ES2629003T3 - Células de tejido de cordón umbilical humano como tratamiento para la enfermedad de alzheimer - Google Patents

Abstract

Composición para utilizarse en la reducción de la formación de placas o la disminución de las placas en un paciente con Alzheimer, que comprende una población homogénea de células aisladas procedentes de tejido de cordón umbilical humano, en la que las células pueden obtenerse de tejido de cordón umbilical humano sustancialmente exento de sangre, son capaces de autorrenovarse y proliferar en cultivo, tienen cariotipos normales y mantienen cariotipos normales durante los pases, y en la que las células expresan cada uno de los marcadores CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C y no producen CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 ni HLA-DR,DP,DQ.

Description

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enfermedad de Alzheimer puede diagnosticarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluida la medición de beta amiloide y tau, o sus precursores, fragmentos o compuestos metabólicos en el LCR. La enfermedad de Alzheimer también puede diagnosticarse mediante la medición de isoprostanos en los fluidos del individuo, incluidos orina y sangre. Otros métodos de diagnóstico pueden incluir el uso de técnicas obtención de imágenes del cerebro, por ejemplo, la resonancia magnética (RM) para examinar la atrofia cerebral, la tomografía por emisión de positrones (TEP) para obtener imágenes de las placas y los ovillos de la enfermedad de Alzheimer, y RM funcional (RMf) para medir los niveles de oxígeno en sangre en el hipocampo o en otras áreas de memoria y/o aprendizaje del cerebro.

El tipo exacto de células que componen la población de células administradas está en función del criterio del profesional sanitario. En una forma de realización, las células administradas son células de origen posnatal. En algunas formas de realización, las células de origen posnatal proceden de tejido placentario humano, y en otras formas de realización las células de origen posnatal proceden de tejido de cordón umbilical. En otra forma de realización, las células administradas son células madre. En una forma de realización preferente, las células son hUTC. Más adelante se hace una descripción detallada de los tipos de células adecuados para la presente invención.

La población de células puede administrarse en, cerca de o lejos de una zona del cerebro donde las placas se han acumulado en el, o adyacentes al, tejido neural de un individuo. Tales zonas del cerebro pueden incluir cualquiera implicada en la memoria y el aprendizaje, incluidas pero no limitadas a, la amígdala, el cuerpo estriado, cuerpos mamilares tales como el hipocampo y el diencéfalo, la corteza temporal, el tálamo, el hipotálamo, la corteza periférica y el neocórtex. El sitio de administración exacto puede ser cualquiera que el profesional sanitario determine como el más eficaz. En otra forma de realización, la población de células se administra directamente al LCR.

La administración de células puede hacerse mediante cualquier medio que el profesional sanitario determine como el más eficaz, y puede incluir el uso de un catéter, jeringa, shunt, estent, microcatéter, bomba, implantación con un dispositivo o implantación con un andamiaje. Además, la administración de células puede ser mediante suministro intranasal, suministro intravascular, inyección intracerebral e inyección intraventricular. En una forma de realización, la población de células puede administrarse en una sola inyección. En algunas formas de realización, la población de células se administra más en más de una inyección. En otra forma de realización, se utiliza una bomba para asegurar la administración lenta y continua de la población de células.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden la población de células pueden formularse como líquidos, semisólidos (por ejemplo, geles) o sólidos (por ejemplo, matrices, andamiajes y similares). Las composiciones líquidas se formulan para la administración por cualquier vía aceptable conocida en la técnica para conseguir suministrar la población de células a los tejidos neurales diana. Por lo general, estas incluyen la inyección

o infusión, ya sea de manera difusa, o dirigida al sitio de la formación de la placa neurítica. Por ejemplo, en una forma de realización, la población de células se administra por inyección estereotáxica directa, por ejemplo, aguja. La aguja puede tener cualquier tamaño que facilite el desplazamiento de las células a través del orificio hueco. La aguja puede insertarse directamente a través de un orificio en el cráneo, a través del tejido neural del cerebro al sitio neural de interés, o, como alternativa, la aguja puede utilizarse con un dispositivo que ayude a guiar la aguja hasta el sitio de tejido, tal como, por ejemplo, un alambre guía. La aguja y el dispositivo de guía pueden montarse previamente o enviarse al facultativo cualificado, el propio facultativo cualificado puede montar el dispositivo justo antes o durante el uso.

En una forma de realización alternativa, puede utilizarse un catéter portador para suministrar la población de células, y puede insertarse en un dispositivo de inserción que facilite la introducción, por ejemplo, por inyección, de las células en los sujetos. Tales dispositivos de introducción incluyen tubos, por ejemplo, catéteres, para inyectar células y fluidos en el cuerpo de un sujeto receptor. En una forma de realización, las células de la invención pueden introducirse en el sujeto en un lugar deseado utilizando una micropipeta. Las células de la invención pueden insertarse en un dispositivo de inserción de este tipo, por ejemplo, una micropipeta o jeringa, en forma de solución, por ejemplo, una suspensión de células. Además, las células de la invención pueden administrarse en un canal de guía (por ejemplo, canales de guía de poliacrilonitrilo/cloruro de polivinilo (PAN/PVC)), tales como los descritos en Bunge et al., J. Neurology, 1994; 241:536.

La población de células o las composiciones y/o matrices que comprenden las células pueden suministrarse al sitio mediante un microcatéter, intracateterización o mediante una minibomba. El excipiente o vehículo puede ser cualquiera de los conocidos por ser farmacéuticamente aceptable para la administración a un paciente, en particular localmente en el sitio en el que va a inducirse la diferenciación celular.

Medios acondicionados y lisados celulares

En una forma de realización, el medio acondicionado se administra al individuo además de, o en lugar de, las células. En otra forma de realización, el lisado celular se administra al individuo además de, o en lugar de, las

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células. En otra forma de realización, el medio acondicionado y el lisado celular se administran al individuo además de, o en lugar de, las células.

El medio acondicionado procedente de las PPDC cultivadas puede utilizarse in vitro e in vivo. El uso del medio acondicionado de PPDC u otro medio acondicionado puede permitir que los factores tróficos beneficiosos secretados por las PPDC sean utilizados alogénicamente en un paciente sin introducir células intactas que podrían desencadenar el rechazo, u otras respuestas inmunitarias adversas. El medio acondicionado se prepara cultivando las células en un medio de cultivo, a continuación, eliminando las células del medio.

El medio acondicionado preparado a partir de la población de células de origen posnatal puede utilizarse tal cual, concentrarse adicionalmente, por ejemplo, mediante ultrafiltración o liofilización, o incluso secarse, purificarse parcialmente, combinarse con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica, o combinarse con otros compuestos tales como productos biológicos, por ejemplo composiciones de proteínas farmacéuticamente útiles. El medio acondicionado puede utilizarse in vitro o in vivo, en solitario o combinado con células vivas autólogas o singénicas, por ejemplo. El medio acondicionado, si se introduce in vivo, puede introducirse localmente en un sitio de tratamiento, o en un lugar alejado para proporcionar el desarrollo celular o los factores tróficos necesarios a un paciente.

Según formas de realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso estable y escalable para fabricar medios acondicionados de hUTC con concentración reducida de suero. En resumen, el método incluye el cultivo de hUTC en condiciones de concentración reducida de suero. Posteriormente, las hUTC se lavan y se cultivan en medio basal sin suero. Después de aproximadamente 24 horas, se recoge el medio acondicionado, se filtra y se concentra mediante el uso de una membrana con un tamaño de poro de aproximadamente 5 kDa o de peso molecular similar.

Las células procedentes de tejido umbilical humano (hUTC) pueden aislarse siguiendo los métodos descritos en las publicaciones de patente estadounidenses nº 2005/0054098 y nº 2005/0058631. A continuación, las células aisladas pueden cultivarse en cultivo estático siguiendo los métodos que se describen en las publicaciones de patente estadounidenses nº 2005/0054098 y nº 2005/0058631 hasta el momento en el que se prepara el medio acondicionado.

El medio acondicionado puede prepararse en cualquier duplicación de la población de células. En otra forma de realización, el medio acondicionado se prepara a partir de aproximadamente la duplicación de la población 20 hasta aproximadamente la duplicación de la población 44. En otra forma de realización, el medio acondicionado se prepara en aproximadamente la duplicación de la población 30.

El medio acondicionado se prepara aislando primero las células de un medio de cultivo convencional en el que se cultivaban las células. A continuación, las células se siembran en cultivo estático a cualquier densidad de siembra. En una forma de realización, las células se sembraron a una densidad de aproximadamente 1.000 células por cm cuadrado a aproximadamente 10.000 células por cm cuadrado. En otra forma de realización, las células se sembraron a una densidad de aproximadamente 5.000 células por cm cuadrado.

Después de la siembra de células, aproximadamente a 5.000 células/cm2, se priva progresivamente a las células del medio de cultivo convencional que tiene un contenido de suero bovino de aproximadamente un 15% reduciendo el contenido de suero bovino en el medio en incrementos hasta que las células se cultivan sólo en medio basal. El suero bovino puede reducirse en incrementos de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 60%. En una forma de realización, el suero bovino se reduce en incrementos de aproximadamente un 50% (es decir, suero bovino al 15%, 7,5%, 3,25% y 0% en el medio). Se deja que las células se desarrollen en cada medio con concentración reducida de suero durante aproximadamente 1 a aproximadamente 3 pases. En una forma de realización, las células se cultivan en cada medio con concentración reducida de suero durante aproximadamente 2 pases. Antes de añadir el medio con concentración reducida de suero bovino final, las células se siembran a aproximadamente 10.000 células/cm2. Cuando se añade a las células el medio basal (suero bovino al 0%), las células se mantienen en el medio durante no más de 24 horas.

A continuación, el medio acondicionado se aísla de las células y se filtra utilizando un filtro de aproximadamente 0,22 micras o similar. El filtro puede estar esterilizado o no. A continuación, el medio acondicionado filtrado se concentra utilizando un filtro con un tamaño de poro de aproximadamente 5K o un dispositivo similar. El filtrado se desecha, mientras que el medio acondicionado concentrado retenido en el filtro se recoge.

En otra forma de realización, las hUTC aisladas se cultivan en cultivo en perlas microtransportadoras siguiendo los métodos que se describe en la publicación de patente estadounidense nº 2008/0166328 (véanse los Ejemplos), hasta el momento en que se prepara el medio acondicionado.

El medio acondicionado puede prepararse en cualquier duplicación de la población de células. En otra forma de realización, el medio acondicionado se prepara a partir de aproximadamente la duplicación de la población

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El tejido posparto que comprendía una placenta entera o un fragmento o sección de la misma se desagrega mediante fuerza mecánica (trituración o fuerzas de cizallamiento). El procedimiento de aislamiento también puede utilizar un proceso de digestión enzimática. Se sabe en la técnica que muchas enzimas son útiles para el aislamiento de células individuales a partir de matrices tisulares complejas para facilitar el desarrollo en cultivo. Las enzimas de digestión van desde débilmente digestivas (por ejemplo, desoxirribonucleasas y la proteasa neutra, dispasa) hasta fuertemente digestivas (por ejemplo, papaína y tripsina), y están disponibles en el mercado. Una lista no exhaustiva de enzimas compatibles con la presente invención incluyen actividades enzimáticas mucolíticas, metaloproteasas, proteasas neutras, serín-proteasas (tales como tripsina, quimotripsina o elastasa), y desoxirribonucleasas. Actualmente resultan preferentes las actividades enzimáticas seleccionadas de entre metaloproteasas, proteasas neutras y actividades mucolíticas. Por ejemplo, se sabe que las colagenasas son útiles para aislar diversas células de los tejidos. Las desoxirribonucleasas pueden digerir ADN monocatenario y pueden minimizar la formación de agregados celulares durante el aislamiento. Los métodos preferentes implican el tratamiento enzimático, por ejemplo con colagenasa y dispasa, o colagenasa, dispasa y hialuronidasa. En determinadas formas de realización, en la etapa de disociación se utiliza una mezcla de colagenasa y la proteasa neutra dispasa. Las formas de realización más específicas emplean la digestión en presencia de al menos una colagenasa de Clostridium histolyticum, y cualquiera de las actividades proteasa, dispasa y termolisina. Otras formas de realización más emplean la digestión con actividades enzimáticas tanto colagenasa como dispasa. También se utilizan métodos que incluyen la digestión con una actividad hialuronidasa además de las actividades colagenasa y dispasa. El experto entenderá que muchos de tales tratamientos enzimáticos son conocidos en la técnica para el aislamiento de células a partir de diversas fuentes de tejido. Por ejemplo, las mezclas de enzimas para la disociación de tejido comercializadas con el nombre comercial LIBERASE™ (Roche, Indianapolis, IN) son adecuadas para utilizarse en los presentes métodos. Se conocen otras fuentes de enzimas, y el experto también puede obtener tales enzimas directamente a partir de sus fuentes naturales. El experto también está bien preparado para evaluar enzimas nuevas o adicionales o combinaciones de enzimas por su utilidad para el aislamiento de las células de la invención. Los tratamientos enzimáticos preferentes tienen una duración de 0,5, 1, 1,5 o 2 horas o más. En otras formas de realización preferentes, el tejido se incuba a 37°C durante el tratamiento enzimático de la etapa de disociación.

En algunas formas de realización de la divulgación, el tejido posparto se separa en secciones que comprenden diversos aspectos del tejido, tales como los aspectos neonatal, neonatal/materno y materno de la placenta, por ejemplo. A continuación, las secciones separadas se disocian mediante disociación mecánica y/o enzimática según los métodos descritos en el presente documento. Las células de linaje neonatal o materno pueden identificarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, mediante análisis del cariotipo o hibridación in situ para la detección de un cromosoma Y.

Los métodos para la selección del medio de cultivo más apropiado, la preparación del medio y las técnicas de cultivo celular son bien conocidos en la técnica y se describen en diversos fuentes, incluidas Doyle et al., (eds.), 1995, CELL & TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley & Sons, Chichester; y Ho y Wang (eds.), 1991, ANIMAL CELL BIOREACTORS, Butterworth-Heinemann, Boston.

Después de cultivar las células aisladas o los fragmentos de tejido durante un período de tiempo suficiente, las células de origen posnatal se habrán multiplicado, ya sea como resultado de la migración desde el tejido posparto o de la división celular, o de ambos. En algunas formas de realización de la divulgación, las células de origen posnatal se someten a pases o se llevan a un recipiente de cultivo separado que contiene medio recién preparado que contiene el mismo medio o un tipo de medio diferente al utilizado inicialmente, en el que la población de células puede hacerse proliferar por mitosis. Las células de la invención pueden utilizarse en cualquier momento entre el pase 0 y la senescencia. Preferentemente, las células se someten a pases entre aproximadamente 3 y aproximadamente 25 veces, más preferentemente se someten a pases de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 veces, y preferentemente se someten a pases 10 u 11 veces. Puede realizarse la clonación y/o subclonación para confirmar que se ha aislado una población clonal de células.

En algunos aspectos de la divulgación, los diferentes tipos de células presentes en el tejido posparto se fraccionan en subpoblaciones a partir de las que pueden aislarse las células de origen posnatal. El fraccionamiento o la selección pueden llevarse a cabo mediante técnicas convencionales de separación de células, incluidas pero no limitadas al tratamiento enzimático para disociar el tejido posparto en sus células componentes, seguido de clonación y selección de tipos de células específicos, incluidos pero no limitados a la selección basada en marcadores morfológicos y/o bioquímicos; cultivo selectivo de las células deseadas (selección positiva), destrucción selectiva de las células no deseadas (selección negativa); separación basada en la aglutinabilidad celular diferencial en la población mixta como, por ejemplo, con aglutinina de soja; procedimientos de congelación-descongelación; propiedades de adherencia diferencial de las células en la población mixta; filtración; centrifugación convencional y zonal; elutriación centrífuga (centrifugación contracorriente); separación a gravedad unitaria; distribución a contracorriente; electroforesis; y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se describen técnicas adecuadas de selección clonal y separación de células en Freshney, 1994, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, 3ª ed., Wiley-Liss, Inc., Nueva York.

El medio de cultivo se cambia según sea necesario, por ejemplo, aspirando cuidadosamente el medio de la placa, por ejemplo, con una pipeta, y volviéndolo a abastecer de medio recién preparado. Se sigue incubando hasta

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que se acumula en la placa un número o densidad suficiente de células. Las secciones de tejido explantado original pueden eliminarse y las células restantes tripsinizarse mediante técnicas convencionales o con un rascador de células. Después de la tripsinización, las células se recogen, se llevan a un medio recién preparado y se incuban como anteriormente. En algunas formas de realización, el medio se cambia al menos una vez aproximadamente 24 horas después de la tripsinización para eliminar las células flotantes. Se considera que las células que permanecen en el cultivo son células de origen posnatal.

Las células de origen posnatal pueden crioconservarse. Por consiguiente, en una forma de realización preferente que se describe con mayor detalle más adelante, las células de origen posnatal para la transferencia autóloga (ya sea para la madre o el bebé) pueden proceder de tejidos posparto apropiados tras el nacimiento de un bebé, a continuación crioconservarse de manera que estén disponibles en caso de que más adelante se necesiten para la administración.

Las células de origen posnatal pueden caracterizarse, por ejemplo, mediante sus características de desarrollo (por ejemplo, capacidad de duplicación de la población, tiempo de duplicación, pases hasta la senescencia), un análisis del cariotipo (por ejemplo, cariotipo normal; linaje materno o neonatal), citometría de flujo (por ejemplo, análisis FACS), inmunohistoquímica y/o inmunocitoquímica (por ejemplo, para la detección de epítopos), perfiles de expresión génica (por ejemplo, matrices génicas; reacción en cadena de la polimerasa (por ejemplo, PCR con transcriptasa inversa, PCR en tiempo real y PCR convencional)), matrices de proteínas, secreción de proteínas (por ejemplo, mediante ensayo de coagulación de plasma o análisis del medio acondicionado de PDC, por ejemplo, mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)), reacción linfocitaria mixta (por ejemplo, como medida de la estimulación de las PBMC) y/u otros métodos conocidos en la técnica.

Los ejemplos de células de origen posnatal procedentes de tejido placentario se depositaron en la Colección americana de cultivos tipo (ATCC, Manassas, VA) y se les asignó los números de registro ATCC del siguiente modo: (1) la cepa con denominación PLA 071003 (P8) se depositó el 15 de junio de 2004 y se le asignó el nº de registro PTA-6074; (2) la cepa con denominación PLA 071003 (P11) se depositó el 15 de junio de 2004 y se le asignó el nº de registro PTA-6075; y (3) la cepa con denominación PLA 071003 (P16) se depositó el 16 de junio de 2004 y se le asignó el nº de registro PTA-6079. Los ejemplos de células de origen posnatal procedentes de tejido de cordón umbilical se depositaron en la Colección americana de cultivos tipo el 10 de junio de 2004, y se les asignaron los números de registro ATCC del siguiente modo: (1) a la cepa con denominación UMB 022803 (P7) se le asignó el nº de registro PTA-6067; y (2) a la cepa con denominación UMB 022803 (P17) se le asignó el nº de registro PTA6068.

En diversas formas de realización, las células de origen posnatal poseen una o más de las siguientes características de desarrollo (1) necesitan L-valina para desarrollarse en cultivo; (2) son capaces de desarrollarse en atmósferas que contienen una cantidad de oxígeno de aproximadamente un 5% a al menos aproximadamente un 20%; (3) tienen el potencial de experimentar al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo antes de llegar a la senescencia; y (4) se fijan y proliferan en un recipiente para cultivo tisular recubierto o no recubierto, en el que el recipiente para cultivo tisular recubierto comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina o fibronectina.

En determinadas formas de realización, las células de origen posnatal tienen un cariotipo normal, que se mantiene a medida que las células se someten a pases. El cariotipado es particularmente útil para identificar y distinguir las células neonatales de las maternas de origen placentario. Los expertos en la materia conocen y disponen de métodos de cariotipado.

En otras formas de realización, las células de origen posnatal pueden caracterizarse por la producción de determinadas proteínas, incluidas (1) la producción de al menos uno de entre factor tisular, vimentina y alfa actina de músculo liso; y (2) la producción de al menos uno de los marcadores de superficie celular CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C, detectada mediante citometría de flujo. En otras formas de realización, las células de origen posnatal pueden caracterizarse por la falta de producción de al menos uno de los marcadores de superficie celular CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G y HLA-DR,DP,DQ, detectada mediante citometría de flujo. Resultan particularmente preferentes las células que producen al menos dos de entre factor tisular, vimentina y alfa actina de músculo liso. Resultan más preferentes las células que producen las tres proteínas factor tisular, vimentina y alfa actina de músculo liso.

En otras formas de realización, las células de origen posnatal pueden caracterizarse por la expresión de genes, que con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de médula ósea de cresta ilíaca, está aumentada para un gen que codifica al menos uno de entre interleucina 8; reticulón 1; ligando 1 de quimiocina (motivo C-X-C) (actividad estimuladora del crecimiento de melonoma, alfa); ligando 6 de quimiocina (motivo C-X-C) (proteína 2 quimiotáctica para granulocitos); ligando 3 de quimiocina (motivo C-X-C); factor de necrosis tumoral, proteína 3 inducida por alfa; miembro 2 de la superfamilia de lectinas tipo C; tumor de Wilms 1; miembro A2 de la familia de aldehído deshidrogenasas 1; renina; receptor 1 de lipoproteína de baja densidad oxidada; clon IMAGE:4179671 de Homo sapiens; proteína quinasa C zeta; proteína hipotética

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endotelio vascular. Las células preferentes, cuando se desarrollan en medio de crecimiento, son sustancialmente estables con respecto a los marcadores celulares producidos en su superficie, y con respecto al patrón de expresión de diversos genes, por ejemplo como se determina mediante una prueba diagnóstica médica comercializada con el nombre comercial de GENECHIP (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Las células permanecen sustancialmente constantes, por ejemplo en cuanto a sus características de marcadores de superficie a lo largo de los pases, durante múltiples duplicaciones de la población.

Otro aspecto de la invención caracteriza el uso de poblaciones de las células de origen posnatal descritas anteriormente. En algunas formas de realización de la divulgación, la población de células es heterogénea. Una población heterogénea de células de la divulgación puede comprender al menos aproximadamente un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de células de origen posnatal de la invención. Las poblaciones heterogéneas de células de la divulgación pueden comprender adicionalmente células madre u otras células progenitoras, tales como mioblastos u otras células progenitoras del músculo, hemangioblastos, o células precursoras de los vasos sanguíneos, o pueden comprender adicionalmente células neurales completamente diferenciadas. En algunas formas de realización, la población es sustancialmente homogénea, es decir, comprende sustancialmente sólo células de origen posnatal (preferentemente al menos aproximadamente un 96%, 97%, 98%, 99% o más de células de origen posnatal). La población homogénea de células de la divulgación puede comprender células de origen umbilical o placentario. Las poblaciones homogéneas de células de origen umbilical están preferentemente exentas de células del linaje materno. Las poblaciones homogéneas de células de origen placentario pueden ser de linaje neonatal o materno. La homogeneidad de una población de células puede conseguirse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante clasificación de células (por ejemplo, citometría de flujo) o por expansión clonal según métodos conocidos. Por lo tanto, las poblaciones homogéneas de células de origen posnatal preferentes pueden comprender una estirpe celular clonal de las células de origen posnatal. Tales poblaciones son particularmente útiles cuando se ha aislado un clon de células con funcionalidad sumamente deseable.

En una forma de realización, las células son células de origen posnatal que se administran como células indiferenciadas, es decir, tal como se cultivaron en el medio de crecimiento. Como alternativa, las células de origen posnatal pueden administrarse tras la exposición en cultivo a condiciones que estimulan la diferenciación hacia un tejido neural deseado.

En una forma de realización preferente, las células son hUTC.

Además, la población de células puede incluir más de un tipo de célula. De hecho, algunas formas de realización incluyen la administración de células que rodean y sustentan a la célula neural tal como el tejido vascular.

Células genéticamente modificadas

Las células utilizadas en la invención también pueden modificarse genéticamente para que produzcan productos génicos terapéuticamente útiles, para que produzcan agentes que faciliten o apoyen la supervivencia del tejido neural, la diferenciación, la actividad fagocítica, o para que produzcan factores que atraigan células progenitoras a la zona de las placas neuríticas.

La modificación genética puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de diversos vectores, incluidos pero no limitados a, vectores virales de integración, por ejemplo, vector retroviral o vectores virales adenoasociados; vectores de replicación no integrativos, por ejemplo, vectores papiloma virus, vectores SV40, vectores adenovirales;

o vectores virales de replicación defectuosa. Otros métodos de introducción de ADN en las células incluyen el uso de liposomas, electroporación, una pistola de partículas, o por inyección directa de ADN.

Por ejemplo, las células pueden modificarse por ingeniería genética para que expresen y/o secreten una molécula extraña (por ejemplo, una molécula heteróloga normalmente no fabricada por la célula) o para que modifiquen la producción de una molécula para tratar el dolor crónico. Tales moléculas pueden ser producidas por las células tras la introducción de moléculas heterólogas de ácido nucleico mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica.

En una forma de realización, las células de la invención pueden modificarse para que expresen el receptor de un neurotransmisor. En otra forma de realización, las células de la invención se modifican para que produzcan un neurotransmisor. En otra forma de realización, las células de la invención se modifican para que produzcan un fragmento de un neurotransmisor, incluido pero no limitado a, un fragmento del extremo C' terminal o del extremo N' terminal. En otra forma de realización, una molécula extraña potencia la capacidad neuroregeneradora de las células administradas, ayuda a restablecer la comunicación neurosensorial de las interneuronas GABA, y/o ayuda a restablecer el equilibrio de neurotransmisores excitadores/inhibidores en el sujeto.

En otra forma de realización, las células se modifican por ingeniería genética para que expresen y/o secreten moléculas extrañas que promuevan el éxito de la administración (por ejemplo, mediante modulación por

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era heterogénea (XX/XY), lo que indica una presencia no detectada previamente de células de origen materno. Cada una de las muestras celulares se caracterizó como homogénea. (Tabla 6-1).

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Tabla 6-1. Resultados del cariotipo de las PPDC.

Tejido

Pase Células en metafase contadas Células en metafase analizadas Número de cariotipos Cariotipo ISCN

Placenta

22 20 5 2 46,XX

Umbilical

23 20 5 2 46, XX

Umbilical

6 20 5 2 46, XY

Placenta

2 20 5 2 46, XX

Umbilical

3 20 5 2 46, XX

Placenta-N

0 20 5 2 46, XY

Placenta-V

0 20 5 2 46, XY

Placenta-M

0 21 5 4 46, XY[18]/ 46,XX[3]

Placenta-M

4 20 5 2 46,XX

Placenta-N

9 25 5 4 46, XY[5]/ 46,XX[20]

Placenta-N C1

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C3

1 20 6 4 46, XY[2]/ 46,XX[18]

Placenta-N C4

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C15

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C20

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C22

1 20 5 2 46, XY

Leyenda: N-lado neonatal; V-zona de las vellosidades; M-lado materno; C-clon

35 Resumen. El análisis cromosómico identificó las PPDC de origen placentario y de origen umbilical cuyos cariotipos parecían normales tal como interpretó un laboratorio de citogenética clínica. El análisis del cariotipo también identificó estirpes celulares carentes de células maternas, determinado por un cariotipo homogéneo.

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Evaluación mediante citometría de flujo de marcadores de superficie de células humanas de origen posnatal

Puede utilizarse la caracterización de proteínas de superficie celular o "marcadores" mediante citometría de flujo para determinar la identidad de una estirpe celular. La coherencia de la expresión puede determinarse a partir

45 de múltiples donantes, y en las células expuestas a diferentes condiciones de procesamiento y cultivo. Las estirpes de células posparto aisladas a partir de cordón umbilical se caracterizaron mediante citometría de flujo, lo que proporcionó un perfil para la identificación de estas estirpes celulares.

VII. Materiales y métodos

Medios y recipientes de cultivo. Las células se cultivaron en medio de crecimiento, en matraces de cultivo tisular T75, T150 y T225 tratados con plasma (Corning, Corning, NY) hasta la confluencia. Las superficies de cultivo de los matraces se recubrieron con gelatina incubando gelatina al 2% (p/v) (Sigma, St. Louis, MO) durante 20 minutos a temperatura ambiente.

55 Tinción con anticuerpos. Las células adherentes de los matraces se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS); (Gibco, Carlsbad, MO) y se desprendieron con tripsina/EDTA (Gibco). Las células se recolectaron, se centrifugaron y se resuspendieron en FBS al 3% (v/v) en PBS a una concentración celular de 1x107 por mililitro. Según las especificaciones del fabricante, se añadió el anticuerpo contra el marcador de superficie celular de interés (véase más adelante) a 100 microlitros de suspensión de células y la mezcla se incubó en oscuridad durante 30 minutos a 4°C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo no unido. Las células se resuspendieron en 500 microlitros de PBS y se analizaron mediante citometría de flujo.

65 Análisis de citometría de flujo. El análisis de citometría de flujo se realizó con un instrumento FACScalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA).

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5

15

25

35

45

55

Tabla 8-5. Genes con expresión disminuida en las células de origen umbilical y de origen placentario en comparación con las demás estirpes celulares ensayadas.

Genes con expresión disminuida en las células de origen umbilical y placentario

ID del conjunto de sondas

Nombre del gen Número de registro del NCBI

210135_s_at

Caja homeótica de la baja estatura 2 AF022654.1

205824_at

Proteína 2 de choque térmico de 27 kDa NM_001541.1

209687_at

Ligando 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (factor derivado de células estromales 1) U19495.1

203666_at

Ligando 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (factor derivado de células estromales 1) NM_000609.1

212670_at

Elastina (estenosis aórtica supravalvular, síndrome de Williams-Beuren) AA479278

213381_at

ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022) N91149

206201_s_at

Caja homeótica de mesénquima 2 (caja homeótica específica de la detención del crecimiento) NM_005924.1

205817_at

Homólogo 1 de la caja homeótica de “sine oculis” (Drosophila) NM_005982.1

209283_at

Cristalina, alfa B AF007162.1

212793_at

Activador de la morfogénesis 2 asociado a “disheveled” BF513244

213488_at

Proteína DKFZP586B2420 AL050143.1

209763_at

Similar a neuralina 1 AL049176

205200_at

Tetranectina (proteína de unión a plasminógeno) NM_003278.1

205743_at

Dominio 3 de homología con src (SH3) y rico en cisteínas NM_003149.1

200921_s_at

Gen de translocación de linfocitos B, antiproliferativa NM_001731.1

206932_at

Colesterol 25-hidroxilasa NM_003956.1

204198_s_at

Factor de transcripción 3 relacionado con el enanismo AA541630

219747_at

Proteína hipotética FLJ23191 NM_024574.1

204773_at

Receptor de interleucina 11, alfa NM_004512.1

202465_at

Potenciador de la procolágeno C-endopeptidasa NM_002593.2

203706_s_at

Homólogo 7 de “frizzled” (Drosophila) NM_003507.1

212736_at

Gen hipotético BC008967 BE299456

214587_at

Colágeno, tipo VIII, alfa 1 BE877796

201645_at

Tenascina C (hexabraquión) NM_002160.1

210239_at

Proteína 5 de la caja homeótica de “iroquois” U90304.1

203903_s_at

Hefaestina NM_014799.1

205816_at

Integrina, beta 8 NM_002214.1

203069_at

Glicoproteína 2 de vesícula sináptica NM_014849.1

213909_at

ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744 AU147799

206315_at

Factor 1 tipo receptor de citocinas NM_004750.1

204401_at

Canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia/baja, subfamilia N, miembro 4 NM_002250.1

36

(continuación)

5

15

25

35

45

216331_at

Integrina, alfa 7 AK022548.1

209663_s_at

Integrina, alfa 7 AF072132.1

213125_at

Proteína DKFZP586L AW007573

202133_at

Coactivador de la transcripción con motivo de unión a PDZ (TAZ) AA081084

206511_s_at

Homólogo 2 de la caja homeótica de “sine oculis” (Drosophila) NM_016932.1

213435_at

Proteína KIAA1034 AB028957.1

206115_at

Respuesta de crecimiento precoz 3 NM_004430.1

213707_s_at

Caja homeótica de “distal-less” 5 NM_005221.3

218181_s_at

Proteína hipotética FLJ20373 NM_017792.1

209160_at

Familia 1 de aldo-ceto reductasas, miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II) AB018580.1

213905_x_at

Biglicano AA845258

201261_x_at

Biglicano BC002416.1

202132_at

Coactivador de la transcripción con motivo de unión a PDZ (TAZ) AA081084

214701_s_at

Fibronectina 1 AJ276395.1

213791_at

Proencefalina NM_006211.1

205422_s_at

Integrina, tipo beta 1 (con dominios de repetición tipo EGF) NM_004791.1

214927_at

Inserto de longitud completa de ARNm de Homo sapiens, clon de ADNc EUROIMAGE 1968422 AL359052.1

206070_s_at

EphA3 AF213459.1

212805_at

Proteína KIAA0367 AB002365.1

219789_at

Receptor del péptido natriurético tipo C/guanilato ciclasa C (receptor del péptido natriurético atrial tipo C) AI628360

219054_at

Proteína hipotética FLJ14054 NM_024563.1

213429_at

ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222) AW025579

204929_s_at

Proteína 5 de membrana asociada a vesículas (miobrevina) NM_006634.1

201843_s_at

Proteína 1 de la matriz extracelular tipo fibulina que contienen EGF NM_004105.2

221478_at

Similar a proteína 3 de interacción con BCL2/adenovirus E1B de 19 kDa AL132665.1

201792_at

Proteína 1 de unión a AE NM_001129.2

204570_at

Polipéptido 1 de la subunidad VIIa de la citocromo c oxidasa (músculo) NM_001864.1

201621_at

Neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1 NM_005380.1

202718_at

Proteína 2 de unión al factor de crecimiento insulinoide, 36 kDa NM_000597.1

Tabla 8-6. Genes con expresión aumentada en los fibroblastos en comparación con las demás estirpes celulares ensayadas.

Las Tablas 8-6, 8-7 y 8-8 muestran la expresión de genes aumentada en los fibroblastos humanos (Tabla 86), las células ICBM (Tabla 8-7) y las MSC (Tabla 8-8).

Genes con expresión aumentada en los fibroblastos

fosfatasa de doble especificidad 2

proteína KIAA0527

ADNc de Homo sapiens: FLJ23224 fis, clon ADSU02206

dineína, citoplasmática, polipéptido intermedio 1

anquirina 3, nódulo de Ranvier (anquirina G)

inhibina, beta A (activina A, activina AB, polipéptido alfa)

ectonucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 4 (función supuesta)

proteína KIAA1053

proteína asociada a microtúbulos 1A

proteína con dedos de zinc 41

proteína HSPC019

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5

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cuatro a dieciséis anticuerpos de captura diferentes en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de un procedimiento ELISA tipo sándwich, se obtiene una imagen de toda la placa para captar la señal quimioluminiscente generada en cada aplicación dentro de cada pocillo de la placa. La señal generada en cada aplicación es proporcional a la cantidad de proteína diana en la muestra o patrón original.

XV. Resultados

Ensayo ELISA. MCP-1 e IL-6 fueron secretados por las PPDC procedentes de cordón umbilical y por los fibroblastos dérmicos (Tabla 11-1). SDF-1alfa y GCP-2 fueron secretados por los fibroblastos. GCP-2 e IL-8 fueron secretados por las PPDC procedentes de cordón umbilical. No se detectó TGF-beta2 de ninguno de los tipos celulares mediante ELISA.

Tabla 11-1. Resultados del ELISA: detección de factores tróficos

MCP-1

IL-6 VEGF SDF-1alfa GCP-2 IL-8 TGF-beta2

Fibroblasto

17±1 61±3 29±2 19±1 21±1 ND ND

Umbilical (022803)

1.150±74 4.234±289 ND ND 160±11 2.058±145 ND

Umbilical (071003)

2.794±84 1.356±43 ND ND 2.184±98 2.369±23 ND

Leyenda: ND: no detectado, =/-e.e.m.

Ensayo ELISA multiplexado SEARCHLIGHT. TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MiP1beta, MCP1, RANTES, I309, TARC, MDC e IL-8 fueron secretados a partir de las PPDC procedentes de cordón umbilical (Tablas 11-2 y 11-3). No se detectaron Ang2, VEGF ni PDGFbb.

Tabla 11-2. Resultados del ensayo ELISA multiplexado SEARCHLIGHT

TIMP1

ANG2 PDGFbb TPO KGF HGF FGF VEGF HBEGF BDNF

hFB

19.306,3 ND ND 230,5 5,0 ND ND 27,9 1,3 ND

U1

57.718,4 ND ND 1.240,0 5,8 559,3 148,7 ND 9,3 165,7

U3

21.850,0 ND ND 1.134,5 9,0 195,6 30,8 ND 5,4 388,6

Leyenda: hFB (fibroblastos humanos), U1 (PPDC procedentes de cordón umbilical (022803)), U3 (PPDC procedentes de cordón umbilical (071003)). ND: No detectado.

Tabla 11-3. Resultados del ensayo ELISA multiplexado SEARCHLIGHT

MIP1a

MIP1b MCP1 RANTES I309 TARC Eotaxina MDC IL-8

hFB

ND ND 39,6 ND ND 0,1 ND ND 204,9

U1

ND 8,0 1.694,2 ND 22,4 37,6 ND 18,9 51.930,1

U3

ND 5,2 2.018,7 41,5 11,6 21,4 ND 4,8 10.515,9

Leyenda: hFB (fibroblastos humanos), U1 (PPDC procedentes de cordón umbilical (022803)), U3 (PPDC procedentes de cordón umbilical (071003)). ND: No detectado.

Resumen. Las células de origen umbilical secretan varios actores tróficos. Algunos de estos factores tróficos, tales como HGF, bFGF, MCP-1 e IL-8, desempeñan papeles importantes en la angiogénesis. Otros factores tróficos, tales como BDNF e IL-6, tienen un papel importante en la regeneración o la protección neural.

EJEMPLO 12

Inmunología in vitro

Se evaluaron in vitro estirpes de células posnatales para determinar sus características inmunitarias en un intento por predecir la respuesta inmunitaria, de haberla, que inducirían estas células tras la administración in vivo. Se ensayaron estirpes de células posparto mediante citometría de flujo para detectar la expresión de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86 y B7-H2. Estas proteínas son expresadas por las células presentadoras de antígenos (APC) y son necesarias para la estimulación directa de los linfocitos T CD4+ vírgenes (Abbas y Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5ª ed. (2003) Saunders, Filadelfia, p. 171). Las estirpes celulares también se analizaron mediante citometría de flujo para detectar la expresión de HLA-G (Abbas y Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5ª ed. (2003) Saunders, Filadelfia, p. 171), CD178 (Coumans, et al., (1999) Journal of Immunological Methods 224, 185-196) y PD-L2 (Abbas y Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5ª ed. (2003) Saunders, Filadelfia, p. 171; Brown, et al. (2003) The Journal of Immunology 170, 1257-1266). Se cree que la expresión de estas proteínas por las células que residen en los tejidos placentarios interviene en el estado inmunoprivilegiado de los tejidos placentarios in utero. Para predecir el grado de inducción de una respuesta inmunitaria in vivo por parte de las estirpes celulares procedentes de cordón umbilical posparto, se ensayaron las estirpes celulares en una reacción linfocitaria mixta (MLR) unidireccional.

XVI. Materiales y métodos

45

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15

25

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45

55

DPM para el ensayo de proliferación ID de placa: Placa 1 Número de análisis Sistema de cultivo Repeticiones 1 2 3 IM03-7769 Valor inicial de la proliferación del receptor 79 119 138 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 241 272 175 Donante alogénico de MLR IM03-7768 (tratadas con mitomicina C) 23.971 22.352 20.921 MLR con estirpe celular (célula tipo B tratada con mitomicina C) 664 559 1.090 SI (donante) SI (estirpe celular) IM03-7770 Valor inicial de la proliferación del receptor 206 134 262 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 1091 602 524 Donante alogénico de MLR IM03-7768 (tratadas con mitomicina C) 45.005 43.729 44.071 MLR con estirpe celular (célula tipo B tratada con mitomicina C) 533 2.582 2.376 SI (donante) SI (estirpe celular) IM03-7771 Valor inicial de la proliferación del receptor 157 87 128 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 293 138 508 Donante alogénico de MLR IM03-7768 (tratadas con mitomicina C) 24.497 34.348 31.388 MLR con estirpe celular (célula tipo B tratada con mitomicina C) 601 643 a

Media DE CV 112,0 30,12 26,9 229,3 49,54 21,6 22.414,7 1.525,97 6,8 771,0 281,21 36,5 200 7 200,7 64,17 32,0 739,0 307,33 41,6 44.268,3 660,49 1,5 1.830,3 1.128,24 61,6 221 9 124,0 35,17 28,4 313,0 185,81 59,4 30.077,7 5.054,53 16,8 622,0 29,70 4,8

47

(continuación)

5

15

25

35

45

55

65

SI (donante) SI (estirpe celular) IM03-7772 Valor inicial de la proliferación del receptor 56 98 51 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 133 120 213 Donante alogénico de MLR IM03-7768 (tratadas con mitomicina C) 14.222 20.076 22.168 MLR con estirpe celular (célula tipo B tratada con mitomicina C) a a a SI (donante) SI (estirpe celular) IM03-7768 (donante alogénico) Valor inicial de la proliferación del receptor 84 242 208 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina) 361 617 304 Estirpe celular tipo B Valor inicial de la proliferación del receptor 126 124 143 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina) 822 1075 487 ID de placa: Placa 2 Número de análisis Sistema de cultivo Repeticiones 1 2 3 IM03-7773 Valor inicial de la proliferación del receptor 908 181 330 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 269 405 572 Donante alogénico de MLR IM03-7768 (tratadas con mitomicina C) 29.151 28.691 28.315 MLR con estirpe celular (célula tipo B tratada con mitomicina C) 567 732 905 SI (donante) SI (estirpe celular) IM03-7774 Valor inicial de la proliferación del receptor 893 1.376 185 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 261 381 568 Donante alogénico de MLR IM03-7768 (tratadas con mitomicina C) 53.101 42.839 48.283 MLR con estirpe celular (célula tipo B tratada con mitomicina C) 515 789 294 SI (donante) SI (estirpe celular)

243 5 68,3 25,81 37,8 155,3 50,36 32,4 18.822,0 4.118,75 21,9 a a a 275 a 178,0 83,16 46,7 427,3 166,71 39,0 131,0 10,44 8,0 794,7 294,95 37,1 Media DE CV 473,0 384,02 81,2 415,3 151,76 36,5 28.719,0 418,70 1,5 734,7 169,02 23,0 61 2 818,0 599,03 73,2 403,3 154,71 38,4 48.074,3 5.134,18 10,7 532,7 247,97 46,6 59 1

48

(continuación)

5

15

25

IM03-7775

Valor inicial de la proliferación del receptor 1.272 300 544 705,3 505,69 71,7

Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C)

232 199 484 305,0 155,89 51,1

Donante alogénico de MLR IM03-7768 (tratadas con mitomicina C)

23.554 10.523 28.965 21.014,0 9.479,74 45,1

MLR con estirpe celular (célula tipo B tratada con mitomicina C)

768 924 563 751,7 181,05 24,1

SI (donante)

30

SI (estirpe celular)

1

IM03-7776

Valor inicial de la proliferación del receptor 1530 137 1046 904,3 707,22 78,2

Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C)

420 218 394 344,0 109,89 31,9

Donante alogénico de MLR IM03-7768 (tratadas con mitomicina C)

28.893 32.493 34.746 32.044,0 2.952,22 9,2

MLR con estirpe celular (célula tipo B tratada con mitomicina C)

a a a a a a

SI (donante)

35

SI (estirpe celular)

a

Tabla 12-3. Índice de estimulación medio de células de la placenta y un donante alogénico en una reacción linfocitaria mixta con seis receptores alogénicos individuales.

Receptor

Placenta

Placa 1 (receptores 1-3)

279 3

Placa 2 (receptores 4-6)

46,25 1,3

Reacción linfocitaria mixta -Cordón umbilical. Se examinó a seis donantes de sangre humanos voluntarios para identificar un único donante alogénico que presentara una fuerte respuesta de proliferación en una reacción linfocitaria mixta con los otros cinco donantes de sangre. Este donante se seleccionó como donante control positivo alogénico. Los cinco donantes de sangre restantes se seleccionaron como receptores. Las estirpes celulares

45 de origen umbilical y donante control positivo alogénico se trataron con mitomicina C y se cultivaron en una reacción linfocitaria mixta con los cinco receptores alogénicos individuales. Las reacciones se realizaron por triplicado utilizando dos placas de cultivo celular con tres receptores por placa (Tabla 12-4). El índice de estimulación medio varió entre 6,5 (placa 1) y 9 (placa 2) y los controles positivos donante alogénico variaron entre 42,75 (placa 1) y 70 (placa 2) (Tabla 12-5).

Tabla 12-4. Datos de la reacción linfocitaria mixta -estirpe celular A (cordón umbilical)

DPM para el ensayo de proliferación ID de placa: Placa 1

Número de análisis

Sistema de cultivo Repeticiones

1

2 3 Media DE CV

IM04-2478

Valor inicial de la proliferación del receptor 1.074 406 391 623,7 390,07 62,5

Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C)

672 510 1.402 861,3 475,19 55,2

Donante alogénico de MLR IM04-2477 (tratadas con mitomicina C)

43.777 48.391 38.231 43.466,3 5.087,12 11,7

MLR con estirpe celular (célula tipo A tratada con mitomicina C)

2.914 5.622 6.109 4.881,7 1.721,36 35,3

49

(continuación)

5

15

25

35

45

55

SI (donante) SI (estirpe celular) IM04-2479 Valor inicial de la proliferación del receptor 530 508 527 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 701 567 1.111 Donante alogénico de MLR IM04-2477 (tratadas con mitomicina C) 25.593 24.732 22.707 MLR con estirpe celular (célula tipo A tratada con mitomicina C) 5.086 3.932 1.497 SI (donante) SI (estirpe celular) IM04-2480 Valor inicial de la proliferación del receptor 1.192 854 1.330 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 2.963 993 2.197 Donante alogénico de MLR IM04-2477 (tratadas con mitomicina C) 25.416 29.721 23.757 MLR con estirpe celular (célula tipo A tratada con mitomicina C) 2.596 5.076 3.426 SI (donante) SI (estirpe celular) IM04-2481 Valor inicial de la proliferación del receptor 695 451 555 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 738 1.252 464 Donante alogénico de MLR IM04-2477 (tratadas con mitomicina C) 13.177 24.885 15.444 MLR con estirpe celular (célula tipo A tratada con mitomicina C) 4.495 3.671 4.674 SI (donante) SI (estirpe celular) ID de placa: Placa 2 Número de análisis Sistema de cultivo Repeticiones 1 2 3 IM04-2482 Valor inicial de la proliferación del receptor 432 533 274 Control de autoestimulación (células autólogas tratadas con mitomicina C) 1.459 633 598 Donante alogénico de MLR IM04-2477 (tratadas con mitomicina C) 24.286 30.823 31.346 MLR con estirpe celular (célula tipo A tratada con mitomicina C) 2.762 1.502 6.723 SI (donante) SI (estirpe celular)

70 8 521,7 11,93 2,3 793,0 283,43 35,7 24.344,0 1.481,61 6,1 3.505,0 1.832,21 52,3 47 7 1.125,3 244,90 21,8 2.051,0 993,08 48,4 26.298,0 3.078,27 11,7 3.699,3 1.262,39 34,1 23 3 567,0 122,44 21,6 818,0 400,04 48,9 17.835,3 6.209,52 34,8 4.280,0 534,95 12,5 31 8 Media DE CV 413,0 130,54 31,6 896,7 487,31 54,3 28.818,3 3.933,82 13,7 3.662,3 2.724,46 74,4 70 9

50

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Claims (1)

1. imagen1