BRPI0710054B1 - métodos para identificar um ou uma pluralidade de metabólitos celulares, para triar um composto de teste, e, para testar um composto de teste - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA IDENTIFICAR UM OU UMA PLURALIDADE DE METABÓLITOS CELULARES, PARA TRIAR UM COMPOSTO DE TESTE E PARA TESTAR UM COMPOSTO DE TESTE, E, PERFIL DE BIOMARCADOR PARA IDENTIFICAR UM COMPOSTO DE TESTE COMO UM COMPOSTO TÓXICO. A invenção provê perfis de biomarcador de metabólitos celulares e métodos para triar compostos químicos incluindo agentes farmacêuticos, compostos de fármacos de ponta e candidatos e outros produtos químicos usando células-tronco embriônicas humanas (hESC) ou células específicas de linhagem produzidas a partir das mesmas. Os métodos da invenção são utilizáveis para testar a toxicidade, particularmente toxicidade desenvolvimental, e detectar os efeitos teratogênicos destes compostos químicos.

Description

Este pedido reivindica o benefício de prioridade de pedidos de patente provisória US, números de série 60/790.647, depositado em 10 de abril de 2006, e 60/822.163, depositado em 11 de agosto de 2006, cujos conteúdos são incorporados aqui por referência.

Fundamentos da invenção Campo da invenção

Esta invenção provê métodos para a triagem toxicológica de fármacos e outros compostos químicos. A invenção especificamente provê reagentes que são células-tronco embriônicas humanas (hESC) ou células específicas de linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, assim como a métodos para usar estas células para detectar toxicidade desenvolvimental ou efeitos teratogênicos de compostos farmacêuticos e outros produtos químicos . Mais particularmente, a invenção provê um meio in vitropara analisar a toxicidade de compostos previsores de sua toxicidade durante o desenvolvimento humano. Biomarcadores previsores candidatos para efeitos tóxicos ou teratogênicos são identificados e aqui providos.

Fundamentos da invenção

Os defeitos congênitos são a causa principal de morbidez infantil nos Estados Unidos, afetando 1 em cada 33 recém-nascidos (Brent &Beckman, 1990, Bull NY Acad Med 66: 123-63; Rosano et al, 2000, J Epidemiology Community Health 54:660-66), ou 25 aproximadamente 125.000 recém-nascidos por ano. Entende-se que a toxicidade desenvolvimental pode causar defeitos congênitos e pode gerar letalidade embriônica, restrição ao crescimento intra-uterino (IUGR), dismorfogenese (como má formações esqueletais), e toxicidade funcional, que podem levar a distúrbios cognitivos como autismo. Existe uma preocupação crescente sobre o papel que a exposição a produtos químicos pode desempenhar no início destes distúrbios. De fato, estima-se que 5% a 10% de todos os defeitos congênitos são causados por exposição uterina a agentes teratogênicos conhecidos (Beckman &Brent, 1984, Annu Rev Pharmacol 24: 483-500).

Existe a preocupação de que a exposição a produtos químicos pode estar desempenhando um papel significante e evitável na ocorrência dos defeitos congênitos (Claudio et al, 2001, Environm Health Perspect 109: A254-A261). Esta preocupação tem sido difícil de avaliar, no entanto, porque a técnica não dispõe de um modelo robusto e eficiente para testar a toxicidade desenvolvimental para os mais do que 80.000 produtos químicos no mercado, mais os novos 2.000 compostos introduzidos anualmente (General Accounting Office (GAO), 1994, Toxic Substances Control Act: Preliminary Observações on Legislative Mudanças to Make TSCA More Effective, Testimony, 07/13/94, GAO/T-RCED-94-263). Menos do que 5% destes compostos foram testados para as conseqüências na reprodução e mesmo menos para a toxicidade desenvolvimental (Environmental Protective Agency (EPA), 1998, Chemical Hazard Data Availability Study, Office of Pollution Prevention and Toxins). Apesar de algumas tentativas terem sido feitas para usar sistemas de modelo animal para avaliar a toxicidade (Piersma, 2004, Toxicology Letters149: 147-53), diferenças inerentes na sensibilidade de humanos in utero tem limitado a utilidade previsora destes modelos. Desenvolvimento de sistema de modelo de células com base em humanos teria um enorme impacto no desempenho de fármacos e a avaliação de risco dos produtos químicos.

Toxicidade, particularmente toxicidade desenvolvimental, é também um obstáculo principal na progressão de compostos através do processo de desenvolvimento de fármacos. Atualmente, o teste de toxicidade é conduzido em modelos de animais como um meio para prever os efeitos adversos de exposição ao composto, particularmente no desenvolvimento e organogenese em embriões e fetos humanos. Os modelos os mais prevalecentes que contribuem para a aprovação pelo FDA de novos fármacos investigacionais são os estudos com animais completos em coelhos e ratos (Piersma, 2004, Toxicology Letters149:147-53). Os estudos in vivo se baseiam na administração de compostos a animais grávidos em diferentes estágios de gravidez e desenvolvimento embriônico / fetal (primeira semana de gestação, estágio de organogenese e extensão completa da gestação). NO entanto, estes modelos de animais in vivo são limitados por uma falta de robustez entre as respostas do animal e do humana a compostos químicos durante o desenvolvimento. As diferenças entre espécies são com freqüência manifestadas em tendências como a sensibilidade à dose e processamento farmacocinético de compostos. Atualmente, os modelos de animais são apenas 50% eficientes em prever a desenvolvimental resposta humana a compostos (Greaves et al, 1004, Nat Rev Drug Discov 3 :226-36). Assim, os modelos in vitroprevisores dirigidos a humanos apresentam uma oportunidade para reduzir os custos do desenvolvimento de novos fármacos e permitir fármacos mais seguros.

Os modelos in vitrotem sido empregados na indústria de fármacos há mais de 20 anos (Huuskonen, 2005, Toxicology & Applied Pharm 207:S495-S500). Muitos dos testes in vitroatuais envolvem os modelos de diferenciação usando culturas de células primárias ou linhagens de células imortalizadas (Huuskonen, 2005, Toxicology & Applied Pharm 207:S495S500). Infelizmente, estes modelos diferem de modo significante de suas contra-partes in vivo em sua capacidade de avaliar com precisão o desenvolvimento da toxicidade. Em particular, a iniciativa ECVAM (European Center for Validation of Alternative Methods) tem usado célulastronco embriônicas de camundongo como um sistema de triagem para toxicologia desenvolvimental previsora. O teste de células-tronco embriônicas (EST) tem mostrado resultados muito promissores, com uma correlação estatisticamente significante de 78% aos estudos in vivo, e o teste foi capaz de diferenciar teratogênios fortes de compostos moderados/ fracos ou não embriotóxicos (Spielmann et al, 1997, In Vitro ToxicologyH): 119-27). Este modelo é limitado em parte devido aos pontos finais toxicológicos serem definidos somente para compostos que afetam a diferenciação cardíaca. Este modelo também falha em considerar as diferentes desenvolvimentais entre as espécies dentre os camundongos e humanos, e assim não se dirige de modo completo à necessidade na técnica para sistemas de modelos específicos para humanos.

Assim, permanece a necessidade na técnica para um método in vitro,específico de humanos para determinar de modo confiável a toxicidade desenvolvimental em agentes farmacêuticos e outros compostos químicos. Também existe a necessidade na técnica para melhor compreender o desenvolvimento humano e sua perturbação por toxinas ou outros agentes desreguladores do desenvolvimento, para auxiliar no controle clínico de distúrbios congênitos adquiridos e as muitas doenças que compartilham estas vias bioquímicas, como o câncer.

A presente invenção provê a avaliação de uma pluralidade de moléculas pequenas, preferivelmente secretadas ou excretadas por células hES ou células específicas de linhagem derivadas de hESC, como célulastronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, e é determinada e correlacionada com um estado de saúde e doença ou insulto. As análises similares foram aplicadas a outros sistemas biológicos na técnica (Want et al., 2005 Chem Bio Chem 6: 1941-51), provendo biomarcadores de doença ou respostas tóxicas que podem ser detectadas em fluidos biológicos (Sabatine et al, 2005 Circulation112:3868-875).

Sumário da invenção

A presente invenção provê reagentes e métodos para a triagem in vitrode toxicidade e teratogenicidade de produtos químicos farmacêuticos e não farmacêuticos usando células-tronco embriônicas humanas não diferenciadas (hESC) ou células específicas de linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais. A invenção provê métodos in vitroespecíficos de humanos para determinar confiavelmente toxicidade, particularmente toxicidade desenvolvimental e teratogenicidade, de fármacos e outros compostos químicos usando célulastronco embriônicas humanas (hESCs) ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais. Como provido aqui, hESCs ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, são utilizáveis para avaliar efeitos tóxicos de compostos químicos, particularmente referidos efeitos tóxicos e teratogênicos em desenvolvimento humano, assim superando as limitações associadas com modelos interespécies de animais. Em particular, a invenção demonstra que perfis metabólitos de células hES ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais são alterados em resposta a desreguladores conhecidos de desenvolvimento humano.

A invenção mostra que o metaboloma de hESC é uma fonte de biomarcadores humanos para doença e resposta tóxica. Em formas de realização particulares, exposição de hESC a valproato induziu mudanças significantes em diferentes vias metabólicas, consistentes com sua atividade conhecida como um teratogênio humano. Em outras formas de realização, exposição de hESC a níveis variados de etanol induziu significantes alterações em vias metabólicas consistentes com efeitos conhecidos do álcool em desenvolvimento fetal.

Em um aspecto, a invenção provê métodos para usar célulastronco embriônicas humanas pluripotentes não diferenciadas (hESC) ou células específicas de linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, para uma avaliação in vitro . Em métodos da invenção, nESCs não diferenciadas ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais são expostas um composto de testes, preferivelmente em concentrações refletivas de níveis em vivo ou em níveis encontrados em circulação maternal. Outras formas de realização deste aspecto da invenção provêem a determinação da capacidade do composto de teste de induzir a diferenciação de hESC pluripotente em tipos de células particulares. Em outras formas de realização, os métodos da invenção são providos usando células não limitadas à linhagem pluripotentes. O benefício de usar células-tronco pluripotentes é que elas permitem a análise de resposta(s) tóxica(s) global(ais) e são isoladas do alvo fisiológico de toxicidade desenvolvimental, isto é o embrião humano. Além disso, porque estas células não diferenciaram em linhagem específica, o potencial para falsos negativos é reduzido. Em ainda outras formas de realização são providos métodos usando células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, para avaliar toxicidade e particularmente toxicidade desenvolvimental e teratogenicidade .

Em outro aspecto a invenção provê métodos para identificar biomarcadores previsores de respostas tóxicas a compostos químicos, particularmente produtos químicos farmacêuticos e não farmacêuticos, e particularmente a teratogênios conhecidos. Em formas de realização deste aspecto, um conjunto dinâmico representativo de uma pluralidade de metabólitos celulares, preferivelmente secretados ou excretados por células hES ou células específicas de linhagem derivadas de hESC, como célulastronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, é determinado e correlacionado com estado de saúde e doença ou de insulto tóxico. Os metabolites celulares de acordo com este aspecto da invenção geralmente estão na faixa de cerca de 10 a 15 cerca de 1500 Daltons, mais particularmente de cerca de 100 a cerca de 1000 Daltons, e incluem mas não são limitados a compostos como açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidos graxos e compostos de baixo peso molecular de sinalização. Referidos perfis de biomarcadores são diagnósticos para toxicidade de compostos químicos, particularmente produtos químicos farmacêuticos e não farmacêuticos, que participam em e revelam mecanismos funcionais de resposta celular a insulto químico patológico ou tóxico, assim servindo como biomarcadores de doença ou resposta tóxica que podem ser detectados em fluidos biológicos. Em formas de realização particularmente preferidos deste aspecto da invenção, estes biomarcadores são utilizáveis para identificar vias metabólicas ativas (ou ativadas), após as mudanças moleculares previstas, inter alia, por outros métodos (como transcriptômicos e proteômicos).

A invenção assim também provê biomarcador e pluralidade de biomarcadores, em alguns casos associados com metabólitos de vias metabólicas particulares, que são indicativos de insultos tóxicos ou teratogênicos. Referidos marcadores como providos pela invenção são usados para identificar insultos tóxicos e teratogênicos, e em formas de realização particulares são usados para caracterizar a quantidade ou extensão de referido insulto ao estarem correlacionados com a quantidade ou a extensão de um biomarcador particular ou pluralidade de biomarcadores detectados em meios de cultura de células. Em formas de realização particulares, a referida pluralidade de biomarcadores provendo um padrão diagnóstico de insultos tóxicos e teratogênicos, mais particularmente identificando uma ou uma multiplicidade de vias metabólicas específicas compreendendo metabólitos detectados após os insultos tóxicos e teratogênicos.

A presente invenção é vantajosa comparada com inter alia o modelo de camundongo ECVAM porque o teste de toxicidade e identificação do biomarcador são realizados com células humanas, especificamente célulastronco embriônicas humanas (hESC). Células-tronco embriônicas humanas são capazes de recapitular a organogenese de mamíferos in vitro(Reubinoff et al., 2000, Nature Biotechnology 18:399-404; He et al., 2003, Circ Res 93:329; Zeng et al., 2004, Stem-Cells 22:925-40; Lee et al., 2000, Mol Genet Metab 86:257-68; Yan et al., 2005, Stem-Cells 22:781-90) porque elas são células pluripotentes e de auto-renovação. Assim, hESCs podem revelar mecanismos de toxicidade, particularmente toxicidade desenvolvimental, e identificar as vias desenvolvimentais que são particularmente sensíveis aos produtos químicos durante o desenvolvimento humano inicial. O modelo embriônico "humano para humano" provido pelos métodos inventivos descritos aqui permite uma melhora compreensão das vias associados com toxicidade desenvolvimental, como este é um sistema desenvolvido diretamente do organismo alvo, assim como sendo um teste mais sensível e preciso para o for insulto tóxico ou teratogênico em desenvolvimento humano.

Os métodos da invenção provêem outras vantagens em identificar biomarcadores importantes para toxicidade e teratogenicidade por triagem funcional de hESCs ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais. Estes biomarcadores com vantagem identificam vias metabólicas e celulares e mecanismos de toxicidade, particularmente toxicidade desenvolvimental. Importantemente, estes biomarcadores também podem auxiliar na avaliação dos efeitos tóxicos de produtos químicos sobre o embrião humano em desenvolvimento.

Em ainda outro aspecto da invenção, produtos celulares secretados ou excretados diferencialmente detectados identificados por métodos da invenção incluem os associados com distúrbios e alterações neurodesenvolvimentais em via metabólicas associadas, e incluem mas não são limitados a quinurenina, glutamato, ácido piroglutâmico, 8metoxiquinurenato, N'-formilquinurenina 5-hidroxitriptofano, N-acetil-Dtriptofano e outros metabólitos em vias metabólicas triptofano e glutamato.

A toxicidade funcional na vida pós-natal pode ser prevista usando hESC porque células diferenciadas com propriedades in vivo críticas podem ser geradas in vitro .hESCs podem ser usados para produzir células específicas de linhagem, incluindo células-tronco específicas de linhagem, células precursoras e células terminalmente diferenciadas, provendo nas mesmas populações enriquecidas de células tipicamente presentes in vivo em misturas de diferentes tipos de células compreendendo tecidos. A invenção assim provê métodos para usar hESCs para produzir estas populações enriquecidas e específicas de estado de desenvolvimento de células para a triagem da toxicidade de compostos químicos, particularmente fármacos, compostos de ponta para fármacos e compostos candidatos em desenvolvimento de fármacos, para identificar as toxicidades específicas para humanos dos referidos compostos químicos. Estes aspectos dos métodos da invenção são vantajosos com relação aos sistemas de modelos de animais in vitroe in vivo reconhecidos na técnica.

As formas de realização específicas preferidas da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição mais detalhada de algumas formas de realização preferidas e as reivindicações.

Breve descrição dos desenhos

Estes e outros objetos e aspectos da invenção serão melhor entendidos a partir da seguinte descrição detalhada tomada em conjunto com os desenhos em que:

Figuras IA a 1C são perfis de biomarcadores de metabólitos celulares secretados produzidos após contato de hESCs com 1 rnM valproato. Estes perfis foram produzidos usando cromatografia de líquido/tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo (TOF)(LC/ESI-TOF-MS) após tratamento das células com valproato durante 24 horas (Figura IA), quatro dias (Figura IB) e oito dias (Figura 1C). As moléculas pequenas secretadas a partir de células-tronco embriônicas humanas tratadas (azul ) e não tratadas (vermelho) foram medidas.

Figuras 2A a 2D são perfis de biomarcadores de metabólitos celulares secretados/excretados produzidos após contato de hESCs com 1 mM valproato. Estes perfis foram produzidos usando cromatografia de líquido/ tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo (LC/ESI-TOF-MS) após tratamento das células com valproato durante 24 horas (Figura 2A), quatro dias (Figura 2B), oito dias (Figura 2C), e perfis metabólicos comparativos de células hES (azul ) e meio condicionado (amarelo) (Figura 2D).

Figuras 3A a 3D são fotomicrografias de morfologia celular mostrando as células-tronco embriônicas pluripotentes após uma cultura prolongada. O marcador Oct-4 foi retido em um modo similar como controles não tratados (Figura 3A=5 dias valproato, Figura 3B=5 dias controle, Figura 3C-8 dias valproato, Figura 3D-8 dias controle).

Figura 4 mostra os resultados de espectrometria de massa comparativa na presença de padrões químicos confirmando a identidade química de ácido fólico (massa exata 441,14), ácido piroglutâmico (massa exata 129.04), glutamato (massa neutra exata 147,05) e quinurenina (massa exata 208,08).

Figura 5 representa a via de metabolismo de quinurenina de triptofano em humanos (Wang et al., 2006, J Biol Chem 281, 22021-22028, publicado eletronicamente em 5 de junho de 2006).

Figura 6 ilustra um agrupamento hierárquico de diferenças de mudanças de vezes de massas únicas de 22.573 e é representativo de experimentos independentes múltiplos em que hESCs e precursores neurais produzidos a partir de hESCs foram tratadas com 1 mM valproato. Células não embriônicas (fibroblastos humanos) foram usados como controles (dados não mostrados). As mudanças de duplicações positivas são vermelhas, as mudanças de duplicações negativas são verde, e os dados faltando são cinza.

Figura 7 mostra a expressão relativa de enzimas nas vias de síntese de quinurenina e serotonina em células hES. INDO, indolamina 2,3 dioxigenase, TDO ou TDO2, triptofano 2,3-dioxigenase. (TDO2 foi regulado de modo positivo em células hES tratadas com valproato em comparação a controles.) AFMID, arilformamidase, TPH1, triptofano hidroxilase, AADAT, aminoadipato aminotransferase, KYNU, quinunreninase, GAPDH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, gene de controle doméstico. KMO, quinurenina 3-monooxigenase, não foi expressado em células tratadas com valproato ou controles.

Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas

A invenção provê reagentes, incluindo células-tronco embriônicas humanas hESC) ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais produzidas a partir das mesmas, para avaliar a toxicidade desenvolvimental usando o metaboloma de células-tronco embriônicas humanas. Células-tronco embriônicas humanas são células pluripotentes, de auto-renovação isoladas diretamente de embriões humanos pré-implante que recapitulam a organogenese in vitro. As células precursoras específicas de linhagem são derivadas de células hES e entraram em uma linhagem celular específica, mas ainda permanecem multipotentes com relação ao tipo celular dentro da linhagem específica. Por exemplo, precursores neurais estão comprometidos com a diferenciação neural mas ainda permanecem não limitados com relação a seu tipo de célula neural. Também estão dentro do escopo dos métodos inventivos os tipos de células terminalmente diferenciadas, como neurônios. As vias bioquímicas do desenvolvimento humano e doenças são ativas em hESCs e ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, porque elas recapitulam a diferenciação em células somáticas funcionais. A desregulação destas vias durante o desenvolvimento contribuiu para distúrbios como defeitos do tubo neural (NTDs) e prejuízo cognitivo. Os agentes ambientais, ou seja os produtos químicos ou fármacos, participam na ontogênese de alguns distúrbios congênitos adquiridos. A questão de quais vias durante o desenvolvimento humano inicial são particularmente suscetíveis aos efeitos do ambiente permanece não resolvida.

O metaboloma, definido como o conjunto dinâmico total de metabólitos celulares presentes em células, é um produto de estados de saúde ou doença/insulto. Metabolômica é particularmente sensível aos efeitos ambientais em comparação com outras áreas de estudo "ômicas", como genômica e proteômica. Os metabólitos celulares incluem mas não são limitados a açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos e ácidos graxos, particularmente as espécies secretadas ou excretadas das células, que participam nos mecanismos funcionais de uma resposta celular a insulto patológico ou químico. Estes metabólitos celulares servem como biomarcadores de doença ou resposta tóxica e podem ser detectados em fluidos biológicos (Soga et al, 2006, JBiol Chem 281:16768-78; Zhao et al., 2006, Birth Defects Res A Clin Mol Teratol 76'-23 0-6), incluindo meios de cultura de hESC. Importante, o perfil metabolômico pode confirmar as mudanças funcionais que são com freqüência previstas por transcriptômica e proteômica.

No entanto, porque se sabe que as hESCs são altamente sensíveis a microambiente da cultura (Levenstein et al., 2005, Stem cells24: 568-574; Li et al, 2005, Biotechnol Bioeng91 _:688-698.), sua aplicação como uma fonte de biomarcadores previsores em resposta a compostos químicos, incluindo toxinas, teratogênios e particularmente agentes farmacêuticos, compostos de ponta de fármaco e compostos candidatos no desenvolvimento de fármacos, e sua utilidade no estabelecimento de modelos in vitro de doença e desenvolvimento era incerta, inter alia, porque os versados na técnica podem antecipar que a exposição a um produto químico exógeno seria altamente prejudicial à sobrevivência das células hES e excluíram a obtenção de informação utilizável a partir das mesmas. Esta preocupação acabou demonstrada como não sendo justificada.

Como usado aqui, o termo "células-tronco embriônicas humanas (hESCs)" se destina a incluir células-tronco não diferenciadas originalmente derivadas da massa celular interna de blastócitos em desenvolvimento e especificamente células-tronco pluripotentes, não diferenciadas humanas e os tipos de células parcialmente diferenciadas das mesmas, (por exemplo, progenitores a jusante de hESC diferenciantes). Como provido aqui, culturas in vitrode hESC são pluripotentes e não imortalizadas e podem ser induzidas para produzir tipos de células específicas de linhagem e células diferenciadas usando métodos bem estabelecidos na técnica. Em formas de realização preferidas , hESCs utilizáveis na prática dos métodos desta invenção são derivadas de blastócitos pré-implantes como descrito por Thomson et al., em Patente US de comum propriedade No. 6.200,806. As linhagens de células múltiplas hESC estão atualmente disponíveis em dados de células-tronco nos Estados Unidos e Reino Unido.

Os termos "célula-tronco progenitora,""célula específica de linhagem,""célula derivada de hESC" e "célula diferenciada" como usados aqui se destinam a englobar células específicas de linhagem que são diferenciadas de células hES de modo que as células estão comprometidas com a linhagem específica de potência diminuída. Em algumas formas de realização, estas células precursoras específicas de linhagem permanecem não diferenciadas com relação ao tipo de célula final. Por exemplo, células-tronco neuronais são derivadas de hESCs e são diferenciadas o suficiente para se comprometer com a linhagem neuronal. No entanto, o precursor neuronal retém "um rigor" em que ele retém o potencial para se desenvolver em qualquer tipo de célula neuronal. Os tipos de células adicionais incluem células terminalmente diferenciadas derivadas de hESCs ou células precursoras específicas de linhagem, por exemplo células neurais.

O termo " metabólito celular " como usado aqui refere-se a qualquer molécula pequena secretada e/ou excretada por uma hESC ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, produzidas a partir das mesmas. Em formas de realização preferidas, metabólitos celulares incluem mas não são limitados a açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidos graxos, hormônios, vitaminas, oligopeptídeos (menos do que cerca de 100 aminoácidos de comprimento), assim como os fragmentos iônicos dos mesmos. Células também podem ser lisadas a fim de medir os produtos celulares presentes dentro da célula. Em particular, referidos metabólitos celulares tem de cerca de 10 a cerca de 3600 Daltons de peso molecular, mais particularmente cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons, e ainda mais particularmente de cerca de 100 a cerca de 1000 Daltons. hESCs são cultivadas de acordo com métodos da invenção usando métodos padrões de cultura de células bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo os métodos descritos em Ludwig et al. (2006, .’Feederindependent culture of human embryonic stem cells Nat Methods 3_: 63746.). Em formas de realização preferidas, hESCs são cultivadas na ausência de uma camada de células alimentadoras durante a prática dos métodos inventivos; no entanto, hESCs podem ser cultivadas em camada de células alimentadoras antes da prática dos métodos desta invenção.

O termo "administrar" como usado aqui refere-se a contar culturas in vitro de hESCs ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais produzidas a partir das mesmas, com um composto químico tóxico, teratogênico, ou de teste. Em uma forma de realização preferida a dosagem do composto é administrada em uma quantidade equivalente aos níveis obtidos ou obteníveis in vivo, por exemplo, em circulação materna.

As frases "identificar metabólitos celulares que são diferencialmente produzidos' ou "detectar alterações nas células ou alternações em atividade celular" como usado aqui incluem mas não são limitadas a comparações de células hES tratadas ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, a células não tratadas (controle) (isto é, células cultivadas na presença (tratadas) ou ausência (não tratadas) de um composto químico tóxico, teratogênico, ou de teste). Detecção ou medida das variações em metabólitos celulares, excretados ou secretados dos mesmos, entre células tratadas e células não tratadas está incluída nesta definição. Em uma forma de realização preferida, alterações em células ou atividade celular são medidas por determinação de um perfil de mudanças em metabólitos celulares tendo um peso molecular de menos do que 3000 Daltons, mais particularmente entre 10 e 1500 Daltons, e ainda mais particularmente entre 100 e 1000 Daltons, em uma célula tratada versus célula não tratada como ilustrado em Figuras IA a 1C.

O termo "correlacionar" como usado aqui refere-se à correlação positiva ou correspondência de alterações em metabólitos celulares incluindo mas não limitados a açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidos graxos, e compostos excretados ou secretados de baixo peso molecular de células hES ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, para uma resposta tóxica em vivo. Os metabólitos celulares triados podem estar envolvidos em uma ampla faixa de vias bioquímicas nas células e relacionados com uma variedade de atividades biológicas incluindo, mas não limitadas a inflamação, resposta anti-inflamatória, vasodilatação, neuroproteção, estresse oxidativo, atividade antioxidante, replicação de DNA, e controle do ciclo celular, metilação e biossíntese de, inter alia, nucleotídeos, carboidratos, aminoácidos e lipídeos dentre outros. As alterações em subconjuntos específicos de metabólitos celulares podem corresponder a uma via metabólica ou desenvolvimental particular e assim revelam efeitos de um composto de teste no desenvolvimento in vivo.

O termo "método de separação física" como usado aqui referese a qualquer método bem conhecido do versado suficiente para produzir um perfil de mudanças e diferenças em moléculas pequenas produzidas em hESCs ou células específicas na linhagens derivadas de hESC, como célulastronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, contatadas com um composto químico tóxico, teratogênico ou de teste de acordo com métodos desta invenção. Em uma forma de realização preferida, métodos de separação física permitem detecção de metabólitos celulares incluindo mas não limitados a açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidos graxos, hormônios, vitaminas, e oligopeptídeos, assim como os fragmentos iônicos dos mesmos e compostos de baixo peso molecular (preferivelmente com um peso molecular menor do que 3000 Daltons, mais particularmente entre 10 e 1500 Daltons, e ainda mais particularmente entre 100 e 1000 Daltons). Em formas de realização particulares, esta análise é realizada por cromatografía de líquido/ tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo (LC/ESI-TOF-MS), no entanto será entendido que os metabólitos celulares como especificados aqui podem ser detectados usando métodos alternativos de espectrometria ou outros métodos conhecidos na técnica para analisar estes tipos de compostos celulares nesta faixa de tamanho.

Os dados para análise estatística foram extraídos de cromatogramas (espectros de sinais de massa) usando o software Agilent Mass Hunter (Produto No. G3297AA, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); será entendido que os métodos de análise estatística alternativos também podem ser usados. As massas foram depositadas juntas se elas estavam na faixa de 10 ppm e eluídas em uma janela de tempo de retenção de 2 min. Uma massa depositada junto foi considerada como sendo a mesma molécula através de análises diferentes LC/ESI-TOF-MS (referida aqui como "massa exata," que será entendida como sendo ±10 ppm). O armazenamento dos dados é requerido para análise estatística e comparação de massas através da experiência completa. Se picos múltiplos dentro da mesma massa no mesmo tempo de retenção dentre de uma única amostra forem detectados por Mass Hunter, eles foram obtidos em média para auxiliar na análise dos dados. As massas faltando uma distribuição isotópica natural ou com uma relação sinal-para-ruído de menos que 3 foram removidas dos dados antes da análise. Um versado na técnica irá notar que os resultados deste teste fornecem valores relativos que são avaliados de acordo com os valores anotados em 10 ppm para dar uma identidade para o peso molecular detectado. Assim, uma mudança de massa em 10 ppm é considerado consistente com a determinação da identidade de um metabólito celular específico anotado conhecido na técnica devido às diferenças na fonte de ionização e instrumentação, por exemplo entre diferentes experimentos ou usando diferentes instrumentos.

Como usado aqui, uma mass foi considerada como sendo a mesma através de ciclos de LC/ESI-TOF-MS usando um algoritmo simples que primeiro classifica os dados por massa e tempo de retenção. Após a classificação, um composto foi considerado singular se ele tinha uma diferença de tempo de retenção menor do que ou igual a três minutos e uma diferença de massa menor do que ou igual à fórmula ponderada (0,000011 x massa). Se uma série de medidas configurar esta definição, ele foi considerado como sendo do mesmo composto. Se ou a massa ou o tempo de retenção variar em mais do que os limites listados acima, ele foi considerado como sendo um composto diferente e recebeu uma nova designação única.

Os testes de significância foram determinados realizando-se ANOVAs nos valores de abundância transformados de base log 2 de compostos singulares presentes em meios tratados e não tratados no mesmo ponto de tempo. Um projeto de bloco completo randomizado foi usado com o modelo ANOVA incluindo os efeitos de tratamento, experimentos, e um prazo residual, com a seguinte fórmula: Log2 (abundânciaíè)= tratamentof + experimento^, + errotó.

Os dados faltando foram omitidos do teste mudando os graus de liberdade em vez de considerar que os dados faltando estavam ausentes. Esta suposição foi feita devido ao fato da filtração extensiva realizada pelo software Mass Hunter poder perder ou filtrar alguns picos porque eles estão abaixo de um certo limiar de abundância e não zero. O teste ANOVA F foi considerado significante se seu valor p for menor que 0,05. As mudanças na duplicação foram calculadas usando a média de mínimos quadrados durante um tempo dado e tratamento.

O termo "biomarcador" como usado aqui refere-se a metabólitos celulares que demonstram alterações significantes entre controles tratados e não tratados. Em formas de realização preferidas, biomarcadores são identificados como especificado acima, por métodos incluindo LC/ESITOF-MS. Biomarcadores metabolômicos são identificados por sua consistência e massa molecular única com as quais o marcador é detectado em resposta a um composto químico tóxico, teratogênico ou de teste particular; assim, a identidade real do composto subjacente que corresponde ao biomarcador não é requerida para a prática desta invenção. Altemativamente, alguns biomarcadores podem ser identificados por, por exemplo, análise da expressão do gene, incluindo PCR em tempo real, RT-PCR, análise Northern, e hibridização in situ, mas estes não estarão geralmente dentro da definição do termo "metabólitos celulares" como especificado aqui.

O metaboloma basal de nESCs não diferenciadas serviu como uma coleção de assinaturas bioquímicas de vias funcionais que são relevantes para seu caráter tronco e auto-renovação. Os perfis metabólitos foram conduzidos em metabólitos celulares excretados ou secretados como oposto a compostos intracelulares. Por fim, biomarcadores descobertos in vitrosão esperados como sendo utilizáveis para análise de biofluidos in vivo, como soro, fluido amniótico, e urina, misturas complexas de biomoléculas extracelulares. Isto é vantajoso em comparação com os procedimentos invasivos como biopsias de tecido porque as moléculas pequenas em biofluidos podem ser detectadas não invasivamente (em contraste com compostos intracelulares). Além disso, o processamento do sobrenadante celular para espectrometria de massa é mais robusto e menos laborioso do que os extratos celulares. No entanto, os extratos celulares (de, por exemplo, células lisadas) podem ser usados nos métodos da invenção.

O termo "perfil do biomarcador" como usado aqui refere-se a uma pluralidade de biomarcadores identificados pelos métodos inventivos. Os perfis de biomarcador de acordo com invenção podem prover uma "impressão digital" molecular dos efeitos teratogênicos e tóxicos de um composto de teste e transferir os metabólitos celulares, metabólitos celulares especificamente excretados e secretados, que foram alterados de modo significante após a administração do composto de teste a hESCs ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais. Nestas formas de realização, cada um dentre uma pluralidade de biomarcadores é caracterizado e identificado por sua massa molecular e consistência singulares com que o biomarcador é detectado em resposta a um composto químico tóxico, teratogênico ou de teste particular; assim a identidade real do composto subjacente que corresponde ao biomarcador não é requerida para a prática desta invenção.

O termo "portfolio de biomarcador " como usado aqui referese a uma coleção de perfis de biomarcadores individuais. Os portfolios de biomarcadores pode ser usado como referências para comparar o perfil de biomarcadores de compostos novos ou desconhecidos. Portfolios de biomarcadores podem ser usados para identificar vias comuns, particularmente vias metabólicas ou desenvolvimentais, de resposta tóxica ou teratogênica.

Estes resultados especificados aqui demonstraram que a metabolômica de células-tronco embriônicas humanas, e metabolômica de células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, podem ser usadas na descoberta de biomarcadores e identificação de vias. Metabolômicas detectaram moléculas pequenas secretadas por hESCs ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, produzidas a partir dai e os biomarcadores identificados podem ser usados para pelo menos dois fins: primeiro para determinar as vias metabólicas ou desenvolvimentais específicas que respondem a ou são afetadas por exposição a toxinas ou teratogênios, particularmente as referidas vias utilizadas ou afetadas durante o desenvolvimento inicial, que são sensíveis a compostos químicos tóxicos, teratogênicos ou de teste que são desreguladores desenvolvimentais e participam na ontogênese de defeitos congênitos; e segundo, para prover metabólitos celulares que podem ser medidos em biofluidos para auxiliar no controle e diagnóstico de exposição a agentes tóxicos, efeitos congênitos ou outras doenças.

Um portfolio de biomarcador de hESCs ou células específicas na linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, produzidas a partir dos mesmos podem servir também como uma ferramenta de triagem de produção elevada nas fases pré-clínicas de descoberta de fármacos. Além disso, esta abordagem pode ser usada para detectar efeitos prejudiciais de produtos químicos ambientais (metais pesados, produtos de refugo industrial) e nutricionais (como álcool) sobre o desenvolvimento humano. Por fim, os métodos desta invenção utilizando o metaboloma de hESC ou o metaboloma de células específicas de linhagem derivadas de hESC, como células-tronco neurais, células precursoras neurais e células neurais, podem auxiliar as agências relacionadas com agentes farmacêuticos, biotecnologia e ambiental na tomada de decisões para o desenvolvimento de compostos e doses criticas para a exposição aos humanos. A integração de biologia química com a tecnologia de célula-tronco embriônica também oferece oportunidades singulares para reformar a compreensão de desenvolvimento humano e doença. Metabolômica de células diferenciadas de hESC pode servir a papeis similares e pode ser utilizável para elucidar mecanismos de toxicidade e doença com maior sensibilidade para tipos de células ou tecido particulares e em um modo específico humano. Por exemplo, vias metabólicas chaves, incluindo como especificado aqui síntese e degradação de folato, glutamato e triptofano, podem ser diferencialmente desreguladas em estágios anteriores versusestágios posteriores do desenvolvimento humano. Além disso, perfis metabólitos of células precursoras neurais ou populações de células neuronais podem revelar biomarcadores de distúrbios neurodesenvolvimentais em tipos de células alvo. A associação de metabolômica a biologia de células-tronco pode informar os mecanismos de ação de ácido fólico e defeitos do tubo neural no embrião humano inicial.

Portfolios de biomarcadores produzidos usando os métodos dependentes de hESC e dependentes de células específicas de linhagens derivadas de hESC desta invenção também podem ser usados em métodos de triagem de produção elevada para a avaliação pré-clínica de fármacos candidatos e compostos de ponta na descoberta de fármacos. Este aspecto dos métodos inventivos produz um impacto mínimo sobre os recursos da indústria em comparação com os modelos de toxicologia desenvolvimental atuais, porque a implementação deste tecnologia não requer animais experimentais. O impacto positivo resultante sobre a produtividade permite que as equipes de pesquisa na indústria farmacêutica selecionem e antecipem compostos no desenvolvimento exploratório com uma maior confiança e um risco diminuído de entrar efeitos desenvolvimentais adversos.

O termo "via desenvolvimental" como usado aqui refere-se a via desenvolvimental ou metabólica em desenvolvimento embriônico e fetal. "Sobrenadante" como usado aqui por incluir, mas não é limitado a meios extracelulares, meios co-cultivados, células, ou uma solução de células fracionadas ou lisadas.

Os perfis metabólitos celulares obtidos da análise de toxinas, teratogênios, álcool, e compostos químicos de teste podem ser usados para compor uma biblioteca de portfolios de biomarcadores. Estes portfolios então podem ser usados como uma referência para a análise toxicológica de compostos químicos desconhecidos. Uma estratégia similar foi validada como um meio para determinar as mudanças celulares que surgem em resposta a produtos químicos em sistemas não ESC (Daston & Nacliff, 2005, Reprod Toxicology19:381-94; Fella et al., 2005, Proteomics5: 1914-21). Os perfis metabólicos de novos compostos podem ser comparados a portfolios de biomarcadores conhecidos para identificar mecanismos comuns de resposta tóxica. Esta abordagem pode revelar marcadores funcionais de resposta tóxica, que servem como moléculas de triagem que são compartilhadas, pelo menos em parte, como uma conseqüência de exposição a vários compostos tóxicos e teratogênicos diferentes. Estas moléculas pequenas derivadas de hESC podem ser usadas com mediadores mensuráveis de resposta tóxica que refmem ou substituem os sistemas de triagem onerosos e complexos (como em modelos de animais in vivo) e tem a vantagem adicional de serem específicos para células humanas e vias metabólicas e desenvolvimentais humanas.

Exemplos

Os exemplos que seguem são ilustrativos de formas de realização específicas da invenção, e vários usos das mesmas. Eles são enunciados para fins explanatórios apenas, e não devem ser tomados como limitação da invenção.

Exemplo 1 Triagem de toxicologia desenvolvimental

Para demonstrar a eficácia de hESCs como um sistema de modelo para teste de toxicidade desenvolvimental, hESCs foram tratadas com um conhecido teratogênio, valproato (VPA). Valproato é um estabilizador de humor comum e fármaco anti-convulsiva com indicações clínicas em epilepsia e distúrbio bipolar (Williams et al., 2001, Dev Med Child Neuro 43:202-6) que foram associados com anormalidades desenvolvimentais (Meador et al., 2006, Neurology 67: 407-412). O mecanismo pelo qual valproato produz defeitos desenvolvimentais, no entanto, não é completamente entendido, apesar da suscetibilidade aumentada do sistema nervoso (Bjerkedal et al., 1982, Lance 2j.l09: Wyszynski et al., 2005, Neurology 64_1961-5; Rasalam et al., 2005, Dev Med Child Neuro 47:551555). Exposição a valproato resulta em um aumento pronunciado em defeitos de espinha bífida e tubo neural (NTDs; Bjerkedal et al., 1982, Lancet 2:109) em dez a vinte vezes os da população geral, bem como distúrbio cognitivo como autismo (Adab et al., 2004, J Neurol Neurosurg Psychiatry 15 575-83). Entretanto, uma vez que VPA é um fármaco anti-convulsivo com indicações clínicas em epilepsia e distúrbio bipolar (Williams et al., 2001, Dev Med Child Neurol 43:202-06), tratamento geralmente deve ser mantido durante toda a gravidez.

Suplementação com ácido fólico antes de gravidez reduz a incidência de espinha bífida em 70% (Shaw et al., 1995, Epidemiology 6j219226) embora seu mecanismo preciso de ação seja desconhecido. Além disso, homocisteína e glutationa também têm sido implicadas em NTDs (Zhao et al., 2006, Birth Defects Res A Clin Mol Teratol 76:230-6). Deste modo, perfis metabólitos de folato e vias relacionadas foram candidatos para mudanças em resposta a valproato. Nos resultados enunciados aqui, ácido fólico foi significantemente aumentado (por 16%) nos meios de cultura extracelular de células hES tratadas com valproato (p =0,022 em oito dias, Tabela 3 e Figura 4) mas não seu diidrofolato derivado. Uma vez que células de mamífero não sintetizam ácido fólico, valproato pode agir interferindo com a absorção celular de ácido fólico.

Exposição de hESCs foi realizada como segue. Hl hESCs (passagem 41) foram cultivadas em Matrigel (BD Scientific, San Jose, CA) na ausência de uma camada alimentadora. hESCs foram mantidas em meio de cultura condicionado (CM) coletado de fibroblastos embriônicos de camundongo (MEFs) (80% DMEM/F12, Invitrogen, Carlsbad, CA) e 20% de substituição de soro KNOCKOUT (Invitrogen) suplementados com Lglutamina 1 mM (Invitrogen), MEM a 1% de aminoácidos não essenciais (Invitrogen), e 2mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma, Chemical Co., SL Louis, MO). Antes de alimentar hESCs, o meio de cultura foi suplementado com 4 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico recombinante humano (Invitrogen). hESCs foram passadas quando as fontes foram -80% confluentes. Para passagem, hESCs foram incubadas em uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen)/DMEM/F12 por 7-10 minutos a 37 C. Após este tratamento, hESCs foram lavadas e semeadas em placas revestidas de Matrigel fresco. Em estudos paralelos descritos aqui, células de Hl e H9 foram cultivadas em meio de cultura definido conhecido como TeSR (Ludwig et al., 2006, Id.). hESCs Hl e H9 (equivalentes a NIH código WA01/WA09) foram tratadas com valproato (VPA) (22pM e 1 mM) (Sigma # P4543) de acordo com procedimento resumido abaixo; cada experimento envolveu três tratamentos com VPA separados, e cada grupo de tratamento teve um grupo de controle paralelo com um total de seis pratos de cultura de 6 cavidades (Nunc, Naperville, IL) por experimento (dois discos de cultura de 6 cavidades por tratamento). Tratamento 1 (rotulado 24H) células de hESC expostas a 1 mM de VPA (Sigma) durante 24 horas seguidas por coleta de sobrenadante e grânulos de células. Em um segundo grupo de tratamento (rotulado 4D), células de hESC foram expostas a 22pM ou 1 mM VPA durante 4 dias e coletadas no dia 4. Em um terceiro grupo de tratamento (rotulado cultura estendida, EC), células de hESC receberam 22pM ou 1 mM VPA durante 4 dias seguido por cultura em meios de hESC padrão por quatro dias adicionais. Para este grupo, células e sobrenadante foram coletados no dia oito.

Para avaliar os efeitos de tratamento de VPA teratogênico em hESCs, as células tratadas foram analisadas como especificado abaixo para determinar mudanças em um conjunto dinâmico total de moléculas pequenas presentes em células de acordo com estados de saúde e doença ou de insulto. Moléculas pequenas incluindo mas não limitadas a açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidos graxos, hormônios, vitaminas, oligopeptídeos (menos do que cerca de 100 aminoácidos em comprimento), bem como fragmentos iônicos dos mesmos e compostos de peso molecular baixo de sinalização foram conhecidos como participando em e revelando mecanismos funcionais de resposta celular a insulto patológico ou químico. Estas análises também foram usadas para identificar vias ativas seguindo mudanças moleculares previstas por outras análises incluindo por exemplo transcriptômica e proteômica.

Sobrenadante de hESCs tratadas com VPA e de controle foi submetido a cromatografia de líquido e tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo (LC/ESITOF-MS) para avaliar mudanças e diferenças em moléculas pequenas (como definido aqui) produzidas pelas células na presença e ausência de tratamento de VPA. Sobrenadante foi coletado das placas de controle e tratadas de hESCs a 24H, 4D, e 8D, e CM foi coletado como um controle "sem tratamento". O sobrenadante e meios de cultura foram armazenados a -80°C até preparação para análise de espectrometria de massa. Para análise, amostras foram preparadas em uma solução de 20% de Acetonitrila (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA) (compreendendo 500 |iL de sobrenadante, 400pL de acetonitrila e 1,1 mL de água destilada) e centrifugadas através de uma coluna de Centricon Millipore 3kDa (Millipore, Billerica, MA) por 3 horas a 4575 x g para remover as proteínas. O fluxo completo foi retido para análise, pois continha moléculas pequenas livres de compostos de peso molecular grande como proteínas. Em cada análise, três replicas para cada amostra foram injetadas em uma coluna de Cl8 de 2,1 x 200mm usando um gradiente de 90 minutos de 5% de Acetonitrila, 95% de Agua, 0,1% Ácido Fórmico para 100% de Acetonitrila, 0,1% de Ácido Fórmico a uma taxa de fluxo de 40pL/min. ESI-TOF-MS (TOF) foi realizada no fluxo completo usando um espectrômetro de massa Agilent ESI-TOF. Dados foram coletados a 100-3600 m/z, e particularmente na faixa de 0-1500 m/z. Os dados de material foram analisados para identificar as moléculas pequenas separadas usando um programa de compilação e análise de computador (Mass Hunter) fornecido pelo fabricante e de acordo com instruções do fabricante (Agilent; análises estatísticas foram realizadas como descrito abaixo na Descrição Detalhada e Formas de realização Preferidas. Esta análise gerou listas de aspectos de pares com tempo de retenção/massa exata. Outro programa (Mass Profiler, Agilent) foi usado para comparar conjuntos de ciclos múltiplos para encontrar mudanças de intensidade iônica de aspectos que mudaram entre as condições de amostra. Testes de significância foram determinados executando ANOVAs no valores de abundância transformados de base log 2 de compostos únicos presentes em meios tratados e não tratados a cada ponto de tempo.

A pluralidade de moléculas pequenas identificadas usando estes métodos foi então comparada com massa exata e tempo de retenção de ESI-TOF-MS usando bases de dados públicas (por exemplo, em http://metlin.scripps.edu.,www.nist.gov/srd/chemistry.htm; http://www.metabolomics.ca/). Análise de espectrometria de massa também inclui estruturas químicas previstas de moléculas pequenas baseadas em massa exata, apesar de bases de dados públicas disponíveis presentemente não incluírem, em cada exemplo, moléculas pequenas correspondentes devido às limitações da base de dados. Além disso, bases de dados privadas mais abrangentes são disponíveis para análises comparativas, como NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library: Versão 05. NIST ASCII.

Os resultados destas análises são mostrados em Figuras IA a 1C e Figura 2A a 2C. Em Figuras IA a 1C, cada aspecto no gráfico corresponde a uma molécula pequena com massa exata específica e tempo de retenção. Os gráficos resumem diferenças significantes encontradas entre grupos tratados (azul ) e não tratados (vermelho) em diferentes pontos de tempo. Como mostrado na Figura, em 24 horas (24H) existia uma regulação negativa consistente das biomoléculas secretadas em células tratadas (azul) em comparação aos controles não tratados (vermelho). Em quatro dias (4D) e oito dias (EC), células tratadas (azul ) secretaram um número maior de moléculas pequenas em comparação com células não tratadas (vermelho); referidas moléculas pequenas foram assim consideradas como biomarcadores candidatos. Em particular, metabólitos da via folato, incluindo tetraidrofolato (massa exata 444) e diidrofolato (massa exata 441) foram detectados. Estas descobertas foram consideradas significantes porque elas mostram pela primeira vez que hESCs contatadas com um teratogênio conhecido (VPA) que causa um defeito congênito (espinha bífida) respondeu por uma regulação de modo positivo a uma via metabólica que produz um composto (folato) conhecido como melhorando os efeitos de teratogênio quando administrado a uma mulher grávida de um embrião em desenvolvimento ou feto.

Além disso, os resultados mostrados em Figuras IA a 1C revelaram aproximadamente 40 moléculas pequenas que estavam ausentes em grupos tratados, sugerindo que vias celulares múltiplas foram "silenciadas" em resposta a VPA em 24 horas em comparação com controles não tratados. Em quatro e oito dias após tratamento, entretanto, candidatos de biomarcadores múltiplos foram regulados de modo positivo em células-tronco embriônicas humanas tratadas versus não tratadas; estes resultados são mostrados em Tabela 1. biomarcadores candidatos foram identificados como moléculas pequenas mostrando uma mudança em células tratadas versus células não tratadas medidas como tendo uma diferença de pelo menos duas vezes. Em muitos exemplos, estas moléculas pequenas estão ausentes ou detectadas em concentrações muito baixas em células-tronco embriônicas humanas não tratadas.

Esses estudos demonstraram que os métodos reivindicados para avaliar a toxicidade desenvolvimental e a identificação de biomarcadores usando hESCs proveu informação robusta em mudanças em teor de molécula pequena de células em resposta a serem contatadas com um teratogênio conhecido, VPA. Os resultados relativos a um composto (VPA) que está envolvido na etiologia de espinha bífida e defeitos de tubo neural (NTDs)(Bjerkedal et al., 1982, Lancet 2: 109) quando exposto a um conceptushumano em desenvolvimento são particularmente surpreendentes. Os resultados mostrados aqui indicaram um aumento marcado (2 a 8 vezes) em metabólitos chave da via de folato (ácido diidrofólico, ácido tetraidrofólico, S-adenosilmetionina) seguindo tratamento com VPA (em comparação com células não tratadas). Estes métodos foram reproduzíveis, tendo sido repetidos com resultados consistentes obtidos em três estudos independentes usando hESCs e em células não embriônicas (fibroblastos humanos) como controles (dados não mostrados), e sugeriram um resposta adaptiva até agora desconhecida do feto para o insulto químico/ambiental e identificaram marcadores sensíveis para referido(s) insulto(s). O mecanismo para defeitos desenvolvimentais de VPA, entretanto, não é completamente entendido apesar do fato de que o sistema nervoso é particularmente sensível a seus efeitos (Bjerkedal et al, 1982, 5 Lancet2:109; Narita et al, 2000, Pediatric Res52:576-79; Rasalam et al., 2005, Dev Med Child Neurol47:551-55). Suplementação com ácido fólico antes de gravidez previne a incidência de espinha bífida em 70% (Shaw et al., 1995, Epidemiology6:219-226), apesar do mecanismo exato de ação ser também desconhecido. A informação obtida aqui pode ser usada para elucidar 10 mecanismos de ação de ácido fólico e defeitos de tubo neural no embrião humano inicial. Estes métodos também podem ser aplicados a outros teratogênios conhecidos, como ácido retinóico, warfarina, e talidomida (Franks et al., 2004, Lancet 363: 1802-11) para validar a habilidade previsora de hESCs usando os métodos da invenção. Tabela 1 : Moléculas pequenas candidatas (biomarcadores) de toxicidade desenvolvimental detectadas em células-tronco embriônicas humanas não diferenciadas tratadas com 1 mM valproato em comparação com controles não tratados.

RT= tempo de retenção

A detecção de molécula pequena foi conduzida com LC/ESI-TOF-MS em amostras triplicadas de sobrenadantes processadas independentemente.

Como discutido acima, perfis metabólitos foram determinados em 24 horas, quatro dias e oito dias após tratamento com valproato. Em quatro dias após tratamento, biomarcadores candidatos múltiplos foram regulados de modo positivo em células-tronco embriônicas humanas tratadas versus não tratadas (mostrado em Figuras 2A a 2C). Além dos resultados enunciados acima com respeito a níveis aumentados de alguns metabólitos, picos de metabólitos múltiplos foram regulados de modo negativo em resposta a valproato em 24 horas em comparação com controles não tratados (Figuras 2A a 2C). hESCs foram cultivadas em meio condicionado de fibroblastos embriônicos de camundongo, que geraram 1277 dos 3241 compostos medidos. Muitos metabólitos em desenvolvimento de humanos e doenças estão provavelmente presentes em meio condicionado de fibroblastos embriônicos de camundongos devido às vias metabólicas comuns. A investigação rigorosa é requerida para validar biomarcadores candidatos que não são exclusivos para hESCs e também estão presentes nos meios.

Exemplo 2 Análise de Expressão de Gene

A eficácia de uma análise mostrada no Exemplo 1 foi confirmada pelos estudos de expressão de gene, em que mudanças em expressão de genes foram observadas seguindo tratamento com VPA de hESCs. Tratamento com VPA não foi prejudicial a hESCs, que se mantiveram viáveis para passagens múltiplas após a exposição a teratogênio, assim possibilitando análise de expressão de genes a ser realizada .

Células WA01 de hES código Hl/NIH tratadas e de controle (passagem 41) foram analisadas por PCR de tempo real, e cada grupo de tratamento foi dividido aos pares com um grupo de controle correspondente que recebeu a combinação de meios de cultura de crescimento padrão de CM+bFGF sem VPA. Nesses estudos, RNA celular total foi extraído de células coletadas em 24 horas (24H), 4 dias (4D) e 8 dias (EC) usando o Kit RNA Easy (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Níveis de expressão de genes de teste candidatos e um gene "housekeeping" (Beta-2microglobulina) foram avaliados por PCR de tempo real quantitativo usando um sistema de detecção DNA Motor-Opticon 2 (MJ Research, Watertown, MA). O gene "housekeeping"atua como um controle interno para normalização de níveis de RNA. Os iniciadores usados para reações de PCR em tempo real foram projetados usando software Beacon Designer (Premier Biosoft International, Paio Alto, CA). RNA foi transcrito reverso usando kit de síntese de cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA), em que cada reação de síntese de cDNA (20 |1L) incluiu 4 pL de 5x mistura de reação iScript, 1 pL de transcriptase reversa iScript, e 2 pL de RNA. PCR foi realizado em cDNA em misturas de reação de PCR (25 pL) cada contendo 12,5 pL de Supermix (contém dNTPs, taq DNA polimerase, SYBR Green I, e fluorescina), 250 nM de iniciador dianteiro, 250 nM de iniciador reverso, e 1,6 pL de produtos de RT-PCR. Análise de curva de fusão e de eletroforese de gel de agarose foram realizadas após reação de PCR de tempo real para monitorar a especificidade de PCR, em que os produtos de PCR foram detectados com SYBR Green I usando o Kit iQ SYBR Green Supermix (BioRad).

Quantificação da expressão relativa de PCR de tempo real foi realizada usando o método 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001, Methods 25:402-8), e um modelo linear geral foi empregado para se adequar aos dados de expressão. O procedimento PROC GLM em SAS (versão 8,2; SAS Institute, Cary, NC) foi usado para estimar as médias de mínimos quadrados em expressão entre hESCs tratadas e não tratadas e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante.

PCR de tempo real foi conduzido em amostras de 24 horas (24H), 4 dias (4D) 25 e 8 dias (EC) após tratamento com VPA para investigar os níveis de expressão de reguladores epigenéticos (tais como DNA metiltransferase-1, DNMT-1, BMI-1, EED) e fatores de transcrição críticos responsáveis por padronização embriônica e neurodesenvolvimento (RUNX2, BMP7, FGF8, CBX2, GLI3, SSH e SP8) em células-tronco embriônicas humanas. Estes experimentos mostraram que hESCs tratadas com VPA foram submetidas a mudanças marcadas em sua atividade transcriptional após o tratamento com teratogênio. VPA induziu regulação de modo negativo especialmente marcada (2 a 30 vezes) de níveis de transcrição logo em 24 horas após exposição em todos genes testados (com a exceção de DNMT-1 e Shh). Em 4 dias após tratamento, entretanto, expressão da DNA metiltransferase-1 ubíqua foi quase abolida, e "sonic hedgehog", que é absolutamente crítico para neurogenese (Ye et al, 1998, Cell 93:755-66), foi regulado de modo negativo cinco vezes em comparação com controles não tratados. Em 8 dias após tratamento de VPA, a maioria dos genes foram regulados de modo positivo em comparação com controles não tratados.

Estes resultados corporificam duas implicações principais para toxicologia desenvolvimental. Primeiro, VPA induziu mudanças persistentes em moduladores epigenéticos chaves que também participam em diferenciação de outras tecidos, como DNMT-1 e o membro EED de família policomb. Segundo,os efeitos de teratogênios persistiram em hESCs durante estágios críticos de neurogenese e organogenese. Por exemplo, genes cuja expressão foi afetada como mostrado aqui (incluindo “sonic hedgehog"e FGF-8) são conhecidos como sendo reguladores mestres de diferenciação de neurônios serotonérgicos no cérebro (Ye et al., 1998, Cell 93:755-66). De importância particular é o fato de que a expressão de DNMT-1 é quase abolida em quatro dias após tratamento. In vivo, a desregulação desta enzima é letal para embriões, uma vez que é a principal metiltransferase de manutenção durante a replicação de DNA (Li et al, 1992, Cell 69:915-26).

Seguindo exposição a teratogênio, alterações específicas temporais em expressão de gene desenvolvimental foram observadas. Genes desenvolvimentais diferem em sua suscetibilidade para teratogênios em tempos diferentes. Esta indicação pode ser crítica para entender a especificidade de desreguladores epigenéticos em alguns órgãos ou tecidos. RUNX2, por exemplo, é um ativador transcripcional de desenvolvimento ósseo (Napierala et al., 2005, Mol Genet Metab 86:257-68), e é mais sensível a regulação de modo positivo mediada por VPA em estágios muito prematuros ou tardios após a exposição. Resultados de PCR de tempo real de hESCs descritas aqui foram correlacionados a resultados anteriores in vivo em camundongos (Okada et al.,2004, Bith Defects Res A CHn Moí Ter atol 70:870-879) e ratos (Miyazaki et al, 2005, Int J Devi Neuroscience23:28797). Nestes estudos de animal, VPA inibiu a expressão de genes Polycomb, Eed, Bmil e Cbx2 e induziu regulação de modo negativo de Shh enquanto níveis de FGF8 permaneceram inalterados. Os resultados mostrados aqui em quatro dias seguindo tratamento de VPA (Tabela 2) foram consistentes com essas observações usando outros sistemas de modelo desenvolvimentais.

Tabela 2: Tratamento com VPA 1 mM resultou em mudanças marcadas na expressão de reguladores epigenéticos e genes desenvolvimentais que são críticos para a padronização embriônica e a diferenciação de neurônios.

Níveis de expressão de gene expressão são relativos a um gene de "housekeeping"(gene alvo/Beta-2-Microglobulina).

Exemplo 3 Metaboloma de célula-tronco embriônica humana: Perfis metabolites seguindo exposição a teratogênio

Exposição de células hES ao valproato de teratogênio induziu mudanças significantes em diferentes vias metabólicas, incluindo vias importantes durante a gravidez e desenvolvimento. Um via metabólica alternativa ativada durante gravidez é mostrada na Figura 5, em que triptofano é convertido em quinurenina. Para investigar este aspecto da invenção, hESCs foram cultivadas como descrito no Exemplo 1, e o procedimento para tratamento com valproato foi realizado como descrito desta maneira. Tratamento 1 (24 horas) expôs as células hES a 22pM de valproato durante 24 horas seguido por coleta de sobrenadante e grânulos de células. No grupo de tratamento (4 dias), células hES foram expostas a 22pM de valproato por 4 dias e coletadas no dia 4. No terceiro tratamento ou cultura estendida (EC, 8 dias), células hES receberam valproato por 4 dias seguido por cultura em meios de cultura celular de hES padrão por um adicional de quatro dias. Células e sobrenadante foram coletados no dia oito. Cada tratamento teve um grupo de controle paralelo com um total de seis culturas de discos de 6 cavidades por experimento (dois discos de cultura de 6 cavidades por tratamento).

Análise de metaboloma foi realizada como descrito no Exemplo 1 (Wu e McAllister, 2003, J Mass Spectrom 38: 1043-53). Misturas complexas foram separadas por cromatografia de líquido (LC) antes de espectrometria de massa de tempo de vôo (TOF) de ionização por eletropulverização (ESI) de acordo com métodos descritos nesse Exemplo e Exemplo 1. Software Mass Hunter (Agilent) foi aplicado para desconvolutar os dados e determinar a abundância de cada massa. Dados foram extraídos do espectro de massa completo usando a faixa m/z de 0 a 1500 e a picos de massa mais abundantes de 2 milhões de topo de cada amostra foram usados para desconvolutar os dados. A razão mínima de sinal-ruído foi fixada em 5. As massas com uma abundância relativa mínima maior que 0,1% foram exportadas do software Mass Hunter e usadas para outras análises. hESCs tratadas com 22pM de valproato resultaram em 3.241 sinais de massa detectados em 42 injeções. Do total de 3.241 sinais de massa detectados nestes experimentos, 1.963 compostos foram medidos exclusivamente em células hES e 1.278 compostos também estavam presentes em meio condicionado; 443 destes foram apenas medidos em 1 de 42 injeções. 110 compostos (3%) tiveram diferenças estatisticamente significantes em pelo menos um ponto de tempo em hESCs tratadas com valproato comparados com controle. Mudanças de vezes tão elevadas quanto setea treze vezes foram medidas após tratamento com valproato, mas estes sinais de massa exibiram alta variabilidade em todos os experimentos. Massas representativas identificadas seguindo tratamento de células com 1 mM e 22 pM de VPA são resumidas em Tabelas 3 e 4, respectivamente. Vários picos (1 ,963) foram detectados em células hES mas não em meio condicionado. Uma dessas moléculas pequenas foi quinurenina, um composto produzido por uma via metabólica de triptofano alternativa, ativada durante gravidez e resposta imune. Os níveis de quinurenina aumentaram por 44% (valor de p = 0,004 em quatro dias, Tabela 5) seguindo tratamento com valproato. Quinurenina foi detectada exclusivamente em células hES e estava ausente em meio condicionado. A identidade química deste pico foi confirmada por espectrometria de massa comparativa na presença do padrão químico (Figura 4). Os resultados destes experimentos sugeriram que quinurenina é um biomarcador candidato para distúrbios neurodesenvolvimentais, em particular aqueles originados por exposição do embrião humano a fármacos anti-epiléticos como VPA (Omoy et al., 2006, Reproductive Toxicol21.: 399409). Surpreendentemente, estudos recentes têm sugerido que metabolismo de quinurenina pode ser um novo alvo para o mecanismo de ação de fármacos anti-epiléticos (Kocki et al., 2006, Eur J Pharmacol542:147-51). Distúrbios cognitivos e comportamentais são efeitos adversos conhecidos de exposição a anti-epiléticos durante a gravidez. Triptofano é o precursor de serotonina, um neurotransmissor chave na patogênese destas e de outras doenças, como depressão. Além disso, níveis de plasma aumentados de quinurenina foram ligados à depressão pós-parto (Kohl et al., 2005, J Affect Disord86_il35-42). A alteração em metabolismo de triptofano detectado aqui é um meio para examinar novos mecanismos em patogênese de distúrbios comportamentais relacionados a seratonina como autismo (Chugani, 2004, Merit Retard Dev Disabil Res Rev 10112-116). Um aumento em níveis de quinurenina durante desenvolvimento pode reduzir a biodisponibilidade de triptofano e conseqüentemente serotonina, conduzindo a disfunção cognitiva.

Glutamato e ácido piroglutâmico foram também elevados em hESCs tratadas com valproato. Glutamato e ácido piroglutâmico foram elevados em resposta a valproato (20% e 27%, respectivamente), apesar de apenas ácido piroglutâmico demonstrar mudanças estatisticamente significantes (p=0,021 em 4 dias, Figuras 3 A a 3D). Glutationa (GSH) é metabolizada por gama-glutamil transpeptidase em glutamato, um neurotransmissor de receptores de NMDA, e cisteinilglicina (Cys-Gly). Glutationa (massa neutral exata 612,15) e S-adenosil-homocisteína (massa neutral exata 384,12) foram detectadas em níveis muito baixos em comparação a outros sinais de massa (dados não mostrados). Para estes experimentos de detecção de nível baixo, moléculas pequenas foram identificadas por ESI-TOF-MS comparativos com padrões químicos que alcançaram "picos" em meios condicionados em diferentes concentrações e usados para confirmar massas exatas neutrais e tempos de retenção de sinais de massa experimentais (Figuras 3 A a 3D). Massas exatas neutrais e/ou fórmulas químicas empíricas geradas por ESI-TOF-MS foram procuradas em bases de dados públicas (incluindo por exemplo http://metlin.scripps.edu., www.nist.gov/srd/chemistry.htm,www.metabolomics.ca) para compostos candidatos.

Estes resultados sugeriram que valproato afeta a via de síntese de glutamato no embrião humano desenvolvido. A afinidade de fármacos anti-epiléticos com respeito a alvos de glutamato foi previamente sugerida (Rogawski e Loscher, 2004, Nat Rev Neurosci 2004 5:553-64). Níveis anormais de metabólitos de glutamato foram medidos em soro maternal e fluido amniótico de mulheres grávidas cujo crianças foram diagnosticados com espinha bífida (Groenen et al., 2004, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.', 112:16-23) com ressonância magnética nuclear (RMN). Os níveis de glutamina e hidroxiprolina foram significantemente maiores em NTDs, e como um resultado os métodos de hESC dados aqui provêem um meio robusto para modelar as alterações in vivo de desenvolvimento. Tabela 5. Mudanças em perfis metabólicos de quatro compostos em células hES tratadas com 10 valproato versus controles não tratados em 24 horas (24h), 4 dias (4D), e oito dias (8D) após tratamento.

RT= tempo de retenção

Mudanças na duplicação são representadas como diferença de porcentagem das médias dos mínimos quadrados de células hES tratadas com valproato e não tratadas, valores de p foram determinados por ANOVA. A massa é uma massa neutral média detectada por ESITOF-MS e RT é o tempo de retenção médio em que a molécula eluiu. Valores P menores do que 0,05 estão em negrito.

Exemplo 4 Quinurenina: Biomarcador para diagnose e tratamento de toxicidade desenvolvimental e distúrbios de sistema nervoso central

Quinurenina foi mostrada no Exemplo 3 como sendo detectada em células hES tratadas com valproato. Quinurenina (junto com glutamato e ácido piroglutâmico) foi diferencialmente produzida em células-tronco embriônicas humanas tratadas com valproato (hES) versus controles.

Quinurenina é um novo biomarcador utilizável para a identificação de distúrbios neurodesenvolvimentais em crianças e toxicidade desenvolvimental in vitrode produtos químicos . Este exemplo descreve a identificação de biomarcadores para distúrbios neurodesenvolvimentais, incluindo produtos celulares diferencialmente produzidos em hESCs tratadas com teratogênio. O aminoácido triptofano (TRP) é um precursor da serotonina de neurotransmissor, um mediador chave de numerosos distúrbios do sistema nervoso central, como depressão, neurodegeneração e diminuição da capacidade cognitiva. Catabolismo de triptofano no ácido quinurênico é uma via alternativa para metabolismo de triptofano (Figura 5), que é ativado em circunstâncias específicas como resposta inflamatória ou gravidez. Regulação de modo positivo da via quinurenina está correlacionada com psicose em doenças de adultos como esquizofrenia e distúrbio bipolar, uma indicação que níveis aumentados de via intermediária podem alavancar traços psicóticos (Miller et al., 2006, Brain Res16:25-37). Significantemente, metabolismo usando a via quinurenina é acompanhado por metabolismo de triptofano decaído usando a via de serotonina (na ausência de triptofano exógeno, um aminoácido essencial não sintetizado por mamíferos incluindo homem). Um aumento em níveis de quinurenina durante o desenvolvimento pode reduzir a biodisponibilidade de triptofano e conseqüentemente serotonina, conduzindo à disfunção cognitiva.

Além disso, ácido quinurênico (KYNA), um dos produtos finais desta via metabólica de triptofano, é um antagonista de neurotransmissão de glutamato e receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA). Estudos recentes têm demonstrado que ácido quinurênico é um dos alvos que podem servir como fármacos através de seu papel na ativação do GPR35 de receptor de GPCR previamente órfão (Wang et al., 2006, J Biol Chem 281:22021-8). Acido quinolinico (QUIN), outro produto de extremidade da via (Figura 5), e 3hidroxi-quinurenina, um intermediário, atuam como agentes neurotóxicos (Guillemin et al., 2005, J Neuroinflammation26, 16; Chiarugui et al., 2001, JNeurochem 11, 1310-8). QUIN está envolvido na patogênese de mal de Alzheimer onde sua neurotoxicidade pode estar envolvida em inflamação diminuída e em convulsões interagindo com o complexo de receptor de Nmetil-D-aspartato (NMDA), um tipo de receptor de glutamato (Guillemin et al., 2002, J Neuroinflammation26:16, Nemeth et al., 2005, Curr Neurovasc Res 2, 249-60). Quinurenina (KYN), outra via intermediária, é sintetizada no cérebro e é transportada através da barreira sangue-cérebro (Nemeth et al., 2005, Curr Neurovasc Res 2:249-60). KYN é metabolizado para o ácido quinolinico neurotóxico (QUIN) e o ácido quinurênico neuroprotetor (KYNA) (Figura 5). Níveis de soro aumentado de KYN têm sido correlacionados a manifestação clínica de depressão com etiologias diferentes, como distúrbio pós parto (Kohl et al., 2005, J Affect Disord86, 135-42) e tratamento com interferon-alfa (Capuron et al., 2003, Biol Psychiatry54:90614V

Exposição de células hES a valproato, um desregulador de desenvolvimento humano, induziu mudanças significantes em diferentes vias metabólicas, incluindo a produção de quinurenina (massa neutral exata 208,08), que foi significantemente regulada de modo positivo em resposta a valproato como detectado por cromatografia de líquido e tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo (LC/ESI-TOF-MS) como descrito no Exemplo 4. Adicionalmente, novas entidades químicas, tendo massas neutrais exatas de 328,058, 336,163, 343,080, foram detectadas e não estão ainda catalogadas nas bases de dados públicas.

Quando precursores neurais derivados de hESCs foram expostos a 1 mM de valproato, uma diminuição marcada em ambos, serotonina (176,0946) e indolacetaldeído (159,0689), um subproduto à jusante de serotonina gerada por atividade de monoaminoxoidase (MAO) foi observada (Tabela 6). Glutamato e ácido piroglutâmico ou hidroxiprolina (p=0,021) foram também elevados em células hES tratadas com valproato. Estes resultados sugerem que valproato afeta a via de síntese de glutamateno no embrião humano em desenvolvimento. Esse achado emula neurofisiologia in vivo, onde compostos da via quinurenina modulam a atividade em receptores de glutamato de NMDA e produzem fenótipos epiléticos, incluindo ataques repentinos (Perkins e Stone, 1982, Brain Res247: 184-187).

Como uma conseqüência de uma identificação de quinurenina aqui, inibidores químicos de síntese de quinurenina podem ser usados como novas terapêuticas em distúrbios de humor; por exemplo, moléculas pequenas que antagonizam 2,3-dioxigenase de indoleamina (IDO) ou atividades de formilase de quinurenina, que converte triptofano (TRP) em quinurenina (KYN). Inibição de catabolismo de TRP em KYN pode ser usada para melhorar os sintomas de doença em distúrbios cognitivos e neurodegenerativos aumentando os níveis de serotonina, através de síntese elevada deste neurotransmissor ou depleção reduzida através da via quinurenina.

Coletivamente, as mudanças de metabólito detectadas em células hES em resposta a valproato convergem fúncionalmente em direção à vias de folato, quinurenina e glutamato. Figura 6 ilustra o agrupamento hierárquico das diferenças de mudança de duplicação de 22.573 massas singulares. Mudanças nas vias acima mencionadas foram consistentes e reproduzíveis em estudos independentes múltiplos de hESCs tratadas com VPA 1 mM, e precursores neurais produzidos a partir de hESCs (Figura 6).

Exemplo 5 Análise de Expressão de Genes de Via Quinurenina

A eficácia da análise no Exemplo 4 foi confirmada por estudos de expressão de gene, em que mudanças em expressão de genes foram observadas seguindo tratamento com VPA de hESC. Tratamento de valproato de células-tronco embriônicas humanas induziu uma regulação positiva marcada na quinurenina de molécula pequena, um metabólito intermediário no catabolismo de triptofano. Triptofano é o precursor do neurotransmissor serotonina (5HT). Deste modo, se expressão de enzimas no metabolismo de triptofano para quinurenina e sua via oposta, síntese de serotonina, foi alterada em células-tronco embriônicas humanas foi investigado para examinar as propriedades mecanísticas da via quinurenina e sua resposta a valproato.

Células-tronco embriônicas humanas tratadas com 1 mM valproato e controles não tratados foram coletadas em quatro dias após tratamento e armazenados a -80 °C antes de isolação de RNA usando RNeasy (Qiagen). 5 pg de gabaritos de RNA foram transcritos reversos e amplificados (QIAGEN OneStep RT-PCR) de acordo com instruções do fabricante usando iniciadores projetados para transcrever as seqüências humanas dos seguintes 10 genes: INDO, indoleamina 2,3 dioxigenase, TDO ou TDO2, triptofano 2,3dioxigenase, AFMID, arilformamidase, TPH1, triptofano hidroxilase, a enzima limitante de taxa em biossíntese de serotonina, AADAT, aminoadipato aminotransferase, KYNU, quinunreninase, KMO, quinurenina 3-monooxigenase, GAPDH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase.

Os resultados deste estudo mostraram que a maioria das enzimas na via quinurenina e síntese de serotonina foram expressadas em células hES em quatro dias após tratamento de células hES com 1 mM valproato (Figura 7). Indoleamina 2, 3 dioxigenase INDO, catabolisa triptofano na via quinurenina, e produz quinurenina como um produto de extremidade. A expressão de triptofano 2,3 dioxigenase (TDO ou TDO2) foi também examinada. TDO2, como INDO, catalisa a primeira etapa na via quinurenina. Esses dados sugerem que a expressão de TD02 foi regulada de modo positivo em células hES tratadas com valproato em comparação com controles não tratados. A enzima limitante de taxa em síntese de 5HT, TPH1, foi também expressada em células hES (Figura 7). Expressão destas enzimas apoiou a conclusão de que células hES recapitulam vias metabólicas de catabolismo de triptofano e síntese de serotonina. De maneira interessante, VPA induziu expressão pronunciada de enzimas de limitantes de taxa nesta via.

Exemplo 6 Triagem de toxicologia desenvolvimental para exposição a álcool prénatal

Para identificar os metabólitos diferencialmente secretados em resposta a álcool, bem como as vias envolvidas em síndrome de álcool fetal, células-tronco embriônicas humanas foram tratadas com 0, 0,1 e 0,3% etanol por quatro dias seguido por espectrometria de massa de LC/ESI-TOF de acordo com métodos principais descritos acima para valproato no Exemplo 1. Meios extracelulares foram coletados e processados em 24 horas e quatro dias após tratamento, e 49.481 sinais de massa foram detectados após três réplicas técnicas. Dentre os 49.481 sinais de massa, 1.860 compostos foram significantemente diferentes (p<0,05) em pelo menos um tratamento e tiveram um mudança de tempo significante (<1 ou >1). (Tabela 7). Massas armazenadas foram anotadas in silico pesquisando massas neutrais em várias bases de dados diferentes. Estas bases de dados incluíram Metlin, Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB), NIST Chemistry WebBook, Human Metabolome Database. A massa foi considerada identificada quando sua massa neutral estava dentro de 10 ppm de um composto conhecido anotado em uma destas bases de dados listadas acima.

O composto quinurenina putativo (massa neutral exata medida 208,0816) foi regulado de modo positivo três vezes no dia quatro, mas não 24 horas, em ambos os tratamentos (0,1 %, p = 0,001 e 0,3% p = 0,002, respectivamente). Outro metabólito putativo na via quinurenina, 8metoxiquinurenato (219,0532) foi também regulada de modo positivo em quatro dias em resposta a ambos, tratamento com álcool a 0,1% e 0,3% (p<0,05). A análise também detectou uma regulação de modo negativo significante de 5-hidroxi-L-triptofano (220,0848) em quatro dias seguindo tratamento com álcool a 0,3% (p<0,05) em comparação com controles não tratados. 5-hidroxi-L-triptofano é o único metabólito intermediário entre triptofano e serotonina e sua síntese é mediada por triptofano hidroxilase, a enzima limitante de taxa em síntese de serotonina. Estes resultados sugerem que exposição a álcool durante desenvolvimento humano pode afetar biodisponibilidade de serotonina devido a regulação de modo positivo de catabolismo de triptofano em quinureninas. Além disso, exposição ao álcool induziu mudanças significantes em vias metabólicas e moléculas pequenas envolvidas em desenvolvimento neural como glutamato, gabapentina, adrenalina e glutationa.

Exemplo 7 Triagem de toxicologia desenvolvimental de células precursoras neuronais

Avaliação metabolômica de teratógenos em desenvolvimento embriônico não é limitado exclusivamente a hESCs. Os métodos da invenção são também utilizáveis com outras células-tronco progenitoras, incluindo células-tronco restritas na linhagem como células precursoras neurais. Para ilustrar a eficácia de triagem de toxicologia em células-tronco específicas de linhagem, precursores neuronais derivados de hESCs foram tratados com 1 mM valproato de acordo com métodos descritos no Exemplo 1.

Aproximadamente 135 compostos foram diferencialmente secretados em precursores neuronais tratados com VPA versus controle. (Ver Tabela 6). Os resultados desse estudo ilustraram que os métodos da invenção revelam alterações no perfil metabólico de células-tronco específicas de linhagem em resposta à exposição a teratogênio.

Os resultados descritos aqui estão enunciados nas seguintes tabelas.

Todas as referências citadas aqui são incorporadas por referência. Além disso, a invenção não se destina a ser limitada às formas de realização descritas da invenção. Deve ser entendido que a descrição acima enfatiza algumas formas de realização específicas da invenção e que todas as modificações e alternativas equivalentes à mesma estão dentro do espírito e escopo da invenção como especificada nas reivindicações anexas.

Claims (46)

1. Método para identificar toxicidade ou teratogenicidade de um composto teste, o método in vitrocaracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) cultivar células-tronco embriônicas humanas (“hESCs”) ou células-tronco pluripotentes humanas na presença ou ausência do composto de teste; b) separar membros de uma população de metabólitos celulares com um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons que são secretados a partir de hESCs ou células-tronco pluripotentes humanas; c) detectar um ou uma pluralidade de metabólitos celulares diferencialmente produzidos tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons a partir de hESCs ou células-tronco pluripotentes humanas cultivadas na presença e ausência do composto de teste; e d) identificar pelo menos um metabólito celular tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons que é diferencialmente produzido em células cultivadas na presença do composto de teste.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido em maiores quantidades na presença do composto de teste do que na ausência do composto de teste.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido em maiores quantidades na ausência do composto de teste do que na presença do composto de teste.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o metabólito celular tem um peso molecular de cerca de 100 a cerca de 1000 Daltons.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou uma pluralidade de metabólitos celulares é separado usando um método de separação física.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o método de separação física é cromatografia de líquido/tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os metabólitos celulares são tetraidrofolato, diidrofolato ou outros metabólitos na via metabólica de folato, glutationa, ou glutationa oxidada.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os metabólitos celulares são quinurenina, 8-metoxiquinurenato, N'-formilquinurenina 7,8-diidro-7,8diidroxiquinurenato, 5-hidroxitriptofano, N-acetil-D-triptofano, glutamato, ácido piroglutâmico ou outros metabólitos nas vias metabólicas de triptofano ou glutamato, histamina, dopamina, ácido 3,4-diidroxibutírico, serotonina, ou ácido gama-aminobutírico (GABA)..

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de metabólitos celulares é identificada.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de metabólitos celulares identificados compreende um perfil de biomarcador.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que um dos metabólitos celulares compreendendo um perfil de biomarcador é quinurenina.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de metabólitos celulares identificados compreende um perfil de biomarcador característico de resposta de célulatronco pluripotente humana hESC a um composto tóxico ou teratogênico.

13. Método para triar um composto de teste para identificar um efeito do composto em células-tronco embriônicas humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes humanas contatadas com o composto de teste, caracterizadopelo fato de compreender as etapas de: a) cultivar hESCs ou células-tronco pluripotentes humanas na presença ou ausência de um composto de teste b) separar membros de uma população de metabólitos celulares com um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons que são secretados a partir de hESCs ou células-tronco pluripotentes humanas; c) detectar um ou uma pluralidade de metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons; e d) identificar pelo menos um metabólito celular tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons que é diferencialmente secretado entre células cultivadas na presença versus na ausência do composto de teste.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido em maiores quantidades na presença do composto de teste do que na ausência do composto de teste.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido em maiores quantidades na ausência do composto de teste do que na presença do composto de teste.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares tem um peso molecular de cerca de 100 a cerca de 1000 Daltons.

17. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

18. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que um ou uma pluralidade de metabólitos celulares é separada usando um método de separação física.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o método de separação física é cromatografia de líquido/tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo.

20. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os metabólitos celulares são tetraidrofolato, diidrofolato ou outros metabólitos na via metabólica de folato, glutationa, ou glutationa oxidada.

21. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os metabólitos celulares são quinurenina, 8metoxiquinurenato, N'-formilquinurenina 7,8-diidro-7,8-10 diidroxiquinurenato, 5-hidroxitriptofano, N-acetil-D-triptofano, glutamato, ácido piroglutâmico ou outros metabólitos nas vias metabólicas de triptofano ou glutamato, histamina, dopamina, serotonina, ácido gama-aminobutírico (GABA) ou outras espécies de ácido butírico.

22. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de metabólitos celulares é identificada.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato em que a pluralidade de metabólitos celulares identificados compreende um perfil de biomarcador.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que um dos metabólitos celulares compreendendo um perfil de biomarcador é quinurenina.

25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de metabólitos celulares identificados compreende um perfil de biomarcador característico de resposta de hESC ou de célula-tronco pluripotente humana a um composto tóxico ou teratogênico.

27. Método para testar um composto de teste para toxicidade ou teratogenicidade a células específicas na linhagem derivadas de hESC ou células específicas na linhagem derivadas de célula-tronco pluripotente humana contatadas com o composto de teste, caracterizadopelo fato de compreender as etapas de: a) cultivar células específicas na linhagem derivadas de hESC ou células específicas na linhagem derivadas de célula-tronco pluripotente humana na presença ou ausência de um composto de teste; b) separar membros de uma população de metabólitos celulares com um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons que são secretados a partir de células específicas na linhagem derivadas de hESC ou células específicas na linhagem derivadas de célula-tronco pluripotente humana; c) detectar um ou uma pluralidade de metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons produzidos por células específicas na linhagem derivadas de hESC ou células específicas na linhagem derivadas de célula-tronco pluripotente humana contatadas com um composto tóxico ou teratogênico; e d) identificar compostos de teste em que células específicas na linhagem derivadas de hESC ou células específicas na linhagem derivadas de célula-tronco pluripotente humana contatadas com um composto de teste diferencialmente produzem um ou uma pluralidade de metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido em maiores quantidades na presença do composto de teste do que na ausência do composto de teste.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos metabólitos celulares é produzido em maiores quantidades na ausência do composto de teste do que na presença do composto de teste.

30. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o metabólito celular é um metabólito de célula pequena tendo um peso molecular de cerca de 100 a cerca de 1000 Daltons.

31. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

32. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou uma pluralidade de metabólitos celulares é separado usando um método de separação física.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o método de separação física é cromatografia de líquido/tempo de ionização por eletropulverização de espectrometria de massa por tempo de vôo.

34. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os metabólitos celulares candidatos são tetraidrofolato, diidrofolato ou outros metabólitos na via metabólica de folato, glutationa, ou glutationa oxidada.

35. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os metabólitos celulares candidatos são quinurenina, 8metoxiquinurenato, N'-formilquinurenina 7,8-diidro-7,8diidroxiquinurenato 5-hidroxitriptofano, N-acetil-D-triptofano, glutamato, ácido piroglutâmico ou outros metabólitos nas vias metabólicas de triptofano ou glutamato, histamina, dopamina, ácido 3,4-diidroxibutírico, serotonina, ácido gamaaminobutírico (GABA) ou outras espécies de ácido butírico.

36. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de metabólitos celulares é identificada.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de metabólitos celulares identificados compreendem um perfil de biomarcador.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de um dos metabólitos celulares compreendendo um perfil de biomarcador é quinurenina.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é um composto tóxico ou teratogênico.

40. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de metabólitos celulares identificados compreende um perfil de biomarcador característico de resposta de hESC a um composto tóxico ou teratogênico.

41. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de identificar pelo menos um metabólito celular tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons que é diferencialmente produzido nas células na presença ou ausência do composto de teste em um perfil de biomarcador compreendendo um ou uma pluralidade de metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons os quais são diferencialmente produzidos em células-tronco embriônicas humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes humanas contatadas com um composto tóxico ou compostos.

42. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de identificar pelo menos um metabólito celular tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons que é diferencialmente produzido nas células na presença ou ausência do composto de teste em um perfil de biomarcador compreendendo um ou uma pluralidade de metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons os quais são diferencialmente produzidos em células-tronco embriônicas humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes humanas contatadas com um composto tóxico ou compostos.

43. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de identificar pelo menos um metabólito celular tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons que é diferencialmente produzido nas células na presença ou ausência do composto de teste em um perfil de biomarcador compreendendo um ou uma pluralidade de metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons os quais são diferencialmente produzidos em células-tronco embriônicas humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes humanas contatadas com um composto tóxico ou compostos.

44. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons são diferencialmente produzidos nas células na presença ou ausência do composto de teste são detectados.

45.Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois metabólitos celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons são diferencialmente produzidos nas células na presenĢa ou ausencia do composto de teste säo detectados.

46. Método de acordo com a reivindicaĢāo 27, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois metabolites celulares tendo um peso molecular de cerca de 10 a cerca de 1500 Daltons säo diferencialmente produzidos nas células na presenĢa ou auséncia do composto de teste säo detectados.

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