BRPI0707300A2 - composição imunogênica, método para preparação da mesma e ensaio imunológico para análise de uma vacina contra influenza - Google Patents

composição imunogênica, método para preparação da mesma e ensaio imunológico para análise de uma vacina contra influenza Download PDF

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Abstract

COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, MéTODO PARA PREPARAçãO DA MESMA E ENSAIO IMUNOLóGICO PARA ANáLISE DE UMA VACINA CONTRA INFLUENZA. Uma composição imunogênica que compreende hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza. Estas podem ser de vírus influenza desenvolvidos em cultura de células, e não em ovos. A proteína da matriz pode ser um fragmento de uma proteína da matriz viral de comprimento total, por exemplo, um fragmento Ml da matriz, com um peso molecular de menos de 20 kDa. A composição pode ser uma vacina de subunidade que compreende glicoproteinas de superfície purificadas.

Description

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DA MESMA EENSAIO IMUNOLÓGICO PARA ANÁLISE DE UMA VACINA CONTRAINFLUENZA
Todos os documentos aqui citados são incorporados porreferência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
Essa invenção está no campo das vacinas para aproteção contra infecção pelo vírus influenza e, emparticular, vacinas que incluem proteínas da matriz.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
Várias formas de vacinas contra o vírus influenzaestão disponíveis atualmente (por exemplo, veja oscapítulos 17 & 18 da referência 1) . Vacinas são geralmentebaseadas em vírus vivo ou em vírus inativado. Vacinasinativadas podem se basear em vírions inteiros, vírions"divididos" (split) ou em antígenos de superfíciepurificados.
A hemaglutinina (HA) é o principal imunógeno emvacinas inativadas de influenza, e as doses de vacina sãopadronizadas por referência aos níveis de HA, tipicamentemedidas por um ensaio de imunodifusão radial simples(SRID). As vacinas atuais tipicamente contêm cerca de 15 pgde HA por cepa por dose. Além de conter HA de influenza, asvacinas podem ainda incluir proteínas do vírus influenza.
Por exemplo, todas as vacinas atuais incluem neuraminidase(NA). A referência 2 relata que as vacinas contra influenzaeuropéias também podem incluir quantidades significativasde outras proteínas do vírus influenza. Por exemplo, aproteína da matriz (M) foi encontrada em vacinas divididas,mas não em vacinas de antígeno de superfície purificado.Além dos antígenos do vírus influenza, a referência 2relata que as vacinas também contêm proteínas derivadas doovo, por exemplo, ovalbumina. Essas proteínas surgem porqueo método-padrão para o crescimento do vírus influenza nafabricação de vacinas utiliza ovos de galinha embrionados,com o vírus sendo purificado do conteúdo do ovo (fluidoalantóico).
REVELAÇÃO DA INVENÇÃO
Ao invés de utilizar ovos para o crescimento viral nafabricação de vacinas, foi proposto que os vírus cresçam emcultura de células. Durante a investigação dessa técnica,os inventores detectaram inesperadamente seqüências damatriz. Em particular, enquanto a referência 2 nãoencontrou proteína da matriz em vacinas de antígeno desuperfície purificado preparadas a partir de vírionsdesenvolvidos em ovos, os inventores detectaram proteína damatriz em vacinas de antígeno de superfície purificadopreparadas a partir de vírions desenvolvidos em cultura decélulas.
Dessa forma, a invenção fornece uma composiçãoimunogênica que compreende hemaglutinina e proteínas damatriz do vírus influenza, preparada a partir de vírusdesenvolvido em cultura de células.
A invenção também fornece uma composição imunogênicaque compreende hemaglutinina e proteínas da matriz do vírusinfluenza, em que a composição não contém ovalbumina. Acomposição também pode ser livre de outras proteínas do ovo(por exemplo, ovomucóide) e de DNA de galinha.
A invenção também fornece um método para a preparaçãode uma composição imunogênica que compreende as etapas de:(i) crescimento do vírus influenza em cultura de células;
(ii) preparação de uma composição de antígeno a partir devírus desenvolvidos na etapa (i) , em que a composição deantígeno compreende hemaglutinina e proteínas da matriz; e
(iii) combinação da composição de antígeno com um veículofarmacêutico, para gerar a composição imunogênica.
Uma proteína da matriz em particular que foi observadaé um fragmento de Ml. A proteína Ml de comprimento total éuma proteína de 27,8 kDa, mas o fragmento observado possuium peso molecular de cerca de 5 kDa em um gel de SDS-PAGEde baixo peso molecular (veja abaixo). Ele inclui umaseqüência de aminoácidos altamente conservada LSYSXGALA(ID. DE SEQ. N°: 1), em que X é A ou T. Dessa forma, ainvenção fornece uma composição imunogênica que compreendehemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, emque: a proteína da matriz possui um peso molecular de menosde 2 0 kDa e compreende uma seqüência de aminoácidos quepossui pelo menos 50% de identidade (por exemplo, pelomenos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais) para o ID. DESEQ. N°: 1. Outro fragmento de Ml que foi observado possuicomprimento em torno de 75 aa e é desprovido da metioninado terminal N da seqüência total de Ml (por exemplo, elepossui a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 28 ouID. DE SEQ. N°: 29) . Dessa forma, a invenção fornece umacomposição imunogênica que compreende hemaglutinina eproteínas da matriz do vírus influenza, em que a proteínada matriz é uma proteína Ml desprovida da metionina doterminal N da seqüência de Ml natural. A proteína da matrizpode compreender uma seqüência de aminoácidos que possuipelo menos 50% de identidade (por exemplo, pelo menos 60%,70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais) para o ID. DE SEQ. N°: 28ou para o ID. DE SEQ. N°: 29. Além de não possuir ametionina do terminal Ν, o fragmento pode ser desprovido deum ou mais aminoácidos adicionais abaixo da metionina doterminal N.
Embora essas composições sejam preparadaspreferivelmente a partir de vírus desenvolvido em culturade células, elas podem alternativamente ser preparadas deoutras formas, por exemplo, por adição da proteína damatriz e uma vacina derivada do ovo, com a utilização de umprotocolo de purificação com vírions derivados do ovo, oque resulta na produção e presença da proteína da matriz,por combinação da proteína da matriz com uma HA expressa deforma recombinante (e, opcionalmente, outras proteínasexpressas de forma recombinante) etc.
Preparação de componentes antigênicos
A invenção não utiliza um antígeno de vírion inteiro(WV) , ou seja, ela não engloba vacinas que utilizam umvírus vivo ou um vírion inativado inteiro. Em vez disso, osantígenos da invenção são antígenos não-WV, por exemplo,vírions divididos ou antígenos de superfície purificados.As composições da invenção compreendem pelo menos doisantígenos do vírus influenza: hemaglutinina e matriz. Elastambém podem incluir outro(s) antígeno(s) do vírusinfluenza, por exemplo, neuraminidase. Os antígenostipicamente serão preparados a partir de vírions influenza(preferivelmente crescidos em cultura de células), mas, emalgumas modalidades, os antígenos podem ser expressos em umhospedeiro recombinante (por exemplo, em uma linhagem decélulas de inseto com o uso de um vetor de baculovírus) eusados na forma purificada [3,4] . Em geral, no entanto, osantígenos serão de vírions.
Na preparação de antígenos não-WV a partir de vírions,os vírions podem ser inativados. Meios químicos para ainativação dé um vírus incluem o tratamento com umaquantidade eficaz de um ou mais dos seguintes agentes:detergentes, formaldeído, β-propiolactona, azul demetileno, psoraleno, carboxifulereno (C60), etilaminabinária, acetil etilenoimina, ou combinações destes.Métodos não químicos de inativação viral são conhecidos natécnica como, por exemplo, luz UV ou irradiação gama.
Os vírions podem ser coletados de líquidos que contêmvírus por vários métodos. Por exemplo, um processo depurificação pode envolver a centrifugação por zona com ouso de uma solução de gradiente linear de sacarose queinclui detergente para romper os vírions. Os antígenospodem então ser purificados, após diluição opcional, pordiafiltração.
Vírions divididos podem ser obtidos por tratamento devírions purificados com detergentes (por exemplo, éteretílico, polissorbato 80, desoxicolato, tri-N-butilfosfato, Triton X-100, Triton NlOl, brometo decetiltrimetilamônio, Tergitol NP9 etc.) para a produção depreparações sub-vírion, incluindo o processo de divisão"Tween-éter". Métodos de divisão dos vírus influenza sãobem conhecidos na técnica, por exemplo, veja as referências5-10 etc. A divisão do vírus é tipicamente realizada porruptura ou fragmentação de vírus inteiros, sejam elesinfecciosos ou não infecciosos, com uma concentração deruptura de um agente de divisão. A ruptura resulta em umasolubilização total ou parcial das proteínas virais,alterando a integridade do vírus. Agentes de divisãopreferidos são tensoativos não iônicos e iônicos (porexemplo, catiônicos), por exemplo, alquilglicosídeos,alquiltioglicosídeos, acil açúcares, sulfobetaínas,betaínas, polioxietilenoalquiléteres, N,N-dialquil-Glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanóis,compostos de amônio quaternário, sarcosil, CTABs (brometosde cetil trimetil amônio), tri-N-butil fosfato, Cetavlon,sais de mirisitiltrimetilamônio, lipofectina, lipofectaminae DOT-MA, os octil- ou nonilfenoxi polioxietanóis (porexemplo, os tensoativos Triton, por exemplo, Triton X-IOOou Triton NlOl), ésteres de polioxietileno sorbitano (ostensoativos Tween), éteres de polioxietileno, ésteres depolioxietileno etc. Um procedimento de divisão útil utilizaos efeitos consecutivos de desoxicolato de sódio eformaldeído, e a divisão ocorre durante a purificaçãoinicial do vírion (por exemplo, em uma solução de gradientede densidade de sacarose). Dessa forma, um processo dedivisão pode envolver a clarificação do material que contémo vírion (para a remoção de material não-vírion),concentração dos vírions coletados (por exemplo, com o usode um método de adsorção, por exemplo, adsorção de CaHPO4),separação de vírions inteiros do material não-vírion,divisão do vírions com o uso de um agente de divisão em umaetapa de centrifugação por gradiente de densidade (porexemplo, com o uso de um gradiente de sacarose que contémum agente de divisão, por exemplo, desoxicolato de sódio),e depois filtração (por exemplo, ultrafiltração) pararemoção de materiais indesejados. Os vírions divididospodem ser proveitosamente re-suspensos em solução isotônicade cloreto de sódio tamponada com fosfato. Os produtosBEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ e FLUSHIELD™ são vacinasdivididas.
Vacinas de antigeno de superfície purificadocompreendem os antigenos de superfície de influenza,hemaglutinina e, tipicamente, também neuraminidase.Processos para a preparação dessas proteínas na formapurificada são bem conhecidos na técnica. Os produtosFLUVIRIN™, AGRIPPAL™ e INFLUVAC™ são vacinas desubunidades.
Os antigenos de influenza também podem serapresentados na forma de virossomas [11] (partículaslipossômicas sem ácido nucléico viral-like) , como nosprodutos INFLEXAL V™ e INVAVAC™, mas prefere-se não usarvirossomas com a presente invenção. Dessa forma, em algumasmodalidades, o antigeno de influenza não está na forma deum virossoma.
0 vírus influenza pode ser atenuado. 0 vírus influenzapode ser sensível à temperatura. 0 vírus influenza pode seradaptado ao frio. Essas três características sãoparticularmente úteis guando se utiliza vírus vivo comoantigeno.
As cepas do vírus influenza para uso em vacinas mudamde estação para estação. No atual período interpandêmico,as vacinas tipicamente incluem duas cepas de influenza A(H1N1 e H3N2) e uma cepa de influenza B, e as vacinastrivalentes são típicas. A invenção também pode utilizar HAde cepas pandêmicas (ou seja, cepas para as quais oreceptor da vacina e a população humana geral sãoimunologicamente virgens), por exemplo, cepas dos subtiposH2, H5, H7 ou H9 (em particular, do vírus influenza A), eas vacinas contra influenza para cepas pandêmicas podem sermonovalentes ou podem ser baseadas em uma vacina trivalentenormal suplementada por uma cepa pandêmica. Dependendo daestação e da natureza do antígeno incluído na vacina, noentanto, a invenção pode proteger contra um ou mais dossubtipos HA do vírus influenza A Hl, H2, H3, H4, H5, H6,H7, H8, H9, HlO, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16. A invençãopode proteger contra um ou mais dos vírus subtipos NA deinfluenza A Nl, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 ou N9.
Além de serem adequadas à imunização contra cepasinterpandêmicas, as composições da invenção sãoparticularmente úteis para a imunização contra cepaspandêmicas. As características de uma cepa de influenza quegeram o potencial para causar um surto pandêmico são: (a)ela contém uma nova hemaglutinina, comparada com ashemaglutininas em cepas humanas que circulam atualmente, ouseja, uma que não era evidente na população humana por maisde uma década (por exemplo, H2) , ou que não havia sidoobservada previamente de forma alguma na população humana(por exemplo, H5, H6 ou H9, que geralmente só eramencontradas em populações de pássaros), de tal forma que apopulação humana será imunologicamente virgem para ahemaglutinina da cepa; (b) ela é capaz de ser transmitidahorizontalmente na população humana; e (c) ela é patogênicapara seres humanos. Um vírus com o tipo H5 de hemaglutininaé preferido para a imunização contra influenza pandêmica,por exemplo, uma cepa H5N1. Outras cepas possíveis incluemH5N3, H9N2, H2N2, H7N1 e H7N7, e quaisquer outras cepaspandêmicas que potencialmente venham a surgir. Dentro dosubtipo H5, um vírus pode se classificar em HA ciado 1, HAciado 1', HA ciado 2 ou HA ciado 3 [12] , com os ciados 1 e3 sendo particularmente relevantes.
Outras cepas cujos antígenos podem ser proveitosamenteincluídos nas composições são cepas que são resistentes àterapia antiviral (por exemplo, resistentes ao oseltamivir[13] e/ou zanamivir), incluindo cepas pandêmicasresistentes [14] .
As composições da invenção podem incluir antígeno(s)de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) cepas dovírus influenza, incluindo vírus influenza A e/ou vírusinfluenza B. As vacinas monovalentes não são preferidas, equando uma vacina incluir mais de uma cepa de influenza, asdiferentes cepas são tipicamente desenvolvidasseparadamente e são misturadas após os vírus terem sidocoletados e os antígenos terem sido preparados. Dessaforma, um processo da invenção pode incluir a etapa demistura de antígenos de mais de uma cepa de influenza.
Prefere-se uma vacina trivalente, que inclui antígenos deduas cepas do vírus influenza A e uma cepa do vírusinfluenza B.
Em algumas modalidades da invenção, as composiçõespodem incluir antígeno de uma única cepa influenza A. Emalgumas modalidades, as composições podem incluir antígenode duas cepas de influenza A, desde que essas duas cepasnão sejam HlNl e H3N2. Em algumas modalidades, ascomposições podem incluir antígeno de mais de duas cepas deinfluenza A.
O vírus influenza pode ser uma cepa recombinante(reassortant) , e pode ter sido obtido por técnicas degenética reversa. Técnicas de genética reversa [porexemplo, 15-19] permitem que sejam preparados vírusinfluenza com segmentos genômicos desejados in vitro com ouso de plasmídeos. Tipicamente, elas envolvem a expressãode: (a) moléculas de DNA que codificam as moléculas de RNAviral desejadas, por exemplo, de promotores poli, e (b)moléculas de DNA que codificam proteínas virais, porexemplo, de promotores polll, de forma que a expressão deambos os tipos de DNA na célula leve à montagem de umvírion infeccioso intacto completo. 0 DNA preferivelmentefornece todo o RNA e todas as proteínas virais, mas tambémé possível usar um vírus auxiliar (helper) para forneceruma parte do RNA e das proteínas. Métodos baseados emplasmídeos que utilizam plasmídeos separados para aprodução de cada RNA viral são preferidos [20-22] , e essesmétodos também envolverão o uso de plasmídeos para aexpressar de todas ou algumas (por exemplo, somente asproteínas PBl, PB2, PA e NP) das proteínas virais, com 12plasmídeos sendo usados em alguns métodos.
Para reduzir o número de plasmídeos necessários, umaabordagem recente [23] combina diversos cassetes detranscrição de RNA polimerase I (para a síntese de RNAviral) no mesmo plasmídeo (por exemplo, seqüências quecodificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 segmentos demRNA de influenza A) , e diversas regiões que codificamproteína com promotores de RNA polimerase II no outroplasmídeo (por exemplo, seqüências que codificam 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 ou todos os 8 transcritos de mRNA de influenza
A) . Aspectos preferidos do método da referência 23envolvem: (a) regiões de codificação de mRNA PBl, PB2 e PAem um único plasmídeo; e (b) todos os 8 segmentos quecodificam vRNA em um único plasmídeo. A inclusão dossegmentos de NA e HA em um plasmídeo e dos seis outrossegmentos no outro plasmídeo também pode facilitar oprocesso.
Como alternativa ao uso dos promotores poli paracodificar os segmentos de RNA viral, é possível usarpromotores de bacteriófago polimerase [24] . Por exemplo,promotores para as SP6, T3 ou T7 polimerases podemconvenientemente ser usados. Por causa da especificidadepor espécie dos promotores poli, os promotores debacteriófago polimerase podem ser mais convenientes paramuitos tipos de células (por exemplo, MDCK), embora umacélula também tenha que ser transfectada com um plasmídeoque codifica a enzima polimerase exógena.
Em outras técnicas é possível usar promotores duplospoli e polll para codificar simultaneamente RNAs virais epara mRNAs passíveis de expressão a partir de um únicomodelo [25,26] .
Dessa forma, um vírus influenza A pode incluir um oumais segmentos de RNA de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6segmentos de A/PR/8/34, com os segmentos HA e N sendo deuma cepa da vacina, ou seja, uma recombinante 6:2) . Eletambém pode incluir um ou mais segmentos de RNA de um vírusA/WSN/33, ou de qualquer outra cepa do vírus útil para ageração de vírus recombinante para a preparação da vacina.Tipicamente, a invenção protege contra uma cepa que é capazde transmissão de ser humano para ser humano e, dessaforma, o genoma da cepa normalmente incluirá pelo menos umsegmento de RNA que se originou em um vírus influenzamamífero (por exemplo, em um ser humano). Ele pode incluirsegmento NS que se originou em um vírus influenza aviário.
Os vírus usados como fonte dos antígenos sãogeralmente desenvolvidos em cultura de células, mas, emalgumas modalidades, eles podem se desenvolver em ovos. 0método-padrão atual para o crescimento do vírus influenzautiliza ovos de galinha embrionados específicos, livres depatógenos (SPF), com o vírus sendo purificado do conteúdodo ovo (fluido alantóico). Mais recentemente, no entanto,foram desenvolvidos vírus em cultura de células animais e,por razões de velocidade e alergias de pacientes, essemétodo de crescimento é preferido. Caso seja usado ocrescimento viral baseado no ovo, um ou mais aminoácidospoderão ser introduzidos no fluido alantóico do ovo, juntocom o vírus [10].
0 substrato celular tipicamente será uma linhagem decélulas de origem mamífera. Células de origem mamíferaadequadas incluem, sem limitação, células de hamster, gado,primatas (incluindo seres humanos e macacos) e cachorros.Vários tipos de células podem ser usados, por exemplo,células renais, fibroblastos, células retinianas, célulasdo pulmão etc. Exemplos de células de hamster adequadas sãoas linhagens de células que possuem os nomes BHK21 ou HKCC.Células de macaco adequadas são, por exemplo, células demacaco verde africano, por exemplo, células renais, como nalinhagem de células Vero. Células de cachorro adequadassão, por exemplo, células renais, como na linhagem decélulas MDCK. Dessa forma, linhagens de células adequadasincluem, sem limitação: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5;PER.C6; WI-38 etc. O uso de células mamíferas significa queas vacinas podem ser livres de DNA de galinha, além deserem livres de proteínas do ovo (por exemplo, ovalbumina eovomucóide) reduzindo, dessa forma, a alergenicidade.
Linhagens de células mamíferas preferidas para ocrescimento de vírus influenza incluem: células MDCK [27-3 0], derivadas do rim canino Madin Darby; células Vero [31-33], derivadas do rim de macaco verde africano(Cercopithecus aethiops); ou células PER.C6 [34], derivadasde retinoblastos embriônicos humanos. Essas linhagens decélulas são amplamente disponíveis, por exemplo, da coleçãoda "American Type Cell Culture" (ATCC) [35] , dos "CoriellCell Repositories" [36], ou da "European Collection of CellCultures" (ECACC). Por exemplo, a ATCC fornece váriascélulas Vero diferentes sob os números de catálogo CCL-81,CCL-81.2, CRL-1586 e CRL-1587, e fornece células MDCK sob onúmero de catálogo CCL-34. PER.C6 é disponível pelo ECACCsob o número de depósito 96022940. Como alternativa menospreferida às linhagens de células mamíferas, os vírus podemcrescer em linhagens de células aviárias [por exemplo,referências 37-39], incluindo linhagens de célulasderivadas de patos (por exemplo, retina de pato) ougalinhas. Exemplos de linhagens de células aviárias incluemcélulas-tronco embriônicas aviárias [37,40] e células da25 retina de pato [38] . Células-tronco embriônicas aviáriasadequadas incluem a linhagem de células EBx derivadas decélulas-tronco embriônicas de galinhas, EB45, EB14 e EB14-074 [41] . Fibroblastos de embrião de galinha (CEF) tambémpodem ser usados.
As linhagens de células mais preferidas para ocrescimento de vírus influenza são linhagens de célulasMDCK. A linhagem de células MDCK original é disponível pelaATCC como CCL-34, mas derivados dessa linhagem de célulastambém podem ser usados. Por exemplo, a referência 27revela uma linhagem de células MDCK que foi adaptada para ocrescimento em cultura de suspensão ("MDCK 33016",depositada como DSM ACC 2219). Similarmente, a referência42 revela uma linhagem de células derivada de MDCK quecresce em suspensão em cultura sem soro ("B-702",depositada como FERM BP-7449). A referência 43 revelacélulas MDCK não tumorigênicas, incluindo "MDCK-S" (ATCCPTA-6500) , "MDCK-SF101" (ATCC PTA-6501) , "MDCK-SF102" (ATCCPTA-6502) e "MDCK-SF103" (PTA-6503). A referência 44 revelalinhagens de células MDCK com suscetibilidade elevada àinfecção, incluindo células "MDCK.5Fl" (ATCC CRL-12042).Qualquer uma dessas linhagens de células MDCK pode serusada.
A cultura para o crescimento celular e também oinóculo viral usado para iniciar a cultura serãopreferivelmente isentos de (ou seja, serão testados econsiderados negativos para contaminação por) vírus doherpes simples, vírus sincicial respiratório, vírusparainfluenza 3, coronavírus da SARS, adenovírus,rinovírus, reovírus, vírus do polioma, birnavírus,circovírus e/ou parvovírus [45] . A ausência de vírus doherpes simples é particularmente preferida.
Os vírus podem crescer em células em suspensão [46] ouem cultura aderente. Em uma modalidade, as células podemser adaptadas para crescimento em suspensão. Uma linhagemde células MDCK adequada que está adaptada ao crescimentoem cultura de suspensão é MDCK 33 016 (depositada como DSMACC 2219) . Como alternativa, pode ser usada cultura demicrocarregadores (microcarrier).
As linhagens celulares que apoiam a replicação dovírus influenza crescem preferivelmente em meios de culturalivres de soro e/ou em meios livres de proteínas. Um meio éconsiderado um meio livre de soro no contexto da presenteinvenção quando não há aditivos do soro de origem humana ouanimal. O termo "livre de proteína" visa significarculturas nas quais a multiplicação das células ocorre comexclusão de proteínas, fatores de crescimento, outrosaditivos protéicos e proteínas não séricas, mas podemopcionalmente incluir proteínas como, por exemplo, tripsinaou outras proteases que podem ser necessárias para ocrescimento viral. As células que crescem nestas culturasnaturalmente contêm as próprias proteínas.
As linhagens celulares que apoiam a replicação dovírus influenza crescem preferivelmente abaixo de 37°C [47](por exemplo, 30-360C) durante a replicação viral.
0 método para a propagação do vírus em célulascultivadas geralmente inclui as etapas de inoculação dascélulas cultivadas com a cepa a ser cultivada, o cultivodas células infectadas por um período de tempo desejadopara a propagação do vírus como, por exemplo, comodeterminado pela titulação do vírus ou expressão doantígeno (por exemplo, entre 24 e 168 horas após ainoculação) e coleta do vírus propagado. As célulascultivadas são inoculadas com uma proporção de vírus(medido por PFU ou TCID50) para células de 1:500 a 1:1,preferivelmente 1:100 a 1:5, mais preferivelmente 1:50 a1:10. O vírus é adicionado a uma suspensão das células ou éaplicado a uma monocamada das células, e o vírus éabsorvido sobre as células por pelo menos 60 minutos, masnormalmente menos de 300 minutos, preferivelmente entre 90e 240 minutos a 25°C a 40°C, preferivelmente 28°C a 37°C. Acultura de células infectadas (por exemplo, monocamadas)pode ser removida por congelamento-descongelamento ou poração enzimática para aumentar o teor viral dossobrenadantes da cultura coletados. Os líquidos coletadossão então inativados ou armazenados congelados. As célulascultivadas podem ser infectadas em uma multiplicidade deinfecção ("m.o.i.") de cerca de 0,0001 a 10,preferivelmente 0,002 a 5, mais preferivelmente até 0,001 a2. Ainda mais preferivelmente, as células são infectadas emuma m.o.i de cerca de 0,01. As células infectadas podem sercoletadas 30 a 60 horas após a infecção. De preferência, ascélulas são coletadas 34 a 48 horas após a infecção. Aindamais preferivelmente, as células são coletadas 38 a 40horas após a infecção. Proteases (tipicamente tripsina) sãogeralmente adicionadas durante a cultura de células parapermitir a liberação viral, e as proteases podem seradicionadas em qualquer estágio adequado durante a cultura.
HA é o principal imunógeno nas vacinas inativadas deinfluenza atuais, e as doses da vacina são padronizadas porreferência aos níveis de HA, medidos tipicamente por SRID.As vacinas existentes tipicamente contêm cerca de 15 pg deHA por cepa, embora possam ser usadas doses menores, porexemplo, para crianças ou em situações pandêmicas, ouquando se utiliza um adjuvante. Doses fracionadas, porexemplo, 1/2 (ou seja, 7,5 pg de HA por cepa) , 1/4 e 1/8foram usadas [89,90], bem como doses maiores (por exemplo,doses de 3x ou 9x [48,49]). Dessa forma, as vacinas podemincluir entre 0,1 e 150 pg de HA por cepa de influenza,preferivelmente entre 0,1 e 50 pg, por exemplo, 0,1-20 pg,0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg etc. Dosesespecificas incluem, por exemplo, cerca de 45, cerca de 30,cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, cercade 3,8, cerca de 1,9, cerca de 1,5 etc. por cepa.
Para vacinas vivas, a dosagem é medida por doseinfecciosa média para cultura de tecido (TCID50) , e nãopelo teor de HA, e uma TCID50 entre IO6 e IO8(preferivelmente entre 106,5-107,5) por cepa é típica.
A HA usada com a invenção pode ser uma HA natural comoencontrada em um vírus, ou pode ter sido modificada. Porexemplo, é conhecida a modificação da HA para a remoção dedeterminantes (por exemplo, regiões hiper-básicas em tornodo sít io de clivagem entre HAl e HA2), o que faz com que umvírus seja altamente patogênico em espécies aviárias, namedida em que esses determinantes podem, de outro modo,evitar que um vírus cresça em ovos.
A proteína da matriz
Além de incluir hemaglutinina, as composições dainvenção incluem uma proteína da matriz. O segmento 7 dovírus influenza A codifica os polipeptídeos Ml e M2. Mlestá abaixo da bicamada lipídica viral, enquanto M2 é umaproteína integral da membrana que fornece um canal de íonque é inibido por amantadina. M2 é expressa por um mRNAspliced. O segmento 7 do vírus influenza B codifica ospolipeptídeos Ml e BM2.
A proteína da matriz incluída em composições dainvenção é tipicamente uma proteína Ml de um vírusinfluenza A. A seqüência de comprimento total de 252 aa deMl do vírus influenza A PR/8/34 está disponível nas basesde dados sob GI: 138817, que é o ID. DE SEQ. N°: 2apresentado abaixo:
MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQHRREVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKLKREITFHGAKEISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVAS QARQMVQAMRTIGTHPS S SAGLKNDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK
A proteína da matriz incluída em composições dainvenção preferivelmente compreende uma seqüência deaminoácidos de Ml que tem comprimento de pelo menos maminoácidos, em que os referidos m aminoácidos possuem pelomenos 11% de identidade para o ID. DE SEQ. N°: 2. Os maminoácidos incluirão tipicamente um fragmento de pelomenos ρ aminoácidos consecutivos do ID. DE SEQ. N°: 2.
0 valor de m pode ser, por exemplo, 7, 8, 9, 10, 12,14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100ou mais. O valor de η pode ser, por exemplo, 70 (porexemplo, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99ou mais) . O valor de ρ pode ser, por exemplo, 5, 6, 7, 8,9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70,80, 90, 100 ou mais. Quando η < 100, ρ será menor do que m.
A seqüência de m aminoácidos pode, comparada com o ID.DE SEQ. N° : 2, incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) substituições de aminoácidosconservadoras, ou seja, substituições de um aminoácido comoutro que tenha uma cadeia lateral relacionada. Osaminoácidos codificados geneticamente são geralmentedivididos em quatro famílias: (1) ácidos, ou seja,aspartato, glutamato; (2) básicos, ou seja, lisina,arginina, histidina; (3) não polares, ou seja, alanina,valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,metionina, triptofano; e (4) polares não carregados, ouseja, glicina, asparagina, glutaraina, cisteína, serina,treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosinaalgumas vezes são classificados em conjunto comoaminoácidos aromáticos. Em geral, a substituição deaminoácidos únicos dentro dessas famílias não tem um efeitoimportante sobre a atividade biológica. Os m aminoácidostambém podem incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) eliminações de um único aminoácidoem relação ao ID. DE SEQ. N°: 2. Os m aminoácidos tambémpodem incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10 etc.) inserções (por exemplo, cada um de 1, 2,3, 4 ou 5 aminoácidos) em relação ao ID. DE SEQ. N°: 2.
Proteínas da matriz preferidas para inclusão emcomposições da invenção compreendem um epítopo de Ml. 0epítopo pode ser um epítopo de células T e/ou de células B.Epítopos de células TeB podem ser identificadosempiricamente (por exemplo, com o uso de PEPSCAN [50,51] oude métodos similares), ou podem ser previstos (por exemplo,com o uso do índice antigênico de Jameson-Wolf [52] , porabordagens baseadas na matriz [53] , TEPITOPE [54] , porredes neurais [55] , OptiMer & EpiMer [56, 57] , ADEPT [58] ,Tsites [59] , hidrofilicidade [60] , índice antigênico [61]ou pelos métodos revelados na referência 62 etc.). Por taismétodos, já foram identificados epítopos de células T naproteína viral Ml de influenza A, incluindo os seguintes[63] :
MHC Seqüência ID. DE SEQ. REF.<table>table see original document page 21</column></row><table>
Outros epítopos de células T em Ml incluem: SLLTEVETYV(ID. DE SEQ. N° : 15; resíduos 2-11 do ID. DE SEQ. N°: 2);IIPSGPLK (ID. DE SEQ. N°: 16; resíduos 14-21 do ID. DE SEQ.N°: 2); e LEDVFAGK (ID. DE SEQ. N°: 17; resíduos 28-35 doID. DE SEQ. N0: 2).
Uma proteína da matriz em particular que foi primeirodetectada em vacinas preparadas em cultura de células é umaproteína de 5 kDa com a seqüência do terminal NEISLS YSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18; resíduos 114-125 do ID.
DE SEQ. N°: 2). O resíduo do terminal Neo tamanho dessepolipeptídeo são consistentes com o fato de ele ser umfragmento tríptico de Ml, quando então o polipeptídeo decomprimento total pode ter uma das seguintes seqüências deaminoácidos:
ID. DE SEQ. N° : 19
EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRID. DE SEQ. N°: 20
EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRO ID. DE SEQ. N°: 19 inclui o motivo Cys-Cys-His-Hiscompleto (resíduos 148-162 do ID. DE SEQ. N°: 2) que podefornecer afinidade por zinco [72]. Dessa forma, umaproteína da matriz usada com a invenção pode adicionalmenteincluir um íon zinco.
A seqüência do ID. DE SEQ. N°: 18 inclui a seqüênciaLSYSXGALA (ID. DE SEQ. N°: 1), que é muito bem conservadaentre cepas do vírus influenza A, com o 5 o resíduo "X"sendo Thr (LSYSTGALA, ID. DE SEQ. N°: 21) ou Ala(LSYSAGALA, ID. DE SEQ. N°: 22). São conhecidas variaçõesdesse 9mer conservado (por exemplo, em
A/Swine/Ontario/01911-2/99 (H4N6) o 9mer é LSYSTGALA [GI:10442678; ID. DE SEQ. N°: 23] e em
A/swine/England/191973/92 (H1N7) ele é LGYSTGALA [GI:1835734; ID. DE SEQ. N°: 24], em
A/Chicken/Pennsylvania/13609/93 (H5N2) ele é LSYSTGALT [GI:4584948; ID. DE SEQ. N°: 25], em A/WSN/33 ele é FSYSAGALA[GI: 324407; ID. DE SEQ. N°: 26]), mas O ID. DE SEQ. N°: 1é a seqüência mais comum. A YSXGAL (ID. DE SEQ. N°: 27)central aparece em todas essas seqüências. As seqüênciasnos vírus influenza podem ser localizadas convenientementena "Influenza Sequence Database" (ISD) em www.flu.lanl.gov[73] . Seqüências adicionais podem ser encontradas nareferência 74.
Dessa forma, proteínas da matriz preferidas incluídasem composições da invenção incluem uma ou mais dasseqüências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 21, 22,23, 24, 25, 26 e/ou 27. Enquanto a proteína Ml decomprimento total é uma proteína de 27,8 kDa, no entanto, aproteína da matriz incluída nas composições da invençãopossui um peso molecular < 20 kDa, por exemplo, < 15 kDa, <12 kDa, <10 kDa, < 9 kDa, < 8 kDa, < 7 kDa, < 6 kDa, < 5,5kDa, ou de cerca de 5 kDa. 0 peso molecular da proteína damatriz preferivelmente se situa na faixa de 2-8 kDa, porexemplo, 3-7 kDa, 4-6 kDa ou cerca de 5 kDa. 0 terminal Nda proteína da matriz pode ser Glu-Ile-Ser, seguido por umadas seqüências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 19,20, 21, 22, 23 ou 24.
A proteína da matriz pode formar oligômeros (porexemplo, dímeros, por exemplo, homodímeros) dentro dacomposição.
Caso a proteína da matriz inclua o aminoácido 137(numerado como no ID. DE SEQ. N°: 2), esse aminoácidopoderá ser Ala (como no ID. DE SEQ. N°: 2) ou Thr (comoobservado em vírus patogênicos humanos H5N1).
A proteína da matriz pode estar presente em váriasquantidades, mas tipicamente estará presente em 1 μg/ml a15 μg/ml, por exemplo, entre 2-14 pg/ml, entre 3-13 pg/ml,entre 4-12 μg/ml, entre 5-11 μg/ml, entre 6-10 pg/ml, entre7-9 pg/ml etc. Concentrações de menos de 1 pg/ml também sãopossíveis.
Com a inclusão dessas proteínas da matriz, além dahemaglutinina, as composições da invenção se beneficiam dequaisquer epítopos de células T que estejam presentes, oque pode aumentar a proteção cruzada (dentro do mesmo tipode HA e também entre diferentes tipos de HA) despertada poruma vacina [75]. As proteínas da matriz podem estarpresentes endogenamente em conseqüência da preparação dacomposição (por exemplo, ela pode co-purificar com HA), ouelas podem ser adicionadas como componentes exógenos, porexemplo, para aprimorar vacinas que não contêm o componenteda matriz, incluindo vacinas derivadas do ovo.
Sem se prender a uma teoria, os inventores acreditamque a proteína da matriz possa se ligar à HA em uma vacinapara formar um complexo estável. Caso o complexo seja maisestável do que a HA isoladamente, o prazo de validade deuma vacina pode ser aumentado e, em particular, suahabilidade para tolerar o armazenamento fora de umrefrigerador.
A região em torno do ID. DE SEQ. N° : 1 em Ml podeatuar como um domínio de ligação de lipídeo [76] . Com ainclusão dessa região em uma proteína da matriz, portanto,a proteína pode vantajosamente interagir com adjuvantesgraxos, como descrito com mais detalhe abaixo.
Quando uma composição incluir HA de mais de uma cepado vírus influenza A, ela geralmente também incluiráproteína da matriz de mais de uma cepa. Enquanto as HAs dascepas normalmente serão diferentes entre elas, no entanto,as proteínas da matriz podem ser as mesmas. Caso elas sejamidênticas no produto final, poderá não ser possíveldistinguir as duas proteínas da matriz, mas elas terãoorigens diferentes.
Além de incluir HA e matriz, as composições dainvenção podem incluir neuraminidase e/ou nucleoproteína.
Quando uma composição incluir HA de um vírus influenzaB, ela também poderá incluir proteína Ml de um vírusinfluenza B.
DNA da célula hospedeira
Quando o vírus tiver crescido em uma linhagem celular,é uma prática padronizada a minimização da quantidade deDNA residual da linhagem celular na vacina final, a fim deminimizar qualquer atividade oncogênica do DNA. Essa medidade segurança é particularmente importante quando se incluiuma proteína da matriz do vírus influenza em uma vacina, namedida em que a proteína da matriz pode se ligar aos ácidosnucléicos (incluindo RNA e DNA de fita dupla) [77] e pode,dessa forma, reter DNA mais facilmente do que as vacinasbaseadas em HA existentes.
Dessa forma, a composição preferivelmente contém menosde 10 ng (pref erivelmente menos de 1 ng e, maispreferivelmente, menos de 100 pg) de DNA residual da célulahospedeira por dose, embora quantidades residuais de DNA dacélula hospedeira possam estar presentes. Prefere-se que ocomprimento médio de qualquer DNA residual da célulahospedeira seja menor do que 500 bp, por exemplo, menor doque 4 00 bp, menor do que 3 00 bp, menor do que 2 00 bp, menordo que 100 bp etc. Em geral, o DNA da célula hospedeira queé desejável excluir das composições da invenção ê o DNA queé mas longo do que 100 bp.
A medida do DNA residual da célula hospedeira é agorauma exigência reguladora de rotina para substânciasbiológicas e está dentro dos conhecimentos daqueleshabilitados na técnica. O ensaio usado para medir o DNAtipicamente será um ensaio validado [78,79]. Ascaracterísticas de desempenho de um ensaio validado podemser descritas em termos matemáticos e quantificáveis, esuas possíveis fontes de erro serão identificadas. O ensaiogeralmente irá testar características como, por exemplo,exatidão, precisão, especificidade. Após um ensaio ter sidocalibrado (por exemplo, contra quantidades padronizadasconhecidas de DNA da célula hospedeira) e testado, poderãoser feitas rotineiramente medidas quantitativas de DNA.Três técnicas principais para quantificação de DNA podemser realizadas: métodos de hibridização, por exemplo,Southern blots ou slot blots [80]; métodos de imunoensaio,por exemplo, o Sistema Threshold™ [81] ; e PCR quantitativa[82]. Todos esses métodos são familiares àquelashabilitados na técnica, embora as características precisasde cada método possam depender da célula hospedeira emquestão, por exemplo, a escolha de sondas parahibridização, a escolha de iniciadores e/ou sondas paraamplificação etc. O sistema Threshold™ de MolecularDevices é um ensaio quantitativo para níveis de picogramasde DNA total, e tem sido usado para o monitoramento deníveis de DNA contaminante em substâncias biofarmacêuticas[81] . Um ensaio típico envolve a formação semespecificidade de seqüência de um complexo de reação entreuma proteína de ligação biotinilada de ssDNA, um anticorpoanti-ssDNA conjugado à urease e DNA. Todos os componentesdo ensaio são incluídos no kit completo "Total DNA AssayKit" disponível pelo fabricante. Vários fabricantescomerciais oferecem ensaios de PCR quantitativa paradetecção do DNA residual da célula hospedeira, por exemplo,AppTec™ de Laboratory Services, BioReliance™, de Althea
Technologies etc. Uma comparação de um ensaio dehibridização quimioluminescente com o sistema de DNA totalThreshold™ para medida da contaminação por DNA da célulahospedeira de uma vacina viral humana pode ser encontradana referência 83.
O DNA contaminante pode ser removido durante apreparação da vacina com o uso de procedimentospadronizados de purificação, por exemplo, cromatografiaetc. A remoção de DNA residual da célula hospedeira podeser aprimorada por tratamento de nuclease, por exemplo,pelo uso de uma DNase. Um método conveniente para a reduçãoda contaminação por DNA da célula hospedeira é revelado nasreferências 84 & 85, que envolve um tratamento em duasetapas, primeiro com o uso de uma DNase (por exemplo,Benzonase), que pode ser usada durante o crescimento viral,e a seguir com um detergente catiônico (por exemplo, CTAB),que pode ser usado durante a ruptura do virion. 0tratamento com um agente alquilante, por exemplo, β-propiolactona, também pode ser usado para remover DNA dacélula hospedeira e, vantajosamente, também pode ser usadopara inativar vírions [86] .
Vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, <100pg) de DNA da célula hospedeira por 15 pg de hemaglutininasão preferidas, bem como vacinas que contêm < 10 ng (porexemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira porvolume de 0,25 ml. Vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo,< 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por 50 μg dehemaglutinina são mais preferidas, bem como vacinas quecontêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA dacélula hospedeira por volume de 0,5 ml.
Adjuvantes
As composições da invenção podem vantajosamenteincluir um adjuvante, que pode funcionar para aumentar asrespostas imunológicas (humoral e/ou celular) despertadasem um paciente que recebe a composição. O uso de adjuvantescom vacinas contra influenza foi descrito anteriormente.Nas referências 87 & 88, foi utilizado hidróxido dealumínio, e na referência 89, foi usada uma mistura dehidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. A referência90 também descreveu o uso de adjuvantes de sal de alumínio.
O produto FLUAD™ de Chiron Vaccines inclui uma emulsãoóleo-em-água.
Adjuvantes que podem ser usados com a invençãoincluem, sem limitação:
- Uma composição que contém minerais, incluindo saisde cálcio e sais de alumínio (ou misturas destes). Sais decálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, aspartículas "CAP" reveladas na referência 91). Sais dealumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos etc., comos sais assumindo qualquer forma adequada (por exemplo,gel, cristalinos, amorfos etc.). A adsorção a esses sais épreferida. As composições que contêm minerais também podemser formuladas como uma partícula de sal metálico [92] .Adjuvantes de sal de alumínio serão descritos com maisdetalhe abaixo.
- Agentes indutores de citocina (veja com mais detalheabaixo).
Saponinas [capítulo 22 da referência 128], queformam um grupo heterólogo de glicosídeos de esterol eglicosídeos de triterpenóide que são encontrados na casca,folhas, caules, raízes e até mesmo nas flores de uma amplagama de espécies de plantas. A saponina da casca da árvoreMolina Quillaia saponaria foi amplamente estudada comoadjuvante. A saponina também pode ser obtida comercialmentede Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata(mosquitinho - brides veil) e Saponaria officinalis(saponária - soap root) . Formulações adjuvantes de saponinaincluem formulações purificadas, por exemplo, QS21, além deformulações lipídicas, por exemplo, ISCOMs. QS21 écomercializado como Stimulon™. As composições de saponinaforam purificadas com o uso de HPLC e RP-HPLC. Foramidentificadas frações purificadas específicas com o usodessas técnicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QHBe QH-C. De preferência, a saponina é QS21. Um método deprodução de QS21 é revelado na referência 93 . Asformulações de saponina também podem compreender umesterol, por exemplo, colesterol [94] . Podem ser usadascombinações de saponinas e colesteróis para formarpartículas únicas denominadas complexos imunoestimulantes(ISCOMs) [capítulo 23 da referência 128] . ISCOMstipicamente também incluem um fosfolipídeo, por exemplo,fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquersaponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. Depreferência, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA e QHC.ISCOMs são ainda descritos nas referências 94-96.Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovidos dedetergente adicional [97] . Uma revisão do desenvolvimentode adjuvantes baseados em saponina pode ser encontrada nasreferências 98 & 99.
- Adjuvantes graxos (veja com mais detalhe abaixo),incluindo emulsões óleo-em-água.
- Toxinas bacterianas que ribosilam ADP (por exemplo,a enterotoxina termolábil de E. coli "LT", a toxinacolérica "CT" ou a toxina de pertussis "ρτ") e derivadosdetoxifiçados destas, por exemplo, as toxinas mutantesconhecidas como LT-K63 e LT-R72 [100] . 0 uso de toxinasdetoxifiçadas que ribosilam ADP como adjuvantes raucosos édescrito na referência 101 e como adjuvantes parenterais nareferência 102.
Bioadesivos e mucoadesivos, por exemplo,microesferas de ácido hialurônico esterificado [103] ouquitosana e seus derivados [104].
- Micropartículas (ou seja, uma partícula com -100 nma -150 μιτι de diâmetro, mais preferivelmente -200 nm a -30pm de diâmetro ou -500 nm a -10 μτη de diâmetro) formadaspor materiais que são biodegradáveis e atóxicos (porexemplo, um poli (ácido ot-hidróxi) , um ácidopoliidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, umapolicaprolactona etc.), com poli(lactida-co-glicolida)sendo preferida, opcionalmente tratadas para terem umasuperfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS)ou uma superfície carregada positivamente (por exemplo, comum detergente catiônico, por exemplo, CTAB).
- Lipossomos (capítulos 13 & 14 da referência 128) .Exemplos de formulações lipossômicas adequadas ao uso comoadjuvantes são descritos nas referências 105-107.
- Éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno
[108]. Estas formulações ainda incluem tensoativos de ésterde polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol
[109] , além de tensoativos de alquil éteres ou éster depolioxietileno, em combinação com pelo menos um tensoativonão iônico adicional, por exemplo, octoxinol [110]. Éteresde polioxietileno preferidos são selecionados do seguintegrupo: polioxietileno-9-lauril éter (laureth 9),polioxietileno-9-esteoril éter, polioxietileno-8-esteoriléter, polioxietileno-4-lauril éter, polioxietileno-35-lauril éter e polioxietileno-23-lauril éter.
- Muramil peptídeos, por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina ("nor-MDP"), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida("DTP-DPP" ou "Theramide™") , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(11-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina ("MTP-PE").
Uma preparação de proteína de proteossoma damembrana externa preparada a partir de uma primeirabactéria Gram-negativa em combinação com uma preparação delipossacarídeo derivada de uma segunda bactéria Gram-negativa, em que as preparações de proteína de proteossomada membrana externa e de lipossacarídeo formam um complexoadjuvante estável não covalente. Estes complexos incluem"IVX-908", um complexo composto por membrana externa elipopolissacarídeos de Neisseria meningitidis. Eles foramusados como adjuvantes para vacinas contra influenza [111].
Um polímero de polioxidônio [112,113] ou outroderivado N-oxidado de polietileno-piperazina.
- 51-Monofosfato de metil inosina ("MIMP") [114].
- Um composto poliidroxilado de pirrolizidina [115],por exemplo, um que possua a fórmula:
<formula>formula see original document page 31</formula>
em que R é selecionado do grupo que compreendehidrogênio, grupos acil lineares ou ramificados, nãosubstituídos ou substituídos, saturados ou insaturados,alquil (por exemplo, cicloalquil), alquenil, alquinil earil, ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveldestes. Exemplos incluem, sem limitação: casuarina,casuarina-6-α-D-glicopiranose, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-diepi-casuarina etc.
Um ligante de CDld, por exemplo, uma a-glicosilceramida [116-123] (por exemplo, a-galactosilceramida), α-glicosilceramidas que contêmfitoesfingosina, OCH, KRN7000 [ (2S,3S,4R) -1-0-(a-D-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanetriol], CRONY-lOl, 3''-O-sulfo-galactosilceramidaetc.
Uma gama inulina [124] ou derivado desta, porexemplo, algamulina.
Essas e outras substâncias adjuvantes ativas sãodiscutidas com mais detalhe nas referências 128 & 129.
As composições podem incluir dois ou mais dosreferidos adjuvantes. Por exemplo, elas podemvantajosamente incluir tanto uma emulsão óleo-em-águaquanto um agente indutor de citocina, na medida em que essacombinação aumenta as respostas de citocina despertadas porvacinas contra influenza, por exemplo, a resposta deinterf eron-y, com o aumento sendo bem maior do que oobservado quando a emulsão ou o agente é usadoisoladamente.
Antígenos e adjuvantes em uma composição estarãotipicamente misturados.Adjuvantes de emulsão óleo-em-águaVerificou-se que as emulsões óleo-em-água sãoparticularmente adequadas ao uso em vacinas com adjuvantescontra o vírus influenza. São conhecidas várias destasemulsões, e elas tipicamente incluem pelo menos um óleo epelo menos um tensoativo, com o(s) óleo(s) e o(s)tensoativo(s) sendo biodegradáveis (metabolizáveis) ebiocompativeis. As gotículas de óleo na emulsão geralmentepossuem menos de 5 pm de diâmetro, e podem até mesmo ter umdiâmetro submícron, com esses tamanhos diminutos sendoobtidos com um microfluidificador para fornecer emulsõesestáveis. Gotículas com um tamanho menor do que 220 nm sãopreferidas, na medida em que elas podem ser submetidas àesterilização por filtro.
A invenção pode ser usada com óleos como, por exemplo,aqueles de uma fonte animal (por exemplo, de peixe) ouvegetal. Fontes para óleos vegetais incluem nozes, sementese grãos. Óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco eazeite de oliva, os mais comumente disponíveis,exemplificam os óleos de nozes. 0 óleo de jojoba pode serusado, por exemplo, obtido do grão de jojoba. Óleos desementes incluem óleo de açafroa, óleo de semente dealgodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente degergelim e semelhantes. No grupo dos grãos, o óleo de milhoé o mais facilmente disponível, mas o óleo de outros grãosde cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, arroz, tef,triticalo e semelhantes também podem ser usados. Esteres deácido graxo com 6-10 carbonos de glicerol e 1,2-propanediol, embora não ocorram naturalmente em óleos desementes, podem ser preparados por hidrólise, separação eesterificação dos materiais apropriados, partindo dos óleosde nozes e de semente. Gorduras e óleos do leite demamíferos são metabolizáveis e podem, portanto, ser usadosna prática dessa invenção.
Os procedimentos para separação, purificação,saponificação e outros meios necessários para a obtenção deóleos puros a partir de fontes animais são bem conhecidosna técnica. A maioria dos peixes contém óleosmetabolizáveis que podem ser prontamente recuperados. Porexemplo, o óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado detubarão e o óleo de baleia, por exemplo, espermacete,exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser aquiusados. Vários óleos de cadeia ramificada são sintetizadosbioquimicamente em unidades de isopreno de 5 carbonos e sãogeralmente citados como terpenóides. 0 óleo de fígado detubarão contém um terpenóide ramificado, insaturado,conhecido como esqualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2 , 6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que é particularmenteaqui preferido. 0 esqualano, o análogo saturado doesqualeno, também é um óleo preferido. Óleos de peixe,incluindo esqualeno e esqualano, são facilmente disponíveispor fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodosconhecidos na técnica. Outros óleos preferidos são ostocoferóis (veja abaixo). Podem ser usadas misturas deóleos.
Os tensoativos podem ser classificados por seu "HLB"(equilíbrio hidrófilo/lipófilo). Tensoativos da invençãopreferidos possuem um HLB de pelo menos 10, preferivelmentepelo menos 15 e, mais pref erivelmente, pelo menos 16. Ainvenção pode ser usada com tensoativos que incluem, semlimitação: os tensoativos de ésteres de polioxietilenosorbitano (comumente denominados Tweens), especialmentepolissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido deetileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido debutileno (BO) , vendidos sob o nome comercial DOWFAX™, porexemplo, copolímeros lineares em bloco de E0/P0;
octoxinóis, que podem variar no número de repetições gruposetóxi (oxi-1,2-etanodiil), com octoxinol-9 (Triton X-IOO out-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de particularinteresse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; fosfolipídeos, por exemplo, fosfatidilcolina(Iecitina); nonilfenol etoxilatos, por exemplo, a sérieTergitol™ NP; éteres graxos de polioxietileno derivados dealcoóis laurílico, cetílico, estearílico e oleílico(conhecidos como tensoativos Brij), por exemplo,trietilenoglicol monolauril éter (Brij 30) ; e ésteres desorbitano (comumente conhecidos como SPANs), por exemplo,trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato desorbitano. Tensoativos não iônicos são preferidos.Tensoativos preferidos para inclusão na emulsão são Tween80 (monooleato de polioxietileno sorbitano), Span 85(trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.
Podem ser usadas misturas de tensoativos, por exemplo,misturas de Tween 80/Span 85. Uma combinação de um éster depolioxietileno sorbitano, por exemplo, monooleato depolioxietileno sorbitano (Tween 80) , e um octoxinol, porexemplo, t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) ,também é adequada. Outra combinação útil compreende laureth9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou umoctoxinol.
Quantidades preferidas de tensoativos (% por peso)são: ésteres de polioxietil eno sorbitano (por exemplo,Tween 80) 0,01 a 1%, em particular, cerca de 0,1%; octil-ou nonilfenoxi polioxietanóis (por exemplo, Triton X-IOO,ou outros detergentes na série Triton) 0,001 a 0,1%, emparticular, 0,005 a 0,02%; éteres de polioxietileno (porexemplo, laureth 9) 0,1 a 20%, preferivelmente 0,1 a 10% e,em particular, 0,1 a 1% ou cerca de 0,5%.
Adjuvantes de emulsão óleo-em-água específicos úteiscom a invenção incluem, sem limitação:
- Uma emulsão submícron de esqualeno, Tween 8 0 e Span85. A composição da emulsão por volume pode ser de cerca de5% de esqualeno, cerca de 0,5% de polissorbato 80 e cercade 0,5% de Span 85. Em termos de peso, essas proporções setornam 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,48%de Span 85. Esse adjuvante é conhecido como "MF59" [125-127] , como descrito com mais detalhe no capítulo 10 dareferência 128 e no capítulo 12 da referência 129. Aemulsão MF59 vantajosamente inclui íons citrato, porexemplo, 10 mM de tampão citrato de sódio.
- Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e Tween 80. Aemulsão pode incluir solução salina tamponada com fosfato.Ela também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/oulecitina. Essas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno,de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80, e aproporção de peso de esqualeno:tocoferol é preferivelmente<1, na medida em que essa proporção fornece uma emulsãomais estável. Esqualeno e Tween 80 podem estar presentes emuma proporção de volume de cerca de 5:2. Uma emulsão dessetipo pode ser feita dissolvendo Tween 80 em PBS, para geraruma solução 2%, e depois misturando 90 ml dessa solução comuma mistura de 5 g de DL-α-tocoferol e 5 ml de esqualeno,e microfluidizando-se a mistura. A emulsão resultante podeter gotículas de óleo submícron, por exemplo, com umdiâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferivelmente cerca de18 0 nm.
- Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e umdetergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsãotambém pode incluir um 3d-MPL (veja abaixo). A emulsão podeconter um tampão fosfato.
Uma emulsão que compreende um polissorbato (porexemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (porexemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, umsuccinato de α-tocoferol). A emulsão pode incluir essestrês componentes em uma proporção de massa de cerca de75:11:10 (por exemplo, 750 pg/ml de polissorbato 80, 110pg/ml de Triton X-100 e 100 pg/ml de succinato de a-tocoferol), e essas concentrações devem incluir qualquercontribuição desses componentes por antígenos. A emulsãotambém pode incluir esqualeno. A emulsão também podeincluir um 3d-MPL (veja abaixo). A fase aquosa pode conterum tampão fosfato.
Uma emulsão de esqualano, polissorbato 8 0 epoloxâmero 401 ("Pluronic™ L121"). A emulsão pode serformulada em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4.Essa emulsão é um veículo de liberação útil para muramildipeptídeos, e foi usada com treonil-MDP no adjuvante "SAF-1" [130] (0,05-1% de Thr-MDP, 5% de esqualano, 2,5% dePlurônico L121 e 0,2% de polissorbato 80). Ela também podeser usada sem o Thr-MDP, como no adjuvante "AF" [131] (5%de esqualano, 1,25% de Plurônico L121 e 0,2% depolissorbato 80). A microfluidificação é preferida.- Uma emulsão que possui de 0,5-50% de um óleo, 0,1-10% de um fosfolipídeo e 0,05-5% de um tensoativo nãoiônico. Como descrito na referência 132, componentes defosfolipídeo preferidos são fosfatidilcolina,fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina,fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico,esfingomielina e cardiolipina. São vantajosos tamanhos degotícula submícron.
- Uma emulsão óleo-em-água submícron de um óleo nãometabolizável (por exemplo, óleo mineral leve) e pelo menosum tensoativo (por exemplo, lecitina, Tween 80 ou Span 80).Podem ser incluídos aditivos, por exemplo, saponina QuiIA,colesterol a conjugado saponina-lipófilo (por exemplo, GPI-0100, descrito na referência 133, produzido por adição deamina alifática à desacilsaponina por meio do grupocarboxil de ácido glicurônico), brometo dedimetildioctadecilamônio e/ou N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanodiamina.
- Uma emulsão na qual uma saponina (por exemplo, QuilAou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) estãoassociados como micelas helicoidais [134].
As emulsões podem ser misturadas com antígeno de formaextemporânea, no momento da liberação. Dessa forma, oadjuvante e o antígeno podem ser mantidos separadamente emuma vacina embalada ou distribuída, prontos para aformulação final no momento da utilização. O antígenogeralmente estará em uma forma aquosa, de modo que a vacinaseja finalmente preparada por mistura de dois líquidos. Aproporção de volume dos dois líquidos para a mistura podevariar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5), mas é geralmente decerca de 1:1.
Após o antígeno e o adjuvante terem sido misturados, oantígeno de hemaglutinina geralmente permanecerá em soluçãoaquosa, mas pode se distribuir em torno da interfaceóleo/água. Em geral, pouco ou nenhuma hemaglutinina entrarána fase oleosa da emulsão.
Quando uma composição incluir um tocoferol, qualquerum dos α, β, γ, δ, ε ou ξ-tocoferóis pode ser usado, mas a-tocof eróis sao preferidos. 0 tocoferol pode assumir váriasformas, por exemplo, diferentes sais e/ou isômeros. Saisincluem sais orgânicos, por exemplo, succinato, acetato,nicotinato etc. Tanto D-α-tocoferol quanto DL-α-tocoferolpodem ser usados. Tocoferóis são vantajosamente incluídosem vacinas para uso em pacientes idosos (por exemplo, comidade de 60 anos ou mais) , pois há relatos de que avitamina E possui um efeito positivo sobre a respostaimunológica nesse grupo de pacientes [135]. Eles tambémpossuem propriedades antioxidantes que podem ajudar aestabilizar as emulsões [136]. Um α-tocoferol preferido éo DL-a-tocoferol, e o sal preferido desse tocoferol é osuccinato. Verificou-se que o sal de succinato coopera comligantes relacionados ao TNF in vivo. Além disso, osuccinato de OC-tocoferol é conhecido por ser compatívelcom vacinas contra influenza e por ser um conservante útilcomo alternativa aos compostos mercuriais [9].Agentes indutores de citocina
Agentes indutores de citocina para inclusão emcomposições da invenção são capazes, quando administrados aum paciente, de despertar o sistema imunológico paraliberar citocinas, incluindo interferons e interleucinas.As respostas de citocina são conhecidas por estaremenvolvidas nos estágios iniciais e decisivos da defesa dohospedeiro contra a infecção por influenza [137]. Agentespreferidos podem despertar a liberação de um ou mais de:interferon-γ; interleucina-1; interleucina-2; interleucina-12; TNF-a; TNF-β; e GM-CSF. Agentes preferidos despertam aliberação de citocinas associadas a uma respostaimunológica do tipo Thl, por exemplo, interferon-γ, TNF-a,interleucina-2. Prefere-se a estimulação tanto deinterferon-γ quanto de interleucina-2.
Em conseqüência do recebimento de uma composição dainvenção, portanto, um paciente terá células T que, quandoestimuladas com um antígeno de influenza, irão liberar a(s)citocina(s) desejada(s) de uma forma antígeno-específica.Por exemplo, células T purificadas do seu sangue liberarãoγ-interferon quando expostas in vitro à hemaglutinina dovírus influenza. Métodos para a medida destas respostas emcélulas mononucleares do sangue periférico (PBMC) sãoconhecidos na técnica, e incluem ELISA, ELISPOT, citometriade fluxo e PCR em tempo real. Por exemplo, a referência 138relata um estudo no qual respostas imunológicas mediadaspor células T antígeno-específicas contra o toxóidetetânico, especificamente respostas de γ-interferon, forammonitoradas, e verificou-se que ELISPOT foi o método maissensível para discriminar respostas induzidas pelo TTantígeno-específicas de respostas espontâneas, mas que adetecção de citocina intracitoplasmática por citometria defluxo foi o método mais eficiente para detectar efeitos dere-estimulação.
Agentes indutores de citocina adequados incluem, semlimitação:
- Um oligonucleotídeo imunoestimulante, por exemplo,um que contenha um motivo CpG (uma seqüência dinucleotídicaque contém uma citosina não metilada ligada por uma ligaçãofosfato a uma guanosina) , ou um RNA de fita dupla, ou umoligonucleotídeo que contém uma seqüência palindrômica, ouum oligonucleotídeo que contém uma seqüência poli(dG).
Monofosforil 3-O-desacilado lipídeo A ("3dMPL",também conhecido como "MPL™") [139-142],
- Um composto de imidazoquinolina, por exemplo,Imiquimod ("R-837") [143,144], Resiquimod ("R-848") [145],e seus análogos; e sais destes (por exemplo, os sais decloridrato). Detalhes adicionais sobre imidazoquinolinasimunoestimulantes podem ser encontrados nas referências 146a 150.
Um composto de tiossemicarbazona, por exemplo,aqueles revelados na referência 151. Métodos para aformulação, fabricação e teste de compostos ativos tambémsão descritos na referência 151. As tiossemicarbazonas sãoparticularmente eficazes na estimulação de célulasmononucleares do sangue periférico humano para a produçãode citocinas, por exemplo, TNF-α.
- Um composto de triptantrina, por exemplo, aquelesrevelados na referência 152. Métodos para a formulação,fabricação e teste de compostos ativos também são descritosna referência 152. As tiossemicarbazonas sãoparticularmente eficazes na estimulação de célulasmononucleares do sangue periférico humano para a produçãode citocinas, por exemplo, TNF-a.
- Um análogo nucleosídico, por exemplo: (a)Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):
<formula>formula see original document page 42</formula>
e pró-fármacos deste; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d)ANA380; (e) os compostos revelados nas referências 153 a155; (f) um composto que possui a fórmula:
<formula>formula see original document page 42</formula>
em que : R3
Ri e R2 são, cada um independentemente, H, halo,NRaRb, -0H, Ci-6 alcóxi, Ci. 6 alcóxi substituído,heterociclil, heterociclil substituído, C6.10 aril, C6-I0aril substituído, Ci.6 alquil, ou Ci_6 alquil substituído;
R3 está ausente, H, Ci.6 alquil, C1-S alquilsubstituído, C6-I0 aril, C6.10 aril substituído, heterociclilou heterociclil substituído;
R4 e R5 são, cada um independentemente, H, halo,heterociclil, heterociclil substituído, -C(O)-Rd, Ci-6alquil, Ci-6 alquil substituído, ou ligados em conjunto paraformarem um anel de 5 membros como em R4-5:
<formula>formula see original document page 42</formula>
a ligaçao sendo ootiaa nas ugaçoes indicadas por um <n/wXi e X2 são, cada um independentemente, N, C, 0 ou S;R8 é H, halo, -0H, Ci_6 alquil, C2.6 alquenil, C2.6alquinil, -0H, -NRaRb, -(CH2)n-O-Rc, -0- (Ci.6 alquil), -S(O)pRe, OU -C(O)-Rd;
R9 é H, Ci-s alquil, Ci-6 alquil substituído,heterociclil, heterociclil substituído ou R9a, em que R9a é:
<formula>formula see original document page 43</formula>
a ligação sendo obtida na ligação indicada por um
Ri0 e Ri1 são, cada um independentemente, H, halo, C1-6alcóxi, Ci-6 alcóxi substituído, - NRaRb, ou -0H;
cada Ra e Rb é independentemente H, Ci-6 alquil, C1-6alquil substituído, -C(O)Rd, C6-10 aril;
cada Rc é independentemente H, fosfato, difosfato,trifosfato, Ci-6 alquil ou Ci.6 alquil substituído;
cada Rd é independentemente H, halo, Ci-6 alquil, Ci.6alquil substituído, C^6 alcóxi, C1^ alcóxi substituído, -NH2, -NH (Ci-6 alquil), -NH(Ci_s alquil substituído), -N('Ci-6alquil) 2, -N(Ci-6 alquil substituído)2, C6-i0 aril ouheterociclil;
cada Re é independentemente H, Ci_6 alquil, Ci_6 alquilsubstituído, C6-I0 aril, C6-I0 aril substituído, heterociclilou heterociclil substituído;
cada Rf é independentemente H, Ci.6 alquil, Ci.6 alquilsubstituído, -C(O)Rd, fosfato, difosfato ou trifosfato;
cada η é independentemente 0, 1, 2 ou 3;
cada ρ é independentemente 0, 1 ou 2; ou
(g) um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer umde (a) a (f) , um tautômero de qualquer um de (a) a (f) , ouum sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.
- Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) [156].
- Compostos revelados na referência 157, incluindo:compostos de acilpiperazina, compostos de indolediona,compostos de tetrahidroisoquinolina (THIQ), compostos debenzociclodiona, compostos de aminoazavinil, compostos deaminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) [158,159], compostosde hidraptalamida, compostos de benzofenona, compostos deisoxazol, compostos de esterol, compostos de quinazilinona,compostos de pirrol [160], compostos de antraquinona,5 compostos de quinoxalina, compostos de triazina, compostosde pirazalopirimidina e compostos de benzazol [161].
- Compostos revelados na referência 162.
- Um derivado de fosfato de aminoalquil glucosaminida,por exemplo, RC-529 [163,164].
- Um fosfazeno, por exemplo,poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] ("PCPP"), comodescrito, por exemplo, nas referências 165 e 166.
- Imunopotencializadores de pequena molécula (SMIPs),por exemplo:
N2-metil-l-(2-metilpropi1)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2 , N2-dimetil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-etil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4 , 5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
1-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-butil-1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-pentil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diaminaΝ2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-lH-imidazo[4,5-c] quinolin-4-amina
1-(2-metilpropil)-2-(propiltio)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
2-[[4-amino-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etanol
2-[[4-amino-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4, 5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etil acetato
4-amino-l-(2-metilpropil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4, 5-c] quinolin-2-ona
N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-IH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-IH-imidazo[4,5-c]quinolina2,4-diamina
N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
1-{4-amino-2- [metil(propil)amino]-lH-imidazo[4,5-c] quinolin-l-il}-2-metilpropan-2-ol
1-[4-amino-2-(propilamino)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-l-il] -2-metilpropan-2-ol
N4,N4-dibenzil-1-(2-metóxi-2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.
Os agentes indutores de citocina para uso na presenteinvenção podem ser moduladores e/ou agonistas de ReceptoresToll-Like (TLR). Por exemplo, eles podem ser agonistas deum ou mais das proteínas TLRl, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8e/ou TLR9 humanas. Agentes preferidos são agonistas de TLR7(por exemplo, imidazoquinolinas) e/ou TLR 9 (por exemplo,oligonucleotídeos CpG). Esses agentes são úteis paraativação das vias da imunidade inata.
0 agente indutor de citocina pode ser adicionado àcomposição em vários estágios durante sua produção. Porexemplo, ele pode estar dentro de uma composição deantígeno, e essa mistura pode então ser adicionada a umaemulsão óleo-em-água. Como alternativa, ele pode estardentro de uma emulsão óleo-em-água, quando então o agentepode ser adicionado aos componentes da emulsão antes daemulsificação, ou ele pode ser adicionado à emulsão após aemulsificação. Da mesma forma, o agente pode ser coacervadodentro das gotículas da emulsão. A localização e adistribuição do agente indutor de citocina dentro dacomposição final dependerão de suas propriedadeshidrofilicas/lipofílicas, por exemplo, o agente pode estarlocalizado na fase aquosa, na fase oleosa e/ou na interfaceóleo-água.
O agente indutor de citocina pode ser conjugado a umagente separado, por exemplo, um antígeno (por exemplo,CRMl97). Uma revisão geral das técnicas de conjugação parapequenas moléculas é fornecida na referência 167. Comoalternativa, os adjuvantes podem ser associados de formanão covalente a agentes adicionais, por exemplo, por meiode interações hidrofóbicas ou iônicas.
Dois agentes indutores de citocina preferidos são: (a)oligonucleotídeos imunoestimulantes e (b) 3dMPL.
Oligonucleotídeos imunoestimulantes podem incluirmodificações/análogos nucleotídicos, por exemplo,modificações de fosforotioato, e podem ser de fita dupla ou(exceto para RNA) de fita simples. As referências 168, 169e 170 revelam substituições análogas possíveis, porexemplo, substituição de guanosina com 2'-desoxi-7-deazaguanosina. O efeito adjuvante de oligonucleotídeos CpGé ainda discutido nas referências 171-176. Uma seqüênciaCpG pode ser dirigida a TLR9, por exemplo, o motivo GTCGTTou TTCGTT [177]. A seqüência CpG pode ser específica para aindução de uma resposta imunológica Thl, por exemplo, umODN (oligodesoxinucleotídeo) CpG-A, ou ela pode ser maisespecífica para indução de uma resposta de células B, porexemplo, ODN CpGB. ODNs CpG-A e CpG-B são discutidos nasreferências 178-180. De preferência, o CpG é um ODN CpG-A.De preferência, o oligonucleotídeo CpG é construído de modoque a extremidade 5' esteja acessível para reconhecimentodo receptor. Opcionalmente, duas seqüências deoligonucleotídeos CpG podem ser anexadas em suasextremidades 3' para a formação de "imunômeros" . Veja, porexemplo, as referências 177 & 181-183. Um adjuvante CpGútil é CpG7 909, também conhecido como ProMune™ (Coley
Pharmaceutical Group, Inc.).
Como alternativa, ou adicionalmente, ao uso deseqüências CpG, podem ser usadas seqüências TpG [184].Esses 25 oligonucleotídeos podem ser livres de porções CpGnão metilados.
O oligonucleotídeo imunoestimulante pode ser rico empirimidina. Por exemplo, ele pode compreender mais de umnucleotídeo consecutivo de timidina (por exemplo, TTTT,como revelado na referência 184) e/ou ele pode ter umacomposição de nucleotídeos com > 25% de timidina (porexemplo, > 35%, > 40%, > 50%, > 60%, > 80% etc.). Porexemplo, ele pode compreender mais de um nucleotídeoconsecutivo de citosina (por exemplo, CCCC, como reveladona referência 184) e/ou ele pode ter uma composição denucleotídeos com > 25% de citosina (por exemplo, > 35%, >40%, > 50%, > 60%, > 80% etc.). Esses oligonucleotídeospodem ser livres de porções CpG não metilados.
Oligonucleotídeos imunoestimulantes tipicamentecompreenderão pelo menos 20 nucleotídeos. Eles podemcompreender menos de 100 nucleotídeos.
3dMPL (também conhecido como monofosforil 3 des-O-acilado lipídeo A ou 3-O-desacil-41-monofosforil lipídeo A)é um adjuvante no qual a posição 3 da glicosamina daextremidade redutora no monofosforil lipídeo A foide sacilada. 3dMPL foi preparado a partir de um mutante semheptose de Salmonella minnesota, e é quimicamente similarao lipídeo A, mas desprovido de um grupo fosforil ácido-lábil e de um grupo acil base-lábil. Ele ativa células dalinhagem de monócitos/macrófagos e estimula a liberação devárias citocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-a e GM-CSF(veja também a referência 185) . A preparação de 3dMPL foioriginalmente descrita na referência 186.
3dMPL pode assumir a forma de uma mistura de moléculasrelacionadas que variam por sua acilação (por exemplo,possuindo 3, 4, 5 ou 6 cadeias acil, que podem ser decomprimentos diferentes). Os dois monossacarídeos deglicosamina (também conhecida como 2-desoxi-2-amino-glicose) são N-acilados em seus carbonos da posição 2 (ouseja, nas posições 2 e 2'), e também há 0-acilação naposição 3'. O grupo anexado ao carbono 2 possui a fórmula -NH-CO-CH2-CR1Ri'. 0 grupo anexado ao carbono 2' possui afórmula -NH-CO-CH2-CR2R2'. 0 grupo anexado ao carbono 3'possui a fórmula -O-CO-CH2-CR3R3'. Uma estruturarepresentativa é:
<formula>formula see original document page 49</formula>
(CH2)n-CH3. 0 valor de η é preferivelmente entre 8 e 16,mais preferivelmente entre 9 e 12 e, principalmente, 10.
Os grupos R1', R2' e R3' podem ser, cada umindependentemente: (a) -H; (b) -0H; ou (c) -O-CO-R4, em queR4 é -H ou -(CH2)m-CH3, em que o valor de m épreferivelmente entre 8 e 16 e é, mais preferivelmente, 10,12 ou 14. Na posição 2, m é preferivelmente 14. Na posição2', m é pref erivelmente 10. Na posição 3', m épref erivelmente 12. Os grupos R1', R2' e R3' são, dessaforma, preferivelmente grupos -0-acil de ácido dodecanóico,ácido tetradecanóico ou ácido hexadecanóico.
Quando todos de R1', R2' e R3' forem -H7 então o 3dMPLpossuirá apenas 3 cadeias acil (uma em cada uma dasposições 2, 2' e 31). Quando somente dois de R1', R2' e R3'forem -H, então o 3dMPL poderá ter 4 cadeias acil. Quandoapenas um de R1', R2' e R3' for -H, então o 3dMPL poderá ter5 cadeias acil. Quando nenhum de R1', R2' e R3' for -H, entãoo 3dMPL poderá ter 6 cadeias acil. 0 adjuvante 3dMPL usadode acordo com a invenção pode ser uma mistura dessasformas, com 3 a 6 cadeias acil, e prefere-se incluir 3dMPLcom 6 cadeias acil na mistura e, em particular, paraassegurar que a forma de cadeia hexaacil constitua pelomenos 10% por peso do 3dMPL total, por exemplo, > 20%, >30%, > 40%, > 50% ou mais. Verificou-se que 3dMPL com 6cadeias acil é a forma com ação adjuvante mais ativa.
Dessa forma, a forma mais preferida de 3dMPL parainclusão na composição da invenção possui a fórmula (IV) ,mostrada abaixo.
Quando 3dMPL é usado na forma de uma mistura, então asreferências às quantidades ou concentrações de 3dMPL emcomposições da invenção se referem às espécies combinadasde 3dMPL na mistura.
Em condições aquosas, 3dMPL pode formar agregadosmicelares ou partículas com diferentes tamanhos, porexemplo, com um diâmetro < 15 0 nm ou > 5 00 nm. Um ou ambosdestes podem ser usados com a invenção, e as melhorespartículas podem ser selecionados por ensaios de rotina.Partículas menores (por exemplo, suficientemente pequenaspara gerar uma suspensão aquosa transparente de 3dMPL) sãopreferidas para uso de acordo com a invenção por causa desua atividade superior [187]. Partículas preferidas possuemum diâmetro médio de menos de 220 nm, mais preferivelmentede menos de 200 nm ou menos de 150 nm ou menos de 120 nm, epodem até mesmo ter um diâmetro médio de menos de 100 nm.Na maioria dos casos, no entanto, o diâmetro médio não serámenor do que 50 nm. Essas partículas são suficientementepequenas para serem adequadas à esterilização por filtro. 0diâmetro da particular pode ser avaliado pela técnica derotina de dispersão luminosa dinâmica, que revela odiâmet ro médio de uma partícula. Quando se diz que umapartícula possui um diâmetro de χ nm, geralmente haverá umadistribuição de partículas em torno dessa média, mas pelomenos 50% por número (por exemplo, > 60%, > 70%, > 80%, >90%, ou mais) das partículas terão um diâmetro dentro defaixa de χ ± 25%.
3dMPL pode vantajosamente ser usado em combinação comuma emulsão óleo-em-água. Substancialmente todo o 3dMPLpode es tar localizado na fase aquosa da emulsão.
O 3dMPL pode ser usado isoladamente ou em combinaçãocom um ou mais compostos adicionais. Por exemplo, éconhecido o uso de 3dMPL em combinação com a saponina QS21[188] (incluindo em uma emulsão óleo-em-água [189]), com umoligonucleotídeo imunoestimulante, tanto com QS21 quantocom um oligonucleotídeo imunoestimulante, com fosfato dealumínio [190] , com hidróxido de alumínio [191] ou tantocom fosfato de alumínio quanto com hidróxido de alumínio.Formula (IV)
Adjuvantes graxos
Adjuvantes graxos que podem ser usados com a invençãoincluem as emulsões óleo-em-água descritas acima, e tambémincluem, por exemplo:
- Um composto de fórmula I, II ou III, ou um saldeste:
<formula>formula see original document page 52</formula>
como definido na referência 192, por exemplo, "ER 803058","ER 803732", "ER 804053", ER 804058", "ER 804059", "ER804442", "ER 804680", "ER 804764", ER 803022 OU "ER804057", por exemplo:
<formula>formula see original document page 52</formula><formula>formula see original document page 53</formula>
- Derivados de lipídeo A de Escherichia coli, porexemplo, OM-174 (descrito nas referências 193 & 194) .
Uma formulação de um lipídeo catiônico e um(normalmente neutro) co-lipídeo, por exemplo,aminopropil-dimetil-miristoleiloxi-propanamínio brometo-diftanoilfosfatidil-etanolamina ("Vaxfectin " ) ouaminopropil-dimetil-bis-dodeciloxi-propanamínio brometo-dioleoilfosfatidil-etanolamina ("GAP-DLRIE:DOPE" ) .
Formulações que contêm sais de (±)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanamínio sãopreferidas [195] .
- Monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado (veja acima).
Compostos que contêm lipídeos ligados a umaestrutura central acíclica contendo fosfato, por exemplo, oantaqonista de TLR4 E5564 [196,197]:
<formula>formula see original document page 53</formula>
Adjuvantes de sal de alumínioOs adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio efosfato de alumínio podem ser usados. Esses nomes sãoconvencionais, mas são usados apenas por conveniência, namedida em que nenhum deles é uma descrição precisa do realcomposto químico que está presente (por exemplo, veja ocapítulo 9 da referência 128). A invenção pode usarqualquer um dos adjuvantes de "hidróxido" ou "fosfato" quesão de uso geral como adjuvantes.
Os adjuvantes conhecidos como "hidróxido de alumínio"são tipicamente sais de oxihidróxido de alumínio, que sãonormalmente pelo menos parcialmente cristalinos.Oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pelafórmula AlO(OH), e pode ser distinguido de outros compostosde alumínio, por exemplo, hidróxido de alumínio Al(OH)3,por espectroscopia infravermelha (IR) , em particular pelapresença de uma banda de adsorção a 1.070 cm"1, e um forteressalto a 3.090-3.100 cm"1 [capítulo 9 da referência 128].0 grau de cristalinidade de um adjuvante de hidróxido dealumínio se reflete pela largura da banda de difração nametade da altura (WHH), com partículas pouco cristalinasexibindo um alargamento de linha maior em função detamanhos de cristalito menores. A área de superfícieaumenta à medida que a WHH aumenta, e foi observado queadjuvantes com valores de WHH maiores possuem umacapacidade maior para adsorção de antígeno. Uma morfologiafibrosa (por exemplo, como observado em micrografias detransmissão eletrônica) é típica para adjuvantes dehidróxido de alumínio. 0 pi de adjuvantes de hidróxido dealumínio é tipicamente de cerca de 11, ou seja, o próprioadjuvante possui uma carga de superfície positiva em pHfisiológico. Capacidades de adsorção entre 1,8-2,6 mg deproteína por mg de Al+++ em pH 7,4 foram relatadas paraadjuvantes de hidróxido de alumínio.
Os adjuvantes conhecidos como "fosfato de alumínio"são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio quefreqüentemente também contêm uma pequena quantidade desulfato (ou seja, sulfato de hidroxifosfato de alumínio).Eles podem ser obtidos por precipitação, e as condições dereação e concentrações durante a precipitação influenciam ograu de substituição de fosfato para hidroxil no sal.Hidroxifosfatos geralmente possuem uma proporção molar deP04/A1 entre 0,3 e 1,2. Hidroxifosfatos podem serdist inguidos do AIPO4 estrito pela presença de gruposhidroxil. Por exemplo, uma banda de espectro IR a 3.164 cm"1 (por exemplo, quando aquecido até 200°C) indica apresença de hidroxilas estruturais [capítulo 9 dareferência 128].
A proporção molar de P04/A13+ de um adjuvante defosfato de alumínio geralmente será entre 0,3 e 1,2,preferivelmente entre 0,8 e 1,2 e, mais preferivelmente,0,95 ± 0,1. 0 fosfato de alumínio geralmente será amorfo,particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvantetípico é hidroxifosfato de alumínio amorfo, com umaproporção molar de P04/Al entre 0,84 e 0,92, incluído a 0,6mg de Al3 + /ml. 0 fosfato de alumínio geralmente seráparticulado (por exemplo, morfologia semelhante a umaplaca, como observado em micrografias de transmissãoeletrônica). Diâmetros típicos das partículas estão nafaixa de 0,520 pm (por exemplo, cerca de 5-10 μπι) apósqualquer adsorção de antígeno. Capacidades de adsorçãoentre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ em pH 7,4 foramrelatadas para adjuvantes de fosfato de alumínio.
O ponto de carga zero (PZC) do fosfato de alumínioestá inversamente relacionado ao grau de substituição dehidroxil por fosfato, e esse grau de substituição podevariar, dependendo das condições de reação e daconcentração de reagentes usadas para a preparação do salpor precipitação. O PZC também é alterado por alteração daconcentração de íons fosfato livres em solução (maisfosfato = PZC mais ácido) ou por adição de um tampão como,por exemplo, um tampão histidina (torna o PZC mais básico).Os fosfatos de alumínio usados de acordo com a invençãogeralmente terão um PZC entre 4,0 e 7,0, maispreferivelmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo, cerca de 5,7.
Suspensões de sais de alumínio usadas para preparar ascomposições da invenção podem conter um tampão (porexemplo, um tampão fosfato ou um tampão histidina ou umtampão Tris), mas isso nem sempre é necessário. Assuspensões são preferivelmente estéreis e livres depirogênio. Uma suspensão pode incluir íons fosfato aquososlivres, por exemplo, presentes em uma concentração entre1,0 e 20 mM, pref erivelmente entre 5 e 15 mM e, maispreferivelmente, em torno de 10 mM. As suspensões tambémpodem compreender cloreto de sódio.
A invenção pode usar uma mistura tanto de um hidróxidode alumínio quanto de um fosfato de alumínio [89] . Nessecaso, pode haver mais fosfato do que hidróxido de alumínio,por exemplo, uma proporção de peso de pelo menos 2:1, porexemplo, > 5:1, > 6:1, > 7:1, > 8:1, > 9:1 etc.
A concentração de Al+++ em uma composição paraadministração a um paciente é preferivelmente menor do que10 mg/ml, por exemplo, < 5 mg/ml, < 4 mg/ml, < 3 mg/ml, < 2mg/ml, < 1 mg/ml etc. Uma faixa preferida é entre 0,3 e 1mg/ml. Prefere-se um máximo de 0,85 mg/dose.
Além de incluir um ou mais adjuvantes de sal dealumínio, o componente adjuvante pode incluir um ou maisadjuvantes adicionais ou agentes imunoestimulantes. Estescomponentes adicionais incluem, sem limitação: um adjuvantede monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado ("3d-MPL"); e/ouuma emulsão óleo-em-água. 3d-MPL também é citado como 3des-O-acilado monofosforil lipídeo A ou como 3-O-desacil-4'-monofosforil lipídeo A. 0 nome indica que a posição 3 daglicosamina da extremidade redutora no monofosforil lipídeoA é desacilada. Ele foi preparado a partir de um mutantesem heptose de S. minnesota, e é quimicamente similar aolipídeo A, mas é desprovido de um grupo fosforil ácido-lábil e de um grupo acil base-lábil. Ele ativa células dalinhagem de monócitos/macrófagos e estimula a liberação devárias citocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-a e GM-CSF. Apreparação de 3d-MPL foi originalmente descrita nareferência 186, e o produto vem sendo fabricado e vendidopor Corixa Corporation, sob o nome comercial MPL™.Detalhes adicionais podem ser encontrados nas referências139 a 142.
Composições farmacêuticas
As composições da invenção são farmaceuticamenteaceitáveis. Elas normalmente incluem componentes além dosantígenos; por exemplo, elas tipicamente incluem um ou maisveículos ou excipientes farmacêuticos. Uma discussãodetalhada de cada um dos componentes está disponível nareferência 198.
As composiçoes geralmente estarão em forma aquosa.
A composição pode incluir conservantes, por exemplo,timerosal ou 2-fenoxietanol. Prefere-se, no entanto, que avacina deva ser substancialmente livre de (ou seja, menosde 5 pg/ml) material mercurial, por exemplo, livre detimerosal [9,199]. As vacinas que não contêm mercúrio sãomais preferidas. Vacinas sem conservantes sãoparticularmente preferidas.
Para controlar a tonicidade, prefere-se incluir um salfisiológico, por exemplo, um sal de sódio. Prefere-se ocloreto de sódio (NaCl), que pode estar presente entre 1 e20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluemcloreto de potássio, fosfato de potássio dihidrogênio,dihidrato de f osfato dissódico, cloreto de magnésio,cloreto de cálcio etc.
As composições geralmente terão uma osmolaridade entre200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferivelmente entre 240-360mOsm/kg, e mais preferivelmente estará na faixa de 290-310mOsm/kg. A osmolaridade foi relatada previamente como nãotendo um impacto sobre a dor causada pela vacinação [200],mas, no entanto, prefere-se manter a osmolaridade nessafaixa.
As composições podem incluir um ou mais tampões.Tampões típicos incluem: um tampão fosfato; um tampão Tris;um tampão borato; um tampão succinato; um tampão histidina(particularmente com um adjuvante de hidróxido dealumínio); ou um tampão citrato. Os tampões tipicamenteserão incluídos na faixa de 5-20 mM.
O pH de uma composição geralmente estará entre 5,0 e8,1 e, mais tipicamente, entre 6,0 e 8,0, por exemplo, 6,5e 7,5, ou entre 7,0 e 7,8. Um processo da invenção pode,portanto, incluir uma etapa de ajuste do pH da vacina agranel, antes da embalagem.
A composição é preferivelmente estéril. A composição épreferivelmente não pirogênica, por exemplo, contendo < 1EU (unidade de endotoxina, uma medida-padrão) por dose, epreferivelmente < 0,1 EU por dose. A composição épreferivelmente livre de glúten.
As composições da invenção podem incluir detergentes,por exemplo, um tensoativo de éster de polioxietilenosorbitano (conhecido como "Tweens"), um octoxinol (porexemplo, octoxinol-9 (Triton X-100) ou t-octilfenoxipolietoxietanol), um cetil trimetil amôniobrometo ("CTAS"), ou desoxicolato de sódio, particularmentepara uma vacina dividida ou de antígeno de superfície. 0detergente pode estar presente apenas em quantidadesresiduais. Dessa forma, a vacina pode incluir menos de 1mg/ml de cada um de octoxinol-10 e polissorbato 80. Outroscomponentes residuais em quantidades residuais poderiam serantibióticos (por exemplo, neomicina, canamicina,polimixina B).
A composição pode incluir material para uma únicaimunização, ou pode incluir material para imunizaçõesmúltiplas (ou seja, um kit "multidoses") . A inclusão de umconservante é preferida em arranjos multidoses. Comoalternativa (ou adicionalmente) à inclusão de umconservante em composições multidoses, as composições podemestar contidas em um recipiente que possua um adaptadorasséptico para a remoção de material.As vacinas contra influenza são tipicamenteadministradas em um volume de dosagem de cerca de 0,5 ml,embora metade da dose (ou seja, cerca de 0,25 ml) possa seradministrada em crianças.
As composições e os kits são pref erivelmentearmazenados entre 20C e 8°C. Eles não podem ser congelados.Idealmente eles devem ser mantidos protegidos da luzdireta.
Kits da invenção
As composições da invenção podem ser preparadas deforma extemporânea, no momento da liberação,particularmente quando estiver sendo usado um adjuvante.Dessa forma, a invenção fornece kits que incluem os várioscomponentes prontos para mistura. O kit permite que oadjuvante e o antigeno sejam mantidos separadamente até omomento da utilização. Esse arranjo é particularmente útilquando se utiliza um adjuvante de emulsão óleo-em-água.
Os componentes estão fisicamente separados uns dosoutros dentro do kit, e essa separação pode ser obtida devárias formas. Por exemplo, os dois componentes podem estarem dois recipientes separados, por exemplo, frascos. 0conteúdo dos dois frascos pode então ser misturado, porexemplo, por remoção do conteúdo de um frasco eadicionando-o ao outro frasco, ou removendo-seseparadamente o conteúdo de ambos os frascos e misturando-os em um terceiro recipiente.
Em um arranjo preferido, um dos componentes do kitestá em uma seringa e o outro está em um recipiente como,por exemplo, um frasco. A seringa pode ser usada (porexemplo, com uma agulha) para inserir seu conteúdo nosegundo recipiente para mistura, e a mistura pode então serremovida da seringa. 0 conteúdo misto da seringa pode entãoser administrado a um paciente, tipicamente por meio de umanova agulha estéril. A embalagem de um componente em umaseringa elimina a necessidade de utilização de uma seringaseparada para administração ao paciente.
Em outro arranjo preferido, os dois componentes do kitpodem ser mantidos juntos, mas separadamente, na mesmaseringa, por exemplo, uma seringa de câmara dupla, porexemplo, aquelas reveladas nas referências 201-208 etc.Quando a seringa é acionada (por exemplo, duranteadministração a um paciente), o conteúdo das duas câmaras é,misturado. Esse arranjo evita a necessidade de uma etapaseparada de mistura no momento da utilização.
Os componentes do kit geralmente estarão em formaaquosa. Em alguns arranjos, um componente (tipicamente ocomponente antigênico, e não o componente adjuvante) estáem forma seca (por exemplo, em uma forma liofilizada) , como outro componente estando em forma aquosa. Os doiscomponentes podem ser misturados a fim de reativar ocomponente seco e gerar uma composição aquosa paraadministração a um paciente. Um componente liofilizadotipicamente estará localizado dentro de um frasco, e não emuma seringa. Os componentes secos podem incluirestabilizantes como, por exemplo, lactose, sacarose oumanitol, além de misturas destes, por exemplo, misturas delactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol etc. Umarranjo possível utiliza um componente adjuvante aquoso emuma seringa pré-preenchida e um componente antigênicoliofilizado em um frasco.Embalagem de composições ou componentes do kit
Recipientes adequados para as composições da invenção(ou para os componentes do kit) incluem frascos, seringas(por exemplo, seringas descartáveis), sprays nasais etc.Esses recipientes devem ser estéreis.
Quando uma composição/componente está localizado em umfrasco, o frasco preferivelmente é feito de um material devidro ou de plástico. O frasco é pref erivelmenteesterilizado antes da composição ser adicionada a ele. Paraevitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, osfrascos são preferivelmente lacrados com uma tampa semlátex, e a ausência de látex em todo o material deembalagem é preferida. 0 frasco pode incluir uma dose únicade vacina, ou pode incluir mais de uma dose (um frasco"multidoses"), por exemplo, 10 doses. Frascos preferidossão feitos de vidro incolor.
Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um Luerlock) adaptada de tal forma que uma seringa pré-preenchidapossa ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa possaser expelido no frasco (por exemplo, para reconstituir omaterial Iiofilizado nele contido), e o conteúdo do frascopossa ser removido de volta para a seringa. Após remoção daseringa do frasco, uma agulha pode então ser anexada, e acomposição pode ser administrada a um paciente. A tampapreferivelmente está localizada dentro de um lacre oucobertura, de tal forma que o lacre ou cobertura tenha queser removida, antes que a tampa possa ser acessada. Umfrasco pode ter uma tampa que permite a remoção assépticade seu conteúdo, particularmente para frascos multidoses.
Quando um componente é embalado em uma seringa, aseringa pode ter uma agulha a ela anexada. Caso uma agulhanão esteja anexada, uma agulha separada poderá serfornecida com a seringa para montagem e uso. Uma agulhadesse tipo pode ter uma proteção. Preferem-se agulhas desegurança. Agulhas de 2,54 cm/23 gauge, 2,54 cm/25 gauge e0,625 cm/25 gauge são típicas. As seringas podem serfornecidas com rótulos destacáveis, nos quais podem serimpressos o número do lote, a estação da influenza e a datade validade do conteúdo, para facilitar o gerenciamento dosregistros. 0 embolo na seringa preferivelmente possui umplugue para evitar que o êmbolo seja acidentalmenteremovido durante a aspiração. As seringas podem ter umatampa e/ou êmbolo de borracha de látex. Seringasdescartáveis contêm uma dose única de vacina. A seringageralmente terá uma tampa na ponta para lacrar a ponta,entes da adesão de uma agulha, e a tampa da pontapreferivelmente é feita de uma borracha de butil. Caso aseringa e a agulha sejam embaladas separadamente, a agulhapreferivelmente será adaptada com uma proteção de borrachade butil. Seringas preferidas são aquelas comercializadassob o nome comercial "Tip-Lok ™".
Os recipientes podem ser marcados para exibir umvolume de meia dose, por exemplo, para facilitar aaplicação em crianças. Por exemplo, uma seringa contendouma dose de 0,5 ml pode ter uma marca que exiba um volumede 0,2 5 ml.
Quando é utilizado um recipiente de vidro (porexemplo, uma seringa ou um frasco), prefere-se utilizar umrecipiente feito de um vidro de borossilicato, e não de umvidro de cal sodada.Um kit ou uma composição pode ser embalado (porexemplo, na mesma caixa) com um folheto que inclui detalhesda vacina, por exemplo, instruções para administração,detalhes dos antigenos dentro da vacina etc. As instruçõestambém podem conter avisos, por exemplo, para manter umasolução de adrenalina prontamente disponível em caso dereação anafilática após vacinação etc. Em algumasmodalidades da invenção, o folheto estabelecerá que avacina inclui proteína da matriz.
Métodos de tratamento e administração da vacina
As composições da invenção são adequadas paraadministração a pacientes humanos, e a invenção fornece ummétodo de despertar uma resposta imunológica em umpaciente, que compreende a etapa de administração de umacomposição da invenção ao paciente.
A invenção também fornece um kit ou uma composição dainvenção para uso como medicamento.
A invenção também fornece o uso de: (i) uma preparaçãode antígeno do vírus influenza que inclui hemaglutinina eproteínas da matriz, preparada a partir de vírusdesenvolvido em cultura de células, na fabricação de ummedicamento para despertar uma resposta imunológica em umpaciente.
A resposta imunológica despertada por esses métodos eusos geralmente incluirá uma resposta de anticorpos,preferivelmente uma resposta protetora de anticorpos.Métodos para avaliação de respostas de anticorpos,capacidade neutralizante e proteção após vacinação contra ovírus influenza são bem conhecidos na técnica. Estudos emhumanos demonstraram que as titulações de anticorpos contrahemaglutinina de vírus influenza humano estãocorrelacionadas à proteção (uma titulação da inibição dahemaglutinação da amostra de soro de cerca de 30-40 gerauma proteção em torno de 50% por infecção por um vírushomólogo) [209] . As respostas de anticorpos tipicamente sãomedidas por inibição de hemaglutinação, pormicroneutralização, por imunodifusão radial simples (SRID)e/ou por hemólise radial simples (SRH). Essas metodologiasde ensaio são bem conhecidas na técnica.
As composições da invenção podem ser administradas devárias formas. A via de imunização mais preferida é porinjeção intramuscular (por exemplo, no braço ou na perna),mas outras vias disponíveis incluem injeção subcutânea,intranasal [210-212], oral [213], intradérmica [214,215],transcutânea, transdérmica [216] etc.
As vacinas preparadas de acordo com a invenção podemser usadas para tratar tanto crianças quanto adultos. Asvacinas contra influenza são atualmente recomendadas parauso em imunização pediátrica e de adultos, a partir daidade de 6 meses. Dessa forma, o paciente pode ter menos de1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade ou, pelo menos, 55 anos de idade.Pacientes preferidos para receber as vacinas são os idosos(por exemplo, > 50 anos de idade, > 60 anos de idade e,preferivelmente, > 65 anos de idade) , as crianças (porexemplo, < 5 anos de idade), pacientes hospitalizados,profissionais da área de saúde, militares, mulheresgrávidas, os doentes crônicos, pacientes imunodeficientes,pacientes que receberam um composto antiviral (por exemplo,um composto de oseltamivir ou zanainivir; veja abaixo) nos7 dias anteriores à administração da vacina, pessoas comalergias ao ovo e pessoas que viajam para o exterior. Noentanto, as vacinas não são adequadas apenas para essesgrupos, e podem ser usadas de forma geral em uma população.Para cepas pandêmicas, prefere-se a administração a todasas faixas etárias.
As composições preferidas da invenção satisfazem 1, 2ou 3 dos critérios CPMP quanto à eficácia. Em adultos (18-60 anos) , esses critérios são: (1) > 70% de soroproteção;(2) >4 0% de soroconversão; e/ou (3) um aumento GMT de >2,5 vezes. Em idosos (> 60 anos), esses critérios são: (1)> 60% de soroproteção; (2) > 3 0% de soroconversão; e/ou (3)um aumento GMT de > 2 vezes. Esses critérios se baseiam emestudos abertos com pelo menos 50 pacientes.
O tratamento pode ser por um esquema de dose única oupor um esquema de doses múltiplas. Doses múltiplas podemser usadas em um esquema de imunização primária e/ou em umesquema de imunização de reforço. Em um esquema de dosesmúltiplas, as várias doses podem ser dadas pela mesma viaou por vias diferentes, por exemplo, uma dose primáriaparenteral e um reforço mucoso, uma dose primária mucosa eum reforço parenteral etc. A administração de mais de umadose (tipicamente duas doses) é particularmente útil empacientes imunologicamente virgens, por exemplo, parapessoas que nunca receberam uma vacina contra influenzaantes, ou para a vacinação contra um novo subtipo de HA(como em um surto pandêmico). Doses múltiplas tipicamenteserão administradas com um intervalo de pelo menos 1 semana(por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cercade 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cercade 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanasetc. ) .
As vacinas produzidas pela invenção podem seradministradas aos pacientes simultaneamente (por exemplo,durante a mesma consulta médica ou visita a um profissionalde saúde ou centro de vacinação) com outras vacinas, porexemplo, simultaneamente com uma vacina contra sarampo, umavacina contra caxumba, uma vacina contra rubéola, umavacina MMR, uma vacina contra varicela, uma vacina MMRV,uma vacina contra difteria, uma vacina contra tétano, umavacina contra pertussis, uma vacina DTP, uma vacinaconjugada de H. influenzae do tipo B, uma vacina inativadade poliovírus, uma vacina contra o vírus da hepatite B, umavacina meningocócica conjugada (por exemplo, uma vacinatetravalente A-C-W135-Y), uma vacina contra o vírussincicial respiratório, uma vacina pneumocócica conjugada•etc. A administração simultaneamente com uma vacinapneumocócica e/ou uma vacina meningocócica éparticularmente útil em pacientes idosos.
Da mesma forma, as vacinas da invenção podem seradministradas aos pacientes simultaneamente (por exemplo,durante a mesma consulta médica ou visita a um profissionalde saúde) com um composto antiviral e, em particular, umcomposto antiviral ativo contra vírus influenza (porexemplo, oseltamivir e/ou zanamivir). Esses antiviraisincluem inibidores da neuraminidase, por exemplo, um ácido(3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexeno-l-carboxílico ou ácido 5-(acetilamino)-4 -[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anidro-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galactonon-2-enônico, incluindo ésteres destes(por exemplo, os ésteres etílicos) e sais destes (porexemplo, os sais de fosfato) . Um antiviral preferido é oácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi) -1-ciclohexeno-1-carboxíIico, éster etilico, fosfato (1:1),também conhecido como fosfato de oseltamivir (TAMIFLU™) .
Ensaios
Para caracterizar uma vacina contra influenza, podeser útil determinar a quantidade de proteína da matriz queestá presente. Dessa forma, a invenção fornece ensaios paraanálise de vacinas contra influenza, em que uma amostra davacina é analisada para determinar a presença de proteínada matriz. Os ensaios são particularmente úteis para apesquisa de fragmentos de proteína Ml.
A vacina contra influenza pode incluir antígenos devírus influenza A e/ou influenza Β. A invenção forneceensaios para análise das vacinas que compreendem antígenosde um vírus influenza B, em que uma amostra da vacina éanalisada para determinar a presença de uma proteína damatriz do vírus influenza B.
A vacina contra influenza pode incluir antígenos devários subtipos de HA. A invenção fornece ensaios para aanálise de vacinas que compreendem antígenos de um vírusinfluenza A, em que uma amostra da vacina é analisada paradeterminar a presença de uma proteína da matriz do vírusinfluenza A, e em que o vírus influenza A possui um subtipode hemaglutinina selecionado de: H2, H4, H5, H6, H7, H8,H9, HlO, Hll, H12, H13, H14, H15 OU H16.
A vacina contra influenza pode incluir antígenosdesenvolvidos em cultura de células. A invenção forneceensaios para análise de vacinas desenvolvidas em cultura decélulas, em que uma amostra da vacina é analisada paradeterminar a presença de uma proteína da matriz do vírusinfluenza.
A vacina contra influenza pode incluir um adjuvante. Ainvenção fornece ensaios para a análise de vacinas comadjuvantes contra influenza, em que uma amostra da vacina éanalisada para determinar a presença de uma proteína damatriz do vírus influenza. A invenção também forneceensaios para a análise de vacinas sem adjuvantes contrainfluenza, em que uma amostra da vacina sem adjuvante éanalisada para determinar a presença de uma proteína damatriz do vírus influenza, e em que um adjuvante é entãoadicionado à vacina.
Esses ensaios tipicamente serão imunoensaios, porexemplo, um western blot ou ELISA. Um imunoensaio podeutilizar anticorpos policlonais ou monoclonais. Quando éusado um anticorpo monoclonal, em algumas modalidades elenão é um anticorpo murídeo, pode exemplo, um anticorpomurídeo IgGl. Anticorpos que reconhecem fragmentos de Mlpodem ser usados nos ensaios, incluindo aqueles quereconhecem os fragmentos de Ml aqui revelados, por exemplo,anticorpos que reconhecem fragmentos com um peso molecularde 10 kDa ou menos (por exemplo, < 5 kDa) , que reconhecemfragmentos desprovidos da metionina no terminal N, quereconhecem fragmentos com a seqüência do terminal N do ID.DE SEQ. N°: 15, que reconhecem o ID. DE SEQ. N°: 28 e/ou29, que reconhecem fragmentos que incluem o ID. DE SEQ. N°:30, que reconhecem fragmentos com um resíduo modificado deforma covalente do terminal N etc.
Os ensaios são particularmente úteis para a detecçãode fragmentos de proteína Ml, tais como fragmentos com umpeso molecular de 10 kDa ou menos (por exemplo, < 5 kDa)e/ou os fragmentos aqui revelados (por exemplo, desprovidosda metionina do terminal N da seqüência total de Ml) .
Ensaios preferidos podem distinguir entre a presença deproteína Ml de comprimento total e fragmentos da proteínaMl, e também podem distinguir entre diferentes fragmentos.
Os ensaios podem ser qualitativos, semiquantitativosou quantitativos.
A invenção também fornece vacinas que foram testadasdesta forma.
Aspectos adicionais da invenção
A invenção fornece uma composição imunogênica quecompreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz dovírus influenza, e (ii) um adjuvante. As proteínas do vírusinfluenza podem ser preparadas a partir de vírusdesenvolvido em cultura de células ou desenvolvidos no ovo.Como descrito acima, a composição também pode incluircomponentes adicionais, por exemplo, proteína neuraminidasedo vírus influenza, veículos/excipientes farmacêuticos etc.
A invenção também fornece um método para a preparaçãode uma composição imunogênica que compreende as etapas de:(i) crescimento do vírus influenza; (ii) preparação de umacomposição de antígeno a partir de vírus desenvolvidos naetapa (i) , em que a composição de antígeno compreende
hemaglutinina e proteínas da matriz; e (iii) combinação dacomposição de antígeno com um adjuvante, para gerar acomposição imunogênica.
A invenção fornece uma composição imunogênica que compreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz dovírus influenza, em que a hemaglutinina possui um subtiposelecionado de: H2 , H4 , H5, H6 , H7 , H8, H9, HlO, Hll, H12,H13, H14, H15 ou H16.
A invenção também fornece um método para a preparaçãode uma composição imunogênica que compreende as etapas de:(i) crescimento do vírus influenza; (ii) preparação de umacomposição de antígeno a partir de vírus desenvolvidos naetapa (i) , em que a composição de antígeno compreendehemaglutinina e proteínas da matriz, e em que ahemaglutinina possui um subtipo selecionado de: H2, H4, H5,H6, H7, H8, H9, HlO, Hll, H12, H13, H14, H15 OU H16; e(iii) combinação da composição de antígeno com umadjuvante, para gerar a composição imunogênica.
A invenção fornece uma composição imunogênica quecompreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz dovírus influenza, em que a concentração de hemaglutinina nacomposição é de 29 μg/ml ou menos (por exemplo, < 28 pg/ml,
< 27 pg/ml, < 26 μg/ml, < 25 pg/ml, < 24 pg/ml, < 23 pg/ml,
< 22 pg/ml, < 21 pg/ml, < 20 pg/ml, < 19 pg/ml, < 18 μg/ml,
< 17 pg/ml, < 16 pg/ml, < 15 pg/ml, < 14 pg/ml, < 13 pg/ml,
< 12 pg/ml, < 11 pg/ml, < 10 pg/ml, < 9 pg/ml, < 8 pg/ml, <7 pg/ml, < 6 pg/ml, < 5 pg/ml, < 4 pg/ml, < 3 pg/ml, < 2pg/ml). A composição pode incluir hemaglutinina de mais deuma cepa de vírus influenza, quando então a referidaconcentração é por cepa (ou seja, < 29 μg/ml por cepa).
A invenção fornece uma composição imunogênica quecompreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz dovírus influenza, em que a concentração de hemaglutinina nacomposição é de 31 pg/ml ou mais (por exemplo, > 32 pg/ml,> 33 pg/ml, > 34 pg/ml, > 35 pg/ml, > 40 pg/ml, > 45 pg/ml,≥50 pg/ml, > 55 pg/ml, > 60 pg/ml, > 70 pg/ml, > 80 pg/ml,≥90 pg/ml, > 100 pg/ml etc., mas tipicamente < 200 pg). Acomposição pode incluir hemaglutinina de mais de uma cepade vírus influenza, quando então a referida concentração épor cepa (ou seja, > 31 pg/ml por cepa).
A invenção também fornece uma composição imunogênicaque compreende uma proteína M2 da matriz do vírusinfluenza, mas que é substancialmente livre de uma proteínaMl da matriz do vírus influenza, como definido acima.Vacinas que contêm M2 estão atualmente sendo desenvolvidas[217] . M2 é codificada naturalmente por um segmento viralque também codifica Ml. Dessa forma, em um sistema deexpressão recombinante, talvez a proteína Ml seja expressacomo subproduto. De acordo com a invenção, essa expressãocolateral pode ser evitada, ou as proteínas Ml da matrizpodem ser removidas da composição que contém M2. A proteínaM2 pode ser uma proteína de comprimento total ou pode ser,por exemplo, um fragmento de M2, por exemplo, o domínioextracelular de M2 (conhecido na técnica como "M2e"). Aproteína M2 pode ser conjugada a outro antígeno, porexemplo, a um antígeno do vírus da hepatite Β. A vacinatambém pode ser livre de HA e/ou NA.Considerações gerais
O termo "que compreende" engloba "que inclui", além de"que consiste", por exemplo, uma composição "quecompreende" X pode consistir exclusivamente em X ou podeincluir algo adicional, por exemplo, X + Y.A palavra "substancialmente" não exclui
"completamente", por exemplo, uma composição que é"substancialmente livre" de Y pode ser completamente livrede Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" podeser omitida da definição da invenção.
0 termo "cerca de", em relação a um valor numérico x,significa, por exemplo, χ ± 10%.
A menos que especificamente definido, um processo quecompreende uma etapa de mistura de dois ou mais componentesnão exige qualquer ordem específica de mistura. Dessaforma, os componentes podem ser misturados em qualquerordem. Quando há três componentes, dois componentes podemser combinados entre eles, e depois a combinação pode sercombinada com o terceiro componente etc.
Quando são usados materiais animais (e particularmentebovinos) na cultura de células, eles devem ser obtidos defontes que sejam livres de encefalopatias espongiformestransmissíveis (TSEs) e, em particular, livres deencefalopatia espongiforme bovina (BSE). Em geral, prefere-se o cultivo de células na ausência total de materiais deorigem animal.
Quando um composto é administrado ao corpo como partede uma composição, aquele composto pode alternativamenteser substituído por um pró-fármaco adequado.
Quanto um substrato celular é usado para procedimentosrecombinantes ou de genética reversa, ele preferivelmente éum que tenha sido aprovado para uso na produção de vacinashumanas, por exemplo, como em Ph Eur, capítulo geral 5.2.3.
A identidade entre seqüências de polipeptídeos épreferivelmente determinada pelo algoritmo de pesquisa dehomologia de Smith-Waterman, da forma implementada noprograma MPSRCH (Oxford Molecular), com o uso de pesquisade afinidade de lacuna igap) com os parâmetros: penalidadede lacuna aberta = 12 e penalidade de extensão de lacuna =1 .
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é um SDS-PAGE de várias preparações devacina. As raias "M" são marcadores de peso molecular(kDa) . A raia 1 é a vacina desenvolvida em MDCK. As raias2-6 são vacinas comerciais existentes. As setas mostram (a)HA1 (b) HA2 (c) o fragmento Ml da invenção.
A Figura 2 mostra os resultados da análise westernblot de vírions influenza fracionados com o uso de anti-soro de coelhos imunizados com o fragmento da proteína damatriz de ~5 kDa. O painel da esquerda é um blot com o usode soros pré-imunes, e o painel da direita utiliza sorospós - imunes.
MODOS PARA REALIZA A INVENÇÃO
Embora trabalhando em uma vacina de antígenos desuperfície purificados para o vírus influenza, em que osvírions cresceram em células MDCK, foi observado que umaquantidade relativamente grande de polipeptídeo de baixopeso molecular podia ser detectada por SDS-PAGE após adivisão do vírus influenza A com CTAB. Esse polipeptídeo debaixo peso molecular também estava presente durante apurificação adicional do antígeno, e estava presente napreparação final de antígenos de superfície. Parainvestigar esse polipeptídeo, foi usado um sistema tampãoque permite a identificação de polipeptídeos tão pequenosquanto 2 kDa (Géis Bis-Tris NuPAGE™ Novex de Invitrogen).Com o uso desse sistema, foi identificada uma banda depolipeptídeo com um peso molecular aparente de ~5 kDa. Essabanda de polipeptídeo não era observada nas vacinas atuaisINFLEXAL V™, INFLUSPLIT™, MUTAGRIΡ™, VAXIGRIP™,BEGRIVAC™, FLUARIX™, INFLUVAC™ ou FLUVIRIN™, todas elaspreparada a partir de vírions desenvolvidos no ovo.Surpreendentemente, a banda de polipeptideo foi detectadaem alguns lotes de AGRIPPAL™, mas sua existência oupresença não era previamente reconhecida.
A imunização de coelhos com a banda de ~5 kDa induziuanticorpos que eram capazes de detectar a proteína Mlnativa. A Figura 2 mostra os resultados da análise westernblot de vírions influenza fracionados com o uso de anti-soros dos coelhos, com forte reatividade para a proteína Mldo vírion. Dessa forma, um polipeptideo na banda de ~5 kDacarrega epítopos que são imunogênicos e podem causar aprodução de anticorpos que se ligam à proteína Ml nativacorrespondente.
A análise da seqüência de aminoácidos do terminal N dabanda de ~5 kDa derivada de dois vírus diferentes (um vírusHlNl e um vírus H3N2) revelou um peptídeo com seqüência doterminal N de EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N° : 15). Essaseqüência de aminoácidos é um fragmento da proteína Ml dovírus influenza idêntico às posições de aminoácidos 114 a125 do ID. DE SEQ. N0: 1.
Uma investigação posterior com o uso de análise MS defragmentos trípticos revelou um fragmento mais abundantecom a seqüência de aminoácidos do terminal N do ID. DE SEQ.N°: 28, que é desprovida da metionina do terminal N do ID.DE SEQ. N°: 1:
SLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQR (ID. DE SEQ. N°: 28)
O terminal C desse fragmento pode ter um resíduo Argadicional (ou seja, SLL...QRR, ID. DE SEQ. N°: 29). Aserina do terminal N pode ser modificada de formacovalente, por exemplo, acetilada. 0 12-mer do terminal Ndesse fragmento (SLLTEVETYVLS; ID. DE SEQ. N°: 30) é bemconservado entre cepas.
As composições da invenção podem conter ambos osfragmentos, com o fragmento próximo ao terminal N (porexemplo, ID. DE SEQ. N°: 28) sendo mais abundante.
Entende-se que a invenção foi descrita apenas comoexemplo, e que podem ser feitas modificações aindapermanecendo dentro do escopo e do espírito da invenção.
REFERÊNCIAS
(cujos conteúdos são aqui incorporados por referência)
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<130> PD43DÜ4U0
<1M0> PCTÍIB2007Í001150<1M1> 26Í01Í2007
<150> 733.fi
<151> 27101(2006
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<170> SeqUinTl-. version 1-02<P1Q> 1
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Claims (26)

1. Composição imunogênica, caracterizada porcompreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírusinfluenza, não como um vírion inteiro, preparada a partirde vírus desenvolvido em cultura de células.
2. Composição imunogênica, caracterizada porcompreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírusinfluenza, não como um vírion inteiro, em que a composiçãonão contém ovalbumina.
3 . Composição imunogênica, caracterizada porcompreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírusinfluenza, em que: a proteína da matriz possui um pesomolecular de menos de 20 kDa e compreende uma seqüência deaminoácidos que possui pelo menos 50% de identidade para oID. DE SEQ. N0: 1.
4. Composição imunogênica, caracterizada porcompreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírusinfluenza, em que: a proteína da matriz possui um pesomolecular de menos de 2 0 kDa e compreende uma seqüência deaminoácidos que possui pelo menos 75% de identidade para oID. DE SEQ. N0: 28.
5. Método para a preparação de uma composiçãoimunogênica, caracterizado por compreender as etapas de:(i) crescimento do vírus influenza em cultura decélulas;(ii) preparação de uma composição de antígeno a partirde vírus desenvolvidos na etapa (i), em que a composição deantígeno compreende hemaglutinina e proteínas da matriz nãocomo um vírion inteiro; e(iii) combinação da composição de antígeno com umveículo farmacêutico, para gerar a composição imunogênica.
6. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fatode que a proteína da matriz compreende uma seqüência de 2 0aminoácidos que possui pelo menos 80% de identidade para oID. DE SEQ. N0: 2.
7. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelofato de que a proteína da matriz compreende um epítopo decélula T da proteína Ml do vírus influenza.
8. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizadopelo fato de que a proteína da matriz compreende uma oumais das seguintes seqüências de aminoácidos: ID. DE SEQ.N°: 1; ID. DE SEQ. N°: 21; ID. DE SEQ. N° : 22; ID. DE SEQ.N°: 23; ID. DE SEQ. N°: 24; ID. DE SEQ. N°: 25; ID. DE SEQ.N°: 26; ID. DE SEQ. N°: 27.
9. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizadopelo fato de que a proteína da matriz possui uma seqüênciade aminoácidos que é um fragmento de uma seqüência deaminoácidos da proteína da matriz Ml de comprimento total.
10. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9,caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz édesprovida da metionina do terminal N da seqüência de Mlnatural.
11. Composição ou método, de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a proteínada matriz possui uma seqüência do terminal N SLLTEVETYVLS(ID. DE SEQ. N0 : 30) .
12. Composição ou método, de acordo com areivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a serinado terminal N do ID. DE SEQ. N°: 30 é modificada de formacovalente, por exemplo, acetilada.
13. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9,caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz possuiuma seqüência do terminal N EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°:-18) .
14. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou-13, em que a composição é caracterizada pelo fato decompreender: (i) uma primeira proteína da matriz que possuiuma seqüência do terminal N SLLTEVETYVLS (ID. DE SEQ. N° :-30) ; e (ii) uma segunda proteína da matriz que possui umaseqüência do terminal N EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18).
15. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a proteína damatriz está presente em uma concentração entre 1 pg/ml e 15pg/ml.
16. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de compreender vírusinfluenza dividido ou antígenos de superfície de influenzapurificado.
17. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que ahemaglutinina é de ura subtipo Hl, H2, H3, H5, H7 ou H9 dovírus influenza A.
18. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13, 14, 15, 16, ou 17, caracterizado pelo fato de que asproteínas do vírus influenza são preparadas a partir de umvírus influenza desenvolvido em uma cultura de uma célulahospedeira, e de que a composição contém menos de 10 ng deDNA celular da célula hospedeira.
19. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13, 14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que acomposição contém entre 0,1 e 20 pg de hemaglutinina porcepa viral.
20. Composição ou método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato deque a composição inclui um adjuvante.
21. Composição ou método, de acordo com areivindicação 20, caracterizado pelo fato de que oadjuvante compreende um ou mais sais de alumínio.
22. Composição ou método, de acordo com areivindicação 20, caracterizado pelo fato de que oadjuvante compreende uma emulsão óleo-em-água.
23. Composição imunogênica caracterizada pelo fato decompreender: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz dovírus influenza, não como um vírion inteiro, e (ii) umadj uvante.
24. Composição imunogênica caracterizada pelo fato decompreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírusinfluenza, não como um vírion inteiro, em que ahemaglutinina possui um subtipo selecionado de: H2, H4, H5,H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14 , H15 ou H16.
25. Composição imunogênica caracterizada pelo fato decompreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírusinfluenza, em que a concentração de hemaglutinina nacomposição é de 2 9 pg/ml por cepa ou menor.
26. Ensaio imunológico para análise de uma vacinacontra influenza, caracterizado pelo fato de que umaamostra da vacina é analisada para determinar a presença deum fragmento de proteína Ml da matriz.
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