BRPI0710054A2 - métodos para identificar um ou uma pluralidade de metabólitos celulares, para triar um composto de teste, para testar um composto de teste, e, perfil de biomarcador para identificar um composto de teste como um composto tóxico - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA IDENTIFICAR UM OU UMA PLURALIDADE DE METABóLITOS CELULARES, PARA TRIAR UM COMPOSTO DE TESTE E PARA TESTAR UM COMPOSTO DE TESTE, E, PERFIL DE BIOMARCADOR PARA IDENTIFICAR UM COMPOSTO DE TESTE COMO UM COMPOSTO TóXICO A invenção provê perfis de biomarcador de metabólitos celulares e métodos para triar compostos químicos incluindo agentesfarmacêuticos, compostos de fármacos de ponta e candidatos e outros produtos químicos usando células-tronco embriónicas humanas (hESC) ou células específicas de linhagem produzidas a partir das mesmas. Os métodos da invenção são utilizáveis para testar a toxicidade, particularmente toxicidade desenvolvimental, e detectar os efeitos teratogênicos destes compostos químicos.

Description

"MÉTODOS PARA IDENTIFICAR UM OU UMA PLURALIDADE DEMETABÓLITOS CELULARES, PARA TRIAR UM COMPOSTO DETESTE, PARA TESTAR UM COMPOSTO DE TESTE, E, PERFIL DEBIOMARCADOR PARA IDENTIFICAR UM COMPOSTO DE TESTECOMO UM COMPOSTO TÓXICO"

Este pedido reivindica o benefício de prioridade de pedidos depatente provisória US, números de série 60/790.647, depositado em 10 deabril de 2006, e 60/822.163, depositado em 11 de agosto de 2006, cujosconteúdos são incorporados aqui por referência.

Fundamentos da invençãoCampo da invenção

Esta invenção provê métodos para a triagem toxicológica defármacos e outros compostos químicos. A invenção especificamente provêreagentes que são células-tronco embriônicas humanas (hESC) ou célulasespecíficas de linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais,células precursoras neurais e células neurais, assim como a métodos para usarestas células para detectar toxicidade desenvolvimental ou efeitosteratogênicos de compostos farmacêuticos e outros produtos químicos . Maisparticularmente, a invenção provê um meio in vitro para analisar a toxicidadede compostos previsores de sua toxicidade durante o desenvolvimentohumano. Biomarcadores previsores candidatos para efeitos tóxicos outeratogênicos são identificados e aqui providos.

Fundamentos da invenção

Os defeitos congênitos são a causa principal de morbidezinfantil nos Estados Unidos, afetando 1 em cada 33 recém-nascidos (Brent &Beckman, 1990, Bull NY Acad Med 66: 123-63; Rosano et al, 2000, JEpidemiology Community Health 54:660-66), ou 25 aproximadamente125.000 recém-nascidos por ano. Entende-se que a toxicidadedesenvolvimental pode causar defeitos congênitos e pode gerar letalidadeembriônica, restrição ao crescimento intra-uterino (IUGR), dismorfogenese(como má formações esqueletais), e toxicidade funcional, que podem levar adistúrbios cognitivos como autismo. Existe uma preocupação crescente sobreo papel que a exposição a produtos químicos pode desempenhar no iníciodestes distúrbios. De fato, estima-se que 5% a 10% de todos os defeitoscongênitos são causados por exposição uterina a agentes teratogênicosconhecidos (Beckman & Brent, 1984, Annu Rev Pharmacol 24: 483-500).

Existe a preocupação de que a exposição a produtos químicospode estar desempenhando um papel significante e evitável na ocorrência dosdefeitos congênitos (Cláudio et al, 2001, Environm Health Perspect 109:A254-A261). Esta preocupação tem sido difícil de avaliar, no entanto, porquea técnica não dispõe de um modelo robusto e eficiente para testar a toxicidadedesenvolvimental para os mais do que 80.000 produtos químicos no mercado,mais os novos 2.000 compostos introduzidos anualmente (GeneralAccounting Office (GAO), 1994, Toxie Substanees Control Aet: PreliminaryObservações on Legislative Mudanças to Make TSCA More Effeetive,Testimony, 07/13/94, GAO/T-RCED-94-263). Menos do que 5% destescompostos foram testados para as conseqüências na reprodução e mesmomenos para a toxicidade desenvolvimental (Environmental Protective Agency(EPA), 1998, Chemical Hazard Data Availability Study, Office of PollutionPrevention and Toxins). Apesar de algumas tentativas terem sido feitas parausar sistemas de modelo animal para avaliar a toxicidade (Piersma, 2004,Toxicology Letters 149: 147-53), diferenças inerentes na sensibilidade dehumanos in utero tem limitado a utilidade previsora destes modelos.Desenvolvimento de sistema de modelo de células com base em humanosteria um enorme impacto no desempenho de fármacos e a avaliação de riscodos produtos químicos.

Toxicidade, particularmente toxicidade desenvolvimental, étambém um obstáculo principal na progressão de compostos através doprocesso de desenvolvimento de fármacos. Atualmente, o teste de toxicidadeé conduzido em modelos de animais como um meio para prever os efeitosadversos de exposição ao composto, particularmente no desenvolvimento eorganogenese em embriões e fetos humanos. Os modelos os maisprevalecentes que contribuem para a aprovação pelo FDA de novos fármacosinvestigacionais são os estudos com animais completos em coelhos e ratos(Piersma, 2004, Toxicology Letters 149:147-53). Os estudos in vivo sebaseiam na administração de compostos a animais grávidos em diferentesestágios de gravidez e desenvolvimento embriônico / fetal (primeira semanade gestação, estágio de organogenese e extensão completa da gestação). NOentanto, estes modelos de animais in vivo são limitados por uma falta derobustez entre as respostas do animal e do humana a compostos químicosdurante o desenvolvimento. As diferenças entre espécies são com freqüênciamanifestadas em tendências como a sensibilidade à dose e processamentofarmacocinético de compostos. Atualmente, os modelos de animais sãoapenas 50% eficientes em prever a desenvolvimental resposta humana acompostos (Greaves et al, 1004, Nat Rev Drug Discov 3 :226-36). Assim, osmodelos in vitro previsores dirigidos a humanos apresentam umaoportunidade para reduzir os custos do desenvolvimento de novos fármacos epermitir fármacos mais seguros.

Os modelos in vitro tem sido empregados na indústria defármacos há mais de 20 anos (Huuskonen, 2005, Toxicology & AppliedPharm 207:S495-S500). Muitos dos testes in vitro atuais envolvem osmodelos de diferenciação usando culturas de células primárias ou linhagensde células imortalizadas (Huuskonen, 2005, Toxicology & Applied Pharm207:S495- S500). Infelizmente, estes modelos diferem de modo significantede suas contra-partes in vivo em sua capacidade de avaliar com precisão odesenvolvimento da toxicidade. Em particular, a iniciativa ECVAM(European Center for Validation of Alternative Methods) tem usado células-tronco embriônicas de camundongo como um sistema de triagem paratoxicologia desenvolvimental previsora. O teste de células-tronco embriônicas(EST) tem mostrado resultados muito promissores, com uma correlaçãoestatisticamente significante de 78% aos estudos in vivo, e o teste foi capaz dediferenciar teratogênios fortes de compostos moderados/ fracos ou nãoembriotóxicos (Spielmann et al, 1997, In Vitro Toxicology H): 119-27). Estemodelo é limitado em parte devido aos pontos finais toxicológicos seremdefinidos somente para compostos que afetam a diferenciação cardíaca. Estemodelo também falha em considerar as diferentes desenvolvimentais entre asespécies dentre os camundongos e humanos, e assim não se dirige de modocompleto à necessidade na técnica para sistemas de modelos específicos para humanos.

Assim, permanece a necessidade na técnica para um método invitro, específico de humanos para determinar de modo confiável a toxicidadedesenvolvimental em agentes farmacêuticos e outros compostos químicos.Também existe a necessidade na técnica para melhor compreender odesenvolvimento humano e sua perturbação por toxinas ou outros agentesdesreguladores do desenvolvimento, para auxiliar no controle clínico dedistúrbios congênitos adquiridos e as muitas doenças que compartilham estasvias bioquímicas, como o câncer.

A presente invenção provê a avaliação de uma pluralidade demoléculas pequenas, preferivelmente secretadas ou excretadas por célulashES ou células específicas de linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, e é determinada ecorrelacionada com um estado de saúde e doença ou insulto. As análisessimilares foram aplicadas a outros sistemas biológicos na técnica (Want et al.,2005 Chem Bio Chem 6: 1941-51), provendo biomarcadores de doença ourespostas tóxicas que podem ser detectadas em fluidos biológicos (Sabatine etal, 2005 Circulation 112:3868-875).Sumário da invenção

A presente invenção provê reagentes e métodos para a triagemin vitro de toxicidade e teratogenicidade de produtos químicos farmacêuticose não farmacêuticos usando células-tronco embriônicas humanas nãodiferenciadas (hESC) ou células específicas de linhagem derivadas de hESC,como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais. Ainvenção provê métodos in vitro específicos de humanos para determinarconfiavelmente toxicidade, particularmente toxicidade desenvolvimental eteratogenicidade, de fármacos e outros compostos químicos usando células-tronco embriônicas humanas (hESCs) ou células específicas na linhagemderivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais ecélulas neurais. Como provido aqui, hESCs ou células específicas nalinhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, célulasprecursoras neurais e células neurais, são utilizáveis para avaliar efeitostóxicos de compostos químicos, particularmente referidos efeitos tóxicos eteratogênicos em desenvolvimento humano, assim superando as limitaçõesassociadas com modelos interespécies de animais. Em particular, a invençãodemonstra que perfis metabólitos de células hES ou células específicas nalinhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, célulasprecursoras neurais e células neurais são alterados em resposta adesreguladores conhecidos de desenvolvimento humano.

A invenção mostra que o metaboloma de hESC é uma fonte debiomarcadores humanos para doença e resposta tóxica. Em formas derealização particulares, exposição de hESC a valproato induziu mudançassignificantes em diferentes vias metabólicas, consistentes com sua atividadeconhecida como um teratogênio humano. Em outras formas de realização,exposição de hESC a níveis variados de etanol induziu significantesalterações em vias metabólicas consistentes com efeitos conhecidos do álcoolem desenvolvimento fetal.Em um aspecto, a invenção provê métodos para usar células-tronco embriônicas humanas pluripotentes não diferenciadas (hESC) oucélulas específicas de linhagem derivadas de hESC, como células-tronconeurais, células precursoras neurais e células neurais, para uma avaliação invitro . Em métodos da invenção, nESCs não diferenciadas ou célulasespecíficas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais,células precursoras neurais e células neurais são expostas um composto detestes, preferivelmente em concentrações refletivas de níveis em vivo ou emníveis encontrados em circulação maternal. Outras formas de realização desteaspecto da invenção provêem a determinação da capacidade do composto deteste de induzir a diferenciação de hESC pluripotente em tipos de célulasparticulares. Em outras formas de realização, os métodos da invenção sãoprovidos usando células não limitadas à linhagem pluripotentes. O benefíciode usar células-tronco pluripotentes é que elas permitem a análise deresposta(s) tóxica(s) global(ais) e são isoladas do alvo fisiológico detoxicidade desenvolvimental, isto é o embrião humano. Além disso, porqueestas células não diferenciaram em linhagem específica, o potencial parafalsos negativos é reduzido. Em ainda outras formas de realização sãoprovidos métodos usando células específicas na linhagem derivadas de hESC,como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais,para avaliar toxicidade e particularmente toxicidade desenvolvimental eteratogenicidade.

Em outro aspecto a invenção provê métodos para identificarbiomarcadores previsores de respostas tóxicas a compostos químicos,particularmente produtos químicos farmacêuticos e não farmacêuticos, eparticularmente a teratogênios conhecidos. Em formas de realização desteaspecto, um conjunto dinâmico representativo de uma pluralidade demetabólitos celulares, preferivelmente secretados ou excretados por célulashES ou células específicas de linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, é determinado ecorrelacionado com estado de saúde e doença ou de insulto tóxico. Osmetabólitos celulares de acordo com este aspecto da invenção geralmenteestão na faixa de cerca de 10 a 15 cerca de 1500 Daltons, maisparticularmente de cerca de 100 a cerca de 1000 Daltons, e incluem mas nãosão limitados a compostos como açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos,ácidos graxos e compostos de baixo peso molecular de sinalização. Referidosperfis de biomarcadores são diagnósticos para toxicidade de compostosquímicos, particularmente produtos químicos farmacêuticos e nãofarmacêuticos, que participam em e revelam mecanismos funcionais deresposta celular a insulto químico patológico ou tóxico, assim servindo comobiomarcadores de doença ou resposta tóxica que podem ser detectados emfluidos biológicos. Em formas de realização particularmente preferidos desteaspecto da invenção, estes biomarcadores são utilizáveis para identificar viasmetabólicas ativas (ou ativadas), após as mudanças moleculares previstas,inter alia, por outros métodos (como transcriptômicos e proteômicos).

A invenção assim também provê biomarcador e pluralidade debiomarcadores, em alguns casos associados com metabólitos de viasmetabólicas particulares, que são indicativos de insultos tóxicos outeratogênicos. Referidos marcadores como providos pela invenção são usadospara identificar insultos tóxicos e teratogênicos, e em formas de realizaçãoparticulares são usados para caracterizar a quantidade ou extensão de referidoinsulto ao estarem correlacionados com a quantidade ou a extensão de umbiomarcador particular ou pluralidade de biomarcadores detectados em meiosde cultura de células. Em formas de realização particulares, a referidapluralidade de biomarcadores provendo um padrão diagnóstico de insultostóxicos e teratogênicos, mais particularmente identificando uma ou umamultiplicidade de vias metabólicas específicas compreendendo metabólitosdetectados após os insultos tóxicos e teratogênicos.A presente invenção é vantajosa comparada com inter alia omodelo de camundongo ECVAM porque o teste de toxicidade e identificaçãodo biomarcador são realizados com células humanas, especificamente células-tronco embriônicas humanas (hESC). Células-tronco embriônicas humanassão capazes de recapitular a organogenese de mamíferos in vitro (Reubinoff etal, 2000, Nature Biotechnology 18:399-404; He et al., 2003, Cire Res 93:32-9; Zeng et al., 2004, Stem-Cells 22:925-40; Lee et al., 2000, MoI Genet Metab86:257-68; Yan et al., 2005, Stem-Cells 22:781-90) porque elas são célulaspluripotentes e de auto-renovação. Assim, hESCs podem revelar mecanismosde toxicidade, particularmente toxicidade desenvolvimental, e identificar asvias desenvolvimentais que são particularmente sensíveis aos produtosquímicos durante o desenvolvimento humano inicial. O modelo embriônico"humano para humano" provido pelos métodos inventivos descritos aquipermite uma melhora compreensão das vias associados com toxicidadedesenvolvimental, como este é um sistema desenvolvido diretamente doorganismo alvo, assim como sendo um teste mais sensível e preciso para o forinsulto tóxico ou teratogênico em desenvolvimento humano.

Os métodos da invenção provêem outras vantagens emidentificar biomarcadores importantes para toxicidade e teratogenicidade portriagem funcional de hESCs ou células específicas na linhagem derivadas dehESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e célulasneurais. Estes biomarcadores com vantagem identificam vias metabólicas ecelulares e mecanismos de toxicidade, particularmente toxicidadedesenvolvimental. Importantemente, estes biomarcadores também podemauxiliar na avaliação dos efeitos tóxicos de produtos químicos sobre oembrião humano em desenvolvimento.

Em ainda outro aspecto da invenção, produtos celularessecretados ou excretados diferencialmente detectados identificados pormétodos da invenção incluem os associados com distúrbios e alteraçõesneurodesenvolvimentais em via metabólicas associadas, e incluem mas nãosão limitados a quinurenina, glutamato, ácido piroglutâmico, 8-metoxiquinurenato, N'-formilquinurenina 5-hidroxitriptofano, N-acetil-D-triptofano e outros metabólitos em vias metabólicas triptofano e glutamato.

A toxicidade funcional na vida pós-natal pode ser previstausando hESC porque células diferenciadas com propriedades in vivo críticaspodem ser geradas in vitro . hESCs podem ser usados para produzir célulasespecíficas de linhagem, incluindo células-tronco específicas de linhagem,células precursoras e células terminalmente diferenciadas, provendo nasmesmas populações enriquecidas de células tipicamente presentes in vivo emmisturas de diferentes tipos de células compreendendo tecidos. A invençãoassim provê métodos para usar hESCs para produzir estas populaçõesenriquecidas e específicas de estado de desenvolvimento de células para atriagem da toxicidade de compostos químicos, particularmente fármacos,compostos de ponta para fármacos e compostos candidatos emdesenvolvimento de fármacos, para identificar as toxicidades específicas parahumanos dos referidos compostos químicos. Estes aspectos dos métodos dainvenção são vantajosos com relação aos sistemas de modelos de animais invitro e in vivo reconhecidos na técnica.

As formas de realização específicas preferidas da presenteinvenção serão evidentes a partir da seguinte descrição mais detalhada dealgumas formas de realização preferidas e as reivindicações.

Breve descrição dos desenhos

Estes e outros objetos e aspectos da invenção serão melhorentendidos a partir da seguinte descrição detalhada tomada em conjunto comos desenhos em que:

Figuras IA a IC são perfis de biomarcadores de metabólitoscelulares secretados produzidos após contato de hESCs com 1 mM valproato.

Estes perfis foram produzidos usando cromatografia de líquido/tempo deionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo devôo (TOF)(LC/ESI-TOF-MS) após tratamento das células com valproatodurante 24 horas (Figura IA), quatro dias (Figura IB) e oito dias (Figura 1C).As moléculas pequenas secretadas a partir de células-tronco embriônicashumanas tratadas (azul ) e não tratadas (vermelho) foram medidas.

Figuras 2A a 2D são perfis de biomarcadores de metabólitoscelulares secretados/excretados produzidos após contato de hESCs com 1 mMvalproato. Estes perfis foram produzidos usando cromatografia de líquido/tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massa portempo de vôo (LC/ESI-TOF-MS) após tratamento das células com valproatodurante 24 horas (Figura 2A), quatro dias (Figura 2B), oito dias (Figura 2C), eperfis metabólicos comparativos de células hES (azul ) e meio condicionado(amarelo) (Figura 2D).

Figuras 3A a 3D são fotomicrografias de morfologia celularmostrando as células-tronco embriônicas pluripotentes após uma culturaprolongada. O marcador Oct-4 foi retido em um modo similar como controlesnão tratados (Figura 3A=5 dias valproato, Figura 3B=5 dias controle, Figura3C-8 dias valproato, Figura 3D-8 dias controle).

Figura 4 mostra os resultados de espectrometria de massacomparativa na presença de padrões químicos confirmando a identidadequímica de ácido fólico (massa exata 441,14), ácido piroglutâmico (massaexata 129.04), glutamato (massa neutra exata 147,05) e quinurenina (massaexata 208,08).

Figura 5 representa a via de metabolismo de quinurenina detriptofano em humanos (Wang et ai., 2006, J Biol Chem 281, 22021-22028,publicado eletronicamente em 5 de junho de 2006).

Figura 6 ilustra um agrupamento hierárquico de diferenças demudanças de vezes de massas únicas de 22.573 e é representativo deexperimentos independentes múltiplos em que hESCs e precursores neuraisproduzidos a partir de hESCs foram tratadas com 1 mM valproato. Célulasnão embriônicas (fibroblastos humanos) foram usados como controles (dadosnão mostrados). As mudanças de duplicações positivas são vermelhas, asmudanças de duplicações negativas são verde, e os dados faltando são cinza.

Figura 7 mostra a expressão relativa de enzimas nas vias desíntese de quinurenina e serotonina em células hES. INDO, indolamina 2,3dioxigenase, TDO ou TD02, triptofano 2,3-dioxigenase. (TD02 foi reguladode modo positivo em células hES tratadas com valproato em comparação acontroles.) AFMID, arilformamidase, TPH1, triptofano hidroxilase, AADAT,aminoadipato aminotransferase, KYNU, quinunreninase, GAPDH,gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, gene de controle doméstico. KMO,quinurenina 3-monooxigenase, não foi expressado em células tratadas comvalproato ou controles.

Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas

A invenção provê reagentes, incluindo células-troncoembriônicas humanas hESC) ou células específicas na linhagem derivadas dehESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e célulasneurais produzidas a partir das mesmas, para avaliar a toxicidadedesenvolvimental usando o metaboloma de células-tronco embriônicashumanas. Células-tronco embriônicas humanas são células pluripotentes, deauto-renovação isoladas diretamente de embriões humanos pré-implante querecapitulam a organogenese in vitro . As células precursoras específicas delinhagem são derivadas de células hES e entraram em uma linhagem celularespecífica, mas ainda permanecem multipotentes com relação ao tipo celulardentro da linhagem específica. Por exemplo, precursores neurais estãocomprometidos com a diferenciação neural mas ainda permanecem nãolimitados com relação a seu tipo de célula neural. Também estão dentro doescopo dos métodos inventivos os tipos de células terminalmentediferenciadas, como neurônios. As vias bioquímicas do desenvolvimentohumano e doenças são ativas em hESCs e ou células específicas na linhagemderivadas de hESC, porque elas recapitulam a diferenciação em célulassomáticas funcionais. A desregulação destas vias durante o desenvolvimentocontribuiu para distúrbios como defeitos do tubo neural (NTDs) e prejuízocognitivo. Os agentes ambientais, ou seja os produtos químicos ou fármacos,participam na ontogênese de alguns distúrbios congênitos adquiridos. Aquestão de quais vias durante o desenvolvimento humano inicial sãoparticularmente suscetíveis aos efeitos do ambiente permanece não resolvida.

O metaboloma, definido como o conjunto dinâmico total demetabólitos celulares presentes em células, é um produto de estados de saúdeou doença/insulto. Metabolômica é particularmente sensível aos efeitosambientais em comparação com outras áreas de estudo "ômicas", comogenômica e proteômica. Os metabólitos celulares incluem mas não sãolimitados a açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos e ácidos graxos,particularmente as espécies secretadas ou excretadas das células, queparticipam nos mecanismos funcionais de uma resposta celular a insultopatológico ou químico. Estes metabólitos celulares servem comobiomarcadores de doença ou resposta tóxica e podem ser detectados emfluidos biológicos (Soga et al, 2006, J Biol Chem 281:16768-78; Zhao et al.,2006, Birth Defects Res A Clin Mol Teratol 76'-230-6), incluindo meios decultura de hESC. Importante, o perfil metabolômico pode confirmar asmudanças funcionais que são com freqüência previstas por transcriptômica eproteômica.

No entanto, porque se sabe que as hESCs são altamentesensíveis a microambiente da cultura (Levenstein et al., 2005, Stem cells 24:568-574; Li et al, 2005, Biotechnol Bioeng 91_:688-698.), sua aplicação comouma fonte de biomarcadores previsores em resposta a compostos químicos,incluindo toxinas, teratogênios e particularmente agentes farmacêuticos,compostos de ponta de fármaco e compostos candidatos no desenvolvimentode fármacos, e sua utilidade no estabelecimento de modelos in vitro de doençae desenvolvimento era incerta, inter alia, porque os versados na técnicapodem antecipar que a exposição a um produto químico exógeno seriaaltamente prejudicial à sobrevivência das células hES e excluíram a obtençãode informação utilizável a partir das mesmas. Esta preocupação acaboudemonstrada como não sendo justificada.

Como usado aqui, o termo "células-tronco embriônicashumanas (hESCs)" se destina a incluir células-tronco não diferenciadasoriginalmente derivadas da massa celular interna de blastócitos emdesenvolvimento e especificamente células-tronco pluripotentes, nãodiferenciadas humanas e os tipos de células parcialmente diferenciadas dasmesmas, (por exemplo, progenitores a jusante de hESC diferenciantes). Comoprovido aqui, culturas in vitro de hESC são pluripotentes e não imortalizadase podem ser induzidas para produzir tipos de células específicas de linhageme células diferenciadas usando métodos bem estabelecidos na técnica. Emformas de realização preferidas , hESCs utilizáveis na prática dos métodosdesta invenção são derivadas de blastócitos pré-implantes como descrito porThomson et al., em Patente US de comum propriedade No. 6.200,806. Aslinhagens de células múltiplas hESC estão atualmente disponíveis em dadosde células-tronco nos Estados Unidos e Reino Unido.

Os termos "célula-tronco progenitora," "célula específica delinhagem," "célula derivada de hESC" e "célula diferenciada" como usadosaqui se destinam a englobar células específicas de linhagem que sãodiferenciadas de células hES de modo que as células estão comprometidascom a linhagem específica de potência diminuída. Em algumas formas derealização, estas células precursoras específicas de linhagem permanecem nãodiferenciadas com relação ao tipo de célula final. Por exemplo, células-tronconeuronais são derivadas de hESCs e são diferenciadas o suficiente para secomprometer com a linhagem neuronal. No entanto, o precursor neuronalretém "um rigor" em que ele retém o potencial para se desenvolver emqualquer tipo de célula neuronal. Os tipos de células adicionais incluemcélulas terminalmente diferenciadas derivadas de hESCs ou célulasprecursoras específicas de linhagem, por exemplo células neurais.

O termo " metabólito celular " como usado aqui refere-se aqualquer molécula pequena secretada e/ou excretada por uma hESC oucélulas específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronconeurais, células precursoras neurais e células neurais, produzidas a partir dasmesmas. Em formas de realização preferidas, metabólitos celulares incluemmas não são limitados a açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidosgraxos, hormônios, vitaminas, oligopeptídeos (menos do que cerca de 100aminoácidos de comprimento), assim como os fragmentos iônicos dosmesmos. Células também podem ser lisadas a fim de medir os produtoscelulares presentes dentro da célula. Em particular, referidos metabólitoscelulares tem de cerca de 10 a cerca de 3600 Daltons de peso molecular, maisparticularmente cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons, e ainda maisparticularmente de cerca de 100 a cerca de 1000 Daltons.

hESCs são cultivadas de acordo com métodos da invençãousando métodos padrões de cultura de células bem conhecidos na técnica,incluindo, por exemplo os métodos descritos em Ludwig et al. (2006, :Feeder-independent culture of human embryonic stem cells Nat Methods 3_: 637-46.). Em formas de realização preferidas, hESCs são cultivadas na ausênciade uma camada de células alimentadoras durante a prática dos métodosinventivos; no entanto, hESCs podem ser cultivadas em camada de célulasalimentadoras antes da prática dos métodos desta invenção.

O termo "administrar" como usado aqui refere-se a contarculturas in vitro de hESCs ou células específicas na linhagem derivadas dehESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e célulasneurais produzidas a partir das mesmas, com um composto químico tóxico,teratogênico, ou de teste. Em uma forma de realização preferida a dosagem docomposto é administrada em uma quantidade equivalente aos níveis obtidosou obteníveis in vivo, por exemplo, em circulação materna.

As frases "identificar metabólitos celulares que sãodiferencialmente produzidos' ou "detectar alterações nas células oualternações em atividade celular" como usado aqui incluem mas não sãolimitadas a comparações de células hES tratadas ou células específicas nalinhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, célulasprecursoras neurais e células neurais, a células não tratadas (controle) (isto é,células cultivadas na presença (tratadas) ou ausência (não tratadas) de umcomposto químico tóxico, teratogênico, ou de teste). Detecção ou medida dasvariações em metabólitos celulares, excretados ou secretados dos mesmos,entre células tratadas e células não tratadas está incluída nesta definição. Emuma forma de realização preferida, alterações em células ou atividade celularsão medidas por determinação de um perfil de mudanças em metabólitoscelulares tendo um peso molecular de menos do que 3000 Daltons, maisparticularmente entre 10 e 1500 Daltons, e ainda mais particularmente entre100 e 1000 Daltons, em uma célula tratada versus célula não tratada comoilustrado em Figuras 1A a 1C.

O termo "correlacionar" como usado aqui refere-se àcorrelação positiva ou correspondência de alterações em metabólitos celularesincluindo mas não limitados a açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos,ácidos graxos, e compostos excretados ou secretados de baixo peso molecularde células hES ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, comocélulas-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, para umaresposta tóxica em vivo. Os metabólitos celulares triados podem estarenvolvidos em uma ampla faixa de vias bioquímicas nas células erelacionados com uma variedade de atividades biológicas incluindo, mas nãolimitadas a inflamação, resposta anti-inflamatória, vasodilatação,neuroproteção, estresse oxidativo, atividade antioxidante, replicação de DNA,e controle do ciclo celular, metilação e biossíntese de, inter alia, nucleotídeos,carboidratos, aminoácidos e lipídeos dentre outros. As alterações emsubconjuntos específicos de metabólitos celulares podem corresponder a umavia metabólica ou desenvolvimental particular e assim revelam efeitos de umcomposto de teste no desenvolvimento in vivo.

O termo "método de separação física" como usado aqui refere-se a qualquer método bem conhecido do versado suficiente para produzir umperfil de mudanças e diferenças em moléculas pequenas produzidas emhESCs ou células específicas na linhagens derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, contatadas comum composto químico tóxico, teratogênico ou de teste de acordo commétodos desta invenção. Em uma forma de realização preferida, métodos deseparação física permitem detecção de metabólitos celulares incluindo masnão limitados a açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidos graxos,hormônios, vitaminas, e oligopeptídeos, assim como os fragmentos iônicosdos mesmos e compostos de baixo peso molecular (preferivelmente com umpeso molecular menor do que 3000 Daltons, mais particularmente entre IOe1500 Daltons, e ainda mais particularmente entre 100 e 1000 Daltons). Emformas de realização particulares, esta análise é realizada por cromatografiade líquido/ tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria demassa por tempo de vôo (LC/ESI-TOF-MS), no entanto será entendido que osmetabólitos celulares como especificados aqui podem ser detectados usandométodos alternativos de espectrometria ou outros métodos conhecidos natécnica para analisar estes tipos de compostos celulares nesta faixa detamanho.

Os dados para análise estatística foram extraídos decromatogramas (espectros de sinais de massa) usando o software AgilentMass Hunter (Produto No. G3297AA, Agilent Technologies, Inc., SantaClara, CA); será entendido que os métodos de análise estatística alternativostambém podem ser usados. As massas foram depositadas juntas se elasestavam na faixa de 10 ppm e eluídas em uma janela de tempo de retenção de2 min. Uma massa depositada junto foi considerada como sendo a mesmamolécula através de análises diferentes LC/ESI-TOF-MS (referida aqui como"massa exata," que será entendida como sendo ±10 ppm). O armazenamentodos dados é requerido para análise estatística e comparação de massas atravésda experiência completa. Se picos múltiplos dentro da mesma massa nomesmo tempo de retenção dentre de uma única amostra forem detectados porMass Hunter, eles foram obtidos em média para auxiliar na análise dos dados.

As massas faltando uma distribuição isotópica natural ou com uma relaçãosinal-para-ruído de menos que 3 foram removidas dos dados antes da análise.Um versado na técnica irá notar que os resultados deste teste fornecemvalores relativos que são avaliados de acordo com os valores anotados em 10ppm para dar uma identidade para o peso molecular detectado. Assim, umamudança de massa em 10 ppm é considerado consistente com a determinaçãoda identidade de um metabólito celular específico anotado conhecido natécnica devido às diferenças na fonte de ionização e instrumentação, porexemplo entre diferentes experimentos ou usando diferentes instrumentos.

Como usado aqui, uma mass foi considerada como sendo amesma através de ciclos de LC/ESI-TOF-MS usando um algoritmo simplesque primeiro classifica os dados por massa e tempo de retenção. Após aclassificação, um composto foi considerado singular se ele tinha umadiferença de tempo de retenção menor do que ou igual a três minutos e umadiferença de massa menor do que ou igual à fórmula ponderada (0,000011 χmassa). Se uma série de medidas configurar esta definição, ele foiconsiderado como sendo do mesmo composto. Se ou a massa ou o tempo deretenção variar em mais do que os limites listados acima, ele foi consideradocomo sendo um composto diferente e recebeu uma nova designação única.Os testes de significância foram determinados realizando-seANOVAs nos valores de abundância transformados de base Iog 2 decompostos singulares presentes em meios tratados e não tratados no mesmoponto de tempo. Um projeto de bloco completo randomizado foi usado com omodelo ANOVA incluindo os efeitos de tratamento, experimentos, e umprazo residual, com a seguinte fórmula: Log2 (abundância^)= tratamento, +experimento^, + erro;i.

Os dados faltando foram omitidos do teste mudando os grausde liberdade em vez de considerar que os dados faltando estavam ausentes.Esta suposição foi feita devido ao fato da filtração extensiva realizada pelosoftware Mass Hunter poder perder ou filtrar alguns picos porque eles estãoabaixo de um certo limiar de abundância e não zero. O teste ANOVA F foiconsiderado significante se seu valor ρ for menor que 0,05. As mudanças naduplicação foram calculadas usando a média de mínimos quadrados duranteum tempo dado e tratamento.

O termo "biomarcador" como usado aqui refere-se ametabólitos celulares que demonstram alterações significantes entre controlestratados e não tratados. Em formas de realização preferidas, biomarcadoressão identificados como especificado acima, por métodos incluindo LC/ESI-TOF-MS. Biomarcadores metabolômicos são identificados por suaconsistência e massa molecular única com as quais o marcador é detectado emresposta a um composto químico tóxico, teratogênico ou de teste particular;assim, a identidade real do composto subjacente que corresponde aobiomarcador não é requerida para a prática desta invenção. Alternativamente,alguns biomarcadores podem ser identificados por, por exemplo, análise daexpressão do gene, incluindo PCR em tempo real, RT-PCR, análise Northern,e hibridização in situ, mas estes não estarão geralmente dentro da definição dotermo "metabólitos celulares" como especificado aqui.

O metaboloma basal de nESCs não diferenciadas serviu comouma coleção de assinaturas bioquímicas de vias funcionais que são relevantespara seu caráter tronco e auto-renovação. Os perfis metabólitos foramconduzidos em metabólitos celulares excretados ou secretados como oposto acompostos intracelulares. Por fim, biomarcadores descobertos in viíro sãoesperados como sendo utilizáveis para análise de biofluidos in vivo, comosoro, fluido amniótico, e urina, misturas complexas de biomoléculasextracelulares. Isto é vantajoso em comparação com os procedimentosinvasivos como biopsias de tecido porque as moléculas pequenas embiofluidos podem ser detectadas não invasivamente (em contraste comcompostos intracelulares). Além disso, o processamento do sobrenadantecelular para espectrometria de massa é mais robusto e menos laborioso do queos extratos celulares. No entanto, os extratos celulares (de, por exemplo,células lisadas) podem ser usados nos métodos da invenção.

O termo "perfil do biomarcador" como usado aqui refere-se auma pluralidade de biomarcadores identificados pelos métodos inventivos. Osperfis de biomarcador de acordo com invenção podem prover uma "impressãodigital" molecular dos efeitos teratogênicos e tóxicos de um composto de testee transferir os metabólitos celulares, metabólitos celulares especificamenteexcretados e secretados, que foram alterados de modo significante após aadministração do composto de teste a hESCs ou células específicas nalinhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, célulasprecursoras neurais e células neurais. Nestas formas de realização, cada umdentre uma pluralidade de biomarcadores é caracterizado e identificado porsua massa molecular e consistência singulares com que o biomarcador édetectado em resposta a um composto químico tóxico, teratogênico ou deteste particular; assim a identidade real do composto subjacente quecorresponde ao biomarcador não é requerida para a prática desta invenção.

O termo "portfolio de biomarcador " como usado aqui refere-se a uma coleção de perfis de biomarcadores individuais. Os portfolios debiomarcadores pode ser usado como referências para comparar o perfil debiomarcadores de compostos novos ou desconhecidos. Portfolios debiomarcadores podem ser usados para identificar vias comuns,particularmente vias metabólicas ou desenvolvimentais, de resposta tóxica outeratogênica.

Estes resultados especificados aqui demonstraram que ametabolômica de células-tronco embriônicas humanas, e metabolômica decélulas específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronconeurais, células precursoras neurais e células neurais, podem ser usadas nadescoberta de biomarcadores e identificação de vias. Metabolômicasdetectaram moléculas pequenas secretadas por hESCs ou células específicasna linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, célulasprecursoras neurais e células neurais, produzidas a partir dai e osbiomarcadores identificados podem ser usados para pelo menos dois fins:primeiro para determinar as vias metabólicas ou desenvolvimentaisespecíficas que respondem a ou são afetadas por exposição a toxinas outeratogênios, particularmente as referidas vias utilizadas ou afetadas durante odesenvolvimento inicial, que são sensíveis a compostos químicos tóxicos,teratogênicos ou de teste que são desreguladores desenvolvimentais eparticipam na ontogênese de defeitos congênitos; e segundo, para provermetabólitos celulares que podem ser medidos em biofluidos para auxiliar nocontrole e diagnóstico de exposição a agentes tóxicos, efeitos congênitos ououtras doenças.

Um portfolio de biomarcador de hESCs ou células específicasna linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, célulasprecursoras neurais e células neurais, produzidas a partir dos mesmos podemservir também como uma ferramenta de triagem de produção elevada nasfases pré-clínicas de descoberta de fármacos. Além disso, esta abordagempode ser usada para detectar efeitos prejudiciais de produtos químicosambientais (metais pesados, produtos de refligo industrial) e nutricionais(como álcool) sobre o desenvolvimento humano. Por fim, os métodos destainvenção utilizando o metaboloma de hESC ou o metaboloma de célulasespecíficas de linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais,células precursoras neurais e células neurais, podem auxiliar as agênciasrelacionadas com agentes farmacêuticos, biotecnologia e ambiental na tomadade decisões para o desenvolvimento de compostos e doses criticas para aexposição aos humanos. A integração de biologia química com a tecnologiade célula-tronco embriônica também oferece oportunidades singulares parareformar a compreensão de desenvolvimento humano e doença.

Metabolômica de células diferenciadas de hESC pode servir a papeissimilares e pode ser utilizável para elucidar mecanismos de toxicidade edoença com maior sensibilidade para tipos de células ou tecido particulares eem um modo específico humano. Por exemplo, vias metabólicas chaves,incluindo como especificado aqui síntese e degradação de folato, glutamato etriptofano, podem ser diferencialmente desreguladas em estágios anterioresversus estágios posteriores do desenvolvimento humano. Além disso, perfismetabólitos of células precursoras neurais ou populações de células neuronaispodem revelar biomarcadores de distúrbios neurodesenvolvimentais em tiposde células alvo. A associação de metabolômica a biologia de células-troncopode informar os mecanismos de ação de ácido fólico e defeitos do tuboneural no embrião humano inicial.

Portfolios de biomarcadores produzidos usando os métodosdependentes de hESC e dependentes de células específicas de linhagensderivadas de hESC desta invenção também podem ser usados em métodos detriagem de produção elevada para a avaliação pré-clínica de fármacoscandidatos e compostos de ponta na descoberta de fármacos. Este aspecto dosmétodos inventivos produz um impacto mínimo sobre os recursos da indústriaem comparação com os modelos de toxicologia desenvolvimental atuais,porque a implementação deste tecnologia não requer animais experimentais.O impacto positivo resultante sobre a produtividade permite que as equipes depesquisa na indústria farmacêutica selecionem e antecipem compostos nodesenvolvimento exploratório com uma maior confiança e um riscodiminuído de entrar efeitos desenvolvimentais adversos.

O termo "via desenvolvimental" como usado aqui refere-se avia desenvolvimental ou metabólica em desenvolvimento embriônico e fetal.

"Sobrenadante" como usado aqui por incluir, mas não élimitado a meios extracelulares, meios co-cultivados, células, ou uma soluçãode células fracionadas ou lisadas.

Os perfis metabólitos celulares obtidos da análise de toxinas,teratogênios, álcool, e compostos químicos de teste podem ser usados paracompor uma biblioteca de portfolios de biomarcadores. Estes portfolios entãopodem ser usados como uma referência para a análise toxicológica decompostos químicos desconhecidos. Uma estratégia similar foi validada comoum meio para determinar as mudanças celulares que surgem em resposta aprodutos químicos em sistemas não ESC (Daston & Nacliff, 2005, ReprodToxicology 19:381-94; Fella et al., 2005, Proteomics 5: 1914-21). Os perfismetabólicos de novos compostos podem ser comparados a portfolios debiomarcadores conhecidos para identificar mecanismos comuns de respostatóxica. Esta abordagem pode revelar marcadores funcionais de respostatóxica, que servem como moléculas de triagem que são compartilhadas, pelomenos em parte, como uma conseqüência de exposição a vários compostostóxicos e teratogênicos diferentes. Estas moléculas pequenas derivadas dehESC podem ser usadas com mediadores mensuráveis de resposta tóxica querefinem ou substituem os sistemas de triagem onerosos e complexos (comoem modelos de animais in vivo) e tem a vantagem adicional de seremespecíficos para células humanas e vias metabólicas e desenvolvimentaishumanas.Exemplos

Os exemplos que seguem são ilustrativos de formas derealização específicas da invenção, e vários usos das mesmas. Eles sãoenunciados para fins explanatórios apenas, e não devem ser tomados comolimitação da invenção.

Exemplo 1

Triagem de toxicologia desenvolvimental

Para demonstrar a eficácia de hESCs como um sistema demodelo para teste de toxicidade desenvolvimental, hESCs foram tratadas comum conhecido teratogênio, valproato (VPA). Valproato é um estabilizador dehumor comum e fármaco anti-convulsiva com indicações clínicas emepilepsia e distúrbio bipolar (Williams et al., 2001, Dev Med Child Neuro43:202-6) que foram associados com anormalidades desenvolvimentais(Meador et al., 2006, Neurology 67: 407-412). O mecanismo pelo qualvalproato produz defeitos desenvolvimentais, no entanto, não écompletamente entendido, apesar da suscetibilidade aumentada do sistemanervoso (Bjerkedal et al., 1982, Lance 2j.l09: Wyszynski et al., 2005,Neurology 64_1961-5; Rasalam et al., 2005, Dev Med Child Neuro 47:551-555). Exposição a valproato resulta em um aumento pronunciado em defeitosde espinha bífida e tubo neural (NTDs; Bjerkedal et al., 1982, Lancet 2:109)em dez a vinte vezes os da população geral, bem como distúrbio cognitivocomo autismo (Adab et al., 2004, J Neurol Neurosurg Psychiatry 15 575-83).Entretanto, uma vez que VPA é um fármaco anti-convulsivo com indicaçõesclínicas em epilepsia e distúrbio bipolar (Williams et al., 2001, Dev MedChild Neurol 43:202-06), tratamento geralmente deve ser mantido durantetoda a gravidez.

Suplementação com ácido fólico antes de gravidez reduz aincidência de espinha bífida em 70% (Shaw et al., 1995, Epidemiology 6J219-226) embora seu mecanismo preciso de ação seja desconhecido. Além disso,homocisteína e glutationa também têm sido implicadas em NTDs (Zhao et al.,2006, Birth Defects Res A Clin Mol Teratol 76:230-6). Deste modo, perfismetabólitos de folato e vias relacionadas foram candidatos para mudanças emresposta a valproato. Nos resultados enunciados aqui, ácido fólico foisignificantemente aumentado (por 16%) nos meios de cultura extracelular decélulas hES tratadas com valproato (p =0,022 em oito dias, Tabela 3 e Figura4) mas não seu diidrofolato derivado. Uma vez que células de mamífero nãosintetizam ácido fólico, valproato pode agir interferindo com a absorçãocelular de ácido fólico.

Exposição de hESCs foi realizada como segue. Hl hESCs(passagem 41) foram cultivadas em Matrigel (BD Scientific, San Jose, CA) naausência de uma camada alimentadora. hESCs foram mantidas em meio decultura condicionado (CM) coletado de fibroblastos embriônicos decamundongo (MEFs) (80% DMEM/F12, Invitrogen, Carlsbad, CA) e 20% desubstituição de soro KNOCKOUT (Invitrogen) suplementados com L-glutamina 1 mM (Invitrogen), MEM a 1% de aminoácidos não essenciais(Invitrogen), e 2- mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma, Chemical Co., SL Louis,MO). Antes de alimentar hESCs, o meio de cultura foi suplementado com 4ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico recombinante humano(Invitrogen). hESCs foram passadas quando as fontes foram -80%confluentes. Para passagem, hESCs foram incubadas em uma solução de 1mg/mL de dispase (Invitrogen)/DMEM/F12 por 7-10 minutos a 37 C. Apóseste tratamento, hESCs foram lavadas e semeadas em placas revestidas deMatrigel fresco. Em estudos paralelos descritos aqui, células de Hl e H9foram cultivadas em meio de cultura definido conhecido como TeSR (Ludwiget al., 2006, Id.).

hESCs Hl e H9 (equivalentes a NIH código WA01/WA09)foram tratadas com valproato (VPA) (22μΜ e 1 mM) (Sigma # P4543) deacordo com procedimento resumido abaixo; cada experimento envolveu trêstratamentos com WA separados, e cada grupo de tratamento teve um grupode controle paralelo com um total de seis pratos de cultura de 6 cavidades(Nunc, Naperville, IL) por experimento (dois discos de cultura de 6 cavidadespor tratamento). Tratamento 1 (rotulado 24H) células de hESC expostas a 1mM de VPA (Sigma) durante 24 horas seguidas por coleta de sobrenadante egrânulos de células. Em um segundo grupo de tratamento (rotulado 4D),células de hESC foram expostas a 22μΜ ou 1 mM VPA durante 4 dias ecoletadas no dia 4. Em um terceiro grupo de tratamento (rotulado culturaestendida, EC), células de hESC receberam 22μΜ ou 1 mM VPA durante 4dias seguido por cultura em meios de hESC padrão por quatro dias adicionais.Para este grupo, células e sobrenadante foram coletados no dia oito.

Para avaliar os efeitos de tratamento de VPA teratogênico emhESCs, as células tratadas foram analisadas como especificado abaixo paradeterminar mudanças em um conjunto dinâmico total de moléculas pequenaspresentes em células de acordo com estados de saúde e doença ou de insulto.Moléculas pequenas incluindo mas não limitadas a açúcares, ácidosorgânicos, aminoácidos, ácidos graxos, hormônios, vitaminas, oligopeptídeos(menos do que cerca de 100 aminoácidos em comprimento), bem comofragmentos iônicos dos mesmos e compostos de peso molecular baixo desinalização foram conhecidos como participando em e revelando mecanismosfuncionais de resposta celular a insulto patológico ou químico. Estas análisestambém foram usadas para identificar vias ativas seguindo mudançasmoleculares previstas por outras análises incluindo por exemplotranscriptômica e proteômica.

Sobrenadante de hESCs tratadas com VPA e de controle foisubmetido a cromatografia de líquido e tempo de ionização poreletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo (LC/ESI-TOF-MS) para avaliar mudanças e diferenças em moléculas pequenas (comodefinido aqui) produzidas pelas células na presença e ausência de tratamentode VPA. Sobrenadante foi coletado das placas de controle e tratadas dehESCs a 24H, 4D, e 8D, e CM foi coletado como um controle "semtratamento". O sobrenadante e meios de cultura foram armazenados a -80°Caté preparação para análise de espectrometria de massa. Para análise, amostrasforam preparadas em uma solução de 20% de Acetonitrila (Fisher ScientificCo., Pittsburgh, PA) (compreendendo 500 \xL de sobrenadante, 400μΙ. deacetonitrila e 1,1 mL de água destilada) e centrifugadas através de uma colunade Centricon Millipore 3kDa (Millipore, Billerica, MA) por 3 horas a 4575 χg para remover as proteínas. O fluxo completo foi retido para análise, poiscontinha moléculas pequenas livres de compostos de peso molecular grandecomo proteínas. Em cada análise, três réplicas para cada amostra foraminjetadas em uma coluna de Cl8 de 2,1 χ 200mm usando um gradiente de 90minutos de 5% de Acetonitrila, 95% de Água, 0,1% Ácido Fórmico para100% de Acetonitrila, 0,1% de Ácido Fórmico a uma taxa de fluxo de40μΙ7ηιίη. ESI-TOF-MS (TOF) foi realizada no fluxo completo usando umespectrômetro de massa Agilent ESI-TOF. Dados foram coletados a 100-3600m/z, e particularmente na faixa de 0-1500 m/z. Os dados de material foramanalisados para identificar as moléculas pequenas separadas usando umprograma de compilação e análise de computador (Mass Hunter) fornecidopelo fabricante e de acordo com instruções do fabricante (Agilent; análisesestatísticas foram realizadas como descrito abaixo na Descrição Detalhada eFormas de realização Preferidas. Esta análise gerou listas de aspectos de parescom tempo de retenção/massa exata. Outro programa (Mass Profiler, Agilent)foi usado para comparar conjuntos de ciclos múltiplos para encontrarmudanças de intensidade iônica de aspectos que mudaram entre as condiçõesde amostra. Testes de significância foram determinados executando ANOVAsno valores de abundância transformados de base Iog 2 de compostos únicospresentes em meios tratados e não tratados a cada ponto de tempo.

A pluralidade de moléculas pequenas identificadasusando estes métodos foi então comparada com massa exata etempo de retenção de ESI-TOF-MS usando bases de dados públicas(por exemplo, em http://metlin.scripps.edu.,www.nist.gov/srd/chemistry.htm;http://www.metabolomics.ca/). Análise de espectrometria de massa tambéminclui estruturas químicas previstas de moléculas pequenas baseadas emmassa exata, apesar de bases de dados públicas disponíveis presentemente nãoincluírem, em cada exemplo, moléculas pequenas correspondentes devido àslimitações da base de dados. Além disso, bases de dados privadas maisabrangentes são ' disponíveis para análises comparativas, comoNIST/EPA/NIH Mass Spectral Library: Versão 05. NIST ASCII.

Os resultados destas análises são mostrados em Figuras IA aIC e Figura 2A a 2C. Em Figuras IA a 1C, cada aspecto no gráficocorresponde a uma molécula pequena com massa exata específica e tempo deretenção. Os gráficos resumem diferenças significantes encontradas entregrupos tratados (azul ) e não tratados (vermelho) em diferentes pontos detempo. Como mostrado na Figura, em 24 horas (24H) existia uma regulaçãonegativa consistente das biomoléculas secretadas em células tratadas (azul)em comparação aos controles não tratados (vermelho). Em quatro dias (4D) eoito dias (EC), células tratadas (azul ) secretaram um número maior demoléculas pequenas em comparação com células não tratadas (vermelho);referidas moléculas pequenas foram assim consideradas como biomarcadorescandidatos. Em particular, metabólitos da via folato, incluindo tetraidrofolato(massa exata 444) e diidrofolato (massa exata 441) foram detectados. Estasdescobertas foram consideradas significantes porque elas mostram pelaprimeira vez que hESCs contatadas com um teratogênio conhecido (VPA) quecausa um defeito congênito (espinha bífida) respondeu por uma regulação demodo positivo a uma via metabólica que produz um composto (folato)conhecido como melhorando os efeitos de teratogênio quando administrado auma mulher grávida de um embrião em desenvolvimento ou feto.Além disso, os resultados mostrados em Figuras IA a ICrevelaram aproximadamente 40 moléculas pequenas que estavam ausentes emgrupos tratados, sugerindo que vias celulares múltiplas foram "silenciadas"em resposta a VPA em 24 horas em comparação com controles não tratados.Em quatro e oito dias após tratamento, entretanto, candidatos debiomarcadores múltiplos foram regulados de modo positivo em células-troncoembriônicas humanas tratadas versus não tratadas; estes resultados sãomostrados em Tabela 1. biomarcadores candidatos foram identificados comomoléculas pequenas mostrando uma mudança em células tratadas versuscélulas não tratadas medidas como tendo uma diferença de pelo menos duasvezes. Em muitos exemplos, estas moléculas pequenas estão ausentes oudetectadas em concentrações muito baixas em células-tronco embriônicashumanas não tratadas.

Esses estudos demonstraram que os métodos reivindicadospara avaliar a toxicidade desenvolvimental e a identificação de biomarcadoresusando hESCs proveu informação robusta em mudanças em teor de moléculapequena de células em resposta a serem contatadas com um teratogênioconhecido, VPA. Os resultados relativos a um composto (VPA) que estáenvolvido na etiologia de espinha bífida e defeitos de tubo neural(NTDs)(Bjerkedal et al., 1982, Lancet 2: 109) quando exposto a umconceptus humano em desenvolvimento são particularmente surpreendentes.Os resultados mostrados aqui indicaram um aumento marcado (2 a 8 vezes)em metabólitos chave da via de folato (ácido diidrofólico, ácidotetraidrofólico, S-adenosilmetionina) seguindo tratamento com VPA (emcomparação com células não tratadas). Estes métodos foram reproduzíveis,tendo sido repetidos com resultados consistentes obtidos em três estudosindependentes usando hESCs e em células não embriônicas (fibroblastoshumanos) como controles (dados não mostrados), e sugeriram um respostaadaptiva até agora desconhecida do feto para o insulto químico/ambiental eidentificaram marcadores sensíveis para referido(s) insulto(s).

O mecanismo para defeitos desenvolvimentais de VPA,entretanto, não é completamente entendido apesar do fato de que o sistemanervoso é particularmente sensível a seus efeitos (Bjerkedal et al, 1982,Lancet 2:109; Narita et al, 2000, Pediatric Res 52:576-79; Rasalam et al.,2005, Dev Med Child Neurol 47:551-55). Suplementação com ácido fólicoantes de gravidez previne a incidência de espinha bífida em 70% (Shaw et al.,1995, Epidemiology 6:219-226), apesar do mecanismo exato de ação sertambém desconhecido. A informação obtida aqui pode ser usada para elucidarmecanismos de ação de ácido fólico e defeitos de tubo neural no embriãohumano inicial. Estes métodos também podem ser aplicados a outrosteratogênios conhecidos, como ácido retinóico, warfarina, e talidomida(Franks et al., 2004, Lancet 363: 1802-11) para validar a habilidade previsorade hESCs usando os métodos da invenção.

Tabela 1 : Moléculas pequenas candidatas (biomarcadores) de toxicidadedesenvolvimental detectadas em células-tronco embriônicas humanas nãodiferenciadas tratadas com 1 mM valproato em comparação com controlesnão tratados.

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RT= tempo de retenção

A detecção de molécula pequena foi conduzida com LC/ESI-TOF-MS em amostrastriplicadas de sobrenadantes processadas independentemente.

Como discutido acima, perfis metabólitos foram determinadosem 24 horas, quatro dias e oito dias após tratamento com valproato. Emquatro dias após tratamento, biomarcadores candidatos múltiplos foramregulados de modo positivo em células-tronco embriônicas humanas tratadasversus não tratadas (mostrado em Figuras 2A a 2C). Além dos resultadosenunciados acima com respeito a níveis aumentados de alguns metabólitos,picos de metabólitos múltiplos foram regulados de modo negativo emresposta a valproato em 24 horas em comparação com controles não tratados(Figuras 2A a 2C).

hESCs foram cultivadas em meio condicionado de fibroblastosembriônicos de camundongo, que geraram 1277 dos 3241 compostosmedidos. Muitos metabólitos em desenvolvimento de humanos e doençasestão provavelmente presentes em meio condicionado de fibroblastosembriônicos de camundongos devido às vias metabólicas comuns. Ainvestigação rigorosa é requerida para validar biomarcadores candidatos quenão são exclusivos para hESCs e também estão presentes nos meios.

Exemplo 2

Análise de Expressão de Gene

A eficácia de uma análise mostrada no Exemplo 1 foiconfirmada pelos estudos de expressão de gene, em que mudanças emexpressão de genes foram observadas seguindo tratamento com VPA dehESCs. Tratamento com YPA não foi prejudicial a hESCs, que se mantiveramviáveis para passagens múltiplas após a exposição a teratogênio, assimpossibilitando análise de expressão de genes a ser realizada.

Células WAOl de hES código Hl/NIH tratadas e de controle(passagem 41) foram analisadas por PCR de tempo real, e cada grupo detratamento foi dividido aos pares com um grupo de controle correspondenteque recebeu a combinação de meios de cultura de crescimento padrão deCM+bFGF sem VPA. Nesses estudos, RNA celular total foi extraído decélulas coletadas em 24 horas (24H), 4 dias (4D) e 8 dias (EC) usando o KitRNA Easy (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Níveis de expressão de genes de teste candidatos e um gene"housekeeping" (Beta-2- microglobulina) foram avaliados por PCR de temporeal quantitativo usando um sistema de detecção DNA Motor-Opticon 2 (MJResearch, Watertown, MA). O gene "housekeeping" atua como um controleinterno para normalização de níveis de RNA. Os iniciadores usados parareações de PCR em tempo real foram projetados usando software BeaconDesigner (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA). RNA foi transcritoreverso usando kit de síntese de cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA), emque cada reação de síntese de cDNA (20 μL) incluiu 4 μL de 5x mistura dereação iScript, 1 μL, de transcriptase reversa iScript, e 2 μL, de RNA. PCR foirealizado em cDNA em misturas de reação de PCR (25 μL.) cada contendo12,5 μL de Supermix (contém dNTPs, taq DNA polimerase, SYBR Green I, efluorescina), 250 nM de iniciador dianteiro, 250 nM de iniciador reverso, e1,6 μL de produtos de RT-PCR. Análise de curva de fusão e de eletroforesede gel de agarose foram realizadas após reação de PCR de tempo real paramonitorar a especificidade de PCR, em que os produtos de PCR foramdetectados com SYBR Green I usando o Kit iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad).

Quantificação da expressão relativa de PCR de tempo real foirealizada usando o método 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001, Methods25:402-8), e um modelo linear geral foi empregado para se adequar aos dadosde expressão. O procedimento PROC GLM em SAS (versão 8,2; SASInstitute, Cary, NC) foi usado para estimar as médias de mínimos quadradosem expressão entre hESCs tratadas e não tratadas e P < 0,05 foi consideradoestatisticamente significante.

PCR de tempo real foi conduzido em amostras de 24 horas(24H), 4 dias (4D) 25 e 8 dias (EC) após tratamento com VPA para investigaros níveis de expressão de reguladores epigenéticos (tais como DNAmetiltransferase-1, DNMT-1, BMI-1, EED) e fatores de transcrição críticosresponsáveis por padronização embriônica e neurodesenvolvimento (RUNX2,BMP7, FGF8, CBX2, GLI3, SSH e SP8) em células-tronco embriônicashumanas. Estes experimentos mostraram que hESCs tratadas com VPA foramsubmetidas a mudanças marcadas em sua atividade transcripcional após otratamento com teratogênio. VPA induziu regulação de modo negativoespecialmente marcada (2 a 30 vezes) de níveis de transcrição logo em 24horas após exposição em todos genes testados (com a exceção de DNMT-I eShh). Em 4 dias após tratamento, entretanto, expressão da DNAmetiltransferase-1 ubíqua foi quase abolida, e "sonic hedgehog", que éabsolutamente crítico para neurogenese (Ye et al, 1998, Cell 93:755-66), foiregulado de modo negativo cinco vezes em comparação com controles nãotratados. Em 8 dias após tratamento de VPA, a maioria dos genes foramregulados de modo positivo em comparação com controles não tratados.

Estes resultados corporificam duas implicações principais paratoxicologia desenvolvimental. Primeiro, VPA induziu mudanças persistentesem moduladores epigenéticos chaves que também participam emdiferenciação de outras tecidos, como DNMT-I e o membro EED de famíliapolicomb. Segundo,os efeitos de teratogênios persistiram em hESCs duranteestágios críticos de neurogenese e organogenese. Por exemplo, genes cujaexpressão foi afetada como mostrado aqui (incluindo "sonic hedgehog" eFGF-8) são conhecidos como sendo reguladores mestres de diferenciação deneurônios serotonérgicos no cérebro (Ye et al., 1998, Cell 93:755-66). Deimportância particular é o fato de que a expressão de DNMT-I é quaseabolida em quatro dias após tratamento. In vivo, a desregulação desta enzimaé letal para embriões, uma vez que é a principal metiltransferase demanutenção durante a replicação de DNA (Li et al, 1992, Cell 69:915-26).

Seguindo exposição a teratogênio, alterações específicastemporais em expressão de gene desenvolvimental foram observadas. Genesdesenvolvimentais diferem em sua suscetibilidade para teratogênios emtempos diferentes. Esta indicação pode ser crítica para entender aespecificidade de desreguladores epigenéticos em alguns órgãos ou tecidos.RUNX2, por exemplo, é um ativador transcripcional de desenvolvimentoósseo (Napierala et al., 2005, MoI Genet Metab 86:257-68), e é mais sensívela regulação de modo positivo mediada por VPA em estágios muitoprematuros ou tardios após a exposição. Resultados de PCR de tempo real dehESCs descritas aqui foram correlacionados a resultados anteriores in vivo emcamundongos (Okada et al.,2004, Bith Defects Res A CHn MoI Teratol70:870-879) e ratos (Miyazaki et al, 2005, Int J Devi Neuroscience 23:287-97). Nestes estudos de animal, VPA inibiu a expressão de genes Polycomb,Eed, Bmil e Cbx2 e induziu regulação de modo negativo de Shh enquantoníveis de FGF8 permaneceram inalterados. Os resultados mostrados aqui emquatro dias seguindo tratamento de VPA (Tabela 2) foram consistentes comessas observações usando outros sistemas de modelo desenvolvimentais.

Tabela 2: Tratamento com VPA 1 mM resultou em mudanças marcadas naexpressão de reguladores epigenéticos e genes desenvolvimentais que sãocríticos para a padronização embriônica e a diferenciação de neurônios.

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Níveis de expressão de gene expressão são relativos a um gene de "housekeeping" (genealvo/Beta-2-Microglobulina).

Exemplo 3

Metaboloma de célula-tronco embriônica humana: Perfis metabólitosseguindo exposição a teratogênio

Exposição de células hES ao valproato de teratogênio induziumudanças significantes em diferentes vias metabólicas, incluindo viasimportantes durante a gravidez e desenvolvimento. Um via metabólicaalternativa ativada durante gravidez é mostrada na Figura 5, em que triptofanoé convertido em quinurenina. Para investigar este aspecto da invenção, hESCsforam cultivadas como descrito no Exemplo 1, e o procedimento paratratamento com valproato foi realizado como descrito desta maneira.Tratamento 1 (24 horas) expôs as células hES a 22μΜ de valproato durante24 horas seguido por coleta de sobrenadante e grânulos de células. No grupode tratamento (4 dias), células hES foram expostas a 22μΜ de valproato por 4dias e coletadas no dia 4. No terceiro tratamento ou cultura estendida (EC, 8dias), células hES receberam valproato por 4 dias seguido por cultura emmeios de cultura celular de hES padrão por um adicional de quatro dias.Células e sobrenadante foram coletados no dia oito. Cada tratamento teve umgrupo de controle paralelo com um total de seis culturas de discos de 6cavidades por experimento (dois discos de cultura de 6 cavidades portratamento).

Análise de metaboloma foi realizada como descrito noExemplo 1 (Wu e McAllister, 2003, JMass Spectrom 38: 1043-53). Misturascomplexas foram separadas por cromatografia de líquido (LC) antes deespectrometria de massa de tempo de vôo (TOF) de ionização poreletropulverização (ESI) de acordo com métodos descritos nesse Exemplo eExemplo 1. Software Mass Hunter (Agilent) foi aplicado para desconvolutaros dados e determinar a abundância de cada massa. Dados foram extraídos doespectro de massa completo usando a faixa m/z de 0 a 1500 e a picos demassa mais abundantes de 2 milhões de topo de cada amostra foram usadospara desconvolutar os dados. A razão mínima de sinal-ruído foi fixada em 5.As massas com uma abundância relativa mínima maior que 0,1% foramexportadas do software Mass Hunter e usadas para outras análises.

hESCs tratadas com 22μΜ de valproato resultaram em 3.241sinais de massa detectados em 42 injeções. Do total de 3.241 sinais de massadetectados nestes experimentos, 1.963 compostos foram medidosexclusivamente em células hES e 1.278 compostos também estavam presentesem meio condicionado; 443 destes foram apenas medidos em 1 de 42injeções. 110 compostos (3%) tiveram diferenças estatisticamentesignificantes em pelo menos um ponto de tempo em hESCs tratadas comvalproato comparados com controle. Mudanças de vezes tão elevadas quantosete- a treze - vezes foram medidas após tratamento com valproato, mas estessinais de massa exibiram alta variabilidade em todos os experimentos. Massasrepresentativas identificadas seguindo tratamento de células com 1 mM e 22μΜ de VPA são resumidas em Tabelas 3 e 4, respectivamente. Vários picos(1 ,963) foram detectados em células hES mas não em meio condicionado.Uma dessas moléculas pequenas foi quinurenina, um composto produzido poruma via metabólica de triptofano alternativa, ativada durante gravidez eresposta imune. Os níveis de quinurenina aumentaram por 44% (valor de ρ =0,004 em quatro dias, Tabela 5) seguindo tratamento com valproato.Quinurenina foi detectada exclusivamente em células hES e estavaausente em meio condicionado. A identidade química deste pico foiconfirmada por espectrometria de massa comparativa na presença do padrãoquímico (Figura 4).

Os resultados destes experimentos sugeriram que quinureninaé um biomarcador candidato para distúrbios neurodesenvolvimentais, emparticular aqueles originados por exposição do embrião humano a fármacosanti-epiléticos como VPA (Omoy et al., 2006, Reproductive Toxicol 21.: 399-409). Surpreendentemente, estudos recentes têm sugerido que metabolismo dequinurenina pode ser um novo alvo para o mecanismo de ação de fármacosanti-epiléticos (Kocki et al., 2006, Eur JPharmaeol 542:147-51). Distúrbioscognitivos e comportamentais são efeitos adversos conhecidos de exposição aanti-epiléticos durante a gravidez. Triptofano é o precursor de serotonina, umneurotransmissor chave na patogênese destas e de outras doenças, comodepressão. Além disso, níveis de plasma aumentados de quinurenina foramligados à depressão pós-parto (Kohl et al., 2005, J Affect Disord 86_il35-42).A alteração em metabolismo de triptofano detectado aqui é um meio paraexaminar novos mecanismos em patogênese de distúrbios comportamentaisrelacionados a seratonina como autismo (Chugani, 2004, Merit Retard DevDisabil Res Rev 10- 112-116). Um aumento em níveis de quinurenina durantedesenvolvimento pode reduzir a biodisponibilidade de triptofano econseqüentemente serotonina, conduzindo a disfunção cognitiva.

Glutamato e ácido piroglutâmico foram também elevados emhESCs tratadas com valproato. Glutamato e ácido piroglutâmico foramelevados em resposta a valproato (20% e 27%, respectivamente), apesar deapenas ácido piroglutâmico demonstrar mudanças estatisticamentesignificantes (p=0,021 em 4 dias, Figuras 3 A a 3D). Glutationa (GSH) émetabolizada por gama-glutamil transpeptidase em glutamato, umneurotransmissor de receptores de NMDA, e cisteinilglicina (Cys-Gly).Glutationa (massa neutral exata 612,15) e S-adenosil-homocisteína (massaneutral exata 384,12) foram detectadas em níveis muito baixos emcomparação a outros sinais de massa (dados não mostrados). Para estesexperimentos de detecção de nível baixo, moléculas pequenas foramidentificadas por ESI-TOF-MS comparativos com padrões químicos quealcançaram "picos" em meios condicionados em diferentes concentrações eusados para confirmar massas exatas neutrais e tempos de retenção de sinaisde massa experimentais (Figuras 3 A a 3D). Massas exatas neutrais e/oufórmulas químicas empíricas geradas por ESI-TOF-MS foram procuradas embases de dados públicas (incluindo por exemplo http://metlin.scripps.edu.,www.nist.gov/srd/chemistry.htm,www.metabolomics.ca) para compostoscandidatos.

Estes resultados sugeriram que valproato afeta a via de síntesede glutamato no embrião humano desenvolvido. A afinidade de fármacosanti-epiléticos com respeito a alvos de glutamato foi previamente sugerida (Rogawski e Loscher, 2004, Nat Rev Neurosci 2004 5:553-64). Níveisanormais de metabólitos de glutamato foram medidos em soro maternal efluido amniótico de mulheres grávidas cujo crianças foram diagnosticadoscom espinha bífida (Groenen et al., 2004, Eur J Obstet Gynecol Reprod BioL;112:16-23) com ressonância magnética nuclear (RMN). Os níveis de glutamina e hidroxiprolina foram significantemente maiores em NTDs, ecomo um resultado os métodos de hESC dados aqui provêem um meiorobusto para modelar as alterações in vivo de desenvolvimento.Tabela 5. Mudanças em perfis metabólicos de quatro compostos em célulashES tratadas com 10 valproato versus controles não tratados em 24 horas (24h), 4 dias (4D), e oito dias (8D) após tratamento.

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RT= tempo de retenção

Mudanças na duplicação são representadas como diferença de porcentagem das médias dosmínimos quadrados de células hES tratadas com valproato e não tratadas, valores de ρforam determinados por ANOVA. A massa é uma massa neutral média detectada por ESI-TOF-MS e RT é o tempo de retenção médio em que a molécula eluiu. Valores P menoresdo que 0,05 estão em negrito.

Exemplo 4

Quinurenina: Biomarcador para diagnose e tratamento de toxicidadedesenvolvimental e distúrbios de sistema nervoso central

Quinurenina foi mostrada no Exemplo 3 como sendo detectada em células hES tratadas com valproato. Quinurenina (junto com glutamato eácido piroglutâmico) foi diferencialmente produzida em células-troncoembriônicas humanas tratadas com valproato (hES) versus controles.

Quinurenina é um novo biomarcador utilizável para aidentificação de distúrbios neurodesenvolvimentais em crianças e toxicidadedesenvolvimental in viíro de produtos químicos . Este exemplo descreve aidentificação de biomarcadores para distúrbios neurodesenvolvimentais,incluindo produtos celulares diferencialmente produzidos em hESCs tratadascom teratogênio.

O aminoácido triptofano (TRP) é um precursor da serotoninade neurotransmissor, um mediador chave de numerosos distúrbios do sistemanervoso central, como depressão, neurodegeneração e diminuição dacapacidade cognitiva. Catabolismo de triptofano no ácido quinurênico é umavia alternativa para metabolismo de triptofano (Figura 5), que é ativado emcircunstâncias específicas como resposta inflamatória ou gravidez. Regulaçãode modo positivo da via quinurenina está correlacionada com psicose emdoenças de adultos como esquizofrenia e distúrbio bipolar, uma indicação queníveis aumentados de via intermediária podem alavancar traços psicóticos(Miller et al., 2006, Brain Res 16:25-37). Significantemente, metabolismousando a via quinurenina é acompanhado por metabolismo de triptofanodecaído usando a via de serotonina (na ausência de triptofano exógeno, umaminoácido essencial não sintetizado por mamíferos incluindo homem). Umaumento em níveis de quinurenina durante o desenvolvimento pode reduzir abiodisponibilidade de triptofano e conseqüentemente serotonina, conduzindoà disfiinção cognitiva.

Além disso, ácido quinurênico (KYNA), um dos produtosfinais desta via metabólica de triptofano, é um antagonista deneurotransmissão de glutamato e receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA).Estudos recentes têm demonstrado que ácido quinurênico é um dos alvos quepodem servir como fármacos através de seu papel na ativação do GPR35 dereceptor de GPCR previamente órfão (Wang et al., 2006, J Biol Chem281:22021-8). Ácido quinolínico (QUIN), outro produto de extremidade davia (Figura 5), e 3- hidroxi-quinurenina, um intermediário, atuam comoagentes neurotóxicos (Guillemin et al., 2005, J Neuroinflammation 26, 16;Chiarugui et al., 2001, JNeurochem 11, 1310-8). QUTN está envolvido napatogênese de mal de Alzheimer onde sua neurotoxicidade pode estarenvolvida em inflamação diminuída e em convulsões interagindo com ocomplexo de receptor de N- metil-D-aspartato (NMDA), um tipo de receptorde glutamato (Guillemin et al., 2002, J Neuroinflammation 26:16, Nemeth etal., 2005, Curr Neurovasc Res 2, 249-60). Quinurenina (KYN), outra viaintermediária, é sintetizada no cérebro e é transportada através da barreirasangue-cérebro (Nemeth et al., 2005, Curr Neurovase Res 2:249-60). KYN émetabolizado para o ácido quinolínico neurotóxico (QUIN) e o ácidoquinurênico neuroprotetor (KYNA) (Figura 5). Níveis de soro aumentado deKYN têm sido correlacionados a manifestação clínica de depressão cometiologias diferentes, como distúrbio pós parto (Kohl et al., 2005, J AffeetDisord 86, 135-42) e tratamento com interferon-alfa (Capuron et al., 2003,Biol Psychiatry 54:906- 14V

Exposição de células hES a valproato, um desregulador dedesenvolvimento humano, induziu mudanças significantes em diferentes viasmetabólicas, incluindo a produção de quinurenina (massa neutral exata208,08), que foi significantemente regulada de modo positivo em resposta avalproato como detectado por cromatografia de líquido e tempo de ionizaçãopor eletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo(LC/ESI-TOF-MS) como descrito no Exemplo 4. Adicionalmente, novasentidades químicas, tendo massas neutrais exatas de 328,058, 336,163,343,080, foram detectadas e não estão ainda catalogadas nas bases de dadospúblicas.

Quando precursores neurais derivados de hESCs foramexpostos a 1 mM de valproato, uma diminuição marcada em ambos,serotonina (176,0946) e indolacetaldeído (159,0689), um subproduto à jusantede serotonina gerada por atividade de monoaminoxoidase (MAO) foiobservada (Tabela 6). Glutamato e ácido piroglutâmico ou hidroxiprolina(p=0,021) foram também elevados em células hES tratadas com valproato.Estes resultados sugerem que valproato afeta a via de síntese de glutamatenono embrião humano em desenvolvimento. Esse achado emula neurofisiologiain vivo, onde compostos da via quinurenina modulam a atividade emreceptores de glutamato de NMDA e produzem fenótipos epiléticos, incluindoataques repentinos (Perkins e Stone, 1982, Brain Res 247: 184-187).

Como uma conseqüência de uma identificação de quinureninaaqui, inibidores químicos de síntese de quinurenina podem ser usados comonovas terapêuticas em distúrbios de humor; por exemplo, moléculas pequenasque antagonizam 2,3-dioxigenase de indoleamina (IDO) ou atividades deformilase de quinurenina, que converte triptofano (TRP) em quinurenina(KYN). Inibição de catabolismo de TRP em KYN pode ser usada paramelhorar os sintomas de doença em distúrbios cognitivos eneurodegenerativos aumentando os níveis de serotonina, através de sínteseelevada deste neurotransmissor ou depleção reduzida através da viaquinurenina.

Coletivamente, as mudanças de metabólito detectadas emcélulas hES em resposta a valproato convergem funcionalmente em direção àvias de folato, quinurenina e glutamato. Figura 6 ilustra o agrupamentohierárquico das diferenças de mudança de duplicação de 22.573 massassingulares. Mudanças nas vias acima mencionadas foram consistentes ereproduzíveis em estudos independentes múltiplos de hESCs tratadas comVPA 1 mM, e precursores neurais produzidos a partir de hESCs (Figura 6).

Exemplo 5

Análise de Expressão de Genes de Via QuinureninaA eficácia da análise no Exemplo 4 foi confirmada por estudosde expressão de gene, em que mudanças em expressão de genes foramobservadas seguindo tratamento com VPA de hESC. Tratamento de valproatode células-tronco embriônicas humanas induziu uma regulação positivamarcada na quinurenina de molécula pequena, um metabólito intermediáriono catabolismo de triptofano. Triptofano é o precursor do neurotransmissorserotonina (5HT). Deste modo, se expressão de enzimas no metabolismo detriptofano para quinurenina e sua via oposta, síntese de serotonina, foi alterada emcélulas-tronco embriônicas humanas foi investigado para examinar as propriedadesmecanísticas da via quinurenina e sua resposta a valproato.

Células-tronco embriônicas humanas tratadas com 1 mMvalproato e controles não tratados foram coletadas em quatro dias apóstratamento e armazenados a -80 0C antes de isolação de RNA usando RNeasy(Qiagen). 5 μg de gabaritos de RNA foram transcritos reversos e amplificados(QIAGEN OneStep RT-PCR) de acordo com instruções do fabricante usandoiniciadores projetados para transcrever as seqüências humanas dos seguintes10 genes: INDO, indoleamina 2,3 dioxigenase, TDO ou TD02, triptofano2,3- dioxigenase, AFMID, arilformamidase, TPHl, triptofano hidroxilase, aenzima limitante de taxa em biossíntese de serotonina, AADAT,aminoadipato aminotransferase, KYNU, quinunreninase, KMO, quinurenina3-monooxigenase, GAPDH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase.

Os resultados deste estudo mostraram que a maioria dasenzimas na via quinurenina e síntese de serotonina foram expressadas emcélulas hES em quatro dias após tratamento de células hES com 1 mMvalproato (Figura 7). Indoleamina 2, 3 dioxigenase INDO, catabolisatriptofano na via quinurenina, e produz quinurenina como um produto deextremidade. A expressão de triptofano 2,3 dioxigenase (TDO ou TD02) foitambém examinada. TD02, como INDO, catalisa a primeira etapa na viaquinurenina. Esses dados sugerem que a expressão de TD02 foi regulada demodo positivo em células hES tratadas com valproato em comparação comcontroles não tratados. A enzima limitante de taxa em síntese de 5HT, TPHl,foi também expressada em células hES (Figura 7). Expressão destas enzimasapoiou a conclusão de que células hES recapitulam vias metabólicas de catabolismode triptofano e síntese de serotonina. De maneira interessante, VPA induziuexpressão pronunciada de enzimas de limitantes de taxa nesta via.

Exemplo 6

Triagem de toxicologia desenvolvimental para exposição a álcool pré-natal

Para identificar os metabólitos diferencialmente secretados emresposta a álcool, bem como as vias envolvidas em síndrome de álcool fetal,células-tronco embriônicas humanas foram tratadas com 0, 0,1 e 0,3% etanolpor quatro dias seguido por espectrometria de massa de LC/ESI-TOF deacordo com métodos principais descritos acima para valproato no Exemplo 1.Meios extracelulares foram coletados e processados em 24 horas e quatro diasapós tratamento, e 49.481 sinais de massa foram detectados após três réplicastécnicas. Dentre os 49.481 sinais de massa, 1.860 compostos foramsignificantemente diferentes (p<0,05) em pelo menos um tratamento etiveram um mudança de tempo significante (<1 ou >1). (Tabela 7). Massasarmazenadas foram anotadas in silico pesquisando massas neutrais em váriasbases de dados diferentes. Estas bases de dados incluíram Metlin, BiologicalMagnetic Resonance Data Bank (BMRB), NIST Chemistry WebBook,Human Metabolome Database. A massa foi considerada identificada quandosua massa neutral estava dentro de 10 ppm de um composto conhecidoanotado em uma destas bases de dados listadas acima.

O composto quinurenina putativo (massa neutral exata medida208,0816) foi regulado de modo positivo três vezes no dia quatro, mas não 24horas, em ambos os tratamentos (0,1 %, ρ = 0,001 e 0,3% ρ = 0,002,respectivamente). Outro metabólito putativo na via quinurenina, 8-metoxiquinurenato (219,0532) foi também regulada de modo positivo emquatro dias em resposta a ambos, tratamento com álcool a 0,1% e 0,3%(p<0,05). A análise também detectou uma regulação de modo negativosignificante de 5-hidroxi-L-triptofano (220,0848) em quatro dias seguindotratamento com álcool a 0,3% (p<0,05) em comparação com controles nãotratados. 5-hidroxi-L-triptofano é o único metabólito intermediário entretriptofano e serotonina e sua síntese é mediada por triptofano hidroxilase, aenzima limitante de taxa em síntese de serotonina. Estes resultados sugerem queexposição a álcool durante desenvolvimento humano pode afetar biodisponibilidadede serotonina devido a regulação de modo positivo de catabolismo de triptofano emquinureninas. Além disso, exposição ao álcool induziu mudanças significantes emvias metabólicas e moléculas pequenas envolvidas em desenvolvimento neuralcomo glutamato, gabapentina, adrenalina e glutationa.

Exemplo 7

Triagem de toxicologia desenvolvimental de células precursorasneuronais

Avaliação metabolômica de teratógenos em desenvolvimentoembriônico não é limitado exclusivamente a hESCs. Os métodos da invençãosão também utilizáveis com outras células-tronco progenitoras, incluindocélulas-tronco restritas na linhagem como células precursoras neurais. Parailustrar a eficácia de triagem de toxicologia em células-tronco específicas delinhagem, precursores neuronais derivados de hESCs foram tratados com 1mM valproato de acordo com métodos descritos no Exemplo 1.

Aproximadamente 135 compostos foram diferencialmentesecretados em precursores neuronais tratados com VPA versus controle. (VerTabela 6). Os resultados desse estudo ilustraram que os métodos da invençãorevelam alterações no perfil metabólico de células-tronco específicas delinhagem em resposta à exposição a teratogênio.

Os resultados descritos aqui estão enunciados nas seguintes tabelas.Tabela 3: Metabolitos celulares medidos em celulas-tronco embrionicas humanas tratadas com 1 mM de valproato

<table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table>Tabela 3

<table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table>Tabela 3: Metabolitos celulares medidos em celulas-tronco embrionocas humanas tratadas com 1 mM devalproato

<table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>Tabela 3: Metabolitos celulares medidos em celulas-tronco embrionicas humanas tratadas com 1mM de valproato

<table>table see original document page 54</column></row><table>Tabela 3: Metabolitos celulares medidos em celulas-tronco embrionicas humanas tratadas com 1 mM de valproato

<table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>Tempo

<table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table>Tempo

<table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table>Todas as referências citadas aqui são incorporadas porreferência. Além disso, a invenção não se destina a ser limitada às formas derealização descritas da invenção. Deve ser entendido que a descrição acimaenfatiza algumas formas de realização específicas da invenção e que todas asmodificações e alternativas equivalentes à mesma estão dentro do espírito eescopo da invenção como especificada nas reivindicações anexas.

Claims (54)

1. Método para identificar um ou uma pluralidade demetabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500Daltons que é diferencialmente produzido em células-tronco embriônicashumanas (hESCs) ou células específicas na linhagem derivadas de hESCcontatadas com um composto de teste, caracterizado pelo fato decompreender as etapas de:a) cultivar hESCs ou células específicas na linhagem derivadasde hESC na presença ou ausência de um composto de teste;b) testar um ou uma pluralidade de metabólitos celulares tendoum peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons em hESCs oucélulas específicas na linhagem derivadas de hESC cultivadas na presença eausência do composto de teste; ec) identificar pelo menos um produto metabólito tendo umpeso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons que é diferencialmenteproduzido nas células na presença ou ausência do composto de teste.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelofato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido em maioresquantidades na presença do composto de teste do que na ausência docomposto de teste.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido em maioresquantidades na ausência do composto de teste do que na presença docomposto de teste.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que os metabólitos celulares são secretados ou excretados das hESCsou células específicas na linhagem derivadas de hESC.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o metabólito celular é um produto de molécula pequena tendo umpeso molecular de cerca de 100 a cerca de 1000 Daltons.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que um ou uma pluralidade de metabólitos celulares é testado usandoum método de separação física.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o método de separação física é cromatografia de líquido/tempo deionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo devôo.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que os metabólitos celulares são tetraidrofolato, diidrofolato ou outrosmetabólitos na via metabólica de folato, glutationa, ou glutationa oxidada.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que os metabólitos celulares candidatos são quinurenina, 8-metoxiquinurenato, Ν'-formilquinurenina 7,8-diidro-7,8- diidroxiquinurenato,5-hidroxitriptofano, N-acetil-D-triptofano, glutamato, ácido piroglutâmico ououtros metabólitos nas vias metabólicas de triptofano ou glutamato,histamina, dopamina, ácido 3,4-diidroxibutírico, serotonina, ou ácido gama-aminobutírico (GABA)..

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que uma pluralidade de metabólitos celulares é identificada.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de metabólitos celulares identificadoscompreende um perfil de biomarcador.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que um dos metabólitos celulares compreendendo um perfil debiomarcador é quinurenina.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de metabólitos celulares identificadoscompreende um perfil de biomarcador característico de hESC ou resposta decélula específica de linhagem derivada de hESC a um composto tóxico outeratogênico.

16. Método para triar um composto de teste para identificar umefeito do composto em células-tronco embriônicas humanas (hESCs) oucélulas específicas na linhagem derivadas de hESC contatadas com ocomposto de teste, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:a) cultivar hESCs ou células específicas na linhagem derivadasde hESC na presença ou ausência de um composto de testeb) testar hESCs ou células específicas na linhagem derivadasde hESC cultivadas na presença e ausência do composto de teste paraprodução de um ou uma pluralidade de metabólitos celulares tendo um pesomolecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons; ec) identificar compostos de teste que produzem pelo menos ummetabólito celular tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500Daltons que é diferencialmente produzido nas células na presença ou ausênciado composto de teste.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido emmaiores quantidades na presença do composto de teste do que na ausência docomposto de teste.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido emmaiores quantidades na ausência do composto de teste do que na presença docomposto de teste.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que os metabólitos celulares são secretados ou excretados dashESCs ou células específicas na linhagem derivadas de hESC.

20. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é uma moléculapequena metabólito tendo um peso molecular de cerca de 100 a cerca de 1000Daltons.

21. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

22. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de metabólitos celulares é testada usando ummétodo de separação física.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que o método de separação física é cromatografia delíquido/tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massapor tempo de vôo.

24. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que os metabólitos celulares candidatos são tetraidrofolato,diidrofolato ou outros metabólitos na via metabólica de folato, glutationa, ouglutationa oxidada.

25. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que os metabólitos celulares candidatos são quinurenina, 8-metoxiquinurenato, N'-formilquinurenina 7,8-diidro-7,8-10diidroxiquinurenato, 5-hidroxitriptofano, N-acetil-D-triptofano, glutamato,ácido piroglutâmico ou outros metabólitos nas vias metabólicas de triptofanoou glutamato, histamina, dopamina, serotonina, ácido gama-aminobutírico(GABA) ou outras espécies de ácido butírico.

26. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que uma pluralidade de metabólitos celulares é identificada.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato em que a pluralidade de metabólitos celulares identificadoscompreende um perfil de biomarcador.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que um dos metabólitos celulares compreendendo um perfil debiomarcador é quinurenina.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de metabólitos celulares identificadoscompreende um perfil de biomarcador característico de resposta de hESC aum composto tóxico ou teratogênico.

31. Método para testar um composto de teste para toxicidadeou teratogenicidade a células-tronco embriônicas humanas (hESCs) ou célulasespecíficas na linhagem derivadas de hESC contatadas com o composto deteste, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:a) cultivar hESCs ou células específicas na linhagem derivadasde hESC na presença ou ausência de um composto de testeb) testar hESCs ou células específicas na linhagem derivadasde hESC cultivadas na presença e ausência do composto de teste paraidentificar um ou uma pluralidade de metabólitos celulares tendo um pesomolecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons produzidos por hESCscontatadas com um composto tóxico ou teratogênico; ec) identificar compostos de teste em que hESCs ou célulasespecíficas de linhagem derivadas de hESC produzem um ou uma pluralidadede metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de-1500 Daltons na presença ou ausência do composto de teste em que referidosmetabólitos celulares são produzidos por hESCs ou células específicas nalinhagem derivadas de hESC contatadas com um composto tóxico outeratogênico.

32. Método de acordo com a reivindicação 31 caracterizadopelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido emmaiores quantidades na presença do composto de teste do que na ausência docomposto de teste.

33. Método de acordo com a reivindicação 31 caracterizadopelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido emmaiores quantidades na ausência do composto de teste do que na presença docomposto de teste.

34. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que os metabólitos celulares são secretados ou excretados dashESCs ou células específicas na linhagem derivadas de hESC.

35. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o metabólito celular é um metabólito de célula pequena tendoum peso molecular de cerca de 100 a cerca de 1000 Daltons.

36. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

37. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que metabólitos celulares são testados usando um método deseparação física.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que o método de separação física é cromatografia delíquido/tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massapor tempo de vôo.

39. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que os metabólitos celulares candidatos são tetraidrofolato,diidrofolato ou outros metabólitos na via metabólica de folato, glutationa, ouglutationa oxidada.

40 . Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que os metabólitos celulares candidatos são quinurenina, 8-metoxiquinurenato, Ν'-formilquinurenina 7,8-diidro-7,8- diidroxiquinurenato-5-hidroxitriptofano, N-acetil-D-triptofano, glutamato, ácido piroglutâmico ououtros metabólitos nas vias metabólicas de triptofano ou glutamato,histamina, dopamina, ácido 3,4-diidroxibutírico, serotonina, ácido gama-aminobutíríco (GABA) ou outras espécies de ácido butírico.

41. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que uma pluralidade de metabólitos celulares é identificada.

42. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que a pluralidade de metabólitos celulares identificadoscompreendem um perfil de biomarcador.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizadopelo fato de um dos metabólitos celulares compreendendo um perfil debiomarcador é quinurenina.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

45. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que uma pluralidade de metabólitos celulares identificadoscompreende um perfil de biomarcador característico de resposta de hESC aum composto tóxico ou teratogênico.

46. Perfil de biomarcador para identificar um composto deteste como um composto tóxico, caracterizado pelo fato de que o perfil debiomarcador compreende um ou uma pluralidade de metabólitos celularestendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons os quais sãodiferencialmente produzidos em células-tronco embriônicas humanas (hESCs)ou células específicas nas linhagens derivadas de hESC contatadas com umcomposto tóxico ou compostos.

47. Perfil de biomarcador de acordo com a reivindicação 46,caracterizado pelo fato de compreender tetraidrofolato, diidrofolato ou outrosmetabólitos na via metabólica de folato, glutationa, ou glutationa oxidada.

48. Perfil de biomarcador de acordo com a reivindicação 46,caracterizado pelo fato de compreender quinurenina, 8- metoxiquinurenato,N'-formilquinurenina 7,8-diidro-7,8-diidroxiquinurenato 5- hidroxitriptofano,N-acetil-D-triptofano, glutamato, ácido piroglutâmico ou outros metabólitosnas vias metabólicas de triptofano ou glutamato, histamina, dopamina, ácido3,4-diidroxibutírico, serotonina, ácido gama-aminobutírico (GABA) ou outrasespécies de ácido butírico.

49. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ainda compreender a etapa de comparar pelo menos um produtometabólito tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltonsque é diferencialmente produzido nas células na presença ou ausência docomposto de teste com um perfil de biomarcador compreendendo um ou umapluralidade de metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10a cerca de 1500 Daltons os quais são diferencialmente produzidos em células-tronco embriônicas humanas (hESCs) ou células específicas na linhagemderivadas de hESC contatadas com um composto tóxico ou compostos.

50. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de ainda compreender a etapa de comparar pelo menos um produtometabólito tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltonsque é diferencialmente produzido nas células na presença ou ausência docomposto de teste com um perfil de biomarcador compreendendo um ou umapluralidade de metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10a cerca de 1500 Daltons os quais são diferencialmente produzidos em células-tronco embriônicas humanas (hESCs) ou células específicas na linhagemderivadas de hESC contatadas com um composto tóxico ou compostos.

51. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de ainda compreender a etapa de comparar pelo menos um produtometabólito tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltonsque é diferencialmente produzido nas células na presença ou ausência docomposto de teste com um perfil de biomarcador compreendendo um ou umapluralidade de metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10a cerca de 1500 Daltons os quais são diferencialmente produzidos em células-tronco embriônicas humanas (hESCs) ou células específicas na linhagemderivadas de hESC contatadas com um composto tóxico ou compostos.

52. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que pelo menos dois metabólitos celulares tendo um pesomolecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons são diferencialmenteproduzidos nas células na presença ou ausência do composto de teste sãodetectados.

53. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que pelo menos dois metabólitos celulares tendo um pesomolecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons são diferencialmenteproduzidos nas células na presença ou ausência do composto de teste sãodetectados.

54. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que pelo menos dois metabólitos celulares tendo um pesomolecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons são diferencialmenteproduzidos nas células na presença ou ausência do composto de teste sãodetectados.