BRPI0708424A2

BRPI0708424A2 - prolongamento da sobreviência de uma aloenxerto por inibição da atividade do complemento

Info

Publication number: BRPI0708424A2
Application number: BRPI0708424-2A
Authority: BR
Inventors: Russell P Rother; Hao Wang; Zhen Zhong
Original assignee: Alexion Pharma Inc
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2011-05-31
Also published as: NZ570802A; KR101650264B1; KR101527225B1; JP2009528369A; WO2007103134A3; ES2530637T3; HK1120444A1; AU2007224250B2; CA2644020C; MX2008011054A; PL1988882T3; EP2918269A1; HRP20150182T1; IL193623A0; CN101437501A; US20100135992A1; CA2644020A1; AU2007224250A1; EP1988882A2; RU2445975C2

Abstract

PROLONGAMENTO DA SOBREVI VENCIA DE UM ALOENXERTO POR INIBIçãO DA ATIVIDADE DO COMPLEMENTO Apresentam-se métodos de prolongar a sobrevivência de células, tecidos ou órgãos alotranspíantados. Estes métodos são dirigidos para a administração ao receptor do aloenxerto de um inibidor da atividade do complemento, juntamente com um ou mais imunossu-pressores e/ou métodos imunossupressores. O inibidor da atividade do complemento é administrado cronicamente. Estes métodos foram determinados auxiliar na prevenção da rejeição crónica de aloenxertos. Estes métodos podem ser adicionalmente usados nos casosnos quais o receptor tenha sido pré-sensibilizado para o aloenxerto ou nos quais há uma incompatibilidade de ABO entre o aloenxerto e o receptor.

Description

"PROLONGAMENTO DA SOBREVIVÊNCIA DE UM ALOENXERTO POR INIBI-ÇÃO DA ATIVIDADE DO COMPLEMENTO"

PEDIDO RELACIONADO

Este pedido reivindica o benefício do, e a prioridade para o, pedido de patenteprovisório U.S. número 60/778.859, depositado em 2 de março de 2006, cuja divulgaçãointeira é incorporada neste documento por referência.

CAMPO TÉCNICO

A presente divulgação refere-se aos métodos para prolongar a sobrevivência de umaloenxerto em um mamífero. Em particular, a presente divulgação refere-se a prolongar asobrevivência de um aloenxerto por administração de um inibidor do complemento ou daformação do complemento terminal, especialmente um inibidor da clivagem do complementoC5, além de um ou mais fármacos ou métodos que sejam imunossupressores.

ANTECEDENTES

O transplante de órgãos é o tratamento preferido para a maioria dos pacientes cominsuficiência crônica dos órgãos. Embora o transplante de rim, fígado, pulmão, e coraçãoofereça uma oportunidade excelente para a reabilitação, visto que os receptores retornampara um estilo de vida mais normal, ele está limitado pela adequabilidade médica/cirúrgicados receptores potenciais, uma carência crescente de doadores, e insuficiência prematurada função do órgão transplantado.

O transplante de células, tecidos e órgãos tornou-se muito comum e éfreqüentemente um procedimento que salva vidas. O transplante de órgãos é o tratamentopreferido para a maioria dos pacientes com insuficiência crônica dos órgãos. Apesar dagrande melhoria nos tratamentos de inibir a rejeição, a rejeição continua a ser o maiorimpedimento isolado para o transplante de órgãos bem-sucedido. A rejeição inclui nãosomente a rejeição aguda, como também a rejeição crônica. As taxas de sobrevivência deum ano para os rins transplantados são, em média, 88,3% com os rins de doadores mortose 94,4% com os rins recebidos de doadores vivos. As taxas correspondentes desobrevivência de cinco anos para os rins transplantados são 63,3% e 76,5% (OPTN/SRTRAnnual Report, 2002). Para os fígados, as taxas de sobrevivência dè um ano são 80,2% e76,5% para os fígados de doadores mortos e vivos, respectivamente. As taxascorrespondentes de sobrevivência de enxertos de fígado de cinco anos são 63,5% e 73,0%(OPTN/SRTR Annual Report, 2002). O uso de fármacos imunossupressores, especialmentea ciclosporina A e mais recentemente o tacrolimuns, tem melhorado dramaticamente a taxade sucesso do transplante de órgãos, especialmente por prevenção da rejeição aguda.Porém, conforme os números acima mencionados mostram, há ainda uma necessidade demelhorar as taxas de sucesso, tanto a duração curta quanto especialmente a longa duração.

Conforme visto a partir dos números acima para os transplantes de rins e fígados, as taxasde deficiência de cinco anos para estes órgãos transplantados são da ordem de 25-35%.No ano 2001 sozinho, houve mais do que 23.000 pacientes que receberam um transplantede órgãos, dos quais aproximadamente 19.000 eram rim ou fígado (OPTN/SRTR AnnualReport1 2002). Para este um ano de transplantes sozinho, com as presentes técnicas, podeser esperado que aproximadamente 5.000-6.000 destes rins e fígados transplantadosdeixarão de funcionar dentro de 5 anos. Estes números nem mesmo incluem outros órgãostransplantados ou tecidos ou células transplantadas, tais como a medula óssea.

Existem múltiplos tipos de transplantes. Estes são descritos em Abbas e col., 2000.Um enxerto transplantado a partir de um indivíduo para o mesmo indivíduo é chamado umenxerto autólogo ou auto-enxerto. Um enxerto transplantado entre dois indivíduosgeneticamente idênticos ou singênicos é chamado um enxerto singênico. Um enxertotransplantado entre dois indivíduos geneticamente diferentes, da mesma espécie, échamado um enxerto alogênico ou aloenxerto. Um enxerto transplantado entre indivíduosde espécies diferentes é chamado um enxerto xenogênico ou xenoenxerto. As moléculasque são reconhecidas como estranhas nos aloenxertos são chamadas aloantígenos eaquelas nos xenoenxertos são chamadas xenoantígenos. Os linfócitos ou os anticorpos quereagem com os aloantígenos ou os xenoantígenos são descritos como sendo alorreativos ouxenorreativos, respectivamente.

Atualmente, mais do que 40.000 transplantes de rins, corações, fígados e pâncreassão efetuados nos Estados Unidos a cada ano (Abbas e col., 2000). Os outros transplantespossíveis incluem, porém não estão limitados ao, tecido vascular, olho, córnea, cristalino,pele, medula óssea, músculo, tecido conjuntivo, tecido gastrointestinal, tecido nervoso, osso,células-tronco, ilhotas, cartilagem, hepatócitos, e células hematopoéticas. Infelizmente,existem muito mais candidatos para um transplante do que existem doadores. Para superaresta carência, um esforço maior está sendo feito para aprender como usar os xenoenxertos.

Embora um progresso esteja sendo feito neste campo, o fato é que, no momento, a maioriados transplantes é aloenxertos. Um transplante alogênico, embora atualmente sendo maisprovável de ser bem-sucedido do que um transplante xenogênico, deve superar diversosobstáculos para ser bem-sucedido. Existem diversos tipos de ataques imunológicos feitospelo receptor contra o órgão doador, o que pode resultar na rejeição do aloenxerto. Estesincluem a rejeição hiperaguda, a rejeição vascular aguda (incluindo a rejeição humoralacelerada e a rejeição humoral aguda novamente), e a rejeição crônica. A rejeição énormalmente um resultado do ataque mediado por células T ou de anticorpos humorais,porém pode incluir fatores secundários adicionais, tais como os efeitos do complemento edas citocinas.

Uma lacuna sempre crescente entre o número de pacientes que requerem otransplante de órgão e o número de órgãos doadores disponíveis tornou-se um grandeproblema por todo o mundo. Park e col., 2003. Os indivíduos que desenvolveramanticorpos anti-HLA são ditos estarem imunizados ou sensibilizados. Gloor1 2005. Asensibilização ao HLA é a barreira principal para a utilização ótima de órgãos de doadoresvivos no transplante clínico (Warren e col., 2004) devido ao desenvolvimento de rejeiçãomediada por anticorpo (ABMR) grave. Por exemplo, mais do que 50% de todos osindivíduos que esperam o transplante de rim são pacientes pré-sensibilizados (Glotz e col.,2002) que têm níveis elevados de aloanticorpos amplamente reativos, resultantes demúltiplas transfusões, aloenxertos anteriores malsucedidos, ou gravidez (Kupiec-Weglinski,1996). A função da ABMR é atualmente uma das áreas mais dinâmicas de estudo emtransplante, devido ao reconhecimento que este tipo de rejeição pode resultar em perdaaguda ou crônica da função do aloenxerto. Mehra e col., 2003. Diversos casos de ABMR,incluindo a rejeição hiperaguda (HAR) ou a rejeição humoral acelerada (ACHR), têm sidorelatados que são caracterizados por lesão aguda do aloenxerto que é resistente à terapiaanti-células T potente, pela detecção de anticorpos específicos doadores circulantes, e peladeposição de componentes do complemento no enxerto. A ABMR com aloanticorposcirculantes elevados e ativação do complemento que ocorre em 20-30% dos casos derejeição aguda tem um prognóstico mais insatisfatório do que a rejeição celular. Mauiyyedie col·., 2002.

Os pacientes altamente pré-sensibilizados, que exibem altos níveis dealoanticorpos, normalmente sofrem uma HAR imediata e agressiva. Na prática clínica, comgrandes esforços e avanços significativos na tecnologia, a HAR é evitada obtendo-se umareação cruzada linfocitotóxica pré-transplante para identificar os pacientes sensibilizadoscom anticorpos específicos para os antígenos HLA do doador. Entretanto, os anticorposcirculantes contra o HLA do doador ou outros antígenos endoteliais que não o MHC podemtambém ser responsáveis por uma forma retardada de rejeição humoral aguda, que estáassociada com uma incidência aumentada de perda de enxerto. CoIIins e col., 1999.Portanto, o desenvolvimento de um novo modelo de animal pré-sensibilizado para copiar aABMR em indicações clínicas seria benéfico para os estudos sobre o mecanismo, e para oprogresso muito necessário no controle da rejeição do aloenxerto em hospedeiros pré-sensibilizados.

Alguns pacientes altamente pré-sensibilizados podem beneficiar-se de programasde intervenção, tais como a imunoadsorção (Palmer e col., 1989; Ross e col., 1993; Kriaa ecol., 1995), a plasmaférese e a imunoglobulina intravenosa (Sonnenday e col., 2002; Rochae col., 2003), que foram projetados e implementados para eliminar temporariamente osanticorpos antidoador. Entretanto, além de seus benefícios, as terapias antes mencionadascarregam com elas diversas desvantagens, visto que alguns indivíduos são menossuscetíveis aos seus efeitos (Kriaa e col, 1995; Hakim e col., 1990; Glotz e col., 1993; Tyane (X)I., 1994); elas são extremamente caras, consomem tempo, e são arriscadas (Salama ecol., 2001). Além disso, o efeito transiente e variável destes protocolos tem limitado o seuimpacto. Glotz e col., 2002; Kupin e col., 1991; Schweitzer e col., 2000. Portanto, odesenvolvimento de novas estratégias para reduzir o risco e o custo na prevenção da ABMRseria benéfico para os receptores pré-sensibilizados que recebem um aloenxerto.

SUMÁRIO

Desse modo, proporcionam-se métodos de prolongar a sobrevivência de células,tecidos ou órgãos transplantados. Em particular, proporcionam-se métodos de prolongar asobrevivência de células, tecidos ou órgãos alotransplantados. Estes métodos são dirigidosà utilização de um ou mais imunossupressores e/ou métodos imunossupressores, além deuma inibição da atividade do complemento. Também se proporciona o uso de um ou maisimunossupressores e um inibidor da atividade do complemento na manufatura de um oumais medicamentos ou pacotes de medicamentos. Tais medicamentos ou pacotes demedicamentos são úteis em prolongar a sobrevivência de um aloenxerto em um pacientemamífero.

Os exemplos de aloenxertos são as células, os tecidos, ou os órgãosalotransplantados e incluem, porém não estão limitados ao, tecido vascular, olho, córnea,cristalino, pele, medula óssea, músculo, tecido conjuntivo, tecido gastrointestinal, tecidonervoso, osso, células-tronco, ilhotas, cartilagem, hepatócitos, células hematopoéticas,coração, fígado, pulmão, rim, e pâncreas.

Em certos aspectos, a divulgação proporciona um método de prolongar asobrevivência de um aloenxerto de rim em um mamífero receptor, o dito métodocompreendendo administrar ao dito mamífero a) um fármaco que iniba a atividade docomplemento e b) pelo menos uma terapia imunossupressora, onde a dita terapia éselecionada a partir de i) pelo menos um fármaco imunossupressor ou ii) um tratamentoimunomodulador.

Em certas modalidades, o dito mamífero é um ser humano. Em certas modalidades,o dito aloenxerto é incompatível com o MHC. Em certas modalidades, o dito aloenxertoincompatível com o MHC é um aloenxerto incompatível com o HLA. Em certas modalidades,o dito receptor é ABO incompatível com o dito aloenxerto. Em certas modalidades, o ditofármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente.

Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento inibea formação de C5b ou C5a. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a formação deC5b ou C5a é um anticorpo inteiro ou um fragmento de anticorpo. Em certas modalidades,o dito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo é um anticorpo ou fragmento de anticorpohumano, humanizado, quimerizado ou desimunizado. Em certas modalidades, o ditoanticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo inibe a clivagem do complemento C5. Em certasmodalidades, o dito fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste emum Fab, um F(ab')2, um Fv1 um anticorpo para domínio, e um anticorpo de cadeia individual.Em certas modalidades, o dito fragmento de anticorpo é o pexelizumab. Em certasmodalidades, o dito anticorpo inteiro é o eculizumab. Em certas modalidades, o ditoeculizumab é administrado cronicamente. Em certas modalidades, o dito eculizumab éadministrado uma vez a cada 2 semanas.

Em certas modalidades, o dito inibidor da atividade do complemento é selecionadoa partir do grupo que consiste em um i) receptor de complemento solúvel, ii) CD59, iii) CD55,iv) CD46, e v) um anticorpo para C5, C6, C7, C8, ou C9.

Em certas modalidades, o dito fármaco imunossupressor inibe a atividade da célulaT ou a atividade da célula B. Em certas modalidades, o dito fármaco imunossupressor inibea atividade da célula Tea atividade da célula B. Em certas modalidades, o dito fármacoimunossupressor é selecionado a partir do grupo que consiste em ciclosporina A, tacrolimus,sirolimus, OKT3, um corticosteróide, daclizumab, basiliximab, azatiopreno, micofenolatomofetil, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticorpos anti-células T, ciclofosfamida, leflunamida,brequinar, ATG, ALG, 15-desoxiespergualina, LF15-0195, CTLA-4-lg (belatacept), rituxano ebredinina. Em certas modalidades, mais do que um fármaco imunossupressor éadministrado. Em certas modalidades, o dito método compreende administrar i) um fármacoque iniba a atividade do complemento e ii) a ciclosporina A. Em certas modalidades, o ditométodo compreende administrar i) um fármaco que iniba a atividade do complemento e ii) oLF15-0195. Em certas modalidades, o dito método compreende administrar i) um fármacoque iniba a atividade do complemento, ii) a ciclosporina A, e iii) o LF15-0195. Em certasmodalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento é um anticorpo que inibea clivagem do complemento C5. Em certas modalidades, um método de tratamentoimunomodulador, p.ex., a plasmaférese, a esplenectomia ou a imunoadsorção, é usado emcombinação com um inibidor da atividade do complemento.

Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive por um tempo pelo menos 20%mais longo do que se o dito método fosse para ser efetuado sem o dito fármaco que inibe aatividade do complemento. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive por umtempo pelo menos 40% mais longo do que se o dito método fosse para ser efetuado sem odito fármaco que inibe a atividade do complemento. Em certas modalidades, o ditoaloenxerto sobrevive pelo tempo de vida restante do dito mamífero. Em certas modalidades,o dito aloenxerto sobrevive por pelo menos três meses. Em certas modalidades, o ditoaloenxerto sobrevive por pelo menos seis meses. Em certas modalidades, o dito aloenxertosobrevive por pelo menos um ano. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive porpelo menos cinco anos. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive pelo tempo devida restante do dito ser humano.Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento éadministrado cronicamente por pelo menos 14 dias. Em certas modalidades, o dito fármacoque inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelo menos 28 dias.

Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento éadministrado cronicamente por pelo menos 3 meses. Em certas modalidades, o ditofármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelo menos6 meses. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento éadministrado cronicamente por pelo menos 1 ano. Em certas modalidades, o dito fármacoque inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelo menos 5 anos.

Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento éadministrado cronicamente pelo tempo de vida restante do dito mamífero.

Em certas modalidades, pelo menos um fármaco imunossupressor é administradocronicamente pelo tempo de vida restante do dito mamífero. Em certas modalidades, pelomenos a ciclosporina A é administrada cronicamente pelo tempo de vida restante do ditomamífero. Em certas modalidades, pelo menos o LF15-0195 é administrado cronicamentepelo tempo de vida restante do dito mamífero.

Em certos aspectos, a divulgação proporciona um método de prolongar asobrevivência de um aloenxerto de rim em um mamífero receptor, compreendendoadministrar ao dito mamífero a) um fármaco que iniba a atividade do complemento e b) pelomenos uma terapia imunossupressora, onde a dita terapia é selecionada a partir de i) pelomenos um fármaco imunossupressor ou ii) um tratamento imunomodulador, onde o ditomamífero é pré-sensibilizado para o dito aloenxerto.

Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento inibea formação de C5b ou C5a. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a formação deC5b ou C5a é um anticorpo inteiro ou um fragmento de anticorpo. Em certas modalidades,o dito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo é um anticorpo ou fragmento de anticorpohumano, humanizado, quimerizado ou desimunizado. Em certas modalidades, o ditoanticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo inibe a clivagem do complemento C5. Em certasmodalidades, o dito fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste emum Fab, um F(ab')2, um Fv, um anticorpo para domínio, e um anticorpo de cadeia individual.

Em certas modalidades, o dito fragmento de anticorpo é o pexelizumab. Em certasmodalidades, o dito anticorpo inteiro é o eculizumab. Em certas modalidades, o ditoeculizumab é administrado cronicamente. Em certas modalidades, o dito eculizumab éadministrado uma vez a cada 2 semanas.

Em certas modalidades nas quais se pré-sensibiliza um mamífero para umaloenxerto, o dito aloenxerto sobrevive por um tempo pelo menos 20% mais longo do que seo dito método fosse para ser efetuado sem o dito fármaco que inibe a atividade docomplemento. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive por um tempo pelomenos 40% mais longo do que se o dito método fosse para ser efetuado sem o dito fármacoque inibe a atividade do complemento. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevivepelo tempo de vida restante do dito mamífero. Em certas modalidades, o dito aloenxertosobrevive por pelo menos três meses. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevivepor pelo menos seis meses. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive por pelomenos um ano. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive por pelo menos cincoanos. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive pelo tempo de vida restante dodito ser humano.

Em certas modalidades nas quais se pré-sensibiliza um mamífero para umaloenxerto, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administradocronicamente por pelo menos 14 dias. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe aatividade do complemento é administrado cronicamente por pelo menos 28 dias. Em certasmodalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administradocronicamente por pelo menos 3 meses. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe aatividade do complemento é administrado cronicamente por pelo menos 6 meses. Emcertas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administradocronicamente por pelo menos 1 ano. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe aatividade do complemento é administrado cronicamente por pelo menos 5 anos. Em certasmodalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administradocronicamente pelo tempo de vida restante do dito mamífero.

Em certas modalidades nas quais se pré-sensibiliza um mamífero para umaloenxerto, pelo menos um fármaco imunossupressor é administrado cronicamente pelotempo de vida restante do dito mamífero. Em certas modalidades, pelo menos aciclosporina A é administrada cronicamente pelo tempo de vida restante do dito mamífero.Em certas modalidades, pelo menos o LF15-0195 é administrado cronicamente pelo tempode vida restante do dito mamífero.

Em certos aspectos, a divulgação proporciona o uso de um fármaco que inibe aatividade do complemento e um fármaco imunossupressor na manufatura de ummedicamento ou pacote de medicamento para prolongar a sobrevivência de um aloenxertode rim em um mamífero. Em certas modalidades, mais do que um fármaco imunossupressor é incluído no dito medicamento ou pacote de medicamento. Em certasmodalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento e o dito fármacoimunossupressor estão em uma formulação adequada para a administração simultânea aodito mamífero. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade docomplemento e o dito fármaco imunossupressor estão em uma formulação ou formulaçõesadequadas para a administração seqüencial ao dito mamífero. Em certas modalidades, odito fármaco que inibe a atividade do complemento está em uma formulação adequada paraa administração crônica ao dito mamífero. Em certas modalidades, o dito fármacoimunossupressor está em uma formulação adequada para a administração crônica ao ditomamífero.

Em certos aspectos, a divulgação proporciona um método de prolongar asobrevivência de um aloenxerto em um mamífero receptor, o dito método compreendendoadministrar ao dito mamífero a) um fármaco que iniba a atividade do complemento e b) pelomenos uma terapia imunossupressora, onde a dita terapia é selecionada a partir de i) pelomenos um fármaco imunossupressor compreendendo o LF15-0195 ou ii) um tratamentoimunomodulador.

Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento inibea formação de C5b ou C5a. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a formação deC5b ou C5a é um anticorpo inteiro ou um fragmento de anticorpo. Em certas modalidades,o dito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo é um anticorpo ou fragmento de anticorpohumano, humanizado, quimerizado ou desimunizado. Em certas modalidades, o ditoanticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo inibe a clivagem do complemento C5. Em certasmodalidades, o dito fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste emum Fab, um F(ab')2, um Fv, um anticorpo para domínio, e um anticorpo de cadeia individual.Em certas modalidades, o dito fragmento de anticorpo é o pexelizumab. Em certasmodalidades, o dito anticorpo inteiro é o eculizumab. Em certas modalidades, o ditoeculizumab é administrado cronicamente. Em certas modalidades, o dito eculizumab éadministrado uma vez a cada 2 semanas.

Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive por um tempo pelo menos 20%mais longo do que se o dito método fosse para ser efetuado sem o dito fármaco que inibe aatividade do complemento. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive por umtempo pelo menos 40% mais longo do que se o dito método fosse para ser efetuado sem odito fármaco que inibe a atividade do complemento. Em certas modalidades, o ditoaloenxerto sobrevive pelo tempo de vida restante do dito mamífero. Em certas modalidades,o dito aloenxerto sobrevive por pelo menos três meses. Em certas modalidades, o ditoaloenxerto sobrevive por pelo menos seis meses. Em certas modalidades, o dito aloenxertosobrevive por pelo menos um ano. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive porpelo menos cinco anos. Em certas modalidades, o dito aloenxerto sobrevive pelo tempo devida restante do dito ser humano.

Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento éadministrado cronicamente por pelo menos 14 dias. Em certas modalidades, o dito fármacoque inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelo menos 28 dias.Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento éadministrado cronicamente por pelo menos 3 meses. Em certas modalidades, o ditofármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelo menos6 meses. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento éadministrado cronicamente por pelo menos 1 ano. Em certas modalidades, o dito fármacoque inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelo menos 5 anos.Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento éadministrado cronicamente pelo tempo de vida restante do dito mamífero.

Em certos aspectos, a divulgação proporciona um método de prolongar asobrevivência de um aloenxerto em um mamífero receptor, compreendendo administrar aodito mamífero a) um fármaco que iniba a atividade do complemento e b) pelo menos umaterapia imunossupressora, onde a dita terapia é selecionada a partir de i) pelo menos umfármaco imunossupressor compreendendo o LF15-0195 ou ii) um tratamentoimunomodulador, onde o dito mamífero é pré-sensibilizado para o dito aloenxerto.

Em certas modalidades, o dito fármaco imunossupressor inibe a atividade da célulaT ou a atividade da célula B. Em certas modalidades, o dito fármaco imunossupressor inibea atividade da célula Tea atividade da célula B. Em certas modalidades, o dito fármacoimunossupressor é selecionado a partir do grupo que consiste em ciclosporina A, tacrolimus,sirolimus, OKT3, um corticosteróide, daclizumab, basiliximab, azatiopreno, micofenolato mofetil, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticorpos anti-células T, ciclofosfamida, leflunamida,brequinar, ATG, ALG, 15-desoxiespergualina, LF15-0195, CTLA-4-lg (belatacept), rituxano ebredinina. Em certas modalidades, mais do que um fármaco imunossupressor éadministrado. Em certas modalidades, o dito método compreende administrar i) um fármacoque iniba a atividade do complemento e ii) a ciclosporina A. Em certas modalidades, o dito método compreende administrar i) um fármaco que iniba a atividade do complemento e ii) oLF15-0195. Em certas modalidades, o dito método compreende administrar i) um fármacoque iniba a atividade do complemento, ii) a ciclosporina A, e iii) o LF15-0195. Em certasmodalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento é um anticorpo que inibea clivagem do complemento C5. Em certas modalidades, um método de tratamentoimunomodulador, p.ex., a plasmaférese, a esplenectomia ou a imunoadsorção, é usado emcombinação com um inibidor da atividade do complemento.

Em certos aspectos, a divulgação proporciona o uso de um fármaco que inibe aatividade do complemento e pelo menos um fármaco imunossupressor na manufatura de ummedicamento ou pacote de medicamento para prolongar a sobrevivência de um aloenxertoem um mamífero, onde pelo menos um fármaco imunossupressor compreende o LF15-0195.Em certas modalidades, mais do que um fármaco imunossupressor é incluído no dito medicamento ou pacote de medicamento. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibea atividade do complemento e o dito fármaco imunossupressor estão em uma formulaçãoadequada para a administração simultânea ao dito mamífero. Em certas modalidades, odito fármaco que inibe a atividade do complemento e o dito fármaco imunossupressor estãoem uma formulação ou formulações adequadas para a administração seqüencial ao ditomamífero. Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complementoestá em uma formulação adequada para a administração crônica ao dito mamífero. Emcertas modalidades, o dito fármaco imunossupressor está em uma formulação adequadapara a administração crônica ao dito mamífero.

Em certos aspectos, a divulgação proporciona um pacote farmacêuticocompreendendo um fármaco que inibe a atividade do complemento e pelo menos umfármaco imunossupressor, onde o dito fármaco que inibe a atividade do complemento e odito fármaco imunossupressor são formulados para a administração crônica, onde pelomenos um fármaco imunossupressor compreende o LF15-0195.

Em certas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento é umanticorpo em uma formulação Iiofilizada compreendendo o anticorpo e um lioprotetor. Emcertas modalidades, o dito fármaco imunossupressor está em uma formulação Iiofilizadacompreendendo o fármaco imunossupressor e um lioprotetor. Em certas modalidades, odito fármaco e o dito fármaco imunossupressor estão na mesma formulação Iiofilizadacompreendendo o dito fármaco, o dito fármaco imunossupressor, e um lioprotetor. Emcertas modalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento está em umsistema de injeção compreendendo uma seringa que compreende um cartucho, onde o ditocartucho contém o dito fármaco em uma formulação adequada para injeção. Em certasmodalidades, o dito fármaco imunossupressor está em um sistema de injeçãocompreendendo uma seringa que compreende um cartucho, onde o dito cartucho contém odito fármaco imunossupressor em uma formulação adequada para injeção. Em certasmodalidades, o dito fármaco que inibe a atividade do complemento e o dito fármacoimunossupressor estão em um sistema de injeção compreendendo uma seringa quecompreende um cartucho, onde o dito cartucho contém o dito fármaco e o dito fármacoimunossupressor em uma formulação adequada para injeção. Em certas modalidades, odito fármaco que inibe a atividade do complemento está presente na forma de dosagem deunidade. Em certas modalidades, o dito fármaco imunossupressor está presente na formade dosagem de unidade.

Em certas modalidades, o anticorpo inibe a formação de complemento terminal ouC5a. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo inteiro ou um fragmento deanticorpo. Em certas modalidades, o dito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo é umanticorpo ou fragmento de anticorpo humano, humanizado, quimerizado ou desimunizado.

Em certas modalidades, o dito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo inibe a clivagemdo complemento C5. Em certas modalidades, o dito fragmento de anticorpo é selecionado apartir do grupo que consiste em um Fab, um F(ab')2, um Fv, um anticorpo para domínio, eum anticorpo de cadeia individual. Em certas modalidades, o dito fragmento de anticorpo éo pexelizumab. Em certas modalidades, o dito anticorpo inteiro é o eculizumab.

O pedido contempla a combinação de quaisquer dos aspectos e modalidadesprecedentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSAs Figuras 1A-1D mostram os níveis de anticorpos anti-doadores em receptorespré-sensibilizados versus não sensibilizados, sob diferentes tratamentos.

As Figuras 2A e 2B mostram a comparação entre a terapia tripla usando o anticorpoanti-C5, a CsA e a CyP em receptores de aloenxertos pré-sensibilizados e a terapia decombinação usando somente o anticorpo anti-C5 e a CsA em receptores de aloenxertos pré-sensibilizados. A Figura 2A compara a sobrevivência do aloenxerto de coração em diversosreceptores, sob diferentes tratamentos, conforme indicado. A Figura 2B mostra a histologiae a imunoistologia, por exemplo, para a infiltração de linfócitos nos aloenxertos de coraçãode receptores em diferentes grupos.

A Figura 3 mostra a atividade do complemento terminal bloqueada por um anticorpoanti-C5, em comparação com os agentes imunossupressores.

As Figuras 4A-4D comparam os níveis de anticorpos anti-doadores em receptorespré-sensibilizados de aloenxertos sob monoterapia com o anticorpo anti-C5 sozinho, terapiade combinação dupla com o anticorpo anti-C5 e a CsA1 e terapia de combinação tripla com oanticorpo anti-C5 , a CsA e a CyP.

A Figura 5 mostra a troca das razões dos isótipos da IgG em receptores dealoenxertos que não foram tratados ou sob tratamentos diferentes.

A Figura 6 mostra a expressão em alto nível das proteínas Bcl-2 e Bcl-x1 emenxertos de coração com sobrevivência de longa duração, em comparação com os enxertosde coração de animais não tratados.

As Figuras 7A-7C mostra o segundo transplante (retransplante) aperfeiçoado de umenxerto acomodado a partir de um primeiro receptor de transplante.

As Figuras 8A-8B mostram os resultados dos experimentos de retransplante.

As Figuras 9A-9B mostram os resultados dos experimentos de retransplante.

As Figuras 10A-10D mostram os níveis de anticorpos anti-doadores em receptores

pré-sensibilizados versus não sensibilizados, sob diferentes tratamentos.

As Figuras 11A-11C mostram que o mAb anti-C5 em combinação com a CsA e oLF atinge uma sobrevivência do enxerto de rim ilimitada em camundongos pré-sensibilizados.

A Figura 12 mostra que a atividade hemolítica do complemento foi completamenteinibida nos soros de camundongos BALB/c pré-sensibilizados.

As Figuras 13A-13B mostram a troca das razões dos isótipos da IgG nos receptoresde aloenxertos que não foram tratados ou sob diferentes tratamentos.

A Figura 14 mostra a expressão das proteínas protetoras nos enxertos de rins com sobrevivência de longa duração dos receptores pré-sensibilizados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Visão Geral: Rejeição dos Transplantes ou EnxertosA rejeição aguda ocorre dentro de minutos a horas após o transplante e é devidaaos anticorpos pré-formados para os antígenos dos tecidos transplantados. Ela écaracterizada por hemorragia e oclusão trombótica da vasculatura do enxerto. A ligação doanticorpo ao endotélio ativa o complemento, e o anticorpo e o complemento induzemdiversas alterações no endotélio do enxerto que promovem a trombose intravascular eresultam na oclusão vascular, o resultado sendo que o órgão enxertado sofre danoisquêmico irreversível (Abbas e col., 2000). A rejeição hiperaguda é freqüentementemediada por aloanticorpos de IgM preexistentes, p.ex., aqueles dirigidos contra os antígenosdo grupo sangüíneo ABO expressos nas células sangüíneas vermelhas. Este tipo derejeição, mediada por anticorpos naturais, é a razão principal para a rejeição dexenotransplantes. A rejeição hiperaguda devida aos anticorpos de IgM naturais não é maisum problema principal com os aloenxertos, porque os aloenxertos são normalmenteselecionados para compatibilizar o doador com o tipo ABO do receptor. A rejeiçãohiperaguda de um aloenxerto compatível com o ABO ainda pode ocorrer, normalmente mediada por anticorpos de IgG dirigidos contra os aloantígenos de proteínas, tais como asmoléculas do MHC estranhas, ou contra aloantígenos menos bem definidos expressossobre células endoteliais vasculares. Tais anticorpos podem surgir como um resultado daexposição anterior aos aloantígenos através de transfusão sangüínea, transplantesanteriores, ou múltiplas gravidezes (esta exposição anterior sendo referida como "pré-sensibilização"). Abbas e col., 2000.

A rejeição aguda é um processo de lesão vascular e parenquimal mediada porcélulas T, macrófagos, e anticorpos, que normalmente começa após a primeira semana detransplante. Abbas e col, 2001. Os linfócitos T desempenham uma função central narejeição aguda por resposta aos

aloantígenos, incluindo as moléculas do MHC^ presentes sobre as célulasvasculares endoteliais e parenquimais. As células T ativadas causam a Iise direta dascélulas do enxerto e produzem citocinas que recrutam e ativam as células inflamatórias, asquais causam a necrose. As células tanto CD4+ quanto CD8+ podem contribuir para arejeição aguda. A destruição de células alogênicas em um enxerto é altamente específica euma característica distintiva da morte dos linfócitos T citotóxicos CD8+. Abbas e col., 2000.As células T CD4+ podem ser importantes em mediar a rejeição aguda ao enxerto porsecreção de citocinas e indução de reações similares à hipersensibilidade do tipo retardadanos enxertos, com alguma evidência disponível que indica que as células T CD4+ sãosuficientes para mediar a rejeição aguda. Abbas e col., 2000. Os anticorpos podemtambém mediar a rejeição aguda após o receptor do enxerto instalar uma resposta imunehumoral aos antígenos da parede do vaso e os anticorpos que são produzidos ligarem-se àparede do vaso e ativarem o complemento. Abbas e col., 2000.A rejeição crônica é caracterizada por fibrose com perda de estruturas normais dosórgãos que ocorrem durante um período prolongado. A patogênese da rejeição crônica émenos bem entendida do que aquela da rejeição aguda. As oclusões arteriais do enxertopodem ocorrer como um resultado da proliferação das células do músculo liso da íntima(Abbas e col., 2000). Este processo é chamado arteriosclerose acelerada ou do enxerto epode desenvolver em qualquer transplante de órgão vascularizado dentro de 6 meses a umano após o transplante.

Para um transplante ser bem-sucedido, os diversos modos de rejeição devem sersuperados. Abordagens múltiplas são utilizadas na prevenção da rejeição. Isto poderequerer a administração de imunossupressores, freqüentemente diversos tipos paraprevenir os diversos modos de ataque, p.ex., inibição do ataque das células T1 anticorpos, eefeitos das citocinas e dos complementos. O pré-exame dos doadores para compatibilizá-los com os receptores é também um fator principal na prevenção da rejeição, especialmentena prevenção da rejeição hiperaguda. A imunoadsorção dos anticorpos anti-HLA antes doenxerto pode reduzir a rejeição hiperaguda. Antes do transplante, o receptor ou ohospedeiro pode ser administrado com reagentes anti-células T, p.ex., o anticorpomonoclonal OKT3, a Globulina Anti-Timócito (ATG), a ciclosporina A, ou o tracolimus (FK506). Adicionalmente, os glicoeorticóides e/ou a azatioprina (ou outros análogos de purina)podem ser administrados ao hospedeiro antes do transplante. Os fármacos usados paraauxiliar na prevenção da rejeição ao transplante incluem, porém não estão limitados à ATGou ALG, OKT3, daclizumab, basiliximab, corticosteróides, 15-desoxiespergualina, LF15-0195, ciclosporinas, tracolimus, análogos de purina, tais como azatioprina, metotrexato,micofenolato mofetil, 6-mercaptopurina, bredinina, brequinar, leflunamida, ciclofosfamida,sirolimus, anticorpos monoclonais anti-CD4, CTLA4-lg, rituxano, anticorpos monoclonaisanti-CD154, anticorpos monoclonais anti-LFA1, anticorpos monoclonais anti-LFA-3,anticorpos monoclonais anti-CD2, e anti-CD45.

Os aloenxertos são rejeitados, em parte, pela ativação das células Τ. O receptor dotransplante instala uma resposta de rejeição seguindo o reconhecimento pelas células TCD4+ dos antígenos estranhos no aloenxerto. Estes antígenos são codificados pelocomplexo de histocompatibilidade principal (MHC). Existem moléculas do MHC tanto daClasse I quanto da Classe II. Nos seres humanos, as moléculas do MHC da classe I são oHLA-A1 o HLA-B1 e o HLA-C. As moléculas do MHC da classe Il nos seres humanos sãochamadas HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP. Nos camundongos, as moléculas do MHC daclasse I são H-2K, H-2D e H-2L e as moléculas do MHC da classe Il são I-A e l-E. Quando as células T CD4+ ligam os antígenos do MHC estranhos, elas são ativadas e sofremproliferação clonal. As células T ativadas secretam citocinas que auxiliam na ativação dosmonócitos/macrófagos, das células B e das células T CD8+ citotóxicas. Osmonócitos/macrófagos ativados liberam agentes que resultam no dano do tecido, as célulasB produzem aloanticorpos que resultam na destruição do tecido mediada pelo complemento,e as células T CD8+ matam as células do enxerto em um modo específico para o antígenoatravés da indução da apoptose e da Iise da célula.

Agentes Imunossupressores

Os diversos fármacos utilizados para retardar a rejeição do enxerto (i.e., prolongar asua sobrevivência) trabalham em uma variedade de modos. Os agentes imunossupressoressão amplamente usados. Ver Stepkowski1 2000, quanto a uma revisão do mecanismo deação dos diversos fármacos imunossupressores. A ciclosporina A é um dos fármacosimunossupressores mais amplamente usados para inibir a rejeição do enxerto. Ela é uminibidor da interleucina-2 ou IL-2 (ela impede a transcrição pelo mRNA da interleucina-2).Mais diretamente, a ciclosporina inibe a ativação da calcineurina que normalmente ocorre naestimulação do receptor das células Τ. A calcineurina desfosforila o NFAT (fator nuclear decélulas T ativadas), capacitando-o de entrar no núcleo e ligar-se ao promotor da interleucina-2. Pelo bloqueio deste processo, a ciclosporina A inibe a ativação das células TCD4+ e a cascata resultante de eventos que, de outro modo, ocorreriam. O tracolimus é umoutro imunossupressor que atua por inibição da produção da interleucina-2.

A rapamicina (Sirolimus), o SDZ RAD, e os bloqueadores do receptor deinterleucina-2 são fármacos que inibem a ação da interleucina-2 e, portanto, impedem a cascata de eventos descrita acima.

Os inibidores da biossíntese de purina ou pirimidina são também usados para inibira rejeição do enxerto. Estes impedem a síntese de DNA e, desse modo, inibem a divisãocelular, incluindo a capacidade das células T de dividirem-se. O resultado é a inibição daatividade das células T por prevenção da formação de novas células T. Os inibidores dasíntese de purina incluem a azatioprina, o metotrexato, o micofenolato mofetil (MMF) e amizoribina (bredinina). Os inibidores da síntese de pirimidina incluem o brequimar sódio e aleflunomida. A ciclofosfamida é um inibidor da síntese tanto da purina quanto da pirimidina.

Ainda um outro método para inibir a ativação das células T é tratar o receptor comanticorpos para células Τ. O OKT3 é um anticorpo monoclonal de murino contra a CD3 que é parte do receptor de células T. Este anticorpo inibe o receptor de células T e suprime aativação das células T.

Numerosos outros fármacos e métodos para retardar a rejeição do alotransplantesão conhecidos e usados por aqueles de habilidade na técnica. Uma abordagem tem sidoreduzir as células T, p.ex., por irradiação. Esta tem sido freqüentemente usada nos transplantes de medulas ósseas, especialmente se houver uma compatibilidade parcial como HLA principal. A administração ao receptor de um inibidor (bloqueador) da interação entreIigante de CD40-CD40 e/ou um bloqueador da interação entre CD28-B7 tem sido usada(Patente U.S. 6.280.957). O pedido de patente PCT publicado WO 01/37860 ensina aadministração de um anticorpo monoclonal anti-CD3 e a IL-5 para inibir a resposta imune deTh1. O pedido de patente PCT publicado WO 00/27421 ensina um método para a profilaxiaou o tratamento de rejeição de transplante da córnea por administração de um antagonistado fator de necrose tumoral a. Glotz e col. (2002) mostram que a administração deimunoglobulinas intravenosas (IVIg) pode induzir uma diminuição profunda e continuada nostítulos dos anticorpos anti-HLA, desse modo permitindo um transplante de um órgãoincompatível com o HLA. Protocolos similares incluíram as trocas de plasmas (Taube e col.,1984) ou as técnicas de imunoadsorção acopladas aos agentes imunossupressores (Hiesse e col., 1992) ou uma combinação destas (Montgomery e col., 2000). Changelian e col.(2003) ensinam um modelo no qual a imunossupressão é causada por um inibidor oral dacinase Janus 3 (JAK3), que é uma enzima necessária para a sinalização adequada dosreceptores de citocinas que utilizam a cadeia gama comum (yc) (lnterleucinas^2, -4, -7, -9, -15, -21), o resultando sendo uma inibição da ativação das células T. Os ácidos nucléicossem sentido contra a ICAM-1 têm sido usados sozinhos ou em combinação com umanticorpo monoclonal específico para o antígeno associado com a função de leucócito 1(LFA-1) em um estudo de transplante de aloenxerto de coração (Stepkowski, 2000).Similarmente, um anticorpo anti-ICAM-1 tem sido usado em combinação com o anticorpoanti-LFA-1 para tratar os aloenxertos de coração (Stepkowski, 2000). Os oligonucleotídeossem sentido têm sido adicionalmente usados em conjunção com a ciclosporina em modelosde aloenxertos de coração ou rim de ratos, resultando em um efeito sinérgico de prolongar asobrevivência dos enxertos (Stepkowski, 2000). A rejeição crônica do transplante tem sidotratada por administração de um antagonista de TGF-β, que é uma citocina envolvida nadiferenciação, na proliferação e na apoptose (Publicação de Pedido de Patente U.S. US 2003/0180301).

Complemento e Rejeição do Transplante/

A função do complemento na rejeição do transplante é bastante conhecida. Isto éespecialmente verdadeiro no caso do xenotransplante, porém o complemento tambémdesempenha uma função na rejeição do alotransplante. Quanto a uma revisão, ver Platt e Saudi, 1999. Um aspecto da função do complemento é que a lesão por isquemia-reperfusão pode ocorrer na hora que um enxerto de órgão é reperfundido com o sangue doreceptor. O complemento pode também causar algumas manifestações de rejeição doaloenxerto.

O sistema de complemento é descrito em detalhe na Patente U.S. 6.355.245. Osistema de complemento atua em conjunção com outros sistemas imunológicos do corpopara defender-se contra a intrusão de patógenos celulares e virais. Existem pelo menos 25proteínas de complementos, as quais são encontradas como uma coleção complexa deproteínas plasmáticas e cofatores de membrana. As proteínas plasmáticas constituemcerca de 10% das globulinas no soro do vertebrado. Os componentes do complementoatingem as suas funções defensoras imunes por interação em uma série de eventos declivagem enzimática e ligação de membrana intricados, porém precisos. A cascata docomplemento resultante resulta na produção de produtos com funções opsônicas,imunorreguladoras, e líticas.

A cascata do complemento progride por meio da via clássica ou da via alternativa.Estas vias compartilham muitos componentes e, embora elas difiram em suas etapas iniciais,elas convergem e compartilham os mesmos componentes do "complemento terminal" (C5 até C9), responsáveis pela ativação e pela destruição das células-alvo.

A via clássica do complemento é tipicamente iniciada por reconhecimento peloanticorpo de, e ligação a, um local de antígeno sobre uma célula-alvo. A via alternativa énormalmente independente do anticorpo e pode ser iniciada por certas moléculas sobre assuperfícies dos patógenos. Ambas as vias convergem no ponto onde o componente docomplemento C3 é clivado por uma protease ativa (que é diferente em cada via) paraproduzir C3a e C3b. As outras vias que ativam o ataque do complemento podem atuarposteriormente na seqüência de eventos, resultando em diversos aspectos da função docomplemento.

O C3a é uma anafilatoxina. O C3b se liga às células bacterianas e a outras células,bem como a certos vírus e complexos imunes, e os marca para a remoção da circulação. OC3b nesta função é conhecido como opsonina. A função opsônica do C3b é consideradaser a ação antiinfecciosa mais importante do sistema de complemento. Os pacientes comlesões genéticas que bloqueiam a função do C3b são propensos à infecção por uma amplavariedade de organismos patogênicos, enquanto que os pacientes com lesões posterioresna seqüência da cascata do complemento, i.e., os pacientes com lesões que bloqueiam asfunções de C5, são verificados serem mais propensos somente a infecção por Naisséria, eentão somente algo mais propensos (Fearon, 1983).

O C3b também forma um complexo com outros componentes únicos a cada viapara formar a C5 convertase clássica ou alternativa, a qual cliva o C5 em C5a e C5b. O C3é, desse modo, considerado como a proteína central na seqüência de reações docomplemento, visto que ele é essencial para ambas as vias alternativa e clássica (Wurzner ecol., 1991). Esta propriedade do C3b é regulada pela protease do soro Fator I, que atuasobre o C3b para produzir o iC3b. Embora funcional como opsonina, o iC3b não podeformar uma C5 convertase ativa.

O C5 é uma beta globulina de 190 kDa encontrada no soro normal aaproximadamente 75 μg/mL (0,4 μΜ). O C5 é glicosilado, com cerca de 1,5-3 por cento desua massa atribuídos ao carboidrato. O C5 maduro é um heterodímero de uma cadeia alfade 115 kDa de 999 aminoácidos, que é ligada por dissulfeto a uma cadeia beta de 75 kDade 656 aminoácidos. O C5 é sintetizado como um produto de proteína precursora de cadeiaindividual de um único gene de cópia (Haviland e col., 1991). A seqüência de cDNA dotranscrito deste gene prediz um pró-precursor de C5 secretado de 1659 aminoácidos,juntamente com uma seqüência líder de 18 aminoácidos.

O pró-precursor de C5 é clivado após o aminoácido 655 e 659, para produzir acadeia beta como um fragmento amino terminal (resíduos de aminoácidos +1 a 655) e acadeia alfa como um fragmento carboxil terminal (resíduos de aminoácidos 660 a 1658),com quatro aminoácidos detectados entre as duas.

O C5a é clivado da cadeia alfa de C5 pela C5 convertase alternativa ou clássicacomo um fragmento amino terminal compreendendo os primeiros 74 aminoácidos da cadeiaalfa (i.e., os resíduos de aminoácidos 660-733). Aproximadamente 20 por cento da massade 11 kDa do C5a são atribuídos ao carboidrato. O sítio de clivagem para a ação daconvertase está no, ou é imediatamente adjacente ao, resíduo de aminoácido 733. Um composto que ligaria neste, ou adjacente a este, sítio de clivagem teria o potencial debloquear o acesso das enzimas C5 convertase ao sítio de clivagem e, com isso, atuariacomo um inibidor do complemento.

O C5 pode também ser ativado por meios diferentes da atividade da C5 convertase.A digestão por tripsina limitada (Minta e Man, 1977; Wetsel e Kolb, 19982) e o tratamentocom ácido (Yamamoto e Gewurz, 1978; Vogt e col., 1989) podem também clivar o C5 eproduzir o C5b ativo.

O C5a é uma outra anafilatoxina. O C5b combina-se com C6, C7, e C8 para formaro complexo de C5b-8 na superfície da célula-alvo. Com a ligação das diversas moléculasde C9, o complexo de ataque da membrana (MAC, C5b-9, complexo do complementoterminal - TCC) é formado. Quando números suficientes de MACs inserirem nasmembranas das células-alvo, as aberturas que eles criam (poros de MAC) mediam a Iiseosmótica rápida das células-alvo. As concentrações menores, não líticas, de MACs podemproduzir outros efeitos. Em particular, a inserção na membrana de pequenos números doscomplexos de C5b-9 em células endoteliais e plaquetas pode causar a ativação deletéria dacélula. Em alguns casos, a ativação pode preceder a Iise da célula.

Conforme mencionado acima, o C3a e o C5a são anafilatoxinas. Estescomponentes do complemento ativados podem desencadear a desgranulação de mastócitos,que libera a histamina e outros mediadores da inflamação, resultando na contração domúsculo liso, na permeabilidade vascular aumentada, na ativação de leucócitos, e em outrosfenômenos inflamatórios, incluindo a proliferação celular resultando na hipercelularidade. OC5a também funciona como um peptídeo quimiotático que serve para atrair granulócitos pró-inflamatórios para o local de ativação do complemento.Os anticorpos dos receptores que se ligam aos complementos para os aloantígenosdos doadores são considerados serem a causa principal de rejeição hiperaguda do enxerto.Devido ao teste de reação cruzada pré-transplante, este protótipo de rejeição humoral éagora raramente observado (Regele e col., 2001). Os dados estão agora mostrando que osmecanismos imunes humorais poderiam contribuir para outros tipos de rejeição doaloenxerto (Regele e col., 2001). Os altos níveis de anticorpos reativos de painéis indicandopré-sensibilização humoral foram verificados estarem associados com a sobrevivênciainferior do enxerto de rim (Opelz, 1992), o surgimento de aloanticorpos durante o períodopós-transplante foi descrito predizer um resultado insatisfatório do enxerto (Jeannet e col.,1970; Halloran e col., 1992), e a remoção seletiva da IgG do receptor por imunoadsorçãoreverteu alguns episódios de rejeição, indicando a contribuição dos mecanismos imuneshumorais para a rejeição (Persson e col., 1995; Bõhmig e col., 2000). A ativação docomplemento dentro de um enxerto poderia indicar a lesão do enxerto mediada peloanticorpo. O produto da clivagem do complemento C4d é um marcador para a ativação davia clássica dependente de anticorpo. Os depósitos capilares de C4d nas biópsias dealoenxertos de rins foram associados com o fraco resultado do enxerto.

Uma evidência recentemente crescente indica que a ativação do complementosignificativãmèntè contribui para a sensibilização dos receptores de aloenxertos e odesenvolvimento de lesão do tecido em aloenxertos (Platt e col., 1999). Os anticorpos sãoos mediadores mais completamente investigados de ativar a via clássica do complemento.Clinicamente, os aloanticorpos são sabidos ativar o complemento (Baldwin e col., 2001).Halloran e Collins indicam que a deposição de C4d em capilares peritubulares dealoenxertos renais é um marcador sensível e diagnóstico da rejeição aguda humoral que secorrelaciona fortemente com a presença de anticorpos circulantes específicos paradoadores (Collins e col., 1999; Halloran, 2003). É vista uma evidência de suporte adicionalem animais com inibição do complemento (Pratt e col., 1996; Pruitt e col., 1991; Forbes ecol., 1978) ou deficiência (Pratt e col., 2000; Baurer e col., 1995) que exibem lesãoinflamatória significativamente reduzida e respostas imunes anti-doador diminuídas. NaABMR, o complemento é sugerido ser ativado pela via clássica e desempenhar uma função-chave na patogênese (Collard e col, 1997). Embora a função do complemento na HAR ouna rejeição vascular aguda (AVR) após xenotransplante tenha sido bem documentada (Platte col., 1999), os mecanismos exatos do complemento na patogênese da ABMR após oalotransplante ainda não tinham sido elucidados.

O componente C5 do complemento é clivado para formar produtos com efeitos pró-inflamatórios múltiplos e, assim, representa um alvo atraente para a inibição docomplemento dentro da resposta inflamatória imune-mediada. Conforme descrito acima, oC5a é uma anafilatoxina e um fator quimiotático poderosos. A ativação celular pelo C5ainduz a liberação de mediadores inflamatórios adicionais múltiplos (Jose e col., 1983). Asvias de ativação do complemento (via clássica, alternativa, e de Iectina de ligação aomanano) ao fim resultam na formação do complexo de ataque da membrana citolítico C5b-9(Kirschfunk, 2001), o qual pode mediar tanto a lesão direta do tecido pela Iise celular, quantoa ativação das células pró-inflamatórias em doses sublíticas (Saadi e col., 1995;Papdimitriou e col., 1991). Portanto, o bloqueio da geração tanto de C5a quanto de C5b-9pode ser requerido para a inibição ótima da resposta inflamatória mediada por complementoapós o transplante. Ao mesmo tempo, a inibição da cascata do complemento em C5 nãoprejudica a geração de C3b, conservando a opsonização mediada por C3b dosmicroorganismos patogênicos, bem como a solubilização e a depuração dos complexosimunes (Liszewski, 1993).

O efeito benéfico do mAb anti-C5 tinha sido anteriormente descrito em diversosmodelos experimentais, incluindo a reperfusão miocárdica (Vakeva e col., 1998), o Iuposistêmico eritematoso (Wang e col., 1996) e a artrite reumatóide (Wang e col., 1995); bemcomo em ensaios clínicos humanos (Kirschfink, 2001) de doença auto-imune, desviocardiopulmonar e infarto agudo do miocárdio. Além disso, a inativação do complemento porum Ab monoclonal (mAb) anti-C5 que bloqueia funcionalmente impediu a HAR em modelosde xenotransplante (Krõshus e col., 1995; Wang e col., 1999).

Os métodos de retardar a rejeição do alotransplante por administração de inibidoresdo complemento têm sido testados. O pedido de patente PCT publicado WO 92/10205divulga o uso de uma combinação de ciclosporina e um receptor de complemento solúvel(sCR1) para inibir a rejeição de um alotransplante cardíaco em um modelo de rato pré-sensibilizado. O receptor de complemento 1 liga os complementos C3b e C4b. As formassolúveis do receptor de complemento 1 ocorrem naturalmente ou podem ser geradas viaprocedimentos de DNA recombinante. Estes receptores de complemento solúveis inibiramin vitro as conseqüências da ativação do complemento (Patente U.S. 6.057.131). No WO92/10205, os ratos, os quais tinham sido pré-sensibilizados para o aloenxerto cardíaco queeles estavam recebendo, foram administrados com ciclosporina A intramuscularmente a 10mg/kg/dia, começando dois dias antes do transplante e continuou até a hora da rejeição doenxerto. Adicionalmente, o receptor de complemento solúvel 1 (sCR1) foi administradocomo um bolo intravenoso único, a 15 mg/kg, imediatamente antes da reperfusão do enxerto.Os animais de controle sem nenhum tratamento com fármaco tiverem o enxerto rejeitado emuma média de 3,8 dias. Aqueles administrados com ciclosporina A sozinha rejeitaram osenxertos em uma média de 57 dias (isto foi bem variável com dois ratos que rejeitaramrapidamente em 2 e 4 dias e um terceiro rato que rejeitou em 166 dias). Os ratosadministrados com sCR1 sozinho rejeitaram os enxertos em uma média de 44 dias.Aqueles ratos administrados com a combinação de ciclosporina A e sCR1 rejeitaram osenxertos em uma média de 147 dias. A combinação de ciclosporina A crônica e sCR1 comobolo único foi vista resultar em um efeito sinérgico que prolongou bastante o tempo até arejeição do enxerto. Os estudos iniciais por Pruitt e Bollinger (1991) usaram um modelosimilar de um aloenxerto de rato pré-sensibilizado para mostrar que a administração de umsCR1 sozinho para inativar o complemento resultou no tempo aumentado antes da rejeiçãodo enxerto.

Sims e col. (Patente U.S. 5.135.916) sugerem utilizar inibidores do complemento,p.ex., CD59 ou anticorpos contra C7 ou C9, para bloquear a formação do complexo de C5b-9, para tratar o endotélio vascular de órgãos e tecidos a serem transplantados. Istoimpediria a necrose celular iniciada por C5b-9. Os agentes de inativação de C5b-9 seriamadicionados ao perfusado ou meio de armazenagem para proteger as células vasculares decobertura da ativação do complemento permanente durante a armazenagem in vitro.Adicionalmente, o órgão ou o tecido seria protegido dos efeitos citolíticos e trombóticos quesurgem da ativação do complemento iniciada com o transplante, desse modo evitando arejeição aguda mediada por complemento. Sims e col. (Patente U.S. 5.573.940 e PatenteU.S. 6.100.443) também ensinam um método de expressar CD59 no tecido ou órgãotransplantado, para proteger o órgão transplantado da rejeição. Isto pode ser efetuado portransfecção das células que estão sendo transplantadas.

Embora os diversos fármacos desenvolvidos até o momento, em combinação comos métodos de pré-examinar doadores e receptores para compatibilizar o aloenxerto dodoador com o receptor, tenham com o tempo aumentado a duração média de tempo desobrevivência dos aloenxertos, muitos aloenxertos são, apesar de tudo, rejeitados durante otempo de vida do receptor. Em geral, os avanços da técnica anterior têm sidoprincipalmente dirigidos para superar a rejeição aguda do enxerto. Ademais, a função doscomponentes do complemento terminal ativados na rejeição do aloenxerto mediada poranticorpo não tinha sido examinada usando inibidores que alvejam especificamente acascata de complemento no nível de proteína C5. Os métodos descritos neste documento econforme exemplificados nos Exemplos melhoram a técnica de alotransplante por inibiçãoda rejeição crônica de aloenxertos, em particular, aloenxertos em um receptor pré-sensibilizado. Novos métodos são apresentados para prolongar adicionalmente asobrevivência dos aloenxertos por utilização de uma combinação apropriada de fármacosimunossupressores em combinação com uma administração crônica de um inibidor docomplemento.

Métodos e Usos

Os métodos divulgados neste documento são usados para prolongar asobrevivência do aloenxerto. Os métodos geralmente incluem a administração de uminibidor da atividade do complemento em combinação com um ou mais imunossupressores.Os inibidores do complemento adequados são conhecidos para aqueles dehabilidade na técnica. Os anticorpos podem ser preparados para componentes individuaisdo complemento ativado, p.ex., anticorpos para C5a, C7, C9, etc. (ver, p.ex., a Patente6.534.085, o pedido de Patente U.S. publicado US 2003/0129187; e a Patente U.S.5.660.825). São conhecidas proteínas que inibem a Iise mediada pelo complemento,incluindo a CD59, a CD55, a CD46 e outros inibidores de C8 e C9 (ver, p.ex., a Patente U.S.6.100.443). A Patente U.S. 6.355.245 ensina um anticorpo que se liga ao C5 e impede queele seja clivado para C5a e C5b, desse modo impedindo a formação não somente de C5a,como também do complexo de C5b-9. As proteínas conhecidas como receptores decomplemento e que ligam o complemento são também conhecidas (ver, o Pedido dePatente PCT Publicado WO 92/10205 e a Patente U.S. 6.057.131). O uso de formassolúveis de receptores de complementos, p.ex., o CR1 solúvel, pode inibir as conseqüênciasda ativação do complemento, tais como a explosão oxidativa de neutrófilos, a hemólisemediada por complemento, e a produção de C3a e C5a. Aqueles de habilidade na técnicareconhecem o acima descrito como alguns dos, porém não todos os, métodos conhecidosde inibir o complemento e a sua ativação.

Osjmunossupressores adequados incluem, porém não estão limitados à ATG ouALG, OKT3, daclizumab, basiliximab, corticosteróides, 15-desoxiespergualina, LF15-0195,ciclosporinas, tracolimus, azatioprina, metotrexato, micofenolato mofetil, 6-mercaptopurina,bredinina, brequinar, leflunamida, ciclofosfamida, sirolimus, anticorpos monoclonais anti-CD4, CTLA4-lg, rituxano, anticorpos monoclonais anti-CD154, anticorpos monoclonais anti-LFA1, anticorpos monoclonais anti-LFA-3, anticorpos monoclonais anti-CD2, e anti-CD45.

Uma aloenxerto pode incluir um órgão transplantado, parte de um órgão, tecido oucélula. Estes incluem, porém não estão limitados ao coração, rim, pulmão, pâncreas, fígado,tecido vascular, olho, córnea, cristalino, pele, medula óssea, músculo, tecido conjuntivo,tecido gastrointestinal, tecido nervoso, osso, células-tronco, ilhotas, cartilagem, hepatócitos,e células hematopoéticas.

Pelo menos parte da razão para o fracasso dos aloenxertos é que uma respostapelo receptor de um aloenxerto é a ativação do complemento. Isto resulta na formação deC5a e C5b-9, os quais são moléculas pró-inflamatórias potentes que auxiliam em causar ofracasso do enxerto. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria proposta, os Requerentesteorizaram que a inibição da formação de C5a e C5b-9 ou a inibição de C5a e C5b-9 queestão presentes auxiliaria no impedimento do fracasso do enxerto. Além disso, foi teorizadoque enquanto o aloenxerto estiver presente, o receptor continuará a tentar instalar umaresposta imune contra o enxerto, e esta resposta incluirá as tentativas de produzir C5a eC5b-9. Se não impedida, esta resposta do complemento resultará na rejeição vascularaguda a curto prazo e contribuiria para a rejeição crônica do enxerto a longo prazo. Osmétodos da técnica anterior de utilizar inibidores da atividade do complemento estavamlimitados a administrar estes inibidores somente na hora do transplante. Isto foi útil emprevenir a rejeição aguda, porém, conforme ilustram os resultados divulgados nestedocumento, os resultados aperfeiçoados são obtidos por administração de tais inibidores porum período mais longo. Esta administração a longo prazo auxilia na prevenção da rejeiçãocrônica do aloenxerto, em oposição a somente auxiliar na prevenção de uma rejeição aguda.

O resultado é uma sobrevivência de duração mais longa do aloenxerto, em comparaçãocom não administrar um inibidor da atividade do complemento ou administrar tal inibidorsomente na hora do transplante do aloenxerto. Embora muito comumente, é desejável queo aloenxerto sobreviva pelo tempo de vida restante do receptor, existam momentos quandoo aloenxerto for necessário somente por uma duração mais curta de tempo, p.ex., um órgãode ponte para ligar com ponte o tempo até que o próprio órgão do receptor possa recuperar-se sozinho, em cuja ocasião o aloenxerto não mais será necessário. A duração do tempoque tal enxerto será necessário variará, porém, normalmente, será mais longa do que otempo no qual a rejeição aguda ocorreria e pode ser longa o suficiente para a rejeiçãocrônica ocorrer. Este período de sobrevivência desejado para um enxerto de ponte pode serdiversos meses, p.ex., seis meses.

Para provar que a inibição a longo prazo da atividade do complemento prolongará asobrevivência do aloenxerto, foram efetuados experimentos nos quais foi inibida a ativaçãodo complemento em um modo crônico e não meramente na hora do transplante. Otratamento crônico significa o tratamento durante um período prolongado até o tempo devida do aloenxerto. Este pode ser um tratamento diário, porém não está limitado aotratamento diário. O tratamento crônico manterá uma quantidade efetiva do fármaco noreceptor do aloenxerto. Por exemplo, um método preferido é incluir o anticorpo monoclonalanti-C5 eculizumab no tratamento. Nos estudos de pessoas que sofrem de hemoglobinúrianoturna paroxísmica (PNH), o eculizumab foi administrado em uma dose de 900mg/paciente, uma vez a cada 12-14 dias. Esta dosagem foi verificada bloquear completa econsistentemente a atividade do complemento terminal e inibiu bastante os sintomas daPNH (Hillmen e col., 2004). A dose administrada é capaz de bloquear os efeitos docomplemento por aproximadamente duas semanas antes do eculizumab ser inativado ouremovido do corpo. Portanto, um tratamento crônico de eculizumab pode ser, p.ex., aadministração de 900 mg ao receptor do aloenxerto, uma vez a cada duas semanas, pelorestante do tempo de vida do paciente. Similarmente, outros fármacos podem serdistribuídos cronicamente, conforme necessários, quer isto seja em uma base diária, querseja requerido um outro programa para manter uma quantidade efetiva do fármaco noreceptor de aloenxerto. Porque se sabe bem que a rejeição do aloenxerto pode ser causadapor mais do que somente a ativação do complemento, p.ex., pela atividade das células T, osexperimentos incluíram imunossupressores, tais como a ciclosporina, para auxiliaradicionalmente na prevenção da rejeição do enxerto.

Um método preferido de inibir a atividade do complemento é usar um anticorpomonoclonal que se liga ao complemento C5 e impede que o C5 seja clivado. Isto impede aformação tanto de C5a quanto de C5b-9, enquanto que ao mesmo tempo permite aformação de C3a e C3b, que são benéficos para o receptor. Tais anticorpos que sãoespecíficos para o complemento humano são conhecidos (Patente U.S. 6.355.245). Estesanticorpos divulgados na Patente U.S. 6.355.245 incluem tanto um anticorpo inteiro ou detamanho natural (agora chamado eculizumab) quanto um anticorpo de cadeia individual(agora chamado pexelizumab). Um anticorpo similar contra o C5 de camundongo échamado BB5.1 (Frei e col., 1987). O BB5.1 foi utilizado nos experimentos descritos abaixo.Os anticorpos para inibir a atividade do complemento não necessitam ser anticorposmonoclonais. Eles podem ser, p.ex., anticorpos policlonais. Eles podem adicionalmente serfragmentos de anticorpos. Um fragmento de anticorpo inclui, porém não está limitado a umFab, F(ab')2, um anticorpo de cadeia individual, um anticorpo para domínio e um Fv. Alémdisso, sabe-se bem por aqueles de habilidade na técnica que os anticorpos podem serhumanizados (Jones e col., 1986), quimerizados, ou desimunizados. Um anticorpo podetambém compreender uma porção de Fc mutado, de modo tal que o Fc mutante não ative ocomplemento. Os anticorpos a serem usados na presente divulgação podem ser quaisquerdestes. É preferível usar anticorpos humanizados quando o receptor do aioenxerto for umser humano.

Administração e Formulações

A ativação do inibidor da atividade do complemento é efetuada de acordo commétodos conhecidos para aqueles de habilidade na técnica. Estes inibidores sãoadministrados preferivelmente antes do momento do transplante do aioenxerto ou na horado transplante, com a administração continuando em um modo crônico. Estes inibidorespodem adicionalmente ser administrados durante um episódio de rejeição, caso tal episódiode fato ocorra.

A presente divulgação também proporciona usos de um fármaco que inibe a atividade do complemento e um agente imunossupressor na manufatura de ummedicamento ou pacote de medicamento. Tal medicamento ou pacote de medicamento éútil em prolongar a sobrevivência do aioenxerto em um receptor, em particular, asobrevivência crônica do aioenxerto. Nas modalidades preferidas, o medicamento ou opacote de medicamento é formulado e preparado de modo tal que ele esteja adequado paraa administração crônica ao receptor do aioenxerto, por exemplo, as formulações estáveissão empregadas. Em certas modalidades, o medicamento ou o pacote de medicamento éformulado e preparado de modo tal que ele esteja adequado para a administraçãosimultânea do fármaco que inibe a atividade do complemento e do fármacoimunossupressor ao receptor do aloenxerto. Em certas modalidades, o medicamento ou opacote de medicamento é formulado e preparado de modo tal que ele esteja adequado paraa administração seqüencial (em qualquer ordem) do fármaco que inibe a atividade docomplemento e do fármaco imunossupressor ao receptor do aloenxerto.

Um pacote farmacêutico da presente divulgação pode compreender um fármacoque inibe a atividade do complemento e pelo menos um agente imunossupressor. O pacotefarmacêutico pode adicionalmente compreender um rótulo para a administração crônica. Opacote farmacêutico pode também compreender um rótulo para a auto-administração porum paciente, por exemplo, um receptor de um enxerto de transplante, ou instruções para umcuidador de um receptor de um enxerto de transplante. Em certas modalidades, o fármacoe o agente no pacote farmacêutico estão em uma formulação ou em formulações separadasque são adequadas para a administração crônica e/ou a auto-administração.

A presente divulgação também proporciona formulações Iiofilizadas e formulaçõesadequadas para injeção. Certas modalidades proporcionam uma formulação de anticorpoIiofilizada compreendendo um anticorpo que inibe a atividade do complemento e umlioprotetor. JNas modalidades preferidas, a formulação de anticorpo é adequada para aadministração crônica, por exemplo, a formulação de anticorpo é estável. As modalidadesalternativas proporcionam um sistema de injeção compreendendo uma seringa; a seringacompreende um cartucho contendo um anticorpo que inibe a atividade do complemento eestá em uma formulação adequada para injeção.

Um anticorpo empregado nas diversas modalidades da presente divulgaçãopreferivelmente inibe a formação de complemento terminal ou C5a. Em certas modalidades,o anticorpo que inibe a formação de complemento terminal ou C5a é um anticorpo inteiro ouum fragmento de anticorpo. O anticorpo inteiro ou o fragmento de anticorpo pode ser umanticorpo ou fragmento de anticorpo humano, humanizado, quimerizado ou desimunizado.

Em certas modalidades, o anticorpo inteiro ou o fragmento de anticorpo pode inibir aclivagem do complemento C5. Em certas modalidades, o fragmento de anticorpo é um Fab,um F(ab')2, um Fv1 um anticorpo para domínio, ou um anticorpo de cadeia individual. Nasmodalidades preferidas, o fragmento de anticorpo é o pexelizumab. Nas modalidadespreferidas alternativas, o anticorpo inteiro é o eculizumab.

Em certas modalidades, um fármaco, tal como um anticorpo, que inibe a atividadedo complemento está presente na forma de dosagem de unidade, a qual pode serparticularmente adequada para a auto-administração. Similarmente, um agenteimunossupressor da presente divulgação pode também estar presente na forma dedosagem de unidade. Um produto formulado da presente divulgação pode ser incluído emum recipiente, tipicamente, por exemplo, um frasco pequeno, um cartucho, uma seringa pré-enchida ou caneta descartável. Um dosador, tal como o dispositivo dosador descrito naPatente U.S. 6.302.855, pode também ser usado, por exemplo, com um sistema de injeçãoda presente divulgação.

Em certas modalidades, o eculizumab é distribuído em um regime de dosagem de600 mg, via infusão IV por 25 a 45 minutos, a cada 7 ± 2 dias para as primeiras 4 semanas,seguidos por 900 mg para a quinta dose 7 ± 2 dias posteriormente, então 900 mg a cada 14± 2 dias, após isso. A administração pode ser via infusão IV durante 25 a 45 minutos. Oeculizumab pode ser diluído até uma concentração final de 5 mg/mL, antes da administração.

Uma formulação "estável" é uma na qual o fármaco (p.ex., um anticorpo) ou agentenela essencialmente conserva a sua estabilidade e integridade físicas e químicas naarmazenagem. Diversas práticas analíticas para medir a estabilidade da proteína estãodisponíveis na técnica e são revistas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301,Vincent Lee Ed., Mareei Dekker, Inc., Nova York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. DrugDelivery Rev. 10: 29-90 (1993). A estabilidade pode ser medida em uma temperaturaselecionada, por um período de tempo selecionado. Por exemplo, o grau de agregação quesegue a liofilização e a armazenagem pode ser usado como um indicador da estabilidade daproteína. Por exemplo, uma formulação "estável" pode ser uma onde menos do que cercade 10% e preferivelmente menos do que cerca de 5% da proteína está presente como umagregado na formulação. Em outras modalidades, pode ser determinado qualquer aumentona formação de agregado seguindo a liofilização e a armazenagem da formulação liofilizada.Por exemplo, uma formulação liofilizada "estável" pode ser uma onde o aumento noagregado na formulação liofilizada é menos do que cerca de 5% e preferivelmente menos doque cerca de 3%, quando a formulação liofilizada for armazenada a 2-8 0C por pelo menosum ano. Em outras modalidades, a estabilidade da formulação de proteína pode ser medidausando um ensaio de atividade biológica.

Uma formulação "reconstituída" é uma que tenha sido preparada por dissolução deuma formulação de proteína liofilizada em um diluente, de modo tal que a proteína estejadispersa na formulação reconstituída. A formulação reconstituída é adequada para aadministração (p.ex., a administração parenteral) a um paciente a ser tratado com a proteínade interesse e, em certas modalidades da invenção, pode ser uma que seja adequada paraa administração subeutânea.

Uma formulação reconstituída isotônica é preferível em certas modalidades. Por"isotônica" pretende-se que a formulação de interesse tenha essencialmente a mesmapressão osmótica que o sangue humano. As formulações isotônicas geralmente terão umapressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida usandouma pressão de vapor ou um osmômetro do tipo congelamento por gelo, por exemplo.

Um "lioprotetor" é uma molécula que, quando combinada com um fármaco (p.ex.,um anticorpo) de interesse, impede ou reduz significativamente a instabilidade química e/oufísica do fármaco (p.ex., o anticorpo) com a liofilização e a armazenagem subseqüente. OsIioprotetores ilustrativos incluem os açúcares, tais como a sacarose e a trealose; umaminoácido, tal como o glutamato de monossódio ou a histidina; uma metilamina, tal como abetaína; um sal liotrópico, tal como o sulfato de magnésio; um poliol, tal como os álcoois deaçúcares triídricos ou superiores, p.ex., a glicerina, o eritritol, o glicerol, o arabitol, o xilitol, osorbitol, e o manitol; o propileno glicol; o polietileno glicol; os Pluronics; e as suascombinações. O Iioprotetor preferido é um açúcar não redutor, tal como a trealose ou asacarose.

O Iioprotetor é adicionado à formulação pré-liofilizada em uma "quantidadelioprotetora", o que significa que, após a liofilização do fármaco (p.ex., o anticorpo) napresença da quantidade lioprotetora do lioprotetor, o fármaco (p.ex., o anticorpo)essencialmente conserva a sua estabilidade e integridade físicas e químicas com aliofilização e a armazenagem.

O "diluente" de interesse neste documento é um que é farmaceuticamente aceitável(seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação deuma formulação reconstituída. Os diluentes ilustrativos incluem a água estéril, a águabacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (p.ex., a solução salinatamponada com fosfato), a solução salina estéril, a solução de Ringer ou a solução dedextrose.

Um "conservante" é um composto que pode ser adicionado ao diluente para reduziressencialmente a ação bacteriana na formulação reconstituída, assim facilitando a produçãode uma formulação reconstituída de múltiplos usos, por exemplo. Os exemplos deconservantes potenciais incluem o cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, o cloreto dehexametônio, o cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamônioem que os grupos alquila são compostos de cadeias longas), e o cloreto de benzetônio. Osoutros tipos de conservantes incluem os álcoois aromáticos, tais como o fenol, o álcoolbutílico e benzílico, os alquil parabenos, tais como o metil ou o propil parabeno, o catecol, oresorcinol, o cicloexanol, o 3-pentanol, e o m-cresol.

Um "agente de massa" é um composto que adiciona massa à mistura Iiofilizada econtribui para a estrutura física da torta Iiofilizada (p.ex, facilita a produção de uma tornaIiofilizada essencialmente uniforme, a qual mantém uma estrutura de poro aberta). Osagentes de massa ilustrativos incluem o manitol, o glicina, o polietileno glicol e o sorbitol.

Desse modo, uma formulação de anticorpo Iiofilizada estável pode ser preparadausando um lioprotetor (preferivelmente um açúcar, tal como a sacarose ou a trealose),formulação Iiofilizada esta que pode ser reconstituída para gerar uma formulaçãoreconstituída estável tendo uma concentração de anticorpo que é significativamente maior(p.ex., de cerca de 2-40 vezes maior, preferivelmente 3-10 vezes maior e maispreferivelmente 3-6 vezes maior) do que a concentração de anticorpo na formulação pré-liofilizada. Tais concentrações de proteínas altas na formulação reconstituída sãoconsideradas serem particularmente úteis onde a formulação for pretendida para aadministração subcutânea. Apesar da concentração de proteína muito alta na formulaçãoreconstituída, a formulação reconstituída pode ser estável (i.e., não consegue mostrar níveissignificativos ou inaceitáveis de instabilidade química ou física da proteína) a 2-8 0C. porpelo menos cerca de 30 dias. Ver a Patente U.S. 6.821.515. Em certas modalidades, aformulação reconstituída é isotônica.

Quando reconstituída com um diluente compreendendo um conservante (tal como aágua bacteriostática para injeção, BWFI), a formulação reconstituída pode ser usada comouma formulação de múltiplos usos. Tal formulação é útil, por exemplo, onde um pacienteexposto requerer administrações freqüentes do fármaco ou anticorpo e/ou agente para trataruma condição médica crônica. A vantagem de uma formulação de múltiplos usos é que ela facilita a facilidade de uso para o paciente, reduz desperdício por permitir o uso completodos conteúdos do frasco pequeno, e resulta em uma redução de custos significativa para amanufatura, visto que diversas doses são acondicionadas em um único frasco pequeno(menores custos de enchimento e expedição).

A presente divulgação também proporciona um método para preparar uma formulação compreendendo as etapas de: (a) Iiofilizar uma mistura de um anticorpo e umlioprotetor; e (b) reconstituir a mistura Iiofilizada da etapa (a) em um diluente, de modo talque a formulação reconstituída seja isotônica e estável.

Um artigo de manufatura é também proporcionado neste documento, o qualcompreende: (a) um recipiente que contém uma mistura Iiofilizada de um anticorpo e umlioprotetor; e (b) instruções para reconstituir a mistura Iiofilizada com um diluente, até umaconcentração de anticorpo desejável na formulação reconstituída. O artigo de manufaturapode adicionalmente compreender um segundo recipiente, o qual contém um diluente (p.ex.,a água bacteriostática para injeção (BWFI) compreendendo um álcool aromático).

Um sistema de injeção da presente divulgação pode empregar uma caneta de distribuição de medicação, conforme descrito na Patente U.S. 5.308.341. As canetas dedistribuição de medicação foram desenvolvidas para facilitar a auto-administração damedicação. Uma medicação da presente divulgação pode ser um fármaco que inibe aatividade do complemento, por exemplo, um anticorpo específico para o complemento C5,e/ou um agente imunossupressor. Uma caneta de distribuição de medicação inclui umsuporte do frasco pequeno no qual um frasco pequeno de insulina ou outra medicação podeser recebido. O suporte do frasco pequeno é uma estrutura alongada, geralmente tubular,com extremidades proximal e distai. A extremidade distai do suporte do frasco pequenoinclui meios de montagem para acoplar uma cânula da agulha de extremidade dupla. Aextremidade proximal também inclui meios de montagem para acoplar um corpo da caneta,o qual inclui um aparelho propulsor e de ajuste da dose. Um frasco pequeno contendomedicação descartável, para uso com o suporte do frasco pequeno da técnica anterior, incluiuma extremidade distai tendo um septo elastomérico rompível que pode ser rompido poruma extremidade de uma cânula da agulha de extremidade dupla. A extremidade proximaldeste frasco pequeno inclui uma tampa colocada de modo deslizável em engajamento firmefluido com a parede cilíndrica do frasco pequeno. Esta caneta de distribuição de medicaçãoé usada para inserir o frasco pequeno de medicação em um suporte do frasco pequeno.

Um corpo da caneta então é conectado à extremidade proximal do suporte do frascopequeno. O corpo do frasco pequeno inclui um aparelho de ajuste da dose para designaruma dose de medicação a ser distribuída pela caneta e um aparelho propulsor para impelir atampa do frasco pequeno distalmente por uma distância correspondendo à doseselecionada.

O usuário da caneta fixa uma cânula da agulha de extremidade dupla àextremidade distai do suporte do frasco pequeno, de modo tal que o ponto proximal dacânula da agulha rompa o septo sobre o frasco pequeno. O paciente então seleciona umadose e opera a caneta para impelir a tampa distalmente para distribuir a dose selecionada.

O aparelho de seleção da dose retorna ao zero com a injeção da dose selecionada. Opaciente então remove e descarta a cânula da agulha, e mantém a caneta de distribuição demedicação da técnica anterior em uma posição conveniente para a próxima administraçãode medicação requerida. A medicação no frasco pequeno tornar-se-á esgotada apósdiversas tais administrações de medicação. O paciente então separa o suporte do frascopequeno do corpo da caneta. O frasco pequeno vazio pode então ser removido edescartado. Um novo frasco pequeno pode ser inserido no suporte do frasco pequeno, e osuporte do frasco pequeno e o corpo da caneta podem ser montados novamente e usadosconforme acima explicado.

Desse modo, uma caneta de distribuição de medicação geralmente tem ummecanismo de impulsão para a dosagem exata e a facilidade de uso. Um mecanismo dedosagem, tal como um botão girável, permite o usuário ajustar precisamente a quantidadede medicação que será injetada pela caneta a partir de um frasco pequeno pré-acondicionado de medicação. Para injetar a dose de medicação, o usuário insere a agulhasob a pele e aperta o botão uma vez até que ele aperte. A caneta pode ser um dispositivointeiramente mecânico ou ela pode ser combinada com um circuito eletrônico para ajustarprecisamente e/ou indicar a dosagem de medicação que é injetada no usuário. Ver aPatente U.S. 6.192.891.

A presente divulgação também apresenta formulações de liberação controlada oude liberação prolongada, adequadas para a administração crônica e/ou auto-administraçãode uma medicação.

As diversas formulações podem ser administradas a um paciente que necessita dotratamento (p.ex., um receptor de um aloenxerto) com a medicação (p.ex., um anticorpo dapresente divulgação e pelo menos um agente imunossupressor) por administraçãointravenosa como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, por rotasintramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial,intratecal, oral, tópica, ou inalação.

Em certas modalidades, uma formulação é administrada ao paciente poradministração subcutânea (i.e., embaixo da pele). Para tais propósitos, a formulação podeser injetada usando uma seringa. Entretanto, outros dispositivos para a administração daformulação estão disponíveis, tais como os dispositivos de injeção (p.ex., os dispositivosInject-ease® e Genject?); as canetas injetoras (tais como a GenPen®); os dispositivos semagulhas (p.ex., MediJector® e BioJector®); e os sistemas de distribuição por emplastrosubcutâneo.

Os presentes métodos e usos são descritos com referência aos Exemplos a seguir,os_quais são oferecidos como forma de ilustração e não são pretendidos para limitar adivulgação em nenhum modo. Utilizam-se as práticas padrões bastante conhecidas natécnica ou as práticas especificamente descritas abaixo. As seguintes abreviações sãousadas neste documento: ABMR, rejeição mediada por anticorpo; ACHR, rejeição humoralacelerada; ACR, rejeição celular aguda; AVR1 rejeição vascular aguda; CsA, ciclosporina;CyP, ciclofosfamida; HAR, rejeição hiperaguda; MCP-1, proteína quimiotática de monócito 1;MST, tempo de sobrevivência médio; POD, dia pós-operativo.

Exemplo 1

Métodos

Animais e Fármacos ImunossupressoresOs camundongos adultos machos C3H (H-2k) e os camundongos BALB/c (H-2d) (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) pesando 25-30 gforam escolhidos como doadores e receptores, respectivamente. Nos grupos quereceberam a imunossupressão, os receptores foram injetados com CsA (15 mg/kg/dia, s.c.,diariamente a partir do dia 0 até a rejeição no ponto final ou até o dia 100), ou com CyP (40mg/kg/dia, i.v., no dia 0 e 1), ou com mAb anti-C5 (clone BB5.1, Alexion PharmaceuticalsInc., 40 mg/kg/dia, i.p., dias 0-2, seguidos por duas vezes na semana, dias 0-60). Osanimais foram alojados sob condições convencionais na Instalação para o Cuidado dosAnimais, University of Western Ontario, e foram cuidados de acordo com as diretrizesestabelecidas pelo Canadian Council on Animal Care ("Conselho Canadense sobre oCuidado dos Animais"). Olfertecol., 1993.

Pré-sensibilização com a PeleOs enxertos de pele com espessura total retiradosdos doadores C3H foram cortados em pedados quadrados de 1 χ 1 cm2 e transplantadossobre o posterior do tórax dos receptores BALB/c uma semana antes do transplante decoração a partir dos mesmos doadores. A rejeição foi definida como necrose completa dosenxertos de pele.

Transplante Cardíaco Abdominal e CervicaISete dias após a pré-sensibilização coma pele, os corações dos camundongos C3H foram transplantados no abdômen dosreceptores BALB/c pré-sensibilizados por anastomose da aorta do doador com a aorta doreceptor, e da artéria pulmonar do doador com a veia cava inferior do receptor. Nos gruposcom o transplante novamente, os segundos enxertos de coração coletados doscamundongos C3H nunca antes tratados ou dos receptores BALB/c pré-sensibilizados comsobrevivência de longa duração foram transplantados na área cervical dos receptorescarregando um primeiro enxerto do coração abdominal de sobrevivência de longa duraçãopor anastomose da aorta do doador com a artéria carótida do receptor, e da artériapulmonar do doador com a veia jugular externa do receptor (término-lateral). Os enxertosde coração foram monitorados diariamente até a rejeição, a não ser que de outro modoindicado, e a rejeição foi definida como cessação completa de pulsação.

Grupos ExperimentaisOs receptores pré-sensibNizados foram aleatoriamentedestinados a oito grupos, cada um consistindo em oito animais. Grupo 1, camundongossem nenhum tratamento; Grupo 2, camundongos tratados com CsA; Grupo 3, camundongostratados com CyP; Grupo 4, camundongos tratados com CsA mais CyP; Grupo 5,camundongos tratados com mAb anti-C5; Grupo 6, camundongos tratados com mAb anti-C5mais CsA; Grupo 7, camundongos tratados

com mAb anti-C5 mais CyPj Grupo 8,camundongos tratados com mAb anti-C5 em combinação de CsA e CyP. Quando osimpulsos cardíacos não mais eram palpáveis ou no POD1, os enxertos foram removidospara análise por histologia de rotina, imunoistoquímica e transferência western, as amostrasde soro foram coletadas para a análise por citometria de fluxo e o ensaio hemolítico docomplemento. Cinco animais adicionais foram colocados e sacrificados nos grupos 6 e 8 noPOD3 (MST para os grupos 1-5, 7) para permitir comparações em um ponto de tempouniforme. As amostras de soro foram também coletadas nos POD 11, 21, 28 e 60 no Grupo8, para detectar as alterações seqüenciais de níveis do anticorpo anti-doador e atividade docomplemento. Além disso, quando os receptores pré-sensibilizados tratados por terapiatripla carregavam um primeiro enxerto de coração por 100 dias, eles foram transplantadosnovamente com um segundo coração. Um coração de C3H nunca antes tratado ou umcoração de C3H com sobrevivência de 100 dias de um outro receptor BALB/c pré-sensibilizado foi usado como o segundo coração. Oito animais foram incluídos em cadagrupo de transplante novamente.

Histologia do EnxertoAs amostras de tecido foram fixadas em 10% de formaldeídotamponado. As amostras foram então incrustadas em parafina, e seccionadas para acoloração com H&E. As secções microscópicas foram examinadas em um modo às cegasquanto à gravidade da rejeição por um patologista. Os critérios para a rejeição do enxertoincluíram a presença de vasculite, trombose, hemorragia e infiltração de linfócitos. Estasalterações foram pontuadas: O, nenhuma alteração; 1, alteração mínima; 2, alteraçãobranda; 3, alteração moderada; ou 4, alteração acentuada.

ImunoistoquimicaQuatro secções em micrometros foram cortadas das amostras detecido incrustadas em gel Tissue-Tek O.C.T. (Temperatura de Corte Ótima, Skura Finetek1Torrance1 CA) montadas sobre lâminas de microscópio revestidas com gelatina e coloridaspor um método de coloração com avidina-biotina imunoperoxidase indireto padrão usandoum kit Elite Vectastain ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame1 CA). As amostras foramcoloridas para as células CD4+ e CD8+ com o mAb anti-CD4 de camundongo em ratoconjugado à biotina (clone YTS 191.1.2, Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Ontario,Canadá) e o mAb anti-CD8 de camundongo em rato conjugado à biotina (clone 53-6.7,Pharmingen, Franklin Lakes, NJ), respectivamente. A infiltração de monócitos/macrófagosdentro dos enxertos foi detectada por coloração com mAb anti-Mac-1 de camundongo emrato conjugado à biotina (Çedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Ontario, Canadá). Adeposição de IgG e IgM de camundongo nos enxertos foi detectada usando a IgG anti-camundongo em cabra conjugada à biotina e a IgM anti-camundongo em cabra (Çedarlane).

Para a identificação da deposição do complemento, as secções foram incubadas em sériecom os Abs policlonais anti-C3 ou anti-C5 de cabra (Quidel1 San Diego1 CA), a IgG anti-cabra em coelho biotinilada (Vector Laboratories), e a estreptavidina conjugada à HRP(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). As lâminas foram lavadas com soluçãosalina tamponada com fosfato entre as etapas, e examinadas sob microscopia de luz. Oscontroles negativos foram efetuados omitindo os anticorpos primários. A imunocoloração foiclassificada em cinco campos de alta energia de cada secção, e cinco experimentosindependentes foram efetuados. As secções da coloração com imunoperoxidase foramgraduadas de O a 4+ de acordo com a intensidade da coloração: O, negativa; 1+, confusa; 2+,coloração fraca; 3+, coloração moderada; e 4+ coloração muito intensa.

Citometria de FiuxoOs anticorpos IgG e IgM anti-doadores específicos circulantesforam avaliados no soro do receptor por citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson,Mountain View, CA). Glotz e col. (1992); Tyan e col. (1994). Resumidamente, osesplenócitos dos camundongos C3H foram isolados e incubados a 37°C por 30 minutos comsoro do controle nunca antes tratado e dos grupos experimentais. Para colorir para IgG1IgGI, lgG2a, lgG2b e IgM totais, as células foram lavadas e incubadas com anticorpo decabra conjugado ao FITC específico para a porção Fc da IgG de camundongo ou comanticorpo de cabra conjugado à ficoeritrina específico para a cadeia μ da IgM decamundongo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove1 PA), ou com IgGI anti-camundongo em cabra conjugada ao FITC (CALTAG Laboratories, Burlingame, CA), ou comlgG2a anti-camundongo em cabra conjugada ao FITC (CALTAG), ou com lgG2b anti-camundongo em cabra conjugada ao FITC (CALTAG). Após 1 hora de coloração a 4°C, ascélulas foram lavadas com PBS, suspensas novamente a 5x106/mL, e analisadas porcitometria de fluxo quanto à intensidade de fluorescência do canal média, que representa areatividade da ligação do anticorpo.

Ensaio Hemolítico do CompIementoO mAb anti-C5 purificado foi diluído em sérieduas vezes (175-0,1 μg/ml) em tampão GVB2+ (solução salina tamponada com gelatinaVeronal: 0,1% de gelatina, NaCI a 141 mM, MgCI2 a 0,5 mM, CaCI2 a 0,15 mM, e barbitalsódico a 1,8 mM) e adicionado em triplicata (50 μΙ/poço) a uma placa de 96 poços. O sorodo camundongo BALB/c foi diluído até 40% v/v com tampão GVB2+ e adicionado (50 μΙ/ml)às fileiras da mesma placa de 96 poços, de modo tal que a concentração final do soro decamundongo BALB/c em cada poço fosse 20%. A placa foi então incubada na temperatura ambiente por aproximadamente 30 min, enquanto os eritrócitos de galinha eram preparados.Os eritrócitos de galinha foram lavados 5x1 ml com tampão GVB2+ e suspensos novamenteaté uma concentração final de 5x107VmI em GVB2+. Quatro mililitros dos eritrócitos degalinha foram sensibilizados por adição de anticorpo policlonal anti-RBC de galinha (IntercellTechnologies, Hopewell, NJ1 0,1% v/v) e as células foram incubadas a 4 0C por 15 min comredemoinho freqüente. As células foram então lavadas 2x1 ml com GVB2+ e suspensasnovamente até um volume final de 2,4 ml em GVB2+. Os eritrócitos de galinha (30 μΙ/poço,2,5 χ 106 células) foram adicionados à placa contendo soro e mAb anti-C5 conforme descritoacima, misturados bem, e incubados a 37 0C por 30 min. A placa foi então centrifugada a1000xg por 2 min, e 85 μΙ do sobrenadante foram transferidos para uma nova placa demicrotítulo de 96 poços. A placa foi lida em DO 415 nm usando uma leitora de microplaca ea porcentagem de hemólise foi determinada usando esta fórmula:

% de hemólise = 100 χ (DO da amostra) - (DO do controle de GVB2+)_

(DO do controle 100% lisado) - (DO do controle de GVB2+)com o controle 100% lisado obtido pela adição de 100 μΙ de GVB2+ contendo 0,1% de NP-40aos 30 μg/ml de eritrócitos de galinha, conforme preparados acima.

Análise por Transferência WesternA sonicação das amostras congeladas decoração foi efetuada em tampão de Iise RIPA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) a 4 0C por 1minuto em intervalos de 10 segundos, seguida por microcentrifugação a 13.000 rpm por 10minutos a 4 0C. Os sobrenadantes clarificados foram imediatamente quantificados emtriplicata quanto ao teor de proteína usando o kit de ensaio de proteína compatível comDetergente (BIO-RAD). Os Iisados de coração (10 μg de proteína/poço) foram separadosem NuPAGE, géis de Bis-Tris com gradiente de 4-12%, sistema de tampão MES (Invitrogen)e transferidos para a membrana de poli(difluoreto de vinilideno) (PVDF) (tamanho de porode 0,45 μΐη; Invitrogen) usando um aparelho de transferência semi-seco (BIO-RAD). Asmembranas foram cortadas apropriadamente nos pesos moleculares corretos para permitir odesenvolvimento das manchas com dois anticorpos primários diferentes por mancha, demodo tal que cada mancha fosse exposta a um anticorpo de teste e um anticorpo decontrole interno para assegurar a carga de amostra igual. Os anticorpos primários de testeincluindo os soros policlonais de coelho anti-Bcl-2 (N-19) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.,) eos soros policlonais de coelhos anti-Bcl-XS/L (M-125) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)foram usados para detectar a expressão das proteínas Bcl-2 e Bcl-x1 dentro dos enxertos.

Os soros policlonais de coelhos anti-calsequestrina (CaIbiochem) foram usados comoanticorpo primário de controle interno (Kobayashi e col., 1999). A detecção da ligação doanticorpo primário foi efetuada conforme anteriormente descrito (Arp e col, 1996) porexposição das manchas incubadas lavadas a uma fração de IgG anti-coelho em cabrapoliclonal conjugada à peroxidase de raiz forte (HRP; Roche Laboratories) e entãoapropriadamente desenvolvidas por exposição para aumentar a quimioluminescência paraos anticorpos conjugados à HRP (Roche Laboratories).

Análise EstatisticaOs dados foram descritos como a média ± DP. A sobrevivênciado aloenxerto entre os grupos experimentais foi comparada usando o teste de Iog daclassificação. As verificações histológicas e imunoistológicas foram analisadas usando oteste U de Mann-Whitney. Os dados citométricos de fluxo e os dados da transferênciawestern foram analisados usando ANOVA unidirecional. As diferenças com os valores de ρmenores do que 0,05 foram consideradas significativas.

Exemplo 2

A pré-sensibilização com o enxerto de pele do doador C3H induz a ACHR mediadapor anticorpo em aloenxertos de coração dos receptores BALB/c.

Para desenvolver um modelo adequado de animal pequeno que copia os pacientespré-sensibilizados no clínico e para estudar a ABMR, um novo modelo de ABMR decamundongo totalmente incompatível com o MHC foi desenvolvido através da pré-sensibilização dos receptores de camundongos. Neste modelo, os receptores BALB/c forampré-sensibilizados com os enxertos de pele do doador C3H uma semana antes dotransplante de coração a partir do mesmo doador. Sete dias após a pré-sensibilização coma pele do doador, o nível no soro de IgG anti-doador, porém não o anticorpo IgM1 estavaacentuadamente elevado e atingiu um nível de pico nos receptores BALB/c pré-sensibilizados (Figura 1A). O transplante de coração do mesmo doador foi então efetuadonestes receptores altamente sensibilizados. Sem a imunossupressão, os enxertos decoração do C3H foram rapidamente rejeitados em 3,1 ± 0,4 dias por ACHR, caracterizadapor trombose grave, hemorragia e infarto (Figuras 1B-a). Em contraste, os mesmosenxertos de coração nos receptores BALB/c não sensibilizados (com tempo desobrevivência médio, MST1 de 8,2 ± 0,8 dias) mostram a histologia normal no dia pós-operativo (POD) 3 (Figura 1B-b). Quando comparados aos receptores BALB/c nãosensibilizados, no mesmo dia, os enxertos de coração nos animais pré-sensibilizadosrevelou grande deposição de anticorpo IgG e complemento (C3 e C5), porém mínimainfiltração de células CD4+ e CD8+ (Tabela 1). Além disso, os níveis de IgG anti-doadorcirculantes nos receptores pré-sensibilizados eram significativamente maiores do queaqueles dos mesmos receptores não sensibilizados recebendo um enxerto de coração noPOD3 (P<0,01, Figura 1C). Entretanto, a IgM anti-doador permaneceu em níveis muitobaixos tanto na circulação (Figura 1C) quanto nos enxertos de coração (Tabela 1) e nãomostrou nenhuma diferença significativa entre os receptores não sensibilizados e pré-sensibilizados. Ademais, níveis normais de atividade hemolítica do complemento forammostrados em ambos os receptores de coração pré-sensibilizados e não sensibilizados semtratamento (Figura 1D). Estes dados indicam que este é um modelo de transplante idealpara estudar a ABMR em receptores pré-sensibilizados, nos quais o complementodesempenha uma função importante na patogênese.

Tabela 1.

Comparação das alterações imunoistolóqicas dos aloenxertos de coração de C3Hem receptores BALB/c não sensibilizados e pré-sensibilizados no POD3

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Grades for immunoperoxidase ... intense. = Graus para a coloração comimunoperoxidase: 0, negativa; 1+, confusa; 2+, fraca; 3+, moderada; 4+, intensa. )

O mAb anti-C5 em combinação com a CsA e a CyP impede a ABMR e atinge umasobrevivência do aloenxerto de coração ilimitada nos receptores de camundongos pré-sensibilizados.

O complemento tem sido mostrado desempenhar uma função importante na ABMR.Entretanto, o efeito inibidor de bloquear funcionalmente a cascata do complemento terminalno nível C5 em receptores altamente sensibilizados é desconhecido. No estudoapresentado neste documento, o modelo de pré-sensibilizado foi usado para estudar aeficácia do mAb anti-C5 sozinho ou combinado com CsA e/ou CyP na prevenção de ABMR.Conforme apresentado na Figura 2A, o tratamento com CsA ou CyP ou os dois fármacos emcombinação não impediu a ABMR e os enxertos foram rejeitados em 3,0 ± 0,0 dias, 3,3 ± 0,5dias e 3,5 ± 0,6 dias, respectivamente, com características patológicas típicas de ACHR,incluindo trombose intravascular e hemorragia intersticial (Figura 2B-b, c, d), que eramindistinguíveis dos enxertos de coração em receptores BALB/c pré-sensibilizados nãotratados (Figura 2B-a). A monoterapia anti-C5 ou combinada com CyP não foi capaz demelhorar a sobrevivência do enxerto e os enxertos de coração foram rejeitados por ACHR(Figura 2B-e, f) em 3,5 ± 0,6 dias e 3,2 ± 0,4 dias, respectivamente (Figura 2A). Embora aterapia de combinação do mAb anti-C5 e a CsA, o protocolo capaz de induzir a sobrevivência do aloenxerto de coração de longa duração em animais não sensibilizados,prolongasse de modo desprezível a sobrevivência do enxerto neste modelo pré-sensibilizado, os enxertos de coração foram também rejeitados por rejeição humoral gravecom vasculite, trombose, hemorragia e infiltração mínima das células (Figura 2B-g) em 11,9±1,8 dias (Figura 2A). Em contraste, a terapia tripla de mAb anti-C5 em combinação deCsA e CyP atingiu uma sobrevivência do enxerto do coração ilimitada acima de 100 dias(Figura 2A) nos animais pré-sensibilizados (P<0,01 vs. os animais sem o tratamento outratados com monoterapia ou dois fármacos em combinação), sem nenhuma evidência derejeição (Figura 2B-h). Neste modelo de camundongo pré-sensibilizado, conforme mostradona Tabela 2, somente uma pequena infiltração das células CD4+ e CD8+ dentro dos enxertosfoi observada nos receptores que rejeitaram os seus enxertos de coração dentro de 3 dias.Entretanto, o número destas células T era ligeiramente aumentado se os enxertos decoração sobrevivessem mais tempo nos receptores tratados com mAb anti-C5 mais CsA nahora da rejeição (POD11) e nos receptores tratados com a terapia tripla nos estágios iniciaisde sobrevivência do enxerto (p.ex., POD11). Além disso, com o tratamento contínuo de CsA no grupo de terapia tripla, a infiltração das células CD4+ e CD8+ foi inibida nos enxertos decoração de sobrevivência de longa duração no POD6O e 100. Ademais, uma infiltraçãomoderada de células Mac-I+ dentro dos enxertos, incluindo os monócitos e os macrófagos,foi verificada nos animais não tratados e tratados com CsA, Cyp ou CsA mais CyP,enquanto que a infiltração destas células foi significativamente reduzida nos animais tratados com mAb anti-C5 (Tabela 2). Estes resultados indicam que o mAb anti-C5 quebloqueia funcionalmente capacita o uso e a eficácia de agentes imunossupressoresconvencionais, desse modo impedindo a ABMR e atingindo uma sobrevivência do enxertode coração ilimitada nos receptores pré-sensibilizados.Tabela 2.

Graus para a coloração com imunoperoxidase dos aloenxertos de coração emreceptores de camundonqos pré-sensibilizados na necropsia

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Graus: 0, negativa; 1+, confusa; 2+, fraca; 3+, moderada; 4+, intensa.

O mAb anti-C5 inibe completamente a atividade hemolitica do complemento total ea deposição de C5 local em receptores pré-sensibilizados que recebem um aloenxerto decoração.

O mAb anti-C5 foi anteriormente mostrado bloquear a clivagem da proteína decomplemento C5 para as moléculas pró-inflamatórias C5a e C5b-9 (Kroshus e col., 1995), ebloquear completa e consistentemente a atividade do complemento terminal emcamundongos (Wang e col., 1999). No estudo corrente, a atividade do complemento foimedida avaliando a capacidade do soro do camundongo receptor de Iisar os eritrócitos degalinha pré-sensibilizados ao anticorpo e foi comparada no mesmo ponto de tempo (POD3).

O tratamento dos camundongos com CsA ou CyP ou os dois fármacos em combinação nãoteve nenhum efeito sobre a atividade do complemento terminal, enquanto que o tratamentocom o mAb anti-C5 sozinho ou combinado com CsA ou/e CyP inibiu completamente estaatividade (Figura 3: P<0,01, vs. animais nunca antes tratados e não tratados, bem comoanimais tratados com CsA, CyP, ou CsA mais CyP). Além disso, os soros obtidos deanimais tratados com mAb anti-C5 em diversos pontos de tempo anteriorres mostraramatividade hemolitica similarmente diminuída, sugerindo que o complemento terminal no sorofoi inibido por todo o período de tratamento. Ademais, a deposição de C5 local nos enxertosde coração foi completamente impedida nos receptores pré-sensibilizados tratados commAb anti-C5, porém não nos animais pré-sensibilizados não tratados, ou tratados com CsA,CyP e CsA mais CyP (Tabela 2). Conforme predito, o tratamento com o mAb anti-C5 nãoimpediu a deposição de C3 nos enxertos (Tabela 2). Estes resultados sugerem que aterapia anti-C5 bloqueia completamente a atividade do complemento total após o aloenxertocardíaco em receptores altamente sensibilizados.

Os enxertos de coração com sobrevivência de longa duração em animais pré-sensibiiizados são resistentes à lesão humoral na presença de baixo nível de anticorposanti-doador e complemento - uma situação de acomodação.

Para investigar adicionalmente a função do mAb anti-C5 na rejeição humoral, osníveis de aloanticorpo anti-doador foram medidos nos soros de receptores por citometria defluxo e deposição de anticorpos dentro dos enxertos, por utilização de técnicas deimunocoloração em diferentes grupos. A Figura 4A mostra que no POD3, os receptoresBALB/c pré-sensibilizados não tratados tinham altos níveis de anticorpos IgG anti-doadorescirculantes. Quando pré-sensibilizados, os receptores recebendo monoterapia ou doisfármacos em combinação, CsA e/ou CyP1 parcialmente infra-regularam os níveis de IgGanti-doador circulante, enquanto que o tratamento com mAb anti-C5 sozinho ou combinadocom CsA ou CyP não afetou adicionalmente os níveis de anticorpo anti-doador no mesmodia. Em contraste, com a terapia tripla do mAb anti-C5, CsA e CyP, um alto nível de IgGanti-doador circulante foi gradualmente infra-regulado e atingiu um baixo nível no POD6Ü,após isso permanecendo neste nível até o dia 100 (Figura 4B). Similar aos níveis deanticorpos circulantes nos diferentes grupos de tratamento, a Tabela 2 mostra que a fortedeposição de IgG anti-camundongo estava presente nos enxertos de coração rapidamenterejeitados de animais pré-sensibilizados sem nenhum tratamento ou tratados commonoterapia ou dois fármacos na terapia de combinação. De modo interessante, com aterapia tripla, a deposição de anticorpo IgG foi gradualmente atenuada até um nível brandonos enxertos de coração de sobrevivência de longa duração no POD 100 (Figura 4C-a,Tabela 2). Neste modelo, a IgM permaneceu em níveis muito baixos na circulação (Figura4A, B) ou nos enxertos de coração transplantados (Figura 4C-b, Tabela 2) nos receptorespré-sensibilizados com ou sem tratamento. Ademais, o tratamento com o mAb anti-C5eliminou a atividade do complemento para um nível não detectável até o dia 60, seguido poruma recuperação progressiva até níveis pré-redução no POD 100 após a descontinuação daterapia anti-C5 nos receptores de camundongos pré-sensibilizados que receberam a terapiatripla (Figura 4D). Além disso, a deposição de C5 dentro dos enxertos foi também detectadanos animais pré-sensibilizados com sobrevivência de 100 dias (Tabela 2). Estes dadosdemonstram que a acomodação contínua do transplante ocorre nos receptores pré-sensibilizados tratados com a terapia tripla, apesar da presença de anticorpos anti-enxerto eda ativação do complemento.

O mAb anti-C5 em combinação com CsA e CyP reduz a razão de lgG1/lgG2a eresulta em uma mudança na subclasse da IgG para lgG2b nos receptores com enxertosacomodados.

Para determinar se a terapia tripla à base de mAb anti-C5 induziria uma mudançana subclasse da IgG1 que pode estar associada com a acomodação, os níveis no soro dassubclasses da IgG anti-doador de IgGI, lgG2a e lgG2b foram comparados entre osreceptores não tratados e os receptores com enxerto de coração acomodado. Os soros dosreceptores não tratados continha o isótipo IgGI predominante, indicado por uma alta razãode lgG1/lgG2a (Figura 5A). Em contraste, uma redução significativa na razão delgG1/lgG2a foi observada nos receptores carregando enxertos acomodados (Figura 5A,P<0,01). Além disso, os receptores pré-sensibilizados com os enxertos de coraçãoacomodados mostraram um nível aumentado de lgG2b anti-doador em comparação com osmesmos receptores com enxertos rejeitados (Figura 5B, P<0,01). Ademais, o padrão deisótipos de IgG nos receptores tratados com a monoterapia ou os dois fármacos emcombinação é indistinguível daquele dos animais não tratados. Estes dados indicam que oisótipo de IgGI anti-doador pode estar associado com a rejeição do enxerto, enquanto que aprodução da subclasse de lgG2b anti-doador pode funcionar como um anticorpo protetor edesempenha uma função importante na indução da acomodação.

O mAb anti-C5 em combinação com a CsA e a CyP induz a expressão de Bcl-2 eBcl-x 1 dentro do enxerto em receptores de camundongos altamente sensibilizados.

Para determinar se existe uma relação causai entre a expressão dentro dosenxertos das proteínas protetoras e a resistência do enxerto à lesão humoral neste modelo,a análise por transferência western foi empregada para detectar as proteínas de interessenos tecidos de enxerto de coração a partir de receptores de camundongos altamentesensibilizados. Os enxertos de coração com sobrevivência de longa duração foramverificados expressarem altos níveis das proteínas Bcl-2 e Bcl-x1 no PODIOO, e estasproteínas foram detectadas tão cedo quanto 12 dias após o transplante de coração emreceptores altamente sensibilizados recebendo terapia tripla à base de mAb anti-C5 (Figura6). Em contraste, não havia nenhuma proteína Bcl-2 e Bcl-x1 expressa nos enxertos decoração dos animais não tratados (Figura 6) ou dos animais tratados com a monoterapia ouos dois fármacos na terapia de combinação Este resultado sugere que a resistência doenxerto à lesão humoral em animais com sobrevivência ilimitada está associada com aproteção proporcionada pelas proteínas Bcl-2 e Bcl-x1 neste modelo pré-sensibilizado.

Os receptores pré-sensibilizados com um primeiro enxerto de coração deacomodação aceitam um segundo enxerto de coração acomodado, porém rejeitam umsegundo enxerto de coração nunca antes tratado a partir dos mesmos doadores.

A capacidade dos enxertos acomodados de resistir à rejeição não tinha sido testadadiretamente sob condições patofisiológicas onde os enxertos nunca antes tratados sofremrejeição após o alotransplante. Neste modelo, para determinar se os receptores pré-sensibilizados com um primeiro enxerto de coração de acomodação aceitarão um segundoenxerto acomodado, porém rejeitarão um segundo enxerto nunca antes tratado, os cenáriosde retransplante foram efetuados. Após os enxertos de coração de C3H acomodados teremsobrevivido até o ponto de 100 dias, o tempo no qual os baixos níveis de aloanticorposforam detectados (Figura 4B) e a atividade do complemento retornou aos níveis de pré-tratamento (Figura 4D), no receptor BALB/c pré-sensibilizado tratado com a terapia tripla àbase de mAb anti-C5, estes receptores receberam um segundo enxerto de coração.

Especificamente, um coração de C3H nunca antes tratado (Figura 7A) ou um acomodadopor 100 dias (Figura 7B) de um outro receptor BALB/c pré-sensibilizado foi transplantado nopescoço dos receptores pré-sensibilizados carregando um primeiro coração de C3H deacomodação. Estes receptores rejeitaram um segundo coração nunca antes tratado em 6,6± 1,1 dias (Figura 8A) com AVR grave (Figura 8B-a), enquanto o primeiro coração continuoua sobreviver. Em contraste, quando os corações acomodados, que já tinham sobrevividopor 100 dias em diferentes camundongos pré-sensibilizados, foram usados como segundosenxertos, estes enxertos foram aceitos pelos receptores pré-sensibilizados carregando umprimeiro enxerto de coração de acomodação (Figura 8A). Não houve nenhum sinal derejeição nestes segundos enxertos de coração acomodados 90 dias após o segundotransplante (Figura 8B-b). Estes dados indicam que os enxertos acomodados tornam-seresistentes aos efeitos dos anticorpos anti-doador e do complemento que normalmentemediam a rejeição do aloenxerto nestes receptores pré-sensibilizados. Ademais, o fato queo hospedeiro do enxerto acomodado rejeitou um novo enxerto sugere que a acomodaçãoenvolve alterações no enxerto.

Os receptores pré-sensibilizados que são tratados com CsA rejeitam os enxertos decoração acomodados.

Um outro retransplante foi efetuado para determinar se a acomodação nestemodelo pré-sensibilizado seria causada pelas alterações nos enxertos e/ou nos receptores.

Especificamente, após os enxertos de coração de C3H terem sido acomodados noscamundongos BALB/c pré-sensibilizados por 100 dias, o enxerto de coração acomodadoentão será retransplantado em um segundo receptor BALB/c pré-sensibilizado sendo tratadocom CsA sozinha (Figura 7C), uma terapia que pode impedir a rejeição celular, porém nãopode impedir a rejeição humoral acelerada de um coração de C3H novo nos receptores pré-sensibilizados. Os enxertos de coração de C3H acomodados foram rapidamente rejeitadosnos receptores BALB/c pré-sensibilizados tratados com CsA. Após o retransplante, apatologia nos enxertos de coração acomodados foi alterada de ACHR normal (Figura 9A)para grave, com grande hemorragia intersticial, porém poucos infiltrados de células (Figura9B). Além disso, os altos níveis de IgG anti-doador e os níveis normais de atividadehemolítica do complemento nestes receptores que receberam um coração de C3Hacomodado foram similares àqueles dos receptores pré-sensibilizados tratados com CsAque receberam um coração de C3H nunca antes tratado. Este resultado adicionalmenteindica que a acomodação induzida pela terapia tripla à base de mAb anti-C5 pode originar-se de mecanismos que envolvam alterações não somente no enxerto, como também noreceptor.

Exemplo 3

Rejeição Vascular Aguda em um Modelo de Transplante de Coração

Os experimentos foram efetuados para determinar se a inclusão de um inibidor daformação de complemento terminal atenuaria a rejeição vascular aguda e se o uso de talinibidor em conjunção com um imunossupressor obteria a sobrevivência do aloenxerto delonga duração. Neste grupo de experimentos, um anticorpo monoclonal anti-C5 foi usadoem conjunção com a ciclosporina. O modelo usado era um transplante cardíacoheterotópico de aloenxerto a partir de camundongos C3H em camundongos BALB/c. Estemodelo é um modelo de rejeição vascular aguda grave, com os camundongos C3H eBALB/c sendo fortemente incompatíveis com o MHC. Os transplantes e os outros métodosforam efetuados conforme descrito em Wang e col. (2003).

Transplante Cardíaco Heterotópico

O transplante cardíaco heterotópico intra-abdominal foi efetuado conformeanteriormente descrito por Wang e col. (2003). Resumidamente, uma esternotomia medianafoi efetuada sobre o doador, e o enxerto de coração foi lentamente perfundido in situ com1,0 ml de solução de Iactato de Ringer heparinizada através da veia cava inferior e da aorta,antes da veia cava superior e das veias pulmonares serem ligadas e divididas. A aortaascendente e a artéria pulmonar foram cortadas transversalmente, e o enxerto foi removidodo doador. O enxerto foi então revascularizado com anastomoses términos-laterais entre aartéria pulmonar do doador e a veia cava inferior do receptor, bem como a aorta do doador ea aorta abdominal do receptor, usando uma sutura de náilon 11-0. O batimento do coraçãoenxertado foi monitorado diariamente por palpação abdominal direta. O grau de pulsação foipontuado como: A, batendo fortemente; B1 declínio observável na intensidade da pulsação;ou C, cessação completa dos impulsos cardíacos. Quando os impulsos cardíacos não maiseram palpáveis, o enxerto foi removido para a histologia de rotina. Em certas situações, oscamundongos nos quais ainda estava funcionando o enxerto foram sacrificados para efetuara histologia.

Resultados

Os camundongos (camundongos machos de 8-12 semanas de idade, pesando 25 -30 g) foram divididos em seis grupos experimentais, com seis a oito camundongos por grupo.

O transplante ocorreu no dia 0. As alterações histológicas foram checadas no ponto final (oponto final sendo o fracasso do enxerto) ou, em alguns casos, um camundongo foisacrificado antes do fracasso do enxerto. A dosagem de BB5.1 que foi administrada (40mg/kg de peso do corpo, três vezes por semana) era sabida, a partir dos estudos anteriores,inibir completamente a atividade do complemento terminal.

Grupo 1' (controle) - os camundongos foram administrados com 0,75 mL de soluçãosalina de modo intraperitoneal, nos dias -1, 0, 1 e 2. Subseqüentemente, estescamundongos foram tratados com 0,75 mL de solução salina de modo intraperitoneal, trêsvezes por semana (Segunda Feira, Quarta Feira, Sexta Feira) até o ponto final.

Grupo 2' (ciclosporina A sozinha) - os camundongos foram administrados com 15mg/kg de peso do corpo de ciclosporina A, subcutaneamente, em uma base diária,começando no dia 0 (dia do transplante) até o ponto final.

Grupo 3' (anticorpo anti-complemento sozinho) - os camundongos foramadministrados com o anticorpo anti-C5 de camundongo BB5.1 (Frei e col, 1987) a 40 mg/kgde peso de corpo, de modo intraperitoneal, nos dias -1, 0, 1 e 2, seguidos por 40 mg/kg depeso do corpo administrados três vezes por semana (Segunda Feira, Quarta Feira, SextaFeira) até o ponto final.

Grupo 4' (anticorpo anti-complemento até o dia 14 após o transplante mais aciclosporina A) - os camundongos foram administrados com o anticorpo anti-C5 decamundongo BB5.1 a 40 mg/kg de peso de corpo, de modo intravenoso, nos dias -1 até odia 14, e foram também administrados com a ciclosporina A a 15 mg/kg de peso do corpoem uma base diária, começando no dia 0 até o ponto final. Observar que este difere dosoutros grupos pelo fato de que o BB5.1 foi administrado intravenosamente e em uma basediária.

Grupo 5' (anticorpo anti-complemento até o dia 28 após o transplante mais aciclosporina A) - os camundongos foram administrados com o anticorpo anti-C5 decamundongo BB5.1 a 40 mg/kg de peso do corpo, de modo intraperitoneal, nos dias -1, 0, 1e 2, seguidos por 40 mg/kg de peso do corpo administrados três vezes por semana(Segunda Feira, Quarta Feira, Sexta Feira) até o dia 28, e foram também administrados coma ciclosporina A a 15 mg/kg de peso do corpo, em uma base diária, começando no dia 0 atéo ponto final.

Grupo 6' (anticorpo anti-complemento cronicamente até 100 dias mais aciclosporina) - os camundongos foram administrados com o anticorpo anti-C5 decamundongo BB5.1 a 40 mg/kg de peso do corpo, de modo intraperitoneal, nos dias -1, 0, 1e 2, seguidos por 40 mg/kg de peso do corpo administrados três vezes por semana(Segunda Feira, Quarta Feira, Sexta Feira) até 100 dias, e foram também administradoscom a ciclosporina A a 15 mg/kg de peso do corpo, em uma base diária, começando no dia0 até 100 dias.Os resultados deste experimento são mostrados nas Tabelas 3 e 4. A Tabela 3mostra o tempo de sobrevivência para os enxertos. A Tabela 4 apresenta as pontuaçõeshistológicas.

Tabela 3

Sobrevivência do Aloenxerto

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Tabela 4

Pontuações Médias das Alterações Histológicas dos Aloenxertos de Coração na Necropsia

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Pontuações Médias: O = normal; 1 - alteração mínima; 2 - alteração branda; 3 -alteração moderada; 4 - alteração acentuada. N/A - não disponível.*Vasc - vasculite; Infar - infarto; Linf - infiltração de linfócitos; Trom = trombose;Hemo - hemorragia; Fibrina - deposição de fibrina; PMN - infiltrado de célulaspolimorfonucleares

Os resultados indicam os efeitos sinérgicos de utilizar um fármaco inibidor docomplemento além de um imunossupressor. Nos camundongos não tratados, os enxertosforam rejeitados em aproximadamente 8 dias. O uso da ciclosporina A imunossupressorasozinha, em uma base crônica, diária, resultou em um aumento na sobrevivência do enxertoaté aproximadamente 15 dias após o transplante. O uso do anticorpo anti-C5 BB5.1 parainibir a formação de complemento terminal não teve nenhum efeito por si só, a rejeição do enxerto ocorrendo em 8 dias após o transplante, como no grupo de controle (Grupo 1'). Acombinação de BB5.1 através do dia 28 após o transplante mais a ciclosporina A mostrouum efeito sinérgico, com a sobrevivência do enxerto sendo estendida até aproximadamenteo dia 80. Um resultado mais surpreendente é aquele do Grupo 5', em que o BB5.1 e aciclosporina A foram, cada um, administrados cronicamente após o transplante. Neste caso, a sobrevivência do enxerto foi por mais do que 100 dias (tantos dados quantos atualmentedisponíveis). Adicionalmente, os resultados histológicos mostrados na Tabela 4 indicam quea administração tanto de BB5.1 quanto de ciclosporina A protegeu muito melhor o enxertodè alterações do que o BB5.1 ou a ciclosporina sozinhos, ê que a administração crônica deBB5.1 e ciclosporina A protegeu o enxerto em uma proporção tal que, mesmo em 100 diasapós o transplante, não havia nenhuma alteração histológica vista nos corações enxertados.Um tempo de sobrevivência de 100 dias nestes modelos é considerado ser o padrão ouro.Uma sobrevivência de 100 dias no modelo é acreditada indicar que haverá umasobrevivência ilimitada do aloenxerto. Quando a administração de BB5.1 foi interrompidaapós 28 dias, os enxertos estavam protegidos, porém eles de fato começaram a mostrar algumas alterações histológicas mínimas a brandas em torno do dia 80, que era o tempo noqual ocorria o fracasso do enxerto.

Os camundongos do Grupo 4' foram tratados diferentemente pelo fato de que elesforam administrados com BB5.1 em uma base diária, por uma administração intravenosa.Estes animais tornaram-se doentes, mostrando perda de peso e retenção de urina, e foram sacrificados em um momento no qual os corações enxertados ainda estavam batendo,embora a sua função tivesse declinado. Este foi o primeiro grupo de camundongosestudado e desconhece-se por que foram vistos estes efeitos de doenças. Estes efeitos dedoenças não foram vistos quando o BB5.1 foi administrado de modo intraperitoneal, com umprograma de três vezes por semana. Conforme visto abaixo no Exemplo 4, a administração diária de BB5.1 via uma rota intraperitoneal não causou efeitos de doenças. Também, aadministração intravenosa não foi necessariamente a causa da doença nestes animais. Aadministração intravenosa de eculizumab (um anticorpo equivalente humano ao BB5.1 pelofato de que ele se liga ao C5 humano) tinha sido administrada com êxito, de modointravenoso, sem os efeitos de doenças, aos seres humanos em um estudo de PNH(Hillmen e col., 2004). Os inibidores dos complementos podem ser administrados por outrasrotas, além da intravenosa e da intraperitoneal, com todas as tais rotas sendo bastanteconhecidas por aqueles versados na técnica.

Exemplo 4

Rejeição Acelerada em um Modelo de Transplante de Coração Pré-Sensibilizado

Um segundo grupo de experimentos similares àqueles do Exemplo 3 foi efetuado,porém o camundongo receptor foi pré-sensibilizado ao órgão do doador. Nestesexperimentos, a pré-sensibilização foi ocasionada por transplante prévio de um enxerto depele. Em geral, a pré-sensibilização pode ocorrer não somente como um resultado de terrecebido um enxerto anterior, como pode também ser causada por ter recebido múltiplastransfusões de sangue ou em mulheres que tenham estado grávidas. Além de tais métodosde pré-sensibilização, os aloenxertos com uma incompatibilidade com o ABO serãorapidamente atacados e rejeitados, por causa dos anticorpos pré-formados para osantígenos do ABO, a não ser que sejam empregadas etapas para impedir tal ataque.

Alguns camundongos nestes estudos foram administrados com a ciclofosfamida,além do BB5.1 é/ou da ciclosporina A. Para estes experimentos, os camundongõsreceptores BALB/c foram pré-sensibilizados com os enxertos de pele de C3H uma semanaantes do transplante de coração a partir do mesmo doador (usando o método de Pruitt eBollinger, 1991). Este modelo é projetado para copiar o transplante pré-sensibilizado emseres humanos, especialmente em relação à rejeição humoral acelerada. Os camundongosreceptores foram divididos em oito grupos de seis a oito camundongos, cada. Ostratamentos foram como a seguir.

Grupo 1" (controle) - os camundongos (camundongos machos de 8-12 semanas deidade, pesando 25 - 30 g) foram administrados com 0,75 ml_ de solução salina, de modointraperitoneal, em uma base diária, começando no dia -1 e continuando até o ponto final(rejeição do enxerto).

Grupo 2" (ciclosporina A sozinha) - os camundongos foram administrados comciclosporina A, subcutaneamente, em uma dose de 15 mg/kg de peso do corpo, começandono dia 0 (dia do transplante) até o ponto final.

Grupo 3" (BB5.1 sozinho) - os camundongos foram administrados com o anticorpomonoclonal anti-complemento de camundongo BB5.1, em uma dose de 40 mg/kg de pesodo corpo distribuída de modo intraperitoneal, em uma base diária, começando no dia -1 econtinuando até o ponto final.

Grupo 4" (ciclofosfamida sozinha) - os camundongos foram administrados com aciclofosfamida intravenosamente, em uma dose de 40 mg/kg de peso do corpo, em cada umdos dias 0 e 1.

Grupo 5" (BB5.1 mais ciclosporina A) - os camundongos foram administrados comBB5.1 de modo intraperitoneal, em uma dose de 40 mg/kg de peso do corpo, em uma basediária, começando no dia -1 e continuando até o ponto final. Estes camundongos foramadicionalmente administrados com a ciclosporina A subcutaneamente, em uma dose de 15mg/kg de peso do corpo, em uma base diária, a partir do dia 0 até o ponto final.

Grupo 6" (BB5.1 mais ciclofosfamida) - os camundongos foram administrados comBB5.1 de modo intraperitoneal, em uma dose de 40 mg/kg de peso do corpo, em uma basediária, começando no dia -1 e continuando até o ponto final. Estes camundongos foramadicionalmente administrados com a ciclofosfamida intravenosamente, em uma dose de 40mg/kg de peso do corpo, em cada um dos dias 0 e 1.

Grupo 7" (ciclosporina A mais ciclofosfamida) - os camundongos foramadministrados com a ciclosporina A subcutaneamente, em uma dose de 15 mg/kg de pesodo corpo, em uma base diária, a partir do dia 0 até o ponto final. Estes camundongos foram adicionalmente administrados com a ciclofosfamida intravenosamente, em uma dose de 40mg/kg de peso do corpo, em cada um dos dias 0 e 1.

Grupo 8" (BB5.1 mais ciclosporina A mais ciclofosfamida) - os camundongos foramadministrados com BB5.1 de modo intraperitoneal, em uma dõse de 40 mg/kg de peso docorpo, em uma base diária, começando no dia -1 e continuando até 100 dias. Estescamundongos foram também administrados com a ciclosporina A subcutaneamente, emuma dose de 15 mg/kg de peso do corpo, em uma base diária, a partir do dia 0 até 100 dias.Estes camundongos foram adicionalmente administrados com a ciclofosfamidaintravenosamente, em uma dose de 40 mg/kg de peso do corpo, em cada um dos dias 0 e 1.Dois camundongos neste grupo foram sacrificados no dia 60 para os estudos histológicos (nenhuma rejeição tinha ocorrido ainda) e os quatro camundongos restantes ainda nãotinham rejeitado os seus enxertos perto do dia 100.

Adicionalmente, testou-se um grupo de controle de camundongos que não foi pré-sensibilizado e recebeu somente o tratamento com solução salina como para o Grupo 1".

Os resultados destes experimentos são mostrados nas Tabelas 5 e 6. A Tabela 5 lista os tempos de sobrevivência para os enxertos e a Tabela 6 resume os resultadoshistológicos.

Tabela 5

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>

*Ρ < 0,01 grupo 1" vs. nenhuma pré-sensibilização**P < 0,01 grupo 5" vs. grupos 1"-4" e 6"-7".***P < 0,01 grupo 8" vs. grupos Y-T.

Tabela 6

Pontuações Médias das Alterações Histolóqicas dos Aloenxertos de Coração na Necropsia

<table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>

Pontuações Médias: 0 = norma; 1 - alteração mínima; 2 - alteração branda; 3 -alteração moderada; 4 - alteração acentuada. N/A - não disponível.

*Vasc - vasculite; Infar = infarto; Linf - infiltração de linfócitos; Trom = trombose;Hemo - hemorragia; Fibrina - deposição de fibrina; PMN - infiltrado de célulaspolimorfonucleares

Os resultados mostrados na Tabela 5 indicam uma diferença entre o modelo decamundongo pré-sensibilização e o modelo de camundongo não pré-sensibilizado, conformeusado no Exemplo 3. Os resultados indicam que na ausência de pré-sensibilização, osenxertos são rejeitados em aproximadamente 8 dias na ausência de tratamento comquaisquer fármacos. A pré-sensibilização dos animais causa uma rejeição mais rápida, arejeição do enxerto nos animais pré-sensibilizados sendo em aproximadamente 3 dias naausência de qualquer tratamento com fármaco. O tratamento com BB5.1, ciclosporina A ouciclofosfamida não teve nenhum efeito sobre a sobrevivência do enxerto, com os enxertossendo rejeitados em aproximadamente 3-4 dias em cada um destes grupos de animais. Acombinação de BB5.1 e ciclosporina A mostrou algum efeito, com a rejeição ocorrendo emtorno do dia 12. A combinação de BB5.1 e ciclofosfamida não teve nenhum efeito protetor,com a rejeição ocorrendo em torno do dia 3. Similarmente, a combinação de ciclosporina Ae ciclofosfamida essencialmente não teve nenhum efeito protetor, com a rejeição ocorrendoem 3-4 dias. Muito surpreendentemente, a combinação de todos os três fármacos(administração crônica de BB5.1 e ciclosporina mais administração de ciclofosfamida nahora do transplante) mostrou um efeito altamente sinérgico, com todos os camundongossobrevivendo por mais do que 100 dias. Novamente, uma sobrevivência de 100 dias nestemodelo é considerada ser o padrão de outro e assume uma sobrevivência ilimitada.

Estes resultados, bem como os resultados histológicos como mostrados na Tabela6 indicam que a combinação de tratamento crônico com um inibidor do complemento e umimunossupressor, tal como a ciclosporina A, no tratamento de um camundongo pré-sensibilizado, resulta em alguma atenuação da rejeição acelerada. O tratamento destesanimais adicionalmente com a ciclofosfamida na hora do transplante e no primeiro dia apóso transplante resulta em um tempo muito maior de sobrevivência, nenhuma rejeição tendosido vista perto de pelo menos o dia 100.

Exemplo 5

Os Aloenxertos de Rins de C3H Sucumbem à ABMR nos Receptores BALB/c Pré-Sensibilizados

Desenvolveu-se um novo modelo de camundongo de ABMR com característicasque copiam estreitamente a indicação clínica de alotransplante renal em pacientesaltamente pré-sensibilizados. Os camundongos BALB/c receptores foram pré-sensibilizadoscom enxertos de pele dos doadores C3H inteiramente alogênicos. Após a pré-sensibilização, os níveis de IgG anti-doador circulante estavam acentuadamente elevados eatingiram níveis de pico sete dias após o enxerto de pele (Figura 10A). Neste momento, osaloenxertos de rim da mesma linhagem do doador (C3H) foram transplantados nosreceptores pré-sensibilizados; estes enxertos foram rapidamente rejeitados em todos osanimais em 8,5 ± 1,3 dias (Figura 11 A). Os enxertos rejeitados mostraram característicashistológicas consistentes com a rejeição humoral acelerada, incluindo 1) evidência devasculite, hemorragia e edema no interstício, bem como necrose glomerular e tubular(Figura 10B-a); 2) deposição extensa dentro do enxerto de IgG (Figura 10B-c), C3 (Figura10B-e) e C5 (Figura 10B-gr); 3) níveis significativamente mais elevados de IgG anti-doadorCirculante comparados cõm aqueles observados entre os receptores não pré-sensibilizados,avaliados no mesmo dia após o transplante (p<0,01; Figura 10C); 4) níveis normais deatividade do complemento (Figura 10D) e 5) grande infiltração dentro dos enxertos decélulas Mac-I+, incluindo os monócitos e os macrófagos (Figura 10B-/). Em contraste, oscamundongos BALB/c não pré-sensibilizados rejeitaram os enxertos de rim de C3H em 55,2± 5,6 dias e mostraram histologia normal do enxerto no POD8 (Figura 10B-6), sem nenhumadeposição detectável de IgG (Figura 10B-d), pouca ou nenhuma infiltração de células Mac-1+ (Figura 10B-y) e somente deposição branda de C3 (Figura 10B-f) e C5 (Figura 10Β-Λ). Apré-sensibilização com a pele do doador não pareceu aumentar os níveis de IgG anti-doadorcirculante (Figura 10C) ou a atividade do complemento no soro (Figura 10D). Estes dadossugerem que este novo modelo de aloenxerto de rim oferece uma ferramenta excelente parainvestigar a função potencial do complemento na rejeição do aloenxerto renal mediada poranticorpo em receptores altamente pré-sensibilizados.

O mAb Anti-C5 em Combinação com CsA e LF Impede a ABMR e Atinge umaSobrevivência do Aloenxerto de Rim Ilimitada em Receptores de Camundongos Pré-Sensibilizados

Os experimentos iniciais efetuados durante o desenvolvimento deste modeloavaliaram os efeitos imunossupressores da CsA e da ciclofosfamida (CyP) noprolongamento da sobrevivência do enxerto de rim. Entretanto, o tratamento com CyPestava associado com uma nefrotoxicidade significativa, proibindo uma avaliação adicional(dados não mostrados). O tratamento breve com LF não estava associado com anefrotoxicidade, e a modelagem adicional usou este agente como parte do regimeimunossupressor experimental.

Avaliou-se se o mAb anti-C5, sozinho ou combinado com tratamento com CsA e LFde curta duração, poderia impedir a ABMR em receptores de camundongos pré-sensibilizados recebendo aloenxertos renais. Conforme apresentado na Figura 11 A, osenxertos entre os receptores pré-sensibilizados tratados com a monoterapia de CsA ou LF1ou com os dois fármacos em combinação, foram rejeitados em 9,3 ± 2,5 dias, 6,0 ±1,0 diase 11,7 + 2,1 dias, respectivamente. Além disso, a monoterapia com mAb anti-C5, ou o anti-C5 em combinação com CsA ou LF1 foi incapaz de aperfeiçoar a sobrevivência do enxerto,com a rejeição ocorrendo em 7,0 ±1,0 dias e 8,3 ± 3,2 dias, respectivamente (Figura 11 A).

Estes enxertos de rim rejeitados também desenvolveram características patológicas típicasde rejeição humoral mediada por anticorpo (dados não mostrados), com o padrão derejeição virtualmente idêntico àquele observado nos receptores BALB/c pré-sensibilizados,não tratados (Figura 10B-a). Em contraste, a terapia tripla consistindo em tratamento commAb anti-C5, CsA e LF de curta duração efetivamente impediu a rejeição do enxerto eatingiu uma sobrevivência do aloenxerto de rim ilimitada por >100 dias entre os animais pré-sensibilizados (Figura 11 A). Ademais, os enxertos de rim de sobrevivência de longaduração demonstraram função normal do rim, conforme indicada pelos níveis de creatininano soro dentro da faixa normal (Figura 11B; p<0,01 vs. camundongos não tratados ouaqueles tratados com a monoterapia de CsA ou LF ou os dois fármacos em combinação).

Os aloenxertos de rim em PODIOO nos receptores pré-sensibilizados tratados com a terapiatripla tiveram histologia normal (Figura 11C-a), sem nenhuma infiltração detectável dascélulas CD4+, CD8+ ou Mac-I+ (Figura 11C-Ò, c, d). Além disso, uma grande infiltraçãodentro dos enxertos de células Mac-I+ foi verificada nos animais não tratados e tratadoscom CsA, LF ou CsA mais LF, enquanto que a infiltração destas células foisignificativamente reduzida nos animais tratados com mAb anti-C5 (Tabela 7). Estesresultados indicam que o tratamento com um mAb anti-C5 que bloqueia funcionalmentejuntamente com a CsA e o LF de curta duração impede a ABMR e permite a sobrevivênciado aloenxerto de rim ilimitada em receptores altamente pré-sensibilizados.

O Tratamento com mAb Anti-C5 Inibe Completamente a Atividade do ComplementoTerminal e a Deposição de C5 Local em Receptores Pré-Sensibilizados RecebendoAloenxertos de Rim

Para determinar a eficácia sistêmica e local do tratamento com mAb anti-C5 nestemodelo, a atividade do complemento foi avaliada, conforme medida por um ensaiohemolítico de soro in vitro, entre os camundongos em diferentes grupos de tratamento, nomesmo ponto de tempo (POD7). O tratamento dos camundongos com CsA ou LF, ou comos dois fármacos em combinação, não teve nenhum efeito inibitório sobre a atividade docomplemento terminal, enquanto que o tratamento com o mAb anti-C5 sozinho oucombinado com CsA e/ou LF inibiu completamente a atividade do complemento no soro(p<0,01, vs. camundongos nunca antes tratados, camundongos pré-sensibilizados nãotratados, ou animais tratados com CsA, LF, ou CsA mais LF) (Figura 12). A atividadehemolítica do complemento foi restaurada até níveis normais perto do PODIOO após acessação do tratamento no POD6O (Figura 12). Além disso, a deposição de C5 local (dentrodo enxerto) foi completamente impedida nos receptores pré-sensibilizados tratados commAb anti-C5, porém estava evidente nos animais pré-sensibilizados tratados com CsA, LF e CsA mais LF (Tabela 7). Conforme predito, a terapia com mAb anti-C5 não impediu adeposição de C3 dentro do enxerto (Tabela 7). Estes resultados indicam que a terapia commAb anti-C5 bloqueia completamente a atividade do complemento terminal, porém conservaos componentes do complemento iniciais após o transplante de rim alogênico nosreceptores pré-sensibilizados.

Os Enxertos de Rim com Sobrevivência de Longa Duração Resistem à LesãoHumoral em Receptores Pré-Sensibilizados Através da Acomodação

Para investigar se a sobrevivência de longa duração destes enxertos de rim estáassociada com o desenvolvimento de acomodação, mediram-se os níveis de anticorpo anti-doador circulante, a atividade do complemento no soro e a deposição de anticorpo e complemento dentro do enxerto nos camundongos dos diferentes grupos de tratamento, nahora da rejeição. Os receptores BALB/c pré-sensibilizados, não tratados, produziram altosníveis de anticorpos IgG anti-doador circulantes (Figura 13A), que foram parcialmentereduzidos com o tratamento com CsA ou LF sozinhos ou em combinação. A adição de anti-C5 à monoterapia com CsA ou LF não atenuou adicionalmente os níveis de anticorpo anti- doador. Com a terapia tripla de mAb anti-C5, CsA e LF, os níveis de IgG anti-doadorcirculante foram acentuadamente inibidos e permaneceram baixos no PODIOO (*p<0,01 vs.animais pré-sensibilizados, não tratados, ou aqueles tratados com a monoterapia ou os doisfármacos em combinação). Entretanto, este baixo nível de anticorpo ainda era mais elevadodo que aquele dos animais nunca antes tratados (**p<0,05 vs. animais pré-sensibilizados tratados com a terapia tripla). Consistente com os efeitos do tratamento sobre os níveis deanticorpos anti-doadores circulantes, uma deposição significativa de IgG dentro do enxertofoi observada nos receptores pré-sensibilizados não tratados ou naqueles recebendo amonoterapia com CsA ou LF ou a combinação dos dois fármacos (Tabela 7). De modointeressante, no PODIOO, os enxertos de rim com sobrevivência de longa duração a partir dos animais tratados com a terapia tripla também demonstraram deposição branda de IgG(Figura 11C-e, Tabela 7). Ademais, a deposição branda a moderada de C3 e C5 foidetectada nos enxertos de rim com sobrevivência de 100 dias nos animais pré-sensibilizados (Figura 11C-f, g, Tabela 7). Os níveis de IgM anti-doador na circulação(Figura 13A) ou nos enxertos de rim transplantados (Tabela 7) permaneceram baixos emtodos os receptores pré-sensibilizados, independente do tratamento. Considerados juntos,estes dados demonstram que a terapia tripla à base de mAb anti-C5 impede a ABMR,apesar da presença da deposição demonstrável de IgG e complemento dentro do enxerto,sugerindo que a sobrevivência do enxerto de longa duração tem sido efetuada através deum processo de acomodação.

A Subclasse de IgG Muda para lgG2b nos Receptores Pré-Sensibilizados comSobrevivência de Longa Duração Carregando os Enxertos de Rim Acomodados

Para determinar se a terapia tripla à base de mAb anti-C5 estava associada comuma mudança na subclasse de IgG1 efetuou-se uma comparação entre os níveis no sorodas subclasses de IgG anti-doador entre os receptores pré-sensibilizados, não tratados, eaqueles carregando enxertos de rim acomodados. Os soros dos receptores pré-sensibilizados não tratados continham predominantemente anticorpos anti-doadores IgGI1 lgG2a e lgG3 (Figura 13B). O mesmo padrão foi observado entre os receptores pré-sensibilizados, tratados com CsA1 LF1 ou os dois fármacos em combinação (dados nãomostrados). Em contraste, entre os receptores pré-sensibilizados carregando enxertosacomodados (PODTOO), a subclasse de IgG anti-doador predominante era lgG2b (Figura13B, p<0,01). Estes dados sugerem que a produção de anticorpos lgG2b anti-doadores pode estar associada com a indução da acomodação do enxerto.

As Proteínas Protetoras Bcl-2 e Bcl-x1 Expressam nos Enxertos de RimAcomodados

Formula-se a hipótese que a resistência dos enxertos acomodados aos baixosníveis de aloanticorpos e complemento pode estar associada com a expressão dentro doenxerto das proteínas protetoras, tais como Bcl-x1 e Bcl-2, anteriormente descritas seremsupra-reguladas na vasculatura dos enxertos acomodados em modelos de xenotransplante(Bach e col., 1997). A expressão destas proteínas foi avaliada entre os receptores pré-sensibilizados recebendo terapia tripla à base de mAb anti-C5. Os enxertos de rimacomodados a partir dos receptores pré-sensibilizados tratados com a terapia tripla à basede mAb anti-C5 expressam altos níveis de proteínas Bcl-2 e Bcl-x1 no PODIOO (Figura 14).Em contraste, a expressão destas proteínas não era detectável nos enxertos de rimrejeitados de animais pré-sensibilizados, não tratados (Figura 14), ou de animais pré-sensibilizados tratados com a monoterapia com CsA ou LF ou os dois fármacos emcombinação (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que a resistência dosenxertos acomodados à lesão humoral nestes animais pré-sensibilizados pode estarassociada com a proteção proporcionada pelas proteínas Bcl-2 e Bcl-x1.Tabela 7

Coloração com a Imunoperoxidase dos aloenxertos de rim nos receptores decamundonqos pré-sensibilizados na necropsia*

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*Os enxertos foram coletados na hora da rejeição ou no PODIOO (para o grupo daterapia tripla) após o transplante. A intensidade da coloração foi pontuada como se segue: 0,negativa, 1+, confusa; 2+, fraca; 3+, moderada; 4+, intensa.

Exemplo 6

Métodos para o Exemplo 5

AnimaisOs camundongos adultos machos C3H (H-2k) e os camundongos BALB/c(H-2d) (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) pesando 25-30 g foram escolhidos como doadorese receptores, respectivamente. Os animais foram alojados sob condições convencionais naInstalação para o Cuidado dos Animais, The University of Western Ontario, e foram cuida-dos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Canadian Council on Animal Care("Conselho Canadense sobre o Cuidado dos Animais").

Pré-sensibilização com a PeleOs enxertos de pele com espessura total retiradosdos doadores C3H foram cortados em pedados de 1 χ 1 cm2 e transplantados sobre os dor-sos dos camundongos receptores BALB/c. A rejeição foi definida como necrose completados enxertos de pele.

Transplante de Rim OrtotópicoSete dias após a pré-sensibilização com a pele, osrins dos camundongos C3H foram transplantados no abdômen dos receptores BALB/c pré-sensibilizados por anastomose das aortas do doador e do receptor, e da veia renal do doa-dor com a veia cava inferior do receptor, usando suturas de náilon 11-0. O ureter do doadorfoi também suturado à bexiga do receptor usando suturas 10-0. Os rins nativos foram re-movidos imediatamente após o enxerto. A rejeição do enxerto levando à morte do hospe-deiro foi usada como o ponto final da rejeição para os transplantes de rim.

Grupos ExperimentaisOs receptores pré-sensibilizados foram aleatoriamente desti-nados a oito grupos, cada um consistindo em cinco animais: Grupo 1, camundongos nãotratados; Grupo 2, camundongos tratados com CsA (15 mg/kg/dia, s.c., diariamente a partirdo dia O1 para estudar o ponto final (rejeição do enxerto ou dia pós-operativo (POD)IOO);Grupo 3, camundongos tratados com mAb anti-C5 (clone BB5.1, Alexion Pharmaceuticals,Inc., 40 mg/kg/dia, i.p., diariamente, dias 0-14, seguidos por duas vezes semanalmente até odia 60); Grupo 4, camundongos tratados com LF15-0195 (LF, 2 mg/kg/dia, s.c., dias 0-14);Grupo 5, camundongos tratados com mAb anti-C5 mais CsA; Grupo 6, camundongos trata-dos com mAb anti-C5 mais LF; Grupo 7, camundongos tratados com CsA mais LF; Grupo 8,camundongos tratados com a terapia tripla consistindo em mAb anti-C5, CsA e LF. Na horada rejeição, os enxertos de rim foram removidos para a análise por histologia de rotina, imu-noistoquímica e transferência western, e as amostras de soro foram coletadas para a avalia-ção dos níveis de anticorpos anti-doadores e da atividade do complemento.

Medição da Creatinina no SoroAs amostras de soro foram obtidas no ponto final doestudo (hora da rejeição ou PODIOO) após o transplante de rim. Os níveis de creatinina nosoro foram quantificados em amostras de 10 μί, usando o procedimento da Sigma Diagnos-tics (Sigma, St. Louis, MO), que mede a creatinina por uma modificação cinética da reaçãode Jaffe (Junge e col., 2004).

Histologia do Enxertohia necropsia, as amostras de tecido foram processadas paraa coloração com hematoxilinã e eosina (H&F) (Wang e col., Jl 2003) e avaliadas quanto àvasculite, trombose, hemorragia e infiltração de linfócitos; as alterações foram pontuadascomo: 0, nenhuma; 1, mínima; 2, branda; 3, moderada ou 4, acentuada em comparaçãocom os tecidos normais.

ImunoistoquimicaAs amostras de tecido incrustadas em gel de Temperatura deCorte Ótima (O.C.T.) (Skura Finetek, Torrance, CA) foram seccionadas e tingidas para ascélulas CD4+, CD8+ e Mac-I+ que se infiltram e para a deposição de IgG1 IgM1 C3 e C5 u-sando um kit Elite Vectastain ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Os anticor-pos primários biotinilados incluíam o anti-CD4 (YTS 191.1.2, Cedarlane Laboratories Ltd.,Homby, Ontario, Canadá), o anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciencers, Franklin Lakes, NJ) e o anti-Mac-1 (Cedarlane). A deposição de IgG e IgM dentro dos enxertos foi detectada usando aIgG anti-camundongo em cabra biotinilada e a IgM anti-camundongo em cabra (Cedarlane).

A deposição do complemento foi detectada seguindo a incubação em série com os Abs poli-clonais anti-C3 de camundongo ou anti-C5 de camundongo em cabra (Quidel, San Diego,CA), a IgG anti-cabra em coelho biotinilada (Vector Laboratories), e a estreptavidina conju-gada à HRP (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). Os controles negativos foramefetuados omitindo os anticorpos primários. A imunocoloração foi classificada em cincocampos de alta energia de cada secção usando amostras de tecidos de cinco animais porgrupo experimental. A imunorreatividade foi graduada de 0 a 4+ de acordo com a intensida-de da coloração, como se segue: 0, negativa; 1+, confusa; 2+, fraca; 3+, moderada; e 4+coloração muito intensa.

Citometria de FluxoOs anticorpos IgG e IgM anti-doadores específicos circulantesforam avaliados nos soros dos receptores por citometria de fluxo. Resumidamente, os es-plenócitos dos camundongos C3H foram isolados e incubados a 37°C, por 30 minutos, comamostras de soro obtidas nos pontos de tempo indicados, a partir dos camundongos dosdiversos grupos de tratamento. Para colorir para a IgG total ou as subclasses de anticorposespecíficos, as células lavadas foram incubadas com anticorpos anti-camundongos em ca-bra conjugados ao FITC específicos para a porção Fc de IgG de camundongo, IgGI de ca-mundongo, lgG2a de camundongo, lgG2b de camundongo ou lgG3 de camundongo (todasda CALTAG Laboratories, Burlingame1 CA) ou com um anticorpo de cabra conjugado à fico-eritrina específico para a IgM de camundongo (Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove, PA), por 1 hora, a 4 °C, lavadas e analisadas sobre um citômetro de fluxoFACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) (Collins e col., 1999; Pratt e col., 1996).Os resultados são expressos como a intensidade de fluorescência do canal média comouma medida do nível de cada isótipo anti-doador nas amostras.

Ensaio Hemolítico do CompIementoA atividade do complemento terminal nos sorosdos camundongos receptores foi determinada por métodos padrões, para avaliar a capaci-dade dos soros de Iisar os eritrócitos dê galinhas pré-sensibilizadõs com anticorpos especí-ficos para eritrócitos, conforme anteriormente descrito (Wang e col., 1999).

Análise por Transferência WesternAs amostras congeladas de rim foram sonicadas,separadas por eletroforese e transferidas para membranas de poli(difluoreto de vinilideno)(PVDF; Invitrogen). A expressão dentro do enxerto de Bcl-2 e BcI-X$/l foi detectada usandoos soros policlonais N-19 e M-125, respectivamente (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Aanti-calsequestrina policlonal (CaIbiochem) serviu como um controle de carga de amostra(Kobayashi e col., 1999). A ligação do anticorpo foi detectada por IgG anti-coelho em cabraconjugada à peroxidase da raiz forte e desenvolvimento de quimioluminescência aumentada(Roche Laboratories) (Arp e col., 1996).

Análise EstatisticaOs dados são descritos como a média ± desvio padrão (DP). Asobrevivência do aloenxerto entre os grupos experimentais foi comparada usando o teste delog da classificação. As verificações histológicas e imunoistológicas foram analisadas usan-do o ANOVA na classificação. Os dados citométricos de fluxo e da transferência westemforam analisados usando ANOVA unidirecional. As diferenças com os valores de ρ menoresdo que 0,05 foram consideradas significativas.

Será apreciado que os métodos e as composições da presente divulgação podemser incorporados na forma de uma variedade de modalidades, somente algumas da quaissão divulgadas neste documento. Será aparente para o profissional que existem outras mo-dalidades e que não saem do espírito da divulgação. Assim, as modalidades descritas sãoilustrativas e não devem ser interpretadas como restritivas.

LISTA DE REFERÊNCIAS

As publicações e os outros materiais usados neste documento para esclarecer osfundamentos da divulgação, e em particular, os casos, para proporcionar detalhes adicionaiscom relação à prática, são incorporados neste documento por referência em sua totalidade,e por conveniência, são referidos pelo autor e data no texto e respectivamente agrupados naLista de Referências a seguir.

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Patente U.S. 6.534.058Patente U.S. 6.821.515

Os conteúdos de todas as referências citadas neste documento são incorporadospor referência em sua totalidade.

Claims

1. Método de prolongar a sobrevivência de um aloenxerto de rim em um mamíferoreceptor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao dito mamífero a)um fármaco que iniba a atividade do complemento e b) pelo menos uma terapia imunossu-pressora, onde a dita terapia é selecionada a partir de i) pelo menos um fármaco imunossu-pressor ou ii) um tratamento imunomodulador.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que odito mamífero é um ser humano.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que odito aloenxerto é incompatível com o MHC.

4. Método, cie acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que odito aloenxerto incompatível com o MHC é um aloenxerto incompatível com o HLA.

5. "Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que odito receptor é ABO incompatível com o ABO para o dito aloenxerto.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oditó fármaco que inibe a atividade do complemento inibe a formação de C5b ou C5a.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco que inibe a formação de C5b ou C5a é um anticorpo inteiro ou um fragmentode anticorpo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que odito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo é um anticorpo ou fragmento de anticorpohumano, humanizado, quimerizado ou desimunizado.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo inibe a clivagem do complemento C5.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um Fab1 umF(ab')2> um Fv, um anticorpo de domínio e um anticorpo de cadeia individual.

12. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fragmento de anticorpo é o pexelizumab.

13. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito anticorpo inteiro é o eculizumab.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito eculizumab é administrado uma vez a cada 2 semanas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito inibidor da atividade do complemento é selecionado a partir do grupo que consiste emum i) receptor de complemento solúvel, ii) CD59, iii) CD55, iv) CD46 e v) um anticorpo paraC5, C6, C7, C8 ou C9.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco imunossupressor inibe a atividade da célula T ou a atividade da célula B.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco imunossupressor inibe a atividade da célula Tea atividade da célula B.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco imunossupressor é selecionado a partir do grupo que consiste em ciclospori-na A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, um corticosteróide, daclizumab, basiliximab, azatiopreno,micofenolato mofetil, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticorpos anti-células T, ciclofosfami-da, leflunamlcla, breqtiinar, ATG, ALGr15-desoxiespergualina; um análogode purina, rituxa-no, CTLA-4-lg (belatacept), IVIg, LF15-0195 e bredinina.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quemais do que um fármaco imunossupressor é administrado.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito método compreende administrar i) um fármaco que iniba a atividade do complementoe ii) a ciclosporina A.

21. Método, de acordo com a-reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito método compreende administrar i) um fármaco que iniba a atividade do complementoe ii) o LF15-0195.

22. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito método compreende administrar i) um fármaco que iniba a atividade do complemento,ii) a ciclosporina A, e iii) o LF15-0195.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive pelo tempo de vida restante do dito mamífero.

24. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive por pelo menos três meses.

25. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive por pelo menos seis meses.

26. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive por pelo menos um ano.

27. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive por pelo menos cinco anos.

28. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 14 dias.

29. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 28 dias.

30. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 3 meses.

31. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 6 meses.

32. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco-que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 1" arro.

33. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 5 anos.

34. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente pelotempo de vida restante do dito mamífero.

35. MétodoT de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quepelo menos um fármaco imunossupressor é administrado cronicamente pelo tempo de vidarestante do dito mamífero.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quepelo menos a ciclosporina A é administrada cronicamente pelo tempo de vida restante dodito mamífero.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de quepelo menos o LF15-0195 é administrado cronicamente pelo tempo de vida restante do ditomamífero.

38. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito tratamento imunomodulador é a plasmaférese, a esplenectomia ou a imunoadsorção.

39. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que omamífero é pré-sensibilizado ao dito aloenxerto.

40. Método de prolongar a sobrevivência de um aloenxerto em um mamífero recep-tor, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende administrar ao dito ma-mífero a) um fármaco que iniba a atividade do complemento e b) pelo menos uma terapiaimunossupressora, onde a dita terapia é selecionada a partir de i) pelo menos um fármacoimunossupressor compreendendo o LF15-0195 ou ii) um tratamento imunomodulador.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito mamífero é um ser humano.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto é incompatível com o MHC.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto incompatível com o MHC é um aloenxerto incompatível com o HLA

44. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito receptor é incompatível com ABO para o dito aloenxerto.

45. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto é selecionado a partir do grupo que consiste em i) coração, ii) rim, iii) pul-mão, iv) pâncreas, v) fígado, vi) tecido vascular, vii) olho, viii) córnea, ix) cristalino, x) pele,xi) medula óssea, xii) músculo, xiii) tecido conjuntivo, xiv) tecido gastrointestinal, xv) tecidonervoso, xvi) osso, xvii) células-tronco, xviii) ilhotas, xix) cartilagem, xx) hepatócitos.e xxi)células hematopoéticas.

46. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente.

47. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento inibe a formação de C5b ou C5a.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a formação de C5b ou C5a é um anticorpo inteiro ou um fragmentode anticorpo.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo é um anticorpo ou fragmento de anticorpohumano, humanizado, quimerizado ou desimunizado.

50. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo inibe a clivagem do complemento C5.

51. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um Fab, umF(ab')2, um Fv, um anticorpo de domínio e um anticorpo de cadeia individual.

52. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fragmento de anticorpo é o pexelizumab.

53. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito anticorpo inteiro é o eculizumab.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito eculizumab é administrado uma vez a cada 2 semanas.

55. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito inibidor da atividade do complemento é selecionado a partir do grupo que consiste emum i) receptor de complemento solúvel, ii) CD59, iii) CD55, iv) CD46 e v) um anticorpo paraC5, C6, C7, C8 ou C9.

56. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco imunossupressor inibe a atividade da célula T ou a atividade da célula B.

57. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco imunossupressor inibe a atividade da célula Tea atividade da célula B.

58. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco imunossupressor adicionalmente compreende um fármaco selecionado apartir do grupo que consiste em ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, um corticoste-róide, daclizumab, basiliximab, azatiopreno, micofenolato mofetil, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticorpos anti-células T, ciclofosfamida, leflunamida, brequinar, ATG, ALG,- 15-desoxiespergualina, um análogo de purina, rituxano, CTLA-4-lg (belatacept), IVIg e bre-dinina.

59. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito método compreende administrar i) um fármaco que iniba a atividade do complemento,ii) a ciclosporina A e iii) o LF15-0195.

60. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive pelo tempo de vida restante do dito mamífero.

61. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive por pelo menos três meses.

62. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive por pelo menos seis meses.

63. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive por pelo menos um ano.

64. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito aloenxerto sobrevive por pelo menos cinco anos.

65. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 14 dias.

66. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 28 dias.

67. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 3 meses.

68. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 6 meses.

69. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 1 ano.

70. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente por pelomenos 5 anos.

71. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito fármaco que inibe a atividade do complemento é administrado cronicamente pelotempo de vida restante do dito mamífero.

72. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de quepelo menos um fármaco imunossupressor é administrado cronicamente pelo tempo de vidarestante do dito mamífero.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de quepelo menos a ciclosporina A é administrada cronicamente pelo tempo de vida restante dodito mamífero.

74. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de quepelo menos o LF15-0195 é administrado cronicamente pelo tempo de vida restante do ditomamífero.

75. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito tratamento imunomodulador é a plasmaférese, a esplenectomia ou a imunoadsorção.

76. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo dito mamífero é pré-sensibilizado para o dito aloenxerto.

77. Uso de um fármaco que inibe a atividade do complemento e pelo menos umfármaco imunossupressor, CARACTERIZADO por ser na manufatura de um medicamentoou pacote de medicamento para prolongar a sobrevivência de um aloenxerto de rim em um mamífero.

78. Uso, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de quemais do que um fármaco imunossupressor é incluído no dito medicamento ou pacote demedicamento.

79. Uso, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco que inibe a atividade do complemento e o dito fármaco imunossupressor estãoem uma formulação adequada para a administração simultânea ao dito mamífero.

80. Uso, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco que inibe a atividade do complemento e o dito fármaco imunossupressor estãoem uma formulação ou formulações adequadas para a administração seqüencial ao ditomamífero.

81. Uso, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco que inibe a atividade do complemento está em uma formulação adequada paraa administração crônica ao dito mamífero.

82. Uso, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco imunossupressor está em uma formulação adequada para a administraçãocrônica ao dito mamífero.

83. Uso de um fármaco que inibe a atividade do complemento e um fármaco imu-nossupressor CARACTERIZADO por ser na manufatura de um medicamento ou pacote demedicamento para prolongar a sobrevivência de um aloenxerto de rim em um mamífero,em que o pelo menos um fármaco imunossupressor compreende o LF15-0195.

84. Uso1 de acordo com a reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de quemais do que um fármaco imunossupressor é incluído no dito medicamento ou pacote demedicamento.

85. Uso, de acordo com a reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco que inibe a atividade do complemento e o dito fármaco imunossupressor estãoem uma formulação adequada para a administração simultânea ao dito mamífero.

86. Uso, de acordo com a reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco que inibe a atividade do complemento e o dito fármaco imunossupressor estãoem uma formulação ou formulações adequadas para a administração seqüencial ao ditomamífero.

87. Uso, de acordo com a reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco que inibe a atividade do complemento está em uma formulação adequada paraa administração crônica ao dito mamífero.

88. Uso, de acordo com a reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de que odito fármaco imunossupressor está em uma formulação adequada para a administraçãocrônica ao dito mamífero.

89. Pacote farmacêutico, CARACTERIZADO por compreender um fármaco que ini-be a atividade do complemento e pelo menos um fármaco imunossupressor, onde o ditofármaco que inibe a atividade do complemento e o dito fármaco imunossupressor são formu-lados para a administração crônica,onde pelo menos um fármaco imunossupressor compreende o LF15-0195.