BRPI0707579A2 - sistema de expressço de polinucleotÍdeos, mÉtodos de controle da populaÇço de um organismo em um meio ambiente natural para o mesmo, de controle biolàgico, e de separaÇço de sexos, e, mÉtodo ou controle biolàgico ou da populaÇço - Google Patents

Abstract

SISTEMA DE EXPRESSçO DE POLINUCLEOTÍDEOS, MÉTODOS DE CONTROLE DA POPULAÇçO DE UM ORGANISMO EM UM MEIO AMBIENTE NATURAL PARA O MESMO, DE CONTROLE BIOLàGICO, E DE SEPARAÇçO DE SEXOS, E, METODO OU CONTROLE BIOLàGICO OU DA POPULAÇçO. Um sistema de expressão de polinueleotídeos é provido, o qual é capaz de emendar alternativamente os transcritos de RNA de uma sequência polinucleotídica a ser expressada em um organismo.

Description

"SISTEMA DE EXPRESSÃO DE POLINUCLEOTÍDEOS, MÉTODOS DECONTROLE DA POPULAÇÃO DE UM ORGANISMO EM UM MEIOAMBIENTE NATURAL PARA O MESMO, DE CONTROLEBIOLÓGICO, E DE SEPARAÇÃO DE SEXOS, E, MÉTODO OUCONTROLE BIOLÓGICO OU DA POPULAÇÃO"

Todas as referências incorporadas aqui são por meio distoincorporadas por referência, salvo de outra forma evidente.

INTRODUÇÃO

A presente invenção refere-se a um sistema de expressão degenes, em combinação com seqüências de controle de emenda, referidasseqüências de controle provendo um mecanismo para emenda alternativa.

Emenda alternativa envolve a remoção de um ou mais íntronse ligação dos éxons de flanqueamento. Esta reação é catalisada pelaespliceossoma, uma máquina macromolecular composta de cinco RNAs ecentenas de proteínas (Jurica, M. S. & Moore, M. J. (2003) Mol. Cell 12, 5-14). Emenda alternativa gera mRNAs múltiplos a partir de um gene único,deste modo aumentando a diversidade de proteomas (Graveley, B. R. (2001)Trends Genet. 17, 100-107).

Emenda alternativa também desempenha um papel chave naregulação de expressão de genes em muitos processos relativos aodesenvolvimento variando de determinação de sexo a apoptose (Black, D. L.(2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 291-336), e defeitos na emenda alternativaforam ligadas a muitos distúrbios humanos (Cáceres, J. F. & Kornblihtt, A. R.(2002) Trends Genet. 18, 186-193). Geralmente, emenda alternativa éregulada por proteínas que se associam com pré-mRNA e funcionam ou paraaumentar ou reprimir a capacidade do espliceossoma de reconhecer o(s)sítio(s) de emenda flanqueando o éxon regulado (Smith, C. W. & Valcarcel, J.(2000) Trends Biochem. Sei. 25, 381-388).

Se um éxon alternativo particular será incluído ou excluído deum RNA maduro em cada célula é determinado, como se pensa, pelaconcentração relativa de um número de reguladores de emenda positivos enegativos e as interações destes fatores com o pré-mRNA e componentes doespliceossoma (Smith, C. W. & Valcarcel, J. (2000) Trends Biochem. Sei. 25,381-388).

Espliceossomas são complexos grandes de RNA nuclearpequeno e partículas de proteína (snRNPs) que juntam-se com pré-mRNApara realizar a emenda de RNA, removendo os íntrons dos RNAs nucleareseucarióticos, assim produzindo mRNA que é então traduzido para proteína emribossomas.

Apesar de pelo menos 74% de genes humanos codificaremmRNAs emendados alternativamente (Johnson, J. M., Castle, J., Garrett-Engele, P., Kan, Z., Loerch, P. M., Armour C. D., Santos, R., Schadt, E. E.,Stoughton, R. & Shoemaker, D. D. (2003) Science 302, 2141-2144),relativamente poucos reguladores de emenda foram identificados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê umsistema de expressão de polinucleotídeos compreendendo:

pelo menos uma seqüência polinucleotídica heterólogacodificando uma proteína funcional, definida entre um códon de partida e umcódon de parada, e/ou polinucleotídeos para RNA interferência (RNAi), a serexpressada em um organismo; ligado operativamente

pelo menos um promotor ligado operativamente ao mesmo; e

pelo menos uma seqüência de controle de emenda que, emcooperação com um espliceossoma, é capaz de (i) mediar a emenda de umtranscrito de RNA da seqüência de codificação para produzir um primeiroproduto de RNA mensageiro (mRNA) emendado, e (ii) mediar pelo menosuma emenda alternativa de referido transcrito de RNA para produzir umproduto de mRNA emendado alternativo;em que, quando pelo menos uma seqüência polinucleotídicaheteróloga codifica uma proteína funcional, pelo menos um dos produtos demRNA maduro compreendendo uma Matriz de Leitura Aberta (ORF)contínua estendendo-se a partir de referido códon de partida para referidocódon de parada, assim definindo uma proteína, que é a referida proteínafuncional, ou está relacionada com a referida proteína funcional por pelomenos uma deleção de aminoácido, e que é funcional quando traduzida, e,opcionalmente, sofreu uma modificação pós-translacional;

a mediação sendo selecionada dentre o grupo consistindo de:mediação específica de sexo, mediação específica de estágio, mediaçãoespecífica de linhagem germinal, mediação específica de tecido, ecombinações das mesmas.

O sistema de expressão pode ser DNA ou RNA ou um híbridoou combinação de ambos. Visa-se que o sistema compreenda ambos ribo- edesoxirribonucleotídeos, isto é porções de DNA e porções de RNA. Estespoderiam correspondem a elementos genéticos diferentes, tal que o sistema éum híbrido de DNA/RNA, com alguns elementos funcionais providos porDNA e outros por RNA.

Preferivelmente, a mediação é em um modo específico desexo, específica de estágio, específica de linhagem germinal ou específica detecido. Em particular, a mediação específica de sexo é particularmentepreferida. No entanto, também prefere-se que uma combinação destes quatromodos de mediação possa ser utilizada. Prefere-se particularmente que,quando uma combinação destes modos é usada, que isto inclua a mediaçãoespecífica de sexo. Um exemplo particularmente preferido de tal combinaçãoé uma combinação de mediação específica de sexo, específica de tecido eespecífica de estágio de emenda alternativa.

O sistema pode ser adaptado para expressão de um gene.Preferivelmente, a seqüência polinucleotídica a ser expressada compreendeuma seqüência de codificação para uma proteína ou polipeptídeo, isto é pelomenos um éxon, e preferivelmente 2 ou mais éxons, capazes de codificar umpolipeptídeo, tal como uma proteína ou fragmento da mesma.

Será entendido que um éxon é qualquer região de DNA dentrode um gene, que está presente em uma molécula de RNA maduro derivadodeste gene, em vez de ser emendado da molécula de RNA transcrito. Paragenes de codificações de proteína, moléculas de RNA maduro correspondema moléculas de mRNA maduro, que podem codificar uma ou mais proteínasou polipeptídeos. Exons de muitos genes eucarióticos intercalam-se comsegmentos de DNA não de codificação.

A pelo menos uma seqüência polinucleotídica heteróloga podecodificar uma proteína funcional, definida entre um códon de partida e umcódon de parada a ser expressada em um organismo. Alternativamente, ou emadição, a pelo menos uma seqüência polinucleotídica heteróloga codifica oucompreende polinucleotídeos para RNA interferência (RNAi), a serexpressado em um organismo.

Estas seqüências, a serem expressadas no organismo, tambémpodem ser referidas como as seqüências, cuja expressão deve ser regulada noreferido organismo.

Preferivelmente, a seqüência polinucleotídica a ser expressadacompreende dois ou mais éxons de codificação, sendo segmentos ouseqüências polinucleotídicas que codificam aminoácidos quando traduzidasdo mRNA. Preferivelmente, os éxons diferentes são diferencialmenteemendados juntos para prover mRNAs alternativos. Preferivelmente,referidos mRNAs emendados alternativos têm potenciais de codificaçãodiferentes, isto é codificam proteínas diferentes ou seqüências depolipeptídeos. Assim, a expressão da seqüência de codificação é regulada pelaemenda alternativa nos modos acima mencionados de mediação.

A seqüência polinucleotídica a ser expressada podecompreender polinucleotídeos de RNA interferência (RNAi). Tais seqüênciassão capazes de prover, por exemplo, uma ou mais extensões de RNAfilamento duplo (dsRNA), preferivelmente na forma de um transcritoprimário, que por sua vez é capaz de processar pela enzima de tipo RNA PolIII "Dicer." Tais extensões incluem, por exemplo, extensões de RNAfilamento único que podem formar laços, tais como os encontrados em RNAgrampo de cabelo curto (shRNA), ou com regiões mais longas que sãosubstancialmente auto-complementares.

Assim, onde o sistema é DNA, os polinucleotídeos para RNAinterferência são desoxirribonucleotídeos que, quando transcritos nosribonucleotídeos pré-RNA, provêem uma extensão de dsRNA, comodiscutido acima.

Polinucleotídeos para RNA interferência são particularmentepreferidos quando referidos polinucleotídeos estão posicionados paraminimizar a interferência com emenda alternativa. Isto pode ser realizado porposicionamento distai destes polinucleotídeos das seqüências de controle deemenda alternativa, preferivelmente 3' para as seqüências de controle. Emoutra forma de realização preferida, regiões substancialmente auto-complementares podem ser separadas de cada por uma ou mais seqüências decontrole de emenda, tais como um íntron, que media q emenda alternativa.

Preferivelmente, as regiões auto-complementares são arranjadas como umasérie de duas ou mais repetições invertidas, cada repetição invertida separadapor seqüência de controle de emenda, preferivelmente um íntron, comodefinido em outra parte.

Nesta configuração, transcritos emendados alternativamentediferentes podem ter suas regiões auto-complementares substancialmenteseparadas por diferentes comprimentos de seqüência não auto-complementarno transcrito maduro (emenda pós alternativa). Será notado que regiões quesão substancialmente auto-complementares são aqueles que são capazes deformar grampos de cabelo, por exemplo, como porções da seqüência sãocapazes de formar pares de bases com outras porções da seqüência. Estas duasporções não têm de ser exatamente complementares mutuamente, porquepodem ocorrer alguns desalinhamentos ou tolerância de extensões em cadaporção que não forma pares de base umas com as outras. Tais extensõespodem não ter um equivalente em outra porção, tal que a simetria é perdida e"protuberâncias" se formam, como é conhecido com complementação depares de base geralmente.

Em outra forma de realização preferida, um ou maissegmentos de seqüência substancialmente complementares a outra seção dotranscrito primário é posicionado, relativo à pelo menos uma seqüência decontrole de emenda, de modo que isto não está incluído em todos dostranscritos produzidos por emenda alternativa do transcrito primário. Por essemétodo, alguns transcritos são produzidos que tendem a produzir dsRNAsenquanto outros não; por mediação da emenda alternativa, por exemplomediação específica de sexo, mediação específica de estágio, mediaçãoespecífica de linhagem germinal, mediação específica de tecido, ecombinações das mesmas, dsRNA pode ser produzido em um modoespecífico de sexo, específica de estágio, específica de linhagem germinal ouespecífica de tecido, ou combinações das mesmas.

O sistema é preferivelmente capaz de expressar pelo menosuma proteína de interesse, isto é referida proteína funcional a ser expressadaem um organismo. Referida pelo menos uma proteína de interesse pode terum efeito terapêutico ou pode, preferivelmente, ser um marcador, porexemplo DsRed, proteína fluorescente verde (GFP) ou um ou mais de seusmutantes ou variantes, ou outros marcadores que são bem conhecidos natécnica.

O mais preferivelmente, a proteína funcional a ser expressadaem um organismo tem um efeito letal, deletério ou esterilizante. Ondereferência é feita aqui para um efeito letal, será notado que ela abrange umefeito deletério e esterilizante, tal como um efeito capaz de matar o organismoper se ou sua descendência, ou capaz de reduzir ou destruir a função dedeterminados tecidos do mesmo, dos quais os tecidos reprodutivos sãoparticularmente preferidos, de modo que o organismo ou sua descendênciasão estéreis. Assim, alguns efeitos letais, tais como venenos, matarão oorganismo ou tecido em uma matriz de tempo curto relativo a seu tempo devida, enquanto outros podem simplesmente reduzir a capacidade dosorganismo de funcionar, por exemplo reprodutivãmente.

Um efeito letal resultante em esterilização é particularmentepreferido, como isto permite ao organismo competir no ambiente natural ("noestado selvagem") com organismo de tipo selvagem, mas o inseto estéril nãopode então produzir uma descendência viável. Desta forma, a presenteinvenção realiza um resultado similar às técnicas tais como técnica de insetoestéril (SIT) em insetos, sem os problemas associados com SIT, tal como ocusto, perigo ao usuário, e reduzida competitividade do organismo irradiado.

Preferivelmente, o sistema compreende pelo menos ummecanismo de retro-alimentação positiva, isto é pelo menos proteínafuncional a ser diferencialmente expressada, através de emenda alternativa, epelo menos um promotor para o mesmo, onde um produto de um gene a serexpressado serve como um fator de controle transcripcional positivo para opelo menos um promotor, e pelo qual o produto, ou a expressão do produto, écontrolável. Preferivelmente, um melhorador é associado com o promotor, oproduto de gene servindo para melhorar a atividade do promotor através domelhorador. Preferivelmente, o fator de controle é o produto do gene de tTAou um análogo do mesmo, e onde uma ou mais unidades de operador de tetOé ligada operativamente como promotor e é o melhorador, tTA ou seu análogoservindo para melhorar atividade do promotor via tetO. Prefere-se queproteína funcional codifique o produto de tTAV ou tTAF e preferivelmente, opromotor está substancialmente inativo na ausência do fator de controletranscripcional positivo. Os promotores apropriados, preferivelmentemínimos, para esse sistema podem ser selecionados dentre: hsp70, umpromotor mínimo de P, um promotor mínimo de CMV, um promotor mínimobaseado de Act5C, um fragmento de promotor de BmA3, um fragmento depromotor de hunchback, um promotor de núcleo de Adh, e um promotormínimo de Act5C, ou combinações dos mesmos.

Em uma forma de realização, a proteína funcional épreferivelmente um fator de indução de apoptose, tal como a proteína de AIFdescrita por exemplo em Cande et al (Journal of Cell Science 115, 4727-4734(2002)) ou homólogos da mesma. Homólogos de AIF são encontrados emmamíferos e até mesmo em invertebrados, incluindo insetos, nematóides,fungos, e plantas, significando que o gene de AIF foi conservado ao longo detodo o reino eucariótico. Também preferido é Hid, o produto de proteína dogene defeituoso de involução de cabeça de Drosophila melanogaster, ouReaper (Rpr), o produto do gene Reaper de Drosophila, ou mutantes dosmesmos. Uso de Hid foi descrito por Heinrich e Scott (Proc. Natl Acad. SciUSA 97, 8229-8232 (2000). Uso de um derivado mutante, HidA,a5 foi descritopor Horn e Wimmer (Nature Biotechnology 21, 64-70 (2003)). Uso de umderivado mutante de Rpr, Rpr , é descrito aqui (ver também White et al1996, Wing et al., 2001, e Olson et al., 2003). Ambos, Rpr e Hid são proteínaspró-apoptóticas, que se ligam a IAP1, como se pensa. IAPl é uma proteínaanti-apoptótica bem conservada. Hid e Rpr são, portanto, esperados comotrabalhando através de uma extensa faixa filogenética (Huang et al., 2002,Vernooy et al., 2000) apesar de sua própria seqüência não ser bemconservada.

Também é preferido Nippl Dm, o homólogo de Drosophila deNippl de mamífero (Parker et al Biochemical Journal 368, 789-797 (2002);Bennett et al, Genetics 164, 235-245 (2003)). NipplDm é outro exemplo deuma proteína com efeito letal se expressada a um nível apropriado, como seriaentendido pelo versado. De fato, muitos outros exemplos de proteínas comum efeito letal serão conhecidos pelo versado na técnica.

Também prefere-se que a proteína funcional seja, ela mesma,um transativador transcripcional, tal como o sistema tTAV descrito acima.

Prefere-se que o promotor possa ser ativado por condiçõesambientais, por exemplo a presença ou ausência de um fator particular talcomo tetraciclina no sistema tet descrito aqui, tal que a expressão do gene deinteresse possa ser facilmente manipulada pelo versado. Alternativamente,umexemplo preferido de promotor apropriado é o promotor de choque térmicohsp 70, permitindo ao usuário controlar a expressão por variação datemperatura ambiente para a qual os hospedeiros estão expostos em umlaboratório ou no campo, por exemplo. Outro exemplo preferido de controlede temperatura está descrito em Fryxell e Miller (Journal of EconomicEntomology 88, 1221-1232 (1995)).

Também preferido como um promotor é o promotor específicode embrião syra (Horn & Wirnmer (2003) de Drosophila melanogaster, ouseus homólogos, ou promotores de outros genes específicos de embrião ouativos de embrião, tais como os do gene de Drosophila lento como melaço(slam), ou seus homólogos de outras espécies.

Também prefere-se que o sistema compreenda outros fatores amontante, 5', e/ou fatores a jusante, 3', para controlar a expressão. Exemplosincluem melhoradores tais como os melhoradores de gordura corporal dosgenes de proteína yolk de Drosophila, e os melhoradores de região dehomologia (hr) de baculovírus, por exemplo AcMNPV. Também será notadoque os produtos de RNA irão incluir UTRs 5' e 3' apropriados, por exemplo.

A seqüência de controle de emenda permite um nível adicionalde controle de expressão de proteína, em adição ao promotor e/ou melhoradordo gene. Por exemplo, a expressão específica de sexo ou de tecido emembriões de inseto apenas seria extremamente difícil por métodosconvencionais. Promotores com esta especificidade são desconhecidos,mesmo em Drosophila. No entanto, usando controle combinatorial de acordocom a presente invenção, um promotor específico de embrião, por exemplosrya, pode ser combinado com um sistema de emenda alternativa apropriado.

Prefere-se que qualquer combinação de promotor e mecanismode emenda alternativa seja considerada. O promotor é preferivelmenteespecífico para uma proteína particular tendo um efeito temporal pequeno ouespecial confinado, por exemplo um efeito autônomo celular.

Alternativamente, prefere-se que o promotor possa serespecífico para uma classe de proteínas ou uma proteína específica que temum efeito a longo prazo e/ou sistema extenso, tais como um hormônio, fatorde crescimento positivo ou negativo, morfogene ou outra molécula secretadaou sinalizando superfície celular. Isto irá permitir, por exemplo, um padrão deexpressão mais amplo de modo que uma combinação de um promotor demorfogene com um mecanismo de emenda alternativa específico de estágiopoderia resultar no morfogene sendo expressado apenas uma vez que foialcançada uma determinada fase do ciclo da vida, mas o efeito do morfogeneainda seria sentido (isto é o morfogene pode ainda agir e ter um efeito) paraalém desta etapa do ciclo da vida. Exemplos preferidos seriam moléculas demorfogene/sinalização Hedgehog, Wingless/WNTs, TGFp/BMPs, EGF e seushomólogos, moléculas de sinalização conservadas evolucionariamente bemconhecidas.

Prevê-se também que um promotor que é ativado por umafaixa de fatores de proteína, por exemplo transativadores, ou que tem umamplo efeito sistêmico, tais como um hormônio ou morfogene, poderia serusado em combinação com um mecanismo de emenda alternativa pararealizar um controle específico de tecido ou sexo ou controle específico desexo ou estágio, ou outras combinações de controle específico de estágio,tecido, linhagem germinal e sexo.

Prevê-se também que mais de um promotor, e opcionalmenteum melhorador para o mesmo, pode ser usado no presente sistema, quer comomeios alternativos para iniciar a transcrição da mesma proteína ou por virtudedo fato de que o sistema genético compreende mais de um sistema deexpressão de gene (isto é mais de um gene e seu promotor acompanhante).

Em um outro aspecto, a presente invenção provê um métodode transformação, compreendendo expressar duas ou mais moléculas deRNA, derivadas de um transcrito primário simples, ou transcritos primáriossubstancialmente similares, por emenda alternativa, referidas duas ou maismoléculas de RNA preferivelmente codificando diferentes proteínas oupolipeptídeos, em um organismo contatando o organismo com o sistema deexpressão e preferivelmente induzindo a expressão do sistema de expressão.Métodos de introdução ou transformação do sistema de gene e indução deexpressão são bem conhecidos na técnica com relação ao organismorelevante.

Também são providos organismos (isto é transformantes)transformados pelo presente sistema.

Onde referência a um nucleotídeo ou seqüência de proteínaparticular é feita, será entendido que isto inclui referência a qualquer mutanteou variante dos mesmos, tendo atividade biológica substancialmenteequivalente ao mesmo. Preferivelmente, o mutante ou variante tem pelomenos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos95%, preferivelmente pelo menos 99%, preferivelmente pelo menos 99,9%, eo mais preferível pelo menos 99,99% de identidade de seqüência com asseqüências de referência.

As seqüências providas podem tolerar alguma variação deseqüência e ainda emendar corretamente. Existem alguns nucleotídeosconhecidos por serem importantes. Estes são aqueles requeridos para todasemendas, por exemplo como mostrado na Figura 34 abaixo. O GU inicial e oAG final do íntron são particularmente importantes e, por isso, preferidos,como discutido em outra parte, embora -5% de íntrons iniciam GC, aocontrário. Esta seqüência de consenso é preferida, embora se aplique paratodas as emendas, não especificamente a emenda alternativa. Na Figura 34,Pu = A ou G; Py = C ou U.

Preferivelmente, o sistema é ou compreende um plasmídeo.Como mencionado acima, isto pode ser quer DNA, RNA ou uma mistura deambos. Se o sistema compreende RNA, então pode ser preferível traduzir demodo reverso o RNA em DNA por meio de uma transcriptase reversa. Setranscrição reversa é requerida, então o sistema pode também compreenderuma seqüência de codificação para a proteína RT e um promotor apropriadopara a mesma. Alternativamente, a RTase e promotor assim pode ser providoem um sistema separado, tais como um vírus. Neste caso, o sistema apenasseria ativado seguindo a infecção com aquele vírus. A necessidade de incluirseqüências cis-atuantes apropriadas para a transcriptase reversa ou RNApolimerase dependente de RNA seria evidente para o versado na técnica.

No entanto, é particularmente preferido que o sistema sejapredominantemente DNA e mais preferivelmente consista apenas de DNA,pelo menos com relação às seqüências a serem expressadas no organismo.

Enquanto em algumas formas de realização a pelo menos umaseqüência polinucleotídica heteróloga a ser expressada em um organismo éuma seqüência polinucleotídica de RNA interferência (RNAi), éparticularmente preferido que esta seja uma seqüência polinucleotídica capazde codificar uma proteína funcional. A descrição irá focalizarpredominantemente as seqüências polinucleotídicas codificando uma proteínafuncional, mas será entendido que ela também refere-se a polinucleotídeos deRNA interferência (RNAi), salvo especificado em contrário.

Será entendido que referência é feita à códons de partida e deparada entre os quais a seqüência polinucleotídica a ser expressada em umorganismo é definida, mas que esta não exclui posicionamento de pelo menosuma seqüência de controle de emenda, elementos da mesma, ou outrasseqüências, tais como íntrons, nesta região. De fato, será evidente da presentedescrição que a seqüência de controle de emenda, pode, em algumas formasde realização, estar posicionada nesta região.

Ademais, a seqüência de controle de emenda, por exemplo,pode sobrepor com o códon de partida pelo menos, no sentido que o G deATG pode ser, em algumas formas de realização, o 5' G inicial da seqüênciade controle de emenda. Assim, o termo "entre" pode ser considerado comoreferindo a partir do início (3' para o nucleotídeo inicial, isto é A) do códon departida, preferivelmente 3' para o segundo nucleotídeo do códon de partida(isto é T), até o lado 5' do primeiro nucleotídeo do códon de parada.Alternativamente, como será evidente por uma simples leitura de umaseqüência polinucleotídica, o códon de parada pode também ser incluído.

A pelo menos uma seqüência polinucleotídica heteróloga a serexpressada em um organismo é uma seqüência heteróloga. Por "heterólogo",seria entendido que ele refere-se a uma seqüência que não seria, no tiposelvagem, normalmente encontrada em associação com, ou ligada a, pelomenos um elemento ou componente da pelo menos uma seqüência de controlede emenda. Por exemplo, onde a seqüência de controle de emenda é derivadade um organismo particular, e o polinucleotídeo heterólogo é uma seqüênciade codificação de uma proteína ou polipeptídeo, isto é, é uma seqüênciapolinucleotídica codificando uma proteína funcional, então a seqüência decodificação poderia ser derivada, em parte ou completamente, de um gene domesmo organismo, desde que a origem de pelo menos alguma parte daseqüência polinucleotídica transcrita não foi a mesma como a origem da pelomenos uma seqüência de controle de emenda. Alternativamente, a seqüênciade codificação poderia ser de um organismo diferente e, nesse contexto,poderia ser pensado como "exógeno". O polinucleotídeo heterólogo poderiatambém ser pensado como "recombinante", em que a seqüência decodificação para uma proteína ou polipeptídeo é derivada de locais diferentes,ou dentro do mesmo genoma (isto é o genoma de uma espécie simples ousubespécie) ou de genomas diferentes (isto é genomas de diferentes espéciesou subespécies).

Heterólogo pode referir-se à seqüência diferente da seqüênciade controle de emenda e pode, assim, referir-se ao fato de o promotor, eoutras seqüências tais como 5' UTR e/ou 3' UTR poderem ser heterólogas àseqüência polinucleotídica a ser expressada no organismo, desde que areferida seqüência polinucleotídica não é encontrada em associação com ouligada operativamente ao promotor, 5' UTR e/ou 3 'UTR, no tipo selvagem,isto é o contexto natural de referida seqüência polinucleotídica, se presente.

Será entendido que heterólogo também aplica-se a seqüências"designer" ou híbridas que não são derivadas de um organismo particular massão baseadas em um número de componentes de organismos diferentes, comoisto iria atender à exigência de que a seqüência e pelo menos um componenteda seqüência de controle de emenda não estão ligados ou encontrados emassociação no tipo selvagem, mesmo se uma parte ou elemento da seqüênciahíbrida for assim encontrada, enquanto pelo menos uma parte ou elementonão é. Preferivelmente, uma porção de pelo menos 50 nucleotídeos daseqüência híbrida não é encontrada em associação com pelo menos umcomponente da seqüência de controle de emenda, mais preferivelmente 200nucleotídeos e o mais preferível, 500 nucleotídeos.

Também será entendido que versões sintéticas de seqüênciasde ocorrência natural são visadas. Tais seqüências sintéticas são tambémconsideradas como heterólogas, a menos que elas sejam de seqüência idênticaa uma seqüência que seria, no tipo selvagem ou contexto natural,normalmente encontrada em associação com, ou ligada a, pelo menos umelemento ou componente da pelo menos uma seqüência de controle deemenda.

Isto aplica-se igualmente para onde o polinucleotídeoheterólogo é um polinucleotídeo de RNA interferência.

Em uma forma de realização, onde a seqüênciapolinucleotídica a ser expressada compreende uma seqüência de codificaçãode uma proteína ou polipeptídeo, será entendido que referência a expressãoem um organismo refere-se à provisão de uma ou mais seqüências de RNAstranscritos, preferivelmente mRNAs maduros, mas isto pode, preferivelmente,também referir-se aos polipeptídeos traduzidos no referido organismo.

RT-PCR, que demonstra a presença de um transcrito, não deuma proteína, pode ser usado para identificar as seqüências de RNAstranscritos. Isto também é particularmente útil quando a própria proteína não étraduzida ou não é funcional ou não identificável por anticorpos criadoscontra a proteína de ocorrência natural ou de tipo selvagem, devido a RNAi,modificação pós-translacional ou duplicação distorcida.

Em outra forma de realização, onde a seqüênciapolinucleotídica a ser expressada compreende polinucleotídeos de RNAinterferência, também será entendido que a referência à expressão em umorganismo refere-se à interação dos polinucleotídeos de RNA interferência,ou transcritos do mesmo, na via de RNAi, por exemplo ligação de Dicer ouformação de RNA interferência pequeno (siRNA). De fato, é particularmentepreferido que os polinucleotídeos de RNA interferência compreendamseqüências de siRNA e são, por esta razão, preferivelmente de 20-25nucleotídeos de comprimento, especialmente onde o organismo é mamífero.

Em insetos e nematóides especialmente, prevê-se proverporção de dsRNA, por exemplo por formação de grampo de cabelo, que podeentão ser processada pelo Sistema Dicer. Células de mamíferos geralmenteproduzem uma retro-alimentação de interferon contra as seqüências dedsRNA longas, assim para células de mamíferos é mais comum proverseqüências menores, tais como siRNAs. Seqüências anti-sentido ouseqüências tendo homologia a microRNAs que são moléculas de RNA deocorrência natural marcando os 3' UTRs de proteína são também visadascomo seqüências de RNAi de acordo com uma forma de realização dapresente invenção.

Cada seqüência de controle de emenda no sistema compreendepelo menos um sítio aceitador de emenda e pelo menos um sítio doador deemenda. O número de sítios doadores e aceitadores pode variar, dependendodo número de segmentos da seqüência que devem ser emendados juntos.Preferivelmente, sítios de ramificação estão incluídos em cada seqüência decontrole de emenda. Um sítio de ramificação é a seqüência em que o doadorde emenda está inicialmente ligado, ver figura 32, que mostra que a emendaocorrendo em dois estágios, em que o éxon 5' é separado e então ligado aoéxon 3'.

Referindo-se à referida figura, o A é o único nucleotídeoessencial, e está, por esta razão, preferivelmente incluído. Sem estar limitadopela teoria, acredita-se que emenda de pré-mRNA prossegue através de umintermediário lariat, como é feito na auto-emenda de grupo II. Primeiro,clivagem ocorre na junção 5' - algumas vezes chamada de sítio doador deemenda. O fosfato na extremidade 5' do íntron então torna-se ligado ao 2' OHde uma adenina de aproximadamente 25 nucleotídeos a montante daextremidade 3' do íntron, que é algumas vezes chamado de sítio aceitador.Este resíduo A é chamado de ponto de ramificação. A próxima etapa é que aclivagem ocorre na junção de emenda 3' e o fosfato 5' do éxon a jusante éligado ao 31OH do éxon a montante.

Prefere-se particularmente que a maneira ou mecanismo deemenda alternativa seja específico de sexo. Preferivelmente, a seqüência decontrole de emenda é derivada de um íntron tra. No entanto, é particularmentepreferido que o mecanismo de emenda alternativa seja derivado do Cctra dogene transformer de mosca-do-mediterrêno, ou de outro ortólogo ouhomólogo do gene transformer de Drosophila, preferivelmente de C. rosa, ouB. zonata especialmente um derivado de um mosca tefrítida da fruta.

Também prefere-se que a seqüência de controle de emendaseja derivada do mecanismo de emenda alternativa do Gene Actin-4, emparticular que de Aedes spp. e mais preferível de AaActin-4, que é um gene deAedes/Stegomyia aegypti que mostra emenda específica de tecido, estágio ede sexo.

Preferivelmente, emenda alternativa, particularmente amediada por Actin-4, pode adicionar seqüências que influenciam a traduçãoou estabilidade de RNA, por exemplo.

Também prefere-se que o mecanismo de emenda compreendapelo menos um fragmento do gene doublesex (dsx), preferivelmente oderivado de Drosophila, B. mori, lagarta-rosada, traça das maçãs e pêras, ouum mosquito, em particular A. gambiae ou especialmente A. aegypti.

Prefere-se que a seqüência de controle de emenda e aseqüência polinucleotídica heteróloga codificando uma proteína funcional,definidas entre um códon de partida e um códon de parada, e/oupolinucleotídeos para RNA interferência (RNAi), a serem expressadas em umorganismo, sejam providas na forma de uma construção de minigene ou uméxon de cassete.

Isto é particularmente preferido quando a seqüência decontrole de emenda é derivada de dsx (preferivelmente minigene 1 comodescrito nos exemplos e representado em SEQ ID NO. 149 (éxons estãopresentes nas posições 1-135, 1311-2446 e 3900-4389 de SEQ ID NO. 149)que foi incluída na construção LA3491) ou Actin-4.

Os exemplos particularmente preferidos da presente invençãosão providos nos exemplos, e podem ser selecionados dentre o grupoconsistindo dos plasmídeos ou construções, em particular qualquer um dos deacordo com qualquer uma das figuras 19-31, especialmente qualquer um dosplasmídeos mostrados nas Figuras 16-18, 22- 24, 26-32, 49, 52-55, e 61-69,e/ou SEQ ID NOs 46-48, 50-56, 143-145 e 151-162.

Preferivelmente, a proteína funcional a ser expressada em umorganismo é tTAV, tTAV2 ou tTAV3.

Outras proteínas a serem expressadas no organismo são, oucomo evidente previstas, em combinação com a referida proteína funcional,preferivelmente um gene letal como discutido em outra parte.

Um ORP contínuo pode também ser pensado como um ORFininterrupto, isto é uma seqüência polinucleotídica em mRNA maduro, quenão inclui nucleotídeos não de codificação, por exemplo aqueles tendo opotencial para serem traduzidos em aminoácidos. Nesta definição, prefere-seque o códon de parada não seja incluído.

Em algumas formas de realização, a pelo menos umaseqüência de controle de emenda regula a emenda alternativa por meio deambos, nucleotídeos intrônicos e exônicos. No entanto, em uma forma derealização, é particularmente preferido que a pelo menos uma seqüência decontrole de emenda seja uma seqüência de controle de emenda intrônica. Emoutras palavras, prefere-se que a pelo menos uma seqüência de controle deemenda seja substancialmente derivada de polinucleotídeos que formam partede um íntron e são deste modo excisados do transcrito primário por emenda,de modo que estes nucleotídeos não são conservados na seqüência de mRNAmaduro.

Assim, seqüências intrônicas podem ser pensadas comodistintas de seqüências "exônicas", que são conservadas na molécula de RNA(pós emenda) processada. Onde a molécula de RNA processada codifica umaseqüência de proteína ou polipeptídeo, e é capaz de ser traduzida, isto é tem aestrutura correta e modificações tais como uma terminação, e um sinal depoliadenilação, por exemplo, é conhecido como mRNA maduro ouprocessado e algumas das seqüências exônicas então codificam paraaminoácidos, quando traduzidos.

Será entendido que em emenda alternativa, seqüências podemser intrônicas sob algumas circunstâncias (isto é em algumas emendasalternativas variantes), mas exônicas sob outras circunstâncias (isto é emoutras variantes). Assim, a pelo menos uma seqüência de controle de emendada presente invenção é preferivelmente substancialmente derivada depolinucleotídeos que formam parte de um íntron em pelo menos uma variantede emenda alternativa, isto é, ou no primeiro produto de mRNA emendado ouem pelo menos um produto de mRNA alternativamente emendado. Assim,íntrons ou seqüências intrônicas podem ser vistos como emendados em pelomenos um transcrito ou tipo de transcrito.

Por exemplo, considerando o íntron tra de C. capitata (íntronCctra), que é um exemplo particularmente preferido de uma pelo menos umaseqüência de controle de emenda de acordo com a presente invenção. Deacordo com figura 2 A de Pane et al, reproduzida como figura 33, todos os 8dos sítios de ligação de Tra/Tra2 putativos realçados estão na seqüênciaintrônica no sentido que eles estão em porções da seqüência emendada no Flde transcrito mas por outro lado 6 dentre os 8 são exônicos no sentido queeles estão em éxons que estão incluídos ou retidos em quer Ml ou M2 detranscrito, ou ambos. Assim, estes sítios de ligação de Tra/Tra2 são intrônicosno presente sentido como eles são capazes de controlar a emenda alternativa,mas são emendados fora, isto é não presentes, em pelo menos uma variante deemenda alternativa, isto é pelo menos um mRNA que foi emendado em umamaneira alternativa de pré-RNA.

Em emenda "normal" (não alternativa) e em emendaalternativa, íntrons são geralmente removidos do pré-RNA para formar ummRNA emendado, que pode então ser traduzido em um polipeptídeo, taiscomo uma proteína ou fragmento de proteína, tendo uma seqüência deaminoácido. Assim, será prontamente evidente para um versado comodeterminar aquelas seqüências do presente sistema que devem serconsiderados intrônicas, em vez de exônicas.

Será, como evidente, notado que somente uma parte de ummRNA é De fato traduzida, isto é, tipicamente a parte entre o códon departida e o códon de parada, embora será entendido que algumas vezesmúltiplas partidas e paradas estão presentes. Assim, quando a referência éfeita aqui para a tradução de uma seqüência de mRNA, será notado que isto éreferente à tradução da porção partindo no primeiro nucleotídeo do códon departida e terminando após o último nucleotídeo antes da partida do códon deparada, que pode ser considerado como a porção de codificação.

Como mencionado acima, seqüências exônicas podem estarenvolvidas na mediação do controle de emenda alternativa, mas prefere-seque pelo menos algumas seqüências intrônicas de controle estejam envolvidasna mediação da emenda alternativa. Em outras palavras, o sistema deexpressão de gene da presente invenção pode também incluir seqüências decontrole de emenda presentes em éxons, enquanto ocorre algum envolvimentointrônico de controle. Exemplos particularmente preferidos destes são asseqüências de controle de emenda derivadas de ou contendo elementos dogene dsx, onde, sem estar vinculado pela teoria, pensa-se que as seqüênciasexônicas auxiliam no mecanismo de emenda alternativa.

Assim, em algumas formas de realização, a pelo menos umaseqüência de controle de emenda não compreende seqüência exônica e seráentendido que isto é previsto por definições usadas para descrever a presenteinvenção. Assim, como será evidente, é possível para alguns nucleotídeosserem englobados dentro da definição de pelo menos uma seqüência decontrole de emenda e também dentro da definição de uma seqüênciapolinucleotídica codificando uma proteína funcional. Em outras palavras, adefinição destes elementos pode se sobrepor, tal que determinadosnucleotídeos podem ser cobertos pela definição de mais de um elemento.

No entanto, o versado reconhecerá que isto não é incomum embiologia molecular, como nucleotídeos podem freqüentemente realizar maisde um papel. Por exemplo, na presente invenção, um nucleotídeo pode formarparte de um seqüência de codificação de uma proteína funcional, mas poderiatambém formar parte de uma seqüência reconhecida e ligada por um fator deemenda, um exemplo de que a proteína TRA ou complexo TRA/TRA, comodiscutido em outra parte. Não é incomum que, por exemplo, alguns vírusterem um genoma altamente concentrado onde a mesma extensão depolinucleotídeos pode codificar para duas ou mesmo três proteínas diferentes,cada lida em uma matriz diferente.

Como evidente, pode também ser que a seqüência de controlede emenda ou seqüências sejam unicamente intrônicas, isto é sem nenhumainfluência exônica. De fato, isto é particularmente preferido.

Em algumas formas de realização, prefere-se que a pelo menosuma seqüência de controle de emenda seja capaz de ser removida do pré-RNA, por emenda. Preferivelmente, a pelo menos uma seqüência de controlede emenda não resulta em uma armação em pelo menos uma variante deemenda. Preferivelmente isto é uma variante de emenda codificando umaproteína funcional de comprimento completo. Em outras palavras, pelo menosa uma seqüência de controle de emenda preferivelmente não media a remoçãode nucleotídeos que formam parte, ou foram planejados para formar parte de,uma seqüência polinucleotídica codificando uma proteína funcional, definidaentre um códon de partida e um códon de parada, e/ou polinucleotídeos deRNA interferência (RNAi), a serem expressados em um organismo. Por isso,entende-se que nucleotídeos que são excisados por emenda, em pelo menosuma variante de emenda, não são nucleotídeos que codificam aminoácidos naforma de tipo selvagem da proteína ou gene. Uma ou mais variantes deemendas podem ter referidos nucleotídeos excisados, mas pelo menos umavariante deve reter estes nucleotídeos, de modo que uma armação nãoinduzida em pelo menos uma variante. Estes nucleotídeos removidos sãoaqueles que são removidos em adição às seqüências que são normalmenteemendadas tais como o íntron.

No entanto, em vista do acima, prevê-se também que asvariantes de emenda diferentes podem resultar na mesma seqüência sendo lidaem matrizes diferentes.

Interação da pelo menos uma seqüência de controle de emendacom maquinário de emenda celular, por exemplo o espliceossoma, conduz aou media a remoção de uma série de, preferivelmente, pelo menos 50nucleotídeos consecutivos do transcrito primário e ligação (emenda) junto deseqüências nucleotídicas que não foram consecutivas no transcrito primário(porque elas, ou seu complemento se a seqüência anti-sentido for considerada,não foram consecutivas na seqüência de modelo original do qual o transcritoprimário foi transcrito). Referida série de pelo menos 50 nucleotídeosconsecutivos compreende um íntron. Esta mediação atua preferivelmente emum modo específico de sexo, específica de estágio, específica de linhagemgerminal ou específica de tecido, ou combinação das mesmas, tal que ostranscritos primários equivalentes em sexos, estágios, tipos de tecido,diferentes etc, tendem a remover íntrons de diferente tamanho ou seqüência,ou em alguns casos podem remover um íntron em um caso mas não no outro.

Este fenômeno, a remoção de íntrons de tamanho diferente ou seqüência emcircunstâncias diferentes, ou a remoção diferencial de íntrons de um tamanhoou seqüência dado, em circunstâncias diferentes, é conhecido como emendaalternativa. Emenda alternativa é um fenômeno bem conhecido na natureza, emuitos exemplos são conhecidos, ver acima.

Em algumas formas de realização, a pelo menos umaseqüência de controle de emenda é associada com uma matriz de leituraaberta heteróloga tal que, em pelo menos uma variante de emenda, a matriz deleitura aberta heteróloga é separada, por exemplo por um códon de parada ouarmação, enquanto em pelo menos uma variante de emenda alternativa amatriz de leitura aberta heteróloga não é separada. Transcritos do segundotipo codificam ou potencialmente codificam uma proteína funcional,considerando que aqueles do primeiro tipo codificam uma proteína comfunção alterada, separada ou mesmo sem função, atividade ou estabilidaderelativa àqueles de segundo tipo.

Geralmente, será evidente para o versado na técnica que amatriz de leitura aberta heteróloga pode ser, ela mesma, um compósito oufusão de seqüências de várias fontes. Emenda para produzir uma proteínafuncional pode ainda produzir uma proteína alterada relativa à matriz deleitura aberta heteróloga de protótipo, por exemplo se o íntron emendadoalternativamente inserido incluir seqüência que é exônica em todas as formasde emenda alternativa, e por esta razão conservada em mRNAs maduros dosegundo tipo. No entanto, é particularmente preferido que pelo menos umtranscrito remova todas, ou substancialmente todas, das seqüênciasemendadas alternativamente inseridas, tal que a matriz de leitura abertaheteróloga seja restaurada, ou substancialmente restaurada, para a formaintacta, com poucas ou nenhuma seqüência endogenamente associada com oíntron restante no mRNA maduro. Endógeno é usado aqui em contraste aheterólogo, então será entendido que este refere-se a uma seqüência que seria,no tipo selvagem, normalmente encontrada em associação com, ou ligada a,pelo menos um elemento ou componente da pelo menos uma seqüência decontrole de emenda.

Alternativamente, um ou mais transcritos podem removernucleotídeos adicionais, de modo que a matriz de leitura aberta heteróloga éseparada, não pela inserção de nucleotídeos extras (por exemplo códon deparada ou armação, mas também seqüência potencialmente de codificaçãoque separa a função), mas sim por deleção de nucleotídeos da matriz deleitura aberta heteróloga, por exemplo de tal forma a induzir uma armação.Uma ou mais variantes de emenda podem ter nucleotídeos excisados, maspelo menos uma variante precisa conservar estes nucleotídeos, de modo queuma armação não é induzida em pelo menos uma variante. Estes nucleotídeosremovidos são aqueles que são removidos em adição às seqüências que sãonormalmente emendadas tais como o íntron, onde uma seqüência intrônicapode ser considerada como uma que forma parte de um íntron em pelo menosuma variante de emenda alternativa do análogo natural.

Quando nucleotídeos exônicos devem ser removidos, entãoestes devem ser removidos em múltiplos de três, se é desejado evitar umaarmação, mas como um nucleotídeo único ou múltiplos de dois (que não sãotambém múltiplos de três) se é desejado induzir uma armação. Será notadoque se apenas um ou alguns múltiplos de dois nucleotídeos são removidos,então isto poderia conduzir a uma seqüência de proteína completamentediferente sendo codificada em ou em torno da junção de emenda do mRNA.

Este é particularmente o caso em uma forma de realização dosistema onde éxon de cassetes são usados para interromper uma matriz deleitura aberta em algumas variantes de emenda mas não outras, tais como em,por exemplo, tra, especialmente Cctra.

Em outra forma de realização preferida da presente invenção,toda ou parte de uma matriz de leitura aberta está em um éxon de cassete, porexemplo algumas formas de realização de Dsx derivadas de Aedes, sãoprovidas com, por exemplo, uma região de codificação de tTAV em um éxonde cassete que está apenas presente em variantes de emendas específicas defêmeas.

Onde a mediação de emenda alternativa é específica de sexo,prefere-se que a variante de emenda codificando uma proteína funcional a serexpressada em um organismo seja a variante de emenda Fl, isto é umavariante de emenda encontrada apenas ou predominantemente em fêmeas, epreferivelmente é a variante a mais abundante encontrada em fêmeas, apesarda mesma não ser essencial. Correspondentemente para configurações ondetoda ou parte de uma matriz de leitura aberta funcional está em um éxon decassete, prefere-se que este éxon de cassete esteja incluído em transcritosencontrados apenas ou predominantemente em fêmeas, e preferivelmente taistranscritos são, individualmente ou em combinação, as variantes as maisabundantes encontras em fêmeas, apesar disto não ser essencial.

Em uma forma de realização preferida, seqüências sãoincluídas em uma seqüência híbrida ou recombinante ou construção que sãoderivadas de seqüências intrônicas de ocorrência natural que são elas própriassujeitas a emenda alternativa, em seu contexto nativo ou original. Por estarazão, uma seqüência intrônica pode ser considerada como uma que formaparte de íntron em pelo menos uma variante de emenda alternativa do análogonatural. Assim, seqüências correspondentes a extensões contíguas únicas deseqüência intrônica de ocorrência natural são previstas, mas também híbridosde tais seqüências, incluindo híbridos de duas seqüências intrônicas deocorrência natural diferentes, e também seqüências com deleções ou inserçõesrelativas a extensões contíguas únicas de seqüência intrônica de ocorrêncianatural, e híbridos das mesmas. Referidas seqüências derivadas de seqüênciasintrônicas de ocorrência natural poderão ser associadas, na invenção, comseqüências não fazendo parte, elas mesmas, de qualquer íntron de ocorrêncianatural. Se tais seqüências forem transcritas, e preferivelmente retidas noRNA maduro em pelo menos uma variante de emenda, elas podem ser entãoconsideradas exônicas.

Também será notado que a referência a uma "armação"poderia também referir-se a uma codificação direta de um códon de parada,que também é provável de conduzir a uma proteína não funcionando comoseria uma ruptura da seqüência de mRNA emendado causada por inserção oudeleção de nucleotídeos. Produção de variantes de emenda diferentes de duasou mais proteínas diferentes ou seqüências de polipeptídeo de funçãodiferencial é também prevista, em adição à produção de duas ou maisproteínas diferentes ou seqüências de polipeptídeo das quais uma ou mais nãotem função prevista ou discernível. Também é prevista a produção devariantes de emenda diferentes de duas ou mais proteínas diferentes ouseqüências de polipeptídeo de função similar, mas diferindo a localizaçãosubcelular, estabilidade ou capacidade de se ligar a ou se associar com outrasproteínas ou ácidos nucléicos.

Preferivelmente, a pelo menos uma seqüência de controle deemenda é intrônica e compreende em sua extremidade 5' um nucleotídeo deguanina (G). Em outras palavras, nucleotídeo 5' da seqüência de controle deemenda, 3' para o sítio doador de emenda, e preferivelmente na superfície oujunção do éxon com seqüência de controle de emenda, é Guanina (G), no pré-RNA, ou C em uma seqüência de DNA anti-sentido correspondendo àmesma.

Além disso, o nucleotídeo adjacente (3' para referida G) épreferivelmente Citosina (C) no pré-RNA, ou uma G correspondente em umaseqüência de DNA, mas é mais preferível Uracila (U) no pré-RNA,ou um Acorrespondente na seqüência anti-sentido de DNA. Assim, os doisnucleotídeos 5' da seqüência de controle de emenda são preferivelmente 51GTcom relação ao filamento sentido de DNA, 5'-GU no transcrito primário.

Preferivelmente, pelo menos uma seqüência de controle deemenda intrônica também compreende em sua extremidade 3' um nucleotídeode guanina 3' e preferivelmente AG-3' na junção do sítio aceitador de emendacom éxon, por exemplo, ver figura 34.

Preferivelmente, a seqüência de flanqueamento 5' para o sítiodoador de emenda no sistema compreende 5'-TG, de modo que a seqüênciapode ser representada 3' de seqüência de controle de emenda-** de 5 '-TG-*,onde * representa o sítio doador de emenda e ** representa o sítio aceitadorde emenda.

Preferivelmente, a seqüência de controle de emenda é tambémflanqueada em seu lado 3' por um nucleotídeo de G, e mais preferível pornucleotídeos de GT, tal que a seqüência poderia ser representada como: 5'-TG- *- seqüência de controle de emenda ** -GT-3' *. Será notado que esta é aseqüência de DNA de filamento sentido (TG). Assim, o pré-RNA transcritoirá ler UG por exemplo, onde U substitui T.

Derivados de Guanina ou Timina tendo a mesma função sãotambém visados.

Prefere-se particularmente que a emenda seja específica desexo e ainda mediada ou controlada ligando a proteína TRA ou complexo deproteína TRA/TRA2, ou homólogos da mesma. Em insetos, por exemplo, aproteína TRA é diferencialmente expressada em sexos diferentes. Emparticular, a proteína TRA é conhecida como estando presente basicamenteem fêmeas, por esta razão, media a emenda alternativa de tal forma que umseqüência de codificação é expressada em um modo específico de sexo, isto é,que em alguns casos uma proteína é expressada apenas em fêmeas ou em umnível muito maior em fêmeas do que em machos ou, alternativamente, emoutros casos uma proteína é expressada apenas em machos, ou em um nívelmuito maior em machos do que em fêmeas. Enquanto prefere-se que aproteína seja expressada apenas em machos, é particularmente preferido que aproteína seja expressada apenas em fêmeas, No entanto, o mecanismo pararealizar esta emenda alternativa específica de sexo mediada pela proteínaTRA ou pelo complexo TRA/TRA2 é conhecido e é discutido, por exemplo,em Pane et al (Development 129, 3715-3725 (2002)).

Preferivelmente, a pelo menos uma seqüência de controle deemenda compreende, e mais preferivelmente consiste de, o íntron tra derivadodo gene tra de Ceratitis capitata (Cctrd), que tem uma região alternativamenteemendada. No transcrito Fl, como ilustrado pela figura 33 (figura 2A de Paneet al (2002) supra), este é o primeiro íntron. Homólogos do gene tra em outrasespécies, tais como Bactrocera oleae, Ceratitis rosa, Baetroeera zonata eDrosophila melanogaster também tem região alternativamente emendada emum local similar dentro da seqüência de codificação de tra. íntrons trasderivados destes insetos também são particularmente preferidos.

O padrão de emenda em Cctra em particular é bemconservado, com aqueles transcritos encontrados em machos contendomaterial exônico adicional relativo ao transcrito de Fl, tal que estestranscritos não codificam proteína funcional de comprimento completo. Porcontraste, o transcrito de Fl não codifica proteína Tra de comprimentocompleto; este transcrito é substancialmente específico de fêmea na maiorparte dos estágios do ciclo da vida, ainda que seja especulado que embriõesmuito prematuros de ambos os sexos podem conter uma quantidade pequenadeste transcrito. Os requerentes descreveram a seqüência emendada dotranscrito de Fl, mas não os transcritos específicos de machos ou nãoespecíficos de sexo, como o íntron tra, ou mesmo o íntron F1 de tra. Assim aversão desta seqüência encontrada no gene CCtra é o íntron Cctra.

Assim o gene tra é regulado em parte por emenda alternativaespecífica de sexo, enquanto seu produto chave, a proteína Tra, é ela própriaenvolvida em emenda alternativa. Em insetos, emenda alternativa específicade sexo mediada pela proteína Tra, ou um complexo compreendendo asproteínas TRA e TRA2, incluem seqüências de controle de emenda deDípteros derivadas do gene doublesex (dsx) e também o próprio íntron tra,embora o mesmo excluiria o íntron tra de Drosophila (Dmtra), que éprincipalmente mediado pelo produto de gene Sxl em Drosophila, em vez deTRA ou complexo TRA/TRA2.

Fora de Drosophila, o produto de gene Sxl não édiferencialmente expressado em sexos diferentes. Não se pensa que Sxl atuena mediação de emenda alternativa específica de sexo em insetos nãodrosófilos.

Exemplos da proteína TRA que liga aos sítios de proteína deligação (as seqüências nucleotídicas especificamente reconhecidas pelaproteína Tra) no íntron tra são preferivelmente de Díptera, preferivelmente dafamília Tephritidae, mais preferivelmente dos gêneros Ceratitis, Anastrephaou Bactrocera. No entanto, prevê-se também que outros dípteros, tais comodrosófilos ou mosquitos de várias formas discutidas acima, também sãocapazes de prover a proteína TRA ou homólogas da mesma, que são capazesde se ligar aos sítios apropriados nas seqüências de controle de emendaderivadas do gene dsx, o gene tra ou o íntron tra, isto é o íntron traalternativamente emendado completamente removido no transcrito de Fl,mesmo naqueles casos, tais como Drosophila, onde o gene tra natural (Dmtra)não é, ele mesmo, regulado por proteína Tra. Em algumas formas derealização, o "íntron tra" pode ser definido como uma seqüência de controlede emenda onde emenda alternativa do transcrito de RNA é regulada porTRA, por exemplo sua ligação, sozinha ou em combinação (isto é quandocomplexada) com TRA2. Isto exclui o íntron tra de Drosophila.

Prefere-se particularmente que as seqüências de controle deemenda sejam derivadas do íntron tra. Referido íntron tra pode ser derivado,como discutido em outra parte, de Ceratitis, Anastrepha ou Bactrocera. Oíntron tra de Ceratitis capitata do gene transformer foi inicialmentecaracterizado por Pane et al (2002), supra. No entanto, será notado quehomólogos existem em outras espécies, e podem ser facilmente identificadosem referidas espécies e também em seus vários gêneros. Assim, quandoreferência é feita a tra será notado que isto também refere-se aos homólogosde tra em outras espécies, especialmente em espécies de Ceratitis, Anastraphaou Bactrocera.

Por "derivado" será entendido que, usando a referência aoíntron tra, isto refere-se a seqüências que aproximam-se a ou replicamexatamente o íntron tra, como descrito na técnica, nesse caso por Pane et al(2002), supra. No entanto, será notado que, como estas são seqüênciasintrônicas, alguns nucleotídeos podem ser adicionados ou substituídos semuma perda substancial na função.

Exemplos preferidos disso incluem o íntron dsx,preferivelmente provido na forma de um minigene. Nesse exemplo, pode serpreferível deletar, como feito nos exemplos, quantidades relativamentegrandes de íntrons alternativamente emendados, por exemplo 90% ou mais deum íntron em alguns casos, enquanto ainda conservando a função de emendaalternativa. Assim, apesar de deleções grandes estarem previstas, prevê-setambém que inserções, substituições ou deleções mesmo menores, porexemplo de nucleotídeo único, também são preferidas.

O comprimento exato da seqüência de controle de emendaderivado do íntron tra não é essencial, desde que seja capaz de mediar aemenda alternativa. A este relação, pensa-se que cerca de 55 a 60nucleotídeos é o comprimento mínimo de um íntron tra modificado, embora oíntron tra de tipo selvagem (variante de emenda Fl) de C. capitata é na regiãode 1345 nucleotídeos de comprimento.

Prefere-se particularmente que a seqüência de 1345 ntd decomprimento completo de Cctra seja usada.

Como com todas as seqüências nucleotídicas discutidas aqui,prefere-se que um certo grau de homologia de seqüência seja prevista, salvode outra forma evidente. Assim, prefere-se que a seqüência de controle deemenda tenha pelo menos 80% de homologia de seqüência com a referênciaSEQ ID NO., preferivelmente pelo menos 80% de homologia de seqüênciacom a referência SEQ ID NO., preferivelmente pelo menos 80% dehomologia de seqüência com a referência SEQ ID NO., mais preferivelmentepelo menos 90% de homologia de seqüência com a referência SEQ ID NO.,mais preferivelmente pelo menos 95% de homologia de seqüência com areferência SEQ ID NO., ainda mais preferivelmente pelo menos 99%homologia de seqüência com a referência SEQ ID NO., e a mais preferível,pelo menos 99.9% de homologia de seqüência com a referência SEQ ID NO.

Um algoritmo apropriado tal como BLAST pode ser usado para determinarhomologia de seqüência. Se quantidades grandes de seqüência são deletadasdo tipo selvagem, então a comparação de seqüência pode ser sobre ocomprimento completo do tipo selvagem ou sobre seqüências alinhadas dehomologia similar.

No entanto, será entendido que apesar da homologia deseqüência acima, determinados elementos, em particular os nucleotídeos deflanqueamento e sítio de ramificação de emenda devem ser conservados, parafuncionamento eficiente do sistema. Em outras palavras, enquanto porçõespodem ser deletadas ou, de outro modo, alteradas, funcionalidade ou atividadede emenda alternativa, a pelo menos 30%, preferivelmente 50%,preferivelmente 70%, mais preferivelmente 90%, e, a mais preferível, 95%comparada ao tipo selvagem deve ser conservada. Isto pode ser aumentado dotipo selvagem, bem como, por engenharia apropriada dos sítios que ligamfatores de emenda alternativa ou interagem com espliceossoma, por exemplo.

Em particular, prefere-se que onde a seqüência de controle deemenda compreende um íntron tra modificado, ela compreenda pelo menos20 a 40 pares de base de 5' e, preferivelmente, assim a extremidade 3' dereferido íntron. Além disso, prefere-se que pelo menos 3 ou 4 e, maispreferido, pelo menos 5, preferivelmente 6, mais preferivelmente 7 e, maispreferido, todos os 8 dos 8 domínios de ligação de TRA putativos do íntrontra de C. capitata, como ensinado por Pane et al (2002), ou homólogos disso,sejam providos. Como evidente, se mais de tais sítios forem descobertos emdevido curso, então é visado que a seqüência de controle de emenda poderiaincluir mais do que 8 sítios. De fato, é previsto que mais do que 8 sítiospossam ser engenheirados na seqüência de controle de emenda e que aemenda alternativa possa ser regulada desta forma, especialmente se algunssítios estiverem ligados com afinidades diferentes levando um resultado deemendas alternativas diferentes.

Uma seqüência de consenso par os domínios de ligação deTRA putativos do íntron tra de C. capitata é dada abaixo como SEQ ID NO 1,uma seqüência de DNA3 embora o RNA correspondente equivalente étambém preferido.

As seqüências de consenso preferidas são 1:TCWWCRATCAACA (SEQ ID NO. 1), onde W = AouTeR = AouG.

Considerações similares aplicam-se a doublesex, onde aseqüência de consenso da proteína TRA é também aquela dada em SEQ IDNO. 1 como um complexo de proteína compreendendo as 'proteínas Tra eTRA2 é um regulador chave de emenda alternativa de doublesex , como é dehomólogos tra (embora não sejam os homólogos tra encontrados emdrosofilídeos).

Como mencionado acima, as seqüências de controle deemenda são preferivelmente derivadas do íntron tra, preferivelmente dafamília Tephritidae. Prefere-se particularmente que o íntron tra seja derivadode B. zonata ou, preferivelmente, de outras moscas de frutas nãodrosofilídeos. No entanto, é particularmente preferido que o íntron tra sejaderivado dos gêneros de Ceratitis, em particular C. rosa e,o mais preferível,C. capitata. Estes são mais vastamente conhecidos como as moscas-de-natal edo-mediterrâneo, respectivamente.

Com relação ao íntron tra derivado de B. zonata, osrequerentes demonstraram que isto pode levar a uma emenda alternativaespecífica de sexo em mosca mexicana das frutas transgênica (.Anastraphaludens) e em mosca-do-mediterrâneo transgênica (C capitata). Os requerentestambém demonstraram que uma variedade de proteínas pode ser expressadaem um modo específico de sexo através de emenda alternativa, incluindotTAV 3 e Rpr.

Em relação ao íntron tra derivado de C. rosa, os requerentesdemonstraram com sucesso emenda alternativa em um modo específico desexo de um transgene em mosca-do-mediterrâneo.

Com relação ao íntron tra derivado de C. capitata (mosca-do-mediterrâneo), os requerentes demonstraram que este pode mediar a emendaespecífica de sexo em mosca-do-mediterrâneo transgênica, e outras tefritidas,e outras tefritidas tais como A. Iudens (mosca mexicana das frutas). Nãoapenas isso, os requerentes demonstraram que este íntron pode trabalhar comsucesso através de toda faixa de insetos e, em particular, dípteros. De fato, osrequerentes demonstraram que o íntron tra de C. capitata (referido comoCctra) pode prover emenda alternativa específica de sexo em Drosophilatransgênica, que não é uma tefrítida, e também no mosquito Aedes aegypti.Embora mosquitos sejam dípteros, eles divergiram de drosófilos e tefrítidoscerca de 250 milhões de anos atrás e, por esta razão, são parentes bem maisdistantes que os drosofilídeos são para as tefritidas, para os quais o tempo dedivergência foi estimado como 120-150 milhões de anos. Assim, isto mostrauma ampla aplicabilidade da presente invenção através de uma extensa faixade insetos.

No que diz relação a seqüências de controle de emendaderivadas do íntron dsx, também os requerentes demonstraram que isto podeser usado para emendar alternativamente, em um modo específico de sexo,em uma ampla faixa de insetos. Conseqüentemente, é particularmentepreferido que o dsx seja derivado de Bombyx mori (bicho da seda),Pectinophora gossypiella (lagarta rosada) Pectinophora gossypiella, Cydiapomonella (traça das maças e pêras), Drosophila, e mosquitos tais comoAnopheles sp., por exemplo A. gambiae. Mosquitos particularmentepreferidos incluem Stegomyia spp., particularmente S. aegypti (tambémconhecido como Aedes aegypti).

De fato, em A. aegypti, os requerentes demonstraram umnúmero considerável de construções de DNA5 que são capazes de proveremenda alternativa específica de sexo.

Será notado que o sistema ou construção seja preferivelmenteadministrado como um plasmídeo, mas geralmente testado após integrar nogenoma. Administração pode ocorrer por métodos conhecidos na técnica, taiscomo parenteral, intravenosa, intramuscular, oral, transdérmica, liberadaatravés de uma membrana mucosa, e assim por diante. Injeção em embriões éparticularmente preferida. O plasmídeo pode ser linearizado antes ou duranteadministração, e nem todos dentre os plasmídeos podem ser integrados nogenoma. Onde apenas parte do plasmídeo é integrada no genoma, prefere-seque esta parte inclua a pelo menos uma seqüência de controle de emendacapaz de mediar a emenda alternativa.

Preferivelmente, o sistema de expressão de polinucleotídeos éum sistema genético letal dominante recombinante, cujo efeito letal écondicional. Condições apropriadas incluem temperatura, de modo que osistema é expressado a uma temperatura mas não, ou em menor grau, emoutra temperatura, por exemplo. O sistema genético letal pode atuar emcélulas ou tecidos específicos ou impor seu efeito em todo o organismo.Sistemas que não são estritamente letais mas impõem um custo substancial àaptidão física são também previstos, por exemplo levando à a cegueira,aptidão ao vôo (para organismos que poderiam normalmente voar), ouesterilidade. Sistemas que interferem com a determinação de sexo sãotambém previstos, por exemplo transformando ou tendendo a transformartodo ou parte de organismo de um tipo sexual a outro. Será entendido quetodos tais sistemas e conseqüências são englobados pelo termo letal comousado aqui. Similarmente, "matar", e termos similares referem-se à expressãoefetiva do sistema letal e assim a imposição de um fenótipo deletério ou dedeformidade sexual, por exemplo morte.

Mais preferivelmente, o sistema de expressão depolinucleotídeo é um sistema genético letal dominante recombinante, cujoefeito letal é condicional e não é expressado sobre condições permissivasrequerendo a presença de uma substância que está ausente do ambientenatural do organismo, tal que o efeito letal do sistema letal ocorre no ambientenatural do organismo.

Em outras palavras, as seqüências de codificações codificamum ligado letal a um sistema tal como o sistema tet descrito em WO 01/39599e/ou W02005/012534.

De fato, prefere-se que a expressão de referido gene letalocorra sob o controle de uma proteína de transativador reprimível. Tambémprefere-se que o gene cuja expressão é regulada por emenda alternativacodifique um proteína de transativador tal como tTA. Isto não é incompatívelcom a proteína regulada ser uma letal. De fato, é particularmente preferidoque ela seja os dois. A este respeito, os requerentes preferem particularmenteque o sistema inclua um sistema de retro-alimentação positivo como ensinadoem W02005/012534.

Preferivelmente, o efeito letal do sistema letal dominante écondicionalmente supressivo.

Organismos apropriados sobre os quais o presente sistemapode ser usado incluem mamíferos tais como camundongos, ratos e animaisde criação. Também são preferidos peixes, tais como salmão e truta. Plantastambém são preferidas, mas é particularmente preferido que o organismohospedeiro seja um inseto, preferivelmente um díptero ou tefrítidos.

Preferivelmente, o organismo não é um humano, preferivelmente não é ummamífero, preferivelmente não é um pássaro, preferivelmente é uminvertebrado, preferivelmente é um artrópode.

Em particular, prefere-se que o inseto seja da Ordem Díptera,especialmente dípteros superiores e particularmente ele é uma mosca tefrítidadas frutas, preferivelmente mosca-do-mediterrâneo (Ceratitis capitata),preferivelmente mosca mexicana das frutas {Anastrepha ludens),preferivelmente mosca oriental das frutas (.Bactrocera dorsalis), mosca daazeitona (Baetroeera oleae), mosca do melão (.Baetroeera eueurbitae),mosca-de-natal {Ceratitis rosa), mosca da cereja (Rhagoletis eerasi), moscadas frutas de Queensland Baetroeera tyroni), mosca do pêssego (Baetroeerazonatá), mosca das frutas do Caribe (.Anastrepha suspensa) ou mosca dasfrutas da índia Ocidental {Anastrepha oblíqua). Também é particularmentepreferido que o organismo hospedeiro seja um mosquito, preferivelmente dosgêneros Stegomyia, Aedes, Anopheles ou Culex. São particularmentepreferidos Stegomyia aegyptae, também conhecidos como Aedes aegypti,Stegomyia albopieta (também conhecidos como Aedes albopietus), Anophelesstephensi, Anopheles albimanus e Anopheles gambiae.

Dentro dos Dípteros, outro grupo preferido é Calliphoridae,particularmente o verme-parafuso do Novo Mundo (Cochliomyiahominivorax), verme-parafuso do Velho Mundo (Chrysomya bezziana) emosca australiana da ovelha (Lueilia euprina). Lepidópteros e Coleópterostambém são preferidos, especialmente traças, incluindo traça das maçãs epêras (Cydia pomonella), e o bicho da seda (Bombyx mori), a lagarta rosada(Peetinophora gossypiella), a lagarta da couve (Plutella xylostella), amariposa (Lymantria dispar), a traça de laranja-da-baía (Amyelois transitella),a lagarta mineira do pessegueiro {Anarsia lineatella), e a broca da haste doarroz (Tryporyza ineertulas), as traças noctuídas, especialmente Heliothiane.Dentre os Coleópteros, o besouro japonês (.Popilla japoniea), o besourofranjado branco (Graphognatus spp.), o gorgulho do algodão {Anthonomousgrandis), a lagarta da raiz do milho (Diabrotiea spp), e escaravelho dabatateira {Leptinotarsa decemlineata) são particularmente preferidos.

Preferivelmente, o inseto não é um drosofilídeo, especialmenteDm. Assim, em algumas formas de realização, expressão em drosofilídeos,especialmente Dm é excluída. Em outras formas de realização, a seqüência decontrole de emenda não é derivada do íntron tra de um drosofilídeo,especialmente Dm.

Prefere-se que a expressão da seqüência polinucleotídicaheteróloga conduza a uma conseqüência fenotípica no organismo. Prefere-separticularmente que a proteína funcional não seja beta-galactosidase, maspossa estar associada com marcadores visíveis (incluindo fluorescência),viabilidade, fertilidade, fecundidade, conveniência, aptidão ao vôo, visão, ediferenças comportamentais. Será notado, como evidente, que, em algumasformas de realização, os sistemas de expressão são tipicamente condicionais,com o fenótipo sendo expressado apenas sobre algumas condições, porexemplo restritivas.

Em um outro aspecto, provê-se também um método decontrole populacional de um organismo em um ambiente natural para omesmo, compreendendo:

i) reproduzir um lote do organismo,

o organismo transportando um sistema de expressão de genecompreendendo um sistema de acordo com a presente invenção que é umsistema genético letal dominante,

ii) distribuir os referidos animais de lote no meio ambiente emum local para controle populacional; e

iii) obter um controle da população através da letalidade emestágio prematuro por expressão do sistema letal na descendência que resultada inter-reprodução dos referidos indivíduos no lote com os indivíduos dosexo oposto da população selvagem.

Preferivelmente, a letalidade de estágio prematuro éembriônica ou antes de maturidade sexual, preferivelmente no início dedesenvolvimento, mais preferível, nos estágios prematuros da vida larval ouembriônica.

Preferivelmente, o efeito letal do sistema letal é condicional eocorre no referido ambiente natural através da expressão de um gene letal,

a expressão de referido gene letal estando sob controle de umaproteína de transativados reprimível, a referida reprodução ocorrendo sobcondições permissivas na presença de uma substância, a substância estandoausente do referido ambiente natural e capaz de reprimir referidotransativador.

Preferivelmente, o efeito letal é expressado nos embriões dereferida descendência. Preferivelmente, o organismo é um animal multicelularinvertebrado ou é como discutido em outra parte.

Também provê-se um método de controle biológico,compreendendo:

i) reproduzir um lote de organismos machos e fêmeastransformados com o sistema de expressão de acordo com a presente invençãosob condições permissivas, permitindo a sobrevivência dos machos e fêmeas,para dar um agente de controle biológico de sexo dual;

ii) opcionalmente antes da próxima etapa impor ou permitircondições restritivas para causar a morte de indivíduos de um sexo e, assim,prover um agente de controle biológico de sexo único compreendendoindivíduos do outro sexo transportando o sistema genético letal condicional;

iii) liberar o agente de controle biológico de sexo dual ou desexo único no meio ambiente em um locus para controle biológico; e

iv) obter controle biológico através da expressão do sistemagenético na descendência resultante de inter-reprodução dos indivíduos doagente de controle biológico com indivíduos do sexo oposto da populaçãoselvagem.

Preferivelmente, ocorre separação de sexos antes dadistribuição de organismo por expressão de um sistema genético letalespecífico de sexo.

Preferivelmente, o efeito letal resulta em matar mais de 90%da classe alvo da progênie de acasalamentos entre os organismo liberados e apopulação selvagem.

Também provê-se um método de separação de sexoscompreendendo:

i) reproduzir um lote de organismos machos e fêmeastransformados com o sistema de expressão de gene sob condições permissivasou restritivas, permitindo a sobrevivência dos machos e fêmeas; e

ii) remover as condições permissivas ou restritivas para induziro efeito letal do gene letal em um sexo e não em outro por emenda alternativaespecífica de sexo do gene letal.

Preferivelmente, o efeito letal resulta em matar mais do que90% da classe alvo da progênie de acasalamentos entre organismos liberadose a população selvagem.

Também provê-se um método de controle biológico oupopulacional compreendendo;

i) reproduzir um lote de organismo machos e fêmeastransformados com o sistema de expressão de genes sob condiçõespermissivas ou restritivas, permitindo a sobrevivência dos machos e fêmeas;

ii) remover as condições permissivas ou restritivas para induziro efeito letal do gene letal em um sexo e não em outro por emenda alternativaespecífica de sexo do gene letal para obter uma separação de sexos;

iii) esterilizar ou parcialmente esterilizar os indivíduosseparados e

iv) realizar referido controle através de da liberação dosindivíduos estéreis ou parcialmente estéreis separados no meio ambientenatural do organismo.

Preferivelmente, a esterilização é realizada através do uso eradiação ionizante. Geralmente, no entanto, métodos evitando irradiação,como usado na técnica de inseto estéril (SIT) são especialmente preferidos etêm muitas vantagens de custo e saúde sobre os métodos associados com ouseguidos pelo uso de radiação.

Também provê-se um método para eliminar seletivamentefêmeas de uma população. O equivalente para machos também é previsto.

Métodos de separação de sexo são enormemente importantescomercialmente em, por exemplo, bichos da seda, onde os machos produzemseda em maior e melhor quantidade do que as fêmeas. Assim, métodos deseparação de sexo que eliminam as fêmeas e, em particular bichos da sedafêmeas são particularmente preferidos.

Prevê-se também que a proteína funcional pode ser umaexpressada diferencialmente, mas detectável em mais de um variante deemenda e preferivelmente, por esta razão, em ambos sexos, por exemplo. Taisexemplos incluem uma proteína fluorescente, tais como eGFP, CopGFP eDsRed2. Esta pode ser usada em um método de separação ou escolha de sexonão letal, de modo que se pode separar os dois tipos sem matar qualquer umdeles.

Os requerentes verificaram surpreendentemente que oposicionamento da seqüência de controle de emenda pode ser alterado emelhores resultados obtidos. Preferivelmente, a seqüência de controle deemenda é a "primeira" seqüência de controle de emenda, quando lida a partirdo promotor, na direção de 5' a 3'. Os requerentes verificaram que emdeterminadas construções com um íntron em 5' UTR do sistema este fatoconduzida a reduzidos níveis ou expressão de proteína alternativamenteemendada mediada pela seqüência de controle de emenda da presenteinvenção.

Preferivelmente, a seqüência de controle de emenda é 3' para ocódon de partida. Preferivelmente, a seqüência de controle de emenda estáinserida dentro do primeiro éxon, isto é a extensão de seqüênciaimediatamente 3' para o sítio de partida de transcrição. Será entendido que taistermos podem referir-se à seqüência de DNA que codifica o transcrito, oupara o próprio transcrito de RNA.

Onde a seqüência de controle de emenda é 3' para o códon departida, prefere-se que seja também 5' para o primeiro códon de parada namatriz (que é 3' para e em matriz com o códon de partida), de modo que aemenda alternativa produz transcritos que codificam proteína ou seqüênciasde polipeptídeos diferentes. Assim em uma forma de realização preferida, aconstrução ou seqüência polinucleotídica compreende os seguintes elementosem ordem de 5' a 3', com relação ao filamento sentido ou transcrito primário:partida de transcrição, partida de tradução, íntron capaz de emendaalternativa, seqüência de codificação de toda ou parte de uma proteína, códonde parada.

A seqüência de controle de emenda pode ser definida comopreferivelmente até e incluindo 5' G (GT/C) seu equivalente 3' G,especialmente em tra, mas, como mencionado acima, pode incluir algumasseqüências exônicas e, por esta razão, poderia incluir o nucleotídeo o mais 3'(último) do éxon (isto é G).

Prefere-se particularmente que a seqüência de controle deemenda seja imediatamente adjacente, na direção de 3', do códon de partida,de modo que G de ATG está 5' para partida (extremidade 5') da seqüência decontrole de emenda. Isto é particularmente vantajoso como permite a G docódon de partida de ATG ser a seqüência de flanqueamento de 5' G para aseqüência de controle de emenda.

Alternativamente, a seqüência de controle de emenda é 3' parao códon de partida mas dentro de 1000 bp exônico, preferivelmente 500 bpexônico, preferivelmente 300 bp exônico, preferivelmente 200 bp exônico,preferivelmente 150 bp exônico, preferivelmente 100 bp exônico, maispreferivelmente 75 bp exônico, mais preferivelmente 50 bp exônico, maispreferivelmente 30 bp exônico, mais preferivelmente 20 bp exônico, e, o maispreferível, 10 ou mesmo 5, 4, 3, 2, ou 1 bp exônico.

A presente invenção é um aperfeiçoamento no sistemadefinido como LAl 188 em W02005/012534. Esse plasmídeo tem um númerode defeitos, sendo o principal que os nucleotídeos exônicos foram excisadoscom o íntron Cctra usado ai, assim resultando em uma armação induzida notranscrito.

Especificamente, em adição a seqüência derivada de Cctra (oíntron Cctra), 4 nucleotídeos de seqüência de tTAV foram removidos notranscrito específico de fêmea. Por esta razão, embora vários transcritosemendados alternativamente foram produzidos, incluindo um transcritoespecífico de fêmea, nenhum foi capaz de codificar a proteína tTAVfuncional. Por esta razão, esta construção não foi capaz de prover expressãoespecífica de sexo de proteína tTAV funcional.

Desde que emenda não foi direcionada à seqüência de doadorde emenda (5'-GT...) normalmente usada no íntron Cctra, claramente estaconstrução não conteve todas das seqüências regulatórias necessárias paradirecionar emenda na forma do íntron Cctra em "seu contexto nativo" Noentanto, isto realça outro tecido. Provavelmente a única coisa faltando foi oTG...GT de flanqueamento, do qual é possível que apenas importava 5' G.

Uma benefício chave da presente invenção é, em particular emrelação a tra, que as exigências das seqüências exônicas são tão mínimas (porexemplo 2 nucleotídeos em cada extremidade) que elas podem facilmente serprojetadas em maiores seqüências de codificação, usando a redundância nocódigo genético. Assim, os nucleotídeos exônicos "extras" podem ser tantoparte de seqüência de proteína heteróloga como a seqüência de flanqueamentodo íntron em seu contexto nativo ao mesmo tempo.

Conseqüentemente, o íntron Ccfra em LAl 118 foi +132bp 3'para o G do Códon de partida ATG (para o último nucleotídeo exônico). Defato, embora o íntron Cctra em LAl 118 seja o primeiro íntron lido na direçãode 5' a 3' do códon de partida ATG, ele não é o "primeiro" íntron quando lidona direção de 5' a 3' do promotor. De fato, é o segundo íntron, como não hámais um íntron (derivado de gene Adh de Drosophila melanogaster) amontante do Códon de partida de ATG. Esta informação está incluída naTabela 3.

Será entendido que onde referência é feita a códon de partidade ATGs ou G de flanqueamento, ou seqüências de 5'- TG...GT-31, que istoestá relacionado com a seqüência de DNA, mas isto também abrange aseqüência de DNA anti-sentido correspondente e, igualmente, a seqüência deRNA correspondente.

Descrição das Seqüências da presente invenção

SEQ ID NO. 1 seqüência de consenso traSEQ ID NO. 2 Seqüência de flanqueamento 5' de LA3097SEQ ED NO. 3 Seqüência de flanqueamento 3' de LA3097SEQ ID NO. 4 iniciador 688 iel-transcrSEQ ID NO. 5 iniciador 790 Aedsx-m-r2SEQ ID NO. 6 iniciador 761 Aedsx-fem-rSEQ ID NO. 7 iniciador AedsxRl

SEQID NO. 8 Seqüência de consenso de Pane et alSEQ ID NO. 9 seqüência de consenso de Scali et al 2005SEQ ID NOS. 10 - 33 e 107 - 138 seqüências de consenso desítios de ligação Tra/Tra2 putativos deduzidos de Drosophila (ver Tabela 2).SEQ ID NO. 34: Matriz de leitura aberta de tTAV

SEQ ID NO. 35: Seqüência de proteína de tTAVSEQ ID NO. 36: Matriz de leitura aberta de tTAV2SEQ ID NO. 37: Seqüência de proteína de tTAV2SEQ ID NO. 38: Matriz de leitura aberta de tTAV3SEQ ID NO. 39: Seqüência de proteína de tTAV3SEQ ID NO. 40: Fragmento 1 de seqüência específica defêmea dsx de lagarta rosada

SEQ ID NO. 41: fragmento 2 de seqüência específica de fêmeadsx de lagarta rosada (PBW, Pectinophora gossypiella)

SEQ ID NO. 42: seqüência específica de macho de dsx delagarta rosada (PBW, Pectinophora gossypiella)

SEQ ID NO. 43: Seqüência de gene parcial dsx de Aedesaegypti. Toda seqüência exônica é incluída, mas apenas seqüência intrônicaparcial- ver figuras 47 e 48 para anotação.

SEQ ID NO. 44: seqüência de gene de fêmea dsx de traça dasmaçãs e pêras (Cydia pomonella): inclui uma extensão de nucleotídeosdesconhecidos, preferivelmente além de 100, preferivelmente inferior a 50,mais preferivelmente inferior a 20, mais preferivelmente inferior 10, e, o maispreferível, inferior a 5.

SEQ ID NO. 45: seqüência de macho dsx de traça das maçãs epêras (Cydiapomonella).

SEQ ID NO. 46: seqüência de construção depLA3435/plasmídeo dsx de Bombyx mori.

SEQ ID NO. 47: seqüência de construção de pLA3359 dsx deAnopheles gambiae.

SEQ ID NO. 48: seqüência de construção de pLA3433 Agdsx(Anopheles gambiae) com éxon 2 incluído.

SEQ ID NO. 49: seqüência de construção de pLAl 118 - íntronCctra

SEQ ID NO. 50: seqüência de construção de pLA3077 - íntronCctra-tTAV.

SEQ ID NO. 51 : seqüência de construção de pLA3097 -íntron Cctra-tTAV.SEQ ID NO. 52: seqüência de pLA3233 - íntron Cctra -tTAV2.

SEQ ID NO 53: seqüência de construção de pLA3014 - íntronCctra - ubiquitina - ReaperKR.

SEQ ID NO. 54: seqüência de construção de pLA3166 - íntronCctra -ubiquitina - ReaperKR.

SEQ BD NO. 55: seqüência de pLA3376 - íntron Bztra -ReaperKR -- íntron Bztra - tTAV3.

SEQ ED NO. 56: seqüência de construção de pLA3242 -íntron Crtra - ReaperKR.

SEQ ID NO. 57: Seqüência parcial de um transcrito de machogerado em Drosophila melanogaster de transformantes de LA3077 quediferem para a seqüência gerada em linhagens de LA3077 de mosca-do-mediterrâneo. Esta seqüência corresponde ao transcrito M3 representado nafigura 36.

SEQ ID NO. 58: Seqüência parcial de homólogo tra deBactrocera zonata. Seqüência de íntron prevista para ser emendada em umtranscrito específico de fêmea tra de B. zonata (+3 a +970bp em seqüência).Nucleotídeo exônicos de flanqueamento estão nas posições 1-2 e 971-972,isto é nas extremidades de 5' e 3' da seqüência intrônica. De fato, deve-seobservar que a seqüência intrônica é flanqueada em sua extremidade 5' porum nucleotídeo de guanina, que se pensa ser crítico de uma saída limpa doíntron.

SEQ ID NO 59: Seqüência parcial de homólogo tra deCeratitis rosa. Seqüência de íntron prevista para ser emendada em umtranscrito específico de fêmea tra de C. rosa (+3 a 1311 bp em seqüência).

Nucleotídeo exônicos de flanqueamento são apresentados nasposições 1-2 e 1312-3. Novamente, observa-se que seqüência intrônica éflanqueada em sua extremidade de 5' por um nucleotídeo de guanina, que sepensa ser crítico de uma saída limpa do íntron.

SEQ ID NOS. 60-70: Iniciadores como referido nas figuras44-46 e 50-51.

SEQ ID NO. 71 : fragmento 3 específico de fêmea dsx delagarta rosada (PBW, Pectinophora gossypiella).

SEQ ID NO. 72: Matriz de leitura aberta de ubiquitina deDrosophila melanogaster.

SEQ ID NO. 73: Seqüência de proteína de ubiquitina deDrosophila melanogaster.

SEQ ID NOS. 74-105 são iniciadores como discutido acimanos exemplos.

SEQ ID NO. 106 é seqüência nucleotídica de LAl 172,incluindo espinha dorsal de plasmídeo.

SEQ ID NOs 107-138 estão descritas acima.

SEQ ID NO. 139 iniciador de HSP

SEQ ID NO. 140 iniciador de VP 16

SEQ ID NO. 141 iniciador de AgéxonlF

SEQ ID NO. 142 iniciador TETRRl

SEQ ID NO. 143 seqüência de plasmídeo LA3576

SEQ ID NO. 144 seqüência de plasmídeo LA3582

SEQ ID NO. 145 seqüência de plasmídeo LA3596

SEQ ID NO. 146 PBW - dsx (Fig 6)

SEQ ID NO. 147 bombyx - dsx (Fig 6)

SEQ ID NO. 148 traça das maçãs e pêras - dsx (Fig 6)

SEQ ID NO. 149 DSX Minigene 1 de construção LA3491

SEQ ED NO. 150 DSX Minigene 2 de construção LA3534

SEQ ID NO. 151 seqüência completa de plasmídeo LA3619

SEQ ID NO. 152 seqüência completa de plasmídeo LA3612

SEQ ID NO. 153 seqüência de plasmídeo LA3491SEQ ID NO. 154 seqüência de plasmídeo LA3515SEQ ID NO. 155 seqüência de plasmídeo LA3545SEQ LD NO. 156 seqüência de plasmídeo LA3604SEQ ID NO. 157 seqüência de plasmídeo LA3646SEQ ID NO. 158 seqüência de plasmídeo LA3054SEQ ID NO. 159 seqüência de plasmídeo LA3056SEQ ID NO. 160 seqüência de plasmídeo LA3488SEQ ID NO. 162 seqüência de plasmídeo LA3570

A invenção será agora descrita por referência aos seguintes,exemplos não limitantes.

EXEMPLOS

Transformer

Exemplo 1-íntron tra de Ceratitis capitata

Os requerentes prepararam uma inserção de um cassete deíntron Cctra em uma matriz de leitura aberta sintética (ORP). Duas versõesdesta emenda corretamente em mosca-do-mediterrâneo, em outras palavras aemenda do cassete de íntron Cctra fielmente recapitula o que serianormalmente feito no contexto do gene de Cctra endógeno. Isto foi paraproduzir 3 variantes de emendas 3 (principais ou sozinhas) em fêmeas, umadas quais é específica de fêmea (chamada Fl) enquanto as outras duas deambos, machos e fêmeas (chamadas Ml e M2). Uma vez que cada um dostranscritos não específicos de sexo contêm material exônico adicional comcódons de parada, os requerentes também realizaram isto de modo que apenasa variante de emenda de fêmea produz proteína funcional.

Cada uma destas construções (LA3077 e LA3097) tem oíntron Cctra flanqueado por TG e GT (para dar 5'...TG\íntron\GT...3'. Umaconstrução antiga, que não funciona perfeitamente, é LAl 188. LAl 118 écompletamente bem caracterizada - emenda é exatamente como acima excetoque 4 nucleotídeos adicionais são removidos. O íntron está no contexto5'...TGGCAC|íntron|GT...3'; emenda remove 4 bases adicionais, isto é5'...TG|GCACintronIG7...3' (figura 33).

Em todos os casos o íntron é invariável, e é simplesmente aseqüência de íntron Cctra completa. Como é normal para íntrons, ele começacom GT e termina com AG. Quase todos os íntrons começam com GT5 assim,o uso de GC alternativo raro em LAl 118 é surpreendente [íntrons GC-AG sãouma alternativa conhecida - em um estudo em grande escala, 0,5% de todosíntrons foram notificados para uso de GC-AG (Burset et al., 2001), emboraisto possa ser subestimado, particularmente de íntrons alternativamenteemendados, dos quais talvez 5% poderiam utilizar GC-AG (Thanaraj e Clark, 2001)].

Análise de RT-PCR foi efetuada em LA3077, (uma construçãode retro-alimentação positiva com o íntron Cctra na matriz de leitura aberta detTAV). Moscas adultas transformadas de ambos os sexos foram criadas emdieta substancialmente livre de tetraciclina ("sem tetraciclina") por 7 dias.Moscas foram então coletadas para extração de RNA e RT PCR usandoiniciadores (HSP- SEQ ID NO. 104 e VP16 SEQ ID NO. 105) foram usadospara analisar o padrão de emenda do íntron CcTRA (Figura 34). Em duasamostras de fêmea os requerentes encontraram o padrão de emenda correto doCctra (776 bp, correspondendo a remoção precisa do íntron Cctra) e nãonotaram tal banda em machos.

Os requerentes encontraram que LA3077 e LA3097correspondentemente deram uma letalidade específica de fêmea repressível.LA3077 foi testado fenotipicamente através de cruzamento de moscasheterozigóticas de LA3077 para tipo selvagem, com e sem tetraciclina.Letalidade de fêmea variou de 50 a 70%. LA3097 (uma versão modificada deLA3077 por meio da qual o íntron Cctra imediatamente segue o códon departida em tTAV ORF), demonstrou um nível muito maior de letalidadeespecífica de fêmea, atingindo um máximo de 100% (Figura 35). O íntronCctra foi também inserido em tTAV2 na mesma posição como LA3097, naconstrução LA3233, e isto deu um resultado fenotípico similar como LA3097(Figura 35).

Os requerentes também prepararam transformantes de LA3077em Drosophila. Fenotipicamente, a construção funciona perfeitamente, isto é,que ela é letal específica de fêmea altamente efetiva. No entanto,sequenciamento das variantes de emenda de uma destas inserções demonstrouque a emenda desta construção em Drosophila não é igual como é na mosca-do-mediterrâneo (SEQ ID NO. 57). O transcrito crítico, aquele específico defêmea, é o mesmo em ambos, mas em pelo menos um dos transcritos nãoespecíficos de sexo é diferente. Ele incorpora ainda seqüência exônica extra,com códons de parada, mas a junção de emendas não são exatamente iguais(Figura 36). Esta observação é extremamente importante na medida em quedemonstra que esse método (regulação de expressão de gene por uso deíntrons alternativamente emendados) pode ser bastante utilizado em toda umafaixa filogenética.

Um teste simples para determinar se um regulador de emendaexônica ainda não caracterizado (tais como melhoradores e supressores) podeestar modificando a função do íntron emendado alternativamente, poderiamincluir a realização da construção e introdução no tecido alvo, e entãoexaminar seu padrão de emenda. Em muitos casos isto não vai requerer atransformação de linhagem germinal, assim, o teste pode ser bastante rápido,por exemplo por expressão transiente em células de cultura de tecidoapropriadas ou in vivo. Por exemplo, teste in vivo em insetos poderia serrealizado liberando o DNA por microinjeção. No entanto, como o versadoapreciará, microinjeção junto com eletroporação, ou eletroporação,transformação química, métodos balísticos, por exemplo, foram todosutilizados em vários contextos e tais métodos de introdução de plasmídeo eexpressão de proteína a partir dos mesmos são bem conhecidos na técnica.Os requerentes também realizaram recentemente e obtiveramtransgênicos com, o íntron Cctra em um gene diferente (LA3014) (todos osexemplos acima são tTAV). LA3014 contém uma fusão ubiquitina - Reaperiaia jusante de um íntron Cctra. Dados fenotípicos (Figura 35) mostram queLA3014 mosca-do-mediterrâneo transgênica resultou em letalidade específicade fêmea repressível. Análise de RT-PCR em RNA extraído de machos efêmeas adultos criados sem tetraciclina, usando iniciadores (HSP, SEQ IDNO 74) e ReaperKR (SEQ ID NO. 75), demonstra que emenda correta estavaocorrendo em fêmeas (banda de 508bp) e nenhuma destas bandas foiencontrada em machos (Figura 37). LA3166 é outra construção com o íntronCctra localizado dentro da região de codificação de ubiquitina fiisionada aoReaperKR, mas localizada em uma posição diferente em ubiquitina. LA3166também produz um efeito letal específico de fêmea repressível dominante namosca-do-mediterrâneo (Figura 35).

Os requerentes também realizaram recentemente e obtiveramtransgênicos com construções baseadas em Cctra com "apenas íntron" comíntron em um gene diferente (todos os exemplos acima estão em tTAV ouuma de suas variantes, isto é tTAV2 ou tTAV3). Estas construções funcionamcomo previsto. Este é um resultado importante, deste modo mostrando quenão ocorrem seqüências exônicas essenciais em Cctra que os requerentessimplesmente duplicaram (em função, se não necessariamente em seqüência)por acaso, em tTAV. Também os requerentes realizaram construções ubi-rprKR deste tipo (LA3014 e LA3166), o que também valida o método de fusãode ubiquitina descrito acima.

A fim de demonstrar a faixa filogenética do íntron Cctra, osrequerentes geraram LA3097 e LA3233 de Anastrepha ludens transgênico.LA3097 e LA3233 foram selecionados para injeção em Anastrepha ludenscomo demonstraram a melhor letalidade específica de fêmea em Ceratitiscapitata (ver exemplo 13). Dados fenotípicos foram gerados de 4 linhagens deLA3097 independentes e 1 linhagem de LA3233 (ver figura 38). Letalidadeespecífica de fêmea foi geralmente pouco menor em Anastrepha ludensquando comparada a C. capitata mas atingiu 100% em uma linhagem.

Anastrepha ludens transformada com LA3097 e criada comtetraciclina até eclosão foram isolados e mantidos sem tetraciclina durante 7dias. RNA foi então extraído e análise de RT-PCR foi realizada usandoiniciadores HSP (SEQ ID NO. 76) e TETRRl (SEQ ID NO. 77). O padrãocorreto de emenda específico de fêmea (como Fl) foi observado a partir deRNA isolado em fêmeas (348bp) mas não de machos demonstrando a funçãodo íntron Cctra em uma espécie diferente (figura 39)

A banda do macho mais brilhante e banda específica de fêmeaforam purificadas e precipitadas para sequenciamento. O transcrito específicode fêmea foi verificado como sendo corretamente emendado nas fêmeas demosca mexicana das frutas como esperado para LA3097:

LA3097: AGCCACCATG|GT.. .íntron.. .AG | GTCAGCCGCCAs duas seqüências de flanqueamento acima são SEQ IDNOS. 2 e 3, respectivamente.

Exemplo 2: íntron tra de Bactocera zonata

Os requerentes isolaram o íntron tra de Bactocera zonata (B.zonata) (SEQ ID NO. 58) usando iniciadores ROSAI (SEQ ID NO. 78),ROSA2 (SEQ ID NO. 79), e ROSA3 (SEQ ID NO. 80).

Estas seqüências de iniciadores foram designadas com base emseqüência de codificação conservada de Ceratitis capitata e homólogos tra deBactrocera oleae. Usando ROSA2 e ROSA3 ou ROSAI e ROSA3 comoiniciadores, o íntron tra e sua região de codificação de flanqueamento foramamplificados de DNA genômico de Bactroeera zonata. Então os requerentesusaram estes produtos de PCR como um modelo e amplificaram o fragmentode íntron tra para fazer a construção LA3376 (figura 31 e SEQ ID NO. 55).Os iniciadores (BZNHE- SEQ ID NO. 81 e BZR-SEQ ID NO. 82) foramusados para fazer as construções; estes iniciadores contêm seqüênciasadicionais para propósitos de clonagem. O íntron Bztra em LA3376 é clonadoem ORF de tTAV3 e também de Reaper101. Transformantes de mosca-do-mediterrâneo foram gerados e RNA extraído das moscas macho e fêmea.

RT-PCR foi então realizado em ambos as emendas Reaperiai(HB- SEQ ID NO. 83) e ReaperKR SEQ ID NO. 84) e tTAV3 (SRY- SEQ IDNO. 85) e AV3F- SEQ ID NO. 86). Os fragmentos esperados de 200bp paraReaper KR e 670 bp para tTAV3, correspondendo a emenda em um padrãoequivalente ao transcrito de Fl de Cctra (Pane et al, 2002), foram gerados emfêmeas (figura 40).

Exemplo 3: Isolamento e emenda do íntron tra de Ceratitis rosa (C. rosa,mosca-de-natal).

Iniciadores ROSA2 (SEQ ID NO. 87) e ROSA3 (SEQ ID NO.88) foram projetados baseados na seqüência de codificação conservada deCeratitis capitata e Bactrocera oleae. Usando ROSA2 e ROSA3 comoiniciadores, o íntron tra e sua região de codificação de flanqueamento foramamplificados de DNA genômico de Ceratitis rosa (SEQ ID NO. 59). Então osrequerentes usaram os produtos de PCR como um modelo e amplificaram ofragmento de íntron tra para fazer as construções. Os iniciadores (CRNHE-SEQ ID NO 89 e CRR SEQ ID NO 90) foram usados durante a construção deLA3242 (SEQ ID NO. 56 e figura 32. LA3242 contém íntron de C. rosa naextremidade 5' de ORF de ReaperKR. Embriões de Ceratitis capitata foraminjetados com DNA de LA3242, embriões injetados foram criados até idadeadulta em uma dieta substancialmente livre de tetraciclina. RNA foi extraídode machos e fêmeas adultos; isto foi usado como um modelo de RT PCRusando iniciadores HB (SEQ ID NO. 91) e ReaperKR (SEQ ID NO. 92). Abanda de emenda específica de fêmea esperada (200bp), correspondendo aemenda no padrão equivalente ao do transcrito Flde Cctra, foi observada emfêmeas e não em machos (figura 41).Doublesex

Exemplo 4 - dsx Bombyx mori em PBW

A seqüência de um homólogo de Bombyx mori (bicho-da-seda)de Dsx de Drosophila (Bmdsx) foi previamente descrita e um produto deemenda específico de macho e de fêmea foi identificado (Suzuki et al, 2001).Ambos machos e fêmeas usaram o mesmo 3' polyA, e há dois éxonsespecíficos de fêmea. Um trabalho sugeriu que a emenda específica de sexonão é dependente em tra/tra2, em outras palavras mesmo se o padrão parece omesmo, o mecanismo subjacente pode ser diferente (Suzuki et al., 2001),embora seus dados, principalmente a falta de sítios de ligação tra-tra2reconhecíveis, no entanto, não sejam atraentes. Além disso, uma construçãode minigene dsx de B. mori (contendo seqüência exônica e seqüênciaintrônica truncada) foi transformada no B. mori e os transformantes delinhagem germinal mostram emenda específica de sexo (Funaguma et al.,2005).

Os requerentes geraram um minigene de Bmdsx com base naseqüência usada no trabalho de Funaguma et al, com algumas mudançassignificantes, e o injetaram na lagarta rosada para averiguar se se poderiaobter emenda específica de sexo em uma espécie divergente. A construção deminigene, gerada pelos requerentes, não incluía éxon 1, que está presente emambos, machos e fêmeas. Além disso, os requerentes removeram o íntronentre éxon 3 e 4 (os dois éxons específicos de fêmea), incluíram umaseqüência heteróloga (contendo sítios de clonagem múltiplos, MC S), usarama seqüência de melhorador/promotor de Hr5-IE1 do baculovírus AcNPV eusaram uma seqüência de terminação transcripcional de 3' derivada de SV40(ver figura 42 para um esquema). Os fragmentos de éxon / íntron deflanqueamento individuais usados foram amplificados e recombinados juntospor PCR e ligados em uma construção transportando um fragmento depromotor melhorador Hr5/ IEl e SV40 3' UTR (figura 22 e SEQ ID NO. 22).Α3435 foi injetado nos embriões da lagarta rosada{Pectinophora gossypiella). As larvas do primeiro instar foram coletadas após5-7 dias e analisadas individualmente por RT-PCR (usando iniciadores IEltranscr- SEQ ID NO. 93 e SV40-RT-P2- SEQ ID NO. 94) para determinar seBMdsx pode sofrer emenda específica de macho e fêmea (figura 43). Aanálise dos requerentes detectou a banda específica de macho (prevista paraser 442bp) em 4 amostras (Trilhas 1, 2, 3 e 4) e a banda específica de fêmea(prevista para ser 612bp) em 1 amostra (Trilha 5).

A emenda correta de dsx B. mori em PBW demonstra que osrequerentes podem realizar (de fato realizaram) a expressão específica de sexode uma seqüência heteróloga (aqui, MC S) em um lepidóptero utilizando umsistema de emenda alternativa. Além disso, uma vez que este sistema deemenda foi derivado de uma espécie heteróloga, isto sugere que taisconstruções poderiam funcionar sobre uma extensa faixa filogenética. Noentanto, a identificação de sistemas de emenda alternativa nas espécies deinteresse é também prevista, e métodos para identificar tais sistemas deemenda alternativa são providos aqui ou serão conhecidos do versado natécnica. Ao prover um MCS no exemplo dos requerentes (ver figura 42), aexpressão de uma seqüência de interesse, por exemplo uma região decodificação de uma proteína de interesse poderia prontamente ser conseguidainserindo-se a referida seqüência. Se a referida seqüência codificou umaproteína apropriada, um fenótipo específico de sexo, por exemplo letalidadeespecífica de sexo condicional, poderia assim ser introduzido, por exemploem uma lagarta rosada.

Exemplo 5: Isolamento de dsx de traça das maçãs e pêras

O gene dsx da traça das maçãs e pêras (Cydia pomonella) foiisolado efetuando 3' RACE usando iniciadores que foram baseados emalinhamentos de seqüência de B. oleae, B. tyroni, C. capitata, D.melanogaster, B. mori, e A. gambiae. RNA foi isolado de uma traça das maçãse pêras, macho e fêmea, e 3' RACE, para gerar cDNA, foi realizado usando oiniciador de TT7T25 (SEQ ID NO. 95).

PCR foi realizado usando os iniciadores dslc (SEQ ID NO.96) e TT7 (SEQ ID NO. 97). Dois ciclos de PCR aninhado foram entãorealizados no produto do primeiro PCR usando os iniciadores codling2a (SEQID NO. 98) e TT7 (SEQ ID NO. 99) e o produto do segundo ciclo de PCRusando Codling2b (SEQ ID NO. 100) e TT7. As seqüências específicas demacho e fêmea isoladas compartilham a similaridade de seqüência ahomólogos dsx previamente isolados (Macho-SEQ ID NO. 43 e Fêmea- SEQID NO. 42).

Exemplo 6: Isolamento de PBW dsx

O gene dsx da lagarta rosada foi isolado realizando 3' RACEusando iniciadores que foram baseados em alinhamentos de seqüência de B.oleae, B. tyroni, C. capitata, D. melanogaster, B. mori, e A. gambiae. RNA foiisolado de uma traça das maçãs e pêras, macho e fêmea, e 3' RACE, paragerar cDNA, foi realizado usando TT7T25 (seqüência definida aqui). PCR foirealizado usando os iniciadores Pbwdsx2 (SEQ ID NO. 101) e TT7 (SEQ IDNO. 102). PCR aninhado foi então realizado no produto do primeiro PCRusando os iniciadores Pbwdsx3 (SEQ ID NO. 103) e TT7. Três seqüênciasespecíficas de fêmea foram isoladas: PBWdsx-Fl (SEQ ID NO. 40),PBWdsx-F2 (figura 10), e PBWdsx-F3 (SEQ ID NO. 71) e uma seqüênciaespecífica de macho (SEQ ID NO. 42). As seqüências específicas de macho efêmea isoladas compartilham similaridade de seqüência a homólogos dsxisolados previamente.

Exemplo 7: dsx em Anopheles gambiae

A seqüência do gene dsx de Anopheles gambiae foipreviamente descrita (Scali et al 2005). No entanto, quando os requerentestentaram repetir o trabalho descrito, eles verificaram que existiam algumasdiferenças na emenda que ocorre. Quando os requerentes tentaram repetir aamplificação do transcrito específico de fêmea usando iniciadores projetadosda seqüência de mRNA (Acesso; AY903308 de seqüência de codificação defêmea e AY903307 de seqüência de codificação de macho), a amplificaçãofalhou. No entanto, quando Scali e colaboradores mostraram que havia uméxon compartilhado, o que não tinha sido previamente descrito, os requerentesprojetaram iniciadores para amplificar o transcrito e gene dsx completo.Usando estes iniciadores e iniciadores projetados a partira da seqüência deDNA genômico (Acesso; GI: 19611767) os requerentes verificaram que aemenda do transcrito de fêmea é diferente daquele descrito por Scali et al2005 (figura 44). O transcrito mostrou que o éxon de fêmea estava em umaposição diferente. Há várias explicações para estas diferenças, mas as maisprováveis são ou algum tipo de diferença de cepa nos Anopheles, que osrequerentes usaram para obter dados, ou a seqüência publicada não é deAnopheles gambiae, ou se tem mais de uma isoforma de fêmea, comomostrado para Stegomyia aegypti no Exemplo 20.

Os requerentes também usaram com sucesso iniciadores,projetados em torno de sua versão da emenda de dsx de Anopheles gambiae,que são capazes de distinguir entre machos e fêmeas de Anopheles gambiae(figura 45). Isto fornece uma boa evidência de que o sistema será funcionalcomo um mecanismo de emenda específica de sexo quando fusionado a umaproteína de interesse, como tTAV ou uma matadora.

O gene dsx de Anopheles gambiae que os requerentes isolaramdo DNA genômico, que tem várias mudanças na seqüência nucleotídicacomparada com a seqüência genômica relatada, foi clonado em LA3359 (SEQID NO. 47) e LA3433 (SEQ ID NO. 48), cujos esquemas podem serencontrados nas figuras 23 e figura 24, respectivamente.

Exemplo 8: dsx em Stegomyia aegypti

A emenda do gene parece ser similar a dsx Anopheles gambiae(Scali et al 2005). O gene dsx de Stegomyia aegypti está ilustradodiagramaticamente na figura 47 ou 48. O transcrito específico de macho (Ml)é produzido que não inclui éxons 5a ou 5b. Duas variantes de emendaespecífica de fêmea (Fie F2) têm a seguinte estrutura; Fl compreende éxons1-4, 5a, 6 e 7 mas não 5b, F2 compreende éxons 1-4 e 5b (figura 46). Alémdisso, mais um transcrito (Cl) está presente em ambos, machos e fêmeas; istocompreende éxons 1-4 e 7, mas não éxons 5a, 5b ou 6.

A emenda do gene parece ser similar a dsx Anopheles gambiae(Scali et al 2005). O gene dsx de Stegomyia aegypti é ilustradodiagramaticamente na figura 47 ou 48.

Actin 4

Exemplo 9: Gene Actin-4 de Stegomyia aegypti

Uma forma de obter expressão específica de sexo, de tecido ede estágio de um gene de interesse é ligá-lo ao gene Actin-4 de Stegomyiaaegypti (AeAct-4). Esse gene é apenas expressado no desenvolvimento demúsculos aptos a voar de Stegomyia aegypti fêmea (Munoz et al 2004). Elesforam usados em hibridização in-situ para um RNA detectar o perfil deexpressão de AeAct-4. Tomou-se um fragmento do gene Actin-4 deStegomyia aegypti, compreendendo uma região de promotor putativa, umíntron emendado alternativamente, e uma seção de região não traduzida 5'(UTR) e colocou-se na frente da seqüência codificando para tTAV (figura 49)para testar a função da emenda específica de sexo quando fusionada a tTAV.

Os requerentes integraram LAl 172 no genoma de Stegomyiaaegypti usando piggyBac. Duas linhagens independentes foram geradas(linhagens 2 e 8). Ambas as linhagens mostraram a emenda correta do geneActin-4-tTAV (figuras 50 e 51). O promotor de Actin-4 e íntron emendadoalternativamente podem, por esta razão, ser usados com sucesso para prover aemenda específica de sexo, de tecido e de estágio de um gene de interesse emStegomyia aegypti.

Descrição das figuras e das listagens seqüência de exemplos 1-9Figura 19: Um uso do elemento P na geração de expressãoespecifica de linhagem germinal de um gene de interesse (Gene E).

Inserção do elemento P IVS3 e seqüências de flanqueamentoexônicas a montante de uma fusão de ubiquitina - gene E que permite aexpressão específica de linhagem germinal de gene E sob um promotor ativode linhagem germinal. A - Promotor ativo de linhagem germinal; B - Matrizde leitura aberta de elemento P; C - P íntron 'IVS3'; D - Ubiquitina; E -Região de codificação de proteína de interesse por exemplo tTAV.

Figura 20: Expressão específica de sexo usando dsx.

A: íntron usado como íntron Cctra acima, mas dandoexpressão específica de macho.Um fragmento de dsx (aqui a versão deAnopheles) é inserido em uma região de codificação heteróloga (caixassombreadas). O íntron está completamente removido em machos, mas emfêmeas a região de codificação é prematuramente terminada.

B: Uma abordagem alternativa a expressão específica demacho, no qual uma região de codificação heteróloga é fusionada a umfragmento de dsx.

C: Expressão específica de fêmea: a região de codificaçãoheteróloga está inserida no éxon específico de fêmea, ou como uma fusão namatriz para um fragmento de Dsx, ou com seus próprios códons de partida eparada.

D: Expressão diferencial: projetos BeC podem sercombinados para resultar na expressão de gene a em fêmeas e b em machos.

Figura 21: Emenda alternativa específica de sexo de Cctra

A: Cctra é emendado em fêmeas para produzir três transcritos:Fl, que codifica proteína Tra, e Ml e M2, que não codificam, porque elesincluem éxons adicionais com códons de parada (re-escrito de Pane et al.2002). Machos produzem apenas transcritos Ml e M2 e assim não produzemproteína Tra funcional de todo.Β: Se esse íntron for para funcionar similarmente em umaregião de codificação heteróloga, isto similarmente permitiria às fêmeas, masnão aos machos, produzir proteína funcional X.

Figura 22: Representação diagramática de construçãopLA3435/ plasmídeo (SEQ ID NO.46).

Figura 23: Mapa de plasmídeo de pLA3359 do gene dsx deAnopheles gambiae colocado sob o controle de um promotor Hr5-IE1 paraavaliar a emenda via expressão transiente .

Figura 24: pLA3433 - gene dsx de Anopheles gambiaecolocado sob o controle de promotor Hr5-IE1, com adição de éxon 2, paraavaliar a emenda através de expressão transiente .

Figura 25: Representação esquemática de construçãopLAl 188.

Figura 26: Representação esquemática de construçãopLA3077.

Figura 27: Representação esquemática de construçãopLA3097.

Figura 28: Representação esquemática de construçãopLA3233.

Figura 29: Representação esquemática de construçãopLA3014.

Figura 30: Representação esquemática de construçãopLA3166.

Figura 31: Representação esquemática de construçãopLA3376.

Figura 32: Representação esquemática de construçãopLA3242.

Figura 33: Seqüência de flanqueamento de CctraEmenda do íntron Cctra em LA3077 e LA3097 é exatamentecomo seria vista no íntron Cctra nativo. Emenda em LAl 118 resulta naremoção de 4 nucleotídeos adicionais. Em todos os casos os íntrons sãoflanqueados por éxon TG exônico 5' e 3' GT.

Figura 34: Gel mostrando emenda específica de sexocorreta de íntron(s) derivada de CcTra (banda de 776 bp em fêmeas) emCeratitis capitata transformada com LA3077. Trilha 1: Marcador(SmartLadder™ de Eurogentec, bandas de aproximadamente 0,8, 1,0 e l,5kbsão indicadas); Trilhas 2 e 3: Ceratitis capitata LA3077 /+ machos; Trilhas 4e 5: Ceratitis capitata LA3077 /+ fêmeas.

Figura 35: Dados fenotípicos de construções específicas defêmea transformadas em Ceratitis capitata.

Coluna 1: Designação de construção LA#, por exemploLA3077, LA3097, LA3233, etc, é indicada pelo número, com linhas deinserção independentes referidas por letra; Colunas 2 e 3: Resultados semtetraciclina (NT) resulta de cada linhagem transformada obtida nos machostotais (2) e fêmeas totais (3). Colunas 4 e 5: Tetraciclina (TET) resulta decada linhagem transformada dada em machos totais (4) e fêmeas totais (5).

Figura 36: transcritos de construções de íntron Cctra emDrosophila e Ceratitis capitata.

A linha de topo representa o DNA de construção contendoíntron tra flanqueado por gene desejado (a caixa aberta). A caixa vermelharepresenta os éxons específicos de macho. íntrons são representados porlinhas sólidas. A seta acima da primeira linha representa as posições dosoligonucleotídeos usados nos experimentos de RT-PCR. A barra indica aescala da figura.

Figura 37: Gel mostrando emenda específica de fêmeacorreta de seqüência derivada de CcTRA (banda de 508bp) em Ceratitiscapitata de fêmea transformada com LA3014. Trilha 1: Marcador(SmartLadder™ de Eurogentec, bandas de aproximadamente 0,4 e l,0kb sãoindicadas); Trilha 2: Ceratitis capitata LA3014 /+ macho; Trilha 4: Ceratitiscapitata LA3014 /+ fêmea; Trilhas 3 e 5: sem controles negativos detranscriptase reversa (banda de fundo, provavelmente de DNA genômico,pode ser vista nas trilhas 2 e 4).

Figura 38: Dados fenotípicos de Anastrepha ludenstransgênico transformado com LA3097 ou LA3233. Coluna 1: ConstruçãoLa# (LA3097 ou LA3233) indicou, com linhas de inserção independentesreferidas por letra; Colunas 2 e 3: não tetraciclina (NT) resulta de cadalinhagem transformada obtida em machos totais (2) e fêmeas totais (3).Colunas 4 e 5: Tetraciclina (TET) resulta para cada linhagem transformadadada em machos totais (4) e fêmeas totais (5).

Figura 39: GeI mostrando emenda específica de sexocorreta de emenda CcTRA (banda de 348bp em fêmeas) em Anastrephaludens transformada com LA3097. Trilha 1 : Marcador (SmartLadder™ deEurogentec, bandas de aproximadamente 0,4 e I5Okb são indicadas); Trilhas2, 3 e 4: A. ludens LA3097 /+ machos; Trilhas 5, 6 e 7: A. ludens LA3097 /+fêmeas.

Figura 40: Gel mostrando emenda específica de sexocorreta de BzTRA em ReaperKR (banda de 200 bp em fêmeas) e tTAV3(banda de 670 bp em fêmeas) regiões de LA3376, em Ceratitis capitatatransformada com LA3376. Trilha 1: Marcador (SmartLadder™ deEurogentec, bandas de aproximadamente 0,2, 0,6 e I5Okb são indicadas);Trilhas 2 e 3: C. capitata LA3376 /+ machos testadas para emenda emReaperKR; Trilhas 4 e 5: C. capitata LA3376 /+ fêmeas testadas para emendaem ReaperKR; Trilha 6: SmartLadder™; Trilhas 7 e 8: C. capitata LA3376 /+machos testada para emendas em tTAV; Trilhas 9 e 10: C. capitata LA3376/+ fêmeas testadas para emenda e, tTAV; Trilha 11: SmartLadder™.

Figura 41: Gel mostrando emenda de CrTRA específica desexo correta em CrTRA - ReaperKR (banda de 200 bp em fêmeas) emCeratitis capitata injetada com LA3242. Trilha 1: Marcador (SmartLadder™de Eurogentec, bandas de aproximadamente 0,2, 0,6 e l,0kb são indicadas);Trilhas 2-7: C. capitata machos de tipo selvagem injetados com LA3242;Trilha 8: SmartLadder™; Trilhas 9-14: C. capitata fêmeas de tipo selvageminjetadas com LA3242; Trilha 15: SmartLadder™.

Figura 42: Representação esquemática de construção deminigene Bmdsx.

Duas construções de minigenes derivadas do gene dsx deBombyx mori são ilustradas diagramaticamente, junto com a emendaalternativa prevista destas construções (padrão de fêmea mostrado acima daconstrução, padrão de macho abaixo). (A) é a construção de minigene dsx deBombyx mori usada em Funaguma et al., 2005) (B) é pLA3435. AeBdiferem entre si de várias formas: (i) Éxon 1 é excluído de pLA3435; (ii) oíntron entre éxons específicos de fêmea 3 e 4 foi removido e uma seqüênciaheteróloga pequena foi inserida em pLA3435 (iii) Funaguma et al., usam opromotor iel do baculovírus BmNPV e um BmA 33' UTR comparado compLA3435 que usa melhorador/promoter hr5-IEl do baculovírus AcNPV de eum 3' SV40 3' UTR. (iv) pLA3435 usa as seqüências de íntron ligeiramentemais longas quando comparadas com (A) (ver figura 15 para seqüência). Duasconstruções de minigenes derivadas do gene dsx de Bombyx mori sãoilustradas diagramaticamente, junto com a emenda alternativa prevista destasconstruções (padrão de fêmea mostrado acima da construção, padrão demacho abaixo).

Figura 43: Emenda específica de sexo de construção deminigene BMdsx em PBW.

Análise de expressão transiente de pLA3435 usando RT-PCRmostra a presença de um fragmento de 442 bp (Trilhas 1,2,3 e 4) em machos eum fragmento de 612 bp em fêmeas (Trilha 5), mostrando que o minigeneBMdsx com um fragmento heterólogo inserido entre éxon 3 e 4 é capaz deemendar corretamente na traça divergente, PBW. Marcadores sãoSmartLadder™ de Eurogentec; bandas de aproximadamente 0,2, 0,4 e 0,6 kbsão indicadas

Figura 44: Emenda específica de sexo de dsx Anophelesgambiae.

Anófelos (A) mostram a emenda que foi relatada por Scali etal 2005. No entanto, quando RT- PCR foi realizado usando os iniciadores dosrequerentes (spl-agdsx-e3 (SEQ ID NO. 60) e spl-agdsx-m (SEQ ID NO. 61))um padrão de emenda diferente para fêmeas foi revelado, representado porAnófelos (B).

Figura 45: Identificação de Anopheles gambiae macho efêmea usando iniciadores dsx.

RNA foi extraído da Anopheles gambiae macho e fêmea e ostranscritos de dsx foram amplificados por RT-PCR usando os iniciadores spl-agdsx-e3 (SEQ ID NO. 62) e spl-agdsx-m (SEQ ID NO. 63); o padrão debanda resultante é mostrado no gel acima. As bandas esperadas para ostranscritos de macho e fêmea, são indicadas por setas brancas, as bandasforam clonadas e seqüenciadas e são idênticas à seqüência prevista da versãodos requerentes de transcrito de dsx (ver SEQ ID NO. 47 (LA3359) e SEQ IDNO. 48 (LA3433)). Os marcadores de peso molecular são mostrados em kb(SmartLadder™ de Eurogentec; tamanhos são aproximados).

Figura 46; Identificação de Stegomyia aegypti macho efêmea usando iniciadores dsx.

Os iniciadores para o RT-PCR de Stegomyia aegypti de A e Bforam AedesxFl (SEQ ID NO. 64) e AedesxR5 (SEQ ID NO. 65) e foramtestados em pupas, um estágio de vida de Stegomyia aegypti que pode sersexuado convenientemente e corretamente; a amplificação de RT-PCRresultante é mostrada na imagem em gel (A). As pupas, macho e fêmea,mostram uma banda específica de sexo distintiva. Então os iniciadores foramtestados em extrações de RNA de larvas, que não podem ser prontamentesexuadas por sua morfologia e a amplificação de RT-PCR resultante mostradaem imagem em gel (B). As larvas mostram um padrão de banda claro quedistingue machos de fêmeas sem ambigüidade. Imagem em gel (C) mostrauma banda de aproximadamente 600 bp de RT-PCR usando os iniciadoresAedessxFl e AedesxRl (SEQ ID NO. 66) de pupas de indivíduos machos efêmeas. O sequenciamento desta banda mostrou uma variante de emendaespecífica de fêmea a qual parece não possuir o éxon compartilhado de machopara o qual AedesxRS é previsto se recombinar (éxon 7, ver figura 56). Osmarcadores de peso molecular são mostrados em kb (SmartLadder™ deEurogentec; tamanhos são aproximados).

Figura 47: Representação diagramática de parte do genedsx de Stegomyia aegypti (fora de escala).

Um fragmento do gene dsx de Stegomyia aegypti érepresentado acima. Exons 5a e 5b são específicos de fêmea e éxon 6 é uméxon específico de macho. Duas variantes de emendas específicas de fêmeaforam encontradas (F1 e F2) as quais compreendem éxons 1-4,5b,6 e 7 (Fl) ou1-4,5a (F2); transcritos em machos (Ml) compreendem éxons 1-4,6 e 7 masnão éxon 5a ou 5b e um transcrito (Cl) de 1-4 e 7 mas não éxons 5a, 5b ou 6é mostrado em machos e fêmeas. O número para cada um dos éxons após #refere-se a contig 1.370

(http ://www.broad.mit.edu/annotation/disease vetorIAedesaegypti/\ que se lêem orientação oposta, e após * refere-se à seqüêncianucleotídica mostrada em SEQ ID NO. 43.

Figura 48: Representação diagramática do gene dsx deStegomyia aegypti.

O gene dsx completo de Stegomyia aegypti é representadoacima Exon 5 é o éxon específico de fêmea e éxon 6 é um éxon putativoespecífico de macho. Em princípio, transcritos em fêmeas compreendeméxons 1,2,3,4,5 e 7, e machos compreendem éxons 1,2,3,4,6 e 7. O número decada um dos éxons após # refere-se ao contig 1.370

(http://www.broad.mit.edu/annotation/disease vectorIAedesaegyptií) que se lê na orientação oposto, e após * refere-se à figura 12.

Figura 49: Mapa de Plasmídeo de pLA 1172.

A região de codificação para tTAV foi colocada sob o controlede um fragmento do gene Actin-4 de Stegomyia aegypti (Munoz et al 2005)que inclui o 5' UTR, primeiro íntron, e seqüências a montante (promotorputativo). A construção também contém seqüência tetO Nipper. A construçãotem extremidades de tipo piggyBac e um marcador de DsRed2 paraintegração estável em um genoma.

Figura 50: Emenda específica de sexo de tTAV emtransformantes LA1172.

Imagem em gel de RT-PCR de RNA extraído de pupasmachos e fêmeas de LA 1172 linhagem 2 . Os iniciadores usados foramAgexonl (SEQ ID NO. 67) e Tra (tTAV) seq+ (SEQ ID NO. 68).Sequenciamento das bandas de RT-PCR mostrou a emenda esperadaocorrendo em machos e fêmeas. Os dados mostrados no diagrama acima sãode LAl 172 linhagem 2, a linhagem 8 mostrou exatamente os mesmosresultados (dados não mostrados). Marcadores são SmartLadder™ deEurogentec; tamanhos aproximados são indicados, em kb).

Figura 51: RT-PCR de amostras de tipo selvagem,mostrando variante de emendas específicas de sexo do gene Actin-4 deStegomyia aegypti.

Imagem em gel de RT-PCR de RNA extraída de diferentesestágios de desenvolvimento, e dissecações de adultos, de LAl 172 linhagem8 . Os iniciadores usados foram Agexonl (SEQ ID NO. 69) e Éxon 3 (SEQID NO. 70). A imagem em gel mostra que a expressão forte do gene Actin-4apenas ocorre no estágio de pupa, e que a expressão de adulto é geralmentelimitada para o tórax de fêmea onde os músculos de vôo são encontrados.Tabela 17, abaixo mostra os conteúdos de cada trilha.

Tabela 1.

<table>table see original document page 67</column></row><table>

OUTROS EXEMPLOS

Exemplo 10: Traças.

Os requerentes realizaram recentemente construções baseadasem seus dados de expressão transiente usando uma construção de minigenerecombinante derivada de Bombyx mori. Isto ainda é discutido abaixo naseção intitulada " alinhamento de seqüência dsx de traça e motivosconservados"

Exemplo 11: Uso de Bztra

Os requerentes realizaram recentemente duas construçõesbaseadas em Bztra, expressadas na mosca mexicana das frutas (LA3376).LA3376 concede letalidade específica de fêmea repressível. Os requerentespreviamente mostraram que LA3376 funciona e emenda corretamente emmosca-do-mediterrâneo. Transformantes em mosca mexicana das frutas(Anastrepha ludens) também foram gerados com LA3376. Estes foramanalisados para emenda correta do íntron Bztra a fim de demonstrar a faixafilogenética do íntron Bztra por RT-PCR usando iniciadores SRY e AV3F(figura 15 e "géis de RT-PCR de mosca-do-mediterrâneo " seção acima). Istomostra uma emenda correta do íntron Bztra em mosca mexicana das frutas.Exemplo 12: Dmdsx em mosca-do-mediterrâneo (DmDsx em exemplo demosca-do-mediterrâneo transgênica: fusão nipper em #797)

Os requerentes também obtiveram recentemente dados emuma construção de Dmdsx em mosca-do-mediterrâneo. A construção usou umfragmento do gene doublesex em Drosophila melanogaster para darexpressão específica de sexo de um fragmento de gene NipplDm deDrosophila melanogaster (os requerentes chamam este fragmento "nipper").Os requerentes não notaram uma emenda específica de sexo clara. Noentanto, os dados fenotípicos mostram alguma especificidade de sexo; osrequerentes notaram a letalidade aumentada de fêmeas, a cerca de 75% depenetração. Como evidente, esta penetrância incompleta poderia ser devido anível de expressão, falta de toxicidade de nipper em mosca-do-mediterrâneo,etc. Os requerentes também notaram uma significante redução no número demachos, mas a fonte de tTA, LA670, usada neste experimento poderia elaprópria matar alguns dos machos.

Os requerentes testaram três linhagens transgênicas de mosca-do-mediterrâneo independentes que transportam uma fusão de nipper paraseqüência DmDsx que se destinava a ser expressada especificamente emfêmeas. Esta construção pode não ter funcionado perfeitamente possivelmentedevido à seqüência essencial de emenda alternativa correta e/ou os sítios deligação Sxl requeridos por DmDsx, e uma vez que a mosca-do-mediterrâneonão usa Sxl na via de determinação de sexo, DmDsx pode estar incapaz deemendar completamente esta fusão na forma correta em mosca-do-mediterrâneo. No entanto, os requerentes alcançaram sucesso em causar demodo reprodutível uma letalidade aumentada em fêmeas comparada aosmachos através de três linhagens em uma eficiência muito similar(aproximadamente 75% mais letalidade observada em fêmeas do que emmachos). Isto demonstra que o sistema dsx pode funcionar através de espéciesde parentesco bastante distante (separação evolucionária é em torno de 120-150 milhões de anos), e se a seqüência Ccdsx foi usada, pode ter bemfuncionado devido à exigência de Sxl de Dmdsx .

Os resultados de 797 são mostrados abaixo, usando umsistema nipper de emenda TetO 14 dsx (Pub EGFP). Eles mostram que estesistema é letal em um estágio larval ( -50%), e é provável ser atuante commaior sucesso em fêmeas (-75%). 797 é marcado com verde (G), 670 comvermelho (R). 670 é uma fonte de tTAV, assim, espera-se ver um fenótipo nasmoscas R+G; G (e R) são apenas controles. NP não fluorescente (isto é tiposelvagem) é também um controle onde incluído. Toda a progênie criada emmeio livre de tet.

Todas as três linhagens independentes vistas como atuando demaneira similar.

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Média de todas as 3 linhagens: número de fêmeas R+G = 21%do número de machos R+G, assim, a mortalidade em excesso substancial emfêmeas R+G com relação a machos. Esse efeito não é visto em fêmeas decontrole R apenas ou G apenas, nem em tipo selvagem.

Exemplos 13-15:

Os requerentes demonstraram recentemente :

(5) emenda específica de sexo em construções de minigenebaseadas em Aadsx recombinante ;

(6) fenótipo específico de sexo de uma construção baseada emCctra; e

(7) emenda específica de sexo em construções baseadas emAedes - Actin4.

Pelo menos alguns de cada um destes exemplos não apenasmostram minigenes, mas realmente mostram emendas para gerartTAV/tTAV2 ou ubi tTAV2

Exemplo 13: Minigenes doublesex (dsx) de Aedes

Ver também seção intitulada Sítios de ligação dsx Tra2 deAedes. Os requerentes isolaram o gene dsx de Aedes aegypti (Aadsx) eidentificaram 6 transcritos desta região (figura 1). Estes são: 2 transcritosespecíficos de machos (Ml e M2), 3 transcritos específicos de fêmeas (Fl, F2e F3) e um transcrito encontrado em ambos, machos e fêmeas (MF). Os15 requerentes realizaram duas construções de minigenes. Nestas construções, agrande maioria da seqüência intrônica foi deletada. Por exemplo, minigene 1de DSX é aproximadamente 4,4kb em comprimento, considerando que suasseqüências terminais são separadas por aproximadamente 26kb em seucontexto natural, isto é, no DNA genômico de Aedes aegypti.

A emenda em minigene 2 da figura 1 é ilustrativa comoemenda ocorre na forma de "fêmea" em ambos, machos e fêmeas. Isto podesignificar que esse sistema depende de uso de aceitador de emendaalternativa. Nesse modelo, ocorre competição entre aceitadores de emendaalternativas, com algum fator específico de sexo influenciando isso, o fatorespecífico de sexo provavelmente sendo Tra. Mas a deleção dos aceitadoresde emenda 3' de Ml e M2 força a emenda nas formas F, por remoção daalternativa.

Assim, prefere-se que um ou mais dos aceitadores de emendaespecíficos de fêmea (Fl e/ou F2) sejam providos junto com um aceitadorde emenda 3' adicional. O mais preferível, referido aceitador de emendaadicional é o aceitador de emenda 3' de variante de emenda de Ml ou M2 (ouambos), embora seja previsto que isto não é essencial pois outros aceitadoresde emenda 3' conhecidos irão provavelmente funcionar.

Figura 1 ilustra os vários transcritos produzidos por emendaalternativa do gene doublesex de Aedes aegypti (Aadsx). Será notado queAedes aegypti é também conhecido como Stegomyia aegypti. A figura mostrao gene Aadsx do quarto éxon, que não é emendado alternativamente, isto é,está presente em todos os transcritos discutidos aqui. Numeração é doprimeiro nucleotídeo do quarto éxon (acgacgaact...). Note-se que o diagramaestá fora de escala — os íntrons são muito mais longos que os éxons. A regiãoalternativamente emendada total compreende acima de 43kb.

Este fragmento de minigene foi incluído em uma construçãode expressão (LA3515). Aedes aegypti transgênicos foram gerados porrecombinação específica de sítio no sítio de attP, usando o método de Nimmoet al (2006 : Nimmo, D.D., Alphey, L. Meredith, J.M. e Eggleston, P (2006).High efficiency site-specific genetic engineering of the mosquito genoma.InsectoMolecularBiology, 15: 129-136)

Um segundo minigene, menor, foi construído similarmente(minigene 2 de DSX) e uma construção de expressão para este foi inserida nomesmo sítio de atfP como minigene 1 de DSX, para permitir comparaçãodireta (LA3534). Minigene 2 de DSX não mostrou emenda específica desexo. Isto indica que as seqüências presentes em minigene 1 de DSX mas nãoem minigene 2 de DSX (aproximadamente 2029bp, ver Fig 1 e SEQ ID NO.150, onde éxons são encontrados nas posições 29-163 e 1535-2572) sãoessenciais para a emenda alternativa correta, mesmo se o primeiro íntronemendado alternativamente, e a seqüência exônica imediatamenteflanqueando o mesmo, estiverem presentes em ambas construções.

Os requerentes produziram duas linhagens transgênicas(LA3491 e LA3534) usando construções de minigenes de gene dsx de Aedesaegypti. LA3491 é uma fusão de éxon 4 compartilhado, éxons de casseteespecíficos de fêmea, e parte do primeiro éxon 3' compartilhado (éxon 5 emMl transcrito).

Transcritos da região de minigene LA3491 foram analisadospor PCR de transcriptase reversa (RT-PCR) e sequenciamento. Transcritoscorrespondendo à emenda alternativa na forma de F2 foram encontrados emfêmeas mas não em machos (Fig 2 e 3) e na forma Fl ocorreu algumaexpressão de macho mas ela foi muito baixa (Fig 4). Enquanto transcritoscorrespondendo à forma de Ml foram detectados em machos mas não emfêmeas (Fig 2). Uma vez que o minigene não continha o aceitador de emendade 3' da variante M2, este transcrito não foi possível a partir desta construção.Esse minigene não contém qualquer seqüência exógena, embora o mesmodemonstre claramente emenda específica de sexo de um fragmento de Aadsx,de fato um fragmento de "minigene" altamente deletado.

Será evidente que algumas seqüências são importantes paracontrolar emenda e devem ser, assim, conservadas, como discutido em outraparte. Isto pode ser facilmente estabelecido por deleção de algumas porções eteste para emenda alternativa por RT-PCR por exemplo.

Figura 2 mostra RT-PCR de machos e fêmeas de linhagemtransgênica de Aedes aegypti LA3491 usando os iniciadores 688 - iel-transcr(SEQ ID NO. 4) e 790 - Aedsx-m-r2 (SEQ ID NO. 5). Usando estesiniciadores, emenda no padrão de F2 iria dar uma banda de aproximadamente985bp enquanto emenda no padrão de Ml iria dar uma banda deaproximadamente 516bp. Uma banda de aproximadamente 985bp (F2)apareceu apenas em trilhas representando fêmeas e uma banda deaproximadamente 516bp de transcrito 1 específico de macho (Ml) apareceuapenas em machos. Estes bandas foram seqüenciadas e mostraram que aemenda correta tinha ocorrido, isto é tipo F2 e tipo Ml respectivamente. Aausência de bandas nos controles de RT (-RT CON) mostra que não houvecontaminação de DNA genômico mas amostras. Trilhas 1 e 11 sãomarcadores (SmartLadder™ de Eurogentec, bandas de l,5kb a 0,2kb sãoindicadas). Trilhas 2 e 3 são controles negativos (sem transcriptase reversa) etrilhas 2-9 representam reações realizadas em extratos dos machos e fêmeas,como marcado.

Figura 3 mostra RT-PCR dos machos e fêmeas de linhagenstransgênicas de Aedes aegypti LA3491 usando os iniciadores 688 - iel-transcr(SEQ ID NO. 4) e 761 - Aedsx-fem-r (SEQ ID NO. 6).Usando estesiniciadores, emenda no padrão de F2 iria dar uma banda de aproximadamente525bp. Uma banda de aproximadamente 525bp estava presente nas reaçõesem extratos de fêmeas, mas não de reações correspondentes em extratos demachos. Sequenciamento desta banda de 525bp confirmou estar correto, isto éa emenda de tipo F2 ocorreu. Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec,bandas de 1,5kb a 0,2kb são indicadas).

Figura 4 mostra RT-PCR dos machos e fêmeas de linhagenstransgênicas de Aedes aegypti de LA3491 usando os iniciadores 688 - iel-transcr (SEQ ID NO. 4) e AedsxRl (SEQ ID NO. 4).Usando estes iniciadores,emenda no padrão Fl iria dar uma banda de 283bp. A banda deaproximadamente 283bp está predominantemente presente em fêmeas,embora haja evidência de uma quantidade pequena de emenda em machos.Sequenciamento confirmou que esta banda de fato corresponde à emenda nopadrão Fl. Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, bandas de l,5kb a 0,2kbsão indicadas).

LA3534 é idêntico a LA3491 exceto para uma deleção 3' deaproximadamente 2kb. Esta construção não mostrou nenhuma emendadiferencial entre machos e fêmeas (Fig 1, minigene 2). Géis de RT-PCR nãoforam mostrados para este caso. Com base nestes resultados, váriasconstruções foram projetadas para incorporar a emenda específica de sexo deLA3491 (Fig 1, minigene 1) em um sistema de retro-alimentação positivo.LA3612 (Fig 5), que incorpora uma fusão de ubiquitina e tTAV2 na região decodificação dsx, é engenheirado de modo que quando o transcrito de fêmeaF2 é produzido, a ubiquitina é clivada e o tTAV2 é liberado para iniciar esustentar o sistema de retro-alimentação positiva. LA3619 (Fig 5) tem tTAV2sem ubiquitina e usando seu próprio códon de partida de tradução. LA3646(Fig 5) é idêntico a LA3619 exceto os códons de partida para o gene de dsxfoi mudado; isto deve melhorar a quantidade de tTAV2 produzida removendoa tradução não específica.

Figura 5 é uma representação diagramática de plasmídeos combase em emenda em minigene dsx de Aedes aegypti. Para maior certeza, seráentendido que o primeiro íntron de fêmea representa qualquer emenda Fl, F2ou F3, e tTAV no diagrama refere-se a tTAV2 (será notado que outrasproteínas ou outras versões de tTA ou tTAV poderiam alternativamente serusadas). Em cada um destes plasmídeos, além de LA3491, a seqüênciaheteróloga foi adicionada ao éxon F2. "ATG putativo" representa qualquerseqüência de tripleto ATG em seqüência exônica localizada 5' com relação aoDNA heterólogo. Em LA3646, estes códons de partida de tradução putativos("ATG putativo") foram removidos ou modificados. No caso de construçãoLA3612, tradução de um ATG a montante (5') que está em matriz com aregião de codificação de ubi-tTAV irá ainda (assumindo nenhumaintervenção de códon de parada) produzir tTAV funcional, seguindoseparação das porções de ubiquitina e tTAV por ação de protease. Osvários cassetes de emenda alternativa estão ligados operativamente a umpromotor apropriado, terminador transcripcional e outras seqüênciasregulatórias.

Esse exemplo mostra emenda específica de sexo de umfragmento de "minigene" altamente comprimido em um contexto heterólogo(isto é promotor heterólogo, 5' UTR e 3' UTR). Embora não mostre expressãodiferencial de uma seqüência não Aedes, como os éxons emendadosalternativamente são derivados do gene Aadsx e não contêm materialadicional, isto ilustra claramente a possibilidade desta abordagem. Emqualquer caso, os promotores, 5' UTR e 3' UTR5 são heterólogos. Osrequerentes realizaram construções adicionais que ilustram vários métodosdiferentes para obter expressão diferencial (específica de sexo) de umaproteína heteróloga por este dsx.

Alinhamento de seqüência TRA

Pane et al. (2002) sugeriram que determinadas seqüênciasrelacionadas a sítios de ligação conhecidos do complexo TRA/TRA2 emDrosophila poderiam ser importantes na regulação da emenda de Cctra, e istotambém era conhecido para dsx de Drosophila e foi também sugerido paradsx de Anopheles gambiae (Scali et al 2005). A seqüência de consenso édiferentemente descrita como

UC(U/A)(U/A)C(A/G)AUCAACA (Pane et al), SEQ ID NO. 8, ouUC(U/A)(U/A)CAAUCAACA (Scali et al 2005), SEQ ID NO. 9.

E notável que estas definições sejam extremamente similares.Pane et al identificam 8 alinhamentos parciais para esse consenso naseqüência de Cctra (7 ou mais nucleotídeos alinhando as 13 seqüênciasnucleotídicas de consenso). Scali et al identificam 6 alinhamentos em Agdsx(9/13 ou melhor). Tais seqüências são também conhecidas para regular aemenda alternativa do gene fruitless de Drosophila; Scali et al reviram 3alinhamentos naquela seqüência (12/13 ou melhor). Emenda correta de dsxpode também requerer um região rica em purina, como discutido por Scali et al.

Como pode ser visto da Tabela 2 e figura 7, osrequerentes identificaram o que se pensa ser agrupamentos significantes desítios de ligação para Tra/Tra2 em minigene 1 dsx de Aedes aegypti dosrequerentes.Alinhamento de seqüência dsx de traça e motivos conservados

Figura 6 mostra um alinhamento dos segundos éxonsespecíficos de fêmea e seqüências de flanqueamento de gene dsxs da lagartarosada {Pectinophora gossypiella, PBW - dsx, SEQ LD NO. 146), bicho-da-seda (Bombyx rnori, bombyx-dsx, SEQ DD NO. 147) e traça das maçãs epêras (Cydia pomonella, traça das maças e pêras- dsx, SEQ ED NO. 148). Osegundo éxon específico de fêmea é mostrado em negrito. Os requerentesidentificaram múltiplas cópias de uma seqüência nucleotídica curta, repetida,conservada em seqüência e localização aproximada entre estas traças deparentesco relativamente distante; estas estão localizadas apenas 5' para oéxon específico de fêmea. As repetições AGTGAC/T conservadas estãosublinhadas. Asteriscos (*) representam nucleotídeos idênticos, traços (-)representam intervalos para melhor alinhamento. Os éxons estãorepresentados na SEQ ID NOS. pela seguinte numeração de nucleotídeos:SEQ ID NO. 146289-439; SEQ ID NO. 147 339-492; e SEQ ID NO. 148285-439.

Sítios de ligação Tra2 Aedes dsx.

Em fêmeas de Drosophila melanogaster, Tra e um produto dogene tra2 constitutivamente ativo, atuam como reguladores de emenda porligação dos sítios de melhorador de emenda no pré-mRNA de dsx, que ativa osítio do aceitador 3' fraco do éxon específico de fêmea (Scali et al). Emmachos não há expressão de TRA e sítio do aceitador 3' fraco não éreconhecido e a emenda ocorre no éxon de macho. Para buscar por sítios deligação Tra/Tra2 putativos, os requerentes usaram a seqüência de consensodestes sítios de ligação deduzidas para Drosophila Tra/Tra2 e procuraram adistribuição destes na seqüência de gene dsx de Aedes aegypti. Isto émostrado na Tabela 2, abaixo.

<table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>

Tabela 2: * = em 3491, apenas 9/13 mas 6/6 no núcleo. Esta tabela não inclui 9/13 deidentidades além daquelas em 3491 com identidade de 6/6 com seqüência de núcleo dewwcrat. Esta seqüência de núcleo de consenso (WWCRAT) é particularmente preferida.Figura 7 é uma representação diagramática de sítios de ligaçãoTra/Tra2 putativos na região de codificação dsx de plasmídeo LA3491. Essediagrama está aproximadamente em escala e representa uma seqüência deaproximadamente 4kb. Os requerentes puderam calcular a possibilidade deum alinhamento aleatório para a seqüência de consenso Tra/Tra2.Considerando que todos os 4 nucleotídeos ocorrem em uma freqüência igual,as chances de qualquer dado nucleotídeo em uma seqüência aleatória ser oprimeiro nucleotídeo de um alinhamento 10/13 ou melhor para o consenso sãode aproximadamente 7x10"4. Assim, seria de se esperar um pouco menos doque um tal alinhamento por 1000 nucleotídeos de tal seqüência aleatória. Ocálculo para isto é apresentado abaixo:

Emenda específica de sexo: probabilidades

Perguntas

Um seqüência de consenso de sítio de ligação consiste de 13bases. Dez daquelas posições (fixas) (chamado conjunto X) deve ser cadauma base específica. As outras três (chamado de conjunto Y) pode ser cada deduas bases específicas. Considerando que cada base possível A, G, C e T éigualmente provável e que a base de cada posição é independente das basesem outras posições, qual é a probabilidade de uma seqüência de 13 basesselecionada aleatoriamente exatamente alinhar esta seqüência? Quais são asprobabilidade de tal seqüência ser um desalinhamento próximo (permitindoaté uma, duas, três ou quatro diferenças)? As respostas são dadas na Tabela 2abaixo e os aspectos operacionais são mostrados a seguir.

Respostas

Tabela 3

<table>table see original document page 78</column></row><table>Aspectos operacionais

<formula>formula see original document page 79</formula>

P(desalinhamento em exatamente 1 posição) =

P( desalinhamentos em uma das 10 posições de X ou desalinhamento em uma das 3 posições de Y)

P(de s alinhamento em exatamente 2 posições) =

P(desalinhamentos em 2 dos 10 X ou desalinhamento em 1 dos 10 X e 1 dos 3 Y ou desalinhamentoem 2 dos 3 Y)

<formula>formula see original document page 79</formula>

P(desalinhamento em exatamente 3 posições) =

P(desalinhamentos em 3 dos 10 X ou desalinhamentos em 2 dos 10 X e 1 dos 3 Y ou desalinhamentosem 1 dos 10 X e 2 dos 3 Y ou desalinhamentos em 3 dos 3 Y)

<formula>formula see original document page 79</formula>

P(desalinhamento em exatamente 4posições) =

P(des alinhamentos em 4 dos 10 X ou desalinhamentos em 3 dos 10 X e 1 dos 3 Y ou desalinhamentosem2 dos IOX e 2 dos 3 Y ou desalinhamentos em 1 dos 10 X e 3 dos 3 Y)

<formula>formula see original document page 79</formula>

P(desalinhamento em até 1 posição) =

P(desalinhamento em até 2 posições)

P(dealinhamento em até 3 posições)

<formula>formula see original document page 79</formula>

P(desalinhamento em até 4 posições)

Experimento 14: CctraOs requerentes possuem uma linhagem de LA3097(LA3097A) que mostra expressão muito boa de seu marcador fluorescente; édesconhecido se esta linhagem é um evento de integração simples. Estalinhagem mostra evidência de emenda específica de sexo, quando criadas semtetraciclina todas as fêmeas morreram como embriões, e quandoadministrados com 3(^g/ml de tetraciclina ambos, machos e fêmeas,sobrevivem.

Esse exemplo é importante. Ele mostra que Cctra provêemenda alternativa específica de sexo em Aedes, e que isto pode ser usadopara resultar em letalidade específica de sexo. Assim, por esta razão, elefornece uma evidência da faixa filogenética de emenda CcTRA. Assim, éinteiramente plausível que a presente invenção possa ser aplicada para todosdípteros, como os requerentes demonstraram que Cctra trabalha emDrosophila, tefrítidas e mosquitos, que essencialmente estendem-se sobretoda ordem de Dípteros.

É surpreendente que Cctra funcione em Aedes, dado a rápidaevolução de seqüência de tra.

Os requerentes transformaram Aedes aegypti com construçãoLA3097. Machos heterozigóticos da linhagem transgênica resultante foramcruzados com tipo selvagem e a progênie criada em meio de cultura aquososuplementado com tetraciclina para uma concentração final de 30 μg/ml.Adultos foram recuperados como segue: 14 machos e uma fêmea, deste modomostrando letalidade específica de fêmea resultante.

Esta espécie e cepa têm normalmente uma relação de sexo deaproximadamente 1:1, por esta razão esta construção resultou em letalidadeespecífica de fêmea em Aedes aegypti. Construções equivalentes que nãocontinham a seqüência intrônica de Cctra resultaram em letalidade nãoespecífica de sexo. Por esta razão, o íntron Cctra pode ser usado para proverregulação (isto é, específica de sexo) de expressão de gene diferencial emmosquitos, e isto pode ainda ser usado para prover letalidade específica desexo e um método para eliminação seletiva de fêmeas de uma população.

Em maiores detalhes: em 0 μ§/ηι1 de tetraciclina, machossobrevivem apenas para pupas, isto é não se tornam adultos. Fêmeas morremtão prematuramente que não foram vistas, provavelmente como embriões,assim, ainda há um efeito diferencial entre os sexos. No entanto, a letalidadepupal em machos sugere que o sistema não é completamente desligado emmachos. A linhagem de inserção única que os requerentes recuperaram éincomum, em que ela mostra expressão extremamente forte do marcador;outras inserções com níveis de expressão mais típicos poderiam bem nãomostrar letalidade para machos.

Emenda em LA3097A

Análise de emenda de LA3097 de mosquitos transgênicos deLA3097A por RT-PCR mostrou que machos e fêmeas compartilharam doistranscritos, uma banda de aproximadamente 950 bp e uma banda fraca deaproximadamente 800 bp (figura 59). Sequenciamento destas bandasmostraram que banda de 900 bp corresponde a uma variante de emenda nãoespecífica de sexo (AeM2, -920 bp), e a banda fraca foi uma mistura de umavariante de emenda não específica de sexo (AeM 1, ~804bp) e a forma defêmea (AeF 1, ~765bp), ver figura 60. A emenda do transcrito de AeFl foiidêntica à mostrada para esta construção em mosca-do-mediterrâneo (figura33). A emenda dos transcritos de M diferem um pouco da vista no contextonativo (Emenda de CcTRA em mosca-do-mediterrâneo, que o gene nativo oucomo observado pelos requerentes de LA3097 em mosca-do-mediterrâneotransgênica); em AeMl, o segundo éxon emendado alternativamente (MElb)não está incluído no transcrito de AeMl maduro e, em AeM2, o segundo éxonde emenda alternativa (ME2b) está similarmente não incluído no transcritoAeM2 maduro. Em outras palavras, para cada um destes transcritos oprimeiro, mas não o segundo, éxon de cassete está presente, relativo aoprotótipo de mosca-do-mediterrâneo. Note-se que, como uma conseqüênciada ausência do segundo éxon de cassete em AeMl5 e a matriz de leitura detTAV2 relativa ao primeiro éxon de cassete nesta construção, a emenda nopadrão de AeMl não conduz a interrupção da matriz de leitura aberta detTAV2, mas sim à adição de 39 nucleotídeos (correspondendo a 13aminoácidos) entre a ATG e o resto da matriz de leitura aberta de tTAV2. Éprovável que esta variante de tTAV2 possa reter alguma atividade, relativa aotTAV2 normal ou prototípico (como codificado pela variante de emenda deFl). Na ausência de tetraciclina, um efeito fenotípico foi observado emmachos bem como em fêmeas, embora mais fraco em machos do que emfêmeas. Produção de uma variante parcialmente ativa de tTAV2 a partir dotranscrito de AeMl em machos (e fêmeas) pode explicar isso.

Figura 59 mostra RT-PCR dos machos e fêmeas de linhagemtransgênica de Aedes aegypti LA3097A usando os iniciadores HSP (SEQ IDNO. 139) e VP16 (SEQ ID NO. 140).Usando estes iniciadores, emenda nopadrão de CcFl (isto é correspondendo à variante de Fl de Ceratitis capitata)resultaria em uma banda de aproximadamente 765bp e emenda na CcMl1005bp e CcM2 1094bp. Em ambos, machos e fêmeas, uma banda forte deaproximadamente 950bp (l)foi observada junto com uma banda fraca deaproximadamente 800bp (2). Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec,bandas de 1,5kb a 0,4kb são indicadas).

Análise de seqüência de vários clones de banda 2 (isto évariantes de emenda de AeMl/Ae Fl) de machos e fêmeas mostraram que umdentre cinco clones de fêmeas mostraram emenda de AeM2 (20%), enquantoem machos, três dos quatro clones mostraram emenda de AeM2 (75%); todosos outros clones mostraram emenda de AeFl. Isto indica que há maistranscrito de AeFl presente em fêmeas que em machos e isto explicaria oefeito de morte diferencial visto entre os mesmos.

Figura 60 ilustra os vários transcritos produzidos por emendaalternativa de Cctra de linhagem transgênica de Aedes aegypti LA3Q91A.3097 representa a seqüência de DNA de Cctra e os número referem-se afigura descrita em outra parte. Sombreamento e caixas também referem-se àfigura 33. Nota-se que o diagrama está fora de escala.

Exemplo 15: Actin-4 de Aedes

Os requerentes obtiveram onze linhagens de LA3545, queusam o gene actin-4 de Aedes (AeAct-4 ou AaAct4) para dirigir a expressãode tTAV2. Em construção LA3545, uma seqüência codificando tTAV2 foiinserida no segundo éxon de AaAct4 (fig 10). Para transcritos emendados nopadrão característico de emenda AaAct4 em fêmeas, o ATG da região decodificação de tTAV2 será o primeiro ATG (o mais a 5') do transcrito.Emenda no padrão característico de emenda AaAct4 em machos introduz umarranjo de códons de partida e de parada antes da seqüência de tTAV2 quetende a inibir ou interferir com a tradução do ATG da região de codificaçãode tTAV2. Estas linhagens devem apenas expressar tTAV2 em pupas defêmeas. A emenda é mostrada na figura 8, abaixo.

Figura 8 mostra RT-PCR de adultos machos e fêmeas delinhagem transgênica de Aedes aegypti LA3545AeC usando os iniciadoresAgéxonlF (SEQ ID NO. 141) e TETRRl (SEQ ID NO. 142).Usando estesiniciadores, emenda em um padrão equivalente àquele do gene AaAct4 nativoiria dar bandas de aproximadamente 347bp para a variante de emenda de tipofêmea e de aproximadamente 595bp para a variante de emenda de tipo macho.Uma banda de aproximadamente 347 bp (F) foi encontrada apenas em reaçõesem extratos de fêmeas; uma banda de aproximadamente 595bp (M) foiencontrada em ambos, machos e fêmeas. Sequenciamento confirmou que aemenda correta ocorreu tanto em machos como em fêmeas. Marcador(SmartLadder™ de Eurogentec, bandas de l,5kb a 0,2kb são indicadas).

Os requerentes também obtiveram Aedes aegypti transgênicoportando construção LA3604, que é similar a LA3545 exceto que este tem umcódon de partida engenheirado na porção de éxon 1 que está presente emambos, transcritos de tipo macho e de tipo fêmea (Fig 10). Isto está dispostopara ser o primeiro ATG em qualquer tipo de transcrito. LA3604 codificatTAV2 fusionado a ubiquitina (LA3545 codifica tTAV, enquanto LA3604codifica ubi-tTAV2). Esta construção deve produzir proteína de tTAV2completamente funcional em fêmeas apenas, mesmo se a forma de macho forexpressada em fêmeas o éxon de macho extra contém vários códons departida e de parada que poderiam prevenir a tradução da proteína de fusãoubi-tTAV2.

A emenda alternativa de AaAct4 ocorre no 5' UTR (do genenativo). Ela pode ou não ter uma parte regulatória no gene nativo. Umapossibilidade é como a seguir: na variante de emenda específica de fêmea, ocódon de partida da região de codificação de AaAct4 é o primeiro ATG dotranscrito. No entanto, na variante de emenda específica de macho, existemvárias seqüências de ATG adicionais a 5' para o códon de partida da região decodificação de AaAct4; a maior destes tem códons de parada na matriz emuma distância pequena 3'. Esta arrumação de seqüência pode interferir com atradução eficiente da proteína AaAct4 e assim reduzir expressão da proteínaem machos como comparado com fêmeas. Esta é a arrumação em LA3545.

No entanto, um efeito diferencial maior entre machos e fêmeasseria esperado se o íntron fosse incluído na região de codificação (em vez de5' UTR), isto é, inserido entre os códons de partida e parada dopolinucleotídeo para expressão no organismo. Nesse caso, o éxon de casseteespecífico de macho mudaria o potencial de codificação do transcrito, em vezde simplesmente interferir com tradução.

Isso é obtido na construção LA3604. Os requerentesmodificaram o primeiro éxon compartilhado para incluir uma seqüência deATG em um contexto de seqüência apropriado para uma iniciaçãotranslacional. Nesta seqüência modificada, esse é o primeiro ATG em ou asvariantes de emenda de tipo macho (M) ou de tipo fêmea (F). Seguindo aemenda na forma de F, esse (projetado) ATG de 5' está na matriz com aregião de codificação de ubi-tTAV. Transcritos de tipo F codificariam, poresta razão, uma proteína de fusão, compreendendo seções codificadas por (i)parte de qual é normalmente 5' UTR de Act4 (mas aqui obviamente traduzida,e assim, não UTR em todas), (ii) região de codificação de ubiquitina e (iii)região de codificação de tTAV2.

Atividade de ubiquitina proteases celulares irão liberar aproteína de tTAV2. Tradução do ATG 5' engenheirado seria terminada porcódons de parada em matriz na seqüência adicional (éxon de cassete) presenteem transcritos emendados na forma M. Isto poderia, assim, evitar a expressãode tTAV2 funcional em machos, assim dando expressão específica de sexo detTAV2. Obviamente, isto proporcionaria um método geral de expressãoespecífica de sexo de uma proteína, substituindo-se o segmento tTAV2 comoutra proteína ou seqüência de interesse. Usando esta estratégia osrequerentes proveram transgênicos e mostraram a emenda específica de sexo(Fig 9).

Figura 9 mostra RT-PCR dos machos e fêmeas de linhagemtransgênica de Aedes aegypti LA3604AeA usando os iniciadores AgexonlF(SEQ ID NO. 141) e TETRRl (SEQ ID NO. 142).Usando estes iniciadores,emenda na forma de fêmea iria dar uma banda de aproximadamente 575 bp,enquanto inclusão do éxon de cassete específico de macho aumentaria omesmo a aproximadamente 823bp. Uma banda de aproximadamente 575bpfoi vista em cada fêmea analisada, enquanto uma banda de aproximadamente823bp foi vista em cada macho analisado. Estas bandas parecem sersubstancialmente específicas para os respectivos sexos. Sequenciamentodestas bandas mostrou que a emenda correta ocorreu em machos e fêmeas.Marcador: SmartLadder™ de Eurogentec, bandas de 1,5 kb a 0,2 kb sãoindicadas.Figura 10, abaixo, é uma representação diagramática deLA3545 e LA3604 de plasmídeos. SI: éxon 1 compartilhado; Ml: seqüênciaadicional incluída em éxon 1 específico de macho; S2: éxon 2 compartilhado(extremidade de 5' apenas); ubi: seqüência codificando ubiquitina; tTAV2:seqüência codificando tTAV2.

Em várias das linhagens transgênicas LA3545, um efeitoespecífico de sexo e tecido foi observado: fêmeas não são aptas a voar. Duasdas linhagens mostraram 90-100% de um fenótipo de inaptidão ao vôo defêmeas, uma linhagem mostra 70% sem a aptidão ao vôo e outros 50%. Estefenótipo é provavelmente devido à expressão específica de fêmea de tTAV2no desenvolvimento de músculos aptos a voar. A diferença nos fenótiposentre as linhagens é devido aos efeitos posicionais na expressão do promotorAaAct4. Devido a uma posição de genes na expressão de genoma poder serinfluenciada pelo número de fatores (regiões de heterocromatina oueucromatina, elementos melhoradores e supressores, proximidade de outrosgenes) que podem ser vistos prontamente nos marcadores fluorescentesusados para identificar transgênicos. Todas as onze linhagens de LA3545foram identificadas porque elas têm perfis fluorescentes diferentes, mesmo seelas tem os mesmos promotores e marcador. Esta variação é devido aosefeitos posicionais. Isto poderia então significar que os requerentes esperaramque algumas linhagens de LA3545 expressassem mais tTAV2 do que outras,devido aos efeitos posicionais, e as linhagens que expressam mais irão dar umfenótipo de inaptidão ao vôo específico de fêmea.

Para testar esta hipótese, os requerentes desenvolveram umalinhagem separada de Aedes aegypti com um gene repórter tetO-DsRed2(LA3576 ver Fig 17 e SEQ ID NO. 143), quando cruzados com linhagensLA3545 diferentes isto iria permitir a visualização de onde e quando Actin4-tTAV2 estava sendo expressado. Dentre as 8 linhagens de LA3545 cruzadaspara LA3576 todas mostraram fluorescência de músculo de vôo indiretoespecífico de fêmeas em larvas L4 tardias, pupas e adultos, m quatro daslinhagens, a expressão de DsRed2 pareceu ser específica (isto é exclusiva)para os músculos aptos ao vôo indiretos de fêmeas; em outros, quatro tecidosadicionais mostraram expressão de DsRed2. Este fenômeno, onde expressãode um transgene depende, em parte, da região ou ponto no genoma em queestá inserido, é chamado efeito de posição, e será bem conhecido e entendidopela pessoa versada na técnica.

Usando LA3576, provou-se que a expressão de tTAV2 emLA3604 foi específica de fêmea, ocorre principalmente nos músculos de vôoindiretos e é específica de estágio. Várias construções de efetuador tetO foramentão construídas para analisar seus efeitos. Os transgênicos tetO- MichelobX(LA3582, ver Fig 15 e SEQ ID NO. 144) quando cruzados para LA3545demonstraram todos fenótipos de inaptidão ao vôo específicos de fêmea quepoderiam ser reprimidos por tetraciclina. Isto prova que Actin4 pode ser usadapara dirigir um gene efetuador em um modo específico de estágio, tecido esexo.

Porque algumas linhagens de LA3545 têm um fenótipo deinaptidão ao vôo específico de fêmea sem a presença de um gene efetuadorinduzido, isto mostrou que tTAV2 poderia atuar como uma molécula deefetuador. tTAV2 é composto de um tTA, um domínio de ligação de tetO eVP16, uma proteína de vírus de herpes simplex. VP16 ativa a transcrição degenes virais prematuros imediatos usando suas seqüências amino-terminaispara fixar a uma ou mais proteínas codificadas de hospedeiro que reconhecemseqüências de DNA em seus promotores. Em LA3604, um efetuador de tetO -VP16 foi adicionado para melhorar o efeito de tTAV2. Em três linhagenstransgênicas de LA3604 isto levou a um fenótipo de inaptidão ao vôoespecífico de fêmeas de 100% quando criadas sem tetraciclina, mostrando queVPl6 é uma molécula efetuadora efetiva. Nota-se que LA3604 tem um códonde partida potencial (ATG) engenheirado a 5' de para o íntron emendadoalternativamente. Assim, nesta construção, o éxon específico de macho éesperado para interromper a matriz de leitura aberta codificando tTAV (ubi-tTAV); uma vez que a seqüência específica de macho contém vários códonsde parada, isto tenderá a reduzir ou eliminar a produção de tTAV funcionalem machos. Por meio de comparação, o éxon específico de macho 5' para ocódon de partida de tTAV em LA3545. No entanto, inserindo um número decódons de partida 5' para o códon de partida de tTAV (que é o primeiro ATGdo transcrito de fêmea mas não do transcrito de macho), nenhum destescódons de partida adicionais sendo apropriados para a produção eficiente detTAV funcional devido a estar fora da matriz ou ter códons de paradaintervindo, esta arrumação também irá tender a reduzir ou eliminar aprodução de tTAV funcional em machos, consistente com dados fenotípicosacima.

Exemplo 16: Uso de ubiquitina e posicionamento de íntrons

Os requerentes realizaram recentemente construções baseadasem Cctra com o íntron de cassete de Cctra em uma variedade de contextosdiferentes, isto é flanqueado por seqüências diferentes. Várias linhagens demosca-do-mediterrâneo transgênicas transportando estes foram construídas.Isto mostra que o sistema é geral e robusto, isto é, que vai funcionar para umaextensa faixa de seqüências de interesse heterólogas.

Os requerentes também obtiveram pelo menos um exemplofeito recentemente de uma fusão Cctra -ubi-tTAV dando uma emenda correta(DsRed- Cctra - ubi-tTAV).

Exemplos preferidos da proteína funcional colocam aseqüência de codificação para ou ubiquitina ou tTA, ou seus mutantesfuncionais e ou variantes tais como tTAV, tTAV2 ou tTAV3, 3' para o íntron.Estes estão dispostos de modo que estes elementos estão substancialmenteadjacentes à extremidade 3' do íntron, mais preferivelmente de modo que aregião de codificação inicia dentro de 20 nucleotídeos ou menos do limite doíntron 3'), e, o mais preferivelmente, imediatamente adjacente à extremidade 3' doíntron, embora isto seja menos relevante se o sistema de ubiquitina for usado.

Exemplos preferidos de construções de acordo com a presenteinvenção estão listados na Tabela 4, abaixo. Será notado que LAl 118 não estádentro do escopo da presente invenção, como ele não codifica uma proteínafuncional, isto é não funciona propriamente. Pensa-se que isto é devido ao usoinesperado de um doador de emenda 5' de 4bp para a junção com seqüênciade íntron Cctra, conduzindo a uma armação que é induzida em todas asemendas. Assim, isto é incluído apenas com a finalidade de informação.

Tabela 4

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Tabela 4 mostra construções que contêm uma seqüência decontrole de emenda que é derivada de um íntron tra. Os íntrons foramderivados de C. capitata (mosca-do-mediterrâneo), B. zonata ou C. rosa (vercoluna 2). Referido íntron foi inserido dentro da região de codificação tal quea distância entre ATG de iniciador putativo e o último nucleotídeo do éxonimediatamente precedendo o íntron tra foi como deve estar indicado na coluna

3. íntron é inserido em ou adjacente à região de codificação para ubiquitina,tTAV, ReaperKR, nipper ou ubiquitina- DsRed como mostrado na coluna 4.Estes foram gerados e mostrados como emendando com sucesso, por RT-PCRou fenotipicamente em mosca-do-mediterrâneo em, em alguns casos, tambémquer em Drosophila melanogaster (LA3077) ou Anastrepha ludens (LA3097,LA3233, LA3376). Além disso, a distância entre o ATG e a extremidade doéxon imediatamente precedendo o íntron tra (assumindo emenda em forma detipo Fl) pode variar de Obp a pelo menos +949bp sem conseqüências adversaspara emenda (ver Tabela 4, coluna 3). Assim, é razoável assumir que esta distânciapode ser até pelo menos 900 e preferivelmente até pelo menos 949 bp.

Mais informação nestes exemplos está sumarizada na Tabela5. A opção preferida é usar nenhuma seqüência endógena para obter ocontrole de emenda alternativa correto de expressão (+Obp na tabela 4). Osrequerentes preferiram inserir o íntron tra entre os dinucleotídeos deflanqueamento TG... GT na região de codificação da proteína de interessepara ser emendados alternativamente de modo a assegurar emenda corretacomo isto pode ser importante, No entanto os requerentes não irão se limitar aisto, se necessário, como outros nucleotídeos de flanqueamento podemfuncionar corretamente também. Exemplos LA1038, LA3054 e LA3056inclui alguma seqüência exônica de flanqueamento endógena do gene CCtranatural. Na tabela 5, se 6 nucleotídeos ou menos (incluindo o códon de partidaATG) estão incluídos de fusões particulares para 3' ou 5' da junção deemenda, para os propósitos de sumário desta tabela estes não serãoconsiderados como fazendo parte da fusão. Tabela 4 pode estarcorrelacionada com a tabela 3 para encontrar qual íntron tra (Cctra, Bztra ouCrtra) é usado em cada exemplo. Novamente, LAl 118 está apenas incluídopara os fins de informação e está fora do escopo da presente invenção.

Tabela 5

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Como mencionado acima quando um íntron é colocado 5' parauma região de codificação de proteína (ORF-X), prefere-se posicionar ou usarubiquitina 3' para o íntron, 5' para ORP-X5 assim, e provendo regulaçãoespecífica de fêmea de ORF-X, enquanto introduzindo separação física entreesta seqüência e o íntron tra, assim reduzindo a possibilidade de queseqüências dentro de ORF-X irão interferir com a emenda do íntron tra.

Construções e seqüências compostas também são previstas,por exemplo da forma:

X-ubi-Y

com o íntron alternativamente emendado inserido entre aregião de codificação Xea região codificando ubiquitina (ubi), ou dento daregião de codificação de ubiquitina, ou entre a região codificando ubiquitina eregião de codificação Y. Assim X será expressado sem restrição de emendado íntron, enquanto Y será apenas expressado quando o íntron é emendadoem uma forma apropriada. Mais configurações e arrumações deste tipo geralserão evidentes para o versado na técnica. Alguns exemplos dos mesmos sãoLA3014, LA3054, LA3056, LA3166, LA3488 e LA3596, sendo que todosusam fusões de ubiquitina, desta forma demonstrando a capacidade destaidéia ser aplicada com sucesso em mosca-do-mediterrâneo transgênica.Exemplos alternativos em mosquitos transgênicos incluem LA3604 eLA3612, mostrando a extensa aplicabilidade filogenética deste sistema emnão apenas espécies diferentes (mosquitos e mosca-do-mediterrâneo), mastambém em diferentes contextos incluindo AaActin4, Aadsx e Cctra.

LA3596 (ver Fig 67 e SEQ ID NO. 145) é de projeto similar aLA3488, planejado para gerar fluorescência verde (por expressão de proteínafluorescente TurboGreen localizada nuclear) em ambos sexos, masfluorescência vermelha apenas em fêmeas (por expressão de proteína fluorescenteDsRed2 localizada nuclear). Isto é obtido pela fusão destas duas proteínas, dirigidapor cassete de melhorador/promotor de Hr5-Iel, ligado junto com um ligador de 11aminoácidos curto (ligador de SG4) e a região de codificação compreendendoubiquitina (com uma mutação em pontos planejada para estabilizar a proteínaresultante reduzindo sua propensão à degradação mediada por ubiquitina) e o íntronCctra para limitar expressão de DsRed2 para fêmeas. Moscas-do-mediterrâneotransgênicas foram geradas com esta construção. Fluorescência vermelha foilimitada a fêmeas nesta linhagem como esperado, enquanto fluorescência verde foiobservada em ambos, machos e fêmeas. Isto poderia ser usado para separação desexos por triagem de fluorescência para uma particular proteína fluorescente, nessecaso fluorescência vermelha representando expressão de DsRed2.

Exemplo 17: Outra exemplificação de Cctra

Referência também é feita a LA3014 e LA3166 e dadosfenotípicos dos mesmos em outros exemplos.

Os requerentes previamente realizaram e obtiveramtransgênicos com o íntron Cctra em uma proteína funcional diferente detTAV, ver LA3014 e LA3166. LA3014 contém uma fusão de ubiquitina -reaperKR a jusante de um íntron Cctra. Dados fenotípicos mostram que mosca-do-mediterrâneo transgênica LA3014 concedeu letalidade específica de fêmearepressível. Análise de RT-PCR em RNA extraído de machos e fêmeasadultos criados sem tetraciclina, usando iniciadores e ReaperKR, demonstramque emenda correta estava ocorrendo em fêmeas (banda de 508 bp) enenhuma desta banda foi encontrada em machos (figura 37). LA3166 é outraconstrução com o íntron Cctra colocado dentro da região de codificação deubiquitina fusionado a reaperKR, mas colocado em uma posição diferente emubiquitina. LA3166 também produz um efeito letal específico de fêmearepressível dominante em mosca-do-mediterrâneo.

LA103 8 é um novo exemplo do uso do íntron Cctra em umcontexto de seqüência diferente, aqui colocado em um fragmento deNipplDm chamado 'nipper' que também emenda-se corretamente em mosca-do-mediterrâneo transgênica quando analisada por RT-PCR (figura 12).LA670 foi requerido como uma fonte de tTAV para dirigir a expressão denipper alternativamente emendado.

Os requerentes também realizaram recentemente e obtiveramtransgênicos com, construções baseadas em Cctra "somente íntron" com oíntron em um gene diferente (muitos dos exemplos acima, salvo especificadoem contrário, estão em tTAV ou uma de suas variantes, isto é tTAV2 outTAV3). Estas construções funcionam como previsto. Isto é um resultadoimportante, deste modo mostrando que existem seqüências exônicas nãoessenciais em Cctra que os requerentes simplesmente duplicaram (em função,se não necessariamente em seqüência) por acaso, em tTAV. Também osrequerentes realizaram construções de ubi - rpr1® deste tipo (LA3014 e LA3166),que também validam o método de fusão de ubiquitina descrito acima. O método defusão de ubiquitina é ainda exemplificado por análise RT-PCR de LA3054,LA3056 e LA3488 (figuras 11,13,14), como descrito no Exemplo 16, acima.

Exemplo 17: Outra exemplificação de Cctra

Referência também é feita a LA3014 e LA3166 e dadosfenotípicos a partir dos mesmos em outros exemplos.

Os requerentes previamente realizaram e obtiveramtransgênicos com, o íntron Cctra em uma proteína funcional diferente detTAV, ver LA3014 e LA3166. LA3014 contém uma fusão de ubiquitina -ReaperKR a jusante de um íntron Cctra. Dados fenotípicos mostram quemosca-do-mediterrâneo transgênica de LA3014 concedeu letalidadeespecífica de fêmea repressível. Análise de RT-PCR em RNA extraído deadultos machos e fêmeas criados sem tetraciclina, usando iniciadores eReaperKR, demonstram que a emenda correta estava ocorrendo em fêmeas(banda de 508bp) e nenhuma desta banda foi encontrada em machos (figura37). LA3166 é outra construção com o íntron Cctra substituído dentro daregião de codificação de ubiquitina fusionada ao Reaperiai, mas substituídoem uma posição diferente em ubiquitina. LA3166 também produz um efeitoletal específico de fêmea repressível dominante em mosca-do-mediterrâneo.

LA1038 é um novo exemplo do uso do íntron Cctra em umcontexto de seqüência diferente, aqui substituído em um fragmento de NipplDmchamado 'nipper' que também emenda corretamente e, mosca-do-mediterrâneotransgênica quando analisada por RT-PCR (figura 12). LA670 foi requerida comouma fonte de tTAV para conduzir expressão nipper alternativamente emendada.

Os requerentes realizaram recentemente e obtiveramtransgênicos com, construções baseadas em Cctra apenas de íntron com oíntron em um gene diferente (muitos dos exemplos acima, salvo aparente,ocorrem em tTAV ou uma das suas variantes, isto é tTAV2 ou tTAV3). Estasconstruções funcionam como previsto. Isto é um resultado importante, destemodo mostrando que existem seqüências exônicas não essenciais em Cctra que osrequerentes simplesmente duplicaram (em função, se não necessariamente emseqüência) aleatoriamente, em tTAV. Também os requerentes notaramconstruções de ubi - rpr deste tipo (LA3014 e LA3166), que também validamo método de fusão de ubiquitina descrito acima. O método de fusão de ubiquitinaé ainda exemplificado por análise de RT-PCR de LA3054, LA3056 e LA3488(figuras 11,13, 14), e como descrito no Exemplo 16, acima.

Figura 11: Gel mostrando emenda específica de sexo deíntron(s) derivados de Cctra (banda de 780bp em fêmeas) em Ceratitiscapitata transformadas com LA3488. Emenda na forma de Fl poderia darum produto de aproximadamente 780bp. Uma banda deste tamanho éclaramente visível de fêmeas (trilha 4), mas não de machos, nem em trilhascom reações das quais a enzima de transcriptase reversa foi omitida ("semRT"). Por esta razão, o íntron derivado de Cctra é capaz de emenda alternativaespecífica de sexo nesse contexto de seqüência novo. Trilha 1: Marcador(SmartLadder™ de Eurogentec, bandas de aproximadamente 0,8, 1,0 e l,5kb sãoindicadas); Trilhas 2 e 3: LA3488 de Ceratitis capitata /+ machos (controle deRT e sem controle RT, respectivamente); Trilhas 4 e 5: LA3488 de Ceratitiscapitata /+ fêmeas (controle de RT e sem controle de RT, respectivamente).

Figura 12: Gel mostrando emenda específica de sexo deíntron(s) derivados de Cctra em Ceratitis capitata transformada comLA1038. Emenda na forma de Fl poderia dar um produto deaproximadamente 230bp. Uma banda deste tamanho é claramente visível defêmeas (trilhas 1, 2, 7, 8, 9 e 10), mas não de machos. Por esta razão, o íntronderivado de Cctra é capaz de emenda alternativa específica de sexo nessecontexto de seqüência novo. Trilha 15: Marcador (SmartLadder™ deEurogentec, bandas de aproximadamente 0,2, 0,4 e 0,6kb são indicadas); Trilhas1, 2, 7, 8, 9 e 10: LA670 Ceratitis capitata; fêmeas de LAl038; Trilhas 3, 4, 5,6, 11, 12, 13 e 14: LA670 de Ceratitis capitata·, machos de LAl038.

Figura 13: Gel mostrando emenda específica de sexo deíntron(s) derivados de Cctra em Ceratitis capitata transformada comLA3054. Emenda na forma de Fl poderia dar um produto deaproximadamente 340 bp. Uma banda deste tamanho é claramente visível natrilha 7, mas não de machos. Por esta razão, o íntron derivado de Cctra écapaz de emenda alternativa específica de sexo nesse contexto de seqüêncianovo. Trilha 1 : Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, bandas deaproximadamente 0,4, 0,6, 0,8 e l,0kb são indicadas); Trilhas 2-5: machos deLA3054 de Ceratitis capitata·, Trilha 7: fêmea de LA3054 Ceratitis capitata.Figura 14: Gel mostrando emenda específica de sexo deíntron(s) derivados de Cctra e, Ceratitis capitata transformada comLA3056. Emenda na forma de Fl poderia dar um produto deaproximadamente 200 bp. Uma banda deste tamanho é claramente visível deuma fêmea (trilha 6), mas não de machos (trilhas 2-4). Por esta razão, o íntronderivado de Cctra é capaz de emenda alternativa específica de sexo nesse contextode seqüência novo. Trilha 1: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, bandas deaproximadamente 0,2, 0,4, 0,6 e 0,8kb são indicadas); Trilhas 2-5: LA3056 deCeratitis capitata /+ machos; Trilhas 6-7: LA3056 Ceratitis capitata /+ fêmeas.

Figura 15: Gel mostrando emenda específica de sexo deíntron(s) derivados de BzTra em Anastrepha ludens transformada comLA3376. Emenda na forma Fl poderia dar um produto de aproximadamente672 bp. Uma banda deste tamanho é claramente visível de fêmeas (trilha 4),mas não de machos, nem em trilhas com reações de que enzima detranscriptase reversa foi omitida ("sem RT"), iniciadores usados foram SRY eAV3F. Por esta razão, o íntron derivados de Bztra é capaz de emendaalternativa específica de sexo nesse contexto de seqüência novo e espécie.Trilha 1: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, bandas deaproximadamente 0,6, 0,8, e l,0kb são indicadas); Trilhas 2 e 3: LA3376Anastrepha ludens /+ machos (controle de RT e sem controle RT,respectivamente); Trilhas 4 e 5: LA3376 de Anastrepha ludens /+ fêmeas(controle de RT e sem controle de RT, respectivamente).

Figura 18 e SE ID NOs 149 e 150 mostra seqüências deminigenel de DSX, minigene2 de DSX e mapa de plasmídeo de LA3619.Figuras 19-51 são como por Exemplos 1-9 acima. Figuras 52-58, 68 e 69mostram vários diagramas e seqüências de plasmídeo. Figuras 59-60 estãodescritas acima e Figuras 61-66 mostram vários diagramas e seqüências deplasmídeo. Fig 67 é pLA3596, como discutido em outra parte.REFERÊNCIAS

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O seguinte refere-se aos vários plasmídeos do presente eenfatiza a posição de certos elementos aqui preferidos.

<223> Seqüência de pLA3359 (SEQ ID NO. 47).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Mini-gene de Anopheles gambiae dsx (Agdsx), [um mini-gene é uma seqüência recombinante derivado de um gene particular (o geneAgdsx neste exemplo) por ligação junta de segmentos não contíguos enquantoretendo a ordem 5'-3' original; isto é equivalente para deleção de algunssegmentos internos de um fragmento mais longo de seqüência genômicaderivado do gene], (1-3135): incluindo parte de Agdsx de éxon3, éxon 4a(fêmea), éxon 4b (fêmea) e parte do éxon5 (macho e fêmea).

<***> éxons derivados de Agdsx de posições 426 a 560 (partedo éxon 3); 1068 a 2755 (incluindo parte do éxon 4, encontrado em fêmeas);1809 a 2755 (incluindo parte do éxon 4, encontrado em fêmeas); e 2914 a3135 (incluindo parte do éxon 5, encontrado em machos).

<***> Alternativamente transcrito emendado começa nosegmento derivado de baculovírus AcMNPV Iel (prematuro imediato 1) emposição -8031 (fragmento Iel é da posição 7431 a 8060).

<***> Aspecto incluído:

1. íntron adicional derivado de gene "scraps" de Drosophila("íntron 'scraps"') a montante para seqüência Agdsx de posição 8075 a 8137.

<223> Seqüência de pLA3433 (SEQ ID NO. 48).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Mini-gene de Agdsx (778-4623): incluindo parte de Agdsxdo éxon 2, éxon3, éxon 4a (fêmea), éxon 4b (fêmea) e parte do éxon5 (machoe fêmea).

<***> éxons derivados de Agdsx de posição 778 a 908 (partedo éxon 2); 1913 a 2048 (parte do éxon 3); 2556 a 2642 (parte do éxon 4a);3297 a 4243 (parte do éxon 4b) e 4402 a 4623 (parte do éxon 5).

<***> Alternativamente transcrito emendado começa nosegmento derivado de baculovírus AcMNPV Iel (prematuro imediato 1) emposição -606 (fragmento Iel é da posição 6 a 635).

<***> Aspecto incluído:

1. íntron adicional derivado de gene "scraps" deDrosophila("íntron 'scraps'") a montante para seqüência Agdsx de posição650 a 712.

<223> Seqüência de pLA3491.

<* * *> Aspectos chaves incluem:

1. Mini-gene de Aedes aegypti dsx (Aadsx): incluindo parte deAadsx éxon 4, éxon 5a (fêmea), éxon 5b (fêmea), e parte do éxon6 (macho efêmea).

<***> éxons derivados de Aadsx de posição 1316 a 1450(parte do éxon 4); 2626 a 3761 (parte do éxon 5a); 3293 a 3761 (parte do éxon5b); e 5215 a 5704 (parte do éxon 6).

<***> Parte do transcrito Fl é previsto como compreendendonucleotídeos ~1174-1450, 2626-3761, 5215-5850.

<***> Parte do transcrito F2 é previsto como compreendendonucleotídeos -1174-1450, 3293-3761, 5215—5850.

<***> Parte do transcrito F3 é previsto como compreendendonucleotídeos -1174-1450, 2626-3083, 3293-3761, 5215—5850.

<***> Parte do transcrito Ml é previsto como compreendendonucleotídeos ~1174-1450, 5215—5850.

<***> o transcrito alternativamente emendado começa emsegmento derivado de baculovírus AcMNPV Iel (prematuro imediato 1) emposição ~1174 (fragmento Iel é de posição 574 a 1203).

<***> Aspecto incluído:

1. íntron adicional derivado de gene "scraps" de Drosophila("íntron 'scraps"') a montante para seqüência Aadsx de posição 1218 a 1280.

<223> Seqüência de pLA3646.

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Mini-gene de Aadsx (17218-11707): incluindo parte deAadsx éxon 4 de posição 17113 a 16979, éxon 5a de posição 15803 a 15025 +14010 a 13650, éxon 5b de posição 15136 a 15025 + 14010 a 13650 e éxon 6de posição 12196 a 11707 (nota: orientação reversa).

<***> parte do éxon 4 contém mutações de 4 pontos comrelação ao tipo selvagem em posições 17087 (ATG-ACG), 17053 (ATG-ACG), 17050 (ATG-ACG) e 17041 (ATG-ACG) (nota: orientação reversa);parte do éxon 5a e 5b contém mutações de 3 pontos com relação ao tiposelvagem em posições 15129 (ATG-ATA), 15116 (ATG-ATA) e 15113(ATG-ATA) (nota: orientação reversa). Todas destas mutações são paraeliminar seqüências de ATG.

<***> tTAV2 é inserido nos éxons de sobreposição 5a e 5b daposição 15024 a 14011 (nota: orientação reversa).

<***> O transcrito alternativamente emendado começa emfragmento derivado de hsp70 de posição -17312 (fragmento hsp70 é deposição 17354 a 17225); (nota: orientação reversa).

<***> Aspecto incluído:

1. íntron adicional derivado de gene "scraps" de Drosophila("íntron 'scraps"') a montante para seqüência Aadsx de posição 1107 a 1045(nota: orientação reversa)

Seqüência de pLA3435 (SEQ ID NO. 46).

<223> Aspectos chaves incluem:

1. Mini-gene de dsx Bombyx mori (Bmdsx) (1411-3161) comum ligador exógeno entre éxons 3 e 4 de fêmea fusionados.

<***> Fragmento de éxons dois compartilhados (141 Ibp-1554bp)<***> Parte de éxon três específico de fêmea (2121bp-2202)fusionado para parte de éxon 4 específico de fêmea (2225bp-2290bp) usandoum ligador exógeno (2203bp-2224bp)

<***> Fragmento de éxon cinco compartilhado (3007bp-3161bp)

<***> Produto de emenda de minigene dsx fêmea é codificadopor 1411-1554 + 2121-2290 + 3007-3161.

<***> Produto de emenda de minigene dsx macho écodificado por 1411 -1554 + 3007-3161.

<***> Transcrição é prevista para começar emaproximadamente posição -1239 dentro do segmento derivado de baculovírusAcMNPV Iel (prematuro imediato 1) promotor (639bp-1268bp).

<223> Seqüência de pLA3534.

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Mini-gene de Aadsx (6996-4425): contendo Aadsx éxon 4,parte de éxon 5a (fêmea) e parte de éxon 5b (fêmea), inclusive de fragmentosde íntron Aadsx.

<***> éxons derivados de Aadsx de posição 6968 a 6834(parte de éxon 4), 5462 a 4425 (parte de éxon 5a) e 4795 a 4425 (parte deéxon 5b); (nota: orientação reversa).

<***> parte transcrito Fl é prevista como compreendendonucleotídeos -7146-6834, 5462—4300 (nota: orientação reversa).

<***> Parte do transcrito F2 é prevista como compreendendonucleotídeos -7146-6834, 4795—4300 (nota: orientação reversa).

<***> Parte do transcrito F3 é prevista como compreendendonucleotídeos -7146-6834, 5462-5005, 4795—4300 (nota: orientação reversa).

<***> q transcrito alternativamente emendado começa emsegmento derivado de baculovírus AcMNPV Iel (prematuro imediato 1) emposição -7146 (fragmento Iel é de posição 7746 a 7117, orientação reversa).<223> Seqüência de pLA3612.

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de ubiquitina-tTAV2 inserida em uméxon fêmea de gene Aadsx.

<***> Ubiquitina-tTAV2 é de posição 15185-16429 emAadsx (ubiquitina é de 15185-15412; tTAV2 é de 15413-16429), inclusive decódon de partida e de parada.

<***> Seqüência derivada de Aadsx: 13150-15184, 16438-18805.

<***> Transcrito alternativamente emendado Aadsx-ubiquitina-tTAV2 começa em segmento derivado de hsp70 (fragmento hsp70éde 13014-13143).

<223> Seqüência de pLA3619.

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de tTAV2 inserida em um éxonfêmea de gene Aadsx.

<***> Seqüência derivada de Aadsx: 5635-3641, 2610-243(nota: orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado Aadsx-tTAV2começa em segmento derivado de hsp70 de 5642-5771 (nota: orientaçãoreversa).

<***> O transcrito tTAV2 é previsto como sendo traduzidoentre 2619-3635, inclusive de códon de partida e de parada (nota: orientaçãoreversa).

<223> Seqüência de pLA3545.

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Promotor AaActin4 e 5' UTR incluindo primeiro expressãode tTAV íntron regula.

<***> Seqüência derivada de AaActin4 é de posição 923-4285.

<***> q transcrito alternativamente emendado é previsto paracomeçar em aproximadamente -2366.

<***> q primeiro íntron de AaActin4 (variante de emendafêmea) é de 2458-4259.

<***> tTAV é previsto como sendo traduzido entre 4300-5316, inclusive de códon de partida e de parada.

<223> Seqüência de pLA3604.

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Promotor AaActin4 e 5' UTR regula expressão ubiquitina-tTAV2.

<***> Seqüência derivada de AaActin4 é de posição 5795-2407 (nota: orientação reversa).

<***> O transcrito alternativamente emendado é previsto paracomeçar em aproximadamente -4353 (nota: orientação reversa).

<***> O primeiro íntron de AaActin4 (variante de emendafêmea) é de 2455-4254 (nota: orientação reversa).

<***> O transcrito ubiquitina-tTAV2 é previsto como sendotraduzido a partir do códon de partida engenheirado no primeiro éxon do geneAaAct4 a 4299-4297 (ubiquitina é de 2406-2179; tTAV2 é de 2178-1162);(nota: orientação reversa).

<223> Seqüência de pLA3641.

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de tTAV inserida em um éxon fêmeade gene CodlingDsx.

<***> tTAV é de posição 2731-3747 no gene CodlingDsx.

<***> Transcrito alternativamente emendado Dsx-tTAVcomeça em segmento derivado de hsp70 (fragmento hsp70 é de 4811-4940).

<***> q transcrito tTAV é previsto como sendo traduzidoentre 2731-3747, inclusive do códon de partida e de parada (nota: orientaçãoreversa).

<223> Seqüência de pLA3570

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de tTAV inserida em um éxon fêmeade gene PBW-Dsx.

<***> Região de codificação de tTAV é de 2336-3352.

<***> Transcrito alternativamente emendado Dsx-tTAVcomeça em segmento derivado de hsp70 (fragmento hsp70 é de 4683-4812).

<***> o transcrito tTAV é previsto como sendo traduzidoentre 2336-3352, inclusive do códon de partida e de parada (nota: orientaçãoreversa).

<223> Seqüência de pLAl 188 (SEQ ID NO. 49)

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de tTAV com íntron Cctra inserido.

<***> íntron Cctra é de posição 3905-2561 em tTAV (nota:orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado tTAV começaem segmento derivado de hsp70 de posição 4217 (fragmento hsp70 é de4260-4131); (nota: orientação reversa).

<***> q transcrito tTAV Fl é previsto como sendo traduzidoentre 4040-1679 (nota: orientação reversa).

<***> Aspecto incluído:

1. íntron Adh dentro do transcrito Fl previsto de posição4118-4049 (nota: orientação reversa).

<223> Seqüência de pLA3077 (SEQ ED NO. 50).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de tTAV com íntron Cctra inserido.

<***> íntron Cctra é de posição 3975-2631 em tTAV (nota:orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado tTAV começaem segmento derivado de hsp70 de posição -4217 (fragmento hsp70 é de4260-4131); (nota: orientação reversa).

<***> q transcrito tTAV Fl é previsto como sendo traduzidoentre 4039-1678, inclusive de códon de partida e de parada (nota: orientaçãoreversa).

<***> Aspecto incluído:

1. Intron Adh dentro do transcrito Fl previsto de posição4117-4048 (nota: orientação reversa).

<223> Seqüência de pLA3097 (SEQ ID NO. 51).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de tTAV com íntron Cctra inserido.

<***> íntron Cctra é de posição 3282-1938 em tTAV (nota:orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado tTAV começaem segmento derivado de hsp70 de posição -3382 (fragmento hsp70 é de3425-3296); (nota: orientação reversa).

<***> q transcrito tTAV Fl é previsto como sendo traduzidoentre 3285-924, inclusive de códon de partida e de parada (nota: orientaçãoreversa).

<223> Seqüência de pLA3233 (SEQ ID NO. 52).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de tTAV2 com íntron Cctra inserido.

<***> íntron Cctra é de posição 3289-1945 em tTAV2 (nota:orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado tTAV2 começaem segmento derivado de hsp70 de posição -3389 (fragmento hsp70 é de3432-3303); (nota: orientação reversa).<***> q transcrito tTAV2 Fl é previsto como sendo traduzidoentre 3292-931, inclusive de códon de partida e de parada (nota: orientaçãoreversa).

<223> Seqüência de pLA3014 (SEQ ID NO. 53).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de ubi-reaper[KR] com íntron Cctrainserido.

<***> Intron Cctra é de posição 3356-4700 em ubi-reaper[KR].

<***> Transcrito alternativamente emendado ubi-reaper[KR]começa em segmento derivado de hsp70 de posição -3234 (fragmento hsp70é de 3191-3320).

<***> o transcrito ubi-reaper[KR] Fl é previsto como sendotraduzido entre 3331-5143, inclusive de códon de partida e de parada(ubiquitina é de 3331-3355, 4701-4948; reaper[KR] é de 4949-5143).

<223> Seqüência de pLA3166 (SEQ ID NO. 54).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de ubi-reaper[KR] com íntron Cctrainserido.

<***> Jntron Cctra é de posição 9987-8643 em ubi-reaper[KR] (nota: orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado ubi-reaper[KR]começa em segmento derivado de hsp70 de posição -10227 (fragmento hsp70é de 10270-10141); (nota: orientação reversa).

<***> O transcrito ubi-reaper[KR] Fl é previsto como sendotraduzido entre 10126-8359, inclusive de códon de partida e de parada(ubiquitina é de 10126-9988, 8642-8554; reaper[KR] é de 8553-8359); (nota:orientação reversa).

<223> Seqüência de pLA3376 (SEQ ED NO. 55).<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de tTAV2 com íntron Cctra inserido.

2. Região de codificação de tTAV3 com íntron Bztra inserido.

3. Região de codificação de reaper[KR] com íntron Bztrainserido.

<***> íntron Cctra é de posição 3289-1945 em tTAV2 (nota:orientação reversa).

<***> íntron Bztra é de posição 5981-5014 em tTAV3 (nota:orientação reversa).

<***> íntron Bztra é de posição 16391-17358 em reaper[KR].

<***> Transcrito alternativamente emendado tTAV2 começaem segmento derivado de hsp70 de posição -3389 (fragmento hsp70 é de3432-3303); (nota: orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado tTAV3 começaem segmento derivado de sry-alfa de posição -6019 (fragmento sry-alfa é de6243-5999); (nota: orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado reaper[KR]começa em segmento derivado de hunchback de posição -16339 (fragmentohunchback é de 16289-16372).

<***> o transcrito tTAV2 Fl é previsto como sendo traduzidoentre 3292-931, inclusive de códon de partida e de parada (nota: orientaçãoreversa).

<***> q transcrito tTAV3 Fl é previsto como sendo traduzidoentre 5984-4006, inclusive de códon de partida e de parada (nota: orientaçãoreversa).

<***> q transcrito reaper[KR] é previsto como sendotraduzido entre 16385-17550, inclusive de códon de partida e de parada.

<223> Seqüência de pLA3242 (SEQ ID NO. 56).

<***> Aspectos chaves incluem:1. Região de codificação de tTAV com íntron Cctra inserido.

<***> Região de codificação de reaper[KR] com íntron Crtrainserido.

<***> íntron Cctra é de posição 3282-1938 em tTAV (nota:orientação reversa).

<***> Intron Crtra é de posição 5488-4180 em reaperKR(nota: orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado reaperKRcomeça em segmento derivado de hunchback de posição -5540 (fragmentohunchback é de 5590-5507); (nota: orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado tTAV começaem segmento derivado de hsp70 de posição -3382 (fragmento hsp70 é de3425-3296); (nota: orientação reversa).

<***> O transcrito reaperKR Fl é previsto como sendoprincipalmente traduzido entre 4088-5494, inclusive de códon de partida e deparada (nota: orientação reversa).

<***> q transcrito tTAV Fl é previsto como sendoprincipalmente traduzido entre 924-3285, inclusive de códon de partida e deparada (nota: orientação reversa).

<223> Seqüência de pLAl 172 (SEQ ID NO. 106).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de tTAV entre fragmentos derivadosde AaActin4.

<***> Fragmentos derivados de AaActin4 são de 7868-11257e 12366-13100.

<***> O transcrito tTAV é previsto como sendo traduzidoentre 11342-12358, inclusive de códon de partida e de parada.

<***> q transcrito AaActin4-tTAV é previstos para começarna posição -9312.<***> AaActin4 contém um íntron (variante de emenda tipofêmea) de posição 9403-11204.

<223> Seqüência de pLA1038 (Fig. 12).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Fragmento de região de codificação de NipplDm ('nipper')com íntron Cctra inserido com seqüência exônica tra de flanqueamento.

<***> íntron Cctra é de posição 3365-4709 em nipper.

<***> íntron Cctra é flanqueado por seqüência exônica Cctrade posições 3343-3364 e 4710-4729.

<***> Transcrito alternativamente emendado nipper começaem segmento derivado de hsp70 de posição -3243 (fragmento hsp70 é de3200-3329).

<***> O transcrito nipper Fl é previsto como sendo traduzidoentre 3340-5014, inclusive de códon de partida e de parada.

<223> Seqüência de pLA3054 (SEQ ID NO. 158).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de DsRed-ubi-tTAV com íntronCctra inserido com seqüência exônica tra de flanqueamento.

<***> íntron Cctra é de posição 3509-2165 em DsRed-ubi-tTAV (nota: orientação reversa).

<***> íntron Cctra é flanqueado por seqüência exônica Cctrade posições 3531-3510 e 2164-2145 (nota: orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado DsRed-ubi-tTAV começa ou em segmento derivado de hsp70 de posição -3243(fragmento hsp70 é de 4930-4801) ou segmento derivado de Opie2 de posição-4353 (fragmento Opie2 é de 4795-4255); (nota: orientação reversa).

<***> O transcrito DsRed-ubi-tTAV Fl é previsto comosendo traduzido entre 4320-888, inclusive de códon de partida e de parada(DsRed é de 4212-3538; ubiquitina é de 2135-1908; tTAV é de 1907-888);(nota: orientação reversa).

<223> Seqüência de pLA3056 (SEQ ID NO. 159).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de DsRed-ubi-tTAV com íntronCctra inserido com seqüência exônica tra de flanqueamento.

<***> Intron Cctra é de posição 3731-2387 em DsRed-ubi-tTAV (nota: orientação reversa).

<***> Intron Cctra é flanqueado por seqüência exônica Cctrade posições 3753-3732 e 2386-2145 (nota: orientação reversa).

<***> Transcrito alternativamente emendado DsRed-ubi-tTAV começa ou em segmento derivado de hsp70 de posição -5109(fragmento hsp70 é de 5152-5023) ou segmento derivado de Opie2 de posição-4575 (fragmento Opie2 é de 5017-4477); (nota: orientação reversa).

<***> O transcrito DsRed-ubi-tTAV Fl é previsto comosendo traduzido entre 4542-888, inclusive de códon de partida e de parada(DsRed é de 4434-3760; ubiquitina é de 2135-1908; tTAV é de 1907-888);(nota: orientação reversa).

<***> Aspecto incluído:

1. íntron adicional derivado de gene Cctra (segundo íntron detranscrito Cctra Fl) dentro do transcrito Fl previsto de posição 2222-2168(nota: orientação reversa).

<223> Seqüência de pLA3488 (SEQ ID NO. 160).

<***> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de TurboGreen-ubi-DsRed comíntron Cctra inserido.

<***> íntron Cctra é de posição 2263-3607 em TurboGreen-ubi-DsRed.

<***> Transcrito alternativamente emendado TurboGreen-ubi-DsRed começa no segmento derivado de baculovírus de AcMNPV Iel(prematuro imediato 1) em posição ~1180 (fragmento Iel é de 580-1209).

<***> q transcrito TurboGreen-ubi-DsRed Fl é previstocomo sendo traduzido entre 1311-4467, inclusive de códon de partida e deparada (TurboGreen é de 1311-2093; Iigador SG4 é de 2094-2123; ubiquitinaé de 2124-3696, inclusive de íntron Cctra; DsRed é de 3697-4467).

<***> Aspecto incluído:

1. Intron adicional derivado de gene "scraps" de Drosophila("íntron 'scraps'") dentro do transcrito Fl previsto de posição 1224-1286.

<223> Seqüência de pLA3596 (SEQ ID NO. 145).

<* * *> Aspectos chaves incluem:

1. Região de codificação de TurboGreen-ubi-DsRed2 comíntron Cctra inserido.

<***> íntron Cctra é de posição 5947-7291 em TurboGreen-ubi-DsRed2.

<***> TurboGreen-ubi-DsRed2 o transcrito alternativamenteemendado começa no segmento derivado de baculovírus AcMNPV Iel(prematuro imediato 1) em posição -4864 (fragmento Iel é de 4264-4893).

<***> O transcrito TurboGreen-ubi-DsRed2 Fl é previstocomo sendo traduzido entre 4995-8148, inclusive de códon de partida e deparada (TurboGreen é de 4995-5777; Iigador SG4 é de 5778-5807; ubiquitinaé de 5808-7380, inclusive de íntron Cctra; DsRed2 é de 7381-8151).

<***> Aspecto incluído:

1. íntron adicional derivado de gene "scraps" de Drosophila("intron 'scraps"') dentro do transcrito Fl previsto de posição 4908-4970.

2. Mutação de aminoácido destinada para comparar a LA3488de posição 7294-7296.

Claims (44)

1. Sistema de expressão de polinucleotídeos, caracterizadopelo fato de compreender:pelo menos uma seqüência polinucleotídica heterólogacodificando uma proteína funcional, definida entre um códon de partida e umcódon de parada, e/ou polinucleotídeos para RNA interferência (RNAi), a serexpressado em um organismo;pelo menos um promotor ligado operativamente ao mesmo; epelo menos uma seqüência de controle de emenda que, emcooperação com um espliceossoma, é capaz de (i) mediar a emenda de umtranscrito de RNA da seqüência de codificação para dar um primeiro produtode RNA mensageiro (mRNA) emendado, e (ii) mediar pelo menos umaemenda alternativa de referido transcrito de RNA para dar um produto demRNA emendado alternativo;em que, quando a pelo menos uma seqüência polinucleotídicaheteróloga codifica uma proteína funcional, pelo menos um dentre osprodutos de mRNA maduros compreendendo uma matriz de leitura abertacontínua (ORF) se estendendo a partir do referido códon de partida parareferido códon de parada, assim definindo uma proteína, que é referidaproteína funcional, ou está relacionada com referida proteína funcional por,pelo menos, uma deleção de aminoácido e que é funcional quando traduzidae, opcionalmente, sofreu uma modificação pós-translacional;a mediação sendo selecionada dentre o grupo consistindo de:mediação específica de sexo, mediação específica de estágio, mediaçãoespecífica de linhagem germinal, mediação específica de tecido, ecombinações das mesmas.

2. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mediação é específica dosexo.

3. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a seqüênciapolinucleotídica a ser expressada compreende dois ou mais éxons decodificação para a proteína funcional.

4. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a proteína éum marcador, ou tem um efeito letal, deletério ou esterilizante.

5. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína tem um efeito letalresultando em esterilização.

6. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o efeito letal da proteína écondicionalmente suprimivel.

7. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína é selecionada dentreo grupo consistindo de um fator indutor de apoptose, Hid, Reaper (Rpr) eNippl Dm.

8. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o sistemacompreende pelo menos um mecanismo de retro-alimentação positivo, sendopelo menos uma proteína funcional a ser diferencialmente expressada, viaemenda alternativa, e pelo menos um promotor para o mesmo, em que umproduto de um gene a ser expressado serve como um fator de controletranscricional positivo para, pelo menos, um promotor, e assim o produto, oua expressão do produto, é controlável.

9. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 8, caracterizado pelo fato de que um melhorador está associadocom o promotor, o produto de gene servindo para melhorar a atividade dopromotor via o melhorador.

10. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o fator de controle é o produtode gene tTA ou um análogo do mesmo, e em que uma ou mais das unidadesde operador tetO é ligada operativamente com o promotor e é o melhorador,tTA ou seu análogo servindo para melhorar a atividade do promotor via tetO.

11. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a proteínafuncional é, ela mesma, um transativador transcricional, como o sistematTAV, compreendendo tTAV, tTAV2, ou tTAV3.

12. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o promotoré ativado por condições ambientais, por exemplo a presença ou ausência deum fator particular como tetraciclina no sistema tet ou por variação datemperatura ambiental.

13. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que opromotor é selecionado dentre o grupo consistindo de promotor específico doembrião srya, ou seus homólogos, o gene de Drosophila "slow asmolasses " (slam) ou seus homólogos.

14. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de aindacompreender um melhorador.

15. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a mediaçãode emenda alternativa é específica de sexo e a seqüência de controle deemenda é derivada de um intron tra.

16. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a seqüência de controle deemenda é derivada do gene transformer de mosca-do-mediterrâneo Cctra, oude outro ortólogo ou homólogo do gene transformer de Drosophila.

17. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 16, caracterizado pelo fato de que referido outro ortólogo ouhomólogo do gene transformer de Drosophila é de uma mosca tefiítida dafruta.

18. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 17, caracterizado pelo fato de que de que a mosca tefrítida dafruta é C. rosa, ou B. zonata.

19. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que aseqüência de controle de emenda é derivada de mecanismo de emendaalternativa do gene Actin-4.

20. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o gene Actin-4 é de Aedesspp.

21. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o gene Actin-4 é de Aedesaegypti AeActin-4.

22. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que omecanismo de emenda compreende pelo menos um fragmento do genedoublesex (dsx), preferivelmente o derivado de Drosophila, B. mori, lagartarosada, traça das maçãs e pêras, ou um mosquito, particularmente Aedesgambiae ou especialmente Aedes aegypti.

23. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 19 a 22, caracterizado pelo fato de que a seqüência de controlede emenda e a seqüência polinucleotídica heteróloga codificando umaproteína funcional, definida entre um códon de partida e um códon de parada,e/ou polinucleotídeos para RNA interferência (RNAi), a ser expressado emum organismo, são providas na forma de uma construção de minigene ou uméxon de cassete.

24. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sistema é um plasmídeo ouconstrução selecionado dentre o grupo consistindo de qualquer uma dasfiguras 16-18, 22-24, 26-32, 49, 52-55, e 61-69, e/ou SEQ ID NO: 46-48, 50--56, 143-145 e 151-162.

25. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que pelo menosuma seqüência de controle de emenda é intrônica e compreende em suaextremidade 5' nucleotídeo guanina (G), em RNA.

26. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que pelo menosuma seqüência de controle de emenda é intrônica e compreende em suaextremidade 5' nucleotídeos UG e UT em sua extremidade 3', em RNA.

27. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a mediaçãoé específica de sexo e ainda mediada ou controlada por ligação da proteínaTRA ou complexo de proteína TRA/TRA2, ou homólogos das mesmas.

28. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende aseqüência de consenso: TCWWCRATCAACA. em que W = A ou TeR = A ou G.

29. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que oorganismo é um mamífero, um peixe, um invertebrado, um artrópode, uminseto ou uma planta.

30. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que oorganismo é um inseto da Ordem Díptera.

31. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o inseto é uma moscatefrítida das frutas selecionada dentre o grupo consistindo de: mosca-do-mediterrâneo (Ceratis capitata), mosca mexicana das frutas (.Anastrephaludens), mosca oriental das frutas (.Bactrocera dorsalis), mosca da azeitona(.Baetroeera oleae), mosca do melão (.Baetroeera eueurbitae), mosca dasfrutas do natal (Ceratitis rosa), mosca da cereja (Rhagoletis eerasi), mosca-de-queensland (Baetroeera tyroni), mosca-do-pêssego (.Baetroeera zonata),mosca das frutas do Caribe (Anastrepha suspensa) e mosca das frutas da índiaocidental (Anastrepha oblíqua).

32. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o inseto é um mosquito dosgêneros Stegomyia, Aedes, Anopheles ou Culex.

33. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o mosquito é selecionadodentre Aedes aegypti, Aedes albopietus, Anopheles stephenst, Anophelesalbimanus e Anopheles gambiae.

34. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o inseto é selecionado dentreo grupo consistindo de: verme-parafuso do Novo Mundo (Coehliomyiahominivorax), verme-parafuso do Velho Mundo (Chrysomya bezziana), emosca varejeira da ovelha australiana (Lueilia euprina), traça das maçãs epêras (Cydia pomonella), o bicho-da-seda (Bombyx mori), a lagarta-rosada(Peetinophora gossypiellà), a lagarta da couve {Plutella xylostella), amariposa-cigana (.Lymantria díspar), a lagarta da laranja-da-baía (Amyeloistransitella), a lagarta mineira do pessegueiro (Anarsia lineatella), e a broca dahaste do arroz (Tryporyza ineertulas), as traças noctuídas, especialmenteHeliothiane, o besouro japonês (.Popilla japoniea), o besouro branco(Graphognatus spp.), o gorgulho do algodão (Anthonomous grandis), alagarta da raiz do milho {Diabrotica spp), e escaravelho da batateira(.Leptinotarsa decemlineata).

35. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o inseto não é uma drosófila.

36. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo comqualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a expressãoda seqüência polinucleotídica heteróloga leva a uma conseqüência fenotípicano organismo.

37. Sistema de expressão de polinucleotídeos de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a seqüênciapolinucleotídica a ser expressada compreende um polinucleotídeo para RNAinterferência (RNAi).

38. Método de controle da população de um organismo em ummeio ambiente natural para o mesmo, caracterizado pelo fato de compreender:i) reproduzir um lote do organismo,o organismo transportando um sistema de expressão de genescompreendendo um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações1-36, que é um sistema genético letal dominante,ii) distribuir os referidos animais do lote no meio ambiente emum locus para controle da população; eiii) obter um controle da população através da letalidade emestágio prematuro por expressão do sistema letal na descendência que resultada inter-reprodução dos referidos indivíduos no lote com os indivíduos dosexo oposto da população selvagem.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que a letalidade em estágio prematuro é embriônica ou antes damaturidade sexual.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a letalidade em estágio prematuro ocorre de modo prematurono desenvolvimento.

41. Método de acordo com a reivindicação 38 ou 39,caracterizado pelo fato de que o efeito letal do sistema letal é condicional eocorre no referido meio ambiente natural via a expressão de um gene letal, aexpressão de referido gene letal estando sob o controle de uma proteína detransativador reprimível, a referida reprodução ocorrendo sob condiçõespermissivas na presença de uma substância, a substância estando ausente doreferido meio ambiente natural e capaz de reprimir referido transativador.

42. Método de controle biológico, caracterizado pelo fato decompreender:i) reproduzir um lote de organismos machos e fêmeastransformados com o sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações-1-36, sob condições permissivas, permitindo a sobrevivência de machos efêmeas, para dar um agente de controle biológico de sexo dual;ii) opcionalmente antes da próxima etapa impor ou permitircondições restritivas para causar a morte de indivíduos de um sexo e, assim,prover um agente de controle biológico de sexo único compreendendoindivíduos do outro sexo transportando o sistema genético letal condicional;iii) liberar o agente de controle biológico de sexo dual ou desexo único no meio ambiente em um locus para controle biológico; eiv) obter controle biológico através da expressão do sistemagenético na descendência resultante de inter-reprodução dos indivíduos doagente de controle biológico com indivíduos do sexo oposto da populaçãoselvagem.

43. Método de separação de sexos, caracterizado pelo fato decompreender:i) reproduzir um lote de organismos machos e fêmeastransformados com o sistema de expressão como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 36 sob condições permissivas ou restritivas, permitindoa sobrevivência de machos e fêmeas; eii) remover as condições permissivas ou restritivas para induziro efeito letal do gene letal em um sexo e não no outro por emenda alternativaespecífica de sexo do gene letal.

44. Método ou controle biológico ou da população,caracterizado pelo fato de compreender:i) reproduzir um lote de organismos machos e fêmeastransformados com o sistema de expressão de genes como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 36, sob condições permissivas ourestritivas, permitindo a sobrevivência de machos e fêmeas;ii) remover as condições permissivas ou restritivas para induziro efeito letal do gene letal em um sexo e não no outro por emenda alternativaespecífica do sexo do gene letal para obter separação de sexos;iii) esterilizar ou parcialmente esterilizar os indivíduosseparados, eiv) obter referido controle através da liberação de indivíduosestéreis ou parcialmente estéreis separados no meio ambiente natural doorganismo.