BRPI0709900A2

BRPI0709900A2 - mÉtodo e composiÇço para inibir a ativaÇço de complemento dependente de masp-2, ,e, mÉtodos para fabricar um medicamento, para tratar um indivÍduo que sofre de uma condiÇço mediada por complemento dependente de masp-2, para tratar e/ou prevenir a aterosclerose em um indivÍduo em necessidade do mesmo, para tratar um indivÍduo que sofre de uma malignidade, de um distérbio endàcrino e de condiÇço oftalmolàgica mediada por complemento

Info

Publication number: BRPI0709900A2
Application number: BRPI0709900-2A
Authority: BR
Inventors: Hans-Wilhelm Schwaeble; Cordula Margaret Stover; Clark E Tedford; James B Parent; Teizo Fujita
Original assignee: Univ Leicester; Omeros Corp
Priority date: 2006-04-03
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2011-07-26
Also published as: CA2648188A1; CN103705921A; WO2007117996A2; HUE048745T2; KR101522258B1; HUE028834T2; CN101460195B; PT2007425T; PL3067067T3; SI3067067T1; MX366119B; CN103705921B; AU2007234982A1; EP3067067A1; RU2484097C2; US20170233493A1; CN101460195A; ES2589315T3; EP2007425B1; EP2007425A4

Abstract

MÉTODO E COMPOSIÇçO PARA INIBIR A ATIVAÇçO DE COMPLEMENTO DEPENDENTE DE MASP-2, E, MÉTODOS PARA FABRICAR UM MEDICAMENTO, PARA TRATAR UM INDIVIDUO QUE SOFRE DE UMA CONDIÇçO MEDIADA POR COMPLEMENTO DEPENDENTE DE MASP-2, PARA TRATAR E/OU PREVENIR A ATEROSCLEROSE EM UM INDIVÍDUO EM NECESSIDADE DO MESMO, PARA TRATAR UM INDIVÍDUO QUE SOFRE DE UMA MALIGMDADE, DE UM DISTURBIO ENDàCRINO E DE CONDIÇçO OFTALMOLàGICA MEDIADA POR COMPLEMENTO<D>Em um aspecto, a invenção fornece métodos de inibir os efeitos de ativação de complemento dependente de MASP-2 em um indivíduo vivo. Os métodos compreendem a etapa de administrar, a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em algumas formas de realização, o agente inibidor de MASP-2 inibe a lesão celular associada com a ativação do caminho de complemento alternativo mediado por MASP-2, enquanto deixando o componente do caminho clássico (dependente de Clq) do sistema imune intacto. Em um outro aspecto, a invenção fornece composições para inibir os efeitos da ativação de complemento dependente de lectina, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

Description

"MÉTODO E COMPOSIÇÃO PARA INIBIR A ATIVAÇÃO DECOMPLEMENTO DEPENDENTE DE MASP-2, E, MÉTODOS PARAFABRICAR UM MEDICAMENTO, PARA TRATAR UM INDIVÍDUOQUE SOFRE DE UMA CONDIÇÃO MEDIADA POR COMPLEMENTODEPENDENTE DE MASP-2, PARA TRATAR E/OU PREVENIR AATEROSCLEROSE EM UM INDIVÍDUO EM NECESSIDADE DOMESMO, PARA TRATAR UM INDIVÍDUO QUE SOFRE DE UMAMALIGNIDADE, DE UM DISTÚRBIO ENDÓCRINO E DE CONDIÇÃOOFTALMOLÓGICA MEDIADA POR COMPLEMENTO"

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido é uma continuação em parte do Pedido U.S. N211/150.883, depositado em 9 de junho de 2005, a prioridade do qual éreivindicado sob 35 U.S.C.§120, que reivindica o benefício do PedidoProvisório U.S. N- 60/578.847, depositado em 10 de junho de 2004, sob 35U.S.C.§ 119(e) e também reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Ne60/788.876, depositado em 3 de abril de 2006, sob 35 U.S.C.§ 119(e).

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a métodos de inibir os efeitosadversos de ativação de complemento dependente de MASP-2.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O sistema de complemento fornece um mecanismo de açãoinicial para iniciar e amplificar a resposta inflamatória à infecção microbianae outros insultos agudos (Μ. K. Liszewski e J. P. Atkinson, 1993, emFundamental Immunology, Terceira Edição, editado por W. E. Paul, RavenPress, Ltd., Nova Iorque). Embora a ativação de complemento forneça umadefesa de primeira linha valiosa contra patógenos potenciais, as atividades decomplemento que promovem uma resposta inflamatória protetora tambémpodem representar uma ameaça potencial para o hospedeiro (K. R. Kalli, etal., Springer Semin. Immunopathol. 15: 417-431, 1994; Β. P. Morgan, Eur. J.Clinicai Investig. 24: 219-228, 1994). Por exemplo, os produtos proteolíticosC3 e C5 recrutam e ativam neutrófilos. Estas células ativadas sãoindiscriminadas na sua liberação de enzimas destrutivas e podem causar lesãoa órgão. Além disso, a ativação de complemento pode causar a deposição decomponentes de complemento lítico próximo das células hospedeiras assimcomo dos alvos microbianos, resultando na Iise da célula hospedeira.

O sistema de complemento foi implicado como contribuindopara a patogênese de numerosos estados de doença agudos e crônicos,incluindo: infarte do miocárdio, revascularização seguinte ao acidentevascular cerebral, ARDS, lesão de reperfusão, choque séptico, derramecapilar seguinte às queimaduras térmicas, inflamação após o desviocardiopulmonar, rejeição a transplante, artrite reumatóide, esclerose múltipla,miastenia grave e mal de Alzheimer. em quase todas estas condições, ocomplemento não é a causa mas é um de diversos fatores envolvidos napatogênese. Não obstante, a ativação de complemento pode ser ummecanismo patológico principal e representa um ponto eficaz para o controleclínico em muitos destes estados de doença. O reconhecimento crescente daimportância da mediada por complemento lesão de tecido em uma variedadede estados de doença salienta a necessidade quanto a medicamentosinibitórios de complemento eficazes. Nenhum medicamento foi aprovado parao uso humano que especificamente alvejasse e inibisse a ativação decomplemento.

Correntemente, é amplamente aceito que o sistema decomplemento pode ser ativado através de três caminhos distintos: o caminhoclássico, o caminho da lectina e o caminho alternativo. O caminho clássico éusualmente deflagrado pelo anticorpo ligado a uma partícula estranha (isto é,um antígeno) e assim requer exposição anterior a este antígeno para a geraçãode anticorpo específico. Visto que a ativação do caminho clássico estáassociada com o desenvolvimento de uma resposta imune, o caminho clássicoé parte do sistema imune adquirido. Ao contrário, tanto o caminho da lectinaquanto o alternativo são independentes da imunidade clonal e são parte dosistema imune inato.

A primeira etapa na ativação do caminho clássico é a ligaçãode uma molécula de reconhecimento específica, Clq, à IgG e IgM ligadas aantígeno. A ativação do sistema de complemento resulta na ativaçãoseqüencial de zimogênios de serina protease. A Clq está associada com aspró-enzimas de serina protease Clr e Cls como um complexo chamado Cl e,na ligação de Clq a um complexo imune, clivagem autoproteolítica do sítioArg-IIe de Clr é seguido pela ativação por Clr de Cls, que deste modo adquirea capacidade para clivar C4 e C2. a clivagem de C4 em dois fragmentos,designados C4a e C4b, possibilita que os fragmentos C4b formem ligaçõescovalentes com grupos hidroxila ou amino adjacentes e a geração subseqüentede C3 convertase (C4b2b) através de interação não covalente com ofragmento C2b de C2 ativado. A C3 convertase (C4b2b) ativa C3 levando àgeração da C5 convertase (C4b2b3b) e a formação do complexo de ataque àmembrana (C5b-9) que pode causar a Iise microbiana. as formas ativadas deC3 e C4 (C3b e C4b) são covalentemente depositadas nas superfícies alvoestranhas, que são reconhecidas pelos receptores de complemento nosfagócitos múltiplos.

Independentemente, a primeira etapa na ativação do sistema decomplemento pelo caminho da lectina também é a ligação de moléculas dereconhecimento específicas, que é seguido pela ativação de serina proteasesassociadas. Entretanto, ao invés da ligação de complexos imunes por Clq, asmoléculas de reconhecimento no caminho da lectina são proteínas que ligamcarboidrato (lectina que liga manana (MBL), H-ficolina, M-ficolina e L-ficolina) (J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572: 387-400, 2002;Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21: 547-578 (2003); Teh et al.,Immunology 101: 225-232 (2000)). Ikeda et al. primeiro demonstraram que,como Clq, MBL poderia ativar o sistema de complemento na ligação aoseritrócitos revestidos com a manana de levedura em uma maneira dependentede C4 (K. Ikeda et ai, J. Biol. Chem. 262: 7451-7454, 1987). MBL, ummembro da família da proteína colectina, é uma lectina dependente de cálcioque liga carboidratos com grupos 3- e 4-hidróxi orientados no planoequatorial do anel de piranose. Os ligandos proeminentes para MBL são assimD-manose e N-acetil-D-glicosamina, enquanto os carboidratos que não seadaptam a esta exigência estérica têm afinidade indetectável para MBL (Weis,W. I., et ai, Nature 360: 127-134, 1992). A interação entre MBL e açúcaresmonovalentes é extremamente fraca, com constantes de dissociaçãotipicamente na faixa de 2 mM. A MBL alcança ligação firme, específica aosligandos de glicano pela interação com resíduos de monossacarídeo múltiplossimultaneamente (Lee, R. T., et ai., Archiv. Biochem. Biophys. 299: 129-136,1992). MBL reconhece os padrões de carboidrato que habitualmente revestemos microorganismos tais como bactérias, levedura, parasitas e certos vírus. Aocontrário, MBL não reconhece a D-galactose e o ácido siálico, o penúltimo eúltimo açúcares que usualmente revestem glicoconjugados complexos"maduros" presentes no plasma de mamífero e glicoproteínas de superfíciecelular. Esta especificidade de ligação é considerada ajudar a proteger da autoativação. Entretanto, MBL não se liga com alta afinidade aos grupos deglicanos "precursores" de manose alta nas glicoproteínas ligadas em N eglicolipídeos seqüestrados no retículo endoplasmático e de Golgi de célulasde mamífero (Maynard, Y., et ai, J. Biol. Chem. 257: 3788-3794, 1982).Portanto, as células danificadas são alvos potenciais para a ativação docaminho da lectina por intermédio da ligação de MBL.

As ficolinas possuem um tipo diferente de domínio de lectinado que as MBL, chamado o domínio equivalente a fibrinogênio. As ficolinasligam resíduos de açúcar em uma maneira independente de Ca"1"1". Nos sereshumanos, três tipos de ficolinas, L-ficolina, M-ficolina e H-ficolina, foramidentificados. Ambas as ficolinas séricas L-ficolina e H-ficolina têm emcomum uma especificidade quanto a N-acetil-D-glicosamina; entretanto, a H-ficolina também liga N-acetil-D-galactosamina. A diferença na especificidadede açúcar da L-ficolina, H-ficolina e MBL significa que as lectinas diferentespodem ser complementares e alvejam glicoconjugados diferentes, emborasobrepostos. Este conceito é sustentado pelo relato recente de que, daslectinas conhecidas no caminho da lectina, apenas a L-ficolina liga-seespecificamente ao ácido lipoteicóico, um glicoconjugado de parede celularencontrado em todas as bactérias Gram-positivas (Lynch, N. J., et ai., J.Immunol. 172: 1198-1202, 2004). As colectinas (isto é, MBL) e as ficolinasnão carregam nenhuma similaridade na seqüência de aminoácido. Entretanto,os dois grupos de proteínas têm organizações de domínio similares e, comoClq, se agregam em estruturas oligoméricas, que maximizam a possibilidadede ligação de sítio múltiplo. As concentrações séricas de MBL são altamentevariáveis em populações saudáveis e isto é geneticamente controlado pelospolimorfismos/ mutações tanto no promotor quanto nas regiões codificadorasdo gene MBL. Como uma proteína de fase aguda, a expressão de MBL éainda supra-regulada durante a inflamação. A L-ficolina está presente no soroem concentrações similares como MBL. Portanto, o ramo da L-ficolina docaminho da lectina é potencialmente comparável ao ramo da MBL em força.A MBL e as ficolinas também podem funcionar como opsoninas, querequerem a interação destas proteínas com receptores de fagócito (Kuhlman,M., et ai, J. Exp. Med. 169: 1733, 1989; Matsushita, M., et al., J. Biol. Chem.271: 2448-54, 1996). Entretanto, as identidades do(s) receptor(es) nas célulasfagocíticas não foram estabelecidas.

A MBL humana forma uma interação específica e de altaafinidade através do seu domínio equivalente a colágeno com serinasproteases equivalentes a Clr/Cls únicas, chamadas de MBL-serina proteasesassociadas (MASPs). Até agora, três MASPs foram descritas. A primeira,uma enzima "MASP" única foi identificada e caracterizada como a enzimaresponsável pelo início da cascata de complemento (isto é, clivando C2 e C4)(Ji, Y. H., et al, J. Immunol. 150: 571-578, 1993). Mais tarde, confirmou-seque MASP é de fato uma mistura de duas proteases: MASP-I e MASP-2(Thiel, S., et al., Nature 386: 506-510, 1997). Entretanto, foi demonstrado queo complexo MBL-MASP-2 sozinho é suficiente para a ativação decomplemento (Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165: 2093-2100, 2000).Além disso, apenas MASP-2 clivou C2 e C4 em altas taxas (Ambrus, G., etal., J. Immunol. 170: 1374-1382, 2003). Portanto, MASP-2 é a proteaseresponsável pela ativação de C4 e C2 para gerar a C3 convertase, C4b2b. Estaé uma diferença significante do complexo Cl, onde a ação coordenada de duasserina proteases específicas (Clr e Cls) leva à ativação do sistema decomplemento. Recentemente, uma terceira nova protease, MASP-3, foiisolada (Dahl, M.R., et al., Immunity 15: 127-35, 2001). MASP-I e MASP-3são alternativamente produtos unidos do mesmo gene. As funções biológicasde MASP-I e MASP-3 permanecem para serem resolvidas.

MASPs compartilham organizações de domínio idênticas comaquelas de Clr e Cls, os componentes enzimáticos do complexo Cl (Sim, R.B., et al., Biochem. Soe. Trans. 28: 545, 2000). Estes domínios incluem umdomínio de proteína Clr/Cls/Vegf de ouriço-do-mar/ morfogênica óssea(CUB) de terminal N, um domínio equivalente ao fator de crescimentoepidérmico, um segundo domínio CUB, um tandem de domínios de proteínade controle de complemento e um domínio de serina protease. Como nasproteases Cl, a ativação de MASP-2 ocorre através da clivagem de umaligação Arg-Ile adjacente ao domínio de serina protease, que divide a enzimaem cadeias AeB ligadas a dissulfeto, a última consistindo do domínio deserina protease. Recentemente, uma deficiência geneticamente determinadade MASP-2 foi descrita (Stengaard-Pedersen, K., et al., New Eng. J. Med.349: 554-560, 2003). A mutação de um único nucleotídeo leva a uma trocaAsp-Gly no domínio CUB 1 e torna a MASP-2 incapaz de ligar-se à MBL.

A MBL também está associada com uma proteína nãoenzimática aludida como proteína associada a MBL de 19 kDa (MApl9)(Stover, C. M., J. Immunol. 162: 3481-90, 1999) ou proteína pequenaassociada a MBL (sMAP) (Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11: 859-863,1999). MAp 19 é formada pela junção alternativa do produto de gene MASP 2e compreende os primeiros dois domínios de MASP-2, seguidos por umaseqüência extra de quatro aminoácidos únicos. Os genes MASP 1 e MASP 2estão localizados nos cromossomas 3 e 1, respectivamente (Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205: 455-466, 2002).

Diversas linhas de evidência sugerem que existem complexosMBL-MASPs diferentes e uma fração grande das MASPs totais no soro não écomplexada com MBL (Thiel, S., et al., J. Immunol. 165: 878-887, 2000).Tanto a H- quanto a L-ficolina são associadas com MASP e ativam o caminhode complemento da lectina, como o faz a MBL (Dahl, M. R., et al., Immunity15: 127-35, 2001; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002).Tanto o caminho da lectina quanto o clássico formam uma C3 convertasecomum (C4b2b) e os dois caminhos convergem nesta etapa.

O caminho da lectina é amplamente considerado ter um papelprincipal na defesa do hospedeiro contra infecção. Evidência forte para oenvolvimento de MBL na defesa do hospedeiro vem da análise de pacientescom níveis séricos diminuídos de MBL funcional (Kilpatrick, D. C., Biochim.Biophys. Acta 1572: 401-413, 2002). Tais pacientes demonstramsuscetibilidade às infecções bacterianas e fungicas recorrentes. Estes sintomassão usualmente evidentes no início da vida, durante uma janela evidente devulnerabilidade conforme os títulos de anticorpo maternalmente derivadosenfraquecem, mas antes que um repertório completo de respostas de anticorpose desenvolva. Esta síndrome freqüentemente resulta das mutações emdiversos sítios na porção de colágeno de MBL, que interfere com a formaçãoapropriada de oligômeros de MBL. Entretanto, visto que MBL pode funcionarcomo uma opsonina independente de complemento, não é conhecido a qualgrau a suscetibilidade aumentada à infecção é devido à ativação decomplemento prejudicada.

Embora exista evidência extensiva implicando os caminhos decomplemento tanto o clássico quanto o alternativo na patogênese de doençashumanas não infecciosas, o papel do caminho da lectina está apenascomeçando a ser avaliado. Estudos recentes fornecer evidência de que aativação do caminho da lectina pode ser responsável pela ativação de complemento e inflamação relacionada na lesão de isquemia/ reperfusão.Collard et al. (2000) relataram que as células endoteliais cultivadassubmetidas ao estresse oxidativo ligam MBL e mostram deposição de C3 naexposição ao soro humano (Collard, C. D., et al., Am. J. Pathol. 156: 1549-1556, 2000). Além disso, o tratamento de soros humanos com anticorpos monoclonais anti-MBL bloqueadores inibiu a ligação de MBL e a ativação decomplemento. Estas descobertas foram ampliadas para um modelo de rato deisquemia-reperfusão miocárdicas em que os ratos tratados com um anticorpobloqueador direcionado contra MBL de rato mostraram significantementemenos lesão miocárdico na oclusão de uma artéria coronária do que os ratostratados com um anticorpo de controle (Jordan, J. E., et al., Circulation 104:1413-1418, 2001). O mecanismo molecular de ligação de MBL ao endotéliovascular depois do estresse oxidativo é incerto; um estudo recente sugere quea ativação do caminho da lectina depois do estresse oxidativo pode sermediado pela ligação de MBL às citoqueratinas endoteliais vasculares e não aos glicoconjugados (Collard, C. D., et al., Am. J. Pathol. 159: 1045-1054,2001). Outros estudos têm implicado os caminhos clássico e alternativo napatogênese da lesão de isquemia/reperfusão e o papel do caminho da lectinanesta doença permanece controverso (Riedermann, N. C., et al., Am. J.Pathol. 162: 363-367, 2003).Ao contrário dos caminhos clássico e da lectina, nenhuminiciador do caminho alternativo foi encontrado para preencher as funções dereconhecimento que a Clq e lectinas realizam nos outros dois caminhos.Correntemente é amplamente aceito que o caminho alternativo é espontaneamente deflagrado pelas superfícies estranhas ou outras superfíciesanormais (bactérias, levedura, células viralmente infectadas ou tecidodanificado). Existem quatro proteínas plasmáticas diretamente envolvidas nocaminho alternativo: C3, fatores BeDe properdina. A geração proteolítica deC3b a partir de C3 nativo é requerida para o caminho alternativo funcionar. Visto que a C3 convertase do caminho alternativo (C3bBb) contém C3b comouma subunidade essencial, a questão com respeito à origem da primeira C3bpor intermédio do caminho alternativo tem apresentado um problemaintricado e tem estimulado pesquisa considerável.

C3 pertence a uma família de proteínas (junto com C4 e a-2macroglobulina) que contém uma rara modificação pós-traducional conhecidacomo uma ligação de tioéster. O grupo tioéster é composto de uma glutaminacujo grupo carbonila terminal é ligado ao grupo sulfidrila de uma cisteína trêsaminoácidos para diante. Esta ligação é instável e o grupo carbonilaeletrofílico da glutamina pode formar uma ligação covalente com outras moléculas por intermédio de grupos hidroxila ou amino. A ligação de tioésteré razoavelmente estável quando seqüestrada dentro de uma bolsa hidrofóbicade C3 intacto. Entretanto, a clivagem proteolítica de C3 a C3a e C3b resultana exposição da ligação de tioéster altamente reativa em C3b e por estemecanismo C3b covalentemente liga-se a um alvo. Além do seu papel bem documentado na ligação covalente de C3b ao complementos alvo, o tioésterC3 também é considerado ter um papel central na deflagração do caminhoalternativo. De acordo com a "teoria tick-over" amplamente aceita, o caminhoalternativo é iniciado pela geração de uma convertase de fase fluida, iC3Bb,que é formada a partir de C3 com tioéster hidrolisado (iC3; C3(H20)) e fator B(Lachmann, Ρ. J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7: 143-162, 1984). OC3b-equivalente a iC3 é gerado a partir de C3 nativo por uma hidróliseespontânea lenta do tioéster interno na proteína (Pangburn, M. K., et aL, J.Exp. Med. 154: 856-867, 1981). Através da atividade da iC3Bb convertase, asmoléculas de C3b são depositadas sobre a superfície alvo iniciando destemodo o caminho alternativo.

Muito pouco é se sabe acerca dos iniciadores de ativação docaminho alternativo. Os ativadores são considerados incluir paredes celularesde levedura (zymosan), polissacarídeos muito puros, eritrócitos de coelho,certas imunoglobulinas, vírus, fungos, bactérias, células de tumor animal,parasitas e células danificadas. O único traço comum entre estes ativadores éa presença de carboidrato, mas a complexidade e variedade de estruturas decarboidrato têm tornado difícil estabelecer os determinantes molecularescompartilhados, que são reconhecidos.

O caminho alternativo também pode fornecer uma alça deamplificação poderosa para a C3 convertase dos caminhos da lectina/ clássico(C4b2b) visto que qualquer C3b gerada pode participar com fator B naformação da C3 convertase do caminho alternativo (C3bBb) adicional. A C3convertase do caminho alternativo é estabilizada pela ligação de properdina.

A properdina prolonga a meia-vida da C3 convertase do caminho alternativode seis a dez vezes. A adição de C3b à C3 convertase leva à formação da C5convertase do caminho alternativo.

Todos os três caminhos (isto é, o clássico, da lectina ealternativo) foram considerados convergir em C5, que é clivado para formarprodutos com efeitos pró inflamatórios múltiplos. O caminho convergido foialudido como o caminho de complemento terminal. C5a é a anafílatoxinamais potente, induzindo alterações no músculo liso e tônus vascular, assimcomo na permeabilidade vascular. Também é uma quimiotaxina poderosa eativador tanto de neutrófilos quanto de monócitos. A ativação celular mediadapor C5a pode significantemente amplificar as respostas inflamatórias pelaindução da liberação de mediadores inflamatórios adicionais múltiplos,incluindo citocinas, enzimas hidrolíticas, metabólitos do ácido araquidônico eespécies de oxigênio reativas. A clivagem de C5 leva à formação de C5b-9,também conhecida como o complexo de ataque à membrana (MAC). Existeagora forte evidência de que a deposição de MAC sublítico podedesempenhar um papel importante na inflamação além do seu papel como umcomplexo formador de poro lítico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método deinibir os efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2 em um paciente vivo. O método inclui a etapa de administrar a um pacienteem necessidade deste, uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Nestecontexto, a frase "ativação de complemento dependente de MASP-2" refere-se a ativação de complemento de caminho alternativo que ocorre porintermédio do sistema MASP-2 dependente de lectina. Em um outro aspectoda invenção, o agente inibidor de MASP-2 inibe a ativação de complementopor intermédio do sistema MASP-2 dependente de lectina semsubstancialmente inibir a ativação de complemento por intermédio do sistemaclássico ou dependente de Clq, tal que o sistema dependente de Clqpermaneça funcional.

Em algumas formas de realização destes aspectos da invenção,o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo anti-MASP-2 ou fragmentodeste. Em outras formas de realização, o anticorpo anti-MASP-2 tem funçãoefetora reduzida. Em algumas formas de realização, o agente inibidor deMASP-2 é um peptídeo inibidor de MASP-2 ou um inibidor de MASP-2 nãopeptídico.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornececomposições para inibir os efeitos adversos da ativação de complementodependente de MASP-2, que compreende uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um agente inibidor de MASP-2 e um veículo farmaceuticamenteaceitável. Métodos também são fornecidos para a fabricação de ummedicamento para o uso na inibição dos efeitos adversos da ativação decomplemento dependente de MASP-2 em pacientes vivos em necessidadedeste, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agenteinibidor de MASP-2 em um veículo farmacêutico. Métodos também sãofornecidos para a fabricação de medicamentos para o uso na inibição daativação de complemento dependente de MASP-2 para o tratamento de cadauma das condições, doenças e distúrbios descritos aqui abaixo.

Os métodos, composições e medicamentos da invenção sãoúteis para inibir os efeitos adversos da ativação de complemento dependentede MASP-2 in vivo em pacientes mamíferos, incluindo seres humanos quesofrem de uma condição ou lesão patológicas agudas ou crônicas como aindadescrito aqui. Tais condições e lesões incluem sem limitação a ativação decomplemento mediada por MASP-2 em distúrbios autoimunes e/ou condiçõesinflamatórias associadas.

Em um aspecto da invenção, métodos são fornecidos para otratamento de reperfusão isquêmica lesões tratando-se um paciente queexperimenta reperfusão isquêmica, incluindo sem limitação, depois do reparode aneurisma aórtico, desvio cardiopulmonar, reanastomose vascular emconexão com, por exemplo, transplantes de órgão (por exemplo, coração,pulmão, fígado, rim) e/ou reimplantação de extremidade/dedo, acidentevascular cerebral, infarte do miocárdio, ressuscitação hemodinâmica seguintea choque e/ou procedimentos cirúrgicos, com uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um veículofarmacêutico.

Em um aspecto da invenção, métodos são fornecidos para ainibição da aterosclerose tratando-se um paciente que sofre de ou propenso àaterosclerose com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agenteinibidor de MASP-2 em um veículo farmacêutico.

Em um aspecto da invenção, métodos são fornecidos parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um pacienteque experimenta uma condição vascular, incluindo sem limitação condiçõescardiovasculares, condições cerebrovasculares, condições vascularesperiféricas (por exemplo, musculoesqueletal), condições renovasculares,vasculares mesentéricas/entéricas e revascularização para transplantes e/oureimplantes, tratando-se tal paciente com uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um agente inibidor de MASP-2. Tais condições incluem semlimitação o tratamento de: vasculite, incluindo nefrite púrpura de Henoch-Schonlein, vasculite associada com o lupus eritematoso sistêmico, vasculiteassociada com artrite reumatóide (também chamada de artrite reumatóide maligna), vasculite de complexo imune e doença de Takayasu; cardiomiopatiadilatada; angiopatia diabética; doença de Kawasaki (arterite); êmbolo de gásvenenoso (VGE); e/ou restenose seguinte à colocação de sonda, aterectomiarotacional e/ou angioplastia coronária transluminal percutânea (PTCA).

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidos para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de distúrbios gastrintestinais inflamatórios, incluindo masnão limitado a pancreatite, diverticulite e distúrbios intestinais incluindo adoença de Crohn, colite ulcerativa e síndrome do intestino irritável.

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de uma condição pulmonar incluindo mas não limitado àsíndrome da angústia respiratória aguda, lesão pulmonar aguda relacionadacom transfusão, lesão pulmonar aguda de isquemia/ reperfusão, doençapulmonar obstrutiva crônica, asma, granulomatose de Wegener, doença demembrana de base antiglomerular (doença de Goodpasture), síndrome daaspiração de mecônio, síndrome da bronquiolite obliterativa, fibrose pulmonaridiopática, lesão pulmonar aguda secundária à queimadura, edema pulmonarnão cardiogênico, depressão respiratória relacionada com a transfusão eenfisema.

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que tenha passado, esteja passando ou passará por um procedimentode reperfusão extracorporal, incluindo mas não limitado a hemodiálise,plasmaferese, leucoferese, oxigenação de membrana extracorporal (ECMO),precipitação de LDL na oxigenação de membrana extracorporal induzida porheparina (HELP) e desvio cardiopulmonar (CPB).

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de uma condição musculoesqueletal, incluindo mas nãolimitado a osteoartrite, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, gota,artropatia neuropática, artrite psoriática, espondilite ancilosante ou outrasespondiloartropatias e artropatias cristalinas, distrofia muscular ou lupuseritematoso sistêmico (SLE).

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de condições renais incluindo mas não limitado aglomerulonefrite mesangioproliferativa, glomerulonefrite membranosa,glomerulonefrite membranoproliferativa (glomerulonefrite mesangio-capilar),glomerulonefrite após infecção aguda (glomerulonefrite pós estreptocócica),glomerulonefrite crioglobulinêmica, nefrite de lupus, nefrite púrpura deHenoch-Schonlein ou nefropatia de IgA.

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de uma condição dérmica, incluindo mas não limitado àpsoríase, dermatoses bolhosas autoimunes, espongiose eosinofílica,penfigóide bolhoso, epidermólise bolhosa adquirida e herpes gestacional eoutros distúrbios dérmicos ou de uma lesão por queimadura térmica ouquímica que envolva derrame capilar.

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que tenha recebido um órgão ou outro transplante de tecido,incluindo mas não limitado a alotransplante ou xenotransplante de órgãosinteiros (por exemplo, rim, coração, fígado, pâncreas, pulmão, córnea, etc.) ouenxertos (por exemplo, válvulas, tendões, medula óssea, etc.).

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de um distúrbio ou lesão do sistema nervoso central ou umdistúrbio ou lesão do sistema nervoso periféricos, incluindo mas não limitadosà esclerose múltipla (MS), miastenia grave (MG), doença de Huntington(HD), esclerose lateral amiotrófica (ALS), síndrome de Guillain Barre,reperfusão seguinte ao acidente vascular cerebral, discos degenerativos,trauma cerebral, mal de Parkinson (PD), mal de Alzheimer (AD), síndrome deMiller-Fisher, trauma e/ou hemorragia cerebrais, desmielinização e meningite.

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de um distúrbio sangüíneo incluindo mas não limitado asepticemia ou uma condição que resulte da septicemia incluindo semlimitação septicemia severa, choque séptico, síndrome da angústia respiratóriaaguda que resulta de septicemia e síndrome da resposta inflamatóriasistêmica. Métodos relacionados são fornecidos para o tratamento de outrosdistúrbios sangüíneos, incluindo choque hemorrágico, anemia hemolítica,púrpura trombocitopênica trombótica autoimune (TTP), síndrome urêmicahemolítica (HUS) ou outras condições destrutivas da medula/sangue.

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de uma condição urogenital incluindo mas não limitado àdoença da bexiga dolorosa, doença da bexiga sensitiva, cistite não bacterianacrônica e cistite intersticial, infertilidade masculina e feminina, disfunçãoplacentária e aborto e pré-eclâmpsia.

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de diabete em não obeso (diabete Tipo 1 ou diabete melitodependente de insulina) ou de complicações de angiopatia, neuropatia ouretinopatia da diabete do Tipo 1 ou do Tipo 2 (início na idade adulta).

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que é tratado com produtos quimioterapêuticos e/ou terapia deradiação, incluindo sem limitação para o tratamento de condições cancerosas,pela administração de um inibidor de MASP-2 a um tal pacienteperiquimioterapeuticamente ou periterapia de radiação, isto é, antes e/oudurante e/ou depois da administração de produto(s) quimioterapêutico(s) e/outerapia de radiação. A administração de produto periquimioterapêutico ouperiterapia de radiação de inibidores de MASP-2 pode ser útil para reduzir osefeitos colaterais de produto quimioterapêutico ou terapia de radiação. Aindaem um aspecto adicional da invenção, métodos são fornecidos para otratamento de malignidades pela administração de um agente inibidor deMASP-2 em um veículo farmaceuticamente aceitável a um paciente que sofrede uma malignidade.

Em um outro aspecto da invenção métodos são fornecidos parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um pacienteque sofre de um distúrbio endócrino, pela administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um veículofarmacêutico a um tal paciente. As condições submetidas a tratamento deacordo com a presente invenção incluem, por via de exemplo não limitante,tireoidite de Hashimoto, estresse, ansiedade e outros distúrbios hormonaispotenciais que envolvam a liberação regulada de prolactina, fator decrescimento ou fator de crescimento equivalente à insulina eadrenocorticotropina da pituitária.

Em um outro aspecto da invenção métodos são fornecidos parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um pacienteque sofre de degeneração macular relacionada com a idade ou outra condiçãooftalmológica mediada por complemento pela administração de umaquantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em umveículo farmacêutico a um paciente que sofre de uma tal condição.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Os aspectos precedentes e muitas das vantagens anexas destainvenção tornar-se-ão mais facilmente avaliados conforme os mesmos setornarem melhor entendidos por referência à seguinte descrição detalhada,quando considerada em conjunção com os desenhos anexos, em que:

A FIGURA 1 é um fluxograma que ilustra a nova descobertade que o caminho de complemento alternativo requer a ativação dependentede MASP-2 do caminho da lectina para a ativação de complemento;

A FIGURA 2 é um diagrama que ilustra a estrutura genômicade MASP-2 humana;

A FIGURA 3A é um diagrama esquemático que ilustra aestrutura de domínio da proteína MASP-2 humana;

A FIGURA 3B é um diagrama esquemático que ilustra aestrutura de domínio da proteína MAp 19 humana;

A FIGURA 4 é um diagrama que ilustra a estratégia desilenciamento de MASP-2 de murino;A FIGURA 5 é um diagrama que ilustra a construção deminigene da MASP-2 humana;

A FIGURA 6A apresenta resultados que demonstram que adeficiência de MASP-2 leva à perda da ativação de C4 mediada pelo caminhoda lectina como medido pela falta de deposição de C4b na manana;

A FIGURA 6B apresenta resultados que demonstram que adeficiência de MASP-2 leva à perda da ativação de C4 mediada pelo caminhoda lectina como medido pela falta de deposição de C4b em zimosan;

A FIGURA 6C apresenta resultados que demonstram os níveisde ativação de C4 relativos de amostras séricas obtidas de MASP-2+/-;MASP-2-/- e cepas do tipo selvagem como medido pela deposição de C4b emmanana e em zimosan;

A FIGURA 7A apresenta resultados que demonstram que adeficiência de MASP-2 leva à perda da ativação de C3 mediada tanto pelocaminho da lectina quanto pelo caminho alternativo como medido pela faltade deposição de C3b em manana;

A FIGURA 7B apresenta resultados que demonstram que adeficiência de MASP-2 leva à perda de ativação de C3 mediada tanto pelocaminho da lectina quanto pelo caminho alternativo como medido pela faltade deposição de C3b em zimosan;

A FIGURA 8 apresenta resultados que demonstram que aadição de MASP-2 recombinante de murino às amostras séricas MASP-2-/-recupera a ativação de C4 mediada pelo caminho da lectina em uma maneiradependente da concentração de proteína, como medido pela deposição de C4bem manana;

A FIGURA 9 apresenta resultados que demonstram que ocaminho clássico é funcional na cepa MASP-2-/-;

A FIGURA 10 apresenta resultados que demonstram que aativação do sistema de complemento dependente de MASP-2 é ativada nafase de isquemia/reperfusão seguinte ao reparo de aneurisma aórticoabdominal;

A FIGURA IlA apresenta resultados que demonstram que oanticorpo Fab2 anti-MASP-2 #11 inibe a formação da C3 convertase, comodescrito no Exemplo 24;

A FIGURA IlB apresenta resultados que demonstram que oanticorpo Fab2 anti-MASP-2 #11 se liga à MASP-2 de rato nativa, comodescrito no Exemplo 24;

A FIGURA IlC apresenta resultados que demonstram que oanticorpo Fab2 anti-MASP-2 #41 inibe a clivagem de C4, como descrito noExemplo 24;

A FIGURA 12 apresenta resultados que demonstram que todosos anticorpos Fab2 anti-MASP-2 testados que inibiram a formação da C3convertase também foram descobertos inibir a clivagem de C4, como descritono Exemplo 24;

A FIGURA 13 é um diagrama que ilustra os polipeptídeosrecombinantes derivados de MASP-2 de rato que foram usados para omapeamento de epítopo dos anticorpos Fab2 bloqueadores anti-MASP-2,como descrito no Exemplo 25;

A FIGURA 14 apresenta resultados que demonstram a ligaçãode Fab2 anti-MASP-2 #40 e #60 aos polipeptídeos MASP-2 de rato, comodescrito no Exemplo 25;

A FIGURA 15 apresenta resultados que demonstram adepuração de nitrogênio da uréia sangüínea para os camundongos (+/+) dotipo selvagem e MASP-2 (-/-) em 24 e 48 horas depois da reperfusão em ummodelo de lesão de isquemia/reperfusão renal, como descrito no Exemplo 26;

A FIGURA 16A apresenta resultados que demonstram otamanho do infarto para camundongos (+/+) do tipo selvagem e o tamanho doinfarto reduzido nos camundongos MASP-2 (-/-) depois da lesão em ummodelo de oclusão e reperfusão da artéria coronária, como descrito noExemplo 27;

A FIGURA 16B apresenta resultados mostrando a distribuiçãodos animais individuais testados no modelo de oclusão e reperfusão da artériacoronária, como descrito no Exemplo 27;

A FIGURA 17A apresenta resultados mostrando os níveis daproteína VEGF de referência no complexo RPE-coróide isolado decamundongos (+/+) do tipo selvagem e MASP-2 (-/-), como descrito no

Exemplo 28;

A FIGURA 17B apresenta resultados mostrando os níveis deproteína VEGF em complexo RPE-coróide no dia 3 em camundongos (+/+)do tipo selvagem e MASP-2 (-/-) seguinte à lesão induzida por laser em ummodelo de degeração macular, como descrito no Exemplo 28;

A FIGURA 18 apresenta resultados mostrando o volume da neovascularização coroidal média (CNV) no dia sete seguinte à lesão induzidapor laser em camundongos (+/+) do tipo selvagem e MASP-2 (-/-), comodescrito no Exemplo 28;

A FIGURA 19 apresenta resultados mostrando a contagem deartrite clínica média de camundongos (+/+) do tipo selvagem e MASP-2 (-/-)com o tempo seguinte à artrite reumatóide induzida por mAb Col2, comodescrito no Exemplo 29;

A FIGURA 20A é um diagrama mostrando o rompimentoalvejado do gene sMAP (Mapl9), como descrito no Exemplo 30;

A FIGURA 20B apresenta a análise Southern blot de DNA genômico isolado de progênie derivada do acasalamento de camundongossMAP (-/-) quiméricos machos com camundongos C57BL/6 fêmeas, comodescrito no Exemplo 30;

A FIGURA 20C apresenta a análise de genotipagem de PCRde camundongos (+/+) do tipo selvagem e sMAP (-/-), como descrito noExemplo 30;

A FIGURA 21A apresenta a análise Northern blot de mRNAde sMAP e MASP-2 em camundongos sMAP (-/-), como descrito noExemplo 30;

A FIGURA 2IB apresenta a análise de RT-PCR quantitativade cDNA que codifica MASP-2 Η-cadeia, MASP-2 L-cadeia e sMAP, emcamundongos (+/+) do tipo selvagem e sMAP (-/-), como descrito noExemplo 30;

A FIGURA 22A apresenta uma imunomancha de sMAP (-/-),isto é, MAp 19 (-/-), que demonstra a deficiência de MASP-2 e sMAP no sorode camundongo, como descrito no Exemplo 30;

A FIGURA 22B apresenta resultados que demonstram queMASP-2 e sMAP foram detectados no complexo MBL-MASP-sMAP, comodescrito no Exemplo 30;

A FIGURA 23A apresenta resultados mostrando a deposiçãode C4 em reservatórios revestidos com manana no soro de camundongos(+/+) do tipo selvagem e sMAP (-/-), como descrito no Exemplo 30;

A FIGURA 23B apresenta resultados mostrando a deposiçãode C3 em reservatórios revestidos com manana no soro de camundongos(+/+) do tipo selvagem e sMAP (-/-), como descrito no Exemplo 30;

A FIGURA 24A apresenta resultados mostrando areconstituição do complexo MBL-MASP-sMAP no soro sMAP (-/-), comodescrito no Exemplo 30;

As FIGURAS 24B a D apresentam resultados mostrando aligação competitiva de rsMAP e MASP-2Í à MBL, como descrito no Exemplo30;

As FIGURAS 25A e B apresentam resultados mostrando arestauração da atividade de deposição de C4 pela adição de rMASP-2, masnão rsMAP, como descrito no Exemplo 30;As FIGURAS 26A e B apresentam resultados mostrando aredução da atividade de deposição de C4 pela adição de rsMAP, comodescrito no Exemplo 30; e

As FIGURAS 27A e C apresentam resultados mostrando queMASP-2 é responsável pela ativação pelo desvio de C4 de C3, como descritono Exemplo 31.

DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID NO: 1 cDNA de MAp 19 humana

SEQ ID NO: 2 proteína de MAp 19 humana (com líder)

SEQ ID NO: 3 proteína de MAp 19 humana (madura)

SEQ ID NO: 4 cDNA de MASP-2 humana

SEQ ID NO: 5 proteína de MASP-2 humana (com líder)

SEQ ID NO: 6 proteína de MASP-2 humana (madura)

SEQ ID NO: 7 gDNA de MASP-2 humana (exons 1 a 6)ANTÍGENOS: (EM REFERÊNCIA À PROTEÍNA MASP-2 MADURA)

SEQ ID NO: 8 seqüência CUBI (aminoácidos 1 a 121)

SEQ ID NO: 9 seqüência CUBEGF (aminoácidos 1 a 166)

SEQ ID NO: 10 CUBEGFCUBII (aminoácidos 1 a 293)

SEQ ID NO: 11 região EGF (aminoácidos 122 a 166)

SEQ ID NO: 12 domínio de serina protease (aminoácidos 429a 671)

SEQ ID NO: 13 domínio de serina protease inativa(aminoácidos 610 a 625 com mutação de Ser618 para Ala)

SEQ ID NO: 14 TPLGPKWPEPVFGRL (peptídeo CUB 1)

SEQ ID NO: 15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (peptídeo CUBI)

SEQ ID NO: 16 TFRSDYSN (núcleo da região de ligação deMBL)

SEQ ID NO: 17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (regiãode ligação de MBL)

SEQ ED NO: 18 EDECQVAPG (PEPTÍDEO EGF)SEQ ID NO: 19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV(núcleo de ligação da serina protease)Descrição DetalhadaINIBIDORES DE PEPTÍDEO:

SEQ ID NO: 20 cDNA de tamanho natural de MBL

SEQ ID NO: 21 proteína de tamanho natural de MBL

SEQ ID NO: 22 OGK-X-GP (ligação de consenso)

SEQ ID NO: 23 OGKLG

SEQ ID NO: 24 GLR GLQ GPO GKL GPO G

SEQ ID NO: 25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO

GPO

SEQ ID NO: 26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQG

POGKLGPOG

SEQ ID NO: 27 GAOGSOGEKGAOGP QGPOGPOGKMGPKGEOGD O (h-ficolina humana)

SEQ ID NO: 28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGK AGPOGPN GAOGEO (ficolina p35 humana)

SEQ ID NO: 29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (sítio declivagem de C4)

INIBIDORES DE EXPRESSÃO:

SEQ ID NO: 30 cDNA do domínio CUBI-EGF (nucleotídeos22 a 680 da SEQ ID NO: 4)

SEQ ID NO: 31

5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC

3'

Nucleotídeos 12 a 45 da SEQ ID NO: 4 incluindo o sítio deinício de tradução de MASP-2 (sentido)SEQ ID NO: 325'GAC ATTACCTTCCGCTCCGACTCC AACGAGAAG3'Nucleotídeos 361 a 396 da SEQ ED NO: 4 que codifica uma região quecompreende o sítio de ligação MBL de MASP-2 (sentido)

SEQ ID NO: 33

5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'

Nucleotídeos 610 a 642 da SEQ LD NO: 4 que codifica uma região quecompreende o domínio CUBITINICIADORES DE CLONAGEM:

SEQ ID NO: 34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC(5' PCR PARA CUB)

SEQ ID NO: 35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (3' PCRPARA CUB)

SEQ ID NO: 36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (3' PCRPARA CUBIEGF)

SEQ ID NO: 37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (3' PCRPARA CUBIEGFCUBII)

SEQ ID NOS: 38 A 47 são iniciadores de clonagem paraanticorpo humanizado SEQ ID NO: 48 é ligação de peptídeo de 9aminoácidos

VETOR DE EXPRESSÃO:

SEQ ID NO: 49 é o inserto de minigene MASP-2

SEQ ID NO: 50 é o cDNA MASP-2 de murino

SEQ ID NO: 51 é a proteína MASP-2 de murino (w/líder)

SEQ ID NO: 52 é a proteína MASP-2 de murino madura

SEQ ID NO: 53 o cDNA de MASP-2 de rato

SEQ ID NO: 54 é a proteína MASP-2 de rato (w/líder)

SEQ ID NO: 55 é a proteína MASP-2 de rato madura

SEQ ID NO: 56 a 59 são os oligonucleotídeos para amutagênese direcionada ao sítio de MASP-2 humana usados para gerarMASP-2A humana

SEQ ID NO: 60 a 63 são os oligonucleotídeos para amutagênese direcionada ao sítio de MASP-2 de murino usados para gerarMASP-2A de murino

SEQ ID NO: 64 a 65 são os oligonucleotídeos para amutagênese direcionada ao sítio de MASP-2 de rato usados para gerar MASP-2A de rato

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção está fundamentada na descobertasurpreendente pelos presentes inventores de que MASP-2 é necessária parainiciar a ativação do caminho de complemento alternativo. Através do uso deum modelo de camundongo inoperante de MASP-2-/-, os presentes inventoresmostraram que é possível inibir a ativação do caminho de complementoalternativo por intermédio do caminho MASP-2 mediado pela lectinaenquanto deixa o caminho clássico intacto, estabelecendo assim a ativação deMASP-2 dependente de lectina como uma exigência para a ativação decomplemento alternativo na ausência do caminho clássico. A presenteinvenção também descreve o uso de MASP-2 como um alvo terapêutico parainibir a lesão celular associada com a ativação do caminho de complementoalternativo mediada por lectina enquanto deixa o componente do caminhoclássico (dependente de Clq) do sistema imune intacto.

I. DEFINIÇÕES

A menos que aqui especificamente definido, todos os termosaqui usados têm o mesmo significado como seria entendido por aqueles dehabilidade comum na técnica da presente invenção. As seguintes definiçõessão fornecidas de modo a fornecer clareza com respeito aos termos como elessão usados no relatório descritivo e reivindicações para descrever a presenteinvenção.

Como aqui usado, o termo "ativação de complementodependente de MASP-2" refere-se à ativação de complemento de caminhoalternativo que ocorre por intermédio da ativação de MASP-2 dependente delectina.

Como aqui usado, o termo "caminho alternativo" refere-se àativação de complemento que é deflagrada, por exemplo, pelo zimosan deparedes celulares füngicas e de levedura, lipopolissacarídeos (LPS) demembranas externas Gram negativas e eritrócitos de coelho, assim como depolissacarídeos muito puros, eritrócitos de coelho, vírus, bactérias, células detumor de animal, parasitas e células danificadas e que tem sidotradicionalmente considerado surgir da geração proteolítica espontânea deC3b a partir do fator de complemento C3.

Como aqui usado, o termo "caminho da lectina" refere-se àativação de complemento que ocorre por intermédio da ligação específica deproteínas séricas e não séricas que ligam carboidrato incluindo lectina queliga manana (MBL) e as ficolinas.

Como aqui usado, o termo "caminho clássico" refere-se àativação de complemento que é deflagrada pelo anticorpo ligado a umapartícula estranha e requer a ligação da molécula de reconhecimento Clq.

Como aqui usado, o termo "agente inibidor de MASP-2"refere-se a qualquer agente que se liga a ou diretamente interage com MASP-2 e eficazmente inibe a ativação de complemento dependente de MASP-2,incluindo anticorpos anti-MASP-2 e fragmentos de ligação de MASP-2destes, peptídeos naturais e sintéticos, moléculas pequenas, receptores MASP-2 solúveis, inibidores de expressão e inibidores naturais isolados e tambémabrangem peptídeos que competem com MASP-2 quanto a ligação a umaoutra molécula de reconhecimento (por exemplo, MBL, H-ficolina, M-ficolina ou L-ficolina) no caminho da lectina, mas não abrangem anticorposque se ligam a tais outras moléculas de reconhecimento. Os agentes inibidoresde MASP-2 úteis no método da invenção podem reduzir a ativação decomplemento dependente de MASP-2 em mais do que 20%, tal como mais doque 50%, tal como mais do que 90%. Em uma forma de realização, o agenteinibidor de MASP-2 reduz a ativação de complemento dependente de MASP-2 em mais do que 90% (isto é, resultando na ativação de complemento deMASP-2 de apenas 10% ou menos).

Como aqui usado, o termo "anticorpo" abrange anticorpos efragmentos de anticorpo destes, derivados de qualquer mamífero que produzaanticorpo (por exemplo, camundongo, rato, coelho e primata incluindo o serhumano), que especificamente se ligam aos polipeptídeos de MASP-2 ouporções destes. Os anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonais,monoclonais e recombinantes; anticorpos multiespecíficos (por exemplo,anticorpos biespecíficos); anticorpos humanizados; anticorpos de murino;anticorpos monoclonais quiméricos, camundongo-ser humano, camundongo-primata, primata-ser humano; e anticorpos anti-idiotipo e podem ser qualquermolécula intacta ou fragmento desta.

Como aqui usado, o termo "fragmento de anticorpo" refere-sea uma porção derivada de ou relacionada com um anticorpo anti-MASP-2 detamanho natural, no geral incluindo a ligação de antígeno ou região variáveldestes. Os exemplos ilustrativos de fragmentos de anticorpo incluem Fab,Fab', F(ab)2, F(ab')2 e fragmentos Fv, scFv fragmentos, diacorpos, anticorposlineares, moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficosformados de fragmentos de anticorpo.

Como aqui usado, um "Fv de cadeia única" ou fragmento deanticorpo "scFv" compreendem os domínios V^H e V^L de um anticorpo, emque estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Nogeral, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligador de polipeptídeo entreos domínios V^H e V^L, que permite que o scFv forme a estrutura desejada paraa ligação de antígeno.

Como aqui usado, um "anticorpo quimérico" é uma proteína28recombinante que contém os domínios variáveis e as regiões determinadorasde complementaridade derivadas de um anticorpo de espécie não humana (porexemplo, roedor), enquanto o resto da molécula de anticorpo é derivada deum anticorpo humano.

Como aqui usado, um "anticorpo humanizado" é um anticorpoquimérico que compreende uma seqüência mínima que se conforma com asregiões determinadoras de complementaridade específicas derivadas deimunoglobulina não humana que é transplantada em uma matriz de anticorpohumano. Os anticorpos humanizados são tipicamente proteínas recombinantes em que apenas as regiões de anticorpo determinadoras de complementaridadesão de origem não humana.

Como aqui usado, o termo "lectina que liga manana" ("MBL")é equivalente à proteína de ligação de manana ("MBP").

Como aqui usado, o "complexo de ataque à membrana"("MAC") refere-se a um complexo dos cinco componentes de complementode terminal (C5-C9) que insere dentro e rompe membranas. Também aludidocomo C5b-9.

Como aqui usado, "um paciente" inclui todos os mamíferos,incluindo sem limitação seres humanos, primatas não humanos, cães, gatos, cavalos, ovelhas, cabras, vacas, coelhos, porcos e roedores.

Como aqui usado, os resíduos de aminoácido são abreviadoscomo segue: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D),arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutâmico (Glu; E), glutamina(Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (lie; I), leucina (Leu;L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro;P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) evalina (Vai; V).

No sentido mais amplo, os aminoácidos que ocorremnaturalmente podem ser divididos em grupos com base nas característicasquímicas da cadeia lateral dos respectivos aminoácidos. Por aminoácido"hidrofóbico" é intencionado lie, Leu, Met, Phe3 Trp5 Tyr, Vai, Ala, Cys ouPro. Por aminoácido "hidrofílico" é intencionado Gly, Asn, Gln, Ser, Thr,Asp, Glu, Lys, Arg ou His. Este agrupamento de aminoácidos pode ser aindasubclassificado como segue. Por aminoácido "hidrofílico não carregado" éintencionado Ser, Thr, Asn ou Gln. Por aminoácido "ácido" é intencionadoGlu ou Asp. Por aminoácido "básico" é intencionado Lys, Arg ou His.

Como aqui usado o termo "substituição de aminoácidoconservativa" é ilustrada por um substituição entre aminoácidos dentro decada uma das seguinte grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina eisoleucina, (2) fenilalanina, tirosina e triptofano, (3) serina e treonina, (4)aspartato e glutamato, (5) glutamina e asparagina e (6) lisina, arginina ehistidina.

O termo "oligonucleotídeo" como aqui usado refere-se a umoligômero ou polímero de ácido ribonucleico (RNA) ou ácidodesoxirribonucleico (DNA) ou miméticos destes. Este termo também abrangeaquelas oligonucleobases compostas de nucleotídeos, açúcares e ligaçõesinternucleosídicas covalentes (cadeia principal) que ocorrem naturalmenteassim como oligonucleotídeos tendo modificações que não ocorremnaturalmente.

II. O CAMINHO ALTERNATIVO: UM NOVO ENTENDIMENTO

O caminho alternativo de complemento foi primeiro descritopor Louis Pillemer e seus colegas nos idos de 1950 com base nos estudos emque zimosan fabricado a partir de paredes de célula de levedura foi usado paraativar complemento (Pillemer, L. et al., J. Exp. Med. 103: 1-13, 1956; Lepow,I. H., J. Immunol. 125: 471-478, 1980). Desde então, zimosan é consideradocomo o exemplo canônico de um ativador específico do caminho alternativoem soro humano e de roedor (Lachmann, P. J., et al., Springer Semin.Immunopathol. 7: 143-162, 1984; Van Dijk, H., et al., J. Immunol. Methods85: 233-243, 1985; Pangburn, Μ. K., Metods in Enzymol. 162: 639-653,1988). Um ensaio conveniente e amplamente usado para a ativação docaminho alternativo é incubar soro com zimosan revestido em reservatóriosplásticos e determinar a quantidade de deposição de C3b sobre a fase sólida aseguir da incubação. Como esperado, existe deposição substancial de C3bsobre os reservatórios revestidos com zimosan a seguir da incubação comsoro de camundongo normal (Figura 7B). Entretanto, a incubação de soro decamundongos deficientes em MASP-2 homozigotos com reservatóriosrevestidos com zimosan resulta em uma redução substancial na deposição de C3b comparada com aquela de soro normal. Além disso, o uso de soro decamundongos heterozigotos para deficiência na gene MASP 2 neste ensaioresulta em níveis de deposição de C3b que são intermediários entre aquelesobtidos com soro de camundongos deficientes em MASP-2 homozigotos esoro de camundongo normais. Resultados paralelos também são obtidosusando reservatórios revestidos com manana, um outro polissacarídeoconhecido por ativar o caminho alternativo (Figura 7A). Visto que oscamundongos normais e deficientes em MASP-2 compartilham o mesmofundo genético, exceto para o gene MASP 2, estes resultados inesperadosdemonstram que MASP-2 desempenha um papel essencial na ativação docaminho alternativo.

Estes resultados fornecem forte evidência de que o caminhoalternativo não é um caminho da ativação de complemento independente,autônomo como descrito essencialmente em todos os livros texto médicoscorrentes e artigos de revisão recentes sobre complemento. A visão científicacorrente e amplamente mantida é que o caminho alternativo é ativado nasuperfície de certos alvos particulados (micróbios, zimosan, eritrócitos decoelho) através da amplificação da ativação de C3 iiUck-Over" espontânea.Entretanto, a ausência de ativação do caminho alternativo significante emsoro de camundongos inoperantes em MASP-2 por dois "ativadores" bemconhecidos do caminho alternativo torna improvável que a "teoria tick-over"descreva um mecanismo fisiológico importante para a ativação decomplemento.

Visto que a MASP-2 protease é conhecida por ter um papelespecífico e bem definido como a enzima responsável para a iniciação dacascata de complemento de lectina, estes resultados implicam na ativação docaminho da lectina pelo zimosan e manana como uma primeira etapa críticapara a ativação subseqüente do caminho alternativo. C4b é um produto deativação gerado pelo caminho da lectina mas não pelo caminho alternativo.Compatível com este conceito, a incubação de soro de camundongo normalcom reservatórios revestidos com zimosan ou manana resulta na deposição deC4b sobre os reservatórios e esta deposição de C4b é substancialmentereduzida quando os reservatórios revestidos são incubados com soro decamundongos deficientes de MASP-2 (Figuras 6A, 6B e 6C).

O caminho alternativo, além do seu papel amplamente aceitocomo um caminho independente para a ativação de complemento, tambémpode fornecer uma alça de amplificação para a ativação de complementoinicialmente deflagrada por intermédio dos caminhos clássico e da lectina(Liszewski, Μ. K. e J. P. Atkinson, 1993, em Fundamental Imunology,Terceira Edição, editado por W. E. Paul, Raven Press, Ltd., Nova Iorque;Schweinie, J. E., et al., J. Clin. Invest. 84: 1821-1829, 1989). Nestemecanismo de amplificação mediado pelo caminho alternativo, a C3convertase (C4b2b) gerada pela ativação das cascatas de complementoclássica ou de lectina cliva C3 em C3a e C3b e deste modo fornece C3b quepode participar na formação de C3bBb, a C3 convertase do caminhoalternativo. A explicação provável para a ausência de ativação do caminhoalternativo em soro inoperante em MASP-2 é que o caminho da lectina érequerido para a ativação inicial de complemento pelo zimosan, manana eoutros "ativadores" putativos do caminho alternativo, enquanto o caminhoalternativo desempenha um papel crucial para a amplificação da ativação decomplemento. Em outras palavras, o caminho alternativo é uma alça deamplificação de alimentação dependente dos caminhos de complemento delectina e clássico para a ativação, ao invés de uma cascata linearindependente.

Ao invés da cascata de complemento que é ativada através detrês caminhos distintos (caminhos clássico, alternativo e da lectina) comoanteriormente previsto, nossos resultados indicam que é mais precisovisualizar complemento como sendo composto de dois sistemas principais,que correspondem, a uma primeira aproximação, às alas inata (lectina) eadquirida (clássica) do sistema de defesa imune de complemento. Lectinas(MBP, M-ficolina, H-ficolina e L-ficolina) são as moléculas dereconhecimento específicas que deflagram o sistema de complemento inato eo sistema inclui o caminho da lectina e a alça de amplificação do caminhoalternativo associada. Clq é a molécula de reconhecimento específica quedeflagra o sistema de complemento adquirido e o sistema inclui o caminhoclássico e alça de amplificação do caminho alternativo associada. Nós nosreferimos a estes dois sistemas de ativação de complemento maior como osistema de complemento dependente de lectina e o sistema dependente deClq de complemento, respectivamente.

Além dos seus papéis essenciais na defesa imune, o sistema decomplemento contribui para o lesão de tecido em muitas condições clínicas.Assim, existe uma necessidade premente para desenvolver inibidores decomplemento terapeuticamente eficazes para prevenir estes efeitos adversos.

Com o reconhecimento de que o complemento é composto de dois sistemasde ativação de complemento principais vem a realização de que seriaaltamente desejável inibir especificamente apenas o sistema de ativação decomplemento que causa uma patologia particular sem completamenteparalisar as capacidades de defesa imune de complemento. Por exemplo, emestados de doença em que a ativação de complemento é mediadapredominantemente pelo sistema de complemento dependente de lectina, seriavantajoso inibir especificamente apenas este sistema. Isto deixaria o sistemade ativação do complemento dependente de Clq intacto para lidar com o processamento do complexo imune e ajudar na defesa do hospedeiro contra ainfecção.

O componente de proteína preferido para alvejar nodesenvolvimento de agentes terapêuticos para inibir especificamente osistema de complemento dependente de lectina é MASP-2. De todos oscomponentes de proteína do sistema de complemento dependente de lectina(MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina, MASP-2, C2-C9, Fator B, Fator De properdina), apenas MASP-2 tanto é único para o sistema de complementodependente de lectina quanto requerido para o sistema funcionar. As lectinas(MBL, H-ficolina, M-ficolina e L-ficolina) também são componentes únicosno sistema de complemento dependente de lectina. Entretanto, a perda dequalquer um dos componentes de lectina não necessariamente inibiria aativação do sistema devido à redundância de lectina. Seria necessário inibirtodas as quatro lectinas de modo a garantir a inibição da ativação do sistemade complemento dependente de lectina. Além disso, visto que MBL e as ficolinas também são conhecidas por terem atividade opsônica independentede complemento, a inibição da função lectina resultaria na perda destemecanismo de defesa do hospedeiro benéfico contra infecção. Ao contrário,esta atividade opsônica da lectina independente de complementopermaneceria intacto se MASP-2 fosse o alvo inibitório. Um benefícioadicional de MASP-2 como o alvo terapêutico para inibir a ativação dosistema de complemento dependente de lectina é que a concentraçãoplasmática de MASP-2 está entre a mais baixa de qualquer proteína decomplemento (« 500 ng/ml); portanto, concentrações correspondentementebaixas de inibidores de alta afinidade de MASP-2 podem ser requeridos parase obter a inibição completa (Moller-Kristensen, M., et al., J. ImmunolMethods 282: 159-167, 2003).

III. PAPEL DE MASP-2 EM VÁRIAS DOENÇAS E CONDIÇÕES EMÉTODOS TERAPÊUTICOS USANDO AGENTES INIBITÓRIOS DE MASP-2

LESÃO PELA REPERFUSÂO ISOUÊMICO

Lesão de reperfusão isquêmico (I/R) ocorre quando o fluxosangüíneo é restaurado depois de um período ampliado de isquemia. A mesmaé uma fonte comum de morbidez e mortalidade em um amplo espectro dedoenças. Os pacientes cirúrgicos são vulneráveis depois do reparo deaneurisma aórtico, desvio cardiopulmonar, reanastomose vascular emconexão com, por exemplo, transplantes de órgão (por exemplo, coração,pulmão, fígado, rim) e reimplantação de dedo/extremidade, acidente vascularcerebral, infarte do miocárdio e ressuscitação hemodinâmica seguinte ao choque e/ou procedimentos cirúrgicos. Pacientes com doençasateroscleróticas são propensos às infartações do miocárdio, acidentesvasculares cerebrais e isquemia intestinal e de extremidade inferior induzidapor êmbolos. Pacientes com trauma freqüentemente sofrem de isquemiatemporária dos membros. Além disso, qualquer causa de perda de sangue maciça leva a uma reação I/R de corpo inteiro.

A fisiopatologia da lesão I/R é complexa, com pelo menos doisfatores principais contribuindo para o processo: ativação de complemento eestimulação de neutrófilo com a lesão mediada pelo radical oxigênio queacompanha. Na lesão por I/R, a ativação de complemento foi primeiro descrita durante o infarte do miocárdio a mais de 30 anos atrás e tem levado anumerosas investigações sobre a contribuição do sistema de complementopara a lesão de tecido por I/R (Hill, J. H., et al., J. Exp. Med. 133: 885-900,1971). Evidências acumulativas agora apontam para o complemento como ummediador central na lesão por I/R. A inibição de complemento foi bemsucedida na limitação da lesão em diversos modelos de animal de I/R. Nosestudos iniciais, o esgotamento de C3 foi obtido seguinte à infusão do fator deveneno de cobra, relatado ser benéfico durante a I/R em rim e coração(Maroko, P. R., et al., 1978, J. Clin Invest. 61: 661-670, 1978; Stein, S. H., etal., Miner Electrolyte Metab. 11: 256-61, 1985). Entretanto, a forma solúveldo receptor de complemento 1 (sCRl) foi o primeiro inibidor específico decomplemento utilizado para a prevenção da lesão miocárdica por I/R(Weisman, H. F., et al., Science 249: 146-51, 1990). O tratamento sCRldurante a I/R miocárdica atenua o infarte associado com a deposiçãodiminuída de complexos C5b-9 ao longo do endotélio coronário e infiltraçãoleucocitária diminuída depois da reperfusão.

Na I/R miocárdica experimental, o inibidor da Cl esterase (ClINH) administrado antes da reperfusão impede a deposição de Clq esignificantemente reduziu a área de necrose do músculo cardíaco (Buerke, M.,et al., 1995, Circulation 91: 393-402, 1995). Animais geneticamentedeficientes em C3 têm menos necrose tecidual local depois da isquemia demúsculo esqueletal ou intestinal (Weiser, M. R., et al., J. Exp. Med. 183:2343-48, 1996).

O complexo de ataque à membrana é o último veículo de lesãodirecionada a complemento e estudos em animais deficientes em C5 têmmostrado local diminuído e lesão remota em modelos de lesão I/R (Austen,W. G. Jr., et al., Surgery 126: 343-48, 1999). Um inibidor da ativação decomplemento, Crry solúvel (gene Y relacionado com receptor decomplemento), foi mostrado ser eficaz contra lesão quando dada tanto antesquanto depois do início da reperfusão intestinal de murino (Rehrig, S., et al.,J. Immunol. 167: 5921-27, 2001). Em um modelo de isquemia de músculoesqueletal, o uso de receptor de complemento solúvel 1 (sCRl) tambémreduziu a lesão muscular quando dado depois do início da reperfusão(Kyriakides, C., et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281: C244-30, 2001). Emum modelo porcino de I/R miocárdica, os animais tratados com anticorpomonoclonal ("MoAb") para a anafilatoxina C5a antes da reperfusãomostraram infarto atenuado (Amsterdam, Ε. A., et al., Am. J. Physiol. HeartCirc. Physiol. 268: H448-57, 1995). Ratos tratados com C5 MoAbdemonstraram tamanho de infarto atenuado, infiltração de neutrófilo eapoptose no miocárdio (Vakeva, A., et al., Circulation 97: 2259-67, 1998).Estes resultados experimentais salientam a importância da ativação decomplemento na patogênese da lesão I/R.

Está incerto que o caminho de complemento (clássico, lectinaou alternativo) esteja predominantemente envolvido na ativação decomplemento na lesão I/R. Weiser et al. demonstraram um papel importantedos caminhos da lectina e/ou clássico durante a I/R esqueletal mostrando quecamundongos inoperantes em C3 ou C4 foram protegidos contra a lesão I/Rcom base em uma redução significante na permeabilidade vascular (Weiser,M. R., et al., J. Exp. Med. 183: 2343-48, 1996). Ao contrário, experimentosde I/R renal com camundongos inoperantes em C4 não demonstraramnenhuma proteção de tecido significante, enquanto camundongos inoperantesem C3, C5 e C6 foram protegidos da lesão, sugerindo que a ativação decomplemento durante a lesão I/R renal ocorre por intermédio do caminhoalternativo (Zhou, W., et al., J. Clin. Invest. 105: 1363-71, 2000). Usandocamundongos deficientes em fator D, Stahl et al. recentemente apresentaramevidência para um papel importante do caminho alternativo na I/R intestinalem camundongos (Stahl, G., et al., Am. J. Pathol. 162: 449-55, 2003). Aocontrário, Williams et al. sugeriram um papel predominante do caminhoclássico para a iniciação da lesão I/R no intestino de camundongos mostrandotingimento de órgão reduzido para C3 e proteção da lesão em camundongosdeficientes em C4 e IgM (Ragl-/-) (Williams, J. P., et al., J. Appl. Physiol. 86:938-42, 1999).

O tratamento de ratos em um modelo I/R miocárdico comanticorpos monoclonais contra lectina de rato que liga manana (MBL)resultou em lesão de reperfusão pós isquêmica reduzida (Jordan, J. E., et al.,Circulation 104: 1413-18, 2001). Os anticorpos MBL também reduziram adeposição de complemento em células endoteliais in vitro depois do estresseoxidativo indicando um papel para o caminho da lectina na lesão I/Rmiocárdica (Collard, C. D., et al., Am. J. Pathol. 156: 1549-56, 2000).Também há evidência de que a lesão I/R em alguns órgãos pode ser mediadapor uma categoria específica de IgM, chamada de anticorpos naturais eativação do caminho clássico (Fleming, S. D., et al., J. Immunol. 169: 2126-33, 2002; Reid, R. R., et al., J. Immunol. 169: 5433-40, 2002).

Diversos inibidores da ativação de complemento foramdesenvolvidos como agentes terapêuticos potenciais para prevenir a morbideze mortalidade que resulta de complicações I/R miocárdicas. Dois destesinibidores, sCRl (TP10) e scFv anti-05 humanizados (Pexelizumab),completaram os testes clínicos de Fase II. Pexelizumab adicionalmentecompletou um teste clínico de Fase III. Embora TPlO fosse bem tolerado ebenéfico para os pacientes no início dos testes de Fase I/II, resultados de umteste da Fase II terminado em Fevereiro de 2002 falhou em atingir seu pontofinal primário. Entretanto, a análise de sub-grupo dos dados de pacientes dosexo masculino em uma população de alto risco passando por procedimentosde coração aberto demonstraram mortalidade e tamanho de infartosignificantemente diminuídos. A administração de um scFv anti-05humanizado diminuiu a mortalidade de paciente global associada com oinfarte agudo do miocárdio nos testes de Fase II COMA e COMPLY, masfalharam em atingir o ponto final primário (Mahaffey, K. W., et al.,Circulation 108: 1176-83, 2003). Resultados de um teste clínico de scFv anti-05 de Fase III recente (PRIMO-CABG) para melhorar as conseqüênciascirurgicamente induzidas seguinte ao desvio da artéria coronária foramrecentemente liberados. Embora o ponto final primário para este estudo nãofoi atingido, os estudos demonstraram uma redução global na morbidez emortalidade de paciente pós operativo.

Dr. Walsh e colegas demonstraram que camundongos quecarecem de MBL e por este motivo destituídos de ativação do caminho dalectina dependente de MBL mas com caminhos de complemento clássicostotalmente ativos, são protegidos da lesão de reperfusão cardíaca com apreservação resultante da função cardíaca (Walsh et al., J. Immunol. 175:541-46, 2005). Significantemente, camundongos que carecem de Clq, ocomponente de reconhecimento do caminho de complemento clássico, masque tem caminho de complemento MBL intacto, não são protegidos da lesão.Estes resultados indicam que o caminho da lectina tem um papel principal napatogênese de lesão isquêmica de reperfusão miocárdica.

A ativação de complemento é conhecida desempenhar umpapel importante na lesão de tecido associada com isquemia-reperfiisãogastrintestinais (I/R). Usando um modelo de murino de GI/R, um estudorecente por Hart e colegas relata que camundongos geneticamente deficientesem MBL são protegidos da lesão intestinal depois da I/R gastrintestinais (Hartet al., J. Immunol. 174: 6373-80, 2005). A adição de MBL recombinante aoscamundongos deficientes em MBL significantemente aumentou a lesãocomparada com camundongos deficientes em MBL não tratados depois da I/Rgastrintestinais. Ao contrário, camundongos que geneticamente carecem deClq, o componente de reconhecimento do caminho clássico, não sãoprotegidos da lesão de tecido depois da I/R gastrintestinais.

A I/R renais é uma causa importante de insuficiência renalaguda. O sistema de complemento parece estar essencialmente envolvido nalesão renal por I/R. Em um estudo recente, de Vries e colegas relatam que ocaminho da lectina é ativado no curso da lesão renal experimental assim comoclínica por I/R (de Vries et al., Am. J. Path. 165: 1677-88, 2004). Além disso,o caminho da lectina precede e co-localiza com a deposição de complementosC3, C6 e C9 no curso da I/R renal. Estes resultados indicam que o caminho dalectina da ativação de complemento esteja envolvido na lesão renal por I/R.

Um aspecto da invenção é assim direcionado ao tratamento delesões pela reperfusão isquêmica tratando-se um paciente que experimentareperfusão isquêmica com uma quantidade terapeuticamente eficaz de umagente inibidor de MASP-2 em um veículo farmacêutico. O agente inibidor deMASP-2 pode ser administrado ao paciente pela intra-arterial, intravenosa,intracraniana, intramuscular, subcutânea ou outra administração parenteral ede modo potencial oralmente para os inibidores não peptidérgicos e mais adequadamente pela administração intra-arterial ou intravenosa. Aadministração das composições do inibidor de MASP-2 da presente invençãoadequadamente começa imediatamente depois ou tão logo quanto possíveldepois de um evento de reperfusão isquêmica. Em casos onde a reperfusãoocorre em um ambiente controlado (por exemplo, seguinte a um reparo deaneurisma aórtico, transplante de órgão ou religação de membros ou dedosdecepados ou traumatizados), o agente inibidor de MASP-2 pode seradministrado antes e/ou durante e/ou depois da reperfusão. A administraçãopode ser repetida periodicamente como determinado por um médico paraefeito terapêutico ótimo.

ATEROSCLEROSE

Existe evidência considerável de que a ativação decomplemento esteja envolvida na aterogênese em seres humanos. Váriosestudos têm mostrado convincentemente que, embora nenhuma ativação decomplemento significante ocorra em artérias normais, o complemento éextensivamente ativado nas lesões ateroscleróticas e é especialmente forte emplacas vulneráveis e rompidas. Os componentes do caminho de complementoterminal são freqüentemente encontrados em ateromas humanos (Niculescu,F., et al., Mol. Immunol. 36: 949-55, 10-12, 1999; Rus, H. G., et al.,Immunol. Lett. 20: 305-310, 1989; Torzewski, M., et al., Arterioscler.Thromb. Vasc. Biol. 18: 369-378, 1998). A deposição de C3 e C4 em lesõesarteriais também foi demonstrada (Hansson, G. K., et al., Acta Pathol.Microbiol. Immunol. Scand. (A) 92: 429-35, 1984). O grau de deposição deC5b-9 foi descoberto correlacionar com a gravidade da lesão (Vlaicu, R., etal., Atherosclerosis 57: 163-77, 1985). A deposição de complemento iC3b,mas não de C5b-9, foi especialmente forte nas placas rompidas e vulneráveis,sugerindo que a ativação de complemento pode ser um fator em síndromescoronárias agudas (Taskinen S., et al., Biochem. J. 367: 403-12, 2002). Emateroma experimental em coelhos, a ativação de complemento foi descobertapreceder o desenvolvimento de lesões (Seifer, P. S., et al., Lab Invest. 60:747-54, 1989).

Nas lesões ateroscleróticas, o complemento é ativado porintermédio dos caminhos clássicos e alternativo, mas existe pouca evidência,até agora, da ativação de complemento por intermédio do caminho da lectina.Diversos componentes da parede arterial podem deflagrar a ativação decomplemento. O caminho clássico de complemento pode ser ativado pelaproteína reativa C (CRP) ligada ao LDL enzimaticamente degradado (Bhakdi,S., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19: 2348-54, 1999). Compatívelcom esta teoria está a descoberta de que as proteínas de complementoterminal co-localiza com CRP na íntima de lesões humanas iniciais(Torzewski, J., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18: 1386-92, 1998).Do mesmo modo, os anticorpos M ou IgG de imunoglobulina específicos paraLDL oxidado dentro de lesões podem ativar o caminho clássico (Witztum, J.L., Lancet 344: 793-95, 1994). Os lipídeos isolados de lesões ateroscleróticashumanas têm um alto teor de colesterol não esterificado e são capazes deativar o caminho alternativo (Seifert P. S., et al., J. Exp. Med. 172: 547-57,1990). Chlamydia pneumoniae, uma bactéria Gram negativa freqüentementeassociada com lesões ateroscleróticas, também podem ativar o caminhoalternativo de complemento (Campbell L. A., et al., J. Infect. Dis. 172: 585-8,1995). Outros ativadores de complemento potenciais presentes nas lesõesateroscleróticas incluem cristais de colesterol e fragmentos celulares, ambosdos quais podem ativar o caminho alternativo (Seifert, P. S., et al., Mol.Immunol. 24: 1303-08, 1987).

Os subprodutos da ativação de complemento são conhecidoster muitas propriedades biológicas que poderiam influenciar odesenvolvimento de lesões ateroscleróticas. A ativação de complemento localpode induzir a Iise celular e gerar pelo menos alguns dos fragmentos de célulaencontrados no núcleo necrótico de lesões avançadas (Niculescu, F. et al.,Mol. Immunol. 36: 949-55, 10-12, 1999). A ativação de complementosublítica pode ser um fator significante contribuindo com a proliferação decélula do músculo liso e para a infiltração de monócito na íntima arterialdurante a aterogênese (Torzewski J., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.18: 673-77, 1996). A ativação persistente de complemento pode ser nocivaporque pode deflagrar e sustentar a inflamação. Além da infiltração decomponentes de complemento do plasma sangüíneo, as células arteriaisexpressam RNA mensageiro para as proteínas de complemento e a expressãode vários componentes de complemento é supra-regulada nas lesõesateroscleróticas (Yasojima, K., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21:1214-19, 2001).

Um número limitado de estudos na influência de deficiênciasde proteína de complemento na aterogênese foi relatada. Os resultados emmodelos de animal experimentais foram conflitantes. No rato, a formação delesões equivalentes às ateroscleróticas induzidas pelas doses tóxicas devitamina D foi diminuída em animais esgotados por complemento (GeertingerP., et al., Acta. Pathol. Microbiol. Scand. (A) 78: 284-88, 1970). Além disso,em coelhos alimentados com colesterol, a inibição de complemento peladeficiência de C6 genética (Geertinger, P., et al., Artery 1: 177-84, 1977;Schmiedt, W., et al., Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 18: 1790-1795, 1998) oupelo agente anticomplemento K-76 COONa (Saito, E., et al., J. Drug Dev. 3:147-54, 1990) suprimiu o desenvolvimento de aterosclerose sem afetar osníveis de colesterol sérico. Ao contrário, um estudo recente relatou que adeficiência de C5 não reduz o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas emcamundongos deficientes em apolipoproteína E (ApoE) (Patel, S., et ai.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 286: 164-70, 2001). Entretanto, em umoutro estudo o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas em camundongosdeficientes em LDLR (ldlr-) com ou sem a deficiência de C3 foi avaliado(Buono, C., et ai., Circulation 105: 3025-31, 2002). Eles descobriram que amaturação de ateromas para lesões equivalentes à aterosclerótica depende emparte da presença de um sistema de complemento intacto.

Um aspecto da invenção é assim direcionada ao tratamento ouprevenção da aterosclerose tratando-se um paciente que sofre de ou propensoà aterosclerose com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agenteinibidor de MASP-2 em um veículo farmacêutico. O agente inibidor deMASP-2 pode ser administrado ao paciente pela administração intra-arterial,intravenosa, intratecal, intracraniana, intramuscular, subcutânea ou outraadministração parenteral e de modo potencial oralmente para os inibidoresnão peptidérgicos. A administração da composição de inibidor de MASP-2pode começar depois do diagnóstico da aterosclerose em um paciente ouprofilaticamente em um paciente em alto risco de desenvolver uma talcondição. A administração pode ser repetida periodicamente comodeterminado por um médico quanto ao efeito terapêutico ótimo.

OUTRAS DOENÇAS E CONDIÇÕES VASCULARES

O endotélio é largamente exposto ao sistema imune e éparticularmente vulnerável às proteínas de complemento que estão presentesno plasma. A lesão vascular mediada por complemento foi mostradacontribuir para a fisiopatologia de diversas doenças do sistema cardiovascular,incluindo a aterosclerose (Seifert, P. S., et al., Atherosclerosis 73: 91-104,1988), a lesão de isquemia-reperfusão (Weisman, H. F., Science 249: 146-51,1990) e infarte do miocárdio (Tada, T., et al., Virchows Arch 430: 327-332,1997). As evidências sugerem que a ativação de complemento possa seestender a outras condições vasculares.

Por exemplo, existe evidência de que a ativação decomplemento contribua para a patogênese de muitas formas de vasculite,incluindo: nefrite púrpura de Henoch-Schonlein, vasculite associada com olupus eritematoso sistêmico, vasculite associada com a artrite reumatóide(também chamada de artrite reumatóide maligna), vasculite de complexo imune e doença de Takayasu. A nefrite púrpura de Henoch-Schonlein é umaforma de vasculite sistêmica dos vasos pequenos com patogênese imune, emque a ativação de complemento através do caminho da lectina levando aolesão endotelial induzido por C5b-9 é reconhecida como um mecanismoimportante (Kawana, S., et al., Arch. Dermatol. Res. 282: 183-7, 1990; Endo,M., et al., Am J. Kidney Dis. 35: 401-7, 2000). O lupus eritematoso sistêmico(SLE) é um exemplo de doenças autoimunes sistêmicas que afetam órgãosmúltiplos, incluindo pele, rins, juntas, superfícies serosais e sistema nervosocentral e está freqüentemente associada com vasculite severa. Anticorpos anti-endoteliais IgG e complexos IgG capazes de ligação às células endoteliais estão presentes nos soros de pacientes com SLE ativo e depósitos decomplexos IgG imunes e complemento são encontrados nas paredes de vasossangüíneos de pacientes com vasculite de SLE (Cines, D. B., et al., J. Clin.Invest. 73: 611-25, 1984). A artrite reumatóide associada com vasculite,também chamada de artrite reumatóide maligna (Tomooka, K., Fukuoka Igaku Zasshi 80: 456-66, 1989), vasculite do complexo imune, vasculiteassociada com a hepatite A, vasculite leucocitoclástica e a arterite conhecidacomo doença de Takayasu, formam um outro grupo pleomórfico de doençashumanas em que a citotoxicidade dependente de complemento contra tipos decélula endotelial e outros desempenha um papel documentado (Tripathy, N.K., et al, J. Rheumatol. 28: 805-8, 2001).

Evidência também sugere que a ativação de complementodesempenha um papel na cardiomiopatia dilatada. A cardiomiopatia dilatada éuma síndrome caracterizada pela ampliação cardíaca e função sistólicaprejudicada do coração. Os dados recentes sugerem que a inflamaçãoadiantada no miocárdio pode contribuir para o desenvolvimento de doença.C5b-9, o complexo de ataque à membrana terminal de complemento, éconhecido por se correlacionar significantemente com a deposição deimunoglobulina e expressão miocárdica de TNF-alfa. Em biópsiasmiocárdicas de 28 pacientes com cardiomiopatia dilatada, o acúmulomiocárdico de C5b-9 foi demonstrado, sugerindo que a ativação decomplemento mediada por imunoglobulina crônica no miocárdio podecontribuir em parte para a progressão da cardiomiopatia dilatada (Zwaka, T.P., et al., Am. J. Pathol. 161(2): 449-57, 2002).

Um aspecto da invenção é assim direcionado ao tratamento deuma condição vascular, incluindo condições cardiovasculares, condiçõescerebrovasculares, condições vascular periféricas (por exemplo, músculoesqueletal), condições renovasculares e condições vascularesmesentéricas/entéricas, pela administração de uma composição quecompreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidorde MASP-2 em um veículo farmacêutico. Condições para as quais acredita-seque a invenção seja adaptada incluem, sem limitação: vasculite, incluindonefrite púrpura de Henoch-Schonlein, vasculite associada com lupuseritematoso sistêmico, vasculite associada com artrite reumatóide (tambémchamada de artrite reumatóide maligna), vasculite de complexo imune edoença de Takayasu; cardiomiopatia dilatada; angiopatia diabética; doença deKawasaki (arterite); e êmbolo de gás venenoso (VGE). Também, dado que aativação de complemento ocorre como um resultado de trauma luminal e aresposta inflamatória de corpo estranho associada com procedimentos deintervenção cardiovascular, acredita-se que as composições de inibidor deMASP-2 da presente invenção também possam ser usadas na inibição darestenose seguinte à colocação de sonda, aterectomia rotacional e/ouangioplastia coronária transluminal percutânea (PTCA), sozinhas ou emcombinação com outros agentes inibitórios de restenose tais como sãodivulgadas na Patente U.S. N2 6.492.332 concedida a Demopulos.

O agente inibidor de MASP-2 podem ser administrado aopaciente pela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular,intratecal, intracraniana, subcutânea ou outra administração parenteral e demodo potencial oralmente para os inibidores não peptidérgicos. Aadministração pode ser repetida periodicamente como determinado por ummédico quanto ao efeito terapêutico ótimo. Para a inibição de restenose, acomposição de inibidor de MASP-2 pode ser administrada antes e/ou durantee/ou depois da colocação de uma sonda ou do procedimento de aterectomia ouangioplastia. Alternativamente, a composição de inibidor de MASP-2 podeser revestida sobre ou incorporada na sonda.

DISTÚRBIOS GASTRINTESTINAIS

A colite ulcerativa e a doença de Crohn são distúrbiosinflamatórios crônicos do intestino que caem sob a bandeira de doença dointestino inflamatório (IBD). A IBD é caracterizada pela inflamação queocorre espontaneamente, crônica, recorrente de origem desconhecida. Adespeito da pesquisa extensiva na doença tanto em seres humanos quanto emanimais experimentais, os mecanismos precisos de patologia permanecempara serem elucidados. Entretanto, acredita-se que o sistema de complementoseja ativado em pacientes com IBD e é considerado desempenhar um papel napatogênese da doença (Kolios, G., et al., Hepato-Gastroenterology 45: 1601-9, 1998; Elmgreen, J., Dan. Med. Buli. 33: 222, 1986).

Foi mostrado que C3b e outros produtos de complementoativados são encontrados na face luminal das células epiteliais de superfície,assim como na mucosa muscular e vasos sangüíneos submucósicos empacientes IBD (Halstensen, T. S., et al., Immunol. Res. 10: 485-92, 1991;Halstensen, T. S., et al., Gastroenterology 98: 1264, 1990). Além disso, ainfiltração de célula polimorfonuclear, usualmente um resultado da geraçãoC5a, caracteristicamente é observada no intestino inflamatório (Kohl, J., Mol.Immunol. 38: 175, 2001). O inibidor de complemento multifuncional K-76,também foi relatado produzir melhora sintomática da colite ulcerativa em umestudo clínico pequeno (Kitano, A., et al., Dis. Colon Rectum 35: 560, 1992),assim como em um modelo de colite induzida por carragenano em coelhos(Kitano, A., et al., Clin. Exp. Immunol. 94: 348-53, 1993).

Um novo antagonista do receptor C5a humano foi mostradoproteger contra patologia de doença em um modelo de rato de EBD(Woodruff, T. M., et al., J. Immunol. 171: 5514-20, 2003). Camundongos queforam geneticamente deficientes no fator acelerador de declínio (DAF), umaproteína regulatória de complemento de membrana, foram usados em ummodelo de IBD para demonstrar que a deficiência em DAF resultou em lesãode tecido marcantemente maior e aumentou a produção de citocina pró-inflamatória (Lin, F., et al., J. Immunol. 172: 3836-41, 2004). Portanto, ocontrole de complemento é importante na regulagem da homeostase intestinale pode ser um mecanismo patogênico principal envolvido nodesenvolvimento de IBD.

A presente invenção fornece assim métodos para inibir aativação de complemento dependente de MASP-2 em pacientes que sofrem dedistúrbios gastrintestinais inflamatórios, incluindo mas não limitados àpancreatite, diverticulite e distúrbios intestinais incluindo doença de Crohn,colite ulcerativa e síndrome do intestino irritável, pela administração de umacomposição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de umagente inibidor de MASP-2 em um veículo farmacêutico a um paciente quesofre de um tal distúrbio. O agente inibidor de MASP-2 pode ser administradoao paciente pela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular,subcutânea, intratecal, intracraniana ou outra administração parenteral e demodo potencial oralmente para os inibidores não peptidérgicos. Aadministração pode ser adequadamente repetida periodicamente comodeterminado por um médico para controlar sintomas dos distúrbios que sãotratados.

CONDIÇÕES PULMONARES

O complemento foi implicado na patogênese de muitosdistúrbios inflamatórios pulmonares, incluindo: a síndrome da angústiarespiratória aguda (ARDS) (Ware, I., et al., N. Engl. J. Med. 342: 1334-49,2000); lesão pulmonar aguda relacionada com transfusão (TRALI) (Seeger,W., et al., Blood 76: 1438-44, 1990); lesão pulmonar aguda deisquemia/reperfusão (Xiao, F., et al., J. Appl. Physiol. 82: 1459-65, 1997);doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) (Marc, M. M., et al., Am. J.Respir. Cell Mol. Biol. (Epub à frente da impressão), 23 de Março de 2004);asma (Krug, N., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164: 1841-43, 2001);granulomatose de Wegener (Kalluri, R., et al., J. Am. Soe. Nephrol. 8: 1795-800, 1997); e doença de membrana de base antiglomerular (doença deGoodpasture) (Kondo, C., et al., Clin. Exp. Immunol. 124: 323-9, 2001).

E agora bem aceito que grande parte da fisiopatologia da

ARDS envolve uma cascata inflamatória desregulada que começa como umaresposta normal a uma infecção ou outro evento incitante, mas por fim causaautolesão significante para o hospedeiro (Stanley, T. P., EmergingTherapeutic Targets 2: 1-16, 1998). Pacientes com ARDS quaseuniversalmente mostram evidência de ativação extensiva de complemento(níveis plasmáticos aumentados de componentes de complemento C3a e C5a)e o grau da ativação de complemento foi correlacionado com odesenvolvimento e conseqüência de ARDS (Hammerschmidt, D. F., et al.,Lancet 1: 947-49, 1980; Solomkin, J. S., et al., J. Surgery 97: 668-78, 1985).Vários dados experimentais e clínicos sugerem um papel paraa ativação de complemento na fisiopatologia de ARDS. Em modelos deanimal, a ativação sistêmica de complemento leva à lesão pulmonar agudacom histopatologia similar àquela observada na ARDS humana (Till, G. O., et al., Am. J. Pathol. 129: 44-53, 1987; Ward, Ρ. A., Am. J. Pathol. 149: 1081-86, 1996). Inibir a cascata de complemento pelo esgotamento decomplemento geral ou pela inibição específica de C5a confere proteção emmodelos de animal de lesão pulmonar aguda (Mulligan, M. S., et al., J. Clin.Invest. 98: 503-512, 1996). Em modelos de rato, sCRl tem um efeito protetor na lesão pulmonar mediada por complemento e neutrófilo (Mulligan, M. S.,Yeh, et al., J. Immunol. 148: 1479-85, 1992). Além disso, virtualmente todosos componentes de complemento podem ser produzidos localmente nopulmão pelas células alveolares tipo II, macrófagos alveolares e fibroblastospulmonares (Hetland, G., et al., Scand. J. Immunol. 24: 603-8, 1986;Rothman, Β. I., et al., J. Immunol. 145: 592-98, 1990). Assim a cascata decomplemento é bem posicionada para contribuir significantemente para ainflamação pulmonar e, conseqüentemente, para a lesão pulmonar na ARDS.

A asma é, em essência, uma doença inflamatória. Os traçoscardinais da asma alérgica incluem hiperresponsividade das vias aéreas a uma variedade de estímulos específicos e não específicos, produção de muco nasvias aéreas excessiva, eosinofilia pulmonar e concentração elevada de IgEsérica. Embora a asma seja multifatorial na origem, é no geral aceito que amesma surge como um resultado das respostas imunológicas inadequadas aosantígenos ambientais comuns em indivíduos geneticamente suscetíveis. O fato de que o sistema de complemento é altamente ativado no pulmão asmáticohumano está bem documentado (Humbles, Α. A., et al., Nature 406: 998-01,2002; van de Graf, Ε. A., et al., J. Immunol. Methods 147: 241-50, 1992).Além disso, dados recentes de modelos de animal e seres humanos fornecemevidência de que a ativação de complemento é um mecanismo importantecontribuindo para a patogênese da doença (Karp, C. L., et al., Nat. Immunol.1: 221-26, 2000; Bautsch, W., et al., J. Immunol. 165: 5401-5, 2000; Drouin,S. M., et al., J. Immunol. 169: 5926-33, 2002; Walters, D. M., et al., Am. J.Respir. Cell Mol. Biol. 27: 413-18, 2002). Um papel para o caminho dalectina na asma é sustentado pelos estudos usando um modelo de murino deasma fungica crônica. Camundongos com uma deficiência genética na lectinaque liga manana desenvolve uma hiperresponsividade das vias aéreasalteradas comparada com animais normais neste modelo de asma (Hogaboam,C. M., et al., J. Leukoc. Biol. 75: 805-14, 2004).

O complemento pode ser ativado na asma por intermédio dediversos caminhos, incluindo: (a) ativação através do caminho clássico comoum resultado da formação do complexo alérgeno-anticorpo; (b) ativação docaminho alternativo em superfícies alergênicas; (c) ativação do caminho dalectina através do entrosamento de estruturas de carboidrato nos alérgenos; e(d) clivagem de C3 e C5 pelas proteases liberadas de células inflamatórias.Embora muito permaneça para ser aprendido a cerca do papel complexodesempenhado pelo complemento na asma, a identificação da ativação decaminhos de complemento envolvidos no desenvolvimento da asma alérgicapode fornecer um foco para o desenvolvimento de novas estratégiasterapêuticas para esta doença crescentemente importante.

Vários estudos usando modelos de animal têm demonstradoum papel crítico para C3 e o seu produto de clivagem, C3a, nodesenvolvimento do fenótipo alérgico. Drouin e colegas usaram camundongosdeficientes em C3 no modelo de asma da ovalbumina (OVA)/Aspergillusfumigatus (Drouin et al., J. Immunol. 167: 4141-45, 2001). Eles descobriramque, quando inoculados com alérgeno, camundongos deficientes em C3exibem AHR surpreendentemente diminuída e eosinofilia pulmonarcomparada com camundongos de controle do tipo selvagem emparelhados.

Além disso, estes camundongos deficientes em C3 tiveram númerosdramaticamente reduzidos de células produtoras de IL-4 e respostas IgE eIgGl específicas de Ag atenuadas. Taube e colegas obtiveram resultadossimilares no modelo OVA de asma pelo bloqueio da ativação decomplemento ao nível de C3 e C4 usando uma forma recombinante solúvel doreceptor de complemento de camundongo Crry (Taube et al., Am. J. Respir.Crit. Care Med. 168: 1333-41, 2003). Humbles e colegas deletaram a C3aRem camundongos para examinar o papel de C3a na função eosinofílica(Humbles et al., Nature 406: 998-1001, 2000). Usando o modelo OVA deasma, eles observaram a proteção quase completa do desenvolvimento deAHR para metacolina aerossolizada. Drouin e colegas (2002) usaramcamundongos deficientes em C3aR no modelo de asma de OVAJA. fumigatuse demonstraram uma resposta alérgica atenuada muito similar aos animaisdeficientes em C3 com AHR diminuída, recrutamento eosinofílico, produçãode citocina TH2 e secreção de muco no pulmão, assim como respostas IgE eIgG1 específicas de Ag reduzidas (Drouin et al., J. Immunol. 169: 5926-33,2002). Bautsch e colegas realizaram investigações usando uma cepa deporquinhos da índia que têm uma deleção natural de C3aR (Bautsch et al., J.Immunol. 165: 5401-05, 2000). Usando um modelo OVA de asma alérgica,eles observaram proteção significante da broncoconstrição das vias aéreasseguinte à inoculação de antígeno.

Vários estudos recentes usando modelos de animaldemonstraram um papel crítico para C5 e o seu produto de clivagem C5a, nodesenvolvimento do fenótipo alérgico. Abe e colegas relataram evidência deque liga a ativação de C5aR com a inflamação das vias aéreas, produção decitocina e responsividade das vias aéreas (Abe et al., J. Immunol. 167: 4651-60, 2001). Em seus estudos, a inibição da ativação de complemento pelo CRlsolúvel, futhan (um inibidor da ativação de complemento) ou antagonista doC5a hexapeptídico sintético bloquearam a resposta inflamatória e aresponsividade das vias aéreas à metacolina. Em estudos usando um anticorpomonoclonal anti-C5 bloqueador Peng e colegas descobriram que a ativação deC5 contribuiu substancialmente tanto para a inflamação das vias aéreasquanto AHR no modelo OVA de asma (Peng et al., J. Clin. Invest. 115: 1590-1600, 2005). Também, Baelder e colegas relataram que o bloqueio do C5aRsubstancialmente reduziu AHR no modelo A. fumigatus de asma (Baelder etal., J. Immunol. 174: 783-89, 2005). Além disso, o bloqueio tanto do C3aRquanto do C5aR significantemente reduziu a inflamação das vias aéreas comodemonstrado pelos números reduzidos de neutrófilos e eosinófilos em BAL.

Embora os estudos anteriormente listados salientassem aimportância dos fatores de complemento C3 e C5 e seus produtos de clivagemna patogênese da asma alérgica experimental, estes estudos não fornecemnenhuma informação a cerca da contribuição de cada um dos três caminhos deativação de complemento visto que C3 e C5 são comuns a todos os trêscaminhos de ativação. Entretanto, um estudo recente por Hogaboam e colegasindica que o caminho da lectina pode ter um papel principal na patogênese daasma (Hogaboam et al., J. Leukocytye Biol. 75: 805-814, 2004). Estesestudos usado camundongos geneticamente deficientes em lectina que ligamanana-A (MBL-A), uma proteína de ligação de carboidrato que funcionacomo o componente de reconhecimento para a ativação do caminho decomplemento da lectina. em um modelo de asma fungica crônica,camundongos sensibilizados ao A. fumigatus MBL-A(+/+) e MBL-A(-/-)foram examinados nos dias 4 e 28 depois de uma inoculação i.t. com conídiosde A. fumigatus. A AHR em camundongos MBL-A(-/-) sensibilizados foisignificantemente atenuada em ambas as vezes depois da inoculação comconídios comparados com o grupo MBL-A (+/+) sensibilizado. Elesdescobriram que os níveis de citocina TH2 pulmonares (IL-4, IL-5 e IL-13)foram significantemente mais baixos em camundongos MBL-A(-/-)sensibilizados com A. fumigatus comparados com o grupo do tipo selvagemno dia 4 depois dos conídios. Seus resultados indicam que MBL-A e ocaminho da lectina têm um papel principal no desenvolvimento e manutençãoda AHR durante a asma füngica crônica.

Os resultados de um estudo clínico recente em que aassociação entre um polimorfismo de MBL específico e o desenvolvimento deasma fornece evidência adicional de que o caminho da lectina possadesempenhar um papel patológico importante nesta doença (Kaur et al., Clin.Experimental Immunol. 143: 414-19, 2006). As concentrações plasmáticas deMBL variam amplamente entre indivíduos e isto é primariamente atribuívelaos polimorfismos genéticos dentro do gene MBL. Eles descobriram que osindivíduos que portam pelo menos uma cópia de um polimorfismo de MBLespecífico que supra regula a expressão de MBL duas a quatro vezes têm umrisco aumentado de quase cinco vezes de desenvolver asma brônquica. Houvetambém uma severidade aumentada de marcadores de doença em pacientescom asma brônquica que carrega este polimorfismo MBL.

Um aspecto da invenção fornece assim um método para tratardistúrbios pulmonares, pela administração de uma composição quecompreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidorde MASP-2 em um veículo farmacêutico a um paciente que sofre dedistúrbios pulmonares, incluindo sem limitação, a síndrome da angústiarespiratória aguda, lesão pulmonar aguda relacionada com transfusão, lesãopulmonar aguda de isquemia/reperfusão, doença pulmonar obstrutiva crônica,asma, granulomatose de Wegener, doença de membrana de baseantiglomerular (doença de Goodpasture), síndrome da aspiração de mecônio,síndrome da bronquiolite obliterativa, fibrose pulmonar idiopática, lesãopulmonar aguda secundária a queimadura, edema pulmonar não cardiogênico,depressão respiratória relacionada com a transfusão e enfisema. O agenteinibidor de MASP-2 podem ser administrado ao paciente sistemicamente, talcomo pela intra-arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, nasal,subcutânea ou outra administração parenteral ou potencialmente pelaadministração oral para agentes não peptidérgicos. A composição do agenteinibidor de MASP-2 pode ser combinada com um ou mais agentesterapêuticos adicionais, incluindo agentes anti-inflamatórios, anti-histaminas,corticosteróides ou agentes antimicrobiano. A administração pode ser repetidacomo determinado por um médico até que a condição tenha sido resolvida.

CIRCULAÇÃO EXTRACORPORAL

Existem numerosos procedimentos médicos durante os quais osangue é desviado de um sistema circulatório do paciente (sistemas decirculação extracorporal ou ECC). Tais procedimentos incluem hemodiálise,plasmaferese, leucoferese, oxigenador de membrana extracorporal (ECMO),precipitação de LDL na oxigenação de membrana extracorporal induzida porheparina (HELP) e desvio cardiopulmonar (CPB). Estes procedimentosexpõem o sangue ou produtos do sangue às superfícies estranhas que podemalterar a função celular normal e hemostase. Em estudos pioneiros Craddocket al. identificaram a ativação de complemento como a causa provável degranulocitopenia durante a hemodiálise (Craddock, P. R, et al., N. Engl. J.Med. 296: 769-74, 1977). Os resultados de numerosos estudos entre 1977 e opresente momento indicam que muitos dos eventos adversos experimentadospelos pacientes que passam pela hemodiálise ou CPB são causados pelaativação do sistema de complemento (Chenoweth, D. E., Ann. N.Y. Acad.Sei. 516: 306-313, 1987; Hugli, T. E., Complement 3: 111-127, 1986;Cheung, A. K., J. Am. Soe. Nephrol. 1: 150-161, 1990; Johnson, R. J.,Nephrol. Dial. Transplant 9: 36-45 1994). Por exemplo, o potencial ativadorde complemento foi mostrado ser um critério importante na determinação dabiocompatibilidade de hemodialisadores com respeito à recuperação dafunção renal, susceptibilidade à infecção, disfunção pulmonar, morbidez etaxa de sobrevivência de pacientes com insuficiência renal (Hakim, R. M.,Kidney Int. 44: 484-4946, 1993).

Tem sido amplamente acreditado que a ativação decomplemento pelas membranas de hemodiálise ocorre pelos mecanismos decaminho alternativo devido à geração de C4a fraca (Kirklin, J. K., et al, J.Thorac. Cardiovasc. Surg. 86: 845-57, 1983; Vallhonrat, H., et al., ASAIO J.45: 113-4, 1999), mas trabalho recente sugere que o caminho clássico tambémpode estar envolvido (Wachtfogel, Y. T., et al., Blood 73: 468-471, 1989).

Entretanto, existe ainda entendimento inadequado dos fatores que iniciam econtrolam a ativação de complemento nas superfícies artificiais incluindopolímeros biomédicos. Por exemplo, uma membrana Cuprophan usada emhemodiálise foi classificada como um ativador de complemento muitopotente. Embora não se deseje estar limitado pela teoria, os inventoresteorizam que isto talvez possa ser explicado em parte pela sua natureza depolissacarídeo. A ativação do sistema de complemento dependente de MASP-2 identificado nesta patente fornece um mecanismo por meio do qual aativação do caminho da lectina deflagra a ativação do caminho alternativo.

Pacientes que passam por ECC durante CPB sofrem de umareação inflamatória sistêmica, que é em parte causada pela exposição dosangue às superfícies artificiais do circuito extracorporal, mas também pelosfatores independentes da superfície como trauma cirúrgico e lesão deisquemia-reperfusão (Butler, J., et al, Ann. Thorac. Surg. 55: 552-9, 1993;Edmunds, L. H., Ann. Thorac. Surg. 66 (Supl): S12-6, 1998; Asimakopoulos,G., Perfusion 14: 269-77, 1999). A reação inflamatória deflagrada por CPBpode resultar em complicações pós cirúrgicas, no geral chamadas de"síndrome da pós perfusão". Entre estes eventos estão os défícits cognitivos(Fitch, J., et al, Circulation 100(25): 2499-2506, 1999), insuficiênciarespiratória, distúrbios de hemorragia, disfunção renal e, nos casos maisgraves, insuficiência de órgão múltiplo (Wan, S., et al., Chest 112: 676-692,1997). Cirurgia de desvio coronário com CPB leva à ativação profunda decomplemento, ao contrário da cirurgia sem CPB mas com um graucomparável de trauma cirúrgico (E. Fosse, 1987). Portanto, a causa suspeitaprimária destes problemas relacionados com CPB é a ativação inadequada decomplemento durante o procedimento de desvio (Chenoweth, K., et al., N.Engl. J. Med. 304: 497-503, 1981; P. Haslam, et al., Anaesthesia 25: 22-26,1980; J. K. Kirklin, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 86: 845-857, 1983;Moore, F. D., et al., Ann. Surg 208: 95-103, 1988; J. Steinberg, et al., J.Thorac. Cardiovasc. Surg 106: 1901-1918, 1993). Em circuitos CPB, ocaminho de complemento alternativo desempenha um papel predominante naativação de complemento, que resulta da interação do sangue com assuperfícies artificiais dos circuitos CPB (Kirklin, J. K., et al., J. Thorac.Cardiovasc. Surg., 86: 845-57, 1983; Kirklin, J. K., et al., Ann. Thorac. Surg.41: 193-199, 1986; Vallhonrat H., et al., ASAIO J. 45: 113-4, 1999).Entretanto, também há evidência de que o caminho de complemento clássicoé ativado durante a CPB (Wachtfogel, Y. T., et al., Blood 73: 468-471, 1989).

As substâncias inflamatórias primárias são geradas depois daativação do sistema de complemento, incluindo anafilatoxinas C3a e C5a, aopsonina C3b e o complexo de ataque à membrana C5b-9. C3a e C5a sãoestimuladores potentes de neutrófilos, monócitos e plaquetas (Haeffner-Cavaillon, N., et al., J. Immunol., 139: 794-9, 1987; Fletcher, M. P., et al.,Am. J. Physiol. 265: H1750-61, 1993; Rinder, C. S., et al., J. Clin. Invest. 96:1564-72, 1995; Rinder, C. S., et al., Circulation 100: 553-8, 1999). A ativaçãodestas células resulta na liberação de citocinas pró inflamatórias (IL-1, IL-6,IL-8, TNF alfa), radicais livres oxidativos e proteases (Schindler, R., et al.,Blood 76: 1631-8, 1990; Cruickshank, A. M., et al., Clin Sei. (Lund) 79: 161-5, 1990; Kawamura, T., et al., Can. J. Anaesth. 40: 1016-21, 1993; Steinberg,J. B., et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 106: 1008-1, 1993; Finn, A., et al., J.Thorac. Cardiovasc. Surg. 105: 234-41, 1993; Ashraf, S. S., et al., J.Cardiothorac. Vasc. Anesth. 11: 718-22, 1997). C5a foi mostrado superregular as moléculas de adesão CDllb e CD18 de Mac-I em célulaspolimorfonucleares (PMNs) e induzir a desgranulação de PMNs para liberarenzimas pró inflamatórias. Rinder, C., et al., Cardiovasc Pharmacol. 27(Supl1): 56-12, 1996; Evangelista, V., et al., Blood 93: 876-85, 1999; Kinkade, J.M., Jr., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 114: 296-303, 1983; Lamb,N. J., et al., Crit. Care Med. 27: 1738-44, 1999; Fujie, K., et al., Eur. J.

Pharmacol. 374: 117-25, 1999. C5b-9 induz a expressão da molécula deadesão de P-seletina (CD62P) on plaquetas (Rinder, C. S., et al., J. Thorac.Cardiovasc. Surg. 118: 460-6, 1999), ao passo que tanto C5a quanto C5b-9induzem a expressão de superfície de P-selectina nas células endoteliais(Foreman, K. E., et al., J. Clin. Invest. 94: 1147-55, 1994). Estas moléculas deadesão estão envolvidas na interação entre leucócitos, plaquetas e célulasendoteliais. A expressão de moléculas de adesão em células endoteliaisativadas é responsável pelo seqüestro de leucócitos ativados, que depoismedeiam a inflamação e lesão de tecido (Evangelista, V., Blood 1999;Foreman, K. E., J. Clin. Invest. 1994; Lentsch, A. B., et al., J. Pathol. 190: 343-8, 2000). São as ações destes produtos de ativação de complemento nosneutrófilos, monócitos, plaquetas e outras células circulatórias queprovavelmente levam aos vários problemas que surgem depois da CPB.

Diversos inibidores de complemento estão sendo estudadospara aplicações potenciais na CPB. Estes incluem um receptor recombinante de complemento solúvel 1 (sCRl) (Chai, P. J., et al., Circulation 101: 541-6,2000), um anticorpo de cadeia única humanizada anti-C5 (h5Gl.l-scFv ouPexelizumab) (Fitch, J. C. K., et al., Circulation 100: 3499-506, 1999), umhíbrido de fusão recombinante (CAB-2) de proteína do co-fator de membranahumano e fator de aceleração do declínio humano (Rinder, C. S., et al., Circulation 100: 553-8, 1999), um resíduo 13 do peptídeo cíclico que liga C3(Compstatin) (Nilsson, B., et al., Blood 92: 1661-7, 1998) e um anti-fator DMoAb (Fung, M., et al., J. Thoracic Cardiovasc. Surg. 122: 113-22, 2001).SCRl e CAB-2 inibem os caminhos clássico e de complemento alternativosnas etapas de ativação C3 e C5. A Compstatin inibe ambos os caminhos decomplemento na etapa de ativação C3, ao passo que h5Gl.l-scFv o fazapenas na etapa de ativação C5. O Anti-fator D MoAb inibe o caminhoalternativo nas etapas de ativação C3 e C5. Entretanto, nenhum destesinibidores de complemento pode inibir especificamente a ativação do sistemade complemento dependente de MASP-2 identificado nesta patente.

Resultados de um estudo clínico de fase 3 prospectivo grandepara investigar a eficácia e segurança do anticorpo anti-C5 de cadeia únicahumanizado (h5Gl.l-scFv, pexelizumab) na redução da MI perioperativa emortalidade na cirurgia do enxerto de desvio da artéria coronária (CABG) foirelatado (Verrier, E. D., et ai., JAMA 291: 2319-27, 2004). Comparado complacebo, pexelizumab não foi associado com uma redução significante norisco do ponto final de compósito de morte ou MI em 2746 pacientes quepassaram pela cirurgia de CABG. Entretanto, houve uma reduçãoestatisticamente significante 30 dias depois do procedimento entre todos os3099 pacientes que passam pela cirurgia de CABG com ou sem cirurgia deválvula. Visto que pexelizumab inibe a etapa de ativação C5, o mesmo inibe ageração de C5a e sC5b-9 mas não tem nenhum efeito sobre a geração dasoutras duas substâncias inflamatórias de complemento potentes, C3a e C3bopsônico, que também são conhecidos por contribuir para a reaçãoinflamatória deflagrada pelo CPB.

Um aspecto da invenção é assim direcionado à prevenção outratamento da reação inflamatória deflagrada pela exposição extracorporaltratando-se um paciente que passa por um procedimento de circulaçãoextracorporal com uma composição que compreenda uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um veículofarmacêutico, incluindo pacientes que passam por hemodiálise, plasmaferese,leucoferese, oxigenação de membrana extracorporal (ECMO), precipitação deLDL na oxigenação de membrana extracorporal induzida por heparina(HELP) e desvio cardiopulmonar (CPB). Acredita-se que o tratamento comagente inibidor de MASP-2 de acordo com os métodos da presente invençãoseja útil na redução ou prevenção da disfunção cognitiva que algumas vezesresulta de procedimentos CPB. O agente inibidor de MASP-2 pode seradministrado ao paciente pré procedimento e/ou intraprocedimento e/ou pósprocedimento, tal como pela administração intra-arterial, intravenosa,intramuscular, subcutânea ou outra administração parenteral.Alternativamente, o agente inibidor de MASP-2 pode ser introduzido nacorrente sangüínea do paciente durante a circulação extracorporal, tal comoinjetando-se o agente inibidor de MASP-2 na tubulação ou uma membranaatravés do qual ou antes que o sangue seja circulado ou contatando-se osangue com uma superfície que tenha sido revestida com o agente inibidor deMASP-2 tal como uma parede interna da tubulação, membrana ou outrasuperfície tal como um dispositivo CPB.

ARTRITES INFLAM ATÓRIAS E NÃO INFLAMATÓRIAS E OUTRASDOENÇAS MÚSCULO ESOUELETAIS

A ativação do sistema de complemento foi implicada napatogênese de uma ampla variedade de doenças reumatológicas; incluindo aartrite reumatóide (Linton, S. M., et al., Molec. Immunol. 36: 905-14, 1999),artrite reumatóide juvenil (Mollnes, T. E., et al., Arthritis Rheum. 29: 1359-64, 1986), osteoartrite (Kemp, Ρ. A., et al., J. Clin. Lab. Immunol. 37: 147-62,1992), lupus eritematoso sistêmico (SLE) (Molina, H., Current Opinion inRheumatol. 14: 492-497, 2002), síndrome de Behcefs (Rumfeld, W. R, etal., Br. J. Rheumatol. 25: 266-70, 1986) e síndrome de Sjogren (Sanders, M.E., etal., J. Immunol. 138: 2095-9, 1987).

Existe evidência constrangedora de que a ativação decomplemento deflagrada pelo complexo imune seja um mecanismopatológico principal que contribui para o lesão de tecido na artrite reumatóide(RA). Existem numerosas publicações que documentam que os produtos deativação de complemento são elevados no plasma de pacientes RA (Morgan,Β. P., et al., Clin. Exp. Immunol, 73: 473-478, 1988; Auda, G., et al.,Rheumatol. Int. 10: 185-189, 1990; Rumfeld, W.R., et al., Br. J. Rheumatol.25: 266-270, 1986). Os produtos de ativação de complemento tais como C3a,C5a e sC5b-9 também foram encontrados dentro das juntas reumáticas inflamadas e correlações positivas foram estabelecidas entre o grau daativação de complemento e a severidade da RA (Makinde, V. A., et al., Ann.Rheum. Dis. 48: 302-306, 1989; Brodeur, J. P., et al., Arthritis Rheumatism34: 1531-1537, 1991). Tanto na artrite reumatóide adulta quanto na juvenil,níveis séricos e de fluido sinovial elevados de produto de ativação decomplemento de caminho alternativo Bb comparado com C4d (um marcadorpara a ativação do caminho clássico), indicam que a ativação de complementoé mediada predominantemente pelo caminho alternativo (El-Ghobarey, A. F.et al., J. Rheumatology 7: 453-460, 1980; Agarwal, A., et al., Rheumatology39: 189-192, 2000). Os produtos da ativação de complemento podem diretamente danificar tecido (por intermédio de C5b-9) ou indiretamentemediar a inflamação através do recrutamento de células inflamatórias pelasanafilatoxinas C3a e C5a.

Os modelos de animal de artrite experimental foramamplamente usados para investigar o papel de complemento na patogênese daRA. O esgotamento de complemento pelo fator de veneno de cobra emmodelos de animal de RA impede o início da artrite (Morgan, K., et al.,Arthritis Rheumat. 24: 1356-1362, 1981; Van Lent, P. L., et al., Am. J.Pathol. 140: 1451-1461, 1992). A injeção intra-articular da forma solúvel dereceptor de complemento 1 (sCRl), um inibidor de complemento, suprimiu a inflamação em um modelo de rato de RA (Goodfellow, R. M., et al., Clin.Exp. Immunol. 110: 45-52, 1997). Além disso, sCRl inibe o desenvolvimentoe progressão da artrite de rato induzida pelo colágeno (Goodfellow, R. M., etal., Clin Exp. Immunol. 119: 210-216, 2000). CRl solúvel inibe os caminhosclássico e de complemento alternativos nas etapas de ativação de C3 e C5tanto no caminho alternativo quanto no caminho clássico, inibindo destemodo a geração de C3a, C5a e sC5b-9.

Nos idos de 1970 foi reconhecido que a imunização deroedores com colágeno heteróloga do tipo II (CII; o componente de colágeno principal da cartilagem de junta humana) levou ao desenvolvimento de umaartrite autoimune (artrite induzida por colágeno ou CIA) com similaridadessignificantes com a RA humana (Courtenay, J. S., et al., Nature 283: 666-68(1980), Banda et al., J. of Immunol. 171: 2109-2115 (2003)). A respostaautoimune em animais suscetíveis envolve uma combinação complexa de fatores incluindo as moléculas do complexo de histocompatibilidade maior(MHC), citocinas e respostas de célula BeT específicas de CII (revisada porMyers, L. K., et al., Life Sciences 61: 1861-78, 1997). A observação de quequase 40% das cepas de camundongo congênito têm uma deficiênciacompleta em componente de complemento C5 (Cinader, B., et ai., J. Exp.Med. 120: 897-902, 1964) forneceu uma oportunidade indireta para explorar opapel de complemento neste modelo artrítico pela comparação de CIA entrecepas deficientes e suficientes em C5. Os resultados de tais estudos indicamque a suficiência em C5 é uma exigência absoluta para o desenvolvimento daCIA (Watson et al., 1987; Wang, Y., et al., J. Immunol. 164: 4340-4347, 2000). Outra evidência da importância de C5 e complemento em RA foifornecida pelo uso de anticorpos anti-C5 monoclonais (MoAbs). Aadministração intraperitoneal profilática de MoAbs anti-C5 em um modelomurino de CIA quase impediu completamente o início da doença enquantoque o tratamento durante a artrite ativa resultou tanto em benefício clínicoquanto doença histológica mais branda significantes (Wang, Y., et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 92: 8955-59, 1995).

Compreensões adicionais a cerca do papel potencial daativação de complemento na patogênese da doença foram fornecidas pelosestudos usando camundongos transgênicos receptores de célula T K/BxN, ummodelo recentemente desenvolvido de artrite inflamatória (Korganow, A. S.,et al., Immunity 10: 451-461, 1999). Todos os animais KTBxNespontaneamente desenvolveram uma doença autoimune com a maioria(embora não todos) dos traços clínicos, histológicos e imunológicos da RAem seres humanos. Além disso, a transferência de soro de camundongosK/BxN artríticos em animais saudáveis provoca a artrite dentro de dias porintermédio da transferência de imunoglobulinas artritogênicas. Paraidentificar as etapas de ativação de complemento específicas requeridas para odesenvolvimento da doença, o soro de camundongos K/BxN artríticos foitransferido em vários camundongos geneticamente deficientes para umproduto do caminho de complemento particular (Ji, H., et al., Immunity 16:157-68, 2002). DE modo interessante, os resultados do estudo demonstraramque a ativação do caminho alternativo é crítica, ao passo que a ativação docaminho clássico é dispensável. Além disso, a geração de C5a é crítica vistoque tanto os camundongos deficientes em C5 quanto os camundongosdeficientes em C5aR foram protegidos do desenvolvimento da doença.Compatível com estes resultados, um estudo anterior relatou que a remoçãogenética da expressão do receptor C5a protege camundongos da artrite (Grant,E. P., etal., J. Exp. Med. 196: 1461-1471, 2002).

Um MoAb anti-C5 humanizado (5G1.1) que impede aclivagem do componente de complemento humano C5 nos seus componentespró-inflamatórios está sob desenvolvimento pela Alexion Pharmaceuticals,Inc., New Haven, Connecticut, como um tratamento potencial para RA.

Dois grupos de pesquisa independentemente propuseram que ocaminho da lectina promove a inflamação em pacientes RA por intermédio dainteração de MBL com glicoformas de IgG específicas (Malhotra et al., Nat.Med. 1: 237-243, 1995; Cuchacovich et al., J. Rheumatol. 23: 44-51, 1996). ARA está associada com um aumento marcante nas glicoformas de IgG quecarecem de galactose (aludidas como glicoformas IgGO) na região Fc damolécula (Rudd et al., Trends Biotechnology 22: 524-30, 2004). Aporcentagem de glicoformas de IgGO aumenta com a progressão da doença eretorna para normal quando pacientes estão em remissão. In vivo, a IgGO édepositada no tecido sinovial e a MBL está presente em níveis aumentadosem fluido sinovial em indivíduos com RA. A agalactosil IgG (IgGO) agregadana IgG agrupada associada com a RA pode ligar a lectina que liga manose(MBL) e ativa o caminho da lectina de complemento. Além disso, resultadosde um estudo clínico recente que examinou variantes alélicas de MBL empacientes RA sugerem que a MBL pode ter um papel realçador inflamatóriona doença (Garred et al., J. Rheumatol. 27: 26-34, 2000). Portanto, o caminhoda lectina pode ter um papel importante na patogênese de RA.

O lupus eritematoso sistêmico (SLE) é uma doença autoimunede etiologia indefinida que resulta na produção de autoanticorpos, geração decomplexos imunes circulatórios e episódicos, ativação não controlada dosistema de complemento. Embora as origens de autoimunidade no SLEpermaneçam difíceis de se compreender, informação considerável está agoradisponível implicando a ativação de complemento como um mecanismoimportante contribuindo para a lesão vascular nesta doença (Abramson, S. B.,et al., Hospital Practice 33: 107-122, 1998). A ativação dos caminhos decomplemento tanto clássico quanto alternativo está envolvida na doença etanto C4d quanto Bb são marcadores sensíveis da atividade da doença delupus de moderada a severa (Manzi, S., et al., Arthrit. Rheumat. 39: 1178-1188, 1996). A ativação do caminho de complemento alternativo acompanhaos surtos de doença no lupus eritematoso sistêmico durante a gravidez(Buyon, J. P., et al., Arthritis Rheum. 35: 55-61, 1992). Além disso, ocaminho da lectina pode contribuir para o desenvolvimento da doença vistoque os autoanticorpos contra MBL foram recentemente identificados nossoros de pacientes SLE (Seelen, Μ. A., et al., Clin Exp. Immunol. /34: 335-343, 2003).Acredita-se que o complexo imuno-mediado pela ativação decomplemento através do caminho clássico seja um mecanismo pelo qual alesão de tecido ocorre em pacientes SLE. Entretanto, as deficiênciashereditárias em componentes de complemento do caminho clássico aumentamo risco de lupus e doença equivalente a lupus (Pickering, M. C., et al., Adv.Immunol. 76: 227-324, 2000). SLE ou uma síndrome relacionada ocorre emmais do que 80% das pessoas com deficiência completa de Clq, Clr/Cls, C4ou C3. Isto apresenta um paradoxo evidente na reconciliação dos efeitosnocivos com os efeitos protetores de complemento no lupus.

Uma atividade importante do caminho clássico parece ser apromoção da remoção de complexos imunes da circulação e tecidos pelosistema fagocítico mononuclear (Kohler, P. F., et al., Am. J. Med. 56: 406-11,1974). Além disso, o complemento foi recentemente descoberto ter um papelimportante na remoção e descarte de corpos apoptóticos (Mevorarch, D., etal., J. Exp. Med. 188: 2313-2320, 1998). As deficiências na função docaminho clássico pode predispor os pacientes ao desenvolvimento de SLEpela permissão de um ciclo para desenvolvimento em que complexos imunesou células apoptóticas se acumulam nos tecidos, causam inflamação e aliberação de autoantígenos, que por sua vez estimula a produção deautoanticorpos e mais complexos imunes e deste modo evocam uma respostaautoimune (Botto, M., et al., Nat. Genet. 19: 56-59, 1998; Botto, M., ArthritisRes. 3: 201-10, 2001). Entretanto, estes estados de deficiência "completa" noscomponentes do caminho clássico estão presentes em aproximadamente umde 100 pacientes com SLE. Portanto, na vasta maioria de pacientes com SLE,a deficiência de complemento nos componentes do caminho clássico nãocontribui para a etiologia da doença e a ativação de complemento pode ser ummecanismo importante contribuindo para a patogênese de SLE. O fato de queraros indivíduos com deficiências genéticas permanentes nos componentes docaminho clássico freqüentemente desenvolvem SLE em algum ponto nas suasvidas comprova a redundância de mecanismos capazes de deflagrar a doença.

Resultados de modelos de animal de SLE sustentam o papelimportante da ativação de complemento na patogênese da doença. Inibir aativação de C5 usando um MoAb anti-C5 bloqueador diminuiu a proteinuria ea doença renal em camundongos NZB/NZW F1, um modelo de camundongode SLE (Wang Y., et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 8563-8, 1996). Alémdisso, o tratamento com MoAb anti-C5 de camundongos com doença deimunodeficiência severa combinada implantados com células que secretamanticorpos anti-DNA resulta na melhora na proteinuria e quadro histológico renal com um benefício associado na sobrevivência comparada com oscontroles não tratados (Ravirajan, C. T., et ai, Rheumatology 43: 442-7,2004). O caminho alternativo também tem um papel importante nasmanifestações de doença autoimune de SLE visto que o retrocruzamento doscamundongos deficientes em fator B no modelo MRL/lpr de SLE revelou que a falta de fator B diminuiu a vasculite, doença glomerular, consumo de C3 eos níveis de IgG3 RF tipicamente encontrados neste modelo sem alterar osníveis de outros autoanticorpos (Watanabe, H., et al., J. Immunol. 164: 786-794, 2000). Um MoAb anti-C5 humanizado está sob investigação como umtratamento potencial para SLE. Este anticorpo impede a clivagem de C5 para C5a e C5b. Em testes clínicos de Fase I, nenhum efeito adverso sério foiobservado e testes mais humanos estão a caminho para determinar a eficáciana SLE (Strand, V., Lupus 10: 216-221, 2001).

Resultados de estudos tanto de seres humanos quanto deanimal sustentam a possibilidade de que o sistema de complemento contribua diretamente para a patogênese da distrofia muscular. Estudos de biópsiasdistróficas humanas têm mostrado que C3 e C9 são depositados tanto nasfibras necróticas quanto nas não necróticas no músculo distrófico (Cornelio eDones, Ann. Neurol. 16: 694-701, 1984; Spuler e Engel, A. G., Neurology 50:41-46, 1998). Usando métodos de micro-série de DNA, Porter e colegasdescobriram a expressão de gene marcantemente realçada de numerososmRNAs relacionados com complemento em camundongos deficientes emdistrofina (mdx) coincidente com o desenvolvimento da doença distrófica(Porter et al., Hum. Mol. Genet. 11: 263-72, 2002).

Mutações no gene humano que codifica disferlina, umaproteína muscular de transmembrana, foram identificadas como fatores deriso principais para duas formas de doença de músculo esqueletal, a saberdistrofia muscular ao redor dos membros (LGMD) e miopatia de Miyoshi(Liu et al., Nat. Genet. 20: 31-6, 1998). Diversos modelos de camundongocom mutações na disferlina foram desenvolvidos e estes tambémdesenvolveram distrofia muscular progressiva. A ativação da cascata decomplemento foi identificada na superfície de fibras musculares nãonecróticas em alguns pacientes com LGMD (Spuler e Engel., Neurology 50:41-46, 1998). em um estudo recente, Wenzel e colegas mostraram que asfibras musculares deficientes em disferlina tanto de murino quanto de serhumano carecem do fator inibidor de complemento, CD33/DAF, um inibidorespecífico de C5b-9 MAC (complexo de ataque à membrana) (Wenzel et al.,J. Immunol. 175: 6219-25, 2005). Como uma conseqüência, as célulasmusculares não necróticas deficientes em disferlina são mais suscetíveis àsIise celular mediada por complemento. Wenzel e colegas sugerem que a Iisemediada por complemento de células do músculo esqueletal pode ser ummecanismo patológico principal envolvido no desenvolvimento de LGMD emiopatia de Miyoshi em pacientes. Connolly e colegas estudaram o papel decomplemento C3 na patogênese de um modelo severo de distrofia congênita,o camundongo dy-/-, que é deficiente em laminina a2 (Connolly et al., J.Neuroimmunol. 127: 80-7, 2002). Eles geraram animais geneticamentedeficientes tanto em C3 quanto em laminina a2 e descobriram que a ausênciade C3 prolongou a sobrevivência no modelo dy-/- de distrofia muscular. Alémdisso, os camundongos inoperantes duplos (C3-/-, dy-/-) demonstraram maisforça muscular do que o camundongos dy-/-. Este trabalho sugere que osistema de complemento pode contribuir diretamente para a patogênese destaforma de distrofia congênita.

Um aspecto da invenção é assim direcionado para a prevençãoou tratamento de atrites inflamatórias e não inflamatórias e outros distúrbiosmúsculo esqueletais, incluindo mas não limitados a osteoartrite, artritereumatóide, artrite reumatóide juvenil, gota, artropatia neuropática, artritepsoriática, espondilite ancilosante ou outras espondiloartropatias e artropatiascristalinas, distrofia muscular ou lupus eritematoso sistêmico (SLE), pelaadministração de uma composição que compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um veículofarmacêutico a um paciente que sofre de um tal distúrbio. O agente inibidorde MASP-2 pode ser administrado ao paciente sistemicamente, tal como pelaadministração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou outraadministração parenteral ou potencialmente pela administração oral paraagentes não peptidérgicos. Alternativamente, a administração pode ser pelaliberação local, tal como pela injeção intra-articular. O agente inibidor deMASP-2 pode ser administrado periodicamente em um período de tempoampliado para o tratamento ou controle de uma condição crônica ou pode serpela administração única ou repetida no período antes, durante e/ou a seguirdo trauma ou lesão agudos, incluindo procedimentos cirúrgicos realizados najunta.

CONDIÇÕES RENAIS

A ativação do sistema de complemento foi implicada napatogênese de uma ampla variedade de doenças renais; incluindo,glomerulonefrite mesangioproliferativa (nefropatia de IgA, doença de Berger)(Endo, M., et ai., Clin. Nephrology 55: 185-191, 2001), glomerulonefritemembranosa (Kerjashki, D., Arch B Cell Pathol. 58: 253-71, 1990;Brenchley, P. E., et ai, Kidney Int., 41: 933-7, 1992; Salant, D. J., et al.,Kidney Int. 35: 976-84, 1989), glomerulonefrite membranoproliferativa(glomerulonefrite mesangiocapilar) (Bartlow, B. G., et al., Kidney Int. 15:294-300, 1979; Meri, S., et al., J. Exp. Med. 175: 939-50, 1992),glomerulonefrite pós infecção aguda (glomerulonefrite pós estreptocócica), glomerulonefrite crioglobulinêmica (Ohsawa, I., et al., Clin Immunol. 101:59-66, 2001), nefrite de lupus (Gatenby, Ρ. A., Autoimmunity 11: 61-6, 1991)e nefrite púrpura de Henoch-Schonlein (Endo, M., et al., Am. J. Kidney Dis.35: 401-407, 2000). O envolvimento de complemento na doença renal foiavaliada por diversas décadas mas existe ainda um debate maior sobre o seupapel exato na fase inicial, do desenvolvimento e da resolução da doençarenal. Sob condições normais a contribuição de complemento é benéfica parao hospedeiro, mas a ativação e deposição inadequada de complemento podecontribuir para o lesão de tecido.

Existe evidência substancial de que a glomerulonefrite,inflamação dos glomérulos, seja freqüentemente iniciada pela deposição decomplexos imunes sobre as estruturas glomerulares ou tubulares que depoisdeflagram a ativação de complemento, inflamação e lesão tecidual. Kahn eSinniah demonstraram deposição aumentada de C5b-9 nas membranas debase tubular em biópsias tiradas de pacientes com várias formas de glomerulonefrite (Kahn, T. N., et al., Histopath. 26: 351-6, 1995). Em umestudo de pacientes com nefrologia IgA (Alexopoulos, A., et al., Nephrol.Dial. Transplant 10: 1166-1172, 1995), a deposição de C5b-9 nas estruturasde membrana epitelial/base tubulares correlacionadas com os níveis decreatinina plasmática. Um outro estudo de nefropatia membranosademonstrou uma relação entre resultado clínico e níveis de sC5b-9 urinários(Kon, S. P., et al., Kidney Int. 48: 1953-58, 1995). Os níveis elevados desC5b-9 foram correlacionados positivamente com prognóstico deficiente.Lehto et al., mediram os níveis elevados de CD59, um fator regulatório decomplemento que inibe o complexo de ataque à membrana em membranasplasmáticas, assim como C5b-9 na urina de pacientes com glomerulonefritemembranosa (Lehto, T., et al., Kidney Int. 47: 1403-11, 1995). A análisehistopatológica de amostras de biópsia tirada destes mesmos pacientesdemonstrou a deposição de proteínas C3 e C9 nos glomérulos, ao passo que aexpressão de CD59 nestes tecidos foi diminuída comparada com aquela detecido renal normal. Estes vários estudos sugerem que o progresso daglomerulonefrite mediada por complemento resulta na excreção urinária deproteínas de complemento que se correlacionam com o grau de lesão aotecido e prognóstico de doença.

A inibição da ativação de complemento em vários modelos deanimal de glomerulonefrite também demonstrou a importância da ativação decomplemento na etiologia da doença. Em um modelo de glomerulonefritemembranoproliferativa (MPGN), a infusão de anti-soro anti-Thil em ratosdeficientes em C6 (que não podem formar C5b-9) resultou em 90% menosproliferação celular glomerular, 80% de redução na plaqueta e infiltração demacrófago, síntese de colágeno tipo IV diminuída (um marcador para aexpansão de matriz mesangial) e 50% menos proteinúria do que nos ratosC6+ normais (Brandt, J., et al, Kidney Int. 49: 335-343, 1996). Estesresultados implicam C5b-9 como um mediator major do lesão de tecido pelocomplemento neste modelo de soro anti-timócito de rato. Em um outromodelo de glomerulonefrite, a infusão de dosagens graduadas de membranade base glomerular anti-rato de coelho produziu um influxo dependente dadose de leucócitos polimorfonucleares (PMN) que foi atenuado pelotratamento anterior com fator de veneno de cobra (para consumircomplemento) (Scandrett, A. L., et al., Am. J. Physiol. 268: F256-F265,1995). Os ratos tratados com fator de veneno de cobra também mostraramhistopatologia diminuída, proteinúria de longa duração diminuída e níveis decreatinina mais baixos do que os ratos de controle. Utilizando três modelos deGN em ratos (soro anti-timócito, Con A anti-Con A e nefrite de Heymannpassiva), Couser et al., demonstraram a eficácia terapêutica potencial demétodos para inibir complemento pelo uso da proteína sCRl recombinante(Couser, W. G., et al., J. Am. Soe. Nephrol. 5: 1888-94, 1995). Os ratostratados com sCRl mostraram PMN, plaqueta e influxo de macrófagosignificantemente diminuídos, mesangiólise diminuída e proteinúria versusratos de controle. Evidência adicional para a importância da ativação decomplemento na glomerulonefrite foi fornecida pelo uso de um MoAb anti-C5 no modelo de camundongo NZB/W F1. O MoAb anti-C5 inibe a clivagemde C5, bloqueando assim a geração de C5a e C5b-9. A terapia contínua comMoAb anti-C5 por 6 meses resultou em melhora significante do curso daglomerulonefrite, Um anticorpo monoclonal MoAb anti-C5 humanizado(5G1.1) que impede a clivagem de componente de complemento humano C5nos seus componentes pró-inflamatórios está sob desenvolvimento pelaAlexion Pharmaceuticals, Inc., Novo Haven, Connecticut, como umtratamento potencial para a glomerulonefrite.

A evidência direta quanto a um papel patológico decomplemento na lesão renal é fornecida pelos estudos de pacientes comdeficiências genéticas em componentes de complemento específicos. Váriosrelatos têm documentado uma associação de doença renal com deficiências defator regulatório de complemento H (Ault, B. H., Nephrol. 14: 1045-1053,2000; Levy, M., et al., Kidney Int. 30: 949-56, 1986; Pickering, M. C., et al.,Nat. Genet. 31: 424-8, 2002). A deficiência de fator H resulta em níveisplasmáticos baixos de fator B e C3 e no consumo de C5b-9. Tanto aglomerulonefrite membranoproliferativa atípica (MPGN) quanto a síndromeurêmica hemolítica idiopática (HUS) estão associadas com a deficiência defator H. Porcos deficientes em Fator H (Jansen, J. H., et al., Kidney Int. 53:331-49, 1998) e camundongos inoperantes no fator H (Pickering, M. C.,2002) demonstram sintomas equivalentes a MPGN, confirmando aimportância do fator H na regulagem de complemento. As deficiências deoutros componentes de complemento estão associadas com a doença renal,secundária ao desenvolvimento de lupus eritematoso sistêmico (SLE)(Walport5 M. J., Davies, et al., Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 815: 267-81, 1997). Asdeficiências quanto a Clq, C4 e C2 predispõem fortemente aodesenvolvimento de SLE por intermédio de mecanismos que dizem respeito àdepuração defeituosa de complexos imunes e material apoptótico. Em muitosdestes pacientes com SLE a nefrite de lupus ocorre, caracterizada peladeposição de complexos imunes por todo o glomérulo.

Evidência adicional ligando a ativação de complemento e arenal doença foi fornecida pela identificação em pacientes de autoanticorposdirecionados contra componentes de complemento, alguns dos quais foramdiretamente relacionados com a doença renal (Trouw, L. A., et al., Mol.Immunol. 38: 199-206, 2001). Vários destes autoanticorpos mostram um talalto grau de correlação com a doença renal que o termo fator nefrítico (NeF)foi introduzido para indicar esta atividade. Em estudos clínicos, cerca de 50%dos pacientes positivos quanto aos fatores nefríticos desenvolveram MPGN(Spitzer, R. E., et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 64: 177-83, 1992).C3NeF é um autoanticorpo direcionado contra o caminho alternativo daconvertase C3 (C3bBb) e o mesmo estabiliza esta convertase, promovendodeste modo a ativação do caminho alternativo (Daha, M. R., et al., J.Immunol. 116: 1-7, 1976). Do mesmo modo, autoanticorpo com umaespecificidade para o caminho clássico da C3 convertase (C4b2a), chamadoC4NeF, estabiliza esta convertase e promove deste modo a ativação docaminho clássico (Daha, M. R. et al., J. Immunol. 125: 2051-2054, 1980;Halbwachs, L., et al., J. Clin. Invest. 65: 1249-56, 1980). Os autoanticorposAnti-Clq foram descritos como estando relacionados com a nefrite empacientes SLE (Hovath, L., et al., Clin. Exp. Rheumatol. 19: 667-72, 2001;Siegert, C., et al., J. Rheumatol. 18: 230-34, 1991; Siegert, C., et al., Clin.Exp. Rheumatol. 10: 19-23, 1992) e um aumento no título destesautoanticorpos anti-Clq foi relatado para prognosticar um surto de nefrite(Coremans, I. E., et al., Am. J. Klidney Dis. 26: 595-601, 1995). Os depósitosimune eluídos de rins post-mortem de pacientes SLE revelaram o acúmulodestes autoanticorpos anti-Clq (Mannick, M., et al., Arthritis Rheumatol. 40:1504-11, 1997). Todos estes fatos indicam um papel patológico para estesautoanticorpos. Entretanto, nem todos pacientes com autoanticorpos anti-Clqdesenvolvem doença renal e também alguns indivíduos saudáveis têm títulosbaixos de autoanticorpos anti-Clq (Siegert, C. E., et al., Clin. Immunol.Immunopathol. 67: 204-9, 1993).

Além dos caminhos alternativo e clássico da ativação decomplemento, o caminho da lectina também pode ter um papel patológicoimportante na doença renal. Os níveis elevados de MBL, serina proteaseassociada com MBL e produtos de ativação de complemento foramdetectados pelas técnicas de imunoistoquímica em material de biópsia renalobtido de pacientes diagnosticados com diversas doenças renais diferentes,incluindo nefrite púrpura de Henoch-Schonlein (Endo, M., et al., Am. J.Kidney Dis. 35: 401-407, 2000), glomerulonefrite crioglobulinêmica(Ohsawa, I., et al., Clin. Immunol. 101: 59-66, 2001) e neuropatia IgA (Endo,M., et al., Clin. Nephrology 55: 185-191, 2001). Portanto, a despeito do fato20 de que uma associação entre complemento e doenças renais foi conhecida pordiversas décadas, os dados de como o complemento exatamente influenciaestas doenças renais está longe de completa.

Um aspecto da invenção é assim direcionado ao tratamento decondições renais incluindo mas não limitado a glomerulonefritemesangioproliferativa, glomerulonefrite membranosa, glomerulonefritemembranoproliferativa (glomerulonefrite mesangiocapilar), glomerulonefritepós infecção aguda (glomerulonefrite pós estreptocócica), glomerulonefritecrioglobulinêmica, nefrite de lupus, nefrite púrpura de Henoch-Schonlein ounefropatia de IgA, pela administração de uma composição que compreendeuma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2em um veículo farmacêutico a um paciente que sofre de um tal distúrbio. Oagente inibidor de MASP-2 pode ser administrado ao pacientesistemicamente, tal como pela administração intra-arterial, intravenosa,intramuscular, subcutânea ou outra administração parenteral oupotencialmente pela administração oral para agentes não peptidérgicos. Oagente inibidor de MASP-2 pode ser administrado periodicamente em umperíodo de tempo ampliado para o tratamento ou controle de uma condiçãocrônica ou pode ser pela administração única ou repetida no período antes, durante ou a seguir do trauma ou lesão agudos.

DISTÚRBIOS DE PELE

A psoríase é uma condição dérmica crônica, debilitante queafeta milhões de pessoas e é atribuída a fatores tanto genéticos quantoambientais. Os agentes tópicos assim como a fototerapia com UVB e PUVAsão no geral considerados como sendo o tratamento de primeira linha para apsoríase. Entretanto, para a doença generalizada ou mais extensiva, a terapiasistêmica é indicada como um tratamento primário ou, em alguns casos, parapotenciar a terapia de UVB e PUVA.

A etiologia subjacente de várias doenças de pele tais como apsoríase sustenta um papel para os processos imune e pró inflamatórioincluindo o envolvimento do sistema de complemento. Além disso, o papel dosistema de complemento foi estabelecido como um mecanismo de defesa dapele não específico importante. A sua ativação leva à geração de produtos quenão apenas ajudam a manter as defesas do hospedeiro normais, mas tambémmedeiam a inflamação e lesão de tecido. Os produtos pró inflamatórios decomplemento incluem fragmentos grandes de C3 com opsônico e asatividades estimuladoras de célula (C3b e C3bi), anafilatoxinas de pesomolecular baixo (C3a, C4a e C5a) e complexos de ataque à membrana. Entreeles, C5a ou o seu produto de degradação C5a des Arg, parecem ser osmediadores mais importantes porque exercem um efeito quimiotático potentenas células inflamatórias. A administração intradérmica de anafilatoxina C5ainduz mudanças de pele muito similares àquelas observadas na vasculite dehipersensibilidade cutânea que ocorre através do complexo imuno-mediadopela ativação de complemento. A ativação de complemento está envolvida napatogênese das mudanças inflamatórias nas dermatoses bolhosas autoimunes.A ativação de complemento pelo anticorpo de pênfigo na epiderme parece serresponsável pelo desenvolvimento das mudanças inflamatórias característicaschamadas de espongiose eosinofílica. No penfigóide bolhoso (BP), interaçãode antígeno de zona de membrana de base e anticorpo BP leva à ativação decomplemento que parece estar relacionado com os leucócitos que revestem ajunção dermoepidérmica. As anafilatoxinas resultantes não apenas ativam osleucócitos infiltrantes mas também induzem a desgranulação de célulamastóide, que facilita a separação dermoepidérmica e a infiltraçãoeosinofílica. Similarmente, a ativação de complemento parece desempenharum papel mais direto na separação dermoepidérmica observada naepidermólise bolhosa adquirida e herpes gestacional.

A evidência para o envolvimento de complemento na psoríasevem de descobertas experimentais recentes descritas na literatura relacionadacom os mecanismos fisiopatológicos para as mudanças inflamatórias napsoríase e doenças relacionadas. Um corpo crescente de evidência temindicado que a imunidade mediada por célula T desempenha um papelimportante na deflagração e manutenção de lesões psoriáticas. Foi reveladoque linfocinas produzidas pelas células T ativadas em lesões psoriáticas têmuma forte influência na proliferação da epiderme. O acúmulo neutrofílicocaracterístico sob o estrato córneo pode ser observado nas áreas altamenteinflamadas de lesões psoriáticas. Os neutrófilos são quimiotaticamenteatraídos e ativados pela ação sinergística de quimiocinas, IL-8 e Gro-alfaliberados pelos queratinócitos estimulados e particularmente pelo C5a/C5ades-arg produzido por intermédio da ativação do caminho de complementoalternativo (Terui, T., Tahoku J. Exp. Med. 190: 239-248, 2000; Terui, T.,Exp. Dermatol. 9: 1-10, 2000).

Os extratos de escamas psoriáticas contém uma única fraçãode peptídeo quimiotática que é provável estar envolvida na indução daquimiotaxia leucocitária transepidérmica rítmica. Estudos recentesidentificaram a presença de dois peptídeos quimiotáticos não relacionadosnesta fração, isto é, C5a/C5a des Arg e interleucina 8 (IL-8) e suas citocinasrelacionadas. Para investigar a sua contribuição relativa para a migraçãoleucocitária transepidérmica assim como as suas interrelações nas lesõespsoriáticas, as concentrações de C5a/C5a desArg e IL-8 imunorreativos nosextratos de escama lesional psoriáticas e aquelas de dermatoses pustularesestéreis relacionadas foram quantificadas. Foi descoberto que asconcentrações de C5a/C5a desArg e IL-8 foram mais significantemente aumentadas nos extratos de tecido córneo de pele lesional do que naqueles depele ortoqueratótica não inflamatória. O aumento da concentração de C5a/C5adesArg foi específico para os extratos de escama lesional. Com base nestesresultados, parece que C5a/C5a desArg é gerado apenas na pele lesionalinflamatória sob circunstâncias específicas que preferencialmente favorecema ativação de complemento. Isto fornece uma base lógica para o uso de uminibidor da ativação de complemento para melhorar lesões psoriáticas.

Embora o caminho clássico do sistema de complemento tenhasido mostrado ser ativado na psoríase, existem menos relatos sobre oenvolvimento do caminho alternativo nas reações inflamatórias na psoríase.Dentro da perspectiva convencional da ativação de caminhos decomplemento, fragmentos de complemento C4d e Bb são liberados nomomento da ativação dos caminhos clássico e alternativo, respectivamente. Apresença do fragmento C4d ou Bb, portanto, denota uma ativação decomplemento que continua através dos caminhos clássico e/ou alternativo.Um estudo mediu os níveis de C4d e Bb em extratos de escamas psoriáticasusando técnicas de imunoensaio de enzima. As escalas destas dermatosescontiveram níveis mais altos de C4d e Bb detectáveis pelo imunoensaio deenzima do que aqueles no estrato córneo de pele não inflamatória (Takematsu,H., et ai., Dermatológica 181: 289-292, 1990). Estes resultados sugerem que ocaminho alternativo é ativado além do caminho clássico de complemento empele lesional psoriática.

Evidência adicional para o envolvimento de complemento napsoríase e dermatite atópica foi obtida medindo-se componentes decomplemento normais e produtos de ativação no sangue periférico de 35pacientes com dermatite atópica (AD) e 24 pacientes com psoríase em umestágio brando a intermediário. Os níveis de inativadores C3, C4 e Cl (ClINA) foram determinados no soro pela imunodifusão radial, ao passo que osníveis de C3a e C5a foram medidos pelo radioimunoensaio. Em comparaçãocom os controles não atópicos saudáveis, os níveis de C3, C4 e Cl INA foramdescobertos serem significantemente aumentados em ambas as doenças. NaAD, houve uma tendência voltada para níveis C3a aumentados, ao passo quena psoríase, níveis C3a foram significantemente aumentados. Os resultadosindicam que, tanto na AD quanto na psoríase, o sistema de complementoparticipa no processo inflamatório (Ohkonohchi, K., et ai, Dermatológica179: 30-34, 1989).

A ativação de complemento na pele lesional psoriática tambémresulta na deposição de complexos de complemento de terminal dentro daepiderme como definido medindo-se os níveis de SC5b-9 no plasma e tecidoscórneos de pacientes psoriáticos. Os níveis de SC5b-9 em plasma psoriáticoforam descoberto ser significantemente mais altos do que aqueles doscontroles ou aqueles de pacientes com dermatite atópica. Estudos de extratosde proteína total de pele lesional têm mostrado que, enquanto nenhum SC5b-9pode ser detectado nos tecidos córneos não inflamatórios, houve altos níveisde SC5b-9 nos tecidos córneos lesionais da psoríase. Pela imunofluorescênciausando um anticorpo monoclonal para o neoantígeno C5b-9, a deposição deC5b-9 foi observada apenas no estrato córneo da pele psoriática. Em resumo,na pele lesional psoriática, o sistema de complemento é ativado e a ativaçãode complemento prossegue todo o caminho para a etapa terminal, gerandocomplexo de ataque à membrana.

Novos medicamentos biológicos que seletivamente alvejam osistema imune têm recentemente se tornado disponível para tratar a psoríase.Quatro medicamentos biológicos que estão correntemente aprovados peloFDA ou em estudos de Fase 3 são: alefacept (Ameviv®) e efalizuMoAb(Raptiva®) que são moduladores de célula T; etanercept (Enbrei®), umreceptor de TNF solúvel; e inflixiMoAb (Remicade®) um anticorpomonoclonal anti-TNF. Raptiva é uma modificador de resposta imune, em queo mecanismo alvejado de ação é um bloqueio da interação entre LFA-I noslinfócitos e ICAM-I nas células que apresentam antígeno e nas célulasendoteliais vasculares. A ligação de CDl Ia pelo Raptiva resulta em saturaçãode CDll disponível um sítio de ligação nos linfócitos e infra-modulação daexpressão de CDlla da superfície celular nos linfócitos. Este mecanismo deação inibe a ativação de célula T, tráfico de célula para a derme e epiderme ereativação de célula T. Assim, uma pluralidade de evidências científicasindica um papel para o complemento nos estados de doença inflamatórios dapele e métodos farmacêuticos recentes têm alvejado o sistema imune ouprocessos inflamatórios específicos. Nenhum, entretanto, identificou MASP-2como um método alvejado. Com base no novo entendimento dos inventoresdo papel de MASP-2 na ativação de complemento, os inventores acreditamque MASP-2 seja um alvo eficaz para o tratamento da psoríase e outrosdistúrbios dérmicos.

Um aspecto da invenção é assim direcionado ao tratamento dapsoríase, dermatoses bolhosas autoimunes, espongiose eosinofílica,penfigóide bolhoso, epidermólise bolhosa adquirida, dermatite atópica, herpesgestacional e outro distúrbios dérmicos e para o tratamento de queimadurastérmicas e químicas incluindo derrame capilar causado deste modo, pelaadministração de um composição que compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um veículofarmacêutico a um paciente que sofre de um tal distúrbio de pele. O agenteinibidor de MASP-2 pode ser administrado ao paciente topicamente, pelaaplicação de uma pulverização, loção, gel, pasta, pomada ou solução deirrigação contendo o agente inibidor de MASP-2 ou sistemicamente tal comopela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, subcutânea ououtra administração parenteral ou potencialmente pela administração oral paraos inibidores não peptidérgicos. O tratamento pode envolver umaadministração única ou aplicações ou dosagens repetidas para uma condiçãoaguda ou pelas aplicações ou dosagens periódicas para o controle de umacondição crônica.

TRANSPLANTE

A ativação do sistema de complemento significantementecontribui para a reação inflamatória depois do transplante de órgão sólido. Noalotransplante, o sistema de complemento pode ser ativado pelaisquemia/reperfusão e, possivelmente, pelos anticorpos direcionados contra oenxerto (Baldwin, W. M., et al., Springer Seminol Immunopathol. 25: 181-197, 2003). No xenotransplante de não primatas para primatas, os maioresativadores para complemento são os anticorpos pré existentes. Estudos emmodelos de animal têm mostrado que o uso de inibidores de complementopode significantemente prolongar a sobrevivência do enxerto (ver abaixo).Assim, existe um papel estabelecido do sistema de complemento na lesão deórgão depois do transplante do órgão e portanto os inventores acreditam que ouso de inibidores de complemento direcionados a MASP-2 podem impedir olesão ao enxerto depois alo- ou xenotransplante.Os mecanismos imunes inatos, particularmente decomplemento, desempenham um papel maior nas respostas inflamatória eimune contra o enxerto do que foi anteriormente reconhecido. Por exemplo, aativação do caminho de complemento alternativo parece mediar a lesão deisquemia/reperfiisão renal e as células tubulares próximas podem ser tanto afonte quanto o sítio de ataque de componentes de complemento neste cenário.O complemento localmente produzido no rim também desempenha um papelno desenvolvimento de respostas imunes tanto mediadas por célula quanto poranticorpo contra o enxerto.

C4d é o produto de degradação do fator C4 de complementoativado, um componente dos caminhos clássico e dependente de lectina. Otingimento de C4d tem emergido como um marcador útil de rejeição humoraltanto no cenário agudo quanto no crônico e levou ao interesse renovado nasignificância da formação de anticorpo anti-doador. A associação entre C4d eos sinais morfológicos de rejeição celular aguda é estatisticamentesignificante. C4d é encontrado em 24 a 43% dos episódios do Tipo I, em 45%de rejeição do tipo II e 50% de rejeição do tipo III (Nickeleit, V., et al., J. Am.Soe. Nephrol. 13: 242-251, 2002; Nickeleit, V., et al., Nephrol. Dial.Transplant 18: 2232-2239, 2003). Várias terapias estão em desenvolvimentoque inibem complemento ou reduzem a síntese local como um meio para sealcançar um resultado clínico melhorado a seguir do transplante.

A ativação da cascata de complemento ocorre como umresultado de vários processos durante o transplante. A terapia presente,embora eficaz na limitação da rejeição celular, não trata totalmente com todasas barreiras encaradas. Estas incluem a rejeição humoral e a nefropatia oudisfunção de aloenxerto crônica. Embora a resposta global para o órgãotransplantado é um resultado de vários mecanismos efetores na parte dohospedeiro, o complemento pode desempenhar um papel em alguns destes.No cenário do transplante renal, a síntese local de complemento pelas célulastubulares próximas mostra-se de importância particular.

A disponibilidade de inibidores específicos de complementopode fornecer a oportunidade para um resultado clínico melhorado a seguir dotransplante de órgão. Os inibidores que atuam por um mecanismo quebloqueia o ataque de complemento podem ser particularmente úteis, porqueeles mantêm a promessa de aumentar a eficácia e a anulação do esgotamentode complemento sistêmico em um receptor já imuno-comprometido.

O complemento também desempenha um papel crítico narejeição de xenoenxerto. Portanto, os inibidores de complemento eficazes sãode enorme interesse como agentes terapêuticos potenciais. No transplante deórgão de porco para primata, a rejeição hiperaguda (HAR) resulta dadeposição de anticorpo e ativação de complemento. Estratégias e alvosmúltiplos foram testados para impedir a rejeição de xenoenxerto hiperagudona combinação de porco para primata. Estes métodos foram realizados pelaremoção de anticorpos naturais, esgotamento de complemento com fator deveneno de cobra ou prevenção da ativação de C3 com o inibidor decomplemento solúvel sCRl. Além disso, o bloqueador 2 da ativação decomplemento (CAB-2), uma proteína quimérica solúvel recombinantederivada do fator de aceleração do decaimento humano (DAF) e proteína doco-fator de membrana, inibe a C3 e C5 convertases dos caminhos tantoclássico quanto alternativo. CAB-2 reduz a lesão de tecido mediada porcomplemento de um coração de porco perfundido ex vivo com sanguehumano. Um estudo da eficácia de CAB-2 quando um coração de porco foitransplantado heterotopicamente nos macacos rhesus que não recebemnenhuma imunossupressão mostraram que a sobrevivência do enxerto foimarcantemente prolongada em macacos que receberam CAB-2 (Salerno, C.T., et al., Xenotransplantation 9: 125-134, 2002). CAB-2 marcantementeinibiu a ativação de complemento, como mostrado por uma forte redução nageração de C3a e SC5b-9. Na rejeição de enxerto, a deposição tecidual deiC3b, C4 e C9 foi similar ou levemente reduzida da dos controles e adeposição de IgG, IgM5 Clq e fibrina não mudou. Assim, este método para ainibição de complemento anulou a rejeição hiperaguda de corações de porcotransplantada em macacos rhesus. Estes estudos demonstram os efeitos benéficos da inibição de complemento na sobrevivência e os inventoresacreditam que a inibição de MASP-2 também pode ser útil noxenotransplante.

Um outro método tem focalizado na determinação seanticorpos monoclonais de anti-complemento 5 (C5) poderiam prevenir arejeição hiperaguda (HAR) em um modelo de transplante de coração de ratopara camundongo pré sensibilizado e se este MoAb, combinado comciclosporina e ciclofosfamida, poderia obter a sobrevivência de enxerto delonga duração. Foi descoberto que MoAb anti-C5 impede HAR (Wang, H., etai., Transplantation 68: 1643-1651, 1999). Os inventores acreditam assim queoutros alvos na cascata de complemento, tais como MASP-2, também podemser valiosos para prevenir HAR e a rejeição vascular aguda noxenotransplante clínico futuro.

Embora o papel central de complemento na rejeiçãohiperaguda observada em xenoenxertos seja bem estabelecido, um papel sutilno transplante alogênico está surgindo. Uma ligação entre complemento e aresposta imune adquirida há muito é conhecida, com a descoberta de queanimais esgotados em complemento montaram respostas de subnormalanticorpo a seguir da estimulação antigênica. A opsonização de antígeno como produto da divisão do complemento C3d tem sido mostrado aumentarenormemente a eficácia de apresentação de antígeno para as células B e foimostrado atuar por intermédio entrosamento do receptor de complemento tipo2 em certas células B. Este trabalho foi ampliado para o cenário de transplanteem um modelo de enxerto de pele em camundongos, onde camundongosdeficientes em C3 e C4 tiveram um defeito marcante na produção de alo-anticorpo, devido à insuficiência de mudança de classe para o IgG de altaafinidade. A importância destes mecanismos no transplante renal é aumentadodevido à significância de anticorpos anti-doador e rejeição humoral.

Trabalho anterior já demonstrou que a supra-regulagem dasíntese de C3 pelas células tubulares próximas durante a rejeição dealoenxerto a seguir do transplante renal. O papel do complemento localmentesintetizado foi examinado em um modelo de transplante renal decamundongo. Os enxertos de doadores negativos em C3 transplantados emreceptores suficientes em C3 demonstraram a sobrevivência prolongada(>100 dias) quando comparada com enxertos de controle de doadorespositivos em C3, que foram rejeitados dentro de 14 dias. Além disso, aresposta proliferativa de célula T anti-doador em receptores de enxertosnegativos em C3 foi marcantemente reduzida quando comparada com aquelade controles, indicando um efeito de C3 localmente sintetizado naimprimação de célula T.

Estas observações sugerem a possibilidade de que a exposiçãode antígeno doador às células T primeiro ocorre no enxerto e que aapresentação de antígeno realça o complemento localmente sintetizado, pelaopsonização de antígeno doador ou fornecendo-se sinais adicionais às célulasque apresentam tanto antígeno quanto células T. No cenário do transplanterenal, as células tubulares que produzem complemento também demonstram adeposição de complemento na sua superfície celular.

Um aspecto da invenção é assim direcionado à prevenção outratamento de reação inflamatória que resulta do transplante de tecido ouórgão sólido pela administração de uma composição que compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em umveículo farmacêutico para o receptor do transplante, incluindo pacientes quereceberam alotransplante ou xenotransplante de órgãos integrais (porexemplo, rim, coração, fígado, pâncreas, pulmão, córnea, etc.) ou enxertos(por exemplo, válvulas, tendões, medula óssea, etc.). O agente inibidor deMASP-2 pode ser administrado ao paciente pela administração intra-arterial,intravenosa, intramuscular, subcutânea ou outra administração parenteral oupotencialmente pela administração oral para os inibidores não peptidérgicos.

A administração pode ocorrer durante o período agudo seguinte ao transplantee/ou como terapia pós transplante de longa duração. Adicionalmente ou emvez da administração pós transplante, o paciente pode ser tratado com oagente inibidor de MASP-2 antes do transplante e/ou durante o procedimentode transplante, e/ou pelo pré tratamento do órgão ou tecido a ser transplantadocom o agente inibidor de MASP-2. O pré tratamento do órgão ou tecido podeacarretar a aplicação de uma solução, gel ou pasta contendo o agente inibidorde MASP-2 à superfície do órgão ou tecido pela pulverização ou irrigação dasuperfície ou do órgão ou tecido podem ser embebidos em uma soluçãocontendo o inibidor de MASP-2.

DISTÚRBIOS E LESÕES DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL E PERIFÉRICO

A ativação do sistema de complemento foi implicado napatogênese de uma variedade de doenças ou lesões do sistema nervoso central(CNS) ou sistema nervoso periférico (PNS), incluindo mas não limitado aesclerose múltipla (MS), miastenia grave (MG), doença de Huntington (HD),esclerose lateral amiotrófica (ALS), síndrome de Guillain Barre, reperfusão aseguir do acidente vascular cerebral, discos degenerativos, trauma cerebral,mal de Parkinson (PD) e mal de Alzheimer (AD). A determinação inicial deque as proteínas de complemento são sintetizadas nas células do CNSincluindo neurônios, astrócitos e microglia, assim como a compreensão deque as anafilatoxinas geradas no CNS a seguir da ativação de complementopodem alterar a função neuronal, esclareceu o papel potencial docomplemento em distúrbios do CNS (Morgan, B. P., et ai., ImmunologyToday 17: 10: 461-466, 1996). Foi agora mostrado que os receptores de C3a eos receptores de C5a são encontrados nos neurônios e mostram distribuiçãodisseminada em porções distintas dos sistemas cerebrais sensoriais, motores elímbicos (Barum, S. R., Immunologic Research 26: 7-13, 2002). Além disso,as anafilatoxinas C5a e C3a foram mostradas alterar o comportamento docomer e beber em roedores e pode induzir a sinalização de cálcio emmicroglia e neurônios. Estas descobertas aumentam as possibilidades comrespeito à utilidade terapêutica de inibir a ativação de complemento em umavariedade de doenças inflamatórias do CNS incluindo trauma cerebral,desmielinação, meningite, acidente vascular cerebral e mal de Alzheimer.

O trauma ou hemorragia cerebrais é um problema clínicocomum e a ativação de complemento pode ocorrer e exacerbar resultando eminflamação e edema. Os efeitos de inibição de complemento foram estudadosem um modelo de trauma cerebral em ratos (Kaczorowski et aL, J. Cereb.Blood Flow Metab. 15: 860-864, 1995). A administração de sCRlimediatamente antes da lesão cerebral marcantemente inibiu a infiltração deneutrófilo na área lesionada, indicando que o complemento foi importantepara o recrutamento de células fagocíticas. Do mesmo modo, a ativação decomplemento em pacientes a seguir da hemorragia cerebral está claramenteimplicada pela presença de altos níveis de ativação múltipla de produtos decomplemento tanto no plasma quanto no fluido cerebrospinal (CSF). Aativação de complemento e tingimento aumentado de complexos C5b-9 foramdemonstrados no tecido de disco lombar seqüestrado e pode sugerir um papelna ciática induzida pelo tecido da herniação de disco (Gronblad, M., et aL,

Spine 28(2): 114-118, 2003).

A MS é caracterizada por uma perda progressiva doembainhamento de mielina e insolação de axons dentro do CNS. Embora acausa inicial seja desconhecida, existe evidência abundante que implica osistema imune (Prineas, J. W., et aL, Lab Invest. 38: 409-421, 1978; Ryberg,B., J. Neurol. Sei. 54: 239-261, 1982). Também há evidência clara de que ocomplemento desempenha um papel proeminente na fisiopatologia dedoenças desmielinantes do CNS ou PNS incluindo MS, síndrome de Guillain-Barre e síndrome de Miller-Fisher (Gasque, P., et al., Immunopharmacology49: 171-186, 2000; Barnum, S. R. em Bondy S. et ai. (eds.) Inflammatoryevents in neurodegeration, Prominent Press 139-156, 2001). O complementocontribui para a destruição de tecido, inflamação, depuração de fragmentos demielina e ainda a remielinização de axons. A despeito da evidência clara doenvolvimento do complemento, a identificação de produtos terapêuticos decomplemento alvo apenas agora esta sendo avaliada na encefalomielitealérgica experimental (EAE), um modelo animal de esclerose múltipla.Estudos estabeleceram que os camundongos EAE deficientes em C3 ou fatorB mostraram desmielinização atenuada quando comparada com camundongosde controle de EAE (Barnum, Immunologic Research 26: 7-13, 2002). Osestudos em camundongo EAE usando uma forma solúvel de um complementoinibidor cunhado "sCrry" e C3-/- e fator B-/- demonstraram que ocomplemento contribui para o desenvolvimento e progressão do modelo dedoença em diversos níveis. Além disso, a redução marcante na gravidade deEAE nos camundongos do fator B-/- fornece outras evidências quanto aopapel do caminho alternativo de complemento na EAE (Nataf et ai, S.Immunology 165: 5867-5873, 2000).

A MG é uma doença da junção neuromuscular com uma perdade receptores de acetilcolina e destruição da placa de extremidade. sCRl émuito eficaz em um modelo animal de MG, indicando ainda o papel decomplemento na doença (Piddelesden et al., J. Neuroimmunol. 1997).

As marcas histológicas da AD, uma doença neurodegenerativa,são placas senis e emaranhados neurofibrilares (McGeer et al., Res. Immunol.143: 621-630, 1992). Estes marcadores patológicos também tingemfortemente os componentes do sistema de complemento. As evidênciasindicam um estado neuroinflamatório local que resulta na morte neuronal edisfiinção cognitiva. As placas senis contêm peptídeo amilóide-0 anormal(AG, um peptídeo derivado da proteína precursora de amilóide. AD foimostrado ligar Cle pode deflagrar a ativação de complemento (Rogers et aL,Res. Immunol. 143: 624-630, 1992). Além disso, um traço proeminente daAD é a associação de proteínas ativadas do caminho de complemento clássicode Clq para C5b-9, que foi encontrado altamente localizado nas placasneuríticas (Shen, Y., et aL, Brain Research 769: 391-395, 1997; Shen, Y., etaL, Neurosci. Letters 305(3): 165-168, 2001). Assim, AD não apenas inicia ocaminho clássico, mas um estado inflamatório contínuo resultante podecontribuir para a morte de célula neuronal. Além disso, o fato de que aativação de complemento na AD progrediu para a fase C5b-9 terminal indicaque os mecanismos regulatórios do sistema de complemento foram incapazesde deter o processo de ativação de complemento.

Diversos inibidores do caminho de complemento foramproposto como métodos terapêuticos potenciais para a AD, incluindoproteoglicano como inibidores da ligação ClQ, Nafamstat como um inibidorda C3 convertase e bloqueadores da ativação C5 ou inibidores de receptoresC5a (Shen, Y., et aL, Progress in Neurobiology 70: 463-472, 2003). O papelde MASP-2 como uma etapa iniciadora no caminho de complemento inato,assim como para a ativação do caminho alternativo, fornece um métodoterapêutico potencialmente novo e é sustentado pela abundância dos dadosque sugerem o envolvimento do caminho de complemento na AD.

Nas regiões danificadas nos cérebros de pacientes PD, comoem outras doenças degenerativas do CNS, existe evidência de inflamaçãocaracterizada pela reação glial (especialmente microglia), assim comoexpressão aumentada de antígenos HLA-DR, citocinas e componentes decomplemento. Estas observações sugerem que os mecanismos do sistemaimune estejam envolvidos na patogênese do lesão neuronal em PD. Osmecanismos celulares de lesão primária em PD não foram clarificados, mas é,entretanto, provável que as mutações mitocondriais, estresse oxidativo eapoptose desempenhem um papel. Além disso, a inflamação iniciada pelolesão neuronal no estriato e a substancia negra em PD pode agravar o curso dadoença. Estas observações sugerem que o tratamento com medicamentosinibidores de complemento podem atuar para diminuir a progressão de PD(Czlonkowska, A., et ai., Med. Sei. Monit. 8: 165-177, 2002).

Um aspecto da invenção é assim direcionado ao tratamento dedistúrbios ou lesões do sistema nervoso periférico (PNS) e/ou sistema nervosocentral (CNS) tratando-se um paciente que sofre de um tal distúrbio ou lesãocom uma composição que compreenda uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um agente inibidor de MASP-2 em um veículo farmacêutico.Acredita-se que os distúrbios e lesões de CNS e PNS que podem ser tratadosde acordo com a presente invenção incluam mas não sejam limitados àesclerose múltipla (MS), miastenia grave (MG), doença de Huntington (HD),esclerose lateral amiotrófica (ALS), síndrome de Guillain Barre, reperfusãoseguinte ao acidente vascular cerebral, discos degenerativos, trauma cerebral,mal de Parkinson (PD), mal de Alzheimer (AD), síndrome de Miller-Fisher,trauma e/ou hemorragia cerebrais, desmielinização e, possivelmente,meningite.

Para o tratamento de condições do CNS e trauma cerebral, oagente inibidor de MASP-2 pode ser administrado ao paciente pelaadministração intratecal, intracraniana, intraventricular, intra-arterial,intravenosa, intramuscular, subeutânea ou outra administração parenteral e demodo potencial oralmente para os inibidores não peptidérgicos. As condiçõesde PNS e trauma cerebral podem ser tratados por uma via sistêmica deadministração ou alternativamente pela administração local ao sítio dedisfunção ou trauma. A administração das composições de inibidor de MASP-2 da presente invenção pode ser repetida periodicamente como determinadopor um médico até que alívio eficaz ou controle dos sintomas sejam obtidos.DISTÚRBIOS DO SANGUE

A septicemia é causada por uma reação esmagadora dopaciente aos microorganismos invasores. Uma função principal do sistema decomplemento é orquestrar a resposta inflamatória às bactérias invasoras eoutro patógenos. Compatível com este papel fisiológico, a ativação decomplemento tem sido mostrada em numerosos estudos ter um papel principalna patogênese da septicemia (Bone, R. C., Annals. Internai. Med. 115: 457-469, 1991). A definição das manifestações clínicas da septicemia está sempreevoluindo. A septicemia é usualmente definida como a resposta do hospedeirosistêmica a uma infecção. Entretanto, em muitas ocasiões, nenhuma evidênciaclínica para infecção (por exemplo, culturas sangüíneas bacterianas positivas)é encontrada em pacientes com sintomas sépticos. Esta discrepância foiprimeiro levada em conta em uma Conferência de Consenso em 1992 quandoo termo "síndrome da resposta inflamatória sistêmica" (SIRS) foi estabelecidoe para a qual nenhuma presença definível de infecção bacteriana foi requerida(Bone, R. C., et al., Crit. Care Med. 20: 724-726, 1992). Existe agoraconcordância geral de que a septicemia e SIRS são acompanhadas pelaincapacidade para regular a resposta inflamatória. Para os propósitos destarevisão ligeira, nós consideraremos a definição clínica de septicemiaincluindo também a septicemia severa, choque séptico e SIRS.

A fonte predominante de infecção em pacientes sépticos antesdos idos de 1980 foram as bactérias Gram-negativas. Lipopolissacarídeo(LPS), o componente principal da parede celular da bactéria Gram-negativa,foi conhecido por estimular a liberação de mediadores inflamatórios de váriostipos de célula e induzir os sintomas infecciosos agudos quando injetado emanimais (Haeney, M. R., et al, Antimicrobial Chemotherapy 41 (Supl. A): 4Ι-ό, 1998). De maneira interessante, o espectro de microorganismosresponsáveis parece ter mudado de bactérias predominantemente Gram-negativas nos idos de 1970 e 1980 para bactérias predominantemente Gram-positivas no presente, por razões que são correntemente incertas (Martin, G.S., et al., N. Eng. J. Med. 348: 1546-54, 2003).

Muitos estudos têm mostrado a importância da ativação decomplemento na mediação da inflamação e contribuindo para os traços dechoque, particularmente choque séptico e hemorrágico. Os organismos tantoGram-negativos quanto Gram-positivos habitualmente precipitam o choqueséptico. LPS é um ativador potente de complemento, predominantemente porintermédio do caminho alternativo, embora a ativação do caminho clássicomediada pelos anticorpos também ocorra (Fearon, D. T., et al., N. Engl. J.

Med. 292: 937-400, 1975). Os componentes principais da parede celularGram-positiva são peptidoglicano e ácido lipoteicóico e ambos oscomponentes são ativadores potentes do caminho de complementoalternativo, embora na presença de anticorpos específicos eles tambémpossam ativar o caminho de complemento clássico (Joiner, Κ. A., et al., Ann.Rev. Immunol. 2: 461-2, 1984).

O sistema de complemento foi inicialmente implicado napatogênese da septicemia quando foi notado pelos pesquisadores que asanafilatoxinas C3a e C5a medeiam uma variedade de reações inflamatória quepoderiam também ocorrer durante a septicemia. Estas anafilatoxinas evocam avasodilatação e um aumento na micropermeabilidade vascular, eventos quedesempenham um papel central no choque séptico (Schumacher, W. A., et al.,Agents Actions 34: 345-349, 1991). Além disso, as anafilatoxinas induzembroncoespasmo, liberação de histamina a partir dos mastóides e agregação deplaquetas. Além disso, elas exercem numerosos efeitos sobre os granulócitos,tais como quimiotaxia, agregação, adesão, liberação de enzimas lisossômicas,geração de ânion super óxido tóxico e formação de leucotrienos (Shin, H. S.,etal., Science 162: 361-363, 1968; Vogt, W., Complement 3: 177-86, 1986).Estes efeitos biológicos são considerados desempenhar um papel nodesenvolvimento de complicações da septicemia tais como choque ousíndrome da angústia respiratória aguda (ARDS) (Hammerschmidt, D. E., etal., Lancet 1: 947-949, 1980; Slotman, G. T., et al., Surgery 99: 744-50,1986). Além disso, níveis elevados da anafilatoxina C3a estão associados comum resultado fatal na septicemia (Hack, C. E., et al., Am. J. Med. 86: 20-26,1989). Em alguns modelos de animal de choque, certas cepas deficientes emcomplemento (por exemplo, aquelas deficientes em C5) são mais resistentesaos efeitos de infusões de LPS (Hseuh, W., et al., Immunol. 70: 309-14,1990).

Bloqueio da geração de C5a com anticorpos durante o inícioda septicemia em roedores tem sido mostrado melhorar enormemente asobrevivência (Czermak, B. J., et al., Nat. Med. 5: 788-792, 1999).Descobertas similares foram feitas quando o receptor de C5a (C5aR) foibloqueado, com anticorpos ou com um inibidor molecular pequeno (Huber-Lang, M. S., et al., FASEB J. 16: 1567-74, 2002; Riedemann, N. C., et aL, J.Clin. Invest. 110: 101-8, 2002). Estudos experimentais mais antigos emmacacos têm sugerido que o bloqueio de anticorpo de C5a atenuou o choqueséptico induzido pela E. coli e a síndrome da angústia respiratória do adulto(Hangen, D. H., et al., J. Surg. Res. 46: 195-9, 1989; Stevens, J. H., et al., J.Clin. Invest. 77: 1812-16, 1986). Em seres humanos com septicemia, C5a foielevado e associado com as taxas de sobrevivência significantementereduzidas junto com a insuficiência de órgão múltipla, quando comparadoscom aqueles em pacientes menos severamente sépticos e sobreviventes(Nakae, H., et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 84: 189-95,1994; Nakae, et al., Surg. Today 26: 225-29, 1996; Bengtson, A., et al., Arch.Surg. 123: 645-649, 1988). Os mecanismos pelos quais C5a exerce seusefeitos nocivos durante a septicemia estão ainda para serem investigados emmaiores detalhes, mas dados recentes sugerem que a geração de C5a durante asepticemia significantemente compromete as funções imunes inatas deneutrófilos sangüíneos (Huber-Lang, M. S., et al., J. Immunol. 169: 3223-31,2002), a sua capacidade para expressar um surto respiratório e a suacapacidade para gerar citocinas (Riedemann, N. C., et al., Immunity 19: 193-202, 2003). Além disso, a geração de C5a durante a septicemia parece terefeitos pró-coagulantes (Laudes, I. J., et al., Am. J. Pathol. 160: 1867-75,2002). A proteína que modula complemento CI INH também tem mostradoeficácia em modelos de animal de septicemia e ARDS (Dickneite, G., BehringIns. Mitt. 93: 299-305, 1993).

O caminho da lectina também pode ter um papel napatogênese da septicemia. A MBL tem sido mostrada ligar a uma faixa demicroorganismos clinicamente importantes incluindo bactérias tanto Gram-negativas quanto Gram-positivas e ativar o caminho da lectina (Neth, O., etal., Infect. Immun. 68: 688, 2000). O ácido lipoteicóico (LTA) écrescentemente considerado como a contraparte Gram-positiva de LPS. Este éum imunoestimulante potente que induz a liberação de citocina de fagócitosmononucleares e sangue integral (Morath, S. et al., J. Exp. Med. 195: 1635,2002; Morath, S. et al., Infect. Immun. 70: 938, 2002). Recentemente foidemonstrado que a L-ficolina especificamente se liga ao LTA isolado denumerosas espécies de bactérias Gram-positivas, incluindo Staphilococcusaureus e ativa o caminho da lectina (Lynch, N. J., et al., J. Immunol. 172:1198-02, 2004). A MBL também tem sido mostrada ligar-se ao LTA de

Enterocoeeus spp em que a cadeia de poliglicerofosfato é substituída comgrupos glicosila), mas não ao LTA de nove outras espécies incluindo S.aureus (Polotsky, V. Y., et al., Infect. Immun. 64: 380, 1996).

Um aspecto da invenção fornece assim um método para tratara septicemia ou uma condição que resulta da septicemia, pela administraçãode uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde um agente inibidor de MASP-2 em um veículo farmacêutico a um pacienteque sofre de septicemia ou uma condição que resulta de septicemia incluindosem limitação septicemia severa, choque séptico, síndrome da angústiarespiratória aguda que resulta da septicemia e síndrome da respostainflamatória sistêmica. Métodos relacionados são fornecidos para otratamento de outros distúrbios sangüíneos, incluindo choque hemorrágico,anemia hemolítica, púrpura trombocitopênica trombótica autoimune (TTP), síndrome urêmica hemolítica (HUS) ou outras condições destrutivas damedula/sangue, pela administração de uma composição que compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em umveículo farmacêutico a um paciente que sofre de uma tal condição. O agenteinibidor de MASP-2 é administrado ao paciente sistemicamente, tal comopela administração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional(particularmente no caso de ARDS), subcutânea ou outra administraçãoparenteral ou potencialmente pela administração oral para os agentes nãopeptidérgicos. O agente inibidor da composição de MASP-2 pode sercombinado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para combater asseqüelas da septicemia e/ou choque. Para a septicemia ou choque avançadosou uma condição de angústia que resulta desta, a composição de inibidor deMASP-2 pode ser adequadamente administrada em uma forma de dosagem deação rápida, tal como pela liberação intravenosa ou intra-arterial de um bolode uma solução contendo a composição de agente inibidor de MASP-2. A administração repetida pode ser realizada como determinado por um médicoaté que a condição tenha sido resolvida.

CONDIÇÕES UROGENITAIS

O sistema de complemento foi implicado em diversosdistúrbios urogenitais distintos incluindo a doença da bexiga dolorosa, doençada bexiga sensitiva, cistite não bacteriana crônica e cistite intersticial (Holm-Bentzen, M., et al., J. Urol. 138: 503-507, 1987), infertilidade (Cruz, et al.,Biol. Reprod. 54: 1217-1228, 1996), gravidez (Xu, C., et al., Science 287:498-507, 2000), tolerância fetomaternal (Xu, C., et al., Science 287: 498-507,2000) e pré-eclâmpsia (Haeger, M., Int. J. Gynecol. Obstet. 43: 113-127,1993).

A doença da bexiga dolorosa, a doença da bexiga sensitiva,cistite não bacteriana crônica e cistite intersticial são condições definidas porenfermidade de etiologia e patogênese desconhecidas, e, portanto, estão semnenhuma terapia racional. As teorias patogenéticas com respeito aos defeitosnos revestimentos de superfícies epiteliais e/ou mucósicas da bexiga e teoriascom respeito às perturbações imunológicas, predominam (Holm-Bentzen, M.,et al., J. Urol. 138: 503-507, 1987). Pacientes com cistite intersticial relataramterem sido testados quanto às imunoglobulinas (IgA, G, M), componentes decomplemento (Clq, C3, C4) e quanto ao inibidor da Cl-esterase. Houve umesgotamento altamente significante dos níveis séricos de componente decomplemento C4 (p menor do que 0,001) e a imunoglobulina G foimarcantemente elevada (p menor do que 0,001). Este estudo sugere a ativaçãodo sistema de complemento do caminho clássico e sustenta a possibilidade deque um processo imunológico local crônico esteja envolvido na patogênese dadoença (Mattila, J., et al., Eur. Urol. 9: 350-352, 1983). Além disso, a seguirda ligação de autoanticorpos aos antígenos na mucosa da bexiga, a ativaçãode complemento estaria envolvida na produção de lesão de tecido e nainflamação auto-perpetuante crônica típica desta doença (Helin, H., et al.,Clin. Immunol. Immunopathol. 43: 88-96, 1987).

Além do papel de complemento em doenças inflamatóriasurogenitais, as funções reprodutivas podem ser impactadas pela regulagemlocal do caminho de complemento. Inibidores de complemento que ocorremnaturalmente têm evoluído para fornecer células hospedeiras com a proteçãoque eles necessitam para controlar o sistema de complemento do corpo. Crry,um inibidor de complemento de roedor que ocorre naturalmente que éestruturalmente similar aos inibidores de complemento humanos, MCP eDAF, tem sido investigado para delinear o controle regulatório decomplemento no desenvolvimento fetal. De maneira interessante, tentativaspara gerar camundongos Crry-/- foram mal sucedidas. Ao invés, foidescoberto que camundongos Crry-/- homozigotos morreram no útero. Osembriões Crry-/- sobreviveram até cerca de 10 dias após o coito e asobrevivência rapidamente declinou com morte resultante de parada dedesenvolvimento. Também houve uma invasão marcante de célulasinflamatória no tecido placentário de embriões Crry-/-. Ao contrário, osembriões Crry+/+ apareceram ter C3 depositado na placenta. Isto sugere que aativação de complemento ocorreu ao nível da placenta e na ausência deregulagem de complemento, os embriões morreram. Estudos confirmatóriosinvestigaram a introdução da mutação Crry em um fundo deficiente em C3.

Esta estratégia de resgate foi bem sucedida. Juntos, estes dados ilustram que ainterface de complemento fetomaternal deve ser regulada. Alterações sutis naregulagem de complemento dentro da placenta poderia contribuir para adisfunção placentária e aborto (Xu, C., et al., Science 287: 498-507, 2000).

A pré-eclâmpsia é um distúrbio hipertensivo induzido nagravidez em que a ativação do sistema de complemento foi implicado maspermanece controverso (Haeger, M., Int. J. Gynecol. Obstet. 43: 113-127,1993). A ativação de complemento na circulação sistêmica está intimamenterelacionada com a doença estabelecida na pré-eclâmpsia, mas nenhumaelevação foi observada antes da presença de sintomas clínicos e, portanto, oscomponentes de complemento não podem ser usados como prognosticadoresda pré-eclâmpsia (Haeger, et al., Obstet. Gynecol. 78: 46, 1991). Entretanto, aativação de complemento aumentada no ambiente local do leito placentáriopoderia superar os mecanismos de controle local, resultando em níveiselevados de anafilatoxinas e C5b-9 (Haeger, et al., Obstet. Gynecol. 73: 551,1989).

Um mecanismo proposto de infertilidade relacionada comanticorpos antiesperma (ASA) é através do papel da ativação de complementono trato genital. A geração de C3b e iC3b opsonina, que pode potenciar aligação do esperma pelas células fagocíticas por intermédio dos seusreceptores de complemento assim como a formação do complexo C5b-9terminal na superfície do esperma, reduzindo deste modo a motilidade doesperma, são causas potenciais associadas com a fertilidade reduzida. Osníveis de C5b-9 elevados também foram demonstrados em fluido folicularovariano de mulheres inférteis (D'Cruz, O. J., et al., J. Immunol. 144: 3841-3848, 1990). Outros estudos têm mostrado deterioração na migração doesperma e interações esperma/óvulo reduzidas, que pode estar associada comcomplemento (D'Cruz, O. J., et al., J. Immunol. 146: 611-620, 1991;Alexander, N. J., Fértil. Steril. 41: 433-439, 1984). Finalmente, estudos comsCRl demonstraram um efeito protetor contra a lesão mediada por ASA ecomplemento ao esperma humano (D'Cruz, O. J., et al., Biol. Reprod. 54:1217-1228, 1996). Estes dados fornecem diversas linhas de evidência para ouso de inibidores de complemento no tratamento de doenças e distúrbios urogenitais.

Um aspecto da invenção fornece assim um método para inibira ativação de complemento dependente de MASP-2 em um paciente que sofrede um distúrbio urogenital, pela administração de uma composição quecompreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidorde MASP-2 em um veículo farmacêutico a um paciente que sofre de um taldistúrbio. Acredita-se que os distúrbios urogenitais a serem submetidos aotratamento terapêutico com os métodos e composições da presente invençãoincluem, por via de exemplo não limitante, doença da bexiga dolorosa, doençada bexiga sensitiva, cistite não bacteriana crônica e cistite intersticial, infertilidade masculina e feminina, disfunção placentária e aborto e pré-eclâmpsia. O agente inibidor de MASP-2 pode ser administrado ao pacientesistemicamente, tal como pela administração intra-arterial, intravenosa,intramuscular, inalacional, subcutânea ou outra administração parenteral oupotencialmente pela administração oral para agentes não peptidérgicos.Alternativamente, a composição de inibidor de MASP-2 pode ser liberadalocalmente ao trato urogenital, tal como pela irrigação intravesical ouinstilação com uma solução líquida ou composição em gel. A administraçãorepetida pode ser realizada como determinado por um médico para controlarou resolver a condição.

DIABETE E CONDIÇÕES DIABÉTICAS

A microangiopatia retinal diabética é caracterizada pelapermeabilidade aumentada, leucostasia, microtrombose e apoptose de célulascapilares, todas as quais seriam causadas ou promovidas pela ativação decomplemento. As estruturas glomerulares e os micro vasos endoneuriais depacientes com diabete mostram sinais da ativação de complemento. Adisponibilidade ou eficácia diminuídas de inibidores de complemento nadiabete tem sido sugerido pelas descobertas de que a alta glicose in vitrodiminui seletivamente na superfície da célula endotelial a expressão de CD55e CD59, os dois inibidores que são proteínas de membrana ancoradas aoglicosilfosfatidilinositol (GPI) e que CD59 passa pela glicação não enzimáticaque impede a sua função inibidora de complemento.

Estudos por Zhang et ai (Diabete 51: 3499-3504, 2002),investigou a ativação de complemento como um traço da retinopatia diabéticanão proliferativa humana e a sua associação com mudanças nas moléculasinibidoras. Foi descoberto que a deposição de C5b-9, o produto terminal daativação de complemento, ocorre na parede de vasos retinais de doadores deolhos humanos com diabete tipo-2, mas não nos vasos de doadores nãodiabéticos igualados em idade. Clq e C4, os componentes de complementoúnicos para o caminho clássico, não foram detectados nas retinas diabéticas, oque indica que C5b-9 foi gerado por intermédio do caminho alternativo. Osdoadores diabéticos mostraram uma redução prominente nos níveis retinais deCD55 e CD59, os dois inibidores de complemento ligados à membranaplasmática pelas âncoras de GPI. A ativação de complemento em vasosretinais e a redução seletiva nos níveis de CD55 e CD59 retinais similaresforam observadas em ratos com uma duração de 10 semanas de diabeteinduzida por estreptozotocina. Assim, a diabete parece causar regulagemdefeituosa de inibidores de complemento e ativação de complemento queprecede a maioria das outras manifestações de microangiopatia retinaldiabética.

Gerl et al. (Investigative Ophthalmology and Visual Science43: 1104-08, 2000) determinaram a presença de componentes decomplemento ativados nos olhos afetados pela retinopatia diabética. Estudosimunoistoquímicos descobriram depósitos extensivos de complexos C5b-9 decomplemento que foram detectados no coriocapilar imediatamente subjacenteà membrana de Bruch e densamente circundando os capilares em todos os 50espécimes de retinopatia diabética. O tingimento para C3d positivamentecorrelacionou-se com o tingimento de C5b-9, indicativo do fato de que aativação de complemento ocorreu in situ. Além disso, o tingimento positivofoi descoberto para vitronectina, que forma complexos estáveis com C5b-9extracelular. Ao contrário, não houve tingimento positivo para a proteínareativa C (CRP), lectina que liga manana (MBL), Clq ou C4, indicando que aativação de complemento não ocorreu através de um caminho dependente deC4. Assim, a presença de C3d, C5b-9 e vitronectina indica que a ativação decomplemento ocorre até a conclusão, possivelmente através do caminhoalternativo nos coriocapilares mos olhos afetados pela retinopatia diabética. Aativação de complemento pode ser um fator causativo nas seqüelaspatológicas que podem contribuir para a doença de tecido ocular e adeterioração visual. Portanto, o uso de um inibidor de complemento pode seruma terapia eficaz para reduzir ou bloquear o lesão aos microvasos que ocorrena diabete.

A diabete melito dependente de insulina (IDDM, tambémaludida como diabete Tipo-1) é uma doença autoimune associada com apresença de tipos diferentes de autoanticorpos (Nicoloff et al., Clin. Dev.Immunol. 11: 61-66, 2004). A presença destes anticorpos e dos antígenoscorrespondentes na circulação leva à formação de complexos imunescirculatórios (CIC), que são conhecidos por persistir no sangue por períodoslongos de tempo. A deposição de CIC nos vasos sangüíneos pequenos tem opotencial de levar à microangiopatia com conseqüências clínicas debilitantes.Uma correlação existe entre CIC e o desenvolvimento de complicaçõesmicrovasculares em crianças diabéticas. Estas descobertas sugerem que níveiselevados de IgG de CIC estão associados com o desenvolvimento danefropatia diabética precoce e que um inibidor do caminho de complementopode ser eficaz no bloqueio da nefropatia diabética (Kotnik, et al., Croat.Med. J. 44: 707-11, 2003). Além disso, a formação de proteínas decomplemento a jusante e o envolvimento do caminho alternativo é provávelde ser um fator contribuidor na função da célula da ilhota global na IDDM e ouso de um inibidor de complemento para reduzir o lesão potencial ou limitar amorte celular é esperado (Caraher, et al., J. Endocrinol. 162: 143-53, 1999).

As concentrações de MBL circulantes são significantementeelevadas em pacientes com diabete tipo 1 comparados com controlessaudáveis e estas concentrações de MBL correlacionam-se positivamente coma excreção da albumina urinária (Hansen et al., J. Clin. Endocrinol. Metab.88: 4857-61, 2003). Um estudo clínico recente descobriu que as freqüênciasde genótipos de MBL de expressão alta e baixa foram similares entrepacientes com diabete tipo 1 e controles saudáveis (Hansen et al., Diabetes53: 1570-76, 2004). Entretanto, o risco de se ter nefropatia entre os pacientescom diabete foi significantemente aumentado se eles tiveram um genótipo deMBL alto. Isto indica que níveis de MBL altos e a ativação de complementodo caminho da lectina podem contribuir para o desenvolvimento da nefropatiadiabética. Esta conclusão é sustentada por um estudo prospectivo recente emque a associação entre níveis de MBL e o desenvolvimento de albuminuriaem um grupo de pacientes com diabete tipo 1 recém diagnosticada foiexaminada (Hovind et al., Diabetes 54: 1523-27, 2005). Eles descobriram queníveis altos de MBL prematuros no curso da diabete tipo 1 foramsignificantemente associados com o desenvolvimento posterior daalbuminuria persistente. Estes resultados sugerem que MBL e o caminho dalectina podem estar envolvidos na patogênese específica das complicaçõesvasculares diabéticas mais do que meramente causando uma aceleração dealterações existentes. Em um estudo clínico recente (Hansen et al., Arch.Intern. Med. 166: 2007-13, 2006), os níveis de MBL foram medidos na linhade base em um grupo bem caracterizado de pacientes com diabete tipo 2 quereceberam mais do que 15 anos de acompanhamento. Eles descobriram quemesmo depois do ajuste para confundidores conhecidos, o risco de morrer foisignificantemente mais alto entre pacientes com níveis plasmáticos de MBLaltos (>1000 μg/L) do que entre pacientes com níveis de MBL baixos (<1000μg/L).

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que sofre de diabete em não obeso (IDDM) ou de complicações deangiopatia, neuropatia ou retinopatia de IDDM ou diabete de início no adulto(Tipo-2), pela administração de uma composição que compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de MASP-2 em umveículo farmacêutico. O agente inibidor de MASP-2 pode ser administrado aopaciente sistemicamente, tal como pela administração intra-arterial,intravenosa, intramuscular, subcutânea ou outra administração parenteral oupotencialmente pela administração oral para agentes não peptidérgicos.

Alternativamente, a administração pode ser pela liberação local ao sítio desintomas angiopáticos, neuropáticos ou retinopáticos. O agente inibidor deMASP-2 pode ser administrado periodicamente em um período de tempoampliado para o tratamento ou controle de uma condição crônica ou por umaúnica administração ou séries de administrações para o tratamento de umacondição aguda.

ADMINISTRAÇÃO PERIQUIMIOTERAPÊUTICA E TRATAMENTO DEMALIGNI PAPES

A ativação do sistema de complemento também pode estarimplicada na patogênese de malignidades. Recentemente, os neoantígenos docomplexo de complemento C5b-9, IgG, C3, C4, proteína S/vitronectina,fíbronectina e macrófagos foram localizados em 17 amostras de câncer demama e nas 6 amostras de tumores de mama benignos usando anticorpos policlonais ou monoclonais e a técnica da estreptavidina-biotina-peroxidase.Todas as amostras de tecido com carcinoma em cada um dos estágios TNMapresentaram depósitos C5b-9 sobre as membranas de células de tumor,grânulos finos nos resíduos celulares e depósitos difusos nas áreas necróticas(Niculescu, F., et al., Am. J. Pathol. 140: 1039-1043, 1992).

Além disso, a ativação de complemento pode ser umaconseqüência da quimioterapia ou terapia de radiação e assim a inibição daativação de complemento seria útil como um adjunto no tratamento demalignidades para reduzir a inflamação iatrogênica. Quando a quimioterapia eterapia de radiação precedeu a cirurgia, depósitos de C5b-9 foram maisintensos e ampliados. Os depósitos de C5b-9 foram ausentes em todas asamostras com lesões benignas. A proteína S/vitronectina estava presentecomo depósitos fibrilares na matriz de tecido conectivo e como depósitosdifusos em torno das células de tumor, menos intensos e ampliados do que afíbronectina. Depósitos de IgG, C3 e C4 estavam presentes apenas nas amostras de carcinoma. A presença de depósitos C5b-9 é indicativa daativação de complemento e os seus efeitos patogenéticos subseqüentes nocâncer de mama (Niculescu, F., et al., Am. J. Pathol. 140: 1039-1043, 1992).

A terapia a laser de pigmento harmonioso pulsado (577 nm)(PTDL) induz a coagulação da hemoglobina e necrose de tecido, que éprincipalmente limitada aos vasos sangüíneos. Em um estudo de pele normalirradiada com PTDL, as descobertas principais foram como segue: 1)fragmentos C3, C8, C9 e MAC foram depositados nas paredes do vaso; 2)estes depósitos não foram devido à desnaturação das proteínas visto que osmesmos tornaram-se evidentes apenas 7 min depois da irradiação, contrário àdeposição imediata de transferrina nos locais de coágulos de eritrócito; 3) osdepósitos de C3 foram mostrados amplificar a ativação de complemento pelocaminho alternativo, uma reação que foi específica visto que a própria necrosede tecido não levou à tal amplificação; e 4) estas reações precederam oacúmulo local de leucócitos polimorfonucleares. A necrose de tecido foi maispronunciada nos hemangiomas. Os vasos angiomatosos maiores no centro danecrose não fixaram complemento significantemente. Ao contrário, adeposição de complemento nos vasos situados na periferia foi similar àquelaobservada na pele normal com uma exceção: C8, C9 e MAC foram detectadosem alguns vasos sangüíneos imediatamente depois do tratamento com laser,uma descoberta compatível com a montagem do MAC que ocorre diretamentesem a formação de uma C5 convertase. Estes resultados indicam que ocomplemento é ativado na necrose vascular induzida por PTDL e seriaresponsável por resultar em resposta inflamatória.

A terapia fotodinâmica (PDT) de tumores evoca uma respostaimune do hospedeiro forte e uma de suas manifestações é uma neutrofiliapronunciada. Além de fragmentos de complemento (mediadores diretos)liberados como uma conseqüência da ativação de complemento induzida porPDT, existem pelo menos uma dúzia de mediadores secundários que todossurgem como um resultado da atividade de complemento. Os últimos incluemcitocinas IL-I beta, TNF-alfa, IL-6, IL-10, G-CSF e KC, tromboxano,prostaglandinas, leucotrienos, histamina e fatores de coagulação (Cecic, I., etal., CancerLett. 183: 43-51, 2002).

Finalmente, o uso de inibidores da ativação de complementodependente de MASP-2 pode ser prevista em conjunção com o regimeterapêutico padrão para o tratamento de câncer. Por exemplo, o tratamentocom rituximab, um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico, pode estarassociado com efeitos colaterais de primeira dose de moderado a severo,notavelmente em pacientes com altos números de células de tumorcirculantes. Estudos recentes durante a primeira infusão de rituximab mediu aativação de produtos de complemento (C3b/c e C4b/c) e citocinas (fator alfade necrose de tumor (TNF-alfa), interleucina 6 (IL-6) e IL-8) em cincopacientes com linfoma não de Hodgkin (NHL) com grau baixo dereincidência. A infusão de rituximab induziu a ativação rápida decomplemento, precedendo a liberação de TNF-alfa, IL-6 e IL-8. Embora ogrupo de estudo fosse pequeno, o nível da ativação de complemento pareceuestar correlacionado tanto com o número de células B circulantes antes dainfusão (r = 0,85; P = 0,07) e com a severidade dos efeitos colaterais. Osresultados indicaram que o complemento desempenha um papel central napatogênese de efeitos colaterais do tratamento com rituximab. Como aativação de complemento não pode ser evitada pelos corticosteróides, podeser relevante estudar o papel possível de inibidores de complemento durante aprimeira administração de rituximab (van der Kolk, L. E., et al., Br. J.Haematol. 115: 807-811, 2001).

Em um outro aspecto da invenção, métodos são fornecidospara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente que é tratado com produtos quimioterapêuticos e/ou terapia deradiação, incluindo sem limitação para o tratamento de condições cancerosas.

Este método inclui administrar uma composição que compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de MASP-2 em umveículo farmacêutico a um paciente periquimioterapeuticamente, isto é, antese/ou durante e/ou depois da administração de produto(s) quimioterapêutico(s)e/ou terapia de radiação. Por exemplo, a administração de uma composiçãoinibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser começada antes ouconcorrentemente com a administração de quimioterapia ou terapia deradiação e continuada por todo o curso de terapia, para reduzir os efeitosnocivos da quimioterapia e/ou terapia de radiação nos tecidos saudáveis nãoalvejados. Além disso, a composição do inibidor de MASP-2 pode seradministrada a seguir da quimioterapia e/ou terapia de radiação. E entendidoque os regimes de quimioterapia e terapia de radiação freqüentementeacarretam tratamentos repetidos e, portanto, é possível que a administração deuma composição de inibidor de MASP-2 também seja repetitiva erelativamente coincidente com os tratamentos com produto quimioterapêuticoe radiação. Também acredita-se que os agentes inibidores de MASP-2 possamser usados como agentes quimioterapêuticos, sozinhos ou em combinaçãocom outros agentes quimioterapêuticos e/ou terapia de radiação, para tratarpacientes que sofrem de malignidades. A administração pode seradequadamente por intermédio oral (para não peptidérgicos), intravenosa,intramuscular ou outra via parenteral.DISTÚRBIOS ENDÓCRINOS

O sistema de complemento também foi recentementeassociado com umas poucas condições ou distúrbios endócrinos incluindotireoidite de Hashimoto (Blanchin, S., et al., Exp. Eye Res. 73(6): 887-96,2001), estresse, ansiedade e outros distúrbios hormonais potenciais queenvolvem a liberação regulada de prolactina, fator de crescimento ou fator decrescimento equivalente à insulina e adrenocorticotropina da pituitária(Francis, K., et al., FASEB J. 17: 2266-2268, 2003; Hansen, T. K.,Endocrinology 144(12): 5422-9, 2003).

Comunicação de duas vias existe entre os sistemas endócrino eimune usando moléculas tais como hormônios e citocinas. Recentemente, umnovo caminho foi elucidado pelo qual C3a, uma citocina derivada decomplemento, estimula a liberação de hormônio da pituitária anterior e ativa oeixo hipotalâmico-pituitário-adrenal, um reflexo central para a resposta aoestresse e para o controle da inflamação. Os receptores de C3a sãoexpressados nas células que secretam hormônio da pituitária e células que nãosecretam hormônio (foliculoestrelada). C3a e C3adesArg (um metabólito nãoinflamatório) estimulam as culturas de célula da pituitária à liberação deprolactina, hormônio do crescimento e adrenocorticotropina. Os níveis séricosdestes hormônios, juntos com corticosterona adrenal, aumentamdependentemente da dose com a administração in vivo de C3a e C3adesArgrecombinante. A implicação é que o caminho de complemento modula asrespostas inflamatórias específicas de tecido e sistêmicas através dacomunicação com a glândula pituitária endócrina (Francis, K., et al., FASEBJ. 17: 2266-2268, 2003).

Um número crescente de estudos em animais e seres humanosindicam que o hormônio do crescimento (GH) e o fator de crescimento Iequivalente à insulina (IGF-I) modulam a função imune. A terapia de GHaumentou a mortalidade em pacientes criticamente enfermos. A mortalidadeexcessiva foi quase inteiramente devido ao choque séptico ou insuficiência deórgão múltipla, que poderia sugerir que uma modulação induzida por GH dafunção imune e de complemento estivesse envolvida. A lectina que ligamanana (MBL) é uma proteína plasmática que desempenha um papelimportante na imunidade inata através da ativação da cascata de complementoe inflamação a seguir da ligação às estruturas de carboidrato. Evidênciasustenta uma influência significante do hormônio do crescimento nos níveisde MBL e, portanto, potencialmente sobre a ativação de complementodependente de lectina (Hansen, T. K., Endocrinology 144(12): 5422-9, 2003).

A tiroperoxidase (TPO) é um dos autoantígenos principaisenvolvidos nas doenças da tireóide autoimunes. A TPO consiste de ummódulo equivalente à mieloperoxidase de terminal N grande seguido por ummódulo equivalente à proteína de controle complementar (CCP) e um móduloequivalente ao fator de crescimento epidérmico. O módulo CCP é umconstituinte das moléculas envolvidas na ativação do componente decomplemento C4 e estudos foram conduzidos para investigar se C4 podeligar-se à TPO e ativar o caminho de complemento em condições autoimunes.

A TPO por intermédio do seu módulo CCP diretamente ativa complementosem qualquer mediação pela Ig. Além disso, em pacientes com tireoidite deHashimoto, os tirócitos superexpressam C4 e todos os componentes docaminho de complemento a jusante. Estes resultados indicam que a TPO,junto com outros mecanismos relacionados com a ativação do caminho decomplemento, podem contribuir para a destruição celular maciça observadana tireoidite de Hashimoto (Blanchin, S., et ai., 2001).

Um aspecto da invenção fornece assim um método para inibira ativação de complemento dependente de MASP-2 para tratar um distúrbioendócrino, pela administração de uma composição que compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 em umveículo farmacêutico a um paciente que sofre de um distúrbio endócrino. Ascondições do paciente para o tratamento de acordo com a presente invençãoincluem, por via de exemplo não limitante, a tireoidite de Hashimoto,estresse, ansiedade e outros distúrbios hormonais potenciais que envolvem aliberação regulada de prolactina, fator de crescimento ou fator de crescimentoequivalente à insulina e adrenocorticotropina da pituitária. O agente inibidorde MAS-2 pode ser administrado ao paciente sistemicamente, tal como pelaadministração intra-arterial, intravenosa, intramuscular, inalacional, nasal,subcutânea ou outra administração parenteral ou potencialmente pelaadministração oral para agentes não peptidérgicos. A composição de agenteinibidor de MASP-2 pode ser combinada com um ou mais agentesterapêuticos adicionais. A administração pode ser repetida como determinadopor um médico até que a condição tenha sido resolvida.

CONDIÇÕES OFTALMOLÓGICASA degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é umadoença que cega, que aflige milhões de adultos, não obstante as seqüelas deeventos bioquímicos, celulares e/ou moleculares que levam aodesenvolvimento da AMD são deficientemente entendidas. A AMD resulta nadestruição progressiva da mácula que tem sido correlacionada com aformação de depósitos extracelulares chamados de drusa localizados na e emtorno da mácula, por detrás da retina e entre o epitélio de pigmento retinal(RPE) e a coróide. Estudos recentes têm revelado que as proteínas associadascom a inflamação e imuno-mediadas por processes são prevalecentes entre osconstituintes associados com a drusa. Transcritos que codificam várias destasmoléculas foram detectadas em células retinais, RPE e coroidais. Estes dadostambém demonstram que células dendríticas, que são células que apresentamantígeno potentes, são intimamente associadas com o desenvolvimento dedrusa e que a ativação de complemento é um caminho chave que é ativo tantodentro da drusa quanto ao longo da interface RPE-coróide (Hageman, G. S., et al., Prog. Retin. Eye Res., 20: 705-732, 2001).

Diversos estudos independentes têm mostrado uma forteassociação entre AMD e um polimorfismo genético no gene para o fator H decomplemento (CFH) em que a probabilidade de AMD é aumentada por umfator de 7,4 em indivíduos homozigotos quanto ao alelo de risco (Klein, R. J.et al., Science, 308: 362-364, 2005; Haines et al., Science 308: 362-364.2005; Edwards et al., Science 308: 263-264, 2005). O gene CFH foi mapeadopara o cromossoma lq31 uma região que foi implicada na AMD por seisvarreduras de ligação independente (ver, por exemplo, D. W. Schultz et al.,Hum. Mol. Genet. 12: 3315, 2003). A CFH é conhecida ser um reguladorchave do sistema de complemento. Foi mostrado que CFH nas células e nacirculação regula a atividade de complemento pela inibição da ativação de C3para C3a e C3b e pela inativação de C3b existente. A deposição de C5b-9 foiobservada na membrana de Brusch, nos pilares intercapilares e dentro dadrusa em pacientes com AMD (Klein et al.). Os experimentos deimunofluorescência sugerem que na AMD, o polimorfismo de CFH pode darorigem à deposição de complemento nos capilares coroidais e vasos coroidais(Klein et al.).

O inibidor de complemento associado à membrana, o receptorde complemento 1, também está localizado na drusa, mas o mesmo não édetectado em células RPE imunoistoquimicamente. Ao contrário, um segundoinibidor de complemento associado à membrana, proteína de co-fator demembrana, está presente nas células RPE associadas com a drusa, assim comoem elementos pequenos, esféricos subestruturais dentro da drusa. Esteselementos anteriormente não identificados também mostramimunorreatividade forte para os fragmentos proteolíticos de componente decomplemento C3 que são caracteristicamente depositados nos locais daativação de complemento. E proposto que estas estruturas representam fragmentos residuais de células RPE degenerantes que são os alvos de ataquedo complemento (Johnson, L. V., et al., Exp. Eye Res. 73: 887-896, 2001).

A identificação e localização destes reguladores decomplemento múltiplos assim como a ativação de produtos de complemento(C3a, C5a, C3b, C5b-9) têm levado os investigadores a concluírem que a ativação de complemento crônica desempenha um papel importante noprocesso da biogênese de drusa e na etiologia da AMD (Hageman et al.,Progress Retinal Eye Res. 20: 705-32, 2001). A identificação de produtos daativação de C3 e C5 na drusa não fornece nenhum discernimento a cerca de seo complemento é ativado por intermédio do caminho clássico, do caminho da lectina ou da alça de amplificação alternativa, como entendido de acordo coma presente invenção, visto que tanto C3 quanto C5 são comuns a todos os três.Entretanto, dois estudos têm observado quanto a imuno-rotulação da drusausando anticorpos específico para Clq, o componente de reconhecimentoessencial para a ativação do caminho clássico (Mullins et al., FASEB J. 14:835-846, 2000; Johnson et al., Exp. Eye Res. 70: 441-449, 2000). Ambos osestudos concluíram que a imuno-rotulação de Clq na drusa não foi no geralobservada. Estes resultados negativos com Clq sugerem que a ativação decomplemento na drusa não ocorre por intermédio do caminho clássico. Alémdisso, a imuno-rotulação da drusa quanto aos constituintes do complexoimune (as cadeias leves de IgG, IgM) está relatada no estudo de Mullins et al.,2000 como sendo de fraca a variável, indicando ainda que o caminho clássicodesempenha um papel menor na ativação de complemento que ocorre nesteprocesso de doença.

Dois estudos publicados recentes têm avaliado o papel decomplemento no desenvolvimento da neovascularização coroidal (CNV)induzida por laser em camundongos, um modelo de CNV humano. Usandométodos imuno-histológicos, Bora e colegas (2005) descobriram deposiçãosignificante da ativação de produtos de complemento C3b e C5b-9 (MAC) nocomplexo neovascular seguinte ao tratamento com laser (Bora et al., J.Immunol. 174: 491-7, 2005). De maneira importante, a CNV não desenvolveem camundongos geneticamente deficientes em C3 (camundongos C3-/-), ocomponente essencial requerido em todos os caminhos de ativação decomplemento. Os níveis de mensagem de RNA para VEGF, TGF-P2 e β-FGF,três fatores angiogênicos implicados na CNV, foram elevadas no tecidoocular de camundongos depois da CNV induzida por laser. Significantemente,o esgotamento de complemento resultou em uma redução marcante nos níveisde RNA destes fatores angiogênicos.

Usando métodos de ELISA, Nozaki e colegas demonstraramque as anafilatoxinas C3a e C5a potentes são geradas no início no curso deCNV induzida por laser (Nozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 103:2328-33, 2006). Além disso, estes dois fragmentos bioativos de C3 e C5induziram a expressão de VEGF seguinte à injeção intravítrea noscamundongos do tipo selvagem. Compatível com estes resultados Nozaki ecolegas também mostraram que a ablação genética de receptores para C3a eC5a reduz a expressão de VEGF e a formação de CNV depois da lesão porlaser e que a neutralização mediada por anticorpo de C3a ou C5a ou obloqueio farmacológico de seus receptores também reduz a CNV. Estudosanteriores têm estabelecido que o recrutamento de leucócitos e macrófagosem particular, desempenha um papel central na CNV induzida por laser(Sakurai et al., Invest. Opthomol. Vis. Sei. 44: 3578-85, 2003; Espinosa-Heidmann, et al, Invest. Opthomol. Vis. Sei. 44: 3586-92, 2003). No seudocumento de 2006, Nozaki e colegas relatam que o recrutamento deleucócito é marcantemente reduzido em camundongos C3aR(-/-) e C5aR(-/-)depois da lesão a laser.

Um aspecto da invenção fornece assim um método para inibira ativação de complemento dependente de MASP-2 para tratar a degeraçãomacular relacionada com a idade ou outra condição oftalmológica mediadapor complemento pela administração de uma composição que compreendeuma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2em um veículo farmacêutico a um paciente que sofre de uma tal condição ououtra condição oftalmológica mediada por complemento. A composição deinibidor de MASP-2 pode ser administrada localmente aos olhos, tal comopela irrigação ou aplicação da composição na forma de um gel, pomada ougotas. Alternativamente, o agente inibidor de MASP-2 pode ser administradoao paciente sistemicamente, tal como pela administração intra-arterial,intravenosa, intramuscular, inalacional, nasal, subeutânea ou outraadministração parenteral ou potencialmente pela administração oral paraagentes não peptidérgicos. A composição de agente de inibidor de MASP-2pode ser combinada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, taiscomo são divulgados na Publicação do Pedido de Patente U.S. N- 2004-0072809-A1. A administração pode ser repetida como determinado por ummédico até que a condição tenha sido resolvida ou esteja controlada.IV. AGENTES INIBIDORES DE MASP-2

Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de inibiros efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2. Osagentes inibidores de MASP-2 são administrados em uma quantidade eficazpara inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em umpaciente vivo. Na prática deste aspecto da invenção, os agentes inibidores deMASP-2 representativos incluem: moléculas que inibem a atividade biológicade MASP-2 (tal como inibidores de molécula pequena, anticorpos anti-MASP-2 ou peptídeos bloqueadores que interagem com MASP-2 ouinterferem com uma interação de proteína-proteína) e moléculas quediminuem a expressão de MASP-2 (tais como as moléculas de ácido nucleicode anti-sentido de MASP-2, as moléculas de RNAi específicas de MASP-2 eribozimas de MASP-2), prevenindo deste modo MASP-2 de ativar oscaminhos de complemento alternativos. Os agentes inibidores de MASP-2podem ser usados sozinhos como uma terapia primária ou em combinaçãocom outros produtos terapêuticos como uma terapia adjuvante para realçar osbenefícios terapêuticos de outros tratamentos médicos.

A inibição da ativação de complemento dependente de MASP-2 é caracterizada por pelo menos uma das seguintes mudanças em umcomponente do sistema de complemento que ocorre como um resultado daadministração de um agente inibidor de MASP-2 de acordo com os métodosda invenção: a inibição da geração ou produção dos produtos da ativação dosistema de complemento dependente de MASP-2 C4b, C3a, C5a e/ou C5b-9(MAC) (medidos, por exemplo, como descrito no Exemplo 2), a redução daativação de complemento alternativa avaliada em um ensaio hemolíticousando as células sangüíneas vermelhas de coelho ou porquinho da índia nãosensibilizados, a redução da clivagem de C4 e a deposição de C4b (medida,por exemplo como descrito no Exemplo 2) ou a redução da clivagem de C3 edeposição de C3b (medido, por exemplo, como descrito no Exemplo 2).De acordo com a presente invenção, os agentes inibidores deMASP-2 são utilizados que são eficazes na inibição da ativação do sistema decomplemento dependente de MASP-2. Os agentes inibidores de MASP-2úteis na prática deste aspecto da invenção incluem, por exemplo, anticorposanti-MASP-2 e fragmentos destes, péptídeos inibidores de MASP-2,moléculas pequenas, receptores solúveis e inibidores de expressão de MASP-2. Os agentes inibidores de MASP-2 podem inibir a ativação do sistema decomplemento dependente de MASP-2 pelo bloqueio da função biológica deMASP-2. Por exemplo, um agente inibidor pode eficazmente bloquear asinterações de proteína para proteína de MASP-2, interfere com a dimerizaçãoou montagem de MASP-2, bloqueia a ligação de Ca , interfere com o sítioativo da serina protease de MASP-2 ou pode reduzir a expressão da proteínade MASP-2.

Em algumas formas de realização, os agentes inibidores deMASP-2 que inibem seletivamente a ativação de complemento de MASP-2,deixando a ativação do sistema de complemento dependente de Clqfuncionalmente intacto.

Em uma forma de realização, um agente inibidor de MASP-2útil nos métodos da invenção é um agente inibidor de MASP-2 específico queespecificamente se liga a um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO: 6com uma afinidade de pelo menos 10 vezes maior do que para outrosantígenos no sistema de complemento. Em uma outra forma de realização, umagente inibidor de MASP-2 especificamente se liga a um polipeptídeo quecompreende a SEQ ID NO: 6 com uma afinidade de ligação de pelo menos100 vezes maior do que para outros antígenos no sistema de complemento. Aafinidade de ligação do agente inibidor de MASP-2 pode ser determinadausando um ensaio de ligação adequado.

O polipeptídeo de MASP-2 exibe uma estrutura molecularsimilar a MASP-1, MASP-3 e Clr e Cls, as proteases do sistema decomplemento Cl. A molécula de cDNA apresentada na SEQ ID NO: 4codifica um exemplo representativo de MASP-2(que consiste da seqüência deaminoácido apresentada na SEQ ID NO: 5) e fornece o polipeptídeo deMASP-2 humana com uma seqüência líder (aminoácido de 1 a 15) que éclivada depois da secreção, resultando na forma madura de MASP-2 humana(SEQ ID NO: 6). Como mostrado na FIGURA 2, o gene da MASP 2 humanoabrange doze exons. O cDNA de MASP-2 humano é codificado pelo exons B,C, D, F, G, Η, I, J, K e L. Uma junção alternativa resulta em uma proteína de20 kDa chamada de proteína associada a MBL 19 ("MApl9", também aludidacomo "sMAP") (SEQ ID NO: 2), codificada pela (SEQ ID NO: 1) que seorigina dos exons B, C, D e E como mostrado na FIGURA 2. A molécula decDNA apresentada na SEQ ID NO: 50 codifica o MASP-2 de murino (queconsiste da seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 51) efornece o polipeptídeo MASP-2 de murino com uma seqüência líder que éclivada depois da secreção, resultando na forma madura de MASP-2 demurino (SEQ ID NO: 52). A molécula de cDNA apresentada na SEQ ID NO:53 codifica a MASP-2 de rato (que consiste da seqüência de aminoácidoapresentada na SEQ ID NO: 54) e fornece o polipeptídeo de MASP-2 de ratocom uma seqüência líder que é clivada depois da secreção, resultando naforma madura de MASP-2 de rato (SEQ ID NO: 55).

Aqueles habilitados na técnica reconhecem que as seqüênciasdivulgadas na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 53 representamalelos únicos de MASP-2 de ser humano, murino e rato respectivamente e quea variação e junção alélicas alternativas são esperadas ocorrer. As variantesalélicas das seqüências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 50 e SEQ ID NO: 53, incluindo aquelas contendo mutações silenciosas eaquelas em que mutações resultam nas mudanças de seqüência deaminoácido, estão dentro do escopo da presente invenção. As variantesalélicas da seqüência de MASP-2 podem ser clonadas sondando-se bibliotecasde cDNA ou genômicas de indivíduos diferentes de acordo comprocedimentos padrão.

Os domínios da proteína MASP-2 humana (SEQ ID NO: 6)são mostrados na FIGURA 3A e incluem um domínio da proteínamorfogênica de Clr/Cls/Vegf de ouriço-do-mar/osso de terminal N (CUBI)(aminoácidos de 1 a 121 da SEQ ID NO: 6), um domínio equivalente ao fatorde crescimento epidérmico (aminoácidos de 122 a 166), um segundo domínioCUBI (aminoácidos de 167 a 293), assim como um tandem de domínios deproteína de controle de complemento e um domínio de serina protease. Asjunções alternativas do gene MASP 2 resulta em MAp 19 mostrado naFIGURA 3B. MAp 19 é uma proteína não enzimática contendo a regiãoCUBl-EGF de terminal N de MASP-2 com quatro resíduos adicionais(EQSL) derivados do exon E como mostrado na FIGURA 2.

Diversas proteínas foram mostradas ligar a ou interagir comMASP-2 através de interações de proteína para proteína. Por exemplo,MASP-2 é conhecida ligar-se a e formar complexos dependentes de Cacom, as proteínas MBL da lectina, H-ficolina e L-ficolina. Cada complexo deMASP-2/lectina foi mostrado ativar complemento através da clivagemdependente de MASP-2 de proteínas C4 e C2 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem.262: 7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al, J. Exp. Med. 176: 1497-2284,2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). Estudos têmmostrado que os domínios CUBl-EGF de MASP-2 são essenciais para aassociação de MASP-2 com MBL (Thielens, N. M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001). Também foi mostrado que os domínios CUB1EGFCUBIImedeiam a dimerização de MASP-2, que é requerida para a formação de umcomplexo de MBL ativo (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275: 30962-30969,2000). Portanto, agentes inibidores de MASP-2 podem ser identificados queligam a ou interferem com regiões alvo de MASP-2 conhecidas por seremimportantes para a ativação de complemento dependente de MASP-2.ANTICORPOS ANTI-MASP-2

Em algumas formas de realização deste aspecto da invenção, oagente inibidor de MASP-2 compreende um anticorpo anti-MASP-2 que inibea ativação do sistema de complemento dependente de MASP-2. Os anticorposanti-MASP-2 úteis neste aspecto da invenção incluem anticorpos policlonais,monoclonais ou recombinantes derivados de qualquer mamífero que produzaanticorpo e podem ser multiespecíficos, quiméricos, humanizados, anti-idiotípicos e fragmentos de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo incluemFab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos scFv e anticorpos decadeia única como ainda aqui descrito.

Diversos anticorpos anti-MASP-2 foram descritos naliteratura, algumas das quais são listadas abaixo na TABELA 1. Estesanticorpos anti-MASP-2 anteriormente descritos podem ser triados quanto acapacidade para inibir a ativação do sistema de complemento dependente deMASP-2 usando os ensaios aqui descritos. Por exemplo, anticorpos Fab2 antirato de MASP-2 foram identificados que bloqueiam a ativação decomplemento dependente de MASP-2, como descrito em mais detalhes nosExemplos 24 e 25 aqui. Uma vez que um anticorpo anti-MASP-2 éidentificado que funcione como um agente inibidor de MASP-2, o mesmopode ser usado para produzir anticorpos anti-idiotípicos e usados paraidentificar outras moléculas de ligação de MASP-2 como descrita maisabaixo.

Tabela 1: Anticorpos específicos de MASP-2 da literatura

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ANTICORPO ANTI-MASP-2S COM FUNÇÃO EFETORA REDUZIDA

Em algumas formas de realização deste aspecto da invenção,os anticorpos anti-MASP-2 têm função efetora reduzida de modo a reduzir ainflamação que pode surgir da ativação do caminho de complemento clássico.

A capacidade das moléculas IgG para deflagrar o caminho de complementoclássico foi mostrado residir dentro da porção Fc da molécula (Duncan, A. R.,et al., Nature 332: 738-740 1988). As moléculas IgG em que a porção Fc damolécula foi removida pela clivagem enzimática são destituídas desta funçãoefetora (ver Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Nova Iorque, 1988). Conseqüentemente, os anticorpos comfunção efetora reduzida podem ser gerados como o resultado da falta daporção Fc da molécula por ter uma seqüência Fc geneticamente engendradaque minimiza a função efetora ou sendo dos isótipos IgG2 ou IgG4 humanos.Os anticorpos com função efetora reduzida podem serproduzidos pela manipulação biológica molecular padrão da porção Fc dascadeias pesadas de IgG como descrito no Exemplo 9 aqui e também descritoem Jolliffe, et al., Intl Rev. Immunol. 10: 241-250, 11993 e Rodrigues, et al.,5 J. Immunol. 151: 6954-6961, 1998. Os anticorpos com função efetorareduzida também incluem os isotipos IgG2 e IgG4 humanos que têm umacapacidade reduzida para ativar complemento e/ou interagir com receptoresFc (Ravetch, J. V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492, 1991; Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148: 3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al.,Immunol. Today 14: 215-221, 1993). Os anticorpos humanizados outotalmente humanos específicos para MASP-2 humana compreendidos dosisotipos IgG2 ou IgG4 podem ser produzidos por um de diversos métodosconhecidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica, como descritoem Vaughan, T. J., et al., Nature Biotechnical 16: 535-539, 1998.

PRODUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-MASP-2S

Os anticorpos anti-MASP-2 podem ser produzidos usandopolipeptídeos de MASP-2 (por exemplo, MASP-2 de tamanho natural) ouusando peptídeos que carregam epítopo de MASP-2 antigênico (por exemplo,uma porção do polipeptídeo MASP-2). Os peptídeos imunogênicos podem sertão pequenos quanto cinco resíduos de aminoácido. Por exemplo, opolipeptídeo MASP-2 incluindo a seqüência de aminoácido inteira da SEQ IDNO: 6 pode ser usado para induzir anticorpos anti-MASP-2 úteis no métododa invenção. Domínios MASP-2 particulares conhecidos por estaremenvolvidos nas interações proteína-proteína, tais como os domínios CUBI eCUBIEGF, assim como a região que abrange o sítio ativo da serina-protease,podem ser expressadas como polipeptídeos recombinantes como descrito noExemplo 5 e usados como antígenos. Além disso, peptídeos quecompreendem uma porção de pelo menos 6 aminoácidos do polipeptídeoMASP-2 (SEQ ID NO: 6) também são úteis para induzir anticorpos MASP-2.Os exemplos adicionais de antígenos derivados de MASP-2 úteis para induziranticorpos MASP-2 são fornecidos abaixo na TABELA 2. Os peptídeos epolipeptídeos MASP-2 usados para incitar anticorpos podem ser isoladoscomo polipeptídeos naturais ou peptídeos recombinantes ou sintéticos epolipeptídeos recombinantes cataliticamente inativos, tais como MASP-2A,como ainda descrito nos Exemplos 5 a 7. Em algumas formas de realizaçãodeste aspecto da invenção, anticorpos anti-MASP-2 são obtidos usando umacepa de camundongo transgênico como descrito nos Exemplos 8 e 9 e aindadescritos abaixo.

Os antígenos úteis para produzir anticorpos anti-MASP-2também incluem polipeptídeos de fusão, tais como fusões de MASP-2 ou umaporção destes com um polipeptídeo de imunoglobulina ou com proteína deligação de maltose. O imunogene de polipeptídeo pode ser uma molécula detamanho natural ou uma porção destes. Se a porção de polipeptídeo éequivalente a hapteno, tal porção pode ser vantajosamente unida ou ligada aum veículo macromolecular (tal como a hemocianina do lapa buraco defechadura (KLH), albumina sérica bovina (BSA) ou toxóide do tétano) paraimunização.

Tabela 2: Antígenos derivados de MASP-2

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ANTICORPOS POLICLONAIS

Os anticorpos policlonais contra MASP-2 podem serpreparados imunizando-se um animal com polipeptídeo MASP-2 ou umaporção imunogênica deste usando métodos bem conhecidos por aqueles dehabilidade comum na técnica. Ver, Por exemplo, Green, et al., "Production ofPoliclonal Antisera," em Imunochemical Protocols (Manson, ed.), página 105e como ainda descrito no Exemplo 6. A imunogenicidade de um polipeptídeoMASP-2 pode ser aumentada através do uso de um adjuvante, incluindo géisminerais, tais como hidróxido de alumínio ou adjuvante de Freund (completoou incompleto), substâncias ativas na superfície tais como lisolecitina, polióisplurônicos, poliânions, emulsões oleosas, hemocianina do lapa buraco defechadura e dinitrofenol. Os anticorpos policlonais são tipicamente incitadosem animais tais como cavalos, vacas, cães, galinhas, ratos, camundongos,coelhos, porquinhos da índia, cabras ou ovelhas. Alternativamente, umanticorpo anti-MASP-2 útil na presente invenção também pode ser derivadode um primata sub-humano. As técnicas gerais para incitar anticorposdiagnostica e terapeuticamente úteis em babuínos podem ser encontradas, porexemplo, em Goldenberg et al., International Patent Publication No. WO91/11465 e em Losman, M. J., et al., Int. J. Câncer 46: 310, 1990. Soroscontendo anticorpos imunologicamente ativos são depois produzidos a partirdo sangue de tais animais imunizados usando procedimentos padrão bemconhecidos na técnica.ANTICORPOS MONOCLONAIS

Em algumas formas de realização, o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo monoclonal anti-MASP-2. Os anticorpos monoclonais anti-MASP-2 são altamente específicos, sendo direcionados contra um epítopoMASP-2 único. Como aqui usado, o modificador "monoclonal" indica ocaráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma populaçãosubstancialmente homogênea de anticorpos e não devem ser interpretadoscomo requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Osanticorpos monoclonais podem ser obtidos usando qualquer técnica queforneça a produção de moléculas de anticorpo pelas linhagens de célulacontínuas em cultura, tal como o método do hibridoma descrito por Kohler,G., et al., Nature 256: 495, 1975 ou eles podem ser fabricados pelos métodosdo DNA recombinante (ver, por exemplo, a Patente U.S. N- 4.816.567concedido a Cabilly). Os anticorpos monoclonais também podem ser isoladosa partir de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas emClackson, T., et al., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks, J. D., et al., J. Mol.Biol. 222: 581-597, 1991. Tais anticorpos podem ser de qualquer classe deimunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclassedestes.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser obtidospela injeção em um mamífero adequado (por exemplo, um camundongoBALB/c) com uma composição que compreenda um polipeptídeo de MASP-2ou porção destes. Depois de um período predeterminado de tempo, osesplenócitos são removidos do camundongo e colocados em suspensão em ummeio de cultura de célula. Os esplenócitos são depois fundidos com umalinhagem de célula imortal para formar um hibridoma. os hibridomasformados são cultivados em cultura de célula e triados quanto a suacapacidade para produzir um anticorpo monoclonal contra MASP-2. Umexemplo que descreve ainda a produção de anticorpos monoclonais anti-MASP-2 é fornecido no Exemplo 7. (Ver também Current Protocols inImunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, páginas 2.5.1-2.6.7, 1991).

Os anticorpos monoclonais humanos podem ser obtidosatravés do uso de camundongos transgênicos que foram engendrados paraproduzir anticorpos humanos específicos em resposta à inoculação antigênica.Nesta técnica, elementos dos locais de cadeia pesada e leve daimunoglobulina humana são introduzidos em cepas de camundongosderivadas de linhagens de célula tronco embrionárias que contêm interrupçõesalvejadas dos locais da cadeia pesada e da cadeia leve da imunoglobulinaendógena. Os camundongos transgênicos podem sintetizar anticorposhumanos específicos para os antígenos humanos, tais como os antígenosMASP-2 aqui descritos e os camundongos podem ser usados para produzirhibridomas que secretam anticorpo de MASP-2 humana fundindo-se ascélulas B de tais animais às linhagens de célula de mieloma adequadas usandoa tecnologia de Kohler-Milstein convencional como descrito ainda noExemplo 7. Camundongos transgênicos com um genoma da imunoglobulinahumana são comercialmente disponíveis (por exemplo, da Abgenix, Inc.,Fremont, CA e Medarex, Inc., Annandale, N.J.). Os métodos para a obtençãode anticorpos humanos a partir de camundongos transgênicos são descritos,por exemplo, por Green, L. L., et al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg, N.,et al., Nature 368: 856, 1994; e Tailor, L. D., et al., Int. Immun. 6: 579, 1994.

Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados apartir de culturas de hibridoma por uma variedade de técnicas bemestabelecidas. Tais técnicas de isolação incluem a cromatografia de afinidadecom Proteína-A Sepharose, cromatografia de exclusão de tamanho ecromatografia de troca iônica (ver, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1-2.7.12 e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G(IgG)," em Methods in Molecular Biology, The Human Press, Inc., Vol. 10,páginas 79-104, 1992).

Uma vez produzidos, os anticorpos policlonais, monoclonaisou derivados de fago são primeiro testados quanto a ligação de MASP-2específica. Uma variedade de ensaios conhecidos por aqueles habilitados natécnica pode ser utilizada para detectar anticorpos que especificamente seligam a MASP-2. Os ensaios exemplares incluem análise de Western blot ouimunoprecipitação pelos métodos padrão (por exemplo, como descrito emAusubel et aL), imunoeletroforese, ensaios imunossorventes ligados a enzima,dot blots, ensaios de inibição ou competição e ensaios intercalados (comodescrito em Harlow e Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1988). Uma vez que os anticorpos são identificadosque especificamente se ligam a MASP-2, os anticorpos anti-MASP-2 sãotestados quanto a capacidade para funcionar como um agente inibidor deMASP-2 em um de diversos ensaios tais como, por exemplo, um ensaio declivagem de C4 específico de lectina (descrito no Exemplo 2), um ensaio dedeposição de C3b (descrito no Exemplo 2) ou um ensaio de deposição de C4b(descrito no Exemplo 2).

A afinidade de anticorpos monoclonais anti-MASP-2 pode serfacilmente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica (ver,por exemplo, Scatchard, A., NY Acad. Sei. 51: 660-672, 1949). Em umaforma de realização, os anticorpos monoclonais anti-MASP-2 úteis para osmétodos da invenção ligam-se a MASP-2 com uma afinidade de ligação de<100 nM, preferivelmente <10 nM e o mais preferivelmente <2nM.

ANTICORPOS QUIMÉRICOS/HUMANIZADOS

Os anticorpos monoclonais úteis no método da invençãoincluem anticorpos quiméricos em que uma porção da cadeia pesada e/ou leveé idêntica com ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorposderivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclassede anticorpo particular, enquanto o resto da(s) cadeia(s) é idêntico com ouhomólogo às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de umaoutra espécie ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpo,assim como fragmentos de tais anticorpos (Patente U.S. N2 4.816.567concedida a Cabilly e Morrison, S. L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 81:6851-6855, 1984).

Uma forma de um anticorpo quimérico útil na invenção é umanticorpo monoclonal anti-MASP-2 humanizado. As formas humanizadas deanticorpos não humanos (por exemplo, de murino) são anticorpos quiméricos,que contêm seqüências mínimas derivadas de imunoglobulina não humana.Os anticorpos monoclonais humanizados são produzidos transferindo-se asregiões determinadoras de complementaridade (CDR) não humanas (porexemplo, de camundongo), das cadeias variáveis pesadas e leves daimunoglobulina de camundongo em um domínio variável humano.Tipicamente, resíduos de anticorpos humanos são depois substituídos nasregiões de matriz das contrapartes não humanas. Além disso, anticorposhumanizados podem compreender resíduos que não são encontrados noanticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas pararefinar ainda mais o desempenho de anticorpo. No geral, o anticorpohumanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um etipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todasdas alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina nãohumana e todas ou substancialmente todas das regiões de matriz Fv sãoaquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpohumanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção deuma região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de umaimunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones, P. T., et al., Nature321: 522-525, 1986; Reichmann, L., et al, Nature 332: 323-329, 1988; ePresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992.Os anticorpos humanizados úteis na invenção incluemanticorpos monoclonais humanos incluindo pelo menos uma região CDR3 deligação de MASP-2. Além disso, as porções Fc podem ser substituídas demodo a produzir anticorpos IgA ou IgM assim como IgG humanos. Taisanticorpos humanizados terão utilidade clínica particular porque elesespecificamente reconhecerão MASP-2 humana mas não evocarão umaresposta imune em seres humanos contra o próprio anticorpo.Conseqüentemente, eles são melhor adaptados para a administração in vivoem seres humanos, especialmente quando administração repetida ou de longaduração são necessárias.

Um exemplo da geração de um anticorpo anti-MASP-2humanizado a partir de um anticorpo anti-MASP-2 monoclonal de murino éaqui fornecido no Exemplo 10. As técnicas para a produção de anticorposmonoclonais humanizados também são descritas, por exemplo, por Jones, P.T., et ai, Nature 321: 522, 1986; Carter, P., et ai., Proc. Nat'l. Acad. Sei.USA 89: 4285, 1992; Sandhu, J. S., Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992; Singer,I.I., et al., J. Immun. 150: 2844, 1993; Sudhir (ed.), Anticorpo EngineeringProtocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering TherapeuticAntibodies," em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et ai.(eds.), John Wiley & Sons, Inc., páginas 399-434, 1996; e pela Patente U.S.Ns 5.693.762 concedida a Queen, 1997. Além disso, existem entidadescomerciais que sintetizarão anticorpos humanizados a partir de regiões deanticorpo de murino específicas, tais como a Protein Design Labs (MountainView, CA).

ANTICORPO RJE C QMBIN A NTE S

Os anticorpos anti-MASP-2 também podem ser fabricadosusando métodos recombinantes. Por exemplo, anticorpos humanos podem serfabricados usando-se bibliotecas de expressão de imunoglobulina humana(disponíveis por exemplo, da Stratagene, Corp., La Jolla, CA) para produzirfragmentos de anticorpos humanos (VH, VL, Fv5 Fd, Fab ou F(ab')2). Estesfragmentos são depois usados para construir anticorpos humanos integraisusando técnicas similares àquelas para a produção de anticorpos quiméricos.

ANTICORPOS ANTI-IDIOTÍPICOS

Uma vez que os anticorpos anti-MASP-2 são identificadoscom a atividade inibidora desejada, estes anticorpos podem ser usados paragerar anticorpos anti-idiotípicos que se parecem com uma porção de MASP-2usando técnicas que são bem conhecidas no ramo. Ver, por exemplo,Greenspan, N. S., et al., FASEB J. 7: 437, 1993. Por exemplo, anticorpos que se ligam a MASP-2 e competitivamente inibem uma interação de proteína deMASP-2 requerida para a ativação de complemento podem ser usados paragerar anti-idiotipos que se parecem com o sítio de ligação de MBL naproteína MASP-2 e portanto ligam e neutralizam um ligando de ligação deMASP-2 tal como, por exemplo, MBL.

FRAGMENTOS DE IMUNOGLOBULINA

Os agentes inibidores de MASP-2 úteis no método da invençãoabrangem não apenas moléculas de imunoglobulina intactas mas também osfragmentos bem conhecidos incluindo fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 eFv, scFv, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeiasimples e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

E bem conhecido na técnica que apenas uma pequena porçãode uma molécula de anticorpo, o parátopo, está envolvida na ligação doanticorpo ao seu epítopo (ver, por exemplo, Clark, W. R., The ExperimentalFoundations of Modern Imunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). Asregiões pFc' e Fc do anticorpo são efetores do caminho de complementoclássico, mas não estão envolvidos na ligação de antígeno. Um anticorpo apartir do qual a região pFc' foi enzimaticamente clivada ou que foi produzidosem a região pFc', é designado um fragmento F(ab')2 e retém ambos dossítios de ligação de antígeno de um anticorpo intacto. Um fragmento F(ab')2isolado é aludido como um fragmento monoclonal bivalente por causa dosdois sítios de ligação de antígeno. Similarmente, um anticorpo a partir do quala região Fc foi enzimaticamente clivado ou que foi produzido sem a regiãoFc, é designado um fragmento Fab e retém um dos sítios de ligação deantígeno de uma molécula de anticorpo intacta.

Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos pela hidróliseproteolítica, tal como pela digestão com pepsina ou papaína de anticorposinteiros pelos métodos convencionais. Por exemplo, fragmentos de anticorpopodem ser produzidos pela clivagem enzimática de anticorpos com pepsinapara fornecer um fragmento 5S denotados F(ab')2. Este fragmento pode serainda clivado usando um agente redutor de tiol para produzir fragmentosmonovalentes 3,5S Fab'. Opcionalmente, a reação de clivagem pode serrealizada usando um grupo bloqueador para os grupos sulfidrila que resultamda clivagem de ligações de dissulfeto. Como uma alternativa, uma clivagemenzimática usando pepsina produz dois fragmentos Fab monovalentes e umfragmento Fc diretamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, PatenteU.S. N- 4.331.647 concedida a Goldenberg; Nisonoff, A., et ai, Arch.Biochem. Biophys. 89: 230, 1960; Porter, R. R., Biochem. J. 73: 119, 1959;Edelman, et ai., em Methods in Enzymology, 1: 422, Academic Press, 1967; epor Coligan nas páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10.-2.10.4.

Em algumas formas de realização, o uso de fragmentos deanticorpo que carecem da região Fc são preferidos para evitar a ativação docaminho de complemento clássico que é iniciado na ligação de Fc ao receptorFcy. Existem diversos métodos pelos quais pode-se produzir um MoAb queevite as interações de receptor Fcy. Por exemplo, a região Fc de um anticorpomonoclonal pode ser removida quimicamente usando a digestão parcial pelasenzimas proteolíticas (tal como a digestão com ficina), gerando deste modo,por exemplo, fragmentos de anticorpo que ligam antígeno tais comofragmentos Fab ou F(ab)2 (Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28: 69-71,1991).

Alternativamente, o isotipo γ4 IgG humano, que não ligareceptores Fcy, pode ser usado durante a construção de um anticorpohumanizado como aqui descrito. Anticorpos, anticorpos de cadeia simples edomínios de ligação de antígeno que carecem do domínio Fc também podemser engendrados usando técnicas recombinantes aqui descritas.

FRAGMENTOS DE ANTICORPO DE CADEIA ÚNICA

Alternativamente, pode-se criar moléculas de ligação de cadeiade peptídeo simples específicas para MASP-2 em que as regiões Fv de cadeiapesada e leve são conectadas. Os fragmentos Fv podem ser conectados porum ligador peptídico para formar uma proteína (scFv) de ligação de antígenode cadeia única. Estas proteínas de ligação antígeno de cadeia única sãopreparadas construindo-se um gene estrutural que compreende seqüências deDNA que codificam os domínios Vh e VL que são conectadas por umoligonucleotídeo. O gene estrutural é inserido em um vetor de expressão, queé subseqüentemente introduzido em uma célula hospedeira, tal como E. coli.As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia depolipeptídeo com um peptídeo ligador que liga em ponte os dois domínios V.Métodos para a produção de scFvs são descritos por exemplo, por Whitlow, etai, "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2: 97, 1991; Bird,et ai, Science 242: 423, 1988; Patente U.S. Ns 4.946.778 concedida a Ladner;Pack, P., et ai, Bio/Technology 11: 1271, 1993.

Como um exemplo ilustrativo, um scFv específico de MASP-2pode ser obtido pela exposição de linfócitos ao polipeptídeo de MASP-2 invitro e selecionando bibliotecas de demonstração de anticorpo nos vetores defago ou similares (por exemplo, através do uso de proteína ou peptídeo deMASP-2 imobilizados ou rotulados). Os genes que codificam polipeptídeostendo domínios de ligação de polipeptídeo de MASP-2 potenciais podem serobtidos pela triagem de bibliotecas de peptídeo aleatórias demonstradas emfago ou em bactérias tais como E. coli. Estas bibliotecas de demonstração depeptídeo aleatórias podem ser usadas para triar quanto a peptídeos queinteragem com técnicas de MASP-2 para criar e triar tais bibliotecas dedemonstração de peptídeo aleatórias são bem conhecidas na técnica (PatenteU.S. N2 5.223.409 concedida a Lardner; Patente U.S. N^ 4.946.778 concedidaa Ladner; Patente U.S. Ns 5.403.484 concedida a Lardner; Patente U.S. N55.571.698 concedida a Lardner; e Kay et al., Phage Display of Peptides andProteins Academic Press, Inc., 1996) e bibliotecas de demonstração depeptídeo aleatórias e kits para triar tais bibliotecas são comercialmentedisponíveis, por exemplo, da CLONTECH Laboratories, Inc. (Paio Alto,Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), Novo England Biolabs, Inc.(Beverly, Mass.) e Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ.).

Uma outra forma de um fragmento de anticorpo anti-MASP-2útil neste aspecto da invenção é um peptídeo que codifica uma regiãodeterminadora de complementaridade (CDR) única que se liga a um epítopoem um antígeno de MASP-2 e inibe a ativação de complemento dependentede MASP-2. Os peptídeos de CDR ("unidades de reconhecimento mínimo")podem ser obtidos construindo-se genes que codificam a CDR de umanticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, usando-se areação da cadeia da polimerase para sintetizar a região variável de RNA decélulas que produzem anticorpo (ver, por exemplo, Larrick et ai., Methods: ACompanion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991; Courtenay-Luck,"Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," em MonoclonalAntibodies: Production, Engineering and Clinic Application, Ritter et al.(eds.), página 166, Cambridge University Press, 1995; e Ward et al., "GeneticManipulation and Expression of Antibodies," em Monoclonal Antibodies:Principies and Applications, Birch et al. (eds.), página 137, Wiley-Liss, Inc.,1995).

Os anticorpos de MASP-2 aqui descritos são administrados aum paciente em necessidade deste para inibir a ativação de complementodependente de MASP-2. Em algumas formas de realização, o agente inibidorde MASP-2 é um anticorpo monoclonal anti-MASP-2 humano ouhumanizado de alta afinidade com função efetora reduzida.

INIBIDORES DE PEPTÍDEO

Em algumas formas de realização deste aspecto da invenção, oagente inibidor de MASP-2 compreende inibidores de peptídeo MASP-2isolados, incluindo inibidores de peptídeo naturais isolados e inibidores depeptídeo sintéticos que inibem a ativação do sistema de complementodependente de MASP-2. Como aqui usado, o termo "inibidores de peptídeode MASP-2 isolados" refere-se a peptídeos que inibem a ativação decomplemento dependente de MASP-2 pela ligação a, competição com MASP-2 quanto a ligação a uma outra molécula de reconhecimento (por exemplo,MBL, H-ficolina, M-ficolina ou L-ficolina) no caminho da lectina, e/oudiretamente interagindo com MASP-2 para inibir a ativação de complementodependente de MASP-2 que são substancialmente puros e são essencialmentelivres de outras substâncias com que os mesmos possam ser encontrados nanatureza a um grau prático e apropriado quanto ao seu uso pretendido.

Os inibidores de peptídeo foram usados com êxito in vivo parainterferir com as interações de proteína-proteína e sítios catalíticos. Porexemplo, os inibidores de peptídeo para as moléculas de adesãoestruturalmente relacionadas com LFA-I foram recentemente aprovadas parao uso clínico em coagulopatias (Ohman, E. M., et al., European Heart J. 16:50-55, 1995). Os peptídeos lineares curtos (<30 aminoácidos) foram descritosque impedem ou interferem com a adesão dependente de integrina(Murayama, O., et al., J. Biochem. 120: 445-51, 1996). Os peptídeos maislongos, variando no comprimento de 25 a 200 resíduos de aminoácido,também foram usados bem sucedidamente para bloquear a adesão dependentede integrina (Zhang, L., et al., J. Biol. Chem. 271(47): 29953-57, 1996). Nogeral, inibidores de peptídeo mais longos têm afinidades mais altas e/ouíndices de dissociação mais lentos do que os peptídeos curtos e portantopodem ser inibidores mais potentes. Os inibidores de peptídeo cíclico tambémmostraram ser inibidores eficazes de integrinas in vivo para o tratamento dedoença inflamatória humana (Jackson, D. Y., et al., J. Med. Chem. 40: 3359-68, 1997). Um método de produzir peptídeos cíclicos envolve a síntese depeptídeos em que os aminoácidos terminais do peptídeo são cisteínas,permitindo deste modo que o peptídeo exista em uma forma cíclica pelaligação de dissulfeto entre os aminoácidos de terminal, que mostrarammelhorar a afinidade e meia vida in vivo para o tratamento de neoplasmashematopoiéticos (por exemplo, Patente U.S. N2 6.649.592 concedida aLarson).

INIBIDORES DE PEPTÍDEO DE MASP-2 SINTÉTICOS

Os peptídeos inibidores de MASP-2 úteis nos métodos desteaspecto da invenção são exemplificados pelas seqüências de aminoácido queimitam as regiões alvo importantes para a função de MASP-2. Os peptídeosinibidores úteis na prática dos métodos da invenção variam em tamanho decerca de 5 aminoácidos a cerca de 300 aminoácidos. A TABELA 3 forneceuma lista de peptídeos inibidores exemplares que podem ser úteis na práticadeste aspecto da presente invenção. Um peptídeo inibidor de MASP-2candidato pode ser testado quanto a capacidade para funcionar como umagente inibidor de MASP-2 em um de diversos ensaios incluindo, porexemplo, um ensaio de clivagem C4 específica de lectina (descrito noExemplo 2) e uma deposição de ensaio de C3b (descrito no Exemplo 2).

Em algumas formas de realização, os peptídeos inibidores deMASP-2 são derivados de polipeptídeos de MASP-2 e são selecionados daproteína de MASP-2 madura e tamanho natural (SEQ ID NO: 6) ou de umdomínio particular da proteína de MASP-2 tal como, por exemplo, o domínioCUBI (SEQ ID NO: 8), o domínio CUBIEGF (SEQ ID NO: 9), o domínioEGF (SEQ ID NO: 11) e o domínio de serina protease (SEQ ID NO: 12).Como anteriormente descrito, as regiões CUBEGFCUBII foram mostradasserem requeridas para a dimerização e ligação com MBL (Thielens et al.,supra). Em particular, a seqüência de peptídeo TFRSDYN (SEQ ED NO: 16)no domínio CUBI de MASP-2 foi mostrado estar envolvida na ligação a MBLem um estudo que identificou um ser humano que carrega uma mutaçãohomozigótica de Asp 105 para Gly 105, resultando na perda de MASP-2 docomplexo de MBL (Stengaard-Pedersen, K., et al., New England J. Med. 349:554-560, 2003).

Os peptídeos inibidores de MASP-2 também podem serderivados de MApl9 (SEQ ID NO: 3). Como descrito no Exemplo 30,MAp 19 (SEQ ID NO: 3) (também aludida como sMAP), tem a capacidadepara infra-regular o caminho da lectina, que é ativado pelo complexo MBL.Iwaki et al., J. Immunol. 177: 8626-8632, 2006. Embora não desejando estarligado pela teoria, é provável que sMAP seja capaz de ocupar o sítio deligação de MASP-2/sMAP em MBL e impedir MASP-2 de ligar ao MBL.Também foi relatado que sMAP compete com MASP-2 em associação comficolina A e inibe a ativação de complemento pelo complexo de ficolinaA/MASP-2. Endo Y. et al., Immunogenetics 57: 837-844 (2005).

Em algumas formas de realização, os peptídeos inibidores deMASP-2 são derivados das proteínas de lectina que ligam a MASP-2 e estãoenvolvidos no caminho de complemento da lectina. Diversas lectinasdiferentes foram identificadas que estão envolvidas neste caminho, incluindolectina que liga manana (MBL), L-ficolina, M-ficolina e H-ficolina. (Ikeda,K., et al., J. Biol. Chem. 262: 7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp.Med. 176: 1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). Estas lectinas estão presentes no soro como oligômeros desubunidades homotriméricas, cada uma tendo fibras equivalentes a colágenono terminal N com domínios de reconhecimento de carboidrato. Estas lectinasdiferentes foram mostradas ligar a MASP-2 e o complexo lectina/MASP-2ativa o complemento através da clivagem de proteínas C4 e C2. H-ficolinatem uma região de terminal amino de 24 aminoácidos, um domínioequivalente a colágeno com 11 repetições Gly-Xaa-Yaa, um domínio degargalo de 12 aminoácidos e um domínio equivalente a fibrinogênio de 207aminoácidos (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). H-ficolina se liga a GlcNAc e aglutina eritrócitos humanos revestidos com LPSderivado de S. typhimurium, S. minnesota e E. coli. H-ficolina tem sidomostrada estar associada com MASP-2 e MAp 19 e ativa o caminho da lectina. Id. L-ficolina/P35 também se liga a GlcNAc e foi mostrada estarassociada com MASP-2 e MAp 19 em soro humano e este complexo foimostrado ativar o caminho da lectina (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 164:2281, 2000). Conseqüentemente, Os peptídeos inibidores de MASP-2 úteis napresente invenção podem compreender uma região de pelo menos 5aminoácidos selecionados da proteína MBL (SEQ ID NO: 21), a proteína deH-ficolina (número de acesso no Genbank NM 173452), a proteína M-ficolina(número de acesso no Genbank 000602) e a proteína de L-ficolina (número deacesso no Genbank NM 015838).

Mais especificamente, os cientistas identificaram o sítio deligação de MASP-2 em MBL como estando dentro dos 12 tripletos Gly-X-Y"GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSGSOG PKG QKG DOG KS" (SEQ ID NO: 26) que residem entre a dobradiça eo gargalo na porção de terminal C do domínio equivalente a colágeno deMBP (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279: 14065, 2004). Esta região de sítio de ligação de MASP-2 também é altamente conservada na H-ficolina humanae L-ficolina humana. Um sítio de ligação de consenso foi descrito que estápresente em todas as três proteínas de lectina que compreendem a seqüênciade aminoácido "OGK-X-GP" (SEQ ID NO: 22) onde a letra "O" representahidroxiprolina e a letra "X" é um resíduo hidrofóbico (Wallis et al., 2004,supra). Conseqüentemente, em algumas formas de realização, os peptídeosinibidores de MASP-2 úteis neste aspecto da invenção têm pelo menos 6aminoácidos no comprimento e compreendem a SEQ ID NO: 22. Ospeptídeos derivados de MBL que incluem a seqüência de aminoácido "GLRGLQ GPO GKL GPO G" (SEQ ID NO: 24) foi mostrada ligar MASP-2 invitro (Wallis, et al., 2004, supra). Para realçar a ligação a MASP-2, peptídeospodem ser sintetizados que são flanqueados por dois tripletos GPO em cadaextremidade ("GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O" SEQ IDNO: 25 para realçar a formação de hélices triplas como encontrado naproteína MBL nativa (como ainda descrito em Wallis, R., et al., J. Biol.Chem. 279: 14065, 2004).

Os peptídeos inibidores de MASP-2 também podem serderivados de H-ficolina humana que incluem a seqüência "GAO GSO GEKGAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO" (SEQ ID NO: 27) da regiãode ligação de MASP-2 de consenso em H-ficolina. Também são incluídospeptídeos derivados de L-ficolina humana que incluem a seqüência "GCOGLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAOGEO" (SEQ ID NO: 28) da região de ligação de MASP-2 de consenso na L-ficolina.

Os peptídeos inibidores de MASP-2 também podem serderivados do sítio de clivagem C4 tal como"LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI" (SEQ ID NO: 29) que é o sítio declivagem C4 ligado à porção de terminal C da antitrombina III (Glover, G. I.,etal., Mol. Immunol. 25: 1261 (1988)).Tabela 3: Peptídeos inibidores de MASP-2 exemplares

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Nota: A letra "O" representa hidroxiprolina. A letra "X" é um resíduohidrofóbico.Os peptídeos derivados do sítio de clivagem C4 assim comooutros peptídeos que inibem o sítio de serina protease de MASP-2 podem serquimicamente modificados de modo que sejam inibidores de proteaseirreversíveis. Por exemplo, as modificações apropriadas podem incluir, masnão são necessariamente limitadas a, halometil cetonas (Br, Cl, I, F) noterminal C, Asp ou Glu, ou anexados às cadeias laterais funcionais; gruposhaloacetila (ou outro α-haloacetila) nos grupos amino ou outras cadeiaslaterais funcionais; grupos contendo epóxido ou imina nos terminais amino oucarbóxi ou nas cadeias laterais funcionais; ou ésteres de imidato nos terminaisamino ou carbóxi ou nas cadeias laterais funcionais. Tais modificaçõesproporcionariam a vantagem de inibir permanentemente a enzima pela ligaçãocovalente do peptídeo. Isto pode resultar em doses eficazes mais baixas e/ou anecessidade quanto à administração menos freqüente do peptídeo inibidor.

Além dos peptídeos inibidores descritos acima, os peptídeoinibidores de MASP-2 úteis no método da invenção incluem peptídeoscontendo a região CDR3 de ligação de MASP-2 de MoAb anti-MASP-2obtido como aqui descrito. A seqüência das regiões de CDR para o uso nasintetização dos peptídeos pode ser determinada pelos métodos conhecidos natécnica. A região variável de cadeia pesada é um peptídeo que no geral variade 100 a 150 aminoácidos no comprimento. A região variável de cadeia leve éum peptídeo que no geral varia de 80 a 130 aminoácidos no comprimento. Asseqüências de CDR dentro das regiões variáveis de cadeia pesada e leveincluem apenas aproximadamente 3 a 25 seqüências de aminoácido quepodem ser facilmente seqüenciadas por uma pessoa de habilidade comum natécnica.

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que variaçõessubstancialmente homólogas dos peptídeo inibidores de MASP-2 descritasacima também exibirão atividade inibidora de MASP-2. As variaçõesexemplares incluem, mas não são necessariamente limitadas a, peptídeostendo inserções, deleções, substituições e/ou aminoácidos adicionais nasporções de terminal carbóxi ou terminal amino dos peptídeos objetos emisturas destes. Conseqüentemente, aqueles peptídeos homólogos tendoatividade inibidora de MASP-2 são considerados como sendo úteis nosmétodos desta invenção. Os peptídeos descritos também podem incluirmotivos duplicados e outras modificações com substituições conservativas.As variantes conservativas são descritas aqui em outro lugar e incluem amudança de um aminoácido por um outro de carga, tamanho ouhidrofobicidade semelhantes e outros.

Os peptídeo inibidores de MASP-2 podem ser modificadospara aumentar a solubilidade e/ou para maximizar a carga positiva ounegativa de modo se parecer mais intimamente com o segmento na proteínaintacta. O derivado pode ter ou não a estrutura de aminoácido primária exatade um peptídeo aqui divulgado contanto que o derivado funcionalmenteretenha a propriedade desejada de inibição de MASP-2. As modificaçõespodem incluir a substituição de aminoácido com um dos vinte aminoácidoshabitualmente conhecidos ou com um outro aminoácido, com um aminoácidoderivatizado ou substituído com características ancilares desejáveis, tais comoresistência à degradação enzimática ou com um D-aminoácido ou substituiçãocom uma outra molécula ou composto, tal como um carboidrato, que imita aconfirmação e função naturais do aminoácido, aminoácidos ou peptídeo;deleção de aminoácido; inserção de aminoácido com um dos vinteaminoácidos habitualmente conhecidos ou com um outro aminoácido, comum aminoácido derivatizado ou substituído com características ancilaresdesejáveis, tais como resistência à degradação enzimática ou com um D-aminoácido ou substituição com uma outra molécula ou composto, tal comoum carboidrato, que imite a confirmação e função naturais do aminoácido,aminoácidos ou peptídeo; ou substituição com uma outra molécula oucomposto, tal como um carboidrato ou monômero de ácido nucleico, queimita a conformação natural, distribuição de carga e função do peptídeoprecursor. Os peptídeos também podem ser modificados pela acetilação ouamidação.

A síntese de peptídeos inibidores derivados pode contar comtécnicas conhecidas da biossíntese de peptídeo, biossíntese de carboidrato eoutras. Como um ponto de partida, o técnico pode contar com um programade computador adequado para determinar a conformação de um peptídeo deinteresse. Uma vez que a conformação de peptídeo aqui divulgada éconhecida, então o técnico pode determinar em uma maneira de planejamentoracional qual tipo de substituições podem ser feitas em um ou mais sítios paramoldar um derivado que retenha a conformação básica e carregue adistribuição do peptídeo precursor mas que possa possuir características quenão estão presentes ou são realçadas em relação àquelas encontradas nopeptídeo precursor. Uma vez que as moléculas derivadas candidatas sãoidentificadas, os derivados podem ser testados para determinar se os mesmosfuncionam como agentes inibidores de MASP-2 usando os ensaios aquidescritos.

TRIAGEM QUANTO A PEPTÍDEOS INIBIDORES DE MASP-2

Pode-se usar também a modelagem molecular e oplanejamento molecular racional para gerar e triar quanto a peptídeos queimitem as estruturas moleculares de regiões de ligação chave de MASP-2 einibir as atividades de complemento de MASP-2. As estruturas molecularesusadas para a modelagem incluem as regiões de CDR de anticorpos anti-MASP-2 monoclonais, assim como as regiões alvo conhecidas por seremimportantes para a função de MASP-2 incluindo a região requerida para adimerização, a região envolvida na ligação a MBL e o sítio ativo da serinaprotease como anteriormente descrito. Os métodos para identificar peptídeosque se ligam a um alvo particular são bem conhecidos na técnica, porexemplo, a impressão molecular pode ser usada para a construção de novo deestruturas macromolecular tais como peptídeos que se ligam a uma moléculaparticular. Ver, por exemplo, Shea, K. J., "Molecular Imprinting of SyntheticNetwork Polymers: The De Novo Synthesis of Macromolecular Binding andCatalytic Sties," TRIP 2: (5) 1994.

Como um exemplo ilustrativo, um método de prepararimitações de peptídeos de ligação de MASP-2 é como segue. Os monômerosfuncionais de um peptídeo de ligação de MASP-2 conhecidos ou a região deligação de um anticorpo anti-MASP-2 que exiba inibição de MASP-2 (opadrão) são polimerizados. O padrão é depois removido, seguido pelapolimerização de uma segunda classe de monômeros no vazio deixado pelopadrão, para fornecer uma nova molécula que exibe uma ou maispropriedades desejadas que são similares ao padrão. Além de prepararpeptídeos desta maneira, outras moléculas de ligação de MASP-2 que sãoagentes inibidores de MASP-2 tais como polissacarídeos, nucleosídeos,medicamentos, nucleoproteínas, lipoproteínas, carboidratos, glicoproteínas,esteróides, lipídeos e outros materiais biologicamente ativos também podemser preparados. Este método é útil para planejar uma ampla variedade deimitações biológicas que são mais estáveis do que as suas contrapartesnaturais porque elas são tipicamente preparadas pela polimerização de radicallivre de monômeros funcionais, resultando em um composto com uma cadeiaprincipal não biodegradável.

SÍNTESE DE PEPTÍDEO

Os peptídeos inibidores de MASP-2 podem ser preparadosusando técnicas bem conhecidas no ramo, tal como a técnica sintética de fasesólida inicialmente descrita por Merrifield, em J. Amer. Chem. Soe. 85: 2149-2154, 1963. A síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usandoSintetizador de Peptídeo da Applied Biosystems 43IA (Foster City, Calif.) deacordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Outras técnicas podemser encontradas, por exemplo, em Bodanszky, M., et ai, Peptide Synthesis,segunda edição, John Wiley & Sons, 1976, assim como em outros trabalhosde referência conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Os peptídeos também podem ser preparados usando técnicasde engenharia genética padrão conhecidas por aqueles habilitados na técnica.por exemplo, o peptídeo pode ser produzido enzimaticamente pela inserção deácido nucleico que codifica o peptídeo em um vetor de expressão,expressando o DNA e traduzindo o DNA no peptídeo na presença dosaminoácidos requeridos. O peptídeo é depois purificado usando técnicascromatográficas ou eletroforéticas ou por meio de uma proteína veiculo quepode ser fundida a e subseqüentemente clivada do peptídeo pela inserção novetor de expressão em fase com a seqüência que codifica o peptídeo umaseqüência de ácido nucleico que codifica a proteína veiculo. A fusão proteína-peptídeo pode ser isolada usando técnicas cromatográficas, eletroforéticas ouimunológicas (tal como a ligação a um resina por intermédio de um anticorpoà proteína). O peptídeo pode ser clivado usando metodologia química ouenzimaticamente, como, por exemplo, pelas hidrolases.

Os peptídeo inibidores de MASP-2 que são úteis no método dainvenção também podem ser produzidos em células hospedeirasrecombinantes seguindo técnicas convencionais. Para expressar umaseqüência que codifica o peptídeo inibidor de MASP-2, uma molécula deácido nucleico que codifica o peptídeo deve ser operavelmente ligada àsseqüências regulatórias que controlam a expressão transcricional em um vetorde expressão e depois introduzida em uma célula hospedeira. Além asseqüências regulatórias transcricionais, tais como promotores e realçadores,vetores de expressão podem incluir seqüências regulatórias traducionais e umgene marcador, que são adequadas para a seleção de células que carregam ovetor de expressão.

As moléculas de ácido nucleico que codificam um peptídeoinibidor de MASP-2 podem ser sintetizados com "máquinas de gene" usandoprotocolos tais como o método da fosforamidita. Se DNA de filamento duploquimicamente sintetizado é requerido para uma aplicação tal como a síntesede um gene ou um fragmento de gene, então cada filamento complementar éfabricado separadamente. A produção de genes curtos (60 a 80 pares de base)é tecnicamente direta e pode ser realizada pela sintetização dos filamentoscomplementares e depois recozendo-os. Para a produção de genes maislongos, os genes sintéticos (de filamento duplo) são montados na formamodular a partir de fragmentos de filamento duplo que são de 20 a 100nucleotídeos no comprimento. Para as revisões sobre a síntese depolinucleotídeo, ver, por exemplo, Glick e Pasternak, "MolecularBiotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA", ASMPress, 1994; Itakura, K., et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323, 1984; e Climie,S., et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 87: 633, 1990.

INIBIDORES DE MOLÉCULA PEQUENA

Em algumas formas de realização, os agentes inibidores de

MASP-2 são inibidores de molécula pequena incluindo substâncias naturais esintéticas que têm um peso molecular baixo, tais como por exemplo,peptídeos, peptidomiméticos e inibidores não peptídicos (incluindooligonucleotídeos e compostos orgânicos). Os inibidores de molécula pequenade MASP-2 podem ser gerados com base na estrutura molecular das regiõesvariáveis dos anticorpos anti-MASP-2.

Os inibidores de molécula pequena também podem serplanejados e gerados com base na estrutura cristalina de MASP-2 usandoplanejamento de medicamento computacional (Kuntz I. D., et al., Science257: 1078, 1992). A estrutura cristalina de MASP-2 de rato foi descrita(Feinberg, H., et al., EMBO J. 22: 2348-2359, 2003). Usando o métododescrito por Kuntz et al., as coordenadas de estrutura cristalina de MASP-2são usadas como uma entrada para um programa de computador tal comoDOCK, que produz uma lista de estruturas de molécula pequena que sãoesperadas ligar a MASP-2. O uso de tais programas de computador é bemconhecido por uma pessoa de habilidade na técnica, por exemplo, a estruturacristalina do inibidor da HTV-I protease foi usado para identificar ligandosnão peptídicos únicos que são inibidores da HTV-I protease pela avaliaçãodos ajustes dos compostos encontrados na base de dados da CambridgeCrystallographic para o sítio de ligação da enzima usando o programa DOCK(Kuntz, I. D., et al., J. Mol. Biol. 161: 269-288, 1982; DesJarlais, R. L., et al,PNAS 87: 6644-6648, 1990).

A lista de estruturas de molécula pequena que são identificadaspor um método computacional como inibidores de MASP-2 potenciais étriada usando um ensaio de ligação de MASP-2 tal como descrito no Exemplo7. As moléculas pequenas que são descobertas ligar a MASP-2 são depoisensaiadas em um ensaio funcional tal como descrito no Exemplo 2 paradeterminar se elas inibem a ativação de complemento dependente de MASP-2.

RECEPTORES SOLÚVEIS DE MASP-2

Acredita-se que outros agentes inibidores de MASP-2adequados incluam receptores solúveis de MASP-2, que podem serproduzidos usando técnicas conhecidas por aqueles de habilidade comum natécnica.

INIBIDORES DE EXPRESSÃO DE MASP-2

Em uma outra forma de realização deste aspecto da invenção,o agente inibidor de MASP-2 é um inibidor da expressão de MASP-2 capazde inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2. Na prática desteaspecto da invenção, inibidores da expressão de MASP-2 representativosincluem moléculas de ácido nucleico de MASP-2 de anti-sentido (tal comomRNA de anti-sentido, DNA de anti-sentido ou oligonucleotídeos de anti-sentido), ribozimas de MASP-2 e moléculas de RNAi de MASP-2.

As moléculas de RNA e DNA de anti-sentido atuam parabloquear diretamente a transdução de mRNA de MASP-2 pela hibridização aomRNA de MASP-2 e prevenir a tradução da proteína de MASP-2. Umamolécula de ácido nucleico de anti-sentido pode ser construída em váriosmodos diferentes contanto que seja capaz de interferir com a expressão deMASP-2. por exemplo, uma molécula de ácido nucleico de anti-sentido podeser construída invertendo-se a região codificadora (ou uma porção destes) docDNA de MASP-2 (SEQ ID NO: 4) em relação à sua orientação normal paraa transcrição para permitir a transcrição de seu complemento.

A molécula de ácido nucleico de anti-sentido é de modousualmente substancial idêntica a pelo menos uma porção do gene ou genesalvos. O ácido nucleico, entretanto, não necessita ser perfeitamente idênticopara inibir a expressão. No geral, homologia mais alta pode ser usada paracompensar quanto ao uso de uma molécula de ácido nucleico de anti-sentidomais curta. A identidade percentual mínima é tipicamente maior do que cercade 65%, mas uma identidade percentual mais alta pode exercer uma repressãomais eficaz da expressão da seqüência endógena. A identidade percentualsubstancialmente maior de mais do que cerca de 80% tipicamente é preferida,embora cerca de 95% até a identidade absoluta é tipicamente mais preferido.

A molécula de ácido nucleico de anti-sentido não necessita tero mesmo padrão de intron ou exon como o gene alvo e segmentos nãocodificadores do gene alvo podem ser igualmente eficazes na obtenção dasupressão de anti-sentido da expressão do gene alvo como segmentoscodificadores. Uma seqüência de DNA de pelo menos cerca de mais oumenos 8 nucleotídeos pode ser usada como a molécula de ácido nucleico deanti-sentido, embora uma seqüência mais longa é preferível. Na presenteinvenção, um exemplo representativo de um agente inibidor útil de MASP-2 éuma molécula de ácido nucleico de MASP-2 de anti-sentido que é pelo menosnoventa por cento idêntica ao complemento do cDNA de MASP-2 queconsiste da seqüência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 4. Aseqüência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 4 codifica a proteínade MASP-2 que consiste da seqüência de aminoácido apresentada na SEQ IDNO: 5.

O alvejamento de oligonucleotídeos anti-sentido para ligarmRNA de MASP-2 é um outro mecanismo que pode ser usado para reduzir onível da síntese de proteína de MASP-2. Por exemplo, a síntese depoligalacturonase e o receptor de acetilcolina muscarínico tipo 2 é inibidopelos oligonucleotídeos de anti-sentido direcionados às suas respectivasseqüências de mRNA (Patente U.S. N° 5.739.119 concedida a Cheng ePatente U.S. N° 5.759.829 concedida a Shewmaker). Além disso, os exemplosde inibição de anti-sentido foram demonstradas com a ciclina da proteínanuclear de anti-sentido, o gene de resistência a medicamento múltiplo(MDG1), ICAM-1, E-selectina, STK-1, receptor GABAa estriatal e EGFhumano (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5.801.154 concedida aBaracchini; Patente U.S. N° 5.789.573 concedida a Baker; Patente U.S. N°5.718.709 concedida a Considine; e Patente U.S. N° 5.610.288 concedida aReubenstein).

Um sistema foi descrito que possibilita uma pessoa dehabilidade comum determinar quais oligonucleotídeos são úteis na invenção,que envolve sondar quanto aos sítios adequados no mRNA alvo usando aclivagem de Rnase H como um indicador para a acessibilidade de seqüênciasdentro dos transcritos. Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res. 26: 5079-5085,1998; Lloyd, et al., Nucleic Acids Res. 29: 3665-3673, 2001. Uma mistura deoligonucleotídeos de anti-sentido que são complementares a certas regiões dotranscrito de MASP-2 é adicionada aos extratos de célula que expressamMASP-2, tais como hepatócitos e hibridizados de modo a criar um sítiovulnerável à RNAseH. Este método pode ser combinado com a seleção deseqüência auxiliada por computador que pode prognosticar a seleção deseqüência ótima para as composições de anti-sentido com base na suacapacidade relativa para formar dímeros, grampos de cabelo ou outrasestruturas secundárias que reduziriam ou impediriam a ligação específica aomRNA alvo em uma célula hospedeira. Esta análise de estrutura secundária econsiderações de seleção de sítio alvo podem ser realizadas usando o softwarede análise do iniciador OLIGO (Rychlik, I., 1997) e o software de algoritmoBLASTN 2.0.5 (Altschul, S. F., et al., Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402,1997). Os compostos de anti-sentido direcionados contra a seqüência alvopreferivelmente compreendem de cerca de 8 a cerca de 50 nucleotídeos nocomprimento. Os oligonucleotídeos de anti-sentido que compreendem decerca de 9 a cerca de 35 ou os nucleotídeos são particularmente preferidos. Osinventores consideram todas as composições de oligonucleotídeo na faixa de9 a 35 nucleotídeos (isto é, aqueles de aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou35 bases no comprimento) são altamente preferidos para a prática de métodoscom base em oligonucleotídeo de anti-sentido da invenção. As regiões alvoaltamente preferidas do mRNA de MASP-2 são aquelas que estão no oupróximos do códon de início de tradução AUG e aquelas seqüências que sãosubstancialmente complementares às regiões 5' do mRNA, por exemplo,entre as regiões -10 e +10 da seqüência de nucleotídeo do gene MASP-2(SEQ ID NO: 4). Os inibidores de expressão de MASP-2 exemplares sãofornecidos na TABELA 4.

Tabela 4: Inibidores de expressão exemplares de MASP-2

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Como mencionado acima, o termo "oligonucleotídeo" comoaqui usado refere-se a um oligômero ou polímero de ácido ribonucleico(RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA) ou miméticos destes. Este termotambém abrange aquelas oligonucleobases compostas de nucleotídeos,açúcares e ligações internucleosídicas covalentes (cadeia principal) queocorrem naturalmente assim como oligonucleotídeos tendo modificações quenão ocorrem naturalmente. Estas modificações permitem que se introduzacertas propriedades desejáveis que não são oferecidas através dosoligonucleotídeos que ocorrem naturalmente, tais como propriedades tóxicasreduzidas, estabilidade aumentada contra a degradação pela nuclease ecaptação celular realçada. Em formas de realização ilustrativas, os compostosde anti-sentido da invenção diferem do DNA nativo pela modificação dacadeia principal de fosfodiéster para prolongar a vida do oligonucleotídeo deanti-sentido em que os substituintes de fosfato são substituídos pelosfosforotioatos. Do mesmo modo, uma ou ambas as extremidades dooligonucleotídeo podem ser substituídas por um ou mais derivados de acridinaque intercalam entre pares de base adjacentes dentro de um filamento de ácidonucleico.

Uma outra alternativa para anti-sentido é o uso da"interferência de RNA" (RNAi). RNAs de filamento duplo (dsRNAs) podemprovocar o silenciamento de gene em mamíferos in vivo. A função natural deRNAi e a co-supressão parecem ser a proteção do genoma contra invasãopelos elementos genéticos móveis tais como retrotransposons e vírus queproduzem RNA ou dsRNA aberrantes na célula hospedeira quando elas setornam ativas (ver, por exemplo, Jensen, J., et al., Nat. Genet. 21: 209-12,1999). A molécula de RNA de filamento duplo pode ser preparada pelasintetização de dois filamentos de RNA capazes de formar uma molécula deRNA de filamento duplo, cada uma tendo um comprimento de cerca de 19 a(por exemplo, 19 a 23 nucleotídeos). por exemplo, uma molécula dedsRNA útil nos métodos da invenção pode compreender o RNA quecorresponde a uma seqüência e seu complemento listado na TABELA 4.

Preferivelmente, pelo menos um filamento de RNA tem uma projeção 3' de 1a 5 nucleotídeos. Os filamentos de RNA sintetizados são combinados sobcondições que formam uma molécula de filamento duplo. A seqüência deRNA pode compreender pelo menos uma porção de 8 nucleotídeos da SEQID NO: 4 com um total comprimento de 25 nucleotídeos ou menos. Oplanejamento de seqüências de siRNA para um dado alvo está dentro dahabilidade comum de uma pessoa na técnica. Serviços comerciais estãodisponíveis que planejam a seqüência siRNA e garantem pelo menos 70% desilenciamento da expressão (Qiagen, Valencia, Calif).

O dsRNA pode ser administrado como uma composiçãofarmacêutica e realizado por métodos conhecidos, em que um ácido nucleicoé introduzido em uma célula alvo desejada. Os métodos de transferência degene habitualmente usados incluem fosfato de cálcio, DEAE-dextrano,eletroporação, microinjeção e métodos virais. Tais métodos são divulgadosem Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons3Inc., 1993.

As ribozimas também podem ser utilizadas para diminuir aquantidade e/ou atividade biológica de MASP-2, tais como ribozimas quealvejam o mRNA de MASP-2. As ribozimas são moléculas de RNAcatalíticas que podem clivar moléculas de ácido nucleico tendo uma seqüênciaque seja completa ou parcialmente homóloga à seqüência da ribozima. Epossível planejar transgenes de ribozima que codificam ribozimas de RNAque especificamente formam par com um RNA alvo e clivam a cadeiaprincipal de fosfodiéster em um local específico, deste modo inativandofuncionalmente o RNA alvo. Na realização desta clivagem, a ribozima não épor si só alterada e é assim capaz de reciclar e clivando outras moléculas. Ainclusão de seqüências de ribozima dentro dos RNAs de anti-sentido confereatividade de clivagem de RNA aos mesmos, aumentando deste modo aatividade das construções de anti-sentido.

As ribozimas úteis na prática da invenção tipicamentecompreendem uma região de hibridização de pelo menos cerca de novenucleotídeos, que é complementar na seqüência de nucleotídeo a pelo menosparte do mRNA de MASP-2 alvo e uma região catalítica que é adaptada paraclivar o mRNA de MASP-2 alvo (ver no geral, EPA N2 0 321 201;W088/04300; Haseloff, J., et ai, Nature 334: 585-591, 1988; Fedor, M. J .,etai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 1668-1672, 1990; Cech, T. R., et al., Ann.Rev. Biochem. 55: 599-629, 1986).

As ribozimas podem ser alvejadas diretamente às células naforma de oligonucleotídeos de RNA que incorporam seqüências de ribozimaou introduzidas na célula como um vetor de expressão que codifica o RNA deribozima desejado. As ribozimas podem ser usadas e aplicadas em grandeparte do mesmo modo como descrito para os polinucleotídeos de anti-sentido.

RNA e DNA de anti-sentido, ribozimas e moléculas de RNAiúteis nos métodos da invenção podem ser preparados por qualquer métodoconhecido na técnica para a síntese de moléculas de DNA e RNA. Estasincluem técnicas para sintetizar quimicamente oligodesoxirribonucleotídeos eoligorribonucleotídeos bem conhecidos no ramo, tais como por exemplo asíntese química de fosforamidita de fase sólida. Alternativamente, asmoléculas de RNA podem ser geradas pela transcrição in vitro e in vivo deseqüências de DNA que codificam a molécula de RNA de anti-sentido. Taisseqüências de DNA podem ser incorporadas em uma ampla variedade devetores que incorporam promotores da RNA polimerase adequados tais comoos promotores da polimerase T7 ou SP6. Alternativamente, construções decDNA de anti-sentido que sintetizam RNA de anti-sentido constitutiva ouindutivelmente, dependendo do promotor usado, podem ser introduzidasestavelmente em linhagens de célula.

Várias modificações bem conhecidas das moléculas de DNApodem ser introduzidas como um meio de aumentar a estabilidade e meiavida. As modificações úteis incluem, mas não são limitadas à adição deseqüências flanqueadoras de ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos àsextremidades 5' e/ou 3' da molécula ou o uso de fosforotioato ou 2'-0-metilaao invés de ligações de fosfodiesterase dentro da cadeia principal deoligodesoxirribonucleotídeo.

V. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE LIBERAÇÃODOSAGEM

Em um outro aspecto, a invenção fornece composições parainibir os efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2 que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agenteinibidor de MASP-2 e um veículo farmaceuticamente aceitável. Os agentesinibidores de MASP-2 pode ser administrado a um paciente em necessidadedeste, em doses terapeuticamente eficazes para tratar ou melhorar condiçõesassociadas com a ativação de complemento dependente de MASP-2. Umadose terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade do agente inibidor deMASP-2 suficiente para resultar na melhora de sintomas da condição.

A toxicidade e eficácia terapêutica dos agentes inibidores deMASP-2 podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrãoutilizando modelos de animal experimentais, tais como o modelo decamundongo MASP-2 -/- de murino que expressam o transgene humano deMASP-2 descrito no Exemplo 3. Usando tais modelos de animal, o NOAEL(nenhum nível de efeito adverso observado) e o MED (a dose minimamenteeficaz) podem ser determinados usando métodos padrão. A razão de doseentre os efeitos NOAEL e MED é a razão terapêutica, que é expressada comoa razão NOAEL/MED. Os agentes inibidores de MASP-2 que exibem razõesou índices terapêuticos grandes são mais preferidos. Os dados obtidos a partirdos ensaios de cultura de célula e estudos de animal podem ser usados naformulação de uma faixa de dosagens para o uso em seres humanos. Adosagem do agente inibidor de MASP-2 preferivelmente reside dentro de umafaixa de concentrações circulantes que incluem o MED com pouca ounenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendoda forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada.

Para qualquer formulação de composto, a doseterapeuticamente eficaz pode ser estimada usando modelos de animal. Porexemplo, uma dose pode ser formulada em um modelo de animal para seobter uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui o MED. Osníveis quantitativos do agente inibidor de MASP-2 no plasma também podeser medido, por exemplo, pela cromatografia líquida de alto desempenho.

Além dos estudos de toxicidade, a dosagem eficaz tambémpode ser estimada com base na quantidade de proteína de MASP-2 presenteem um paciente vivo e a afinidade de ligação do agente inibidor de MASP-2.Foi mostrado que os níveis de MASP-2 em pacientes humanos normais estápresente no soro em níveis baixos na faixa de 500 ng/ml e os níveis deMASP-2 em um paciente particular podem ser determinados usando umensaio quantitativo para MASP-2 descrito em Moller-Kristensen M., et ai, J.Immunol. Methods 282: 159-167, 2003.

No geral, a dosagem de composições administradas quecompreendem agentes inibidores de MASP-2 varia dependendo de fatores taiscomo a idade, peso, altura, sexo, condição médica geral e história médicaanterior do paciente. Como uma ilustração, agentes inibidores de MASP-2,tais como anticorpos anti-MASP-2, podem ser administrados em faixas dedosagem de cerca de 0,010 a 10,0 mg/kg, preferivelmente de 0,010 a 1,0mg/kg, mais preferivelmente de 0,010 a 0,1 mg/kg do peso corporal dopaciente. Em algumas formas de realização a composição compreende umacombinação de anticorpos anti-MASP-2 e os peptídeo inibidores de MASP-2.

A eficácia terapêutica de composições de inibidor de MASP-2e métodos da presente invenção em um dado paciente e as dosagensapropriadas, podem ser determinadas de acordo com ensaios de complementobem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. O complemento geranumerosos produtos específicos. Durante a última década, ensaios sensíveis eespecíficos foram desenvolvidos e estão disponíveis comercialmente para amaioria destes produtos de ativação, incluindo os fragmentos de. ativaçãopequenos C3a, C4a e C5a e os fragmentos de ativação grandes iC3b, C4d, Bbe sC5b-9. A maior parte destes ensaios utilizam anticorpos monoclonais quereagem com antígenos novos (neoantígenos) expostos no fragmento, mas nãonas proteínas nativas a partir das quais os mesmos são formados, tornando estes ensaios muito simples e específicos. A maioria conta com a tecnologiaELISA, embora o radioimunoensaio seja ainda algumas vezes usado para C3ae C5a. Estes últimos ensaios medem tanto os fragmentos não processadosquanto seus fragmentos 'desArg', que são as formas principais encontradas nacirculação. Os fragmentos não processados e C5adeSArg são rapidamente depurados pela ligação aos receptores de superfície celular e estão por estarazão presentes em concentrações muito baixas, ao passo que C3adeSArg não seliga à células e acumula-se no plasma. As medições de C3a fornecem umindicador sensível, independente do caminho da ativação de complemento. Aativação do caminho alternativo pode ser avaliada medindo-se o fragmentoBb. A detecção do produto de fase fluida da ativação do caminho de ataque demembrana, sC5b-9, fornece evidência de que o complemento está sendoativado até a conclusão. Porque tanto o caminho da lectina quanto o caminhoclássico geram os mesmos produtos de ativação, C4a e C4d, as mediçõesdestes dois fragmentos não fornecer nenhuma informação a cerca de qualdestes dois caminhos gerou os produtos de ativação.

AGENTES ADICIONAIS

As composições e métodos que compreendem agentesinibidores de MASP-2 podem opcionalmente compreender um ou maisagentes terapêuticos adicionais, que podem aumentar a atividade do agenteinibidor de MASP-2 ou que fornecem funções terapêuticas relacionadas emuma maneira aditiva ou sinergística. Por exemplo, um ou mais agentesinibidores de MASP-2 podem ser administrados em combinação com um oumais agentes anti-inflamatórios e/ou analgésicos. A inclusão e seleção deagente(s) adicional(is) serão determinadas para se obter um resultadoterapêutico desejado. Os agentes anti-inflamatórios e/ou analgésicosadequados incluem: antagonistas do receptor de serotonina; agonistas doreceptor de serotonina; antagonistas do receptor de histamina; antagonistas doreceptor de bradicinina; inibidores de calicreína; antagonistas do receptor detaquicinina, incluindo antagonistas do subtipo de receptor de neurocininaj eneurocinina2; antagonistas do receptor de peptídeo relacionado com o gene dacalcitonina (CGRP); antagonistas do receptor de interleucina; inibidores deenzimas ativas no caminho sintético para os metabólitos do ácidoaraquidônico, incluindo inibidores da fosfolipase, incluindo inibidores daisoforma PLA2 e inibidores da isoforma PLC7, inibidores da ciclooxigenase(COX) (que podem ser inibidores de COX-1, COX-2 ou não seletivo COX-Ie -2), inibidores da lipooxigenase; antagonistas do receptor de prostanóideincluindo os antagonistas de subtipo do receptor EP-I e EP-4 eicosanóides eantagonistas de subtipo do receptor de tromboxano; antagonistas do receptorde leucotrieno incluindo antagonistas do subtipo de receptor B4 deleucotrieno e antagonistas do subtipo de receptor D4 de leucotrieno; agonistasdo receptor de opióide, incluindo agonistas do subtipo de receptor de opióideμ, opióide δ e opióide κ; agonistas de purinoceptor e antagonistas incluindoos antagonistas do receptor de P2x e P2y; abridores dos canal de potássiosensíveis ao trifosfato de adenosina (ATP); inibidor MAP de cinases;inibidores da acetilcolina nicotínica; e agonistas do receptor alfa adrenérgico(incluindo alfa-1, alfa-2 e agonistas alfa-1 e 2 não seletivos).

Quando usado na prevenção ou tratamento de restenose, oagente inibidor de MASP-2 da presente invenção pode ser combinado comum ou mais agentes anti-restenose para a administração concomitante. Osagentes anti-restenose adequados incluem: agentes antiplaqueta incluindo:inibidores de trombina e antagonistas de receptor, antagonistas de receptor dodifosfato de adenosina (ADP) (também conhecidos como antagonistas doreceptor de purinoceptor 1), inibidores de tromboxano e antagonistas dereceptor e antagonistas do receptor de glicoproteína de membrana deplaqueta; inibidores de moléculas de adesão celular, incluindo inibidores deselectina e inibidores de integrina; agentes anti-quimiotáticos; antagonistas doreceptor de interleucina; e inibidores da sinalização celular incluindo:inibidores da proteína cinase C (PKC) e tirosina fosfatases de proteína,moduladores de inibidores da tirosina cinase de proteína intracelular,inibidores de domínios de Iiomologia2 src (SH2) e antagonistas do canal de cálcio.

Os agentes inibidores de MASP-2 da presente invençãotambém podem ser administrados em combinação com um ou mais outrosinibidores de complemento. Nenhum dos inibidores de complemento écorrentemente aprovado para o uso em seres humanos, entretanto algunsagentes farmacológicos mostraram bloquear complemento in vivo. Muitosdestes agentes também são tóxicos ou são apenas inibidores parciais (Asghar,S. S., Pharmacol. Rev. 36: 223-44, 1984) e a dose de uso tem sido limitada aouso como ferramentas de pesquisa. K76COOH e mesilato de nafamstat sãodois agentes que têm mostrado alguma eficácia em modelos de animal detransplante (Miyagawa, S., et al., Transplant Proc. 24: 483-484, 1992). Asheparinas de epso molecular baixo também foram mostradas serem eficazesna regulagem da atividade de complemento (Edens, R. E., et al., ComplementToday, pp. 96-120, Basel: Karger, 1993). Acredita-se que estes inibidores demolécula pequena possam ser úteis como agentes para o uso em combinaçãocom os agentes inibidores de MASP-2 da presente invenção.

Outros inibidores de complemento que ocorrem naturalmentepodem ser úteis em combinação com os agentes inibidores de MASP-2 dapresente invenção. Os inibidores biológicos de complemento incluem o fatorde complemento 1 solúvel (sCRl). Este é um inibidor que ocorrenaturalmente que pode ser encontrado na membrana externa de célulashumanas. Outros inibidores de membrana incluem DAF5 MCP e CD59. Asformas recombinantes foram testadas quanto a sua atividade anti-complemento in vitro e in vivo. sCRl foi mostrado ser eficaz emxenotranplante, em que o sistema de complemento (tanto alternativo quantoclássico) fornece o deflagrador para uma síndrome de rejeição hiperativadentro de minutos de sangue perfundido através do órgão recém transplantado(Platt J. L., et al, Immunol. Today / /: 450-6, 1990; Marino I. R., et al.,Transplant Proc. 1071: 6, 1990; Johnstone, P. S., et al., Transplantation 54:573-6, 1992). O uso de sCRl protege e prolonga o tempo de sobrevivência doórgão transplantado, implicando o caminho de complemento na patogênese dasobrevivência de órgão (Leventhal, J. R. et al., Transplantation 55: 857-66,1993; Pruitt, S. K., et al., Transplantation 57: 363-70, 1994).

Os inibidores de complemento adicionais adequados para ouso em combinação com as composições da presente invenção tambémincluem, por via de exemplo, MoAbs tais como aqueles que sãodesenvolvidos pela Alexion Pharmaceuticals, Inc., Novo Haven, Connecticute MoAbs anti-properdin.

Quando usados no tratamento de artrites (por exemplo,osteoartrite e artrite reumatóide), o agente inibidor de MASP-2 da presenteinvenção pode ser combinado com um ou mais agentes condroprotetores, quepodem incluir um ou mais promotores de anabolismo de cartilagem e/ou umou mais inibidores de catabolismo de cartilagem e adequadamente tanto umagente anabólico quanto um agente inibidor catabólico, para a administraçãoconcomitante. Os agentes condroprotetores promotores anabólicos adequadosincluem agonistas do receptor de interleucina (IL) incluindo IL-4, IL-10, IL-13, rhIL-4, rhIL-10 e rhIL-13 e IL-4, IL-IO ou IL-13 quiméricos; agonistas dasuperfamília do fator de crescimento transformador β, incluindo TGF-β,TGF-βΙ, TGF-P2, TGF-p3, proteínas morfogênicas ósseas incluindo BMP-2,BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (OP-I) e OP-2/BMP-8, fatores dediferenciação de crescimento incluindo GDF-5, GDF-6 e GDF-7, TGF-Ps eBMPs recombinantes e TGF-ps e BMPs quiméricos; fatores de crescimentoequivalentes à insulina incluindo IGF-1; e fatores de crescimento defibroblasto incluindo bFGF. Os agentes condroprotetores inibitórioscatabólicos adequados incluem antagonistas do receptor de Interleucina-I (IL-1) (IL-Ira), incluindo receptores de IL-I solúveis humanos (shuIL-lR),rshuIL-lR, rhlL-lra, anticorpo anti-ILl, AFl 1567 e AF12198; Antagonistasdo Receptor do Fator de Necrose de Tumor (TNF) (TNF-α), incluindoreceptores solúveis incluindo sTNFRI e sTNFRII, receptores solúveis de TNFrecombinante e receptores solúveis de TNF quimérico incluindo rhTNFR:Fc quimérico, receptores de Fc de fusão solúvel e anticorpos anti-TNF;inibidores da ciclooxigenase-2 (específicos de COX-2), incluindo DuP 697,SC-58451, celecoxib, rofecoxib, nimesulida, diclofenaco, meloxicam,piroxicam, NS-398, RS-57067, SC-57666, SC-58125, flosulida, etodolac, L-745.337 e DFU-T-614; inibidores da cinase de proteína ativada por Mitógeno(MAPK), incluindo inibidores de ERKl, ERK2, SAPKl, SAPK2a, SAPK2b,SAPK2d, SAPK3, incluindo SB 203580, SB 203580 iodo, SB202190, SB242235, SB 220025, RWJ 67657, RWJ 68354, FR 133605, L-167307, PD98059, PD 169316; inibidores de fator nuclear capa B (NFkB), incluindo oéter feniletílico do ácido cafeico (CAPE), DM-CΑΡΕ, peptídeo SN-50,himenialdisina e ditiocarbamato de pirrolidona; inibidores da óxido nítricosintase (NOS), incluindo NG-monometil-L-arginina, 1400W, difenilenoiódio,S-metil isotiouréia, S-(aminoetil) isotiouréia, L-N6-(I-Iminoetil)Iisina, 1,3-PBITU, 2-etil-2-tiopseudouréia, aminoguanidina, éster metílico de Νω-ηίΐΓ0-L-arginina e N®-nitro-L-arginina, inibidores das metaloproteinases de matriz(MMPs), incluindo inibidores de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14 e MMP-15 eincluindo U-24522, minociclina, 4-Abz-Gly-Pro-D-Leu-D-Ala-NHOH, Ac-Arg-Cys-Gly-Val-Pro-Asp-NH2, rhuman TIMP1, rhuman TIMP2 efosforamidon; moléculas de adesão celular, incluindo agonistas e antagonistasde integrina incluindo ανβ3 MoAb LM 609 e echistatina; agentes anti-quimiotáticos incluindo receptores de F-Met-Leu-Phe, receptores de IL-8,receptores de MCP-I e receptores de MIPl-I/ RANTES; inibidores dasinalização intracelular, incluindo (a) inibidores da cinase de proteína,incluindo tanto (i) inibidores da proteína cinase C (PKC) (isozima) incluindocalphostin C, G-6203 e GF 109203X e (ii) inibidores das tirosina cinases deproteína; (b) moduladores de tirosina fosfatases de proteína intracelulares(PTPases); e (c) inibidores de domínios SH2 (domínios src Homology2).

Para algumas aplicações, podem ser benéfico administrar osagentes inibidores de MASP-2 da presente invenção em combinação com umagente inibidor de espasmo. Por exemplo, para as aplicações urogenitais, podeser benéfico incluir pelo menos um agente inibidor de espasmos do músculoliso e/ou pelo menos um agente anti-inflamatório e para procedimentosvasculares pode ser útil incluir pelo menos um inibidor de vasoespasmo e/oupelo menos um agente anti-inflamatório e/ou pelo menos um agente anti-restenose. Os exemplos adequados de agentes inibidores de espasmo incluem:antagonistas do subtipo de receptor de serotonina2; antagonistas do receptorde taquicinina; doadores de óxido nítrico; abridores do canal de potássiosensíveis ao ATP; antagonistas do canal de cálcio; e antagonistas do receptorde endotelina.

VEÍCULOS E VEÍCULOS DE LIBERAÇÃO FARMACÊUTICOS

No geral, as composições de agente inibidor de MASP-2 dapresente invenção, combinados com qualquer outros agentes terapêuticosselecionados, são adequadamente contidos em um veículo farmaceuticamenteaceitável. O veículo é não tóxico, biocompatível e é selecionado de modo anão afetar danosamente a atividade biológica do agente inibidor de MASP-2(e quaisquer outros agentes terapêuticos combinados com o mesmo). Osveículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares para os peptídeos sãodescritos na Patente U. S. Ne 5.211.657 concedida a Yamada. Os anticorposanti-MASP-2 e os peptídeos inibidores úteis na invenção podem serformulados em preparações nas formas sólidas, semi-sólidas, gel, líquida ougasosa tais como tabletes, cápsulas, pós, grânulos, ungüentos, soluções,depósitos, inalantes e injeções que permitam a administração oral, parenteralou cirúrgica. A invenção também considera a administração local dascomposições revestindo-se os dispositivos médicos e outros.

Os veículos adequados para a liberação parenteral porintermédio da liberação injetável, infusão ou irrigação e tópica incluem águadestilada, solução salina tamponada por fosfato fisiológica, soluções deRinger normal ou lactatada, solução de dextrose, solução de Hank oupropanodiol. Além disso, óleos estéreis, fixos podem ser utilizados como umsolvente ou meio de suspensão. Para este propósito qualquer óleobiocompatível pode ser utilizado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos.Além disso, ácidos graxos tais como ácido oléico encontram uso napreparação de injetáveis. O veículo e agente podem ser compostos como umlíquido, suspensão, gel polimerizável ou não polimerizável, pasta ou pomada.

O veículo também pode compreender um veículo de liberaçãopara sustentar (isto é, prolongar, retardar ou regular) a liberação do(s)agente(s) ou para realçar a liberação, captação, estabilidade oufarmacocinéticas do(s) agente(s) terapêutico(s). Um tal veículo de liberaçãopode incluir, por via de exemplo não limitante, micropartículas, microesferas,nanoesferas ou nanopartículas compostas de proteínas, lipossomas,carboidratos, compostos orgânicos sintéticos, compostos inorgânicos,hidrogéis poliméricos ou copoliméricos e micelas poliméricas. Os sistemas deliberação de hidrogel e micela adequados incluem os copolímerosPEO:PHB:PEO e complexos de copolímero/ciclodextrina divulgados na WO2004/009664 A2 e os complexos de PEO e PEO/ciclodextrina divulgados naUS 2002/0019369 Al. Tais hidrogéis podem ser injetados localmente no sítio de ação pretendido ou subcutânea ou intramuscularmente para formar umdepósito de liberação sustentada.

Para a liberação intra-articular, o agente inibidor de MASP-2pode ser carregado em veículos líquidos ou em gel descritos acima que sãoinjetáveis, veículos de liberação sustentada descritos acima que são injetáveis ou um ácido hialurônico ou derivado do ácido hialurônico.

Para a administração oral de agentes não peptidérgicos, oagente inibidor de MASP-2 pode ser carregado em um enchedor ou diluenteinertes tais como sacarose, amido de milho ou celulose.

Para a administração tópica, o agente inibidor de MASP-2pode ser carregado em ungüento, loção, creme, gel, gota, supositório,pulverização, líquida ou pó ou em gel ou sistemas de liberaçãomicrocapsulares por intermédio de um emplastro transdérmico.

Vários sistemas de liberação nasal e pulmonar, incluindoaerossóis, inaladores de dose medida, inaladores de pó seco e nebulizadores, estão sendo desenvolvidos e podem ser adequadamente adaptados para aliberação da presente invenção em um veículo de liberação em aerossol,inalante ou nebulizado, respectivamente.

Para a liberação intratecal (IT) ou intracerebroventricular(ICV), sistemas de liberação apropriadamente estéreis (por exemplo, líquidos;géis, suspensões, etc.) podem ser usados para administrar a presente invenção.

As composições da presente invenção também podem incluirexcipientes biocompatíveis, tais como agentes de dispersão ou umectação,agentes de suspensão, diluentes, tampões, realçadores de penetração,emulsificadores, aglutinantes, espessadores, agentes flavorizantes (para aadministração oral).

VEÍCULOS FARMACÊUTICOS PARA ANTICORPOS E PEPTÍDEOS

Mais especificamente com respeito aos anticorpos anti-MASP-2 e peptídeos inibidores, as formulações exemplares podem serparenteralmente administradas como dosagens injetáveis de uma solução oususpensão do composto em um diluente fisiologicamente aceitável com umveículo farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como água, óleos,solução salina, glicerol ou etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares taiscomo agentes umectantes ou emulsificantes, tensoativos, substânciastamponantes de pH e outros podem estar presentes nas composições quecompreendem anticorpos anti-MASP-2 e peptídeos inibidores. Oscomponentes adicionais de composições farmacêuticas incluem petróleo (talcomo de origem animal, vegetal ou sintética), por exemplo, óleo de soja eóleo mineral. No geral, glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicolsão veículos líquidos preferidos para soluções injetáveis.

Os anticorpos anti-MASP-2 e peptídeos inibidores tambémpodem ser administrados na forma de uma preparação de injeção ou implantede depósito que pode ser formulada em uma tal maneira como para permitiruma liberação sustentada ou pulsátil dos agentes ativos.

VEÍCULOS FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS PARA OSINIBIDORES DE EXPRESSÃO

Mais especificamente com respeito aos inibidores de expressãoúteis nos métodos da invenção, composições são fornecidas quecompreendem um inibidor de expressão como descritos acima e um veículoou diluente farmaceuticamente aceitáveis. A composição pode compreenderainda um sistema de dispersão coloidal.

As composições farmacêuticas que incluem inibidores deexpressão podem incluir, mas não são limitadas a, soluções, emulsões eformulações contendo lipossoma. Estas composições podem ser geradas apartir de uma variedade de componentes que incluem, mas não são limitadosa, líquidos preformados, sólidos auto-emulsificantes e semi-sólidos auto-emulsificantes. A preparação de tais composições tipicamente envolvecombinar o inibidor de expressão com um ou mais dos seguintes: tampões,antioxidantes, polipeptídeos de peso molecular baixo, proteínas, aminoácidos,carboidratos incluindo glicose, sacarose ou dextrinas, agentes queladores taiscomo EDTA, glutationa e outros estabilizadores e excipientes. Solução salinatamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica nãoespecífica são exemplos de diluentes adequados.

Em algumas formas de realização, as composições podem serpreparadas e formuladas como emulsões que são tipicamente sistemasheterogêneos de um líquido disperso em um outro na forma de gotículas (ver,Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1, Rieger e Banker (eds.),Marcek Dekker, Inc., N. Y., 1988). Os exemplos de emulsificadores queocorrem naturalmente usados nas formulações de emulsão incluem acácia,cera de abelha, lanolina, lecitina e fosfatídeos.

Em uma forma de realização, as composições incluindo ácidosnucleicos podem ser formuladas como microemulsões. Uma microemulsão,como aqui usado refere-se a um sistema de água, óleo e anfífilo, que é umasolução líquida única opticamente isotrópica e termodinamicamente estável(ver Rosoff em Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1). O método da invençãotambém pode usar lipossomas para a transferência e liberação deoligonucleotídeos de anti-sentido para o sítio desejado.

As composições e formulações farmacêuticas de inibidores deexpressão para a administração tópica podem incluir emplastrostransdérmicos, ungüentos, loções, cremes, géis, pastilhas, supositórios,pulverizações, líquidas e pós. Veículos farmacêuticos convencionais, assimcomo bases aquosas, em pó ou oleosas e espessadores e outros podem serusados.MODOS DE ADMINISTRAÇÃO

As composições farmacêuticas que compreendem agentesinibidores de MASP-2 podem ser administradas em vários modos dependendode se um modo local ou sistêmico de administração é mais apropriado para acondição que é tratada. Adicionalmente, como aqui descrito acima comrespeito aos procedimentos de reperfusão extracorporais, os agentesinibidores de MASP-2 podem ser administrados por intermédio da introduçãodas composições da presente invenção ao sangue ou plasma recirculantes.Além disso, as composições da presente invenção podem ser liberadasrevestindo-se ou incorporando-se as composições sobre ou dentro de umdispositivo médico implantável.

LIBERAÇÃO SISTÊMICA

Como aqui usado, os termos "liberação sistêmica" e"administração sistêmica" são intencionados a incluir mas não são limitadosàs vias oral e parenteral incluindo intramuscular (IM), subcutânea,intravenosa (IV), intra-arterial, inalacional, sublingual, bucal, tópica,transdérmica, nasal, retal, vaginal e outras vias de administração queeficazmente resultam em disseminação do agente liberado a um sítio único oumúltiplo de ação terapêutica pretendida. As vias preferidas de liberaçãosistêmica para as presentes composições incluem intravenosa, intramuscular,subcutânea e inalacional. Será avaliado que a via de administração sistêmicaexata para os agentes selecionados utilizados em composições particulares dapresente invenção será determinada em parte levando-se em conta asuscetibilidade do agente aos caminhos de transformação metabólicaassociados com uma dada via de administração. Por exemplo, os agentespeptidérgicos podem ser mais adequadamente administrados pelas vias outrasque não a oral.

Os anticorpos e polipeptídeos inibidores de MASP-2 podemser liberados em um paciente em necessidade deste por qualquer meiosadequados. Os métodos de liberação de anticorpos e polipeptídeos de MASP-2 incluem a administração pelas vias oral, pulmonar, parenteral (por exemplo,injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou subcutânea),inalação (tal como por intermédio uma formulação de pó fino), transdérmica,nasal, vaginal, retal ou sublingual de administração e podem ser formuladosem formas de dosagem apropriadas para cada via de administração.

Por via de exemplo representativo, anticorpos e peptídeosinibidores de MASP-2 podem ser introduzidos em um corpo vivo pelaaplicação a uma membrana corporal capaz de absorver os polipeptídeos, porexemplo as membranas nasais, gastrintestinais e retais. Os polipeptídeos sãotipicamente aplicados à membrana absortiva em conjunção com um realçadorde permeação. (Ver, por exemplo, Lee, V. H. L., Crit. Rev. Ther. Drug CarrierSys. 5: 69, 1988; Lee, V. H. L., J. Controlled Release 13: 213, 1990; Lee, V.H. L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Mareei Dekker, Nova Iorque(1991); DeBoer, A. G., et al., J. Controlled Release, 13: 241, 1990). Porexemplo, STDHF é um derivado sintético de ácido fusídico, um tensoativoesteroidal que é similar em estrutura aos sais biliares e tem sido usado comoum realçador de permeação para a liberação nasal. (Lee, W. A., Biopharm.22, Nov./Dez. 1990).

Os anticorpos e polipeptídeos inibidores de MASP-2 podemser introduzidos em associação com uma outra molécula, tal como um lipídeo,para proteger os polipeptídeos da degradação enzimática. Por exemplo, aligação covalente de polímeros, especialmente polietileno glicol (PEG), temsido usada para proteger certas proteínas da hidrólise enzimática no corpo eassim prolongar a meia vida (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990). Muitos sistemas poliméricos têm sido relatados para a liberaçãode proteína (Bae, Y. H., et al., J. Controlled Release 9: 271, 1989; Hori, R., etal., Pharm. Res. 6: 813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sei. 79: 505,1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10: 195, 1989; Asano, M., etal., J. Controlled Release 9: 111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. ControlledRelease 9: 195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12: 235, 1990;Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sei. 78: 117, 1989; Takakura, Y., et al., J.Pharm. Sei. 78: 219, 1989).

Recentemente, lipossomas foram desenvolvidos comestabilidade sérica e meias-vidas em circulação melhoradas (ver, porexemplo, a Patente U.S. Ne 5.741.516 concedido a Webb). Além disso, váriosmétodos de preparações de lipossoma e equivalentes a lipossoma comoveículos de medicamento potenciais foram revisados (ver, por exemplo,Patente U.S. Ne 5.567.434 concedido a Szoka; Patente U.S. N2 5.552.157concedida a Yagi; Patente U.S. Ns 5.565.213 concedida a Nakamori; PatenteU.S. N5 5.738.868 concedida a Shinkarenko; e Patente U.S. N- 5.795.587concedida a Gao).

Para aplicações transdérmicas, os anticorpos e polipeptídeos inibidores de MASP-2 podem ser combinados com outros ingredientesadequados, tais como veículos e/ou adjuvantes. Não existe nenhuma limitaçãosobre a natureza de tais outros ingredientes, exceto que eles devem serfarmaceuticamente aceitáveis quanto a sua administração pretendida e nãopode degradar a atividade dos ingredientes ativos da composição. Os exemplos de veículos adequados incluem ungüentos, cremes, géis oususpensões, com ou sem colágeno purificado. Os anticorpos e polipeptídeosinibidores de MASP-2 também podem ser impregnados em emplastrostransdérmicos, gessos e bandagens, preferivelmente nas formas líquida ousemi-líquida.

As composições da presente invenção podem sersistemicamente administradas em uma base periódica em intervalosdeterminados para manter um nível desejado de efeito terapêutico. Porexemplo, composições podem ser administradas, tais como pela injeçãosubeutânea, a cada duas a quatro semanas ou em intervalos menos freqüentes.O regime de dosagem será determinado pelo médico considerando váriasfatores que podem influenciar a ação da combinação de agentes. Estes fatoresincluirão o grau de progresso da condição que é tratada, da idade, sexo e pesodo paciente e outros fatores clínicos. A dosagem para cada agente individualvariará como uma função do agente inibidor de MASP-2 que é incluído nacomposição, assim como a presença e natureza de qualquer veículo deliberação de medicamento (por exemplo, um veículo de liberação sustentada).Além disso, a quantidade de dosagem pode ser ajustada levando-se em contaa variação na freqüência de administração e o comportamentofarmacocinético do(s) agente(s) liberado(s).

LIBERAÇÃO LOCAL

Como aqui usado, o termo "local" abrange a aplicação de ummedicamento em ou em torno de um sítio de ação localizada pretendida epode incluir por exemplo a liberação tópica à pele ou outros tecidos afetados,liberação oftálmica, administração, colocação ou irrigação intratecal (IT),intracerebroventricular (ICV), intra-articular, intracavidade, intracraniana ouintravesicular. A administração local pode ser preferida para permitir aadministração de uma dose mais baixa, para evitar efeitos colateraissistêmicos e para o controle mais preciso do tempo de liberação econcentração dos agentes ativos no sítio de liberação local. A administraçãolocal fornece uma concentração conhecida no sítio alvo, independente davariabilidade interpaciente no metabolismo, fluxo sangüíneo, etc. O controlede dosagem melhorada também é fornecido pelo modo direto de liberação.

A liberação local de um agente inibidor de MASP-2 pode serobtida no contexto de métodos cirúrgicos para tratar uma doença ou condição,tal como por exemplo durante procedimentos tais como cirurgia de desvioarterial, aterectomia, procedimentos a laser, procedimentos ultra-sônicos,angioplastia de balão e colocação de sonda. Por exemplo, um inibidor deMASP-2 pode ser administrado a um paciente em conjunção com umprocedimento de angioplastia de balão. Um procedimento de angioplastia debalão envolve inserir um cateter tendo um balão esvaziado dentro de umaartéria. O balão esvaziado é posicionado na proximidade da placaaterosclerótica e é inflado tal que a placa seja comprimida contra a paredevascular. Como um resultado, a superfície do balão está em contato com acamada de células endoteliais vasculares na superfície do vaso sangüíneo. Oagente inibidor de MASP-2 pode ser ligado ao cateter da angioplastia de balãoem uma maneira que permita a liberação do agente no sítio da placaaterosclerótica. O agente pode ser ligado ao cateter de balão de acordo comprocedimentos padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, o agente pode serarmazenado em um compartimento do cateter de balão até que o balão sejainflado, ponto no qual é liberado no ambiente local. Alternativamente, oagente pode ser impregnado na superfície do balão, tal que o mesmo contateas células da parede arterial conforme o balão é inflado. O agente tambémpode ser liberado em um cateter de balão perfurado tal como aquelesdivulgados em Flugelman, M. Y., et al., Circulation 85: 1110-1117, 1992. Vertambém o Pedido PCT publicado WO 95/23161 quanto a um procedimentoexemplar para ligar uma proteína terapêutica a um cateter de angioplastia debalão. Do mesmo modo, o agente inibidor de MASP-2 pode ser incluído emum gel ou revestimento polimérico aplicado a uma sonda ou pode serincorporado no material da sonda, tal que a sonda elua o agente inibidor deMASP-2 depois da colocação vascular.

As composições de inibidor de MASP-2 usadas no tratamentode artrites e outros distúrbios musculoesqueletais podem ser localmenteliberadas pela injeção intra-articular. Tais composições podemadequadamente incluir um veículo de liberação sustentada. Como um outroexemplo de casos em que a liberação local pode ser desejada, as composiçõesde inibidor de MASP-2 usadas no tratamento de condições urogenitais podemser adequadamente instiladas intravesicalmente ou dentro de uma outraestrutura urogenital.

REVESTIMENTOS EM UM DISPOSITIVO MÉDICO

Os agentes inibidores de MASP-2 tais como anticorpos epeptídeos inibidores podem ser imobilizados sobre (ou dentro) de umasuperfície de um dispositivo médico implantável ou ligável. A superfíciemodificada tipicamente estará em contato com o tecido vivo depois daimplantação em um corpo animal. Por "dispositivo médico implantável ouligável" é intencionado qualquer dispositivo que seja implantado em ou ligadoao tecido de um corpo animal, durante a operação normal do dispositivo (porexemplo, sondas e dispositivos de liberação de medicamento implantável).Tais dispositivos médicos implantáveis ou ligáveis podem ser fabricados, porexemplo, de nitrocelulose, diazocelulose, vidro, poliestireno, cloreto depolivinila, polipropileno, polietileno, dextrano, Sefarose, ágar, amido, náilon,aço inoxidável, titânio e polímeros biodegradáveis e/ou biocompatíveis. A ligação da proteína a um dispositivo pode ser realizada por qualquer técnicaque não destrua a atividade biológica da proteína ligada, por exemplo pelaligação de um ou ambos dos resíduos de terminal N ou C da proteína aodispositivo. A ligação também pode ser feita em um ou mais sítios internos naproteína. As ligações múltiplas (tanto internas quanto nas extremidades daproteína) também podem ser usadas. Uma superfície de um dispositivomédico implantável ou ligável pode ser modificada para incluir gruposfuncionais (por exemplo, carboxila, amida, amino, éter, hidroxila, ciano,nitrido, sulfanamido, acetilínico, epóxido, silânico, anídrico, succinímico,azido) para a imobilização da proteína a este. As químicas de ligação incluem,mas não são limitadas à formação de derivados de ésteres, éteres, amidas,azido e sulfanamido, cianato e outras ligações aos grupos funcionaisdisponíveis nos anticorpos de MASP-2 ou peptídeos inibidores. Os anticorposde MASP-2 ou fragmentos inibidores também podem ser ligados nãocovalentemente pela adição de uma seqüência de rótulo de afinidade àproteína, tal como GST (D. B. Smith e K. S. Johnson, Gene 67: 31, 1988),poliistidinas (E. Hochuli et ai., J. Chromatog. 411: 77, 1987) ou biotina. Taisrótulos de afinidade podem ser usados para a ligação reversível da proteína aum dispositivo.

As proteínas também podem ser covalentemente ligadas àsuperfície de um corpo de dispositivo, por exemplo, pela ativação covalenteda superfície do dispositivo médico. Por via de exemplo representativo, a(s)proteína(s) matricelular(es) pode(m) ser ligada(s) ao corpo de dispositivo porqualquer um dos seguintes pares de grupos reativos (um membro do parestando presente na superfície do corpo de dispositivo e o outro membro dopar estando presente na(s) proteína(s) matricelular(es)): hidroxila/ácidocarboxílico para produzir uma ligação de éster; hidroxila/anidrido paraproduzir uma ligação de éster; hidroxila/isocianato para produzir uma ligaçãode uretano. Uma superfície de um corpo de dispositivo que não possui gruposreativos úteis podem ser tratados com gravação com plasma de descarga derádio-freqüência (RFGD) para gerar grupos reativos de modo a permitir adeposição de proteína(s) matricelular(es) (por exemplo, tratamento complasma de oxigênio para introduzir grupos contendo oxigênio; tratamento complasma de propil amino para introduzir grupos amina).

Os agentes inibidores de MASP-2 que compreendemmoléculas de ácido nucleico tais como inibidores de peptídeo que codificaRNAi ou DNA de anti-sentido, podem ser embutidos em matrizes porosasligadas a um corpo de dispositivo. As matrizes porosas representativas úteispara fabricar a camada de superfície são aquelas preparadas a partir decolágeno de tendão ou dérmico, como pode ser obtido de uma variedade defontes comerciais (por exemplo, Sigma e Collagen Corporation) ou matrizesde colágeno preparadas como descrito nas Patentes U.S. N— 4.394.370concedida a Jefferies e 4.975.527 concedida a Koezuka. Um material decolágeno é chamado de UltraFiber® e é obtenível da Norian Corp. (MountainView, Califórnia).

Certas matrizes poliméricas também podem ser utilizadas sedesejado e incluem polímeros de éster acrílico e polímeros de ácido láctico,como divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. Ne 4.526.909 concedida aUrist e 4.563.489 concedida a Urist. Os exemplos particulares de polímerosúteis são aqueles de ortoésters, anidridos, propileno-cofiimaratos ou umpolímero de um ou mais monômeros do ácido α-hidróxi carboxílico, (porexemplo, ácido α-hidróxi acético (ácido glicólico) e/ou ácido a-hidróxipropiônico (ácido láctico)).

REGIMES DE TRATAMENTO

Nas aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas sãoadministradas a um paciente suscetível a ou de outro modo em risco de, umacondição associada com a ativação de complemento dependente de MASP-2em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco de desenvolversintomas da condição. Nas aplicações terapêuticas, as composiçõesfarmacêuticas são administradas a um paciente suspeito de ou que já sofre de,uma condição associada com a ativação de complemento dependente deMASP-2 em uma quantidade terapeuticamente eficaz suficiente para aliviarou pelo menos parcialmente reduzir, os sintomas da condição. Nos regimestanto profilático quanto terapêutico, as composições que compreendemagentes inibidores de MASP-2 podem ser administradas em diversas dosagensaté que um resultado terapêutico suficiente tenha sido obtido no paciente. Aaplicação das composições de inibidor de MASP-2 da presente invenção podeser realizada por uma única administração da composição ou uma seqüêncialimitada de administrações, para o tratamento de uma condição aguda, porexemplo, lesão de reperfusão ou outra lesão traumática. Alternativamente, acomposição pode ser administrada em intervalos periódicos em um período detempo ampliado para o tratamento de condições crônicas, por exemplo,artrites ou psoríase.Os métodos e composições da presente invenção podem serusados para inibir a inflamação e processos relacionados que tipicamenteresultam de diagnóstico e procedimentos médicos terapêuticos e cirúrgicos.Para inibir tais processos, a composição de inibidor de MASP-2 da presenteinvenção pode ser aplicada periprocedimentalmente. Como aqui usado"periproceduralmente" refere-se à administração da composição inibidorapré-procedimental e/ou intraprocedimental e/ou pós-procedimentalmente, istoé, antes do procedimento, antes e durante o procedimento, antes e depois doprocedimento, antes, durante e depois do procedimento, durante oprocedimento, durante e depois do procedimento ou depois do procedimento.A aplicação periprocedimental pode ser realizada pela administração local dacomposição ao sítio cirúrgico ou procedimental, tal como pela injeção ouirrigação contínua ou intermitente do sítio ou pela administração sistêmica.Os métodos adequados para a liberação perioperativa local de soluções deagente inibidor de MASP-2 são divulgados nas Patentes US N- 6.420.432concedida a Demopulos e 6.645.168 concedida a Demopulos. Os métodosadequados para a liberação local de composições condroprotetoras incluindoagente(s) inibidor(es) de MASP-2 são divulgados no Pedido de PatenteInternacional PCT WO 01/07067 A2. Os métodos e composições adequadospara a liberação sistêmica alvejada de composições condroprotetorasincluindo agente(s) inibidor(es) de MASP-2 são divulgados no Pedido dePatente Internacional PCT WO 03/063799 A2.

VI. EXEMPLOS

Os seguintes exemplos meramente ilustram o melhor modoagora considerado para a prática da invenção, mas não devem serinterpretados como limitantes da invenção. Todas as citações de literaturaaqui são expressamente incorporadas por referência.

EXEMPLO 1

Este exemplo descreve a geração de uma cepa de camundongodeficiente em MASP-2 (MASP-2-/-) mas suficiente de MAp19 (MAp19+/+).

Materiais e Métodos: O vetor de alvejamento pKO-NTKV1901 foi planejado para romper os três exons que codificam a extremidade determinal C de MASP-2 de murino, incluindo o exon que codifica o domíniode serina protease, como mostrado na FIGURA 4. PKO-NTKV 1901 foiusado para transfectar a linhagem de célula ES de murino E14.1a (SV129Ola). Clones resistentes à Neomicina e sensíveis à Timidina Cinase foramselecionados. 600 clones ES foram triados e, destes, quatro clones diferentesforam identificados e verificados pela southern blot conter o evento dealvejamento e recombinação seletivo esperado como mostrado na FIGURA 4.Quimeras foram geradas a partir desses quatro clones positivos pelatransferência de embrião. As quimeras foram depois retrocruzadas no fundogenético C57/BL6 para criar machos transgênicos. Os machos transgênicosforam cruzados com fêmeas para gerar Fls com 50% da progênie mostrandoheterozigosidade para o gene MASP-2 rompido. Os camundongosheterozigotos foram intercruzados para gerar progênie homozigóticadeficiente em MASP-2, resultando em camundongos heterozigotos e do tiposelvagem na razão de 1:2:1, respectivamente.

Resultado e Fenótipo: Os camundongos homozigotosdeficientes em MASP-2-/- resultantes foram descobertos serem viáveis eférteis e foram verificados ser deficientes em MASP-2 pela southern blot paraconfirmar o evento de alvejamento correto, pela Northern blot para confirmara ausência de mRNA de MASP-2 e pela Western blot para confirmar aausência de proteína de MASP-2 (dados não mostrados). A presença demRNA de MAp19 e a ausência de mRNA de MASP-2 foram aindaconfirmadas usando a RT-PCR resolvida com o tempo em uma máquinaLeveCycler. Os camundongos MASP-2-/- continuaram a expressar mRNA eproteína de MAp19, MASP-1 e MASP-3 como esperado (dados nãomostrados). A presença e abundância de mRNA nos camundongos MASP-2-/- quanto a Properdin, Fator B, Fator D, C4, C2 e C3 foram avaliadas pelaanálise de LeveCycler e descoberto ser idênticas àquelas dos controles deninhada do tipo selvagem (dados não mostrados). O plasma de camundongoshomozigotos MASP-2-/- é totalmente deficiente da ativação de complementomediada pelo caminho da lectina e ativação de complemento de caminhoalternativo como ainda descrito no Exemplo 2.

A geração de uma cepa MASP-2-/- em um fundo C57BL6puro: Os camundongos MASP-2-/- são retro-cruzados com uma linhagemC57BL6 pura por nove gerações antes do uso da cepa MASP-2-/- como ummodelo de animal experimental.

EXEMPLO 2

Este exemplo demonstra que MASP-2 é requerido para aativação de complemento por intermédio dos caminhos alternativo e dalectina.

Métodos e Materiais:

Ensaio de Clivagem C4 Específico do Caminho da Lectina:Um ensaio de clivagem C4 foi descrito por Petersen, et al., J. Immunol.Methods 257: 107 (2001) que mediu a ativação do caminho da lectina queresulta do ácido lipoteicóico (LTA) de S. aureus, que liga L-ficolina. O ensaiodescrito no Exemplo 11 foi adaptado para medir a ativação do caminho dalectina por intermédio de MBL revestindo-se a placa com LPS e manana ouzimosan antes da adição de soro de camundongos MASP-2 -/- como descritoabaixo. O ensaio também foi modificado para remover a possibilidade declivagem C4 devido ao caminho clássico. Isto foi obtido usando-se umtampão de diluição de amostra contendo NaCl 1 M, que permite ligação dealta afinidade de componentes de reconhecimento do caminho da lectina aosseus ligandos mas impede a ativação de C4 endógeno, deste modo excluindoa participação do caminho clássico pela dissociação do complexo Cl.Resumidamente descrito, nas amostras de soro do ensaio modificado (diluídasem tampão de sal alto (1 M de NaCl)) são adicionados a placas revestidascom ligando, seguido pela adição de uma quantidade constante de C4purificado em um tampão com uma concentração fisiológica de sal. Oscomplexos de reconhecimento ligados contendo MASP-2 clivam o C4,resultando na deposição de C4b.

Métodos de Ensaio:

1) Placas microtituladoras Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc5Cat. N° 442404, Fisher Scientific) foram revestidas com 1 μg/ml de manana(M7504 Sigma) ou qualquer outro ligando (por exemplo, tal como aqueleslistados abaixo) diluído em tampão de revestimento (15 mM de Na2COs, 35mM de NaHCO3, pH 9,6).

Os seguintes reagentes foram usados no ensaio:

a. manana (1 μ§ΔΌ5εηΉΐόπο de manana (M7504 Sigma) em1OO μΐ de tampão de revestimento);

b. zimosan (1 μg/reservatório de zimosan (Sigma) em 100 μΐde tampão de revestimento);

c. LTA (1 μg/reservatório em 100 μΐ de tampão derevestimento ou 2 μg/reservatório em 20 μΐ de metanol)

d. 1 μg do Mab 4H5 específico em H-ficolina em tampão derevestimento

e. PSA de Aerococcus viridans (2 μg/reservatório em 100 μΐde tampão de revestimento)

f. 100 μΐ/reservatório de S. aureus DSM20233 fixado emformalina (OD550 = 0,5) em tampão de revestimento.

2) As placas foram incubadas durante a noite a 4°C.

3) Depois da incubação noturna, os sítios de ligação deproteína residuais foram saturados incubando-se as placas com 0,1% detampão de bloqueio de HSA-TBS (0,1% (p/v) HSA em 10 mM de Tris-Cl,140 mM de NaCl, 1,5 mM de NaN3, pH 7,4) por 1 a 3 horas, depois lavandoas placas 3X com TBS/tween/Ca2+ (TBS com 0,05% de Tween 20 e 5 mM deCaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7,4).

4) As amostras de soro a serem testadas foram diluídas emtampão de ligação de MBL (1 M de NaCl) e as amostras diluídas foramadicionadas às placas e incubadas durante a noite a 4°C. Os reservatórios querecebem tampão apenas foram usados como controles negativos.

5) A seguir da incubação noturna a 4°C, as placas foramlavadas 3X com TBS/tween/Ca2+. C4 humano (100 μΐ/reservatório de 1 μΐdiluído em BBS (4 mM de barbital, 145 mM de NaCl5 2 mM de CaCl2, 1 mMde MgCl2, pH 7,4)) foi depois adicionado às placas e incubadas por 90minutos a 37°C. As placas foram lavadas mais uma vez 3X comTB S/tween/Ca2+.

6) A deposição de C4b foi detectada com um C4c anti-humano de galinha conjugado com fosfatase alcalina (diluída 1:1000 emTBS/tween/Ca ), que foi adicionado às placas e incubadas por 90 minutos natemperatura ambiente. As placas foram depois lavadas mais uma vez 3X comTBS/tween/Ca2+.

7) A fosfatase alcalina foi detectada pela adição de 100 μΐ desolução de substrato de fosfato de p-nitrofenila, incubando na temperaturaambiente por 20 minutos e lendo a OD40S em uma leitora de placa demicrotítulo.

Resultados: As FIGURAS 6A-B mostram a quantidade dedeposição de C4b em manana (FIGURA 6A) e zimosan (FIGURA 6B) emdiluições séricas de MASP-2+/+ (cruzes), MASP-2+/- (círculos fechados) eMASP-2-/- (triângulos fechados). A FIGURA 6C mostra a atividade de C4convertase relativa em placas revestidas com zimosan (barras brancas) oumanana (barras sombreadas) de camundongos MASP-2-/+ (n = 5) ecamundongos MASP-2-/- (n = 4) relativo aos camundongos do tipo selvagem(n = 5) com base na medição da quantidade de deposição de C4b normalizadapara soro do tipo selvagem. As barras de erro representam o desvio padrão.Como mostrado nas FIGURAS 6A-C, o plasma de camundongos MASP-2-/-é totalmente deficiente na ativação de complemento mediada pelo caminho dalectina em placas revestidas com manana e em zimosan. Estes resultadosclaramente demonstraram que MASP-2, mas não MASP-I ou MASP-3, é ocomponente efetor do caminho da lectina.

Ensaio de deposição de C3b:

1) As placas microtituladoras Nunc Maxisorb (Maxisorb,Nunc, cat. No. 442404, Fisher Scientific) são revestidas com 1μg/reservatório de manana (M7504 Sigma) ou qualquer outro ligando diluídoem tampão de revestimento (15 mM de Na2CO3, 35 mM de NaHCO3, pH 9,6)e incubadas durante a noite a 4°C.

2) Os sítios de ligação de proteína residuais são saturadospela incubação da placa com 0,1% de tampão bloqueador de HSA-TBS (0,1%(p/v) de HSA em 10 mM de Tris-Cl, 140 mM de NaCl, 1,5 mM de NaN3, pH7,4) por 1 a 3 horas.

3) As placas são lavadas em TBS/tw/Ca++(TBS com 0,05%de Tween 20 e 5 mM de CaCl2) e BBS diluído é adicionado às amostras desoro (4 mM de barbital, 145 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2,pH 7,4). Os reservatórios que recebem apenas tampão são usados comocontroles negativos. Um conjunto de controle de amostras de soro obtido doscamundongos do tipo selvagem ou MASP-2-/- são esgotados em Clq antes douso no ensaio. O soro de camundongo esgotado em Clq foi preparado usandoDynabeads ligadas à proteína A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) revestidascom Clq IgG anti-humano de coelho (Dako, Glostrup, Dinamarca), de acordocom as instruções do fornecedor.

4) A seguir da incubação noturna a 4°C e uma outra lavagemcom TBS/tw/Ca++, C3 convertido e ligado é detectado com um Anticorpo C3canti-humano policlonal (Dako A 062) diluído em TBS/tw/Ca^ a 1:1000). Oanticorpo secundário é IgG anti-coelho de cabra (molécula inteira) conjugadaà fosfatase alcalina (Sigma Immunochemicals A-3812) diluída 1:10.000 emTBS/tw/Ca++. A presença de caminho de complemento alternativo (AP) édeterminada pela adição de 100 μl de solução de substrato (conjuntos detablete de Fosfato de p-Nitrofenila Sigma Fast, Sigma) e incubação natemperatura ambiente. A hidrólise é monitorada quantitativamente medindo-se a absorção a 405 nm em uma leitora de placa de microtítulo. Uma curvapadrão é preparada para cada análise usando diluições em série de amostrasde plasma/soro.

Resultados: Os resultados mostrados nas FIGURAS 7A e 7Bsão de soro reunido de diversos camundongos. As cruzes representam soro deMASP-2+/+, os círculos cheios representam soro MASP-2+/+ esgotados emClq, os quadrados abertos representam soro MASP-2-/- e os triângulosabertos representam soro MASP-2-/- esgotado em Clq. Como mostrado nasFIGURAS 7A-B, o soro de camundongos MASP-2-/- testados em um ensaiode deposição de C3b resulta em níveis muito baixos de ativação de C3 emplacas revestidas com manana (FIGURA 7A) e com zimosan (FIGURA 7B).Estes resultados claramente demonstram que MASP-2 é requerido paracontribuir com a geração de C3b inicial a partir de C3 para iniciar o caminhode complemento alternativo. Este é um resultado surpreendente do ponto devista da teoria amplamente aceita de que fatores de complemento C3, fator B,fator D e properdina formam um caminho alternativo funcional independenteem que C3 pode sofrer uma mudança conformacional espontânea a umaforma "equivalente a C3b" que depois gera um convertase iC3Bb de fasefluida e deposita moléculas C3b nas superfícies de ativação tais comozimosan.

MASP-2 recombinante reconstitui a Ativação de C4 Dependente do Caminhoda lectina em soro dos camundongos MASP-2-/-

De modo a estabelecer que a ausência de MASP-2 foi a causadireta da perda da ativação de C4 dependente do caminho da lectina noscamundongos MASP-2-/-, o efeito de adicionar proteína de MASP-2recombinante às amostras séricas foi examinado no ensaio de clivagem C4descrito acima. Proteínas recombinantes de MASP-2 de murinofuncionalmente ativo e MASP-2A de murino cataliticamente inativo (em queo resíduo de serina de sítio ativo no domínio da serina protease foi substituídono lugar do resíduo de alanina) foram produzidos e purificados como descritoabaixo no Exemplo 5. Os soros reunidos de 4 camundongos MASP-2 -I-foram pré-incubados com concentrações de proteína crescentes de MASP-2de murino recombinante ou MASP-2A de murino recombinante inativo e aatividade da C4 convertase foi ensaiada como descrito acima.

Resultados: Como mostrado na FIGURA 8, a adição deproteína MASP-2 recombinante de murino funcionalmente ativa (mostradacomo triângulos abertos) ao soro obtido dos camundongos MASP-2 -/-restauraram o caminho da ativação de C4 dependente de lectina em umamaneira dependente da concentração de proteína, ao passo que a proteínaMASP-2A de murino cataliticamente inativa (mostrada como estrelas) nãorestaura a ativação de C4. Os resultados mostrados na FIGURA 8 sãonormalizados para a ativação C4 observada com soro de camundongo do tiposelvagem reunido (mostrado como uma linha pontilhada).

EXEMPLO 3

Este exemplo descreve a geração de uma cepa de camundongotransgênico que é MASP-2-/-, MAp 19+/+ de murino e que expressa umtransgene de MASP-2 humano (um MASP-2 de murino inoperante e umMASP-2 humano operante).

Materiais e Métodos: Um minigene que codifica MASP-2humana chamado "mini hMASP-2" (SEQ ID NO: 49) como mostrado naFIGURA 5 foi construído que inclui a região promotora do gene de MASP 2humano, incluindo os primeiros 3 exons (exon 1 ao exon 3) seguido pelaseqüência de cDNA que representa a seqüência codificadora dos 8 exonsseguintes, codificando deste modo a proteína de MASP-2 de tamanho naturaldirecionada por este promotor endógeno. A mini construção de hMASP-2 foiinjetada em ovos fertilizados de MASP-2-/- de modo a substituir o geneMASP 2 de murino deficiente pelo MASP-2 humano transgenicamenteexpressado.

EXEMPLO 4

Este exemplo descreve a isolação da proteína de MASP-2humana na forma de pró enzima a partir de soro humano.

Método de isolação da MASP-2 humana: Um método paraisolar MASP-2 a partir de soro humano foi descrito em Matsushita et al., J.Immunol. 165: 2637-2642, 2000. Em resumo, o soro humano é passadoatravés de uma coluna de levedura manana-Sepharose usando um tampão deimidazol de 10 mM (pH 6,0) contendo 0,2 M de NaCl, 20 mM de CaCl2, 0,2 mM de NPGB, 20 μΜ ρ-APMSF e 2% de manitol. A pró-enzimas MASP-I eMASP-2 complexam com AlBL e eluem com o tampão acima contendo 0,3 Mde mannose. Para separar as pró-enzimas MASP-I e MASP-2 de MBL,preparações contendo o complexo são aplicadas a anti-MBL-Sepharose edepois MASPs são eluídas com tampão de imidazol contendo 20 mM de EDTA e 1 M de NaCl. Finalmente, as pró-enzimas MASP-I e MASP-2 sãoseparadas uma da outra passando-se através de anti-MASP-I-Sepharose nomesmo tampão como usado para o anti-MBL-Sepharose. MASP-2 érecuperado nos efluentes, ao passo que MASP-I é eluído com 0,1 M detampão de glicina (pH 2,2).

EXEMPLO 5

Este exemplo descreve a expressão recombinante e a produçãode proteína de MASP-2 de ser humano, de rato e de murino de tamanhonatural, recombinantes, polipeptídeos derivados de MASP-2 e formasmutantes cataliticamente inativadas de MASP-2Expressão de MASP-2 de ser humano, de murino e de rato de tamanho natural:

A seqüência de cDNA de tamanho natural de MASP-2 humana(SEQ ID NO: 4) também foi subclonada no vetor de expressão de mamíferopCI-Neo (Promega)5 que direciona a expressão eucariótica sob o controle daregião realçadora/promotora de CMV (descrita em Kaufman R. J. et al.,Nucleic Acids Research 19: 4485-90, 1991; Kaufman, Methods inEnzymology, 185: 537-66 (1991)). O cDNA de camundongo de tamanhonatural (SEQ ED NO: 50) e cDNA de MASP-2 de rato (SEQ ID NO: 53)foram cada um subclonados no vetor de expressão pED. Os vetores deexpressão de MASP-2 foram depois transfectados na linhagem de célula deovário de hamster chinês aderente DXBl usando o procedimento detransfecção de fosfato de cálcio padrão descrito em Maniatis et al., 1989. Ascélulas transfectadas com estas construções cresceram muito lentamente,implicando que a protease codificada é citotóxica.

Em um outro método, a construção de minigene (SEQ ID NO:49) contendo o cDNA humano de MASP-2 direcionado pelo seu promotorendógeno é transitoriamente transfectado em células de ovário de hamsterchinês (CHO). A proteína MASP-2 humana é secretada no meio de cultura eisolada como descrito abaixo.

Expressão de MASP-2 cataliticamente inativa de tamanho natural:

Análise racional: MASP-2 é ativado pela clivagemautocatalítica depois que os subcomponentes de reconhecimento MBL ouficolinas (L-ficolina, H-ficolina ou M-ficolina) ligam ao se respectivo padrãode carboidrato. A clivagem autocatalítica resultando na ativação de MASP-2freqüentemente ocorre durante o procedimento de isolação de MASP-2 dosoro ou durante a purificação a seguir da expressão recombinante. De modo ase obter uma preparação de proteína mais estável para o uso como umantígeno, uma forma cataliticamente inativa de MASP-2, planejada comoMASP-2A foi criada pela substituição do resíduo de serina que está presentena tríade catalítica do domínio de protease com um resíduo de alanina em rato(SEQ ID NO: 55 Ser617 a Ala617); em camundongo (SEQ ID NO: 52 Ser617a Ala617); ou em ser humano (SEQ ID NO: 3 Ser618 a Ala618).

De modo a gerar proteínas de MASP-2A de ser humano emurino cataliticamente inativas, a mutagênese direcionada ao sítio foirealizada usando os oligonucleotídeos mostrados na TABELA 5. Osoligonucleotídeos na TABELA 5 foram planejados para recozer à região docDNA de ser humano e de murino que codifica a serina enzimaticamenteativa e o oligonucleotídeo contêm um desemparelhamento de modo a mudar ocódon da serina em um códon de alanina. Por exemplo, oligonucleotídeos dePCR SEQ ID NOS: 56-59 foram usados em combinação com cDNA deMASP-2 humana (SEQ ID NO: 4) para amplificar a região do códon departida para a serina enzimaticamente ativa e da serina para o códon de parada para gerar a leitura aberta completa do MASP-2A mutado contendo amutação de Ser618 para Ala618. Os produtos de PCR foram purificadosdepois da eletroforese em gel de agarose e preparação de faixa esobreposições de adenosina única foram gerados usando um procedimento deformação de cauda padrão. O MASP-2A com cauda de adenosina foi depoisclonado no vetor solto pGEM-T, transformado na E. coli.

Uma proteína de MASP-2A de cataliticamente inativa de ratofoi gerada submetendo-a à cinase e recozimento SEQ ID NO: 64 e SEQ IDNO: 65 combinando-se estes dois oligonucleotídeos em quantidades molaresiguais, aquecendo-se a IOO0C por 2 minutos e lentamente esfriando até a temperatura ambiente. O fragmento recozido resultante tem extremidadescompatíveis com PstI e XbaI e foi inserido no lugar do fragmento PstI-XbaIdo cDNA de MASP-2 de rato do tipo selvagem (SEQ ID NO: 53) para gerarMASP-2A de rato.

5' GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3'(SEQ DD NO: 64)

5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3'(SEQ ID NO: 65)

Os MASP-2A de ser humano, de murino e rato foram cadauma subclonados ainda dentro dos vetores de expressão de mamífero pED oupCI-Neo e transfectados na linhagem de célula do ovário do hamster chinêsDXB 1 como descrito abaixo.

Em um outro método, uma forma cataliticamente inativa deMASP-2 é construída usando o método descrito em Chen et ai., J. Biol.Chem., 276(28): 25894-25902, 2001. Em resumo, o plasmídeo contendo ocDNA de MASP-2 humana de tamanho natural (descrito em Thiel et al.,Nature 386: 506, 1997) é digerido com XhoI e EcoRI e o CDNA de MASP-2(aqui descrito como a SEQ ID NO: 4) é clonado nos sítios de restriçãocorrespondentes do vetor de transferência de baculovírus pFastBacl (LifeTechnologies, NY). O sítio ativo da serina protease de MASP-2 em Ser618 édepois alterado para Ala618 substituindo-se os oligonucleotídeos de filamentoduplo que codificam os aminoácidos de 610 a 625 da região de peptídeo (SEQID NO: 13) com os aminoácidos 610 a 625 da região nativa para criar umpolipeptídeo de MASP-2 de tamanho natural com um domínio de proteaseinativo. Construção de Plasmídeos de Expressão Contendo Regiões dePolipeptídeo Derivadas de Masp-2 Humana.

As seguintes construções são produzidas usando o peptídeo desinal de MASP-2 (resíduos 1 a 15 da SEQ ID NO: 5) para secretar váriosdomínios de MASP-2. Uma construção que expressa o domínio CUBI daMASP-2 humana (SEQ ID NO: 8) é fabricada pela PCR amplificando aregião que codifica os resíduos de 1 a 121 de MASP-2 (SEQ ED NO: 6) (quecorresponde ao domínio CUB1 de terminal N). Uma construção que expressao domínio CUBIEGF da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 9) é fabricado pelaPCR amplificando a região que codifica os resíduos de 1 a 166 de MASP-2(SEQ ID NO: 6) (que corresponde ao domínio CUBLEGF de terminal N).Uma construção que expressa o domínio CUBIEGFCUBII da MASP-2humana (SEQ ED NO: 10) é fabricado pela PCR amplificando a região quecodifica os resíduos de 1 a 293 da MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (que correspondeao domínio CUBIEGFCUBII de terminal N). Os domínios mencionadosacima são amplificados pela PCR usando VentR polimerase e pBS-MASP-2como um padrão, de acordo com métodos de PCR estabelecidos. A seqüênciade iniciador 5' do iniciador de sentido (5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' SEQ ID NO: 34) introduz um sítio de restrição BamHI(sublinhado) na extremidade 5' dos produtos de PCR. Os iniciadores de anti-sentido para cada um dos domínios MASP-2, mostrados abaixo na TABELA5, são planejados para introduzir um códon de parada (negrito) seguido porum sítio EcoRI (sublinhado) no final de cada produto de PCR. Uma vezamplificados, os fragmentos de DNA são digeridos com BamHI e EcoRI eclonados nos sítios correspondentes do vetor pFastBacl. As construçõesresultantes são caracterizadas pelo mapeamento de restrição e confirmadaspelo seqüenciamento de dsDNA.

Tabela 5: Iniciadores de per de MASP-2

<table>table see original document page 179</column></row><table><table>table see original document page 180</column></row><table>

A expressão eucariótica recombinante de MASP-2 e a produção de proteínade MASP-2A de camundongo, rato e ser humano enzimaticamente inativa.

As construções de expressão de MASP-2 e MASP-2Adescritas acima foram transfectadas em células DXB1 usando o procedimentode transfecção do fosfato de cálcio padrão (Maniatis et al., 1989). MASP-2Afoi produzido em meio isento de soro para garantir que as preparações nãoforam contaminadas com outras proteínas séricas. O meio foi colhido decélulas confluentes a cada segundo dia (quatro vezes no total). O nível deMASP-2A recombinante produziu em média aproximadamente 1,5 mg/litrode meio de cultura para cada uma das três espécies.

Purificação da proteína de MASP-2 A: A MASP-2A (mutanteSer-Ala descrita acima) foi purificada pela cromatografia de afinidade emcolunas de MBP-A-agarose. Esta estratégia permitiu a purificação rápida semo uso de rótulos estranhos. MASP-2A (100 a 200 ml de meio diluído com umvolume igual de tampão de carregamento (50 mM de Tris-Cl, pH 7,5,contendo 150 mM de NaCl e 25 mM de CaCl2) foi carregado em uma colunade afinidade de MBP-agarose (4 ml) pré-equilibrada com 10 ml de tampão decarga. Seguindo a lavagem com mais 10 ml de tampão de carregamento, aproteína foi eluída em frações de 1 ml com 50 mM de Tris-Cl, pH 7,5,contendo 1,25 M de NaCl e 10 mM de EDTA. As frações contendo a MASP-2A foram identificadas pela eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Ondenecessário, MASP-2A foi purificada ainda mais pela cromatografia de trocaiônica em uma coluna MonoQ (HR 5/5). A proteína foi dialisada com 50 mMde Tris-Cl pH 7,5, contendo 50 mM de NaCl e carregada na colunaequilibrada no mesmo tampão. A seguir da lavagem, MASP-2A ligada foieluída com um gradiente de 0,05 a 1 M de NaCl em 10 ml.

Resultados: Os rendimentos de 0,25 a 0,5 mg de proteína deMASP-2A foram obtidos a partir de 200 ml de meio. A massa molecular de77,5 kDa determinada pelo MALDI-MS é maior do que o valor calculado dopolipeptídeo não modificado (73,5 kDa) devido à glicosilação. A ligação deglicanos em cada um dos sítios de N-glicosilação responde pela massaobservada. MASP-2A migra como uma faixa única nos géis de SDS-poliacrilamida, que demonstram que a mesma não é proteoliticamenteprocessada durante a biossíntese. A massa molecular média ponderadadeterminada pela ultracentrifugação em equilíbrio está de acordo com o valorcalculado para homodímeros do polipeptídeo glicosilado.

PRODUÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS DE MASP-2 HUMANARECOMBINANTES

Um outro método para a produção de polipeptídeos derivadosde MASP-2 e MASP2A recombinantes é descrito em Thielens, N. M., et al.,J. Immunol. 166: 5068-5077, 2001. Em resumo, as células de inseto deSpodoptera frugiperda (células Sf9 Ready-Plaque obtidas da Novagen,Madison, WI) são cultivadas e mantidas em meio isento de soro SÍ90011(Life Technologies) suplementado com 50 IU/ml de penicilina e 50 mg/ml deestreptomicina (Life Technologies). As células de inseto de Trichoplusia ni(High Five) (fornecidos por Jadwiga Chroboczek, Instituí de BiologieStructurale, Grenoble, França) são mantidas em meio TC100 (LifeTechnologies) contendo 10% de FCS (Dominique Dutscher, Brumath5França) suplementado com 50 IU/ml de penicilina e 50 mg/ml deestreptomicina. Os baculovírus recombinantes são gerados usando o sistemaBac-to-Bac (Life Technologies). O DNA de bacmídeo é purificado usando osistema de purificação Qiagen midiprep (Qiagen) e é usado para transfectarcélulas de inseto Sf9 usando cellfectin em meio Sf900 II SFM (LifeTechnologies) como descrito no protocolo do fabricante. As partículas viraisrecombinantes são coletadas 4 dias mais tarde, tituladas pelo ensaio de placade vírus e amplificadas como descrito por King e Posver, no The BaculovirusExpression System: A Laboratory Guide, Chapman e Hall Ltd., Londres, pp.111-114, 1992.

As células High Five (1,75 χ 10 células/frasco de cultura detecido de 175 cm ) são infectadas com os vírus recombinantes contendopolipeptídeos de MASP-2 em uma multiplicidade de infecção de 2 em meioSf900 II SFM a 28°C por 96 h. Os sobrenadantes são coletados pelacentrifugação e fosforofluoridato de diisopropila é adicionado a umaconcentração final de 1 mM.

Os polipeptídeos de MASP-2 são secretados no meio decultura. Os sobrenadantes de cultura são dialisados contra 50 mM de NaC 1, 1mM de CaCl2, 50 mM de cloridreto de trietanolamina, pH 8,1 e carregada a1,5 ml/min em uma coluna Q-Sepharose Fast Flow (Amersham PharmaciaBiotech) (2,8 χ 12 cm) equilibrada no mesmo tampão. A eluição é conduzidaaplicando-se um gradiente linear de 1,2 litro a 350 mM de NaCl no mesmotampão. As frações contendo os polipeptídeos recombinantes de MASP-2 sãoidentificados pela análise de Western blot, precipitadas pela adição de(NH4)2SO4 a 60% (p/v) e deixados durante a noite a 4°C. As pelotas sãorecolocadas em suspensão em 145 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, 50 mM decloridreto de trietanolamina, pH 7,4 e aplicadas em uma coluna TSK G3000SWG (7,5 χ 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA) equilibrada nomesmo tampão. Os polipeptídeos purificados são depois concentrados a 0,3mg/ml pela ultrafiltração em microconcentradores Microsep (corte de p.m. =10.000) (Filtron, Karlstein, Alemanha).EXEMPLO 6

Este exemplo descreve um método de produzir anticorpospoliclonais contra polipeptídeos de MASP-2.Materiais e Métodos:

Antígenos de MASP-2: O anti-soro policlonal anti-MASP-2humana é produzido imunizando-se coelhos com os seguintes polipeptídeosde MASP-2 isolados: MASP-2 humana (SEQID NO: 6) isolada de soro comodescrito no Exemplo 4; MASP-2 humana recombinante (SEQ ED NO: 6),MASP-2A contendo o domínio da protease inativa (SEQ ID NO: 13), comodescrito nos Exemplos 4 e 5; e CUBI (SEQ ID NO: 8), CUBEGFI (SEQ IDNO: 9) e CUBEGFCUBII (SEQ ID NO: 10) recombinantes expressados comodescrito acima no Exemplo 5.

Anticorpos policlonais: Coelhos de seis semanas de idade,iniciados com BCG (vacina do bacilo de Calmette-Guerin) são imunizadospela injeção de 100 de polipeptídeo de MASP-2 a 100 μ£/ιη1 em soluçãosalina estéril. As injeções são feitas a cada 4 semanas, com o título deanticorpo monitorado pelo ensaio de ELISA como descrito no Exemplo 7. Ossobrenadantes de cultura são coletados para a purificação de anticorpo pelacromatografia de afinidade de proteína A.

EXEMPLO 7

Este exemplo descreve um método para a produção deanticorpos monoclonais de murino contra rato ou polipeptídeos de MASP-2humana.

Materiais e Métodos:

Camundongos A/J machos (Harlan, Houston, Tex.), 8 a 12semanas de idade, são subcutaneamente injetados com 100 μg depolipeptídeos rMASP-2 ou rMASP-2A de ser humano ou rato (fabricadoscomo descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 5) em adjuvante de Freundcompleto (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) em 200 μΐ de solução salinatamponada com fosfato (PBS) pH 7,4. Em intervalos de duas semanas oscamundongos são duas vezes subcutaneamente injetados com 50 μg depolipeptídeo rMASP-2 ou rMASP-2A de ser humano ou rato em adjuvante deFreund incompleto. Na quarta semana os camundongos são injetado com 50μg de polipeptídeo de rMASP-2 ou rMASP-2A de ser humano ou rato emPBS e são fundidos 4 dias mais tarde.Para cada fusão, suspensões de célula única são preparadas apartir do baço de um camundongo imunizado e usadas para a fusão comcélulas de mieloma Sp2/0. 5x10 das Sp2/0 e 5 χ 10 das células do baço sãofundidas em um meio contendo 50% de polietileno glicol (P.M. 1450)(Kodak, Rochester, N.Y.) e 5% de sulfóxido de dimetila (Sigma ChemicalCo., St. Louis, Mo.). As células são depois ajustadas a uma concentração de1,5 χ 10^5 células do baço por 200 μl da suspensão em meio Iscove (Gibco,Grand Island, N.Y.), suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100unidades/ml de penicilina, 100 μL/ml de estreptomicina, 0,1 mM dehipoxantina, 0,4 μΜ de aminopterina e 16 μΜ de timidina. Duzentosmicrolitros da suspensão de célula são adicionados a cada reservatório decerca de vinte placas de microcultura de 96 reservatórios. Depois de cerca dedez dias os sobrenadantes de cultura são retirados para a triagem quanto areatividade com fator MASP-2 purificado em um ensaio de ELISA.

Ensaio de ELISA: Reservatórios de placas de microtesteImmulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) são revestidos pela adiçãode 50 μl de hMASP-2 purificada a 50 ng/ml ou rMASP-2 de rato (ou rMASP-2A) durante a noite na temperatura ambiente. A concentração baixa deMASP-2 para revestimento permite a seleção de anticorpos de alta afinidade.

Depois que a solução de revestimento é removida batendo-se a placa, 200 μlde BLOTTO (leite em pó desnatado) em PBS são adicionados a cadareservatório por uma hora para bloquear os sítios não específicos. Uma horamais tarde, os reservatórios são depois lavados com um tampão PBST (PBScontendo 0,05% de Tween 20). Cinqüenta microlitros de sobrenadantes decultura de cada reservatório de fusão são coletados e misturados com 50 μΐ deBLOTTO e depois adicionados aos reservatórios individuais das placas demicroteste. Depois de uma hora de incubação, os reservatórios são lavadoscom PBST. Os anticorpos de murino ligados são depois detectados pelareação com IgG anti-camundongo de cabra conjugada com peroxidase derábano (HRP) (específica de Fc) (Jackson ImunoResearch Laboratories, WestGrove, Pa.) e diluídos a 1:2.000 em BLOTTO. A solução de substrato deperoxidase contendo 0,1% de 3,3,5,5 tetrametil benzidina (Sigma, St. Louis,Mo.) e 0,0003% de peróxido de hidrogênio (Sigma) é adicionada aosreservatórios para o desenvolvimento de cor por 30 minutos. A reação éterminada pela adição de 50 μl de H2SO4 2 M por reservatório. A DensidadeÓptica a 450 nm da mistura de reação é lida com uma Leitora BioTek ELISA(BioTek Instruments, Winooski, Vt.).

Ensaio de Ligação de MASP-2:

Os sobrenadantes de cultura que testam positivos no ensaio deMASP-2 ELISA descrito acima podem ser testados em um ensaio de ligaçãopara determinar a afinidade de ligação que os agentes inibidores de MASP-2têm para MASP-2. Um ensaio similar também pode ser usado para determinarse os agentes inibidores ligam-se a outros antígenos no sistema decomplemento.

Os reservatórios da placa de microtítulo de poliestireno (placasde ligação de meio de 96 reservatórios, Corning Costar, Cambridge, MA) sãorevestidos com MASP-2 (20 ng/100 μl/reservatório, Advanced ResearchTechnology, San Diego, CA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS)pH 7,4 durante a noite a 4°C. Depois de aspirar a solução de MASP-2, osreservatórios são bloqueados com PBS contendo 1% de albumina séricabovina (BSA; Sigma Chemical) por 2 horas na temperatura ambiente. Osreservatórios sem revestimento de MASP-2 servem como os controles defundo. As alíquotas de sobrenadantes de hibridoma ou MoAbs anti-MASP-2purificados, em concentrações variáveis em solução de bloqueio, sãoadicionadas aos reservatórios. Seguindo uma incubação de 2 horas natemperatura ambiente, os reservatórios são extensivamente enxagüados comPBS. Anti-MoAb de MASP-2 ligado a MASP-2 é detectado pela adição deIgG anti-camundongo de cabra conjugado a peroxidase (Sigma Chemical) emsolução de bloqueio, que é deixada incubar por 1 hora na temperaturaambiente. A placa é enxaguada mais uma vez cuidadosamente com PBS e 100μl de substrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB) (Kirkegaard and PerryLaboratories, Gaithersburg, MD) são adicionados. A reação de TMB é extintapela adição de 100 μl de ácido fosfórico IMea placa é lida a 450 nm emuma leitora de microplaca (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices,Sunnyvale, CA).

Os sobrenadantes de cultura dos reservatórios positivos sãodepois testados quanto a capacidade para inibir a ativação de complementoem um ensaio funcional tal como o ensaio de clivagem C4 como descrito noExemplo 2. As células nos reservatórios positivos são depois clonados peladiluição limitante. Os MoAbs são testados mais uma vez quanto a reatividadecom hMASP-2 em um ensaio de ELISA como descrito acima. Os hibridomasselecionados são cultivados em frascos giratórios e o sobrenadante de culturagasto coletado para a purificação de anticorpo pela cromatografla de afinidadede proteína A.

EXEMPLO 8

Este exemplo descreve a geração de um camundongosilenciado em MASP-2-/- que expressa MASP-2 humana para o uso como um20 modelo em que para triar quanto a agentes inibidores de MASP-2.

Materiais e Métodos: Um camundongo MASP-2-/- comodescrito no Exemplo 1 e um camundongo MASP-2-/- que expressa umaconstrução de transgene de MASP-2 humana (MASP-2 humana operante)como descrito no Exemplo 3 são cruzados e a progênie que são murino25 MASP-2-/-, murino MAp 19+, MASP-2+ humana são usados para identificaragentes inibidores de MASP-2 humanos.

Tais modelos de animal podem ser usados como substratos deteste para a identificação e eficácia de agentes inibidores de MASP-2 taiscomo anticorpos anti-MASP-2 de ser humano, os peptídeo inibidores deMASP-2 e não peptídeos e composições que compreendem agentes inibidoresde MASP-2. Por exemplo, o modelo de animal é exposto a um composto ouagente que é conhecido por deflagrar a ativação de complemento dependentede MASP-2 e um agente inibidor de MASP-2 é administrado ao modelo deanimal em um tempo e concentração suficientes para evocar uma redução dossintomas de doença no animal exposto.

Além disso, os camundongos MASP-2-/- de murino, MAp 19+,MASP-2+ de ser humano podem ser usados para gerar linhagens de célulacontendo um ou mais tipos de célula envolvidos em uma doença associadacom MASP-2 que podem ser usados como um modelo de cultura de célulapara aquele distúrbio. A geração de linhagens de célula contínuas a partir deanimais transgênicos é bem conhecida na técnica, por exemplo ver Small, J.A., et ai, Mol. Cell Biol., 5: 642-48, 1985.

EXEMPLO 9

Este exemplo descreve um método de produzir anticorpos

humanos contra MASP-2 humana em um camundongo silenciado em MASP-2 que expressa MASP-2 humana e imunoglobulinas humanas.

Materiais e Métodos:

Um camundongo MASP-2-/- foi gerado como descrito noExemplo 1. Um camundongo foi depois construído que expressa MASP-2humana como descrito no Exemplo 3. Um camundongo MASP-2-/-homozigoto e um camundongo MASP-2-/- que expressa MASP-2 humana sãocada um cruzados com um camundongo derivado de uma linhagem de célulatronco embrionária engendrada para conter rompimentos alvejados dos locaisde cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina endógena e a expressão depelo menos um segmento do local da imunoglobulina humana.Preferivelmente, o segmento do local de imunoglobulina humana incluiseqüências não rearranjadas de componentes de cadeia pesada e leve. Tanto ainativação de genes de imunoglobulina endógena quanto a introdução degenes da imunoglobulina exógena podem ser obtidos pela recombinaçãohomóloga alvejada. Os mamíferos transgênicos que resultam deste processosão capazes de rearranjar funcionalmente as seqüências de componente daimunoglobulina e que expressam um repertório de anticorpos de váriosisotipos codificados pelos genes da imunoglobulina humana, sem expressargenes da imunoglobulina endógena.

A produção e propriedades de mamíferos tendo estaspropriedades são descritas, por exemplo ver Thomson, A. D., Nature 148:1547-1553, 1994 e Sloane, B. F., Nature Biotechnology 14: 826, 1996. Ascepas geneticamente engendradas de camundongos em que os genes deanticorpo de camundongo são inativados e funcionalmente substituídos comgenes do anticorpo humano são comercialmente disponíveis (por exemplo,XenoMousP, disponível da Abgenix, Fremont CA). Os camundongos daprogênie resultante são capazes de produzir MoAb humano contra MASP-2humana que são adequados para o uso na terapia humana.

EXEMPLO 10

Este exemplo descreve a geração e produção de anticorposanti-MASP-2 de murino humanizados e fragmentos de anticorpo.

Um anticorpo anti-MASP-2 monoclonal de murino é geradoem camundongos AU machos como descrito no Exemplo 7. O anticorpo demurino é depois humanizado como descrito abaixo para reduzir a suaimunogenicidade pela substituição das regiões constantes de murino com suascontrapartes humanas para gerar uma IgG quimérica e fragmento Fab doanticorpo, que são úteis para inibir os efeitos adversos da ativação decomplemento dependente de MASP-2 em pacientes humanos de acordo com apresente invenção.

1. Clonagem de genes da região variável anti-MASP-2 apartir de células de hibridoma de murino. O RNA total é isolado dascélulas de hibridoma que secretam MoAb anti-MASP-2 (obtido como descritono Exemplo 7) usando RNAzol seguindo o protocolo do fabricante (Biotech,Houston, Tex.). O cDNA do primeiro filamento é sintetizado do RNA totalusando oligo dT como o iniciador. A PCR é realizada usando os iniciadores 3'derivados da região C constante da imunoglobulina e conjuntos iniciadores dedegeneração derivados do peptídeo líder ou da primeira região de matriz degenes Vh ou Vk de murino como os iniciadores 5'. A PCR ancorada érealizada como descrita por Chen e Platsucas (Chen, P. F., Scand. J. Immunol.35: 539-549, 1992). Para a clonagem do gene VK, o cDNA de filamento duploé preparado usando um iniciador NotI-MAKl (5'- TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEQ ID NO: 38). Adaptadoresrecozidos ADl (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEQ ID NO: 39)e AD2 (5 '-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEQ ID NO: 40) são ligados tantoao terminal 5' quanto ao 3' do cDNA de filamento duplo. Os adaptadores nasextremidades 3' são removidos pela digestão com NotI. O produto digerido édepois usado como o padrão na PCR com o oligonucleotídeo ADl como oiniciador 5' e MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3'SEQ ID NO: 41) como o iniciador 3'. Fragmentos de DNA deaproximadamente 500 pares de base são clonados em pUC19. Diversos clonessão selecionados para a análise de seqüência para verificar que a seqüênciaclonada abrange a região constante da imunoglobulina de murino esperada.Os oligonucleotídeos NotI-MAKl e MAK2 são derivados da região Vk e têm182 e 84 pares de base, respectivamente, a jusante do primeiro par de base dogene C capa. Os clones são escolhidos que incluem a Vk completa e opeptídeo líder.

Para a clonagem do gene VH, o cDNA de filamento duplo épreparado usando o iniciador NotI MAGl (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' SEQ ID NO: 42). Os adaptadores recozidos ADl eAD2 são ligados tanto ao terminal 5' quanto ao terminal 3' do cDNA defilamento duplo. Os adaptadores nas extremidades 3' são removidos peladigestão NotI. O produto digerido são usados como o padrão na PCR com ooligonucleotídeo de ADl e MAG2 (5 '-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEQ ID NO: 43) como iniciadores. Osfragmentos de DNA de 500 a 600 pares de base no comprimento são clonadosno pUC19. Os oligonucleotídeos Notl-MAGl e MAG2 são derivados daregião C7.7.1 de murino e têm 180 e 93 pares de base, respectivamente, ajusante do primeiro par de base do gene C7.7.1 de murino. Clones sãoescolhidos que abrangem o peptídeo Vh e líder completo.

2. Construção de Vetores de expressão para IgG e Fab deMASP-2 Quiméricos. Os genes Vh e Vk clonados descritos acima são usadoscomo padrão em uma reação de PCR para adicionar a seqüência de consensode Kozak à extremidade 5' e o doador de junção para a extremidade 3' daseqüência de nucleotídeo. Depois as seqüências são analisadas para confirmara ausência de erros de PCR, os genes Vh e Vk são inseridos em cassetes de vetor de expressão contendo C.71 e C. capa humanos respectivamente, paradar pSV2neoVH-huCy 1 e pSV2neoV-huCy. DNAs plasmídicos purificadospor gradiente de CsCl dos vetores de cadeia pesada e leve são usados paratransfectar células COS pela eletroporação. Depois de 48 horas, osobrenadante de cultura é testado pelo ELISA para confirmar a presença de aproximadamente 200 ng/ml de IgG quimérico. As células são colhidas e oRNA total é preparado. O cDNA do primeiro filamento é sintetizado do RNAtotal usando oligo dT como o iniciador. Este cDNA é usado como o padrão naPCR para gerar os fragmentos de DNA Fd e capa. Para o gene Fd, a PCR érealizada usando 5' -AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATT GGCTGTGGAAC T-3' (SEQ ID NO: 44) como o iniciador 5' e um iniciador 3' derivadode CHl (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEQ IDNO: 45). A seqüência de DNA é confirmada para conter o Vh completo e odomínio CHl de IgGl humana.

Depois da digestão com as enzimas apropriadas, os fragmentosFd de DNA são inseridos nos sítios de restrição de HindIII e BamHI docassete de vetor de expressão pSV2dhfr-TUS para dar pSV2dhfrFd. Oplasmídeo pSV2 é comercialmente disponível e consiste de segmentos deDNA de várias fontes: pBR322 DNA (linha fina) contém a origem pBR322de replicação de DNA (pBR ori) e o gene da resistência à ampicilinalactamase (Amp); SV40 DNA, representado pelo sombreamento mais largo emarcante, contém a origem SV40 de replicação de DNA (SV40 ori), promotorinicial (5' em relação aos genes dhfr e neo) e sinal de poliadenilação (3' emrelação aos genes dhfr e neo). O sinal de poliadenilação derivado de SV40(pA) também é colocado na extremidade 3' do gene Fd.

Para o gene capa, a PCR é realizada usando 5'- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (SEQ ID NO: 46) como oiniciador 5' e um iniciador 3' derivado de CK (5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEQ ID NO: 47). A seqüência de DNA éconfirmada para conter as regiões Vk completa e CK humana. Depois dadigestão com enzimas de restrição apropriadas, os fragmentos de DNA capasão inseridos nos sítios de restrição HindIII e BamHI do cassete de vetor deexpressão pSV2neo-TUS para dar pSV2neoK. A expressão tanto do gene Fdquanto capa são direcionadas pelos elementos realçadores e promotoresderivados de HCMV. Visto que o gene Fd não inclui o resíduo de aminoácidode cisteína envolvido na ligação de dissulfeto inter-cadeia, este Fab quiméricorecombinante contém cadeias pesada e leve não covalentemente ligadas. EsteFab quimérico é designado como cFab.

Para se obter Fab recombinante com uma ligação de dissulfetode inter-cadeia pesada e leve, o gene Fd acima pode ser ampliada para incluira seqüência codificadora para 9 aminoácidos adicionais (EPKS CDKTH SEQID NO: 48) da região de dobradiça de IgGl humano. O segmento de DNA deBstEII-BamHI que codifica 30 aminoácidos na extremidade 3' do gene Fdpode ser substituído com segmentos de DNA que codifica o Fd ampliado,resultando em pSV2dhfrFd/9aa.

3. Expressão e Purificação de IgG Anti-MASP-2 Quimérica

Para gerar linhagens de célula que secretam IgG anti-MASP-2quimérica, células NSO são transfectadas com DNAs plasmídicos purificadosde pSV2neoVH-huCyl e pSV2neoV-huC capa pela eletroporação. As célulastransfectadas são selecionadas na presença de 0,7 mg/ml de G418. As célulassão cultivadas em um frasco giratório de 250 ml usando meio contendo soro.

O sobrenadante de cultura de cultura giratória de 100 ml écarregada em uma coluna PROSEP-A 10 ml (Bioprocessing, Inc., Princeton,N.J.). A coluna é lavada com 10 volumes de leito de PBS. O anticorpo ligadoé eluído com 50 mM de tampão de citrato, pH 3,0. Volume igual de Hepes 1M, pH 8,0 é adicionado à fração contendo o anticorpo purificado para ajustaro pH a 7,0. Os sais residuais são removidos pela troca de tampão com PBSpela ultrafiltração em membrana Millipore (corte de P.M.: 3.000). Aconcentração de proteína do anticorpo purificado é determinada pelo métodoBCA (Pierce).

4. Expressão e purificação de Fab anti-MASP-2 quimérico

Para gerar linhagens de célula que secretam Fab anti-MASP-2quimérico, células CHO são transfectadas com DNAs plasmídicos purificadosde pSV2dhfrFd (ou pSV2dhfrFd/9aa) e pSV2neocapa, pela eletroporação. Ascélulas transfectadas são selecionadas na presença de G418 e metotrexato. Aslinhagens de célula selecionadas são amplificadas em concentraçõescrescentes de metotrexato. As células são célula únicas subclonadas peladiluição limitante. As linhagens de célula subclonadas de célula única de altaprodução são depois cultivadas em 100 ml de cultura giratória usando meioisento de soro.

O Fab anti-MASP-2 quimérico é purificado pela cromatografiade afinidade usando um MoAb anti-idiotípico de camundongo para o MoAbde MASP-2. Um MoAb de MASP-2 anti-idiotípico pode ser fabricadoimunizando-se camundongos com um anti-MoAb de MASP-2 de murinoconjugado com hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH) e triagemquanto a ligação de MoAb específica que pode ser competida com MASP-2humana. Para a purificação, 100 ml de sobrenadante de culturas giratórias decélulas CHO que produzem cFab ou cFab/9aa são carregados na coluna deafinidade ligada com um MoAb de MASP-2 anti-idiotípico. A coluna é depoislavada cuidadosamente com PBS antes que o Fab ligado seja eluído com 50mM de dietilamina, pH 11,5. Os sais residuais são removidos pela troca detampão como descrito acima. A concentração de proteína do Fab purificado édeterminada pelo método BCA (Pierce).

A capacidade da IgG de MASP-2 quimérica, cFab e cFAb/9aapara inibir os caminhos de complemento dependentes de MASP-2 pode serdeterminada usando-se os ensaios inibitórios descritos no Exemplo 2.

EXEMPLO 11

Este exemplo descreve um ensaio de clivagem de C4 in vitrousado como uma triagem funcional para identificar agentes inibidores deMASP-2 capazes de bloquear a ativação de complemento dependente deMASP-2 por intermédio de L-ficolina/P35, H-ficolina, M-ficolina ou manana.

Ensaio de Clivagem de C4: Um ensaio de clivagem C4 foidescrito por Petersen, S. V., et al., J. Immunol. Methods 257: 107, 2001, quemediu a ativação do caminho da lectina que resulta do ácido lipoteicóico(LTA) de S. aureus que liga L-ficolina.

Reagentes: S. aureous fixo em formalina (DSM20233) épreparado como segue: as bactérias são cultivadas durante a noite a 37°C emmeio de sangue soja tríptico, lavado três vezes com PBS, depois fixado por 1hora na temperatura ambiente em PBS/0,5% de formalina e lavadas umas trêsvezes mais com PBS, antes de serem recolocadas em suspensão em tampão derevestimento (15 mM de Na2CO3, 35 mM de NaHCO3, pH 9,6).

Ensaio: Os reservatórios de uma placa de microtítulo NuncMaxiSorb (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) são revestidos com:100 μΐ de S. aureus fixo em formalina DSM20233 (OD550 = 0,5) em tampãode revestimento com 1 μg de L-ficolina em tampão de revestimento. Depoisda incubação noturna, os reservatórios são bloqueados com 0,1% de albuminasérica humana (HSA) em TBS (10 mM de Tris-HCl, 140 mM de NaCl, pH7,4), depois são lavadas com TBS contendo 0,05% de Tween 20 e 5 mM deCaCl2 (tampão de lavagem). Amostras de soro humano são diluídas em 20mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, 0,05% de Triton X-100,0,1% de HSA, pH 7,4, que impede a ativação de C4 endógeno e dissocia ocomplexo de Cl (composto de Clq, Clr e Cls). agentes inibidores de MASP-2, incluindo anti-MoAbs de MASP-2 e peptídeos inibidores são adicionadosàs amostras de soro em concentrações variáveis. As amostras diluídas sãoadicionadas à placa e incubadas durante a noite a 4°C. Depois de 24 horas, asplacas são lavadas cuidadosamente com tampão de lavagem, depois 0,1 μg deC4 humano purificado (obtido como descrito em Dodds, A. W., MethodsEnzymol. 223: 46, 1993) em 100 μl de barbital a 4 mM, 145 mM de NaCl, 2mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7,4 é adicionado a cada reservatório.Depois de 1,5 hora a 37°C, as placas são lavadas mais uma vez e a deposiçãode C4b é detectada usando anti-C4 humano de galinha conjugado comfosfatase alcalina (obtido da Immunsystem, Uppsala, Suécia) e medidousando o substrato colorimétrico de fosfato de p-nitrofenila.

Ensaio de C4 em manana: O ensaio descrito acima é adaptadopara medir a ativação do caminho da lectina por intermédio de MBLrevestindo-se a placa com LSP e manana antes da adição de soro misturadocom vários agentes inibidores de MASP-2.

Ensaio de C4 em H-ficolina (Hakata Ag): O ensaio descritoacima é adaptado para medir a ativação do caminho da lectina por intermédioda H-ficolina revestindo-se a placa com LPS e H-ficolina antes da adição desoro misturado com vários agentes inibidores de MASP-2.EXEMPLO 12

O seguinte ensaio demonstra a presença de ativação docaminho clássico em camundongos do tipo selvagem e MASP-2-/-.

Métodos: Complexos imunes foram gerados in situ revestindo-se placas microtituladoras (Maxisorb5 Nunc, cat. Nfi 442404, Fisher Scientific)com 0,1% de albumina sérica humana em 10 mM de Tris, 140 mM de NaCl,pH 7,4 por 1 hora na temperatura ambiente seguido pela incubação noturna a4°C com anti-soro anti soro integral de ovelha (Scottish Antibody ProductionUnit, Carluke, Escócia) diluído 1:1000 em TBS/tween/Ca . As amostras desoro foram obtidas de camundongos do tipo selvagem e MASP-2-/- eadicionadas às placas revestidas. As amostras de controle foram preparadasem que Clq foi esgotado das amostras de soro do tipo selvagem e MASP-2-/-.O soro de camundongos esgotado em Clq foi preparado usando Dynabeadsligados à proteína A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) revestido com IgG anti-Clq humano de coelho (Dako, Glostrup, Dinamarca), de acordo com asinstruções do fornecedor. As placas foram incubadas por 90 minutos a 37°C.O C3b ligado foi detectado com um anticorpo anti-C3c humano policlonal(Dako A 062) diluído em TBS/tw/Ca^ a 1:1000. O anticorpo secundário éIgG anti-coelho de cabra.Resultados: A FIGURA 9 mostra a deposição relativa de

níveis de C3b em placas revestidas com IgG em soro do tipo selvagem, soroMASP-2-/-, soro do tipo selvagem esgotado em Clq e soro MASP-2-/-esgotado em Clq. Estes resultados demonstram que o caminho clássico estáintacto na cepa de camundongo MASP-2-/-.EXEMPLO 13

O seguinte ensaio é usado para testar se um agente inibidor deMASP-2 bloqueia o caminho clássico analisando-se o efeito de um agenteinibidor de MASP-2 sob condições em que o caminho clássico é iniciadopelos complexos imunes.Métodos: Para testar o efeito de um agente inibidor de MASP-2 nas condições da ativação de complemento onde o caminho clássico éiniciado pelos complexos imunes, as amostras de 50 μΐ em triplicata contendo90% de NHS são incubadas a 37°C na presença de 10 μ^πιΐ de complexoimune (IC) ou PBS e amostras em triplicata paralelas (+/-IC) também sãoincluídas que contêm 200 nM de anticorpo monoclonal anti-properdinadurante a incubação a 37°C. Depois de uma incubação de duas horas a 37°C,13 mM de EDTA são adicionados a todas as amostras para interromper aativação adicional de complemento e as amostras são imediatamente esfriadas a 5°C. As amostras são depois armazenadas a -70°C antes de serem ensaiadasquanto aos produtos de ativação de complemento (C3a e sC5b-9) usando kitsELISA (Quidel, Catálogo N- AO15 e A009) seguindo as instruções dofabricante.

EXEMPLO 14

Este exemplo demonstra que o sistema de ativação decomplemento de MASP-2 dependente de lectina é ativado na fase deisquemia/reperfusão a seguir reparo de aneurisma aórtico abdominal.

Análise Racional Experimental e Planejamento: Pacientes quepassam pelo reparo de aneurisma aórtico abdominal (AAA) são submetidos auma lesão de isquemia-reperfusão, que é amplamente mediada pela ativaçãode complemento. Nós investigamos o papel do caminho da lectina dependentede MASP-2 da ativação de complemento em lesão de isquemia-reperfusão empacientes que passam por reparo de AAA. O consumo de lectina que ligamanana (MBL) no soro foi usado para medir a quantidade de ativaçãodependente de MASP-2 do caminho da lectina que ocorreu durante areperfusão.

Isolação de Amostra de Soro de Paciente: UM total de 23pacientes que passam por reparo de AAA infra-renal eletivo e 8 pacientes decontrole que passam por cirurgia abdominal maior foram incluídos nesteestudo.

Para os pacientes que passam pelo reparo de AAA, amostrasde sangue sistêmico foram tiradas de cada artéria radial do paciente (porintermédio uma linha arterial) em quatro pontos de tempo definidos durante oprocedimento: ponto de tempo 1: indução de anestesia; ponto de tempo 2:exatamente antes do clampeamento aórtico; ponto de tempo 3: exatamenteantes da remoção do clampe aórtico; e ponto de tempo 4: durante areperfiisão.

Para os pacientes de controle que passam por cirurgiaabdominal maior, as amostras de sangue sistêmico foram tiradas na induçãode anestesia e em duas horas depois do início do procedimento.

Ensaio quanto aos níveis de MBL: Cada amostra de plasma depaciente foi ensaiada quanto aos níveis de lectina que liga manana (MBL)usando técnicas de ELISA.

Resultados: Os resultados deste estudo são mostrados naFIGURA 10, que apresenta um gráfico mostrando a mudança percentualmédia nos níveis de MBL (eixo y) em cada um dos vários pontos de tempo(eixo x). Os valores de partida para MBL são 100%, com as diminuiçõesrelativas mostradas a seguir. Como mostrado na FIGURA 10, pacientes AAA(n=23) mostram uma diminuição significante nos níveis de MBLplasmáticos, produzindo em média uma diminuição de 41% aproximadamenteno momento da isquemia/reperfusão a seguir da AAA. Ao contrário, nospacientes de controle (n=8) que passam por cirurgia abdominal maior apenasum consumo menor de MBL foi observado nas amostras plasmáticas.

Os dados apresentados fornecem uma indicação forte de que ocaminho da lectina dependente de MASP-2 do sistema de complemento éativado na fase de isquemia/reperfusão a seguir do reparo de AAA. Adiminuição nos níveis de MBL parece estar associada com a lesão deisquemia-reperfusão porque os níveis de MBL caem significante erapidamente quando o vaso principal clampeado é reperfundido depois dofinal da operação. Ao contrário, os soros de controle de pacientes que passampor cirurgia abdominal maior sem um insulto de isquemia-reperfusão maiorapenas mostram uma leve diminuição nos níveis de plasma de MBL. Em vistada contribuição bem estabelecida da ativação de complemento em lesão dereperfusão, nós concluímos que a ativação do caminho da lectina dependentede MASP-2 nas células endoteliais isquêmicas é um fator principal napatologia de lesão da isquemia/ reperfusão. Portanto, um bloqueio ou reduçãotransitórios específicos no caminho da lectina dependente de MASP-2 da ativação de complemento seria esperado ter um impacto terapêutico benéficosignificante para melhorar o resultado de procedimentos clínicos e doençasque envolvem um insulto isquêmico transitório, por exemplo, infarte domiocárdio, infarto do intestino, queimaduras, transplante e acidente vascularcerebral.

EXEMPLO 15

Este exemplo descreve o uso da cepa MASP-2-/- como ummodelo de animal para testar agentes inibidores de MASP-2 úteis para tratarArtrite Reumatóide.

Fundamentos e Análise Racional: Modelo de Artrite deMurino: Os camundongos transgênicos (tg) receptores de célula T (TCR)K/BxN, são um modelo recentemente desenvolvido de artrite inflamatória(Kouskoff, V., et al, Cell 87: 811-822, 1996; Korganow, A. S., et al,Immunity 10: 451-461, 1999; Matsumoto, I., et al, Science 286: 1732-1735,1999; Maccioni M. et al, J. Exp. Med. 195(8): 1071-1077, 2002). Oscamundongos K/BxN espontaneamente desenvolvem uma doença autoimunecom a maioria dos traços clínicos, histológicos e imunológicos de RA emseres humanos (Ji, H., et al, Immunity 16: 157-168, 2002). O distúrbio demurino é específico de junta, mas é iniciado depois perpetuado pelaautorreatividade da célula T, depois B à glicose-6-fosfato isomerase ("GPI"),um antígeno ubiquamente expressado. Além disso, a transferência de soro (ouIgs anti-GPI purificadas) de camundongos K/BxN artríticos em animaissaudáveis provoca a artrite dentro de vários dias. Também foi mostrado queanticorpos anti-GPI policlonal ou uma reunião de anticorpos monoclonaisanti-GPI do isotipo IgGl induzem a artrite quando injetados em receptoressaudáveis (Maccioni et al., 2002). O modelo de murino é relevante para a RAhumana, porque o soro de pacientes RA também foi descoberto conteranticorpos anti-GPI, que não é encontrado em indivíduos normais. Umcamundongo deficiente em C5 foi testado neste sistema e descoberto bloquearo desenvolvimento da artrite (Ji, H., et al., 2002, supra). Também houveinibição forte da artrite em camundongos nulos em C3, implicando o caminhoalternativo, entretanto, camundongos nulos em MBP-A não desenvolvemartrite. Em camundongos entretanto, a presença de MBP-C pode compensarquanto a perda de MBP-A.

Com base nas observações aqui descritas de que MASP-2desempenha um papel essencial no início tanto do caminho da lectina quantodo alternativo, o modelo artrítico K/BxN é útil para triar quanto a agentesinibidores de MASP-2 que sejam eficazes para o uso como um agenteterapêutico para tratar a RA.

Métodos: O soro de camundongos K/BxN artríticos é obtidoaos 60 dias de idade, reunido e injetado (150 a 200 μΐ i.p.) em receptores deMASP-2-/- (obtidos como descrito no Exemplo 1); e as ninhadas de controlecom ou sem agentes inibidores de MASP-2 (MoAb, peptídeos inibidores eoutros como aqui descrito) nos dias 0 e 2. Um grupo de camundongosnormais também são pré tratados com um agente inibidor de MASP-2 pordois dias antes de receber a injeção de soro. Um outro grupo de camundongosrecebe uma injeção de soro no dia 0, seguido por um agente inibidor deMASP-2 no dia 6. Um índice clínico é avaliado com o tempo com um pontomarcado para cada pata afetada, Vi ponto marcado para uma pata apenas cominchaço brando. A espessura do tornozelo também é medida por um calibre (aespessura é definida como a diferença da medição do dia 0).EXEMPLO 16

Este exemplo descreve um ensaio para a inibição de lesão aotecido mediado por complemento em um modelo ex vivo de corações decoelho perfundidos com plasma humano.

Fundamentos e Análise Racional: A ativação do sistema decomplemento contribui para a rejeição hiperaguda de xenoenxertos. Estudosanteriores têm mostrado que a rejeição hiperaguda pode ocorrer na ausênciade anticorpos anti-doador por intermédio da ativação do caminho alternativo(Johnston, P. S., et ai, Transplant Proc. 23: 877-879, 1991).

Métodos: Determinar se agentes inibidores de anti-MASP-2isolados tais como anticorpos anti-MASP-2 obtidos como descrito noExemplo 7 são capazes de inibir o caminho de complemento no lesão detecido, os anti-MoAbs de MASP-2 e fragmentos de anticorpo podem sertestados usando um modelo ex vivo em que corações de coelho isolados sãoperfundidos com plasma humano diluído. Este modelo foi anteriormentemostrado causar lesão ao miocárdio do coelho devido à ativação do caminhode complemento alternativo (Gralinski, M. R., et al., Immunopharmacology34: 79-88, 1996).EXEMPLO 17

Este exemplo descreve um ensaio que mede a ativação deneutrófilo que é útil como uma medida de uma dose eficaz de um agenteinibidor de MASP-2 para o tratamento de condições associadas com ocaminho dependente de lectina de acordo com os métodos da invenção.

Métodos: Um método para medir a elastase de neutrófilo foidescrita em Gupta-Bansal, R., et al., Molecular Immunol. 37: 191-201, 2000.Em resumo, o complexo de elastase e soro αΐ-antitripsina é medido com umensaio intercalado de dois sítios que utiliza anticorpos tanto contra elastasequanto α1-antitripsina. As placas microtituladoras de poliestireno sãorevestida com uma diluição 1:500 de anticorpo de elastase anti-humano (TheBinding Site, Birmingham, UK) em PBS durante a noite a 4°C. Depois deaspirar a solução de anticorpo, os reservatórios são bloqueados com PBScontendo 0,4% de TEM por 2 horas na temperatura ambiente. As alíquotas(100 μl) de amostras de plasma que são tratadas com ou sem um agenteinibidor de MASP-2 são adicionadas aos reservatórios. Seguinte a umaincubação de 2 horas na temperatura ambiente, os reservatórios sãoextensivamente enxaguados com PBS. O complexo elastase-al-antitripsinaligado é detectado pela adição de uma diluição 1:500 de anticorpo al-antitripsina conjugado a peroxidase em solução de bloqueio que é deixadaincubar por 1 h na temperatura ambiente. Depois da lavagem da placa comPBS, alíquotas de 100 μl de substrato de TMB são adicionadas. A reação deTMB é extinta pela adição de 100 μl de ácido fosfórico e a placa é lida a 450nm em uma leitora de microplaca.

EXEMPLO 18

Este exemplo descreve um modelo de animal para testaragentes inibidores de MASP-2 úteis para tratar a isquemia/reperfusãomiocárdicas.

Métodos: Um modelo de isquemia-reperfusão miocárdicas foidescrito por Vakeva et al., Circulation 97: 2259-2267, 1998 e Jordan et al.,Circulation 104(12): 1413-1418, 2001. O modelo descrito pode sermodificado para o uso em camundongos MASP-2-/- e MASP-2+/+ comosegue. Em resumo, camundongos machos adultos são anestesiados. A veiajugular e a traquéia são canuladas e a ventilação é mantida com 100% deoxigênio com um ventilador de roedor ajustado para manter o CO2 exaladoentre 3,5% e 5%. Uma toracotomia esquerda é realizada e uma sutura écolocada 3 a 4 mm da origem da artéria coronária esquerda. Cinco minutosantes da isquemia, os animais são ministrados com um agente inibidor deMASP-2, tal como anticorpos anti-MASP-2 (por exemplo, em uma faixa dedosagem dentre 0,01 a 10 mg/kg). A isquemia é depois iniciada apertando-sea sutura em torno da artéria coronária e mantida por 30 minutos, seguido porquatro horas de reperfusão. Animais operados simulado são preparadosidenticamente sem apertar a sutura.

Análise da Deposição de Complemento C3: Depois dareperfusão, as amostras para imunoistoquímica são obtidas da região centraldo ventrículo esquerdo, fixadas e congeladas a -80°C até processadas. Asseções de tecido são incubadas com um anticorpo C3 anti-rato de cabraconjugado com HRP. As seções de tecido são analisadas quanto a presença detingimento de C3 na presença de agentes inibidores anti-MASP-2 comocomparados com animais de controle operados simulado e animais MASP-2-/- para identificar agentes inibidores de MASP-2 que reduzam a deposição deC3 in vivo.

EXEMPLO 19

Este exemplo descreve o uso da cepa MASP-2-/- como ummodelo de animal para testar agentes inibidores de MASP-2 quanto acapacidade para proteger tecido transplantado da lesão de isquemia/reperfusão.

Fundamentos/Análise Racional: E conhecido que a lesão deisquemia/ reperfusão ocorre em um órgão de doador durante o transplante. Ograu de lesão ao tecido está relacionado com a extensão da isquemia e émediado pelo complemento, como demonstrado em vários modelos deisquemia e através do uso de agentes inibidores de complemento tais comoreceptor solúvel tipo 1 (CRI) (Weisman et al., Science 249: 146-151, 1990;Mulligan et al., J. Immunol. 148: 1479-1486, 1992; Pratt et al., Am. J. Path.163(4): 1457-1465, 2003). Um modelo de animal para o transplante foidescrito por Pratt et al., Am. J. Path. 163(4): 1457-1465, que pode sermodificado para o uso com o modelo de camundongo MASP-2-/- e/ou para ouso como um sistema modelo de MASP-2+/+ em que para triar agentesinibidores de MASP-2 quanto a capacidade para proteger tecido transplantadoda lesão de isquemia/reperfusão. A inundação do rim de doador com fluido deperfusão antes do transplante fornece uma oportunidade para introduziragentes inibidores anti-MASP-2 no rim do doador.

Métodos: Camundongos MASP-2-/- e/ou MASP-2+/+ sãoanestesiados. O rim do doador esquerdo é dissecado e a aorta é ligada nadireção da cabeça e na direção da cauda à artéria renal. Um cateter de tuboportex (Portex Ltd5 Hythe, UK) é inserido entre as ligaduras e o rim éperfundido com 5 ml de Solução de Perfusão Renal Soltran (Baxter HealthCare, UK) contendo agentes inibidores de MASP-2 tais como anticorposmonoclonais anti-MASP-2 (em uma faixa de dosagem de 0,01 mg/kg a 10mg/kg) por um período de pelo menos 5 minutos. O transplante renal é depoisrealizado e os camundongos são monitorados com o tempo.

Análise de Receptores de Transplante: Os transplantes renaissão colhidos em vários intervalos de tempo e as seções de tecido sãoanalisadas usando anti-C3 para determinar o grau da deposição de C3.

EXEMPLO 20

Este exemplo descreve o uso de um modelo de artrite induzidopor colágeno (CLA) de animal para testar agentes inibidores de MASP-2 úteispara tratar a artrite reumatóide (RA).

Fundamentos e Análise Racional: A artrite induzida porcolágeno (CIA) representa uma poliartrite autoimune indutível em cepassuscetíveis de roedores e primatas depois da imunização com colágeno tipo IInativo e é reconhecido como um modelo relevante para a artrite reumatóidehumana (RA) (ver Courtney et al., Nature 283: 666 (1980); Trenthan et al., J.Exp. Med. 146: 857 (1977)). Tanto a RA quanto a CIA são caracterizadaspela inflamação de junta, formação de pano e erosão de cartilagem e osso. Acepa de murino susceptível à CIA DBA/ILacJ é um modelo desenvolvido deCIA em que os camundongos desenvolvem a artrite clinicamente severadepois da imunização com colágeno bovino tipo II (Wang et al., J. Immunol.164: 4340-4347 (2000). Uma cepa de camundongo deficiente em CS foicruzada com DBA/ILacJ e a cepa resultante foi descoberta ser resistente aodesenvolvimento de artrite CIA (Wang et al., 2000, supra).

Com base nas observações aqui descritas que MASP-2desempenha um papel essencial no início tanto do caminho da lectina quantodo alternativo, o modelo artrítico de CIA é útil para triar quanto aos agentesinibidores de MASP-2 que são eficazes para o uso como agentes terapêuticospara tratar RA.

Métodos: Um camundongo MASP-2-/- é gerado como descritono Exemplo 1. O camundongo MASP-2-/- é depois cruzado com umcamundongo derivado da cepa DBA/ILacJ (The Jackson Laboratory). Aprogênie Fl e progênie subseqüente são intercruzadas para produzirhomozigotos MASP-2-/- na linhagem DBA/ILacJ.

A imunização com colágeno é realizada como descrito emWang et al., 2000, supra. Em resumo, camundongos DBA/ILacJ do tiposelvagem e camundongos DBA/ILacJ MASP-2-/- são imunizados comcolágeno bovino tipo II (BCII) ou colágeno tipo II de camundongo (MCII)(obtido da Elastin Products, Owensville, MO), dissolvido em 0,01 M de ácidoacético em uma concentração de 4 mg/ml. Cada camundongo é injetadointradermicamente na base da cauda com 200 μg de CII e 100 μg demicobactérias. Os camundongos são re-imunizados depois de 21 dias e sãoexaminados diariamente quanto ao aparecimento de artrite. Um índiceartrítico é avaliado com o tempo com respeito à severidade da artrite em cadapata afetada.

Os agentes inibidores de MASP-2 são triados noscamundongos DBA/ILacJ CIA do tipo selvagem pela injeção de um agenteinibidor de MASP-2 tal como os anticorpos monoclonais anti-MASP-2 (emuma faixa de dosagem de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg) no momento da imunizaçãocom colágeno, sistêmica ou localmente em uma ou mais juntas e um índiceartrítico é avaliado com o tempo como descrito acima. Os anticorposmonoclonais anti-hMASP-2 como agentes terapêuticos podem ser facilmenteavaliados em um modelo de camundongo DBA/ILacJ CIA MASP-2-/-,hMASP-+/+ operante.

EXEMPLO 21

Este exemplo descreve o uso de um modelo de animal(NZB/W) Fl para testar agentes inibidores de MASP-2 úteis para tratar aglomerulonefrite mediada pelo complexo imune.

Fundamentos e Análise Racional: Camundongos New Zealandpretos χ New Zealand brancos (NZB/W) Fl espontaneamente desenvolvemuma síndrome autoimune com similaridades notáveis à glomerulonefritemediada pelo complexo imune humana. Os camundongos NZB/W Flinvariavelmente sucumbem à glomerulonefrite aos 12 meses de idade. Comodebatido acima, foi demonstrado que a ativação de complemento desempenhaum papel significante na patogênese da glomerulonefrite mediada pelocomplexo imune. Foi mostrado ainda que a administração de um MoAb anti-C5 no modelo de camundongo NZB/W Fl resultou em melhora significantedo curso da glomerulonefrite (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 8563-8568 (1996)). Com base nas observações aqui descritas de que MASP-2desempenha um papel essencial na iniciação tanto do caminho da lectinaquanto do alternativo, o modelo de animal NZB/W Fl é útil para triar quantoaos agentes inibidores de MASP-2 que são eficazes para o uso como agentesterapêuticos para tratar a glomerulonefrite.

Métodos: Um camundongo MASP-2-/- é gerado como descritono Exemplo 1. O camundongo MASP-2-/- é depois separadamente cruzadocom um camundongo derivado tanto da cepa NZB quanto da NZW (TheJackson Laboratory). Fl e a progênie subseqüente são intereruzadas paraproduzir homozigotos MASP-2-/- tanto no fundamento genético NZB quantono NZW. Para determinar o papel de MASP-2 na patogênese daglomerulonefrite neste modelo, o desenvolvimento desta doença emindivíduos F1 que resultam de cruzamentos de camundongos do tiposelvagem NZB x NZW ou camundongos MASP-2-/-NZB x MASP-2-/-NZWé comparado. Em intervalos semanais amostras de urina serão coletadas doscamundongos F1 MASP-2+/+ e MASP-2-/- e os níveis de proteína da urinamonitorados quanto a presença de anticorpos anti-DNA (como descrito emWang et al., 1996, supra). A análise histopatológica dos rins também érealizada para monitorar a quantidade de deposição de matriz mesangial edesenvolvimento de glomerulonefrite.

O modelo de animal NZB/W F1 também é útil para triar quantoaos agentes inibidores de MASP-2 que são eficazes para o uso como agentesterapêuticos para tratar a glomerulonefrite. Em 18 semanas de idade,camundongos NZB/W F1 do tipo selvagem são injetados intraperitonealmentecom agentes inibidores anti-MASP-2, tais como os anticorpos monoclonaisanti-MASP-2 (em uma faixa de dosagem de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg) em umafreqüência semanal ou bissemanal. Os marcadores histopatológicos ebioquímicos mencionados acima de glomerulonefrite são usados para avaliaro desenvolvimento da doença nos camundongos e para identificar agentesinibidores de MASP-2 úteis para o tratamento desta doença.

EXEMPLO 22

Este exemplo descreve o uso de uma alça de tubo como ummodelo para testar agentes inibidores de MASP-2 úteis para prevenir o lesão atecido que resulta da circulação extracorpórea (ECC) tal como um circuito dedesvio cardiopulmonar (CPB).

Fundamentos e Análise Racional: Como debatido acima,pacientes que passam por ECC durante CPB sofrem de uma reaçãoinflamatória sistêmica, que é parcialmente causada pela exposição do sangueàs superfícies artificiais do circuito extracorpóreo, mas também por fatoresindependentes da superfície como trauma cirúrgico e lesão de isquemia-reperfusão (Butler5 J., et ai, Ann. Thorac. Surg. 55: 552-9, 1993; Edmunds,L. H., Ann. Thorac. Surg. 66 (Supl): S12-6, 1998; Asimakopoulos, G.,Perfiision 14: 269-77, 1999). Foi mostrado ainda que o caminho decomplemento alternativo desempenha um papel predominante na ativação decomplemento em circuitos CPB, que resulta da interação do sangue com assuperfícies artificiais dos circuitos CPB (ver Kirklin et ai., 1983, 1986,debatido supra). Portanto, com base nas observações aqui descritas de que MASP-2 desempenha um papel essencial no início tanto do caminho dalectina quanto do alternativo, o modelo de alça de tubo é útil para triar quantoa agentes inibidores de MASP-2 que são eficazes para o uso como agentesterapêuticos para prevenir ou tratar uma reação inflamatória deflagrada pelaexposição extracorpórea.

Métodos: Uma modificação de um modelo de alça de tuboanteriormente descrito para circuitos de desvio cardiopulmonar é utilizada(ver Gong et aL, J. Clinic Immunol. 16(4): 222-229 (1996)) como descrito emGupta-Bansal et ai., Molecular Immunol. 37: 191-201 (2000). Em resumo, osangue é recém coletado de um paciente saudável em um tubo vacutainer de 7 ml (contendo 7 unidades de heparina por ml de sangue integral). Tubo depolietileno similar ao que é usado durante procedimentos de CPB (porexemplo, D.I. 2,92 mm; D.E. 3,73 mm, comprimento: 45 cm) é enchido com1 ml de sangue e fechado em uma alça com um pedaço curto de tubo desilicona. Um tubo de controle contendo sangue heparinizado com 10 mM de EDTA foi incluído no estudo como um controle de fundamento. A amostra eos tubos de controle foram rotacionados verticalmente em um banho de águapor 1 hora a 37°C. Depois da incubação, as amostras de sangue foramtransferidas em tubos de microcentrífuga de 1,7 ml contendo EDTA,resultando em uma concentração final de 20 mM de EDTA. as amostrasforam centrifugadas e o plasma foi coletado. Agentes inibidores de MASP-2,tais como os anticorpos anti-MASP-2 são adicionados ao sangue heparinizadoimediatamente antes da rotação. As amostras de plasma são depoissubmetidas aos ensaios para medir a concentração de C3a e C5b-9 solúveiscomo descrito em Gupta-Bansal et ai., 2000, supra.

EXEMPLO 23

Este exemplo descreve o uso de um sistema de modelo deligação e perfuração cecal de roedor (CLP) para testar agentes inibidores deMASP-2 úteis para tratar septicemia ou uma condição que resulta desepticemia, incluindo septicemia severa, choque séptico, síndrome da angústiarespiratória aguda que resulta de septicemia e síndrome da respostainflamatória sistêmica.

Fundamentos e Análise Racional: Como debatido acima, aativação de complemento foi mostrada em numerosos estudos ter um papelprincipal na patogênese da septicemia (ver Bone, R. C., Annals. Internai.Med. 115: 457-469, 1991). O modelo de roedor CLP é um modeloreconhecido que imita o curso clínico da septicemia em seres humanos e éconsiderado ser um modelo substituto razoável para septicemia em sereshumanos (ver Ward, P., Nature Review Immunology Vol 4: 133-142 (2004).Um estudo recente tem mostrado que o tratamento de animais com CLP comanticorpos anti-C5a resultou em bacteremia reduzida e melhorouenormemente a sobrevivência Huber-Lang et al., J. of Immunol. 169: 3223-3231 (2002). Portanto, com base nas observações aqui descritas de queMASP-2 desempenha um papel essencial no início tanto do caminho dalectina quanto do alternativo, o modelo de roedor de CLP é útil para triarquanto aos agentes inibidores de MASP-2 que são eficazes para o uso comoagentes terapêuticos para prevenir ou tratar a septicemia ou uma condição queresulta da septicemia.

Métodos: O modelo CLP é adaptado do modelo descrito emHuber-Lang et al., 2004, supra como segue. Animais MASP-2-/- e MASP-2+1+ são anestesiados. Uma incisão abdominal na linha central de 2 cm é feitae o ceco é firmemente ligado abaixo da válvula ileocecal, evitando aobstrução do intestino. O ceco é depois perfurado completamente com umaagulha de calibre 21. A incisão abdominal foi depois fechada em camadascom sutura de seda e grampos de pele (Ethicon, Summerville, NJ).Imediatamente depois da CLP, os animais recebem uma injeção de um agenteinibidor de MASP-2 tal como anticorpos monoclonais anti-MASP-2 (em umafaixa de dosagem de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg). Os anticorpos monoclonais anti-hMASP-2 como agentes terapêuticos podem ser facilmente avaliados emum modelo de camundongo CLP operante em MASP-2-/-, hMASP-+/+. Oplasma dos camundongos são depois analisados quanto aos níveis deanafilatoxinas derivadas de complemento e estouro respiratório usando osensaios descritos em Huber-Lang et al., 2004, supra.

EXEMPLO 24

Este exemplo descreve a identificação de fragmentos deanticorpo Fab2 anti-MASP-2 de alta afinidade que bloqueia a atividade deMASP-2.

Fundamentos e Análise Racional: MASP-2 é uma proteína complexa com muitos domínios funcionais separados, incluindo: sítio(s) deligação para MBL e ficolinas, um sítio catalítico de serina protease, um sítiode ligação para o substrato proteolítico C2, um sítio de ligação para osubstrato proteolítico C4, um sítio de clivagem MASP-2 para a autoativaçãode zimogênio de MASP-2 e dois sítios de ligação de Ca+"*". Os fragmentos deanticorpo Fab2 foram identificados que ligam com alta afinidade a MASP-2 eos fragmentos Fab2 identificados foram testados em um ensaio funcional paradeterminar se eles foram capazes de bloquear a atividade funcional de MASP-2.

Para bloquear a atividade funcional de MASP-2, um anticorpoou fragmento de anticorpo Fab2 devem ligar e interferir com um epítopoestrutural em MASP-2 que é requerido para a atividade funcional de MASP-2.Portanto, muitos ou todos dos Fab2s anti-MASP-2 de ligação de alta afinidadepodem não inibir a atividade funcional de MASP-2 a menos que eles liguemaos epítopos estruturais em MASP-2 que são diretamente envolvidos naatividade funcional de MASP-2.

Um ensaio funcional que mediu a inibição de formação docaminho da lectina C3 convertase foi usado para avaliar a "atividadebloqueadora" de Fab2s anti-MASP-2. E conhecido que o papel fisológicoprimário de MASP-2 no caminho da lectina é para gerar o componentefuncional seguinte do caminho de complemento mediado por lectina, a sabero caminho da lectina C3 convertase. O caminho da lectina C3 convertase éum complexo enzimático crítico (C4bC2a) que proteoliticamente cliva C3 emC3a e C3b. MASP-2 não é um componente estrutural do caminho da lectinaC3 convertase (C4bC2a); entretanto, a atividade funcional de MASP-2 érequerida de modo a gerar os dois componentes de proteína (C4b, C2a) quecompreendem o caminho da lectina C3 convertase. Além disso, todas asatividades funcionais separadas de MASP-2 listadas acima parecem serrequeridas de modo que MASP-2 gere o caminho da lectina C3 convertase.Por estas razões, acredita-se que um ensaio preferido para usar na avaliaçãoda "atividade bloqueadora" de Fab2s anti-MASP-2 seja um ensaio funcionalque meça a inibição de formação do caminho da lectina C3 convertase.

Geração de Fab2s de Alta Afinidade: Uma biblioteca dedemonstração de fago de seqüências de anticorpo de cadeia leve e pesadavariáveis humanas e a tecnologia de seleção de anticorpo automatizada paraidentificar Fab2s que reajam com ligandos selecionados de interesse foi usadopara criar Fab2s de alto afinidade para a proteína MASP-2 de rato (SEQ IDNO: 55). Uma quantidade conhecida de proteína de MASP-2 de rato (~ 1 mg,> 85% pura) foi utilizada para a triagem de anticorpo. Três rodadas deamplificação foram utilizadas para a seleção dos anticorpos com a melhorafinidade. Aproximadamente 250 acertos diferentes que expressamfragmentos de anticorpo foram escolhidos para a triagem por ELISA. Osacertos de alta afinidade foram subseqüentemente seqüenciados paradeterminar a imparidade dos diferentes anticorpos.

Cinqüenta anticorpos anti-MASP-2 únicos foram purificados e250 μg de cada anticorpo Fab2 purificado foram usados para a caracterizaçãoda afinidade de ligação de MASP-2 e teste funcional do caminho decomplemento, como descrito em mais detalhes abaixo.

Ensaios usados para Avaliar a Atividade Inibidora (bloqueadora) deFab2s Anti-MASP-2

1. Ensaios para Medir a Inibição da Formação de Caminho da LectinaConvertase:

Fundamentos: O caminho da lectina C3 convertase é ocomplexo enzimático (C4bC2a) que proteoliticamente cliva C3 nos doisfragmentos pró inflamatórios potentes, a anafilatoxina C3a e C3b opsônico. Aformação da C3 convertase parece ser uma etapa chave no caminho da lectinaem termos de mediar a inflamação. MASP-2 não é um componente estruturaldo caminho da lectina C3 convertase (C4bC2a); portanto anticorpos anti-MASP-2 (ou Fab2) não inibirão diretamente a atividade da C3 convertase préexistente. Entretanto, a atividade da serina protease de MASP-2 é requeridade modo a gerar os dois componentes de proteína (C4b, C2a) quecompreendem o caminho da lectina C3 convertase. Portanto, Fab2 anti-MASP-2 que inibe a atividade funcional de MASP-2 (isto é, Fab2 anti-MASP-2 bloqueador) inibirão a formação de novo do caminho da lectina C3convertase. C3 contém um grupo de tioéster incomum e altamente reativocomo parte de sua estrutura. Na clivagem de C3 pela C3 convertase nesteensaio, o grupo tioéster em C3b pode formar uma ligação covalente com osgrupos hidroxila ou amino nas macromoléculas imobilizadas no fundo dosreservatórios plásticos por intermédio de ligações de éster ou amida,facilitando assim a detecção de C3b no ensaio de ELISA.

A levedura manana é um ativador do caminho da lectinaconhecido. No seguinte método para medir a formação da C3 convertase, osreservatórios plásticos revestidos com manana foram incubados por 30 min a37°C com soro de rato diluído para ativar o caminho da lectina. Osreservatórios foram depois lavados e ensaiados quanto a C3b imobilizado nosreservatórios usando métodos de ELISA padrão. A quantidade de C3b geradoneste ensaio é uma reflexão direta da formação de novo do caminho da lectinaC3 convertase. Fab2s anti-MASP-2 nas concentrações selecionadas foramtestados neste ensaio quanto a sua capacidade para inibir a formação da C3convertase e a geração de C3b conseqüente.Métodos:

Placas Costar Médium Binding de 96 reservatórios foramincubadas durante a noite a 50C com manana diluída em 50 mM de tampão decarbonato, pH 9,5 a 1 μg/50 μl/reservatório. Depois da incubação noturna,cada reservatório foi lavado três vezes com 200 μl de PBS. Os reservatóriosforam depois bloqueados com 100 μl/reservatório de 1% de albumina séricabovina em PBS e incubados por uma hora na temperatura ambiente commistura suave. Cada reservatório foi depois lavado três vezes com 200 μl dePBS. As amostras de Fab2 anti-MASP-2 foram diluídas nas concentraçõesselecionadas em tampão GVB contendo Ca+* e Mg4^+ (4,0 mM de barbital,141 mM de NaCl, 1,0 mM de MgCl2s 2,0 mM de CaCl2, 0,1% de gelatina, pH7,4) a 5°C. Um soro de rato a 0,5% foi adicionado às amostras acima a 5°C e100 μl foram transferidos a cada reservatório. As placas foram cobertas eincubadas por 30 minutos em um banho de água a 37°C para permitir aativação de complemento. A reação foi interrompida transferindo-se as placasdo banho de água a 37°C para um recipiente contendo uma mistura de gelo-água. Cada reservatório foi lavado cinco vezes com 200 μl de PBS-Tween 20(0,05% de Tween 20 em PBS), depois lavado duas vezes com 200 μl de PBS.Um 100 μl/reservatório de diluição 1:10.000 do anticorpo primário (coelhoanti-humano C3c, DAKO A0062) foi adicionado em PBS contendo 2,0 mg/mlde albumina sérica bovina e incubada 1 hora na temperatura ambiente commistura suave. Cada reservatório foi lavado 5 χ 200 μl de PBS. 100μl/reservatório de diluição 1:10.000 do anticorpo secundário (IgG anti-coelhode cabra conjugado a peroxidase, American Qualex A102PU) foi adicionadoem PBS contendo 2,0 mg/ml de albumina sérica bovina e incubada por umahora na temperatura ambiente em um agitador com mistura suave. Cadareservatório foi lavado cinco vezes com 200 μl de PBS. 100 μl/reservatóriodo substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) foramadicionados e incubados na temperatura ambiente por 10 min. A reação deperoxidase foi interrompida pela adição de 100 μl/reservatório de H3PO4 1,0Mea OD450 foi medida.

2. Ensaio para Medir a Inibição da Clivagem de C4 Dependente deMASP-2

Fundamentos: A atividade de serina protease de MASP-2 éaltamente específica e apenas dois substratos de proteína para MASP-2 foramidentificados; C2 e C4. A clivagem de C4 gera C4a e C4b. Fab2 anti-MASP-2pode ligar-se aos epítopos estruturais em MASP-2 que estão diretamenteenvolvidos na clivagem de C4 (por exemplo, sítio de ligação de MASP-2 paraC4; sítio catalítico da MASP-2 serina protease) e deste modo inibem aatividade funcional da clivagem de C4 de MASP-2.

A levedura manana é um ativador do caminho da lectinaconhecido. No seguinte método para medir a atividade de clivagem de C4 deMASP-2, reservatórios plásticos revestidos com manana foram incubados porminutos a 37°C com soro de rato diluído para ativar o caminho da lectina.Visto que o anticorpo primário usado neste ensaio de ELISA apenasreconhece C4 humano, o soro de rato diluído também foi suplementado comC4 humano (1,0 μg/ml). Os reservatórios foram depois lavados e ensaiadosquanto a C4b humano imobilizado nos reservatórios usando métodos deELISA padrão. A quantidade de C4b gerado neste ensaio é uma medida daatividade de clivagem de C4 dependente de MASP-2. Fab2 anti-MASP-2 nasconcentrações selecionadas foi testado neste ensaio quanto a sua capacidadepara inibir a clivagem de C4.

Métodos: Placas Costar Médium Binding de 96 reservatóriosforam incubadas durante a noite a 5°C com manana diluída em tampão decarbonato a 50 mM, pH 9,5 a 1,0 μg/50 μl/reservatório. Cada reservatório foilavado 3X com 200 μl de PBS. Os reservatórios foram depois bloqueadoscom 100 μl/reservatório de albumina sérica bovina a 1% em PBS e incubadaspor uma hora na temperatura ambiente com agitação suave. Cada reservatóriofoi lavado 3X com 200 IA de PBS. Amostras de Fab2 anti-MASP-2 foramdiluídas nas concentrações selecionadas em Ca++ e Mg++ contendo tampãoGVB (4,0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1,0 mM de MgCl2, 2,0 mM deCaCl2, 0,1% de gelatina, pH 7,4) a 5°C. 1,0 μg/ml de C4 humano (Quidel)também foi incluído nestas amostras. 0,5% de soro de rato foi adicionado àsamostras acima a 5°C e 100 μl foram transferidos a cada reservatório. Asplacas foram cobertas e incubadas por 30 min em um banho de água a 37°Cpara permitir a ativação de complemento. A reação foi interrompidatransferindo-se as placas do banho de água a 37°C para um recipientecontendo uma mistura de gelo-água. Cada reservatório foi lavado 5 χ 200 μΐcom PBS-Tween 20 (0,05% de Tween 20 em PBS), depois cada reservatóriofoi lavado 2X com 200 μΐ de PBS. 100 μl/reservatório de diluição 1:700 deanti-C4 humano de galinha conjugado com biotina (Immunsystem AB,Uppsala, Suécia) foram adicionados em PBS contendo 2,0 mg/ml de albuminasérica bovina (BSA) e incubados uma hora na temperatura ambiente comagitação suave. Cada reservatório foi lavado 5 χ 200 μl de PBS. 100μl/reservatório de 0,1 μg/ml de estreptavidina conjugada com peroxidase(Pierce Chemical #21126) foi adicionado em PBS contendo 2,0 mg/ml deBSA e incubados por uma hora na temperatura ambiente em um agitador comagitação suave. Cada reservatório foi lavado 5 χ 200 μΐ com PBS. 100μΐ/reservatório do substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & PerryLaboratories) foram adicionados e incubados na temperatura ambiente por 16min. A reação de peroxidase foi interrompida pela adição de 100μΐ/reservatório de H3PO4 1,0 M e a OD450 foi medida.

3. Ensaio de Ligação de Fab2 de MASP-2 anti-rato ao MASP-2 de rato'Nativo'

Fundamentos: MASP-2 está usualmente presente no plasmacomo um complexo dimérico de MASP-2 que também inclui moléculasespecíficas de lectina (proteína de ligação manose (MBL) e ficolinas).Portanto, se uma pessoa está interessada em estudar a ligação de Fab2 anti-MASP-2 para a forma fisiologicamente relevante de MASP-2, é importante odesenvolver um ensaio de ligação em que a interação entre o Fab2 e MASP-2'nativo' no plasma é usada, ao invés de MASP-2 recombinante purificado.Neste ensaio de ligação o complexo de MASP-2-MBL 'nativo' de soro derato a 10% foi primeiro imobilizado em reservatórios revestidos com manana.A afinidade de ligação de vários Fab2s anti-MASP-2 ao MASP-2 'nativo'imobilizado foi depois estudada usando uma metodologia de ELISA padrão.

Métodos: Placas Costar High Binding de 96 reservatóriosforam incubadas durante a noite a 5°C com manana diluída em 50 mM detampão de carbonato, pH 9,5 a 1 μ§/50 μΐ/reservatório. Cada reservatório foilavado 3X com 200 μΐ de PBS. Os reservatórios foram bloqueados com 100μΐ/reservatório de leite em pó desnatado a 0,5% em PBST (PBS com 0,05%de Tween 20) e incubados por uma hora na temperatura ambiente comagitação suave. Cada reservatório foi lavado 3X com 200 μΐ de Tampão deLavagem de TBS/Tween/Ca^ (solução salina tamponada com Tris, 0,05% deTween 20, contendo 5,0 mM de CaCl2, pH 7,4). 10% de soro de rato emTampão de Ligação de Sal Alto (20 mM de Tris, 1,0 M de NaCl, 10 mM deCaCl2, 0,05% de Triton-X 100, 0,1% (p/v) de albumina sérica bovina, pH 7,4)foi preparado em gelo. 100 μl/reservatório foram adicionados e incubadosdurante a noite a 5°C. Os reservatórios foram lavados 3X com 200 μl de Tampão de Lavagem de TBS/Tween/Ca++. Os reservatórios foram depoislavados 2X com 200 μl de PBS. 100 μl/reservatório de concentraçãoselecionada de Fab2 anti-MASP-2 diluído em Tampão GVB contendo Ca++ eMg++ (4,0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1,0 mM de MgCl2, 2,0 mM deCaCl2, 0,1% de gelatina, pH 7,4) foram adicionados e incubados por uma hora na temperatura ambiente com agitação suave. Cada reservatório foi lavado 5 χ200 μl de PBS. 100 μl/reservatório de anti-Fab2 de cabra conjugado comHRP (Biogenesis Cat No 0500-0099) diluído 1:5000 em 2,0 mg/ml dealbumina sérica bovina em PBS foram adicionados e incubados por uma horana temperatura ambiente com agitação suave. Cada reservatório foi lavado 5 χ 200 μl de PBS. 100 μl/reservatório do substrato de peroxidase TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories) foram adicionados e incubados natemperatura ambiente por 70 min. A reação de peroxidase foi interrompidapela adição de 100 μl/reservatório de H3PO4 1,0 M e a OD450 foi medida.RESULTADOS:

Aproximadamente 250 Fab2s diferentes que reagiram com alta

afinidade com a proteína MASP-2 de rato foram escolhidos para a triagem porELISA. Estes Fab2s de alto afinidade foram seqüenciados para determinar aimparidade dos anticorpos diferentes e 50 anticorpos anti-MASP-2 únicosforam purificados para análise adicional. 250 μg de cada anticorpo Fab2 purificado foram usados para a caracterização da afinidade de ligação deMASP-2 e testar o caminho funcional de complemento. Os resultados destaanálise são mostrados abaixo na TABELA 6.Tabela 6: FAB2 anti-MASP-2 que bloqueia a ativação de complemento pelocaminho da lectina

<table>table see original document page 217</column></row><table>

Como mostrado acima na TABELA 6, dos 50 Fab2s anti-MASP-2 testados, dezessete Fab2s foram identificados como Fab2bloqueador de MASP-2 que potentemente inibem a formação da C3convertase com IC50 igual ou menor do que 10 nM de Fab2s (uma taxa deacerto positivo de 34%). Oito dos dezessete Fab2s identificados têm IC50s nafaixa subnanomolar. Além disso, todos os dezessete dos Fab2s bloqueadoresde MASP-2 mostrado na TABELA 6 deram inibição essencialmente completada formação de C3 convertase no ensaio do caminho da lectina C3convertase. A FIGURA IlA graficamente ilustra os resultados do ensaio deformação da C3 convertase para o anticorpo Fab2 #11, que é representativodos outros anticorpos Fab2 testados, os resultados dos quais são mostrados naTABELA 6. Esta é uma consideração importante, visto que é teoricamentepossível que um Fab2 "bloqueador" possa apenas fracionalmente inibir afunção de MASP-2 mesmo quando cada molécula de MASP-2 é ligada peloFab2.

Embora a manana seja um ativador do caminho da lectinaconhecido, é teoricamente possível que a presença de anticorpos anti-mananano soro de rato também possam ativar o caminho clássico e gerar C3b porintermédio da C3 convertase do caminho clássico. Entretanto, cada um dosdezessete Fab2s anti-MASP-2 bloqueadores listados neste exemplopotentemente inibem a geração de C3b (>95%), demonstrando assim aespecificidade deste ensaio para a C3 convertase do caminho da lectina.

Os ensaios de ligação também foram realizados com todos osdezessete dos Fab2s bloqueadores de modo a calcular um Kd aparente paracada um. Os resultados dos ensaios de ligação de Fab2s de MASP-2 anti-ratoa MASP-2 de rato nativo para seis dos Fab2s bloqueadores também sãomostrados na TABELA 6. A FIGURA IlB graficamente ilustra os resultadosde um ensaio de ligação com o anticorpo Fab2 #11. Ensaio de ligaçãosimilares também foram realizados para os outros Fab2s, os resultados doqual são mostrados na TABELA 6. No geral, os Kds aparentes obtidos para aligação de cada um dos seis Fab2s à MASP-2 'nativa' corresponderazoavelmente bem com a IC50 para o Fab2 no ensaio funcional da C3convertase. Existe evidência de que MASP-2 passa por uma mudançaconformacional de uma forma 'inativa' para uma 'ativa' na ativação da suaatividade de protease (Feinberg et al., EMBO J 22: 2348-59 (2003); Gal et al,J. Biol. Chem. 280: 33435-44 (2005)). No plasma de rato normal usado noensaio de formação da C3 convertase, MASP-2 está presente primariamentena conformação de zimogênio. Ao contrário, no ensaio de ligação, MASP-2está presente como parte de um complexo com MBL ligado à mananaimobilizada; portanto, a MASP-2 pode estar na conformação 'ativa' (Petersenet al, J. Immunol Methods 257: 107-16, 2001). Conseqüentemente, não sepoderia esperar necessariamente uma correspondência exata entre a IC50 eKd para cada um dos dezessete Fab2 bloqueadores testados nestes doisensaios funcionais visto que em cada ensaio o Fab2 estaria ligando uma formaconformacional diferente de MASP-2. Não obstante, com a exceção do Fab2#88, parece haver uma correspondência razoavelmente fechada entre o IC50 eo Kd aparente para cada um dos outros dezesseis Fab2 testados nos doisensaios (ver a TABELA 6).

Diversos dos Fab2s bloqueadores foram avaliados quanto ainibição da clivagem mediada por MASP-2 de C4. A FIGURA IlCgraficamente ilustra os resultados de um ensaio de clivagem C4, mostrando ainibição com Fab2 #41, com um IC50 = 0,81 nM (ver a TABELA 6). Comomostrado na FIGURA 12, todos dos Fab2s testados foram descobertos inibir aclivagem de C4 com IC50s similares àqueles obtidos no ensaio da C3convertase (ver a TABELA 6).

Embora a manana seja um ativador do caminho da lectinaconhecida, é teoricamente possível que a presença de anticorpos anti-mananáno soro de rato também ativasse o caminho clássico e deste modo geraria C4bpela clivagem mediada por Cls de C4. Entretanto, diversos Fab2s anti-MASP-2 foram identificados que potentemente inibem a geração de C4b(>95%), demonstrando assim a especificidade deste ensaio para a clivagem deC4 mediada por MASP-2. C4, igual a C3, contém um grupo tioéster incomume altamente reativo como parte da sua estrutura. Na clivagem de C4 porMASP-2 neste ensaio, o grupo tioéster em C4b pode formar uma ligaçãocovalente com grupos hidroxila ou amino em macromoléculas imobilizadasno fundo dos reservatórios plásticos por intermédio de ligações de éster ouamida, facilitando assim a detecção de C4b no ensaio de ELISA.

Estes estudos claramente demonstram a criação de FAB2s dealta afinidade para a proteína de MASP-2 de rato que funcionalmentebloqueiam a atividade tanto da C4 quanto da C3 convertase, prevenindo destemodo a ativação do caminho da lectina.

EXEMPLO 25

Este exemplo descreve o mapeamento de epítopo para diversosdos anticorpos Fab2 de MASP-2 anti-rato bloqueadores que foram geradoscomo descrito no Exemplo 24.

Métodos:

Como mostrado na FIGURA 13, as seguintes proteínas, todascom rótulos 6X His de terminal N foram expressadas em células CHO usandoo vetor pED4:

MASP-2A de rato, uma proteína MASP-2 de tamanho natural,inativada anterando-se a serina no centro ativo para alanina (S613A);

MASP-2K de rato, uma proteína MASP-2 de tamanho naturalalterada para reduzir a autoativação (R424K);

CUBI-II, um fragmento de terminal N de MASP-2 de rato quecontém apenas os domínios CUBI, equivalente a EGF e CUBII; e

CUBI/equivalente a EGF, um fragmento de terminal N deMASP-2 de rato que contêm apenas os domínios CUBI e equivalente a EGF.

Estas proteínas foram purificadas a partir dos sobrenadantes decultura pela cromatografia de afinidade em níquel, como anteriormentedescrita (Chen et al., J. Biol. Chem. 276: 25894-02 (2001)).

Um polipeptídeo de terminal C (CCPII-SP), contendo CCPII eo domínio de serina protease de MASP-2 de rato, foi expressado na E. colicomo uma proteína de fusão da tiorredoxina usando pTrxFus (Invitrogen). Aproteína foi purificada a partir de lisados de célula usando a resina deafinidade Thiobond. O parceiro de fusão de tiorredoxina foi expressado apartir do pTrxFus vazio como um controle negativo.

Todas as proteínas recombinantes foram dialisadas em tampãode TBS e as suas concentrações determinadas medindo-se a OD a 280 nm.ANÁLISE DOT BLOT:

As diluições em série dos cinco polipeptídeos de MASP-2recombinantes descritos acima e mostrados na FIGURA 13 (e o polipeptídeode tiorredoxina como um controle negativo para o polipeptídeo de CCPII-serina protease) foram manchados em uma membrana de nitrocelulose. Aquantidade de proteína manchada variou de 100 ng a 6,4 μ§, em etapas decinco vezes. Em experimentos posteriores, a quantidade de proteínamanchada variou de 50 ng para abaixo de 16 pg, mais uma vez em etapas decinco vezes. As membranas foram bloqueadas com leite em pó desnatado a5% em TBS (tampão bloqueador) depois de incubadas com 1,0 μg/ml de Fab2s anti-MASP-2 em tampão bloqueador (contendo 5,0 mM de Ca2+). OsFab2s ligados foram detectados usando Fab anti-humano conjugado a HRP(AbD/ Serotec; diluído 1/10.000) e um kit de detecção ECL (Amersham).Uma membrana foi incubada com Ab humano de coelho anti MASP-2policlonal (descrito em Stover et al., J Immunol 163: 6848-59 (1999)) comoum controle positivo. Neste caso, o Ab ligado foi detectado usando IgG anti-coelho de cabra conjugado a HRP (Dako; diluído 1/2.000).

Ensaio de Ligação de MASP-2

As placas de ELISA foram revestidas com 1,0 μg/ reservatóriode MASP-2A recombinante ou polipeptídeo CUBI-II em tampão de carbonato(pH 9,0) durante a noite a 4°C. Os reservatórios foram bloqueados com 1% deBSA em TBS, depois diluições em série dos Fab2s anti-MASP-2 foramadicionadas em TBS contendo 5,0 mM de Ca2+. As placas foram incubadaspor uma hora na temperatura ambiente. Depois da lavagem três vezes comTBS/tween/Ca2+, Fab anti-humano conjugado a HRP (AbD/Serotec) diluído1/10.000 em TBS/Ca foi adicionado e as placas incubadas por um adicionalde uma hora na temperatura ambiente. O anticorpo ligado foi detectadousando um kit de substrato de TMB peroxidase (Biorad).

RESULTADOS:

Os resultados da análise de manchas pontos que demonstram areatividade dos Fab2s com vários polipeptídeos de MASP-2 são fornecidosabaixo na TABELA 7. Os valores numéricos fornecidos na TABELA 7indicam a quantidade de proteína manchada requerida para daraproximadamente a força de sinal semi-máxima. Como mostrado, todos ospolipeptídeos (com a exceção do parceiro de fusão de tiorredoxina sozinho)foram reconhecidos pelo Ab de controle positivo (soros humanos anti-MASP-2 policlonais, incitados em coelhos).

Tabela 7: Reatividade com vários polipeptídeos de MASP-2 recombinantes de rato em manchas pontos

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NR = Nenhuma reação. O anticorpo de controle positivo é de soros anti-

MASP-2 humana policlonais, incitados em coelhos.

Todos os Fab2s reagiram com MASP-2A assim como MASP-2K (dados não mostrados). A maioria dos Fab2s reconheceram o polipeptídeoCCPII-SP mas não os fragmentos de terminal N. As duas exceções são Fab2#60 e Fab2 #57. Fab2 #60 reconhece MASP-2A e o fragmento CUBI-II, masnão o polipeptídeo equivalente a CUBI/EGF ou o polipeptídeo CCPII-SP,sugerindo que o mesmo se liga a um epítopo em CUBIT ou transpondo odomínio CUBIT e o equivalente a EGF. Fab2 #57 reconhece MASP-2A masnão qualquer um dos fragmentos de MASP-2 testados, talvez indicando queeste Fab2 reconhece um epítopo em CCP1. Fab2 #40 e #49 ligaram apenas aoMASP-2A completo. No ensaio de ligação de ELISA mostrado na FIGURA14, Fab2 #60 também ligou ao polipeptídeo CUBI-II, embora com umaafinidade aparente levemente mais baixa.

Estas descobertas demonstram a identificação de Fab2sbloqueadores múltiplos às regiões múltiplas da proteína de MASP-2EXEMPLO 26

Este exemplo descreve a análise de camundongos MASP-2-/-em um Modelo de Isquemia/Reperfusão Renal de Murino.

Fundamentos/Análise racional: A lesão por Isquemia-Reperfusão (I/R) no rim na temperatura do corpo tem relevância em váriascondições clínicas, incluindo choque hipovolêmico, oclusão da artéria renal eprocedimentos de clampeamento cruzado.

A isquemia-reperfusão (I/R) renal é uma causa importante deinsuficiência renal aguda, associada com uma taxa de mortalidade de até 50%(Levy et al., JAMA 275: 1489-94, 1996; Thadhani et al., N. Engl. J. Med.334: 1448-60, 1996). A insuficiência renal após o transplante é umacomplicação comum e ameaçadora da vida depois do transplante renal(Nicholson et al., Kidney Int. 58: 2585-91, 2000). O tratamento eficaz para alesão I/R renal não está correntemente disponível e a hemodiálise é o únicotratamento disponível. A fisiopatologia da lesão I/R renal é complicada.Estudos recentes têm mostrado que o caminho da lectina da ativação decomplemento pode ter um papel importante na patogênese da lesão I/R renal(deVries et al., Am. J. Path. 165: 1677-88, 2004).Métodos:

Um camundongo MASP-2(-/-) foi gerado como descrito noExemplo 1 e retrocruzado por pelo menos 10 gerações com C57B1/6. Seiscamundongos machos MASP-2(-/-) e seis (+/+) do tipo selvagem pesandoentre 22 e 25 g foram administrados com uma injeção intraperitoneal deHypnovel (6,64 mg/kg; Roche products Ltd. Welwyn Garden City, UK) esubseqüentemente anestesiados pela inalação de isoflurano (AbbottLaboratories Ltd., Kent, UK). Isoflurano foi escolhido porque é um anestésicode inalação branda com toxicidade hepática mínima; as concentrações sãoproduzidas acuradamente e o animal recupera-se rapidamente, mesmo depoisde anestesia prolongada. Hypnovel foi administrado porque o mesmo produzuma condição de neuroleptanalgesia no animal e significa que menosisoflurano necessita ser administrado. Uma almofada que foi colocada pordetrás do animal de modo a manter uma temperatura corporal constante. Emseguida, uma incisão abdominal central foi realizada e a cavidade corporalmantida aberta usando um par de retratores. O tecido conectivo foi afastadoacima e abaixo da veia e artéria renais tanto do rim direito quanto do esquerdoe o pedículo renal foi clampeado por intermédio da aplicação de grampos demicroaneurisma por um período de 55 minutos. Este período de isquemia foicom base inicialmente em um estudo anterior realizado neste laboratório(Zhou et al., J. Clin. Invest. 105: 1363-71 (2000)). Além disso, um tempoisquêmico padrão de 55 minutos foi escolhido a seguir da titulação isquêmicae foi descoberto que 55 minutos deram lesão compatível que também foireversível, com baixa mortalidade, menos do que 5%. Depois da oclusão, 0,4ml de solução salina quente (37°C) foi colocada na cavidade abdominal edepois o abdômen foi fechado durante o período de isquemia. A seguir daremoção dos grampos de microaneurisma, os rins foram observados atémudança de cor, uma indicação de re-fluxo de sangue para os rins. Mais 0,4ml de solução salina quente foi colocado na cavidade abdominal e a aberturafoi suturada, depois do que os animais foram retornados para as suas gaiolas.Amostras de sangue da cauda foram tomadas em 24 horas depois da remoçãodos grampos e em 48 horas os camundongos foram sacrificados e umaamostra de sangue adicional foi coletada .

Avaliação de Lesão Renal: A função renal foi avaliada em 24e 48 horas depois da reperfusão em seis camundongos machos MASP-2(-/-) eseis WT (+/+). A medição da creatinina do sangue foi determinada pelaespectrometria de massa, que fornece um índice reprodutível de função renal(sensibilidade <1,0 μπιοΙ/L). A FIGURA 15 graficamente ilustra a depuraçãodo nitrogênio da uréia do para os controles C57B1/6 do tipo selvagem eMASP-2 (-/-) em 24 horas e 48 horas depois da reperfusão. Como mostradona FIGURA 15, os camundongos MASP-2(-/-) demonstraram uma reduçãosignificante na quantidade de uréia de sangue em 24 e 48 horas, emcomparação com os camundongos de controle do tipo selvagem, indicandoum efeito funcional protetor de lesão renal no modelo de lesão de isquemia-reperfusão.

De ponta a ponta, a uréia do sangue aumentada foi observadatanto nos camundongos WT (+/+) quanto nos MASP-2 (-/-) em 24 e 48 horasa seguir do procedimento cirúrgico e insulto isquêmico. Os níveis de uréia dosangue em uma cirurgia de animal WT (+/+) não isquêmica foramseparadamente determinados ser 5,8 mmol/L. Além dos dados apresentadosna FIGURA 15, um animal MASP-2 (-/-) mostrou proteção quase completado insulto isquêmico, com valores de 6,8 e 9,6 mmol/L em 24 e 48 horas,respectivamente. Este animal foi excluído da análise em grupo como umtestemunho potencial, em que nenhuma lesão isquêmica pode ter estadopresente. Portanto, a análise final mostrada na FIGURA 15 incluiu 5camundongos MASP-2(-/-) e camundongos 6 WT (+/+) e uma reduçãoestatisticamente significante na uréia do sangue foi observada em 24 e 48horas nos camundongos MASP-2 (-/-) (teste t de Student ρ < 0,05). Estasdescobertas indicam que a inibição da atividade de MASP-2 seria esperado terum efeito protetor ou terapêutico de lesão renal devido à lesão isquêmica.

EXEMPLO 27

Este exemplo descreve a análise de camundongos MASP-2(-/-)

em um Modelo de Isquemia/Reperfusão Miocárdica de Camundongo.

Fundamentos/Análise racional:

A lectina que liga manose (MBL) é uma molécula circulanteque inicia a ativação de complemento em uma maneira imuno-independentecomplexa, em resposta a uma ampla faixa de estruturas de carboidrato. Estasestruturas podem ser componentes de agentes infecciosos ou porções decarboidrato endógeno alteradas particularmente dentro de células necróticas,oncóticas ou apoptóticas. Estas formas de morte de célula ocorrem nomiocárdio reperfundido onde a ativação de complemento provavelmenteexpande a lesão além da fronteira que existe no momento quando a isquemiaé terminada pela reperfusão. Embora exista evidência convincente de que aativação de complemento agrava a reperfusão miocárdica, o mecanismo de talativação não é bem entendido e a inibição de todos os caminhos conhecidos éprovável que tenha efeitos adversos intoleráveis. Um estudo recente sugereque a ativação pode envolver a MBL, ao invés do caminho clássico ou alça deamplificação alternativa (como definido na presente invenção), visto que ainfartação foi reduzida em camundongos nulos em MBL(AZC), mas não nosnulos em Clq, (Walsh M. C. et al., Jour of Immunol. 175: 541-546 (2005)).Entretanto, embora encoraj adores, estes camundongos ainda abrigamcomponentes circulantes, tais como Ficolina A, capazes de ativarcomplemento através do caminho da lectina.

Este estudo investigou camundongos MASP-2(-/-) versuscontroles (+/+) do tipo selvagem para determinar se o MASP-2(-/-) seriamenos sensível à lesão de isquemia e reperfusão miocárdicas. Oscamundongos MASP-2(-/-)foram submetidos à isquemia regional e o tamanhodo infarto foi comparado com os seus companheiros de ninhada do tiposelvagem.

Métodos: O seguinte protocolo foi fundamentado em umprocedimento para induzir a lesão de isquemia/reperfusão anteriormentedescrita por Marber et al., J. Clin Invest. 95: 1446-1456 (1995)).

Um camundongo MASP-2(-/-) foi gerado como descrito noExemplo 1 e retrocruzado por pelo menos 10 gerações com C57B1/6. Setecamundongos MASP-2 (-/-) e sete camundongos (+/+) do tipo selvagemforam anestesiados com cetamina/medetomidina (100 mg/kg e 0,2 mg/kg,respectivamente) e colocados deitados de costas em uma almofada deaquecimento termostaticamente controlado para manter a temperatura retal a37 ± 0,3°C. Os camundongos foram intubados sob visão direta e ventiladoscom ar ambiente em uma taxa respiratória de 11 O/min e um volume tidal de225O/min (Ventilador - Hugo Sachs Elektronic MiniVent Tipo 845,Alemanha).

O pelo foi raspado e uma incisão de pele anterolateral feita apartir da axila esquerda até o processus xiphoideus. O músculo pectoralismajor foi dissecado, cortado na sua margem externa e movido na cova axilar.

O músculo pectoralis minor foi cortado na sua margem craniana ecaudalmente movido. O músculo foi mais tarde usado como uma abamuscular que cobre o coração durante a oclusão da artéria coronária. Osmúsculos do 5o espaço intercostal e a pleura parietalis foram penetradas compinças em um ponto levemente mediai em relação à margem do pulmãoesquerdo, evitando assim o lesão do pulmão ou do coração. Depois dapenetração da pleura as pinças foram cuidadosamente direcionadas para alémda pleura na direção do esterno sem tocar o coração e a pleura e os músculosintercostais foram dissecados com um cauterizador acionado por bateria(Harvard Apparatus, UK). Cuidado especial foi exercido em evitar qualquerhemorragia. Usando a mesma técnica, a toracotomia foi ampliada até a linhaaxilar branda. Depois de cortar a 4a costela na sua margem externa do espaçointercostal foi ampliada até que o coração inteiro foi exposto da base ao ápice.

Com dois fórceps de artéria pequenos o pericárdio foi aberto e uma talapericardial confeccionada para mover o coração levemente anterior. A artériacoronária descendente (LAD) anterior esquerda foi exposta e uma sutura demonofilamento 8-0 com uma agulha curva foi depois passada sob a LAD. Osítio de ligação da LAD reside exatamente caudal da ponta do átrio esquerdo,cerca de 1/4 do comprimento da linha indo da crista atrioventricular até oápice do ventrículo esquerdo.

Todos os experimentos foram realizados em uma maneiracega, com o investigador não estando ciente do genótipo de cada animal.Depois da conclusão dos procedimentos de instrumentação e cirúrgicos, oscamundongos foram deixados em um período de equilíbrio de 15 min. Oscamundongos depois passaram por 30 min de oclusão da artéria coronáriacom 120 min de tempo de reperfusão.

Modelo de oclusão e reperfusão da artéria coronária

A oclusão da artéria coronária foi obtida usando o sistema depeso pendurado como anteriormente descrito (Eckle et al., Am J PhysiolHeart Circ Physiol 29/: H2533-H2540, 2006). Ambas as extremidades daligadura de monofilamento foram passadas através de um pedaço comprido de2 mm de um tubo de politeno PE-10 e ligado a um comprimento de suture 5-0usando cola de cianoacrilato. A sutura foi depois direcionada a duas hastes demetal móveis horizontalmente montadas e massas de 1 g cada foram ligadas aambas as extremidades da sutura. pela elevação das hastes, as massas foramsuspendidas e a sutura colocada sob tensão controlada para ocluir a LAD comuma pressão definida e constante. A oclusão da LAD foi verificada pelapalidez da área em risco, mudando de cor da zona de perfusão de LAD devermelho vivo para violeta, indicando a cessação de fluxo sangüíneo. Areperfusão foi obtida baixando-se as hastes até que as massas repousassemsobre as almofadas de operação e a tensão da ligadura foi aliviada. Areperfusão foi verificada pelos mesmos três critérios usados para verificar aoclusão. Os camundongos foram excluídos de outra análise se todos os trêscritérios não foram atingidos no início da oclusão da artéria coronária oudentro de 15 min de reperfusão, respectivamente. Durante a oclusão da artériacoronária, a temperatura e umidade da superfície do coração foram mantidoscobrindo-se o coração com a aba de músculo pectoralis minor e selando-se atoracotomia com uma gaze úmida em solução salina a 0,9%.Medição do tamanho do infarte do miocárdio:

O tamanho do infarto (ESiF) e a área em risco (AAR) foramdeterminados pela planometria. Depois da injeção i.v. de 500 I.U. de heparinaa LAD foi re-ocluída e 300 μΐ de Azul de Evans a 5% (p/vol) (Sigma-Aldrich,Poole, UK) foram lentamente injetados na veia jugular para delinear a áreaem risco (AAR). Isto faz com que o corante entre na região não isquêmica doventrículo esquerdo e deixa a AAR isquêmica não tingida. Depois que oscamundongos foram eutanizados pelo deslocamento cervical, o coração foirapidamente removido. O coração foi esfriado em gelo e montado em umbloco de agarose a 5% e depois cortado em 8 fatias transversais de 800 μηι deespessura. Todas as fatias foram incubadas a 37°C por 20 min com 3% decloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (Sigma Aldrich, Poole, UK) dissolvidos emtampão de Na2HPO4ZNaH2PO4 0,1 M ajustado ao pH 7,4. As fatias foramfixadas durante a noite em formaldeído a 10%. As fatias foram colocadasentre duas lamínulas e os lados de cada fatia foram digitalmente formadas emimagem usando um escaner óptico de alta resolução. As imagens digitaisforam depois analisadas usando o software SigmaScan (SPSS, US). Otamanho da área infartada (clara), a área do ventrículo esquerdo (LV) emrisvo (vermelha) e a zona LV normalmente perfundida (azul) foram esboçadasem cada seção pela identificação de sua aparência de cor e bordas coloridas.As áreas foram quantificadas em ambos os lados de cada fatia e calculada emmédia por um investigador. O tamanho do infarto foi calculado como uma%da zona de risco para cada animal.

RESULTADOS: O tamanho da área infartada (clara), a área deLV em risco (vermelha) e a zona LV normalmente perfundida (azul) foramesboçadas em cada seção pela identificação de sua aparência de cor e bordascoloridas. As áreas foram quantificadas em ambos os lados de cada fatia ecalculadas em média por um investigador. O tamanho do infarto foi calculadocomo uma% da zona de risco para cada animal. A FIGURA 16A mostra aavaliação de sete camundongos WT (+/+) e sete camundongos MASP-2 (-/-)para a determinação de seu tamanho de infarto depois que passam pela técnicade oclusão e reperfusão da artéria coronária descrita acima. Como mostradona FIGURA 16A, camundongos MASP-2 (-/-) demonstraram uma reduçãoestatisticamente signifícante (p < 0,05) no tamanho do infarto versus oscamundongos (+/+) do tipo selvagem, indicando um efeito miocárdicoprotetor de lesão no modelo de lesão de isquemia-reperfusão. A FIGURA 16Bmostra a distribuição dos animais individuais testados, indicando um efeitoprotetor claro para os camundongos MASP-2 (-/-).

EXEMPLO 28

Este exemplo descreve os resultados de MASP-2-/- em umModelo de Degeração Macular de Murino.

Fundamentos/Análise racional: A degeneração macularrelacionada com a idade (AMD) é a causa que leva à cegueira depois da idadede 55 no mundo industrializado. A AMD ocorre em duas formas principais:AMD neovascular (úmida) e AMD atrófica (seca). A forma neovascular(úmida) responde por 90% da perda visual severa associada com a AMD,embora apenas -20% dos indivíduos com AMD desenvolvem a forma úmida.

As marcas clínicas da AMD incluem corpos colóides múltiplos, atrofiageográfica e neovascularização coroidal (CNV). Em dezembro de 2004, oFDA aprovou Macugen (pegaptanib), uma nova classe de medicamentosoftálmicos para especificamente alvejar e bloquear os efeitos do fator decrescimento endotelial vascular (VEGF), para o tratamento da forma úmida(neovascular) de AMD (Ng et ai, Nat Rev. Drug Discov 5: 123-32 (2006)).

Embora Macugen represente uma nova opção terapêutica promisssora paraum subgrupo de pacientes com AMD, permanece uma necessidade prementepara desenvolver tratamentos adicionais para esta doença complexa. Linhasmúltiplas, independentes de investigação implica um papel central para aativação de complemento na patogênese da AMD. A patogênese daneovascularização coroidal (CNV), a forma mais séria da AMD, podeenvolver a ativação de caminhos de complemento.

A mais de vinte e cinco anos atrás, Ryan descreveu um modelode lesão induzido por laser de CNV em animais (Ryan, S. J., Tr. Am. Opth.

Soe. LXXVII: 707-745, 1979). O modelo foi inicialmente desenvolvidousando macacos rhesus, entretanto, a mesma tecnologia tem sido desde entãousada para desenvolver modelos similares de CNV em uma variedade deanimais de pesquisa, incluindo o camundongo (Tobe et al., Am. J. Pathol.153: 1641-46, 1998). Neste modelo, a fotocoagulação a laser é usada paraquebrar a membrana de Bruch, uma ação que resulta na formação demembranas equivalente a CNV. O modelo induzido por sal captura muito dostraços importantes da condição humana (para uma revisão recente, verAmbati et al., Survey Ophthalmology 48: 257-293, 2003). O modelo decamundongo induzido por laser é agora bem estabelecido e é usado como umabase experimental em um número grande e sempre crescente de projetos depesquisa. É no geral aceito que o modelo induzido por laser compartilhasimilaridade biológica suficiente com CNV em seres humanos que préestudos clínicos da patogênese e inibição de medicamento usando este modelosão relevantes à CNV em seres humanos.

Métodos:

Um camundongo MASP-2-/- foi gerado como descrito noExemplo 1 e retrocruzado por 10 gerações com C57B1/6. O estudo correntecomparou os resultados quando camundongos machos MASP-2 (-/-) eMASP-2 (+/+) foram avaliadas no curso da CNV induzida por laser, ummodelo acelerado da AMD neovascular focalizou no volume da CNVinduzido por laser pela microscopia confocal de laser de varredura como umamedida de lesão de tecido e determinação de níveis de VEGF, um fatorangiogênico potente implicado na CNV, no epitélio pigmentar retinal(RPE)/coróides pelo ELISA depois da lesão a laser.Indução da neovascularização coroidal (CNV): A

fotocoagulação a laser (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75Am; Oculeve GL,Iridex, Mountain View, CA) foi realizada em ambos os olhos de cada animalnos dias zero por um único indivíduo mascarado ao grupo de medicamentodesignado. As manchas de laser foram aplicadas em uma maneirapadronizada em torno do nervo óptico, usando um sistema de liberação delâmpada de fenda e uma lâminula como uma lente de contato. O ponto finalmorfológico da lesão a laser foi o aparecimento de uma bolha de cavitação,um sinal considerado estar correlacionado com o rompimento da membranade Bruch. Os métodos detalhados e pontos finais que foram avaliados sãocomo segue.

Angiografia de Fluoresceína: A angiografia de fluoresceínafoi realizada com uma câmera e sistema de formação de imagem (câmeraTRC 50 IA; sistema ImageNet 2.01; Topcon, Paramus, NJ) na semana 1depois da fotocoagulação a laser. As fotografias foram capturadas com umalente 20-D em contato com a lente de câmera de fundo depois da injeçãointraperitoneal de 0,1 ml de fluoresceína sódica a 2,5%. Um perito em retinanão envolvido na fotocoagulação a laser ou angiografias avaliou osangiogramas de fluoresceína em uma única sessão na maneira mascarada.

Volume de neovascularização coroidal (CNV): Uma semanadepois da lesão a laser, os olhos foram enucleados e fixados com 4% deparaformaldeído por 30 min a 4°C. Os copos oculares foram obtidos pelaremoção dos segmentos anteriores e foram lavados três vezes em PB S,seguido pela desidratação e reidratação através de uma série de metanol.Depois de bloquear duas vezes com tampão (PBS contendo 1% de albuminasérica bovina e 0,5% de Triton X-100) por 30 minutos na temperaturaambiente, os copos oculares foram incubados durante a noite a 4°C com 0,5%de FITC-isolectina B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA), diluído comPBS contendo 0,2% de BSA e 0,1% de Triton X-100, que liga os resíduos deβ-D-galactose terminal nas superfícies de células endoteliais e seletivamenterotula a vasculatura de murino. Depois de duas lavagens com PBS contendo0,1% de Triton X-100, a retina neurossensora foi suavemente descolada ecortada do nervo óptico. Quatro incisões radiais relaxantes foram feitas e oresto do complexo RPE —coróide-esclerótica remanescente foi montada planaem médio anti-murchação (Immu-Mount Vectashield Mounting Médium;Vector Laboratories) e coberto com lamínula.

As montagens planas foram examinadas com um microscópioconfocal de varredura a laser (TCS SP; Leica, Heidelberg, Alemanha). Osvasos foram visualizados excitando-se com o comprimento de onda doargônio azul (488 nm) e emissão de captura entre 515 e 545 nm. Uma objetivade imersão em óleo de 40X foi usada para todos os estudos de formação deimagem. As seções ópticas horizontais (passo de 1 μηι) foram obtidas dasuperfície do complexo de RPE-coróide-esclerótica. O plano focai maisprofundo em que a rede vascular coroidal circundante que conecta à lesãopôde ser identificada foi julgada ser o piso da lesão. Qualquer vaso na áreaalvejada por laser e superficial a este plano de referência foi julgada comoCNV. As imagens de cada seção foram digitalmente armazenadas. A área defluorescência relacionada com CNV foi medida pela análise de imagemcomputarizada com o software do microscópio (TCS SP; Leica). A soma daárea fluorescente toda em cada seção horizontal foi usada como um índicepara o volume de CNV. A formação de imagem foi realizada por um operadormascarado à designação de grupo de tratamento.

Porque a probabilidade de cada lesão por laser desenvolverCNV é influenciada pelo grupo ao qual o mesmo pertence (camundongo, olhoe mancha de laser), os volumes de lesão médios foram comparados usandoum modelo misturado linear com um planejamento repetido-medido deplotagem de fenda. O fator de plotagem inteiro foi o grupo genético ao qual oanimal pertence, ao passo que o fator de plotagem de fenda foi o olho. Asignificância estatística foi determinada ao nível de 0,05. Comparações posthoc de médias foram construídas com um ajuste de Bonferroni paracomparações múltiplas.

VEGF ELISA. Em três dias depois da lesão pelas 12 manchasa laser, o complexo RPE-coróide foi sonificado em tampão de Iise (20 mM deimidazol HCl, 10 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM de EGTA, 1% deTriton X-100, 10 mM de NaF, 1 mM de molibdato de Na e 1 mM de EDTAcom inibidor de protease) em gelo por 15 min. Os níveis de proteína VEGFno sobrenadante foram determinados por um kit de ELISA (R&D Systems,Minneapolis, MN) que reconhece todas as variantes de junção, de 450 a 570nm (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e normalizados para aproteína total. Medições em duplicata foram realizadas em uma maneiramascarada por um operador não envolvido na fotocoagulação, formação deimagem ou angiografia. Os números de VEGF foram representados como amédia +/- SEM de pelo menos três experimentos independentes e comparadosusando o teste U de Mann-Whitney. A hipótese nula foi rejeitada em P < 0,05.

RESULTADOS:

Avaliação dos Níveis de VEGF:

A FIGURA 17A graficamente ilustra os níveis de proteínaVEGF no complexo RPE-coróide isolado de camundongos C57B16 do tiposelvagem e MASP-2(-/-) no dia zero. Como mostrado na FIGURA 17A, aavaliação dos níveis de VEGF indicam uma diminuição nos níveis dereferência para VEGF nos camundongos MASP-2 (-/-) versus oscamundongos de controle C57bl do tipo selvagem. A FIGURA 17Bgraficamente ilustra os níveis de proteína VEGF medidos nos três diasseguintes à lesão induzida por laser. Como mostrado na FIGURA 17B osníveis de VEGF foram significantemente aumentados nos camundongos (+/+)do tipo selvagem três dias a seguir da lesão induzida por laser, compatívelcom os estudos publicados (Nozaki et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:2328-33 (2006)). Entretanto, níveis surpreendentemente muito baixos deVEGF foram observados nos camundongos MASP-2 (-/-).Avaliação da neovascularização coroidal (CNV):

Além da redução nos níveis de VEGF a seguir da degeraçãomacular induzida por laser, a área de CNV foi determinada antes e depois dalesão por laser. A FIGURA 18 graficamente ilustra o volume de CNV medidoem camundongos C57bl do tipo selvagem e camundongos MASP-2(-/-) nodia sete a seguir da lesão induzida por laser. Como mostrado na FIGURA 18,os camundongos MASP-2 (-/-) demonstraram uma redução de cerca de 30%na área da CNV a seguir do lesão induzido por laser no dia sete emcomparação aos camundongos de controle do tipo selvagem.

Estas descobertas indicam uma redução no VEGF e CNVcomo observado nos camundongos MASP (-/-) versus o controle (+/+) do tiposelvagem e que o bloqueio de MASP-2 com um inibidor teria um efeitopreventivo ou terapêutico no tratamento da degeração macular.

EXEMPLO 29

Este exemplo descreve os resultados de MASP-2(-/-) em umModelo de Artrite Reumatóide Induzida por Anticorpo Monoclonal de Murino

Fundamentos/Análise racional: O modelo de animal mais

habitualmente usado para a artrite reumatóide (RA) é a artrite induzida porcolágeno (CIA) (para revisões recentes, ver Linton e Morgan, Mol. Immunol.36: 905-14, 1999). O colágeno tipo II (CII) é um dos constituintes principaisdas proteínas de matriz articular e a imunização com CII nativo em adjuvanteinduz a poliartrite autoimune por uma resposta autoimune reativa cruzada aoCII na cartilagem de junta. Como na RA, a suscetibilidade para CIA estáligada à expressão de certa classe de alelos II MHC. Algumas cepas decamundongos, incluindo a cepa C57B1/6, são resistentes à CIA clássicaporque eles carecem de um haplotipo de MHC apropriado e portanto nãogeram títulos altos de anticorpo anti-CII. Entretanto, foi descoberto que aartrite compatível pode ser induzida em todas as cepas de camundongos pelaadministração i.v. ou i.p. em camundongos de um coquetel de quatroanticorpos monoclonais específicos contra o colágeno tipo II. Estes anticorposmonoclonais artridogênicos são comercialmente disponíveis (Chondrex, Inc.,Redmond, WA). Este modelo de transferência passiva de CIA foi usado comêxito em vários relatos publicados recentes usando a cepa de camundongoC57B1/6 (Kagari et ai, J. Immunol. 169: 1459-66, 2002; Kato et ai, J.Rheumatol. 30: 247-55, 2003; Banda et al, J. Immunol. 177: 1904-12, 2006).

O estudo seguinte comparou a sensibilidade dos camundongos (+/+) do tiposelvagem (WT) e MASP-2 (-/-), ambos compartilhando os fundamentosgenéticos de C57B1/6, para o desenvolvimento de artrite usando o modelo detransferência passiva de CIA.

Métodos:

Animais: Um camundongo MASP-2(-/-) foi gerado comodescrito no Exemplo 1 e retrocruzado por 10 gerações com C57B1/6.Quatorze camundongos C57BL/6 do tipo selvagem machos e fêmeas quetinham de sete a oito semanas de idade no momento da injeção de anticorpo edez camundongos C57B1/6 MASP-2(-/-) e (+/+) do tipo selvagem machos efêmeas que tiveram de sete a oito semanas de idade no momento da injeção deanticorpo foram usados neste estudo. Vinte camundongos foram injetadoscom um coquetel de anticorpo monoclonal para se obter 20 respondedoressólidos (dois grupos de dez). Os animais (dez/grupo) foram alojados comcinco animais/gaiola e foram aclimatizados por cinco a sete dias antes de iniciar o estudo.

Os camundongos foram injetados intravenosamente com umcoquetel de anticorpo monoclonal (Chondrex, Redmond WA) (5 mg) no dia 0e dia 1. O agente de teste foi um anticorpo monoclonal + LPS da Chondrex.No dia 2, os camundongos foram dosado ip com LPS. Os camundongos forampesados nos dias 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e ante do término no dia 14. No dia 14 oscamundongos foram anestesiados com isoflurano e sangrados terminalmentepara soro. Depois da coleta do sangue, os camundongos foram eutanizados,com a remoção dos membros tanto traseiros quanto dianteiros com os joelhos,que foram colocados em formalina para processamento futuro.

Grupos de Tratamento:

Grupo 1 (controle): 4 camundongos da cepa C57/BL/6 WT(+/+);

Grupo 2 (teste): 10 camundongos da cepa C57/BL/6 WT (+/+)(receberam coquetel mAb mais LPS); e

Grupo 3 (teste): 10 camundongos da cepa C57/BL/MASP-2K0/6AÍ (-/-) (receberam coquetel mAb mais LPS)

As contagens artríticas clínica foram avaliadas diariamenteusando o seguinte sistema de contagem: 0 = normal; 1 = 1 junta de patadianteira ou traseira afetada; 2 = 2 juntas de pata dianteira ou traseiraafetadas; 3=3 juntas de pata dianteira ou traseira afetadas; 4 = moderado(eritema e inchaço moderado ou 4 juntas de dedo afetadas); 5 = severo (patainteira com eritema difuso e inchaço severo, incapaz de flexionar os dedos)

Resultados:

A FIGURA 19 mostra os dados de grupo plotados para acontagem de artrite clínica diária média por até duas semanas. Nenhumacontagem de artrite clínica foi observada no grupo de controle que nãorecebeu o tratamento CoL2 MoAb. Os camundongos MASP (-/-) tiveram umacontagem de artrite clínica mais baixa a partir do dia 9 ao dia 14. A contagemde artrite clínica global com a análise da área sob a curva (AUC) indicaramuma redução de 21% no grupo MASP-2 (-/-) versus os camundongos WT(+/+). Entretanto, os fundamentos de camundongo C57B16 como debatidoanteriormente não fornece uma contagem de artrite clínica global robusta.

Devido à taxa de incidência e tamanho de grupo pequenas, embora tendampositivamente, os dados fornecidos apenas tenderam (p = 0,1) e não foramestatisticamente significantes ao nível ρ < 0,05. Animais adicionais nosgrupos de tratamento seriam necessários para mostrar a significânciaestatística. Devido à incidência reduzida de artrite, as contagens de pataafetada foram avaliadas quanto a severidade. Nenhuma incidência única deuma contagem de artrite clínica de mais do que 3 foi observada em qualquerum dos camundongos MASP-2 (-/-), que foi observada em 30% doscamundongos WT (+/+),sugerindo ainda que (1) a severidade da artrite podeestar relacionada com a ativação do caminho de complemento e (2) que obloqueio de MASP-2 pode ter um efeito benéfico na artrite.

EXEMPLO 30

Este exemplo demonstra que a Proteína Associada com aManose que liga Lectina Pequena (Mapl9 ou sMAP) é um inibidor daativação de complemento dependente de MASP-2.

Fundamentos/Análise racional:

Abstrato:

A lectina que liga manose (MBL) e as ficolinas são proteínasde reconhecimento padronizadas que atuam na imunidade inata e deflagram aativação do caminho de complemento da lectina através de proteasesassociadas com a MBL-serina (MASPs). Na ativação do caminho da lectina,MASP-2 cliva C4 e C2. A proteína pequena associada a MBL (sMAP), umaforma truncada de MASP-2, também está associada com complexos deMBL/ficolina-MASP. Para clarificar o papel de sMAP, mós geramoscamundongos deficientes em sMAP (sMAP-/-) pelo rompimento alvejado doexon específico de sMAP. Por causa do rompimento de gene, o nível deexpressão de MASP-2 também foi diminuído em camundongos sMAP-/-.Quando sMAP recombinante (rsMAP) e MASP-2 recombinante (rMASP-2)reconstituíram o complexo MBL-MASP-sMAP em soro deficiente, a ligaçãodestes recombinantes a MBL foi competitiva e a atividade de clivagem de C4do complexo de MBL-MASP-sMAP foi restaurada pela adição de rMASP-2,ao passo que a adição de rsMAP atenuou a atividade. Portanto, MASP-2 éessencial para a ativação de C4 e sMAP desempenha um papel regulador naativação do caminho da lectina.

Introdução:

O sistema de complemento medeia uma reação de cadeia deproteólise e montagem de complexos de proteína, desempenha um papelprincipal na biodefesa como uma parte dos sistemas imunes tanto inatoquanto adaptivo. O sistema de complemento de mamífero consiste de trêscaminhos de ativação, o caminho clássico, o caminho alternativo e o caminhoda lectina (Fujita, Nat. Rev. Immunol. 2: 346-353 (2002); Walport, N Engl JMed 344: 1058-1066 (2001)). O caminho da lectina fornece a linhagemprimária de defesa contra patógenos invasores. Os componentes dereconhecimento de patógeno deste caminho, a lectina que liga manose (MBL)e as ficolinas, ligam-se às séries de carboidratos nas superfícies de bactérias,vírus e parasitas e ativam as proteases séricas associadas com MBL (MASPs)para deflagrar uma cascata de reação a jusante. A importância do caminho dalectina para a defesa imune inata é sublinhada por vários estudos clínicosligando uma deficiência de MBL com susceptibilidade aumentada a umavariedade de doenças infecciosas, particularmente na infância precoce antesque o sistema imune adaptativo seja estabelecido (Jack et al, Immunol Rev180: 86-99 (2001); Neth et al. Infect Immun 68: 688-693 (2000);Summerfield et al., Lancet 345: 886-889 (1995); Super et al., Lancet 2: 1236-1239 (1989)). Entretanto, o caminho da lectina também contribui para aativação indesejada de complemento, que está envolvido na inflamação elesão tecidual em várias condições patológicas, incluindo a lesão porisquemia/perfusão no coração e rins (de Vries et al., Am J Pathol 165: 1677-1688 (2004); Fiane et al., Circulation 108: 849-856 (2003); Jordan et al,Circulation 104: 1413-1418 (2001); Walsh et al., J Immunol 175: 541-546(2005)).

Como mencionado acima, o caminho da lectina envolve oreconhecimento de carboidrato pelo MBL e ficolinas (Fujita et al, ImmunolRev 198: 185-202 (2004); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21: 547-578(2003); Matsushita e Fujita, Immunobiology 205: 490-497 (2002) e estaslectinas formam complexos com MASP-I (Matsushita e Fujita, J Exp Med176: 1497-1502 (1992); Sato et al, Int Immunol 6: 665-669 (1994); Takada etal, Biochem Biophys Res Commun 196: 1003-1009 (1993), MASP-2 (Thielet al, Nature 386: 506-510 (1997), MASP-3 (Dahl et al, Immunity 15: 127-135 (2001) e uma proteína truncada de MASP-2 (proteína pequena associadaa MBL; sMAP ou MApl9) (Stover et al, J Immunol 162: 3481-3490 (1999);Takahashi et al, Int Immunol 11: 8590863 (1999). Os membros da família deMASP consistem de seis domínios; dois domínios de C1r/C1s/Uegf/proteínamorfogenética óssea (CUB), um domínio equivalente a fator de crescimentoepidérmico (EGF), duas proteínas de controle de complemento (CCP) oudomínios de repetições de consenso curtas (SCR) e um domínio de serinaprotease (Matsushita et al, Curr Opin Immunol 10: 29-35 (1998). MASP-2 esMAP são gerados pela junção alternativa a partir de um único gene estruturale sMAP consiste do primeiro domínio CUB (CUB 1), o domínio equivalentea EGF e um extra de 4 aminoácidos na extremidade de terminal C codificadopor um exon específico de sMAP. MASP-I e MASP-3 também são gerados apartir de um único gene pela junção alternativa (Schwaeble et al,Immunobiology 205: 455-466 (2002). Quando MBL e ficolinas ligam aoscarboidratos na superfície de micróbios, a forma de pró-enzima de MASP éclivada entre o segundo CCP e o domínio da protease, resultando na formaativa que consiste de dois polipeptídeos, chamados de cadeias pesada (H) eleve (L) e assim adquirindo atividades proteolíticas contra componentes decomplemento. Evidência acumulada mostra que MASP-2 cliva C4 e C2(Matsushita et al, J. Immunol 165: 2637-2642 (2000) que leva à formação daC3 convertase (C4bC2a). Nós propusemos que MASP-I cliva C3 diretamentee de modo subseqüente ativa a alça de amplificação (Matsushita e Fujita,Immunobiology 194: 443-448 (1995), mas esta função é controversa (Ambruset al, J. Immunol 170: 1374-1382 (2003). Embora MASP-3 também contenhaum domínio de serina protease na cadeia L e exiba a sua atividade proteolíticacontra um substrato sintético (Zundel et al, J Immunol 172: 4342-4350(2004), os seus substratos fisiológicos não foram identificados. A função desMAP que carece do domínio de serina protease permanece desconhecida.

No presente estudo, para esclarecer o papel de sMAP naativação do caminho de complemento da lectina, nós rompemos o exonespecífico de sMAP que codifica 4 resíduos de aminoácido (EQSL) naextremidade de terminal C de sMAP e gerou camundongos sMAP-/-. Nósrelatamos aqui pela primeira vez a capacidade de sMAP para infra-regular aativação do caminho da lectina.

Materiais e Métodos

Camundongos

Um vetor de alvejamento foi construído contendo exons 1 a 4e parte de exon 6 do gene MASP-2 do camundongo 129/Sv e um cassete dogene de resistência à neomicina ao invés do exon 5 (Figura 20A). Um geneDT-A foi inserido na extremidade 3' do vetor e três sítios Iox ρ foraminseridos para realizar o alvejamento condicional para remover o cassete deneomicina e região promotora no futuro. O vetor de alvejamento foisubmetido à eletroporação em células ES de 129/Sv. Os clones Es alvejadosforam microinjetados em blastocistos C57BL/6J que foram implantados nosúteros de mães ICR adotivas. Camundongos machos quiméricos foramacasalados com camundongos C57BL/6J fêmeas para produzir camundongos(+/-) heterozigotos. Os camundongos (+/-) heterozigotos foram triados pelaanálise Southern blot de DNA da cauda digerido com BamHI usando a sondaindicada na FIGURA 20A. A análise Southern blot mostrou faixas de 6,5 kbpe 11 kbp em DNA de camundongos (+/-)heterozigotos (Figura 20B).Camundongos (+/-) heterozigotos foram retrocruzados com camundongosC57BL/6J. Para se obter camundongos (-/-) homozigotos, camundongos (+/-)heterozigotos foram intercruzados. Camundongos (-/-) homozigotos(fundamentos C57BL/6J) foram identificados pela genotipagem com base emPCR de DNA da cauda. A análise de PCR foi realizada usando uma misturade iniciadores de sentido específicos do exon 4 e específicos do gene neo eum iniciador de anti-sentido específico do exon 6. O DNA de camundongos (-/-) homozigotos produziu uma única faixa de 1,8 kbp (Figura 20C). Em todosos experimentos, camundongos de 8 a 12 semana de idade foram usados deacordo com as diretrizes para a experimentação com animal da FukushimaMedicai University.Análise Northern blot

Poli(A) + RNA (1 μg) de fígados de camundongo (+/+) do tiposelvagem e homozigotos (-/-)foi separado pela eletroforese, transferido parauma membrana de náilon e hibridizado com uma sonda de cDNA rotuladacom 32P específico para sMAP, cadeia H de MASP-2, cadeia L de MASP-2ou o gene neo. A mesma membrana foi desprovida e reibridizada com umasonda específica para a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH).RT-PCR Quantitativa

A PCR em tempo real foi realizada com o LeveCycler System(Roche Diagnostics). Os cDNAs sintetizados de 60 ng de poli(A)+ RNA defígados de camundongos (+/+) do tipo selvagem e homozigotos (-/-)foramusados como padrão para a PCR em tempo real e fragmentos de cDNA decadeias H e L de MASP-2 e sMAP foram amplificados e monitorados.Imunomanchamento

A amostra foi submetida à eletroforese em 10 ou 12% de géisde SDS-poliacrilamida sob condições redutoras e as proteínas foramtransferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Asproteínas nas membranas foram detectadas com anti-soro anti-MASP-1incitado contra a cadeia L de MASP-I ou com anti-soro anti-MASP-2/sMAPincitado contra o peptídeo da cadeia H de MASP-2.

Detecção de MASPs e sMAP no complexo MBL-MASPsAdAP

Soro de camundongo (20 μΐ) foi adicionado a 480 μΐ detampão TBS-Ca2+ (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M de NaCl e 5 mM deCaCl2) contendo 0,1% (p/v) de BSA (TBS-Ca2+/BSA) e incubados com 40 μΐde pasta a 50% de manana-gel de agarose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emtampão TBS-Ca /BSA a 4°C por 30 min. Depois da incubação cada gel foi lavado com tampão TBS-Ca2+ e o tampão de amostragem para SDS-PAGEfoi adicionado ao gel. O gel foi fervido e o sobrenadante foi submetido aSDS-PAGE, seguido pelo imunomanchamento para detectar MASP-1,MASP-2 e sMAP no complexo de MBL.

Ensaio de deposição de C4

O soro de camundongo foi diluído com tampão TBS-

Ca2+/BSA até 100 μΐ. A amostra diluída foi adicionada aos reservatórios demicrotítulo revestido com manana e incubada na temperatura ambiente por 30min. Os reservatórios foram lavados com o tampão de lavagem gelado(tampão TBS-Ca2+ contendo 0,05% (v/v) de Tween 20). Depois da lavagem,C4 humano foi adicionado a cada reservatório e incubados em gelo por 30min. Os reservatórios foram lavados com o tampão de lavagem gelado e oanticorpo policlonal humano anti-C4 conjugado a HRP (Biogenesis, Poole,Inglaterra) foi adicionado a cada reservatório. A seguir da incubação a 37°Cpor 30 min, os reservatórios foram lavados com o tampão de lavagem esolução de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada a cadareservatório. Depois do desenvolvimento, H3PO4 1 M foi adicionado e aabsorbância foi medida a 450 nm.

Ensaio de deposição C3

O soro de camundongo foi diluído com tampão BBS (4 mM debarbital, 145 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2 e 1 mM de MgCl2, pH 7,4)contendo 0,1% (p/v) de HSA até 100 μΐ. A amostra diluída foi adicionada aosreservatórios microtituladores revestidos com manana e incubada a 37°C por1 hora. Os reservatórios foram lavados com o tampão de lavagem. Depois dalavagem, anticorpo policlonal C3c anti-humano conjugado a HRP (Dako,Glostrup, Dinamarca) foi adicionado a cada reservatório. A seguir daincubação na temperatura ambiente por 1 h, os reservatórios foram lavadoscom o tampão de lavagem e solução de TMB foi adicionada a cadareservatório. A cor foi medida como descrito acima.

Recombinantes

O camundongo sMAP recombinante (rsMAP), rMASP-2 e ocamundongo MASP-2 mutante inativo (MASP-2Í) cujo resíduo de serina desítio ativo no domínio da serina protease foi substituído no lugar do resíduode alanina foram preparados como descrito anteriormente (Iwaki e Fujita, 2005).

Reconstituição do complexo MBL-MASP-sMAP

O soro de camundongo homozigoto (-/-) (20 μΐ) e váriasquantidades de MASP-2Í e/ou rsMAP foram incubados em um volume totalde 40 μl em tampão de TBS-Ca2+ em gelo durante a noite. A mistura foiincubada com pasta fluida de manana-gel de agarose e MASP-2Í e rsMAP nocomplexo de MBL-MASP ligado ao gel foram detectados como descrito em"Detecção de MASPs e sMAP no complexo de MBL-MASP-sMAP".Reconstituição da atividade de deposição de C4

O soro de camundongos homozigotos (-/-) (0,5 μl) e váriasquantidades de rMASP-2 e/ou rsMAP foram incubadas em um volume totalde 20 μl em TBS-Ca2+ em gelo durante a noite. A mistura foi diluída com 80μl de tampão de TBS-Ca2+/BSA e adicionada aos reservatórios revestidoscom manana. Todos os procedimentos subseqüentes foram realizados comodescrito em "ensaio de deposição de C4".Resultados

FIGURA 20: O rompimento alvejado do gene sMAP. (A)Mapas de restrição parcial do gene MASP-2/sMAP, o vetor de alvejamento eo alelo alvejado. O exon específico de sMAP (exon 5) foi substituído com um cassete de gene neo. (B) A análise Southern blot de DNA genômico daprogênie derivada do acasalamento de camundongos machos quiméricos comcamundongos fêmeas C57BL/6J. O DNA da cauda foi digerido com BamHI ehibridizado com a sonda descrita em (A). Uma faixa de 11 kbp foi derivadado alelo do tipo selvagem e uma faixa de 6,5 kbp do alelo alvejado. (C)Análise de genotipagem por PCR. O DNA da cauda foi analisado usando umamistura de iniciadores de sentido específicos do exon 4 e específicos do geneneo e um iniciador de anti-sentido específico do exon 6. Uma faixa de 2,5 kbpfoi obtida a partir do alelo do tipo selvagem, uma faixa de 1,8 kb do aleloalvejado.

FIGURA 21: A expressão de mRNAs de sMAP e MASP-2 emcamundongos homozigotos (-/-). (A) Análise Northern blot. Poli(A)+ RNAsde fígados de camundongos (+/+) do tipo selvagem e homozigotos (-/-) foisubmetido à eletroforese, transferido para uma membrana de náilon ehibridizado com uma sonda rotulada com 32P específica para sMAP, cadeiaH de MASP-2, cadeia L de MASP-2 ou o gene neo. Uma faixa específica paraneo (2,2 kb) foi observada em camundongos homozigotos (-/-). (B) RT-PCRQuantitativa. As cadeias H e L de MASP-2 e os fragmentos de cDNA desMAP foram amplificados pela PCR em tempo real em um instrumentoLeveCycler (Roche Diagnostics). Os cDNAs sintetizados de poli(A)+ RNAsde fígados de camundongos (+/+) do tipo selvagem e homozigotos (-/-) foramusados como padrão. Os dados mostrados são as médias de doisexperimentos.

FIGURA 22: Deficiências de MASP-2 no soro decamundongos homozigotos (-/-). (A) Imunomanchamento de MASP-2 esMAP em soro de camundongo. O soro de camundongos (+/+) do tiposelvagem ou homozigotos (-/-) (2 μl) foi submetido ao imunomanchamento edetectados com anti-soro anti-MASP-2/sMAP. (B) Detecção de MASPs esMAP no complexo MBL-MASP-sMAP. O soro de camundongo foiincubado com manana-gel de agarose e sMAP, MASP-I e MASP-2 nocomplexo de MBL ligado ao gel foram detectados como descrito emMateriais e Métodos.

FIGURA 23: Clivagem diminuída de C4 e C3 no soro decamundongos homozigotos (-/-). (A) Deposição de C4 em reservatóriosrevestidos com manana. O soro de camundongo foi diluído 2 vezes eincubado em reservatórios revestidos com manana na temperatura ambientepor 30 min. Depois da lavagem dos reservatórios, C4 humano foi adicionadoa cada reservatório e incubados em gelo por 30 min. A quantidade de C4humano depositada nos reservatórios foi medida usando anticorpo policlonalhumano anti-C4 conjugado a HRP. (B) Deposição de C3 em reservatóriosrevestidos com manana. Soro de camundongo diluído foi adicionado aosreservatórios revestidos com manana e incubados a 37°C por 1 h. A deposiçãode C3 endógeno nos reservatórios foi detectada com anticorpo policlonal deC3c anti-humano conjugado a HRP.

FIGURA 24: Ligação competitiva de sMAP e MASP-2 aMBL. (A) Reconstituição do complexo de MBL-MASP-sMAP no soro decamundongos homozigotos (-/-). MASP-2Í e/ou rsMAP (4 μg) foramincubados com o soro de camundongos homozigotos (-/-) (20 μl). A misturafoi ainda incubada com manana-gel de agarose e rsMAP e MASP-2Í na fraçãoligada ao gel foram detectados pelo imunomanchamento. (B) Váriasquantidades de MASP-2Í (0 a 5 μg) e uma quantidade constante de rsMAP (5μg) foram incubadas com o soro de camundongos homozigotos (-/-) (20 μl) eainda incubadas com manana-gel de agarose. (C) Uma quantidade constantede MASP-2Í (0,5 μg) e várias quantidades de rsMAP (0 a 20 μg) foramincubadas com o soro de camundongos homozigotos (-/-) (20 μl). (D) Váriasquantidades de rsMAP (0 a 20 μ§) foram incubadas com soro de camundongo(+/+) do tipo selvagem (20 μl).

FIGURA 25: Restauração da atividade de deposição de C4pela adição de rMASP-2. Várias quantidades de rsMAP (0 a 5 μg) (A) ourMASP-2 (0 a 1,5 μg) (B) foram incubadas com 0,5 μΐ do soro decamundongos homozigotos (-/-) em um volume total de 20 μΐ em tampãoTBS-Ca2+ em gelo durante a noite. Depois a mistura foi diluída com 80 μΐ detampão TBS-Ca2+/BSA e adicionada aos reservatórios revestidos commanana e a quantidade de C4 depositada nos reservatórios foi medida.

FIGURA 26: Redução da atividade de deposição de C4 pelaadição de sMAP. (A) rMASP-2 (1 μg) e várias quantidades de rsMAP (0 a 0,5μg) foram incubadas com 0,5 μΐ do soro de camundongos homozigotos (-/-).A mistura foi adicionada aos reservatórios revestidos com manana e aquantidade de C4 depositada nos reservatórios foi medida. (B) rsMAP (0 a 0,7μg) foi incubada com soro do tipo selvagem (0,5 μΐ) e a quantidade de C4depositada em reservatórios revestidos com manana foi medida.

RESULTADOS:

A expressão de sMAP e MASP-2 em camundongos homozigotos (-/-)

Para clarificar o papel de sMAP in vivo, nós estabelecemos umcamundongo alvejado em gene que carece de sMAP. Um vetor dealvejamento foi construído para substituir o exon específico para sMAP (exon5) com um cassete de gene de resistência à neomicina (Figura 20A). Osclones ES positivos foram injetados em blastocistos C57BL/6 e o cruzamentode quimeras do criador com fêmeas C57BL/6J. A análise Southern blot deDNA da cauda de filhotes de cor de cutia mostram uma transmissão germinaldo alelo alvejado (Figura 20B). Camundongos heterozigotos (+/-) foramtriados pela análise Southern blot de DNA da cauda digerido com BamHIusando a sonda indicada na FIGURA 20A. A análise Southern blot mostroufaixas de 6,5 kbp e 11 kbp no DNA de camundongos heterozigotos (+/-)(Figura 20B). Camundongos heterozigotos (+/-) foram retrocruzados comcamundongos C57BL/6J. Para se obter camundongos homozigotos (-/-),camundongos heterozigotos (+/-) foram intercruzados. Camundongoshomozigotos (-/-) (fundamentos C57BL/6J) foram identificados pela PCRcom base na genotipagem de DNA da cauda, produzindo uma única faixa de1,8 kbp (Figura 20C).

Camundongos homozigotos (-/-) desenvolveram-senormalmente e não mostraram nenhuma diferença significante no pesocorporal dos camundongos (+/+) do tipo selvagem. Não houve nenhumadiferença morfológica entre cada um deles. Em uma análise Northern blot, asonda específica para sMAP detectou uma única faixa de 0,9 kb emcamundongos (+/+) do tipo selvagem, ao passo que nenhuma faixa específicafoi detectada em camundongos homozigotos (-/-) (Figura 2IA). Quando asonda específica para a cadeia H ou L de MASP-2 foi usada, diversas faixasespecíficas foram detectadas em camundongos (+/+) do tipo selvagem comorelatado anteriormente (Stover et al, 1999) e a sonda específica da cadeia Htambém detectou a faixa específica de sMAP. Entretanto, em camundongoshomozigotos (-/-) as faixas correspondentes foram muito fracas e diversas faixas extras foram detectadas. Nós também realizamos uma análise de RT-PCR quantitativa para checar os níveis de expressão de mRNAs de sMAP eMASP-2. Em camundongos homozigotos (-/-), a expressão de mRNA desMAP foi completamente abolida e aquela de MASP-2 também foi diminuídaacentuadamente: esta foi quantificada como cerca de 2% daquela decamundongos (+/+) do tipo selvagem tanto na cadeia H quanto na L pela PCRem tempo real (Figura 21B). Além disso, nós examinamos a expressão deMASP-2 ao nível da proteína. Tanto sMAP quanto MASP-2 foramindetectáveis no soro de camundongos homozigotos (-/-) peloimunomanchamento (Figura 22A). Depois da incubação do soro decamundongos homozigotos (-/-) com manana-gel de agarose, tanto sMAPquanto MASP-2 não foram detectáveis na fração ligada aos géis, emboraMASP-I fosse detectada no complexo (Figura 22B).

Atividades de clivagem de C4 e C3 através do caminho da lectina no soro decamundongos homozigotos (-/-)

Quando o soro de camundongos homozigotos (-/-) foiincubado em reservatórios revestidos com manana, a quantidade de C4humano depositada nos reservatórios foi de cerca de 20% daquela em soronormal nas diluições variando de 1/400 a 1/50 (Figura 23A). Nós tambémexaminamos a atividade de deposição de C3 do caminho da lectina no soro decamundongos homozigotos (-/-). O soro de camundongo foi adicionado aosreservatórios revestidos com manana e a quantidade de C3 endógenodepositada nos reservatórios foi medida. A quantidade foi diminuída no sorodeficiente e foi de 21% daquele em soro normal a uma diluição de 1/10(Figura 23B).

Reconstituição do complexo de MBL-MASP-sMAP no soro de camundongoshomozigotos (-/-)

Quando camundongo sMAP recombinante (rsMAP) ou ocamundongo MASP-2 mutante inativo (MASP-2Í) foi adicionado ao soro decamundongos homozigotos (-/-), ambos os recombinantes foram capazes deligar ao MBL (Figura 24A, linhas 3 e 4). Quando rsMAP e MASP-2Í foramsimultaneamente incubados com o soro (Figura 24A, linha 5), ambos osrecombinantes foram detectados no complexo de MBL-MASP-sMAP.

Entretanto a quantidade de sMAP ligada ao complexo foi menor do quequando apenas rsMAP foi incubado com o soro. Depois nós investigamosmais a ligação competitiva de sMAP e MASP-2 ao MBL. Uma quantidadeconstante de rsMAP e várias quantidades de MASP-2Í foram adicionadas aosoro deficiente. A ligação de rsMAP diminuiu em uma maneira dependente dadose com quantidades crescentes de MASP-2Í (Figura 24B). Inversamente, aquantidade de MASP-2Í ligada ao MBL diminuiu pela adição de rsMAP(Figura 24C). Quando rsMAP foi adicionado ao soro do tipo selvagem, aligação tanto de sMAP endógeno quanto de MASP-2 ao MBL diminuíram emuma maneira dependente da dose (Figura 24D).

Reconstituição da atividade de deposição de C4 no soro de camundongoshomozigotos (-/-)

Nós realizamos um experimento de reconstituição dadeposição de C4 em reservatórios revestidos com manana usandorecombinantes. Quando rsMAP foi adicionado ao soro deficiente, aquantidade de C4 depositada realmente diminuiu aos níveis basais em umamaneira dependente da dose (Figura 25A). Quando rMASP-2 foi adicionadoao soro, a quantidade de C4 foi restaurada em até 46% daquela do soro dotipo selvagem em uma maneira dependente da dose e atingiu um platô (Figura25B). Em seguida, nós investigamos o efeito de sMAP sobre a deposição deC4. Quando uma quantidade constante de rMASP-2 e várias quantidades dersMAP foram adicionadas ao soro deficiente, a quantidade de C4 depositadadiminuiu com a adição de rsMAP em uma maneira dependente da dose(Figura 26A) e a adição de rsMAP ao soro do tipo selvagem tambémdiminuiu a quantidade de C4 depositada (Figura 26B), sugerindo que sMAPdesempenha um papel regulador na ativação do caminho da lectina.

Debate

Nós geramos camundongos sMAP-/- através do rompimentoalvejado do exon específico de sMAP. O nível de expressão de MASP-2também foi extremamente diminuído tanto ao nível de mRNA quanto deproteína nestes camundongos (Figuras 21 e 22). Uma análise Northern blotcom uma sonda MASP-2 mostrou apenas faixas extras no poli(A)+ RNA decamundongos sMAP-/-, sugerindo que a junção normal do gene MASP-2 foialterada pelo alvejamento do gene sMAP e portanto, o nível de expressão deMASP-2 foi acentuadamente diminuído. Como um resultado, a clivagem deC4 pelo complexo MBL-MASP no soro deficiente foi diminuído em cerca de80% comparado com aquele no soro normal (Figura 23A). Nos experimentosde reconstituição, a atividade de clivagem de C4 foi restaurada pela adição derMASP-2 mas não rsMAP (Figura 25). A redução na deposição de C4observada no soro deficiente deve ser causado pelas deficiências de MASP-2no complexo de MBL-MASP (Figura 22B). Portanto, está claro que MASP-2é essencial para a ativação de C4 pelo complexo de MBL-MASP. Entretanto,a adição de rMASP-2 não restaura completamente a atividade de clivagem e adeposição de C4 atingiu um platô. Como relataram anteriormente (Cseh et al,J Immunol 169: 5735-5743 (2002); Iwaki e Fujita, J Endotoxin Res 11: 47-50(2005), a maior parte do rMASP-2 foi convertida para a forma ativa pelaautoativação durante os procedimentos de purificação e alguns perderam a suaatividade de protease. Visto que os estados ativo ou inativo de MASP-2 nãotem nenhuma influência significante na sua associação com MBL (Zundel etal, J Immunol 172: 4342-4350 (2004), é possível que rMASP-2 que perdeu asua atividade de protease se ligue a MBL e competitivamente impeça aassociação da forma ativa, resultando deste modo em uma restauraçãoincompleta da deposição de C4. A atividade de clivagem C3 do caminho dalectina também foi atenuada no soro deficiente (Figura 23Β). O declínio naquantidade de C3 depositado é provavelmente devido ao nível muito baixo deatividade da C3 convertase, que consiste de fragmentos C4b e C2a geradospelo MASP-2.

MASP e sMAP cada um associado como homodímeros ecomplexos formados com MBL ou L-ficolina através de seus domíniosequivalentes a CUB e EGF de terminal N (Chen e Wallis, J Biol Chem 276:25894-25902 (2001); Cseh et al, J Immunol 169: 5735-5743 (2002); Thielenset al, J Immunol 166: 5068-5077 (2001); Zundel et al, J Immunol 172: 4342-4350 (2004)). As estruturas cristalinas de sMAP e do segmento CUBl-EGF-CUB2 de MASP-2 revelam a sua estrutura homodimérica (Feinberg et al,EMBO J 22: 2348-2359 (2003); Gregory et al, J Biol Chem 278: 32157-32164 (2003)). O domínio equivalente a colágeno de MBL está envolvido naassociação com MASPs (Wallis e Cheng, J Immunol 163: 4953-4959 (1999);Wallis e Drickamer, J Biol Chem 279: 14065-14073 (1999) e algumas mutações introduzidas no domínio diminuíram a ligação de MBL aossegmentos CUB1-EGF-CUB2 de MASP-I e MASP-2 (Wallis e Dodd, J BiolChem 275: 30962-30969 (2000)). Os sítios de ligação para MASP-2 e paraMASP-1/3 se sobrepõem mas não são idênticos (Wallis et al, J Biol Chem279: 14065-13073 (2004)). Embora o sítio de ligação sMAP de MBL nãotenha sido ainda identificado, os sítios de ligação para sMAP e MASP-2 sãoprovavelmente idênticos, porque a região CUBl-EGF é a mesma em sMAP eMASP-2. Assim, é razoável que sMAP e MASP-2 compitam entre si paraligar MBL na reconstituição do complexo de MBL-MASP-sMAP (Figura 24).A afinidade de sMAP quanto a MBL é mais baixa do que de MASP-2 (Csehet al, J Immunol 169: 5735-5743 (2002); Thielens et al, J Immunol 166:5068-5077 (2001)). A concentração de sMAP em soro de camundongo nãofoi determinada. Como mostrado na FIGURA 22A, entretanto, a quantidadede sMAP no soro do tipo selvagem é muito maior do que aquele de MASP-2.Portanto sMAP é capaz de ocupar o sítio de ligação de MASP-2/sMAP e impedir MASP-2 de ligação ao MBL e conseqüentemente a atividade declivagem de C4 do complexo MBL-MASP é reduzida. O mecanismoregulatório de sMAP no caminho da lectina permanece para ser investigado. Eainda desconhecido se sMAP desempenha o seu papel regulador antes oudepois da ativação de complemento. sMAP pode impedir a ativaçãoinadvertida do complexo de MBL-MASP antes da infecção microbiana ousuprimir a ativação excessiva do caminho da lectina uma vez ativado. Existeum outro regulador potencial no caminho da lectina. MASP-3 também é umcompetidor de MASP-2 na ligação a MBL e infra-regula a atividade declivagem de C4 e C2 de MASP-2 (Dahl et al, Immunity 15: 127-135 (2001)).Embora a interação entre sMAP e MASP-3 não tenha sido investigada, épossível que eles sejam capazes de infra-regular a ativação do caminho dalectina cooperativamente.

Neste relato nós demonstramos que sMAP e MASP-2 competem para ligar MBL e sMAP tem a capacidade para infra-regular ocaminho da lectina, que é ativado pelo complexo de MBL-MASP. E razoávelque sMAP também regule uma outra via do caminho da lectina ativado pelocomplexo ficolina-MASP. MASP-2 e sMAP também são competidores paraligar a ficolina A de camundongo e infra-regulam a atividade de clivagem de C4 do complexo de ficolina A-MASP (Y Endo et ai, em preparação). Umestudo de camundongos nulos em MBL foi recentemente relatado (Shi et al, JExp Med 199: 1379-1390 (2004). Os camundongos nulos em MBL não têmnenhuma atividade de clivagem de C4 no caminho MBL da lectina e sãosuscetíveis à infecções pelo Staphilococcus aureus. No presente estudo, camundongos sMAP-/-, que também são deficientes em MASP-2, mostraramreduções na atividade de clivagem C3 além da atividade de clivagem de C4no caminho da lectina. Por causa da sua atividade opsonização prejudicada, oscamundongos deficientes em sMAP podem ser suscetíveis às infecçõesbacterianas. Investigação adicional dos camundongos deficientes em sMAP esclarecerá a função do caminho da lectina na proteção contra doençasinfecciosas.

Uma outra descoberta importante é que a adição de rsMAP aosoro normal resulta em uma redução na ativação de C4 (Figura 26B). Ocaminho da lectina também foi demonstrado regular a inflamação e lesão tecidual em diversos órgãos (de Vries et al, Am J Pathol 165: 1677-1688(2004); Fiane et al, Circulation 108: 849-856 (2003); Jordan et al, Circulation104: 1413-1418 (2001); Walsh et al, J Immunol 175: 541-546 (2005)). Empacientes deficientes em MBL que passam por tratamento para um aneurismoaórtico toráxico abdominal, o complemento não foi ativado e os níveis demarcadores pró inflamatórios foram reduzidos a seguir da cirurgia (Fiane etal, Circulation 108: 849-856 (2003)). As evidências acumuladas têmdemonstrado o papel fisiopatológico potencial de MBL durante condições deisquemia e reperfusão em uma variedade de leitos vasculares. Portanto, obloqueio específico de MBL ou a inibição do caminho de complemento dalectina pode representar uma estratégia terapeuticamente relevante para aprevenção do lesão associado com a isquemia/perfusão. Assim, é possível quesMAP seja um dos candidatos para um tal inibidor, visto que o mesmo atuacomo um atenuador do caminho da ativação da lectina.

EXEMPLO 31

Este exemplo demonstra que MASP-2 é responsável pelaativação do desvio C4 de C3.

Fundamentos/Análise racional: Mais recentemente, tem sidomostrado que inibir o caminho alternativo protege o rim da insuficiênciaaguda isquêmica (Thurman et al., J. Immunol 170: 1517-1523 (2003)). Osdados aqui descritos implicam que o caminho da lectina instrui a ativação docaminho alternativo, que por sua vez amplifica a ativação de complementosinergisticamente. Nós levantamos a hipótese de que a inibição transitória docaminho da lectina também pode afetar a ativação do caminho alternativo eassim melhora o resultado de longa duração no transplante de órgão comolimitando o lesão e a inflamação de enxerto mediados por complemento epode moderar a indução não desejada de uma resposta imune adaptiva contrao enxerto e reduz o risco de rejeição secundária do enxerto através do sistemaimune adaptivo. Isto é sustentado pelos dados clínicos recentes mostrando queum caminho da lectina parcialmente prejudicado, que resulta de deficiênciasde MBL herdadas (presentes em cerca de 30% da população humana), estáassociada com a sobrevivência de haloenxerto renal aumentada em sereshumanos (Berger, Am J Transplant 5: 1361-1366 (2005)).

O envolvimento de componente de complementos C3 e C4 nalesão por isquemia-reperflisão (I/R) foi bem estabelecido em modelos deisquemia intestinal e muscular transitória usando cepas de camundongoalvejadas no gene (Weiser et al., J Exp Med 183: 2342-2348 (1996); Williamset al. J Appl Physiol 86: 938-42, (1999)). É bem estabelecido que C3 tem umpapel proeminente na lesão I/R renal e rejeição de enxerto secundária (Zhouet al., J Clin Invest 105: 1363-1371 (2000); Pratt et al., Nat Med 8: 582-587(2002); Farrar, et al., Am J. Pathol 164: 133-141 (2004)). Foi portantosurpreendente que um fenótipo para as deficiências C4 não fosse observadonos modelos publicados de rejeição de aloenxerto renal de camundongo (Lin,2005 No prelo). Uma análise subseqüente de soros e plasma destescamundorigos deficientes em C4, entretanto, indicou que estes camundongosretêm uma atividade funcional residual mostrando a clivagem dependente deLP de C3 e ainda a ativação a jusante de complemento (ver a FIGURA 27C).

A existência de um desvio C4 funcional (e desvio C2) é umfenômeno anteriormente descrito (mas não completamente caracterizado)pelos diversos investigadores (Miller et al., Proc Natl Acad Sci 72: 418-22(1975); Knutzen Steuer et al., J Immunol 143(7): 2256-61 (1989); Wagner etal., J Immunol 163: 3549-3558 (1999) e diz respeito ao caminho alternativo-independente da metabolização de C3 em soros deficientes de C4 (e C2).

Métodos: Efeitos do caminho da lectina e do caminho clássicosobre a deposição de C3. O plasma de camundongo (com EGTA/ Mg comoanticoagulante) foi diluído e re-calcificado em 4,0 mM de barbital, 145 mMde NaCl, 2,0 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgCl2, pH 7,4, depois adicionado àsplacas de microtítulo revestidas com manana (como mostrado na FIGURA27A e 27C) ou zimosan (como mostrado na FIGURA 27B) e incubadas por90 min a 37°C. As placas foram lavadas 3 vezes com 10 mM de Tris-Cl, 140mM de NaCl5 5,0 mM de CaCl2, 0,05% de Tween 20, pH 7,4 depois adeposição de C3b foi medida usando um anticorpo C3c anti-camundongo.

Resultados: Os resultados mostrados na FIGURA 27A-C sãorepresentativos de 3 experimentos independentes. Quando do uso dos mesmossoros em reservatórios revestido com complexos de imunoglobulina ao invésde manana ou zimosan, a deposição de C3b e clivagem do Fator B sãoobservados em soros de camundongo WT (+/+) e soros MASP-2(-/-)reunidos, mas não em soros esgotados de Clq (dados não mostrados). Istoindica que a ativação do caminho alternativo pode ser restaurada em sorosMASP-2-/- quando o C3b inicial é fornecido por intermédio da atividade deCP. A FIGURA 27C representa a descoberta surpreendente de que C3 podeser eficientemente ativado em uma maneira dependente do caminho da lectinaem plasma deficiente em C4 (-/-). Este "desvio de C4" é abolido pela inibiçãoda ativação do caminho da lectina através da pré incubação de plasma commanana ou manose solúveis.

Pode ser observado que a deposição de C3b em manana ezimosan é severamente comprometida em camundongos deficientes emMASP-2 (-/-), mesmo sob condições experimentais que de acordo comdocumentos muito anteriormente publicados sobre a ativação do caminhoalternativo devem ser permissivas para todos os três caminhos. Comomostrado na FIGURA 27A-C, plasma de camundongos deficiente em MASP-2 (-/-) não ativam C4 por intermédio do caminho da lectina e não clivam C3,nem por intermédio do caminho da lectina nem pelo caminho alternativo. Nósportanto levantamos a hipótese de que MASP-2 é requerido neste desvio deC4. Outro progresso na identificação de componentes prováveis de estaremenvolvidos no desvio de C4 dependente do caminho da lectina foi maisrecentemente relatado pelo Prof. Teizo Fuj ita. O plasma de camundongosdeficientes em C4 cruzados com a cepa de camundongo deficiente MASP-1/3de Fujita perde a capacidade residual do plasma deficiente em C4 para clivarC3 por intermédio do caminho da lectina. Isto foi restaurado pela adição deMASP-I recombinante aos plasmas deficientes em C4 e MASP-1/3combinados (Takahashi, Mol Immunol 43: 153 (2006), sugerindo que MASP-1 está envolvido na formação de complexos derivados do caminho da lectinaque clivam C3 na ausência de C4 (MASP-1 recombinante não cliva C3, mascliva C2; Rossi et al., J Biol Chem 276: 40880-7 (2001); Chen et al., J BiolChem 279: 26058-65 (2004). Nós observamos que MASP-2 é requerido paraque este desvio seja formado.

Embora parâmetros e histologia mais funcionais equantitativos sejam requeridos para consolidar este estudo piloto, seusresultados preliminares fornecem suporte forte à hipótese de que a ativação decomplemento por intermédio do caminho da lectina contribuisignificantemente para a fisiopatologia da lesão I/R renal, visto quecamundongos MASP-2-/- mostram uma recuperação muito mais rápida dasfunções renais.

Embora a forma de realização preferida da invenção tenha sidoilustrada e descrita, será avaliado que várias mudanças podem ser feitas nesseponto sem divergir do espírito e escopo da invenção.

As formas de realização da invenção em que uma propriedadeou privilégio exclusivos são reivindicados são definidos como segue:LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Schwaeble, H.W.Stover, C.M.Tedford, C. E.Parent, J.B.Fujita, T.

<120> MÉTODOS PARA TRATAR CONDIÇÕES ASSOCIADAS COM A ATIVAÇÃO DE

COMPLEMENTO DEPENDENTE DE MASP-2<130> OMER-1-292OO<150> US 11/645,359<151> 2006-12-22<150> US 60/788,876<151> 2006-04-03<150> US 60/578,847<151> 2004-06-10<150> US 11/150,883<151> 2005-06-09<160> 65

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 725

<212> DNA

<213> Homo sapien

<220>

<221> CDS<222> (27)..(584)<4 00> 1

ggccaggcca gctggacggg cacacc atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt 53

Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu1 5

ctg tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct 101

Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro10 15 20 25

gtg ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat 14 9

Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn

30 35 40

gac cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg 197

Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu

45 50 55

cgc ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag 245

Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu

60 65 70

tac gac ttc gtc aag ctg age tcg ggg gcc aag gtg ctg gcc acg ctg 293

Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu

75 80 85

tgc ggg cag gag age aca gac acg gag cgg gcc cct ggc aag gac act 341

Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr90 95 100 105

ttc tac tcg ctg ggc tcc age ctg gac att acc ttc cgc tcc gac tac 389

Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr

110 115 120

tcc aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gca gcc gag 437

Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu

125 130 135

gac att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg ccc acc tgc gac 485

Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp

140 145 150

cac cac tgc cac aac cac ctg ggc ggt ttc tac tgc tcc tgc cgc gca 533

His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala

155 160 165

ggc tac gtc ctg cac cgt aac aag cgc acc tgc tca gag cag age ctc 581Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu170 175 180 185

tag cctcccctgg agctccggcc tgcccagcag gtcagaagcc agagccagcc 634tgctggcctc agctccgggt tgggctgaga tggctgtgcc ccaactccca ttcacccacc 694atggacccaa taataaacct ggccccaccc c 725

<210> 2<211> 185 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 2 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cya Gly Ser Val Ala Thr1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser65 70 75 80Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu145 150 155 160Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 180 185 <210> 3 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapien <4 00> 3 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr65 70 75 80Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg145 150 155 160Asn Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 165 170

<210> 4<211> 2460<212> DNA<213> Homo sapien<220>

<221> CDS<222> (22)..(2082)

<400> 4 ggccagctgg i acgggcacac c atg agg ctg ctg acc CtC ctg ggc Ctt ctg 51 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 tgt ggc tcg gtg gee acc CCC ttg ggc ccg aag tgg CCt gaa CCt gtg 99Cys Gly Ser Val Ala 15 Thr Pro Leu Gly Pro 20 Lys Trp Pro Glu Pro 25 Val ttc ggg cgc ctg gea tcc CCC ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat gac 147Phe Gly Arg Leu 30 Ala Ser Pro Gly Phe 35 Pro Gly Glu Tyr Ala 40 Asn Asp cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gea CCC CCC ggc tac cgc ctg cgc 195Gln Glu Arg 45 Arg Trp Thr Leu Thr 50 Ala Pro Pro Gly Tyr 55 Arg Leu Arg CtC tac ttc acc cac ttc gac ctg gag CtC tcc cac ctc tgc gag tac 243Leu Tyr 60 Phe Thr His Phe Asp 65 Leu Glu Leu Ser His 70 Leu Cys Glu Tyr gac ttc gtc aag ctg age tcg ggg gcc aag gtg ctg gcc acg ctg tgc 291Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys 75 80 85 90 ggg cag gag age aca gac acg gag cgg gcc CCt ggc aag gac act ttc 339Gly Gln Glu Ser Thr 95 Asp Thr Glu Arg Ala 100 Pro Gly Lys Asp Thr 105 Phe tac tcg ctg ggc tcc age ctg gac att acc ttc cgc tcc gac tac tcc 387Tyr Ser Leu Gly 110 Ser Ser Leu Asp Ile 115 .Thr Phe Arg Ser Asp 120 Tyr Ser aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gea gcc gag gac 435Asn Glu Lys 125 Pro Phe Thr Gly Phe 130 Glu Ala Phe Tyr Ala 135 Ala Glu Asp att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg CCC acc tgc gac cac 483Ile Asp 140 Glu Cys Gln Val Ala 145 Pro Gly Glu Ala Pro 150 Thr Cys Asp His cac tgc cac aac cac ctg ggc ggt ttc tac tgc tcc tgc cgc gea ggc 531His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly 155 160 165 170 tac gtc ctg cac cgt aac aag cgc acc tgc tca gcc ctg tgc tcc ggc 579Tyr Val Leu His Arg 175 Asn Lys Arg Thr Cys 180 Ser Ala Leu Cys Ser 185 Gly cag gtc ttc acc cag agg tet ggg gag CtC age age CCt gaa tac cca 627Gln Val Phe Thr 190 Gln Arg Ser Gly Glu 195 Leu Ser Ser Pro Glu 200 Tyr Pro cgg ccg tat CCC aaa CtC tcc agt tgc act tac age ate age ctg gag 675Arg Pro Tyr 205 Pro Lys Leu Ser Ser 210 Cys Thr Tyr Ser Ile 215 Ser Leu Glu gag ggg ttc agt gtc att ctg gac ttt gtg gag tcc ttc gat gtg gag 723Glu Gly 220 Phe Ser Val Ile Leu 225 Asp Phe Val Glu Ser 230 Phe Asp Val Glu aca cac CCt gaa acc ctg tgt CCC tac gac ttt ctc aag att caa aca 771Thr His Pro Glu Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr 235 240 245 250 gac aga gaa gaa cat ggc cca ttc tgt ggg aag aca ttg CCC cac agg 819Asp Arg Glu Glu His 255 Gly Pro Phe Cys Gly 260 Lys Thr Leu Pro His 265 Arg att gaa aca aaa age aac acg gtg acc ate acc ttt gtc aca gat gaa 867Ile Glu Thr Lys 270 Ser Asn Thr Val Thr 275 Ile Thr Phe Val Thr 280 Asp Glu tca gga gac cac aca ggc tgg aag ate cac tac acg age aca gcg cag 915Ser Gly Asp 285 His Thr Gly Trp Lys 290 Ile His Tyr Thr Ser 295 Thr Ala Glncct tgc cct tat ccg atg gcg cca cct aat ggc cac gtt tca cct gtg 963

Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val

300 305 310

caa gcc aaa tac ate ctg aaa gac age ttc tcc ate ttt tgc gag act 1011

Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr315 320 325 330

ggc tat gag ctt ctg caa ggt cac ttg ccc ctg aaa tcc ttt act gea 1059

Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala

335 340 345

gtt tgt cag aaa gat gga tet tgg gac cgg cca atg ccc gcg tgc age 1107

Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser

350 355 360

att gtt gac tgt ggc cct cct gat gat cta ccc agt ggc cga gtg gag 1155

Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu

365 370 375

tac ate aca ggt cct gga gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac 1203

Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr

380 385 390

age tgt gaa gag acc ttc tac aca atg aaa gtg aat gat ggt aaa tat 1251

Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr395 400 405 410

gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg age tcc aaa gga gaa aaa tca 1299

Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser

415 420 425

ctc cca gtc tgt gag cct gtt tgt gga cta tca gcc cgc aca aca gga 1347

Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly

430 435 440

ggg cgt ata tat gga ggg caa aag gea aaa cct ggt gat ttt cct tgg 1395

Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp

445 450 455

caa gtc ctg ata tta ggt gga acc aca gea gea ggt gea ctt tta tat 1443

Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr

460 465 470

gac aac tgg gtc cta aca gct gct cat gcc gtc tat gag caa aaa cat 14 91

Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His475 480 485 490

gat gea tcc gcc ctg gac att cga atg ggc acc ctg aaa aga cta tca 1539

Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser

495 500 505

cct cat tat aca caa gcc tgg tet gaa gct gtt ttt ata cat gaa ggt 1587

Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly

510 515 520

tat act cat gat gct ggc ttt gac aat gac ata gea ctg att aaa ttg 1635

Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu

525 530 535

aat aac aaa gtt gta ate aat age aac ate acg cct att tgt ctg cca 1683

Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro

540 545 550

aga aaa gaa gct gaa tcc ttt atg agg aca gat gac att gga act gea 1731

Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala555 560 565 570

tet gga tgg gga tta acc caa agg ggt ttt ctt gct aga aat cta atg 1779

Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met

575 580 585

tat gtc gac ata ccg att gtt gac cat caa aaa tgt act gct gea tat 1827

Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr

590 595 600

gaa aag cca ccc tat cca agg gga agt gta act gct aac atg ctt tgt 1875

Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys

605 610 615

gct ggc tta gaa agt ggg ggc aag gac age tgc aga ggt gac age gga 1923

Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly620 625 630ggg gca ctg gtg ttt cta gat agt gaa aca gag agg tgg ttt gtg gga 1971

Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly

635 640 645 650

gga ata gtg tcc tgg ggt tcc atg aat tgt ggg gaa gca ggt cag tat 2019

Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr

655 660 665

gga gtc tac aca aaa gtt att aac tat att ccc tgg ate gag aac ata 2067

Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile

670 675 680

att agt gat ttt taa cttgcgtgtc tgcagtcaag gattcttcat ttttagaaat 2122

Ile Ser Asp Phe685

gcctgtgaag accttggcag cgacgtggct cgagaagcat tcatcattac tgtggacatg 2182

gcagttgttg ctccacccaa aaaaacagac tccaggtgag gctgctgtca tttctccact 2242

tgccagttta attccagcct tacccattga ctcaagggga cataaaccac gagagtgaca 2302

gtcatctttg cccacccagt gtaatgtcac tgctcaaatt acatttcatt accttaaaaa 2362

gccagtctct tttcatactg gctgttggca tttctgtaaa ctgcctgtcc atgctctttg 2422

tttttaaact tgttcttatt gaaaaaaaaa aaaaaaaa 2460

<210> 5

<211> 686

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 5

Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr1 5 10 15

Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser

20 25 30

Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr

35 40 45

Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe

50 55 60

Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser65 70 75 80

Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp

85 90 95

Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser

100 105 110

Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr

115 120 125

Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val

130 135 140

Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu145 150 155 160

Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn

165 170 175

Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg

180 185 190

Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu

195 200 205

Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile

210 215 220

Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu225 230 235 240

Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly

245 250 255

Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn

260 265 270

Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly

275 280 285

Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met

290 295 300

Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu305 310 315 320Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys 325 Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe 340 Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala 355 360Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg 370 375 Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile385 390 Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly 405 Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu 420 Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr 435 440Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe 450 455 Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu465 470 Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln 485 Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg 500 Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His 515 520Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile 530 535 Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys545 550 Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly 565 Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn 580 Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala 595 600Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met 610 615 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp625 630 Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe 645 Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly 660 Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu 675 680<210> 6 <211> 671 <212> PRT <213> Homo sapien <4 00> 6 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro1 5 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr 20 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr 35 40Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu 50 55 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala65 70 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys 85

Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln 330 335 Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly345 350 Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro 365 Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly 380 Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe 395 400Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly 410 415 Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro425 430 Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly 445 Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly 460 Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr 475 480Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp 490 495 Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala505 510 Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly 525 Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile 540 Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser 555 560Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr 570 575 Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile585 590 Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro 605 Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly 620 Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 635 640Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 650 655 Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val665 670 Asn Ile Ile Ser Asp Phe 685 Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 10 15 Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp25 30 Arg Leu Arg Leu Tyr Δ S Phe Thr HisCys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 60 Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 75 80Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Qn QRSer Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg145 150 155 160Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln 165 170 175 Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val 195 200 205 Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr 210 215 220 Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His225 230 235 240Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr . Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser 245 250 255 Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro 275 280 285 Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu305 310 315 320Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp385 390 395 400Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu 405 410 415 Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly 420 425 430 Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu 435 440 445 Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu 450 455 460 Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu465 470 475 480Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln 485 490 495 Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala 500 505 510 Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val 515 520 525 Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu 530 535 540 Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu545 550 555 560Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro 565 570 575 Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr 580 585 590 Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser595 600

Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly

610 615

Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp625 630

Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala645

Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile660

<210> 7<211> 4900<212> DNA<213> Homo sapien<400> 7

cctgtcctgc ctgcctggaa ctctgagcag gctggagtca tggagtcgat tcccagaatc 60

ccagagtcag ggaggctggg ggcaggggca ggtcactgga caaacagatc aaaggtgaga 120

ccagcgtagg actgcagacc aggccaggcc agctggacgg gcacaccatg aggtaggtgg 180

gcgccacagc ctccctgcag ggtgtggggt gggagcacag gcctgggcct caccgcccct 240

gccctgccca taggctgctg accctcctgg gccttctgtg tggctcggtg gccaccccct 300

taggcccgaa gtggcctgaa cctgtgttcg ggcgcctggc atcccccggc tttccagggg 360

agtatgccaa tgaccaggag cggcgctgga ccctgactgc accccccggc taccgcctgc 420

gcctctactt cacccacttc gacctggagc tctcccacct ctgcgagtac gacttcgtca 480

aggtgccgtc agacgggagg gctggggttt ctcagggtcg gggggtcccc aaggagtagc 540

cagggttcag ggacacctgg gagcaggggc caggcttggc caggagggag atcaggcctg 600

ggtcttgcct tcactccctg tgacacctga ccccacagct gagctcgggg gccaaggtgc 660

tggccacgct gtgcgggcag gagagcacag acacggagcg ggcccctggc aaggacactt 720

tctactcgct gggctccagc ctggacatta ccttccgctc cgactactcc aacgagaagc 780

cgttcacggg gttcgaggcc ttctatgcag ccgagggtga gccaagaggg gtcctgcaac 840

atctcagtct gcgcagctgg ctgtgggggt aactctgtct taggccaggc agccctgcct 900

tcagtttccc cacctttccc agggcagggg agaggcctct ggcctgacat catccacaat 960

gcaaagacca aaacagccgt gacctccatt cacatgggct gagtgccaac tctgagccag 1020

ggatctgagg acagcatcgc ctcaagtgac gcagggactg gccgggcgcg gcagctcacg 1080

cctgtaattc cagcactttg ggaggccgag gctggcttga taatttgagg gtcaggagtt 1140

caaggccagc cagggcaaca cggtgaaact ctatctccac taaaactaca aaaattagct 1200

gggcgtggtg gtgcgcacct ggaatcccag ctactaggga ggctgaggca ggagaattgc 1260

ttgaacctgc gaggtggagg ctgcagtgaa cagagattgc accactacac tccacctggg 1320

cgacagacta gactccgtct caaaaaacaa aaaacaaaaa ccacgcaggg ccgagggccc 1380

atttacaagc tgacaaagtg ggccctgcca gcgggagcgc tgcaggatgt ttgattttca 1440

gatcccagtc cctgcagaga ccaactgtgt gacctctggc aagtggctca atttctctgc 1500

tccttagaag ctgctgcaag ggttcagcgc tgtagccccg ccccctgggt ttgattgact 1560

cccctcatta gctgggtgac ctcggccgga cactgaaact cccactggtt taacagaggt 1620

gatgtttgca tctttctccc agcgctgctg ggagcttgca gcgaccctag gcctgtaagg 1680

tgattggccc ggcaccagtc ccgcacccta gacaggacct aggcctcctc tgaggtccac 1740

tctgaggtca tggatctcct gggaggagtc caggctggat cccgcctctt tccctcctga 1800

cggcctgcct ggccctgcct ctcccccaga cattgacgag tgccaggtgg ccccgggaga 1860

ggcgcccacc tgcgaccacc actgccacaa ccacctgggc ggtttctact gctcctgccg 1920

cgcaggctac gtcctgcacc gtaacaagcg cacctgctca ggtgagggag gctgcctggg 1980

ccccaacgca ccctctcctg ggatacccgg ggctcctcag ggccattgct gctctgccca 2040

ggggtgcgga gggcctgggc ctggacactg ggtgcttcta ggccctgctg cctccagctc 2100

cccttctcag ccctgcttcc cctctcagca gccaggctca tcagtgccac cctgccctag 2160

cactgagact aattctaaca tcccactgtg tacctggttc cacctgggct ctgggaaccc 2220

ctcatgtagc cacgggagag tcggggtatc taccctcgtt ccttggactg ggttcctgtt 2280

ccctgcactg ggggacgggc cagtgctctg gggcgtgggc agccccaccc tgtggcgctg 2340

accctgctcc cccgactcgg tttctcctct cggggtctct ccttgcctct ctgatctctc 2400

ttccagagca gagcctctag cctcccctgg agctccggct gcccagcagg tcagaagcca 24 60

gagccaggct gctggcctca gctccgggtt gggctgagat gctgtgcccc aactcccatt 2520

cacccaccat ggacccaata ataaacctgg ccccacccca cctgctgccg cgtgtctctg 2580

gggtgggagg gtcgggaggc ggtggggcgc gctcctctct gcctaccctc ctcacagcct 2640

catgaacccc aggtctgtgg gagcctcctc catggggcca cacggtcctt ggcctcaccc 2700

cctgttttga agatggggca ctgaggccgg agaggggtaa ggcctcgctc gagtccaggt 2760

ccccagaggc tgagcccaga gtaatcttga accaccccca ttcagggtct ggcctggagg 2820

agcctgaccc acagaggaga caccctggga gatattcatt gaggggtaat ctggtccccc 2880

gcaaatccag gggtgattcc cactgcccca taggcacagc cacgtggaag aaggcaggca 2940

605

Asp Ser Gly Gly 620 Ala Leu Val PhePhe Val Gly 635 Gly Ile Val Ser Trp 640Gly Gln 650 Tyr Gly Val Tyr Thr 655 LysGlu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 665 670atgttggggc tcctcacttc ctagaggcct cacaactcaagggtggggtg gtggtatggg atggggacca agccttccttacaccccgcc ccgtggcagc agcatcacgt gttccagcgaagtcatgatc actgttgcct tgaacttcca agaacagcccgggaaagggg gtgatgagag atccttcttc cggatgttccctggtcttgg ctgggttcgg gtaggagacc catgatgaattggctgtaag ggaatttagg ggagctccga aggggcccttctcttttccc gaattcccag ggacccagga gagtgtccctcatccacccc cgccccccgc cctggcagag ctggtggaacctggggttgc gactctggct caggacacca ccacgctccctgtgcgctcc atcccgagtg ctgcctgttt cagctaaagcctctctaagc ggcccctcag ccatcgggtg ggtcgtttgggctggccacc tgcagggccc agcccaaccc agggatgcagtcccagtttc ctgctcccca aggcatccac cctgctgttgcacgccaagt cactcccctg cccttccctc cttccagcccacccagaggt ctggggagct cagcagccct gaatacccacagttgcactt acagcatcag cctggaggag gggttcagtgtccttcgatg tggagacaca ccctgaaacc ctgtgtccctctcctgggcc cctcatcttg tcccagatcc tcccccttcatcctgcagca tggcccccac cacgttcccg tcaccctcggctctatggag gtcaaggctg gggcttcgag tacaagtgtgcaccccaatc catggcctgg gttggcctca ttggctgtccgttacttccc tccgcccagg ccagacccag gcagctgctcttctcagatt caaacagaca gagaagaaca tggcccattccaggattgaa acaaaaagca acacggtgac catcacctttccacacaggc tggaagatcc actacacgag cacagtgagctggaagcgca gagctgcctc tctctggagt gcaaggagctgggcaggact aggaagggac accaggttta gtggtgctgaaaggggaagc acccgtgccc tcctcagcag cacccagcatccacccattc acccatcact catcttttac ccacccacccccctcatcct tccaaccatt catcaatcac ccacccatccccacccattc ttctacctac ccatcctatc catccatcctacccatcctt cgttcggtca tccatcatca tccatccatc<210> 8<211><212><213><4 00> 8

Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys15 10

Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe

20 25

Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln

35 40

Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu

50 55

Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp65 70 75

Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly

85 90

Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr

100 105

Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn

115 120

Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala

130 135

<210> 9<211> 181<212> PRT<213> Homo sapien<4 00> 9

Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys15 10

atgccccccagaaggatagaggaaggagagcagggcaaggtccaggaaccaaacttgggaaggctcgaggtcttcctctttcagtgctcttgggggtgtgctcaaagcaatttctgggtaatgtcccagcgtgcgagggctgtgctccggggccgtatcctcattctggaacgactttctgcccagctgctgaccccaccggaggcagagctgaaatgctcccagctttctgtgggaagagtcacagatgaagtgggctcgtagagtgtaggtctgaggccttcaccacttttgccactcatcctttgcctctatcagca

ctgcagctgggcccagcccacaccagactcgtcaaaacagagggggctggatcactggggagatgctcctcctgtgtgtcagcccctaccagtgagggccgagaaaccccggcctcagggcacatccctgtgatagagggccaggtcttccaaactctccctttgtggagcaaggtctggaccccctacttcttcaggtgtggggagggggaggaggtggatgagcttctcattgccccaaatcaggagaagatccttgggggctcttctagcagcttctcattcttcaaatccttctgtacacaaccattccttctacc

136PRT

Homo sapien

Gly Ser

Gly Arg

Glu Arg45

Tyr Phe60

Phe Val

Gln Glu

Ser Leu

Glu Lys125

Val Ala

15Leu Ala30

Arg Trp

Thr His

Lys Leu

Ser Thr95

Gly Ser110

Pro Phe

Thr

Ser

Thr

Phe

Ser80Asp

Ser

Thr

300030603120318032403300336034203480354036003660372037803840390039604020408041404200426043204380444045004560462046804740480048604900

Gly Ser Val Ala Thr15Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser65 70 75 80Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu145 150 155 160Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser 180 <210> 10 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 10 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser65 70 75 80Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu145 150 155 160Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg 180 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu225 230 235 240Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly

275 280 285Trp Lys Ile His Tyr 290 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapien <4 00> 11 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys1 5 10 15 Asp His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg 20 25 30 Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys 35 40 <210> 12 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapien <4 00> 12 Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val1 5 10 15 Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn 20 25 30 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala 35 40 45 Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His 50 55 60 Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr65 70 75 80His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn 85 90 95 Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys 100 105 110 Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly 115 120 125 Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val 130 135 140 Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys145 150 155 160Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly 165 170 175 Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala 180 185 190 Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile 195 200 205 Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser225 230 235 240

Asp Phe

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo sintético

<4 00> 13

Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ala Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu15 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo sintético<4 00> 14

Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu15 10 15

<210> 15<211> 43<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo sintético<4 00> 15

Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp15 10 15

Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln

35 40

<210> 16<211> 8<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Peptideo sintético<4 00> 16

Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn

1 5

<210> 17

<211> 25

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo sintético<4 00> 17

Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr15 10 15

Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe20 25

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Peptideo sintético<4 00> 18

Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly

1 5

<210> 19

<211> 25

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo sintético<4 00> 19

Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys15 10 15

Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val20 25

<210> 20

<211> 960

<212> DNA

<213> Homo sapien

<220><221> CDS<222> (51)..(797)<400> 20attaactgag attaaccttc cctgagtttt ctcacaccaa ggtgaggacc atg tcc 56

Met Ser1

ctg ttt cca tca ctc cct ctc ctt ctc ctg agt atg gtg gca gcg tct 104Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala Ala Ser

5 10 15

tac tca gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc cct gca 152Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala

20 25 30

gtg att gcc tgt age tct cca ggc ate aac ggc ttc cca ggc aaa gat 200Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp

35 40 45 50

ggg cgt gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa ggg ctc 248Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu

55 60 65

aga ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca 296Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro

70 75 80

ggg cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga 344

Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly

85 90 95

aaa agt ccg gat ggt gat agt age ctg gct gcc tca gaa aga aaa gct 392Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala

100 105 110

ctg caa aca gaa atg gca cgt ate aaa aag tgg ctc acc ttc tct ctg 440Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu

115 120 125 130

ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa ata atg 488Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met

135 140 145

acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc tct gtg 536Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val

150 155 160

gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat ctc ate 584Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile

165 170 175

aag gag gaa gcc ttc ctg ggc ate act gat gag aag aca gaa ggg cag 632Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln

180 185 190

ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg aac gag 680Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu

195 200 205 210

ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta ttg cta ctg 728Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu

215 220 225

aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc cat ctg gcc 776Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala

230 235 240

gtc tgt gag ttc cct ate tga agggtcatat cactcaggcc ctccttgtct 827Val Cys Glu Phe Pro Ile245

ttttactgca acccacaggc ccacagtatg cttgaaaaga taaattatat caatttcctc 887atatccagta ttgttccttt tgtgggcaat cactaaaaat gatcactaac agcaccaaca 947aagcaataat agt 960

<210> 21<211> 248<212> PRT<213> Homo sapien<400> 21

Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala1 5 10 15 Ala Ser Tyr Ser 20 Glu Thr Val Thr Cys 25 Glu Asp Ala Gln Lys 30 Thr CysPro Ala Val 35 Ile Ala Cys Ser Ser 40 Pro Gly Ile Asn Gly 45 Phe Pro GlyLys Asp 50 Gly Arg Asp Gly Thr 55 Lys Gly Glu Lys Gly 60 Glu Pro Gly GlnGly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly65 70 75 80Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp 85 90 95 Pro Gly Lys Ser 100 Pro Asp Gly Asp Ser 105 Ser Leu Ala Ala Ser 110 Glu ArgLys Ala Leu 115 Gln Thr Glu Met Ala 120 Arg Ile Lys Lys Trp 125 Leu Thr PheSer Leu 130 Gly Lys Gln Val Gly 135 Asn Lys Phe Phe Leu 140 Thr Asn Gly GluIle Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala145 150 155 160Ser Val Ala Thr Pro 165 Arg Asn Ala Ala Glu 170 Asn Gly Ala Ile Gln 175 AsnLeu Ile Lys Glu 180 Glu Ala Phe Leu Gly 185 Ile Thr Asp Glu Lys 190 Thr GluGly Gln Phe 195 Val Asp Leu Thr Gly 200 Asn Arg Leu Thr Tyr 205 Thr Asn TrpAsn Glu 210 Gly Glu Pro Asn Asn 215 Ala Gly Ser Asp Glu 220 Asp Cys Val LeuLeu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His225 230 235 240Leu Ala Val Cys Glu 245 Phe Pro Ile

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de consenso de peptideo sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (1)

<223> Em que X na posição 1 representa hidroxiprolina<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Em que X na posição 4 representa resíduo hidrofóbico

<4 00> 22

Xaa Gly Lys Xaa Gly Pro1 5

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (1)

<223> Em que X representa hydroxiprolina

<4 00> 23

Xaa Gly Lys Leu Gly1 5

<210> 24

<211> 16<212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Peptideo sintético <220> <221> MISC FEATURE <222> (9)..(15) <223> Em que X nas posições 9 e 15 representa hidroxiprolina <400> 24 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa Gly1 5 10 15<210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Peptideo sintético <220> <221> MISC FEATURE <222> (3) . .(21) <223> Em que X nas posições 3, 6, 15, 21, 24, 27 representa hydroxiprolina <400> 25 Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly1 5 10 15Lys Leu Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa 20 25 <210> 26 <211> 53 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Peptideo sintético <220> <221> misc feature <222> (26) . . (26) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220> <221> misc feature <222> (32) . . (32) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220> <221> misc feature <222> (35)..(35) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220> <221> misc feature <222> (41) .. (41) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220> <221> misc feature <222> (50)..(50) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<4 00> 26 Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly1 5 10 15Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa 20 25 30Gly Asn Xaa Gly Pro Ser Gly Ser Xaa Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly 35 40 45Asp Xaa Gly Lys Ser 50 <210> 27<211> 33<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo sintético<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (3)..(33)

<223> Em que X nas posições 3, 6, 12, 18, 21, 30, 33 representa

hidroxiprolina<400> 27

Gly Ala Xaa Gly Ser Xaa Gly Glu Lys Gly Ala Xaa Gly Pro Gln Gly1 5 10 15

Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly Glu Xaa Gly Asp20 25 30

Xaa

<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223>

2845PRT

Seqüência artificialPeptideo sintético

MISC_FEATURE(3)..(45)

Em que X nas posições 3,hidroxiprolina<400> 28

Gly Cys Xaa Gly Leu Xaa Gly Ala1 5

Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Arg20

Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Asn Gly35 40

2924PRT

Seqüência artificial

6, 9, 27, 30, 36, 42, 45 representa

Xaa Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly

10 15

Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys25 30

Ala Xaa Gly Glu Xaa45

<210><211><212><213><220><223><400>

Peptideo sintético29

Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu1 5

Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile20

<210> 30

<211> 559

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 30

atgaggctgc tgaccctcct gggccttctgaagtggcctg aacctgtgtt cgggcgcctgaatgaccagg agcggcgctg gaccctgactttcacccact tcgacctgga gctctcccactcgggggcca aggtgctggc cacgctgtgccctggcaagg acactttcta ctcgctgggctactccaacg agaagccgtt cacggggttcgagtgccagg tggccccggg agaggcgcccggcggtttct actgctcctg ccgcgcaggctcagccctgt gctccggcc<210> 31<211> 34

Pro Asn Arg Val Thr Ile Lys Ala10 15

tgtggctcgggcatcccccggcaccccccgctctgcgagtgggcaggagatccagcctgggaggccttctacctgcgacctacgtcctgc

tggccaccccgctttccagggctaccgcctacgacttcgtgcacagacacacattaccttatgcagccgaaccactgccaaccgtaacaa

cttgggcccgggagtatgccgcgcctctaccaagctgagcggagcgggccccgctccgacggacattgaccaaccacctggcgcacctgc

60120180240300360420480540559<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<400> 31

cgggcacacc atgaggctgc tgaccctcct gggc

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<400> 32

gacattacct tccgctccga ctccaacgag aag

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<400> 33

agcagccctg aatacccacg gccgtatccc aaa

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<400> 34

cgggatccat gaggctgctg accctc

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<400> 35

ggaattccta ggctgcata

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<400> 36

ggaattccta cagggcgct

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<400> 37

ggaattccta gtagtggat

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<400> 38

tgcggccgct gtaggtgctg tcttt

<210> 39<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<4 00> 39

ggaattcact cgttattctc gga

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<4 00> 40tccgagaata acgagtg

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<4 00> 41

cattgaaagc tttggggtag aagttgttc

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<4 00> 42

cgcggccgca gctgctcaga gtgtaga

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<4 00> 43

cggtaagctt cactggctca gggaaata

<210>44

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<4 00> 44

aagaagcttg ccgccaccat ggattggctg tggaact

<210> 45

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<4 00> 45

cgggatcctc aaactttctt gtccaccttg g

<210> 46

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligo sintético

<4 00> 46

aagaaagctt gccgccacca tgttctcact agctct<210> 47<211> 26<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Oligo sintético<400> 47cgggatcctt ctccctctaa cactct<210> 48<211> 9<212> PRT<213> Seqüência artificial<220><223> Peptideo sintético<400> 47cggatcctt ctccctctaa cactct<210> 48<211> 9<212> PRT<213> Sequencia artificial<220><223> Peptideo sintetico<400> 48Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His1 5<210> 49<211> 4960<212> DNA<213> Homo Sapien<400> 49

ccggacgtgg tggcgcatgc ctgtaatccc agctactcgg gaggctgagg caggagaatt 60gctcgaaccc cggaggcaga ggtttggtgg ctcacacctg taatcccagc actttgcgag 120gctgaggcag gtgcatcgct ttggctcagg agttcaagac cagcctgggc aacacaggga 180gacccccatc tctacaaaaa acaaaaacaa atataaaggg gataaaaaaa aaaaaaagac 240aagacatgaa tccatgagga cagagtgtgg aagaggaagc agcagcctca aagttctgga 300agctggaaga acagataaac aggtgtgaaa taactgcctg gaaagcaact tctttttttt 360tttttttttt tttgaggtgg agtctcactc tgtcgtccag gctggagtgc agtggtgcga 420tctcggatca ctgcaacctc cgcctcccag gctcaagcaa ttctcctgcc tcagcctccc 480gagtagctgg gattataagt gcgcgctgcc acacctggat gatttttgta tttttagtag 540agatgggatt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctcaaact cccaacctcg tgatccaccc 600accttggcct cccaaagtgc tgggattaca ggtataagcc accgagccca gccaaaagcg 660acttctaagc ctgcaaggga atcgggaatt ggtggcacca ggtccttctg acagggttta 720agaaattagc cagcctgagg ctgggcacgg tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg 780gaggctaagg caggtggatc acctgagggc aggagttcaa gaccagcctg accaacatgg 840agaaacccca tccctaccaa aaataaaaaa ttagccaggt gtggtggtgc tcgcctgtaa 900tcccagctac ttgggaggct gaggtgggag gattgcttga acacaggaag tagaggctgc 960agtgagctat gattgcagca ctgcactgaa gccggggcaa cagaacaaga tccaaaaaaa 1020agggaggggt gaggggcaga gccaggattt gtttccaggc tgttgttacc taggtccgac 1080tcctggctcc cagagcagcc tgtcctgcct gcctggaact ctgagcaggc tggagtcatg 1140gagtcgattc ccagaatccc agagtcaggg aggctggggg caggggcagg tcactggaca 1200aacagatcaa aggtgagacc agcgtagggc tgcagaccag gccaggccag ctggacgggc 1260acaccatgag gtaggtgggc gcccacagcc tccctgcagg gtgtggggtg ggagcacagg 1320cctgggccct caccgcccct gccctgccca taggctgctg accctcctgg gccttctgtg 1380tggctcggtg gccaccccct tgggcccgaa gtggcctgaa cctgtgttcg ggcgcctggc 1440atcccccggc tttccagggg agtatgccaa tgaccaggag cggcgctgga ccctgactgc 1500accccccggc taccgcctgc gcctctactt cacccacttc gacctggagc tctcccacct 1560ctgcgagtac gacttcgtca aggtgccgtc aggacgggag ggctggggtt tctcagggtc 1620ggggggtccc caaggagtag ccagggttca gggacacctg ggagcagggg ccaggcttgg 1680ccaggaggga gatcaggcct gggtcttgcc ttcactccct gtgacacctg accccacagc 1740tgagctcggg ggccaaggtg ctggccacgc tgtgcgggca ggagagcaca gacacggagc 1800gggcccctgg caaggacact ttctactcgc tgggctccag cctggacatt accttccgct 1860ccgactactc caacgagaag ccgttcacgg ggttcgaggc cttctatgca gccgagggtg 1920agccaagagg ggtcctgcaa catctcagtc tgcgcagctg gctgtggggg taactctgtc 1980ttaggccagg cagccctgcc ttcagtttcc ccacctttcc cagggcaggg gagaggcctc 2040tggcctgaca tcatccacaa tgcaaagacc aaaacagccg tgacctccat tcacatgggc 2100tgagtgccaa ctctgagcca gggatctgag gacagcatcg cctcaagtga cgcagggact 2160ggccgggcgc agcagctcac gcctgtaatt ccagcacttt gggaggccga ggctggctga 2220tcatttgagg tcaggagttc aaggccagcc agggcaacac ggtgaaactc tatctccact 2280aaaactacaa aaattagctg ggcgtggtgg tgcgcacctg gaatcccagc tactagggag 2340gctgaggcag gagaattgct tgaacctgcg aggtggaggc tgcagtgaac agagattgca 2400ccactacact ccagcctggg cgacagagct agactccgtc tcaaaaaaca aaaaacaaaa 2460acgacgcagg ggccgagggc cccatttaca gctgacaaagcgctgccagg atgtttgatt tcagatccca gtccctgcagggcaagtggc tcaatttctc tgctccttag gaagctgctgcccgccccct gggtttgatt gactcccctc attagctgggaaactcccac tggtttaaca gaggtgatgt ttgcatctttttgcagcgac cctaggcctg taaggtgatt ggcccggcacgacgaggcct cctctgaggt ccactctgag gtcatggatcggatcccgcc tctttccctc ctgacggcct gcctggccctcgagtgccag gtggccccgg gagaggcgcc cacctgcgacgggcggtttc tactgctcct gccgcgcagg ctacgtcctgctcagccctg tgctccggcc aggtcttcac ccagaggtctatacccacgg ccgtatccca aactctccag ttgcacttacgttcagtgtc attctggact ttgtggagtc cttcgatgtggtgtccctac gactttctca agattcaaac agacagagaagaagacattg ccccacagga ttgaaacaaa aagcaacacgagatgaatca ggagaccaca caggctggaa gatccactaccccttatccg atggcgccac ctaatggcca cgtttcacctgaaagacagc ttctccatct tttgcgagac tggctatgagcctgaaatcc tttactgcag tttgtcagaa agatggatctgtgcagcatt gttgactgtg gccctcctga tgatctaccccacaggtcct ggagtgacca cctacaaagc tgtgattcagctacacaatg aaagtgaatg atggtaaata tgtgtgtgagctccaaagga gaaaaatcac tcccagtctg tgagcctgttaacaggaggg cgtatatatg gagggcaaaa ggcaaaacctcctgatatta ggtggaacca cagcagcagg tgcacttttaagctgctcat gccgtctatg agcaaaaaca tgatgcatcccaccctgaaa agactatcac ctcattatac acaagcctggtgaaggttat actcatgatg ctggctttga caatgacatacaaagttgta atcaatagca acatcacgcc tatttgtctgctttatgagg acagatgaca ttggaactgc atctggatggtcttgctaga aatctaatgt atgtcgacat accgattgtttgcatatgaa aagccaccct atccaagggg aagtgtaactcttagaaagt gggggcaagg acagctgcag aggtgacagcagatagtgaa acagagaggt ggtttgtggg aggaatagtgtggggaagca ggtcagtatg gagtctacac aaaagttattgaacataatt agtgattttt aacttgcgtg tctgcagtcaatgcctgtga agaccttggc agcgacgtgg ctcgagaagctggcagttgt tgctccaccc aaaaaaacag actccaggtgcttgccagtt taattccagc cttacccatt gactcaagggcagtcatctt tgcccaccca gt.gtaatgtc actgctcaaaaagccagtct cttttcatac tggctgttgg catttctgtatgtttttaaa cttgttctta ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa

tggggccctgagaccaactgcaagggttcatgacctcgggctcccagcgccagtcccgcatcctgggagggcctctcccccaccactgcccaccgtaacaggggagctcaagcatcagccgagacacaccgaacatggccgtgaccatcaacgagcacaggtgcaagccacttctgcaagtgggaccggcagtggccgagtacagctgtggctgatggattgtggactatggtgattttctatgacaactgccctggacatctgaagctggcactgattaccaagaaaagggattaacccgaccatcaaagctaacatgcggaggggcactcctggggttaactatattcaggattcttcattcatcattaggctgctgtgacataaaccttacatttcaaactgcctgt

ccagcgggagtgtgacctctgcgctgtagcccggacactgtgctgggagcccctagacagagtccaggctcagacattgaacaaccacctagcgcacctggcagccctgatggaggagggctgaaaccctcattctgtggcctttgtcaccgcacgcttgaatacatcctgtcacttgcccaatgcccgctggagtacataagagacctttctggacgagcagcccgcaccttggcaagtgggtcctaacttcgaatgggtttttatacaaattgaataaaagctgaatcaaaggggtttaatgtactgctttgtgctggtggtgtttctccatgaattgcctggatcgaatttttagaaactgtggacacatttctccaacgagagtgattaccttaaaccatgctctt

<210><211><212><213><220><221><222><4 00>

50

2090DNA

MASP-2 CDS de murino

(2090)

CDS(33)50

ggcgctggac tgcagagcta tggtggcaca cc atg agg

Met Arg1

ggt ctg ctg tgg agt ttg gtg gcc aca ctt ctgGly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr Leu Leu

10 15

gaa cct gta ttc ggg cgc ctg gtg tcc cct ggcGlu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser Pro Gly

25

30

gct gac cat caa gat cga tcc tgg aca ctg actAla Asp His Gln Asp Arg Ser Trp Thr Leu Thr

45

cta ctcLeu Leu

ggt tcaGly Ser20ttc ccaPhe Pro35

gca cccAla Pro

10

50

cgc ctg cgc ctc tac ttc acc cac ttt gac ctg gaa ctc

ate ttc ctgIle Phe Leu5

aag tgg cctLys Trp Pro

gag aag tatGlu Lys Tyr

cct ggc tacPro Gly Tyr55

tet tac cgc

252025802640270027602820288029403000306031203180324033003360342034803540360036603720378038403900396040204080414042004260432043804440450045604620468047404800486049204960

53

101

149

197

24521

Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg

60 65 70

tgc gag tat gac ttt gtc aag ttg age tca ggg acc aag gtg ctg gcc 293

Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala

75 80 85

aca ctg tgt ggg cag gag agt aca gac act gag cag gea cct ggc aat 341

Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn

90 95 100

gac acc ttc tac tca ctg ggt ccc age cta aag gtc acc ttc cac tcc 389

Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser

105 110 115

gac tac tcc aat gag aag ccg ttc aca ggg ttt gag gcc ttc tat gea 437

Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala120 125 130 135

gcg gag gat gtg gat gaa tgc aga gtg tet ctg gga gac tca gtc cct 485

Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro

140 145 150

tgt gac cat tat tgc cac aac tac ttg ggc ggc tac tat tgc tcc tgc 533

Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys

155 160 165

aga gcg ggc tac att ctc cac cag aac aag cac acg tgc tca gcc ctt 581

Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu

170 175 180

tgt tca ggc cag gtg ttc aca gga aga tet ggg tat ctc agt age cct 629

Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro

185 190 195

gag tac ccg cag cca tac ccc aag ctc tcc age tgc acc tac age ate 677

Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile200 205 210 215

cgc ctg gag gac ggc ttc agt gtc ate ctg gac ttc gtg gag tcc ttc 725

Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe

220 225 230

gat gtg gag acg cac cct gaa gcc cag tgc ccc tat gac tcc ctc aag 773

Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys

235 240 245

att caa aca gac aag ggg gaa cac ggc cca ttt tgt ggg aag acg ctg 821

Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu

250 255 260

cct ccc agg att gaa act gac age cac aag gtg acc ate acc ttt gcc 869

Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser His Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala

265 270 275

act gac gag tcg ggg aac cac aca ggc tgg aag ata cac tac aca age 917

Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser280 285 290 295

aca gea cgg ccc tgc cct gat cca acg gcg cca cct aat ggc age att 965

Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile

300 305 310

tca cct gtg caa gcc acg tat gtc ctg aag gac agg ttt tet gtc ttc 1013

Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe

315 320 325

tgc aag aca ggc ttc gag ctt ctg caa ggt tet gtc ccc ctg aaa tca 1061

Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser

330 335 340

ttc act gct gtc tgt cag aaa gat gga tet tgg gac cgg ccg atg cca 1109

Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro

345 350 355

gag tgc age att att gat tgt ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc 1157

Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly360 365 370 375

cat gtg gac tat ate aca ggc cct caa gtg act acc tac aaa gct gtg 1205

His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Gln Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val380 385 390

att cag tac age tgt gaa gag act ttc tac aca atg age age aat ggt 1253Ile Gln Tyr

aaa tatLys Tyr

aaa ctcLys Leu425ata ggaIle Gly440

cct tggPro Trp

ctt ataLeu Ile

aaa agaLys Arg

aggArg

catHis520attIle

ctcLeu505gaaGlu

aaaLys

tgc ctaCys Leu

gga actGly Thr

aac ctaAsn Leu585acc gtgThr Val600

ctc tgtLeu Cys

agt gggSer Gly

gtg ggaVal Gly

cag tatGln Tyr665aac ataAsn Ile680<210><211><212><213><4 00>Met Arg1

gtgVal410

CCC

Pro

ggaGly

caaGln

catHis

atgMet490tcaSer

ggcGly

ctcLeu

ccgPro

gtgVal570atgMet

tatTyr

gctAla

ggg

Gly

ggaGly650

ggg

Gly

ataIle

Ser Cys395

tgt gagCys Glu

ccg gttPro Val

cgc ataArg Ile

gtc ttgVal Leu4 60gac aatAsp Asn475

gca gcgAla Ala

cct catPro His

tac actTyr Thr

Glu Glu Thr

gct gat ggaAla Asp Gly415

tgt gag cctCys Glu Pro

430gtt gga gggVal Gly Gly445

ttg ctg ggtLeu Leu Gly

tgg gtc ctaTrp Val Leu

aagLys

cgaArg555gctAla

aacAsn540aaaLys

ggcGly

tccSer

tacTyr

cacHis525aaaLys

tccSer

actThr510ggtGly

ctgLeu495caaGln

gctAla

gtc acaVal Thr

gaa gct gcaGlu Ala Ala

ttt gtgPhe Val

gaa aagGlu Lys

ggcGly

gcaAla635ataIle

ttaLeu620ttaLeu

gttVal

tggTrp

gacAsp

ctcLeu605gagGlu

ggg ttaGly Leu575ata ccaIle Pro590

tat ccaTyr Pro

act ggtThr Gly

gtc tacVal Tyr

agt aatSer Asn

gtg ttt ctaVal Phe Leu

tcc tgg ggtSer Trp Gly655

aca aaa gtcThr Lys Val

670ttc taaPhe685

Phe400ttcPhe

gttVal

cagGln

caaGln

acaThr480aacAsn

gccAla

ggtGly

ateIle

tccSer560accThr

attIle

ggaGly

ggcGly

gatAsp640tccSer

ateIle

Tyr Thr Met

tgg acgTrp Thr

tgt gggCys Gly

cct gcaPro Ala450act acaThr Thr465

gcc gctAla Ala

ate cgaIle Arg

tgg cccTrp Pro

tttPhe

aacAsn545ttaLeu

gacAsp530ggaGly

atgMet

cag aagGln Lys

gct gacAla Asp

gta agaVal Arg610aag gacLys Asp625

aat gagAsn Glu

att aatIle Asn

aac tatAsn Tyr

ageSer

ctgLeu435aagLys

gcaAla

catHis

atgMet

gagGlu515aatAsn

ageSer

agaArg

ggg

Gly

cacHis595gtaVal

ageSer

acaThr

tgtCys

attIle675

Ser Ser Asn Gly405

tcc aaa gga gaaSer Lys Gly Glu420

tcc aca cac actSer Thr His Thr

cct ggtPro Gly

gca gcaAla Ala

gct gtaAla Val485ggc ateGly Ile500

gaa ateGlu Ile

gacAsp

ggtGly470tatTyr

tttPhe455gcaAla

gagGlu

ctc aaaLeu Lys

ttt ataPhe Ile

gatAsp

ateIle

acaThr

cttLeu580caaGln

ataIle

atgMet

gacAsp565cttLeu

gcaAla

cctPro550ttcPhe

ttgLeu535gttVal

actThr

gct agaAla Arg

aaa tgt accLys Cys Thr

age gct aacSer Ala Asn

tgc aga ggtCys Arg Gly630

cag cga tggGln Arg Trp645

ggg gcg gcaGly Ala Ala660

ccc tgg aatPro Trp Asn

atgMet615gacAsp

tttPhe

ggcGly

gagGlu

51

685

PRT

MASP-2 CDS de murino51

Leu Leu Ile Phe Leu Gly5

1301

1349

1397

1445

1493

1541

1589

1637

1685

1733

1781

1829

1877

1925

1973

2021

2069

2090

Leu

Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr10 15Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser

20 25 30

Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp Thr

35 40 45

Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe

50 55 60

Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser65 70 75 80

Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp

85 90 95

Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser

100 105 110

Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr

115 120 125

Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val

130 135 140

Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu145 150 155 160

Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn

165 170 175

Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg

180 185 190

Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu

195 200 205

Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile

210 215 220

Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln225 230 235 240

Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly

245 250 255

Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser His

260 265 270

Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly

275 280 285

Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro Thr

290 295 300

Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu305 310 315 320

Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln

325 330 335

Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly

340 345 350

Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro

355 360 365

Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Gln

370 375 380

Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe385 390 395 400

Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe

405 410 415

Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Leu Pro Pro Val Cys Glu Pro Val

420 425 430

Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ile Gly Gly Arg Ile Val Gly Gly Gln

435 440 445

Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Gln

450 455 460

Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asn Trp Val Leu Thr465 470 475 480

Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Lys Arg Met Ala Ala Ser Ser Leu Asn

485 490 495

Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala

500 505 510

Trp Pro Glu Glu Ile Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly515 520 525

Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile

530 535 540

Asn Gly Ser Ile Met Pro Val Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser545 550 555 560

Leu Met Arg Thr Asp Phe Thr Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr

565 570 575

Gln Lys Gly Leu Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile

580 585 590

Ala Asp His Gln Lys Cys Thr Thr Val Tyr Glu Lys Leu Tyr Pro Gly

595 600 605

Val Arg Val Ser Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Thr Gly Gly

610 615 620

Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp625 630 635 640

Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser

645 650 655

Ile Asn Cys Gly Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile

660 665 670

Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu Asn Ile Ile Ser Asn Phe675 680 685

<210> 52<211> 670<212> PRT

<213> Proteína madura de MASP-2 de murino<400> 52

Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val1 5 10 15

Ser Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp

20 25 30

Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His

35 40 45

Phe Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr65 70 75 80

Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro

85 90 95

Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe

100 105 110

Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg

115 120 125

Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr

130 135 140

Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln145 150 155 160

Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly

165 170 175

Arg Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys

180 185 190

Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val

195 200 205

Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala

210 215 220

Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His225 230 235 240

Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser

245 250 255

His Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr

260 265 270

Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro

275 280 285

Thr Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val290 295 300 Leu Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu305 310 315 320Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Gln Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly385 390 395 400Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Leu Pro Pro Val Cys Glu Pro 405 410 415 Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ile Gly Gly Arg Ile Val Gly Gly 420 425 430 Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly 435 440 445 Gln Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asn Trp Val Leu 450 455 460 Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Lys Arg Met Ala Ala Ser Ser Leu465 470 475 480Asn Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln 485 490 495 Ala Trp Pro Glu Glu Ile Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala 500 505 510 Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr 515 520 525 Ile Asn Gly Ser Ile Met Pro Val Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala 530 535 540 Ser Leu Met Arg Thr Asp Phe Thr Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu545 550 555 560Thr Gln Lys Gly Leu Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro 565 570 575 Ile Ala Asp His Gln Lys Cys Thr Thr Val Tyr Glu Lys Leu Tyr Pro 580 585 590 Gly Val Arg Val Ser Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Thr Gly 595 600 605 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 610 615 620 Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly625 630 635 640Ser Ile Asn Cys Gly Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 645 650 655 Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu Asn Ile Ile Ser Asn Phe

660 665 670

<210> 53<211> 2091<212> DNA

<213> MASP-2 CDS de rato<220>

<221> CDS

<222> (10)..(2067)

<400> 53

tggcacaca atg agg cta ctg ate gtc ctg ggt ctg ctt tgg agt ttg gtg 51

Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val1 5 10

gcc aca ctt ttg ggc tcc aag tgg cct gag cct gta ttc ggg cgc ctg 99

Ala Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu15 20 25 30

gtg tcc ctg gcc ttc cca gag aag tat ggc aac cat cag gat cga tcc 147

Val Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Sertgg acgTrp Thr

cac ttcHis Phe

ttg accLeu Thr80aca gatThr Asp95

ccc agePro Ser

ttc acaPhe Thr

aga acaArg Thr

tac ctgTyr Leu160cag aacGln Asn175

ggg aggGly Arg

aaa ctcLys Leu

ate accIle Thr

gcc cagAla Gln240tac ggcTyr Gly255

age aacSer Asn

aca ggcThr Gly

cca acgPro Thr

gtc ctgVal Leu320ctg caaLeu Gln335

gat ggaAsp Gly

ggc cctGly Pro

35

ctg act gea ccc

Leu Thr Ala Pro50

aac ctg gaa ctc

Asn Leu Glu Leu65

tca ggg acc aag

Ser Gly Thr Lys

act gag cgg geaThr Glu Arg Ala100

cta aag gtc accLeu Lys Val Thr. 115

gga ttt gag gccGly Phe Glu Ala130

tcc ctg gga gacSer Leu Gly Asp145

ggc ggc tac tacGly Gly Tyr Tyr

aag cat acc tgcLys His Thr Cys180

tet ggc ttt ctcSer Gly Phe Leu195

tcc age tgc gccSer Ser Cys Ala210

ctg gac ttc gtgLeu Asp Phe Val225

tgc ccc tac gacCys Pro Tyr Asp

ccg ttt tgt gggPro Phe Cys Gly260

aag gtg acc attLys Val Thr Ile275

tgg aag ata cacTrp Lys Ile His290

gcg cca cct aatAla Pro Pro Asn305

aag gac age tttLys Asp Ser Phe

ggt tet gtc cccGly Ser Val Pro340

tet tgg gac cggSer Trp Asp Arg355

ccc gat gac ctaPro Asp Asp Leu

40

cct ggc ttc cgcPro Gly Phe Arg55

tet tac cgc tgcSer Tyr Arg Cys70

gtg cta gcc acgVal Leu Ala Thr85

cct ggc aat gacPro Gly Asn Asp

ttc cac tcc gacPhe His Ser Asp120

ttc tat gea gcgPhe Tyr Ala Ala135

tca gtc cct tgtSer Val Pro Cys150

tgc tcc tgc cgaCys Ser Cys Arg165

tca gcc ctt tgtSer Ala Leu Cys

agt age cct gagSer Ser Pro Glu200

tac aac ate cgcTyr Asn Ile Arg215

gag tcc ttt gatGlu Ser Phe Asp230

tcc ctc aag attSer Leu Lys Ile245

aag acg ctg cccLys Thr Leu Pro

acc ttt acc accThr Phe Thr Thr280

tac aca age acaTyr Thr Ser Thr295

ggt cac att tcaGly His Ile Ser310

tet gtc ttc tgcSer Val Phe Cys325

ctg aag tca ttcLeu Lys Ser Phe

ccg ata cca gagPro Ile Pro Glu360

ccc aat ggc cacPro Asn Gly His

ctg cgc ctc tacLeu Arg Leu Tyr60

gag tat gac ttt

Glu Tyr Asp Phe75

ctg tgt ggg cagLeu Cys Gly Gln90

acc ttc tac tca

Thr Phe Tyr Ser105

tac tcc aat gag

Tyr Ser Asn Glu

gag gat gtg gat

Glu Asp Val Asp140

gac cat tat tgc

Asp His Tyr Cys155

gtg ggc tac att

Val Gly Tyr Ile170

tca ggc cag gtg

Ser Gly Gln Val185

tac cca cag cca

Tyr Pro Gln Pro

ctg gag gaa ggcLeu Glu Glu Gly220

gtg gag atg cacVal Glu Met His235

caa aca gac aagGln Thr Asp Lys250

ccc agg att gaaPro Arg Ile Glu265

gac gag tca gggAsp Glu Ser Gly

gea cag ccc tgcAla Gln Pro Cys300

cct gtg caa gcc·Pro Val Gln Ala315

aag act ggc ttcLys Thr Gly Phe330

act gct gtc tgtThr Ala Val Cys345

tgc age att attCys Ser Ile Ile

gtg gac tat ateVal Asp Tyr Ile

45

ttc acc 195

Phe Thr

gtc aag 243

Val Lys

gag agt 2 91

Glu Ser

ctg ggt 339

Leu Gly110

aag cca 387

Lys Pro

125

gaa tgc 435

Glu Cys

cac aac 483

His Asn

ctg cac 531

Leu His

ttc act 579

Phe Thr190

tac ccc 627

Tyr Pro

205

ttc agt 675

Phe Ser

cct gaa 723

Pro Glu

agg gaa 771

Arg Glu

act gac 819

Thr Asp270

aac cac 867

Asn His

285

cct gat 915

Pro Asp

acg tat 963

Thr Tyr

gag ctt 1011

Glu Leu

cag aaa 1059

Gln Lys350

gac tgt 1107

Asp Cys

365

aca ggc 1155Thr Gly370 375 380

cct gaa gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac age tgt gaa gag 1203

Pro Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu

385 390 395

act ttc tac aca atg age age aat ggt aaa tat gtg tgt gag gct gat 1251

Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp

400 405 410

gga ttc tgg acg age tcc aaa gga gaa aaa tcc ctc ccg gtt tgc aag 1299

Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys415 420 425 430

cct gtc tgt gga ctg tcc aca cac act tca gga ggc cgt ata att gga 1347

Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly

435 440 445

gga cag cct gea aag cct ggt gac ttt cct tgg caa gtc ttg tta ctg 1395Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu

450 455 460

ggt gaa act aca gea gea ggt gct ctt ata cat gac gac tgg gtc cta 1443

Gly Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu

465 470 475

aca gcg gct cat gct gta tat ggg aaa aca gag gcg atg tcc tcc ctg 14 91

Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu

480 485 490

gac ate cgc atg ggc ate ctc aaa agg ctc tcc ctc att tac act caa 1539

Asp Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln495 500 505 510

gcc tgg cca gag gct gtc ttt ate cat gaa ggc tac act cac gga gct 1587

Ala Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala

515 520 525

ggt ttt gac aat gat ata gea ctg att aaa ctc aag aac aaa gtc aca 1635

Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr

530 535 540

ate aac aga aac ate atg ccg att tgt cta cca aga aaa gaa gct gea 1683

Ile Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala

545 550 555

tcc tta atg aaa aca gac ttc gtt gga act gtg gct ggc tgg ggg tta 1731

Ser Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu

560 565 570

acc cag aag ggg ttt ctt gct aga aac cta atg ttt gtg gac ata cca 1779

Thr Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro575 580 585 590

att gtt gac cac caa aaa tgt gct act gcg tat aca aag cag ccc tac 1827

Ile Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr

595 600 605

cca gga gea aaa gtg act gtt aac atg ctc tgt gct ggc cta gac cgc 1875

Pro Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg

610 615 620

ggt ggc aag gac age tgc aga ggt gac age gga ggg gea tta gtg ttt 1923

Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe

625 630 635

cta gac aat gaa aca cag aga tgg ttt gtg gga gga ata gtt tcc tgg 1971

Leu Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp

640 645 650

ggt tet att aac tgt ggg ggg tca gaa cag tat ggg gtc tac acg aaa 2019

Gly Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys655 660 665 670

gtc acg aac tat att ccc tgg att gag aac ata ata aat aat ttc taa 2067

Val Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe675 680 685

tttgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2091

<210> 54<211> 685<212> PRT

<213> MASP-2 CDS de rato<4 00> 54

Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly1 5 Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu 20 Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly 35 40Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg 50 55 Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys65 70 Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr 85 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp 100 Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp 115 120Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala 130 135 Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys145 150 Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg 165 Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys 180 Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu 195 200Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg 210 215 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp225 230 Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile 245 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro 260 Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr 275 280Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr 290 295 Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser305 310 Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys 325 Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe 340 Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu 355 360Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His 370 375 Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile385 390 Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys 405 Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys 420 Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser 435 440Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro 450 455 Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile465 470 Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr 485

Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr 10 15 Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser25 30 Asn His Gln Asp Arg Ser Trp Thr 45 Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 60 Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Thr 75 80Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 90 95 Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser105 110 Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 125 Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Thr 140 Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu 155 160Val Gly Tyr Ile Leu His 'Gln Asn 170 175 Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg 185 190 Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu 205 Leu Glu Glu Gly Phe Ser Ile Thr 220 Val Glu Met His Pro Glu Ala Gln 235 240Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr Gly 250 255 Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser Asn265 270 Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly 285 Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro Thr 300 Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu 315 320Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln 330 335 Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly345 350 Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro 365 Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Glu 380 Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe 395 400Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe 410 415 Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro Val425 430 Gly Gly Arg Ile Ile â â S Gly Gly GlnTrp Gln Val Leu Leu Leu Gly Glu 460 His Asp Asp Trp Val Leu Thr Ala 475 480Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp Ile 490 495Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala Trp

500 505 510

Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly Phe

515 520 525

Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile Asn

530 535 540

Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser Leu545 550 555 560

Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr Gln

565 570 575

Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile Val

580 585 590

Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro Gly

595 600 605

Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly Gly

610 615 620

Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp625 630 635 640

Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser

645 650 655

Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr

660 665 670

Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe675 680 685

<210> 55<211> 670<212> PRT

<213> Proteína madura de MASP-2 de murino<4 00> 55

Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val1 5 10 15

Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp

20 25 30

Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His

35 40 45

Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu

50 55 60

Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr65 70 75 80

Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro

85 , 90 95

Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe

100 105 110

Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg

115 120 125

Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr

130 135 140

Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His Gln145 150 155 160

Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly

165 170 175

Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys

180 185 190

Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser Ile

195 200 205

Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu Ala

210 215 220

Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr225 230 235 240

Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser

245 250 255

Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr260 265 270Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro 275 280 285 Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu305 310 315 320Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly385 390 395 400Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro 405 410 415 Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly 420 425 430 Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly 435 440 445 Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr 450 455 4 60 Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp465 470 475 480Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala 485 490 495 Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly 500 505 510 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile 515 520 525 Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser 530 535 540 Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr545 550 555 560Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile 565 570 575 Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro 580 585 590 Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly 595 600 605 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 610 615 620 Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly625 630 635 640Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 645 650 655 Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 660 665 670 <210> 56 <211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador de PCR de MASP-2 de Homo Sapien

<400> 56

atgaggctgc tgaccctcct gggccttc

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> iniciador de PCR de MASP-2 de Homo Sapien<400> 57

gtgcccctcc tgcgtcacct ctg<210> 58<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador de PCR de MASP-2 de Homo Sapien<400> 58

cagaggtgac gcaggagggg cac<210> 59<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> iniciador de PCR de MASP-2 de Homo Sapien

<400> 59

ttaaaatcac taattatgtt ctcgatc<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR de MASP-2 de murino

<400> 60

atgaggctac tcatcttcct gg

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR de MASP-2 de murino

<400> 61

ctgcagaggt gacgcagggg ggg

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR de MASP-2 de murino

<400> 62

ccccccctgc gtcacctctg cag

<210> 63

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR de MASP-2 de murino

<400> 63

ttagaaatta cttattatgt tctcaatcc

<210> 64

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotideo de MASP-2 de rato

<400> 64

gaggtgacgc aggaggggca ttagtgttt

<210> 65

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotideo de MASP-2 de rato<400> 65

ctagaaacac taatgcccct cctgcgtcac ctctgca

Claims

1. Método para inibir a ativação de complemento dependentede MASP-2 em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelofato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade de umagente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação de complementodependente de MASP-2.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o agente inibidor de MASP-2 especificamente se liga a umpolipeptídeo que compreende a SEQ ID NO: 6.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o agente inibidor de MASP-2 especificamente se liga a umpolipeptídeo que compreende a SEQ ID NO: 6 com uma afinidade de pelomenos 10 vezes maior do que o mesmo se liga a um antígeno diferente nosistema de complemento.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o agente inibidor de MASP-2 se liga ao polipeptídeo em um localdentro dos resíduos de aminoácido de 1 a 176 da SEQ ID NO: 6.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo ou fragmento desteque especificamente se ligam a uma porção da SEQ ID NO: 6.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o anticorpo ou fragmento deste são monoclonais.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o anticorpo ou fragmento deste são policlonais.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o anticorpo ou fragmento deste são um anticorpo recombinante.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o anticorpo tem função efetora reduzida.

10. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ouhumano.

11. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é produzido em um animal transgênico deficiente5 em MASP-2.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente inibidor de MASP-2 é um peptídeo derivado de umpolipeptídeo selecionado do grupo que consiste de MASP-2 humana, MBLhumana que inibe MASP-2, H-ficolina humana que inibe MASP-2, M-ficolina humana que inibe MASP-2, L-ficolina humana que inibe MASP-2 eC4 humano que inibe MASP-2.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente inibidor de MASP-2 é um agente não peptídico queespecificamente se liga a um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO: 6.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o agente inibidor de MASP-2 se liga ao polipeptídeo em umlocal dentro dos resíduos de aminoácido 1 a 176 da SEQ ID NO: 6.

15. Método para inibir a ativação de complemento dependentede MASP-2 em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade de umagente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir seletivamente a ativação decomplemento dependente de MASP-2 sem substancialmente inibir a ativaçãode complemento dependente de Clq.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o agente inibidor de MASP-2 especificamente se liga a umpolipeptídeo que compreende a SEQ ID NO: 6.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que o agente inibidor de MASP-2 se liga ao polipeptídeo em umlocal dentro dos resíduos de aminoácido de 1 a 176 da SEQ ID NO: 6.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o agente inibidor de MASP-2 é um anticorpo ou fragmentodeste que especificamente se ligam a uma porção da SEQ ID NO: 6.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o anticorpo ou fragmento deste são monoclonais.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ouhumano.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é produzido em um animal transgênico deficienteem MASP-2.

22. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o agente inibidor de MASP-2 é um peptídeo derivado de umpolipeptídeo selecionado do grupo que consiste de MASP-2 humana, MBLhumana que inibe MASP-2, H-ficolina humana que inibe MASP-2, L-ficolinahumana que inibe MASP-2 e C4 humano que inibe MASP-2.

23. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o agente inibidor de MASP-2 é um agente não peptídico queespecificamente se liga a um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO: 6.

24. Composição para inibir a ativação de complementodependente de MASP-2, caracterizada pelo fato de que compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor de MASP-2 e umcarreador farmaceuticamente aceitável.

25. Método para fabricar um medicamento para o uso nainibição dos efeitos de ativação de complemento dependente de MASP-2 emindivíduo vivos em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de quecompreende combinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agenteinibidor de MASP-2 em um carreador farmacêutico.

26. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2, a dita condiçãosendo uma condição vascular, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que a condição vascular é selecionada do grupo que consiste deuma condição cardiovascular, uma condição cerebrovascular, uma condiçãovascular periférica (por exemplo, musculoesqueletal), uma condiçãorenovascular, uma condição vascular mesentérica/entérica, revascularizaçãopara transplantes e/ou reimplantes, vasculite, nefrite púrpura de Henoch-Schonlein, vasculite associada com o lupus eritematoso sistêmico, vasculiteassociada com a artrite reumatóide, vasculite de complexo imune, doença deTakayasu, cardiomiopatia dilatada, angiopatia diabética, doença de Kawasaki(arterite), êmbolo de gás venenoso (VGE) e restenose seguinte à colocação desonda, aterectomia rotacional e angioplastia coronária transluminal percutânea(PTCA).

28. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2 associada comuma lesão de isquemia-reperfusão, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que a lesão de isquemia-reperfusão está associada com o reparode aneurisma aórtico, desvio cardiopulmonar, reanastomose vascular emconexão com transplantes de órgão e/ou reimplantação de extremidade/dedo,acidente vascular cerebral, infarte do miocárdio e ressucitação hemodinâmicaseguinte ao choque e/ou procedimentos cirúrgicos.

30. Método para tratar e/ou prevenir a aterosclerose em umindivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de quecompreende administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

31. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2 associada comum distúrbio gastrintestinal inflamatório, caracterizado pelo fato de quecompreende administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o distúrbio gastrintestinal inflamatório é selecionado dogrupo que consiste de pancreatite, doença de Crohn, colite ulcerativa,síndrome do intestino irritável e diverticulite.

33. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2, a dita condiçãosendo uma condição pulmonar, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que a condição pulmonar é selecionada do grupo que consiste desíndrome da angústia respiratória aguda, lesão pulmonar aguda relacionadacom transfusão, lesão pulmonar aguda de isquemia/reperfusão, doençapulmonar obstrutiva crônica, asma, granulomatose de Wegener, doença demembrana de base antiglomerular (doença de Goodpasture), síndrome daaspiração de mecônio, síndrome da bronquiolite obliterativa, fibrose pulmonaridiopática, lesão pulmonar aguda secundária à queimadura, edema pulmonarnão cardiogênico, depressão respiratória relacionada com a transfusão eenfisema.

35. Método para inibir a ativação de complemento dependentede MASP-2 em um indivíduo que tenha passado, esteja passando ou passarápor um procedimento de reperfusão extracorporal, caracterizado pelo fato deque compreende administrar uma quantidade de um agente inibidor deMASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o procedimento de reperfiisão extracorporal é selecionado dogrupo que consiste de hemodiálise, plasmaferese, leucoferese, oxigenador demembrana extracorporal (ECMO), precipitação de LDL na oxigenação demembrana extracorporal induzida por heparina (HELP) e desviocardiopulmonar (CPB).

37. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2, a dita condiçãosendo uma condição musculoesqueletal, caracterizado pelo fato de quecompreende administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que a condição musculoesqueletal é selecionada do grupo queconsiste de osteoartrite, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, gota,artropatia neuropática, artrite psoriática, espondiloartropatia, artropatiacristalina, distrofia muscular e lupus eritematoso sistêmico (SLE).

39. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2, a dita condiçãosendo uma condição renal, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a condição renal é selecionada do grupo que consiste deglomerulonefrite mesangioproliferativa, glomerulonefrite membranosa,glomerulonefrite membranoproliferativa (glomerulonefrite mesangiocapilar),glomerulonefrite pós infecção aguda (glomerulonefrite pós estreptocócica),glomerulonefrite crioglobulinêmica, nefrite de lupus, nefrite púrpura deHenoch-Schonlein e nefropatia de IgA.

41. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2, a dita condiçãosendo uma condição de pele, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que a condição de pele é selecionada do grupo que consiste depsoríase, dermatoses bolhosas autoimunes, espongiose eosinofílica,penfigóide bolhoso, epidermólise bolhosa adquirida, herpes gestacional, lesãopor queimadura térmica e lesão por queimadura química.

43. Método para inibir a ativação de complemento dependentede MASP-2 em um indivíduo que tenha passado, esteja passando ou passarápor um procedimento de transplante de órgão ou tecido, caracterizado pelofato de que compreende administrar uma quantidade de um agente inibidor deMASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP--2.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que o procedimento de transplante é selecionado do grupo queconsiste de alotransplante de órgão, xenotransplante de órgão, enxerto deórgão e tecido.

45. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2 associada comum distúrbio ou lesão do sistema nervoso, caracterizado pelo fato de quecompreende administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2eficaz para inibir a ativação de complemento de dependente de MASP.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que o distúrbio ou lesão do sistema nervoso são selecionados dogrupo que consiste de esclerose múltipla, miastenia grave, doença deHuntington, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Guillain Barre,reperfusão seguinte ao acidente vascular cerebral, discos degenerativos,trauma cerebral, mal de Parkinson, mal de Alzheimer, síndrome de Miller-Fisher, trauma e/ou hemorragia cerebrais, desmielinização e meningite.

47. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2 associada comum distúrbio sangüíneo, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que o distúrbio sangüíneo é selecionado do grupo que consiste desepticemia, septicemia severa, choque séptico, síndrome da angústiarespiratória aguda que resulta de septicemia, síndrome da respostainflamatória sistêmica, choque hemorrágico, anemia hemolítica, púrpuratrombocitopênica trombótica autoimune e síndrome urêmica hemolítica.

49. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2 associada comuma condição urogenital, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizadopelo fato de que a condição urogenital é selecionada do grupo que consiste dedoença da bexiga dolorosa, doença da bexiga sensitiva, cistite não bacterianacrônica, cistite intersticial, infertilidade, disfunção placentária e aborto e pré-eclâmpsia.

51. Método para tratar um indivíduo que sofre de umacondição mediada por complemento dependente de MASP-2 associada comdiabete em não obeso (diabete Tipo 1 ou diabete melito dependente deinsulina) e/ou complicações associadas com a diabete do Tipo 1 ou do Tipo 2(início na idade adulta), caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz parainibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizadopelo fato de que a complicação associada com a diabete do Tipo 1 ou Tipo 2 éselecionada do grupo que consiste de angiopatia, neuropatia e retinopatia.

53. Método para inibir a ativação de complemento dependentede MASP-2 em um indivíduo que tenha passado, esteja passando ou passarápor tratamento quimioterapêutico e/ou terapia de radiação, caracterizado pelofato de que compreende administrar uma quantidade de um agente inibidor deMASP-2 eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

54. Método para tratar um indivíduo que sofre de umamalignidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar umaquantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação decomplemento dependente de MASP-2.

55. Método para tratar um indivíduo que sofre de um distúrbioendócrino, caracterizado pelo fato de que compreende administrar umaquantidade de um agente inibidor de MASP-2 eficaz para inibir a ativação decomplemento dependente de MASP-2.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizadopelo fato de que o distúrbio endócrino é selecionado do grupo que consiste detireoidite de Hashimoto, estresse, ansiedade, distúrbios hormonais queenvolvem a liberação regulada de prolactina, fator de crescimento ou outrofator de crescimento equivalente à insulina e adrenocorticotropina dapituitária.

57. Método para tratar um indivíduo que sofre de condiçãooftalmológica mediada por complemento, caracterizado pelo fato de quecompreende administrar uma quantidade de um agente inibidor de MASP-2eficaz para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizadopelo fato de que a condição oftalmológica é a degeneração macularrelacionada com a idade.