BRPI0709635A2 - bactéria pertencendo ao gênero bacillus, e, métodos para produzir uma substáncia derivada de purina, e um nucleotìdeo de purina - Google Patents

Abstract

BACTéRIA PERTENCENDO AO GêNERO BACILLUS, E, MéTODOS PARA PRODUZIR UMA SUBSTáNCIA DERIVADA DE PURINA, E UM NUCLEOTìDEO DE PURINA. Uma substância de purina pode ser produzida cultivando uma bactéria Bacilius que é capaz de produzir a substância de purina e tem uma atividade enzimática reduzida de transaldolase em um meio de cultura para produzir e acumular a substância de purina no meio de cultura ou uma célula da bactéria, e coletar a substância de purina do meio de cultura ou da célula.

Description

bacteria pertencendo ao gênero bacillus, e, métodos

PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA DERIVADA DE PURINA, E UMNUCLEOTÍDEO DE PURINA"

Campo Técnico

A presente invenção se refere a um método para produzirsubstâncias derivadas de purina tal como nucleotídeos de purina tipicamenteincluindo ácido 5'-inosínico e ácido 5'-guanílico, e nucleosídeos de purina talcomo inosina e guanosina, que são substâncias importantes como matérias-primas para síntese dos nucleotídeos de purina, e assim por diante, e umabactéria pertencendo ao gênero Bacillus usado para o método. Substânciasderivadas de purina são úteis como condimentos, drogas, matérias-primasdestes, e assim por diante.

Técnica anterior

Métodos para produzir inosina e guanosina por fermentaçãousando cepas auxotróficas de adenina de bactérias Bacillus e derivados destasque são adicionalmente concedidos com resistência a várias drogas tal comoanálogos de purina (Documentos de patente 1 a 8), e tais microorganismos dogênero Brevibacterium (Documentos de patente 9 e 10, Documento de nãopatente 1), e assim por diante foram conhecidos.

Tais cepas mutantes são tipicamente obtidas tratando ummicroorganismo com radiação ultravioleta ou nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina), e selecionando um mutante alvo usando um meiode seleção adequado.

Além disso, cepas que produzem substâncias derivadas depurina também foram criadas usando técnicas de engenharia genética embactérias Bacillus (Documentos de patente lia 20), bactérias Brevibacterium(Documento de patente 21), e bactérias Escherichia (Documento de patente22). Especificamente, por exemplo, um método para produzir eficientementeum composto derivado de ácido nucleico tal como hipoxantina, uracila,guanina e adenina com uma bactéria Bacillus na qual um gene (purR)codificando o repressor de operon de purina é rompido é descrito (Documentode patente 23).

Em Bacillus subtilis, o repressor de operon de purina comodescrito acima é conhecido por regular, além dos genes de operon de purina, ogene purA que está envolvido em biossíntese de AMP (Documento de nãopatente 2), o gene glyA que está envolvido em biossíntese de ácidoformiltetrahidrofólico (Documento de não patente 3), o gene pbuG quecodifica o transportador de hipoxantina/guanina (Documento de não patente 4), e assim por diante.

Além disso, um microorganismo que produz eficientementederivado de inosina por fornecimento de auxotrofia de adenina porrompimento do gene de succinil-AMP sintase (purA) em adição arompimento do gene purR, e supressão de decomposição de inosina em hipoxantina por rompimento do gene de nucleosídeo de purina fosforilase(deoD), e um método para produzir inosina usando o microorganismo foramdescritos (Documento de patente 8).

Transaldolase é uma das enzimas da via de pentose fosfato,que catalisa a reação reversível gerando D-eritrose-4-fosfato e D-frutose-6-fosfato a partir de sedoheptulose-7-fosfato e D-gliceraldeído-3-fosfato. Existeapenas pouco conhecimento sobre a relação entre esta enzima e a viabiossintética de substâncias derivadas de purina, e não foi tentado criar umabactéria produtora de substância derivada de purina reduzindo a atividadedesta enzima.

Documento de patente 1: Publicação de Patente Japonesa (KOKOKU) No.38-23099

Documento de patente 2: Publicação de Patente Japonesa No. 54-17033Documento de patente 3: Publicação de Patente Japonesa No. 55-2956Documento de patente 4: Publicação de Patente Japonesa No. 55-45199Documento de patente 5: Publicação de Patente Japonesa No. 57-14160Documento de patente 6: Publicação de Patente Japonesa No. 57-41915Documento de patente 7: Patente Japonesa Não Examinada (KOKAI) No. 59-42895

Documento de patente 8: Patente Japonesa Não Examinada No. 2004-242610Documento de patente 9: Publicação de Patente Japonesa No. 51-5075Documento de patente 10: Publicação de Patente Japonesa No. 58-17592Documento de patente 11: Patente Japonesa Não Examinada No. 58-158197Documento de patente 12: Patente Japonesa Não Examinada No. 58-175493Documento de patente 13: Patente Japonesa Não Examinada No. 59-28470Documento de patente 14: Patente Japonesa Não Examinada No. 60-156388Documento de patente 15: Patente Japonesa Não Examinada No. 1 -27477Documento de patente 16: Patente Japonesa Não Examinada No. 1-174385Documento de patente 17: Patente Japonesa Não Examinada No. 3-58787Documento de patente 18: Patente Japonesa Não Examinada No. 3-164185Documento de patente 19: Patente Japonesa Não Examinada No. 5-84067Documento de patente 20: Patente Japonesa Não Examinada No. 5-192164Documento de patente 21: Patente Japonesa Não Examinada No. 63-248394Documento de patente 22: Publicação de Patente Internacional W099/03988Documento de patente 23: Patente Norte-Americana No. 6.284.495Documento de não patente 1: Agric. Biol. Chem., 1978, 42, 399-405Documento de não patente 2: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, 92, 7455-7459

Documento de não patente 3: J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183Documento de não patente 4: J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209Descrição da invenção

Objetivo a ser atingido pela invenção

Um objetivo da presente invenção é criar uma bactériaBacillus adequada para a produção de substâncias derivadas de purina talcomo nucleosídeos de purina e/ou nucleotídeos de purina por fermentação, efornecer um método para produzir uma substância derivada de purina usandouma tal bactéria.

Meios para atingir o objetivo

Os requerentes da presente invenção conduziram váriaspesquisas a fim de atingir o objetivo mencionado acima. Como um resultado,foi encontrado que se a atividade enzimática de transaldolase da via depentose fosfato fosse diminuída em uma bactéria Bacillus, uma capacidade dabactéria de produzir um nucleosídeo de purina ou um nucleotídeo de purinafosse melhorada, e consumada a presente invenção.

A presente invenção assim fornece os seguintes.

(1) Uma bactéria pertencendo ao gênero Bacillus tendo umacapacidade de produzir substância derivada de purina caracterizado pelo fatode que a bactéria foi modificada de forma que atividade enzimática detransaldolase é diminuída.

(2) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus, caracterizadopelo fato de que a substância derivada de purina é nucleosídeo de purinaselecionado a partir do grupo consistindo de inosina, xantosina, guanosina eadenosina.

(3) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, caracterizado pelo fato de que a substância derivada de purina énucleotídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo de ácidoinosínico, ácido xantílico, ácido guanílico e ácido adenílico.

(4) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, caracterizado pelo fato de que a atividade de transaldolase é diminuídapela ruptura de um gene codificando transaldolase, ou reduzindo quantidadede expressão do gene codificando transaldolase.

(5) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, caracterizado pelo fato de que o gene codificando transaldolase é umgene codificando uma proteína das seguintes (A) ou (B):

(A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 1,

(B) uma proteína compreendendo uma seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 1 o que inclui substituições, deleções, inserções,adições ou inversões de um ou diversos resíduos de aminoácidos e tematividade de transaldolase.

(6) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que é adicionalmente modificada de forma que atividade defosforribosil pirofosfato sintetase deve aumentar.

(7) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que foi adicionalmente modificada de forma que quantidade deexpressão do operon de purina é aumentada.

(8) A Bacillus como descrito acima, caracterizada pelo fato deque quantidade de expressão do operon de purina é aumentada por ruptura dogene purR, que é um gene codificando um repressor do operon de purina, oudeleção de uma parte de região atenuadora do operon de purina.

(9) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que foi adicionalmente modificada de forma que atividade defosforilase de nucleosídeo de purina é diminuída.

(10) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que foi adicionalmente modificada de forma que atividade frutosebifosfatase é diminuída.

(11)A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que foi adicionalmente modificada de forma que a atividade de IMPdesidrogenase é diminuída.

(12) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que é Bacillus subtilis.

(13) Um método para produzir uma substância derivada depurina, que compreende cultivar a bactéria pertencendo ao gênero Bacilluscomo descrito acima em um meio para causar acumulação de uma substânciaderivada de purina em células da bactéria ou no meio, e coletar a substânciaderivada de purina das células ou meio.

(14) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato deque a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purina ou umnucleotídeo de purina.

(15) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato deque a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purina selecionado apartir do grupo consistindo de inosina, xantosina, guanosina e adenosina.

(16) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato deque a substância derivada de purina é um nucleotídeo de purina selecionado apartir do grupo consistindo de ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílicoe ácido adenílico.

(17) Um método para produzir um nucleotídeo de purina, quecompreende produzir um nucleosídeo de purina pelo método como descritoacima, reagir o nucleosídeo de purina com um doador de fosfato selecionadoa partir do grupo consistindo de ácido polifosfórico, fenil fosfato e carbamilfosfato, e um microorganismo tendo uma capacidade de produzir um éster deácido 5'-fosfórico de nucleosídeo ou fosfatase ácida para produzir umnucleotídeo de purina, e coletar o nucleotídeo de purina.

Melhor modo para realizar a invenção

<1> Bactéria Bacillus da presente invenção

(I) Fornecer a capacidade de produzir uma substância derivadade purina

A bactéria Bacillus da presente invenção é uma bactériaBacillus tendo uma capacidade de produzir uma substância derivada de purinae foi modificada de forma que atividade enzimática de transaldolase édiminuída.O termo "substância derivada de purina" significa umasubstância tendo um esqueleto de purina, e exemplos destas incluemnucleosídeos de purina, nucleotídeos de purina, e assim por diante. Osnucleosídeos de purina incluem inosina, xantosina, guanosina, adenosina, eassim por diante, e os nucleotídeos de purina incluem ésteres de 5'-ácidofosfórico de nucleosídeos de purina, por exemplo, ácido inosínico (inosina -5'-fosfato, de agora em diante também referido como "IMP"), ácido xantílico(xantosina-5'-fosfato, de agora em diante também referido como "XMP"),ácido guanílico (guanosina-5'-monofosfato, de agora em diante tambémreferido como "GMP"), ácido adenílico (adenosina-5'-monofosfato, de agoraem diante também referido como "AMP"), e assim por diante.

A frase "capacidade de produzir uma substância derivada depurina" significa uma capacidade da bactéria Bacillus da presente invenção deproduzir, secretar ou causar acumulação de uma substância derivada de purinanas células bacterianas ou em um meio quando a bactéria é cultivada no meioaté um ponto em que a substância derivada de purina pode ser coletada dascélulas ou meio. A bactéria Bacillus da presente invenção pode ter umacapacidade de produzir dois ou mais tipos das substâncias derivadas de purinamencionadas acima.

A bactéria Bacillus tendo a capacidade de produzir umasubstância derivada de purina pode ser uma bactéria tendo inerentemente acapacidade de produzir uma substância derivada de purina, ou uma bactériaviável modificando tais bactérias Bacillus como descrito abaixo usando umatécnica de mutagênese ou DNA recombinante de forma que elas tenham acapacidade de produzir uma substância derivada de purina. Além disso, elapode ser uma bactéria Bacillus à qual a capacidade de produzir umasubstância derivada de purina é concedida ou de qual a capacidade deproduzir uma substância derivada de purina é melhorada modificando abactéria de forma que atividade enzimática de transaldolase seja diminuída,de uma maneira tal como descrito posteriormente.

Na presente invenção, a frase "atividade enzimática édiminuída" abrange um estado que atividade enzimática de transaldolasemencionada acima, ou uma enzima de decompõe uma substância derivada depurina mencionada posteriormente tal como inosina monofosfato (IMP)desidrogenase é menor do que aquela em uma cepa não modificada, porexemplo, uma cepa tipo selvagem da bactéria Bacillus, e um estado em que aatividade substancialmente desapareceu. O mesmo deve se aplicar à atividadedo repressor de operon de purina descrito posteriormente.

Exemplos da bactéria Bacillus usada para obter a bactériaBacillus da presente invenção incluem Bacillus subtilis, Bacillusamyloliquefaciens, Bacillus pumilus, e assim por diante.

Exemplos de Bacillus subtilis incluem Bacillus subtilis 168Marburg (ATCC 6051), Bacillus subtilis PY79 (Plasmid, 1984, 12, 1-9) eassim por diante, e exemplos de Bacillus amyloliquefaciens incluem Bacillusamyloliquefaciens T (ATCC 23842), Bacillus amyloliquefaciens N (ATCC23845), e assim por diante. Exemplos de Bacillus pumilus incluem Bacilluspumilus Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005, Patente Norte-Americana No.3.616.206), e assim por diante. Estas cepas podem ser obtidas a partir daAmerican Type Culture Collection (Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA20108, Estados Unidos da América).

Uma bactéria Bacillus tendo a capacidade de produzir umasubstância derivada de purina pode ser obtida fornecendo, por exemplo,auxotrofia de nucleosídeo de purina ou resistência a uma droga tal comoanálogo de purina para tais bactérias Bacillus como descrito acima(Publicação Patente Japonesa Nos. 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160,57-41915 e 59-42895). Uma bactéria Bacillus tendo auxotrofia ou resistênciaa droga pode ser obtida tratando a bactéria com agente mutagênico que éusado para mutagênese usual tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina(NTG) ou EMS (etil metanossulfonato).

Exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleosídeode purina incluem os seguintes.

Como um exemplo específico de cepa produtora de inosinapertencendo ao gênero Bacillus, a cepa KMBS16 de Bacillus subtilis pode serusada. Esta cepa é derivada da cepa trpC2 conhecida de Bacillus subtilis (168Marburg), caracterizada pelo fato de que um gene purR codificando orepressor de operon de purina (purR::spc), um gene purA codificandosuccinil-AMP sintase (purA::erm), e um gene deoD codificando fosforilase denucleosídeo de purina (deoD::kan) são rompidos (Patente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610, US2004166575A1). Cepa AJ3772 de Bacillussubtilis (FERM P-2555, Patente Japonesa Não-examinada No. 62-014794) eassim por diante também pode ser usado.

Exemplos de bactérias Bacillus que tem uma capacidade deproduzir guanosina incluem uma bactéria Bacillus que tem atividadeaumentada de IMP desidrogenase (Patente Japonesa Não-examinada No. 3-58787), uma bactéria Bacillus que é obtida introduzindo um vetorcompreendendo um gene conferindo resistência a análogo de purina oudecoinina em um mutante auxotrófico de adenina (Publicação PatenteJaponesa No. 4-28357), e assim por diante.

Exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleotídeode purina incluem os seguintes.

Como uma bactéria Bacillus produtora de ácido inosínico,cepas produtoras de inosina de Bacillus subtilis que têm atividade de fosfataseatenuada foram relatadas (Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805; Fujimoto, M., Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259).Exemplos de bactérias Bacillus produtoras de ácido guanílico incluemmutantes de bactérias Bacillus que têm auxotrofia de adenina, resistência adecoinina ou sulfóxido de metionina, e uma capacidade de produzir ácido 5'-guanílico (guanosina-5'-monofosfato, de agora em diante referido como"GMP") (Publicação Patente Japonesa No. 56-12438).

Além disso, uma bactéria produtora de ácido xantílico pode serconstruída pelo método usado para melhoramento de bactérias corineformesdas quais exemplo típico é Corynebacterium ammoniagenes. Por exemplo,obtendo uma cepa melhorada de PRPP amidotransferase (Patente JaponesaNão-examinada No. 8-168383), uma cepa resistente a aminoácido alifático(Patente Japonesa Não-examinada No. 4-262790), ou uma cepa resistente adihidroprolina (Publicação Não Examinada de Patente Sul Coreana No. 2003-56490), uma bactéria produtora de ácido xantílico pode ser construída.

Além disso, exemplo de um método para melhorar bactériasBacillus que têm a capacidade de produzir uma substância derivada de purinatambém inclui melhorar as atividades de enzimas envolvidas em biossíntesede purina que são comuns à biossíntese de nucleosídeos de purina enucleotídeos de purina, i.e., enzimas de biossíntese de purina, em célulasbacterianas. A atividade da enzima nas células é preferivelmente aumentadapara um nível maior do que aquele de uma cepa não modificada de bactériaBacillus, por exemplo, uma bactéria Bacillus tipo selvagem. A frase"atividade é aumentada" abrange, por exemplo, quando número de moléculasde enzima por célula é aumentado, e quando a atividade específica pormolécula de enzima é aumentada, e assim por diante. Por exemplo, aatividade pode ser aumentada aumentando a quantidade de expressão do geneda enzima.

Exemplos de uma enzima envolvida na biossíntese de purinaincluem, por exemplo, fosforribosil pirofosfato amidotransferase, fosforribosilpirofosfato sintetase (PRPP sintetase [EC: 2.7.6.1]), e assim por diante.

Alguns dos catabólitos produzidos por metabolismo de fontesde açúcar tal como glicose que circula na via de pentose fosfato sãoconvertidos em ribose-5-fosfato via ribulose-5-fosfato. A partir da ribose-5-fosfato biossintetizada, fosforribosil pirofosfato (PRPP) é produzido, o qual éum precursor indispensável para biossíntese de nucleosídeo de purina,histidina e triptofano. Especificamente, ribose-5-fosfato é convertido emPRPP por fosforribosil pirofosfato sintetase. Portanto, uma capacidade deproduzir substância derivada de purina pode ser concedida a uma bactériaBacillus modificando de forma que a atividade de fosforribosil pirofosfatosintetase desta seja aumentada.

A frase "atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase éaumentada" significa que a atividade de fosforribosil pirofosfato sintetaseaumenta se comparada com aquela de uma cepa não modificada tal como umacepa tipo selvagem ou uma cepa parental. A atividade da fosforribosilpirofosfato sintetase pode ser medida, por exemplo, pelo método de Switzer etal. (Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11) ou Roth et al. (Methods Enzymol.,1978, 51, 12-17). Uma bactéria Bacillus na qual a atividade de fosforribosilpirofosfato sintetase é aumentada pode ser produzida, por exemplo,aumentando expressão de um gene codificando a fosforribosil pirofosfatosintetase em uma bactéria Bacillus de acordo com um método de usar umplasmídeo contendo o gene ou integrando o gene em um cromossomo, o quepode ser realizado da mesma maneira que aquela do método descrito emPatente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610. Embora o gene prs deSEQ ID NO: 3 derivado de uma bactéria Bacillus (No. de Acesso de GenBankX16518) possa ser mencionado como o gene codificando fosforribosilpirofosfato sintetase utilizável para a presente invenção, qualquer dos genesderivados de outras bactérias, animais ou plantas codificando uma proteínatendo a atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase pode ser usado.

Além disso, quando PRPP que é um precursor indispensávelpara biossíntese de nucleosídeo de purina, histidina e triptofano é produzidouma vez, uma parte é convertida em nucleotídeos de purina e nucleosídeos depurina pelas enzimas envolvidas na biossíntese de purina. Exemplos de genescodificando tais enzimas incluem os genes do operon de purina de Bacillussubtilis, especificamente, genes do operon de purD purEKB-purC(orf) QLF-purMNH(J) (Ebbole D.J. and Zalkin H., J. BioL Chem., 1987, 262, 17, 8274-87) (no momento, também chamado purEKBCSQLFMNHD, Bacillus subtilisand Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press,Washington D.C., 2002, No. de Acesso de GenBank NC 000964), e os genesdo regulon pur de Escherichia coli (Escherichia and Salmonella, SecondEdition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C.,1996).

Por conseguinte, melhorar expressão destes genes concede oumelhora a capacidade de produzir uma substância derivada de purina pode serfornecido ou melhorado. Em adição, genes do operon de purina que podemser usados para a presente invenção não são limitados a estes, e genesderivados de outros microorganismos, animais e plantas também pode serusado.

Exemplos do método para aumentar quantidade de expressãodo operon de purina incluem aumentar expressão de genes dos genes deoperon de purina em uma bactéria Bacillus por um método de usar umplasmídeo contendo os genes ou integrando os genes em um cromossomo ouos semelhantes.

O segundo método para aumentar quantidade de expressão dooperon de purina inclui, substituir um promotor do operon de purina por umpromotor mais forte, e substituir a região -35 ou -10 do promotor nativo poruma seqüência consenso.

Por exemplo, em Bacillus subtilis (B. subtilis cepa 168Marburg, ATCC 6051), a seqüência de -35 do operon de purina é umaseqüência consenso (TTGACA), mas a seqüência de -10 é TAAGAT, quedifere da seqüência consenso TATAAT (Ebbole, D.J. and H. Zalikn, J. Biol.Chem., 1987, 262, 8274-8287). Portanto, mudando a seqüência de -10(TAAGAT) para a seqüência consenso similar TATAAT, TATGAT ouTAAAAT, a atividade transcricional do operon de purina pode ser aumentada.Uma seqüência de promotor pode ser substituída pelo mesmo método queaquele da substituição gênica, que é descrito abaixo.

O terceiro método para aumentar quantidade de expressão dooperon de purina inclui reduzir quantidade de expressão do repressor deoperon de purina (Patente Norte-Americana No. 6.284.495). A frase"expressão de um repressor de operon de purina" inclui tanto transcrição deum gene de operon como tradução de um produto de transcrição. Além disso,"quantidade de expressão é diminuída" inclui quando a quantidade deexpressão é menor do que aquela em uma cepa não modificada tal como umabactéria Bacillus tipo selvagem, e quando a expressão foi substancialmenteeliminada.

Quantidade de expressão do repressor de operon de purina(repressor de purina) pode ser diminuída, por exemplo, tratando uma bactériaBacillus com radiação de raios ultravioleta ou agente mutagênico usado emum tratamento de mutagênese usual tal como NTG ou EMS e selecionandoum mutante mostrando quantidade de expressão diminuída do repressor depurina pode ser empregado.

Além disso, uma bactéria Bacillus exibindo uma quantidade deexpressão diminuída do repressor de purina também pode ser obtida por, porexemplo, além de um tratamento de mutagênese, substituindo um genecodificando o repressor de purina em um cromossomo (purR, Acesso deGenBank NC_000964, região de codificação corresponde aos números 54439a 55293 de nucleotídeos, SEQ ID NO: 5) com um gene correspondente quenão funciona normalmente (daqui para frente, também referido como "genetipo rompido") por recombinação homóloga utilizando uma técnica derecombinação gênica (Experiments in Molecular Genetics, Cold SpringHarbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J.Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202).

Por exemplo, um gene tipo rompido para um gene normalpode ser substituído por um gene tipo rompido no cromossomo hospedeiro deuma maneira como descrito abaixo. A seguir, a ruptura do gene purR éexplicada. Outros genes tal como genes purA, deoD, guaB, fbp e ywjH podemser similarmente rompidos.

Quando um plasmídeo ou o semelhante que tem umaseqüência homóloga a uma seqüência no cromossomo e que não é capaz de sereplicar em células de bactérias Bacillus é introduzido na célula, resultandoem recombinação no sítio da seqüência tendo homologia em uma certafreqüência. O plasmídeo inteiro é então recombinado no cromossomo.Posteriormente, se recombinação é adicionalmente causada no sítio daseqüência tendo homologia no cromossomo, o plasmídeo é removido docromossomo. Neste momento, dependendo do sítio onde a recombinaçãoocorre, o gene tipo rompido pode ser mantido no cromossomo, e o genenormal original pode ser removido do cromossomo com o plasmídeo.Selecionando uma tal cepa, é possível obter uma cepa na qual o gene purRnormal no cromossomo foi substituído pelo gene purR tipo rompido.

Tais técnicas de ruptura gênica baseadas em recombinaçãohomóloga já foram estabelecidas e incluem um método de utilizar um DNAlinear, um método de utilizar um plasmídeo sensível a temperatura e assimpor diante. Além disso, o gene purR também pode ser rompido usando umplasmídeo que contém o gene purR no qual um gene marcador tal como umgene de resistência a droga foi inserido e que não é capaz de replicar na célulabacteriana alvo. Isto é, em um transformante que foi transformado com umplasmídeo tal como descrito acima, o gene marcador é incorporado no DNAcromossômico e concede resistência a droga. Uma vez que o gene marcador éincorporado no cromossomo em uma alta taxa por recombinação homólogadas seqüências de gene purR que coloca o gene marcador no plasmídeo entreo gene purR no cromossomo, uma cepa com gene purR rompido pode sereficientemente selecionada.

O gene purR tipo rompido usado para a ruptura gênica podeser obtido, especificamente, deletando uma certa região do gene purR pordigestão com uma enzima de restrição e re-ligação, inserindo outro fragmentode DNA (gene marcador etc.) no gene purR, ou causando substituição,deleção, inserção, adição ou inversão de um ou mais nucleotídeos in aseqüência de nucleotídeos da região de codificação, região promotora ou ossemelhantes do gene purR por uma mutagênese específica de sítio (Kramer,W. and Frits, HJ., Methods in Enzymology, 1987, 154, 350-367) ou por PCRrecombinante (PCR Technology, Stockton Press (1989)) ou por tratamentocom um agente químico tal como hipossulfito de sódio ou hidroxilamina(Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1978, 75, 2170-2174), seguido por seleção de uma cepa na qual a atividade do repressorcodificado pelo gene purR é diminuída ou transcrição do gene é diminuída.

Entre estes métodos, deletar uma certa região do gene purR por digestão comuma enzima de restrição e re-ligação ou inserir outro fragmento de DNA nogene purR é preferível em vista de confiabilidade e estabilidade. A regiãocerta do gene purR a ser deletada pode ser uma seqüência de extremidade 5',seqüência interna ou seqüência de extremidade 3' do gene purR. Entretanto, sea região responde por 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais,particularmente 97% ou mais, do comprimento completo de gene purR,certeza de redução da atividade de repressor é aumentada. Além disso,quando uma mutação de mudança de quadro é causada por deleção ouinserção de nucleotídeos na região de codificação do gene purR, é preferívelcausar deleção ou inserção de nucleotídeos em múltiplos sítios e causardeleção ou inserção de nucleotídeos no lado de extremidade 3', em vista dereduzir seguramente a atividade de repressor.

Redução da atividade de repressor de purina também pode seratingida, além da ruptura gênica mencionada acima, introdução de umamutação que reduz a atividade intracelular de repressor de purina no genepurR no cromossomo baseado em um método de mutagênese convencional.Por exemplo, ela pode ser atingida introduzindo uma substituição deaminoácido (mutação de sentido incorreto), um códon de parada (mutaçãosem sentido), ou uma mutação de mudança de quadro que adiciona ou deletaum ou dois nucleotídeos, ou deletando o gene parcialmente ou inteiramente.Além disso, a atividade do repressor também pode ser diminuída inserindoum transposon no gene purR no cromossomo.

Redução da atividade do repressor de purina também pode seratingida substituindo uma seqüência de controle de expressão do gene purRtal como promotor no DNA cromossômico por um mais fraco. A força de umpromotor é definida pela freqüência de iniciação de síntese de RNA.

Exemplos de método para avaliar a força de promotores e promotores fortessão descritos no artigo de Goldstein et al. (Prokaryotic promoters inbiotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128), e assim por diante.

Além disso, também é possível introduzir substituição de nucleotídeo paradiversos nucleotídeos em uma região promotora de um gene alvo e com issomodificar o promotor a ser enfraquecido como descrito em Publicação dePatente Internacional WOOO/18935. Além disso, sabe-se que substituição dediversos nucleotídeos no espaçador entre o sítio de ligação de ribossomo(RBS) e o códon de início, em particular, uma seqüência imediatamente antesdo códon de início, afeta fortemente eficiência de tradução de mRNA. Estamodificação de RBS pode ser combinada com transcrição decrescente de umgene alvo.

Além disso, um DNA recombinante no qual uma mutação quedesestabiliza RNA mensageiro transcrito a partir do gene purR é introduzidopode ser preparado e transformado em uma bactéria Bacillus hospedeira.

Atividades de enzimas codificadas pelos genes purA, deoD,guaB, fbp e ywjH descritos posteriormente também podem ser diminuídas damesma maneira como descrito acima.

O gene purR pode ser obtido a partir de um DNAcromossômico de um microorganismo tendo o operon de purina por PCRusando oligonucleotídeos preparados baseado na seqüência de nucleotídeosconhecida do gene purR como iniciadores. O gene purR também pode serobtido a partir de uma biblioteca de DNA cromossômico de ummicroorganismo tendo o operon de purina por hibridização usando umoligonucleotídeo preparado com base na seqüência conhecida de nucleotídeosdo gene purR como uma sonda. A seqüência de nucleotídeos do gene purR dacepa 168 Marburg de Bacillus subtilis foi relatada (No. de Acesso deGenBank D26185 (a região de codificação corresponde aos números denucleotídeos 118041 a 118898), ou NC_000964 (a região de codificaçãocorresponde aos números de nucleotídeos 54439 a 55296)). A seqüência denucleotídeos do gene purR e a seqüência de aminoácidos codificada pelo genesão mostradas em SEQ ID NOS: 5 e 6 de Listagem de Seqüências (PatenteJaponesa Não-examinada No. 2004-242610).

Iniciadores usados para PCR para obter o gene purR podemser quaisquer daqueles possibilitando amplificação de uma parte oucomprimento completo do gene purR, e exemplos específicos incluemoligonucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ IDNO: 17 (GAAGTTGATGATCAAAA) e SEQ ID NO: 18(AC AT ATTGTTG ACGAT AAT).

O gene purR usado para preparação do gene tipo rompido nãoprecisa ser necessariamente o gene purR de comprimento completo, e elepode ter um comprimento requerido para causar ruptura gênica. Além disso, omicroorganismo usado para obter cada gene não é particularmente limitado,contanto que um microorganismo no qual o gene tenha uma homologia com ogene purR da bactéria Bacillus usada para construção de uma cepa com generompido em um grau tal que cause recombinação homóloga. Entretanto,normalmente é preferível usar o gene originário da mesma bactéria Bacilluscomo a bactéria Bacillus objetiva.

Exemplos do gene marcador descrito acima incluem genes deresistência a droga tal como um gene de resistência a espectinomicina, genede resistência a canamicina e gene de resistência a tetraciclina. O gene deresistência a espectinomicina de Enterococcus faecalis pode ser obtidopreparando o plasmídeo pDG1726 da cepa ECElOl de Escherichia colicomercialmente disponível a partir do Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) e removendo o gene de resistência como uma gaveta do plasmídeo. O gene deresistência a eritromicina de Staphylococcus aureus pode ser obtidopreparando o plasmídeo pDG646 da cepa ECE91 de Escherichia colicomercialmente disponível a partir do Bacillus Genetic Stock Center (BGSC)e removendo o gene de resistência como uma gaveta do plasmídeo. O gene deresistência a canamicina derivado de Streptococcus faecalis pode ser obtidopreparando o plasmídeo pDG783 da cepa ECE94 de Escherichia colicomercialmente disponível a partir do Bacillus Genetic Stock Center (BGSC)e removendo o gene de resistência como uma gaveta do plasmídeo. Alémdisso, o gene de resistência a cloranfenicol de Staphylococcus aureus pode ser obtido preparando o plasmídeo pC194 da cepa IEl7 de Bacillus subtiliscomercialmente disponível a partir do Bacillus Genetic Stock Center (BGSC)e realizando PCR usando tal plasmídeo como um modelo para amplificar oplasmídeo. O gene de resistência a tetraciclina de Streptococcus agalactiaepode ser obtido preparando o plasmídeo pDG1513 da cepa ECE99 de Escherichia coli, e removendo o plasmídeo como uma gaveta do plasmídeo(Gene, 1995, 167:335-336).

Quando um gene de resistência a droga é usado como o genemarcador, uma cepa com gene purR rompido pode ser obtida inserindo o genede resistência a droga no gene purR em um plasmídeo em um sítioapropriado, transformando um microorganismo com o plasmídeo obtido eselecionando um transformante que se tornou resistente a droga. Ruptura dogene purR no cromossomo pode ser confirmada analisando o gene purR ou ogene marcador no cromossomo usando Southern blotting ou PCR.Incorporação do gene de resistência a espectinomicina, gene de resistência aeritromicina ou gene de resistência a canamicina mencionados acima em umDNA cromossômico pode ser confirmada por PCR usando iniciadores quepodem amplificar estes genes.

Também se sabe que expressão do operon de purina é reguladapela seqüência de terminador-antiterminador localizada depois do promotor(de agora em diante referido como seqüência atenuadora) (Ebbole, D.J. andZalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287; Ebbole D.J. and Zalkin H.,J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894-10902; Ebbole, D.J. and Zalkin, H., J.Bacteriol., 1989, 171, 2136-2141). Portanto, quantidade de expressão dooperon de purina pode ser aumentada deletando a seqüência atenuadora.Deleção da seqüência atenuadora pode ser atingida pelo mesmo método queaquele para ruptura de purR.

A fim de adicionalmente aumentar transcrição do operon depurina, os métodos descritos acima podem ser combinados. Por exemplo, ogene purR pode ser rompido, e depois, o operon de purina do qual a seqüênciaatenuadora é deletada pode ser amplificado usando um plasmídeo oumúltiplas cópias de um tal operon de purina podem ser introduzidas em umcromossomo.

As atividades de uma enzima envolvida em biossíntese depurina também podem ser melhoradas dessensibilizando a enzima queparticipa na biossíntese de purina para regulação desta, por exemplo, deacordo com o método mencionado acima para dessensibilizar uma enzimapara inibição por retroalimentação (Patente Internacional 99/03988).

Além disso, a capacidade de produzir substância derivada depurina também pode ser melhorada atenuando absorção de substânciasderivadas de purina pelas células. Por exemplo, a absorção de nucleosídeos depurina pelas células pode ser atenuada bloqueando uma reação envolvida naabsorção de nucleosídeos de purina pelas células. Um exemplo da reaçãoenvolvida na absorção de os nucleosídeos de purina pelas células incluireações catalisadas por nucleosídeo permeases.

Além disso, quando um nucleosídeo de purina é produzido,atividade de uma enzima de decompõe o nucleosídeo de purina pode serdiminuída a fim de melhorar a capacidade de produzir um nucleosídeo depurina. Um exemplo de uma tal enzima inclui nucleosídeo de purinafosforilase.

Nucleotídeos de purina biossintetizados a partir de PRPP porenzimas envolvidas em biossíntese de purina são desfosforilados e com issoconvertidos em um nucleosídeo de purina. Para causar eficientementeacumulação de um nucleosídeo de purina, é preferível reduzir uma atividadede nucleosídeo de purina fosforilases, o que adicionalmente degradanucleosídeos de purina em hipoxantina ou os semelhantes. Isto é, é preferívelatenuar ou eliminar uma atividade de um nucleosídeo de purina fosforilaseque emprega nucleosídeos de purina, tal como inosina, como um substrato.

Especificamente, a atividade de nucleosídeo de purinafosforilase pode ser diminuída rompendo os genes deoD e pupG codificandonucleosídeo de purina fosforilase em bactérias Bacillus. A bactéria Bacillusda presente invenção pode ser modificada rompendo um ou ambos os genesdeoD e pupG. Como os genes deoD e pupG, por exemplo, aqueles genesderivados de bactérias Bacillus (deoD: No. de Acesso de GenBankNC_000964 (SEQ ID NO: 7), pupG: No. de Acesso de GenBank NC_000964(SEQ ID NO: 9)) podem ser usados, e uma cepa com gene rompido pode serobtida da mesma maneira que aquela usada para a ruptura mencionada acimado gene purR.A capacidade de produzir uma substância derivada de purinatambém pode ser melhorada diminuindo a atividade de succinil-AMP sintase.Um exemplo do gene codificando succinil-AMP sintase inclui o gene purA.Um exemplo do gene purA inclui, por exemplo, aqueles tendo a seqüência denucleotídeos registrada como No. de Acesso de GenBank NC_000964 (regiãode codificação corresponde aos números de nucleotídeos 4153460 a 4155749da fita complementar, SEQ ID NO: 11).

A capacidade de produzir uma substância derivada de purinatambém pode ser melhorada diminuindo uma atividade de inosinamonofosfato (IMP) desidrogenase. Um exemplo do gene codificando IMPdesidrogenase inclui o gene guaB. Um exemplo do gene guaB inclui, porexemplo, aqueles tendo a seqüência de nucleotídeos registrada como No. deAcesso de GenBank NC_000964 (região de codificação corresponde aosnúmeros de nucleotídeos 15913 a 17376, SEQ ID NO: 13).

Além disso, a capacidade de produzir uma substância derivadade purina, também pode ser aumentada diminuindo uma atividade de frutosebifosfatase. Um exemplo do gene codificando frutose bifosfatase inclui ogene fbp. Um exemplo do gene fbp inclui, por exemplo, aqueles tendo aseqüência de nucleotídeos registrada como No. de Acesso de GenBankNC_000964 (região de codificação corresponde aos números de nucleotídeos4127053 a 4129065, SEQ ID NO: 15).

Além disso, como um método para melhorar uma capacidadede produzir substância derivada de purina, amplificação de um genecodificando uma proteína tendo uma atividade de secretar uma substânciaderivada de purina pode ser contemplada. Um exemplo de uma bactéria naqual um tal gene foi amplificado inclui uma bactéria Bacillus na qual o generhtA é amplificado (Patente Japonesa Não Examinada No. 2003-219876).

Os genes purR, deoD, pupG, purA, guaB e fbp a seremrompidos como descrito acima, e o gene prs cuja expressão deve sermelhorada podem ser variantes conservativas, por exemplo, DNAscodificando proteínas tendo seqüências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 6, 8,10, 12, 14, 16 e 4 o que inclui substituições, deleções, inserções, adições ouinversões de um ou diversos resíduos de aminoácidos, respectivamente, etendo atividade do repressor de purina, nucleosídeo de purina fosforilase,succinil-AMP sintase, IMP desidrogenase, frutose bifosfatase ou fosforribosilpirofosfato sintetase, respectivamente. Número pretendido pelo termomencionado acima "diversos" é, por exemplo, 2 a 50, preferivelmente 2 a 30,mais preferivelmente 2 a 10.

Tal mudança de seqüências de aminoácidos como descritoacima normalmente é mudança conservativa que mantém atividades deproteínas. Exemplos de substituição conservativa de aminoácidos incluem:substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gln5 His ou Lys por Arg;substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn; substituição de Asn, Gluou Gln por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys; substituição de Asn, Glu,Lys, His, Asp ou Arg por Gln; substituição de Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu;substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr porHis; substituição de Leu, Met, Val ou Phe por lie; substituição de lie, Met,Val ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys;substituição de lie, Leu, Val ou Phe por Met; substituição de Trp, Tyr, Met,Ile ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Ala por Ser; substituição de Ser ouAla por Thr; substituição de Phe ou Tyr por Trp; substituição de His, Phe ouTrp por Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai.

Exemplos específicos de variantes conservativas dos genespurR, deoD, pupG, purA, guaB e fbp e do gene prs descritos acima incluemDNAs mostrando uma homologia de, por exemplo, 70% ou mais,preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais,particularmente preferivelmente 95% ou mais, com DNAs tendo asseqüências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 13, 15 e 3,respectivamente. Mais especificamente, os exemplos das variantesconservativas incluem DNAs que são capazes de hibridizar com DNAs tendoseqüências de nucleotídeos complementares às seqüências de nucleotídeos deSEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 13, 15 e 3 em condições estringentes. Um exemplodas condições estringentes inclui condições de lavagem a 60°C econcentrações salinas de lxSSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 0,lxSSC,0,1% de SDS, uma vez ou mais vezes, preferivelmente duas vezes ou trêsvezes.

Homologia de DNAs pode ser avaliada por busca BLAST,busca FASTA, o método de cálculo de Crustal W, e assim por diante.

BLAST (ferramenta básica de busca de alinhamento local) éum algoritmo de busca heurística usado pelos programas blastp, blastn, blastx,megablast, tblastn e tblastx, e os resultados obtidos por estes programas sãoconsiderados significantes com base em uso do método estatístico de Karlin,Samuel, and Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statisticalsignificance of molecular sequence features by using general scoringschemes", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications andstatisties for multiple high-scoring segments in molecular sequences", Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90:5873-7). O método de busca FASTA foidescrito por W.R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison withFASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63-98). O métodode Clustal W é descrito por Thompson J.D., Higgins D.G., and Gibson TJ.("CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting, position-specific gap penalties andweight matrix choice", Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680).

Além disso, DNA usado para preparação de um gene tiporompido também pode ser uma variante conservativa de gene purR, deoD,pupG, purA ou guaB.

Incorporação de um gene alvo no DNA cromossômico debactéria Bacillus pode ser realizada da mesma maneira que aquela para o genecodificando transaldolase descrito posteriormente.

(2) Modificação para diminuir atividade enzimática detransaldolase

A bactéria Bacillus da presente invenção pode ser obtidamodificando uma cepa tendo a capacidade de produzir uma substânciaderivada de purina tal como aquelas descritas acima de forma que a atividadeenzimática de transaldolase é diminuída. A ordem da modificação não élimitada, e depois de modificar uma bactéria de forma que a atividadeenzimática de transaldolase desta seja diminuída, capacidade produtora denucleotídeo de purina pode ser concedida à bactéria.

Transaldolase é uma enzima catalisando a reação reversívelgerando D-eritrose-4-fosfato e D-frutose-6-fosfato a partir de sedoheptulose-7-fosfato e D-gliceraldeído-3-fosfato, e esta reação é uma das reações da viade pentose fosfato. A "via de pentose fosfato" significa a via na qual glicoseabsorvida em células é fosforilada por glicose quinase para biossintetizarglicose-6-fosfato, e glicose-6-fosfato é oxidativamente convertido em ribose-5-fosfato, e a via consistindo de processo reversível para interconversão defosfatos de triose, tetrolose, pentose, hexose e heptose pelas ações deepimerase, transcetolase (EC: 2.2.1.1) e transaldolase (EC: 2.2.1.2).

A atividade enzimática de transaldolase pode ser medida pelométodo seguinte. Por exemplo, a atividade pode ser medida convertendo D-gliceraldeído-3-fosfato gerado em hidroxiacetona fosfato com triosefosfatoisomerase e medindo hidroxiacetona fosfato usando glicerol-3-fosfatodesidrogenase e NADH (Ochoa, T., and Horecker, B.L., 1966, MethodsEnzymol., 9, 499-505).

Tal modificação que a atividade enzimática de transaldolase édiminuída pode ser atingida, por exemplo, como explicado acima para rupturado gene purR, substituindo um gene correspondente que não funcionanormalmente (e.g., gene tipo rompido obtido inserindo um gene marcador talcomo gene de resistência a droga no gene de transaldolase) para o gene detransaldolase no cromossomo por recombinação homóloga. Além disso, comodescrito para o gene purR, uma mutação para reduzir atividade enzimática detransaldolase intracelular pode ser introduzida no gene de transaldolase nocromossomo por métodos convencionais de mutagênese.

Exemplos de transaldolase de Bacillus subtilis incluem umaproteína consistindo de 212 resíduos de aminoácidos mostrada em SEQ IDNO: 2, e um gene codificando a proteína, preferivelmente um gene tendo aseqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 (gene ywjH, No. de Acesso deGenBank NC_000964), pode ser usado para a modificação. O gene ywjHexiste a cerca de 325° no cromossomo de Bacillus subtilis.

O gene codificando transaldolase também pode ser umavariante conservativa do gene ywjH como os genes mencionados acima.Especificamente, exemplos incluem um DNA codificando uma proteína tendoa seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 incluindo substituições,deleções, inserções, adições ou inversões de um ou diversos resíduos deaminoácidos e tendo a atividade enzimática de transaldolase. Exemplosincluem adicionalmente um DNA codificando uma proteína mostrando umahomologia de 50% ou mais, preferivelmente 70% ou mais, maispreferivelmente 80% more, particularmente preferivelmente 90% ou mais,mais preferivelmente 95% ou mais, com a seqüência de aminoácidosmostrada em SEQ ID NO: 2, e tendo a atividade enzimática de transaldolase.Mais especificamente, exemplos incluem um DNA que é capaz de hibridizarcom um DNA tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 emcondições estringentes. As condições estringentes incluem condições delavagem a 60°C e concentrações salinas de lxSSC, 0,1% de SDS,preferivelmente 60°C, 0,1><SSC, 0,1% de SDS, uma vez ou mais vezes,preferivelmente duas vezes ou três vezes.Um tal DNA codificando uma proteína substancialmenteidêntica a transaldolase como descrito acima pode ser obtido, por exemplo,modificando uma seqüência de nucleotídeos codificando uma tal enzima deforma que o resíduo de aminoácido de uma parte específica é substituído,deletado, inserido, adicionado ou invertido pela mutagênese específica desítio. Um tal DNA modificado como descrito acima também pode ser obtidopor um tratamento de mutagênese convencionalmente conhecido. Exemplosdo tratamento de mutagênese incluem um tratamento in vitro de DNA antesde tratamento de mutagênese com hidroxilamina, e um tratamento de um microorganismo tal como bactéria Escherichia contendo DNA antes detratamento de mutagênese com radiação ultravioleta ou um agentemutagênico usado para tratamento de mutagênese convencional tal como N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso.

O gene alvo pode ser obtido, por exemplo, por método de PCR(reação em cadeia da polimerase, White, T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5,185-189) usando um DNA cromossômico de uma bactéria Bacillus como ummodelo e oligonucleotídeos preparados baseado em seqüência de nucleotídeosde gene alvo como iniciadores. O DNA cromossômico pode ser preparado apartir de uma bactéria servindo como uma doadora de DNA, por exemplo,pelo método de Saito e Miura (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys.Acta, 1963, 72, 619-629; Text for Bioengineering Experiments, Editado pelaSociety for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifükan, 1992)ou os semelhantes. Os iniciadores para PCR pode ser preparado baseado emuma seqüência gênica conhecida de uma bactéria Bacillus, ou baseado em informação em uma região conservada entre genes de outras bactérias cujasseqüências são conhecidas.

Exemplos do vetor para incorporar um gene alvo em um DNAcromossômico de bactéria Bacillus incluem um vetor tendo uma origem dereplicação sensível a temperatura, tal como pHV1248 (Prtit, M.-A., et. al., J.Bacteriol., 1990, 172, 6736-6740), vetores para Ε. coli tal como pHSG398(Takara Shuzo) e pBluescript SK- (Stratagene), e assim por diante.

A fim de ligar um gene objetivo e um vetor carregando ummarcador que funciona em bactérias Bacillus para preparar um DNArecombinante, o vetor é digerido com uma enzima de restrição se combinandocom a extremidade do gene objetivo. A ligação normalmente é realizadausando uma ligase tal como T4 DNA ligase.

Para introduzir um DNA recombinante preparado comodescrito acima em uma bactéria Bacillus, qualquer dos métodos detransformação conhecidos que foram até agora relatados pode ser empregado.Exemplos incluem, por exemplo, um método de preparar células competentesa partir de células que estão na fase de crescimento seguido por introduzir oDNA nestas, (Dubunau D. and Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971, 56,209-221) e um método de fazer células hospedeiras em protoplastos ouesferoplastos, que podem facilmente adquirir DNA recombinante, seguido porintroduzir o DNA recombinante nas células aceptoras de DNA (Chang, S. andChoen, S.N., Molec. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115).

<2> Método para produzir uma substância derivada de purina

A bactéria Bacillus da presente invenção produzeficientemente uma substância derivada de purina. Portanto, cultivando abactéria Bacillus da presente invenção em um meio apropriado, umasubstância derivada de purina, tal como nucleosídeo de purina e nucleotídeode purina pode ser produzida e acumulada em células da bactéria ou no meio.

Como para o meio usado para a presente invenção, culturapode ser realizada de uma maneira convencional usando um meioconvencional contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e saisminerais assim como nutrientes traço orgânicos tal como aminoácidos evitaminas, como requerido. Ou um meio sintético ou um meio natural podeser usado. Quaisquer tipos de fonte de carbono e fonte de nitrogênio podemser usados contanto que eles possam ser utilizados por uma cepa a sercultivada.

Como a fonte de carbono, açúcares tal como glicose, frutose,sucrose, maltose, manose, galactose, arabinose, xilose, trealose, ribose,hidrolisados de amido e melaço, e álcoois tal como glicerol e manitol sãousados, e ácidos orgânicos tal como ácido glucônico, ácido acético, ácidocítrico, ácido maleico, ácido fumárico e ácido succínico também podem serusados independentemente ou em combinação com outras fontes de carbono.

Como a fonte de nitrogênio, amônia, sais de amônio tal comosulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato deamônio e acetato de amônio, sais de ácido nítrico, nitrogênio orgânico talcomo hidrolisado de soja, e assim por diante são usados.

Como os nutrientes traço orgânicos, aminoácidos, vitaminas,ácidos graxos, ácidos nucleicos, aqueles contendo estas substâncias tal comopeptona, ácido casamino, extrato de levedura e produto de decomposição deproteína de soja e assim por diante são usados. Quando uma cepa mutanteauxotrófica que requer um aminoácido ou os semelhantes para crescimento éusada, é necessário suplementar o nutriente requerido.

Como os sais minerais, sais de ácido fosfórico, sais demagnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e assim por diantesão usados.

Embora as condições de cultura possam variar dependendo dotipo de bactéria Bacillus a ser usado, Bacillus subtilis, por exemplo, écultivada como cultura sob aeração, enquanto que a temperatura defermentação é controlada para ser de 20 a 50°C, e pH para ser de 4 a 9.Quando pH cai durante a cultura, o meio é neutralizado com uma basealcalina tal como gás amônia. Um nucleosídeo de purina é acumulado nomeio depois de cerca de 40 horas a 3 dias de cultura de uma maneira tal comodescrito acima.Depois de término da cultura, inosina acumulada no meio podeser coletada de uma maneira convencional. Por exemplo, ela pode ser isoladapor precipitação, cromatografia de troca iônica e assim por diante.

Além disso, se o microorganismo usado para a presenteinvenção carece de um gene codificando uma nucleosidase ou nucleotidase,um nucleosídeo ou nucleotídeo correspondente pode ser acumulado. Alémdisso, se auxotrofia de inosina é concedida, um precursor ou substânciasrelevantes envolvidas na via de biossíntese desta podem ser acumulados.

Além disso, reagindo inosina ou guanosina preparada pelométodo da presente invenção com nucleosídeo de purina fosforilase oufosforribosiltransferase, ácido 5'-inosínico ou ácido 5'-guanílico podem serobtidos.

Além disso, também é possível fosforilar o nucleosídeo depurina produzido usando o microorganismo da presente invenção reagindofosfotransferase no nucleosídeo de purina para produzir um nucleotídeo depurina (éster de ácido 5'-fosfórico de nucleosídeo) (Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-295996). Por exemplo, o método para produzir umnucleotídeo de purina usando uma bactéria Escherichia na qual um genecodificando inosina guanosina quinase de Escherichia coli é introduzido(Patente Internacional 91/08286), e o método para produzir um nucleotídeo depurina usando Corynebacterium ammoniagenes na qual um gene codificandoinosina guanosina quinase de Exiguobacterium acetylicum é introduzido(Patente Internacional 96/30501) pode ser usado.

Além disso, também é possível produzir um nucleotídeo depurina (éster de ácido 5'-fosfórico de nucleosídeo) reagindo o nucleosídeo depurina produzido usando o microorganismo da presente invenção com umdoador de fosfato selecionado a partir do grupo consistindo de ácidopolifosfórico, fenil fosfato e carbamil fosfato, e um microorganismo tendouma capacidade de produzir um éster de ácido 5'-fosfórico de nucleosídeo oufosfatase ácida (EC 3.1.3.2). Embora o microorganismo tendo umacapacidade de produzir um éster de ácido 5'-fosfórico de nucleosídeo não sejaparticularmente limitado contanto que um microorganismo tendo umacapacidade de converter um nucleosídeo de purina em um nucleotídeo depurina seja escolhido, exemplos incluem, por exemplo, o microorganismodescrito em Publicação de Patente Internacional W096/37603.

Além disso, Escherichia blattae JCM 1650, Serratia ficariaATCC 33105, Klebsiella planticola IFO 14939 (ATCC 33531), Klebsiellapneumoniae IFO 3318 (ATCC 8724), Klebsiella terrigena IFO 14941 (ATCC33257), Morganella morganii IFO 3168, Enterobacter aerogenes IFO 12010,Enterobacter aerogenes IFO 13534 (ATCC 13048), Chromobacteriumfluviatile IAM 13652, Chromobacterium violaceum IFO 12614, Cedecealapagei JCM 1684, Cedecea davisiae JCM 1685, Cedecea neteri JCM 5909, eassim por diante descritas em Patente Japonesa Não-examinada No. 07-231793 também podem ser usadas.

Como a fosfatase ácida, por exemplo, a fosfatase ácida descritaem Patente Japonesa Não-examinada No. 2002-000289 pode ser usada, e umafosfatase ácida cuja afinidade com um nucleosídeo é aumentada (PatenteJaponesa Não-examinada No. 10-201481), uma fosfatase ácida mutante cujaatividade de nucleotidase é diminuída (Patente Internacional 96/37603), umafosfatase ácida mutante cuja atividade de hidrólise de éster de ácido fosfóricoé diminuída (Patente Japonesa Não-examinada No. 2001-245676) e assim pordiante podem ser mais preferivelmente usadas.

Também é possível obter um nucleotídeo de purinafosforilando quimicamente um nucleosídeo de purina produzido usando omicroorganismo da presente invenção (Bulletin of the Chemical Society ofJapan, 42, 3505). Além disso, um método de obter GMP acoplando omicroorganismo tendo uma capacidade de produzir XMP da presenteinvenção e atividade de XMP aminase usando o sistema regenerante de ATPde um microorganismo, e um método de obter IMP acoplando inosina quinase(Biosci. Biotech. Biochem., 51, 840 (1997); Patente Japonesa Não-examinadaNo. 63-230094) também podem ser usados.

Nucleosídeo de inosina, guanosina ou purina preparado pelométodo da presente invenção usado para a preparação mencionada acima denucleotídeo de purina pode ser um produto purificado, ou caldo defermentação de nucleosídeo de purina, ou um produto bruto contendo umnucleosídeo de purina.

Exemplos

Daqui para frente, a presente invenção será maisespecificamente explicada com referência a exemplos.

Exemplo 1

<Construção de cepa bacteriana deficiente em genes pupG edeoD codificando nucleosídeo de purina fosforilases>

Uma cepa deficiente no gene de nucleosídeo de purinafosforilase (deoD) foi construída a partir da cepa recombinante KMBS310como descrito abaixo. A cepa KMBS310 (Pedido de Patente Japonesa No.2005-280186), que é derivada de Bacillus subtilis (cepa 168 Marburg de B.subtilis, ATCC 6051), é deficiente no gene de repressor de operon de purina(purR), gene de succinil-AMP sintase (purA) e gene de nucleosídeo de purinafosforilase (pupG), e tem gene de IMP desidrogenase (guaB) atenuado,caracterizado pelo fato de que a região promotora de operon de purina eseqüência SD do gene de PRPP sintetase(prs) foram modificadas (Pedido dePatente Japonesa No. 2005-280186). Expressão do operon de purina e dogene de PRPP sintetase foram melhoradas pelas modificações da regiãopromotora e da seqüência SD, respectivamente.

Um DNA genômico preparado a partir da cepa KMBS16(purR::spc purA::erm deoD::kan, Patente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610) pelo método de Fouet e Sonenshein (J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844) foi usado para transformar células competentes da cepa 168 Marburg deB. subtilis preparada pelo método de Dubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol.Biol., 1971, 56, 209-221), e colônias cultivadas em uma placa de ágar LBcontendo 5 μg/ml de canamicina foram obtidas. Colônias que não se tornaramresistentes a espectinomicina nem resistentes a eritromicina foramselecionadas a partir das colônias obtidas, e uma cepa entre estas foidesignada KMBS5 (deoD::kan).

Um DNA genômico preparado a partir de KMBS5 pelométodo de Fouet e Sonenshein (J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844) foi usadopara transformar células competentes da cepa KMBS310 preparada pelométodo de Dubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221), ecolônias cultivadas em uma placa de ágar LB contendo 5 μg/ml decanamicina e 20 μg/ml de guanina foram obtidas. Diversas colônias foramselecionadas a partir das colônias obtidas como descrito acima, e um dostransformantes para o qual pode ser confirmado que deoD::kan substituiu ogene deoD tipo selvagem, e todas as mutações derivadas de KMBS310 nãoforam substituídas pelas seqüências tipo selvagem foi designado KMBS321.

Exemplo 2

<Construção de cepa bacteriana deficiente em um ou ambos degene fbp codificando frutose bifosfatase e gene ywjH codificandotransaldolase, cultura e avaliação desta>

(1) Preparação de cepa deficiente em gene fbp

Uma cepa deficiente no gene de frutose bifosfatase (fbp) foiconstruída a partir da cepa recombinante KMBS321 mencionada acima comodescrito abaixo. A cepa KMBS321, que é derivada de Bacillus subtilis (cepa168 Marburg de B. subtilis, ATCC 6051), é deficiente no gene de repressor deoperon de purina (purR), gene de succinil-AMP sintase (purA) e gene denucleosídeo de purina fosforilase (pupG), e tem gene de IMP desidrogenase(guaB) atenuado, caracterizada pelo fato de que região promotora modificadade operon de purina e seqüência SD do gene de PRPP sintetase (prs) forammodificadas.

(i) Amplificação de região antes de fbp por PCR

Iniciadores de PCR 28-mero e 50-mero tendo as seguintesseqüências de nucleotídeos foram preparados baseado na informação de umbanco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 eV01277).

TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA (SEQ ID NO:19) cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGC ATGTGC ATGATAAGGTGA(SEQ ID NO: 20, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem à região antes de promotor do gene de resistência acloranfenicol (cat) clonada em pC194)

PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o DNA cromossômico da cepa 168 Marburg de B.subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter umfragmento de amplificação contendo um região de extremidade 5' de gene fbpe cerca de 1350 bp antes de região.

(ii) Amplificação de região depois de fbp por PCR

Iniciadores de PCR 50-mero e 27-mero tendo as seguintesseqüências de nucleotídeos foram preparados baseado na informação de umbanco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 eV01277).

acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG (SEQ ID NO: 21, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem a uma região depois de gene estrutural do gene de resistência acloranfenicol (cat) clonada em pC194)

TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA (SEQ ID NO: 22)PCR (98°C por 10 segundos, 550C por 30 segundos, 72°C por1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o DNA cromossômico da cepa 168 Marburg de B.subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter umfragmento de amplificação contendo uma região de extremidade 3' de genefbp e cerca de 1770 bp depois de região.

(iii) Amplificação de gene cat por PCR

Iniciadores de PCR 50-mero tendo as seguintes seqüências denucleotídeos foram preparados baseado na informação de um banco de dadosde genes (Nos. de Acesso de GenBank VO1277 e NC_000964).

tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (SEQ ID NO: 23, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem à seqüência de região de extremidade 5' do gene fbp, e elesforam designados como sendo complementares à região de extremidade 3' deSEQ ID NO: 20)

cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (SEQ ID NO: 24, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem à seqüência de região de extremidade 3' do gene fbp, e elesforam designados como sendo complementares à região de extremidade 3' de

SEQ ID NO: 21)

PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o plasmídeo pC194 carregando o gene de resistência acloranfenicol (cat) como um modelo e os iniciadores mencionados acima paraobter um fragmento de amplificação de cerca de 980 bp contendo o gene cat.

(iv) Amplificação de fragmento compreendendo região de fbpinserida com gene cat por PCR recombinante

Os fragmentos de DNA amplificados em (i) a (iii) descritosacima foram purificados usando Coluna MicroSpin S-400 (AmershamPharmacia Biotech), e então uma mistura destes em quantidades apropriadasfoi usada como um modelo junto com as seqüências de SEQ ID NOS: 19 e 22para realizar PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por4,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer) ecom isso obter um fragmento compreendendo a região de fbp inserida com ogene cat.

(v) Preparação de cepa produtora de inosina com fbp rompido

O fragmento de DNA compreendendo a região de fbp na qualo gene cat (fbp::cat) obtido em (iv) havia sido inserido foi sujeito aeletroforese em gel de agarose, e o fragmento alvo foi extraído do gel. Ofragmento de DNA purificado como descrito acima foi usado paratransformar células competentes da cepa KMBS321 de B. subtilis preparadapelo método de Dubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221), e colônias cultivadas em uma placa de ágar LB contendo 2,5 μg/ml decloranfenicol e 20 μg/ml de guanina foram obtidas. DNAs cromossômicosforam preparados a partir destas colônias, cepas nas quais região de fbp emum cromossomo foi substituída pela região de fbp cuja seqüência interna foisubstituída pelo gene de resistência a cloranfenicol (fbp::cat) por duplarecombinação foram identificadas pelo método de PCR descrito em (iv), euma destas cepas foi designada TABS133.

(2) Preparação de cepa deficiente em gene ywjH

Uma cepa deficiente no gene de transaldolase (ywjH) foiconstruída a partir da cepa recombinante KMBS321 mencionada acima comodescrito abaixo. A cepa KMBS321 (Pedido de Patente Japonesa No. 2005-280186), que é derivada de Bacillus subtilis (cepa 168 Marburg de B. subtilis,ATCC 6051), é deficiente no gene de repressor de operon de purina (purR),gene de succinil-AMP sintase (purA) e gene de nucleosídeo de purinafosforilase (pupG), e tem gene de IMP desidrogenase (guaB) atenuado,caracterizada pelo fato de que a região promotora de operon de purina eseqüência SD do gene de PRPP sintetase (prs), e deficiente no gene denucleosídeo de purina fosforilase (deoD) são modificadas.

(i) Amplificação de região antes de ywjH por PCRIniciadores de PCR 28-mero e 50-mero tendo as seguintes

seqüências de nucleotídeos foram preparados baseado na informação de umbanco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 eVO1277).

ATGGACGGAATCGAAATCTTAAAACGGA (SEQ ID NO:25) cgtttgttgaactaatgggtgctttAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC (SEQID NO: 26, os nucleotídeos indicados com letras minúsculas correspondem àregião antes de promotor do gene de resistência a cloranfenicol (cat) clonadaem pC194)

PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o DNA cromossômico da cepa 168 Marburg de B.subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter umfragmento de amplificação contendo uma região de extremidade 5' de geneywjH e cerca de 1420 bp antes de região.

(ii) Amplificação de região depois de ywjH por PCRIniciadores de PCR 50-mero e 28-mero tendo as seguintes

seqüências de nucleotídeos foram preparados baseado na informação de umbanco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 eV01277).

acagctccagatccatatccttctTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG (SEQ ID NO: 27, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem a uma região depois de gene estrutural do gene de resistência acloranfenicol (cat) clonada em pC194)

GGATGACGTTATCGATAATGACTTCCTT (SEQ ID NO:28)PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o DNA cromossômico da cepa 168 Marburg de B.subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter umfragmento de amplificação contendo uma região de extremidade 3' de geneywjH e cerca de 1370 bp depois de região.

(iii) Amplificação de gene cat por PCR

Iniciadores de PCR 50-mero tendo as seguintes seqüências denucleotídeos foram preparados baseado na informação de um banco de dadosde genes (Nos. de Acesso de GenBank VO1277 e NC_000964).gagaagcgaatgaattaggaattctAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (SEQ ID NO: 29, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem à seqüência de região de extremidade 5' do gene ywjH, e elesforam designados como sendo complementares à região de extremidade 3' deSEQ ID NO: 26)

ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (SEQ ID NO: 30, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem à seqüência de região de extremidade 3' do gene ywjH, e elesforam designados como sendo complementares à região de extremidade 3' deSEQ ID NO: 27)

PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o plasmídeo pC194 carregando o gene de resistência acloranfenicol (cat) como um modelo e os iniciadores mencionados acima paraobter um fragmento de amplificação de cerca de 980 bp contendo o gene cat.

(iv) Amplificação de fragmento compreendendo região deywjH inserida com gene cat por PCR recombinante

Os fragmentos de DNA amplificados em (i) a (iii)mencionados acima foram purificados usando Coluna MicroSpin S-400(Amersham Pharmacia Biotech), e então uma mistura destes em quantidadesapropriadas foi usada como um modelo junto com as seqüências de SEQ IDNOS: 25 e 28 para realizar PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30segundos, 72°C por 4 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model9600, Perkin-Elmer) e com isso obter um fragmento compreendendo a regiãode ywjH inserida com o gene cat.

(v) Preparação de cepa produtora de inosina com ywjHrompido

O fragmento de DNA compreendendo a região de ywjH naqual o gene cat (ywjH::cat) obtido em (iv) havia sido inserido foi sujeito aeletroforese em gel de agarose, e o fragmento alvo foi extraído do gel. Ofragmento de DNA purificado como descrito acima foi usado paratransformar células competentes da cepa KMBS321 de B. subtilis preparadapelo método de Dubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221), e colônias cultivadas em uma placa de ágar LB contendo 2,5 μg/ml decloranfenicol e 20 μg/ml de guanina foram obtidas. DNAs cromossômicosforam preparados a partir destas colônias, cepas nas quais região de ywjH emum cromossomo foi substituída pela região de ywjH cuja seqüência internafoi substituída pelo gene de resistência a cloranfenicol (ywjH::cat) por duplarecombinação foram identificadas pelo método de PCR descrito em (iv), euma destas cepas foi designada TABS135.(3) Construção de cepa com deficiência dupla de fbp e ywjH

Uma cepa deficiente no gene de transaldolase (ywjH) foiconstruída a partir da cepa recombinante TABS133 como descrito abaixo. Acepa TABS133, que é derivada de Bacillus subtilis (cepa 168 Marburg de B.subtilis, ATCC 6051), é deficiente no gene de repressor de operon de purina(purR), gene de succinil-AMP sintase (purA), gene de nucleosídeo de purinafosforilase (pupG) e gene de frutose bifosfatase (fbp), e tem gene de IMPdesidrogenase (guaB) atenuado, caracterizada pelo fato de que a regiãopromotora de operon de purina e seqüência SD do gene de PRPP sintetase(prs) são modificadas.

(i) Amplificação de região antes de ywjH por PCR

Iniciadores de PCR 26-mero e 50-mero tendo as seguintesseqüências de nucleotídeos foram preparados baseado na informação de umbanco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 eM29725).

TAAAGCGTGATAGACATACAGTGCTG (SEQ ID NO: 31)cattgcaagacttttttcaccaagcAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC (SEQ IDNO: 32, os nucleotídeos indicados com letras minúsculas correspondem àregião antes de promotor do gene de resistência a tetraciclina (tet) clonada empDG1513)

PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por2,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o DNA cromossômico da cepa 168 Marburg de B.subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter umfragmento de amplificação contendo uma região de extremidade 5' de geneywjH e cerca de 2250 bp antes de região.

(ii) Amplificação de região depois de ywjH por PCR

Iniciadores de PCR 50-mero e 26-mero tendo as seguintesseqüências de nucleotídeos foram preparados baseado na informação de umbanco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 eM29725).

gagagagttcaaaattgatcctttTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG (SEQ ID NO: 33, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem a uma região depois de gene estrutural do gene de resistência atetraciclina (tet) clonada em pDG1513)

TTGCATATACATGTCAGGAGCATTCA (SEQ ID NO: 34)

PCR (98°C por 10 segundos, 5 50C por 30 segundos, 72°C por2,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o DNA cromossômico da cepa 168 Marburg de B.subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter umfragmento de amplificação contendo uma região de extremidade 3' de geneywjH e cerca de 2280 bp depois de região.

(iii) Amplificação de gene tet por PCR

Iniciadores de PCR 50-mero tendo as seguintes seqüências denucleotídeos foram preparados baseado na informação de um banco de dadosde genes (Nos. de Acesso de GenBank M29725 e NC_000964).

gagaagcgaatgaattaggaattctGCTTGGTGAAAAAAGTCTTGCAATG (SEQ ID NO: 35, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem à seqüência de região de extremidade 5' do gene ywjH, e elesforam designados como sendo complementares à região de extremidade 3' deSEQ ID NO: 32)

ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAAAGGATCAATTTTGAACTCTCTC (SEQ ID NO: 36, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem à seqüência de região de extremidade 3' do gene ywjH, e elesforam designados como sendo complementares à região de extremidade 3' deSEQ ID NO: 33)

PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por2,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o plasmídeo pDG1513 carregando o gene de resistência atetraciclina (tet) como um modelo e os iniciadores mencionados acima paraobter um fragmento de amplificação de cerca de 2070 bp contendo o gene cat.

(iv) Amplificação de fragmento compreendendo região deywjH inserida com gene tet por PCR recombinante

Os fragmentos de DNA amplificados em (i) a (iii)mencionados acima foram purificados usando Coluna MicroSpin S-400(Amersham Pharmacia Biotech), e então uma mistura destes em quantidadesapropriadas foi usada como um modelo junto com as seqüências de SEQ IDNOS: 31 e 34 para realizar PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30segundos, 72°C por 7 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model9600, Perkin-Elmer) e com isso obter um fragmento compreendendo a regiãoywjH inserida com o gene tet.

(v) Preparação de cepa produtora de inosina com fbp e ywjHrompidos

O fragmento de DNA compreendendo a região ywjH na qual ogene tet (ywjH::tet) obtido em (iv) havia sido inserido foi sujeito a eletroforese emgel de agarose, e o fragmento alvo foi extraído do gel. O fragmento de DNApurificado como descrito acima foi usado para transformar células competentes dacepa TABS133 de B. subtilis preparada pelo método de Dubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol., 1971, 56,209-221), e colônias cultivadas em uma placa deágar LB contendo 12,5 μg/ml de tetraciclina e 20 μg/ml de guanina foram obtidas.DNAs cromossômicos foram preparados a partir destas colônias, cepas nas quaisregião de ywjH em um cromossomo foi substituída pela região de ywjH cujaseqüência interna foi substituída pelo gene de resistência a tetraciclina (ywjH::tet)por dupla recombinação foram identificadas pelo método de PCR descrito em (iv),e uma destas cepas foi designada TABS174.

(4) Produção de nucleosídeo de purina por cepa produtora de inosinadeficiente em um ou ambos de gene fbp e gene ywjH

A cepa TABS133 deficiente em gene fbp, a cepa TABS135deficiente em gene ywjH, a cepa TABS174 deficiente em ambos os genes, euma cepa de controle KMBS321 foram cada uniformemente aplicadas emuma placa de meio LB contendo 20 mg/L de guanina, e cultivadas durante anoite a 34°C. As células correspondendo a 1/8 da placa foram inoculadas em20 ml de meio de fermentação contido em um frasco Sakaguchi com volumede 500-ml, então 50 g/L de carbonato de cálcio foi adicionado ao meio, e ascélulas foram cultivadas a 34°C com agitação. Setenta e duas horas depois doinício da cultura, o meio foi amostrado, e quantidades de inosina ehipoxantina contidas no meio foram medidas por métodos conhecidos. Asquantidades de inosina acumuladas observadas com a cepa TABS133deficiente em gene fbp e com a cepa TABS135 deficiente em gene ywjHforam superiores do que aquelas observadas com a cepa KMBS321 comouma cepa de controle. Além disso, a quantidade de inosina acumuladaobservada com a cepa deficiente em ambos os genes foi maior do que aquelaobservada com a cepa TABS133 ou cepa TABS135.

[Composição de meio de fermentação]

Glicose30 g/LKH2PO4I g/LNH4CB2 g/LMameno (T-N)* 1,35 g/LDL-Metionina0,4 g/LL-Triptofano0,02 g/L

AdeninaO5I g/LGuanosina0,075 g/LMgS040,4 g/LFeSO4O5Ol g/LMnSO4O5Ol g/L

Adecanol (antiespuma)0,5 ml/L(ajustado para pH 7,0 com KOH)Carbonato de Cálcio50 g/L*: Hidrolisado de proteína de soja

Tabela 1

<table>table see original document page 43</column></row><table>

[Explicação de Listagem de Seqüências]SEQ ID NO: 1: Seqüência de nucleotídeos de gene ywjHSEQ ID NO: 2: Seqüência de aminoácidos de transaldolaseSEQ ID NO: 3: Seqüência de nucleotídeos de gene prsSEQ ID NO: 4: Seqüência de aminoácidos de fosforribosil pirofosfatosintetase

SEQ ID NO: 5: Seqüência de nucleotídeos de gene purRSEQ ID NO: 6: Seqüência de aminoácidos de repressor de purinaSEQ ID NO: 7: Seqüência de nucleotídeos de gene deoDSEQ ID NO: 8: Seqüência de aminoácidos de produto de gene deoD(nucleosídeo de purina fosforilase)

SEQ ID NO: 9: Seqüência de nucleotídeos de gene pupGSEQ ID NO: 10: Seqüência de aminoácidos de produto de gene pupG(nucleosídeo de purina fosforilase)SEQ ID NO: 11: Seqüência de nucleotídeos de gene purASEQ ID NO: 12: Seqüência de aminoácidos de succinil-AMP sintaseSEQ ID NO: 13: Seqüência de nucleotídeos de gene guaBSEQ ID NO: 14: Seqüência de aminoácidos de IMP desidrogenaseSEQ ID NO: 15: Seqüência de nucleotídeos de gene fbpSEQ ID NO: 16: Seqüência de aminoácidos de frutose bifosfataseSEQ ID NO: 17: Iniciador para amplificação de gene purRSEQ ID NO: 18: Iniciador para amplificação de gene purRSEQ ID NO: 19: Iniciador para amplificação de região antes de gene fbpSEQ ID NO: 20: Iniciador para amplificação de região antes de gene fbpSEQ ID NO: 21: Iniciador para amplificação de região depois de gene fbpSEQ ID NO: 22: Iniciador para amplificação de região depois de gene fbpSEQ ID NO: 23: Iniciador para amplificação de gene catSEQ ID NO: 24: Iniciador para amplificação de gene catSEQ ID NO: 25: Iniciador para amplificação de região antes de gene ywjHSEQ ID NO: 26: Iniciador para amplificação de região antes de gene ywjHSEQ ID NO: 27: Iniciador para amplificação de região depois de gene ywjHSEQ ID NO: 28: Iniciador para amplificação de região depois de gene ywjHSEQ ID NO: 29: Iniciador para amplificação de gene catSEQ ID NO: 30: Iniciador para amplificação de gene catSEQ ID NO: 31: Iniciador para amplificação de região antes de gene ywjHSEQ ID NO: 32: Iniciador para amplificação de região antes de gene ywjHSEQ ID NO: 33: Iniciador para amplificação de região depois de gene ywjHSEQ ID NO: 34: Iniciador para amplificação de região depois de gene ywjHSEQ ID NO: 35: Iniciador para amplificação de gene tetSEQ ID NO: 36: Iniciador para amplificação de gene tet

Aplicabilidade Industrial

Usando a bactéria Bacillus da presente invenção, eficiência deprodução de um nucleosídeo de purina e/ou um nucleotídeo de purina podeser melhorada.LISTAGEM DA SEQÜENCIA

<110><120>

<130><150><151><160><170><210><211><212><213><220><221><222><400>atg ttaMet Leu1

aat gaaAsn Glu

gca aagAla Lys

gac gtcAsp Val

50gag gaaGlu Glu65

att acgIle Thr

gca cttAla Leu

gcc aacAla Asn

Ajinomoto Co., Inc.

"Bactéria capaz de produzir substância de purina e processo para

produção de substância de purina"C757-C7064JP2006-1193242006-04-2436

PatentIn version 3.31

636DNA

Bacillus subtilis

CDS(1) ·1

ttcPhe

ttaLeu

gaa

Glu

35

gtg

Val

(636)

ttt gttPhe Val5

gga attGly Ile20

gct aacAla Asn

aaa gggLys Gly

atg ate gagMet Ile Glu

ccaPro

attIle145ateIle

ttcPhe130tcaSer

attIle

gtgVal

actThr

cagGln115ctgLeu

aaa ateLys Ile

85ggc ttaGly Leu100

gcg cttAla Leu

gga cgtGly Arg

gaa gtt aaaGlu Val Lys

ctt agaLeu Arg

ctc actLeu Thr

gac tggAsp Trp210<210><211><212>

gcaAla

ggg

Gly

aaaLys195aacAsn

2

212

PRT

gcgAla

gctAla180cacHis

aaaLys

tcaSer165catHis

ccgPro

gatAsp

ctcLeu

gtaVal

tetSer

gaa

Glu

70

cca

Pro

ggcGly

cttLeu

ttaLeu

cagGln150ateIle

ateIle

ttaLeu

aca gcc aatThr Ala Asn

gcc ggt gtaAla Gly Val25

tca ttc cacSer Phe His40

gta age gcaVal Ser Ala55

gga aaa gaaGly Lys Glu

atg acg tetMet Thr Ser

ate aaaIle Lys

gct gccAla Ala120gat gacAsp Asp135

att tttIle Phe

acaThr105agaArg

ateIle

gacAsp

cgc cat ccgArg His Pro

ggc aca atgGly Thr Met185

aca gac aaaThr Asp Lys200

ateIle10acgThr

gacAsp

gagGlu

ctgLeu

gac

Asp

90

aac

Asn

gcgAla

ggcGly

attIle

cagGln170ccgPro

ggaGly

gat gaa att agaAsp Glu Ile Arg

acgThr

cgtArg

gttVal

gcg

Ala

75

ggt

Gly

aatAsn

cttLeu

attIle60aagLys

cct agtPro Ser

3.0cgc gagArg Glu45

tet ttgSer Leu

ate gctIle Ala

tta aaa gcgLeu Lys Ala

gtt acaVal Thr

ggg gcaGly Ala

cac aacHis Asn140cac ggcHis Gly155

cac gtgHis Val

ttgLeu

acaThr125

ggg

Gly

ateIle110tatTyr

cttLeu

gaa gcgGlu Ala15

tta gtaLeu Val

ate acaIle Thr

aaa gctLys Ala

ccg aacPro Asn80gta agaVal Arg95

ttc aatPhe Asn

gta tetVal Ser

gac ctgAsp Leu

ctt gacLeu Asp

aca gaaThr Glu

ctg aaa gtc attLeu Lys Val Ile190

ate gaa caa ttcIle Glu Gln Phe205

acgThr

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480

528

576

624

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20 25 30

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50 55 60

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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165 170 175

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<213> Bacillus subtilis<220>

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100 105 110

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<213> Bacillus subtilis<220>

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50 55 60

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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Glu Arg Asn Leu Glu Glu Lys Asn Arg Leu Leu Glu Lys Met Tyr Glu

165 170 175

aca gaa ggg ttt aaa ctt gag gat ate tta gac gaa tat tat gag tac 576

Thr Glu Gly Phe Lys Leu Glu Asp Ile Leu Asp Glu Tyr Tyr Glu Tyr

180 185 190

gga cag cag att aaa aag tat gtt tgc gat aca tct gtt gtc tta aac 624

Gly Gln Gln Ile Lys Lys Tyr Val Cys Asp Thr Ser Val Val Leu Asn

195 200 205

gat gct ctt gat gaa ggg cgc cgt gta tta ttt gaa ggc gca caa ggg 672

Asp Ala Leu Asp Glu Gly Arg Arg Val Leu Phe Glu Gly Ala Gln Gly

210 215 220

gtt atg ctc gat ate gac caa gga aca tac ccg ttt gtt acg tca tct 720

Val Met Leu Asp Ile Asp Gln Gly Thr Tyr Pro Phe Val Thr Ser Ser

225 230 235 240

aac ccg gtt gcc ggc ggt gtc acg ate ggt tct ggt gtc ggc ccg acc 768

Asn Pro Val Ala Gly Gly Val Thr Ile Gly Ser Gly Val Gly Pro Thr

245 250 255

aaa ate aag cac gtt gtc ggt gta tca aaa gca tat acg act cgt gtc 816

Lys Ile Lys His Val Val Gly Val Ser Lys Ala Tyr Thr Thr Arg Val

260 265 270

ggc gac ggt cct ttt ccg act gag ctg aaa gat gaa ate ggc gat caa 864

Gly Asp Gly Pro Phe Pro Thr Glu Leu Lys Asp Glu Ile Gly Asp Gln

275 280 285

ate cgt gaa gtc gga cgc gaa tat gga aca aca aca ggc cgc ccg cgc 912

Ile Arg Glu Val Gly Arg Glu Tyr Gly Thr Thr Thr Gly Arg Pro Arg

290 295 300

cgt gtc ggc tgg ttt gac age gtt gtt gtc cgc cac gcc cgc cgt gtg 960

Arg Val Gly Trp Phe Asp Ser Val Val Val Arg His Ala Arg Arg Val

305 310 315 320

age gga att aca gat ctt tct ctg aac tca att gac gtc cta gca gga 1008

Ser Gly Ile Thr Asp Leu Ser Leu Asn Ser Ile Asp Val Leu Ala Gly

325 330 335att gaa acg ttg aaa ate tgt gtg gcg tac cgc tac aaa ggc gaa ate 1056

Ile Glu Thr Leu Lys Ile Cys Val Ala Tyr Arg Tyr Lys Gly Glu Ile

340 345 350

att gaa gaa ttc cca gea agt ctt aag gea ctt gct gaa tgt gag ccg 1104

Ile Glu Glu Phe Pro Ala Ser Leu Lys Ala Leu Ala Glu Cys Glu Pro

355 360 365

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Val Tyr Glu Glu Met Pro Gly Trp Thr Glu Asp Ile Thr Gly Ala Lys

370 375 380

age ttg age gag ctt ccg gaa aat gcg cgc cat tat ctt gag cgt gtg 1200

Ser Leu Ser Glu Leu Pro Glu Asn Ala Arg His Tyr Leu Glu Arg Val385 390 395 400

tet cag ctg aca ggc att ccg ctt tet att ttc tet gtc ggt cca gac 1248

Ser Gln Leu Thr Gly Ile Pro Leu Ser Ile Phe Ser Val Gly Pro Asp

405 410 415

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Arg Ser Gln Thr Asn Val Leu Arg Ser Val Tyr Arg Ala Asn420 425 430

<210> 12<211> 430<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<400> 12

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Gly Lys Ile Thr Asp Phe Leu Ser Glu Asn Ala Glu Val Ile Ala Arg

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

Arg Ile Ser Asn Arg Ala His Val Ile Leu Pro Tyr His Leu Lys Leu

100 105 110

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115 120 125

Lys Lys Gly Ile Gly Pro Ala Tyr Met Asp Lys Ala Ala Arg Ile Gly

130 135 140

Ile Arg Ile Ala Asp Leu Leu Asp Arg Asp Ala Phe Ala Glu Lys Leu145 150 155 160

Glu Arg Asn Leu Glu Glu Lys Asn Arg Leu Leu Glu Lys Met Tyr Glu

165 170 175

Thr Glu Gly Phe Lys Leu Glu Asp Ile Leu Asp Glu Tyr Tyr Glu Tyr

180 185 190

Gly Gln Gln Ile Lys Lys Tyr Val Cys Asp Thr Ser Val Val Leu Asn

195 200 205

Asp Ala Leu Asp Glu Gly Arg Arg Val Leu Phe Glu Gly Ala Gln Gly

210 215 220

Val Met Leu Asp Ile Asp Gln Gly Thr Tyr Pro Phe Val Thr Ser Ser225 230 235 240

Asn Pro Val Ala Gly Gly Val Thr Ile Gly Ser Gly Val Gly Pro Thr

245 250 255

Lys Ile Lys His Val Val Gly Val Ser Lys Ala Tyr Thr Thr Arg Val

260 265 270

Gly Asp Gly Pro Phe Pro Thr Glu Leu Lys Asp Glu Ile Gly Asp Gln

275 280 285

Ile Arg Glu Val Gly Arg Glu Tyr Gly Thr Thr Thr Gly Arg Pro Arg

290 295 300

Arg Val Gly Trp Phe Asp Ser Val Val Val Arg His Ala Arg Arg Val305 310 315 320Ser Gly Ile Thr Asp Leu Ser Leu Asn Ser Ile Asp Val Leu Ala Gly

325 330 335

Ile Glu Thr Leu Lys Ile Cys Val Ala Tyr Arg Tyr Lys Gly Glu Ile

340 345 350

Ile Glu Glu Phe Pro Ala Ser Leu Lys Ala Leu Ala Glu Cys Glu Pro

355 360 365

Val Tyr Glu Glu Met Pro Gly Trp Thr Glu Asp Ile Thr Gly Ala Lys

370 375 380

Ser Leu Ser Glu Leu Pro Glu Asn Ala Arg His Tyr Leu Glu Arg Val385 390 395 400

Ser Gln Leu Thr Gly Ile Pro Leu Ser Ile Phe Ser Val Gly Pro Asp

405 410 415

Arg Ser Gln Thr Asn Val Leu Arg Ser Val Tyr Arg Ala Asn420 425 430

<210> 13<211> 1542<212> DNA

<213> Bacillus subtilis<220>

<221> CDS<222> (1)..(1542)<400> 13

atg tgg gaa agt aaa ttt tca aaa gaa ggc tta acg ttc gac gat gtg 48

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ctg ctt gtg cca gca aag tct gag gta ctt ccg cat gat gtg gat tta 96

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20 25 30

tct gta gaa ctt aca aaa acg tta aag cta aat att cct gtc ate age 144

Ser Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser

35 40 45

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50 55 60

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Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile Glu Gln65 70 75 80

cag gct gaa caa gtt gat aaa gta aag cgt tct gag cgc ggc gtt ate 288

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85 90 95

aca aat ccc ttc ttt tta act cct gat cac caa gta ttt gat gcg gag 336

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100 105 110

cat ttg atg ggg aaa tac aga att tcc ggt gtt ccg att gta aat aac 384

His Leu Met Gly Lys Tyr Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val Asn Asn

115 120 125

gaa gaa gac cag aag ctt gtt gga att att aca aac cgt gac ctt cgt 432

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130 135 140

ttt att tct gac tac tca atg aaa ate age gac gtc atg acg aaa gaa 480

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Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys

165 170 175

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Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln

180 185 190

aat aaa tta aaa ggt ctt ate aca att aaa gac att gaa aaa gtc att 624

Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile

195 200 205

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gcg gca gtt ggt gtaAla Ala Val Gly Val225

gtt gaa gcc aat gttVal Glu Ala Asn Val245

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gaa tta aac att attGlu Leu Asn Ile Ile275

gcg ctt ate gaa gctAla Leu Ile Glu Ala290

ggt tca att tgt actGly Ser Ile Cys Thr305

att aca gca att tatIle Thr Ala Ile Tyr325

aca ate ate gcc gacThr Ile Ile Ala Asp340

gca ttg gca gcc ggcAla Leu Ala Ala Gly355

ggc aca tca gaa ageGly Thr Ser Glu Ser370

ttt aag gta tac cgcPhe Lys Val Tyr Arg385

agt aaa gac cgt tacSer Lys Asp Arg Tyr405

gga att gaa gga cgcGly Ile Glu Gly Arg420

tat cag cta gtc ggaTyr Gln Leu Val Gly435

aaa gat ctg cgt gcgLys Asp Leu Arg Ala450

ggc gca gga ctt cgcGly Ala Gly Leu Arg465

cat cgt aat aag gcgHis Arg Asn Lys Ala485

aca gga ttt gtg tatThr Gly Phe Val Tyr500

gat tgaAsp

215

act ggc gat acaThr Gly Asp Thr230

gat gtg att gttAsp Val Ile Val

aac aca gtt acaAsn Thr Val Thr265

gct gga aac gtgAla Gly Asn Val280

gga gca gac gttGly Ala Asp Val295

aca cgt gtt gtaThr Arg Val Val310

gat tgt gcg actAsp Cys Ala Thr

ggt ggg att aaaGly Gly Ile Lys345

gga cat gct gttGly His Ala Val360

cct ggt gaa actPro Gly Glu Thr375

ggc atg gga tcaGly Met Gly Ser390

ttc caa gaa gaaPhe Gln Glu Glu

aca cct tac aaaThr Pro Tyr Lys425

ggc ctt cgt tctGly Leu Arg Ser440

cta aga gaa gaaLeu Arg Glu Glu455

gaa age cat ccgGlu Ser His Pro470

ctt cct ggt ctaLeu Pro Gly Leu

gat gaa tgt tgtAsp Glu Cys Cys505

220

atg act cgc gtc aaaMet Thr Arg Val Lys235

ate gat aca gct cacIle Asp Thr Ala His250

aaa ate cgt gaa acgLys Ile Arg Glu Thr270

gca aca gct gaa gcgAla Thr Ala Glu Ala285

gtc aaa gtt gga ataVal Lys Val Gly Ile300

gcc ggg gtg ggt gttAla Gly Val Gly Val315

gaa gca aga aaa cacGlu Ala Arg Lys His330

ttc tct ggc gat atePhe Ser Gly Asp Ile350

atg ctc gga age ttgMet Leu Gly Ser Leu365

gaa ate tac caa ggcGlu Ile Tyr Gln Gly380

gtt gct gca atg gaaVal Ala Ala Met Glu395

aac aaa aaa ttt gttAsn Lys Lys Phe Val410

ggg cca gtt gaa gaaGly Pro Val Glu Glu430

ggt atg ggg tat tgcGly Met Gly Tyr Cys445

gct cag ttc att cgcAla Gln Phe Ile Arg460

cat gac gta cag attHis Asp Val Gln Ile475

ttt ggt tct cat cagPhe Gly Ser His Gln490

caa tcc ggc ttt tttGln Ser Gly Phe Phe510

aag ctt 720

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255

tat ccc 816

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aca aga 864

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ggg cct 912

Gly Pro

ccg caa 960

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ggc aaa 1008

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335

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ctt gca 1104

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aga aga 1152

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aaa gga 1200

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cct gaa 1248

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415

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ggg tcc 1344

Gly Ser

atg act 1392

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aca gtg 1440

Thr Val480

aaa aaa 1488

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495

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Ser Ser

1542

<210> 14

<211> 513

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 14Met Trp Glu Ser Lys Phe Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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Gln Ala Glu Gln Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg

130 135 140

Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu145 150 155 160

Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys

165 170 175

Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln

180 185 190

Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile

195 200 205

Glu Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp Ile His Gly Arg Leu Ile Val Gly

210 215 220

Ala Ala Val Gly Val Thr Gly Asp Thr Met Thr Arg Val Lys Lys Leu225 230 235 240

Val Glu Ala Asn Val Asp Val Ile Val Ile Asp Thr Ala His Gly His

245 250 255

Ser Gln Gly Val Leu Asn Thr Val Thr Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Pro

260 265 270

Glu Leu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Ala Thr Ala Glu Ala Thr Arg

275 280 285

Ala Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Val Val Lys Val Gly Ile Gly Pro

290 295 300

Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Val Val Ala Gly Val Gly Val Pro Gln305 310 315 320

Ile Thr Ala Ile Tyr Asp Cys Ala Thr Glu Ala Arg Lys His Gly Lys

325 330 335

Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Phe Ser Gly Asp Ile Thr Lys

340 345 350

Ala Leu Ala Ala Gly Gly His Ala Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Ala

355 360 365

Gly Thr Ser Glu Ser Pro Gly Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Gly Arg Arg

370 375 380

Phe Lys Val Tyr Arg Gly Met Gly Ser Val Ala Ala Met Glu Lys Gly385 390 395 400

Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Glu Glu Asn Lys Lys Phe Val Pro Glu

405 410 415

Gly Ile Glu Gly Arg Thr Pro Tyr Lys Gly Pro Val Glu Glu Thr Val

420 425 430

Tyr Gln Leu Val Gly Gly Leu Arg Ser Gly Met Gly Tyr Cys Gly Ser

435 440 445

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450 455 460

Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ser His Pro His Asp Val Gln Ile Thr Val465 470 475 480

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485 490 495

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age aagSer Lys

gtg gtaVal Val

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cag cacGln His

gac ateAsp Ile

gea ttgAla Leu

ttt gatPhe Asp130cga atgArg Met145

aaa ttaLys Leu

ctg ttaLeu Leu

gaa ateGlu Ile

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gaa gaaGlu Glu

gat gtcAsp Val

aat attAsn Ile

500

15

2013DNA

Bacillus subtilis

505

510

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aaaLys

tac

Tyr

35

aca

Thr

gagGlu

gtgVal

ttcPhe

gtcVal115gcgAla

attIle

cgcArg

tacTyr

attIle195cttLeu

ggcGly

ctgLeu

cttLeu

ateIle

(2013)

aat aat gtc ataAsn Asn Val Ile5

gag ggg ttt attGlu Gly Phe Ile20

cta gat cta etcLeu Asp Leu Leu

ctt ttaLeu Leu

gaaGlu

catHis

ttgLeu

ageSer100tatTyr

ate ateIle Ile

ttt gtcPhe Val

70cgc aatArg Asn85

ggt gtcGly Val

aat

Asn

55

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Ser

ggtGly

attIle

ctaLeu

gea

Ala

40

ttg

Leu

aaa

Lys

25

caa

Gln

aaaLys

tat ccg gaaTyr Pro Glu

aaa gaa gcgLys Glu Ala

aag etcLys Leu

aaa geaLys Ala165aaa acaLys Thr180

gat cagAsp Gln

gct tacAla Tyr

gat attAsp Ile

ate aacIle Asn245tgg ateTrp Ile260

cgc ateArg Ile

gttVal150ctgLeu

gaaGlu

ateIle

ageSer

tatTyr230tatTyr

ttaLeu135tcaSer

cctPro

caaGln

attIle

gttVal215gacAsp

catHis

ggc gccGly Ala

tgt gccCys Ala

gat ctgAsp Leu

tca ggaSer Gly

tac gatTyr Asp105gac aaaAsp Lys120

aac gagAsn Glu

tat tgcTyr Cys

gcc caaAla Gln

gct ggcAla Gly185gaa cttGlu Leu200

cag cgaGln Arg

cgc ggcArg Gly

tet gtcSer Val

tat tccTyr Ser265cgc tacArg Tyr

aatAsn10aggArg

aaaLys

gcgAla

cacHis

cga

Arg

90

aga

Arg

ctgLeu

tggTrp

tccSer

tttPhe170aacAsn

ggcGly

ttgLeu

ccgPro

gatAsp250ggtGly

gacAsp

tca cct tat catSer Pro Tyr His

gga tggGly Trp

tac gatTyr Asp

ata ttgIle Leu60

gga gagGly Glu75

gtc aaaVal Lys

acg gttThr Val

30tgt gaaCys Glu45

aac ctgAsn Leu

tat cagTyr Gln

gag aagGlu Lys

gaaGlu

aaaLys

tatTyr

tetSer155gctAla

att gatIle Asp

tta ateLeu Ile125aaa gaaLys Glu140

aag tatLys Tyr

gaaGlu110aaaLys

acgThr

accThr

tat att acgTyr Ile Thr

aag gagLys Glu

caa gccGln Ala

gtgVal

cagGln235attIle

gtcVal220ccgPro

cagGln

caa tatGln Tyr190gat aagAsp Lys205

gac catAsp His

gat agaAsp Arg

tgg ggaTrp Gly

tcc aaa gtg tgcSer Lys Val Cys270

aac ctg gat attAsn Leu Asp Ile

gea catAla His15

ttg gaaLeu Glu

gaa aaaGlu Lys

cca aaaPro Lys

gea ttcAla Phe80ata cgcIle Arg95

tta geaLeu Ala

cat gacHis Asp

att catIle His

cgc tccArg Ser160gag gagGlu Glu175

tac tccTyr Ser

ctg ateLeu Ile

ctg catLeu His

att atgIle Met240aat cacAsn His255

ctg gccLeu Ala

att gagIle Glu

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

S16

864275 280 285

gac gtg tac ggc ate aac ctg aga ccg ctg ctg aac ctg gcc gaa aaa 912

Asp Val Tyr Gly Ile Asn Leu Arg Pro Leu Leu Asn Leu Ala Glu Lys

290 295 300

tat tat gat gat aat cca gcg ttc cgt cca aaa gea gac gaa aac agg 960

Tyr Tyr Asp Asp Asn Pro Ala Phe Arg Pro Lys Ala Asp Glu Asn Arg

305 310 315 320

cca gag gat gag att aag caa ate aca aaa ate cat caa gcg att gcc 1008

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325 330 335

atg ate caa ttc aag ctt gag age ccg att ate aag aga cgg ccg aac 1056

Met Ile Gln Phe Lys Leu Glu Ser Pro Ile Ile Lys Arg Arg Pro Asn

340 345 350

ttt aat atg gaa gag cgg ctg tta tta gag aaa ata gac tat gac aaa 1104

Phe Asn Met Glu Glu Arg Leu Leu Leu Glu Lys Ile Asp Tyr Asp Lys

355 360 365

aat gaa ate acg ctg aac gga aaa aca tat caa ctg gaa aac acc tgc 1152

Asn Glu Ile Thr Leu Asn Gly Lys Thr Tyr Gln Leu Glu Asn Thr Cys

370 375 380

ttt gcg acg att aat ccg gag cag cca gat cag cta tta gaa gaa gaa 1200

Phe Ala Thr Ile Asn Pro Glu Gln Pro Asp Gln Leu Leu Glu Glu Glu

385 390 395 400

gea gaa gtc ata gac aag ctg cta ttc tet gtc cag cat tcc gaa aag 1248

Ala Glu Val Ile Asp Lys Leu Leu Phe Ser Val Gln His Ser Glu Lys

405 410 415

ctg ggc cgc cat atg aat ttt atg atg aaa aaa ggc age ctt tat tta 1296

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420 425 430

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435 440 445

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Asn Gly Asn Met Glu Thr Met Met Ile Glu Asp Lys Pro Tyr Ala Gly

450 455 460

cgt gag ctg ctc gat gta ttt gaa cga ttc ttg cgg gaa gcc ttt gcc 1440

Arg Glu Leu Leu Asp Val Phe Glu Arg Phe Leu Arg Glu Ala Phe Ala

465 470 475 480

cac ccg gaa gaa acc gat gac ctg gcg aca gat atg gct tgg tat tta 1488

His Pro Glu Glu Thr Asp Asp Leu Ala Thr Asp Met Ala Trp Tyr Leu

485 490 495

tgg aca ggc gaa tac tcc tcc ctc ttc gga aaa cgc gcc atg acg aca 1536

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500 505 510

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515 520 525

aac ccg tat tat tat tta cga gaa gac gag gea acc tgc cga aac ate 1632

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530 535 540

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Leu Ala Glu Phe Gly Leu Asn Pro Asp His Gly His Ile Ile Asn Gly

545 550 555 560

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565 570 575

gga aaa atg ate gtc ate gac ggc ggc ttc tcc aaa gcc tac caa tcc 1776

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580 585 590

aca aca ggc ate gcc ggc tac acg ctg cta tac aac tcc tac ggc atg 1824

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595 600 605

cag ctc gtc gcc cat aaa cac ttc aat tcc aag gea gaa gtc cta age 1872

Gln Leu Val Ala His Lys His Phe Asn Ser Lys Ala Glu Val Leu Ser610 615 620

acc gga acc gac gtc tta acg gtc aaa cga tta gtg gac aaa gag ctt 1920

Thr Gly Thr Asp Val Leu Thr Val Lys Arg Leu Val Asp Lys Glu Leu625 630 635 640

gag cgg aag aaa gtg aag gaa acg aat gtg ggt gag gaa ttg ttg cag 1968

Glu Arg Lys Lys Val Lys Glu Thr Asn Val Gly Glu Glu Leu Leu Gln

645 650 655

gaa gtt gcg att tta gag agt ttg cgg gag tat cgg tat atg aag 2013

Glu Val Ala Ile Leu Glu Ser Leu Arg Glu Tyr Arg Tyr Met Lys660 665 670

<210> 16<211> 671<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<400> 16

Met Phe Lys Asn Asn Val Ile Leu Leu Asn Ser Pro Tyr His Ala His1 5 10 15

Ala His Lys Glu Gly Phe Ile Leu Lys Arg Gly Trp Thr Val Leu Glu

20 25 30

Ser Lys Tyr Leu Asp Leu Leu Ala Gln Lys Tyr Asp Cys Glu Glu Lys

35 40 45

Val Val Thr Glu Ile Ile Asn Leu Lys Ala Ile Leu Asn Leu Pro Lys

50 55 60

Gly Thr Glu His Phe Val Ser Asp Leu His Gly Glu Tyr Gln Ala Phe65 70 75 80

Gln His Val Leu Arg Asn Gly Ser Gly Arg Val Lys Glu Lys Ile Arg

85 90 95

Asp Ile Phe Ser Gly Val Ile Tyr Asp Arg Glu Ile Asp Glu Leu Ala

100 105 110

Ala Leu Val Tyr Tyr Pro Glu Asp Lys Leu Lys Leu Ile Lys His Asp

115 120 125

Phe Asp Ala Lys Glu Ala Leu Asn Glu Trp Tyr Lys Glu Thr Ile His

130 135 140

Arg Met Ile Lys Leu Val Ser Tyr Cys Ser Ser Lys Tyr Thr Arg Ser145 150 155 160

Lys Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ala Gln Phe Ala Tyr Ile Thr Glu Glu

165 170 175

Leu Leu Tyr Lys Thr Glu Gln Ala Gly Asn Lys Glu Gln Tyr Tyr Ser

180 185 190

Glu Ile Ile Asp Gln Ile Ile Glu Leu Gly Gln Ala Asp Lys Leu Ile

195 200 205

Thr Gly Leu Ala Tyr Ser Val Gln Arg Leu Val Val Asp His Leu His

210 215 220

Val Val Gly Asp Ile Tyr Asp Arg Gly Pro Gln Pro Asp Arg Ile Met225 230 235 240

Glu Glu Leu Ile Asn Tyr His Ser Val Asp Ile Gln Trp Gly Asn His

245 250 255

Asp Val Leu Trp Ile Gly Ala Tyr Ser Gly Ser Lys Val Cys Leu Ala

260 265 270

Asn Ile Ile Arg Ile Cys Ala Arg Tyr Asp Asn Leu Asp Ile Ile Glu

275 280 285

Asp Val Tyr Gly Ile Asn Leu Arg Pro Leu Leu Asn Leu Ala Glu Lys

290 295 300

Tyr Tyr Asp Asp Asn Pro Ala Phe Arg Pro Lys Ala Asp Glu Asn Arg305 310 315 320

Pro Glu Asp Glu Ile Lys Gln Ile Thr Lys Ile His Gln Ala Ile Ala

325 330 335

Met Ile Gln Phe Lys Leu Glu Ser Pro Ile Ile Lys Arg Arg Pro Asn

340 345 350

Phe Asn Met Glu Glu Arg Leu Leu Leu Glu Lys Ile Asp Tyr Asp Lys

355 360 365

Asn Glu Ile Thr Leu Asn Gly Lys Thr Tyr Gln Leu Glu Asn Thr Cys370 375 380Phe Ala Thr Ile Asn Pro Glu Gln Pro Asp Gln Leu Leu Glu Glu Glu385 390 395 400

Ala Glu Val Ile Asp Lys Leu Leu Phe Ser Val Gln His Ser Glu Lys

405 410 415

Leu Gly Arg His Met Asn Phe Met Met Lys Lys Gly Ser Leu Tyr Leu

420 425 430

Lys Tyr Asn Gly Asn Leu Leu Ile His Gly Cys Ile Pro Val Asp Glu

435 440 445

Asn Gly Asn Met Glu Thr Met Met Ile Glu Asp Lys Pro Tyr Ala Gly

450 455 460

Arg Glu Leu Leu Asp Val Phe Glu Arg Phe Leu Arg Glu Ala Phe Ala465 470 475 480

His Pro Glu Glu Thr Asp Asp Leu Ala Thr Asp Met Ala Trp Tyr Leu

485 490 495

Trp Thr Gly Glu Tyr Ser Ser Leu Phe Gly Lys Arg Ala Met Thr Thr

500 505 510

Phe Glu Arg Tyr Phe Ile Lys Glu Lys Glu Thr His Lys Glu Lys Lys

515 520 525

Asn Pro Tyr Tyr Tyr Leu Arg Glu Asp Glu Ala Thr Cys Arg Asn Ile

530 535 540

Leu Ala Glu Phe Gly Leu Asn Pro Asp His Gly His Ile Ile Asn Gly545 550 555 560

His Thr Pro Val Lys Glu Ile Glu Gly Glu Asp Pro Ile Lys Ala Asn

565 570 575

Gly Lys Met Ile Val Ile Asp Gly Gly Phe Ser Lys Ala Tyr Gln Ser

580 585 590

Thr Thr Gly Ile Ala Gly Tyr Thr Leu Leu Tyr Asn Ser Tyr Gly Met

595 600 605

Gln Leu Val Ala His Lys His Phe Asn Ser Lys Ala Glu Val Leu Ser

610 615 620

Thr Gly Thr Asp Val Leu Thr Val Lys Arg Leu Val Asp Lys Glu Leu625 630 635 640

Glu Arg Lys Lys Val Lys Glu Thr Asn Val Gly Glu Glu Leu Leu Gln

645 650 655

Glu Val Ala Ile Leu Glu Ser Leu Arg Glu Tyr Arg Tyr Met Lys660 665 670

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador<4 00> 17gaagttgatgatcaaaa<210> 18<211> 19<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador<400> 18

acatattgtt gacgataat

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador<400> 19

ttcccttagg gttattttcg tttcaaaa<210> 20<211> 50<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 20

cgtttgttga actaatgggt gcttttatga

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

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<223> Iniciador

<400> 21

acagctccag atccatatcc ttctttttta

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

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<223> Iniciador

<400> 22

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<210> 23

<211> 50

<212> DNA

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<220>

<223> Iniciador

<400> 23

tcaccttatc atgcacatgc tcataaaagc

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

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<220>

<223> Iniciador

<400> 24

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<210> 25

<211> 28

<212> DNA

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<223> Iniciador

<4 00> 25

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<210> 26

<211> 50

<212> DNA

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<223> Iniciador

<4 00> 26

cgtttgttga actaatgggt gctttagaat

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

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<220>

<223> Iniciador

<4 00> 27

acagctccag atccatatcc ttctttgacc

<210> 28

<211> 28

gcatgtgcat gataaggtga 50

gagagtttgc gggagtatcg 50

27

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ggatatggat ctggagctgt 50

28

tcctaattca ttcgcttctc 50

tgatttcaga agttaaacag 50<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 28

ggatgacgtt atcgataatg acttcctt

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 29

gagaagcgaa tgaattagga attctaaagc

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

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<220>

<223> Iniciador

<4 00> 30

ctgtttaact tctgaaatca ggtcaaagaa

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<4 00> 31

taaagcgtga tagacataca gtgctg

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 32

cattgcaaga cttttttcac caagcagaat

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<4 00> 33

gagagagttc aaaattgatc ctttttgacc

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 34

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<210> 35

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 35

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<210> 36

28

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ggatatggat ctggagctgt 50

26

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tgatttcaga agttaaacag 50

26

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<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador

<400> 36

ctgtttaact tctgaaatca ggtcaaaaag gatcaatttt gaactctctc

Claims (17)

1. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus, caracterizada pelofato de que tem uma capacidade de produzir uma substância derivada depurina, em que a bactéria foi modificada de forma que atividade enzimáticade transaldolase seja diminuída.

2. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comreivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a substância derivada de purinaé um nucleosídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo deinosina, xantosina, guanosina e adenosina.

3. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comreivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a substância derivada de purinaé um nucleotídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo de ácidoinosínico, ácido xantílico, ácido guanílico e ácido adenílico.

4. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que aatividade de transaldolase é diminuída pela ruptura de um gene codificandotransaldolase, ou diminuindo quantidade de expressão do gene codificandotransaldolase.

5. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comreivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o gene codificandotransaldolase é um gene codificando uma proteína das seguintes (A) ou (B):(A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 1,(B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:l o que inclui substituições, deleções, inserções, adições ouinversões de um ou diversos resíduos de aminoácidos e tem atividade detransaldolase.

6. Bactéria pertencendo, ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que foiadicionalmente modificada de forma que atividade frutose bifosfatase édiminuída.

7. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que foiadicionalmente modificada de forma que atividade de fosforribosil pirofosfatosintetase é aumentada.

8. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que foiadicionalmente modificada de forma que quantidade de expressão do operonde purina é aumentada.

9. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comreivindicação 8, caracterizada pelo fato de que quantidade de expressão dooperon de purina é aumentada por ruptura do gene purR, que é um genecodificando um repressor do operon de purina.

10. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que foiadicionalmente modificada de forma que atividade de fosforilase denucleosídeo de purina é diminuída.

11. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que foiadicionalmente modificada de forma que Atividade de IMP désidrogenase édiminuída.

12. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que éBacillus subtilis.

13. Método para produzir uma substância derivada de purina,caracterizado pelo fato de compreendercultivar a bactéria pertencendo ao gênero Bacillus comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em um meio para causaracumulação de uma substância derivada de purina em células da bactéria ouno meio, ecoletar a substância derivada de purina das células ou meio.

14. Método de acordo com reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purinaou um nucleotídeo de purina.

15. Método de acordo com reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purinaselecionado a partir do grupo consistindo de inosina, xantosina, guanosina eadenosina.

16. Método de acordo com reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleotídeo de purinaselecionado a partir do grupo consistindo de ácido inosínico, ácido xantílico,ácido guanílico e ácido adenílico.

17. Método para produzir um nucleotídeo de purina,caracterizado pelo fato de compreender:produzir um nucleosídeo de purina pelo método como definidona reivindicação 15,reagir o nucleosídeo de purina com um doador de fosfatoselecionado a partir do grupo consistindo de ácido polifosfórico, fenil fosfatoe carbamil fosfato, e um microorganismo tendo uma capacidade de produzirum éster de ácido 5'-fosfórico de nucleosídeo ou fosfatase ácida para produzirum nucleotídeo de purina, ecoletar o nucleotídeo de purina.