BRPI0708082A2 - processo para produzir ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e/ou ácido docosahexaenóico em uma planta transgênica, molécula de ácido nucléico, planta transgênica, e uso de óleos, lipìdeos ou ácidos graxos livres - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA PRODUZIR áCIDO EICOSAPENTAENóICO, áCIDO DOCOSAPENTAENóICO E/OUáCIDO DOCOSAUEXAENóICO EM UMA PLANTA TRANSGêNICA, MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO, PLANTA TRANSGêNICA, E, USO DE óLEOS, LIPìDEOS OU áCIDOS GRAXOS LIVRES. A invenção refere-se a um processo para produzir ácido eicosapentanóico, ácido docosapentanóico e/ou ácido docohexanóico em plantas transgênicas, De acordo com o citado processo, a planta é proporcionada com pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo com uma atividade de <30>6 dessaturase, pelo menos uma seqúéncia de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo com uma atividade de <30>6 alongase, pelo menos uma seqúência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo com uma atividade de <30>5 dessaturase, e pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo com uma atividade de <30>5 alongase, a seqúência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo com uma atividade de <30>5 alongase sendo modificada em relação à sequência de ácido nucleico no organismo do qual a seqhência se origina, de tal modo que está adaptada para uso de códon em pelo menos um tipo de planta, Para a produção de ácido ácido docosahexanóico, pelo menos uma seqúência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo com uma atividade de <30>4 dessaturase também é introduzida na planta.

Description

"PROCESSO PARA PRODUZIR ÁCIDO EICOSAPENTAENÓICO,ÁCIDO DOCOSAPENTAENÓICO E/OU ÁCIDODOCOS AHEXAENÓICO EM UMA PLANTA TRANSGÊNICA,MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, PLANTA TRANSGÊNICA, E5 USODE ÓLEOS, LIPÍDEOS OU ÁCIDOS GRAXOS LIVRES"

A presente invenção refere-se a um processo para a produçãode ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e/ou ácidodocosahexaenóico em plantas transgênicas, proporcionando na planta pelomenos uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeopossuindo uma atividade de A6-dessaturase; pelo menos uma seqüência deácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo uma atividade de Δ6-alongase; pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo possuindo uma atividade de A5-dessaturase; e pelo menos umaseqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo umaatividade de A5-alongase, onde a seqüência de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo possuindo uma atividade de A5-alongase está modificada porcomparação com a seqüência de ácido nucleico no organismo do qual aseqüência é derivada pelo fato de que está adaptada para uso de códon emuma ou mais espécies de planta.

Em uma modalidade preferida há adicionalmente a provisão deoutras seqüências de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo possuindoa atividade de uma co3-dessaturase e/ou de uma A4-dessaturase na planta.

Em uma outra modalidade preferida há a provisão de outrasseqüências de ácido nucleico que codificam acil-CoA desidrogenase(s), acil-ACP (proteína carreadora) dessaturase(s), acil-ACP tioesterase(s), ácidograxo acil transferase(s), acil-CoA:lisofosfolipídeo acil transferase(s), ácidograxo sintase(s), ácido graxo hidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s),acilcoenzima A oxidase(s), ácido graxo dessaturase(s), ácido graxoacetilenases, lipoxigenases, triacilglicerol lipases, aleno óxido sintases,hidroperóxido liases ou ácido graxo alongase(s) na planta.

A invenção adicionalmente se refere às moléculas de ácidograxo recombinantes compreendendo pelo menos uma seqüência de ácidonucleico que codifica um polipeptídeo possuindo uma atividade de Δ6-dessaturase; pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo possuindo uma atividade de A5-dessaturase; pelo menos umaseqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo umaatividade de Δό-alongase; e pelo menos uma seqüência de ácido nucleico quecodifica um polipeptídeo possuindo uma atividade de A5-alongase e que estámodificada por comparação com a seqüência de ácido nucleico no organismodo qual a seqüência se origina pelo fato de que está adaptada para uso decódon em uma ou mais espécies de planta.

Uma outra parte da invenção refere-se aos óleos, lipídeos e/ouácido graxos que tem sido produzidos pelo processo de acordo com ainvenção, e ao uso deles.

Finalmente, a invenção também se refere às plantastransgênicas que têm sido produzidas pelo processo da invenção ou quecompreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, eao uso delas como gêneros alimentícios ou rações.

Síntese de lipídeo pode ser dividida em duas seções: a síntesede ácido graxos e sua ligação em sn-glicerol-3-fosfato, e a adição oumodificação de um grupo cabeça polar. Lipídeos úteis que são usados emmembranas compreendem fosfolipídeos, glicolipídeos, esfingolipídeos efosfoglicerídeos. Síntese de ácido graxo inicia com a conversão de acetil-CoAem malonil-CoA por acetil-CoA carboxilase ou em acetil-ACP por acetiltransacilase. Após reação de condensação, estas duas moléculas produtojuntas formam acetoacetil-ACP, que é convertido via uma série de reações decondensação, redução e desidratação de modo que seja obtida uma moléculade ácido graxo saturada com o comprimento de cadeia desejado. A produçãode ácidos graxos insaturados a partir destas moléculas é catalisada pordessaturases específicas, quer aerobicamente por meio de oxigênio molecularquer anaerobicamente (em relação à síntese de ácido graxo emmicroorganismos, veja F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli and Salmonella.ASM Press: Washington, D.C., p. 612-636 e referências lá citadas; Lengeleret al. (Ed.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, e asreferências lá citadas, e Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews57:522-542 e as referências lá citadas) . Para sofrerem outras etapas dealongamento, os ácidos graxos ligados em fosfolipídeo resultantes têm que serretornados para a coleção de ácido graxo CoA éster. Isto é tornado possívelpelas acil-CoA:lisofosfolipídeo aciltransferases. Além disso, estas enzimassão capazes de transferirem os ácidos graxos alongados dos CoA ésteres devolta para os fosfolipídeos. Se apropriado, esta seqüência de reações pode serseguida repetidamente.

Ademais, ácido graxos têm que ser subseqüentementetransportados para vários sítios de modificação e incorporados no lipídeo dearmazenagem triacilglicerol. Uma outra etapa importante durante a síntese delipídeo é a transferência de ácido graxos para os grupos cabeça polares, porexemplo por glicerol ácido graxo aciltransferase (veja Frentzen, 1998, Lipid,100(4-5) :161-166).

Uma visão geral da biossíntese de ácido graxos em plantas,dessaturação, o metabolismo de lipídeo e o transporte de membrana decompostos lipídicos, beta-oxidação, a modificação de ácido graxos, co-fatorese a armazenagem e a montagem de triacilglicerol, incluindo as referênciasdadas pelos seguintes jornais: Kinney (1997) Genetic Engineering, Ed.: JKSetlow, 19:149-166; Ohlrogge e Browse (1995) Plant Cell 7:957-970;Shanklin e Cahoon (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker (1996) Genetic Engeneering, Ed.: JK Setlow, 18:111-13;Gerhardt (1992) Prog. Lipid R. 31:397-417; Gühnemann-Schâfer & Kindl(1995) Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al. (1995) Prog. LipidRes. 34:267-342; Stymne et al. (1993) em Biochêmistry and MolecularBiology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Ed.: Murata e Somerville,Rockville5 American Society of Plant Physiologists, 150-158; Murphy & Ross(1998) Plant Journal. 13(1) :1-16.

Dependendo do padrão de dessaturação, podem serdistinguidas duas classes grandes de ácidos graxos poliinsaturados, os ácidosgraxos ω6 e ω3, que diferem com relação ao metabolismo deles e à funçãodeles.

No texto que segue, ácidos graxos poliinsaturados sãoreferidos como PUFA, PUPAs, LCPUFA ou LCPUFAs (ácidos graxospoliinsaturados, PUFA, ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa,LCPUFA).

O ácido graxo ácido linoleico (18:2Δ9,12) atua como ummaterial inicial para a rota metabólica ω6, enquanto que a rota ω3 processa-sevia ácido linolênico (18:3Δ9,12,15) . Ácido linolênico é formado de ácidolinoleico pela atividade de uma co3-dessaturase (Tocher et al. (1998) Prog.Lipid Res. 37: 73-117; Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 4105-4113).

Mamíferos, e portanto também humanos, não possuematividade de dessaturase correspondente (Δ12- e ω3-dessaturase) para aformação dos materiais iniciais e portanto têm que adquirir estes ácidosgraxos (ácido graxos essenciais) via o alimento. Partindo-se destesprecursores, os ácidos graxos poliinsaturados fisiologicamente importantesácido araquidônico (= ARA, 20:4Δ5;8'η'14), e um ácido graxo ω6 e os doisácidos graxos ω3- ácido eicosapentaenóico (= EPA, 20:5a5,8'11'14'17) e ácidodocosahexaenóico (DHA, 22:6Δ4'7'10'13'17'19) são sintetizados via uma seqüênciade reações de dessaturase e alongase.

O alongamento dos ácidos graxos, por alongases, pelos átomos2 ou 4 C, é de importância crucial para a produção de C20- e C22-PUFAs,respectivamente. Este processo processa-se via 4 etapas. A primeira etapa é acondensação de malonil-CoA em ácido graxo acil-CoA por cetoacil-CoAsintase (KCS, aqui abaixo referida como alongase) . Esta é seguida por umaetapa de redução (cetoacil-CoA redutase, KCR), uma etapa de desidratação(desidratase) e uma etapa de redução final (enoil-CoA redutase) . Tem sidopostulado que a atividade de alongase afeta a especificidade e a velocidade doprocesso inteiro (Millar e Kunst (1997) Plant Journal 12:121-131) .

Ácidos graxos e triacilglicerídeos possuem uma multiplicidadede aplicações na indústria de alimentos, em nutrição animal, em cosméticos eno setor farmacológico. Dependendo de ser são ácidos graxos livres saturadosou insaturados se não triacilglicerídeos com um conteúdo elevado de ácidosgraxos saturados ou insaturados, são adequados para aplicações muitodiferentes. Assim, por exemplo, lipídeos com ácidos graxos insaturados,especificamente com ácidos graxos poliinsaturados, são preferidos emnutrição humana. Os ácidos graxos poliinsaturados ω3 são supostos empossuírem um efeito positivo sobre o nível de colesterol no sangue e assimsobre a prevenção de doença cardíaca. O risco de doença cardíaca, derramescerebrais ou hipertensão pode ser reduzido marcantemente pela adição destesácidos graxos ω3 no alimento (Shimikawa (2001) World Rev. Nutr. Diet. 88: 100-198).

Ácidos graxos ω3 também possuem um efeito positivo sobreprocessos inflamatórios, especificamente sobre processos inflamatórioscrônicos, em associação com doenças imunológicas tal como artritereumatóide (Calder (2002) Proc. Nutr. Soe. 61: 345-358; Cleland e James(2000) J. Rheumatol. 27: 2305-2307). Portanto são adicionados em gênerosalimentícios, especialmente em gêneros alimentícios dietéticos, ou sãoempregados em medicamentos. Ácidos graxos ω6 tal como ácidoaraquidônico tendem a possuir um efeito negativo em conexão com estasdoenças reumatológicas.

Ácidos graxos ω3 e ω6 são precursores de hormônios detecido, conhecidos como eicosanóides, tais como as prostaglandinas, que sãoderivadas de ácido di-homo-y-linolênico, ácido araquidônico e ácidoeicosapentaenóico, e dos tromboxanos e leucotrienos, que são derivados deácido araquidônico e ácido eicosapentaenóico. Eicosanóides (conhecidoscomo a série PG2) que são formados a partir de ácidos graxos ω6, geralmentepromovem reações inflamatórias, enquanto que eicosanóides (conhecidoscomo a série PG3) de ácidos graxos ω3 possuem pouco ou nenhum efeito pró-inflamatório.

Ácidos graxos poliinsaturados ω3 de cadeia longa tais comoácido eicosapentaenóico (= EPA, C20:5A5>8'11>14'17) ou ácido docosahexaenóico(= DHA, C22:óm'7'10'13'16'19) são componentes importantes da nutrição humanadevido aos seus vários papéis em aspectos de saúde, incluindo odesenvolvimento de cérebro de criança, a funcionalidade dos olhos, e asíntese de hormônios e outras substâncias de sinal, e a prevenção de distúrbioscardiovasculares, câncer e diabetes (Poulos, A (1995) Lipids 30:1-14;Horrocks, LA e Yeo YK (1999) Pharmacol Res 40:211-225) .

Devido à composição de alimento de humano dos dias atuais, éparticularmente importante uma adição de ácidos graxos poliinsaturados ω3.Assim, por exemplo, ácidos graxos poliinsaturados tais como ácidodocosahexaenóico (= DHA, C22:6M'7'10'13'16'19) ou ácido eicosapentaenóico (=EPA, C20:5A5'8'n'14'17) são adicionados em fórmula infantil para melhorar ovalor nutricional. Portanto há uma demanda para a produção de ácidos graxospoliinsaturados de cadeia longa.

Os vários ácidos graxos e triglicerídeos são principalmenteobtidos de microorganismos tais como Mortierella ou Schizochytrium ou deplantas produtoras de óleo tais como feijões-soja, colza, e algas tais comoCrypthecodinium ou Phaeodactilum e outras, sendo obtidos, como uma regra,na forma de seus triacilglicerídeo (= triglicerídeos = trigliceróis) . Contudo,também podem ser obtidos de animais, por exemplo, peixe. Os ácidos graxoslivres são vantajosamente preparados por hidrólise dos triacilglicerídeos.

Ácidos graxos poliinsaturados de cadeia muito longa tais como DHA, EPA,ácido araquidônico (ARA, C20:4AWU4), ácido di-homo-y-linolênico(DHGL, C20:3A8'n'14) ou ácido docosapentaenóico (DPA, C22:5A7'10'13'16'19)contudo, não são sintetizados em colheitas oleosas tais como colza, feijões-soja, girassóis e açafroa. Fontes naturais convencionais destes ácidos graxossão peixe tais como arenque, salmão, sardinha, peixe vermelho, enguia, carpa,truta, halibut, cavala, zander ou tuna, ou algas.

Devido às características positivas dos ácidos graxospoliinsaturados, não tem havido falta de tentativas no passado para tornardisponíveis genes que estão envolvidos na síntese destes ácidos graxos outriglicerídeos para a produção de óleos em vários organismos com umconteúdo modificado de ácidos graxos insaturados. Assim, WO 91/13972 eseu equivalente US descrevem A9-dessaturase. WO 93/11245 reivindica umaA15-dessaturase e WO 94/11516 uma A12-dessaturase. Outras dessaturasessão descritas, por exemplo, em EP-A-0.550.162, WO 94/18337, WO97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0.794.250, Stukey et al.(1990) J. Biol. Chem., 265: 20144-20149, Wada et al. (1990) Nature 347:200-203 ou Huang et at (1999) Lipids 34: 649-659. Contudo, a caracterizaçãobioquímica das várias dessaturases tem sido insuficiente até o presente porqueas enzimas, sendo proteínas ligadas à membrana, apresentam uma grandedificuldade em isolamento e caracterização delas (McKeon et al. (1981)Methods in Enzymol. 71: 12141-12147, Wang et at (1988) Plant Physiol.Biochem., 26: 777-792).

Como uma regra, dessaturases ligadas à membrana sãocaracterizadas pelo fato de serem introduzidas em um organismo adequadoque é subseqüentemente analisado para atividade de enzima pela análise dosmateriais iniciais e dos produtos. Δό-Dessaturases são descritas em WO93/06712, US 5.614.393, WO 96/21022, WO 00/21557 e WO 99/27111. Aaplicação desta enzima para a produção de ácidos graxos em organismostransgênicos é descrita em WO 98/46763, WO 98/46764 e WO 98/46765. Aexpressão de várias dessaturases e a formação de ácidos graxospoliinsaturados também são descritas e reivindicadas em WO 99/64616 ouWO 98/46776. Com relação à eficácia de expressão de dessaturases e seuefeito sobre a formação de ácidos graxos poliinsaturados, tem que ser notadoque a expressão de uma única dessaturase como descrito até o presente apenastem resultado em conteúdos baixos de lipídeos / ácidos graxos insaturados taiscomo, por exemplo, ácido γ-linolênico e ácido estearidônico.

Têm havido numerosas tentativas no passado para se obteremgenes de alongase. Millar e Kunst (1997) Plant Journal 12:121-131 e Millar etal. (1999) Plant Cell 11:825-838 descrevem a caracterização de alongases deplanta para a síntese de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (C22:1)e para a síntese de ácidos graxos de cadeia muito longa para a formação deceras em plantas (C28-C32) . A síntese de ácido araquidônico e EPA édescrita, por exemplo, em WO 01/59128, WO 00/12720, WO 02/077213 eWO 02/08401. A síntese de ácidos graxos poliinsaturados C24 é descrita, porexemplo, em Tvrdik et al. (2000) J. Cell Biol. 149:707-718 ou em WO02/44320.

Microorganismos especialmente adequados para a produção dePUFAs são microalgas tais como Phaeodactilum tricornutum, espéciePorphiridium, espécie Thraustochytrium, espécie Schizochytrium ou espécieCrypthecodinium, ciliados tais como Stilonychia ou Colpidium, fungos taiscomo Mortierella, Entomophthora ou Mucor e/ou musgos tais comoPhyscomitrella, Ceratodon e Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998)Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73:269-278). Seleção de cepa tem resultado no desenvolvimento de numerosascepas mutantes dos microorganismos em questão que produzem uma série decompostos desejáveis incluindo PUFAs. Contudo, a mutação e a seleção decepas com uma produção melhorada de uma molécula particular tal como osácidos graxos poliinsaturados é um processo difícil e consumidor de tempo.

Além disso, apenas quantidades limitadas dos ácidos graxos poliinsaturadosdesejados tais como DPA5 EPA ou ARA podem ser produzidas com o auxíliodos microorganismos acima mencionados; em adição, são geralmente obtidoscomo misturas de ácidos graxos. Isto é o motivo de processos recombinantesserem preferido sempre que possível.

Plantas superiores compreendem ácidos graxos poliinsaturadostais como ácido linoleico (C18:2) e ácido linolênico (C18:3) . ARA, EPA eDHA não são formados no óleo de semente de plantas superiores, ou apenasem quantidades minúsculas. (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des HuilesVégétales [Novo Dicionário de Óleos Vegetais]. Technique & Documentation- Lavoisier, 1995. ISBN: 27430-0009-0). Contudo, a produção de LCPUFAsem plantas superiores, preferivelmente em colheitas oleosas tais como colza,linhaça, girassóis e feijões-soja, seria vantajosa porque quantidades grandesde LCPUFAs de qualidade alta para a indústria de alimento, nutrição animal epropósitos farmacêuticos poderiam ser obtida economicamente. Para este fim,é vantajoso introduzir, em sementes oleosas, genes que codificam as enzimasdas biossíntese de LCPUFA via processos recombinante e expressá-los nasmesmas. Estes genes codificam por exemplo A6-dessaturases, A6-alongases,A5-dessaturases ou A4-dessaturases. Estes genes podem ser vantajosamenteisolados de microorganismos e plantas inferiores que produzem LCPUFAs eincorporá-los em membranas ou triacilglicerídeos. Assim, já tem sido possívelisolar genes de A6-dessaturase do musgo Physcomitrella patens e genes deAό-alongase de P. patens e do nematódeo C. elegans.

Plantas transgênicas que compreendem e expressam genescodificadores de enzimas da biossíntese de LCPUFA e que, como umaconseqüência, produzem LCPUFAs têm sido descritas, por exemplo, em DE-A-102 19 203 (processo para a produção de ácidos graxos poliinsaturados emplantas). Contudo, estas plantas produzem LCPUFAs em quantidades querequerem otimização adicional para processamento dos óleos que estãopresentes nas plantas. Assim, o conteúdo de ARA nas plantas descritas emDE-A-102 19 203 é de apenas 0,4 a 2% e o conteúdo de EPA é de apenas 0,5a 1%, em cada caso baseado no conteúdo de lipídeo total da planta.

Para tornar possível a fortificação de alimento e de ração comácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, portanto há uma necessidadegrande de um processo simples, barato para a produção de ácidos graxospoliinsaturados de cadeia longa, especificamente em sistemas de planta.

Um objetivo da invenção é portanto a provisão de um processocom o qual ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, especialmenteácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e/ou ácidodocosahexaenóico podem ser produzidos em quantidades grandes e de modobarato em plantas transgênicas.

Agora tem sido verificado de modo surpreendente que orendimento de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, especialmenteácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e/ou ácidodocosahexaenóico, pode ser aumentado pela expressão de uma seqüência deA5-alongase otimizada em plantas transgênicas.

Os PUFAs produzidos pelos processo da invençãocompreendem um grupo de moléculas que animais superiores não são maiscapazes de sintetizar e assim têm que consumir, ou que os próprios animaissuperiores não são mais capazes de produzir em quantidades suficientes eassim têm que consumir quantidades adicionais dos mesmos, embora possamfacilmente ser sintetizados por outros organismos tais como bactérias.

Conseqüentemente, o objetivo desta invenção é alcançado peloprocesso da invenção para produzir ácido eicosapentaenóico, ácidodocosapentaenóico e/ou ácido docosahexaenóico em uma planta transgênica,compreendendo a provisão na planta de pelo menos uma seqüência de ácidonucleico que codifica um polipeptídeo possuindo uma atividade de Δ6-dessaturase; pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo possuindo uma atividade de Δό-alongase; pelo menos umaseqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo umaatividade de A5-dessaturase; e pelo menos uma seqüência de ácido nucleicoque codifica um polipeptídeo possuindo uma atividade de A5-alongase, ondea seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo umaatividade de A5-alongase está modificada por comparação com a seqüência deácido nucleico no organismo do qual a seqüência é derivada pelo fato de queestá adaptada para uso de códon em uma ou mais espécies de planta. Paraproduzir DHA é adicionalmente necessário proporcionar pelo menos umaseqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo umaatividade de A4-dessaturase na planta.

A "provisão na planta" significa no contexto da presenteinvenção que medidas são tomadas de modo que a seqüências de ácidonucleico codificadora de um polipeptídeo a possuindo uma atividade de Δ6-dessaturase, um polipeptídeo possuindo uma atividade de Δό-alongase, umpolipeptídeo possuindo uma atividade de Δ5-dessaturase e um polipeptídeopossuindo uma atividade de A5-alongase estão presentes juntos em umaplanta. A provisão na planta" assim compreende a introdução de seqüênciasde ácido nucleico na planta tanto por transformação de uma planta com umaou mais moléculas de ácido graxo recombinantes que compreendem as citadasseqüências de ácido nucleico, quanto pelo cruzamento de plantas parentaisadequadas que compreendem uma ou mais seqüências de ácido nucleico.

A seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeopossuindo uma atividade de A5-alongase é modificada de acordo com ainvenção por comparação com a seqüência de ácido nucleico no organismo doqual a seqüência se origina pelo fato de que está adaptada para uso de códonem uma ou mais espécies de planta. Isto significa que a seqüência de ácidonucleico tem sido especificamente otimizada para o propósito da invençãosem a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de ácido nucleicotendo sido já alterada pela mesma.

O código genético é redundante porque utiliza 61 códons como objetivo de especificar 20 aminoácidos. Portanto, os 20 aminoácidosproteinogênicos são em sua maioria codificados por uma pluralidade detriplete (códons) . Os códons sinônimos que especificam um aminoácidoindividual, contudo, não são usados com a mesma freqüência em umorganismo particular; ao contrário há códons preferidos que sãofreqüentemente usados, e códons que são usados mais raramente. Estasdiferenças em uso de códon são atribuídas às pressões evolucionárias seletivase especialmente à eficiência de tradução. Uma razão para a eficiência detradução menor de códons raramente ocorrentes poderia ser que as coleçõesde amino-acil-tRNA correspondentes estão exauridas e assim não maisdisponíveis para a síntese de proteína.

Em adição, organismos diferentes preferem códons diferentes.Por esta razão, a expressão de um DNA recombinante derivado de uma célulade mamífero freqüentemente processa-se apenas subotimamente em célulasde E. coli. Portanto é possível em alguns casos aumentar a expressão porsubstituição dos códons raramente usados por códons freqüentementeutilizados. Sem o desejo de se ligar a uma teoria, é assumido que asseqüências de DNA códon-otimizadas tornam possível a tradução maiseficiente, e os mRNAs formados dos mesmos possivelmente possuem umameia-vida maior na célula e portanto estão mais freqüentemente paratradução. Do que tem sido citado acima, segue que a otimização de códon énecessária apenas se o organismo no qual a seqüência de ácido nucleico épara ser expressada difere dado organismo do qual a seqüência de ácidonucleico é originalmente derivada.

Para muitos organismos dos quais a seqüência de DNA de umnúmero relativamente grande de genes é conhecida há tabelas das quais asfreqüências de uso de códons particulares no respectivo organismo podem serobtidas. É possível com o auxílio destas tabelas traduzir seqüências deproteína com acuraria relativamente alta de volta para uma seqüência de DNAque compreende os códons preferidos no respectivo organismo para os váriosaminoácidos da proteína. Tabelas sobre o uso de códon podem serencontradas inter alia no seguinte endereço da Internet:http ://www.kazusa. or.ip/Kodon/E .html. Em adição, várias companhiasproporcionam programa de computador para otimização de gene, tal como,por exemplo, Entelechon (Software Leto) ou Geneart (SoftwareGeneOptimizer).

Adaptação das seqüências ao uso de códon em um organismoparticular pode ser feita com o auxílio de vários critérios. Por um lado, épossível usar para um aminoácido particular sempre o códon que ocorre maisfreqüentemente no organismo selecionado mas, por outro lado, a freqüêncianatural dos vários códons também pode ser levada em consideração, de modoque todos os códons para um aminoácido particular são incorporados naseqüência otimizada de acordo com sua freqüência natural. Seleção daposição na qual um triplete de bases particular é usado pode ocorreraleatoriamente neste caso. A seqüência de DNA foi adaptada de acordo com ainvenção levando em consideração a freqüência natural de códons individuais,também sendo adequado o uso de códons ocorrendo mais freqüentemente noorganismo selecionado.

É particularmente preferido que uma seqüência de ácidonucleico de Ostreococcus tauri que codifica um polipeptídeo possuindo umaatividade de A5-alongase, tal como, por exemplo, o polipeptídeo descrito emSEQ ID No. 110, seja adaptada pelo menos ao uso de códon em colza, feijão-soja e/ou linho. A seqüência de ácido nucleico originalmente derivada deOstreococcus tauri é preferivelmente a seqüência mostrada em SEQ ID No.109. A seqüência de DNA codificadora de A5-alongase é adaptada em pelomenos 20% das posições, preferivelmente em pelo menos 30% das posições,particularmente preferivelmente em pelo menos 40% das posições e maispreferivelmente em pelo menos 50% das posições ao uso de códon em colza,feijão-soja e/ou linho.

A seqüência de ácido nucleico usada é mais preferivelmente aseqüência indicada em SEQ ID No. 64.

Será reconhecido que a invenção também inclui aquelasseqüências de DNA códon-otimizadas que codificam um polipeptídeopossuindo a atividade de a A5-alongase e cuja seqüência de aminoácidos estámodificada em uma ou mais posições por comparação com a seqüência detipo selvagem mas que ainda possui substancialmente a mesma atividade quea da proteína de tipo selvagem.

A seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeopossuindo uma atividade de A6-dessaturase é preferivelmente selecionada dogrupo consistindo de:

a) seqüências de ácido nucleico possuindo a seqüênciamostrada em SEQ ID No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39 ou 41, preferivelmente possuindo a seqüência descrita emSEQ ID No. 1,

b) seqüências de ácido nucleico que codificam a seqüência deaminoácidos indicada em SEQ ID No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 ou 42, preferivelmente em SEQ ID No 2,

c) seqüências de ácido nucleico que hibridizam com a fitacomplementar das seqüências de ácido nucleico a) ou b) acima indicadas, emparticular da seqüência de ácido nucleico indicada em SEQ ID No 1, sobcondições estringentes,

d) seqüências de ácido nucleico que são pelo menos 60%,65%, 70%, 75% ou 80%, preferivelmente pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90%, particularmente preferivelmente pelomenos 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% e especialmente pelo menos 96%, 97%,98% ou 99%, idênticas às seqüências de ácido nucleico indicadas em a) ou b)acima, especialmente à seqüência indicada em SEQ ID No. 1, e

e) seqüências de ácido nucleico que codificam uma seqüênciade aminoácido e que possuem pelo menos um, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou8, preferivelmente todos os padrões de aminoácidos indicados em SEQ IDNo. 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50.

Padrão de aminoácido significa seqüências de aminoácidoscurtas que preferivelmente compreendem pelo menos 50, particularmentepreferivelmente menos do que 40 e especialmente de 10 a 40 e até maispreferivelmente de 10 a 30 aminoácidos.

Para a presente invenção, a identidade é verificadapreferivelmente sobre o comprimento total das seqüências de nucleotídeos oude aminoácidos da invenção, por exemplo para a seqüência de ácido nucleicoindicada em SEQ ID NO: 64 sobre o comprimento total de 903 nucleotídeos.

A seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeopossuindo uma atividade de A6-alongase é preferivelmente selecionada dogrupo consistindo de:

a) seqüências de ácido nucleico possuindo a seqüência descritaem SEQ ID No. 171, 173, 175, 177, 179, 181 ou 183, especialmentepossuindo a seqüência descrita em SEQ ID No. 171,

b) seqüências de ácido nucleico que codificam a seqüência deaminoácidos indicada em SEQ ID No. 172, 174, 176, 178, 180, 182 ou 184,especialmente a seqüência de aminoácidos indicada em SEQ ID No. 172,

c) seqüências de ácido nucleico que hibridizam com a fitacomplementar das seqüências de ácido nucleico a) ou b) acima indicadas,especialmente da seqüência de ácido nucleico indicada em SEQ ID No. 1, sobcondições estringentes,

d) seqüências de ácido nucleico que são pelo menos 60%,65%, 70%, 75% ou 80%, preferivelmente pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90%, particularmente preferivelmente pelomenos 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% e especialmente pelo menos 96%, 97%,98% ou 99%, idênticas às seqüências de ácido nucleico indicadas em a) ou b)acima, especialmente à seqüência indicada em SEQ ID No. 171, e

e) seqüências de ácido nucleico que codificam uma seqüênciade aminoácido e que possuem pelo menos um, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou8, preferivelmente todos os padrões de aminoácidos indicados em SEQ IDNo. 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 ou 192.

A seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeopossuindo uma atividade de A6-alongase é em particular igualmente umaseqüência códon-otimizada de acordo com a presente invenção,preferivelmente a seqüência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID NO: 122.

A seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeopossuindo uma atividade de A5-dessaturase é preferivelmente selecionada dogrupo consistindo de:

a) seqüências de ácido nucleico possuindo a seqüência descritaem SEQ ID No. 51, 53 ou 55, preferivelmente possuindo a seqüência descritaem SEQ ID No. 51,

b) seqüências de ácido nucleico que codificam a seqüência deaminoácidos indicada em SEQ ID No. 52, 54 ou 56, preferivelmente aseqüência de aminoácidos indicada em SEQ ID No. 52,

c) seqüências de ácido nucleico que hibridizam com a fitacomplementar das seqüências de ácido nucleico indicadas em a) ou b) acima,especialmente da seqüência de ácido nucleico indicada em SEQ ID No. 51,sob condições estringentes,

d) seqüências de ácido nucleico que são pelo menos 60%,65%, 70%, 75% ou 80%, preferivelmente pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90%, particularmente preferivelmente pelomenos 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% e especialmente pelo menos 96%, 97%,98% ou 99%, idênticas às seqüências de ácido nucleico indicadas em a) ou b)acima, especialmente ao ácido nucleico indicado sob SEQ ID No. 51, e

e) seqüências de ácido nucleico que codificam uma seqüênciade aminoácido que possui pelo menos um, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6 ou 7,preferivelmente todos os padrões de aminoácidos indicados em SEQ ID No.57,58, 59, 60,61,62 ou 63.

Seqüências de ácido nucleico adicionalmente adequadaspodem ser encontradas pelo técnico experiente na literatura ou nas bibliotecasde gene bem conhecidas tal como, por exemplo, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Em uma outra modalidade preferida do processo,adicionalmente uma ou mais seqüências de ácido nucleico que codificam umpolipeptídeo possuindo a atividade de uma ω-3-dessaturase e/ou da Δ4-dessaturase são introduzidas na planta.

A seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeopossuindo uma atividade de ω-3-dessaturase é preferivelmente selecionada dogrupo consistindo de:

a) seqüências de ácido nucleico possuindo a seqüência descritaem SEQ ID No. 193 ou 195, preferivelmente a seqüência descrita em SEQ IDNo. 193,

b) seqüências de ácido nucleico que codificam a seqüência deaminoácidos indicada em SEQ ID No. 194,

c) seqüências de ácido nucleico que hibridizam com a fitacomplementar das seqüência de ácido nucleico indicada em SEQ ID No. 193ou 195 sob condições estringentes, ed) seqüências de ácido nucleico que são pelo menos 60%,65%, 70%, 75% ou 80%, preferivelmente pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90%, particularmente preferivelmente pelomenos 91%, 92%, 93%, 94% ou 95%, e especialmente pelo menos 96%, 97%,98% ou 99%, idênticas à seqüência indicada em SEQ ID No. 193 ou 195.

A ω-3-dessaturase vantajosamente usada no processo dainvenção torna possível mudar da rota biossintética ω-6 para a rotabiossintética ω-3, acarretando uma mudança de ácidos graxos Cl8:2 paraC18:3. É adicionalmente vantajoso que a ω-3-dessaturase converta uma amplavariedade de fosfolipídeos tais como as fosfatidilcolina (= PC),fosfatidilinositol(= PIS) ou fosfatidil-etanol-amina (= PE) . Finalmente,produtos de dessaturação também podem ser encontrados nos lipídeosnaturais (= NL), isto é nos triglicerídeos.

A seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeopossuindo uma atividade de A4-dessaturase é preferivelmente selecionada dogrupo consistindo de:

a) seqüências de ácido nucleico possuindo a seqüência descritaem SEQ ID No. 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 ou 93, preferivelmentepossuindo a seqüência descrita em SEQ ID No. 77,

b) seqüências de ácido nucleico que codificam a seqüência deaminoácidos indicada em SEQ ID No. 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 ou 94,preferivelmente a seqüência de aminoácidos indicada em SEQ ID No 78,

c) seqüências de ácido nucleico que hibridizam com a fitacomplementar das seqüências de ácido nucleico indicadas em a) ou b) acima,especialmente da seqüência de ácido nucleico indicada em SEQ ID No. 77,sob condições estringentes,

d) seqüências de ácido nucleico que são pelo menos 60%,65%, 70%, 75% ou 80%, preferivelmente pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90%, particularmente preferivelmente pelomenos 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% e especialmente pelo menos 96%, 97%,98% ou 99%, idênticas à seqüência indicada em SEQ ID No. 77, e

e) seqüências de ácido nucleico que codificam uma seqüênciade aminoácido que possui pelo menos um, por exemplo 2, 3„ 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13 ou 14, preferivelmente todos os padrões de aminoácidosindicados em SEQ ID No. 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,105;106, 107 ou 108.

A A4-dessaturase que é vantajosamente usada no processo dainvenção catalisa a introdução de ligação dupla no ácido graxo ácidodocosapentaenóico, acarretando a formação de docosahexaenóico.

É vantajoso para o processo descrito da invenção a introduçãoadicional de outros ácidos nucleicos que codificam as enzimas demetabolismos de ácido graxo ou lipídeo nas plantas em adição às seqüênciasde ácido nucleico que codificam os polipeptídeos possuindo uma atividade deA6-dessaturase, uma atividade de A6-alongase, uma atividade de Δ5-dessaturase e uma atividade de A5-alongase, e às seqüências de ácidonucleico que são introduzidas se apropriadas e que codificam um polipeptídeopossuindo uma atividade de a>3-dessaturase e/ou uma atividade de Δ4-dessaturase.

É possível em princípio usar todos os genes do metabolismode ácido graxo ou lipídeo em combinação com as seqüências de ácidonucleico usadas no processo da invenção; genes de metabolismo de ácidograxo ou lipídeo selecionados do grupo de acil-CoA desidrogenase(s), acil-ACP (proteína carreadora) dessaturase(s), acil-ACP tioesterase(s), ácidograxo aciltransferase(s),acilCoA:lisofosfolipídeo aciltransferases, ácido graxosintase(s), ácido graxo hidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s),acilcoenzima A oxidase(s), ácido graxo dessaturase(s), ácido graxoacetilenases, lipoxigenases, triacilglicerol lipases, aleno óxido sintases,hidroperóxido liases ou ácido graxo alongase(s) são preferivelmente usadasde acordo com as Δ-6-alongase, Δ-6-dessaturase, Δ-5-dessaturase e a Δ-5-alongase, e se apropriadas a co3-dessaturase e/ou a A4-dessaturase, sendopossível o uso de genes individuais ou de uma pluralidade de genes emcombinação.

Os ácidos nucleicos usados no processo da invenção sãovantajosamente expressados em tecidos vegetativos (tecido somático) .Tecido vegetativo significa no contexto desta invenção um tecido que épropagado através de divisões mitóticas. Tecido deste tipo também ocorreatravés de reprodução assexuada (apomixia) e propagação. Propagação é otermo usado quando o número de indivíduos aumenta em geraçõesconsecutivas. Estes indivíduos que ocorrem através de propagação assexuadasão muito substancialmente idênticos aos seus pais. Exemplos de tais tecidossão folha, flor, raiz, caule, brotos acima ou abaixo do solo (rebentos laterais,estolhos), rizomas, botões, tubérculos tais como tubérculos-raiz outubérculos-caule, bulbo, corpos de geração, botões de geração, búlbulos outurion. Tais tecidos também podem ocorrer através de pseudo-viviparidade,viviparidade verdadeira ou viviparidade causada por humanos. Contudo,sementes que ocorrem através de agamospermia, como são típicas deAsteraceae, Poaceae ou Rosaceae, também estão incluídas entre os tecidosvegetativos nos quais expressão ocorre de modo vantajoso. Os ácidosnucleicos usados no processo da invenção são expressados em uma extensãopequena ou não são expressados em tecido germinativo (tecido de linhagemgerminativa). Exemplos de tais tecidos são tecidos que ocorrem através dereprodução sexual, i.e. divisões meióticas de célula, tais como, por exemplo,sementes que ocorrem através de processos sexuais.

Uma extensão pequena significa que, comparado com o tecidovegetativo, a expressão medida em nível de RNA e/ou de proteína é menor doque 5%, vantajosamente menor do que 3%, particularmente vantajosamentemenor do que 2%, mais preferivelmente menor do que 1; 0,5; 0,25 ou0,125%.

As seqüências de ácido nucleico são particularmentepreferivelmente expressadas nas folhas das plantas transgênicas. Isto tem avantagem de que os LCPUFAs produzidos de acordo com a invenção podemser ingeridos por animais e humanos diretamente pelo consumo das folhas, enão é necessário processamento prévio do material de planta.

Expressão da seqüências de ácido nucleico da invenção nafolha pode ser conseguida pelo uso de promotores constitutivos ou específicosde folha.

"Promotores constitutivos" são promotores que tornampossível a expressão em um número grande de, preferivelmente em todos os,tecidos durante um período substancial de desenvolvimento da planta,preferivelmente através de desenvolvimento da planta. Um promotor de umaplanta ou de um vírus de planta é preferivelmente usado. O promotor dotranscrito 35S de CaMV (vírus do mosaico da couve-flor) (Franck et al.(1980) Cell 21: 285-294), o promotor 19S CaMV (US 5.352.605), o promotorde actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171), o promotorde legumina B (GenBank Acc. No X03677), o promotor de agrobacteriumnopalina sintase, o promotor dual TR, o promotor de agrobacterium octopinasintase, o promotor de ubiquitina (Holtorf et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:637-649), o promotor Smas, o promotor de cinamoil álcool desidrogenase(US 5.683.439), os promotores das subunidades de ATPase vacuolar, opromotor pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588), opromotor MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3(12): 2723-2730), o promotorde histona H3 de milho (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 276-285),o promotor de gene de nitrilase 1 de arabidopsis (GenBank Acc. No. U38846,nucleotídeos 3862-5325) e o promotor da proteína rica em prolina de trigo(WO 91/13991) e outros promotores constitutivos que medeiam expressão degene constitutivo. O promotor de transcrito 35S de CaMV 35S éparticularmente preferido.

Em princípio é possível usar todos os promotores constitutivosnaturalmente ocorrentes com suas seqüências regulatórias como aquelesmencionados acima para o processo novo. Contudo, é igualmente possível ouso de promotores sintéticos com adição ou sozinhos.

"Promotores específicos de folha" são promotores quemostram uma atividade alta na folha e nenhuma atividade ou atividade baixaem outros tecidos. "Atividade baixa" significa no contexto da invenção que aatividade em outros tecidos é menor do que 20%, preferivelmente menor doque 10%, particularmente preferivelmente menor do que 5% e maispreferivelmente menor do que 3, 2 ou 1% da atividade na folha. Exemplos depromotores específicos de folha adequados são os promotores da subunidadepequena de rubisco (Timko et al. (1985) Nature 318: 579-582) e da proteínaligante a/b de clorofila (Simpson et al. (1985) EMBO J. 4: 2723-2729).

O técnico experiente está ciente de outros promotoresespecíficos de folha, ou pode isolar outros promotores adequados comprocessos conhecidos. Assim, o técnico experiente é capaz de identificarelementos de ácido nucleico regulatórios específicos de folha com o auxíliode processos convencionais de biologia molecular, e.g. experimentos dehibridização ou estudos de ligação de DNA-proteína. Isto exige por exemploem uma primeira etapa o isolamento do poli(A) + RNA total do tecido foliardo organismo desejado do qual as seqüências regulatórias são para seremisoladas, e montagem de uma biblioteca de cDNA. Em uma segunda etapa,clones de cDNA que são baseados em moléculas de poli(A) + RNA de umtecido não-foliar são usados para identificar, por meio de hibridização,aqueles clones da primeira biblioteca cujas moléculas de poli(A) + RNAcorrespondentes se acumulam apenas em tecido foliar. Subseqüentemente,estes cDNAs identificados neste modo são usados para isolar promotores quepossuem elementos regulatórios específicos de folha. Outros processosbaseados em PCR para isolamento de promotores específicos de folhaadequados estão adicionalmente disponíveis para o técnico experiente.

Claro que também é possível que as seqüências de ácidonucleico da presente invenção sejam expressadas nas sementes das plantastransgênicas pelo uso de promotores específicos de semente que são ativos noembrião e/ou no endosperma. Promotores específicos de semente podem emprincípio serem isolados de ambas as plantas dicotiledôneas emonocotiledôneas. Promotores preferidos são citados aqui adiante: USP(promotor de proteína desconhecida) e vicilina (Vicia faba) (Bãumlein et al.(1991) Mol. Gen Genet. 225(3) : 459-467), napina (colza) (US 5,608,152),conlinina (Iinho) (WO 02/102970), proteína carreadora de acila (colza) (US5.315.001 e WO 92/18634), oleosina (Arabidopsis thaliana) (WO 98/45461 eWO 93/20216), faseolina (Phaseolus vulgaris) (US 5.504.200), Bce4 (WO91/13980), legume 134 (promotor LegB4) (Báumlein et al. (1992) Plant J.2(2) : 233-239), Lpt2 e Iptl (cevada) (WO 95/15389 e WO 95/23230),promotores específicos de semente de arroz, milho e trigo (WO 99/16890),Amy32b, Amy 6-6 e aleuraina (US 5.677.474), Bce4 (colza) (US 5,530,149),glicinina (feijão-soja) (EP 571.741), fosfoenolpiruvato carboxilase (feijão-soja) (JP 06/62870), ADR 12-2 (feijão-soja) (WO 98/08962), isocitrato liase(colza) (US 5,689,040) ou α-amilase (cevada) (EP 781.849).

Em uma modalidade particularmente preferida da presenteinvenção, as seqüências de ácido nucleico usadas, especialmente a seqüênciade ácido nucleico que codifica uma A5-alongase e que está modificada porcomparação com a seqüência de ácido nucleico no organismo do qual aseqüência se origina ao ser adaptada ao uso de códon em uma ou maisespécies de planta, preferivelmente a seqüência de ácido nucleico descrita emSEQ ID NO 64, são expressadas em tecido generativo, especialmente nasemente. Expressão específica na semente vantajosamente ocorre pelo uso deum dos promotores específicos de semente acima mencionados,especialmente pelo uso de promotor napina. Nesta modalidadeparticularmente preferida, o conteúdo de LCPUFAs produzidos,especialmente de ácidos graxos C22 no óleo de semente é de pelo menos 5%em peso, vantajosamente pelo menos 6, 7, 8, 9 ou 10% em peso,preferivelmente pelo menos 11, 12, 13, 14 ou 15% em peso, particularmentepreferivelmente pelo menos 16, 17, 18, 19 ou 20% em peso, muitoparticularmente preferivelmente pelo menos 25, 30, 35 ou 40% em peso, doconteúdo de óleo de semente. Em uma outra modalidade particularmentepreferida com a seqüência de ácido nucleico descrita em SEQ ID NO: 63, oconteúdo de ácidos graxos C22 no óleo de semente é pelo menos 8% em pesodo conteúdo de óleo de semente.

Em uma outra modalidade particularmente preferida dapresente invenção, as seqüências de ácido nucleico usadas, especialmente aseqüência de ácido nucleico que codifica uma A5-alongase e que estámodificada por comparação com a seqüência de ácido nucleico no organismodo qual a seqüência se origina ao ser adaptada ao uso de códon em uma oumais espécies de planta, preferivelmente a seqüência de ácido nucleicodescrita em SEQ ID NO: 64, são expressadas em tecido generativo,especialmente na semente. Expressão específica na semente vantajosamenteocorre pelo uso de promotores específicos de semente acima mencionados,especialmente usando o promotor napina. Nesta modalidade particularmentepreferida, o conteúdo de ácido docosahexaenóico no óleo de semente é pelomenos 1% em peso, preferivelmente pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 ou 1,5% empeso, particularmente preferivelmente pelo menos 1,6, 1,7, 1,8 ou 1,9% empeso, especialmente pelo menos 2, 2.1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8 ou 2,9%em peso, adicionalmente preferivelmente pelo menos 3, 3,5 ou 4% em pesodo conteúdo de óleo de semente. Em uma outra modalidade particularmentepreferida com a seqüência de ácido nucleico descrita em SEQ ID NO: 63, oconteúdo de ácido docosahexaenóico no óleo de semente é pelo menos 1,9%em peso do conteúdo de óleo de semente. É sabido pelo técnico experiente emconexão com isto que para produzir ácido docosahexaenóico são requeridasadicionalmente uma ou mais seqüências de ácido nucleico que codificam umpolipeptídeo possuindo a atividade de uma atividade de A4-dessaturase. Umaseqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo aatividade de uma atividade de A4-dessaturase é vantajosamente selecionadado grupo consistindo de seqüências de ácido nucleico possuindo a seqüênciadescrita em SEQ ID No. 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 ou 93, preferivelmentepossuindo a seqüência descrita em SEQ ID No. 77.

Em uma outra modalidade particularmente preferida dapresente invenção, as seqüências de ácido nucleico usadas, especialmente aseqüência de ácido nucleico que codifica uma A5-alongase e que estámodificada por comparação com a seqüência de ácido nucleico no organismodo qual a seqüência se origina ao ser adaptada ao uso de códon em uma oumais espécies de planta, preferivelmente a seqüência de ácido nucleicodescrita em SEQ ID NO: 64, são expressadas em tecido generativo,especialmente na semente. Expressão específica na semente vantajosamenteocorre pelo uso de um dos promotores específicos de semente mencionadosacima, especialmente usando o promotor napina. Nesta modalidadeparticularmente preferida, o conteúdo de ácido docosahexaenóico no óleo desemente é pelo menos 1% em peso, preferivelmente pelo menos 1,1, 1,2, 1,3,1,4 ou 1,5% em peso, particularmente preferivelmente pelo menos 1,6, 1,7,1,8 ou 1,9% em peso, especialmente pelo menos 2, 2,1, 2,2, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8ou 2,9% em peso, adicionalmente preferivelmente pelo menos 3, 3,5 ou 4%em peso do conteúdo de óleo de semente. Neste caso, o conteúdo deLCPUFAs produzidos, especialmente de ácidos graxos C22, no óleo desemente é pelo menos 5% em peso, vantajosamente pelo menos 6, 7, 8, 9 ou10% em peso, preferivelmente pelo menos 11, 12, 13,14 ou 15% em peso,particularmente preferivelmente pelo menos 16, 17, 18, 19 ou 20% em peso,muito particularmente preferivelmente pelo menos 25, 30, 35 ou 40% empeso do conteúdo de óleo de semente. Em uma outra modalidadeparticularmente preferida com a seqüência de ácido nucleico descrita em SEQID NO 63, o conteúdo de ácido docosahexaenóico no óleo de semente é pelomenos 1,9% em peso do conteúdo de óleo de semente, com o conteúdo deácidos graxos C22 no óleo de semente sendo pelo menos 8% em peso doconteúdo de óleo de semente. Expressão de gene de planta também pode serrealizada via um promotor quimicamente induzível (veja uma revisão emGatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108) .Promotores quimicamente induzíveis são particularmente adequados quando édesejado que a expressão de gene ocorra em uma maneira tempo-específica.Exemplos de tais promotores são um promotor induzível por ácido salicílico(WO 95/19443), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz et al. (1992)Plant J. 2, 397-404) e um promotor induzível por etanol.

Promotores que respondem às condições de estresse biótico ouabiótico também são adequados, por exemplo o promotor de gene PRPlinduzido por patógeno (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), opromotor hsp8 de tomate induzível por calor (US 5.187.267), o promotor dealfa-amilase de batata induzível por frio (WO 96/12814) ou o promotor pinllinduzível por ferimento (EP-A-O 375 091).

Outros promotores que também são particularmente adequadossão aqueles que ocasionam a expressão específica em plastídeo, porqueplastídeos constituem o compartimento nos quais precursores e algunsprodutos finais da biossíntese de lipídeo são sintetizados. Promotoresadequados, tal como o promotor de RNA viral polimerase, são descritos emWO 95/16783 e WO 97/06250, e o promotor Arabidopsis clpP, descrito emWO 99/46394.

Será reconhecido que os ácidos graxos poliinsaturadosproduzidos de acordo com a invenção podem ser produzidos não apenas emplantas transgênicas intactas mas também em culturas de célula de planta ouem culturas de calo.

Os ácidos graxos poliinsaturados produzidos no processo estãovantajosamente ligados em fosfolipídeos e/ou triacilglicerídeos, mas tambémpodem ocorrer como ácidos graxos livres se não ligados na forma de outrosésteres de ácido graxo nos organismos. Podem nesta conexão estar presentescomo "produtos puros" se não vantajosamente na forma de misturas de váriosácidos graxos ou misturas de diferentes fosfolipídeos tais comofosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidil-etanol-amina e/ou fosfatidilserinae/ou triacilglicerídeos, monoacilglicerídeos e/ou diacilglicerídeos. OsLCPUFAs EPA, DPA e DHA produzidos no processo estão vantajosamentepresentes em fosfatidilcolina e/ou fosfatidil-etanol-amina e/ou nostriacilglicerídeos. Os triacilglicerídeos também podem adicionalmentecompreender outros ácidos graxos tais como ácidos graxos de cadeia curtapossuindo 4 a 6 átomos de C, ácidos graxos de cadeia média possuindo 8 a 12átomos de C ou ácidos graxos de cadeia longa possuindo 14 a 24 átomos deC. Preferivelmente compreendem ácidos graxos de cadeia longa,particularmente preferivelmente ácidos C2o- ou C22-graxos.

O termo "glicerídeo" é entendido com o significado de glicerolesterificado com um, dois ou três radicais carboxila (mono-, di- outriglicerídeo). "Glicerídeo" também é entendido com o significado de umamistura de vários glicerídeos. O glicerídeo é preferivelmente um triglicerídeo.O glicerídeo ou mistura de glicerídeos pode compreender outras adições, porexemplo ácidos graxos livres, antioxidantes, proteínas, carboidratos,vitaminas e/ou outras substâncias.

Um "glicerídeo" para o propósito do processo de acordo com ainvenção é adicionalmente entendido com o significado de derivados que sãoderivados de glicerol. Em adição aos triglicerídeos de ácido graxo acimadescritos, estes também incluem glicerofosfolipídeos e gliceroglicolipídeos.Exemplos preferidos que podem ser mencionados aqui são osglicerofosfolipídeos tais como lecitina(fosfatidilcolina), cardiolipina,fosfatidilglicerol, fosfatidilserina e alquilacilglicerofosfolipídeos.

Fosfolipídeos são para serem entendidos com o significado de,para os propósitos da invenção, de fosfatidilcolina, fosfatidil-etanol-amina,fosfatidilserina, fosfatidilglicerol e/ou fosfatidilinositol.

Os ésteres de ácido graxo com moléculas de ácido Ci8-, C20-e/ou C22- graxo poliinsaturado podem ser isolados na forma de um óleo oulipídeo, por exemplo na forma de compostos tais como esfingolipídeos,fosfoglicerídeos, lipídeos, glicolipídeos tais como glicoesfmgolipídeos,fosfolipídeos tais como fosfatidil-etanol-amina, fosfatidilcolina,fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol ou difosfatidilglicerol,monoacilglicerídeos, diacilglicerídeos, triacilglicerídeos ou outros ésteres deácido graxo tais como os ésteres de acetil-coenzima A que compreendem osácidos graxos poliinsaturados com pelo menos duas, três ou quatro,preferivelmente quatro, cinco ou seis ligações duplas, das plantas úteis quetêm sido usadas para a preparação de ésteres de ácido graxo; vantajosamente,são isolados na forma de seus diacilglicerídeos, triacilglicerídeos e/ou naforma de fosfatidil-éster, especialmente preferivelmente na forma detriacilglicerídeos, fosfatidilcolina e/ou fosfatidil-etanol-amina. Em adição aestes ésteres, os ácidos graxos poliinsaturados também estão presentes nasplantas como ácidos graxos livres ou ligados em outros compostos. Comouma regra, os vários compostos acima mencionados (ésteres de graxo e ácidosgraxos livres) estão presentes nos organismos com uma distribuiçãoaproximada de 80 a 90% em peso de triglicerídeos, 2 a 5% em peso dediglicerídeos, 5 a 10% em peso de monoglicerídeos, 1 a 5% em peso deácidos graxos livres, 2 a 8% em peso de fosfolipídeos, o total dos várioscompostos totalizando 100% em peso.

Os LCPUFAs produzidos no processo da invenção sãoproduzidos com um conteúdo de pelo menos 4% em peso, vantajosamente depelo menos 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% em peso, preferivelmente de pelo menos 11,12, 13, 14 ou 15% em peso, particularmente preferivelmente de pelo menos16, 17, 18, 19, ou 20% em peso, muito particularmente preferivelmente depelo menos 25, 30, 35 ou 40% em peso baseado nos ácidos graxos totais naplanta transgênica. Os ácidos graxos EPA, DPA e/ou DHA produzidos noprocesso da invenção estão em adição presentes com um conteúdo em cadacaso de pelo menos 5% em peso, preferivelmente em cada caso de pelo menos6, 7, 8 ou 9% em peso, particularmente preferivelmente em cada caso de pelomenos 10, 11 ou 12% em peso, mais preferivelmente em cada caso de pelomenos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20% em peso baseado nos ácidos graxostotais na planta transgênica.

Os ácidos graxos são vantajosamente produzidos na formaligada. É possível com o auxílio dos ácidos nucleicos usados no processo dainvenção que estes ácidos graxos insaturados sejam postos na posição snl,sn2 e/ou sn3 dos triacilglicerídeos vantajosamente produzidos.

Vantajosamente, pelo menos 11% dos triacilglicerídeos estão duplamentesubstituídos (significando nas posições snl e sn2 ou sn2 e sn3).

Triacilglicerídeos triplamente substituídos também são detectáveis. Visto queuma pluralidade de etapas de reação ocorre a partir dos compostos iniciaisácido linoleico (Cl8:2) e ácido linolênico (Cl8:3), os produtos finais doprocesso, tais como, por exemplo, ácido araquidônico (ARA) ou ácidoeicosapentaenóico (EPA), não resultam como produtos puros absolutos;traços ou quantidades maiores dos precursores também estão semprepresentes no produto final. Se, por exemplo, ambos ácido linoleico e ácidolinolênico estão presentes na planta inicial, os produtos finais tais como ARAou EPA e/ou DPA e/ou DHA também estão presentes como misturas. Osprecursores devem vantajosamente totalizar não mais do que 20% em peso,preferivelmente não mais do que 15% em peso, particularmentepreferivelmente tão tanto 10% em peso, muito particularmentepreferivelmente não mais do que 5% em peso baseado na quantidade deproduto final respectivo. Vantajosamente, apenas ARA ou EPA e/ou DPAe/ou DHA são produzidos no processo da invenção, ligados ou como ácidoslivres, como produtos finais em uma planta transgênica.

Esteres de ácido graxo ou misturas de ácidos graxosproduzidos pelo processo da invenção vantajosamente compreendem de 6 a15% de ácido palmítico, 1 a 6% de ácido esteárico; 7-85% de ácido oleico;0,5 a 8% de ácido vacânico, 0,1 a 1% de ácido aráquico, 7 a 25% de ácidosgraxos saturados, 8 a 85% de ácidos graxos monoinsaturados e 60 a 85%ácidos graxos poliinsaturados, em cada caso baseado em 100% e no conteúdode ácido graxo total dos organismos. Preferivelmente pelo menos 0:1; 0,2;0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 ou 1% de ácido araquidônico no conteúdo deácido graxo total, estão presentes como ácido graxo poliinsaturado vantajosono éster de ácido graxo ou em misturas de ácidos graxos. Os ésteres de ácidograxo ou as misturas de ácidos graxos produzidos pelo processo da invençãoadicionalmente vantajosamente compreendem ácidos graxos selecionados dogrupo de ácidos graxos ácido erúcico (ácido 13-docosaenóico), ácidoestercúlico (ácido 9,10-metileno-octadec-9-enóico), ácido malválico (ácido8,9-metileno-heptadec-8-enóico), ácido chaulmoógrico (ácido ciclo-penteno-dodecanóico), ácido furano-graxo (ácido 9,12-epóxi-octadeca-9,ll-dienônico), ácido vernônico (9,10-epóxi-octadec-12-enônico), ácido tárico(ácido 6-octadecinônico), ácido 6-nonadecinônico, ácido santálbico (ácidot11-octadecen-9-inóico), ácido 6,9-octadeceninônico, ácido pirúlico (ácidot10-heptadecen- 8-inônico), ácido crepenínico (ácido 9-octadecen-12-inônico), ácido 13,14-diidro-orofeico, ácido octadecen-13-eno-9,l1-diiônico,ácido petroselênico (ácido cis-6-octadecenônico), ácido 9cl2t-octadecadienóico, ácido calendúlico (ácido 8tl0tl2c-octadecatrienóico), ácidocatálpico (ácido 9tlltl3-coctadecatrienóico), ácido eleostérico (ácido9clltl3t-octadecatrienóico), ácido jacárico (ácido 8cl0tl2c-octdecatrienóico), ácido punícico (ácido 9clltl3c-octadecatrienóico, ácidoparinárico (ácido 9clltl3tl5c-octadecatetraenóico), ácido pinolênico (ácidotodo-cis-5,9,12-octadecatrienóico), ácido labalênico (ácido 5,6-octadecadienalênico); ácido ricinoleico (ácido 12-hidróxi-oleico) e/ou ácidocoriólico (ácido 13-hidróxi-9cllt-octadecadienônico) . Em geral, os ácidosgraxos acima mencionados estão vantajosamente presentes apenas em traçosnos ésteres de ácido graxo ou nas misturas de ácidos graxos produzidos peloprocesso da invenção, significando que sua ocorrência, baseada no conteúdode ácido graxo total, é menor do que 30%, preferivelmente menor do que25%, 24%, 23%, 22% ou 21%, particularmente preferivelmente menor do que20%; 15%, 10%, 9%, 8%, 7%; 6% ou 5%, muito particularmentepreferivelmente menor do que 4%, 3%, 2% ou 1%. Em uma formaadicionalmente preferida da invenção a ocorrência destes ácidos graxos acimamencionados, baseado nos ácidos graxos totais, é menor do que 0,9%; 0,8%;0,7%; 0,6% ou 0,5%), particularmente preferivelmente menor do que 0,4%;0,3%; 0,2%; 0,1%. Os ésteres de ácido graxo ou as misturas de ácidos graxosproduzidos pelo processo da invenção vantajosamente compreendem menosdo que 0,1% baseado nos ácidos graxos totais e/ou não compreendem ácidobutírico, nem colesterol e nem ácido nisíniço (ácido tetracosa-hexaenóico,C23:6A3,8,12,15,18,21).

É possível por meio da seqüências de ácido nucleico usadas noprocesso da invenção alcançar um aumento de rendimento de LCPUFAs nasplantas transgênicas de pelo menos 50%, vantajosamente de pelo menos 80%),particularmente vantajosamente de pelo menos 100%, muito particularmentevantajosamente de pelo menos 150%, comparado com as plantas não-transgênicas.

Ácidos graxos poliinsaturados quimicamente puros oucomposições de ácido graxo também podem ser sintetizados pelos processosdescritos acima. Para este fim, os ácidos graxos ou as composições de ácidograxo são isolados das plantas na maneira conhecida, por exemplo viaextração, destilação, cristalização, cromatografia ou uma combinação destesprocessos. Estes ácidos graxos quimicamente puros ou composições de ácidograxo são vantajosos para aplicações no setor de indústria de alimentos, nosetor cosmético e especialmente no setor de indústria farmacológica.

Em princípio, todas as plantas dicotiledôneas oumonocotiledôneas úteis são adequadas para o processo da invenção. Plantasúteis significam plantas que servem para produzir alimentos para humanos eanimais, para produzir outros artigos consumíveis, fibras e fármacos, taiscomo cereais,, e.g. milho, arroz, trigo, cevada, painço, aveia, centeio, trigo-mouro; tais como tubérculos, e.g. batata, mandioca, batata doce, inhameetc.;tais como plantas de açúcar, e.g. cana-de-açúcar ou beterraba; tais comolegumes, e.g. feijões, ervilha, feijão-fava etc.: tais como colheitas oleosas egordurosas, e.g. feijão-soja, colza, girassol, açafroa, linho, camolina etc., paramencionar umas poucas. Plantas vantajosas são selecionadas do grupo defamílias de planta consistindo das famílias de Aceraceae, Actinidiaceae,Anacardiaceae, Apiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Arecaceae, Betulaceae,Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Cannaceae,Caprifoliaceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae,CucurbitaceaerDioscoreacea, Elaeagnaceae, Ericceae, Euphorbiaceae,Fabaceae, Fagaceae, Grossulariaceae, Juglandaceae, Lauraceae, Liliaceae,Linaceae, Malvaceae, Moraceae, Musaceae, Oleaceae, Oxalidaceae,Papaveraceae, Poaceae, Polygonaceae, Punicaceae, Rosaceae, Rubiaceae,Rutaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae e Valerianaceae.

Exemplos que podem ser mencionados são as seguintesplantas: Anacardiaceae tais como os gêneros Pistacia, Mangifera,Anacardium, por exemplo o gênero e espécie Pistacia vera [pistache],Mangifer indica (manga) ou Anacardium occidentale (cajueiro), Asteraceaetais como os gêneros Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara,Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, e.g. o gênero e espécieCalendula officinalis (cravo-de-defiinto comum), Carthamus tinctorius(açafroa), Centaurea cyanus (espinheiro azul), Cichorium intybus (chicória),Cynara scolymus (alcachofra), Helianthus annus (girassol), Lactuca sativa,Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactusscariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativasubsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta (alface), Tagetes lúcida,Tagetes erecta ou Tagetes tenuifolia (Cravo-de-defunto francês), Apiaceae talcomo o gênero Daucus, e.g. o gênero e espécie Daucus carota (cenoura),Betulaceae tal como o gênero Corilus, e.g. os gêneros e espécies Corilusavellana ou Corilus colurna (avelã), Boraginaceae tal como o gênero Borago,e.g. o gênero e espécie Borago officinalis (borragem), Brassicaceae tais comoos gêneros Brassica; Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, e.g. osgêneros e espécies Brassica napus, Brassica rapa ssp. (colza), Sinapis arvensisBrassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia,Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelinasativa, Melanosinapis communis (mostarda), Brassica oleracea (beterraba deração) ou Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae tais como os gêneros Anana,Bromelia (abacaxi), e.g. os gêneros e espécies Anana comosus, Ananasananas ou Bromelia comosa (abacaxi), Caricaceae tal como o gênero Caricasuch as o gênero e espécie Carica papaya (papaia), Cannabaceae tal como ogênero Cannabis tal como o gênero e espécie Cannabis sative (cânhamo),Convolvulaceae tais como os gêneros Ipomoea, Convolvulus, e.g. os gênerose espécies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatus,Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea trilobaou Convolvulus panduratus (batata doce, batata), Chenopodiaceae tal como ogênero Beta tais como os gêneros e species Beta vulgaris, Beta vulgaris var.altíssima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta marítima, Beta vulgaris var.perennis, Beta vulgaris var. conditiva ou Beta vulgaris var. esculenta(beterraba), Cucurbitaceae tal como o gênero Cucubita, e.g. os gêneros eespécies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo ou Cucurbitamoschata (abóbora), Elaeagnaceae tal como o gênero Elaeagnus, e.g. o gêneroe espécie Olea europaea (oliva), Ericaceae tal como o gênero Kalmia, e.g. osgêneros e espécies Kalmia fatifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphilla,Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros ou Kalmialúcida (loureiro de monhanha), Euphorbiaceae tais como os gêneros Manihot,Janipha, Jatropha, Ricinus, e.g. os gêneros e espécies. Manihot utilissima,Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihotmanihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta (mandioca) ou Ricinscommunis (plantas de rícino), Fabaceae tais como os gêneros Pisum, Albizia,Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo,Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, e.g. os gêneros e espécies Pisum sativum,Pisum arvense, Pisum humile (ervilha), Albizia berteriana, Albizia julibrissin,Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana,Albizia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans,Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobiumberterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu,Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa,Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophilla, Albizia lebbek,Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa (acácia), Medicagosativa, Medicago falcata, Medicago varia (alfafa) Glycine max Dolichos soja,Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida ou Soja max(feijão-soja), Geraniaceae tais como os gêneros Pelargonium, Cocos, Oleum,e.g. os gêneros e espécies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides ouOleum cocois (coqueiro), Gramineae tal como o gênero Saccharum, e.g. ogênero e espécie Saccharum officinarum, Juglandaceae tais como os gênerosJuglans, Wallia, e.g. os gêneros e espécies Juglans regia, Juglans ailanthifolia,Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglanscalifornica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglansmajor, Juglans icrocarpa, Juglans nigra ou Wallia nigra (nogueira), Lauraceaetais como os gêneros Persea, Laurus, e.g. os gêneros e espécies Laurus nobilis(loureiro), Persea americana, Persea gratíssima ou Persea persea (abacate),Leguminosae tal como o gênero Arachis. e.g. o gênero e espécie Arachishypogaea (amendoim), Linaceae tais como os gêneros Linum, Adenolinum,e.g. os gêneros e espécies Linum usitatissimum, Linum humile, Linumaustriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linumflavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii,Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linumpratense ou Linum trigynum (linho), Lythrarieae tal como o gênero Punica,e.g. o gênero e espécie Punica granatum (romã), Malvaceae tal como o gêneroGossypium, e.g. os gêneros e espécies Gossypium hirsutum, Gossypiumarboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum ou Gossypiumthurberi (algodão), Musaceae tal como o gênero Musa, e.g. os gêneros eespécies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisíaca, Musa spp. (banana),Onagraceae tais como os gêneros Camissonia, Oenothera, e.g. os gêneros eespécies Oenothera biennis ou Camissonia brevipes (prímula da noite),Palmae tal como o gênero Elaeis, e.g. o gênero e espécie Elaeis guineensis(palmeira oleosa), Papaveraceae tal como o gênero Papaver, e.g. os gêneros eespécies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium (papoula),Pedaliaceae tal como o gênero Sesamum e.g o gênero e espécie Sesamumindicum (gergelim), Piperaceae tais como os gêneros Piper, Artanthe,Peperomia, Steffensia, e.g. os gêneros e espécies Piper aduncum, Piperamalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betei, Piper cubeba, Piperlongum,, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artantheelongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata (pimentamalagueta), Poaceae tais como os gêneros Hordeum, Secale, Avena,Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (milho), triticum, e.g.os gêneros e espécies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeummurinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras,Hordeum hexastichon, Hordeumhexastichum, Hordeum irregulare, Hordeumsativum, Hordeum secalinum (cevada), Secale cereale (centeio), Avena sativa,Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida(aveia), Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum,Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcussorghum, Sorghum aetiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum,Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra,Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghumsaccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghumvulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum(painço), Oryza sativa, Oryza latifolia (arroz), Zea mays (milho), Triticumaestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticummacha, Triticum sativum ou Triticum vulgare (trigo), Porphyridiaceae taiscomo os gêneros Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium,Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, e.g. o gênero e espécie Porphyridiumcruentum, Proteaceae tal como o gênero Macadamia, e.g. o gênero e espécieMacadamia intergrifolia (macadâmia), Rubiaceae tal como o gênero Coffea,e.g. os gêneros e espécies Coffea spp., Coffea arabica, Coffea canephora ouCoffea liberica (café), Scrophulariaceae tal como o gênero Verbascum, e.g. osgêneros e espécies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascumdensiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascumlychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascumphlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum ouVerbascum thapsus (verbasco), Solanaceae tais como os gêneros Capsicum,Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, e.g. os gêneros e espécies Capsicumannuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens(pimenta), Capsicum annuum (páprica), Nicotiana tabacum, Nicotiana alata,Nicotiana attenuata, Nieotiana glauca, Nieotiana langsdorffii, Nieotianaobtusifolia, Nieotiana quadrivalvis, Nieotiana repanda, Nieotiana rústica,Nieotiana silvestris (tabaco), Solanum tuberosum (batata), Solanummelongena (beringela), Lycopersicon esculentum, Lycopersiconlycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium ou Solanumlycopersicum (tomate), Sterculiaceae tal como o gênero Theobroma, e.g. ogênero e espécie Theobroma cacao (cacau), ou Theaceae tal como o gêneroCamellia, e.g. o gênero e espécie Camellia sinensis (chá) .

Em uma modalidade vantajosa do processo, as plantas úteissão plantas de fruta oleosa que compreendem quantidades grandes decompostos lipídicos, tais como amendoim, colza, canola, girassol, açafroa(Carthamus tinctoria), papoula, mostarda, cânhamo, planta de óleo de rícino,oliva, gergelim, Calendula, Punica, prímula da noite, verbascuni, cardo, rosasselvagens, avelã, amêndoa, macadâmia, abacate, loureiro, abóbora/aboboreira,linho, feijão-soja, pistache, borragem, árvores (palmeira oleosa, coqueiro ounogueira) ou colheitas aráveis tais como milho, trigo, centeio, aveia, triticale,arroz, cevada, algodão, mandioca, pimenta, Tagetes, plantas Solanaeeae taiscomo batata, tabaco, beringela e tomate, espécie Vicia, ervilha, alfafa ouplantas de arbusto (café, cacau, chá), espécie Salix, e gramíneas perenes ecolheita de forragem. Plantas vantajosas de acordo com a invenção sãoplantas de fruta oleosa tais como amendoim, colza, canola, girassol, açafroa,papoula, mostarda, cânhamo, planta de óleo de rícino, oliva, Calendula,Punica, prímula da noite, abóbora/aboboreira, linho, feijão-soja, borragem,árvores (palmeira oleosa, coqueiro) . Plantas especialmente preferidas sãoplantas que são altas em ácidos C18:2- e/ou C18:3-graxos, tais como girassol,açafroa, tabaco, verbascum, gergelim, algodão, abóbora/aboboreira, papoula,prímula da noite, nogueira, linho, cânhamo ou cardo. Plantas muitoespecialmente preferidas são as plantas tais como açafroa, girassol, papoula,prímula da noite, nogueira, linho, ou cânhamo.

Também é vantajosa a expressão das seqüências de ácidonucleico da invenção nas folhas de plantas de ração ou de alimento e assim oaumento do conteúdo de ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóicoe/ou ácido docosahexaenóico nas folhas. Plantas de ração preferidas são, porexemplo, espécies trifoliares, tais como trevo vermelho (Trifolium pratense),trevo branco (Trifolium repens), trevo híbrido (Trifolium hybridum), sanfeno(Onobrychis viccifolia), trevo egípcio (Trifolium alexandrinium) e trevopérsico (Trifolium resupinatum) . Plantas de alimento preferidas são porexemplo espécie de alface tais como Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca.esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata,Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locustacommunis e Valeriana locusta.

É possível através de atividade enzimática das seqüências deácido nucleico que são usadas no processo da invenção e que codificampolipeptídeos possuindo atividade de Δ -6-alongase, Δ-6-dessaturase, Δ-5-dessaturase e/ou Δ-5-alongase, vantajosamente em combinação comseqüências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos possuindo atividadede ω-3-dessaturase e/ou A4-dessaturase, e outras seqüências de ácido nucleicoque codificam polipeptídeos de metabolismo de ácido graxo ou lipídeo, taiscomo outros polipeptídeos possuindo atividade de Δ-5-, Δ-6-, Δ-8-, Δ-12-dessaturase ou (Δ-5-, ou Δ-9-alongase, produzir uma ampla variedade deácidos graxos poliinsaturados no processo da invenção. Dependendo dasplantas úteis escolhidas para uso no processo da invenção, misturas de váriosácidos graxos poliinsaturados ou ácidos graxos poliinsaturados individuaistais como EPA, DPA ou DHA podem ser produzidos na forma livre ou ligada.

Dependendo da composição de ácido graxo prevalecente na planta inicial(ácidos graxos C 18:2 ou Cl8:3), os ácidos graxos resultantes são derivados deácidos graxos C 18:2, tais como GLA, DGLA ou ARA ou são derivados deácidos graxos C 18:3, tais como EPA, DPA ou DHA. Se o único ácido graxoinsaturado presente na planta usada para o processo é ácido linoleico (LA,C18:2a9'12), os únicos produtos possíveis do processo são GLA, DGLA eARA, que podem estar presentes como ácidos graxos livres ou ligados. Se oúnico ácido graxo insaturado presente na planta usada no processo é ácido γ-linolênico (ALA, C18:3A9'12'15), por exemplo como em linho, os únicosprodutos possíveis do processo são SDA, ETA, EPA, DPA e/ou DHA, quepodem estar presentes como descrito acima como ácidos graxos livres ouligados. É possível produzir em uma maneira selecionada apenas produtosindividuais na planta pela modificação da atividade das enzimas usadas noprocesso e envolvidas na síntese de Δ-6-alongase, Δ-6-dessaturase, Δ-5-dessaturase e/ou Δ-6-alongase, vantajosamente em combinação com outrosgenes do metabolismo de lipídeo ou ácido graxo. Vantajosamente, apenasEPA, DPA ou DHA ou misturas dos mesmos são sintetizados. Visto que osácidos graxos são sintetizados em cadeias de biossíntese, os produtos finaisrespectivos não estão presentes como substâncias puras nos organismos.Quantidades pequenas dos compostos precursores estão sempre presentes noproduto final. Estas quantidades pequenas são menores do que 20% em peso,vantajosamente menores do que 15% em peso, particularmentevantajosamente menores do que 10% em peso, muito particularmentevantajosamente menores do que 5, 4, 3, 2 ou 1% em peso baseado nosprodutos finais EPA, DPA ou DHA ou misturas dos mesmos.

Para aumentar o rendimento no processo de acordo com ainvenção para a produção de óleos e/ou triglicerídeos com um conteúdo deácido graxo poliinsaturado que está vantajosamente aumentado, é vantajoso oaumento de quantidade de produto inicial para a síntese de ácidos graxos. Istopode ser obtido por exemplo pela introdução de um ácido nucleico quecodifica um polipeptídeo com A12-dessaturase no organismo. Isto éparticularmente vantajoso em plantas úteis, tais como plantas produtoras deóleo tais como plantas da família Brassicaceae, tal como do gênero Brassica,por exemplo colza; a família Elaeagnaceae, tal como o gênero Elaeagnus, porexemplo o gênero e espécie Olea europaea ou a família Fabaceae, tal como ogênero Glycine, por exemplo o gênero e espécie Glycine max, que são altasem ácido oleico. Visto que estes organismos possuem um conteúdo de ácidolinoleico apenas baixo (Mikoklajczak et al. (1961) Journal of the AmericanOil Chemical Society 38: 678 - 681) é vantajoso usar as citadas Δ12-dessaturases para produzir o material inicial material ácido linolênico a partirde ácido oleico. Também é possível em adição que os ácidos graxos iniciaissejam proporcionados de fora, mas isto é menos preferido por razões de custo.

Musgos e algas são os únicos sistemas de planta conhecidosque produzem quantidades consideráveis de ácidos graxos poliinsaturados taiscomo ácido araquidônico (ARA) e/ou ácido eicosapentaenóico (EPA) e/ouácido docosahexaenóico (DHA). Musgos compreendem PUPAs em lipídeosde membrana, enquanto que algas, organismos relacionados com algas, ealguns fungos também acumulam quantidades substanciais de PUFAs nafração de triacilglicerol. Moléculas de ácido nucleico isoladas de cepas queacumulam PUFAs também na fração de triacilglicerol são portantoparticularmente vantajosas para o processo da invenção e assim paramodificar o sistema de produção de lipídeo e PUFA em uma planta tal comouma planta útil tal como planta de colheita oleosa, por exemplo colza, canola,linho, cânhamo, feijão-soja, girassol, borragem. Portanto podem servantajosamente usadas no processo da invenção.

Ácidos nucleicos usados no processo da invenção sãovantajosamente derivados de plantas tais como algas, por exemplo algas dafamília de Prasinophyceae tais como dos gêneros Heteromastix, Mammella,Mantoniella, Micromonas, Nephroselmis, Ostreococcus, Prasinocladus,Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pycnoocus, Pyramimonas, Scherffelia ouTetraselmis tais como os gêneros e espécies Heteromastix longifillis,Mamiella gilva, Mantoiella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmisolivacea, Nephroselmis pyriformis, Neproselmis rotunda, Ostreococcus tauri,Ostreococcus sp. Prasinocladus ascus, Prasinocladus lubricus, Pycnacoccusprovasolii, Pyramimonas amilifera, Pyramimonas disomata, Pyramimonasobovata, Pyramimonas orientalis, Pyramimonas parkae, Pyramimonasspinefera, Pyramimonas sp., Tetraselmis apiculta, Tetraselmis carteriaformis,Tetraselmis chuff, Tetraselmis convolutae, Tetraselmis desikacharyi,Tetraselmis gracilis, Tetraselmis harem, Tetraselmis impellucida, Tetraselmisinconspicua, Tetraselmis levis, Tetraselmis maculata, Tetraselmis marina;Tetraselmis striata, Tetraselmis subcordiformis, Tetraselmis suecica,Tetraselmis tetrabrachia, Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa,Tetraselmis verrucosa fo. rubens ou Tetraselmis sp. ou algae from the familyEuglenaeease such as from the genera Ascoglena, Astasia, Colacium,Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalophacus, Khawkinea, Lepociriclis,Phacus, Strombomonas ou Traehelomonas tais como os gêneros e espéciesEuglena acus, Euglena geniculata, Euglena gracilis, Euglena mixocilindracea,Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trachelomonascilíndrica ou Trachelomonas volvocina.

Outras plantas vantajosas são algas tais como Isochrysis ouCrypthecodinium, algas/diatomáceas tais como Thalassiosira ouPhaeodactilum, musgos tais como Physcomitrella ou Ceratodon ou plantassuperiores tais como as Primulaceae tais como Aleuritia, Calendula stella,Osteospermum spinescens ou Osteospermum hyoseroides, microorganismostais como fungos tais como Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora,Entomophthora, Mucor ou Mortierella, bactérias tais como shewanella,leveduras ou animais tais como nematódeos, tais como Caenorhabditis,insetos, rãs, holotúrias ou peixes. As seqüências de ácido nucleico isoladas deacordo com a invenção são vantajosamente derivadas de um animal da ordemdos vertebrados. As seqüências de ácido nucleico são preferivelmentederivadas da classe de Vertebrata, Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii;Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae ouOncorhynchus ou Vertebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus ouEvertebrata tais como Protochordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae suchas Amaroucium constellatum, Botrillus schlosseri, Ciona intestinalis, Molgulacitrina, Molgula manhattensis, Perophora viridis ou Styela partita. Os ácidosnucleicos são particularmente vantajosamente derivados de fungos, animaisou de plantas tais como algas ou musgos, preferivelmente da ordem deSalmoniformes tais como da família de Salmonidae tal como do gêneroSalmo, por exemplo dos gêneros e espécies Oncorhynchus mykiss, Truttatrutta ou Salmo trutta fario, de algas tais como os gêneros Mantoniella ouOstreococcus ou de diatomáceas tais como os gêneros Thalassiosira ouPhaeodactilum ou de algas tais como Crypthecodinium.

Em uma modalidade preferida, o processo adicionalmentecompreende a etapa de obter uma célula ou uma planta inteira quecompreende as seqüências de ácido nucleico que são usadas no processo e quecodificam uma Δ-6-dessaturase, Δ-6-alongase, Δ-5-dessaturase e/ou Δ-57alongase e, se apropriadas, seqüências de ácido nucleico que codificamuma ω-3-dessaturase e/ou uma Δ-4-dessaturase, sendo possível que a célulae/ou a planta útil também compreenda outras seqüências de ácido nucleico demetabolismo de lipídeo ou ácido graxo. As seqüências de ácido nucleicopreferivelmente usadas no processo são para a expressão vantajosamenteincorporadas em pelo menos um construto de gene e/ou um vetor comodescrito adiante, sozinha ou em combinação com outras seqüências de ácidonucleico que codificam proteínas de metabolismo de ácido graxo ou lipídeo, efinalmente transformadas na célula ou planta. Em uma outra modalidadepreferida, este processo adicionalmente compreende a etapa de obter os óleos,lipídeos ou ácidos graxos livres das plantas úteis. A célula produzida nestamaneira ou a planta útil produzida nesta maneira é vantajosamente uma célulade uma planta produtora de óleo, planta vegetal, planta alface, ou plantaornamental ou a própria planta como enunciado acima.

Crescimento significa o cultivo no caso de órgãos, tecido oucélulas de planta sobre ou em um meio nutriente ou da planta inteira sobre ouem um substrato, por exemplo em hidrocultura, solo de pote de flor ou sobreum campo arável.

Para os propósitos da invenção, "transgênico" ou"recombinante" significa com relação a, por exemplo, uma seqüência de ácidonucleico, um cassete de expressão (= construto de gene) ou um vetorcompreendendo as seqüências de ácido nucleico usadas no processo de acordocom a invenção ou uma planta transformada com as seqüências de ácidonucleico, vetor ou cassete de expressão usado no processo de acordo com ainvenção, todas aquelas construções produzidas por processos recombinantesnos quais qualquer uma de

a) a seqüência de ácido nucleico, ou

b) uma seqüência de controle genético que estáoperacionalmente ligada com a seqüência de ácido nucleico, por exemplo umpromotor, ou

c) (a) e (b) não estão localizadas em seu ambiente genéticonatural ou têm sido modificadas por processos recombinantes, sendo possívelque a modificação seja, por exemplo, uma substituição, adição, deleção,inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. Ambientegenético natural significa o locus cromossômico ou genômico natural noorganismo original ou a presença em uma biblioteca genômica. No caso dabiblioteca genômica, o ambiente genético natural da seqüência de ácidonucleico é preferivelmente retido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueiaa seqüência de ácido nucleico pelo menos sobre um lado e possui umcomprimento de seqüência de pelo menos 50 pb, preferivelmente pelo menos500 pb, especialmente preferivelmente pelo menos 1000 pb, muitoespecialmente preferivelmente pelo menos 5000 pb. Um cassete de expressãonaturalmente ocorrente - por exemplo a combinação naturalmente ocorrentedo promotor da seqüência de ácido nucleico usada no processo de acordo coma invenção com a seqüência de ácido nucleico que codifica proteínas comcorrespondente atividade de Δ6-dessaturase, Δ6-alongase, A5-dessaturase eA5-alongase, vantajosamente em combinação com seqüências de ácidonucleico que codificam proteínas possuindo atividade de co3-dessaturase e/ouA4-dessaturase - torna-se um cassete de expressão transgênico quando estecassete de expressão é modificado por processos não-naturais, sintéticos("artificiais") tais como, por exemplo, tratamento transgênico. Processosadequados são descritos, por exemplo, em US 5.565.350 ou WO 00/15815.

Uma " planta transgênica" para os propósitos da invenção éentendida como mencionado acima com significado de que os ácidosnucleicos usados no processo não estão em seu locus natural no genoma daplanta. Neste caso, é possível que as seqüências de ácido nucleico sejamexpressadas homóloga ou heterologamente. Contudo, transgênico tambémsignifica que, embora os ácidos nucleicos de acordo com a invenção estejamem sua posição natural no genoma da planta, a seqüência tem sido modificadacom relação à seqüência natural, e/ou que as seqüências regulatórias dasseqüências naturais têm sido modificadas. Transgênico é preferivelmenteentendido com o significado de que ocorre a expressão dos ácidos nucleicosusados no processo de acordo com a invenção em um locus não natural nogenoma, i.e. expressão homóloga ou, preferivelmente, heteróloga dasseqüências de ácido nucleico.

Organismos transgênicos preferidos são plantas úteis tais comoplantas produtoras de óleo, plantas hortaliça, plantas alface ou plantasornamentais que são vantajosamente selecionadas do grupo de famílias deplanta consistindo das famílias de Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae,Apiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Arecaceae, Betulaceae, Boraginaceae,Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Cannaceae, Caprifoliaceae,Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae,Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Fagaceae,Grossulariaceae, Juglandaceae, Lauraceae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae,Moraceae, Musaceae, Oleaceae, Oxalidaceae, Papaveraceae, Poaceae,Polygonaceae, Punicaceae, kosaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Scrophulariaceae,Solanaceae, Sterculiaceae e Valerianaceae.

Plantas hospedeiras que são adequadas para os ácidosnucleicos, o cassete de expressão ou o vetor usado no processo de acordo coma invenção são, em princípio vantajosamente todas plantas úteis que sãocapazes de sintetizar ácidos graxos, especificamente ácidos graxosinsaturados, e que são adequadas para a expressão de genes recombinantes.

Exemplos que devem ser mencionados neste ponto sã plantas tais comoArabidopsis, Asteraceae tal como Calendula ou plantas úteis tais como feijão-soja, amendoim, planta de óleo de rícino, girassol, milho, algodão, linho,colza, coqueiro, palmeira oleosa, açafroa (Carthamus tinctorius) ou cacaueiro.Outras plantas vantajosas são mencionadas em outros pontos neste pedido.

Microorganismos são geralmente usados como hospedeirosintermediários para a produção de plantas transgênicas úteis. Célulashospedeiras intermediárias utilizáveis são detalhadas em: Goeddel, GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA (1990).

Cepas de expressão que podem ser vantajosamente ser usadaspara este propósito são, por exemplo, aquelas com uma atividade de proteasemenor. São descritas, por exemplo, em Gottesman, S., Gene ExpressionTechnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,Califórnia (1990) 119-128.

Plantas transgênicas que compreendem os ácidos graxospoliinsaturados de cadeia longa sintetizados no processo de acordo com ainvenção podem ser vantajosamente comercializadas diretamente semqualquer necessidade de os óleos, lipídeos ou ácidos graxos sintetizadosserem isolados. Esta formar de comercialização é particularmente vantajosa.

"Plantas" para os propósitos da presente invenção são plantasintactas e todas as parte de planta, órgãos de planta ou partes de planta taiscomo folha, caule, sementes, raiz, tubérculos, anteras, fibras, pêlos de raiz,pedúnculos, embriões, colos, cotilédones, pecíolos, material colhido, tecido deplanta, tecido reprodutivo e culturas de célula que são derivadas da plantatransgênica real e/ou podem ser usadas para produzir a planta transgênica.Neste contexto, a semente compreende todas as partes de planta tais como ascapaz de semente, células epidermais, células de semente, endosperma outecido embriônico.

Os compostos produzidos no processo da invenção, contudo,também podem serem isolados das plantas na forma de seus óleos, gordura,lipídeos e/ou ácidos graxos livres. Ácidos graxos poliinsaturados produzidospelo processo da invenção podem ser obtidos pela colheita das plantas oucélulas de planta quer da cultura na qual crescem quer do campo. Isto ocorrepor prensagem ou extração das partes de planta, preferivelmente das sementesde planta. É possível nesta conexão que os óleos, gorduras, lipídeos e/ouácidos graxos livres sejam obtidos por prensagem pelo denominada extraçãofria ou prensagem fria sem entrada de calor. Para tornar mais fácil a quebradas partes da planta, especificamente das sementes, elas são previamentetrituradas, vaporizadas ou torradas. As sementes pré-tratadas nesta maneirapodem ser então prensadas ou extraídas com solvente tal como hexano. Osolvente é depois removido de novo. É possível neste modo isolar mais doque 96% dos compostos produzidos no processo da invenção. Os produtosobtidos neste modo são então adicionalmente processados, isto é, refinados.

Isto exige inicialmente por exemplo que a mucilagem de planta e a matériasuspensa sejam removidas. A denominada despectinização pode ocorrerenzimaticamente ou, por exemplo, química/fisicamente pela adição de ácidotal como ácido fosfórico. Os ácidos graxos livres são então removidos portratamento com uma base, por exemplo solução de hidróxido de sódio. Oproduto resultante é intensamente lavado com água para remover o álcalirestante no produto, e é seco. Com o objetivo de remover as matériascoloridas ainda presentes no produto, os produtos são submetidos a umalvejamento com, por exemplo terra alvejante ou carbono ativado.Finalmente, o produto também é desodorizado por exemplo com vapor.

Os PUFAs ou LCPUFAs produzidos por este processo sãopreferivelmente moléculas de ácido C20 e/ou C22 graxo possuindo pelo menosquatro ligações duplas na molécula de ácido graxo, preferivelmente cinco ouseis ligações duplas. Estas moléculas de ácido C20 e/ou C22 graxo podem serisoladas da planta na forma de um lipídeo ou um ácido graxo livre. Plantastransgênicas adequadas são por exemplo aquelas mencionadas acima.

Estes óleos, lipídeos ou ácidos graxos da invençãocompreendem, como descrito acima, vantajosamente 6 a 15% de ácidopalmítico, 1 a 6% de ácido esteárico; 7 - 85% de ácido oleico; 0,5 a 8% deácido vacânico, 0,1 a 1% de ácido aráquico, 7 a 25% de ácidos graxossaturados, 8 a 85% de ácidos graxos monoinsaturados e 60 a 85% ácidosgraxos poliinsaturados, em cada caso baseado em 100% e no conteúdo deácido graxo total das plantas.

Ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa vantajosospresentes nos ésteres de ácido graxo ou misturas de ácidos graxos tais comoésteres de ácido fosfatidil-graxo ou ésteres de triacilglicerídeo sãopreferivelmente pelo menos 10; 11; 12; 13; 14;15; 16; 17; 18; 19 ou 20% empeso baseado no conteúdo de ácido graxo total de ácido eicosapentaenóico,baseado no conteúdo de ácido graxo total, e/ou pelo menos 1; 2; 3; 4; 5 ou 6%em peso de ácido docosapentaenóico, baseado no conteúdo de ácido graxototal, e/ou pelo menos 1; 2; 3; preferivelmente pelo menos 4; 5; 6;particularmente preferivelmente pelo menos 7 ou 8 e mais preferivelmentepelo menos 9 ou 10% em peso de ácido docosahexaenóico, baseado noconteúdo de ácido graxo total.

Os ésteres de ácido graxo ou as misturas de ácidos graxos quetêm sido produzidos pelo processo da invenção adicionalmente compreendemácidos graxos selecionados do grupo de ácidos graxos ácido erúcico (ácido13-docosaenóico), ácido estercúlico (ácido 9,10-metileno-octadec-9-enóico),ácido malválico (ácido 8,9-metileno-heptadec-8-enóico), ácidochaulmoógrico (ácido ciclo-penteno-dodecanóico), ácido furano-graxo (ácido9,12-epóxi-octadeca-9,11 -dienônico), ácido vernônico (ácido 9,10-epóxi-octadec-12-enônico), ácido tárico (ácido 6-octadecinõnico), ácido 6-nonadecinônico, ácido santálbico (ácido tl l-octadecen-9-inóico), ácido 6,9-octadeceninônico, ácido pirúlico (ácido tlO-heptadecen- 8-inônico), ácidocrepenínico (ácido 9-octadecen-12-inônico), ácido 13,14-diidro-orofeico,ácido octadecen-13 -eno-9,11 -diiônico, ácido petroselênico (ácido cis-6-octadecenônico), ácido 9cl2t-octadecadienóico, ácido calendúlico (ácido8t10t 12c-octadecatrienóico), ácido catálpico (ácido 9tlltl3-coctadecatrienóico), ácido eleostérico (ácido 9cl ltl3t-octadecatrienóico),ácido jacárico (ácido 8cl0tl2c-octdecatrienóico), ácido punícico (ácido9c 1 ltl3c-octadecatrienóico, ácido parinárico (ácido 9clltl3tl5c-octadecatetraenóico), ácido pinolênico (ácido todo-cis-5,9,12-octadecatrienóico), ácido labalênico (ácido 5,6-octadecadienalênico) ; ácidoricinoleico (ácido 12-hidróxi-oleico) e/ou ácido coriólico (ácido 13-hidróxi-9c 1 lt-octadecadienônico) . Em geral, os ácidos graxos acima mencionadosestão vantajosamente presentes apenas em traços nos ésteres de ácido graxoou nas misturas de ácidos graxos produzidos pelo processo da invenção,significando que sua ocorrência, baseada no conteúdo de ácido graxo total, émenor do que 30%, preferivelmente menor do que 25%, 24%, 23%, 22% ou21%, particularmente preferivelmente menor do que 20%; 15%, 10%, 9%,8%, 7%; 6% ou 5%, muito particularmente preferivelmente menor do que 4%,3%, 2% ou 1%. Em uma forma adicionalmente preferida da invenção aocorrência destes ácidos graxos acima mencionados, baseado nos ácidosgraxos totais, é menor do que 0,9%; 0,8%; 0,7%; 0,6% ou 0,5%,particularmente preferivelmente menor do que 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1%. Osésteres de ácido graxo ou as misturas de ácidos graxos produzidos peloprocesso da invenção vantajosamente compreendem menos do que 0,1%baseado nos ácidos graxos totais e/ou não compreendem ácido butírico, nemcolesterol e nem ácido nisínico (ácido tetracosa-hexaenóico,C23:6A3,8,12,15,18,21).

Uma outra modalidade de acordo com a invenção o uso dosóleos, lipídeos, ácidos graxos e/ou da composição de ácido graxo, que sãoproduzidos pelo processo da invenção, em gêneros de ração, em gênerosalimentícios, cosméticos ou fármacos. Os óleos, lipídeos, ácidos graxos oumisturas de ácido graxo obtidos no processo de acordo com a invenção podemser usados para misturar com outros óleos, lipídeos, ácidos graxos ou misturasde ácidos graxos de origem animal, tais como, por exemplo, óleos de peixe,na maneira com que o técnico experiente está familiarizado. Estes óleos,lipídeos, ácidos graxos ou misturas de ácidos graxos que são produzidos nestemodo e consistem de componentes vegetais e animais também podem serusados para a preparação de gêneros de ração, gêneros alimentícios, cosmeticsou fármacos.

O termo "óleo", "lipídeo" ou "gordura" é entendido com osignificado de uma mistura de ácidos graxos compreendendo ácido(s)graxo(s) insaturado(s) e/ou saturado(s), preferivelmente esterificado(s) . Épreferido que o óleo, a gordura ou o lipídeo seja alto em ácido(s) graxo(s)poliinsaturado(s) livre ou esterificado(s), em particular ácido linoleico, ácidoγ- linolênico, ácido di-homo-y-linolênico, ácido araquidônico, ácido a-linolênico, ácido estearidônico, ácido eicosatetraenóico, ácidoeicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico ou ácido docosahexaenóico.Preferivelmente, a quantidade de ácidos graxos insaturados esterificados é deaproximadamente 30%, com uma quantidade de 50% sendo especialmentepreferida e uma quantidade de 60%, 70%, 80% ou maior sendo maispreferida. A quantidade de ácido graxo pode ser determinada porcromatografia gasosa após conversão dos ácidos graxos em metil-ésteres portransesterificação. O óleo, o lipídeo ou a gordura pode compreender váriosoutros ácidos graxos saturados ou insaturados, por exemplo ácido calendúlico,ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico esemelhante. Em particular, a quantidade dos vários ácidos graxos pode variar,dependendo da planta inicial.

Como descrito acima, os ésteres de ácido graxo poliinsaturadovantajosamente possuindo três, quatro, cinco ou seis, particularmentevantajosamente possuindo cinco ou seis ligações duplas e que têm sidopreparados no processo vantajosamente tomam a forma de ésteres de ácidograxo, por exemplo, ésteres de esfmgolipídeo, ésteres de fosfoglicerídeo,ésteres de lipídeo, ésteres de glicolipídeo, ésteres de fosfolipídeo, ésteres demonoacilglicerol, ou outros ésteres de ácido graxo, preferência sendo dadaaos ésteres de fosfolipídeo e/ou ésteres de triacilglicerol.

Partindo com os ésteres de ácido graxo poliinsaturadoproduzidos assim no processo de acordo com a invenção e vantajosamentepossuindo pelo menos três, quatro, cinco ou seis ligações duplas, os ácidosgraxos poliinsaturados que estão presentes podem ser liberados por exemplovia tratamento com álcali, por exemplo NaOH ou KOH aquosos, ou porhidrólise ácida, vantajosamente na presença de um álcool tal como metanol ouetanol, ou via clivagem enzimática, e isolados via, por exemplo, separação defases e subseqüente acidulação com, por exemplo, H2SO4. Contudo, os ácidosgraxos também podem ser liberados diretamente sem as etapas deprocessamento descritas acima.Substratos das seqüências de ácido nucleico usadas noprocesso que codificam polipeptídeos com atividade de Δ6-dessaturase, Δ6-alongase, Δ5-dessaturase e/ou Δ5-alongase e opcionalmente seqüências deácido nucleico que codificam polipeptídeos possuindo atividade de ω3-dessaturase e/ou A4-dessaturase, e/ou de outros ácidos nucleicos são usados,tais como as seqüências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos dometabolismo de ácido graxo ou lipídeo selecionados do grupo consistindo deacil-CoA desidrogenase(s), acil-ACP [= proteína carreadora] dessaturase(s),acil-ACP tioesterase(s), ácido graxo acil transferase(s), acil-CoArlisofosfolipideo aciltransferases, ácido graxo sintase(s), ácido graxohidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s),ácido graxo dessaturase(s), ácido graxo acetilenases, lipoxigenases,triacilglicerol lipases, alenoxido sintases, hidroperóxido liases ou ácido graxoalongase(s) são vantajosamente ácidos C16-, C18- ou C20- graxos.

Preferivelmente, os ácidos graxos convertidos no processo como substratossão convertidos na forma de seus ésteres de acil-CoA e/ou na forma de seusésteres de fosfolipídeo.

Para produzir os PUFAs de cadeia longa de acordo com ainvenção, os ácidos C16-graxos saturados, monoinsaturados e/ou os ácidosC18-graxos poliinsaturados têm que ser primeiro, dependendo do substrato, serdessaturados e/ou alongados ou apenas dessaturados por atividade enzimáticada dessaturase e/ou alongase e subseqüentemente alongados em pelo menosdois átomos de carbono por uma alongase. Após um ciclo de alongamento,esta atividade de enzima leva quer partindo de ácidos C16-graxos aos ácidosC18-graxos quer partindo de ácidos C18-graxos aos ácidos C20-graxos, e apósdois ciclos de alongamento partindo de ácidos Ci6-graxos leva aos ácidos C20-graxos. A atividade das dessaturases ou alongases usadas no processo deacordo com a invenção preferivelmente leva aos ácidos C20- e/ou C22-graxos,vantajosamente com pelo menos duas ou três ligações duplas na molécula deácido graxo, preferivelmente com quatro, cinco ou seis ligações duplas,especialmente preferivelmente aos ácidos C22-graxos com pelo menos cincoligações duplas na molécula de ácido graxo. Produtos especialmentepreferidos do processo de acordo com a invenção são ácidoeicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e/ou ácido docosahexaenóico.

Os ácidos Ci8-graxos com pelo menos duas ligações duplas no ácido graxopodem ser alongados pela atividade enzimática de acordo com a invenção naforma de ácido graxo livre ou na forma de ésteres, tais como fosfolipídeos,glicolipídeos, esfingolipídeos, fosfoglicerídeos, monoacilglicerol,diacilglicerol ou triacilglicerol.

O sítio de biossíntese preferido de ácidos graxos, óleos,lipídeos ou gorduras nas plantas que são vantajosamente usadas é, porexemplo, geralmente a semente ou as camadas celulares da semente, de modoque tenha sentido a expressão específica de semente dos ácidos nucleicosusados no processo. Contudo, é óbvio que a biossíntese de ácidos graxos,óleos ou lipídeos não necessita ser limitada ao tecido de semente, mastambém pode ocorrer em uma maneira específica de tecido em todas as partesrestantes da planta, por exemplo em células epidermais ou nos tubérculos. Asíntese vantajosamente ocorre de acordo com o processo da invenção notecido vegetativo (somático).

Devido ao processo de acordo com a invenção, os ácidosgraxos poliinsaturados que são produzidos podem, em princípio, seremaumentados em duas maneiras nas plantas usadas no processo.

Vantajosamente a coleção de ácidos graxos livres poliinsaturados e/ou aquantidade de ácidos graxos poliinsaturados esterificados produzidos peloprocesso pode ser aumentada. Vantajosamente, a coleção de ácidos graxospoliinsaturados esterificados nas plantas transgênicas é aumentada peloprocesso de acordo com a invenção, vantajosamente na forma de fosfatidil-ésteres e/ou triacil-ésteres.As seqüências usadas no processo da invenção são clonadasindividualmente nos construtos de expressão ou proporcionadas em umamolécula de ácido nucleico recombinante de junção e usadas para introduçãoe expressão em organismos. Estes construtos de expressão possibilitam que osácidos graxos poliinsaturados produzidos no processo da invenção sejamsintetizados de modo ótimo.

Os ácidos nucleicos usados no processo podem, apósintrodução em uma planta ou célula de planta, quer estarem localizados emum plasmídeo separado quer vantajosamente estarem integrados no genomada célula hospedeira. No caso de integração no genoma, a integração pode seraleatória ou ocorrer por recombinação de tal modo que o gene nativo ésubstituído pela cópia introduzida, modelando assim a produção do compostodesejado pela célula, ou através do uso de gene em trans, de modo que o geneé funcionalmente conectado em uma unidade de expressão funcional quecompreende pelo menos uma seqüência garantindo a expressão de um gene epelo menos uma seqüência garantindo a poliadenilação de um genefuncionalmente transcrito. As seqüências de ácido nucleico sãovantajosamente introduzidas nas plantas via cassetes de multiexpressão ouconstrutos para expressão multiparalela, i.e. as seqüências de ácido nucleicoestão presentes em uma unidade de expressão de junção.

O construto de ácido nucleico pode compreender mais do queuma seqüência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo possuindo aatividade enzimática da Δ-12-dessaturase, A4-dessaturase, A5-dessaturase,Aό-dessaturase, A5-alongase, Δ6- alongase, e/ou ω-3- dessaturase. Também épossível que esteja presente uma pluralidade de cópias de uma seqüência deácido nucleico codificadora de um polipeptídeo possuindo a atividadeenzimática da Δ-12-dessaturase, Δ-4-dessaturase, Δ5-dessaturase, Δό-dessaturase, Δ5-alongase, Δό-alongase, e/ou a>3-dessaturase.

Para a introdução, os ácidos nucleicos usados no processo sãovantajosamente amplificados e ligados na maneira conhecida.Preferivelmente, um procedimento seguindo o protocolo para Pfu DNApolimerase ou uma mistura de Pfu/Taq DNA polimerases é seguido. Osiniciadores são selecionados dependendo da seqüência a ser amplificada. Osiniciadores devem ser expedientemente escolhidos em um tal modo que oamplicon compreenda a seqüência codogênica inteira desde o códon deiniciação até o códon de terminação. Após a amplificação, o amplificon éexpedientemente analisado. Por exemplo, a análise pode ser realizada porseparação eletroforética em gel com respeito à qualidade e à quantidade.

Depois, o amplicon pode ser purificado seguindo um protocolo padrão (porexemplo Qiagen). Uma alíquota do amplicon purificado está então disponívelpara a etapa de clonagem subseqüente. Vetores de clonagem adequados sãogeralmente conhecidos pelo técnico experiente. Estes incluem, em particular,vetores que são capazes de replicação em sistemas microbianos, isto éprincipalmente vetores que garantem clonagem eficiente em leveduras oufungos e que tornam possível a transformação estável de plantas. Aqueles quetêm que ser mencionados em particular são sistemas de vetores binários e co-integrados que são adequados para a transformação mediada por T-DNA. Taissistemas de vetor são, como uma regra, caracterizados pelo fato de quecompreendem pelo menos os genes vir requeridos para a transformaçãomediada por Agrobacterium e as seqüências T-DNA-delimitantes (borda T-DNA). Estes sistemas de vetor preferivelmente também compreendem outrasregiões cis-regulatórias tais como promotores e terminadores e/ou marcadoresde seleção, por meio das quais organismos adequadamente transformadospodem ser identificados. Embora no caso de sistemas de vetor cointegradosgenes vir e seqüências de T-DNA estão arranjados no mesmo vetor, sistemasbinários são baseados em pelo menos dois vetores, um dos quais possui genesvir, mas não T-DNA, enquanto que um segundo possui T-DNA, mas nãogenes vir. Devido a este fato, os últimos vetores mencionados sãorelativamente pequenos, fáceis de manipular e capazes de replicação tanto emE. coli quanto em Agrobacterium. Estes vetores binários incluem vetores dasséries pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. De acordo com a invenção,pBinl9, pBIlOl, pBinAR, pGPTV e pCAMBIA são usados de modopreferido. Uma visão geral de vetores binários e de seu uso é encontrada emHellens et al. (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451.

Com o objetivo de preparar os vetores, os vetores podem serprimeiro linearizados com endonuclease(s) de restrição e entãoenzimaticamente modificados em uma maneira adequada. Depois, o vetor épurificado, e uma alíquota é empregada na etapa de clonagem.Na etapa declonagem, o amplificado enzimaticamente clivado e, se apropriado, purificadoé clonado com fragmentos de vetor que têm sido preparados em uma maneirasimilar, usando ligase. Neste contexto, um construto de ácido nucleicoparticular, ou vetor ou construto de plasmídeo, pode possuir um ou mais doque um segmentos de gene codogênico. Os segmentos de gene codogêniconestes construtos são preferivelmente ligados operacionalmente comseqüências regulatórias. As seqüências regulatórias incluem, em particular,seqüências de planta tais como os promotores e terminadores descritos acima.

Os construtos podem vantajosamente serem estavelmente propagados emmicroorganismos, em particular Escherichia coli e Agrobacteriumtumefaciens, sob condições seletivas e assim tornar possível a transferência deDNA heterólogo em plantas.

As seqüências de ácido nucleico e os construtos de ácidonucleico usados no processo da invenção podem ser introduzidos emmicroorganismos e então em plantas, vantajosamente usando vetores declonagem, e assim serem usados na transformação de plantas tais comoaqueles que são publicados em e citados nos mesmo: Plant Molecular Biologyand Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Capítulo 6/7, p. 71-119(1993) ; F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher. Plants; em:Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu,Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer;em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R.Wu, Aeademic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Molec. Biol. (1991) 42: 205-225. Assim, os ácidos nucleicos, construtosde ácido nucleico e/ou vetores usados no processo podem ser utilizados para amodificação recombinante de um amplo espectro de plantas de modo que asúltimas se tornam melhores e/ou produtoras de LCPUFA mais eficientes.

Devido à introdução do gene de A6-dessaturase, Δ6-alongase,A5-dessaturase e A5-alongase em uma planta, sozinho ou em combinaçãocom outros genes, não é apenas possível aumentar o fluxo de biossíntese nadireção do produto final, mas também aumentar, ou criar de nono acomposição de triacilglicerol e/ou fosfatidil-éster correspondente. Igualmente,o número ou atividade de outros genes que estão envolvidos na importação denutrientes que são requeridos para a biossíntese de um ou mais ácidos graxos,óleos, lipídeos polares e/ou neutros, pode ser aumentado, de modo que aconcentração destes precursores, co-fatores ou intermediários dentro dascélulas ou dentro do compartimento de armazenagem é aumentada, destemodo a capacidade das células para produzirem PUFAs, como descritoabaixo, é ainda mais aumentada. Pela otimização da atividade ou peloaumento do número de um ou mais genes de Δ6-dessaturase, Δ6-alongase,A5-dessaturase e/ou A5-alongase que estão envolvidos na biossíntese destescompostos, ou pela destruição da atividade de um ou mais genes que estãoenvolvidos na degradação destes compostos, pode ser possível aumentar orendimento, a produção e/ou a eficiência de produção em moléculas de ácidograxo e lipídeo de organismos e vantajosamente de plantas.

As moléculas de ácido nucleico usadas no processo dainvenção codificam proteínas ou suas partes, enquanto que as proteínas ou aproteína individual ou suas partes compreende(m) uma seqüência deaminoácidos que possui homologia suficiente em relação a uma seqüência deaminoácidos que é mostrada nas seqüências SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 172 ou SEQ ID NO 52 e, se apropriado, SEQ ID NO 194 ouSEQ ID NO 78, de modo que as proteínas ou suas partes ainda possuam umaatividade de Δ-6-dessaturase, Δ-6-alongase, Δ-5-dessaturase e/ou Δ-5-alongase e se apropriado, uma atividade de Δ-4-dessaturase e/ou co-3-dessaturase. As proteínas ou suas partes que é/são codificada(s) pela moléculade ácido nucleico / moléculas de ácido nucleico preferivelmente aindapossuem sua atividade enzimática essencial e a capacidade para participaremno metabolismo de compostos necessários para construção de membranascelulares ou de corpos lipídicos em organismos, vantajosamente em plantas,ou no transporte de moléculas através destas membranas. As proteínascodificadas pelas moléculas de ácido nucleico são pelo menos cerca de 70%,80% ou 90%, e particularmente preferivelmente pelo menos cerca de 85%,86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% ou mais idênticas às seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ IDNO. 65, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 194 ouSEQ ID NO 78. Homologia ou homólogo significa no contexto da invençãoidentidade ou idêntico.

A homologia foi calculada sobre a região de seqüência deácido nucleico ou de aminoácido inteira. Para comparar várias seqüências, otécnico experiente tem disponível uma série de programas que são baseadosem vários algoritmos. Os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith eWaterman dão resultados particularmente confiáveis. O programa Pileup (J.Mol. Evolution (1987) 25: 351-360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151-153) ou os programas Gap e BestFit (Needleman e Wunsch (1970) J. Mol.Biol: 48: 443-453 e Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489),que são pare do pacote de programas de computador GCG [Genetic ComputerGroup, 575 Science, Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991) ], foramusados para realizar as comparações de seqüências. Os dados de homologia deseqüência fornecidos acima em % foram determinados sobre a região deseqüência inteira usando o programa GAP com os seguintes ajustes: Peso deLacuna: 50, Peso de Comprimento 3, Combinação Média: 10,000 e MáCombinação Média: 0,000. A não ser que seja especificado de outro modo,estes ajustes foram sempre usados como ajustes padrão para comparações deseqüências.

Atividade enzimática essencial das ω-3-dessaturase, Δ-6-dessaturase, Δ-6-alongase, A5-alongase, A4-dessaturase e/ou A5-dessaturaseusadas no processo da invenção significa que, comparadas com asproteína/enzimas codificadas pela seqüência possuindo SEQ ID NO. 64, SEQID NO. 1, SEQ ID NO. 171, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 193 ou SEQ IDNO. 77, ainda possuem uma atividade enzimática de pelo menos 10%,preferivelmente de pelo menos 20%, particularmente preferivelmente de pelomenos 30% e mais preferivelmente de pelo menos 40, 50 ou 60%, e assim sãocapazes de participarem no metabolismo de compostos necessários para asíntese de ácidos graxos, vantajosamente ésteres de ácido graxo tais comofosfatidil-ésteres e/ou ésteres de triacilglicerídeo, em uma planta ou célula deplanta, ou no transporte de moléculas através de membranas.

Ácidos nucleicos que podem ser vantajosamente usados noprocesso são derivados de bactérias, fungos, diatomáceas, animais tais comoCaernorhabditis ou Oncorhynchus ou plantas tais como algas ou musgo taiscomo os gêneros Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium,Phytophthora, Ceratodon, Pytium irregulare, Mantoniella, Ostreococcus,Isochrysis, Aleurita, muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactilum,Crypthecodinium, specifically from os gêneros e espécies Pytium irregulare,Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis, Thalassiosirapseudonona, Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri,Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusariumgraminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysisgalbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Musearioides viallii,Mortierella alpina, Borago offieinalis, Phaeodaetilum tricornutum,Caenorhabditis elegans ou particularmente vantajosamente de Pytiumirregulare, Thraustoehytrium sp. e/ou Ostreococcus tauri.

É possível adicionalmente usar no processo da invençãoseqüências de nucleotídeos que codificam uma Δ-12- dessaturase, Δ9-alongase ou Δ-8- dessaturase. As seqüências de ácido nucleico usadas noprocesso are vantajosamente introduzidas em um corrente de querosene quetorna possível a expressão dos ácidos nucleicos em plantas.

As seqüências de ácido nucleico que codificam as Δ12-dessaturase, ω-3- dessaturase, Δ-9-alongase, Δό-dessaturase, Δ-8- dessaturase,Δ-6- alongase, Δ-5- dessaturase, Δ-5- alongase ou Δ-4- dessaturase sãofuncionalmente ligadas em um ou mais sinais regulatórios para aumentar aexpressão de gene. Estas seqüências regulatórias são intencionadas para tornarpossível a expressão selecionada dos genes. Isto pode significar por exemplo,dependendo da planta, que o gene é expressado e/ou sobreexpressado apenasapós indução, ou que ele é expressado e/ou sobreexpressado imediatamente.

Seqüências vantajosamente usadas para a expressão tornam possível aexpressão constitutiva, tal como os promotores CaMV35S, CaMV36S,CaMV35Smas, nos, mas, ubi, stpt, Iea ou Super. Expressão preferivelmenteocorre em tecido vegetativo como descrito acima. Em outra modalidadepreferida, a expressão ocorre em sementes.

Estas seqüências regulatórias são por exemplo seqüências nasquais indutores ou repressores se ligam e assim regulam a expressão do ácidonucleico. Em adição às seqüências regulatórias que não estão ligadas em seulocus natural nas seqüências de ácido nucleico, ou em vez destas seqüências, aregulação natural destas seqüências ainda pode estar presente antes que osgenes estruturais reais e se apropriado, tenham sido geneticamentemodificados de modo que regulação natural seja desligada e expressão dosgenes seja aumentada. O construto de gene também pode adicionalmentevantajosamente compreender uma ou mais denominadas "seqüênciasintensificadoras" funcionalmente ligadas no promotor, que torna possível aexpressão aumentada da seqüência de ácido nucleico. Seqüências vantajosasadicionais também podem ser inseridas na extremidade 3' das seqüências deDNA5 tais como outros elementos regulatórios ou terminadores. Terminadoresvantajosos são por exemplo terminadores virais trais como terminadores 35Sou outros. As seqüências de ácido nucleico usadas no processo de acordo coma invenção podem estar presentes em uma ou mais cópias do cassete deexpressão (= construto de gene). Preferivelmente, apenas uma cópia dosgenes está presente em cada cassete de expressão. Este construto de gene, ouos construtos de gene, podem ser introduzidos na planta simultânea ousucessivamente e expressados juntos no organismo hospedeiro. Nestecontexto, o(s) construto(s) de gene pode(m) ser inserido(s) em um ou maisvetores e estar(em) presente(s) na célula na forma livre, se não ser(em)inserido(s) no genoma. É vantajoso para a inserção de outros genes na plantaquando os genes a serem expressados estão presentes juntos em um construtode gene. Contudo, também é possível introduzir em cada caso um construtode gene contendo uma seqüência de ácido nucleico dentro de uma planta ecruzar as plantas resultantes umas com as outras com o objetivo de obterprogênie que contém todos os construtos de gene juntos.

Neste contexto, as seqüências regulatórias ou fatores podem,como descrito acima, preferivelmente ter um efeito positivo sobre a expressãode gene dos genes introduzidos, intensificando-a assim. Deste modo, umaintensificação dos elementos regulatórios, vantajosamente em nível detranscrição, pode ocorrer pelo uso de sinais de transcrição fortes tais comopromotores e/ou intensificadores. Em adição, contudo, tradução intensificadatambém é possível, por exemplo pela melhoria da estabilidade do mRNA.Para garantir a integração estável dos genes de biossíntese naplanta transgênica sobre uma pluralidade de gerações, cada um dos ácidosnucleicos que codifica Δό-dessaturase, Δό-alongase, A5-dessaturase ou Δ5-alongase e se apropriada a co3-dessaturase ou A4-dessaturase e que são usadosno processo deve ser expressado sob o controle de um promotor separado.

Isto pode ser idêntico ou diferente para cada uma das seqüências. Nestecontexto, o cassete de expressão é vantajosamente construído em um tal modoque um promotor é seguido por um sítio de clivagem adequado para inserçãodo ácido nucleico a ser expressado, o sítio de clivagem é vantajosamente emum poliligador. Se apropriado, um terminador pode estar posicionado atrás dopoliligador. Esta seqüência é repetida várias vezes, preferivelmente três,quatro, cinco ou seis vezes, de forma que até seus genes podem sercombinados em um construto e assim introduzidos na planta transgênica a serexpressada. Para expressar as seqüências de ácido nucleico, as últimas sãoinseridas atrás do promotor via o sítio de clivagem adequado, por exemplo nopoliligador. Vantajosamente, cada seqüência de ácido nucleico possui seupróprio promotor e, se apropriado, seu próprio terminador. Contudo, tambémé possível inserir uma pluralidade de seqüências de ácido nucleico atrás de umpromotor e, se apropriado, antes de um terminador. Aqui, o sítio de inserção,ou a seqüência, dos ácidos nucleicos inseridos no cassete de expressão não éde importância crítica, isto é uma seqüência de ácido nucleico pode serinserida na primeira ou última posição no cassete sem a expressão sersubstancialmente influenciada pela posição. Em um USP, LegB4 ou DC3, eterminadores diferentes podem ser usados no cassete de expressão. Em umaoutra modalidade vantajosa, promotores idênticos tal como o promotorCaMV35S também podem ser usados.

Como descrito acima, a transcrição dos genes que têm sidointroduzidos deve ser vantajosamente terminada por terminadores adequadosna extremidade 3' dos genes de biossíntese que têm sido introduzidos (atrásdo códon de terminação). Um exemplo da seqüência que pode ser usada nestecontexto é o terminador OCS 1 ou o terminador 35SCaMV. Como é o casocom os promotores, seqüências de terminador diferentes devem ser aquiusadas para cada gene.

Como descrito acima, o construto de gene também podecompreender outros genes a serem introduzidos nos organismos. É possível evantajosa a introdução nas plantas hospedeiras, e a expressão nelas, de genesregulatórios tais como genes para indutores, repressores ou enzimas que,devido à sua atividade de enzima, participam na regulação de um ou maisgenes da rota de biossíntese. Estes genes podem ser de origem heteróloga ouhomólogo. Além disso, outros genes de biossíntese do metabolismo de ácidograxo ou lipídeo podem estar vantajosamente presentes no construto de ácidonucleico, ou no construto de gene ou alternativamente, estes genes tambémpodem estar presentes em um outro ou adicionalmente outros construtos deácido nucleico. O gene de biossíntese do metabolismo de ácido graxo oulipídeo que é preferivelmente escolhido é um ou mais genes selecionados dogrupo deacil-CoA desidrogenase(s), acil-ACP [= proteína carreadora]dessaturase(s), acil-ACP tioesterase(s), ácido graxo acil- transferase(s), acil-CoA:lisofosfolipídeo aciltransferases, ácido graxo sintase(s), ácido graxohidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s), acilcoenzima A oxidase(s),ácido graxo dessaturase(s), ácido graxo acetilenases, lipoxigenases,triacilglicerol lipases, alenoxido sintases, hidroperóxido liases ou ácido graxoalongase(s) ou combinações dos mesmos.Seqüências de ácido nucleicoespecialmente vantajosas são genes de biossíntese do metabolismo de ácidograxo ou lipídeo selecionados do grupo de acil-CoA:lisofosfolipídeoaciltransferase, A8-dessaturase, A9-dessaturase, A12-dessaturase e/ou Δ9-alongase.

Neste contexto, os genes ou ácidos nucleicos acimamencionados podem ser clonados nos cassetes de expressão, como aquelesmencionados, em combinação com outras alongases e dessaturases e usadaspara transformar plantas com o auxílio de Agrobacterium.

O termo "vetor" usado nesta descrição refere-se a umamolécula de ácido nucleico que é capaz de transportar outro ácido nucleico noqual está ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", uma alça de DNA defita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados.Um outro tipo de vetor é um vetor viral, sendo possível que segmentos deDNA adicionais sejam ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes dereplicação autônoma em uma célula hospedeira na qual têm sito introduzidos(por exemplo vetores bacterianos com origem de replicação bacteriana).Outros vetores são vantajosamente integrados no genoma da célulahospedeira quando são introduzidos na célula hospedeira, e assim replicamjuntos com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores podem governara expressão de genes com os quais estão em ligação operável. Estes vetoressão referidos no presente contexto como "vetores de expressão".Normalmente, vetores de expressão que são adequados para técnicas derecombinação de DNA tomam a forma de plasmídeos. Na presente descrição,"plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente porque oplasmídeo está na forma do vetor que é mais freqüentemente usado. Contudo,também é intencionado que a invenção cubra outras formas de vetores deexpressão, tais como vetores virais, que exercem funções similares. Ademais,o termo vetor também é intencionado para incluir outros vetores com os quaiso técnico experiente está familiarizado, tais como fagos, vírus tais comoSV40, CMV, TMV, transposons, elementos IS, fasmídeos, fagomídeos,cosmídeos, DNA linear ou circular.

Os vetores de expressão recombinantes vantajosamente usadosno processo compreendem as seqüências de ácido nucleico ou o construto degene acima citado usando no processo em uma forma que é adequada paraexpressar os ácidos nucleicos usados em uma célula hospedeira, o quesignifica que os vetores de expressão recombinantes compreendem uma oumais seqüências regulatórias, que são selecionadas tendo por base as célulashospedeiras a serem utilizadas para a expressão, cuja(s) seqüência(s)regulatória(s) é/estão ligada(s) operacionalmente com a seqüência de ácidonucleico a ser expressada. Em um vetor de expressão recombinante,"operacionalmente ligado" significa que a seqüência de nucleotídeos deinteresse está ligada na(s) seqüência(s) regulatória(s) em um tal modo que aexpressão da seqüência de nucleotídeos é tornada possível e são ligadas umasnas outras em uma tal maneira que ambas as seqüências trazem a função predita que é atribuída à seqüência (por exemplo em um sistema detranscrição/tradução in vitro, ou em uma célula hospedeira se o vetor éintroduzido na célula hospedeira) . O termo "seqüência regulatória" éintencionada para compreender prootores, intensificadores e outroselementos de controle de expressão (por exemplo sinais de poliadenilação).

Estas seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA (1990), ou veja: Gruber e Crosby, em Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, Ed.: Glick eThompson, Capítulo 7, 89-108, incluindo as referências lá citadas. Seqüênciasregulatórias compreendem aquelas que governam a expressão constitutiva daseqüência de nucleotídeos em muitos tipos de célula hospedeira e aquelas quegovernam a expressão direta da seqüência de nucleotídeos apenas nas célulashospedeiras específicas sob condições específicas. O técnico experiente sabeque o projeto de vetor de expressão pode depender de fatores tais como aescolha da célula hospedeira a ser transformada, o grau desejado de expressãoda proteína e semelhante.

Os vetores de expressão usados podem ser projetados para aexpressão das seqüências de ácido nucleico usadas no processo em um talmodo que podem ser transformados em hospedeiros intermediáriosprocarióticos e finalmente, após introdução nas plantas, tornam possível aexpressão dos genes nelas. Isto é vantajoso por causa de simplicidade, etapasintermediárias em construção de vetor são freqüentemente realizadas emmicroorganismos. Por exemplo, os genes de Δό-desaturates, Δό-alongase, Δ5-desaturate e/ou Δ-5-alongase podem ser expressados em células bacterianas,células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), células delevedura e outras células fungicas (veja Romanos, M.A., et al. (1992) Yeast8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) "Heterologous geneexpression in filamentous fungi", em More Gene Manipulations in Fungi,J.W. Bennet & L.L. Lasure, Editors, pp. 396-428: Academic Press: SanDiego; e van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, PJ. (1992) "Gene transfersystems and vector development for filamentous fungi", em AppliedMolecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Editors, pp. 1-28,Cambridge University Press: Cambridge), Algae (Falciatore et al. (1999)Marine Biotechnology. 1: (3) :239-251), ciliados, com vetores após umprocesso de transformação como descrito em WO 98/01572, epreferivelmente em células de plantas multicelulares (veja Schmidt, R. eWillmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana Ieaf e cotiledon explants" Plant CellRep.:538-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, BocaRaton, Florida, capítulo 6/7, pp. 71-119 (1993) ; F.F. White, B. Jenes et al.,"Techniques for Gene Transfer" em: Transgenic Plants, vol. 1, Engineeringand Utilization, Editors.: Kung e R. Wu, Academic Press (1993), 128-43;Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205-225 (ereferências citadas nas mesmas) ) . Hospedeiros adequados são o que sãoadicionalmente discutidos em Goeddel, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Ovetor de expressão recombinante pode alternativamente ser transcrito etraduzido in vitro por exemplo usando seqüências regulatórias de promotor T7e Τ7 polimerase.

Expressão de proteínas em procariotos normalmente ocorrecom vetores que compreendem promotores constitutivos ou induzíveis quecontrolam a expressão de proteínas de fusão ou de não-fusão. Vetores deexpressão de fusão típicos são inter alia pGEX (Pharmacia Biotech Inc;Smith, D.B., e Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New EnglandBiolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) dos quaisglutationa S-transferase (GST), proteína ligadora E de maltose e proteína A,respectivamente, são fusionados na proteína alvo.recombinante.

Exemplos de vetores de expressão em E. coli de não-fusãoinduzíveis adequados são inter alia pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) e pETlld (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods inEnzymology 185, Academic, Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89).

Expressão de gene alvo pelo vetor pTrc é baseada em transcrição pela RNApolimerase de hospedeiro a partir de um promotor de fusão híbrido trp-lac. Áexpressão de gene alvo do vetor pET Ild é baseada na transcrição de umpromotor de fusão T7-gnl O-Iac que é mediada por uma RNA polimerase viralco-expressada (T7 gnl) . Esta polimerase viral é proporcionada pelas cepashospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) de um profago λ residente quehospeda um gene T7 gnl sob controle de transcrição do promotor IacUV 5.

Outros vetores adequados em organismos procarióticos sãoconhecidos pelo técnico experiente, estes vetores são por exemplo em E. colipLG338, pACYCi84, e série pBR tal como pBR322, a série pUC tal comopUC18 ou pUC19, a série M113mp, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236,pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, λ^ΙΙ ou pBdCI, emstreptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 ou pIJ361, em bacillus pUBllO, pC194ou pBD214, em corynebacterium pSA77 ou pAJ667.

Em uma outra modalidade, o vetor de expressão é um vetor deexpressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão na levedura S.cerevisiae incluem pYeDessaturasecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultzet al. (1987) Gene 54:113-123) e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego,CA) . Vetores e processos para construir vetores adequados para uso emoutros fungos, tais como os fungos filamentosos, são, descritos em detalhe emvan den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems andvector development for filamentous fungi", em: Applied Molecular Geneticsof fungi, J.F. Peberdy et al., editores, pp. 1-28, Cambridge University Press:Cambridge, ou em More Gene Manipulations in Fungi (J.W. Bennet & L.L.Lasure, Editors, pp. 396-428: Academic Press: San Diego). Outros vetores delevedura adequados são por exemplo pAG-1, YEp6, YEp 13 ou pEMBLYe23.

Alternativamente, as seqüências de ácido nucleico usadas noprocesso da invenção podem ser expressadas em células de inseto usandovetores de expressão de baculovírus. Vetores de baculovírus disponíveis paraexpressar proteínas em células de inseto cultivadas (e.g. células Sf9) incluema série pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell. BioL 3:2156-2165) e a série pVL(Lucklow e Summers (1989) Virology 170:31-39) .

Os vetores acima mencionados proporcionam apenas umavisão pequena dos possíveis vetores adequados. Outros plasmídeos sãoconhecidos pelo técnico experiente e são descritos por exemplo em CloningVectors (Editors Pouwels, P.H. et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) . Para outros sistemas de expressãoadequados para células procarióticas e eucarióticas veja em capítulos 16 e 17de Sambrook, J., Fritsch, E.F., e Maniatis, T., Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Os genes usados no processo também podem ser expressadosem células de planta de célula única (tais como algas), veja Falciatore et al.(1999) Marine Biotechnology 1 (3) :239-251 e referências citadas na mesma,e em células de planta de plantas superiores (por exemplo espermatófitos taiscomo colheitas aráveis). Exemplos de vetores de expressão de plantacompreendem aqueles que são descritos em detalhe em: Becker, D., Kemper,E., Schell, J., e Masterson, R. (1992) PlantMoL Biol. 20:1195-1197; e Bevan,M.W. (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; "Vectors for Gene Transfer inHigher Plants"; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization,Ed: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, p. 15-38.

Um cassete de expressão de planta preferivelmentecompreende seqüências regulatórias que são capazes de governar a expressãode genes em células de planta e são operacionalmente ligadas de modo quecada seqüência possa realizar sua função, tal como terminação de transcrição,por exemplo sinais de poliadenilação. Os sinais de poliadenilação preferidossão aqueles que são derivados de Agrobacterium tumefaciens T-DNA5 talcomo o gene 3 do plasmídeo Ti, pTiACH5 (Gielen et al., (1984) EMBO J. 3835 et seq.), que é conhecido como octopina sintase, ou seus equivalentesfuncionais, mas todos os outros terminadores que são funcionalmente ativosem plantas também estão disponíveis.

Visto que a regulação da expressão de gene de planta é muitasvezes limitada ao nível de transcrição, um cassete de expressão de plantapreferivelmente compreende outras seqüências que estão operacionalmenteligadas, tais como intensificadores de tradução, por exemplo a seqüênciaoverdrive, que intensifica a seqüência líder não-traduzida 5' do vírus domosaico de tabaco, que aumenta a razão de proteína/RNA (Gallie et al. (1987)Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

Como descrito acima, a expressão de gene de planta tem queestar operacionalmente ligada com um promotor adequado que controla aexpressão de gene. Promotores vantajosamente utilizáveis são promotoresconstitutivos (Benfey et al., EMBO J. (1989) 8: 2195-2202), tais comoaqueles que são derivados de vírus de planta, tais como 35S CaMV (Franck etal. (1980) Cell 21: 285-294), 19S CaMV (veja também US 5352605 e WO84/02913), ou promotores de planta, tal como o promotor de subunidadepequena Rubisco, que é descrito em US 4.962.028.

Outras seqüências preferidas para uso para conexão funcionalnos cassetes de expressão de gene de planta são seqüências de seleção que sãonecessárias para guiar o produto de gene para dentro de seu compartimentocelular, por exemplo para dentro de vacúolos, o núcleo de célula, todos ostipos de plastídeos tais como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, oespaço extracelular, a mitocôndria, o retículo endoplásmico, corpos oleosos,peroxissomos e outros compartimentos de células de planta; (veja uma revisãoem Kermode (1996) Crit. Rev. Plant Sei. 15(4) : 284-423 e literatura citada(na mesma).

DNA vetor pode ser introduzido em células procarióticas oueucarióticas via técnicas de transfecção ou transformação tradicionais. Ostermos "transformação", e "transfecção", conjugação e transdução comousados no presente contexto são intencionados para incluírem amultiplicidade de processos da arte anterior para introduzir ácidos nucleicosheterólogos (por exemplo DNA) em uma célula hospedeira, incluindocoprecipitação por fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediadapor DEAE-dextrano, lipofecção, competência natural, transferênciaquimicamente mediada, eletroporação ou bombardeio de partícula. Processosadequados para a transformação ou transfecção de células hospedeiras,incluindo células de planta, podem ser encontrados em Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd Ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989) e em outros manuais de laboratório tal como Methods in MolecularBiology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed: Gartland e Davey,Humana Press, Totowa, New Jersey.

O termo "(molécula de) ácido nucleico" como aqui usadocompreende em uma modalidade vantajosa adicionalmente a seqüência não-traduzida localizada na extremidade 3' e na extremidade 5' da região de genecodificador: pelo menos 500, preferivelmente 200, particularmentepreferivelmente 100 nucleotídeos da seqüência a montante da extremidade 5'da região de codificação e pelo menos 100, preferivelmente 50,particularmente preferivelmente 20 nucleotídeos da seqüência a jusante daextremidade 3' da região de gene codificador. Uma molécula de ácidonucleico "isolada" está separada de outras moléculas de ácido nucleico queestão presentes na fonte natural do ácido nucleico. Uma molécula de ácidonucleico "isolada" preferivelmente não possui seqüências que naturalmenteflanqueiam o ácido nucleico no DNA genômico o ácido nucleico no DNAgenômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado (e.g. seqüênciaslocalizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico). Em váriasmodalidades, a molécula isolada de Δ-6-dessaturase, Δ-6-alongase ou Δ-5-dessaturase e, se apropriada, a molécula de ω-3-dessaturase ou A4-dessaturaseusada no processo pode por exemplo compreender menos do que cerca de 5kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeos quenaturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucleico no DNA genômico dacélula da qual o ácido nucleico é derivado.

As moléculas de ácido nucleico usadas no processo podem seisoladas pelo uso de técnicas padrão de biologia molecular e a informação deseqüência aqui proporcionadas. Também é possível por exemplo com oauxílio de algoritmos comparativos identificar uma seqüência homóloga ouregiões de seqüência conservadas, homólogas em nível de DNA ouaminoácido. Estas podem ser usadas como sonda de hibridização em técnicasde hibridização padrão (como descrito por exemplo em Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989) para isolamento de outras seqüências de ácido nucleico úteis noprocesso. A molécula de ácido nucleico no processo, ou suas partes, podemalém disso serem isoladas por reação em cadeia de polimerase, em cujo casoiniciadores oligonucleotídeo baseados nesta seqüência ou em suas partes sãousados (e.g. uma molécula de ácido nucleico compreendendo a seqüênciacompleta ou uma sua parte pode ser isolado por reação em cadeia depolimerase usando iniciadores oligonucleotídeo que têm sido construídostendo por base esta seqüência idêntica) . Por exemplo, mRNA pode serisolado de células (e.g. pelo processo de extração com tiocianato deguanidínio de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294- 5299) e cDNApode ser preparado com o auxílio de transcriptase reversa (e.g. transcripasereversa de MLV Moloney obtenível de GibcoBRL, Bethesda, transcriptasereversa de MD ou AMV, obtenível de Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL) . Iniciadores oligonucleotídeo sintéticos para amplificaçãopor meio de reação em cadeia de polimerase podem ser construídos baseando-se em uma ou mais das seqüências mostradas em SEQ ID NO. 64, SEQ IDNO. 1, SEQ ID NO 171, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 193 ou SEQ ID NO 77ou com o auxílio das seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NO.65, SEQ ID NO,2, SEQ ID NO. 172, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO,194 ouSEQ ID NO 78. Um ácido nucleico da invenção pode ser amplificado portécnicas de amplificação por PCR padrão usando cDNA ou alternativamenteDNA genômico como modelo e iniciadores oligonucleotídeo padrão. O ácidonucleico amplificado nesta maneira pode ser clonado em um vetor adequado ecaracterizado por análise de seqüência de DNA. Oligonucleotídeos podem serpreparados por processos de síntese padrão, por exemplo usando umsintetizador de DNA automático.

Homólogos das seqüências de ácido nucleico de A5-alongase,ω-3-dessaturase, Δ-6-dessaturase, Δ-6-alongase, Δ-4-dessaturase ou Δ5-dessaturase usadas, possuindo a seqüência SEQ ID NO 64, SEQ ID NO 1,SEQ ID NO 171, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 193 ou SEQ ID NO 77,significam por exemplo variantes alélicas possuindo pelo menos cerca de 40,50 ou 60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60 ou 70%, maispreferivelmente pelo menos cerca de 70 ou 80%, 90% ou 95% e ainda maispreferivelmente pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ou homologiaem relação a uma das seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO64, 66, 68 ou 70, em relação a uma das seqüências de nucleotídeos mostradasem SEQIDNO 1,3,5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25,27, 29,31,33,35,37, 39 ou 41, em relação a uma das seqüências de nucleotídeos mostradas emSEQ ID NO. 171, 173, 175, 177, 179, 181 ou 183, em relação a uma dasseqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO 51, 53 ou 55, emrelação a uma das seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO 193ou 195 ou em relação a uma das seqüências de nucleotídeos mostradas em ouSEQ ID NO 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 ou 93, especialmente as seqüênciasde nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO 64, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.171, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 193 ou SEQ ID NO. 77, ou seushomólogos, derivados ou análogos ou partes das mesmas. Também estãoincluídas moléculas de ácido nucleico isoladas da seqüência de nucleotídeosque hibridizam por exemplo sob condições estringentes com uma dasseqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO 64, SEQ ID NO 1,SEQ ID NO 171, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 193 ou SEQ ID NO. 77 comuma parte das mesmas. Uma parte significa nesta conexão de acordo com ainvenção que pelo menos 25 pares de base (=pb), 50 pb, 75 pb, 100 pb, 125pb ou 150 pb, preferivelmente pelo menos 175 pb, 200 pb, 225 pb, 250 pb,275 pb ou 300 pb, particularmente preferível 350 pb, 400 pb, 450 pb, 500 pbou mais pares de base são usados para a hibridização. Também é possívelvantajosamente usar a seqüência completa. Variantes alélicas compreendemem particular variantes funcionais que podem ser obtidas por deleção,inserção ou substituição de nucleotídeos da seqüência descrita em SEQ IDNO. 64, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 171, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 193ou SEQ ID NO. 77, mas onde a atividade de enzima das proteínas codificadaspelas mesmas é substancialmente retida para a inserção.

Moléculas de ácido nucleico vantajosas para o processo dainvenção podem ser isoladas tendo por base sua homologia em relação com asseqüências de ácido nucleico de ω-3-dessaturase, Δό-dessaturase, Δ-5-dessaturase, A5-alongase, A4-dessaturase e/ou Δό-alongase aqui descritaspelo uso de seqüências ou de uma parte das mesmas como sonda dehibridização em técnicas de hibridização padrão sob condições dehibridização estringentes. É possível nesta conexão por exemplo usarmoléculas de ácido nucleico que são pelo menos 15 nucleotídeos decomprimento e hibridizam sob condições estringentes com as moléculas deácido nucleico que compreendem uma seqüência de nucleotídeos de SEQ IDNO. 64, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 171, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 193ou SEQ ID NO. 77. Também é possível usar moléculas de ácido nucleicopossuindo pelo menos 25, 50, 100, 250 ou mais nucleotídeos.

O termo "hibridiza sob condições estringentes," como aquiusado é intencionado para descrever condições de hibridização e lavagem sobas quais as seqüências de ácido nucleico que são pelo menos 60%mutuamente homólogas normalmente permanecem hibridizadas juntas. Ascondições são preferivelmente tais que as seqüências que são pelo menoscerca de 65%, preferivelmente pelo menos cerca de 70% e particularmentepreferivelmente pelo menos cerca de 75% ou mais mutuamente homólogasnormalmente permanecem hibridizadas juntas. Estas condições estringentessão conhecidas pelo técnico experiente e podem ser encontradas em CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NX. (1989), 6,3,Ι-ό,3,6. Um exemplo preferido, não-restritivo de condições de hibridizaçãoestringentes são hibridizações em 6 χ cloreto de sódio / citrato de sódio (=SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais etapas de lavagem e, 0,2 χSSC, SDS 0,1% a de 50 a 65°C. O técnico experiente está ciente de que estascondições de hibridização diferem dependendo do tipo de ácido nucleico e,por exemplo dos solventes orgânicos presentes, em relação à temperatura e àconcentração do tampão. A temperatura por exemplo sob "condições dehibridização padrão" está, dependendo do tipo de ácido nucleico, entre 42°C e58°C em tampão aquoso com uma concentração de 0,1 a 5 χ SSC (pH 7,2).

Se solvente orgânico, por exemplo, formamida 50%, estiver presente notampão acima mencionado, a temperatura sob condições padrão é cerca de42°C. As condições de hibridização para híbridos de DNA:DNA sãopreferivelmente por exemplo 0,1 χ SSC e 20°C a 45°C, preferivelmente 30°Ca 45°C. As condições de hibridização para híbridos de DNArRNA sãopreferivelmente por exemplo 0,1 χ SSC e 30°C a 55°C, preferivelmente 45°Ca 55°C. As temperaturas de hibridização acima mencionadas sãodeterminadas por exemplo para um ácido nucleico com um comprimento decerca de 100 pb (= pares de base) e um conteúdo de G + C de 50% naausência de formamida. O técnico experiente conhece como as condições dehibridização necessárias podem ser determinadas tendo por base livros-textotais como aqueles mencionados acima ou a partir dos seguintes livros-textoSambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989;Hames e Higgins (editors) 1985, "Nucleic Acids Hybridization. A PracticalApproach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (editor)1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press atOxford University Press, Oxford.

Com o objetivo de determinar a percentagem de homologia (=identidade) de duas seqüências de aminoácidos (por exemplo ima dasseqüências de SEQ TD NO. 65, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 172, SEQ IDNO 52, SEQ ID NO, 194 ou SEQ ID NO 78) ou dois ácidos nucleicos (porexemplo SEQ ID NO 64, SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 171, SEQ ID NO 51,SEQ ID NO 193 ou SEQ ID NO 77), as seqüências são escritas uma sob aoutra em ordem capaz de compará-las otimamente (por exemplo, lacunaspodem ser introduzidas na seqüência da proteína ou do ácido nucleico com opropósito de gerar alinhamento ótimo com a outra proteína ou o outro ácidonucleico). Então, os radicais de aminoácido ou nucleotídeos nascorrespondentes posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo sãocomparados. Se uma posição em uma seqüência está ocupada pelo mesmoradical de aminoácido ou o mesmo nucleotídeo que o da posiçãocorrespondente em outra seqüência, então as moléculas são homólogas nestaposição (i.e. "homologia" de aminoácido ou de ácido nucleico como usada nopresente contexto corresponde à "identidade" de aminoácido ou ácidonucleico). A percentagem de homologia entre as duas seqüências é umafunção do número de posições idênticas que as seqüências compartilham (i.e.homologia % = número de posições idênticas / número total de posições χ100). Os programas e algoritmos usados para determinar a homologia sãodescritos acima.

Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma ω-3-dessaturase, Δό-dessaturase, Δ-5-dessaturase, A5-alongase, A4-dessaturasee/ou Δ-6-alongase que é usada no processo e que é homóloga a uma seqüênciade proteína de SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 172, SEQ IDNO. 52, SEQ ID NO. 194 ou SEQ ID NO. 78 pode ser gerada pela introduçãode uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo em umaseqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.171, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 193 ou SEQ ID NO. 77, de modo que umaou mais substituições, adições ou deleções sejam introduzidas na proteínacodificada. Mutações podem ser introduzidas em relação a uma dasseqüências de SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 171, SEQ IDNO. 51, SEQ ID NO. 193 ou SEQ ID NO. 77 por técnicas padrão tais comomutagênese sítio-específica e mutagênese mediada por PCR. Substituiçõesconservativas de aminoácido são preferivelmente produzidas em um ou maisdos resíduos de aminoácido não-essenciais preditos. Em uma "substituiçãoconservativa de aminoácido" o resíduo de aminoácido é substituído por umresíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral similar. Famílias deresíduos de aminoácido possuindo cadeias laterais similares têm sidodefinidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias lateraisbásicas (e.g. lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (e.g. ácidoaspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (e.g.glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeiaslaterais não-polares (e.g. alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenil-alanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (e.g.treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g. tirosina, fenil-alanina, triptofano, histidina). Um resíduo de aminoácido predito não-essencial em uma ω-3-dessaturase, Δ-6-dessaturase, A5-dessaturase, Δ5-alongase, A4-dessaturase ou Δ-6-alongase é portanto preferivelmentesubstituído por outro resíduo de aminoácido de mesma família de cadeialateral. Uma possibilidade alternativa em outra modalidade é a introdução demutações aleatoriamente sobre o todo ou uma parte da seqüência codificadorade ω-3-dessaturase, Δό-dessaturase, A5-dessaturase, 5-alongase, Δ4-dessaturase ou Δό-alongase, e.g. por mutagênese de saturação, e os mutantesresultantes podem ser selecionados para a atividade de ω-3-dessaturase, Δ6-dessaturase, Δ-5-dessaturase, Δ-5-alongase, Δ-4-dessaturase ou Δ-6-alongaseaqui descrita com o objetivo de identificar mutantes que têm retido a atividadede ω-3-dessaturase, Δό-dessaturase, A5-dessaturase, A5-alongase,A4-dessaturase ou Δό-alongase. A proteína codificada pode serrecombinantemente expressada após a mutagênese, e a atividade da proteínapode ser determinada por exemplo pelo uso de ensaios aqui descritos.

A invenção é ilustrada com mais detalhe pelos exemplos queseguem, que não são para serem entendidos como limitantes. O conteúdo detodas as referências, pedidos de patente, patentes e pedidos de patentepublicados citados no presente pedido de patente é com este aqui incorporadocomo referência.

A seguinte tabela mostra os identificadores de seqüência comousados no pedido de prioridade de 21 de fevereiro de 2006, com o número depedido alemão de 102006008030.0, e os correspondentes identificadores deseqüência neste pedido de subseqüente. A seqüência de ácido nucleicoidentificada por SEQ ID NO: 1 do pedido de prioridade corresponde porexemplo à seqüência de ácido nucleico identificada por SEQ ID NO: 64 dopedido subseqüente.

Tabela de concordância de identificadores de seqüência do pedido deprioridade e dos identificadores de seqüência no pedido subseqüente:

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Exemplos

Exemplo 1: Processos de clonagem geral

Os processos de clonagem tais como, por exemplo, clivagensde restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação de fragmentos deDNA, transferência de ácidos nucleicos para membranas de nitrocelulose e denáilon, ligação de fragmentos de DNA, transformação de células deEscherichia coli, culturas bacterianas e as análises subseqüentes de DNArecombinante foram realizados como descrito por Sambrook et al. (1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).

Exemplo 2: Analise de seqüência de DNA recombinante

Moléculas de DNA recombinantes foram seqüenciadas comum seqüenciador de DNA de fluorescência de laser ABI pelo processo deSanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467).Fragmentos resultantes de uma reação em cadeia de polimerase foramseqüenciados e verificados que evitam erros de polimerase em construtos aserem expressados.

Exemplo 3: Clonagem de genes de Ostreococcus tauri

Foi possível por pesquisa de regiões conservadas em um bancode dados de seqüência de Ostreococcus tauri (seqüências genômicas) em cadacaso uma seqüência codificadora de uma proteína possuindo atividade de Δ-5-alongase ou atividade de Δ-6-alongase. Estas sao as seguintes sequencias:

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OtElo2.1 mostra similaridade maior a uma alongase de Daniorerio (GenBank AAN77156; aproximadamente de 26% de identidade),enquanto que OtElol5I mostra similaridade maior à alongase dePhyscomitrella (PSE) (aproximadamente 36% de identidade) (alinhamentosforam realizados com o algoritmo tBLASTn (Altschul et al. (1990) J. Mol.Biol. 215:,403 - 410) ).

A clonagem das alongases foi realizada como segue:40 ml de uma cultura de Ostreococcus tauri na faseestacionária foram centrifugados e ressuspensos em 100 μΐ de águaduplamente destilada e armazenados a -20°C. Os DNA genômicoscorrespondentes foram amplificados pelo processo de PCR. Os pares deiniciadores correspondentes foram selecionados de modo que hospedassem aseqüência de consenso de levedura para tradução de eficiência alta (Kozak(1986) Cell 44: 283-292) além do códon de iniciação. Amplificação dosOtElo DNAs foi realizada em cada caso com 1 μl de células descongeladas,dNTPs 200 μΜ, 2,5 U de Taq polimerase e 100 pmol de cada iniciador emum volume total de 50 μl. As condições para a PCR foram como segue:primeira desnaturação a 95°C por 5 minutos, seguido por 30 ciclos a 94°C por30 segundos, 55°C por 1 minuto e 72°C por 2 minutos, e uma etapa dealongamento final a 72°C por 10 minutos.

Exemplo 4: Otimização de genes de alongase de Ostreococcus tauri

Alongases do organismo Ostreococcus tauri foram isoladascomo descrito em exemplo 3. Com o objetivo de aumentar o conteúdo deácidos graxos C22, as seqüências SEQ ID No. 143 (A6-alongase) e SEQ IDNo. 109 (codificadora de uma proteína identificada por SEQ ID No. 110) (Δ5-alongase) foram adaptadas ao uso de códon em colza, linho e feijão-soja. Paraeste propósito, a seqüência de aminoácidos de Δ6-alongase e de Δ5-alongase(SEQ ID NO. 144 para Δ6-alongase; SEQ ID NO. 65 para a A5-alongase) foitraduzida de volta para obter seqüências de DNA degeneradas. Estasseqüências de DNA foram adaptadas por meio do programa GeneOptimizer(de Geneart, Regensburg) ao uso de códon em colza, feijão-soja e linho,levando-se em consideração a freqüência natural de códons individuais. Asseqüências otimizadas obtidas neste modo, que são indicadas em SEQ ID NO.64 (Δ5-alongase) e SEQ ID NO. 122 (codificadora de uma proteínaidentificada por SEQ ID NO. 123) (Δό-alongase) foram sintetizadas in vitro.

Exemplo 5: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão heterólogaem leveduras

Para caracterizar a função das seqüências de ácido nucleicootimizadas, as matrizes de leitura abertas dos respectivos DNAs foramclonadas a jusante do promotor GALl induzível por galactose depYES2. 1/V5-His-TOPO (Invitrogen), resultando nos plasmídeos pOTE1.2(compreendendo à seqüência de Δ6-alongase) e pOTE2.2 (compreendendo aseqüência de Δ5-alongase).

Visão geral das seqüências de alongase clonadas no vetor de levedurapYES2.1/V5-His-TOPO:

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A cepa 334 de Saccharomyces cerevisiae foi transformada poreletroporação (1500 V) com os vetores pOTE1.2 e pOTE2.2 e com osconstrutos comparativos pOTEl.l e pOTE2.1 que compreendem a seqüênciade ácido nucleico natural codificadora de Δ6-alongase e A5-alongase,respectivamente. Uma levedura transformada com o vetor vazio pYES2 foiusada como um controle. As leveduras transformadas foram selecionadassobre placas de ágar de meio mínimo completo (CMdum) com glicose 2%mas sem uracil. Após a seleção, três transformantes em cada caso foramselecionados para expressão funcional adicional.

Para expressar as alongases Ot, inicialmente pré-culturascompostas em cada caso de 5 ml de meio líquido CMdum com rafinose 2%(p/v) mas sem uracil foram inoculadas com os transformantes selecionados eincubadas a 30°C, 200 rpm por 2 dias. 5 ml de meio líquido CMdum (semuracila) com rafinose 2% foram então inoculadas com as pré-culturas parauma OD600 de 0,05. Além disso, ácido γ-linolênico (GLA) 0,2 raM foiadicionado em cada caso na cultura de levedura transformada com pOTEl. 1 epOTE1.2. Baseado na atividade de OtELO 1.1, é para ser esperado umalongamento do ácido γ-linolênico para ácido graxo 20:3. Ácido araquidônicoe ácido eicosapentaenóico respectivamente 0,2 mM foram adicionados emcada caso na cultura de levedura transformada com pOTE2.1 e pOTE2.2.Correspondendo a uma atividade de 0tEL02.1, é para ser esperado que osácidos graxos ARA e EPA serão alongados respectivamente para os ácidosgraxos 22:4 e 22:5. Expressão foi induzida pela adição de galactose 2% (p/v) .As culturas foram incubadas a 20°C por mais 96 h.

Exemplo 6: Expressão de OtELQ2.2 (como mostrado em SEQ ID NO: 64) eOtELO 1.2 (como em SEO ID NO: 122) em leveduras

Leveduras transformadas como em exemplo 5 com osplasmídeos pYES2, pOTE1.2 e pOTE2.1, foram analisadas na seguintemaneira:

As células de levedura das culturas principais foram colhidaspor centrifugação (100, χ g, 5 min, 20°C) e lavadas com NaHCO3 100 mM,pH 8,0, com o objetivo de remover o meio restante e os ácidos graxos. Metil-ésteres de ácido graxo (FAMEs) foram preparados dos sedimentos de célulade levedura por metanólise ácida. Para este propósito, os sedimentos de célulaforam incubados com 2 mL de ácido sulfurico metanólico 1 N e dimetóxi-propano 2% (v/v) a 80°C por 1 h. Os FAMES foram extraídos por extraçãoduas vezes com éter de petróleo (PE). Para remover ácidos graxos nãoderivados, as fases orgânicas foram lavadas uma vez com 2 ml de NaHCO3100 mM, pH 8,0 e com 2 ml de água destilada. As fases PE foram então secascom Na2S04, evaporadas sob argônio e recolhidas em 100 μΐ de PE. Asamostras foram separadas em uma coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm,0,25 μιη, Agilent) em um cromatógrafo a gás Hewlett-Packard 6850 comdetector de ionização de chama. As condições para a análise por GLC foramas seguintes: a temperatura de forno foi programada de 50°C a 250°C em umavelocidade de 5°C/min e finalmente 10 min a 250°C (manutenção).

Os sinais foram identificados por comparação dos tempos deretenção com padrões de ácido graxo apropriados (Sigma). A metodologia édescrita por exemplo em Napier e Michaelson (2001) Lipids 36(8) : 761-766;Sayanova et al. (2001) Journal of Experimental Botany 52(360) : 1581-1585,Sperling et al. (2001) Arch. Biochem. Biophys. 388(2) : 293-298 eMichaelson et al. (1998) FEBS Letters 439(3) : 215-218. Os resultados dasanálises são mostrados em tabela 1.

Foi possível confirmar as atividades apropriadas de ambospara pOTE 1.1 /pOTE 1.2 e para pOTE2.1/2.2. A seqüência otimizada(respectivamente pOTE1.2 e pOTE2.2) mostrou atividade em ambos os casos.

Síntese de ácido γ-linolênico pôde ser aumentada apenas ligeiramente porpOTE1.2 comparado com a seqüência de tipo selvagem. Em contraste, foipossível observar para pOTE2.2 surpreendentemente tento um aumento naatividade quanto uma alteração na especificidade (tabela 1). Nesta conexão, aatividade para alongamento de EPA havia virtualmente dobrado, enquantoque o alongamento de ARA havia mais do que quadruplicado. Assim foipossível com a otimização da seqüência da A5-alongase de Ostreococcus tauriaumentar o rendimento dos precursores de DHA 6-vezes em levedura com amesma quantidade de substrato.

Exemplo 7: Clonagem de plasmídeos de expressão para a expressãoespecífica de semente em plantas

As seguintes condições gerais descritas aplicam-se a todos osexperimentos subseqüentes a não ser que seja descrito de outro modo.

pBinl9, pBIlOl, pBinAR, pGPTV, pCAMBIA ou pSUN sãopreferivelmente usados para os seguintes experimentos de acordo com ainvenção. Uma visão geral dos vetores binários e de seu uso pode serencontrada em Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5: 446-451. Umderivado de pGPTV como descrito em DE10205607 foi usado. Este vetordifere de pGPTV por um sítio de clivagem de restrição AscI adicionalmenteinserido.

Ponto de partida do procedimento de clonagem do vetor declonagem pUC 19 (Maniatis et al.) . Na primeira etapa, o fragmento depromotor de conlinina foi amplificado usando os seguintes iniciadores:Cnll C 5': gaattcggcgcgccgagctcctcgagcaacggttccggcggtatagagttgggtaattcgaCnll C 3': cccgggatcgatgccggcagatctccaccattttttggtggtgatComposição da mistura de PCR (50 μl) :

5,00 μl de cDNA modelo

5,00 μl de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM

5,00 μl de dNTP 2 mM

1,25 μl de cada iniciador (10 pmol/μl)

0,50 μl de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:

Temperatura de anelamento: 1 min 55°C

Temperatura de desnaturação: 1 min 94°C

Temperatura de alongamento: 2 min 12°C

Número de ciclos: 35

O produto de PCR foi primeiro incubado por 2 horas a 37°Ccom a enzima de restrição EcoRI e então por 12 horas a 25°C com a enzimade restrição SmaI. O vetor de clonagem pUC19 foi incubado na mesmamaneira. Depois, o produto de PCR e o vetor clivado de 2668 pb foramseparados por eletroforese em gel de agarose e os correspondentes fragmentosde DNA foram excisados. O DNA foi purificado por meio do Qiagen GelPurification Kit seguindo as instruções do fabricante. Depois, vetor e produtode PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit da Roche foi usado para estepropósito. O plasmídeo resultante pUC19-Cn11-C foi verificado porseqüenciamento.

Na etapa seguinte, o terminador OCS (Genbank AccessionV00088; De Greve, H., et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 (6) : 499-511) foiamplificado do vetor pGPVT-USP/OCS (DE 102.05.607) usando os seguintesiniciadores:

OCS_C 5': aggcctccatggcctgctttaatgagatatgcgagacgcc

OCS_C 3': cccgggccggacaatcagtaaattgaacggag

Composição da mistura de PCR (50 μl) :

5,00 μl de cDNA modelo5,00 μl de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM

5,00 μl de dNTP 2 mM

1,25 μl de cada iniciador (10 pmol/μl)

0,50 μl de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:

Temperatura de anelamento: 1 min 55°C

Temperatura de desnaturação: 1 min 94°C

Temperatura de alongamento: 2 min 12°C

Número de ciclos: 35

O produto de PCR foi primeiro incubado por 2 horas a 37°Ccom a enzima de restrição StuI e então por 12 horas a 25°C com a enzima derestrição SmaI. O vetor pUC 19-Cn11-C foi incubado por 12 horas a 25°Ccom a enzima de restrição SmaI. Depois, o produto de PCR e o vetor clivadoforam separados por eletroforese em gel de agarose e os correspondentesfragmentos de DNA foram excisados. O DNA foi purificado por meio doQiagen Gel Purification Kit seguindo as instruções do fabricante. Depois,vetor e produto de PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit da Roche foiusado para este propósito. O plasmídeo resultante pUC19-Cn11-C_OCS foiverificado por seqüenciamento.

Na etapa seguinte, o promotor Cnll-B foi amplificado porPCR por meio dos seguintes iniciadores:

Cn11B 5': aggcctcaacggttccggcggtatag

Cn11B 3': cccggggttaacgctagcgggcccgatatcggatcccattttttggtggtgattggttctComposição da mistura de PCR (50 μl) :

5,00 μl de cDNA modelo

5,00 μl de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM

5,00 μl de dNTP 2 mM

1,25 μl de cada iniciador (10 pmol/μl)

0,50 de Advantage polimerase (Clontech)Condições da reação PCR:

Temperatura de anelamento: 1 min 55°CTemperatura de desnaturação: 1 min 94°CTemperatura de alongamento: 2 min 72°CNúmero de ciclos: 35

O produto de PCR foi primeiro incubado por 2 horas a 37°Ccom a enzima de restrição StuI e então por 12 horas a 25°C com a enzima derestrição SmaI: O vetor pUC19-Cnll-C foi incubado por 12 horas a 25°C coma enzima de restrição SmaI. Depois, o produto de PCR e o vetor clivadoforam separados por eletroforese em gel de agarose e os correspondentesfragmentos de DNA foram excisados. O DNA foi purificado por meio doQiagen Gel Purification Kit seguindo as instruções do fabricante. Depois,vetor e produto de PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit da Roche foiusado para este propósito. O plasmídeo resultante pUC19-Cnll-C_Cnll_BOCS foi verificado por seqüenciamento.

Em uma outra etapa, o terminador OCS para CnllB foiinserido. Para este fim, a PCR foi realizada usando os seguintes iniciadores:

OCS2 5': aggcctcctgetttaatgagatatgcgagacOCS2 3': cccgggcggacaatcagtaaattgaacggag

Composição da mistura de PCR (50 μΐ):

5,00 μΐ de cDNA modelo

5,00 μΐ de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM

5,00 μΐ de dNTP 2 mM

1,25 μΐ de cada iniciador (10 pmol/μΐ)

0,50 μΐ de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:Temperatura de anelamento: 1 min 550CTemperatura de desnaturação: 1 min 94°CTemperatura de alongamento: 2 min 12°CNúmero de ciclos: 35

O produto de PCR foi primeiro incubado por 2 horas a 37°Ccom a enzima de restrição StuI e então por 12 horas a 25°C com a enzima derestrição SmaI. O vetor pUC 19-CnllC_CnllB_OCS foi incubado por 12horas a 250C com a enzima de restrição SmaI. Depois, o produto de PCR evetor clivado foram separados por eletroforese em gel de agarose e osfragmentos de DNA correspondentes foram excisados. O DNA foi purificadopor meio do Qiagen Gel Purification Kit seguindo as instruções do fabricante.

Depois, vetor e produto de PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit daRoche foi usado para este propósito. O plasmídeo resultante pUC19-Cnll-C_CnllB_OCS2 foi verificado por seqüenciamento.

Na etapa seguinte, o promotor Cnll-A é amplificado por PCRusando os seguintes iniciadores:

Cnll-B 5': aggcctcaacggttccggcggtatagagCnl 1-B 3': aggccttctagactgcaggcggccgcccgcattttttggtggtgattggt

Composição da mistura de PCR (50μ1):5,00 μΐ de cDNA modelo

5,00 μΐ de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM5,00 μΐ de dNTP 2 mM1,25 μΐ de cada iniciador (10 pmol/μΐ)

0,50 μΐ de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:Temperatura de anelamento: 1 min 55°CTemperatura de desnaturação: 1 min 94°CTemperatura de alongamento: 2 min 72°CNúmero de ciclos: 35

O produto de PCR foi incubado por 2 horas a 37°C com aenzima de restrição StuI. O vetor pUC19-Cnll-C foi incubado por 12 horas a25°C com a enzima de restrição SmaI. Depois, o produto de PCR e vetorclivado foram separados por eletroforese em gel de agarose e oscorrespondentes fragmentos de DNA foram excisados. O DNA foi purificadopor meio do Qiagen Gel Purification Kit seguindo as instruções do fabricante.

Depois, vetor e produto de PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit daRoche foi usado para este propósito. O plasmídeo resultantepUC 19Cnl 1 C_Cnl 1 BCnl 1A 0CS2 foi verificado por seqüenciamento.

Em uma outra etapa, o terminador OCS para CnllA foiinserido. Para este fim, a PCR foi realizada com os seguintes iniciadores:

OCS2 5': ggcctcctgctttaatgagatatgcgaOCS2 3': aagcttggcgcgccgagctcgtcgacggacaatcagtaaattgaacggaga

Composição da mistura de PCR (50 μΐ):5,00 μΐ de cDNA modelo

5,00 μΐ de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM5,00 μΐ de dNTP 2 mM1,25 μΐ de cada iniciador (10 pmol/μΐ)

0,50 μΐ de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:

Temperatura de anelamento: 1 min 55°CTemperatura de desnaturação: 1 min 94°CTemperatura de alongamento: 2 min 72°CNúmero de ciclos: 35

O produto de PCR foi primeiro incubado por 2 horas a 37°Ccom a enzima de restrição StuI e então por 2 horas a 37°C com a enzima derestrição HindIII. O vetor pUC19-Cnll-C_CnllB_CnllA_OCS2 foi incubadopor 2 horas a 37°C com a enzima de restrição StuI e for 2 horas a 37°C com aenzima de restrição HindIII. Depois, o produto de PCR e vetor clivado foramseparados por eletroforese em gel de agarose e os correspondentes fragmentosde DNA foram excisados. O DNA foi purificado por meio do Qiagen GelPurification Kit seguindo as instruções do fabricante. Depois, vetor e produtode PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit da Roche foi usado para estepropósito. O plasmídeo resultante PUC19Cnll-C_CnllB_CnllA_OCS3 foiverificado por seqüenciamento.

Na etapa seguinte, o plasmídeopUC 19Cnl 1 C Cnl 1 B Cnl 1A OC S3 foi usado para clonar as Δ6-, Δ5-dessaturase e Δό-alongase. Para este fim, a Δό-dessaturase de Phytiumirregulare (W002/26946) foi amplificada usando os seguintes iniciadores de PCR:

D6Des(Pir) 5': agatctatggtggacctcaagcctggagtgD6Des(Pir) 3': ccatggcccgggttacatcgctgggaactcggtgat

Composição da mistura de PCR (50 μΐ):

5,00 μΐ de cDNA modelo

5,00 μΐ de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM5,00 μΐ de dNTP 2 mM1,25 μΐ de cada iniciador (10 pmol/μΐ)

0,50 μΐ de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:

Temperatura de anelamento: 1 min 55°CTemperatura de desnaturação: 1 min 94°CTemperatura de alongamento: 2 min 12°CNúmero de ciclos: 35

O produto de PCR foi primeiro incubado por 2 horas a 37°Ccom a enzima de restrição BglII e então por 2 horas a 37°C com a enzima derestrição NcoI. O vetor pUC19-CnllC_CnllB_CnllA_OCS3 foi incubadopor 2 horas a 37°C com a enzima de restrição BglII e for 2 horas a 37°C coma enzima de restrição NcoI. Depois, o produto de PCR e vetor clivado foramseparados por eletroforese em gel de agarose e os correspondentes fragmentosde DNA foram excisados. O DNA foi purificado por meio do Qiagen GelPurification Kit seguindo as instruções do fabricante. Depois, vetor e produtode PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit da Roche foi usado para estepropósito. O plasmídeo resultante PUC19Cn11_d6Des(Pir) foi verificado porseqüenciamento.

Na etapa seguinte, o plasmídeo pUC19-Cn11_d6Des(Pir) foiusado para clonar a A5-deaaturase de Thraustochytrium ssp. (W002/26946).

Para este fim, a A5-dessaturase de Thraustochytrium ssp. foi amplificadausando os seguintes iniciadores de PCR:

D5Des(Tc) 5': gggatccatgggcaagggcagcgagggccg

D5Des(Tc) 3': ggcgccgacaccaagaagcaggactgagatatc

Composição da mistura de PCR. (50 μl) :

5,00 μl de cDNA modelo

5,00 μl de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM

5,00 μl de dNTP 2 mM

1,25 μl de cada iniciador (10 pmol/μl)

0,50 μl de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:

Temperatura de anelamento: 1 min 550C

Temperatura de desnaturação: 1 min 94°C

Temperatura de alongamento: 2 min 12°C

Número de ciclos: 35

O produto de PCR foi primeiro incubado por 2 horas a 37°Ccom a enzima de restrição BamHI e então por 2 horas a 37°C com a enzimade restrição EcoRV. O vetor PUC19-Cn11_d6Des(Pir) foi incubado por 2horas a 37°C com a enzima de restrição BamHI e for 2 horas a 37°C com aenzima de restrição EcoRV. Depois, o produto de PCR e vetor clivado foramseparados por eletroforese em gel de agarose e os correspondentes fragmentosde DNA foram excisados. O DNA foi purificado por meio do Qiagen GelPurification Kit seguindo as instruções do fabricante. Depois, vetor e produtode PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit da Roche foi usado para estepropósito. O plasmídeo resultante pUC19Cnll_d6Des(Pir) _d5Des(Tc) foiverificado por seqüenciamento.

Na etapa seguinte, o plasmídeo pUC19-Cnll_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) foi usado para clonar a Δό-alongase de Physcomitrella patens(W001/59128), para cujo propósito a última foi amplificada usando osseguintes iniciadores de PCR:

D6Elo(Pp) 5': gcggccgcatggaggtcgtggagagattctacggtgD6Elo(Pp) 3': gcaaaagggagctaaaactgagtgatctaga

Composição da mistura de PCR (50 μΐ):5,00 μΐ de cDNA modelo

5,00 μΐ de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM5,00 μΐ de dNTP 2 mM1,25 μΐ de cada iniciador (10 pmol/μΐ)0,50 μΐ de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:

Temperatura de anelamento: 1 min 55°CTemperatura de desnaturação: 1 min 94°CTemperatura de alongamento: 2 min 72°CNúmero de ciclos: 35

O produto de PCR foi primeiro incubado por 2 horas a 37°Ccom a enzima de restrição NotI e então por 2 horas a 37°C com a enzima derestrição XbaI. O vetor pUC 19Cnll_d6Des(Pir) _d5Des(Tc) foi incubado por2 horas a 37°C com a enzima de restrição NotI e por 2 horas a 37°C com aenzima de restrição XbaI. Depois, o produto de PCR e vetor clivado foramseparados por eletroforese em gel de agarose e os correspondentes fragmentosde DNA foram excisados. O DNA foi purificado por meio do Qiagen GelPurification Kit seguindo as instruções do fabricante. Depois, vetor e produtode PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit da Roche foi usado para estepropósito. O plasmídeo resultante pUC19-Cnll_ dóDes(Pir) dsDes(Tc)_D6Elo(Pp) foi verificado por seqüenciamento.

O vetor binário para a transformação de plantas foi preparadopartindo de pUC19Cnll_d6Des(Pir) _d5Des(Tc) _D6Elo(Pp) . Para este fim,pUC 19-Cnl l_d6Des(Pir) dsDes(Tc) _D6Elo(Pp) foi incubado por 2 horas a37°C com a enzima de restrição AscL O vetor pGPTV foi tratado na mesmamaneira. Depois, o fragmento de pUC19-Cnll_d6Des(Pir) _d5Des(Tc)_D6E Io(Pp) e vetor pGPTV clivado foram separados por eletroforese em gelde agarose e os correspondentes fragmentos de DNA foram excisados. ODNA foi purificado por meio de Qiagen Gel Purification Kit seguindo asinstruções do fabricante. Depois, vetor e produto de PCR foram ligados. ORapid Ligation Kit da Roche foi usado para este propósito. O plasmídeoresultante pGPTV-Cnll_d6Des(Pir) _d5Des(Tc) _D6Elo(Pp) foi verificadopor seqüenciamento.

Um outro construto, pGPTV- Cnll dóDes(Pir) _d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) _D12Des(Co), foi usado. Para este fim, a amplificação foirealizada com os seguintes iniciadores, partindo de PUC19-CnllC_OCS:

Cnll OCS 5': gtcgatcaacggttccggcggtatagagttgCnll OCS 3,: gtcgatcggacaatcagtaaattgaacggaga

Composição da mistura de PCR (50μ1) :

5,00 μΐ de cDNA modelo

5,00 μΐ de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM5,00 μΐ de dNTP 2 mM1,25 μΐ de cada iniciador (10 pmol/μΐ)0,50 μΐ de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:

Temperatura de anelamento: 1 min 55°CTemperatura de desnaturação: 1 min 94°CTemperatura de alongamento: 2 min 72°CNúmero de ciclos: 35O produto de PCR foi incubado por 2 horas a 37°C com aenzima de restrição SalI. O vetor pUC19 foi incubado por 2 horas a 37°C coma enzima de restrição SalI. Depois, o produto de PCR e o vetor clivado foramseparados por eletroforese em gel de agarose e os correspondentes fragmentosde DNA foram excisados. O DNA foi purificado por meio de Qiagen GelPurification Kit seguindo as instruções do fabricante. Depois, vetor e produtode PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit da Roche foi usado para estepropósito. O plasmídeo resultante pUC19-Cnll_OCS foi verificado porseqüenciamento.

Em uma outra etapa, o gene de A12-dessaturase de Calendulaofficinalis (WOOl/85968) foi clonado em pUC19-Cnll_0CS. Para este fim,dl2Des(Co) foi amplificado com os seguintes iniciadores:

D12Des(Co) 5': agatctatgggtgcaggcggtcgaatgcD12Des(Co) 3': ccatggttaaatcttattacgatacc

Composição da mistura de PCR (50 μΐ) :

5,00 μΐ de cDNA modelo

5,00 μΐ de tampão IOx (Advantage polimerase) + MgCl2 25mM5,00 μΐ de dNTP 2 mM1,25 μΐ de cada iniciador (10 pmol/μΐ)0,50 μΐ de Advantage polimerase (Clontech)

Condições da reação PCR:

Temperatura de anelamento: 1 min 5 5 0CTemperatura de desnaturação: 1 min 94°CTemperatura de alongamento: 2 min 72°CNúmero de ciclos: 35

O produto de PCR foi incubado por 2 horas a 37°C com aenzima de restrição Bg/II e depois for 2 horas na mesma temperatura comNcoI. O vetor pUC19-Cnll_OCS foi incubado na mesma maneira. Depois, Ofragmento de PCR e o vetor clivado foram separados por eletroforese em gelde agarose e os correspondentes fragmentos de DNA foram excisados. ODNA foi purificado por meio de Qiagen Gel Purification Kit seguindo asinstruções do fabricante. Depois, vetor e produto de PCR foram ligados. ORapid Ligation Kit da Roche foi usado para este propósito. O plasmídeoresultante pUC 19-Cnl 1_D 12Des(Co) foi verificado por seqüenciamento.

O plasmídeo pUC19-Cnll_D12Des(Co) e o plasmídeopUC 19-Cnl l dóDes(Pir) _d5Des(Tc) _D6Elo(Pp) foram incubados por 2horas a 37°C com a enzima de restrição SalI. Depois, o fragmento de vetor e ovetor clivado foram separados por eletroforese em gel de agarose e oscorrespondentes fragmentos de DNA foram excisados. O DNA foi purificadopor meio de Qiagen Gel Purification Kit seguindo as instruções do fabricante.

Depois, vetor e fragmentos de vetor foram ligados. O Rapid Ligation Kit daRoche foi usado para este propósito. O plasmídeo resultante pUC19-Cnl l_d6Des(Pir) _d5Des(Tc) _D6Elo(Pp) _D12Des(Co) foi verificado porseqüenciamento.

O vetor binário para a transformação de plantas foi preparadopartindo de pUCl9-Cnl l_d6Des(Pir) _d5Des(Tc) _D6Elo(Pp) _D12Des(Co).Para este fim, pUCl 9-Cnl l_d6Des(Pir) _d5Des(Tc) _D6Elo(Pp)_D12Des(Co) foi incubado por 2 horas a 37°C com a enzima de restriçãoAscL O vetor pGPTV foi tratado na mesma maneira. Depois, o fragmento depUC 19Cnl l_d6Des(Pir) _d5Des(Tc) _D6Elo(Pp) _D12Des(Cq) e o vetorpGPTV clivado foram separados por eletroforese em gel de agarose e oscorrespondentes fragmentos de DNA foram excisados. O DNA foi purificadopor meio de Qiagen Gel Purification Kit seguindo as instruções do fabricante.

Depois, vetor e produto de PCR foram ligados. O Rapid Ligation Kit daRoche foi usado para este propósito. O plasmídeo resultante pGPTV-Cnl l dóDes(Pir) _d5Des(Tc) _D6Elo(Pp) _D12Des(Co) foi verificado porseqüenciamento.

Um outro exemplo de uso dos construtos de expressãoespecífica de semente é o promotor Napin. Preparação destes construtos deexpressão nos vetores pGPTV ou pSUN é descrita em Wu et al. (2005) Nat.Biotech. 23:1013-1017.

Um outro vetor adequado para transformação de planta épSUN2. Este vetor foi usado em combinação com o sistema Gateway(Invitrogen, Karlsruhe) com o objetivo de aumentar o número de cassetes deexpressão presentes no vetor para mais do quatro. Para este propósito, ocassete A Gateway foi inserido no vetor pSUN2 de acordo com as instruçõesdo fabricante, como descrito abaixo:

O vetor pSUN2 (1 μΒ) foi incubado com a enzima de restriçãoEcoRV a 37°C por 1 h. O cassete A Gateway (Invitrogen, Karlsruhe) foientão ligado no vetor cortado usando o Rapid Ligation kit da Roche,Mainnheim. O plasmídeo resultante foi transformado em células E. coliDB3.1 (Invitrogen). O plasmídeo pSUN-GW isolado foi então verificado porseqüenciamento.

Na segunda etapa, o cassete de expressão foi cortado depUC19- Cnll_d6Des(Pir) _d5Des(Tc) _D6Elo(Pp) _D12Des(Co) usando AscIe ligado em vetor pSUN-GW igualmente tratado. O plasmídeo obtido nestamaneira pSUN-4G foi usado para outros construtos de gene.

Para este propósito, primeiramente um clone pENTR foimodificado de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Oplasmídeo pENTRIA (Invitrogen) foi incubado com a enzima de restriçãoEcoRI a 37°C por 1 h e então tratado com enzima Klenow e com uma misturade dNTP 1 μΜ por 30 min, e subseqüentemente o adaptador AscI (5'-ggcgcgcc; fosforilado na extremidade 5', de fita dupla) foi ligado no vetorpENTR IA. Os genes foram inseridos como descrito acima em etapas nocassete Cnl e estes foram modificados e transferidos via AscI no vetorpENTR, resultando no vetor pENTR-Cnl.

Em uma outra etapa, o construto pSUN-8G foi preparado. Paraeste propósito, iniciadores 5' e 3' para os genes com as SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e7 com os sítios de clivagem de restrição descritos acima e com os primeiros eem cada caso últimos 20 nucleotídeos da matriz de leitura aberta foramproduzidos e amplificados com as condições padrão (veja acima) e ligados novetor pENTRCnl, que foi subseqüentemente submetido a uma reação derecombinação com o vetor pSUN-4G de acordo com as instruções dofabricante.

O construto pSUN-8G foi preparado nesta maneira e foitransformado em Brassica juncea e Brassica napus. As sementes das plantastransgênicas foram analisadas por cromatografia gasosa.

Um outro construto que foi usado para transformação de B.juncea e B. napus foi o construto pSUN-9G. Este construto foi preparado deacordo com Wu et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1013-1017 com o promotornapina. Em uma modificação de Wu et al. 2005, a seqüência codificadora de0tEL02.2 foi inserida na maneira descrita em vez de o gene OmELO. Oconstruto resultante pSUN-9G foi então transformado em B. juncea e B.napus.

Exemplo 8: Extração de lipídeo do material de planta

O efeito da modificação genética em plantas sobre a produçãode composto desejado (tal como um ácido graxo) pode ser determinado pelocrescimento da planta modificada sob condições adequadas (tais comoaquelas descritas acima) e análise do meio e/ou dos componentes celularespara a produção elevada do produto desejado (i.e. de lipídeos ou um ácidograxo). As técnicas analíticas são conhecidas pelo técnico experiente ecompreendem espectroscopia, cromatografia em camada fina, vários tipos deprocessos de coloração, processos enzimáticos e microbiológicos ecromatografia analítica tal como cromatografia líquida de desempenho alto(veja, por exemplo, Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2,p. 89-90 e p. 443-613, VCH: Weinheim (1985) ; Fallon A. et al. (1987)"Applications of HPLC in Biochemistry" em: Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology, Vol. 17; Rehm et al. (1993)Biotechnology, Vol. 3, Capítulo III: "Product recovery and purification", p.469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparation:downstream processing for Biotechnology, John Wiley e Sons; Kennedy, J.F.,e Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, JohnWiley e Sons; Shaeiwitz, J.A., e Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations,em: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3; Capítulo 11, p.1-27, VCH: Weinheim; e Dechow, F.J. (1989) Separation and purificationtechniques in biotechnology, Noyes Publications).

Em adição aos processos acima mencionados, os lipídeos deplanta são extraídos do material de planta como descrito por Cahoon et al.(1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22) :12935-12940 e Browse et al.(1986) Analytic Biochemistry 152:141-145. A análise qualitativa equantitativa de lipídeos ou ácidos graxos é descrita por Christie, William W.,Advances in Lipid Methodology, Ayr, Scotland: Oily Press (Oily Press LipidLibrary; 2) ; Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. APractical Guide Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 pp.(Oily Press Lipid Library; 1) ; "Progress in Lipid Research, Oxford:Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) sob o título: "Progress in the Chemistryof Fats and Other Lipids CODEN".

Em adição a medição de produto final da fermentação,também é possível analisar outros componentes das rotas metabólicas que sãousados para a produção do composto desejado, tais como intermediários esubprodutos, com o objetivo de determinar a eficiência de produção total docomposto. Os processos analíticos compreendem medição da quantidade denutrientes no meio (por exemplo açúcares, hidrocarbonetos, fontes denitrogênio, fosfato e outros íons), medição da composição e do crescimentoda biomassa, análise da produção de metabólitos convencionais de rotas debiossíntese e medição de gases que são gerados durante a fermentação.Processos padrão para estas medições são descritas em Applied MicrobialPhysiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes e P.F. Stanbury, Ed., IRLPress, p. 103-129; 131-163 e 165-192 (ISBN: 0199635773) e referênciascitadas nos memos.

Um exemplo é a análise de ácidos graxos (abreviações:

FAME, metil-éster de ácido graxo; GC-MS, cromatografia gás-líquido /espectrometria de massa; TAG5 triacil-glicerol; TLC, cromatografia emcamada fina).

A detecção não-ambígua de produtos de ácido graxo pode serobtida por análise de organismos recombinantes usando processos analíticospadrão: GC, GC-MS ou TLC, como descrito em várias ocasiões por Christie eas referências lá citadas (1997, em Advances on Lipid Methodology, FourthEdition: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren [Processos de Cromatografia Gasosa /Espectrometri de Massa], Lipide 33:343-353).

O material a ser analisado pode ser rompido por sonicação,moagem em um moinho de vidro, nitrogênio líquido e moagem ou via outrosprocessos aplicáveis. Após rompimento, o material tem que ser centrifugado.

O sedimento é ressuspenso em água destilada, aquecido por 10 minutos a100°C, esfriado sobre gelo e recentrifiigado, seguido por extração por umahora a 90°C em ácido sulfórico 0,5 M em metanol com dimetóxi-propano 2%,que acarreta compostos de lipídeo e de óleo hidrolisados, que dá lipídeostransmetilados. Estes metil-ésteres de ácido graxo são extraídos em éter depetróleo e finalmente submetidos a uma análise de GC usando uma colunacapilar (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm)em um gradiente de temperatura de entre 170°C e 240°C por 20 minutos e 5minutos a 240°C. A identidade dos metil-ésteres de ácido graxo resultantespode ser definida usando padrões que estão disponíveis em fontes comerciais(i.e. Sigma).

Material de planta é inicialmente mecanicamentehomogeneizado por cominuição em um almofariz e pilão para torná-lo maistratável para extração.

Isto é seguido por aquecimento a 100°C por 10 minutos e,após esfriamento sobre gelo, por ressedimentação. O sedimento de célula éhidrolisado por uma hora a 90°C com ácido sulfurico metanólico 1 M edimetóxi-propano 2%, e os lipídeos são transmetilados. Os metil-ésteres deácido graxo (FAMEs) resultantes são extraídos em éter de petróleo. OsFAMEs extraídos são analisados por cromatografia de gás-líquido usandouma coluna capilar (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m,0,32 mm) e em um gradiente de temperatura de 170°C a 240°C em 20minutos e 5 minutos a 240°C. A identidade dos metil-ésteres de ácido graxo éconfirmada por comparação com padrões de FAME correspondentes (Sigma)A identidade e a posição da ligação dupla podem ser analisadasadicionalmente por derivação química adequada das misturas de FAME, porexemplo para dar derivados de 4,4-dimetóxi-azolina (Christie, 1998) por meiode GC-MS.

Exemplo 9: Uso de A5-alongase otimizada (como mostrada em SEQ ID NO:64) de Ostreococcus tauri para construtos para expressão constitutiva

Vetores de transformação baseados em pGPTV-35S, umplasmídeo baseado em pBIN19-35S (Bevan M. (1984) Nucl. Acids Res.18:203), foram produzidos para a transformação de plantas. Para estepropósito, primeiramente um cassete de expressão consistindo de elementopromotor CaMV35S (SEQ D No. 161) e do terminador 35S (SEQ ID NO.162; Franck, A. et al. (1980) Cell 21 (1) : 285294) foi montado em um vetorpUC. Isto exigiu que o promotor fosse inserido via os sítios de clivagem derestrição Sall/Xbal e o terminador via os sítios de clivagem de restriçãoBamHI/Smal. Em adição, um poliligador com o sítio de clivagem XhoI foiligado no terminador ('ligação tripla'). O plasmídeo resultante pUC19-35Sfoi então empregado para clonar genes PUFA. Em paralelo, as matrizes deleitura aberta das seqüências de Δό-dessaturase (SEQ ID NO. 1), Δ5-dessaturase (SEQ ID NO,51) e Δό-alongase (SEQ ID NO. 171) foraminseridas via o sítio de clivagem EcoRV em vetores pUC19-35S. Osplasmídeos resultantes pUC-D6, pUC-D5, pUC-E6(Tc) foram usados paraconstruir o vetor binário pGPTV-35S D6D5E6(Tc). Para este propósito, ovetor pGPTV foi digerido com a enzima SalI, o plasmídeo pUC-D6 foidigerido com Sall/Xhol, e os fragmentos corretos foram ligados. O plasmídeoresultante pGPTV-D6 foi então digerido com SalI, o plasmídeo pUC-D5 foidigerido com Sall/Xhol, e os fragmentos corretos foram ligados. O plasmídeoresultante pGPTV-D6-D5 foi então ligado uma vez mais com SalI, oplasmídeo pUC-E6(Tc) com Sall/Xhol, e os fragmentos corretos foramligados. Estas etapas de clonagem seqüencial resultaram no vetor bináriopGPTV-D6D5E6(Tc), que foi empregado para a transformação.

Em um outro procedimento, a seqüência de d6Elo(Tp) (SEQID NO. 163) foi inserida no vetor pUC19-35S em vez de a seqüênciad6Elo(Tc). O plasmídeo resultante pUC-E6(Tp) foi usado para preparar ovetor binário pGPTV-35S_D6D5E6(Tp).

Em um outro procedimento, a matriz de leitura aberta de(o3Des (SEQ ID NO. 193) foi clonada em pUC19-35S. O plasmídeoresultante pUC-co3Pi foi transferido via Sall/Xhol para dentro do vetoresbinários pGPTV-D6D5E6(Tc) e pGPTV-D6D5E6(Tp). Os vetoresresultantes pGPTVD6D5E6(Tc) ω3Ρΐ e pGPTV-D6D5E6(Tp) ω3Ρί foramempregados para a transformação de planta.

Em um outro procedimento, a matriz de leitura aberta da Δ5-alongase otimizada de Ostreococcus tauri (SEQ ID No. 64) e a matriz deleitura aberta da A4-dessaturase de Thraustochytrium sp. (SEQ ID No. 77)foram clonadas em pUC19-35S. Os plasmídeos resultantes pUC-E5 e pUC-D4 foram então transferidos via Sall/Xhol de acordo com as informaçõesacima para dentro do vetor pGPTV-D6D5E6(Tp) co3Pi. O vetor resultantepGPTVD6D5E6(Tp) a>3PiE5D4 foi empregado para a transformação deplanta.

Todos os vetores binários foram transformados em células E.coli DH5a (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Clonespositivos foram identificados por PCR5 e DNA plasmídeo foi isolado (QiagenDneasy).

Exemplo 10: Transformação de vetores binários constitutivos em plantasa) Geração de plantas transgênicas Brassica napus e Brassica juncea. Oprotocolo para a transformação de planta colza foi usado (modificação deMoloney et al. (1992) Plant Cell Reports 8:238-242)

O vetor binário pGPTV-D6D5E6(Tp) co3PiE5D4 foitransformado em Agrobacterium tumefaciens C58Cl:pGV2260 (Deblaere etal. (1984) Nucl Acids. Res. 13: 4777-4788). Uma diluição de 1:50 de umacultura noturba da colônia agrobacteriana positivamente transformada emmeio Murashige-Skoog (Mur ashige e Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473)suplementada com sacarose 3% (meio 3MS) foi usada para a transformaçãode Orychophragmus violaceus. Pecíolos ou hipocótilos de plantas estéreisrecentemente germinadas (em cada caso aproximadamente de 1 cm ) foramincubados com uma diluição de agrobactérias de 1:50 por 5-10 minutos emuma placa de Petri. Isto é seguido por 3 dias de coincubação no escuro a 25°Csobre meio 3MS suplementado com ágar Bacto 0,8%. Depois, o cultivo foicontinuado com 16 horas de luz/8 horas de escuro e um ritmo semanal sobremeio MS suplementado com Claforan (cefotaxima-sódio) 500 mg/l,canamicina 50 mg/l, benzil-amino-purina (BAP) 20 μΜ e glicose 1,6 g/l.Brotos crescendo foram transferidos para meio MS suplementado comsacarose 2%, Claforan 250 mg/l e ágar Bacto 0,8%. Se brotos não sedesenvolveram após três semanas, ácido 2-indol-butírico foi adicionado nomeio como hormônio de crescimento para enraizamento.

Brotos regenerados foram obtidos sobre meio 2MS comcanamicina e Claforan, então, após enraizamento, transferidos para dentro desolo e, após cultivo, crescidos por duas semanas em uma cabine de ambientecontrolado ou na estufa, permitidos florirem, as sementes maturadas foramcolhidas e analisadas para expressão de alongase tal como atividade de Δ6-alongase ou para atividade de Δ5- ou Δό-dessaturase por meio de análise delipídeo. Nesta maneira, foram identificadas linhagens com conteúdos elevadosde ácidos C2o- e C22-graxos poliinsaturados.

b) Geração de plantas transgênicas de Orychophragmus violaceus

O protocolo para a transformação de plantas colza foi usado(modificação de Moloney et al. (1992) Plant Cell Reports 8:238-242) comodescrito sob a).

Para gerar plantas transgênicas, o vetor binário pGPTV-D6D5E6(Tp) cú3PíE5D4 foi transformado em Agrobacterium tumefaciensC58Cl:pGV2260 (Deblaere et al. (1984) Nucl. Acids. Res. 13: 4777-4788).

Uma diluição 1:50 de uma cultura noturna de colônia de Agrobacteriumpositivamente transformada em meio Murashige-Skoog (Murashige e Skoog(1962) Physiol Plant, 15: 473) com sacarose 3% (meio 3MS) foi usada paratransformar Orychophragmus violaceus. Pecíolos ou hipocótilos de plantasestéreis recentemente germinadas (em cada caso aproximadamente de 1 cm )foram incubados com uma diluição de agrobactérias de 1:50 em uma placa dePetri por 5-10 minutos. Isto é seguido por coincubação sobre meio 3MS comágar Bacto 0,8% por 3 dias no escuro a 25°C. O cultivo foi então continuadocom 16 horas de luz/8 horas de escuro e um ritmo semanal sobre meio MScom Claforan (cefotaxima-sódio) 500 mg/l, canamicina 10 mg/l, benzil-amino-purina (BAP) 20 μΜ e glicose 1,6 g/l. Brotos crescendo foramtransferidos para meio MS com sacarose 2%, Claforan 250 mg/l e ágar Bacto0,8%. Se brotos não se desenvolveram após três semanas, ácido 2-indol-butírico foi adicionado no meio como hormônio de crescimento paraenraizamento.

Brotos regenerados foram obtidos sobre meio 2MS comcanamicina e Claforan, então, após enraizamento, transferidos para dentro desolo e, após cultivo, crescidos por duas semanas em uma cabine de ambientecontrolado ou na estufa, permitidos florirem, as sementes maturadas foramcolhidas e analisadas para expressão de alongase tal como atividade de Δ6-alongase ou para atividade de Δ5- ou Δ6-dessaturase por meio de análise delipídeo. Nesta maneira, foram identificadas linhagens com conteúdos elevadosde ácidos C20- e C22-graxos poliinsaturados.

c) Transformação de plantas Arabidopsis thaliana

Foi usado o protocolo de Bechthold et al. (1993) C.R. Acad.Sei. Ser, III Sei. Vie. 316:.l 194-1199.

Para gerar plantas transgênicas, o vetor binário geradopGPTV-D6D5E6(Tp) ®3PiE5D4 foi transformado em Agrobacteriumtumefaciens C58Cl:pMP90 (Deblaere et al. (1984) Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788) e, de acordo com o protocolo de Bechthold et al. (1993), flores deArabidopsis thaliana cv. Columbia O foram imersas em uma soluçãoagrobacteriana com C)D600=1,0. O procedimento foi repetido de novo doisdias mais tarde. Sementes destas flores foram então posicionadas sobre placasde ágar com 1/2 MS, sacarose 2% e canamicina 50 mg/l. Mudas verdes foramentão transferidas para solo.

Exemplo 11: Análise de material de planta de plantas transgênicasOrvchophragmus ou Arabidopsis

Extração de material foliar de plantas transgênicasOrychophragmus violaceus e Arabidopsis thaliana transformadas compGPTV-D6D5E6(Tp) oo3PiE5D4 e a análise por cromatografia a gás foirealizada como descrita em exemplo 8. Tabela 2 mostra os resultados dasanálises. Os vários ácidos graxos são indicados em percentagem em peso. Foipossível mostrar que os ácidos graxos de cadeia longa poliinsaturados foramsintetizados por ambas as espécies de planta diferentes. Foisurpreendentemente possível com a seqüência otimizada de A5-alongase(como mostrada em SEQ ID NO 64) de Ostreococcus tauri obter umrendimento distintamente mais alto de DHA do que o relatado por exemplopor Robert et al. (2005) Functional Plant Biology 32: 473-479 paraArabidopsis thaliana com 1,5% de DHA. Foi possível pela primeira vezrealizar uma síntese de ácidos graxos de cadeia longa poliinsaturados paraOrychophragrnus violaceus.

Exemplo 12: Análise de sementes de linhagens transgênicas_deBrassicaguncea

Extração de sementes de plantas transgênicas de Brassicajuncea transformadas com pSUN-9G, e a análise por cromatografia a gás foirealizada como descrita em exemplo 8. Tabela 6 mostra os resultados dasanálises. Os vários ácidos graxos são indicados em área percentual. Como emWu et al. 2005 foi possível mostrar a síntese de ácidos graxos de cadeia longapoliinsaturados (PUFA) . Surpreendentemente, o uso de seqüência dealongase modificada 0tEL02.2 tal como a seqüência de ácido nucleicodescrita por SEQ ID NO: 64 resultou em um aumento drástico no conteúdo deácidos graxos C22- No total, o óleo de semente continha cerca de 8% em peso% de ácidos graxos C22 poliinsaturados. Especificamente, o conteúdo de ácidograxo ácido docosahexaenóico (DHA) no óleo de semente foi 1,9% em peso%, representando um aumento por um fator de 10 comparado com Wu et al. 2005.

Exemplo 13: Análise detalhada das classes de lipídeo e a análise de posiçãodo material foliar de O. violaceus

Cerca de 1 g de tecido foliar foi aquecido era 4 mL deisopropanol a 950C por 10 minutos, homogeneizado por Polytron e agitadoapós adição de 1,5 ml de clorofórmio. As amostras foram centrifugadas, osobrenadante foi coletado, e a pelota foi extraída de novo comisopropanoliclorofórmio 1:1 (v/v). Os dois extratos foram combinados, secose dissolvidos em clorofórmio. O extrato de lipídeo foi pré-fracionado em umacoluna prepsep de sílica (Fisher Scientific, Nepean, Canada) em lipídeosneutros, glicolipídeos e fosfolipídeos, eluindo com clorofórmio:ácido acético100:1 (v/v), acetonae: ácido acético 100:1 (v/v) e metanol:clorofórmio:água100:50:40 (v/v/v), respectivamente. Estas frações foram adicionalmentefracionadas sobre placas de cromatografia de camada fina de sílica G-25(TLC; Macherey-Nagel, Düren, Alemanha). Lipídeos neutros foramdesenvolvidos com hexana:dietil-éter:ácido acético (70:30:1), glicolipídeoscom clorofórmio:metanol:amônia (65:25:4 v/v/v) e fosfolipídeos comclorofórmio: metanol: amônia: água (70:30:4:1 v/v/v/v). As classes de lipídeoindividuais foram identificadas após borrifo com primulina sob luz UV;removidas por raspagem das placas e quer usadas para transmetilação diretaquer extraídas por um solvente adequado para análise adicional.

Foi possível pelos processos descritos que as várias classes delipídeo (lipídeos neutros, fosfolipídeos e galactolipídeos) fossem fracionadase analisadas separadamente. Os glicolipídeos foram adicionalmenteexaminados para a posição dos ácidos graxos individuais,

a) Análise regioespecífica dos triacilglicerídeos (TAG)

Três a cinco mg de TAG purificado por TLC foram secos sobnitrogênio em um tubo de vidro, ressuspensos em tampão aquoso por brevetratamento com ultra-som (Tris 1 M pH 8; CaCl2 2,2% (w/v) ; sais biliares0,05% (w/v) ) e incubados a 40°C por 4 minutos. Após adição de 0,1 ml dasolução de lipase pancreática (10 mg/ml em água), as amostras foramvigorosamente agitadas por 3 minutos, e a digestão foi interrompida pelaadição de 1 mL de etanol e 1,5 ml de HCl 4 M. Os TAGs parcialmentedigeridos foram extraídos com dietil-éter, lavados com água, secos edissolvidos em um volume pequeno de clorofórmio. Monoacilgliceróis(MAG) foram separados dos ácidos graxos livres e TAGs não digeridos sobreuma placa de TLC como descrito acima para os lipídeos neutros. O pontocorrespondente para os MAGs foi analisado por GC e representou a posiçãosn-2 dos TAGs. A distribuição dos ácidos graxos nas posições sn-1 e sn-3restantes foi calculada pela seguinte fórmula: sn-1 + sn-3 = (TAG χ 3 - MAG)/2.

Esta análise de posição dos triacilglicerídeos revelou nestecaso que EPA e DHA estão presentes em concentrações similares nasposições sn-2 e sn-1/3, enquanto que ARA é para ser encontrado apenas emquantidades pequenas nos triacilglicerídeos, e aqui principalmente na posiçãosn-2 (Tab. 3).

b) Análise estereoespecífica de fosfolipídeos

Fosfatidilglicol (PG), fosfatidil-etanol-amina (PE) efosfatidilcolina (PC) extraídos e Jfracionados foram secos sob N2 eressuspensos em 0,5 ml de tampão borato (0,5M, pH 7,5, contendo CaCl2 0,4mM). Após um breve tratamento de ultra-som, 5 U de fosfolipase A2 doveneno de Naja mossambica (Sigma P-7778) e 2 ml de dietil-éter foramadicionados e as amostras foram agitadas na temperatura ambiente por 2horas. A fase de éter foi seca, a digestão foi interrompida com 0,3 ml de HCl1 M, e a mistura reacional foi extraída com clorofórmio:metanol (2:1 v/v). Osfosfolipídeos digeridos foram separados por TLC emclorofórmio:metanol:amônia:água (70:30:4:2 v/v/v/v) e pontos quecorresponderam aos ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos liberados foramremovidos por raspagem e diretamente transmetilados.

Análise de posição dos fosfolipídeos mostrou um acúmulo deEPA e DHA na posição sn-2 de fosfatidilcolina (PC), enquanto que DHA foisimilarmente distribuído em posições sn-1 e sn-2 em fosfatidiletanolamina(PE). Apenas traços de, ou nenhum, ARA era para ser encontrado em ambosos fosfolipídeos (Tab. 4). As concentrações de EPA e DHA emfosfatidilglicerol foram menores do que nos outros fosfolipídeos investigados,com acúmulo na posição sn-2 também sendo observado nesta classe delipídeo (Tab. 4, PG).

c) Análise estereoespecífica de glicolipídeos

Os galactolipídeos foram investigados como uma outra classede lipídeo polar. Galactolipídeos são encontrados nas membranas de plasídeose formam os componentes principais de lá.

Monogalactosildiacilglicerol (MGDG) edigalactosildiaciglicerol (DGDG) purificados por TLC foram secos sobnitrogênio e dissolvidos em 0,5 mL de dietil-éter. Então 25 unidades da lipasede Rhizopus arrhizus (Sigma 62305), ressuspensos em 2 ml de tampão borato(50 mM, pH 7,5 contendo CaCl2 2 mM), foram adicionados, e as amostrasforam agitadas na temperatura ambiente por 2 horas. A fase de éter foi seca ea digestão foi interrompida pela adição de 0,3 ml de HCl 1 M, e os lipídeosforam extraídos com 4 ml de clorofórmio:metanol (2:1 v/v) . Após secagem,os galactolipídeos digeridos estavam em um volume pequeno declorofórmio:metanol (2:1 v/v) e desenvolveram duas vezes sobre uma placade TLC de sílica pré-revestida, primeiramente com clorofórmio:metanol:amônia:água (70:30:4:1 v/v/v/v) para cerca de dois terços da altura da placa,seguido pelo desenvolvimento completo em hexano:dietil-éter:ácido acético(70:30:1) . Os pontos que correspondem aos ácidos graxos livres elisogalactolipídeos liberados foram identificados após borrifo com primulina,raspados e diretamente transmetilados por análise por GC.

Foi possível também verificar VLCPUFA nestes lipídeos, comum acúmulo de EPA na posição sn-2 sendo observada. DHA era para serencontrado apenas nos digalactodiacilgliceróis (DGDG) e foi indetectável nosmonogalactodiacilgliceróis (MGDG) (Tabela 5). A distribuição de VLCPUFAem galactolipídeos, um compartimento no qual estes ácidos graxos não eramesperados, mostra a dinâmica da síntese e a transformação tardia. VLCPUFAem lipídeos polares são de valor nutricional particular porque podem serabsorvidos melhor nos intestinos de mamíferos do que os lipídeo neutros.Tabela 1: Teste de seqüências otimizadas de pOTEl.l e pOTE2.1 emlevedura. As taxas de conversão foram determinadas de acordo com asconversões de substrato. Uma elevação distinta em atividade foi alcançávelcom a sequencia otimizada em plasmideo pOTE2.2.

<table>table see original document page 108</column></row><table>

Tabela 2: Análise de cromatografia a gás de material foliar deOrychophragmus violaceus e Arabidopsis thaliana. Os ácidos graxosindividuais são indicados em área percentual.

<table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110><120><130><150><151><150><151><160><170><210><211><212><213><220><221><222><4 00>atg gtgMet Val1

ate cgcIle Arg

aag gtcLys Val

BASF Plant Science GmbH

Processo para produzir ácidos gaxos poliinsaturadosB 8172

DE 10 2006 008 030.02006 02 21EP 06120309.72006 09 07199

Biomax PatentTool de acordo com PatentIN formato 3.11

1380DNA

Phytium irregulare

CDS

(1)..(1380)1

gac ctc aagAsp Leu Lys5

atgMet

cac

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Leu

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260 265 270

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325 330 335

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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gaa ttc gtc gtg gat ttt gta cgc gat gga ccc gcc atg taa1434

Glu Phe Val Val Asp Phe Val Arg Asp Gly Pro Ala Met465 470 475

<210> 24<211> 477<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum<400> 24

Met Gly Lys Gly Gly Asp Ala Arg Ala Ser Lys Gly Ser Thr Ala Ala1 5 10 15

Arg Lys Ile Ser Trp Gln Glu Val Lys Thr His Ala Ser Pro Glu Asp

20 25 30

Ala Trp Ile Ile His Ser Asn Lys Val Tyr Asp Val Ser Asn Trp His

35 40 45

Glu His Pro Gly Gly Ala Val Ile Phe Thr His Ala Gly Asp Asp Met

50 55 60

Thr Asp Ile Phe Ala Ala Phe His Ala Pro Gly Ser Gln Ser Leu Met65 70 75 80

Lys Lys Phe Tyr Ile Gly Glu Leu Leu Pro Glu Thr Thr Gly Lys Glu85 90 95

Pro Gln Gln Ile Ala Phe Glu Lys Gly Tyr Arg Asp Leu Arg Ser Lys

100 105 HO

Leu Ile Met Met Gly Met Phe Lys Ser Asn Lys Trp Phe Tyr Val Tyr

115 120 125

Lys Cys Leu Ser Asn Met Ala Ile Trp Ala Ala Ala Cys Ala Leu Val

130 135 140

Phe Tyr Ser Asp Arg Phe Trp Val His Leu Ala Ser Ala Val Met Leu145 150 155 160

Gly Thr Phe Phe Gln Gln Ser Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His

165 170 175

His Gln Val Phe Thr Lys Arg Lys His Gly Asp Leu Gly Gly Leu Phe

180 185 190

Trp Gly Asn Leu Met Gln Gly Tyr Ser Val Gln Trp Trp Lys Asn Lys

195 200 205

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210 215 220

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Ser Val Gln Gln Ala Gln Ser Tyr Arg Glu Leu Gln Ala Asp Gly Lys

245 250 255

Asp Ser Gly Leu Val Lys Phe Met Ile Arg Asn Gln Ser Tyr Phe Tyr

260 265 270

Phe Pro Ile Leu Leu Leu Ala Arg Leu Ser Trp Leu Asn Glu Ser Phe

275 280 285

Lys Cys Ala Phe Gly Leu Gly Ala Ala Ser Glu Asn Ala Ala Leu Glu

290 295 300

Leu Lys Ala Lys Gly Leu Gln Tyr Pro Leu Leu Glu Lys Ala Gly Ile305 310 315 320

Leu Leu His Tyr Ala Trp Met Leu Thr Val Ser Ser Gly Phe Gly Arg

325 330 335

Phe Ser Phe Ala Tyr Thr Ala Phe Tyr Phe Leu Thr Ala Thr Ala Ser

340 345 350

Cys Gly Phe Leu Leu Ala Ile Val Phe Gly Leu Gly His Asn Gly Met

355 360 365

Ala Thr Tyr Asn Ala Asp Ala Arg Pro Asp Phe Trp Lys Leu Gln Val

370 375 380

Thr Thr Thr Arg Asn Val Thr Gly Gly His Gly Phe Pro Gln Ala Phe385 390 395 400

Val Asp Trp Phe Cys Gly Gly Leu Gln Tyr Gln Val Asp His His Leu

405 410 415

Phe Pro Ser Leu Pro Arg His Asn Leu Ala Lys Thr His Ala Leu Val

420 425 430

Glu Ser Phe Cys Lys Glu Trp Gly Val Gln Tyr His Glu Ala Asp Leu

435 440 445

Val Asp Gly Thr Met Glu Val Leu His His Leu Gly Ser Val Ala Gly

450 455 460

Glu Phe Val Val Asp Phe Val Arg Asp Gly Pro Ala Met465 470 475

<210> 25<211> 1374<212> DNA<213> Mortierella isabellina<220><221> CDS<222> (1)..(1374)<4 00> 25

atg gct gct gct ccc agt gtg agg acg ttt act cgg gcc gag att ctgMet Ala Ala Ala Pro Ser Val Arg Thr Phe Thr Arg Ala Glu Ile Leu1 5 10 15

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Leu Met Ile Ile35

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act gac gtc ttt

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gcc aac ttt tac

Ala Asn Phe Tyr

aac gat gac ttt

Asn Asp Asp Phe100

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Ser Leu Gly Tyr115

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ggt ctc ttc tgg

Gly Leu Phe Trp

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cac aac act cacHis Asn Thr His210

att gac act cacIle Asp Thr His225

ttc tcg gac gtcPhe Ser Asp Val

atg gtc ctt aacMet Val Leu Asn260

cgt ctc tcc tggArg Leu Ser Trp275

cag gcc cac aagGln Ala His Lys290

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ttg ttc att aag1008

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cag gct gtt tgc1056

Gln Ala Val Cys340

gac aac aag gtgAsp Asn Lys Val40

gga agt gtt attGly Ser Val Ile55

gac act ttc cacAsp Thr Phe His70

gtt ggt gat attVal Gly Asp Ile85

gcg gcc gag gtcAla Ala Glu Val

tac gat tcc tccTyr Asp Ser Ser120

tgc ate tgg ggcCys Ile Trp Gly135

tcg acc ctc gccSer Thr Leu Ala150

cag cag tgt ggaGln Gln Cys Gly165

cag gac cgt ttcGln Asp Arg Phe

tgc cag ggc ttcCys Gln Gly Phe200

cac gcc gcc cccHis Ala Ala Pro215

cct ctg ttg acgPro Leu Leu Thr230

cct gac gag gagPro Asp Glu Glu245

cag acc tgg ttcGln Thr Trp Phe

tgc ctc cag tccCys Leu Gln Ser280

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gcc gtg cac tggAla Val His Trp310

gac ccc gtc aac

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acc tgg tac ctcThr Trp Tyr Leu315

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ggc aag gac ggcGly Lys Asp Gly

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370 375 380

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450 455

<210> 26<211> 457<212> PRT

<213> Mortierella isabellina<400> 26

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

Leu Gly Gly Val Cys Gln Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys

195 200 205

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210 215 220

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Arg Leu

Gln Ala290Gln Leu305

Leu Phe

Gln Ala

Asn Gly

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1374DNA

Mortierella

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. (1374)

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gacAsp

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Val

85

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Ala

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Asn Leu

Ile Ser

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Lys Tyr

Glu Val

Gly Lys455

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agt gtgSer Val

aat gagAsn Glu

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gat tccAsp Ser

ate tggIle Trp135

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Phe Tyr265Ser Ile280

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Trp Thr

Asn Met

Leu Ala345Lys Glu360

Gly Arg

Leu Asn

Asn Phe

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Ala Gln

Thr Arg250

Phe Pro

Leu Phe

Val Pro

Trp Tyr315Met Val330

Ile Val

Glu Ala

Asp Val

Tyr Gln395Ser Lys410

Arg TyrArg Leu

Met Trp

Ile Leu

Val Leu285Ile Ser300

Leu Ala

Tyr Phe

Phe Ser

Val Asp365His Pro380

Ile Glu

Ile Gln

His Thr

Asn Glu445

Ser Arg Phe

255Ser Phe Ala270

Pro Asn Gly

Leu Val Glu

Thr Met Phe320

Leu Val Ser

335Leu Asn His350

Met Asp Phe

Gly Leu Phe

His His Leu400

Pro Ala Val

415Thr Gly Met430

Val Ser Lys

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ggcGly

gtg

Val

40

att

Ile

cacHis

attIle

gtcVal

tccSer120ggcGly

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tat gatTyr Asp

ctc acgLeu Thr

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ctg tcgLeu Ser

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gat gcc gagAsp Ala Glu

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Glu

45

ggc

Gly

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aag gac ggcLys Asp Gly

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144

192

240

288

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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290 295 300

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528

576

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672

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768

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435 440 445

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450 455

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<213> Mortierella alpina<4 00> 28

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85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

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Gly Leu Phe Trp Gln Gln Arg Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Gln Ala His Lys Pro Ser Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val Glu

290 295 300

Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe305 310 315 320

Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Met Val Tyr Phe Leu Val Ser

325 330 335

Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His

340 345 350

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355 360 365

Phe Thr Lys Gln Ile Ile Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe

370 375 380

Ala Asn Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu385 390 395 400

Phe Pro Ser Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala Val405 410 415Glu Thr

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29

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gag

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528

576

624

672

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260 265 270

ccg ctg ctg ctg ctc gcg cgc ctg age tgg ctc gcg cag tcg ttc ttcPro Leu Leu Leu Leu Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Gln Ser Phe Phe

275 280 285

tac gtg ttc acc gag ttc tcg ttc ggc ate ttc gac aag gtc gag ttcTyr Val Phe Thr Glu Phe Ser Phe Gly Ile Phe Asp Lys Val Glu Phe

290 295 300

gac gga ccg gag aag gcg ggt ctg ate gtg cac tac ate tgg cag ctcAsp Gly Pro Glu Lys Ala Gly Leu Ile Val His Tyr Ile Trp Gln Leu305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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cac ctg ttc ccg ctc gtg ccg cgc cac aac ttg cca aag gtc aac gtg1248

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455

<210> 30<211> 459<212> PRT

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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Ala Leu130Leu Ser145

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Ala His

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Pro Leu

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Ser Ile

Asp Phe370

Val Phe385

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Leu Ile

Gly Phe

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85

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340Gly His Asn355

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Lys Ser Leu420

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1374DNA

MortierellaCDS

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Lys Val

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Lys His215Glu Gly230

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Phe Phe

Ala Arg

Phe Ser295Ala Gly310

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Ala Ser

Gly Met

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Val Pro

Cys Lys

Ile Tyr

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aat gagAsn Glu

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105Lys Gly Met120

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Phe Phe Asn

Leu Phe Tyr170

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Phe Ile Gly

Lys Glu Met250

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265Leu Ser Trp280

Phe Gly Ile

Leu Ile Val

Met Ser Leu330

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345Ser Val Tyr360

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Gly Gly Leu

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425Glu Val Val440

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Glu Phe Ile

Gly Leu Tyr125

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Ser Phe Ala155

Gln Gln Ser

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Gln Ala Phe

Leu Ala Gln285

Phe Asp Lys300

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Leu Leu Ala

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Ile Pro Phe

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Ala110Asp

Ile

Met

Gly

Thr190Phe

Pro

Ile

Ala

Leu270Ser

Val

Trp

Val

Leu350Thr

Arg

Ile

Val

His430Ala

95Ser

Ala

Ala

Tyr

Trp175Leu

Ser

Asn

Asp

Phe255Tyr

Phe

Glu

Gln

Ala335Val

Lys

Ala

Asp

Asn415Glu

Asp

Tyr

Ser

Val

Met160Leu

Gly

Val

Leu

Thr240Glu

Phe

Phe

Phe

Leu320Tyr

Phe

Pro

Ser

His400Val

Thr

Ile

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ttt gtc cct 144

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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Gly Leu Phe Trp Gln Gln Arg Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Met Val Tyr Phe Leu Val Ser

325 330 335

cag gct gtt tgc ggt aac ctg ttg gcg att gtg ttc tcg ctc aac cac1056

Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His

340 345 350

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240

288

336

384

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480

528

576

624

672

720

768

316

864

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370 375 380

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ttc cct tcg atg cct cgc cac aac ttt tca aag ate cag cct gct gtc1248

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455

<210> 32<211> 457<212> PRT

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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275 280 285

Gln Ala His Lys Pro Ser Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val Glu

290 295 300

Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe305 310 315 320

Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Met Val Tyr Phe Leu Val Ser

325 330 335

Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Ala Asn Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu385 390 395 400

Phe Pro Ser Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala Val

405 410 415

Glu Thr Leu Cys Lys Lys Tyr Gly Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met

420 425 430

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435 440 445

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450 455

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<213> Mortierella isabellina<220>

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165 170 175

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180 185 190

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245 250 255

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260 265 270

cgt ctc tcc tgg tgc ctc cag tcc ate ctc ctt gtt ctg cct aac ggtArg Leu Ser Trp Cys Leu Gln Ser Ile Leu Leu Val Leu Pro Asn Gly

275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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ttc cct tcg atg cct cgc cac aac ttt tca aag ate cag cct gct gtc1248

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405 410 415

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Glu Thr Leu Cys Lys Lys Tyr Gly Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met

420 425 430

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528

576

624

672

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768

816

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912

960gcc gcc tcc aag atg ggt aag gcg cag taa1374

Ala Ala Ser Lys Met Gly Lys Ala Gln

450 455

<210> 34<211> 457<212> PRT

<213> Mortierella isabellina<400> 34

Met Ala Ala Ala Pro Ser Val Arg Thr Phe Thr Arg Ala Glu Ile Leu15 10 15

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20 25 30

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50 55 60

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Ala Asn Phe Tyr Val Gly Asp Ile Asp Glu Ser Asp Arg Ala Ile Lys

85 90 95

Asn Asp Asp Phe Ala Ala Glu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gln

100 105 HO

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115 120 125

Ser Phe Asn Leu Cys Ile Trp Gly Leu Ser Thr Phe Ile Val Ala Lys

130 135 140

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Gly Leu Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His

165 170 175

His Gln Val Phe Gln Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe

180 185 190

Leu Gly Gly Val Cys Gln Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys

195 200 205

His Asn Thr His His Ala Ala Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro Asp

210 215 220

Ile Asp Thr His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met225 230 235 240

Phe Ser Asp Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe

245 250 255

Met Val Leu Asn Gln Thr Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe Ala

260 265 270

Arg Leu Ser Trp Cys Leu Gln Ser Ile Leu Leu Val Leu Pro Asn Gly

275 280 285

Gln Ala His Lys Pro Ser Gly Ala Arg Val Ser Ile Ser Leu Val Glu

290 295 300

Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe305 310 315 320

Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Met Val Tyr Phe Leu Val Ser

325 330 335

Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His

340 345 350

Asn Gly Met Pro Val Ile Ser Lys Glu Glu Ala Val Asp Met Asp Phe

355 360 365

Phe Thr Lys Gln Ile Ile Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe

370 375 380

Ala Asn Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu385 390 395 400

Phe Pro Ser Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala Val

405 410 415

Glu Thr Leu Cys Lys Lys Tyr Gly Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met420 425 430Ile Glu Gly Thr Ala Glu Val Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Ser Lys

435 440 445

Ala Ala Ser Lys Met Gly Lys Ala Gln

450 455

<210> 35<211> 1563<212> DNA

<213> Ceratodon purpureus<220>

<221> CDS<222> (1) . . (1563)<400> 35

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

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Ser Gly295Met His310

Pro Val

Asn Leu

Ile Ser

Ile Thr375Gly Gly390

Arg His

Lys Tyr

Glu Val

Gly Lys455

alpina

agt gtgSer Val

aat gagAsn Glu

aac aagAsn Lys

agt gtgSer Val

55act ttcThr Phe70

ggt gatGly Asp

Phe

Phe200Pro

Thr

Glu

Phe

Ser280Ala

Trp

Asn

Leu

Lys360Gly

Leu

Asn

Asn

Phe440Ala

Trp185Ser

Asn

Trp

Leu

Tyr265Ile

Arg

Thr

Met

Ala345Glu

Arg

Asn

Phe

Val425Ser

Gln

Gly Asp Leu PheSer SerVal His

Ser Glu235Thr Arg250

Phe Pro

Leu Phe

Val Pro

Trp Tyr315Leu Val330

Ile Val

Glu Ala

Asp Val

Tyr Gln395Ser Lys410

Arg TyrArg Leu

Trp Trp205Gly Glu220

His Ala

Met Trp

Ile Leu

Val Leu285Ile Ser300

Leu Ala

Tyr Phe

Phe Ser

Val Asp365His Pro380

Ile Glu

Ile Gln

His Thr

Asn Glu445

Gly Ala Phe190

Lys Asp Lys

Asp Pro Asp

Leu Glu Met240

Ser Arg Phe

255Ser Phe Ala270

Pro Asn Gly

Leu Val Glu

Thr Met Phe320

Leu Val Ser

335Leu Asn His350

Met Asp Phe

Gly Leu Phe

His His Leu400

Pro Ala Val

415Thr Gly Met430

Val Ser Lys

agg acgArg Thr

ggc aagGly Lys

25gtg tacVal Tyr40

att ctcIle Leu

cac cccHis Pro

att gatIle Asp

gcc gag gtt cgc

ttt act cggPhe Thr Arg10

aag gat gccLys Asp Ala

gat gtc cgcAsp Val Arg

acg cac gttThr His Val60

gag gct gctGlu Ala Ala75

gag age gatGlu Ser Asp90

aag ctg cgc

gcc gag att ttgAla Glu Ile Leu15

gag gea ccc tttGlu Ala Pro Phe30

gag ttt gtc cctGlu Phe Val Pro45

ggc aag gac ggcGly Lys Asp Gly

tgg gag act cttTrp Glu Thr Leu80

cgt gcc ate aagArg Ala Ile Lys95

acc ttg ttc cag

96

144

192

240

288

336Asn Asp Asp Phe Ala Ala Glu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gln

100 105 HO

tcc ctt ggc tac tac gac tcg tcc aag gca tac tat gcc ttc aag gtc 384

Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala Phe Lys Val

115 120 125

tcg ttc aac ctc tgc ate tgg ggc ttg tcg act ttc att gtt gcc aag 432

Ser Phe Asn Leu Cys Ile Trp Gly Leu Ser Thr Phe Ile Val Ala Lys

130 135 140

tgg ggc cag acc tcg acc ctc gcc aac gtg ctc tcg gct gcg ctc ttg 480

Trp Gly Gln Thr Ser Thr Leu Ala Asn Val Leu Ser Ala Ala Leu Leu145 150 155 160

ggt ctc ttc tgg cag cag tgc gga tgg ttg gcg cac gac ttt ttg cac 528

Gly Leu Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His

165 170 175

cac cag gtc ttc cag gac cgt ttc tgg ggt gat ctt ttc ggc gcc ttc 576

His Gln Val Phe Gln Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe

180 185 190

ttg gga ggt gtc tgc cag ggt ttc tcg tcc tcc tgg tgg aag gac aag 624

Leu Gly Gly Val Cys Gln Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys

195 200 205

cac aac act cac cac gct gct ccc aac gtc cac ggc gag gat ccc gac 672

His Asn Thr His His Ala Ala Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro Asp

210 215 220

att gac act cac cct ctg ttg acc tgg agt gag cat gct ctg gag atg 720

Ile Asp Thr His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met225 230 235 240

ttc tcg gat gtt cct gac gag gag ctg acc cgt atg tgg tcg cgc ttc 768

Phe Ser Asp Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe

245 250 255

atg gtc ctc aac cag acc tgg ttc tac ttc ccc att ctc tcg ttt gcc 816

Met Val Leu Asn Gln Thr Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe Ala

260 265 270

cgt ctg tcc tgg tgc ctc cag tcc att atg ttt gtt ctg ccc aac ggt 864

Arg Leu Ser Trp Cys Leu Gln Ser Ile Met Phe Val Leu Pro Asn Gly

275 280 285

cag gcc cac aag ccc tet gga gcg cgt gtg ccc att tcg ttg gtc gag 912

Gln Ala His Lys Pro Ser Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val Glu

290 295 300

cag ctg tet ctg gct atg cac tgg acc tgg tac ctc gcc acc atg ttc 960

Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe305 310 315 320

ctg ttc att aag gat ccc gtc aac atg att gtg tac ttt ttg gtg tcg1008

Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Ile Val Tyr Phe Leu Val Ser

325 330 335

cag gct gtt tgc ggc aac ttg ttg gcg att gtg ttc tcg ctc aac cac1056

Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His

340 345 350

aac ggc atg cct gtg ate tcc aag gag gaa gcg gtc gat atg gac ttc1104

Asn Gly Met Pro Val Ile Ser Lys Glu Glu Ala Val Asp Met Asp Phe

355 360 365

ttc acc aag cag ate ate acg ggt cgt gat gtt cac cct ggt ctg ttt1152

Phe Thr Lys Gln Ile Ile Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe

370 375 380

gcc aac tgg ttc acg ggt gga ttg aac tac cag att gag cac cac ttg1200

Ala Asn Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu385 390 395 400

ttc cct tcg atg ccc cgc cac aac ttt tca aag ate cag cct gct gtc1248Phe Pro Ser Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala Val

405 410 415

gag act ttg tgc aaa aag tac ggt gtc cga tac cat acc act ggt atg1296

Glu Thr Leu Cys Lys Lys Tyr Gly Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met

420 425 430

ate gag gga act gea gag gtc ttt age cgt ttg aac gag gtc tcc aag1344

Ile Glu Gly Thr Ala Glu Val Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Ser Lys

435 440 445

gcg gcc tcc aag atg ggc aag gea cag taa1374

Ala Ala Ser Lys Met Gly Lys Ala Gln

450 455

<210> 42<211> 457<212> PRT

<213> Mortierella alpina<4 00> 42

Met Ala Ala Ala Pro Ser Val Arg Thr Phe Thr Arg Ala Glu Ile Leu15 10 15

Asn Ala Glu Ala Leu Asn Glu Gly Lys Lys Asp Ala Glu Ala Pro Phe

20 25 30

Leu Met Ile Ile Asp Asn Lys Val Tyr Asp Val Arg Glu Phe Val Pro

35 40 45

Asp His Pro Gly Gly Ser Val Ile Leu Thr His Val Gly Lys Asp Gly

50 55 60

Thr Asp Val Phe Asp Thr Phe His Pro Glu Ala Ala Trp Glu Thr Leu65 70 75 80

Ala Asn Phe Tyr Val Gly Asp Ile Asp Glu Ser Asp Arg Ala Ile Lys

85 90 95

Asn Asp Asp Phe Ala Ala Glu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gln

100 105 HO

Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala Phe Lys Val

115 120 125

Ser Phe Asn Leu Cys Ile Trp Gly Leu Ser Thr Phe Ile Val Ala Lys

130 135 140

Trp Gly Gln Thr Ser Thr Leu Ala Asn Val Leu Ser Ala Ala Leu Leu145 150 155 160

Gly Leu Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His

165 170 175

His Gln Val Phe Gln Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe

180 185 190

Leu Gly Gly Val Cys Gln Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys

195 200 205

His Asn Thr His His Ala Ala Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro Asp

210 215 220

Ile Asp Thr His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met225 230 235 240

Phe Ser Asp Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe

245 250 255

Met Val Leu Asn Gln Thr Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe Ala

260 265 270

Arg Leu Ser Trp Cys Leu Gln Ser Ile Met Phe Val Leu Pro Asn Gly

275 280 285

Gln Ala His Lys Pro Ser Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val Glu

290 295 300

Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe305 310 315 320

Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Ile Val Tyr Phe Leu Val Ser

325 330 335

Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His340 345 350Asn Gly

Phe Thr370Ala Asn385

Phe Pro

Glu Thr

Ile Glu

Ala Ala450<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220>

Met Pro Val Ile Ser Lys Glu Glu Ala Val Asp Met Asp Phe

355 360 365

Lys Gln Ile Ile Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe

375 380

Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu390 395 400

Ser Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala Val

405 410 415

Leu Cys Lys Lys Tyr Gly Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met

420 425 430

Gly Thr Ala Glu Val Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Ser Lys435 440 445

Ser Lys Met Gly Lys Ala Gln455

43

444

PRT

Seqüência artificial

Variante(5)..(10)

xaa na posição 5 a 10 é qualquer aminoácido

Variante(11)..(11)

xaa na posição 11 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(16)..(16)

xaa na posição 16 é qualquer aminoácido

Variante(17)..(17)

xaa na posição 17 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(19)..(20)

xaa na posição 19 a 20 é qualquer aminoácido

Variante(22)..(23)

xaa na posição 22 a 23 é qualquer aminoácido

Variante(25)..(25)

xaa na posição 25 é qualquer aminoácido

Variante(27).. (27)

xaa na posição 27 é qualquer aminoácido

Variante(30)..(30)

xaa na posição 30 é qualquer aminoácido

Variante(32)..(34)

xaa na posição 32 a 34 é qualquer aminoácido

Variante(37)..(38)

xaa na posição 37 a 38 é qualquer aminoácido<221> Variante

<222> (40)..(42)

<223> xaa na posição 40 a 42 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (44).. (46)

<223> xaa na posição 44 a 46 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (48)..(48)

<223> xaa na posição 48 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (51)..(59)

<223> xaa na posição 51 a 59 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (60)..(77) ,

<223> xaa na posição 60 a 77 é qualquer um ou nenhum aminoácido

<220>

<221> Variante

<222> (79)..(82)

<223> xaa na posição 79 a 82 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (84) . . (84)

<223> xaa na posição 84 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (87).. (92)

<223> xaa na posição 87 a 92 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (94)..(97)

<223> xaa na posição 94 a 97 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (99) . . (101)

<223> xaa na posição 99 a 101 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (103)..(104)

<223> xaa na posição 103 a 104 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (106)..(132)

<223> xaa na posição 106 a 132 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (133).. (134)

<223> xaa na posição 133 a 134 é qualquer um ou nenhum aminoacido<220>

<221> Variante

<222> (136)..(138)

<223> xaa na posição 136 a 138 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (140)..(140)

<223> xaa na posição 140 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (142)..(142)

<223> xaa na posição 142 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (145)..(145)

<223> xaa na posição 145 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (153)..(153)

<223> xaa na posição 153 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (159)..(160)

<223> xaa na posição 159 a 160 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (162)..(171)

<223> xaa na posição 162 a 171 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (172)..(172)

<223> xaa na posição 172 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (174)..(176)

<223> xaa na posição 174 a 176 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (181)..(182)

<223> xaa na posição 181 a 182 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (186)..(186)

<223> xaa na posição 186 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (190)..(190)

<223> xaa na posição 190 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (194)..(195)

<223> xaa na posição 194 a 195 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (197)..(200)

<223> xaa na posição 197 a 200 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (201)..(207)

<223> xaa na posição 201 a 207 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (214)..(214)

<223> xaa na posição 214 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (216)..(216)

<223> xaa na posição 216 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (218) . . (218)

<223> xaa na posição 218 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (220) . . (238)<223> xaa na posição 220 a 238 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (239)..(250) <223> xaa na posição 239 a 250 é qualquer um ou nenhum<220> <221> Variante <222> (252)..(255) <223> xaa na posição 252 a 255 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (257) .. (258) <223> xaa na posição 257 a 258 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (260)..(261) <223> xaa na posição 260 a 261 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (264)..(264) <223> xaa na posição 264 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (267)..(269) <223> xaa na posição 267 a 269 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (271) .. (284) <223> xaa na posição 271 a 284 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (285)..(296) <223> xaa na posição 285 a 296 é qualquer um ou nenhum<220> <221> Variante <222> (298) .. (298) <223> xaa na posição 298 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (300)..(305) <223> xaa na posição 300 a 305 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (307)..(326) <223> xaa na posição 307 a 326 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (327)..(328) <223> xaa na posição 327 a 328 é qualquer um ou nenhum<220> <221> Variante <222> (330)..(336) <223> xaa na posição 330 a 336 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (338)..(339) <223> xaa na posição 338 a 339 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (342) .. (342) <223> xaa na posição 342 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante<222> (345) .. (347)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (352)..(352)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (354)..(359)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (360) .. (363)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (365)..(367)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (369)..(370)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (372)..(372)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (374)..(379)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (380) .. (384)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (386)..(387)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (390)..(390)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (404)..(405)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (410) .. (411)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (413)..(416)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (418) . . (419)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (423)..(427)<223> xaa na posição<220>

345 a 347 é qualquer aminoácido

352 é qualquer aminoácido

354 a 359 é qualquer aminoácido

360 a 363 é qualquer um ou nenhum aminoácido

365 a 367 é qualquer aminoácido

369 a 370 é qualquer aminoácido

372 é qualquer aminoácido

37 4 a 37 9 é qualquer aminoácido

380 a 384 é qualquer um ou nenhum aminoácido

386 a 387 é qualquer aminoácido

390 é qualquer aminoácido

404 a 405 é qualquer aminoácido

410 a 411 é qualquer aminoácido

413 a 416 é qualquer aminoácido

418 a 419 é qualquer aminoácido

423 a 427 é qualquer aminoácido<221> Variante<222> (430)..(435)

<223> xaa na posição 430 a 435 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (438)..(438)

<223> xaa na posição 438 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (441) . . (443)

<223> xaa na posição 441 a 443 é qualquer aminoácido<4 00> 43

Lys Val Tyr Asp xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa His Pro Gly Gly xaa

1 5 10 15

xaa Val xaa xaa Thr xaa xaa Gly xaa Asp xaa Thr Asp xaa Phe xaa

20 25 30

xaa xaa His Pro xaa xaa Ala xaa xaa xaa Leu xaa xaa xaa Tyr xaa

35 40 45

Gly Asp xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

50 55 60

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Phe xaa xaa65 70 75 80

xaa xaa Arg xaa Leu Arg xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa xaa xaa

85 90 95

xaa Ser xaa xaa xaa Tyr xaa xaa Lys xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

100 105 HO

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

115 120 125

xaa xaa xaa xaa xaa xaa Ala xaa xaa xaa Gly xaa Phe xaa Gln Gln

130 135 140

xaa Gly Trp Leu Ala His Asp Phe xaa His His Gln Val Phe xaa xaa145 150 155 160

Arg xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa xaa xaa

165 170 175

Gln Gly Phe Ser xaa xaa Trp Trp Lys xaa Lys His Asn xaa His His

180 185 190

Ala xaa xaa Asn xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Asp

195 200 205

Pro Asp Ile Asp Thr xaa Pro xaa Leu xaa Trp xaa xaa xaa xaa xaa

210 215 220

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa225 230 235 240

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gln xaa xaa xaa xaa Phe

245 250 255

xaa xaa Leu xaa xaa Ala Arg xaa Ser Trp xaa xaa xaa Ser xaa xaa

260 265 270

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

275 280 285

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Leu xaa Glu xaa xaa xaa xaa xaa

290 295 300

xaa His xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa305 310 315 320

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Phe xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

325 330 335

Gly xaa xaa Leu Ala xaa Val Phe xaa xaa xaa His Asn Gly Met xaa

340 345 350

Val xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Phe xaa xaa xaa Gln

355 360 365

xaa xaa Thr xaa Arg xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

370 375 380

Phe xaa xaa Trp Phe xaa Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His385 390 395 400

Leu Phe Pro xaa xaa Pro Arg His Asn xaa xaa Lys xaa xaa xaa xaaVal xaa xaa

xaa xaa xaa435

<210> 44

<211> 31

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante

<222> (2)..(3)

<223> xaa na posição 2 a 3 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (6)..(6)

<223> xaa na posição 6 é Asp ou Glu<220>

<221> Variante

<222> (9)..(9)

<223> xaa na posição 9 é Leu ou Val<220>

<221> Variante

<222> (12).. (12)

<223> xaa na posição 12 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (13)..(13)

<223> xaa na posição 13 é Leu, Met ou Val<220>

<221> Variante

<222> (17).. (18)

<223> xaa na posição 17 a 18 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (19)..(19)

<223> xaa na posição 19 é Ala, Asn, Pro ou Ser<220>

<221> Variante

<222> (20)..(20)

<223> xaa na posição 20 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (21)..(21)

<223> xaa na posição 21 é Ile ou Val<220>

<221> Variante

<222> (22).. (22)

<223> xaa na posição 22 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (23)..(23)

<223> xaa na posição 23 é Pro ou Val<220>

<221> Variante

<222> (24)..(24)

<223> xaa na posição 24 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (25)..(25)

<223> xaa na posição 25 é Ile ou Val<220>

<221> Variante

405 410 415

Leu Cys Lys xaa xaa xaa xaa xaa Tyr His xaa xaa xaa420 425 430

Gly Thr xaa Glu Val xaa xaa xaa Leu440<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Leu xaa1

xaa xaa

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

(26)..(26)

xaa na posição 26 é Glu ou Lys

Variante(27)..(27)

xaa na posição 27 é Ala, Ser ou Thr

Variante(30).. (30)

xaa na posição 30 é qualquer um ou nenhum aminoácido

44

xaa Gln Ile xaa His His xaa Phe Pro xaa xaa Pro Arg His

5 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Leu Cys xaa Lys20 25 30

4527PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(2)

xaa na posição 2 é Asp, Gly ou Asn

Variante(3).. (4)

xaa na posição 3 a 4 é qualquer aminoácido

Variante

(9)..(9)

xaa na posição 9 é qualquer aminoácido

Variante

(10)..(10)

xaa na posição 10 é Ala, Gln ou Ser

Variante(14) .. (14)

xaa na posição 14 é Asp ou Asn

Variante(18)..(18)

xaa na posição 18 é qualquer aminoácido

Variante(21)..(21)

xaa na posição 21 é Ala ou Ser

Variante(22)..(22)

xaa na posição 22 é Ala, Ser ou Val

Variante(23)..(23)

xaa na posição 23 é Pro ou Thr

Variante

(25)..(25)

xaa na posição 25 é Leu ou Val

Variante

(26)..(26)

xaa na posição 26 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (27).. (27)

<223> xaa na posição 27 é Glu, Gly, Asn ou Ser<400> 45

Gly xaa xaa xaa Gln Gly Phe Ser xaa xaa Trp Trp Lys xaa Lys His

1 5 10 15

Asn xaa His His xaa xaa xaa Asn xaa xaa xaa20 25

<210> 46 <211> 31 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (2) .. (3) <223> xaa na posição 2 a 3 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (5) . . (5) <223> xaa na posição 5 é Glu, Lys ou Arg<220> <221> Variante <222> (7)..(7) <223> xaa na posição 7 é Ala ou Gly<220> <221> Variante <222> (8)..(8) <223> xaa na posição 8 é Ser ou Thr<220> <221> Variante <222> (10)..(10) <223> xaa na posição 10 é Ala, Ser ou Val<220> <221> Variante <222> (12)..(13) <223> xaa na posição 12 a 13 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (14) .. (14) <223> xaa na posição 14 é Phe ou Met<220> <221> Variante <222> (16)..(16) <223> xaa na posição 16 é Pro ou Ser<220> <221> Variante <222> (17)..(18) <223> xaa na posição 17 a 18 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (20)..(22) <223> xaa na posição 20 a 22 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (24)..(25) <223> xaa na posição 24 a 25 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (26)..(26) <223> xaa na posição 26 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante<222><223><220><221><222><223><400>Thr xaa1

xaa xaa

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

(28)..(28)

xaa na posição 28 é qualquer aminoácido

Variante(29)..(29)

xaa na posição 29 é qualquer um ou nenhum aminoácido

46

xaa Gly xaa Asp xaa xaa Asp xaa Phe xaa xaa xaa His xaa

5 10 15

Ala xaa xaa xaa Leu xaa xaa xaa Tyr xaa xaa Gly Asp20 25 30

4726PRT

Seqüência artificial

Variante(2) .. (2)

xaa na posição 2 é Phe, Leu ou Val

Variante

(3)..(3)

xaa na posição 3 é qualquer aminoácido

Variante

(4) .. (4)

xaa na posição 4 é Ala, Gly ou Ser

Variante

(5) .. (5)

xaa na posição 5 é Gln ou Thr

Variante

(6)..(6)

xaa na posição 6 é Ala, Cys ou Pro

Variante(7)..(7)

xaa na posição 7 é Ser, Thr ou Val

Variante(8)..(8)xaa na posição

é Cys, Ser ou Thr

Variante(10)..(11)

xaa na posição 10 a 11 é qualquer aminoácido

Variante(14). . (14)

xaa na posição 14 é Ile ou Leu

Variante(17) . . (18)

xaa na posição 17 a 18 é qualquer aminoácido

Variante(19)..(20)

xaa na posição 19 a 20 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(22)..(23)

xaa na posição 22 a 23 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante<222> (26) . . (26)<223> xaa na posição 26 é Ala, Pro ou Ser<4 00> 47Phe xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa xaa Leu Ala xaa Val1 5 10 15xaa xaa xaa xaa Asn xaa xaa Gly Met xaa 20 25<210> 48<211> 13<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <221> Variante<222> (6) .. (6)<223> xaa na posição 6 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante<222> (8) . . (8)<223> xaa na posição 8 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante<222> (11).· (H) ,<223> xaa na posição 11 é qualquer um ou nenhum aiinoacido<220> <221> Variante<222> (13)..(13)<223> xaa na posição 13 é Asp ou Ser<4 00> 48Pro Asp Ile Asp Thr xaa Pro xaa Leu Leu xaa Trp xaa1 5 10<210> 49<211> 17<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <221> Variante<222> (2) . . (3)<223> xaa na posição 2 a 3 é qualquer aminoacido<220> <221> Variante<222> (4) ·- (4) ,<223> xaa na posição 4 é qualquer um ou nenhum aminoácido<22Ό> <221> Variante<222> (7)..(8)<223> xaa na posição 7 a 8 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante<222> (9) .. (9)<223> xaa na posição 9 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante<222> (11) . - (H)<223> xaa na posição 11 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante<222> (12) . . (12)<223> xaa na posição 12 é Phe ou Leu<220> <221> Variante<222> (15)..(15)<223> xaa na posição 15 é Ile ou Leu<4 00> 49

Gln xaa xaa xaa Tyr Phe xaa xaa xaa Leu xaa xaa Ala Arg xaa Ser

1

Trp

10

15

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>

5020PRT

Seqüência artificial

Variante(2) . . (2)

xaa na posição 2 é Asp, Glu ou Thr

Variante

(3)..(3)

xaa na posição 3 é Ala ou Thr

Variante

(4).. (4)

xaa na posição 4 é Asp, Gly, Ser ou Thr

Variante

(5)..(7)

xaa na posição 5 a 7 é qualquer aminoácido

Variante(9) .. (10)

xaa na posição 9 a 10 é qualquer aminoácido

Variante

(13)..(13)

xaa na posição 13 é Phe, Leu ou Val

Variante

(14)..(15)

xaa na posição 14 a 15 é qualquer aminoácido

Variante

(17)..(17)

xaa na posição 17 é Ala, Asp, Gly, Asn ou Ser

Variante

(18)..(19)

xaa na posição 18 a 19 é qualquer aminoácido

Variante(20)..(20)

xaa na posição 20 é Ala, Gln ou Ser

50

His xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa xaa Glu Val xaa xaa xaa Leu

15 10 15

xaa xaa xaa xaa20

51

1320DNA

Thraustochytrium ssp.

<210><211><212><213><220><221><222><4 00>

CDS

(1)..(1320)5148

96

144

atg ggc aag ggc age gag ggc cgc age gcg gcg cgc gag atg acg gccMet Gly Lys Gly Ser Glu Gly Arg Ser Ala Ala Arg Glu Met Thr Ala1 5 10 15

gag gcg aac ggc gac aag cgg aaa acg att ctg ate gag ggc gtc ctgGlu Ala Asn Gly Asp Lys Arg Lys Thr Ile Leu Ile Glu Gly Val Leu

20 25 30

tac gac gcg acg aac ttt aag cac ccg ggc ggt tcg ate ate aac ttcTyr Asp Ala Thr Asn Phe Lys His Pro Gly Gly Ser Ile Ile Asn Phe

35 40 45

ttg acc gag ggc gag gcc ggc gtg gac gcg acg cag gcg tac cgc gag 192

Leu Thr Glu Gly Glu Ala Gly Val Asp Ala Thr Gln Ala Tyr Arg Glu

50 55 60

ttt cat cag cgg tcc ggc aag gcc gac aag tac ctc aag tcg ctg ccgPhe His Gln Arg Ser Gly Lys Ala Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Pro65 70 75 80

aag ctg gat gcg tcc aag gtg gag tcg cgg ttc tcg gcc aaa gag cagLys Leu Asp Ala Ser Lys Val Glu Ser Arg Phe Ser Ala Lys Glu Gln

85 90 95

gcg cgg cgc gac gcc atg acg, cgc gac tac·gcg gcc ttt cgc gag. gagAla Arg Arg Asp Ala Met Thr Arg Asp Tyr Ala Ala Phe Arg Glu Glu

100 105 HO

ctc gtc gcc gag ggg tac ttt gac ccg tcg ate ccg cac atg att tacLeu Val Ala Glu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ile Pro His Met Ile Tyr

115 120 125

cgc gtc gtg gag ate gtg gcg ctc ttc gcg ctc tcg ttc tgg ctc atgArg Val Val Glu Ile Val Ala Leu Phe Ala Leu Ser Phe Trp Leu Met

130 135 140

tcc aag gcc tcg ccc acc tcg ctc gtg ctg ggc gtg gtg atg aac ggcSer Lys Ala Ser Pro Thr Ser Leu Val Leu Gly Val Val Met Asn Gly145 150 155 160

att gcg cag ggc cgc tgc ggc tgg gtc atg cac gag atg ggc cac gggIle Ala Gln Gly Arg Cys Gly Trp Val Met His Glu Met Gly His Gly

165 170 175

tcg ttc acg ggc gtc ate tgg ctc gac gac cgg atg tgc gag ttc ttcSer Phe Thr Gly Val Ile Trp Leu Asp Asp Arg Met Cys Glu Phe Phe

180 185 190

tac ggc gtc ggc tgc ggc atg age ggg cac tac tgg aag aac cag cacTyr Gly Val Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gln His

195 200 205

age aag cac cac gcc gcg ccc aac cgc ctc gag cac gat gtc gat ctcSer Lys His His Ala Ala Pro Asn Arg Leu Glu His Asp Val Asp Leu

210 215 220

aac acg ctg ccc ctg gtc gcc ttt aac gag cgc gtc gtg cgc aag gtcAsn Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Glu Arg Val Val Arg Lys Val225 230 235 240

aag ccg gga tcg ctg ctg gcg ctc tgg ctg cgc gtg cag gcg tac ctcLys Pro Gly Ser Leu Leu Ala Leu Trp Leu Arg Val Gln Ala Tyr Leu

245 250 255

ttt gcg ccc gtc tcg tgc ctg ctc ate ggc ctt ggc tgg acg ctc tacPhe Ala Pro Val Ser Cys Leu Leu Ile Gly Leu Gly Trp Thr Leu Tyr

260 265 270

ctg cac ccg cgc tac atg ctg cgc acc aag cgg cac atg gag ttc gtcLeu His Pro Arg Tyr Met Leu Arg Thr Lys Arg His Met Glu Phe Val

275 280 285

tgg ate ttc gcg cgc tac att ggc tgg ttc tcg ctc atg ggc gct ctcTrp Ile Phe Ala Arg Tyr Ile Gly Trp Phe Ser Leu Met Gly Ala Leu

290 295 300

ggc tac tcg ccg ggc acc tcg gtc ggg atg tac ctg tgc tcg ttc ggcGly Tyr Ser Pro Gly Thr Ser Val Gly Met Tyr Leu Cys Ser Phe Gly305 310 315 320

ctc ggc tgc att tac att ttc ctg cag ttc gcc gtc age cac acg cac1008

Leu Gly Cys Ile Tyr Ile Phe Leu Gln Phe Ala Val Ser His Thr His

240

288

336

384

432

80

528

576

624

672

720

768

816

864

912

960ctg ccg gtg1056

Leu Pro Val

gcc gac cac1104

Ala Asp His355

tgg atg tcg1152

Trp Met Ser

370gcg ccg cag1200

Ala Pro Gln385

ttc aag cgc1248

Phe Lys Arg

gtc tcg acc1296

Val Ser Thr

gcc gac acc1320

Ala Asp Thr435<210> 52<211> 439<212> PRT<213> Thraustochytrium ssp.<4 00> 52

Met Gly Lys Gly Ser Glu Gly Arg Ser Ala Ala Arg Glu Met Thr Ala1 5 10 15 Glu Ala Asn Gly 20 Asp Lys Arg Lys Thr 25 Ile Leu Ile Glu Gly 30 Val LeuTyr Asp Ala Thr Asn Phe Lys His Pro Gly Gly Ser Ile Ile Asn Phe 35 40 45 Leu Thr 50 Glu Gly Glu Ala Gly 55 Val Asp Ala Thr Gln 60 Ala Tyr Arg GluPhe His Gln Arg Ser Gly Lys Ala Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Pro65 70 75 80Lys Leu Asp Ala Ser Lys Val Glu Ser Arg Phe Ser Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ala Arg Arg Asp 100 Ala Met Thr Arg Asp 105 Tyr Ala Ala Phe Arg 110 Glu GluLeu Val Ala 115 Glu Gly Tyr Phe Asp 120 Pro Ser Ile Pro His 125 Met Ile TyrArg Val Val Glu Ile Val Ala Leu Phe Ala Leu Ser Phe Trp Leu Met 130 135 140 Ser Lys Ala Ser Pro Thr Ser Leu Val Leu Gly Val Val Met Asn Gly145 150 155 160Ile Ala Gln Gly Arg 165 Cys Gly Trp Val Met 170 His Glu Met Gly His 175 GlySer Phe Thr Gly 180 Val Ile Trp Leu Asp 185 Asp Arg Met Cys Glu 190 Phe PheTyr Gly Val Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gln His 195 200 205 Ser Lys 210 His His Ala Ala Pro 215 Asn Arg Leu Glu His 220 Asp Val Asp LeuAsn Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Glu Arg Val Val Arg Lys Val

325 330 335

acc aac ccg gag gac cag ctg cac tgg ctc gag tac gcg

Thr Asn Pro Glu Asp Gln Leu His Trp Leu Glu Tyr Ala

340 345 350

acg gtg aac att age acc aag tcc tgg ctc gtc acg tgg

Thr Val Asn Ile Ser Thr Lys Ser Trp Leu Val Thr Trp

360 365

aac ctg aac ttt cag ate gag cac cac ctc ttc ccc acg

Asn Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr

375 380

ttc cgc ttc aag gaa ate agt cct cgc gtc gag gcc ctc

Phe Arg Phe Lys Glu Ile Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu390 395 400

cac aac ctc ccg tac tac gac ctg ccc tac acg age gcg

His Asn Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Pro Tyr Thr Ser Ala

405 410 415

acc ttt gcc aat ctt tat tcc gtc ggc cac tcg gtc ggc

Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly420 425 430

aag aag cag gac tga

Lys Lys Gln Asp

440225 230 235 240

Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ala Leu Trp Leu Arg Val Gln Ala Tyr Leu

245 250 255

Phe Ala Pro Val Ser Cys Leu Leu Ile Gly Leu Gly Trp Thr Leu Tyr

260 265 270

Leu His Pro Arg Tyr Met Leu Arg Thr Lys Arg His Met Glu Phe Val

275 280 285

Trp Ile Phe Ala Arg Tyr Ile Gly Trp Phe Ser Leu Met Gly Ala Leu

290 295 300

Gly Tyr Ser Pro Gly Thr Ser Val Gly Met Tyr Leu Cys Ser Phe Gly305 310 315 320

Leu Gly Cys Ile Tyr Ile Phe Leu Gln Phe Ala Val Ser His Thr His

325 330 335

Leu Pro Val Thr Asn Pro Glu Asp Gln Leu His Trp Leu Glu Tyr Ala

340 345 350

Ala Asp His Thr Val Asn Ile Ser Thr Lys Ser Trp Leu Val Thr Trp

355 360 365

Trp Met Ser Asn Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr

370 375 380

Ala Pro Gln Phe Arg Phe Lys Glu Ile Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu385 390 395 400

Phe Lys Arg His Asn Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Pro Tyr Thr Ser Ala

405 410 415

Val Ser Thr Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly

420 425 430

Ala Asp Thr Lys Lys Gln Asp435

tauri

a aat aac gat ggg ate ccc acg gtg gag ate 48

ι Asn Asn Asp Gly Ile Pro Thr Val Glu Ile

10 15

; gag cgg gcg gag gea aac gtg aag ctg tcc 96

j Glu Arg Ala Glu Ala Asn Val Lys Leu Ser25 30

ccg gcg gcg ctg gcg aag acg ttc gcg agg cgg 144

Pro Ala Ala Leu Ala Lys Thr Phe Ala Arg Arg

40 45

ggg gtg gag tac gat gtg acg gat ttt aag cac 192

Gly Val Glu Tyr Asp Val Thr Asp Phe Lys His55 60att ttc tat gcg ttg tca aac acc ggg gcg gac 240

Ile Phe Tyr Ala Leu Ser Asn Thr Gly Ala Asp70 75 80

aag gag ttt cat cat cgg tcg aga aag gcg agg 288

Lys Glu Phe His His Arg Ser Arg Lys Ala Arg

90 95

ctc ccg tet cga ccg gcc aag acg gcc aag gtg 336

Leu Pro Ser Arg Pro Ala Lys Thr Ala Lys Val

105 HO

ctc caa gat ttc gcc aag tgg cgg aaa gaa ttg 384

Leu Gln Asp Phe Ala Lys Trp Arg Lys Glu Leu

120 125

ttc aag ccc tet ccg gcg cac gtg gcg tat cgc 432

Phe Lys Pro Ser Pro Ala His Val Ala Tyr Arg130 " ~ 135 140

ttc gcc gag ctc gcg gcg atg tac gct ctc ggg acg tac ctg atg tac

<210> 53 <211> 1371 <212> DNA <213> Ostreococcus <220> <221> CDS <222> (1) - .(1371) <400> 53 atg tgc gtg gag acgMet Cys Val Glu Thr1 5gcg ttc gac ggt gagAla Phe Asp Gly Glu 20 gcg gag aag atg gagAla Glu Lys Met Glu 35 tac gtc gtg ate gagTyr Val Val Ile Glu 50 ccg gga gga acg gttPro Gly Gly Thr Val65 gcg acg gaa gcg ttcAla Thr Glu Ala Phe 85aaa gcc ttg gcg gcgLys Ala Leu Ala Ala 100 gac gac gcg gag atgAsp Asp Ala Glu Met 115 gag aga gat gga ttcGlu Arg Asp Gly Phe

480528

624

672

720

768

816

64

912

960

Phe Ala Glu Leu Ala Ala Met Tyr Ala Leu Gly Thr Tyr Leu Met Tyr145 150 155 160

gct cga tac gtc gtc tcc tcg gtg ctc gtg tac gct tgc ttt ttc ggcAla Arg Tyr Val Val Ser Ser Val Leu Val Tyr Ala Cys Phe Phe Gly

165 170 175

gcc cga tgc ggt tgg gtg cag cac gag ggc gga cac age tcg ctg acg 57 6

Ala Arg Cys Gly Trp Val Gln His Glu Gly Gly His Ser Ser Leu Thr

180 185 190

ggc aac att tgg tgg gac aag cgc ate cag gcc ttc aca gcc ggg ttcGly Asn Ile Trp Trp Asp Lys Arg Ile Gln Ala Phe Thr Ala Gly Phe

195 200 205

ggt ctc gcc ggt age ggc gac atg tgg aac tcg atg cac aac aag catGly Leu Ala Gly Ser Gly Asp Met Trp Asn Ser Met His Asn Lys His

210 215 220

cac gcg acg cct caa aag gtt cgt cac gac atg gat ctg gac acc accHis Ala Thr Pro Gln Lys Val Arg His Asp Met Asp Leu Asp Thr Thr225 230 235 240

ccc gcg gtg gcg ttc ttc aac acc gcg gtg gaa gac aat cgt ccc cgtPro Ala Val Ala Phe Phe Asn Thr Ala Val Glu Asp Asn Arg Pro Arg

245 250 255

ggc ttt age aag tac tgg ttg cgc ctt cag gcg tgg acc ttc ate cccGly Phe Ser Lys Tyr Trp Leu Arg Leu Gln Ala Trp Thr Phe Ile Pro

260 265 270

gtg acg tcc ggc ttg gtg ctc ctt ttc tgg atg ttt ttc ctc cac cccVal Thr Ser Gly Leu Val Leu Leu Phe Trp Met Phe Phe Leu His Pro

275 280 285

tcc aag gct ttg aag ggt ggc aag tac gaa gag ttg gtg tgg atg ctcSer Lys Ala Leu Lys Gly Gly Lys Tyr Glu Glu Leu Val Trp Met Leu

290 295 300

gcc gcg cac gtc ate cgc acg tgg acg ate aag gcg gtg acc gga ttcAla Ala His Val Ile Arg Thr Trp Thr Ile Lys Ala Val Thr Gly Phe305 310 315 320

acc gcg atg cag tcc tac ggc tta ttt ttg gcg acg age tgg gtg age1008

Thr Ala Met Gln Ser Tyr Gly Leu Phe Leu Ala Thr Ser Trp Val Ser

325 330 335

ggc tgc tat ctg ttt gea cac ttc tcc acg tcg cac acg cac ctg gat1056

Gly Cys Tyr Leu Phe Ala His Phe Ser Thr Ser His Thr His Leu Asp

340 345 350

gtg gtg ccc gcg gac gag cat.ctc tcc tgg gtt cga tac gcc gtc gat1104

Val Val Pro Ala Asp Glu His Leu Ser Trp Val Arg Tyr Ala Val Asp

355 360 365

cac acg ate gac ate gat ccg agt caa ggt tgg gtg aac tgg ttg atg1152

His Thr Ile Asp Ile Asp Pro Ser Gln Gly Trp Val Asn Trp Leu Met

370 375 380

ggc tac ctc aac tgc caa gtc ate cac cac ctc ttt ccg age atg ccg1200

Gly Tyr Leu Asn Cys Gln Val Ile His His Leu Phe Pro Ser Met Pro385 390 395 400

cag ttc cgc cag ccc gag gta tet cgc cgc ttc gtc gcc ttt gcg aaa1248

Gln Phe Arg Gln Pro Glu Val Ser Arg Arg Phe Val Ala Phe Ala Lys

405 410 415

aag tgg aac ctc aac tac aag gtc atg acc tac gcc ggt gcg tgg aag1296

Lys Trp Asn Leu Asn Tyr Lys Val Met Thr Tyr Ala Gly Ala Trp Lys

420 425 430

gea acg ctc gga aac ctc gac aac gtg ggt aag cac tac tac gtg cac1344

Ala Thr Leu Gly Asn Leu Asp Asn Val Gly Lys His Tyr Tyr Val His435 440 445

ggc caa cac tcc gga aag acg gcg taa 1371 Gly Gln 450 His Ser Gly Lys Thr 455 Ala <210> 54 <211> 456 <212> PRT <213> Ostreococcus tauri <400> 54 IleMet Cys Val Glu Thr Glu Asn Asn Asp Gly Ile Pro Thr Val Glu 1 5 10 15 Ala Phe Asp Gly 20 Glu Arg Glu Arg Ala 25 Glu Ala Asn Val Lys 30 Leu SerAla Glu Lys Met Glu Pro Ala Ala Leu Ala Lys Thr Phe Ala Arg Arg 35 40 45 HisTyr Val Val Ile Glu Gly Val Glu Tyr Asp Val Thr Asp Phe Lys 50 55 60 Pro Gly Gly Thr Val Ile Phe Tyr Ala Leu Ser Asn Thr Gly Ala Asp65 70 75 80Ala Thr Glu Ala Phe Lys Glu Phe His His Arg Ser Arg Lys Ala Arg 85 90 95 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Pro Ser Arg Pro Ala Lys Thr Ala Lys Val 100 105 110 Asp Asp Ala Glu Met Leu Gln Asp Phe Ala Lys Trp Arg Lys Glu Leu 115 120 125 Glu Arg 130 Asp Gly Phe Phe Lys 135 Pro Ser Pro Ala His 140 Val Ala Tyr ArgPhe Ala Glu Leu Ala Ala Met Tyr Ala Leu Gly Thr Tyr Leu Met Tyr145 150 155 160Ala Arg Tyr Val Val Ser Ser Val Leu Val Tyr Ala Cys Phe Phe Gly 165 170 175 Ala Arg Cys Gly Trp Val Gln His Glu Gly Gly His Ser Ser Leu Thr 180 185 190 Gly Asn Ile Trp Trp Asp Lys Arg Ile Gln Ala Phe Thr Ala Gly Phe 195 200 205 Gly Leu Ala Gly Ser Gly Asp Met Trp Asn Ser Met His Asn Lys His 210 215 220 His Ala Thr Pro Gln Lys Val Arg His Asp Met Asp Leu Asp Thr Thr225 230 235 240Pro Ala Val Ala Phe 245 Phe Asn Thr Ala Val 250 Glu Asp Asn Arg Pro 255 ArgGly Phe Ser Lys Tyr Trp Leu Arg Leu Gln Ala Trp Thr Phe Ile Pro 260 265 270 Val Thr Ser Gly Leu Val Leu Leu Phe Trp Met Phe Phe Leu His Pro 275 280 285 Ser Lys 290 Ala Leu Lys Gly Gly 295 Lys Tyr Glu Glu Leu 300 Val Trp Met LeuAla Ala His Val Ile Arg Thr Trp Thr Ile Lys Ala Val Thr Gly Phe305 310 315 320Thr Ala Met Gln Ser Tyr Gly Leu Phe Leu Ala Thr Ser Trp Val Ser 325 330 335 Gly Cys Tyr Leu Phe Ala His Phe Ser Thr Ser His Thr His Leu Asp 340 345 350 Val Val Pro 355 Ala Asp Glu His Leu 360 Ser Trp Val Arg Tyr 365 Ala Val AspHis Thr 370 Ile Asp Ile Asp Pro 375 Ser Gln Gly Trp Val 380 Asn Trp Leu MetGly Tyr Leu Asn Cys Gln Val Ile His His Leu Phe Pro Ser Met Pro385 390 395 400Gln Phe Arg Gln Pro Glu Val Ser Arg Arg Phe Val Ala Phe Ala Lys 405 410 415 Lys Trp Asn Leu Asn Tyr Lys Val Met Thr Tyr Ala Gly Ala Trp Lys420 425 430

Ala Thr Leu Gly Asn Leu Asp Asn Val Gly Lys His Tyr Tyr Val His

435 440 445

Gly Gln His Ser Gly Lys Thr Ala

450 455

<210> 55<211> 1254<212> DNA

<213> Leishmania major<220>

<221> CDS<222> (1).. (1254)<400> 55

atg gcc ctc gac aat gtc cgt ccg cac caa ccg aac gag gtg ctg ateMet Ala Leu Asp Asn Val Arg Pro His Gln Pro Asn Glu Val Leu Ile1 5 10 15

gat ggc gtc ctt tac gac tgc acc gat ttc cgg cat ccg ggt ggc ageAsp Gly Val Leu Tyr Asp Cys Thr Asp Phe Arg His Pro Gly Gly Ser

20 25 30

att ctg aaa tac tac ctc ggc age ggc gac gcc acc gag acg tac caaIle Leu Lys Tyr Tyr Leu Gly Ser Gly Asp Ala Thr Glu Thr Tyr Gln

35 40 45

cag ttc cac ttg aag ctg ccc agg gcg gac aag tat ctc aag cgg ctgGln Phe His Leu Lys Leu Pro Arg Ala Asp Lys Tyr Leu Lys Arg Leu

50 55 60

ccg aat cgc ccg gcg ccg cca cag cac age gtc aac gtg gat gag cagPro Asn Arg Pro Ala Pro Pro Gln His Ser Val Asn Val Asp Glu Gln65 70 75 80

aag cga ttg gag aag ctc tcg cgg gac ttc aag gcg ctg cag gat gcgLys Arg Leu Glu Lys Leu Ser Arg Asp Phe Lys Ala Leu Gln Asp Ala

85 90 95

tgc gta gag gag ggc ctt ttt aac gcc age tgg ccg cac ate gtc tacCys Val Glu Glu Gly Leu Phe Asn Ala Ser Trp Pro His Ile Val Tyr

100 105 HO

cgg ttt tet gag ctg ate ctg atg cac gcc ate ggt ctt tac atg ctcArg Phe Ser Glu Leu Ile Leu Met His Ala Ile Gly Leu Tyr Met Leu

115 120 125

ttc cgt ctt ccg ate ctg tgg ccc gtc gcg ctg gtg ate ctt gga gtgPhe Arg Leu Pro Ile Leu Trp Pro Val Ala Leu Val Ile Leu Gly Val

130 135 140

gcg gag ggg cga tgt ggc tgg tgg atg cac gag gcc ggt cac tac ageAla Glu Gly Arg Cys Gly Trp Trp Met His Glu Ala Gly His Tyr Ser145 150 155 160

gtc aca ggc att ccg tgg ttg gac att aaa ata cag gag gta ctc tacVal Thr Gly Ile Pro Trp Leu Asp Ile Lys Ile Gln Glu Val Leu Tyr

165 170 175

gga ctt ggc gat gga atg age gcg tcg tgg tgg cgg tcg cag cat aacGly Leu Gly Asp Gly Met Ser Ala Ser Trp Trp Arg Ser Gln His Asn

180 185 190

aag cat cac gct act ccg cag aag cac cgg cac gac gtg gac ctt gagLys His His Ala Thr Pro Gln Lys His Arg His Asp Val Asp Leu Glu

195 200 205

acg ctg cct ctc gtc gcc ttc aac aag ate ate gcg cgc cgc ggc aagThr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Lys Ile Ile Ala Arg Arg Gly Lys

210 215 220

agg aac gcg age att cgc cgc tgg ate tcc ctg cag atg ttc ctc ttcArg Asn Ala Ser Ile Arg Arg Trp Ile Ser Leu Gln Met Phe Leu Phe225 230 235 240

ggc ccc gtc acc tgc tcc ctt gtc gcc ctc tac tgg cag ctc ttc ctaGly Pro Val Thr Cys Ser Leu Val Ala Leu Tyr Trp Gln Leu Phe Leu

245 250 255

cac gtc cgc cac gcc atg cgc act cag cgt tac aca gag ggc tet gccHis Val Arg His Ala Met Arg Thr Gln Arg Tyr Thr Glu Gly Ser Ala

96

14'

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

116260 265 270

ate ctg tgc cgc tgg ate gtg gtc ggc gtt ate tgt cac cag ctg cagIle Leu Cys Arg Trp Ile Val Val Gly Val Ile Cys His Gln Leu Gln

275 280 285

gtc tcg ttc tgg caa ggc ctc ggc ggc gtt ctc ttc tcc cag gcc ttcVal Ser Phe Trp Gln Gly Leu Gly Gly Val Leu Phe Ser Gln Ala Phe

290 295 300

age gcc gcc tac ate ttc ata aac ttc gcc ctc aac cac tet cac ctgSer Ala Ala Tyr Ile Phe Ile Asn Phe Ala Leu Asn His Ser His Leu305 310 315 320

ccg atg ctt ccg gaa gac gaa cac gcg cac ttc gtc gag tac gcg gcc1008

Pro Met Leu Pro Glu Asp Glu His Ala His Phe Val Glu Tyr Ala Ala

325 330 335

ate tac acc atg aac gtg aca ccg tcg tgg ttc gtg acg tgg ttc atg·1056

Ile Tyr Thr Met Asn Val Thr Pro Ser Trp Phe Val Thr Trp Phe Met

340 345 350

ggc tac ctt aac tac cag gtg gaa cac cac ctc ttc cct acc atg-cca1104

Gly Tyr Leu Asn Tyr Gln Val Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro

355 360 365

cag ttc cgc ttc gtc caa ctg gcg ccg cga gtg cgg aaa ctt ttt gag1152

Gln Phe Arg Phe Val Gln Leu Ala Pro Arg Val Arg Lys Leu Phe Glu

370 375 380

gaa aac ggc ctc aag tac gat tcg cgt ccg tac atg gag tcg ctc cag1200

Glu Asn Gly Leu Lys Tyr Asp Ser Arg Pro Tyr Met Glu Ser Leu Gln385 390 395 400

aaa acc ttc aag aac ctc ggc gac gtg gcc gag ttc ate gtt gct ggg1248

Lys Thr Phe Lys Asn Leu Gly Asp Val Ala Glu Phe Ile Val Ala Gly405 410 415

aac taa

1254

Asn

<210> 56<211> 417<212> PRT

<213> Leishmania major<4 00> 56

Met Ala Leu Asp Asn Val Arg Pro His Gln Pro Asn Glu Val Leu Ile1 5 10 15

Asp Gly Val Leu Tyr Asp Cys Thr Asp Phe Arg His Pro Gly Gly Ser

20 25 30

Ile Leu Lys Tyr Tyr Leu Gly Ser Gly Asp Ala Thr Glu Thr Tyr Gln

35 40 45

Gln Phe His Leu Lys Leu Pro Arg Ala Asp Lys Tyr Leu Lys Arg Leu

50 55 60

Pro Asn Arg Pro Ala Pro Pro Gln His Ser Val Asn Val Asp Glu Gln65 70 75 80

Lys Arg Leu Glu Lys Leu Ser Arg Asp Phe Lys Ala Leu Gln Asp Ala

85 90 95

Cys Val Glu Glu Gly Leu Phe Asn Ala Ser Trp Pro His Ile Val Tyr

100 105 HO

Arg Phe Ser Glu Leu Ile Leu Met His Ala Ile Gly Leu Tyr Met Leu

115 120 125

Phe Arg Leu Pro Ile Leu Trp Pro Val Ala Leu Val Ile Leu Gly Val

130 135 140

Ala Glu Gly Arg Cys Gly Trp Trp Met His Glu Ala Gly His Tyr Ser145 150 155 160

Val Thr Gly Ile Pro Trp Leu Asp Ile Lys Ile Gln Glu Val Leu Tyr165 170 175Gly Leu Gly Asp Gly Met Ser Ala Ser Trp Trp Arg Ser Gln His 180 185 190 Lys His His Ala Thr Pro Gln Lys His Arg His Asp Val Asp Leu 195 200 205 Thr Leu 210 Pro Leu Val Ala Phe 215 Asn Lys Ile Ile Ala 220 Arg Arg GlyArg Asn Ala Ser Ile Arg Arg Trp Ile Ser Leu Gln Met Phe Leu225 230 235 Gly Pro Val Thr Cys Ser Leu Val Ala Leu Tyr Trp Gln Leu Phe 245 250 255His Val Arg His Ala Met Arg Thr Gln Arg Tyr Thr Glu Gly Ser 260 265 270 Ile Leu Cys 275 Arg Trp Ile Val Val 280 Gly Val Ile Cys His 285 Gln LeuVal Ser 290 Phe Trp Gln Gly Leu 295 Gly Gly Val Leu Phe 300 Ser Gln AlaSer Ala Ala Tyr Ile Phe Ile Asn Phe Ala Leu Asn His Ser His305 310 315 Pro Met Leu Pro Glu 325 Asp Glu His Ala His 330 Phe Val Glu Tyr Ala 335Ile Tyr Thr Met Asn Val Thr Pro Ser Trp Phe Val Thr Trp Phe 340 345 350 Gly Tyr Leu Asn Tyr Gln Val Glu His His Leu Phe Pro Thr Met 355 360 365 Gln Phe Arg Phe Val Gln Leu Ala Pro Arg Val Arg Lys Leu Phe 370 375 380 Glu Asn Gly Leu Lys Tyr Asp Ser Arg Pro Tyr Met Glu Ser Leu385 390 395 Lys Thr Phe Lys Asn Leu Gly Asp Val Ala Glu Phe Ile Val Ala 405 410 415

240

320

100

Asn

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221>

57

401

PRT

Seqüência artificial

Variante(2) .. (2)

xaa. na posição 2 é qualquer aminoácido

Variante(5)..(5)

xaa na posição 5 é qualquer aminoácido

Variante(8)..(8)

xaa na posição 8 é qualquer aminoácido

Variante(10)..(10)

xaa na posição 10 é qualquer aminoácido

Variante(12) . . (12)

xaa na posição 12 é qualquer aminoácido

Variante(17)..(26)

xaa na posição 17 a 26 é qualquer aminoácidoVariante<222> (27) .. (29)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (33) . . (37)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (40)..(44)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (46) . . (46)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (48) . . (48)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (50)..(51)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (54)..(56)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (58)..(69)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (70)..(77)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (79)..(89)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (91) . . (91)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (93) .. (94)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (96)..(97)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (99)..(100)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (103) .. (104)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (106)..(110)<223> xaa na posição<220>

27 a 29 é qualquer um ou nenhum aminoácido

33 a 37 é qualquer aminoácido

4 0 a 4 4 é qualquer aminoácido

46 é qualquer aminoácido

4 8 é qualquer aminoácido

50 a 51 é qualquer aminoácido

54 a 56 é qualquer aminoácido

58 a 69 é qualquer aminoácido

7 0 a 7 7 é qualquer um ou nenhum aminoácido

7 9 a 8 9 é qualquer aminoácido

91 é qualquer aminoácido

93 a 94 é qualquer aminoácido

96 a 97 é qualquer aminoácido

99 a 100 é qualquer aminoácido

103 a 104 é qualquer aminoácido

106 a 110 é qualquer aminoácido<221> Variante <222> (112) .. (127) <223> xaa na posição 112 a<220> <221> Variante <222> (128)..(129) <223> xaa na posição 128 a<220> <221> Variante <222> (131)..(137) <223> xaa na posição 131 a<220> <221> Variante <222> (142)..(143) <223> xaa na posição 142 a<22 0> <221> Variante <222> (146)..(146) <223> xaa na posição 146 é<220> <221> Variante <222> (149)..(149) <22 3> xaa na posição 149 é<220> <221> Variante <222> (151) .. (151) <223> xaa na posição 151 é<220> <221> Variante <222> (154)..(155) <223> xaa na posição 154 a<22 0> <221> Variante <22 2> (157)..(157) <223> xaa na posição 157 é<22 0> <221> Variante <22 2> (159)..(166) <223> xaa na posição 159 a<22 0> <22 1> Variante <222> (168). .(168) <223> xaa na posição 168 é<220> <221> Variante <222> (170) .. (172) <223> xaa na posição 170 a<220> <22 1> Variante <222> (174) .. (176) <223> xaa na posição 174 a<220> <221> Variante <222> (17 8) .. (180) <223> xaa na posição 178 a<220> <221> Variante <222> (182) . . (182) <223> xaa na posição 182 é<220> <221 > Variante <222> (187) .. (187) <223> xaa na posição 187 é

112 a 127 é qualquer aminoácido

128 a 129 é qualquer um ou nenhum aminoácido

131 a 137 é qualquer aminoácido

142 a 143 é qualquer aminoácido

14 6 é qualquer aminoácido

14 9 é qualquer aminoácido

151 é qualquer aminoácido

154 a 155 é qualquer aminoácido

157 é qualquer aminoácido

159 a 166 é qualquer aminoácido

168 é qualquer aminoácido

170 a 172 é qualquer aminoácido

174 a 176 é qualquer aminoácido

178 a 180 é qualquer aminoácido

182 é qualquer aminoácido

187 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (189)..(192)

<223> xaa na posição 189 a 192 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (195) . . (195)

<223> xaa na posição 195 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (198)..(198)

<223> xaa na posição 198 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (200)..(200)

<223> xaa na posição 200 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (202) . . (202)

<223> xaa na posição 202 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (206) . . (221)

<223> xaa na posição 206 a 221 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (223)..(225)

<223> xaa na posição 223 a 225 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (227) . . (229)

<223> xaa na posição 227 a 229 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (231).. (231)

<223> xaa na posição 231 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (234)..(236)

<223> xaa na posição 234 a 236 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (238)..(239)

<223> xaa na posição 238 a 239 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (241) . . (241)

<223> xaa na posição 241 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (243)..(245)

<223> xaa na posição 243 a 245 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (248)..(258)

<223> xaa na posição 248 a 258 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (260)..(285)

<223> xaa na posição 260 a 285 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (286)..(286)<223> xaa na posição 286 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (288).. (289)

<223> xaa na posição 288 a 289 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (291).. (298)

<223> xaa na posição 291 a 298 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (300)..(300)

<223> xaa na posição 300 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (302).. (303)

<223> xaa na posição 302 a 303 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (305)..(307)

<223> xaa na posição 305 a 307 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (309)..(309)

<223> xaa na posição 309 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (312).. (324)

<223> xaa na posição 312 a 324 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (327).. (329)

<223> xaa na posição 327 a 329 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (331)..(338)

<223> xaa na posição 331 a 338 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (339)..(339)

<223> xaa na posição 339 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (341).. (341)

<223> xaa na posição 341 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (343).. (343)

<223> xaa na posição 343 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (345)..(346)

<223> xaa na posição 345 a 346 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (349)..(349)

<223> xaa na posição 34 9 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (351)..(352)

<223> xaa na posição 351 a 352 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (358) . . (359)

<223> xaa na posição 358 a 359 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (364) . . (369)

<223> xaa na posição 364 a 369 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (371) . . (379)

<223> xaa na posição 371 a 379 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (381) . . (381)

<223> xaa na posição 381 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (383) . . (386)

<223> xaa na posição 383 a 38 6 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (388)..(393)

<223> xaa na posição 388 a 393 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (395)..(396)

<223> xaa na posição 395 a 396 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (399)..(400)

<223> xaa na posição 399 a 400 é qualquer aminoácido<4 00> 57

Ile xaa Gly Val xaa Tyr Asp xaa Thr xaa Phe xaa His Pro Gly Gly

1 5 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Asp Ala Thr

20 25 30

xaa xaa xaa xaa xaa Phe His xaa xaa xaa xaa xaa Ala xaa Lys xaa

35 40 45

Leu xaa xaa Leu Pro xaa xaa xaa Ala xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

50 55 60

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Asp xaa xaa65 70 75 80

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa Phe xaa xaa Ser xaa

85 90 95

xaa His xaa xaa Tyr Arg xaa xaa Glu xaa xaa xaa xaa xaa Ala xaa

100 105 110

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

115 120 125

xaa Val xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Arg Cys Gly Trp xaa xaa His

130 135 140

Glu xaa Gly His xaa Ser xaa Thr Gly xaa xaa Trp xaa Asp xaa xaa145 150 155 160

xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa Gly xaa xaa xaa Ser xaa xaa xaa

165 170 175

Trp xaa xaa xaa His xaa Lys His His Ala xaa Pro xaa xaa xaa xaa

180 185 190

His Asp xaa Asp Leu xaa Thr xaa Pro xaa Val Ala Phe xaa xaa xaa

195 200 205

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Trp xaa xaa

210 215 220

xaa Gln xaa xaa xaa Phe xaa Pro Val xaa xaa xaa Leu xaa xaa Leu225 230 235 240

xaa Trp xaa xaa xaa Leu His xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa245 250 255xaa xaa

xaa xaa

xaa Leu290xaa xaa305

xaa xaa

xaa xaa

His His

xaa Arg370xaa xaa385Val

Glu xaa260xaa xaa275

xaa xaa

xaa His

xaa xaa

xaa Val340Leu Phe355

xaa xaaTyr xaa

xaa xaa xaa xaaxaa xaaxaa xaa

xaa His310Tyr Ala325

xaa Trp

Pro xaa

xaa xaa

xaa xaa390

xaa xaa280xaa xaa295

Leu xaa

xaa xaa

xaa Met

xaa Pro360xaa xaa375

xaa xaa

xaa xaa265

xaa xaa

xaa xaa

xaa xaa

xaa Thr330xaa xaa345

Gln Phexaa xaaxaa Thr

xaa xaa

xaa xaa

Tyr xaa300xaa xaa315

xaa xaa

Leu Asn

Arg xaa

xaa Leu380xaa xaa395

xaa xaa270xaa xaa285

Phe xaa

xaa xaa

xaa xaa

xaa Gln350xaa xaa365

xaa TyrAsn Leu

xaa xaa

Gly xaa

xaa Phe

xaa xaa320xaa xaa335

xaa xaa

xaa xaa

xaa xaa

xaa xaa400

<210> 58 <211> 59 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (3) .. (4) <223> xaa na posição 3 a 4<220> <221> Variante <222> (7) .. (7) <223> xaa na posição 7 é q<220> <221> Variante <222> (10) .. (10) <223> xaa na posição 10 é<220> <221> Variante <222> (12)..(12) <223> xaa na posição 12 é<220> <221> Variante <222> (15)..(15) <223> xaa na posição 15 é<220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é<220> <221> Variante <222> (19)..(19) <223> xaa na posição 19 é<220> <221> Variante <222> (21) .. (21) <223> xaa na posição 21 é<220> <221> Variante <222> (22). . (22) <223> xaa na posição 22 é<220> <221> Variante <222> (23)..(23)<223> xaa na posição 23 é Ile ou Met<220>

<221> Variante

<222> (24).. (24)

<223> xaa na posição 24 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (25).. (25)

<223> xaa na posição 25 é Ala ou Glu<220>

<221> Variante

<222> (26)..(26)

<223> xaa na posição 26 é Phe ou Val<220>

<221> Variante

<222> (27).. (28)

<223> xaa na posição 27 a 28 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (30)..(30)

<223> xaa na posição 30 é Phe, Leu ou Val<220>

<221> Variante

<222> (32).. (32)

<223> xaa na posição 32 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (33).. (33)

<223> xaa na posição 33 é Ala ou Gly<220>

<221> Variante

<222> (34)..(34)

<223> xaa na posição 34 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (36)..(36)

<223> xaa na posição 36 é Ala ou Gly<220>

<221> Variante

<222> (37)..(38)

<223> xaa na posição 37 a 38 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (40)..(40)

<223> xaa na posição 40 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (41)..(41)

<223> xaa na posição 41 é Asn ou Ser<220>

<221> Variante

<222> (42)..(42)

<223> xaa na posição 42 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (44)..(44)

<223> xaa na posição 44 é Asn ou Ser<220>

<221> Variante

<222> (49)..(49)

<223> xaa na posição 49 é Ala ou Thr<220>

<221> Variante<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Gly Trp1

xaa Trp

xaa xaa

xaa Pro50

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

(51) .. (51)

xaa na posição 51 é Asn ou Gln

Variante

(52)..(52)

xaa na posição 52 é Lys ou Arg

Variante

(53)..(53)

xaa na posição 53 é qualquer aminoácido

Variante

(54) .. (54)

xaa na posição 54 é Glu ou Arg

Variante(57) .. (57)

xaa na posição 57 é Met ou Val

58

xaa xaa His Glu xaa Gly His xaa Ser xaa Thr Gly xaa Ile

5 10 15

xaa Asp xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa Gly xaa

20 25 30

Ser xaa xaa xaa Trp xaa xaa xaa His xaa Lys His His Ala

35 40 45

xaa xaa xaa xaa His Asp xaa Asp Leu55

5950PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(2)

xaa na posição 2 é Asn ou Thr

Variante(4)..(4)

xaa na posição 4 é qualquer aminoácido

Variante(6) .. (6)

xaa na posição 6 é qualquer aminoácido

Variante(7)..(8)

xaa na posição 7 a 8 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(10)..(10)

xaa na posição 10 é qualquer aminoácido

Variante(11)-. (12)

xaa na posição 11 a 12 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante

(14)..(14)

xaa na posição 14 é Ile ou Val

Variante

(15)..(15)

xaa na posição 15 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (21)..(21) <223> xaa na posição 21<220> <221> Variante <222> (22)..(22) <223> xaa na posição 22<220> <221> Variante <222> (27)..(28) <223> xaa na posição 27<220> <221> Variante <222> (29)..(29) <223> xaa na posição 29<220> <221> Variante <222> (30)..(30) <223> xaa na posição 30<220> <221> Variante <222> (31)..(31) <223> xaa na posição 31<220> <221> Variante <222> (32)..(32) <223> xaa na posição 32<220> <221> Variante <222> (34) . . (34) <223> xaa na posição 34<220> <221> Variante <222> (35)..(36) <223> xaa na posição 35<220> <221> Variante <222> (37)..(37) <223> xaa na posição 37<220> <221> Variante <222> (38)..(38) <223> xaa na posição 38<220> <221> Variante <222> (39)..(39) <223> xaa na posição 39<220> <221> Variante <222> (40)..(40) <223> xaa na posição 40<220> <221> Variante <222> (41)..(41) <223> xaa na posição 41<220> <221> Variante <222> (42)..(42) <223> xaa na posição 42<220> <221> Variante <222> (44). . (44)

é Ser ou Thr

é qualquer aminoácido

a 28 é qualquer aminoácido

é Glu ou Gln

é lie, Leu ou Val

é Ala ou Ser

é qualquer aminoácido

é Phe ou Val

a 36 é qualquer aminoácido

é Phe ou Leu

é qualquer aminoácido

é Glu ou Lys

é Glu, Lys ou Arg

é qualquer aminoácido

é Gly ou Asn<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Val xaa1

His Leu

Arg xaa

xaa Tyr50

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>

xaa na posição 4 4 é qualquer aminoácido

Variante

(46)..(46)

xaa na posição 46 é qualquer aminoácido

Variante

(47)..(47)

xaa na posição 47 é Asp, Ser ou Val

Variante

(48) .. (48)

xaa na posição 48 é qualquer aminoácido

Variante

(49)..(49)

xaa na posição 49 é Pro ou Thr59

Trp xaa Met xaa xaa xaa Asn xaa xaa xaa Gln xaa xaa His

5 10 15

Phe Pro xaa xaa Pro Gln Phe Arg xaa xaa xaa xaa xaa xaa

20 25 30

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Leu xaa Tyr xaa xaa xaa35 40 45

6020PRT

Seqüência artificial

Variante(2) . . (2)

xaa na posição 2 é Asp ou Glu

Variante(5)..(5)

xaa na posição 5 é qualquer aminoácido

Variante(8) .. (8)

xaa na posição 8 é Ala, Cys ou Val

Variante(10) . . (10)

xaa na posição 10 é Asp ou Asn

Variante(12)..(12)

xaa na posição 12 é Lys ou Arg

Variante

(17)..(17)

xaa na posição 17 é qualquer aminoácido

Variante

(18)..(18)

xaa na posição 18 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(20)..(20)

xaa na posição 20 é Phe, Ile ou Leu60Ile xaa1

xaa xaa

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>

Gly Val xaa Tyr Asp xaa Thr xaa Phe xaa His Pro Gly Gly5 10 15

Ile xaa20

6161PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(2)

xaa na posição 2 é qualquer aminoácido

Variante(4)..(4)

xaa na posição 4 é Ala ou Leu

Variante(8)..(10)

xaa na posição 8 a 10 é qualquer aminoácido

Variante

(11) . · (H)

xaa na posição 11 é Ala, Ile ou Val

Variante

(12)..(12)

xaa na posição 12 é Ala ou Val

Variante

(13)..(13)

xaa na posição 13 é Glu ou Arg

Variante

(14) . . (14)

xaa na posição 14 é Asp, Lys ou Arg

Variante

(15)..(15)

xaa na posição 15 é Gly, Asn ou Val

Variante

(16)..(16)

xaa na posição 16 é Lys ou Arg

Variante(17)..(18)

xaa na posição 17 a 18 é qualquer aminoácido

Variante

(19)..(19)

xaa na posição 19 é Ala, Gly ou Ser

Variante

(20)..(23)

xaa na posição 20 a 23 é qualquer aminoácido

Variante(25).. (26)

xaa na posição 25 a 26 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(28)..(29)<223> xaa na posição 28 a 29 é qualquer um ou<220> <221> Variante <222> (31)..(31) <223> xaa na posição 31 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (32) . . (32) <223> xaa na posição 32 é Phe, Trp ou Tyr<220> <221> Variante <222> (33) . . (33) <223> xaa na posição 33 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (35)..(35) <223> xaa na posição 35 é Ala, Gly ou Ile<220> <221> Variante <222> (38) . . (38) <223> xaa na posição 38 é Ser ou Thr<220> <221> Variante <222> (39)..(39) <223> xaa na posição 39 é Cys ou Ser<220> <221> Variante <222> (40)..(40) <223> xaa na posição 40 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (42)..(42) <223> xaa na posição 42 é Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (43)..(43) <223> xaa na posição 43 é Ala, Gly ou Leu<220> <221> Variante <222> (45)..(45) <223> xaa na posição 45 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (47)..(47) <223> xaa na posição 47 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (48) . . (48) <223> xaa na posição 48 é Phe ou Leu<220> <221> Variante <222> (49)..(49) <223> xaa na posição 49 é Phe ou Tyr<220> <221> Variante <222> (52)..(52) <223> xaa na posição 52 é Pro ou Val<220> <221> Variante <222> (53)..(53) <223> xaa na posição 53 é Arg ou Ser<220> <221> Variante<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Thr xaa1

xaa xaa

xaa Phe

xaa Leu50

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

(54)..(55)

xaa na posição 54 a 55 é qualquer aminoácido

Variante

(56)..(56)

xaa na posição 56 é Leu ou Met

Variante

(57)..(57)

xaa na posição 57 é Lys ou Arg

Variante

(58)..(58)

xaa na posição 58 é Gly ou Thr

Variante

(59)..(59)

xaa na posição 59 é qualquer aminoácido

Variante

(60)..(60)

xaa na posição 60 é Lys ou Arg

Variante(61)..(61)

xaa na posição 61 é His ou Tyr61

Pro xaa Val Ala Phe xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

5 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa Trp xaa xaa Leu xaa xaa Gln xaa xaa

20 25 30

xaa Pro Val xaa xaa xaa Leu xaa xaa Leu xaa Trp xaa xaa

35 40 45

His xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa55 60

6234PRT

Seqüência artificial

Variante(2) .. (5)

xaa na posição 2 a 5 é qualquer aminoácido

Variante(6) .. (6)

xaa na posição 6 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(8)..(9)

xaa na posição 8 a 9 é qualquer um ou nenhum aminoacidoVariante

(11) · · (H)

xaa na posição 11 é Asp ou Pro

Variante

(12)..(12)

xaa na posição 12 é Met ou Val

Variante(13).. (13)

xaa na posição 13 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (14) . . (14)

<223> xaa na posição 14 é Asn ou Pro<220>

<221> Variante

<222> (15) . . (15)

<223> xaa na posição 15 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (16)..(17)

<223> xaa na posição 16 a 17 é Asp ou Glu<220>

<221> Variante

<222> (18).. (18)

<223> xaa na posição 18 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (19)..(19)

<223> xaa na posição 19 é Ala ou Leu<220>

<221> Variante

<222> (20)..(20)

<223> xaa na posição 20 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (21)..(21)

<223> xaa na posição 21 é Phe ou Trp<220>

<221> Variante

<222> (22).. (22)

<223> xaa na posição 22 é Leu ou Val<220>

<221> Variante

<222> (23)..(23)

<223> xaa na posição 23 é Glu ou Arg<220>

<221> Variante

<222> (26)..(26)

<223> xaa na posição 26 é Ala ou Val<220>

<221> Variante

<222> (27)..(27)

<223> xaa na posição 27 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (28) . . (28)

<223> xaa na posição 28 é His ou Tyr<220>

<221> Variante

<222> (30)..(30)

<223> xaa na posição 30 é He, Met ou Val<220>

<221> Variante

<222> (31) . . (31)

<223> xaa na posição 31 é Asp ou Asn<220>

<221> Variante

<222> (32) . . (32)

<223> xaa na posição 32 é Ile ou Val<220>

<221> Variante<222> (33) . . (33)<223> xaa na posição 33 é Asp, Ser ou Thr<220>

<221> Variante<222> (34).. (34)

<223> xaa na posição 34 é Pro ou Thr<400> 62

Ala xaa xaa xaa xaa xaa His xaa xaa Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa

1 5 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Tyr Ala xaa xaa xaa Thr xaa xaa xaa20 25 30

xaa xaa

<210> 63 <211> 28 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (4)..(4) <223> xaa na posição 4 é Glu ou Gln<220> <221> Variante <222> (5) . . (5) <223> xaa na posição 5 é Ala ou Thr<220> <221> Variante <222> (6)..(6) <223> xaa na posição 6 é Phe ou Tyr<220> <221> Variante <222> (7)..(7) <223> xaa na posição 7 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (8) .. (8) <223> xaa na posição 8 é Glu ou Gln<220> <221> Variante <222> (11) · · (H) <223> xaa na posição 11 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (12) . . (12) <223> xaa na posição 12 é Lys ou Arg<220> <221> Variante <222> (13) .. (14) <223> xaa na posição 13 a 14 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (15)..(15) <223> xaa na posição 15 é Lys ou Arg<220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é Asp ou Arg<220> <221> Variante <222> (19)..(19) <223> xaa na posição 19 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (21) . . (22)<223><220><221><222><223>

xaa na posição 21 a 22 é qualquer aminoácido

Variante(25)..(26)

xaa na posição 25 a 26 é qualquer aminoácido

<220> <221> Variante <222> (27) • - (27) <223> xaa na posição 27 é Asp ou Pro <400> 63 Asp Ala Thr xaa xaa xaa xaa xaa Phe His xaa xaa xaa xaa xaa Ala1 5 10 15 xaa Lys xaa Leu xaa xaa Leu Pro xaa xaa xaa Ala 20 25 <210> 64 <211> 903 <212> DNA <213> Ostreococcus tauri <220> <221> CDS <222> (1) · .(903) <4 00> 64 atg tet gct tet gga gct ttg ttg cct gct att gct ttc gct gct tacMet Ser Ala Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Ile Ala Phe Ala Ala Tyr1 5 10 15 gct tac gct acc tac gct tat gct ttc gag tgg tet cat gct aac ggaAla Tyr Ala Thr Tyr Ala Tyr Ala Phe Glu Trp Ser His Ala Asn Gly 20 25 30 ate gat aac gtg gat gct aga gag tgg att gga gct ttg tet ttg agaIle Asp Asn 35 Val Asp Ala Arg Glu 40 Trp Ile Gly Ala Leu 45 Ser Leu ArgCtC CCt gea att gct acc acc atg tac CtC ttg ttc tgc Ctt gtg ggaLeu Pro 50 Ala Ile Ala Thr Thr 55 Met Tyr Leu Leu Phe 60 Cys Leu Val GlyCCt aga ttg atg gct aag agg gag gct ttt gat cct aag gga ttc atgPro Arg Leu Met Ala Lys Arg Glu Ala Phe Asp Pro Lys Gly Phe Met65 70 75 80CtC gct tac aac gct tac caa acc gct ttc aac gtt gtg gtg ctc ggaLeu Ala Tyr Asn Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Asn Val Val Val Leu Gly 85 90 95 atg ttc gct aga gag ate tet gga ttg gga caa cct gtt tgg gga tetMet Phe Ala Arg 100 Glu Ile Ser Gly Leu 105 Gly Gln Pro Val Trp 110 Gly Seract atg CCt tgg age gat agg aag tcc ttc aag att ttg ttg gga gtgThr Met Pro 115 Trp Ser Asp Arg Lys 120 Ser Phe Lys Ile Leu 125 Leu Gly Valtgg ctc cat tac aac aat aag tac CtC gag ttg ttg gat act gtg ttcTrp Leu His Tyr Asn Asn Lys Tyr Leu Glu Leu Leu Asp Thr Val Phe 130 135 140 atg gtg gct agg aaa aag acc aag cag ctc tet ttc ttg cat gtg tacMet Val Ala Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr145 150 155 160cat cat gct ttg ttg att tgg gct tgg tgg Ctt gtt tgt cat ctc atgHis His Ala Leu Leu 165 Ile Trp Ala Trp Trp 170 Leu Val Cys His Leu 175 Metgct acc aac gat tgc ate gat gct tat ttc gga gct gct tgc aac tetAla Thr Asn Asp 180 Cys Ile Asp Ala Tyr 185 Phe Gly Ala Ala Cys 190 Asn Serttc ate cac ate gtg atg tac tcc tac tac ctc atg tet gct ttg ggaPhe Ile His 195 Ile Val Met Tyr Ser 200 Tyr Tyr Leu Met Ser 205 Ala Leu Glyatt aga tgc CCt tgg aag aga tat ate acc cag gct cag atg ttg caaIle Arg Cys Pro Trp Lys Arg Tyr Ile Thr Gln Ala Gln Met Leu Gln

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672210 215 220

ttc gtg ate gtg ttc gct cat gct gtt ttc gtg ctc aga caa aag cacPhe Val Ile Val Phe Ala His Ala Val Phe Val Leu Arg Gln Lys His225 230 235 240

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245 250 255

ttg gtg ctc ttc gga aac ttc tac ctc aag gct tac tet aac aag tetLeu Val Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Leu Lys Ala Tyr Ser Asn Lys Ser

260 265 270

agg gga gat gga gct tet tet gtt aag cct gct gag act act aga geaArg Gly Asp Gly Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Glu Thr Thr Arg Ala

275 280 285

cct tet gtg aga aga acc agg tcc agg aag ate gat tgaPro Ser Val Arg Arg Thr Arg Ser Arg Lys Ile Asp290 295 300

<210> 65<211> 300<212> PRT

<213> Ostreococcus tauri<400> 65

Met Ser Ala Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Ile Ala Phe Ala Ala Tyr1 5 10 15

Ala Tyr Ala Thr Tyr Ala Tyr Ala Phe Glu Trp Ser His Ala Asn Gly

20 25 30

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35 40 45

Leu Pro Ala Ile Ala Thr Thr Met Tyr Leu Leu Phe Cys Leu Val Gly

50 55 60

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Leu Ala Tyr Asn Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Asn Val Val Val Leu Gly

85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

Met Val Ala Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr145 150 155 160

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165 170 175

Ala Thr Asn Asp Cys Ile Asp Ala Tyr Phe Gly Ala Ala Cys Asn Ser

180 185 190

Phe Ile His Ile Val Met Tyr Ser Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Leu Gly

195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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<210> 66<211> 834<212> DNA<213> Pavlova sp

720

768

816

864

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10 15

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25 30

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40 45

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55 60

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90 95

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105 HO

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120 125

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135 140

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170 175

atg tat tcc tac tac acc atg gcg ctc ctg ggcMet Tyr Ser Tyr Tyr Thr Met Ala Leu Leu Gly

185 190

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200 205

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250 255

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275<210> 68<211> 1077<212> DNA

<213> Thalassiosira pseudonana<220>

<221> CDS<222> (1) .. (1077)<400> 68

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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96

144

192

240

288

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100 105 HO

gtg atg aat aga gac cat ccg ttt att gga agt aga agt ttg gtt ggg 384

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

aat gat gat ggg aat aat gag gat caa tgt cac aag gct atg aag gat 960

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ata tcg gag ggt gcg aag gag gtt, gtg ggg cat gea gcg aag gat gct1008

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325 330 335

gga aag ttg gtg gct acg gcg agt aag gct gta aag agg aag gga act1056

Gly Lys Leu Val Ala Thr Ala Ser Lys Ala Val Lys Arg Lys Gly Thr

340 345 350

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355<210> 69<211> 358<212> PRT

<213> Thalassiosira pseudonana<400> 69

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20 25 30

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Leu Thr Gln Ala Gln Leu Leu Gln Phe Thr Ser Val Val Val Tyr Thr225 230 235 240

Gly Cys Thr Gly Tyr Thr His Tyr Tyr His Thr Lys His Gly Ala Asp

245 250 255

Glu Thr Gln Pro Ser Leu Gly Thr Tyr Tyr Phe Cys Cys Gly Val Gln

260 265 270

Val Phe Glu Met Val Ser Leu Phe Val Leu Phe Ser Ile Phe Tyr Lys

275 280 285

Arg Ser Tyr Ser Lys Lys Asn Lys Ser Gly Gly Lys Asp Ser Lys Lys

290 295 300

Asn Asp Asp Gly Asn Asn Glu Asp Gln Cys His Lys Ala Met Lys Asp305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355<210> 70<211> 903<212> DNA

<213> Ostreococcus tauri<220>

<221> CDS<222> (1) . . (903)<400> 70

atg age gcc tcc ggt gcg ctg ctg ccc gcg ate gcg tcc gcc gcg tacMet Ser Ala Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Ile Ala Ser Ala Ala Tyr1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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48

96

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192

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70 75 80

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288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

816

864

903115 120 125 Trp Leu 130 His Tyr Asn Asn Lys 135 Tyr Leu Glu Leu Leu 140 Asp Thr Val PheMet Val Ala Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr145 150 155 160His His Ala Leu Leu 165 Ile Trp Ala Trp Trp 170 Leu Val Cys His Leu 175 MetAla Thr Asn Asp 180 Cys Ile Asp Ala Tyr 185 Phe Gly Ala Ala Cys 190 Asn SerPhe Ile His 195 Ile Val Met Tyr Ser 200 Tyr Tyr Leu Met Ser 205 Ala Leu GlyIle Arg 210 Cys Pro Trp Lys Arg 215 Tyr Ile Thr Gln Ala 220 Gln Met Leu GlnPhe Val Ile Val Phe Ala His Ala Val Phe Val Leu Arg Gln Lys His225 230 235 240Cys Pro Val Thr Leu Pro Trp Ala Gln Met Phe Val Met Thr Asn Met 245 250 255 Leu Val Leu Phe 260 Gly Asn Phe Tyr Leu 265 Lys Ala Tyr Ser Asn 270 Lys SerArg Gly Asp 275 Gly Ala Ser Ser. Val 280 Lys Pro Ala Glu Thr 285 Thr Arg AlaPro Ser 290 Val Arg Arg Thr Arg 295 Ser Arg Lys Ile Asp 300 <210> 72 <211> 339 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

Variante(3)..(29)

xaa na posição 3 a 29 é qualquer aminoácido

<221><222><223><220>

<221> Variante<222> (30)..(43)

<223> xaa na posição 30 a 43 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

Variante(45)..(50)

xaa na posição 45 a 50 é qualquer aminoácido

<221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

Variante(53)..(73)

xaa na posição 53 a 73 é qualquer aminoácido

Variante(74)..(79)

xaa na posição 7 4 a 7 9 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(81)..(82)

xaa na posição 81 a 82 é qualquer aminoácido

Variante(85)..(86)

xaa na posição 85 a 86 é qualquer aminoácido

Variante(88)..(90)

xaa na posição 88 a 90 é qualquer aminoácido

Variante(92)..(110)

xaa na posição 92 a 110 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (112)..(127) <223> xaa na posição 112 a<220> <221> Variante <222> (128)..(128) <223> xaa na posição 128 é<220> <221> Variante <222> (130)..(130) <223> xaa na posição 130 é<220> <221> Variante <222> (133)..(134) <223> xaa na posição 133 a<220> <221> Variante <222> (137)..(137) <223> xaa na posição 137 é<220> <221> Variante <222> (139)..(140) <223> xaa na posição 139 a<220> <221> Variante <222> (143)..(144) <223> xaa na posição 143 a<220> <221> Variante <222> (147) .. (147) <223> xaa na posição 147 é<220> <221> Variante <222> (149)..(149) <223> xaa na posição 149 é<220> <221> Variante <222> (151)..(152) <223> xaa na posição 151 a<220> <221> Variante <222> (154) .. (154) <223> xaa na posição 154 é<220> <221> Variante <222> (159)..(159) <223> xaa na posição 159 é<220> <221> Variante <222> (163)..(166) <223> xaa na posição 163 a<220> <221> Variante <222> (170)..(179) <223> xaa na posição 170 a<220> <221> Variante <222> (180)..(182) <223> xaa na posição 180 a<220> <221> Variante <222> (184 ) .. (184)

112 a 127 é qualquer aminoácido

128 é qualquer um ou nenhum aminoácido

130 é qualquer aminoácido

133 a 134 é qualquer aminoácido

137 é qualquer aminoácido

139 a 140 é qualquer aminoácido

143 a 144 é qualquer aminoácido

147 é qualquer aminoácido

149 é qualquer aminoácido

151 a 152 é qualquer aminoácido

154 é qualquer aminoácido

159 é qualquer aminoácido

163 a 166 é qualquer aminoácido

170 a 179 é qualquer aminoácido

180 a 182 é qualquer um ou nenhum aminoácido<223> xaa na posição 184 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (188)..(190) <223> xaa na posição 188 a 190 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (193)..(193) <223> xaa na posição 193 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (196)..(197) <223> xaa na posição 196 a 197 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (203)..(206) <223> xaa na posição 203 a 206 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (208)..(210) <223> xaa na posição 208 a 210 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (217)..(217) <223> xaa na posição 217 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (222)..(223) <223> xaa na posição 222 a 223 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (226)..(252) <223> xaa na posição 226 a 252 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (253) . . (267) <223> xaa na posição 253 a 267 é qualquer um ou nenhum<220> <221> Variante <222> (269)..(272) <223> xaa na posição 269 a 272 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (276)..(277) <223> xaa na posição 276 a 277 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (280)..(282) <223> xaa na posição 280 a 282 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (284)..(291) <223> xaa na posição 284 a 291 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (292)..(324) <223> xaa na posição 292 a 324 é qualquer um ou nenhum<220> <221> Variante <222> (326)..(337) <223> xaa na posição 326 a 337 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante<222> (338) . . (338)

<223> xaa na posição 338 é qualquer um ou nenhum aminoácido<400> 72

Leu Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

1 5 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

20 25 30

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Pro xaa xaa xaa xaa

35 40 45

xaa xaa Tyr Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

50 55 60

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Met65 70 75 80

xaa xaa Tyr Asn xaa xaa Gln xaa xaa xaa Asn xaa xaa xaa xaa xaa

85 90 95

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa

100 105 HO

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

115 120 125

Trp xaa His Tyr xaa xaa Lys Tyr xaa Glu xaa xaa Asp Thr xaa xaa

130 135 140

Met Val xaa Arg xaa Lys xaa xaa Gln xaa Ser Phe Leu His xaa Tyr145 150 155 160

His His xaa xaa xaa xaa Trp Ala Trp xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

165 170 175

xaa xaa xaa xaa xaa xaa Asp xaa Tyr Phe Gly xaa xaa xaa Asn Ser

180 185 190

xaa Ile His xaa xaa Met Tyr Ser Tyr Tyr xaa xaa xaa xaa Leu xaa

195 200 205

xaa xaa Cys Pro Trp Lys Arg Tyr xaa Thr Gln Ala Gln xaa xaa Gln

210 215 220

Phe xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa225 230 235 240

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

245 250 255

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Met xaa xaa xaa xaa

260 265 270

Val Leu Phe xaa xaa Phe Tyr xaa xaa xaa Tyr xaa xaa xaa xaa xaa

275 280 285

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

290 295 300

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa305 310 315 320

xaa xaa xaa xaa Ala xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa325 330 335

xaa xaa Val

<210> 73<211> 45<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <221> Variante<222> (4)..(4)<223> xaa na posição 4 é Ala ou Gly<220> <221> Variante<222> (5) . . (5)<223> xaa na posição 5 é Ala ou Leu<220> <221> Variante<222> (6)..(6)<223> xaa na posição 6 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (9) . . (9) <223> xaa na posição 9 é Phe ou Ile <220> <221> Variante <222> (12)..(12) <223> xaa na posição 12 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (14) .. (14) <223> xaa na posição 14 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (20) .. (20) <223> xaa na posição 20 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (21) .. (21) <223> xaa na posição 21 é Leu ou Met<220> <221> Variante <222> (22)..(22) <223> xaa na posição 22 é Ala ou Ser<220> <221> Variante <222> (23)..(23) <223> xaa na posição 23 é Ala ou Leu<220> <221> Variante <222> (25)..(26) <223> xaa na posição 25 a 26 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (27)..(27) <223> xaa na posição 27 é Arg ou Ser<220> <221> Variante <222> (34)..(34) <223> xaa na posição 34 é Ile ou Leu<220> <221> Variante <222> (39)..(39) <223> xaa na posição 39 é Leu ou Met<220> <221> Variante <222> (40)..(40) <223> xaa na posição 40 é Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (43)..(43) <223> xaa na posição 43 é Cys, Thr ou Val<220> <221> Variante <222> (44)..(44) <223> xaa na posição 44 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (45) .. (45) <223> xaa na posição 45 é Cys ou Val<4 00> 73 Tyr Phe Gly xaa xaa xaa Asn Ser xaa Ile His xaa Val xaa Met Tyr1 5 10 15Ser Tyr Tyr xaa xaa xaa xaa Leu xaa xaa xaa Cys Pro Trp Lys Arg 20 25 30Tyr xaa Thr Gln Ala Gln xaa xaa Gln Phe xaa xaa xaa 35 40 45<210> 74 <211> 43 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (2) . . (2) <223> xaa na posição 2 é Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (5) . . (5) <223> xaa na posição 5 é Cys ou Asn<220> <221> Variante <222> (6) .. (6) <223> xaa na posição 6 é Asp ou Asn<220> <221> Variante <222> (9) .. (10) <223> xaa na posição 9 a 10 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (12)..(12) <223> xaa na posição 12 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (13)..(14) <223> xaa na posição 13 a 14 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (17) . . (17) <223> xaa na posição 17 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (18) .. (18) <223> xaa na posição 18 é Phe ou Trp<220> <221> Variante <222> (21) . . (21) <223> xaa na posição 21 é Ala ou Leu<220> <221> Variante <222> (23)..(23) <223> xaa na posição 23 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (25)..(26) <223> xaa na posição 25 a 26 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (28) .. (28) <223> xaa na posição 28 é Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (33)..(33) <223> xaa na posição 33 é Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (37) .. (37)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Trp xaa1

xaa xaa

xaa na posição 37 é Ala, Thr ou Val

Variante

(38).. (38)

xaa na posição 38 é qualquer aminoácido

Variante

(39)..(39)

xaa na posição 39 é Ile ou Leu

Variante

(40).. (40)

xaa na posição 40 é qualquer aminoácido74

His Tyr xaa xaa Lys Tyr xaa xaa Leu xaa xaa xaa Asp Thr

5 10 15

Met Val xaa Arg xaa Lys xaa xaa Gln xaa Ser Phe Leu His20 25 30

xaa Tyr His His xaa xaa xaa xaa Trp Ala Trp 35 40<210> 75 <211> 37 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (2) . . (3) <223> xaa na posição 2 a 3 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (5) . . (5) <223> xaa na posição 5 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (9) .. (9) <223> xaa na posição 9 é Gly, Ser ou Thr<220> <221> Variante <222> (10)..(10) <223> xaa na posição 10 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (13)..(14) <223> xaa na posição 13 a 14 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (15)..(15) <223> xaa na posição 15 é Ala ou Ser<220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é Ala ou Ser<220> <221> Variante <222> (18)..(18) <223> xaa na posição 18 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (19)..(19) <223> xaa na posição 19 é Glu ou Lys<220> <221> Variante <222> (20)..(20)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Met xaa1

xaa xaa

xaa xaa

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222>

xaa na posição 20 é Ala, Asn ou Ser

Variante(21)..(21)

xaa na posição 21 é Lys ou Arg

Variante(22) .. (22)

xaa na posição 22 é Ala, Gly ou Ser

Variante

(23)..(23)

xaa na posição 23 é qualquer aminoácido

Variante

(24) .. (24)

xaa na posição 24 é Glu ou Gly

Variante

(25).. (29)

xaa na posição 25 a 29 é qualquer aminoácido

Variante

(30)..(30)

xaa na posição 30 é Asn, Pro ou Gln

Variante

(31)..(32)

xaa na posição 31 a 32 é Ala, Asp ou Glu

Variante

(33)..(33)

xaa na posição 33 é Gly, Ser ou Thr

Variante

(34)..(34)

xaa na posição 34 é Asn, Gln ou Thr

Variante

(35)..(36)

xaa na posição 35 a 36 é qualquer aminoácido

Variante(37)..(37)

xaa na posição 37 é Ala, Asp ou Pro

75

xaa Leu xaa Val Leu Phe xaa xaa Phe Tyr xaa xaa xaa Tyr

5 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

20 25 30

xaa xaa xaa35

7619PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(3)

xaa na posição 2 a 3 é qualquer aminoácido

Variante(4)..(7)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Lys xaa1

xaa xaa

xaa na posição 4 a 7 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante

(9) . . (9)

xaa na posição 9 é Phe, Leu ou Val

Variante

(10)..(10)

xaa na posição 10 é qualquer aminoácido

Variante

(13).. (13)

xaa na posição 13 é Ala, Leu ou Val

Variante

(14) .. (14)

xaa na posição 14 é qualquer aminoácido

Variante(16) .. (16)

xaa na posição 16 é Thr ou Val

Variante

(17) .. (17)

xaa na posição 17 é Ala, Ile ou Leu

Variante

(18)..(18)

xaa na posição 18 é Phe, Ile ou Leu76

xaa xaa xaa xaa xaa Met xaa xaa Tyr Asn xaa xaa Gln xaa5 10 15

Asn

<210><211><212><213><220><221><222><400>atg acgMet Thr1

cac aacHis Asn

gat gtgAsp Val

ctg gccLeu Ala

50cgg ggcArg Gly65

ccg gacPro Asp

ggc ctcGly Leu

77

1560DNA

Traustochytrium sp.

CDS

(1)..(1560)77gtcVal

aagLys

acc

Thr

35

gca

Ala

gtcVal

ggcGly

tcgSer

ggc tacGly Tyr5

ccg gatPro Asp20

aag ttcLys Phe

gac gagAsp Glu

gac gccAsp Ala

gcg ageAla Ser

ggc aag gag gccGly Lys Glu Ala55

tcg gac gcg gtgSer Asp Ala Val70

caa ggc ggc gcgGln Gly Gly Ala85

■tcg gcc tcg tacSer Ala Ser Tyr100

gagGlu

tggTrp

gtg

Val

40

acc

Thr

ate ccgIle Pro10tgc gcgCys Ala25

cac ccgHis Pro

gtg ctgVal Leu

ctg cgc aagLeu Arg Lys

aac gag aagAsn Glu Lys90

tac acg tggTyr Thr Trp105

ttc gag cagPhe Glu Gln

ate cac gggIle His Gly

ggc ggc gacGly Gly Asp45

tac gag actTyr Glu Thr60

tac cgc ateTyr Arg Ile75

gaa aag cggGlu Lys Arg

aac age gacAsn Ser Asp

gtc cgc gcg 48

Val Arg Ala15

cac gtg tac 96

His Val Tyr30

att ate ctg 144

Ile Ile Leu

tac cat gtg 192

Tyr His Val

ggc aag ctg 240

Gly Lys Leu80

acg ctc tcg 288

Thr Leu Ser95

ttt tac agg 336

Phe Tyr Arg110gta atg cgc gag cgc gtc gtg gct cgg ctc aag gag cgc ggc aag gcc 384

Val Met Arg Glu Arg Val Val Ala Arg Leu Lys Glu Arg Gly Lys Ala

115 120 125

cgc cgc gga ggc tac gag ctc tgg ate aag gcg ttc ctg ctg ctc gtc 432

Arg Arg Gly Gly Tyr Glu Leu Trp Ile Lys Ala Phe Leu Leu Leu Val

130 135 140

ggc ttc tgg age tcg ctg tac tgg atg tgc acg ctg gac ccc tcg ttc 480

Gly Phe Trp Ser Ser Leu Tyr Trp Met Cys Thr Leu Asp Pro Ser Phe

145 150 155 160

ggg gcc ate ctg gcc gcc atg tcg ctg ggc gtc ttt gcc gcc ttt gtg 528

Gly Ala Ile Leu Ala Ala Met Ser Leu Gly Val Phe Ala Ala Phe Val

165 170 175

ggc acg tgc ate cag cac gac ggc aac cac ggc gcc ttt gcc cag tcg 576

Gly Thr Cys Ile Gln His Asp Gly Asn His Gly Ala Phe Ala Gln Ser

180 185 190

cga tgg gtc aac aag gtt gcc ggg tgg acg ctc gac atg ate ggc gcc 624

Arg Trp Val Asn Lys Val Ala Gly Trp Thr Leu Asp Met Ile Gly Ala

195 200 205

age ggc atg acg tgg gag ttc cag cac gtc ctg ggc cac cat ccg tac 672

Ser Gly Met Thr Trp Glu Phe Gln His Val Leu Gly His His Pro Tyr

210 215 220

acg aac ctg ate gag gag gag aac ggc ctg caa aag gtg age ggc aag 720

Thr Asn Leu Ile Glu Glu Glu Asn Gly Leu Gln Lys Val Ser Gly Lys

225 230 235 240

aag atg gac acc aag ctg gcc gac cag gag age gat ccg gac gtc ttt 768

Lys Met Asp Thr Lys Leu Ala Asp Gln Glu Ser Asp Pro Asp Val Phe

245 250 255

tcc acg tac ccg atg atg cgc ctg cac ccg tgg cac cag aag cgc tgg 816

Ser Thr Tyr Pro Met Met Arg Leu His Pro Trp His Gln Lys Arg Trp

260 265 270

tac cac cgt ttc cag cac att tac ggc ccc ttc ate ttt ggc ttc atg 864

Tyr His Arg Phe Gln His Ile Tyr Gly Pro Phe Ile Phe Gly Phe Met

275 280 285

acc ate aac aag gtg gtc acg cag gac gtc ggt gtg gtg ctc cgc aag 912

Thr Ile Asn Lys Val Val Thr Gln Asp Val Gly Val Val Leu Arg Lys

290 295 300

cgg ctc ttc cag att gac gcc gag tgc cgg tac gcg age cca atg tac 960

Arg Leu Phe Gln Ile Asp Ala Glu Cys Arg Tyr Ala Ser Pro Met Tyr

305 310 315 320

gtg gcg cgt ttc tgg ate atg aag gcg ctc acg gtg ctc tac atg gtg1008

Val Ala Arg Phe Trp Ile Met Lys Ala Leu Thr Val Leu Tyr Met Val

325 330 335

gcc ctg ccg tgc tac atg cag ggc ccg tgg cac ggc ctc aag ctg ttc1056

Ala Leu Pro Cys Tyr Met Gln Gly Pro Trp His Gly Leu Lys Leu Phe

340 345 350

gcg ate gcg cac ttt acg tgc ggc gag gtg ctc gea acc atg ttc att1104

Ala Ile Ala His Phe Thr Cys Gly Glu Val Leu Ala Thr Met Phe Ile

355 360 365

gtg aac cac ate ate gag ggc gtc tcg tac gct tcc aag gac gcg gtc1152

Val Asn His Ile Ile Glu Gly Val Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ala Val

370 375 380

aag ggc acg atg gcg ccg ccg aag acg atg cac ggc gtg acg ccc atg1200

Lys Gly Thr Met Ala Pro Pro Lys Thr Met His Gly Val Thr Pro Met

385 390 395 400

aac aac acg cgc aag gag gtg gag gcg gag gcg tcc aag tet ggc gcc1248

Asn Asn Thr Arg Lys Glu Val Glu Ala Glu Ala Ser Lys Ser Gly Ala405 410 415gtg gtc aag tca gtc ccg ctc gac gac tgg gcc gcc gtc cag tgc cag1296

Val Val Lys Ser Val Pro Leu Asp Asp Trp Ala Ala Val Gln Cys Gln

420 425 430

acc tcg gtg aac tgg age gtc ggc tcg tgg ttc tgg aat cac ttt tcc1344

Thr Ser Val Asn Trp Ser Val Gly Ser Trp Phe Trp Asn His Phe Ser

435 440 445

ggc ggc ctc aac cac cag att gag cac cac ctg ttc ccc ggg ctc age1392

Gly Gly Leu Asn His Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Gly Leu Ser

450 455 460

cac gag acg tac tac cac ate cag gac gtc gtt cag tcc acc tgc gcc1440

His Glu Thr Tyr Tyr His Ile Gln Asp Val Val Gln Ser Thr Cys Ala465 470 475 480

gag tac ggc gtc ccg tac cag cac gag cct tcg ctc tgg acc gcg tac1488

Glu Tyr Gly Val Pro Tyr Gln His Glu Pro Ser Leu Trp Thr Ala Tyr

485 490 495

tgg aag atg ctc gag cac ctc cgt cag ctc ggc aat gag gag acc cac1536

Trp Lys Met Leu Glu His Leu Arg Gln Leu Gly Asn Glu Glu Thr His

500 505 510

gag tcc tgg cag cgc gct gcc tga1560

Glu Ser Trp Gln Arg Ala Ala

515 520

<210> 78<211> 519<212> PRT

<213> Traustochytrium sp.<400> 78

Met Thr Val Gly Tyr Asp Glu Glu Ile Pro Phe Glu Gln Val Arg Ala1 5 10 15

His Asn Lys Pro Asp Asp Ala Trp Cys Ala Ile His Gly His Val Tyr

20 25 30

Asp Val Thr Lys Phe Ala Ser Val His Pro Gly Gly Asp Ile Ile Leu

35 40 45

Leu Ala Ala Gly Lys Glu Ala Thr Val Leu Tyr Glu Thr Tyr His Val

50 55 60

Arg Gly Val Ser Asp Ala Val Leu Arg Lys Tyr Arg Ile Gly Lys Leu65 70 75 80

Pro Asp Gly Gln Gly Gly Ala Asn Glu Lys Glu Lys Arg Thr Leu Ser

85 90 95

Gly Leu Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Thr Trp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg

100 105 HO

Val Met Arg Glu Arg Val Val Ala Arg Leu Lys Glu Arg Gly Lys Ala

115 120 125

Arg Arg Gly Gly Tyr Glu Leu Trp Ile Lys Ala Phe Leu Leu Leu Val

130 135 140

Gly Phe Trp Ser Ser Leu Tyr Trp Met Cys Thr Leu Asp Pro Ser Phe145 150 155 160

Gly Ala Ile Leu Ala Ala Met Ser Leu Gly Val Phe Ala Ala Phe Val

165 170 175

Gly Thr Cys Ile Gln His Asp Gly Asn His Gly Ala Phe Ala Gln Ser

180 185 190

Arg Trp Val Asn Lys Val Ala Gly Trp Thr Leu Asp Met Ile Gly Ala

195 200 205

Ser Gly Met Thr Trp Glu Phe Gln His Val Leu Gly His His Pro Tyr

210 215 220

Thr Asn Leu Ile Glu Glu Glu Asn Gly Leu Gln Lys Val Ser Gly Lys225 230 235 240Lys Met Asp Thr Lys Leu Ala Asp Gln Glu Ser Asp Pro Asp Val Phe

245 250 255

Ser Thr Tyr Pro Met Met Arg Leu His Pro Trp His Gln Lys Arg Trp

260 265 270

Tyr His Arg Phe Gln His Ile Tyr Gly Pro Phe Ile Phe Gly Phe Met

275 280 285

Thr Ile Asn Lys Val Val Thr Gln Asp Val Gly Val Val Leu Arg Lys

290 295 300

Arg Leu Phe Gln Ile Asp Ala Glu Cys Arg Tyr Ala Ser Pro Met Tyr305 310 315 320

Val Ala Arg Phe Trp Ile Met Lys Ala Leu Thr Val Leu Tyr Met Val

325 330 335

Ala Leu Pro Cys Tyr Met Gln Gly Pro Trp His Gly Leu Lys Leu Phe

340 345 350

Ala Ile Ala His Phe Thr Cys Gly Glu Val Leu Ala Thr Met Phe Ile

355 360 365

Val Asn His Ile Ile Glu Gly Val Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ala Val

370 375 380

Lys Gly Thr Met Ala Pro Pro Lys Thr Met His Gly Val Thr Pro Met385 390 395 400

Asn Asn Thr Arg Lys Glu Val Glu Ala Glu Ala Ser Lys Ser Gly Ala

405 410 415

Val Val Lys Ser Val Pro Leu Asp Asp Trp Ala Ala Val Gln Cys Gln

420 425 430

Thr Ser Val Asn Trp Ser Val Gly Ser Trp Phe Trp Asn His Phe Ser

435 440 445

Gly Gly Leu Asn His Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Gly Leu Ser

450 455 460

His Glu Thr Tyr Tyr His Ile Gln Asp Val Val Gln Ser Thr Cys Ala465 470 475 480

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450 455 460

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485 490 495

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500 505 510

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515<210> 94<211> 519<212> PRT

<213> Thraustochytrium sp<400> 94

Met Thr Val Gly Tyr Asp Glu Glu Ile Pro Phe Glu Gln Val Arg Ala1 5 10 15

His Asn Lys Pro Asp Asp Ala Trp Cys Ala Ile His Gly His Val Tyr

20 25 30

Asp Val Thr Lys Phe Ala Ser Val His Pro Gly Gly Asp Ile Ile Leu

35 40 45

Leu Ala Ala Gly Lys Glu Ala Thr Val Leu Tyr Glu Thr Tyr His Val

50 55 60

Arg Gly Val Ser Asp Ala Val Leu Arg Lys Tyr Arg Ile Gly Lys Leu65 70 75 80

Pro Asp Gly Gln Gly Gly Ala Asn Glu Lys Glu Lys Arg Thr Leu Ser

85 90 95

Gly Leu Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Thr Trp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg

100 105 110

Val Met Arg Glu Arg Val Val Ala Arg Leu Lys Glu Arg Gly Lys Ala

115 120 125

Arg Arg Gly Gly Tyr Glu Leu Trp Ile Lys Ala Phe Leu Leu Leu Val

130 135 140

Gly Phe Trp Ser Ser Leu Tyr Trp Met Cys Thr Leu Asp Pro Ser Phe145 150 155 160

Gly Ala Ile Leu Ala Ala Met Ser Leu Gly Val Phe Ala Ala Phe Val

165 170 175

Gly Thr Cys Ile Gln His Asp Gly Asn His Gly Ala Phe Ala Gln Ser

180 185 190

Arg Trp Val Asn Lys Val Ala Gly Trp Thr Leu Asp Met Ile Gly Ala

195 200 205

Ser Gly Met Thr Trp Glu Phe Gln His Val Leu Gly His His Pro Tyr

210 215 220

Thr Asn Leu Ile Glu Glu Glu Asn Gly Leu Gln Lys Val Ser Gly Lys225 230 235 240

Lys Met Asp Thr Lys Leu Ala Asp Gln Glu Ser Asp Pro Asp Val Phe

245 250 255

Ser Thr Tyr Pro Met Met Arg Leu His Pro Trp His Gln Lys Arg Trp

260 265 270

Tyr His Arg Phe Gln His Ile Tyr Gly Pro Phe Ile Phe Gly Phe Met

275 280 285

Thr Ile Asn Lys Val Val Thr Gln Asp Val Gly Val Val Leu Arg Lys

290 295 300

Arg Leu Phe Gln Ile Asp Ala Glu Cys Arg Tyr Ala Ser Pro Met Tyr305 310 315 320

Val Ala Arg Phe Trp Ile Met Lys Ala Leu Thr Val Leu Tyr Met Val

325 330 335

Ala Leu Pro Cys Tyr Met Gln Gly Pro Trp His Gly Leu Lys Leu Phe

340 345 350

Ala Ile Ala His Phe Thr Cys Gly Glu Val Leu Ala Thr Met Phe Ile

355 360 365

Val Asn His Ile Ile Glu Gly Val Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ala Val

370 375 380

Lys Gly Thr Met Ala Pro Pro Lys Thr Met His Gly Val Thr Pro Met385 390 395 400

Asn Asn Thr Arg Lys Glu Val Glu Ala Glu Ala Ser Lys Ser Gly Ala

405 410 415

Val Val Lys Ser Val Pro Leu Asp Asp Trp Ala Val Val Gln Cys Gln

420 425 430

Thr Ser Val Asn Trp Ser Val Gly Ser Trp Phe Trp Asn His Phe Ser

435 440 445

Gly Gly Leu Asn His Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Gly Leu Ser

450 455 460

His Glu Thr Tyr Tyr His Ile Gln Asp Val Phe Gln Ser Thr Cys Ala465 470 475 Glu Tyr Gly Val Pro Tyr Gln His Glu Pro Ser Leu Trp Thr Ala 485 490 495Trp Lys Met Leu Glu His Leu Arg Gln Leu Gly Asn Glu Glu Thr 500 505 510 Glu Ser Trp Gln Arg Ala Ala

515

<210> 95

<211> 575

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante

<222> (2) . . (3)

<223> xaa na posição 2 a 3 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (5)..(13)

<223> xaa na posição 5 a 13 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (14)..(48)

<223> xaa na posição 14 a 48 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (51).. (51)

<223> xaa na posição 51 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (54)..(54)

<223> xaa na posição 54 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (56) . . (56)

<223> xaa na posição 56 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (62)..(62)

<223> xaa na posição 62 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (64)..(65)

<223> xaa na posição 64 a 65 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (66) . . (81)

<223> xaa na posição 66 a 81 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (85) . . (85)

<223> xaa na posição 85 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (87)..(87)

<223> xaa na posição 87 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (89) . . (91)

<223> xaa na posição 89 a 91 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (97) . . (97)

<223> xaa na posição 97 é qualquer aminoácido<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>

Variante(99)..(99)

xaa na posição 99 é qualquer aminoácido

Variante(102)..(102)

xaa na posição 102 é qualquer aminoácido

Variante(105)..(105)

xaa na posição 105 é qualquer aminoácido

Variante(108)..(108)

xaa na posição 108 é qualquer aminoácido

Variante(110)..(110)

xaa na posição 110 é qualquer aminoácido

Variante(115)..(116)

xaa na posição 115 a 116 é qualquer aminoácido

Variante(119)..(119)

xaa na posição 119 é qualquer aminoácido

Variante(121)..(121)

xaa na posição 121 é qualquer aminoácido

Variante(123)..(124)

xaa na posição 123 a 124 é qualquer aminoácido

Variante(127)..(128)

xaa na posição 127 a 128 é qualquer aminoácido

Variante(130)..(130)

xaa na posição 130 é qualquer aminoácido

Variante(132)..(137)

xaa na posição 132 a 137 é qualquer aminoácido

Variante(138)..(154)

xaa na posição 138 a 154 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(156)..(156)

xaa na posição 156 é qualquer aminoácido

Variante

(158)..(158)

xaa na posição 158 é qualquer aminoácido

Variante

(159)..(159)<223> xaa na posição 159 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (161)..(161)

<223> xaa na posição 161 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (164)..(164)

<223> xaa na posição 164 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (166).. (168)

<223> xaa na posição 166 a 168 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (171).. (173)

<223> xaa na posição 171 a 173 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> . (175)..(175)

<223> xaa na posição 175 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (177).. (177)

<223> xaa na posição 177 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (179).. (181)

<223> xaa na posição 179 a 181 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (183)..(184)

<223> xaa na posição 183 a 184 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (185)..(185)

<223> xaa na posição 185 é qualquer um ou nenhum ammoacido<220>

<221> Variante

<222> (189)..(189)

<223> xaa na posição 189 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (192)..(193)

<223> xaa na posição 192 a 193 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (196) . . (196)

<223> xaa na posição 196 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (200)..(200)

<223> xaa na posição 200 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (204)..(204)

<223> xaa na posição 204 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (206)..(207)

<223> xaa na posição 206 a 207 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (208) . . (211)

<223> xaa na posição 208 a 211 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (213).. (214)

<223> xaa na posição 213 a 214 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (215) . . (216)

<223> xaa na posição 215 a 216 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (218)..(220)

<223> xaa na posição 218 a 220 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (222)..(224)

<223> xaa na posição 222 a 224 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (226)..(226)

<223> xaa na posição 226 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (240) . . (240)

<223> xaa na posição 240 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (245) . . (250)

<223> xaa na posição 245 a 250 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (253).. (253)

<223> xaa na posição 253 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (265)..(266)

<223> xaa na posição 265 a 266 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (270) . . (270)

<223> xaa na posição 270 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (273)..(273)

<223> xaa na posição 273 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (283)..(284)

<223> xaa na posição 283 a 284 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (285)..(290)

<223> xaa na posição 285 a 290 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (292) . . (293)

<223> xaa na posição 292 a 293 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (295) . . (297)

<223> xaa na posição 295 a 297 é qualquer aminoácido<220><221> Variante

<222> (299)..(302)

<223> xaa na posição 299 a 302 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (313)..(313)

<223> xaa na posição 313 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (316)..(317)

<223> xaa na posição 316 a 317 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (319)..(319)

<223> xaa na posição 319 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (322).. (322)

<223> xaa na posição 322 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (324)..(327)

<223> xaa na posição 324 a 327 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (330)..(330)

<223> xaa na posição 330 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (334)..(334)

<223> xaa na posição 334 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (336)..(336)

<223> xaa na posição 336 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (338)..(339)

<223> xaa na posição 338 a 339 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (341)..(342)

<223> xaa na posição 341 a 342 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (346)..(346)

<223> xaa na posição 34 6 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (349)..(350)

<223> xaa na posição 34 9 a 350 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (353)..(354)

<223> xaa na posição 353 a 354 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (356) . . (359)

<223> xaa na posição 356 a 359 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (362)..(363)

<223> xaa na posição 362 a 363 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (367)..(368) <223> xaa na posição 367 a<220> <221> Variante <222> (371)..(371) <223> xaa na posição 371 é<220> <221> Variante <222> (373)..(375) <223> xaa na posição 373 a<220> <221> Variante <222> (377) . . (377) <223> xaa na posição 377 é<220> <221> Variante <222> (381)..(381) <223> xaa na posição 381 é<220> <221> Variante <222> (384)..(385) <223> xaa na posição 384 a<220> <221> Variante <222> (387)..(387) <223> xaa na posição 387 é<220> <221> Variante <222> (390)..(392) <223> xaa na posição 390 a<220> <221> Variante <222> (395)..(395) <223> xaa na posição 395 é<220> <221> Variante <222> (397)..(398) <223> xaa na posição 397 a<220> <221> Variante <222> (400) .. (402) <223> xaa na posição 400 a<220> <221> Variante <222> (405)..(405) <223> xaa na posição 405 é<220> <221> Variante <222> (408)..(409) <223> xaa na posição 408 a<220> <221> Variante <222> (412)..(413) <223> xaa na posição 412 a<220> <221> Variante <222> (417) . . (417) <223> xaa na posição 417 é<220> <221> Variante <222> (427) . . (427)

367 a 368 é qualquer aminoácido

371 é qualquer aminoácido

373 a 375 é qualquer aminoácido

377 é qualquer aminoácido

381 é qualquer aminoácido

384 a 385 é qualquer aminoácido

387 é qualquer aminoácido

390 a 392 é qualquer aminoácido

395 é qualquer aminoácido

397 a 398 é qualquer aminoácido

400 a 4 02 é qualquer aminoácido

405 é qualquer aminoácido

408 a 409 é qualquer aminoácido

412 a 413 é qualquer aminoácido

417 é qualquer aminoácido<223> xaa na posição 427 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (434)..(435)

<223> xaa na posição 434 a 435 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (438)..(438)

<223> xaa na posição 438 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (440) . . (440)

<223> xaa na posição 440 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (442).. (443)

<223> xaa na posição 442 a 443 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (444)..(452)

<223> xaa na posição 444 a 452 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (454) . . (454)

<223> xaa na posição 454 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (456)..(457)

<223> xaa na posição 456 a 457 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (459) . . (459)

<223> xaa na posição 459 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (463) . . (464)

<223> xaa na posição 4 63 a 4 64 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (466) . . (466)

<223> xaa na posição 466 é. qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (468) . . (472)

<223> xaa na posição 4 68 a 472 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (473) . . (473)

<223> xaa na posição 473 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (475) . . (483)

<223> xaa na posição 475 a 483 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (484) . . (489)

<223> xaa na posição 484 a 489 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (491)..(492)

<223> xaa na posição 491 a 492 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Met xaa1

xaa xaa

xaa xaa

Val Arg50

(496)..(496)

xaa na posição 4 96 é qualquer aminoácido

Variante(506)..(507)

xaa na posição 506 a 507 é qualquer aminoácido

Variante(527)..(527)

xaa na posição 527 é qualquer aminoácido

Variante(530)..(532)

xaa na posição 530 a 532 é qualquer aminoácido

Variante(534).. (538)

xaa na posição 534 a 538 é qualquer aminoácido

Variante(540)..(542)

xaa na posição 540 a 542 é qualquer aminoácido

Variante(544)..(545)

xaa na posição 54 4 a 54 5 é qualquer aminoácido

Variante(548) .. (548)

xaa na posição 548 é qualquer aminoácido

Variante(556)..(556)

xaa na posição 556 é qualquer aminoácido

Variante(558)..(559)

xaa na posição 558 a 559 é qualquer aminoácido

Variante(561)..(562)

xaa na posição 561 a 562 é qualquer aminoácido

Variante(565)..(565)

xaa na posição 565 é qualquer aminoácido

Variante(568)..(569)

xaa na posição 568 a 569 é qualquer aminoácido

Variante(573)..(573)

xaa na posição 573 é qualquer aminoácido95

xaa Gly xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

5 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

20 25 30

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

35 40 45

xaa His Asn xaa Pro xaa Asp Ala Trp Cys Ala xaa His xaa55 60xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa65 70 75 80

xaa Val Tyr Asp xaa Thr xaa Phe xaa xaa xaa His Pro Gly Gly Asp

85 90 95

xaa Ile xaa Leu Ala xaa Gly Lys xaa Ala Thr xaa Leu xaa Glu Thr

100 105 HO

Tyr His xaa xaa Gly Val xaa Asp xaa Val xaa xaa Lys Tyr xaa xaa

115 120 125

Gly xaa Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

130 135 140

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Tyr xaa Trp xaa xaa Ser145 150 155 160

xaa Phe Tyr xaa Val xaa xaa xaa Arg Val xaa xaa xaa Leu xaa Glu

165 170 175

xaa Gly xaa xaa xaa Arg xaa xaa xaa Glu Leu Trp xaa Lys Ala xaa

180 185 190

xaa Leu Leu xaa Gly Phe Trp xaa Ser Leu Tyr xaa Met xaa xaa xaa

195 200 205

xaa xaa xaa Asp xaa xaa xaa xaa Ala xaa xaa xaa Ala xaa xaa xaa

210 215 220

Gly xaa Phe Ala Ala Phe Val Gly Thr Cys Ile Gln His Asp Gly xaa225 230 235 240

His Gly Ala Phe xaa xaa xaa xaa xaa xaa Asn Lys xaa Ala Gly Trp

245 250 255

Thr Leu Asp Met Ile Gly Ala Ser xaa xaa Thr Trp Glu xaa Gln His

260 265 270

xaa Leu Gly His His Pro Tyr Thr Asn Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa

275 280 285

xaa xaa Lys xaa xaa Gly xaa xaa xaa Asp xaa xaa xaa xaa Asp Gln

290 295 300

Glu Ser Asp Pro Asp Val Phe Ser xaa Tyr Pro xaa xaa Arg xaa His305 310 315 320

Pro xaa His xaa xaa xaa xaa Tyr His xaa Phe Gln His xaa Tyr xaa

325 330 335

Pro xaa xaa Phe xaa xaa Met Thr Ile xaa Lys Val xaa xaa Gln Asp

340 345 350

xaa xaa Val xaa xaa xaa xaa Arg Leu xaa xaa Ile Asp Ala xaa xaa

355 360 365

Arg Tyr xaa Ser xaa xaa xaa Val xaa Arg Phe Trp xaa Met Lys xaa

370 375 380

xaa Thr xaa Leu Tyr xaa xaa xaa Leu Pro xaa Tyr xaa xaa Gly xaa385 390 395 400

xaa xaa Gly Leu xaa Leu Phe xaa xaa Ala His xaa xaa Cys Gly Glu

405 410 415

xaa Leu Ala Thr Met Phe Ile Val Asn His xaa Ile Glu Gly Val Ser

420 425 430

Tyr xaa xaa Lys Asp xaa Val xaa Gly xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

435 440 445

xaa xaa xaa xaa Pro xaa Thr xaa xaa Gly xaa Thr Pro Met xaa xaa

450 455 460

Thr xaa Lys xaa xaa xaa xaa xaa xaa Ser xaa xaa xaa xaa xaa xaa465 470 475 480

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Pro xaa xaa Asp Trp Ala xaa

485 490 495

Val Gln Cys Gln Thr Ser Val Asn Trp xaa xaa Gly Ser Trp Phe Trp

500 505 510

Asn His Phe Ser Gly Gly Leu Asn His Gln Ile Glu His His xaa Phe

515 520 525

Pro xaa xaa xaa His xaa xaa xaa xaa xaa Ile xaa xaa xaa Val xaa

530 535 540

xaa Thr Cys xaa Glu Tyr Gly Val Pro Tyr Gln xaa Glu xaa xaa Leu545 550 555 560

xaa xaa Ala Tyr xaa Lys Met xaa xaa His Leu Arg xaa Leu Gly565 570<210> 96 <211> 58 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (2)..(4) <223> xaa na posição 2 a . 4 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (10)..(10) <223> xaa na posição 10 é Ala ou Val<220> <221> Variante <222> (13)..(13) <223> xaa na posição 13 é Ala ou Ser<220> <221> Variante <222> (14)..(14) <223> xaa na posição 14 é Pro ou Val<220> <221> Variante <222> (27)..(27) <223> xaa na posição 27 é Asn ou Ser<220> <221> Variante <222> (34)..(34) <223> xaa na posição 34 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (37)..(37) <223> xaa na posição 37 é Gly, Gln ou Ser<220> <221> Variante <222> (38)..(39) <223> xaa na posição 38 a 39 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (41)..(41) <223> xaa na posição 41 é Glu ou Thr<220> <221> Variante <222> (42)..(42) <223> xaa na posição 42 é Asn, Thr ou Val<220> <221> Variante <222> (43)..(44) <223> xaa na posição 43 a 4 4 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (45) .. (45) <223> xaa na posição 45 é His ou Tyr<220> <221> Variante <222> (47)..(47) <223> xaa na posição 47 é Gln ou Ser<220> <221> Variante <222> (48)..(48) <223> xaa na posição 48 é Asp ou Gly<220> <221> Variante<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Trp xaa1

Trp Phe

His xaa

xaa xaa50

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

(49)..(49)

xaa na posição 49 é Ile ou Val

Variante

(50)..(50)

xaa na posição 50 é Phe ou Val

Variante

(51)..(51)

xaa na posição 51 é qualquer aminoácido

Variante

(52).. (52)

xaa na posição 52 é Glu ou Ser

Variante(55)..(55)

xaa na posição 55 é Ala ou Glu

96

xaa xaa Gln Cys Gln Thr Ser xaa Asn Trp xaa xaa Gly Ser

5 10 15

Trp Asn His Phe Ser Gly Gly Leu xaa His Gln Ile Glu His

20 25 30

Phe Pro xaa xaa xaa His xaa xaa xaa xaa xaa Ile xaa xaa

35 40 45

xaa xaa Thr Cys xaa Glu Tyr Gly55

9761PRT

Seqüência artificial

Variante(2) . . (2)

xaa na posição 2 é qualquer aminoácido

Variante(7).. (7)

xaa na posição 7 é Ile ou Val

Variante(16)..(16)

xaa na posição 16 é Asn ou Ser

Variante(21)..(21)

xaa na posição 21 é Ala ou Ser

Variante(22)..(22)

xaa na posição 22 é qualquer aminoácido

Variante

(23)..(23)

xaa na posição 23 é Asn ou Ser

Variante

(24) .. (24)

xaa na posição 24 é Lys ou Arg

Variante

(25)..(25)

xaa na posição 25 é qualquer aminoácido<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Gly xaa1

His Gly

Trp Thr

His xaa50

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221>

Variante(26)..(26)

xaa na posição 26 é Leu, Met ou Val

Variante(29).. (29)

xaa na posição 29 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(31)..(31)

xaa na posição 31 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante

(42)..(42)

xaa na posição 42 é Ala ou Gly

Variante

(43)..(43)

xaa na posição 43 é Phe ou Met

Variante(47).. (47)

xaa na posição 47 é Phe, Leu ou Met

Variante(50)..(50)

xaa na posição 50 é qualquer aminoácido

Variante

(59)..(59)

xaa na posição 59 é Leu ou Val

Variante

(60) . . (60)

xaa na posição 60 é Ile ou Leu

Variante(61)..(61)

xaa na posição 61 é Asp ou Glu

97

Phe Ala Ala Phe xaa Gly Thr Cys Ile Gln His Asp Gly xaa

5 10 15

Ala Phe xaa xaa xaa xaa xaa xaa Asn Lys xaa Ala xaa Gly

20 25 30

Leu Asp Met Ile Gly Ala Ser xaa xaa Thr Trp Glu xaa Gln

35 40 45

Leu Gly His His Pro Tyr Thr Asn xaa xaa xaa55 60

9840PRT

Seqüência artificial

Variante

(3) . . (3)

xaa na posição 3 é Lys ou Arg

Variante

(4)..(4)

xaa na posição 4 é Phe ou TyrVariante<222> (7)..(7) <223> xaa na posição 7 é Ile ou Leu <220> <221> Variante <222> (9) .. (9) <223> xaa na posição 9 é Ala ou Gly <220> <221> Variante <222> (11).·(12) <223> xaa na posição 11 a 12 é qualquer um ou nenhum<220> <221> Variante <222> (14) . . (15) <223> xaa na posição 14 a 15 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (16)..(17) <223> xaa na posição 16 a 17 é qualquer um ou nenhum<220> <221> Variante <222> (20)..(20) <223> xaa na posição 20 é Ile ou Leu<220> <221> Variante <222> (21) .. (21) <223> xaa na posição 21 é Ala ou Asn<220> <221> Variante <222> (24) .. (24) <223> xaa na posição 24 é Phe, Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (25)..(25) <223> xaa na posição 25 é Gln, Ser ou Thr<220> <221> Variante <222> (28)..(28) <223> xaa na posição 28 é Phe ou Val<220> <221> Variante <222> (29)..(29) <223> xaa na posição 29 é Glu ou Gly<220> <221> Variante <222> (31)..(31) <223> xaa na posição 31 é Ala ou Val<220> <221> Variante <222> (32)..(32) <223> xaa na posição 32 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (33)..(33) <223> xaa na posição 33 é Arg ou Ser<220> <221> Variante <222> (34)..(34) <223> xaa na posição 34 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (37)..(37) <223> xaa na posição 37 é Phe ou Tyr<220><221><222><223><4 00>Tyr His1

xaa Met

Variante(38)..(38)

xaa na posição 38 é qualquer aminoácido98

xaa xaa Gln His xaa Tyr xaa Pro xaa xaa Phe xaa xaa xaa

5 10 15

Thr xaa xaa Lys Val xaa xaa Gln Asp xaa xaa Val xaa xaa20 25 30

xaa xaa Arg Leu xaa xaa Ile Asp 35 40<210> 99 <211> 59 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (3) . . (3) <223> xaa na posição 3 é Ala ou Ile<220> <221> Variante <222> (6) .. (6) <223> xaa na posição 6 é Ala, Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (7)..(7) <223> xaa na posição 7 é Ile ou Leu<220> <221> Variante <222> (9) .. (9) <223> xaa na posição 9 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (10) .. (10) <223> xaa na posição 10 é Gly ou Leu<220> <221> Variante <222> (12) .. (12) <223> xaa na posição 12 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (13)..(13) <223> xaa na posição 13 é Met ou Val<220> <221> Variante <222> (14) .. (14) <223> xaa na posição 14 é Ala ou Gly<220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (19) .. (19) <223> xaa na posição 19 é Phe ou Met<220> <221> Variante <222> (20)..(20) <223> xaa na posição 20 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (22)..(22) <223> xaa na posição 22 é Pro ou Val<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223> <220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Phe Trp1

xaa Tyr

His xaa

xaa Ile50

<210><211><212><213><220><221><222>

Variante(23)..(24)

xaa na posição 23 a 24 é qualquer aminoácido

Variante(26)..(26)

xaa na posição 26 é Leu ou Val

Variante(27)..(27)

xaa na posição 27 é qualquer aminoácido

Variante

(30)..(30)

xaa na posição 30 é qualquer aminoácido

Variante

(31)..(31)

xaa na posição 31 é Ile ou Met

Variante

(32)..(32)

xaa na posição 32 é Ala ou Gly

Variante

(34) . . (34)

xaa na posição 34 é Phe ou Leu

Variante

(35)..(35)

xaa na posição 35 é Ala ou Thr

Variante(39)..(39)

xaa na posição 39 é Leu ou Val

Variante(49)..(49)

xaa na posição 49 é Ile ou Val

Variante

(56)..(56)

xaa na posição 56 é Ala ou Gly

Variante

(57)..(57)

xaa na posição 57 é Ser ou Thr

99

xaa Met Lys xaa xaa Thr xaa xaa Tyr xaa xaa xaa Leu Pro

5 10 15

xaa xaa Gly xaa xaa xaa Gly xaa xaa Leu Phe xaa xaa xaa

20 25 30

xaa Cys Gly Glu xaa Leu Ala Thr Met Phe Ile Val Asn His

35 40 45

Glu Gly Val Ser Tyr xaa xaa Lys Asp55

10045PRT

Seqüência artificial

Variante(3) . . (3)<223> xaa na posição 3 é Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (5) . . (5) <223> xaa na posição 5 é Asp ou Lys<220> <221> Variante <222> (7) . . (9) <223> xaa na posição 7 a 9 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (14)..(14) <223> xaa na posição 14 é Asp ou Gly<220> <221> Variante <222> (15)..(15) <223> xaa na posição 15 é Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (17).. (17) <223> xaa na posição 17 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (19)..(19) <223> xaa na posição 19 é Ala ou Gly<220> <221> Variante <222> (20) .. (20) <223> xaa na posição 20 é Ala ou Leu<220> <221> Variante <222> (22)..(22) <223> xaa na posição 22 é Lys ou Arg<220> <221> Variante <222> (23)..(23) <223> xaa na posição 23 é Asp ou Glu<220> <221> Variante <222> (24) .. (24) <223> xaa na posição 24 é Ala ou Cys<220> <221> Variante <222> (26) . . (26) <223> xaa na posição 26 é Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (28) .. (28) <223> xaa na posição 28 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (30)..(30) <223> xaa na posição 30 é Ser ou Thr<220> <221> Variante <222> (33)..(33) <223> xaa na posição 33 é He, Pro ou Val<220> <221> Variante <222> (34)..(34) <223> xaa na posição 34 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante<222> (36) .. (36) <223> xaa na posição 36 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (37)..(37) <223> xaa na posição 37 é Pro ou Ser<220> <221> Variante <222> (39)..(39) <223> xaa na posição 39 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (41) . . (41) <223> xaa na posição 41 é Leu ou Met<220> <221> Variante <222> (42) .. (42) <223> xaa na posição 42 é Glu ou Arg<220> <221> Variante <222> (45)..(45) <223> xaa na posição 45 é Lys ou Arg<4 00> 100 Tyr Asp xaa Thr xaa Phe xaa xaa xaa His Pro Gly1 5 10xaa Leu xaa xaa Gly xaa xaa xaa Thr xaa Leu xaa

15

u xaa Tyr

20 25 30

xaa xaa Gly xaa xaa Asp xaa Val xaa xaa Lys Tyr xaa35 40 45

<210> 101 <211> 24 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (2) .. (6) <223> xaa na posição 2 a 6 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (16)..(16) <223> xaa na posição 16 é Ser ou Thr <220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é Phe ou Tyr <220> <221> Variante <222> (19)..(20) <223> xaa na posição 19 a 20 é Leu ou Met<220> <221> Variante <222> (22)..(22) <223> xaa na posição 22 é Leu ou Met <4 00> 101 Asp xaa xaa xaa xaa xaa Gln Glu Ser Asp Pro Asp Val Phe Ser xaa1 5 10 15xaa Pro xaa xaa Arg xaa His Pro 20 <210> 102 <211> 27 <212> PRT <213> Seqüência artificial

<220><221> Variante <222> (2)..(2) <223> xaa na posição 2 é Asp ou Glu<220> <221> Variante <222> (5) . . (5) <223> xaa na posição 5 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (7)..(7) <223> xaa na posição 7 é Leu ou Met<220> <221> Variante <222> (8)..(8) <223> xaa na posição 8 é Lys ou Arg<220> <221> Variante <222> (9) .. (9) <223> xaa na posição 9 é Glu ou Arg<220> <221> Variante <222> (12) . . (12) <223> xaa na posição 12 é Ala ou Val<220> <221> Variante <222> (13)..(13) <223> xaa na posição 13 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (14)..(14) <223> xaa na posição 14 é Lys ou Arg<220> <221> Variante <222> (16)..(16) <223> xaa na posição 16 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (18)..(18) <223> xaa na posição 18 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (20) .. (21) <223> xaa na posição 20 a 21 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (22)..(22) <223> xaa na posição 22 é Gln ou Arg<220> <221> Variante <222> (24)..(24) <223> xaa na posição 24 é Ala ou Gly<220> <221> Variante <222> (25)..(26) <223> xaa na posição 25 a 26 é qualquer aminoácido<400> 102 Ser xaa Phe Tyr xaa Val xaa xaa xaa Arg Val xaa xaa xaa Leu xaa

1 5 10 15

Glu xaa Gly xaa xaa xaa Arg xaa xaa xaa Glu

20 25

<210> 103<211> 28<212> PRT<213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Gly xaa1

xaa xaa

Seqüência artificial

Variante(2) . . (3)

xaa na posição 2 a 3 é qualquer aminoácido

Variante(4) .. (4)

xaa na posição 4 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(6)..(10)

xaa na posição 6 a 10 é qualquer aminoácido

Variante(11)..(12)

xaa na posição 11 a 12 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(15)..(15)

xaa na posição 15 é qualquer aminoácido

Variante(17)..(18)

xaa na posição 17 a 18 é qualquer aminoácido

Variante(20)..(20)

xaa na posição 20 é Asp ou Thr

Variante(22)..(22)

xaa na posição 22 é Ala ou Gly

Variante

(24) .. (24)

xaa na posição 24 é qualquer aminoácido

Variante

(25)..(25)

xaa na posição 25 é Ala ou Thr

Variante

(26)..(26)

xaa na posição 26 é qualquer aminoácido

Variante(28)..(28)

xaa na posição 28 é Glu ou Gly103

xaa xaa Glu xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Val Arg xaa His

5 10 15

Pro xaa Asp xaa Trp xaa xaa xaa His xaa20 25

<210> 104<211> 28<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <221> Variante<222> (5) . . (5)<223> xaa na posição 5 é qualquer<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220>

Variante(7)..(7)

xaa na posição 7 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(9)-.(9)

xaa na posição 9 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante

(11) . - (H)

xaa na posição 11 é Phe ou Trp

Variante

(12)..(12)

xaa na posição 12 é Ser, Thr ou Val

Variante(15).. (15)

xaa na posição 15 é qualquer aminoácido

Variante(18)..(18)

xaa na posição 18 é Ile ou Leu

Variante(19)..(19)

xaa na posição 19 é Glu ou Ser

Variante(22) .. (22)

xaa na posição 22 é Lys ou Arg

Variante(23)..(23)

xaa na posição 23 é qualquer aminoácido

<221> Variante <222> (26) ..(26) <223> xaa na posição 26 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (27) .·(27) <223> xaa na posição 27 é Ala ou Glu<220> <221> Variante <222> (28) .·(28) <223> xaa na posição 28 é Asp, Glu ou Lys<400> 104 Val Pro Tyr Gln xaa Glu xaa Ser xaa Leu xaa xaa 1 5 10Met xaa xaa His Leu xaa xaa Leu Gly xaa xaa xaa 20 25<210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (4) . . (4) <223> xaa na posição 4 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (5) . . (5)

15<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Gly Phe1

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>

xaa na posição 5 é Cys ou Ser

Variante

(7)..(8)

xaa na posição 7 a 8 é qualquer aminoácido

Variante(10)..(12)

xaa na posição 10 a 12 é qualquer aminoácido

Variante

(13)..(13)

xaa na posição 13 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(15)..(15)

xaa na posição 15 é Ile ou Pro

105

Trp xaa xaa Leu xaa xaa Met xaa xaa xaa xaa Asp xaa5 10 15

10629PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(7)

xaa na posição 2 a 7 é qualquer aminoácido

Variante

(8) .. (12)

xaa na posição 8 a 12 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante

(14)..(14)

xaa na posição 14 é Asp ou Val

Variante(18) .. (18)

xaa na posição 18 é Glu, Asn ou Gln

Variante(19)..(19)

xaa na posição 19 é qualquer aminoácido

Variante(21)..(21)

xaa na posição 21 é Gln ou Arg

Variante(22)..(22)

xaa na posição 22 é Glu ou Lys

Variante

(23)..(23)

xaa na posição 23 é Ala ou Glu

Variante

(24) .. (24)

xaa na posição 24 é Ala, Leu ou Val

Variante

(25)..(26)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Val xaa1

Met xaa

<210 ><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Ala xaa1

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Trp xaa1

<210><211><212>

xaa na posição 25 a 26 é qualquer aminoácido

Variante

(27)..(27)

xaa na posição 27 é Ala, Glu ou Ser

Variante

(28)..(28)

xaa na posição 28 é Ala, Glu ou Asn106

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa Thr Pro

5 10 15

xaa Thr xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Ser20 25

107

11

PRT

Seqüência artificial

Variante(2) . . (2)

xaa na posição 2 é Glu ou Asn

Variante(3) . . (3)

xaa na posição 3 é Cys ou Val

Variante(6) .. (6)

xaa na posição 6 é Ala ou Gly

Variante(8) . . (8)

xaa na posição 8 é Pro ou Val

Variante(9)..(10)

xaa na posição 9 a 10 é qualquer aminoácido

107

xaa Arg Tyr xaa Ser xaa xaa xaa Val5 10

1088

PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(2)

xaa na posição 2 é Ala ou Ile

Variante

(5)..(5)

xaa na posição 5 é Phe, Ile ou Leu

Variante

(6)..(6)

xaa na posição 6 é Phe ou Leu108

Lys Ala xaa xaa Leu Leu5

109903DNA48

96

144

192

240

288

<213> Ostreococcus tauri<220>

<221> CDS<222> (1) . . (903)<400> 109

atg age gce tec ggt gcg ctg ctg ccc gcg ate gcg ttc gcc gcg tacMet Ser Ala Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Ile Ala Phe Ala Ala Tyr1 5 10 15

gcg tac gcg acg tac gcc tac gcc ttt gag tgg tcg cac gcg aat ggcAla Tyr Ala Thr Tyr Ala Tyr Ala Phe Glu Trp Ser His Ala Asn Gly

20 25 30

ate gac aac gtc gac gcg cgc gag tgg ate ggt gcg ctg tcg ttg aggIle Asp Asn Val Asp Ala Arg Glu Trp Ile Gly Ala Leu Ser Leu Arg

35 40 45

ctc ccg gcg ate gcg acg acg atg tac ctg ttg ttc tgc ctg gtc ggaLeu Pro Ala Ile Ala Thr Thr Met Tyr Leu Leu Phe Cys Leu Val Gly

50 55 60

ccg agg ttg atg gcg aag cgc gag gcg ttc gac ccg aag ggg ttc atgPro Arg Leu Met Ala Lys Arg Glu Ala Phe Asp Pro Lys Gly Phe Met65 70 75 80

ctg gcg tac aat gcg tat cag acg gcg ttc aac gtc gtc gtg ctc gggLeu Ala Tyr Asn Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Asn Val Val Val Leu Gly

85 90 95

atg ttc gcg cga gag ate tcg ggg ctg ggg cag ccc gtg tgg ggg tca 336

Met Phe Ala Arg Glu Ile Ser Gly Leu Gly Gln Pro Val Trp Gly Ser

100 105 HO

acc atg ccg tgg age gat aga aaa tcg ttt aag ate ctc ctc ggg gtgThr Met Pro Trp Ser Asp Arg Lys Ser Phe Lys Ile Leu Leu Gly Val

115 120 125

tgg ttg cac tac aac aac aaa tat ttg gag cta ttg gac act gtg ttcTrp Leu His Tyr Asn Asn Lys Tyr Leu Glu Leu Leu Asp Thr Val Phe

130 135 140

atg gtt gcg cgc aag aag acg aag cag ttg age ttc ttg cac gtt tatMet Val Ala Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr145 150 155 160

cat cac gcc ctg ttg ate tgg gcg tgg tgg ttg gtg tgt cac ttg atgHis His Ala Leu Leu Ile Trp Ala Trp Trp Leu Val Cys His Leu Met

165 170 175

gcc acg aac gat tgt ate gat gcc tac ttc ggc gcg gcg tgc aac tcgAla Thr Asn Asp Cys Ile Asp Ala Tyr Phe Gly Ala Ala Cys Asn Ser

180 185 190

ttc att cac ate gtg atg tac tcg tat tat ctc atg tcg gcg ctc ggcPhe Ile His Ile Val Met Tyr Ser Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Leu Gly

195 200 205

att cga tgc ccg tgg aag cga tac ate acc cag gct caa atg ctc caaIle Arg Cys Pro Trp Lys Arg Tyr Ile Thr Gln Ala Gln Met Leu Gln

210 215 220

ttc gtc att gtc ttc gcg cac gcc gtg ttc gtg ctg cgt cag aag cacPhe Val Ile Val Phe Ala His Ala Val Phe Val Leu Arg Gln Lys His225 230 235 240

tgc ccg gtc acc ctt cct tgg gcg caa atg ttc gtc atg acg aac atgCys Pro Val Thr Leu Pro Trp Ala Gln Met Phe Val Met Thr Asn Met

245 250 255

ctc gtg ctc ttc ggg aac ttc tac ctc aag gcg tac tcg aac aag tcgLeu Val Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Leu Lys Ala Tyr Ser Asn Lys Ser

260 265 270

cgc ggc gac ggc gcg agt tec gtg aaa cca gcc gag acc acg cgc gcgArg Gly Asp Gly Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Glu Thr Thr Arg Ala

275 280 285

ccc age gtg cga cgc acg cga tet cga aaa att gac taaPro Ser Val Arg Arg Thr Arg Ser Arg Lys Ile Asp290 295 300

<210> 110

384

432

480

528

576

624

672

720

768

816

64

903<211> 300 <212> PRT <213> Ostreococcus tauri <400> 110 Met Ser Ala Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Ile Ala Phe Ala Ala Tyr1 5 10 15 Ala Tyr Ala Thr Tyr Ala Tyr Ala Phe Glu Trp Ser His Ala Asn Gly 20 25 30 Ile Asp Asn Val Asp Ala Arg Glu Trp Ile Gly Ala Leu Ser Leu Arg 35 40 45 Leu Pro Ala Ile Ala Thr Thr Met Tyr Leu Leu Phe Cys Leu Val Gly 50 55 60 Pro Arg Leu Met Ala Lys Arg Glu Ala Phe Asp Pro Lys Gly Phe Met65 70 75 80Leu Ala Tyr Asn Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Asn Val Val Val Leu Gly 85 90 95 Met Phe Ala Arg Glu Ile Ser Gly Leu Gly Gln Pro Val Trp Gly Ser 100 105 110 Thr Met Pro Trp Ser Asp Arg Lys Ser Phe Lys Ile Leu Leu Gly Val 115 120 125 Trp Leu His Tyr Asn Asn Lys Tyr Leu Glu Leu Leu Asp Thr Val Phe 130 135 140 Met Val Ala Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr145 150 155 160His His Ala Leu Leu Ile Trp Ala Trp Trp Leu Val Cys His Leu Met 165 170 175 Ala Thr Asn Asp Cys Ile Asp Ala Tyr Phe Gly Ala Ala Cys Asn Ser 180 185 190 Phe Ile His Ile Val Met Tyr Ser Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Leu Gly 195 200 205 Ile Arg Cys Pro Trp Lys Arg Tyr Ile Thr Gln Ala Gln Met Leu Gln 210 215 220 Phe Val Ile Val Phe Ala His Ala Val Phe Val Leu Arg Gln Lys His225 230 235 240Cys Pro Val Thr Leu Pro Trp Ala Gln Met Phe Val Met Thr Asn Met 245 250 255 Leu Val Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Leu Lys Ala Tyr Ser Asn Lys Ser 260 265 270 Arg Gly Asp Gly Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Glu Thr Thr Arg Ala 275 280 285 Pro Ser Val Arg Arg Thr Arg Ser Arg Lys Ile Asp 290 295 300 <210> 111 <211> 834 <212> DNA <213> Pavlova sp <220> <221> CDS <222> (1) · .(834) <4 00> 111 atg atg ttg gcc gea ggc tat Ctt cta gtg etc tcg gcc gct cgc cagMet Met Leu Ala Ala Gly Tyr Leu Leu Val Leu Ser Ala Ala Arg Gln1 5 10 15 age ttc cag cag gac att gac aae CCC aae ggg gcc tac tcg acc tcgSer Phe Gln Gln Asp Ile Asp Asn Pro Asn Gly Ala Tyr Ser Thr Ser 20 25 30 tgg act ggc ctg CCC att gtg atg tet gtg gtc tat CtC age ggt gtgTrp Thr Gly Leu Pro Ile Val Met Ser Val Val Tyr Leu Ser Gly Val 35 40 45 ttt ggg etc aca aag tac ttc gag aae cgg aag CCC atg acg ggg ctgPhe Gly Leu Thr Lys Tyr Phe Glu Asn Arg Lys Pro Met Thr Gly Leu 50 55 60 aag gac tac atg ttc act tac aat etc tac cag gtg ate ate aae gtgLys Asp Tyr Met Phe Thr Tyr Asn Leu Tyr Gln Val Ile Ile Asn Val

65 70 75 80

tgg tgc gtg gtg gcc ttt ctc ctg gag gtg cgg cgt gcg ggc atg tca 288

Trp Cys Val Val Ala Phe Leu Leu Glu Val Arg Arg Ala Gly Met Ser

85 90 95

ctc ate ggc aat aag gtg gac ctt ggg ccc aac tcc ttc agg ctc ggc 336

Leu Ile Gly Asn Lys Val Asp Leu Gly Pro Asn Ser Phe Arg Leu Gly

100 105 HO

ttc gtc acg tgg gtg cac tac aac aac aag tac gtg gag ctc ctc gac 384

Phe Val Thr Trp Val His Tyr Asn Asn Lys Tyr Val Glu Leu Leu Asp

115 120 125

acc cta tgg atg gtg ctg cgc aag aag acg cag cag gtc tcc ttc ctc 432

Thr Leu Trp Met Val Leu Arg Lys Lys Thr Gln Gln Val Ser Phe Leu

130 135 140

cac gtc tat cat cac gtg ctt ctg.atg tgg gcc tgg ttc gtt gtc gtc 480

His Val Tyr His His Val Leu Leu Met Trp Ala Trp Phe Val Val Val145 150 155 160

aag ctc ggc aat ggt ggt gac gea tat ttt ggc ggt ctc atg aac tcg 528

Lys Leu Gly Asn Gly Gly Asp Ala Tyr Phe Gly Gly Leu Met Asn Ser

165 170 175

ate ate cac gtg atg atg tat tcc tac tac acc atg gcg ctc ctg ggc 576

Ile Ile His Val Met Met Tyr Ser Tyr Tyr Thr Met Ala Leu Leu Gly

180 185 190

tgg tca tgc ccc tgg aag cgc tac ctc acg cag gea cag ctc gtg cag 624

Trp Ser Cys Pro Trp Lys Arg Tyr Leu Thr Gln Ala Gln Leu Val Gln

195 200 205

ttt tgc ate tgc ctc gcc cac tcc aca tgg gcg gea gta acg ggt gcc 672

Phe Cys Ile Cys Leu Ala His Ser Thr Trp Ala Ala Val Thr Gly Ala

210 215 220

tac ccg tgg cga att tgc ttg gtg gag gtg tgg gtg atg gtg tcc atg 720

Tyr Pro Trp Arg Ile Cys Leu Val Glu Val Trp Val Met Val Ser Met225 230 235 240

ctg gtg ctc ttc aca cgc ttc tac cgc cag gcc tat gcc aag gag gcgLeu Val Leu Phe Thr Arg Phe Tyr Arg Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Ala

245 250 255

aag gcc aag gag gcg aaa aag ctc gea cag gag gea tca cag gcc aagLys Ala Lys Glu Ala Lys Lys Leu Ala Gln Glu Ala Ser Gln Ala Lys

260 265 270

gcg gtc aag gcg gag taaAla Val Lys Ala Glu

275<210> 112<211> 277<212> PRT<213> Pavlova sp<400> 112

Met Met Leu Ala Ala Gly Tyr Leu Leu Val Leu Ser Ala Ala Arg Gln1 5 10 15

Ser Phe Gln Gln Asp Ile Asp Asn Pro Asn Gly Ala Tyr Ser Thr Ser

20 25 30

Trp Thr Gly Leu Pro Ile Val Met Ser Val Val Tyr Leu Ser Gly Val

35 40 45

Phe Gly Leu Thr Lys Tyr Phe Glu Asn Arg Lys Pro Met Thr Gly Leu

50 55 60

Lys Asp Tyr Met Phe Thr Tyr Asn Leu Tyr Gln Val Ile Ile Asn Val65 70 75 80

Trp Cys Val Val Ala Phe Leu Leu Glu Val Arg Arg Ala Gly Met Ser

85 90 95

Leu Ile Gly Asn Lys Val Asp Leu Gly Pro Asn Ser Phe Arg Leu Gly

100 105 HO

Phe Val Thr Trp Val His Tyr Asn Asn Lys Tyr Val Glu Leu Leu Asp

115 120 125

Thr Leu Trp Met Val Leu Arg Lys Lys Thr Gln Gln Val Ser Phe Leu

768

816

834130His Val145

Lys Leu

Ile Ile

Trp Ser

Phe Cys210Tyr Pro225

Leu Val

Lys Ala

Ala Val

<210><211><212><213><220><221><222><4 00>atg tgcMet Cys1

cgg tacArg Tyr

cac ttcHis Phe

atg cacMet His

50agt ctaSer Leu65

tat gatTyr Asp

gcg caaAla Gln

gtg atgVal Met

gcg gcgAla Ala130gat aagAsp Lys145

aaa atgLys Met

gcg tggAla Trp

135

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Gly Asn Gly Gly Asp Ala Tyr165

His Val Met Met Tyr Ser Tyr180 185

Cys Pro Trp Lys Arg Tyr Leu195 200

Ile Cys Leu Ala His Ser Thr215

Trp Arg Ile Cys Leu Val Glu230

Leu Phe Thr Arg Phe Tyr Arg245

Lys Glu Ala Lys Lys Leu Ala260 265

Lys Ala Glu2751131077DNA

Thalassiosira pseudonana

Trp Ala155Phe Gly170

Tyr Thr

Thr Gln

Trp Ala

Val Trp235Gln Ala250

Gln Glu

140Trp

Gly

Met

Ala

Ala220Val

Tyr

Ala

Phe Val

Leu Met

Ala Leu190Gln Leu205

Val Thr

Met Val

Ala Lys

Ser Gln270

Val

Asn175Leu

Val

Gly

Ser

Glu255Ala

Val160Ser

Gly

Gln

Ala

Met240Ala

Lys

CDS(1) ·113tcaSer

accThr

gcc

Ala

35

tcc

Ser

ccgPro

atgMet

gtgVal

aatAsn115ttgLeu

tatTyr

gacAsp

gcaAla

(1077)

tcaSer

accThr20ttcPhe

tacTyr

tcaSer

aagLys

ctgLeu100agaArg

catHis

ttgLeu

cagGln

tggTrp180

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gccAla

ccaPro

aaaLys

ctaLeu

tca

Ser

85

ctc

Leu

gacAsp

agtSer

gagGlu

gtcVal165tgg

Trp

ccg tca caa tccPro Ser Gln Ser

gcc ctcAla Leu

gcc gccAla Ala

gtc ccaVal Pro

55aag tacLys Tyr70

ctc ctaLeu Leu

ctc ctcLeu Leu

25acc gccThr Ala40

ctc ggtLeu Gly

gtt acgVal Thr

acg gaaThr Glu

aaa acaLys Thr10

ctc accLeu Thr

aca cccThr Pro

ctc accLeu Thr

aatAsn

catHis

ggg

Gly

ttcPhe150tccSer

ggg tgg acgGly Trp Thr105

ccg ttt attPro Phe Ile120age tcg tatSer Ser Tyr135

ttt gat acgPhe Asp Thr

ttc ctc cacPhe Leu His

gacAsp

tca

Ser

90

gtg

Val

aac

Asn

75

atg

Met

tatTyr

ate gcc ctc cgcIle Ala Leu Arg185

gga agtGly Ser

gcg gtgAla Val

tat tttTyr Phe155ate tacIle Tyr170

ttc tccPhe Ser

acaThr

ctcLeu

ggcGly

gtaVal60tacTyr

gtgVal

gcgAla

agaArg

tgg

Trp140atgMet

cacHis

cccPro

tcc ctc cta gcaSer Leu Leu Ala15

aca aca tgg tgcThr Thr Trp Cys30

ctc acc gcc gaaLeu Thr Ala Glu45

ttc tac ctg ctgPhe Tyr Leu Leu

ctt gccLeu Ala

ttg tacLeu Tyr

att gtgIle Val110agt ttgSer Leu125

gtt catVal His

gtg ttgVal Leu

cac acgHis Thr

ggt ggaGly Gly190

aaa aagLys Lys80

aat gtgAsn Val95

gat gcgAsp Ala

gtt gggVal Gly

tat tgtTyr Cys

aggArg

accThr175gacAsp

ggg

Gly160ataIle

attIle

96

144

192

240

288

336

384

432

180

528

576tac ttc ggg gca ctc ctc aac tcc ate ate cac gtc ctc atg tat tccTyr Phe Gly Ala Leu Leu Asn Ser Ile Ile His Val Leu Met Tyr Ser

195 200 205

tac tac gcc ctt gcc cta ctc aag gtc agt tgt cca tgg aaa cga tacTyr Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Lys Val Ser Cys Pro Trp Lys Arg Tyr

210 215 220

ctg act caa gct caa tta ttg caa ttc aca agt gtg gtg gtt tat acgLeu Thr Gln Ala Gln Leu Leu Gln Phe Thr Ser Val Val Val Tyr Thr225 230 235 240

ggg tgt acg ggt tat act cat tac tat cat acg aag cat gga gcg gatGly Cys Thr Gly Tyr Thr His Tyr Tyr His Thr Lys His Gly Ala Asp

245 250 255

gag aca cag cct agt tta gga acg tat tat ttc tgt tgt gga gtg cagGlu Thr Gln Pro Ser Leu Gly Thr Tyr Tyr Phe Cys Cys Gly Val Gln

260 265 270

gtg ttt gag atg gtt agt ttg ttt gta ctc ttt tcc ate ttt tat aaaVal Phe Glu Met Val Ser Leu Phe Val Leu Phe Ser Ile Phe Tyr Lys

275 280 285

cga tcc tat tcg aag aag aac aag tca gga gga aag gat age aag aagArg Ser Tyr Ser Lys Lys Asn Lys Ser Gly Gly Lys Asp Ser Lys Lys

290 295 300

aat gat gat ggg aat aat gag gat caa tgt cac aag gct atg aag gatAsn Asp Asp Gly Asn Asn Glu Asp Gln Cys His Lys Ala Met Lys Asp305 310 315 320

ata tcg gag ggt gcg aag gag gtt gtg ggg cat gca gcg aag gat gct1008

Ile Ser Glu Gly Ala Lys Glu Val Val Gly His Ala Ala Lys Asp Ala

325 330 335

gga aag ttg gtg gct acg gcg agt aag gct gta aag agg aag gga act1056

Gly Lys Leu Val Ala Thr Ala Ser Lys Ala Val Lys Arg Lys Gly Thr

340 345 350

cgt gtt act ggt gcc atg tag1077

Arg Val Thr Gly Ala Met355

<210> 114<211> 358<212> PRT

<213> Thalassiosira pseudonana<400> 114

Met Cys Ser Ser Pro Pro Ser Gln Ser Lys Thr Thr Ser Leu Leu Ala1 5 10 15

Arg Tyr Thr Thr Ala Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Thr Thr Trp Cys

20 25 30

His Phe Ala Phe Pro Ala Ala Thr Ala Thr Pro Gly Leu Thr Ala Glu

35 40 45

Met His Ser Tyr Lys Val Pro Leu Gly Leu Thr Val Phe Tyr Leu Leu

50 55 60

Ser Leu Pro Ser Leu Lys Tyr Val Thr Asp Asn Tyr Leu Ala Lys Lys65 70 75 80

Tyr Asp Met Lys Ser Leu Leu Thr Glu Ser Met Val Leu Tyr Asn Val

85 90 95

Ala Gln Val Leu Leu Asn Gly Trp Thr Val Tyr Ala Ile Val Asp Ala

100 105 HO

Val Met Asn Arg Asp His Pro Phe Ile Gly Ser Arg Ser Leu Val Gly

115 120 125

Ala Ala Leu His Ser Gly Ser Ser Tyr Ala Val Trp Val His Tyr Cys

130 135 140

Asp Lys Tyr Leu Glu Phe Phe Asp Thr Tyr Phe Met Val Leu Arg Gly145 150 155 160

Lys Met Asp Gln Val Ser Phe Leu His Ile Tyr His His Thr Thr Ile165 170 175Ala Trp Ala Trp Trp Ile Ala Leu Arg Phe Ser Pro Gly Gly Asp Ile 180 185 190 Tyr Phe Gly Ala Leu Leu Asn Ser Ile Ile His Val Leu Met Tyr Ser 195 200 205 Tyr Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Lys Val Ser Cys Pro Trp Lys Arg Tyr 210 215 220 Leu Thr Gln Ala Gln Leu Leu Gln Phe Thr Ser Val Val Val Tyr Thr225 230 235 240Gly Cys Thr Gly Tyr Thr His Tyr Tyr His Thr Lys His Gly Ala Asp 245 250 255 Glu Thr Gln Pro 260 Ser Leu Gly Thr Tyr 265 Tyr Phe Cys Cys Gly 270 Val GlnVal Phe Glu 275 Met Val Ser Leu Phe 280 Val Leu Phe Ser Ile 285 Phe Tyr LysArg Ser 290 Tyr Ser Lys Lys Asn 295 Lys Ser Gly Gly Lys 300 Asp Ser Lys LysAsn Asp Asp Gly Asn Asn Glu Asp Gln Cys His Lys Ala Met Lys Asp305 310 315 320Ile Ser Glu Gly Ala Lys Glu Val Val Gly His Ala Ala Lys Asp Ala 325 330 335 Gly Lys Leu Val Ala Thr Ala Ser Lys Ala Val Lys Arg Lys Gly Thr 340 345 350 Arg Val Thr 355 Gly Ala Met <210> 115 <211> 903 <212> DNA <213> Ostreococcus tauri <220> <221> CDS <222> (1) · .(903) <4 00> 115 atg age gcc tcc ggt gcg ctg ctg ccc gcg ate gcg tcc gcc gcg tacMet Ser Ala Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Ile Ala Ser Ala Ala Tyr

48

Tyr

1 5 10 15

gcg tac gcg acg tac gcc tac gcc ttt gag tgg tcg cac gcg aat ggc 96

Ala Tyr Ala Thr Tyr Ala Tyr Ala Phe Glu Trp Ser His Ala Asn Gly

20 25 30

ate gac aac gtc gac gcg cgc gag tgg ate ggt gcg ctg tcg ttg agg 144

Ile Asp Asn Val Asp Ala Arg Glu Trp Ile Gly Ala Leu Ser Leu Arg

35 40 45

ctc ccg gcg ate gcg acg acg atg tac ctg ttg ttc tgc ctg gtc gga 192

Leu Pro Ala Ile Ala Thr Thr Met Tyr Leu Leu Phe Cys Leu Val Gly

50 55 60

ccg agg ttg atg gcg aag cgc gag gcg ttc gac ccg aag ggg ttc atg 240

Pro Arg Leu Met Ala Lys Arg Glu Ala Phe Asp Pro Lys Gly Phe Met65 70 75 80

ctg gcg tac aat gcg tat cag acg gcg ttc aac gtc gtc gtg ctc ggg 288

Leu Ala Tyr Asn Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Asn Val Val Val Leu Gly

85 90 95

atg ttc gcg cga gag ate tcg ggg ctg ggg cag ccc gtg tgg ggg tca 336

Met Phe Ala Arg Glu Ile Ser Gly Leu Gly Gln Pro Val Trp Gly Ser

100 105 HO

acc atg ccg tgg age gat aga aaa tcg ttt aag ate ctc ctc ggg gtg 384

Thr Met Pro Trp Ser Asp Arg Lys Ser Phe Lys Ile Leu Leu Gly Val

115 120 125

tgg ttg cac tac aac aac aaa tat ttg gag cta ttg gac act gtg ttc 432

Trp Leu His Tyr Asn Asn Lys Tyr Leu Glu Leu Leu Asp Thr Val Phe

130 135 140

atg gtt gcg cgc aag aag acg aag cag ttg age ttc ttg cac gtt tat 480

Met Val Ala Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr145 150 155 160

cat cac gcc ctg ttg ate tgg gcg tgg tgg ttg gtg tgt cac ttg atg 528HiS His Ala Leu Leu Ile Trp Ala Trp Trp Leu Val Cys His Leu Met 165 170 175 gcc acg aac gat tgt ate gat gcc tac ttc ggc gcg gcg tgc aac tcgAla Thr Asn Asp Cys Ile Asp Ala Tyr Phe Gly Ala Ala Cys Asn Ser 180 185 190 ttc att cac ate gtg atg tac tcg tat tat ctc atg tcg gcg ctc ggcPhe Ile His Ile Val Met Tyr Ser Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Leu Gly 195 200 205 att cga tgc ccg tgg aag cga tac ate acc cag gct caa atg ctc caaIle Arg Cys Pro Trp Lys Arg Tyr Ile Thr Gln Ala Gln Met Leu Gln 210 215 220 ttc gtc att gtc ttc gcg cac gcc gtg ttc gtg ctg cgt cag aag cacPhe Val Ile Val Phe Ala His Ala Val Phe Val Leu Arg Gln Lys His225 230 235 240tgc ccg gtc acc Ctt CCt tgg gcg caa atg ttc gtc atg acg aac atgCys Pro Val Thr Leu Pro Trp Ala Gln Met Phe Val Met Thr Asn Met 245 250 255 CtC gtg ctc ttc ggg aac ttc tac ctc aag gcg tac tcg aac aag tcgLeu Val Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Leu Lys Ala Tyr Ser Asn Lys Ser 260 265 270 cgc ggc gac ggc gcg agt tcc gtg aaa cca gcc gag acc acg cgc gcgArg Gly Asp Gly Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Glu Thr Thr Arg Ala 275 280 285 CCC age gtg cga cgc acg cga tet cga aaa att gac taa Pro Ser Val Arg Arg Thr Arg Ser Arg Lys Ile Asp 290 295 300 <210> 116 <211> 300 <212> PRT <213> Ostreococcus tauri <400> 116 Met Ser Ala Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Ile Ala Ser Ala Ala Tyr1 5 10 15 Ala Tyr Ala Thr Tyr Ala Tyr Ala Phe Glu Trp Ser His Ala Asn Gly 20 25 30 Ile Asp Asn Val Asp Ala Arg Glu Trp Ile Gly Ala Leu Ser Leu Arg 35 40 45 Leu Pro Ala Ile Ala Thr Thr Met Tyr Leu Leu Phe Cys Leu Val Gly 50 55 60 Pro Arg Leu Met Ala Lys Arg Glu Ala Phe Asp Pro Lys Gly Phe Met65 70 75 80Leu Ala Tyr Asn Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Asn Val Val Val Leu Gly 85 90 95 Met Phe Ala Arg Glu Ile Ser Gly Leu Gly Gln Pro Val Trp Gly Ser 100 105 110 Thr Met Pro Trp Ser Asp Arg Lys Ser Phe Lys Ile Leu Leu Gly Val 115 120 125 Trp Leu His Tyr Asn Asn Lys Tyr Leu Glu Leu Leu Asp Thr Val Phe 130 135 140 Met Val Ala Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr145 150 155 160His His Ala Leu Leu Ile Trp Ala Trp Trp Leu Val Cys His Leu Met 165 170 175 Ala Thr Asn Asp Cys Ile Asp Ala Tyr Phe Gly Ala Ala Cys Asn Ser 180 185 190 Phe Ile His Ile Val Met Tyr Ser Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Leu Gly 195 200 205 Ile Arg Cys Pro Trp Lys Arg Tyr Ile Thr Gln Ala Gln Met Leu Gln 210 215 220 Phe Val Ile Val Phe Ala His Ala Val Phe Val Leu Arg Gln Lys His225 230 235 240Cys Pro Val Thr Leu Pro Trp Ala Gln Met Phe Val Met Thr Asn Met 245 250 255

576

624

672

720

768

816

864

903Leu Val Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Leu Lys Ala Tyr Ser Asn Lys Ser 260 265 270Arg Gly Asp Gly Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Glu Thr Thr Arg Ala 275 280 285Pro Ser Val Arg Arg Thr Arg Ser Arg Lys Ile Asp290 295 300<210> 117 <211> 339 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (3)..(29) <223> xaa na posição 3 a 29 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (30)..(43) <223> xaa na posição 30 a 43 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (45)..(50) <223> xaa na posição 45 a 50 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (53)..(73) <223> xaa na posição 53 a 7 3 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (74)..(79) <223> xaa na posição 74 a 79 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (81)..(82) <223> xaa na posição 81 a 82 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (85)..(86) <223> xaa na posição 85 a 8 6 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (88)..(90) <223> xaa na posição 88 a 90 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (92)..(110) <223> xaa na posição 92 a 110 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (112) .. (127) <223> xaa na posição 112 a 127 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (128)..(128) <223> xaa na posição 128 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (130)..(130) <223> xaa na posição 130 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (133)..(134) <223> xaa na posição 133 a 134 é qualquer aminoácido<220><221> Variante

<222> (137)..(137)

<223> xaa na posição 137 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (139)..(140)

<223> xaa na posição 139 a 140 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (143)..(144)

<223> xaa na posição 143 a 144 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (147)..(147)

<223> xaa na posição 147 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (149)..(149)

<223> xaa na posição 14 9 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (151).. (152)

<223> xaa na posição 151 a 152 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (154)..(154)

<223> xaa na posição 154 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (159)..(159)

<223> xaa na posição 159 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (163)..(166)

<223> xaa na posição 163 a 166 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (170)..(179)

<223> xaa na posição 170 a 179 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (180)..(182)

<223> xaa na posição 180 a 182 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (184)..(184)

<223> xaa na posição 184 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (188)..(190)

<223> xaa na posição 188 a 190 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (193)..(193)

<223> xaa na posição 193 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (196)..(197)

<223> xaa na posição 196 a 197 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (203)..(206)

<223> xaa na posição 203 a 206 é qualquer aminoácido<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Leu Leu1

xaa xaa

xaa xaa

xaa xaa50

xaa xaa65

xaa xaaxaa xaa

Variante(208)..(210)xaa na posição 208 a

Variante

(217)..(217)

xaa na posição 217 é

Variante(222)..(223)xaa na posição 222 a

Variante(226)..(252)xaa na posição 226 a

Variante

(253)..(267)

xaa na posição 253 a

Variante

(269)..(272)

xaa na posição 269 a

Variante

(276) .. (277)

xaa na posição 276 a

Variante(280)..(282)xaa na posição 280 a

Variante(284)..(291)xaa na posição 284 a

Variante(292)..(324)xaa na posição 292 a

Variante(326)..(337)xaa na posição 326 a

Variante(338)..(338)xaa na posição 338 é117

xaa xaa xaa xaa xaa5

xaa xaa xaa xaa xaa20

xaa xaa xaa xaa xaa35

Tyr Leu xaa xaa xaa55

xaa xaa xaa xaa xaa70

Tyr Asn xaa xaa Gln85

xaa xaa xaa xaa xaa100

210 é qualquer aminoácido

qualquer aminoácido

223 é qualquer aminoácido

252 é qualquer aminoácido

2 67 é qualquer um ou nenhum aminoácido

272 é qualquer aminoácido

277 é qualquer aminoácido

282 é qualquer aminoácido

291 é qualquer aminoácido

324 é qualquer um ou nenhum aminoácido

337 é qualquer aminoácido

qualquer um ou nenhum aminoácido

xaa xaa xaa xaa10

xaa xaa xaa xaa25

xaa xaa xaa xaa40

xaa xaa xaa xaa

xaa xaa xaa xaa75

xaa xaa xaa Asn90

xaa xaa xaa xaa105

xaa xaa xaa xaa xaa15

xaa xaa xaa xaa xaa30

Pro xaa xaa xaa xaa45

xaa xaa xaa xaa xaa60

xaa xaa xaa xaa Met80

xaa xaa xaa xaa xaa95

xaa xaa xaa Gly xaa110xaa xaa

Trp xaa130Met Val145

His His

xaa xaa

xaa Ile

xaa xaa210Phe xaa225

xaa xaa

xaa xaa

Val Leu

xaa xaa290xaa xaa305

xaa xaa

xaa xaa

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220>

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

115 120 125

His Tyr xaa xaa Lys Tyr xaa Glu xaa xaa Asp Thr xaa xaa

135 140

xaa Arg xaa Lys xaa xaa Gln xaa Ser Phe Leu His xaa Tyr150 155 160

xaa xaa xaa xaa Trp Ala Trp xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

165 170 175

xaa xaa xaa xaa Asp xaa Tyr Phe Gly xaa xaa xaa Asn Ser

180 185 190

His xaa xaa Met Tyr Ser Tyr Tyr xaa xaa xaa xaa Leu xaa195 200 205

Cys Pro Trp Lys Arg Tyr xaa Thr Gln Ala Gln xaa xaa Gln

215 220

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa230 235 240

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

245 250 255

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Met xaa xaa xaa xaa

260 265 270

Phe xaa xaa Phe Tyr xaa xaa xaa Tyr xaa xaa xaa xaa xaa275 280 285

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

295 300

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa310 315 320

xaa xaa Ala xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa325 330 335

Val

118

45

PRT

Seqüência artificial

Variante

(4) .. (4)

xaa na posição 4 é Ala ou Gly

Variante

(5) . . (5)

xaa na posição 5 é Ala ou Leu

Variante(6)..(6)

xaa na posição 6 é qualquer aminoácido

Variante(9) .. (9)

xaa na posição 9 é Phe ou Ile

Variante(12).. (12)

xaa na posição 12 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(14)..(14)

xaa na posição 14 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(20)..(20)

xaa na posição 20 é qualquer aminoácido<221> Variante <222> (21).. (21) <223> xaa na posição 21 é Leu ou Met<220> <221> Variante <222> (22) . . (22) <223> xaa na posição 22 é Ala ou Ser<220> <221> Variante <222> (23)..(23) <223> xaa na posição 23 é Ala ou Leu<220> <221> Variante <222> (25)..(26) <223> xaa na posição 25 a 26. é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (27) . . (27) <223> xaa na posição 27 é Arg ou Ser<220> <221> Variante <222> (34)..(34) <223> xaa na posição 34 é Ile ou Leu<220> <221> Variante <222> (39)..(39) <223> xaa na posição 39 é Leu ou Met<220> <221> Variante <222> (40)..(40) <223> xaa na posição 40 é Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (43)..(43) <223> xaa na posição 43 é Cys, Thr ou Val<220> <221> Variante <222> (44)..(44) <223> xaa na posição 44 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (45)..(45) <223> xaa na posição 45 é Cys ou Val<400> 118

Tyr Phe Gly xaa xaa xaa Asn Ser xaa Ile His xaa Val xaa

1 5 10 15

Ser Tyr Tyr xaa xaa xaa xaa Leu xaa xaa xaa Cys Pro Trp Lys Arg

20 25 30

Tyr xaa Thr Gln Ala Gln xaa xaa Gln Phe xaa xaa xaa35 40 45

<210> 119<211> 43<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante<222> (2) . . (2)

<223> xaa na posição 2 é Leu ou Val<220>

<221> Variante<222> (5) . . (5)

<223> xaa na posição 5 é Cys ou Asn<220><221> Variante <222> (6)..(6) <223> xaa na posição 6 é Asp ou Asn <220> <221> Variante <222> (9)..(10) <223> xaa na posição 9 a 10 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (12)..(12) <223> xaa na posição 12 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (13)..(14) <223> xaa na posição 13 a 14 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (18)..(18) <223> xaa na posição 18 é Phe ou Trp<220> <221> Variante <222> (21)..(21) <223> xaa na posição 21 é Ala ou Leu<220> <221> Variante <222> (23)..(23) <223> xaa na posição 23 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (25)..(26) <223> xaa na posição 25 a 26 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (28)..(28) <223> xaa na posição 28 é Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (33)..(33) <223> xaa na posição 33 é Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (37) .. (37) <223> xaa na posição 37 é Ala, Thr ou Val<220> <221> Variante <222> (38)..(38) <223> xaa na posição 38 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (39)..(39) <223> xaa na posição 39 é Ile ou Leu<220> <221> Variante <222> (40) .. (40) <223> xaa na posição 40 é qualquer aminoácido<400> 119

Trp xaa His Tyr xaa xaa Lys Tyr xaa xaa Leu xaa xaa xaa Asp Thr

1 5 10 15

xaa xaa Met Val xaa Arg xaa Lys xaa xaa Gln xaa Ser Phe Leu His20 25 30

xaa Tyr His His xaa xaa xaa xaa Trp Ala Trp35 40

<210> 120 <211> 37 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (2)..(3) <223> xaa na posição 2 a 3 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (5) . . (5) <223> xaa na posição 5 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (9) .. (9) <223> xaa na posição 9 é Gly, Ser ou Thr<220> <221> Variante <222> (10)..(10) <223> xaa na posição 10 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (13)..(14) <223> xaa na posição 13 a 14 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (15)..(15) <223> xaa na posição 15 é Ala ou Ser<220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é Ala ou Ser<220> <221> Variante <222> (18)..(18) <223> xaa na posição 18 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (19)..(19) <223> xaa na posição 19 é Glu ou Lys<220> <221> Variante <222> (20)..(20) <223> xaa na posição 20 é Ala, Asn ou Ser<220> <221> Variante <222> (21)..(21) <223> xaa na posição 21 é Lys ou Arg<220> <221> Variante <222> (22)..(22) <223> xaa na posição 22 é Ala, Gly ou Ser<220> <221> Variante <222> (23)..(23) <223> xaa na posição 23 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (24)..(24) <223> xaa na posição 24 é Glu ou Gly<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Met xaa1

xaa xaa

xaa xaa

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

Variante(25)..(29)

xaa na posição 25 a 29 é qualquer aminoácido

Variante

(30)..(30)

xaa na posição 30 é Asn, Pro ou Gln

Variante

(31)..(32)

xaa na posição 31 a 32 é Ala, Asp ou Glu

Variante

(33)..(33)

xaa na posição 33 é Gly, Ser ou Thr

Variante

(34)..(34)

xaa na posição 34 é Asn, Gln ou Thr

Variante

(35)..(36)

xaa na posição 35 a 36 é qualquer aminoácido

Variante(37)..(37)

xaa na posição 37 é Ala, Asp ou Pro120

xaa Leu xaa Val Leu Phe xaa xaa Phe Tyr xaa xaa xaa Tyr

5 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xqffe xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

20 25 30

xaa xaa xaa

3512119PRT

Seqüência artificial

Variante(2) . . (3)

xaa na posição 2 a 3 é qualquer aminoácido

Variante(4)..(7)

xaa na posição 4 a 7 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante

(9) .. (9)

xaa na posição 9 é Phe, Leu ou Val

Variante

(10)..(10)

xaa na posição 10 é qualquer aminoácido

Variante

(13)..(13)

xaa na posição 13 é Ala, Leu ou Val

Variante

(14)..(14)

xaa na posição 14 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (16)..(16)

<223> xaa na posição 16 é Thr ou Val<220>

<221> Variante

<222> (17) . . (17)

<223> xaa na posição 17 é Ala, Ile ou Leu<220>

<221> Variante

<222> (18)..(18)

<223> xaa na posição 18 é Phe, Ile ou Leu

<400> 121 Lys xaa xaa xaa xaa xaa xaa Met xaa xaa Tyr Asn xaa xaa Gln xaa- 1 5 10 15 xaa xaa Asn <210> 122 <211> 879 <212> DNA <213> Ostreococcus tauri <220> <221> CDS <222> (1) · .(879) <400> 122 atg tct gga ttg agg gct cct aac ttc ttg cat agg ttc tgg acc aagMet Ser Gly Leu Arg Ala Pro Asn Phe Leu His Arg Phe Trp Thr Lys1 5 10 15 tgg gat tac gct ate tct aag gtg gtg ttc act tgc gct gat tct ttcTrp Asp Tyr Ala Ile Ser Lys Val Val Phe Thr Cys Ala Asp Ser Phe 20 25 30 cag tgg gat ate gga CCt gtt tct tct tct acc gct cat ttg cct gctGln Trp Asp Ile Gly Pro Val Ser Ser Ser Thr Ala His Leu Pro Ala 35 40 45 att gag tct cct act cct ttg gtg acc tct ttg ctc ttc tac ttg gtgIle Glu Ser Pro Thr Pro Leu Val Thr Ser Leu Leu Phe Tyr Leu Val50 55 60 act gtg ttc ttg tgg tac gga aga ttg acc aga tcc . tcc gat aag aagThr Val Phe Leu Trp Tyr Gly Arg Leu Thr Arg Ser Ser Asp Lys Lys65 70 75 80ate aga gag CCt acc tgg ttg agg aga ttc ate ate tgc cac aac gctIle Arg Glu Pro Thr Trp Leu Arg Arg Phe Ile Ile Cys His Asn Ala 85 90 95 ttc ttg att gtg ctc tcc ttg tac atg tgt ttg gga tgc gtt gct caaPhe Leu Ile Val Leu Ser Leu Tyr Met Cys Leu Gly Cys Val Ala Gln 100 105 110 gct tac caa aac gga tac acc ttg tgg gga aac gag ttc aag gct actAla Tyr Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Trp Gly Asn Glu Phe Lys Ala Thr 115 120 125 gag acc caa ttg gct ctc tac ate tac ate ttc tac gtg tcc aag ateGlu Thr Gln Leu Ala Leu Tyr Ile Tyr Ile Phe Tyr Val Ser Lys Ile130 135 140 tac gag ttc gtg gat acc tac ate atg ctc ctc aag aac aac ctc aggTyr Glu Phe Val Asp Thr Tyr Ile Met Leu Leu Lys Asn Asn Leu Arg145 150 155 160caa gtg tct ttc ttg cac ate tac cac cac tct acc ate tct ttc ateGln Val Ser Phe Leu His Ile Tyr His His Ser Thr Ile Ser Phe Ile 165 170 175 tgg tgg ate ate gct aga aga gea cct gga gga gat gct tat ttc tccTrp Trp Ile Ile Ala Arg Arg Ala Pro Gly Gly Asp Ala Tyr Phe Ser 180 185 190 gct gct ctc aac tct tgg gtt cat gtg tgc atg tac act tac tac ctcAla Ala Leu Asn Ser Trp Val His Val Cys Met Tyr Thr Tyr Tyr Leu

96

14'

192

240

288

336

384

132

480

528

576

62*174 195 200 205 CtC tct acc ttg att gga aag gaa gat CCt aag agg tct aac tac ctcLeu Ser Thr Leu Ile Gly Lys Glu Asp Pro Lys Arg Ser Asn Tyr Leu 210 215 220 tgg tgg gga agg cat ttg acc caa atg caa atg ctc cag ttc ttc ttcTrp Trp Gly Arg His Leu Thr Gln Met Gln Met Leu Gln Phe Phe Phe225 230 235 240aac gtg ctc caa gct Ctt tat tgc gct tcc ttc tcc act tac cct aagAsn Val Leu Gln Ala Leu Tyr Cys Ala Ser Phe Ser Thr Tyr Pro Lys 245 250 255 ttc ctc tcc aag ate ttg ctc gtg tac atg atg tct ttg ctc gga CttPhe Leu Ser Lys Ile Leu Leu Val Tyr Met Met Ser Leu Leu Gly Leu 260 265 270 ttc gga cac ttc tac tac tct aag cac ate gct gct gct aag ttg caaPhe Gly His Phe Tyr Tyr Ser Lys His Ile Ala Ala Ala Lys Leu Gln 275 280 285 aag aag cag cag tga Lys Lys Gln Gln 290 <210> 123 <211> 292 <212> PRT <213> Ostreococcus tauri <400> 123 Met Ser Gly Leu Arg Ala Pro Asn Phe Leu His Arg Phe Trp Thr Lys1 5 10 15 Trp Asp Tyr Ala Ile Ser Lys Val Val Phe Thr Cys Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Gln Trp Asp Ile Gly Pro Val Ser Ser Ser Thr Ala His Leu Pro Ala 35 40 45 Ile Glu Ser Pro Thr Pro Leu Val Thr Ser Leu Leu Phe Tyr Leu Val 50 55 60 Thr Val Phe Leu Trp Tyr Gly Arg Leu Thr Arg Ser Ser Asp Lys Lys65 70 75 80Ile Arg Glu Pro Thr Trp Leu Arg Arg Phe Ile Ile Cys His Asn Ala 85 90 95 Phe Leu Ile Val Leu Ser Leu Tyr Met Cys Leu Gly Cys Val Ala Gln 100 105 110 Ala Tyr Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Trp Gly Asn Glu Phe Lys Ala Thr 115 120 125 Glu Thr Gln Leu Ala Leu Tyr Ile Tyr Ile Phe Tyr Val Ser Lys Ile 130 135 140 Tyr Glu Phe Val Asp Thr Tyr Ile Met Leu Leu Lys Asn Asn Leu Arg145 150 155 160Gln Val Ser Phe Leu His Ile Tyr His His Ser Thr Ile Ser Phe Ile 165 170 175 Trp Trp Ile Ile Ala Arg Arg Ala Pro Gly Gly Asp Ala Tyr Phe Ser 180 185 190 Ala Ala Leu Asn Ser Trp Val His Val Cys Met Tyr Thr Tyr Tyr Leu 195 200 205 Leu Ser Thr Leu Ile Gly Lys Glu Asp Pro Lys Arg Ser Asn Tyr Leu 210 215 220 Trp Trp Gly Arg His Leu Thr Gln Met Gln Met Leu Gln Phe Phe Phe225 230 235 240Asn Val Leu Gln Ala Leu Tyr Cys Ala Ser Phe Ser Thr Tyr Pro Lys 245 250 255 Phe Leu Ser Lys Ile Leu Leu Val Tyr Met Met Ser Leu Leu Gly Leu 260 265 270 Phe Gly His Phe Tyr Tyr Ser Lys His Ile Ala Ala Ala Lys Leu Gln 275 280 285

Lys Lys Gln Gln

290<210> 124<211> 1047<212> DNA

<213> Marchantia polymorpha<220>

<221> CDS<222> (1)..(1047)<400> 124

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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144

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384

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576

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672

720

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816

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<210> 125<211> 348<212> PRT

<213> Marchantia polymorpha<400> 125

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

Ser Asn Ala Ser Gln Pro Lys Thr Val Lys Val Glu340 345

<210> 126<211> 83148

96

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240

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336

384

432

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<221> CDS<222> (1)..(831)<400> 126

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528

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20 25 30

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

Lys Lys Trp Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ala Ser145 150 155 160

Ile Ser Phe Ile Trp Gly Ile Ile Ala Arg Phe Ala Pro Gly Gly Asp

165 170 175

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180 185 · 190

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195 200 205

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245 250 255

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260 265 270

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275<210> 128<211> 1146<212> DNA

<213> Leishmania major<220>

<221> CDS<222> (1)..(1146)<400> 128

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20 25 30

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50 55 60

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ata ctg gcc tac etc tcc ttg att gtc acc ttg cgc ctg ttg cat cgtIle Leu Ala Tyr Leu Ser Leu Ile Val Thr Leu Arg Leu Leu His Arg

48

96

144

192

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tac ttt ctc acgTyr Phe Leu Thr225

age aag ttc aagSer Lys Phe Lys

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aag tcc acg gag1104

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ctg ctc ttc ccaLeu Leu Phe Pro230

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cag tcc gcg tacGln Ser Ala Tyr

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130 135 140

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165 170 175

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20 25 30

Gln Trp Asp Ile Gly Pro Val Ser Ser Ser Thr Ala His Leu Pro Ala

35 40 45

Ile Glu Ser Pro Thr Pro Leu Val Thr Ser Leu Leu Phe Tyr Leu Val50 55 60

Thr Val Phe Leu Trp Tyr Gly Arg Leu Thr Arg Ser Ser Asp Lys Lys65 70 75 80

Ile Arg Glu Pro Thr Trp Leu Arg Arg Phe Ile Ile Cys His Asn Ala

85 90 95

Phe Leu Ile Val Leu Ser Leu Tyr Met Cys Leu Gly Cys Val Ala Gln

100 105 HO

Ala Tyr Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Trp Gly Asn Glu Phe Lys Ala Thr

115 120 125

Glu Thr Gln Leu Ala Leu Tyr Ile Tyr Ile Phe Tyr Val Ser Lys Ile

130 135 140

Tyr Glu Phe Val Asp Thr Tyr Ile Met Leu Leu Lys Asn Asn Leu Arg145 150 155 160

Gln Val Ser Phe Leu His Ile Tyr His His Ser Thr Ile Ser Phe Ile

165 170 175

Trp Trp Ile Ile Ala Arg Arg Ala Pro Gly Gly Asp Ala Tyr Phe Ser

180 185 190

Ala Ala Leu Asn Ser Trp Val His Val Cys Met Tyr Thr Tyr Tyr Leu

195 200 205

Leu Ser Thr Leu Ile Gly Lys Glu Asp Pro Lys Arg Ser Asn Tyr Leu

210 215 220

Trp Trp Gly Arg His Leu Thr Gln Met Gln Met Leu Gln Phe Phe Phe225 230 235 240

Asn Val Leu Gln Ala Leu Tyr Cys Ala Ser Phe Ser Thr Tyr Pro Lys

245 250 255

Phe Leu Ser Lys Ile Leu Leu Val Tyr Met Met Ser Leu Leu Gly Leu

260 265 270

Phe Gly His Phe Tyr Tyr Ser Lys His Ile Ala Ala Ala Lys Leu Gln

275 280 285

Lys Lys Gln Gln

290

<210> 132<211> 873<212> DNA

<213> Marchantia polymorpha<220>

<221> CDS<222> (1)..(873)<400> 132

atg gag gcg tac gag atg gtg gat agt ttt gtg tcg aag acg gtt ttcMet Glu Ala Tyr Glu Met Val Asp Ser Phe Val Ser Lys Thr Val Phe1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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Gly Leu Ser Ser Tyr Leu Thr Phe Val Phe Leu Gly Leu Ile Val Ile

50 55 60

aag age ctg gat ctt aag ccc cgc tcc aag gag ccc gcc att ttg aac 240

Lys Ser Leu Asp Leu Lys Pro Arg Ser Lys Glu Pro Ala Ile Leu Asn65 70 75 80

ctg ttt gtg ate ttc cac aac ttc gtc tgc ttc gea ctc agt ctg tacLeu Phe Val Ile Phe His Asn Phe Val Cys Phe Ala Leu Ser Leu Tyr

85 90 95

atg tgc gtg gga att gtc cgt caa gct ate ctc aac agg tac tct ctg 336

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100 105 HO

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48

96

144

288

384624

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Tyr Ile Phe Tyr Met Ser Lys Tyr Ile Glu Phe Met Asp Thr Val Ile

130 135 140

atg att ttg aag cgc aac acg cgc cag ate act gtg ttg cat gtg tac 480

Met Ile Leu Lys Arg Asn Thr Arg Gln Ile Thr Val Leu His Val Tyr145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

gtg ctc atg tac ctc tac tac ctt ttg gea gea act ctg gga aag aacVal Leu Met Tyr Leu Tyr Tyr Leu Leu Ala Ala Thr Leu Gly Lys Asn195 200 205

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Glu Lys Ala Arg Arg Lys Tyr Leu Trp Trp Gly Lys Tyr Leu Thr Gln

210 215 220

ctg cag atg ttc cag ttt gtc ctt aac atg att cag gct tac tac gat 720

Leu Gln Met Phe Gln Phe Val Leu Asn Met Ile Gln Ala Tyr Tyr Asp225 230 235 240

att aag aac aac tcg cct tac cca caa ttt ttg ate cag att ttg ttc 768

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245 250 255

tac tac atg ate tcg ctt tta gcg cta ttt gga aac ttt tac gtt cac 816

Tyr Tyr Met Ile Ser Leu Leu Ala Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Val His

260 265 270

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275 280 285

gea gaa taaAla Glu290

<210> 133<211> 290<212> PRT

<213> Marchantia polymorpha<400> 133

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20 25 30

Ile Thr Lys Gly Leu Pro Cys Val Asp Ser Pro Thr Pro Ile Val Leu

35 40 45

Gly Leu Ser Ser Tyr Leu Thr Phe Val Phe Leu Gly Leu Ile Val Ile

50 55 60

Lys Ser Leu Asp Leu Lys Pro Arg Ser Lys Glu Pro Ala Ile Leu Asn65 70 75 80

Leu Phe Val Ile Phe His Asn Phe Val Cys Phe Ala Leu Ser Leu Tyr

85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

Tyr Ile Phe Tyr Met Ser Lys Tyr Ile Glu Phe Met Asp Thr Val Ile

130 135 140

Met Ile Leu Lys Arg Asn Thr Arg Gln Ile Thr Val Leu His Val Tyr145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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Glu Lys Ala Arg Arg Lys Tyr Leu Trp Trp Gly Lys Tyr Leu Thr Gln

210 215 220

Leu Gln Met Phe Gln Phe Val Leu Asn Met Ile Gln Ala Tyr Tyr Asp225 230 235 240

Ile Lys Asn Asn Ser Pro Tyr Pro Gln Phe Leu Ile Gln Ile Leu Phe

245 250 255

Tyr Tyr Met Ile Ser Leu Leu Ala Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Val His

260 265 270

Lys Tyr Val Ser Ala Pro Ala Lys Pro Ala Lys Ile Lys Ser Lys Lys275 280 285

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<213> Physcomitrella patens<220>

<221> CDS<222> (1).-(873)<400> 134

atg gag gtc gtg gag aga ttc tac ggt gag ttg gat ggg aag gtc tcgMet Glu Val Val Glu Arg Phe Tyr Gly Glu Leu Asp Gly Lys Val Ser1 5 10 15

cag ggc gtg aat gca ttg ctg ggt agt ttt ggg gtg gag ttg acg gatGln Gly Val Asn Ala Leu Leu Gly Ser Phe Gly Val Glu Leu Thr Asp

20 25 30

acg ccc act acc aaa ggc ttg ccc ctc gtt gac agt ccc aca ccc ateThr Pro Thr Thr Lys Gly Leu Pro Leu Val Asp Ser Pro Thr Pro Ile

35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 HO

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115 120 125

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130 135 140

gtt ate atg ata ctg aag cgc age acc agg caa ata age ttc ctc cacVal Ile Met Ile Leu Lys Arg Ser Thr Arg Gln Ile Ser Phe Leu His145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

agt age cca aag tta aaa aat aag tac ctt ttt tgg ggc agg tac ttgSer Ser Pro Lys Leu Lys Asn Lys Tyr Leu Phe Trp Gly Arg Tyr Leu210 215 220

96144192240288336384432480528576624672aca caa ttc caa atg ttc cag ttt atg ctg aac tta gtg cag gct tacThr Gln Phe Gln Met Phe Gln Phe Met Leu Asn Leu Val Gln Ala Tyr225 230 235 240

tac gac atg aaa acg aat gcg cca tat cca caa tgg ctg ate aag attTyr Asp Met Lys Thr Asn Ala Pro Tyr Pro Gln Trp Leu Ile Lys Ile

245 250 255

ttg ttc tac tac atg ate tcg ttg ctg ttt ctt ttc ggc aat ttt tacLeu Phe Tyr Tyr Met Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Asn Phe Tyr

260 265 270

gta caa aaa tac ate aaa ccc tet gac gga aag caa aag gga gct aaaVal Gln Lys Tyr Ile Lys Pro Ser Asp Gly Lys Gln Lys Gly Ala Lys

275 280 285

act gag tgaThr Glu290<210> 135<211> 290<212> PRT

<213> Physcomitrella patens<400> 135

Met Glu Val Val Glu Arg Phe Tyr Gly Glu Leu Asp Gly Lys Val Ser1 5 10 15

Gln Gly Val Asn Ala Leu Leu Gly Ser Phe Gly Val Glu Leu Thr Asp

20 25 30

Thr Pro Thr Thr Lys Gly Leu Pro Leu Val Asp Ser Pro Thr Pro Ile

35 40 45

Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Leu Thr Ile Val Ile Gly Gly Leu Leu

50 55 60

Trp Ile Lys Ala Arg Asp Leu Lys Pro Arg Ala Ser Glu Pro Phe Leu65 70 75 80

Leu Gln Ala Leu Val Leu Val His Asn Leu Phe Cys Phe Ala Leu Ser

85 90 95

Leu Tyr Met Cys Val Gly Ile Ala Tyr Gln Ala Ile Thr Trp Arg Tyr

100 105 HO

Ser Leu Trp Gly Asn Ala Tyr Asn Pro Lys His Lys Glu Met Ala Ile

115 120 125

Leu Val Tyr Leu Phe Tyr Met Ser Lys Tyr Val Glu Phe Met Asp Thr

130 135 140

Val Ile Met Ile Leu Lys Arg Ser Thr Arg Gln Ile Ser Phe Leu His145 150 155 160

Val Tyr His His Ser Ser Ile Ser Leu Ile Trp Trp Ala Ile Ala His

165 170 175

His Ala Pro Gly Gly Glu Ala Tyr Trp Ser Ala Ala Leu Asn Ser Gly

180 185 190

Val His Val Leu Met Tyr Ala Tyr Tyr Phe Leu Ala Ala Cys Leu Arg

195 200 205

Ser Ser Pro Lys Leu Lys Asn Lys Tyr Leu Phe Trp Gly Arg Tyr Leu

210 215 220

Thr Gln Phe Gln Met Phe Gln Phe Met Leu Asn Leu Val Gln Ala Tyr225 230 235 240

Tyr Asp Met Lys Thr Asn Ala Pro Tyr Pro Gln Trp Leu Ile Lys Ile

245 250 255

Leu Phe Tyr Tyr Met Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Asn Phe Tyr

260 265 270

Val Gln Lys Tyr Ile Lys Pro Ser Asp Gly Lys Gln Lys Gly Ala Lys275 280 285

Thr Glu290<210> 136<211> 957<212> DNA

<213> Mortierella alpina<220>

720

768

816

864

873<221> CDS <222> (1) · .(957) <400> 136 atg gag tcg att gcg cca ttc ctc cca tca aag atg ccg caa gat ctgMet Glu Ser Ile Ala Pro Phe Leu Pro Ser Lys Met Pro Gln Asp Leu1 5 10 15 ttt atg gac Ctt gcc acc gct ate ggt gtc cgg gcc gcg CCC tat gtcPhe Met Asp Leu Ala Thr Ala Ile Gly Val Arg Ala Ala Pro Tyr Val 20 25 30 gat CCt ctc gag gcc gcg ctg gtg gcc cag gcc gag aag tac ate CCCAsp Pro Leu Glu Ala Ala Leu Val Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ile Pro 35 40 45 acg att gtc cat cac acg cgt ggg ttc ctg gtc gcg gtg gag tcg cctThr Ile Val His His Thr Arg Gly Phe Leu Val Ala Val Glu Ser Pro- 50 - - —. 5-5 .6.0-. — - ttg gcc cgt gag ctg ccg ttg atg aac ccg ttc cac gtg ctg ttg ateLeu Ala Arg Glu Leu Pro Leu Met Asn Pro Phe His Val Leu Leu Ile65 70 75 80gtg CtC gct tat ttg gtc acg gtc ttt gtg ggc. atg cag ate atg aagVal Leu Ala Tyr Leu Val Thr Val Phe Val Gly Met Gln Ile Met Lys 85 90 95 aac ttt gag cgg ttc gag gtc aag acg ttt tcg ctc ctg cac aac tttAsn Phe Glu Arg Phe Glu Val Lys Thr Phe Ser Leu Leu His Asn Phe 100 105 110 tgt ctg gtc tcg ate age gcc tac atg tgc ggt ggg ate ctg tac gagCys Leu Val Ser Ile Ser Ala Tyr Met Cys Gly Gly Ile Leu Tyr Glu 115 120 125 gct tat cag gcc aac tat gga ctg ttt gag aac gct gct gat cat accAla Tyr Gln Ala Asn Tyr Gly Leu Phe Glu Asn Ala Ala Asp His Thr 130 135 140 ttc aag ggt Ctt cct atg gcc aag atg ate tgg ctc ttc tac ttc tccPhe Lys Gly Leu Pro Met Ala Lys Met Ile Trp Leu Phe Tyr Phe Ser145 150 155 160aag ate atg gag ttt gtc gac acc atg ate atg gtc ctc aag aag aacLys Ile Met Glu Phe Val Asp Thr Met Ile Met Val Leu Lys Lys Asn 165 170 175 aac cgc cag ate tcc ttc ttg cac gtt tac cac cac age tcc ate ttcAsn Arg Gln Ile Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ser Ser Ile Phe 180 185 190 acc ate tgg tgg ttg gtc acc ttt gtt gea CCC aac ggt gaa gcc tacThr Ile Trp Trp Leu Val Thr Phe Val Ala Pro Asn Gly Glu Ala Tyr 195 200 205 ttc tct gct gcg ttg aac tcg ttc ate cat gtg ate atg tac ggc tacPhe Ser Ala Ala Leu Asn Ser Phe Ile His Val Ile Met Tyr Gly Tyr 210 215 220 tac ttc ttg tcg gcc ttg ggc ttc aag cag gtg tcg ttc ate aag ttcTyr Phe Leu Ser Ala Leu Gly Phe Lys Gln Val Ser Phe Ile Lys Phe225 230 235 240tac ate acg cgc tcg cag atg aca cag ttc tgc atg atg tcg gtc cagTyr Ile Thr Arg Ser Gln Met Thr Gln Phe Cys Met Met Ser Val Gln 245 250 255 tct tcc tgg gac atg tac gcc atg aag gtc Ctt ggc cgc CCC gga tacSer Ser Trp Asp Met Tyr Ala Met Lys Val Leu Gly Arg Pro Gly Tyr 260 265 270 CCC ttc ttc ate acg gct ctg Ctt tgg ttc tac atg tgg acc atg ctcPro Phe Phe Ile Thr Ala Leu Leu Trp Phe Tyr Met Trp Thr Met Leu 275 280 285 ggt ctc ttc tac aac ttt tac aga aag aac gcc aag ttg gcc aag cagGly Leu Phe Tyr Asn Phe Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Leu Ala Lys Gln 290 295 300 gcc aag gcc gac gct gcc aag gag aag gea agg aag ttg cag taa Ala Lys Ala Asp Ala Ala Lys Glu Lys Ala Arg Lys Leu Gln 305 310 315

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

S16

ϊ 64

912

957<210> 137<211> 318<212> PRT

<213> Mortierella alpina<400> 137

Met Glu Ser Ile Ala Pro Phe Leu Pro Ser Lys Met Pro Gln Asp Leu1 5 10 15

Phe Met Asp Leu Ala Thr Ala Ile Gly Val Arg Ala Ala Pro Tyr Val

20 25 30

Asp Pro Leu Glu Ala Ala Leu Val Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ile Pro

35 40 45

Thr Ile Val His His Thr Arg Gly Phe Leu Val Ala Val Glu Ser Pro

50 55 60

Leu Ala Arg Glu Leu Pro Leu Met Asn Pro Phe His Val Leu Leu Ile65 70 75 80

Val Leu Ala Tyr Leu Val Thr Val Phe Val Gly Met Gln Ile Met Lys

85 90 95

Asn Phe Glu Arg Phe Glu Val Lys Thr Phe Ser Leu Leu His Asn Phe

100 105 HO

Cys Leu Val Ser Ile Ser Ala Tyr Met Cys Gly Gly Ile Leu Tyr Glu

115 120 125

Ala Tyr Gln Ala Asn Tyr Gly Leu Phe Glu Asn Ala Ala Asp His Thr

130 135 140

Phe Lys Gly Leu Pro Met Ala Lys Met Ile Trp Leu Phe Tyr Phe Ser145 150 155 160

Lys Ile Met Glu Phe Val Asp Thr Met Ile Met Val Leu Lys Lys Asn

165 170 175

Asn Arg Gln Ile Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ser Ser Ile Phe

180 185 190

Thr Ile Trp Trp Leu Val Thr Phe Val Ala Pro Asn Gly Glu Ala Tyr

195 200 205

Phe Ser Ala Ala Leu Asn Ser Phe Ile His Val Ile Met Tyr Gly Tyr

210 215 220

Tyr Phe Leu Ser Ala Leu Gly Phe Lys Gln Val Ser Phe Ile Lys Phe225 230 235 240

Tyr Ile Thr Arg Ser Gln Met Thr Gln Phe Cys Met Met Ser Val Gln

245 250 255

Ser Ser Trp Asp Met Tyr Ala Met Lys Val Leu Gly Arg Pro Gly Tyr

260 265 270

Pro Phe Phe Ile Thr Ala Leu Leu Trp Phe Tyr Met Trp Thr Met Leu

275 280 285

Gly Leu Phe Tyr Asn Phe Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Leu Ala Lys Gln

290 295 300

Ala Lys Ala Asp Ala Ala Lys Glu Lys Ala Arg Lys Leu Gln305 310 315

<210> 138<211> 242<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante<222> (3) . . (5)

<223> xaa na posição 3 a 5 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (6)..(6)

<223> xaa na posição 6 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante<222> (8) . . (16)

<223> xaa na posição 8 a 16 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (19)..(20)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (22)..(42)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (43)..(49)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (52)..(56)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (59)..(59)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (62) .. (63)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (65) .. (68)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (70)..(73)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (75)..(75)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (77)..(78)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (80)..(94)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (95)..(98)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (101)..(101)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (104)..(105)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (108) .. (108)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (111)..(111)<223> xaa na posição<220>

19 a 20 é qualquer aminoácido

22 a 42 é qualquer aminoácido

43 a 49 é qualquer um ou nenhum aminoácido

52 a 56 é qualquer aminoácido

59 é qualquer aminoácido

62 a 63 é qualquer aminoácido

65 a 68 é qualquer aminoácido

70 a 73 é qualquer aminoácido

75 é qualquer aminoácido

77 a 78 é qualquer aminoácido

80 a 94 é qualquer aminoácido

95 a 98 é qualquer um ou nenhum aminoácido

101 é qualquer aminoácido

104 a 105 é qualquer aminoácido

108 é qualquer aminoácido

111 é qualquer aminoácido<221> Variante<222> (114)..(114)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (116)..(120)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (122)..(124)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (127) .. (127)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (131)..(132)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (134)..(135)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (139)..(143)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (148)..(149)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (151)..(151)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (154)..(155)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (158)..(159)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (162)..(162)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (165)..(165)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (168)..(168)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (170)..(184)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (185)..(190)<223> xaa na posição

114 é qualquer aminoácido

116 a 120 é qualquer aminoácido

122 a 124 é qualquer aminoácido

127 é qualquer aminoácido

131 a 132 é qualquer aminoácido

134 a 135 é qualquer aminoácido

139 a 14 3 é qualquer aminoácido

148 a 149 é qualquer aminoácido

151 é qualquer aminoácido

154 a 155 é qualquer aminoácido

158 a 159 é qualquer aminoácido

162 é qualquer aminoácido

165 é qualquer aminoácido

168 é qualquer aminoácido

170 a 184 é qualquer aminoácido

185 a 190 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Leu Pro1

Tyr Leu

xaa xaa

xaa His50

xaa xaa65

xaa xaa

xaa xaa

Met xaa

His His130

Variante(192) . . (193)

xaa na posição 192 a 193 é qualquer aminoácido

Variante(196)..(196)

xaa na posição 196 é qualquer aminoácido

Variante(199)..(203)

xaa na posição 199 a 203 é qualquer aminoácido

Variante(205)..(206)

xaa na posição 205 a 206 é qualquer aminoácido

Variante(208)..(213)

xaa na posição 208 a 213 é qualquer aminoácido

Variante(214)..(219)

xaa na posição 214 a 219 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(222)..(227)

xaa na posição 222 a 227 é qualquer aminoácido

Variante(229)..(230)

xaa na posição 229 a 230 é qualquer aminoácido

Variante(233) .. (235)

xaa na posição 233 a 235 é qualquer aminoácido

Variante(237)..(237)

xaa na posição 237 é qualquer aminoácido

Variante(241)..(241)

xaa na posição 241 é qualquer aminoácido138

xaa xaa xaa xaa Pro xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

5 10 15

xaa xaa Val xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

20 25 30

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

35 40 45

Asn xaa xaa xaa xaa xaa Leu Ser xaa Tyr Met xaa xaa Gly

55 60

xaa xaa Ala xaa xaa xaa xaa Tyr xaa Leu xaa xaa Asn xaa70 75 80

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

85 90 95

Phe Tyr xaa Ser Lys xaa xaa Glu Phe xaa Asp Thr xaa Ile

100 105 HO

Leu xaa xaa xaa xaa xaa Gln xaa xaa xaa Leu His xaa Tyr115 120 125

xaa xaa Ile xaa xaa Ile Trp Trp xaa xaa xaa xaa xaa Ala135 140Pro Gly Gly xaa xaa Tyr xaa Ser Ala xaa xaa Asn Ser xaa xaa His145 150 155 160

Val xaa Met Tyr xaa Tyr Tyr xaa Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

165 170 175

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Thr xaa

180 185 190

xaa Gln Met xaa Gln Phe xaa xaa xaa xaa xaa Gln xaa xaa Tyr xaa

195 200 205

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Tyr Pro xaa xaa xaa

210 215 220

xaa xaa xaa Leu xaa xaa Tyr Met xaa xaa xaa Leu xaa Leu Phe Gly225 230 235 240

xaa Phe

<210> 139 <211> 60 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (2) . . (2) <223> xaa na posição 2 é Phe ou Trp<220> <221> Variante <222> (3) . . (3) <223> xaa na posição 3 é Leu, Met ou Val<220> <221> Variante <222> (6) .. (6) <223> xaa na posição 6 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (7)..(7) <223> xaa na posição 7 é Phe ou Ile<220> <221> Variante <222> (9) .. (9) <223> xaa na posição 9 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (11) · · (H) <223> xaa na posição 11 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (13)..(15) <223> xaa na posição 13 a 15 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (16)..(16) <223> xaa na posição 16 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (18)..(18) <223> xaa na posição 18 é lie, Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (19)..(19) <223> xaa na posição 19 é Ser ou Thr<220> <221> Variante <222> (20)..(20) <223> xaa na posição 20 é Phe ou Val<220><221> Variante

<222> (23)..(23)

<223> xaa na posição 23 é Ile ou Val<220>

<221> Variante

<222> (27)..(27)

<223> xaa na posição 27 é Ala, Ser ou Thr<220>

<221> Variante

<222> (28) . . (28)

<223> xaa na posição 28 é Ser ou Thr<220>

<221> Variante

<222> (29)..(29)

<223> xaa na posição 29 é Ile ou Val<220>

<221> Variante

<222> (30)..(31)

<223> xaa na posição 30 a 31 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (32) . . (32)

<223> xaa na posição 32 é Ile ou Leu<220>

<221> Variante

<222> (34).. (34)

<223> xaa na posição 34 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (35)..(35)

<223> xaa na posição 35 é Ala, Ile ou Leu<220>

<221> Variante

<222> (36)..(36)

<223> xaa na posição 36 é Ala, Ile ou Val<220>

<221> Variante

<222> (37)..(39)

<223> xaa na posição 37 a 39 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (42)..(42)

<223> xaa na posição 42 é Gly ou Asn<220>

<221> Variante

<222> (44)..(44)

<223> xaa na posição 44 é Asp ou Glu<220>

<221> Variante

<222> (45)..(45)

<223> xaa na posição 45 é Ala ou Ser<220>

<221> Variante

<222> (47).. (47)

<223> xaa na posição 47 é Phe, Trp ou Tyr<220>

<221> Variante<222> (49)..(49)

<223> xaa na posição 49 é Ala ou Thr<220>

<221> Variante<222> (50)..(50)

<223> xaa na posição 50 é qualquer aminoácido<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Glu xaa1

Gln xaa

Trp xaa

xaa xaa50

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221>

Variante(51)..(51)

xaa na posição 51 é Leu ou Val

Variante

(54).. (54)

xaa na posição 54 é qualquer aminoácido

Variante

(55)..(55)

xaa na posição 55 é Ile ou Val

Variante

(58)..(58)

xaa na posição 58 é qualquer aminoácido

Variante

(59)..(59)

xaa na posição 59 é Leu ou Met

139

xaa Asp Thr xaa xaa Met xaa Leu xaa Lys xaa xaa xaa xaa

5 10 15

xaa xaa Leu His xaa Tyr His His xaa xaa xaa xaa xaa xaa

20 25 30

xaa xaa xaa xaa xaa Ala Pro xaa Gly xaa xaa Tyr xaa Ser

35 40 45

xaa Asn Ser xaa xaa His Val xaa xaa Tyr55 60

14022PRT

Seqüência artificial

Variante(2) . . (2)

xaa na posição 2 é Ala ou Leu

Variante(3)..(3)

xaa na posição 3 é Phe ou Tyr

Variante

(5) . . (5)

xaa na posição 5 é Cys ou Ser

Variante

(6) . . (6)

xaa na posição 6 é Gly, Leu ou Val

Variante(8) .. (9)

xaa na posição 8 a 9 é qualquer aminoácidoVariante

(10).· (H) . ,

xaa na posição 10 a 11 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(13).. (14)

xaa na posição 13 a 14 é qualquer aminoácidoVariante(15).. (16)

xaa na posição 15 a 16 é qualquer um ou nenhum aimoácido

<222><223><220>

<221> Variante

(18)..(18)

xaa na posição 18 é Gly, Ser ou Thr

<222><223><220>

<221> Variante

(19)..(19)

xaa na posição 19 é Leu ou Val

<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>

Variante(20)..(20)

xaa na posição 20 é Phe ou Trp

Variante(21)..(21)

xaa na posição 21 é Glu, Gly ou Asn140

Ser xaa xaa Met xaa xaa Gly xaa xaa xaa xaa Ala xaa xaa xaa xaa

1 5 10 15

Tyr xaa xaa xaa xaa Asn20

14118PRT

Seqüência artificial

<210><211><212><213><220>

<221> Variante(2) .. (3)

xaa na posição 2 a 3 é qualquer aminoácido

<222><223><220>

<221> Variante<222> (6)..(6)

<223> xaa na posição 6 é qualquer aminoácido<220>

Variante(9)..(12)

xaa na posição 9 a 12 é qualquer aminoácido

<221><222><223><220>

<221> Variante

(13)..(13)

xaa na posição 13 é Gly, He, Leu ou Val

Variante(15)..(15)

xaa na posição 15 é Ala ou Ser

<222><223><220><221><222><223><220>

<221> Variante<222> (16) . . (16)

<223> xaa na posição 16 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

(17)..(17)

xaa na posição 17 é Trp ou Tyr

<222><223><220><221><222><223><400>

Variante(18)..(18)

xaa na posição 18 é Ala, Cys ou Asp141

Thr xaa xaa Gln Met xaa Gln Phe xaa xaa xaa xaa xaa Gln xaa xaa

1 5 10 15

xaa xaa<210> 142

<211> 25

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante

<222> (2).. (2) ,

<223> xaa na posição 2 é qualquer um ou nenhum ammoacido

<220>

<221> Variante

<222> (4).. (5)

<223> xaa na posição 4 a 5 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (6)..(6)

<223> xaa na posição 6 é Phe, Ile ou Leu<220>

<221> Variante

<222> (7).. (8)

<223> xaa na posição 7 a 8 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (9)..(9)

<223> xaa na posição 9 é He, Leu ou Met<220>

<221> Variante

<222> (11).. (12)

<223> xaa na posição 11 a 12 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (14)..(15)

<223> xaa na posição 14 a 15 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (16)..(16)

<223> xaa na posição 16 é Ser ou Thr<220>

<221> Variante

<222> (17)..(17)

<223> xaa na posição 17 é Leu ou Met<220>

<221> Variante

<222> (19).. (19)

<223> xaa na posição 19 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (20).. (20)

<223> xaa na posição 20 é Phe ou Leu<220>

<221> Variante

<222> (22).. (23)

<223> xaa na posição 22 a 23 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (25)..(25)

<223> xaa na posição 25 é Phe ou Tyr

<400> 142

Tvr xaa Pro xaa xaa xaa xaa xaa xaa Leu xaa xaa Tyr xaa xaa xaa

1 5 10 15

xaa Leu xaa xaa Phe xaa xaa Phe xaa

20 25

<210> 143<211> 879

<212> DNA

<213> Ostreococcus tauri<220>

<221> CDS

<222> (1) . . (879)

<400> 143 atg agt ggc tta cgt gea CCC aac ttt tta cac aga ttc tgg aca aagMet Ser Gly Leu Arg Ala Pro Asn Phe Leu His Arg Phe Trp Thr Lys1 5 10 15 tgg gac tac gcg att tcc aaa gtc gtc ttc acg tgt gcc gac agt tttTrp Asp Tyr Ala Ile Ser Lys Val Val Phe Thr Cys Ala Asp Ser Phe 20 25 30 cag tgg gac ate ggg cca gtg agt tcg agt acg gcg cat tta CCC gccGln Trp Asp Ile Gly Pro Val Ser Ser Ser Thr Ala His Leu Pro Ala 35 40 45 att gaa tcc cct acc cca ctg gtg act age ctc ttg ttc tac tta gtcIle Glu 50 Ser Pro Thr Pro Leu 55 Val Thr Ser Leu Leu 60 Phe Tyr Leu Valaca gtt ttc ttg tgg tat ggt cgt tta acc agg agt tca gac aag aaaThr Val Phe Leu Trp Tyr Gly Arg Leu Thr Arg Ser Ser Asp Lys Lys65 70 75 80att aga gag cct acg tgg tta aga aga ttc ata ata tgt cat aat gcgIle Arg Glu Pro Thr Trp Leu Arg Arg Phe Ile Ile Cys His Asn Ala 85 90 95 ttc ttg ata gtc ctc agt Ctt tac atg tgc Ctt ggt tgt gtg gcc caaPhe Leu Ile Val 100 Leu Ser Leu Tyr Met 105 Cys. Leu Gly Cys Val 110 Ala Glngcg tat cag aat gga tat act tta tgg ggt aat gaa ttc aag gcc acgAla Tyr Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Trp Gly Asn Glu Phe Lys Ala Thr 115 120 125 gaa act cag Ctt gct ctc tac att tac att ttt tac gta agt aaa ataGlu Thr 130 Gln Leu Ala Leu Tyr 135 Ile Tyr Ile Phe Tyr 140 Val Ser Lys Iletac gag ttt gta gat act tac att atg Ctt ctc aag aat aac ttg cggTyr Glu Phe Val Asp Thr Tyr Ile Met Leu Leu Lys Asn Asn Leu Arg145 150 155 160caa gta agt ttc cta cac att tat cac cac age acg att tcc ttt attGln Val Ser Phe Leu 165 His Ile Tyr His His 170 Ser Thr Ile Ser Phe 175 Iletgg tgg ate att gct cgg agg gct ccg ggt ggt gat gct tac ttc ageTrp Trp Ile Ile Ala Arg Arg Ala Pro Gly Gly Asp Ala Tyr Phe Ser 180 185 190 gcg gcc ttg aac tca tgg gta cac gtg tgc atg tac acc tat tat ctaAla Ala Leu 195 Asn Ser Trp Val His 200 Val Cys Met Tyr Thr 205 Tyr Tyr Leutta tca acc Ctt att gga aaa gaa gat cct aag cgt tcc aac tac CttLeu Ser 210 Thr Leu Ile Gly Lys 215 Glu Asp Pro Lys Arg 220 Ser Asn Tyr Leutgg tgg ggt cgc cac cta acg caa atg cag atg Ctt cag ttt ttc ttcTrp Trp Gly Arg His Leu Thr Gln Met Gln Met Leu Gln Phe Phe Phe225 230 235 240aac gta Ctt caa gcg ttg tac tgc gct tcg ttc tet acg tat CCC aagAsn Val Leu Gln Ala 245 Leu Tyr Cys Ala Ser 250 Phe Ser Thr Tyr Pro 255 Lysttt ttg tcc aaa att ctg ctc gtc tat atg atg age Ctt ctc ggc ttgPhe Leu Ser Lys 260 Ile Leu Leu Val Tyr 265 Met Met Ser Leu Leu 270 Gly Leuttt ggg cat ttc tac tat tcc aag cac ata gea gea gct aag ctc cagPhe Gly His Phe Tyr Tyr Ser Lys His Ile Ala Ala Ala Lys Leu Gln 275 280 285 aaa aaa cag cag tga

Lys Lys Gln Gln290

<210> 144 <211> 292 <212> PRT <213> Ostreococcus tauri <400> 144 Thr LysMet Ser Gly Leu Arg Ala Pro Asn Phe Leu His Arg Phe Trp 1 5 10 15 Trp Asp Tyr Ala Ile Ser Lys Val Val Phe Thr Cys Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Gln Trp Asp Ile Gly Pro Val Ser Ser Ser Thr Ala His Leu Pro Ala 35 40 45 ValIle Glu Ser Pro Thr Pro Leu Val Thr Ser Leu Leu Phe Tyr Leu 50 55 60 Thr Val Phe Leu Trp Tyr Gly Arg Leu Thr Arg Ser Ser Asp Lys Lys65 70 75 80Ile Arg Glu Pro Thr Trp Leu Arg Arg Phe Ile Ile Cys His Asn Ala 85 90 95 Phe Leu Ile Val Leu Ser Leu Tyr Met Cys Leu Gly Cys Val Ala Gln 100 105 110 Ala Tyr Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Trp Gly Asn Glu Phe Lys Ala Thr 115 120 125 Glu Thr Gln Leu Ala Leu Tyr Ile Tyr Ile Phe Tyr Val Ser Lys Ile130 135 140 Tyr Glu Phe Val Asp Thr Tyr Ile Met Leu Leu Lys Asn Asn Leu Arg145 150 155 160Gln Val Ser Phe Leu His Ile Tyr His His Ser Thr Ile Ser Phe Ile 165 170 175 Trp Trp Ile Ile Ala Arg Arg Ala Pro Gly Gly Asp Ala Tyr Phe Ser 180 185 190 Ala Ala Leu Asn Ser Trp Val His Val Cys Met Tyr Thr Tyr Tyr Leu 195 200 205 Leu Ser Thr Leu Ile Gly Lys Glu Asp Pro Lys Arg Ser Asn Tyr Leu210 215 220 Trp Trp Gly Arg His Leu Thr Gln Met Gln Met Leu Gln Phe Phe Phe225 230 235 240Asn Val Leu Gln Ala Leu Tyr Cys Ala Ser Phe Ser Thr Tyr Pro Lys 245 250 255 Phe Leu Ser Lys Ile Leu Leu Val Tyr Met Met Ser Leu Leu Gly Leu 260 265 270 Phe Gly His Phe Tyr Tyr Ser Lys His Ile Ala Ala Ala Lys Leu Gln 275 280 285 Lys Lys Gln Gln 290 <210> 145 <211> 831 <212> DNA

<213> Thraustochytrium sp<220>

<221> CDS<222> (1) . . (831)<400> 145

atg gat gtc gtc gag cag caa tgg cgc cgc ttc gtg gac gcc gtg gacMet Asp Val Val Glu Gln Gln Trp Arg Arg Phe Val Asp Ala Val Asp1 5 10 15

aac gga ate gtg gag ttc atg gag cat gag gag ccc aac aag ctg aacAsn Gly Ile Val Glu Phe Met Glu His Glu Glu Pro Asn Lys Leu Asn

20 25 30

gag ggc aag ctc tcc acc tcg acc gag gag atg atg gcg ctt ate gtcGlu Gly Lys Leu Ser Thr Ser Thr Glu Glu Met Met Ala Leu Ile Val

35 40 45

ggc tac ctg gcg ttc gtg gtc ctc ggg tcc gcc ttc atg aag gcc tttGly Tyr Leu Ala Phe Val Val Leu Gly Ser Ala Phe Met Lys Ala Phe50 55 60

gtc gat aag cct ttc gag ctc aag ttc ctc aag ctc gtg cac aac ateVal Asp Lys Pro Phe Glu Leu Lys Phe Leu Lys Leu Val His Asn Ile65 70 75 80

ttc ctc acc ggt ctg tcc atg tac atg gcc acc gag tgc gcg cgc cagPhe Leu Thr Gly Leu Ser Met Tyr Met Ala Thr Glu Cys Ala Arg Gln

85 90 95

gea tac ctc ggc ggc tac aag ctc ttt ggc aac ccg atg gag aag ggcAla Tyr Leu Gly Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Asn Pro Met Glu Lys Gly

100 105 HO

acc gag tcg cac gcc ccg ggc atg gcc aac ate ate tac ate ttc tacThr Glu Ser His Ala Pro Gly Met Ala Asn Ile Ile Tyr Ile Phe Tyr

115 120 125

gtg age aag ttc ctc gaa ttc ctc gac acc gtc ttc atg ate ctc ggcVal Ser Lys Phe Leu Glu Phe Leu Asp Thr Val Phe Met Ile Leu Gly

130 135 140

aag aag tgg aag cag ctc age ttt ctc cac gtc tac cac cac gcg ageLys Lys Trp Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ala Ser145 150 155 160

ate age ttc ate tgg ggc ate ate gcc cgc ttc gcg ccc ggt ggc gacIle Ser Phe Ile Trp Gly Ile Ile Ala Arg Phe Ala Pro Gly Gly Asp

165 170 175

gcc tac ttc tet acc ate ctc aac age age gtg cat gtc gtg ctc tacAla Tyr Phe Ser Thr Ile Leu Asn Ser Ser Val His Val Val Leu Tyr

180 185 190

ggc tac tac gcc tcg acc acc ctc ggc tac acc ttc atg cgc ccg ctgGly Tyr Tyr Ala Ser Thr Thr Leu Gly Tyr Thr Phe Met Arg Pro Leu

195 200 205

cgc ccg tac att acc acc att cag ctc acg cag ttc atg gcc atg gtcArg Pro Tyr Ile Thr Thr Ile Gln Leu Thr Gln Phe Met Ala Met Val

210 215 220

gtc cag tcc gtc tat gac tac tac aac ccc tgc gac tac ccg cag cccVal Gln Ser Val Tyr Asp Tyr Tyr Asn Pro Cys Asp Tyr Pro Gln Pro225 230 235 240

ctc gtc aag ctg ctc ttc tgg tac atg ctc acc atg ctc ggc ctc ttcLeu Val Lys Leu Leu Phe Trp Tyr Met Leu Thr Met Leu Gly Leu Phe

245 250 255

ggc aac ttc ttc gtg cag cag tac ctc aag ccc aag gcg ccc aag aagGly Asn Phe Phe Val Gln Gln Tyr Leu Lys Pro Lys Ala Pro Lys Lys

260 265 270

cag aag acc ate taaGln Lys Thr Ile275

<210> 146<211> 276<212> PRT

<213> Thraustochytrium sp<400> 146

Met Asp Val Val Glu Gln Gln Trp Arg Arg Phe Val Asp Ala Val Asp1 5 10 15

Asn Gly Ile Val Glu Phe Met Glu His Glu Glu Pro Asn Lys Leu Asn

20 25 30

Glu Gly Lys Leu Ser Thr Ser Thr Glu Glu Met Met Ala Leu Ile Val

35 40 45

Gly Tyr Leu Ala Phe Val Val Leu Gly Ser Ala Phe Met Lys Ala Phe

50 55 60

Val Asp Lys Pro Phe Glu Leu Lys Phe Leu Lys Leu Val His Asn Ile65 70 75 80

Phe Leu Thr Gly Leu Ser Met Tyr Met Ala Thr Glu Cys Ala Arg Gln

85 90 95

Ala Tyr Leu Gly Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Asn Pro Met Glu Lys Gly

100 105 110

Thr Glu Ser His Ala Pro Gly Met Ala Asn Ile Ile Tyr Ile Phe Tyr

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

816

831115 120 125

Val Ser Lys Phe Leu Glu Phe Leu Asp Thr Val Phe Met Ile Leu Gly

130 135 140

Lys Lys Trp Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ala Ser145 150 155 160

Ile Ser Phe Ile Trp Gly Ile Ile Ala Arg Phe Ala Pro Gly Gly Asp

165 170 175

Ala Tyr Phe Ser Thr Ile Leu Asn Ser Ser Val His Val Val Leu Tyr

180 185 190

Gly Tyr Tyr Ala Ser Thr Thr Leu Gly Tyr Thr Phe Met Arg Pro Leu

195 200 205

Arg Pro Tyr Ile Thr Thr Ile Gln Leu Thr Gln Phe Met Ala Met Val

210 215 220

Val Gln Ser Val Tyr Asp Tyr Tyr Asn Pro Cys Asp Tyr Pro Gln Pro225 230 235 240

Leu Val Lys Leu Leu Phe Trp Tyr Met Leu Thr Met Leu Gly Leu Phe

245 250 255

Gly Asn Phe Phe Val Gln Gln Tyr Leu Lys Pro Lys Ala Pro Lys Lys

260 265 270

Gln Lys Thr Ile275

<210> 147<211> 1146<212> DNA

<213> Leishmania major<220>

<221> CDS<222> (1).-{1146)<400> 147

atg gtc tct ctg gag cag gcc gaa cag ate gcg gcc gcg ate gag gta 48

Met Val Ser Leu Glu Gln Ala Glu Gln Ile Ala Ala Ala Ile Glu Val1 5 10 15

cct gac tgg gtc ttg aca aag tct gcg gcg ctg gtg tac age tgc ttc 96

Pro Asp Trp Val Leu Thr Lys Ser Ala Ala Leu Val Tyr Ser Cys Phe

20 25 30

ggc tcc gcc gcc aat gct ttt gaa age agt ate aag ate aac ttc ccg 144

Gly Ser Ala Ala Asn Ala Phe Glu Ser Ser Ile Lys Ile Asn Phe Pro

35 40 45

gcg cag cat gcg ttc gtg gag gcg tgg atg cgc gcg cgc tcc cac cct 192

Ala Gln His Ala Phe Val Glu Ala Trp Met Arg Ala Arg Ser His Pro

50 55 60

ttt gcg gag cgc ctg ccg tac ctg aat ccg tgg cac gtt ate gcc tcg 240

Phe Ala Glu Arg Leu Pro Tyr Leu Asn Pro Trp His Val Ile Ala Ser65 70 75 80

ata ctg gcc tac etc tcc ttg att gtc acc ttg cgc ctg ttg cat cgt 288

Ile Leu Ala Tyr Leu Ser Leu Ile Val Thr Leu Arg Leu Leu His Arg

85 90 95

gta ctc ggt aag ttc tcg tgc cgc act etc gga ttg gtg cac aac ctc 336

Val Leu Gly Lys Phe Ser Cys Arg Thr Leu Gly Leu Val His Asn Leu

100 105 HO

ggt ctc cat ctt ctc tcg ttg tac atg age ctt ggt ctc atg ate age 384

Gly Leu His Leu Leu Ser Leu Tyr Met Ser Leu Gly Leu Met Ile Ser

115 120 125

gcg cgc gcc gcg ggg tac tcg ctc tgg aac aac gcg gtc ggc acc tcc 432

Ala Arg Ala Ala Gly Tyr Ser Leu Trp Asn Asn Ala Val Gly Thr Ser

130 135 140

ccg gct gag tgg cgc att gcg aag ctg ate tgg ctc ttc tat gtc tcg 480

Pro Ala Glu Trp Arg Ile Ala Lys Leu Ile Trp Leu Phe Tyr Val Ser145 150 155 160

aag gtg gtg gaa tgg gtg gac acg gta att atg tta tta aag cag aac 528

Lys Val Val Glu Trp Val Asp Thr Val Ile Met Leu Leu Lys Gln Asn

165 170 175

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<213> Physcomitrella patens<400> 152

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245 250 255

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260 265 270

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Phe Tyr Asn Phe Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Leu Ala Lys Gln

295 300

Ala Asp Ala Ala Lys Glu Lys Ala Arg Lys Leu Gln310 315

155236PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(8)

xaa na posição 2 a 8 é qualquer aminoácido

Variante(10).. (10)

xaa na posição 10 é qualquer aminoácido

Variante(13)..(14)

xaa na posição 13 a 14 é qualquer aminoácido<221> Variante <222> (16)..(36) <223> xaa na posição 16 a 36 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (37)..(43) <223> xaa na posição 37 a 43 é qualquer um ou nenhum<220> <221> Variante <222> (46)..(47) <223> xaa na posição 46 a 47 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (49)..(50) <223> xaa na posição 49 a 50 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (53)..(53) <223> xaa na posição 53 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (56)..(57) <223> xaa na posição 56 a 57 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (59)..(62) <223> xaa na posição 59 a 62 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (64)..(67) <223> xaa na posição 64 a 67 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (69)..(69) <223> xaa na posição 69 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (71) .. (72) <223> xaa na posição 71 a 72 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (74).. (82) <223> xaa na posição 74 a 82 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (83)..(86) <223> xaa na posição 83 a 86 é qualquer um ou nenhum<220> <221> Variante <222> (88)..(89) <223> xaa na posição 88 a 89 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (91)..(92) <223> xaa na posição 91 a 92 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (95) . . (95) <223> xaa na posição 95 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (98)..(99) <223> xaa na posição 98 a 99 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (102)..(102) <223> xaa na posição 102<220> <221> Variante <222> (105)..(105) <223> xaa na posição 105<220> <221> Variante <222> (108)..(108) <223> xaa na posição 108<220> <221> Variante <222> (111) ..(114) <223> xaa na posição 111<220> <221> Variante <222> (116)..(116) <223> xaa na posição 116<220> <221> Variante <222> (121)..(121) <223> xaa na posição 121<220> <221> Variante <222> (125)..(126) <223> xaa na posição 125<220> <221> Variante <222> (128) . . (129) <223> xaa na posição 128<220> <221> Variante <222> (133). . (137) <223> xaa na posição 133<220> <221> Variante <222> (142)..(142) <223> xaa na posição 142<220> <221> Variante <222> (145)..(145) <223> xaa na posição 145<220> <221> Variante <222> (148). . (148) <223> xaa na posição 148<220> <221> Variante <222> (152).. (152) <223> xaa na posição 152<220> <221> Variante <222> (156)..(156) <223> xaa na posição 156<220> <221> Variante <222> (159)..(159) <223> xaa na posição 159<220> <221> Variante <222> (162)..(162)

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

a 114 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

a 126 é qualquer aminoácido

a 129 é qualquer aminoácido

a 137 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido<223> xaa na posição 162 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (164)..(165)

<223> xaa na posição 164 a 165 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (167).. (178)

<223> xaa na posição 167 a 178 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (179)..(184)

<223> xaa na posição 179 a 184 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (186)..(187)

<223> xaa na posição 186 a 187 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (190) . . (190)

<223> xaa na posição 190 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (193)..(197)

<223> xaa na posição 193 a 197 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (199) . . (200)

<223> xaa na posição 199 a 200 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (202) . . (207)

<223> xaa na posição 202 a 207 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (208) . . (213)

<223> xaa na posição 208 a 213 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (216) . . (217)

<223> xaa na posição 216 a 217 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (219)..(221)

<223> xaa na posição 219 a 221 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (223)..(224)

<223> xaa na posição 223 a 224 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (227)..(229)

<223> xaa na posição 227 a 229 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (231)..(231)

<223> xaa na posição 231 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (235)..(235)

<223> xaa na posição 235 é qualquer aminoácido

<400> 155

Pro xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Leu xaa Tyr Leu xaa xaa Val xaa15 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

20 25 30

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa His Asn xaa xaa Leu

35 40 45

xaa xaa Leu Ser xaa Tyr Met xaa xaa Gly xaa xaa xaa xaa Ala xaa

50 55 60

xaa xaa xaa Tyr xaa Leu xaa xaa Asn xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa65 70 75 80

xaa xaa xaa xaa xaa xaa Ala xaa xaa Ile xaa xaa Phe Tyr xaa Ser

85 90 95

Lys xaa xaa Glu Phe xaa Asp Thr xaa Ile Met xaa Leu Lys xaa xaa

100 105 HO

xaa xaa Gln xaa Ser Phe Leu His xaa Tyr His His xaa xaa Ile xaa115 120 - 125xaa Ile Trp Trp xaa xaa xaa xaa xaa Ala Pro Gly Gly xaa Ala Tyr

130 135 140

xaa Ser Ala xaa Leu Asn Ser xaa Val His Val xaa Met Tyr xaa Tyr145 150 155 160

Tyr xaa Leu xaa xaa Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

165 170 175

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Thr xaa xaa Gln Met xaa Gln Phe

180 185 190

xaa xaa xaa xaa xaa Gln xaa xaa Tyr xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

195 200 205

xaa xaa xaa xaa xaa Tyr Pro xaa xaa Leu xaa xaa xaa Leu xaa xaa

210 215 220

Tyr Met xaa xaa xaa Leu xaa Leu Phe Gly xaa Phe225 230 235

<210> 156<211> 59<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante<222> (2)..(2)

<223> xaa na posição 2 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (5)..(5)

<223> xaa na posição 5 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (6)..(6)

<223> xaa na posição 6 é Phe ou Ile<220>

<221> Variante<222> (8)..(8)

<223> xaa na posição 8 é lie, Leu ou Val<220>

<221> Variante<222> (10) . . (13)

<223> xaa na posição 10 a 13 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (14)..(14)

<223> xaa na posição 14 é Lys ou Arg<220>

<221> Variante<222> (16) . . (16)

<223> xaa na posição 16 é lie, Leu ou Val<220>

<221> Variante<222> (21)..(21) <223> xaa na posição 21<220> <221> Variante <222> (25)..(25) <223> xaa na posição 25<220> <221> Variante <222> (26)..(26) <223> xaa na posição 26<220> <221> Variante <222> (28)..(29) <223> xaa na posição 28<220> <221> Variante <222> (32). . (32) <223> xaa na posição 32<220> <221> Variante <222> (33)..(33) <223> xaa na posição 33<220> <221> Variante <222> (34)..(34) <223> xaa na posição 34<220> <221> Variante <222> (35)..(35) <223> xaa na posição 35<220> <221> Variante <222> (36)..(37) <223> xaa na posição 36<220> <221> Variante <222> (40)..(40) <223> xaa na posição 40<220> <221> Variante <222> (42) . . (42) <223> xaa na posição 42<220> <221> Variante <222> (45)..(45) <223> xaa na posição 45<220> <221> Variante <222> (47) . . (47) <223> xaa na posição 47<220> <221> Variante <222> (48). . (48) <223> xaa na posição 48<220> <221> Variante <222> (52). . (52) <223> xaa na posição 52<220> <221> Variante <222> (53). . (53) <223> xaa na posição 53<220>

é Ile ou Val

é Ala ou Ser

é Ser ou Thr

a 29 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é Ala, Ile ou Leu

é Ile ou Val

é Ala ou Thr

a 37 é qualquer aminoácido

é Gly ou Asn

é Asp ou Glu

é Phe ou Trp

é Ala ou Thr

é Ala ou Ile

é qualquer aminoácido

é Ile ou Val<221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Phe xaa1

Ser-Phe

xaa xaa

Leu Asn50

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>

Variante

(56)..(56)

xaa na posição 56 é qualquer aminoácido

Variante

(57)..(57)

xaa na posição 57 é Leu ou Met

Variante(59)..(59)

xaa na posição 59 é Ala, Gly ou Thr

156

Asp Thr xaa xaa Met xaa Leu xaa xaa xaa xaa xaa Gln xaa

5 10 15

Leu His xaa Tyr His His xaa xaa Ile xaa xaa Ile Trpxaa

20 25 30

xaa xaa xaa Ala Pro xaa Gly xaa Ala Tyr xaa Ser xaa xaa

35 40 45

Ser xaa xaa His Val xaa xaa Tyr xaa55

15722PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(2)

xaa na posição 2 é Leu ou Met

Variante

(5) . . (5)

xaa na posição 5 é Ala, Cys ou Ser

Variante

(6)..(6)

xaa na posição 6 é qualquer aminoácido

Variante

(7)..(7)

xaa na posição 7 é Glu ou Gly

Variante

(8)..(10)

xaa na posição 8 a 10 é qualquer aminoácidoVariante

(11) · · (H)

xaa na posição 11 é Gln ou Ser

Variante(13) .. (16)

xaa na posição 13 a 16 é qualquer aminoácido

Variante(18).. (18)

xaa na posição 18 é qualquer aminoácido

Variante(20)..(20)

xaa na posição 20 é Phe ou Trp

Variante(21) .. (21)<223> xaa na posição 21 é Gly ou Asn

<400> 157

Ser xaa Tyr Met xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Ala xaa xaa xaa xaa

1 5 10 15

Tyr xaa Leu xaa xaa Asn20

<210> 158

<211> 16

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante

<222> (2)..(2)

<223> xaa na posição 2 é Leu ou Met

<220>

<221> Variante

<222> (3)..(3)

<223> xaa na posição 3 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (6).. (8)

<223> xaa na posição 6 a 8 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (9) . . (9)

<223> xaa na posição 9 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (11).. (11)

<223> xaa na posição 11 é qualquer iam ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (13)..(13)

<223> xaa na posição 13 é Ala ou Ser<220>

<221> Variante

<222> (14) .. (14)

<223> xaa na posição 14 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (15)..(15)

<223> xaa na posição 15 é Trp ou Tyr<220>

<221> Variante

<222> (16)..(16)

<223> xaa na posição 16 é Cys ou Asp

<400> 158

Gln xaa xaa Gln Phe xaa xaa xaa xaa Val xaa Gln xaa xaa xaa xaa

1 5 10 15

<210> 159

<211> 24

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante

<222> (3)..(4)

<223> xaa na posição 3 a 4 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (5)..(5)

<223> xaa na posição 5 é Ile ou Leu<220>

<221> Variante(6).. (7)

xaa na posição 6 a 7 é qualquer aminoácido

Variante(8) .. (8)xaa na posição

é Ile ou Leu

<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220>

<221> Variante

(15)..(15)

xaa na posição 15 é Ser ou Thr

Variante(10)..(11)

xaa na posição 10 a 11 é qualquer aminoácido

Variante(14)..(14)

xaa na posição 14 é qualquer aminoácido

<222><223><220>

<221> Variante

(16)..(16)

xaa na posição 16 é Leu ou Met

<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>

Variante(18)..(18)

xaa na posição 18 é qualquer aminoácido

Variante(21)..(22)

xaa na posição 21 a 22 é qualquer aminoácido

Variante(24) . . (24)

xaa na posição 24 é Phe ou Tyr159

Tyr Pro xaa xaa xaa xaa xaa xaa Leu xaa xaa Tyr Met xaa xaa xaa

1 5 10 15

Leu xaa Leu Phe xaa xaa Phe xaa20

<210> 160<211> 8<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <221> Variante<222> (2) . . (2)<223> xaa na posição 2 é Trp ou<220> <221> Variante<222> (3) . . (3)<223> xaa na posição 3 é Ile ou<220> <221> Variante<222> (6)..(6)<223> xaa na posição 6 é Phe ou<4 00> 160Ile xaa xaa Phe Tyr xaa Ser Lys1 5<210> 161<211> 755<212> DNA<213> Cauliflower mosaic virus<400> 161cctgcaggtc aacatggtgg agcacgacac acttgtctacagtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaacctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtgtggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcccgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagctccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgataactgtctactcc aaaaatatca aagatacagt ctcagaagactcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct cggattccattattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaaaaaggccatc gttgaagatg cctctgccga cagtggtcccgaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtcttgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccacctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gagga<210> 162<211> 211<212> DNA

<213> Cauliflower mosaic virus<400> 162

agtccgcaaa aatcaccagt ctctctctac aaatctatcttaatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttctttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgtatttctaatt cctaaaacca aaatccagtg a<210> 163

819DNA

Thalassiosira pseudonana

tccaaaaataagggtaatataagatagtggatcgttgaagatcgtggaaaatggtggagccaaagggcaatgcccagctatgccatcattaaagatggactcaaagcaagtatccttcgc

tcaaagatacccggaaacctaaaaggaaggatgcctctgcaagaagacgtacgacacactttgagacttttctgtcacttgcgataaaggccccacccactggattgatgaagacccttc

ctctctattt ttctccagaatatagggttt cgctcatgtgaaaatacttc tatcaataaa

<211><212><213><220><221><222><400>

CDS

(1)..(819)163

atg gac gcc tac aac gct gca atg gat aag ateMet Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Met Asp Lys Ile1 5 10

gat tgg tet gat ccc gat gga aag ttc cgt gccAsp Trp Ser Asp Pro Asp Gly Lys Phe Arg Ala

20 25

tgg ctc tgc gac ttc cgt age gcc ate acc ateTrp Leu Cys Asp Phe Arg Ser Ala Ile Thr Ile

35 40

gcc ttc gtc ate ctc ggt tcc gcc gtc atg caaAla Phe Val Ile Leu Gly Ser Ala Val Met Gln

50 55

gat ccc tac ccc ate aaa ttc ctc tac aac gtcAsp Pro Tyr Pro Ile Lys Phe Leu Tyr Asn Val65 70 75

tgt gcc tac atg act gtc gag gcg gga ttt ttgCys Ala Tyr Met Thr Val Glu Ala Gly Phe Leu

85 90

tat acc gtc atg cct tgc aat cat ttc aat gtgTyr Thr Val Met Pro Cys Asn His Phe Asn Val

100 105

gcg aat ctt ctt tgg ttg ttt tat att tcc aagAla Asn Leu Leu Trp Leu Phe Tyr Ile Ser Lys

115 120

gat acc att ttc att gtg ttg ggg aag aag tggAsp Thr Ile Phe Ile Val Leu Gly Lys Lys Trp

130 135

ttg cat gta tac cat cac acc acc ate ttt ctaLeu His Val Tyr His His Thr Thr Ile Phe Leu145 150 155

gcc aat gtc ttg tac gat ggt gac ate ttc cttAla Asn Val Leu Tyr Asp Gly Asp Ile Phe Leu165 170

ggt gcc gccGly Ala Ala

gat agaAsp Arg

gcc ctcAla Leu45

tcc ctcSer Leu60

tcc caaSer Gln

gag

Glu

30

ate

Ile

CCC

Pro

ateIle

gcc tac cgcAla Tyr Arg

aat gat cctAsn Asp Pro110

gtg tgg gacVal Trp Asp125

cgt caa ttaArg Gln Leu140

ttc tat tggPhe Tyr Trp

acc ate ttgThr Ile Leu

ate ateIle Ile15

gac tggAsp Trp

tac ateTyr Ile

gca atgAla Met

ttc cttPhe Leu80aat ggaAsn Gly95

ccc gtgPro Val

ttt tggPhe Trp

tet ttcSer Phe

ctg aatLeu Asn160ctc aatLeu Asn175

60120180240300360420480540600660720755

60120180211

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528gga ttc ate cac acg gtg atg tac acg tat tac ttc ate tgt atg cat 576

Gly Phe Ile His Thr Val Met Tyr Thr Tyr Tyr Phe Ile Cys Met His

180 185 190

acc aaa gat tcc aag acg ggc aag agt ctt cct ata tgg tgg aag tcgThr Lys Asp Ser Lys Thr Gly Lys Ser Leu Pro Ile Trp Trp Lys Ser

195 200 205

agt ttg acg gcg ttt cag ttg ttg caa ttc act ate atg atg agt cagSer Leu Thr Ala Phe Gln Leu Leu Gln Phe Thr Ile Met Met Ser Gln

210 215 220

gct acc tac ctt gtc ttc cac ggg tgt gat aag gtg tcg ctt cgt ateAla Thr Tyr Leu Val Phe His Gly Cys Asp Lys Val Ser Leu Arg Ile225 230 235 240

acg att gtg tac ttt gtg tcc ctt ttg agt ttg ttc ttc ctt ttt gctThr Ile Val Tyr Phe Val Ser Leu Leu Ser Leu Phe Phe Leu Phe Ala

24b 250 255

cag ttc ttt gtg caa tca tac atg gea ccc aaa aag aag aag agt gctGln Phe Phe Val Gln Ser Tyr Met Ala Pro Lys Lys Lys Lys Ser Ala260 265 270

624

672

720

768

816

tag

819

<210> 164

<211> 272

<212> PRT

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 164 Met Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Met Asp Lys Ile Gly Ala Ala Ile Ile1 5 10 15 Asp Trp Ser Asp Pro Asp Gly Lys Phe Arg Ala Asp Arg Glu Asp Trp 20 25 30 Trp Leu Cys 35 Asp Phe Arg Ser Ala 40 Ile Thr Ile Ala Leu 45 Ile Tyr IleAla Phe 50 Val Ile Leu Gly Ser 55 Ala Val Met Gln Ser 60 Leu Pro Ala MetAsp Pro Tyr Pro Ile Lys Phe Leu Tyr Asn Val Ser Gln Ile Phe Leu65 70 75 80Cys Ala Tyr Met Thr Val Glu Ala Gly Phe Leu Ala Tyr Arg Asn Gly 85 90 95 Tyr Thr Val Met Pro Cys Asn His Phe Asn Val Asn Asp Pro Pro Val 100 105 110 Ala Asn Leu 115 Leu Trp Leu Phe Tyr 120 Ile Ser Lys Val Trp 125 Asp Phe TrpAsp Thr Ile Phe Ile Val Leu Gly Lys Lys Trp Arg Gln Leu Ser Phe 130 135 140 Leu His Val Tyr His His Thr Thr Ile Phe Leu Phe Tyr Trp Leu Asn145 150 155 160Ala Asn Val Leu Tyr 165 Asp Gly Asp Ile Phe 170 Leu Thr Ile Leu Leu 175 AsnGly Phe Ile His Thr Val Met Tyr Thr Tyr Tyr Phe Ile Cys Met His 180 185 190 Thr Lys Asp Ser Lys Thr Gly Lys Ser Leu Pro Ile Trp Trp Lys Ser 195 200 205 Ser Leu 210 Thr Ala Phe Gln Leu 215 Leu Gln Phe Thr Ile 220 Met Met Ser GlnAla Thr Tyr Leu Val Phe His Gly Cys Asp Lys Val Ser Leu Arg Ile225 230 235 240Thr Ile Val Tyr Phe Val Ser Leu Leu Ser Leu Phe Phe Leu Phe Ala 245 250 255 Gln Phe Phe Val 260 Gln Ser Tyr Met Ala 265 Pro Lys Lys Lys Lys 270 Ser Ala<210> 165

<211> 837<212> DNA

<213> Phaeodactylum tricornutum<220>

<221> CDS<222> (1)..(837)<400> 165

atg atg gta cct tca agt tat gac gag tat ate gtc atg gtc aac gacMet Met Val Pro Ser Ser Tyr Asp Glu Tyr Ile Val Met Val Asn Asp1 5 10 15

ctt ggc gac tet att ctg age tgg gcc gac cct gat cac tat cgt ggaLeu Gly Asp Ser Ile Leu Ser Trp Ala Asp Pro Asp His Tyr Arg Gly

20 25 30

cat acc gag gga tgg gag ttc act gac ttt tet gct gct ttt age attHis Thr Glu Gly Trp Glu Phe Thr Asp Phe Ser Ala Ala Phe Ser Ile

35 40 45

gcc gtc gcg tac etc ctg ttt gtc ttt gtt gga tet etc att atg agtAla Val Ala Tyr Leu Leu Phe Val Phe-Va-I-Gly Ser Leu Ile Met Ser

50 55 60

atg gga gtc ccc gea att gac cct tat ccg ctc aag ttt gtc tac aatMet Gly Val Pro Ala Ile Asp Pro Tyr Pro Leu Lys Phe Val Tyr Asn65 70 75 80

gtt tca cag att atg ctt tgt gct tac atg acc att gaa gcc agt cttVal Ser Gln Ile Met Leu Cys Ala Tyr Met Thr Ile Glu Ala Ser Leu

85 90 95

cta gct tat cgt aac ggc tac aca ttc tgg cct tgc aac gat tgg gacLeu Ala Tyr Arg Asn Gly Tyr Thr Phe Trp Pro Cys Asn Asp Trp Asp

100 105 HO

ttt gaa aag ccg cct ate gct aag ctc ctc tgg ctc ttt tac gtt tccPhe Glu Lys Pro Pro Ile Ala Lys Leu Leu Trp Leu Phe Tyr Val Ser

115 120 125

aaa att tgg gat ttt tgg gac acc ate ttt att gtt ctc ggg aag aagLys Ile Trp Asp Phe Trp Asp Thr Ile Phe Ile Val Leu Gly Lys Lys

130 135 140

tgg cgt caa ctt tcc ttc ctg cac gtc tac cat cac acc acc ate tttTrp Arg Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr His His Thr Thr Ile Phe145 150 155 160

ctc ttc tac tgg ttg aat gea cat gta aac ttt gat ggt gat att ttcLeu Phe Tyr Trp Leu Asn Ala His Val Asn Phe Asp Gly Asp Ile Phe

165 170 175

ctc acc ate gtc ttg aac ggt ttc ate cac acc gtc atg tac acg tacLeu Thr Ile Val Leu Asn Gly Phe Ile His Thr Val Met Tyr Thr Tyr

180 185 190

tac ttc att tgc atg cac acc aag gtc cca gag acc ggc aaa tcc ttgTyr Phe Ile Cys Met His Thr Lys Val Pro Glu Thr Gly Lys Ser Leu

195 200 205

ccc att tgg tgg aaa tet agt ttg aca age atg cag ctg gtg cag ttcPro Ile Trp Trp Lys Ser Ser Leu Thr Ser Met Gln Leu Val Gln Phe

210 215 220

ate acg atg atg acg cag gct ate atg ate ttg tac aag ggc tgt gctIle Thr Met Met Thr Gln Ala Ile Met Ile Leu Tyr Lys Gly Cys Ala225 230 235 240

gct ccc cat age cgg gtg gtg aca tcg tac ttg gtt tac att ttg tcgAla Pro His Ser Arg Val Val Thr Ser Tyr Leu Val Tyr Ile Leu Ser

245 250 255

ctc ttt att ttg ttc gcc cag ttc ttt gtc age tca tac ctc aag ccgLeu Phe Ile Leu Phe Ala Gln Phe Phe Val Ser Ser Tyr Leu Lys Pro

260 265 270

aag aag aag aag aca gct taaLys Lys Lys Lys Thr Ala

275<210> 166<211> 278<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum<400> 166

96

144

192

240

288

336

384

132

480

528

576

624

672

720

768

816

837Met1

Leu

His

Ala

Met

65

Val

Met

Gly

Thr

Val

50

Gly

Ser

Leu AlaPhe Glu

Lys

Trp145Leu

Leu

Tyr

Pro

Ile225Ala

Leu

Ile130Arg

Phe

Thr

Phe

Ile210Thr

Pro

Phe

Lys Lys

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>

Val Pro Ser Ser Tyr Asp Glu Tyr Ile Val Met Val Asn

5 10 15

Asp Ser Ile Leu Ser Trp Ala Asp Pro Asp His Tyr Arg

20 25 30

Glu Gly Trp Glu Phe Thr Asp Phe Ser Ala Ala Phe Ser35 40 45

Ala Tyr Leu Leu Phe Val Phe Val Gly Ser Leu Ile Met55 60Val Pro Ala Ile Asp Pro Tyr Pro Leu Lys Phe Val Tyr

70 75

Gln Ile Met Leu Cys Ala Tyr Met Thr Ile Glu Ala Ser

85 90 95

Tyr Arg Asn Gly Tyr Thr Phe Trp Pro Cys Asn Asp Trp

100 105 HO

Lys Pro Pro Ile Ala Lys Leu Leu Trp Leu Phe Tyr Val115 120 125

Trp Asp Phe Trp Asp Thr Ile Phe Ile Val Leu Gly Lys

135 140

Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr His His Thr Thr Ile

150 155

Tyr Trp Leu Asn Ala His Val Asn Phe Asp Gly Asp Ile165 170 175

Ile Val Leu Asn Gly Phe Ile His Thr Val Met Tyr Thr

180 185 190

Ile Cys Met His Thr Lys Val Pro Glu Thr Gly Lys Ser195 200 205

Trp Trp Lys Ser Ser Leu Thr Ser Met Gln Leu Val Gln215 220Met Met Thr Gln Ala Ile Met Ile Leu Tyr Lys Gly Cys

230 235

His Ser Arg Val Val Thr Ser Tyr Leu Val Tyr Ile Leu245 250 255

Ile Leu Phe Ala Gln Phe Phe Val Ser Ser Tyr Leu Lys

260 265 270

Lys Lys Thr Ala275167272PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(2)

xaa na posição 2 é qualquer aminoácido

Variante(4)..(10)

xaa na posição 4 a 10 é qualquer aminoácido

Variante(12)..(13)

xaa na posição 12 a 13 é qualquer aminoácido

Variante(15)..(16)

xaa na posição 15 a 16 é qualquer aminoácido

Variante(18)..(18)

xaa na posição 18 é qualquer aminoácido

Variante(22)..(23)

Asp

Gly

Ile

Ser

Asn80Leu

Asp

Ser

Lys

Phe160Phe

Tyr

Leu

Phe

Ala240Ser

Pro<223> xaa na posição 22 a 23 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (24) .. (24) <223> xaa na posição 24 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (26) .. (28) <223> xaa na posição 26 a 28 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (30)..(30) <223> xaa na posição 30 é qualquer aminoácido<220> < 2-2-1 > Variante - -------- --------- -------<222> (32)..(34) <223> xaa na posição 32 a 34 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (37)..(38) <223> xaa na posição 37 a 38 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (40)..(41) <223> xaa na posição 40 a 41 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (44)..(45) <223> xaa na posição 44 a 4 5 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (47) .. (48) <223> xaa na posição 47 a 4 8 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (51)..(52) <223> xaa na posição 51 a 52 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (55)..(56) <223> xaa na posição 55 a 56 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (58)..(60) <223> xaa na posição 58 a 60 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (61)..(61) <223> xaa na posição 61 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220> <221> Variante <222> (64) . . (64) <223> xaa na posição 64 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (69)..(69) <223> xaa na posição 69 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (72)..(72) <223> xaa na posição 72 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante<222> (79) . . (79)

<223> xaa na posição 79 é

<220>

<221> Variante

<222> (86)..(86)

<223> xaa na posição 86 é

<220>

<221> Variante

<222> (89)..(90)

<223> xaa na posição 89 a

<220>

<221> Variante

<222> (99)..(100)

<223> xaa na posição 99 a

<220> -

<221> Variante

<222> (104)..(109)

<223> xaa na posição 104<220>

<221> Variante

<222> (112)..(112)

<223> xaa na posição 112<220>

<221> Variante

<222> (114)..(114)

<223> xaa na posição 114<220>

<221> Variante

<222> (121).. (121)

<223> xaa na posição 121<220>

<221> Variante

<222> (124)..(124)

<223> xaa na posição 124<220>

<221> Variante

<222> (162)..(162)

<223> xaa na posição 162<220>

<221> Variante

<222> (164)..(165)

<223> xaa na posição 164<220>

<221> Variante

<222> (174)..(174)

<223> xaa na posição 174<220>

<221> Variante

<222> (195)..(197)

<223> xaa na posição 195<220>

<221> Variante

<222> (212)..(213)

<223> xaa na posição 212<220>

<221> Variante

<222> (216)..(216)

<223> xaa na posição 216<220>

<221> Variante

<222> (219)..(220)

<223> xaa na posição 219<220>

qualquer aminoácido

qualquer aminoácido

90 é qualquer aminoácido

100 é qualquer aminoácido

a 109 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

a 165 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

a 197 é qualquer aminoácido

a 213 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

a 220 é qualquer aminoácido<221> Variante

<222> (223)..(223)

<223> xaa na posição 223 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (226)..(231)

<223> xaa na posição 226 a 231 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (234) . . (238)

<223> xaa na posição 234 a 238 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (240) . . (243)

<223> xaa na posição 240 -a—2-43—é—qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (245) . . (245)

<223> xaa na posição 245 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (247)..(248)

<223> xaa na posição 247 a 248 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (253)..(253)

<223> xaa na posição 253 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (261)..(261)

<223> xaa na posição 261 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (264) . . (265)

<223> xaa na posição 264 a 265 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (271) . . (271)

<223> xaa na posição 271 é qualquer aminoácido

<4 00> 167 Asp xaa Tyr xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly xaa xaa Ile xaa xaa1 5 10 15 Trp xaa Asp Pro Asp xaa xaa xaa Arg xaa xaa xaa Glu xaa Trp xaa 20 25 30 xaa xaa Asp 35 Phe xaa xaa Ala xaa 40 xaa Ile Ala xaa xaa 45 Tyr xaa xaaPhe Val 50 xaa xaa Gly Ser xaa 55 xaa Met xaa xaa xaa 60 xaa Pro Ala xaaAsp Pro Tyr Pro xaa Lys Phe xaa Tyr Asn Val Ser Gln Ile xaa Leu65 70 75 80Cys Ala Tyr Met Thr xaa Glu Ala xaa xaa Leu Ala Tyr Arg Asn Gly 85 90 95 Tyr Thr xaa xaa Pro Cys Asn xaa xaa xaa xaa xaa xaa Pro Pro xaa 100 105 110 Ala xaa Leu 115 Leu Trp Leu Phe Tyr 120 xaa Ser Lys xaa Trp 125 Asp Phe TrpAsp Thr Ile Phe Ile Val Leu Gly Lys Lys Trp Arg Gln Leu Ser Phe 130 135 140 Leu His Val Tyr His His Thr Thr Ile Phe Leu Phe Tyr Trp Leu Asn145 150 155 160Ala xaa Val xaa xaa 165 Asp Gly Asp Ile Phe 170 Leu Thr Ile xaa Leu 175 AsnGly Phe Ile His Thr Val Met Tyr Thr Tyr Tyr Phe Ile Cys Met HisThr Lys

Ser Leu210Ala xaa225

xaa xaa

Gln Phe

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>

Gly Lys1

Thr Ile

xaa xaa

Tyr Thr50

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>

180 185 190

xaa xaa xaa Thr Gly Lys Ser Leu Pro Ile Trp Trp Lys Ser195 200 205

Thr xaa xaa Gln Leu xaa Gln Phe xaa xaa Met Met xaa Gln215 220

xaa xaa xaa xaa xaa Gly Cys xaa xaa xaa xaa xaa Arg xaa230 235 240

xaa Tyr xaa Val xaa xaa Leu Ser Leu Phe xaa Leu Phe Ala

245 250 255

Phe Val xaa Ser Tyr xaa xaa Pro Lys Lys Lys Lys xaa Ala260 265 270

168

59

PRT

Seqüência artificial

Var i ante(27).. (27)

xaa na posição 27 é qualquer aminoácido

Variante

(29) . . (29)

xaa na posição 29 é qualquer aminoácido

Variante

(30).. (34)

xaa na posição 30 a 34 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(39)..(39)

xaa na posição 39 é Leu ou Val168

Lys Trp Arg Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr His His Thr

5 10 15

Phe Leu Phe Tyr Trp Leu Asn Ala xaa Val xaa xaa xaa xaa

20 25 30

Phe Leu Thr Ile xaa Leu Asn Gly Phe Ile His Thr Val Met

35 40 45

Tyr Tyr Phe Ile Cys Met His Thr Lys55

169

60PRT

Seqüência artificial

Variante(7)..(7)

xaa na posição 7 é Phe ou Met

Variante(14)..(14)

xaa na posição 14 é Ile ou Val

Variante

(17)..(17)

xaa na posição 17 é qualquer aminoácido

Variante

(18)..(18)

xaa na posição 18 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(20)..(20)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Tyr Asn1

xaa xaa

xaa xaa

Tyr xaa50

<210><211><212><213><220>

xaa na posição 20 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(28) . . (28)

xaa na posição 28 é Phe ou Val

Variante(29).. (29)

xaa na posição 29 é qualquer aminoácido

Variante

(33)..(33)

xaa na posição 33 é Asp ou His

Variante

(34)..(34)

xaa na posição 34 é Phe ou Trp

Variante

(35)..(35)

xaa na posição 35 é Asp ou Asn

Variante

(36)..(36)

xaa na posição 36 é Phe ou Val

Variante

(37) . . (37)

xaa na posição 37 é Glu ou Asn

Variante

(38) .. (38)

xaa na posição 38 é Asp ou Lys

Variante(41) .. (41)

xaa na posição 41 é Ile ou Val

Variante(43)..(43)

xaa na posição 43 é qualquer aminoácido

Variante(50)..(50)

xaa na posição 50 é Ile ou Val

Variante(53)..(53)

xaa na posição 53 é Ile ou Val

169

Val Ser Gln Ile xaa Leu Cys Ala Tyr Met Thr xaa Glu Ala

5 10 15

Leu xaa Ala Tyr Arg Asn Gly Tyr Thr xaa xaa Pro Cys Asn

20 25 30

xaa xaa xaa xaa Pro Pro xaa Ala xaa Leu Leu Trp Leu Phe

35 40 45

Ser Lys xaa Trp Asp Phe Trp Asp Thr Ile55 60

17039

PRT

Seqüência artificial<221> Variante

<222> (11).. (11)

<223> xaa na posição 11 é Ala ou Ser<220>

<221> Variante

<222> (12).. (12)

<223> xaa na posição 12 é Phe ou Met<220>

<221> Variante

<222> (15).. (15)

<223> xaa na posição 15 é Leu ou Val<220>

<221> Variante

<222> (18)..(18)

<223> xaa na posição 18 é qualquer um ou nenhum aminoácido

<220>

<221> Variante

<222> (20)..(20)

<223> xaa na posição 20 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (22)..(22)

<223> xaa na posição 22 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (23) . . (23)

<223> xaa na posição 23 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (26) .. (27)

<223> xaa na posição 26 a 27 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (28) .. (28)

<223> xaa na posição 28 é Ile ou Leu<220>

<221> Variante

<222> (29)..(29)

<223> xaa na posição 29 é Leu ou Val<220>

<221> Variante

<222> (30)..(30)

<223> xaa na posição 30 é Phe ou Tyr<220>

<221> Variante

<222> (31).. (31)

<223> xaa na posição 31 é His ou Lys<220>

<221> Variante

<222> (34)..(34)

<223> xaa na posição 34 é Ala ou Asp<220>

<221> Variante

<222> (35)..(35)

<223> xaa na posição 35 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (36) . . (36)

<223> xaa na posição 36 é Pro ou Val<220>

<221> Variante

<222> (37)..(38)

<223> xaa na posição 37 a 38 é qualquer aminoácido<400> 170

Leu Pro Ile Trp Trp Lys Ser Ser Leu Thr xaa xaa Gln Leu xaa Gln

1 5 10 15

Phe xaa Ile xaa Met xaa xaa Gln Ala xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly

20 25 30

Cys xaa xaa xaa xaa xaa Arg35

<210> 171<211> 831<212> DNA

<213> Traustochytrium sp.<220>

<221> CDS<222> (1) . . (831)<400> 171

atg gac gtc gtc gag cag(caa tgg cgc cgc ttc gtg gac gcc gtg gacMet Asp Val Val Glu Gln Gln Trp Arg Arg Phe Val Asp Ala Val Asp1 5 10 15

aac gga ate gtg gag ttc atg gag cat gag aag ccc aac aag ctg aacAsn Gly Ile Val Glu Phe Met Glu His Glu Lys Pro Asn Lys Leu Asn

20 25 30

gag ggc aag ctc ttc acc tcg acc gag gag atg atg gcg ctt ate gtcGlu Gly Lys Leu Phe Thr Ser Thr Glu Glu Met Met Ala Leu Ile Val

35 40 45

ggc tac ctg gcg ttc gtg gtc ctc ggg tcc gcc ttc atg aag gcc tttGly Tyr Leu Ala Phe Val Val Leu Gly Ser Ala Phe Met Lys Ala Phe

50 55 60

gtc gat aag cct ttc gag ctc aag ttc ctc aag ctc gtg cac aac ateVal Asp Lys Pro Phe Glu Leu Lys Phe Leu Lys Leu Val His Asn Ile65 70 75 80

ttc ctc acc ggt ctg tcc atg tac atg gcc acc gag tgc gcg cgc cagPhe Leu Thr Gly Leu Ser Met Tyr Met Ala Thr Glu Cys Ala Arg Gln

85 90 95

gea tac ctc ggc ggc tac aag ctc ttt ggc aac ccg atg gag aag ggcAla Tyr Leu Gly Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Asn Pro Met Glu Lys Gly

100 105 HO

acc gag tcg cac gcc ccg ggc atg gcc aac ate ate tac ate ttc tacThr Glu Ser His Ala Pro Gly Met Ala Asn Ile Ile Tyr Ile Phe Tyr

115 120 125

gtg age aag ttc ctc gaa ttc ctc gac acc gtc ttc atg ate ctc ggcVal Ser Lys Phe Leu Glu Phe Leu Asp Thr Val Phe Met Ile Leu Gly

130 135 140

aag aag tgg aag cag ctc age ttt ctc cac gtc tac cac cac gcg ageLys Lys Trp Lys Gln Leu Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ala Ser145 150 155 160

ate age ttc ate tgg ggc ate ate gcc cgc ttc gcg ccc ggt ggc gacIle Ser Phe Ile Trp Gly Ile Ile Ala Arg Phe Ala Pro Gly Gly Asp

165 170 175

gcc tac ttc tet acc ate ctc aac age age gtg cat gtc gtg ctc tacAla Tyr Phe Ser Thr Ile Leu Asn Ser Ser Val His Val Val Leu Tyr

180 185 190

ggc tac tac gcc tcg acc acc ctc ggc tac acc ttc atg cgc ccg ctgGly Tyr Tyr Ala Ser Thr Thr Leu Gly Tyr Thr Phe Met Arg Pro Leu

195 200 205

cgc ccg tac att acc acc att cag ctc acg cag ttc atg gcc atg gtcArg Pro Tyr Ile Thr Thr Ile Gln Leu Thr Gln Phe Met Ala Met Val

210 215 220

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260 265 270

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<213> Ostreococcus tauri<220>

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Lys Tyr Val Ser Ala Pro Ala Lys Pro Ala Lys Ile Lys Ser Lys Lys275 280 285

Ala Glu290<210> 181<211> 873<212> DNA

<213> Physcomitrella patens<220>

<221> CDS<222> (1)..(873)<400> 181

atg gag gtc gtg gag aga ttc tac ggt gag ttg gat ggg aag gtc tcgMet Glu Val Val Glu Arg Phe Tyr Gly Glu Leu Asp Gly Lys Val Ser1 5 10 15

cag ggc gtg aat gca ttg ctg ggt agt ttt ggg gtg gag ttg acg gatGln Gly Val Asn Ala Leu Leu Gly Ser Phe Gly Val Glu Leu Thr Asp

864873

489620 25 30

acg CCC act acc aaa ggc ttg CCC CtC gtt gac agt CCC aca CCC ate 144Thr Pro Thr Thr Lys Gly Leu Pro Leu Val Asp Ser Pro Thr Pro Ile 35 40 45 192gtc CtC ggt gtt tct gta tac ttg act att gtc att gga ggg Ctt ttg Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Leu Thr Ile Val Ile Gly Gly Leu Leu 50 55 60 240tgg ata aag gcc agg gat ctg aaa ccg cgc gcc tcg gag cca ttt ttg Trp Ile Lys Ala Arg Asp Leu Lys Pro Arg Ala Ser Glu Pro Phe Leu 65 70 75 80 288CtC caa gct ttg gtg Ctt gtg cac aac ctg ttc tgt ttt gcg CtC agt Leu Gln Ala Leu Val 85 Leu Val His Asn Leu 90 Phe Cys Phe Ala Leu 95 Ser ctg tat atg tgc gtg ggc ate gct tat cag gct att acc tgg cgg tac 336Leu Tyr Met Cys Val Gly Ile Ala- Tyr- Gln Ala- -Ile- -Thr- -Trp_ Arg- Tyr 100 105 110 tct CtC tgg ggc aat gea tac aat CCt aaa cat aaa gag atg gcg att 384Ser Leu Trp Gly Asn Ala Tyr Asn Pro Lys His Lys Glu Met Ala Ile 115 120 125 432ctg gta tac ttg ttc tac atg tct aag tac gtg gaa ttc atg gat acc Leu Val Tyr Leu Phe Tyr Met Ser Lys Tyr Val Glu Phe Met Asp Thr 130 135 140 480gtt ate atg ata ctg aag cgc age acc agg caa ata age ttc CtC cac Val Ile Met Ile Leu Lys Arg Ser Thr Arg Gln Ile Ser Phe Leu His 145 150 155 160 gtt tat cat cat tct tca att tcc CtC att tgg tgg gct att gct cat 528Val Tyr His His Ser Ser Ile Ser Leu Ile Trp Trp Ala Ile Ala His 165 170 175 cac gct CCt ggc ggt gaa gea tat tgg tct gcg gct ctg aac tca gga 576His Ala Pro Gly 180 Gly Glu Ala Tyr Trp 185 Ser Ala Ala Leu Asn 190 Ser Gly gtg cat gtt CtC atg tat gcg tat tac ttc ttg gct gcc tgc Ctt cga 624Val His Val Leu Met Tyr Ala Tyr Tyr Phe Leu Ala Ala Cys Leu Arg 195 200 205 672agt age cca aag tta aaa aat aag tac Ctt ttt tgg ggc agg tac ttg Ser Ser 210 Pro Lys Leu Lys Asn 215 Lys Tyr Leu Phe Trp 220 Gly Arg Tyr Leu aca caa ttc caa atg ttc cag ttt atg ctg aac tta gtg cag gct tac 720Thr Gln Phe Gln Met Phe Gln Phe Met Leu Asn Leu Val Gln Ala Tyr 225 230 235 240 768tac gac atg aaa acg aat gcg cca tat cca caa tgg ctg ate aag att Tyr Asp Met Lys Thr Asn Ala Pro Tyr Pro Gln Trp Leu Ile Lys Ile 245 250 255 ttg ttc tac tac atg ate tcg ttg ctg ttt Ctt ttc ggc aat ttt tac 816Leu Phe Tyr Tyr Met Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Asn Phe Tyr 260 265 270 864gta caa aaa tac ate aaa CCC tct gac gga aag caa aag gga gct aaa Val Gln Lys Tyr Ile Lys Pro Ser Asp Gly Lys Gln Lys Gly Ala Lys 275 280 285 873act gag tga Thr Glu 290 <210> 182 <211> 290 <212> PRT <213> Physcomitrella patens <4 00> 182 Met Glu Val Val Glu Arg Phe Tyr Gly Glu Leu Asp Gly Lys Val Ser 1 5 10 15 Gln Gly Val Asn Ala Leu Leu Gly Ser Phe Gly Val Glu Leu Thr Asp 20 25 30 Thr Pro Thr Thr Lys Gly Leu Pro Leu Val Asp Ser Pro Thr Pro Ile

35 40 45Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Leu Thr Ile Val Ile Gly Gly Leu Leu

50 55 60

Trp Ile Lys Ala Arg Asp Leu Lys Pro Arg Ala Ser Glu Pro Phe Leu65 70 75 80

Leu Gln Ala Leu Val Leu Val His Asn Leu Phe Cys Phe Ala Leu Ser

85 90 95

Leu Tyr Met Cys Val Gly Ile Ala Tyr Gln Ala Ile Thr Trp Arg Tyr

100 105 HO

Ser Leu Trp Gly Asn Ala Tyr Asn Pro Lys His Lys Glu Met Ala Ile

115 120 125

Leu Val Tyr Leu Phe Tyr Met Ser Lys Tyr Val Glu Phe Met Asp Thr

130 135 140

Val Ile Met Ile Leu Lys Arg Ser Thr Arg Gln Ile Ser Phe Leu His145 150 155 160

Val Tyr His- His Ser- Ser-- Ile Ser- Lcu lie Trp Trp Ala Ile Ala His

165 170 175

His Ala Pro Gly Gly Glu Ala Tyr Trp Ser Ala Ala Leu Asn Ser Gly

180 185 190

Val His Val Leu Met Tyr Ala Tyr Tyr Phe Leu Ala Ala Cys Leu Arg

195 200 205

Ser Ser Pro Lys Leu Lys Asn Lys Tyr Leu Phe Trp Gly Arg Tyr Leu

210 215 220

Thr Gln Phe Gln Met Phe Gln Phe Met Leu Asn Leu Val Gln Ala Tyr225 230 235 240

Tyr Asp Met Lys Thr Asn Ala Pro Tyr Pro Gln Trp Leu Ile Lys Ile

245 250 255

Leu Phe Tyr Tyr Met Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Asn Phe Tyr

260 265 270

Val Gln Lys Tyr Ile Lys Pro Ser Asp Gly Lys Gln Lys Gly Ala Lys275 280 285

Thr Glu290<210> 183<211> 957<212> DNA

<213> Mortierella alpina<220>

<221> CDS<222> (1)..(957)<400> 183

atg gag tcg att gcg cca ttc ctc cca tca aag atg ccg caa gat ctgMet Glu Ser Ile Ala Pro Phe Leu Pro Ser Lys Met Pro Gln Asp Leu15 10 15

ttt atg gac ctt gcc acc gct ate ggt gtc cgg gcc gcg ccc tat gtcPhe Met Asp Leu Ala Thr Ala Ile Gly Val Arg Ala Ala Pro Tyr Val

20 25 30

gat cct ctc gag gcc gcg ctg gtg gcc cag gcc gag aag tac ate cccAsp Pro Leu Glu Ala Ala Leu Val Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ile Pro

35 40 45

acg att gtc cat cac acg cgt ggg ttc ctg gtc gcg gtg gag tcg cctThr Ile Val His His Thr Arg Gly Phe Leu Val Ala Val Glu Ser Pro

50 55 60

ttg gcc cgt gag ctg ccg ttg atg aac ccg ttc cac gtg ctg ttg ateLeu Ala Arg Glu Leu Pro Leu Met Asn Pro Phe His Val Leu Leu Ile65 70 75 80

gtg ctc gct tat ttg gtc acg gtc ttt gtg ggc atg cag ate atg aagVal Leu Ala Tyr Leu Val Thr Val Phe Val Gly Met Gln Ile Met Lys

85 90 95

aac ttt gag cgg ttc gag gtc aag acg ttt tcg ctc ctg cac aac tttAsn Phe Glu Arg Phe Glu Val Lys Thr Phe Ser Leu Leu His Asn Phe

100 105 HO

tgt ctg gtc tcg ate age gcc tac atg tgc ggt ggg ate ctg tac gagCys Leu Val Ser Ile Ser Ala Tyr Met Cys Gly Gly Ile Leu Tyr Glu

48

96

144

192

240

288

336

38<115 120 125 gct tat cag gcc aac tat gga ctg ttt gag aac gct gct gat cat acc 432Ala Tyr 130 Gln Ala Asn Tyr Gly 135 Leu Phe Glu Asn Ala 140 Ala Asp His Thr ttc aag ggt Ctt CCt atg gcc aag atg ate tgg CtC ttc tac ttc tcc 480Phe Lys Gly Leu Pro Met Ala Lys Met Ile Trp Leu Phe Tyr Phe Ser 145 150 155 160 aag ate atg gag ttt gtc gac a cc atg ate atg gtc CtC aag aag aac 528Lys Ile Met Glu Phe Val Asp Thr Met Ile Met Val Leu Lys Lys Asn 165 170 175 aac cgc cag ate tee ttc ttg cac gtt tac cac cac age tcc ate ttc 57 6Asn Arg Gln Ile Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ser Ser Ile Phe 180 185 190 acc ate tgg tgg ttg gtc acc ttt gtt gea CCC aac ggt gaa gcc tac 624Thr Ile Trp 195 Trp -Leu Val- Thr Phe 200 Va 1 Ala- -Pro- -Asn- -Gly- 205 -Gl-U- Ala Tyr — -ttc tct gct gcg ttg aac tcg ttc ate cat gtg atc atg tac ggc tac 672Phe Ser 210 Ala Ala Leu Asn Ser 215 Phe Ile His Val Ile 220 Met Tyr Gly Tyr tac ttc ttg tcg gcc ttg ggc ttc aag cag gtg tcg ttc ate aag ttc 720Tyr Phe Leu Ser Ala Leu Gly Phe Lys Gln Val Ser Phe Ile Lys Phe 225 230 235 240 tac ate acg cgc tcg cag atg aca cag ttc tgc atg atg tcg gtc cag 768Tyr Ile Thr Arg Ser Gln Met Thr Gln Phe Cys Met Met Ser Val Gln 245 250 255 tct tcc tgg gac atg tac gcc atg aag gtc Ctt ggc cgc CCC gga tac 816Ser Ser Trp Asp 260 Met Tyr Ala Met Lys 265 Val Leu Gly Arg Pro 270 Gly Tyr CCC ttc ttc ate acg gct ctg Ctt tgg ttc tac atg tgg acc atg CtC 864Pro Phe Phe 275 Ile Thr Ala Leu Leu 280 Trp Phe Tyr Met Trp 285 Thr Met Leu ggt CtC ttc tac aac ttt tac aga aag aac gcc aag ttg gcc aag cag 912Gly Leu Phe Tyr Asn Phe Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Leu Ala Lys Gln 290 295 300 957gcc aag gcc gac gct gcc aag gag aag gea agg aag ttg cag taa Ala Lys Ala Asp Ala Ala Lys Glu Lys Ala Arg Lys Leu Gln 305 310 315 <210> 184 <211> 318 <212> PRT <213> Mortierella alpina <4 00> 184 Met Glu Ser Ile Ala Pro Phe Leu Pro Ser Lys Met Pro Gln Asp Leu 1 5 10 15 Phe Met Asp Leu 20 Ala Thr Ala Ile Gly 25 Val Arg Ala Ala Pro 30 Tyr Val Asp Pro Leu Glu Ala Ala Leu Val Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ile Pro 35 40 45 Thr Ile 50 Val His His Thr Arg 55 Gly Phe Leu Val Ala 60 Val Glu Ser Pro Leu Ala Arg Glu Leu Pro Leu Met Asn Pro Phe His Val Leu Leu Ile 65 70 75 80 Val Leu Ala Tyr Leu Val Thr Val Phe Val Gly Met Gln Ile Met Lys 85 90 95 Asn Phe Glu Arg 100 Phe Glu Val Lys Thr 105 Phe Ser Leu Leu His 110 Asn Phe Cys Leu Val 115 Ser Ile Ser Ala Tyr 120 Met Cys Gly Gly Ile 125 Leu Tyr Glu Ala Tyr 130 Gln Ala Asn Tyr Gly 135 Leu Phe Glu Asn Ala 140 Ala Asp His Thr Phe Lys Gly Leu Pro Met Ala Lys Met Ile Trp Leu Phe Tyr Phe Ser 145 150 155 160 Lys Ile Met Glu Phe Val Asp Thr Met Ile Met Val Leu Lys Lys AsnAsn Arg

Thr Ile

Phe Ser210Tyr Phe225

Tyr Ile

Ser Ser

Pro Phe

Gly Leu290Ala Lys305<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

165 170 175

Gln Ile Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ser Ser Ile Phe

180 185 190

Trp Trp Leu Val Thr Phe Val Ala Pro Asn Gly Glu Ala Tyr195 200 205

Ala Ala Leu Asn Ser Phe Ile His Val Ile Met Tyr Gly Tyr215 220Leu Ser Ala Leu Gly Phe Lys Gln Val Ser Phe Ile Lys Phe230 235 240

Thr Arg Ser Gln Met Thr Gln Phe Cys Met Met Ser Val Gln

245 250 255

Trp Asp Met Tyr Ala Met Lys Val Leu Gly Arg Pro Gly Tyr

260 265 270

Phe Ile Thr Ala Leu Leu Trp Phe Tyr Met Trp Thr Met Leu275 280 285

Pho Tyr Asn Phe Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Leu Ala Lys Gln

295 300

Ala Asp Ala Ala Lys Glu Lys Ala Arg Lys Leu Gln310 315

185251PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(11)

xaa na posição 2 a 11 é qualquer aminoácido

Variante(14) .. (15)

xaa na posição 14 a 15 é qualquer aminoácido

Variante(17)..(23)

xaa na posição 17 a 23 é qualquer aminoácido

Variante

(25) .. (25)

xaa na posição 25 é qualquer aminoácido

Variante

(26).. (28)

xaa na posição 26 a 28 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(30)..(31)

xaa na posição 30 a 31 é qualquer aminoácido

Variante(32)..(34)

xaa na posição 32 a 34 é qualquer um ou nenhum aminoácido

Variante(36)..(37)

xaa na posição 36 a 37 é qualquer aminoácido

Variante(39).. (44)

xaa na posição 39 a 44 é qualquer aminoácido

Variante(47).. (51)

xaa na posição 47 a 51 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante<222> (54) . . (54)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (57)..(63)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (65)..(68)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (70)..(70)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (72)..(72)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (75)..(82)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (83)..(86)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (88)..(91)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (93)..(93)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (96)..(96)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (99)..(100)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (103)..(103)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (106)..(107)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (109)..(109)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (111)..(115)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (117)..(119)

54 é qualquer aminoácido

57 a 63 é qualquer aminoácido

65 a 68 é qualquer aminoácido

70 é qualquer aminoácido

72 é qualquer aminoácido

75 a 82 é qualquer aminoácido

83 a 8 6 é qualquer um ou nenhum aminoácido

a 91 é qualquer aminoácido

93 é qualquer aminoácido

96 é qualquer aminoácido

99 a 100 é qualquer aminoácido

103 é qualquer aminoácido

106 a 107 é qualquer aminoácido

109 é qualquer aminoácido

111 a 115 é qualquer aminoácido<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221>

xaa na posição 117 a 119 é qualquer aminoácido

Variante(126)..(126)xaa na posição

Variante(129)..(130)xaa na posição

Variante(133)..(134)xaa na posição

-Variante---

126 é qualquer aminoácido

129 a 130 é qualquer aminoácido

133 a 134 é qualquer aminoácido

(136) .. (138) .xaa na posição

Variante(143)'.'. (143)xaa na posição

Variante(148)..(149)xaa na posição

Variante(153) .. (154)xaa na posição

Variante(157)..(158)xaa na posição

Variante(160)..(160)xaa na posição

Variante(163)..(179)xaa na posição

Variante(180)..(185)xaa na posição

Variante(187)..(188)xaa na posição

Variante(190)..(191)xaa na posição

Variante(194)..(198)xaa na posição

Variante(200). . (201)xaa na posição

Variante

136 a 138 é qualquer aminoácido

143 é qualquer aminoácido

14 8 a 14 9 é qualquer aminoácido

153 a 154 é qualquer aminoácido

157 a 158 é qualquer aminoácido

160 é qualquer aminoácido

163 a 179 é qualquer aminoácido

180 a 185 é qualquer um ou nenhum aminoácido

187 a 188 é qualquer aminoácido

190 a 191 é qualquer aminoácido

194 a 198 é qualquer aminoácido

200 a 201 é qualquer aminoácido<222> (203).. (208)

<223> xaa na posição 203 a 208 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (209) . . (209)

<223> xaa na posição 209 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante<222> (212)..(217)

<223> xaa na posição 212 a 217 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (219)..(220)

<223> xaa na posição 219 a 220 é qualquer aminoácido

<2 2 0 > -------------- -----

<221> Variante<222> (223)..(225)

<223> xaa na posição 223 a 225 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (227)..(227)

<223> xaa na posição 227 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (233)..(246)

<223> xaa na posição 233 a 24 6 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (247).. (250)

<223> xaa na posição 247 a 250 é qualquer um ou nenhum aminoácido<4 00> 185

Ser xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Tyr Leu xaa xaa Val

15 10 15

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Lys xaa xaa xaa xaa Lys xaa xaa xaa

20 25 30

xaa xaa Pro xaa xaa Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa His Asn xaa xaa

35 40 45

xaa xaa xaa Leu Ser xaa Tyr Met xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Ala

50 55 60

xaa xaa xaa xaa Tyr xaa Leu xaa Gly Asn xaa xaa xaa xaa xaa xaa65 70 75 80

xaa xaa xaa xaa xaa xaa Met xaa xaa xaa xaa Tyr xaa Phe Tyr xaa

85 90 95

Ser Lys xaa xaa Glu Phe xaa Asp Thr xaa xaa Met xaa Leu xaa xaa

100 105 HO

xaa xaa xaa Gln xaa xaa xaa Leu His Val Tyr His His xaa Ser Ile

115 120 125

xaa xaa Ile Trp xaa xaa Ile xaa xaa xaa Ala Pro Gly Gly xaa Ala

130 135 140

Tyr Phe Ser xaa xaa Leu Asn Ser xaa xaa His Val xaa xaa Tyr xaa145 150 155 160

Tyr Tyr xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa

165 170 175

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Thr xaa xaa Gln xaa xaa Gln

180 185 190

Phe xaa xaa xaa xaa xaa Gln xaa xaa Tyr xaa xaa xaa xaa xaa xaa

195 200 205

xaa Tyr Pro xaa xaa xaa xaa xaa xaa Leu xaa xaa Tyr Met xaa xaa

210 215 220

xaa Leu xaa Leu Phe Gly Asn Phe xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa225 230 235 240

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Lys245 250<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>

18660PRT

Seqüência artificial

Variante(3).. (4)

xaa na posição 3 a 4 é qualquer aminoácido

Variante(7)..(7)

xaa na posição 7 é Leu, Met ou Val

Variante(10)..(10)

xaa na posição 10 é qualquer aminoácido

Variante(11) . · (H)

xaa na posição 11 é Phe ou Ile

Variante(13)..(13)

xaa na posição 13 é lie, Leu ou Val

Variante(15)..(18)

xaa na posição 15 a 18 é qualquer aminoácido

Variante(19)··(19)

xaa na posição 19 é Lys ou Arg

Variante(21)..(21)

xaa na posição 21 é lie, Leu ou Val

Variante(22)..(22)

xaa na posição 22 é Ser ou Thr

Variante(23)..(23)

xaa na posição 23 é Phe ou Val

Variante(26) . . (26)

xaa na posição 26 é Ile ou Val

Variante

(30)..(30)

xaa na posição 30 é Ala ou Ser

Variante

(31)..(31)

xaa na posição 31 é Ser ou Thr

Variante(33)..(34)

xaa na posição 33 a 34 é qualquer aminoácido

Variante(37) . . (37)<223> xaa na posição 37 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (38) . . (38) <223> xaa na posição 38 é Ala, Ile ou Leu<220> <221> Variante <222> (39)..(39) <223> xaa na posição 39 é Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (40)..(40) <223> xaa na posição 40 é Ala ou Thr<220> <221> Variante - - - --------<222> (41) .. (42) <223> xaa na posição 41 a 42 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (45)..(45) <223> xaa na posição 45 é Gly ou Asn<220> <221> Variante <222> (47)..(47) <223> xaa na posição 47 é Asp ou Glu<220> <221> Variante <222> (50)..(50) <223> xaa na posição 50 é Phe ou Trp<220> <221> Variante <222> (52)..(52) <223> xaa na posição 52 é Ala ou Thr<220> <221> Variante <222> (53)..(53) <223> xaa na posição 53 é Ala ou Ile<220> <221> Variante <222> (57)..(57) <223> xaa na posição 57 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (58)..(58) <223> xaa na posição 58 é Ile ou Val

<4 00> 186Ser Lys xaa1

xaa xaa xaa

xaa xaa Ile35

Tyr xaa Ser50

<210> 187<211> 23<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante<222> (3).. (3)

<223> xaa na posição 3 é Leu ou Met<220>

xaa Glu Phe xaa Asp Thr xaa xaa Met xaa Leu xaa xaa

5 10 15

Gln xaa xaa xaa Leu His xaa Tyr His His xaa xaa Ile

20 25 30

Trp xaa xaa xaa xaa xaa xaa Ala Pro xaa Gly xaa Ala

40 45

xaa xaa Leu Asn Ser xaa xaa His Val55 60<221> Variante <222> (4) .. (4) <223> xaa na posição 4 é Phe ou Tyr<220> <221> Variante <222> (6) . . (6) <223> xaa na posição 6 é Ala ou Cys<220> <221> Variante <222> (7)..(7) <223> xaa na posição 7 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (8)..(8) <223> xaa na posição 8 c Glu -OU- Gly .. - _____________<220> <221> Variante <222> (9) .. (9) <223> xaa na posição 9 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (10)..(10) <223> xaa na posição 10 é Ala, Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (11) · · (H) <223> xaa na posição 11 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (12) . . (12) <223> xaa na posição 12 é Ala ou Gln<220> <221> Variante <222> (14) .. (17) <223> xaa na posição 14 a 17 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (19) .. (19) <223> xaa na posição 19 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (20)..(20) <223> xaa na posição 20 é Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (21) .. (21) <223> xaa na posição 21 é Phe ou Trp<4 00> 187 Leu Ser xaa xaa Met xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Ala xaa xaa xaa

15 10 15

xaa Tyr xaa xaa xaa Gly Asn20

<210> 188

<211> 24

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante

<222> (3)..(4)

<223> xaa na posição 3 a 4 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (5)..(5)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221 ><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>Tyr Pro1

Leu xaa

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220>

xaa na posição 5 é Ile ou Leu

Variante(6)..(7)

xaa na posição 6 a 7 é qualquer aminoácido

Variante(8) . . (8)

xaa na posição 8 é Ile ou Leu

Variante(10)..(11)

xaa na posição 10 a 11 é qualquer aminoácidoVar i ante-------------------------------

(14).. (14)

xaa na posição 14 é qualquer aminoácido

Variante

(15)..(15)

xaa na posição 15 é Ser ou Thr

Variante

(16)..(16)

xaa na posição 16 é Leu ou Met

Variante(18)..(18)

xaa na posição 18 é qualquer aminoácido

Variante(21) .. (22)

xaa na posição 21 a 22 é qualquer aminoácido

Variante(24)..(24)

xaa na posição 24 é Phe ou Tyr188

xaa xaa xaa xaa xaa xaa Leu xaa xaa Tyr Met xaa xaa xaa

5 10 15

Leu Phe xaa xaa Phe xaa20

18920PRT

Seqüência artificial

Variante(2)..(2)

xaa na posição 2 é Ile ou Leu

Variante(4)..(5)

xaa na posição 4 a 5 é qualquer aminoácido

Variante

(7)..(7)

xaa na posição 7 é Leu ou Met

Variante

(8) . . (8)

xaa na posição 8 é qualquer aminoácido<221> Variante <222> (11)..(14) <223> xaa na posição 11 a 14 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (15)..(15) <223> xaa na posição 15 é Gly, Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é Ala ou Ser<220> <221> Variante <222> (18)..(18) <223>- xaa na posição 18 é qualquer- aminoácido----<220> <221> Variante <222> (19)..(19) <223> xaa na posição 19 é Trp ou Tyr<220> <221> Variante <222> (20).. (20) <223> xaa na posição 20 é Ala ou Asp<4 00> 189

Tyr xaa Thr xaa xaa Gln xaa xaa Gln Phe xaa xaa xaa xaa xaa Gln

15 10 15

xaa xaa xaa xaa20

<210> 190

<211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<221> Variante

<222> (2)..(5)

<223> xaa na posição 2 a 5 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (6)..(6)

<223> xaa na posição 6 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (8)..(9)

<223> xaa na posição 8 a 9 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (11) . . (12)

<223> xaa na posição 11 a 12 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (13) . . (13)

<223> xaa na posição 13 é Phe ou Leu<220>

<221> Variante

<222> (14) . . (14)

<223> xaa na posição 14 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (15) . . (15)

<223> xaa na posição 15 é Ile ou Leu<220>

<221> Variante

<222> (16) . . (16)<223> xaa na posição 16 é qualquer aminoácido<400> 190

Lys xaa xaa xaa xaa xaa Pro xaa xaa Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa1 5 10 15

His Asn <210> 191 <211> 18 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (2) .. (2) <223> xaa na posição 2 é Pro ou Thr<220> ------ -------<221> Vari ante <222> (3) . . (3) <223> xaa na posição 3 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (4) .. (4) <223> xaa na posição 4 é Glu ou Pro<220> <221> Variante <222> (5) . . (5) <223> xaa na posição 5 é lie, Leu, Met ou Val<220> <221> Variante <222> (6) .. (6) <223> xaa na posição 6 é Leu, Met ou Val<220> <221> Variante <222> (7)..(8) <223> xaa na posição 7 a 8 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (9) . . (9) ' <223> xaa na posição 9 é lie, Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (10)..(11) <223> xaa na posição 10 a 11 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (14)..(15) <223> xaa na posição 14 a 15 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante <222> (18)..(18) <223> xaa na posição 18 é Gly ou Leu<400> 191

Ser xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Tyr Leu xaa xaa Val1 5 10 15

xaa xaa

<210> 192

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência

artificial<220>

<221> Variante

<222> (2)..(2)

<223> xaa na posição 2 é Ala, Gly ou Asn<220>

<221> Variante

<222> (3)..(3)

<223> xaa na posição 3 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante

<222> (4) .. (4)

<223> xaa na posição 4 é lie, Leu ou Met<220>

<221> Variante

<222>-(5) . . (b)---------------------------------------

<223> xaa na posição 5 é lie, Leu ou Val<220>

<221> Variante

<222> (6)..(6)

<223> xaa na posição 6 é Trp ou Tyr<220>

<221> Variante

<222> (7)..(7)

<223> xaa na posição 7 é lie, Leu ou Val<220>

<221> Variante

<222> (10)..(10)

<223> xaa na posição 10 é Phe, Met ou Val

<4 00> 192

Met xaa xaa xaa xaa xaa xaa Phe Tyr xaa15 10

<210> 193

<211> 1086

<212> DNA

<213> Phytophthora infestans<220>

<221> CDS

<222> (1) . . (1086)

<400> 193

atg gcg acg aag gag gcg tat gtg ttc CCC act ctg acg gag ate aag 48Met Ala Thr Lys Glu Ala Tyr Val Phe Pro Thr Leu Thr Glu Ile Lys 1 5 10 15 cgg tcg cta cct aaa gac tgt ttc gag gct tcg gtg CCt ctg tcg ctc 96Arg Ser Leu Pro Lys Asp Cys Phe Glu Ala Ser Val Pro Leu Ser Leu 20 25 30 tac tac acc gtg cgt tgt ctg gtg ate gcg gtg gct cta acc ttc ggt 144Tyr Tyr Thr 35 Val Arg Cys Leu Val 40 Ile Ala Val Ala Leu 45 Thr Phe Gly ctc aac tac gct cgc gct ctg CCC gag gtc gag age ttc tgg gct ctg 192Leu Asn 50 Tyr Ala Arg Ala Leu 55 Pro Glu Val Glu Ser 60 Phe Trp Ala Leu gac gcc gca ctc tgc acg ggc tac ate ttg ctg cag ggc ate gtg ttc 240Asp Ala Ala Leu Cys Thr Gly Tyr Ile Leu Leu Gln Gly Ile Val Phe 65 70 75 80 288tgg ggc ttc ttc acg gtg ggc cac gat gcc ggc cac ggc gcc ttc tcg Trp Gly Phe Phe Thr Val Gly His Asp Ala Gly His Gly Ala Phe Ser 85 90 95 cgc tac cac ctg Ctt aac ttc gtg gtg ggc act ttc atg cac tcg ctc 336Arg Tyr His Leu Leu Asn Phe Val Val Gly Thr Phe Met His Ser Leu 100 105 110 ate ctc acg CCC ttc gag tcg tgg aag ctc acg cac cgt cac cac cac 384Ile Leu Thr 115 Pro Phe Glu Ser Trp 120 Lys Leu Thr His Arg 125 His His Hisaag aac acg ggc aac att gac cgt gac gag gtc ttc tac ccg caa cgcLys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Arg Asp Glu Val Phe Tyr Pro Gln Arg

130 135 140

aag gcc gac gac cac ccg ctg tct cgc aac ctg att ctg gcg ctc gggLys Ala Asp Asp His Pro Leu Ser Arg Asn Leu Ile Leu Ala Leu Gly145 150 155 160

gca gcg tgg ctc gcc tat ttg gtc gag ggc ttc cct cct cgt aag gtcAla Ala Trp Leu Ala Tyr Leu Val Glu Gly Phe Pro Pro Arg Lys Val

165 170 175

aac cac ttc aac ccg ttc gag cct ctg ttc gtg cgt cag gtg tca gctAsn His Phe Asn Pro Phe Glu Pro Leu Phe Val Arg Gln Val Ser Ala

180 185 190

gtg gta ate tct ctt ctc gcc cac ttc ttc gtg gcc gga ctc tcc ateVal Val Ile Ser Leu Leu Ala His Phe Phe Val Ala Gly Leu Ser Ile

. .. . . 195 - - 200 _______ - 205_____________

tat ctg age ctc cag ctg ggc ctt aag acg atg gca ate tac tac tatTyr Leu Ser Leu Gln Leu Gly Leu Lys Thr Met Ala Ile Tyr Tyr Tyr

210 215 220

gga cct gtt ttt gtg ttc ggc age atg ctg gtc att acc acc ttc ctaGly Pro Val Phe Val Phe Gly Ser Met Leu Val Ile Thr Thr Phe Leu225 230 235 240

cac cac aat gat gag gag acc cca tgg tac gcc gac tcg gag tgg acgHis His Asn Asp Glu Glu Thr Pro Trp Tyr Ala Asp Ser Glu Trp Thr

245 250 255

tac gtc aag ggc aac ctc tcg tcc gtg gac cga tcg tac ggc gcg ctcTyr Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp Arg Ser Tyr Gly Ala Leu

260 265 270

att gac aac ctg age cac aac ate ggc acg cac cag ate cac cac cttIle Asp Asn Leu Ser His Asn Ile Gly Thr His Gln Ile His His Leu

275 280 285

ttc cct ate att ccg cac tac aaa ctc aag aaa gcc act gcg gcc ttcPhe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Lys Lys Ala Thr Ala Ala Phe

290 295 300

cac cag gct ttc cct gag ctc gtg cgc aag age gac gag cca att ateHis Gln Ala Phe Pro Glu Leu Val Arg Lys Ser Asp Glu Pro Ile Ile305 310 315 320

aag gct ttc ttc cgg gtt gga cgt ctc tac gca aac tac ggc gtt gtg1008

Lys Ala Phe Phe Arg Val Gly Arg Leu Tyr Ala Asn Tyr Gly Val Val

325 330 335

gac cag gag gcg aag ctc ttc acg cta aag gaa gcc aag gcg gcg acc1056

Asp Gln Glu Ala Lys Leu Phe Thr Leu Lys Glu Ala Lys Ala Ala Thr

340 345 350

gag gcg gcg gcc aag acc aag tcc acg taa1086

Glu Ala Ala Ala Lys Thr Lys Ser Thr

355 360

<210> 194<211> 361<212> PRT

<213> Phytophthora infestans<4 00> 194

Met Ala Thr Lys Glu Ala Tyr Val Phe Pro Thr Leu Thr Glu Ile Lys15 10 15

Arg Ser Leu Pro Lys Asp Cys Phe Glu Ala Ser Val Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Tyr Tyr Thr Val Arg Cys Leu Val Ile Ala Val Ala Leu Thr Phe Gly

35 40 45

Leu Asn Tyr Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Glu Ser Phe Trp Ala Leu

50 55 60

Asp Ala Ala Leu Cys Thr Gly Tyr Ile Leu Leu Gln Gly Ile Val Phe65 70 75 80Trp Gly

Arg Tyr

Ile Leu

Lys Asn130Lys Ala145

Ala Ala

Asn His

-Val Val

Tyr Leu210Gly Pro225

His His

Tyr Val

Ile Asp

Phe Pro290His Gln305

Lys Ala

Asp Gln

Glu Ala

<210><211><212><213><220><221><222><4 00>atg actMet Thr1

aag cacLys His

ctc tacLeu Tyr

ctg ctcLeu Leu

50ctc cacLeu His65

ttc tggPhe Trp

tcg cgc

Phe Phe Thr85

His Leu Leu100Thr Pro Phe115

Thr Gly Asn

Asp Asp His

Trp Leu Ala165

Phe Asn Pro180Ile Ser Leu195

Ser Leu Gln

Val Phe Val

Asn Asp Glu245

Lys Gly Asn260Asn Leu Ser275

Ile Ile Pro

Ala Phe Pro

Phe Phe Arg325

Glu Ala Lys

340Ala Ala Lys3551951077DNA

SaprolegniaCDS

(1)··(1077)195

gag gat aagGlu Asp Lys5

tcg ate ccgSer Ile Pro20

tac acg gccTyr Thr Ala35

tac gcg gcgTyr Ala Ala

gcg ctc gttAla Leu Val

ggc ttc ttcGly Phe Phe85

tac cac age

Val Gly

Asn Phe

Glu Ser

Ile Asp135Pro Leu150

Tyr Leu

Phe Glu

Le.u .ALa-

Leu Gly215Phe Gly230

Glu Thr

Leu Ser

His Asn

His Tyr295Glu Leu310

Val GlyLeu PheThr Lys

diclina

His Asp Ala90

Val Val Gly

105Trp Lys Leu120

Arg Asp Glu

Ser Arg Asn

Val Glu Gly170

Pro Leu Phe

185His ?he Phe200

Leu Lys Thr

Ser Met Leu

Pro Trp Tyr250

Ser Val Asp

265Ile Gly Thr280

Lys Leu Lys

Val Arg Lys

Arg Leu Tyr330

Thr Leu Lys

345Ser Thr360

Gly His Gly AlaThr PheThr His

Val Phe140Leu Ile155

Phe Pro

Val Arg

Val Ala

Met Ala220Val Ile235

Ala'Asp

Arg Ser

His Gln

Lys Ala300Ser Asp315

Ala AsnGlu Ala

Met His110Arg His125

Tyr Pro

Leu Ala

Pro Arg

Gln Val190Gly Leu205

Ile Tyr

Thr Thr

Ser Glu

Tyr Gly270Ile His285

Thr Ala

Glu Pro

Tyr Gly

Lys Ala350

Phe Ser95

Ser Leu

His His

Gln Arg

Leu Gly160Lys Val175

Ser Ala

Ser Ile

Tyr Tyr

Phe Leu240Trp Thr255

Ala Leu

His Leu

Ala Phe

Ile Ile320Val Val335

Ala Thr

acg aagThr Lys

aac gcgAsn Ala

cgc gcgArg Ala

cgc tcgArg Ser

55tgc gccCys Ala70

acg gtcThr Val

gtcVal

tgcCys

ate

Ile

40

acg

Thr

accThr

ggcGly

gagGlu

ttt

Phe

25

ttc

Phe

ccgPro

tacTyr

cacHis

gtc aac ttt ate

ttc

Phe

10

gag

Glu

aacAsn

ttcPhe

ateIle

gacAsp90ate

ccgPro

tcgSer

gcgAla

attIle

tac

Tyr

75

tgc

Cys

acg ctcThr Leu

aac ctcAsn Leu

tcg gccSer Ala

45gcc gatAla Asp60

gtg cagVal Gln

ggc cacGly His

ggc tgc ate

acg gag ctcThr Glu Leu15

ggc ctc tcgGly Leu Ser30

tcg gcg gcgSer Ala Ala

aac gtt ctgAsn Val Leu

ggc gtc ateGly Val Ile80

tcg gcc ttcSer Ala Phe95

atg cac tet672

Ser Arg Tyr His Ser Val Asn Phe Ile Ile Gly Cys Ile Met His Ser

100 105 HO

gcg att ttg acg ccg ttc gag age tgg cgc gtg acg cac cgc cac cac 384

Ala Ile Leu Thr Pro Phe Glu Ser Trp Arg Val Thr His Arg His His

115 120 125

cac aag aac acg ggc aac att gat aag gac gag ate ttt tac ccg cac 432

His Lys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Lys Asp Glu Ile Phe Tyr Pro His

130 135 140

cgg tcg gtc aag gac ctc cag gac gtg cgc caa tgg gtc tac acg ctc 480

Arg Ser Val Lys Asp Leu Gln Asp Val Arg Gln Trp Val Tyr Thr Leu145 150 155 . 160

ggc ggt gcg tgg ttt gtc tac ttg aag gtc ggg tat gcc ccg cgc acg 528

Gly Gly Ala Trp Phe Val Tyr Leu Lys Val Gly Tyr Ala Pro Arg Thr

165 170 175

atg age cac ttt gac ccg tgg gac ccg ctc ctc ctt cgc cgc gcg, tcg 57 6

Met Ser His Phe Asp Pro Trp Asp Pro Leu Leu Leu Arg Arg Ala Ser

180 185 190

gcc gtc ate gtg tcg ctc ggc gtc tgg gcc gcc ttc ttc gcc gcg tac 624

Ala Val Ile Val Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Phe Phe Ala Ala Tyr

195 200 205

gcg tac ctc aca tac tcg ctc ggc ttt gcc gtc atg ggc ctc tac tacAla Tyr Leu Thr Tyr Ser Leu Gly Phe Ala Val Met Gly Leu Tyr Tyr

210 215 220

tat gcg ccg ctc ttt gtc ttt gct tcg ttc ctc gtc att acg acc ttc 720

Tyr Ala Pro Leu Phe Val Phe Ala Ser Phe Leu Val Ile Thr Thr Phe225 230 235 240

ttg cac cac aac gac gaa gcg acg ccg tgg tac ggc gac tcg gag tgg 768

Leu His His Asn Asp Glu Ala Thr Pro Trp Tyr Gly Asp Ser Glu Trp

245 250 255

acg tac gtc aag ggc aac ctc tcg age gtc gac cgc tcg tac ggc gcg 816

Thr Tyr Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp Arg Ser Tyr Gly Ala

260 265 270

ttc gtg gac aac ctg age cac cac att ggc acg cac cag gtc cac cac 864

Phe Val Asp Asn Leu Ser His His Ile Gly Thr His Gln Val His His

275 280 285

ttg ttc ccg ate att ccg cac tac aag ctc aac gaa gcc acc aag cac 912

Leu Phe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Asn Glu Ala Thr Lys His

290 295 300

ttt gcg gcc gcg tac ccg cac ctc gtg cgc agg aac gac gag ccc ate 960

Phe Ala Ala Ala Tyr Pro His Leu Val Arg Arg Asn Asp Glu Pro Ile305 310 315 320

ate acg gcc ttc ttc aag acc gcg cac ctc ttt gtc aac tac ggc gct1008

Ile Thr Ala Phe Phe Lys Thr Ala His Leu Phe Val Asn Tyr Gly Ala

325 330 335

gtg ccc gag acg gcg cag ate ttc acg ctc aaa gag tcg gcc gcg gcc1056

Val Pro Glu Thr Ala Gln Ile Phe Thr Leu Lys Glu Ser Ala Ala Ala

340 345 350

gcc aag gcc aag tcg gac taa1077

Ala Lys Ala Lys Ser Asp355

<210> 196<211> 358<212> PRT

<213> Saprolegnia diclina<4 00> 196

Met Thr Glu Asp Lys Thr Lys Val Glu Phe Pro Thr Leu Thr Glu Leu15 10 15

Lys His Ser Ile Pro Asn Ala Cys Phe Glu Ser Asn Leu Gly Leu Ser

20 25 30

Leu Tyr Tyr Thr Ala Arg Ala Ile Phe Asn Ala Ser Ala Ser Ala AlaLeu Leu

50Leu His65

Phe TrpSer ArgAla Ile

His

Arg-1-4.5Gly

Met

Ala

Ala

Tyr225Leu

Lys130Ser

Gly

Ser

Val

Tyr210Ala

His

Thr Tyr

Phe Val

Leu Phe290Phe Ala305

Ile Thr

Val Pro

Ala Lys

<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221>

35 40 45

Tyr Ala Ala Arg Ser Thr Pro Phe Ile Ala Asp

55 60

Ala Leu Val Cys Ala Thr Tyr Ile Tyr Val Gln

70 75

Gly Phe Phe Thr Val Gly His Asp Cys Gly His

85 90

Tyr His Ser Val Asn Phe Ile Ile Gly Cys Ile

100 105

Leu Thr Pro Phe Glu Ser Trp Arg Val Thr His115 120 125

Asn Thr Gly Asn Ile Asp Lys Asp Glu Ile Phe

135 140

Val Lys Asp Leu Gln Asp Val Arg Gln Trp Val

__________ 150_____________________155 _____

Ala Trp Phe Val Tyr Leu Lys Val Gly Tyr Ala

165 170

His Phe Asp Pro Trp Asp Pro Leu Leu Leu Arg

180 185

Ile Val Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Phe Phe195 200 205

Leu Thr Tyr Ser Leu Gly Phe Ala Val Met Gly

215 220

Pro Leu Phe Val Phe Ala Ser Phe Leu Val Ile

230 235

His Asn Asp Glu Ala Thr Pro Trp Tyr Gly Asp

245 250

Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp Arg Ser

260 265

Asp Asn Leu Ser His His Ile Gly Thr His Gln275 280 285

Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Asn Glu Ala

295 300

Ala Ala Tyr Pro His Leu Val Arg Arg Asn Asp

310 315

Ala Phe Phe Lys Thr Ala His Leu Phe Val Asn

325 330

Glu Thr Ala Gln Ile Phe Thr Leu Lys Glu Ser

340 345

Ala Lys Ser Asp355197359PRT

Seqüência artificial

Variante(2) . . (5)

xaa na posição 2 a 5 é qualquer aminoácido

Variante(12).. (12)

xaa na posição 12 é qualquer aminoácido

Variante(14)..(14)

xaa na posição 14 é qualquer aminoácido

Variante(16)..(16)

xaa na posição 16 é qualquer aminoácidoVariante

Asn Val

Gly Val

Ser Ala

95Met His110

Arg His

Tyr Pro

Tyr Thr

Pro Arg175Arg Ala190

Ala Ala

Leu Tyr

Thr Thr

Ser Glu255Tyr Gly270

Val His

Thr Lys

Glu Pro

Tyr Gly335Ala Ala350

Leu

Ile

80

Phe

Ser

His

His

Leu160.Thr

Ser

Tyr

Tyr

Phe240Trp

Ala

His

His

Ile320Ala

Ala<222> (18)..(19) <223> xaa na posição 18<220> <221> Variante <222> (23)..(26) <223> xaa na posição 23<220> <221> Variante <222> (33)..(33) <223> xaa na posição 33<220> <221> Variante <222> (35)..(38) <223> xaa na posição 35<220> - <221> Variante <222> (40) .. (40) <223> xaa na posição 40<220> <221> Variante <222> (42)..(45) <223> xaa na posição 42<220> <221> Variante <222> (47)..(48) <223> xaa na posição 47<220> <221> Variante <222> (51)..(52) <223> xaa na posição 51<220> <221> Variante <222> (54)..(60) <223> xaa na posição 54<220> <221> Variante <222> (62) . . (62) <223> xaa na posição 62<220> <221> Variante <222> (64)..(65) <223> xaa na posição 64<220> <221> Variante <222> (67)..(68) <223> xaa na posição 67<220> <221> Variante <222> (71)..(72) <223> xaa na posição 71<220> <221> Variante <222> (75)..(76) <223> xaa na posição 75<220> <221> Variante <222> (87)..(87) <223> xaa na posição 87<220> <221> Variante <222> (90)..(90) <223> xaa na posição 90<220>

a 19 é qualquer aminoácido

a 26 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

a 38 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

a 4 5 é qualquer aminoácido

a 48 é qualquer aminoácido

a 52 é qualquer aminoácido

a 60 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

a 65 é qualquer aminoácido

a 68 é qualquer aminoácido

a 72 é qualquer aminoácido

a 76 é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido

é qualquer aminoácido<221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

(97)..(98)xaa na posição

Variante(101)..(102)xaa na posição

Variante(104)..(105)xaa na posição

Variante(109)..(109)-x a a—η a—posiç ão_

Variante(118)..(119)xaa na posição

Variante(133)..(133)xaa na posição

Variante(136)..(136)xaa na posição

Variante(140)..(140)xaa na posição

Variante(142)..(144)xaa na posição

Variante(146)..(149)xaa na posição

Variante(151)..(155)xaa na posição

Variante(158)..(158)xaa na posição

Variante(161)..(162)xaa na posição

Variante(165)..(166)xaa na posição

Variante(168)..(169)xaa na posição

Variante(172)..(174)xaa na posição

97 a 98 é qualquer aminoácido

101 a 102 é qualquer aminoácido

104 a 105 é qualquer aminoácido

118 a 119 é qualquer aminoácido

133 é qualquer aminoácido

136 é qualquer aminoácido

140 é qualquer aminoácido

142 a 144 é qualquer aminoácido

146 a 149 é qualquer aminoácido

151 a 155 é qualquer aminoácido

158 é qualquer aminoácido

161 a 162 é qualquer aminoácido

165 a 166 é qualquer aminoácido

168 a 169 é qualquer aminoácido

172 a 174 é qualquer aminoácido<220> <221> Variante<222> (177) .. (177)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (179)..(180)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (183) .. (184)<223> xaa na posição<220> <221> Variante< 22 2>- - . (186)_______(-1-8-7)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (191) .. (192)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (195) . . (195)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (196)..(197)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (199)..(199)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (202)..(202)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (204) . . (205)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (206)..(207)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (210) . . (212)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (215) . . (217)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (219) . . (220)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (224) .. (224)<223> xaa na posição<220> <221> Variante<222> (226)..(226)

177 é qualquer aminoácido

179 a 180 é qualquer aminoácido

183 a 184 é qualquer aminoácido

18 6 a 187 é qualquer aminoácido

191 a 192 é qualquer aminoácido

195 é qualquer aminoácido

196 a 197 é qualquer um ou nenhum aminoácido

199 é qualquer aminoácido

202 é qualquer aminoácido

204 a 205 é qualquer aminoácido

206 a 207 é qualquer um ou nenhum aminoácido

210 a 212 é qualquer aminoácido

215 a 217 é qualquer aminoácido

219 a 220 é qualquer aminoácido

224 é qualquer aminoácido<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221>

xaa na posição 226 é qualquer aminoácido

Variante(230)..(230)xaa na posição

Variante(232)..(232)xaa na posição

Variante(245)..(245)xaa na posição

Variante ______

230 é qualquer aminoácido

232 é qualquer aminoácido

245 é qualquer aminoácido

(250) .. (250)xaa na posição

Variante(271)..(272)xaa na posição

Variante(278)..(278)xaa na posição

Variante(284)..(284)xaa na posição

Variante(297)..(298)xaa na posição

Variante(301)..(302)xaa na posição

Variante(304)..(305)xaa na posição

Variante(307)..(307)xaa na posição

Variante(309)..(309)xaa na posição

Variante(313)..(314)xaa na posição

Variante(320) . . (320)xaa na posição

Variante(324)..(327)xaa na posição

Variante

250 é qualquer aminoácido

271 a 272 é qualquer aminoácido

278 é qualquer aminoácido

284 é qualquer aminoácido

297 a 298 é qualquer aminoácido

301 a 302 é qualquer aminoácido

304 a 305 é qualquer aminoácido

307 é qualquer aminoácido

309 é qualquer aminoácido

313 a 314 é qualquer aminoácido

320 é qualquer aminoácido

324 a 327 é qualquer aminoácido<222> (329)..(330)

<223> xaa na posição 329 a 330 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (334) . . (334)

<223> xaa na posição 334 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (336)..(338)

<223> xaa na posição 336 a 338 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (340) . . (341)

<223> xaa na posição 340 a 341 é qualquer aminoácido

<220>---------------------------------------------- -------------------

<221> Variante<222> (347) . . (348)

<223> xaa na posição 347 a 348 é qualquer aminoácido<220>

<221> Variante<222> (349) . . (352)

<223> xaa na posição 34 9 a 352 é qualquer um ou nenhum aminoácido<220>

<221> Variante<222> (357) . . (357)

<223> xaa na posição 357 é qualquer aminoácido<4 00> 197

Lys xaa xaa xaa xaa Phe Pro Thr Leu Thr Glu xaa Lys xaa Ser xaa

15 10 15

Pro xaa xaa Cys Phe Glu xaa xaa xaa xaa Leu Ser Leu Tyr Tyr Thr

20 25 30

xaa Arg xaa xaa xaa xaa Ala xaa Ala xaa xaa xaa xaa Leu xaa xaa

35 40 45

Ala Arg xaa xaa Pro xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Leu xaa Ala xaa

50 55 60

xaa Cys xaa xaa Tyr Ile xaa xaa Gln Gly xaa xaa Phe Trp Gly Phe65 70 75 80

Phe Thr Val Gly His Asp xaa Gly His xaa Ala Phe Ser Arg Tyr His

85 90 95

xaa xaa Asn Phe xaa xaa Gly xaa xaa Met His Ser xaa Ile Leu Thr

100 105 HO

Pro Phe Glu Ser Trp xaa xaa Thr His Arg His His His Lys Asn Thr

115 120 125

Gly Asn Ile Asp xaa Asp Glu xaa Phe Tyr Pro xaa Arg xaa xaa xaa

130 135 140

Asp xaa xaa xaa xaa Arg xaa xaa xaa xaa xaa Leu Gly xaa Ala Trp145 150 155 _ 160

xaa xaa Tyr Leu xaa xaa Gly xaa xaa Pro Arg xaa xaa xaa His Phe

165 170 175

xaa Pro xaa xaa Pro Leu xaa xaa Arg xaa xaa Ser Ala Val xaa xaa

180 185 190

Ser Leu xaa xaa xaa Ala xaa Phe Phe xaa Ala xaa xaa xaa xaa Tyr

195 200 205

Leu xaa xaa xaa Leu Gly xaa xaa xaa Met xaa xaa Tyr Tyr Tyr xaa

210 215 220

Pro xaa Phe Val Phe xaa Ser xaa Leu Val Ile Thr Thr Phe Leu His225 230 235 240

His Asn Asp Glu xaa Thr Pro Trp Tyr xaa Asp Ser Glu Trp Thr Tyr

245 250 255

Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp Arg Ser Tyr Gly Ala xaa xaa

260 265 270

Asp Asn Leu Ser His xaa Ile Gly Thr His Gln xaa His His Leu Phe275 280 285Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu xaa xaa Ala Thr290 295 300xaa Ala xaa Pro xaa Leu Val Arg xaa xaa Asp Glu305 310 315 Ala Phe Phe xaa xaa xaa xaa Leu xaa xaa Asn Tyr 325 330 xaa xaa Ala xaa xaa Phe Thr Leu Lys Glu xaa xaa 340 345 Ala Ala Ala Lys xaa Lys Ser 355 <210> 198 <211> 60 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (10)..(10) <223> xaa na posição 10 é Ala ou Glu <220> <221> Variante <222> (15)..(15) <223> xaa na posição 15 é Ala ou Gly <220> <221> Variante <222> (36)..(36) <223> xaa na posição 36 é Phe ou Leu <220> <221> Variante <222> (37) . . (37) <223> xaa na posição 37 é Ile ou Val <220> <221> Variante <222> (43)..(43) <223> xaa na posição 43 é qualquer aminoácido <220> <221> Variante <222> (49)..(49) <223> xaa na posição 49 é Ile ou Val <4 00> 198 Thr Thr Phe Leu His His Asn Asp Glu xaa Thr Pro1 5 10 Ser Glu Trp Thr Tyr Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser 20 25 Tyr Gly Ala xaa xaa Asp Asn Leu Ser His xaa Ile 35 40 xaa His His Leu Phe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys50 55 60<210> 199 <211> 60 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <221> Variante <222> (6)..(6) <223> xaa na posição 6 é Ala ou Cys <220> <221> Variante <222> (9) .. (9) <223> xaa na posição 9 é Gly ou Ser <220> <221> Variante <222> (16)..(16) <223> xaa na posição 16 é qualquer aminoácido

xaa xaa Phe xaa

Pro Ile Ile xaa320

Gly xaa Val xaa335

xaa xaa xaa xaa350

Trp Tyr xaa Asp15

Val Asp Arg Sèr30

Gly Thr His Gln45<220> <221> Variante <222> (17)..(17) <223> xaa na posição 17 é Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (20)..(21) <223> xaa na posição 20 a 21 é Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (23)..(23) <223> xaa na posição 23 é Cys ou Thr<220> <221> Variante <222> (24) (24)------- --- ----------------------- -----------<223> xaa na posição 24 é Phe ou Ile<220> <221> Variante <222> (28)..(28) <223> xaa na posição 28 é Ala ou Leu<220> <221> Variante <222> (37)..(37) <223> xaa na posição 37 é Lys ou Arg<220> <221> Variante <222> (38)..(38) <223> xaa na posição 38 é Leu ou Val<220> <221> Variante <222> (52)..(52) <223> xaa na posição 52 é Lys ou Arg<220> <221> Variante <222> (55)..(55) <223> xaa na posição 55 é Ile ou Val<220> <221> Variante <222> (59)..(59) <223> xaa na posição 59 é qualquer aminoácido<4 00> 199 Thr Val Gly His Asp xaa Gly His xaa Ala Phe Ser Arg Tyr His xaa

15 10 15

xaa Asn Phe xaa xaa Gly xaa xaa Met His Ser xaa Ile Leu Thr Pro

20 25 30

Phe Glu Ser Trp xaa xaa Thr His Arg His His His Lys Asn Thr Gly

35 40 45

Asn Ile Asp xaa Asp Glu xaa Phe Tyr Pro xaa Arg50 55 60

Claims (19)

1. Processo para produzir ácido eicosapentaenóico, ácidodocosapentaenóico e/ou ácido docosahexaenóico em uma planta transgênica,caracterizado pelo fato de compreender a provisão na planta de pelo menosuma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo umaatividade de Δό-dessaturase; pelo menos uma seqüência de ácido nucleico quecodifica um polipeptídeo possuindo uma atividade de Δό-alongase; pelomenos uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeopossuindo uma atividade de A5-dessaturase; e pelo menos uma seqüência deácido nucleico que codifica um polipeptídeo possuindo uma atividade de Δ5-alongase e opcionalmente uma A4-dessaturase, onde a seqüência de ácidonucleico que codifica um polipeptídeo possuindo uma atividade de Δ5-alongase está modificada por comparação com a seqüência de ácido nucleicono organismo do qual a seqüência é derivada pelo fato de que está adaptadapara uso de códon em uma ou mais espécies de planta.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a seqüência de ácido nucleico está adaptada pelo menos parauso de códon em colza, feijão-soja e/ou linho,

3. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico está adaptadapara levar em consideração a freqüência natural de códons individuais,

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, caracterizado pelo fato de que as seqüências de ácido nucleicomodificadas correspondem à seqüência de ácido nucleico indicada em SEQ ID No, 64.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, caracterizado pelo fato de que as seqüências de ácido nucleico sãoexpressadas sob o controle de promotor específico de semente.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o promotor é promotor USP, vicilina, napina, Glp, SBP,peroxireduxina, legumina, Fad3, conlinina ou oleosina.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o conteúdo de ácidos graxos C22 poliinsaturados no óleo desemente é 5% em peso ou mais do conteúdo de óleo de semente.

8. Processo de acordo com qualquer uma das seqüênciasprecedentes, caracterizado pelo fato de que adicionalmente sãoproporcionadas na planta uma ou mais seqüências de ácido nucleicocodificadoras de um polipeptídeo possuindo a atividade de uma ω3dessaturase e/ou uma A4-dessaturase.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o conteúdo de ácido docosahexaenóico no óleo de semente é-1% em peso ou mais do conteúdo de óleo de semente.

10. Processo de acordo com qualquer uma das seqüênciasprecedentes, caracterizado pelo fato de que o ácido eicosapentaenóico, ácidodocosapentaenóico e/ou ácido docosahexaenóico estão presentes na plantaprincipalmente ligados como éster em fosfolipídeos ou triacilglicerídeos.

11. Processo de acordo com qualquer uma das seqüênciasprecedentes, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta produtora deóleo selecionada do grupo consistindo de Brassica napus, Brassica juncea eGlycine max.

12. Processo de acordo com qualquer uma das seqüênciasprecedentes, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender o ácidoeicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e/ou ácido docosahexaenóico naforma de seus óleos, lipídeos ou ácidos graxos livres da planta.

13. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fatode compreender uma seqüência de ácido nucleico como mostrada em SEQ ID No 64.

14. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizadapelo fato de compreender:a) uma ou mais cópias de pelo menos um promotor que é ativoem células de planta,b) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que codificaum polipeptídeo possuindo uma atividade de Δό-dessaturase,c) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que codificaum polipeptídeo possuindo uma atividade de A5-dessaturase,________________d) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que codificaum polipeptídeo possuindo uma atividade de Δό-alongase, e) pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que codificaum polipeptídeo possuindo uma atividade de A5-alongase e que estámodificada por comparação com a seqüência de ácido nucleico no organismodo qual a seqüência é derivada ao ser adaptada ao uso de códon em uma oumai espécies de planta, e f) uma ou mais cópias de pelo menos uma seqüências determinador.

15. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com areivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleicomodificada corresponde à seqüência de ácido nucleico indicada em SEQ IDNo, 64.

16. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo comuma das reivindicações 14 ou 15, caracterizada pelo fato de adicionalmentecompreender uma ou mais seqüências de ácido nucleico codificadoras de umpolipeptídeo possuindo a atividade de uma co3-dessaturase e/ou a Δ-4-dessaturase.

17. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de compreenderuma molécula de ácido nucleico recombinante como definida em qualqueruma das reivindicações 22 a 25 ou de compreender a seqüência de ácidonucleico indicada em SEQ ID No, 64.

18.

Uso de óleos, lipídeos ou ácidos graxos livres comodefinidos na reivindicação 19 ou obtidos pelo processo como definido nareivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser para produzir gêneros deração, gêneros alimentícios, cosméticos ou fármacos.