO: 325), DOM16-18 (SEQ IDNO: 326), DOM16-19 (SEQ ID NO: 327), DOM16-20 (SEQ ID NO: 328),DOMl6-21 (SEQ ID NO: 329), DOMl6-22 (SEQ ID NO: 330), DOMl6-23(SEQ ID NO: 331), DOMl6-24 (SEQ ID NO: 332), DOMl6-25 (SEQ IDNO: 333), DOM16-26 (SEQ ID NO: 334), DOM16-27 (SEQ ID NO: 335),DOM 16-28 (SEQ ID NO: 336), DOM16-29 (SEQ ID NO: 337), DOM16-30(SEQ ID NO: 338), DOM16-31 (SEQ ID NO: 339), DOM16-32 (SEQ IDNO: 340), DOMl6-33 (SEQ ID NO: 341), DOM16-35 (SEQ ID NO: 342),DOM 16-37 (SEQ ID NO: 343), DOM16-38 (SEQ ID NO: 344), DOM16-39(SEQ ID NO: 345), DQM16-40 (SEQ ID NO: 346), DOM16-41 (SEQ IDNO: 347), DOM16-42 (SEQ ID NO: 348), DOM16-43 (SEQ ID NO: 349),DOMl6-44 (SEQ ID NO: 350), DOM16-45 (SEQ ID NO: 351), DOM16-46(SEQ ID NO: 352), DOM16-47 (SEQ ID NO: 353), DOM16-48 (SEQ IDNO: 354), DOM16-49 (SEQ ID NO: 355), DOM16-50 (SEQ ID NO: 356),DOMl6-59 (SEQ ID NO: 357), DOMI6-6O (SEQ ID NO: 358), DOM16-61(SEQ ID NO: 359), DOM16-62 (SEQ ID NO: 360), DOM16-63 (SEQ IDNO: 361), DOM 16-64 (SEQ ID NO: 362), DOM16-65 (SEQ ID NO: 363),DOMl6-66 (SEQ ID NO: 364), DOMl6-67 (SEQ ID NO: 365), DOMl6-68(SEQ ID NO: 366), DOM16-69 (SEQ ID NO: 367), DOM16-70 (SEQ IDNO: 368), DOM16-71 (SEQ ID NO: 369), DOM16-72 (SEQ ID NO: 370),DOM 16-73 (SEQ ID NO: 371), DOM16-74 (SEQ ID NO: 372), DOM16-75(SEQ ID NO: 373), DOM16-76 (SEQ ID NO: 374), DOM16-77 (SEQ IDNO: 375), DOM16-78 (SEQ ID NO: 376), DOM16-79 (SEQ ID NO: 377),DOMl6-80 (SEQ ID NO: 378), DOM16-81 (SEQ ID NO: 379), DOM16-82(SEQ ID NO: 380), DOM16-83 (SEQ ID NO: 381), DOM16-84 (SEQ IDNO: 382), DOM16-85 (SEQ ID NO: 383), DOM16-87 (SEQ ID NO: 384),DOMl6-88 (SEQ ID NO: 385), DOM16-89 (SEQ ID NO: 386), DOM16-90(SEQ ID NO: 387), DOM16-91 (SEQ ID NO: 388), DOM16-92 (SEQ IDNO: 389), DOM16-94 (SEQ ID NO: 390), DOM16-95 (SEQ ID NO: 391),DOM 16-96 (SEQ ID NO: 392), DOM16-97 (SEQ ID NO: 393), DOM16-98(SEQ ID NO: 394), DOMl6-99 (SEQ ID NO: 395), DOMl6-100 (SEQ IDNO: 396), DOMI6-IOI (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398),DOM 16-103 (SEQ ID NO: 399), DOM16-104 (SEQ ID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO: 401), DOM 16-106 (SEQ ID NO: 402), DOM 16-107 (SEQID NO: 403), DOMl6-108 (SEQ ID NO: 404), DOMl6-109 (SEQ ID NO:405), DOM16-HO (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407),DOMl6-112 (SEQ ID NO: 408), DOM16-113 (SEQ ID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO: 410), DOM16-115 (SEQ ID NO: 411), DOM16-116 (SEQID NO: 412), DOM16-117 (SEQ ID NO: 413), DOM16-118 (SEQ ID NO:414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416)DOM 16-39-8 (SEQ ID NO: 417), DOM16-39-34 (SEQ ID NO: 418)DOMl6-39-48 (SEQ ID NO: 419),DOMl6-39-87 (SEQ ID NO: 420)DOMl6-39-90 (SEQ ID NO: 421),DOMl6-39-96 (SEQ ID NO: 422)DOMl6-39-100 (SEQ ID NO: 423),DOMl6-39-101 (SEQ ID NO: 424)DOM 16-39-102 (SEQ ID NO: 425),DOMl6-39-103 (SEQ ID NO: 426)DOMl6-39-104 (SEQ ID NO: 427),DOMl6-39-105 (SEQ ID NO: 428)DOMl 6-39-106 (SEQ ID NO: 429),DOM 16-39-107 (SEQ ID NO: 430)DOM 16-39-108 (SEQ ID NO: 431),DOMl6-39-109 (SEQ ID NO: 432)DOM16-39-HO (SEQ ID NO: 433),DOM 16-39-111 (SEQ ID NO: 434)DOM16-39-112 (SEQ ID NO: 435),DOM16-39-113 (SEQ ID NO: 436)DOMl6-39-114 (SEQ ID NO: 437),DOM 16-39-115 (SEQ ID NO: 438)DOM 16-39-116(SEQ ID NO: 439),DOM16-39-117 (SEQ ID NO: 440)DOM 16-39-200 (SEQ ID NO: 441),DOMl6-39-201 (SEQ ID NO: 442)DOMl6-39-202 (SEQ ID NO: 443),DOMl6-39-203 (SEQ ID NO: 444)DOMl6-39-204 (SEQ ID NO: 445),DOMl6-39-205 (SEQ ID NO: 446)DOMl6-39-206 (SEQ ID NO: 447),DOMl6-39-207 (SEQ ID NO: 448)DOM 16-39-209 (SEQ ID NO: 449),DOM16-52 (SEQ ID NO: 450), NBl(SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQ ID NO: 453), NB4(SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ ID NO: 455), NB6 (SEQ ID NO: 456), NB7(SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQ ID NO: 459), NBlO(SEQ ID NO: 460), NBll (SEQ ID NO: 461), NB12 (SEQ ID NO: 462),NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14 (SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQ ID NO:465), NB16 (SEQ ID NO: 466), NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18 (SEQ IDNO: 468), NB19 (SEQ ID NO: 469), NB20 (SEQ ID NO: 470), NB21 (SEQID NO: 471) e NB22 (SEQ ID NO: 472).
O ligando que tenha especificidade de ligação para EGFRpode inibir a ligação de fator de crescimento epidérmico (EGF) e/ou fator alfade crescimento transformador (TGFalfa) ao EGFR, inibir a atividade deEGFR, e/ou inibir a atividade de EGFR sem inibir substancialmente a ligaçãode fator de crescimento epidérmico (EGF) e/ou fator alfa de crescimentotransformador (TGFalfa) ao EGFR.
O ligando que tenha especificidade de ligação para EGFRpode conter um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR que liga EGFR com uma afinidade (KD)que está entre cerca de 100 nM e cerca de 1 pM ou de cerca de 10 nM a cercade 100 pM, como determinado pela ressonância de plasma de superfície.
O ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF epara EGFR pode ligar EGFR com uma afinidade (KD) que está entre cerca de100 nM e cerca de 1 pM ou de cerca de 10 nM a cerca de 100 pM, comodeterminado pela ressonância de plasma de superfície.
O ligando que tenha especificidade de ligação para EGFRpode compreender um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR que é um Vlffl-
O ligando que tenha especificidade de ligação para EGFRpode compreender um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR que é selecionado do grupo que consistede um Vh humano e um Vl humano.
Em algumas formas de realização, o ligando que tenhaespecificidade de ligação para EGFR é um formato equivalente a IgG quecompreende pelo menos dois domínios variáveis únicos de imunoglobulinacom especificidade de ligação para EGFR.
Em algumas formas de realização, o ligando que tenhaespecificidade de ligação para EGFR compreende uma região de anticorpo Fc.
Em algumas formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável de imunoglobulina único que antagoniza(inibe) a ligação de EGFR humano a um receptor, em que o dito polipeptídeode domínio variável de imunoglobulina único compreende uma seqüênciaCDR3 que é a mesma seqüência de CDR3 de um dAb anti-EGFR aquidivulgado.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável de imunoglobulina único que liga EGFR,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDRl que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDRl do dAb anti-EGFR.
Em outras formas de realização, o ligando compreendepolipeptídeo de domínio variável de imunoglobulina único que liga ao EGFR,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido do dAb anti-EGFR aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido do dAb anti-EGFR aqui divulgado em não mais doque 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDR2 que tem pelomenos 50% de identidade com a seqüência de CDR2 do dAb anti-EGFR.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga EGFR,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido do dAb anti-EGFR aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido do dAb anti-EGFR aqui divulgado em não mais doque 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDR3 que tem pelomenos 50% de identidade com a seqüência de CDR3 do dAb anti-EGFR.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga EGFR,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDRl que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDRl do dAb anti-EGFRe tem uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDR2 do dAb anti-EGFR.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga EGFR5em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDR2 que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDR2 do dAb anti-EGFRe tem uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDR3 do dAb anti-EGFR.
Ern outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga EGFR,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDRl que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDRl do dAb anti-EGFRe tem uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDR3 do dAb anti-EGFR.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga EGFR,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-EGFR aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDRl que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDRl do dAb anti-EGFRe tem uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDR2 do dAb anti-EGFR e tem uma seqüência de CDR3 quetem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDR3 do dAb anti-EGFR.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de EGFR tendo uma seqüência de CDRl que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDRl de um dAb anti-EGFR aquidivulgado.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de EGFR tendo uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDR2 de um dAb anti-EGFR aquidivulgado.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de EGFR tendo uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDR3 de um dAb anti-EGFR aquidivulgado.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de EGFR tendo uma seqüência de CDRl que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDRl de um dAb anti-EGFR aquidivulgado e uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos 50% de identidadecom a seqüência de CDR2 do dAb anti-EGFR.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de EGFR tendo uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDR2 de um dAb anti-EGFR aquidivulgado e uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidadecom a seqüência de CDR3 do dAb anti-EGFR.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de EGFR tendo uma seqüência de CDRl que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDRl de um dAb anti-EGFR aquidivulgado e uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidadecom a seqüência de CDR3 do dAb anti-EGFR.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de EGFR tendo uma seqüência de CDRl que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDRl de um dAb anti-EGFR aquidivulgado e uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos 50% de identidadecom a seqüência de CDR2 do dAb anti-EGFR e uma seqüência de CDR3 quetem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDR3 do dAb anti-EGFR.
Em algumas formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável de imunoglobulina único que antagoniza(inibe) a ligação de VEGF humano a um receptor, em que o dito polipeptídeode domínio variável de imunoglobulina único compreende uma seqüência deCDR3 que é a mesma seqüência de CDR3 de um dAb anti-VEGF aquidivulgado.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável de imunoglobulina único que liga VEGF,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDRl que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDRl do dAb anti-VEGF.
Em outras formas de realização, o ligando compreendepolipeptídeo de domínio variável de imunoglobulina único que liga ao VEGF,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido do dAb anti-VEGF aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido do dAb anti-VEGF aqui divulgado em não mais doque 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDR2 que tem pelomenos 50% de identidade com a seqüência de CDR2 do dAb anti-VEGF.Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga VEGF,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido do dAb anti-VEGF aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido do dAb anti-VEGF aqui divulgado em não mais doque 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDR3 que tem pelomenos 50% de identidade com a seqüência de CDR3 do dAb anti-VEGF.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga VEGF,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDRl que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDRl do dAb anti-VEGFe tem uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDR2 do dAb anti-VEGF.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga VEGF,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDR2 que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDR2 do dAb anti-VEGFe tem uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDR3 do dAb anti-VEGF.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga VEGF,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDRl que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDRl do dAb anti-VEGFe tem uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDR3 do dAb anti-VEGF.
Em outras formas de realização, o ligando compreende umpolipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina que liga VEGF,em que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é idêntica àseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado ou difere daseqüência de aminoácido de um dAb anti-VEGF aqui divulgado em não maisdo que 25 posições de aminoácido e tem uma seqüência de CDRl que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDRl do dAb anti-VEGFe tem uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDR2 do dAb anti-VEGF e tem uma seqüência de CDR3 quetem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDR3 do dAb anti-VEGF.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de VEGF tendo uma seqüência de CDRl que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDRl de um dAb anti-VEGF aquidivulgado.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de VEGF tendo uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDR2 de um dAb anti-VEGF aquidivulgado.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de VEGF tendo uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDR3 de um dAb anti-VEGF aquidivulgado.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de VEGF tendo uma seqüência de CDRl que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDRl de um dAb anti-VEGF aquidivulgado e uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos 50% de identidadecom a seqüência de CDR2 do dAb anti-VEGF.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de VEGF tendo uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDR2 de um dAb anti-VEGF aquidivulgado e uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidadecom a seqüência de CDR3 do dAb anti-VEGF.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de VEGF tendo uma seqüência de CDRl que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDRl de um dAb anti-VEGF aquidivulgado e uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidadecom a seqüência de CDR3 do dAb anti-VEGF.
Em uma outra forma de realização, a invenção é umantagonista de VEGF tendo uma seqüência de CDRl que tem pelo menos50% de identidade com a seqüência de CDRl de um dAb anti-VEGF aquidivulgado e uma seqüência de CDR2 que tem pelo menos 50% de identidadecom a seqüência de CDR2 do dAb anti-VEGF e uma seqüência de CDR3 quetem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDR3 do dAb anti-VEGF.
Em formas de realização adicionais, qualquer um dos ligandosaqui descritos compreende ainda uma toxina, tal como uma citotoxina,gerador de radical livre, antimetabólito, proteína, polipeptídeo, peptídeo,agente fotoativo, composto de anti-sentido, produto quimioterapêutico,radionuclídeo ou intracorpo. Em formas de realização particulares, a toxina éuma toxina ativa na superfície (por exemplo, um gerador de radical livre, umradionuclídeo).
Em outras formas de realização, o ligando compreende aindauma porção que prolonga a meia-vida, tal como uma porção de polialquilenoglicol, albumina sérica ou um fragmento desta, receptor de transferrina ouuma porção de ligação de transferrina deste ou uma porção que compreendeum sítio de ligação para um polipeptídeo que realça meia-vida in vivo. Emalgumas formas de realização, a porção que prolonga a meia-vida é umaporção que compreende um sítio de ligação para um polipeptídeo que realça ameia-vida in vivo selecionado do grupo que consiste de um aficorpo, umdomínio de SpA5 um domínio classe A de receptor de LDL, um domínio deEGF e um avimer.
Em outras formas de realização, a porção que prolonga a meia-vida é um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, um domíniovariável único de imunoglobulina) que compreende um sítio de ligação para aalbumina sérica ou receptor Fc neonatal.
Em formas de realização particulares, a porção que prolonga ameia-vida é um domínio variável único de imunoglobulina que compreendeum sítio de ligação para a albumina sérica que compete quanto à ligação àalbumina sérica humana com um dAb selecionado do grupo que consiste deDOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-l (SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ IDNO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479),DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484),DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-l (SEQ ED NO: 486), DOM7h-7(SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ IDNO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492),DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27(SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO:497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499),DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7r-18(SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503), DOM7r-20 (SEQ ID NO:504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506),DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25(SEQ ID NO: 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO:511), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513),DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32(SEQ ID NO: 516) e DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517).
Por exemplo, o domínio variável único de imunoglobulina quecompreende um sítio de ligação para a albumina sérica pode compreenderuma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 85% de identidade deseqüência de aminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAbselecionado do grupo que consiste de DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473),DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7r-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-l(SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO:478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8(SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO:483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ IDNO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491),DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21(SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO:496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498),DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17(SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO:503), DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505),DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24(SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO:510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512),DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-3Q (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31(SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516) e DOM7r-33 (SEQ IDNO: 517).
A invenção também diz respeito a um ácido nucleico isoladoou recombinante que codifica um ligando aqui descrito e a um vetor (porexemplo, vetor recombinante) que compreende o ácido nucleicorecombinante. A invenção também diz respeito a uma célula hospedeira (porexemplo, célula hospedeira recombinante, célula hospedeira isolada) quecompreende um ácido nucleico recombinante ou vetor da invenção. Ainvenção também diz respeito a um método para produzir um ligando, quecompreende manter uma célula hospedeira da invenção sob condiçõesadequadas para a expressão do dito ácido nucleico ou vetor, por meio do qualum ligando é produzido. Em algumas formas de realização, o métodocompreende ainda isolar o ligando.
A invenção também diz respeito a um ligando da invençãopara o uso em terapia ou diagnóstico e ao uso de um ligando da invenção paraa fabricação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou supressãode uma doença aqui descrita (por exemplo, o câncer).
A invenção também diz respeito a uma composiçãofarmacêutica para o tratamento, prevenção ou supressão de uma doença aquidescrita (por exemplo, o câncer) que compreende como um ingrediente ativoum ligando da invenção.
Em algumas formas de realização, a invenção diz respeito aum ligando para o uso no tratamento de câncer ou células cancerosas quesuperexpressam EGFR e/ou VEGF.
Em outras formas de realização, a invenção diz respeito ao usode um ligando para a fabricação de um medicamento para matar células (porexemplo, matar seletivamente células cancerosas em relação às célulasnormais).
Em outras formas de realização, a invenção diz respeito ao usode um ligando para a fabricação de um medicamento para tratar célulascancerosas que superexpressam EGFR e/ou VEGF.
A invenção também diz resoeito a métodos teranêuticos auecompreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de umligando da invenção a um paciente em necessidade deste.
Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a ummétodo para tratar câncer que compreende administrar a um paciente emnecessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de ligando dainvenção. Em algumas formas de realização, o método compreende aindaadministrar ao paciente um agente quimioterapêutico (por exemplo, em umadose baixa).
Em outras formas de realização, o método para tratar câncercompreende administrar a um paciente em necessidade deste uma quantidadeterapeuticamente eficaz de ligando da invenção e uma composiçãoantineoplástica, em que a dita composição antineoplástica compreende pelomenos um agente quimioterapêutico. O agente quimioterapêutico pode serselecionado do grupo que consiste de agentes alquiladores, antimetabólitos,análogos do ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina einibidores relacionados, alcalóides vinca, epipodofilotoxinas, antibióticos, L-Asparaginase, inibidor da topoisomerase, interferons, complexos decoordenação da platina, uréia substituída por antracenodiona, derivados demetil hidrazina, supressores adrenocorticais, adrenocorticosteróides,progestinas, estrogênios, antiestrogênios, androgênios, antiandrogênio eanálogo do hormônio que libera gonadotropina. Em algumas formas derealização, o agente quimioterapêutico é selecionado do grupo que consiste decisplatina, dacarbazina, dactinomicina, mecloretamina, estreptozocina,ciclofosfamida, capecitabina, carmustina, lomustina, doxorrubicina,daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposida, metotrexato,5-fluorouracila, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel, docetaxel,doxetaxe, aldesleucina, asparaginase, busulfan, carboplatina, cladribina,dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiuréia, ifosfamida, interferon alfa,irinotecan, leuprolida, leucovorin, megestrol, melfalan, mercaptopurina.oxaliplatina, plicamicina, mitotano, pegaspargase, pentostatina, pipobroman,plicamicina, estreptozocina, tamoxifen, teniposida, testolactona, tioguanina,tiotepa, mostarda de uracila, vinorrelbina, clorambucila, taxol, um antagonistado receptor do fator de crescimento adiconal e uma combinação de qualquerum dos precedentes.
Em algumas formas de realização, o método é um método detratar um câncer selecionado do grupo que consiste de câncer da bexiga,câncer ovariano, câncer colo-retal (carcinoma colo-retal), câncer mamário,câncer pulmonar (carcinoma pulmonar de célula não pequena), câncergástrico, câncer pancreático, câncer prostático, câncer da cabeça e pescoço,câncer renal e câncer da vesícula biliar.
A invenção também diz respeito a um método de administrar aum paciente tratamento anti-VEGF e tratamento anti-EGFR, o métodocompreendendo a administração simultânea de um tratamento anti-VEGF eum tratamento anti-EGFR pela administração ao dito paciente de umaquantidade terapeuticamente eficaz de um ligando que tenha especificidade deligação para VEGF e EGFR.
A invenção também diz respeito a uma composição (porexemplo, composição farmacêutica) que compreende um ligando da invençãoe um carreador fisiológica ou farmaceuticamente aceitável. Em algumasformas de realização, a composição compreende um veículo para aadministração intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial,intratecal, intraarticular, subcutânea, pulmonar, intranasal, vaginal ou retal.
A invenção também diz respeito a um dispositivo de liberaçãode medicamento que compreende a composição (por exemplo, composiçãofarmacêutica) da invenção ou um ligando da invenção. Em uma forma derealização, o dispositivo de liberação de medicamento é para administrarsimultaneamente a um paciente tratamento anti-VEGF e tratamento anti-EGFR. e o dispositivo compreendendo um ligando aue tenha especificidade deligação para VEGF e EGFR. Em algumas formas de realização, o dispositivode medicamento compreende uma pluralidade de doses terapeuticamenteeficazes de ligando.
Em outras formas de realização, o dispositivo de liberação demedicamento é selecionado do grupo que consiste de um dispositivo deliberação parenteral, dispositivo de liberação intravenosa, dispositivo deliberação intramuscular, dispositivo de liberação intraperitoneal, dispositivode liberação transdérmico, dispositivo de liberação pulmonar, dispositivo deliberação intraarterial, dispositivo de liberação intratecal, dispositivo deliberação intraarticular, dispositivo de liberação subcutâneo, dispositivo deliberação intranasal, dispositivo de liberação vaginal, dispositivo de liberaçãoretal, uma seringa, um dispositivo de liberação transdérmica, uma cápsula, umtablete, um nebulizador, um inalador, um atomizador, um aerossolizador, umanévoa, um inalador de pó seco, um inalador de dose medida, um pulverizadorde dose medida, uma névoa de dose medida, um atomizador de dose medida,um cateter.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
As FIGs. IA-IE ilustram vinte e sete seqüências denucleotídeo que codificam anticorpos de domínio (dAbs) humanos {Homosapiens) que especificamente ligam VEGF humano. As seqüências denucleotídeo apresentadas são as SEQ ID NOS: 1 a 27, 535 e 536.
As FIGs. 2A-2C são um alinhamento de doze seqüências denucleotídeo que codificam dAbs humanos que ligam VEGF humano. Asseqüências de nucleotídeo apresentadas são as SEQ ID NO: 18 e SEQ IDNOS: 28-38.
As FIGs. 3A-3D são um alinhamento de doze seqüências denucleotídeo que codificam dAbs humanos que ligam VEGF humano. Asseqüências de nucleotídeo apresentadas são as SEQ ID NO: 20 e SEQ IDNOS: 39-49.
As FIGs. 4A-4J são um alinhamento de cinqüenta e trêsseqüências de nucleotídeo que codificam dAbs humanos que ligam VEGFhumano. As seqüências de nucleotídeo apresentadas são as SEQ ID NOs: 24,50-99, 537 e 538.
As FIGs. 5A-5C ilustram as seqüências de aminoácido dedAbs codificados por várias das seqüências de ácido nucleico mostradas nasFIGs. 1A-1E. As seqüências de aminoácido apresentadas são as SEQ IDNOS: 100-126.
A FIG. 6 é um alinhamento das seqüências de aminoácido dedAbs codificados pelas seqüências de ácido nucleico mostradas na FIG. 2A-2C. As seqüências de aminoácido apresentadas são as SEQ ID NOs: 117 ESEQ ID NOS: 127-137.
As FIG. 7A-7B são um alinhamento das seqüências deaminoácido de dAbs codificados pelas seqüências de ácido nucleicomostradas nas FIGs. 3A-2D. O símbolo - foi inserido na seqüência deTARl5-8-500 para facilitar o alinhamento. As seqüências de aminoácidoapresentadas são as SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NOS: 138-148.
As FIGs. 8A-8D são um alinhamento das seqüências deaminoácido de dAbs codificados pelas seqüências de ácido nucleicomostradas nas FIGs. 4A-4J. As seqüências de aminoácido apresentadas são asSEQ ID NOs: 123, 149-198, 539 e 540.
As FIGs. 9A-90 ilustram diversas seqüências de nucleotídeoque codificam anticorpos de domínio (dAbs) humanos (Homo sapiens) queespecificamente ligam EGFR humano. As seqüências de nucleotídeoapresentadas são as SEQ ID NOS: 199-324.
As FIGs. IOA-101 ilustram as seqüências de aminoácido dedAbs codificados pelas seqüências de ácido nucleico mostradas nas FIGs. 9 A-90. As seqüências de aminoácido apresentadas são as SEQ ID NOS: 325-450.
As FIG. 1IA-IIB ilustram as seqüências de aminoácido dediversos VHH5 Camelídeos que ligam EGFR que são divulgados na WO2005/044858. NBl (SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQID NO: 453), NB4 (SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ ID NO: 455), NB6 (SEQID NO: 456), NB7 (SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQID NO: 459), NBlO (SEQ ID NO: 460), NBll (SEQ ID NO: 461), NB12(SEQ ID NO: 462), NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14 (SEQ ID NO: 464),NB15 (SEQ ID NO: 465), NB16 (SEQ ID NO: 466), NB17 (SEQ ID NO:467), NB18 (SEQ ID NO: 468), NB19 (SEQ ID NO: 469), NB20 (SEQ IDNO: 470), NB21 (SEQ ID NO: 471), NB22 (SEQ ID NO: 472).
A FIG. 12A é um alinhamento das seqüências de aminoácidode três Vks que ligam albumina sérica de camundongo (MSA). As seqüênciasde aminoácido alinhadas são de Vks designados MSA16, que também éaludido como DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), MSA 12, que também éaludido como DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474) e MSA 26, que também éaludido como DOM7rn-26 (SEQ ID NO: 475).
A FIG. 12B é um alinhamento das seqüências de aminoácido^O de seis Vks que ligam albumina sérica de rato (RSA). As seqüências deaminoácido alinhadas são de Vks designados DOM7r-l (SEQ ID NO: 476),DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478), DOM7r-5 (SEQID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480) e DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481).
A FIG. 12C é um alinhamento das seqüências de aminoácidode seis Vks que ligam albumina sérica humana (HSA). As seqüências deaminoácido alinhadas são de Vks designados DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482),DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6(SEQ ID NO: 485), DOM7h-l (SEQ ID NO: 486) e DOM7h-7 (SEQ ID NO:487).A FIG. 12D é um alinhamento das seqüências de aminoácidode sete VhS que ligam albumina sérica humana e uma seqüência de consenso(SEQ ID NO: 488). As seqüências alinhadas são de VKs designados DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ IDNO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493),DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494) e DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495).
A FIG. 12E é um alinhamento das seqüências de aminoácidode três Vks que liga albumina sérica humana e albumina sérica de rato. Asseqüências de aminoácido alinhadas são de Vks designados DOM7h-8 (SEQID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497) e DOM7r-14 (SEQ ID NO:φ 498).
A FIG. 13 é uma ilustração das seqüências de aminoácido deVks que liga albumina sérica de rato (RSA). As seqüências ilustradas são deVks designados DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO:500), DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502),DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503).
As FIGs. 14A-14B são um ilustração das seqüências deaminoácido de VhS que ligam albumina sérica de rato (RSA). As Seqüênciasilustradas são de VHs designadas DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21(SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO:™ 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509),DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7r-28(SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO:514), DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516) eDOM7r-33 (SEQ ID NO: 517).
A FIG. 15 ilustra as seqüências de aminoácido de diversosVhhS de Camelídeo que ligam albumina sérica de camundongo que sãodivulgadas na WO 2004/041862. Seqüência A (SEQ ID NO: 518), SeqüênciaB (SEQ ID NO: 519), Seqüência C (SEQ ID NO: 520), Seqüência D (SEQ IDNO: 521), Seqüência E (SEQ ID NO: 522), Seqüência F (SEQ ID NO: 523),Seqüência G (SEQ ID NO: 524), Seqüência H (SEQ ID NO: 525), SeqüênciaI (SEQ ID NO: 526), Seqüência J (SEQ ID NO: 527), Seqüência K (SEQ IDNO: 528), Seqüência L (SEQ ID NO: 529), Seqüência M (SEQ ID NO: 530),Seqüência N (SEQ ID NO: 531), Seqüência 0 (SEQ ID NO: 532), SeqüênciaP (SEQ ID NO: 533), Seqüência Q (SEQ ID NO: 534).
A FIG. 16 é um mapa de um vetor usado para preparar formatoequivalente a IgGs.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Dentro deste relatório descritivo as formas de realização foramdescritas em um modo que se parece com um relatório descritivo claro econciso a ser escrito, mas é intencionado e será avaliado que as formas derealização podem ser variadamente combinadas ou separadas sem divergir dainvenção.
Como aqui usado, o termo "ligando" refere-se a um compostoque compreende pelo menos um peptídeo, polipeptídeo ou porção de proteínaque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para um compostoalvo endógeno desejado. Os ligandos de acordo com a invençãopreferivelmente compreendem domínios variáveis de imunoglobulina que têmespecificidades de ligação diferentes e não contém pares de domínio variávelque têm a mesma especificidade. Preferivelmente cada domínio que tenha umsítio de ligação que tenha especificidade de ligação para uma superfície dacélula alvo é um domínio variável único de imunoglobulina (por exemplo, odomínio variável de cadeia pesada único de imunoglobulina (por exemplo,VH, Vhh) (por exemplo, Vl)) que tenha especificidade de ligação para um alvode superfície celular desejado (por exemplo, uma proteína de membrana, talcomo uma proteína receptora). Cada domínio de polipeptídeo que tenha umsítio de ligação que tenha especificidade de ligação para um alvo de superfíciecelular também pode compreender uma ou mais regiões determinadoras decomplementaridade (CDRs) de um anticorpo ou fragmento de anticorpo (porexemplo, um domínio variável único de imunoglobulina) que tenhaespecificidade de ligação para uni alvo de superfície celular desejado em umformato adequado, tal que o domínio de ligação tenha especificidade deligação para o alvo de superfície celular. Por exemplo, as CDRs podem serenxertadas sobre uma armação ou esqueleto de proteína adequados, tais comoum aficorpo, uma armação SpA, um domínio classe A de receptor de LDL ouum domínio de EGF. Além disso, o ligando pode ser bivalente(heterobivalente) ou multivalente (heteromultivalente) como aqui descrito. Oprimeiro e segundo domínios carecem de domínios que compartilhem amesma especificidade. Assim, "ligandos" incluem polipeptídeos quecompreendem dois dAbs em que cada dAb liga a um alvo de superfíciecelular diferente, Ligandos também incluem polipeptídeos que compreendempelo menos dois dAbs que ligam diferentes alvos de superfície celular (ou asCDRs de um dAbs) em um formato adequado, tal como um formato deanticorpo (por exemplo, formato equivalente a IgG, scFv, Fab, Fab', F(ab')2)ou uma armação ou esqueleto de proteína adequados, tais como um aficorpo,um esqueleto de SpA, um domínio classe A de receptor de LDL, um domíniode EGF, avímero e ligandos multiespecíficos como aqui descritos. O domíniode polipeptídeo que tem um sítio de ligação que tenha especificidade deligação para uma alvo de superfície celular (isto é, primeiro ou segundo alvode superfície celular) também pode ser um domínio de proteína quecompreende um sítio de ligação para um alvo desejado, por exemplo, umdomínio de proteína é selecionado de um aficorpo, um domínio de SpA, umdomínio classe A de receptor de LDL, um avímero (ver, por exemplo,Publicação dos Pedidos de Patente U.S. N25 2005/0053973, 2005/0089932,2005/0164301). Se desejado, um "ligando" pode compreender ainda uma oumais porções adicionais, que podem ser cada uma independentemente umpeptídeo, polipeptídeo ou porção de proteína ou uma porção não peptídica(por exemplo, um polialquileno glicol, um lipídeo, um carboidrato). Porexemplo, o ligando pode compreender ainda uma porção que prolonga ameia-vida corno aqui descrita (por exemplo, uma porção de polialquilenoglicol, uma porção que compreende albumina, um fragmento de albumina ouvariante de albumina, uma porção que compreende transferrina, umfragmento de transferrina ou variante de transferrina, uma porção que ligaalbumina, uma porção que liga receptor Fc neonatal).
Como aqui usado, "alvo" refere-se a uma molécula biológica(por exemplo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, lipídeo, carboidrato) à qualum domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligação pode ligar. O alvopode ser, por exemplo, um alvo intracelular (por exemplo, uma proteína alvointracelular) ou um alvo de superfície celular (por exemplo, uma proteína demembrana, uma proteína receptora). Preferivelmente, o alvo é VEGF ouEGFR.
A frase "domínio variável único de imunoglobulina" refere-sea uma região variável de anticorpo (VH, VHH, Vl) quer especificamente ligaum alvo, antígeno ou epítopo independentemente de outros domínios V;entretanto, como o termo é aqui usado, um domínio variável único deimunoglobulina pode estar presente em um formato (por exemplo,heteromultímero) com outras regiões variáveis ou domínios variáveis onde asoutras regiões ou domínios não são requeridos para a ligação de antígeno pelodomínio variável de imunoglobulina única (isto é, onde o domínio variávelúnico de imunoglobulina liga antígeno independentemente dos domíniosvariáveis adicionais). Cada "domínio variável único de imunoglobulina"abrange não apenas um polipeptídeo variável de domínio único de anticorpoisolado, mas também polipeptídeos maiores que compreendem um ou maismonômeros de uma seqüência de polipeptídeo variável de domínio único deanticorpo. Um "anticorpo de domínio" ou "dAb" é o mesmo como umpolipeptídeo de "domínio variável único de imunoglobulina" como o termo éaqui usado. Um polipeptídeo de domínio variável único de imunoglobulina,como aqui usado refere-se a um polipeptídeo de domínio variável único deimunoglobulina de mamífero, preferivelmente humano, mas também incluiroedor (por exemplo, como divulgado na WO 00129004, os conteúdos daqual são aqui incorporados por referência em sua totalidade) ou dAbs Vhhcamelídeos. Como aqui usado, dAbs camelídeos são polipeptídeos de domíniovariável único de imunoglobulina que são derivados de espécies incluindocamelo, lhama, alpaca, dromedário e guanaco e compreende anticorpos decadeia pesada naturalmente destituídos de cadeia leve (Vhh)· dAbs similarespodem ser obtidos para anticorpos de cadeia simples de outra espécie, talcomo nurse shark. Os ligandos preferidos compreendem pelo menos doispolipeptídeos de domínio variável único de imunoglobulina diferentes ou pelomenos dois dAbs diferentes.
Como aqui usado "fator de crescimento endotelial vascular"(VEGF) refere-se às proteínas VEGF-A de mamífero que ocorremnaturalmente ou endógenas e às proteínas tendo uma seqüência de aminoácidoque é a mesma como aquela de uma proteína VEGF-A de mamífero queocorre naturalmente ou endógena correspondente (por exemplo, proteínasrecombinantes, proteínas sintéticas (isto é, produzida usando os métodos daquímica orgânica sintética)). Conseqüentemente, como aqui definido, o termoinclui proteína VEGF-A madura, variantes polimórficas ou alélicas e outrasisoformas de um VEGF-A (por exemplo, produzidas pela junção alternativaou outros processos celulares) e formas modificadas ou não modificadas daprecedente (por exemplo, lipidada, glicosilada). A junção alternativa de RNAque codifica VEGF-A humano (Homo sapiens) produz diversas isoformas deVEGF humano.A que difere no número de aminoácidos na seqüência deproteína. Por exemplo, isoformas aludidas como VEGF-121, VEGF-165,VEGF-189 e VEGF-206 são produzidas em seres humanos. (Ver, porexemplo, Ferrara, N., Endocrine Reviews, 25(4): 581-611 (2004)). Estasisoformas e outras isoformas que ocorrem naturalmente são expressamenteabrangidas pelo termo "VEGF". VEGF-A que ocorre naturalmente ouendógeno incluem proteínas tipo selvagem tais como VEGF-A madura5variantes polimórficas ou alélicas e outras isoformas que ocorremnaturalmente em mamíferos (por exemplo, seres humanos, primatas nãohumanos). Tais proteínas podem ser recuperadas ou isoladas de uma fonte queproduz naturalmente VEGF-A, por exemplo. Estas proteínas e proteínas tendoa mesma seqüência de aminoácido como um VEGF que ocorre naturalmenteou endógeno correspondente, são aludidos pelo nome do mamíferocorrespondente. Por exemplo, onde o mamífero correspondente é um serhumano, a proteína é designada como um VEGF humano.
Um ligando (por exemplo, domínio variável único deimunoglobulina) que inibe a ligação de VEGF ao VEGFRl ou VEGFR2 inibea ligação no ensaio de ligação de VEGFRl ou ensaio de VEGFR2 aquidescritos em pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menoscerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelomenos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95%quando o ligando é ensaiado em uma concentração de cerca de 1 nM, de cercade 10 nM, de cerca de 50 nM, de cerca de 100 nM, de cerca de 1 μΜ, de cercade 10 μΜ ou de cerca de 100 μΜ. Um ligando que inibe a ligação de VEGFao VEGFRl ou VEGFR2, também pode ou alternativamente, inibir a ligaçãono ensaio de ligação de VEGFRl ou ensaio de VEGFR2 com um IC50 decerca de 1 μΜ ou menos, de cerca de 500 nM ou menos, de cerca de 100 nMou menos, de cerca de 75 nM ou menos, de cerca de 50 nM ou menos, decerca de 10 nM ou menos ou de cerca de 1 nM ou menos.
Um ligando (por exemplo, domínio variável único deimunoglobulina) que inibe a atividade de VEGF inibe a viabilidade nobioensaio de VEGF aqui descrito em pelo menos cerca de 20%, pelo menoscerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelomenos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%,pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95%.
Um ligando (por exemplo, domínio variável único deimunoglobulina) que não inibe substancialmente a ligação de VEGF aoVEGFRl ou VEGFR2 não inibe significantemente a ligação no ensaio deligação de VEGFRl ou ensaio de VEGFR2 aqui descritos. Por exemplo, umtal ligando poderia inibir a ligação de VEGF no ensaio de ligação deVEGFRl ou ensaio de VEGFR2 aqui descrito com um IC50 de cerca de 1mM ou mais alto ou inibir a ligação em não mais do que cerca de 20%, nãomais do que cerca de 15%, não mais do que cerca de 10% ou não mais do quecerca de 5%.
Como aqui usado "receptor do fator de crescimentoepidérmico" (EGFR, ErbBl, HERl) refere-se às proteínas EGFR de mamíferoque ocorrem naturalmente ou endógenas e às proteínas tendo uma seqüênciade aminoácido que é a mesma como aquela de uma proteína de EGFR demamífero que ocorre naturalmente ou endógena correspondente (porexemplo, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (isto é, produzidausando os métodos da química orgânica sintética)). Conseqüentemente, comoaqui definido, o termo inclui proteína de EGFR madura, variantespolimórficas ou alélica e outras isoformas de um EGFR (por exemplo,produzidas pela junção alternativa ou outros processos celulares) e formasmodificadas ou não modificadas do precedente (por exemplo, lipidada,glicosilada). EGFR que ocorrem naturalmente ou endógenos incluemproteínas do tipo selvagem tal como EGFR maduro, variantes polimórficas oualélicas e outras isoformas que ocorrem naturalmente em mamíferos (porexemplo, seres humanos, primatas não humanos). Tais proteínas podem serrecuperadas ou isoladas de uma fonte que naturalmente produz EGFR, porexemplo. Estas proteínas e as proteínas tendo a mesma seqüência deaminoácido como um EGFR que ocorre naturalmente ou endógenocorrespondente, são aludidos pelo nome do mamífero correspondente. Porexemplo, onde o mamífero correspondente é um ser humano, a proteína édesignada como um EGFR humano.
Um ligando (por exemplo, domínio variável único deimunoglobulina) que inibe a ligação de EGF e/ou TGF alfa ao EGFR inibe aligação no ensaio de ligação de EGFR ou ensaio de quinase de EGFR aquidescrito com um IC50 de cerca de 1 μΜ ou menos, de cerca de 500 nM oumenos, de cerca de 100 nM ou menos, de cerca de 75 nM ou menos, de cercade 50 nM ou menos, de cerca de 10 nM ou menos ou de cerca de 1 nM oumenos.
Um ligando (por exemplo, domínio variável único deimunoglobulina) que inibe a atividade de EGFR inibe a atividade de quinasede EGFR no ensaio de quinase de EGFR aqui descrito com um IC50 de cercade 1 μΜ ou menos, de cerca de 500 nM ou menos, de cerca de 100 nM oumenos, de cerca de 75 nM ou menos, de cerca de 50 nM ou menos, de cercade 10 nM ou menos ou de cerca de 1 nM ou menos.
Um ligando (por exemplo, domínio variável único deimunoglobulina) que não inibe substancialmente a ligação de EGF ou TGFalfa ao EGFR não inibe significantemente a ligação de EGF e/ou TGF alfa aoEGFR no ensaio de ligação de receptor ou ensaio de quinase aqui descritos.Por exemplo, um tal ligando poderia inibir a ligação de EGF ou TGF alfa aoEGFR no ensaio de ligação de receptor ou ensaio de quinase aqui descritoscom um IC50 de cerca de 1 mM ou mais alto.
"Afinidade" e "avidez" são termos da técnica que descrevem aforça de uma interação de ligação. Com respeito aos ligandos da invenção,avidez refere-se à força global de ligação entre os alvos (por exemplo,primeiro alvo de superfície celular e segundo alvo de superfície celular) nacélula e o ligando. Avidez é mais do que a soma das afinidades individuaispara os alvos individuais.
Como aqui usado, "porção de toxina" refere-se a uma porçãoque compreende uma toxina. Uma toxina é um agente que tem efeitos nocivossobre ou altera a fisiologia celular (por exemplo, causa a necrose, apoptosecelulares ou inibe a divisão celular).
Como aqui usado, o termo "dose" refere-se à quantidade deligando administrada a um paciente todo de uma vez (dose unitária) ou emduas ou mais administrações em um intervalo de tempo definido. Porexemplo, a dose pode referir-se à quantidade de ligando (por exemplo,ligando que compreende um domínio variável único de imunoglobulina queliga VEGF e um domínio variável único de imunoglobulina que liga EGFR)administrados a um paciente durante o curso de um dia (24 horas) (dosediária), dois dias, uma semana, duas semanas, três semanas ou um ou maismeses (por exemplo, por uma única administração ou por duas ou maisadministrações). O intervalo entre doses pode ser qualquer quantidadedesejada de tempo.
Como aqui usado "complementar" refere-se a quando doisdomínios de imunoglobulina pertencem às famílias de estruturas que formampares cognatos ou grupos ou são derivados de tais famílias e retêm estacaracterística. Por exemplo, um domínio Vh e um domínio Vl de umanticorpo são complementares; dois domínios Vh não são complementares edois domínios Vl não são complementares. Os domínios complementarespodem ser encontrados em outros membros da superfamília daimunoglobulina, tal como os domínios Va e Vp (ou γ e δ) do receptor decélula T. Os domínios que são artificiais, tais como domínios com base nosesqueletos de proteína que não ligam epítopos a menos que engendrados paraassim fazê-lo, não são complementares. Do mesmo modo, dois domínios combase (por exemplo) em um domínio de imunoglobulina e um domínio defibronectina não são complementares.Como aqui usado, "imunoglobulina" refere-se a uma famíliade polipeptídeos que retêm a característica de dobra da imunoglobulina demoléculas de anticorpo, que contém duas folhas β e, usualmente, uma ligaçãode dissulfeto conservada. Os membros da superfamília da imunoglobulinaestão envolvidos em muitos aspectos das interações celulares e não celularesin vivo, incluindo papéis que se estendem sobre vasta área no sistema imune(por exemplo, anticorpos, moléculas receptoras de célula T e outras),envolvimento na adesão celular (por exemplo as moléculas ICAM) esinalização intracelular (por exemplo, moléculas receptoras, tais como oreceptor de PDGF). A presente invenção é aplicável a todas as moléculas dasuperfamília da imunoglobulina que possuem domínios de ligação.Preferivelmente, a presente invenção diz respeito a anticorpos.
Como aqui usado "domínio" refere-se a uma estrutura dedomínio dobrada que retêm a sua estrutura terciária independentemente doresto da proteína. No geral, os domínios são responsáveis pelas propriedadesfuncionais distintas de proteínas e em muitos casos podem ser adicionadas,removidas ou transferidas para outras proteínas sem perda de função do restoda proteína e/ou do domínio. Por domínio variável único de anticorpo éintencionado um domínio de polipeptídeo dobrado que compreendeseqüências características de domínios variáveis de anticorpo. O mesmo incluiportanto domínios variáveis de anticorpo completos e domínios variáveismodificados, por exemplo em que uma ou mais alças foram substituídas porseqüências que não são características de domínios variáveis de anticorpo oudomínios variáveis de anticorpo que foram truncados ou compreendemextensões de terminal N ou C, assim como fragmentos dobrados de domíniosvariáveis que retêm pelo menos em parte a atividade de ligação eespecificidade do domínio de tamanho natural. Assim, cada ligandocompreende pelo menos dois domínios diferentes.
"Repertório" Uma coleção de diversas variantes, por exemplovariantes de polipeptídeo que diferem em sua seqüência primária. Umabiblioteca usada na presente invenção abrangerá um repertório depolipeptídeos que compreende pelo menos 1000 membros.
"Biblioteca" O termo biblioteca refere-se a uma mistura depolipeptídeos ou ácidos nucleicos heterogêneos. A biblioteca é composta demembros, cada um dos quais tem uma única seqüência de polipeptídeo ouácido nucleico. Neste âmbito, biblioteca é sinônimo de repertório. Asdiferenças de seqüência entre os membros da biblioteca são responsáveis peladiversidade presente na biblioteca. A biblioteca pode tomar a forma de umamistura simples de polipeptídeos ou ácidos nucleicos ou pode estar na formade organismos ou células, por exemplo bactérias, vírus, células animal ouvegetal e outras, transformadas com uma biblioteca de ácidos nucleicos.Preferivelmente, cada organismo ou célula individuais contêm apenas um ouum número limitado de membros da biblioteca. Vantajosamente, os ácidosnucleicos são incorporados em vetores de expressão, de modo a permitir aexpressão dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos. Em umaspecto preferido, portanto, uma biblioteca pode tomar a forma de umapopulação de organismos hospedeiros, cada organismo contendo uma ou maiscópias de um vetor de expressão contendo um único membro da biblioteca naforma de ácido nucleico que pode ser expressado para produzir o seu membrode polipeptídeo correspondente. Assim, a população de organismoshospedeiros tem o potencial para codificar um grande repertório de variantesde polipeptídeo geneticamente diversas.
Como aqui usado um anticorpo refere-se a IgG, IgM, IgA, IgDou IgE ou um fragmento (tal como um Fab, F(ab')2, Fv, Fv ligado adissulfeto, scFv, anticorpo multiespecífico de conformação fechada, scFvligado a dissulfeto, diacorpo) seja derivado de qualquer espécie quenaturalmente produz um anticorpo ou criado pela tecnologia de DNArecombinante; seja isolado do soro, células B, hibridomas, transfectomas,levedura ou bactérias.
Como aqui descrito um "antígeno' é uma molécula que éligada por um domínio de ligação de acordo com a presente invenção.Tipicamente, os antígenos são ligados pelos ligandos de anticorpo e sãocapazes de incitar uma resposta de anticorpo in vivo. Estes podem ser umpolipeptídeo, proteína, ácido nucleico ou outra molécula. No geral, osligandos específicos duplos de acordo com a invenção são selecionadosquanto a especificidade de alvo contra dois alvos particulares (por exemplo,antígenos). No caso de anticorpos convencionais e fragmentos destes, o sítiode ligação de anticorpo definido pelas alças variáveis (LI, L2, L3 e Hl, H2,H3) é capaz de ligação ao antígeno.
Um "epítopo" é uma unidade de estrutura convencionalmenteligado por um par de VH/VL de imunoglobulina. Os epítopos definem o sítiode ligação mínimo para um anticorpo e assim representam o alvo deespecificidade de um anticorpo. No caso de um anticorpo de domínio único,um epítopo representa a unidade de ligação de estrutura por um domíniovariável na isolação.
"Matriz Universal" refere-se a uma seqüência de matriz deanticorpo único que corresponde às regiões de um anticorpo conservado naseqüência como definido por Rabat ("Sequences of Proteins ofImmunological Interest", US Department of Health and Human Services) ouque corresponde ao repertório ou estrutura da imunoglobulina da linhagerminativa humana como definido por Chotia e Lesk, (1987) J. Mol. Biol.196: 910-917. A invenção fornece o uso de uma única matriz ou um conjuntode tais matrizes, que foi descoberto permitir a derivação de virtualmentequalquer especificidade de ligação não obstante a variação nas regiõeshipervariáveis sozinhas.
A frase, "meia-vida," refere-se ao tempo tomado para aconcentração sérica do ligando reduzir em 50%, in vivo, por exemplo devido àdegradação do ligando e/ou depuração ou seqüestro do ligando duploespecífico pelos mecanismos naturais. Os ligandos da invenção sãoestabilizados in vivo e a sua meia-vida aumentada pela ligação às moléculasque resistem à degradação e/ou depuração ou seqüestro. Tipicamente, taismoléculas são proteínas que ocorrem naturalmente que por si só têm umameia-vida longa in vivo. A meia-vida de um ligando é aumentada se a suaatividade funcional persiste, in vivo, por um período mais longo do que umligando similar que não é específico para a molécula que aumenta a meia-vida. Assim um ligando específico para HSA e duas moléculas alvo sãocomparados com o mesmo ligando em que a especificidade ao HSA não estápresente, isto é não liga HSA mas liga uma outra molécula. Por exemplo, omesmo pode ligar um terceiro alvo na célula. Tipicamente, a meia-vida éaumentada em 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou mais. Aumentos na faixa de 2x,3x, 4x, 5x, IOx, 20x, 30x, 40x, 50x ou mais da meia-vida são possíveis.Alternativamente ou além disso, aumentos na faixa de até 3Ox, 40x, 5Ox, 60x,70x, 80x, 90x, IOOx, 150x da meia-vida são possíveis.
Como aqui aludido, o termo "compete" significa que a ligaçãode um primeiro alvo ao seu domínio de ligação alvo cognato é inibido quandoum segundo alvo é ligado ao seu domínio de ligação alvo cognato. Porexemplo, a ligação pode ser inibida estericamente, por exemplo pelo bloqueiofísico de um domínio de ligação ou pela alteração da estrutura ou ambiente deum domínio de ligação tal que a sua afinidade ou avidez para um alvo sejareduzida.
Como aqui usado, os termos "severidade baixa," "severidademédia," "severidade alta," ou "condições de severidade muito alta"descrevem condições para a hibridização de ácido nucleico e lavagem.Orientação para realizar reações de hibridização pode ser encontrada emCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ν. Y. (1989),6.3.1-6.3.6, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Osmétodos aquosos e não aquosos são descritos em que a referência e cada umpodem ser usados. As condições de hibridização específicas aqui aludidas sãocomo segue: (1) condições de hibridização de severidade baixa em 6X cloretode sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por duas lavagensem 0,2X SSC, 0,1% de SDS pelo menos a 50°C (a temperatura das lavagenspode ser aumentada para 55°C para condições de severidade baixa); (2)condições de hibridização de severidade média em 6X SSC a cerca de 45°C,seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 60°C; (3)condições de hibridização de severidade alta em 6X SSC a cerca de 45°C,seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 65°C; epreferivelmente (4) condições de hibridização de severidade muito alta são0,5 M de fosfato de sódio, 7% de SDS a 65°C, seguido por uma ou maislavagens em 0,2X SSC, 1% de SDS a 65°C. Condições de severidade muitoalta (4) são as condições preferidas e aquelas que devem ser usadas a menosque de outro modo especificado.
Seqüências similares ou homólogas (por exemplo, pelo menosde cerca de 70% de identidade de seqüência) às seqüências aqui divulgadastambém são parte da invenção. Em algumas formas de realização, aidentidade de seqüência ao nível de aminoácido pode ser de cerca de 80%,85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais alto.Ao nível de ácido nucleico, a identidade de seqüência pode ser de cerca de70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% ou mais alta. Alternativamente, identidade substancial existe quando ossegmentos de ácido nucleico hibridizarão sob condições de hibridizaçãoseletiva (por exemplo, condições de hibridização de severidade muito alta), aocomplemento do filamento. Os ácidos nucleicos podem estar presentes emcélulas inteiras, em um lisado de célula ou em uma forma parcialmentepurificada ou substancialmente pura.
Os cálculos de "homologia" ou "identidade de seqüência" ou"similaridade" entre duas seqüências (os termos são aqui usadosintercambiavelmente) são realizados como segue. As seqüências sãoalinhadas com propósitos de comparação ótima (por exemplo, intervalo spodem ser introduzidos em uma ou ambas de uma primeira e uma segundaseqüência de aminoácido ou ácido nucleico para alinhamento ótimo e asseqüências não homólogas podem ser desconsideradas para os propósitos decomparação). Em uma forma de realização preferida, o comprimento de umaseqüência de referência alinhada com propópsitos de comparação é de pelomenos 30%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelomenos 50%, ainda mais preferivelmente pelo menos 60% e ainda maispreferivelmente pelo menos 70%, 80%, 90% ou 100% do comprimento daseqüência de referência. Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeo nasposições de aminoácido correspondentes ou posições de nucleotídeo sãodepois comparadas. Quando uma posição na primeira seqüência é ocupadapelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posiçãocorrespondente na segunda seqüência, então as moléculas são idênticasnaquela posição (como aqui usado "homologia" de aminoácido ou ácidonucleico é equivalente a "identidade" de aminoácido ou ácido nucleico). Aidentidade percentual entre as duas seqüências é uma função do número deposições idênticas compartilhadas pelas seqüências, levando-se em conta onúmero de intervalos e o comprimento de cada intervalo, que necessita serintroduzido para o alinhamento ótimo das duas seqüências.
Os alinhamentos de seqüência de aminoácido e nucleotídeo ehomologia, similaridade ou identidade, como aqui definido sãopreferivelmente preparados e determinados usando o algoritmo BLAST 2Sequences, usando parâmetros de valor pré definido (Tatusova, T. A. et al.,FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999)). Alternativamente, o algoritmoBLAST (versão 2.0) é utilizado para o alinhamento de seqüência, com osparâmetros ajustados aos valores pré definidos. BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool) é o algoritmo de procura heurística utilizado pelosprogramas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx; estes programas atribuemsignificância às suas descobertas usando os métodos estatísticos de Karlin eAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87(6): 2264-8.
A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicose científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmenteentendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica (por exemplo, emcultura de célula, genéticas moleculares, química de ácido nucleico, técnicasde hibridização e bioquímica). Técnicas padrão são usadas para métodosmoleculares, genéticos e bioquímicos (ver no geral, Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al., Short Protocolsin Molecular Biology (1999) 4a Ed, John Wiley & Sons, Inc. que são aquiincorporados por referência) e métodos químicos.
A invenção diz respeito a ligandos que têm especificidade deligação para VEGF (por exemplo, VEGF humano), ligandos que têmespecificidade de ligação para EGFR (por exemplo, EGFR humano) e aosligandos que têm especificidade de ligação para VEGF e EGFR (por exemplo,VEGF humano e EGFR humano). Por exemplo, o ligando pode compreenderum domínio de polipeptídeo tendo um sítio de ligação com especificidade deligação para VEGF, um domínio de polipeptídeo tendo um sítio de ligaçãocom especificidade de ligação para EGFR ou compreendendo um domínio depolipeptídeo tendo um sítio de ligação com especificidade de ligação paraVEGF e um domínio de polipeptídeo tendo um sítio de ligação comespecificidade de ligação para EGFR.
Os ligandos da invenção fornecem diversas vantagens. Porexemplo, como aqui descrito, o ligando pode ser feito de encomenda para teruma meia-vida sérica in vivo desejada. Assim, os ligandos podem ser usadospara controlar, reduzir ou eliminar a toxicidade geral de agentes terapêuticos,tais como a citotoxina usada para tratar câncer. Além disso, dAbs são muitomenores do que anticorpos convencionais e podem ser administrados para seobter melhor penetração de tecido do que os anticorpos convenci onais. Assim,dAbs e ligandos que compreendem um dAb fornecem vantagens em relaçãoaos anticorpos convencionais quando administrados para tratar câncer, porexemplo pelo alvejamento de tumores sólidos. Além disso, muitos cânceressupraexpressam EGFR e ligandos que têm especificidade de ligação paraEGFR e VEGF podem ser administrados para alvejar a atividade inibitória deVEGF aos tumores ou o ambiente de células cancerosas. Este método forneceduas atividades benéficas diretamente ao sítio de um tumor ou câncer, isto é,atividade anticâncer direta pela ligação ao EGFR e inibição da ligação deligandos (por exemplo, EGF, TGF alfa) ao receptor e inibição da angiogêneseque sustenta a formação e desenvolvimento de tumor. Conseqüentemente,ligandos que têm especificidade de ligação para VEGF e EGFR podem seradministrados a um paciente com câncer (por exemplo, câncer que expressaEGFR) para fornecer terapia superior usando um único agente terapêutico.
Além disso, os sinais transduzidos através da EGFR podemlevar à produção de fatores angiogênicos, tais como VEGF. As célulascancerosas (por exemplo, em um tumor) que expressam ou supraexpressamEGFR podem produzir um alto nível de VEGF que atua localmente parainduzir a formação de vasculatura de tumor. Conseqüentemente, os ligandosda invenção que têm especificidade de ligação para VEGF e EGFR podem seradministrados a um paciente para alvejar a liberação da atividade do inibidorde VEGF do ligando às células que superexpressam EGFR.Conseqüentemente, a terapia anti-angiogênica pode ser liberadaespecificamente aos sítios onde VEGF está sendo produzida (por exemplo, àscélulas que superexpressam EGFR).
Em algumas formas de realização, o ligando temespecificidade de ligação para VEGF e compreende um (pelo menos um)domínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação paraVEGF. Em outras formas de realização, o ligando tem especificidade deligação para EGFR e compreende um (pelo menos um) domínio variávelúnico de imunoglobulina com especificidade de ligação para EGFR. em certasformas de realização, o ligando tem especificidade de ligação para VEGF eEGFR e compreende um (pelo menos um) domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF e um (pelo menosum) domínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligaçãopara EGFR.
O ligando da invenção pode ser formatado como aqui descrito.Por exemplo, o ligando da invenção pode ser formatado para adaptar a meia-vida sérica in vivo. Se desejado, o ligando pode compreender ainda umatoxina ou uma porção de toxina como aqui descritas. Em algumas formas derealização, o ligando compreende uma toxina ativa na superfície, tal como umgerador de radical livre (por exemplo, toxina contendo selênio) ou umradionuclídeo. Em outras formas de realização, a toxina ou porção de toxina éum domínio de polipeptídeo (por exemplo, um dAb) tendo um sítio de ligaçãocom especificidade de ligação para um alvo intracelular. Em formas derealização particulares, o ligando é um formato equivalente a IgG que tenhaespecificidade de ligação para VEGF e EGFR (por exemplo, VEGF humano eEGFR humano).
Formatos de Ligando
O ligando da invenção pode ser formatado como um ligandomonoespecífico, específico duplo ou multiespecífico como aqui descrito. Ver,também a WO 03/002609, as divulgações inteiras das quais são aquiincorporadas por referência, com respeito à formatação de ligando. Taisligandos específicos duplos compreendem domínios variáveis únicos deimunoglobulina que têm especificidades de ligação diferentes. Tais ligandosespecíficos duplos podem compreender combinações de domínios de cadeiapesada e leve. Por exemplo, o ligando duplo específico pode compreender umdomínio Vh e um domínio VL, que pode ser ligado junto com na forma de umscFv (por exemplo, usando um ligador adequado tal como Gly4Ser) ouformatado em um anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação de antígenodeste (por exemplo, fragmento F(ab')2). Os ligandos específicos duplos nãocompreendem pares VH/VL complementares que formam um sítio de ligaçãode antígeno de anticorpo de duas cadeias convencionais que liga antígeno ouepítopo cooperativãmente. Ao invés, os ligandos de formato duplocompreendem um par complementar VhNl, em que os domínios V têmespecificidades de ligação diferentes.
Além disso, os ligandos específicos duplos podemcompreender um ou mais domínios Ch ou Cl se desejado. Uma região dedobradiça também pode ser incluída se desejado. Tais combinações dedomínios podem, por exemplo, imitar anticorpos naturais, tais como IgG ouIgM ou fragmentos destes, tais como moléculas Fv, scFv, Fab ou F(ab')2.Outras estruturas, tais como um ramo único de uma molécula IgG quecompreende domínios VH, VL, Ch e CL, são considerados. Preferivelmente, oligando específico duplo da invenção compreende apenas dois domíniosvariáveis embora diversos de tais ligandos possam ser incorporados junto coma mesma proteína, por exemplo dois de tais ligandos podem ser incorporadosem um IgG ou uma imunoglobulina multimérica, tal como IgM.Alternativamente, em uma outra forma de realização uma pluralidade deligandos específicos duplos é combinada para formar um multímero. Porexemplo, dois ligandos específicos duplos diferentes são combinados paracriar uma molécula tetra-específica. Será avaliado por uma pessoa habilitadana técnica que as regiões variáveis leve e pesada de um ligando específicoduplo produzidas de acordo com o método da presente invenção podem estarna mesma cadeia de polipeptídeo ou alternativamente, em cadeias depolipeptídeo diferentes. No caso em que as regiões variáveis estão em cadeiasde polipeptídeo diferentes, então elas podem ser ligadas por intermédio de umligador, no geral um ligador flexível (tal como uma cadeia de polipeptídeo),um grupo de ligação química ou qualquer outro método conhecido na técnica.
Os ligandos podem ser formatados como anticorpos oufragmentos de anticorpo bi- ou multiespecíficos ou em estruturas que não deanticorpo bi- ou multiespecíficos. Os formatos adequados incluem, qualquerestrutura de polipeptídeo adequada em que um domínio variável de anticorpoou uma ou mais das suas CDRs podem ser incorporados de modo a conferirespecificidade de ligação para antígeno na estrutura. Uma variedade deformatos de anticorpo adequados são conhecidos na técnica, tais como,formato biespecífico equivalente a IgGs (por exemplo, anticorpos quiméricos,anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos de cadeia simples,heterodímeros de cadeias pesadas e/ou cadeias leves de anticorpo, fragmentosde ligação de antígeno de qualquer um dos precedentes (por exemplo, umfragmento de Fv (por exemplo, Fv de cadeia única (scFv), um Fv ligado adissulfeto), um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2),um domínio variável único (por exemplo, VH, VL, Viffl), um dAb e versõesmodificadas de qualquer um dos precedentes (por exemplo, modificados pelaligação covalente de polialquileno glicol (por exemplo, polietileno glicol,polipropileno glicol, polibutileno glicol) ou outro polímero adequado). Ver, aPCT/GB03/002804, depositada em 30 de junho de 2003, que designou osEstados Unidos, (WO 2004/081026) no que diz respeito aos domíniosvariáveis únicos PEGuilados e dAbs, métodos adequados para preparar osmesmos, meia vida in vivo aumentada dos domínios variáveis únicosPEGuilados e monômeros e multímeros de dAb, PEGs adequados, tamanhoshidrodinâmicos preferidos de PEGs e tamanhos hidrodinâmicos preferidos dedomínios variáveis únicos PEGuilados e monômeros e multímeros de dAb. Adivulgação inteira da PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026), incluindo aspartes aludidas acima, são aqui incorporadas por referência.O ligando pode ser formatado usando um ligador adequado talcomo (Gly4Ser)n, onde η = de 1 a 8, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. Sedesejado, ligandos, incluindo monômeros, dímeros e trímeros de dAb, podemser ligados a uma região de anticorpo Fc5 que compreende um ou ambos dedomínios CH2 e CH3 e opcionalmente uma região de dobradiça. Por exemplo,vetores que codificam ligandos ligados como uma seqüência de nucleotídeoúnica a uma região Fc podem ser usados para preparar tais polipeptídeos.
Ligandos e monômeros de dAb também podem sercombinados e/ou formatados em estruturas de multi-ligando que não deanticorpo para formar complexos multivalentes, que ligam moléculas alvocom o mesmo antígeno, fornecendo deste modo avidez superior. Por exemploreceptores bacterianos naturais tais como SpA podem ser usados comoesqueletos para o enxerto de CDRs para gerar ligandos que se ligamespecificamente a um ou mais epítopos. Detalhes deste procedimento sãodescritos na US 5.831.012. Outros esqueletos adequados incluem aqueles combase na fibronectina e aficorpos. Os detalhes de procedimentos adequados sãodescritos na WO 98/58965. Outros esqueletos adequados incluem lipocalina eCTLA4, como descrito em van den Beuken et al., J. Mol. Biol. 310: 591-601(2001) e esqueletos tais como aqueles descritos na WO 00/69907 (MedicaiResearch Council), que são com base por exemplo na estrutura de anel deGroEL bacteriano ou outros polipeptídeos acompanhantes. Os esqueletos deproteína podem ser combinados; por exemplo, as CDRs podem ser enxertadasem um esqueleto de CTLA4 e usadas juntas com domínios Vh ou Vl daimunoglobulina para formar um ligando. Do mesmo modo, fibronectina,lipocalina e outros esqueletos podem ser combinados.
Uma variedade de métodos adequados para preparar qualquerformato desejado é conhecida na técnica. Por exemplo, cadeias e formatos deanticorpo (por exemplo, formato biespecífico equivalente às IgGs, anticorposquiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos decadeia simples, homodímeros e heterodímeros de cadeias pesadas e/oucadeias leves de anticorpo) podem ser preparados pela expressão deconstruções de expressão adequados c/ou cultura de células, adequadas (porexemplo, hibridomas, heteroibridomas, células hospedeiras recombinantescontendo construções recombinantes que codificam o formato). Além disso,formatos tais como fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos oucadeias de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação biespecífica, taiscomo um fragmento Fv (por exemplo, Fv de cadeia única (scFv), um Fvligado a dissulfeto), um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmentoF(ab')2), podem ser preparados pela expressão de construções de expressãoadequados ou pela digestão enzimática de anticorpos, por exemplo usandopapaína ou pepsina.
O ligando r>ode ser formatado como um lieandomultiespecífico, por exemplo como descrito na WO 03/002609, asdivulgações inteiras da qual são aqui incorporadas por referência. Tal ligandomultiespecífico possui mais do que uma especificidade de ligação de epítopo.
No geral, o ligando multi-específico compreende dois ou mais domínios deligação de epítopo, tais como dAbs ou domínio de proteína que não deanticorpo que compreende um sítio de ligação para um epítopo, por exemplo,um aficorpo, um domínio de SpA, um domínio classe A de receptor de LDL,um domínio de EGF, um avímero. Os ligandos multiespecíficos podem serformatados ainda como aqui descrito.
Em algumas formas de realização, o ligando é um formatoequivalente a IgG. Tais formatos têm a estrutura de quatro cadeiasconvencionais de uma molécula IgG (2 cadeias pesadas e duas cadeias leves),em que uma ou mais das regiões variáveis (VH e ou VL) foram substituídascom um dAb ou domínio variável único de uma especificidade desejada.Preferivelmente, cada uma das regiões variáveis (2 regiões Vh e 2 regiões Vl)é substituída com um dAb ou domínio variável único. O(s) dAb(s) oudomínio(s) variável(is) único(s) que é/são incluído(s) em um formatoequivalente a IgG pode(m) ter a mesma especificidade ou especificidadesdiferentes. Em algumas formas de realização, o formato equivalente a IgG étetravalente e pode ter uma, duas, três ou quatro especificidades. Por exemplo,o formato equivalente a IgG pode ser monoespecífico e compreender 4 dAbsque tenham a mesma especificidade; biespecífica e compreender 3 dAbs quetenham a mesma especificidade e um outro dAb que tenha uma especificidadediferente; biespecífica e compreender dois dAbs que tenham a mesmaespecificidade e dois dAbs que tenham uma especificidade comum masdiferente; triespecífica e compreender primeiro e segundo dAbs que tenham amesma especificidade, um terceiro dAb com uma especificidade diferente eum quarto dAb com uma especificidade diferente do primeiro, segundo eterceiro dAbs; ou tetraespecífica e compreender quatro dAbs que cada um temuma especificidade diferente. Fragmentos de ligação de antígeno de formatosequivalentes a IgG (por exemplo, Fab, F(ab')2, Fab', Fv5 scFv) podem serpreparados. Além disso, uma região constante particular da porção Fc (porexemplo, de uma IgG, tal como IgGl), variante ou porção desta pode serselecionada de modo a adaptar a função efetora. Por exemplo, se a função deativação de complemento e/ou de citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC) é desejada, o ligando pode ser um Formato equivalente aIgG1. Se desejado, o formato equivalente a IgG pode compreender um regiãoconstante mutada (região constante de cadeia pesada de IgG variante) paraminimizar a ligação aos receptores Fc e/ou capacidade para fixarcomplemento, (ver por exemplo, Winter et al, GB 2.209.757 B; Morrison etal., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, 22 de dezembro de 1994).
Os ligandos da invenção podem ser formatados como umaproteína de fusão que contém um primeiro domínio variável único deimunoglobulina que é fundido diretamente a um segundo domínio variávelúnico de imunoglobulina. Se desejado um tal formato pode compreenderainda uma porção que prolonga a meia-vida. Por exemplo, o ligando podecompreender um primeiro domínio variável único de imunoglobulina que éfundido diretamente a um seeundo domínio variável único de imunoglobulinaque é fundido diretamente a um domínio variável único de imunoglobulinaque liga albumina sérica.
No geral a orientação dos domínios de polipeptídeo que têmum sítio de ligação com especificidade de ligação para um alvo e se o ligandocompreender um ligador, é uma questão de escolha de planejamento.Entretanto, algumas orientações, com ou sem ligadores, podem fornecercaracterísticas de ligação melhores do que as outras orientações. Todas asorientações (por exemplo, dAbl-ligador-dAb2; dAb2-ligador-dAbl) que sãoabrangidas pela invenção são ligandos que contêm uma orientação quefornece características de ligação desejadas podem ser facilmenteidentificadas pela triagem.
Formatos Que Prolongam a Meia-Vida
Os ligandos e monômeros dAb aqui divulgados podem serformatados para prolongar a sua meia-vida sérica in vivo. A meia-vida in vivoaumentada é útil em aplicações in vivo de imunoglobulinas, especialmenteanticorpos e mais especialmente fragmentos de anticorpo de tamanhopequeno tais como dAbs. Tais fragmentos (Fvs, Fvs ligados a dissulfeto,Fabs, scFvs, dAbs) são rapidamente depurados do corpo, o que pode limitaras aplicações clínicas.
Um ligando pode ser formatado como um fragmento deligação de antígeno maior de um anticorpo ou como um anticorpo (porexemplo, formatado como um Fab3 Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv) que têmtamanho hidrodinâmico grande. Os ligandos também podem ser formatadospara ter um tamanho hidrodinâmico grande, por exemplo, pela ligação de umgrupo de polialquileno glicol (por exemplo, grupo de polietileno glicol (PEG),polipropileno glicol, polibutileno glicol), albumina sérica, transferrina,receptor de transferrina ou pelo menos a sua porção de ligação de transferrina,uma região de anticorpo Fc ou pela conjugação a um domínio de anticorpo.
Em algumas formas de realização, o lisando Cnor exemplo, monômero dedAb) é PEGuilado. Preferivelmente o ligando PEGuilado (por exemplo,monômero de dAb) liga VEGF e/ou EGFR substancialmente com a mesmaafinidade ou avidez como o mesmo ligando que não é PEGuilado. Porexemplo, o ligando pode ser um ligando PEGuilado que compreende um dAbque liga VEGF ou EGFR com uma avidez que difere da avidez de ligando naforma não PEGuilada em não mais do que um fator de cerca de 1000,preferivelmente não mais do que um fator de cerca de 100, maispreferivelmente não mais do que um fator de cerca de 10 ou com avidezsubstancialmente inalterada de afinidade relativa à forma não PEGuilada. Ver,a PCT/GB03/002804, depositada em 30 de junho de 2003, que designou osEstados Unidos, (WO 2004/081026) com respeito aos domínios variáveisúnicos PEGuilados e dAbs, métodos adequados para preparar os mesmos,meia-vida in vivo aumentada dos domínios variáveis únicos PEGuilados emonômeros e multímeros de dAb, PEGs adequados, os tamanhoshidrodinâmicos preferidos de PEGs e tamanhos hidrodinâmicos preferidos dedomínios variáveis únicos PEGuilados e monômeros e multímeros dAb. Adivulgação inteira da PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026), incluindo aspartes aludidas acima, são aqui incorporadas por referência.
O tamanho hidrodinâmico dos ligandos (por exemplo,monômeros e multímeros dAb) da invenção pode ser determinado usandométodos que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a cromatografia defiltração em gel pode ser usada para determinar o tamanho hidrodinâmico deum ligando. As matrizes de filtração em gel adequadas para determinar ostamanhos hidrodinâmicos de ligandos, tais como matrizes de agarosereticuladas, são bem conhecidas e facilmente disponíveis.
O tamanho de um formato de ligando (por exemplo, o tamanhode uma porção de PEG ligada a um monômero de dAb), pode ser variadodependendo da aplicação desejada. Por exemplo, onde o ligando éintencionado para deixar a circulacão e entrar nos tecidos perifericos, edesejável manter o tamanho hidrodinâmico do ligando baixo para facilitar aextravasação da corrente sangüínea. Alternativamente, onde é desejado ter oligando persistindo na circulação sistêmica por um período de tempo maislongo o tamanho do ligando pode ser aumentado, por exemplo pelaformatação como uma proteína equivalente a Ig ou pela adição de uma porçãode PEG de 30 a 60 kDa (por exemplo, PEG de 30 a PEG de 40 kDa linearesou ramificados, tal como a adição de duas porções de PEG de 20 kDa). Otamanho do formato de ligando pode ser adaptado para se obter uma meia-vida sérica in vivo desejada, por exemplo para controlar a exposição a umatoxina e/ou para reduzir os efeitos colaterais de agentes tóxicos.
O tamanho hidrodinâmico de ligando (por exemplo,monômero de dAb) e a sua meia-vida sérica também podem ser aumentadospela conjugação ou ligação do ligando a um domínio de ligação (por exemplo,anticorpo ou fragmento de anticorpo) que liga um antígeno ou epítopo queaumenta a meia-vida in vivo, como aqui descrito. Por exemplo, o ligando (porexemplo, monômero de dAb) pode ser conjugado ou ligado a um anticorpoanti-albumina sérica ou anti-receptor Fc neonatal ou fragmento de anticorpo,por exemplo, um dAb anti-SA ou anti-receptor Fc neonatal, Fab, Fab' ou scFvou a um aficorpo anti-SA ou aficorpo anti-receptor Fc neonatal.
Os exemplos de albumina, fragmentos de albumina ouvariantes de albumina adequados para o uso em um ligando de acordo com ainvenção são descritos na WO 2005/077042A2, que é aqui incorporado porreferência em sua totalidade. Em particular, os seguintes de albumina,fragmentos de albumina ou variantes de albumina podem ser usados napresente invenção:
• SEQ ID NO: 1 como divulgada na WO 2005/077042A2,(esta seqüência sendo explicitamente incorporada na presente divulgação porreferência);
• Fragmento ou variante de albumina que compreende ouque consiste dos aminoácidos 1 a 387 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2;
• Albumina ou fragmento ou variante desta, quecompreendam uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo queconsiste de: (a) aminoácidos 54 a 61 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2 (b) aminoácidos 76 a 89 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2 (c) aminoácidos 92 a 100 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2 (d) aminoácidos 170 a 176 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2 (e) aminoácidos 247 a 252 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2 (f) aminoácidos 266 a 277 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2 (g) aminoácidos 280 a 288 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2 (h) aminoácidos 362 a 368 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2 (i) aminoácidos 439 a 447 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2 (j) aminoácidos 462 a 475 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2; (k) aminoácidos 478 a 486 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2; e (1) aminoácidos 560 a 566 da SEQ ID NO: 1 na WO2005/077042A2.
Outros exemplos de albumina, fragmentos e análogosadequados para o uso em um ligando de acordo com a invenção são descritosna WO 03/076567A2, que é aqui incorporada por referência em suatotalidade. Em particular, os seguintes de albumina, fragmentos ou variantespodem ser usados na presente invenção:
• Albumina sérica humana como descrita na WO03/076567A2, por exemplo, na Figura 3 (esta informação de seqüência sendoexplicitamente incorporada na presente divulgação por referência);
• Albumina sérica humana (HA) que consiste de uma cadeiade polipeptídeo única não glicosilada de 585 aminoácidos com um pesomolecular da fórmula de 66.500 (Ver, Meloun, et al., FEBS Letters 58: 136(1975); Behrens, et al., Fed. Prot. 34: 591 (1975); Lawn, et al., Nucleic AcidsResearch 9: 6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. BioL Chem. 261: 6747(1986));
• Uma variante ou análogo ou fragmento polimórficos dealbumina como descritos em Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37: 219(1973);
• Um fragmento ou variante de albumina como descritos naEP 322094, por exemplo, HA(l-373), HA(l-388), HA(l-389), HA(l-369) eHA(1-419) e fragmentos entre 1-369 e 1-419;
• Um fragmento ou variante de albumina como descritos naEP 399666, por exemplo, HA(1-177) e HA( 1-200) e fragmentos entre HA(1-X), onde X é qualquer número de 178 a 199.
Onde uma (uma ou mais) porção que estende a meia-vida (porexemplo, albumina, transferrina e fragmentos e análogos destes) é usada nosligandos da invenção, esta pode ser conjugada ao ligando usando qualquermétodo adequado, tal como, pela fusão direta à porção de ligação alvo (porexemplo, dAb ou fragmento de anticorpo), por exemplo pelo uso de umaconstrução de nucleotídeo única que codifica uma proteína de fusão, em que aproteína de fusão é codificada como uma cadeia de polipeptídeo única com aporção que prolonga a meia-vida localizada no terminal N ou C em relação ásporções que ligam alvo da superfície celular. Alternativamente, a conjugaçãopode ser obtida pelo uso de um ligador de peptídeo entre as porções, porexemplo, um peptídeo ligador como descrito na WO 03/076567A2 ou WO2004/003019 (estas divulgações de ligador sendo incorporadas por referênciana presente divulgação para fornecer exemplos para o uso na presenteinvenção). Tipicamente, um polipeptídeo que realça a meia-vida sérica in vivoé um polipeptídeo que ocorre naturalmente in vivo e que resiste à degradaçãoou remoção pelos mecanismos endógenos que removem material nãodesejado do organismo (por exemplo, ser humano). Por exemplo, umpolipeptídeo aue realça a meia-vi da sérica ivi vivo pode ser selecionado deproteínas da matriz extracelular, proteínas encontradas no sangue, proteínasencontradas na barreira hematoencefálica ou em tecido neural, as proteínaslocalizadas ao rim, fígado, pulmão, coração, pele ou osso, proteínas deestresse, proteínas específicas de doença ou proteínas envolvidas notransporte de Fc.
Os polipeptídeos adequados que realçam a meia-vida sérica invivo incluem, por exemplo, proteínas de fusão de agente neurofarmacêuticoφ de ligando específico do receptor de transferrina (ver a Patente U.S. N-5.977.307, as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência),receptor de célula endotelial capilar cerebral, transferrina, receptor detransferrina (por exemplo, receptor de transferrina solúvel), insulina, receptordo fator de crescimento equivalente a insulina 1 (IGF 1), receptor do fator decrescimento equivalente a insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina, fator X decoagulação sangüínea, αΐ-antitripsina e HNF Ια. Os polipeptídeos adequadosque realçam a meia-vida sérica também incluem a glicoproteína alfa-1(orosomucóide; AAG), alfa-1 antiquimiotripsina (ACT), microglobulina alfa-1 (proteína HC; AIM), antitrombina III (AT III), apolipoproteína A-I (Apo A-1), apolipoproteína B (Apo B), ceruloplasmina (Cp), componente decomplemento C3 (C3), componente de complemento C4 (C4), inibidor daesterase Cl (Cl INH), proteína reativa C (CRP), ferritina (FER), hemopexina(HPX), lipoproteína(a) (Lp(a)), proteína de ligação de manose (MBP),mioglobina (Myo), pré albumina (transtiretina; PAL), proteína de ligação deretinol (RBP) e fator reumatóide (RF).
As proteínas adequadas da matriz extracelular incluem, porexemplo, colágenos, lamininas, integrinas e fibronectina. Colágenos são asproteínas maiores da matriz extracelular. Cerca de 15 tipos de moléculas decolágeno são correntemente conhecidos, encontrados em diferentes partes docorpo, por exemplo, colágeno tipo I (responsável por 90% do colágeno docorpo) encontrado no osso, pele. tendão, ligamentos. cómea, órgãos internosou colágeno tipo II encontrado na cartilagem, disco vertebral, notocorda ehumor vítreo do olho.
As proteínas adequadas do sangue incluem, por exemplo,proteínas plasmáticas (por exemplo, fibrina, macroglobulina a-2, albuminasérica, fibrinogênio (por exemplo, fibrinogênio A, fibrinogênio B), proteína Aamilóide sérica, haptoglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina e β-2-microglobulina), enzimas e inibidores de enzima (por exemplo,plasminogênio, lisozima, cistatina C, alfa-l-antitripsina e inibidor da tripsinapancreática), proteínas do sistema imune, tais como proteínas deimunoglobulina (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, cadeias leves deimunoglobulina (capa/lambda)), proteínas de transporte (por exemplo,proteína de ligação de retinol, microglobulina a-1), defensinas (por exemplo,beta-defensina 1, defensina 1 de neutrófilo, defensina 2 de neutrófilo edefensina 3 de neutrófilo) e outras.
As proteínas adequadas encontradas na barreirahematoencefálica ou em tecido neural incluem, por exemplo, receptor demelanocortina, mielina, transportador de ascorbato e outras.
Os polipeptídeos adequados que realçam a meia-vida sérica invivo também incluem proteínas localizadas no rim (por exemplo, policistina,colágeno tipo IV, transportador de ânion orgânico Kl, antígeno de Heymann),proteínas localizadas no fígado (por exemplo, álcool desidrogenase, G250),proteínas localizadas no pulmão (por exemplo, componente secretor, que ligaIgA), proteínas localizadas no coração (por exemplo, HSP 27, que estáassociada com a cardiomiopatia dilatada), proteínas localizadas na pele (porexemplo, queratina), proteínas específicas de osso tais como proteínasmorfogênicas (BMPs), que são um subconjunto da superfamília β do fator docrescimento transformante de proteínas que demonstram atividadeosteogênica (por exemplo, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), proteínas específicas de tumor (por exemplo5 antígeno trofoblasto, receptorde herceptina, receptor de estrogênio, catepsinas (por exemplo, catepsina B,que pode ser encontrada no fígado e baço)).
As proteínas específica de doença adequadas incluem, porexemplo, antígenos expressados apenas em células T ativadas, incluindoLAG-3 (gene de ativação de linfócito), ligando de osteoprotegerina (OPGL;ver Nature 402, 304-309 (1999)), 0X40 (um membro da família de receptorTNF, expressado em células T ativadas e especificamente supra-regulado nascélulas que produzem o vírus da leucemia de célula T humana tipo I (HTLV-I); ver Immunol. 165 (1): 263-70 (2000)). As proteínas específicas de doençaadequadas também incluem, por exemplo, metaloproteases (associadas comartrite/cânceres) incluindo CG6512 Drosófila, paraplegina humana, FtsHhumana, AFG3L2 humana, fitsH murina; e fatores de crescimentoangiogênicos, incluindo o fator de crescimento de fibroblasto ácido (FGF-1),fator de crescimento de fibroblasto básico (FGF-2), fator de crescimentoendotelial vascular/fator de permeabilidade vascular (VEGF/VPF), fator docrescimento transformador α (TGF a), fator-alfa de necrose de tumor (TNF-a), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), fator decrescimento endotelial derivado de plaqueta (PD-ECGF), fator de crescimentoplacentário (PI GF), fator de crescimento derivado de plaqueta midkine BB(PDGF) e fractalkine.
Os polipeptídeos adequados que realçam a meia-vida sérica invivo também incluem proteínas de estresse tais como as proteínas de choquetérmico (HSPs). As HSPs são normalmente encontrados intracelularmente.
Quando elas são encontradas extracelularmente, é um indicador de que umacélula morreu e espalhou seus conteúdos. Esta morte de célula nãoprogramada (necrose) ocorre quando como um resultado de trauma, doençaou lesão, as HSPs extracelulares deflagram uma resposta a partir do sistemaimune. A ligação à HSP extracelular pode resultar na localização dascomposições da invenção em um sítio de doença=
As proteínas adequadas envolvidas no transporte de Fcincluem, por exemplo, receptor Brambell (também conhecido como FcRB).
Este receptor de Fc tem duas funções, ambas das quais são potencialmenteúteis para a liberação. As funções são (1) transporte de IgG da mãe para acriança através da placenta (2) proteção da IgG da degradação prolongandodeste modo a sua meia-vida sérica. E considerado que o receptor recicla IgGde endossomas. (Ver, Holliger et ai, Nat Biotechnol 15(7): 632-6 (1997)).
Os métodos para a análise farmacocinética e determinação dameia-vida de ligando será familiar àqueles habilitados na técnica. Detalhespodem ser encontrados em Kenneth, A et al: Chemical Stability ofPharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists e em Peters et al,Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Referência também éfeita a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicada por MareeiDekker, 2a Rev. da edição (1982), que descreve parâmetros farmacocinéticostais como as meias-vidas t alfa e t beta e a área sob a curva (AUC).Ligandos que Contêm uma Porção de Toxina ou Toxina
A invenção também diz respeito a ligandos que compreendemuma porção de toxina ou toxina. As porções de toxina adequadas compreendeuma toxina (por exemplo, toxina ativa na superfície, citotoxina). A porção detoxina ou toxina pode ser ligada ou conjugada ao ligando usando qualquermétodo adequado. Por exemplo, a porção de toxina ou toxina pode sercovalentemente ligada ao ligando diretamente ou através de um ligadoradequado. Os ligadores adequados podem incluir ligadores não cliváveis oucliváveis, por exemplo, ligadores cliváveis pelo pH que compreendem umsítio de clivagem para uma enzima celular (por exemplo, esterases celulares,proteases celulares tais como catepsina B). Tais ligadores cliváveis podem serusados para preparar um ligando que possa liberar uma porção de toxina outoxina depois que o ligando é internalizado.
Uma variedade de métodos para ligar ou conjugar uma porçãode toxina ou toxina a um ligando pode ser usada. O método particularselecionado dependerá da porção de toxina ou toxina e ligando a seremligados ou conjugados. Se desejado, ligadores que contêm grupos funcionaisterminais podem ser usados para ligar o ligando e a porção de toxina outoxina. No geral, a conjugação é realizada pela reação da porção de toxina outoxina que contém um grupo funcional reativo (ou é modificado para conterum grupo funcional reativo) com um ligador ou diretamente com um ligando.As ligações covalentes formadas pela reação de uma porção de toxina outoxina que contém (ou é modificada para conter) uma porção química ougrupo funcional que podem, sob condições apropriadas, reagir com umsegundo grupo químico formando deste modo uma ligação covalente. Sedesejado, um grupo químico reativo adequado pode ser adicionado a ligandoou a um ligador usando qualquer método adequado. (Ver, por exemplo,Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego,CA (1996)). Muitas combinações de grupo químico reativo adequado sãoconhecidas na técnica, por exemplo um grupo amina pode reagir com umgrupo eletrofílico tal como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, iodo),éster N-hidroxissuccinimidílico (NHS) e outros. Os tióis podem reagir commaleimida, iodoacetila, acrilolila, dissulfetos de piridila, ácido 5-tiol-2-nitrobenzóico (TNB-tiol) e outros. Um grupo funcional de aldeído pode serligado a moléculas contendo amina ou hidrazida e um grupo azida pode reagircom um grupo fosforoso trivalente para formar ligações de fosforamidato oufosforimida. Os métodos adequados para introduzir grupos ativadores emmoléculas são conhecidos na técnica (ver por exemplo, Hermanson, G. T.,Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)).
As porções de toxina e toxinas adequadas incluem, porexemplo, um maitansinóide (por exemplo, maitansinol, por exemplo, DM1,DM4), um taxano, uma caliqueamicina, uma duocarmicina ou derivadosdestas. O maitansinóide pode ser, por exemplo, maitansinol ou um análogo demaitansinol. Os exemplos de análogos de maitansinol incluem aqueles tendoum anel aromático modificado (por exemplo, C-19-descloro, C-20-desmetóxi,C-20-acilóxi) e aqueles tendo modificações em outras posições (por exemplo,C-9-CH, C-14-alcoximetila, C-14-hidroximetila ou aceloximetila, C-15-hidróxi/acilóxi, C-15-metóxi, C-18-N-desmetila, 4,5-desóxi). Maitansinol eanálogos de maitansinol são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N—5.208.020 e 6.333.410, os conteúdos das quais são aqui incorporados porreferência. Maitansinol pode ser ligado a anticorpos e fragmentos deanticorpo usando, por exemplo, um 3-(2-piridilditio)proprionato de N-succinimidila (também conhecido como 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidila ou SPP), 4-succinimidil-oxicarbonil-a-(2-piridilditio)-tolueno(SMPT), 3-(2-piridilditio)butirato de N-succinimidila (SDPB), 2 iminotiolanoou anidrido S-acetilsuccínico. O taxano pode ser, por exemplo, um taxol,taxotere ou novo taxano (ver, por exemplo, a WO 01/38318). Acaliqueamicina pode ser, por exemplo, uma caliqueamicina complexada combromo (por exemplo, um complexo de alfa, beta ou gama bromo), umacaliqueamicina complexada com iodo (por exemplo, um complexo de alfa,beta ou gama iodo) ou análogos e imitações destes. Caliqueamicinascomplexadas com bromo incluem Il-BR, I2-BR, 13-BR, I4-BR, Jl-BR, J2-BR e Kl-BR. As caliqueamicinas complexadas com iodo incluem Il-I5 I2-I,13-I, Jl-I5 J2-I, Ll-I e Kl-BR. As caliqueamicinas e mutantes, análogos emiméticos destas são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nes 4.970.198,5.264.586, 5.550.246, 5.712.374 e 5.714.586, os conteúdos da qual são aquiincorporados por referência. Os análogos de duocarmicina (por exemplo,KW-2189, DC88, DC89 CBI-TMI e derivados destes) são descritos, porexemplo, na Patente U.S. Ns 5.070.092, Patente U.S. N- 5.187.186, PatenteU.S. Ns 5.641.780, Patente U.S. Ne 5.641.780, Patente U.S. N- 4.923.990 ePatente U.S. N- 5.101.038, os conteúdos da qual são aqui incorporados porreferência.
Os exemplos de outras toxinas incluem, mas não são limitadosa antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercapto-purina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquiladores (porexemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, CC-1065 (ver as Patentes USNqs 5.475.092, 5.585.499, 5.846.545), melfalan, carmustina (BSNU) elomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol,estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP)cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antigamentedaunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina(antigamente actinomicina), bleomicina, mitramicina, mitomicina, puromicinaantramicina (AMC)), duocarmicina e análogos ou derivados destes e agentesanti-mitóticos (por exemplo, vincristina, vinblastina, taxol, auristatinas (porexemplo, auristatina E) e maitansinóides e análogos ou homólogos destes.
A toxina também pode ser uma toxina ativa na superfície, talcomo uma toxina que é um gerador de radical livre (por exemplo, porções detoxina contendo selênio) ou porção contendo radionuclídeo. As porçõescontendo radionuclídeo adequadas, incluem por exemplo, porções quecontenham iodo radioativo (131I ou 125I), ítrio (90Y), lutécio (177Lu), actmio(225Ac), praseodímio, astatina (211At), rênio (186Re), bismuto (212Bi ou 213Bi),índio (111In), tecnécio (99mTc), fósforo (32P), ródio (88Rh), enxofre (35S),carbono (14C), trítio (3H), cromo (51Cr), cloro (36Cl), cobalto (57Co ou 58Co),ferro (59Fe), selênio (75Se) ou gálio (67Ga).
A toxina pode ser uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo, defontes bacterianas, por exemplo, toxina da difteria, exotoxina de pseudomonas(PE) e proteínas vegetais, por exemplo, a cadeia A de ricina (RTA), asproteínas inativadoras de ribossoma (RIPs) gelonina, proteína antiviral deerva-dos-cancros, saporina e dodecandron são considerados para o uso comotoxinas.
Os compostos anti-sentido de ácidos nucleicos planejados paraligar, desativar, promover a degradação ou impedir a produção do mRNAresponsável pela geração de uma proteína alvo particular também podem serusados como uma toxina. Os compostos anti-sentido incluem RNA ou DNAde anti-sentido, oligonucleotídeos de filamento único ou duplo ou seusanálogos, que podem hibridizar especificamente à espécie de mRNAindividual e impedir a transcrição e/ou processamento de RNA da espécie demRNA e/ou tradução do polipeptídeo codificado e deste modo efetuar umaredução na quantidade do respectivo polipeptídeo codificado. Ching, et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86: 10006-10010 (1989); Broder, et al., Ann.Int. Med. 113: 604-618 (1990); Loreau, et al., FEBS Letters 274: 53-56(1990); os produtos terapêuticos de anti-sentido úteis incluem por exemplo:Veglin® (VasGene) e OGX-Ol 1 (Oncogenix).
As toxinas também podem ser agentes fotoativos. Os agentesfotoativos adequados incluem materiais com base em porfirina tais comoporfímero sódico, as porfirinas verdes, clorina E6, o próprio derivado dehematoporfirina, ftalocianinas, etiopurpurinas, texafrina e outras.
A toxina pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo queliga um alvo intracelular (por exemplo, um intracorpo), tal como um dAb queliga um alvo intracelular. Tais anticorpos ou fragmentos de anticorpo (dAbs)podem ser direcionados aos compartimentos ou alvos subcelulares definidos.Por exemplo, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo (dAbs) podem ligarum alvo intracelular selecionado de erbB2, EGFR, BCR-ABL, p21 Ras,Caspase3, Caspase7, Bcl-2, p53, Ciclina E, ATF-I/CREB, HPV16 E7, HP I,colagenases Tipo IV, catepsina L assim como outras descritas emKontermann, R. E., Methods, 34: 163-170 (2004), aqui incorporadas porreferência em sua totalidade.Domínios de polipeptídeo que ligam VEGF
A invenção fornece domínios de polipeptídeo (por exemplo,domínios variáveis únicos de imunoglobulina, monômeros dAb) que têm umsítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF. em formas derealização preferidas, o domínio de polipeptídeo (por exemplo, dAb) liga-seao VEGF com uma afinidade (KD; KD = Koff (IcdyKon (ka)) de 300 nM a 1pM (isto é, 3 χ IO"7 a 5 χ IO"12 M), preferivelmente de 50 nM a 1 pM, maispreferivelmente de 5 nM a 1 pM e o mais preferivelmente de 1 nM a 1 pM,por exemplo e Kd de 1 χ 10" M ou menos, preferivelmente 1 χ 10"° M oumenos, mais preferivelmente 1 χ IO"9 M ou menos, vantajosamente 1 χ IO"10M ou menos e o mais preferivelmente 1 χ IO"11 M ou menos; e/ou umaconstante de taxa Koff de 5x10" s" a 1 χ 10" s" preferivelmente de 1 χ 10" s"1 a 1 χ IO"6 s"1, mais preferivelmente de 5 χ IO"3 s'1 a 1 χ IO"5 s"1 por exemplo 5χ 10" s" ou menos, preferivelmente 1x10" s" ou menos, vantajosamente 1 χIO'3 s"1 ou menos, mais preferivelmente 1 χ IO"4 s"1 ou menos, ainda maispreferivelmente IxlO"5 s"1 ou menos e o mais preferivelmente IxlO"6 s"1 oumenos como determinado pela ressonância de plasma de superfície.
Em algumas formas de realização, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGFcompete quanto à ligação ao VEGF com um dAb selecionado do grupo queconsiste de TAR15-1 (SEQ ID NO: 100), TARl5-3 (SEQ ID NO: 101),TARl5-4 (SEQ ID NO: 102), TARl5-9 (SEQ ID NO: 103), TARl5-10 (SEQID NO: 104), TARl5-11 (SEQ ID NO: 105), TAR15-12 (SEQ ID NO: 106),TARl 5-13 (SEQ ID NO: 107), TARl 5-14 (SEQ ID NO: 108), TARl 5-15(SEQ ID NO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO: 110), TAR15-17 (SEQ ID NO:111), TAR15-18(SEQIDNO: 1 12), TAR15-19 (SEQ ID NO: 113),TAR15-(SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ ID NO: 115), TAR15-5 (SEQ IDNO: 116), TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-7 (SEQ ID NO: 118),TARl 5-8 (SEQ ID NO: 119), TAR15-23 (SEQ ID NO: 120), TAR15-24(SEQ ID NO: 121), TARl 5-25 (SEQ ID NO: 122), TARl 5-26 (SEQ ID NO:123), TAR15-27 (SEQ ID NO: 124), TAR15-29 (SEQ ID NO: 125), TAR15-(SEQ ID NO: 126), TARl 5-6-500 (SEQ ID NO: 127), TARl5-6-501(SEQ ID NO: 128), TARl5-6-502 (SEQ ID NO: 129), TARl5-6-503 (SEQID NO: 130), TAR15-6-504 (SEQ ID NO: 131), TAR15-6-505 (SEQ ID NO:132), TARl5-6-506 (SEQ ID NO: 133), TARl 5-6-507 (SEQ ID NO: 134),TARl5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO: 136), TAR15-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQ ID NO: 138), TAR15-8-501(SEQ ID NO: 139), TAR15-8-502 (SEQ ID NO: 140), TAR15-8-503 (SEQID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506 (SEQ ID NO:143), TARl5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TAR15-8-508 (SEQ ID NO: 145),TARl 5-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO: 147), TAR15-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQ ID NO: 149), TARl 5-26-501(SEQ ID NO: 150), TARl 5-26-502 (SEQ ID NO: 151), TARl 5-26-503 (SEQID NO: 152), TARl5-26-504 (SEQ ID NO: 153), TARl5-26-505 (SEQ IDNO: 154), TARl5-26-506 (SEQ ID NO: 155), TARl 5-26-507 (SEQ ID NO
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Em algumas formas de realização, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGFcompreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 80%,pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cercade 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menoscerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% deidentidade de seqüência de aminoácido com a seqüência de aminoácido de umdAb selecionado do grupo que consiste de TAR15-1 (SEQ ID NO: 100),TARl5-3 (SEQ ID NO: 101), TARl5-4 (SEQ ID NO: 102), TARl5-9 (SEQID NO: 103), TAR15-10 (SEQ ID NO: 104), TARl5-11 (SEQ ID NO: 105),TAR15-12 (SEQ ID NO: 106), TAR15-13 (SEQ ID NO: 107), TAR15-14(SEQ ID NO: 108), TAR15-15 (SEQ ID NO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO:110), TARl5-17 (SEQ ID NO: 111), TARl 5-18 (SEQ ID NO: 112), TARl5-19(SEQ ID NO: 113), TAR15-20 (SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ IDNO: 115), TARl 5-5 (SEQ ID NO: 116), TARl 5-6 (SEQ ID NO: 117),TARl5-7 (SEQ ID NO: 118),TAR15-8 (SEQ ID NO: 119), TAR15-23 (SEQID NO: 120), TAR15-24 (SEQ ID NO: 121), TAR15-25 (SEQ ID NO: 122),TARl5-26 (SEQ ID NO: 123), TARl5-27 (SEQ ID NO: 124), TARl 5-29(SEQ ID NO: 125), TARl 5-30 (SEQ ID NO: 126), TARl 5-6-500 (SEQ IDNO: 127), TAR15-6-501 (SEQ ID NO: 128), TARl 5-6-502 (SEQ ID NO:129), TARl5-6-503 (SEQ ID NO: 130), TAR15-6-504 (SEQ ID NO: 131),TARl5-6-505 (SEQ ID NO: 132), TARl5-6-506 (SEQ ID NO: 133), TARl5-6-507 (SEQ ID NO: 134), TAR15-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509(SEQ ID NO: 136), TARl5-6-510 (SEQ ID NO: 137), TARl5-8-500 (SEQID NO: 138), TAR15-8-501 (SEQ ID NO: 139), TAR15-8-502 (SEQ ID NO:140), TARl5-8-503 (SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142),TARl5-8-506 (SEQ ID NO: 143), TARl 5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TARl5-8-508 (SEQ ID NO: 145), TARl 5-8-509 (SEQ ID NO: 146), TARl 5-8-510(SEQ ID NO: 147), TARl 5-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQID NO: 149), TAR15-26-501 (SEQ ID NO: 150), TAR15-26-502 (SEQ IDNO: 151), TARl5-26-503 (SEQ ID NO: 152), TARl 5-26-504 (SEQ ID NO:153), TARl 5-26-505 (SEQ TD NO: 154), TARl 5-26-506 (SEO ID NO: 155),
TARl 5-26-507 (SEQ ID NO: 156), TARl 5-26-508 (SEQ ID NO: 157)TARl 5-26-509 (SEQ ID NO: 158), TARl 5-26-510 (SEQ ID NO: 159)TARl 5-26-511 (SEQ ID NO: 160), TARl 5-26-512 (SEQ ID NO: 161)TARl 5-26-513 (SEQ ID NO: 162), TARl 5-26-514 (SEQ ID NO: 163)TARl 5-26-515 (SEQ ID NO: 164), TARl 5-26-516 (SEQ ID NO: 165)TARl 5-26-517 (SEQ ID NO: 166), TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167)TARl 5-26-519 (SEQ ID NO: 168), TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169)TARl 5-26-521 (SEQ ID NO: 170), TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171)TARl 5-26-523 (SEQ ID NO: 172), TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173)TARl 5-26-525 (SEQ ID NO: 174), TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175)TARl 5-26-527 (SEQ ID NO: 176), TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177)TARl 5-26-529 (SEQ ID NO: 178), TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179)TARl 5-26-531 (SEQ ID NO: 180), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181)TARl 5-26-533 (SEQ ID NO: 182), TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183)TARl 5-26-535 (SEQ ID NO: 184), TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185)TARl 5-26-537 (SEQ ID NO: 186), TARl 5-26-538 (SEQ ID NO: 187)TARl5-26-539 (SEQ ID NO: 188), TARl5-26-540 (SEQ ID NO: 189),TARl5-26-541 (SEQ ID NO: 190), TAR15-26-542 (SEQ ID NO: 191),TARl5-26-543 (SEQ ID NO: 192), TARl 5-26-544 (SEQ TD NO: 193),TARl5-26-545 (SEQ ID NO: 194), TAR15-26-546 (SEQ ID NO: 195),TARl5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TAR15-26-548 (SEQ ID NO: 197),TAR15-26-549 (SEQ ID NO: 198), TAR15-26-550 (SEQ ID NO: 539) eTARl 5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
Em formas de realização preferidas, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGFcompreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos de cerca de90%, pelo menos de cerca de 91%, pelo menos de cerca de 92%, pelo menosde cerca de 93%, pelo menos de cerca de 94%, pelo menos de cerca de 95%,pelo menos de cerca de 96%, pelo menos de cerca de 97%, pelo menos decerca de 98% ou pelo menos de cerca de 99% de identidade de seqüência deaminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado do grupoque consiste de TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-8 (SEQ ID NO: 119) eTARl 5-26 (SEQ ID NO: 123). Por exemplo, o domínio de polipeptídeo quetem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF podecompreender TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-8 (SEQ ID NO: 119) ouTAR15-26 (SEQ ID NO: 123).
Em algumas formas de realização, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGFcompete com qualquer um dos dAbs aqui divulgados quanto à ligação aoVEGF.
Preferivelmente o domínio de polipeptídeo que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para VEGF é um domínio variávelúnico de imunoglobulina. O domínio de polipeptídeo que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para VEGF pode compreenderqualquer domínio variável de imunoglobulina adequado e preferivelmentecompreende um domínio variável de ser humano ou um domínio variável quecompreende regiões de matriz humana. Em certas formas de realização, odomínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade deligação para VEGF compreende uma matriz universal, como aqui descrita.
A matriz universal pode ser uma matriz Vl (νλ ou Vk), talcomo uma matriz que compreende as seqüências de aminoácido de matrizcodificadas pelo segmento de gene da imunoglobulina da linha germinativahumana DPKl5 DPK2, DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9,DPK10, DPK12, DPKl3, DPKl5, DPKl6, DPKl 8, DPKl9, DPK20, DPK21,DPK22, DPK23, DPK24, DPK25, DPK26 ou DPK28. Se desejado, a matrizVl pode compreender ainda a seqüência de aminoácido de matriz codificadapelo segmento de gene da imunoglobulina da linha germinativa humana Jk 1,TK2. .T.,3. -L4 ou .L5.
Em outras formas de realização a matriz universal pode seruma matriz VH, tal como uma matriz que compreende as seqüências deaminoácido de matriz codificadas pelo segmento de gene da imunoglobulinade linha germinativa humana DP4, DP7, DP8, DP9, DPlO5 DP31, DP33,DP38, DP45, DP46, DP47, DP49, DP50, DP51, DP53, DP54, DP65, DP66,DP67, DP68 ou DP69. Se desejado, a matriz Vh pode compreender ainda aseqüência de aminoácido de matriz codificada pela linha germinativa humanaJhI, Jh2, Jh3, Jh4, JH4b, Jh5 e Jh6 segmento de gene da imunoglobulina.
Em certas formas de realização, o domínio de polipeptídeo quetem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGFcompreende uma ou mais regiões de matriz que compreendem uma seqüênciade aminoácido que é a mesma como a seqüência de aminoácido de umaregião de matriz correspondente codificada por um segmento de gene deanticorpo da linha germinativa humana ou as seqüências de aminoácido deuma ou mais das ditas regiões de matriz coletivamente compreendem até 5diferenças de aminoácido em relação à seqüência de aminoácido da ditaregião de matriz correspondente codificada por um segmento de gene deanticorpo da linha germinativa humana.
Em outras formas de realização, as seqüências de aminoácidode FWl, FW2, FW3 e FW4 do domínio de polipeptídeo que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para VEGF são a mesma como asseqüências de aminoácido da regiões de matriz correspondentes codificadaspor um segmento de gene de anticorpo da linha germinativa humana ou asseqüências de aminoácido de FWl, FW2, FW3 e FW4 coletivamente contêmaté 10 diferenças de aminoácido em relação às seqüências de aminoácido deregiões de matriz correspondentes codificadas pelo dito segmento de gene deanticorpo da linha germinativa humana.
Em outras formas de realização, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGFcompreende as regiões FWl, FW2 e FW3 e a seqüência de aminoácido dasditas regiões FWl, FW2 e FW3 são os mesmos como as seqüências deaminoácido de regiões de matriz correspondentes codificadas pelos segmentosde gene de anticorpo da linha germinativa humana.
Em formas de realização particulares, o domínio depolipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação paraVEGF compreende a matriz Vl de DPK9 ou uma matriz Vh selecionada dogrupo que consiste de DP47, DP45 e DP38. O domínio de polipeptídeo quetem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF podecompreender um sítio de ligação para um ligando genérico, tal como aproteína A, proteína L e proteína G.
Em certas formas de realização, o domínio de polipeptídeo quetem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF ésubstancialmente resistente à agregação. Por exemplo, em algumas formas derealização, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 9%, menos doque cerca de 8%, menos do que cerca de 7%, menos do que cerca de 6%,menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cercade 3%, menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% do domínioue polipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligaçãopara VEGF agrega quando uma solução de 1 a 5 mg/ml, 5 a 10 mg/ml, IOa20 mg/ml, 20 a 50 mg/ml, 50 a 100 mg/ml, 100 a 200 mg/ml ou 200 a 500mg/ml de ligando ou dAb em um solvente que é rotineiramente usado para aformulação de medicamento tal como solução salina, solução salinatamponada, solução salina tamponada com citrato, água, uma emulsão, e,qualquer um destes solventes com um excipiente aceitável tal como aquelesaprovados pelo FDA, é mantido a cerca de 22°C, 22 a 25°C, 25 a 30°C, 30 a37°C, 37 a 40°C, 40 a 50°C, 50 a 60°C, 60 a 70°C, 70 a 80°C, 15 a 20°C, 10 a15°C, 5 a 10°C, 2 a 5°C, 0 a 2°C, -IO0C a 0°C, -20°C a -10°C, -40°C a -20°C,-60°C a -40°C ou -BO0C a -60°C, por um neríodo de tenroo. Dor exemclo. decerca de 10 minutos, 1 hora, 8 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 1semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1ano ou 2 anos.
A agregação pode ser avaliada usando qualquer métodoadequado, tal como, pela microscópia, avaliando a turbidez de uma soluçãopela inspeção visual ou espectroscópia ou qualquer outro método adequado.
Preferivelmente, a agregação é avaliada pela dispersão de luz dinâmica. Osdomínios de polipeptídeo que têm um sítio de ligação com especificidade deligação para VEGF que são resistentes à agregação fornecem diversasvantagens. Por exemplo, tais domínios de polipeptídeo que têm um sítio deligação com especificidade de ligação para VEGF pode ser facilmenteproduzido em alto rendimento como proteínas solúveis pela expressão usandoum sistema de produção biológica adequado, tal como E. coli e pode serformulado e/ou armazenado em concentrações mais altas do que ospolipeptídeos convencionais e com menos agregação e perda de atividade.
Além disso, o domínio de polipeptídeo que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para VEGF que é resistente àagregação pode ser produzido mais economicamente do que outrospolipeptídeos de ligação de antígeno ou epítopo (por exemplo, anticorposconvencionais). Por exemplo, no geral, a preparação de polipeptídeos deligação de antígeno ou epítopo intencionados para as aplicações in vivo incluiprocessos (por exemplo, a filtração em gel) que removem polipeptídeosagregados. A insuficiência para remover tais agregados pode resultar em umapreparação que não é adequada para aplicações in vivo porque, por exemplo,agregados de um polipeptídeo de ligação de antígeno que é intencionado aatuar como um antagonista pode funcionar como um agonista pela indução dereticulação ou formação de grupo do antígeno alvo. Agregados de proteínatambém podem reduzir a eficácia de polipeptídeo terapêutico pela indução deuma resposta imune no paciente ao qual os mesmos são administrados.
Ao contrário, o domínio de polipeptídeo resistente à agregaçãoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF dainvenção pode ser preparado para aplicações in vivo sem a necessidade paraincluir etapas de processo que removem agregado e podem ser usadas emaplicações in vivo sem as desvantagens anteriormente mencionadas causadaspelo agregado de polipeptídeo.
Em algumas formas de realização, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGFdesdobra-se reversivelmente quando aquecido a uma temperatura (Ts) eesfriados a uma temperatura (Tc), em que Ts é maior do que a temperatura defusão (Tm) do domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligação comespecificidade de ligação para VEGF e Tc é mais baixo do que a temperaturade fusão do domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligação comespecificidade de ligação para VEGF. Por exemplo, um domínio depolipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação paraVEGF pode desdobrar reversivelmente quando aquecido a 50°C e esfriado emtorno da temperatura ambiente. Um polipeptídeo que desdobrareversivelmente perde função quando desdobrado mas readquire a função naredobramento, Tais polipeptídeos são distinguidos dos polipeptídeos queagregam quando desdobrados ou que inadequadamente redobram(polipeptídeos mal dobrados), isto é, não readquirem a função.
O desdobramento e o redobramento de polipeptídeo podem seravaliados, por exemplo, pela detecção direta ou indiretamente da estrutura dopolipeptídeo usando qualquer método adequado. Por exemplo, a estrutura depolipeptídeo pode ser detectada pelo dicroísmo circular (CD) (por exemplo,CD distante do UV, CD próximo do UV), fluorescência (por exemplo,fluorescência de cadeias laterais de triptofano), susceptibilidade à proteólise,ressonância magnética nuclear (RMN) ou pela detecção ou medição de umafunção de polipeptídeo que é dependente na dobra apropriada (por exemplo,ligação ao ligando alvo, ligação ao ligando genérico). Em um exemplo, odesdobramento de polipeptídeo é avaliado usando um ensaio funcional emque a perda da função de ligação (por exemplo, ligação de um ligandogenérico e/ou alvo, ligação de um substrato) indica que o polipeptídeo estádesdobrado.
O grau de desdobramento e redobramento de um domínio depolipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação paraVEGF pode ser determinado usando uma curva de desdobramento oudesnaturação. Uma curva de desdobramento pode ser produzida plotando-se atemperatura como a ordenada e a concentração relativa de polipeptídeodobrado como a abscissa. A concentração relativa de domínio de polipeptídeodobrado que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação paraVEGF pode ser determinada direta ou indiretamente usando qualquer métodoadequado (por exemplo, CD, fluorescência, ensaio de ligação). Por exemplo,um domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidadede ligação para solução de VEGF pode ser preparado e a elipticidade dasolução determinada pelo CD. O valor de elipticidade obtido representa umaconcentração relativa de ligando dobrado (por exemplo, monômero dAb) de100%, O domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligação comespecificidade de ligação para VEGF na solução é depois desdobradoaumentando-se incrementalmente a temperatura da solução e a elipticidade édeterminada em incrementos adequados (por exemplo, depois de cadaaumento de um grau na temperatura). O domínio de polipeptídeo que tem umsítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF em solução édepois redobrado reduzindo-se incrementalmente a temperatura da solução e aelipticidade é determinada em incrementos adequados. Os dados podem serplotados para produzir uma curva de desdobramento e uma curva deredobramento. As curvas de desdobramento e redobramento têm uma formasigmoidal característica que inclui uma porção em que o domínio depolipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação paramoléculas de VEGF é dobrado, uma transição de desdobramento/redobramento em que o domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligaçãocom especificidade de ligação para moléculas VEGF é desdobrado em váriosgraus e uma porção em que o domínio de polipeptídeo que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para VEGF é desdobrado. Aintercepção do eixo y da curva de redobramento é a quantidade relativa dedomínio de polipeptídeo redobrado que tem um sítio de ligação comespecificidade de ligação para VEGF recuperada. Uma recuperação de pelomenos de cerca de 50% ou pelo menos de cerca de 60% ou pelo menos decerca de 70% ou pelo menos de cerca de 75% ou pelo menos de cerca de 80%ou pelo menos de cerca de 85% ou pelo menos de cerca de 90% ou pelomenos de cerca de 95% é indicativo de que o ligando ou monômero de dAbdesdobra reversivelmente.
Em uma forma de realização preferida, a reversibilidade dedesdobramento de um domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligaçãocom especificidade de ligação para VEGF é determinada preparando-se umdomínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade deligação para solução de VEGF e plotando as curvas de desdobramento eredobramento pelo calor. O domínio de polipeptídeo que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para solução de VEGF pode serpreparado em qualquer solvente adequado, tal como um tampão aquoso quetem um pH adequado para permitir o domínio de polipeptídeo que tenha umsítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF dissolver (porexemplo, o pH que é de cerca de 3 unidades acima ou abaixo do pontoisoelétrico (pi)). O domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligação comespecificidade de ligação para solução de VEGF é concentrado o bastantepara permitir que o desdobramento/dobra sejam detectados. Por exemplo, oligando ou solução de monômero dAb podem ser de cerca de 0,1 μΜ a cercade 100 μΜ ou preferivelmente de cerca de 1 μΜ a cerca de 10 μΜ.
Se a temperatura de fusão (Tm) de um domínio depolipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação paraVEGF é conhecida, a solução pode ser aquecida a cerca de dez graus abaixoda Tm (Tm - 10) e a dobra avaliada pela elipticidade ou fluorescência (porexemplo, varredura de CD distante do UV de 200 nm a 250 nm, CD decomprimento de onda fixo a 235 nm ou 225 nm; espectros de emissãofluorescente de triptofano de 300 a 450 nm com excitação a 298 nm) parafornecer 100% em relação ao ligando dobrado ou monômero de dAb. Asolução é depois aquecida a pelo menos dez graus acima da Tm (Tm +10) emincrementos pré determinados (por exemplo, aumento de cerca de 0,1 a cercade 1 grau) e elipticidade ou fluorescência são determinados a cadaincremento. Então, o domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligaçãocom especificidade de ligação para VEGF é redobrado pelo esfrimento a pelomenos Tm - 10 em incrementos pré determinados e a elipticidade oufluorescência determinados em cada incremento. Se a temperatura de fusão deum domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidadede ligação para VEGF não é conhecido, a solução pode ser desdobradaaquecendo-se incrementalmente de cerca de 250C a cerca de IOO0C e depoisredobrado esfriando-se incrementalmente a pelo menos cerca de 25°C e aelipticidade ou fluorescência em cada incremento de aquecimento eesfriamento são determinadas. Os dados obtidos podem ser plotados paraproduzir uma curva de desdobramento e uma curva de redobramento, em queo intercepto do eixo y da curva de redobramento é a quantidade relativa deproteína redobrada recuperada. Em algumas formas de realização, o domíniode polipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligaçãopara VEGF não compreende um domínio variável de imunoglobulinaCamelídeo ou um ou mais aminoácidos de matriz que são únicos aosdomínios variáveis de imunoglobulina codificados pelos segmentos de genede anticorpo da linha germinativa de Camelídeo.
Preferivelmente, o domínio de polipeptídeo que tem um sítiode ligação com especificidade de ligação para VEGF é secretado em umaquantidade de pelo menos cerca de 0,5 mg/L quando expressados em E. coliou em espécies de Pichia (por exemplo, P. pastoris). Em outras formas derealização preferidas, um domínio de polipeptídeo que tem um sítio de ligaçãocom especificidade de ligação para VEGF é secretado em uma quantidade depelo menos cerca de 0,75 mg/L, pelo menos cerca de 1 mg/L, pelo menoscerca de 4 mg/L, pelo menos cerca de 5 mg/L, pelo menos cerca de 10 mg/L,pelo menos cerca de 15 mg/L, pelo menos cerca de 20 mg/L, pelo menoscerca de 25 mg/L, pelo menos cerca de 30 mg/L, pelo menos cerca de 35mg/L, pelo menos cerca de 40 mg/L, pelo menos cerca de 45 mg/L ou pelomenos cerca de 50 mg/L ou pelo menos cerca de 100 mg/L ou pelo menoscerca de 200 mg/L ou pelo menos cerca de 300 mg/L ou pelo menos cerca de400 mg/L ou pelo menos cerca de 500 mg/L ou pelo menos cerca de 600mg/L ou pelo menos cerca de 700 mg/L ou pelo menos cerca de 800 mg/L,pelo menos cerca de 900 mg/L ou pelo menos cerca de 1 g/L quandoexpressados na E. coli ou em espécies de Pichia (por exemplo, P. pastoris).
Em outras formas de realização preferidas, um domínio de polipeptídeo quetem um sítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF é secretadoem uma quantidade de pelo menos cerca de 1 mg/L a pelo menos cerca de 1g/L, pelo menos cerca de 1 mg/L a pelo menos cerca de 750 mg/L, pelomenos cerca de 100 mg/L a pelo menos cerca de 1 g/L, pelo menos cerca de200 mg/L a pelo menos cerca de 1 g/L, pelo menos cerca de 300 mg/L a pelomenos cerca de 1 g/L, pelo menos cerca de 400 mg/L a pelo menos cerca de 1g/L, pelo menos cerca de 500 mg/L a pelo menos cerca de 1 g/L, pelo menoscerca de 600 mg/L a pelo menos cerca de 1 g/L, pelo menos cerca de 700mg/L a pelo menos cerca de 1 g/L, pelo menos cerca de 800 mg/L a pelomenos cerca de 1 g/L ou pelo menos cerca de 900 mg/L a pelo menos cercade 1 g/L quando expressados na E. coli ou em espécies de Pichia (porexemplo, P. pastoris). Embora, um domínio de polipeptídeo que tenha umsítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF aqui descrito possaser secretável quando expressado na E. coli ou em espécies de Pichia (porexemplo, P. pastoris), este pode ser produzido usando qualquer métodoadequado, tal como métodos químicos sintéticos ou métodos de produçãobiológica que não utiliza E. coli ou espécies de Pichia.Domínio de polipeptídeos que ligam EGFR
A invenção fornece domínios de polipeptídeo (por exemplo,dAb) que têm um sítio de ligação com especificidade de ligação para EGFR.
Em formas de realização preferidas, o domínio de polipeptídeo (por exemplo,dAb) liga-se ao EGFR com uma afinidade (KD; KD = Koff (Icd)ZKon (ka)) de300 nM a 1 pM (isto é, 3 χ IO"7 a 5 χ IO"12 Μ), preferivelmente de 100 nM a 1pM ou 50 nM a 10 pM, mais preferivelmente de 10 nM a 100 pM e o maispreferivelmente de cerca de 1 nM, por exemplo, e K0 de 1 χ 10" M ou menos,preferivelmente 1x10" M ou menos, mais preferivelmente de cerca de 1 χ10"9 M ou menos, 1 χ 10"10 M ou menos ou 1 χ 10"11 M ou menos; e/ou umaconstante de taxa Koff de 5 χ IO"1 s"1 a 1 χ 10"7 S-1Jpreferivelmente de 1 χ 10"2S-1 a x 10"6 S-1J mais preferivelmente de 5 χ 10"3 s"1 a 1 χ 10"5 s"1, por exemplo5 χ 10 s" ou menos, preferivelmente de 1 χ 10" s" ou menos,vantajosamente de 1 χ 10"3 s"1 ou menos, mais preferivelmente de 1 χ 10"4 s"1ou menos, ainda mais preferivelmente de 1 χ 10"5 s"1 ou menos e o maispreferivelmente de 1 χ 10"6 s"1 ou menos como determinado pela ressonânciade plasma de superfície.
Em algumas formas de realização, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para EGFRcompete quanto à ligação ao EGFR com um dAb selecionado do grupo queconsiste de DOMl6-17 (SEQ ID NO: 325), DOMl6-18 (SEQ ID NO: 326),DOM 16-19 (SEQ ID NO: 327), DQM16-20 (SEO ID NO: 328), DOM16-21(SEQ ID NO: 329), DOM16-22 (SEQ ID NO: 330), DOM16-23 (SEQ IDNO: 331), DOM16-24 (SEQ ID NO: 332), DOM16-25 (SEQ ID NO: 333),DOM 16-26 (SEQ ID NO: 334), DOM16-27 (SEQ ID NO: 335), DOM16-28(SEQ ID NO: 336), DOM16-29 (SEQ ID NO: 337), DOM16-30 (SEQ IDNO: 338), DOM16-31 (SEQ ID NO: 339), DOM16-32 (SEQ ID NO: 340),DOM 16-33 (SEQ ID NO: 341), DOM16-35 (SEQ ID NO: 342), DOM16-37(SEQ ID NO: 343), DOM16-38 (SEQ ID NO: 344), DOM16-39 (SEQ IDNO: 345), DOMl6-40 (SEQ ID NO: 346), DOMl6-41 (SEQ ID NO: 347),DOMl6-42 (SEQ ID NO: 348), DOM16-43 (SEQ ID NO: 349), DOM16-44(SEQ ID NO: 350), DOM16-45 (SEQ ID NO: 351), DOM16-46 (SEQ IDNO: 352), DOMl6-47 (SEQ ID NO: 353), DOMl6-48 (SEQ ID NO: 354),DOM 16-49 (SEQ ID NO: 355), DOM16-50 (SEQ ID NO: 356), DOM16-59(SEQ ID NO: 357), DOMI6-6O (SEQ ED NO: 358), DOM16-61 (SEQ IDNO: 359), DOM16-62 (SEQ ID NO: 360), DOM16-63 (SEQ ID NO: 361),DOMl6-64 (SEQ ID NO: 362), DOM16-65 (SEQ ID NO: 363), DOM16-66(SEQ ID NO: 364), DOM16-67 (SEQ ID NO: 365), DOM16-68 (SEQ IDNO: 366), DOMl6-69 (SEQ ID NO: 367), DOMl6-70 (SEQ ID NO: 368),DOM 16-71 (SEQ ID NO: 369), DOM16-72 (SEQ ID NO: 370), DOM16-73(SEQ ID NO: 371), DOM16=74 (SEQ ID NO: 372), DOM16-75 (SEQ IDNO: 373), DOMI6-76 (SEQ ID NO: 374), DOMl6-77 (SEQ ID NO: 375),DOMl6-78 (SEQ ID NO: 376), DOM16-79 (SEQ ID NO: 377), DOMI6-8O(SEQ ID NO: 378), DOM16-81 (SEQ ID NO: 379), DOM16-82 (SEQ IDNO: 380), DOM 16-83 (SEQ ID NO: 381), DOM16-84 (SEQ ID NO: 382),DOM 16-85 (SEQ ID NO: 383), DOM16-87 (SEQ ID NO: 384), DOM16-88(SEQ ID NO: 385), DOMl6-89 (SEQ ID NO: 386), DOMl6-90 (SEQ IDNO: 387), DOM16-91 (SEQ ID NO: 388), DOM16-92 (SEQ ID NO: 389),DOMl6-94 (SEQ ID NO: 390), DOM16-95 (SEQ ID NO: 391), DOM16-96(SEQ ID NO: 392), DOM16-97 (SEQ ID NO: 393), DOM16-98 (SEQ IDNO: 394), DOM16-99 (SEO ID NO: 395), DOMIÓ-IOO (SEO ID NO: 396),DOMI6-IOI (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398), DOM16-103 (SEQ ID NO: 399), DOMl6-104 (SEQ ID NO: 400), DOMl6-105 (SEQID NO: 401), DGM16-106 (SEQ ID NO: 402), DOM16-107 (SEQ ID NO:403), DOM 16-108 (SEQ ID NO: 404), DOM16-109 (SEQ ID NO: 405),DOM16-HO (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407), DOM16-112 (SEQ ID NO: 408), DOM16-113 (SEQ ID NO: 409), DOM16-114 (SEQID NO: 410), DOM16-115 (SEQ ID NO: 411), DOM16-116 (SEQ ID NO:412), DOM16-117 (SEQ ID NO: 413), DOM16-118 (SEQ ID NO: 414),DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416), DOM16-39-8 (SEQ ID NO: 417), DOM16-39-34 (SEQ ID NO: 418), DOM16-39-48(SEQ ID NO: 419), DOM16-39-87 (SEQ ID NO: 420), DOM16-39-90 (SEQID NO: 421), DOM16-39-96 (SEQ ID NO: 422), DOM16-39-100 (SEQ IDNO: 423), DOM16-39-101 (SEQ ID NO: 424), DOM16-39-102 (SEQ IDNO: 425), DOMl6-39-103 (SEQ ID NO: 426), DOMl6-39-104 (SEQ IDNO: 427), DOMl6-39-105 (SEQ ID NO: 428), DOMl6-39-106 (SEQ IDNO: 429), DQM16-39-107 (SEQ ID NO: 430), DQM16-39-108 (SEQ IDNO: 431), DOM 16-39-109 (SEQ ID NO: 432), DOM16-39-HO (SEQ IDNO: 433), DOM16-39-111 (SEQ ID NO: 434), DOM16-39-112 (SEQ IDNO: 435), DOM 16-39-113 (SEQ ID NO: 436), DOM16-39-114 (SEQ IDNO: 437), DOM16-39-115 (SEQ ID NO: 438), DOM16-39-116 (SEQ IDNO: 439), DOM16-39-117 (SEQ ID NO: 440), DOM16-39-200 (SEQ IDNO: 441), DOM16-39-201 (SEQ ID NO: 442), DOM16-39-202 (SEQ IDNO: 443), DOM16-39-203 (SEQ ID NO: 444), DOM16-39-204 (SEQ IDNO: 445), DOM16-39-205 (SEQ ID NO: 446), DOM16-39-206 (SEQ IDNO: 447), DOM16-39-207 (SEQ ID NO: 448), DOM16-39-209 (SEQ IDNO: 449), DOM16-52 (SEQ ID NO: 450), NBl (SEQ ID NO: 451), NB2(SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQ ID NO: 453), NB4 (SEQ ID NO: 454), NB5(SEQ ID NO: 455), NB6 (SEQ ID NO: 456), NB7 (SEQ ID NO: 457), NB8(SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQ TD NO: 459), NBlO (SEQ ID NO: 460),NBll (SEQ ID NO: 461), NB12 (SEQ ID NO: 462), NB13 (SEQ ID NO:463), NB14 (SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQ ID NO: 465), NB16 (SEQ IDNO: 466), NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18 (SEQ ID NO: 468), NB19 (SEQID NO: 469), NB20 (SEQ ID NO: 470), NB21 (SEQ ID NO: 471) e NB22(SEQ ID NO: 472).
Em algumas formas de realização, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para EGFRcompreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 80%,pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cercade 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menoscerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% deidentidade de seqüência de aminoácido com a seqüência de aminoácido de umdAb selecionado do grupo que consiste de DOMl6-17 (SEQ ID NO: 325),DOMl6-18 (SEQ ID NO: 326), DOM16-19 (SEQ ID NO: 327), DOM16-20(SEQ ID NO: 328), DOMl6-21 (SEQ ID NO: 329), DOMl6-22 (SEQ IDNO: 330), DOMl6-23 (SEQ ID NO: 331), DOMl6-24 (SEQ ID NO: 332),DOM 16-25 (SEQ ID NO: 333), DOM16-26 (SEQ ID NO: 334), DOM16-27(SEQ ID NO: 335), DOMl6-28 (SEQ ID NO: 336), DOMl6-29 (SEQ IDNO: 337), DOMl6-30 (SEQ ID NO: 338), DOMl6-31 (SEQ ID NO: 339),DOMl6-32 (SEQ ID NO: 340), DOM16-33 (SEQ ID NO: 341), DOM16-35(SEQ ID NO: 342), DOM16-37 (SEQ ID NO: 343), DOM16-38 (SEQ IDNO: 344), DOMl6-39 (SEQ ID NO: 345), DOMI6-40 (SEQ ID NO: 346),DOM 16-41 (SEQ ID NO: 347), DOM16-42 (SEQ ID NO: 348), DOM16-43(SEQ ID NO: 349), DOM16-44 (SEQ ID NO: 350), DOM16-45 (SEQ IDNO: 351), DOM16-46 (SEQ ID NO: 352), DOM16-47 (SEQ ID NO: 353),DOMl6-48 (SEQ ID NO: 354), DOMl6-49 (SEQ ID NO: 355), DOMl6-50(SEQ ID NO: 356), DOM16-59 (SEQ ID NO: 357), DOMI6-6O (SEQ IDNO: 358), DOM16-61 (SEO TD NO: 359), DOM16-62 (SEO ID NO: 360),DOM 16-63 (SEQ ID NO: 361), DOM16-64 (SEQ ID NO: 362), DOM16-65(SEQ ID NO: 363), DOM16-66 (SEQ ID NO: 364), DOM16-67 (SEQ IDNO: 365), DOM16-68 (SEQ ID NO: 366), DOM16-69 (SEQ ID NO: 367),DOM 16-70 (SEQ ID NO: 368), DOM16-71 (SEQ ID NO: 369), DOM16-72(SEQ ID NO: 370), DOM16-73 (SEQ ID NO: 371), DOM16-74 (SEQ IDNO: 372), DOM16-75 (SEQ ID NO: 373), DOM16-76 (SEQ ID NO: 374),DOMl6-77 (SEQ ID NO: 375), DOMl6-78 (SEQ ID NO: 376), DOMl6-79(SEQ ID NO: 377), DOMI6-8O (SEQ ID NO: 378), DOM16-81 (SEQ IDNO: 379), DOMl6-82 (SEQ ID NO: 380), DOMl6-83 (SEQ ID NO: 381),DOM 16-84 (SEQ ID NO: 382), DOM16-85 (SEQ ID NO: 383), DOM16-87(SEQ ID NO: 384), DOMl6-88 (SEQ ID NO: 385), DOMl6-89 (SEQ IDNO: 386), DOM16-90 (SEQ ID NO: 387), DOM16-91 (SEQ ID NO: 388),DOM 16-92 (SEQ ID NO: 389), DOM16-, 94 (SEQ ID NO: 390), DOM16-95(SEQ ID NO: 391), DOMl6-96 (SEQ ID NO: 392), DOMl6-97 (SEQ IDNO: 393), DOM16-98 (SEQ ID NO: 394), DOM16-99 (SEQ ID NO: 395),DOM 16-100 (SEQ ID NO: 396), DQM16-101 (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398), DOM16-103 (SEQ ID NO: 399), DOM16-104 (SEQID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO: 401), DOMI6-IO6 (SEQ ID NO:402), DOMl6-107 (SEQ ID NO: 403), DOMl6-108 (SEQ ID NO: 404),DOM 16-109 (SEQ ID NO: 405), DOM16-HO (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407), DOM16-112 (SEQ ID NO: 408), DOM16-113 (SEQID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO: 410), DOM16-115 (SEQ ID NO:411), DOM16-116 (SEQ ID NO: 412), DOM16-117 (SEQ ID NO: 413),DOMl6-118 (SEQ ID NO: 414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416), DOM16-39-8 (SEQ ID NO: 417), DOM16-39-34(SEQ ID NO: 418), DOM16-39-48 (SEQ ID NO: 419), DOMl6-39-87 (SEQφ ID NO: 420), DOMl6-39-90 (SEQ ID NO: 421), DOMl6-39-96 (SEQ IDNO: 422), DOMl6-39-100 (SEQ ID NO: 423), DOMl6-39-101 (SEQ IDNO: 424), DOM16-39-102 (SEO ID NO: 425), DOM16-39-103 (SEQ IDNO: 426), DOM16-39-104 (SEQ ID NO: 427), DOM16-39-105 (SEQ IDNO: 428), DOM16-39-106 (SEQ ID NO: 429), DOM16-39-107 (SEQ IDNO: 430), DOMl6-39-108 (SEQ ID NO: 431), DOM16-39-109 (SEQ IDNO: 432), DOM16-39-HO (SEQ ID NO: 433), DOM16-39-111 (SEQ IDNO: 434), DOM16-39-112 (SEQ ID NO: 435), DOM16-39-113 (SEQ IDNO: 436), DOM16-39-114 (SEQ ID NO: 437), DOM16-39-115 (SEQ IDNO: 438), DOM16-39-116 (SEQ ID NO: 439), DOM16-39-117 (SEQ IDNO: 440), DOM16-39-200 (SEQ ID NO: 441), DOM16-39-201 (SEQ IDNO: 442), DOM16-39-202 (SEQ ID NO: 443), DOM16-39-203 (SEQ IDNO: 444), DOM16-39-204 (SEQ ID NO: 445), DOM16-39-205 (SEQ IDNO: 446), DOM16-39-206 (SEQ ID NO: 447), DOM16-39-207 (SEQ IDNO: 448), DOM16-39-209 (SEQ ID NO: 449), DOM16-52 (SEQ ID NO:450), NBl (SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ ID NO: 452), NB3 (SEQ ID NO:453), NB4 (SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ ID NO: 455), NB6 (SEQ ID NO:456), NB7 (SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ ID NO: 458), NB9 (SEQ ID NO:459), NBlO (SEQ ID NO: 460), NBll (SEQ ID NO: 461), NB12 (SEQ IDNO: 462), NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14 (SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQID NO: 465), NB16 (SEQ ID NO: 466), NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18(SEQ ID NO: 468), NB19 (SEQ ID NO: 469), NB20 (SEO ID NO: 470),NB21 (SEQ ID NO: 471) e NB22 (SEQ ID NO: 472).
Em formas de realização preferidas, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para EGFRcompreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 90%,pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cercade 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menoscerca de 99% de identidade de seqüência de aminoácido com a seqüência deaminoácido de DOMl6-39 (SEQ ID NO: 345). Por exemplo, o domínio depolipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação paraEGFR pode compreender a seqüência de aminoácido de DOM 16-39-87 (SEQID NO: 420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO: 423), DOM16-39-107 (SEQ IDNO: 430), DOMl6-39-109 (SEQ ID NO: 432), DOM16-39-115 (SEQ IDNO: 438) ou DOM16-39-200 (SEQ ID NO: 441).
Em algumas formas de realização, o domínio de polipeptídeoque tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para EGFRcompete com qualquer um dos dAbs aqui divulgados quanto à ligação ao™ EGFR.
Preferivelmente, o domínio de polipeptídeo que tem um sítiode ligação com especificidade de ligação para EGFR é um domínio variávelúnico de imunoglobulina. O domínio de polipeptídeo que tem um sítio deligação com especificidade de ligação para EGFR pode compreender qualquerdomínio variável de imunoglobulina adequado e preferivelmente compreendeum domínio variável humano ou um domínio variável que compreenderegiões de matriz humana. Em certas formas de realização, o domínio depolipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação paraEGFR compreende uma matriz universal, como aqui descrita.
Em certas formas de realização, o domínio de polipeptídeo quetem um sítio de ligação com especificidade de ligação para EGFR resiste àagregação, desdobra reversivelmente, compreende uma região de matriz e/oué secretada como descrito acima para o domínio de polipeptídeo que tem umsítio de ligação com especificidade de ligação para VEGF.
Monômeros dAb que ligam Albumina Sérica
Os ligandos da invenção podem compreender ainda ummonômero de dAb que liga albumina sérica (SA) com um Kd de 1 nM a 500μΜ (isto é, χ IO"9 a 5 χ IO"4), preferivelmente de 100 nM a 10 μΜ.Preferivelmente, para um ligando que compreende um dAb anti-SA, a ligação(por exemplo, Kd e/ou Kofr como medidas pela ressonância de plasma desuperfície, por exemplo, usando BiaCore) do ligando ao(s) seu(s) alvo(s) é de1 a 100000 vezes (preferivelmente de 100 a 100000, mais preferivelmente de1000 a 100000 ou de 10000 a 100000 vezes) mais forte do que para a SA.Preferivelmente, a albumina sérica é a albumina sérica humana (HSA). Emuma forma de realização, o primeiro dAb (ou um monômero de dAb) liga SA(por exemplo, HSA) com um Kd de aproximadamente 50, preferivelmente 70e mais preferivelmente 100, 150 ou 200 nM.
Em certas formas de realização, o monômero de dAb que ligaSA resiste à agregação, desdobra reversivelmente e/ou compreende umaregião de matriz como descrita acima para os monômeros de dAb que ligamVEGF.
Em formas de realização particulares, o fragmento de ligaçãode antígeno de um anticorpo que liga albumina sérica é um dAb que ligaalbumina sérica humana. Em certas formas de realização, o dAb ligaalbumina sérica humana e compete quanto à ligação à albumina com um dAbselecionado do grupo que consiste de DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473),DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-l(SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO:478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8(SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO:483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ IDNO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491),DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21(SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO:496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498),DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17(SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO:503), DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505),DOM7r-22 (SEO TD NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24(SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO:510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512),DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31(SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516) e DOM7r-33 (SEQ IDNO: 517).
Em certas formas de realização, o dAb liga albumina séricahumana e compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menoscerca de 80% ou pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% oupelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 96% ou pelo menos cercade 97% ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% deidentidade de seqüência de aminoácido com a seqüência de aminoácido de umdAb selecionado do grupo que consiste de DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473),DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-l(SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO:478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8(SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO:483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ IDNO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ TD NO: 491),DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21(SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO:496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498),DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17(SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO:503), DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505),DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24(SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO:510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512),DOM7r-29 (SEO ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31(SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516) e DOM7r-33 (SEQ IDNO: 517).
Por exemplo, o dAb que liga albumina sérica humana podecompreender uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos cerca de90% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 96% ou pelo menoscerca de 97% ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% deidentidade de seqüência de aminoácido com DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482),DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6(SEQ ID NO: 485), DOM7h-l (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO:487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ IDNO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492),DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494) e DOM7h-27(SEQ ID NO: 495).
A identidade de seqüência de aminoácidos é preferivelmentedeterminado usando um adequados seqüência alinhamento algoritmo eparâmetros de valor pré definido, tal como BLAST P (Karlin e Altschul, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 87(6): 2264-2268 (1990)).
Ern formas de realização mais particulares, o dAb é um VkdAb que liga humana albumina sérica e tem uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste de DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485),DOM7h-l (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8(SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497) e DOM7r-14 (SEQ IDNO: 498) ou um VH dAb que tem uma seqüência de aminoácido selecionadodo grupo que consiste de: DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492),DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27(SEQ ID NO: 495). Em outras formas de realização, o fragmento de ligaçãode antígeno de um anticorpo que liga albumina sérica é um dAb que ligaalbumina sérica humana e compreende as CDRs de qualquer uma dasseqüências de aminoácido precedentes.
Os Vhh de Camelídeo adequados que ligam albumina séricaincluem aqueles divulgados na WO 2004/041862 (Ablynx N.V.) e aqui, talcomo a Seqüência A (SEQ ID NO: 518), Seqüência B (SEQ ID NO: 519),Seqüência C (SEQ ID NO: 520), Seqüência D (SEQ ID NO: 521), SeqüênciaE (SEQ ID NO: 522), Seqüência F (SEQ ID NO: 523), Seqüência G (SEQ IDNO: 524), Seqüência H (SEQ ID NO: 525), Seqüência I (SEQ ID NO: 526),Seqüência J (SEQ ID NO: 527), Seqüência K (SEQ ID NO: 528), SeqüênciaL (SEQ ID NO: 529), Seqüência M (SEQ ID NO: 530), Seqüência N (SEQ IDNO: 531), Seqüência O (SEQ ID NO: 532), Seqüência P (SEQ ID NO: 533),Seqüência Q (SEQ ID NO: 534). Em certas formas de realização, a Vhh deCamelídeo liga albumina sérica humana e compreende uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 85%ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menoscerca de 96% ou pelo menos cerca de 97% ou pelo menos cerca de 98% oupelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência de aminoácido comqualquer uma das SEQ ID NOS: 518 a 534.
A identidade de seqüência de aminoácido é preferivelmentedeterminada usando um algoritmo de alinhamento de seqüência adequado eparâmetros de valor pré definidos, tais como BLAST P (Karlin e Altschul,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87(6): 2264-2268 (1990)).
Em algumas formas de realização, o ligando compreende umdAb anti-albumina sérica que compete com qualquer dAb anti-albuminasérica aqui divulgado quanto à ligação à albumina sérica (por exemplo,albumina sérica humana).
Moléculas de Acido Nucleico, Vetores e Células Hospedeiras
A invenção também fornece moléculas de ácido nucleicoisoladas e/ou recombinantes que codificam ligandos (por exemplo, ligandosespecíficos duplos e ligandos específicos múltiplos) como aqui descritos.
Os ácidos nucleicos aqui aludidos como "isolados" são ácidosnucleicos que foram separados dos ácidos nucleicos do DNA genômico ouRNA celular de sua fonte de origem (por exemplo, como o mesmo existe emcélulas ou em uma mistura de ácidos nucleicos tal como uma biblioteca) eincluem ácidos nucleicos obtidos pelos métodos aqui descritos ou outrosmétodos adequados, incluindo ácidos nucleicos essencialmente puros, ácidosnucleicos produzidos pela síntese química, pelas combinações de métodosbiológicos e químicos e ácidos nucleicos recombinantes que são isolados (verpor exemplo, Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476(1991); Lewis, A. P. e J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)).
Os ácidos nucleicos aqui aludidos como "recombinantes" sãoácidos nucleicos que foram produzidos pela metodologia de DNArecombinante, incluindo aqueles ácidos nucleicos que são gerados pelosprocedimentos que contam com um método de recombinação artificial, talcomo a reação da cadeia da polimerase (PCR) e/ou clonagem em um vetorusando enzimas de restrição.
Em certas formas de realização, o ácido nucleico isolado e/ourecornoinante compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica umligando, como aqui descrito, em que o dito ligando compreende umaseqüência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 80%, pelo menoscerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelomenos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%,pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade deseqüência de aminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb que ligaVEGF aqui divulgado ou um dAb que liga EGFR aqui divulgado.
Por exemplo, em algumas formas de realização, o ácidonucleico isolado e/ou recombinante compreende uma seqüência denucleotídeo que codifica um ligando que tenha especificidade de ligação paraVEGF, como aqui descrito, em que o dito ligando compreende uma seqüênciade aminoácido que tem pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%,pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cercade 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menoscerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência deaminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado do grupoque consiste de TARl 5-1 (SEQ ID NO: 100), TARl 5-3 (SEQ ID NO: 101),TARl 5-4 (SEQ ID NO: 102), TARl 5-9 (SEQ ID NO: 103), TARl5-10 (SEQID NO: 104), TAR15-11 (SEQ ID NO: 105), TAR15-12 (SEQ ID NO: 106),TARl5-13 (SEQ ID NO: 107), TAR15-14 (SEQ ID NO: 108), TAR15-15(SEQ ID NO: 109), TAR15-16 (SEQ ID NO: 110), TAR15-17 (SEQ ID NO:111), TARl5-18 (SEQ ID NO: 112), TAR15-19 (SEQ ID NO: 113), TAR15-(SEQ ID NO: 114), TAR 15-22 (SEQ ID NO: 115), TAR15-5 (SEQ IDNO: 116), TARl5-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-7 (SEQ ID NO: 118),TARl5-8 (SEQ ID NO: 119), TAR15-23 (SEQ ID NO: 120), TAR15-24(SEQ ID NO: 121), TARl 5-25 (SEQ ID NO: 122), TARl 5-26 (SEQ ID NO:123), TARl5-27 (SEQ ID NO: 124), TAR15-29 (SEQ ID NO: 125), TAR15-30 (SEQ ID NO: 126), TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 127), TAR15-6-501(SEQ ID NO: 128), TAR15-6-502 (SEQ ID NO: 129), TARl5-6-503 (SEQID NO: 130), TAR15-6-504 (SEQ ID NO: 131), TAR15-6-505 (SEQ ID NO:132), TARl5-6-506 (SEQ ID NO: 133), TARl5-6-507 (SEQ ID NO: 134),TARl5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO: 136), TARl 5-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQ ID NO: 138), TAR15-8-501(SEQ ID NO: 139), TARl5-8-502 (SEQ ID NO: 140), TARl5-8-503 (SEQID NO: 141), TARl5-8-505 (SEQ ID NO: 142), TARl5-8-506 (SEQ ID NO:143), TARl5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TAR15-8-508 (SEQ ID NO: 145),TAR15-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO: 147), TAR15-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQ ID NO: 149), TAR15-26-501(SEQ ID NO: 150), TARl 5-26-502 (SEQ ID NO: 151), TARl5-26-503 (SEQID NO: 152), TARl5-26-504 (SEQ ID NO: 153), TARl5-26-505 (SEQ IDNO: 154), TARl5-26-506 (SEQ ID NO: 155), TARl 5-26-507 (SEQ ID NO:156), TARl5-26-508 (SEQ ID NO: 157), TARl5-26-509 (SEQ ID NO: 158),TARl5-26-510 (SEQ ID NO: 159), TARl5-26-511 (SEQ ID NO: 160),TARl5-26-512 (SEQ ID NO: 161), TARl5-26-513 (SEQ ID NO: 162),TARl5-26-514 (SEQ ID NO: 163), TARl5-26-515 (SEQ ID NO: 164),TARl5-26-516 (SEQ ID NO: 165), TARl5-26-517 (SEQ ID NO: 166),TARl5-26-518 (SEQ ID NO: 167), TARl5-26-519 (SEQ ID NO: 168),TARl5-26-520 (SEQ ID NO: 169), TARl5-26-521 (SEQ ID NO: 170),TARl5-26-522 (SEQ ID NO: 171), TARl5-26-523 (SEQ ID NO: 172),TARl5-26-524 (SEQ ID NO: 173), TARl5-26-525 (SEQ ID NO: 174),TARl5-26-526 (SEQ ID NO: 175), TARl5-26-527 (SEQ ID NO: 176),TARl5-26-528 (SEQ ID NO: 177), TARl5-26-529 (SEQ ID NO: 178),TAR15-26-530 (SEQ ID NO: 179), TARl 5-26-531 (SEQ ID NO: 180),TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181), TARl 5-26-533 (SEQ ID NO: 182),TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183), TARl 5-26-535 (SEQ ID NO: 184),TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185), TARl 5-26-537 (SEQ ID NO: 186),TARl 5-26-538 (SEQ ID NO: 187), TARl 5-26-539 (SEQ ID NO: 188),TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189), TARl 5-26-541 (SEQ ID NO: 190),TARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191), TARl 5-26-543 (SEQ ID NO: 192),TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 193), TARl 5-26-545 (SEQ ID NO: 194),TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195), TARl 5-26-547 (SEQ ID NO: 196),TARl 5-26-548 (SEQ ID NO: 197), TARl 5-26-549 (SEQ ID NO: 198),TARl5-26-550 (SEQ ID NO: 539) e TARl 5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
Em outras formas de realização, o ácido nucleico isolado e/ourecombinante compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica umligando que tenha especificidade de ligação para EGFR, como aqui descrito,em que o dito ligando compreende uma seqüência de aminoácido que tempelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cercade 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menoscerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelomenos cerca de 99% de identidade de seqüência de aminoácido com aseqüência de aminoácido de um dAb selecionado do grupo que consiste deDOMl6-17 (SEQ ID NO: 325), DOM16-18 (SEQ ID NO: 326), DOM16-19(SEQ ID NO: 327), DOM16-20 (SEQ ID NO: 328), DOM16-21 (SEQ IDNO: 329), DOM16-22 (SEQ ID NO: 330), DOM16-23 (SEQ ID NO: 331),DOM 16-24 (SEQ ID NO: 332), DOM16-25 (SEQ ID NO: 333), DOM16-26(SEQ ID NO: 334), DOM16-27 (SEQ ID NO: 335), DOM16-28 (SEQ IDNO: 336), DOM16-29 (SEQ ID NO: 337), DOM16-30 (SEQ ID NO: 338),DOM 16-31 (SEQ ID NO: 339), DOM16-32 (SEQ ID NO: 340), DOM16-33(SEQ ID NO: 341), DOM16-35 (SEQ ID NO: 342), DOM16-37 (SEQ IDNO: 343), DOM16-38 (SEQ ID NO: 344), DOM16-39 (SEQ ID NO: 345),DOM 16-40 (SEQ ID NO: 346), DOM16-41 (SEQ ID NO: 347), DOM16-42(SEQ ID NO: 348), DOM16-43 (SEQ ID NO: 349), DOM16-44 (SEQ IDNO: 350), DOM 16-45 (SEQ ID NO: 351), DOM16-46 (SEQ ID NO: 352),DOM 16-47 (SEQ ID NO: 353), DOM16-48 (SEQ ID NO: 354), DOM16-49(SEQ ID NO: 355), DOMl6-50 (SEQ ID NO: 356), DOMl6-59 (SEQ IDNO: 357), DOMl6-60 (SEQ ID NO: 358), DOMl6-61 (SEQ ID NO: 359),DOM 16-62 (SEQ ID NO: 360), DOM16-63 (SEQ ID NO: 361), DOM16-64(SEQ ID NO: 362), DOM16-65 (SEQ ID NO: 363), DOM16-66 (SEQ IDNO: 364), DOM16-67 (SEQ ID NO: 365), DOM16-68 (SEQ ID NO: 366),) DOM 16-69 (SEQ ID NO: 367), DOM16-70 (SEQ ID NO: 368), DOM16-71(SEQ ID NO: 369), DOM16-72 (SEQ ID NO: 370), DOM16-73 (SEQ IDNO: 371), DOMl6-74 (SEQ ID NO: 372), DOM16-75 (SEQ ID NO: 373),DOMl6-76 (SEQ ID NO: 374), DOM16-77 (SEQ ID NO: 375), DOM16-78(SEQ ID NO: 376), DOM16-79 (SEQ ID NO: 377), DOMI6-8O (SEQ IDNO: 378), DOM16-81 (SEQ ID NO: 379), DOM16-82 (SEQ ID NO: 380),DOM 16-83 (SEQ ID NO: 381), DOM16-84 (SEQ ID NO: 382), DOM16-85(SEQ ID NO: 383), DOM16-87 (SEQ ID NO: 384), DOM16-88 (SEQ IDNO: 385), DOM16-89 (SEQ ID NO: 386), DOM16-90 (SEQ ID NO: 387),DOM 16-91 (SEQ ID NO: 388), DOM16-92 (SEQ ID NO: 389), DOM16-94(SEQ ID NO: 390), DOM16-95 (SEQ ID NO: 391), DOM16-96 (SEQ IDNO: 392), DOMl6-97 (SEQ ID NO: 393), DOMl6-98 (SEQ ID NO: 394),DOM 16-99 (SEQ ID NO: 395), DOMI6-IOO (SEQ ID NO: 396), DOM16-101 (SEQ ID NO: 397), DOM16-102 (SEQ ID NO: 398), DOM16-103 (SEQID NO: 399), DOM16-104 (SEQ ID NO: 400), DOM16-105 (SEQ ID NO:401), DOM 16-106 (SEQ ID NO: 402), DOM16-107 (SEQ ID NO: 403),DOMl6-108 (SEQ ID NO: 404), DOMl6-109 (SEQ ID NO: 405), DOMl6-110 (SEQ ID NO: 406), DOM16-111 (SEQ ID NO: 407), DOM16-112 (SEQID NO: 408), DOM16-113 (SEQ ID NO: 409), DOM16-114 (SEQ ID NO:410), DOM16-115 (SEQ ID NO: 411), DOM16-116 (SEQ ID NO: 412),DOM16-117 (SEQ ID NO: 413), DOM16-118 (SEQ ID NO: 414), DOM16-119 (SEQ ID NO: 415), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 416), DOM16-39-8(SEQ ID NO: 417), DOM16-39-34 (SEQ ID NO: 418), DOM16-39-48 (SEQID NO: 419), DOM16-39-87 (SEQ ID NO: 420), DOM16-39-90 (SEQ IDNO: 421), DOMl 6-39-96 (SEQ ID NO: 422), DOM16-39-100 (SEQ ID NODOMl6-39-102 (SEQ ID NODOMl6-39-104 (SEQ ID NODOM16-39-106 (SEQ ID NODOM16-39-108 (SEQ ID NODOM16-39-110 (SEQ ID NODOM16-39-112 (SEQ ID NODOM16-39-114 (SEQ ID NODOM16-39-116 (SEQ ID NODOMl6-39-200 (SEQ ID NODOM16-3 9-202 (SEQ ID NODOMl6-39-204 (SEQ ID NODOM16-39-206 (SEQ ID NODOMl6-39-209 (SEQ ID NODOMl6-52 (SEQ ID NO: 450), NBl (SEQ ID NO: 451), NB2 (SEQ IDNO: 452), NB3 (SEQ ID NO: 453), NB4 (SEQ ID NO: 454), NB5 (SEQ IDNO: 455), NB6 (SEQ ID NO: 456), NB7 (SEQ ID NO: 457), NB8 (SEQ IDNO: 458), NB9 (SEQ ID NO: 459), NBlO (SEQ ID NO: 460), NBll (SEQID NO: 461), NB12 (SEQ ID NO: 462), NB13 (SEQ ID NO: 463), NB14(SEQ ID NO: 464), NB15 (SEQ ID NO: 465), NB16 (SEQ ID NO: 466),NB17 (SEQ ID NO: 467), NB18 (SEQ ID NO: 468), NB19 (SEQ ID NO:469), NB20 (SEQ ID NO: 470), NB21 (SEQ ID NO: 471) e NB22 (SEQ IDNO: 472).
Em outras formas de realização, o ácido nucleico isolado e/ou
423), DOM16-39-101 (SEQ ID NO: 424) 425), DOMl 6-39-103 (SEQ ID NO: 426) 427), DOMl 6-39-105 (SEQ ID NO: 428) 429), DOMl6-39-107 (SEQ ID NO: 430) 431), DOMl6-39-109 (SEQ ID NO: 432) 433), DOMl 6-39-111 (SEQ ID NO: 434) 435), DOMl 6-39-113 (SEQ ID NO: 436) 437), DOMl6-39-115 (SEQ ID NO: 438) 439), DOMl6-39-117 (SEQ ID NO: 440) 441), DOMl 6-39-201 (SEQ ID NO: 442) 443), DOMl6-39-203 (SEQ ID NO: 444) 445), DOMl 6-39-205 (SEQ ID NO: 446) 447), DOMl6-39-207 (SEQ ID NO: 448)recombinante que codifica um ligando que tenha especificidade de ligaçãopara VEGF, como aqui descrito, em que o dito ácido nucleico compreendeuma seqüência de nucleotídeo tem pelo menos cerca de 80%, pelo menoscerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelomenos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%,pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade deseqüência de nucleotídeo com uma seqüência de nucleotídeo que codifica umdAb anti-VEGF selecionado do grupo que consiste de TARl5-1 (SEQ IDNO: 1), TARl5-3 (SEQ ID NO: 2), TARl5-4 (SEQ ID NO: 3), TARl5-9) (SEQ ID NO: 4), TAR15-10 (SEQ ID NO: 5), TAR15-11 (SEQ ID NO: 6),TAR15-12 (SEQ ID NO: 7), TAR15-13 (SEQ ID NO: 8), TAR15-14 (SEQID NO: 9), TAR15-15 (SEQ ID NO: 10), TAR15-16 (SEQ ID NO: 11),TARl5-17 (SEQ ID NO: 12), TAR15-18 (SEQ ID NO: 13), TAR15-19 (SEQID NO: 14), TAR15-20 (SEQ ID NO: 15), TAR 15-22 (SEQ ID NO: 16),TARl 5-5 (SEQ ID NO: 17), TARl 5-6 (SEQ ID NO: 18), TARl 5-7 (SEQ IDNO: 19), TARl5-8 (SEQ ID NO: 20), TARl5-23 (SEQ ID NO: 21), TARl 5-24 (SEQ ID NO: 22), TARl5-25 (SEQ ID NO: 23), TARl5-26 (SEQ ID NO:24), TARl5-27 (SEQ ID NO: 25), TARl 5-29 (SEQ ID NO: 26), TARl5-30(SEQ ID NO: 27), TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 28), TAR15-6-501 (SEQ IDNO: 29), TARl 5-6-502 (SEQ ID NO: 30), TARl 5-6-503 (SEQ ID NO: 31),TARl5-6-504 (SEQ ID NO: 32), TARl5-6-505 (SEQ ID NO: 33), TARl5-6-506 (SEQ ID NO: 34), TARl5-6-507 (SEQ ID NO: 35), TARl5-6-508 (SEQID NO: 36), TARl5-6-509 (SEQ ID NO: 37), TARl5-6-510 (SEQ ID NO:38), TARl5-8-500 (SEQ ID NO: 39), TARl5-8-501 (SEQ ID NO: 40),TARl5-8-502 (SEQ ID NO: 41), TARl5-8-503 (SEQ ID NO: 42), TARl5-8-505 (SEQ ID NO: 43), TARl5-8-506 (SEQ ID NO: 44), TARl5-8-507 (SEQID NO: 45), TARl5-8-508 (SEQ ID NO: 46), TARl5-8-509 (SEQ ID NO:47), TARl5-8-510 (SEQ ID NO: 48), TARl 5-8-511 (SEQ ID NO: 49),TARl 5-26-500 (SEQ ID NO: 50), TARl5-26-501 (SEQ ID NO: 51), TARl5-26-502 (SEQ ID NO: 52), TARl5-26-503 (SEQ ID NO: 53), TARl5-26-504(SEQ ID NO: 54), TARl5-26-505 (SEQ ID NO: 55), TARl5-26-506 (SEQID NO: 56), TARl5-26-507 (SEQ ID NO: 57), TARl 5-26-508 (SEQ ID NO:58), TARl 5-26-509 (SEQ ID NO: 59), TARl 5-26-510 (SEQ ID NO: 60),TARl 5-26-511 (SEQ ID NO: 61), TAR15-26-512 (SEQ ID NO: 62), TAR15-26-513 (SEQ ID NO: 63), TARl5-26-514 (SEQ ID NO: 64), TARl5-26-515(SEQ ID NO: 65), TARl 5-26-516 (SEQ ID NO: 66), TARl5-26-517 (SEQID NO: 67), TAR15-26-518 (SEQ ID NO: 68), TAR15-26-519 (SEQ ID NO:69), TARl5-26-520 (SEQ ID NO: 70), TAR15-26-521 (SEQ ID NO: 71),) TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 72), TARl5-26-523 (SEQ ID NO: 73), TARl5-26-524 (SEQ ID NO: 74), TARl 5-26-525 (SEQ ID NO: 75), TARl 5-26-526(SEQ ID NO: 76), TARl5-26-527 (SEQ ID NO: 77), TARl5-26-528 (SEOID NO: 78), TARl5-26-529 (SEQ ID NO: 79), TARl 5-26-530 (SEQ ID NO:80), TARl 5-26-531 (SEQ ID NO: 81), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 82),TARl5-26-533 (SEQ ID NO: 83), TAR15-26-534 (SEQ ID NO: 84), TAR15-26-535 (SEQ ID NO: 85), TARl5-26-536 (SEQ ID NO: 86), TARl5-26-537(SEQ ID NO: 87), TAR15-26-538 (SEQ ID NO: 88), TAR15-26-539 (SEQID NO: 89), TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 90), TARl 5-26-541 (SEQ ID NO:91), TAR15-26-542 (SEQ ID NO: 92), TAR15-26-543 (SEQ ID NO: 93),TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 94), TARl 5-26-545 (SEQ ID NO: 95), TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 96), TARl5-26-547 (SEQ ID NO: 97), TARl 5-26-548(SEQ ID NO: 98), TARl 5-26-549 (SEQ ID NO: 99), TARl 5-21 (SEQ IDNO: 535), TARl5-2 (SEQ ID NO: 536), TARl5-26-550 (SEQ ID NO: 537) eTARl 5-26-551 (SEQ ID NO: 538). Preferivelmente, a identidade deseqüência de nucleotídeo é determinada no comprimento inteiro da seqüênciade nucleotídeo que codifica o dAb anti-VEGF selecionado.
Em outras formas de realização, o ácido nucleico isolado e/ourecombinante que codifica um ligando que tenha especificidade de ligaçãopara EGFR, como aqui descrito, em que o dito ácido nucleico que codifica umligando que tenha especificidade de ligação para EGFR, como aqui descrito,compreende uma seqüência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 80%,pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cercade 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menoscerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% deidentidade de seqüência de nucleotídeo com uma seqüência de nucleotídeoque codifica um dAb anti-EGFR selecionado do grupo que consiste deDOM16-17 (SEQ ID NO: 199), DOM16-18 (SEQ ID NO: 200), DOM16-19(SEQ ID NO: 201), DOMl6-20 (SEQ ID NO: 202), DOMl6-21 (SEQ IDNO: 203), DOMl6-22 (SEQ ID NO: 204), DOMl6-23 (SEQ ID NO: 205),DOM 16-24 (SEQ ID NO: 206), DOM16-25 (SEQ ID NO: 207), DOM16-26(SEQ ID NO: 208), DOMl6-27 (SEQ ID NO: 209), DOMl6-28 (SEQ IDNO: 210), DOM16-29 (SEQ ID NO: 211), DOM16-30 (SEQ ID NO: 212),DOM 16-31 (SEQ ID NO: 213), DOM16-32 (SEQ ID NO: 214), DOM16-33(SEQ ID NO: 215), DOMl6-35 (SEQ ID NO: 216), DOMl6-37 (SEQ IDNO: 217), DOM 16-38 (SEQ ID NO: 218), DOM16-39 (SEQ ID NO: 219),DOM 16-40 (SEQ ID NO: 220), DOM16-41 (SEQ ID NO: 221), DOM16-42(SEQ ID NO: 222), DOMl6-43 (SEQ ID NO: 223), DOMl6-44 (SEQ IDNO: 224), DOMl6-45 (SEQ ID NO: 225), DOMl6-46 (SEQ ID NO: 226),DOMl6-47 (SEQ ID NO: 227), DOMl6-48 (SEQ ID NO: 228), DOMl6-49(SEQ ID NO: 229), DOM16-50 (SEQ ID NO: 230), DOM16-59 (SEQ IDNO: 231), DOMl6-60 (SEQ ID NO: 232), DOMl6-61 (SEQ ID NO: 233),DOM 16-62 (SEQ ID NO: 234), DOM16-63 (SEQ ID NO: 235), DOM16-64(SEQ ID NO: 236), DOM16-65 (SEQ ID NO: 237), DOM16-66 (SEQ IDNO: 238), DOM16-67 (SEQ ID NO: 239), DOM16-68 (SEQ ID NO: 240),DOM 16-69 (SEQ ID NO: 241), DOM16-70 (SEQ ID NO: 242), DOM16-71(SEQ ID NO: 243), DOMl6-72 (SEQ ID NO: 244), DOMl6-73 (SEQ IDNO: 245), DOMl6-74 (SEQ ID NO: 246), DOMl6-75 (SEQ ID NO: 247),DOMl6-76 (SEQ ID NO: 248), DOMl6-77 (SEQ ID NO: 249), DOMl6-78(SEQ ID NO: 250), DOM16-79 (SEQ ID NO: 251), DOM16-8Q (SEQ IDNO: 252), DOM16-81 (SEQ ID NO: 253), DOM16-82 (SEQ ID NO: 254),DOM 16-83 (SEQ ID NO: 255), DOM16-84 (SEQ ID NO: 256), DOM16-85(SEQ ID NO: 257), DOM16-87 (SEQ ID NO: 258), DOM16-88 (SEQ IDNO: 259), DOM16-89 (SEQ ID NO: 260), DOM16-90 (SEQ ID NO: 261),DOM 16-91 (SEQ ID NO: 262), DOM16-92 (SEQ ID NO: 263), DOM16-94(SEQ ID NO: 264), DOM16-95 (SEQ ID NO: 265), DOM16-96 (SEQ IDNO: 266), DOM16-97 (SEQ ID NO: 267), DOM16-98 (SEQ ID NO: 268),) DOM 16-99 (SEQ ID NO: 269), DOMló-lOO (SEQ ID NO: 270), DOM16-101 (SEQ ID NO: 271), DOM16-102 (SEQ ID NO: 272), DOM16-103 (SEQID NO: 273), DOM16-104 (SEQ ID NO: 274), DOM16-105 (SEQ ID NO:275), DOM 16-106 (SEQ ID NO: 276), DOM16-107 (SEQ ID NO: 277),DOMl6-108 (SEQ ID NO: 278), DOM16-109 (SEQ ID NO: 279), DOM16-110 (SEQ ID NO: 280), DOM16-111 (SEQ ID NO: 281), DOM16-112 (SEQID NO: 282), DOM16-113 (SEQ ID NO: 283), DOM16-114 (SEQ ID NO:284), DOM16-115 (SEQ ID NO: 285), DOM16-116 (SEQ ED NO: 286),DOM16-117 (SEQ ID NO: 287), DOM16-118 (SEQ ID NO: 288), DOM16-119 (SEQ ID NO: 289), DOM16-39-6 (SEQ ID NO: 290), DOM16-39-8(SEQ ID NO: 291), DOM16-39-34 (SEQ ID NO: 292), DOM16-39-48 (SEQID NO: 293), DOM16-39-87 (SEQ ID NO: 294), DOM16-39-90 (SEQ IDNO: 295), DOMl6-39-96 (SEQ ID NO: 296), DOMl6-39-100 (SEQ ID NO:297), DOM16-39-101 (SEQ ID NO: 298), DOM16-39-102 (SEQ ID NO:299), DOM16-39-103 (SEQ ID NO: 300), DOM16-39-104 (SEQ ID NO:301), DOM16-39-105 (SEQ ID NO: 302), DOM16-39-106 (SEQ ID NO:303), DOMl6-39-107 (SEQ ID NO: 304), DOMl6-39-108 (SEQ ID NO:305), DOM 16-39-109 (SEQ ID NO: 306), DOM16-39-HO (SEQ ID NO:307), DOMl6-39-111 (SEQ ID NO: 308), DOM16-39-112 (SEQ ID NO:309), DOMl6-39-113 (SEQ ID NO: 310), DOM16-39-114 (SEQ ID NO:311), DOMl6-39-115 (SEQ ID NO: 312), DOM16-39-116 (SEQ ID NO:313), DOM16-39-117 (SEO ID NO: 314), DOM16-39-2QO (SEQ ID NO:315), DOMl6-39-201 (SEQ ID NO: 316), DOM16-39-202 (SEQ ID NO:317), DOMl6-39-203 (SEQ ID NO: 318), DOM16-39-204 (SEQ ID NO:319), DOMl6-39-205 (SEQ ID NO: 320), DOM16-39-206 (SEQ ID NO:321), DOMl6-39-207 (SEQ ID NO: 322), DOM16-39-209 (SEQ ID NO:323) e DOM 16-52 (SEQ ID NO: 324). Preferivelmente, a identidade deseqüência de nucleotídeo é determinada no comprimento inteiro da seqüênciade nucleotídeo que codifica o dAb anti-EGFR selecionado.
A invenção também fornece um vetor que compreende umamolécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Em certas formas derealização, o vetor é um vetor de expressão que compreende um ou maiselementos ou seqüências de controle de expressão que são operavelmenteligados ao ácido nucleico recombinante da invenção. A invenção tambémfornece um célula hospedeira recombinante que compreende uma molécula deácido nucleico recombinante ou vetor da invenção. Os vetores adequados (porexemplo, plasmídeos, fagmídeos), elementos de controle de expressão, célulashospedeiras e métodos para produzir células hospedeiras recombinantes dainvenção são bem conhecidos na técnica e os exemplos são ainda aquidescritos.
Os vetores de expressão adequados podem conter várioscomponentes, por exemplo, uma origem de replicação, um gene marcadorselecionável, um ou mais elementos de controle de expressão, tais como umelemento de controle de transcrição (por exemplo, promotor, realçador,terminador) e/ou um ou mais sinais de tradução, uma seqüência de sinal ouseqüência líder e outras. Elementos de controle de expressão e uma seqüênciade sinal, se presente, podem ser fornecidos pelo vetor ou outra fonte. Porexemplo, as seqüências de controle transcricional e/ou traducional de umácido nucleico clonado que codifica uma cadeia de anticorpo podem serusadas para direcionar a expressão.
Uin promotor pode ser fornecido para a expressão em umacélula hospedeira desejada. Promotores podem ser constitutivos ou indutíveis.Por exemplo, um promotor pode ser operavelmente ligado a um ácidonucleico que codifica um anticorpo, cadeia de anticorpo ou porção desta, talque o mesmo direcione a transcrição do ácido nucleico. Uma variedade depromotores adequados para hospedeiros procarióticos (por exemplo, ospromotores lac, tac, T3, T7 para a E. coli) e eucarióticos (por exemplo, opromotor inicial ou tardio do vírus 40 símio, promotor de repetição determinal longo do vírus do sarcoma de Rous, promotor de citomegalovírus,promotor tardio de adenovírus) são disponíveis.
Além disso, vetores de expressão tipicamente compreendemum marcador selecionável para a seleção de células hospedeiras que carregamo vetor, e, no caso de um vetor de expressão replicável, uma origem oureplicação. Genes que codificam produtos que conferem resistência aantibiótico ou medicamento são marcadores selecionáveis comuns e podemser usados em procariótico (por exemplo, gene da lactamase (resistência àampicilina), gene Tet para resistência à tetraciclina) e células eucarióticas (porexemplo, neomicina (G418 ou geneticina), gpt (ácido micofenólico), genes deresistência à ampicilina ou higromicina). Os genes marcadores dadiidrofoliato redutase permitem a seleção com metotrexato em um variedadede hospedeiros. Os genes que codificam o produto de gene de marcadoresauxotróficos do hospedeiro (por exemplo, LEU2, URA3, HIS3) sãofreqüentemente usados como marcadores selecionáveis em levedura. O uso devetores virais (por exemplo, baculovírus) ou de fago e vetores que sãocapazes de integrar no genoma da célula hospedeira, tal como vetoresretrovirais, também são considerados. Os vetores de expressão adequadospara a expressão em células de mamífero e células procarióticas {E. coli),células de inseto (células S2 Drosophila Schnieder, SD) e levedura (P.methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) são bem conhecidos na técnica.
As células hospedeiras adequadas podem ser procarióticas,incluindo células bacterianas tais como E. coli, B. subtilis e/ou outrasbactérias adequadas; as células eucarióticas, tais como as células fóngicas oude levedura (por exemplo, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomycescerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) ou outrascélulas eucarióticas inferiores e células de eucariotas superiores tais comoaquelas de insetos (por exemplo, células S2 de Drosophila Schnieder, célulasSf9 de inseto (WO 94/26087 (0'Connor)), mamíferos (por exemplo, célulasCOS, tais como COS-I (Acesso do ATCC N- CRL-1650) e COS-7 (Acessodo ATCC Nfi CRL-1651), CHO (por exemplo, Acesso do ATCC Nq CRL-9096, CHO DG44 (Urlaub, G. e Chasin, LA., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,77(7): 4216-4220 (1980))), 293 (Acesso do ATCC Ns CRL-1573), HeLa(Acesso do ATCC N2 CCL-2), CVl (Acesso do ATCC Na CCL-70), WOP(Dailey, L., et al., J Virol., 54: 739-749 (1985), 3T3, 293T (Pear, W. S., et ai.,Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 90: 8392-8396 (1993)) células NSO, célulasSP2/0, HuT 78 e outras ou vegetais (por exemplo, tabaco). (Ver, por exemplo,Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Associates e John Wiley & Sons Inc. (1993)) Em algumas formasde realização, a célula hospedeira é uma célula hospedeira isolada e não éparte de um organismo multicelular (por exemplo, planta ou animal). Emformas de realização preferidas, a célula hospedeira é uma célula hospedeiranão humana.
A invenção também fornece um método para produzir umligando (por exemplo, ligando específico duplo, ligando específico múltiplo)da invenção, que compreende manter uma célula hospedeira recombinanteque compreende um ácido nucleico recombinante da invenção sob condiçõesadequadas para a expressão do ácido nucleico recombinante, por meio do qualo ácido nucleico recombinante é expressado e um ligando é produzido. Emalgumas formas de realização, o método compreende ainda isolar o ligando.Preparação de Ligandos Com Base em Imunoglobulina
Os ligandos (por exemplo, ligandos específicos duplos,ligandos específicos múltiplos) de acordo com a invenção podem serpreparados de acordo com técnicas anteriormente estabelecidas, usadas nocampo do engendramento de anticorpo, para a preparação de scFv, anticorposde "fago" e outras moléculas de anticorpo engendradas. As técnicas para apreparação de anticorpos são por exemplo descritas nas seguintes revisões enas referências nestas citadas: Winter & Milstein, (1991) Nature 349: 293-299; Pluckthun (1992) Imunological Reviews 13 0: 151-188; Wright et al.,(1992) Crit. Rev. Immunol. 12: 125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993)Curr. Opin. Biotechnol. 4, 446-449; Carter, et al. (1995) J. Hematother. 4,463-470; Chester, K. A. & Hawkins, R. E. (1995) Trends Biotechnol. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nat. Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D.(1997) Nat. Biotechnol. 15, 618-619; Pluckthun, A. & Pack, P. (1997)Immunotechnology 3, 83-105; Carter, P. & Merchant, A. M. (1997) Curr.Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) CâncerImmunol. Imunother. 45, 128-130.
As técnicas adequadas utilizadas para a seleção de domíniosvariáveis de anticorpo com uma especificidade desejada utiliza bibliotecas eprocedimentos de seleção que são conhecidos na técnica. Bibliotecas naturais(Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan et al. (1996) NatureBiotech., 14: 309) que usam genes V rearranjados colhidos das células Bhumanas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Asbibliotecas sintéticas (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381;Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4457; Nissim et al.(1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; DeKruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97) são preparadas clonando-se genes Vda imunoglobulina, habitualmente usando PCR. Os erros no processo da PCRpodem levar a um alto grau de randomização. As bibliotecas Vh e/ou Vlpodem ser selecionadas contra antígenos ou epítopos alvo separadamente,caso este em que a ligação de domínio único é diretamente selecionada paraou junto com.
Sistemas de Vetor de Biblioteca
Uma variedade de sistemas de seleção é conhecida na técnicaque são adequados para o uso na presente invenção. Os exemplos de taissistemas são descritos abaixo.
Os sistemas de expressão lambda de bacteriófago podem sertriados diretamente como placas de bacteriófago ou como colônias delisogênios, ambos como anteriormente descritos (Huse et al. (1989) Science,246: 1275; Caton e Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87;Mullinax et at. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 87: 8095; Persson et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 88: 2432) e são de uso na invenção.Embora tais sistemas de expressão possam ser usados para triar até IO6membros diferente de uma biblioteca, eles não são realmente adaptados para atriagem de números maiores (maiores do que 106 membros). De uso particularna construção de bibliotecas são os sistemas que demonstram seleção, quepermitem que um ácido nucleico seja ligado ao polipeptídeo que o mesmoexpressa. Como aqui usado, um sistema que demonstra seleção é um sistemaque permite a seleção, por meios de demonstração adequados, dos membrosindividuais da biblioteca pela ligação do genérico e/ou alvo.
Os protocolos de seleção para isolar membros desejados debibliotecas grandes são conhecidos na técnica, como tipificado pelas técnicasde demonstração de fago. Tais sistemas, em que seqüências de peptídeodiversas são demonstradas na superfície de bacteriófago filamentoso (Scott eSmith (1990) Science, 249: 386), têm se mostrado útil para criar bibliotecasde fragmentos de anticorpo (e as seqüências de nucleotídeo que as codificam)para a seleção e amplificação in vitro de fragmentos de anticorpo específicosque ligam um antígeno alvo (McCafferty et al., WO 92/01047). As seqüênciasde nucleotídeo que codificam as regiões variáveis são ligadas aos fragmentosde gene que codificam sinais líder que as direcionam ao espaçoperiplasmático da E. coli e como um resultado os fragmentos de anticorporesultantes são demonstrados na superfície do bacteriófago, tipicamente comofusões às proteínas de revestimento de bacteriófago (por exemplo, pIII oupVIII). Alternativamente, fragmentos de anticorpo são demonstradosexternalmente nos capsídeos de fago lambda (fagocorpos). Uma vantagemdos sistemas de demonstração com base em fago é que, porque eles sãosistemas biológicos, os membros de biblioteca selecionados podem seramplificados simplesmente cultivando-se o fago contendo o membro dabiblioteca selecionado em células bacterianas. Além disso, visto que aseqüência de nucleotídeo que codifica o membro da biblioteca de polipeptídeoestá contida em um vetor de fago ou fagomídeo, o seqüenciamento, aexpressão e a manipulação genética subseqüente são relativamente direto.
Os métodos para a construção de bibliotecas que demonstramanticorpo de bacteriófago e bibliotecas de expressão de fago lambda são bemconhecidos na técnica (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature,352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991)Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J. Immunol., 147: 3610;Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) supra; Barbas et al.(1992) supra; Hawkins e Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al.,1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313,aqui incorporadas por referência).
Um método particularmente vantajoso foi o uso de bibliotecasde fago scFv (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070;McCafferty et al. (1990) supra; Claekson et al. (1991) Nature, 352: 624;Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581: Chiswell et ai. (1992) TrendsBiotechnol., 10: 80; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267). Várias formasde realização de bibliotecas de seFv demonstradas nas proteínas derevestimento de bacteriófago foram descritas. Refinamentos dos métodos dedemonstração de fago também são conhecidos, por exemplo como descritosna WO 96/06213 e WO 92/01047 (Medicai Research Council et al.) e WO97/08320 (Morphosys), que são aqui incorporadas por referência.
Outros sistemas para gerar bibliotecas de polipeptídeosenvolve o uso de mecanismo enzimático isento de célula para a síntese invitro dos membros da biblioteca. Em um método, as moléculas de RNA sãoselecionadas pelas rodadas alternativas de seleção contra um alvo eamplificação pela PCR (Tuerk e Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington eSzostak (1990) Nature, 346: 818). Uma técnica similar pode ser usada paraidentificar seqüências de DNA que ligam um fator de transcrição humano prédeterminado (Thiesen e Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry eJoyce (1992) Science, 257: 635; WO 92/05258 e WO 92/14843). Em umamaneira similar, a tradução in vitro pode ser usada para sintetizarpolipeptídeos como um método para gerar bibliotecas grandes. Estes métodosque no geral compreendem complexos de polissoma estabilizados, sãodescritos ainda na WO 88/08453, WO 90/05785, WO 90/07003, WO91/02076, WO 91/05058 e WO 92/02536. Os sistemas de demonstraçãoalternativos que não são fundamentados em fago, tais como aquelesdivulgados na WO 95/22625 e WO 95/11922 (Affymax) usam os polissomaspara demonstrar polipeptídeos para a seleção.
Ainda uma outra categoria de técnicas envolve a seleção derepertórios em compartimentos artificiais, que permitem a ligação de um genecom o seu produto de gene. Por exemplo, um sistema de seleção em que osácidos nucleicos que codificam produtos de gene desejáveis podem serselecionados em microcápsulas formadas pelas emulsões de água em óleo édescrita na WO 99/02671, WO 00/40712 e Tawfik & Griffiths (1998) NatureBiotechnol 16(7), 652-6. Os elementos genéticos que codificam um produtode gene tendo uma atividade desejada são compartimentalizados emmicrocápsulas e depois transcritas e/ou traduzidas para produzir seusrespectivos produtos de gene (RNA ou proteína) dentro das microcápsulas. Oselementos genéticos que produzem produto de gene tendo atividade desejadasão subseqüentemente selecionados. Este método seleciona os produtos degene de interesse pela detecção da atividade desejada por uma variedade demeios.
Construção de Biblioteca
As bibliotecas intencionadas para a seleção, podem serconstruídas usando técnicas conhecidas no ramo, por exemplo comoapresentado acima ou podem ser adquiridas de fontes comerciais. Asbibliotecas que são úteis na presente invenção são descritas, por exemplo, naWO 99/20749. Uma vez que um sistema de vetor é escolhido e uma ou maisseqüências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos de interesse sãoclonados no vetor da biblioteca, pode-se gerar diversidade dentro dasmoléculas clonadas empreendendo-se a mutagênese antes da expressão;alternativamente, as proteínas codificadas podem ser expressadas eselecionadas, como descrito acima, antes que a mutagênese e rodadasadicionais de seleção sejam realizadas. A mutagênese das seqüências de ácidonucleico que codificam polipeptídeos estruturalmente otimizadas é realizadapelos métodos moleculares padrão. De uso particular é a reação da cadeia dapolimerase ou PCR, (Mullis e Faloona (1987) Methods Enzymol., 155: 335,aqui incorporada por referência). A PCR, que usa ciclos múltiplos dereplicação de DNA catalisados por uma DNA polimerase termoestável,dependente de DNA para amplificar a seqüência alvo de interesse, é bemconhecida na técnica. A construção de várias bibliotecas de anticorpo foidebatida em Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 ereferências nesta citadas.
A PCR é realizada usando DNA padrão (pelo menos 1 fg; maisutilmente, 1 a 1000 ng) e pelo menos 25 pmol de iniciadores deoligonucleotídeo; pode ser vantajoso usar uma quantidade maior de iniciadorquando a reunião de iniciador é pesadamente heterogênea, visto que cadaseqüência é reapresentada apenas por uma fração pequena das moléculas dareunião e as quantidades tornam-se limitantes nos últimos ciclos deamplificação. Uma mistura de reação típica inclui: 2 μΐ de DNA, 25 pmol deiniciador de oligonucleotídeo, 2,5 μΐ de IOX tampão de PCR 1 (Perkin-Elmer,Foster City, CA), 0,4 μΐ de 1,25 μΜ de dNTP, 0,15 μΐ (ou 2,5 unidades) deTaq DNA polimerase (Perkin Elmer, Foster City, CA) e água deionizada a umvolume total de 25 μΐ. Oleo mineral é revestido e a PCR é realizada usandoum ciclador térmico programável. O comprimento e a temperatura de cadaetapa de um ciclo de PCR, assim como o número de ciclos, é ajustado deacordo com as exigências de severidade em vigor. A temperatura e o controlede tempo de recozimento são determinados tanto pela eficiência com que uminiciador é esperado recozer a um padrão e o grau de desemparelhamento quedeva ser tolerado; obviamente, quando as moléculas de ácido nucleico sãosimultaneamente amplificadas e mutagenizadas, o desemparelhamento érequerido, pelo menos na primeira rodada de síntese. A capacidade paraotimizar a severidade das condições de recozimento de iniciador está bemdentro do conhecimento de uma pessoa de habilidade moderada na técnica.Uma temperatura de recozimento entre 3 O0C e 12°C é usada. A desnaturaçãoinicial das moléculas padrão normalmente ocorre entre 92°C e 99°C por 4minutos, seguido por 20 a 40 ciclos que consistem de desnaturação (94 a99°C por 15 segundas a 1 minuto), recozendo (temperatura determinada comodebatido acima; 1 a 2 minutos) e extensão (72°C por 1 a 5 minutos,dependendo do comprimento do produto amplificado). A extensão final é nogeral por 4 minutos a 72°C e pode ser seguida por uma etapa indefinida (0 a24 horas) a 4°C.
Combinação de Domínios Variáveis Únicos
Os domínios úteis na invenção, uma vez selecionados, podemser combinados por um variedade de métodos conhecidos na técnica,incluindo métodos covalentes e não covalentes. Os métodos preferidosincluem o uso de ligadores de polipeptídeo, como descritos, por exemplo, emconexão com moléculas scFv (Bird et al., (1988) Science 242: 423-426). Odebate de ligadores adequados é fornecido em Bird et ai. Science 242, 423-426; Hudson et al., Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson etal, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883. Os ligadores são preferivelmenteflexíveis, permitindo que os dois domínios únicos interagissem. Um exemplode ligador é um ligador (Gly4Ser)n, onde η = 1 a 8, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou7. Os ligadores usados em diacorpos, que são menos flexíveis, também podemser utilizados (Holliger et al., (1993) Proc Nat Acad Sci USA 90: 6444-6448).Em uma forma de realização, o ligador utilizado não é uma região dedobradiça da imunoglobulina.
Os domínios variáveis podem ser combinados usando métodosoutros que não de ligadores. Por exemplo, o uso de pontes de dissulfeto,fornecidos através de resíduos de cisteína que ocorrem naturalmente ouengendrados, podem ser explorados para estabilizar dímeros Vh-Vh,Vl-Vl ouVh-Vl (Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7: 697-704) ou pela remodelagem dainterface entre os domínios variáveis para melhorar o "ajuste" e assim aestabilidade de interação (Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7: 617-621;Zhu et al., (1997) Protein Science 6: 781-788). Outras técnicas para unir ouestabilizar domínios variáveis de imunoglobulinas e em particular domíniosVh de anticorpo, podem ser utilizados como apropriado.
Caracterização de LigandosA ligação de um ligando específico duplo à célula ou a ligaçãode cada domínio de ligação a cada alvo específico pode ser testada pelosmétodos que serão familiares àqueles habilitados na técnica e incluem ELISA.Em uma forma de realização preferida da invenção a ligação é testada usandoELISA de fago monoclonal. O ELISA de fago pode ser realizado de acordocom qualquer procedimento adequado: um protocolo exemplar é apresentadoabaixo.
As populações de fago produzidas em cada rodada de seleçãopodem ser tríadas quanto à ligação pelo ELISA ao antígeno ou epítoposelecionados, para identificar anticorpos de fago "policlonal". O fago decolônias bacterianas infectadas únicas destas populações pode ser depoistriado pelo ELISA para identificar anticorpos "monoclonais" de fago.Também é desejável triar fragmentos de anticorpo solúveis quanto à ligaçãoao antígeno ou epítopo e isto também pode ser empreendido pelo ELISAusando reagentes, por exemplo, contra um rótulo de terminal C ou N (ver porexemplo Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 e referênciasnesta citadas.
A diversidade dos anticorpos monoclonais de fagoselecionados também pode ser avaliada pela eletroforese em gel de produtosde PCR (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), sondagem(Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) ou pelo seqüenciamento doDNA vetorial.
Estrutura de Ligandos
No caso em que cada domínio variável é selecionado derepertórios de gene V, selecionado por exemplo, usando a tecnologia dedemonstração de fago como aqui descrita, então estes domínios variáveiscompreendem uma região de matriz universal, tal que os mesmos podem serreconhecidos por um ligando genérico duplo específico como aqui definido.
O uso de matrizes universais, ligandos genéricos e outros é descrito na WO99/20749.
Onde repertórios de gene V são usados a variação naseqüência de polipeptídeo é preferivelmente localizada dentro das alçasestruturais dos domínios variáveis. As seqüências de polipeptídeo de cadadomínio variável pode ser alterada pelo embaralhamento de DNA ou pelamutação de modo a realçar a interação de cada domínio variável com seu parcomplementar. O embaralhamento de DNA é conhecido na técnica edivulgado, por exemplo, por Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 e PatenteU.S. N2 6.297.053, ambos os quais são aqui incorporados por referência.Outros métodos de mutagênese são bem conhecidos por aqueles de habilidadena técnica.
No geral, as moléculas de ácido nucleico e as construções devetor requeridas para a seleção, preparação e formatação de ligandosespecíficos duplos podem ser construídas e manipuladas como apresentadoem manuais de laboratório padrão, tais como Sambrook et ai. (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA.
A manipulação de ácidos nucleicos úteis na presente invençãoé tipicamente realizada em vetores recombinantes. Como aqui usado, vetorrefere-se a um elemento separado que é usado para introduzir DNAheterólogo em células para a sua expressão e/ou replicação. Os métodos pelosquais a seleção ou construção e, subseqüentemente, uso de tais vetores sãobem conhecidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Numerososvetores são publicamente disponíveis, incluindo plasmídeos bacterianos,bacteriófago, cromossomas artificiais e vetores epissômicos. Tais vetorespodem ser usados para a clonagem e mutagênese simples; alternativamenteum vetor de expressão de gene é utilizado. Um vetor de uso de acordo com ainvenção pode ser selecionado para acomodar uma seqüência codificadora depolipeptídeo de um tamanho desejado, tipicamente de 0,25 quilobase (kb) a40 kb ou mais no comprimento. Uma célula hospedeira adequada étransformada com o vetor depois das manipulações de clonagem in vitro.Cada vetor contém vários componentes funcionais, que no geral incluem umsítio de clonagem (ou "poliligador"), uma origem de replicação e pelo menosum gene marcador selecionável. Se o dado vetor é um vetor de expressão, omesmo adicionalmente possui um ou mais dos seguintes: elemento realçador,promotor, terminação de transcrição e seqüências de sinal, cada umposicionado na vicinidade do sítio de clonagem, tal que estes possam seroperativamente ligados ao gene que codifica um ligando específico duplo deacordo com a invenção.
Tanto os vetores de clonagem quanto os de expressão no geralcontêm seqüências de ácido nucleico que possibilitam o vetor de replicar emuma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tipicamente em vetores declonagem, esta seqüência é uma que possibilita o vetor de replicarindependentemente do DNA cromossômico hospedeiro e inclui origens dereplicação ou seqüências que replicam autonomamente. Tais seqüências sãobem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origemde replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactériasGram-negativas, a origem de plasmídeo de 2 mícrons é adequada paralevedura e várias origens virais (por exemplo, SV 40, adenovírus) são úteispara os vetores de clonagem em células de mamífero. No geral, a origem dereplicação não é necessária para os vetores de expressão de mamífero a menosque estes sejam usados em células de mamífero capazes de replicar níveisaltos de DNA, tais como células COS.
Vantajosamente, um vetor de clonagem ou expressão podeconter um gene de seleção também aludido como um marcador selecionável.Este gene codifica uma proteína necessária para a sobrevivência oucrescimento de células hospedeiras transformadas cultivadas em um meio decultura seletivo. As célula hospedeiras não transformadas com o vetorcontendo o gene de seleção portanto não sobreviverá no meio de cultura. Osgenes de seleção típicos codificam proteínas que conferem resistência aosantibióticos e outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexatoou tetraciclina, complemento de deficiências auxotróficas ou fornecimento denutrientes críticos não disponíveis no meio de cultivo.
Visto que a replicação de vetores que codificam um ligandoespecífico duplo de acordo com a presente invenção é mais convenientementerealizada em E. coli, um marcador selecionável de E. coli, por exemplo, ogene da β-lactamase que confere resistência ao antibiótico ampicilina, é deuso. Estes podem ser obtidos de plasmídeos da E. coli, tais como pBR322 ouum plasmídeo pUC tal como pUC18 ou pUC19.
Os vetores de expressão usualmente contêm um promotor queé reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operavelmente ligado àseqüência codificadora de interesse. Um tal promotor pode ser indutível ouconstitutivo. O termo "operavelmente ligada" refere-se a uma justaposição emque os componentes descritos estão em uma relação que os permite funcionarna sua maneira pretendida. Uma seqüência de controle "operavelmenteligada" a uma seqüência codificadora é ligada em um tal modo que aexpressão da seqüência codificadora é obtida sob condições compatíveis comas seqüências de controle.
Os promotores adequados para o uso com hospedeirosprocarióticos incluem, por exemplo, os sistemas de promotor de β-lactamase elactose, fosfatase alcalina, o sistema de promotor de triptofano (trp) epromotores híbridos tais como o promotor tac. Promotores para o uso emsistemas bacterianos também no geral conterão uma seqüência de Shine-Delgarno operavelmente ligada à seqüência codificadora.
Os vetores preferidos são vetores de expressão quepossibilitam a expressão de uma seqüência de nucleotídeo que corresponde aum membro da biblioteca de polipeptídeo. Assim, a seleção com o primeiroe/ou segundo antígeno ou epítopo pode ser realizada pela propagação eexpressão separada de um clone único que expressa o membro da bibliotecade polipeptídeo ou pelo uso de qualquer sistema que demonstre seleção.
Como descrito acima, o sistema que demonstra seleç-ao preferido é ademonstração de bacteriófago. Assim, os vetores de fago ou fagomídeopodem ser usados, (por exemplo, pITl ou pIT2. As seqüências líder úteis nainvenção incluem pelB, stll, ompA, phoA, bla e pelA. Um exemplo sãovetores de fagomídeo que têm uma origin E. coli de replicáção (para areplicação do filamento duplo) e também uma origem de fago de replicáção(para a produção de DNA de filamento único). A manipulação e expressão detais vetores é bem conhecida na técnica (Hoogenboom e Winter (1992) supra;Nissim et ai. (1994) supra). Em resumo, o vetor contém um gene da β-lactamase para conferir seletividade no fagomídeo e um promotor Iac amontante de um cassete de expressão que consiste (do terminal N para C) deuma seqüência líder pelB (que direciona o polipeptídeo expressado ao espaçoperiplasmático), um sítio de clonagem múltiplo (para clonar a versão denucleotídeo do membro da biblioteca), opcionalmente, um ou mais rótulos depeptídeo (para a detecção), opcionalmente, um ou mais códons de paradaTAG e a proteína de fago pIII. Assim, usando várias cepas supressoras e nãosupressoras de E. coli e com a adição de glicose, iso-propil ΐίο-β-D-galactosídeo (IPTG) ou um fago auxiliar, tal como VCS Ml3, o vetor é capazde replicar como um plasmídeo sem nenhuma expressão, produzemquantidades grandes do membro da biblioteca de polipeptídeo apenas ouproduzem fago, alguns dos quais contêm pelo menos uma cópia da fusão depolipeptídeo-pIII na sua superfície.
A construção de vetores que codificam ligando específicoduplos de acordo com a invenção utiliza técnicas de ligação convencionais.
Os vetores isolados ou fragmentos de DNA são clivados, adaptados ereligados na forma desejada para gerar o vetor requerido. Se desejado, aanálise para confirmar que as seqüências corretas estão presentes no vetorconstruído pode ser realizada em uma maneira conhecida. Os métodosadequados para construir vetores de expressão, preparar transcritos in vitro,introduzir DNA em células hospedeiras e realizar análises para avaliar aexpressão e função são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Apresença de uma seqüência de gene em uma amostra é detectada ou a suaamplificação e/ou expressão quantificadas pelos métodos convencionais, taiscomo a análise de Southern ou Northern, Western blotting, dot blotting deDNA, RNA ou proteína, hibridização in situ, imunocitoquímica ou análise deseqüência de moléculas de ácido nucleico ou proteína. Aqueles habilitados natécnica facilmente imaginarão como estes métodos podem ser modificados, sedesejado.
Esqueletos
Os esqueletos podem ser fundamentados nas moléculas deimunoglobulina ou podem não ser de imununoglobulina na origem comoapresentado acima. Cada domínio do ligando específico duplo pode ser umesqueleto diferente. Os esqueletos de imunoglobulina preferidos como aquidefinidos incluem qualquer um ou mais daqueles selecionados dos seguintes:uma molécula de imunoglobulina que compreende pelo menos (i) o domínioCL (subclass capa ou lambda) de um anticorpo; ou (ii) o domínio CHl deuma cadeia pesada de anticorpo; uma molécula de imunoglobulina quecompreende os domínios CHl e CH2 de uma cadeia pesada de anticorpo; umamolécula de imunoglobulina que compreende os domínios CHI, CH2 e CH3de uma cadeia pesada de anticorpo; ou qualquer um dos subconjuntos (ii) emconjunção com o domínio CL (subclasse capa ou lambda) de um anticorpo.Um domínio de região de dobradiça também pode ser incluído. Taiscombinações de domínios podem, por exemplo, imitar anticorpos naturais,tais como IgG ou IgM ou fragmentos destes, tais como moléculas Fv, scFv,Fab ou F(ab')2- Aqueles habilitados na técnica estarão cientes de que esta listanão é intencionada a ser exaustiva.Esqueletos de Proteína
Cada domínio de ligação compreende um esqueleto deproteína e uma ou mais CDRs que estão envolvidas na interação específica dodomínio com um ou mais epítopos. Vantajosamente, um domínio de ligaçãode epítopo de acordo com a presente invenção compreende três CDRs. Osesqueletos de proteína adequados incluem qualquer um daqueles selecionadosdo grupo que consiste dos seguintes: aqueles com base nos domínios deimunoglobulina, aqueles com base em fibronectina, aqueles com base emaficorpos, aqueles com base em CTLA4, aqueles com base emacompanhantes tais como GroEL, aqueles com base em lipocallin e aquelescom base nos receptores Fc bacterianos SpA e SpD. Aqueles habilitados natécnica avaliarão que esta lista não é intencionada a ser exaustiva.
Esqueletos para o Uso na Construção de Ligandos
Seleção da Conformação da Cadeia Principal
Os membros da superfamília da imunoglobulina todoscompartilham uma dobra similar para a sua cadeia de polipeptídeo. Porexemplo, embora os anticorpos sejam altamente diversos em termos de suaseqüência primária, comparação das seqüências e estruturas cristalográficastem revelado que, ao contrário da expectativa, cinco das seis alças de ligaçãode antígeno de anticorpos (Hl, H2, LI, L2, L3) adoptam um número limitadode conformações de cadeia principal ou estruturas canônicas (Chotia e Lesk(1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chotia et al. (1989) Nature, 342: 877). Aanálise de comprimentos de alça e resíduos chave tem portanto permitido oprognóstico das conformações de cadeia principal de Hl, H2, LI, L2 e L3encontradas na maioria dos anticorpos humanos (Chotia et al. (1992) J. Mol.Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al.(1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Embora a região H3 seja muito mais diversaem termos da seqüência, comprimento e estrutura (devido ao uso desegmentos D), a mesma também forma um número limitado de conformaçõesde cadeia principal para comprimentos de alça curta que dependem docomprimento e da presença de resíduos ou tipos particulares de resíduo, nasposições chave na alça e na matriz de anticorpo (Martin et al. (1996) .T. Mol.Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
As bibliotecas de ligandos e/ou domínios de ligação podem serplanejados em que certos comprimentos de alça e resíduos chave foramescolhidos para garantir que a conformação de cadeia principal dos membrosseja conhecida. Vantajosamente, estas são conformações reais de moléculasda superfamília da imunoglobulina encontrada na natureza, para minimizar asmudanças em que elas não são funcionais, como debatido acima. Ossegmentos de gene V da linha germinativa servem como uma matriz básicaadequada para a construção de bibliotecas de receptor de anticorpo ou célulaT; outras seqüências são também de uso. Variações podem ocorrer em umafreqüência baixa, tal que um pequeno número de membros funcionais podepossuir uma conformação de cadeia principal alterada, que não afeta a suafunção.
A teoria de estrutura canônica também é de uso para avaliar onúmero de conformações de cadeia principal diferentes codificado pelosligandos, para prognosticar a conformação de cadeia principal com base nasseqüências duplas específicas de ligando e aos resíduos escolhidos paradiversificação que não afetam a estrutura canônica. E conhecido que, nodomínio Vk humano, a alça Ll pode adotar uma de quatro estruturascanônicas, a alça L2 tem uma estrutura canônica única e que 90% dosdomínios Vk humanos adoptam uma de quatro ou cinco estruturas canônicaspara a alça L3 (Tomlinson et al. (1995) supra); assim, apenas no domínio VK,estruturas canônicas diferentes podem se combinar para criar uma faixa deconformações de cadeia principal diferentes. Dado que o domínio Vχ codificauma faixa diferente de estruturas canônicas para as alças LI, L2 e L3 e que osdomínios Vk e νλ, podem emparelhar com qualquer domínio Vh que possacodificar diversas estruturas canônicas para as alças Hl e H2, o número decombinações de estrutura canônica observado para estas cinco alças é muitogrande. Isto implica que a geração de diversidade na conformação de cadeiaprincipal pode ser essencial para a produção de uma ampla faixa deespecificidades de ligação. Entretanto, pela construção de uma biblioteca deanticorpo com base em uma conformação de cadeia principal conhecido únicafoi descoberto, ao contrário da expectativa, que a diversidade na conformaçãode cadeia principal cadeia principal não é requerida para gerar diversidadesuficiente para alvejar substancialmente todos os antígenos. Ainda maissurpreendentemente, a conformação de cadeia principal única não precisa seruma estrutura de consenso - uma conformação única que ocorre naturalmentepode ser usada como a base para uma biblioteca inteira. Assim, em umaspecto preferido, os ligandos da invenção possuem uma conformação decadeia principal única conhecida.
A conformação de cadeia principal única que é escolhida épreferivelmente comum entre as moléculas do tipo da superfamília daimunoglobulina em questão. Uma conformação é comum quando um númerosignificante de moléculas que ocorrem naturalmente são observadas adotá-la.Conseqüentemente, em um aspecto preferido da invenção, a ocorrêncianatural das conformações de cadeia principal diferentes para cada alça deligação de um domínio de imunoglobulina é considerada e depois um domíniovariável que ocorrem naturalmente é escolhido que possui a combinaçãodesejada de conformações de cadeia principal para as alças diferentes. Senenhuma é disponível, o equivalente mais próximo pode ser escolhido. Epreferível que a combinação desejada de conformações de cadeia principalpara as alças diferentes seja criada pela seleção de segmentos de gene da linhagerminativa que codificam as conformações de cadeia principal desejadas. Emais preferível, que os segmentos de gene da linha germinativa selecionadossejam freqüentemente expressados na natureza e o mais preferível que elessejam os mais freqüentemente expressados de todos os segmentos de gene dalinha germinativa naturais.
No planejamento de ligandos (por exemplo, ds-dAbs) oubibliotecas destes a incidência das conformações de cadeia principaldiferentes para cada uma das seis alças de ligação de antígeno pode serseparadamente considerada. Para Hl, H2, LI, L2 e L3, uma dadaconformação que é adotada entre 20% e 100% das alças de ligação deantígeno das moléculas que ocorrem naturalmente é escolhida. Tipicamente, asua incidência observada está acima de 35% (isto é entre 35% e 100%) e,idealmente, acima de 50% ou ainda acima de 65%. Visto que a vasta maioriadas alças H3 não têm estruturas canônicas, é preferível selecionar umaconformação de cadeia principal que seja comum entre aquelas alças quedemonstram estruturas canônicas. Para cada uma das alças, a conformaçãoque é observada mais freqüentemente no repertório natural é portantoselecionada. Em anticorpos humanos, as estruturas canônicas mais populares(CS) para cada alça são como segue: Hl -CS 1 (79% do repertórioexpressado), H2 - CS 3 (46%), Ll - CS 2 de Vk (39%), L2 - CS 1 (100%), L3 -CS 1 de Vk (36%) (o cálculo assume uma razão κ:λ de 70:30, Hood et al.(1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). Para as alças H3que têm estruturas canônicas, um comprimento CDR3 (Kabat et al. (1991)Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Healthand Humana Services) de sete resíduos com uma ponte salina do resíduo 94para o resíduo 101 parece ser a mais comum. Existem pelo menos 16seqüências de anticorpo humanas na biblioteca de dados EMBL com ocomprimento H3 requerido e resíduos chaves para formar esta conformação epelo menos duas estruturas crsitalográficas no banco de dados de proteína quepodem ser usadas como uma base para a modelagem de anticorpo (2cgr e/tet). Os segmentos de gene da linha germinativa mais freqüentementeexpressados nesta combinação de estruturas canônica são o segmento Vh 3-23(DP-47), o segmento Jh JH4b, o segmento Vk 02/012 (DPK9) e o segmentoJk JkI- Os segmentos Vh DP45 e DP38 também são adequados. Estessegmentos portanto podem ser usados em combinação como uma base paraconstruir uma biblioteca com a conformação de cadeia principal únicadesejada.
Alternativamente, ao invés de escolher a conformação decadeia principal única com base na ocorrência natural das conformações decadeia principal diferentes para cada uma das alças de ligação na isolação, aocorrência natural de combinações de conformações de cadeia principal éusada como a base para escolher a conformação de cadeia principal única. Nocaso de anticorpos, por exemplo, a ocorrência natural de combinações deestrutura canônica para qualquer dois, três, quatro, cinco ou para todos os seisdas alças de ligação de antígeno podem ser determinadas. Aqui, é preferívelQUC Cl conformação escolhida seja comum em anticorpos que ocorremnaturalmente e mais preferível que seja observada mais freqüentemente norepertório natural. Assim, em anticorpos humanos, por exemplo, quandocombinações naturais das cinco alças de ligação de antígeno, Hl, H2, LI, L2 eL3, sejam consideradas, a combinação mais freqüente de estruturas canônicasé determinada e depois combinada com a conformação mais popular para aalça H3, como uma base para a escolha da conformação de cadeia principalúnica.
Diversificação da Seqüência Canônica
Tendo selecionado diversas conformações de cadeia principalconhecidas ou, preferivelmente uma conformação de cadeia principal únicaconhecida, ligandos específicos duplos (por exemplo, ds-dAbs) ou bibliotecaspara o uso na invenção podem ser construídos variando-se cada sítio deligação da molécula de modo a gerar um repertório com diversidade estruturale/ou funcional. Isto significa que variantes são geradas tal que as mesmaspossuam diversidade suficiente na sua estrutura e/ou na sua função de modoque as mesmas sejam capazes de fornecer uma faixa de atividades.
A diversidade desejada é tipicamente gerada pela variação damolécula selecionada em uma ou mais posições. As posições a serem trocadaspodem ser escolhidas ao acaso ou são preferivelmente selecionadas. Avariação pode ser depois obtida pela randomização, durante o que oaminoácido residente é substituído por qualquer aminoácido ou análogo deste,naturais ou sintéticos, produzindo um número muito grande de variantes oupela substituição do aminoácido residente com um ou mais de umsubconjunto definido de aminoácidos, produzindo um número mais limitadode variantes.
Vários métodos foram relatados para introduzir taldiversidade. A PCR propensa a erro (Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226:889), mutagênese química (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) oucepas mutadoras bacterianas (Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359)podem ser usadas para introduzir mutações aleatórias nos genes quecodificam a molécula. Os métodos para mutar as posições selecionadastambém são bem conhecidos na técnica e incluem o uso de oligonucleotídeosdesemparelhados ou degenerados, com ou sem o uso da PCR. Por exemplo,diversas bibliotecas de anticorpo sintéticas foram criadas pelo alvejamento demutações às alças de ligação de antígeno. A região H3 de um Fab de ligaçãode toxóido do tétano humano foi randomizada para criar uma faixa de novasespecificidades de ligação (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA,89: 4457). As regiões aleatórias ou semi-aleatórias H3 e L3 foram anexadasaos segmentos de gene V da linha germinativa para produzir bibliotecasgrandes com regiões de matriz não mutadas (Hoogenboom & Winter (1992) J.Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBOJ., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). Tal diversificaçãofoi prolongada para incluir algumas ou todas das outras alças de ligação deantígeno (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995)Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO 97/08320, supra).
Visto que a randomização de alça tem o potencial para criaraproximadamente mais do que IO15 estruturas para H3 sozinho e um númerosimilarmente grande de variantes para as outras cinco alças, não é praticávelusar a tecnologia de transformação corrente ou mesmo pelo uso de sistemasisentos de célula para produzir uma biblioteca que represente todas ascombinações possíveis. Por exemplo, em uma das maiores bibliotecasconstruídas até agora, 6 χ IO10 anticorpos, que é apenas uma fração dadiversidade potencial para uma biblioteca deste projeto, foram generados(Griffiths et al. (1994) supra).
Preferivelmente, apenas os resíduos que estão diretamenteenvolvidos na criação ou modificação da função desejada de cada domínio damolécula de ligando específico duplo são diversificados. Para muitasmoléculas, a função de cada domínio será ligar um alvo e portanto adiversidade deve ser concentrada no sítio de ligação alvo, enquanto se evitamudar os resíduos que são cruciais ao empacotamento global da molécula oumanter a conformação de cadeia principal escolhida.
Diversificação da Seqüência Canônica Conforme a Mesma se Aplica aosDomínios de Anticorpo
No caso de ligandos com base em anticorpo (por exemplo, ds-dAbs), o sítio de ligação para cada alvo é mais freqüentemente o sítio deligação do antígeno. Assim, preferivelmente apenas aqueles resíduos no sítiode ligação de antígeno são variados. Estes resíduos são extremamentediversos no repertório de anticorpo humano e são conhecidos fazer contatosem complexos de resolução de anticorpo/ antígeno alta. Por exemplo, em L2 éconhecido que as posições 50 e 53 são diversas nos anticorpos que ocorremnaturalmente e são observados fazer contato com o antígeno. Ao contrário, ométodo convencional seria diversificar todos os resíduos na RegiãoDeterminadora de Complementaridade (CDRl) correspondente comodefinido por Kabat et al. (1991, supra), alguns dos sete resíduos comparadoscom os dois diversificaram na biblioteca para o uso de acordo com ainvenção. Isto representa uma melhora significante em termos da diversidadefuncional requerida para criar uma faixa de especificidades de ligação deantígeno.
Na natureza, a diversidade de anticorpo é o resultado de doisprocessos: recombinação somática de segmentos de gene V, D e J da linhagerminativa para criar um repertório primário primitivo (chamado dediversidade de linha germinativa e juncional) e hipermutação somática dosgenes V rearranjados resultantes. A análise das seqüências de anticorpohumanas tem mostrado que a diversidade no repertório primário estáfocalizada no centro do sítio de ligação de antígeno ao passo que ahipermutação somática espalha diversidade às regiões na periferia do sítio deligação de antígeno que são altamente conservadas no repertório primário (verTomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813). Esta complementaridadeprovavelmente evoluiu como uma estratégia eficiente para a pesquisa deespaço de seqüência e, embora aparentemente única aos anticorpos, a mesmapode ser facilmente aplicada a outros repertórios de polipeptídeo. Os resíduosque são variados são um subconjunto daqueles que formam o sítio de ligaçãopara o alvo. Os subconjuntos diferentes (incluindo a sobreposição) deresíduos no sítio de ligação alvo são diversificados em estágios diferentesdurante a seleção, se desejado.
No caso de um repertório de anticorpo, um repertório'primitivo' inicial pode ser criado onde alguns, mas não todos, dos resíduosno sítio de ligação de antígeno são diversificados. Como aqui usado nestecontexto, o termo "primitivo" refere-se às moléculas de anticorpo que não têmnenhum alvo pré determinado. Estas moléculas se parecem com aquelas quesão codificadas pelos genes da imunoglobulina de um indivíduo que nãopassou pela diversificação imune, como é o caso com indivíduos fetais erecém-nascidos, cujos sistemas imunes ainda não foram inoculados por umaampla variedade de estímulos antigênicos. Este repertório é depoisselecionado contra uma faixa de antígenos ou epítopos. Se requerido, maisdiversidade pode ser depois introduzida fora da região diversificada norepertório inicial. Este repertório maduro pode ser selecionado quanto afunção, especificidade ou afinidade modificadas.
Os repertórios primitivos de domínios de ligação para aconstrução de ligandos específicos duplos em que algum ou todos dosresíduos no sítio de ligação de antígeno são variados são conhecido naJj) técnica. (Ver, a WO 2004/058821, WO 2004/003019 e WO 03/002609). Abiblioteca "primária" imita o repertório primário natural, com diversidaderestrita aos resíduos no centro do sítio de ligação de antígeno que são diversosnos segmentos de gene V da linha germinativa (diversidade de linhagerminativa) ou diversificados durante o processo de recombinação(diversidade juncional). Estes resíduos que são diversificados incluem, masnão são limitados a, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97,H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 e L96. Na biblioteca "somática", adiversidade é restrita aos resíduos que são diversificados durante o processode recombinação (diversidade juncional) ou são mutados de modo altamentesomático. Estes resíduos que são diversificados incluem, mas não sãolimitados a: H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 e L96.
Todos os resíduos listados acima como adequados para a diversificação nestasbibliotecas são conhecidos por fazer contatos em um ou mais complexos deanticorpo-antígeno. Visto que em ambas as bibliotecas, nem todos os resíduosno sítio de ligação de antígeno são variados, a diversidade adicional éincorporada durante a seleção pela variação dos resíduos remanescentes, sefor desejado assim fazê-lo. Deve estar evidente a uma pessoa habilitada natécnica que qualquer subconjunto de qualquer um destes resíduos (ou resíduosadicionais que compreendem o sítio de ligação de antígeno) pode ser usadopara a diversificação inicial e/ou subseqüente do sítio de ligação de antígeno.
Na construção de bibliotecas para o uso na invenção, adiversificação de posições escolhidas é tipicamente obtida ao nível de ácidonucleico, alterando-se a seqüência codificadora que especifica a seqüência dopolipeptídeo tal que vários aminoácidos possíveis (todos os 20 ou umsubconjunto destes) possam ser incorporados nesta posição. Usando anomenclatura IUPAC, o códon mais versátil é NNK, que codifica todos osaminoácidos assim como o códon de parada TAG. O códon NNK épreferivelmente usado de modo a introduzir a diversidade requirida. Outroscódons que alcançam as mesmas finalidades também são de uso, incluindo ocódon NNN, que leva à produção dos códons de parada adicionais TGA e TAA.
Uma característica da diversidade de cadeia lateral no sítio deligação de antígeno de anticorpos humanos é uma tendência pronunciada quefavorece certos resíduos de aminoácido. Se a composição de aminoácido dasdez posições mais diversas em cada uma das regiões VH, Vk e νλ sãosomadas, mais do que 76% da diversidade de cadeia lateral vem apenas desete resíduos diferentes, estes sendo, serina (24%), tirosina (14%), asparagina(11%), glicina (9%), alanina (7%), aspartato (6%) e treonina (6%). Estatendência para resíduos hidrofílicos e resíduos pequenos que podem fornecerflexibilidade de cadeia principal provavelmente reflete a evolução desuperfícies que são pré dispostas a ligar uma ampla faixa de antígenos ouepítopos e pode ajudar a explicar a promiscuidade requerida de anticorpos norepertório primário.
Visto que é preferível imitar esta distribuição de aminoácidos,a distribuição de aminoácidos nas posições a serem variados preferivelmenteimitam aqueles observados no sítio de ligação de antígeno de anticorpos. Taltendência na substituição de aminoácidos que permite a seleção de certospolipeptídeos (não apenas polipeptídeos de anticorpo) contra uma faixa deantígenos alvo é facilmente aplicado a qualquer repertório de polipeptídeo.Existem vários métodos para predispor a distribuição de ammoaciao naposição a ser variada (incluindo o uso de mutagênese de tri-nucleotídeo, ver aWO 97/08320), da qual o método preferido, devido á facilidade de síntese, é ouso de códons degenerados convencionais. Pela comparação do perfil deaminoácido codificado por todas as combinações de códons degenerados(com a degenerescência única, dupla, tripla e quádrupla em razões iguais emcada posição) com o uso do aminoácido natural é possível calcular o códonmais representativo. Os códons (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C e(AGT)(AGC)(CT) - que são, DVT, DVC e DVY, respectivamente usando anomenclatura da IUPAC - são aqueles mais próximos ao perfil de aminoácidodesejado: estes codificam 22% de serina e 11% de tirosina, asparagina,glicina, alanina, aspartato, treonina e cisteína. Preferivelmente, portanto, asbibliotecas são construídas usando os códons DVT, DVC ou DVY em cadauma das posições diversificadas.
As composições e usos terapêuticos e de diagnóstico
A invenção fornece composições que compreendem osligandos da invenção e um carreador, diluente ou excipientefarmaceuticamente aceitáveis e métodos terapêutico e de diagnóstico queutilizam os ligandos ou composições da invenção. Os ligandos de acordo como método da presente invenção podem ser utilizados em aplicaçõesterapêuticas e profiláticas in vivo, aplicações de diagnóstico in vivo e outras.
Os usos terapêuticos e profiláticos de ligandos da invençãoenvolvem a administração de ligandos de acordo com a invenção a ummamífero receptor, tal como um ser humano. Os ligandos ligam-se aos alvoscom alta afinidade e/ou avidez. Em algumas formas de realização, tais comoligandos equivalente a IgG, os ligandos podem permitir o recrutamento decélulas citotóxicas para mediar a morte de células cancerosas, por exemplopela citoxicidade celular dependente de anticorpo.
Os ligandos substancialmente puros de pelo menos 90 a 95%de homogeneidade são preferidos para a administração a um mamífero e 98 a99% ou mais de homogeneidade são mais preferidos para os usosfarmacêuticos, especialmente quando o mamífero é um ser humano. Uma vezpurificado, parcialmente ou até a homogeneidade como desejado, os ligandospodem ser usados diagnostica ou terapeuticamente (incluindoextracorporeamente) ou no desenvolvimento e realização de procedimentos deensaio, corantes imunofluorescentes e outros (Lefkovite e Pernis, (1979 e1981) Immunological Methods, Volumes I e II, Academic Press, NY).
Por exemplo, os ligandos da presente invenção tipicamenteencontrão uso na prevenção, supressão ou tratamento de estados de doença.Por exemplo, os ligandos podem ser administrados para tratar, suprimir ouprevenir uma doença inflamatória crônica, hipersensibilidade alérgica, câncer,infecção bacteriana ou viral, distúrbios autoimunes (que incluem, mas não sãolimitados a, diabete Tipo I, asma, esclerose múltipla, artrite reumatóide, artritereumatóide juvenil, artrite psoriática, espondiloartropatia (por exemplo,espondilite anquilosante), Iupo eritematoso sistêmico, doença do intestinoinflamatório (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa), miasteniagrave e síndrome de Behcet, psoríase, endometriose e adesões abdominais(por exemplo, após cirurgia abdominal).
Os ligandos são úteis para tratar doenças infecciosas em que ascélulas infectadas com um agente infeccioso contêm níveis mais altos deEGFR de superfície celular do que as células não infectadas ou que contêmum ou mais alvos de superfície celular que não estão presentes nas células nãoinfectadas, tais como uma proteína que é codificada pelo agente infeccioso(por exemplo, bactérias, vírus).
Os ligandos de acordo com a invenção que são capazes deligar ao EGFR podem ser internalizados pelas células que expressam EGFR(por exemplo, submetidos à endocitose) e podem liberar agentes terapêuticos(por exemplo, uma toxina) intracelularmente (por exemplo, liberar um dAbque liga um alvo intracelular). Além disso, ligandos fornecem um meio peloqual um domínio de ligação (por exemplo, um monômero dAb) que éespecificamente capaz de ligar a um alvo intracelular pode ser liberado a umambiente intracelular. Esta estratégia requer, por exemplo, um domínio deligação com propriedades físicas que permitam que ele permaneça funcionaldentro da célula. Alternativamente, se o compartimento intracelular dedestinação final está oxidando, um ligando bem dobrado pode não necessitarser isento de dissulfeto.
No presente pedido, o termo "prevenção" envolve aadministração da composição protetora antes da indução da doença."Supressão refere-se à administração da composição depois de um eventoindutivo, mas antes do aparecimento clínico da doença. "Tratamento" envolvea administração da composição protetora depois que os sintomas da doençamanifestaram-se. Tratamento inclui a melhora dos sintomas associados com adoença e também prevenção ou retardo do início da doença e tambémdiminuição da severidade ou freqüência dos sintomas da doença.
O termo "câncer" refere-se à condição patológica emmamíferos que é tipicamente caracterizada pela proliferação ou sobrevivênciacelulares desreguladas. Os exemplos de câncer incluem, mas não sãolimitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia emalignidades linfóides. Os exemplos mais particulares de cânceres incluemcâncer de célula escamosa (por exemplo, câncer de célula escamosa epitelial),câncer pulmonar (por exemplo, carcinoma pulmonar de célula pequena,carcinoma pulmonar de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão,carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritôneo, câncer hepatocelular,câncer gástrico ou estomacal incluindo câncer gastrintestinal, câncerpancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer hepático,câncer da bexiga, câncer da vesícula biliar, hepatoma, câncer mamário, câncercolônico, câncer retal, câncer colo-retal, mieloma múltiplo, leucemiamielogênica crônica, leucemia mielogênica aguda, carcinoma endometrial ouuterino, carcinoma da glândula salivar, câncer do rim ou renal, câncerprostático, câncer vulvar, câncer da tireóide, carcinoma hepático, carcinomaanal, carcinoma peniano, câncer da cabeça e pescoço e outros. Os câncerescaracterizados pela expressão de EGFR na superfície de células cancerosas(cânceres que expressam EGFR) incluem, por exemplo, câncer da bexiga,câncer ovariano, câncer colo-retal, câncer mamário, câncer pulmonar (porexemplo, carcinoma pulmonar de célula não pequena), câncer gástrico, câncerpancreático, câncer prostático, câncer da cabeça e pescoço, câncer renal ecâncer da vesícula biliar.
Os sistemas de modelo animal que podem ser usados paraavaliar a eficácia dos ligandos da invenção na prevenção, tratamento ousupressão da doença (por exemplo, câncer) são disponíveis. Os modelosadequados de câncer incluem, por exemplo, xenoenxertos e modelosortotópicos de cânceres humanos em modelos de animal, tais como o modelode mieloma SCID-hu (Epstein J e Yaccoby, S., Methods Mol Med. 113: 183-90 (2005), Tassone P, et al, Clin Câncer Res. 11(11): 4251-8 (2005)),modelos de camundongo de câncer pulmonar humano (por exemplo,Meuwissen R e Berns A, Genes Dev, 19(6): 643-64 (2005)) e modelos decamundongo de cânceres metastáticos (por exemplo, Kubota T., J CellBiochem. 56(1): 4-8 (1994)).
No geral, os presentes ligandos serão utilizados na formapurificada junto com carreadores farmacologicamente apropriados.Tipicamente, estes carreadores incluem soluções, emulsões ou suspensõesaquosas ou alcoólico/aquosas, incluindo solução salina e/ou meio tamponado.Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose deRinger, dextrose e cloreto de sódio e Ringer lactado. Os adjuvantesfisiologicamente aceitáveis adequados, se necessários para manter umcomplexo de polipeptídeo em suspensão, podem ser escolhidos deespessadores tais como carboximetilcelulose, polivinil-pirrolidona, gelatina ealginatos.
Os veículos intravenosos incluem fluido e reabastecedores denutriente e reabastecedores de eletrólito, tais como aqueles com base emdextrose de Ringer. Conservantes e outros aditivos, tais comoantimicrobianos, antioxidantes, agentes queladores e gases inertes, tambémpodem estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences,16a Edição). Uma variedade de formulações adequadas pode ser usada,incluindo formulações de liberação prolongada.
Os ligandos da presente invenção podem ser usados comocomposições separadamente administradas ou em conjunção com outrosagentes. Os ligandos podem ser administrados e ou formulados juntos comum ou mais produtos terapêuticos ou agentes ativos adicionais. Quando umligando é administrado com um agente terapêutico adicional, o ligando podeser administrado antes, simultaneamente com ou subseqüente à administraçãodo agente adicional. No geral, o ligando e o agente adicional sãoadministrados em uma maneira que forneça uma sobreposição do efeitoterapêutico. Os agentes adicionais que podem ser administrados ouformulados com o ligando da invenção incluem, por exemplo, váriosmedicamentos imunoterapêuticos, tais como ciclosporina, metotrexato,adriamicina ou cisplatina, antibióticos, antimicóticos, agentes anti-virais eimunotoxinas. Por exemplo, quando o antagonista é administrado paraprevenir, suprimir ou tratar a inflamação pulmonar ou uma doençarespiratória, o mesmo pode ser administrado em conjunção com inibidores defosfodiesterase (por exemplo, inibidores de fosfodiesterase 4),broncodilatadores (por exemplo, agonistas beta2, anticolinérgicos, teofilina),agonistas beta de ação curta (por exemplo, albuterol, salbutainol, bambuterol,fenoterol, isoeterina, isoproterenol, levalbuterol, metaproterenol, pirbuterol,terbutalina e tornlato), agonistas beta de ação longa (por exemplo, formoterole salmeterol), anticolinérgicos de ação longa (por exemplo, brometo deipratrópio e brometo de oxitrópio), anticolinérgicos de ação longa (porexemplo, tiotrópio), teofilina (por exemplo, formulação de ação curta,formulação de ação longa), esteróides inalados (por exemplo, beclometasona,beclometasone, budesonida, flunisolida, propionato de fluticasona etriancinolona), esteróides orais (por exemplo, metilprednisolona,prednisolona, prednisolon e prednisona), agonistas beta de ação curtacombinados com anticolinérgicos (por exemplo, albuterol/salbutamol/ipratrópio e fenoterol/ipratrópio), agonistas beta de ação longa combinadoscom esteróides inalados (por exemplo, salmeterol/fluticasona eformoterol/budesonida) e agentes mucolíticos (por exemplo, erdosteína,acetilcisteína, bromecsína, carbocisteína, guiafenesina e glicerol iodado).
Os ligandos da invenção podem ser coadministrados (porexemplo, para tratar câncer, uma doença inflamatória ou outra doença) comuma variedade de agentes co-terapêuticos adequados, incluindo citocinas,analgésicos/antipiréticos, antieméticos e produtos quimioterapêuticos. Outrosagente co-terapêuticos adequados incluem agentes imunossupressivosselecionados do grupo que consiste de ciclosporina, azatioprina, ácidomicofenólico, micofenolato mofetila, corticosteróides, metotrexato, sais deouro, sulfasalazina, antimaláricos, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15-desoxiespergualina, 6-mercaptopurina, ciclofosfamida, rapamicina, tacrolimus(FK-506), OKT3 e globulina anti-timocítica, agentes anti-inflamatóriosselecionados do grupo que consiste de aspirina, outros salicilatos,medicamentos esteroidais, NSAIDs (medicamentos anti-inflamatórios nãoesteroidais), inibidores de Cox-2 e DMARDs (medicamentos anti-reumáticosmodificadores de doença); agentes anti-psoríase selecionado do grupo queconsiste de alcatrão, vitamina A, antralina, calcipotrien, tarazoteno,corticosteróides, metotrexato, retinóides, ciclosporina, etanercept, alefacept,efaluzimab, 6-tioguanina, micofenolato mofetila, tacrolimus (FK-506) ehidroxiuréia.
As citocinas incluem, sem limitação, uma linfocina, fatores denecrose de tumor, citocina equivalente ao fator de necrose de tumor,linfotoxina, interferon, proteína inflamatória de macrófago, fator estimuladorde colônia de granulócito monócito, interleucina (incluindo, sem limitação,interleucina-1, interleucina-2, interleucina-6, interleucina-12, interleucina-15,interleucina-18), fatores de crescimento, que incluem, sem limitação, (porexemplo, hormônio do crescimento, fator do crescimento equivalente ainsulina 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2), fator estimulador de colônia de granulócito(GC SF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PGDF), fator decrescimento epidérmico (EGF) e agentes para a estimulação da eritropoiese,por exemplo, eritropoietina humana recombinante (alfa Epoetina), EPO, umagonista hormonal, antagonistas hormonais (por exemplo, flutamida,tamoxifeno, acetato de leuprolida (LUPRON)) e esteróides (por exemplo,dexametasona, retinóide, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona,desidrotestosterona, glicocorticóide, mineralocorticóide, estrogênio,testosterona, progestina).
Os analgésicos/antipiréticos podem incluir, sem limitação, porexemplo, aspirina, acetaminofeno, ibuprofeno, naproxen sódico, cloridreto debuprenorfina, cloridreto de propoxifeno, napsilato de propoxifeno, cloridretode meperidina, cloridreto de hidromorfona, sulfato de morfina, cloridreto deoxicódone, fosfato de codeína, bitartarato de diidrocodeína, cloridreto depentazocina, bitartarato de hidrocódone, tartrato de levorfanol, diflunisal,salicilato de trolamina, cloridreto de nalbufina, ácido mefenâmico, tartarato debutorfanol, salicilato de colina, butalbital, citrato de feniltoloxamina, citratode difenidramina, metotrimeprazina, cloridreto de cinamedrina, meprobamatoe outros.Antieméticos também podem ser coadministrados paraprevenir ou tratar a náusea e vômito (por exemplo, os antieméticos adequadosincluem cloridreto de meclizina, nabilona, proclorperazina. dimenidrinato,cioridreto de prometazina, tietilperazina, escopolamina e outros).
Agentes quimioterapêutico, como este termo é aqui usado,incluem, mas não são limitados a, por exemplo agentes antimicrotúbulo, porexemplo, taxol (paclitaxel), taxotere (docetaxel); agentes alquiladores, porexemplo, ciclofosfamida, carmustina, lomustina e clorambucila; antibióticoscitotóxicos, por exemplo, dactinomicina, doxorrubicina, mitomicina-C ebleomicina; antimetabólitos, por exemplo, citarabina, gencitatina, metotrexatoe 5-fluorouracila; antimióticos, por exemplo, alcalóides vinca de vincristina,por exemplo, etoposídeo, vinblastina e vincristina; e outros tais comocisplatina, dacarbazina, procarbazina e hidroxiuréia; e combinações destes.
Os ligandos da invenção podem ser usados para tratar câncerem combinação com um outro agente terapêutico. Por exemplo, um ligandoda invenção pode ser administrado em combinação com um agentequimioterapêutico ou uma composição antineoplástica que compreende um(pelo menos um) agente quimioterapêutico. Vantajosamente, em um talmétodo terapêutico, a quantidade de agente quimioterapêutico que deve seradministrada para ser eficaz pode ser reduzida. Assim a invenção fornece ummétodo de tratar câncer que compreende administrar a um paciente emnecessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ligando dainvenção e um agente quimioterapêutico, em que o agente quimioterapêuticoé administrado em uma dose baixa. No geral a quantidade de agentequimioterapêutico que é co-administrada com um ligando da invenção é decerca de 80% ou de cerca de 70% ou de cerca de 60% ou de cerca de 50% oude cerca de 40% ou de cerca de 30% ou de cerca de 20% ou de cerca de 10%ou menos, da dose de agente quimioterapêutico sozinho que é normalmenteadministrada a um paciente. Assim, a co-terapia é particularmente vantajosaquando o agente quimioterapêutico causa efeitos colaterais nocivos ouindesejáveis que podem ser reduzidos ou eliminados em uma dose mais baixa.
As composições farmacêuticas podem incluir "coquetéis" devários citotóxicos ou outros agentes em conjunção com ligandos da presenteinvenção ou ainda combinações de ligandos de acordo com a presenteinvenção tendo especificidades diferentes, tais como ligandos selecionadosusando antígenos ou epítopos alvos diferentes, sejam eles reunidos ou nãoantes da administração.
A via de administração das composições farmacêuticas deacordo com a invenção pode ser qualquer via adequada, tal como qualquer umdaquelas habitualmente conhecidas por aqueles de habilidade comum natécnica. Para a terapia, incluindo sem limitação a imunoterapia, os ligandos dainvenção podem ser administrados a qualquer paciente de acordo comtécnicas padrão. A administração pode ser por qualquer modo apropriado,incluindo parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica,intratecal, intraarticularmente, por intermédio da via pulmonar ou também,apropriadamente, pela infusão direta (por exemplo, com um cateter). Adosagem e freqüência de administração dependerá da idade, sexo e condiçãodo paciente, administração concorrente de outros medicamentos, contra-indicações e outros parâmetros a serem levados em conta pelo médico. Aadministração pode ser local (por exemplo, liberação local ao pulmão pelaadministração pulmonar, (por exemplo, administração intranasal) ou injeçãolocal diretamente em um tumor) ou sistêmico como indicado.
Os ligandos desta invenção podem ser liofilizados paraarmazenagem e reconstituídos em um carreador adequado antes do uso. estatécnica tem sido mostrada ser eficaz com imunoglobulinas convencionais etécnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na técnica podem serutilizadas. Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que a liofilização ereconstituição podem levar a graus variáveis de perda de atividade deanticorpo (por exemplo, com imunoglobulinas convencionais, os anticorposIgM tendem a ter perda de atividade maior do que os anticorpos IgG) e que osníveis de uso podem ter que ser ajustados para cima para compensar.
As composições contendo os ligandos podem seradministradas para os tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em certasaplicações terapêuticas, uma quantidade adequada para realizar pelo menos ainibição parcial, supressão, modulação, morte ou algum outro parâmetromensurável, de uma população de células selecionadas é definido como uma"dose terapeuticamente eficaz". As quantidades necessárias para se obter estadosagem dependerá da severidade da doença e do estado geral da saúde dopaciente, mas no geral varia de 0,005 a 5,0 mg de ligando por quilograma depeso corporal, com doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo mais habitualmenteusadas. Para as aplicações profiláticas, as composições contendo os presentesligandos ou coquetéis destes também podem ser administradas em dosagenssimilares ou levemente mais baixas, para prevenir, inibir ou retardar o iníciode doença (por exemplo, para sustentar a remissão ou quiescência ou paraprevenir a fase aguda). O médico habilitado será capaz de determinar ointervalo de dosagem apropriado para tratar, suprimir ou prevenir a doença.Quando um ligando é administrado para tratar, suprimir ou prevenir umadoença, o mesmo pode ser administrado até quatro vezes por dia, duas vezessemanalmente, uma vez semanalmente, uma vez a cada duas semanas, umavez ao mês ou uma vez a cada dois meses, em uma dose, por exemplo, decerca de 10 μg/kg a cerca de 80 mg/kg, de cerca de 100 μg/kg a cerca de 80mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 80 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cercade 70 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 60 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg acerca de 50 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, de cerca de 1mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, decerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, de cerca de 10 μg/kg a cerca de 10mg/kg, de cerca de 10 μg/kg a cerca de 5 mg/kg, de cerca de 10 μg/kg a cercade 2,5 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg, de cerca de 2 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg,de cerca de 4 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg, de cerca de 6 mg/kg, de cerca de 7mg/kg, de cerca de 8 mg/kg, de cerca de 9 mg/kg ou de cerca de 10 mg/kg.Em formas de realização particulares, o ligando específico duplo éadministrado para tratar, suprimir ou prevenir uma doença inflamatóriacrônica uma vez a cada duas semanas ou uma vez ao mês em um dose decerca de 10 μg/kg a cerca de 10 mg/kg (por exemplo, de cerca de 10 μg/kg, decerca de 100 μg/kg, cerca de 1 mg/kg, de cerca de 2 mg/kg, de cerca de 3mg/kg, de cerca de 4 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg, de cerca de 6 mg/kg, decerca de 7 mg/kg, de cerca de 8 mg/kg, de cerca de 9 mg/kg ou de cerca de 10mg/kg).
Em formas de realização particulares, o ligando da invenção éadministrado em uma dose que fornece a saturação de EGFR ou umaconcentração sérica in vivo desejada. O médico habilitado pode determinar adosagem apropriada para se obter saturação, por exemplo pela titulaçãoligando e monitorando a quantidade de sítios de ligação livres em células queexpressam EGFR ou a concentração sérica de ligando. Os regimesterapêuticos que envolvem administrar um agente terapêutico para se obter asaturação alvo ou uma concentração sérica desejada de agente são comuns natécnica, particularmente no campo da oncologia.
O tratamento ou terapia realizados usando as composiçõesaqui descritas são considerados "eficazes" se um ou mais sintomas sãoreduzidos (por exemplo, em pelo menos 10% ou pelo menos um ponto emuma escala de avaliação clínica), em relação a tais sintomas presentes antesdo tratamento ou em relação a tais sintomas em um indivíduo (modelohumano ou animal) não tratado com tal composição ou outro controleadequado. Os sintomas obviamente variarão dependendo da doença oudistúrbio alvejados, mas podem ser medidos por um médico ou técnicoordinariamente habilitado. Tais sintomas podem ser medidos, por exemplo,monitorando-se o nível de um ou mais indicadores bioquímicos da doença oudistúrbio (por exemplo, níveis de uma enzima ou metabólito correlacionadoscom a doença, números de célula afetados, etc.), monitorando-se asmanifestações físicas (por exemplo, inflamação, tamanho de tumor, etc.) oupor uma escala de avaliação clinicai aceita, por exemplo, a Escala de Situaçãode Incapacidade Expandida (para a esclerose múltipla), O Questionário deDoença do Intestino Inflamatório de Irvine (32 avaliações pontuais avaliam aqualidade de vida com respeito à função intestinal, sintomas sistêmicos,função social e situação emocional - faixas de classificação de 32 a 224, comas classificações mais altas indicando uma melhor qualidade de vida), aEscala de Qualidade de Vida da Artrite Reumatóide ou outra escala deavaliação clínica aceita como conhecido no campo. Uma redução prolongada(por exemplo, um dia ou mais, preferivelmente mais longo) nos sintomas dadoença ou distúrbio em pelo menos 10% ou em um ou mais pontos em umadada escala clínica é indicativo de tratamento "eficaz". Similarmente, aprofilaxia realizada usando uma composição como aqui descrita é "eficaz" seo início ou severidade de um ou mais sintomas é retardado, reduzido ouabolido em relação a tais sintomas em um indivíduo similar (modelo humanoou animal) não tratado com a composição.
Uma composição contendo ligandos de acordo com a presenteinvenção pode ser utilizada em cenários profiláticos e terapêuticos para ajudarna alteração, inativação, norte ou remoção de uma população de célula alvoseleta em um mamífero. Além disso, os ligandos e repertórios selecionados depolipeptídeos aqui descritos podem ser usados extracorporeamente ou in vitroseletivamente para matar, esgotar ou de outro modo remover eficazmente umapopulação de célula alvo de uma coleção heterogênea de células. O sangue deum mamífero pode ser combinado extracorporeamente com os ligandos, porexemplo, anticorpos, receptores de superfície celular ou proteínas de ligaçãodestes por meio do qual as células indesejadas são mortas ou de outro modoremovidas do sangue para retornar ao mamífero de acordo com técnicaspadrão.
Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a ummétodo para liberar terapia antiangiogênica (terapia anti-VEGF) a um sítiocontendo células que expressam ou supraexpressam EGFR, que compreendeadministrar uma quantidade eficaz de um ligando que tenha especificidade deligação para VEGF e para EGFR a um paciente em necessidade deste.
A invenção também diz respeito ao uso de um ligando quetenha especificidade de ligação para VEGF e para EGFR para liberar terapiaanti-angiogênica (terapia anti-VEGF) a um sítio contendo células queexpressam ou supraexpressam EGFR. A invenção também diz respeito ao usode um ligando que tenha especificidade de ligação para VEGF e para EGFRpara a fabricação de um medicamento para liberar terapia anti-angiogênica(terapia anti-VEGF) a um sítio contendo células que expressam ousupraexpressam EGFR ou para inibir a angiogênese em um sítio contendocélulas que expressam de supraexpressar EGFR.
Em formas de realização particulares, a invenção diz respeito aum método de tratar câncer que compreende administrar a um paciente emnecessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ligando,como aqui descrito, que tenha especificidade de ligação para VEGF e paraEGFR. Em formas de realização particulares, o paciente tem um câncer queexpressa EGFR, tal como, câncer da bexiga, câncer ovariano, câncer colo-retal, câncer mamário, câncer pulmonar (por exemplo, carcinoma pulmonarde célula não pequena), câncer gástrico, câncer pancreático, câncer prostático,câncer da cabeça e pescoço, câncer renal e câncer da vesícula biliar.
Em outras formas de realização, a invenção diz respeito a ummétodo para tratar câncer, que compreende administrar a um paciente emnecessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de ligando, comoaqui descrito, (por exemplo, um ligando que tenha especificidade de ligaçãopara VEGF, um ligando que tenha especificidade de ligação para EGFR, umligando que tenha especificidade de ligação para VEGF e EGFR) e umacomposição antineoplástica, em que a dita composição antineoplásticacompreende pelo menos um agente quimioterapêutico selecionado do grupoque consiste de agentes alquiladores, antimetabólitos, análogos do ácidofólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores relacionados,alcalóides vinca, epipodofilotoxinas, antibióticos, L-Asparaginase, inibidor datopoisomerase, interferons, complexos de coordenação da platina, uréiasubstituída por antracenodiona, derivados de metil hidrazina, supressoradrenocortical, adrenocorticosteróides, progestinas, estrogênios,antiestrogênio, androgênios, antiandrogênio e análogo do hormônio que liberagonadotropina. Em algumas formas de realização, o agente quimioterapêuticoé selecionado do grupo que consiste de cisplatina, dicarbazina, dactinomicina,mecloretarnina, estreptozocina, ciclofosfamida, capecitabina, carmustina,lomustina, doxorrubicina, daunorrubicina, procarbazina, mitomicina,citarabina, etoposida, metotrexato, 5-fluorouracila, vinblastina, vincristina,bleomicina, paclitaxel, docetaxel, doxetaxo, aldesleucina, asparaginase,busulfan, carboplatina, cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina,hidroxiuréia, ifosfamida, interferon alfa, irinotecano, leuprolida, leucovorin,megestrol, melfalan, mercaptopurina, oxaliplatina, plicamicina, mitotano,pegaspargase, pentostatina, pipobromano, plicamicina, estreptozocina,tamoxifeno, teniposida, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracila,vinorrelbina, clorambucila, taxol, um antagonista de receptor do fator decrescimento adicional e uma combinação de qualquer um dos precedentes.
Ensaios para avaliar ligandos
Os ligandos da invenção podem ser ensaiados usando qualquerensaio in vitro ou in vivo adequado. Por exemplo, usando os ensaios oubioensaios de ligação de receptor aqui descritos.
Bioensaio para a atividade de VEGF:Este bioensaio mede a capacidade de ligandos (por exemplo,dAbs) para neutralizar a proliferação induzida por VEGF de células HUVE(edotelial vascular humana). As células HUVE plaqueadas em placas de 96reservatórios são incubadas por 72 horas com proteína VEGF e dAb pré-equilibradas. O número de célula é depois medido usando um corante deviabilidade celular.
O ensaio é realizado como segue. As células HUVE sãotripsinadas a partir de um frasco de 175 cm sub-confluente. O meio é retiradopor aspiração, as células são lavadas com 5 ml de tripsina e depois incubadascom 2 ml de tripsina na temperatura ambiente por 5 min. As células sãosuavemente deslocadas da base do frasco batendo contra a sua mão. 8 ml demeio de indução são depois adicionados ao frasco, pipetando as células paradispersar quaisquer grumos. As células viáveis são contadas usando coranteazul de tripano.
As células são giradas e lavadas 2X em meio de indução, ascélulas giradas e aspirando o meio depois de cada lavagem. Depois daaspiração final as células são diluídas a 105 células/ml (em meio de indução) eplaqueadas a 100 μΐ por reservatório em uma placa de 96 reservatórios(10.000 células/reservatório). A placa é incubada por >2 horas a cerca de37°C para permitir a ligação de células.
60 μΐ de proteína de dAb e 60 μΐ de meio de indução contendo40 ng/ml de VEGF165 (para uma concentração final de 10 ng/ml) sãoadicionados a uma placa de 96 reservatórios e selada com película. A misturade dAb/VEGF é depois incubada a 37°C por 0,5 a 1 hora.
A placa de dAb/VEGF é removida do incubador e 100 μΐ desolução adicionados a cada reservatório da placa contendo HUVEC (volumefinal de 200 μΐ). Esta placa é depois retornada ao incubador a 37°C por umperíodo de pelo menos 72 horas.
Os reservatórios de controle incluem os seguintes:reservatórios contendo células, mas nenhum VEGF; reservatórios contendocélulas, um anticorpo anti-VEGF que neutraliza o controle positivo e VEGF;e reservatórios de controle contendo apenas células e VEGF.
A viabilidade celular é avaliada pela adição de 20 μΐ porreservatório de reagente Celltiter96 e a placa é incubada a 37°C por 2 a 4horas até que uma cor marrom se desenvolva. A reação é interrompida pelaadição de 20 μΐ por reservatório de SDS a 10% (p/v). A absorbância é depoislida a 490 nm usando uma leitora de microplaca Wallac.
A absorbância dos reservatórios de controle sem nenhumVEGF é subtraída de todos os outros valores. A absorbância é proporcional aonúmero de célula. Os reservatórios de controle contendo anticorpos anti-VEGF de controle também devem exibir proliferação celular mínima. Osreservatórios contendo apenas VEGF devem exibir proliferação de célulamáxima.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1. Ensaios de Ligação de Receptor de VEGF
VEGF é um mitogênio específico para as células endoteliais invitro e um fator angiogênico potente in vivo, com altos níveis da proteínasendo expressados em vários tipos de tumores. Esta é uma glicoproteína de 45kDa que é ativa como um homodímero. Diversas isoformas foram descritasque ocorrem através de junção de mRNA alternativas. Destas isoformasVEGF-121 e VEGF-165 parecem ser as mais abundantes.
A ação específica de VEGF sobre as células endoteliais éprincipalmente regulada por dois tipos de tirosina quinases receptoras (RTK),VEGF Rl (Fit-I) e VEGF R2 (KDR/Flk-1). Entretanto, parece que asatividades de VEGF tais como mitogenicidade, quimiotaxia e indução demudanças morfológicas são mediadas por VEGF R2, embora ambos osreceptores sofram fosforilação na ligação de VEGF.
Ensaio de Ligação 2 do Receptor de VEGFEste método descreve um ensaio de ligação de receptor deVEGF para medir a capacidade dos ligandos (por exemplo, dAbs) paraprevenir a ligação de VEGF-165 ao Receptor 2 de VEGF. Um VEGF humanorecombinante. A quimera R2/Fc foi usada neste ensaio, que compreende odomínio extracelular de VEGF humano. R2 fundido à região Fc de IgGihumana. Em resumo, o receptor foi capturado em uma placa de ELISA,depois a placa foi bloqueada para impedir a ligação não específica. Umamistura de VEGF-165 e ligando foi depois adicionada, a placa foi lavada e oVEGF-165 ligado ao receptor detectado usando um anticorpo anti-VEGFbiotinilado e um anticorpo anti-biotina conjugado à Rábano Peroxidase(HRP). A placa foi desenvolvida usando um substrato colorimétrico e a ODlida a 450 nm. Se o dAb bloqueou a ligação de VEGF ao receptor entãonenhuma cor foi detectada.
O ensaio foi realizado como segue. Uma placa de ensaio NuncMaxisorp de 96 reservatórios foi revestida durante a noite a 4°C com 100 μΐpor reservatório de VEGF humano recombinante. R2/Fc (R&D Systems, Cat.N2: 357-KD-050) a uma concentração de 0,5 μg/ml em tampão de carbonato.Os reservatórios foram lavados 3 vezes com 0,05% de Tween/PBS e 3 vezescom PBS. 200 μΐ por reservatório de BSA a 2% em PBS foram adicionadospara bloquear a placa e a placa foi incubada por um mínimo de 1 hora natemperatura ambiente.
Os reservatórios foram lavados (como acima), depois 50 μΐ porreservatório de ligando foram adicionados a cada reservatório. 50 μΐ deVEGF, a uma concentração de 6 ng/ml em diluente (para uma concentraçãofinal de 3 ng/ml), foram depois adicionados a cada reservatório e a placa foiincubada por 2 horas na temperatura ambiente (para o ensaio desobrenadantes; 80 μΐ de sobrenadante foram adicionados a cada reservatóriodepois 20 μΐ de VEGF a uma concentração de 15 ng/ml).
Os seguintes controles foram incluídos: 0 ng/ml de VEGF(apenas diluente); 3 ng/ml de VEGF (R&D Systems, Cat N2: 293-VE-050); 3ng/ml de VEGF com 0,1 μ£/πι1 de anticorpo neutralizador anti-VEGF (R&DSystems cat# MAB293).
A placa foi lavada (como acima) e depois 100 μΐ de anticorpoanti-VEGF biotinilado (R&D Systems, Cat Ns: BAF293), 0,5 μ^πύ emdiluente, foram adicionados e incubados por 2 horas na temperatura ambiente.
Os reservatórios foram lavados (como acima) depois 100 μΐ deanticorpo anti-biotina conjugados com HRP (diluição 1:5000 em diluente;Stratech, Cat N2: 200-032-096) foram adicionados. A placa foi depoisincubada por 1 hora na temperatura ambiente.
A placa foi lavada (como acima) garantindo que quaisquertraços de Tween-20 fossem removidos para limitar o fundo no ensaio deperoxidase subseqüente e para ajudar a prevenção de bolhas nos reservatóriosda placa de ensaio que poderiam dar leituras de OD imprecisas.
100 μΐ de solução de Peroxidase de MicroReservatórioSureBlue I-Componente TMB foram adicionados a cada reservatório e aplaca foi deixada na temperatura ambiente por até 20 minutos. Um produtosolúvel azul profundo desenvolveu conforme o conjugado rotulado com HRPligado reagiu com o substrato. A reação foi interrompida pela adição de 100μΐ de ácido clorídrico 1 M (a cor azul virou para amarelo). A OD, a 450 nm,da placa foi lida em uma leitora de placa de 96 reservatórios dentro de 30minutos da adição de ácido. A OD450nm é proporcional à quantidade deconjugado de estreptavidina-HRP ligado.
Para alguns ensaios a proteína L foi adicionada. A proteína Lreticula dois monômeros dAb.
Os resultados esperados dos controles são como segue: 0ng/ml de VEGF deve dar um sinal baixo de <0,15 OD; 3 ng/ml de VEGFdeve dar um sinal de >0,5 OD; e 3 ng/ml de VEGF pré-incubado com 0,1μg/ml de anticorpo neutralizador deve dar um sinal <0,2 OD.Ensaio de Ligação de Receptor 1 de VEGF
Este ensaio mede a ligação de VEGF-165 ao VEGF Rl e acapacidade de ligandos para bloquear esta interação. Um VEGF humanorecombinante. A quimera Rl/Fc foi usada aqui, que compreende o domínioextracelular de VEGF humano. Rl fundido à região Fc da IgGi humana. Oreceptor foi capturado em uma placa de ELISA depois a placa foi bloqueadapara prevenir a ligação não específica. Uma mistura de VEGF-165 e ligandofoi depois adicionada, a placa foi lavada e o receptor ligado VEGF-165detectado usando um anticorpo anti-VEGF biotinilado e um anticorpo anti-biotina conjugado a HRP. A placa foi desenvolvida usando um substratocolorimétrico e a OD lida a 450 nm.
O ensaio foi realizado como segue. Uma placa de ensaio de 96reservatórios Nunc Maxisorp colorimétrico foi revestido durante a noite a 4°Ccom 100 μΐ por reservatório de VEGF humano recombinante. Rl/Fc (R&DSystems, Cat N°: 321-FL-050) cerca de 0,1 μg/ml em tampão de carbonato.Os reservatórios foram lavados 3 vezes com 0,05% de Tween/PBS e 3 vezescom PBS.
200 μΐ por reservatório de BSA a 2% em PBS foramadicionados para bloquear a placa e a placa foi incubada por um mínimo de 1hora na temperatura ambiente.
Os reservatórios foram lavados (como acima), depois 50 μΐ porreservatório de proteína dAb purificada foram adicionados a cadareservatório. 50 μΐ de VEGF, a uma concentração de 1 ng/ml em diluente(para uma concentração final de 500 pg/ml), foram depois adicionados a cadareservatório e a placa incubada por 1 hora na temperatura ambiente (ensaio desobrenadantes; 80 μΐ de sobrenadante foram adicionados a cada reservatóriodepois 20 μΐ de VEGF a cerca de 2,5 ng/ml).
Os seguintes controles foram incluídos: 0 ng/ml de VEGF(apenas diluente); 500 pg/ml de VEGF; e 500 pg/ml de VEGF com 1 μg/mlde anticorpo anti-VEGF (R&D Systems cat#MAB293).
A placa foi lavada (como acima) e depois 100 μΐ de anticorpoanti-VEGF biotinilado, 50 ng/ml em diluente, foram adicionados e incubadospor 1 hora na temperatura ambiente.
Os reservatórios foram lavados (como acima) depois 100 μΐ deanticorpo anti-biotina conjugado com HRP foram adicionados (diluição 1:5000em diluente). A placa foi depois incubada por 1 hora na temperatura ambiente.
A placa foi lavada (como acima), garantindo que quaisquertraços de Tween-20 fossem removidos para limitar o fundo no ensaio deperoxidase subseqüente e para ajudar na prevenção de bolhas nosreservatórios da placa de ensaio que poderiam dar leituras de OD imprecisas.
100 μΐ de solução de SureBlue I-Component TMB MicroWellPeroxidase foram adicionados a cada reservatório e a placa foi deixada natemperatura ambiente por até 20 minutos. Um produto solúvel azul profundodesenvolveu conforme o conjugado rotulado ligado a HRP reagiu com osubstrato. A reação foi interrompida pela adição de 100 μ 1 de ácido clorídrico1 Μ. A OD, a 450 mn, da placa foi lida em uma leitora de placa de 96reservatórios dentro de 30 minutos da adição de ácido. A OD450 nm éproporcional à quantidade de conjugado de estreptavidina-HRP ligado.
O resultado esperado dos controles: 0 ng/ml de VEGF devedar um sinal baixo de <0,15 OD; 500 pg/ml de VEGF deve dar um sinal de>0,8 OD; e 500 pg/ml de VEGF pré-incubados com 1 μg/ml de anticorponeutralizador deve dar um sinal de <0,3 OD
Tabela 1
<formula>formula see original document page 179</formula>O TARl 5-1 teve um Kd de 50 a 80 nM quando testado emvárias concentrações em um chip BIAcore de baixa densidade. Outros VKdAbs foram passados no chip de baixa densidade em uma concentração (50nívl). dAbs diferentes mostraram cinéticas de ligação diferentes.
Tabela 2
<table>table see original document page 180</column></row><table>
* dAb foi ensaiado a 50 nM
VH dAbs foram passados no chip de VEGF de baixadensidade em um BIAcore a uma concentração (50 nM). dAbs diferentesmostraram cinéticas de ligação diferentes.
Exemplo 2. Ligação de EGFR
Ensaio de ligação de EGFR
25 μΐ de ligando (por exemplo, dAb) foram plaqueados emuma placa de 96 reservatórios e depois 25 μΐ de estreptavidina-Alexa Fluor (1μ§/ηι1) (Molecular Probes) e 25 μΐ de células A431 (ATCC N- CRL-1555) (8χ 105/ml) foram adicionados. Todos os reagentes foram preparados emPB S/1% de B SA. A placa foi incubada por 30 minutos na temperaturaambiente.
Sem perturbar as células, 25 μΐ de EGF biotinilado(Invitrogen) a 40 ng/ml foram adicionados a cada reservatório e a placa foiincubada por três horas na temperatura ambiente. A fluorescência foi medidausando o Sistema de Detecção Celular AB8200 (Applied Biosystems).
Os ligandos (por exemplo, dAbs) que inibiram a ligação deEGF biotinilado ao EGFR expressado em células A431 resultam emcontagens de fluorescência mais baixas. Os reservatórios sem ligandoforneceram uma referência da fluorescência máxima (isto é, ligação de EGFbiotinilado) e os reservatórios sem ligando ou EGF biotinilado forneceramuma referência do nível de fundo de fluorescência. Estes controles foramincluídos em todos os ensaios.
Os resultados obtidos neste ensaio usando certos dAbs anti-EGFR são apresentados na Tabela 3.
Ensaio de quinase de EGFR
Em uma placa de 96 reservatórios, 5 χ IO4 células A431(ATCC N2 CRL-1555) foram plaqueadas por reservatório em RPMI-1640suplementado com 10% de soro bovino fetal. A placa foi incubada durante anoite a 37°C/5% de CO2 para permitir que as células adiram, depois o meiofoi substituído com RPMI-1640. A placa foi incubada por 4 horas a 37°C /5% de CO2. O ligando (preparado em RPMI-1640) foi adicionado aosreservatórios e a placa foi incubada por 45 minutos a 37°C / 5% de CO2. EGF(Invitrogen) foi adicionado aos reservatórios para dar uma concentração finalde 100 ng/ml e a placa foi incubada por 10 minutos na temperatura ambiente.Os reservatórios foram lavados duas vezes com PBS gelado. O tampão de Iisefrio (1% de NP-40, 20 mM de Tris, 137 mM de NaCl5 10% de glicerol, 2 mMde EDTA, 1 mM de ortovanadato de sódio, 10 μg/ml de aprotinina, 10 μg/mlde leupeptina) foi adicionado e a placa foi incubada em gelo por 10 minutos.
Os sobrenadantes foram transferidos a uma placa de ELISAque foi revestida durante a noite com anticorpo anti-EGFR (R&D Systems) a1 μg/ml em tampão de carbonato. A placa de ELISA foi incubada por 2 horasna temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes com PBS/0,05% deTween 20. O anticorpo anti-fosfotirosina conjugado à rábano peroxidase(Upstate Biotechnology) a 1 μg/ml foi adicionado e a placa foi incubada por 1hora na temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes com PBS/Tweene três vezes com PBS. A reação foi desenvolvida com substrato de peroxidasede micro-reservatório de 1 componente SureBlue TMB (KPL) e a reação foiinterrompida com HCl 1 M depois de 25 minutos. A absorbância foi lidausando uma leitora de placa Wallac.
Os resultados obtidos neste ensaio usando certos dAbs anti-EGFR são apresentados na Tabela 3.
Tabela 3
<table>table see original document page 182</column></row><table>
* os dados apresentados são os valores mais baixos e mais altos obtidos e a (média)
Exemplo 3. Formato equivalente a IgGs que têm especificidade de ligaçãopara VEGF e EGFR.
Vetores
O esqueleto pBudCE4.1 (Invitrogen) foi usado para aclonagem de regiões constantes da imunoglobulina, tais como a regiãoconstante de cadeia pesada de IgGj e a região constante de cadeia leve capa(ver a FIG. 16 para visão geral). Um líder de cadeia Ig Capa foi usado parafacilitar a secreção da proteína expressada. As regiões constantes Ig (IgGl eCK humanas) foram produzidas pela GeneArt (Alemanha).
A região constante de cadeia pesada e o peptídeo de sinalforam clonados em pBudCE4.1 como um fragmento Hind III/BglII nos sítiosde restrição HindIII/BamH I.A região constante de cadeia leve e o peptídeo de sinal foramclonados em pBudCE4.1 como um fragmento Notl/Mlul.Clonagem de dAb em vetores IgG e produção de formato equivalente a TgG
VK dAb (específico ao VEGF ou EGFR) foi clonado no vetorIgG como um fragmento Sall/BsiWI. VH dAb (específico ao VEGF ou EGFRfoi clonado no vetor IgG como um fragmento BamHI/XhoL
O plasmídeo foi depois transfectado em células T HEK293(ATCC GRL-11268) e a IgG foi expressada transientoriamente por cinco dias.A IgG produzida foi purificada usando a forma aerodinâmica da Proteína A.
A IgG purificada foi checada em um gel de SDS redutor e nãoredutor e as faixas de tamanho esperado foram observadas.
Diversos dAbs que ligam VEGF ou EGFR foram formatadosnos formatos equivalentes à IgG que têm especificidade de ligação paraVEGF e EGFR. Os formatos equivalentes à IgG foram preparados pelaprodução de construções que codificaram uma cadeia pesada de IgG em queVH é um dAb e uma cadeia leve Capa em que VK é um dAb. Os formatosequivalentes à IgG que foram preparados são mostrados na Tabela 4 e osresultados obtidos para alguns dos formatos equivalentes a IgG nos ensaiossão apresentados na Tabela 5. (Dummy VH e Dummy VK são seqüências dalinha germinativa que não se ligam a VEGF ou EGFR).Tabela 4
<table>table see original document page 184</column></row><table>Tabela 5
<table>table see original document page 185</column></row><table>
Embora esta invenção tenha sido particularmente mostrada edescrita com referências às suas formas de realização preferidas, seráentendido por aqueles habilitados na técnica que várias mudanças na forma edetalhes possam ser feitas nesse sentido sem divergir do escopo da invençãoabrangido pelas reivindicações anexas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Domantis LimitedIgnatovich, OlgaHolmes, SteveBeckmann, Rolandde Wildt, Rudolf Μ. T,<120> Ligandos que têm especificidade de ligação para VEGF e/ou EGFR
métodos de uso para tais<130> 3440.1008003<140> PCT/GB2007/00004 9<141> 2007-01-10<150> 11/331,415<151> 2006-01-11<160> 540
<170> FastSEQ for Windows Versão 4.0<210> 1<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 1
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt cctgagttaa gttggtacca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat ggttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cgtatgtatc ggcctgctac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324
<210> 2<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 2
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt agggagttaa agtggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaggctcct gatctatcat ggttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gatttttttg ttcctgatac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324
<210> 3
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 3
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca ggatattgcg aatgatttaa tgtggtacca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcgt aattcccgtt tgcaaggtgg ggtcccatca 180
cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cttgttcatc gcccttatac gatcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324
<210> 4
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 4
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gtttattggg ccgcatttaa cgtggtatca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat tcttccttgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcagcct 240gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgtatt atccttctac gttcggccaa 300gggaccaagg tgaaaatcaa gcgg 324
<210> 5<211> 324<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 5
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc
atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat
cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat
gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag
gggaccaagg tggaaatcag acgg
<210> 6
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 6
gacatccaga tgatccagtc tccatcctcc
atcacttgcc gggcaagtca gtttattggt
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat
cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat
gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag
gggaccaagg tggaaatcaa acgg
<210> 7
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 7
gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 8<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 8
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc
atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg
gggaaagccc ctaagctcct gatctatatg
cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat
gaagatttag ctacgtacta ctgtcaacag
gggaccaagg tggaaatcaa acgg
<210> 9
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 9
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc
atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat
cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat
gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag
gggaccaagg tggaaatcaa acgg
<210> 10
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 10
gacatccaga tgacccagtc tccatcctccatcacttgcc gggcaagtca gtctattggggggaaagccc ctatgctcct gatctatcatcgtttcagtg gcagtggatc tgggacagatgaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag
ctgtctgcatccggagttaaacgtccatttttcacv-ci_catatatgtttc
ctgtaggagagttggtaccatgcaaagtggccatcagcagagcctaggac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300324
ctgtccgcataatgagttaagcttccagttttcactctcagttctgggtt
ctgtaggagagttggtatcatgcaaagtggccatcagcagatccttatac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300324
tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
gtggattggt cctgagttaa gttggtacca gcagaaacca 120
gatctatcat ggttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
ctgtcaacag gttctgtata gtcctttgac gttcggccaa 300acgg 324
ctgtctgcataatgagttaatcttccctttttcactctcaacgcttttgc
ctgtaggagaagtggtatcatgcaaagtggccatcagcagttccttttac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300324
ctgtctgcatcctgagttaaggttccatttttcactctcacgtctgtatt
ctgtaggagagttggtaccatgcaaagtggccatcagcagatcctggtac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300324
ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60cgtgagttaa gttggtacca gcagaaacca 120agttccaatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gggatgtatt ggccttatac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa<210> 11<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 11
gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 12<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 12
gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 13<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 13
gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagatgttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 14<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 14
gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagatttcg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 15<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 15
gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 16<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 16
gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtca
acgg
324
tccatcctccgtggattaaggatctatcattgggacagatctgtcaacagacgg
ctgtctgcat ctgtaggagaccggccttac attggtaccaggttccattt tgcaaagtggttcactctca ccattagcagactcttttta tgccttatac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300324
tccatcctccgtctattagtgatctataattgggacagatctgtcaacagacgg
ctgtctgcatactgcgttacggttccatgtttcactctcaacttgggata
ctgtaggaga ccgtgtcacc 60tgtggtatca gcagaaacca 120tgccaaatgg ggtcccatca 180ccatcagcag tctgcaacct 240ctcctatgac gttcggccaa 300
324
tccatcctccgtggattggggatctatcattgggacagatctgtcaacagacgg
ctgtctgcatcatgatttattcgtcctcttttcactctcacttatgggtt
ctgtaggagacgtggtaccatgcaaagtggccatcagcagatccttttac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300324
tccatcctccggatattggggatctaccggtgggacagatctgtcaacagacgg
ctgtctgcatggtttgttagagttcctattttcactctcaacgtggggta
ctgtaggagatgtggtatcatgcaaagtggccatcagcagttcctcatac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300324
tccatcctccgaagatttttgatctatcattgggacagatctgtcaacagacgg
ctgtctgcataatggtttaaagttccacgtttcactctcagttcttctgt
ctgtaggaga ccgtgtcacc 60gttggtatca gcagaaacca 120tgcaaagtgg ggtcccatca 180ccatcagcag tctgcaacct 240atccttatac gttcggccaa 300
324
tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60gagtattggg actaatttat cttggtacca gcagaaacct 120gggaaagccc ctaggctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 17<211> 354<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 17
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccagggaagg gtctggagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acagcctgcggggcgggcta gttttgacta<210> 18<211> 348<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 18
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccagggaagg gtctagagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acagcctgcgactcagtttg actactgggg<210> 19<211> 357<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 19
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccagggaagg gtctagagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acagcctgcgcagattctgt ctaattttga<210> 20<211> 372<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 20
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcgg cctccggattccagggaagg gtcttgagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acagcctgcggatcgtacgg ctgggtctagaccgtctcga gc<210> 21<211> 363<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 21
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccagggaagg gtctggagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acagcctgcgattagtccta ctccgttgggage<210> 22<211> 348
gatetategg acgtccatgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
ctgtcaacag cagttttttt ggcctcatac gttcggccaa 300
acgg 324
tgggggaggccacctttaggggtctcatatgttcaccatctgccgaggacctggggtcag
ttggtacagcttgtatgataattagttctgtcccgcgacaaccgcggtatggaaccctgg
ctggggggtctggtttgggtggggttctggattccaagaaattactgtgctcaccgtctc
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120tacatactac 180cacgctgtat 240gaaagcgggg 300gage 354
tgggggaggccacctttcatggtctcatttgttcaccatctgccgaggactcagggaacc
ttggtacagcctttatgataattgggggggtcccgcgacaaccgcggtatctggtcaccg
ctggggggtc cctgcgtctc 60tgatgtgggt ccgccaggct 120atggtcttaa tacatactac 180attccaagaa cacgctgtat 240attactgtgc gaaagcgggg 300tetegage 348
tgggggaggccacctttaatggtctcagaggttcaccatctgccgaggacctactggggt
ttggtacagcaagtatcctaatttctccgttcccgcgacaaccgcggtatcagggaaccc
ctggggggtctgatgtgggtctggtcaggaattccaagaaattactgtgctggtcaccgt
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120tacatactac 180cacgctgtat 240gaaaaatcct 300etegage 357
tgggggaggccacctttcagggtctcactggttcaccatctgccgaggacgggtaattct
ttggtacagctggtatcctaattgaggggctcccgcgacaaccgcggtattttgactact
ctggggggtctgtggtgggtagggtgatagattccaagaaattactgtgcggggtcaggg
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120gacatactac 180cacgctgtat 240gaaagcgggg 300aaccctggtc 360372
tgggggaggccacctttaagggtctcaggtgttcaccatctgccgaggatgtttgactac
ttggtacagcgcttatgagaatttctcctatcccgcgacaaccgcggtattggggtcagg
ctggggggtctgggttgggtatggtggttgattccaagaaattactgtgcgaaccctggt
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120gacatactac 180cacgctgtat 240gaaagagtcg 300caccgtctcg 360363<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 22
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccagggaagg gtctagagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acagcctgcgactatgtttg actactgggg<210> 23<211> 348<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 23
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccagggaagg gtctagagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acagcctgcggaggattttg actactgggg<210> 24<211> 348<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 24
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccagggaagg gtctagagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acagcctgcgcggaagtttg actactgggg<210> 25<211> 369<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 25
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccggggaagg gtctagagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acagcctgcgggggggcctc ctacgtatgtgtctcgagc<210> 26<211> 369<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 26
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccagggaagg gtctagagtggcagactccg tgaagggccgctgcaaatga acaacctgcgctttcgtctg agggtttttcgtctcgagc<210> 27<211> 369<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 27
gaggtgcagc tgttggagtctcctgtgcag cctccggattccagggaagg gtctagagtg
tgggggaggccacctttactggtctcatatattcaccatctgccgaggactcagggaacc
ttggtacagcgggtatgagaatttctagggtcccgcgacaaccgcggtatctggtcaccg
ctggggggtctggggtgggtgtggtcggtgattccaagaaattactgtgctctcgagc
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120gacatactac 180cacgctgtat 240gaaatcggat 300348
tgggggaggccacctttagtggtctcatttgttcaccatctgccgaggactcagggaacc
ttggtacagcgcttatgagaatttctggggtcccgcgacaaccgcggtatctggtcaccg
ctggggggtctgggttgggtggggtcggtgattccaagaaattactgtgctctcgagc
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120gacatactac 180cacgctgtat 240gaaatattcg 300348
tgggggaggccacctttgggggtctcagaggttcaccatctgccgaggactcagggaacc
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348DNA
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<211> 348
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ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggtaggta
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa
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ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac
cgcgcctttg actactgggg tcagggaacc
<210> 97
<211> 348
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 97
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggctcctgtgcag cctccggatt cacctttaagccagggaagg gtctagagtg ggtctcagaggcagactccg tgaagggccg gttcaccatcctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggaccggaagtttg actactgggg tcagggaacc
ttggtacagcgcttatccgaatttcgcctttcccgcgacaaccgcggtatctggtcaccg
ctggggggtctaatgtgggtcgggtaagaaattccaagaaattactgtgctctcgagc
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120gacgtactac 180cacgctgtat 240gaaagatccc 300348
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98
348
DNA
Homo sapiens98
<210><211><212><213><4 00>
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Homo sapiens
<212><213><4 00>
99
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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggctcctgtgcag cctccggatt cacctttaagccagggaagg gtctagagtg ggtctcagaggcagactccg tgaagggccg gttcaccatcctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggaccggaggtttg actactgggg tcagggaacc<210> 100<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
15 10
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln20 25
ctggggggtctaatgtgggtcgggtcacaaattccaagaaattactgtgctctcgagc
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120caagtactac 180cacgctgtat 240gaaagatcct 300348
Ser Ala Ser Val Gly15
Trp Ile Gly Pro Glu30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Met Tyr Arg Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 101<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Arg Glu
20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Phe Phe Val Pro Asp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 102
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Asp
20 25 30
Leu Met Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Arg Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Val His Arg Pro Tyr
85 90 95
Thr Ile Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Pro His
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Ser Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Tyr Tyr Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Lys Ile Lys Arg100 105
<210> 104
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Pro Glu
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 .70 75 80
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85 90 95
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Asn Glu
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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85 90 95
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Pro Glu
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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<213> Homo sapiens
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15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asn Glu
20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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85 90 95
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Pro Glu
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 " 55 60
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15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Glu
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Met Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Lys Pro Ala20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Gly Ser Met Leu Pro Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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85 90 95
Thr Phe Glv Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly His Asp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Ser Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Met Gly Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Gly Leu
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
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85 90 95
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile Phe Asn Gly
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Ser Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Leu Leu Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Phe Phe Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 116
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15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr
20 25 30
Asp Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser115
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Leu Tyr
20 25 30
Asp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Gly Gly Asp Gly Leu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Gly Thr Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15^
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 119
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Trp Tyr
20 25 30
Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Gly Asp Arg Thr Ala Gly Ser Arg Gly Asn Ser Phe Asp
100 105 110
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Thr Val Ser Ser115
<210> 123
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ala Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Val Ser Ser115
<210> 124
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 124
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Phe Tyr
20 25 30
Lys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Val Gly Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Met Gly Gly Gly Pro Pro Thr Tyr Val Val Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 125<211> 123<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Glu Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Glu Arg Gly Arg Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ala Leu Ser Ser Glu Gly Phe Ser Arg Ser Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 126<211> 123<212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 126 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ala Arg Gly Phe Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Gly Phe Pro His Lys Ser Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 127 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 127 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Glv Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 IO^ 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr 20 25 30 Asp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Gly Gly Asp Gly Leu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 128 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Phe 20 25 30 Asp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Gly Gly Asp Gly Leu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Gly Thr Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser115
<210> 129
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 129
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Leu Phe
20 25 30
Asp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Gly Gly Asp Gly Leu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Gly Thr Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser115
<210> 130
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Leu Tyr
20 25 30
Asp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Gly Gly Asp Gly Leu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Gly Thr Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser115
<210> 131
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 131
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Leu Tyr
20 25 30
Asp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
Thr Val Ser Ser115
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<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
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15 10 15
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20 25 30
Asp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 133
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15 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 134
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15 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 135
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<213> Homo sapiens
<4 00> 138
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Ala
Gly
Val Ser Ser
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115 120
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
20 25
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50 55
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100 105
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115 120
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20 25
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50 55
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Val Gln ProThrGly
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Asn Thr
Val Tyr
Asn Ser110
Gly Gly15
Trp Pro
Trp Val
Ser Val
Leu Tyr80Tyr Cys95
Phe Asp
Val Gln Pro
Thr Phe Gln30
Gly Leu Glu45
Tyr Ala Asp60
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Ala Val Tyr
Gly Asn Ser110
Ser
Gly Gly15
Trp Tyr
Trp Val
Ser Val
Leu Tyr80Tyr Cys95
Phe Asp
Val Gln Pro
Thr Phe Gln30
Gly Leu Glu45
Tyr Ala Asp60
Lys Asn ThrAla Val Tyr
Gly Gly15
Trp Tyr
Trp Val
Ser Val
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<210> 150
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 150
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Thr Val Ser Ser115
<210> 151
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ala Tyr20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
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Thr Val
<210> 152
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 152
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Trp Tyr20 25 30
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<210> 153
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 153
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Thr Val
<210> 154
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 154
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Ala Tyr20 25 30Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
Thr Val Ser Ser115
<210> 155
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 155
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Arg Tyr20 25 30Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
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<210> 156
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ala Phe20 25 30Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
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<210> 157
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ala Tyr20 25 30Pro Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
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<210> 158
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 158
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe20 25 30Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
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<210> 159
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 159
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Phe Leu Phe20 25 30Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
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115
<210> 160
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 160
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Phe20 25 30Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 161
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 161
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Phe Ala20 25 30Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
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115
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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Thr Val Ser Ser115
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr20 25 30Pro Ile Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Glu Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys8590Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly100 105
Thr Val Ser Ser115
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr20 25 30Pro Ile Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly His Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Thr Val Ser Ser115
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<213> Homo sapiens
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gtatattggt attaatttaa tttggtacca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcttccgttt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tcggtgtatg atcctcctac gtacggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgggc 326
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca ggatattttt tggttgttat cttggtacca gcagaaacca 120gggaaagccc ctacgctcct gatctattct acttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tattatcttg atcctcctac gttcagccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgggc 326
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cctgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gtttattggt gttaatttaa attggtacca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaggctcct gatctatttg tcgtccattc tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acttatgata ttcctactac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgggc 326
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gacatccaga tgacccagtt tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcgagtca gcatattgag aggtggttaa attggtatca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcgt tcgtcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gatgctattc ttcctcatac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgggc 326
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca ggggattggg gtgaatttac agtggtacca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctatttt agttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gattttgatt ttcctcagac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgggc 326
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca ggagattggt gttagtttat cgtggtacca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg ggttccgagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gatcataatt ggcctatgac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa tggaaatcaa acgggc 326
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atcacttgcc gggcaagtgc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60gggaaagccc ctaagctcct ggagattggt gttagtttat cgtggtacca gcagaaacca 120cgtttcagtg gcagtggatc gatctattgg ggttccgagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta
gggaccaagg tggaaatcaa
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gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtaagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 215<211> 326<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 215gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcggggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 216<211> 326<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 216gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 217<211> 326<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 217
gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 218<211> 326<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 218
gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaagctcctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tgaaaatcaa<210> 219<211> 326<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 219gacatccaga tgacccagtc
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tccatcctccgatgattgatgatccttcggtgggacagatctgtcatcagacgggc
ctgtctgcatgagaatttagagttccgggtttcactctcaggtcattctg
ctgtaggagacttggtaccatgcaaagtggccatcagcagctcctggtac
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326
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tccatcctccggagattgctgatctataattgggacagatctgtcaatggacgggc
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gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcagggaaagccc ctaggcttctcgtttcagtg gcagtggatcgaagattttg ctacgtactagggaccaagg tggaaatcaa<210> 225<211> 326<212> DNA
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ctgtctgcatattaatttgcgcttccatttttcactctcatcttatgatt
ctgtaggagaagtggtatcatgcaaagtggccatcagcagtgcctaagac
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tccatcctccggagattggtgatctattggtgggacagatctgtcaacagacgggc
ctgtctgcatgttagtttatggttccgagtttcactctcatggtatggtt
ctgtaggagacgtggtaccatgcaaagtggccatcagcagggcctgatac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300326
tccatcttccgcatattggggatctattggtgggacagatctgtcaacagacgggc
ctgtctgcatattgagttaagcttccgtttttcactctcaagtgtttatg
ctgtaggagaattggtatcatgcaaagtggccatcagcagttcctactac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300326
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ctgtctgcatgcggagttagagttccgtttttcactctcagctgctcata
ctgtaggagatgtggtatcatgcaaagtggccatcagcaggtcctcctac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300326
tccatcctccggatattagtgatctatatgtgggacagatctgtcaacagacgggc
ctgtctgcatcgtagtttagtcttccacttttcactctcatatgattctt
ctgtaggagacttggtaccatgcaaagtggccatcagcagatccttcgac
ccgtgtcacc 60gcggaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300326<213> Homo sapiens<400> 225
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
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<212> DNA
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<4 00> 228
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gaatattggt gtgtcgttat cgtggtacca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaggctcct gatctattat gggtccaatt tgctaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gagttttcgt ggcctgtgac gttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcaa acgggc 32 6<210> 231
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 231
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
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gggaccaagg tggaaatcaa acgggc 326
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gggaaagccc ctaagctcct gatctattat acgtcctatt tgcaaagtgg
cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag
gaagattttg ctacatacta ctgtcaacag gagacgacgt ggccttatac
gggaccaagg tggaaatcaa acgggc
<210> 270
<211> 326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 270
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttgtctgcat ctgtaggagaatcacttgcc gggcaagtca gtatattggg gcggagttaa attggtaccagggaaagccc ctaagctcct gatctattgg acttccgtgt tgcaaagtggcgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaggaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gcgattctgg cgcctcttacgggaccaagg tggaaatcaa acgggc<210> 271
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ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300326
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300326
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300326
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300326<211> 326<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 271
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gttagtttaa attggtatca gcagaaacca 120
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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acatccagat gacccagtct ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac cgtgtcacca 60
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<212> DNA
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gggaccaagg tggaaatcaa
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<212> DNA
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<400> 277
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326
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326
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riomo sapiens279
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gacatccaga tgacccagtc
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ctgtaggagaattggtaccatgcaaagtggccatcagcagatcctgcgac
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ctgtaggagaattggtaccatgcaaagtggccatcagcaggtcctcctac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300326
tccatcctccgtggattggggatctatttttgggacagatctgtcaacagacgggc
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326<213> Homo sapiens<400> 288
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<211> 326
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<210> 303
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<212> DNA
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<210> 305
<211> 326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<211> 326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 306
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 307
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<210> 310
<211> 326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 310
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gggaccaagg tggaaatcaa acgggc 326
<210> 313
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gggaccaagg tggaaatgaa acgggc 32 6
<210> 314
<211> 326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 314
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
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gggaccaagg tggaaatcaa acgggc 326
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<211> 326
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<213> Homo sapiens
<4 00> 315
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<213> Homo sapiens
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<210> 317
<211> 326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 317
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
vi uU> oia
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<213> Homo sapiens
<400> 320
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<4 00> 321
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<4 00> 322
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 324
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc
tcctgtgctg cctccggatt cacctttgct gagcagccga
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt atttctagtt
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat
tatcggatta gtcggtttga ctactggggt cagggaaccc
<210> 325
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 325
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
tgcaaagtgg ggtcccatcaccatcagcag tctgcaacctcgcctctgac gttcggccaa
180240300326
ctgtaggagaactggtaccatgcaaagtggccatcagcagcgcctctgac
ccgtgtcaccgcagaaaccaggtcccatcatctgcaacctgttcggccaa
60
120
180
240
300
326
ctggggggtctgacttgggcttggtgatctattccaagaaattactgtgctggtcaccgt
cctgcgtctcccgccaggcttacatactaccacgctgtatgaaaggtgtgctcgagc
60120180240300357
1
10
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 Tyr Trp Ile Ser Glu Leu Gln Ser Gly 50 55 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65
70
Pro
75
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
85
90
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210> 326
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 326
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
1 5 10
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
20 25
Leu Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40
Tyr Trp Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro
50 55
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
85 90
Thr Tyr Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
Ser Ala Ser Val Gly15
Tyr Ile Gly Ala Glu30
Pro Lys Leu Leu Ile45
Ser Arg Phe Ser Gly60
Ser Ser Leu Gln Pro80
Ser Asn Thr Pro Tyr95
Arg
Ser Ala Ser Val Gly15
Tyr Ile Gly Ile Asn30
Pro Lys Leu Leu Ile45
Ser Arg Phe Ser Gly60
Ser Ser Leu Gln Pro80
Val Tyr Asp Pro Pro95
Arg100 105
<210> 327
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 327
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Phe Trp Leu
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Leu Asp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Ser Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 328
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 328
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Val Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Leu Ser Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Asp Ile Pro Thr
85 90 95
Thr Phe .Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 329
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 329
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ile Asn
20 25 30
Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asp Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 330
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 330Asp Ile Gln Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Ile Glu Arg Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ala Ile Leu Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 331
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 331
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Val Asn
20 25 30
Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 332
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15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ile Asn
20 25 30
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35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Tyr Asp Tyr Pro Asn
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 333
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 333
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Gly Ser Gly
20 25 30
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Val Gly Trp Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Cys Val Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 334
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 334
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Val Glu
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gly Ser Glu Leu Gln Ser GIy Val Pro Ser Ar.g. Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ala Leu Pro Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 335<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 335
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Gly Val Ser
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Val Trp Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 ' 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Val Gly Ala Gly Pro Met
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 336
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 336
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Gly Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Ile Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Tyr Pro Ala85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 337
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 337
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Glu His Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 338<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 338
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 Iu 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Gly Val Ser
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gly Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp His Asn Trp Pro Met
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 339<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 339
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ala Leu Ile Met Gly Asp
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ala Gly Val Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ser Arg Ser Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Met Ile Asp Glu Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Leu Arg Ser Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Sèr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Gly His Ser Ala Pro Gly
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 341
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Ile Gly Val Ser
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Met Trp Gly Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Ala Ala Pro Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 342
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Gly Val Ser
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Leu Pro Pro Asp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 343
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ala Ser Asp
20 25 30
Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45 Tyr Asn Gly Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Trp Leu Trp Ser Glu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 344 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 344 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Ile Gly Asp Ala 20 25 30 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ile Arg Arg Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Lys Ile Lys Arg 100 105 <210> 345 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 345 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Leu 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 346 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 346 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ile Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Lys85 90 95
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<213> Homo sapiens
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15 10 15
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20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 348
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15 10 15
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20 25 30
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85 90 95
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<213> Homo sapiens
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20 25 30
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85 90 95
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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85 90 95
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15 10 15
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20 25 30
Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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15 10 15
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20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Trp Val Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
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85 90 95
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<213> Homo sapiens
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15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Val Ser20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
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85 90 95
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<213> Homo sapiens
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15 10 15
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20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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<213> Homo sapiens
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15 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<213> Homo sapiens
<400> 356
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15 10 15
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20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Phe Ser Trp Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 357
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Pro Ile Asp Asp Gly
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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<211> 108
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<213> Homo sapiens
<4 00> 358
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15 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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85 90 95
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 359
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15 10 15
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20 25 30
Leu Met Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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<213> Homo sapiens
<400> 360
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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85 90 95
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15 10 15
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20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Met Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
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<210> 362
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 362
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Val Ser
20 25 30
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ser Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Tyr Pro Ser
85 90 95
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 363
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Val Tyr20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Arg Asp Pro Ile
85 90 95
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Thr Met
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 365
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 365
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Ala Asn
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ile Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Leu Tyr Thr Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 366
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 366
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Val Thr
20 25 30
Leu Met Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Gln Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Val Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 367<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 367
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Ile Gly Val Ser
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Tyr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Met Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Gly Ile Lys Arg100 105
<210> 368
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 368
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ile Ser
20 25 30
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Ala Ser Gln Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Asp Phe Pro Asn
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 369
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 369
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Ile Gly Val Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu His Thr Ile Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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20 25 30
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Val Ser
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 401
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Trp Pro Ile Gly Asp Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 402
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1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Trp Glu
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Met Leu Leu Ile
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 403<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 403
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Gly Asp Arg
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Val Ser Gln Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 404
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 404
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Gly Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Val Glu
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ala Leu Pro Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Gly Ala Ser
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Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
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<213> Homo sapiens
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15 10 15
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20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Val Asp Arg Ile Pro 95 ValThr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg <210> 407 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 407 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gln Gly Ile Asp 30 His PheLeu Ser Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu IleTyr Phe Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Asn Ala Ser Ile Pro 95 IleThr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg <210> 408 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 408 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gln Asn Ile Gly 30 Thr AsnLeu Lys Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Glu Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu IleTyr Tyr Gly Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Asp Tyr Asp Phe Pro 95 TyrThr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg <210> 409 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 409 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Ser 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gln Trp Ile Gly 30 Gly GluLeu Asn Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu IleTyr Trp Val Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Ala Arg Tyr Pro Ala85 90 95
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<213> Homo sapiens
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<400> 435
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<4 00> 438
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 439
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 439
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Met Lys Arg100 105
<210> 440
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 440
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Asp Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 441
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 441
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 442
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 442
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210> 443
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 443
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Arg Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 444
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 444
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 445
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asn Leu
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 446
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asn Leu
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 447
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Asn
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Asn Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 449
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ile Asn
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50Ser Gly65
Glu Asp
Thr Phe
<210><211><212><213><400>Glu Val1
Ser Leu
Pro Met
Ser Ser
50Lys Gly65
Leu GlnAla LysThr Leu
Ser Gly Thr Asp70
Phe Ala Thr Tyr85
Gly Gln Gly Thr100
450119PRT
Homo sapiens450
Gln Leu Leu Glu5
Arg Leu Ser Cys20
Thr Trp Ala Arg35
Ile Ser Ser Phe
Arg Phe Thr Ile70
Met Asn Ser Leu85
Gly Val Tyr Arg100
Val Thr Val Ser
55 60
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
75 80
Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu
90 95
Lys Val Glu Ile Lys Arg105
Ser Gly
Ala Ala
Gln Ala
40Gly Asp55
Ser ArgArg AlaIle SerSer
Gly
Ser
25
Pro
Leu
Asp
Glu
Arg105
Gly Leu10
Gly Phe
Gly Lys
Thr Tyr
Asn Ser
75Asp Thr90
Phe Asp
Val Gln
Thr Phe
Gly Leu
45Tyr Ala60
Lys AsnAla ValTyr Trp
Pro
Ala
30
Glu
Asp
Thr
Tyr
Gly110
Gly Gly15
Glu Gln
Trp Val
Ser Val
Leu Tyr80Tyr Cys95
Gln Gly
<210><211><212><213><220><223><400>Glu Val1
Ser Leu
Val Met
Val Gly
50Val Lys65
Tyr Leu
Cys Ala
Asn Tyr
<210><211><212><213><220><223><4 00>Gln Val1
Ser Leu
451127PRT
Desconhecido
Camelideo
451
Gln Leu Val Glu5
Arg Leu Ser Cys20
Gly Trp Phe Arg35
Ile Gly Arg Ser
Gly Arg Phe Thr70
Gln Met Asn Ser85
Ala Ser Thr Tyr100
Asn Tyr Trp Gly115
452127PRT
Desconhecido
Ser Gly Gly
Ala Ala Ser25
Gln Ala Pro40
Gly Gly Asp55
Ile Ser Trp
Leu Lys Pro
Ser Arg Asp105
Gln Gly Thr120
Gly Leu10
Gly Arg
Gly Lys
Asn Thr
Asp Asn
75Glu Asp90
Thr IleGln Val
Val Gln
Thr Phe
Glu Arg
45Tyr Tyr60
Ala Lys
Thr Ala
Phe Thr
Thr Val125
Ala Gly Gly15
Ser Asn Tyr30
Asp Phe Val
Ala Asp Ser
Asn Thr Met80
Val Tyr Tyr95
Lys Trp Ala110
Ser Ser
Camelideo452
Gln Leu Gln Glu5
Arg Leu Ser Cys20
Val Met Gly Trp Phe Arg
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ala Gly Gly
10 15
Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
25 30
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val35 40 45
Gly Ala Ile His Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Arg Ile Ile Tyr Ser Tyr Val Asn Tyr Val Asn Pro Gly
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 453<211> 122<212> PRT<213> Desconhecido<220>
<223> Camelideo<4 00> 453
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Arg Thr Phe Tyr Gly Ser Thr Trp Ser Lys Tyr Asp Tyr Arg
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 454<211> 129<212> PRT<213> Desconhecido<220>
<223> Camelideo<4 00> 454
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Trp Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Thr Tyr Leu Val Asp Val Trp Ala Val His Val Pro Ile Arg
100 105 110
Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser115 120 125
Ser
<210> 455<211> 125<212> PRT<213> Desconhecido<220>
<223> Camelideo<4 00> 455
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Gly Gly Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Leu Arg Pro Ser Pro Asn Tyr Asn His Glu Arg Ser Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 456 <211> 129 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 456 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Leu Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Thr Tyr Asn Pro Tyr Ser Arg Asp His Tyr Phe Pro Arg Met 100 105 110 Thr Thr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 457 <211> 122 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <400> 457 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Thr Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Thr Tyr 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val ' 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Arg Phe Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Val Tyr Leu65 70 75 80Glu Met Asn Ser Leu D S Lys Pro Glu Asp Thr Ω Π Ala Val Tyr Tyr Cys Ω C Ala
85 90 95Ala Arg Glu Gly Val Ala Leu Gly Leu Arg 100 105 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 458 <211> 121 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <400> 458 Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly1 5 10Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 Ala Ala Ile Gly Leu Asn Thr Tyr Tyr- Ala 50 55 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn65 70 Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90Thr Ser Gly Val Val Gly Gly Thr Pro Lys 100 105 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 459 <211> 122 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 459 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly1 5 10Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 Ala Thr Ile Ser Trp Thr Asn Ser Thr Asp 50 55 Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala65 70 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 85 90Ala Asp Lys Trp Ala Ser Ser Thr Arg Ser 100 105 Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 460 <211> 123 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 460 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly1 5 10Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 35 40
110
Leu
Gly
Lys
Asp
Thr
75
Tyr
Arg
Val Gln
Thr Phe
Glu Arg
. 45Ser Val60
Val TyrTyr CysTyr Asp
Ala
Ser
30
Glu
Lys
Leu
Ala
Tyr110
Gly Gly15
Ser Tyr
Phe Val
Gly Arg
Gln Met80
Ala Arg95
Trp Gly
75
Val Gln
Gly Phe
Asp Arg45
Ala Asp60
Asn ThrVal TyrAsp Tyr
Ala
Ser
30
Glu
Ser
Ala
Tyr
Asp110
Gly Gly15
Arg Tyr
Phe Val
Val Lys
Tyr Leu80Cys Ala95
Tyr Trp
15
30
45Ala Ala Ile Asn Trp Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Lys Pro Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysAla Ala Ser Glu 100 Trp Gly Gly Ser Asp 105 Tyr Asp His Asp Tyr 110 Asp TyrTrp Gly Gln 115 Gly Thr Gln Val Thr 120 Val Ser Ser <210> 461 <211> 123 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <400> 461 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Arg Ser Phe Ser 30 Ser TyrAla Met Ala 35 Trp Phe Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Glu Arg 45 Glu Phe ValAla Ala Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Val Ser Val50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Lys Pro Glu Asp 90 Thr Ala Arg Tyr Tyr 95 í—l___,Ala Ala Asp Glu 100 Thr Phe His Ser Ser 105 Ala Tyr Gly Glu Tyr 110 Glu TyrTrp Gly Gln 115 Gly Thr Gln Val Thr 120 Val Ser Ser <210> 462 <211> 133 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 462 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Thr Ala Ser 25 Gly Arg Thr Phe Ser 30 Ser TyrAla Met Gly 35 Trp Phe Arg Gln Thr 40 Pro Gly Lys Glu Arg 45 Glu Phe ValAla Ala Ile Thr Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Met Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asp Ser 85 Leu Met Leu Asp Asp 90 Thr Ser Val Tyr Tyr 95 CysAla Ala Asp Ser 100 Ser Arg Pro Gln Tyr 105 Ser Asp Ser Ala Leu 110 Arg ArgIle Leu Ser 115 Leu Ser Asn Ser Tyr 120 Pro Tyr Trp Gly Gln 125 Gly Thr Gln
Val Thr Val Ser Ser
130<210> 463<211> 120<212> PRT<213> Desconhecido<220><223><220><221><222><223><4 00>Glu Val1
Ser Leu
Ala Met
Ser Ser50
Lys Asp65
Leu Gln
Camelideo
VARIANTE3, 13Xaa=Orn463
Xaa Leu Val Glu5
Arg Leu Ser Cys20
Ser Trp Val Arg35
Ile Ser Tyr Asn
Arg Phe Thr Ile70
Met Asn Ser Leu85
Ala Ser Ser Gly Ser Tyr100
Ser Gly
Val Ala
Gln Ala
40Gly Asp55
Ser ArgLys SerTyr Pro
Gly Gly10
Ser Gly25
Pro Gly
Thr Thr
Asp Asn
Glu Asp
90Gly His105
Leu Val Xaa ProPhe ThrLys Gly
Tyr Tyr60
Ala Lys75
Thr AlaPhe Glu
Phe Ala
30Leu Gln45
Ala Glu
Asn Thr
Val Tyr
Ser Trp110
Gly Gly15
Asp Tyr
Trp Val
Ser Met
Leu Tyr80Tyr Cys95
Gly Gln
Gly Thr Gln 115 Val Thr Val Ser Ser 120 <210> 464 <211> 121 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 464 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Arg Thr Phe Ser 30 GlyAla Met Gly 35 Trp Phe Arg Gln Ala 40 Pro Gly Glu Glu Arg 45 Glu PheAla Ala 50 Ile Ser Trp Arg Gly 55 Thr Ser Thr Tyr Tyr 60 Gly Asp SerLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val65 70 75 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Lys Pro Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95Ala Ala Gly Ser 100 His Ser Asp Tyr Ala 105 Pro Asp Tyr Asp Tyr 110 TrpGln Gly Thr 115 Gln Val Thr Val Ser 120 Ser <210> 465 <211> 123 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 465 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Arg Thr Phe Ser 30 SerAla Ile Gly 35 Trp Phe Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Glu Arg 45 Glu PheAla Ala 50 Ile Ser Trp Gly Gly 55 Ser Asn Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp SerLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val65 70 75 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
80
8085 90 95
Ala Ala Gly Glu Val Ser Asn Ser Asp Tyr Ala Tyr Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 466 <211> 122 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 466 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Met Gly Trp 20 25 30 Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Ser 35 40 45 Arg Ser Gly Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe 50 55 60 Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Leu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn65 70 75 80Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ala Leu 85 90 95 Ala Ile Arg Leu Gly Ile Pro Arg Gly Glu Thr Glu Tyr Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 467 <211> 121 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 467 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gln Arg Gly Gly Met Arg His Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Leu Met Tyr Gly Val Asp Arg Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 468 <211> 127 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 468 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Ile 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Phe ValSer Ala
50Gly Arg65
Gln Met
Ala Val
Ala Tyr
<210><211><212><213><220><223><400>Glu Val1
Ser Leu
35
Ile Asn Ser Asn
Phe Thr Ile Ser70
Asn Ser Leu Lys85
Gln Ala Tyr Ser100
Asp Tyr Trp Gly115469126PRT
Desconhecido
40 45
Gly Asn Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys55 60
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
75 80
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
90 95
Ser Ser Ser Asp Tyr Tyr Ser Gln Glu Gly
105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser120 125
Camelideo469
Gln Leu Val Glu5
Arg Leu Ser Cys20
Gly Trp Phe Arg Gln Ala35
Leu Ser Gly Asp
Ile Asn
50Arg Phe65
Met Asp
Thr Ser
Tyr Ala
<210><211><212><213><220><223><4 00>Gln Val1
Ser Leu
Ala Met
Ala Arg
50Asn Tyr65
Ala Arg
Thr Ala
Pro Asp
<210><211><212><213><220><223>
Thr Ile Ser Arg70
Ser Leu Glu Pro85
Leu Tyr Pro Ser100
Asp Trp Gly Gln
115
470
126
PRT
Desconhecido
Camelideo
470
Lys Leu Glu Glu5
Arg Leu Ser Cys20
Gly Trp Tyr Arg35
Ile Thr Gly Thr
Ala Asp Ser Val70
Asn Thr Val Tyr85
Val Tyr Tyr Cys100
Tyr Trp Gly Gln115
471126PRT
DesconhecidoCamelideo
Ser Gly
Ala Val
Pro Gly
40Arg Thr55
Asp Asn
Giu Asp
Asn Leu
Gly Thr120
Gly Gly1.0Ser Gly25
Lys Glu
Asp Tyr
Pro Lys
Ser Ala90
Arg Tyr105
Gln Val
Leu Val
Arg Thr
Arg Glu
Ala Asp60
Asn Thr75
Val TyrTyr ThrThr Val
Gln
Phe
Phe
45
Ser
Val
Tyr
Leu
Ser125
Ala Gly
15Ser Ser30
Val Ala
Val Lys
Tyr Leu
Cys Ala95
Pro Gly110Ser
Gly
Met
Thr
Gly
Gln80Gly
Thr
Ser Gly
Ala Ala
Gln Ala
40Gly Thr55
Lys Gly
Leu Gln
Ala Ala
Gly Thr120
Gly Gly10Ser Gly25
Pro Gly
Gly Ile
Arg Phe
Met Asn90
Asp Arg105
Gln Val
Leu Val Gln
Ser Ile Phe
Lys Gln Arg45
Thr Gly Ala60
Thr Ile Ser75
Ser Leu Lys
Ser Arg Thr
Thr Val Ser125
Ala
Ser
30
Glu
Val
Arg
Pro
Ile110Ser
Gly Gly15
Ile Asn
Leu Val
Ser Thr
Asp Asn80
Glu Asp95
Val Val<400> 471
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Ser Ser Ala Gln Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Thr Phe Ser Gly Gly Pro Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Tyr Thr Arg Pro Gly Ser Met Trp Val Ser Ser Leu
100 105 110
Tyr Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 . 120 125
<210> 472<211> 123<212> PRT<213> Desconhecido<220>
<223> Camelideo<4 00> 472
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu His Thr Phe Arg Gly Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Thr Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Tyr Ser Tyr Arg Tyr Thr Thr Leu Asn Gln Tyr Asp Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 473<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 473
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys His
20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 474<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 474
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Arg His
20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 475
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 475
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Tyr His
20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 476
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 476
Asp Ile Gln Thr Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Arg Met Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 477
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 477
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Met Gln Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 478
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 478
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Gly Ser Gln Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Leu Gln Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<21Ü> 479
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 479
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Arg Gln
20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg
100 105
<210> 480
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 480
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Pro Tyr85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 481
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 481
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile His Arg Gln
20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Phe Ser Lys Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 482
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 482
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile Ala Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Ser Leu Gln Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ala Val Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 483<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 483
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Asp Thr Gly
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Val Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Gly Ser Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 484<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 484
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ile Gly Asp Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 485
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 485
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Leu Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg rhe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Val Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 486
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 486
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Val Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gln100 105
<210> 487
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 487
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val -Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 Tyr Arg Asn Ser Gln Leu Gln Ser Gly50 55 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 85 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 100 105<210> 488 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Consenso <220> <221> VARIANTE <222> 30, 31 <223> Xaa = Qualquer aminoácido <4 00> 488 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25Asn Met Ser 35 <210> 489 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 489 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 35 40 Ser Ser Ile Asp Phe Met Gly Pro His50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp65 70 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 85 Ala Lys Gly Arg Thr Ser Met Leu Pro 100 105Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 <210> 490 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 490 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 35 40 Ser Thr Ile Thr His Thr Gly Gly Val50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp65 70
Lys Ala Pro Lys Leu45
Val Pro Ser Arg Phe60
Thr Ile Ser Ser Leu75
Gln Thr Phe Ala Val90
Ile Lys Arg
Leu Ile
Ser Gly
Gln Pro80Pro Pro95
Gly Leu Val Gln Pro10
Gly Phe Thr Phe Xaa30
Gly Gly15
Xaa Tyr
Gly10Gly
Gly
Thr
Asn
Asp
90
Met
Ser
Leu Val
Phe Thr
Lys Gly
Tyr Tyr60
Ser Lys75
Thr AlaLys GlySer
Gln
Phe
Leu
45
Ala
Asn
Val
Lys
Pro
Ser
30
Glu
Asp
Thr
Tyr
Phe110
Gly Gly15
Lys Tyr
Trp Val
Ser Val
Leu Tyr80Tyr Cys95
Asp Tyr
Gly Leu Val Gln Pro10
Gly Phe Thr Phe Tyr30
Gly Lys Gly Leu Glu45
Thr Tyr Tyr Ala Asp60
Asn Ser Lys Asn Thr75
Gly Gly15
Asp Tyr
Trp Val
Ser Val
Leu Tyr80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr. Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asn Pro Ser Tyr Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 491 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 491 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Leu Pro Gly Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55. 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg' Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Thr Pro Asp Tyr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 492 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 492 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Lys Tyr 20 25 30 Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Leu Gly Glu Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Met Asp Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 493 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 493 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr 20 25 30 Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Leu Pro His Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 494
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 494
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Val Asn Ser Gly Val Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Asn Gln Ser Tyr His Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 495<211> 118<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 495
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ile Ser Asn Gly Lys Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Asp Trp Met Tyr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 496
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 496
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Pro Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Thr Tyr Arg Val Pro 95 ProThr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg <210> 497 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 497 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gln His Ile His 30 Arg GluLeu Arg Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu IleTyr Gln Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Lys Tyr Leu Pro Pro 95 TyrThr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg <210> 498 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 498 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gln His Ile His 30 Arg GluLeu Arg Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu IleTyr Gln Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Arg Tyr Arg Val Pro 95 TyrThr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg <210> 499 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 499 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gln Ser Ile Gly 30 Arg ArgLeu Lys Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Ala Ala Pro Arg 45 Leu Leu IleTyr Arg Thr Ser Trp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Thr Ser Gln Trp Pro 95 HisThr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg
<210> 500<211> 108<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 500
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile Tyr Lys Asn
20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ser Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser.Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 501
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 501
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Trp Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 502
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 502
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Tyr Lys Ser
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ser Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Gln Met Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 503
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 503
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Tyr Arg His20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His Asn Pro Pro Lys
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 504
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 504
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr. Phe Trp Pro Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Lys Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser115
<210> 505
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 505
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Asn Leu Glu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser115
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<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 506
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser ■ Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Leu Ser Asn Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 507 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 507 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lvs Val Val Lys Asp Asn Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 508 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 508 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Thr Gly Gly Lys Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 509 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 509 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Thr Gly Pro Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 510 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 510 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Thr /"· 1 - - VJJ. U Asn Arg Gly Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 511 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 511 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Asp Val Leu Lys Thr Gly Leu Asp Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 512 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 512 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Ala Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Met Ile Ser Ser Ser Gly Leu Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 ' 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Arg Leu Phe Pro Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1.5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
Ala Lys Gly Arg Gly Arg Phe Asn Val Leu Gln Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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115 120
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
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20 25 30
Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 516
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Lys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Val Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser115
<210> 517
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 517
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Ala Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Trp Gly Thr Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser115
<210> 518
<211> 115
<212> PRT
<213> Desconhecido
<220>
<223> Camelideo<400> 518
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr100 105 110
Val Ser Ser115
<210> 519
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<212> PRT
<213> Desconhecido
<220>
<223> Camelideo<400> 519
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr100 105 110
Val Ser Ser115
<210> 520
<211> 114
<212> PRT
<213> Desconhecido
<220>
<223> Camelideo<4 00> 520
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Asp Ser Gly Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Phe65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val100 105 110
Ser Ser
<210> 521
<211> 114
<212> PRT
<213> Desconhecido<220>
<223> Camelideo<400> 521
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ala Asp Gly Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Lys Met Leu Thr65 70 75 80
Leu Asp Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ala Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val100 105 110
Ser Ser
<210> 522
<211> 128
<212> PRT
<213> Desconhecido
<220>
<223> Camelideo<400> 522
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Thr Thr Phe Ser Ser Ala
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Ala Ile Lys Trp Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Thr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Asp Arg Tyr Arg Asp Arg Met Gly Pro Met Thr Thr
100 105 110
Thr Asp Phe Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 523<211> 124<212> PRT<213> Desconhecido<220>
<223> Camelideo<4 00> 523Gln Val Lys Leu Glu
1 5
Ser Leu Arg Leu Ser20
Ala Met Gly Trp Phe35
Ala Ser Ile Gly Ser50
Lys Gly Arg Phe Thr65
Leu Gln Met Asn Ser85
Ala Val Asn Arg Tyr100
Glu Ser Gly
Cys Ala Ala
Arg Gln Ala40
Ser Gly Ile55
Ile Ser Arg70
Leu Lys ProGly Ile Pro
Gly Gly Leu10
Ser Gly Arg25
Pro Gly Arg
Thr Thr Asn
Asp Asn Ala75
Glu Asp Thr90
Tyr Arg Ser105
Val Gln Thr
Thr Phe Ser30
Glu Arg Glu45
Tyr Ala Asp60
Lys Asn Thr
Gly Leu Cys
Gly Thr Gln110
Gly Gly15
Ser Phe
Phe Val
Ser Val
Val Tyr80Tyr Cys95
Tyr GlnAsn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 524 <211> 120 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <400> 524 Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Met Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ile Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Ala His Arg Gln Thr Val Val Arg Gly Pro Tyr Leu Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 525 <211> 123 <212> PRT <213> Desc onhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 525 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Lys Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ser Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Asn Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Thr Asn Leu Trp Pro Arg Asp Arg Asn Leu Tyr Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 526 <211> 125 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <400> 526 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Gly Ile Tyr 20 25 30 Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Arg Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Lys Asn Ala Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Asp Ser Ser Gly Arg Leu Tyr Trp Thr Leu Ser Thr Ser Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 527 <211> 125 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <400> 527 Gln Val Gln Leu Val Glu Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Gly Ile Tyr 20 25 30 Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Arg Tyr Ile Asp Ser Val50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Asp Ser Ser Gly Arg Leu Tyr Trp Thr Leu Ser Thr Ser Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 528 <211> 124 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <4 00> 528 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu 35 40 45 Ala Gly Val Thr Trp Ser Gly Ser Ser Thr Phe Tyr Gly Asp Ser Val50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Thr65 70 75 80Leu Glu Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Gly Leu Tyr Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 529 <211> 131 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <400> 529 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ala Trp
20 25 30
Pro Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
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Thr Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Pro Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ser Ser His Thr Phe Gly Ile Tyr Trp
100 105 110
Asn Leu Arg Asp Asp Tyr Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130<210> 530<211> 126<212> PRT<213> Desconhecido<220>
<223> Camelideo<4 00> 530
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp His Tyr
20 25 30
Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Thr Leu Glu Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Leu Leu Leu Arg Val Glu Glu Leu Gln Ala Ser Asp
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 531<211> 128<212> PRT<213> Desconhecido<220>
<223> Camelideo<400> 531
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Cys Ile Ser Asn Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
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<210> 532<211> 120
<212> PRT
<213> Desconhecido
<220>
<223> Camelideo
<400> 532
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Tyr Gly Leu Thr Phe Trp Arg Ala 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Val Ala Arg Asn Trp Gly Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Arg Thr Tyr Gly Sèr Ala Thr Tyr Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 533 <211> 123 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <400> 533 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Asp Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ala Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Arg Asn Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Ala Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Glu Trp Pro Phe Ser Thr Ile Pro Ser Gly Trp Arg Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 534 <211> 125 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Camelideo <400> 534 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Ala Ser Ser His 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 4 0 45 Val Gly Ile Asn Arg Gly Gly Val Thr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Ile Cys85 90
Ala Ala Arg Pro Glu Tyr Ser Phe Thr Ala Met
100 105
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120
<210> 535<211> 324<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 535
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat
atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt cctgagttaa
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat ggttccattt
cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca
gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgacgt
gggaccaagg tggaaatcaa acgg
<210> 536
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 536
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat
atcacttgcc gggcaagtca gtttattggg aaggagttac
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cagtccttgt
cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcattctca
gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag catatgtata
gggaccaagg tggaaatcaa acga
<210> 537
<211> 348
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 537
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc
tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat
cggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg
<210> 538
<211> 348
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 538
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc
tcctgcgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt
gcagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat
cggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg
<210> 539
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 539
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
1 5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
20 25
Pro Ile Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40
Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Glu Thr Tyr
50 55
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
95
Ser Lys Gly Asp Met110
Ser Ser125
ctgtaggagagttggtaccatgcaaagtggccatcagcagatcctccgac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300324
ccgtaggagagttggtatcatgcaaagtggccatcagcagggccttttac
ccgtgtcacc 60gcagaaacca 120ggtcccatca 180tctgcaacct 240gttcggccaa 300324
ctggggggtctaatgtgggtcgggttctgaattccaagaaattactgtgctctcgagc
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120gacatactac 180cacgctgtat 240gaaagatcct 300348
ctggggggtctaatgtgggtcgggttctcgattccaagaaattactgtgctctcgagc
cctgcgtctc 60ccgccaggct 120gacatactac 180cacgctgtat 240gaaagatcct 300348
Val Gln Pro Gly Gly15
Thr Phe Lys Ala Tyr30
Gly Leu Glu Trp Val45
Tyr Ala Asp Ser Val60
Lys Asn Thr Leu Tyr65 70
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala85
Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp100
Thr Val Ser Ser115
<210> 540
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 540
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala20
Pro Ile Met Trp Val Arg Gln Ala
35 40
Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser
50 55
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg65 70
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala85
Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp100
Thr Val Ser Ser115
75 80Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val105 110 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Δ S Glu Trp ValArg Thr Tyr Tyr lI ~J Ala Asp Ser Val 60 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val105 110

Claims (35)

1. Ligando que tem especificidade de ligação para o fator decrescimento endotelial vascular (VEGF) e receptor do fator epidérmico(EGFR), caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um domíniovariável único de imunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF epelo menos um domínio variável único de imunoglobulina com especificidadede ligação para EGFR, em que cada dito domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF compete quanto àligação ao VEGF com um anticorpo de domínio anti-VEGF (dAb)selecionada do grupo que consiste de TARl 5-6 (SEQ ID NO: 117), TARl5-8(SEQ ID NO: 119), TAR15-26 (SEQ ID NO: 123), TAR15-6-500 (SEQ IDNO: 127), TARl5-6-501 (SEQ ID NO: 128), TARl 5-6-502 (SEQ ID NO:- 129), TARl5-6-503 (SEQ ID NO: 130), TAR15-6-504 (SEQ ID NO: 131),TARl 5-6-505 (SEQ ID NO: 132), TAR15-6-506 (SEQ ID NO: 133), TAR15-- 6-507 (SEQ ID NO: 134), TARl5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TARl5-6-509(SEQ ID NO: 136), TAR15-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQID NO: 138), TAR15-8-501 (SEQ ID NO: 139), TAR15-8-502 (SEQ ID NO:- 140), TARl5-8-503 (SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142),TARl5-8-506 (SEQ ID NO: 143), TAR15-8-507 (SEQ ID NO: 144), TAR15-- 8-508 (SEQ ID NO: 145), TAR15-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510(SEQ ID NO: 147), TAR15-8-511 (SEQ ID NO: 148), TAR15-26-500 (SEQID NO: 149), TAR15-26-501 (SEQ ID NO: 150), TAR15-26-502 (SEQ IDNO: 151), TARl5-26-503 (SEQ ID NO: 152), TAR15-26-504 (SEQ ID NO:- 153), TARl 5-26-505 (SEQ ID NO: 154), TARl 5-26-506 (SEQ ID NO: 155),TARl5-26-507 (SEQ ID NO 156), TARl 5-26-508 (SEQ ID NO 157),TARl 5-26-509 (SEQ ID NO 158), TARl 5-26-510 (SEQ ED NO 159),TARl 5-26-511 (SEQ ID NO 160), TARl5-26-512 (SEQ ID NO 161),TARl 5-26-513 (SEQ ID NO 162), TARl 5-26-514 (SEQ ID NO 163),TARl5-26-515 (SEQ ID NO 164), TARl5-26-516 (SEQ ID NO 165),TARl 5-26-517 (SEQ ID NO: 166), TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167), TARl 5-26-519 (SEQ ID NO: 168), TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169), TARl 5-26-521 (SEQ ID NO: 170), TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171), TARl 5-26-523 (SEQ ID NO: 172), TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173), TARl 5-26-525 (SEQ ID NO: 174), TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175), TARl 5-26-527 (SEQ ID NO: 176), TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177), TARl 5-26-529 (SEQ ID NO: 178), TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179), TARl 5-26-531 (SEQ ID NO: 180), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181), TARl 5-26-533 (SEQ ID NO: 182), TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183), TARl 5-26-535 (SEQ ID NO: 184), TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185), TARl 5-26-537 (SEQ ID NO: 186), TARl 5-26-538 (SEQ ID NO: 187), TARl 5-26-539 (SEQ ID NO: 188), TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189), TARl 5-26-541 (SEQ ID NO: 190), TARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191), TARl 5-26-543 (SEQ ID NO: 192), TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 193), TARl 5-26-545 (SEQ ID NO: 194), TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195), TARl 5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TARl 5-26-548 (SEQ ID NO: 197),TARl5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TAR15-26-550 (SEQ ID NO: 539) eTARl5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
2. Ligando de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que cada dito domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para VEGF compreende uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência deaminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionado do grupoque consiste de TAR15-6 (SEQ ID NO: 1 17), TAR15-8 (SEQ ID NO: 119),TARl 5-26 (SEQ ID NO: 123), TARl 5-6-500 (SEQ ID NO: 127), TARl 5-6-- 501 (SEQ ID NO: 128), TAR15-6-502 (SEQ ID NO: 129), TAR15-6-503(SEQ ID NO: 130), TARl 5-6-504 (SEQ ID NO: 131), TARl5-6-505 (SEQID NO: 132), TAR15-6-506 (SEQ ID NO: 133), TAR15-6-507 (SEQ ID NO:- 134), TARl5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO: 136),TARl5-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQ ID NO: 138), TAR15-- 8-501 (SEQ ID NO: 139), TARl 5-8-502 (SEQ ID NO: 140), TARl 5-8-503(SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506 (SEQID NO: 143), TARl5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TARl5-8-508 (SEQ ID NO:- 145), TARl5-8-509 (SEQ ID NO: 146), TARl5-8-510 (SEQ ID NO: 147), TARl 5-8-511 (SEQ [D NO: 148), TARl 5-26-500 (SEQ ID NO: 149) TARl 5-26-501 (SEQ ID NO: 150), TARl 5-26-502 (SEQ ID NO: 151) TARl 5-26-503 (SEQ ID NO: 152), TARl 5-26-504 (SEQ ID NO: 153) TARl 5-26-505 (SEQ ID NO: 154), TARl 5-26-506 (SEQ ID NO: 155) TARl 5-26-507 (SEQ ID NO: 156), TARl 5-26-508 (SEQ ID NO: 157) TARl 5-26-509 (SEQ ID NO: 158), TARl 5-26-510 (SEQ ID NO: 159) TARl 5-26-511 (SEQ ID NO: 160), TARl 5-26-512 (SEQ ID NO: 161) TARl 5-26-513 (SEQ ID NO: 162), TARl 5-26-514 (SEQ ID NO: 163) TARl 5-26-515 (SEQ ID NO: 164), TARl 5-26-516 (SEQ ID NO: 165) TARl 5-26-517 (SEQ ID NO: 166), TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167) TARl 5-26-519 (SEQ ID NO: 168), TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169) TARl 5-26-521 (SEQ ID NO: 170), TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171) TARl 5-26-523 (SEQ ID NO: 172), TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173) TARl 5-26-525 (SEQ ID NO: 174), TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175) TARl 5-26-527 (SEQ ID NO: 176), TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177) TARl 5-26-529 (SEQ ID NO: 178), TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179) TARl 5-26-531 (SEQ ID NO: 180), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181) TARl 5-26-533 (SEQ ID NO: 182), TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183) TAR15-26-535 (SEQ ID NO: 184), TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185) TARl 5-26-537 (SEQ ID NO: 186), TAR15-26-538 (SEQ ID NO: 187) TARl 5-26-539 (SEQ ID NO: 188), TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189) TARl 5-26-541 (SEQ ID NO: 190), TARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191) TARl 5-26-543 (SEQ ID NO: 192), TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 193) TARl 5-26-545 (SEQ ID NO: 194), TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195)TARl5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TAR15-26-548 (SEQ ID NO: 197),TARl5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TARl 5-26-550 (SEQ ID NO: 539) eTARl 5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
3. Ligando de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que dito ligando inibe a ligação do fator decrescimento epidérmico (EGF) e/ou fator alfa de crescimento transformador(TGFalfa) ao EGFR.
4. Ligando de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o dito ligando inibe a atividade de EGFR.
5. Ligando de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o dito ligando inibe a atividade de EGFR seminibir substancialmente a ligação de fator de crescimento epidérmico (EGF)e/ou fator alfa de crescimento transformador (TGFalfa) ao EGFR.
6. Ligando de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o dito ligando inibe a ligação de VEGF aoreceptor do fator de crescimento endotelial vascular 1 (VEGFRl) e/oureceptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2).
7. Ligando de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o dito ligando inibe a atividade de VEGF.
8. Ligando de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o dito ligando inibe a atividade de VEGF seminibir substancialmente a ligação de VEGF ao receptor do fator decrescimento endotelial vascular 1 (VEGFRl) e/ou receptor do fator decrescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2).
9. Ligando de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que cada dito domínio variável único deimunoglobulina que especificidade de ligação para VEGF compete quanto àligação ao VEGF com bevacizumab.
10. Ligando de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que cada dito domínio variável único deimunoglobulina que tem especificidade de ligação para EGFR competequanto à ligação ao EGFR com cetuximab.
11. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 10, caracterizado pelo fato de que cada domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF liga VEGF comuma afinidade (KD) que está entre cerca de 100 nM e cerca de 1 pM, comodeterminado pela ressonância de plasma de superfície.
12. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 11, caracterizado pelo fato de que cada domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para EGFR liga EGFR comuma afinidade (KD) que está entre cerca de 100 nM e cerca de 1 pM, comodeterminado pela ressonância de plasma de superfície.
13. Ligando de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que cada domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR liga EGFR com uma afinidade (KD) queestá entre cerca de 10 nM e cerca de 100 pM, como determinado pelaressonância de plasma de superfície.
14. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesρ de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito ligando liga VEGF com umaafinidade (KD) que está entre cerca de 100 nM e cerca de 1 pM, comodeterminado pela ressonância de plasma de superfície.
15. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 10 e 14, caracterizado pelo fato de que o dito ligando liga EGFR comuma afinidade (KD) que está entre cerca de 100 nM e cerca de 1 pM, comodeterminado pela ressonância de plasma de superfície.
16. Ligando de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o dito ligando liga EGFR com uma afinidade (KD) que estáentre cerca de 10 nM e cerca de 100 pM, como determinado pela ressonânciade plasma de superfície.
17. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o dito ligando compreende umdomínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação paraVEGF que é um Vhh e/ou um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para EGFR que é um Vioi-
18. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variávelúnico de imunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF e umdomínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação para(φ EGFR que são independentemente selecionados do grupo que consiste de umVh humano e um Vl humano.
19. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o dito ligando é um formatoequivalente a IgG que compreende dois domínios variáveis únicos deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF e dois domíniosvariáveis únicos de imunoglobulina com especificidade de ligação paraEGFR.
20. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 19, caracterizado pelo fato de que dito ligando compreende uma regiãode anticorpo Fc.
21. Ligando que tem especificidade de ligação para o fator decrescimento endotelial vascular (VEGF), caracterizado pelo fato de quecompreende pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para VEGF, em que cada dito domínio variávelúnico de imunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF competequanto à ligação ao VEGF com um anticorpo de domínio anti-VEGF (dAb)selecionado do grupo que consiste de TARl5-6 (SEQ ID NO: 117), TARl5-8(SEQ ID NO: 119), TAR15-26 (SEQ ID NO: 123), TAR15-6-500 (SEQ IDNO: 127), TARl5-6-501 (SEQ ID NO: 128), TAR15-6-502 (SEQ ID NO:129), TARl 5-6-503 (SEQ ID NO: 130), TAR15-6-504 (SEQ ID NO: 131),TARl 5-6-505 (SEQ ID NO: 132), TARl5-6-506 (SEQ ID NO: 133), TARl5-6-507 (SEQ ID NO: 134), TARl 5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TARl 5-6-509(SEQ ID NO: 136), TAR15-6-510 (SEQ ID NO: 137), TAR15-8-500 (SEQID NO: 138), TAR15-8-501 (SEQ ID NO: 139), TAR15-8-502 (SEQ ID NO:140), TARl5-8-503 (SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142),TARl5-8-506 (SEQ ID NO: 143), TAR15-8-507 (SEQ ID NO: 144), TAR15-8-508 (SEQ ID NO: 145), TARl5-8-509 (SEQ ID NO: 146), TARl 5-8-510(SEQ ID NO: 147), TARl5-8-511 (SEQ ID NO: 148), TARl5-26-500 (SEQID NO: 149), TARl5-26-501 (SEQ ID NO: 150), TARl5-26-502 (SEQ IDNO: 151), TAR15-26-503 (SEQ ID NO: 152), TAR15-26-504 (SEQ ID NO:153), TARl5-26-505 (SEQ ID NO: 154), TAR15-26-506 (SEQ ID NO: 155)TARl 5-26-507 (SEQ ID NO: 156), TARl 5-26-508 (SEQ ID NO: 157)TARl 5-26-509 (SEQ ID NO: 158), TARl 5-26-510 (SEQ ID NO: 159)TARl 5-26-511 (SEQ ID NO: 160), TARl 5-26-512 (SEQ ID NO: 161)TARl 5-26-513 (SEQ ID NO: 162), TARl 5-26-514 (SEQ ID NO: 163)TARl 5-26-515 (SEQ ID NO: 164), TARl 5-26-516 (SEQ ID NO: 165)TARl 5-26-517 (SEQ ID NO: 166), TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167)TARl 5-26-519 (SEQ ID NO: 168), TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169)TARl 5-26-521 (SEQ ID NO: 170), TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171)TARl 5-26-523 (SEQ ID NO: 172), TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173)TARl 5-26-525 (SEQ ID NO: 174), TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175)TARl 5-26-527 (SEQ ID NO: 176), TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177)TARl 5-26-529 (SEQ ID NO: 178), TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179)TARl 5-26-531 (SEQ ID NO: 180), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181)TARl 5-26-533 (SEQ ID NO: 182), TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183)TARl 5-26-535 (SEQ ID NO: 184), TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185)TARl 5-26-537 (SEQ ID NO: 186), TARl 5-26-538 (SEQ ID NO: 187)TARl5-26-539 (SEQ ID NO: 188), TARl5-26-540 (SEQ ID NO: 189),TARl5-26-541 (SEQ ID NO: 190), TAR15-26-542 (SEQ ID NO: 191),TARl 5-26-543 (SEQ ID NO: 192), TAR15-26-544 (SEQ ID NO: 193),TARl 5-26-545 (SEQ ID NO: 194), TAR15-26-546 (SEQ ID NO: 195),TARl5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TAR15-26-548 (SEQ ID NO: 197),TARl 5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TARl5-26-550 (SEQ ID NO: 539) eTARl5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
22. Ligando de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que cada dito domínio variável único de imunoglobulina comespecificidade de ligação para VEGF compreende uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência deaminoácido com a seqüência de aminoácido de um dAb selecionada do grupoque consiste de TAR15-6 (SEQ ID NO: 117), TAR15-8 (SEQ ID NO: 119),TARl 5-26 (SEQ ID NO: 123), TAR15-6-500 (SEQ ID NO: 127), TAR15-6-- 501 (SEQ ID NO: 128), TAR15-6-502 (SEQ ID NO: 129), TAR15-6-503(SEQ ID NO: 130), TAR15-6-504 (SEQ ID NO: 131), TAR15-6-505 (SEQID NO: 132), TAR15-6-506 (SEQ ID NO: 133), TAR15-6-507 (SEQ ID NO:- 134), TARl5-6-508 (SEQ ID NO: 135), TAR15-6-509 (SEQ ID NO: 136),TARl5-6-510 (SEQ ID NO: 137), TARl5-8-500 (SEQ ID NO: 138),TAR15-- 8-501 (SEQ ID NO: 139), TARl5-8-502 (SEQ ID NO: 140), TARl 5-8-503(SEQ ID NO: 141), TAR15-8-505 (SEQ ID NO: 142), TAR15-8-506 (SEQID NO: 143), TARl5-8-507 (SEQ ID NO: 144), TARl5-8-508 (SEQ ID NO:- 145), TAR15-8-509 (SEQ ID NO: 146), TAR15-8-510 (SEQ ID NO: 147),TARl5-8-511 (SEQ ID NO: 148), TARl5-26-500 (SEQ ID NO: 149),TARl 5-26-501 (SEQ ID NO 150), TARl5-26-502 (SEQ ID NO: 151),TARl 5-26-503 (SEQ ID NO 152), TARl 5-26-504 (SEQ ID NO: 153),TARl 5-26-505 (SEQ ID NO 154), TARl5-26-506 (SEQ ID NO: 155),TARl 5-26-507 (SEQ ID NO 156), TARl 5-26-508 (SEQ ID NO: 157),TARl 5-26-509 (SEQ ID NO 158), TARl5-26-510 (SEQ ID NO: 159),TARl 5-26-511 (SEQ ID NO: 160), TARl 5-26-512 (SEQ ID NO: 161) TARl 5-26-513 (SEQ ID NO: 162), TARl 5-26-514 (SEQ ID NO: 163) TARl 5-26-515 (SEQ ID NO: 164), TARl 5-26-516 (SEQ ID NO: 165Ϊ / TARl 5-26-517 (SEQ ID NO: 166), TARl 5-26-518 (SEQ ID NO: 167) TARl 5-26-519 (SEQ ID NO: 168), TARl 5-26-520 (SEQ ID NO: 169) TARl 5-26-521 (SEQ ID NO: 170), TARl 5-26-522 (SEQ ID NO: 171) TARl 5-26-523 (SEQ ID NO: 172), TARl 5-26-524 (SEQ ID NO: 173) TARl 5-26-525 (SEQ ID NO: 174), TARl 5-26-526 (SEQ ID NO: 175) TARl 5-26-527 (SEQ ID NO: 176), TARl 5-26-528 (SEQ ID NO: 177) TARl 5-26-529 (SEQ ID NO: 178), TARl 5-26-530 (SEQ ID NO: 179) TARl 5-26-531 (SEQ ID NO: 180), TARl 5-26-532 (SEQ ID NO: 181) TARl 5-26-533 (SEQ ID NO: 182), TARl 5-26-534 (SEQ ID NO: 183) TARl 5-26-535 (SEQ ID NO: 184), TARl 5-26-536 (SEQ ID NO: 185) TARl 5-26-537 (SEQ ID NO: 186), TARl 5-26-538 (SEQ ID NO: 187) TARl 5-26-539 (SEQ ID NO: 188), TARl 5-26-540 (SEQ ID NO: 189) TARl 5-26-541 (SEQ ID NO: 190), TARl 5-26-542 (SEQ ID NO: 191) TARl 5-26-543 (SEQ ID NO: 192), TARl 5-26-544 (SEQ ID NO: 193) TARl 5-26-545 (SEQ ID NO: 194), TARl 5-26-546 (SEQ ID NO: 195) TARl 5-26-547 (SEQ ID NO: 196), TARl 5-26-548 (SEQ ID NO: 197)O TARl5-26-549 (SEQ ID NO: 198), TARl5-26-550 (SEQ ID NO: 539) eTARl5-26-551 (SEQ ID NO: 540).
23. Ligando de acordo com as reivindicações 21 ou 22,caracterizado pelo fato de que o dito ligando inibe a ligação de VEGF aoreceptor do fator de crescimento endotelial vascular 1 (VEGFRl) e/oureceptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGF2).
24. Ligando de acordo com as reivindicações 21 ou 22,caracterizado pelo fato de que o dito ligando inibe a atividade de VEGF.
25. Ligando de acordo com as reivindicações 21 ou 22,caracterizado pelo fato de que o dito ligando inibe a atividade de VEGF seminibir substancialmente a ligação de VEGF ao receptor do fator decrescimento endotelial vascular 1 (VEGFRl) e/ou receptor do fator decrescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2).
26. Ligando de acordo com as reivindicações 21 ou 22,caracterizado pelo fato de que cada dito domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF compete quanto àligação ao VEGF com bevacizumab.
27. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 21 a 26, caracterizado pelo fato de que cada dito domínio variável único deimunoglobulina com especificidade de ligação para VEGF liga VEGF comuma afinidade (KD) que está entre cerca de 100 nM e cerca de 1 pM, comodeterminado pela ressonância de plasma de superfície.
28. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 21 a 26, caracterizado pelo fato de que o dito ligando liga VEGF com umaafinidade (ND) que está entre cerca de 100 nM e cerca de 1 pM, comodeterminado pela ressonância de plasma de superfície.
29. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 21 a 28, caracterizado pelo fato de que o dito ligando compreende umdomínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação paraVEGF que é um Vhh-
30. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 21 a 28, caracterizado pelo fato de que o dito ligando compreende umdomínio variável único de imunoglobulina com especificidade de ligação paraVEGF que é selecionado do grupo que consiste de um Vh humano e um Vlhumano.
31. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 21 a 30, caracterizado pelo fato de que o dito ligando é um monômerod Ab.
32. Ligando de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 31, caracterizado pelo fato de que é para o uso em terapia oudiagnóstico.
33. Uso do ligando como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 31, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deuma droga para tratar câncer.
34. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeum ligando como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 31 eum carreador fisiologicamente aceitável.
35. Dispositivo de dispensação de droga, caracterizado pelo fatode que compreende a composição como definida na reivindicação 34.
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