BRPI0707920A2 - peptìdeo monomérico, peptìdeo multimérico o compreendendo, seu uso, peptìdeo dimérico, fusão e composição farmacêutica compreendendo o mesmo, bem como métodos de detecção de fcrn in vitro, sinterização de um dìmero de peptìdeo e para purificação de fcrn - Google Patents

peptìdeo monomérico, peptìdeo multimérico o compreendendo, seu uso, peptìdeo dimérico, fusão e composição farmacêutica compreendendo o mesmo, bem como métodos de detecção de fcrn in vitro, sinterização de um dìmero de peptìdeo e para purificação de fcrn Download PDF

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Adam R Mezo
Kevin A Mcdonnell
Cristina Tan A Hehir
Alfredo C Castro
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Syntonix Pharmaceuticals Inc
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Abstract

PEPTIDEO MONOMéRICO, PEPTìDEO MULTIMéRICO O COMPREENDENDO, SEU USO, PEPTIDEO DIMéRICO, FUSãO E COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMPREENDENDO O MESMO, BEM COMO MéTODOS DE DETECçãO DE FcRn in vitro, SINTERIZAçãO DE UM DIMERO DE PEPTIDEO E PARA PURIFICAçãO DE FcRn. A presente presente invenção refere-se a peptídeos que se ligam a FcRn humano e inibem ligação da porção Fc de uma IgG a um FnRn, deste modo modulando os níveis de IgG no soro. As composições e métodos descritos podem ser usados, por exemplo, no tratamento de doenças auto-imunes e distúrbios inflamatórios. A invenção refere-se também a métodos de uso e métodos de fabricação dos peptídeos da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEO MONO-MÉRICO, PEPTÍDEO MULTIMÉRICO O COMPREENDENDO, SEU USO, PEPTÍ-DEO DIMÉRICO, FUSÃO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDEN-DO O MESMO, BEM COMO MÉTODOS DE DETECÇÃO DE FcRn in vitro, SIN-TERIZAÇÃO DE UM DÍMERO DE PEPTÍDEO E PARA PURIFICAÇÃO DE FcRn".
PEDIDOS DE PATENTES ANTERIORES
O presente pedido de patente reivindica prioridade para os Pe-didos de Patente Provisórios U.S. Nos. 60/774.853, depositado em 17 defevereiro de 2006, e 60/805.634, depositado em 23 de junho de 2006, cujosconteúdos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se, em geral, ao campo de imunomodulado-res. Mais especificamente, a invenção refere-se a peptídeos que se ligam ao Receptorneonatal Fc (FcRn) e inibem a ligação do FcRn a uma porção Fc de uma imunoglobu-lina G (IgG), deste modo modulando os níveis de IgG no soro. A invenção refere-seainda a peptídeo moduladores da atividade de FcRn que podem prevenir FcRn defuncionar em mecanismos celulares relacionados à manutenção de níveis de IgG nosoro, medicamentos compreendendo esses peptídeos e métodos de tratamento deum indivíduo para doenças ou distúrbios que podem ser aliviados pela diminuição deníveis de IgG no soro através da administração desses medicamentos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O isotipo de anticorpo mais abundante no soro é IgG, que tem umpapel crítico na mediação de proteção contra patógenos bem como na media-ção de respostas alérgicas e inflamatórias que aceleram recrutamento de com-ponentes do sistema imune para os tecidos, mucosas e superfícies dermais.Junghans, Immunologic Research 16(1):29 (1997). Além disso, IgG é tambémum componente-chave de uma variedade de doenças auto-imunes.
Sob condições normais, a meia-vida de IgG no soro é um perío-do prolongado com relação à meia-vida no soro de outras proteínas doplasma. Por exemplo, a meia-vida no soro de IgG é 5 a 7 dias em camun-dongos e 22-23 dias em seres humanos. Roopenian e outros, J. Immunology170:3528 (2003); Junghans e Anderson, Proc. Nati Acad. Sei. USA 93:5512(1996). Em parte, esta meia-vida longa de IgG é devido à sua ligação ao re-ceptor Fe, FcRn. FcRn se liga à região constante de IgG1 conhecida comoFc. Embora FcRn fosse originalmente caracterizado como um receptor detransporte neonatal para IgG materna, ele também funciona em adultos paraproteger IgG de degradação. FcRn se liga a IgG que sofreu pinocitose paraprotegê-la de Iisossomas degradantes e então a recicla de volta para o com-partimento extracelular. Junghans e Anderson, Proc. Nati Acad. Sei. USA93:5512 (1996), Roopenian e outros, J. Immunology 170:3528 (2003). Se aconcentração de IgG atingir um nível que excede FcRn disponível, IgG não-Iigada não será protegida de mecanismos degradantes e vai conseqüente-mente ter uma meia-vida no soro mais curta. Brambell e outros, Nature203:1352 (1964). Ainda, embora FcRn seja expresso na superfície celular,acredita-se que muito de FcRn seja intracelular e esteja associado commembranas de vesícula endoplásmica, e que a interação entre IgG e FcRnaconteça intracelularmente após IgG sofrer pinocitose para a célula.
Estruturalmente, FcRn existe como um heterodímero compostode uma cadeia leve, chamada cadeia beta (β), e uma cadeia pesada não-covalentemente ligada, chamada cadeia alfa (α). A cadeia leve de FcRn1 queé melhor conhecida como p2-microglobulina (β2ηη), é também um componen-te do complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC I). A cadeia α deFcRn é uma proteína de 46 kD composta de um domínio extracelular que édividido em três subdomínios, α1, a2 e a3; uma região de transmembrana; eum filamento citoplástico relativamente curto. Burmeister e outros, Nature372:336(1994).
FcRn foi primeiro identificado no intestino de rato neonatal ondeele funciona para mediar a absorção de anticorpo IgG do leite da mãe e faci-litar seu transporte para o sistema circulatório. Leach e outros, J. Immuno-Iogy 157:3317 (1996). FcRn foi também isolado de placenta humana ondeele faz a mediação de absorção e transporte de IgG materna para a circula-ção fetal. Em adultos, FcRn é expresso em tecido epitelial (Patentes U.S.Nos. 6.030.613 e 6.086.875), tal como, mas não limitado a, pulmão (Israel eoutros, Immunology 92:69 (1997)), epitélio tubular proximal intestinal e renal(Kobayashi e outros, Am. J. Physiol. (2002); Renal Physioi 282:F358(2002)), bem como superfícies nasal, vaginal e da árvore biliar. Ainda, a ex-pressão ubíqua de FcRn nas células endoteliais é sugestiva de sua impor-tância na homeostase de IgG. Ward e outros, International Immunology15(2): 187 (2002); Ghetie e outros, Eur. J. Immunology 26:690 (1996).
Em geral, FcRn funciona em homeostase de IgG através da an-tagonização do catabolismo de IgG através da ligação à porção Fc de IgG.Uma vez sofrendo pinocitose, IgG é capturada em vacúolos intracelularesque estão começando a se fundir com endossomas iniciais ácidos. Estudoscristalográficos sugerem que a estequiometria do complexo FcRn-IgG sejacomposta de duas moléculas de FcRn para uma IgG (Burmeister e outros,Nature 372:336 (1994)) e ligação das duas moléculas é imaginada acontecerna porção Fc de IgG próximo à interface dos domínios CH2 e CH3 (Burmeis-ter e outros, Nature 372:379 (1994)). O evento de fusão endossomal repre-senta um estágio do curso degradante lisossomal, que degrada ou cataboli-sa biomoléculas complexas contidas dentro do endossoma em componentesconstitutivos. O ambiente de pH baixo do endossoma inicial promove a liga-ção de FcRN à IgG bem como a liberação de qualquer antígeno ligado àIgG. Conseqüentemente, o antígeno é degradado e o complexo FcRn-IgGevita degradação e é por fim reciclado para a superfície celular onde o pHfisiológico do ambiente extracelular promove a liberação da IgG do FcRn.
A fim de estudar as contribuições de FcRn para homeostase deIgG, camundongos foram engenheirados de modo que pelo menos parte dosgenes codificando p2m e cadeia pesada de FcRn foi "inativada" ("knocked-ouf) de modo que essas proteínas não são expressas. O WO 02/43658;Junghans e Anderson, Proc. Nati Acad. Sei. USA 93:5512 (1996). Em am-bas linhagens de camundongo inativado, a meia-vida e a concentração deIgG no soro são drasticamente reduzidas, sugerindo um mecanismo depen-dente de FcRn relacionado com a homeostase de IgG.
A inibição de IgG se ligando a FcRn reduz a meia-vida no sorode IgG através da prevenção da reciclagem de IgG. Deste modo, agentesque bloqueiam ou antagonizam a ligação de IgG a FcRn podem ser usadosem métodos de regulagem, tratamento ou prevenção de distúrbios envol-vendo reações imunes, tal como, por exemplo, doenças e distúrbios auto-imunes e inflamatórias caracterizados pela presença de anticorpos IgG ina-propriadamente expressos. Um exemplo de um método de bloqueio de Fcde IgG se ligando a FcRn envolve a geração de anticorpos de bloqueio paraFcRn. Na verdade, anticorpos capazes de bloqueio da ligação de FcRn comIgG foram gerados usando uma linhagem de camundongo inativado na ca-deia pesada de FcRn (WO 02/43658). Recentemente, peptídeos foram iden-tificados que se ligam a complexos de FcRn. Kolonin e outros, Proc. Natl.Acad Sei. USA 99(20): 13055-60 (2002); Patente U.S. n9 6.212.022. No en-tanto, neste momento agentes adicionais são necessários para regular, tra-tar ou prevenir condições, doenças e distúrbios caracterizados por reaçõesimunes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Deste modo, a presente invenção provê peptídeos que se ligamespecificamente a FcRn e inibem Fc de IgG de se ligar a FcRn, deste modoprevenindo IgG de reciclagem através da prevenção de FcRn de funcionarem seu papel de proteção de IgG de degradação pelos lisossomas. Em mo-dalidades exemplares, os peptídeos se ligam a FcRn e inibem a subclasseIgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4 de Fc de ligação a FcRn.
Em algumas modalidades, os peptídeos da invenção compre-endem a seqüência:
<formula>formula see original document page 5</formula> onde:
- X6 é escolhido de aminoácidos positivamente carregados, ami-noácidos aromáticos, aminoácidos aromáticos positivamente carregados eseus análogos;
- X7 é escolhido de fenilalanina e análogos de fenilalanina,
- X8 e X9 são cada um independentemente escolhidos de glicina,sarcosina, ácido aspártico, D-aminoácidos, ácido α-aminoisobutírico e seusanálogos, ou X8, quando tomado junto com X9, forma um mimético de dipep-tídeo;
- X10 é escolhido de aminoácidos e seus análogos, ou X10,quando tomado junto com X9, forma um mimético de dipeptídeo;
Xi1 é escolhido de tirosina e análogos de tirosina; e
Alternativamente, os peptídeos da invenção podem compreen-der a seqüência:
RrGly-X6-X7-X8-X9-Xio_Xii"R2
onde:
- R1 tem a fórmula X1-X2-X3-X^
onde
- X1 é escolhido de hidrogênio, acila e grupos de proteção deaminoácido;
- X2 está ausente ou é escolhido de um aminoácido e peptídeosde 2-15 aminoácidos de comprimento, e seus análogos;
- X3 está ausente ou é um aminoácido ou análogo dele que écapaz de formar uma ponte com X10, X12 ou X13, onde a ponte é escolhida deuma ponte amino terminal para carbóxi terminal, uma ponte de cadeia lateralpara estrutura principal e uma ponte de cadeia lateral para cadeia lateral;
- X4 está ausente ou é escolhido de um aminoácido, peptídeosde 2-15 aminoácidos de comprimento e seus análogos;
- X6,-X7,-X8,-X9,-X10 e-X11 são conforme acima definido, e
- R2 tem a fórmula -X12-X13-X14-Xis
onde
- X12 está ausente ou é um aminoácido ou análogo dele;
- Xi3 está ausente ou é um aminoácido ou análogo dele;
- X14 está ausente ou é escolhido de um aminoácido, peptídeosde 2-15 aminoácidos de comprimento e análogos deles; e
- X15 é um grupo amino ou um grupo de proteção carbóxi.
Os peptídeos da invenção são tipicamente de pelo menos de 7e até 50 aminoácidos de comprimento. Os peptídeos da invenção podemexistir como um multímero, tal como, por exemplo, um dímero, um trímero ouum tetrâmero. Em algumas modalidades, os peptídeos da invenção podemser mais suscetíveis à pinocitose, que permite ligação mais rápida do peptí-deo e conseqüentemente, menos excreção pelo rim. A invenção refere-seainda a composições farmacêuticas compreendendo um ou mais peptídeosda invenção.
Os peptídeos da invenção podem compreender:
a) uma seqüência de aminoácido escolhida de:
QRFCTGHFGGLYPCNGP (SEQ ID N0:1),GGGCVTGHFGGIYCNYQ (SEQ ID N0:2),KIICSPGHFGGMYCQGK (SEQ ID N0:3),PSYCIEGHIDGIYCFNA (SEQ ID NO: 4) eNSFCRGRPGHFGGCYLF (SEQ ID NO: 5);
b) uma seqüência de aminoácido que é substancialmente idên-tica a uma ou mais de SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ IDN0:4e SEQ ID NO:5;
c) uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80% idênti-ca a uma ou mais de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:4 e SEQ ID NO:5;
d) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ouSEQ ID NO:5 modificada por uma, duas, três, quatro ou cinco mutações pordeleção, substituição ou adição;
e) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ouSEQ ID NO:5 modificada por pelo menos uma substituição de aminoácido,onde o pelo menos um aminoácido é substituído com um aminoácido de o-corrência natural;
f) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ouSEQ ID NO:5 modificada por pelo menos uma substituição de aminoácido,onde o pelo menos um aminoácido é substituído com um D-aminoácido eseus análogos;
g) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ouSEQ ID NO:5 modificada por pelo menos uma substituição de aminoácido,onde o pelo menos um aminoácido é substituído com um aminoácido N-metilado;
h) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ouSEQ ID NO:5 modificada por pelo menos uma substituição de aminoácido,onde o pelo menos um aminoácido é substituído com um aminoácido de o-corrência não-natural; e
i) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ouSEQ ID NO:5 modificada por pelo menos uma substituição de aminoácido,onde o pelo menos um aminoácido é substituído com um mimético de ami-noácido.
A invenção refere-se ainda a um método de regulagem dos ní-veis de IgG no soro de um indivíduo compreendendo administrar ao indiví-duo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compre-endendo um ou mais peptídeos da invenção capazes de ligação a e preven-ção de FcRn de ligação à porção Fc de uma molécula de IgG. Em certasmodalidades, os métodos da invenção são empregados para reduzir a meia-vida de IgG solúvel no soro de um indivíduo. O resultado de administraçãode uma composição da invenção é que a meia-vida de IgG solúvel no sorodo indivíduo é reduzida comparado com a meia-vida de IgG no soro do indi-víduo antes da administração do peptídeo.
A invenção provê ainda métodos para inibição da ligação daporção Fc de uma IgG humana a FcRn para realizar uma diminuição na con-centração no soro da porção de Fc de IgG para um FcRn conforme compa-rado com a concentração no soro de IgG antes do tratamento. O método dediminuição da concentração no soro de IgG compreende administrar ao indi-víduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compre-endendo um ou mais peptídeos da invenção capazes de ligação a FcRn eprevenção de FcRn de se ligar à porção Fc de uma molécula de IgG. Emuma modalidade, a diminuição na concentração no soro de IgG humana épelo menos 5%, tal como uma diminuição de pelo menos 15% ou uma dimi-nuição na concentração no soro de IgG humana de pelo menos 25%.
Uma modalidade da invenção provê um método de tratamentode um indivíduo que tem pelo menos uma doença auto-imune compreen-dendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz deuma composição compreendendo um ou mais peptídeos da invenção capa-zes de ligação a FcRn e prevenção do FcRn de se ligar à porção Fc de umamolécula de IgG. Uma modalidade alternativa da invenção provê um métodode tratamento de um indivíduo com pelo menos um distúrbio inflamatórioatravés da administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamenteeficaz de uma composição compreendendo um ou mais peptídeos da inven-ção capazes de ligação a FcRn e prevenção de FcRn de se ligar à porção Fcde uma molécula de IgG. Em outras modalidades, os métodos da invençãopodem ser usados para prevenir, tratar ou regular uma resposta imune auma proteína terapêutica ou um vetor de terapia de gene.
Modalidades, objetivos e vantagens adicionais da invenção sãomostrados em parte na descrição que segue e em parte serão óbvios a partirda descrição ou podem ser aprendidos através de prática da invenção. Es-sas modalidades, objetos e vantagens da invenção podem ser realizados eatingidos por meio dos elementos e combinações particularmente apontadosnas reivindicações apensas.
Deve ser compreendido que ambas a descrição geral acima e adescrição detalhada que segue são apenas exemplares e explicativas e nãorestritivas da invenção conforme reivindicado.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 mostra as seqüências de cDNA do FcRn de compri-mento completo humano e estruturas de leitura aberta (ORFs) de beta-2 mi-croglobulina (p2m) humana.
A figura 2 mostra uma visão geral da síntese de monômeros depeptídeo aldeído N-terminal (SEQ ID NO:319).
A figura 3 mostra uma visão geral da síntese de dímeros de pep-tídeo através de alquilação redutiva. A síntese do Peptídeo nQ 270 é mostra-da como um exemplo ilustrativo.
A figura 4 mostra uma visão geral da síntese de dímeros de pep-tídeos usando um peptídeo contendo Iigante bis-tiol e um peptídeo bromoa-cetilado. A síntese do Peptídeo n9 100 é mostrada como um exemplo ilustra-tivo. Colchetes horizontais postos acima da seqüência de peptídeo indicam apresença de uma ponte (SEQ ID N0:320).
A figura 5 mostra a síntese de dímeros de peptídeo usando umpeptídeo contendo Iigante tiol e um peptídeo bromoacetilado. A síntese doPeptídeo n5 122 é mostrada como um exemplo ilustrativo. Colchetes hori-zontais postos acima da seqüência de peptídeo indicam a presença de umaponte (SEQ ID N0:320).
A figura 6 mostra a síntese de dímeros de peptídeo usando umIigante contendo diácido. A síntese de Peptídeo n9 283 é mostrada como umexemplo ilustrativo. Colchetes horizontais postos abaixo da seqüência depeptídeo indicam a presença de uma ponte (SEQ ID NO:321).
A figura 7 mostra a síntese de dímeros de peptídeo usando umIigante contendo amina. A síntese de Peptídeo n9 280 é mostrada como umexemplo ilustrativo. Colchetes horizontais postos abaixo da seqüência depeptídeo indicam a presença de uma ponte (SEQ ID NO:321).
A figura 8 mostra a síntese de fusões de peptídeo-Fc usando umpeptídeo aldeído e a proteína CysFc. A síntese do Peptídeo n9 252-Fc émostrada como um exemplo ilustrativo. Colchetes horizontais postos abaixoda seqüência de peptídeo indicam a presença de uma ponte.
A figura 9 mostra a cinética de catabolismo de IgG humana emcamundongos TG32GB (camundongos engenheirados para expressar o F-cRn humano e p2m humana, mas não o FcRn ou β2ηι de murino).
A figura 10 mostra que a cinética de catabolismo de IgG humanabiotinilada em macacos cinomólogos é acelerada seguindo a injeção intra-venosa de Peptídeo n9 270.
A figura 11 mostra os níveis no soro de IgG endógena em ma-cacos cinomólogos seguindo a injeção intravenosa de Peptídeo n9 270.
A figura 12 é uma representação dos resultados mostrados nafigura 11, onde os níveis de IgG de macaco cinomólogo endógena foramnormalizados para t0.
A figura 13 mostra os níveis de albumina no soro endógena emmacacos cinomólogos seguindo a injeção intravenosa de Peptídeo n9 270.
A figura 14 mostra os níveis de IgM endógeno em macacos ci-nomólogos seguindo a injeção intravenosa de Peptídeo ID n9 270.
A figura 15 mostra a cinética de catabolismo de IgG humana emcamundongos TG32B seguindo a injeção intravenosa de Peptídeo n9 231 ePeptídeo n9 252-Fc.
A figura 16 mostra a cinética de catabolismo de IgG humana emcamundongos TG32B seguindo a injeção intravenosa de Peptídeo n9 270.
A figura 17 mostra a cinética de catabolismo de IgG humana emcamundongos TG32B seguindo injeção intravenosa de Peptídeo n9 283.
A figura 18 mostra o peso molecular do Peptídeo n9 289 atravésde análise SDS-PAGE de Peptídeo purificado n9 289 em um gel Tri-Gly a 4-20%. A faixa 1 contém marcadores de peso molecular. A faixa 2 contém ma-terial de partida PEG30KDa não-conjugado. A faixa 3 contém mistura de rea-ção bruta. A faixa 4 contém Peptídeo purificado n9 289.
A figura 19 mostra a cinética de catabolismo de IgG humana emcamundongos TG32B seguindo injeção intravenosa de Peptídeo n9 289.
A figura 20 mostra a cinética de catabolismo de IgG humana bio-tinilada em macacos cinomólogos seguindo injeção intravenosa de 5 mg/kgde Peptídeo n9 283.
A figura 21 mostra a cinética de catabolismo de IgG humana bio-tinilada em macacos cinomólogos seguindo injeção intravenosa de 1 mg/kgde Peptídeo n9 283.
A figura 22 mostra o efeito de Peptídeo n9 283 (5 mg/kg) sobre aconcentração de IgG em macacos cinomólogos.
A figura 23 mostra o efeito do Peptídeo n9 283 (1 mg/kg) sobre aconcentração de IgG em macacos cinomólogos.
A figura 24 mostra o efeito de Peptídeo n9 283 (5 mg/kg,3x/semana, ev) sobre a concentração de albumina em macacos cinomólo-gos.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES
I. Definições
"Afinidade" refere-se às características da interação de ligaçãoentre duas moléculas biologicamente ativas que indica a resistência da inte-ração de ligação. A medição de afinidade é relatada como uma constante dedissociação (K0)1 que é a concentração, normalmente relatada em nM, pMou fM, em uma solução compreendendo uma molécula biologicamente ativana qual a molécula biologicamente ativa começa a não mais se ligar (disso-cia) a seu par de ligação sob condições específicas. Resistência de afinida-de está inversamente relacionada com o valor da Kd-
O termo "aminoácido", conforme aqui usado, refere-se a umcomposto contendo um grupo de ácido carboxílico e um grupo amino. Porexemplo, um aminoácido pode ter a fórmula estrutural H2N-[C(R)(R')]n-C(O)OH, onde η é um inteiro maior do que ou igual a um e R e R' são inde-pendentemente selecionados de hidrogênio e cadeias laterais de aminoáci-do, e onde ReR' podem ser tomados juntos para formarem um anel carbo-cíclico ou heterocíclico. Por exemplo, quando η é igual a um, o aminoácidoda fórmula H2N-[C(R)(R')]-C(0)0H é um alfa aminoácido, e quando η é iguala dois, o aminoácido da fórmula H2N-C(Ri)(R1')-C(R2)(R'2)-C(0)0H é umbeta aminoácido, onde R1, FV1 R2 e R2' são, cada um, independentementeescolhidos de cadeias laterais de aminoácido, e onde R e R', ou R2 e R2',podem ser tomados juntos para formarem um anel carbocíclico ou heterocí-clico. O termo "resíduo de aminoácido", conforme aqui usado, refere-se a umaminoácido que é parte de um peptídeo ou proteína, e tendo a fórmula -N(H)-[C(R)(R')]n-C(0)-. O termo "cadeia lateral de aminoácido" conformeaqui usado refere-se a qualquer cadeia lateral de um aminoácido de ocor-rência natural ou sintético. Por exemplo, metila pode ser referida como umacadeia lateral de alanina, e 2-amino-1-etila pode ser referida como a cadeialateral de ácido 2,4-diaminobutanóico.
Um aminoácido pode ter quiralidade R ou S em qualquer átomoquiral. A convenção Fisher é usada para designar a quiralidade do alfa ami-no carbono de alfa aminoácidos, se o alfa amino carbono for quiral, como ί-ου D-. Um "D-aminoácido" é um aminoácido tendo uma configuração D noalfa carbono. Onde nenhuma configuração for indicada, um versado na téc-nica compreenderia que o aminoácido seria um L-aminoácido. Os aminoáci-dos descritos aqui podem também estar na forma de misturas racêmicas,não-racêmicas e diastereoméricas.
Aminoácidos exemplares podem ser escolhidos dos vinte ami-noácidos codificados e seus análogos, bem como de, por exemplo, outros a-aminoácidos, β-aminoácidos, γ-aminoácidos, δ-aminoácidos e ω-aminoácidos. Aminoácidos não-codificados são bem-conhecidos na técnicade peptídeo, tal como aqueles descritos em M. Bodanszky, Principies ofPeptide Synthesis, 1ã e 2ã ed. rev., Springer-Verlag, Nova York, N.Y. (1984)e (1993) e Stewart e Young1 Solid Phase Peptide Synthesis, 2§ ed., PierceChemical Co., Rockford III, (1984). Aminoácidos codificados e não-codificados e análogos de aminoácido podem ser comprados comercialmen-te da, por exemplo, Novabiochem; Bachem; Sigma Chemical Co.; AdvancedChemtech ou sintetizados usando métodos conhecidos na técnica.
Um aminoácido pode ser escolhido de, por exemplo, alanina, β-alanina, ácido α-aminoadípico, ácido 2-aminobutanóico, ácido A-aminobutanóico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 6-amino hexa-nóico, ácido 2-amino heptanodióico, ácido 7-amino heptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido aminometilpirrol carboxílico, ácido 8-amino-3,6-dioxa-octanóico, ácido aminopiperidinocarboxílico, ácido 3-amino-propiônico, ami-noserina, ácido aminotetraidropiran-4-carboxílico, arginina, asparagina, ácidoaspártico, ácido azetidino carboxílico, benzotiazolilalanina, butilglicina, carni-tina, 4-clorofenilalanina, citrulina, cicloexilalanina, cicloexilstatina, cisteína,ácido 2,4-diaminobutanóico, ácido 2,3-diaminopropiônico, diidroxifenilalani-na, ácido dimetiltiazolidino carboxílico, ácido glutâmico, glutamina, glicina,histidina, homoserina, hidroxiprolina, isoleucina, ácido isonipecótico, leucina,lisina, metanoprolina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, ácido p-aminobenzóico, penicilamina, fenilalanina, fenilglicina, piperidinilalanina, pi-peridinilglicina, prolina, pirrolidinilalanina, sarcosina, selenocisteína, serina,estatina, tetraidropiranglicina, tienilalanina, treonina, triptofano, tirosina, vali-na, alo-isoleucina, alo-treonina, ácido 2,6-diamino-4-hexanóico, ácido 2,6-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, dicarboxidina, homoarginina,homocitrulina, homocisteína, homocistina, homofenilalanina, homoprolina eácido 4-hidrazinobenzóico.
Aminoácidos são geralmente classificados por propriedades dacadeia lateral em quatro grupos: ácido, básico, hidrofílico (polar) e hidrofóbi-co (não-polar). Aminoácidos descritos aqui podem ser identificados por seusnomes completos ou pelos códigos de uma ou três letras padrão correspon-dentes. Códigos de uma letra em letra minúscula são usados para indicarquiralidade D.
Um "análogo de aminoácido" é um aminoácido, ou um miméti-co de molécula pequena de um aminoácido, que compartilha uma química,carga, estérica ou outra propriedade comum de um dado aminoácido. Porexemplo, análogos de alanina incluem, por exemplo, β-alanina, etilglicina,ácido α-aminobutírico e D-alanina; análogos de cisteína incluem, por exem-pio, homocisteína, D-cisteína e penicilamina; análogos de fenilalanina inclu-em, por exemplo, 3-fluorfenilalanina, 4-metilfenilalanina, fenilglicina, 1-naftilalanina e 3,3-difenilalanina, 4-aminofenilalanina, pentafluorfenilalanina,2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-nitrofenilalanina, 2-pirrolidinilalanina, 3-piperidilalanina, 4-piperidilalanina; e análogos de histidina incluem por e-xemplo, 1-metilistidina, ácido 2,4-diaminobutírico, tiazolilalanina, ácido 2,3-diaminopropiônico, guanilalanina, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, A-piridilalanina, tienilalanina, ornitina, 4-guanilfenilalanina e A-aminofenilalanina.
"Grupo de proteção amino", conforme aqui usado, refere-se aqualquer substituinte que pode ser usado para prevenir um grupo amino emuma molécula de sofrer uma reação química enquanto mudança químicaacontece em outro local na molécula. Um grupo de proteção amino pode serremovido sob as condições químicas apropriadas. Vários grupos de proteçãoamino são conhecidos daqueles versados na técnica, e exemplos de gruposde proteção amino, métodos para sua adição e métodos para sua remoçãopodem ser encontrados em T.W. Green, Protective Groups in Organic Syn-thesis, John Wiley and Sons, Nova York, 1991; Capítulo 7, M. Bodanszky,Principies of Peptide Synthesis, 1ãe2§ ed. revisadas, Springer-Verlag, NovaYork, N.Y. (1984) e (1993) e Stewart e Young, Soiid Phase Peptide Synthe-s/s, 2à ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill (1984), cujas revelações sãoaqui incorporadas a título de referência. O termo "amino(monossubstituído)protegido" significa que há um grupo de proteção amino no átomo de nitro-gênio amino(monossubstituído). Ainda, o termo "carboxamida protegida" sig-nifica que há um grupo de proteção amino na nitrogênio carboxamida. E-xemplos de tais grupos de proteção amino incluem o grupo formila ("For"), ogrupo tritila, o grupo ftalimido, o grupo tricloroacetila, os grupos cloroacetila,bromoacetila e iodoacetila, grupos de bloqueio do tipo uretano, tal como t-butoxicarbonila ("Boc"), 2-(4-bifenil)propil-2-oxicarbonila ("Bpoc"), 2-fenilpropil-2-oxicarbonila ("Poc"), 2-(4-xenil)isopropoxicarbonila, 1,1-difenile-til-1 -oxicarbonila, 1,1 -difenilpropil-1 -oxicarbonila, 2-(3,5-dimetoxifenil)propil-2-oxicarbonila ("Ddz"), 2-(p-toluil)propil-2-oxicarbonila, ciclopentaniloxicarboni-Ia, 1-metilciclopentaniloxicarbonila, cicloexaniloxicarbonila, 1-metilcicloexa-niloxicarbonila, 2-metilcicloexaniloxicarbonila, 2-(4-tolílsulfonil)-etoxicarbonila,2-(metilsulfonil)etoxicarbonila, 2-(trifenilfosfino)-etoxicarbonila, 9-fluorenilme-toxicarbonila ("Fmoc"), 2-(trimetilsilil)etoxicarbonila, aliloxicarbonila, 1-(trimetilsililmetil)prop-l-eniloxicarbonila, 5-benzisoxalilmetoxicarbonila, A-acetoxibenzil-oxicarbonila, 2,2,2-tricloroetoxicarbonila, 2-etinil-2-propoxicar-bonila, ciclopropilmetoxicarbonila, isoborniloxicarbonila, 1-piperidinocarbo-nila, benziloxicarbonila ("Cbz"), 4-fenilbenziloxicarbonila, 2-metilbenziloxicar-bonila, a-2,4,5-tetrametilbenziloxicarbonila ("Tmz"), 4-metoxibenziloxicar-bonila, 4-fluorbenziloxicarbonila, 4-clorobenziloxicarbonila, 3-clorobenzi-oxicarbonila, 2-clorobenziloxicarbonila, 2,4-diclorobenziloxicarbonila, A-bromobenziloxicarbonila, 3-bromobenziloxicarbonila, 4-nitrobenzilóxi-carbo-nila, 4-cianobenziloxicarbonila, 4-(deciloxi)benziloxicarbonila e similar; o gru-po benzoilmetilsulfonila, ditiassuccinoíla ("Dts"), o grupo 2-(nitro)fenilsulfenila("Nps"), o grupo de oxido de difenil-fosfina e grupos de proteção amino simi-lares. Por exemplo, grupos de proteção amino podem ser escolhidos de Boc,Cbz e Fmoc. Mais de uma variedade de grupo de proteção amino pode serempregada contanto que o grupo amino derivado seja estável às condiçõesda(s) reação(ões) subsequente(s) e possa ser removido no ponto apropriadosem romper o restante dos compostos.
O termo "aromático", conforme aqui usado, refere-se a um sis-tema de anel aromático mono-, bi- ou outro multi-carbocíclico. O grupo aro-mático pode opcionalmente ser fundido a um ou mais anéis escolhidos dearomáticos, cicloalquilas e heterociclilas. Aromáticos podem ter de 5-14membros, tal como, por exemplo, de 5-10 membros no anel. Um ou maisátomos de hidrogênio podem ser também substituídos por um grupo substi-tuinte selecionado de acila, acilamino, acilóxi, alquenila, alcóxi, alquila, alqui-nila, amino, aromático, arilóxi, azido, carbamoíla, carboalcóxi, carbóxi, car-boxiamido, carboxiamino, ciano, cicloalquila, amino dissubstituído, formila,guanidino, halo, heteroarila, heterociclila, hidróxi, iminoamino, amino monos-substituído, nitro, oxo, fosfonamino, sulfinila, sulfonamino, sulfonila, tio, tioa-cilamino, tioureído e ureído. Exemplos não-limitantes de grupos aromáticosincluem fenila, naftila, indolila, bifenila e antracenila.
Um "aminoácido aromático", conforme aqui usado, é um ami-noácido tendo uma cadeia lateral que compreende uma estrutura de anelaromático. Aminoácidos aromáticos incluem, por exemplo, histidina, tirosina,triptofano, fenilalanina, 1-naftilalanina e 4-piridilalanina.
"Grupo de proteção carbóxi" refere-se a um dos derivados deéster do grupo de ácido carboxílico geralmente empregado para bloquear ouproteger o grupo de ácido carboxílico enquanto reações são realizadas emoutros grupos funcionais no composto. Exemplos de tais grupos de proteçãode ácido carboxílico incluem t-butila, 4-nitrobenzila, 4-metoxibenzila, 3,4-dimetilbenzila, 2,4-dimetoxibenzila, 2,4,6-trimetoxibenzila, 2,4,6-trimetilben-zila, pentametilbenzila, 3,4-metilenodioxibenzila, benzidrila, 4,4'-dimetoxini-thia, 4,4',4"-trimetoxinitrila, 2-fenilpropila, trimetilsilila, t-butildimetilsilila, fena-cila, 2,2,2-tricloroetila, p-(trimetilsilil)etila, beta-(di(n-butil)metilsilil)etila, p-toluenossulfoniletila, 4-nitrobenzilsulfoniletila, alila, cinamila, 1-(trimetilsilil-metil)-propenila e porções similares. A espécie de grupo de proteção carbóxiempregada não é crítica contanto que o ácido carboxílico derivatizado sejaestável às condições de reação(ões) subsequente(s) e possa ser removidono ponto apropriado sem romper o restante da molécula. Exemplos adicio-nais desses grupos são encontrados em E. Haslam, Protective Groups inOrganic Chemistry, J.G.W. McOmie, Ed., Plenum Press, Nova York, N.Y.(1973), Capítulo 5, e T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis,2ã ed., John Wiley and Sons, Nova York, N.Y. (1991), Capítulo 5. Um termorelacionado é "carbóxi protegido", que refere-se a um grupo carbóxi substitu-ído com um dos grupos de proteção carbóxi acima descritos.
"Ligar", "ligação" e "ligado" refere-se a uma interação não-covalente entre um polipeptídeo e outra molécula biologicamente ativa que édependente da complementaridade estérica e química das duas moléculas.
A complementaridade estérica e química de polipeptídeos é determinada poruma seqüência de aminoácido específica.
"Moléculas biologicamente ativas" refere-se a peptídeos, ácidosnucléicos e/ou moléculas pequenas, tal como moléculas orgânicas ou inor-gânicas pequenas bem como seus fragmentos, capazes de tratar uma doen-I ça ou condição através da realização de uma função ou uma ação, ou esti-mulação ou resposta a uma função, uma ação ou uma reação, em um con-texto biológico (por exemplo, em um organismo, uma célula ou um modelo invitro dela).
Uma "ponte" refere-se a uma ligação covalente entre dois ami-noácidos não-adjacentes, análogos de aminoácido ou outras porções quími-cas em um peptídeo. A ponte pode ser, por exemplo, uma ponte de estruturaprincipal para estrutura principal, cadeia lateral para estrutura principal, oucadeia lateral para cadeia lateral. A ponte pode ser preparada através deuma reação de ciclização que resulta na formação de uma nova ligação a-mida, éster, éter, tioéter, alceno ou dissulfeto. Uma ponte de estrutura princi-pal para estrutura principal, por exemplo, resulta da formação de uma Iacta-ma nos terminais N- e G-.
Um "peptídeo cíclico" refere-se a um peptídeo tendo uma Iiga-ção intramolecular ligando em ponte dois aminoácidos não-adjacentes.
Um "dímero" de peptídeo, conforme aqui usado, é uma molécu-la compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia de peptídeo quepodem ser iguais ou diferentes. O dímero pode compreender ainda pelo me-nos um Iigante opcional ao qual os dois peptídeos são covalentemente Iiga-dos.
Um "mimético de dipeptídeo" é substancialmente similar (porexemplo, substancialmente isostérico, ou tendo uma posição ou orientaçãosubstancialmente similar) a um dipeptídeo tal como, por exemplo, glicilglici-na. O mimético de dipeptídeo pode compreender qualquer combinação demoléculas ligadas contanto que as limitações estruturais listadas acima se-jam reconhecidas. Miméticos de polipeptídeo podem ter uma ou mais Iiga-ções de peptídeo opcionalmente substituídas por uma ligação selecionadade, por exemplo: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- (eis e trans) -COCH2-CH(OH)CH2)- e -CH2 SO-, através de métodos bem-conhecidos natécnica. O versado na técnica vai reconhecer que miméticos de dipeptídeopodem incluir, por exemplo, miméticos de β-turn. Vide, por exemplo, R.M.Friedinger, J. Med. Chem. 46:5553-5566 (2003) e S. Hanessian, Tetrahedron53:12789-12854(1997).
Exemplos não-limitantes de miméticos de dipeptídeo incluem:
<formula>formula see original document page 18</formula>
(lactama de D1L-Friedinger);
(Inserir formula pg. 21)<formula>formula see original document page 19</formula>
(lactama de L,L-Friedinger)
- ácido (3S)-3-amino-2-oxo-1-piperidina-acético e ácido (3R)-3-amino-2-oxo-1-piperidina-acético;
- ácido (3S)-3-amino-2-oxo-1-azepina acético e ácido (3R)-3-amino-2-oxo-1-azepina acético;
- ácido (3S)-3-amino-2-oxo-1-pirrolidina acético e ácido (3R)-3-amino-2-oxo-1-pirrolidina acético;
- (3R)-3-amino-1-carboximetil-valerolactama; e
- 3-amino-N-1 -carboximetil-2,3,4,5-tetraidro-1 H-[1 ]-benzazepin-2-ona.
O termo "ponte dissulfeto" refere-se à ligação covalente forma-da entre os grupos sulfidrila (isto é, tiol ou mercaptano) de 2 aminoácidos (talcomo, por exemplo, cisteína, penicilamina e homocisteína) quando da oxida-ção. Uma ponte dissulfeto pode ligar em ponte dois aminoácidos contidos nomesmo peptídeo linear, resultando na ciclização do peptídeo linear. Umaponte dissulfeto pode também ser formada entre dois peptídeos, deste modoproduzindo um dímero de peptídeo.
Um "domínio" é uma região de um peptídeo ou peptídeos tendoalguma característica física ou papel distintivo incluindo, por exemplo, umaestrutura independentemente dobrada composta de uma seção de uma ca-deia de peptídeo. Um domínio pode se ligar a outro domínio que é igual oudiferente. Um domínio pode conter a seqüência da característica física distin-tiva do peptídeo ou ele pode conter um fragmento da característica físicaque retém suas características de ligação (isto é, ele pode se ligar a um se-gundo domínio).
"Dose eficaz", "quantidade eficaz", "quantidade terapeutica-mente eficaz" e similar referem-se a uma quantidade de um agente suficien-te para prover uma mudança fisiológica, farmacológica e/ou cognitiva dese-jada que pode variar dependendo do paciente, da doença e do tratamento. Aquantidade pode ser ou uma dose para o tratamento de um indivíduo acredi-tado ter um distúrbio particular, caso onde ela deve suficientemente aliviarou melhorar os sintomas do distúrbio ou condição, ou pode ser uma doseprofilática, caso onde ela deve ser suficiente para prevenir, parcialmente oucompletamente, o aparecimento de sintomas no indivíduo.
O termo "fusão", conforme aqui usado, refere-se a um conjuga-do covalente entre um peptídeo da invenção e outra molécula, que pode ser,por exemplo, uma proteína, um peptídeo, uma molécula pequena, um polí-mero (por exemplo, polietileno glicol ou um polissacarídeo) ou um ácido nu-cléico. Uma fusão de peptídeo-molécula pequena ou peptídeo-polímero po-de ser preparada sinteticamente, enquanto uma fusão de peptídeo-proteínaou peptídeo-peptídeo pode ser preparada através de conjugação química ouatravés de expressão em uma célula hospedeiro apropriada.
Os termos "modula", "modulando" e "modulação" referem-se aoaumento ou diminuição de um nível de um peptídeo ativo. Modulação podeacontecer direta ou indiretamente.
O termo "multímero", conforme aqui usado, refere-se a uma mo-lécula compreendendo cadeias de peptídeo múltiplas, que podem ser iguaisou diferentes. O multímero pode compreender ainda pelo menos um Iiganteopcional ao qual pelo menos dois peptídeos estão covalentemente ligados.
Um multímero pode ser, por exemplo, um dímero, trímero ou tetrâmero. UmIigante pode ser, por exemplo, um Iigante bis-tiol, um Iigante tris-tiol, um Ii-gante tetratiol, um Iigante ácido carboxílico, um Iigante ácido tricarboxílico,um Iigante ácido tetracarboxílico, um Iigante amina, um Iigante triamina ouum Iigante tetraamina.
O termo "peptídeo" refere-se a moléculas compreendendo ami-noácidos, incluindo, por exemplo, LeD aminoácidos, linearmente acopladosatravés de ligações amida. Peptídeos podem adicionalmente conter deriva-dos de aminoácido ou porções não-aminoácido tal como, por exemplo, mi-méticos de dipeptídeo. Um peptídeo da invenção pode variar de a partir de,por exemplo, 2-100, 5-30, 7-50, 10-30 ou 1-50 aminoácidos (inclusive) decomprimento, tal como, por exemplo, de a partir de 11-35 aminoácidos. Pep-tídeos podem compreender modificações adicionais tal como, por exemplo,glicosilação, acetilação, fosforilação, PEGuilação, lipidação ou conjugaçãocom uma molécula orgânica ou inorgânica.
"Positivamente carregado", conforme aqui usado, refere-se aum aminoácido, mimético de aminoácido ou porção química que é positiva-mente carregado em um pH maior do que 6, tal como, por exemplo, de apartir de pH 6-8, 6-9, 7-8 ou 7-9. Por exemplo, aminoácidos positivamentecarregados incluem lisina, arginina e ácido 2,4-diaminobutírico.
O termo "aminoácido aromático positivamente carregado" refe-re-se a um aminoácido que é positivamente carregado em um pH maior doque 6, tal como, por exemplo, de a partir de pH 6-8, 6-9, 7-8 ou 7-9. Por e-xemplo, aminoácidos aromáticos positivamente carregados incluem histidina,4-aminofenilalanina e 4-guanilfenilalanina.
Uma seqüência de aminoácido que é "substancialmente idênti-ca" a uma dada seqüência pode ser, por exemplo, pelo menos 60%,64%,70%, 75%, 76%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 94%, 95%, 97%, 98% ou99% idêntica à dada seqüência. Ela pode ser derivada da dada seqüênciaatravés de truncamento, deleção, substituição ou adição de pelo menos umaminoácido e/ou pode diferir de uma dada seqüência através de, por exem-plo, adição, deleção ou substituição de pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8aminoácidos.
"Tratar", "tratamento" e "tratando" refere-se à redução na seve-ridade ou duração de uma doença ou condição; à melhora de um ou maissintomas associados com uma doença ou condição; à provisão de efeitosbenéficos a um indivíduo com uma doença ou condição, sem necessaria-mente cura da doença ou condição; ou à prevenção de uma doença ou condição.
Um "trímero" de peptídeo é uma molécula compreendendo pri-meira, segunda e terceira cadeias de peptídeo, que podem ser iguais ou di-ferentes. Um trímero de peptídeo pode compreender ainda pelo menos umligante opcional ao qual pelo menos dois dos peptídeos estão covalentemen-te ligados.
II. Peptídeos da Invenção
Os peptídeos da invenção foram avaliados com base em afini-dade relativa para FcRn e capacidade em bloquear a porção Fc de IgG deligação a FcRn. Peptídeos que demonstram a habilidade em se ligar a FcRne/ou bloquear a ligação de FcRn à porção Fc de IgG compartilham certasigualdades de seqüência ou características. Então, uma modalidade da in-venção provê um peptídeo capaz de inibição da ligação da porção Fc deuma IgG humana a receptor neonatal Fc humano, compreendendo a se-qüência:
<formula>formula see original document page 22</formula> onde:
- X6 é escolhido de aminoácidos positivamente carregados, ami-noácidos aromáticos, aminoácidos aromáticos positivamente carregados eseus análogos;
- X7 é escolhido de fenilalanina e análogos de fenilalanina,
- X8 e X9 são cada um independentemente escolhidos de glicina,sarcosina, ácido aspártico, D-aminoácidos, ácido α-aminoisobutírico e seusanálogos, ou X8, quando tomado junto com X9, forma um mimético de dipep-tídeo;
- X10 é escolhido de aminoácidos e seus análogos, ou X10,quando tomado junto com X9, forma um mimético de dipeptídeo;
- Xn é escolhido de tirosina e análogos de tirosina; eem certas modalidades, o peptídeo varia de a partir de 7 a 50aminoácidos de comprimento e se liga a FcRn humano, prevenindo FcRn dese ligar à IgG humana.
Em uma modalidade exemplar, um peptídeo da invenção com-preende:
<formula>formula see original document page 22</formula>
Em outra modalidade, peptídeos da invenção podem ser repre-sentados pela fórmula:R1 -Gly-X6-X7-X8-X9-X10-X11-R2
onde:
- R1 tem a fórmula X1-X2-X3-X4-onde
- X1 é escolhido de hidrogênio, acila e grupos de proteção deaminoácido;
- X2 está ausente ou é escolhido de um aminoácido e peptídeosde 2-15 aminoácidos de comprimento;
- X3 está ausente ou é um aminoácido que é capaz de formaruma ponte com X10, X12 ou X13, onde a ponte é escolhida de uma ponte ami-no terminal para carbóxi terminal, uma ponte de cadeia lateral para estruturaprincipal e uma ponte de cadeia lateral para cadeia lateral;
- X4 está ausente ou é escolhido de um aminoácido e peptídeosde 2-15 aminoácidos de comprimento;
-X6, -X7, -X8, -X9, -Xi0e -X11 são conforme acima definido, e
- R2 tem a fórmula -Xi2-Xi3-Xi4-X-i5onde
- Xi2 está ausente ou é um aminoácido;
-X13 está ausente ou é um aminoácido;
- X14 está ausente ou é escolhido de um aminoácido e peptídeosde 2-15 aminoácidos de comprimento; e
- X15 é um grupo amino ou um grupo de proteção carbóxi.
O termo "aminoácido" conforme usado para definir os peptídeosda invenção inclui análogos de aminoácido.
Em uma modalidade, X6 é um aminoácido positivamente carre-gado escolhido de lisina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido 2,3-diaminopropiônico, arginina, guanilalanina e seus análogos. Em outra moda-lidade, X6 é um aminoácido aromático escolhido de tirosina, triptofano, fenila-lanina e seus análogos. Em outra modalidade, X6 é um aminoácido aromáti-co positivamente carregado escolhido de histidina, 1-metil histidina, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-piridilalanina, 4-aminofenilalanina, 4-guanilfenilalanina, tiazolilalanina e seus análogos. Em outra modalidade, X6é 4-guanilfenilalanina. Em outra modalidade, X6 é escolhido de histidina, 3-piridilalanina, 4-piridilalanina, 4-guanilfenilalanina e seus análogos.
Análogos de histidina exemplares são escolhidos de, mas nãolimitados a: ácido diaminobutírico; tiazolilalanina; ácido 2,3-diaminopropiônico; guanilalanina; 2-piridilalanina; 3-piridilalanina; tienilalani-na; ornitina; 4-guanilfenilalanina; 1-metil histidina; 4-aminofenilalanina; 2-pirrolidinilalanina; 3-piperidilalanina; e 4-piperidilalanina.
Derivados de fenilalanina exemplares podem ser escolhidos de,mas não limitados a, 4-aminofenilalanina; pentafluorfenilalanina; 2-piridilalanina; 3-piridilalanina; 4-nitrofenilalanina; 1-naftilalanina; homofenila-lanina; fenilglicina; 2-metilfenilalanina; 3-metilfenilalanina; 4-metilfenilalanina;2-clorofenilalanina; 3-clorofenilalanina; 4-clorofenilalanina; 3,3-di-fenilalanina;4,4-bi-fenilalanina; 4-t-butilfenilalanina; cicloexilalanina; (4-aminoacetil)-fenilalanina; ácido L-1,2,3,4-tetraidroisoquinolino-3-carboxílico; D-betametilfenilalanina; e L-betametilfenilalanina.
Em uma modalidade, Xi0 é escolhido de aminoácidos neutros ehidrofóbicos, e seus análogos.
Em uma modalidade, X2 é escolhido de um aminoácido e pep-tídeos de 2 ou 3 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, X2 in-clui pelo menos um aminoácido hidrofóbico. Em outra modalidade, X2 é umaminoácido ou um peptídeo de 2-15 aminoácidos de comprimento, onde oaminoácido carbóxi-terminal é um aminoácido hidrofóbico.
Em uma modalidade, X4 é um aminoácido ou peptídeo de 2-15aminoácidos de comprimento, onde o aminoácido carbóxi terminal é N-metilado.
Em uma modalidade, o peptídeo é linear. Em outra modalidade,pelo menos um de X10, X12 ou Xi3 é um aminoácido que é capaz de formaruma ponte com X3, onde a ponte é escolhida de uma ponte de terminal ami-no para terminal carbóxi, uma ponte de cadeia lateral para estrutura principale uma ponte de cadeia lateral para cadeia lateral. Em uma modalidade, aponte é uma ponte de cadeia lateral para cadeia lateral, que pode ser umaponte dissulfeto, uma ponte éter, uma ponte tioéter, uma ponte alceno ouuma ponte amida.
Em uma modalidade, a ponte de cadeia lateral para cadeia la-teral é uma ponte dissulfeto entre: cisteína e cisteína, cisteína e homocisteí-na; cisteína e penicilamina; homocisteína e homocisteína; homocisteína epenicilamina; ou penicilamina e penicilamina. Em outra modalidade, a pontede cadeia lateral para cadeia lateral é uma ponte amida entre: ácido aspárti-co e lisina; ácido aspártico e ornitina; ácido aspártico e ácido 2,4-diaminobutírico; ácido aspártico e ácido 2,3-diaminobutírico; ácido glutâmicoe lisina; ácido glutâmico e ornitina; ácido glutâmico e ácido 2,4-diaminobutírico; ou ácido glutâmico e ácido 2,3-diaminopropiônico.
Em uma modalidade, o peptídeo compreende pelo menos umacisteína (por exemplo, em X3) ou análogo de cisteína escolhido de: homocis-teína, D-cisteína e penicilamina.
Em uma modalidade, pelo menos um de X8 e X9 é um D-aminoácido ou é escolhido de: glicina, ácido α-aminoisobutírico e sarcosina.
Em uma modalidade, X8, tomado junto com X9, forma um mi-mético de dipeptídeo escolhido de:
- beta-alanina;
- ácido 4-aminobutanóico;
- ácido 5-aminopentanóico;
- ácido 3-(aminometil)benzóico;
- ácido 4-(aminometil)benzóico;
- ácido 3-(aminofenil)acético;
- ácido 4-(aminofenil)acético;<formula>formula see original document page 26</formula>
- ácido 3-amino-2-oxo-1-piperidina-acético;
- ácido (3S)-3-amino-2-oxo-1-piperidina-acético e ácido (3R)-3-amino-2-oxo-1-piperidina-acético;
- ácido (3S)-3-amino-2-oxo-1-azepina acético e ácido (3R)-3-amino-2-oxo-1-azepina acético;
- ácido (3S)-3-amino-2-oxo-1-pirrolidina acético e ácido (3R)-3-amino-2-oxo-1-pirrolidina acético;
- (3R)-3-amino-1-carboximetil-valerolactama; e
- 3-amino-N-1 -carboximetil-2,3,4,5-tetraidro-1 H-[1 ]-benzazepin-2-ona.
Em algumas modalidades, o peptídeo compreende pelo menosum análogo de fenilalanina escolhido de: triptofano; tirosina; 2-aminofenilalanina; 3-aminofenilalanina; 4-aminofenilalanina; pentafluorfenila-lanina; 2-piridilalanina; 3-piridilalanina; 4-nitrofenilalanina; 1-naftilalanina;homofenilalanina; fenilglicina; 2-metilfenilalanina; 3-metilfenilalanina; A-metilfenilalanina; 2-clorofenilalanina; 3-clorofenilalanina; 4-clorofenilalanina;3,3-difenilalanina; 4,4'-bifenilalanina; 4-t-butilfenilalanina; cicloexilalanina; (4-aminoacetil)fenilalanina; ácido L-1,2,3,4-tetraidroisoquinolino-3-carboxílico;D-beta-metilfenilalanina; e L-beta-metilfenilalanina.
Em algumas modalidades, o peptídeo compreende pelo menosum análogo de tirosina escolhido de: fenilalanina; 4-aminofenilalanina; A-metoxifenilalanina; pentafluorfenilalanina; 2-piridilalanina; 3-piridilalanina; A-piridilalanina; 4-nitrofenilalanina; 2-nitrotirosina; e 4-fluorfenilalanina.
Em uma modalidade, X9 e X10l tomados juntos, formam ummimético de dipeptídeo escolhido de:<formula>formula see original document page 27</formula>
- Lactama de D1L-Friedinger
<formula>formula see original document page 27</formula>
- Lactama de L,L-Friedinger
Em certas modalidades, o peptídeo da invenção compreendepelo menos um análogo de histidina escolhido de: ácido 2,4-diaminobutírico;tiazolilalanina; ácido 2,3-diaminopropiônico; guanilalanina; 2-piridilalanina; 3-piridilalanina; 4-piridilalanina; tienilalanina; ornitina; lisina; arginina; 4-guanilfenilalanina; 1-metil histidina; 3-metil histidina; 1,3-dimetil histidina; 4-aminofenilalanina; 2-pirrolidinilalanina; 3-piperidilalanina; e 4-piperidilalanina.
Em certas modalidades, o número de aminoácidos entre aque-les aminoácidos que formam uma ponte varia de a partir de 6-12. Em outrasmodalidades, oito ou nove aminoácidos existem entre aminoácidos formandouma ponte.
Em algumas modalidades, os peptídeos da invenção são pelomenos sete e até 50 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidadesos peptídeos são de 11 a 35 aminoácidos de comprimento.
Em certas modalidades, os peptídeos da invenção existem co-mo um multímero, tal como um dímero, um trímero ou um tetrâmero. Ospeptídeos de um multímero podem ser iguais ou diferentes.
Em uma modalidade, o peptídeo é um dímero, tal como um dí-mero que é o produto de alquilação redutiva. Em outra modalidade, o dímeroé o produto de uma reação entre monômeros de peptídeo individuais e umIigante multivalente. Em uma modalidade, o Iigante multivalente é escolhidode Iigantes tiol, ácido, álcool e amina. Em outra modalidade, o dímero é oproduto de uma reação de alquilação tal como, por exemplo, a reação dealquilação de um tiol e um haleto de alquila.
Em uma modalidade, os peptídeos são sintetizados na resina,e então multimerizados (por exemplo, dimerizados) através de reação comum Iigante multivalente, tal como, por exemplo, um Iigante multivalente ácidoou amina, conforme descrito no Exemplo 15.
Em algumas modalidades, o peptídeo da invenção compreendepelo menos 2 das modificações descritas acima.
Em certas modalidades, os peptídeos da invenção compreen-dem:
a) uma seqüência de aminoácido escolhida de:QRFCTGHFGGLYPCNGP (SEQ ID NO:1),GGGCVTGHFGGIYCNYQ (SEQ ID NO:2),KIICSPGHFGGMYCQGK (SEQ ID NO:3),PSYCIEGHIDGIYCFNA (SEQ ID NO: 4) eNSFCRGRPGHFGGCYLF (SEQ ID NO: 5);
b) uma seqüência de aminoácido que é substancialmente idên-tica a uma ou mais de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO:4 e SEQ ID NO:5.
Em algumas modalidades, o peptídeo compreende uma se-qüência de aminoácido que é pelo menos 64%, pelo menos 70%, pelo me-nos 76%, pelo menos 82%, pelo menos 88%, pelo menos 94% ou 100% i-dêntica a uma ou mais das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5. Em outras modalidades, o peptídeo da inven-ção pode compreender SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO:4 ou SEQ ID NO:5 tendo pelo menos uma ou até cinco mutações de de-leção, substituição ou adição. Todos os peptídeos da invenção inibem a liga-ção de FnRn humano à IgG.
Em algumas modalidades, um peptídeo da invenção pode com-preender SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4 ou SEQID NO:5 modificada por pelo menos uma substituição de aminoácido conser-vativa. Em certas modalidades, um peptídeo da invenção pode compreenderSEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5modificada por pelo menos uma substituição de aminoácido, onde o aminoá-cido é substituído com um aminoácido de ocorrência natural. Em algumasmodalidades, um peptídeo da invenção pode ter SEQ ID N0:1, SEQ IDN0:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0:4 ou SEQ ID N0:5 modificada por pelomenos uma substituição de aminoácido, onde o aminoácido é substituídocom um D-aminoácido. Em algumas modalidades, um peptídeo da invençãopode ter SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0:4 ou SEQID NO:5 modificada por pelo menos uma substituição de aminoácido, onde oaminoácido é substituído com um aminoácido N-metilado. Em algumas mo-dalidades, um peptídeo da invenção pode ter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5 modificada por pelo menosuma substituição de aminoácido, onde o aminoácido é substituído com umaminoácido de ocorrência não-natural. Em certas modalidades, um peptídeoda invenção pode ter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO:4 ou SEQ ID N0:5 modificada por pelo menos uma substituição de ami-noácido, onde o aminoácido é substituído com um mimético de aminoácido.
Alternativamente, os peptídeos da invenção podem compreen-der uma seqüência de aminoácido escolhida da Tabela 1 que é capaz de seligar a FcRn, deste modo inibindo ligação de FcRn à porção Fc de uma mo-lécula de IgG. A invenção inclui ainda peptídeos compreendendo uma vari-ante das seqüências listadas na Tabela 1, onde variantes incluem, mas nãoestão limitadas a: truncamentos; peptídeos que compartilham pelo menos68%, 72%, 76%, 80%, 84%, 88%, 92% ou 96% de identidade com pelo me-nos um dos peptídeos da Tabela 1. Variantes também incluem peptídeoscompreendendo uma seqüência listada na Tabela 1 que contém pelo menosuma substituição de aminoácido, onde o aminoácido é substituído com umaminoácido de ocorrência natural, um aminoácido de ocorrência não-natural,um análogo de aminoácido ou um mimético de aminoácido.Tabela 1
SEQ ID NO:6 AGQRFCTGHFGGLYPCNGPGTGGGKSEQ ID NO:7 AGGGCVTGHFGGYCNTQGTGGGKSEQ ID NO:8 AGKIICSPGHFGGMYCQGKGTGGGKSEQ ID NO:9 AGPSYCIEGHIDGIYCFNAGTGGGKSEQ ID N0:10 AGNSFCRGRPGHFGGCYLFGTGGGK
Em uma modalidade, os peptídeos da invenção podem compre-ender uma seqüência de aminoácido listada na Tabela 1 que tem 1, 2, 3, 4,5, 6 ou mais substituições de aminoácido conservativas. Em outra modalida-de, os peptídeos da invenção podem compreender uma seqüência de ami-noácido listada na Tabela 1 que foi substituída com 1,2,3, 4, 5, 6 ou maisaminoácidos de ocorrência natural.
Em algumas modalidades, os peptídeos da invenção podemcompreender uma seqüência de aminoácido listada na Tabela 1 que foisubstituída com 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais aminoácidos de ocorrência não-natural. Em outra modalidade, os peptídeos da invenção podem compreen-der uma seqüência de aminoácido listada na Tabela 1 que foi substituídacom 1,2,3, 4, 5, 6 ou mais aminoácidos N-metilados. Em outra modalidade,os peptídeos da invenção podem compreender uma seqüência de aminoáci-do listada na Tabela 1 que foi substituída com 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais amino-ácidos na configuração D. Em ainda outra modalidade, os peptídeos da in-venção podem compreender uma seqüência de aminoácido listada na Tabe-la 1 que foi substituída com 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais miméticos de aminoácido.
Modalidades exemplares da invenção são providas abaixo.
Muitas dessas modalidades compreendem as seqüências de aminoácidolistadas na Tabela 1 modificadas para incluir uma ou mais substituições deaminoácido. Embora essas modalidades provejam exemplos de substitui-ções adequadas, deve ser compreendido que outras substituições que nãodestroem a atividade biológica dos peptídeos são compreendidas pela in-venção.
Em uma modalidade exemplar, um peptídeo da invenção com-preende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:6 modificada com umasubstituição de Cisteína para Penicilamina na posição 6 e uma substituiçãode Glicina para Sarcosina na posição 12 (onde as posições dos aminoácidossão baseadas na numeração de aminoácido na SEQ ID NO:6). Em outramodalidade, um peptídeo compreende o aminoácido da SEQ ID NO:6 modi-ficado com uma substituição de Cisteína para Penicilamina na posição 6 euma substituição de Leucina para N-metilleucina na posição 13.
Em outra modalidade, um peptídeo da invenção pode compre-ender a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:6 modificada com umasubsituição de cisteína para Penicilamina na posição 6, substituições de am-bas glicinas nas posições 11 e 12, respectivamente por uma (3R)-amino-1-I carboximetil-2-valerolactama única; e uma substituição de Ieucina para N-metilleucina na posição 13.
Em uma modalidade, um peptídeo da invenção pode compre-ender a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:6 modificada com umasubstituição de cisteína para penicilamina na posição 6, uma substituição deglicina para sarcosina na posição 12 e uma substituição de Ieucina para N-metilleucina na posição 13. Em outra modalidade, um peptídeo da invençãopode compreender a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:6 modificadacom uma substituição de cisteína em penicilamina na posição 6, substitui-ções de ambas glicinas nas posições 11 e 12, respectivamente para uma(3R)-amino-1-carboximetilcaprolactama única e uma subsituição de Ieucinapara N-metilleucina na posição 13.
Em uma modalidade, um peptídeo da invenção pode compre-ender a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:6 modificada com umasubstituição de cisteína em penicilamina na posição 6, uma substituição dehistidina em 3-piridilalanina na posição 9, uma substituição de glicina emsarcosina na posição 12 e uma Ieucina para N-metilleucina na posição 13.Em outra modalidade, um peptídeo da invenção pode compreender a se-qüência de aminoácido da SEQ ID NO:6 modificada com uma substituiçãode cisteína em penicilamina na posição 6, uma substituição histidina em 4-guanilfenilalanina na posição 9, uma substituição de glicina para sarcosinana posição 12 e uma Ieucina para N-metilleucina na posição 13. Em aindaoutra modalidade, um peptídeo da invenção pode compreender a seqüênciade aminoácido da SEQ ID NO:6 modificada com uma substituição de cisteí-na para penicilamina na posição 6, uma substituição de histidina para 4-piridilalanina na posição 9, uma substituição de glicina em sarcosina na po-sição 12 e uma substituição de Ieucina para N-metilleucina na posição 13.
Em certas modalidades, os peptídeos da invenção podem exis-tir como um multímero, tal como um dímero, trímero ou tetrâmero. Os peptí-deos do multímero podem ser iguais ou diferentes. Os peptídeos podem sermultimerizados conforme acima descrito e nos Exemplos que seguem.
Em uma modalidade, a afinidade dos peptídeos da invençãopara FcRn será representada por K0 com um valor variando de 50 fM a 1mM. Em outra modalidade, a afinidade dos peptídeos da invenção será re-presentada por um Kd com um valor variando de a partir de 50 fM a 100 μΜ,ou um valor variando de a partir de 50 fM a 1 nM, ou um valor variando de apartir de 1 pM a 1 nM. Em outra modalidade, uma composição compreen-dendo pelo menos um dos peptídeos da invenção vai modular a concentra-ção de IgG no soro. Em uma modalidade, os peptídeos da invenção podembloquear uma região constante de IgG de ligação a FcRn através da ligaçãoa pelo menos um aminoácido de FcRN que também especificamente intera-ge com uma região constante de IgG.
II. Métodos de Fabricação dos Peptídeos da Invenção
Métodos gerais de sintetização de peptídeos da invenção
Os peptídeos da invenção podem ser sintetizados usando técni-cas bem-conhecidas no campo. Por exemplo, peptídeos da invenção quesão compostos totalmente de aminoácidos de ocorrência natural podem sersintetizados recombinantemente em células usando polinucleotídeos codifi-cando o peptídeo. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) e Ausubele outros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associa-tes and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternativamente, os peptídeos dainvenção podem ser sintetizados usando métodos sintéticos conhecidos talcomo síntese de fase sólida. Técnicas sintéticas são bem-conhecidas nocampo. Vide, por exemplo, Merrifield, Chemical Polypeptides, Katsoyannis ePanayotis Eds., pp. 335-61(1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soe. 85:2149(1963); Davis e outros, Biochem. Intl. 10:394 (1985); Finn e outros, The Pro-teins (3a ed.) 2:105 (1976); Erikson e outros, The Proteins (3§ ed.) 2:257(1976). Protocolos Fmoc/tBu padrão podem ser usados como descrito emW.C. Chan e P.D. White Eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Prae-tical Approach Oxford University Press Inc. Nova York (2000) e Patente U.S.ng 3.941.763. Alternativamente, proteínas quiméricas da invenção podem sersintetizadas usando uma combinação de métodos recombinantes e sintéti-cos. Em certas aplicações, pode ser benéfico usar ou um método recombi-I nante, um método sintético ou uma combinação de métodos recombinantese sintéticos.
2. Métodos para sintetização de análogos de peptídeo dospeptídeos da invenção
Conforme aqui usado, os vinte aminoácidos convencionais e su-as abreviações seguem uso convencional. Vide Immunology - A Synthesis,2- Edição, E.S Golub e D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland,Mass (1991). Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte ami-noácidos convencionais, aminoácidos não-naturais tal como aminoácidos a-,a-di-substituídos, N-alquil aminoácidos, N-metil aminoácidos, ácido láctico eoutros aminoácidos convencionais podem ser também componentes ade-quados para polipeptídeos da presente invenção. Exemplos de aminoácidosnão-convencionais incluem: ácido aminoisobutírico, ácido 3-amino-1-carboximetilvalerolactama, 4-guanil-fenilalanina, ácido 5-aminopentanóico, 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν-trimetillisina, ε-Ν-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil histidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina, penicilamina, sarcosina e outros aminoácidose imino ácidos similares (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação do poli-peptídeo usada aqui, a direção para a esquerda é a direção amino terminal ea direção para a direita é a direção carbóxi terminal, de acordo com uso pa-drão e convenção.
Substituições de aminoácido conservativas podem compreen-der resíduos dé aminoácido de ocorrência não-natural, que são tipicamenteincorporados através de síntese de peptídeo química ao invés de síntese emsistemas biológicos. Esses incluem peptidomiméticos e outras formas rever-tidas ou invertidas de porções de aminoácido.
Resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classescom base em propriedades de cadeia lateral comuns:
1) hidrofóbico: norleucina, Met1 Ala, Val1 Leu, lie;
2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn1 Gln;
3) ácido: Asp, Glu;
4) básico: His, Lys1 Arg;
5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly, Pro; e
6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
Por exemplo, substituições não-conservativas podem envolver atroca de um membro dessas classes por um membro de outra classe.
Ao fazer tais mudanças, de acordo com certas modalidades, oíndice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. Cada aminoácidorecebeu um índice hidropático com base em suas características de hidrofo-bicidade e carga. Eles são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); Ieucina (+3,8);fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8);glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3);prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); Iisina (-3,9); e arginina (-4,5).
A importância do índice de aminoácido hidropático em conferirfunção biológica interativa em uma proteína é compreendida na técnica. Kytee outros, J. MoL Biol. 157:105-131 (1982). Sabe-se que certos aminoácidospodem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice hidropáticoou score similar e ainda reter uma atividade biológica similar. Fazendo mu-danças com base no índice hidropático, em certas modalidades, a substitui-ção de aminoácidos cujos índices idiopáticos estão dentro de ±2 está incluí-da. Em certas modalidades, aqueles que estão dentro de ±1 estão incluídos,e em certas modalidades, aqueles com ±0,5 estão incluídos.
É também compreendido na técnica que a substituição dos a-minoácidos similares pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade,particularmente onde a proteína ou peptídeo biologicamente funcional entãocriado for pretendido para uso na ligação a um alvo de proteína específico.
Os valores de hidrofilicidade que seguem foram dados a essesresíduos de aminoácido: arginina (+3,0); Iisina (+3,0); aspartato (+3,0 ±1);glutamato (+3,0 ±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); Qlici-na (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteí-na (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); Ieucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tiro-sina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Fazendo mudanças combase em valores de hidrofilicidade similares, em certas modalidades, a subs-I tituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2está incluída, em certas modalidades, aqueles que estão dentro de ±1 estãoincluídos, em certas modalidades, aqueles dentro de ±0,5 estão incluídos.
Um versado na técnica será capaz de determinar variantes a-dequadas dos polipeptídeos conforme mostrado aqui usando técnicas bem-conhecidas. Em certas modalidades, um versado na técnica pode identificaráreas adequadas da molécula que podem ser mudadas sem destruir a ativi-dade se direcionando a regiões não acreditadas ser importantes para ativi-dade. Em certas modalidades, uma pessoa pode identificar resíduos e por-ções da molécula que são conservados dentre polipeptídeos similares. Emcertas modalidades, mesmo áreas que podem ser importantes para ativida-de biológica ou para estrutura podem ser submetidas a substituições de a-minoácido conservativas sem destruir a atividade biológica e sem afetar ad-versamente a estrutura do polipeptídeo.
Adicionalmente, um versado na técnica pode revisar estudosde estrutura-função identificando resíduos em peptídeos similares que sãoimportantes para atividade ou estrutura. Em vista de tal comparação, umapessoa pode prever a importância de resíduos de aminoácido em um peptí-deo que corresponde aos resíduos de aminoácido que são importantes paraatividade ou estrutura em peptídeos similares. Um versado na técnica podeoptar por substituições de aminoácido quimicamente similares para tais resí-duos de aminoácido importantes previstos.Um versado na técnica pode também analisar a estrutura tridi-mensional e a seqüência de aminoácido em relação àquela estrutura empeptídeos similares. Um versado na técnica pode gerar variantes de testecontendo uma substituição de aminoácido única em cada resíduo de amino-ácido desejado. As variantes podem então ser avaliadas usando ensaios deatividade conhecidos daqueles versados na técnica. Tais variantes poderiamser usadas para reunir informação sobre variantes adequadas. Por exemplo,se alguém constatou que uma mudança em um resíduo de aminoácido parti-cular resultou em atividade destruída, indesejavelmente reduzida ou inade-quada, variantes com tal mudança podem ser evitadas. Em outras palavras,com base na informação reunida de tais experimentos de rotina, um versadona técnica pode prontamente determinar os aminoácidos onde substituiçõesadicionais devem ser evitadas ou sozinhas ou em combinação com outrasmutações.
De acordo com certas modalidades, substituições de aminoáci-do podem ser aquelas que: (1) reduzem susceptibilidade à proteólise, (2)reduzem susceptibilidade à oxidação, (3) alteram afinidades de ligação as-sociadas com a função biológica e/ou (4) conferem ou modificam outras pro-priedades físico-químicas ou funcionais em tais polipeptídeos. De acordocom certas modalidades, substituições de aminoácido únicas ou simples (emcertas modalidades, substituições de aminoácido conservativas) podem serfeitas na seqüência de ocorrência natural (em certas modalidades, na porçãodo polipeptídeo fora do(s) domínio(s) formando contatos intermoleculares).Em certas modalidades, uma substituição de aminoácido conservativa tipi-camente pode não substancialmente mudar as características estruturais daseqüência de origem (por exemplo, um aminoácido de substituição não devetender a quebrar uma hélice que acontece na seqüência de origem, ou rom-per outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüência de ori-gem). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reco-nhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and MolecularPrincipies, Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, Nova York (1984);Introduction to Protein Structure, C. Branden e J. Tooze, Eds., Garland Pu-blishing, Nova York, N.Y. (1991); e Thornton e outros, Nature 354:105(1991).
Em certas modalidades, derivados de aminoácido compreen-dem modificações covalentes, incluindo, mas não limitado a, ligação químicacom polímeros, lipídeos ou outras porções orgânicas ou inorgânicas. Emcertas modalidades, um agente de ligação específico quimicamente modifi-cado pode ter meia-vida de circulação maior do que um agente de ligaçãoespecífico que não é quimicamente modificado. Em certas modalidades, umagente de ligação específico quimicamente modificado pode ter capacidadede direcionamento aperfeiçoada para células, tecidos e/ou órgãos deseja-dos. Em certas modalidades, um agente de ligação específico derivado écovalentemente modificado para incluir uma ou mais ligações de polímerosolúveis em água incluindo, mas não limitado a, polietileno glicol, polioxieti-Ieno glicol ou polipropileno glicol. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos.4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; e 4.179.337. Emcertas modalidades, um agente de ligação específico derivado compreendeum ou mais polímeros, incluindo, mas não limitado a, monometóxi-polietilenoglicol, dextrano, celulose ou outros polímeros baseados em carboidrato, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, umco-polímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados(por exemplo, glicerol) e álcool de polivinila, bem como misturas de tais po-límeros.
3. Métodos para sintetização de análogos dos peptídeos dainvenção
Análogos de peptídeo são geralmente usados na indústria far-macêutica como fármacos não-peptídeo com propriedades análogas àquelasdo peptídeo molde. Esses tipos de compostos não-peptídeo são chamados"miméticos de peptídeo" ou "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug.Res. 15:29 (1986); Veber e Freidinger, TINS p. 392 (1985); e Evans e outros,J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que são aqui incorporados a título de refe-rência. Tais compostos são freqüentemente desenvolvidos com o auxílio demodelagem molecular computadorizada. Miméticos de peptídeo que sãoestruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser u-sados para produzir um efeito terapêutico ou profilático similar. Em geral,peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo paradig-ma (isto é, um polipeptídeo que tem uma propriedade bioquímica ou ativida-de farmacológica), tal como um anticorpo humano, mas tem uma ou maisligações peptídeo opcionalmente substituídas por uma ligação selecionadade: -CH2NH, -CH2S, -CH2-CH2-, -CH=CH- (eis e trans); -COCH2-; -CH(OH)CH2- e -CH2SO-, através de métodos bem-conhecidos na técnica.Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência deconsenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-Iisina nolugar de L-lisina) pode ser usada em certas modalidades para gerar peptí-deos mais estáveis. Ainda, peptídeos não-naturais compreendendo uma se-qüência de consenso ou uma variação de seqüência de consenso substan-cialmente idêntica podem ser gerados através de métodos conhecidos natécnica (Rizo e Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporadoaqui a título de referência), tal como, por exemplo, através da adição de re-síduos de cisteína internos capazes de formar pontes dissulfeto intramolecu-lares que ciclizam o peptídeo.
Dimerização ou oligomerização de peptídeo pode aumentar aavidez de uma seqüência de peptídeo por um dado receptor. Vide, por e-xemplo, Johnson e outros, Chem. BioL 12:939 (1997). É imaginado que dí-meros e multímeros de ordem superior dos peptídeos da invenção pudes-sem ser sintetizados usando uma variedade de métodos bem-conhecidos natécnica. Os dímeros ou multímeros poderiam ser sintetizados diretamenteem um sintetizador de peptídeo automático como uma seqüência de peptí-deo contínua. Alternativamente, multímeros de peptídeo poderiam ser sinte-tizados através da reação de monômeros de peptídeo individuais com umaporção Iigante multivamente. Vide, por exemplo, Rose, J. Am. Chem. Soe.116:30 (1994). Como outro exemplo, multímeros de peptídeo podem ser sin-tetizados incorporando grupos Iigantes ramificados antes da síntese da se-qüência de peptídeo como na síntese de "peptídeos antigênicos múltiplos"(MAP). D. Posnett e outros, J. BioL Chem. 263:1719 (1988). A invenção pro-vê um novo método para formação desses dímeros de peptídeo que envolvea reação dos terminais N dos peptídeos, enquanto em resina, com uma mo-lécula ligante, tal como, por exemplo, ácido succínico, de modo que peptí-deos adjacentes na conta de resina de fase sólida vão reagir uns com osoutros e formar um dímero unido pelos terminais N do peptídeo. Clivagemsubsequente da resina provê um dímero de peptídeo N-terminalmente liga-do.
4. Construção de vetores de expressão para a expressãode peptídeos da invenção
Ácidos nucléicos codificando peptídeos da invenção podem sersintetizados através de métodos padrão conhecidos na técnica, por exemplo,através do uso de um sintetizador de DNA automático (tal como são comer-cialmente disponíveis da Biosearch, Applied Biosystems, etc). Métodos adi-cionais de síntese de ácido nucléico são conhecidos na técnica. Vide, porexemplo, Patentes U.S. Nos. 6.015.881; 6.281.331; 6.469.136. Para produ-ção recombinante de peptídeos da invenção, seqüências de polinucleotídeocodificando os peptídeos são inseridas em veículos de expressão apropria-dos, isto é, vetores que contêm os elementos necessários para a transcriçãoe tradução da seqüência de codificação inserida, ou no caso de um vetorviral de RNA, os elementos necessários para replicação e tradução. Os áci-dos nucléicos codificando os peptídeos da invenção são inseridos em veto-res na estrutura de leitura apropriada.
Vetores usados na transformação geralmente conterão ummarcador selecionável usado para identificar transformantes. Em sistemasbacterianos, isto pode incluir um gene de resistência a antibiótico tal comoampicilina ou canamicina. Marcadores selecionáveis para uso em células demamífero culturadas incluem genes que conferem resistência a fármacos, talcomo neomicina, higromicina e metotrexato. O marcador selecionável podeser um marcador selecionável amplificável. Um marcador selecionável ampli-ficável é o gene de DHFR ou cDNA de DHFR. Simonesn e Levinson1 Proc.Natl. Acad. Sei. USA 80:2495 (1983). Marcadores selecionáveis são revistospor Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterowrth Publishers, Stoneham,MA (1986)) e a escolha de marcadores selecionáveis está dentro do nível dehabilidade comum na técnica. Marcadores selecionáveis podem ser tambémintroduzidos na célula em um plasmídeo separado ao mesmo tempo que ogene de interesse, ou eles podem ser introduzidos no mesmo plasmídeo. Seno mesmo plasmídeo, o marcador selecionável e o gene de interesse podemestar sob o controle de promotores diferentes ou do mesmo promotor, o úl-timo arranjo produzindo uma mensagem bicistrônica. Construtos deste tiposão conhecidos na técnica (por exemplo, Patente U.S. n5 4.713.339).
Elementos de expressão em um sistema de expressão variamem sua resistência e especificidades. Dependendo do sistema hospedei-ro/vetor utilizado, qualquer um de vários elementos de transcrição e traduçãoadequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, pode ser usadoem um vetor de expressão. Por exemplo, quando clonando em sistemasbacterianos, promotores induzíveis tal como pL de bacteriófago λ, plac, ptrp,ptac (promotor híbrido ptrp-lac) e similar podem usados; quando clonandoem sistemas de célula de inseto, promotores tal como o promotor de polie-dron de baculovírus pode ser usado; quando clonando em sistemas de célu-la de planta, promotores derivados do genoma de células de planta (por e-xemplo, promotores de choque térmico; o promotor para a subunidade pe-quena de RUBISCO; o promotor para a proteína de ligação de clorofila a/b)ou de vírus de planta (por exemplo, o promotor de RNA 35S de CaMV; opromotor da proteína de revestimento de TMV) pode ser usado; quando clo-nando em sistemas de célula de mamífero, promotores derivados do geno-ma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou devírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promo-tor do vírus vaccinia de 7,5K) podem ser usados; quando gerando linhagensde célula que contêm cópias múltiplas de produto de expressão, vetores ba-seados em SV40-, BPV- e EBV podem ser usados com um marcador sele-cionável apropriado.
Em casos onde vetores de expressão de planta são usados, aexpressão das seqüências codificando formas lineares e não-ciclizadas dasproteínas quiméricas da invenção pode ser direcionada por qualquer um devários promotores. Por exemplo, promotores virais tal como os promotores35S RNA e 19S RNA de CaMV (Brisson e outros, Nature 310:511-514(1984)), ou o promotor da proteína de revestimento de TMV (Takamatsu eoutros, EMBO J. 6:307-311 (1987)) podem ser usados; alternativamente,promotores de planta tal como a subunidade pequena de RUBISCO (Coruzzie outros, EMBO J., 3:1671-1680 (1984); Broglie e outros, Science 224:838-843 (1984)) ou promotores de choque térmico, por exemplo, hsp17.5-E ouhsp17.3-B de soja (Gurley e outros, Mol. Cell Biol 6:559-565 (1986)) podemser usados. Esses construtos pode ser introduzidos em células de plantausando plasmídeos Ti, plasmídeo Ri, vetores de vírus de planta, transforma-ção de DNA direta, microinjeção, eletroporação.e tc., Weissbach & Weissba-ch, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Seção VIII,pp. 421-463 (1988) e Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2- Ed.,Blackie1 Londres, Cap. 7-9(1988).
Em um sistema de expressão de inseto que pode ser usado pa-ra produzir as proteínas quiméricas da invenção, vírus de poliidrose nuclearde Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressaros genes estrangeiros. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda.
Uma seqüência de codificação pode ser clonada em regiões não-essenciais(por exemplo, o gene de poliedro) do vírus e posta sob controle de um pro-motor AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedro). Inserção bem-sucedidade uma seqüência de codificação vai resultar em inativação do gene de poli-edro e produção de vírus recombinante não-ocluído (isto é, vírus sem o re-vestimento proteináceo codificado pelo gene de poliedro). Esses vírus re-combinantes são então usados para infectar células de Spodoptera frugiper-da onde o gene inserido é expresso (vide, por exemplo, Smith e outros, J.Viroi 46:584 (1983); Patente U.S. nQ 4.215.051). Exemplos adicionais destesistema de expressão podem ser encontrados em Ausubel e outros, Eds.,Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wi-Iey Interscience (1989).
Outro sistema que pode ser usado para expressar o peptídeo dainvenção é o sistema de expressão do gene de glutamina sintetase, tambémreferido como ó "sistema de expressão GS" (Lonza Biologics PLC, Berkishi-re, UK). Este sistema de expressão é descrito em detalhes na Patente U.S.n9 5.981.216.
Em células hospedeiro de mamífero, vários sistemas de ex-pressão de base viral podem ser utilizados. Em casos onde um adenovírusfor usado como um vetor de expressão, uma seqüência de codificação podeser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovírus,por exemplo, o promotor tardio e uma seqüência líder tripartida. Este genequimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus através de re-combinação in vitro ou in vivo. Inserção em uma região não-essencial dogenoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) vai resultar em um vírus re-combinante que é viável e capaz de expressar peptídeos em hospedeirosinfectados. Vide, por exemplo, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. USA81:3655 (1984). O promotor de 7,5K de vaccinia pode ser também usado.Vide, por exemplo, Mackett e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:7415(1982); Mackett e outros, J. Virol. 49:857 (1984); Panicali e outros, Proc. Na-tl. Acad. Sei. USA 79:4927 (1982).
5. Expressão de peptídeos da invenção em célula-alvo a-propriada
Veículos de expressão podem ser transfectados ou co-transfectados em uma célula-alvo adequada, para expressar os polipeptí-deos da invenção. Técnicas de transfecçãó conhecidas no campo incluem,
mas não estão limitadas a, precipitação de fosfato de cálcio (Wigler e outros,Cell 14:725 (1978)), eletroporação (Neumann e outros, EMBO, J. 1:841(1982)) e reagentes baseados em lipossoma. Uma variedade de sistemas devetor de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar as pro-teínas quiméricas descritas aqui incluindo ambas células procarióticas e eu-carióticas. Esses incluem, mas não estão limitados a, microorganismos talcomo bactérias (por exemplo, E. coli) transformados com vetores de expres-são de DNA de bacteriófago ou DNA de plasmídeo contendo uma seqüênciade codificação apropriada; levedura ou fungos filamentosos transformadoscom vetores de expressão de levedura ou fungos recombinantes contendouma seqüência de codificação apropriada; sistemas de célula de inseto in-fectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo,baculovírus) contendo uma seqüência de codificação apropriada; sistemasde célula de planta infectados com vetores de expressão de vírus recombi-nante (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor ou vírus do mosaico dotabaco) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombi-nante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo uma seqüência de codificaçãoapropriada; ou sistemas de célula animal, incluindo células de mamífero (porexemplo, células CHO1 Cos, HeLa).
6. Métodos para sintetização de moléculas de fusão quecompreendem um peptídeo da invenção
Em algumas modalidades, os peptídeos da invenção existemcomo uma proteína de fusão compreendendo o peptídeo da invenção e umparceiro de fusão. Em uma modalidade, o parceiro de fusão confere proprie-dades, tal como uma ou mais de meia-vida prolongada, transporte aumenta-do para o peptídeo da invenção e/ou pode aumentar a eficácia in vivo ou invitro.
Adicionalmente, os polipeptídeos heterólogos da presente in-venção podem ser combinados com partes do domínio constante de imuno-globulinas (IgG), resultando em polipeptídeos quiméricos. Essas moléculasde fusão particulares facilitam a purificação e mostram uma meia-vida au-mentada in vivo. Isto foi mostrado, por exemplo, em proteínas quiméricasconsistindo nos primeiros dois domínios do polipeptídeo CD4 humano e vá-rios domínios das regiões constantes das cadeias pesadas ou leves de imu-noglobulinas de mamífero. EP O 394 827; Traunecker e outros, Nature,331:84-86 (1988). Moléculas de fusão que têm uma estrutura dimérica ligadaa dissulfeto devido à parte IgG podem em alguns casos ser mais eficientesem ligação e neutralização de outras moléculas do que, por exemplo, umpolipeptídeo monomérico ou fragmento de polipeptídeo sozinho. Vide, porexemplo, Fountoulakis e outros, J. Biochem. 270:3958-3964 (1995).
A invenção também provê um polinucleotídeo codificando amolécula de fusão de qualquer um dos peptídeos descritos acima. Este poli-nucleotídeo pode ser parte de um vetor que também compreende uma se-qüência reguladora para transcrição do polinucleotídeo. A invenção provêainda uma célula hospedeiro compreendendo qualquer uma das moléculasde fusão descritas acima, um polinucleotídeo codificando a molécula de fu-são de qualquer um desses peptídeos ou um vetor que compreende um po-linucleotídeo codificando a molécula de fusão de qualquer um desses peptí-deos e uma seqüência reguladora para transcrição do polinucleotídeo. A in-venção provê ainda uma composição compreendendo qualquer uma dasmoléculas de fusão ou nucleotídeos descritos acima e/ou qualquer um dosvetores ou células hospedeiros descritos acima e um tampão ou veículo far-maceuticamente aceitável.
a. Fusões compreendendo domínios Fc de anticorpo
Em uma modalidade, um peptídeo da invenção pode ser conju-gado com o domínio Fc de IgG para aumentar sua meia-vida de circulação.Em certas modalidades, os peptídeos são covalentemente ligados ao domí-nio Fc. Métodos de fabricação de proteínas quiméricas compreendendo umdomínio de imunoglobulina Fc ambos recombinantemente e semi-sinteticamente são bem-conhecidos daqueles versados na técnica. Por e-xemplo, um aldeído pode ser incorporado ao derivado de peptídeo, e reagidocom a proteína Fc usando uma reação de alquilação redutiva que é seletivapara o terminal N de Fe. Kinstler, Adv. Drug Del. Rev. 54:477 (2002). Alter-nativamente, um tioéster de peptídeo pode ser reagido com Fc carregandoum resíduo de cisteína de terminal N Dawson e Kent, Ann. Rev. Biochem.69:923 (2000).
Tais derivados de fusão de peptídeo-Fc podem ter uma habili-dade aumentada em bloquear a interação IgG-FcRn devido à adição de doisou mais sítios de ligação para FcRn por todo o domínio Fe. Tais fusões depeptídeo-Fc podem também proteger o peptídeo de degradação e entãoaumentar a eficácia in vivo do peptídeo. Proteínas de fusão que têm umaestrutura dimérica ligada a dissulfeto devido à porção IgG podem ser tam-bém mais eficientes em ligação e neutralização de outras moléculas do queo peptídeo da invenção, por exemplo, conforme descrito por Fountoulakis eoutros, J. Biochem., 270:3958-3964 (1995).
Em modalidades onde o peptídeo da invenção é parte de umaproteína de fusão com um domínio Fc de IgG, o Fc de IgG humana podecompreender domínios hinge, CH2 e GH3 de IgG humana, tal como IgGI,lgG2 e lgG4 humana. A invenção também provê uma molécula de fusãocompreendendo um peptídeo da invenção e um polipeptídeo de Fc varianteou um fragmento de um polipeptídeo de Fc variante, onde o Fc variantecompreende domínios hinge, CH2 e CH3 de lgG2 humana com uma muta-ção Pro331 Ser, conforme descrito na Patente U.S. nQ 6.900.292.
I Domínios Fc adequados para conjugação com peptídeos da in-venção incluem aqueles tendo aminoácidos mutados nas posições selecio-nadas da região Fc para atenuar suas funções efetoras (incluindo citotoxidezde célula dependente de anticorpo e citotoxidez dependente de complemen-to). Por exemplo, uma variante de Fcn2 com a mutação Pro331Ser tem me-nos atividade de complemento do que Fcn2 natural e não se liga ao FcgR. Fcde lgG4 é deficiente em ativação de cascata de complemento, e sua afinida-de de ligação para FcdR é cerca de uma ordem de magnitude menor do queaquela do isotipo mais ativo, IgGI. Em uma modalidade, um peptídeo dainvenção é conjugado a uma variante de Fcn4 com mutação Leu235Ala queexibe funções efetoras mínimas conforme comparado com Fc04 natural. Emoutra modalidade, o peptídeo da invenção é conjugado a uma variante deFe0i com mutações Leu234Val, Leu235Ala e Pro331Ser que também exi-bem menos função efetora do que Fcm natural.
b. Fusões compreendendo albumina
Em certas modalidades, os peptídeos da invenção podem serconjugados a porções de ligação de albumina. Tais conjugados de porçãode ligação de albumina-peptídeo podem ter meias-vidas in vivo mais longase podem então requerer doses de peptídeo menores para atingir o efeitoterapêutico desejado. Chuang e outros, Pharm. Res. 19:569 (2002): PatenteU.S. nQ 6.685.179. Então, uma modalidade da invenção provê uma moléculade fusão compreendendo o peptídeo da invenção com um par de fusão dealbumina compreendendo albumina, um ou mais fragmentos de albumina,um peptídeo que se liga à albumina e/ou uma molécula que conjuga com umlipídeo ou outra molécula que se liga à albumina.
Métodos de fabricação de proteínas de fusão compreendendoalbumina são conhecidos na técnica. Por exemplo, peptídeos modificadospor reagentes de capeamento aromáticos hidrofóbicos foram mostrados seligar à albumina não-covalentemente e prolongar as meias-vidas dos peptí-deos em coelhos. Zobel e outros, Bioorg. Med. Chem. Lett. 13:1513 (2003).
Como outro exemplo, peptídeos modificados com grupos reativos tiol forammostrados se ligar covalentemente a um resíduo de cisteína livre único emalbumina de soro. Kim e outros, Diabetes 52:751 (2003).
c. Fusões com porções peguiladas
Em uma modalidade, o peptídeo da invenção pode ser peguila-do para incluir mono- ou poli- (por exemplo, 2-4) porções de PEG. Peguila-ção pode ser realizada através de qualquer uma das reações de peguilaçãoconhecidas na técnica. Métodos para preparação de um produto de proteínapeguilado vão geralmente incluir (a) reação de um polipeptídeo com um poli-etileno glicol (tal como um derivado de éster ou aldeído de PEG reativo) sobcondições com o que o peptídeo da invenção se liga a um ou mais gruposPEG; e (b) obtenção do(s) produto(s) de reação. Em geral, as condições dereação ótimas para as reações serão determinadas caso a caso com baseem parâmetros conhecidos e o resultado desejado.
Existem vários métodos de ligação de PEG disponíveis àquelesversados na técnica e descritos na, por exemplo, EP 0 401 384; Malik e ou-tros, Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992); Francis, Focus on Growth Fac-tors, 3(2):4-10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221 e WO95/34326. Por exemplo, a etapa de peguilação de peptídeos da invençãopode ser realizada através de uma reação de acilação ou uma reação dealquilação com uma molécula de polietileno glicol reativa.
Então, os peptídeos da invenção incluem peptídeos peguiladosonde um ou mais grupos PEG são ligados através de grupos acila ou alquila.Tais peptídeos podem ser mono-peguilados ou poli-peguilados (por exem-plo, aqueles contendo 2-6 ou 2-5 grupos PEG). Os grupos PEG são geral-mente ligados ao peptídeo nos grupos a- ou ε-amino de aminoácidos, mas écompreendido que os grupos PEG poderiam ser ligados a qualquer grupoamino do peptídeo que seja suficientemente reativo para se ligar a um grupoPEG sob condições de reação adequadas.
Peguilação através de acilação geralmente envolve reação deum derivado de éster ativo de polietileno glicol (PEG) com um peptídeo dainvenção. Para reações de acilação, o(s) polímero(s) selecionado(s) tipica-mente tem um grupo éster reativo único. Qualquer molécula de PEG reativaconhecida ou subseqüentemente encontrada pode ser usada para realizar areação de peguilação. Um exemplo de um éster de PEG ativado adequado éPEG esterificado para N-hidroxissuccinimida (NHS). Conforme aqui usado,acilação é compreendida incluir, sem limitação, os seguintes tipos de Iiga-ções entre um peptídeo da invenção e um polímero tal como PEG: amida,carbamato, uretana e similar. Vide, por exemplo, Chamow, BioconjugateChem., 5:133-140 (1994). Condições de reação podem ser selecionadas dequalquer uma daquelas conhecidas na técnica de peguilação ou aquelessubseqüentemente desenvolvidas, mas devem evitar condições tal comotemperatura, solvente e pH que poderiam inativar o peptídeo da invenção.
Peguilação através de acilação vai geralmente resultar em umpeptídeo poli-peguilado da invenção. A ligação de conexão pode ser umaamida. O produto resultante pode ser substancialmente apenas (por exem-plo, >95%), mono-, di- ou tri-peguilado. No entanto, algumas espécies comgraus maiores de peguilação podem ser formadas em quantidades depen-dendo das condições de reação específicas usadas. Se desejado, espéciespeguiladas mais purificadas podem ser separadas da mistura (particularmen-te espécies não-reagidas) através de técnicas de purificação padrão, incluin-do dentre outras diálise, salting-out, ultrafiltragem, cromatografia de troca deíon, cromatografia de filtragem em gel e eletroforese.
Peguilação através de alquilação envolve reação de um deriva-do de aldeído terminal de PEG com um peptídeo da invenção na presençade um agente de redução. Para a reação de alquilação redutiva, o(s) políme-ro(s) selecionado(s) deve(m) ter um grupo aldeído reativo único. Um aldeídode PEG reativo exemplar é proprionaldeído polietileno glicol, que é estávelem água, ou seus derivados mono C1-C10 alcóxi ou arilóxi. Vide, por exem-pio, Patente U.S. ns 5.252.714.
7. Purificação de peptídeos biologicamente expressos dainvenção
Dependendo do sistema de expressão usado, o peptídeo ex-presso da invenção é então isolado através de procedimentos bem estabe-lecidos na técnica (por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografiade exclusão de tamanho, cromatografia de troca de íon).
Os vetores de expressão podem codificar tags que permitem pu-rificação fácil da proteína quimérica recombinantemente produzida. Exem-pios incluem, mas não estão limitados a, vetor pUR278 (Ruther e outros,EMBO J. 2:1791 (1983)) onde DNA codificando um peptídeo da invenção éligado ao vetor em estrutura com a região de codificação Iac ζ de modo queuma proteína híbrida é produzida; vetores pGEX podem ser usados paraexpressar proteínas quiméricas da invenção com um tag de glutationa S-transferase (GST). Essas proteínas são geralmente solúveis e podem facil-mente ser purificadas de células através de absorção a contas de glutationa-agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores in-cluem sítios de clivagem (trombina ou protease Fator Xa ou PreScission Pro-tease® (Pharmacia, Peapack, N.J.) para remoção fácil do tag após purifica-ção.
Para aumentar a eficiência de produção, os polinucleotídeospodem ser feitos para codificar unidades múltiplas dos peptídeos da inven-ção separados por sítios de clivagem enzimática. O polipeptídeo resultantepode ser clivado (por exemplo, através de tratamento com a enzima apropri-ada) a fim de recuperar as unidades de peptídeo. Isto pode aumentar o ren-dimento dos peptídeos dirigidos por um promotor único. Quando usada emsistemas de expressão viral apropriados, a tradução de cada peptídeo dainvenção codificado pelo mRNA é direcionada internamente no transcrito,por exemplo, através de um sítio de entrada do ribossomo interno, IRES.Então, o construto policistrônico direciona a transcrição de um mRNA policis-trônico grande, único, que, por sua vez, direciona a tradução de polipeptí-deos individuais múltiplos. Esta abordagem elimina a produção e processa-mento enzimático de poliproteínas e pode significantemente aumentar o ren-dimento dos polipeptídeos da invenção dirigido por um promotor único.
Células hospedeiro contendo construtos de DNA codificando ospeptídeos da invenção podem ser cultivadas em um meio de crescimentoapropriado, isto é, um meio contendo nutrientes requeridos para o cultivo deI células. Nutrientes requeridos para cultivo de célula podem incluir uma fontede carbono, uma fonte de nitrogênio, aminoácidos essenciais, vitaminas,minerais e fatores de crescimento. Opcionalmente o meio pode conter sorode bezerro bovino ou soro de bezerro fetal. Em uma modalidade, o meio nãocontém substancialmente nenhuma IgG. O meio de crescimento vai geral-mente selecionar células contendo o construto de DNA através de, por e-xemplo, seleção de fármaco ou deficiência em um nutriente essencial que écomplementado pelo marcador selecionável no construto de DNA ou co-transfectado com o construto de DNA. Células de mamífero culturadas sãogeralmente cultivadas em meio contendo soro ou livre de soro comercial-mente disponível (por exemplo, MEM1 DMEM). Seleção de um meio apropri-ado para a linhagem celular particular está dentro do nível de habilidade co-mum na técnica.
Os peptídeos da invenção podem ser produzidos em um animaltransgênico, tal como um roedor, vaca, porco, ovelha, cabra ou outros ani-mais não-humanos que têm incorporado um gene estranho ao seu genoma.Devido ao fato desse gene estar presente em tecidos de linha germinativa,ele passa do pai para a prole. Genes exógenos são introduzidos em embri-ões de célula única (Brinster e outros, Proc. NatL Acad. Sei. USA 82:4438,1985). Métodos de produção de animais transgênicos são conhecidos natécnica, incluindo transgênicos que produzem moléculas de imunoglobulina.Wagner e outros, Proc. Nati Acad. Sei. USA 78:6376 (1981); McKnight eoutros, Cell 34:335 (1983); Brinster e outros, Nature 306:332 (1983); Ritchiee outros, Nature 312:517 (1984); Baldassarre e outros, Theriogenology59:831 (2003); Robl e outros, Theriogenology 59:107 (2003); Malassagne eoutros, Xenotransplantation 10(3):267 (2003).
8. Métodos para avaliação e encontro de peptídeos que seligam a FcRn e bloqueiam a interação FcRn-IgG
Peptídeos se ligando a FcRn podem ser identificados usandobibliotecas de display de fago. Bibliotecas de display de fago podem serprontamente geradas conforme descrito em Smith e Petrenko, Chem. Rev.87:391 (1997). Alternativamente, bibliotecas de display de fago podem seradquiridas de uma fonte comercial tal como, por exemplo, Dyax Corp. (Cam-bridge, MA). Dependendo das condições de avaliação, fago pode ser identi-ficado com uma variedade de propriedades diferentes. Para identificar peptí-deos que se ligam a FcRn (e então competem com IgG para ligação a F-cRn), uma biblioteca de fago pode ser avaliada quanto à ligação a FcRn eatravés de competição com IgG. Opcionalmente, peptídeos que se ligam areceptores alternados podem ser eliminados da biblioteca através de incu-bação da biblioteca de fago com um ou mais receptores alternados. Então,fago que se liga a receptor(es) alternado(s) seriam depletados do grupo defago desejado. Através de seqüenciamento o DNA de clones de fago capa-zes de se ligar a FcRn, peptídeos capazes de ligação a FcRN e inibição deligação de IgG-FcRn podem ser identificados.
Exemplos de outros métodos para identificar peptídeos de liga-ção de FcRn incluem: display de mRNA (Roberts e Szostak, Proc. Nati A-cad. Sei. USA 94:12297 (1997); display baseado em célula (Bder e Wittrup,Nat. Biotechnol. 15:5553 (1997) e bibliotecas de peptídeo sintético (Lam,Nature 354:82 (1991); Houghten e outros, Nature 354:84 (1991)).
9. Métodos para Avaliação de Peptídeos que se ligam a F-cRn e Bloqueiam a interação IgG=FcRn
Vários métodos podem ser usados para avaliar a habilidade deum peptídeo ou peptidomimético em se ligar a FcRn e bloquear a interaçãoFcRn:lgG. Por exemplo, ressonância de plasmon de superfície (SPR) é ummétodo bem-conhecido na técnica para avaliar eventos de ligação (BiacoreAB, Uppsala, Suécia). Usando este método, um dos pares de ligação (FcRnou IgG) é imobilizado no SPR sensor chip e enquanto o outro par é passadosobre o chip, que é monitorado quanto a um sinal resultante. No mesmo ex-perimento, o peptídeo a ser avaliado como um competidor da interação entreIgG e FcRn é passado sobre o chip. Qualquer diminuição em sinal pode serinterpretada como uma medida da habilidade do peptídeo em bloquear ainteração entre FcRn e IgG.
Outros métodos para avaliação dos inibidores de peptídeo pos-síveis da interação IgGiFcRn são também bem-conhecidos na técnica. Ums I tal método é um ensaio de competição de IgG em um formato de placa de96 cavidades. Neste exemplo de ensaio, FcRn humano solúvel em uma pla-ca de 96 cavidades é exposto à IgG e um peptídeo de teste. IgG ligada resi-dual, conforme detectado através de um anticorpo anti-lgG e reagentes devisualização de ELISA padrão, provê uma medida da habilidade do peptídeoem bloquear a interação FcRn-IgG.
A habilidade de um peptídeo em bloquear ligação de IgG-FeRnpode ser também realizada em células transfectadas com DNA codificandoum FcRn humano para desenvolver uma linhagem celular capaz de expres-sar FcRn humano em sua superfície celular. Um ensaio de competição deligação pode ser aplicado onde inibidores de peptídeo de ligação IgG-FcRncompetem com uma molécula de IgG fluorescentemente marcada. O nívelde IgG residual ligada às células pode ser medido usando, por exemplo, umselecionador de célula ativado fluorescente (FACS).
d. Usos dos Peptídeos da Invenção
Os peptídeos da invenção se ligam a FcRn e inibem a porção deFc da região constante de IgG de se ligar a FcRn resultando em catabolismoaumentado de IgG em comparação com o catabolismo de IgG na ausênciade peptídeos da invenção. Em modalidades exemplares, a região constantede IgG é de subclasse IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em modalidades particula-res, a região constante de IgG é de subclasse IgGI, lgG2 ou lgG4. Os pep-tídeos da invenção são então úteis para tratar qualquer doença ou condição,onde catabolismo aumento de IgG é desejável. Por exemplo, os peptídeosda invenção podem ser usados para tratar uma doença auto-imune, um dis-túrbio inflamatório, uma doença cardiovascular com uma etiologia baseadaem inflamação (por exemplo, esclerose arterial), rejeição de transplante e/oudoença enxerto versus hospedeiro (GVHD). Os peptídeos da invenção po-dem ser também usados para detectar FcRn em um paciente ou uma amos-tra biológica (por exemplo, um fluido corporal, uma amostra de tecido ou cé-lula, sobrenadante de cultura celular). Os peptídeos da invenção podem sertambém usados para purificar FcRn de uma amostra biológica (por exemplo,um fluido corporal, uma amostra de tecido ou célula, sobrenadante de cultu-ra celular).
Então, a invenção provê um método de regulagem de um estadode doença caracterizado por anticorpos IgG inapropriadamente expressosou quantidades ou níveis indesejados de IgG, compreendendo administraruma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo da invenção. Emuma modalidade, o estado de doença é escolhido de doenças inflamatórias,doenças auto-imunes e câncer. Em outras modalidades, a invenção provêmétodos para regulagem de um estado de doença através da modulação daconcentração de IgG no soro. Em certas modalidades, os métodos da inven-ção podem ser empregados para tratar, prevenir ou regular uma reação i-mune a uma proteína terapêutica, tal como, por exemplo, uma eritropoietina,uma enzima de armazenamento Iisossomal ou um fator de coagulação, talcomo, por exemplo, fibrinogênio, pró-trombina, fator V, fator VII, fator VIII,fator IX, fator X, fator XI, fator XII, fator Xlll ou fator von Willebrand. Em ou-tras modalidades, os métodos da invenção podem ser empregados para tra-tar, prevenir ou regular uma reação imune a um vetor de terapia de gene.
l. Doenças Auto-imunes
Os peptídeos da invenção podem ser usados para tratar doen-ças auto-imunes incluindo, mas não limitado a, Alopecia Areata, EspondiliteAnquilosante, Síndrome Antifosfolipídeo, Doença de Addison Auto-imune,Anemia Hemolítica Auto-imune, Hepatite Auto-imune, Síndrome Linfoprolife-rativa Auto-imune (ALPS), Púrpura Trombocitopênica Auto-imune (ATP),Doença de Behcet, Penfigóide Bolhoso, Cardiomiopatia, Sprue Celíaco-Dermatite Herpetiformis, Síndrome da Disfunção Imune da Fadiga Crônica(CFIDS), Polineuropatia Desmielinante Inflamatória Crônica, Penfigóide Ci-catricial, Síndrome CREST1 Doença da Aglutinina Fria, Doença de Crohn,Doença de Dego1 Dermatomiosite, Dermatomiosite-juvenil, Lúpus Discóide,Crioglobulinemia Mista Essencial, Fibromialgia-Fibromiosite, Doença deGrave, Guillain-Barré, Tiroidite de Hashimoto, Fibrose Pulmonar Idiopática,Trombocitopenia Púrpura Idiopática (ITP), Nefropatia IgA, Diabetes InsulinoDependente, Artrite Juvenil, Líquen Plano, Lúpus, Doença de Ménière, Do-ença do Tecido Conectivo Mista, Esclerose Múltipla, Miastenia Grave (MG),I Pénfigo, Pênfigo Vulgar, Anemia Perniciosa, Poliarterite Nodosa, Policondri-te, Síndromes Poliglandulares, Polimialgia Reumática, Poliomiosite e Derma-tomiosite, Agamaglobulinemia Primária, Cirrose Biliar Primária, Psoríase,Fenômeno de Raynaud, Síndrome de Reiter, Febre Reumática, Artrite Reu-matóide, Sarcoidose, Escleroderma, Síndrome de Sjógren, Síndrome Stiff-Man, Arterite Takayasu, Arterite Temporal/Arterite da Célula Gigante, Rejei-ção de Transplante, Colite Ulcerativa, Uveíte, Vasculite, Vitiligo e Granulo-matose de Wegener.
Em uma modalidade, a doença auto-imune é escolhida de pên-figo bolhoso, púrpura trombocitopenia idiopática (ITP), miastenia grave (MG),pênfigo (por exemplo, pênfigo vulgar) e rejeição de transplante.
Em outra modalidade, os peptídeos da invenção podem ser u-sados em combinação com esteróides para imunossupressão.
2. Distúrbios Inflamatórios
Os peptídeos da invenção podem ser usados para tratar distúr-bios inflamatórios incluindo, mas não limitado a, asma, colite ulcerativa esíndrome do intestino inflamatório alergia, incluindo rinite/sinusite alérgica,alergias de pele (urticária, angioedema, dermatite atópica), alergias alimen-tares, alergias a fármaco, alergias a inseto, mastocitose, artrite, incluindoosteoartrite, artritite reumatóide e espondiloartropatias.
3. Doenças ou Condições que Requerem Administração deuma Proteína TerapêuticaFreqüentemente, em doenças ou condições que requerem aadministração de uma proteína terapêutica, o indivíduo vai desenvolver anti-corpos contra a proteína terapêutica, que, por sua vez, previne da proteínaterapêutica estar disponível para seu propósito terapêutico pretendido. Destemodo, os peptídeos da invenção podem ser usados em combinação com aproteína terapêutica para aumentar o benefício da proteína terapêutica atra-vés da redução dos níveis de IgG; onde, anticorpos IgG são responsáveispela biodisponibilidade menor de uma proteína terapêutica.
Deste modo, uma modalidade provê um método de regulagem,tratamento ou prevenção de uma condição, doença ou distúrbio resultantede uma resposta imune a um fator de coagulação compreendendo contatode uma célula com uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer umdos peptídeos descritos aqui, onde o fator de coagulação é escolhido de fi-brinogênio, pró-trombina, fator V, fator VII, fator VIII, fator IX, fator X, fator XI,fator XII, fator Xlll ou fator de von Willebrand. Este método pode ser usadopara regular ou tratar ou prevenir uma resposta imune a um fator de coagu-lação em um paciente sofrendo de, por exemplo, hemofilia A ou hemofilia B.Em uma modalidade, os peptídeos da presente invenção bloqueiam inibido-res de fator VIII. Em outra modalidade, o método pode ser usado para regu-lar ou tratar ou prevenir uma resposta imune a, por exemplo, eritropoietinaterapêutica em um paciente sofrendo de aplasia de célula vermelha pura(PRCA).
4. Doenças ou Condições que Requerem Terapia de GeneObstáculos para a implementação bem-sucedida de terapia degene para o tratamento de uma doença ou condição também incluem o de-senvolvimento de anticorpos específicos para a proteína terapêutica codifi-cada pelo transgene bem como possivelmente para o vetor usado para apli-car o transgene. Deste modo, o peptídeo da invenção pode ser administradoem combinação com terapia de gene para aumentar o benefício da proteínaterapêutica codificada através da redução dos níveis de IgG. Esses métodossão particularmente úteis em situações onde anticorpos IgG são responsá-veis pela biodisponibilidade menor de um vetor de terapia de gene ou daproteína terapêutica codificada. O vetor de terapia de gene pode ser, porexemplo, um vetor viral tal como adenovírus e vírus adeno associado. Doen-ças que podem ser tratadas usando terapia de gene incluem, mas não estãolimitadas a, fibrose cística, hemofilia, PRCA, distrofia muscular ou doençasde armazenamento lisossomal, tal como, por exemplo, doença de Gaucher edoença de Fabry.
5. Imagem In vivo e Detecção de FcRn
Os peptídeos da invenção podem ser também usados em en-saios para detectar FcRn. Em algumas modalidades, o ensaio é um ensaiode ligação que detecta ligação de um peptídeo da invenção com FcRn. Nes-I ses ensaios, ou FcRn ou os peptídeos da invenção podem ser imobilizados,enquanto o outro (ou FcRn ou os peptídeos da invenção) é passado sobre opar de ligação imobilizado. Ou o FcRn ou os peptídeos da invenção podemser detectavelmente marcados. Marcadores adequados incluem radioisóto-pos, incluindo, mas não limitado a, 64Cu1 67Cu, 90Y, 111In, 124I1 125I1 131I1 137Cs,186Re, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 241Am, 244Cm e "mTc-MDP; enzimas tendoprodutos detectáveis (por exemplo, luciferase, peroxidase, fosfatase alcalina,β-galactosidase e similar); fluorescedores e marcadores fluorescentes; porexemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina,aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina; metais de emissão de fluores-cência, por exemplo, 152Eu, ou outros da série dos lantanídeos, ligados aospeptídeos da invenção através de grupos de quelação de metal tal comoEDTA; compostos quimioluminescentes, por exemplo, luminol, isoluminol,éster de acridino teromático, sais de acridino, imidazol e oxalato esteror; ecompostos bioluminescentes, pór exemplo, luciferina, ou aequorina (proteínafluorescente verde), moléculas de ligação específica, por exemplo, partículasmagnéticas, microesferas, nanoesferas, nanocristais quantum dot Iumines-centes e similar,
Alternativamente, pares de ligação específica podem ser usadosenvolvendo, por exemplo, um anticorpo ou reagente de segundo estágio queé detectavelmente marcado e que pode amplificar o sinal. Por exemplo, ospeptídeos da invenção podem ser conjugados à biotina, e estreptavidinaconjugada à peroxidase de rábano silvestre adicionada como um reagentede segundo estágio. Digoxina e antidigoxina provêem outro par de ligaçãoadequado. Em outras modalidades, um anticorpo de segundo estágio podeser conjugado a uma enzima tal como peroxidase em combinação com umsubstrato que sofre uma mudança de cor na presença da peroxidase. A au-sência ou presença de ligação entre peptídeos da invenção de FcRn podeser determinada através de vários métodos, incluindo citometria de fluxo decélulas dissociadas, microscopia, radiografia, fluorimetria, detecção cromo-gênica, imagem de fósforo, detecção de quimioluminescência em película econtagem de cintilação. Tais reagentes e seus métodos de uso são bem-conhecidos na técnica.
Para aplicações de diagnóstico in vivo, tecidos específicos oumesmo distúrbios celulares específicos que podem ser caracterizados, pelomenos em parte, pela expressão de FcRn, podem ter imagem feita atravésda administração de uma quantidade suficiente de um peptídeo marcado dainvenção.
Uma ampla variedade de íons de metal adequados para imagemde tecido in vivo foi testada e utilizada clinicamente. Para imagem com radio-isótopos, as características que seguem são geralmente desejáveis: (a) dosede radiação baixa para o paciente; (b) rendimento de fóton alto que permiteque um procedimento de medicina nuclear seja realizado em um período detempo curto; (c) habilidade de serem produzidos em quantidades suficientes;(d) custo aceitável; (e) preparação simples para administração; e (f) nenhu-ma necessidade que o paciente seja seqüestrado subseqüentemente. Essascaracterísticas geralmente traduzem no que segue: (a) a exposição à radia-ção ao órgão mais crítico é menos do que 5 rad; (b) uma imagem única podeser obtida dentro de várias horas após infusão; (c) o radioisótopo não declinaatravés da emissão de uma partícula; (d) o isótopo pode ser prontamentedetectado; e (e) a meia-vida é menos do que quatro dias (Lamb e Kramer,"Commercial Production of Radioisotopes for Nuclear Medicine", In Radiotra-cers For Medicai Applications, Vol. 1, Rayudu (Ed.), CRC Press, Inc., BocaRaton, pp. 17-62). Em uma modalidade, o metal é tecnécio-99m.Deste modo, a invenção provê um método de obtenção de umaimagem de uma região interna de um indivíduo que compreende administra-ção a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição compre-endendo pelo menos um dos peptídeos da invenção contendo um metal on-de o metal é radioativo, e registro da imagem cintigráfica obtida a partir dodeclínio do metal radioativo. Da mesma maneira, a invenção provê métodospara aumento de uma imagem de ressonância magnética (MR) de uma regi-ão interna de um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo umaquantidade eficaz de uma composição compreendendo pelo menos um dospeptídeos da invenção contendo um metal onde o metal é paramagnético, eregistro da imagem MR de uma região interna do indivíduo.
Outros métodos providos pela presente invenção incluem ummétodo de aumento de uma imagem sonográfica de uma região interna deum indivíduo compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidadeeficaz de uma composição compreendendo pelo menos um dos peptídeosda invenção contendo um metal e registro da imagem sonográfica de umaregião interna do indivíduo. Nesta aplicação, o metal pode ser um íon de me-tal pesado não-tóxico. Um método de aumento de uma imagem de raio X deuma região interna de um indivíduo é também provido, o qual compreendeadministrar a um indivíduo uma composição de peptídeo contendo um metal,e registro da imagem de raio X de uma região interna do indivíduo. Um íonde metal pesado não-tóxico, radioativo, pode ser usado.
Peptídeos da invenção podem ser ligados a quelantes tal comoaqueles descritos na Patente U.S. ne 5.326.856. O complexo peptídeo-quelante pode então ser radiomarcado para prover um agente de imagempara diagnóstico ou tratamento de doenças ou condições envolvendo a regu-Iagem de níveis de IgG. Os peptídeos da invenção podem ser também usa-dos nos métodos que são descritos na Patente U.S. n9 5.449.761 para criarum peptídeo radiomarcado para uso em imagem ou radioterapia.
6. Dosagem e Modalidades de Tratamento
Os peptídeos da invenção podem ser administrados intraveno-sa, subcutânea, intramuscularmente, oral, sublingual, bucal, sublingual, na-sal, retal, vaginàlmente ou através de via pulmonar. Os peptídeos da inven-ção podem ser implantados dentro ou ligados a um apoio sólido de biopolí-mero que permite a liberação lenta da proteína quimérica ao sítio desejado.
A dose do peptídeo da invenção vai variar dependendo da do-ença ou condição a ser tratada, da severidade da doença ou condições, doindivíduo, incluindo seu gênero, idade, peso e resultado desejado e da via deadministração particular usada. Dosagens podem variar de 0,1 a 100.000pg/kg de peso do corpo. Em uma modalidade, a faixa de dosagem é 1-10.000 pg/kg. Em outra modalidade, a faixa de dosagem é 10-1.000 pg/kg.Em outra modalidade, a taxa de dosagem é 100-500 pg/kg. O peptídeo dainvenção pode ser administrado continuamente ou em intervalos de tempoespecificados. Ensaios in vitro podem ser empregados para determinar asfaixas e/ou programas de dose ótimos para administração. Outras dosagenseficazes podem ser prontamente determinadas por uma pessoa de habilida-de comum na técnica através de testes de rotina estabelecendo curvas dedose reposta, por exemplo, a quantidade dos peptídeos da invenção neces-sária para aumentar ou diminuir o nível de IgG pode ser calculada a partir deexperimentação in vivo. Aqueles de habilidade vão compreender que níveisde dose podem variar como uma função do composto específico, a severi-dade dos sintomas e a susceptibilidade do indivíduo a efeitos colaterais, edosagens preferidas para um dado composto são prontamente determiná-veis por aqueles de habilidade na técnica através de uma variedade de mei-os. Por exemplo, a fim de calcular a dose de peptídeos da invenção, aquelesversados na técnica podem usar informação prontamente disponível comrelação à quantidade necessária para ter o efeito desejado, dependendo doagente particular usado.
7. Composições Farmacêuticas
A invenção refere-se também a uma composição farmacêuticacompreendendo pelo menos um dos peptídeos da invenção e um veículo ouexcipiente farmaceuticamente aceitável. Exemplos de veículos farmacêuti-cos são descritos em Remington's Pharmaceuticai Sciences de E.W. Martin.Exemplos de excipientes podem incluir amido, glicose, lactose, sacarose,gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestea-rato glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno,glicol, água, etanol e similar. A composição pode também conter reagentesde tamponamento de pH e agentes umectantes ou emulsificantes.
Para administração oral, a composição farmacêutica pode tomara forma de comprimidos ou cápsulas preparados através de meios conven-cionais. A composição pode também ser preparada como um líquido, porexemplo, como um xarope ou uma suspensão. O líquido pode incluir agen-tes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ougorduras comestíveis hidrogenadas), agentes emulsificantes (lecitina ou a-cácia), veículos não-aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleo-sos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados) e conservantes (por exem-plo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparaçõespodem também incluir agentes aromatizantes, de coloração e adoçantes.
Alternativamente, a composição pode ser apresentada como um produtoseco para constituição com água e outro veículo adequado.
Para administração bucal e sublingual a composição pode tomara forma de comprimidos ou pastilhas de acordo com protocolos convencionais.
Para administração através de inalação, os compostos para usode acordo com a presente invenção são convenientemente aplicados naforma de um spray aerossol a partir de uma embalagem pressurizada ounebulizador (por exemplo, em PBS), com um propelente adequado, por e-xemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluormetano,dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressu-rizado a unidade de dosagem pode ser determinada provendo uma válvulapara aplicar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo,gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados con-tendo uma mistura de pó do composto e uma base em pó adequada tal co-mo Iactose ou amido.
A composição farmacêutica pode ser formulada para adminis-tração parenteral (isto é, intravenosa ou intramuscular) através de injeção debolus. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de do-sagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose comum conservante adicionado. As composições podem tomar tais formas talcomo suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos epodem conter agentes de formulação tal como agentes de suspensão, esta-bilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar naforma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, águalivre de pirogênio.
A composição farmacêutica pode ser também formulada paraadministração retal como um supositório ou enema de retenção, por exem-plo, contendo bases de supositório convencionais tal como manteiga de ca-cau ou outros glicerídeos.
Peptídeos da invenção podem ser ligados a quelantes tal comoaqueles descritos na Patente U.S. nQ 5.326.856. O complexo peptídeo-quelante pode então ser radiomarcado para prover um agente de imagempara diagnóstico ou tratamento de doenças ou condições envolvendo a regu-lagem de níveis de IgG. Os peptídeos da invenção podem ser também usa-dos nos métodos que são descritos na Patente U.S. nQ 5.449.761 para cria-ção de um peptídeo radiomarcado para uso em radioterapia.
8. Purificação de FcRn
Os peptídeos da invenção podem ser também usados para puri-ficar FcRn. Em algumas modalidades, o peptídeo é covalentemente ligado auma matriz cromatográfica apropriada para formar um meio de separação deFcRn eficiente. Uma solução contendo FcRn é então passada sobre a matrizcromatografia resultando na ligação não-covalente de FcRn ao par de liga-ção imobilizado. Soluções contendo FcRn podem ser de amostras biológicastal como fluido corporal, uma amostra de tecido ou célula, sobrenadante decultura. O FcRn é purificado através de lavagem do complexo peptídeo imo-bilizado: FcRn com uma solução adequada para remover impurezas e entãoliberar o FcRn da matriz cromatográfica com uma solução de eluição ade-quada.
Peptídeos da invenção podem ser ligados a matrizes cromato-gráficas adequadas usando várias abordagens químicas bem-conhecidasdaqueles versados na técnica. Por exemplo, os peptídeos da invenção po-dem ser ligados a matrizes contendo grupos adequadamente reativos talcomo, por exemplo, tióis, aminas, ácidos carboxílicos, álcoois, aldeídos, ha-letos de alquila, N-alquil-maleimidas, N-hidróxi-succinimidil éteres, epóxidos,hidroxilaminas, hidrazidas.
Em outras modalidades, os peptídeos da invenção podem sermodificados para que contenham porções químicas ou seqüências de peptí-deo que se ligam não-covalentemente a uma matriz cromatográfica apropri-ada. Por exemplo, os peptídeos poderiam ser modificados com uma porçãoI de biotina e poderiam ser não-covalentemente ligados a uma matriz croma-tográfica contendo uma proteína avidina. Alternativamente, o peptídeo modi-ficado poderia ser incubado com a solução de FcRn e a mistura resultantepassada sobre a matriz cromatográfica apropriada para isolar o complexo
FcRn:peptídeo.
Exemplos de usos similares de peptídeos para purificação deafinidade podem ser encontrados em Kelley e outros "Development and Va-Iidation of an Affinity Chromatography Step Using a Peptide Ligand for cGMPProduction of Factor VIII" em Biotechnology and Bioengineering, Vol. 87, nQ3, Wiley InterScienc, 2004, pp. 400-412 e Patente U.S. n9 6.197.526.
EXEMPLOS
Os Exemplos, que pretendem ser puramente exemplares da in-venção e não devem então ser considerados limitar a invenção de modo al-gum, também descrevem e detalham aspectos e modalidades da invençãoacima discutidos. Os exemplos não pretendem representar que os experi-mentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Esforçosforam feitos para assegurar precisão com relação aos números usados (porexemplo, quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros de desvios deexperimento devem ser levados com consideração. A menos que de outromodo indicado, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecularponderai médio, temperatura é em graus Centígrados e pressão está na oupróximo da pressão atmosférica.Exemplo 1: Expressão de FcRn Humano Solúvel (shFcRn)
cDNA de FcRn humano solúvel foi clonado, expresso e purifi-cado conforme descrito na literatura usando o sistema de expressão de glu-tamina sintetase em células de ovário de hamster Chinês (CHO) Vide Paten-te U.S. ng 5.623.053. Um códon de parada foi posto após a posição de ami-noácido 274 na seqüência de proteína de FcRn humano a fim de remover aregião de transmembrana.
Exemplo 2: Transfecção de Células HEK 293 com FcRn Humano
Células de rim embriônicas humanas (HEK) 293 (ATCC, Ma-nassas, VA) foram transfectadas usando o SuperFect Transfection Reagent(Qiagen, Valencia, CA) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabri-cante. O construto de cDNA de FcRN de comprimento completo mostradona figura 1 (C.M. Story e outros, J. Exp. Med. 180:2377-2381 (1994), N.E.Simister e outros, Eur. J. Immunol. 26:1527-1531 (1996)) foi originalmenteclonado em pcDNA6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) como o vetor de plasmídeo afim de gerar o vetor de expressão de FcRn, FcRn:pcDNA6. O construto decDNA de P2Im humana também mostrado na figura 1 foi originalmente clona-do em pcDNA3 (Invitrogen) como o vetor de plasmídeo para gerar o vetor deexpressão de β2ΓΤΐ, p2m:pcDNA3 (D. Gussow e outros, J. Immunol.139:3132-3138(1987)).
No dia antes da transfecção, células HEK293 foram semeadasa 0,5-2,5 χ 106 células por 100 mm de placa e incubadas a 37° C e 5% deCO2 por 16 horas em cDMEM. A composição de cDMEM contém: 1L deDMEM (Invitrogen ne 11995-065); 10 ml de HEPES a 1M, pH 7,55; 10 ml desolução de aminoácido MEM (Invitrogen n5 11130-051); 10 ml de solução deaminoácido não-essencial MEM (Invitrogen nQ 11140-050); 10 ml de piruvatode sódio a 100 mM (Invitrogen nQ 11360-070); 10 ml de líquido de PenicilinaEstreptomicina (Invitrogen nQ 15140-148); 10 ml de solução de L-glutamina(Invitrogen nQ 25030-081); 1 ml de solução de 2-mercaptoetanol em soluçãosalina tamponada com fosfato da Dulbecco a 55 mM (DPBS) (Invitrogen n921985-023); 100 ml de soro bovino fetal inativado com calor (FBS) (Invitro-gen). No dia da transfecção, 5 pg do construto de FcRn:pcDNA6 e 5 pg deDNA de p2m:pcDNA3 foram adicionados a 290 μΙ_ de DMEM (Invitrogen). Asolução foi misturada por alguns segundos e centrifugada. Então, 60 μΙ_ deSuperFect Transfection Reagent (Qiagen) foram adicionados à solução deDNA e vortexados por 10 segundos. A solução de DNA/SuperFect foi incu-bada por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente, tempo durante o qual omeio da placa contendo célula foi aspirado e as células lavadas uma vezcom 4 ml de PBS. Após a incubação de 5 a 10 minutos do DNA/SuperFect, 3ml de meio de crescimento completo (cDMEM) foram adicionados à soluçãode DNA/SuperFect, a solução foi misturada e imediatamente adicionada às
- I células na placa de 100 mm.
As células foram incubadas com a solução de DNA/SuperFectpor 2 a 3 horas a 37° C e 5% de CO2. O meio contendo a solução deDNA/SuperFect foi removido das células e as células foram lavadas 3 vezescom PBS e cDMEM fresco foi adicionado às células. Após uma incubaçãode 48 horas, o meio foi avaliado através de análise immunoblot para deter-minar se expressão transiente do complexo FcRn/p2m tinha acontecido. Ain-da, as células foram passadas em uma razão de 1:4 em cDMEM contendo250 pg/L de Geneticin (Invitrogen) como um antibiótico e 5 pg/L de Blastici-din para selecionar transfectantes estáveis resistentes a Blasticidin. Após 4semanas de seleção de antibiótico, células sobreviventes foram semeadasem placas de cultura de tecido de 96 cavidades em uma densidade de 1 cé-lula por cavidade. Por fim 12 clones foram selecionados e cada um expandi-do e checado quanto à expressão através de análise immunoblot para FcRne p2m. Esta análise identificou o clone 11 de 293 expressando FcRn e p2mcomo possuindo o nível mais alto de expressão e foi então usado em ensai-os subseqüentes.
Exemplo 3: Avaliação de Bibliotecas de Fago quanto a Ini-bidores de FcRN-IgG
Peptídeos capazes de inibição da ligação da porção Fc de IgG aFcRn foram identificados através de avaliação de bibliotecas de display defago filamentoso licenciadas da Dyax Corp. (Cambridge, MA). Mais especifi-camente, as três bibliotecas que seguem foram usadas em combinação: TN-9-IV, TN-10-X, TN-11 e TN-12-1 foram usadas na avaliação. O número totalde fago viável individual contido em cada biblioteca foi refletido pelo númerode transformantes estabelecido para cada biblioteca quando as bibliotecasforam expressas em E. coli e plaqueadas em uma diluição clonal conformedescrito pelo protocolo Dyax. O número de transformantes para TN-9-IV,TN10-X, TN-11-1 e TN-12-1 foi 3,2 χ 1091 2 χ 109, 2,7 χ 109 e 1,4 χ 109, res-pectivamente. Outro modo de se referir ao número absoluto de fagos viáveisem um dado volume é declarando as unidades de formação de placa (pfu)por volume de unidade.
а. Tampões usados em avaliação de fago
Os tampões que seguem foram usados para a avaliação de pep-tídeos de ligação a FcRn.
1. Caldo NZCYM: 10 g de NZ Amina-A; 5 g de cloreto de sódio;5 g de Extrato de Levedura Bacto (Difco); 1 g de Casaminoácidos; 1 g de póanidro de sulfato de magnésio: os ingredientes foram dissolvidos em 800 mlde água, ajustados para pH 7,5 com hidróxido de sódio a 1N e então trazi-dos para um volume total de 1L com água e autoclavados por 20 minutos.
2. Tampão de ligação (BB): PBS, pH 6 mais EDTA.C a 10 mM.NZCYM-T: caldo NCZYM mais 12,5 pg/ml de Tetraciclina.
3. HBSS-E: Solução Salina Equilibrada de Hank (Invitrogen)mais EDTA a 10 mM (Invitrogen).
4 . Sais Min A: 10,5 g de K2HPO4 (fosfato de potássio dibásico);4,5 g de KH2PO4 (fosfato de potássio monobásico); 1,0 (NH4)2SO4 (sulfatode amônio) e 0,5 g de citrato de sódio dissolvidos em 1L de água.
5. Caldo LB: 10 g de Bacto Tryptone; 5 g de extrato de leveduraBacto; 10 g de cloreto de sódio dissolvidos em 1 L de água e autoclavadospor 20 minutos.
6. CBS pH 2: citrato de sódio a 50 mM; cloreto de sódio a 150mM: tampão foi trazido para pH 2 com HCI e filtrado esterilizado.
7 . Ágar LB: 30 g de Bacto Tryptone; 15 g de extrato de leveduraBacto; 30 g de cloreto de sódio dissolvidos em 3 L de água e autoclavadospor 20 minutos.
8 . Ágar Mole LB: 20 g de Bacto Triptona; 10 g de extrato de le-vedura Bacto; 20 g de cloreto de sódio; 14 g de ágar Bactor dissolvidos em 2L de água usando calor suave sem ferver.
9 . Tampão TE: Tris a 0 mM, EDTA a 1 mM, pH 7.
b. Protocolo de Avaliação: Rodada 1
Aproximadamente 100 equivalentes de biblioteca aleatórios decada biblioteca foram agrupados de acordo com seu título, o que significa;24 μL de TN9-IV (1,3 χ 101°'ρίυ/μΙ_), 12,5 μΙ_ de TN10-X (1,6 χ 1010 ptu/pL),225 μL de TN11-I (1,2 χ 109 pfu/μΐ.) e 48,7 μΙ_ de TN12-I (2,9 χ 109 pfu/μΐ.)foram misturados com 189 μΙ_ de PBS, 75 μΙ_ de polietileno glicol (PEG) a17% gelado (peso molecular médio: 8000 Da, Sigma-AIdrich, St. Louis, MO)e 75 μL de cloreto de sódio a 3M e incubados em gelo por 30 minutos. Umfrasco T75 de células de clone 11 293 (Exemplo 2) foi separado em umarazão de 1:3 com HBSS-E. As células foram transferidas para um tubo demicrocentrífuga de 1 ml, lavadas uma vez com tampão de ligação frio e osobrenadante removido. As células foram incubadas com o fago por 1,5 horaa 4o C em um rotator. Após a incubação, as células foram lavadas cinco ve-zes com 1 ml de BB gelado seguido cada vez por centrifugação a 1400 rpmpor 2 minutos. O fago fortemente ligado foi eluído através da adição de 66μΜ de IgG humana (Calbiochem, São Diego, CA) que tinham sido dialisadosem BB. A mistura de fago-lgG foi incubada com as células por 1 hora a 4o C.Seguindo uma etapa de centrifugação (Giro a 1400 rpm por 2 minutos), opélete de célula foi lavado primeiro com 200 μΙ_ de 66 μΜ de IgG, centrifuga-do (giro de 1400 rpm por 2 minutos) e lavado em um momento final com 100μl de IgG. As lavagens de IgG foram combinadas com eluição de IgG paravolume final de 500 μΙ. O fago no eluente foi titulado e amplificado conformedescrito abaixo.
c. Titulação de Fago
Soluções de fago foram diluídas em etapas de 100 vezes. Tipi-camente 2 μΙ de solução de fago foram adicionados a 198 μΙ_ de caldoNZCYM de uma maneira serial para atingir diluições de até 10"10. Fago diluí-do foi adicionado a uma cultura de células de E. coli XL1 Blue MRF quandoas células de E. coli XLI Blue MRF estavam sendo cultivadas em fase Iog eatingiram uma densidade óptica de 0,5 a A600 (absorbância de UV a 600nm). A cultura foi incubada em temperatura ambiente por 10 minutos. Emseguida, 0,5 ml das células infectadas foi adicionado a 3,5 ml de ágar detopo derretido (uma mistura 50/50 de caldo LB e ágar LB) em aproximada-mente 55° C e espalhado sobre uma placa de ágar padrão e incubado danoite para o dia a 37° graus. O título foi calculado a partir de uma placa con-tendo 30 a 300 placas. Para uma placa contendo 50 placas, plaqueada deuma diluição de fago de 10"8, os cálculos seriam realizados como segue: 50placas/500 pL de células infectadas χ diluição de 10 vezes durante infecçãoχ diluição de fago 108 = 108 unidades de formação de placa por μί.
Quando necessário para ELISA e análise de seqüenciamentode fago subsequentes, plugs de ágar individuais contendo placas de fagoforam pegos com pipetas Pasteur autoclavadas. Os tampão foram deposita-dos em placas de cultura de tecido de fundo redondo estéreis de 96 cavida-des (Greiner), às quais 100 μί por cavidade de TE foram adicionados. Fagofoi eluído das placas por 2 horas a 37° C ou da noite para o dia a 4o C.d. Amplificação de Fago
Uma cultura de células de E. coli XL1 blue MRF foi cultivada emcaldo NZCYM-T de uma diluição 1/100 de uma cultura da noite para o diasaturada até que a cultura atingiu uma densidade óptica de 0,5 a A600. Ascélulas foram concentradas através de centrifugação delas por 15 minutos a3500 rpm, seguido por ressuspensão em sais Min A para 1/20 do volumeoriginal. O fago eluído das células após uma rodada de seleção foi diluídopara um volume final de 1 ml em sais Min A e adicionado a 1 ml da culturabacteriana concentrada. Após uma incubação de 15 minutos em um banhode água a 37° C, a mistura de fago-célula foi adicionada a 2 ml de caldoNZCYM 2X e pulverizada sobre uma placa NUNC grande com NZCYM mais50 pg/ml de ampicilina até secar. As placas foram incubadas por 14 a 18horas a 37° C. Colônias que se formaram da noite para o dia foram raspadasgentilmente com uma barra de espalhamento na presença de 20 ml de PBS.Bactérias e fago contendo PBS foram coletados em um tubo de centrífuga.Bactérias que permaneceram na placa foram raspadas novamente na pre-sença de 10 ml de PBS e coletadas. Um enxágüe de 10 ml de PBS final foiaplicado à placa, e agrupado com todo o material raspado. As células bacte-rianas foram peletizadas através de centrifugação (15 minutos a 3500 rpm) eo sobrenadante transparente foi decantado em outro tubo de centrífuga, cla-rificado novamente e finalmente decantado novamente. Então, um volumede 0,15 mL de PEG a 17% + NaCI a 3M foi adicionado ao sobrenadante, quefoi misturado e armazenado da noite para o dia a 4o C. O fago precipitadocoletado através de centrifugação (8500 χ g por 30 minutos), após o que oI sobrenadante foi descartado. O pélete de fago foi ressuspenso em um volu-me pequeno de PBS, clarificado com um breve giro e precipitado novamentecom um volume 0,15 de PEG a 17% + NaCI a 3M. O pélete de fago final foiressuspenso em PBS e titulado em preparação para a próxima rodada deseleção.
e. Rodada 2
A biblioteca de fago amplificada foi diluída de modo que apenas10 equivalentes de biblioteca aleatórios foram diluídos em 1 ml de tampãode ligação. Um terço de um frasco T75 de células 293 não-transfectadas foilavado uma vez com tampão de ligação frio. Uma etapa de subtração incluí-da para remover fago da biblioteca que expressava peptídeos capazes deligação a células que não expressavam FcRn foi realizada duas vezes atra-vés de incubação do fago com as células não-transfectadas por 15 minutos.O sobrenadante foi recuperado. Então um terço de um frasco T75 de célulasde clone 11 293 foi lavado uma vez com tampão de ligação frio e incubadocom o fago por 1,5 hora a 4o C em um rotator. As células foram lavadas ecentrifugadas (giro a 1400 rpm por 2 minutos) cinco vezes com 1 ml de tam-pão de ligação frio e o fago fortemente ligado foi eluído com 200 pL de 66μΜ de IgG humana (dialisada em tampão de ligação) através da incubaçãoda mistura fago-célula-lgG por 1 hora a 4o C. Após centrifugação (giro a1400 rpm por 2 minutos), o sobrenadante foi coletado e o pélete foi lavadocom 200 μl de 66 uM de IgG, seguido por uma lavagem de 100 μL de 66 uMde IgG. O fago no eluente foi titulado e amplificado conforme descrito abaixona seção designada título de fago e amplificação de fago.
f . Rodada 3
Esta rodada foi realizada conforme acima descrito para a Roda-da 2. No término da Rodada 3, o fago no eluente foi titulado e ensaiadoquanto a inibidores de IgG-FcRn usando o ELISA de fago.g-ELISAdeFago
As etapas que seguem foram realizadas para identificar, atravésde ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), fagos codificando pep-tídeos que eram capazes de se ligar a FcRn. Primeiro as soluções que se-guem foram preparadas:
Tampão A: PBS + Tween a 0,1 % + BSA a 0,5%
Tampão B: MES a 10 mM, pH 5,5 + NaCI a 150 mM + Tween a0,1%
Tampão C: MES a 50 mM, pH 6,0 + NaCI a 150 mM + Tween a0,1%
Uma cultura de E. coli XL1 blue MRF' para a propagação deum fago que demonstrou a habilidade em se ligar a FcRn foi cultivada parauma densidade óptica de 0,5 a A600 de uma diluição de 1:100 de uma cultu-ra da noite para o dia. Então, 10 μί de cada eluente de placa de fago quetinha sido preparado conforme acima descrito foram adicionados a 30 μLdas células de E. coli XL1 blue MRF' em cavidades de uma placa de 96 ca-vidades e incubados por 15 minutos em temperatura ambiente. Então, 130μL de caldo NZCYM contendo 50 μg/ml de Ampicilina foram adicionados acada cavidade e as placas foram incubadas da noite para o dia a 37° C.
Uma placa de microtitulação bloqueada com BSA, revestidacom estreptavidina, (Pierce) foi preparada enxaguando-a com 200 μl por ca-vidade de tampão A, e revestindo-a da noite para o dia a 4o C com 1 mg/mlde FcRn humano solúvel biotinilado (Exemplo 4, seção A), em tampão A. Otampão contendo FcRn foi descartado e a placa foi enxaguada duas vezescom tampão C. Então, 70 μΙ de tampão B foram adicionados a cada cavida-de da placa, seguido pela adição de 30 μΙ de uma cultura bacteriana conten-do fago. Após 1 hora em temperatura ambiente, a placa foi lavada cinco ve-zes com 200 μΙ de tampão C. Então, 100 μΙ de tampão C contendo uma dilu-ição 1:10000 de um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Phar-macia) foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada em tempe-ratura ambiente por uma hora. Então, as placas foram lavadas 9 vezes comtampão C, desenvolvidas com TMB 1 etapa (KPL), paradas após 5-15 minu-tos com ácido sulfúrico a 2M e lidas a 450 nm com uma leitora de placaSpectra Max Plus (Molecular Devices).
h. Amplificação por PCR de DNA de Fago
Fago eluído de placas em TE foram amplificados para seqüen-Ciamento usando o PCR Core System Il kit de acordo com as instruções dofabricante (Promega). Então, 5 ml de fago eluído foram adicionados a umamistura de reação contendo 200 μΜ cada de dNTP, 500 nM de primer3PCRUP (5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3') (SEQ ID NO:11),500 nM de primer 3PCRDN (5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3')(SEQ ID NO: 12), 1x Taq DNA Polymerase Buffer (1 Ox: KCI a 500 mM, Tris-HCI a 100 mM pH 9,0 a 25° C1 Triton X-100 a 1%, MgCI2 a 15 mm) e 1,25unidade de enzimas Taq DNA Polymerase. As reações foram submetidas aoprograma que segue em um ciclizador térmico MJ Research PCT-200: 5 mi-nutos a 94° C; 30 ciclos consistindo em 15 segundos a 94° C, 30 segundos a55° C e 60 segundos a 72° C, seguido por 7 minutos a 72° C. O produto re-sultante foi purificado usando o QiaQuick PCR Prep kit (Qiagen) de acordocom as instruções do fabricante, quantificado através de absorbância a A260e seqüenciado usando primer 3SEQ-80 (5'-GATAAACCGAT6ACAATTAAAGGCTCC-3') (SEQ ID NO:13).
Seqüenciamento de fago que foi amplificado seguindo as 3 ro-dadas de avaliação revelou as seqüências de DNA que codificavam as se-qüências de aminoácido providas na figura 1. Esses "hits de fago" foram u-sados coletivamente para identificar uma seqüência de peptídeo de consen-so, definida pela seqüência de aminoácido: G-H-F-G-G-X-Y- (SEQ ID NO:14).
EXEMPLO 4: ELISA de Competição de Peptideo-IgGA fim de determinar se os peptídeos da invenção que foram de-rivados da avaliação das bibliotecas de display de fago filamentoso eramcapazes de bloquear a ligação de IgG a FcRn1 o ensaio ELISA que segue foidesenvolvido e realizado.
a. Biotinilação de ShFcRn
Uma solução de FcRn humano solúvel (shFcRn) em tampão Trisfoi dialisada duas vezes, cada vez por 3 horas em 2 litros de PBS, pH 8.0. Aquantidade de shFcRn recuperada foi determinada medindo a absorbância a280 nm. A concentração de shFcRn foi obtida multiplicando a leitura de ab-sorbância pelo coeficiente de extinção para shFcRn, que é: ε = 85880 M"1cm"1. Biotoinilação de shFcRn foi realizada tratando o shFcRn dialisado comum excesso molar de 2 vezes de SuIfo-NHS-LC-Biotina (Invitrogen, Carls-bad, CA) por 2 horas a 4o C. Em seguida, mistura de reação de shFcRn-Sulf-NHS-LC-Biotina foi dialisada duas vezes em 2 L de PBS frio, seguido poroutra leitura de absorbância para determinar a concentração da proteína res-tante. O shFcRn biotinilado foi armazenado a 4o C com 0,1% de azida desódio até necessário.
b. Ensaio ELISA de Competição de Peptideo-IgG
Placas revestidas com ReactiBind Neutravidin de 96 cavidadesbloqueadas com BSA (Pierce, Rockford, IL) foram lavadas duas vezes com200 μ l/cavidade de Tampão A (Tampão A:PBS pH 7,4 (Gibco, 14040), BSAa 0,5% sem IgG, Tween-20 a 0,05%). As cavidades foram revestidas com100 μΙ/cavidade de 1 pg/ml de shFcRn biotinilado em Tampão A. A placa foivedada e incubada a 37° C por 2 horas. Em seguida, a placa foi lavada com200 μ l/cavidade de Tampão B (Tampão B: MES a 100 mM pH 6, NaCI a 150mM, BSA a 0,5% sem IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA),Tween-20 a 0,05%). Então, 50 μΙ/cavidade de IgG humano a 6 mM (Calbio-chem, São Diego, CA) em Tampão B bem como 50 μΙ/cavidade dos várioscompetidores de peptídeo (em várias concentrações) foram adicionados, demodo que a concentração final de IgG na cavidade era 3 nM. Para permitirmistura, a placa foi balançada por 2 minutos, vedada e incubada a 37° C por2 horas. Seguindo a incubação, o líquido foi aspirado da placa e 100μl/cavidade de uma diluição 1:10 000 de fragmento F(ab') de IgG anti-humano de cabra conjugado a peroxidase-fragmento F(ab')2 específico(Jackson ImmunoResearch, West Grove1 PA) em Tampão B foram adiciona-dos. A placa foi coberta, incubada por 30 minutos em temperatura ambientee lavada 4 vezes com 200 μΙ/cavidade de tampão B gelado. A solução desubstrato TMB SureBIue (100 pUcavidade, KPL, Gaithersburg1 MD) foi adi-cionada e a placa foi deixada incubar em temperatura ambiente até a cor sedesenvolver, que levou 5 a 10 minutos. Uma vez a cor desenvolvida, 100μl/cavidade de solução de parada TMB (KPL, Gaithersburg, MD) foram adi-cionados e a absorbância foi medida a 450 nm. Os dados foram postos emI gráfico como absorbância vs. concentração de peptídeo para derivar os valo-res de 50% de concentração inibidora (IC50)·
Exemplo 5: Ensaio FACS de Competição de Peptídeo-lggEm adição a usar a abordagem ELISA descrita no Exemplo 4para determinar se os peptídeos da invenção que foram derivados da avalia-ção de bibliotecas de displayde fago filamentoso eram capazes de bloqueara ligação de IgG a FcRn em células, o ensaio de classificação celular ativadocom fluorescência (FACS) que segue foi desenvolvido e realizado.a. Marcação de Synagis® com Alexa-Fluor-488
IgGI humanizado (Synagis®, Medlmmune, Gaitherburg, MD) foimarcado com Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit (Molecular Pro-bes/lnvitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabri-cante. Rapidamente, 50 μΙ de bicarbonato de sódio a 1M, pH 9,0 foram adi-cionados a 500 μΙ de uma solução de 2 mg/ml de IgG em PBS. A solução deproteína foi adicionada ao Alexa Fluor 488 succinimidil éster (pó seco) e in-cubada em temperatura ambiente por 1 hora. A proteína foi purificada atra-vés de cromatografia de exclusão de tamanho usando a coluna componentedo kit (Bio-Rad BioGeI P-30 Fine size exclusion purification resin). A amostrafoi carregada na coluna e eluída com PBS. A primeira faixa colorida continhaa proteína marcada. O grau de marcação foi determinado medindo a absor-bância da IgG eluída a 280 nm e 494 nm. A concentração molar de proteínafoi determinada usando a fórmula: concentração de proteína (M) = [A28o-(A494χ 0,11) x fator de diluição]/203.000. Ainda, a fórmula usada para derivar osmoles de corante por mol de proteínas foi: = A494 χ fator de diluição/71.000χ concentração de proteína (M). Tipicamente, 4-7 moles de Alexa-Fluor 488foram incorporados por mol de IgG.
b. Ensaio FACS de Competição de IgG-Peptideo UsandoCélulas de Clone 11 293
Na preparação do ensaio, células do clone 11 293 HEK (Exem-plo 2) em meio DMEM completo (Gibco, Carlsbad, CA) contendo 5 pg/ml deBlasticidin e 250 pg/ml de G418 (Gibco, Carlsbad, CA) foram giradas (spundown) e ressuspensas em Tampão C (Tampão C: PBS da Dulbecco (Gibco,Carlsbad, CA) contendo EDTA a 10 mM (Gibco)) em uma concentração de 3χ 106 celuas/ml. Células (0,1 ml) foram pipetadas em cada cavidade de umaplaca de ensaio de 96 cavidades e as placas foram centrifugadas a 2600RPM por 5 minutos usando uma centrífuga de bancada Sorvall RT7. Os so-brenadantes foram suavemente decantados e a placa foi blotted em umatoalha de papel. Competidores de peptídeo (90 μΙ) solubilizados em TampãoC em várias concentrações foram adicionados à placa e misturados comuma pipeta multicanal. 10 μΙ de Synagis® marcado com Alexa 488 foram adi-cionados a cada cavidade na placa, de modo que a concentração final deSynagis® marcado com Alexa 488 era 100 nM. A placa foi enrolada em folha,posta em gelo por uma hora e subseqüentemente centrifugada a 2600 rpmpor 5 minutos em uma centrífuga de bancada Sorvall RT7 seguido por umalavagem única com 100 μΙ de Tampão C e uma segunda etapa de centrifu-gação. As células foram ressuspensas em 200 μΙ de Tampão C e analisadasem um citômetro de fluxo Beckman Coulter EPICS XL.
Exemplo 6: Métodos para a Determinação de Constantes deLigação de Equilíbrio (K0) para Peptídeos Usando Ressonância de
Plasmon de Superfície (SPR)
As etapas que seguem foram realizadas para reticular FcRnhumano ou cinomólogo solúvel para a superfície de dextrano de um sensorchip CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) através de uma reação de acopla-mento de amina envolvendo cloridrato de 1-etil-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) (Biacore AB, Uppsala, Suécia) e N-hidroxissuccinimida(NHS) (Biacore AB1 Uppsala, Suécia) conforme recomendado pela Biacore(BlAppIications Handbook, Versão AB, seção 4.2, Biacore AB, Uppsala, Su-écia). A proteína FcRn foi diluída em acetato de sódio a 50 mM, pH 4,5 (Bia-core AB, Uppsala, Suécia) para uma concentração de 10 a 30 pg/ml e usadapara revestir uma célula de fluxo no sensor chip. Sítios residuais na célula defluxo de FcRn foram bloqueados com cloridrato de etanolamina a 1M pH 8,5(Biacore, AB, Uppsala, Suécia). Uma célula de fluxo de controle foi bloquea-da com etanolamina para subtração de referência. Para análise dos peptí-deos monoméricos, FcRN foi revestido para uma densidade final de 4000-5000 unidades de resposta (RU). Para análise dos dímeros de peptídeo,FcRn foi revestido para uma densidade de 2000-2500 RU. Todas as medi-ções de SPR foram realizadas usando um instrumento BIACORE 3000 (Bia-core AB Uppsala, Suécia). Para medições feitas em pH 6 ou pH 7,4, experi-mentos foram realizados em fosfato a 50 mM, cloreto de sódio a 100 mM,tensoativo P20 a 0,01% (Biacore AB, Uppsala, Suécia).
a. Procedimento Representativo para a Determinação deConstante de Ligação de Peptídeos Monoméricos
Dez diluições de 2 vezes do peptídeo foram injetadas no chipFcRn-CM5 em uma taxa de 20 μΙ/min por 2 minutos. O peptídeo foi dissoci-ado do chip por 2,5 minutos com tampão. Qualquer peptídeo restante foi re-movido do chip com uma injeção de 30 segundos em tampão HBS-P (Biaco-re AB, Uppsala, Suécia) em uma taxa de 30 μΙ/min. Sensorgramas foramgerados e analisados usando software BiaEvaI versão 3.1 (Biacore AB, Upp-sala, Suécia). A RU de equilíbrio observada para cada injeção foi posta emgráfico contra concentração. Os valores K0 de equilíbrio foram derivadosatravés de análise dos gráficos usando o modelo de afinidade de estado es-tável incluído no software BiaEvaI.
b. Procedimento Representativo para Determinação deConstante de Ligação de peptídeos Diméricos
Dez diluições de 2 vezes do peptídeo foram injetadas em chipFcRn-CM5 em uma taxa de 30 μΙ/min por 10 minutos. Os peptídeos foramdissociados do chip por 10 minutos com tampão. Qualquer peptídeo restantefoi removido do chip com duas injeções de 60 segundos de uma soluçãocontendo Tris-cloridrato a 50 mM, NaCI a 100 ml, tensoativo P20 a 0,01 % pH9,0 a 100 μl/min.
Sensorgramas foram gerados e analisados usando softwareBiaEvaI versão 3.1 (Biacore AB1 Uppsala, Suécia). A RU de equilíbrio obser-vada para cada injeção foi posta em gráfico contra concentração. Os valoresKd de equilíbrio foram derivados através de análise dos gráficos usando omodelo de afinidade de estado estável incluído no software BiaEval.
Exemplo 7: Síntese de Peptídeos Monoméricos Contendo
Ligações Dissulfeto
Síntese de peptídeos monoméricos foi realizada usando síntesede peptídeo de fase sólida ou manualmente com um frasco de fundo redon-do com frita ou usando um sintetizador Omega Advanced Chemtech 306(Advanced Chemtech, Louisville, KY). Protocolos Fmoc/tBu padrão foramusados (W.C. Chan e P.D. White Eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach. Oxford University Press Inc. Nova Yorque (2000)), emcombinação com uma resina de amida Rink (Novabiochem, São Diego, CA)ou PAL-PEG-OS (Applied Biosystems, Foster City, CA) para dar amidas C-terminais quando da clivagem. Os reagentes de acoplamento foram hexaflu-orfosfato de 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HBTU) e N-hidroxibenzotriazol (HOBt) (Novabiochem, São Diego, CA). A base era diiso-propiletamina (DIEA) (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) e N,N-dimetilformamida(DMF) era o solvente (EM Science, Kansas City, MO). O ciclo de síntesetípico envolvia etapas de desproteção de 2 χ 10 minutos com 20% de piridi-na em DMF, acoplamentos de aminoácido de 2 χ 30 minutos comHOBt/HBTU e uma etapa de capeamento de 10 minutos com anidrido acéti-co/HOBt. Peptídeos foram clivados da resina através de tratamento por 2horas com ácido trifluoracético a 95%; tanoditiol a 2,5%; triisopropilsilano a1,5% e água a 1 % e precipitados com éter gelado, centrifugados e trituradostrês vezes com éter.Peptídeos contendo cisteína brutos foram oxidados para seusdissulfetos correspondentes dissolvendo os peptídeos para uma concentra-ção de 1 mg/ml em uma mistura 4:1 de ácido acético e água (EM Science,Kansas City, MO). Dez equivalentes molares de iodo (solução em água a1M, Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) foram adicionados à solução e a misturade reação foi misturada por uma hora em temperatura ambiente. A reaçãofoi parada através da adição progressiva de tiossulfato de sódio a 1M (Sig-ma-AIdrich, St. Louis, MO) até que uma solução transparente foi obtida. Amistura de reação foi concentrada in vácuo e subseqüentemente purificadausando um sistema HPLC de fase reversa Waters Prep600 (Millford, MA)equipado com uma coluna C18 Phenomenex de 250 χ 21,2 mm (TorrenceCA). O eluente escolhido para a etapa de purificação de HPLC foi um gradi-ente de acetonitrila em água contendo 0,1% (p/v) de TFA. Frações apropria-das foram coletadas, agrupadas e liofilizadas. Identidade e pureza de peptí-deo foram confirmadas através de HPLC analítica de fase reversa em com-binação com uma coluna de 250 mm χ 2 mm (Phenomenex, Torrence, CA)acoplada com espectrometria de massa por eletropulverização (Mariner ES-MS) (Applied Biosystems, Foster City, CA).
A Tabela 2 provê uma listagem das seqüências de peptídeo defago originais derivadas da avaliação da biblioteca de expressão de peptídeousada para identificar peptídeos com uma alta afinidade para FcRn humanoe a habilidade em bloquear a interação IgG-FcRn. A coluna 1 contém o iden-tificador de peptídeo. A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dospeptídeos. A coluna 3 contém a IC5o de cada peptídeo conforme determina-do pelo ELISA de competição de IgG mostrado no Exemplo 4. As colunas 4e 5 contêm a K0 de cada peptídeo conforme determinado em pH 6 e pH 7,4,respectivamente, através da análise Biocore mostrada no Exemplo 6.
Tabela 2. Seqüências de Peptídeo de Fago Originais
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A Tabela 3 provê uma listagem de truncamentos do peptídeo daSEQ ID NO:6. O efeito dos truncamentos sobre os parâmetros de ligaçãodesses peptídeos com FcRn humano é mostrado. A coluna 1 contém o iden-tificador de peptídeo. A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dospeptídeos. A coluna 3 contém a IC50 de cada peptídeo conforme determina-do através do ELISA de competição de IgG mostrado no Exemplo 4. As co-lunas 4 e 5 contêm a Kd de cada peptídeo conforme determinado em pH 6 epH 7,4, respectivamente, através da análise Biacore mostrada no Exemplo 6.
Tabela 3. Truncamentos de SEQ ID NO: 6
<table>table see original document page 76</column></row><table>
A Tabela 4 provê uma listagem de peptídeos e análogos de pep-tídeo derivados da SEQ ID NO:1, onde os aminoácidos únicos foram substi-tuídos com alanina (uma alanina scarí). O efeito de substituições sobre osparâmetros de ligação desses peptídeos com FcRn humano é mostrado. Acoluna 1 contém o identificador de peptídeo. A coluna 2 contém a seqüênciade aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 contém a IC5o de cada peptídeoconforme determinado pelo ensaio ELISA de competição de IgG mostradono Exemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a K0 de cada peptídeo conformedeterminado em pH 6 e pH 7,4, respectivamente, através da análise Biacoremostrada no Exemplo 6.Tabela 4: Alanina Scan da SEQ ID N0:1
<table>table see original document page 77</column></row><table>
A Tabela 5 provê uma listagem de peptídeos e análogos de pep-tídeo derivados de SEQ ID NO:1 onde substituições de cisteína com deriva-dos de cisteína foram realizadas. O efeito das substituições sobre os parâ-metros de ligação desses peptídeos com FcRn humano é mostrado. A colu-na 1 contém um identificador de peptídeo. A coluna 2 contém a seqüênciade aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 contém a IC5o de cada peptídeoconforme determinado pelo ELISA de competição de IgG mostrado no E-xemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a K0 de cada peptídeo conforme deter-minado em pH 6 e pH 7,4, respectivamente, através da análise Biacore mos-trada no Exemplo 6.
Tabela 5. Derivados de Cisteína da SEQ ID NO:1
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*"Pen" = L-penicilamina; "hC" = L-homocisteína;A Tabela 6 provê uma listagem de peptídeos derivados de SEQID NO:1 e Peptídeo nQ 32 onde aminoácidos únicos foram substituídos porN-metil aminoácidos. O efeito das substituições sobre os parâmetros de liga-ção desses peptídeos com FcRn humano é mostrado. A coluna 1 contém umidentificador de peptídeo. A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dospeptídeos. A coluna 3 contém a IC5o de cada peptídeo conforme determina-do pelo ELISA de competição de IgG mostrado no Exemplo 4. As colunas 4e 5 contêm a K0 de cada peptídeo conforme determinado em pH 6 e pH 7,4,respectivamente, através da análise Biacore mostrada no Exemplo 6.
<table>table see original document page 78</column></row><table>
*Sar = sarcosina; NMeAIa = N-metil alanina; o prefixo "NM" sig-nifica N-metil aminoácido
A Tabela 7 provê uma listagem de truncamentos de derivadosde peptídeo derivados de Peptídeo ne 32. O efeito dos truncamentos sobreos parâmetros de ligação desses peptídeos com FcRn humano é mostrado.
A coluna 1 contém um identificador de peptídeo. A coluna 2 contém a se-qüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 contém a IC5o de cadapeptídeo conforme determinado pelo ELISA de competição de IgG mostradono Exemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a K0 de cada peptídeo conformedeterminado em pH 6 e pH 7,4, respectivamente, através da análise Biacoremostrada no Exemplo 6.Tabela 7. Truncamento de Peptídeo n° 32
<table>table see original document page 79</column></row><table>
* "Pen" = L-penicilamina
A Tabela 8 provê uma listagem de peptídeos e análogos de pep-tídeo derivados do Peptídeo n9 32, onde substituições com vários aminoáci-dos e derivados de aminoácido foram geradas onde há normalmente a se-qüência: Gly-Gly-Leu. A coluna 1 contém um identificador de peptídeo. Acoluna 2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 con-tém a IC50 de cada peptídeo conforme determinado pelo ELISA de competi-ção de IgG mostrado no Exemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a K0 de cadapeptídeo conforme determinado em pH 6 e pH 7,4, respectivamente, atravésda análise Biacore mostrada no Exemplo 6.
Tabela 8. Análogos de Peptídeo n°32 em Gly-Gly-Leu_
<table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table>
A Tabela 9 provê uma listagem de peptídeos e análogos de pep-tídeo derivados do Peptídeo n9 32, onde substituições com vários aminoáci-dos e derivados de aminoácido foram geradas onde há normalmente a se-qüência: Arg-Phe-Penicilamina. A coluna 1 contém o identificador de peptí-deo A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna3 contém a IC50 de cada peptídeo conforme determinado pelo ELISA decompetição de IgG mostrado no Exemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a Kdde cada peptídeo conforme determinado em pH 6 e pH 7,4, respectivamen-te, através da análise Biacore mostrada no Exemplo 6.
Tabela 9. Análogos de Peptídeo ns 32 em Arg-Phe-Pen
<table>table see original document page 80</column></row><table>
A Tabela 10 provê uma listagem de peptídeos e análogos depeptídeo derivados do Peptídeo n9 32, onde substituições com vários ami-noácidos e derivados de aminoácido foram geradas onde há normalmente aseqüência: Penicilamina-Thr-Gly. A coluna 1 contém o identificador de peptí-deo. A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna3 contém a IC50 de cada peptídeo conforme determinado pelo ELISA decompetição de IgG mostrado no Exemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a K0de cada peptídeo conforme determinado em pH 6 e pH 7,4, respectivamen-te, através da análise Biacore mostrada no Exemplo 6.<table>table see original document page 81</column></row><table>
*"NMeAla" = N-metil alanina
A Tabela 11 provê uma listagem de peptídeos e análogos depeptídeo derivados do Peptídeo n- 187, onde substituições com vários ami-noácidos e derivados de aminoácido foram geradas onde há normalmente aseqüência: Phe-Gly-Sarcosina. A coluna 1 contém o identificador de peptí-deo. A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna3 contém a IC50 de cada peptídeo conforme determinado pelo ELISA decompetição de IgG mostrado no Exemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a K0de cada peptídeo conforme determinado em pH 6 e pH 7,4, respectivamen-te, através da análise Biacore mostrada no Exemplo 6.
<table>table see original document page 81</column></row><table>
*"Sar" = sarcosina; "Aib" = ácido aminoisobutírico
A Tabela 12 provê uma listagem de peptídeos e análogos depeptídeo derivados do Peptídeo nQ 32, onde substituições com vários ami-noácidos e derivados de aminoácido foram geradas onde há normalmente aseqüência: His-Phe-Gly. A coluna 1 contém o identificador de peptídeo. Acoluna 2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 mos-tra a estrutura química de cadeia lateral de análogo de Phe. A coluna 4 con-tém a IC50 de cada peptídeo conforme determinado pelo ELISA de competi-ção de IgG mostrado no Exemplo 4. A coluna 5 contém a Kd de cada peptí-deo conforme determinado em pH 6 através da análise Biacore mostrada noExemplo 6.
Tabela 12. Análogos de Peptídeo n9 32 em His-Phe-Gly
<table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>
*"Sar" = sarcosina; "NMeLeu" = N-metil Ieucina
1 SYN927 é ciclizado através de uma ligação amida entre as ca-deias laterais Asp e Lys
A Tabela 13 provê uma listagem de vários peptídeos e análogosde peptídeo, onde aminoácidos únicos foram substituídos com tirosina. Oefeito das substituições sobre os parâmetros de ligação desses peptídeoscom FcRn humano é também provido. A coluna 1 contém o identificador depeptídeo. A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. Acoluna 3 mostra a estrutura química de cadeia lateral de análogo de Tyr. Acoluna 4 contém a IC50 de cada peptídeo conforme determinado pelo ELISAde competição de IgG mostrado no Exemplo 4. As colunas 5 e 6 contêm aK0 de cada peptídeo conforme determinado em pH 6 e pH 7,4, respectiva-mente, através da análise Biacore mostrada no Exemplo 6.Tabela 13. Substituições de Tirosina
<table>table see original document page 84</column></row><table>
A Tabela 14 provê uma listagem de peptídeos e análogos depeptídeo derivados do Peptídeo ns 32, onde substituições com vários ami-noácidos e derivados de aminoácido foram geradas onde há normalmente aseqüência: Gly-Leu. A coluna 1 contém o identificador de peptídeo. A coluna2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 contém aIC50 de cada peptídeo conforme determinado pelo ELISA de competição deIgG mostrado no Exemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a K0 de cada peptídeoconforme determinado em pH 6 e pH 7,4, respectivamente, através da análi-se Biacore mostrada no Exemplo 6.e uma Ieucina tomadas juntas por um mimético de dipeptídeo onde há nor-malmente a seqüência: Gly-Leu. A coluna 1 contém o identificador de peptí-deo. A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna3 provê a descrição para a identidade de X na seqüência. A coluna 4 mostraa estrutura química do análogo chamado X. A coluna 5 contém a IC5o de ca-da peptídeo conforme determinado pelo ELISA de competição de IgG mos-trado no Exemplo 4. A coluna 6 contêm a K0 de cada peptídeo conforme de-terminado em pH 6 através da análise Biacore mostrada no Exemplo 6.
Tabela 15. Análogos de Peptidomiméticos de Peptídeo n° 32 em Gly-Leu
<table>table see original document page 84</column></row><table>
Exemplo 8: Síntese de Peptídeos Contendo Análogos deHistidina
Análogos de histidina modificados (Tabela 16) foram sintetizadosconforme descrito no Exemplo 7 para a síntese de dissulfetos de peptídeo mo-nomérico exceto pelos análogos de histidina modificados que seguem. O peptí-deo n° 259 foi sintetizado através de suspensão da resina contendo os análo-gos de peptídeo completamente protegidos para Peptídeo n° 99 em iodeto demetila puro por 15 horas. A resina foi lavada com diclorometano e o peptídeo foiclivado da resina, oxidado e purificado através de HPLC conforme acima des-crito para dar o peptídeo histidina monometilado Peptídeo n° 259.
O Peptídeo n° 260 foi sintetizado suspendendo a resina conten-do os análogos de peptídeo completamente protegidos para o Peptídeon° 99 em iodeto de metila puro por 72 horas. A resina foi lavada com diclo-rometano e o peptídeo foi clivado da resina, oxidado e purificado através dedeo monomérico exceto pelos análogos de histidina modificados que se-guem. O peptídeo nQ 259 foi sintetizado através de suspensão da resina con-tendo os análogos de peptídeo completamente protegidos para Peptídeo nõ99 em iodeto de metila puro por 15 horas. A resina foi lavada com diclorome-tano e o peptídeo foi clivado da resina, oxidado e purificado através de H-PLG conforme acima descrito para dar o peptídeo histidina monometiladoPeptídeo nQ 259.
O Peptídeo n- 260 foi sintetizado suspendendo a resina con-tendo os análogos de peptídeo completamente protegidos para o Peptídeon- 99 em iodeto de metila puro por 72 horas. A resina foi lavada com diclo-rometano e o peptídeo foi clivado da resina, oxidado e purificado através deHPLC conforme acima descrito para dar o peptídeo histidina di-metiladoPeptídeo nQ 260.
O Peptídeo n9 269 foi sintetizado suspendendo a resina con-tendo o análogo de peptídeo completamente protegido para o Peptídeo ng248 em diclorometano sob nitrogênio. Dez equivalentes molares de 2,4,6-tri-terc-butilpiridina (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) foram adicionados a umasuspensão seguido por cinco equivalentes molares de metil-trifIuormetano-sulfonato (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO). A reação foi deixada prosseguir por4 horas enquanto agitando e enxaguada primeiro com diclorometano, segui-do por um enxágue com dimetilformamida e finalmente com diclorometanonovamente. O peptídeo foi clivado da resina, oxidado e purificado através deHPLC conforme acima descrito para dar peptídeo N-metil-tiazólio, Peptídeo ne 269.
O Peptídeo ng 271 foi sintetizado tratando o peptídeo Peptídeon- 261 com 30 equivalentes de sulfato de cobre, 30 equivalentes de ácidoascórbico e 10 equivalentes de azida de sódio em uma solução de tampãode fosfato de sódio a 100 mM em pH 7,5 com etanol a 33%, acetonitrila a10%, Ν,Ν-dimetilformaimda a 10%. A reação prosseguiu por 2 horas e a mis-tura foi purificada através de HPLC conforme acima descrito para dar o pep-tídeo contendo cadeia lateral 1,2,3-triazol Peptídeo nQ 271.
A Tabela 16 provê uma listagem de vários peptídeos e análo-<table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table>
Exemplo 9: Síntese de Peptídeos Contendo Análogos dePeptidomimético de Gly-Gly
TcxJos dos miméticos de aminoácido Gly-Gly (Tabela 17) foram incorpo-rados como seus aminoácidos F-moc amino protegidos e estavam comercialmentedisponíveis a menos que de outro modo mencionado (Chem-lmpex, Wood Dale1 IL).
Peptídeos contendo ácido 3(R)-3-amino-2-oxo-1-piperidina-acético foram sintetizadosincorporando o derivado N-Fmoc de ácido 3(R)-3-amino-2-oxo-1-piperidina-1-acéticono Peptídeo n° 227 de acordo com o protocolo descrito por R.M. Freidinger e outros, J.Org. Chem. 47:10-109 (1982). Peptídeos contendo ácido 3(R)-3-amino-2-oxo-1-pirrolidina acético foram sintetizados incorporando o derivado N-Fmoc de 3(R)-3-amino-2-oxo-1-pirrolidina acético no Peptídeo 214 de acordo com o protocolo descritopor R.M. Feridingere outros, J. Org. Chem. 47:104-109 (1982). Peptídeos contendo omimético do peptídeo 5,5-bicíclico foram sintetizados incorporando o mimético do di-peptídeo 5,5-bicíclico no Peptídeo n° 197 ou Peptídeo n° 198 de acordo com o proto-colo descrito por N.L. Subasinghe e outros, J. Med. Chem. 36:2356-2361 (1993) coma exceção de que todos os D-aminoácidos foram usados. Peptídeos contendo o mi-mético de dipeptídeo 6,5-bicíclico foram sintetizados incorporando o mimético de di-peptídeo 6,5-bicíclico no Peptídeo n° 204 de acordo com o protocolo descrito por F.A.Etzkom e outros, J. Am. Chem. Soe. 116:10412 (1994) com a exceção que todos osD-aminoácidos foram usados. Peptídeos contendo a Iactama de (D1L)-Freidinger fo-ram sintetizados incorporando a Iactama de (D1L)-Freidinger no Peptídeo n° 216 deacordo com o protocolo descrito por R.M. Freidinger e outros, J. Org. Chem. 47:104-109 (1982) com a exceção que L-metionina foi usada ao invés de D-metionina.
A Tabela 17 provê uma listagem de peptídeos e análogos desinghe e outros, J. Med. Chem. 36:2356-2361 (1993) com a exceção de quetodos os D-aminoácidos foram usados. Peptídeos contendo o mimético dedipeptídeo 6,5-bicíclico foram sintetizados incorporando o mimético de di-peptídeo 6,5-bicíclico no Peptídeo n9 204 de acordo com o protocolo descritopor F.A. Etzkorn e outros, J. Am. Chem. Soe. 116:10412 (1994) com a exce-ção que todos os D-aminoácidos foram usados. Peptídeos contendo a Iac-tama de (DjL)-Freidinger foram sintetizados incorporando a Iactama de(D1L)-Freidinger no Peptídeo n9 216 de acordo com o protocolo descrito porR.M. Freidinger e outros, J. Org. Chem. 47:104-109 (1982) com a exceçãoque L-metionina foi usada ao invés de D-metionina.
A Tabela 17 provê uma listagem de peptídeos e análogos depeptídeo derivados da SEQ ID NO:1 onde substituições com vários aminoá-cidos e derivados de aminoácido foram geradas onde há normalmente duasglicinas adjacentes (Gly-Gly). A coluna 1 contém o identificador de peptídeo.A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna 3contém a IC50 de cada peptídeo conforme determinado pelo ELISA de com-petição de IgG mostrado no Exemplo 4. As coluna 4 e 5 contêm a K0 de ca-da peptídeo conforme determinado em pH 6 e pH 7,4, respectivamente, a-través da análise Biacore mostrada no Exemplo 6.
Tabela 17. Análogos de SEQ ID NO:1 em Gly-Gly
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*"beta-Ala" = beta-alanina; "Apa" = ácido 5-aminopentanóico
A Tabela 18 provê uma listagem de peptídeos e análogos depeptídeo derivados de Peptídeo n9 99 com uma substituição de duas glicinasjuntas por um análogo de peptidomimético onde há normalmente a seqüên-cia: Gly-Gly. A coluna 1 contém o identificador de peptídeo. A coluna 2 con-tém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 provê a descrição<table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table>
Peptídeos ciclizados com Iactama (Tabela 19) foram sintetiza-dos através de síntese de peptideo de fase sólida conforme mostrado acimano Exemplo 7 com a exceção que os aminoácidos que seguem foram usa-dos como substitutos para várias cisteínas: Fmoc-Lys(AIoc)-OH, Fmoc-Orn(AIoc)-OH1 Fmoc-Dab(AIoc)-OH e Fmoc-Dap(AIoc)-OH, Fmoc-GIu(OAIiI)-OH e Fmoc-Asp(OAIiIa)-OH (Bachem, Torrance, CA). Seguindo o término doprocesso para gerar peptídeos completamente protegidos em resina, a resi-na foi inchada em diclorometano, purgada com nitrogênio e tratada com 0,1equivalente molar de tetracis-(trifenilfosfino)paládio(0) (Sigma-AIdricn, St.Louis, MO) e 30 equivalentes molares de fenilsilano (Sigma-AIdrich, St.Louis, MO) e a reação foi deixada prosseguir por três horas. A resina foi la-vada primeiro com diclorometano, com DMF e finalmente mais cinco vezescom uma solução de trietilamina a 1% (v/v) e ácido dietilditiocarbâmico emDFM a 1% (v/v). Uma etapa de lavagem adicional com DMF foi seguida portratamento da resina com hexafluorfosfafto de benzotriazol-1-il-óxi-tris-pirrolidina-fosfônio (PyBOP) (Novabiochem, São Diego, CA) e DIEA por 16horas. Os peptídeos foram clivados da resina e purificados conforme descri-to acima no Exemplo 7.
A Tabela 19 provê uma listagem de vários peptídeos da inven-ção com substituições de aminoácido de resíduos cisteína por aminoácidose análogos de aminoácido que permitiriam a ciclização dos respectivos pep-tídeos através de uma ponte lactama. O impacto das substituições sobre osparâmetros de ligação desses peptídeos com FcRn humano é também pro-vido. A coluna 1 contém o identificador de peptideo. A coluna 2 contém aseqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 contém a IC5o de cadapeptideo conforme determinado pelo ELISA de competição de IgG mostradono Exemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a K0 de cada peptideo conformedeterminado em pH 6 e pH 7,4, respectivamente, através da análise Biacoremostrada no Exemplo 6.A Tabela 19 provê uma listagem de vários peptídeos da inven-ção com substituições de aminoácido de resíduos cisteína por aminoácidose análogos de aminoácido que permitiriam a ciclização dos respectivos pep-tídeos através de uma ponte lactama. O impacto das substituições sobre osparâmetros de ligação desses peptídeos com FcRn humano é também pro-vido. A coluna 1 contém o identificador de peptídeo. A coluna 2 contém aseqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 contém a IC5o de cadapeptídeo conforme determinado pelo ELISA de competição de IgG mostradono Exemplo 4. As colunas 4 e 5 contêm a K0 de cada peptídeo conformedeterminado em pH 6 e pH 7,4, respectivamente, através da análise Biacoremostrada no Exemplo 6.
Tabela 19. Peptídeos Ciclizados com Lactama
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1 Há uma ligação amida entre as cadeias laterais dos aminoáci-dos sublinhados; Dab = ácido 1,3-diaminobutírico; Dap = ácido 1,2-diaminopropiônico; Orn = ornitinaExemplo 11: Síntese de Análogos de Peptídeo Lineares
Análogos de peptídeo lineares foram sintetizados conforme a-cima descrito no Exemplo 7, com a exceção que aminoácidos de formaçãode dissulfeto foram substituídos conforme mostrado nas Tabelas 20 e 21.
A Tabela 20 provê uma listagem de peptídeos e análogos depeptídeo lineares derivados da SEQ ID NO:1. Os parâmetros de ligaçãodesses peptídeos com FcRn humano são também providos. A coluna 1 con-tém o identificador de peptídeo. A coluna 2 contém a seqüência de aminoá-cido dos peptídeos. A coluna 3 contém a IC5o de cada peptídeo conformedeterminado pelo ELISA de competição de IgG mostrado no Exemplo 4. Ascolunas 4 e 5 contêm a Kd de cada peptídeo conforme determinado em pH 6e pH 7,4, respectivamente, através da análise Biacore mostrada no Exemplo 6·
Tabela 20. Análogos Lineares de SEQ ID NO:1 _
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1 "Sar" = sarcosina; "NMeLeu" = N-metil leucina<table>table see original document page 94</column></row><table>
*"Sar" = sarcosina; "NMeLeu" = N-metil Ieucina
Exemplo 12: Síntese de Dímeros de Peptídeo Através de Al-quilação Redutiva
Dímeros de peptídeo (Tabela 22) foram gerados através de al-quilação redutiva de um peptídeo aldeído e um peptídeo amina amino (N) oucarbóxi (C) terminal.
Peptídeo aminas N-terminais foram sintetizadas conforme des-crito acima no Exemplo 7 para a síntese de dissulfetos de peptídeo mono-mérico.
Peptídeo aminas C-terminais foram também sintetizadas con-forme acima descrito no Exemplo 7 para a síntese de dissulfetos de peptídeomonomérico, exceto que resina 1,2-diaminoetano (Novabiochem, São Diego,<table>table see original document page 95</column></row><table>
*"Sar" = sarcosina; "NMeLeu" = N-metil Ieucina
Exemplo 12: Síntese de Dímeros de Peptídeo Através de Al-quilação Redutiva
Dímeros de peptídeo (Tabela 22) foram gerados através de al-quilação redutiva de um peptídeo aldeído e um peptídeo amina amino (N) oucarbóxi (C) terminal.
Peptídeo aminas N-terminais foram sintetizadas conforme des-crito acima no Exemplo 7 para a síntese de dissulfetos de peptídeo mono-- mérico.
Peptídeo aminas C-terminais foram também sintetizadas con-forme acima descrito no Exemplo 7 para a síntese de dissulfetos de peptídeomonomèrico, exceto que resina 1,2-diaminoetano (Novabiochem, São Diego,CA) foi usada na etapa de síntese. Conseqüentemente, clivagem a partir daresina resultou em uma etil amina C-terminal.
Peptídeo aldeídos N-terminais (figura 2) foram sintetizados rea-gindo a amina não-protegida do aminoácido N-terminal com 5 equivalentesde anidrido succínico (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) na presença de DIEAem DMF por 2 horas. Uma reação subsequente com 2,2-dimetil-1,3-dioxolano metamina (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) na presença de PyBOPe DIEA por 2 horas deu a resina diol protegida. Então, clivagem do peptídeobruto a partir da resina, seguido por oxidação e purificação de cisteína con-forme descrito acima no Exemplo 7 para a síntese de dissulfetos de peptídeomonomèrico, deu o peptídeo diol. O diol foi dissolvido em ácido acético a33% seguido por 2 equivalentes de periodato de sódio (Sigma-AIdrich, St.Louis, MO) que foram adicionados e a reação foi deixada prosseguir por 5minutos. A mistura de reação foi extinta com 20 equivalentes (com relaçãoao diol) de etileno glicol (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) e após dez minutos,a mistura de reação bruta foi diluída 3 vezes com água e purificada em umacoluna Sep-Pak C18 (Waters Corp., Milford, MA) usando um gradiente altode acetonitrila em água contendo TFA a 0,1%. O peptídeo aldeído foi Iiofili-sina, antes da clivagem a partir da resina.
Os dímeros de peptídeo foram sintetizados (figura 3) através dareação de um equivalente de peptídeo aldeído com um equivalente de pep-tídeo contendo amina em uma concentração de 40 mg/ml em DMF contendoácido acético a 2%. Após 60 minutos, 2 equivalentes de cianoboroidreto desódio (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) foram adicionados e a reação foi deixa-da agitar por 1 hora. A mistura de reação foi diluída 10 vezes com água epurificada através de HPLC e analisada através de espectroscopia de massa(Mariner ES-MS) seguindo cromatografia líquida (Applied Biosystems, FosterCity, CA) conforme descrito no Exemplo 7.
A Tabela 22 provê uma listagem de peptídeos diméricos da in-venção que foram sintetizados através de alquilação redutiva. A coluna 1contém o identificador de peptídeo. A coluna 2 contém a seqüência de ami-noácido dos peptídeos. A coluna 3 contém a IC5o de cada peptídeo conformedeterminado através do ELISA de competição de IgG mostrado no Exemplo4. As colunas 4 e 5 contêm a K0 de cada peptídeo conforme determinadoem pH 6 e pH 7,4, respectivamente, através da análise Biacore mostrada noExemplo 6. A Coluna 6 contém a IC5o de cada peptídeo conforme determi-nado através de análise FACS de ligação de IgG competitiva conforme mos-trado no Exemplo 5.
Tabela 22. Dímeros e Trímeros Sintetizados Através de Alquilação Redutiva
<table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table>
X = ácido 3(R)-3-amino-2-oxo-1-piperidina-acético
Exemplo 13: Síntese de dímeros de peptídeo por Iigantes ti-ol e peptídeos bromoacetilados
Dímeros de peptídeo (Tabela 23) foram também sintetizados a-través da reação de peptídeos bromoacetilados com um Iigante tiol. Peptí-deos bromoacetilados foram sintetizados (figura 4) através da reação dogrupo α-amino livre da resina de peptídeo protegida com 4 equivalentes debrometo de bromoacetila (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) e 8 equivalentes deDIEA (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) em DMF. Após 1 hora, a resina foi Ia-vada com DMF, seguido por DCM e clivada a partir da resina conforme des-crito acima no Exemplo 7. No caso onde peptídeos ciclizados com Iactamaforam dimerizados usando um Iigante bis-tiol, a etapa de ciclização on-resinfoi realizada antes da etapa de bromoacetilação. No caso onde peptídeoscontendo dissulfeto foram dimerizados usando um Iigante bis-tiol, a etapa deoxidação de iodo foi realizada após clivagem conforme descrito acima noExemplo 7.
Os Iigantes bis-tiol foram sintetizados (figura 4) através da rea-ção da resina NH2-Gly-2-Clorotritila (Novabiochem, São Diego, CA) com 2equivalentes de hemissulfato de N,N-bis(N'-Fmoc-3-aminopropil)glicina depotássio (Chem-lmpex, Wood Dale, IL) na presença de 2 equivalentes dePyBOP (Novabiochem, São Diego, CA) e DIEA em DMF por 18 horas. Oproduto de proteção Fmoc foi removido com dois tratamentos de 10 minutosde piperidina a 20% em DMF. Para alguns dos compostos do ligante, beta-alaninas foram também incorporadas como unidades espaçadoras. Fmoc-beta-Ala-OH (Novabiochem) foi acoplado à resina conforme acima usandoPyBOP e DIEA. Após o grupo de proteção Fmoc ter sido removido com pipe-ridina a 20% em DMF, ou outra unidade espaçadora de beta-alanina foi in-corporada ou o ligante bis-tiol foi incorporado reagindo a resina amina N-terminal com 2 equivalentes de N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP;ção da resina NH2-Gly-2-Clorotritila (Novabiochem, São Diego1 CA) com 2equivalentes de hemissulfato de N,N-bis(N'-Fmoc-3-aminopropil)glicina depotássio (Chem-lmpex, Wood Dale, IL) na presença de 2 equivalentes dePyBOP (Novabiochem, São Diego, CA) e DIEA em DMF por 18 horas. Oproduto de proteção Fmoc foi removido com dois tratamentos de 10 minutosde piperidina a 20% em DMF. Para alguns dos compostos do ligante, beta-alaninas foram também incorporadas como unidades espaçadoras. Fmoc-beta-Ala-OH (Novabiochem) foi acoplado à resina conforme acima usandoPyBOP e Dl EA. Após o grupo de proteção Fmoc ter sido removido com pipe-ridina a 20% em DMF, ou outra unidade espaçadora de beta-alanina foi in-I corporada ou o ligante bis-tiol foi incorporado reagindo a resina amina N-terminal com 2 equivalentes de N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP;Pierce, Rockford, IL) e 4 equivalentes de DIEA por 18 horas.
Subseqüentemente, remoção do grupo de proteção S-acetila foirealizada reagindo 0,05 mmol das resinas de peptídeo com uma soluçãodesgaseificada contendo 1 ml de DMF e 0,4 ml de tampão A (Tampão A:cloridrato de hidroxilamina a 1M (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO), fosfato desódio a 40 mM, pH 7,5, EDTA a 50 mM (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO)) por18 horas. As resinas foram lavadas com DMF, seguido por DCM1 e clivadasda resina com uma solução a 50% de TFA em DCM com triisopropilsilano a2% por 15 minutos. Os Iigantes brutos foram processados e purificados con-forme descrito acima no Exemplo 7.
Os dímeros de peptídeo foram gerados usando Iigantes bis-tiol(figura 4) reagindo um equivalente do ligante bis-tiol purificado com dois e-quivalentes de peptídeo N-terminal bromoacetilado em DMF com água a10% e fosfato de sódio a 100 mM a 50%, pH 7,5. Após 18 horas, a misturade reação bruta foi purificada através de coluna de HPLC de fase reversaconforme acima descrito no Exemplo 7.
O peptídeo nQ 122 foi sintetizado (figura 5) reagindo um peptídeobromoacetilado com um peptídeo derivatizado com SATP. Resumidamente,a resina de peptídeo bruta com uma amina N-terminal livre foi reagida com 2equivalentes de SATP em DMF por 2 horas. O grupo de proteção S-acetila<table>table see original document page 100</column></row><table>
Exemplo 14: Síntese de Trímeros de Peptídeo Através deAlquilação Redutiva: Peptídeo n° 247<table>table see original document page 101</column></row><table>
Exemplo 14: Síntese de Trímeros de Peptídeo Através de
Alquilação Redutiva: Peptídeo n9 247
Trímeros de peptídeo (Tabela 22) foram gerados através de al-quilação redutiva de um peptídeo aldeído e um peptídeo amino amina N-terminal.
Peptídeo aminas N-terminais foram sintetizados conforme des-crito acima no Exemplo 7 para a síntese de dissulfetos de peptídeo mono-mérico com a exceção que o terminal N foi capeado com um Iigante aminabifuncional tal como bis-aminopropil glicina (BAPG; usada como Bis-Fmoc-BAPG comprado da Sigma-Aldrich1 St. Louis1 MO), seguido por acoplamentode sarcosina. Peptídeo aldeídos N-terminais (figura 2) foram sintetizadosconforme descrito no Exemplo 12. Os trímeros de peptídeo foram sintetiza-dos (como na figura 3) reagindo dois equivalentes de peptídeo aldeído comum equivalente de peptídeo contendo amina em uma concentração de 40mg/ml em DMF contendo ácido acético a 2%. Após 60 minutos, 4 equivalen-tes de cianoboroidreto de sódio (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) foram adicio-nados e a reação foi deixada agitar por 1 hora. A mistura de reação foi diluí-da 10 vezes com água e purificada através de HPLC e analisada através deespectroscopia de massa (Mariner ES-MS) seguindo cromatografia líquida(Applied Biosystems, Foster City, CA) conforme descrito no Exemplo 7.Exemplo 15: Síntese de Dímeros de Peptídeo Usando Ligan-tes Diácido e Amina
Dímeros de peptídeo ligados à amida (Tabela 24) foram geradosou reagindo os terminais N de dois monômeros de peptídeo on-resin comum Iigante ácido bifuncional ou realizando a síntese do peptídeo on resincontendo um Iigante amina bifuncional, deste modo amarrando os terminaisC de dois monômeros de peptídeo on-resin.
Dímeros de peptídeo ligados N-terminalmente foram sintetiza-dos conforme acima descrito no Exemplo 7 para a síntese de dissulfetos depeptídeo monoméricos com as exceções que seguem: Antes dos peptídeosserem clivados da resina, os terminais N de dois monômeros de peptídeosão unidos com um Iigante ácido bifuncional. Por exemplo, o Peptídeo ns283 é sintetizado reagindo a resina de peptídeo contendo a seqüência depeptídeo análoga ao Peptídeo n- 235 com um terminal N não-protegido com0,5 equivalente de ácido succínico (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) na pre-sença de 1 equivalente de PyBOP e 2 equivalentes de Dl EA. Isto resulta empeptídeos adjacentes na resina sendo covalentemente ligados por ligaçõesamida através de seus terminais N.
O dímero de peptídeo resultante é clivado da resina e purificadoconforme descrito no Exemplo 7 com a exceção que os dissulfetos de peptí-deo são não-oxidados antes da purificação por HPLC. O peptídeo reduzidopurificado é dissolvido para cerca de 0,1 mg/ML em fosfato de sódio a 10mM, pH 7,5 com DMSO a 20% e misturado por 3 dias em temperatura ambi-ente. Esta etapa de oxidação permite a formação das ligações dissulfetodentro de um monômero de peptídeo do dímero, conforme oposto a entredois monômeros de um dímero. A mistura de reação é diluída com água pa-ra concentração de peptídeo de 0,05 mg/mL e purificada em uma colunaC18 Sep-Pak (Waters Corp., Milford, MA) usando um gradiente alto de ace-tonitrila em água contendo TFA a 0,1%. O dímero de peptídeo foi Iiofilizado esubmetido à análise através de espectroscopia de massa (Mariner ES-MS)seguindo cromatografia líquida (Applied Biosystems, Foster City, CA) con-forme descrito no Exemplo 7. (Vide figura 6). No caso de Peptídeo ns 283, opadrão de ligação dissulfeto foi confirmado digerindo o peptídeo com tripsinapor 30 minutos, então analisando os peptídeos resultantes através de LCMS.Tripsina é conhecida clivar após resíduos arginina e lisina, e cliva PeptídeonQ 283 na ligação arginina-fenilalanina. O produto principal de LCMS de Pep-tídeo n9 283 é NH2-[Phe Phe-Pen-Thr-GIy-His-Phe-GIy-Sar-NMeLeu-Tyr-Pro-Cys]-CONH2 (dissulfeto) (LCMS: M+H = 1355,6 Da), que indica que asligações dissulfeto do Peptídeo nQ 283 são formadas entre cada 13 monôme-ro de peptídeo de aminoácido.
O Peptídeo n9 201 foi sintetizado como Peptídeo n9 283 com asexceções que a seqüência de peptídeo era análoga ao Peptídeo n9 32, oIigante diácido usado era etileno gíicol-bis(ácido succínico-N-hidroxissuccinimido éster) (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) e que nenhum Py-BOP foi usado para a reação de acoplamento.
O Peptídeo n9 279 foi sintetizado como no Peptídeo n9 283 coma exceção que o Iigante diácido usado era Bi-dPEG6-N-hidroxissuccinimidoéster (Quanta Biodesigns Ltd.) e que nenhum PyBOP foi usado para a rea-ção de acoplamento.
O Peptídeo n9 281 fo sintetizado como Peptídeo n9 283 com aexceção que a resina de peptídeo foi tratada com um grande excesso deanidrido succínico (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO), que resulta em todos ospeptídeos na resina contendo um terminal N capeado com succinato. Estaresina foi tratada com 0,5 equivalente de Ν,Ν'-dimetiletil-enodiamina (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) na presença de 1 equivalente de PyBOP e 2 equiva-lentes de DlEA. As subseqüentes etapas de clivagem, purificação e oxida-ção foram realizadas como com Peptídeo n9 283.
O Peptídeo n9 282 foi sintetizado como peptídeo n9 283 com aexceção que o Iigante diácido usado era ácido N-metil-iminodiacético (Sig-ma-AIdrich, St. Louis, MO).
O Peptídeo n9 284 foi sintetizado como Peptídeo n9 283 com aexceção que o Iigante diácido usado era ácido 3,3-dimetilglutárico (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO).
O Peptídeo n9 285 foi sintetizado como Peptídeo n9 283 com aexceção que o ligante diácido usado era Boc-Asp(OH)-OH (Novabiochem,São Diego, CA).
O Peptídeo № 286 foi sintetizado como Peptídeo nQ 283 com aexceção que o Iigante diácido usado era Boc-GIu(OH)-OH (Novabiochem,São Diego, CA).
Dímeros de peptídeo C-terminalmente ligados foram sintetiza-dos conforme descrito acima no Exemplo 7 para a síntese de dissulfetos depeptídeo monoméricos com a exceção que um Iigante amina bifuncional éacoplado à resina antes da síntese do peptídeo. Isto resulta em dímeros depeptídeo com seus terminais C covalentemente ligados por ligações amida.Por exemplo, o Peptídeo ng 280 foi sintetizado primeiro acoplando Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (Novabiochem, São Diego, CA) à resina, seguido pelo aco-plamento de aminoácidos para dar uma uma seqüência análoga ao Peptídeo№ 235. Isto resulta na ligação covalente de duas cadeias de peptídeo con-forme elas estão sendo sintetizadas na resina. O dímero de peptídeo resul-tante é clivado da resina, purificado e oxidado conforme acima descrito paraos dímeros N-terminalmente ligados (vide figura 7).
O Peptídeo № 287 foi sintetizado como Peptídeo nQ 280 com aexceção que um resíduo glicina (GIy) é inserido entre a seqüência do Peptí-deo ne 235 e o Iigante Lisina de ramificação.
O Peptídeo nQ 288 foi sintetizado como Peptídeo nQ 280 com asexceções que dois resíduos glicina (GIy-GIy) são inseridos entre a seqüênciade Peptídeo nQ 235 e o Iigante Iisina de ramificação.
A Tabela 24 provê uma listagem de peptídeos diméricos da in-venção que foram sintetizados usando ligações amida. A coluna 1 contém oidentificador de peptídeo. A coluna 2 contém a seqüência de aminoácido dospeptídeos. A coluna 3 contém a IC50 de cada peptídeo conforme determina-do através do ELISA de competição de IgG mostrado no Exemplo 4.Tabela 24. Dímeros Sintetizados Usando Ligantes Amida
<table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table>
Exemplo 16: Síntese de Fusões de Peptideo-Fc Através de
Alquilação Redutiva
Peptídeo aldeídos N-terminais Peptídeo n9 252, Peptídeo nQ 229e Peptídeo nQ 232 (Tabela 25) foram sintetizados conforme descrito no E-xemplo 12. Todas as três fusões de peptídeo-Fc foram geradas usando omesmo protocolo (figura 8): CysFc (domínio Fc possuindo uma cisteína N-terminal) e 4,5 equivalentes de peptídeo aldeído foram incubados em geloem acetato de sódio a 80mM pH 5,5 por 1 hora. Cianoboroidreto de sódio foiadicionado para uma concentração final de 20 mM e a reação foi incubadapor 16 horas a 4o C. A mistura de reação foi analisada através de SDS-PAGE para assegurar a adição de predominantemente um peptídeo únicopara a proteína Fe. A mistura de proteína foi dialisada duas vezes com PBSe ensaiada quanto à atividade de bloqueio in vitro (Tabela 25). No caso doPeptídeo nQ 252-Fc, a proteína foi também avaliada no modelo de catabo-Iismo de IgG de camundongo TG32B (figura 15). A produção de CysFc podeser realizada conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente US nQUS 2005/0027109, onde a revelação da produção de CysFc é incorporadaaqui a título de referência.
A Tabela 25 provê uma listagem de proteínas de fusão de peptí-deo-Fc da invenção que foram sintetizadas usando CysFc e aldeído-peptídeos. A coluna 1 contém o identificador da fusão de peptídeo-Fc. A co-luna 2 contém a seqüência de aminoácido dos peptídeos. A coluna 3 contéma IC50 de cada peptídeo conforme determinado pelo ELISA de competiçãode IgG mostrado no Exemplo 4.
Tabela 25. Fusões de Peptideo-Fc
<table>table see original document page 107</column></row><table>
1Pen = penicilamina; Sar = sarcosina; NmeLeu = N-metilleucina
Exemplo 17: Camundongos Transgênicos
Camundongos transgênicos foram obtidos do Dr. Roopenian doJackson Laboratory em Bar Harbor1 ME. Os genes de FcRn e β2ηη de murinoendógenos foram inativados através de inserção de uma seqüência de poli-nucleotídeo estrangeira através de recombinação homóloga e substituídostransgenicamente com os genes de FcRn humano e p2m humano (muFcRn(-/-), mup2m (-/-), +huFcRn, +hup2m). Esses camundongos são referidospelo nome de linhagem TG32B.
Exemplo 18: Efeito de Peptídeo n9 270 sobre Catabollsmode IgG Humana em Camundongos TG32B Usando 5 mg/kg e 10 mg/kg
Camundongos TG32B adultos foram injetados intravenosamentecom 500 mg/kg de IgG humana (MP Biomedicals1 Irvine1 CA) em t = O hora(T0). Em 24, 48, 72, 96 e 120 horas, os camundongos foram injetados intra-venosamente ou com 5 mg/kg ou 10 mg/kg de Peptídeo nQ 270. Injeções decontrole foram realizadas em cada ponto de tempo usando o veículo PBScom acetato de sódio a 15 mM, pH 5. Amostras de sangue foram tomadasantes das injeções em todos os pontos de tempo, bem como em 168 horas.Soro foi preparado e armazenado a -20° C até que um ELISA foi realizado(figura 9).
Um ELISA específico do domínio Fc de IgG foi usado para de-tectar os níveis de IgG humana no soro em cada ponto de tempo. Resumi-damente, 30 μΙ de uma solução de estoque de 10 pg/ml de IgG anti-humanode cabra (Pierce, Rockford1 IL) foram diluídos com 6 ml de bicarbonato desódio a 0,05 M, pH 9,6 (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO). Uma placa de 96 ca-vidades foi revestida com 50 μΙ/cavidade desta solução e incubada por 1 ho-ra a 37° C. A solução de revestimento foi removida e lavada uma vez comPBST (solução salina tamponada com fosfato com Tween-20 a 0,05%). En-tão 200 Mg/cavidade de uma solução de estoque de albumina de soro bovinoa 2% (BSA) em PBS foram adicionados e a placa incubada por 1 hora a 37°C. As cavidades foram lavadas três vezes com PBST e uma curva padrão foigerada em triplicata através da realização de diluições 2-5 vezes começandode 50 ng/ml de hlgG1. Então 100 μΙ ou das soluções padrão ou de amostraforam adicionados às cavidades e a placa foi incubada por 1 hora a 37° C.Mais três lavagens de PBST foram realizadas seguido pela adição de 100 μΙde uma diluição 1:10.000 de um conjugado IgG anti-humano de cabra [Fc]-HRP (Pierce, Rockford, ÍL) em PBS contendo BSA a 2%. A placa foi deixadaincubar por 1 hora a 37° C seguido por lavagens com PBST e a adição de100 μΙ de substrato TMB One-Component (BioFX, Owings Mills, MD) a cadacavidade. O desenvolvimento de cor foi parado após 5 minutos através daadição de 100 μΙ de ácido sulfúrico a 0,25M a cada cavidade. A absorbânciaUV para cada cavidade foi medida a 450 nm e uma curva de calibragem foiusada para derivar um gráfico de concentrações de IgG no soro vs. tempopara os experimentos.
Exemplo 19: Efeito do Peptídeo n9 231, Peptídeo ns 274 ePeptídeo ne 252-Fc sobre Catabolismo de IgG Humana em Camundon-gos TG32B
Camundongos TG32B adultos foram injetados intravenosamentecom 500 mg/kg de IgG humana (MP Biomedicals, Irvine, CA) em t = 0 hora(T0). Em 24, 48 e 72 horas, os camundongos foram injetados intravenosa-mente ou com 1 mg/kg de Peptídeo nQ 231, 1 mg/kg de Peptídeo nQ 274 ou20 mg/kg de Peptídeo ns 252-Fc. Injeções de controle foram realizadas emcada ponto de tempo usando acetato de sódio a 15 mM, pH 5 e serviramcomo o veículo para todas as injeções. Amostras de sangue foram tomadasantes das injeções em todos os pontos de tempo, bem como em 30, 96 e144 horas. Soro foi preparado e armazenado a -20° C até que um ELISA foirealizado.
A concentração de IgG humana no soro em cada ponto de tem-po foi determinada conforme acima descrito no Exemplo 18 (figura 15).
Exemplo 20: Efeito de Peptídeo n9 270 sobre Catabolismode IgG Bem Como IgG, IgM e Albumina Endógenas em Macacos Cino-mólogos
Três macacos cinomólogos adultos com um peso médio de 4,8kg foram injetados intravenosamente com uma dose IV de 5 mg/kg de IgGhumana biotinilada (MP Biomedicals, Irvine, CA) e 0 hora. A 24, 48, 72 e 96horas, os animais foram injetados intravenosamente em uma taxa de 1ml/min com ou 10 mg/kg de Peptídeo n9 270 ou um volume igual de veículo(acetato de sódio a 30 mM, pH 5). Em 120 horas, o animal C06215 foi trata-do com uma quinta dose de 10 mg/kg de Peptídeo nQ 270. Amostras de san-gue foram tomadas antes de todas as injeções, bem como em 120, 168, 192e 244 horas e em 30 dias. Soro foi preparado e armazenado a -20° C atéque um ELISA foi realizado (figuras 10-12).
O traçador de biotina-hlgG foi detectado usando um ELISA es-pecífico de Estreptavidina-Fc. Placas revestidas com estreptavidina (Pierce,Rockford, IL1 nQ cat. 15121) foram lavadas três vezes com PBST (soluçãosalina tamponada com fosfato + Tween-20 a 0,05%). Amostras e padrões desoro foram diluídos com PBSB (PBS + BSA a 2%). Uma curva padrão foiestabelecida com uma faixa de 1,56 ng/ml a 200 ng/ml. Amostras (100 μΙ) oupadrões diluídos foram adicionados por cavidade e incubados por duas ho-ras em temperatura ambiente. Em seguida, as cavidades foram lavadas trêsvezes com PBST (300 μΙ/cavidade). Fc-HRP anti-humano de cabra (Pierce,Rockford1 IL1 η9 Cat. 31416) foi diluído 1:25.000 com PBSB e 100μΙ/cavidade foram adicionados e as placas foram incubadas por 30 minutosem temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes com PBST (300μΙ/cavidade) e desenvolvida com 100 μΙ/cavidade de substrato BioFx Super-sensitive TMB (300 μΙ/cavidade) e desenvolvida com 100 μΙ/cavidade desubstrato BioFx Supersensitive TMB (BioFx, Owing Mills, MD) por aproxima-damente cinco minutos em temperatura ambiente. O desenvolvimento dareação foi parado adicionando 100 μΙ/cavidade de ácido sulfúrico a 0,25M ea absorbância de cada cavidade foi medida em um comprimento de onda de450 nm.
IgG de cinomólogo endógena foi detectada usando o protocoloELISA que segue. Primeiro, albumina de soro antimacaco de coelho foi dilu-ída para 2 μg/ml em tampão de revestimento (tampão de revestimento = 1cápsula de carbonato-bicarbonato, Sigma-AIdrich, St. Louis, MO, nQ Cat.C-3041, dissolvida em 100 mL de água). Em seguida, uma placa de 96 cavida-des (Costar/Corning) foi revestida com 100 μΙ/cavidade de 2 μg/ml de IgGantimacaco de coelho (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) e incubada por umahora a 37° C. A placa foi lavada quatro vezes com PBST (PBS com Tween-20 a 0,05%) e bloqueada por uma hora a 37° C com 200 μ l/cavidade dePBSB (BSA a 1% em PBS; diluído de BSA a 10% em estoque de PBS; K-PL). A placa foi lavada novamente quatro vezes com PBST. Amostras e pa-drões de soro foram diluídos com PBSB. Uma curva padrão foi estabelecidacom uma faixa de 2000 ng/ml para 1,9 ng/ml de IgG de macaco (AntibodiesIncorporated, Davis, CA). Então 100 μΙ/cavidade de cada amostra foram in-cubados por uma hora a 37° C. A placa foi lavada três vezes com PBST. 100μ l/cavidade de uma diluição 1:30.000 de IgG antimacaco de coelho-HRP(Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) em PBSB foram adicionados e incubados poruma hora a 37° C. A placa foi lavada três vezes com PBST e desenvolvidacom 100 μ l/cavidade de substrato SureBIue TMB (KPL, Gaithersburg, MD)por aproximadamente cinco minutos em temperatura ambiente. A reação dedesenvolvimento foi parada com 100 μΙ/cavidade de solução de parada TMP(KPL, Gaithersburg, MD) e a absorbância de cada cavidade foi medida emum comprimento de onda de 450 nm.
Albumina de soro de cinomólogo endógena foi detectada usan-do o protocolo ELISA que segue. Primeiro, albumina de soro antimacaco decoelho foi diluída para 5 pg/ml em tampão de revestimento (tampão de re-vestimento = 1 cápsula de carbonato-bicarbonato, Sigma-Aldrich1 St. Louis,MO n9 Cat.C-3041, dissolvida em 100 mL de água). Em seguida, uma placade 96 cavidades (Costar/Corning) foi revestida com 100 μΙ/cavidade albumi-na de soro antimacaco de coelho (Nordic Immunology, Países Baixos, ns cat.RAMon/Alb) e incubada por uma hora a 37° C. A placa foi lavada quatro ve-zes com PBST (PBS com Tween-20 a 0,05%) e bloqueada por uma hora aI 37° C com 300 μ l/cavidade de uma solução de estoque de gelatina de peixea 5% (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO, n5 catG-7765) em PBS. A placa foi la-vada novamente quatro vezes com PBST. Amostras e padrões de soro fo-ram diluidos.com PBSB. Uma curva padrão foi estabelecida com uma faixade 200 ng/ml a 0,39 ng/ml de albumina de soro de macaco (Nordic Immuno-logy, Países Baixos, ns CatMonAIb BateladaNo.6082). Então 100 μΙ/cavidadede cada amostra foram incubados por uma hora a 37° C. A placa foi lavadaseis vezes com PBST. 100 μΙ/cavidade de uma diluição 1:30.000 de conju-gado albumina anti-humana de cabra-HRP (Academy Bio-Medical, Inc.,Houston, TX, ne Cat.AL10H-G1a) em PBSB foi adicionada e incubada poruma hora a 37° C. A placa foi lavada seis vezs com PBST e desenvolvidacom 100 μ g/cavidade de substrato SureBIue TMB (KPL, Gaithersburg, MD)por aproximadamente cinco minutos em temperatura ambiente. A reação dedesenvolvimento foi parada com 100 μl/cavidade de solução de parada TMP(KPL, Gaithersburg, MD) e a absorbância de cada cavidade foi medida emum comprimento de onda de 450 nm (figura 13).
IgM de cinomólogo endógena foi detectado usando protocoloELISA. Primeiro anticorpo IgM antimacaco de cabra foi diluído para 5 μg/mlem tampão de revestimento (tampão de revestimento = 1 cápsula de carbo-nato-bicarbonato, Sigma-AIdrich, St. Louis, MO, nQ CatC-3041, dissolvida em100 mL de água). Em seguida, uma placa de 96 cavidades (Costar-Corning)foi revestida com 100 μl/cavidade do IgM antimacaco de cabra 5 μg/ml (KPL,Gaithersburg1 MD1 nQ Cat.071-11-031) e incubada por uma hora a 37° C. Aplaca foi lavada quatro vezes com PBST (PBS com Tween-20 a 0,05%) ebloqueada por uma hora a 37° C com 200 μΙ/cavidade de PBSB (BSA a 1%em PBS; diluído de BSA a 10% em estoque de PBS; KPL). A placa foi Iava-da novamente quatro vezes com PBST. Amostras e padrões de soro foramdiluídos com PBSB. Uma curva padrão foi estabelecida com uma faixa de2000 η g/m I a 15,6 ng/ml de IgM de macaco (Alpha Diagnostic International,San Antonio, TX1 nQ Cat.2001301). Então 100 μΙ/cavidade de cada amostraforam incubados por uma hora a 37° C. A placa foi lavada quatro vezes comPBST. 100 μ l/cavidade de uma diluição 1:10.000 de conjugado IgM antima-caco de cabra-HRP (RDI, Concord, MA, nQ Cat.617103007) em PBSB foramadicionados e incubados por uma hora a 37° C. A placa foi lavada quatrovezes com PBST e desenvolvida com 100 μΙ/cavidade de substrato Sure-Blue TMB (KPL, Gaithersburg, MD) por aproximadamente cinco minutos emtemperatura ambiente. A reação de desenvolvimento foi parada com 100μ l/cavidade de solução de parada TMP (KPL, Gaithersburg, MD) e a absor-bância de cada cavidade foi medida em um comprimento de onda de 450 nm(figura 14).
Exemplo 21: Efeito do Peptídeo n9 270 sobre Catabolismode IgG Humana em Camundongos TG32B Usando Programas de Dosa-gem Variáveis
Camundongos adultos TG32B foram injetados intravenosamen-te com 500 mg/kg de IgG humana (MP Biomedicals, Irvine, CA) em t = 0 ho-ras (T0). Um grupo de quatro camundongos foi injetado intravenosamentecom 5 mg/kg de Peptídeo nQ 270 em t = 24 horas; um segundo grupo dequatro camundongos foi injetado intravenosamente com 5 mg/kg de Peptí-deo nQ 270 em t = 24 e 72 horas; um terceiro grupo de quatro camundongosfoi injetado intravenosamente com 2,5 mg/kg de Peptídeo ne 270 em t = 24,48, 72, 96 horas. Injeções de controle foram realizadas em cada ponto detempo usando o veículo PBS com acetato de sódio a 15 mM, pH 5 usandoum grupo adicional de camundongos. Amostras de sangue foram tomadasantes das injeções em todos os pontos de tempo, bem como em 168 horas.Soro foi preparado e armazenado a -20° C até que um ELISA foi realizadocomo no Exemplo 18 (figura 16).
Exemplo 22: Experimentos de Camundongo TG32B Adi-cionais
Experimentos adicionais foram realizados com Peptídeo nQ 270em camundongos TG32B. Usando o mesmo design experimental conformedescrito no Exemplo 18, Peptídeo n- 270 foi verificado eficaz na aceleraçãoda taxa de catabolismo de IgG usando vias de administração subcutânea(SC) e intraperitoneal (IP). Cinco doses diárias de 5 mg/kg de Peptídeo ne270 começando em 24 horas foram verificadas reduzir a meia-vida de IgGpara 56 horas seguindo ambas injeções subcutânea (SC) e intraperitoneal(IP) de Peptídeo nQ 270. Essas meias-vidas são significantemente mais cur-tas do que grupos controle típicos que exibem meias-vidas de IgG de 80 a100 horas. Ainda, a concentração de hlgG foi reduzida em 56% (SC) e 66%(IP) após 168 horas usando Peptídeo nQ 270 conforme comparado com ogrupo controle.
O Peptídeo n9 230 foi também testado nos camundongosTG32B usando o protocolo experimental descrito no Exemplo 18. Vinte equatro horas após a injeção intravenosa de IgG humana, injeções intraveno-sas diárias (IV) de 5 mg/kg de Peptídeo nQ 230 foram administradas por umtotal de cinco dias. A meia-vida de hlgG foi reduzida para 39 horas conformecomparado com a meia-vida do grupo controle de 92 horas. Ainda, a con-centração de hlgG foi reduzida em 76% após 168 horas conforme compara-do com o grupo controle.
O Peptídeo nQ 230 foi também testado em dois experimentosdesenvolvidos para avaliar o efeito de uma dose de peptídeo única conformecomparado com três doses de peptídeo diárias. Usando o protocolo experi-mental descrito no Exemplo 18, vinte e quatro horas após a injeção IV deIgG humana, um grupo animal foi tratado com uma dose IV única de 5 mg/kgde Peptídeo ng 230, enquanto um segundo grupo animal recebeu três dosesIV diárias consecutivas de 5 mg/kg de Peptídeo ne 230. Após 120 horas, adose única de Peptídeo nQ 230 reduziu a concentração de hlgG nos camun-Corp., Japão, Sunbright MEGC-30TS) por 18 horas. A mistura de reaçãobruta foi purificada em uma coluna C4 (Júpiter, Phenomenex) conforme des-crito no Exemplo 7, Iiofilizada e purificada novamente com cromatografia detroca de cátion (Fractoprep S03-, n° Cat. 1.17972, EMD Chemicals Inc.,Gibbstown, NJ) com o que o peptídeo se ligou à resina em acetato de sódioa 10 mM pH 5, a resina foi lavada com acetato de sódio a 10 mM pH 5, e opeptídeo foi eluído com cloreto de sódio a 100 mM em acetato de sódio a 10mM pH 5. A solução de peptídeo foi dialisada contra ácido acético a 1% eliofilizada. O peptídeo purificado foi analisado através de SDS-PAGE de-monstrando uma faixa de tingimento de peptídeo em ~50 kDa e através deHPLC demonstrando que não há nenhum peptídeo livre residual (figura 18).
Tabela 26. Análogo Peguilado de Peptídeo n° 285_
<table>table see original document page 114</column></row><table>
(Inserir pg. 132)
Exemplo 25: Efeito de Peptídeo n° 289 sobre Catabolismode IgG Humana em Camundongos TG32BTabela 26. Análogo Peguilado de Peptídeo № 285
<table>table see original document page 115</column></row><table>
Exemplo 25: Efeito de Peptídeo n9 289 sobre Catabolismode IgG Humana em Camundongos TG32B
Camundongos TG32B adultos foram injetados intravenosamentecom 500 mg/kg de IgG humana (MP Biomedicals, Irvine, CA) em t = O hora(T0). Em 24 horas, os camundongos foram injetados intravenosamente com25 mg/kg de Peptídeo n9 289. Amostras de sangue foram tomadas em 24,48, 72, 96, 120 e 168 horas. Soro foi preparado e armazenado a -20° C atéque um ELISA foi realizado. A concentração de IgG humana no soro em ca-da ponto de tempo foi determinada conforme acima descrito no Exemplo 18(figura 19).
Exemplo 26: Efeito de Peptídeo n9 283 Sobre Catabolismode hlgG e Concentrações de IgG5 IgM e albumina Endógenos em Maca-cos CinomólogosDezoito macacos cinomólogos foram divididos em seis gruposde três animais cada e todos os animais foram tratados com 5 mg/kg de IgGhumana biotinilada (MP Biomedical) em t = -3 dias. Começando em t=0, osanimais foram tratados por quatro semanas com Peptídeo n9 283 de acordocom o regime de dosagem que segue: 1) 1 mg/kg 3x/semana intravenosa-mente; 2) 1 mg/kg 1 x/semana subcutaneamente; 3) 1 mg/kg 3x/semanasubcutaneamente; 4) 5 mg/kg 3x/semana intravenosamente; 5) 5 mg/kg1x/semana subcutaneamente; 6) 5 mg/kg 3x/semana subcutaneamente. No-te que a última dose de peptídeo para o grupo 4 foi no dia 16. Amostras desoro foram tomadas no dia -3d, -15min, 1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 7d, 9d, 11d, 14d,16d, 18d, 21 d, 23d, 25d, 28d, 30d, 32d, 35d, 42d, 49d, 176. A concentraçãode IgG humana biotinilada, IgG endógena e albumina foi determinada con-forme descrito no Exemplo 20 e mostrado nas figuras 20-24.
O relatório descritivo é compreendida mais completamente àluz dos ensinamentos das referências citadas no relatório. As modalidadesno relatório provêem uma ilustração de modalidades da invenção e não de-vem ser consideradas limitar o escopo da invenção. O versado na técnicareconhece prontamente que muitas outras modalidades são compreendidaspela invenção. Todas as publicações a patentes citadas neste relatório des-critivo são incorporadas a título de referência em sua totalidade. Até o pontoque o material incorporado a título de referência contradisser ou for inconsis-tente com o presente relatório, o relatório vai substituir qualquer tal material.
A citação de quaisquer referências aqui não é uma admissão que tais refe-rências são técnica anterior à presente invenção.
A menos que de outro modo indicado, todos os números ex-pressando quantidades de ingredientes, condições de reação e assim pordiante usados no relatório, incluindo reivindicações, devem ser compreendi-dos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Des-te modo, a menos que de outro modo indicado o contrário, os parâmetrosnuméricos são aproximações e podem variar dependendo das propriedadesdesejadas buscadas pela presente invenção. Por fim, e não como uma ten-tativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das rei-vindicações, cada parâmetro numérico deve ser construído à luz do númerode dígitos significantes e abordagens de arredondanmento comuns.
A menos que de outro modo indicado, o termo "pelo menos"precedendo uma série de elementos deve ser compreendido se referir a ca-da elemento na série. Aqueles versados na técnica vão reconhecer, ou se-rão capazes de averiguar usando não mais do que experimentação de roti-na, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritaaqui. Tais equivalentes pretendem ser compreendidos pelas reivindicaçõesque seguem.

Claims (53)

1. Peptídeo monomérico, caracterizado pelo fato de que com-preende:-Gly-H6-F7-G8-G9-X10-Y11-em que:- H6 é histidina, mas pode ser opcionalmente substituída por umaminoácido positivamente carregado, análogo de aminoácido positivamentecarregado, aminoácido aromático, análogo de aminoácido aromático, amino-ácido aromático positivamente carregado, ou análogo de aminoácido aromá-tico positivamente carregado,- F7 é fenilalanina, mas pode ser opcionalmente substituída porum análogo de fenilalanina,- G8 e G9 são cada um glicina, mas podem ser independente-mente substituídos por um análogo de glicina, sarcosina, análogo de sarco-sina, ácido aspártico, análogo de ácido aspártico, D-aminoácido, análogo deD-aminoácido, ácido α-aminoisobutírico, ou análogo de ácido a-aminoisobutírico, ou- G8 junto de G9, pode ser opcionalmente substituído por ummimético de dipeptíde;- X10 é um aminoácido ou um análogo de aminoácido; ou- X10, quando tomado junto pela substituição por G9, forma ummimético de dipeptídeo;- X11 é tirosina, mas pode ser opcionalmente substituída por umanálogo de tirosina, eem que o peptídeo é 10 a 50 aminoácidos e/ ou análogos de a-minoácido de comprimento, e é capaz de inibir a ligação ao receptor Fc neo-natal humano (FcRn).
2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende:R1-Gly-H6-F7-G8-G9-X10-Y11-R2em que:R1 tem a fórmula X1-X2-X3-X4-em que:- X1 é escolhido de hidrogênio, acila e grupos de proteção deaminoácido;- X2 está ausente ou é de 1-15 aminoácidos e/ou análogos deaminoácidos de comprimento;- X3 está ausente ou é um aminoácido ou análogo de aminoá-cido que é capaz de formar uma ponte com Xi0, X12 ou X13, onde a ponte éescolhida de uma ponte amino terminal para carbóxi terminal, uma ponte decadeia lateral para estrutura principal e uma ponte de cadeia lateral para ca-deia lateral;- X4 está ausente ou é de 1-15 aminoácidos e/ou análogos deaminoácidos de comprimento,- R2 tem a fórmula -X12-X13-X14-X15em que:- X12 está ausente ou é um aminoácido ou análogo dele;- X13 está ausente ou é um aminoácido ou análogo dele;- X14 é de 1-15 aminoácidos e/ou análogos de aminoácidos decomprimento, e- X15 é um grupo amino ou um grupo de proteção carbóxi.
3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o peptídeo é de 11-35 aminoácidos e/ou análogos de ami-noácidos de comprimento.
4. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o peptídeo é de 10-30 aminoácidos e/ou análogos de ami-noácidos de comprimento.
5. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência:em que- R6 é escolhido a partir de:<formula>formula see original document page 120</formula>Gs e Gg são independentemente escolhidos a partir de:<formula>formula see original document page 121</formula> em que R é escolhido a partir de<formula>formula see original document page 121</formula>- quando tomados juntos, formam um mimético de dipeptídeoescolhidos a partir de:<formula>formula see original document page 121</formula>- quando tomado junto com G9, forma um mimético de dipeptí-deo escolhidos a partir de: <formula>formula see original document page 122</formula> - R11 é escolhido a partir de: <formula>formula see original document page 122</formula>
6. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 5, caracterizado pelo fato de que compreende:a) <formula>formula see original document page 122</formula> em que:- R6 é escolhido a partir de: <formula>formula see original document page 122</formula><formula>formula see original document page 123</formula><formula>formula see original document page 124</formula>em que:-G8 e G9 são independentemente escolhidos a partir de:<formula>formula see original document page 125</formula> em que:-Ré escolhido a partir de: <formula>formula see original document page 125</formula> - quando tomados juntos, formam um mimético de dipeptídeoescolhidos a partir de: <formula>formula see original document page 125</formula><formula>formula see original document page 126</formula><formula>formula see original document page 127</formula> em que:- G9 quando tomado junto com Xi0, formam um mimético de di-peptídeo escolhidos a partir de: <formula>formula see original document page 127</formula> em que:- Rn é escolhido a partir de: <formula>formula see original document page 127</formula>
7. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a-6, caracterizado pelo fato de que X2 é de 1-3 aminoácidos e/ou análogos deaminoácidos de comprimento.
8. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a-7, caracterizado pelo fato de que X3 é um aminoácido ou análogo de amino-ácido capaz de formar uma ponte com X10, X12, ou X13.
9. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, 7 e 8, caracterizado pelo fato de que H6 é substituído por um aminoácidoaromático positivamente carregado, ou análogo de aminoácido aromáticopositivamente carregado.
10. Peptídeo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pe-lo fato de que H6 é histidina.
11. Peptídeo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteriza-do pelo fato de que H6 é <formula>formula see original document page 128</formula>
12. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, 7 a 10, caracterizado pelo fato de que F7 é fenilalanina.
13. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5,-6 e 11, caracterizado pelo fato de que F7 é <formula>formula see original document page 128</formula>
14. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, 7 a 10, e 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de G8 e G9 ésubstituído por um D-aminoácido, ácido α-aminoisobutírico, ou sarcosina.
15. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, 7 a 10, 12 e 14, caracterizado pelo fato de que Xi0 é um aminoácidoneutro, análogo de aminoácido neutro, aminoácido hidrofóbico, ou análogode aminoácido hidrofóbico.
16. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5,-6, 11 e 13, caracterizado pelo fato de que R11 e <formula>formula see original document page 128</formula>
17. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5,-6, 11, 13 e 16, caracterizado pelo fato de que R6 é <formula>formula see original document page 128</formula>, R7 é<formula>formula see original document page 128</formula>
18. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 17, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é linear.
19. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2a 18, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de X10, X12 ou Xi3 é umaminoácido ou análogo de aminoácido que é capaz de formar uma pontecom X3, onde a ponte é escolhida de uma ponte amino terminal para carbóxiterminal, uma ponte de cadeia lateral para estrutura principal e uma ponte decadeia lateral para cadeia lateral.
20. Peptideo de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que X3 forma uma ponte com Χίο, X12 ou Xi3.
21. Peptídeo de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o peptídeo tem nove aminoácidos e/ou análogos de amino-ácidos entre os aminoácidos e/ou análogos de aminoácidos que formam aponte.
22. Peptídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a ponte de cadeia lateral para cadeia lateral é uma pontedissulfeto, uma ponte éter, uma ponte tioéter, uma ponte alceno ou uma pon-te amida.
23. Peptídeo de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a ponte de cadeia lateral para cadeia lateral é também(a) uma ponte dissulfeto entre:- cisteína e cisteína;- cisteína e homocisteína;- cisteína e penicilamina;- homocisteína e homocisteína;- homocisteína e penicilamina; e- penicilamina e penicilamina, ou(b) uma ponte amida entre:- ácido aspártico e lisina;- ácido aspártico e ornitina;- ácido aspártico e ácido 2,4-diaminobutírico;- ácido aspártico e ácido 2,3-diaminopropiônico;- ácido glutâmico e lisina;- ácido glutâmico e ornitina;- ácido glutâmico e ácido 2,4-diaminobutírico;- ácido glutâmico e ácido 2,3-diaminopropiônico.
24. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 5 e 7 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende:Gly-H6-Phe-G8-G9-X10-Tyr.
25. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 24, caracterizado pelo fato de que compreende:Gly-His-Phe-Gly-Gly-Xio-Tyr.
26. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 24, caracterizado pelo fato de que compreende:Gly-His-Phe-Gly-Sar-Xio-Tyr.
27. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2a 24 e 26, caracterizado pelo fato de que compreende:Pen-Thr-Gly-His-Phe-Gly-Sar-X10-Tyr.
28. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 24, 26 e 27, caracterizado pelo fato de que compreende:Arg-Phe-Pen-Thr-GIy-His-Phe-GIy-Sar-NMeLeu-Tyr-Pro-Cys.
29. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de que compreende a seqüência:QRFCTGHFGGLYPCNGP;GGGCVTGHFGGIYCNYQ;KIICSPGHFGGMYCQGK;PSYCIEGHIDGIYCFNA;NSFCRGRPGHFGGCYLF;AGQRFCTGHFGGLYPCNGPGTGGGK;AGGGCVTGHFGGIYCNTQGTGGGK;AGKIICSPGHFGGMYCQGKGTGGGK;AGPSYCIEGHIDGIYCFNAGTGGGK;AGNSFCRGRPGHFGGCYLFGTGGGK;CTGHFGGLYPCNGP;QRFCTGHFGGLYPC;CTGHFGGLYPC;TGHFGGLYP;RFCTGHFGGLYPCNGP;FCTGHFGGLYPCNGP;QRFCTGHFGGLYPCNG;QRFCTGHFGGLYPCN;QAFCTGHFGGLYPCNGP;QRACTGHFGGLYPCNGP;QRFCAGHFGGLYPCNGP;QRFCTAHFGGLYPCNGP;QRFCTGAFGGLYPCNGP;QRFCTGHAGGLYPCNGP;QRFCTGHFAGLYPCNGP;QRFCTGHFGALYPCNGP;QRFCTGHFGGAYPCNGP;QRFCTGHFGGLAPCNGP;QRFCTGHFGGLYACNGP;QRFCTGHFGGLYPCAGP;QRFCTGHFaGLYPCNGP;QRFCTGHFGaLYPCNGP;QRFCTGHFaaLYPCNGP;QRFCGHF-betaAIa-LYPCNGP;QRFCTGHFGGLFPCNGP;QRFCTGHFGGLYP-hC-NGP;QRF-hC-TGHFGGLYP-hC-NGP;QRFcTGHFGGLYPCNGP;QRFCTGHFGGLYPCNGP;QRFcTGHFGGLYPcNGP;QRF-Pen-TGHFGGLYPCNGP;QRFCTGHFGGLYP-Pen-NGP;QRF-Pen-TGHFGGLYP-Pen-NGP;QRFCTGHF-Apa-LYPCNGP;QRFCTG-Dab-FGGLYPCNGP;QRFDTGHFGGLYP-Dab-NGP;QRFDTGHFGGLYPKNGP;QRF-Pen-TGHFGpLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGrLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGhLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGiLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGfLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGyLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFG-Aib-LYPCNGP;QRF-Pen-TGHFdGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFpGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFrGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFhGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFiGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFfGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFyGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHF-Aib-GLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(4-amino-Phe)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(4-metóxi-Phe)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(pentaflúor-Phe)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(2-piridilalanina)-GGLYPCNGP;QRFVTGHFpGLYPANGP;QRF-Pen-TGH-(3-PiridilAla)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(4-nitro-Phe)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(1-naftilalanina)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(2- naftilalanina)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGGL-(4-amino-Phe)-PCNGP;QRF-Pen-TGHFGGL-(4-metóxi-Phe)-PCNGP;QRF-Pen-TGHFGGL-( pentaflúor-Phe)-PCNGP;QRF-Pen-TGHFGGL-(2- PiridilAla)-PCNGP;QRF-Pen-TGHFGGL-(3- PiridilAla)-PCNGP;QRF-Pen-TGHFGGL-(4-nitro-Phe)-PCNGP;QRF-Pen-TGHFGGLYP-hC-NGP;QRF-hC-TGHFGGLYP-Pen-NGP;QRFSTGHFGGLYPSNGP;QRF-Dab-TGHFGGLYPENGP;QRFKTGHFGGLYPENGP;QRF-Pen-TGHFGaLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFaGLYPCNGP;QRFETGHFGGLYPKNGP;QRFETGHFGGLYP-Dab-NGP;QRFETGHFGGLYP-Dap-NGP;QRFDTGHFGGLYP-Dap-NGP;RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = 3-amino-N-1-carboximetil-2,3,4,5-tetraidro-1H-[1]-benzazepina-2-ona =QRFKTGHFGGLYPDNGP;QRF-Dab-TGHFGGLYPDNGP;F-Pen-TGHFGGLYPC;F-Pen-TGHFGGLYPC;QRF-Pen-TGHFGGHYPCNGP;QRFDTGHFGGLYP-Orn-NGP;QRFETGHFGGLYP-Orn-NGP;QRF-Pen-TGHFGGL-(2-nitro-Tyr)-PCNGP;QRF-Pen-TGH-(2-MePhe)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(3-MePhe)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(4-MePhe)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TG-Thz-FGGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(homoPhe)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(Cha)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(PheNHAc)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHWGGLYPCNGP;QRf-Pen-TGHFGGLYPCNGP;QRY-Pen-TGHFGGLYPCNGP;QRW-Pen-TGHFGGLYPCNGP;RF-Pen-TGHFGGLYPC;QRF-Pen-TGHFGGIYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(fenilGly)-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-(Tic)-GGLYPCNGP;QRFDTGH-(2MePhe)-GGLYPKNGP;QRFDTGHFGaLYPKNGP;QRFDTGHFaGLYPKNGP;QRFDTGHFGGLYKNGP;QRF-Pen-T-Sar-HFGGLYPCNGP;QRF-Pen-TG-Dap-FGGLYPCNGP;QRF-Pen-TGH-NMePhe-GGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHF-Sar-GLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFG-Sar-LYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGG-NMeLeu-YPCNGP;QRF-Pen-TGHFGGL-NMeTyr-PCNGP;QRF-Pen-TGHFGGFYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGGWYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGGMYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGGLYPCNGP;DTGHFGGLYPKNGP;FDTGHFGGLYPKNGP;RFDTGHFGGLYPKNGP;QRFDTGHFGGLYPKNGP;QRFDTGHFGGLYPKN;QRF-Dap-TGHFGGLYPDNGP;QRF-Dap-TGHFGGLYPENGP;QRF-Orn-TGHFGGLYPDNGP;QRF-Orn-TGHFGGLYPENGP;RFDTGHFGGLYPK;QRFDTGHFGGLYPK;RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = ácido 4-aminometil-benzóico=;RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = ácido (3-aminometil)- benzóico =<formula>formula see original document page 135</formula> QRF-Pen-TG-(1 Me)His-FGGLYPCNGP;QRF-Pen-TG-Dab-FGGLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFGGL-(4-flúor-Phe)-PCNGP;QRF-Pen-TGHFGpLYPC;RF-Pen-TGHFGpLYPC;F-Pen-TGHFGpLYPC;RF-Pen-TGHFGpLYPCNGP;F-Pen-TGHFGpLYPCNGP;RF-Pen-TGHFGG-NMeLeu-YPCNGP;RF-Pen-TGHFG-Sar-YPCNGP;QRF-Pen-TGHFaaLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFapLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFfpLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFfaLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFppLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFfG-NMeLeu-YPCNGP;QRF-Pen-TGHFaG-NMeLeu-YPCNGP;QRF-Pen-TGHFfGPYPCNGP;QRFVTGHFppLYPANGP;QRFVTGHFGpLYPANGP;QRFDTGHFGpLYPKNGP;QRFLTGHFGpLYPANGP;QRFITGHFGpLYPANGP;QRFFTGHFGpLYPANGP;QRFYTGHFGpLYPANGP;QRFWTGHFGpLYPANGP;QRFVTGHFGpLYPVNGP;QRFVTGHFGpLYPLNGP;QRFVTGHFGpLYPINGP;QRFVTGHFGpLYPFNGP;QRFVTGHFGpLYPYNGP;QRFVTGHFGpLYPWNGP;QRFVTGHFGpVYPANGP;QRFVTGHFGplYPANGP;QRFVTGHFGpFYPANGP;QRFVTGHFGpYYPANGP;Q RFVTG H FGpWYPAN G P;RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = ácido 3-amino-2-oxo-1-piperidina- acé--.,-OJi..tiCO= " T ;RF-Pen-TGHF-X-LYPC1 em que X = ácido 3-amino-2-oxo-1-piperidina-yQ-1-.acetico = °;RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = 3-amino-N-1-carboximetil-2,3,4,5-tetraidro-1H-[1]-benzazepina-2-ona = H ° ;RFVTGHF-X-LYPA, em que X = ácido 3-amino-2-oxo-1-piperidina- acético =RFVTGHF-X-LYPA, em que X = 3-amino-2-oxo-1-piperidine-acetic acid =RFVTGHF-X-LYPA, em que X = 3-amino-N-1-carboximetil-2,3,4,5-tetraidro--1H-[1]-benzazepina-2-ona = H °;RFVTGHF-X-LYPA, em que X = 3-amino-N-1-carboximetil-2,3,4,5-tetraidro--1 H-[1 ]-benzazepina-2-ona = HRFVTGHF-X-LYPA, em que X = ácido 3-aminofenil acetico = ° ;QRF-Pen-TGHFG-Sar-NMeLeu-YPCNGP;QRF-Pen-TGHFa-Sar-NMeLeu-YPCNGP;QRF-Pen-TGHFa-Sar-LYPCNGP;QRFVTGHFGpWYPINGP;QRFVTGHF-X-WYPINGP, em que X = ácido 3-amino-2-oxo-1-piperidina-acetico = °;RF-Pen-TG-NMeHis-FGGLYPC;RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = ácido 3(S)-amino-2-oxo-1-piperidina-acético =o ;QRF-Pen-TGHFG-X-YPCNGP1 em que X = D1L-Iactama de Friedinger = <formula>formula see original document page 137</formula> QRF-Pen-GGHFGGLYPCNGP;QRFC-NMeAIa-GHFGGLYPCNGP;RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = mimético do dipeptídeo 5,5-bicíclicoRF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = mimético do dipeptídeo 5,5-bicíclico =QRF-Pen-TGHFpPLYPCNGP;QRF-Pen-TGHFfPLYPCNGP;RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = mimético do dipeptídeo 6,5-bicíclico =RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = ácido 3(R)-amino-2-oxo-1-azepinza a-cético = fi;RFVTGHF-X-LYPA, em que X = mimético do dipeptídeo 5,5-bicíclico =RFVTGHF-X-LYPA, em que X = mimético do dipeptídeo 6,5-bicíclico =RFVTGHF-X-LYPA, em que X = ácido 3(R)-amino-2-oxo-1-azepina acético =RFVTGHFGpWYP;RFVTGHFGpWYPANGP;FVTGHFGpWYPA;VTGHFGpWYPA;QRF-Pen-(NMeAIa)-GHFGGLYPCNGP;RF-Pen-TGHF-X-LYPC, em que X = ácido 3(R)-amino-2-oxo-1-pirrolidinaacético =o ;QRF-Pen-TGHFG-X-YPCNGP1 em que X = L1L-Iactama de Friedinger =<formula>formula see original document page 138</formula>RF-Pen-TGHFf-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGHFv-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGHFI-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGHFw-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGH-(2-CI-Phe)-GGLYPC;RF-Pen-TGH-(3-CI-Phe)-GGLYPC;RF-Pen-TGH-(4-CI-Phe)-GGLYPC;RF-Pen-TGH-(3,3-Di-Phe)-GGLYPC;RF-Pen-TGH-(4,4-Bi-Phe)-GGLYPC;RF-Pen-TGH-(4-t-Butil-Phe)-GGLYPC;RF-Pen-TGHF-X-NMeLeu-YPC1 em que X = ácido 3(R)-amino-2-oxo-1-piperidina-acetico = H ° ;RF-Pen-NMeAIa-GHF-X-NMeLeu-YPC1 em que X = ácido 3(R)-amino-2-oxo-- 1-piperidina-acético = ° ;RF-Pen-TGHFG-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGHFG-Sar-NMeLeu-YPC;RFVTGHFG-Sar-NMeLeu-YPA;RFVTGHFG-Sar-NMeLeu-YPA;RF-Pen-TGHFGGWYPC;QRF-Pen-TGHFG-Sar-WYPCNGP;RF-Pen-TGHF-X-NMeLeu-YPC1 em que X = ácido 3(R)-amino-2-oxo-1-azepina acetico=RF-Pen-TGHFt-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGHFs-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGHFd-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGHFn-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGHFe-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGHFq-Sar-NMeLeu-YPC;RFVTGHFGpWYPA;RF-Pen-TG-Thz-FG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TG-2PiridilAla-FG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TG-3PiridilAla-FG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TG-ThieniIAIa-FG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TG-Dab-FG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TG-Orn-FG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TGKFG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TGRFG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TG-4GuanilPhe-FG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TG-4aminoPhe-FG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TG-His(Me)-FGGLYPC;RF-Pen-TG-His(Me)2-FGGLYPC;RF-Pen-TG-PropargiIGIy-FG-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TG-(2-PirrolidinilAla)-FG-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TG-(3-PiperidialAla)-FG-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TG-(4-PiperidilAla)-FG-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGFFG-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGAFG-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TGH-((D/L)-betametilPhe)-G-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TG-(4-PiridilAla)- FG-Sar-NMeLeu-YPC;RF-Pen-TG-Thz(Me)-FG-Sar-NMeL-YPC;RF-Pen-TG-triazolilAla-FG-Sar-NMeL-YPC;QRF-Pen-TGHFGpLYP-Pen-NGP;QRF-Pen-HGHFGGLYPCNGP; orQRF-Pen-TG-Dap(GuaniI)-FGGLYPCNGP.
30. Peptídeo multimérico, caracterizado pelo fato de que com-preende um ou mais peptídeos monoméricos, como definidos em qualqueruma das reivindicações 1 a 29. em que cada peptídeo monomérico pode serigual ou diferente.
31. Peptídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que compreende a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 140</formula>
32. Peptídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que compreende a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 140</formula><formula>formula see original document page 141</formula><formula>formula see original document page 142</formula> em que X= 3(R)-amino-1-carboximetil-valerolactama; <formula>formula see original document page 142</formula> em que X= 3(R)- amino-1-carboximetil-valerolactama; <formula>formula see original document page 142</formula><formula>formula see original document page 143</formula><formula>formula see original document page 144</formula><formula>formula see original document page 145</formula>
33. Peptídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que o peptídeo é um dímero, um trímero ou um tetrâmero.
34. Peptídeo de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o peptídeo é um dímero.
35. Peptídeo de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que o dímero é o produto de uma reação entre monômeros depeptídeo individuais e um Iigante multivalente.
36. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 35, caracterizado pelo fato de que o peptídeo se liga especificamente aFcRn humano e inibe a ligação de FcRn humano a IgG humana.
37. Fusão, caracterizada pelo fato de que compreende o peptí-deo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 36, com outramolécula.
38. Fusão de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelofato de que a molécula é escolhida a partir de polietileno glicol (PEG), albu-mina, transferrina e a porção Fc de uma imunoglobulina.
39. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo, comodefinido em qualquer uma das reivindicações 30 a 36.
40. Composição de acordo com a reivindicação 39, caracteriza-da pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo é ca-paz de diminuir a concentração no soro de IgG humana conforme compara-do com a concentração no soro de IgG humana antes do tratamento com opeptídeo.
41. Uso de um peptídeo, como definido em qualquer uma dasreivindicações 30 a 36, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de ummedicamento.
42. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelofato de que o medicamento é capaz de modular a concentração no soro delgG.
43. Uso de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelofato de que a IgG é específica para uma proteína terapêutica ou um vetor deterapia de gene.
44. Uso de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelofato de que a proteína terapêutica é eritropoietina ou um fator de coagula-ção.
45. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelofato de que o medicamento é para o tratamento de um estado de doençaescolhido de doenças inflamatórias, doenças auto-imunes e câncer.
46. Uso de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelofato de que a doença auto-imune é escolhida a partir de alopecia areata, es-pondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídeo, doença de Addison auto-imune, anemia hemolítica auto-imune, hepatite auto-imune, síndrome Iinfo-proliferativa auto-imune (alps), púrpura trombocitopenia auto-imune (atp),doença de Behcet, penfigóide bolhoso, cardiomiopatia, sprue celíaco-dermatite herpetiforme, síndrome da disfunção imune e fadiga crônica, poli-neuropatia desmielinante inflamatória crônica, penfigóide cicatricial, síndro-me CREST, doença por aglutinina fria, doença de Crohn1 doença de Dego1dermatomiosite, dermatomiosite-juvenil, lúpus discóide, crioglobulinemia mis-ta essencial, fibromialgia-fibromiosite, doença de Grave, tireoidité de Hashi-moto Guillain-Barré, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopeniaidiopática, Nefropatia IgA, diabetes insulino-dependente, artrite juvenil, Ii-quen plano, lúpus, doença de Méniere, doença de tecido conectivo mista,esclerose múltipla, miastenia grave, pênfigo, anemia perniciosa, poliarteritenodosa, policondrite, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, poli-miosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primá-ria, psoríase, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, febre reumática,artrite reumatóide, sarcoidose, escleroderma, síndrome de Sjõgren, síndro-me de stiff-man, arterite takayasu, arterite temporal/arterite da célula gigante,rejeição de transplante, colite ulcerativa uveíte, vasculite, vitiligo e Granulo-matose de Wegener.
47. Uso de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelofato de que a doença auto-imune é escolhida a partir de pênfigo bolhoso,púrpura trombocitopenia idiopática (ITP), miastenia grave (MG), pênfigo erejeição de transplante.
48. Uso de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelofato de que o pênfigo é pênfigo vulgar.
49. Uso de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelofato de que a doença inflamatória é escolhida a partir de asma, colite ulcera-tiva e síndrome do intestino inflamatório, mastocitose e artrite.
50. Método de detecção de FcRn in vitro, caracterizado pelo fatode que compreende marcação do peptídeo, como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 36, com um marcador detectável escolhido de radioi-sótopos, enzimas tendo produtos detectáveis, fluorforos, compostos quimio-luminescentes, partículas magnéticas, microesferas, nanoesferas, biotina,estreptavidina e digoxina.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pe-lo fato de que o método de detecção está incluído em um kit de diagnóstico.
52. Método para sintetização de um dímero de peptídeo, carac-terizado pelo fato de que compreende uma primeira etapa de síntese depeptídeo de fase sólida, uma segunda etapa de tratamento da resina de fasesólida com uma molécula que pode reagir com e se ligar a dois peptídeosadjacentes; e uma terceira etapa de liberação dos peptídeos ligados da resi-na.
53. Método de purificação de FcRn, caracterizado pelo fato deque compreende:(a) imobilização do peptídeo, como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 36 para um apoio sólido,(b) contato de uma solução contendo FcRn com o peptídeo imo-bilizado sobre um apoio sólido; e(c) purificação de FcRn através da separação da solução do ditoapoio sólido.
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