BRPI0709349A2

BRPI0709349A2 - métodos para expansão celular e usos de células e de meios condicionados produzidos através deles para terapia

Info

Publication number: BRPI0709349A2
Application number: BRPI0709349-7A
Authority: BR
Inventors: Shai Meretzki; Zami Aberman; Ora Burger
Original assignee: Pluristem Ltd
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2007-03-22
Publication date: 2011-07-12
Also published as: KR101557256B1; DK2626417T3; US20160022738A1; EP2010647A4; IL236213A; EP2366775A1; EP2366775B1; KR101490449B1; PT2548951E; JP5733894B2; WO2007108003A2; ES2549528T3; EP2626417A1; JP2014088408A; EP3091071A1; CA2646384C; EP2626417B1; KR20140136045A; EP2548951A1; HUE028796T2

Abstract

MéTODOS PARA EXPANSãO CELULAR E USOS DE CéLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVéS DELES PARA TERAPIA, onde é previsto um método de expansão celular; o método compreendendo realizar a cultura de células aderentes de placenta e tecido adiposo sob condições de cultura tridimensional, as quais suportam a expansão celular.

Description

"MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA" CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

presente invenção

refere-se a métodos de expansão celular, populações de células produzidas através deles e usos das mesmas. Especificamente, a presente invenção refere-se a métodos de expansão de células aderentes de placenta e tecidos adiposos (ao longo de todo o PCT) e usos terapêuticos das mesmas, tais como para transplante de céIulas-tronco hematopoiéticas.

No mundo médico emdesenvolvimento, existe uma crescente necessidade de células-tronco adultas em grandes quantidades com a finalidade de realizar enxertos celulares e para engenharia de tecido. Além disso, a terapia com células-tronco adultas está em constante desenvolvimento para tratar e curar várias condições, tais como doenças hematopoiéticas, doenças cardíacas, mal de Parkinson, mal de Alzheimer, derrame, queimaduras, distrofia muscular, doenças auto-imunes, diabetes e artrite.

As células-tronco hematopoiéticas (HSC) são células precursoras que dão origem a todos os tipos de células do sangue tanto da linhagem mielóide como da linhagem linfóide. O enxerto e início da hematopoiese por HSCs dependem da capacidade de essas células aderirem e proliferarem dentro da BM do receptor.É amplamente aceito que as células-tronco estão intimamente associadas in vivo a nichos distintos existentes na medula, os quais oferecem sinais moleculares que mediam coletivamente sua diferenciação e 5 auto-renovação, via contatos célula-célula ou interações de curto alcance. Esses nichos são parte do "microambiente indutivo hematopoiético" (HIM), composto de células da medula, i.e. macrófagos, fibroblastos, adipócitos e células endoteliais. As células da medula mantêm a integridade funcional do HIM oferecendo proteínas de matriz extracelular (ECM) e componentes de membrana basal que facilitam o contato célula-célula. Também fornecem várias citocinas solúveis ou residentes necessárias para a diferenciação e proliferação controladas de células hematopoiéticas. 15 As interações entre HSC e o

estroma são necessárias para preservar a viabilidade das HSCs e evitar sua diferenciação. Depois do transplante de HSCs, as HSCs transplantadas devem aderir ao microambiente da medula óssea (BM) e alojar-se nos nichos apropriados 20 antes de se proliferar e diferenciar. Durante o processo de adesão, as HSCs transplantadas deixam a corrente sangüínea e transmigram seguindo um gradiente de quimiocinas através da barreira de células endoteliais da BM para chegar aos nichos dedicados. As HSCs do doador devem então aderir aos nichos 25 hematopoiéticos nos quais encontram um microambiente mais favorável à divisão de HSC e, onde podem ser estabelecidos contatos físicos e químicos em seqüência contínua entre as HSCs e as células mesenquimais, a ECM e os fatores decrescimento secretados. Todos esses processos envolvem um conjunto complexo de moléculas, tais como citocinas, quimiocinas, hormônios, esteróides, proteínas de matriz extracelular, fatores de crescimento, proteínas de interação célula-a-célula, proteínas de adesão e proteínas de matriz.

o número total de células enxertadas nos nichos dedicados da BM fundamenta o sucesso do transplante de HSCs. Para realizar o enxerto, as HSCs do doador que são transplantadas para a circulação sangüínea 10 devem aderir à medula do receptor na qual geram focos funcionais de hematopoiese. o número desses focos é concluído como o produto do total de HSCs transfundidas multiplicado por sua eficiência de enxerto.

Um dos principais problemas 15 envolvidos no transplante de HSC é a baixa taxa de sobrevivência dessas células no sistema aceitante. Está bem documentado que as HSCs transplantadas por via intravenosa são liberadas da circulação e visualizadas na BM dentro de alguns minutos após sua transfusão. Três a cinco horas após o transplante de HSCs, não são detectadas células do doador no sangue periférico dos receptores [Askenasy e outros 2002 Transplanted hematopoietic cells seed in clusters in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20:301-10]. A vasta maioria das células transplantadas é destruída logo após serem transfundidas. Conseqüentemente, a colonização da medula do receptor é de baixa eficiência e apenas 1-5% das células transfundidas são detectados na BM do receptor 2-3 dias pós-transplante [Kerre e outros 2001 2001 Both CD34+38+and CD34+38- cells home specifically to the bone marrow of NOD/LtSZ scid/scid mice but show different kinetics in expansion. J Immunol. 167:3692-8; Jetmore et al 2002 2002 Homing efficiency, cell cycle kinetics, and survival of quiescent and cycling human CD34(+) cells transplanted into conditioned NOD/SCID recipients. Blood. 99:1585-93].

Células Estromais Mesenquimais (MSCs) constituem uma população de células heterogêneas, capazes de se diferenciar em tipos diferentes de células mesenquimais maduras. A diferenciação dessas células em células endoteliais reticulares, fibroblastos, adipócitos e células precursoras osteogênicas, dependem da influência de vários fatores bioativos.

O uso de MSCs para o suporte do- enxerto de HSC é conhecido na técnica. Várias publicações demonstraram alta eficiência no enxerto de HSC quando co-transplantadas com células-tronco mesenquimais (Gurevitch e outrosl999 1999 Transplantation of allogeneic or xenogeneic bone marrow within the donor stromal microenvironment. Transplantation. 68:1362-8; Fan et al 2001 2001 Successful allogeneic bone marrow transplantation (BMT) by injection of bone marrow cells via portal vein: stromal cells as BMT-facilitating cells. [Stem Cells. 19:144-50]. Também foi demonstrado que o co-transplante de células-tronco mesenquimais humanas em um modelo de enxerto humano-ovelha, resultou na melhora do enxerto de longo prazo de BM quimérica com HSC humana em animais [Almeida-Porada e outros 2000]. O co-transplante de células progenitoras estromaishumanas em ovelha fetal pré-imune resulta no rápido aparecimento de células do doador humano na circulação e aumenta os níveis celulares na medula óssea em pontos posteriores no tempo após o transplante (Blood. 95:3620-7].

Foi descoberto que a injeção simultânea de HSC e de células-tronco mesenquimais acelerou a hematopoiese [Zhang e outros 2004. Stem Cells 22:1256-62], Recentemente, essas descobertas foram estendidas para um modelo animal mais próximo - o macaco Rhesus. Quando HSC haploidênticas e células-tronco mesenquimais foram co-transplantadas, ficou demonstrado o enxerto facilitado de HSC [Liu e outros 2005 Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 26; 385-8]. 0 uso de células-tronco mesenquimais para promover o enxerto de HSC em seres humanos também foi recentemente relatado [Koc ON, J Clin Oncol. 2000;18:307-316; Lazarus HM, Biol Blood Marrow Transplant. 2005 May; 11(5):389-98].

Aparentemente a contribuição das MSCs para o enxerto hematopoiético reside na produção de citocinas de suporte de HSC que ajudam a mediar e equilibrar os potenciais de adesão, auto-renovação e comprometimento das HSCs transplantadas, na reconstrução do microambiente hematopoiético danificado, o que é necessário para a adesão e proliferação das HSCs e inibição das células T originadas no doador, as quais podem, causar a Doença Enxerto-Hospedeiro (GvHD), [Charbord P., e Moore, K., Ann. N.Y. Acad. Sei. 1044: 159-167 (2005); Patentes norte-americanas nos' 6.010.696; 6555374]. Por exemplo, em um estudo de Maitra [Maitra B, et ai., Bone Marrow Transplant. 33 (6) : 597-604 .(2004)], verificou-se que as células-tronco mesenquimais humanas suportam as células-tronco hematopoiéticas do doador não relacionadas e a ativação de célula T suprimida em modelo com camundongos NOD-SCID, demonstrando que as MSCs obtidas da medula óssea humana não relacionadas podem melhorar o resultado do transplante alogênico.

Um obstáculo importante ao uso de MSCs é a dificuldade de isolar grandes quantidades de populações dessas células que ocorrem normalmente, o que é tecnicamente difícil e dispendioso, devido, em parte, à quantidade limitada de células. A fonte mais óbvia de MSCs é a medula óssea, mas o importante desconforto envolvido na obtenção de aspirados da medula óssea e o risco da biópsia servem como inconvenientes para esses métodos. A crença amplamente difundida de que o embrião humano e feto constituem vida independente torna o embrião humano uma fonte problemática de células-tronco, agregando um aspecto religioso e ético às dificuldades logísticas já existentes.

Recentemente, vêm sendo feitas tentativas de encontrar fontes alternativas para extração de células-tronco. Essas fontes alternativas são, por exemplo, o tecido adiposo, folículos capilares, testículos, mucosa olfativa humana, saco vitelino embrionário, placenta, pele adolescente e sangue (por exemplo, sangue do cordão umbilical e até mesmo sangue menstrual). Contudo, a extração de células-tronco das fontes alternativas em quantidades adequadas para fins terapêuticos e de pesquisa ainda é limitada e geralmente trabalhosa, envolvendo, por exemplo,extrair células ou tecidos de um indivíduo doador ou paciente, realizar a cultura e/ou propagação das células in Vitro, dissecação, etc.

A placenta é considerada uma das fontes mais acessíveis de células-tronco que não envolve nenhum desconforto nem limitações éticas. Verificou-se que as MSCs obtidas da placenta possuem propriedades semelhantes às MSCs obtidas da BM. São plástico-aderentes, expressam marcadores de membrana CD105, CD73 e CD90 e não possuem a expressão de moléculas de superfície CD45, CD34, CD14, CD19 e HLA-DR. Contudo, diferentemente das MSCs oriundas da BM, as (PD)-MSCs oriundas da placenta tratadas com interferon-γ diminuíram muito minimamente a expressão HLA-DR. Além disso, as células PD-MSCs demonstram propriedades imunossupressoras que são melhoradas na presença de interferon-γ. (Chang CJ, Yen ML, Chen YC, Chien CC, Huang HI, Bai CH, Yen BL. Placenta-derived Multipotent Cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the present of interferon-gamma. Stem Cells. 2006 Nov;24(11):2466-77.)

Além dos marcadores de MSC, as PD-MSCs demonstram marcadores de superfície ESC únicos de SSEA-4, TRA-1-61 e TRA-1-80 que sugerem que estas podem ser células muito primitivas. (Yen BL, Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M, Shun CT, Yen ML, Lee MC, Chen YC. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 2005/23 (1) :3-9) . Além disso, as PD-MSCs (origem fetal), mas não as MSCs oriundas da BM, são positivas para o antígeno G de leucócito humano intracelular (HLA). ? (ChangCJ, Yen ML, Chen YC, Chien CC, Huang HI, Bai CH, Yen BL. Placenta-derived multipotent cells exhibít immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 2006 Nov; 24 (11) :2466-77.)

Estudos demonstraram que opotencial de expansão das PD-MSCs era significativamente maior do que o das MSCs adultas obtidas da BM (Yen BL., Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M, Shun CT, Yen ML, Lee MC, Chen YC. Isolation of Multipotent cells from Human 10 Term Placenta. Stem Cells. 2005;23 (1) :3-9; M.J.S. de Groot-Swings, Frans H.J. Claas, Willem E. Fibbe and Humphrey H.H. Pierternella S. In't Anker, Sicco A. Scherjon, Carin Kleijburg-van der Keur, Godelieve. Placenta Isolation of Mesenchymal Stem Cells of Fetal or Maternal Origin from 15 Human. Stem Cells,2004;22; 1338-1345) . Além disso, as células aderentes obtidas da placenta podem se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condroblastos. Como as MSCs obtidas da BM, descobriu-se que as MSCs obtidas da placenta suprimem a proliferação de linfócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) sugerindo que o transplante combinado de HSC e (PD)-MSCs obtidas da placenta pode reduzir o potencial da doença enxerto-hospedeiro (GvHD) em receptores [Li CD e outros, Cell Res . Jul; 15(7):539-47 (2005)] e pode melhorar o suporte hematopoiético [Zhang Yi e outros, Chinese Medicai 25 Journal 117(6): 882-887 (2004)]. 0 uso da placenta como fonte de células epiteliais amnióticas é ensinado, por exemplo, em WO 00/73421, mas obter essas células ainda é trabalhoso e a produção de MSCs é muito pequena.9/76

Uma outra maneira de resolver o problema da quantidade limitada de MSCs é a expansão ex-vivo dessas células usando diferentes condições de cultura [por exemplo, Patentes norte-americanas n°s. 6.326.198;

5 6030836; 6555374; 6.335.195; 6.338.942]. Contudo, o inconveniente desses métodos permanece no tempo gasto, procedimentos específicos de seleção e isolamento que exigem, tornando esses métodos caros e fastidiosos.

Verificou-se em vários estudos 10 que a cultura tridimensional (3D) de células é mais eficiente em termos de produção [Ma T, e outros, Biotechnology Progress. Biotechnol Prog 15:715-24 (1999); Yubing Xie, Tissue Engineering 7(5): 585-598 (2001)]. o uso de procedimentos de cultura 3D que imitam o ambiente natural 15 das MSCs é baseado na fertilização dessas células em um biorreator de perfusão contendo espumas poliativas (Wendt, D. e outros, Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)], sustentáculos porosos tubulares de ácido poli-L-lático (PLLA) em um biorreator de perfusão de fluxo radial 20 [Kitagawa e outros, Biotechnology and Bioengineering 93(5);947-954 (2006)] e um biorreator de fluxo constante para o desenvolvimento e expansão de células-tronco hematopoiéticas (Patente norte-americana N0' 6.911.201).

Uma estrutura tridimensional que fixa as células estromais foi sugerida na Patente norte-americana N°" 6.022.743 e esponja de colágeno foi sugerida como matriz 3D em Hosseinkhani, H e outros [Tissue Engineering 11(9-10); 1476-1488 (2005)]. Contudo, o uso deMSCs desenvolvidas nessas condições para suportar o enxerto in vivo de HSCs depois do transplante de HSC, nunca foi sugerido em nenhum desses estudos. Também, foi necessária a otimização demorada de várias condições, por exemplo, condições de perfusão, ou várias técnicas de isolamento para tipos específicos de célula.

Foi sugerido o uso de uma placenta pós-parto perfundida como reator 3D para a realização da cultura de MSCs na Patente norteio americana n°" 7045148 e nos Pedidos de Patente norte-americano nos' 20020123141, 20030032 179 e 2005011871. Contudo, esse procedimento está limitado a até 24 horas depois de a placenta ser isolada e envolve perfusão, portanto, desenvolvimento em massa das 15 células e não é possível sua manutenção por períodos prolongados de tempo.

Existe, então, uma necessidade amplamente reconhecida e seria altamente vantajoso ter novos métodos de expansão celular e usos de células e meios 20 condicionados produzidos através dos mesmos para terapia e que não possuam as limitações acima.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da presente invenção, é previsto um método de expansão celular, o método compreendendo realizar a cultura de células aderentes da placenta ou tecido adiposo sob condições de cultura tridimensional, as quais suportam a expansão celular.De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é previsto um método para produzir um meio condicionado, o método compreendendo: realizar a cultura de células aderentes de uma placenta ou tecido adiposo em condições de cultura tridimensional que permitem a expansão celular; e colher um meio condicionado das células aderentes expandidas, produzindo assim o meio condicionado.

Ainda de acordo com um outro aspecto da presente invenção, é prevista uma população de células geradas de acordo com o método acima.

Ainda de acordo com um outro aspecto da presente invenção, é prevista uma população isolada de células compreendendo células aderentes da 15 placenta ou tecido adiposo, na qual as células aderentes secretam um nível mais elevado de pelo menos um fator selecionado do grupo que consiste de SCF, IL-6 e Flt-3 do que o secretado pelas células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é prevista uma população isolada de células compreendendo células aderentes da placenta ou tecido adiposo, na qual as células aderentes expressam um nível mais elevado de pelo menos uma proteína 25 selecionada do grupo que consiste da família da histona H2A (H2AF), Aldeido desidrogenase X (ALDH X) , fator de alongamento eucariótico de translação 2 (EEEF2), reticulocalbina 3, domínio fixador de cálcio EF-hand (RCN2)e músculo liso básico calponina 1 (CNNl) do que o expressado por células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

De acordo ainda com um aspecto adicional da presente invenção, é prevista uma população isolada de células compreendendo células aderentes da placenta ou tecido adiposo, na qual as células aderentes expressam um nivel mais baixo de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste de ribonucleoproteína nuclear heterogênea Hl (Hnrphl) , precursor CD44 da isoforma 2 do antígeno, 3 fosfoadenosina 5 sintase de fosfossulfato 2 isoforma a (Papss2) e proteína ribossômica L7a (rpL7a) do que o expressado por células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

Ainda de acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é prevista uma população isolada de células aderentes da placenta ou tecido adiposo, na qual as células aderentes são caracterizadas por uma atividade imunossupressora maior do que a das células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

De acordo com outras características dos modos de realização preferidos da invenção descritos abaixo, a atividade imunossupressora compreende redução da proliferação de células T.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é prevista uma composição farmacêuticacompreendendo, como ingrediente ativo, a população de células geradas de acordo com o método acima.

De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é prevista uma composição farmacêutica compreendendo, como

ingrediente ativo, o meio condicionado produzido de acordo com o método acima.

De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é prevista uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, a população de células isolada de acordo com o acima.

De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é previsto um método para tratar uma condição que pode beneficiar-se do transplante de 15 células estromais em um indivíduo com essa necessidade, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficiente de células aderentes de um tecido selecionado do grupo que consiste de placenta e tecido adiposo, tratando desse modo a condição do indivíduo que pode se beneficiar do transplante de células-tronco.

De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é previsto um método para tratar uma condição que pode beneficiar-se do transplante de células estromais em um indivíduo com essa necessidade, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficiente de um meio condicionado de células aderentes obtidas de um tecido selecionado do grupo que consiste de placenta e tecido adiposo, tratando dessemodo a condição do indivíduo que pode se beneficiar do transplante de células-tronco.

De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é previsto um método para reduzir a resposta imunológica de um indivíduo com essa necessidade, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficiente da população isolada de células das reivindicações 3, 4, 5, 6, ou 7, de modo a reduzir a resposta imunológica do indivíduo.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, o indivíduo é tratado com terapia celular.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, o método compreende ainda administrar células-tronco.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células-tronco compreendem células-tronco hematopoiéticas.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células são administradas concomitantemente ao meio condicionado ou células aderentes.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células são administradas em seguida à administração do meio condicionado ou de células aderentes.De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células aderentes são obtidas a partir de uma cultura tridimensional.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células aderentes são obtidas a partir de uma cultura bidimensional.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, a condição é selecionada a partir do grupo de deficiência de células-tronco, doença cardíaca, mal de Parkinson, câncer, mal de Alzheimer, derrame, queimaduras, perda de tecido, perda de sangue, anemia, doenças auto-15 imunes, diabetes, artrite, Esclerose Múltipla, doença enxerto-hospedeiro (GvHD), doenças neurodegenerativas, encefalomielite auto-imune (EAE) , lúpus sistêmico eritematoso (SLE), artrite reumatóide, esclerose sistêmica, síndrome de Sjorgen, esclerose múltipla (MS), Miastenia 20 Gravis (MG), Síndrome de Guillain-Barré (GBS), Tiroidite de Hashimoto (HT), Doença de Graves, Diabetes Melitus Insulino-dependente (IDDM) e Doença Intestinal Inflamatória.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, a cultura tridimensional compreende um biorreator 3D.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidosdescritos, o biorreator é selecionado a partir do grupo que consiste de um biorreator de fluxo constante, um biorreator de tanque de mistura e um biorreator de leito estacionário .

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, a cultura das células é efetuada sob um fluxo contínuo de um meio de cultura.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, a cultura tridimensional compreende um material aderente selecionado a partir do grupo que consiste de um poliéster, um polialquileno, um polifluorcloroetileno, um cloreto polivinílico, um poliestireno, uma polissulfona, um 15 acetato de celulose, uma fibra de vidro, uma partícula cerâmica, matrigel, um componente de matriz extracelular, um colágeno, um ácido lático poli-L e uma fibra metálica inerte.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, a cultura é efetuada por pelo menos 3 dias.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, a cultura é efetuada até que as células aderentes atinjam pelo menos 60% de confluência.De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, a condição pode se beneficiar da facilitação do enxerto de células-tronco hematopoiéticas.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células aderentes compreendem um conjunto de expressões de marcadores positivos selecionadas a partir do grupo que consiste de CD73, CD90, CD29 e CD105.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células aderentes compreendem um conjunto de expressões de marcadores negativos selecionadas a partir do grupo que consiste de CD45, CD80, HLA-DR, CDllb, CD14, CD19, 15 CD34 e CD79.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células aderentes secretam um nível maior de pelo menos um fator selecionado a partir do grupo que consiste de SCF, Flt-3 e IL-6 do que o secretado pelas células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em uma cultura 2D.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos 25 descritos, as células aderentes secretam um nível maior de pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste da família da histona H2A (H2AF), Aldeído desidrogenase X (ALDH X) , fator de alongamento eucarióticode translação 2 (EEEF2), reticulocalbina 3, domínio fixador de cálcio EF-hand (RCN2) e músculo liso, básico, calponina 1 (CNNl) do que o secretado por células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em uma cultura 2D.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células aderentes expressam um nível menor de expressão de pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste de ribonucleoproteína nuclear heterogênea Hl (Hnrphl), precursor CD44 da isoforma 2 do antígeno, 3 fosfoadenosina 5 sintase de fosfossulfato 2 isoforma a (Papss2) e proteína ribossômica L7a (rpL7a) do que o secretado por células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em uma cultura 2D.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células aderentes ou meio são caracterizadas por uma atividade imunossupressora maior do que a . das células aderentes da placenta ou tecido adiposb desenvolvidas em uma cultura 2D.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, a atividade imunossupressora compreende redução da proliferação de células T.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, as células compreendem ter um fenótipo de célula-tronco estromal.De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, o fenótipo de célula-tronco estromal compreende 5 atividade de supressão de células T.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, o fenótipo de célula-tronco estromal compreende a atividade de suporte de células-tronco hematopoiéticas.

De acordo ainda com outras características dos modos de realização preferidos descritos, o uso da população celular descrita acima é para fabricação de um medicamento identificado para transplante.

A presente invenção aborda com sucesso as desvantagens das configurações atualmente conhecidas, fornecendo métodos novos de expansão celular e usos de células e meio condicionado produzido através dos mesmos para terapia.

A menos que definido de modo contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento possuem o mesmo significado normalmente compreendido por uma pessoa com conhecimentos normais da técnica à qual pertence a presente invenção. Embora na prática ou em testes da presente invenção possam ser utilizados métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos, abaixo se encontram descritos métodos e materiais adequados. No caso de conflito, o relatório da patente, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, osmateriais, métodos e exemplos são ilustrativos somente e não se destinam a ser limitadores.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção é aqui descrita, a titulo de exemplo somente, com referência aos desenhos anexos. Agora, com referência especifica aos detalhes dos desenhos, destaca-se que as particularidades ilustradas são dadas a titulo de exemplo e com a finalidade de discussão ilustrativa dos modos de realização preferidos da presente 10 invenção somente e são apresentadas com a intenção de fornecer o que se acredita ser a descrição mais útil e prontamente compreensível dos princípios e aspectos conceituais da invenção. A esse respeito, não se faz nenhuma tentativa de mostrar detalhes estruturais da invenção com 15 mais detalhes do que o necessário para uma compreensão básica da invenção, a descrição tomada com os desenhos tornando evidente aos técnicos no assunto como as várias formas da invenção podem ser realizadas na prática.

Nos desenhos:

as figuras la-g ilustram o microambiente tipo osso criadono sistema do biorreator contendotransportadores 3-D. As Figuras la-b são micrografias por elétron ilustrando a comparação do osso natural (Figura la) e a estrutura do transportador PluriX™3D 7 dias após a fertilização de Células Estromais Aderentes (3D-ASC), imitando o microambiente ósseo (Figura lb) . As figuras lc-f sãomicrografias por elétron ilustrando a matriz PluriX™ 3D fertilizada com 3D-ASC, produzida a partir da medula óssea, 20 dias (Figuras lc-d, ampliadas 150 e 250 vezes, respectivamente) e 40 dias (Figuras le-f, ampliadas 350 e 500vezes, respectivamente) após a fertilização. A Figura Ig é um diagrama do biorreator de fluxo constante Plurix 3D com partes separadas definidas por números:

Reservatório de meio de cultura (1), suprimento de mistura de gás (2),filtro (3), ponto de injeção (4), coluna na qual os transportadores 3D são colocados (5), monitor de fluxo (6), válvula de fluxo (6a), recipiente separador (7), analisadores de crescimento de células (8); bomba peristáltica(9), ponto de amostragem (10), eletrodo de medição de O2 dissolvido (11), eletrodo de medição de pH (12) sistema de controle (13), meio de crescimento fresco (14), meio de crescimento usado (15);

a figura 2 é um gráfico ilustrando diferentes lotes de produção de células estromais aderentes (3D-ASC; Lotes 5-8) obtidas da placenta, desenvolvidas em condições de crescimento 3D dentro dos sistemas de biorreator. As ASCs (2X10"6) foram fertilizadas no biorreator a uma densidade de 10000 - 15000 células / um transportador. Em seguida a uma cultura de 12dias, 3D-ASCs atingiram uma densidade entre 150.000-250.000 células/transportador ou 22,5-37,5 X IO6 em um biorreator contendo 150 transportadores ;

as figuras 3a-b são gráficos de barras ilustrando a diferença dos níveis de expressão dos marcadores de membrana expressos em 3D-ASCs obtidas da placenta (roxo escuro), em comparação aos marcadores de membrana nas células da placenta submetidas à cultura em condições de cultura 2D convencional (roxo claro). As células aderentes foramdesenvolvidas durante 4-6 semanas em frascos (2D) ou durante 2-3 semanas no sistema do biorreator, em transportadores de poliestireno

(3D). Em seguida à extração dos frascos ou transportadores, as células foram incubadas e fixadas a um painel de anticorpos monoclonais (MAb), os quais reconhecem os marcadores de membrana característicos das MSCs (Figura 3a),

ou células hematopoiéticas (Figura 3b). Observe a expressão significativamente mais alta de marcadores de membrana MSC em células de cultura 2D, conforme ilustrado para os marcadores de membrana CD90, CD105, CD73 e

CD29, comparados aos marcadores de membrana MSC expressos em células aderentes de cultura 3D, especialmente CD105, que mostraram 56% deexpressão em células de cultura 3D contra 87% nas células de cultura 2D (Figura 3a) . As ASCs de ambas as culturas 2D e 3D não expressaram nenhum marcador de membrana hematopoiética (Figura 3b);

as figuras 4a-d são gráficos de barra que ilustram uma comparação dos níveis de proteína em ASCs produzidas a partir da placenta submetida à cultura em condições 2D e 3D ou meios condicionados das mesmas. As Figuras 4a-cilustram níveis de ligante Flt-3 (Figura 4a), IL- 6 (Figura 4b) e SCF (Figura 4c) em pg/ml, normalizados para 1 χ IO6 células/ml, conforme analisado por ELISA, nos meios condicionados de ASCs de cultura 2D e 3D. Os resultadosrepresentam um de três experimentos independentes. A Figura 4d ilustra os níveis de expressão de diferentes proteínas celulares, conforme analisado por espectrometria em massa com reagentes iTRAQ, amostras de proteínasrotuladas comparadas entre si. As amostras de proteína foram extraídas das ASCs desenvolvidas sob condições 2D (barras brancas) e 3D (barras cinza) . A figura representa um de dois experimentos replicados. Observe a diferença donível de expressão de algumas das proteínas em células e meios condicionados de condições de cultura 2D e 3D;as figuras 5a-d são micrografias ilustrando a capacidade de diferenciação in vitro das 3D-ASCs obtidas da placenta em osteoblastos. As ASCs obtidas da placenta humana foram submetidas à cultura em um meio de indução osteogênica (DMEM contendo

10% de FCS, 100 nM de dexametasona, 0,05 mM de ácido ascórbico 2-fosfato, 10 mM de B-glicerofosfato) por um período de 3 semanas. As Figuras 5a-b mostram células que expressam matriz calcificada, conforme indicado por

coloração com Vermelho S Alizzarin. As Figuras 5c-d mostram células de controle, as quais não foram tratadas com meio de indução osteogênica e mantiveram um fenótipo tipo fibroblasto e não 15 demonstraram mineralização;

a figura 6 é um gráfico ilustrando a porcentagem de células CD45+ humanas detectadas na medula óssea (BM) de camundongos NOD-SCID tratados com quimioterapia (25 mg/kg de injeções intraperitoneais de bussulfano durante duassemanas consecutivas) 3,5 semanas depois do transplante.

Células CD34+ (100.000) purificadas de células obtidas do sangue do cordão mononuclear foram transplantadas isoladamente (5 camundongos a) ou co- transplantadas com 0,5 χ IO6 células aderentes obtidas da placenta submetidas a condições de cultura 2D (2D-ASC; 2 camundongos, b) , oucélulas aderentes obtidas da placenta submetidas a condições de cultura 3D (3D-ASC) no biorreator PluriX™ (5 camundongos, c). BM foi então coletada do fêmur e tibia dos camundongos. As células humanas da BM foramdetectadas por citometria de fluxo. A porcentagem de CD45 expressando células humanas foi determinada incubando as células com CD45-FITC anti-humano.

Observe a maior porcentagem de células humanas (hCD45+) na medula óssea decamundongos transplantados com 2D-ASC (b) assim como com 3D-ASC (c) em comparação à porcentagem de células humanas nos camundongos tratados com HSCs isoladamente (a). O maior enxerto visto em camundongos tratados com células submetidas àcultura 3D-ASC em comparação a camundongos tratados com células submetidas à cultura 2D-ASC indica uma vantagem terapêutica maior exclusiva das ASCs submetidas à cultura 3D; as figuras 7a-b são análises FACS de enxerto humano decélulas CD45+ em camundongos transplantados com células CD34+ somente (Figura 7a) em comparação a células CD34+ juntamente com tecido adiposo obtido de ASCs (Figura 7b). Observe a porcentagem significativamente maior dapopulação hematopoiética humana (hCD45+) (7a -2 9%) em um camundongo co-transplantado com ASC obtida de tecido adiposo em comparação a umcamundongo tratado com CD34+ humana isoladamente (7b-12%); a figura 8 é um gráfico de barras que ilustra uma reação de linfócitos mistos conduzida entre células mononucleares do sangue do cordão humano (CB) e iguais quantidades de células do sangue do cordão expostas a radiação (3000 Rad) (iCB), monócitos extraídos do sangue periférico humano (PBMC), ASCs placentárias submetidas à cultura 2D ((2D) ou cultura 3D (3D), ou uma combinação de PBMC e ASCs placentárias submetidas à cultura 2D e 3D (PBMC+2D e PBMC+3D). O tamanho da população de células CB é representado pela absorção de 3H-timidina (medida em CPM) que foi medida durante as últimas 18 horas de cultura. A elevação na proliferação estimulada de células CB indica uma resposta imunológica de nível maior. Observe o nível menor de resposta imunológica demonstrado por células incubadas com células aderentes e, em particular, a redução da resposta imunológica de CB às PBMCs quando co-incubadas com células aderentes. Foram feitas três réplicas de cada reação.

DESCRIÇÃO DOS MODOS DE REALIZAÇÃO PREFERIDOS

A presente invenção é de métodos novos para expansão celular e usos de células e meiocondicionado produzidos através dos mesmos para terapia relacionada a células-tronco, enxerto de células-tronco e suporte HSC.

Os princípios e operação da presente invenção podem ser mais bem compreendidos com referência aos desenhos e descrições anexas.

Antes de explicar em detalhes pelo menos um modo de realização da invenção, deve-se compreender que a invenção não está limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição que se segue ou exemplificada pelos Exemplos. A invenção é passível de outros modos de realização ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras. Também, deve-se compreender que a fraseologia e a terminologia são aqui empregadas com a finalidade de descrição e não devem ser consideradas como limitadoras.

No mundo médico emdesenvolvimento, existe uma crescente necessidade de células-tronco e, mais especificamente, células-tronco estromais (também chamadas de "células-tronco mesenquimais") para fins clínicos e de pesquisa. As MSCs são utilizadas para suporte de transplante e enxerto de HSC e também para curar um número crescente de condições, tais como, doenças cardíacas, deficiências BM, doenças neuronais e condições que necessitem de transplante de órgão ou tecido.

Os obstáculos ao uso de células-tronco residem na dificuldade técnica de isolar grandes quantidades de populações de células-tronco ouprogenitoras que normalmente ocorre devido à quantidade limitada dessas células na maioria dos tecidos, o desconforto e o risco envolvidos nos procedimentos para obtenção de células-tronco e a perda que se segue de células B de memória e células-tronco hematòpoiéticas com os atuais procedimentos de extração. Obter células do embrião humano acrescenta um aspecto religioso e ético às dificuldades técnicas já existentes.

Fontes alternativas de células-tronco obtidas da medula óssea incluem tecidos adiposos e placenta. Contudo, atualmente não existem métodos para expansão eficiente de células-tronco desses tecidos.

Durante a colocação da presente invenção em prática, os presentes inventores descobriram que as células aderentes da placenta ou do tecido adiposo podem ser propagadas de maneira eficiente em condições de cultura 3D. De modo surpreendente, os presentes inventores descobriram que essas células compreendem propriedades funcionais semelhantes às das MSCs e, portanto, essas células e o meio condicionado produzido a partir delas, podem ser usados para fins terapêuticos, tais como transplante, regeneração de tecido e suporte HSC in vivo.

Conforme ilustrado aqui abaixo e na parte de Exemplos que se segue, os presentes inventores conseguiram expandir células aderentes obtidas do tecido adiposo e da placenta compreendendo propriedades de células-tronco estromais em configurações 3D. As células assim expandidas foram consideradas viáveis, depois de crio-preservação, conforme evidenciado pelos ensaios de aderência e re-população (veja Exemplo 1). A análise de citometria de fluxo das células aderentes obtidas da placenta descobriu um padrão de expressão de marcador distinto (veja as Figuras 3a-b). Mais importante, as células aderentes obtidas do tecido adiposo e da placenta propagadas em configurações 2D ou 3D eram capazes de suportar enxerto de HSC (veja Exemplo 2), consubstanciando o uso na prática clinica das células da presente invenção como células-tronco estromais.

Assim, de acordo com um aspectoda presente invenção, é previsto um método de expansão celular.

0 método compreendendo a cultura de células aderentes da placenta ou tecido adiposo sob condições de cultura tridimensional (3D) que aceitam expansão celular.

Conforme aqui usados, os termos "expandir" e "expansão" referem-se à manutenção das células substancialmente sem diferenciação e, em última análise, o crescimento celular, i.e., o aumento de uma população de células (por exemplo, pelo menos 2 vezes) sem a diferenciação que acompanha esse aumento.

Conforme aqui usados, os termos "manter" e "manutenção" referem-se à renovação celular substancialmente sem diferenciação, i.e., população celular substancialmente estacionária sem a diferenciação que acompanha essa estacionaridade.

Conforme aqui usada, a frase "células aderentes" refere-se a uma população de célulashomogêneas ou heterogêneas que são dependentes de ancoragem, i.e. necessitam de fixação a uma superfície a fim de crescer in vitro.

Conforme aqui usada, a frase 5 "tecido adiposo" refere-se a um tecido conectivo que compreende células de gordura (adipócitos).

Conforme aqui usado, o termo "tecido placentário" refere-se a qualquer parte do órgão feminino mamífero que reveste a parede do útero e durante a 10 gravidez envolve o feto à qual é preso pelo cordão umbilical. Depois do nascimento, a placenta é expelida (e é chamada de placenta pós-parto).

Conforme aqui usada, a frase "condições de cultura tridimensional" refere-se à disposição das células em condições que sejam compatíveis com o crescimento celular ao mesmo tempo em que permite que as células se desenvolvam em mais de uma camada. É bem reconhecido o ambiente in situ de uma célula em um organismo vivo (ou tecido) como uma arquitetura tridimensional. As células são circundadas por outras células. São mantidas em uma rede complexa de fibras em nano-escala da matriz extracelular que permite o estabelecimento de vários microambientes locais. Seus ligantes extracelulares não realizam somente a mediação da fixação à membrana basal, 25 como também o acesso a uma variedade de vasos vasculares e linfáticos. Oxigênio, hormônios e nutrientes são transportados às células e os produtos residuais são removidos. As condições de cultura tridimensional dapresente invenção são desenvolvidas para imitar esse microambiente como exemplificado abaixo.

Assim, células aderentes deste aspecto da presente invenção são recuperadas de um tecido adiposo ou placentário.

As células placentárias podem ser obtidas a partir de uma placenta a pleno termo ou pré-termo. De preferência, as placentas são recolhidas uma vez tenha cessado o sangramento. A placenta é, de preferência, perfundida por um período de tempo suficiente para remover as células residuais. 0 termo "perfundir" ou "perfusão" aqui utilizado refere-se ao ato de despejar ou passar um fluido sobre ou através de um órgão ou tecido. 0 tecido placentário pode ser de qualquer mamífero, mais preferivelmente o tecido placentário é humano. Uma fonte conveniente de tecido placentário é de uma placenta pós-parto (por exemplo, 1-6 horas), contudo, a fonte de tecido placentário ou de células ou o método de isolar o tecido placentário não é essencial para a invenção.

As células aderentes extraídasda placenta podem ser obtidas tanto das partes da placenta fetal (i.e., âmnio ou partes internas da placenta, veja Exemplo 1) como maternal (i.e. decídua basalis e decídua parietalis). Os espécimes de tecido são lavados em tampão fisiológico (por exemplo, solução salina tamponada por fosfato (PBS) ou tampão de Hank). As suspensões em célula única são feitas tratando o tecido com uma enzima digestiva (veja abaixo) e/ou triturando e escorrendo as partes dotecido em um filtro de nylon ou transferindo suavemente por pipeta (Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA) com o meio de lavagem.

As células aderentes obtidas de tecido adiposo podem ser isoladas por meio de uma variedade de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, esses métodos estão descritos na Patente norte-americana n°' 6.153.432. 0 tecido adiposo pode ser extraído de locais de tecido omental/visceral, mamário, gonadal ou outros locais com tecido adiposo. Uma fonte preferida de tecido adiposo é o tecido adiposo omental. Em humanos, o tecido adiposo é geralmente isolado por lipossucção.

Células aderentes isoladas do tecido adiposo podem ser obtidas tratando o tecido com uma 15 enzima digestiva, como por exemplo, colagenase, tripsina e/ou dispase e/ou concentrações eficientes de hialuronidase ou DNAse; e ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA); a temperaturas entre 25-50°C, por períodos entre 10 minutos e 3 horas. As células podem então ser passadas por um filtro de trama de nylon ou gaze de algodão entre micra a 800 micra. As células são então submetidas à centrifugação diferencial diretamente nos meios ou em Ficoll ou Percoll ou outro gradiente particulado. As células são centrifugadas a velocidades entre 100 e 3000 χ g por períodos entre 1 minuto 25 até 1 hora a temperaturas entre 4-50°C (veja a Patente norte-americana n°" 7.078.230).

Além de células aderentes extraídas da placenta ou tecido adiposo, a presente invençãotambém contempla o uso de células aderentes de outras fontes de células que são caracterizadas pelo fenótipo de células-tronco estromais (como será ainda descrito aqui abaixo). As fontes de tecido das quais podem ser retiradas células aderentes incluem, mas não se limitam ao sangue do cordão, foliculos capilares [por exemplo, conforme descrito no Pedido de Patente norte-americano 20060172304], testículos [por exemplo, conforme descrito em Guan K. e outros, Nature. 2006 Apr 27;440(7088):1199-203], mucosa olfativa humana [por exemplo, conforme descrito em Marshall, CT. e outros, Histol Histopathol. 2006 Jun;21 ( 6) :633-43], saco vitelino embrionário [por exemplo, conforme descrito em Geijsen N, Nature. 2004 Jan 8;427 (6970) :148-54] e líquido amniótico [Pieternella e outros (2004) Stem Cells 22:1338-1345], todos eles conhecidos por incluir células-tronco mesenquimais. Células aderentes dessas fontes de tecido podem ser isoladas realizando a cultura das células em uma superfície aderente, isolando assim as células aderentes de outras células na população inicial.

Independente da origem (por exemplo, placenta ou tecido adiposo), de preferência, a retirada da célula é realizada sob condições estéreis. Assim que as células isoladas são obtidas, permite-se sua adesão a um material aderente (por exemplo, configurado como uma superfície) e, através dele, isolar as células aderentes. Isso pode ser efetuado antes (veja o Exemplo 1) ou concomitantemente à cultura em condições de cultura 3D.

Conforme aqui utilizado, "um material aderente" refere-se a um material não-citotóxico(i.e., biologicamente compatível) sintético, que ocorre normalmente ou uma combinação que possui uma estrutura química (por exemplo, grupos expostos com superfície carregada) capazes de reter as células em uma superfície.

Exemplos de materiais aderentes que podem ser usados de conformidade com este aspecto da presente invenção incluem, mas não se limitam a, um poliéster, um polialquileno, um polifluorcloroetileno, um cloreto polivinílico, um poliestireno, uma polissulfona, um acetato de celulose, uma fibra de vidro, uma partícula cerâmica, matrigel, um componente de matriz extracelular (por exemplo, fibronectina, condronectina, laminina), um colágeno, um ácido lático poli-L e uma fibra de metal inerte.

Outras etapas da purificação ou enriquecimento de células-tronco estromais podem ser realizadas usando métodos que são bem conhecidos na técnica (tais como por FACS usando expressão de marcador de células-tronco estromais, conforme descrito aqui abaixo).

Exemplos não limitadores demeios de base úteis na cultura, de acordo com a presente invenção, incluem Meio Mínimo Essencial Eagle, ADC-1, LPM (Soro Bovino Sem Albumina) , FlO(HAM), F12(HAM), DCCM1, DCCM2, RPMl 1640, Meio BGJ (com e sem Modificação Fitton-Jackson), Meio Basal Eagle (BME-com adição de base de sal de Earle), Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM-sem soro), Yamane, IMEM-20, Meio Eagle de Modificação Glasgow (GMEM) , Meio Leibovitz L-15, Meio 5A de McCoy, Meio M199 (M199E-combase de sal de Earle) , Meio M199 (M199H-com base de sal de Hank) , Meio Mínimo Essencial Eagle (MEM-E-com base de sal de Earle), Meio Mínimo Essencial Eagle (MEM-H-com base de sal de Hank) e Meio Mínimo Essencial Eagle (MEM-NAA com 5 aminoácidos não essenciais), dentre numerosos outros, incluindo meio 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Um meio preferido para uso na presente 10 invenção é DMEM. Esses e outros meios úteis estão disponíveis na GIBCO, Grand Island, N.Y., EUA e Biological Industries, Bet Ha'Emek, Israel, dentre outras. Uma série desses meios se encontra resumida em Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", PP. 62 72, editado por William 15 B. Jakoby e Ira H. Pastan, publicado pela Academic Press, Inc.

o meio pode ser suplementado, por exemplo, com soro, tal como soro fetal bovino ou outras espécies e, opcional ou alternativamente, fatores de crescimento, citocinas e hormônios (por exemplo, hormônio do crescimento, eritropoeitina, trombopoietina, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 7, fator estimulante de colônia de macrófagos, c-kit fator ligante/célula-tronco, ligante de osteoprotegerina, insulina, fatores de crescimento tipo insulina, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento de nervos, fator neurotrófico ciliar, fator de crescimento obtido de plaqueta e proteína morfogenética do osso em concentrações de níveis entre pigograma/ml até miligrama/ml.Ainda é reconhecido que podem ser acrescentados componentes adicionais ao meio de cultura. Esses componentes podem ser antibióticos, antimicóticos, albumina, aminoácidos e outros componentes conhecidos na técnica para a cultura de células. Além disso, podem ser acrescentados componentes para melhorar o processo de diferenciação quando necessário (veja mais abaixo).

Uma vez as células aderentes estejam à mão, podem ser passadas para configurações tridimensionais (veja Exemplo 1 da parte de Exemplos que segue). Será observado, no entanto, que as células podem ser transferidas para uma matriz configurada em 3D, imediatamente após o isolamento (conforme mencionado aqui acima).

Assim, o material aderentedeste aspecto da presente invenção é configurado para cultura 3D, proporcionando assim uma matriz de crescimento que aumenta substancialmente a superfície de fixação disponível para a adesão das células estromais, de modo a 20 imitar a infra-estrutura do tecido (por exemplo, placenta).

Por exemplo, para uma matriz de crescimento de 0, 5mm de altura, o aumento é de um fator de pelo menos 5 a 30 vezes, calculado pela projeção sobre uma base da matriz de crescimento. Esse aumento em um fator 25 de cerca de 5 a 30 vezes é por camada de unidade e se for usada uma pluralidade dessas camadas, seja empilhadas ou separadas por espaçadores ou similar,, o fator de 5 a 30 vezes se aplica a cada uma dessas estruturas. Quando é usadaa matriz em forma de lâmina, de preferência lâminas de fibra não trançada, ou lâminas de polímeros de espuma com poros abertos, a espessura preferida da laminada é de cerca de 50 a 1000 μιη ou mais, sendo prevista a porosidade adequada para entrada das células, entrada de nutrientes e para a remoção de produtos residuais da lâmina. De acordo com um modo de realização preferido, os poros possuem um diâmetro efetivo de 10 μιη a 100 μιη. Essas lâminas podem ser preparadas a partir de fibras de várias espessuras, sendo a espessura de fibra preferida ou faixa de diâmetro de fibra entre cerca de 0,5 μπι e 20 μπι, ainda mais preferíveis são as fibras na faixa de 10 μπι e 15 μπι de diâmetro.

As estruturas da invenção podem ser apoiadas por, ou ainda melhor fixadas a uma lâmina porosa de suporte ou tela proporcionando estabilidade dimensional e resistência física.

Essas lâminas de matriz também podem ser cortadas, perfuradas ou retalhadas para fornecer partículas com área projetada da ordem de cerca de 0,2 mrcr até cerca de 10 mm2, com a mesma ordem de espessura (cerca de 50 a 1000 μια) .

Outros detalhes relativos à fabricação, uso e/ou vantagens da matriz de crescimento que foi usada para colocar a presente invenção em prática são descritos na Patente norte-americana n°" 5.168.085 e, em especial, na patente norte-americana n°' 5.266.476, ambas aqui incorporadas por referência.A superfície aderente pode possuir um formato selecionado do grupo que consiste de quadrados, anéis, discos e cruciformes.

Para produção em alta escala, a cultura é realizada de preferência em um biorreator 3D.

Exemplos desses biorreatores incluem, mas não estão limitados a um biorreator de fluxo constante, um biorreator de tanque de mistura contínua e um biorreator de leito estacionário.

Conforme ilustrado no Exemplo1 da parte de Exemplos, um biorreator de fluxo constante tridimensional (3D) (conforme descrito na Patente norte-americana n°" 6911201) é capaz de suportar o crescimento e manutenção prolongada de células estromais. Nesse biorreator, as células estromais são fertilizadas em transportadores porosos feitos de uma matriz de tecido não trançado de poliéster, embaladas em coluna de vidro, possibilitando desse modo a propagação de grandes números de células em um volume relativamente pequeno.

A matriz usada no biorreatorde fluxo constante pode ser na forma de lâmina, lâminas de tecido não trançado ou lâminas de polímeros com espuma de poro aberto, sendo a espessura preferida da lâmina de cerca de 50 a 1000 μm ou mais, sendo provida porosidade adequada para a entrada da célula, entrada de nutrientes e para a remoção de produtos residuais da lâmina.

Ouros biorreatores 3D podem ser utilizados com a presente invenção e incluem, mas não selimitam a um biorreator de tanque de mistura continua, no qual um meio de cultura é cons tant emente alimentado ao biorreator e um produto é constantemente drenado para manter o estado estável constante no tempo dentro do reator. Um biorreator de tanque de mistura com um cesto de leito fibroso pode ser encontrado, por exemplo, na New Brunswick Scientific Co., Edison NJ. Um biorreator de leito estacionário, um biorreator de suspensão a ar, no qual o ar é geralmente alimentado no fundo de um tubo de corrente de ar central e flui para cima durante a formação de bolhas e desengatando o gás de escape no topo da coluna, um biorreator de perfusão para fertilização de células com espumas poliativas [conforme descrito em Wendt, D. e outros, Biotechnol Bioeng 84:205-214, (2003)], ácido lático poli-L tubular (PLLA), plataformas porosas em um Biorreator de perfusão de fluxo radial [conforme descrito em Kitagawa e outros, Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006). Outros biorreatores que podem ser usados de acordo com a presente invenção estão descritos nas Patentes norte-americanas n°s. 6.277.151, 6.197.575, 6.139.578, 6.132.463, 5.902.741 e 5.629.186.

De preferência, a fertilização celular é efetuada com 100.000-1.5000.000 células/mm por fertilização.

De preferência, as células são extraídas assim que atingirem pelo menos 40% de confluência, 60% de confluência e 90% de confluência, embora depreferência, evitando diferenciação e envelhecimento descontrolados.

A cultura é realizada por pelo menos cerca de 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 20 dias, um 5 mês ou até mais. Será verificado que a cultura em um biorreator pode prolongar esse período. A passagem também pode ser realizada para aumentar o número de células.

As células aderentes da presente invenção compreendem, de preferência, pelo menos um 10 "fenótipo de célula-tronco estromal".

Conforme aqui utilizado, "um fenótipo de célula-tronco estromal" refere-se a um fenótipo estrutural ou funcional típico de uma célula-tronco estromal obtida da medula óssea (i.e. mesenquimal).

Conforme aqui utilizada, afrase "célula-tronco" refere-se a uma célula que não é terminalmente diferenciada.

Assim, por exemplo, as células podem possuir o formato de fuso. Alternativamente ou, além disso, as células podem expressar um marcador ou uma coleção de marcadores (por exemplo, marcador de superfície) típicos das células-tronco estromais. Exemplos de marcadores de superfície de células-tronco estromais (positivos e negativos) incluem, mas não se limitam a CD105+, CE29+, 25 CD44+, CD7 3+, CD90+, CD34-, CD45-, CD80-, CD19-, CD5-, CD20-, CDllB-, CDl4-, CDl9-, CD79-, HLA-DR- e FMC7-. Outros marcadores de células-tronco estromais incluem, mas não se limitam à hidroxilase de tirosina, nestina e H-NF.Exemplos de fenótiposfuncionais típicos das células-tronco estromais incluem, mas não se limitam à atividade de supressão de células T (não estimulam as células T e, inversamente, as suprimem) , atividade de suporte de células-tronco hematopoiéticas, bem como diferenciação adipogênica, hepatogênica, osteogênica e neurogênica.

Quaisquer dessas características estruturais ou funcionais podem ser usadas para qualificar as células da presente invenção (veja Exemplos 1-2 da parte de Exemplos que se segue).

As populações de células geradas de acordo com os presentes ensinamentos são caracterizadas por um perfil único de expressão de proteína, conforme mostrado no Exemplo 1 da parte de Exemplos. Então, por exemplo, as células aderentes da placenta ou tecido adiposo geradas de acordo com os presentes ensinamentos, são capazes de expressar e/ou secretar altos níveis de fatores selecionados. Por exemplo, essas células expressam ou secretam um nível de SCF, Flt-3, H2AF ou ALDH X pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou de preferência 12 vezes maior que o expressado ou secretado pelas células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D. Além disso, ou alternativamente, a população de células da presente invenção secreta ou expressa um nível de IL-6, EEEF2, RCN2 ou CNNl pelo menos 2, 3, ou 5 vezes maior que o expressado ou secretado pelas células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D. Além disso,ou alternativamente, as populações de células da presente invenção são caracterizadas pelo nivel mais baixo de expressão de várias outras proteínas, se comparadas às células de cultura 2D. Assim, por exemplo, secretam ou expressam menos de 0,6, 0,5, 0,25 ou 0,125 do nível de expressão de Hnrphl, precursor CD44 da isoforma 2 do antígeno, Papss2 ou rpL7a expresso ou secretado por células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

Durante a colocação em práticada presente invenção, os presentes inventores perceberam que as células aderentes estromais e, particularmente as 3D-ASCs, demonstraram atividade imunossupressora. Conforme mostrado no Exemplo 3 da parte de Exemplos que se segue, verificou-se que as células estromais aderentes e, especialmente as 3D-ASCs, suprimem a reação imunológica das células mononucleares do sangue do cordão humano em um ensaio MLR. Assim, as células da presente invenção podem compreender atividades biológicas que podem ser preferencialmente utilizadas na prática clínica (por exemplo, atividade de supressão de células T, atividade de suporte de células-tronco hematopoiéticas).

Durante a colocação em prática da presente invenção, os presentes inventores perceberam que o meio condicionado das células da presente invenção pode compreender atividades biológicas que podem ser preferencialmente utilizadas na prática clínica (por exemplo, atividade de supressão de células T, atividade de suporte de células-tronco hematopoiéticas).Portanto, a presente invenção contempla ainda a coleta de meio condicionado e seu uso como está ou em seguida a outras etapas de concentração, enriquecimento ou fracionamento, usando métodos bem conhecidos na técnica. De preferência, um meio condicionado da presente invenção é obtido a partir de uma cultura de células de médio logaritmo de alta viabilidade.

Conforme mencionado aqui acima, as células e os meios condicionados da presente invenção são caracterizados por um fenótipo de células-tronco estromais e como tais podem ser usadas em qualquer pesquisa e aplicação clinica que possa beneficiar-se do uso dessas células.

O enxerto e inicio da hematopoiese pelas HSCs transplantadas dependem de processos complexos que incluem adesão, depois de um gradiente de quimiocinas através da barreira celular endotelial até a medula óssea e alojamento nos nichos apropriados, enquanto são estabelecidos contatos físicos entre as células transplantadas, a ECM e as células mesenquimais dos nichos. Todos esses processos envolvem um conjunto complexo de moléculas, tais como citocinas, hormônios, esteróides, proteínas de matriz extracelular, fatores de crescimento, interação célula-a-célula e proteínas de adesão e proteínas de matriz.

É sabido que apenas 1-5% das HSCs transfundidas são detectadas na BM do receptor 2-3 dias pós-transplante [Kerre e outros, J Immunol. 167:3692-8 (2001); Jetmore e outros, Blood. 99:1585-93(2002)].A contribuição das MSCs para o enxerto hematopoiético é, em parte, pela inibição da produção de células T originadas no doador, as quais causam doença enxerto-hospedeiro [GvHD, Charbord P., e Moore, K., Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 1044: 159-167 (2005); Maitra B. e outros, Bone Marrow Transplant. 33 (6) :597-604 . (2004); Patentes norte-americanas nos' 6.010.696; 6555374]; e em parte por oferecerem um suporte de células-tronco hematopoiéticas (HSC) (i.e., sustentando e auxiliando na proliferação, maturação e/ou adesão das células-tronco hematopoiéticas).

Conforme mostrado no Exemplo 2 da parte de Exemplos que se segue, verificou-se, surpreendentemente, que as células aderentes obtidas da placenta e do tecido adiposo suportavam o enxerto de HSC mesmo depois da quimioterapia.

Dados esses resultados, é concebivel que células ou meios da presente invenção possam ser usados em qualquer aplicação clinica para a qual o transplante de células-tronco estromais seja utilizado.

Portanto, de acordo com um outro aspecto da presente invenção, é previsto um método para o tratamento de uma condição médica (por exemplo, patologia, doença, síndrome) que pode beneficiar-se do transplante de células-tronco estromais em um indivíduo com essa necessidade.

Conforme aqui utilizado, o termo "tratamento" refere-se a inibir ou deter odesenvolvimento de uma patologia e/ou provocar a redução, remissão ou regressão de uma patologia. Aqueles versados na técnica compreenderão que várias metodologias e ensaios podem ser usados para avaliar o desenvolvimento de uma patologia e, de modo semelhante, várias metodologias e ensaios podem ser usados para avaliar a redução, remissão ou regressão de uma patologia. De preferência, o termo "tratamento" refere-se a aliviar ou diminuir um sintoma associado a uma doença cancerosa. De preferência, o tratamento cura, por exemplo, elimina substancialmente os sintomas associados à condição médica.

Conforme aqui utilizada, a expressão "uma condição médica que pode beneficiar-se de transplante de células-tronco estromais" refere-se a qualquer condição médica que pode ser aliviada pela administração de células/meios da presente invenção.

Os termos ou frases "transplante', "substituição celular" ou "enxerto" são aqui utilizados um no lugar do outro e referem-se à introdução das células da presente invenção no tecido alvo.

Conforme aqui utilizado, o termo"indivíduo" refere-se a qualquer indivíduo (por exemplo, mamífero), de preferência um ser humano.

0 método deste aspecto da presente invenção compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficiente das células ou meios da presente invenção (descritos aqui acima), tratando desse modo a condição médica que pode beneficiar-se do transplante de células-tronco estromais no indivíduo.As células que podem ser administradas, de acordo com este aspecto da presente invenção, incluem as células aderentes acima descritas que podem ser submetidas à cultura em configurações bidimensionais ou tridimensionais, bem como células derivadas da mesma, mesenquimais e não mesenquimais, parcial ou terminalmente diferenciadas.

Os métodos para dar origem a células especificas de uma linhagem a partir das células-tronco estromais da presente invenção são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes norte-americanas n°3' 5.486.359, 5.942.225, 5.736.396, 5.908.784 e 5.902.741.

As células podem ser nativas ou geneticamente modificadas, como para dar origem a uma linhagem de interesse (veja o Pedido de Patente norte-americano n°' 20030219423) .

As células e os meios podem ser de fonte autóloga ou não autóloga (i.e. alogênica ou xenogênica) de preparados frescos ou congelados (por exemplo, crio-preservados).

Dependendo da condição médica, o indivíduo pode receber drogas químicas adicionais (por exemplo, imunomoduladores, quimioterapia, etc.) ou células.

Assim, por exemplo, para melhorar o enxerto de células-tronco (por exemplo, aumentar o número de HSCs viáveis na BM do receptor e melhorar favoravelmente o número de glóbulos brancos) as células/meios da presente invenção podem ser administradas antes, concomitantemente ou depois do transplante de HSC.De preferência, as HSCs e células-tronco estromais partilham antigenos HLA comuns. De preferência, as HSCs e células estromais são de um único indivíduo. Alternativamente, as HSCs e células estromais são de indivíduos diferentes.

Os termos ou frases"transplante", "substituição celular" ou "enxerto" são usados um no lugar do outro aqui e referem-se à introdução das células da presente invenção no tecido alvo. As células podem ser obtidas do receptor ou de um doador alogênico ou xenogênico.

Considerando que provavelmente as células não autólogas induzem uma reação imunológica quando administradas no corpo, foram desenvolvidas várias abordagens para reduzir a probabilidade de rejeição de células não autólogas. Estas incluem suprimir o sistema imunológico do receptor ou encapsular as células não autólogas em membranas imunoisolantes, semipermeáveis antes do transplante.

As técnicas de encapsulamentosão geralmente classificadas como microencapsulamento envolvendo pequenos veículos esféricos emacroencapsulamento, envolvendo membranas maiores de lâmina plana e fibra oca (Uludag, H. e outros. Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev. 2000;42:29-64).

Métodos para preparar as microcápsulas são conhecidos na técnica e incluem, porexemplo, aqueles descritos por Luz MZ e outros, Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly (allylamine). Biotechnol Bioeng. 2000, 70:479-83, Chang TM e Prakash S. Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetícally engineered microorganisms. Mol Biotechnol. 2001, 17:249-60 e Lu MZ e outros, a Novel cell encapsulation method using photosensitive poly (allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate). J. Microencapsul. 2000, 17:245-10 51.

Por exemplo, as microcápsulas são preparadas realizando a complexação de colágeno modificado com uma casca de terpolimero de 2-hidroxietil metilacrilato (HEMA), ácido metacrílico (MAA) e metacrilato de metila (MMA) , resultando em uma espessura de cápsula de 2—5 μιη. Essas microcápsulas podem ser ainda encapsuladas com mais cascas de terpolimero de μιη, a fim de proporcionar uma superfície lisa carregada negativamente e minimizar a absorção de proteína no plasma (Chia, S.M. e outros. Multi- layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials. 2002 23: 849-56).

Outras microcápsulas se baseiam no alginato, um polissacarídeo marinho (Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Technol. Ther. 2003, 5:665-8) ou seus derivados. Por exemplo, as microcápsulas podem ser preparadas por complexação de polieletrólito entre os poliânions do alginato de sódio e sulfato de celulose e sódio com policátion hidrocloreto depoli(metileno-co-guanidina) na presença de cloreto de cálcio.

Será observado que o encapsulamento das células é melhorado quando são usadas cápsulas menores. Portanto, o controle de qualidade, estabilidade mecânica, propriedades de difusão e atividades in vitro das células encapsuladas melhoraram quando o tamanho da cápsula foi reduzido de 1 mm para 400 μκι (Canaple L. e outros. Improving cell encapsulation through size control. J. Biomater Sci Polym Ed. 2002;13:7 83-96). Além disso, verificou-se que biocápsulas nanoporosas com tamanho de poro bem controlado, de cerca de 7 nm apenas, químicas adaptadas à superfície e microarquiteturas precisas foram bem sucedidas em imunoisolar microambientes para células (Williams D. Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medicai devices. Med. Device Technol. 1999, 10: 6-9; Desai T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002, 2: 633-46).

Exemplos de agentesimunossupressores incluem, mas não se limitam a metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sais de ouro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximabe (REMICADE), etanercepte, bloqueadores TNF.alfa, um agente biológico que marca uma citocina inflamatória e Droga Antiinflamatória Não Esteróide (NSAIDs). Exemplos de NSAIDs incluem mas não se limitam a ácido acetilsalicílico,salicilato de magnésio colina, diflunisal, salicilato de magnésio, salsalato, salicilato de sódio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, meclofenamato, naproxeno,nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inibidores Cox-2 e tramadol.

Em qualquer dos métodos aqui descritos, as células ou meios podem ser administrados por si ou, de preferência, como parte de uma composição farmacêutica que compreende ainda uma barreira farmaceuticamente aceitável.

Conforme aqui utilizado, o termo "composição farmacêutica" refere-se a uma preparação de um ou mais dos conjugados químicos aqui descritos, com outros componentes químicos, tais como transportadores farmaceuticamente adequados ou excipientes. A finalidade de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um indivíduo.

Daqui em diante, a expressão "transportador farmaceuticamente adequado" refere-se a um transportador ou um diluente que não cause irritação importante em um indivíduo e não anule a atividade biológica e as propriedades do composto administrado. Exemplos, sem limitações, de transportadores são propileno glicol, solução salina, emulsões e misturas de solventes orgânicos com água.

Aqui o termo "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar a administração de umcomposto. Exemplos de excipientes, sem limitação, incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis.

De acordo com um modo de realização preferido da presente invenção, o transportador farmacêutico é uma solução salina aquosa.

Técnicas para formulação e administração de drogas podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição, a qual é aqui incorporada por referência.

Pode-se administrar a composição farmacêutica de maneira sistêmica (conforme detalhado aqui acima). Alternativamente, pode-se administrar a composição farmacêutica localmente, por exemplo, via injeção da composição farmacêutica diretamente em uma região de tecido de um paciente.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas por processos bem conhecidos na técnica, como por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, pulverização, emulsificação, encapsulamento, aprisionamento ou liofilização.

As composições farmacêuticas para uso de acordo com a presente invenção podem, portanto, ser formuladas de maneira convencional, usando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitáveis compreendendoexcipientes e auxiliares, os quais facilitam o processamento dos ingredientes ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.

Para injeção, os ingredientesativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão de sal fisiológico. Para administração transmucosal, são usados penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada na formulação. Esses penetrantes são geralmente conhe3cidos na técnica.

Para qualquer preparação usada nos métodos da invenção, a quantidade terapeuticamente eficiente ou dose pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro e de cultura de célula. De preferência, a dose é formulada em um modelo animal para chegar a uma concentração ou titulação desejada. Essa informação pode ser usada para determinar com maior precisão a dose útil em humanos.

A toxicidade e a eficácia terapêutica dos ingredientes ativos aqui descritos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão in vitro, em culturas de células ou animais experimentais.

Os dados obtidos a partirdesses ensaios in vitro e de cultura de células e estudos animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem pode variardependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual tendo em vista o quadro apresentado pelo paciente 5 (veja por exemplo, Fingi e outros, 1975 em "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 ρ. 1). Por exemplo, o paciente portador de Parkinson pode ser monitorado sintomaticamente em relação à melhora das funções motoras, indicando resposta positiva ao tratamento.

Para injeção, os ingredientes ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão de sal fisiológico. A quantidade e intervalo da

dosagem podem ser ajustados individualmente de acordo com os níveis do ingrediente ativo que são suficientes para regular efetivamente a síntese do neurotransmissor pelas células implantadas. As dosagens necessárias para atingir o efeito desejado dependem de características individuais e da via de administração. Ensaios de detecção podem ser usados para determinar concentrações no plasma.

Dependendo da gravidade e da resposta da condição a ser tratada, a dose pode ser por administração única ou uma pluralidade de administrações, com a duração do tratamento indo desde vários dias até várias semanas ou até ser obtida diminuição do quadro da doença.A quantidade de uma composição a ser administrada, naturalmente, vai depender do indivíduo que está sendo tratado, da gravidade da doença, do modo de administração, do discernimento do médico responsável pela prescrição, etc. A dosagem e o tempo de administração serão correspondentes a um monitoramento cuidadoso e contínuo da alteração da condição individual. Por exemplo, um paciente tratado para Parkinson receberá uma quantidade de células que é suficiente para aliviar os sintomas da doença com base nas indicações do monitoramento.

Em seguida ao transplante, as células da presente invenção sobrevivem, de preferência, na área doente por um período de tempo (por exemplo, pelo menos 6 meses), de modo que seja observado um efeito terapêutico.

As composições incluindo apreparação da presente invenção formuladas em um transportador farmacêutico compatível também podem ser preparadas, colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada.

As composições da presenteinvenção podem, se desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo de aplicação, como por exemplo, um kit aprovado pelo FDA, o qual pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender folha metálica ou plástica, como por exemplo, a embalagem tipo blister. A embalagem ou dispositivo de aplicação pode ser acompanhado de instruções para a administração. A embalagem ou aplicadortambém pode ser acompanhado de um aviso associado ao recipiente na forma prescrita por uma agência governamental reguladora da fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, cujo aviso reflete a aprovação da agência 5 para a forma das composições ou administração humana ou veterinária. Esse aviso, por exemplo, pode ser um rótulo aprovado pela U.S. Food and Drug Administration (Agência Governamental Norte-americana que regula alimentos e Medicamentos) para drogas que necessitam de prescrição, ou 10 um encarte aprovado para o produto.

EXEMPLOS

Agora é feita referência aos seguintes exemplos, os quais juntamente com as descrições acima, ilustram a invenção de maneira não limitadora.

Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais usados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas, de DNA andrecombinante. Essas técnicas são explicadas completamente na literatura. Veja, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook e outros (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., Ed. (1994); Ausubel e outros, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson e outros, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren e outros (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring harborLaboratory press, New York (1998); metodologias definidas nas Patentes norte-americanas nos· 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites e outros (eds), "Basic and Clinicai Immunology" (8a. Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); os imunoensaios disponíveis são amplamente descritos na patente e literatura científica, veja, por exemplo, Patentes norte-americanas ηΟΞ· 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3 . 879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521;"OligonucIeotide Synthesis" Gait, M. J., Ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames , B.D. e Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshmey, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak e outros,"Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) ; todos eles aqui incorporados por referência como se integralmente mencionados. Outras referências gerais são fornecidas aolongo deste documento. Acredita-se que os procedimentos nelas contidos sejam bem conhecidos na técnica e são fornecidos para conveniência do leitor. Todas as informações nelas contidas são aqui incorporadas por referência.

EXEMPLO 1

Produção e cultura de células estromais aderentes (ASC) da medula óssea, placenta e tecidos adiposos

As células aderentes foram 10 submetidas à cultura em um sistema de biorreator contendo transportadores 3D para produzir células 3D-ASC, caracterizadas por um perfil especifico de expressão do marcador de célula. A eficiência de crescimento foi testada através da contagem de células. A capacidade de 15 diferenciação dessas células foi testada por cultura em um meio de diferenciação.

MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Células estromais da medula óssea - As células estromais da medula óssea (BM) foram obtidas por aspiração da medula no esterno de doadores hematologicamente saudáveis que se submeteram a cirurgia de coração aberto ou biópsia de BM. Os produtos aspirados da medula foram diluídos 3 vezes em Solução Salina Balanceada de Hank (HBSS; GIBCO BRL/Invitrogen, Gaithersbur MD) e submetidos à centrifugação de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Robbins Scientific Corp. Sunnyvale, CA). Depois, as células mononucleares da medula (<1,077 gm/cm3) foram coletadas, lavadas 3 vezes em HBSS e recolocadas emsuspensão no meio de crescimento [DMEM (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel) suplementado com 10% de FCS (GIBCO BRL) , IO"4 M mercaptoetanol (Merck, White House Station, NJ), mistura de Pen-Strep-Nystatin (100 U/ml: 100 5 ug/ml: 1,25 um/ml; Beit Ha'Emek), 2 mM de L-glutamina (Beit Ha'Emek); As células dos doadores individuais foram incubadas separadamente em frascos de cultura de tecido (Corning, Acton, MA) a 37°C (5% de CO2) com troca semanal dos meios de cultura. As células foram divididas a cada 3-4 10 dias usando 0,25% de tripsina-EDTA (Beit Ha1Emek). Depois de 2-40 passagens, ao atingir 60-80% de confluência, as células foram coletadas para análise ou para cultura em biorreatores.

Células estromais obtidas da placenta - As partes internas de uma placenta de parto a termo (Bnei Zion Medicai Center, Haifa, Israel) foram cortadas sob condições esterilizadas, lavadas 3 vezes com Tampão de Hank e incubadas por 3 horas a 37°C com 0, 1% de Colagenase (lmg/ml de tecido; Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO). 20 Usando transferência suave por pipeta, as células suspensas foram então lavadas com DMEM suplementado com 10% de FCS, mistura de Pen-Strep-Nystatin (100 U/ml:100 ug/ml: 1,25 un/mil) e 2 mM de L-glutamina, fertilizadas em frascos de 75 cm2 e incubadas a 37°C em uma incubadora de cultura de 25 tecido sob condição umidifiçada com 5% de CO2. Depois, permitiu-se que as células aderissem a uma superfície plástica durante 72 horas após o que os meios foram trocados a cada 3-4 dias. Ao chegar a 60-80% de confluência(geralmente 10-12 dias), as células foram destacadas do frasco de crescimento usando 0,25% de trips"ina-EDTA e fertilizadas em novos frascos. As células da cultura foram depois coletadas para análise ou para cultura em biorreatores.

Células estromais obtidas de tecido adiposo - As células estromais foram obtidas de tecido adiposo humano por procedimentos de lipossucção (Rambam Haifa, Israel). O tecido adiposo foi lavado intensamente com volumes iguais de PBS e digerido a 37°C durante 30 minutos com colagenase (20 mg/ml). As células foram então lavadas com DMEM contendo 10% de FCS, mistura de Pen-Strep-Nystatin (100 U/ml:100 ug/ml: 1,25 un/mil) e L-Glutamina e centrifugadas a 1200 rpm durante 10 minutos RT, colocadas novamente em suspensão com solução para Iise (1:10; Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel, a fim de descartar os glóbulos vermelhos do sangue), centrifugadas e novamente colocadas em suspensão com DMEM contendo 10% de FCS, mistura de Pen-Strep-Nystatin (100 U/ml:100 ug/ml: 1,25 un/mil) e L-Glutamina. As células lavadas foram então fertilizadas em um frasco de meio de cultura de tecido esterilizado a 3-10 X IO7 células/frasco. Nos dias que se seguiram, as células foram lavadas com PBS para remover RBC residual e células mortas. As células foram mantidas a 37°C em uma incubadora de cultura de tecido sob condição umidifiçada com 5% de CO2. O meio foi trocado a cada 3-4 dias. Com 60-80% de confluência, as células foram destacadas do frasco de crescimento usando 0,25% de tripsina-EDTA efertilizadas em novos frascos. Depois de 2-40 passagens, quando as células chegaram a 60-80% de confluência, as células foram coletadas para análise ou para cultura em biorreatores.

Biorreator de Fluxo constante

PluriX™ - O biorreator de fluxo constante PluriX™ (Pluristem, Haifa, Israel; conforme ilustrado na Figura lg, veja também a Patente norte-americana N0' 6.911.201) foi carregado com 1-100 ml de transportadores porosos 3D embalados (4 mm de diâmetro) feitos de uma matriz de tecido não trançado de poliéster. Esses transportadores possibilitam a propagação de grandes números de células em um volume relativamente pequeno. Os objetos de vidro foram desenhados e fabricados pela Pluristem. 0 biorreator foi mantido em uma incubadora a 37°C com velocidade de vazão regulada e monitorada por uma válvula (6a na Figura lg) e bomba peristáltica (9 na Figura lg). 0 biorreator contém um ponto de amostragem e injeção (4 na Figura lg), permitindo a fertilização seqüencial das células. 0 meio de cultura foi 20 fornecido com pH de 6,7-7,4 a partir de um reservatório (1 na Figura lg). 0 reservatório foi abastecido com uma mistura de gás filtrado (2,3 na Figura lg) contendo ar/C02/02 em proporções diferentes, dependendo da densidade das células no biorreator. A proporção de O2 era adequada ao nivel de O2 25 dissolvido na saida do biorreator, determinado por um monitor (6 na Figura lg) . A mistura de gás foi fornecida ao reservatório via tubos de silicone ou difusor (Degania Bet, Emek Hayarden, Israel). o meio de cultura foi passado por umrecipiente separador (7 na Figura lg) que possibilita a coleta de células circulantes, não aderentes. A circulação do meio foi obtida por uma bomba peristáltica (9 na Figura lg) . 0 biorreator era ainda equipado com um ponto de amostragem adicional (10 na Figura lg) e recipientes para troca continua de meio.

Produção de células estromais aderentes 3D (3D-ASC) - Culturas de células 2D aderentes, humanas, primárias, não confluentes, desenvolvidas conforme 10 acima descrito, foram lavadas com tripsina, novamente colocadas em suspensão em DMEM suplementadas com 10% de FBS, mistura de Pen-Strep-Nystatin (100 U/ml:100 ug/ml: 1,25 un/mil) e 2 mM de L-glutamina e fertilizadas (IO3-IO5 células/ml) via um ponto de injeção nos transportadores 3D em um biorreator de fluxo constante estéril (veja. a Figura lg). Antes da inoculação, o biorreator foi enchido com PBS-ca-Mg (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel), colocado em autoclave (120°C, 30 min.) e lavado com meio de crescimento de Dulbecco contendo 10% de soro fetal de bezerro e uma mistura de Pen-Strep-Nystatin (100 U/ml:100 ug/ml: 1,25 un/ml) . o fluxo foi mantido a uma velocidade de 0,1-5 ml/min. O processo de fertilização envolveu a paralisação da circulação durante 2-48 horas, permitindo com isso que as células sedimentassem nos transportadores. 0 biorreator foi mantido em condições controladas de temperatura (37°Cc) e pH (pH = 6,7-7,4); usando uma incubadora abastecida de ar esterilizado e CO2 conforme necessário. O meio de crescimento foi substituído 2-3 vezespor semana. 0 meio de circulação foi substituído por meios frescos DME a cada 4 horas até 7 dias. A uma densidade de 1 χ IO6-I X IO7 células/ml (depois de 12-40 dias de crescimento), o volume total do meio foi removido do biorreator e o biorreator e transportadores foram lavados 3-5 vezes com PBS. As células 3D-ASC foram então destacadas dos transportadores com Tripsina-EDTA; (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel; 3-15 minutos com agitação suave, 1-5 vezes) e foram depois novamente colocadas em suspensão em DMEM e crio-preservadas.

Ensaios biológicos dequalidade 3D-ASC - As células 3D-ASC crio-preservadas foram descongeladas e contadas. Para avaliação da viabilidade celular, foram fertilizadas 2 χ IO5 células em um frasco de cultura de tecido de 150 cm2 e sua capacidade de aderência e re-população foi avaliada dentro de 7 dias depois da fertilização. Depois, o fenótipo do marcador de membrana 3D-ASC foi analisado usando citômetro de fluxo de anticorpos monoclonais por fluorescência (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Comparação entre o perfil do marcador de membrana celular de células aderentes de cultura 3D e 2D usando ensaios de citometria de fluxo - 100.000-200.000 células aderentes de culturas 2D e culturas de sistema de fluxo 3D foram suspensas em 0,1 ml de meio de cultura em um tubo de 5 ml e incubadas (4°C, 30 minutos, condições escuras) com concentrações de saturação de cada um dos seguintes MAbs: CD90 anti-humano FITC conjugado(Chemicon International Inc. Temecula, CA), CD73 anti-humano PE conjugado (Bactlab Diagnostic, Ceasarea, Israel), CD105 anti-humano PE conjugado (eBioscience, San Diego, CA) , CD29 anti-humano FITC conjugado (eBioscience, San Diego, CA) , CD46 anti-humano Cy7-PE conjugado (eBioscience), CD19 anti-humano PE conjugado (IQProducts, Groningen, Holanda), CD14 MAb anti-humano PE conjugado (IQProducts), CDllbO anti-humano FITC-conjugado (IQProducts) e CD34 anti-humano PE conjugado (IQProducts) ou com HLA-DR MAb anti-humano FITC 10 conjugado (IQProducts). Depois da incubação, as células foram lavadas duas vezes em PBS gelado contendo 1% de FCS tornado inativo por calor, novamente colocadas em suspensão em 500 μl de formaldeído 0,5% e analisadas usando o citômetro de fluxo FC-500 (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Comparação entre o perfil de proteína de células aderentes de cultura 3D e 2D usando análise de espectrometria em massa - foram produzidas ASCs por procedimentos de culturas 2D e 3D a partir da placenta, conforme descrito acima. Resumidamente, as culturas 2D foram produzidas pela cultura de células 0,3-0,75 X IO6 em frascos de 175 cm2 durante 4 dias em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37°C até atingir 60-80% de confluência. As culturas 3D foram produzidas fertilizando 2-10 X IO6 células/grama em um biorreator contendo 200 transportadores e realizando a cultura durante 18 dias. Depois da extração, as células foram lavadas (3 vezes) para remover todo soro, granulado e congelado. As proteínas foram isoladas dos grânulos [usando o kit Tri-Reagente (Sigma, Saint Louis, EUA) e digeridas comtripsina e rotuladas com reagente iTRAQ (Applied Biosciences, Foster City, CA)], de acordo com o protocolo dos fabricantes. Resumidamente, os reagentes iTRAQ são reagentes traçadores isobáricos não poliméricos. Os 5 peptideos dentro de cada amostra são rotulados com um de quatro tags isobáricos codificados por isótopo via suas cadeias terminais N e/ou laterais de lisina. As quatro amostras rotuladas são misturadas e os peptideos analisados por espectrometria em massa. Depois da fragmentação dos 10 peptideos, cada tag libera um ion repórter de massa distinto; a relação dos quatro repórteres dá, portanto, abundâncias relativas do peptídeo dado em uma amostra (informações no:

http; //does.appliedbiosystems.com/pebiodocs/0113379.pdf) .

A análise proteômica dacultura 2D contra cultura 3D das ASCs obtidas da placenta foi realizada no centro proteômico Smoler (departamento de biologia, Technion, Haifa, Israel) usando LC-MS/MS em QTOF-Premier (Waters, San Francisco, CA) com identificação e análise feitas pelo software Pep-Miner [Beer, I. e outros, Proteomics, 4, 950-60 (2004)] contra a parte humana da base de dados nr. As proteínas analisadas foram: ribonucleoproteína nuclear heterogênea Hl (Hnrph 1 GeneBank Acesso N0' NP_005511) , família da histona H2A (HEAF., GeneBank Acesso N0' NP_034566.1), fator de alongamento eucariótico de translação 2 (EEEF2, GeneBank Acesso N0' NP 031933.1), reticulocalbina 3, domínio fixador de cálcio EF-hand (RCN2, GeneBank Acesso N0' NP_065701), precursorCD44 da isoforma 2 do antigeno (GeneBank Acesso Nc' NP_0 01001389, músculo liso, básico, calponina 1 (CNN1, GeneBank Acesso N0' NP__001290), 3 fosfoadenosina, sintase de fosfossulfato 2 isoforma a (Papss2, GeneBank Acesso N0' 5 NP_00 4 6 61), proteína ribossômica L7a (rpL7a, GeneBank Acesso N°- NP_000963) e Aldeído desidrogenase X (ALDH X, GeneBank Acesso N0' P47738). Cada experimento foi feito duas vezes. Por causa da natureza da análise, cada proteína foi analisada de acordo com o número de peptídeos que apareceram em uma amostra (2-20 aparecimentos de uma proteína em cada análise).

Comparação entre proteínas secretadas em células aderentes de cultura 3D e 2D usando ELISA - ASCs de procedimentos de cultura 2D e 3D produzidas a partir da placenta, foram produzidas conforme acima descrito, com culturas 3D pela duração de 24 dias. Depois, foram coletados e analisados os meios condicionados para o ligante Flt-3, IL-6, Trombopoietina (TPO) e fator de célula-tronco (SCF), usando ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN), em três experimentos independentes. Os resultados foram normalizados para 1 χ IO6 células/ml.

Meios diferenciadores de osteoblasto - A diferenciação osteogênica foi avaliada por cultura de células em um meio diferenciador de osteoblasto consistindo de DMEM suplementado com 10% de FCS, 100 nM de dexametasona, 0,05 mM de ácido ascórbico 2-fosfato, 10 mM de B-glicerofosfato por um período de 3 semanas. A matriz calcificada foi indicada pela coloração com Vermelho SAlizzarin e a fosfatase alcalina foi detectada pelo kit de teste para fosfatase alcalina (todos os reagentes da Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO). RESULTADOS

o Sistema Biorreator PluriX™cria um microambiente tipo fisiológico.

A fim de produzir condições de cultura eficientes para as células aderentes, foi criado artificialmente um ambiente tipo fisiológico (ilustrado na 10 Figura la) , usando o biorreator PluriX (Pluristerci, Haifa, Israel; transportador ilustrado na Figura Ig e mostrado antes da fertilização na Figura lb) . Conforme mostrado nas Figuras lc-f, as células 3D-ASC produzidas pela medula óssea foram submetidas à cultura com sucesso e expandidas na 15 matriz 3D, 20 dias (Figuras lb-c, ampliadas 150 e 250 vezes, respectivamente) e 40 dias (Figuras lc-d, ampliadas 350 e 500 vezes, respectivamente).

Células cultivadas no sistema Biorreator PluriX foram significativamente expandidas 20 Foram desenvolvidos lotes diferentes de produção de células 3D-ASC obtidas da placenta nos sistemas do biorreator PluriX. A densidade de fertilização foi de 13.300 células/transportador (até um total de 2 χ IO6 células) . Quatorze dias depois da sedimentação, a densidade celular 25 multiplicou 15 vezes, chegando a aproximadamente 200.000 células/transportador (Figura 2) ou 30 X IO6 em um biorreator à densidade de 1,5 X IO4 células/ml e 30 dias depois da fertilização os transportadores continham umnúmero de células 50 vezes maior, i.e. aproximadamente 0,5 χ 10 6 células/transportador, ou 0,5 χ 10 7 células/ml. A densidade celular nos transportadores nos vários níveis da coluna de desenvolvimento era 5 consistente, indicando uma transferência homogênea de oxigênio e nutrientes para as células. 0 sistema de cultura 3D provou, portanto, que oferece condições de suporte para o desenvolvimento e manutenção prolongada de culturas de células mesenquimais de alta densidade, 10 as quais podem ser desenvolvidas eficientemente até uma quantidade suficiente com a finalidade de suportar o enxerto e transplante bem sucedido.

3D-ASCs mostram

características únicas de marcador de membrana - A fim de 15 estabelecer a diferença do perfil de secreção de moléculas solúveis e produção de proteínas, efetuada pelo procedimento de cultura 3D que imita o ambiente ósseo, foi realizada a análise FACs. Conforme mostrado na Figura 3a, a análise FACS dos marcadores de célula ilustra que as 3D-ASCs exibem um 20 padrão de expressão de marcador diferente do que as células aderentes desenvolvidas em condições 2D. As células de cultura 2D expressaram níveis significativamente maiores de marcadores de membrana positiva CD90, CD105, CD73 e CD29 em comparação às células de cultura 3D. Por exemplo, CD105 25 mostrou uma expressão de 56% em células de cultura 3D contra 87% em células de cultura 2D. ASCs de ambas as culturas de placenta 2D e 3D não expressaram nenhum marcador de membrana hematopoiético (Figura 3b).3D-ASCs mostram um perfil único de fatores solúveis - 0 nicho hematopoiético inclui células de suporte que produzem uma abundância de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. A fim de definir mais a diferença entre as ASCs de cultura 2D e 3D, o perfil das quatro principais proteínas hematopoiéticas secretadas nos meios condicionados de culturas de ASC 2D e 3D foi obtido por ELISA. As Figuras 4a-c mostram que o desenvolvimento das células em condições 3D produziu meio condicionado com níveis maiores de ligante Flt-3 (Figura 4a), IL-60 (Figura 4b) e SCF (Figura 4c), enquanto foram detectados níveis baixos de IL-6 e nível de ligante Flt-3 próximo de zero nos meios condicionados das culturas 2D. A Produção de Trombopoietina (TPO) foi muito baixa e igual em ambas as culturas.

3D-ASCs mostram um perfil único de proteína na análise de espectrometria em massa - A fim de estabelecer mais a diferença entre as ASCs de cultura 2D e 3D, o perfil de proteína dessas células foi analisado por espectrometria em massa. A Figura 4d mostra que as ASCs de cultura 2D e 3D demonstram um perfil de expressão de proteína notavelmente diferente. Conforme mostrado na Tabela 1 abaixo, as células de cultura 3D mostram um nível de expressão muito maior de HWAF e ALDH X (mais de 9 e 12 vezes maior, respectivamente) e um nível maior das proteínas EEEF2, RCN2 e CNNl (cerca de 3, 2,5 e 2 vezes, respectivamente). Além disso, as células de cultura 3D mostram cerca de metade dos níveis de expressão dasproteínas Hnrphl e precursor CD44 da isoforma 2 do antígeno e cerca de um terço dos níveis de expressão de Papss2 e rpL7a.

Tabela 1

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3D-ASCs têm a capacidade dediferenciar em osteoblastos - A fim de caracterizar mais as 3D-ASCs, as células foram submetidas à cultura em um meio diferenciador de osteoblasto por um período de 3 semanas. Depois, foi realizada precipitação de cálcio. As células diferenciadas mostraram que produzem cálcio (ilustrado em vermelho nas Figuras 5a-b), enquanto as células de controle mantiveram um fenótipo tipo fibroblasto e não demonstraram mineralização (Figuras 5c-d). Esses resultados mostram que 3D-ASCs obtidas da placenta têm a capacidade de diferenciar in vitro em células de osteoblastos.

EXEMPLO 2

Avaliação da Capacidade das 3D-ASCs obtidas da placenta de melhorar o enxerto HSC

0 suporte 3D-ASC do enxerto HSC foi avaliado pelo nível de células hematopoiéticashumanas (hCD45+) detectadas em camundongos NOD-SCID imuno-deficientes previamente tratados com quimioterapia ou expostos letalmente a radiação.

MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Isolamento de CD34+Células

Amostras de sangue do cordão umbilical foram retiradas sob condições estéreis durante o parto (Bnei Zion Medicai Center, Haifa, Israel) e as células mononucleares foram fracionadas usando o Lymphoprep (Axis-Shield PoC AS, Oslo, Noruega), com configuração de gradiente de densidade e foram crio-preservadas. As células mononucleares descongeladas foram lavadas e incubadas com anticorpos anti-CD34 e isoladas usando midi MACS (Miltenyl Biotech, Bergish Gladbach, Alemanha). Células de mais de uma amostra foram reunidas para atingir a quantidade desejada (50.000-100.000 células).

Detecção de células transplantadas em camundongos expostos a radiação - Camundongos NOD-SCID macho e fêmea com sete semanas de idade (N0D-CB17-Prkdcscid/J; Harlan/ Weizmann 2Inst., Rehovot Israel) foram mantidos em gaiolas de sistema aberto esterilizadas, receberam dietas estéreis e água ácida purificada por autoclave. Os camundongos foram sub-letalmente expostos a radiação (350 cGy) e depois (48 horas pós-irradiação) transplantados com 50.000-100.000 células hCD34 +' com ou sem ASCs adicionais (0,5 X IO6 - 1 X IO6) obtidas da placenta ou tecido adiposo (3-7 camundongos em cada grupo), por injeção intravenosa em uma veia lateral do rabo. Quatro a seis semanas depois do transplante oscamundongos foram sacrificados por deslocamento e a BM coletada lavando o fêmur e a tibia dos animais com tampão FACS (50 ml PBS, 5 ml FBS, 0,5 ml de sódio azid 5%). Foram detectadas células humanas na BM dos camundongos por citometria de fluxo e a porcentagem das células de expressão do marcador de células hematopoiéticas CD45 humana e murina nos camundongos NOD-SCID tratados foi calculada incubando as células com CD45-FITC anti-humano (IQ Products, Groningen, Holanda). O limite mais baixo para enxerto humano ineguívoco foi designado em 0,5%.

Detecção de células

transplantadas em camundongos tratados com quimioterapia -camundongos NOD-SCID, machos, com 6,5 semanas de idade (NOD.CBl7/JhkiHsd-scid; Harlan, Rehovot Israel), mantidos conforme descrito aqui acima para os camundongos expostos a radiação, foram injetados intraperitonealmente com Bussulfano (25 mg/kg durante 2 dias consecutivos). Dois dias depois da segunda injeção de Bussulfano, os camundongos foram injetados com células CD34+ isoladamente, ou juntamente com 0,5 X IO6 ASCs produzidas a partir da placenta. Três semanas e meia após o transplante, os camundongos foram sacrificados e foi determinada a presença de células hematopoiéticas humanas, conforme descrito aqui acima, para os camundongos expostos a radiação.

RESULTADOS

3D-ASC melhoraram o enxerto de HSC em camundongos expostos a radiação - Células hematopoiéticas humanas CD34 + e 3D-ASC obtidas da placentaou tecido adiposo foram co-transplantadas em camundongos NOD-SCID expostos a radiação. A eficiência do enxerto foi avaliada 4 semanas depois do co-transplante e comparada aos camundongos transplantados com HSC isoladamente. Conforme mostrado na Tabela 2 e Figura 6, o co-transplante de 3D-ASC e células UCB CD34+ resultou em taxas consideravelmente mais elevadas de enxerto e níveis mais altos de células humanas na BM dos camundongos receptores comparados aos camundongos tratados com células UCB CD34+ isoladamente.

Tabela 2

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3D-ASC melhoraram o enxerto deHSC em camundongos tratados com quimioterapia - Células hematopoiéticas humanas CD34+ foram co-transplantadas com 500.000- 2D-ASC ou 3D-ASC obtidas da placenta em camundongos NOD-SCID previamente tratados com quimioterapia. A eficiência do enxerto foi avaliada 3,5 semanas depois do co-transplante e comparada aos camundongos transplantados com HSC isoladamente. Conforme mostrado na Tabela 3, o co-transplante de ASC e células UCB CD34+ resultou em níveis maiores de enxerto na BM dos camundongos receptores em comparação às células UCB CD34+ isoladamente. Além disso, como mostrado na Tabela 3, o nível médio de enxerto foi maior em camundongos co-transplantados com células aderentes obtidas da placenta desenvolvidas no sistema biorreator PluriX (3D-ASC) do que no co-transplante de camundongos comcélulas do mesmo doador, desenvolvidas em condições de cultura 2D estática convencionais (frasco).

Tabela 3

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Os resultados da análise FACS mostrados nas Figuras 7a-b demonstram a vantagem de co-transplantar ASC com hHSCs (Figura 7b) e a capacidade de ASC de melhorar a recuperação do sistema hematopoiético após o transplante HSC.

Tomados em conjunto, esses resultados mostram que as ASCs podem servir como células de suporte para melhorar a recuperação hematopoiética após o transplante de HSCs (autólogas ou alogênicas). A capacidade de as 3D-ASCs melhorarem o enxerto de células-tronco hematopoiéticas e/ou progenitoras após o transplante de HSCs pode resultar da capacidade de as 3D-ASC secretarem citocinas de suporte HSC que podem melhorar a adesão, a capacidade de auto-renovação e proliferação das células transplantadas, ou da capacidade dessas células reconstruírem o microambiente hematopoiéticodanificado, o que é necessário para a adesão e proliferação das HSCs transp1antáveis.

EXEMPLO 3

A supressão da resposta do linfócito por ASCs de cultura 2D e 3DVerificou-se que as células estromais aderentes e, particularmente 3D-ASCs, suprimem a reação imunológica de células mononucleares do sangue do cordão humano em um ensaio MLR.

MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Ensaio de reação delinfócitos mistos (MLR) - As propriedadesimunossupressoras e imunoprivilegiadas de procedimentos de cultura 2D e 3D, as ASCs produzidas da placenta, foram verificadas pelo ensaio MLR, o qual mede a histocompatibilidade no local HLA, conforme efetuado pela taxa de proliferação de linfócitos incompatíveis na cultura misturada de células responsivas (de proliferação) e estimulantes (não proliferativas). Foram usadas células mononucleares do sangue de cordão (CB) humano (2 X IO5) e foram estimuladas por meio da co-cultura com iguais quantidades (IO5) dos monócitos obtidos do sangue periférico humano (3000Rad) expostos a radiação (PBMC) ou com células aderentes de cultura 2D ou 3D produzidas a partir da placenta, ou uma combinação de células aderentes e PBMCs. Cada ensaio foi replicado três vezes. As células foram submetidas à co-cultura durante 4 dias em meio RPMI 1640 (contendo 20% FBS em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37°C) , em uma placa com 96 furos. As placas foram submetidas à vibração com ΙμΟ 3H-timidina durante as últimas 18 horas de cultura. As células foram então coletadas em filtro de fibra de vidro e a absorção de timidina foi quantificada com um contador de cintilação.RESULTADOS

A Figura 8 mostra a resposta imunológica das células CB conforme representado pela proliferação elevada dessas células quando estimuladas com PBMCs, o que, sem ser garantido pela teoria, está provavelmente associado à proliferação de células T em resposta à incompatibilidade HLA. Contudo, um nivel consideravelmente menor de resposta imunológica foi demonstrado por essas células quando incubadas com as células aderentes da presente invenção. Além disso, a resposta imunológica CB para PBMCs foi substancialmente reduzida quando co-incubadas com essas células aderentes. Assim, de maneira semelhante às MSCs, verificou-se que as ASCs têm a capacidade potencial de reduzir a proliferação de células T das células do doador, típica de GvHD. Embora ambas as culturas, 2D e 3D, tenham reduzido a resposta imunológica dos linfócitos e, em linha com as outras vantagens das 3D-ASCs descritas aqui acima, as 3D ASCs foram mais imunossupressoras.

Observa-se que certas características da invenção, as quais, para fins de clareza, são descritas no contexto dos modos de realização separados, também podem ser previstas em combinação em um modo de realização único. Inversamente, várias características da invenção, as quais, para fins de concisão, são descritas no contexto de um modo de realização único, também podem ser previstas separadamente ou em qualquer sub-combinação adequada.Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com modos de realização específicos da mesma, é claro que muitas alternativas, modificações e variações se tornarão evidentes para os técnicos no assunto. Conseqüentemente, a invenção destina-se a abranger todas essas alternativas, modificações e variações que se enquadram no espírito e amplo escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente e números de Acesso ao GenBank mencionados neste relatório são aqui incorporados em sua integralidade por referência no relatório como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual ou número de Acesso ao GenBank fosse específica e individualmente indicado para ser aqui incorporado por referência. Além disso, a menção ou identificação de qualquer referência neste pedido não deverá ser interpretada como uma admissão de que essa referência está disponível como anterioridade à presente invenção.

Claims

1 . "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo um método para expansão celular, onde o método é caracterizado por realizar a cultura de células aderentes da placenta ou tecido adiposo sob condições de cultura tridimensional, as quais suportam a expansão celular.

2. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo um método para produção de um meio condicionado, o método sendo caracterizado por compreender:(a) a cultura de células aderentes de uma placenta ou tecido adiposo em condições de cultura tridimensional que permitem expansão celular; e (b) coletar um meio condicionado de ditas células aderentes expandidas, produzindo desse modo o meio condicionado.

3. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", caracterizado por compreender uma população de células geradas de acordo com o método da reivindicação 1.

4 . "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo uma população isolada de células, caracterizada pelo fato de prever células aderentes da placenta ou tecido adiposo, na qual ditas células aderentes secretam um nível maior de pelomenos um fator selecionado a partir do grupo que consiste de SCF, IL-6 e Flt-3 do que o secretado pelas células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

5. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO 5 CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo uma população isolada de células, caracterizada pelo fato de prever células aderentes da placenta ou tecido adiposo, na qual ditas células aderentes expressam um nivel maior de pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste da família da histona H2A (H2AF) , Aldeído desidrogenase X (ALDH X) , fator de alongamento eucariótico de translação 2 (EEEF2), reticulocalbína 3, domínio fixador de cálcio EF-hand (RCN2) e calponina 1 músculo liso, básico (CNNl) do que o expressado por células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

6. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo uma população isolada de células, caracterizada pelo fato de prever células aderentes da placenta ou tecido adiposo, na qual ditas células aderentes expressam um nível menor de pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste de ribonucleoproteína nuclear heterogênea Hl (Hnrphl), precursor CD44 da isoforma 2 do antígeno, 3 fosfoadenosina 5 sintase de fosfossulfato 2 isoforma a (Papss2) e proteína ribossômica L7a (rpL7a) do que oexpressado por células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

7. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA",compreendendo uma população isolada de células compreendendo células aderentes da placenta ou tecido adiposo, na qual ditas células aderentes são caracterizadas por uma atividade imunossupressora 10 maior do que a das células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

8. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA",compreendendo a população isolada de células de acordo com o reivindicado em 7, caracterizada pelo fato de que a dita atividade imuno s sup r e s s o r a compreende redução da proliferação de células T.

9. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo uma composição farmacêutica, caracterizada por ter como ingrediente ativo, a população de células geradas de acordo com a reivindicação 1.

10. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo uma composição farmacêutica, caracterizada por ter comoingrediente ativo, o meio condicionado produzido de acordo com a reivindicação 2.

11. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo uma composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender como ingrediente ativo, a população isolada de células das reivindicações 4, 5, 6 ou 7.

12. "MÉTODOS PTVRA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo um método para tratar uma condição que pode beneficiar-se do transplante de células estromais em um indivíduo com essa necessidade, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficiente de células aderentes de um tecido selecionado do grupo que consiste de placenta e tecido adiposo, tratando desse modo a condição que pode beneficiar-se do transplante de células-tronco no indivíduo.

13. "MÉTODOS PARA EXPANSÃOCELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo um método para tratar uma condição que pode beneficiar-se do transplante de células estromais em um indivíduo com essa necessidade, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficiente de um meio condicionado de células aderentes obtidas de um tecido selecionado do grupoque consiste de placenta e tecido adiposo, tratando a condição que pode beneficiar-se do transplante de células-tronco no indivíduo.

14. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO 5 CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo um método para reduzir a resposta imunológica de um indivíduo com essa necessidade, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo uma quantidadeterapeuticamente eficiente da população isolada de células das reivindicações 3, 4, 5, 6 ou 7, de modo a reduzir a resposta imunológica do indivíduo.

15. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo 0 método da reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é tratado com terapia celular.

16. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo fato de se administrar ainda células-tronco.

17. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método da reivindicação 16, caracterizado pelo fato que as ditas células-tronco compreendem células-troncohematopoiéticas.

18. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método da reivindicação 16, caracterizado pelo fato de queas ditas células-tronco são administradas concomitantemente a dito meio condicionado ou células aderentes.

19. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo ométodo da reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as ditas células-tronco são administradas em seguida à administração de dito meio condicionado ou células aderentes.

20. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método das reivindicações 12 e 13, caracterizado pelo fato de que as ditas células aderentes são obtidas a partir de uma cultura tridimensional.

21. "MÉTODOS PARA EXPANSÃOCELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método das reivindicações 12 e 13, caracterizado pelo fato de que as ditas células aderentes são obtidas a partir de uma cultura bidimensional.

22. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo ométodo das reivindicações 12 e 13, caracterizado pelo fato de que dita condição é selecionada a partir do grupo que consiste de deficiência de células-tronco, doença cardíaca, mal de Parkinson, câncer, mal de Alzheimer, derrame, queimaduras, perda de tecido, perda de sangue, anemia, doenças auto-imunes, diabetes, artrite, Esclerose Múltipla, doença enxerto-hospedeiro (GvHD), doençasneurodegenerativas, encefalomielite auto-imune (EAE), lúpus sistêmico eritematoso (SLE), artrite reumatóide, esclerose 10 sistêmica, síndrome de Sjorgen, esclerose múltipla (MS), Miastenia Gravis (MG), Síndrome de Guillain-Barré (GBS), Tiroidite de Hashimoto (HT), Doença de Graves, Diabetes Melitus Insulino-dependente (IDDM) e Doença Intestinal Inflamatória.

23. -"MÉTODOS PARA EXPANSÃOCELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método ou população de células das reivindicações 1, 2, 3 ou 20, caracterizados pelo fato de que dita cultura tridimensional compreende um biorreator 3D.

24. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método da reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que dito biorreator é selecionado a partir do grupo que consiste de um biorreator de fluxo constante, um biorreator com tanque de mistura contínua e um biorreator de leito estacionário.

25. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método ou população de células das reivindicações 1, 2, 3 ou 20, caracterizados pelo fato de que dita cultura de ditas células é realizada sob um fluxo continuo de um meio de cultura.

26. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método ou população de células das reivindicações 1, 2, 3 ou 20, caracterizados pelo fato de que dita cultura tridimensional compreende um material aderente selecionado do grupo que consiste de um poliéster, um polialquileno, um polifluorcloroetileno, um cloreto polivinilico, um poliestireno, uma polissulfona, um acetato de celulose, uma fibra de vidro, uma partícula cerâmica, matrigel, um componente de matriz extracelular, um colágeno, um ácido lático poli-L e uma fibra metálica inerte.

27. "MÉTODOS PARA EXPANSÃOCELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método ou população de células das reivindicações 1, 2, 3 ou 20, caracterizados pelo fato de que dita cultura é realizada por pelo menos 3 dias.

28. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo ométodo ou população de células da reivindicação 21, caracterizados pelo fato de que dita cultura é realizada por pelo menos 3 dias.

29. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método ou população de células das reivindicações 1, 2, 3 ou 20, caracterizados pelo fato de que dita cultura é realizada até que ditas células aderentes atinjam pelo menos 60% deconfluência.

30. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo os métodos das reivindicações 12 e 13, caracterizados pelo fatode que a condição pode beneficiar-se da facilitação do enxerto de células-tronco hematopoiéticas.

31. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo os métodos, população de células ou meio das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 20, caracterizados pelo fato de que ditas células aderentes compreendem um conjunto de expressões de marcador positivo selecionado a partir do grupo que consiste de CD73, CD90, CD29 e CD105.

32. "MÉTODOS PARA EXPANSÃOCELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo os métodos, população de células ou meio das reivindicações 1,- 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 20, caracterizados pelo fato de que ditas células aderentes compreendem um conjunto de expressões de marcador negativo selecionado a partir do grupo que consiste de CD45, CD80, HLA-DR, CDllb, CD14, CD19, CD34 e CD79.

33. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo os métodos, população de células ou meio das reivindicações 1, 2, 3, ou 20, caracterizados pelo fato de que ditas células aderentes secretam um nivel maior de pelo menos um fator selecionado do grupo que consiste de SCF, Flt-3 e IL- 6 do que o secretado pelas células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2 D.

34. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo os métodos, população de células ou meio das reivindicações 1, 2, 3, ou 20, caracterizados pelo fato de que ditas células aderentes expressam um nivel maior de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste da família da histona H2A (H2AF), Aldeído desidrogenase X (ALDH X), fator de alongamento eucariótico de translação 2 (EEEF2), reticu1ocaIbina 3, domínio fixador de cálcio EF-hand (RCN2) e calponina 1músculo liso, básico (CNNl) do que o secretado por células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

35. "METODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo os métodos, população de células ou meio das reivindicações 1, 2, 3, ou 20, caracterizados pelo fato de que ditas células aderentes expressam um nivel menor de pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste de ribonucleoproteína nuclear heterogênea Hl (Hnrphl), precursor CD44 da isoforma 2 do antígeno, 3 fosfoadenosina 5 sintase de fosfossulfato 2 isoforma a (Papss2) e proteína ribossômica L7a (rpL7a) do que o secretado por células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

36. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo os métodos, população de células ou meio das reivindicações 1, 2, 3, ou 20, caracterizados pelo fato de que ditas células aderentes ou meio são definidos por uma atividade imunossupressora maior do que a de células aderentes da placenta ou tecido adiposo desenvolvidas em cultura 2D.

37. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo a população isolada de células da reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que dita atividade imunossupressora compreende redução da proliferação de células T.

38. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO 5 CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método ou população de células das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, -6, 7, 12 ou 13, caracterizados pelo fato de que ditas células compreendem células que possuem um fenótipo de célula-tronco estromal.

39. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método da reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que dito fenótipo de célula-tronco estromal compreende atividade de supressão de célula T.

40. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOS PRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo o método da reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que dito fenótipo de célula-tronco estromal compreende atividade de suporte de célula-tronco hematopoiética.

41. "MÉTODOS PARA EXPANSÃO CELULAR E USOS DE CÉLULAS E DE MEIOS CONDICIONADOSPRODUZIDOS ATRAVÉS DELES PARA TERAPIA", compreendendo uso da população de células das reivindicações 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado por servir para fabricação de um medicamento identificado para transplante.