DE69916807T2

DE69916807T2 - Kostimulatorische blockade und gemischter chimerismus in allotransplantationen

Info

Publication number: DE69916807T2
Application number: DE1999616807
Authority: DE
Inventors: Megan Sykes; H. Mohamed SAYEGH
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; General Hospital Corp
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; General Hospital Corp
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1999-02-04
Publication date: 2005-01-13
Anticipated expiration: 2019-02-05
Also published as: AU748443B2; JP2002502824A; WO1999039727A1; US6514513B1; EP1053006A1; AU746825B2; EP1053006A4; US6280957B1; EP1058555A1; CA2319764A1; IL137361A0; DE69916807D1; EP1058555B1; AU2588099A; WO1999039726A1; AU2583999A; ATE265220T1; US20020055122A1; IL137614A0; EP1058555A4

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft Gewebe- und Organtransplantationen.
Das Gebiet der Organtransplantation hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten wesentlich weiter entwickelt, was zu bemerkenswerten Verbesserungen bezüglich des Überlebens von Kurzzeittransplantaten führte. Empfänger von Organtransplantaten sehen sich jedoch noch wesentlichen Risiken langfristiger Morbidität und Mortalität ausgesetzt. Obwohl moderne immunsuppressive Verabreichungen zu einer dramatischen Verringerung des Vorkommens akuter Abstoßungserscheinungen führte, müssen sie nun auch eine ähnliche Wirkung für die chronische Abstoßung erreichen, welche nach wie vor die Hauptursache des Transplantatverlusts während der langfristigen Folgeperiode darstellt. Zusätzlich birgt das Erfordernis einer langlebigen immunsuppressiven Arzneimitteltherapie ein signifikantes Risiko für schwere Nebenwirkungen, einschließlich Tumoren, Infektionen und metabolischen Erkrankungen. Die zuverlässige Induktion einer spenderspezifischen Toleranz werden beide Probleme lösen, indem der Bedarf an einer chronischen nicht-spezifischen Immunsuppression vermieden würde und indem schädliche immunologische Reaktionen gegenüber dem Allo-Transplantat aufgehoben werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Induktion von Toleranz gegenüber Allo-Antigenen. Die erfindungsgemäßen Verwendungen betreffen präparative Verabreichungsformen, welche die Notwendigkeit einer Thymusbestrahlung oder T-Zell-inhibierende Antikörper oder beides minimiert oder eliminiert.
Demzufolge betrifft die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors der co-stimulatorischen Interaktion von CD40-Ligand-CD40 zur Förderung von Tole ranz durch ein Empfängersäugetier, z. B. einem Primaten, z. B. einem Menschen, gegenüber einem Transplantat von einem Spendersäugetier derselben Spezies. Die Erfindung schließt ein: die Verwendung eines Inhibitors, z. B. eines Blockers, der co-stimulatorischen Interaktion von CD40-Ligand-CD40 zur Herstellung Biner pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung an den Empfänger verabreicht wird (gegebenenfalls kann ein Inhibitor oder Blocker der Interaktion von CD28-B7 verabreicht werden); durch intravenöse Injektion von hämatopoetischen Stammzellen, die aus einem anderen Organ als von dem Transplantat erhalten wurden und nicht direkt von einem menschlichen Embryo gewonnen wurden, z. B. einer Knochenmarkspräparation in das Empfängersäugetier; und vorzugsweise wird das Transplantat in den Empfänger implantiert. Von den hämatopoetischen Zellen wird angenommen, dass sie den Empfänger auf das folgende Transplantat vorbereiten, indem sie Toleranz sowohl auf den Ebenen der B-Zellen als auch der T-Zellen induzieren.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die CD40-Ligand-CD40-Interaktion durch einen Antikörper oder einen löslichen Liganden oder Rezeptor für den CD40-Liganden oder CD40, das verabreicht werden soll, inhibiert, beispielsweise durch einen anti-CD40L-Antikörper, z. B. 5c8- oder einen Antikörper mit ähnlicher Wirksamkeit oder einen Antikörper, der ein Epitop aufweist, welches mit dem Epitop von 5c8 überlappt (vgl. US-PS 5,474,711 ). Vorzugsweise bindet der Inhibitor den CD40-Liganden.
In Ausführungsformen, bei denen die CD28-B7-Interaktion inhibiert ist, kann sie auch durch einen löslichen Liganden oder Rezeptor oder Antikörper gegen das CD28 oder B7 inhibiert sein, z. B. durch einen löslichen CTLA4, beispielsweise ein CTLA4-Fusionsprotein, z. B. eine CTLA4-Immunoglobulinfusion, z. B. ein CTLA4/Ig, das verabreicht werden soll. Vorzugsweise bindet der Inhibitor B7. In bevorzugten Ausführungsformen werden anti-B7-1- und/oder B7-2-Antikörper verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen werden CTLA4-Ig und ein anti-CD40L-Antikörper verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen sind sowohl der Spender als auch der Empfänger Menschen.
In bevorzugten Ausführungsformen wird ein Blocker der CD40/CD40L-Interaktion, beispielsweise ein anti-CD40L-Antikörper vor der Verabreichung eines Blockers der CD28/B7-Interaktion verabreicht, z. B. CTLA4/Ig. Der CD40/CD40L-Blocker kann an dem Tag verabreicht werden, an dem das Spendergewebe eingeführt wird, und der CD28/B7-Blocker kann an den Tagen 2, 3, 4, 5 oder noch mehr Tage später verabreicht werden.
Das Transplantat exprimiert vorzugsweise ein Haupt-Histokompatibilitätskomplex(MHC)-Antigen, vorzugsweise ein Antigen der Klasse II.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Verwendung ohne T-Zell-Depletion oder -Inaktivierung durchgeführt, beispielsweise ohne die Verabreichung einer Thymusbestrahlung oder anti-T-Zell-Antikörper.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Verwendung mit einer T-Zell-Depletion oder -Inaktivierung durchgeführt, beispielsweise durch die Verabreichung einer Thymusbestrahlung oder anti-T-Zell-Antikörper.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Verwendung mit einer partiellen T-Zell-Depletion oder -Inaktivierung durchgeführt, beispielsweise durch eine Thymusbestrahlung oder durch Verabreichung von anti-T-Zell-Antikörpern in solchen Mengen, dass sie eine partielle Depletion von Empfänger-T-Zellen ergeben.
Es können auch eine oder mehrere nachträgliche Transplantat-Implantation-Verabreichungen von Spender-Stammzellen, die nicht direkt von einem menschlichen Embryo gewonnen werden, bereitgestellt werden. Eine nachträgliche Transplantatverabreichung von solchen hämatopoetischen Stammzellen kann bereitgestellt werden: mindestens zwei Tage, eine Woche, einen Monat oder 6 Monate nach der vorhergehenden Verabreichung von solchen Stammellen; mindestens 2 Tage, eine Woche, einen Monat, 6 Monate oder zu einer beliebigen Zeit in der Lebensspanne des Empfängers nach der Implantation des Transplantats; wenn der Empfänger Anzeichen einer Abstoßung zu zeigen beginnt, was beispielsweise durch einen Abfall der Funktion des transplantierten Organs, durch eine Änderung der spenderspezifischen Antikörperantwort des Wirts oder durch eine Änderung der Lymphozytenantwort des Wirts auf ein Spenderantigen nachgewiesen wird; wenn der Spiegel von Chimärismus abfällt; wenn der Spiegel von Chimärismus unterhalb eines vorbestimmten Werts abfällt; wenn der Spie gel des Chimärismus einen Spiegel erreicht oder darunter fällt, bei dem die Färbung mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch für ein Spender-PBMC-Antigen ist, gleich ist oder weniger ist als die Färbung mit einer isotypischen Kontrolle, welche nicht an PBMC bindet, beispielsweise, wenn die spenderspezifischen monoklonalen Färbungen weniger als 1–2% der Zellen ausmachen, oder im Allgemeinen, wie es benötigt wird, um eine Toleranz aufrechtzuerhalten oder auf andere Weise die Akzeptanz eines Transplantats zu verlängern.
Obwohl die Verfahren, bei denen Blocker von beiden Wegen verabreicht werden, gewöhnlich den Bedarf an weiteren präparativen Schritten ausschließen werden, enthalten einige Ausführungsformen die Inaktivierung von T-Zellen, vorzugsweise von reaktiven T-Zellen des Empfängersäugetiers gegenüber dem Transplantat. Dies kann z. B., durch die Einführung eines Antikörpers, der zur Bindung von T-Zellen des Empfängersäugetiers fähig ist, in das Empfängersäugetier gelöst werden. Die Verabreichung von Antikörpern oder anderen Mitteln, um T-Zellen zu inaktivieren, kann vor der Einführung von hämatopoetischen Stammzellen, die nicht direkt von einem menschlichen Embryo gewonnen wurden, in das Empfängersäugetier oder vor der Implantation des Transplantats in den Empfänger, durchgeführt werden.
Monoklonale Präparationen können in den erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen schließen ein: die Einführung eines Spenderspezies-spezifischen Stromagewebes in das Empfängersäugetier, vorzugsweise hämatopoetisches Stromagewebe, z. B. fötale Leber oder Thymus. In bevorzugten Ausführungsformen wird das einzuführende Gewebe gleichzeitig mit oder vor den hämatopoetischen Stammzellen, die nicht direkt von einem menschlichen Embryo gewonnen werden, eingeführt, wobei solche hämatopoetische Stammzellen gleichzeitig mit oder vor dem Antikörper verabreicht werden.
Obwohl Verfahren, bei denen Blocker von beiden Wegen verabreicht werden, gewöhnlich den Bedarf weiterer präparativer Schritte ausschließen, enthalten einige Ausführungsformen die Inaktivierung von Thymozyten oder T-Zellen, welche vor der Transplantation der hämatopoetischen Stammzelle oder des Transplantats durchgeführt werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Verfahren die Verringerung oder Inhibition der Aktivität von Thymozyten oder T-Zellen ein, vorzugsweise die Aktivität von T-Zellen des Thymus oder des Lymphknotens durch eine Kurzzeitverabreichung eines immunsuppressiven Mittels an den Empfänger, beispielsweise eine Chemikalie oder Arzneimittel, z. B. Cyclosporin, die ausreicht, um Thymozyten oder T-Zellen, vorzugsweise T-Zellen des Thymus oder des Lymphknotens, zu inaktivieren.
Die Dauer einer Kurzzeitverabreichung eines immunsuppressiven Mittels ist ungefähr gleich oder weniger als 30, 40, 60, 120 oder 365 Tage; ungefähr gleich oder weniger als 8–12 Tage, vorzugsweise ungefähr 10 Tage; ungefähr gleich oder weniger als zwei, drei, vier, fünf oder zehn mal der 8–12 oder 10-Tageperiode. Die Kurzzeitverabreichung kann vor oder ungefähr zur selben Zeit als die Behandlung zur Induktion von Toleranz begann anfangen, zum Beispiel ungefähr zu der Zeit, bei der die Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden; innerhalb 1, 2, 4, 6, 8, 10 oder 30 Tagen vor oder nachdem die Behandlung zur Induktion von Toleranz begann, beispielsweise innerhalb 1, 2, 4, 6, 8, 10 oder 30 Tagen oder nachdem die Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden. Die Kurzzeitverabreichung eines immunsuppressiven Mittels kann zusammen mit einem Anti-T-Zell-Antikörper durchgeführt werden. Die Kurzzeitverabreichung eines immunsuppressiven Mittels sollte bezüglich der Konzentration und der Dauer ausreichend sein, um T-Zellen, z. B. T-Zellen des Thymus oder des Lymphknotens, zu inaktivieren, welche ansonsten nicht durch eine Antikörper-basierende Inaktivierung von T-Zellen inaktiviert werden würden, beispielsweise eine Inaktivierung durch intravenöse Verabreichung von Präparationen des ATG-Antikörpers oder Ähnlichen.
Andere bevorzugte Ausführungsformen schließen solche ein, bei denen dasselbe Säugetier der Spender des Transplantats und der hämatopoetischen Zellen, die nicht direkt von einem menschlichen Embryo gewonnen wurden, oder beides, ist und der Antikörper ein anti-humanes-Thymozyten-polyklonales Antiserum ist, was beispielsweise aus einem Pferd oder Schwein erhalten worden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Verwendung die Einführung eines von einem Spender gewonnenen Transplantats in einen menschlichen Empfänger, welches aus einem anderen Organ als die hämatopoetischen Stammzellen gewonnen wurde, z. B. einem Herz, Pankreas, Leber oder Niere.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Verwendung die Herstellung eines hämatopoetischen Raums ein, beispielsweise durch Bestrahlung des Empfängers mit einer niedrigen Dosis einer Ganzkörperbestrahlung, die ausreicht, um die Bildung von hämatopoetischen Misch-Chimären zu ermöglichen, beispielsweise weniger als 400, z. B. 300 cGy-Ganzkörperbestrahlung, um das Knochenmark des Empfängers teilweise zu depletieren. Andere Mittel zur Herstellung eines hämatopoetischen Raums, z. B. eine Verabreichung von Antikörpern oder Arzneimitteln, die einen hämatopoetischen Raum erzeugen, z. B. Cyclophosphamid oder Busulfan, an den Empfänger, können verwendet werden. Beispielsweise kann der hämatopoetische Raum durch Verabreichung eines Inhibitors der Zellproliferation, z. B. DSG oder ein anti-Metabolit, z. B. Brequinar, oder ein anti-T-Zell-Antikörper, z. B. ein anti-CD4- oder anti-CDS-Antikörper oder beide, gebildet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform schließt die Erfindung ein: die Verwendung eines Inhibitors, z. B. eines Blockers, der co-stimulatorischen Interaktion von CD40-Ligand-CD40 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung an den Empfänger verabreicht wird (gegebenenfalls kann ein Inhibitor oder Blocker der CD28-B7-Interaktion verabreicht werden); durch intravenöse Injektion von hämatopoetischen Stammzellen in das Empfängersäugetier, die nicht direkt aus einem menschlichen Embryo gewonnen wurden, z. B. eine Knochenmarkspräparation, und Implantation des Transplantats in den Empfänger.
Die Verwendung kann ohne T-Zell-Depletion oder -Inaktivierung durchgeführt werden, mit T-Zell-Depletion oder -Inaktivierung oder mit partieller T-Zell-Depletion oder -Inaktivierung. Eine T-Zell-Inaktivierung kann durch die Anwendung einer Thymusbestrahlung oder durch anti-T-Zell-Antikörper bewirkt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Spendergewebe, z. B. hämatopoetische Zellen, beispielsweise partiell oder ganz, von Spender-T-Zellen depletiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verabreichung der costimulatorischen Blockade und vorzugsweise jede notwendige Bestrahlung oder T-Zell-Depletion innerhalb 48, bevorzugter innerhalb 24 Stunden nach der Implantation des Transplantats.
"Transplantat", wie hier verwendet, bezeichnet ein Körperteil, Organ, Gewebe oder Zellen. Organe wie Leber, Niere, Herz oder Lunge oder andere Körperteile wie Knochen oder Skelettgerüst, Gewebe wie Haut, Darm, endokrine Drüsen oder Vorläuferstammzellen verschiedener Typen sind alles Beispiele von Transplantaten.
"Hämatopoetische Stammzelle", wie hier verwendet, bezeichnet eine Zelle, z. B. eine Knochenmarkszelle oder eine fötale Leber- oder Milzzelle, welche in der Lage ist, sich in sämtliche myeloiden und lymphoiden Linien zu entwickeln und aufgrund der Fähigkeit, sich selbst zu erneuern, eine langfristige hämatopoetische Rekonstitution ermöglichen kann. Gereinigte Präparationen von hämatopoetischen Zellen oder Präparationen, welche andere Zelltypen einschließen, beispielsweise des Knochenmarks, können in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die hämatopoetischen Stammzellen an einer Stelle in dem Empfängersäugetier vorkommen. Die Präparation sollte unreife Zellen einschließen, d. h. nicht-differenzierte hämatopoetische Stammzellen; diese erwünschten Zellen können aus einer Präparation abgetrennt werden oder es kann eine komplexe Präparation verabreicht werden. Zum Beispiel können im Fall von Knochenmarksstammzellen die gewünschten primitiven Zellen aus einer Präparation abgetrennt werden oder es kann eine komplexe Knochenmarksprobe, einschließlich solcher Zellen, verwendet werden. Hämatopoetische Stammzellen können aus fötalen, neonatalen, unreifen oder reifen Tieren stammen, werden aber nicht direkt von einem menschlichen Embryo erhalten. Es können Stammzellen, die aus dem Blut des Rückenmarks des Empfängers oder des Spenders stammen, in den erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden; vgl. US-PSen 5,192,553 und 5,004,681. Es sind periphere hämatopoetische Stammzellen des Bluts bevorzugt.
"Immunsuppressives Agens, das zur Inaktivierung von T-Zellen des Thymus oder Lymphknotens fähig ist", wie hier verwendet, bezeichnet ein Agens, z. B. ein chemisches Agens, z. B. ein Arzneimittel, welches, wenn es in einer angemessenen Dosierung verabreicht wird, in einer Inaktivierung der T-Zellen des Thymus oder Lymphknotens resultiert. Beispiele solcher Agenzien sind Cyclosporin, FK-506 und Rapamycin. Es können auch anti-T-Zell-Antikörper verwendet werden. Ein Agens sollte in einer ausreichenden Dosierung verabreicht werden, um eine signifikante Inaktivierung der T-Zellen des Thymus oder Lymphknotens zu bewirken, welche nicht durch Verabreichung eines anti-T-Zell-Antikörpers inaktiviert sind, z. B. durch eine anti-ATG-Präparation. Potentielle Agenzien und nützliche Konzentrationen davon können durch in vitro- oder in vivo-Tests vordurch mustert werden, z. B. durch Verabreichung des potentiellen Agens an ein Testtier, Entfernen einer Probe von Thymus oder Lymphknotengewebe und Testen auf das Vorkommen von aktiven T-Zellen in einem in vitro- oder in vivo-Assay. Solche vordurchmusterten potentiellen Agenzien können dann in Transplantats-Assays weiter getestet werden.
"Thymus- oder Lymphknoten- oder Thymozyten- oder T-Zelle", wie hier verwendet, bezeichnet Thymozyten oder T-Zellen, die gegenüber einer Inaktivierung durch traditionelle Verfahren der T-Zell-Inaktivierung resistent sind, z. B. Inaktivierung durch eine einzelne intravenöse Verabreichung von anti-T-Zell-Antikörpern, z. B. Antikörper, z. B. eine ATG-Präparation.
"Thymusbestrahlung", wie hier verwendet, bezeichnet eine Behandlung, bei der mindestens die Hälfte und vorzugsweise mindestens 75, 90 oder 95% der verabreichten Bestrahlung auf den Thymus gerichtet ist. Eine Ganzkörperbestrahlung wird nicht als Thymusbestrahlung angesehen, selbst wenn der Thymus im Verlauf der Ganzkörperbestrahlung bestrahlt wird.
"MHC-Antigen", wie hier verwendet, bezeichnet ein Proteinprodukt eines oder mehrerer MHC-Gene; der Ausdruck schließt Fragmente oder Analoga von Produkten von MHC-Genen ein, welche eine Immunantwort in einem Empfängerorganismus hervorrufen können. Beispiele von MHC-Antigenen schließen die Produkte (und Fragmente oder Analoga davon) der menschlichen MHC-Gene, d. h. die HLA-Gene, ein.
"Hämatopoetischer Raum-erzeugende Bestrahlung", wie hier verwendet, bezeichnet eine Bestrahlung, die auf das hämatopoetische Gewebe gerichtet ist, d. h. auf Gewebe, in dem sich Stammzellen befinden, z. B. dem Knochenmark. Sie ist von ausreichender Intensität, um eine signifikante Anzahl der hämatopoetischen Stammzellen abzutöten oder zu inaktivieren. Sehr oft wird sie als eine Ganzkörperbestrahlung durchgeführt.
Eine "Kurzzeitverabreichung eines immunsuppressiven Mittels", wie hier verwendet, bezeichnet einen vorübergehenden nicht-chronischen Verlauf einer Behandlung. Die Behandlung sollte vor oder zum Zeitpunkt, nachdem die Behandlung zur Induktion von Toleranz begonnen hat, anfangen, z. B. etwa zu dem Zeitpunkt, wenn die Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden, z. B. kann die Kurzzeitverabreichung an dem Tag beginnen, an dem die Behandlung zum Induzieren von Toleranz begonnen hat, z. B. an dem Tag, an dem die Stammzellen in den Empfänger eingeführt werden, oder die Kurzzeitverabreichung kann innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen, bevor oder nachdem die Behandlung zur Induktion von Toleranz begonnen hat, anfangen, z. B. innerhalb von 1, 2, 4, 6, 8 oder 10 Tagen, bevor oder nachdem die Stammzellen in den Empfänger eingeführt worden sind. Die Kurzzeitverabreichung kann für einen Zeitraum der gleich oder weniger als etwa 8–12 Tage, vorzugsweise etwa 10 Tage, oder eine Zeit, welche etwa gleich oder weniger ist als 2, 3, 4, 5 oder 10 mal der 8–12- oder 10-Tagesperiode, dauern. Im optimalen Fall dauert die Kurzzeitverabreichung etwa 30 Tage. Die Dosierung sollte ausreichend sein, um einen Blutspiegel zu erhalten, der ausreichend ist, um T-Zellen des Thymus oder Lymphknotens zu inaktivieren. Eine Dosierung von etwa 15 mg/kg/Tag wurde in Primaten als wirksam gefunden.
"Stromagewebe", wie hier verwendet, bezeichnet das Stützgewebe oder -matrix eines Organs und wird von dessen funktionellen Elementen oder Parenchym unterschieden.
"Fördernde Akzeptanz eines Transplantats", wie hier verwendet, bezeichnet eine beliebige Zunahme an Zeit, für die ein Transplantat akzeptiert oder funktionell ist, oder welche die Immunantwort gegenüber dem Transplantat in dem Empfänger herabsetzt, z. B. durch die Induktion von Toleranz.
"Toleranz", wie hier verwendet, bezeichnet eine Inhibition der Immunantwort eines Transplantatsempfängers, welche ansonsten nicht vorkommen würde, z. B. als Antwort auf die Einführung eines nicht-körpereigenen MHC-Antigens in den Empfänger. Die Toleranz kann humorale, zelluläre oder beide Antworten beinhalten. Toleranz, wie hier verwendet, bezeichnet nicht nur eine vollständige immunologische Toleranz gegenüber einem Antigen, sondern auch eine teilweise immunologische Toleranz, d. h. einen Grad von Toleranz gegenüber einem Antigen, der größer ist als der, der vorliegen würde, wenn das erfindungsgemäße Verfahren nicht eingesetzt worden wäre. Toleranz, wie hier verwendet, bezeichnet eine antigenspezifische Inhibition des Immunsystems des Spenders im Vergleich zu dem breiten Spektrum der Inhibition des Immunsystems, wie es mit Immunsuppressantien beobachtet wird.
"Ein Blocker", wie hier verwendet, bezeichnet ein Molekül, das ein Mitglied eines Liganden/Gegen-Ligandenpaars bindet und welches die Interaktion zwischen dem Liganden und Gegen-Liganden inhibiert und welches die Fähigkeit des gebundenen Mitglieds, ein Signal zu transduzieren, stört. Der Blocker kann ein Antikörper (oder Fragment davon) gegen den Ligand oder Gegen-Ligand, ein löslicher Ligand (lösliches Fragment des Gegen-Liganden), ein löslicher Gegen-Ligand (lösliches Fragment des Gegen-Liganden) oder anderes Protein, Peptid oder anderes Molekül sein, welches spezifisch an den Gegen-Ligand oder Ligand bindet, z. B. ein Protein oder Peptid, welches aufgrund dessen Fähigkeit, den Ligand oder Gegen-Ligand in einem Affinitäts-Assay zu binden, ausgewählt wurde, beispielsweise ein Phagen-Anzeigesystem.
"Partielle T-Zell-Depletion", wie hier verwendet, bezeichnet einen Zustand, bei dem einige, aber nicht alle der T-Zellen des Subjekts deletiert sind. In einigen Dosierungsschemen ist die Verabreichung einer Einzeldosis eines T-Zell-depletierenden Agens zur Erzeugung einer oartiellen T-Zell-Depletion nützlich.
Die Verwendung des Artikels "ein" oder "eine" ist nicht limitierend bezüglich der Anzahl, es sei denn, sie wurde eindeutig durch den Zusammenhang eingeschränkt. Beispielsweise können Verwendungen, welche die Verabreichung "eines" Inhibitors einschließen, die Verabreichung eines oder von mehr als einem Inhibitor einschließen.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen minimieren oder eliminieren den Bedarf einer Thymusbestrahlung. Die Erfindung stellt zuverlässige, nicht-toxische Mittel zur Induktion von Transplantationstoleranz bereit. Sie minimiert die Probleme der chronischen Organtransplantatsabstoßung und einer Immunsuppressions-bezogenen Toxizität. BMT mit CTLA4Ig plus MR1 minimiert oder eliminiert spezifisch spenderreaktive T-Zellen bei gleichzeitiger Vermeidung der nicht-spezifischen Depletion oder Suppression von T-Zellen, welches ein Bestandteil von klinisch verfügbaren Immunsuppressionsstrategien ist und zu schweren Komplikationen führen kann. Dieses Behandlungsprotokoll ist geeignet sowohl für eine Tot- als auch Lebend-Organ-Transplantation, da sie die zuverlässige Einführung einer deletionalen Toleranz mit einer nicht-toxischen Konditionierungs-Dosierungsschema, beginnend an dem Tag der Transplantation, ermöglicht. Da das Repertoire der peripheren T-Zellen durch die Konditionierung nicht global depletiert ist und nur eine niedrige minimal myelosuppressive Dosis einer Ganzkörperbestrahlung verabreicht wird, ist die klinische Nützlichkeit dieser Verfahrensweise extrem hoch.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Patentansprüchen ersichtlich.
Detaillierte Beschreibung
Zeichnungen
Die Zeichnungen werden zuerst kurz beschrieben.
1 ist ein Plot des Prozentsatzes von Spender-WBC gegenüber der Zeit nach BMT. Hohe Spiegel eines Spender-Chimärismus multipler Linie wurde in peripherem Blut für 34 Wochen nach BMT beobachtet. Die Ergebnisse von einem oder zwei ähnlichen Experimenten sind als Gruppendurchschnitte gezeigt. Alle Tiere erhielten 3 Gy WBI und 15 × 106 allogenisches BMC am Tag 0. Nur MR1 plus CTLA4Ig zusammen (D) ermöglichte die zuverlässige Einführung eines stabilen Chimärismus (n = 5) mit hohen Spiegeln von Spenderzellen in der gesamten Nachbehandlung. Die Verabreichung von MR1 alleine (C) führte zu signifikanten Spiegeln von Chimärismus, aber der Chimärismus senkte sich über die Zeit (n = 5). Wenn CTLA4Ig alleine gegeben wurde (B), war kein Chimärismus durch FCM (n = 4) nachweisbar. Eine Kontrollgruppe (n = 5), die depletierende Dosen von anti-CD4 und anti-CD8-mAbs an den T-5 und T-1 (A) erhielt, zeigte wesentliche Spiegel von Spender-Chimärismus mit Plateauspiegeln von T-Zell-Chimärismus, die jedoch signifikant niedriger waren als der Chimärismus von B-Zellen, Granulozyten und Monozyten.
2 ist ein Plot des Transplantatüberlebens gegenüber den Tagen nach der Transplantation. Es wurde ein beständiges Überleben von spenderspezifischen Hauttransplantaten in Chimären, die mit 3 Gy WBI und allogenischem (B10.A) BMC hergestellt und mit MR1 plus CTLA4Ig behandelt wurden, beobachtet. Es sind die kombinierten Ergebnisse von zwei Experimenten gezeigt. Die Empfänger wurden mit spenderspezifischen (B10.A) und Hauttransplantaten eines Dritten (A.SW) bei 3, 6 oder 10 Wochen nach BMT transplantiert. Die Mäuse, welche die Vollbehandlung von BMT und MR1 plus CTLA4Ig erhielten, nahmen die Spenderhauttransplantate (B) permanent (12 von 14) an, mit der Ausnahme von zwei Tieren, welche ihre Transplantate an den Tagen 57 bzw. 76 abgestoßen haben. Neun Transplantate wurden bei einer idealen Bedingung für mehr als 110 Tage angenommen und 5 Transplantate für mehr als 140 Tage. Hauttransplantate eines Dritten (B) wurden in dem erwarteten Zeitrahmen (MST = 10 T) abgestoßen. MR1 alleine (A) führte zu einer Verlängerung des Überlebens des spenderspezifischen Hauttransplantats (MST = 42 T), allerdings überlebten nur 2 von 9 Transplantaten mehr als 100 Tage. CTLA4Ig alleine (A) konnte das Hauttransplantatüberleben nicht verbessern (n = 7, MST = 10 T). Kontrollmäuse, die mit 3 Gy WBI plus BMC (n = 4) behandelt wurden und Mäuse, die 3 Gy WBI und MR1 plus CTLA4Ig alleine erhielten (ohne BMT, nicht gezeigt), stoßen die Spenderhaut innerhalb von 2 Wochen ab. Eine Kontrollgruppe, die mit TCD-mAbs an T-5 und T-1 plus BMT (+3 Gy WBI) (n = 5) hergestellt wurden, nahmen die Spenderhauttransplantate permanent in 60% der Fälle an. Die Transplantate der dritten Partei wurden innerhalb von 2 Wochen in allen Gruppen abgestoßen.
3 zeigt eine Darstellung der spezifischen Deletion von spenderreaktiven peripheren T-Zellen in Empfängern von BMT und MR1 plus CTLA4Ig. Die Ergebnisse eines von zwei ähnlichen Experimenten sind gezeigt. Es wurde eine FCM-Analyse zu den angegebenen Zeitpunkten durchgeführt mit dem Prozentsatz von Vβ-positiven Zellen, die unter den selektierten CD4-positiven PBL bestimmt wurden. Der Hauptprozentsatz von CD4+-Lymphozyten, die Vβ5.1/2 oder Vβ11 exprimieren, war in den Mäusen, die BMC (+3 Gy WBI) mit MR1 plus CTLA4Ig (n = 10) erhielten, bereits eine Woche nach BMT (P < 0,01 für Vβ11, P < 0,05 für Vβ5) geringer als in Empfängern von BMC (+3 Gy WBI) alleine (n = 4). Die spenderspezifische Deletion vervollständigte sich graduell bei 3, 5 und 8 Wochen nach BMT und wurde für die Länge der Nachperiode aufrecht erhalten. Der Prozentsatz von Vβ8.1/2+-CD4-Zellen blieb in allen Gruppen beständig, was die Spezifität der Vβ5.1/2 oder Vβ11-Deletion bei den gemischten Chimären zeigt. Mäuse, die BMC (+3 Gy WBI) alleine oder zusätzlich zu CTLA4Ig (n = 4) erhielten, zeigten keinerlei Deletion, genauso wie Kontrollmäuse, die mit MR1 plus CTLA4Ig alleine (ohne BMC, nicht gezeigt) behandelt wurden. MR1 alleine führt lediglich zu einer leichten und vorübergehenden Deletion bei diesem Experiment (n = 5). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. P-Werte sind als Vergleich mit der Kontrollgruppe, die 3 Gy WBI plus BMC erhielten, gezeigt. NL B6 bezeichnet eine naive C57BL/6-Kontrolle, NL B10.A bezeichnet eine naive B10.A-Kontrolle.
4 zeigt eine Darstellung einer extrathymischen klonalen Deletion nach BMT und co-stimulatorische Blockade mit CTLA4Ig und MR1. A: ATX-Empfänger (n = 6) zeigten eine spezifische partielle Deletion von Vβ5.1/2 und Vβ11-positive CD4-Zellen in PBL eine Woche nach BMT plus CTLA4Ig und MR1. Ein ähnlicher Grad von Deletion wurde in euthymischen Kontrollen (n = 5) beobachtet, die unter derselben Konditionierung hergestellt wurden. CD4-Zellen in ATX-Kontrollen, die CTLA4Ig plus MR1 und WBI ohne BMT (n = 4) erhielten, zeigten keine Deletion von diesen Vβ. Der Prozentsatz von Vβ-positiven Zellen wurde durch FCM-Analyse von selektierten CD4-positiven PBL. P-Werte sind zum Vergleich zwischen ATX BMT-Empfänger, die CTLA4Ig plus MR1 erhielten, und ATX nicht-BMT-Kontrollen gezeigt. B: In zwei euthymischen Chimären, die 20 Wochen nach BMT getötet wurden (bei Gegenwart von 3 Gy WBI plus Behandlung mit CTLA4Ig plus MR1), wurden Vβ5.1/2+- und Vβ11+CD4+-Splenozyten (SPL) in demselben Ausmaß deletiert, wie in naiven B10.A-Kontrollen (obere Abbildung). Im Gegensatz dazu war der Prozentsatz von Vβ5.1/2+- und Vβ11+CD8+-Splenozyten im Vergleich zu naiven B6-Mäusen reduziert, aber war im Wesentlichen höher als in naiven B10.A-Mäusen (mittlere Abbildung). Reifer Vβ5.1/2+- und Vβ11+-Thymozyten (THY) zeigten eine mit B10.A vergleichbare Deletion zur selben Zeit (untere Abbildung). Eine Kontrollmaus, die WBI und CTLA4Ig plus MR1 (aber kein BMT) erhielt, zeigte keine Deletion, weder in Splenozyten noch in Thymozyten. Der Prozentsatz von Vβ-positiven Zellen wurde durch FCM-Analyse in selektierten CD4-positiven (oder CD8-positiven) 34-2-12-negative Splenozyten bestimmt und in selektierten KH-95high(d. h. Dd high)-Thymozyten (vgl. Materialien und Methoden). NL B6 bezeichnet eine naive C57BL/6-Kontrolle, NL B10.A bezeichnet eine naive B10.A-Kontrolle.
Herkunft der Zellen für eine allogenische Stammzelltransplantation
Die Herkunft von hämatopoetischen Stammzellen, die nicht direkt aus einem menschlichen Embryo gewonnen wurden, schließen Knochenmarkszellen, mobilisierte periphere Blutzellen und, wenn erhältlich, Blutzellen des Rückenmarks ein. Mobilisierte periphere Stammzellen sind für die erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt. Es können in der Erfindung in vitro-expandierte hämatopoetische Zellen verwendet werden.
Die Induktion von Toleranz mit einer Knochenmarkstransplantation
Das folgende Verfahren wurde entworfen, um die Überlebenszeit eines implantierten Organs in einem allogenischen Wirt vor dessen Abstoßung zu verlängern. Das Organ kann ein beliebiges Organ sein, z. B. eine Leber, eine Niere, ein Pankreas oder ein Herz. Die Hauptstrategien der Verwendung schließen ein: die Verabreichung von Inhibitoren des CD40-Ligand-CD40 (und gegebenenfalls einen Inhibitor der CD28-B7-Interaktion) und Transplantation von Toleranzinduzierenden Stammzellen, z. B. Knochenmarksstammzellen. Das Verfahren umfasst irgendeinen oder alle diese Schritte. Vorzugsweise können sie in der folgenden Reihenfolge durchgeführt werden.
Eine Präparation eines monoklonalen anti-CD40-Ligand-Antikörpers und gegebenenfalls eines CTLA4-IgG-Fusionsproteins werden an das Subjekt verabreicht.
Es kann auch notwendig oder wünschenswert sein, beim Empfänger eine Splenektomie durchzuführen.
Knochenmarkszellen (BMC) oder eine andere Quelle von hämatopoetischen Stammzellen des Spenders, die nicht direkt aus einem menschlichen Embryo gewonnen wurden, z. B. periphere hämatopoetische Stammzellen des Spenders, werden in den Empfänger injiziert. Hämatopoetische Stammellen des Spenders kommen an geeigneten Stellen des Empfängers vor und wachsen mit den verbleibenden Wirtszellen gleichmäßig und proliferieren, wobei es zur Bildung einer chimärischen lymphohämatopoetischen Population kommt. Durch diesen Prozess werden neu gebildete und prä-existierende B-Zellen (und die von ihnen hergestellten Antikörper) an Spender-Antigene präsentiert, so dass das Transplantat als eigen erkannt wird. Eine Toleranz gegenüber dem Spender wird auch auf der Ebene von T-Zellen in Tieren beobachtet, bei denen eine hämatopoetische Stammzelle, z. B. eine BMC-Einpflanzung durchgeführt worden ist. Wenn ein Organtransplantat in einem solchen Empfänger mehrere Monate, nachdem der gemischte Knochenmarks-Chimärismus induziert worden ist, eingesetzt wird, sollte das Transplantat sowohl durch die humorale als auch durch die zelluläre Zweige des Immunsystems akzeptiert werden. Diese Vorgehensweise hat den zusätzlichen Vorteil, dass eine Organtransplantation ausreichend lang nach der Transplantation von hämatopoetischen Zellen, z. B. BMT, z. B. einer fötalen Lebersuspension, durchgeführt werden kann, so dass die normale Gesundheit und Immunkompetenz zum Zeitpunkt der Organtransplantation wieder hergestellt sein wird.
Das Subjekt kann einer Ganzkörperbestrahlung ausgesetzt sein, um einen hämatopoetischen Raum zu entwerfen, z. B. 300 cGy-Ganzkörper-Röntgenstrahlen.
Schließlich können T-Zellen, insbesondere T-Zellen des Thymus oder Lymphknotens, weiter durch die Kurzzeitverabreichung eines immunsuppressiven Mittels, z. B. Cyclosporin, an den Empfänger supprimiert werden.
Während beliebige dieser Verfahren dazu beitragen können, das Überleben eines implantierten Organs zu unterstützen, werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn alle Schritte in Kombination verwendet werden.
Die oben beschriebenen Vorgehensweisen sind so konzipiert, um das Problem einer Transplantatsabstoßung in synergistischer Weise zu verhindern.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen können in Kombination, wie beschrieben, oder einzeln angewendet werden.
Die Einführung von Knochenmarkszellen kann verändert werden, besonders durch (1) Verlängern des Zeitintervalls zwischen der Injektion von hämatopoetischen Stammzellen und der Implantation des Transplantats; (2) Erhöhen der Menge von injizierten hämatopoetischen Stammzellen; (3) Variieren der Zahl von Injektionen von hämatopoetischen Stammzellen; (4) Variieren des Verfahrens der Abgabe von hämatopoetischen Stammzellen; (5) Variieren der Gewebeherkunft von hämatopoetischen Stammzellen, beispielsweise kann eine fötale Leberzellsuspension verwendet werden; oder (6) Variieren der Spenderquelle von hämatopoetischen Stammzellen.
Die Mittel zur Vorbereitung des Empfängers für die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen können variieren. Zum Beispiel kann an einem Empfänger eine Splenektomie durchgeführt werden. Das Letztere würde bevorzugt vor dem nicht-myeloablativen Dosierungsschema verabreicht werden, z. B. am Tag –14.
Stromagewebe, das vor der hämatopoetischen Zelltransplantation eingeführt wird, z. B. BMT, kann variiert werden durch: (1) Verabreichung von der fötalen Leber und Thymusgewebe als eine flüssige Zellsuspension; (2) Verabreichung von fötaler Leber oder stromales Thymusgewebe, aber nicht beides; (3) Einsetzen eines stromalen Implantats in andere eingekapselte, gut vaskularisierte Stellen oder (4) Verwendung eines erwachsenen Thymus als Herkunft des Stromagewebes.
Beispiel 1
In diesem Tierversuch induzierte die Behandlung von Mäusen mit einzelnen Injektionen eines anti-CD40-Ligand-Antikörpers und CTLA4Ig, eine niedrige Dosis (3 Gy) Ganzkörperbestrahlung, plus eine vollständige MHC-fehlgepaarte allogenische Knochenmarkstransplantation zuverlässig hohe Spiegel (> 40%) einer stabilen (> 8 Monate) Spender-Hämatopoese multipler Linie. Chimärische Mäuse akzeptierten durchweg die Spenderhauttransplantate (> 100 Tage) und stoßen schnell die Transplantate eines Dritten ab. Eine progressive Deletion von spenderreaktiven Wirts-T-Zellen kam unter peripheren CD4+-Lymphozyten vor, was bereits eine Woche nach der Knochenmarkstransplantation begann. Eine frühe Deletion von peripheren spenderreaktiven Wirts-CD4-Zellen fand auch in thymektomierten, ähnlich behandelten Marks-Empfängern statt, was eine Rolle von peripherer klonaler Deletion von reaktiven Spender-T-Zellen nach allogenischer Knochenmarkstransplantation in der Gegenwart einer co-stimulatorischen Blockade zeigt. Es folgte eine zentrale intrathymische Deletion von sich neu entwickelnden T-Zellen, nachdem eine Spender-Stammzelleinpflanzung stattgefunden hat.
Eine Transplantation eines festen Organs (Haut) war in der Induktionsphase der Toleranz im Modell nicht notwendig. Stattdessen stellte die permanente Einpflanzung von hämatopoetischen Spenderzellen die Toleranz von zuvor existierenden T-Zellen des Wirts und von T-Zellen, welche sich im Anschluss an das Verschwinden der co-stimulatorischen blockierenden Agenzien von der Zirkulation entwickelten, sicher. Diese letztgenannte Toleranz findet über intrathymische Deletionsmechanismen statt (4), vermutlich als eine Konsequenz der Gegenwart von spenderabgeleiteten APC in dem Thymus, was in gemischten Langzeit-Chimären gezeigt worden ist, welche mit anderen Dosierungsschemen hergestellt wurden, welche eine initiale Depletion des T-Zell-Repertoirs mit mAbs einschließen. Die hier beschriebene Arbeit zeigt, dass eine co-stimulatorische Blockade zu einer peripheren Deletion von spenderreaktiven T-Zellen führt, was dann die Einpflanzung von vollständig MHC-fehlgepaarten allogenischen plurpo tenten Stammzellen ermöglicht, welche eine zentrale Toleranz unter den T-Zellen induziert, welche sich nachfolgend in dem Thymus entwickeln.
Dies wird im Nachfolgenden detaillierter beschrieben.
Tiere
Weibliche C57BL/6(B6: H-2b)-, B10.A(B10.A: H-2a)- und A.SW(H-2s)-Mäuse wurden vom Frederick Cancer Research Center (Frederick, MD) oder von "The Jackson Laboratory" (Bar Harbor, ME) bezogen. Die Mäuse wurden in einer spezifischen pathogenfreien Mikroisolator-Umgebung gehalten, wie beschrieben in Sykes M., M. L. Romick, K. A. Hoyles und D. H. Sachs, 1990, J. Exp. Med. 171: 645–658.
Konditionierung und Knochenmarkstransplantation
Gleichaltrige (6–8 Wochen alt) weibliche B6-Mäuse erhielten 3 Gy einer Ganzkörperbestrahlung und wurden am selben Tag intravenös (T0) mit nicht geteiltem BM injiziert, welches von MHC-fehlgepaarten weiblichen B10.A-Spendern (10–12 Wochen alt) gewonnen worden sind. Eine Kontrollgruppe wurde i. p. injiziert mit depletierenden Dosierungen von Ratten-IgG2b-anti-Maus-CD4-mAb GK1.5 und anti-Maus-CD8-mAb 2.43 an den Tagen –5 und –1, wie beschrieben in Sharabi Y. und D. H. Sachs, 1989, J. Exp. Med. 169: 493–502. Murine CTLA4Ig wurde i. p. injiziert als eine Einzeldosis (0,5 mg) an Tag +2 und Hamster-anti-Maus-CD40L-mAb (MR1) wurde i. p. injiziert an dem Tag 0 (0,45 mg). CTLA4Ig war eine großzügige Spende von Bristol-Myers, Squibb Pharmaceuticals, Seattle, WA; das MR1-Hybridom wurde dankenswerterweise bereitgestellt von Dr. Randolph J. Noelle. Thymektomien wurden 4 Wochen vor BMT durchgeführt. Die Vollständigkeit der Thymektomie wurde zum Zeitpunkt der Tötung zwei Wochen nach BMT bestätigt durch Augensichtung und zweifarbiger FACS-Färbung (CD4-FITC gegen CD8-PE) von mediastinalem Gewebe. Mäuse, die irgendein Anzeichen von verbleibendem Thymusgewebe aufwiesen, wurden von der Analyse ausgeschlossen.
Durchflusszytometrieanalyse des Multilinien-Chimärismus
Es wurde eine Durchflusszytometrieanalyse (FCM) des Multilinien-Chimärismus durchgeführt, wie kürzlich beschrieben in Tomita Y., D. H. Sachs, A. Khan und M. Sykes, 1996, Transplantation 61: 469–477. Kurz dargestellt wurden die Eigenschaften des Vorwärtswinkels und 90 Grad-Lichtstreuungseigenschaften verwendet, um Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten in peripheren weißen Blutzellen zu unterscheiden. Eine Zweifarben-FCM wurde eingesetzt, um Spender- und Wirtszellen von bestimmten Linien zu unterscheiden, und der Prozentsatz von Spenderzellen wurde berechnet wie beschrieben in Tomita Y., D. H. Sachs, A. Khan und M. Sykes, 1996, Transplantation 61: 469–477, durch Substrahieren der Kontrollfärbung von Quadranten, die Spender- und Wirtszellen enthalten, welche einen bestimmten Linienmarker exprimieren und durch Teilen des Nettoprozentsatzes von Spenderzellen durch den gesamten Nettoprozentsatz von Spender- plus Wirtszellen von dieser Linie. Tote Zellen wurden ausgeschlossen unter Verwendung von Propidiumiodidfärbung. Eine nicht-spezifische FcgR-Bindung wurde durch anti-Maus-FcgR-mAb 2.4G2 blockiert, Unkeless J. C., 1979, J. Exp. Med. 150: 580–596. Fluoresceinisocyanat(FITC)-konjugierte-mAbs schließen anti-CD4, anti-CD8, anti-B220 ein (alle bezogen von PharMingen, San Diego, CA) und anti-MAC1 (Caltag, San Francisco, CA). Die Negativkontrolle-mAb HOPC1-FITC, die keine Reaktivität gegenüber Mauszellen zeigte, wurde in unserem Laboratorium hergestellt. Die biotinylierten anti-H-2Dd-mAb 34-2-12 und Kontroll-mAb HOPC1 wurden mit Phycoerythrin-Streptavidin (PEA) entwickelt.
Durchflusszytometrieanalyse der T-Zell-Rezeptor-Vβ-Familien
Periphere Blutlymphozyten wurden mit anti-Vβ5.1/2-FITC, Vβ11-FITC und Vβ8.1/2-FITC-mAb gegenüber Phydroerythrin-konjugierten anti-CD4-mAb (alle PharMingen) gefärbt. Nicht-spezifische Phycoerythrin-konjugierte Ratten-IgG2a (PharMingen) dienten als Negativkontrolle. Eine Zweifarben-FCM-Analyse wurde durchgeführt auf selektierten CD4+-Zellen. Splenozyten (SPL) wurden mit anti-Vβ5.1/2-FITC, Vβ11-FITC und Vβ8.1/2-FITC-mAb gegenüber Phycoerythrinkonjugierten anti-CD4-mAb (oder anti-CD8-mAb, PharMingen) und gegenüber anti-34-2-12-BIO, das mit CyChrom-Streptavidin (CCA, PharMingen) entwickelt wurde, gefärbt. Eine Dreifarben-FCM-Analyse wurde durchgeführt auf 34-2-12-negativen, CD4-positiven (oder CD8-positiven) Zellen. Thymozyten wurden mit anti-TCRβ-FITC (PharMingen), anti-Vβ5.1/2-FITC, Vβ11-FITC und Vβ8.1/2-FITC gegenüber anti-KH95-BIO (anti-Db, PharMingen), das mit PEA entwickelt wurde, gefärbt. Eine Zweifarben-FCM-Analyse wurde auf selektierten Klasse I (KH95)-High-Zellen durchgeführt und der Prozentsatz von Vβ-positiven Zellen in diesem Gate wurde korrigiert gegenüber dem Prozentsatz von TCR-Hochzellen in demselben Gate, wie beschrieben in Tomita Y., A. Khan und M. Sykes, 1994, J. Immunol. 153: 1087–1098. Eine Hintergrundfärbung (wie bestimmt durch nicht-reaktive-mAb HOPC-FITC) wurde von dem Prozentsatz der Zellen, die mit jedem anti-Vβ-mAb gefärbt sind, substrahiert. Die P-Werte wurden unter Verwendung eines zweiteiligen Student-T-Tests berechnet.
Hauttransplantation
Schwanzhaut mit voller Stärke aus B10.A(spenderspezifischen)- und vollständig MHC-fehlgepaarten A.SW(dritte Partei)-Mäusen wurde auf der lateralen Brustkorbwand transplantiert, mit 5–0 Operationsseidennähten und Bandagen gefestigt, gefolgt von täglichen Augenschein- und taktilen Inspektionen für 3 Wochen und dann mindestens jede Woche danach. Die Transplantate wurden als abgestoßen angesehen, wenn weniger als 10% des Transplantats lebensfähig blieben.
Stabiler hämatopoetischer Chimärismus multipler Linien nach Behandlung mit CTLA4Ig plus anti-CD40L-mAb (MR1)
Zum Bestimmen, ob das Blockieren der CD28- und CD40-co-stimulatorischen Wege das Überleben von vollständig MHC-fehlgepaartem Knochenmark ermöglichen könnten und die Induktion von gemischtem Chimärismus und Toleranz ermöglichen könnten, wurden B6-Mäuse mit 3 Gy WBI behandelt und erhielten 15 × 106 nicht-aufgetrennte Knochenmarkszellen (BMC) aus vollständig MHC-fehlgepaarten B10.A-Spendern. Eine Einzeldosis eines anti-CD40L-mAb (MR1) und CTLA4Ig wurde entweder alleine oder in Kombination an den Tagen 0 bzw. +2 verabreicht. Die Spender-Hämatopoese wurde an mehreren Zeitpunkten nach BMT durch Durchflusszytometrie-Analyse von peripheren WBC bestimmt. Durch Färbung mit-mAb der spezifisch für Spender Klasse I gegenüber verschiedenen Linienmarkern ist, wurde der Nettoprozentsatz von Spenderzellen unter diesen Linien bestimmt.
Die kombinierte Verabreichung von CTLA4Ig plus MR1 führte zu hohen Spiegeln von Chimärismus in allen hämatopoetischen Linien, einschließlich T-Zellen, B-Zellen und myeloide Zellen (1D). Die Spenderrekonstitution erreichte durchschnittlich mehr als 40% bei allen Linien bis 7 Wochen und blieb während der Beobachtungsperiode von 34 Wochen hoch. Besonders überraschend war der hohe Spiegel der Spenderrepräsentation unter CD4- und CD8-Zellen bis 7 Wochen nach BMT, selbst wenn die Wirte keine T-Zell-Depletion bei ihrer Konditionierung erhielten. Die Spender-T-Zellen-Spiegel in der Gruppe, die mit MR1 plus CTLA4Ig behandelt wurden, war während der gesamten langfristigen Nachbehandlung (34 Wochen) stabil und waren im Durchschnitt höher als bei denen in einer Kontrollgruppe, die mit anti-CD4- und anti-CD8-depletierenden-mAbs konditioniert worden sind (1A). 15 der 16 Mäuse, die mit der Kombination von MR1 und CTLA4Ig behandelt wurden, entwickelten hohe Spiegel von Chimärismus (eine Maus zeigte keinen nachweisbaren Chimärismus und wurde von der weiteren Analyse als ein Ausbrecher ausgeschlossen). Eine Behandlung mit MR1 alleine führte zu hohen Spiegeln von Spenderzellen unter den myeloiden Linien und B-Zellen bei frühen Zeitpunkten nach BMT und zu niedrigeren Spiegeln von Chimärismus unter CD4- und CD8-Zellen. Die Induktion des Chimärismus war weniger konstant als in der Gruppe, die beide co-stimulatorische Blockierungsreagenzien erhielten, jedoch war der Spender-Chimärismus in dieser Gruppe nicht stabil (1C). Mäuse, die CTLA4Ig alleine erhielten, zeigten keinen Chimärismus im peripheren Blut, was durch FCM nachgewiesen wurde, zu jeder Zeit nach BMT (1B). In gleicher Weise konnten Kontrolltiere, die WBI und BMC alleine erhielten, keinen hämatopoetischen Chimärismus aufweisen.
Spenderspezifische Hauttransplantatstoleranz in Chimären, die mit CTLA4Ig plus MR1 hergestellt wurden
Die Transplantation von Primärhaut wird als der am meisten stringente Test von Transplantationstoleranz angesehen. Daher wurde Schwanzhaut voller Dicke von einem Spender (B10.A) und eines Dritten (A.SW) in Empfänger zu verschiedenen Zeitpunkten nach BMT eintransplantiert. Mäuse, die sowohl CTLA4Ig als auch MR1 erhielten, plus 3 Gy WBI und BMT, akzeptierten durchgehend Spenderhauttransplantate, die 3, 6 oder 10 Wochen nach BMT eingepflanzt wurden, mit der Ausnahme von zwei Tieren, welche ihre Transplantate 57 bzw. 76 Tage nach der Transplantatseinpflanzung abgestoßen haben (2B). Die Transplantate eines Dritten wurden leicht abgestoßen (die mittlere Überlebenszeit (MST) = 10 Tage), was die Spenderspezifität der induzierten Toleranz zeigt. Dieses Überleben des Hauttransplantats ist vergleichsweise von Vorteil selbst gegenüber Kontrolltieren, welche mit T-Zell-depletierenden Antikörpern konditioniert wurden, bei denen lediglich 60% der Spenderhauttransplantate länger als 100 Tage überlebten (2A). Mäuse, die mit MR1 alleine neben 3 Gy WBI und BMT behandelt wurden, zeigten eine Verlängerung des Spenderhauttransplantat-Überlebens (MST = 42 Tage) (2A). Jedoch wurden nur 2 von 9 Transplantaten für 100 Tage angenommen. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die BMT, gefolgt von 3 Gy WBI und CTLA4Ig erhielten, in diesem speziellen Protokoll kein verlängertes Überleben von Spenderhauttransplantaten (MST = 10 Tage) in Übereinstimmung mit dem Fehlen von Chimärismus.
Diese Ergebnisse zeigen das Vorhandensein einer spenderspezifischen Toleranz über eine vollständige MHC-Barriere in Chimären, die mit MR1 plus CTLA4Ig hergestellt worden sind. Die Fähigkeit von gemischten Chimären, die mit MR1 und CTLA4Ig hergestellt wurden, um Hauttransplantate eines Dritten schnell abzustoßen, ist ein Beweis für deren Immunkompetenz.
Deletion von spenderreaktiven T-Zellen in Chimären, die mit CTLA4Ig plus MR1 hergestellt wurden
Zur Untersuchung, ob eine Deletion von spenderreaktiven T-Zellen stattfindet, wenn der Chimärismus mit MR1 und CTLA4Ig induziert ist, wurden periphere Blutlymphozyten auf das Vorkommen von bestimmten Vβ-Untereinheiten auf deren T-Zell-Rezeptoren analysiert. Der Spenderstamm B10.A exprimiert I-E, welches erforderlich ist, um Superantigene, die sich vom Brustdrüsentumorvirus (Mtv)-8 und -9 ableiten, endogene Retroviren, die in dem B6/B10-Hintergrundgenom kodiert sind, zu präsentieren. Sich entwickelnde Thymozyten, deren T-Zell-Rezeptoren Vβ11 oder Vβ5.1/2 enthalten, welche an diese Superantigene binden, werden in I-E-positiven B10.A-Mäusen deletiert (Acha-Orbea H. und E. Palmen, 1991, Immunol. Today 12: 356–361; Tomonari K. und S. Fairchild, Immunogenetics 33: 157–162; Dyson P. J., A. M. Knight, S. Fairchild, E. Simpson und K. Tomonari, 1991, Nature 349: 531–532), nicht aber in B6-Mäusen, da sie kein I-E exprimieren (Tomonari K. und Fairchild, 1991, Immunogenetics 33: 157–162; Dyson P. J., A. M. Knight, S. Fairchild, E. Simpson und K. Tomonari, 1991, Nature 349: 531–532; Bill J., O. Kanagavaa, D. Woodland und E. Palmer, 1989, J. Exp. Med. 169: 1405–1419).
Eine teilweise Deletion von Vβ5+- und Vβ11+-peripheren CD4-T-Zellen wurde bereits 1 Woche nach BMT in Mäusen festgestellt, welche 3 Gy WBI, gefolgt von MR1 plus CTLA4Ig erhielten (3). Die Deletion wurde in progressiver Weise vollständiger im Verlauf der darauf folgenden Wochen und erreichte ähnliche Spiegel wie jene in Chimären, welche mit einer T-Zell-Depletion hergestellt wurden (nicht gezeigt). Eine Deletion von diesen Vβ5+- und Vβ11+-Zellen wurde in der gesamten Nachfolgeperiode aufrecht erhalten (> 6 Monate bei dem ersten Experiment, für das die Daten des Chimärismus in 1 gezeigt sind). Die Prozentsätze von Vβ8-tragenden CD4-Zellen, die keine Superantigene auf dem Spender oder Wirt erkennen, waren zu keinem Zeitpunkt reduziert, was einen unspezifischen Deletionsprozess ausschließt. Mäuse, die mit BMT (plus 3 Gy WBI) und MR1 alleine behandelt worden sind, zeigten eine frühe partielle Deletion von Vβ5 und Vβ11, welche in dem gezeigten Experiment lediglich transient war (3). Jedoch wurde in dem in 1 gezeigten Experiment eine Deletion noch zu späteren Zeitpunkten für die Gruppe, die BMT (plus 3 Gy WBI) und MR1 alleine erhielten, beobachtet, was mit den höheren Anfangsspiegeln des Chimärismus, welche für diese Gruppe in diesem Experiment beobachtet wurden, korrelierte. Kontrolltiere, die 3 Gy WBI plus BMT alleine oder BMT (plus 3 Gy WBI) mit CTLA4Ig erhielten, zeigten keinerlei Vβ5- oder Vβ11-Deletion. Wie erwartet fand keine Deletion von Vβ5 und Vβ11 in den Kontrolltieren statt, welche WBI und MR1 plus CTLA4Ig ohne BMT erhielten (nicht gezeigt). Eine Herunterregulation der Spiegel der TCR-Expression anstelle der Deletion erscheint eine unwahrscheinliche Erklärung für die Abnahme der Vβ5+- und Vβ11+-CD4-T-Zellen in Chimären zu sein, da die Intensität der Vβ5- und Vβ11-Färbung auf den Zellen, die in dem Blut nach 1 oder 3 Wochen nach BMT zurückblieben, ähnlich der Färbung in den nicht-transplantierten Kontrollen war (Daten nicht gezeigt). Somit konnte kein Beweis für eine TCR-Heruntermodulation festgestellt werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass in BMT-Empfängern, die mit MR1 plus CTLA4Ig und 3 Gy WBI behandelt wurden, spenderreaktive Wirts-T-Zellen anfangen, aus der Peripherie schon bald nach BMT zu verschwinden. Weder CTLA4Ig noch MR1 ist dafür bekannt, direkt zytotoxisch für die T-Zellen zu sein, an welche sie binden. 3 Gy WBI verursacht lediglich eine transiente und milde Leukopenie und nur eine partielle T-Zell-Depletion. Dieser Zeitverlauf legt nahe, dass die Deletion, die nach einer Woche beobachtet wird, nicht vollständig auf intrathymische Mechanismen zurückzuführen ist, da eine ausreichende Anzahl von Thymozyten wahrscheinlich nicht aus dem Thymus während dieser Periode emigrieren würde, um das bereits bestehende periphere Repertoire so "zu verdünnen", dass es den beobachteten Abfall bei den Vβ5+- und Vβ11+-CD4-Lymphozyten in PBL erklären könnte.
Die extrathymische klonale Deletion findet in der frühen Periode nach BMT und co-stimulatorischer Blockade statt
Um direkt zu bestimmen, ob eine periphere Deletion für den frühen Abfall bei den spenderreaktiven CD4-T-Zellen in Chimären verantwortlich ist, erhielten thymektomierte (ATC) B6-Mäuse B10.A BMC nach einer Konditionierung mit 3 Gy WBI und MR1 plus CTLA4Ig. Wie in 4A gezeigt, wiesen ATX-Mäuse eine partielle Deletion von Vβ5+- und Vβ11+-peripheren CD4-Zellen des Bluts eine Woche nach BMT auf und der Grad der Deletion war vergleichbar mit jenem in euthymischen Empfängern. Vβ8+-CD4-Zellen waren nicht vermindert, was auf die Spezifität der Deletion für Superantigene, die durch den Spender präsentiert werden, hinweist. Ähnlich behandelte ATX-Mäuse, die kein BMT erhielten, zeigten keine Reduktion bei dem Prozentsatz von Vβ5+- oder Vβ11-CD4-Zellen im Vergleich zu nicht behandelten B6-Mäusen (4A), was zeigt, dass diese periphere Deletion spezifisch als Antwort auf das Spendermark in BMT-Empfängern vorkommt.
Ein weiterer Beweis, dass eine periphere Deletion eine Rolle in der frühen Periode nach BMT in diesem Modell spielt, wurde von Chimären erhalten, die 20 Wochen nach BMT und CTLA4Ig plus MR1 getötet worden sind. Unter den Splenozyten von diesen Mäusen war der Prozentsatz von Vβ5+- und Vβ11+-Zellen unter den CD4+-T-Zellen zu ähnlichen Spiegeln reduziert wie in normalen Kontroll-B10.A-Mäusen. Jedoch waren die Prozentsätze von Vβ5+- und Vβ11+-Zellen unter CD8+-Splenozyten wesentlich höher als unter CD4+-Splenozyten. Dennoch waren die Prozentsätze von CD8-Splenozyten, welche diese Vβ verwenden, signifikant geringer als jene unter den normalen Kontroll-B6-Mäusen (4B). Wie weiter unten diskutiert, spiegelt dieser Unterschied höchstwahrscheinlich die Verdünnung des peripheren CD8-Pools durch neue Emigranten des Thymus wider, welche durch einen zentralen Deletionsmechanismus in den Chimären toleriert werden.
Es wurde gezeigt, dass eine periphere Deletion eine Konsequenz der starken T-Zell-Antworten in vivo ist, jedoch wurde sie nur nach einer bemerkenswerten Expansion von Antigen-erkennenden Zellen angetroffen. Obwohl eine Woche nach der Transplantation der früheste Zeitpunkt war, an dem spenderreaktive Wirts-T-Zellen untersucht wurden, konnte kein Anzeichen für eine solche an fängliche Expansion beobachtet werden. Kürzlich haben in vitro-Hinweise gezeigt, dass co-stimulatorische Signale eine wesentliche Rolle bei der Vermeidung von apoptotischem Zelltod nach einer TCR-Einbindung spielt. Jedoch wurde eine Apoptose, die in vivo durch ein Antigen induziert wird, das in der Gegenwart einer co-stimulatorischen Blockade auftritt, nicht beschrieben.
Hinweis für eine zentrale Deletion von spenderreaktiven T-Zellen in Langzeit-Chimären
Reife Empfänger-T-Zellen (einschließlich von CD4- und CD8-Zellen) in dem Thymus zeigten eine bemerkenswerte Deletion von Vβ5 und Vβ11, wenn die Tiere 20 Wochen nach BMT (4B) getötet wurden, was zeigt, dass sich neu entwickelnde spenderreaktive Thymozyten effektiv während der Reifung in dem Thymus in Langzeit-Chimären deletiert werden.
Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass eine extrathymische klonale Deletioni früh nach der BMT unter dem Mantel einer co-stimulatorischen Blockade stattfindet. Es wird somit eine allogenische pluripotente Stammzell-Einpflanzung ermöglicht und eine nachfolgende Toleranzbarmachung von sich neu entwickelnden spenderreaktiven Thymozyten findet durch deletionale Mechanismen in dem Thymus statt ähnlich zu denen, welche in Tieren stattfindet, die anfangs mit T-Zell-depletierenden-mAbs behandelt worden sind. Das erklärt auch die Abweichung bei der Höhe der Deletion von CD4-Zellen im Vergleich, zu CD8-Zellen in peripheren Geweben von Langzeit-Chimären. Vβ5+- und Vβ11+-CD4-Zellen werden einer Deletion sowohl intrathymisch als auch in der Peripherie ausgesetzt, wenn sie ein Superantigen plus Spender MHC-Klasse II erkennen. CD8-Zellen, welche diese Vβ exprimieren, werden effizient intrathymisch beim CD8+CD4+-Stadium der Reife deletiert. Jedoch werden CD8+CD4–-Zellen nicht sehr effektiv extrathymisch deletiert, selbst wenn eine schwache proliferative Aktivität gegenüber Superantigenen, die durch Klasse II-MHC präsentiert werden, in der Peripherie beschrieben worden ist. Daraus folgt, dass der wesentliche Unterschied beim Deletionsgrad zwischen peripheren CD4- und CD8-Zellen sehr wahrscheinlich auf die stärkere Verbreitung der extrathymischen Deletion unter den CD4- im Vergleich zu den CD8-Zellen, die zum Zeitpunkt des BMT vorher vorhanden sind, zurückzuführen. Diese Schlussfolgerung wird weiter durch die Beobachtung gestützt, dass ATX-Empfänger von BMT plus einer co-stimulatorischen Blockade eine signifikante Reduktion von Vβ5- und Vβ11- positiven CD4-Splenozyten aufwiesen, nicht aber von CD8-Splenozyten zwei Wochen nach BMT.
Beispiel 2
Eine Thymusbestrahlung (TI) oder eine wiederholte Verabreichung von T-Zell-depletierenden-mAbs (TCD-mAbs) ermöglicht eine allogenische Markseinpflanzung mit einem stabilen gemischten Chimärismus und Toleranz. Da beide Behandlungen mit einer Toxizität bei den klinischen Einstellungen verbunden sein könnten, haben wir beurteilt, ob eine T-Zell-co-stimulatorische Blockade verwendet werden könnte, um diese zu ersetzen.
C57BL/6-Mäuse erhielten depletierende anti-CD4 und anti-CD8-mAbs an den Tagen –5, 3 Gy einer Ganzkörperbestrahlung (WBI, Tag 0) und 15 × 10⁶ vollständig MHC-fehlgepaarte B10.A-Knochenmarkszellen (BMC). Zusätzlich wurden die Wirte mit einem anti-CD154-mAb (Tag 0) und/oder CTLA4Ig (Tag +2) injiziert. Der Chimärismus im peripheren Blut wurde gefolgt durch eine FACS-Analyse und die Toleranz wurde durch Hauttransplantation bestimmt und auch durch MLR- und CML-Assays. Die Häufigkeit von bestimmten Vβ-Familien wurde durch FACS bestimmt, um die Deletion von spenderreaktiven T-Zellen zu beurteilen.
Der Chimärismus war transient und eine Toleranz war nicht in Tieren vorhanden, welche TCD-mAbs am Tag –5 ohne eine co-stimulatorische Blockade erhielten. Der Zusatz von anti-CD154-mAb (CD154 wird auch als CD40-Ligand und gp39 bezeichnet) und CTLA4Ig, alleine oder in Kombination, verhinderte konstant die Induktion von hohen Spiegeln eines stabilen (> 6 Monate) Multilinien-Chimärismus, mit einer spezifischen Toleranz gegenüber Hauttransplantaten und Spender-Antigenen durch MLR- und CML-Assays. Langzeit-Chimäre zeigten eine Deletion von spenderreaktiven CD4+pBL, Splenozyten und reifen Thymozyten. Eine Verabreichung von TCD-mAbs nur ein Tag vor der Knochenmarkstransplantation (BMT) plus anti-CD154-mAb ermöglichte auch eine Induktion eines permanenten Chimärismus und Toleranz.
Somit kann eine Injektion von anti-CD154-mAb oder CTLA4Ig den Bedarf an TI oder einem verlängerten Wirts-TCD für die Induktion eines gemischten Chimärismus und einer deletionalen Toleranz decken und damit weiter die Toxizität dieses Protokolls erniedrigen. Das Erreichen einer Toleranz bei einer Konditionierung, welche über 24 Stunden angewandt wird, macht diesen Ansatz sogar noch nützlicher für eine Transplantation von Leichenorganen.
Dieses Beispiel wird noch genauer unten diskutiert.
Tiere
Die Herkunft und die Behandlung von Tieren waren im Wesentlichen dieselben wie in Beispiel 1.
Konditionierung und Knochenmarkstransplantation (BMT)
Weibliche B6-Mäuse desselben Alters (6–13 Wochen alt) erhielten 3 Gy WBI und wurden intravenös am selben Tag (T0) mit nicht-geteiltem Knochenmark (BM) injiziert, welches aus den Oberschenkeln und dem Schienbein von vollständig MHC-fehlgepaarten weiblichen B10.A-Spendern (10–13 Wochen alt) entnommen wurde. Die Empfänger wurden intraperitoneal (i. p.) mit depletierenden Dosen von Ratten-IgG2b-anti-Maus-CD4-mAb GK1.5 (etwa 1,8 mg pro Maus) und anti-Maus-CD8-mAb 2.43 (etwa 1,4 mg pro Maus) an den Tagen –5 und –1 (Gruppe A) oder am Tag –5 allein (Gruppen B, C, D, E) injiziert. Am Tag vor der BMT wurde der Erfolg der T-Zell-Depletion durch FACS in PBL überprüft und eindeutige Fehler waren von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Bei dem dritten Experiment wurden GK1.5 und 2.43 am Tag –1 etwa 24 Stunden vor BMT verabreicht. Murine CTLA4Ig wurden i. p. als eine Einzeldosis (0,5 mg) am Tag +2 injiziert und Hamster-anti-Maus-CD154-mAb (MR1) wurde i. p. am Tag 0 (0,45 mg) injiziert. CTLA4Ig war eine großzügige Spende von Bristol-Myers, Squibb Pharmaceuticals, Seattle, WA; das MR1-Hybridom wurde dankenswerterweise zur Verfügung gestellt von Dr. Randolph J. Noelle (Dartmouth Medical School, Lebanon, NH). Ein Hamster-anti-Maus-IgG-mAb (Cappel, ICN Pharmaceuticals, Aurora, OH) und der murine-mAb L6 (Bristol-Myers, Squibb Pharmaceuticals, Seattle, WA) wurden als Kontrollen am Tag 0 und Tag +2 bei dem zweiten Experiment injiziert.
Druchflusszytometrie-Analyse von Chimärismus
Präparation von Geweben: Etwa 0,4 ml peripheren Bluts wurden in heparinisierte Gefäße gesammelt und die roten Blutzellen wurden mit deionisiertem Wasser lysiert. Thymus und Milz wurden aus den Tieren entnommen und leicht mit dem Unterteil einer Spritze aufgebrochen. Milz wurde in ACK-Lysepuffer (Biowhittaker, Walkersville, MD) aufgebrochen, um die roten Zellen zu lysieren. Knochenmarkszellen wurden aus dem Oberschenkel und Schienbein entnommen, indem die Knochen mit Medium umspült wurden. Die Zellen wurden in FAXS-Medium, enthaltend 1 × HBSS, 0,1% Natriumazid, und 0,1% Rinderserumalbumin (Fisher Scientific, Fair Lawn; NJ) resuspendiert.
Die allogenische Rekonstitution verschiedener Linien in WBC, Milz, BM und Thymus wurde anhand Zweifarben-FACS bewertet. Kurz gesagt wurden ein Vorwärtswinkel und 90 Grad Lichtstreuungseigenschaften verwendet, um Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten in peripherem WBC zu unterscheiden. Eine Zweifarben-FACS wurde eingesetzt, um Spender- und Wirtszellen von bestimmten Linien zu unterscheiden und der Prozentsatz von Spenderzellen wurde berechnet, indem die Kontrollfärbung von Quadranten, die Spender- und Wirtszellen enthalten, die einen bestimmten Linienmarker exprimieren, substrahiert werden und indem der Nettoprozentsatz von Spenderzellen durch den Gesamtnettoprozentsatz von Spender- plus Wirtszellen von dieser Linie dividiert wird. Tote Zellen wurden ausgeschlossen unter Verwendung von Propidiumiodid-Färbung. Eine nicht-spezifische FcγR-Bindung wurde durch anti-Maus-FcγR-mAb 2.4G2 blockiert. Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-konjugierte-mAbs schlossen anti-CD4, anti-CD8, anti-B220 (alle bezogen von PharMingen, San Diego, CA) und Anti-MAC1 (Caltag, San Francisco, CA) ein. Die Negativkontrolle-mAb HOPC1-FITC, die keine Reaktivität gegenüber Mauszellen aufweist, wurde in unserem Labor hergestellt. Biotinylierte anti-H-2Dd-mAb 34-2-12 und Kontroll-mAb HOPC1 wurden mit Phycoerythrin-Streptavidin (PEA) entwickelt.
Durchflusszytometrie-Analyse von T-Zell-Rezeptor-Vβ-Famillien
Diese Verfahren wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Gemischte Lymphozyten-Reaktionen (MLR)
Splenozyten wurden dreifach in flachbödigen Platten mit 96 Vertiefungen, die 4 × 10⁵ Responder mit 4 × 10⁵ Stimulatoren enthielten (30 Gy bestrahlt, ¹³⁷Cs-Quelle) in RPMI 1640-Medium (Gibco, Grand Island, NY), ergänzt mit 15% (vol/vol) kontrolliertem prozessiertem Serumersatz (CPSR-2, Sigma), 4% Nährstoffgemisch (7,3 mg/ml L-Glutamin, 4 × nicht-essentielle Aminosäuren (Gibco), 2,75 mg/ml Natriumpyruvat, 250 E/ml Penicillin und 250 mg/ml Streptomycin), 1% HEPES-Puffer und 10 mM 2-Mercaptoethanol bei 37°C in 5% CO₂ für 3 bis 4 Tage kultiviert, bevor sie mit [³H]-Thymidin pulsmarkiert wurden und etwa 18 Stunden später geerntet wurden. Die Stimulationsindices wurden berechnet, indem die Durchschnittswerte der Zähler pro Minute (CPM) der anti-Spender- und anti-Drittpartei-Antworten durch die Durchschnitts-CPM der anti-Wirtantworten, die ähnlich dem Hintergrund-CPM waren (d. h. CPM mit keiner Stimulatorzellpopulation) dividiert.
Zellvermittelter Lympholyse(CML)-Assay
Splenozyten von Kontrollen, BMT-Empfängern und normalen Mäusen wurden in RPMI 1640 (Mediatech, Herndon, VA), enthaltend 10% fötales Rinderserum (Sigma, St. Louis, MO), 0,09 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 E/ml Penicillin und 0,2 μg/ml Streptomycin, 0,025 mM 2-ME und 0,01 M HEPES-Puffer resuspendiert. Responder- und Stimulatorzellen (30 Gy bestrahlt, ¹³⁷Cs-Quelle) wurden bis zu einer Konzentration von 8 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt. 8 × 10⁵ Responderzellen wurden mit 8 × 10⁵ Stimulatorzellen pro Vertiefung in den Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen co-kultiviert. Die Kulturen wurden in zwei Reihen mit jeweils drei Replikaten angesetzt und nach 5 Tagen Inkubation in 8% CO₂ bei 37°C wurden Zweifach-Serienverdünnungen aus der zweiten Reihe der Triplikate hergestellt, so dass die zytolytische Kapazität bei fünf verschiedenen Respondern zu den Zielverhältnissen untersucht werden konnte. 8 × 10³ ⁵¹Cr-markierte, zwei Tage lang mit Concanavalin A stimulierte Lymphoblaten wurden zu jeder Vertiefung zugefügt und für 4 Stunden in 8% CO₂ bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden unter Verwendung des Titertek-Überstandssammelsystems (Skatron, Inc., Sterling, VA) geerntet und die ⁵¹Cr-Freisetzung wurde mit einem automatischen Gammazähler bestimmt. Der Prozentsatz der spezifischen Lyse wurde mit der folgenden Formel berechnet: % spezifische Lyse = [(experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)] × 100%.
Immunhistochemische Färbung
Gefrorene Thymusschnitte (4 μm) wurden wie kürzlich beschrieben hergestellt und gefärbt (21). Kurz gesagt wurden die Schnitte mit ISCR-3 (Maus-IgG2b-anti- MHC-Klasse II I-E, 1 : 200 Verdünnung von Aszites) und 25-9-17 (Maus-IgG2a-anti-MHC-Klasse II I-A^b, 1 : 50 Verdünnung) gefärbt. Aszites, die HOPC-1-mAb (nicht-reaktive Maus IgG2a, 1 : 100 Verdünnung) oder 74-11-10 (Maus-IgG2b-anti-Schwein-MHC-Klasse I, 1 : 200 Verdünnung) enthielten, wurden als Negativkontrollfärbungen verwendet. Biotinylierte Ratten-anti-Maus-IgG2a oder IgG2b-mAbs wurden als Sekundärreagenzien verwendet. Die Färbung wurde unter Verwendung des Vectastain ABC-Kits (Vector Corporation, Burlingame, CA) entwickelt.
Hauttransplantation
Die Schwanzhaut voller Dicke von B10.A(spenderspezfischen)- und vollständig mHC-fehlgepaarten A.SW(Drittpartei)-Mäusen wurde auf die laterale Thoraxwand 5 bis 10 Wochen nach BMT transplantiert und mit 5–10 Seidennähten und Bandagen gesichert, welche eine Woche später entfernt wurden. Die Transplantate wurden dann täglich durch Augenbeschau und Abtasten für die ersten drei Wochen und mindestens wöchentlich danach untersucht. Die Transplantate wurden als abgestoßen angesehen, wenn weniger als 10% des Transplantats als lebensfähig zurückblieben.
Statistische Analyse
Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiteiligen Student-T-Tests bestimmt zum Vergleich der Durchschnittswerte mit ungleichen Varianzen. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden als signifikant eingestuft, wenn p < 0,05 war.
Hämatopoetischer Multilinien-Chimärismus in WBC
Alle Mäuse in den beschriebenen Experimenten erhielten eine nicht-myeloablative Dosis von 3 Gy WBI und 15 × 10⁶ BMC (mit Ausnahme der Kontrollmäuse, die eine Konditionierung ohne BM erhielten), mit TCD-Antikörpern und co-stimulatorisch blockierenden Antikörpern, die zu dieser Konditionierung wie beschrieben zugefügt wurden. Die Spender-Hämatopoese in WBC wurde zu mehreren Zeitpunkten nach BMT bestimmt. Der Nettoprozentsatz der Spenderzellen bei den unterschiedlichen Linien wurde durch Färbung mit einem-mAb, der spezifisch für die Spenderklasse I versus verschiedenen Linienmarkern ist, bestimmt.
Eine Gruppe der Empfänger (Gruppe A) wurde mit dem kürzlich beschriebenen Dosierungsschema (Tomita et al., 1996, Transplantation 61: 469) von zwei Dosen TCD-mAbs an den Tagen –5 und –1 behandelt. Drei von fünf dieser Empfänger entwickelten einen lang anhaltenden Multilinien-Chimärismus, wobei der durchschnittliche Prozentsatz der Spenderrepräsentation unter den CD4- und CD8-Zellen unterhalb des Spender-Chimärismus unter den B-Zellen und den myeloiden Linien lag. Die verbleibenden 2 Mäuse entwickelten anfangs hohe Spiegel von B-Zell- und myeloiden Chimärismus, aber niedrigere Spiegel von T-Zell-Chimärismus (nach 7 Wochen sichtbar) und der Chimärismus begann in allen Linien unmittelbar nach BMT abzufallen.
Eine andere Kontrollgruppe von Mäusen erhielt nur eine Dosis von TCD-mAb an dem Tag –5 ohne weitere Behandlung (Gruppe B). Diese Konditionierung führte zu hohen Spiegeln der anfänglichen Spenderrekonstitution unter den B-Zellen und myeloiden Zellen, aber sie führte nicht zu substanziellen Spiegeln unter den T-Zellen über die siebte Woche hinaus. 4 von 5 Mäusen wiesen danach einen scharfen Abfall bei ihren Chimärismusspiegeln auf.
Zum Untersuchen, ob CTLA4Ig und anti-CD154-mAb eine Induktion von lang anhaltendem Chimärismus und Toleranz ohne eine zweite Dosis von TCD-mAbs (oder Thymusbestrahlung) ermöglichen könnte, wurden sie zu dem Konditionierungsdosierungsschema der TCD-mAbs, die nur an dem Tag –5 verabreicht wurden, hinzugefügt. Die Verabreichung von CTLA4Ig alleine in einer Einzeldosis an dem Tag +2 (Gruppe C) führte zu hohen Spiegeln von einer Spenderrepopulation in allen Linien in 3 von 5 Mäusen.
Wenn eine Einzeldosis von anti-CD154-mAb an dem Tag 0 verabreicht wurde (Gruppe D), wurden in allen Linien hohe Spiegel eines stabilen Spender-Chimärismus in allen 5 Empfängern induziert. 7 Wochen nach BMT war der Prozentsatz der Spenderzellen größer als 50% unter den T-Zellen, B-Zellen, Monozyten und Granulozyten in allen Tieren und war für mehr als 6 Monate stabil, was die Einpflanzung von pluripotenten Stammzellen zeigt.
Die Behandlung von Empfängern mit einer Kombination von anti-CD154-mAb (Tag 0) plus CTLA4Ig (Tag +2) (Gruppe E) resultierte in ähnlichen Chimärismus-Spiegeln wie jene, die mit anti-CD154-mAb alleine beobachtet wurden. Alle 6 Mäuse entwickelten hohe Spiegel von stabilem Multilinien-Chimärismus, welche ähnlich waren zu jenen der Gruppe D, wobei es keinen klaren Vorteil von dieser Kombination der Behandlung im Vergleich zu der Verabreichung von anti-CD154-mAb allein gab.
In der Gruppe von Mäusen, die mit TCD an dem Tag –5 plus einem Hamster-Kontroll-mAb und einem Maus-Kontroll-mAb konditioniert wurden, folgte der Chimärismus einem Verlauf, der vergleichbar mit dem der Gruppe B war, mit hohen Anfangsspiegeln unter den B-Zellen und myeloiden Zellen, welche schnell anfingen, abzufallen.
Die Durchschnittsspiegel der Spenderrepräsentation in WBC, die in Mäusen beobachtet wurden, die eine co-stimulatorische Blockade erhielten (Gruppen C, D und E), waren nicht nur höher als der in der Gruppe B, aber war auch höher als in Mäusen, welche zwei Dosen von TCD-mAbs erhielten (Gruppe A). Speziell hervorzuheben war der hohe Spiegel des Spender-T-Zell-Chimärismus, welcher zur Vorhersage der Entwicklung von Toleranz in dem nicht-myeloablativen Modell dient. In mehreren Mäusen war der T-Zell-Chimärismus höher als der myeloide Chimärismus, was ein gegensätzliches Muster zu dem in Mäusen ist, welche mit zwei Dosen von TCD-mAbs konditioniert worden sind. Diese Ergebnisse wurden in einem zweiten getrennten Experiment bestätigt, welches ein vergleichbares Resultat ergab mit einem erhöhten Multilinien-Chimärismus bei den Empfängern von CTLA4Ig und/oder anti-CD154-mAb im Vergleich zu der Kontrollgruppe, die TCD-mAbs an dem Tag –5 und –1 erhielten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass CTLA4Ig und anti-CD154-mAb als Einzelagenzien jeweils wirksam sind, um dem Bedarf einer verlängerten TCD oder TI in diesem Modell gerecht zu werden, was zu hohen Spiegeln eines stabilen Chimärismus unter all den getesteten hämatopoetischen Linien führt.
Eintägige Konditionierungsdosierungschema
Da das oben beschriebene Konditionierungsdosierungsschema 5 Tage vor BMT beginnt, wäre sie nicht für die Verwendung von Spendern von Leichenorganen optimal. Die Konditionierung wurde modifiziert, indem die TCD-mAbs nur etwa 24 Stunden vor dem BMT in einem dritten Experiment verabreicht wurden (n = 3). Anti-CD154-mAb wurde zur Verwendung in diesem Protokoll ausgewählt. Höhere Spiegel von Multilinien-Chimärismus wurden erreicht nach Konditionierung mit TCD-mAbs an dem Tag –1 und anti-CD154-mAb an dem Tag 0 ohne irgend einen nennenswerten Wirksamkeitsverlust, was die klinische Nützlichkeit dieses Ansatzes weiter erhöht.
Hämatopoetischer Chimärismus in Milz, Thymus und BM
Zum Zeitpunkt der Tötung (29 Wochen nach BMT) wurde der Chimärismus in Milz, Thymus und Knochenmark durch FACS in einer Untergruppe von Mäusen bestimmt, um das Vorkommen von Multilinien-Chimärismus und somit eine Stammelleinpflanzung zu bestätigen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden ähnlich hohe Spiegel einer Spenderrepräsentation unter CD4⁺-, CD8⁺- und B220⁺-Splenozyten, unter reifen Thymozyten und unter Knochenmarkszellen, in allen drei Gruppen, die eine co-stimulatorische Blockade erhielten, beobachtet. Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen diesen drei Gruppen für irgendein Gewebe oder Linie beobachtet. Vergleichbare Ergebnisse wurden 43 Wochen nach BMT in dem zweiten Experiment gewonnen, was bestätigt, dass eine substanzielle Einpflanzung von Spenderstammzellen stattgefunden hat.
Der Prozentsatz von Spenderzellen unter CD4⁺-, CD8⁺- und B220⁺-Splenozyten, Thymozyten und Knochenmarkszellen wurde durch FACS zum Zeitpunkt der Tötung 29 Wochen nach BMT bestimmt. Die Ergebnisse von einem der zwei ähnlichen Experimente sind als Durchschnittsprozentsätze der Spenderrepräsentation gezeigt Gruppe A (n = 1): TCD Tag –5, Tag –1; Gruppe B (n = 1): TCD nur Tag –5; Gruppe C (n = 2): TCD Tag –5 plus CTLA4Ig; Gruppe D (n = 2): TCD Tag –5 plus anti-CD154-mAb; Gruppe E (n = 2): TCD Tag –5 plus CTLA4Ig plus anti-CD154-mAb. Der P-Wert ist für den Vergleich zwischen den Gruppen C, D und E nicht signifikant. NL B6 und NL B10.A bezeichnen normale B6 bzw. normale B10.A.
Hauttransplantatüberleben
Zur Bestimmung, ob eine spenderspezifische Toleranz induziert worden ist, wurde eine Hauttransplantation, welche den stringentesten Test für eine Transplantationstoleranz darstellt, durchgeführt. Es wurde Haut des Spenders eines Dritten für 10 Wochen, 7 Wochen (zweites Experiment) oder 5 Wochen (drittes Experiment) nach BMT transplantiert. In der Gruppe, welche zwei Dosen TCD-mAbs (Gruppe A) erhielten, akzeptierten die drei erfolgreichen Chimären die Spenderhauttransplantate durchgehend (> 130 Tage), während alle Mäuse, die mit TCD-mAbs nur an dem Tag –5 ohne weitere Behandlung erzeugt wurden (Gruppe B), ihre Transplantate innerhalb von 15 Tagen abgestoßen haben, was mit dem Fehlen eines Langzeit-Chimärismus übereinstimmt.
In der Gruppe von Empfängern, die mit TCD-mAbs an dem Tag –5 plus CTLA4Ig alleine (Gruppe C) behandelt wurden, wurden die Spendertransplantate durchweg von den drei erfolgreichen Chimären angenommen. Eine der zwei Mäuse konnte keine hohen Spiegel eines Multilinien-Chimärismus entwickeln und stieß ihr Spendertransplantat am Tag 9 ab und die zweite starb mit ihrem Transplantat, welches sich noch in einem guten Zustand befand, 16 Tage nach BMT. Alle Tiere, die anti-CD154-mAb alleine (Gruppe D) oder anti-CD154-mAb plus CTLA4Ig (Gruppe E) erhielten, nahmen ihre Spendertransplantate durchweg an. Das Langzeitüberleben der Transplantate hielt sie in einem perfekten Zustand mit einer nachträglichen Periode von bis zu 160 Tagen.
Kontrollmäuse, welche eine Konditionierung ohne BMT oder TCD-mAbs an dem Tag –5 plus Kontroll-Antikörper erhielten, haben ihre Spendertransplantate umgehend abgestoßen. Alle Gruppen haben ihre Transplantate der Drittpartei einheitlich innerhalb von 2 Wochen abgestoßen, was zeigt, dass die induzierte Toleranz spezifisch war und dass die Chimären immunkompetent waren.
Das zweite Experiment zeigte eine ähnliche spenderspezifische Akzeptanz des Hauttransplantats in Mäusen, die TCD und eine co-stimulatorische Blockade erhielten. Die Chimären in dem dritten Experiment, welche TCD-mAbs an dem Tag –1 und anti-CD154-mAb erhielten, nahmen ihre Spendertransplantate an (> 40 Tage), während sie die Transplantate der Drittpartei umgehend abgestoßen haben.
MLR- und CML-Reaktivität
Um weiter die Entwicklung von Toleranz einzuschätzen, wurden MLR- und CML-Assays zum Zeitpunkt der Tötung beim ersten Experiment durchgeführt. 4 von 6 getesteten Chimären aus den Gruppen C, D und E zeigten keine Antwort gegenüber Spender-Antigenen, während sie ihre Reaktivität gegenüber Antigenen einer Drittpartei aufrecht erhielten (Stimulationsindex > 1,9). Die Chimäre von Gruppe A, eine von zwei Chimären von jeweils den Gruppen C und E, die Maus von Gruppe B und eine Kontrolle, welche die Konditionierung ohne BMT erhalten hat, waren allgemein hyporeaktiv. Die Ergebnisse der CML-Assays zeigten ein ähnliches Muster wie das, welches für die MLR-Reaktivität beobachtet wurde (Tabelle 2). Eine Chimäre von jeweils den Gruppen C und D zeigten ein effektives Abtöten gegenüber Zielen einer Drittpartei, während sie nicht Ziele des Spenders abtöteten. Die verbleibenden Tiere, einschließlich der Kontrollmaus, welche nicht BMT erhalten hat, zeigten im Allgemeinen eine Hyporeaktivität, obwohl eine Immunkompetenz in vivo gezeigt wurde, anhand der Fähigkeit, die Hauttransplantate einer Drittpartei unverzüglich abzustoßen. Obwohl die Seneszenz der Mäuse eine in einigen Fällen beobachtete generalisierte Hyporeaktivität in vitro verursacht haben kann, stellen diese MLR- und CML-Untersuchungen einen weiteren Hinweis für das Vorkommen einer spenderspezifischen Toleranz in Chimären, die mit einer co-stimulatorischen Blockade hergestellt wurden, dar.
Deletion von spenderreaktiven T-Zellen
Eine zentrale Deletion, ist der Hauptmechanismus für die Erhaltung von Toleranz in dem gemischten Chimärismusmodell. Eine Deletion von spenderreaktiven T-Zellen in PBL, Thymus und Milz wurde durch die Analyse des Vorkommens von bestimmten Vβ-Untereinheiten auf dem TCR untersucht. Der Spenderstamm B10.A exprimiert I-E, welches für die Präsentation von Superantigenen benötigt wird, welches sich von dem Brustdrüsen-Tumorvirus(Mtv)-8 und -9 der endogenen Retroviren, die in dem B6/B10-Hintergrundgenom kodiert sind, ableiten. Sich entwickelnde Thymozyten, deren TCR Vβ11 oder Vβ5.1/2 enthalten, welche an diese Superantigene binden, sind in I-E-positiven B10.A-Mäusen, aber nicht in B6-Mäusen deletiert, da sie kein I-E exprimieren. 8 Wochen nach BMT (in dem ersten Experiment) zeigten alle Mäuse in den Gruppen A, D und E und 4 von 5 Mäusen in Gruppe C (eine der Mäuse, welche abfallende Spiegel von Chimärismus aufwiesen, zeigte eine unvollständige Deletion) eine starke Reduktion bei Vβ5^–- und Vβ11⁺-CD4⁺-PBL, aber keinen Abfall bei der Vβ8⁺-Kontrolle CD4^–-PBL. Die Deletion in den Gruppen D und E war in signifikanter Weise stärker ausgeprägt als in der Gruppe B, was mit dem allgemeinen Verlust des Chimärismus und Toleranz in der letzteren Gruppe übereinstimmt. Zum Zeitpunkt der Tötung 43 Wochen nach BMT (zweites Experiment) zeigten alle getesteten Tiere in den Gruppen C, D und E eine starke Reduktion in dem Prozentsatz der Vβ5^–-reifen Wirtstyp-Thymozyten im Vergleich zu einer natürlichen B6-Maus oder einer Kontrolle, die eine Konditionierung ohne BMT erhalten hat. Zum selben Zeitpunkt waren auch die Prozentsätze der Vβ5- und Vβ11-positiven Empfänger CD4⁺- und CD8⁺-Splenozyten drastisch reduziert. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass eine zentrale Deletion von spen derreaktiven T-Zellen der Hauptmechanismus von Toleranz in Langzeit-Chimären, die mit diesem Dosierungsschema hergestellt wurden, darstellt.
Spender Klasse II⁺-Zellen im Thymus
Zellen hämatopoetischen Ursprungs sind wichtige Mediatoren einer negativen Selektion in dem Thymus mit den kritischen Zellen, welche sich unter den stärksten Subpopulationen in dieser Hinsicht befinden. Wir haben deshalb nach Spenderzellen gesucht, die eine dendritische Zellmorphologie in den Thymi von Chimären zum Zeitpunkt der Tötung aufwiesen (29 Wochen nach BMT). Alle getesteten Chimären (zwei von jeder der Gruppen C, D und E) zeigten das Vorkommen von Spender Klasse II⁺-Zellen mit dendritischer Zellmorphologie. Eine Kontrollmaus, die eine Konditionierung ohne BMT erhalten hat, war für die Spender Klasse II⁺-Zellen negativ. Klasse II⁺-Zellen des Wirts waren in allen Empfängern normal verteilt. Diese Entdeckungen stützen die Schlussfolgerung, dass eine intrathymische Deletion ein Hauptmechanismus der Toleranz während einer Langzeit-Nachbehandlung darstellt.
Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass eine co-stimulatorische T-Zell-Blockade sehr wirksam ist. Sowohl anti-CD154-mAb und CTLA4Ig waren als einzelne Agenzien beim Ersetzen der Thymusbestrahlung oder der wiederholten Verabreichung von TCD-mAbs wirksam. Die klinische Relevanz dieser neu entwickelten Dosierungsschemen für eine Induktion von Toleranz wird weiter durch die Fähigkeit erhöht, die Konditionierungsbehandlung nur 24 Stunden vor BMT zu beginnen, was sie für die Transplantation von Leichenorganen anwendbar macht.
Tabelle 1. Chimärismus in Milz, Thymus und Knochenmark
Der Prozentsatz von Spenderzellen unter den CD4^–-, CD8^–-, B220^–-Splenozyten, Thymozyten und Knochenmarkszellen wurde anhand FACS zum Zeitpunkt der Tötung, 29 Wochen nach BMT, bestimmt. Die Ergebnisse eines von zwei ähnlichen Experimenten sind als durchschnittlicher Prozentsatz der Spenderrepräsentation dargestellt. Gruppe A (n = 1): TCD Tag –5, Tag –1; Gruppe B (n = 1): TCD nur Tag –5; Gruppe C (n = 2): TCD Tag –5 plus CTLA4Ig; Gruppe D (n = 2): TCD Tag –5 plus anti-CD154-mAb; Gruppe E (n = 2): TCD Tag –5 plus CTLA4Ig plus anti-CD154-mAb. Der P-Wert ist für einen Vergleich zwischen den Gruppen C, D und E nicht signifikant. NL B6 bzw. NL B10.A bezeichnen eine normale B6 bzw. eine normale B10.A.
Tabelle 2. CML-Assays
Die Ergebnisse der CML-Assays sind als Prozent der spezifischen Lyse gegen Eigen(B6)-, Drittpartei(A.SW)- und Spender(B10.A)-Zielen, 29 Wochen nach BMT (erstes Experiment) gezeigt. Das höchste getestete Responder : Ziel-Verhältnis (100 : 1) ist dargestellt. NL B6 und NL B10.A bezeichnen normale B6 bzw. normale B10.A. Kein BMT bezeichnet eine Maus, die eine Konditionierung (WBI, TCD-mAbs Tag –5, CTLA4Ig plus anti-CD154-mAb) ohne BMT erhalten hat. Die Gruppenbeschreibungen sind aus Tabelle 1 zu entnehmen.
Weitere Ausführungsformen
Die hier beschriebenen Verwendungen zur Induktion von Toleranz gegenüber oder zum Fördern der Akzeptanz von einem allogenischen Antigen oder allogenischen Transplantat kann überall dort verwendet werden, wo zwischen Spender und Empfänger irgendeinen Grad von fehlender Übereinstimmung bei MHC-Loci oder anderen Loci, welche eine Transplantatsabstoßung beeinflussen, vorhanden ist. Es kann eine fehlende Übereinstimmung bei mindestens einem MHC-Locus oder bei mindestens einem weiteren Locus, der die Erkennung und Abstoßung vermittelt, z. B. ein Locus eines kleineren Antigens, geben. Bezüglich der Klasse I- und Klasse II-MHC-Loci kann der Spender und Empfänger sein: Übereinstimmung bei Klasse I und fehlende Übereinstimmung bei Klasse II; Übereinstimmung bei Klasse I und Übereinstimmung bei Klasse II; fehlende Übereinstimmung bei Klasse I und fehlender Übereinstimmung bei Klasse II; Übereinstimmung bei Klasse I, Übereinstimmung bei Klasse II. In beliebigen dieser Kombinationen können weitere Loci mit einer Kontrollerkennung und -abstoßung, z. B. Loci eines kleineren Antigens, übereinstimmen oder nicht übereinstimmen. Wie oben ausgeführt, ist es bevorzugt, dass es eine Übereinstimmung bei mindestens einem Locus gibt. Eine fehlende Übereinstimmung bei MHC-Klasse I bedeutet eine fehlende Übereinstimmung für eine oder mehrere MHC-Klasse I-Loci, z. B. im Falle des Menschen, eine fehlende Übereinstimmung bei einem oder mehreren HLA-A, HLA-B oder HLA-C. Eine fehlende Übereinstimmung bei MHC-Klasse II bedeutet eine fehlende Übereinstimmung bei einem oder mehreren MHC-Klasse II-Loci, z. B. in dem Fall des Menschen, eine fehlende Übereinstimmung bei einem oder mehreren einer DPα, einer DPβ, einer DQα, einer DQβ, einer DRα oder einer DR.
Die hier beschriebenen Verwendungen zum Induzieren von Toleranz gegenüber einem allogenischen Antigen oder einem allogenischen Transplantat kann dort verwendet werden, wo es zwischen dem Spender und Empfänger irgendeinen Grad von Reaktivität in einem gemischten Lymphozyten-Assay gibt, z. B. wenn es keine, eine niedrige, mittlere oder hohe gemischte Lymphozytenreaktivität zwischen dem Spender und dem Empfänger gibt. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine gemischte Lymphozytenreaktivität verwendet, um eine fehlende Übereinstimmung für Klasse II zu definieren, und die Erfindung umfasst Verfahren zum Durchführen von allogenischen Transplantaten zwischen Individuen mit einem beliebigen Grad einer fehlenden Übereinstimmung bei Klasse II, wie es anhand eines gemischten Lymphozyten-Assays definiert ist. Serologische Tests können verwendet werden, um eine fehlende Übereinstimmung bei Klasse I- oder II-Loci zu bestimmen, und die Erfindung schließt Verfahren zum Durchführen von allogenischen Transplantaten zwischen Individuen mit einem beliebigen Grad einer fehlenden Übereinstimmung bei Klasse I und/oder Klasse II ein, wie anhand serologischer Verfahren gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Mittel zum Durchführen von allogenischen Transplantaten zwischen Individuen, welche sowohl bei Klasse I als auch bei Klasse II keine Übereinstimmung aufweisen, wie durch einen serologischen und/oder gemischten Lymphozytenreaktivitäts-Assay bestimmt.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen sind besonders nützlich zum Ersetzen eines Gewebes oder Organs, das von einer neoplastischen Störung betroffen ist, insbesondere eine Störung, die gegenüber normalen Therapieformen widerstandsfähig ist, z. B. Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie. Die erfindungsgemäßen Verwendungen können verwendet werden zum Induzieren von Toleranz gegenüber einem Allotransplantat, z. B. einem Allotransplantat von einem Spender, der bei einem oder mehreren Klasse I-Loci, bei einem oder mehreren Klasse II-Loci oder bei einem oder mehreren Loci von jeweils der Klasse I und Klasse II, keine Übereinstimmung hat. In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Transplantat Gewebe des Verdauungstrakts oder des Darms ein, z. B. Gewebe vom Magen oder Darmgewebe, z. B. des Dünndarms, Dickdarms oder Enddarms.
Es ist möglich, einen gemischten Chimärismus mit einer geringeren Bestrahlungstoxizität durch Fraktionierung der Bestrahlungsdosen zu induzieren, d. h. durch Bestrahlung in zwei oder mehreren Verabreichungen oder Sitzungen. Dementsprechend kann in jedem erfindungsgemäßen Verfahren, das eine Be strahlung eines Empfängers erforderlich macht, z. B. eines Primaten, z. B. eines Menschen, Empfänger eines Allotransplantats, die Bestrahlung entweder in einer einzelnen Verabreichung abgegeben werden oder bevorzugter kann sie in zwei oder mehrere Verabreichungen oder Sitzungen fraktioniert werden. Die Summe der fraktionierten Dosierungen ist bezüglich der Bestrahlungsdosierung vorzugsweise gleich, z. B. in Rad oder Gy, was einen gemischten Chimärismus ergibt, wenn sie in einer Einzelbestrahlung verabreicht wird. Fraktionen sind bezüglich der Dosierung vorzugsweise etwa gleich. Auch eine Hyperfraktionierung der Bestrahlungsdosen kann in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Die einzelnen Fraktionen können am selben Tag abgegeben werden oder können durch Intervalle von einem, zwei, drei, vier, fünf oder mehreren Tagen unterbrochen sein. Eine Ganzkörperbestrahlung, eine Bestrahlung des Thymus oder beides kann fraktioniert werden.
Eine Thymusbestrahlung kann auch fraktioniert werden. Zum Beispiel kann eine Einzeldosis von 700 cGy ersetzt werden mit z. B. zwei Fraktionen von 350 cGy oder sieben Fraktionen von 100 cGy.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen können eine Splenektomie des Empfängers einschließen.
In jeder der hier beschriebenen Verwendungen, insbesondere die Verwendungen bei Primaten oder klinische Verwendungen, ist es bevorzugt, einen gemischten Chimärismus zu bilden im Vergleich zu einem vollständigen Ersetzen der Stammzellen des Empfängers mit Spenderzellen.
Blocker der CD40-Ligand-CD40-Interaktion (und gegebenenfalls der CD28-B7-Interaktion) (oder beide) können in wiederholter Weise verabreicht werden. Zum Beispiel können Blocker ein, zwei, drei oder mehrere Male vor der Spender-Knochenmarkstransplantation verabreicht werden. Typischerweise wird bei der Knochenmarkstransplantation eine Vordosis an den Patienten bei etwa 0 und –2 Tagen verabreicht. Zusätzlich können auch frühere Dosen 6, 7 oder 8 Tage vor der Knochenmarkstransplantation gegeben werden. Es kann wünschenswert sein, eine erste Behandlung zu verabreichen und dann die vorherige Knochenmarksverabreichung alle 1–5 Tage zu wiederholen. Blocker können ein, zwei, drei oder mehrere Male nach der Spender-Knochenmarkstransplantation verabreicht werden. Typischerweise kann eine nachträgliche Knochenmarkstransplantatsbehandlung etwa 2–14 Tage nach der Knochenmarkstransplantation gemacht werden. Die nachträgliche Knochenmarksverabreichung kann so viele Male wie benötigt wiederholt werden. Wenn mehr als eine Verabreichung gegeben wird, kann zwischen den Verabreichungen etwa 1 Woche liegen. Zusätzliche Dosen können verabreicht werden, wenn der Patient eine frühe oder nicht gewollte T-Zell-Erholung durchzumachen scheint. Vorzugsweise werden die Blocker mindestens einmal verabreicht (und vorzugsweise zwei, drei oder mehrere Male) vor der Spender-Knochenmarkstransplantation und mindestens einmal (und vorzugsweise zwei, drei oder mehrere Male) nach der Spender-Knochenmarkstransplantation.
CD40-CD40L-Blocker können vor den CD28-B7-Blockern verabreicht werden, wenn CD2-B7-Blocker verwendet werden. Sie können auch gleichzeitig oder nach den CD2-B7-Blockern verabreicht werden, wenn CD2-B7-Blocker verwendet werden.
Einige der hier beschriebenen Verwendungen schließen die Verabreichung von hämatopoetischen Stammzellen, die nicht direkt von menschlichen Embryonen gewonnen wurden, an einen Empfänger ein. In vielen dieser Verwendungen werden solche hämatopoetischen Stammzellen vor oder gleichzeitig mit der Einpflanzung eines Transplantats verabreicht, wobei der Zweck der Verabreichung der hämatopoetischen Stammzellen in erster Linie die Induktion von Toleranz gegenüber dem Transplantat ist. Die Erfinder haben herausgefunden, dass eine oder mehrere aufeinander folgende Verabreichungen (z. B. eine zweite, dritte, vierte, fünfte oder weitere aufeinander folgende Verabreichung) von hämatopoetischen Stammzellen wünschenswert bei der Herstellung und/oder Aufrechterhaltung von Toleranz sein kann. Somit schließt die Erfindung auch Verwendungen ein, bei denen hämatopoetische Stammzellen, die nicht direkt von menschlichen Embryonen gewonnen wurden, an einen Empfänger, z. B. einen Primaten, z. B. einen Menschen, verabreicht werden, dem zuvor hämatopoetische Stammzellen als Teil in einer der hier aufgeführten Verwendungen verabreicht worden sind.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, glauben die Erfinder, dass eine wiederholte Verabreichung von Stammzellen den gemischten Chimärismus und möglicherweise auch eine langfristige deletionale Toleranz in Transplantatsempfängern fördern kann. Demzufolge kann jede hier aufgeführte Verwendung, welche die Verabreichung von hämatopoetischen Stammzellen einschließt, weiter die mehrfache Verabreichung von Stammzellen einschließen. In bevorzugten Aus führungsformen wird eine erste und eine zweite Verabreichung von Stammzellen vor der Implantation eines Transplantats bereitgestellt; eine erste Verabreichung von Stammzellen wird vor der Implantation eines Transplantats bereitgestellt und eine zweite Verabreichung von Stammzellen wird zum Zeitpunkt der Implantation des Transplantats bereitgestellt. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird eine erste Verabreichung von Stammzellen vor oder gleichzeitig mit der Implantation eines Transplantats bereitgestellt und eine zweite Verabreichung von Stammzellen wird nach der Implantation eines Transplantats bereitgestellt. Der Zeitraum zwischen den Verabreichungen von hämatopoetischen Stammzellen kann variiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine aufeinander folgende Verabreichung von hämatopoetischen Stammzellen bereitgestellt: mindestens 2 Tage, 1 Woche, 1 Monat oder 6 Monate nach der vorhergehenden Verabreichung von Stammzellen; mindestens 2 Tage, 1 Woche, 1 Monat oder 6 Wochen nach der Implantation des Transplantats.
Die Verwendung kann weiter die Schritte der Verabreichung einer zweiten oder folgenden Dosis von hämatopoetischen Stammzellen einschließen, wenn der Empfänger beginnt, Anzeichen einer Abstoßung aufzuweisen, was z. B. durch einen Abfall in der Funktion des transplantierten Organs, durch eine Veränderung in der spenderspezifischen Antikörperantwort des Wirts oder durch eine Veränderung in der Lymphozytenantwort des Wirts auf ein Spender-Antigen nachgewiesen werden kann; wenn der Spiegel des Chimärismus abfällt; wenn der Spiegel des Chimärismus unterhalb eines vorbestimmten Werts fällt; wenn der Spiegel des Chimärismus einen Spiegel erreicht oder darunter fällt, bei dem die Färbung mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch für ein Spender-PBMC-Antigen ist, gleich oder geringer ist als die Färbung mit einer isotypischen Kontrolle, welche nicht an PBMC bindet, z. B. wenn die spenderspezifischen monoklonalen Färbungen weniger als 1–2% der Zellen ausmachen; oder im Allgemeinen, wie es benötigt wird, um eine Toleranz aufrechtzuerhalten oder anderweitig die Akzeptanz eines Transplantats zu verlängern. Somit können die erfindungsgemäßen Verwendungen modifiziert werden, um einen weiteren Schritt einzuschließen, zum Bestimmen, ob ein Subjekt, das eine oder mehrere Verabreichungen von hämatopoetischen Stammzellen erhalten hat, eine nachfolgende Verabreichung von hämatopoetischen Stammzellen benötigt und, wenn dies der Fall ist, die Verabreichung einer nachfolgenden Dosis von hämatopoetischen Stammzellen an den Empfänger einschließt.
Jede der hier aufgeführten Verwendungen kann die Verabreichung von Agenzien einschließen, z. B. 15-Desoxyspergualin, Myophenolatmofetil, Brequinamatrium oder ähnliche Agenzien, welche die Herstellung, Spiegel oder Aktivität von Antikörpern im Empfänger inhibieren. Es können ein oder mehrere dieser Agenzien verabreicht werden: vor der Implantation des Spendergewebes, z. B. ein, zwei oder drei Tage oder eine, zwei oder drei Wochen vor der Implantation des Spendergewebes; zum Zeitpunkt der Implantation des Spendergewebes; oder nach Implantation des Spendergewebes, z. B. ein, zwei oder drei Tage oder eine, zwei oder drei Wochen nach der Implantation eines Transplantats.
Die Verabreichung des Agens kann eingeleitet werden: wenn der Empfänger beginnt, Anzeichen einer Abstoßung aufzuweisen, was z. B. durch einen Abfall der Funktion des transplantierten Organs, durch eine Veränderung in der spenderspezifischen Antikörperantwort des Wirts oder durch eine Veränderung in der Lymphozytenantwort des Wirts gegenüber einem Spender-Antigen nachgewiesen werden kann; wenn der Spiegel des Chimärismus abfällt; wenn der Spiegel des Chimärismus unterhalb eines vorbestimmten Werts fällt; wenn der Spiegel des Chimärismus einen Spiegel erreicht oder darunter fällt, bei dem eine Färbung mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch für ein Spender-PBMC-Antigen ist, gleich oder geringer ist als eine Färbung mit einer isotypischen Kontrolle, welche nicht an PBMC bindet, z. B. wenn die spenderspezifischen monoklonalen Färbungen weniger als 1–2% der Zellen ausmachen; oder im Allgemeinen benötigt wird, um eine Toleranz aufrechtzuerhalten oder anderweitig die Akzeptanz eines Transplantats zu verlängern.
Der Zeitraum, über den das Agens verabreicht wird (oder der Zeitraum, über den klinisch wirksame Spiegel in dem Subjekt aufrechterhalten werden), kann langfristig sein, z. B. für 6 Monate oder mehr als ein Jahr oder länger, oder kurzfristig sein, z. B. für weniger als ein Jahr, bevorzugter 6 Monate oder weniger, bevorzugter ein Monat oder weniger, und bevorzugter 2 Wochen oder weniger. Der Zeitraum wird im Allgemeinen mindestens etwa 1 Woche und vorzugsweise mindestens etwa 2 Wochen in der Dauer betragen. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Zeitraum 2 oder 3 Wochen lang.
Bevorzugte Ausführungsformen schließen die Verabreichung von 15-Desoxyspergualin (6 mg/kg/Tag) für etwa 2 Wochen, beginnend an dem Tag der Transplantatsimplantation, ein.
Ein anti-CD2-Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler, z. B. BTI-322 oder MEDI-507, oder ein monoklonaler, der gegen ein ähnliches oder überlappendes Epitop gerichtet ist, kann zusätzlich oder anstelle irgendeines anti-T-Zell-Antikörpers (z. B. ATG) in einem beliebigen hier beschriebenen Verfahren verwendet werden. BTI-322 ist ein monoklonaler anti-CD2-Antikörper der Ratte. MEDI-507 ist eine humanisierte Version von BTI-322. BTI-322 ist in der US-PS 5,817,311 beschrieben und hier durch Bezugnahme eingeschlossen. BTI-322 wurde mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 11423 hinterlegt. MEDI-507 ist in der PCT/US97/12645 (WO 9903502, veröffentlicht am 28. Januar 1999) beschrieben.
Weitere Ausführungsformen werden von den folgenden Patentansprüchen umfasst.

Claims

Verwendung eines Inhibitors der co-stimulatorischen Interaktion von CD40-Ligand-CD40 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Förderung von Toleranz durch ein Empfängersäugetier gegenüber einem Transplantat von einem Spendersäugetier derselben Spezies, wobei die Förderung von Toleranz erreicht wird, wenn (i) die pharmazeutische Zusammensetzung dem Empfänger verabreicht wurde, (ii) hämatopoetische Stammzellen, die von. einem anderen Organ als das Transplantat erhalten wurden und nicht direkt von einem menschlichen Embryo erhalten wurden, in das Empfängersäugetier eingeführt werden und (iii), nachdem genügend Zeit zur Bildung einer chimären lymphohämatopoetischen Population zur Verfügung stand, das Transplantat dem Empfänger implantiert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, weiter umfassend, dass ein Inhibitor der CD28-B7 verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die CD40-Ligand-CD40-Interaktion durch einen Antikörper oder löslichen Ligand oder Rezeptor des CD40-Liganden oder CD40, das verabreicht werden soll, inhibiert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein anti-CD40L-Antikörper verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die CD28-B7-Interaktion durch einen löslichen Ligand oder Rezeptor oder Antikörper für das CD28 oder B7, das verabreicht werden soll, inhibiert ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei CTLA4/Ig verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei CTLA4/Ig und ein anti-CD40L-Antikörper verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei ein Blocker der CD40/CD40L-Interaktion verabreicht wird vor der Verabreichung eines Blockers der CD28/B7-Interaktion.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Empfängersäugetier ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verwendung ohne Bestrahlung des Thymus oder anti-T-Zell-Antikörper durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verwendung ohne T-Zell-Depletion oder -Inaktivierung durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verwendung mit T-Zell-Depletion oder -Inaktivierung durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verwendung mit partieller T-Zell-Depletion oder -Inaktivierung durchgeführt wird.