BRPI0710858A2

BRPI0710858A2 - uso de uma proteìna anti-secretora, um derivado, homólogo e/ou fragmento da mesma, tendo atividade anti-secretora, e/ou um sal farmaceuticamente ativo da mesma

Info

Publication number: BRPI0710858A2
Application number: BRPI0710858-3A
Authority: BR
Inventors: Eva Jennische; Hans-Arne Hansson; Bergstroem Thomas; Stefan Lange
Original assignee: Lantmonnen As Faktor Ab
Priority date: 2006-04-27
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2011-05-17
Also published as: EP2363140B1; DK2363140T3; AU2007244003A1; KR20090045148A; NZ572256A; US20110305773A1; ES2472737T3; CN101437533A; WO2007126363A3; DK2037950T3; RU2008146731A; ES2374712T3; NZ572257A; JP2011032284A; MX2008013774A; JP2009535328A; PL2363140T3; JP5285043B2; SG171601A1; JP5323682B2

Abstract

USO DE UMA PROTEìNA ANTI-SECRETORA, UM DERIVADO, HOMóLOGO E/OU FRAGMENTO DA MESMA, TENDO ATIVIDADE ANTI-SECRETORA, E/OU UM SAL FARMACEUTICAMENTE ATIVO DA MESMA. A presente invenção refere-se ao uso de uma proteína anti-secretora ou um derivado, homólogo e/ou fragmento dela, tendo atividade anti-secretora, e/ou um sal farmaceuticamente ativo dela, para a fabricação de uma composição farmacêutica e/ou alimento medicinal para o tratamento e/ou prevenção de síndrome do compartimento. Uma síndrome do compartimento pode ser causada ou uma causa de uma variedade de outras condições que são também compreendidas pela presente invenção, tal como infecções virais e bacterianas. Ainda, a invenção refere-se a um método para o tratamento e/ou prevenção de síndrome do compartimento em um mamífero com necessidade dele.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE UMAPROTEÍNA ANTI-SECRETORA, UM DERIVADO, HOMÓLOGO E/OUFRAGMENTO DA MESMA, TENDO ATIVIDADE ANTI-SECRETORA, E/OUUM SAL FARMACEUTICAMENTE ATIVO DA MESMA".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se ao campo de síndrome do com-partimento, e a várias condições associadas a ela. Mais especificamente, ainvenção refere-se à transferência de fluido, sais e substâncias entre célulaspor um lado e do outro espaços extracelulares e o sistema vascular em umcompartimento, formado por um tecido, órgão e/ou uma estrutura definida,em um corpo, opcionalmente com objetivo de normalização. O compartimen-to fechado compreende estruturas variando em tamanho e extensão de umacélula, um tecido, uma unidade anatômica definida para um órgão em umcorpo. A estrutura patologicamente afetada poderia ser mau funcionamentodevido à carga excessiva, trauma, agentes tóxicos, fármacos, hemorragia,tumor, infecção com micróbios tal como bactérias e/ou vírus, causando pres-são de fluido intersticial anormalmente elevada e/ou de outro modo doente.

A invenção refere-se ainda ao uso de proteínas anti-secretoras específicasdentro do campo de síndrome de compartimento sob condições normaisbem como patológicas.

Antecedentes da Invenção

O termo síndrome do compartimento é usado em prática médicapara caracterizar uma condição patológica caracterizada por uma pressãoanormalmente aumentada dentro de um volume fechado, um compartimen-to, que está causando redução ou até mesmo bloqueio do sangue e fluxolinfático através de um volume definido, especificado. Uma pressão muitoalta nos vasos sangüíneos impede o fluxo de sangue através das veias, ca-pilares e até mesmo arteríolas e artérias, altera as condições de trabalho dofluido intestinal nos arredores extracelulares, resultando em uma depleçãode fornecimento adequado de nutrientes e oxigênio para as células e tecidosdentro do dito espaço. Um fator igualmente importante é a falta de drenagemde produtos de refugo e metabólitos, freqüentemente ácidos, que através deseu acúmulo somam mais ao prejuízo da função e metabolismo das célulasdentro do dito compartimento. Um efeito real de ditos distúrbios é que apressão no compartimento aumenta e eventualmente se aproxima de níveispróximos à pressão arterial sistêmica. A pressão sangüínea real na entradado sistema vascular arterial para o compartimento então constitui um ele-mento-chave, determinando o nível máximo para o qual a pressão pode au-mentar. Em estruturas avasculares, tal como cartilagem e discos interverte-brais, fornecimento adequado é dependente da transferência de fluido e ou-tros constituintes para e de uma área através de difusão, através de siste-mas de íon celular e bomba de fluido e através de gradientes de pressãoosmótica, requerendo funcionamento de célula apropriadas. Se uma CP(pressão de compartimento) elevada persiste, ela vai causar lesão severa àscélulas, tecidos e órgãos envolvidos. Hemorragias e inchaço das células etecidos no dito compartimento podem somar ao dano como o faz isquemiasubseqüente.

Quanto maior o tempo que passa com CP elevada, mais ex-tensivo e severo o dano, que eventualmente se torna irreversível e morte decélula necrótica segue. Distorção, deslocamento e cisalhamento mecânicossomam ao dano. Morte de célula apoptótica pode subseqüentemente somarà lesão inicial. A CS (síndrome do compartimento) cria sinais clínicos alar-mantes tal como dor, sensibilidade, inchaço e redução ou até mesmo perdade funionamento, e eventualmente necrose. A gravidade do dano é depen-dente da localização do compartimento, dos tipos de células e tecidos envol-vidos, das características dos arredores extracelulares, da CP real, dos dis-túrbios metabólicos e sua duração para mencionar alguns dos fatores-chavede importância para o resultado e conseqüências a longo prazo.

A maioria dos compartimentos no corpo é delimitada por tecidoconectivo denso, freqüentemente especializado como bainhas, fáscia, ten-dões, ligamentos, cápsulas de junta ou membranas colagenosas não-complacentes similares, tal como o pericárdio. Adicionalmente, muitos ór-gãos endócrinos, tal como a tireóide, e glândulas exócrinas, são envolvidospor e subdivididos por membranas de tecido conectivo e bainhas, deste mo-do formando compartimentos. Outro exemplo de compartimento de envolvi-mento, fechado, rígido, são estruturas ósseas, tal como as extremidades,crânios, vértebras e ossos faciais. Cada tipo de célula e tecido exposto à CPelevada é caracterizado por sua própria tolerância a distúrbios metabólicos emecânicos prevalentes. No entanto, alívio da CP para níveis normais dentrode tempo razoável alivia o dano.

A proteína anti-secretora é uma proteína de 41 kDa que original-mente foi descrita prover proteção contra doenças diarréicas e inflamaçãointestinal (para uma revisão, vide Lange e Lónnroth, 2001). A proteína anti-secretora foi seqüenciada e seu cDNA clonado. A atividade anti-secretoraparece ser principalmente exercida por um peptídeo localizado entre as po-sições 35 e 50 na seqüência de proteína anti-secretora. Investigações imu-noquímicas e imuno-histoquímicas revelaram que proteína anti-secretoraestá presente e pode ser também sintetizada pela maioria dos tecidos e ór-gãos em um corpo. Peptídeos sintéticos, compreendendo a seqüência anti-diarréica, foram caracterizados (W097/08202; W005/030246). Fatores anti-secretores foram previamente revelados normalizar transporte de fluido pato-lógico e/ou reações de inflamação, tal como no intestino e no plexo coróideno sistema nervoso central após provocação com a toxina do cólera (WO97/08202). Adição de fatores anti-secretores a alimento e ração foi entãosugerida ser útil para o tratamento de edema, diarréia, desidratação e infla-mação no WO 97/08202. O WO 98/21978 revela o uso de produtos tendoatividade enzimática para a produção de alimento que induz a formação deproteínas anti-secretoras. O WO 00/038535 revela ainda os produtos alimen-tícios enriquecidos em proteínas anti-secretoras como tal.

Proteína anti-secretora e seus fragmentos foram também mos-trados melhorar o reparo ou tecido nervoso, e proliferação, apoptose, dife-renciação e/ou migração de células-tronco e progenitoras e células deriva-das delas no tratamento de condições associadas com perda e/ou ganho decélulas (WO 05/030246).

No momento não existe quaisquer fármacos disponíveis que blo-queiem inequivocadamente o aumento em pressão e a retorne para níveisnormais em uma CS estabelecida, nem previna o desenvolvimento de danoem uma CS ameaçadora ou existente. Soluções hipertônicas de, por exem-plo, uréia ou manitol, são atualmente usadas para pacientes selecionadossofrendo de ICP (pressão intracranial) elevada, mas os efeitos são transien-tes durando apenas algumas horas, dependendo da localização anatômica edo programa de tratamento real. Corticosteróídes têm sido também usadospara combater ICP elevada, mas efeitos colaterais sérios podem freqüente-mente aparecer. Fármacos adicionais foram defendidos, mas principalmentepara parar sintomas que surgem. Diminuição da temperatura do núcleo docorpo em combinação com anestesia com barbiturado é considerada benéfi-ca. Não há, no entanto, nenhuma terapia de fármaco disponível para CSsurgindo em, por exemplo, músculos, juntas e nervos. Intervenções cirúrgi-cas constituem um tratamento freqüentemente usado, mas sofre da desvan-tagem de per se adicionar lesão e desconforto extras bem como risco para odesenvolvimento de complicações.

Um diagnóstico confiável de uma CS eminente, em desenvolvi-mento ou estabelecida pode ser difícil de fazer mesmo para um médico ex-periente. Auxiliares de diagnóstico baseados no uso de, por exemplo, ultra-som e imagem de ressonância magnética (MRI) têm sido usados, atualmen-te freqüentemente em conexão com programas computadorizados. No pre-sente contexto, determinação da pressão do fluido intersticial no comparti-mento a ser investigado foi feita através da medição da pressão atual com oauxílio de um sensor muito pequeno na ponta de uma fibra de vidro guia deluz. O diâmetro da sonda era 0,4 mm e o diâmetro da fibra de vidro flexívelapenas 0,3 mm, significando que lesão pelo equipamento de medição não éprovável ser de importância, dificilmente adicionando qualquer efeito notávelaos níveis de pressão. Deste modo, o equipamento usado deve ser conside-rado apresentar valores confiáveis sobre a pressão prevalecente no compar-timento, ambos no fluido extracelular e em certos casos também intracelu-Iarmente em células adjacentes e/ou agregados de célula.

Fatores anti-secretores (AF)1 especificamente proteínas e peptí-deos, conforme descrito em detalhes no WO 97/08202, são eficazes emabolir condições hipersecretoras e doenças no intestino, tal como diarréia.Outros exemplos relacionados com os efeitos de AF em relação a condiçõeshipersecretoras são, por exemplo, doenças inflamatórias do intestino, edemacerebral, glaucoma, pressão intracraniana elevada, Morbus Ménière e masti-te. AF foram também considerados para o tratamento de glaucoma (WO97/08202).

Sumário da presente invenção

A presente invenção refere-se ao uso de uma composição farma-cêutica compreendendo uma proteína anti-secretora, um homólogo, derivadoe/ou fragmento dela, tendo atividade anti-secretora e/ou um sal farmaceuti-camente ativo dela, para a fabricação de uma composição farmacêutica e/oualimento medicinal para o tratamento e/ou prevenção da síndrome do com-partimento. A invenção refere-se também ao tratamento e/ou prevenção devárias condições associadas com síndrome do compartimento, tal como in-chaço de células e tecidos, infecções com micróbios compreendendo bacté-rias, e/ou vírus, e/ou a formação de um tamponado, por exemplo, no cora-ção, rim, testículos, ovário, osso, junta, glândulas, estruturas imunolinfáticas,nervo, cérebro, cordão espinhal, pele, músculos e/ou parede vascular.

Ainda, a invenção refere-se a um método para o tratamento e/ouprevenção de uma síndrome do compartimento, tal como mencionado aci-ma, o dito método compreendendo administrar a um mamífero com necessi-dade dele uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição far-macêutica e/ou alimento medicinal compreendendo uma proteína anti-secretora, um derivado, homólogo e/ou fragmento dela, tendo atividade anti-secretora, e/ou um sal farmaceuticamente ativo dela.

A invenção refere-se também a várias doses e vias de adminis-tração adequadas para o propósito pretendido de tratamento bem como aidade, gênero, condição, etc, do paciente.

O tratamento de acordo com a invenção é provável de ser maisútil para pacientes sob risco de desenvolver e/ou sofrer da síndrome docompartimento, e/ou da absorção e/ou liberação de substâncias patogêni-cas. Ainda, tal tratamento é benéfico também em outras condições caracteri-zadas por troca anormal de fluido e íons de compartimento confinados, talcomo compartimento com pressões anormais.

Breve descrição dos desenhosFigura 1: A figura 1 mostra a seqüência de amino ácido de umaproteína anti-secretora de acordo com a SEQ ID NO 6 da presente invenção.A seqüência corresponde à SEQ ID NO 2 da US 6344440.

Figura 2: ICP em ratos medida com uma sonda guia de luz defibra óptica implantada no córtex cerebral na região dos ventrículos laterais.A Figura 2 a demonstra que infecção por HSV-1 no dia 5 resulta em um au-mento em ICP em excesso de 40 mm Hg. Em contraste, tratamento do ratoinfectado com HSV-1 duas vezes por dia com AF, conforme mostrado naFigura 2b, quase levou a ICP de volta para níveis normais. A Figura 2 c de-monstra a ICP baixa demonstrável em um rato não-infectado, não-tratado,normal. A sonda foi calibrada contra pressão de ar ambiente.

Figura 3: Freqüência de sobrevivência de ratos infectados comHSV-1 através da administração de uma solução de vírus na narina direitano dia 0. Metade dos ratos (n = 15) foi tratada duas vezes por dia com 1 pgde AF-16 (linha superior) duas vezes por dia intranasalmente, enquanto aoutra metade recebeu apenas o veículo após a infecção por HSV-1 (linhainferior). Daqueles tratados apenas com o veículo apenas 10% sobreviveramdia 14, contrastando com 60% daqueles tratados com AF-16. Então, AF-16significantemente aumentou a taxa de sobrevivência em encefalite por HSV.

Figura 4: Ampliações baixas (a, b) e altas (c, d) de seções de cé-rebro após infecção por HSV em roedores através de instilação de uma so-lução de vírus na narina direita. Células do nervo com proteína HSV em seucitoplasma são distintamente tingidas de escuro. Células gliais (d) no tálamosão distintamente mostradas devido à sua abundância de proteínas HSV emseu citoplasma. Note que muitas das células nervosas são não-reativas(não-tingidas). Não havia nenhuma diferença na freqüência ou distribuiçãode células cerebrais positivas para HSV-1 entre aqueles animais que foramtratados com AF-16 ou apenas ou veículo.

Figura 5: PCR quantitativa realizada em tecidos cerebrais de ra-tos infectados em sua narina direita com HSV-1. Os espécimes cerebraisforam obtidos entre 5 a 14 dias após inoculação do vírus na narina direita. Oresultado não demonstrou qualquer diferença entre os grupos tratados comveículo e tratados com AF com relação à quantidade de DNA de HSV-1. En-tão, AF-16 não afeta significantemente a produção de HSV-1 apesar do tra-tamento com AF-16 ter melhorado significantemente a taxa de sobrevivência(Figura 2b), conforme comparado com aqueles apenas tratados com o veí-culo (Figura 2 a).

Figura 6: Seções através da lâmina cribriforme, uma estruturaóssea separando o cérebro do nariz e através da qual o nervo olfativo passa.Na figura da esquerda (a) o complexo de corante-proteína Evans blue-albumina (EBA) foi infundido no espaço subaraquinóide no dia 5 após infec-ção por HSV-1. O animal sofreu de encefalite moderada. Note que não hánenhum EBA vermelho na lâmina cribriforme, nem no nariz, como a passa-gem entre o cérebro e a cavidade nasal é bloqueada. Na figura da direita (b)EBA foi infundido no espaço subaracnóide de um rato normal, não-infectado.Note o tingimento vermelho intenso em toda a placa cribriforme, revelandopassagem de CSF do cérebro (acima) para a cavidade nasal (abaixo). Tra-tamento de animais infectados com HSV-1 com AF-16 abriu a passagempara CSF através da placa cribriforme e então resultou em um quadro apa-rentemente idêntico àquele em um animal não-infectado, normal, conformemostrado na Figura b.

Definições e abreviações

Abreviações

ICP: pressão intracranial; CSF: fluido cérebro-espinhal; SNC: sis-tema nervoso central, isto é, o cérebro e o cordão espinhal; IFP: pressão defluido intersticial; HSV: vírus herpes simplex; PBS: solução salina tamponadacom fosfato; CP: pressão do compartimento; CC: compartimento fechado;CS: síndrome do compartimento: AF: fator anti-secretor; AF-16; um peptídeocomposto dos amino ácidos VCHSKTRSNPENNVGL; octa peptídeo IV-CHSKTR; peptídeo septa VCHSKTR; peptídeo ecta CHSKTR; peptídeo pen-ta HSKTR.

Definições

Aqui, "síndrome do compartimento" é definida como uma pressãoelevada resultando em distúrbio metabólicos e eventualmente dano dentrode um espaço definido em células, tecidos, estruturas definidas e/ou órgãosdelimitados por estruturas resistentes à pressão. O termo síndrome do com-partimento é na prática médica usado para caracterizar uma condição pato-lógica caracterizada por uma pressão anormalmente aumentada dentro deum volume confinado, isto é, um compartimento, que causa redução ou atémesmo bloqueio de, por exemplo, sangue e/ou fluxo linfático através de umvolume definido, especificado. A síndrome do compartimento pode causarbem como ser causada por uma variedade de condições, tal como infecçõesvirais e microbianas, tumores, hemorragias, isquemia, trauma, funcionamen-to e/ou carga excessivo e/ou anormal, etc, conforme aqui revelado. No pre-sente contexto, o termo "compartimento confinado" refere-se a um espaçodefinido em células, tecidos, órgãos e/ou uma estrutura anatômica delimita-da por estruturas resistentes à pressão.

Proteínas são macromoléculas biológicas constituídas por resí-duos de amino ácido ligados juntos por ligações peptídeo. Proteínas, comopolímeros lineares de amino ácidos, são também chamadas polipeptídios.Tipicamente, proteínas têm 50-800 resíduos de amino ácidos e então têmpesos moleculares na faixa de a partir de cerca de 6.000 a cerca de váriascentenas de milhares de Dalton ou mais. Proteínas pequenas são chamadaspeptídeos ou oligopeptídeos. Os termos "proteína" e "peptídeo" podem serusados intercomutavelmente no presente contexto.

Uma "composição farmacêutica", no presente contexto, refere-sea uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente ativade uma proteína anti-secretora, opcionalmente em combinação com um ex-cipiente farmaceuticamente ativo, tal como um carreador ou um veículo. Adita composição farmacêutica é formulada para a via de administração apro-priada, que pode variar dependendo da condição do paciente, bem como deoutros fatores, tal como a idade ou escolha preferida. Uma composição far-macêutica compreendendo uma proteína anti-secretora serve como um sis-tema de aplicação de fármaco. A composição farmacêutica quando da admi-nistração apresenta a substância ativa ao corpo de um ser humano ou umanimal. A dita composição farmacêutica pode estar na forma de, por exem-pio, comprimidos, pílulas, pastilhas, cápsulas, stoolpills, géis, etc, mas não élimitada a elas.

O termo "sal farmaceuticamente ativo" refere-se a um sai de pro-teína anti-secretora, que pode ser qualquer sal derivado dela, com base nachamada série Hofmeiser. Outros exemplos de sais farmaceuticamente ati-vos compreendem trifluoracetato, acetato e cloreto de lisina, mas a invençãonão é limitada a eles.

O termo "anti-secretor" refere-se no presente contexto à inibiçãoou diminuição de secreção, especialmente secreções intestinais. Então, otermo "proteína anti-secretora" refere-se a uma proteína capaz de inibir oudiminuir a secreção em um corpo.

Um "alimento medicinal", no presente contexto, refere-se a umalimento que foi preparado com uma composição com uma proteína anti-secretora, de acordo com a invenção. O dito alimento pode ser qualquer ali-mento adequado, em forma de fluido ou sólido, tal como um líquido ou umpó, ou qualquer outro gênero alimentício adequado. Exemplos de tal matériapodem ser encontrados no WO 0038535.

No presente contexto, uma "proteína anti-secretora", ou um ho-mólogo, derivado e/ou fragmento dela, pode ser usado intercomutavelmentecom o termo "fatores anti-secretores" ou "proteínas de fator anti-secretor"conforme definido na patente WO 97/08202, e refere-se a uma proteína anti-secretora ou um peptídeo ou um homólogo, derivado e/ou fragmento delatendo atividade anti-secretora. Então, deve ser compreendido que um "fatoranti-secretor", "proteína de fator anti-secretor", "peptídeo anti-secretor","fragmento anti-secretor" ou uma "proteína anti-secretora" no presente con-texto também referem-se a um derivado, homólogo e/ou fragmento dele. Es-ses termos podem ser também todos usados intercomutavelmente no con-texto da presente invenção. Ainda, no presente contexto, o termo "fator anti-secretor" pode ser abreviado "AP. Proteína anti-secretora no presente con-texto também refere-se a uma proteína com propriedades anti-secretorasconforme previamente definido no WO 97/08202 e no WO 00/38535. Fatoresanti-secretores foram também revelados, por exemplo, no WO 05/030246.Também pretendido pelo termo fator anti-secretor é gema de ovo enriqueci-da em fatores anti-secretores conforme descrito na SE 900028-2 e no WO00/38535 conforme descrito mais abaixo.

Um "nebulizador", no presente contexto, refere-se a um dispositi-vo médico que aplica medicação na forma de uma névoa às vias aéreas.Compressores "nebulizadores" forçam ar através do tubo para um copo deremédio cheio com remédio líquido. A força do ar quebra o líquido em partí-culas tipo névoa que podem ser inaladas profundamente para as vias aé-reas.

Um "inalador", no presente contexto, refere-se a um dispositivomédico que aplica medicação na forma de pó seco às vias aéreas. O ar ina-lado passa o pó seco a ser inalado e distribui as partículas finas que podemser inaladas profundamente nas vias aéreas. Ou o indivíduo a ser tratadoinala para dar a força requerida ao ar ou ar comprimido é usado, alternati-vamente suas combinações.

O termo "aerossol" no presente contexto refere-se a uma sus-pensão gasosa de partículas sólidas ou líquidas finas.

Um "micróbio", conforme aqui revelado, refere-se a um organis-mo vivo microscópico, tal como, por exemplo, uma bactéria, fungo, protozoá-rio bem como vírus. Outros exemplos de micróbios são dados aqui.

Descrição detalhada da invenção

Os presentes inventores surpreendentemente constataram que otratamento de um corpo vivo com proteínas e/ou peptídeos anti-secretores(AF) restaura e normaliza a transferência de nutrientes, produtos de refugo,metabólitos, íons, água e/ou outras moléculas em síndrome do comparti-mento (CS). Proteínas e peptídeos anti-secretores são então surpreenden-temente verificados restaurar e/ou normalizar a transferência de água, íons,metabólitos e substratos que são, por exemplo, transferidos das células,bem como de vasos sangüíneos para um compartimento fechado (CC). Pro-teínas anti-secretoras realmente através disso reduzem e/ou transgridem osefeitos prejudiciais, e podem também prevenir a internalização e/ou a libera-ção de substâncias que entram e/ou sendo liberadas das células. As proteí-nas anti-secretoras, homólogos, derivados, fragmentos e/ou peptídeos delasfuncionam sem importar se a causa inicial da síndrome do compartimento éuma hemorragia, trauma, carga alta, distúrbio vascular, infecção por micró-bios e/ou vírus, agentes tóxicos ou uma combinação de qualquer uma des-sas causas. As proteínas anti-secretoras, homólogos, derivados, fragmentose/ou peptídeos delas então ajudam a melhorar a sobrevivência de células etecidos no CC. Conseqüentemente, dano de outro modo induzido devido aoCS pode ser reduzido, ou até mesmo prevenido.

Há uma necessidade há muito tempo sentida de aperfeiçoar fár-maços com objetivo de tratamento farmacológico da síndrome do comparti-mento, como atualmente nenhuma terapia adequada está disponível. Efeitosbenéficos das proteínas anti-secretoras de acordo com a invenção são e-xemplificados no texto que segue.

Os presentes inventores constataram que proteínas anti-secretoras, homólogos, derivados, fragmentos e/ou peptídeos delas têm e-feitos benéficos em casos de CS de patogênese diferente em uma variedadede locais diferentes. Sem desejar limitar a presente invenção a uma explica-ção científica específica, é no momento acreditado que proteínas e peptí-deos anti-secretores (AF) podem ser capazes de abolir o estabelecimento deCS de tal maneira poderosa, e normalizar as condições acima mencionadas,devido a um efeito exercido que proteínas e peptídeos anti-secretores (AF)são verificados ter sobre ilhas (rafts) de lipídeo e cavéolas em membranascelulares.

Ilhas de lipídeo são domínios de membrana com um tamanhomédio de nanômetros, caracterizados por concentrações focalmente altas decolesterol e esfingomielina (Cf. Lodish e outros, 2004; Pollard & Earnshaw,2002; Ross & Pawlina, 2006). As ilhas de lipídeo contêm uma variedade deproteínas de membrana integrais e periféricas envolvidas em transferênciade massa e sinalização de célula. Tais plataformas de sinalização flutuamnas membranas celulares e são equipadas com elementos necessários parafuncionamentos apropriados como receptores, fatores de acoplamento, sis-temas de proteína G, efetores, enzimas e compostos, e substrato, deste mo-do sendo capazes de receber e conduzir íons, moléculas e sinais específi-cos. Esses domínios estão ainda interagindo com, por exemplo, o citoesque-leto, e, adicionalmente, influenciam a composição e movimento do fluido in-testinal e sua pressão. Flotilina-1 é uma proteína que é um indicador da pre-valência de ilhas de lipídeo. Outro marcador de ilhas de lipídeo é o esfingoli-pídeo GMI. Ainda, ilhas de lipídeo estão relacionadas com cavéolas, invagi-nações em formato de garrafa demonstráveis em uma grande variedade decélulas de mamífero e nos sítios para funções de célula importantes tal comotráfico vesicular e transdução de sinal bem como absorção, internalização eprocessamento intracelular adicional de, por exemplo, vírus. Há um movi-mento de cavéolas, que adicionalmente estão relacionadas com a liberaçãoe internalização de não apenas vírus, mas também micróbios. Há um agru-pamento nas membranas celulares de ilhas de lipídeo e cavéolas de recep-tores de fator de crescimento, receptores de sinal inflamatório, receptores deneurotransmissor e sistemas para reabsorção de neurotransmissores, íonsde canal, aquaporinas e outros transportadores. As ilhas de lipídeo e cavéo-las sofrem mudanças dinâmicas, rápidas, relacionadas à função prevalentede células e órgãos a cada momento.

Os presentes inventores foram recentemente capazes de provarque proteínas anti-secretoras, homólogos, derivados ou fragmentos delas,tendo atividade anti-secretora e/ou funcional equivalente e/ou atividade aná-loga, ou um sal farmaceuticamente ativo dela, têm efeitos benéficos no tra-tamento e/ou prevenção de disfunção de ilhas de lipídeo e/ou cavéolas emmembranas de célula, tal como hipo- e/ou hiperfunção insuficiente, anormal.

Então, proteínas anti-secretoras, derivados, homólogos e/oufragmentos delas, tendo atividade funcional equivalente, e/ou um sal farma-ceuticamente aceitável delas, foram mostrados ter um efeito benéfico sobredisfunção de ilhas de lipídeo e/ou cavéola em membranas celulares e podementão ser usadas para monitorar e/ou beneficamente afetar a estrutura, dis-tribuição e funções múltiplas de ilhas de lipídeo e/ou cavéola em membranasde célula. Exemplos de tal efeito benéfico pode ter combater funcionamentoanormal, tal como hipo- ou hiper-função, restaurar e/ou normalizar as ilhasde Iipfdeo ou cavéola estruturalmente e funcionalmente, para melhorar so-brevivência e/ou resgatar em doenças, lesões, processos de reparo e outrasdisfunções. Ainda, as ditas proteínas anti-secretoras podem ser empregadaspara monitoramento de transporte celular e liberação de produtos de célula,bem como para normalização da distribuição de constituintes de tecido.

Exemplos de condições sob alto risco para a ameaça de desen-volvimento de CS são trauma, ou associado com hemorragias ou não, cargapesada, tumor ou lesão substancial a uma extremidade, tal como uma pernaou peito (por exemplo, tamponamento cardíaco). Carga extrema em ummúsculo ou tendão pode também causar sinais de uma CS. O mesmo é ver-dadeiro em infecções de um órgão, um tecido ou uma junta. Toxinas micro-bianas, e micróbios, compreendendo bactérias tal como Mycobacteria,Pseudomonas, Chlamydia, Cocci, Brucella e Listeria, bem como um amploespectro de vírus podem ser agentes causadores. Uso excessivo de fárma-cos e liberação de, por exemplo, neurotransmissores, muco, enzimas e vírussão outros compostos patogênicos. Tumores, primários ou metástase, bemcomo hemorragia somam à lista de exemplos de causas potencialmente re-sultando em uma CS.

No presente contexto, determinação da pressão do fluido intersti-cial no compartimento a ser investigado é feita medindo a pressão real como auxílio de um sensor na ponta de uma fibra de vidro guia de luz. Então,valores confiáveis de pressão prevalecente no compartimento, e, em certoscasos, também em células adjacentes, são obtidos.

É conhecido da literatura que, por exemplo, muitos tumores sóli-dos têm uma pressão de fluido intersticial alta, impedindo o transporte trans-capilar entre as células de tumor e o sangue e circulação de linfo. Então umobstáculo é criado com relação a tratamento de tumor, devido à absorçãoinsuficiente de agentes terapêuticos, tal como fármacos citotóxicos (Cf. Hel-din e outros, 2004). Ainda, a geração de radicais livres vai em terapia de ra-diação ser insuficiente devido a limitações na habilidade de oxigênio devidoà circulação sangüínea restrita. Há então uma grande necessidade de novosprogramas de tratamento, aperfeiçoamento da eficácia de terapia de câncerao diminuir a pressão de fluido intersticial.

O uso de proteínas e peptídeos anti-secretores (AF) não é limita-do aos tecidos, órgãos e estruturas anatômicas descritos nos exemplos, masinclui sintomas e doenças adicionais também caracterizados por pressão defluido de tecido intersticial elevada e pela absorção e liberação de substân-cias específicas.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente inven-ção podem em um contexto ser administradas através da aplicação topica-mente, localmente in situ, oralmente, no nariz, subcutaneamente e/ou siste-micamente através de vasos sangüíneos ou através do trato respiratório.

O fator anti-secretor é uma classe de proteínas que acontece na-turalmente no corpo. A proteína de fator anti-secretor humano é uma proteí-na de 41 kD compreendendo 382 amino ácidos quando isolada da glândulapituitária. O sítio ativo com relação ao efeito da síndrome do compartimente,de acordo com a presente invenção, parece estar localizado para a proteínaem uma região próxima ao terminal N da proteína, mais provavelmente loca-lizado nos amino ácidos 1-163 da SEQ ID NO:6 ou a um fragmento destaregião.

Os presentes inventores mostraram que o fator anti-secretor éaté certo ponto homólogo com a proteína S5a, também chamada Rpn 10,que constitui uma subunidade de um constituinte prevalecente em todas ascélulas, a proteassoma 26 S, mais especificamente na 19 S/PA 700 cap. Napresente invenção, proteínas anti-secretoras são definidas como uma classede proteínas homólogas tendo as mesmas propriedades funcionais. Os pro-teassomas têm uma variedade de funções relacionadas com a degradaçãode proteínas supérfluas bem como proteínas indesejadas de vida curta, des-naturadas, enoveladas erroneamente e de outro modo anormais. Ainda, ofator anti-secretor/S5a/Rpn 10 está envolvido na distribuição e transporte deconstituintes celulares, mais evidentemente proteínas.

Homólogos, derivados e fragmentos de proteínas e/ou peptídeosanti-secretores de acordo com a presente invenção todos têm uma atividadebiológica análoga de serem capazes de ser usados para a fabricação de ummedicamento para o tratamento e/ou prevenção da síndrome do comparti-mento, bem como em um método para tratamento da síndrome do compar-timento. Homólogos, derivados e fragmentos, no presente contexto, compre-endem pelo menos 4 amino ácidos de uma proteína anti-secretora de ocor-rência natural, que pode ser modificada mais mudando um ou mais aminoácidos a fim de otimizar a atividade biológica do fator anti-secretor no trata-mento e/ou prevenção da síndrome do compartimento.

Ainda, qualquer seqüência de amino ácido sendo pelo menos70% idêntica, tal como sendo pelo menos 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%,87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àseqüência de amino ácido de uma proteína anti-secretora, peptídeo, homó-logo, derivado e/ou fragmento de acordo com a invenção, é também consi-derada estar dentro do escopo da presente invenção. No presente contextoos termos homologia e identidade são usados intercomutavelmente, isto é,uma seqüência de amino ácido tendo um grau de identidade especificadocom outra seqüência de amino ácido tem o mesmo grau de homologia comuma seqüência de amino ácido especificada.

Por um derivado quer no presente contexto dizer uma proteínatendo atividade anti-secretora conforme aqui definido, sendo derivada deoutra substância ou diretamente ou através de modificação ou substituiçãoparcial, onde um ou mais amino ácidos foram substituídos por outro aminoácido, amino ácido que pode ser modificado ou um amino ácido não-natural.

Por exemplo, os derivados de fator anti-secretor de acordo com a invençãopodem compreender um grupo de proteção N terminal e/ou C terminal. Umexemplo de um grupo de proteção N terminal inclui acetila. Um exemplo deum grupo de proteção C terminal inclui amida.

Por proteínas, homólogos, derivados, peptídeos e/ou fragmentodelas tendo uma seqüência de amino ácido pelo menos, por exemplo, 95%idêntica a uma seqüência de amino ácido de referência, quer dizer que aseqüência de amino ácido do, por exemplo, peptídeo, é idêntica à seqüênciade referência, exceto que a seqüência de amino ácido pode incluir até 5 mu-tações por ponto por cada 100 amino ácidos da seqüência de amino ácidode referência. Em outras palavras, para se obter um polipeptídio tendo umaseqüência de amino ácido pelo menos 95% idêntica a uma seqüência deamino ácido de referência, até 5% dos amino ácidos na seqüência de refe-rência podem ser deletados ou substituídos com outro amino ácido, ou vá-rios amino ácidos, até 5% dos amino ácidos totais na seqüência de referên-cia podem ser inseridos na seqüência de referência. Essas mutações da se-qüência de referência podem acontecer nas posições amino ou carbóxi ter-minal da seqüência de amino ácido de referência ou qualquer lugar entreessas posições terminais, interespaçadas ou individualmente entre os aminoácidos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos den-tro da seqüência de referência.

Na presente invenção, um programa de algoritmo local é melhoradequado para determinar identidade. Programas de algoritmo local (tal co-mo Smith Waterman) comparam uma subsequência em uma seqüência comuma subsequência em uma segunda seqüência, e encontram a combinaçãode subsequências e o alinhamento dessas subsequências, que dão o scorede similaridades geral mais alto. Lacunas internas, se permitidas, são pena-lizadas. Algoritmos locais funcionam bem para comparação de duas proteí-nas multidomínio, que têm um domínio único ou apenas um sítio de ligaçãoem comum.

Métodos para determinar identidade e similaridade são codifica-dos em programas publicamente disponíveis. Métodos de programa decomputador preferidos para determinar identidade e similaridade entre duasseqüências incluem, mas não estão limitados a, pacote de programa GCG(Devereux, J. e outros (1994)), BLASTP1 BLASTN e FASTA (Altschul, S.F. eoutros (1990)). O programa BLASTX está publicamente disponível da NCBIe outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S.F. e outros, Altschul, S.F. e ou-tros (1990)). Cada programa de análise de seqüência tem uma matriz descoring de defaulte penalidades de lacuna de default. Em geral, um biologis-ta molecular seria esperado usar os ajustes de default estabelecidos peloprograma de software usado.As proteínas anti-secretoras ou um peptídeo ou um homólogo,derivado e/ou fragmento delas tendo atividade anti-secretora conforme aquidefinido podem compreender 4 amino ácidos ou mais, tal como 5-16 aminoácidos, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a-mino ácidos ou mais. Em outras modalidades preferidas o fator anti-secretorconsiste em 42, 43, 45, 46, 51, 80,128, 129 ou 163 amino ácidos. Em moda-lidades preferidas o fator anti-secretor consiste em 5, 6, 7, 8 ou 16 aminoácidos.

Em uma modalidade preferida, a dita proteína anti-secretora éprovida em uma concentração de pelo menos 1000 FIL unidades/ml na ditagema de ovo. No presente contexto uma unidade FIL corresponde a umaredução de 50% do fluxo de fluido no intestino comparado com um controlesem fornecimento de fatores anti-secretores, conforme revelado no WO00/38535 e na SE 9000028-2.

Em outra modalidade preferida, as proteínas ou um peptídeo anti-secretor ou um homólogo, derivado ou fragmento delas tendo atividade anti-secretora de acordo com a presente invenção consiste em uma seqüênciade acordo com a fórmula que segue:

<formula>formula see original document page 18</formula> onde X1 é I, amino ácido s1-35 de SEQ ID NO 6, ou está ausente, X2 é H, Rou Κ, X3 é S ou L, X4 é T ou A, X5 são amino ácidos 43-46, 43-51, 43-80 ou43-163 de SEQ ID NO 6, ou está ausente.

O fator anti-secretor de acordo com a presente invenção pode serproduzido in vivo ou in vitro, por exemplo, recombinantemente, sinteticamen-te e/ou quimicamente sintetizado, e/ou isolado de uma fonte de ocorrêncianatural de fatores anti-secretores, tal como de glândulas pituitárias de porcoou ovos de ave. Após produção, os fatores anti-secretores podem ser pro-cessados mais, tal como através de clivagem química ou enzimática parafragmentos ativos anti-secretores menores ou através de modificação deamino ácidos. Atualmente não é possível obter fator anti-secretor em formapura através de purificação. É, no entanto, possível produzir uma proteína defator anti-secretor biologicamente ativa recombinantemente ou sinteticamen-te, conforme previamente revelado no WO 97/08202 e no WO 05/030246. OWO 97/08202 também revela a produção de fragmentos biologicamente ati-vos desta proteína de 7-80 arhino ácidos.

O fator anti-secretor de acordo com a invenção pode ainda com-preender um grupo de proteção N terminal e/ou C terminal. Um exemplo deum grupo de proteção N terminal inclui acetila. Um exemplo de um grupo deproteção C terminal inclui amida.

Em uma modalidade preferida da presente invenção o fator anti-secretor é um selecionado dentre SEQ ID NOs.: 1-6, isto é, VCHSKTRSN-PENNVGL (SEQ ID NO. 1, neste contexto também chamado AF-16), IV-CHSKTR (SEO IDNO. 2), VCHSKTR (SEQ ID NO. 3), CHSKTR (SEQ IDNO. 4), HSKTR (SEQ ID NO. 5) ou a seqüência de amino ácido de uma pro-teína anti-secretora de acordo com a SEQ ID NO.: 6 usando as abreviaçõesde uma letra comuns para amino ácidos. As SEQ ID NOs.: 1, 2 e 3 foramanteriormente reveladas no, por exemplo, WO 05/030246. Conforme especi-ficado na listagem de seqüência acompanhante, alguns dos amino ácidosnas seqüências especificadas acima podem ser substituídos por outros ami-no ácidos. A seguir neste parágrafo, a posição de um amino ácido particularem uma seqüência de amino ácido particular é calculada a partir da esquer-da, estipulando a maioria do amino ácido N-terminal como estando na posi-ção 1 naquela seqüência em particular. Qualquer substituição(ões) de aminoácido conforme especificado abaixo pode ser realizada independentementede qualquer uma da(s) substituição(ões) de amino ácido nesta seqüência.Na SEQ ID NO.: 1, o C na posição 2 pode ser substituído por S, H na posi-ção 3 pode ser substituído por R ou K, S na posição 4 pode ser substituídocom L e/ou T na posição 6 pode ser substituído com A. Na SEQ ID NO.: 2, Cna posição 3 pode ser substituído por S, H na posição 4 pode ser substituídopor R ou K, S na posição 5 pode ser substituído por L e/ou T na posição 7pode ser substituído por A. Na SEQ ID NO.: 3, C na posição 3 pode sersubstituído por S, H na posição 3 pode ser substituído por R ou K, S na po-sição 4 pode ser substituído por L e/ou T na posição 6 pode ser substituídopor A. Na SEQ ID NO.: 4, C na posição 1 pode ser substituído por S, H naposição 2 pode ser substituído por R ou K1 S na posição 3 pode ser substitu-ído por L e/ou T na posição 5 pode ser substituído por A. Na SEQ ID NO.: 5,H na posição 1 pode ser substituído por R ou K1 S na posição 2 pode sersubstituído por L e/ou T na posição 4 pode ser substituído por A.

Também pretendida pela presente invenção é a combinação dedois ou mais de qualquer um dos fragmentos de acordo com as SEQ IDNOs.: 1-6, opcionalmente também em combinação com gema de ovo enri-quecida em fatores anti-secretores.

Também pretendida pela presente invenção é a possibilidade detratamento e/ou prevenção da síndrome do compartimento através da admi-nistração de gema de ovo enriquecida em fatores anti-secretores. A SE9000028-2 revela como a formação de fatores anti-secretores pode ser esti-mulada em aves e fatores anti-secretores então sendo recuperados ou con-centrados a partir da digestão de gema de ovo. O WO 00/38535 revela aindacomo tais fatores anti-secretores recuperados ou concentrados podem seradministrados a animais ou humanos com um alimento ou ração, ou, comoprodutos mais ou menos isolados, formulados em produtos farmacêuticos.Então, é também pretendido no presente pedido o uso de gema de ovo enri-quecida em fatores anti-secretores para a preparação de produtos, tal comocomposições farmacêuticas, para tratamento e/ou prevenção da síndromedo compartimento ou para uso em tal método de tratamento.

Em uma modalidade da presente invenção, a composição farma-cêutica de acordo com a invenção compreende ainda um excipiente farma-ceuticamente aceitável. A escolha de excipientes farmaceuticamente aceitá-veis e sua concentração ótima para uso de acordo com a presente invençãopode ser prontamente determinada pela pessoa versada na técnica atravésde experimentação. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis para uso deacordo com a presente invenção incluem solventes, agentes de tampona-mento, conservantes, agentes de quelação, antioxidantes, estabilizadores,agentes emulsificantes, agentes de suspensão e/ou diluentes. As composi-ções farmacêuticas da invenção podem ser formuladas de acordo com práti-ca farmacêutica convencional, por exemplo, de acordo com "Remington: Thescience and practice of pharmacy", 21â edição, ISBN 0-7817-4673 ou "Ency-clopedia of pharmaceutical technology", 2ã edição, ed. Swarbrick, J., ISBN:0-8247-2152-7. Um excipieníe farmaceuticamente aceitável é uma substân-cia que é substancialmente não-prejudicial ao indivíduo ao qual a composi-ção deve ser administrada. Tal excipiente normalmente satisfaz as condi-ções dadas pelas autoridades de saúde nacionais. Farmacopéias oficiais talcomo, por exemplo, Farmacopéia Britânica, a Farmacopéia dos Estados U-nidos da América e a Farmacopéia Européia estabelecem padrões para ex-cipientes farmaceuticamente aceitáveis.

O que segue é uma revisão de composições relevantes para usoopcional em uma composição farmacêutica de acordo com a invenção. Arevisão é baseada na via de administração particular. No entanto, é compre-endido que naqueles casos onde um excipiente farmaceuticamente aceitávelpode ser empregado em formas de dosagem ou composições diferentes, aaplicação de um excipiente farmaceuticamente aceitável particular não élimitada a uma forma de dosagem particular ou de uma função particular doexcipiente. Deve ser enfatizado que a invenção não é limitada ao uso dascomposições mencionadas a seguir.

Composições parenterais:

Para aplicação sistêmica, as composições de acordo com a in-venção podem conter carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitá-veis não-tóxicos convencionais, incluindo microesferas e lipossomas. Aplica-ção transcutânea constitui vias alternativas para administração sistêmica.

As composições para uso de acordo com a invenção podem in-cluir todos os tipos de composições sólidas, semi-sólidas e fluidas.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem incluir sol-ventes, agentes de tamponamento, conservantes, agentes de quelação, an-tioxidantes, estabilizadores, agentes emulsificantes, agentes de suspensãoe/ou diluentes. Exemplos dos agentes diferentes são dados abaixo.

Exemplo de vários agentes:

Exemplos de solventes incluem, mas não estão limitado a, água,álcoois, sangue, plasma, fluido espinhal, fluido de ascite e fluido de linfo.Exemplos de agentes de tamponamento incluem, mas não estãolimitados a, ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácidohidrogeno fosfórico, bicarbonatos, sais de fosfato, dietilamina, etc.

Exemplos de agentes de quelação incluem, mas não estão Iimi-tados a, EDTA e ácido cítrico.

Exemplos de antioxidantes incluem, mas não estão limitados a,hidroxil anisol butilado (BHA), ácido ascórbico e seus derivados, tocoferol eseus derivados, cisteína e suas misturas.

Exemplos de diluentes e agentes de desintegração incluem, masnão estão limitados a, lactose, sacarose, emdex, fosfatos de cálcio, carbona-to de cálcio, sulfato de cálcio, manitol, amidos e celulose microcristalina.

Exemplos de agentes de ligação incluem, mas não estão limita-dos a, sacarose, polissacarídeos, sorbitol, goma acácia, alginato de sódio,gelatina, amidos, celulose, quitosanas, carboximetilcelulose de sódio, metil-celulose, hidroxipropilcelulose, polivinilpirrolidona e polietilenoglicol.

A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode emum contexto ser administrada localmente ou através de infusão periféricaintravenosa ou através de injeção íntramuscular ou subcutânea no pacienteou através de via bucal, pulmonar, nasal, cutânea ou oral. Ainda, é tambémpossível administrar a composição farmacêutica através de derivação cirur-gicamente inserida em um ventrículo cerebral do paciente.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica usada de acor-do com a presente invenção é formulada para administração intra-ocular,local, intranasal, oral, subcutânea e/ou sistêmica. Em uma modalidade prefe-rida, a composição da invenção é administrada através de aplicação comouma suspensão ou, com mais preferência ainda, um pó para inalação comum spray, aerossol, inalador ou nebulizador nasalmente e/ou ao trato respi-ratório.

A administração de um pó compreendendo fatores anti-secretores tem as vantagens adicionais em termos de estabilidade e dosa-gem. Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção pode tam-bém ser topicamente aplicada, intra-ocularmente, intranasalmente, oralmen-te, subcutaneamente e/ou sistemicamente administrada através de vasossangüíneos. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica éformulada para administração intravenosa, intramuscular, local, oral ou na-sal. Tipicamente, quando usada para aplicação tópica ao olho, a concentra-ção aplicada na composição da invenção é de a partir de 1 pg a 10 mg poraplicação, tal como de a partir de 1 pg a mg por aplicação, de preferência50-1000 pg, de preferência 50-250 pg, ou como uma dose única por dia ourepetidas várias vezes por dia (doses múltiplas), mas não é limitada a elas.

Sistemicamente administrada ao sangue, a dose está dentro dafaixa de 0,1 pg a 10 mg por aplicação e kg de peso do corpo, tal como de0,1 pg a 1 mg por aplicação e kg de peso do corpo, de preferência 1-1000μ g/kg de peso do corpo, tal como de preferência 1-50, 10-100, 100-250 ou50-500 pg/kg de peso do corpo, ou como uma dose única por dia ou repetidavárias vezes por dia. Quando gema de ovo enriquecida em fatores anti-secretores é usada de acordo com a presente invenção, esta formulação éde preferência administrada oralmente.

Deste modo, a presente invenção refere-se ao uso de uma prote-ína anti-secretora ou um derivado, homólogo e/ou fragmento dela, tendo ati-vidade anti-secretora, e/ou um sal farmaceuticamente ativo dela, para a fa-bricação de uma composição farmacêutica e/ou alimento médico para o tra-tamento e/ou prevenção da síndrome do compartimento. Em uma modalida-de, a dita proteína anti-secretora consiste em uma seqüência de acordo coma fórmula que segue:

X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5

onde X1 é I, amino ácidos 1-35 de SEQ ID NO.: 6, ou está ausente, X2 é H,R ou Κ, X3 é S ou L, X4 é T ou A, X5 são amino ácidos 43-46, 43-51, 43-80ou 43-163 da SEQ ID NO.: 6 ou está ausente. Em outra modalidade, a in-venção refere-se ao uso de uma proteína anti-secretora que compreendeuma seqüência de amino ácido conforme mostrado na SEQ ID NO.: 1. Emoutra modalidade, a invenção refere-se ao uso de uma proteína anti-secretora, a qual compreende uma seqüência de amino ácido conformemostrado na SEQ ID NO.: 2. Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se ao uso de uma proteína anti-secretora, a qual compreende uma seqüên-cia de amino ácido conforme mostrado na SEQ ID NO.: 3. Em ainda outramodalidade, a invenção refere-se ao uso de uma proteína anti-secretora, aqual compreende uma seqüência de amino ácido conforme mostrado naSEQ ID NO.: 4. Em uma modalidade adicional, a invenção refere-se ao usoou uma proteína anti-secretora, a qual compreende uma seqüência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO.: 5.

Ainda, em outra modalidade, a invenção refere-se ao uso de umaproteína anti-secretora que é uma proteína com uma seqüência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO.: 6 ou um homólogo, derivado e/oufragmento dela compreendendo os amino ácidos 38-42 da SEQ ID NO.: 6.

Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se ao uso de umacomposição farmacêutica conforme aqui revelado, a qual compreende duasou mais proteínas anti-secretoras selecionadas das proteínas conforme re-velado nas SEQ ID NO.: 1-6 e SEQ ID NO.: 6 ou um homólogo, derivadoe/ou fragmento dela compreendendo amino ácidos 38-42 da SEQ ID NO: 6.,ou uma seqüência conforme revelado pela fórmula geral descrita aqui. Asditas seqüências são todas igualmente preferidas para serem usadas napresente invenção.

Em uma modalidade preferida, a dita proteína anti-secretora éprovida em gema de ovo enriquecida em tal proteína anti-secretora, e onde adita proteína anti-secretora é de preferência provida em uma concentraçãode pelo menos 1000 FIL unidades/ml na dita gema de ovo.

Em uma modalidade da invenção, a dita composição farmacêuti-ca compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tal exci-piente pode ser qualquer excipiente de preferência escolhido ser apropriadopara o propósito específico. Exemplos de excipientes são aqui revelados.

Em outra modalidade da invenção, a dita composição farmacêuti-ca é formulada para administração intra-ocular, intranasal, oral, local, subcu-tânea e/ou sistêmica. A via de administração escolhida vai variar dependen-do da condição do paciente a ser tratado e a idade e o gênero do paciente,etc.Em outra modalidade, a dita composição farmacêutica é formula-da para administração como um spray, aerossol ou por um nebulizador ouum inalador. Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se a uma com-posição farmacêutica e/ou alimento medicinal que é formulado para adminis-tração sistemicamente ao sangue em uma dose de 0,1 pg a 10 mg por apli-cação e kg de peso do corpo, tal como de 0,1 pg a 1 mg por aplicação e kgde peso do corpo, de preferência 1-1000 pg/kg de peso do corpo, tal comode preferência 1-50, 10-100, 100-250 ou 50-500 pg/kg de peso do corpo, oucomo uma dose única por dia ou repetidas várias vezes por dia. Em outramodalidade, a dita dose é 1-100 pg por aplicação e kg de peso do corpo edia. A quantidade da composição farmacêutica que é distribuída ao pacientecom necessidade dele vai com certeza variar dependendo do paciente a sertratado, e será decidida pela pessoa versada na técnica, tal como um prati-cante médico, para cada ocasião. A dita administração pode ser realizada oucomo uma dose única ou como aplicações diárias múltiplas.

Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso de uma proteí-na anti-secretora, um derivado, homólogo e/ou fragmento dela, tendo ativi-dade anti-secretora, e/ou um sal farmaceuticamente ativo dela, para a fabri-cação de uma composição farmacêutica e/ou alimento medicinal para trata-mento e/ou prevenção da síndrome do compartimento, onde a dita síndromecausa inchaço anormal de células e tecidos. Em outra modalidade, a ditasíndrome do compartimento é causada por uma carga não-normal (anormal),lesão ou doença relacionada a um músculo, nervo, vaso sangüíneo e/ou umtendão. Tal carga não-normal em um músculo, nervo, vaso sangüíneo, juntae/ou tendão pode, por exemplo, acontecer em um trauma, atividade motoraestendida ou em carga alta. Ainda, fármacos podem causar elevação depressões do fluido de tecido intersticial bem como inchamento de célula. Emoutra modalidade preferida, a dita síndrome é causada por um micróbio. Nocontexto da presente invenção, o dito micróbio pode ser uma bactéria, bemcomo uma infecção viral, por exemplo, por um vírus de RNA ou um vírus deDNA, tal como Herpes viridae, tal como Vírus Herpes Simplex Tipo 1, Papo-vaviridae, Orthomyxoviridae, Flaviridae, Togaviridae, Hepadnaviridae, Vírusda Imunodeficiência Humana ou Vírus da Hepatite C, que são todos com-preendidos pela presente invenção. Em outra modalidade, a invenção refere-se ao uso de uma proteína anti-secretora ou um derivado, homólogo e/oufragmento dela, tendo atividade anti-secretora, e/ou um sal farmaceutica-mente ativo dela, para a fabricação de uma composição farmacêutica e/ouum alimento medicinal para o tratamento e/ou prevenção de uma infecçãoviral e/ou microbiana e/ou sintomas associados com uma infecção viral e/oumicrobiana. Exemplos de uma infecção viral compreendidos pela presenteinvenção incluem infecções por linhagens patogênicas, tal como Mycobacte-ria, Pseudomonas, Chlamydia, Brucella e Listeria. A presente invenção, noentanto, não é limitada a elas. Em uma modalidade da invenção, o dito mi-cróbio, tal como uma enzima de liberação de bactéria, toxinas e/ou pigmen-tos e/ou induzem a formação e/ou liberação de fatores reativos por células etecidos adjacentes. Ainda, no contexto da presente invenção, o dito micróbiopode ser selecionado do grupo selecionado de Protista, Protozoário, vermeou um fungo.

Em outra modalidade, a dita síndrome é causada por um príon.Um príon pode ser definido como uma partícula infecciosa proteinácea, umapartícula de proteína infecciosa similar a um vírus mas sem ácido nucléico eé pensada ser o agente responsável por distúrbio degenerativo contagiosodo sistema nervoso central de ovinos e caprinos e outras doenças degenera-tivas do sistema nervoso. Um príon é um tipo de proteína que é consideradaser a causa de muitos distúrbios do sistema nervoso tal como Doença deCreutzfeldt-Jakob, incluindo suas variantes esporádicas, genéticas e adquiri-das, constituindo a forma humana correspondente da doença da vaca louca,distúrbio degenerativo contagioso do sistema nervoso central de ovinos ecaprinos e condições e doenças relacionadas. Em ainda outra modalidade, adita síndrome é causada por transporte anormal de produtos em uma célulaou tecido.

Em ainda outra modalidade da invenção, a dita síndrome causaisquemia. Isquemia pode ser definida como um estado de pouco oxigênio,que é geralmente devido à obstrução do fornecimento de sangue arterial oufluxo de sangue inadequado levando à hipoxia no tecido. Em ainda outramodalidade, a dita síndrome é causada por um fármaco e/ou uma medidaterapêutica ou de diagnóstico.

Em ainda outra modalidade da invenção, a dita síndrome docompartimento é causada por hemorragias, tal como hemorragias no crânioe/ou no cérebro e/ou na espinha e cordão espinhal e/ou de aneurismas, queé um saco formado pela dilatação da parede de uma artéria, uma veia ou docoração. Em outra modalidade, a dita síndrome é causada por um tampo-namento de um órgão ou estrutura confinado por uma cápsula, tal como umcoração, testículo, ovário, glândulas, órgão linfóide e/ou rim. Tamponamentocardíaco é a compressão do coração causada por acúmulo de sangue oufluido no espaço entre o miocárdio (o músculo do coração) e o pericárdio (osaco de cobertura externo do coração). Em ainda outra modalidade, a ditasíndrome é causada por um tumor benigno e/ou maligno presente em qual-quer lugar em um corpo e/ou está relacionado com o tratamento de tumore/ou estruturas adjacentes. Tumores são caracterizados por pressões inters-ticiais elevadas, que podem reduzir a disponibilidade de células de tumorpara fármacos e medidas terapêuticas. Ainda, a pressão elevada em um tu-mor pode afetar sua tendência em disseminação metastática. Adicionalmen-te, tumores podem através de sua expansão em tamanho causar pressãoalta em tecidos e órgãos normais adjacentes, gerando uma CS. Então CS éuma complicação freqüente e séria em muitas vítimas sofrendo de tumores.Em ainda outra modalidade, a dita síndrome é causada por uma reação i-mune. Ainda, em uma modalidade, a dita síndrome causa dano a ou alterna-tivamente poderia ser uma conseqüência de lesão ou um trauma a discosintervertebrais.

Em uma modalidade adicional, a dita síndrome é causada por uminchamento citotóxico de uma junta e/ou um tendão e/ou um ligamento. Ain-da, em outro aspecto da invenção, a dita síndrome é causada por um in-chamento citotoxicamente dependente de um nervo e/ou uma parede devaso sangüíneo. Em ainda outra modalidade, a dita síndrome é causada porum fármaco e/ou uma composição farmacêutica. Em ainda outra modalida-de, a dita síndrome é causada por efeitos colaterais causados por tratamen-to de um tumor com raio x, radiação de alta energia, esfriamento local, a-quecimento local, terapia de luz e fármâCòs usados para o tratamento dotumor.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um métodopara o tratamento e/ou prevenção da síndrome do compartimento em ummamífero com necessidade dele, o dito método compreendendo administraruma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendouma proteína ou um derivado, homólogo e/ou fragmento dela, tendo ativida-de anti-secretora, e/ou um sal farmaceuticamente ativo dela. Em uma moda-lidade, a invenção refere-se a um método onde a dita proteína anti-secretoraconsiste em uma seqüência de acordo com a fórmula que segue X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5 onde X é I, amino ácidos 1-35 da SEQ ID NO.: 6, ou está au-sente, X2 é H, R ou Κ, X3 é L1 X4 é T ou A, X5 é amino ácidos 43-46, 43-51,43-80 ou 43-163 da SEQ ID NO.: 6, ou está ausente. Em outra modalidade,a presente invenção refere-se a um método onde a dita proteína anti-secretora compreende uma seqüência de amino ácido conforme mostradona SEQ ID NO.: 1. Em ainda outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método onde a dita proteína anti-secretora compreende uma se-qüência de amino ácido conforme mostrado na SEQ ID NO.: 2. Em aindaoutra modalidade, a invenção refere-se a um método onde a dita proteínaanti-secretora compreende uma seqüência de amino ácido conforme mos-trado na SEQ ID NO.: 3. Ainda, a invenção refere-se a um método onde adita proteína anti-secretora compreende uma seqüência de amino ácido con-forme mostrado na SEQ ID NO.: 4. Em ainda outra modalidade, a presenteinvenção refere-se a um método onde a dita proteína anti-secretora compre-ende uma seqüência de amino ácido conforme mostrado na SEQ ID NO.: 5.

Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se a um método onde a ditaproteína anti-secretora é uma proteína com uma seqüência de amino ácidoconforme mostrado na SEQ ID NO.: 6, ou um homólogo, derivado e/oufragmento dela, compreendendo amino ácidos 38-42 da SEQ ID NO.: 6. Emuma modalidade, a invenção refere-se a um método onde a dita composiçãofarmacêutica compreende duas ou mais proteínas anti-secretoras seleciona-das das proteínas SEQ ID NOs.: 1-6 e SEQ ID NO.: 6 ou um homólogo, de-rivado e/ou fragmento dele compreendendo os amino ácidos 38-42 da SEQID NO.: 6 ou uma seqüência conforme descrito pela fórmula geral aqui. Ain-da, em uma modalidade, a invenção refere-se a um método conforme aquirevelado, onde a dita proteína anti-secretora é provida em gema de ovo en-riquecida em tal proteína anti-secretora, e onde a dita proteína anti-secretoraé de preferência provida em uma concentração de pelo menos 1000 FIL uni-dades/ml na dita gema de ovo. Em ainda outra modalidade, a invenção refe-re-se a um método onde a dita composição farmacêutica compreende aindaum excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a ditacomposição farmacêutica é formulada para administração intra-ocular, intra-nasal, oral, local, subcutânea e/ou sistêmica. Em ainda outra modalidade, adita composição farmacêutica e/ou alimento medicinal é formulado para ad-ministração como um spray, aerossol ou por um nebulizador ou um inalador.

Também compreendido por uma modalidade da presente invenção é ummétodo onde a composição farmacêutica é formulada para administraçãosistemicamente ao sangue em uma dose de 0,1 pg a 10 mg por aplicação ekg de peso do corpo e dia, de preferência 1-1000 pg por aplicação e kg depeso do corpo e dia. Em uma modalidade do dito método, a dita administra-ção é realizada ou como uma dose única ou como aplicações diárias múlti-plas. A presente invenção refere-se também a um método para o tratamentoe/ou prevenção da síndrome do compartimento em um mamífero com ne-cessidade dele, o dito método compreendendo administrar uma quantidadeeficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína anti-secretora ou um derivado, homólogo e/ou fragmento dela, tendo atividadeanti-secretora, e/ou um sal farmaceuticamente aceitável dela, onde a ditasíndrome causa inchamento anormal de células e tecidos. Em uma modali-dade, a dita síndrome é causada por uma carga não-normal, lesão ou doen-ça relacionada com um músculo, nervo, vaso sangüíneo, junta e/ou tendão.

Em outra modalidade, a dita síndrome é causada por um micróbio. Em aindaoutra modalidade, a dita síndrome é causada por uma infecção viral. Emuma modalidade, tal infecção viral é causada por um vírus de DNA ou porum vírus de RNA1 tal como Herpes viridae, Vírus Herpes Simplex Tipo 1,Flaviviridae, Papovaviridae, Ortomixoviridae, Hepadnaviridae, Togaviridae,Vírus da Hepatite C e/ou Vírus da Imunodeficiência Humana, que são todos

compreendidos pela presente invenção.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-setambém a um método para o tratamento e/ou prevenção de síndrome docompartimento em um mamífero com necessidade dele, o dito método com-preendendo administrar uma quantidade eficaz de uma composição farma-cêutica compreendendo uma proteína anti-secretora ou um derivado, homó-logo e/ou fragmento dela, tendo atividade anti-secretora, e/ou um sal farma-ceuticamente ativo dela, onde a dita síndrome é causada por um micróbio,tal como, mas não limitado a, Protista, Protozoário, verme, fungo, bactérias.Em uma modalidade, a dita bactéria é selecionada do grupo consistindo emMycobacteria, Pseudomonas, Chlamydia, Cocci, Bruceila e Listeria. Em ain-da outra modalidade, o dito micróbio, tal como bactéria, libera enzimas, toxi-nas e/ou pigmentos e/ou induz a formação e/ou liberação de fatores reativospelas células e tecidos adjacentes. Em outra modalidade da invenção, a ditasíndrome é causada por um príon. Em ainda outra modalidade, a dita sín-drome é causada por transporte anormal de produtos em uma célula ou teci-do. Em ainda outra modalidade, a dita síndrome causa isquemia. Em aindaoutra modalidade, a dita síndrome é causada por um fármaco e/ou uma me-dida terapêutica ou de diagnóstico. Ainda, a presente invenção tambémcompreende uma modalidade onde a dita síndrome causa um funcionamen-to anormal do cérebro e cordão espinhal. Em ainda outra modalidade, a ditasíndrome é causada por hemorragias no crânio e/ou no cérebro e/ou na es-pinha e cordão espinhal e/ou de aneurismas. Em ainda outra modalidade, adita síndrome é causada por um tamponamento de um órgão ou estruturaconfinado por uma cápsula, tal como um coração, rim, testículo, ovário,glândulas e/ou órgão linfóide. Em ainda outra modalidade, a dita síndrome écausada por um tumor benigno e/ou maligno presente em um corpo ou érelacionada ao tratamento do tumor e estruturas adjacentes.Ainda, também compreendida pela presente invenção é uma mo-dalidade, onde a dita síndrome é causada por uma imunorreação. Em outramodalidade, a dita síndrome causa dano a discos intervertebrais.

Deve ser ainda compreendido e claro que um método compreen-dendo administrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêuticaa um mamífero com necessidade dele e/ou o segundo uso médico de umacomposição farmacêutica compreendendo uma proteína anti-secretora ouum derivado, homólogo e/ou fragmento dela, tendo atividade anti-secretora,e/ou um sal farmaceuticamente ativo dela, de acordo com a presente inven-ção, é direcionado a todas as condições descritas aqui estarem associadascom síndrome do compartimento.

Seção experimental

Exemplo N°. 1

Ratos adultos foram infectados tendo uma solução do vírus Her-pes Simplex tipo 1 (HSV-1; cepa 2762, batelada 041028; 1,7 χ 107 PFU/mL;25 pL) instilada em sua narina direita. Um grupo de animais (n = 6) recebeu10 minutos após a infecção 25 pL (10 pg) de AF-16 na narina direita, e teveem seguida a mesma dose de AF-16 instilada duas vezes por dia, toda ma-nhã às 8:00 e toda noite às 18:00, até que o experimento foi terminado nodia 6. Ratos infectados com HSV-1 adicionais (n = 6) receberam no nariznos mesmos intervalos de tempo 25 pL do veículo, solução salina tampona-da com fosfato (PBS). No dia 6, os animais foram anestesiados, uma incisãocirúrgica feita através da pele na cabeça, e osso do crânio teve perióstio etecido conectivo retirados. Um furo com um diâmetro de cerca de 1 mm foifeito através do osso parietal direito e um sensor de pressão em miniaturainserido 3-5 mm no cérebro ou no ventrículo lateral. Um sistema de mediçãode pressão de fibra óptica (sensor Samba System 3200 & Samba Preclin420; Samba Sensors AB, Frólunda, Suécia) com um diâmetro muito peque-no, « 0,4 mm, foi usado. Ratos normais não-infectados tinham uma pressãointracranial (ICP) variando 4-8 mm Hg, ocasionalmente até 12 mm Hg (Figu-ra 2c). Ratos infectados com HSV-1 tratados com apenas o veículo forammedidos ter pressões tão altas quanto 30-45 mm Hg (Figura 2a), considera-velmente afeta os animais conforme refletido pelos sintomas de disfunçãoneurológica de alta gravidade. Em contraste, ratos infectados com HSV-1tratados no momento de infecção com AF-16 duas vezes por dia tinham ICPquase normal, 8-14 mm Hg (Figura 2b). Uma observação-chave foi que tra-tamento intranasal duas vezes por dia com AF-16 preveniu o desenvolvi-mento de disfunções neurológicas tal como nariz úmido, olhos vermelhos,hipersalivação, desconforto respiratório, instabilidade motora, agitação, a-gressividade, letargia, mudanças rápidas de humor, movimentos repetitivos,ataques, sinais de paresia e eventualmente de ficarem inconscientes.

Animais infectados com HSV-1 adicionais com sintomas distinta-mente claros foram também tratados com 10 ou 25 [ig de AF-16 intranasal-mente, começando no dia 5, 6 ou 7, isto é, após terem tido o veículo duranteos dias anteriores. Em tais casos os sintomas de disfunções neurológicasdescritos acima reduziram dentro de meia hora e não eram demonstráveismais após uma hora. Concomitantemente, os efeitos de redução de pressãobenéficos de AF-16 em tais ratos infectados e tratados com AF-16 eram de-tectáveis dentro de uma hora e duraram várias horas. Então, nenhum dosratos tratados agudamente com AF-16 tinha sinais persistentes de ICP pre-judicial e então nenhuma CS se desenvolveu.

Infusão corante Evans blue, conjugado com albumina de sorobovino (EBA), no espaço subaraquinóide e nos ventrículos laterais resultouem ratos normais que o marcador após 15-30 minutos poderia ser demons-trado na mucosa nasal (Figura 5b). Isto demonstrou que uma porção consi-derável do CSF é drenada para os linfáticos na mucosa nasal e mais atravésde glândulas de Iinfo cervicais, ficando azul (vermelho se investigada atravésde microscopia de fluorescência). Ratos infectados com HSV-1 com sinaisde disfunções neurológicas não mostraram se similarmente tendo tido EBAinfundido nenhum tingimento da lamina cribriforme, nem da mucosa nasal(Figura 5a). É visto na figura mencionada (Figura 5a) como não há nenhumtingimento vermelho da metade direita na figura. No entanto, tratamento com10 ou 25 pg de AF-16 intranasalmente deixou a figura em ratos infectadoscom HSV-1 como em ratos não-infectados, normais. Então, infusão intrana-sal de AF-16 reverteu o bloco do fluxo de saída de CSF1 induzido por infec-ção por HSV-1. Deste modo o fluxo de saída de CSF foi restaurado e a ICPficou normal.

A requerente conclui que tratamento de roedores com AF-16 mi-nimiza os sintomas clínicos sobre encefalite por HSV-1 e, mais evidentemen-te, normalizou a ICP de outro modo elevada, contrastando para os efeitosprejudiciais pela ICP muito alta medida naqueles infectados com HSV-1 eapenas tratados com o veículo, PBS. Sabe-se a partir da prática clínica quevítimas sofrendo de encefalite têm ICP elevada, que é de grande importânciacausando não apenas dano cerebral agudo, mas também persistente. Narealidade, a ICP alta é considerada ser de importância-chave como eventu-almente sendo a causa de disfunção neurológica e morte. Então, os resulta-dos do experimento No. 1 da requerente revelaram que a administração deAF-16 a um corpo sofrendo de uma condição que satisfaz os critérios parauma CS realmente combateu imediatamente a ICP patologicamente eleva-da, reduzindo-a e até mesmo levando-a para um nível normal, prevenindo odesenvolvimento de disfunções neurológicas e promovendo sobrevivênciacom nenhum ou mínimo mau funcionamento cerebral residente ou sistêmicopersistente.

Exemplo N°. 2

Em um segundo experimento a requerente investigou se AF-16,em uma dose que reduziu a ICP elevada, conforme revelado no Exemplo 1,também melhorou a sobrevivência de roedores adultos infectados com HSV-1. Deste modo, ratos foram infectados através de instilação em sua narinadireita de 25 pL de uma solução do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1; cepa2762, batelada 041028; 1,7 χ 107 PFU/mL). Metade dos animais recebeu 10minutos mais tarde 25 μι (1, 10 ou 25 pg) de AF-16 em sua narina direita, etiveram em seguida a mesma dose de AF-16 instilada cada manhã às 8:00 etoda noite às 18:00 até que o experimento foi terminado no dia 14. A outrametade do grupo de ratos infectados com HSV-1 recebeu 25 pL do veículo,PBS, no mesmo programa de tempo. Os animais foram várias vezes diaria-mente observados de perto quanto a sinais de disfunção comportamental oudoença geral. Se acontecido, os animais foram sacrificados. A Figura 3 estáilustrando as taxas de sobrevivência para os animais, todos sendo infecta-dos com HSV-1. Os ratos tratados com 1 pg de AF-16 (n = 15; linha superi-or) sobreviveram um tempo significantemente maior, cerca de 60%, no finaldas 2 semanas que o experimento aconteceu (Figura 3). Em contraste, osratos infectados com HSV-1, recebendo apenas veículo (n = 15), morreramem um grau elevado apenas 10% estavam ainda sobrevivendo no final doperíodo de teste, dia 14 (Figura 3). Todos dos ratos infectados, tratados comveículo, desenvolveram sinais de disfunções neurológicas. Tratamento duasvezes por dia intranasalmente com 10 pg ou com 25 pg de AF-16 resultouem que todos os animais infectados sobreviveram, e nenhum mostrouquaisquer sinais de disfunção neurológica. Microscopia de luz de espécimes,fixados em formalina e processados de acordo com procedimento de rotinapara investigações histopatológicas e imunoistoquímicas (Cf. Zhu, Wang &Hansson1 2003), revelaram alterações inflamatórias, degenerativas e reati-vas no hipocampo, no cérebro e no tronco cerebral, mais evidentemente na-queles infectados e então tratados com o veículo. Deve ser ressaltado que ograu e gravidade do dano eram dependentes da duração da exposição e donível de ICP elevada bem como o tempo de sobrevivência. Investigação i-munoistoquímica de cérebros de ratos infectados, tratados com veículo, re-velou que, por exemplo, as imunorreatividades de flotilina-1 e aquaporina 1no plexo coróide não foram mais dificilmente demonstráveis. Em contraste,imunorreatividades de flotilina-1 e aquaporina 1 distintas eram prontamentedemonstráveis no plexo coróide em animais infectados tratados com AF-16,similarmente como em cérebros de rato normal, não-infectado, não-tratado.

Então, tratamento com AF-16 impediu a perda celular e facilitou a normaliza-ção da ocorrência e distribuição de estruturas ordenadas tal como vasos,neurônios incluindo sinapses e células de apoio no sistema nervoso. Ainda,a perda imunoistoquimicamente demonstrável de imunorreatividades de floti-lina-1 e aquaporina no plexo coróide indicou fortemente distúrbio severo deprevalência, distribuição e organização de ilhas de lipídeo, conforme revela-do pelo tingimento de flotilina-1, e distribuição de água perturbada entrecompartimentos, por exemplo, produção de CSF, movimento e fluxo, con-forme revelado pela imunorreatividade de aquaporina 1 baixa. É concluídoque tratamento com AF-6 de animais com encefalite por HSV-1 normalizafuncionamentos essenciais do sistema nervoso central, deste modo abolindoo desenvolvimento de ICP elevada, resultando em uma CS.

É concluído que tratamento pela instilação de 1, 10 ou 25 pg deAF-16 duas vezes por dia em uma narina significantemente aumentou a taxade sobrevivência de ratos adultos infectados com HSV-1 encefalolitogênica eaboliu o desenvolvimento de disfunções neurológicas. Tais efeitos são pro-vavelmente devido ao fato de que o tratamento com AF-16 preveniu a ICPde aumentar para níveis de dano, conforme demonstrado no Exemplo 1, noCC formada pelo crânio, e voltou a ICP para valores próximos do normal,prevenindo o desenvolvimento de CS prejudicial.

Exemplo N°. 3

Uma explicação alternativa para a sobrevivência aperfeiçoada deanimais infectados com HSV-1 poderia ser que o tratamento com AF-16 pre-veniu o vírus de se multiplicar e/ou se espalhar no cérebro. Isto foi demons-trado não ser o caso pelo experimento que segue. Ratos adultos foram infec-tados ao terem uma solução do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1; cepa2762, batelada 041028; 1,7 χ 107 PFU/mL) instilado em sua narina direita.

Metade dos animais recebeu 10 minutos mais tarde 25 pL (1 ou 10 pg) deAF-16 em sua narina direita, e tiveram em seguida a mesma dose de AF-16instilada toda manhã às 8:00 e toda noite às 18:00 até que o experimento foiterminado no dia 6. Os outros grupos dos ratos infectados com HSV-1 rece-beram nos mesmos intervalos de tempo 25 pL do veículo, PBS. Os animaisforam observados de perto quanto a sinais de doença geral e de disfunçãocomportamental e motora. Os animais foram sacrificados por uma overdosede anestésico no dia 6, o crânio aberto e o cérebro removido. Os cérebros,incluindo os bulbos olfativos, foram fixados através de imersão em formalinatamponada por pelo menos um dia. Os cérebros foram dissecados e dividi-dos em vários espécimes, que foram processados para investigação por mi-croscopia de luz após embebimento em parafina e seccinamento. As seçõesforam processadas para tingimento de rotina e para visualização imunoisto-química de proteínas de HSV-1 (Figura 4). Uma constatação impressionantefoi que proteínas de HSV-1 poderiam ser demonstradas não apenas em cé-lulas nervosas (Figuras 4a-c), mas também em células gliais (Figura 4d) nocérebro, incluindo no lobo olfativo e nos gânglios trigeminais. Notar o tingi-mento distinto das células do nervo (preto nas Figuras 4a-c). Não houve, noentanto, nenhuma diferença óbvia com relação à prevalência e distribuiçãode proteínas de HSV-1 nos cérebros de animais infectados tratados com AF-16 conforme comparado com aqueles tratados com apenas o veículo. Emparalelo, camundongos foram infectados com HSV-1 e ou tratados com AF-16 ou o veículo através de instilação duas vezes por dia na narina direita eapós seis dias sacrificados e os espécimes cerebrais processados conformeacima para a demonstração de antígenos de HSV, como descrito. Como pa-ra os ratos não houve nenhuma diferença óbvia na distribuição ou extensãodos antígenos de vírus relacionados ao tratamento.

A requerente então conclui que o tratamento com AF-16 de roe-dores infectados com uma cepa de HSV-1 encefalolitogênica, originalmenteisolada de um caso fatal humano, não altera nem a prevalência nem a distri-buição celular de proteínas virais de HSV-1 no cérebro, conforme compara-do com aqueles tratados com apenas o veículo. Então, tratamento com AF-16 não altera a distribuição de HSV-1 no SNC. A provável causa da sobrevi-vência significantemente aperfeiçoada de roedores, conforme ilustrado noExemplo No. 2, é, então, que a ICP foi prevenida de aumentar para níveisdanificadores pela AF-16 no CC formado pelo osso do crânio, conforme rela-tado no Exemplo No. 1. Deste modo, o desenvolvimento de uma CS prejudi-cial foi abolido.

Exemplo N°. 4

A sobrevivência aperfeiçoada de roedores infectados com HSV-1,conforme ilustrado no Exemplo 2, poderia ser temporariamente devido aofato que AF-16 bloqueou ou pelo menos reduziu a proliferação de vírus HSV-1 no cérebro infectado. Então, ratos adultos foram infectados ao terem umasolução do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1; cepa 2762, batelada 041028;1,7 χ 107 PFU/mL) instilada na sua narina direita. Metade dos animais infec-tados recebeu 10 minutos mais tarde 25 \iL (1 ou 10 μς) de AF-16 em suanarina direita, e tiveram em seguida a mesma dose de AF-16 instilada todamanhã às 8:00 e toda noite às 18:00 até que o experimento foi terminado nodia 6. Os outros grupos dos ratos infectados com HSV-1 receberam nosmesmos intervalos de tempo 25 μΐ_ do veículo, PBS. Os animais foram ob-servados de perto quanto a sinais de doença geral e de disfunção compor-tamental e motora. Os animais foram sacrificados por uma overdose de a-nestésicos no dia 6, o crânio foi então rapidamente aberto e o cérebro remo-vido. Em seguida, as amostras de tecido cerebral foram processadas atravésde RT-PCR para avaliação do número de cópias de HSV-1 demonstrável notecido cerebral, de acordo com os procedimentos de rotina usados no Clini-cai Virology Laboratory, Sahlgrenska University Hospital, Gõteborg, Suécia.

Uma constatação impressionante foi que não houve nenhuma diferença sig-nificante com relação à prevalência e distribuição de cópias de DNA de HSV-1 nos roedores tratados com AF-16 conforme comparado com aqueles tendorecebido apenas o veículo (Figura 5). O experimento descrito acima foi tam-bém realizado em camundongos em paralelo, e resultados similares obtidos,confirmando a eficácia de AF-16 em espécies múltiplas. Então, AF-16 nãoteve quaisquer efeitos significantes sobre a multiplicação de vírus HSV-1,conforme demonstrado pelos dados de PCR (Figura 5). Os efeitos benéficossão provavelmente devido ao fato de que AF-16 abole o aumento anormalem ICP (Figura 2) no CC formado pelo crânio, conforme revelado no Exem-plo 1, que se não-tratado deve resultar em uma CS prejudicial, severamentedanificando o SNC dos animais infectados.

Exemplo N0. 5

Os efeitos beneficiais de AF-16 sobre animais sofrendo de ence-falite por HSV-1 poderiam temporariamente ser devido ao fato de que AFsreduziram reações inflamatórias no SNC. Para testar esta hipótese, ratosadultos foram infectados tendo uma solução do vírus herpes simplex tipo 1(HSV-1; cepa 2762, batelada 041028; 1,7 χ 107 PFU/mL) instilada em suanarina direita. Metade dos animais recebeu 10 minutos mais tarde 25 μί (1ou 10 μg) de AF-16 em sua narina direita, e tiveram em seguida a mesmadose de AF-16 instilada toda manhã às 8:00 e toda noite às 18:00 até que oexperimento foi terminado no dia 6. A outra metade dos ratos infectados comHSV-1 recebeu nos mesmos intervalos de tempo 25 μΙ_ do veículo, soluçãosalina tamponada. No dia 6, amostras de fluido cérebro-espinhal (CSF) fo-ram obtidas dos animais, ou tratados com AF-16 (n = 3), ou o veículo (n = 3),de acordo com os procedimentos descritos por Huang, Sáljõ e Hansson(1996). Quando analisados quando a concentrações dos marcadores infla-matórios IL-1, IL-6 e TNF-α, foi constatado que não havia nenhuma diferen-ça significante nas concentrações de nenhum no CSF dos animais infecta-dos tratados com AF-16 conforme comparado com aqueles tendo sido trata-dos com o veículo. É concluído que tratamento com AF-16 não é provável demelhorar a sobrevivência de roedores sofrendo de encefalite por HSV-1 aoalterar a resposta inflamatória, mas através da normalização da pressão in-tracranial, deste modo prevenindo prevalência de ICP alta em um CC e en-tão o desenvolvimento de uma CS. Os efeitos prejudiciais causados pelaencefalite por HSV-1 foram então considerados ser devido ao fato de que AFimpediu o desenvolvimento de CS.

Exemplo 6

Um tipo diferente de CS cerebral foi induzido pela injeção desangue integral antílogo no espaço subaraquinóide, um procedimento co-nhecido da literatura resultar no desenvolvimento de edema cerebral e ICPelevada. Ratos adultos anestesiados tiveram 50-350 pL de sangue autólogoheparinizado depositados no espaço subaraquinóide através de um pequenoburaco feito no osso occipital ou através de injeção na cisterna magna atra-vés da membrana atlanto-occipital. Buracos feitos em um osso do crânioforam eventualmente tampados com cola SuperBond®. Tais tratamentoscom sangue subaracnoidalmente depositado aumentaram a ICP, induzindo odesenvolvimento de uma CS em um dia ou dentro de uma semana, o tempoexato dependendo das condições e da quantidade de sangue depositado, deacordo com relatos na literatura médica. Nos experimentos da requerente,injeção de 0,2-0,3 mL de sangue heparinizado, autólogo, na cisterna magnaem ratos Sprague-Dawley adultos resultou dentro de 1-3 dias em uma ele-vação da ICP para 13 a 30 mm Hg1 conforme avaliado com uma sonda guiade luz de pressão em miniatura implantada (sensor Samba System 3200 &Samba Preclin 420; Samba Sensors AB, Gruvgatan 6, SE 42130 V.,Frõlunda, Suécia). A ICP normal em ratos adultos, ou não-tratados ou tendotido solução salina tamponada com fosfato (PBS) injetada, foi 6-9 mm Hg.Tratamento com 25 pg de AF-16 intranasalmente duas vezes por dia resul-tou em uma redução da ICP elevada, que reproduzivelmente voltou paraníveis quase normais em 1-2 horas. Os roedores tratados com AF não mos-traram nenhum sinal de função cerebral prejudicada nem qualquer prejuízoóbvio bruto de funções comportamentais ou motoras, em contraste com a-queles tendo tido sangue subaracnoidalmente depositado e então tratadoscom o veículo. É concluído que tratamento com AF-16 reduziu a extensão ea gravidade do dano cerebral induzido por deposição subaraquinóide desangue, conforme comparado com animais que apenas receberam o veícu-lo, PBS. Isto significa que AF-16 está abolindo e, em caso de CS cerebral jáestabelecida, reduzindo sua gravidade. A resposta imediata a AF-16 foi de-cisiva para o efeito benéfico exercido por AF-16.

Exemplo N°. 7

As juntas são envolvidas por cápsulas de colágeno não-complacentes, macias, caracterizadas ainda por pouca elasticidade, masplasticidade. Na artrite, a pressão no fluido sinovial na cavidade da junta ficaelevada, e inflamação soma aos sintomas. Uma CS é prevalente. A fim deinvestigar se tratamento com AF-16 poderia prevenir ou pelo menos reduziro desenvolvimento de tal CS, ratos adultos foram infectados por injeção sis-têmica de uma solução artritogênica de Staphylococcus aureus (SA; cepaLS1). Um grupo de animais (n = 3) foi tratado com AF-16 enquanto um se-gundo grupo de ratos (n = 3) apenas recebeu o veículo, PBS. Após algunsdias as juntas do joelho e mais tarde juntas do membro e pé adicionais fica-ram macias, inchando e tiveram pressão elevada nas cavidades da junta,conforme medido com a sonda Samba Fibre Optic Pressure (sensor Samba3200 & Samba Preclin 420; Samba Sensor AB, Gruvgatan 6, SE 42130 V.Frõlunda, Suécia), bem como no tecido imediatamente circundante. A pres-são em uma junta grande sinovial normal é de 0-5 mm Hg1 mas poderia au-mentar mais de cinco vezes em juntas inflamadas, infectadas. A pressão dofluido intersticial no tecido subcutâneo em uma distância da junta infectadafoi medida para comparação e verificada permanecer dentro dos limitesnormais ± 2 mm Hg. Em contraste, roedores com uma junta grande, infecta-da com AS, e tratados com AF1-6 não tiveram essas juntas inchadas e dolo-rosas, macias, e pressão próximo do normal na junta. Animais infectados,que apenas receberam tratamento com o veículo, PBS, desenvolveram CSde gravidade crescente com o tempo. Amostras do fluido sinovial analisadasquanto à prevalência de bactérias quantitativamente e qualitativamente dequalquer grupo revelaram que o número de S. aureus era mais ou menos omesmo em juntas maiores, sem importar se os ratos tinham sido tratadoscom AF-16 ou não.

A requerente conclui que o tratamento com AF-16 reduziu apressão na junta infectada após inoculação com micróbios artritogênicos, porexemplo, bactérias, e provavelmente também vírus e agentes imunológicos.

Não houve, no entanto, nenhuma diferença na multiplicação ou distribuiçãonas juntas de bactérias patogênicas, por exemplo, Staphylococcus aureus(cepa LS1). Deste modo, as juntas infectadas eram prováveis de ficar danifi-cadas pela infecção por AS, como nenhum antibiótico foi administrado. Osanimais não foram, no entanto, deixados sobreviver por este tempo.

A constatação principal foi que tratamento com AF-16 combateureproduzivelmente a pressão de outro modo elevada na junta afetada, queconstituiu uma CS. Deste modo, nenhuma CS se desenvolveu após trata-mento com AF-16 em juntas infectadas conforme avaliado no presente estudo.

Exemplo N°. 8

Ratos adultos tinham uma condição de CC induzida e avaliadaem músculos esqueletais. Na perna traseira, os vasos grandes entrando noMusculus extensor digitorum Iongus (EDL) foram ocluídos por 1-3 horas apli-cando carga de pressão externa (Cf. Jennische & Hansson, 1987; Jennis-che, Skottner & Hansson1 1987). Em seguida, o fluxo de sangue foi deixadoretomar, e as áreas delimitadas do músculo e a incisão da pele reparadas esuturadas. Este tratamento resultou em uma lesão isquêmica causando ne-crose de uma fração das fibras do músculo esqueletal EDL. Uma CS se de-senvolveu uma vez que o tecido e o tecido intersticial acumularam fluido emtal compartimento fechado e adicionalmente o tecido muscular ficou enchadoe edematoso. A pressão de tal compartimento confinado aumentou, resul-tando no desenvolvimento de uma CS. Intervenção cirúrgica foi requeridapara prevenir que partes do tecido do músculo esqueletal se tornassem ne-cróticas, se não houvesse nenhum tratamento adicional. No entanto, se tra-tado com AF-16 nenhuma síndrome do compartimento fechado se desenvol-veu, uma vez que inchaço reativo do tecido Iesionado e então a pressãodentro do compartimento puderam ser demonstrados com sensores de pres-são Samba quase voltar para o normal. Microscopia de luz de amostras domúsculo EDL confirmou que tratamento com AF-16 reduziu a extensão evolume do dano ao tecido, conforme comparado com aquele em tratamentocom veículo. Então, tratamento com AF-16 preveniu o desenvolvimento deuma CS, eventualmente reduzindo o dano e perda de tecido.

Exemplo N°. 9

Ratos adultos tinham experimentalmente uma condição de CCinduzida afetando o pericárdio e avaliada com relação a efeitos de tratamen-to com o peptídeo AF-16. A cavidade pericardial é delimitante do coração,formando um saco cheio com um volume mínimo de fluido, permitindo aco-modação dos movimentos deslizantes resultantes de contrações repentinase fortes do coração. A cavidade pericardial é em direção à sua periferia con-finada por uma membrana parietal rica em colágeno. Em ratos anestesiadoso pericárdio foi aberto cirurgicamente, através de uma "janela" pequena nodiafragma e mediastino. O interior do pericárdio foi traumatizado friccionan-do-o cirurgicamente através da incisão. Esses animais foram divididos emdois grupos, um tratado com AF-16 enquanto outro tinha apenas o veículo,PBS. Aqueles que tinham sido tratados com AF-16 por uma semana tinhamapenas pouco acúmulo de fluido em sua cavidade pericardial, em pressãobaixa. Em contraste, aqueles animais que após a fricção tinham sido trata-dos com o veículo tiveram seu pericárdio cheio com fluido sob pressão, etinham vários filamentos de fibrina adicionais e céluias inflamatórias. Adicio-nalmente, o envelope pericardial parietal ficou inchado, inflamado e infiltradopor vários vasos sangüíneos recém-formados em partes, aumentados.

O fígado, baço, rim e tireóide foram similarmente mecanicamentelesionados por compressão e expostos à abrasão. Tratamento com AF-16pôde também nesses casos ser demonstrado reduzir o edema e inchaçodessas estruturas, respectivamente, conforme comparado com aquele con-seguido em tratamento com veículo. Ainda a prevalência de ascites e tiposrelacionados de fluido extracelular excessivo em pressão elevada foi reduzi-da. Então AF-16 reduziu a extensão e gravidade da CS nos órgãos e tecidosparenquimatosos.

O desastre de CC, severamente perturbando funções cardíacas,era então menos propenso a se desenvolver nos animais tratados com AF.Então, AF-16 impediu o desenvolvimento de CS cardíaca. Os mesmos efei-tos benéficos do AF foram verdadeiros para as outras estruturas e órgãosparenquimais investigados.

Exemplo N°. 10

Os discos intervertebrais, que separam os corpos vertebrais naespinha, ajustam suas dimensões de acordo com a carga real muitas vezesem um dia. O teor de água no núcleo avascular polposo e o anel fibroso emum disco dependente do fornecimento de fluidos, íons, nutrientes e oxigêniode ligamentos adjacentes e das placas finais das vértebras (Cf. Holm e ou^tros, 2007). Vastos produtos de um disco avascular devem passar pelosmesmos obstáculos antes de atingir sistemas vasculares. Deste modo, roe-dores, coelhos e porcos foram avaliados com relação a efeitos de proteínaAF e de peptídeos AF com relação a efeitos sobre os discos intervertebraisquando carregados e não-carregados. Poderia ser demonstrado que trata-mento com AF-16 reduziu o inchaço e as reações inflamatórias de discosintervertebrais lesionados. Ainda, quando examinadas através de microsco-pia de luz seções tingidas preparadas de tais discos foram demonstradas tersofrido menos dano ao núcleo polposo em animais tratados com AF-16 bemcomo ter menos alterações reativas proeminentes, de outro modo esperadoser reconhecido no anel fibroso e nos Iigamentos confinados e tecido conec-tivo adjacente. Ainda, efeitos de AF e AF-16 após cargas supramaximaisbem como após um trauma a discos invertebrados revelaram que a rigidezdas conexões intervertebrais e a deformação induzida eram mais próximasdo normal após tratamento com AF-16 do que registrado após tratamentocom veículo. É então revelado que os compostos AF são benéficos na redu-ção do inchaço e dano a tecido em trauma ou deformação e/ou carga exces-siva sobre discos intervertebrados.

Exemplo N°. 11

Ratos adultos tinham tido CS experimentalmente induzida desen-volvida em estruturas definidas confinadas por um invólucro macio, tal comoum tendão e um nervo, investigados com relação a se AF-16 afetou seu des-tino. Nervos periféricos e autônomos são todos delimitados por um endoneu-ro, um perineuro e mais externamente um epineuro. Feixinhos de nervosmúltiplos formam um nervo (Cf. Hansson e outros, 1979). Tendões e algunsdos Iigamentos em um corpo são delimitados por uma estrutura tipo mem-brana de colágeno macia, a bainha sinovial. A camada de borda interna daúltima conecta o tendão com sua vagina sinovial, que permite deslizamentoem fricção mínima. A periferia da última estrutura é confinada por uma ca-mada tipo membrana, fibrosa, a vagina fibrosa. O paratendinium de confi-namento é em alguns locais mantido em posição e recebendo nutrição pormesotendões e por vínculos (Cf. Hansson e outros, 1980). Ainda, outro dis-positivo de lubrificação são as bursas, sacos fibrosos fechados tendo umapelícula fina ou fluido e que previne fricção e carga pesada contra e entreestruturas firmes adjacentes. Inchaço e edema devido à carga excessiva etrauma bem como inflamação danificam a estrutura e funcionamento de ner-vos periféricos, tendões e bursas.

Em ratos anestesiados o nervo ciático foi comprimido com o auxí-lio de fórceps especialmente projetado, conforme previamente descrito(Stemme e outros, 1985; Hansson e outros, 1987). Tal procedimento resul-tou não apenas em função e estrutura do nervo prejudicadas, mas tambémem circulação sangüínea e de Iinfo prejudicada, e causou inchaço do nervociático, o desenvolvimento de edema, que incluía estruturas adjacentes e deenvelopamento. A IFP ficou elevada, conforme avaliado pela inserção deuma sonda de medição de pressão de fibra óptica Samba no tecido afetado.Cada segundo rato foi tratado com AF-16 em dose alta, começando no mo-mento da lesão. Cada segundo de ratos identicamente tratados apenas re-cebeu o veículo. A pressão no perineuro foi determinada se elevar em umdia naqueles tratados apenas com o veículo, em concordância com o incha-ço macroscopicamente reconhecido e edema local, isto é, tendo desenvolvi-do uma CS. Em contraste, nervos ciáticos tratados com AF-16 mostraram teruma pressão intraneural que era geralmente levemente elevada ou próximadaquela medida em um nervo normal. Microscopia de luz de seções tingidasfinas de nervos ciáticos Iesionados confirmou que AF-16 reduziu a inflama-ção e o edema e a distorção de tecido.

Resultados similares foram obtidos quando tratando tendões Ie-sionados (Hansson, H.A. e outros, 1980) com AF-16, conforme comparadocom aqueles observados após administração de veículo. Aqueles tendo sidotratados com o veículo desenvolveram sinais de CS em contraste com aque-les tratados com AF e AF-16.

É concluído que AF-16 impede o desenvolvimento de uma CS

em uma lesão, por exemplo, um nervo, um tendão ou bursa.Exemplo N0.12

Durante a cirurgia e em um trauma artérias podem ser Iesiona-das, fazendo com que a parede vascular inche. Esses eventos vão resultarno desenvolvimento de IFP elevada na parede vascular, resultando em rea-ções inflamatórias e reconstrução (Hansson, Jennische & Skottner, 1987).Os ratos em um grupo tinham uma minibomba osmótica Alza pré-acionada,cheia com AF-16, implantada subcutaneamente, e conectada ao sítio de le-são com um tubo de silicone fino, que permitiu aplicação do peptídeo AF-16diretamente ao tecido traumatizado. Animais adicionais tiveram para compa-ração suas bombas cheias com o veículo. As artérias Iesionadas foram in-vestigadas ou 3, 5, 7 ou 14 dias depois. Vasos sangüíneos recuperados dosanimais tratados com veículo eram macios, tinham diâmetro externo maior eeram inchados. Em contraste, aqueles tratados com AF-16 foram reconheci-dos como menos inchados e inflamados. A taxa de patência foi maior paraaqueles tratados com AF-16 conforme comparado com aqueles expostos aveículo. Quando tingidos e seccionados os espécimes da artéria femoral fo-ram investigados após 14 dias era óbvio que aqueles dos ratos tratados comAF-16 mostraram menos dano e menos reações inflamatórias proeminentese menos alterações reativas extensivas tal como formação de uma neoínti-ma compreendendo células de músculo liso, conforme comparado com a-queles tratados apenas com o veículo. Ainda, o número de macrófagos, cé-lulas espumosas e linfócitos foi também reduzido pelo tratamento com AF-16. É concluído que AF-16 teve efeitos benéficos sobre a cicatrização devasos sangüíneos lesionados.

Exemplo N°. 13

Tumores, malignos bem como benignos, foram implantados sub-cutaneamente e intramuscularmente em roedores. Cada segundo animal,tendo tumores com um diâmetro variando de 10 mm a 15 mm, foi tratadocom proteínas de AF ou AF-16, sistemicamente com o auxílio de minibom-bas osmóticas Alzet subcutaneamente implantadas, através de injeções deAF-16 no ou dentro do tumor. Em outro experimento, o peptídeo AF-16 foiaplicado a partir de uma bomba 2001 Alzet implantada diretamente no e/oudentro do tumor com um tubo de silicone fino. Ratos adicionais tiveram aproteína AF induzida pela sua ração ou tendo AF em gema de ovo. Paracomparação, um número igual de ratos recebeu o mesmo tratamento, mascom o veículo. A pressão do fluido intersticial (IFP) no tumor bem como emsuas regiões adjacentes foi determinada com o auxilio de um sensor depressão de fibra de vidro Samba (diâmetro de 0,4 mm), com e sem um tubode proteção, bem como com um equipamento permitindo determinação dapressão do fluido intersticial pela técnica "wick" A IFP nos tumores nos ani-mais tratados com veículo foi significantemente elevada, em excesso de 12mm Hg. A IFP no tecido conectivo adjacente estava variando de 0 a 4 mmHg, mas poderia ocasionalmente ser negativa. Tumores na faixa de 10-15mm, e tratados com AF-16 conforme descrito acima, tiveram uma reduçãona IFP, que reduziu para geralmente 12 mm Hg ou menos. Ainda, AF-16reduziu a intensidade e extensão da reação inflamatória conforme avaliadopor microscopia de luz de seções finas tingidas, preparadas de espécimesfixados e processados.

Em experimentos paralelos realizados em roedores, efeitos bené-ficos puderam ser demonstrados no crescimento e espalhamento de tumo-res implantados tratados com gema de ovo enriquecida em proteínas de AF,conforme comparado com efeitos do veículo.

É concluído que diminuição da IFP em tumores é provável permi-tir microcirculação aperfeiçoada, deste moto tornando os arredores extrace-Iulares menos hipóxicos e promovendo penetração aperfeiçoada de fárma-cos antitumor, que serão também mais eficientemente distribuídos. É conclu-ído que a habilidade de AF-16 em reduzir a IFP em tumores vai permitir efi-cácia aperfeiçoada de tratamento com fármacos específicos. Ainda, terapiade radiação é provável de ser mais eficiente uma vez que a microcirculaçãoaperfeiçoada após tratamento com AF-16 vai aumentar os níveis de oxigêniono tecido exposto, deste modo promovendo a formação dos radicais livres,de importância-chave no impedimento do crescimento do tumor, eventual-mente resultando em morte maior de células de tumor. Tais efeitos de AF-16sobre a IFP são considerados contribuir para erradicação aperfeiçoada detumores, e permitir controle da disseminação em uma vítima.

Exemplo N0. 14

Efeitos de AF foram investigados ainda em células procarióticas,que são confinadas por uma parede celular complexa, deste modo permitin-do o desenvolvimento de pressão elevada devido a funções de membranaimpedidas. Isto foi feito em bactérias, que sintetizam e liberam em uma am-pla variedade de substâncias que podem causar dano a células de mamíferoe então a um corpo. Exemplos de tais produtos são pigmentos, enzimas etoxinas, que são transferidos através da membrana bacteriana externa parao ambiente extracelular. Inibição de tais atividades de membrana reduziriaou até mesmo bloquearia a transferência e/ou liberação de tais substânciaspatogênicas. A fim de investigar se o peptídeo AF-16 afetou a transferênciade produtos bacterianos de sua síntese na bactéria para seu ambiente, oexperimento que segue foi realizado. A bactéria Staphylococcus aureus, quesintetiza um pigmento amarelo, foi culturada da noite para o dia ou, ocasio-nalmente por 2 dias, na presença ou ausência do peptídeo AF-16. Após umdia ou dois a cultura bacteriana foi enxaguada, e então concentrada atravésde centrifugação. O pigmento amarelo formado pela Staphylococcus aureusfoi extraído das bactérias peletizadas, permeabilizadas, com metanol e aabsorção de luz determinada através de espectrometria. As culturas bacteri-anas cultivadas na presença de AF-16 tinham muito mais do pigmento ama-relo do que aquelas expostas só ao veículo, após correção dos valores me-didos para número de bactérias. Esses resultados inequivocamente demons-tram que tratamento com AF-16 abole a transferência e liberação de consti-tuintes formados nas bactérias para o ambiente.

É concluído que o experimento apresentado prova que AF-16influencia eficientemente o transporte de massa intracelular e liberação deprodutos de bactérias vivas.

Sumário e conclusões

Tratamento com o peptídeo de AF-16 aboliu ou pelo menos redu-ziu o desenvolvimento de pressões elevadas em compartimentos fechados.O tratamento com AF reduziu mais os sinais clínicos adversos em exposiçãoà carga excessiva, lesão, isquemia, agentes tóxicos, fármacos e em infec-ções. Se tratados com AF-16 a pressão em compartimentos fechados nãoaumentou para os níveis Iesionais esperados, como evidente se o animalfosse tratado com apenas o veículo. As condições patológicas tratadas nãoestavam relacionadas com qualquer abolição de condições hiper-secretoraspelas proteínas e peptídeos de AF. O efeito descrito da administração depeptídeos e proteínas de AF foi geralmente aparente dentro de uma hora edurou por várias horas. A resposta à administração de AF foi imediata e re-duziu os efeitos prejudiciais da pressão elevada em compartimentos fecha-dos consideravelmente. As proteínas e peptídeos AF então foram eficazesno tratamento de CS em um corpo vivo abolindo o desenvolvimento de umaCS fechada, de outro modo prejudicial para o funcionamento de tecido e ór-gão afetados. Uma pessoa versada na técnica compreende que uma norma-lização de pressão em um compartimento fechado facilita a administração deoutras preparações farmacêuticas, que têm como objetivo reduzir a causa depressão elevada e suas complicações, bem como direcionar esses agentesfarmacêuticos ao seu alvo.

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<110> Lantmânnen AS Faktor AB

<120> abordagem para o tratamento de síndrome do compartimento<130> PD53689PCOO

<160> 6

<170> FastSEQ for Windows Version A.0<210> 1<211> 16<212> PRT<213> Seqüência Artificial

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Claims

1. Uso de uma proteína anti-secretora, um derivado, homólogoe/ou fragmento da mesma, tendo atividade anti-secretora, e/ou um sal far-maceuticamente ativo da mesma, caracterizado pelo fato de ser para a fabri-cação de uma composição farmacêutica e/ou alimento medicinal para o tra-tamento e/ou prevenção da síndrome do compartimento.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a dita proteína anti-secretora consiste em uma seqüência de acordocom a fórmula que segueX1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5em queX1 é I, aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO:6, ou está ausente, X2 éH1 R ou Κ, X3 é S ou L, X4 é T ou A, X5 são aminoácidos 43-46, 43-51, 43-80 ou 43-163 da SEQ ID NO:6, ou está ausente.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a dita proteína anti-secretora compreende uma seqüência de amino-ácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a dita proteína anti-secretora é uma proteína com uma seqüência deaminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO:6 ou um homólogo, derivadoe/ou fragmento da mesma compreendendo aminoácidos 38-42 da SEQ ID NO:6.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a dita composição farmacêutica compreende duas ou mais proteínasanti-secretoras selecionadas das proteínas como definidas em qualquer umadas reivindicações 1 a 4.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que a dita proteína anti-secretora é provida emgema de ovo enriquecida em tal proteína anti-secretora.

7. Uso de acordo com-qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica compreendeainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica é formuladapara administração em uma cavidade do corpo, intra-ocularmente, intrana-salmente, oralmente, localmente, cutaneamente, subcutaneamente, intra-muscularmente e/ou sistemicamente.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8,caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica é formuladapara administração como um spray, aerossol, inalador ou através de um ne-bulizador.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9,caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica e/ou alimentomedicinal é formulado para administração sistemicamente ao sangue emuma dose de 0,1 pg a 10 mg por aplicação e kg de peso do corpo e dia, depreferência 1-1000 pg por aplicação e kg de peso do corpo e dia.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10,caracterizado pelo fato de que a dita administração é realizada ou como umadose única ou como aplicações diárias múltiplas.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11,caracterizado pelo fato de que a dita síndrome causa inchaço anormal dee/ou acúmulo de fluido em células, tecidos e/ou órgãos.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato de que a dita síndrome é causada por um micróbioou por uma infecção viral.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato de que a dita infecção viral é causada por um vírus de RNA e/ou vírusde DNA.

15. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato de que o dito micróbio é selecionado do grupo que consiste de Protista1Protozoário, verme, fungo e bactéria.

16. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato de que a dita bactéria é selecionada do grupo consistindo em Mycobac-teria, Pseudomonas, Cocci, Chlamydia, Brucella e Listeria.

17. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato de que o dito micróbio libera uma ou mais enzimas, toxinas e/ou pig-mentos e/ou induz a formação e/ou liberação de um ou mais fatores reativospor uma célula, tecido e/ou órgão adjacente.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato de que a dita síndrome é causada por um príon.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato de que a dita síndrome é causada por carga anormal,lesão e/ou doença relacionada a um constituinte do trato urogenital comoglândula, músculo, bursa, nervo, vaso sangüíneo, junta e/ou tendão ou atra-vés de um fármaco e/ou medida terapêutica ou de diagnostico, ou por umacarga anormal, transporte e/ou acúmulo de produtos em uma célula, tecidoou órgão, ou por uma carga excessiva, lesão, hemorragias no crânio, no cé-rebro, na espinha dorsal, medula espinhal, de aneurismas, derrame e/ouisquemia, ou por uma tamponada de um órgão e/ou estrutura encerrado poruma cápsula, uma fáscia e/ou uma membrana, ou por uma tamponada dapele, coração, rim, testículos, ovário, glândula e/ou órgão linfóide, ou poruma tamponada de um órgão ou estrutura encerrado por um osso, cartila-gem e/ou uma membrana, ou por um tumor benigno e/ou maligno presenteem um corpo, ou por uma reação imune e/ou por um composto tóxico.

20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato de que é para a melhora da eficácia da terapia docâncer através da diminuição da pressão intersticial.

21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato de que a dita síndrome causa dano a um ou maisdiscos intervertebrais.

22. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato de que a dita síndrome causa isquemia.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato de que a dita síndrome causa uma função anormaldo cérebro e medula espinhal.