BRPI0707300B1 - vacina contra vírion influenza dividido ou antígeno de superfície purificado e método para a preparação de uma composição imunogênica - Google Patents

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Abstract

composição imunogênica, método para preparação da mesma e ensaio imunológico para análise de uma vacina contra influenza. uma composição imunogênica que compreende hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza. estas podem ser de vírus influenza desenvolvidos em cultura de células, e não em ovos. a proteína da matriz pode ser um fragmento de uma proteína da matriz viral de comprimento total, por exemplo, um fragmento ml da matriz, com um peso molecular de menos de 20 kda. a composição pode ser uma vacina de subunidade que compreende glicoproteinas de superfície purificadas.

Description

VACINA CONTRA VÍRION INFLUENZA DIVIDIDO OU ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE PURIFICADO E MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA
Todos os documentos aqui citados são incorporados por referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
Essa invenção está no campo das vacinas para a proteção contra infecção pelo vírus influenza e, em particular, vacinas que incluem proteínas da matriz.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA Várias formas de vacinas contra o vírus influenza estão disponíveis atualmente (por exemplo, veja os capítulos 17 & 18 da referência 1). Vacinas são geralmente baseadas em vírus vivo ou em vírus inativado. Vacinas inativadas podem se basear em vírions inteiros, vírions "divididos" (splít) ou em antígenos de superfície purificados. A hemaglutinina (HA) é o principal imunógeno em vacinas inativadas de influenza, e as doses de vacina são padronizadas por referência aos níveis de HA, tipicamente medidas por um ensaio de imunodifusão radial simples (SRID). As vacinas atuais tipicamente contêm cerca de 15 pg de HA por cepa por dose. Além de conter HA de influenza, as vacinas podem ainda incluir proteínas do vírus influenza. Por exemplo, todas as vacinas atuais incluem neuraminidase (NA). A referência 2 relata que as vacinas contra influenza européias também podem incluir quantidades significativas de outras proteínas do vírus influenza. Por exemplo, a proteína da matriz (M) foi encontrada em vacinas divididas, mas não em vacinas de antígeno de superfície purificado.
Além dos antígenos do vírus influenza, a referência 2 relata que as vacinas também contêm proteínas derivadas do ovo, por exemplo, ovalbumina. Essas proteínas surgem porque o método-padrão para o crescimento do vírus influenza na fabricação de vacinas utiliza ovos de galinha embrionados, com o vírus sendo purificado do conteúdo do ovo (fluido alantóico).
REVELAÇÃO DA INVENÇÃO
Ao invés de utilizar ovos para o crescimento viral na fabricação de vacinas, foi proposto que os vírus cresçam em cultura de células. Durante a investigação dessa técnica, os inventores detectaram inesperadamente seqüências da matriz. Em particular, enquanto a referência 2 não encontrou proteína da matriz em vacinas de antígeno de superfície purificado preparadas a partir de vírions desenvolvidos em ovos, os inventores detectaram proteína da matriz em vacinas de antígeno de superfície purificado preparadas a partir de vírions desenvolvidos em cultura de células.
Dessa forma, a invenção fornece uma composição imunogênica que compreende hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, preparada a partir de vírus desenvolvido em cultura de células. A invenção também fornece uma composição imunogênica que compreende hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, em que a composição não contém ovalbumina. A composição também pode ser livre de outras proteínas do ovo (por exemplo, ovomucóide) e de DNA de galinha. A invenção também fornece um método para a preparação de uma composição imunogênica que compreende as etapas de: (i) crescimento do vírus influenza em cultura de células; (ii) preparação de uma composição de antígeno a partir de vírus desenvolvidos na etapa (i), em que a composição de antígeno compreende hemaglutinina e proteínas da matriz; e (iii) combinação da composição de antígeno com um veículo farmacêutico, para gerar a composição imunogênica.
Uma proteína da matriz em particular que foi observada é um fragmento de M1. A proteína M1 de comprimento total é uma proteína de 27,8 kDa, mas o fragmento observado possui um peso molecular de cerca de 5 kDa em um gel de SDS-PAGE de baixo peso molecular (veja abaixo). Ele inclui uma seqüência de aminoácidos altamente conservada LSYSXGALA (ID. DE SEQ. N°: 1), em que X é A ou T. Dessa forma, a invenção fornece uma composição imunogênica que compreende hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, em que: a proteína da matriz possui um peso molecular de menos de 2 0 kDa e compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 50% de identidade (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais) para o ID. DE SEQ. N°: 1. Outro fragmento de M1 que foi observado possui comprimento em torno de 75 aa e é desprovido da metionina do terminal N da seqüência total de M1 (por exemplo, ele possui a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 28 ou ID. DE SEQ. N°: 29). Dessa forma, a invenção fornece uma composição imunogênica que compreende hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, em que a proteína da matriz é uma proteína M1 desprovida da metionina do terminal N da seqüência de M1 natural. A proteína da matriz pode compreender uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 50% de identidade (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais) para o ID. DE SEQ. N°: 28 ou para o ID. DE SEQ. N°: 29. Além de não possuir a metionina do terminal N, o fragmento pode ser desprovido de um ou mais aminoácidos adicionais abaixo da metionina do terminal N.
Embora essas composições sejam preparadas preferivelmente a partir de vírus desenvolvido em cultura de células, elas podem alternativamente ser preparadas de outras formas, por exemplo, por adição da proteína da matriz e uma vacina derivada do ovo, com a utilização de um protocolo de purificação com vírions derivados do ovo, o que resulta na produção e presença da proteína da matriz, por combinação da proteína da matriz com uma HA expressa de forma recombinante (e, opcionalmente, outras proteínas expressas de forma recombinante) etc.
Preparação de componentes antigênicos A invenção não utiliza um antígeno de vírion inteiro (WV), ou seja, ela não engloba vacinas que utilizam um vírus vivo ou um vírion inativado inteiro. Em vez disso, os antígenos da invenção são antígenos não-WV, por exemplo, vírions divididos ou antígenos de superfície purificados. As composições da invenção compreendem pelo menos dois antígenos do vírus influenza: hemaglutinina e matriz. Elas também podem incluir outro(s) antígeno(s) do vírus influenza, por exemplo, neuraminidase. Os antígenos tipicamente serão preparados a partir de vírions influenza (preferivelmente crescidos em cultura de células), mas, em algumas modalidades, os antígenos podem ser expressos em um hospedeiro recombinante (por exemplo, em uma linhagem de células de inseto com o uso de um vetor de baculovírus) e usados na forma purificada [3,4]. Em geral, no entanto, os antígenos serão de vírions.
Na preparação de antígenos não-WV a partir de vírions, os vírions podem ser inativados. Meios químicos para a inativação de um vírus incluem o tratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais dos seguintes agentes: detergentes, formaldeído, β-propiolactona, azul de metileno, psoraleno, carboxifulereno (C60), etilamina binária, acetil etilenoimina, ou combinações destes. Métodos não químicos de inativação viral são conhecidos na técnica como, por exemplo, luz UV ou irradiação gama.
Os vírions podem ser coletados de líquidos que contêm vírus por vários métodos. Por exemplo, um processo de purificação pode envolver a centrifugação por zona com o uso de uma solução de gradiente linear de sacarose que inclui detergente para romper os vírions. Os antígenos podem então ser purificados, após diluição opcional, por diafiltração. Vírions divididos podem ser obtidos por tratamento de vírions purificados com detergentes (por exemplo, éter etílico, polissorbato 80, desoxicolato, tri-N-butil fosfato, Triton X-100, Triton N101, brometo de cetiltrimetilamônio, Tergitol NP9 etc.) para a produção de preparações sub-vírion, incluindo o processo de divisão "Tween-éter". Métodos de divisão dos vírus influenza são bem conhecidos na técnica, por exemplo, veja as referências 5-10 etc. A divisão do vírus é tipicamente realizada por ruptura ou fragmentação de vírus inteiros, sejam eles infecciosos ou não infecciosos, com uma concentração de ruptura de um agente de divisão. A ruptura resulta em uma solubilização total ou parcial das proteínas virais, alterando a integridade do vírus. Agentes de divisão preferidos são tensoativos não iônicos e iônicos (por exemplo, catiônicos), por exemplo, alquilglicosídeos, alquiltioglicosídeos, acil açúcares, sulfobetaínas, betaínas, polioxietilenoalquiléteres, N,N-dialquil-Glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanóis, compostos de amônio quaternário, sarcosil, CTABs (brometos de cetil trimetil amônio), tri-N-butil fosfato, Cetavlon, sais de mirisitiltrimetilamônio, lipofectina, lipofectamina e DOT-MA, os octil- ou nonilfenoxi polioxietanóis (por exemplo, os tensoativos Triton, por exemplo, Triton X-100 ou Triton N101), ésteres de polioxietileno sorbitano (os tensoativos Tween), éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno etc. Um procedimento de divisão útil utiliza os efeitos consecutivos de desoxicolato de sódio e formaldeído, e a divisão ocorre durante a purificação inicial do vírion (por exemplo, em uma solução de gradiente de densidade de sacarose). Dessa forma, um processo de divisão pode envolver a clarificação do material que contém o vírion (para a remoção de material não-vírion), concentração dos vírions coletados (por exemplo, com o uso de um método de adsorção, por exemplo, adsorção de CaHPO4), separação de vírions inteiros do material não-vírion, divisão do vírions com o uso de um agente de divisão em uma etapa de centrifugação por gradiente de densidade (por exemplo, com o uso de um gradiente de sacarose que contém um agente de divisão, por exemplo, desoxicolato de sódio), e depois filtração (por exemplo, ultrafiltração) para remoção de materiais indesejados. Os vírions divididos podem ser proveitosamente re-suspensos em solução isotônica de cloreto de sódio tamponada com fosfato. Os produtos BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ e FLUSHIELD™ são vacinas divididas.
Vacinas de antígeno de superfície purificado compreendem os antígenos de superfície de influenza, hemaglutinina e, tipicamente, também neuraminidase. Processos para a preparação dessas proteínas na forma purificada são bem conhecidos na técnica. Os produtos FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ e INFLUVAC™ são vacinas de subunidades.
Os antígenos de influenza também podem ser apresentados na forma de virossomas [11] (partículas lipossômicas sem ácido nucléico víral-líke), como nos produtos INFLEXAL VTM e INVAVAC™, mas prefere-se não usar virossomas com a presente invenção. Dessa forma, em algumas modalidades, o antígeno de influenza não está na forma de um virossoma. O vírus influenza pode ser atenuado. O vírus influenza pode ser sensível à temperatura. O vírus influenza pode ser adaptado ao frio. Essas três características são particularmente úteis quando se utiliza vírus vivo como antígeno.
As cepas do vírus influenza para uso em vacinas mudam de estação para estação. No atual período interpandêmico, as vacinas tipicamente incluem duas cepas de influenza A (H1N1 e H3N2) e uma cepa de influenza B, e as vacinas trivalentes são típicas. A invenção também pode utilizar HA de cepas pandêmicas (ou seja, cepas para as quais o receptor da vacina e a população humana geral são imunologicamente virgens), por exemplo, cepas dos subtipos H2, H5, H7 ou H9 (em particular, do vírus influenza A), e as vacinas contra influenza para cepas pandêmicas podem ser monovalentes ou podem ser baseadas em uma vacina trivalente normal suplementada por uma cepa pandêmica. Dependendo da estação e da natureza do antígeno incluído na vacina, no entanto, a invenção pode proteger contra um ou mais dos subtipos HA do vírus influenza A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16. A invenção pode proteger contra um ou mais dos vírus subtipos NA de influenza A N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 ou N9.
Além de serem adequadas à imunização contra cepas interpandêmicas, as composições da invenção são particularmente úteis para a imunização contra cepas pandêmicas. As características de uma cepa de influenza que geram o potencial para causar um surto pandêmico são: (a) ela contém uma nova hemaglutinina, comparada com as hemaglutininas em cepas humanas que circulam atualmente, ou seja, uma que não era evidente na população humana por mais de uma década (por exemplo, H2), ou que não havia sido observada previamente de forma alguma na população humana (por exemplo, H5, H6 ou H9, que geralmente só eram encontradas em populações de pássaros), de tal forma que a população humana será imunologicamente virgem para a hemaglutinina da cepa; (b) ela é capaz de ser transmitida horizontalmente na população humana; e (c) ela é patogênica para seres humanos. Um vírus com o tipo H5 de hemaglutinina é preferido para a imunização contra influenza pandêmica, por exemplo, uma cepa H5N1. Outras cepas possíveis incluem H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 e H7N7, e quaisquer outras cepas pandêmicas que potencialmente venham a surgir. Dentro do subtipo H5, um vírus pode se classificar em HA clado 1, HA clado 1', HA clado 2 ou HA clado 3 [12], com os clados 1 e 3 sendo particularmente relevantes.
Outras cepas cujos antígenos podem ser proveitosamente incluídos nas composições são cepas que são resistentes à terapia antiviral (por exemplo, resistentes ao oseltamivir [13] e/ou zanamivir), incluindo cepas pandêmicas resistentes [14].
As composições da invenção podem incluir antígeno(s) de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) cepas do vírus influenza, incluindo vírus influenza A e/ou vírus influenza B. As vacinas monovalentes não são preferidas, e quando uma vacina incluir mais de uma cepa de influenza, as diferentes cepas são tipicamente desenvolvidas separadamente e são misturadas após os vírus terem sido coletados e os antígenos terem sido preparados. Dessa forma, um processo da invenção pode incluir a etapa de mistura de antígenos de mais de uma cepa de influenza. Prefere-se uma vacina trivalente, que inclui antígenos de duas cepas do vírus influenza A e uma cepa do vírus influenza B.
Em algumas modalidades da invenção, as composições podem incluir antígeno de uma única cepa influenza A. Em algumas modalidades, as composições podem incluir antígeno de duas cepas de influenza A, desde que essas duas cepas não sejam H1N1 e H3N2. Em algumas modalidades, as composições podem incluir antígeno de mais de duas cepas de influenza A. O vírus influenza pode ser uma cepa recombinante (reassortant), e pode ter sido obtido por técnicas de genética reversa. Técnicas de genética reversa [por exemplo, 15-19] permitem que sejam preparados vírus influenza com segmentos genômicos desejados ín vitro com o uso de plasmídeos. Tipicamente, elas envolvem a expressão de: (a) moléculas de DNA que codificam as moléculas de RNA viral desejadas, por exemplo, de promotores polI, e (b) moléculas de DNA que codificam proteínas virais, por exemplo, de promotores polII, de forma que a expressão de ambos os tipos de DNA na célula leve à montagem de um vírion infeccioso intacto completo. O DNA preferivelmente fornece todo o RNA e todas as proteínas virais, mas também é possível usar um vírus auxiliar (helper) para fornecer uma parte do RNA e das proteínas. Métodos baseados em plasmídeos que utilizam plasmídeos separados para a produção de cada RNA viral são preferidos [20-22], e esses métodos também envolverão o uso de plasmídeos para a expressar de todas ou algumas (por exemplo, somente as proteínas PB1, PB2, PA e NP) das proteínas virais, com 12 plasmídeos sendo usados em alguns métodos.
Para reduzir o número de plasmídeos necessários, uma abordagem recente [23] combina diversos cassetes de transcrição de RNA polimerase I (para a síntese de RNA viral) no mesmo plasmídeo (por exemplo, seqüências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 segmentos de mRNA de influenza A), e diversas regiões que codificam proteína com promotores de RNA polimerase II no outro plasmídeo (por exemplo, seqüências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 transcritos de mRNA de influenza A). Aspectos preferidos do método da referência 23 envolvem: (a) regiões de codificação de mRNA PB1, PB2 e PA em um único plasmídeo; e (b) todos os 8 segmentos que codificam vRNA em um único plasmídeo. A inclusão dos segmentos de NA e HA em um plasmídeo e dos seis outros segmentos no outro plasmídeo também pode facilitar o processo.
Como alternativa ao uso dos promotores polI para codificar os segmentos de RNA viral, é possível usar promotores de bacteriófago polimerase [24]. Por exemplo, promotores para as SP6, T3 ou T7 polimerases podem convenientemente ser usados. Por causa da especificidade por espécie dos promotores polI, os promotores de bacteriófago polimerase podem ser mais convenientes para muitos tipos de células (por exemplo, MDCK), embora uma célula também tenha que ser transfectada com um plasmídeo que codifica a enzima polimerase exógena.
Em outras técnicas é possível usar promotores duplos polI e polII para codificar simultaneamente RNAs virais e para mRNAs passíveis de expressão a partir de um único modelo [25,26].
Dessa forma, um vírus influenza A pode incluir um ou mais segmentos de RNA de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6 segmentos de A/PR/8/34, com os segmentos HA e N sendo de uma cepa da vacina, ou seja, uma recombinante 6:2). Ele também pode incluir um ou mais segmentos de RNA de um vírus A/WSN/33, ou de qualquer outra cepa do vírus útil para a geração de vírus recombinante para a preparação da vacina. Tipicamente, a invenção protege contra uma cepa que é capaz de transmissão de ser humano para ser humano e, dessa forma, o genoma da cepa normalmente incluirá pelo menos um segmento de RNA que se originou em um vírus influenza mamífero (por exemplo, em um ser humano). Ele pode incluir segmento NS que se originou em um vírus influenza aviário.
Os vírus usados como fonte dos antígenos são geralmente desenvolvidos em cultura de células, mas, em algumas modalidades, eles podem se desenvolver em ovos. O método-padrão atual para o crescimento do vírus influenza utiliza ovos de galinha embrionados específicos, livres de patógenos (SPF), com o vírus sendo purificado do conteúdo do ovo (fluido alantóico). Mais recentemente, no entanto, foram desenvolvidos vírus em cultura de células animais e, por razões de velocidade e alergias de pacientes, esse método de crescimento é preferido. Caso seja usado o crescimento viral baseado no ovo, um ou mais aminoácidos poderão ser introduzidos no fluido alantóico do ovo, junto com o vírus [10]. O substrato celular tipicamente será uma linhagem de células de origem mamífera. Células de origem mamífera adequadas incluem, sem limitação, células de hamster, gado, primatas (incluindo seres humanos e macacos) e cachorros. Vários tipos de células podem ser usados, por exemplo, células renais, fibroblastos, células retinianas, células do pulmão etc. Exemplos de células de hamster adequadas são as linhagens de células que possuem os nomes BHK21 ou HKCC. Células de macaco adequadas são, por exemplo, células de macaco verde africano, por exemplo, células renais, como na linhagem de células Vero. Células de cachorro adequadas são, por exemplo, células renais, como na linhagem de células MDCK. Dessa forma, linhagens de células adequadas incluem, sem limitação: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38 etc. O uso de células mamíferas significa que as vacinas podem ser livres de DNA de galinha, além de serem livres de proteínas do ovo (por exemplo, ovalbumina e ovomucóide) reduzindo, dessa forma, a alergenicidade. Linhagens de células mamíferas preferidas para o crescimento de vírus influenza incluem: células MDCK [2730], derivadas do rim canino Madin Darby; células Vero [3133], derivadas do rim de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops); ou células PER.C6 [34], derivadas de retinoblastos embriônicos humanos. Essas linhagens de células são amplamente disponíveis, por exemplo, da coleção da “American Type Cell Culture” (ATCC) [35], dos “Coriell Cell Repositories” [36], ou da “European Collection of Cell Cultures” (ECACC). Por exemplo, a ATCC fornece várias células Vero diferentes sob os números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 e CRL-1587, e fornece células MDCK sob o número de catálogo CCL-34. PER.C6 é disponível pelo ECACC sob o número de depósito 96022940. Como alternativa menos preferida às linhagens de células mamíferas, os vírus podem crescer em linhagens de células aviárias [por exemplo, referências 37-39], incluindo linhagens de células derivadas de patos (por exemplo, retina de pato) ou galinhas. Exemplos de linhagens de células aviárias incluem células-tronco embriônicas aviárias [37,40] e células da retina de pato [38]. Células-tronco embriônicas aviárias adequadas incluem a linhagem de células EBx derivadas de células-tronco embriônicas de galinhas, EB45, EB14 e EB14-074 [41]. Fibroblastos de embrião de galinha (CEF) também podem ser usados.
As linhagens de células mais preferidas para o crescimento de vírus influenza são linhagens de células MDCK. A linhagem de células MDCK original é disponível pela ATCC como CCL-34, mas derivados dessa linhagem de células também podem ser usados. Por exemplo, a referência 27 revela uma linhagem de células MDCK que foi adaptada para o crescimento em cultura de suspensão (“MDCK 33016”, depositada como DSM ACC 2219). Similarmente, a referência 42 revela uma linhagem de células derivada de MDCK que cresce em suspensão em cultura sem soro (“B-702”, depositada como FERM BP-7449). A referência 43 revela células MDCK não tumorigênicas, incluindo “MDCK-S” (ATCC PTA-6500), “MDCK-SF101” (ATCC PTA-6501), “MDCK-SF102” (ATCC PTA-6502) e “MDCK-SF103” (PTA-6503). A referência 44 revela linhagens de células MDCK com suscetibilidade elevada à infecção, incluindo células “MDCK.5F1” (ATCC CRL-12042). Qualquer uma dessas linhagens de células MDCK pode ser usada. A cultura para o crescimento celular e também o inóculo viral usado para iniciar a cultura serão preferivelmente isentos de (ou seja, serão testados e considerados negativos para contaminação por) vírus do herpes simples, vírus sincicial respiratório, vírus parainfluenza 3, coronavírus da SARS, adenovírus, rinovírus, reovírus, vírus do polioma, birnavírus, circovírus e/ou parvovírus [45]. A ausência de vírus do herpes simples é particularmente preferida.
Os vírus podem crescer em células em suspensão [46] ou em cultura aderente. Em uma modalidade, as células podem ser adaptadas para crescimento em suspensão. Uma linhagem de células MDCK adequada que está adaptada ao crescimento em cultura de suspensão é MDCK 33016 (depositada como DSM ACC 2219). Como alternativa, pode ser usada cultura de microcarregadores (microcarrier).
As linhagens celulares que apóiam a replicação do vírus influenza crescem preferivelmente em meios de cultura livres de soro e/ou em meios livres de proteínas. Um meio é considerado um meio livre de soro no contexto da presente invenção quando não há aditivos do soro de origem humana ou animal. O termo “livre de proteína” visa significar culturas nas quais a multiplicação das células ocorre com exclusão de proteínas, fatores de crescimento, outros aditivos protéicos e proteínas não séricas, mas podem opcionalmente incluir proteínas como, por exemplo, tripsina ou outras proteases que podem ser necessárias para o crescimento viral. As células que crescem nestas culturas naturalmente contêm as próprias proteínas.
As linhagens celulares que apóiam a replicação do vírus influenza crescem preferivelmente abaixo de 37°C [47] (por exemplo, 30-36°C) durante a replicação viral. O método para a propagação do vírus em células cultivadas geralmente inclui as etapas de inoculação das células cultivadas com a cepa a ser cultivada, o cultivo das células infectadas por um período de tempo desejado para a propagação do vírus como, por exemplo, como determinado pela titulação do vírus ou expressão do antígeno (por exemplo, entre 24 e 168 horas após a inoculação) e coleta do vírus propagado. As células cultivadas são inoculadas com uma proporção de vírus (medido por PFU ou TCID50) para células de 1:500 a 1:1, preferivelmente 1:100 a 1:5, mais preferivelmente 1:50 a 1:10. O vírus é adicionado a uma suspensão das células ou é aplicado a uma monocamada das células, e o vírus é absorvido sobre as células por pelo menos 60 minutos, mas normalmente menos de 300 minutos, preferivelmente entre 90 e 240 minutos a 25°C a 40°C, preferivelmente 28°C a 37°C. A cultura de células infectadas (por exemplo, monocamadas) pode ser removida por congelamento-descongelamento ou por ação enzimática para aumentar o teor viral dos sobrenadantes da cultura coletados. Os líquidos coletados são então inativados ou armazenados congelados. As células cultivadas podem ser infectadas em uma multiplicidade de infecção (“m.o.i.”) de cerca de 0,0001 a 10, preferivelmente 0,002 a 5, mais preferivelmente até 0,001 a 2. Ainda mais preferivelmente, as células são infectadas em uma m.o.i de cerca de 0,01. As células infectadas podem ser coletadas 30 a 60 horas após a infecção. De preferência, as células são coletadas 34 a 48 horas após a infecção. Ainda mais preferivelmente, as células são coletadas 38 a 40 horas após a infecção. Proteases (tipicamente tripsina) são geralmente adicionadas durante a cultura de células para permitir a liberação viral, e as proteases podem ser adicionadas em qualquer estágio adequado durante a cultura. HA é o principal imunógeno nas vacinas inativadas de influenza atuais, e as doses da vacina são padronizadas por referência aos níveis de HA, medidos tipicamente por SRID. As vacinas existentes tipicamente contêm cerca de 15 pg de HA por cepa, embora possam ser usadas doses menores, por exemplo, para crianças ou em situações pandêmicas, ou quando se utiliza um adjuvante. Doses fracionadas, por exemplo, 1/2 (ou seja, 7,5 pg de HA por cepa), 1/4 e 1/8 foram usadas [89,90], bem como doses maiores (por exemplo, doses de 3x ou 9x [48,49]). Dessa forma, as vacinas podem incluir entre 0,1 e 150 pg de HA por cepa de influenza, preferivelmente entre 0,1 e 50 pg, por exemplo, 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg etc. Doses específicas incluem, por exemplo, cerca de 45, cerca de 30, cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, cerca de 3,8, cerca de 1,9, cerca de 1,5 etc. por cepa.
Para vacinas vivas, a dosagem é medida por dose infecciosa média para cultura de tecido (TCID50), e não pelo teor de HA, e uma TCID50 entre 106 e 108 (preferivelmente entre 106'5-107'5) por cepa é típica. A HA usada com a invenção pode ser uma HA natural como encontrada em um vírus, ou pode ter sido modificada. Por exemplo, é conhecida a modificação da HA para a remoção de determinantes (por exemplo, regiões hiper-básicas em torno do sítio de clivagem entre HA1 e HA2), o que faz com que um vírus seja altamente patogênico em espécies aviárias, na medida em que esses determinantes podem, de outro modo, evitar que um vírus cresça em ovos. A proteína da matriz Além de incluir hemaglutinina, as composições da invenção incluem uma proteína da matriz. O segmento 7 do vírus influenza A codifica os polipeptídeos M1 e M2. M1 está abaixo da bicamada lipídica viral, enquanto M2 é uma proteína integral da membrana que fornece um canal de íon que é inibido por amantadina. M2 é expressa por um mRNA splíced. O segmento 7 do vírus influenza B codifica os polipeptídeos M1 e BM2. A proteína da matriz incluída em composições da invenção é tipicamente uma proteína Ml de um vírus influenza A. A seqüência de comprimento total de 252 aa de Ml do vírus influenza A PR/8/34 está disponível nas bases de dados sob GI:138817, que é o ID. DE SEQ. N°: 2 apresentado abaixo: MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTL TVPS ERGLQRRRFVQNALNGNGD PNNMDKAVKLYRKLKREIT FHGAKEISLS YSAGALASCMGLIY NRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQ AAEAMEVAS QARQMVQAMRTIGTH PS S SAGLKN DLLENLQAYQXRMGVQMQRFK A proteína da matriz incluída em composições da invenção preferivelmente compreende uma seqüência de aminoácidos de Ml que tem comprimento de pelo menos m aminoácidos, em que os referidos m aminoácidos possuem pelo menos n% de identidade para o ID. DE SEQ. N° : 2. Os m aminoácidos incluirão tipicamente um fragmento de pelo menos p aminoácidos consecutivos do ID. DE SEQ. N°: 2. 0 valor de m pode ser, por exemplo, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais. O valor de n pode ser, por exemplo, 70 (por exemplo, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mais). O valor de p pode ser, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais. Quando n < 100, p será menor do que m. A seqüência de m aminoácidos pode, comparada com o ID. DE SEQ. N° : 2, incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) substituições de aminoácidos conservadoras, ou seja, substituições de um aminoácido com outro que tenha uma cadeia lateral relacionada. Os aminoácidos codificados geneticamente são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos, ou seja, aspartato, glutamato; (2) básicos, ou seja, lisina, arginina, histidina; (3) não polares, ou seja, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados, ou seja, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina algumas vezes são classificados em conjunto como aminoácidos aromáticos. Em geral, a substituição de aminoácidos únicos dentro dessas famílias não tem um efeito importante sobre a atividade biológica. Os m aminoácidos também podem incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) eliminações de um único aminoácido em relação ao ID. DE SEQ. N°: 2. Os m aminoácidos também podem incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) inserções (por exemplo, cada um de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos) em relação ao ID. DE SEQ. N°: 2.
Proteínas da matriz preferidas para inclusão em composições da invenção compreendem um epítopo de M1. O epítopo pode ser um epítopo de células T e/ou de células B. Epítopos de células T e B podem ser identificados empiricamente (por exemplo, com o uso de PEPSCAN [50,51] ou de métodos similares), ou podem ser previstos (por exemplo, com o uso do índice antigênico de Jameson-Wolf [52], por abordagens baseadas na matriz [53], TEPITOPE [54], por redes neurais [55], OptiMer & EpiMer [56, 57], ADEPT [58], Tsites [59], hidrofilicidade [60], índice antigênico [61] ou pelos métodos revelados na referência 62 etc.). Por tais métodos, já foram identificados epítopos de células T na proteína viral M1 de influenza A, incluindo os seguintes [63]:__________________________________________________ MHC Seqüência ID. DE SEQ. REF.
Outros epítopos de células T em M1 incluem: SLLTEVETYV (ID. DE SEQ. N°: 15; resíduos 2-11 do ID. DE SEQ. N°: 2); IIPSGPLK (ID. DE SEQ. N°: 16; resíduos 14-21 do ID. DE SEQ. N°: 2); e LEDVFAGK (ID. DE SEQ. N°: 17; resíduos 28-35 do ID. DE SEQ. N°: 2).
Uma proteína da matriz em particular que foi primeiro detectada em vacinas preparadas em cultura de células é uma proteína de 5 kDa com a seqüência do terminal N EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18; resíduos 114-125 do ID. DE SEQ. N°: 2). O resíduo do terminal N e o tamanho desse polipeptídeo são consistentes com o fato de ele ser um fragmento tríptico de M1, quando então o polipeptídeo de comprimento total pode ter uma das seguintes seqüências de aminoácidos: ID. DE SEQ. N°: 19 - EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHR ID. DE SEQ. N°: 20 - EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHR O ID. DE SEQ. N°: 19 inclui o motivo Cys-Cys-His-His completo (resíduos 148-162 do ID. DE SEQ. N°: 2) que pode fornecer afinidade por zinco [72]. Dessa forma, uma proteína da matriz usada com a invenção pode adicionalmente incluir um íon zinco. A seqüência do ID. DE SEQ. N°: 18 inclui a seqüência LSYSXGALA (ID. DE SEQ. N°: 1), que é muito bem conservada entre cepas do vírus influenza A, com o 5° resíduo "X" sendo Thr (LSYSTGALA, ID. DE SEQ. N°: 21) ou Ala (LSYSAGALA, ID. DE SEQ. N°: 22). São conhecidas variações desse 9mer conservado (por exemplo, em A/Swine/Ontario/01911-2/99 (H4N6) o 9mer é LSYSTGALA [GI: 10442678; ID. DE SEQ. N°: 23] e em A/swine/England/191973/92 (H1N7) ele é LGYSTGALA [GI: 1835734; ID. DE SEQ. N°: 24], em A/Chicken/Pennsylvania/13609/93 (H5N2) ele é LSYSTGALT [GI: 4584948; ID. DE SEQ. N°: 25], em A/WSN/33 ele é FSYSAGALA [GI: 324407; ID. DE SEQ. N°: 26]), mas o ID. DE SEQ. N°: 1 é a seqüência mais comum. A YSXGAL (ID. DE SEQ. N°: 27) central aparece em todas essas seqüências. As seqüências nos vírus influenza podem ser localizadas convenientemente na "Influenza Sequence Database" (ISD) em www.flu.lanl.gov [73]. Seqüências adicionais podem ser encontradas na referência 74.
Dessa forma, proteínas da matriz preferidas incluídas em composições da invenção incluem uma ou mais das seqüências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e/ou 27. Enquanto a proteína M1 de comprimento total é uma proteína de 27,8 kDa, no entanto, a proteína da matriz incluída nas composições da invenção possui um peso molecular < 20 kDa, por exemplo, < 15 kDa, < 12 kDa, <10 kDa, < 9 kDa, < 8 kDa, < 7 kDa, < 6 kDa, < 5,5 kDa, ou de cerca de 5 kDa. O peso molecular da proteína da matriz preferivelmente se situa na faixa de 2-8 kDa, por exemplo, 3-7 kDa, 4-6 kDa ou cerca de 5 kDa. O terminal N da proteína da matriz pode ser Glu-Ile-Ser, seguido por uma das seqüências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24. A proteína da matriz pode formar oligômeros (por exemplo, dímeros, por exemplo, homodímeros) dentro da composição.
Caso a proteína da matriz inclua o aminoácido 137 (numerado como no ID. DE SEQ. N°: 2), esse aminoácido poderá ser Ala (como no ID. DE SEQ. N°: 2) ou Thr (como observado em vírus patogênicos humanos H5N1). A proteína da matriz pode estar presente em várias quantidades, mas tipicamente estará presente em 1 pg/ml a 15 pg/ml, por exemplo, entre 2-14 pg/ml, entre 3-13 pg/ml, entre 4-12 pg/ml, entre 5-11 pg/ml, entre 6-10 pg/ml, entre 7-9 pg/ml etc. Concentrações de menos de 1 pg/ml também são possíveis.
Com a inclusão dessas proteínas da matriz, além da hemaglutinina, as composições da invenção se beneficiam de quaisquer epítopos de células T que estejam presentes, o que pode aumentar a proteção cruzada (dentro do mesmo tipo de HA e também entre diferentes tipos de HA) despertada por uma vacina [75]. As proteínas da matriz podem estar presentes endogenamente em conseqüência da preparação da composição (por exemplo, ela pode co-purificar com HA), ou elas podem ser adicionadas como componentes exógenos, por exemplo, para aprimorar vacinas que não contêm o componente da matriz, incluindo vacinas derivadas do ovo.
Sem se prender a uma teoria, os inventores acreditam que a proteína da matriz possa se ligar à HA em uma vacina para formar um complexo estável. Caso o complexo seja mais estável do que a HA isoladamente, o prazo de validade de uma vacina pode ser aumentado e, em particular, sua habilidade para tolerar o armazenamento fora de um refrigerador. A região em torno do ID. DE SEQ. N°: 1 em M1 pode atuar como um domínio de ligação de lipídeo [7 6]. Com a inclusão dessa região em uma proteína da matriz, portanto, a proteína pode vantajosamente interagir com adjuvantes graxos, como descrito com mais detalhe abaixo.
Quando uma composição incluir HA de mais de uma cepa do vírus influenza A, ela geralmente também incluirá proteína da matriz de mais de uma cepa. Enquanto as HAs das cepas normalmente serão diferentes entre elas, no entanto, as proteínas da matriz podem ser as mesmas. Caso elas sejam idênticas no produto final, poderá não ser possível distinguir as duas proteínas da matriz, mas elas terão origens diferentes.
Além de incluir HA e matriz, as composições da invenção podem incluir neuraminidase e/ou nucleoproteína.
Quando uma composição incluir HA de um vírus influenza B, ela também poderá incluir proteína M1 de um vírus influenza B. DNA da célula hospedeira Quando o vírus tiver crescido em uma linhagem celular, é uma prática padronizada a minimização da quantidade de DNA residual da linhagem celular na vacina final, a fim de minimizar qualquer atividade oncogênica do DNA. Essa medida de segurança é particularmente importante quando se inclui uma proteína da matriz do vírus influenza em uma vacina, na medida em que a proteína da matriz pode se ligar aos ácidos nucléicos (incluindo RNA e DNA de fita dupla) [77] e pode, dessa forma, reter DNA mais facilmente do que as vacinas baseadas em HA existentes.
Dessa forma, a composição preferivelmente contém menos de 10 ng (preferivelmente menos de 1 ng e, mais preferivelmente, menos de 100 pg) de DNA residual da célula hospedeira por dose, embora quantidades residuais de DNA da célula hospedeira possam estar presentes. Prefere-se que o comprimento médio de qualquer DNA residual da célula hospedeira seja menor do que 500 bp, por exemplo, menor do que 400 bp, menor do que 300 bp, menor do que 200 bp, menor do que 100 bp etc. Em geral, o DNA da célula hospedeira que é desejável excluir das composições da invenção é o DNA que é mas longo do que 100 bp. A medida do DNA residual da célula hospedeira é agora uma exigência reguladora de rotina para substâncias biológicas e está dentro dos conhecimentos daqueles habilitados na técnica. O ensaio usado para medir o DNA tipicamente será um ensaio validado [78,79]. As características de desempenho de um ensaio validado podem ser descritas em termos matemáticos e quantificáveis, e suas possíveis fontes de erro serão identificadas. O ensaio geralmente irá testar características como, por exemplo, exatidão, precisão, especificidade. Após um ensaio ter sido calibrado (por exemplo, contra quantidades padronizadas conhecidas de DNA da célula hospedeira) e testado, poderão ser feitas rotineiramente medidas quantitativas de DNA. Três técnicas principais para quantificação de DNA podem ser realizadas: métodos de hibridização, por exemplo, Southern blots ou slot blots [80]; métodos de imunoensaio, por exemplo, o Sistema Threshold™ [81]; e PCR quantitativa [82]. Todos esses métodos são familiares àquelas habilitados na técnica, embora as características precisas de cada método possam depender da célula hospedeira em questão, por exemplo, a escolha de sondas para hibridização, a escolha de iniciadores e/ou sondas para amplificação etc. O sistema ThresholdTM de Molecular Devices é um ensaio quantitativo para níveis de picogramas de DNA total, e tem sido usado para o monitoramento de níveis de DNA contaminante em substâncias biofarmacêuticas [81]. Um ensaio típico envolve a formação sem especificidade de seqüência de um complexo de reação entre uma proteína de ligação biotinilada de ssDNA, um anticorpo anti-ssDNA conjugado à urease e DNA. Todos os componentes do ensaio são incluídos no kit completo “Total DNA Assay Kit” disponível pelo fabricante. Vários fabricantes comerciais oferecem ensaios de PCR quantitativa para detecção do DNA residual da célula hospedeira, por exemplo, AppTecTM de Laboratory Services, BioRelianceTM, de Althea Technologies etc. Uma comparação de um ensaio de hibridização quimioluminescente com o sistema de DNA total ThresholdTM para medida da contaminação por DNA da célula hospedeira de uma vacina viral humana pode ser encontrada na referência 83. O DNA contaminante pode ser removido durante a preparação da vacina com o uso de procedimentos padronizados de purificação, por exemplo, cromatografia etc. A remoção de DNA residual da célula hospedeira pode ser aprimorada por tratamento de nuclease, por exemplo, pelo uso de uma DNase. Um método conveniente para a redução da contaminação por DNA da célula hospedeira é revelado nas referências 84 & 85, que envolve um tratamento em duas etapas, primeiro com o uso de uma DNase (por exemplo, Benzonase), que pode ser usada durante o crescimento viral, e a seguir com um detergente catiônico (por exemplo, CTAB), que pode ser usado durante a ruptura do vírion. O tratamento com um agente alquilante, por exemplo, β-propiolactona, também pode ser usado para remover DNA da célula hospedeira e, vantajosamente, também pode ser usado para inativar vírions [86].
Vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por 15 pg de hemaglutinina são preferidas, bem como vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por volume de 0,25 ml. Vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por 50 pg de hemaglutinina são mais preferidas, bem como vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por volume de 0,5 ml.
Adjuvantes As composições da invenção podem vantajosamente incluir um adjuvante, que pode funcionar para aumentar as respostas imunológicas (humoral e/ou celular) despertadas em um paciente que recebe a composição. O uso de adjuvantes com vacinas contra influenza foi descrito anteriormente.
Nas referências 87 & 88, foi utilizado hidróxido de alumínio, e na referência 89, foi usada uma mistura de hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. A referência 90 também descreveu o uso de adjuvantes de sal de alumínio. O produto FLUADTM de Chiron Vaccines inclui uma emulsão óleo-em-água.
Adjuvantes que podem ser usados com a invenção incluem, sem limitação: - Uma composição que contém minerais, incluindo sais de cálcio e sais de alumínio (ou misturas destes). Sais de cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, as partículas "CAP" reveladas na referência 91). Sais de alumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos etc., com os sais assumindo qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalinos, amorfos etc.). A adsorção a esses sais é preferida. As composições que contêm minerais também podem ser formuladas como uma partícula de sal metálico [92]. Adjuvantes de sal de alumínio serão descritos com mais detalhe abaixo. - Agentes indutores de citocina (veja com mais detalhe abaixo). - Saponinas [capítulo 22 da referência 128], que formam um grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenóide que são encontrados na casca, folhas, caules, raízes e até mesmo nas flores de uma ampla gama de espécies de plantas. A saponina da casca da árvore Molina Quillaia saponaria foi amplamente estudada como adjuvante. A saponina também pode ser obtida comercialmente de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (mosquitinho - brides veil) e Saponaria officinalis (saponária - soap root). Formulações adjuvantes de saponina incluem formulações purificadas, por exemplo, QS21, além de formulações lipídicas, por exemplo, ISCOMs. QS21 é comercializado como Stimulon™. As composições de saponina foram purificadas com o uso de HPLC e RP-HPLC. Foram identificadas frações purificadas específicas com o uso dessas técnicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QHB e QH-C. De preferência, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é revelado na referência 93. As formulações de saponina também podem compreender um esterol, por exemplo, colesterol [94]. Podem ser usadas combinações de saponinas e colesteróis para formar partículas únicas denominadas complexos imunoestimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 da referência 128]. ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídeo, por exemplo, fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. De preferência, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA e QHC. ISCOMs são ainda descritos nas referências 94-96.
Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovidos de detergente adicional [97]. Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes baseados em saponina pode ser encontrada nas referências 98 & 99. - Adjuvantes graxos (veja com mais detalhe abaixo), incluindo emulsões óleo-em-água. - Toxinas bacterianas que ribosilam ADP (por exemplo, a enterotoxina termolábil de E. coli "LT", a toxina colérica "CT" ou a toxina de pertussis "PT") e derivados detoxificados destas, por exemplo, as toxinas mutantes conhecidas como LT-K63 e LT-R72 [100]. O uso de toxinas detoxificadas que ribosilam ADP como adjuvantes mucosos é descrito na referência 101 e como adjuvantes parenterais na referência 102. - Bioadesivos e mucoadesivos, por exemplo, microesferas de ácido hialurônico esterificado [103] ou quitosana e seus derivados [104]. - Micropartículas (ou seja, uma partícula com ~100 nm a ~150 pm de diâmetro, mais preferivelmente ~200 nm a ~30 qm de diâmetro ou ~500 nm a ~10 qm de diâmetro) formadas por materiais que são biodegradáveis e atóxicos (por exemplo, um poli(ácido α-hidróxi), um ácido poliidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona etc.), com poli(lactida-co-glicolida) sendo preferida, opcionalmente tratadas para terem uma superfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfície carregada positivamente (por exemplo, com um detergente catiônico, por exemplo, CTAB). - Lipossomos (capítulos 13 & 14 da referência 128). Exemplos de formulações lipossômicas adequadas ao uso como adjuvantes são descritos nas referências 105-107. - Éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno [108] . Estas formulações ainda incluem tensoativos de éster de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol [109] , além de tensoativos de alquil éteres ou éster de polioxietileno, em combinação com pelo menos um tensoativo não iônico adicional, por exemplo, octoxinol [110]. Éteres de polioxietileno preferidos são selecionados do seguinte grupo: polioxietileno-9-lauril éter (laureth 9), polioxietileno-9-esteoril éter, polioxietileno-8-esteoril éter, polioxietileno-4-lauril éter, polioxietileno-35- lauril éter e polioxietileno-23-lauril éter. - Muramil peptídeos, por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina ("nor-MDP"), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida ("DTP-DPP" ou "Theramide™") , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina ("MTP-PE").
Uma preparação de proteína de proteossoma da membrana externa preparada a partir de uma primeira bactéria Gram-negativa em combinação com uma preparação de lipossacarídeo derivada de uma segunda bactéria Gram-negativa, em que as preparações de proteína de proteossoma da membrana externa e de lipossacarídeo formam um complexo adjuvante estável não covalente. Estes complexos incluem "IVX-908", um complexo composto por membrana externa e lipopolissacarídeos de Neíssería meníngítídís. Eles foram usados como adjuvantes para vacinas contra influenza [111] .
Um polímero de polioxidônio [112,113] ou outro derivado N-oxidado de polietileno-piperazina. - 5'-Monofosfato de metil inosina ("MIMP") [114]. - Um composto poliidroxilado de pirrolizidina [115], por exemplo, um que possua a fórmula: em que R é selecionado do grupo que compreende hidrogênio, grupos acil lineares ou ramificados, não substituídos ou substituídos, saturados ou insaturados, alquil (por exemplo, cicloalquil), alquenil, alquinil e aril, ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitável destes. Exemplos incluem, sem limitação: casuarina, casuarina-6-a-D-glicopiranose, 3-epl-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-diepi-casuarina etc. - Um ligante de CD1d, por exemplo, uma a- glicosilceramida [116-123] (por exemplo, a- galactosilceramida), a-glicosilceramidas que contêm fitoesfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(a-D-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4- octadecanetriol], CRONY-101, 3''-O-sulfo-galactosilceramida etc. - Uma gama inulina [124] ou derivado desta, por exemplo, algamulina.
Essas e outras substâncias adjuvantes ativas são discutidas com mais detalhe nas referências 128 & 129.
As composições podem incluir dois ou mais dos referidos adjuvantes. Por exemplo, elas podem vantajosamente incluir tanto uma emulsão óleo-em-água quanto um agente indutor de citocina, na medida em que essa combinação aumenta as respostas de citocina despertadas por vacinas contra influenza, por exemplo, a resposta de interferon-γ, com o aumento sendo bem maior do que o observado quando a emulsão ou o agente é usado isoladamente.
Antígenos e adjuvantes em uma composição estarão tipicamente misturados.
Adjuvantes de emulsão óleo-em-água Verificou-se que as emulsões óleo-em-água são particularmente adequadas ao uso em vacinas com adjuvantes contra o vírus influenza. São conhecidas várias destas emulsões, e elas tipicamente incluem pelo menos um óleo e pelo menos um tensoativo, com o(s) óleo(s) e o(s) tensoativo(s) sendo biodegradáveis (metabolizáveis) e biocompatíveis. As gotículas de óleo na emulsão geralmente possuem menos de 5 qm de diâmetro, e podem até mesmo ter um diâmetro submícron, com esses tamanhos diminutos sendo obtidos com um microfluidificador para fornecer emulsões estáveis. Gotículas com um tamanho menor do que 220 nm são preferidas, na medida em que elas podem ser submetidas à esterilização por filtro. A invenção pode ser usada com óleos como, por exemplo, aqueles de uma fonte animal (por exemplo, de peixe) ou vegetal. Fontes para óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. Óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco e azeite de oliva, os mais comumente disponíveis, exemplificam os óleos de nozes. O óleo de jojoba pode ser usado, por exemplo, obtido do grão de jojoba. Óleos de sementes incluem óleo de açafroa, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de gergelim e semelhantes. No grupo dos grãos, o óleo de milho é o mais facilmente disponível, mas o óleo de outros grãos de cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, arroz, tef, triticalo e semelhantes também podem ser usados. Ésteres de ácido graxo com 6-10 carbonos de glicerol e 1,2-propanediol, embora não ocorram naturalmente em óleos de sementes, podem ser preparados por hidrólise, separação e esterificação dos materiais apropriados, partindo dos óleos de nozes e de semente. Gorduras e óleos do leite de mamíferos são metabolizáveis e podem, portanto, ser usados na prática dessa invenção.
Os procedimentos para separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para a obtenção de óleos puros a partir de fontes animais são bem conhecidos na técnica. A maioria dos peixes contém óleos metabolizáveis que podem ser prontamente recuperados. Por exemplo, o óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão e o óleo de baleia, por exemplo, espermacete, exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser aqui usados. Vários óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades de isopreno de 5 carbonos e são geralmente citados como terpenóides. O óleo de fígado de tubarão contém um terpenóide ramificado, insaturado, conhecido como esqualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que é particularmente aqui preferido. O esqualano, o análogo saturado do esqualeno, também é um óleo preferido. Óleos de peixe, incluindo esqualeno e esqualano, são facilmente disponíveis por fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica. Outros óleos preferidos são os tocoferóis (veja abaixo). Podem ser usadas misturas de óleos.
Os tensoativos podem ser classificados por seu "HLB" (equilíbrio hidrófilo/lipófilo). Tensoativos da invenção preferidos possuem um HLB de pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 e, mais preferivelmente, pelo menos 16. A invenção pode ser usada com tensoativos que incluem, sem limitação: os tensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitano (comumente denominados Tweens), especialmente polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido de butileno (BO), vendidos sob o nome comercial DOWFAXTM, por exemplo, copolímeros lineares em bloco de EO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de repetições grupos etóxi (oxi-1,2-etanodiil), com octoxinol-9 (Triton X-100 ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de particular interesse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipídeos, por exemplo, fosfatidilcolina (lecitina); nonilfenol etoxilatos, por exemplo, a série TergitolTM NP; éteres graxos de polioxietileno derivados de alcoóis laurílico, cetílico, estearílico e oleílico (conhecidos como tensoativos Brij), por exemplo, trietilenoglicol monolauril éter (Brij 30); e ésteres de sorbitano (comumente conhecidos como SPANs), por exemplo, trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Tensoativos não iônicos são preferidos. Tensoativos preferidos para inclusão na emulsão são Tween 80 (monooleato de polioxietileno sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.
Podem ser usadas misturas de tensoativos, por exemplo, misturas de Tween 80/Span 85. Uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano, por exemplo, monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80), e um octoxinol, por exemplo, t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100), também é adequada. Outra combinação útil compreende laureth 9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol.
Quantidades preferidas de tensoativos (% por peso) são: ésteres de polioxietileno sorbitano (por exemplo, Tween 80) 0,01 a 1%, em particular, cerca de 0,1%; octil-ou nonilfenoxi polioxietanóis (por exemplo, Triton X-100, ou outros detergentes na série Triton) 0,001 a 0,1%, em particular, 0,005 a 0,02%; éteres de polioxietileno (por exemplo, laureth 9) 0,1 a 20%, preferivelmente 0,1 a 10% e, em particular, 0,1 a 1% ou cerca de 0,5%.
Adjuvantes de emulsão óleo-em-água específicos úteis com a invenção incluem, sem limitação: - Uma emulsão submícron de esqualeno, Tween 80 e Span 85. A composição da emulsão por volume pode ser de cerca de 5% de esqualeno, cerca de 0,5% de polissorbato 80 e cerca de 0,5% de Span 85. Em termos de peso, essas proporções se tornam 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,48% de Span 85. Esse adjuvante é conhecido como "MF59” [125127], como descrito com mais detalhe no capítulo 10 da referência 128 e no capítulo 12 da referência 129. A emulsão MF59 vantajosamente inclui íons citrato, por exemplo, 10 mM de tampão citrato de sódio. - Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e Tween 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada com fosfato. Ela também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/ou lecitina. Essas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80, e a proporção de peso de esqualeno:tocoferol é preferivelmente < 1, na medida em que essa proporção fornece uma emulsão mais estável. Esqualeno e Tween 80 podem estar presentes em uma proporção de volume de cerca de 5:2. Uma emulsão desse tipo pode ser feita dissolvendo Tween 80 em PBS, para gerar uma solução 2%, e depois misturando 90 ml dessa solução com uma mistura de 5 g de DL-a-tocoferol e 5 ml de esqualeno, e microfluidizando-se a mistura. A emulsão resultante pode ter gotículas de óleo submícron, por exemplo, com um diâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferivelmente cerca de 180 nm. - Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (veja abaixo). A emulsão pode conter um tampão fosfato. - Uma emulsão que compreende um polissorbato (por exemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, um succinato de a-tocoferol). A emulsão pode incluir esses três componentes em uma proporção de massa de cerca de 75:11:10 (por exemplo, 750 qg/ml de polissorbato 80, 110 qg/ml de Triton X-100 e 100 qg/ml de succinato de a-tocoferol), e essas concentrações devem incluir qualquer contribuição desses componentes por antígenos. A emulsão também pode incluir esqualeno. A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (veja abaixo). A fase aquosa pode conter um tampão fosfato. - Uma emulsão de esqualano, polissorbato 80 e poloxâmero 401 ("Pluronic™ L121”). A emulsão pode ser formulada em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. Essa emulsão é um veículo de liberação útil para muramil dipeptídeos, e foi usada com treonil-MDP no adjuvante "SAF-1” [130] (0,05-1% de Thr-MDP, 5% de esqualano, 2,5% de Plurônico L121 e 0,2% de polissorbato 80). Ela também pode ser usada sem o Thr-MDP, como no adjuvante "AF” [131] (5% de esqualano, 1,25% de Plurônico L121 e 0,2% de polissorbato 80). A microfluidificação é preferida. - Uma emulsão que possui de 0,5-50% de um óleo, 0,110% de um fosfolipídeo e 0,05-5% de um tensoativo não iônico. Como descrito na referência 132, componentes de fosfolipídeo preferidos são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina e cardiolipina. São vantajosos tamanhos de gotícula submícron. - Uma emulsão óleo-em-água submícron de um óleo não metabolizável (por exemplo, óleo mineral leve) e pelo menos um tensoativo (por exemplo, lecitina, Tween 80 ou Span 80). Podem ser incluídos aditivos, por exemplo, saponina QuilA, colesterol a conjugado saponina-lipófilo (por exemplo, GPI-0100, descrito na referência 133, produzido por adição de amina alifática à desacilsaponina por meio do grupo carboxil de ácido glicurônico), brometo de dimetildioctadecilamônio e/ou N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanodiamina. - Uma emulsão na qual uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) estão associados como micelas helicoidais [134].
As emulsões podem ser misturadas com antígeno de forma extemporânea, no momento da liberação. Dessa forma, o adjuvante e o antígeno podem ser mantidos separadamente em uma vacina embalada ou distribuída, prontos para a formulação final no momento da utilização. O antígeno geralmente estará em uma forma aquosa, de modo que a vacina seja finalmente preparada por mistura de dois líquidos. A proporção de volume dos dois líquidos para a mistura pode variar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5), mas é geralmente de cerca de 1:1.
Após o antígeno e o adjuvante terem sido misturados, o antígeno de hemaglutinina geralmente permanecerá em solução aquosa, mas pode se distribuir em torno da interface óleo/água. Em geral, pouco ou nenhuma hemaglutinina entrará na fase oleosa da emulsão.
Quando uma composição incluir um tocoferol, qualquer um dos α, β, γ, δ, ε ou ξ-tocoferóis pode ser usado, mas a-tocoferóis são preferidos. O tocoferol pode assumir várias formas, por exemplo, diferentes sais e/ou isômeros. Sais incluem sais orgânicos, por exemplo, succinato, acetato, nicotinato etc. Tanto D-a-tocoferol quanto DL-a-tocoferol podem ser usados. Tocoferóis são vantajosamente incluídos em vacinas para uso em pacientes idosos (por exemplo, com idade de 60 anos ou mais), pois há relatos de que a vitamina E possui um efeito positivo sobre a resposta imunológica nesse grupo de pacientes [135]. Eles também possuem propriedades antioxidantes que podem ajudar a estabilizar as emulsões [136]. Um a-tocoferol preferido é o DL-a-tocoferol, e o sal preferido desse tocoferol é o succinato. Verificou-se que o sal de succinato coopera com ligantes relacionados ao TNF in vivo. Além disso, o succinato de a-tocoferol é conhecido por ser compatível com vacinas contra influenza e por ser um conservante útil como alternativa aos compostos mercuriais [9].
Agentes indutores de citocina Agentes indutores de citocina para inclusão em composições da invenção são capazes, quando administrados a um paciente, de despertar o sistema imunológico para liberar citocinas, incluindo interferons e interleucinas.
As respostas de citocina são conhecidas por estarem envolvidas nos estágios iniciais e decisivos da defesa do hospedeiro contra a infecção por influenza [137]. Agentes preferidos podem despertar a liberação de um ou mais de: interferon-γ; interleucina-1; interleucina-2; interleucina-12; TNF-a; TNF-β; e GM-CSF. Agentes preferidos despertam a liberação de citocinas associadas a uma resposta imunológica do tipo Th1, por exemplo, interferon-γ, TNF-a, interleucina-2. Prefere-se a estimulação tanto de interferon-γ quanto de interleucina-2.
Em conseqüência do recebimento de uma composição da invenção, portanto, um paciente terá células T que, quando estimuladas com um antígeno de influenza, irão liberar a(s) citocina(s) desejada(s) de uma forma antígeno-específica. Por exemplo, células T purificadas do seu sangue liberarão γ-interferon quando expostas in vitro à hemaglutinina do vírus influenza. Métodos para a medida destas respostas em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são conhecidos na técnica, e incluem ELISA, ELISPOT, citometria de fluxo e PCR em tempo real. Por exemplo, a referência 138 relata um estudo no qual respostas imunológicas mediadas por células T antígeno-específicas contra o toxóide tetânico, especificamente respostas de γ-interferon, foram monitoradas, e verificou-se que ELISPOT foi o método mais sensível para discriminar respostas induzidas pelo TT antígeno-específicas de respostas espontâneas, mas que a detecção de citocina intracitoplasmática por citometria de fluxo foi o método mais eficiente para detectar efeitos de re-estimulação.
Agentes indutores de citocina adequados incluem, sem limitação: - Um oligonucleotídeo imunoestimulante, por exemplo, um que contenha um motivo CpG (uma seqüência dinucleotídica que contém uma citosina não metilada ligada por uma ligação fosfato a uma guanosina), ou um RNA de fita dupla, ou um oligonucleotídeo que contém uma seqüência palindrômica, ou um oligonucleotídeo que contém uma seqüência poli(dG). - Monofosforil 3-O-desacilado lipídeo A ("3dMPL”, também conhecido como "MPLTM”) [139-142]. - Um composto de imidazoquinolina, por exemplo, Imiquimod ("R-837”) [143,144], Resiquimod ("R-848”) [145], e seus análogos; e sais destes (por exemplo, os sais de cloridrato). Detalhes adicionais sobre imidazoquinolinas imunoestimulantes podem ser encontrados nas referências 146 a 150. - Um composto de tiossemicarbazona, por exemplo, aqueles revelados na referência 151. Métodos para a formulação, fabricação e teste de compostos ativos também são descritos na referência 151. As tiossemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citocinas, por exemplo, TNF-α. - Um composto de triptantrina, por exemplo, aqueles revelados na referência 152. Métodos para a formulação, fabricação e teste de compostos ativos também são descritos na referência 152. As tiossemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citocinas, por exemplo, TNF-α. - Um análogo nucleosídico, por exemplo: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina): e pró-fármacos deste; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) os compostos revelados nas referências 153 a 155; (f) um composto que possui a fórmula: em que: Ri e R2 são, cada um independentemente, H, halo, NRaRb, -OH, C1-6 alcóxi, C1-6 alcóxi substituído, heterociclil, heterociclil substituído, C6-10 aril, Οε-ιο aril substituído, C1-6 alquil, ou C1-6 alquil substituído; R3 está ausente, H, C1-6 alquil, C1-6 alquil substituído, C6-10 aril, C6-10 aril substituído, heterociclil ou heterociclil substituído; R4 e R5 são, cada um independentemente, H, halo, heterociclil, heterociclil substituído, -C(O)-Rd, C1-6 alquil, C1-6 alquil substituído, ou ligados em conjunto para formarem um anel de 5 membros como em R4-5: a ligação sendo ujjLiua nas nyaçues indicadas por um Xi e X2 são, cada um independentemente, N, C, 0 ou S;
Rs é H, halo, -OH, C1-6 alquil, C2-6 alquenil, C2-6 alquinil, -OH, -NRaRb, - (CH2) n-0-Rc, -0-(C1-6 alquil), S (O)pRe, ou -C (0) -Rd; R9 é H, C1-6 alquil, C1-6 alquil substituído, heterociclil, heterociclil substituído ou Roa, em que R9a é: a ligação sendo obtida na ligação indicada por um Rio e Rn são, cada um independentemente, H, halo, Ci-6 alcóxi, Ci-6 alcóxi substituído, - NRaRb, ou -OH; cada Ra e Rb é independentemente H, Ci-6 alquil, Ci-6 alquil substituído, -C(O)Rd, C6-10 aril; cada Rc é independentemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, C1-6 alquil ou C1-6 alquil substituído; cada Rd é independentemente H, halo, C1-6 alquil, C1-6 alquil substituído, C1-6 alcóxi, C1-6 alcóxi substituído, -NH2, -NH(Ci-6 alquil), -NH(Ci-6 alquil substituído), -N(Ci-6 alquil) 2, -N(Ci-6 alquil substituído) 2, C6-10 aril ou heterociclil ; cada Re é independentemente H, C1-6 alquil, C1-6 alquil substituído, C6-10 aril, C6-10 aril substituído, heterociclil ou heterociclil substituído; cada Rf é independentemente H, C1-6 alquil, C1-6 alquil substituído, -C(O)Rd, fosfato, difosfato ou trifosfato; cada n é independentemente 0, 1, 2 ou 3; cada p é independentemente 0, 1 ou 2; ou (g) um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um de (a) a (f), um tautômero de qualquer um de (a) a (f), ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero. - Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) [156]. - Compostos revelados na referência 157, incluindo: compostos de acilpiperazina, compostos de indolediona, compostos de tetrahidroisoquinolina (THIQ), compostos de benzociclodiona, compostos de aminoazavinil, compostos de aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) [158,159], compostos de hidraptalamida, compostos de benzofenona, compostos de isoxazol, compostos de esterol, compostos de quinazilinona, compostos de pirrol [160], compostos de antraquinona, compostos de quinoxalina, compostos de triazina, compostos de pirazalopirimidina e compostos de benzazol [161]. - Compostos revelados na referência 162. - Um derivado de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por exemplo, RC-529 [163,164]. - Um fosfazeno, por exemplo, poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] ("PCPP"), como descrito, por exemplo, nas referências 165 e 166. - Imunopotencializadores de pequena molécula (SMIPs), por exemplo: N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina- 2,4-diamina N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina N2-etil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina 1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina N2-butil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina- 2,4-diamina N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-pentil-1H-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina 1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina 1- (2-metilpropil)-2-(propiltio)-1H-imidazo[4,5-c] quinolin-4-amina 2- [[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c] quinolin-2-il](metil)amino]etanol 2-[[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c] quinolin-2-il](metil)amino]etil acetato 4-amino-1-(2-metilpropil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c] quinolin-2-ona N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis (fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina2,4-diamina N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina 1-{4-amino-2-[metil(propil)amino]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il}-2-metilpropan-2-ol 1-[4-amino-2-(propilamino)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-2-metilpropan-2-ol N4,N4-dibenzil-1-(2-metóxi-2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.
Os agentes indutores de citocina para uso na presente invenção podem ser moduladores e/ou agonistas de Receptores Toll-Like (TLR). Por exemplo, eles podem ser agonistas de um ou mais das proteínas TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 e/ou TLR9 humanas. Agentes preferidos são agonistas de TLR7 (por exemplo, imidazoquinolinas) e/ou TLR9 (por exemplo, oligonucleotídeos CpG). Esses agentes são úteis para ativação das vias da imunidade inata. O agente indutor de citocina pode ser adicionado à composição em vários estágios durante sua produção. Por exemplo, ele pode estar dentro de uma composição de antígeno, e essa mistura pode então ser adicionada a uma emulsão óleo-em-água. Como alternativa, ele pode estar dentro de uma emulsão óleo-em-água, quando então o agente pode ser adicionado aos componentes da emulsão antes da emulsificação, ou ele pode ser adicionado à emulsão após a emulsificação. Da mesma forma, o agente pode ser coacervado dentro das gotículas da emulsão. A localização e a distribuição do agente indutor de citocina dentro da composição final dependerão de suas propriedades hidrofílicas/lipofílicas, por exemplo, o agente pode estar localizado na fase aquosa, na fase oleosa e/ou na interface óleo-água. O agente indutor de citocina pode ser conjugado a um agente separado, por exemplo, um antígeno (por exemplo, CRM197). Uma revisão geral das técnicas de conjugação para pequenas moléculas é fornecida na referência 167. Como alternativa, os adjuvantes podem ser associados de forma não covalente a agentes adicionais, por exemplo, por meio de interações hidrofóbicas ou iônicas.
Dois agentes indutores de citocina preferidos são: (a) oligonucleotídeos imunoestimulantes e (b) 3dMPL.
Oligonucleotídeos imunoestimulantes podem incluir modificações/análogos nucleotídicos, por exemplo, modificações de fosforotioato, e podem ser de fita dupla ou (exceto para RNA) de fita simples. As referências 168, 169 e 170 revelam substituições análogas possíveis, por exemplo, substituição de guanosina com 2'-desoxi-7-deazaguanosina. O efeito adjuvante de oligonucleotídeos CpG é ainda discutido nas referências 171-176. Uma seqüência CpG pode ser dirigida a TLR9, por exemplo, o motivo GTCGTT ou TTCGTT [177]. A seqüência CpG pode ser específica para a indução de uma resposta imunológica Th1, por exemplo, um ODN (oligodesoxinucleotídeo)CpG-A, ou ela pode ser mais específica para indução de uma resposta de células B, por exemplo, ODN CpGB. ODNs CpG-A e CpG-B são discutidos nas referências 178-180. De preferência, o CpG é um ODN CpG-A. De preferência, o oligonucleotídeo CpG é construído de modo que a extremidade 5' esteja acessível para reconhecimento do receptor. Opcionalmente, duas seqüências de oligonucleotídeos CpG podem ser anexadas em suas extremidades 3' para a formação de "imunômeros”. Veja, por exemplo, as referências 177 & 181-183. Um adjuvante CpG útil é CpG7909, também conhecido como ProMuneTM (Coley Pharmaceutical Group, Inc.).
Como alternativa, ou adicionalmente, ao uso de seqüências CpG, podem ser usadas seqüências TpG [184]. Esses 25 oligonucleotídeos podem ser livres de porções CpG não metilados. O oligonucleotídeo imunoestimulante pode ser rico em pirimidina. Por exemplo, ele pode compreender mais de um nucleotídeo consecutivo de timidina (por exemplo, TTTT, como revelado na referência 184) e/ou ele pode ter uma composição de nucleotídeos com > 25% de timidina (por exemplo, > 35%, > 40%, > 50%, > 60%, > 80% etc.). Por exemplo, ele pode compreender mais de um nucleotídeo consecutivo de citosina (por exemplo, CCCC, como revelado na referência 184) e/ou ele pode ter uma composição de nucleotídeos com > 25% de citosina (por exemplo, > 35%, > 40%, > 50%, > 60%, > 80% etc.). Esses oligonucleotídeos podem ser livres de porções CpG não metilados.
Oligonucleotídeos imunoestimulantes tipicamente compreenderão pelo menos 20 nucleotídeos. Eles podem compreender menos de 100 nucleotídeos. 3dMPL (também conhecido como monofosforil 3 des-O-acilado lipídeo A ou 3-O-desacil-4'-monofosforil lipídeo A) é um adjuvante no qual a posição 3 da glicosamina da extremidade redutora no monofosforil lipídeo A foi desacilada. 3dMPL foi preparado a partir de um mutante sem heptose de Salmonella minnesota, e é quimicamente similar ao lipídeo A, mas desprovido de um grupo fosforil ácido-lábil e de um grupo acil base-lábil. Ele ativa células da linhagem de monócitos/macrófagos e estimula a liberação de várias citocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-α e GM-CSF (veja também a referência 185). A preparação de 3dMPL foi originalmente descrita na referência 186. 3dMPL pode assumir a forma de uma mistura de moléculas relacionadas que variam por sua acilação (por exemplo, possuindo 3, 4, 5 ou 6 cadeias acil, que podem ser de comprimentos diferentes). Os dois monossacarídeos de glicosamina (também conhecida como 2-desoxi-2-amino-glicose) são N-acilados em seus carbonos da posição 2 (ou seja, nas posições 2 e 2'), e também há O-acilação na posição 3'. O grupo anexado ao carbono 2 possui a fórmula - NH-CO-CH2-CR1R1'. 0 grupo anexado ao carbono 2' possui a fórmula -NH-CO-CH2-CR2R2' . 0 grupo anexado ao carbono 3' possui a fórmula -O-CO-CH2-CR3R3' . Uma estrutura representativa é: Os grupos R1, R2 e R3 são, cada um independentemente, — (CH2)n-CH3. 0 valor de n é preferivelmente entre 8 e 16, mais preferivelmente entre 9 e 12 e, principalmente, 10.
Os grupos R1', R2' e R3' podem ser, cada um independentemente: (a) —H; (b) —OH; ou (c) —O-CO-R4, em que R4 é —H ou — (CH2)m-CH3, em que o valor de m é preferivelmente entre 8 e 16 e é, mais preferivelmente, 10, 12 ou 14. Na posição 2, τη é preferivelmente 14. Na posição 2' , m é preferivelmente 10. Na posição 3', m é preferivelmente 12. Os grupos R1', R2' e R3' são, dessa forma, preferivelmente grupos -O-acil de ácido dodecanóico, ácido tetradecanóico ou ácido hexadecanóico.
Quando todos de R1', R2' e R3' forem -H, então o 3dMPL possuirá apenas 3 cadeias acil (uma em cada uma das posições 2, 2' e 3') . Quando somente dois de R1', R2' e R3' forem —H, então o 3dMPL poderá ter 4 cadeias acil. Quando apenas um de R1', R2' e R3' for -H, então o 3dMPL poderá ter 5 cadeias acil. Quando nenhum de R1', R2' e R3' for -H, então o 3dMPL poderá ter 6 cadeias acil. O adjuvante 3dMPL usado de acordo com a invenção pode ser uma mistura dessas formas, com 3 a 6 cadeias acil, e prefere-se incluir 3dMPL com 6 cadeias acil na mistura e, em particular, para assegurar que a forma de cadeia hexaacil constitua pelo menos 10% por peso do 3dMPL total, por exemplo, > 20%, > 30%, > 40%, > 50% ou mais. Verificou-se que 3dMPL com 6 cadeias acil é a forma com ação adjuvante mais ativa.
Dessa forma, a forma mais preferida de 3dMPL para inclusão na composição da invenção possui a fórmula (IV), mostrada abaixo.
Quando 3dMPL é usado na forma de uma mistura, então as referências às quantidades ou concentrações de 3dMPL em composições da invenção se referem às espécies combinadas de 3dMPL na mistura.
Em condições aquosas, 3dMPL pode formar agregados micelares ou partículas com diferentes tamanhos, por exemplo, com um diâmetro < 150 nm ou > 500 nm. Um ou ambos destes podem ser usados com a invenção, e as melhores partículas podem ser selecionados por ensaios de rotina. Partículas menores (por exemplo, suficientemente pequenas para gerar uma suspensão aquosa transparente de 3dMPL) são preferidas para uso de acordo com a invenção por causa de sua atividade superior [187]. Partículas preferidas possuem um diâmetro médio de menos de 220 nm, mais preferivelmente de menos de 200 nm ou menos de 150 nm ou menos de 120 nm, e podem até mesmo ter um diâmetro médio de menos de 100 nm. Na maioria dos casos, no entanto, o diâmetro médio não será menor do que 50 nm. Essas partículas são suficientemente pequenas para serem adequadas à esterilização por filtro. O diâmetro da particular pode ser avaliado pela técnica de rotina de dispersão luminosa dinâmica, que revela o diâmetro médio de uma partícula. Quando se diz que uma partícula possui um diâmetro de x nm, geralmente haverá uma distribuição de partículas em torno dessa média, mas pelo menos 50% por número (por exemplo, > 60%, > 70%, > 80%, > 90%, ou mais) das partículas terão um diâmetro dentro de faixa de x ± 25%. 3dMPL pode vantajosamente ser usado em combinação com uma emulsão óleo-em-água. Substancialmente todo o 3dMPL pode estar localizado na fase aquosa da emulsão. O 3dMPL pode ser usado isoladamente ou em combinação com um ou mais compostos adicionais. Por exemplo, é conhecido o uso de 3dMPL em combinação com a saponina QS21 [188] (incluindo em uma emulsão óleo-em-água [189]), com um oligonucleotídeo imunoestimulante, tanto com QS21 quanto com um oligonucleotídeo imunoestimulante, com fosfato de alumínio [190], com hidróxido de alumínio [191] ou tanto com fosfato de alumínio quanto com hidróxido de alumínio.
Formula (IV) Adjuvantes graxos Adjuvantes graxos que podem ser usados com a invenção incluem as emulsões óleo-em-água descritas acima, e também incluem, por exemplo: - Um composto de fórmula I, II ou III, ou um sal deste: como definido na referência 192, por exemplo, "ER 803058", "ER 803732", "ER 804053", ER 804058", "ER 804059", "ER 804442", "ER 804680", "ER 804764", ER 803022 ou "ER 804057", por exemplo: Derivados de lipídeo A de Escherichia coli, por exemplo, OM-174 (descrito nas referências 193 & 194) .
Uma formulação de um lipídeo catiônico e um (normalmente neutro) co-lipídeo, por exemplo, aminopropil-dimetil-miristoleiloxi-propanamínio brometo-diftanoilfosfatidil-etanolamina ("Vaxfectin™") ou aminopropil-dimetil-bis-dodeciloxi-propanamínio brometo-dioleoilfosfatidil-etanolamina ("GAP-DLRIE:DOPE"). Formulações que contêm sais de (±)-N-(3-aminopropil)-N, N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanamínio são preferidas [195]. - Monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado (veja acima).
Compostos que contêm lipídeos ligados a uma estrutura central acíclica contendo fosfato, por exemplo, o antagonista de TLR4 E5564 [196,197]: Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio podem ser usados. Esses nomes são convencionais, mas são usados apenas por conveniência, na medida em que nenhum deles é uma descrição precisa do real composto químico que está presente (por exemplo, veja o capítulo 9 da referência 128). A invenção pode usar qualquer um dos adjuvantes de "hidróxido" ou "fosfato" que são de uso geral como adjuvantes.
Os adjuvantes conhecidos como "hidróxido de alumínio" são tipicamente sais de oxihidróxido de alumínio, que são normalmente pelo menos parcialmente cristalinos. Oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pela fórmula AlO(OH), e pode ser distinguido de outros compostos de alumínio, por exemplo, hidróxido de alumínio Al(OH)3, por espectroscopia infravermelha (IR), em particular pela presença de uma banda de adsorção a 1.07 0 cm-1, e um forte ressalto a 3.090-3.100 cm-1 [capítulo 9 da referência 128]. O grau de cristalinidade de um adjuvante de hidróxido de alumínio se reflete pela largura da banda de difração na metade da altura (WHH), com partículas pouco cristalinas exibindo um alargamento de linha maior em função de tamanhos de cristalito menores. A área de superfície aumenta à medida que a WHH aumenta, e foi observado que adjuvantes com valores de WHH maiores possuem uma capacidade maior para adsorção de antígeno. Uma morfologia fibrosa (por exemplo, como observado em micrografias de transmissão eletrônica) é típica para adjuvantes de hidróxido de alumínio. O pI de adjuvantes de hidróxido de alumínio é tipicamente de cerca de 11, ou seja, o próprio adjuvante possui uma carga de superfície positiva em pH fisiológico. Capacidades de adsorção entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ em pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de hidróxido de alumínio.
Os adjuvantes conhecidos como “fosfato de alumínio" são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio que freqüentemente também contêm uma pequena quantidade de sulfato (ou seja, sulfato de hidroxifosfato de alumínio). Eles podem ser obtidos por precipitação, e as condições de reação e concentrações durante a precipitação influenciam o grau de substituição de fosfato para hidroxil no sal. Hidroxifosfatos geralmente possuem uma proporção molar de PO4/Al entre 0,3 e 1,2. Hidroxifosfatos podem ser distinguidos do AlPO4 estrito pela presença de grupos hidroxil. Por exemplo, uma banda de espectro IR a 3.164 cm-1 (por exemplo, quando aquecido até 200°C) indica a presença de hidroxilas estruturais [capítulo 9 da referência 128]. A proporção molar de PO4/Al3+ de um adjuvante de fosfato de alumínio geralmente será entre 0,3 e 1,2, preferivelmente entre 0,8 e 1,2 e, mais preferivelmente, 0,95 ± 0,1. O fosfato de alumínio geralmente será amorfo, particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo, com uma proporção molar de PO4/Al entre 0,84 e 0,92, incluído a 0,6 mg de Al3+/ml. O fosfato de alumínio geralmente será particulado (por exemplo, morfologia semelhante a uma placa, como observado em micrografias de transmissão eletrônica). Diâmetros típicos das partículas estão na faixa de 0,520 pm (por exemplo, cerca de 5-10 pm) após qualquer adsorção de antígeno. Capacidades de adsorção entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de A1+++ em pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de fosfato de alumínio. O ponto de carga zero (PZC) do fosfato de alumínio está inversamente relacionado ao grau de substituição de hidroxil por fosfato, e esse grau de substituição pode variar, dependendo das condições de reação e da concentração de reagentes usadas para a preparação do sal por precipitação. O PZC também é alterado por alteração da concentração de íons fosfato livres em solução (mais fosfato = PZC mais ácido) ou por adição de um tampão como, por exemplo, um tampão histidina (torna o PZC mais básico). Os fosfatos de alumínio usados de acordo com a invenção geralmente terão um PZC entre 4,0 e 7,0, mais preferivelmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo, cerca de 5,7.
Suspensões de sais de alumínio usadas para preparar as composições da invenção podem conter um tampão (por exemplo, um tampão fosfato ou um tampão histidina ou um tampão Tris), mas isso nem sempre é necessário. As suspensões são preferivelmente estéreis e livres de pirogênio. Uma suspensão pode incluir íons fosfato aquosos livres, por exemplo, presentes em uma concentração entre 1,0 e 20 mM, preferivelmente entre 5 e 15 mM e, mais preferivelmente, em torno de 10 mM. As suspensões também podem compreender cloreto de sódio. A invenção pode usar uma mistura tanto de um hidróxido de alumínio quanto de um fosfato de alumínio [89]. Nesse caso, pode haver mais fosfato do que hidróxido de alumínio, por exemplo, uma proporção de peso de pelo menos 2:1, por exemplo, > 5:1, > 6:1, > 7:1, > 8:1, > 9:1 etc. A concentração de Al+++ em uma composição para administração a um paciente é preferivelmente menor do que 10 mg/ml, por exemplo, < 5 mg/ml, < 4 mg/ml, < 3 mg/ml, < 2 mg/ml, < 1 mg/ml etc. Uma faixa preferida é entre 0,3 e 1 mg/ml. Prefere-se um máximo de 0,85 mg/dose.
Além de incluir um ou mais adjuvantes de sal de alumínio, o componente adjuvante pode incluir um ou mais adjuvantes adicionais ou agentes imunoestimulantes. Estes componentes adicionais incluem, sem limitação: um adjuvante de monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado ("3d-MPL”); e/ou uma emulsão óleo-em-água. 3d-MPL também é citado como 3 des-O-acilado monofosforil lipídeo A ou como 3-O-desacil-4'-monofosforil lipídeo A. O nome indica que a posição 3 da glicosamina da extremidade redutora no monofosforil lipídeo A é desacilada. Ele foi preparado a partir de um mutante sem heptose de S. minnesota, e é quimicamente similar ao lipídeo A, mas é desprovido de um grupo fosforil ácido-lábil e de um grupo acil base-lábil. Ele ativa células da linhagem de monócitos/macrófagos e estimula a liberação de várias citocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-α e GM-CSF. A preparação de 3d-MPL foi originalmente descrita na referência 186, e o produto vem sendo fabricado e vendido por Corixa Corporation, sob o nome comercial MPLTM. Detalhes adicionais podem ser encontrados nas referências 139 a 142.
Composições farmacêuticas As composições da invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Elas normalmente incluem componentes além dos antígenos; por exemplo, elas tipicamente incluem um ou mais veículos ou excipientes farmacêuticos. Uma discussão detalhada de cada um dos componentes está disponível na referência 198.
As composições geralmente estarão em forma aquosa. A composição pode incluir conservantes, por exemplo, timerosal ou 2-fenoxietanol. Prefere-se, no entanto, que a vacina deva ser substancialmente livre de (ou seja, menos de 5 pg/ml) material mercurial, por exemplo, livre de timerosal [9,199]. As vacinas que não contêm mercúrio são mais preferidas. Vacinas sem conservantes são particularmente preferidas.
Para controlar a tonicidade, prefere-se incluir um sal fisiológico, por exemplo, um sal de sódio. Prefere-se o cloreto de sódio (NaCl), que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, fosfato de potássio dihidrogênio, dihidrato de fosfato dissódico, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio etc.
As composições geralmente terão uma osmolaridade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferivelmente entre 240-360 mOsm/kg, e mais preferivelmente estará na faixa de 290-310 mOsm/kg. A osmolaridade foi relatada previamente como não tendo um impacto sobre a dor causada pela vacinação [200], mas, no entanto, prefere-se manter a osmolaridade nessa faixa.
As composições podem incluir um ou mais tampões. Tampões típicos incluem: um tampão fosfato; um tampão Tris; um tampão borato; um tampão succinato; um tampão histidina (particularmente com um adjuvante de hidróxido de alumínio); ou um tampão citrato. Os tampões tipicamente serão incluídos na faixa de 5-20 mM. O pH de uma composição geralmente estará entre 5,0 e 8,1 e, mais tipicamente, entre 6,0 e 8,0, por exemplo, 6,5 e 7,5, ou entre 7,0 e 7,8. Um processo da invenção pode, portanto, incluir uma etapa de ajuste do pH da vacina a granel, antes da embalagem. A composição é preferivelmente estéril. A composição é preferivelmente não pirogênica, por exemplo, contendo < 1 EU (unidade de endotoxina, uma medida-padrão) por dose, e preferivelmente < 0,1 EU por dose. A composição é preferivelmente livre de glúten.
As composições da invenção podem incluir detergentes, por exemplo, um tensoativo de éster de polioxietileno sorbitano (conhecido como "Tweens"), um octoxinol (por exemplo, octoxinol-9 (Triton X-100) ou t-octilfenoxipolietoxietanol), um cetil trimetil amônio brometo ("CTAS"), ou desoxicolato de sódio, particularmente para uma vacina dividida ou de antígeno de superfície. O detergente pode estar presente apenas em quantidades residuais. Dessa forma, a vacina pode incluir menos de 1 mg/ml de cada um de octoxinol-10 e polissorbato 80. Outros componentes residuais em quantidades residuais poderiam ser antibióticos (por exemplo, neomicina, canamicina, polimixina B). A composição pode incluir material para uma única imunização, ou pode incluir material para imunizações múltiplas (ou seja, um kit "multidoses"). A inclusão de um conservante é preferida em arranjos multidoses. Como alternativa (ou adicionalmente) à inclusão de um conservante em composições multidoses, as composições podem estar contidas em um recipiente que possua um adaptador asséptico para a remoção de material.
As vacinas contra influenza são tipicamente administradas em um volume de dosagem de cerca de 0,5 ml, embora metade da dose (ou seja, cerca de 0,25 ml) possa ser administrada em crianças.
As composições e os kits são preferivelmente armazenados entre 2°C e 8°C. Eles não podem ser congelados. Idealmente eles devem ser mantidos protegidos da luz direta.
Kits da invenção As composições da invenção podem ser preparadas de forma extemporânea, no momento da liberação, particularmente quando estiver sendo usado um adjuvante. Dessa forma, a invenção fornece kits que incluem os vários componentes prontos para mistura. O kit permite que o adjuvante e o antígeno sejam mantidos separadamente até o momento da utilização. Esse arranjo é particularmente útil quando se utiliza um adjuvante de emulsão óleo-em-água.
Os componentes estão fisicamente separados uns dos outros dentro do kit, e essa separação pode ser obtida de várias formas. Por exemplo, os dois componentes podem estar em dois recipientes separados, por exemplo, frascos. O conteúdo dos dois frascos pode então ser misturado, por exemplo, por remoção do conteúdo de um frasco e adicionando-o ao outro frasco, ou removendo-se separadamente o conteúdo de ambos os frascos e misturando-os em um terceiro recipiente.
Em um arranjo preferido, um dos componentes do kit está em uma seringa e o outro está em um recipiente como, por exemplo, um frasco. A seringa pode ser usada (por exemplo, com uma agulha) para inserir seu conteúdo no segundo recipiente para mistura, e a mistura pode então ser removida da seringa. O conteúdo misto da seringa pode então ser administrado a um paciente, tipicamente por meio de uma nova agulha estéril. A embalagem de um componente em uma seringa elimina a necessidade de utilização de uma seringa separada para administração ao paciente.
Em outro arranjo preferido, os dois componentes do kit podem ser mantidos juntos, mas separadamente, na mesma seringa, por exemplo, uma seringa de câmara dupla, por exemplo, aquelas reveladas nas referências 201-208 etc. Quando a seringa é acionada (por exemplo, durante administração a um paciente), o conteúdo das duas câmaras é misturado. Esse arranjo evita a necessidade de uma etapa separada de mistura no momento da utilização.
Os componentes do kit geralmente estarão em forma aquosa. Em alguns arranjos, um componente (tipicamente o componente antigênico, e não o componente adjuvante) está em forma seca (por exemplo, em uma forma liofilizada), com o outro componente estando em forma aquosa. Os dois componentes podem ser misturados a fim de reativar o componente seco e gerar uma composição aquosa para administração a um paciente. Um componente liofilizado tipicamente estará localizado dentro de um frasco, e não em uma seringa. Os componentes secos podem incluir estabilizantes como, por exemplo, lactose, sacarose ou manitol, além de misturas destes, por exemplo, misturas de lactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol etc. Um arranjo possível utiliza um componente adjuvante aquoso em uma seringa pré-preenchida e um componente antigênico liofilizado em um frasco.
Embalagem de composições ou componentes do kit Recipientes adequados para as composições da invenção (ou para os componentes do kit) incluem frascos, seringas (por exemplo, seringas descartáveis), sprays nasais etc. Esses recipientes devem ser estéreis.
Quando uma composição/componente está localizado em um frasco, o frasco preferivelmente é feito de um material de vidro ou de plástico. O frasco é preferivelmente esterilizado antes da composição ser adicionada a ele. Para evitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, os frascos são preferivelmente lacrados com uma tampa sem látex, e a ausência de látex em todo o material de embalagem é preferida. O frasco pode incluir uma dose única de vacina, ou pode incluir mais de uma dose (um frasco "multidoses"), por exemplo, 10 doses. Frascos preferidos são feitos de vidro incolor.
Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um Luer lock) adaptada de tal forma que uma seringa pré-preenchida possa ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa possa ser expelido no frasco (por exemplo, para reconstituir o material liofilizado nele contido), e o conteúdo do frasco possa ser removido de volta para a seringa. Após remoção da seringa do frasco, uma agulha pode então ser anexada, e a composição pode ser administrada a um paciente. A tampa preferivelmente está localizada dentro de um lacre ou cobertura, de tal forma que o lacre ou cobertura tenha que ser removida, antes que a tampa possa ser acessada. Um frasco pode ter uma tampa que permite a remoção asséptica de seu conteúdo, particularmente para frascos multidoses.
Quando um componente é embalado em uma seringa, a seringa pode ter uma agulha a ela anexada. Caso uma agulha não esteja anexada, uma agulha separada poderá ser fornecida com a seringa para montagem e uso. Uma agulha desse tipo pode ter uma proteção. Preferem-se agulhas de segurança. Agulhas de 2,54 cm/23 gauge, 2,54 cm/25 gauge e 0,625 cm/25 gauge são típicas. As seringas podem ser fornecidas com rótulos destacáveis, nos quais podem ser impressos o número do lote, a estação da influenza e a data de validade do conteúdo, para facilitar o gerenciamento dos registros. O êmbolo na seringa preferivelmente possui um plugue para evitar que o êmbolo seja acidentalmente removido durante a aspiração. As seringas podem ter uma tampa e/ou êmbolo de borracha de látex. Seringas descartáveis contêm uma dose única de vacina. A seringa geralmente terá uma tampa na ponta para lacrar a ponta, entes da adesão de uma agulha, e a tampa da ponta preferivelmente é feita de uma borracha de butil. Caso a seringa e a agulha sejam embaladas separadamente, a agulha preferivelmente será adaptada com uma proteção de borracha de butil. Seringas preferidas são aquelas comercializadas sob o nome comercial “Tip-Lok TM”.
Os recipientes podem ser marcados para exibir um volume de meia dose, por exemplo, para facilitar a aplicação em crianças. Por exemplo, uma seringa contendo uma dose de 0,5 ml pode ter uma marca que exiba um volume de 0,25 ml.
Quando é utilizado um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco), prefere-se utilizar um recipiente feito de um vidro de borossilicato, e não de um vidro de cal sodada.
Um kit ou uma composição pode ser embalado (por exemplo, na mesma caixa) com um folheto que inclui detalhes da vacina, por exemplo, instruções para administração, detalhes dos antígenos dentro da vacina etc. As instruções também podem conter avisos, por exemplo, para manter uma solução de adrenalina prontamente disponível em caso de reação anafilática após vacinação etc. Em algumas modalidades da invenção, o folheto estabelecerá que a vacina inclui proteína da matriz. Métodos de tratamento e administração da vacina As composições da invenção são adequadas para administração a pacientes humanos, e a invenção fornece um método de despertar uma resposta imunológica em um paciente, que compreende a etapa de administração de uma composição da invenção ao paciente. A invenção também fornece um kit ou uma composição da invenção para uso como medicamento. A invenção também fornece o uso de: (i) uma preparação de antígeno do vírus influenza que inclui hemaglutinina e proteínas da matriz, preparada a partir de vírus desenvolvido em cultura de células, na fabricação de um medicamento para despertar uma resposta imunológica em um paciente. A resposta imunológica despertada por esses métodos e usos geralmente incluirá uma resposta de anticorpos, preferivelmente uma resposta protetora de anticorpos. Métodos para avaliação de respostas de anticorpos, capacidade neutralizante e proteção após vacinação contra o vírus influenza são bem conhecidos na técnica. Estudos em humanos demonstraram que as titulações de anticorpos contra hemaglutinina de vírus influenza humano estão correlacionadas à proteção (uma titulação da inibição da hemaglutinação da amostra de soro de cerca de 30-40 gera uma proteção em torno de 50% por infecção por um vírus homólogo) [209]. As respostas de anticorpos tipicamente são medidas por inibição de hemaglutinação, por microneutralização, por imunodifusão radial simples (SRID) e/ou por hemólise radial simples (SRH). Essas metodologias de ensaio são bem conhecidas na técnica.
As composições da invenção podem ser administradas de várias formas. A via de imunização mais preferida é por injeção intramuscular (por exemplo, no braço ou na perna), mas outras vias disponíveis incluem injeção subcutânea, intranasal [210-212], oral [213], intradérmica [214,215], transcutânea, transdérmica [216] etc.
As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar tanto crianças quanto adultos. As vacinas contra influenza são atualmente recomendadas para uso em imunização pediátrica e de adultos, a partir da idade de 6 meses. Dessa forma, o paciente pode ter menos de 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 1555 anos de idade ou, pelo menos, 55 anos de idade. Pacientes preferidos para receber as vacinas são os idosos (por exemplo, > 50 anos de idade, > 60 anos de idade e, preferivelmente, > 65 anos de idade), as crianças (por exemplo, < 5 anos de idade), pacientes hospitalizados, profissionais da área de saúde, militares, mulheres grávidas, os doentes crônicos, pacientes imunodeficientes, pacientes que receberam um composto antiviral (por exemplo, um composto de oseltamivir ou zanainivir; veja abaixo) nos 7 dias anteriores à administração da vacina, pessoas com alergias ao ovo e pessoas que viajam para o exterior. No entanto, as vacinas não são adequadas apenas para esses grupos, e podem ser usadas de forma geral em uma população. Para cepas pandêmicas, prefere-se a administração a todas as faixas etárias.
As composições preferidas da invenção satisfazem 1, 2 ou 3 dos critérios CPMP quanto à eficácia. Em adultos (1860 anos), esses critérios são: (1) > 70% de soroproteção; (2) > 4 0% de soroconversão; e/ou (3) um aumento GMT de > 2,5 vezes. Em idosos (> 60 anos), esses critérios são: (1) > 60% de soroproteção; (2) > 30% de soroconversão; e/ou (3) um aumento GMT de > 2 vezes. Esses critérios se baseiam em estudos abertos com pelo menos 50 pacientes. O tratamento pode ser por um esquema de dose única ou por um esquema de doses múltiplas. Doses múltiplas podem ser usadas em um esquema de imunização primária e/ou em um esquema de imunização de reforço. Em um esquema de doses múltiplas, as várias doses podem ser dadas pela mesma via ou por vias diferentes, por exemplo, uma dose primária parenteral e um reforço mucoso, uma dose primária mucosa e um reforço parenteral etc. A administração de mais de uma dose (tipicamente duas doses) é particularmente útil em pacientes imunologicamente virgens, por exemplo, para pessoas que nunca receberam uma vacina contra influenza antes, ou para a vacinação contra um novo subtipo de HA (como em um surto pandêmico). Doses múltiplas tipicamente serão administradas com um intervalo de pelo menos 1 semana (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas etc.).
As vacinas produzidas pela invenção podem ser administradas aos pacientes simultaneamente (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional de saúde ou centro de vacinação) com outras vacinas, por exemplo, simultaneamente com uma vacina contra sarampo, uma vacina contra caxumba, uma vacina contra rubéola, uma vacina MMR, uma vacina contra varicela, uma vacina MMRV, uma vacina contra difteria, uma vacina contra tétano, uma vacina contra pertussis, uma vacina DTP, uma vacina conjugada de H. influenzae do tipo B, uma vacina inativada de poliovírus, uma vacina contra o vírus da hepatite B, uma vacina meningocócica conjugada (por exemplo, uma vacina tetravalente A-C-W135-Y), uma vacina contra o vírus sincicial respiratório, uma vacina pneumocócica conjugada etc. A administração simultaneamente com uma vacina pneumocócica e/ou uma vacina meningocócica é particularmente útil em pacientes idosos.
Da mesma forma, as vacinas da invenção podem ser administradas aos pacientes simultaneamente (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional de saúde) com um composto antiviral e, em particular, um composto antiviral ativo contra vírus influenza (por exemplo, oseltamivir e/ou zanamivir). Esses antivirais incluem inibidores da neuraminidase, por exemplo, um ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexeno-1-carboxílico ou ácido 5-(acetilamino)-4-[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anidro-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galactonon-2-enônico, incluindo ésteres destes (por exemplo, os ésteres etílicos) e sais destes (por exemplo, os sais de fosfato). Um antiviral preferido é o ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexeno-1-carboxílico, éster etílico, fosfato (1:1), também conhecido como fosfato de oseltamivir (TAMIFLUTM).
Ensaios Para caracterizar uma vacina contra influenza, pode ser útil determinar a quantidade de proteína da matriz que está presente. Dessa forma, a invenção fornece ensaios para análise de vacinas contra influenza, em que uma amostra da vacina é analisada para determinar a presença de proteína da matriz. Os ensaios são particularmente úteis para a pesquisa de fragmentos de proteína M1. A vacina contra influenza pode incluir antígenos de vírus influenza A e/ou influenza B. A invenção fornece ensaios para análise das vacinas que compreendem antígenos de um vírus influenza B, em que uma amostra da vacina é analisada para determinar a presença de uma proteína da matriz do vírus influenza B. A vacina contra influenza pode incluir antígenos de vários subtipos de HA. A invenção fornece ensaios para a análise de vacinas que compreendem antígenos de um vírus influenza A, em que uma amostra da vacina é analisada para determinar a presença de uma proteína da matriz do vírus influenza A, e em que o vírus influenza A possui um subtipo de hemaglutinina selecionado de: H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16. A vacina contra influenza pode incluir antígenos desenvolvidos em cultura de células. A invenção fornece ensaios para análise de vacinas desenvolvidas em cultura de células, em que uma amostra da vacina é analisada para determinar a presença de uma proteína da matriz do vírus influenza. A vacina contra influenza pode incluir um adjuvante. A invenção fornece ensaios para a análise de vacinas com adjuvantes contra influenza, em que uma amostra da vacina é analisada para determinar a presença de uma proteína da matriz do vírus influenza. A invenção também fornece ensaios para a análise de vacinas sem adjuvantes contra influenza, em que uma amostra da vacina sem adjuvante é analisada para determinar a presença de uma proteína da matriz do vírus influenza, e em que um adjuvante é então adicionado à vacina.
Esses ensaios tipicamente serão imunoensaios, por exemplo, um western blot ou ELISA. Um imunoensaio pode utilizar anticorpos policlonais ou monoclonais. Quando é usado um anticorpo monoclonal, em algumas modalidades ele não é um anticorpo murídeo, pode exemplo, um anticorpo murídeo IgG1. Anticorpos que reconhecem fragmentos de M1 podem ser usados nos ensaios, incluindo aqueles que reconhecem os fragmentos de M1 aqui revelados, por exemplo, anticorpos que reconhecem fragmentos com um peso molecular de 10 kDa ou menos (por exemplo, < 5 kDa), que reconhecem fragmentos desprovidos da metionina no terminal N, que reconhecem fragmentos com a seqüência do terminal N do ID. DE SEQ. N°: 15, que reconhecem o ID. DE SEQ. N°: 28 e/ou 29, que reconhecem fragmentos que incluem o ID. DE SEQ. N°: 30, que reconhecem fragmentos com um resíduo modificado de forma covalente do terminal N etc.
Os ensaios são particularmente úteis para a detecção de fragmentos de proteína M1, tais como fragmentos com um peso molecular de 10 kDa ou menos (por exemplo, < 5 kDa) e/ou os fragmentos aqui revelados (por exemplo, desprovidos da metionina do terminal N da seqüência total de M1). Ensaios preferidos podem distinguir entre a presença de proteína M1 de comprimento total e fragmentos da proteína M1, e também podem distinguir entre diferentes fragmentos.
Os ensaios podem ser qualitativos, semiquantitativos ou quantitativos. A invenção também fornece vacinas que foram testadas desta forma.
Aspectos adicionais da invenção A invenção fornece uma composição imunogênica que compreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, e (ii) um adjuvante. As proteínas do vírus influenza podem ser preparadas a partir de vírus desenvolvido em cultura de células ou desenvolvidos no ovo. Como descrito acima, a composição também pode incluir componentes adicionais, por exemplo, proteína neuraminidase do vírus influenza, veículos/excipientes farmacêuticos etc. A invenção também fornece um método para a preparação de uma composição imunogênica que compreende as etapas de: (i) crescimento do vírus influenza; (ii) preparação de uma composição de antígeno a partir de vírus desenvolvidos na etapa (i), em que a composição de antígeno compreende hemaglutinina e proteínas da matriz; e (iii) combinação da composição de antígeno com um adjuvante, para gerar a composição imunogênica. A invenção fornece uma composição imunogênica que compreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, em que a hemaglutinina possui um subtipo selecionado de: H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16. A invenção também fornece um método para a preparação de uma composição imunogênica que compreende as etapas de: (i) crescimento do vírus influenza; (ii) preparação de uma composição de antígeno a partir de vírus desenvolvidos na etapa (i), em que a composição de antígeno compreende hemaglutinina e proteínas da matriz, e em que a hemaglutinina possui um subtipo selecionado de: H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16; e (iii) combinação da composição de antígeno com um adjuvante, para gerar a composição imunogênica. A invenção fornece uma composição imunogênica que compreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, em que a concentração de hemaglutinina na composição é de 29 pg/ml ou menos (por exemplo, < 28 pg/ml, < 27 pg/ml, < 26 pg/ml, < 25 pg/ml, < 24 pg/ml, < 23 pg/ml, < 22 pg/ml, < 21 pg/ml, < 20 pg/ml, < 19 pg/ml, < 18 pg/ml, < 17 pg/ml, < 16 pg/ml, < 15 pg/ml, < 14 pg/ml, < 13 pg/ml, < 12 pg/ml, < 11 pg/ml, < 10 pg/ml, < 9 pg/ml, < 8 pg/ml, < 7 pg/ml, < 6 pg/ml, < 5 pg/ml, < 4 pg/ml, < 3 pg/ml, < 2 pg/ml). A composição pode incluir hemaglutinina de mais de uma cepa de vírus influenza, quando então a referida concentração é por cepa (ou seja, < 29 pg/ml por cepa). A invenção fornece uma composição imunogênica que compreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, em que a concentração de hemaglutinina na composição é de 31 pg/ml ou mais (por exemplo, > 32 pg/ml, > 33 pg/ml, > 34 pg/ml, > 35 pg/ml, > 40 pg/ml, > 45 pg/ml, > 50 pg/ml, > 55 pg/ml, > 60 pg/ml, > 70 pg/ml, > 80 pg/ml, > 90 pg/ml, > 100 pg/ml etc., mas tipicamente < 200 pg). A composição pode incluir hemaglutinina de mais de uma cepa de vírus influenza, quando então a referida concentração é por cepa (ou seja, > 31 pg/ml por cepa). A invenção também fornece uma composição imunogênica que compreende uma proteína M2 da matriz do vírus influenza, mas que é substancialmente livre de uma proteína M1 da matriz do vírus influenza, como definido acima. Vacinas que contêm M2 estão atualmente sendo desenvolvidas [217]. M2 é codificada naturalmente por um segmento viral que também codifica M1. Dessa forma, em um sistema de expressão recombinante, talvez a proteína M1 seja expressa como subproduto. De acordo com a invenção, essa expressão colateral pode ser evitada, ou as proteínas M1 da matriz podem ser removidas da composição que contém M2. A proteína M2 pode ser uma proteína de comprimento total ou pode ser, por exemplo, um fragmento de M2, por exemplo, o domínio extracelular de M2 (conhecido na técnica como “M2e”). A proteína M2 pode ser conjugada a outro antígeno, por exemplo, a um antígeno do vírus da hepatite B. A vacina também pode ser livre de HA e/ou NA.
Considerações gerais O termo “que compreende” engloba “que inclui”, além de “que consiste”, por exemplo, uma composição “que compreende” X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. A palavra “substancialmente” não exclui “completamente”, por exemplo, uma composição que é “substancialmente livre” de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção. O termo "cerca de", em relação a um valor numérico x, significa, por exemplo, x ± 10%. A menos que especificamente definido, um processo que compreende uma etapa de mistura de dois ou mais componentes não exige qualquer ordem específica de mistura. Dessa forma, os componentes podem ser misturados em qualquer ordem. Quando há três componentes, dois componentes podem ser combinados entre eles, e depois a combinação pode ser combinada com o terceiro componente etc.
Quando são usados materiais animais (e particularmente bovinos) na cultura de células, eles devem ser obtidos de fontes que sejam livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs) e, em particular, livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE). Em geral, prefere-se o cultivo de células na ausência total de materiais de origem animal.
Quando um composto é administrado ao corpo como parte de uma composição, aquele composto pode alternativamente ser substituído por um pró-fármaco adequado.
Quanto um substrato celular é usado para procedimentos recombinantes ou de genética reversa, ele preferivelmente é um que tenha sido aprovado para uso na produção de vacinas humanas, por exemplo, como em Ph Eur, capítulo geral 5.2.3. A identidade entre seqüências de polipeptídeos é preferivelmente determinada pelo algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman, da forma implementada no programa MPSRCH (Oxford Molecular), com o uso de pesquisa de afinidade de lacuna (gap) com os parâmetros: penalidade de lacuna aberta = 12 e penalidade de extensão de lacuna = 1.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um SDS-PAGE de várias preparações de vacina. As raias "M" são marcadores de peso molecular (kDa). A raia 1 é a vacina desenvolvida em MDCK. As raias 2-6 são vacinas comerciais existentes. As setas mostram (a) HA1 (b) HA2 (c) o fragmento M1 da invenção. A Figura 2 mostra os resultados da análise western blot de vírions influenza fracionados com o uso de anti- soro de coelhos imunizados com o fragmento da proteína da matriz de ~5 kDa. O painel da esquerda é um blot com o uso de soros pré-imunes, e o painel da direita utiliza soros pós-imunes.
MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO
Embora trabalhando em uma vacina de antígenos de superfície purificados para o vírus influenza, em que os vírions cresceram em células MDCK, foi observado que uma quantidade relativamente grande de polipeptídeo de baixo peso molecular podia ser detectada por SDS-PAGE após a divisão do vírus influenza A com CTAB. Esse polipeptídeo de baixo peso molecular também estava presente durante a purificação adicional do antígeno, e estava presente na preparação final de antígenos de superfície. Para investigar esse polipeptídeo, foi usado um sistema tampão que permite a identificação de polipeptídeos tão pequenos quanto 2 kDa (Géis Bis-Tris NuPAGETM Novex de Invitrogen). Com o uso desse sistema, foi identificada uma banda de polipeptídeo com um peso molecular aparente de ~5 kDa. Essa banda de polipeptídeo não era observada nas vacinas atuais INFLEXAL VTM, INFLUSPLIT™, MUTAGRIP™, VAXIGRIP™, BEGRIVAC™, FLUARIXTM, INFLUVACTM ou FLUVIRINTM, todas elas preparada a partir de vírions desenvolvidos no ovo. Surpreendentemente, a banda de polipeptídeo foi detectada em alguns lotes de AGRIPPALTM, mas sua existência ou presença não era previamente reconhecida. A imunização de coelhos com a banda de ~5 kDa induziu anticorpos que eram capazes de detectar a proteína M1 nativa. A Figura 2 mostra os resultados da análise western blot de vírions influenza fracionados com o uso de anti- soros dos coelhos, com forte reatividade para a proteína M1 do vírion. Dessa forma, um polipeptídeo na banda de ~5 kDa carrega epítopos que são imunogênicos e podem causar a produção de anticorpos que se ligam à proteína M1 nativa correspondente. A análise da seqüência de aminoácidos do terminal N da banda de ~5 kDa derivada de dois vírus diferentes (um vírus H1N1 e um vírus H3N2) revelou um peptídeo com seqüência do terminal N de EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18). Essa seqüência de aminoácidos é um fragmento da proteína M1 do vírus influenza idêntico às posições de aminoácidos 114 a 125 do ID. DE SEQ. N°: 2.
Uma investigação posterior com o uso de análise MS de fragmentos trípticos revelou um fragmento mais abundante com a seqüência de aminoácidos do terminal N do ID. DE SEQ. N°: 28, que é desprovida da metionina do terminal N do ID. DE SEQ. N°: 2: SLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGIL GFVFTLTVPSERGLQR (ID. DE SEQ. N°: 28) O terminal C desse fragmento pode ter um resíduo Arg adicional (ou seja, SLL...QRR, ID. DE SEQ. N°: 29). A serina do terminal N pode ser modificada de forma covalente, por exemplo, acetilada. O 12-mer do terminal N desse fragmento (SLLTEVETYVLS; ID. DE SEQ. N°: 30) é bem conservado entre cepas.
As composições da invenção podem conter ambos os fragmentos, com o fragmento próximo ao terminal N (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 28) sendo mais abundante.
Entende-se que a invenção foi descrita apenas como exemplo, e que podem ser feitas modificações ainda permanecendo dentro do escopo e do espírito da invenção.
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REIVINDICAÇÕES

Claims (26)

1. Vacina contra vírion influenza dividido ou antígeno de superfície purificado caracterizada por compreender hemaglutinina de vírus influenza e um fragmento com um peso molecular de <10 kDa de proteína da matriz M1, em que o fragmento compreende um epítopo de célula T, que forma um complexo estável, e em que a composição não contém ovalbumina.
2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fragmento de proteína da matriz compreende a sequência LEDVFAGK (ID. DE SEQ. N°: 17) .
3. Vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o fragmento de proteína da matriz compreende a sequência YSXGAL (ID. DE SEQ. N°: 27).
4. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o fragmento de proteína da matriz é desprovido da metionina do terminal N da seqüência de M1 natural.
5. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o fragmento de proteína da matriz possui uma sequência do terminal N EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18).
6. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o fragmento de proteína da matriz possui uma sequência do terminal N SLLTEVETYVLS (ID. DE SEQ. N°: 30).
7. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a serina do terminal N do ID. DE SEQ. N°: 30 é modificada de forma covalente, por exemplo, acetilada.
8. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de a composição compreender: (i) um primeiro fragmento de proteína da matriz que possui uma sequência do terminal N SLLTEVETYVLS (ID. DE SEQ. N°: 30); e (ii) uma segunda proteína da matriz que possui uma sequência do terminal N EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18).
9. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a proteína da matriz está presente em uma concentração entre 1 qg/ml e 15 qg/ml.
10. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a hemaglutinina é de um subtipo H1, H2, H3, H5, H7 ou H9 do vírus influenza A.
11. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a composição contém entre 0,1 e 20 qg de hemaglutinina por cepa viral.
12. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a composição inclui um adjuvante.
13. Vacina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende um ou mais sais de alumínio ou uma emulsão óleo-em-água.
14. Método para a preparação de uma composição imunogênica caracterizado por compreender as etapas de: (i) crescer vírus influenza em cultura de células, em que a tripsina é adicionada para permitir a liberação viral; (ii) preparar uma composição de antígeno a partir de vírus desenvolvidos na etapa (i), em que a composição de antígeno compreende hemaglutinina e proteínas da matriz não como um vírion inteiro que forma um complexo estável; e (iii) combinar a composição de antígeno com um veículo farmacêutico, para gerar a composição imunogênica, em que a proteína da matriz possui uma sequência de aminoácidos que é um fragmento de uma sequência de aminoácidos da proteína de matriz M1 de comprimento total.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz compreende um epítopo de célula T da proteína M1 do vírus influenza.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz compreende uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos: LEDVFAGK (ID. DE SEQ N°: 17) ou YSXGAL (ID. DE SEQ N°: 27).
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz é desprovida da metionina do terminal N da sequência de M1 natural.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz possui uma sequência do terminal N SLLTEVETYVLS (ID. DE SEQ. N°: 30), por exemplo, em que a serina do terminal N da ID. DE SEQ. N°: 30 é modificada de forma covalente, por exemplo, acetilada.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz possui uma sequência do terminal N EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18).
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19 caracterizado pelo fato de a composição compreender: (i) uma primeira proteína da matriz que possui uma sequência do terminal N SLLTEVETYVLS (ID. DE SEQ. N°: 30); e (ii) uma segunda proteína da matriz que possui uma sequência do terminal N EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18).
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz está presente em uma concentração entre 1 pg/ml e 15 pg/ml.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato de a composição compreender vírus influenza dividido ou antígenos de superfície de influenza purificado.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 22, caracterizado pelo fato de que a hemaglutinina é de um subtipo H1, H2, H3, H5, H7 ou H9 do subtipo do vírus influenza A.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 23, caracterizado pelo fato de que as proteínas do vírus influenza são preparadas a partir de um vírus influenza desenvolvido em uma cultura de uma célula hospedeira, e de que a composição contém menos de 10 ng de DNA celular da célula hospedeira.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que a composição contém entre 0,1 e 20 qg de hemaglutinina por cepa viral.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 25, caracterizado pelo fato de que a composição inclui um adjuvante, por exemplo, um ou mais sais de alumínio ou uma emulsão óleo-em-água.
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