BRPI0707327A2

BRPI0707327A2 - galactosidade com atividade alfa-galactosiltransferase

Info

Publication number: BRPI0707327A2
Application number: BRPI0707327-5A
Authority: BR
Inventors: Georgios Tzortzis; Athanasios K Goulas; Theodoros Goulas
Original assignee: Clasado Inc
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2011-05-03
Also published as: PL1979473T3; US20090110770A1; KR101342472B1; JP4960974B2; GB2447006B; GB2447006A; IL192892A0; ATE507287T1; RU2441913C2; WO2007088324A1; AU2007211356B2; AU2007211356A1; IL192892A; CA2637219A1; EP1979473B1; UA95944C2; KR20080098598A; NO20082780L; EP1979473A1; GB0812896D0

Abstract

GALACTOSIDASE COM ATIVIDADE ALFA-GALACTOSlLTRANSFERASE. A presente invenção refere-se a <225>-galactosidase com atividade trans-galactosilaçao isolada de Bifidobacterium bifidum. A <225>-galactosidase é capaz de converter lactose numa mistura de oligossacarídeos que são ligados na posição <225>, e produzem, inesperadamente o dissacarídeo a-ligado, galactobiose. A mistura pode ser incorporada em numerosos produtos alimentares ou alimentos para animais com a finalidade de melhorar a saúde intestinal promovendo o crescimento de bifidobactérias no intestino, e reprimindo o crescimento da microflora patogênica.

Description

"GALACTOSIDASE COM ATIVIDADE ALFA-GALACTOSILTRANSFERASE"

PRODUTO E PROCESSO

A presente invenção refere-se a uma β-galactosidade com atividade trans-galactosilaçao capaz de converter Iactose numa mistura de oligossacarídeos os quais sãoligados em β e produzem, inesperadamente o dissacarídeo α-ligado a1-6 galactobiose. Emparticular, ela refere-se a uma β-galactosidase isolada de uma cepa recentemente desco-berta de Bifidobacterium bifidum.

A invenção refere-se, particularmente, a seqüências de Dna codificando a enzimaβ-galactosidade isolada na enzima codificada por uma seqüência de DNA e a uma célulahospedeira compreendendo a seqüência de DNA ou um vetor recombinante incorporando aseqüência de DNA. A invenção também se refere ao uso da enzima codificada por uma se-qüência de DNA, ou da célula hospedeira contendo uma seqüência de DNA ou um vetorrecombinante para produzir oligossacarídeos.

Bifidobactérias colonizam naturalmente o trato intestinal inferior, um meio que é fra-co em mono- e dissacarídeos visto esses açúcares serem referencialmente consumidospelo hospedeiro e micróbios presentes no trato intestinal superior. De modo a sobreviver notrato intestinal inferior, as bifidobactérias produzem várias espécies de exo- e endoglicosida-des na superfície ligada e/ou formas extracelulares, pelas quais elas pode utilizar diversoscarboidratos.

Além da atividade hidrolase, algumas enzimas das bifidobactérias demonstram ati-vidade transferase. Esta atividade de transglicosilação das glicosidases é extensivamenteusada para a síntese enzimática de vários oligossacarídeos, que provaram agir como fato-res promotores de crescimento das bifidobactérias.

Sabe-se que, membros das bifidobactérias produzem enzimas β-galactosidases,que estão envolvidas no metabolismo bacteriano da lactose. M0ller, P.L et al., em Appl &Environ Microbial, 2001) 62, (5), 2276-2283, descreve o isolamento e caracterização de trêsgenes β-galactosidase de uma cepa de Bifidobacterium bifidum. Eles descobriram, que to-das as três β-galactosidases eram capazes de catalisar a formação de galacto-oligossacarídeos β-ligados por trans-galactosilaçao.

Dumortier et al, em Carbohvdrate Research 201. (1990), 115-123 descreveu a for-mação de oligossacarídeos beta-ligados por uma reação de trans-galactosilação durante ahidrólise da lactose com Bifidobacterium bifidum, DSM 20456. Sua análise da estrutura damistura de oligossacarídeos produzida demonstrou que, as ligações eram ligações β-(1->3),β-(1->6) e β(1->4)-0^3ΐ3θίοεΝ. Dumortier sugeriu que, os compostos produzidos por Bifido-bacterium bifidum estavam envolvidos na aderência das bactérias no intestino grosso.

Uma cepa de Bifidobacterium bifidum foi encontrada que é capaz de produzir umaatividade enzimática galactosidase que converte a lactose numa mistura nova de galacto-oligossacarídeos que, contém inesperadamente até 35% dos dissacarídeos incluindo gala-biose (Gal (a 1-6), Gal. Este dissacarídeo é conhecido (ver Paton, JCe Paton, A W (1998)Clin Microbiol. Revs. 11 450-479; Carlsson1 K A (1989), Ann. Reviews Biochem. 58, 309-350) por ser um antiadesivo capaz de prevenir a aderência de toxinas por exemplo, toxinaShiga e patógenos tais como E. coli à parede do intestino.

Esta cepa de B Bifidum foi depositada sob número de acesso NCIMB 41171 no Na-tional Collection of Industrial & Marine Bactéria, Aberdeen UK em 31 de março de 2003. estáainda descrita na Patente Britânica n° 2 412 380.

Foi agora descoberto que, esta cepa de B bifidum produz várias β-galactosidases,uma das quais, apresentou inesperadamente atividade α-galactosiltransferase. Esta enzimaproduz uma série de diferentes oligossacarídeos que são β-ligados, porém ela produz tam-bém o dissacarídeo α-ligado, galabiose.

De acordo com a invenção é proporcionada uma seqüência de DNA que codificauma proteína com uma seqüência de aminoácido conforme se vê na SEQ ID NO: 2 ou hibri-diza sob condições rigorosas à seqüência do DNA que codifica esta proteína. A seqüênciade DNA é dada em SEQ ID NO: 1 ou pode compreender um fragmento ou degenerativosdesta.

A frase "degenerativo" significa uma seqüência de DNA que é pelo menos 50%homóloga à SEQ ID NO: 1, preferível mente de 50 a 98% de homologia, mais preferivelmen-te de 75 a 95% de homologia.

Essa seqüência de DNA pode compreender substituições, adições ou deleções denucleotídeo que resultam em menos que 60%, preferivelmente menos que 45%, mais prefe-rivelmente menos que 25% de alteração na seqüência de aminoácido mostrada na SEQ IDNO: 2. substituições de nucleotídeo podem resultar em substituições de aminoácido conser-vadoras.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, é proporcionada uma enzimacodificada por uma seqüência de DNA conforme acima. Uma tal enzima pode compreendera seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é proporcionado um vetor recom-binante preferivelmente um vetor de expressão, compreendendo uma seqüência de DNAconforme supra. Um tal vetor pode ser incorporado numa célula hospedeira tal como célulabacteriana, de levedura ou de fungo. Alternativamente, a seqüência de DnA pode ser incor-porada numa célula hospedeira como essa. Uma célula hospedeira adequada pode ser se-lecionada de Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus, por exemplo, Bacillussubtilus ou Bacillus circulans, Escherichia e Aspergillus, por exemplo, Aspergillus niger.

Usando Iactose como um substrato, a enzima codificada por uma seqüência deDNA como indicado acima produz uma mistura de dissacarídeos composto Gal(pi-3) Glc,Gal (β1-3), Gal1 Gal (β1-6) Gal1 e Gal(a1-6)Gal. Também está presente na mistura de oli-gossacarídeos, os trissacarídeos Gal(pi-6) Gal (β1-4 Glc1 Gal(pi-3) Gal(pi-4) Glc1 tetrassa-carídeo Gal (β 1-6)Gal (β 1-4) Glc e pentassacarídeo Gal (β1-6) Gal$1-6) Gal$1-6) Gal(p1-4) Glc.

A enzima ou a célula hospedeira conforme descrito supra pode ser empregada paraproduzir uma mistura de dissacarídeos, incluindo Gal (a 1-6 Gal (galabiose) que pode fazerparte de um produto para melhorar a saúde do intestino. Um tal produto pode ser seleciona-do do grupo consistindo de produtos do leite, (por exemplo, leite em natura, leite em pó talcomo leite em pó integral, leite em pó desnatado, leite em pó acrescido de gordura, soro empó, leite para crianças, fórmula infantil, sorvete, iogurte, queijo, laticínios fermentados), bebi-das tais como suco de fruta, alimentos infantis, cereais, pão, biscoitos, confeitos, bolos, su-plementos alimentares, suplementos dietéticos, produtos comestíveis simbiônticos, produtoscomestíveis prebióticos,. alimentos de animais, ração para aves ou de fato, qualquer outroalimento ou bebida.

Alternativamente, o oligossacarídeo assim produzido pode ser usado para prepara-ção de um medicamento por exemplo, na forma de comprimido ou cápsula, para prevençãoda aderência de patógenos ou toxinas produzidos por patógenos à parede do intestino. Omedicamento pode ser administrado a um paciente, por exemplo, seguinte a um curso detratamento com antibiótico, o qual freqüentemente, altera ou até mesmo destrói a flora intes-tinal saudável normal.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proporcionado um processopara produzir uma enzima conforme acima, compreendendo a cultura de uma célula hospe-deira conforme indicado acima num meio de cultura adequado sob condições que permite aexpressão da enzima e recuperar a enzima resultante da cultura.

A invenção também se dirige a um processo para produzir uma mistura de oligos-sacarídeos, incluindo o dissacarídeo Gal (a 1-6) - Gal (galabiose), compreendendo o conta-to da enzima conforme acima ou uma célula hospedeira conforme acima com um materialcontendo Iactose sob condições que levem à formação da mistura de oligossacarídeos.

Material adequado contendo Iactose pode ser selecionado de Iactose comercial-mente disponível, leite integral, leite semi-desnatado, leite desnatado, leite acrescido degordura e soro, permeado de soro, Tais produtos de leite podem ser obtidos de vacas, búfa-los, ovelhas ou cabras. Leite acrescido de gordura é tido como um leite integral, que foi des-natado para remover a gordura do leite, que é a seguir substituída por adição de gordura ouóleo vegetal.

Descrição Sucinta dos Desenhos

A Figura 1 mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) de β-galactosidasede Bifidobacterium bifidum da invenção, eA figura 2 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 2) correspondente à se-qüência de nucleotídeo da Figura 1.

A Figura 3 é um gráfico mostrando o decurso de tempo da reação durante a síntesede galacto-oligossacarídeo com β-galactosidase e 40% (peso/peso) de lactose em tampãode fosfato a 0,1 M a pH 6,0, como substrato, e

A Figura 4 mostra uma cromatografia de troca de anion de alto desempenho damistura de galacto-oligossacarídeo sintetizada pela β-galactosidase de B. bifidum NCIMB41171 usando 40% (p/p)de Iactose em tampão de fosfato 0,1 M a pH 6,0, como substrato.(Glc = glicose, Gal = galactose, Lac = lactose, a(1,6) galactobiose, DP = grau de polimeriza-ção).

DNA genômico foi isolado da cepa Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) usandoo método de Lawson et al., (1989) Ferns Microbiol Letter, 65 (1-2), 41-45. O DNA foi digeridocom enzimas e fragmentos de restrição com um tamanho máximo de 15 kbp foram ligadoscom vetor pSP72 que tinha sido digerido com a mesma enzima de restrição, células de E.coli foram transtornadas com um vetor contendo inserções consistindo de DNA cromosso-mal digerido Pstl, Eco RI, Bam Hlm Kpnl, Smal ou Hindlll de B. bifidum. Os clones com ati-vidade β-galactosidase foram selecionados de placas de agar-agar Luria Bertani contendopara-nitrofenil, Χ-β-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolin^-D-galactosídeo) e isopropil^-D-tiogalactosídeo (IPTG). As misturas de ligação com DnA cromossomal Bam Hl deram ori-gem a sete clones β-galactosidase positivos, um dos quais é identificado como pB1.

O seqüenciamento de DNA do fragmento de DNA inserido B1 foi realizado usandoo método de terminação de cadeia dideóxi de Sanger (Russel P., 2002 iGenetics, PearsonEducation, lnc, San Francisco, 187-189) usando o kit de seqüenciamento BigDye Terminatorciclo V.3.0 (Applied Biosystems, USA). A seqüência de DNA de B1 é mostrada na Figura 1(SEQ ID NO: 1).

O quadro de leitura aberto (ORF) foi localizado usando o descobridor ORF de NCBI(National Center of Biotechnology Information). A seqüência de nucleotídeo da Figura 1 foitraduzida em todas os seis possíveis quadros de leitura e um quadro de leitura aberto de1052 aminoácidos codificando uma β-galactosidase putativa foi identificado. A tradução estámostrada na Figura 2 (SEQ ID NO: 2).

A presente invenção será ainda descrita à guisa de referência aos seguintes exem-plos:

EXEMPLO 1

Materiais e Métodos

Todas as preparações de reagentes químicos e meio usados por todo este teste fo-ram obtidos de Sigma (Dorset, UK) Invitrogen (Paisley, UK), Oxoid (Basingstoke, UK), Qia-gen (West Sussex, UK) e Promega (Southampton UK).Cepas Bacterianas

A cepa Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) foi mantida em pérolas criogênicasem tubos de Microbank a -70°C. Para experimentos posteriores, a cepa foi ressuscitada emagar Wilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, UK) e meio TPY (meio de extrato de levedura tripti-case fitona) sendo cultivadas anaerobicamente CO2 e N2 (composição 80% e 20% respecti-vamente.) a 37°C por 48 horas. A morfologia da colônia e a ausência de contaminação fo-ram testados por manchamento gram-

Ceoas de E. coli

A cepa DH5a de Escherichia coli usada neste teste foi incubada de modo normal,sob condições aeróbicas a 37°C em agar-agar Luria Bertani (B) ou caldo (Sambrook J eRussel W. D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labora-tory Press, New York) e quando necessário, foi suplementado com antibióticos (100 μg/mLde ampicilina e/ou 15 μg/ml de cloranfenicol) e 40 μl de Χ-β-Gal a 2%, 7 μl de IPTG (isopro-ρil-β-D-tiogalactosídeo) IPTG que foi aplicado na superfície de uma placa de agar de 90 mmpré-fabricada.

A cepa DH5a de E. coli (Invitrogen, Paisley, UK) (genótipo: F cp80/acZA(/acHYA-argF)U169 recA1 extremidade A1 hsdR17(rk, mk)phoA supE44 f/7/-1gryrA96re/AU") é umacepa positiva de α-galactosidase que foi usada em experimentos de expressão e para ou-tras manipulações genéticas.

Extração de DNA Genômico de Bifidobacterium bifidum

DNA genômico foi isolado da cepa Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) usandoo seguinte método em que foi preparado DNA cromossomal de pelota de célula coletada de100 mL de caldo WC anaeróbico. As células foram ressuspensas em 10 mL de tampão TES(10 mM de Tris-HCI, 10 mM EDTA, 10 mM de NaCI1 pH8) sendo tratadas com 200 μl de mis-tura lisozima/mutanolísina (4:1, lisozima 10 mg/mL mutanolisina 1 mg/mL) durante 30 minu-tos a 37°C. As células foram então tratadas com 200 μl de proteinase K (2 20 mg/mL) e 200μl de RNase (ambas 10 mg/mL ) misturadas e incubadas por uma hora a 65°C. Finalmenteas células foram tratadas com 2 mL de SDS a 10% e incubadas por 15 minutos a 65°C. 12mL de fenol/clorofórmio foi adicionado, repetindo-se a extração até que a fase aquosa pu-desse ser facilmente separada da interfase. O DNA genômico foi precipitado com isopropa-nol e ressuspenso em 10 mM de Tris-HCI - 1mM de EDTA (pH8). O DNA genômico foi en-tão digerido com enzimas de restrição, ligado ao pSP72 digerido com as mesmas enzimas etratado com fosfatase alcalina. A digestão de DNA genômico de B. bifidum foi realizada u-sando EcoRIl Pstl, BamHI, Smal e Kpnl. Misturas da ligação foram usadas para transforma-ção de clones positivos de E. coli DH5a e clones positivos de β-galactosidase foram identifi-cados como colônias azuis em placas contendo X-Gal.

Preparação de DNA VetorO vetor usado para a clonagem e expressão por todo este teste foi o pSP72 (Pro-mega, Reino Unido) (Krieg, P.A. e Melton1 D.A. (1987). In vitro RNA synthesis with SP6RNA polymerase. Methods in Enzymology. 155: 397-415).

Este vetor foi escolhido devido à falta de atividade complementar do α-fragmentode β-galactosidade que não é codificado em pSP72. Este vetor não porta o segmento curtode DNA de E coli contendo a seqüência reguladora e a informação de codificação para osprimeiros 146 aminoácidos de β-galactosidase, que, em combinação com cepas de E. co-//'(ou seja, DH5a) que expressam a parte carbóxi-terminal desta β-galactosidase é conferidauma β-galactosidase ativa (complementação a).

O vetor foi digerido com as seguintes enzimas de restrição: Pst\, BamH\, Hind\\\,Sma\, Kpn\ e EcoRI de acordo com as instruções do fabricante usando um excesso de dezvezes da enzima sobre o DNA (unidades de enzima: μgr DNA igual a dez unidades da en-zima por um μgr do DNA de plasmídeo ou dez unidades de enzima por 0,5 pmol do DnA deplasmídeo). Após inativação da enzima por calor (20 minutos a 65°C) os padrões de restri-ção foram analisados por análise de eletroforese de gel horizontal. A presença de um únicofragmento no gel indicou a digestão completa do vetor e a única digestão de restrição dele.

A digestão suficiente do vetor foi testada ainda, por transformação de moléculasnão ligadas para células DH5a de E coli competente. O número de colônias formadas emplacas agar-agar LB suplementado com ampicilina (100 μg/ml) era um indicador das molé-cuias não digeridas e da referência esperada durante experimentos subseqüentes.

Os vetores foram ainda desfosforilados com fosfatase alcalina intestinal de bezerro(CIAP (Promega, Southamptons, UK) de acordo com as instruções do fabricante. A eficiên-cia do tratamento foi testada por auto-ligação (com DNA Iigase de Bacteriófago T4 de acor-do com as instruções do fabricante) seguinte a transformação em células DH5a. O númerode colônias formadas mostrou o número de moléculas recirculadas (vetor não clonado) euma subtração dos acima com as colônias formadas sem tratamento do vetor com CIAPmostrou o número de vetores não-desfosforilados.

Construção de Biblioteca de DNA Genômico

DNA genômico foi parcialmente digerido com seis enzimas de restrição que reco-nhecem, freqüentemente a ocorrência de seqüências hexanucleotídeo dentro de DNA pro-cariótico. EcoRI, BamHI, Pstl, Kprtl, Smal e Hindlll são endonucleases de restrição tipo Ilque reconhecem, especificamente, as seqüências 5'G/AATTC'3, 5'G/GATCC'3,5'CTGCA/G'3, 5'GGTAC/C3\ 5'CCC/GGG3' e 5'A/AGCTT3', respectivamente, e fazem rup-turas de dupla fita dentro dessas seqüências gerando projeções 5' de quatro nucleotídeos,AATT, GATC, AGCT para EcoRI, BamHI e Hind III, respectivamente, e projeções 3' ACGT,GTAC para Pstl e Kpnl, respectivamente e extremidades obtusas para Smal.Todas essas enzimas eram ativas e capazes de clivar DNA apenas na presença deíons magnésio divalentes. Esses íons eram o único co-fator necessário.'

Digestão de Restrição de DNA

Todas as digestões de restrição das amostras de DNA genômico foram incubadaspor 2 horas a 37°C e, finalmente inativadas pelo calor a 65°C por 20 minutos. As reaçõesforam então resfriada sa temperatura ambiente e a quantidade apropriada de tampão decarregamento foi adicionado, seguido por misturação suave com um tubo capilar de vidrovedado. As soluções então foram introduzidas aos poços de um gel de agarose a 0,8% (su-primento de energia 4-5 volts/cm durante 14-16 horas) e o tamanho do DNA digerido foi es-timado com aquele dos padrões de DNA de 1 kbp (Promega, Reino Unido) (Sambrook J.Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)).

Purificação dos fragmentos gerados após digestão de restrição

A purificação do fragmento das misturas de reação e dos geles de agarose foi feitamediante uso do kit de extração de gel QIAEX da Qiagen (West Sussex1 UK). Os protocolosestão descritos com detalhes no manual do fabricante.

Ligação do DNA e Transformação

Após purificação dos fragmentos de DNA com o kit de extração de gel Qiaex1 elesforam ligados com vetor pSP72 tratado com CIAP. Para a ligação, quantidades apropriadasde DNA foram transferidas para tubos de microcentrifuga de 0,5 mL estéreis como mostradona Tabela 1.

Tubo DNA

A Vetor (15 fmoles [-29,7 ng])

B Vetor (15 fmoles -29,7 ng DNA) maisinserto (estranho 15 fmoles -69,3 ng)

C controle pUC (0.056 fmoles [-100 pg])

A relação molar do vetor do DNA de plasmídeo para inserir fragmento de DNA deveser -Yna reação de ligação. A concentração do DNA final deve ser -10 ng/μΙ.

Tabela Γ: Misturas de ligação. O Tubo A mostra o número de Dna de vetor auto-ligado, que deve ser subtraído do número total de transformantes após transformação. OTubo B mostra a ligação do vetor com os fragmentos de DNA e o tubo C mostra o controlena ordem que a eficiência de transformação deve ser calculada.

Antes de cada ligação os fragmentos de DnA foram aquecidos a 45°C por 5 minutospara liqüefazer e qualquer terminal coeso que recozeu durante a preparação do fragmento.Uma relação molar do DNA vetoninserto de 1:1 foi escolhida para todas as reações de liga-ção e o conjunto de reação foi feito de acordo com as instruções da Promega.

Aos tubos A e B 1,0 μί de tampão de ligação 10X e 0,5 unidades Weiss de IigaseDNA Τ4 (Promega, UK) foram adicionados e o volume de ligação foi ajustado para 10 μΙ_com água grau de biologia molecular. Aos tubos C 1,0 μΙ de tampão de ligação 10X foramadicionados e o volume de ligação foi ajustado em 10 μ com água grau de biologia molecular.

Fragmentos de DnA foram adicionados aos tubos juntamente com a água e a se-guir aquecidos a 45°C por 5 minutos para fundir qualquer terminal coeso que tivesse recozi-do durante a preparação. O DNA foi resfriado para 0°C antes do restante dos reagentes deligação serem adicionados e as misturas de reação foram incubadas durante a noite a 16°C(Sambrook e Russell, 2001).

Após precipitação do etanol e purificação dos fragmentos ligados (de modo a remo-ver a mistura de ligação que ocasiona redução da eficiência de transformação) as transfor-mações foram realizada de acordo com as instruções de Hanahan. -50 ng do DNA ligadoem solução 5 μΙ foi adicionado para 100 μΙ de células DH5a de E. coli competente. Apóstratamento térmico e expressão do gene resistente para ampicilina, as células foram espa-Ihadas sobre a superfície das placas LB contendo ampicilina (100 μgr/mL)) X-a-Gal (40 μΙ de2% Χ-β-Gal) e IPTG (7μΙ de 20% IPTG).

Mediu-se o número de transformantes de cad reação de ligação O número detransformantes normalmente obtidos do tubo C foi de 2 χ 105 - 1 χ 106 cfu^g enquanto otubo A foi 500-6009 cfu^g. O número de transformantes no tubo A era uma indicação dotratamento eficiente do DNA vetor. O número de transformantes no tubo B estava numa fai-xa de 2-4 χ 104 cfu^g.

Número de Trasnformantes

AS misturas de ligação com DNA cromossomal PstI deu origem a clones positivospara β-galactosidase de -2500 transformantes selecionados enquanto com BamHl deu ori-gem a 7 clones positivos (-1500 ser. transformantes ), EcoRI deu origem a 3 clones positi-vos (-1300 ser. transformantes), KpnI deu origem a 7 clones positivos (-2000 ser. transfor-mantes), Smal deu origem a 3 clones positivos (-1600 ser transformantes) e Hind\\\ deuorigem a 2 clones positivos (-1200 ser transformantes).

Digestão Positiva do Clone

De modo a identificar os diferentes genes β-galactosidase, os plasmídeos isoladosdos clones positivos foram digeridos de acordo com a seguinte tabela.

N.T. : copiar a fórmula da página 11, onde:

Digestion = digestãoSamples = amostrasEnzymes = enzimas

A primeiras letra (p) indica plasmídeo e o gene de inserto, enquanto a segunda letra(P,B1E1S1K) indica a enzima de restrição que foi usada para isolamento do respectivo clonedo DNA genômico.

A análise por eletroforese de gel dos fragmentos gerados após digestão demons-trou que os plasmídeos pB1, pP1, pP2 e pP011 tem cada um, um inserto, que codifica umadiferente β-galactosidase. Os clones contendo pB1 foram usados para análise futura.

Seqüenciamento do DNA

O seqüenciamento do DNA foi realizado com o método de terminação de cadeia di-deóxi de Sanger mediante emprego do kit de seqüenciamento de ciclo BigDye Terminatorv.3.0 (Applied Biosytems1 (USA) e analisado com o ABI Prism, 3100, um sistema de análisede DNA com base na fluorescência, que incorpora eletroforese capilar.

As extremidades 5'e 3' dos fragmentos de DNA inserido foram seqüenciadas cominiciadores específicos para vetor. Os insertos foram ainda seqüenciados mediante uso deGenome Priming System (GPS-1) (New England Biolabs1 UK), GPS-1 é um sistema in vitrocom base no Transposon TN7 que utiliza TnsABC Transposase para inserir o Transposonaleatoriamente ao DNA alvo. A relação de massa doador: DNA alvo de 1:4 foi usada de a-cordo com as instruções do fabricante. O número de plasmídeos isolados para seqüencia-mento após inserção do Transiniciador ao plasmídeo alvo foi 25. Este número foi calculadode acordo com as instruções do fabricante e presume-se uma profundidade de 5 vezes decobertura.

Para a inserção do plasmídeo pB1 de um transposon-inserto de s 1699 pares debase (bp) na posição a jusante 973 pares de base do sítio de clonagem múltiplo do vetorusado, eliminou completamente atividade β-galactosídeo indicando que o códon inicial esta-va posicionado entre o MCS ( sítio de clonagem múltipla) do vetor e o sítio do transposon,enquanto a inserção do inserto na posição a jusante 841 pares de base do MCS levou àformação de uma β-galactosidade ativa indicando que o códon inicial existe entre 841 paresde base e 973 pares de base a jusante do MCS. A atividade enzimática foi eliminada com-pletamente com a inserção do inserto na posição 3565 pares de base a jusante do MCSindicando que o códon de interrupção fica a jusante desta posição. Além disso, as inserçõesnas posições 1239 pb, 1549 pb, 1683 pb, 1832 pb, 2108 pb, 2189 pb, 2270 pb, 2340 pb,2414 pb, 2574 pb, 2648 pb, 2734 pb, 2807 pb e 3410 pb eliminam completamente a ativida-de enzimática.

A mistura da reação de seqüenciamento continha aproximadamente 400-600ng deDNA de plasmídeo, 3.2 pmol doa solução do iniciador e 4 μΙ da solução BygDye Terminator.

Identificação do Quadro de Leitura Aberto

O quadro de leitura aberto (ORF) de B1 foi localizada mediante uso do descobridorORF de NCBI. O código genético bacteriano foi usado e o comprimento do quadro foi de-terminado em 100 pb. A seqüência de nucleotídeo foi traduzida em todas os seis possíveisquadros e um quadro de leitura aberto de 1052 aminoácidos codificando uma β-galactosidase putativa foi identificado (A tradução é mostrada na Figura 2).

Exemplo 2

Síntese com a enzima clonada β-qalactosidase isolada de Bifidobacterium bifidumNCIMB 4117 em hospedeiro E. coli( cepa DH5a)

A síntese descrita a seguir, a menos que de outro modo indicado, foi realizada comas células hospedeiras DH5a de E. coli totais após tratamento da biomassa de E. coli (cole-tada por centrifugação a 10.000 g) com tolueno a uma concentração de 2000 ppm de modoa aumentar a permeabilidade celular e também a tornar as células inviáveis por destruiçãode suas membranas citoplasmáticas. A biomassa de E-coli foi preparada conforme descritono Exemplo 1, sob "cepas de E. coli".

Síntese com a enzima clonada

A síntese com β-gIactosidase foi realizada a uma concentração do substrato de40% (p/p) de concentração inicial de lactose. A solução de síntese foi preparada em tampãode fosfato a 0,1 Ma pH 6,8 (ou tampão de citrato a 0,1 M pH 6,2 ou tampão de fosfato depotássio pH 6,8)). A síntese foi realizada a 40°C em banho de água com agitação a 150 rpm.O pH ótimo para a enzima específica foi escolhido com base nas medições da atividade (u-sando o-nitrofenil-p-D-galactopiranosídeo como substrato) de uma preparação enzimáticaespecífica a valores variados de pH.

Para a síntese galacto-oligossacarídeo, 5 ml_ de uma suspensão de célula DH5a deE. coli (com uma atividade de 2,2 U/mL) foi centrifugado a (10.000 g) para coleta da biomas-sa sendo descartado o sobrenadante. Esta biomassa foi ressuspensa com 10 g de soluçãode substrato (p/p) a 40% de modo a realizar a síntese.

As concentrações dos diferentes açúcares presentes na mistura durante a síntesesão mostrada na Figura 3. A cromatografia de troca de anion com alto desempenho acopla-da com cromatogramas de detecção por amperimetria pulsada (HPAEC-PAD) de misturasde galacto-oligossacarídeos sintetizada pela β-galactosidase clonada de B. bifidum (NCIMB41171 são mostrada s na figura 4. As concentrações de açúcar na mistura galacto-oligossacarídeos no ponto de tempo ótimo da síntese são dadas na Tabela 1.

Tabela 1

Composição de carboidrato da síntese galacto-oligossacarídeo a 405 (p/p) da con-centração inicial de lactose no ponto de tempo onde se observou a concentração máxima deoligossacarídeo.

<table>table see original document page 11</column></row><table>

Lac: Lactose, Glc: glicose, Gal: galactose, DP: grau de polimerizaçãoListagem de Seqüência

<110> lindsay, clare l<120> "Produto e Processo"<130> 13906WO:GH<150> GB 0601901.2<151> 31-01-2006<160> 2<170> Patentln versão 3.4<210> 1<211> 7281<212> dna<213> Bifidobacterium bifidum<220>

<221> gene

<222> (1)..(7281)

<400> 1

ggatccggtg aacgcgccga gcgcggtgta cgtgctgcgc tcgtgcgagt cggaggagat 60cgcggggatc atgccccagt aggagatgtc gcgcagcgag tagatcacgt cgagcaggat 120gaacacgatg acgaacagga ccatgaacac gccggtgttc acatccacga ggccgaacag 180gccggtgaac accatgatca gcaggatgcc aggcacgatg ccgccaatga actgccacgg 240gcggaaccgg ccccagcggg tgttcgtgtt gtccacgagg ttgccgagca gcgggtcgag 300aaagatctcc gcgatgcgga tgaccaccac gagtccggtg atcaccgcga tgaggcgttt 360ggcaagcgtc ttgtccacgt cgatgaacag cgcggtggtc acgaacgtga tgaagaacgt 420gctcattgtg ttgtagaacg cggcctggcc caggttaccg aatgcgtatg cgatcttctg 480acccgtgttc cgcgtgggct gcggccttcc ggtcgtttcc gtgtgttgtg tggtggatcc 540gctcatggtg tggtggcctc cttgcgacct gtaaagaatc cgtgcgcgtg aaccgctccg 600atcccgcaaa gcgtgagtat agaactttct tgaaaaagta gaaaactata ccgcgtgtcg 660caaatcatgc caacgttctg caaccggcac tccgtgtgga tgagtaaggt ttgaagcctg 720cttgatgtgc ttgaatctta agaaatccac gtattctgca tgttgcaggc cttgtgccgc 780gaaatgctgg aaagaatttg cgcaatcaag taacaatatt tatccttgtt gtacaaggaa 840cccgattcaa cgaggttccc tcactgcggc ggcaacgacg cgacgcaatc cgatgcgaaa 900gcgaggacat catgaacaca accgacgatc agcggaagaa cggcgatccg atcgtctccc 960cgtccatacc gacgacggca tggctcgccg acccgcgcgt gtacgcggtt caccggctcg 1020acgcccattc cgatcatgcg tgctggtctc gctccccagt cgacggcgag agcacgaatc 1080tcaggcagag ccttgacggc gaatggcggg tccgcgtcga gacggcgccg acgggccgtt 1140tccccgatgg gacgagcgac gggccggact ggatcagcga cgtgtcgcct ctgttcgccg 1200cgcccggatt cgacgattcg tcgttctcac gcgtgcaggt gccctcgcat ctggagactg 1260cggggctgct tgccccgcag tacgtgaacg tgcagtaccc atgggacgga catgaggacc 1320cgaaggcccc ggccatcccc gagcatggcc atgtggcggt ctaccggcgc gagttcgacg 1380cggatggcga agtcgcccag gccgtgcgcg aagggcgccc ggtgacgctt accttccagg 1440gcgcggccac agccatctac gtgtggctca acggctcgtt cgttggctac gccgaggact 1500ccttcacgcc cagcgagttc gacgtgacgg acgcgatcaa ggtggacggc aacgtgctgg 1560cggtcgtctg ctacgagtat tcgagcgcga gctggttgga ggatcaggac ttctggcgtc 1620tgcacggcct gttccgctcc gtcgaactca acgcgaggcc cgccgcccac atcgccgacc 1680tccatgccga cgccgactgg gatctcgcca catcaagggg ttcgctctcg ctggatgtgc 1740tgatcgacgg tgccgcgaac gccgcgacgg tcgacttcgc actgtgggac aagaacggca 1800ccatcgtctg gcacaccgcc acgaaagcgg acggaacgct gcacgccgag gccgagatcg 1860atgacgcggc gccatggagc gccgaacgcc ccgacctgta cgagctatcc gtcaccctgc 1920tcgacgcgga cggcaaggtc ctggagaccg ctcgcactcg catcggcttc cggcatgtgg 1980ccatcgagga cggcatcctc aagctcaacg gcaagcgcct cgtgttccgt ggcgtcaacc 2040gccacgagtt cgactgccgg cgcggccggg ccatcaccga agaggacatg ctgtgggaca 2100tccgcttcat gaagcgccac aacatcaacg cggtgcgcac ctcgcactat ccgaaccagt 2160cgcgctggta cgagctgtgc gacgaatacg gcatctacct gatcgacgag accaatctgg 2220agacccatgg cagctggaac agccccggcg acatccccgt gggaacctcc gtccccggtg 2280acgacgaggc ctggctgggc gcgtgcatcg accggctgga cagcatgatc ctgcgcgacc 2340gcaaccatcc cagcgtgctc gtctggtcgc tgggcaacga atcctacgcg ggcgaagtcc 2400tcaaggccat gagcgcgcac gcgcaccggc ttgatccggg tcgtcccgtc cactacgaag 2460gtgtcaactg gaaccatgcc tacgacggga tcagcgactt cgaaagccgt atgtacgcca 2520agccggccga gatccaagac tggctcgaac acggcgacga acggggcgag gcgagcaagc 2580cgttcgtcag ctgtgagtac atgcatgcca tgggcaactc gtgcggcggt ctgagcgagt 2640tcatcgacct cgaacggtac gagcgctact ccggcgggtt catctgggat tacatcgacc 2700aggggctcgt ccagcgtctg cccgacggga gcgaacgcct cagcgtcggc ggagaatggg 2760gcgaccgtcc aaccgactac gaattcgtgg gcaacggcat cgtgttcgcc gaccgcacgc 2820ccagccccaa ggcgcaggag gtcaagcagc tgtattcgcc ggtcaagctc gcccccgacg 2880ggcacggcgt gaccatcgag aaccgcaacc tgttcgccgg caccgacggc tacgtgttcg 2940ccgcacggct cctcgaagac gggcatgaga tctggcatgc cgactaccgt ttcgacgtgg 3000ccgcaggaga tacccaacac catgacatcg ccttcccgga catcgacgcg gacggggata 3060cgcgcgaagt cacctacgag gtcgatctcc tgctcgccga agccaccgca tgggcgccgg 3120ccggctacga gctcgcgttc ggccaactca ccggcacgct caaccccgaa caggacatca 3180ccgagaccag ccatgacgac gacggccgcg caactcgcac gctcagccga tggaacgccg 3240gcatccgccg cgacgacgag gaaattctcc tgtcacgcac tcagggaggc atcgtctcct 33003480354036003660

39003960

ggaagcgcga cgaccgggaa atggtcatcc gtcgccccga actcgtcacg ttccgcccat 3360tgaccgacaa cgatcgcggt aaccattccg gtttcgaccg tgccgcatgg ttcgcggccg 3420gccgatacgc catcgtaacc gaaacgaaaa tccatgaaag cgatgacggt ctcgtagcggaataccagta cgaacttgcc gatccgaacc acacgcccgt gtccgtcact taccatgtcaactccgatat gcgtatgcaa ctgaccgtcg aataccccgg gaacgccact gacatggccagtctgcccgc gttcggtatc gaatgggagc tgcccggcga atacgatcgt ctgcgctactacggccccgg ccccgaggag acctaccgcg accgtaagca gggcggcaag ctcggcatct 3720gggacgccac cgcgaaggcg agcatggcgc cgtatctcat ggtgcaggaa accggcagcc 3780acgaggacgt ccgctggctc gaagccaccg acatccaagg ccacggattg cgcgtcaccc 3840aacgcggcga ccgtcacttc acggccagcc tgctgccctg gaacacctac acgatcgaggccgcgcgccg ccacgaggac ctgcccaaac cgcgccacaa ctacctgcgc ctgctcgcggcccagatggg cgtcggtgga gacgactcct ggggagcccc cgtccacacg gcctaccagc 4020tgcccgccgg caggccgctc accctcgacg tgaacctcga actcatctga ccggcaacgg 4080gcggcggcat gcaccaccat gccgccgccg gccccgccta cgacgcggcg atcgaggcca 4140cgggcgctgc ggccgcggac ggcaccggcg aggaggcgtt cgagcgcgcc ggccacgcgg 4200tccacggcac cacccgccag gtcctctcgc tcatcaccaa cccgatggac gtgatctgcc 4260gcaacatccg caccgtgcgc gagaagatgg caacccgccc cgacatcctc ggctgccacc 4320tcgaaggccc gttcctcgcc ctcaagtgca agggcgcgca cgattcgaac tgcctcaaag 4380acccgatgcc cgaactcatg gaccgcatgc tcgacgcctc gggcgccgac ctcgccgccggcaagctcgg gtgcatccgc cagatcacca tctcgacccc accgactgga ccgcccaacacgtctggtgc gccggccgcc aggtggagta aactccttcc agcaaaatcg acgccggtgc 4560cgcccgtctc gagacgacgt cttacgcctg aggaacgaag cttgcgcgcg gcaccagttc 4620ggtcgtcagc aggatgtgac gacgcacccg ccgctcatgc ttcaacccat cgatcagggt 4680ggagaacgcc atgcgggcca actccctttg atcgatcgca tacgaactca gcggcggcga 4740cgtgtaccgg gcgatcgact ggttgttcac actcaccacg gccaactcgt cgggaacctccacgcgcagt gcgttcaacg cctgcaacgc ccccaccgca agcacgtcgg cggccacgatcaaaccatcg ggcatgctgc cggcctcacg atggtcagcc accaactgct ccgcgagacg 4920atagccgttc tccacggtga acgtgccgga cgaatacacc aatccgtccg tttccaatcccagatgcgcg gcccactgac ggaacgacag ctcgcgaatg tcctcgggat agtcatgcatgcccatgatg ctgcccacgc cgccgagaaa cgcgatatga ctgcggcccg ccgcgatcatcgcgtccaag gcgtccagca tcgtctgcga cagatcggga cacacggagt cgaacaggcg 5160cggcgccgga ttcgtgtcga tgcacacgcc atgcgggagc accatatgca gggctcgcag 5220gtccgcttcg ggaaacaccg tggctcccac ggtgatgaac ccatcaaact ccgttgcgcg 5280ttccgtcaac tcgtgtatgg acaacgtgag ctggtccaat tccaacgact ccgcacgctc 5340

44404500

48004860

498050405100cgcaagaacc ttccgcagat cggcgaagta cgcgtcctgc aattcctccc cggacggagg 5400cgcatccaac accgcgatcg cgggacggaa cacgttgcga taccccatct cctcgcacac 5460gcgcaacaca cgccgacgcg tctcctcctt gatggagaac gacgggtcgt tcaacaagcg 5520tgacaccgtg ctctgcgaca ccccggcccg tcccgcgact tccttgagcg tggccatgac 5580atcctccccg caaactttag taaagggttt tactacagca taacccggga aggcggggtt 5640agcggcattg gcggcgtgga agtttaccca tgactggtag actgcacatg.tcccggcaat 5700aggggcaatg catagggggg tggcgggcat gtgcagcaac attcccgtca ccttacgatt 5760cttatagcgt gtcaggtaaa agaattatga ttctcaatcc accttccggc cgcgcctgca 5820gactcaaatg gccatgatgc atagcgacaa tctctcgcac tatggataaa cccaatccgt 5880gatgaggtga tgcagatccc acatgcgtat ttatcctatt atcctcccct ctgttaaaag 5940gtgacaggaa atcatctatc ctcgtatcgg aaagatccat gccggtattg gatatgtcta 6000tcgcaatgca ggactcgcct tcgtattgcc tgtcgttggc taagtttatc catacatgtg 6060gttgagccgc acgattatgc tgaatggcat tcgtaataag gtttgcaatc atctgtctaa 6120ttagcagacc atcggctagg atatatgcat tctccagatt ggtatgtact tgaactctat 6180ctccgataag ttccatattt tcctgaagaa cattgcgaat gatctcagct acattaactc 6240ggctaagatc agctcggttt aattgctgaa ctttcgacaa ttcgagcaga tgattgacga 6300tttcaacccc agcatgattt gaagccaaag ccttttcgac gaaaggtctg caacgctcat 6360cgaaaagctg gttgtgcagc ggaatctcca atgcggccga agtggccgca agtggatttt 6420ttaactcatg tgacgcatcg gcgataaatt ccttttcccg actgattgcg ctgttgagat 6480cctttaacat gaggttgtat gcggatgcaa tagtgtacgc ctcgtcgttt tcatatggaa 6540taacgatagg ttgcctttcc aatccagcgt cggacgcgat aatctgagag gccacactat 6600tgattcttcg ttgtgtccta gtggcgataa tccaagttat tcctccagat aatatgccga 6660aaacaatgat gggggctatg cttaccgcca atatcagatc ccgggatttt atgtctcctt 6720gttccatagt tagcgttaaa gcatccttac cggagtcata cccggcagaa acgtaatcct 6780taccggagtc aggaggaatg gcttgcgaat tcaaàctatg ttgttcatcg gcatcttctg 6840cctgagtaaa agatttattt acggtcactg tttccagttg ccggttcacg acataatatg 6900tcatggcggt caccactccg gtaagcatga agaacacgat gacgatcgtg gtgaccaatc 6960ttcttcttgt agaccactga aacggtaaac gcagtttcgg atggctggaa tggctcccat 7020tcgacgaagg atattcaggc tttttcatga tatgcgatat ccttgtccgg gaacggtttc 7080aatgaaatca gtgattccga ttttcgtgcg aatcgcatag attgtggtct tgacgattcc 7140tctcgtatga gcgtgatcat cctgccaaat ctcacgatat agacattccg cactaatcac 7200cgcacctcgc gcctcaatca gçgtcctcaa tacggcaagt tctcgtttcc caaactttag 7260ttctgcaccg cgaaccgtga t 7281

<210> 2<211> 1052

<212> PRT

<213> Bifidobacterium bifidum<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(1052)

<400> 2

Met Asn Thr Thr Asp Asp Gln Arg Lys Asn Gly Asp Pro Ile Val Ser1 5 10 15

Pro Ser Ile Pro Thr Thr Ala Trp Leu Ala Asp Pro Arg Val Tyr Ala20 25 30

Val His Arg Leu Asp Ala His Ser Asp His Ala Cys Trp Ser Arg Ser35 40 45

Pro Val Asp Gly Glu Ser Thr Asn Leu Arg Gln Ser Leu Asp Gly Glu50 55 60

Trp Arg Val Arg Val Glu Thr Ala Pro Thr Gly Arg Phe Pro Asp Gly65 70 75 80

Thr Ser Asp Gly Pro Asp Trp Ile Ser Asp Val Ser Pro Leu Phe Ala85 90 95

Ala Pro Gly Phe Asp Asp ser ser Phe Ser Arg Val Gln Val Pro Ser100 105 110

His Leu Glu Thr Ala Gly Leu Leu Ala Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln115 120 125

Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu Asp Pro Lys Ala Pro Ala Ile Pro Glu130 135 140

His Gly His vai Ala Val Tyr Arg Arg Glu Phe Asp Ala Asp Gly Glu145 150 155 160

Val Ala Gln Ala Val Arg Glu Gly Arg Pro Val Thr Leu Thr Phe Gln165 170 175

Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu Asn Gly Ser Phe Val Gly180 185 190

Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu Phe Asp Val Thr Asp Ala195 200 205

Ile Lys Val Asp Gly Asn Val Leu Ala Val Val Cys Tyr Glu Tyr Ser210 215 220

Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu His Gly Leu225 230 235 240

Phe Arg Ser vai Glu Leu Asn Ala Arg Pro Ala Ala His Ile Ala Asp245 250 255

Leu His Ala Asp Ala Asp Trp Asp Leu Ala Thr ser Arg Gly Ser Leu260 265 270

Ser Leu Asp vai Leu Ile Asp Gly Ala Ala Asn Ala Ala Thr Val Asp275 280 285

Phe Ala Leu Trp Asp Lys Asn Gly Thr Ile Val Trp His Thr Ala Thr290 295 300

Lys Ala Asp Gly Thr Leu His Ala Glu Ala Glu Ile Asp Asp Ala Ala305 310 315 320

Pro Trp ser Ala Glu Arg Pro Asp Leu Tyr Glu Leu ser Val Thr Leu325 330 335

Leu Asp Ala Asp Gly Lys Val Leu Glu Thr Ala Arg Thr Arg Ile Gly340 345 350

Phe Arg His vai Ala Ile Glu Asp Gly Ile Leu Lys Leu Asn Gly Lys355 360 365

Arg Leu Val Phe Arg Gly Val Asn Arg His Glu Phe Asp Cys Arg Arg370 375 380

Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Leu Trp Asp Ile Arg Phe Met385 390 395 400

Lys Arg His Asn Ile Asn Ala Val Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln405 410 415

ser Arg Trp Tyr Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Tyr Leu Ile Asp420 425 430

Glu Thr Àsη Leu Glu Thr His Gly ser Trp Asn Ser Pro Gly Asp Ile435 440 445

Pro Val Gly Thr Ser Val Pro Gly Asp Asp Glu Ala Trp Leu Gly Ala450 455 460

Cys Ile Asp Arg Leu Asp Ser Met Ile Leu Arg Asp Arg Asn His Pro465 470 475 480

Ser Val Leu Val Trp Ser Leu Gly Asn Glu ser Tyr Ala Gly Glu Val485 490 495

Leu Lys Ala Met Ser Ala His Ala His Arg Leu Asp Pro Gly Arg Pro500 505 510

Val His Tyr Glu Gly Val Asn Trp Asn His Ala Tyr Asp Gly Ile ser515 520 525

Asp Phe Glu ser Arg Met Tyr Ala Lys Pro Ala Glu Ile Gln Asp Trp530 535 540

Leu Glu His Gly Asp Glu Arg Gly Glu Ala Ser Lys Pro Phe Val Ser545 550 555 560

Cys Glu Tyr Met His Ala Met Gly Asn Ser Cys Gly Gly Leu ser Glu565 570 575

Phe Ile Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr ser Gly Gly Phe Phe Trp580 585 590

Asp Tyr Ile Gly Gln Gly Leu Val Gln Arg Leu Pro Asp Gly ser Glu595 600 605

Arg Leu ser Val Gly Gly Glu Trp Gly Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu610 615 620

Phe Glu Gly Asn Gly Ile vai Phe Ala Asp Arg Thr Pro ser Pro Lys625 630 635 640

Ala Gln Glu vai Lys Gln Leu Tyr ser Pro Val Lys Leu Ala Pro Asp645 650 655

Gly His Gly Val Thr Ile Glu Asn Arg Asn Leu Phe Ala Gly Thr Asp660 665 670

Gly Tyr Val Phe Ala Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gly His Glu Ile Trp675 680 685

His Ala Asp Tyr Arg Phe Asp Val Ala Ala Gly Asp Thr Gln His His690 695 700

Asp Ile Ala Phe Pro Asp Ile Asp Ala Asp Gly Asp Thr Arg Glu Val705 710 715 720

Thr Tyr Glu Val Asp Leu Leu Leu Ala Glu Ala Thr Ala Trp Ala Pro725 730 735

Ala Gly Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Gln Leu Thr Gly Thr Leu Asn Pro740 745 750

Glu Gln Asp Ile Thr Glu Thr Ser His Asp Asp Asp Gly Arg Ala Thr755 760 765

Arg Thr Leu Ser Arg Trp Asn Ala Gly Ile Arg Arg Asp Asp Glu Glu770 775 780

Ile Leu Leu Ser Arg Thr Gln Gly Gly Ile Val Ser Trp Lys Arq Asp785 790 795 800

Asp Arg Glu Met Val Ile Arg Arg Pro Glu Leu Val Thr Phe Arg Pro805 810 815

Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Asn His Ser Gly Phe Asp Arg Ala Ala820 825 830

Trp Phe Ala Ala Gly Arg Tyr Ala lie Val Thr Glu Thr Lys Ile His835 840 845

Glu Ser Asp Asp Gly Leu vai Ala Glu Tyr Gln Tyr Glu Leu Ala Asp850 855 860

Pro Asn His Thr Pro Val Ser Val Thr Tyr His Val Asn Ser Asp Met865 870 875 880

Arg Met Gln Leu Thr Val Glu Tyr Pro Gly Asn Ala Thr Asp Met Ala885 890 895

Ser Leu Pro Ala Phe Gly Ile Glu Trp Glu Leu Pro Gly Glu Tyr Asp900 905 910

Arg Leu Arg Tyr Tyr Gly Pro Gly Pro Glu Glu Thr Tyr Arg Asp Arg915 920 925

Lys Gln Gly Gly Lys Leu Gly Ile Trp Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser930 935 940

Met Ala Pro Tyr Leu Met Val Gln Glu Thr Gly Ser His Asx Asp Val945 950 955 960

Arg Trp Leu Glu Ala Thr Asp Ile Gln Gly His Gly Leu Arg Val Thr965 970 975

Gln Arg Gly Asp Arg His Phe Thr Ala Ser Leu Leu Pro Trp Asn Thr980 985 990

Tyr Thr Ile Glu Ala Ala Arg Arg His Glu Asp Leu Pro Lys Pro Arg995 1000 1005

His Asn Tyr Leu Arg Leu Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly1010 1015 1020

Asp Asp Ser Trp Gly Ala Pro Val His Thr Ala Tyr Gln Leu Pro1025 1030 1035

Ala Gly Arg Pro Leu Thr Leu Asp Val Asn Leu Glu Leu Ile1040

1045

1050

Claims

1. Seqüência de DNA, CARACTERIZADA por:a) codificar uma proteína com uma seqüência de aminoácido como dado na SEQ IDNO: 2, oub) hibridizar sob condições de hibridização rigorosas para a seqüência de a), ouc) ser uma degeneração da seqüência de a) ou b).

2. Seqüência de DNA1 de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelaseqüência ser dada na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento desta.

3. Seqüência de DNA de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2,CARACTERIZADA pela referida seqüência compreender substituições de nucleotídeo, adi-ções ou deleções que resultam em menos que 60%, preferível mente menos que 45%, malespreferivelmente menos que 25% de alteração na seqüência de aminoácido de acordo comSEQ ID NO: 2 ou um fragmento desta.

4. Seqüência de DNA, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2,CARACTERIZADA pela referida seqüência compreender substituições de nucleotídeo queresultam em substituições de aminoácido conservadoras.

5. Enzima, CARACTERIZADA por ser codificada por uma seqüência de DNA deacordo com quaisquer reivindicações 1 a 4.

6. Enzima, CARACTERIZADA por compreender uma seqüência de aminoácido deacordo com a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento desta.

7. β-galactosidase, CARACTERIZADA por ter a seqüência de acordo com a SEQID NO: 2.

8. Vetor recombinante, CARACTERIZADO por compreender uma seqüência deDNA de acordo com quaisquer reivindicações 1 a 4.

9. Vetor, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO por tal vetor ser umvetor de expressão.

10. Célula hospedeira, CARACTERIZADA por compreender uma seqüência deDNA de acordo com quaisquer reivindicações 1 a 4.

11. Célula hospedeira, CARACTERIZADA por compreender o vetor de acordo coma reivindicação 8 ou reivindicação 9.

12. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 10 ou reivindicação 11,CARACTERIZADA pela referida célula ser uma célula bacteriana, uma célula de leveduraou uma célula de fungo.

13. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelareferida célula ser selecionada do grupo consistindo de Bifidobacterium1 Lactococcus, Lac-tobacillus, Escherichia, Bacillus e Aspergillus.

14. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelacélula ser selecionada do grupo consistindo de Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis,Bacillus circulans e Aspergillus niger.

15. Uso de uma enzima, de acordo com quaisquer reivindicações 5-7 ou uma célulade acordo com quaisquer reivindicações 10 a 14, CARACTERIZADO por ser para produçãode uma mistura de oligossacarídeos.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pela mistura com-preender dissacarídeos Gal (β 1-3), Glc, Gal(P 1-3), Gal, Gal (β 1-6) Gal e Gal (a 1-6) Gal.

17. Uso de acordo com a reivindicação 15 ou reivindicação 16, CARACTERIZADOpela mistura compreender trissacarídeos Gal (β 1-6), Gal (β 1-4), Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4)Glc, tetrassacarídeo Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, e pentassacarídeo Gal (β 1-6)Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc.

18. Uso de uma enzima, de acordo com quaisquer reivindicações 5 a 7, ou uma cé-lula, de acordo com quaisquer reivindicações 10 a 14, CARACTERIZADO para produção deuma mistura de oligossacarídeos fazendo parte de um produto selecionado do grupo consis-tindo de produtos de laticínios como leite, leite em pó, leites infantis, fórmula para bebês,sorvete, iogurte, queijo, produtos de leite fermentados, bebidas como suco de fruta, alimen-tos infantis, cereais, pão, biscoitos, doces, bolos suplementos alimentares, suplementos die-téticos, produtos comestíveis probióticos, produtos comestíveis prebióticos, alimentos paraanimais, alimentos para aves e medicamentos.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pela mistura com-preender dissacarídeos Gal (β 1-3) Glc, Gal (β 1-3), Gal, Gal (β-1-6) gal e Gal (a 1-6), Gal,trissacarídeos Gal (β 1-6), Gal (β 1-4), Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc, tetrassacarídeo Gal(β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc, e pentassacarídeo Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal(β 1-4) Glc.

20. Uso de uma célula hospedeira, de acordo com quaisquer reivindicações 10 a-14, CARACTERIZADO para produção de um produto selecionado do grupo consistindo delaticínios, tais como leite, leite em pó, leites infantis, fórmula para bebês, sorvete, iogurte,queijo, produtos de leite fermentados, bebidas como suco de fruta, alimentos infantis, cere-ais, pão, biscoitos, doces, bolos suplementos alimentares, suplementos dietéticos, produtoscomestíveis probióticos, produtos comestíveis prebióticos, alimentos para animais, alimentospara aves e medicamentos.

21. Processo para produção de uma enzima, de acordo com quaisquer reivindica-ções 5 a 7 CARACTERIZADO por compreender a cultura de uma célula hospedeira de a-cordo com quaisquer reivindicações 10 a 14 num meio de cultura adequado sob condiçõesque permitam a expressão dessa enzima e recuperar a enzima resultante da cultura.

22. Processo para produção de uma mistura de oligossacarídeos compreendendodissacarídeos Gal (β 1-3) Glc, Gal (β 1-3), Gal, Gal (β-1-6) Gal e Gal (a 1-6), Gal, trissacarí-deos Gal (β 1-6), Gal (β 1-4), Glc, Gal (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc1 tetrassacarideo Gal (β 1-6) Gal(β 1-6) Gal (β 1-4) Glc1 e pentassacarídeo Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-6) Gal (β 1-4) Glc1CARACTERIZADO por compreender ο contato de uma enzima de acordo com quaisquerreivindicações 5-7 ou de uma célula hospedeira de acordo com quaisquer reivindicações 10a 14 com um material contendo lactose.