ES2333775T3 - Inhibicion de la activacion del complemento c5 para el tratamiento y la prevencion de rechazo de xenoinjerto retrasado o rechazo vascular agudo. - Google Patents
Inhibicion de la activacion del complemento c5 para el tratamiento y la prevencion de rechazo de xenoinjerto retrasado o rechazo vascular agudo. Download PDFInfo
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Abstract
El uso de un anticuerpo o su fragmento, que se une a C5 y que inhibe la activación de células endoteliales del tipo II, para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento del rechazo de xenoinjertos.
Description
Inhibición de la activación del complemento C5
para el tratamiento y la prevención de rechazo de xenoinjerto
retrasado o rechazo vascular agudo.
La gran escasez de órganos de donantes ha
provocado un interés mundial en la xenotransplantación, es decir,
el reemplazo de órganos humanos o tejidos con los de un donante de
una especie diferente, tales como cerdos. Los recientes progresos
son causa de cierto optimismo, aunque todavía quedan obstáculos que
deben ser superados.
Los xenotransplantes han sido clasificados en
dos grupos, concordantes y discordantes, según la distancia
filogenética entre las especies. Los animales que están
evolutivamente cerca y no tienen anticuerpos naturales específicos
entre sí son llamados concordantes. Los animales que son
filogeneticámente distantes y rechazan órganos de una manera
hiperaguda son llamados discordantes. Hay muchas gradaciones en
medio y excepciones a la regla.
Los primates no humanos serían la fuente lógica
de órganos para los seres humanos porque son los más estrechamente
relacionados. Sin embargo, debido a consideraciones del tamaño de
los órganos, carencia de disponibilidad y la probabilidad de
transmisión de enfermedades infecciosas, la mayor parte de los
investigadores han determinado que los primates no son la fuente
preferida de órganos. En cambio, los cerdos son la opción más
probable como fuente de órganos, debido a su fácil disponibilidad,
semejanzas en el tamaño de los órganos, sus características de cría
y la semejanza de los sistemas orgánicos respecto a los seres
humanos. Sin embargo, los cerdos son una especie discordante
respecto a los seres humanos.
Los xenoinjertos son objeto de cuatro mecanismos
de rechazo: (1) rechazo hiperagudo mediado por anticuerpos
preformados, (2) rechazo precoz o acelerado mediado por anticuerpos
inducidos, (3) rechazo de xenoinjerto retrasado o rechazo vascular
agudo (DXR/AVR) mediado por células T, y (4) rechazo crónico mediado
por mecanismos de células T y células B. La inducción de los cuatro
mecanismos puede ser atribuida a un mayor número de antígenos
foráneos presentes que en el tejido del aloinjerto (uno de la misma
especie, es decir, ser humano). Además, los receptores inhibitorios
humanos a menudo no interactúan con otras moléculas MHC de clase I
de la especie, permitiendo así la activación de varios mecanismos
de rechazo que proceden sin inhibición.
Se ha descrito el trasplante de islotes
pancreáticos porcinos y de un hígado de cerdo en pacientes humanos,
(Makowka, et al., 1993; Satake, et al., 1993; Tibell,
et al., 1993), pero los resultados no fueron positivos. Una
mejor inhibición del rechazo de trasplantes con terapia
farmacológica puede conducir a mejores resultados.
El rechazo hiperagudo (HAR) de xenoinjertos se
inicia por la unión de anticuerpos xeno-reactivos a
las células endoteliales del donante seguido de la activación del
complemento, predominantemente mediante la ruta clásica. Los
cerdos, por ejemplo, expresan un determinante de hidrato de carbono
endotelial, gal \alpha (1,3) gal, que no se expresa en seres
humanos, y que es considerado un nuevo antígeno del grupo sanguíneo
respecto al sistema inmunológico humano. La activación del
complemento induce una activación del tipo I de las células
endoteliales, un proceso que es rápido e independiente de la
síntesis de proteínas. Se caracteriza por la retracción celular
reversible, la translocación de selectina P a la superficie apical y
la elaboración de diversas sustancias vasoactivas.
Además, se liberan proteoglicanos de sulfato de
heparina desde la superficie de las células endoteliales dejando
que la célula quede susceptible a daños procoagulantes y mediados
por complemento. Las funciones críticas de las células endoteliales
se pierden y el resultado final es una hemorragia intersticial, una
trombosis difusa y daños del órgano irreversibles que aparecen en
los pocos minutos o varias horas después del trasplante. Éstos son
los rasgos característicos del HAR. El HAR puede prevenirse
reduciendo la actividad del complemento o el nivel de los
anticuerpos anti-xenoinjerto que aparecen de forma
natural.
Incluso si se reduce o elimina el HAR, el
xenoinjerto será rechazado después de unos días por el proceso
denominado rechazo de xenoinjerto retrasado o rechazo vascular
agudo (DXR/AVR). El DXR/AVR se caracteriza por una activación de
las células endoteliales del tipo II, que depende de la síntesis de
proteínas. Aunque se piense que DXR/AVR es, en gran parte,
independiente del complemento, algunos estudios indican que el
complemento todavía puede estar implicado en DXR/AVR. La inhibición
del complemento por el receptor del complemento soluble tipo I
(sCR1) combinado con la inmunodepresión retrasó la aparición de
DXR/AVR de corazones porcinos trasplantados en monos cynomolgus
(Davis, EA et al., Trasplantation 62:
1018-23 (1996)). El trasplante de riñones de cerdo
que expresan el factor acelerador de la degradación humano respecto
a monos cynomolgus también tuvo algún efecto protector contra
DXR/AVR (Zaidi A et al. Trasplantation 65:
1584-90 (1998); Loss M et al.,
Xenotransplantation 7: 186-9 (2000)). La
adición de anticuerpos anti-células endoteliales y
complemento en dosis sublítica indujo la expresión del factor de
tejido (Saadi S et al., J. Exp. Med. 182:
1807-14 (1995)). Las células endoteliales porcinas
expuestas a suero humano expresaron el inhibidor del activador de
plasminógeno (Kalady MF et al., Mol. Med. 4:
629-37 (1998)) y aumentaron la expresión de varios
genes de quimioquina (Selvan RS et al., J. Immunol.
161: 4388-95 (1998)). Se encontró que el
aumento de la expresión de varios genes de quimioquina dependía del
complemento. Sin embargo, se demostró que un anticuerpo monoclónico
anti-C5 era eficaz en la prevención del HAR, pero no
del DXR/AVR (Wang, H. et al., Trasplantation
68: 1643-51 (1999)).
Se han descrito otros usos de anticuerpos y
ligandos frente a C5 en Fitch et al., Circulation
100: 2499 (1999), que se refieren al uso de un anticuerpo de
cadena sencilla específico para C5 humano como inhibidor de la
activación del complemento patológica en pacientes que se someten a
una derivación cardiopulmonar; documento de EE.UU. Nº 6.074.642,
que se refiere al uso de anticuerpos específicos frente a C5 humano
para el tratamiento de la glomerulonefritis; documento WO 99/41271,
que se refiere a ligandos de ácidos nucleicos de afinidad alta con
respecto a las proteínas del sistema del complemento C1q, C3 y C5; y
Würzner, et al., 8: 328 (1991), que se refiere al uso
de anticuerpos monoclónicos contra C5 o C6 para la inhibición de la
formación del complejo del complemento terminal y la lisis de
células.
La selectina E (también conocida como
ELAM-1, CD62 y CD62E) es una molécula de adhesión
celular glicoproteíca de la superficie celular inducible por
citoquinas que se encuentra exclusivamente en las células
endoteliales. La selectina E media la adhesión de varios
leucocitos, incluyendo neutrófilos, monocitos, eosinófilos,
linfocitos T citotóxicos, y un subconjunto de células T, frente al
endotelio activado (Bevilacqua, et al., Science
243: 1160 (1989); Shimuzu, et al., Nature
349: 799 (1991); Graber, et al., J. Immunol.
145: 819 (1990); Carlos, et al., Blood
77: 2266 (1991); Hakkert, et al., Blood
78: 2721 (1991); y Picker, et al., Nature
349: 796 (1991)). La expresión de selectina E se induce en el
endotelio humano en respuesta a las citoquinas IL-1
y TNF, así como lipopolisacáridos bacterianos (LPS), por la
sobre-regulación transcripcional (Montgomery, et
al., Proc Natl Acad Sci 88: 6523 (1991)).
Se ha identificado el receptor de leucocitos
humano para la selectina E humana (Berg, et al., J. Biol.
Chem. 23: 14869 (1991) y Tyrrell, et al., Proc
Natl Acad Sci 88: 10372 (1991)). Estructuralmente, la
selectina E pertenece a una familia de moléculas de adhesión
llamadas "selectinas" que también incluyen a la selectina P y
la selectina L (véanse las revisiones en Lasky, Science
258: 964 (1992) y Bevilacqua y Nelson, J. Clin.
Invest. 91: 379 (1993)). Estas moléculas se caracterizan
por propiedades estructurales comunes tales como un dominio tipo
lectina del extremo amino-terminal, un dominio del
factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un pequeño número de
módulos de repetición del complemento (aproximadamente 60
aminoácidos cada uno) similares a los encontrados en ciertas
proteínas de unión del complemento.
Clínicamente, el aumento de la expresión de la
selectina E en el endotelio tiene que ver con una variedad de
reacciones inflamatorias agudas y crónicas mediadas por los
leucocitos, incluyendo el rechazo de aloinjertos (Allen, et
al., Circulation 88: 243 (1993); Brockmeyer, et
al., Trasplantation 55: 610 (1993); Ferran, et
al., Trasplantation 55: 605 (1993); y Taylor,
et al., Trasplantation 54: 451 (1992)). Los
estudios en los cuales se ha investigado la expresión de la
selectina E humana en aloinjertos cardíacos y renales que sufren un
rechazo celular agudo han demostrado que la expresión de selectina E
está sobreregulada selectivamente en el endotelio vascular del
tejido renal y cardíaco durante el rechazo agudo. Además, el aumento
de la expresión de la selectina E guarda correlación con el curso
precoz del rechazo celular y corresponde a la migración de células
inflamatorias en el tejido del injerto. Tomados juntos, estos
estudios proporcionan pruebas de que la expresión inducida por
citoquina de la selectina E por el endotelio del órgano del donante
contribuye a la unión y la subsecuente transmigración de células
inflamatorias en el tejido del injerto y así desempeña un papel
importante en el rechazo de aloinjertos celulares agudos.
El bloqueo de la
sobre-regulación de la selectina E, que es un
indicativo principal de la activación de células endoteliales del
tipo II característica de DXR/AVR, sería una potencial estrategia
para tratar y prevenir DXR/AVR.
\vskip1.000000\baselineskip
En este documento se describen inhibidores de C5
que se unen a C5 e inhiben la activación de células endoteliales
del tipo II, así como la supresión de la
sobre-regulación de selectina E en células
endoteliales. Estos inhibidores de C5 son útiles para el
tratamiento y la prevención del rechazo de xenoinjertos, y en
particular DXR/AVR. Los inhibidores de C5 también pueden inhibir la
formación de C5a, inhibir la formación del complejo terminal del
complemento ("TCC") y/o bloquear la lisis de células mediadas
por complemento. Los inhibidores incluyen anticuerpos monoclónicos
("MAb") así como homólogos, análogos y sus formas modificadas o
derivadas, incluyendo fragmentos de inmunoglobulina como Fab,
F(ab')_{2}, Fv y anticuerpos de cadena sencilla. También se
incluyen pequeñas moléculas incluyendo péptidos, oligonucleótidos,
peptidomiméticos y compuestos orgánicos con la misma actividad
funcional.
Se mostró que era útil un ejemplo de MAb que se
unía a C5, generado en un modelo in vitro, en el tratamiento
del rechazo de xenoinjertos y DXR/AVR, como se describe más abajo y
que se denomina 137-76. Otros ejemplos incluyen los
anticuerpos monoclónicos anti-C5
137-10, 137-21,
137-30 y 137-50. También se
describen anticuerpos monoclónicos que se unen al mismo epítopo que
el anticuerpo monoclónico 137-76 o el anticuerpo
monoclónico 137-30.
El tratamiento del rechazo de xenoinjertos
retrasado o el rechazo vascular agudo implican la administración de
un inhibidor de C5 como se describe en este documento que inhibe la
activación de células endoteliales del tipo II y que puede
manifestarse por la depresión de la expresión de la selectina E.
Basado en la descripción contenida en este
documento, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo
o sus fragmentos, que se une a C5 y que inhiben la activación de
células endoteliales del tipo II, para la fabricación de un
medicamento para la prevención o el tratamiento del rechazo de
xenoinjertos.
El rechazo de xenoinjertos puede ser un rechazo
de xenoinjertos retrasado ("DXR") o un rechazo vascular agudo
("AVR").
La inhibición de la activación de células
endoteliales del tipo II puede manifestarse por la depresión de la
expresión de selectina E.
El anticuerpo o el fragmento puede inhibir la
lisis de células mediada por el complemento. Puede inhibir la
formación del complejo terminal del complemento ("TCC"). Éste
puede inhibir la formación de C5a.
El anticuerpo o el fragmento que se usa en la
presente invención puede unirse al mismo epítopo en C5 que: (i) el
anticuerpo monoclónico MAb 137-76 que se obtiene del
hibridoma que tiene el Número de Entrada de Depósito ATCC
PTA-2581; o (ii) el anticuerpo monoclónico MAb
137-30 que se obtiene del hibridoma que tiene el
Número de Entrada de Depósito ATCC PTA-2582. El
anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclónico MAb
137-76 que se obtiene del hibridoma que tiene el
Número de Entrada de Depósito ATCC PTA-2581 o que
puede ser el anticuerpo monoclónico MAb 137-30 que
se obtiene del hibridoma que tiene el Número de Entrada de Depósito
ATCC PTA-2582.
El anticuerpo que se usa en la presente
invención puede ser un anticuerpo monoclónico, un anticuerpo
quimérico, un anticuerpo DeImmunized, un anticuerpo humanizado o un
anticuerpo humano.
El fragmento de anticuerpo que se usa en la
presente invención puede ser un Fab, F(ab')_{2}, Fv, o
fragmento de Fv de cadena sencilla y puede ser un fragmento
quimérico, un fragmento DeImmunized, un fragmento humanizado o un
fragmento humano.
La figura 1 muestra la unión de los anticuerpos
anti-C5 al C5 humano en ELISA como una función de la
concentración de anticuerpos (véase el Ejemplo 1). MAb
137-76 mostró una fuerte unión con el C5 humano.
La figura 2 muestra la inhibición de la
hemólisis por ruta clásica por anticuerpos anti-C5
(véase el Ejemplo 2). Los MAbs anti-C5
137-10, 137-21,
137-30, 137-50 y
137-76 inhiben fuertemente la hemólisis por la ruta
clásica. MAb 166-32 se une al factor D, que está
implicado en la ruta del complemento alternativa y actúa como un
control en ésta, y por lo tanto, no muestra inhibición de la
hemólisis por la ruta clásica.
La figura 3 muestra la inhibición de la
activación de C5 por el MAb anti-C5
137-76 en suero humano (10%) activado con zimosan
(véase el Ejemplo 3). El eje Y representa valores dados en unidades
arbitrarias (UA) usando un estándar de suero activado por zimosan
al 100% definido para contener 1000 UA/ml. El eje X representa la
concentración de la prueba y los anticuerpos de control negativos.
MAb 137-76 inhibe la formación de C5a y TCC
(marcadores para la activación de C5), pero no C3bBbP (un marcador
de la ruta alternativa), mientras que MAb G3-519,
una proteína del VIH-1 sin participación en la
activación del complemento, no inhibe la formación de C5a, TCC o
C3bBbP.
La figura 4 muestra la inhibición de la
expresión de selectina E en células endoteliales aórticas porcinas.
Las células endoteliales aórticas porcinas aisladas fueron tratadas
con suero humano (25%) (véase el Ejemplo 4). El Mab
anti-C5 137-76, representado por
círculos rellenos, inhibe completamente la
sobre-regulación de la selectina E de una manera
dependiente de la dosis. El MAb control coincidente con isotipo
irrelevante G3-519, representado por círculos
vacíos, no inhibe la expresión de selectina E. Los triángulos vacíos
representan la expresión de selectina E en células incubadas con
suero inactivado con calor (HIS). Los cuadrados vacíos representan
la expresión de selectina E en células incubadas en ausencia de
suero humano (IMC). El eje Y representa el nivel de expresión de la
selectina E en relaciones OD normalizadas para la cantidad de
células endoteliales en cada pocillo.
Fecha del depósito: 11 de octubre del 2000
Vigencia del depósito: 30 años
Colección de Cultivos Tipo Americana
10801 University Blvd.
Manassas, Virginia
20110-2209
Estados Unidos
Tlfno.:
703-365-2700
Fax:
703-365-2745
Número de Entrada de Depósito:
PTA-2581
Descripción del Depósito: Hibridoma que produce
un anticuerpo monoclónico denominado 137-76.
Número de Entrada de Depósito:
PTA-2582
Descripción del Depósito: Hibridoma que produce
el anticuerpo monoclónico denominado 137-30.
El sistema del complemento desempeña un papel
central en la aclaración de complejos inmunes y en respuestas
inmunes. La excesiva activación del sistema del complemento por un
xenoinjerto puede conducir a consecuencias dañinas, y que hasta
potencialmente ponen en juego la vida, debido a la inflamación
severa y a la destrucción del tejido resultante.
La activación de la ruta del complemento genera
fragmentos biológicamente activos de proteínas del complemento, por
ejemplo las anafilatoxinas C3a, C4a y C5a y complejos de ataque de
la membrana C5b-9 (MAC), que median respuestas
inflamatorias por la implicación de la quimiotaxis de los
leucocitos, la activación de macrófagos, neutrófilos, plaquetas,
mastocitos y células endoteliales, permeabilidad vascular, citolisis
y daño a tejidos. El complemento C5a es uno de los mediadores
proinflamatorios más potentes del sistema del complemento. El C5a
es la forma activada de C5.
En este documento se describen MAbs que se unen
e inhiben la activación de C5. Además de los anticuerpos
monoclónicos, se describen en este documento homólogos, análogos y
sus formas modificadas o derivadas, incluyendo fragmentos de
inmunoglobulina tales como Fab, F(ab')_{2}, Fv y
anticuerpos de cadena sencilla. También se describen en este
documento moléculas incluyendo péptidos, oligonucleótidos,
peptidomiméticos y compuestos orgánicos.
El término análogo se usa comúnmente para
referirse a Fab, ScFv u otros fragmentos con las mismas regiones de
unión, por lo tanto con la misma funcionalidad respecto a un
antígeno definido, como el anticuerpo para el cual es un análogo.
El antígeno en este caso es C5. El término homólogo se usa
comúnmente para referirse a entidades con secuencias de aminoácidos
similares o estructuras, por ejemplo diferentes isotipos de
inmunoglobulinas IgA, IgG, IgE, etc.
Los anticuerpos monoclónicos pueden prepararse
usando el método del hibridoma descrito primeramente por Kohler
et al., Nature, 256: 495 (1975), o por otros
métodos conocidos, posteriormente desarrollados.
En el método del hibridoma, un ratón u otro
animal huésped apropiado se inmuniza para que genere linfocitos que
produzcan, o sean capaces de producir, anticuerpos que se unirán
específicamente a la proteína usada para la inmunización. O bien,
los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Los
linfocitos entonces se fusionan con células de mieloma usando a un
agente de fusión adecuado, tal como el polietilenglicol, para formar
una célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice", pp. 59-103 (Academic
Press, 1986)).
Las células de hibridoma así preparadas se
siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene
preferentemente una o varias sustancias que inhiben el crecimiento o
la supervivencia de las células de mieloma parenterales no
fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parenterales
carecen de la enzima hipoxantina guanina
fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de
cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina,
aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias previenen el
crecimiento de células deficientes de HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquellas
que se fusionan eficazmente, ayudan a la producción estable a alto
nivel de anticuerpos por las células que producen anticuerpos
seleccionados, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT.
Entre estas líneas de células de mieloma están las líneas de mieloma
murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón
MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California,
EE.UU., y células SP2/0 o
X63-Ag8-653 disponibles de la
Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, Md. EE.UU. También
se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de
heteromieloma de ratón-humano para la producción de
anticuerpos monoclónicos humanos (Kozbor, J. Immunol.
133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications, pps. 51-63
(Marcel Dekker, Inc, Nueva York, 1987)). También puede usarse la
línea celular de mieloma de ratón NSO (Colección Europea de
Cultivos Celulares, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido).
El medio de cultivo en el cual las células de
hibridoma son cultivadas se analiza para determinar la producción
de anticuerpos monoclónicos dirigidos contra el antígeno. La
especificidad de unión de los anticuerpos monoclónicos producidos
por células de hibridoma puede ser determinada por
inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal
como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente unido a
enzima (ELISA).
Después de que sean identificadas las células
del hibridoma que producen los anticuerpos de especificidad
deseada, afinidad y/o actividad, pueden ser subclonados los clones
por procedimientos de dilución limitantes y pueden ser cultivados
por métodos estándares (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice", pp. 59-103 (Academic Press,
1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por
ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640.
Además, las células del hibridoma pueden ser cultivadas in
vivo como tumores de ascitos en un animal.
Los anticuerpos monoclónicos secretados por los
subclones son separados apropiadamente del medio de cultivo,
líquido ascético o suero por procedimientos de purificación de
inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo,
cromatografía de proteína A-Sepharose,
hidroxilapatito, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de
afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclónicos
se aísla fácilmente y se secuencia por procedimientos convencionales
(Innis M. et al. En "PCR Protocols. A Guide to Methods and
Applications", Academic, San Diego, CA (1990), Sanger, F. S,
et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 74:
5463-5467 (1977)). Las células del hibridoma sirven
como una fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser
colocado en vectores de expresión, que son entonces transfectados
en células huésped tales como células de E. coli, células COS
símicas, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de
mieloma que no producen, por otra parte, la proteína
inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclónicos en las células huésped recombinantes. La producción
recombinante de anticuerpos será descrita más detalladamente más
abajo.
Pueden aislarse anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos a partir de bibliotecas de fagos de anticuerpos
generadas usando las técnicas descritas en McCafferty, et
al., Nature 348: 552-554 (1990).
Clackson, et al., Nature 352:
624-628 (1991) y Marks, et al., J. Mol.
Biol. 222: 581-597 (1991) describen el
aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente,
usando bibliotecas de fagos. Las siguientes publicaciones describen
la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por
intercambio de cadenas (Marks, et al., Bio/Technology
10: 779-783 (1992)), así como infección
combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia
para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse, et
al., Nuc. Acids. Res. 21:
2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son
alternativas viables respecto a técnicas tradicionales de
hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de
anticuerpos monoclonales.
El ADN también puede ser modificado, por
ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación por dominios
constantes humanos de cadena ligera y pesada en lugar de las
secuencias murinas homólogas (patente de EE.UU. Nº. 4.816.567;
Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:
6851 (1984)).
Otra alternativa es usar la fusión eléctrica en
vez de la fusión química para formar hibridomas. Esta técnica están
muy definidas. En vez de la fusión, también se puede transformar una
célula B para hacerla inmortal usando, por ejemplo, un Virus de
Epstein Barr, o un gen transformante. (Véase, por ejemplo, "
Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody
of Predetermined Specificity", Zurawaki, V. R. et al., en
Monoclonal Antibodies, ed. por Kennett R. H. et al.,
Plenum Press, N. Y. 1980, pps. 19-33). Los MAbs
anti-C5 pueden generarse inmunizando a roedores (por
ejemplo ratones, ratas, hámsteres y conejillos de indias) con C5
natural purificado de plasma humano o suero, C5 recombinante o sus
fragmentos expresados por sistemas eucarióticos o procarióticos.
Pueden usarse otros animales para la inmunización, por ej. primates
no humanos, ratones transgénicos que expresan inmunoglobulinas
humanas y ratones inmunodeficientes (SCID), por sus siglas en
inglés ratones que sufren una mutación severa combinada,
trasplantados con linfocitos B humanos. Los hibridomas pueden ser
generados por procedimientos convencionales fusionando linfocitos B
de los animales inmunizados con células de mieloma (por ejemplo
Sp2/0 y NSO), como se ha descrito anteriormente (Köhler G et
al., Nature 256: 495-7 (1975)).
Además, pueden generarse anticuerpos anti-C5
rastreando bibliotecas de Fv o Fab recombinantes de cadena sencilla
de linfocitos B humanos en sistemas de expresión de fagos. La
especificidad de MAbs frente a C5 humano puede analizarse por ensayo
inmunosorbente unido a enzima (ELISA), como se muestra en la Fig.
1, inmunotransferencia Western, u otras técnicas inmunoquímicas. La
actividad inhibitoria de los anticuerpos sobre la activación del
complemento puede ser evaluada por ensayos hemolíticos, usando RBC
de pollo sensibilizados o de oveja para la ruta del complemento
clásica. Los hibridomas en los pocillos positivos se clonan por
dilución limitante. Los anticuerpos se purifican para determinar la
caracterización de la especificidad frente a C5 humano por los
ensayos descritos anteriormente.
Se diseña un anticuerpo humanizado para que
tenga mayor homología respecto a una inmunoglobulina humana que los
anticuerpos monoclónicos derivados del animal. Los residuos de
aminoácidos no humanos de un dominio variable de "importación"
(de animal) son transfectados en una "estructura" humana. La
humanización puede realizarse esencialmente de acuerdo con el
método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature
321: 522-525 (1986); Riechmann et
al., Nature 332: 323-327 (1988);
Verhoeyen, et al., Science, 239:
1534-1536 (1988)), sustituyendo las regiones
determinantes de complementariedad ("CDR") del roedor o
secuencia CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo
humano. En consecuencia, en tales anticuerpos "humanizados",
las partes CDR del dominio variable humano se han sustituido por la
secuencia correspondiente de una especie no humana. Así, los
anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los
cuales algunos residuos CDR, y posiblemente algunos residuos marco,
son sustituidos por residuos de sitios análogos en los anticuerpos
del roedor.
La elección de dominios variables humanos, ambos
ligeros y pesados, que se usan en la preparación de los anticuerpos
humanizados es importante para reducir la antigenicidad. Según el
llamado método "que mejor se ajusta", la secuencia del dominio
variable de un anticuerpo de roedor se rastrea respecto a la
biblioteca entera de secuencias del dominio variable humano
conocidas. La secuencia humana que es la más cercana a la del roedor
es aceptada entonces como el marco humano (FR) para el anticuerpo
humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296
(1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:
901 (1987)). Otro método usa un marco particular derivado de la
secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo
particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede ser
usado para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992);
Presta et al., J. Immunol., 151: 2623
(1993)).
Es importante además que los anticuerpos
humanizados retengan una afinidad alta respecto al antígeno y otras
propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo,
según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan
mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parenterales
y varios productos humanizados conceptuales usando modelos
tridimensionales de las secuencias parenterales y humanizadas. Los
modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente
disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay
programas de ordenador disponibles que ilustran y muestran
estructuras conformacionales tridimensionales probables de
secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección
de estas representaciones permite el análisis del papel probable de
ciertos residuos en el funcionamiento de la secuencia de
inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de residuos que
influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para
unirse a su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse y
combinarse residuos FR del receptor y secuencias de importación de
modo que la característica del anticuerpo deseada, tal como una
mayor afinidad para el (los) antígeno(s) objetivo(s),
sea maximizada, aunque sean los residuos CDR los que directamente y
más considerablemente influyan en la unión del antígeno.
También se pueden producir animales transgénicos
(por ejemplo, ratones) que sean capaces, bajo la inmunización, de
producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia
de la producción de inmunoglobulina endógena. Tales ratones
transgénicos están disponibles en Abgenix, Inc, Fremont, California,
y Medarex, Inc, Annandale, Nueva Jersey. Se ha descrito que la
eliminación homocigótica del gen de la región de unión de la cadena
pesada (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de la
línea germinal causa una completa inhibición de la producción de
anticuerpos endógenos. La transferencia de la serie de genes de
inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones
mutantes de la línea germinal causará la producción de anticuerpos
humanos bajo la exposición al antígeno. Véase, por ejemplo,
Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature
362: 255-258 (1993); Bruggermann et
al., Year in Immunol. 7: 33 (1993); y Duchosal
et al. Nature 355: 258 (1992). Los anticuerpos
humanos también pueden ser derivados de bibliotecas de exposición a
fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:
381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:
581-597 (1991); Vaughan, et al.,
Nature Biotech 14: 309 (1996)).
Los anticuerpos quiméricos son producidos por
procesos recombinantes muy conocidos en la técnica, y tienen una
región variable animal y una región constante humana. Los
anticuerpos humanizados tienen un mayor grado de secuencias
peptídicas humanas que hacen anticuerpos quiméricos.
También se pueden crear moléculas de unión de
cadena peptídica sencilla en las que están conectadas las regiones
Fv de cadena pesada y ligera. Los anticuerpos de cadena sencilla
("scFv") y el método de su construcción son descritos en la
patente de EE.UU. Nº. 4.946.778. O bien, pueden construirse Fab y
expresarse por medios similares (Evans MJ et al. "Rapid
expression of an anti-human C5 chimeric Fab
utilizing a vector that replicates in COS and 293 células".
J. Immunol. Meth. 184: 123-38 (1995)).
Todos los anticuerpos totalmente y parcialmente humanos son menos
inmunogénicos que los MAbs totalmente murinos, y los fragmentos y
los anticuerpos de cadena sencilla son también menos
inmunogénicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos Delmmunised® son anticuerpos en
los que han sido eliminados los potenciales epítopos de células T,
como se describe en la solicitud de patente internacional
PCT/GB98/01473 (documento WO 98/52976). Por lo tanto, se espera que
la inmunogenicidad en seres humanos sea eliminada o reducida
considerablemente cuando se aplican in vivo. Además, los
anticuerpos pueden ser modificados por medios químicos mediante
conjugación covalente a un polímero para aumentar su período de
semivida circulante, por ejemplo. Los polímeros preferidos, y los
métodos para unirlos a péptidos, se muestran en las patentes de
EE.UU. N^{os}. 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; y 4.609.546. Los
polímeros preferidos son polioles polioxietilados y polietilenglicol
(PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene un
peso molecular promedio preferido entre 1000 y 40.000, más
preferentemente entre 2000 y 20.000, lo más preferentemente entre
3.000 y 12.000.
De ser usado en el tratamiento del rechazo de
xenoinjertos, en particular DXR/AVR en seres humanos, los
anticuerpos anti-C5 serían preferentemente usados
como anticuerpos quiméricos, Delmmunised®, humanizados o humanos.
Tales anticuerpos pueden reducir la inmunogenicidad y así evitar la
respuesta del anticuerpo anti-ratón humano (HAMA).
Es preferible que el anticuerpo sea IgG4, IgG2, u otro IgG
genéticamente modificado o IgM que no aumente la citotoxicidad
celular dependiente del anticuerpo (Canfield SM et al., J.
Exp. Med. 173: 1483-91 (1991)) y la
citolisis mediada por complemento (Xu Y et al., J. Biol.
Chem. 269: 3468-74 (1994); Pulito VL
et al., J. Immunol. 156:
2840-2850 (1996)).
Según las estructuras moleculares de las
regiones variables de los anticuerpos anti-C5, se
podría usar el modelado molecular y un diseño molecular racional
para generar y rastrear pequeñas moléculas que imiten las
estructuras moleculares de la región de unión de los anticuerpos e
inhiban las actividades de C5. Estas pequeñas moléculas pueden ser
péptidos, peptidomiméticos, oligonucleótidos o compuestos orgánicos.
Las moléculas imitantes pueden usarse como inhibidores de la
activación del complemento en indicaciones inflamatorias y
enfermedades autoinmunes. O bien, podrían usarse procedimientos de
rastreo a gran escala comúnmente usados en el campo para aislar
pequeñas moléculas adecuadas a partir de bibliotecas de compuestos
combinatorios.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, esta descripción proporciona
bibliotecas que contienen miméticos de la presente descripción. Una
vez ensambladas, las bibliotecas de la presente descripción pueden
ser rastreadas para identificar a miembros individuales que tienen
bioactividad. Tal rastreo de las bibliotecas para buscar miembros
bioactivos puede implicar, por ejemplo, evaluar la actividad de
unión de los miembros de la biblioteca o evaluar el efecto que los
miembros de la biblioteca tienen en un ensayo funcional. El rastreo
normalmente se lleva a cabo poniendo en contacto los miembros de la
biblioteca (o un subconjunto de los miembros de la biblioteca) con
una diana de interés, tal como, por ejemplo, un anticuerpo, una
enzima, un receptor o una línea celular. Los miembros de la
biblioteca que sean capaces de interactuar con C5 se denominan en
este documento "miembros de la biblioteca bioactivos" o
"miméticos bioactivos". Por ejemplo, un mimético bioactivo
puede ser un miembro de la biblioteca que sea capaz de unirse e
inhibir a C5 o que sea capaz de antagonizar una respuesta funcional
asociada con C5. En otras palabras, el rastreo de las bibliotecas
de la presente descripción determina qué miembros de la biblioteca
son capaces de interaccionar con C5. Además, cuando ocurre realmente
la interacción, el mimético bioactivo (o los miméticos) puede ser
identificado entonces a partir de los miembros de la biblioteca. La
identificación de uno solo (o número limitado) de mimético(s)
bioactivo(s)
de la biblioteca proporciona miméticos que son por sí mismos biológicamente activos, y así útiles como agentes diagnósticos, profilácticos o terapéuticos, y pueden usarse además para avanzar considerablemente en la identificación de compuestos ventajosos en estos campos.
de la biblioteca proporciona miméticos que son por sí mismos biológicamente activos, y así útiles como agentes diagnósticos, profilácticos o terapéuticos, y pueden usarse además para avanzar considerablemente en la identificación de compuestos ventajosos en estos campos.
La síntesis de los miméticos peptídicos de la
biblioteca de la presente descripción puede ser llevada a cabo
usando técnicas de síntesis de péptidos conocidas. Los miméticos
pueden ser sintetizados en un soporte sólido (tal como poliestireno
utilizando 4 como enlazante) mediante técnicas conocidas (véase, por
ejemplo, John M. Stewart y Janis D. Young, "Solid Phase Peptide
Synthesis", 1984, Pierce Chemical Comp., Rockford, Ill.;
Atherton, E., Shepard, R. C. "Solid Phase Peptide Synthesis: A
Practical Approach"; IRL:Oxford, 1989) o en una resina unida a
sililo por unión del alcohol (véase Randolph et al., J Am.
Chem. Soc. 117: 5712-14, 1995).
Además, una combinación de técnicas de síntesis
tanto en solución como en fase sólida puede ser utilizada para
sintetizar los miméticos de péptido de esta descripción. Por
ejemplo, puede utilizarse un soporte sólido para sintetizar la
secuencia del péptido lineal hasta el punto de que se añada la
vuelta inversa estructuralmente unida a la secuencia. La química
combinatoria tradicional (véase, por ejemplo, "The Combinatorial
Index Bunin", Academic Press, New York, 1998; Gallop et
al., J. Med. Chem. 37:
1233-1251,1994) y técnicas de síntesis en paralelo
permiten que se preparen fácilmente un enorme número de compuestos
por combinación secuencial de reactivos en una estructura molecular
básica. Por ejemplo, la anterior síntesis descrita puede ser
realizada usando una técnica de clasificación dirigida de Nicolaou
y colaboradores. (Nicolaou et al., Angew. Chem. Int'l.
Ed. 34: 2289-2291, 1995). Actualmente, el
equipo para esta técnica está comercialmente disponible en IRORI
(La Jolla, California.). O bien, la anterior síntesis descrita puede
ser realizada mediante síntesis en paralelo usando un formato de
placa de 48 ó 98 pocillos en el que cada pocillo contiene una salida
frita para drenar los disolventes y reactivos ("A Practical Guide
to Combinatorial Chemistry", Czarnik y DeWitt, Eds., American
Chemical Society, Washington, D.C., 1997). Robbins (Sunnyvale,
California), Charybdis (Carlsbad, California) y Bohdan (Chicago,
Ill.) actualmente ofrecen el equipo adecuado para esta técnica.
Se describen métodos para rastrear las
bibliotecas según la bioactividad y aislar a miembros de la
biblioteca bioactivos. Las bibliotecas de la presente descripción
pueden ser rastreadas según la bioactividad por una variedad de
técnicas y métodos. Generalmente, el ensayo de rastreo puede ser
realizado (1) poniendo en contacto una biblioteca con C5, o su
fragmento, y permitir que ocurra la unión entre los miméticos de la
biblioteca y la diana, y (2) detectar el acontecimiento de unión
mediante un ensayo apropiado, tal como por un ensayo colorimétrico
descrito por Lam et al. (Nature 354: 8284,
1991) o Griminski et al. (Biotechnology 12:
1008-1011, 1994). Los miembros de la biblioteca
pueden estar en solución y la diana inmovilizada en una fase
sólida. O bien, la biblioteca puede ser inmovilizada en una fase
sólida y puede ser sondada poniendo en contacto con ella la diana
en solución.
Un sistema automatizado para generar y rastrear
una biblioteca de compuestos se describe en las patentes de EE.UU.
Nº. 5.901.069 y 5.463.564. Los intentos más focalizados implican un
rastreo competitivo frente a MAb 137-76, o fabricar
un modelo tridimensional del sitio de unión, y luego fabricar una
familia de moléculas que encajen en el modelo. Éstas son rastreadas
entonces para aquellas con características de unión óptimas.
Además, pueden ser identificadas otras moléculas mediante un ensayo
competitivo, o un rastreo funcional para inhibidores con las mismas
propiedades que MAb 137-76.
Las moléculas de unión de
anti-C5, anticuerpos y fragmentos de esta
descripción pueden ser administrados a pacientes en una formulación
farmacéutica apropiada por una variedad de rutas, incluyendo, pero
sin limitación, infusión intravenosa, inyección de bolo intravenoso
y rutas intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, subcutánea,
intranasal, intratraqueal, intraespinal, intracraneal y oral. Tal
administración les permite unirse al C5 endógeno y así inhibir la
activación de C5.
La dosis preferida estimada de tales anticuerpos
y moléculas está entre 10 y 500 \mug/ml de suero. La dosis actual
puede ser determinada en ensayos clínicos siguiendo una metodología
convencional para determinar las dosis óptimas, es decir,
administrando varias dosis y determinando cuál es la más eficaz.
Las moléculas anti-C5 pueden
funcionar para inhibir la activación del complemento in vivo
y manifestaciones inflamatorias que la acompañan, tales como el
reclutamiento y la activación de macrófagos, neutrófilos, plaquetas,
mastocitos y células endoteliales, edemas y daño de tejidos. Estos
inhibidores pueden usarse para la prevención del rechazo de
xenoinjertos, incluyendo la respuesta DXR/AVR frente a
xenoinjertos.
Las moléculas anti-C5 también
pueden usarse vía diagnóstica para averiguar, o medir, la presencia
de C5 en una muestra de tejido o una muestra de fluido corporal,
tal como suero, plasma, orina o fluido espinal. En esta aplicación,
pueden usarse formatos de ensayo comunes, tales como
inmunohistoquímica o ELISA, respectivamente. Tales pruebas
diagnósticas podrían ser útiles en la determinación de si ciertos
individuos son deficientes en C5 o lo sobreproducen.
La actividad terapéutica de inhibidores de C5
para el tratamiento y la prevención de DXR/AVR en los
xenotransplantes puede ser probada en modelos animales establecidos
(Davis EA et al., Trasplantation 62:
1018-23 (1996); Wang H et al.,
Trasplantation 68: 1644-51 (1999);
Loss M et al., Xenotransplantation 7:
186-96 (2000)).
\vskip1.000000\baselineskip
Se les inyectó a ratones macho A/J (Harlan,
Houston, TX) de 8-12 semanas subcutáneamente 20
\mug de C5 en adyuvante completo de Freund (Laboratorios Difco,
Detroit, MI) en 200 \mul de solución salina tamponada de fosfato
(PBS) pH 7,4. El C5 purificado de plasma humano fue comprado en
Advanced Research Technologies, Inc (San Diego, CA). En intervalos
de dos semanas, a los ratones les fue inyectado dos veces
subcutáneamente 20 \mug de C5 en adyuvante de Freund incompleto
en dos ocasiones. Entonces, dos semanas más tarde y tres días antes
del sacrificio, a los ratones les fue inyectado otra vez
intraperitonealmente 20 \mug del mismo antígeno en PBS. Para cada
fusión, se prepararon suspensiones celulares individuales de bazo de
un ratón inmunizado y se usaron para la fusión con células de
mieloma Sp2/0. 5 x 10^{8} de las Sp2/0 y 5 x 10^{8} de células
de bazo fueron fusionadas en un medio que contenía polietilenglicol
al 50% (P.M. 1450) (Kodak, Rochester, NY) y dimetilsulfóxido al 5%
(Sigma Chemical Co., San Louis, MO). Las células fueron ajustadas
entonces a una concentración de 1,5 x 10^{5} de células de bazo
por 200 \mul de suspensión en medio Iscove (Gibco, Grand Island,
NY), suplementadas con suero bovino fetal del 10%, 100 unidades/ml
de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, hipoxantina 0,1 mM,
aminopterina 0,4 \muM y timidina 16 \muM. Doscientos microlitros
de la suspensión celular fueron añadidos a cada pocillo de
aproximadamente cincuenta placas de microcultivo de 96 pocillos.
Después de aproximadamente diez días, los sobrenadantes del cultivo
fueron retirados para rastrear la reactividad con C5 purificado en
ELISA.
Se revistieron los pocillos de placas de
microensayo de Immulon 2 (Laboratorios Dynatech, Chantilly, VA)
añadiendo 50 \mul de C5 humano purificado en 0,1 \mug/ml
durante la noche a temperatura ambiente. Después de retirar la
solución de revestimiento sacudiendo la placa, se añadieron 200
\mul de BLOTTO (leche seca sin grasa) en solución salina
tamponada de fosfato (PBS) a cada pocillo durante una hora para
bloquear los sitios no específicos. Una hora más tarde, los
pocillos se lavaron entonces con tampón PBST (PBS conteniendo Tween
20 al 0,05%). Se recuperaron cincuenta microlitros de sobrenadantes
del cultivo de cada pocillo de fusión, se mezclaron con 50 \mul
de BLOTTO y luego se añadieron a los pocillos individuales de las
placas de microensayo. Después de una hora de incubación, los
pocillos fueron lavados con PBST. Los anticuerpos murinos ligados
fueron detectados entonces por reacción con IgG antiratón de cabra
conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Fc específico)
(Laboratorios Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) y se diluyeron
a 1:2.000 en BLOTTO. La solución de sustrato de peroxidasa que
contiene
3,3,5,5-tetrametil-benzidina al 0,1%
(Sigma) y agua oxigenada al 0,0003% (Sigma) fue añadida a los
pocillos para el desarrollo del color durante 30 minutos. La
reacción fue terminada por la adición de 50 \mul de
H_{2}SO_{4} 2M por pocillo. La OD a 450 nm de la mezcla de
reacción fue leída con un Lector ELISA de BioTek (Instrumentos
BioTek, Winooski, VT).
Los sobrenadantes del cultivo de los pocillos
positivos fueron probados entonces para detectar la inhibición de
la hemólisis por la ruta clásica de RBC sensibilizados de pollo
mediante suero humano pretitulado (2%) por el método descrito más
abajo. Las células en los pocillos positivos fueron clonadas por
dilución limitante. Se analizaron los MAbs otra vez para detectar
la reactividad con C5 en el ELISA. Los hibridomas seleccionados
fueron cultivados en matraces de agitación y el sobrenadante del
cultivo gastado se recuperó para la purificación del anticuerpo por
cromatografía de afinidad de proteína A. Se probó que cinco MAbs
eran reactivos con C5 humano en ELISA. Estos MAbs se denominan
137-10, 137-21,
137-30, 137-50,
137-76 (Fig. 1). Entre ellos, el MAb
137-76 es el más reactivo con el C5 humano en fase
sólida, mientras que 137-30 es el menos reactivo con
el C5 humano en fase sólida. Estos MAb anti-C5
fueron probados que no eran reactivos con el C5a humano en ELISA.
MAb 13776 no compite con la unión de MAb 137-30
respecto a C5 humano en ELISA, indicando que estos dos anticuerpos
se unen a epítopos distintos en el C5 humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Los MAbs anti-C5 fueron probados
según la inhibición del complemento clásico en ensayos hemolíticos.
En los ensayos, fueron sensibilizados glóbulos rojos de pollo (RBC)
(5 x 10^{7} células/ml) en gelatina/solución salina tamponada con
veronal (GVB^{++}) que contenía MgCI_{2} 0,5 mM y CaCl_{2}
0,15 mM con inmunoglobulinas de RBC antipollo de conejo purificado
a 8 \mug/ml (Inter-Cell Technologies, Hopewell,
NJ) durante 15 minutos a 4ºC. Las células fueron lavadas entonces
con GVB^{++}. Las células lavadas fueron suspendidas de nuevo en
el mismo tampón a 1,7 x 10^{8} células/ml. En cada pocillo de una
placa de microensayo de 96 pocillos de fondo redondo, se mezclaron
50 \mul de suero humano normal (2%) con 50 \mul de GVB^{++} o
se diluyó en serie el MAb de ensayo, después se añadieron 30 \mul
de suspensión de RBC de pollo sensibilizado lavado a los pocillos
que contenían las mezclas. Fueron mezclados cincuenta microlitros de
suero humano normal (2%) con 80 \mul de GVB^{++} para dar la
línea de fondo del color del suero. La mezcla final fue incubada a
37ºC durante 30 minutos. La placa fue sacudida entonces en un
agitador de placas de microensayo durante 15 segundos. La placa fue
centrifugada entonces a 300 x g durante 3 minutos. Los sobrenadantes
(80 \mul) fueron recuperados y se trasladaron a pocillos en
placas de microensayo de fondo plano de 96 pocillos para la medida
de OD a 405 nm. La inhibición en tanto por ciento de la hemólisis se
define como 100 x [(OD_{sin} _{MAb}
OD_{\text{línea de fondo del color del suero}}) (OD_{sin} _{MAb} OD_{\text{línea de fondo del color del suero}})] / (OD_{sin} _{MAb} OD_{\text{línea de fondo del color del suero}}).
OD_{\text{línea de fondo del color del suero}}) (OD_{sin} _{MAb} OD_{\text{línea de fondo del color del suero}})] / (OD_{sin} _{MAb} OD_{\text{línea de fondo del color del suero}}).
La figura 2 muestra los datos que los MAbs
anti-C5 137-10,
137-21, 137-30,
137-50, 137-76 inhiben fuertemente
la hemólisis por la ruta clásica. El MAb antifactor D
166-32 que es específico para la inhibición de la
ruta del complemento alternativa, no inhibe la hemólisis de la ruta
clásica, como se esperaba.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar los efectos de MAb
anti-C5 137-76 en la activación de
C5, se mide la inhibición de la formación de C5a y TCC (complejo
terminal del complemento de C5b-9) en suero humano
activado con zimosan (partícula de levadura) vía la ruta del
complemento alternativa. Las concentraciones diferentes de MAb
anti-C5 137-76 fueron añadidas a
suero humano (10%) activado con zimosan (1 mg/ml). Se usó un MAb
G3-519 control coincidente con isotipo como control
negativo. MAb G3-519 es específico respecto a la
glicoproteína gp120 de cubierta externa del VIH-1 y
no tiene ningún efecto en la actividad del complemento. Los
productos de activación C5a, TCC y C3bBbP fueron medidos por ELISA
cuantitativo. El C5a y TCC son los marcadores específicos para la
activación de C5, mientras que C3bBbP, la convertasa C3/C5
alternativa, para la activación de la ruta del complemento
alternativa. Los ELISA para la determinación de C5a y TCC han sido
descritos detalladamente anteriormente (Bergh K et al.,
J. Immunol. Meth. 152: 79-97 (1992);
Mollnes TE et al., Scand. J. Immunol. 22:
197-202 (1985)). El ELISA para la convertasa C3bBbP
alternativa fue realizado como sigue: Mab de captura inmovilizado
en placas de plástico de microensayo de 96 pocillos era anticuerpo
de properdin antihumano monoclónico de ratón (clon Nº. 2) diluido
1:1000 (Quidel, San Diego, CA). Las muestras de ensayo fueron
diluidas 1:25. La detección se hizo usando C3c antihumano de conejo
policlónico diluido 1:1000 (Behringwerke A/G, Marburg, Alemania), y
luego Ig anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano picante
diluido 1:1000 (Amersham Internacional, Little Chalfont, Reino
Unido).
Los resultados muestran que el MAb
137-76 inhibe completamente la activación de C5,
como se prueba por la inhibición de la producción de los productos
de activación de C5, C5a y TCC (Fig. 3). Por el contrario, el
anticuerpo no tiene ningún efecto en la formación de la convertasa
C3/C5 alternativa C3bBbP, que está corriente arriba de la etapa de
C5 en la cascada del complemento.
\vskip1.000000\baselineskip
La activación de células endoteliales del tipo
II es una característica de DXR/AVR.
La sobre-regulación de la
selectina E en células endoteliales es una de las características de
la activación de células endoteliales del tipo II. Los inventores
examinaron los efectos del MAb anti-C5
137-76 en la sobre-regulación
humana inducida por suero de la selectina E en células endoteliales
aórticas porcinas aisladas (PAEC).
Fueron obtenidas aortas porcinas de un matadero
local (Fellesslakteriet, \diameterkern, Oslo, Noruega). El vaso
fue cortado distal respecto al arco aórtico con unas tijeras
quirúrgicas estériles e inmediatamente fue colocado en un matraz
estéril que contenía tampón de células endoteliales, 2,5 \mug/ml
de anfotericina \beta y 50 \mug/ml de gentamicina. Las aortas
fueron transportadas al laboratorio a los 30 minutos, y se
transfirieron a un segundo matraz que contenía tampón de célula
endotelial recién preparado con antibióticos a 4ºC. Los vasos
intercostales fueron sujetados con pinzas con LigaClip (Compañía
Johnson and Johnson, Ethicon, Cincinnati, OH) antes de que PAEC
fueran aisladas por tratamiento con colagenasa (colagenasa A al 0,1%
(Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), a 37ºC, durante
4-8 minutos). Se suspendieron PAEC aislados en medio
endotelial-SFM (Life Technologies, Paisley,
Escocia), conteniendo suero de ternero fetal al 5% y antibióticos, y
se pusieron en placas en matraces de cultivo (1%) revestidos de
gelatina (25 cm^{2}). El contenido de suero y anfotericina
\beta fue reducido al 1% y 0,5 \mug/ml después de uno y siete
días en cultivo, respectivamente. Los cultivos primarios
subconfluentes se tripsinizaron y se cultivaron hasta la confluencia
en la primera etapa antes de ser congelados para el almacenaje en
alícuotas.
Las PAEC se pusieron en placas de plástico de
microcultivo de 96 pocillos y se cultivaron hasta la confluencia en
suero de ternero fetal al 1% que contenía
Endotelial-SFM, anfotericina \beta a 0,5 \mug/ml
y gentamicina a 50 \mug/ml. Las células se expusieron a 100
\mul/pocillo de suero AB humano reunido al 25-50%
(como una fuente de anticuerpos xeno-reactivos y
complemento) y concentraciones diferentes de MAb
anti-C5 137-76 durante 4 horas a
37ºC. Las células se lavaron con PBS y se fijaron en tampón de
peryodato-lisina-paraformaldehído
al 0,5% durante 10 minutos a 20ºC. Se analizaron diferentes
marcadores de activación por medio de un ELISA basado en células
(CELISA). Para medir la expresión de selectina E, se usó un MAb
frente a selectina E humana (clon 1.2B6, Endogen, Woburn, MA). El
anticuerpo reaccionó específicamente con la selectina E porcina
(Tsang YT et al. "Porcine E-selectin:
cloning and functional characterization". Immunology 85:
140-5 (1995)). Las células fueron incubadas con 50
\mul del MAb anti-selectina E durante 45 minutos
con agitación constante a 20ºC, seguido de tres lavados con PBS. La
Ig antiratón de conejo secundario (Dako, Glostrup, Dinamarca) y la
Ig anticonejo de cerdo conjugada con HRP final (Dako) fueron
aplicadas secuencialmente después de lavar de la misma manera. La
solución de sustrato de peroxidasa (1 \mug/ml
o-fenilendamina en tampón citrato, pH 5,0,
conteniendo H_{2}O_{2} del 0,015%) fue añadida (100
\mul/pocillo) y se desarrolló en la oscuridad a 37ºC durante
10-30 minutos. La reacción del color fue parada con
100 \mul de HCI 1 M, y la OD fue leída con un Contador Multiabel
1420 (Victor, Wallac, Turku, Finlandia) a 490 nm. Las placas de
microtítulo se lavaron posteriormente en agua del grifo, y se
incubaron con violeta de cristal del 0,1% en PBS durante 5 minutos.
Después de un lavado final cuidadoso en agua del grifo, se usaron
100 \mul de ácido acético del 33% para solubilizar la tinción
nuclear y el OD se determinó a 550 nm, representando el recuento de
células real por pocillo. Los datos se representaron como
relaciones de OD a fin de normalizar el número de células presentes
en cada pocillo. Los siguientes controles negativos se incluyeron en
los ensayos: (i) células incubadas con medio solo y teñidas con
antiselectina E y (ii) células incubadas con suero humano y teñidas
con un isotipo y la concentración coincidente con el MAb control.
Las células estimuladas con TNF\alpha fueron usadas como control
positivo.
Los resultados muestran que el MAb
anti-C5 137-76 es muy eficaz en la
inhibición de la activación de células endoteliales tipo II como se
manifiesta por la supresión de la expresión de selectina E en
células endoteliales aórticas porcinas expuestas a suero humano
(Fig. 4).
Claims (22)
1. El uso de un anticuerpo o su fragmento, que
se une a C5 y que inhibe la activación de células endoteliales del
tipo II, para la fabricación de un medicamento para la prevención o
el tratamiento del rechazo de xenoinjertos.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que el
rechazo del xenoinjerto es un rechazo de xenoinjerto retrasado
("DXR") o un rechazo vascular agudo ("AVR").
3. El uso de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que la inhibición de la activación de
células endoteliales del tipo II se manifiesta por la supresión de
la expresión de selectina E.
4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, en el que el anticuerpo o el fragmento inhiben la lisis de
células mediada por el complemento.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4, en el que el anticuerpo o el fragmento inhiben la formación
del complejo terminal del complemento ("TCC").
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, en el que el anticuerpo o el fragmento inhiben la formación
de C5a.
7. El uso de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el anticuerpo o el fragmento se unen al
mismo epítopo en C5 que: (i) el anticuerpo monoclónico MAb
137-76 que se obtiene del hibridoma que tiene el
número de entrada de depósito de ATCC PTA-2581; o
(ii) el anticuerpo monoclónico MAb 137-30 que se
obtiene del hibridoma que tiene el número de entrada de depósito de
ATCC PTA-2582.
8. El uso de la reivindicación 7, en el que el
anticuerpo es un anticuerpo monoclónico MAb 137-76
que se obtiene del hibridoma que tiene el número de entrada de
depósito de ATCC PTA-2581 o es el anticuerpo
monoclónico MAb 137-30 que se obtiene del hibridoma
que tiene el número de entrada de depósito de ATCC
PTA-2582.
9. El uso de un anticuerpo de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo
es un anticuerpo monoclónico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo
Delmmunized®, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
10. El uso de un fragmento de anticuerpo de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el
fragmento de anticuerpo es un Fab, F(ab')_{2}, Fv o
fragmento de Fv de cadena sencilla.
11. El uso de la reivindicación 10, en el que el
fragmento de anticuerpo es un fragmento quimérico, un fragmento
Delmmunized®, un fragmento humanizado o un fragmento humano.
12. Un anticuerpo o su fragmento, que se une a
C5 y que inhibe la activación de células endoteliales del tipo II,
para uso en la prevención o el tratamiento del rechazo de
xenoinjertos.
13. El anticuerpo o el fragmento de la
reivindicación 12, en el que el rechazo de xenoinjertos es un
rechazo de xenoinjerto retrasado ("DXR") o un rechazo vascular
agudo ("AVR").
14. El anticuerpo o el fragmento de la
reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que la inhibición de
la activación de células endoteliales del tipo II se manifiesta por
la supresión de la expresión de selectina E.
15. El anticuerpo o el fragmento de cualquiera
de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el anticuerpo o el
fragmento inhiben la lisis de células mediada por el
complemento.
16. El anticuerpo o el fragmento de cualquiera
de las reivindicaciones 12 a 15, en el que el anticuerpo o el
fragmento inhiben la formación del complejo terminal del complemento
("TCC").
17. El anticuerpo o el fragmento de cualquiera
de las reivindicaciones 12 a 16, en el que el anticuerpo o el
fragmento inhiben la formación de C5a.
18. El anticuerpo o el fragmento de la
reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que el anticuerpo o
el fragmento se unen al mismo epítopo en C5 que: (i) el anticuerpo
monoclónico MAb 137-76 que se obtiene del hibridoma
que tiene el número de entrada de depósito de ATCC
PTA-2581; o (ii) el anticuerpo monoclónico MAb
137-30 que se obtiene del hibridoma que tiene el
número de entrada de depósito de ATCC PTA-2582.
19. El anticuerpo o el fragmento de la
reivindicación 18, en el que el anticuerpo es el anticuerpo
monoclónico MAb 137-76 que se obtiene del hibridoma
que tiene el número de entrada de depósito de ATCC
PTA-2581 o es el anticuerpo monoclónico MAb
137-30 que se obtiene del hibridoma que tiene el
número de entrada de depósito de ATCC PTA-2582.
20. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 18, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclónico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo Delmmunized®, un
anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
21. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 18, en el que el fragmento de anticuerpo
es un Fab, F(ab')_{2}, Fv, o un fragmento de Fv de cadena
sencilla.
22. El fragmento del anticuerpo de la
reivindicación 21, en el que el fragmento del anticuerpo es un
fragmento quimérico, un fragmento Delmmunized®, un fragmento
humanizado o un fragmento humano.
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Families Citing this family (69)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITMI20021527A1 (it) | 2002-07-11 | 2004-01-12 | Consiglio Nazionale Ricerche | Anticorpi anti componente c5 del complemento e loro uso |
| AU2003288472A1 (en) * | 2002-12-02 | 2004-06-23 | Resistentia Pharmaceuticals Ab | Methods and materials for treating inflammatory conditions using a polypeptide comprising a self-C5 amino acid segment and a non-self amino acid segment |
| US20070123466A1 (en) * | 2003-05-13 | 2007-05-31 | New York Society For The Ruptured And Crippled Maintaining The Hospital For Special Surgery | Method of treating recurrent miscarriages |
| ATE498010T1 (de) | 2004-03-01 | 2011-02-15 | Immune Disease Inst Inc | Natürliche igm-antikörper und inhibitoren davon |
| ES2528362T3 (es) * | 2004-05-14 | 2015-02-09 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Prolongación de la supervivencia de un aloinjerto por inhibición de la actividad del complemento |
| US8168584B2 (en) | 2005-10-08 | 2012-05-01 | Potentia Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating age-related macular degeneration by compstatin and analogs thereof |
| AU2013200223B2 (en) * | 2005-11-04 | 2015-08-20 | Genentech, Inc. | Use of Complement Pathway Inhibitors to Treat Ocular Diseases |
| EP3299027A1 (en) * | 2005-11-04 | 2018-03-28 | Genentech, Inc. | Use of complement pathway inhibitors to treat ocular diseases |
| RS53864B1 (sr) | 2006-03-02 | 2015-08-31 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Produžavanje preživljavanja alografta inhibiranjem aktivnosti komplementa |
| PL3167888T3 (pl) | 2006-03-15 | 2024-08-26 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Leczenie pacjentów z napadową nocną hemoglobinurią za pomocą inhibitora dopełniacza |
| ES2892925T3 (es) | 2006-03-31 | 2022-02-07 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Métodos para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos |
| CA2662480C (en) * | 2006-09-05 | 2016-11-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the treatment of antibody mediated neuropathies |
| CN106188303A (zh) | 2006-11-02 | 2016-12-07 | 健泰科生物技术公司 | 人源化的抗‑d因子抗体 |
| PL2148691T3 (pl) | 2007-02-05 | 2015-12-31 | Apellis Pharmaceuticals Inc | Analogi kompstatyny do stosowania w leczeniu stanów zapalnych układu oddechowego |
| CN101874042B9 (zh) | 2007-09-26 | 2019-01-01 | 中外制药株式会社 | 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法 |
| US12492253B1 (en) | 2008-02-25 | 2025-12-09 | Xencor, Inc. | Anti-human C5 antibodies |
| KR102057826B1 (ko) | 2008-04-11 | 2019-12-20 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자 |
| CR20170001A (es) | 2008-04-28 | 2017-08-10 | Genentech Inc | Anticuerpos anti factor d humanizados |
| PY09026846A (es) * | 2008-08-05 | 2015-09-01 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para anticuerpos que se dirigen a la proteína de complemento c5 |
| AU2014201433B2 (en) * | 2008-08-05 | 2016-05-26 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting complement protein C5 |
| EP3912643B8 (en) | 2009-02-13 | 2023-08-23 | Immunomedics, Inc. | Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage |
| EP3009455A1 (en) | 2009-09-16 | 2016-04-20 | Immunomedics Inc. | Class i anti-cea antibodies and uses thereof |
| ES2978177T3 (es) | 2009-12-02 | 2024-09-06 | Immunomedics Inc | Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer |
| TWI812066B (zh) | 2010-11-30 | 2023-08-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體 |
| AU2012250924B2 (en) | 2011-05-02 | 2017-05-25 | Immunomedics, Inc. | Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration |
| CN103796667A (zh) | 2011-06-22 | 2014-05-14 | 艾普莱斯制药公司 | 用补体抑制剂治疗慢性障碍的方法 |
| PE20150159A1 (es) | 2011-12-21 | 2015-02-08 | Novartis Ag | Composiciones y metodos para anticuerpos que actuan sobre el factor p |
| WO2013126006A1 (en) | 2012-02-20 | 2013-08-29 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Polypeptides binding to human complement c5 |
| AU2013302696B9 (en) | 2012-08-14 | 2018-08-09 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease |
| TW201418707A (zh) * | 2012-09-21 | 2014-05-16 | Alexion Pharma Inc | 補體組分ｃ５拮抗劑之篩選分析 |
| ES2879430T3 (es) | 2012-11-15 | 2021-11-22 | Apellis Pharmaceuticals Inc | Análogos de compstatina de acción prolongada y composiciones y métodos relacionados |
| SI2900277T1 (sl) | 2012-12-13 | 2022-05-31 | Immunomedics, Inc. | Odmerki imunokonjugatov protiteles in SN-38 za boljšo učinkovitost in zmanjšano toksičnost |
| EP2975055A4 (en) * | 2013-01-31 | 2016-11-02 | Univ Seoul Nat R & Db Found | C5 ANTIBODIES AND METHOD FOR PREVENTING AND TREATING COMPLEMENT-MEDIATED ILLNESSES |
| WO2014152391A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Apellis Pharmaceuticals, Inc. | Cell-penetrating compstatin analogs and uses thereof |
| AU2014306867B2 (en) | 2013-08-12 | 2017-10-26 | Genentech, Inc. | Compositions and method for treating complement-associated conditions |
| CN105658228B (zh) | 2013-08-28 | 2020-02-07 | 瑞典孤儿比奥维特鲁姆有限公司 | 结合人类补体c5的稳定多肽 |
| MX367423B (es) | 2013-08-28 | 2019-08-21 | Affibody Ab | Polipeptidos de union a c5. |
| WO2015126548A1 (en) | 2014-02-21 | 2015-08-27 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Disease therapy by inducing immune response to trop-2 expressing cells |
| US9139649B2 (en) | 2014-02-25 | 2015-09-22 | Immunomedics, Inc. | Humanized anti-CD22 antibody |
| EP3137503A1 (en) | 2014-05-01 | 2017-03-08 | Genentech, Inc. | Anti-factor d antibody variants and uses thereof |
| WO2015200260A1 (en) | 2014-06-24 | 2015-12-30 | Immunomedics, Inc. | Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis |
| CN117138060A (zh) | 2014-10-07 | 2023-12-01 | 免疫医疗公司 | 抗体-药物缀合物的新辅助剂用途 |
| KR101860280B1 (ko) | 2014-12-19 | 2018-05-21 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법 |
| CN107207607B (zh) | 2014-12-19 | 2021-05-04 | 中外制药株式会社 | 抗-c5抗体及使用方法 |
| CN107428823B (zh) | 2015-01-22 | 2021-10-26 | 中外制药株式会社 | 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法 |
| CN114773470A (zh) | 2015-02-05 | 2022-07-22 | 中外制药株式会社 | 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用 |
| WO2016172427A1 (en) | 2015-04-22 | 2016-10-27 | Immunomedics, Inc. | Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells |
| EP4257134A3 (en) | 2015-06-25 | 2024-01-24 | Immunomedics, Inc. | Combining anti-hla-dr or anti-trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, parp inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer |
| PL3316885T3 (pl) | 2015-07-01 | 2021-12-06 | Immunomedics, Inc. | Immunokoniugaty przeciwciało-sn-38 z linkerem cl2a |
| EP3359555B1 (en) | 2015-10-07 | 2023-12-20 | Apellis Pharmaceuticals, Inc. | Dosing regimens |
| TW201718014A (zh) | 2015-10-12 | 2017-06-01 | 諾華公司 | C5抑制劑於移植相關微血管病之用途 |
| WO2017075252A1 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | Genentech, Inc. | Anti-factor d antibody variant conjugates and uses thereof |
| US10407510B2 (en) | 2015-10-30 | 2019-09-10 | Genentech, Inc. | Anti-factor D antibodies and conjugates |
| ES2984352T3 (es) | 2016-06-14 | 2024-10-29 | Regeneron Pharma | Anticuerpos anti-C5 y usos de los mismos |
| TWI693940B (zh) | 2016-08-05 | 2020-05-21 | 日商中外製藥股份有限公司 | Ｉｌ-８相關疾病之治療用或預防用組成物 |
| IL307593A (en) | 2017-01-31 | 2023-12-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | A pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a c5-related disease and a method for treating or preventing a c5-related disease |
| JP2020516607A (ja) | 2017-04-07 | 2020-06-11 | アペリス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＡｐｅｌｌｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． | 投与レジメンならびに関連組成物および方法 |
| MA51147A (fr) | 2017-12-13 | 2021-03-24 | Regeneron Pharma | Associations d'anticorps anti-c5 et utilisations associées |
| AU2018386304B2 (en) | 2017-12-15 | 2023-12-07 | Apellis Pharmaceuticals, Inc. | Dosing regimens and related compositions and methods |
| KR20200033348A (ko) | 2018-08-01 | 2020-03-27 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | C5-관련 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물 및 c5-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법 |
| CN115068604A (zh) | 2019-07-31 | 2022-09-20 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 通过使用抗c5抗体可伐利单抗来治疗或预防c5相关疾病的剂量和施用方案 |
| WO2021019033A1 (en) | 2019-07-31 | 2021-02-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dosage and administration regimen for the treatment or prevention of c5-related diseases by the use of the anti-c5 antibody crovalimab |
| WO2021067526A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Complement inhibitors for treating drug-induced complement-mediated response |
| CN111171149B (zh) * | 2020-02-23 | 2021-09-07 | 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 | 一种抗补体c5分子的人源化单链抗体及其应用 |
| WO2021231720A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Method of using extracellular vesicles to detect complement activation, and uses thereof to assess and/or monitor treatment of a complement-mediated disease |
| CN114149501B (zh) * | 2020-12-11 | 2023-05-26 | 天士力生物医药股份有限公司 | 抗c5抗体及其应用 |
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| US5506247A (en) | 1988-04-15 | 1996-04-09 | T Cell Sciences, Inc. | Compounds that inhibit complement and/or suppress immune activity |
| US6395888B1 (en) * | 1996-02-01 | 2002-05-28 | Gilead Sciences, Inc. | High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins |
| US5679546A (en) | 1993-09-24 | 1997-10-21 | Cytomed, Inc. | Chimeric proteins which block complement activation |
| AU2191795A (en) * | 1994-03-23 | 1995-10-09 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Method for reducing immune and hemostatic dysfunctions during extracorporeal circulation |
| US6074642A (en) * | 1994-05-02 | 2000-06-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis |
| US5679345A (en) | 1994-06-02 | 1997-10-21 | The Johns Hopkins University | Method for preventing complement-dependent rejection of organ or tissue transplants |
| US5546808A (en) | 1994-09-06 | 1996-08-20 | Harris Instrument Corporation | Apparatus and method for binocular measurement system |
| US5463564A (en) | 1994-09-16 | 1995-10-31 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties |
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