BRPI0711767A2 - composições e métodos para a liberação de óxido nìtrico - Google Patents

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Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS PARA A LIBERAçãO DE óXIDO NìTRICO Proteínas H-NOX são mutadas para exibir propriedadescinéticas e termodinâmicas aumentadas ou ideais for liberação sangúínea de gás NO. As proteínas H-NOX projetadas compreendem mutações que transmitem ligação de ligante de O~ 2~ ou NO alterada em relação ao domínio de H-NOX do tipo selvagem correspondente, e são operacionais como transportadores sangúíneos de gás NO em mamíferos fisiologicamente compatíveis. A invenção também fornece composições farmacêuticas, kits e métodos que utilizam proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes para o tratamento de qualquer condição para a qual a liberação de NO seja benéfica.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA A LIBERAÇÃO DE OXIDO NÍTRICO
'Este pedido reivindica o benefício de pedido provisório U.S. Número de série, depositado em 22 de maio de 2006 por Michael A. Marietta, Stephen P.L. Cary, Elizabeth M. Boon, e Jonathan A. Winger, intitulado "Engineering H-NOX Proteins for Therapeutic Nitric Oxide and Oxygen Delivery" (Caso UC N0 B06-084). Esse pedido provisório U.S.foi convertido a partir de pedido de utilidade U.S. número de série 11/440.588, depositado em 22 de maior de 2006, para um pedido provisório em 1 de maio de 2007, cujas revelações são aqui incorporadas em suas totalidades por referência.
Declaração com relação a pesquisa ou desenvolvimento patrocinado pelo Governo Federal
Esse trabalho foi apoiado pela Concessão No. DE-AC03- 7 6SF. O Governo dos Estados Unidos da América pode ter direitos em qualquer emissão de patente nesse pedido. Campo técnico
Esse pedido pertence a proteínas H-NOX e métodos de uso delas para liberar óxido nítrico (NO) . Proteínas H-NOX fornecem uma nova ferramenta terapêutica para liberação de NO a humanos e, para objetivos veterinários, a animais.
Fundamento da invenção
NO age como um mensageiro químico no controle de vários processos importantes in vivo, que incluem vasodilatação, neurotransmissão, inflamação, agregação plaquetária, e regulação do tônus do músculo liso gastrointestinal e vascular. Desde a descoberta em 1867 pelos Drs. Lauder Brunton e William Murrell de que a nitroglicerina (GTN) é capaz de tratar condições de doença cardíaca como angina pectoris, nitratos orgânicos têm sido amplamente usados para tratar casos agudos de vasoconstricção. Nas últimas décadas, o mecanismo de vasodilatação foi elucidado. NO, que é sintetizado em células endoteliais, se difunde para células de músculo liso e ativa guanilato ciclase (sGC) solúvel para produzir GMP cíclico, e assim induzir a vasodilatação. Então presume-se que o mecanismo clínico de ação de nitratos orgânicos, necessite de sua biotransformação a NO e subseqüente ativação de sGC. No entanto, nitratos orgânicos deixam de ser efeicazes em pacientes após 24-48 horas, devido a um fenômeno chamado tolerância. Portanto, para tratamento de casos crônicos de hipertensão, compostos como n-bloqueadores e inibidores de ACE são usados, embora eles tenham limitações e efeitos colaterais. Portanto, nitrovasodilatores são mais úteis no tratamento de situações agudas em que a rápida vasodilatação é necessária para aliviar sintomas como angina e infarto do miocárdio. A administração prolongada de nitratos orgânicos resulta em eficácia reduzida, e a vasculatura torna-se não responsiva; essa tolerância evita seu uso adicional em casos agudos e crônicos. Portanto, para tratamento agudo, uso não contínuo de nitrovasodilator é empregado com efeito limitado. Para casos crônicos de vasoconstricção, outros modos de tratamento são empregados, tipicamente usando um regime misto de nitratos orgânicos e medicações para pressão sangüínea independente de NO, com sucesso misto.
Duas teorias conflitantes principais sobre o mecanismo de tolerância correm em paralelo à pesquisa pelo mecanismo de biotransformação de nitratos que leva ã liberação de NO. devido ao fato de acreditar-se que NO seja o mediador dos efeitos vasodilatadores de nitratos orgânicos, o mecanismo de liberação de NO de nitratos orgânicos por tornar-se inibido, resultando em tolerância. Mas como os nitratos orgânicos liberam metabolicamente NO em tecidos não é compreendido. Além disso, a teoria com base em mecanismo para tolerância é problemática porque a tolerância também reduz a eficácia de gás de NO endógeno e NO exógeno na mediação da vasodilatação. Portanto, o mecanismo de biotransformação de nitratos orgânicos parece ser separado da razão para tolerância. Uma teoria conflitante postula que a resposta a NO de nitratos orgânicos torna-se deprimida no tecido alvo, talvez porque a geração de NO e os subprodutos da reação inibam a resposta a NO, ou porque a ativação aguda da via de NO tenha um mecanismo de feedback que a dessensibilize a um estímulo adicional. Essa teoria é conhecida como tolerância "end-organ". Recentemente, uma teoria unificadora foi proposta que inclui aspectos da biotransformação de nitratos orgânicos bem como as dessensibilização "end-organ" a NO. Essencialmente, a biotransformação de nitratos orgânicos parece resultar em maiores níveis de superóxido (O2) em tecidos. Superóxido reage na taxa de difusão com NO para produzir peroxinitrito (00N0). Essa reação aprisiona e destrói NO basal, evitando que el ative sGC. Níveis reduzidos de NO levam a vasoconstricção, e 00N0" é um poderoso oxidante que danifica os tecidos. 0 tratamento prolongado com nitratos orgânicos como GTN pode resultar em hipertensão e dano tecidual em pacientes, e esse pode ser moderado com co-administração de antioxidantes como ascorbato. Portanto, um melhor terápico para a liberação de NO aos órgãos e tecidos para aliviar a vasoconstricção é um grande objetivo terapêutico.
Alguma pesquisa tem sido conduzida sobre o uso de transportadores com base em hemoglobina para liberar NO. No entanto, transportadores com base em hemoglobina são limitados devido a sua reatividade com NO na presença de O2, o que leva à inativação de transportadores com base em hemoglobina. 0 NO reage diretamente com o O2 que está ligado à hemoglobina para formar metemoglobina e nitrato. Tanto o ferro de heme quanto o NO ficam oxidados pelos átomos ligados de oxigênio, e a reação ocorre tão rapidamente que não se observa nenhuma substituição de O2 por NO (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.455.676).
Como o NO é produzido e consumido continuamente, há um turnover natural de NO in vivo. Quando se administra hemoglobina sem células, o equilíbrio entre a produção e o consumo de NO é alterada por reações com a hemoglobina sem células. A reação oxidativa entre NO e O2 ligado à hemoglobina é irreversível, causando a destruição de NO, O2 e hemoglobina. A ligação de NO à hemoglobina sem O2 ligado é eficazmente irreversível no contexto fisiológico, na medida em que a meia-vida para a dissociação de nitrosil- hemoglobina é de 5-6 horas inativando eficazmente, dessa forma, hemoglobina como um transportador de O2 sem células.
Após uma molécula de NO reagir com a hemoglobina, ela é eliminada do pool de moléculas sinalizadoras causando, dessa forma, certas condições adversas. Por exemplo, a ligação do NO à hemoglobina (com ou sem O2 ligado) pode evitar o relaxamento vascular e potencialmente leva à hipertensão, a qual é observada algumas vezes após a administração de certas soluções de hemoglobina extracelular.
O NO também é necessário para mediar certas respostas inflamatórias. Por exemplo, o NO produzido pelo êndotélio inibe a agregação plaquetária. Conseqüentemente, na medida em que o NO está ligado por hemoglobina sem célula (com ou sem O2 ligado), a agregação plaquetária pode aumentar. À medida que as plaquetas se agregam, elas liberam compostos vasoconstrictores potentes como, por exemplo, tromboxano A2 e serotonina. Esses compostos podem atuar sinergicamente com os níveis reduzidos de NO causados pela remoção de hemoglobina para produzir uma vasoconstricção significativa. Além de inibir a agregação plaquetária, o NO também inibe a adesão de neutrófilos às paredes celulares, o que, por sua vez, pode causar lesão da parede celular. Foi observado dano da parede endotelial com a infusão de certas soluções de hemoglobina. Transportadores com base em hemoglobina são também prejudicados pelo rápido clearance de hemoglobina sem células do plasma devido à presença de receptores para hemoglobina que removem hemoglobina sem células do plasma. Hemoglobina sem célula também pode causar toxicidade renal, possivelmente em conseqüência da depleção de NO nos glomérulos, causando constrição e subseqüente disfunção.
Em função das limitações das terapias vasodilatadoras, permanece um interesse significativo em terapias adicionais ou alternativas para a liberação de NO. Em particular, são desejados transportadores de NO que produzam menos tolerância. Adicionalmente, são desejados transportadores de NO com uma baixa taxa de inativação por NO na presença de O2, como transportadores de NO que tenhma uma baixa reatividade de NO e/ou uma baixa afinidade por O2. Também são necessários transportadores de oxigênio com constantes de dissociação ou taxas inferiores para ligação de O2 que sejam adequadas para aplicações clínicas ou industriais específicas.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção se baseia, em parte, na descoberta surpreendente de que proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes possuem uma reatividade ao NO bem menor do que a hemoglobina e, dessa forma, são transportadores de NO desejáveis. Se desejadas, podem ser introduzidas mutações nas proteínas H-NOX para alterar sua ligação de O2 e ligantes de NO para otimizar ainda mais o uso de proteínas H-NOX como transportadores de NO. Em algumas modalidades, o uso de uma proteína H-NOX como um transportador de NO produz menos tolerância que o uso de vasodilatadores atuais, como nitratos orgânicos.
Em um aspecto, a invenção apresenta proteínas H-NOX mutantes. Conseqüentemente, em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína H-NOX isolada que possui pelo menos uma mutação que altera o NO, a constante de dissociação ou a reatividade ao NO, comparada com a de uma proteína H-NOX do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX mutante está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades, a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é pelo menos 100 vezes menor que aquela da hemoglobina, como pelo menos 1.000 vezes menor que aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades, a koff, Ki, ou K2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ 10^-4 s-1 a cerca de 10 s-1 a 37°C como cerca de 1x 10^-4 s"1 a cerca de 0,012 s"1 ou cerca de Ix IO"4 s"1 a cerca de Ix 10^-3 s-1 a 37 °C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é entre cerca de 1 μΜ a 37°C, como pelo menos cerca de 10 μΜ ou pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C.
Em algumas modalidades, a invenção apresenta uma proteína H-NOX isolada que possui pelo menos uma mutação que altera a koff, K1, ou K2 para NO ou altera a constante de dissociação de 02 comparada com aquela de uma proteína H-NOX do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a koff, K1, ou K2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ 10^-4 s-1 a cerca de 10 s-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37 °C. Em algumas modalidades, a k0ff, Ki, ou K2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ 10^-4 s-1 a cerca de 0,012 s"1 ou cerca de 1x 10^-4 s-1 a cerca de 1x 10^-3 s-1 a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 10 μΜ como pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C. Em algumas modalidades, a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina, como pelo menos 100 vezes menor que aquela da hemoglobina ou pelo menos l.0000 vezes menor que aquela da hemoglobina.
Em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína H-NOX isolada selecionada do grupo que consiste em H-NOX I5A de T. t engcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y14 0L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R13 5Q de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0H de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, L2 F9W-F142Y, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, β1(1-385); βΐ(1-385) I145Y, βΐ(1-385) I145H, β1(1-194), β1(1-194) Ι145Υ, βΐ(1-194) L9W-I145Y, β2(1-217), β2(1-217) Ι142Υ, H- NOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(l-183) de C. acetobutylicum, e H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans. Em algumas modalidades, a proteína β1 ou β2 ê derivada de uma proteína β1 ou β2 de R. norvegicus ou H. sapiens.
Em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína H-NOX isolada selecionada do grupo que consiste em H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de Τ. tengcongensis, H-NOX W9N de Τ. tengcongensis, H- NOX W9H de Τ. tengcongensis, H-NOX N74E de Τ. tengcongensis, H-NOX N74A de Τ. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0A de T. tengcongensis, I75F- His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F- His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 F9W- F142Y de L. pneumophilia, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, βΐ(1-385) I145H, βΐ(1-194), βΐ(1-194) Ι145Υ, βΐ(1-194) L9W-I145Y, β2(1-217), β2(1-217)1142Υ, Η-ΝΟΧ(1-175) de C. botulinum, H- NOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX(1-197) de C. a.cetobutylicum, H-NOX (1-183) de C. acetobutylicum e H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans. Em algumas modalidades, a proteína βΐ ou β2 é derivada de uma proteína βΐ ou β2 de R. norvegicus ou H. sapiens.
Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está entre 0,1 a 10 vezes aquela da hemoglobina, como entre 0,5 a 2 vezes aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens, como uma constante de dissociação de NO entre 0,1 a 10 vezes ou entre 0,5 a 2 vezes aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens, como pelo menos 100 vezes ou 1.000 vezes menor que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s-1 a 20°C, como menos que cerca de 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s- 1,100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 5 s-1, 3 s" 1, 2 s-1, 1,8 s-1, 1,5 s-1, 1,2 s-1, 1,0 s-1, 0,8 s-1, 0,7 s-1 ou 0,6 s"1 a 20°C. Em algumas modalidades das proteínas H- NOX isoladas, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, como pelo menos cerca de 10 μΜ ou pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a kQff, K1, ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 a cerca de 10 s-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a k0ff, K1, ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 a cerca de 10 s-1 a 37°C, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s-1 a 20°C (por exemplo, menos que cerca de 600 s"1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 ou 1,8 s-1 a 20°C). Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de de 1 μΜ a 37°C, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s-1 a 20°C (por exemplo, menos que cerca de 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 ou 1,8 s-1 a 20°C) . Em algumas modalidades, a taxa de auto-oxidação de heme da proteína H-NOX mutante é de menos do que cerca de 1 h-1 a 3 7 ° C. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a koff, K1, ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 a cerca de 10 s"1 a 37°C, e a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de h"1 37°C. Em algumas modalidades das proteínas H- NOX isoladas, a constante de dissociaçao de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e a taxa de auto- oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C, e a reatividade de NO da proteína H- NOX é de menos que cerca de 700 s"1 a 20°C (por exemplo, menos que cerca de 600 s"1, 500 s"1, 100 s"1, 20 s"1 ou 1,8 s" 1 a 20°C) .
Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX contém uma ou mais mutações (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações) comparada com a proteína H-NOX da qual foi derivada. Em várias modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX contém menos de 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 mutações, comparada com a proteína H-NOX da qual foi derivada. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação da bolsa distai. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação que não está na bolsa distai. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação na qual um resíduo que corresponde a Tyrl40 de T. tengcongensis H-NOX ou Phe 142 de L. pneumophila 2 é substituído por qualquer outro aminoácido.
Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos duas mutações, em que pelo menos uma mutação é a substituição de um resíduo que corresponde a Tyrl4 0 de T. tengcongensis H-NOX ou Phel42 de L. pneumophila 2 por qualquer outro aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação na proteína H-NOX corresponde a uma mutação de Y14 0F ou uma mutação de Y140L de T. tengcongensis ou ou uma mutação F142Y de L. pneumophila 2. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, pelo menos um aminoácido C- terminal (como pelo menos cerca de 50 aminoácidos C- terminais contíguos ou entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos C-terminais contíguos) na proteína H-NOX foram removidos comparado à proteína de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é uma deleção que contém os primeiros 194, 217, ou 3 85 aminoácidos de uma proteína H-NOX como proteína βΐ ou β2 de R. norvegicus ou H. sapiens.
Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX é derivada de uma proteína de mamífero (por exemplo, uma proteína humana como, por exemplo, β1). Em várias modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX é derivada de uma proteína bacteriana (por exemplo, uma proteína de T. tengcongensis) . Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção, por exemplo, polietileno glicol. Heme pode ou não estar ligado à proteína H-NOX. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, NO está ligado à proteína H-NOX. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX é uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana).
Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, ou L. pneumophilia 2 H-NOX F142Y. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis.
Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX de tipo selvagem de L. pneumophilia, βΐ H-NOX de tipo selvagem de H. sapiens, sGC β1 (1-385) de R. norvegicus, β1 H-NOX de tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ H-NOX de tipo selvagem de D. mela.nga.ster, CG14 8 85-PA H-NOX de tipo selvagem de D. melangaster, GCY-35 H-NOX de tipo selvagem de C. elegans, H-NOX de tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX de tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX de tipo selvagem de S. oneidensis, ou H- NOX de tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T. tengcongensis, sGC β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC β1 HNOX H105F de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX I145Y de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX C7 8S de R. norvegicus, ou sGC β1 H-NOX C78E de R. norvegicus. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é β2(1-217) de R. norvegicus, β1 (1-194) de R. norvegicus, β1(1-385) de R. norvegicus, ou β1 (1-385)I145Y de R. norvegicus. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis ou βΐ H-NOX (1-385) I145Y de H. sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y140H de T. tengcongensis, β1 114 OY de H. sapiens ou β1 114 5Y de H. sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T. tengcongensis, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, 2 H-NOX F14 2Y de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, ß1 H-NOX I140Y de H. sapiens, ß1 I145Y de H. sapiens, ß1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, sGC ß1 H- NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC ß1 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC ß1 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC ß1 H-NOX H105F de R. norvegicus, ß1 H-NOX I145Y de R. norvegicus sGC, ß1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, ß1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG 14885-PA H-NOX do tipo selvagem D. melanogaster, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis ou H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas pelo nome de seu gene, seguido pela abreviatura de sua espécie e Identificadores no Genbank (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007) : Npun59 05_Npu_2312 960 6 , alr2278_Ana_17229770, S02144_Sone_24373702, Mdegl343_Mde_23027521, VCA0720_Vch_15601476, CC2 9 92_Ccr_1612 7222, Rsph2043_Rhsp_22958463 (gi: 46192757), Mmcl073 9_Mcsp_22 99902 0 , Tar4_Tte_2 08 0 716 9, Ddes2822_Dde_23475919, CAC3 243_Cac_15896488, gcy- 31 Ce 17568389, CG14885 Dm 24647455, GUCY1B3 Hs 4504215, HpGCS-betal_Hpul_14245738 ,Gycbetal00B_Dm_24 6 5157 7 , CG415 4_Dm_2 4 64 6 993 (gi: NP_650424.2, gi: 62484298), gcy- 32_Ce_13539160, gcy-36_Ce_17568391 (gi: 32566352, gi: 86564713),gcy-35_Ce-17507861(gi:71990146), gcy-3 7_Ce_17 54 0 904 (gi: 71985505), GCYla3_Hs_2 053 56 03, GCYla2-Hs_899477 OU GYCa99B_Dm_7 2 92 7 0 (gi: 68067738) (Lakshminarayan e cols. (2003), "Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins" , BMG Genomics 4: 513). As abreviações de espécies usadas nesses nomes incluem: Ana = Anabaena Sp; Ccr = Caulobacter crescentus; Cac = Clostridium acetobutylicum; Dde = Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp = Magnetococcus sp. ; Mde = Mierobulbifer degradans; Npu = Nostoe punetiforme; Rhsp = Rhodobaeter sphaeroides; Sone = Shewanella oneidensis; Tte = Thermoanaerobaeter tengeongensis; Vch = Vibrio eholerae; Ce = Caenorhabditis elegans; Dm = Drosophila melanogaster; Hpul - Hemieentrotus puleherrimus; Hs = Homo sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas por seu nome do organismo e número de acesso na base de dados Pfam (por exemplo, as seqüências de proteínas seguintes disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 17 de maio de 2007; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007): Caenorhabditis briggsae Q622M5_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61P44_CAEBR,Caenorhabditis briggsae Q61R54_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61V9 0_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61A94_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60TP4_CAEBR,Caenorhabditis briggsae Q6OMl0_CAEBR,Caenorhabditis elegans GCY37 -CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY31_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY36_CAEEL,Caenorhabditis elegansGCY3 2_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY35_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 4_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 3_CAEEL, Oryzias curvinotus Q7T04ü_ORYCU, Oryzias curvinotus Q7 5WFO_ORYCU, Oryzias latipes P79998 JDRYLA, Oryzias latipes Q7ZSZ5_ORYLA, Tetraodon nigroviridis Q4SW38_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4RZ94_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4 S 6 K5_TETNG, Fugru rubripes Q90VY5_ FUGRU, Xenopus laevis Q6INK9_XENLA, Homo sapiens Q5T8 J7_HUMAN, Homo sapiens GCYA2_HUMAN, Homo sapiens GCYB2_HUMAN, Homo sapiens GCYB1_HUMAN, Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM, Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY, Pan troglodytes Q9N192_PANTR, Macaca mulatta Q9N194_MACMU, Hylobates lar Q9N191_HYLLA, Mus musculus Q8BXH3_MOUSE, Mus musculus GCYB1_M0USE, Mus musculus Q3UTI4_MOUSE, Mus musculus Q3UH83_MOUSE, Mus musculus Q6XE4l_MOUSE, Mus musculus Q80YP4_MOUSE, Rattus norvegicus Q80WX7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX8_RAT, Rattus norvegicus Q920Q1_RAT, Rattus norvegicus Q54A4 3_RAT, Rattus norvegicus Q8 0WY0_RAT, Rattus norvegicus Q80WY4_RAT, Rattus norvegicus Q8CH85_RATf Rattus norvegicus Q80WY5_RAT, Rattus norvegicus GCYB1_RAT, Rattus norvegicus Q8CH90_RAT, Rattus norvegicus Q91XJ7_RAT( Rattus norvegicus Q80WX9_RAT, Rattus norvegicus GCYB2_RAT, Rattus norvegicus GCYA2_RAT, Canis familiaris Q4ZHR9_CANFA, Bos taurus GCYB1_B0VIN, Sus scrofa Q4ZHR7_PIG, Gryllus bimaculatus Q59HN5_GRYBI, Manduca sexta 077106_MANSE; Manduca sexta 076340_MANSE; Apis mellifera Q5UAF0_APIME, Apis mellifera Q5FAN0_APIME, Apis mellifera Q6L5L6_APIME, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PYK9_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7Q9W6_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7QF3I_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PS01_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae Q7KQ93_ANOGA, Drosophila melanogaster Q24 086_DROME, Drosophila melanogaster GCYH_DROME, Drosophila melanogaster GCY8E_DROME, Drosophila melanogaster GCYDAJDROME,
Drosophila melanogaster GCYDB_DROME, Drosophila melanogaster Q9VA09_DRC)ME, Drosophila pseudoobscura Q29CE1_DR0PS, Drosophila pseudoobscura Q296C7__DROPS, Drosophila pseudoobscura Q2 96C8_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q29BU7_DROPS, Aplysia californica Q7YWK7_APLCA, Hemicentrotus pulcherrimus Q95NK5_HEMPU, Chlamydomonas reinhardtii, Q5YLC2_CHLRE, Anabaena sp Q 8 YUQ 7_ANAS P, Flavobacteria bacterium BBFL7 Q26GR8_9BACT, Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLA0, 15 proteobactéria marinha gama HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM, proteobactéria marinha gama HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM, Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCR, Acidiphilium cryptum JF-5 Q2DG60_ACICY, Rhodobacter sphaeroides Q3JOU9_RHOS4, Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILP0, Paracoccus denitrificans PD1222, Q3PC67_PARDE, Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB, Jannaschia sp Q28ML8_JANSC, Magnetococcus sp MC-I Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL, Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X2 6 8_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3, Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT, Shewanella oneidensis Q8EF4 9_SHE0N, Saccharophagus degradans Q21E2 0_SACD2, Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR, Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio alginolyticus 12G01 Q1VCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722 Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolyticus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fischeri Q5EIF5_VIBF1, Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY, Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH, Oceanospirillum sp MED92 Q2BKV0_9GAMM, Oceanobacter sp RED65 Q1N035_9GAMM, Desulfovibrio desulfuricans Q310U7_DESDG, Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM, Thermoanaerobacter tengcongensis Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8 903 Q2ZH17_CALSA, Clostridium acetobutylicum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT,
Clostridium tetani Q899J9_CLOTE e Clostridium beijerincki NCIMB 8052 Q2WVNO_CLOSE. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é sGC βΐ H- NOX C78S de R. norvegicus ou sGC βΐ H-NOX C78E de R. norvegicus. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não possui uma mutação no motivo Y-S-R, que inclui Tyrl35, Serl37 e Argl39 de H-NOX humana.
Em um aspecto, a invenção apresenta um ácido nucléico recombinante que codifica qualquer uma ou mais das proteínas H-NOX mutantes aqui descritas. Em modalidades particulares, o ácido nucléico inclui um segmento ou toda a seqüência de ácidos nucléicos de qualquer um dos ácidos nucléicos mostrados nas FIGS. 2-4D ou 8A-8DD. Em algumas modalidades, o ácido nucléico codifica uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana). Em algumas modalidades, o ácido nucléico inclui pelo menos cerca de 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, ou mais nucleotídeos contíguos de um ácido nucléico de H-NOX e contém uma ou mais mutações (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações), comparado com o ácido nucléico de H-NOX do qual foi derivado. Em várias modalidades, um ácido nucléico de H-NOX mutante contém menos do que cerca de qualquer uma de 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 mutações, comparado com o ácido nucléico de H-NOX do qual foi derivado. A invenção também apresenta variantes degeneradas de qualquer ácido nucléico que codifica uma proteína H-NOX mutante.
Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um vetor que inclui qualquer um ou mais dos ácidos nucléicos de H- NOX mutantes aqui descritos. Em outro aspecto, a invenção apresenta uma célula que inclui qualquer um ou mais dos ácidos nucléicos de H-NOX mutantes aqui descritos. Em um aspecto, a invenção apresenta uma célula que inclui qualquer vetor aqui descrito.
Em um aspecto, a invenção apresenta um método de produção de uma proteína H-NOX. Esse método envolve o cultivo de uma célula que possui um ácido nucléico que codifica qualquer uma ou mais das proteínas H-NOX mutantes aqui descritas, sob condições adequadas à produção da proteína H-NOX mutante. Em algumas modalidades, a invenção ainda inclui a etapa de purificação da proteína H-NOX mutante.
Em um aspecto, a invenção apresenta composições farmacêuticas que incluem uma ou mais proteínas H-NOX, como qualquer uma das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes aqui descritas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui uma quantidade farmaceuticamente aceitável de uma proteína H-NOX aqui descrita e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a koff, k1 ou k2 para NO da proteína H- NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 a cerca de 10 s-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina.
Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens, como uma constante de dissociação de NO entre 0,1 a 10 vezes ou entre 0,5 a 2 vezes a da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a reatividade ao NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor do que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens como, por exemplo, pelo menos 100 vezes ou 1.000 vezes menor do que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX é uma proteína do tipo selvagem. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX é uma proteína mutante aqui descrita. Em várias modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a kDff para NO, a kl para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade ao NO, a reatividade de NO a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de duas ou mais das citadas anteriormente, comparada com a de uma proteína do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L- P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H- NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y14 0H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y14 OF de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y4 0L de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de G. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfuricans, H-NOX (728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, B1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, B1 I145Y de H. sapiens, B1 (1-385) de H. sapiens, ß1(1-385) 1145Y de H. sapiens, B1 (1-385) I145H de H. sapiens, B1(1-194) de H. sapiens, B1(1-194) I145Y de H. sapiens, B1(1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, ß2(1-217) de H. sapiens, β2(1-217) Ι142Υ de Η. sapiens, β1 H-NOX H105G de Η. sapiens, β1 H-NOX H105F de Η. sapiens, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ(1-385) de R. norvegicus, β1(1-385) I145Y de R. norvegicus, β1(1-385) I145H de R.
norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, βΐ(1-194) I145Y de R. norvegicus, β1 (1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2(1- 217) de R. norvegicus, β2 (1-217) I142Y de R. norvegicus, β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105F de R. norvegicus, H-NOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(l-183) de C. acetobutylicum, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster; H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus; H-NOX do tipo selvagem de X. laevis, H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-37 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a composição farmacêutica inclui um ou mais lipossomos ou nanoparticulas que incluem ou encapsulam a proteína H-NOX.
Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H- NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, ou H-NOX F142Y de L. pneumophilia 2. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX de tipo selvagem de L. pneumophilia, βΐ H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, sGC β1 H-NOX (1-385)de R. norvegicus, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster H-NOX7 GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis ou H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, sGC βΐ H- NOX H105G de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX H 105F de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX I145Y de R. norvegicus, sGC H-NOX C78S de R. norvegicus, ou sGC β1 H-NOX C78E de R. norvegicus. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é β2(1-217) de R. norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, β1(1-385) de R. norvegicus, ou ß1 (1-385) I145Y de R. norvegicus. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T. tengcongensis ou ß1 H-NOX (1-385) I145Y de H sapiens. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y14 0H de T. tengcongensis, ß1 I140Y de H. sapiens ou ß1 I145Y de H. sapiens. Em algumas modalidades composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX de tipo selvagem de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, ß1 H-NOX I140Y de H. sapiens, ß1 I145Y de H. sapiens, ß1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, sGC ß1 H-NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC ß1 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC ß1 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC ß1 H-NOX H105F de R. norvegicus, ß1 H-NOX I145Y de R. norvegicus sGC, ß1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, ß1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG 14885-PA H-NOX do tipo selvagem D. melanogaster, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. puncti forme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis ou H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas pelo nome de seu gene, seguido pela abreviatura de sua espécie e Identificadores no Genbank (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 21 de maio de 2 0 07; ou 22 de maio de 2007) : Npun5905_Npu_2312 96 06, alr2278_Ana_17229770 ,
S02144_Sone_24 3 73 7 02 , Mdegl343_Mde_2302 7521,
VCA0720_Vch_15 60147 6 , CC2992_Ccr_16127222,
Rsph2 0 4 3_Rhsp_2 2 9584 63 (gi: 46192757),
Mmcl073 9_Mcsp_22999020, Tar4_Tte_2 08 0 716 9,
DdeS2822_Dde_234 7 5 919, CAC3243_Cac_15896488, gcy-
3l_Ce_l7 5 6 83 8 9, CG14885_Dm_24647455, GUCYlB3_Hs_4504215, HpGCS-betal_Hpul_14 24 5 7 3 8, Gycbetal0 0B_Dm_2 4651577,
CG415 4_Dm_2 4 64 6 993 (gi: NP_650424.2, gi: 62484298), gcy- 32_Ce 13539160, gcy-36_Ce_17568391 (gi: 32566352, gi: 86564713), gcy-35_Ce-17507861 (gi: 71990146), gcy- 37_Ce_l754 0 904(gi: 71985505), GCYla3_Hs_20535603,
GCYla2-Hs_8 9 9477 ou GYCa-99B_Dm_729270 (gi: 68067738) (Lakshminarayan e cols. (2003), "Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins", BMG Genomics 4: 5-13). As abreviações de espécies usadas nesses nomes incluem: Ana = Anabaena Sp; Ccr = Caulobacter crescentus; Cac = Clostridium acetobutylicum; Dde = Desulfovibrio desulfurieans; Mcsp = Magnetococcus sp. ; Mde = Mierobulbifer degradans,- Npu = Nostoe punetiforme; Rhsp = Rhodobaeter sphaeroides; Sone = Shewanella oneidensis; Tte = Thermoanaerobacter tengeongensis; Veh = Vibrio eholerae; Ce = Caenorhabditis elegans; Dm = Drosophila melanogaster; Hpul = Hemieentrotus puleherrimus; Hs = Homo sapiens. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é sGC βΐ H- NOX C78S de R. norvegieus ou sGC βΐ H-NOX C78E de R. norvegieus. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas por seu nome do organismo e número de acesso na base de dados Pfam (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2 006; 22 de maio de 2006; 17 de maio de 2007; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007) : Caenorhabditis briggsae Q622M5_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61P44_CAEBR, Caenorhabditis briggsae
Q61R54_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61V90_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61A94_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60TP4_CAEBR,Caenorhabditis briggsae Q6 0M10_CAEBR,Caenorhabditis elegans GCY3 7_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY31_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 6__CAEEL,Caenorhabditis elegans GCY3 2_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY35_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 4_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 3_CAEEL, Oryzias curvinotus Q7T04 0_C>RYCU, Oryzias curvinotus Ql5 WFO_ORYCU, Oryzias latipes P7 9998_ORYLA, Oryzias latipes Q7ZSZ5_ORYLA,, Tetraodon nigroviridis Q4SW38_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4RZ94_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4 S 6 K5_TETNG, Fugu rubripes Q9 0VY5_ FUGRU, Xenopus laevis Q6INK9_XENLA, Homo sapiens Q5T8J7_HUMAN, Homo sapiens GCYA2_HUMAN, Homo sapiens GCYB2_HUMAN, Homo sapiens GCYB1_HUMAN, Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM, Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY, Pan troglodytes Q9N192_PANTR, Macaca mulatta Q9N194_MACMU, Hylobates lar Q9N191__HYLLA, Mus musculus Q8BXH3_MOUSE, Mus musculus GCYBI_MOUSE, Mus musculus Q3UTI4_MOUSE, Mus musculus Q3UH8 3_MOUSE, Mus musculus Q6XE41_MOUSE, Mus musculus Q80YP4_MC>USE, Rattus norvegicus Q80WX7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX8_RAT, Rattus norvegicus Q920Q1_RAT, Rattus norvegicus Q54A43_RAT, Rattus norvegicus Q80WY0_RAT, Rattus norvegicus Q8 0WY4_RAT, Rattus norvegicus Q8CH85_RAT, Rattus norvegicus Q80WY5_RAT, Rattus norvegicus GCYB1_RAT, Rattus norvegicus Q8CH90_RAT, Rattus norvegicus Q91XJ7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX9_RAT, Rattus norvegicus GCYB2_RAT, Rattus norvegicus GCYA2_RAT, Canis familiaris Q4ZHR9_CANFA, Bos taurus GCYB1_B0VIN, Sus scrofa Q4ZHR7_PIG, Gryllus bimaeulatus Q5 9HN5_GRYBI, Manduca sexta 077106JVLANSE, Manduca sexta 076340_MANSE, Apis mellifera Q5UAF0_APIME, Apis mellifera Q5FAN0_APIME, Apis mellifera Q6L5L6_APIME, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PYK9_ANOGA, Anopheles gamhiae cepa PEST Q7Q9W6_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7QF31_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PS01_ANOGA.> Anopheles gambiae cepa PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae Q7KQ93_ANOGA, Drosophila melanogaster Q24 0 8 6_DROME, Drosophila melanogaster GCYH_DROME, Drosophila melanogaster GCY8E_DROME, Drosophila melanogaster GCYDA_DROME, Drosophila melanogaster GCYDB_DROME, Drosophila melanogaster Q9VA09_DROME, Drosophila pseudoobscura Q2 9CE1_DR0PS, Drosophila pseudoobscura Q2 96C7_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C8_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q29BU7_DROPS, Aplysia californica Q7YWK7_APLCA, Hemicentrotus pulcherrimus Q95NK5_HEMPU, Chlamydomonas reinhardtii, Q5YLC2_CHLRE, Anabaena sp Q8YUQ7 ANASP, Flavobacteria bacterium BBFL7 Q26GR8 9BACT, Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q VQE5_9FLAO, proteobactéria marinha gama HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM, proteobactéria marinha gama HTCC22 0 7 QIYTK4_9GAMM, Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCR, Acidiphilium cryptum JF- 5 Q2DG6 0_ACICY, Rhodobacter sphaeroides Q3J0U9 RH0S4, Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILP0, Paracoccus denitrificans PD1222, Q3PC67_PARDE, Silicibacter sp TMI 04 0 Q3QNY2 9RHOB, Jannaschia sp Q28ML8_JANSC, Magnetococcus sp MC-I Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL, Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X2 6 8_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, Colwellia psyehrerythraea Q4 7Y4 3_COLP3, Pseudoalteromonas atlantiea T6c Q3CSZ5_ALTAT, Shewanella oneidensis Q8EF4 9_SHEON, Saeeharophagus degradans Q21E20_SACD2, Saeeharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S14 Q1ZWES_9VIBR, Vibrio vulnifieus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio alginolytieus 12G01 Q1VCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722 Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolytieus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fiseheri Q5E1F5_VIBF1, Vibrio vulnifieus Q7MJS8_VIBVY, Photobaeterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella ehejuensis Q2SFY7_HAHCH, Oceanospirillum sp MED92 Q2BKV0_9GAMM, Oeeanobaeter sp RED6 5 Q1N03 5_9GAMM, Desulfovibrio desulfurieans Q310U7_DESDG; Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM,Thermoanaerobaeter tengeongensis
Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saeeharolytieus DSM 8903 Q2 ZHl7_CALSA, Clostridium aeetobutylieum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT,
Clostridium tetani Q899J9_CLOTE e Clostridium beijerineki NCIMB 8052 Q2WVNO_CLOBE. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não possui uma mutação no motivo Y-S-R, que inclui Tyrl35, Serl37 e Argl39 de H-NOX humana.
A menos que observado explicitamente ou ditado pelo contexto, todas as proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes aqui descritas podem ser usadas em qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas. A proteína H- NOX pode ter ou não heme e/ou NO ligado, e pode estar ligada covalentemente ou não a outra molécula ou porção como polietileno glicol. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é uma proteína de fusão que inclui um domínio de H- NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana).
Em um aspecto, a invenção fornece métodos de liberação de NO a um indivíduo (por exemplo, um mamífero como, por exemplo, um primata (por exemplo, um ser humano, um macaco, um gorila, um chipanzé, um lêmure etc.), um bovino, um eqüino, um suíno, um canino ou um felino) com o uso de uma proteína H-NOX. Em algumas modalidades, o indivíduo sofre ou está em risco de contrair uma condição cardiovascular, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão, uma condição vasoconstrictora, AVC, ou uma deficiência funcional de NO. Em modalidades particulares, uma condição exacerbada por hipertensão é insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou um AVC.
Consequentemente, em algumas modalidades, a invenção fornece um método de liberação de NO a um indivíduo (por exemplo, um ser humano) pela administração a um indivíduo que dela necessita de uma proteína H-NOX em uma quantidade suficiente para liberar uma quantidade eficaz de NO ao indivíduo. Em algumas modalidades, a k0ff, klf ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 nM a cerca de 1 χ 10"4 s"1 a cerca de 10 s-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina.
Em algumas modalidades dos métodos, NO é ligado à proteína H-NOX antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos, o NO não está ligado à proteína H-NOX, antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo, e a proteína H-NOX transporta NO de uma localização no indivíduo para outra localização no indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é administrada por via oral, retal, ou ao sangue do indivíduo. Em modalidades particulares dos métodos, a proteína H-NOX é administrada ao sangue do indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é administrada ao indivíduo pelo menos duas vezes.
Em algumas modalidades dos métodos, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está dentro de 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens, como uma constante de dissociação de NO entre 0,1 a 10 vezes ou entre 0,5 a 2 vezes a da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades dos métodos, a reatividade ao NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor do que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens como pelo menos 100 vezes ou 1.000 vezes menor do que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é uma proteína do tipo selvagem. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é uma proteína mutante aqui descrita. Em várias modalidades dos métodos, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a koff para NO, a kl para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a reatividade de NO a taxa de auto- oxidação, ou qualquer combinação de duas ou mais das citadas anteriormente, comparada com a de uma proteína do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H- NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y14 0F de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfuricans, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, βΐ I140Y de H. sapiens, βΐ Ι145Υ de Η. sapiens, βΐ (1-385) de Η. sapiens, βΐ (1-385) I145Y de Η. sapiens, βΐ(1-385) I145H de Η. sapiens, β1(1- 194) de Η. sapiens, βΐ (1-194) I145Y de Η. sapiens, β1(1- 194) L9W-I145Y de Η. sapiens, β2(1-217) de Η. sapiens, β2(1-217) I142Y de Η. sapiens, βΐ H-NOX H105G de Η. sapiens, βΐ H-NOX H105F de Η. sapiens, βΐ H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ(1-385) de R. norvegicus, βΐ(1-385) I145Y de R. norvegicus, βΐ(1-385) I145H de R. norvegicus, βΐ (1-194)1?. norvegicus, βΐ (1-194) I145Y de R. norvegicus, βΐ (1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2(1-217) de R. norvegicus, β2 (1-217) I142Y de R. norvegicus, βΐ H- NOX H105G de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105F de R. norvegicus, H-NOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum, GCY3 5 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35 (1-252) de C. elegans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster-, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, H-NOX do tipo selvagem de X. laevis, H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de 0. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-3 7 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme. Em algumas modalidades dos métodos, um ou mais lipossomos ou nanopartícuias incluem ou encapsulam a proteína H-NOX.
Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. t engcongensis, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, ou L. pneumophilia 2 H-NOX F142Y. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX de tipo selvagem de L. pneumophilia, βΐ H-NOX de tipo selvagem de H sapiens, sGC βΐ H-NOX (1-385) de R. norvegicus, βΐ H-NOX de tipo selvagem de J?. norvegicus, βΐ H-NOX de tipo selvagem de D. melangaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster H-NOX, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis ou H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T. tengcongensis, sGC β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, R. norvegicus. sGC βΐ H- NOX H105F, sGC βΐ H-NOX I145Y de R. norvegicus, sGC βΐ H- NOX C78S de R. norvegicus, ou sGC βΐ H-NOX C78E de R. norvegicus. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é β2 (1-217) de R. norvegicus, βΐ (1-194) de R. norvegicus, β1(1-385) de R. norvegicus ou β1(1-385) I145Y de R. norvegicus. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T. tengcongensis ou βΐ H-NOX (1-385) 1145Y de H. sapiens. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX não é H- NOX Y140H de T. tengcongensis, β1 114OY de H. sapiens ou βΐ 1145Y de H. sapiens. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX Y4 0L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, 2 H-NOX F14 2Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, β1 H-NOX 114OY de H. sapiens, β1 I145Y de H. sapiens, β1 H- NOX do tipo selvagem de H. sapiens, sGC β1 H-NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, R. norvegicus. sGC β1 H-NOX H105F, β1 H-NOX I145Y de R. norvegicus sGC, β1 H-NOX do tipo selvagem de T. norvegicus, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster H-N0X, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis ou H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas pelo nome de seu gene, seguido pela abreviatura de sua espécie e Identificadores no Genbank (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2 006; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007): Npun5905_Npu_2312 9606, alr2278_Ana_17229770 , S0214 4_Sone_2 4373702, Mdegl3 4 3_Mde_2 3027521, VCA0720_Vch_15601476, CC2992_Ccr_16127222, Rsph2043_Rhsp_229584 63 (gi: 46192757), Mmcl0739_Mcsp_22999020, Tar4_Tte_2 0807169, Ddes2822_Dde_23475919, CAC3243_Cac_15896488, gcy-
31_Ce_17568389, C014885_Dm_24647455, GUCYlB3_Hs_4504 215, HpGCS - be t al_Hpul_14 245738, Gycbe tal 0 0B_Dm_2 4651577, CG4154_Dm_24 646993 (gi: NP_650424.2, gi: 62484298), gcy- 32_Ce 13539160,gcy-36_Ce 17568391 (gi: 32566352, gi: 86564713), gcy-35_Ce-17507861 (gi: 71990146), gcy-37_Ce_1 7540904 (gi: 71985505), GCYla3_Hs_2 0535603, GCYla2-Hs 899477 OU GYCa-99B_Dm_729270 (gi: 68067738) (Lakshminarayan e cols. (2003) , "Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins", BMG Genomics 4: 5-13). As abreviações de espécies usadas nesses nomes incluem: Ana = Anabaena Sp; Ccr = Caulobacter ereseentus; Cac = Clostridium acetobutylicum; Dde = Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp = Magnetococcus sp. ; Mde = Mierobulbifer degradans; Npu = Nostoe punetiforme; Rhsp = Rhodobaeter sphaeroides; Sone = Shewanella oneidensis; Tte = Thermoanaerobaeter tengeongensis; Vch = Vibrio eholerae; Ce = Caenorhabditis elegans; Dm = Drosophila melanogaster; Hpul = Hemieentrotus puleherrimus; Hs = Homo sapiens. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas por seu nome do organismo e número de acesso na base de dados Pfam (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 17 de maio de 2007; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007) : Caenorhabdi tis briggsae Q622M5_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61P44_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61R54_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61 V90_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61 A94_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60TP4_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60M10_CAEBR, Caenorhabditis elegans GCY3 7_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY31_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 6_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 2_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY35_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY34_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 3__CAEEL, Oryzias curvinotus Q7T04 0_ORYCU, Oryzias curvinotus Q75 WFO_ORYCU, Oryzias latipes P79998_ORYLA, Oryzias latipes Q7ZSZ5_ORYLA, Tetraodon nigroviridis Q4SW3 8_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4RZ94_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4 S 6 K5_TETNG, Fugu rubripes Q90VY5_ FUGRU, Xenopus laevis Q6INK9_XENLA, Homo sapiens Q5T8J7_HUMAN, Homo sapiens GCYA2_HUMAN, Homo sapiens GCYB2_HUMAN, Homo sapiens GCYB1_HUMAN, Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM, Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY, Pan troglodytes Q9N 192_PANTR, Macaca mulatta Q9N194_MACMU, Hylobates lar Q9N191_HYLLA, Mus musculus Q8BXH3_MOUSE, Mus musculus GCYBl_MOUSE, Mus musculus Q3UTI4_MOUSE, Mus musculus Q3UH8 3_MOUSE, Mus musculus Q6XE41_MOUSE, Mus musculus Q80YP4_MOUSE, Rattus norvegicus Q80WX7JRAT, Rattus norvegicus Q80WX8_RAT, Rattus norvegicus Q920Q1_RAT, Rattus norvegicus Q54A43_RAT, Rattus norvegicus Q80WY0_RAT, Rattus norvegicus Q80WY4_RAT, Rattus norvegicus Q8CH85_RAT, Rattus norvegicus Q80WY5_RAT, Rattus norvegicus GCYB 1_RAT, Rattus norvegicus Q8CH90_RAT, Rattus norvegicus Q91XJ7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX9_RAT, Rattus norvegicus GCYB2_RAT, Rattus norvegicus GCYA2_RAT, Canis familiaris Q4ZHR9_CANFA, Bos taurus GCYB1_B0VIN, Sus scrofa Q4ZHR7_PIG, Gryllus bimaculatus Q59HN5_GRYBI, Manduca sexta 07 7106_MANSE, Manduca sexta 076340_MANSE, Apis mellifera Q5UAFO_APIME, Apis mellifera Q5 FANO_APIME, Apis mellifera Q6L5L6_APIME, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PYK9_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7Q9W6_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7QF31_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PS01_AN0GA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae Q7KQ93_ANOGA, Drosophila melanogaster Q24 086_DROME, Drosophila melanogaster GCYH_DROME, Drosophila melanogaster GCY8 E_DROME, Drosophila melanogaster GCYDA_DROME, Drosophila melanogaster GCYDB_DROME,Drosophila melanogaster Q9VA09_DROME, Drosophila pseudoobscura Q29CE1_DR0PS, Drosophila pseudoobscura Q296C7_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C8_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q29BU7_DROPSr Aplysia californica Q7YWK7_APLCA, Hemicentrotus pulcherrimus Q95NK5_HEMPU, Chlamydomonas reinhardtii Q5YLC2_CHLRE, Anabaena sp Q8YUQ7_ANASP, Flavobacteria bacterium BBFL7 Q26GR8_9BACT, Psychroflexus torquis ATCC 700755 QlVQE5_9FLAO, proteobactéria marinha gama HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM, proteobactéria marinha gama HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM, Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCR, Acidiphilium cryptum JF- 5 Q2DG6 0_ACICY, Rhodobacter sphaeroides Q3J0U9 RH0S4, Silicibacter pomeroyi Q5LPV 1_SILP0, Paracoccus denitrificans PD1222, Q3PC67_PARDE, Silicibacter sp TMJ040 Q3QNY2_9RHOB, Jannaschia sp Q28ML8_JANSC, Magnetococcus sp MC-I Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL, Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X2 6 8_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3, Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT, Shewanella oneidensis Q8EF4 9_SHEON, Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2, Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR, Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio alginolyticus 12G01 QiIVCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722 Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolyticus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fischeri Q5EIF5_VIBFI, Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY, Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH, Oceanospirillum sp MED92 Q2BKV0_9GAMM, Oeeanobacter sp RED65 Q1N035_9GAMM, Desulfovibrio desulfurieans Q310U7_DESDG, Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM, Thermoanaerobaeter tengeongensis Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saeeharolytieus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA/ Clostridium aeetobutylieum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT, Clostridium tetani Q899J9_CLOTE e Clostridium beijerineki NCIMB 8052 Q2WVNO_CLOBE. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é sGC βΐ H-NOX C78S de R. norvegieus ou sGC βΐ H-NOX C78E de R. norvegieus. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não possui uma mutação no motivo Y-S-R, que inclui Tyrl35, Serl37 e Argl39 de H-NOX humana.
A menos que observado explicitamente ou ditado pelo contexto, todas as proteínas do tipo selvagem e mutantes e todas as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser usadas em qualquer um dos métodos de liberação de NO aqui descritos. A proteína H-NOX pode ter ou não heme e/ou NO ligado, e pode estar ligada covalentemente ou não a outra molécula ou porção como, por exemplo, polietileno glicol.
Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana).
Em um aspecto, a invenção apresenta kits que incluem uma ou mais proteínas H-NOX. Em algumas modalidades, a invenção fornece um kit que inclui uma proteína H-NOX e instruções para utilização do kit para liberar NO a um indivíduo. Em algumas modalidades, a koff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 a cerca de 10 s"1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina. A menos que observado explicitamente ou ditado pelo contexto, todas as proteínas do tipo selvagem e mutantes e todas as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser usadas em qualquer um dos kits aqui descritos. A proteína H-NOX pode ter ou não heme e/ou NO ligado, e pode estar ligada covalentemente ou não a outra molécula ou porção como, por exemplo, polietileno glicol. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana). Em um aspecto, a invenção apresenta uma proteína H-NOX (como qualquer uma das proteínas do tipo selvagem ou mutantes aqui descritas) para uso como um medicamento. Em algumas modalidades, a invenção apresenta uma proteína H- NOX para uso em um método de liberação de NO a um indivíduo. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é usada para tratar qualquer condição para a qual a liberação de NO seja benéfica, como uma condição cardiovascular, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou um AVC), uma condição vasoconstritora, AVC, ou uma deficiência funcional de NO.
Em algumas modalidades, a invenção apresenta o uso de uma proteína H-NOX (como qualquer uma das proteínas do tipo selvagem ou mutantes aqui descritas) para a fabricação de um medicamento, por exemplo, um medicamento para a liberação de NO a um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção apresenta o uso de uma proteína H-NOX para a liberação de NO a um indivíduo. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é usada para tratar qualquer condição para a qual a liberação de NO seja benéfica, como uma condição cardiovascular, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou um AVC), uma condição vasoconstrictora, AVC, ou uma deficiência funcional de NO.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A FIG. IA é uma ilustração da estrutura tridimensional de resíduos da bolsa distai de proteínas H-NOX de ligação de NO e ligação de O2 (acima de heme). Resíduos de coordenação de heme de proteínas H-NOX de ligação de NO e ligação de O2 também são mostrados (abaixo de heme) . A FIG. IA é baseada na estrutura tridimensional de H-NOX de T. tengcongensis relatada por Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), "Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101(35): 12.854-12.859.
A FIG. IB é uma visão lateral estérea da estrutura tridimensional de H-NOX de T. tengcongensis que ilustra características estruturais do domínio de H-NOX. A dobra da proteína é representada por diagramas de fita. O heme, o ligante de di-oxigênio e a histidina proximal são mostrados como modelos bali-and-stick. As α-hélices são rotuladas A- G de acordo com a nomenclatura mostrada na FIG. 5B. As fitas β são rotuladas 1-4. A FIG. IB é de Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004) , "Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101 (35): 12.854- 12.859.
As FIGS. IC-IH são ilustrações da estrutura tridimensional de H-NOX de T. tengcongensis que ilustram resíduos exemplares da bolsa distai em H-NOX de T. tengcongensis. Os resíduos seguintes revelados nas FIGS. IC-IH são os resíduos principais que compreendem a bolsa distai de H-NOX: Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyrl40 e Leu 144, que estão contidos dentro de hélices A, D, E e G. As FIGS. IC-IH foram criadas com o uso de PYMOL (DeLano Scientific, LLP).
A FIG. 2 é um alinhamento de seqüências das proteínas H-NOX seguintes que se ligam ou que se prevê que se liguem ao O2 e NO: Majority (ID. DE SEQ. N°: 1); Ce. gcy-31 (ID. DE SEQ. N°: 2); Ce. gcy-33 (ID. DE SEQ. N°: 3); Ce. gcy-35 (ID. DE SEQ. N°: 4); Dm. CG14885 H-NOX (ID. DE SEQ. N° : 5) ; Dm. CG4154 H-NOX (ID. DE SEQ. N°: 6); Ms. Beta3 H-NOX (ID. DE SEQ. N°: 7); Tt H-NOX (ID. DE SEQ. N°: 8); e Ca H-NOX (ID. DE SEQ. N°: 9). Prevê-se que essas proteínas H-NOX se liguem ao O2, bem como ao NO, porque possuem a tirosina na posição que corresponde ao Y14 0 de H-NOX de T. tengcongensis. A numeração de aminoácidos usada na FIG. 2 começa com o primeiro aminoãcido no domínio de H-NOX ou na proteína de comprimento total como resíduo número 1. O alinhamento foi gerado com o uso dos parâmetros padronizados no programa MegAlign. As abreviações usadas na FIG. 2 são descritas abaixo com relação às FIGS. 4A-4D.
As FIG. 3A-3D são um alinhamento de seqüências das proteínas H-NOX seguintes que se ligam ou que se prevê que se liguem ao NO, mas não ao O2: Majority (ID. DE SEQ. N°: 10); Dm. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 11); sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 12); hs. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 13); hs. beta2 proteína (ID. DE SEQ. N°:14); Ms. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 15); Mm. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 16); Np. betai HD-IiAre (ID. DE SEQ. N°: 17); Tr. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 18); Anopheles_gambiae | XP_310919 (ID. DE SEQ. N°: 19); Apis_mellifera |NP_001011632 (ID. DE SEQ. N°: 20); Bt. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 21); Chlamydomonas reinhardtii|AAR02(ID.DE EQ. N°: 22); Oryzias_curvinotus|BAC983 96 (ID. DE SEQ. N°: 23); Oryzias_latipês|BAA7 66 9I (ID. DE SEQ. N°: 24); Strongylocentrotus_purpuratusIX (ID. DE SEQ. N°: 25); e Sus scrofa betai |NP_001018042+ (ID. DE SEQ. N°: 26). 0 alinhamento foi gerado com o uso dos parâmetros padronizados no programa MegAlign. As abreviações usadas nas FIGS. 3A-3D são descritas abaixo com relação à FIG. 4. As FIGS. 4A-4D são um alinhamento de seqüências de proteínas H-NOX das FIGS. 2 e 3A-3D: Majority (ID. DE SEQ. N°: 27); Dm. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 11); sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 12); hs. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 13); hs. beta2 proteína (ID. DE SEQ. N°: 14); Mm. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 16); Np. betai ΗΌ-like (ID. DE SEQ. N°: 17); Tr. sGC betai proteína (ID. DE SEQ. N°: 18); Chlamydomonas reinhardtii | AAR02 (ID. DE SEQ. N°: 22); Oryzias_curvinotus|BAC983 96 (ID. DE SEQ. N°: 23); Strongylocentrotus_j?urpuratus | X (ID. DE SEQ. N°: 25); Sus scrofa betai |NP_001018042 (ID. DE SEQ. N°: 26); gcy-31a (ID. DE SEQ. N°: 2); gcy-33 (ID. DE SEQ. N°: 3); Ca. H-NOX (ID. DE SEQ. N°: 9); T. betai HD-IiJce (ID. DE SEQ. N°: 8); Ms. sGc beta 3 proteína (ID. DE SEQ. N° : 7); CG14885 (ID. DE SEQ. N°: 5); e Dm. sGC variante curta (ID. DE SEQ. N0': 6). O alinhamento foi gerado com o uso dos parâmetros padronizados no programa MegAlign. Para as FIGS. 2-4D, "Dm. sGC betai proteína" representa βΐ H-NOX de Drosophila melanogaster; "sGC betai proteína" representa βΐ H-NOX de Rattus norvegicus; "hs. sGC betai proteína" representa Homo β1 H-NOX de H. sapiens; "hs. beta2 proteína" representa Homo β2 H-NOX de H. sapiens; "Mm. sGC betai proteína" representa βΐ H-NOX de Mus musculus; "Np. betai HO-like" representa H-NOX de Nostoc puncti forme; "Tr. sGC betai proteína" representa βΐ H-NOX de Takifugu rubripes; "AnopheIes_gambiae|XP_310919" representa βΐ H-NOX de Anopheles gambiae; "Apis_mellifera|NP_001011632" representa β1 H-NOX de Apis mellifera; wBt. sGC betai proteína" representa β1 H-NOX de Bos taurus·, " Chlamydomonas reinhardtii|AAR02" representa β1 H-NOX de Chlamydomonas reinhardtii; nOryzias_curvinotus|BAC98396 representa βΐ H- NOX de Oryzias curvinotus; "Oryzias_latipes|BAA76691" representa βΐ H-NOX de Oryzias latipes; "Strongylocentrotusjpurpuratus|X" representa β1 H-NOX de Strongylocentrotus purpuratus; "Sus scrofa betai SNP 001018042+" representa β1 H-NOX de Sus scrofa; "gcy-31a" representa Gcy-31a H-NOX de Caenorhabditis elegans; "gcy- 33" representa Gcy-33 H-NOX de Caenorhabditis elegans; "gcy-35" representa Gcy-35 H-NOX de Caenorhabditis elegans; "Ca. H-NOX" representa H-NOX de Clostridium acetobutiylicum; "T. betai HD-Iike" representa H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis; "Ms. sGc beta 3 proteína" representa β3 H-NOX de Manduca sexta; "CG14 8 85" representa CG14 885 H-NOX de Drosophila melanogaster; "Dm. sGC variante curta" representa Gcy-88-E-S H-NOX de Drosophila melanogaster e "Dm. CG4154 H-NOX" representa CG4154 H-NOX de Drosophila melanogaster.
A FIG. 5A é um alinhamento de seqüências de membros da família de H-NOX. A numeração de seqüências é aquela de H- NOX de T. tengcongensis. Resíduos não variantes são indicados por um "V", resíduos muito altamente conservados são indicados por "s" . Y140 de H-NOX de T. tengcongensis é indicado por um "H" . Os resíduos de tirosina previstos da bolsa distai que podem estabilizar um complexo de FeII-02 em outras proteínas H-NOX são: posição 70 para Caenorhabditis elegans GCY-35; posição 140 em Drosophila melanogaster CG14885-PA; posição 138 de Caenorhabditis elegans GCY-35; posição 14 0 de Clostridium acetobutylicum; numerado de acordo com Thermoanaerobacter tengcongensis. Os números de acesso são: Homo H. sapiens βΐ [gi: 2746083] (ID. DE SEQ. N°: 28), Rattus norvegicus βΐ [gi: 27127318] (ID. DE SEQ. N°: 29), Drosophila melanogaster βΐ [gi: 861203] (ID. DE SEQ. N°: 30), Drosophila melanogaster CG 14885-PA [gi: 23171476] (ID. DE SEQ. N°: 31), Caenorhabditis elegans GCY-35 [gi: 52782806] (ID. DE SEQ. N°: 32), Nostoc punctiforme [gi: 23129606] (ID. DE SEQ. N°: 33), Caulobacter crescentus [gi: 16127222] (ID. DE SEQ. N°: 34),Shewanella oneidensis [gi: 24373702] (ID. DE SEQ. N°: 35),Legionella pneumophila (ORF 2) [CUCGC_272624] (ID. DE SEQ. N°: 36), Clostridium acetobutylicum [gi: 15896488] (ID. DE SEQ. N° : 37) e Thermoanaerobacter tengcongensis [gi: 20807169] (ID. DE SEQ. N° : 38). Os alinhamentos foram gerados com o uso do programa MegAlign, Lasergene, DNA Star,(veja a página na Internet "dnastar.com/products/megalign.php"). Foram usados os parâmetros padronizados de Clustal-W.
A FIG. 5B é um alinhamento de seqüências de domínios de H-NOX exemplares. As anotações da estrutura secundária e a numeração no topo do alinhamento correspondem ao domínio de H-NOX de T. tengcongensis. As α-hélices são representadas por espirais, e fitas β por setas. A bolsa distai é definida por α-hélices aA, aD, aE e aG. os números de acesso de Pubmed/NCBI são os seguintes: Ther_tengcongensis gi | 208071691 (ID. DE SEQ. N°: 39), Clos_acetobutylicum gi | 158964881 (ID. DE SEQ. N°: 40), Clos_tetani GI: 75543266 (ID. DE SEQ. N°: 41), Desu_desulfuricans gi | 23475919 | (ID. DE SEQ. N°: 42), Vibr_vulnificus gi | 273617341 (ID. DE SEQ. N0 : 43) , Caul_crescentus gi | 16127222 | (ID. DE SEQ. N0 : 44) , Micr_degradans gi | 23027521 | (ID. DE SEQ. N0 : 45) , Vibr_cholerae gi | 15601476 I (ID. DE SEQ. N0 : 46) , Shew_oneidensis gi | 24373702 | (ID. DE SEQ. N0 : 47) , Rat_betal_sGC gi | 27127318 | (ID. DE SEQ. N0 : 48) , Rat_beta2_sGC gi | 21956635 | (ID. DE SEQ. N0 : 49) , Nos t_junctif onrie gi I 23129606 | (ID. DE SEQ. N0 : 50) e Nost_sp. gi I 17229770 | (ID. DE SEQ. N ° : 51) . A seqüência de consenso é mostrada na parte de baixo da FIG. 5B (ID. DE SEQ. N°: 52). Os alinhamentos foram gerados com o uso do programa MULTALIN (Corpeti F. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10.881-10.890), e a FIG. 5B foi preparada com o uso do programa ESPRIPT (Gouet, P. e cols. (1999) Bioinformatics 15: 305-308).
As FIGS. 6A e 6B são ilustrações da estrutura tridimensional do ambiente heme do domínio de H-NOX de T. tengcongensis. As FIGS. 6A e 6B são de Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), "Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases", Proc. Natl. Acad. Sci USA 101(35): 12.854- 12. 859.
As FIGS. 7A-7F são gráficos da espectroscopia de UV visível de proteínas H-NOX após redução anaeróbica (complexos não ligados de Fe11; linha de cima em cada gráfico), antes e depois de serem expostas ao ar (complexos de Fe11-O2; a linha de baixo em cada gráfico) para Tt H-NOX (FIG. 7A) , Tt Y140L (FIG. 7B) , Tt W9F-Y140L (FIG. 7C) , Tt F78Y-Y140L (FIG. 7D), L2 H-NOX e L2 F142Y (FIG. 7E) e β1(1- 385) e β1 (1-385) I145Y (FIG. 7F) . Além dos complexos de Fe11 e Fe11-O2 de L2 F142Y e βΐ (1-385) I145Y, o espectro de L2 H-NOX e βΐ-(1-385) H-NOX do tipo selvagem após redução e exposição ao ar são mostrados na linha do meio na FIG. 7E e 7F, respectivamente, para demonstrar que essas proteínas não se ligam ao O2 antes da adição de uma tirosina da bolsa distai. Os dois ou três números escritos no canto superior esquerdo de cada painel representam o comprimento de onda para o pico das linhas no gráfico. Os números são escritos verticalmente na ordem a qual as linhas correspondentes aparecem verticalmente no gráfico. Por exemplo, o valor de 430 nm na FIG. 7A representa o pico do comprimento de onda para a linha de cima no gráfico (que representa um complexo de Fe11 não ligado) , e o valor de 416 nm na FIG. 7A representa o pico do comprimento de onda para a linha de baixo no gráfico (que representa um complexo de Fe11-O2) . Uma mudança no comprimento de onda na presença de ar indica que a proteína se liga ao O2. A formação de um pico duplo entre 500 e 600 nm na presença de ar também é indicativa de ligação de O2. As FIGS. 7A-7F são de Booni E.M. e cols. (2005), "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chem. Biol. 1: 53-59.
As FIGS. 8A-8DD contêm seqüências de polinucleotídeos de ácidos nucléicos exemplares que codificam proteínas H- NOX e as seqüências de aminoácidos das proteínas H-NOX correspondentes (IDS. DE SEQ. Nos: 53-162).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção se baseia, em parte, na descoberta surpreendente de que proteínas H-NOX possuem uma reatividade ao NO bem menor do que hemoglobina. Essa baixa reatividade intrínseca ao NO (e alta estabilidade ao NO) torna as proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes transportadores de NO desejáveis, por causa da baixa probabilidade de inativação de proteínas H-NOX por NO na presença de O2. Significativamente, a presença de uma tirosina da bolsa distai em algumas proteínas H-NOX (Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), uCrystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101(35): 12.854-12.859) ê sugestiva de reatividade ao NO alta, indesejável, contra-indicando o uso como um transportador de NO. Por exemplo, por analogia, uma proteína de hemoglobina de Mycobacterium tuberculosis, com uma tirosina da bolsa distai estruturalmente análoga, reagem de forma extremamente rápida com NO, e é usada pelo Mycobacterium para remover e evitar eficazmente o NO defensivo produzido por um hospedeiro infectado (Ouellet, H. e cols. (30 de abril de 2002), "Truncated Hemoglobin HbN Protects Mycobacterium Bovis From Nitric Oxide", Proe. Natl. Acad. Sei. USA 99(9): 5.902-5.907). No entanto, descobrimos surpreendentemente que proteínas H-NOX na verdade possuem uma reatividade ao NO bem menor do que aquela da hemoglobina, o que torna possível seu uso como transportadores de NO.
Adicionalmente, foi constatado que a utilidade de proteínas H-NOX como transportadores de NO pode ser melhorada por modificação de suas afinidades para NO ou O2 para maximizar a quantidade de NO que é ligado à proteína H-NOX e para reduzir a. quantidade de proteína H-NOX que é oxidada pela reação de NO com O2 ligado à proteína H-NOX. Em particular, a afinidade de proteínas H-NOX para NO ou O2 e a capacidade das proteínas H-NOX de discriminar entre ligantes de NO e O2 pode ser alterada pela introdução de uma ou mais mutações de aminoácido, permitindo que sejam desenhadas proteínas H-NOX para ligar NO ou O2 com afinidades desejadas. Por exemplo, a constante de dissociação ou taxa de dissociação para NO ou ligação de O2 por proteínas H-NOX pode ser alterada pela introdução de uma única mutação de aminoãcido. Mutações adicionais podem ser introduzidas para também alterar a afinidade para NO e/ou O2. A família da proteína H-NOX pode, portanto ser manipulada para exibir propriedades cinéticas e termodinâmicas aumentadas ou ideais para a liberação de NO.
Por exemplo, podem ser geradas proteínas H-NOX mutantes com constantes de dissociação alteradas e/ou taxas de dissociação para ligação de NO que aumentam a utilidade das proteínas H-NOX para diversas aplicações clínicas e industriais. Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX com uma baixa afinidade por O2 (como uma constante de dissociação de O2 de pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C) é usada para minimizar a quantidade de O2 que liga a proteína H-NOX, assim facilitando a ligação de NO à proteína H-NOX e reduzindo a quantidade of proteína H-NOX que é oxidada devido à reação de NO com O2 ligado ao heme da proteína H- NOX. Essa redução na oxidação de proteínas H-NNOX resulta 25 em menor destruição de NO e O2 que pode ser usado pelos órgãos, tecidos, e células do indivíduo tratado. A capacidade de modular proteínas H-NOX para ligar e liberar NO é uma via terapêutica que discute e supera as desvantagens centrais dos vasodilatadores atuais. Portanto, a presente invenção fornece proteínas, composições, kits, e métodos para a liberação de NO.
Há vários benefícios da utilização de proteínas H-NOX para a liberação de NO. Nitratos orgânicos são eficazes por um tempo limitado devido á tolerância. Uma vez que as proteínas H-NOX liberam NO diretamente a indivíduos sem necessitar da bioconversão dos nitratos a NO, a eficácia das proteínas H-NOX como transportadores de NO não é limitada por inibição dessa via de bioconversão. As maiores limitações de transportadores de NO com base em hemoglobina são sua alta afinidade por O2 e sua propensão a serem inativados por NO. Como mencionado acima, a destruição de níveis mesmo baixos de NO por transportadores com base em hemoglobina pode ter efeitos sérios sobre o estado de repouso tônico da vasculatura e dos órgãos, e leva à hipertensão e ao sofrimento gastrintestinal.
Entrecruzamento intra- e intermolecular foram usados para minimizar a toxicidade de veículos com base em hemoglobina quando usados como transportadores de oxigênio ("Blood Substitutes," R. Winslow ed. Academic Press, 2006). Embora essas modificações superem algumas das questões de toxicidade graves relacionadas ao extravasamento de hemoglobina, permaneceu a alta reatividade de NO. Em contraste, proteínas H-NOX têm uma reatividade de NO muito menor que hemoglobina. Essa menor reatividade leva a menos destruição de NO, O2, e proteína H-NOX uma vez que menos NO reage com O2 ligado à proteína H-NOX. A capacidade de selecionar proteínas H-NOX com constantes de dissociação e taxas de dissociação desejadas para NO também pode minimizar efeitos colaterais ao evitar que muito NO seja liberado (causando hipotensão) e evitando NO de ser liberado em locais indesejados (por exemplo, locais que não são vasoconstritos). A construção proteínas H-NOX para ligar e liberar NO com reatividade de NO mínima fornece um novo transportador de NO gasoso no sangue em que as proteínas H-NOX liberam NO sem serem inativadas por NO. Essas proteínas H-NOX, composições, kits e métodos serão descritos com mais detalhe nessa especificação.
Para liberação de NO, a construção de proteínas H-NOX representa uma importante alternativa que supera o problema persistente de tolerância com os nitrovasodilatadores atuais. 0 uso de proteínas H-NOX como veículso de liberação para NO fornece uma nova via terapêutica para o tratamento de doenças exacerbadas por hipertensão crônica.
Proteínas H-NOX
Visão geral da família de proteínas H-NOX
A menos que indicado de forma diferente, qualquer proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante pode ser usada nas composições, kits e métodos aqui descritos. Como aqui usado, o termo uma "proteína H-N0X" significa uma proteína que possui um domínio de H-NOX (denominada para domínio de ligação Heme-Óxido nítrico e Oxigênio). Uma proteína H-NOX pode ou não conter um ou mais domínios diferentes, além do domínio de H-NOX. As proteínas H-NOX são membros de uma família altamente conservada, bem caracterizada, de hemoproteínas (Iyer, L.M. e cols. (3 de fevereiro de 2003), "Ancient Conserved Domains Shared by Animal Soluble Guanylyl Cyclases And Bacterial Signaling Proteins", BMC Genomics 4(1): 5; Karow, D.S. e cols. (10 de agosto de 2004), "Spectroscopic Characterization of the Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis", Biochemistry 43(31): 10.203-10.211; Boon, E.M. e cols. (2005), "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chem. Biol. 1: 53-59; Boon, E.M. e cols. (outubro de 2005), "Ligand Diserimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins", Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5): 441-446; Boon, E.M. e cols. (2005), nLigand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors", J. Inorg. Biochem. 99 (4): 892-902). As proteínas H-NOX também são denominadas proteínas Pfam 07700 ou proteínas HNOB (Pfam - uma base de dados de alinhamentos de família de domínios de proteínas e Modelos Ocultos de Markov, Marca Registrada (C) 1996-2006 "The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc.", 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, EUA) . Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX possui, ou prevê-se que possua, uma estrutura secundária que inclui seis hélices alfa, seguidas por duas fitas beta, seguidas por uma hélice alfa, seguida por duas fitas beta. Uma proteína H-NOX pode ser uma apoproteína que ê capaz de ligação com heme ou uma holoproteína com heme ligado. Uma proteína H- NOX pode se ligar de forma covalente ou não covalente a um grupo heme. Algumas proteínas H-NOX se ligam ao NO, mas não ao O2, e outras se ligam tanto ao NO quanto ao O2. Os domínios de H-NOX de aeróbios facultativos que foram isolados se ligam ao NO, mas não ao O2. As proteínas H-NOX de procariotas aeróbicos obrigatórios, C. elegans e D. melanogaster, se ligam ao NO e ao O2. Mamíferos possuem duas proteínas H-NOX: βΐ e β2. Um alinhamento de seqüências de H-NOX de camundongo, rato, vaca e humanas mostra que essas espécies compartilham >99% de identidade. Em algumas modalidades, o domínio de H-NOX de uma proteína H-NOX ou toda a proteína H-NOX é pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 OU 99,5% idêntico àquele da região correspondente de uma proteína H- NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis de ocorrência natural ou uma proteína sGC de ocorrência natural (por exemplo, uma proteína sGC βΐ de ocorrência natural) . Como aqui discutido anteriormente, uma proteína H-NOX pode opcionalmente conter uma ou mais mutações em relação à proteína H-NOX de ocorrência natural correspondente. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX inclui um ou mais domínios, além do domínio de H-NOX. Em modalidades particulares, a proteína H-NOX inclui um ou mais domínios ou toda a seqüência de outra proteína. Por exemplo, a proteína H-NOX pode ser uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana). Em algumas modalidades, apenas o domínio de H-NOX está presente.
Uma estrutura cristal de uma H-NOX de ligação de O2 procariótica de Thermoanaerobacter tengcongensis (Nioche, P. e cols. (26 de novembro de 2004) , "Femtomolar Sensitivity of a NO Sensor From Clostridium Botulinum", Science 306 (5.701): 1.550-1.553; Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), "Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101 (35): 12.854-12.859) mostra que um grupo hidroxil da cadeia lateral de tirosina forma uma ligação H crítica para a porção Fe11-O2. Essa rede de ligação de hidrogênio da bolsa distai, que envolve principalmente Y140, estabiliza um complexo de Fe11-O2 (FIG. 6B) . Essa tirosina não está presente em proteínas H-NOX que discriminam contra O2 e só se ligam ao NO. Por exemplo, prevê-se que essa rede de ligação de hidrogênio esteja ausente nas proteínas H-NOX de sGCs e procariotas aeróbicos, sugerindo que esse é um fator molecular fundamental na seletividade de ligante acentuada contra O2 exibida por essas proteínas heme. As FIGS. 7A-7G demonstram nitidamente que a adição de uma tirosina na bolsa distai de uma proteína H-NOX do tipo selvagem que se liga ao NO, mas não ao O2, pode permitir que a proteína H-NOX mutante se ligue ao O2. Dessa forma, uma tirosina na bolsa heme distai da dobra heme de H-NOX atua como um interruptor para ativar e desativar a ligação do O2.
Como ilustrada nas FIGS. 6A e 6B, a estrutura da porfirina é altamente distorcida. Como ilustrado na FIG. 6A, o motivo conservado Y-S-R forma interações de ligação de hidrogênio com as cadeias laterais de ácido propiônico do grupo heme. Na FIG. 6B, o H102 conservado é o ligante proximal ao heme (FIG. 6B).
Como aqui usado, o termo "proteína" inclui proteínas e fragmentos de proteínas, sejam eles isolados de fontes naturais, produzidos por técnicas recombinantes ou sintetizados quimicamente. Uma proteína pode ter uma ou mais modificações, por exemplo, uma modificação pós- tradução (por exemplo, glicosilação etc.) ou qualquer outra modificação (por exemplo, PEGuilação etc.). A proteína pode conter um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural (por exemplo, um aminoãcido com uma modificação da cadeia lateral). Em várias modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos cerca de 50, 100, 150, 181, 200, 250, 300, 350, 400, ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, as proteínas H-NOX podem incluir de cerca de 50 a cerca de 600 aminoácidos como, por exemplo, cerca de 100 a cerca de 500 aminoácidos, cerca de 150 a cerca de 400 aminoácidos, cerca de 150 a cerca de 300 aminoácidos ou cerca de 175 a cerca de 200 aminoácidos.
Fontes de proteínas H-NOX
As proteínas H-NOX de qualquer gênero ou espécie podem ser usadas nas composições, kits e métodos aqui descritos. Em várias modalidades, a proteína H-NOX é uma proteína de um mamífero (por exemplo, um primata (por exemplo, um ser humano, um macaco, um gorila, um chipanzé, um lêmure etc.), um bovino, um eqüino, um suíno, um canino ou um felino) , um inseto, uma levedura ou uma bactéria, ou é derivada de uma proteína desse tipo. Proteínas H-NOX de mamíferos exemplares incluem guanilato ciclase solúvel humana e de rato do tipo selvagem (por exemplo, a subunidade β1) .
Exemplos de proteínas H-NOX incluem proteínas H-NOX de mamíferos do tipo selvagem, por exemplo, de H. sapiens, M. musculus, C. familiaris, B. taurus e R. norvegicus; e proteínas H-NOX do tipo selvagem de vertebrados não mamíferas, por exemplo, de X. Iaevisl O. Iatipes, O. curivatus e F. rubripes. Exemplos de proteínas H-NOX de ligação de NO do tipo selvagem não mamíferas incluem proteínas H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, A. ganúDiae e M. sexta; exemplos proteínas H-NOX de ligação de O2 não mamíferas do tipo selvagem incluem proteínas H-NOX do tipo selvagem de C. elegans gcy-31, gcy-32, gcy-33, gcy- 34, gcy-35, gcy-36, e gcy-37; de D. melanogaster CG14885, CG14 886 e CG4154; e de M. sexta beta-3; exemplos de proteínas H-NOX procarióticas do tipo selvagem incluem T. tengcongensis, V. cholera, V. fischerii, N. punctiforme, D. desulfuricans, L. pneumophila 1, L. pneumophila 2 e C. acetobutylicum.
Os números de Acesso no NCBI para proteínas H-NOX exemplares incluem os seguintes: Homo sapiens βΐ [gi: 2746083], Rattus norvegicus βΐ [gi: 27127318], Drosophila melanogaster βΐ [gi: 861203], Drosophila melanogaster CG14 885-PA [gi: 23171476], Caenorhabditis elegans GCY35 [gi: 52782806], Nostoc punctiforme [gi: 23129606], Caulobacter crescentus [gi: 16127222], Shewanella oneidensis [gi: 24373702], Legionella pneumophila (ORF 2) [CUCGC 272624], Clostridium acetobutylicum [gi: 15896488] e Thermoanaerobacter tengcongensis [gi: 20807169].
Proteínas H-NOX exemplares também incluem as seguintes proteínas H-NOX que são listadas pelo nome de seu gene, seguido pela abreviatura de sua espécie e Identificadores no Genbank (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades):
Npun5 9 0 5_Npu_2 3129606, alr2278_Ana_17229770, S02144_Sone_24373702,Mdegl343_Mde_23027521, VCA0720_Vch_15601476,CC2992_Ccr_16127222,
Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757), Mmc1073 9_Mc sp_2 2999020,Tar4_Tte_20807169, Ddes2822_Dde_23475919,CAC3243_Cac_15896488,gcy- 31 Ce 17568389, CG_14885_Dm_24647455, GUCYlB3_Hs_4 504 215, HpGCS-betal_Hpul_14245738,GycbetalO0B_Dm_24651577 , CG4154_Dm_24646993 (gi: NP_650424.2, gi: 62484298), gcy- 32_Ce_13539160, gcy-36_Ce_17568391 (gi: 32566352, gi: 86564713), gcy-35_Ce-17507861 (gi: 71990146), gcy- 37_Ce_17540904 (gi: 71985505), GCYla3_Hs_20535603, GCYla2-Hs_899477 ou GYCa-99B_Dm_729270 (gi: 68067738) (Lakshminarayan e cols. (2003) , "Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl ciclases and bacterial signaling proteins", BMG Genomics 4: 5-13). As abreviações de espécies usadas nesses nomes incluem: Ana = Anabaena Sp; Ccr = Caulobacter crescentus; Cac = Clostridium acetobutylicum; Dde - Desulfovibrio desulfurieans; Mcsp = Magnetococcus sp. ; Mde = Mierobulbifer degradans; Npu = Nostoe punetiforme; Rhsp = Rhodobaeter sphaeroides; Sone = Shewanella oneidensis; Tte = Thermoanaerobacter tengeongensis; Vch = Vibrio eholerae; Ce = Caenorhabditis elegans; Dm = Drosophila melanogaster; Hpul = Hemieentrotus puleherrimus; Hs = Homo sapiens.
Outras proteínas H-NOX exemplares incluem as seguintes proteínas H-NOX que estão listadas por seu nome do organismo e número de acesso na base de dados Pfam (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 17 de maio de 2007; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades):
Caenorhabditis briggsae Q622M5_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61P44_CAEBR,Caenorhabditis briggsae Q61R54_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61V90_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61A94_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60TP4_CAEBR,Caenorhabditis briggsae Q6 OMl0_CAEBR, Caenorhabditis elegans GCY3 7_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY31_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 6_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 2_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY35_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 4_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY3 3_CAEEL, Oryzias curvinotus Q7T04 0_ORYCU, Oryzias curvinotus Q75WFO_ORYCU, Oryzias latipes P79998_ORYLA, Oryzias latipes Q7ZSZ5_ORYLA, Tetraodon nigroviridis Q4SW3 8_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4RZ94_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4 S 6 K5_TETNG, Fugu rubripes Q90VY5_FUGRU, Xenopus laevis Q6INK9_XENLA, Homo sapiens Q5T8J7_HUMAN, Homo sapiens GCYA2_HUMAN, Homo sapiens GCYB2_HUMAN, Homo sapiens GCYB1_HUMAN, Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM, Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY, Pan troglodytes Q9N192_PANTR, Macaca mulatta Q9N194_MACMU, Hylobates lar Q9N191_HYLLA, Mus musculus Q8BXH3_MOUSE, Mus musculus GCYB1_M0USE, Mus musculus Q3UTI4_MOUSE, Mus musculus Q3 UH8 3 _MOUS E, Mus musculus Q6XE41_MOUSE, Mus musculus Q80YP4_MOUSE, Rattus norvegicus Q80WX7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX8_RAT, Rattus norvegicus Q920Q1_RAT, Rattus norvegicus Q54A43_RAT, Rattus norvegicus Q80WY0_RAT, Rattus norvegicus Q80WY4_RAT, Rattus norvegicus Q8CH85_RAT, Rattus norvegicus Q80WY5_RAT, Rattus norvegicus GCYB 1_RAT, Rattus norvegicus Q8CH90_RAT, Rattus norvegicus Q91XJ7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX9_RAT, Rattus norvegicus GCYB2_RAT, Rattus norvegicus GCYA2_RAT, Canis familiaris Q4ZHR9 CANFA, Bos taurus GCYB1_B0VIN, Sus scrofa Q4ZHR7_PIG, Gryllus bimaculatus Q59HN5_GRYBI, Manduca sexta 077106_MANSE, Manduca sexta 076340_MANSE, Apis mellifera Q5UAFO_APIME, Apis mellifera Q5 FANO_APIME, Apis mellifera Q6L5L6_APIME, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PYK9_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7Q9W6_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7QF31_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PS01_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae Q 7 KQ 9 3_ANOGA, Drosophila melanogaster Q24 086_DROME, Drosophila melanogaster GCYH_DROME, Drosophila melanogaster GCY 8E_DROME, Drosophila melanogaster GCYDA_DROME, Drosophila melanogaster GCYDB_DROME, Drosophila
melanogaster Q9VA09_DROME, Drosophila pseudoobscura Q29CE l_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C7_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C8_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q2 9BU7_DROPS, Aplysia californica Q7YWK7_APLCA,
Hemicentrotus pulcherrimus Q95NK5_HEMPU, Chlamydomonas reinhardtii, Q5YLC2_CHLRE, Anabaena sp Q8YUQ7_ANASP, Flavobacteria bacterium BBFL7 Q26GR8_9BACT, Psychroflexus torquis ATCC 700755 QIVQE5 9FLAO, proteobactéria marinha gama HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM, proteobactéria marinha gama HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM, Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCRf Acidiphilium cryptum JF-5 Q2DG60_ACICY, Rhodobacter sphaeroides Q3J0U9 RHOS4, Silicibacter pomeroyi Q5LPVI_SILP0,Paracoccus denitrificans PD1222,
Q3PC67_PARDE, Silicibacter sp TMl 040 Q3QNY2_9RHOB, Jannaschia sp Q28ML8_JANSC, Magnetococcus sp MC-I Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL, Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X268_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3, Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT, Shewanella oneidensis Q8EF49 SHEON, Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2, Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR, Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio alginolytieus 12G01 QIVCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722 Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolytieus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fischeri Q5E1F5_VIBF1, Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY, Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella chejuensis Q2S FY7_HAHCH, Oceanospirillum sp MED 9 2 Q2BKV0_9GAMM, Oeeanobaeter sp RED65 Q1N03 5_9GAMM, Desulfovibrio desulfurieans Q310U7_DESDG, Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM,Thermoanaerobaeter tengeongensis Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saeeharolytieus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA, Clostridium aeetobutylieum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT,
Clostridium tetani Q899J9_CLOTE e Clostridium beijerineki NCIMB 8052 Q2WVNO_CLOBE. Prevê-se que essas seqüências codifiquem proteínas H-NOX com base na identificação dessas proteínas como pertencentes à família da proteína H-NOX com o uso da base de dados Pfam aqui descrita.
Proteínas H-NOX e ácidos nucléicos adicionais que podem ser adequados para uso nas composições farmacêuticas e métodos aqui descritos podem ser identificados com o uso de métodos padronizados. Por exemplo, programas padronizados de alinhamento de seqüências e/ou de previsão de estrutura podem ser usados para identificar proteínas H- NOX e ácidos nucléicos adicionais com base na similaridade de sua estrutura primária e/ou secundária de proteína prevista com aquela de proteínas H-NOX e ácidos nucléicos conhecidos. Por exemplo, a base de dados Pfam usa algoritmos de alinhamento definidos e Modelos Ocultos de Markov (por exemplo, Pfam 21.0) para categorizar as proteínas em famílias como, por exemplo, a família da proteína H-NOX (Pfam - uma base de dados de alinhamentos de domínio de família de proteína e Modelos Ocultos de Markov, Marca Registrada (C) 1996-2006 "The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc.", 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, EUA) . Bases de dados padronizadas como, por exemplo, a base de dados "swissprot- trembl" (na Internet em "expasy.org", "Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU" - 1 rue Michel Servet CH-1211 Genebra 4, Suíça) também podem ser usadas para identificar membros da família da proteína H-NOX. A estrutura secundária e/ou terciária de uma proteína H-NOX pode ser prevista com a utilização dos ajustes padronizados de programas padronizados de previsão de estrutura como, por exemplo, PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, Nova York, N.Y. 10032, EUA). Alternativamente, a estrutura secundária e/ou terciária real de uma proteína H-NOX pode ser determinada com a utilização de métodos padronizados.
Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui o mesmo aminoácido na posição correspondente que qualquer um dos seguintes resíduos da bolsa distai em H-NOX de T. tengcongensis: Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyrl40, Leul44 ou qualquer combinação de dois ou mais dos citados anteriormente. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui uma prolina ou uma arginina em uma posição que corresponde àquela de Proll5 ou Argl35 de H-NOX de T. tengcongensis, respectivamente, com base no alinhamento de seqüências de suas seqüências de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui uma histidina que corresponde a Hisl05 de R. norvegicus β1 H-NOX. Em algumas modalidades, a proteína H- NOX possui ou prevê-se que tenha uma estrutura secundária que inclui seis hélices alfa, seguidas por duas fitas beta, seguidas por uma hélice alfa, seguida por duas fitas beta.
Essa estrutura secundária foi relatada para proteínas H- NOX.
Se desejado, uma proteína H-NOX recém-identificada pode ser testada para determinar se ela se liga ao heme com a utilização de métodos padronizados. A habilidade de uma proteína H-NOX para funcionar como um transportador de NO pode ser testada determinando-se se a proteína H-NOX se liga ao NO com a utilização de métodos padronizados como aqueles aqui descritos. Se desejado, uma ou mais das mutações aqui descritas podem ser introduzidas na proteína H-NOX para otimizar suas características como transportador de NO. Por exemplo, podem ser introduzidas uma ou mais mutações para alterar sua constante de dissociação de NO, a koff para NO, kl para NO, k2 para NO, constante de dissociação de O2, a estabilidade ao NO, reatividade de NO taxa de auto-oxidação de heme ou qualquer combinação de dois ou mais das citadas anteriormente. Técnicas padronizadas, tais como aquelas aqui descritas, podem ser usadas para medir esses parâmetros.
Como aqui discutido, proteínas H-NOX mutantes (por exemplo, mutantes de classe I e de classe II discutidos abaixo) podem ser derivados por mutagênese a partir dessas ou de outras seqüências-fonte naturais do tipo selvagem (por exemplo, as seqüências listadas nas FIGS. 2-4D ou 8A- 8DD ou qualquer outra seqüência aqui descrita). Como aqui usado, o termo "derivada de" refere-se à fonte da proteína na qual uma ou mais mutações é introduzida. Por exemplo, uma proteína que é "derivada de uma proteína de mamífero" refere-se à proteína de interesse que resulta da introdução de uma ou mais mutações na seqüência de uma proteína do tipo selvagem de mamífero (ou seja, uma seqüência que ocorre na natureza) .
Proteínas H-NOX mutantes
Como aqui discutido anteriormente, uma proteína H-NOX pode conter uma ou mais mutações, por exemplo, uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a koff para NO, a taxa de auto-oxidação, a reatividade ao NO, a estabilic" Nie ao NO, ou qualquer combinação de duas ou mais das C-liJtdas anteriormente, comparadas com aquelas da proteína do tipo selvagem correspondente. Podem ser gerados painéis de proteínas H-NOX projetadas por mutagênese aleatória, seguida por rastreamento empírico para constantes de dissociação, taxas de dissociação, reatividade ao NO, estabilidade, compatibilidade fisiológica necessárias ou desejadas, ou qualquer combinação de dois ou mais das citadas anteriormente, à luz dos ensinamentos aqui fornecidos com a utilização de técnicas aqui descritas e, adicionalmente, como conhecido por aqueles habilitados na técnica. Alternativamente, a mutagênese pode ser direcionada seletivamente para regiões ou resíduos específicos, tais como resíduos da bolsa distai aparentes a partir da estrutura tridimensional determinada experimentalmente ou prevista de uma proteína H-NOX (FIG. IA nessa especificação; e veja, por exemplo, Boon, E. M. e cols. (2005), "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase" , Nature Chemical Biology 1: 53- 59, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação às seqüências de proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes) ou resíduos conservados evolutivamente identificados a partir de alinhamentos de seqüências (FIGS. 2-4 nessa especificação; e veja, por exemplo, Boon E.M. e cols. (2005), "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chemical Biology 1: 53-59, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação às seqüências de proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes).
Como aqui usado, o termo "proteína mutante" significa uma proteína com uma ou mais mutações, comparada com uma proteína que ocorre na natureza. Em uma modalidade, a proteína mutante possui uma seqüência que difere daquela de todas as proteínas que ocorrem na natureza. Em várias modalidades, a seqüência de aminoácidos da proteína mutante é pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 ou 99,5% idêntica àquela da região correspondente de uma proteína que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, a proteína mutante é um fragmento de proteína que contém pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ou 400 aminoácidos contíguos de uma proteína de comprimento total. A identidade de seqüência pode ser medida, por exemplo, com o uso de um software de análise de seqüências com os parâmetros padronizados aqui especificados (por exemplo, Pacote de Softwares de Análise de Seqüências do "Genetics Computer Group", "University of Wisconsin Biotechnology Center", 1710 University Avenue, Madison, WI 53705) . Esse programa combina seqüências similares por atribuição de graus de homologia para várias substituições, eliminações e outras modificações de aminoácidos.
Como aqui usado, o termo "mutação" significa uma alteração em um ácido nucléico ou em uma seqüência de aminoácidos de referência que ocorre na natureza. Mutações de ácidos nucléicos exemplares incluem uma inserção, eliminação, mutação estrutural, mutação silenciosa, mutação do tipo nonsense ou mutação do tipo missense. Em algumas modalidades, a mutação do ácido nucléico não é uma mutação silenciosa. Mutações de proteínas exemplares incluem a inserção de um ou mais aminoácidos (por exemplo, a inserção de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos), a eliminação de um ou mais aminoácidos (por exemplo, a eliminação de resíduos do terminal N, do terminal C e/ou internos como, por exemplo, a eliminação de pelo menos cerca de 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ou mais aminoácidos, ou uma eliminação de cerca de 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ou 400 aminoácidos) , a substituição de um ou mais aminoácidos (por exemplo, a substituição de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos), ou combinações de dois ou mais dos citados anteriormente. Um truncamento funcional exemplar de uma proteína H-NOX inclui os resíduos 1-385 da seqüência de βΐ. Em algumas modalidades, uma proteína mutante possui pelo menos uma alteração de aminoácido, comparada com uma proteína que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, uma seqüência de ácidos nucléicos mutante codifica uma proteína que possui pelo menos uma alteração de aminoácido, comparada com uma proteína que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, o ácido nucléico não é uma versão degenerada de um ácido nucléico que ocorre na natureza que codifica uma proteína com uma seqüência de aminoácidos idêntica a uma proteína que ocorre na natureza. A nomenclatura usada para se referir a uma mutação de aminoácido em particular identifica, inicialmente, o aminoácido do tipo selvagem, seguido pelo número do resíduo e, finalmente, o aminoácido substituto. Por exemplo, Y140L significa que tirosina foi substituída por uma leucina no número de resíduo 14 0.
Uma "mutação conservada evolutivamente" é a substituição de um aminoácido em uma proteína por um aminoácido na posição correspondente de outra proteína na mesma família de proteína. Mutações conservadas evolutivamente exemplares (também denominadas mutações da classe I) estão listadas na Tabela IA. Na Tabela IA, as mutações são numeradas/anotadas de acordo com a seqüência de H-NOX β1 humana, mas são análogas para todas as seqüências de H-NOX. Dessa forma, a posição correspondente em qualquer outra proteína H-NOX pode ser mutada para o resíduo indicado. Por exemplo, Phe4 de H-NOX βΐ humana podem ser mutada para uma tirosina, uma vez que outras proteínas H-NOX possuem uma tirosina nessa posição. 0 resíduo de fenilalanina correspondente pode ser mutado para uma tirosina em qualquer outra proteína H-NOX. Em modalidades específicas, uma ou mais mutações estão confinadas aos resíduos conservados evolutivamente. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações podem incluir pelo menos uma mutação conservada evolutivamente e pelo menos uma mutação não conservada evolutivamente. Se desejado, essas proteínas H-NOX mutantes são submetidas ao rastreamento empírico para constantes de dissociação de N0/02, reatividade ao NO, estabilidade e compatibilidade fisiológica à luz dos ensinamentos aqui fornecidos. Tabela IA. Mutações de H-NOX da Classe I exemplares dirigidas aos resíduos conservados evolutivamente
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Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação da bolsa distai, por exemplo, uma mutação de um resíduo na hélice alfa A, D, E ou G (Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), uCrystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101(35): 12.854-12.859). Mutações exemplares da bolsa distai (também denominadas mutações da classe II) estão listadas na Tabela IB. Na Tabela IB, as mutações são numeradas/anotadas de acordo com a seqüência de H-NOX βΐ humana, mas são análogas para todas as seqüências de H-NOX. Como várias substituições fornecem mutações viáveis em cada resíduo citado, o resíduo em cada posição indicada pode ser alterado para qualquer outro aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural (denominado "X"). Estas mutações podem produzir proteínas H-NOX com diversas características desejadas de afinidade, estabilidade e reatividade.
Tabela 1B. Mutações de H-NOX da Classe II exemplares direcionadas aos resíduos da bolsa distai
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Em modalidades particulares, a mutação é uma mutação de heme da bolsa distai. Como aqui descrito, um determinante molecular crucial que evita a ligação ao O2 em membros da família de H-NOX de ligação ao NO é a ausência de um doador de ligação H na bolsa distai do heme. Conseqüentemente, em algumas modalidades, a mutação altera a ligação de H entre o domínio de H-NOX e o ligante dentro da bolsa distai. Em algumas modalidades, a mutação rompe um doador de ligação H da bolsa distai e/ou transmite redução de ligação de ligante de O2 em relação ao domínio de H-NOX do tipo selvagem correspondente. Resíduos da bolsa distai exemplares incluem hr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyrl40 e Leul44 de H-NOX de T. tengcongensis e os resíduos correspondentes em qualquer outra proteína H-NOX.
Resíduos que não estejam na bolsa distai também podem afetar a estrutura tridimensional do grupo heme; essa estrutura, por sua vez, afeta a ligação de O2 e de NO ao ferro no grupo heme. Conseqüentemente, em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui uma ou mais mutações fora da bolsa distai. Exemplos de resíduos que podem ser mutados, mas que não estão na bolsa distai, incluem Proll5 e Argl35 de H-NOX de T. tengcongensis. Em algumas modalidades, a mutação está na bolsa proximal que inclui His105 como um resíduo que se liga ao ferro de heme.
Em algumas modalidades, quando duas ou mais mutações estão presentes, pelo menos uma mutação está na bolsa distai, e pelo menos uma mutação está fora da bolsa distai (por exemplo, uma mutação na bolsa proximal). Em algumas modalidades, todas as mutações estão na bolsa distai.
Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos da proteína H-NOX não é idêntica ã seqüência de uma proteína que é produzida por um organismo na natureza. Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos da proteína H-NOX não é idêntica a uma seqüência encontrada em qualquer base de dados em 21 de maio de 2006 ou em 22 de maio de 2006 (por exemplo, todas as seqüências previstas conhecidas ou conhecidas como sendo uma seqüência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos de H-NOX). Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos da proteína H-NOX não é idêntica a uma seqüência encontrada em qualquer base de dados em 21 de maio de 2007 ou em 22 de maio de 2007 (por exemplo, todas as seqüências previstas conhecidas ou conhecidas como sendo uma seqüência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos de H- NOX) .
Para reduzir a imunogenicidade de proteínas H-NOX derivadas de outras fontes que não seres humanos, os aminoácidos em uma proteína H-NOX podem ser mutados para os aminoácidos correspondentes em uma H-NOX humana. Por exemplo, um ou mais aminoácidos na superfície da estrutura terciária de uma proteína H-NOX não humana podem ser mutados para o aminoácido correspondente em uma proteína H- NOX humana. Em algumas variações, uma mutação de um ou mais aminoácidos de superfície pode ser combinada com uma mutação de dois ou mais resíduos da bolsa distai, uma mutação de um ou mais resíduos fora da bolsa distai (por exemplo, uma mutação na bolsa proximal), ou combinações de dois ou mais dos citados anteriormente. Mutações exemplares são mostradas na Tabela 2. Além disso, qualquer um dos resíduos listados na Tabela 2 pode ser mutado para qualquer outro aminoácido. A invenção também está relacionada a qualquer combinação de mutações aqui descritas como, por exemplo, mutações duplas, triplas ou maiores. Por exemplo, combinações de qualquer uma das mutações aqui descritas podem ser feitas na mesma proteína H-NOX. Observe que mutações em posições equivalentes em outras proteínas H-NOX de mamíferos ou não mamíferos também são englobadas por essa invenção. Se desejado, resíduos diferentes daqueles mencionados na Tabela 2 também podem ser mutados. Proteínas H-NOX mutantes exemplares compreendem uma ou mais mutações que transmitem alteração da ligação de ligante de O2 ou NO em relação ao domínio de H-NOX do tipo selvagem correspondente, e são operacionais como um transportador de NO gasoso sangüíneo fisiologicamente compatível de mamíferos.
Na Tabela 2 e em todas as tabelas subseqüentes, o número de resíduo para uma mutação indica a posição na seqüência da proteína H-NOX em particular descrita. Por exemplo, T. tengcongensis I5A refere-se à substituição de isoleucina por alanina na quinta posição em H-NOX de T. tengcongensis. A mesma mutação de isoleucina em alanina pode ser feita no resíduo correspondente em qualquer outra proteína H-NOX (esse resíduo pode ou não ser o quinto resíduo na seqüência de outras proteínas H-N0X). Como a seqüências de aminoácidos dos domínios de β1 H-NOX mamíferos diferem em, no máximo, dois aminoácidos, espera- se também que as mutações que produzem as proteínas H-NOX mutantes desejáveis, quando introduzidas nas proteínas βΐ H-NOX do tipo selvagem de rato, produzam proteínas H-NOX mutantes desejáveis quando introduzidas em proteínas βΐ H- NOX do tipo selvagem de outros mamíferos, por exemplo, seres humanos.
Em algumas modalidades a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação na qual um resíduo que corresponde a Ile5, Trp9, Asn74, Proll5, Argl35 ou ou Tyrl40 de H-NOX de T. tengcongensis ou 1145 de βΐ (1-385) ou Phel42 de L. pneumophila 2 ê substituído por qualquer outro aminoácido.
Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos duas mutações, em que pelo menos uma mutação é a substituição de um resíduo que corresponde a Ile5, Trp9, Asn74, Proll5 ou Argl35, ou Tyrl40 de H-NOX de T. tengcongensis, 1145 de βΐ(1-385) ou Phel42 de L. pneumophila 2 por qualquer outro aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação na proteína H-NOX corresponde a uma mutação de I5A, uma mutação de I5L, uma mutação de W9F, uma mutação de Y140F, uma mutação de YI40L, uma mutação de Y140H, uma mutação dupla de W9F Y14 0H ou uma mutação dupla F78Y Y 14OF de T. tengcongensis ou uma mutação de 1145Y de pi. Em algumas modalidades, a mutação na proteína H-NOX corresponde a uma mutação de W9Y, uma mutação de W9H, uma mutação de W9N, uma mutação de N74H, uma mutação de N74E, uma mutação de N74A, uma mutação de P115A, uma mutação de RQ135, um mutante duplo de I5L P115A, um mutante duplo de N74A Y14 0H, ou um mutante duplo W9F N74A de T. tengcongensis. Em algumas modalidades, pelo menos um aminoácido do terminal C (como pelo menos cerca de 50 aminoácidos contíguos do terminal C ou entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos contíguos do terminal C) na proteína H-NOX foram removidos, comparados com a proteína do tipo selvagem correspondente (como R. norvegicus ou H sapiens β1) .
Tabela 2. H-NOX mutantes exemplares de T. tengcongensis (Tt),L. pneumophila (Lp) , D. desulfuricans (Dd) , V. cholera (Vc) , N. puxictiforme (Np) , C. botulinum (Cb) , C. acetobutylicum, (Ca) , de rato, humanas, de C. elegans (Ce) .
<table>table see original document page 73</column></row><table> Tt Ν74Η 7VN74A-
ΥΙ40Η Tt I75F His6 Ti F78Y- Y140L Tt F78Y- Y14ÔF Tt Ψί 15A Tt RI35Q His6
7VY140F Tlf Y140L Tt Y140H TtYUOA Tt L144F His6
Modificações nas proteínas H-NOX
Qualquer uma das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes pode ser modificada e/ou formulada com a utilização de métodos padronizados para aprimorar as aplicações terapêuticas ou industriais. Por exemplo, e particularmente aplicados às proteínas H-NOX heterólogas projetadas, diversos métodos são conhecidos na técnica para o isolamento desses agentes da vigilância imunológica, incluindo entrecruzamento, PEGuilação, decoração de carboidrato etc. (por exemplo, Rohlfs, R.J. e cols. (15 de maio de 1998), "Arterial Blood Pressure Responses to Cell- Free Hemoglobin Solutions And The Reaction With Nitric Oxide", J. Biol. Chem. 273(20): 12.128-12.134; Migita, R. e cols. (junho de 1997), uBlood Volume And Cardiac Index in Rats After Exchange Transfusion With Hemoglobin-Based Oxygen Carriers" , J. Appl. Physiol. 82 (6): 1.995-2.002; Vandegriff, K.D. e cols. (15 de agosto de 2004), "Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)- Conjugated Human Haemoglobin", Biochem. J. 382 (Pt 1): 183- 189, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à modificação de proteínas), bem como outras técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. A fusão de uma proteína H-NOX com uma proteína humana como, por exemplo, albumina sérica humana, pode aumentar a meia-vida sérica, a viscosidade e a pressão oncõtica coloidal. Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX é modificada durante ou depois de sua síntese para diminuir sua imunogenicidade e/ou para aumentar seu tempo de retenção plasmática. As proteínas H- NOX também podem ser encapsuladas (por exemplo, encapsulação dentro de lipossomos ou nanopartícuias).
Características de proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes
Como aqui descrito, foi gerado um grande número de proteínas H-NOX mutantes variadas que fornecem intervalos de constantes de dissociação de NO e de O2, koff de NO, de k0ff de O2, de reatividade ao NO, taxa de auto-oxidfação, tempo de retenção de plasma, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados a qualquer um dos compostos atualmente usados para liberação de NO, como
Como acima discutido, a baixa reatividade intrínseca de NO (e alta estabilidade de NO) tornam a proteína H-NOX de tipo selvagem e mutante transportadores de NO desejáveis por causa da menor probabilidade de inativação das proteínas H-NOX por NO na presença de O2. Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX tem uma baixa afinidade por O2 (coo uma constante de dissociação de O2 de pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C) ou nenhuma afinidade detectável por O2. Um vez que pouco, se houver, O2 é ligado à proteína H- NOX, há oxidação mínima por NO de O2 ligado ao heme da proteína H-NOX. Portanto, NO, O2, e proteína H-NOX mínimos são inativados por essa oxidação de NO. Portanto, mais NO pode ser liberado a locais desejados em um indivíduo e menos O2 que pode ser usado pelos tecidos no indivíduo é destruído.
Como aqui usado, o termo "hemoglobina" significa uma proteína ou um mutante desta da família bem caracterizada de hemoglobinas, que são metaloproteínas de transporte de O2 que contêm ferro, em células sangüíneas vermelhas. A hemoglobina humana purificada, sem estroma, possui uma Kd cinética para o O2 de cerca de 200-500 nM. Esse valor depende da subunidade.
Por "um complexo 6-coordinado de Fe11-NO" entende-se um 6-coordenado ferroso-nitrosil que produz um pico UV-Vis Soret em aproximadamente 416-422 nm, como descrito, por exemplo, por Βοοη, Ε. M. e cols., (agosto 2006), "Niytic Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase βΐ HONOX Domain," J. Biol. Chem. 281(31): 21892-21902, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação à determinação do percentual de uma amostra de proteína H-NOX que contém um complexo 6-coordenado Fe11-NO e o percentual de uma amostra de proteína H-NOX que contém um complexo 5-coordenado Fe11- N0.
Por "um complexo 5-coordenado Fe11-NO" entende-se um 5-coordenado ferroso-nitrosil que produz um pico UV-Vis Soret em aproximadamente 397-400 nm, como descrito, por exemplo, por Βοοη, Ε. M. e cols., (agosto 2006), "Nitic Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase βΐ HONOX Domain," J. Biol. Chem. 281(31): 21892-21902, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação à determinação do percentual de uma amostra de proteína H-NOX que contém um complexo 6-coordenado Fe11-NO e o percentual de uma amostra de proteína H-NOX que contém um complexo 5-coordenado Fe11- NO.
Como aqui usado, o termo "Icoff" significa uma taxa de dissociação, como a taxa de liberação de O2 ou de NO por uma proteína. Um valor numérico de koff menor indica uma taxa de dissociação mais lenta. Para uma proteína H-NOX com um complexo 6-coordenado Fe11-NO, a koff para NO é calculada como descrito por Βοοη, Ε. M. et al. , (agosto 2006), "Nitic Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase βΐ HONOX Domain," J. Biol. Chem. 281(31): 21892-21902, e Βοοη, E.M. et al. (2005). "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase," Nature Chemical Biology 1:53-59, que são que incorporados em suas totalidades por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO para proteínas H-NOX. Para uma proteína H-NOX com um complexo 5-coordenado Fe11-NO, a koff para NO é descrita pela ki para NO e a k2 para NO, como descrito por Winger, J. A. e cols., (janeiro 2007) "Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanyilate Cyclase and Heme- Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs". J. Biol. Chem. 282(2): 897-907, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO, kl de, e k2 de NO para proteínas H-NOX. Para uma proteína H- NOX que contém uma mistura de complexos 5-coordenado e 6- coordenado Fe11-NO, a koff para NO é descrita pela kl para NO e a k2 para NO, como descrito por Winger, J. A. e cols. , (janeiro 2007) "Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanyilate Cyclase and Heme- Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs". J. Biol. Chem. 282 (2): 897-907, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO, kl de, e k2 de NO para proteínas H-NOX.
Em algumas modalidades, a koff, kl ou k2 para NO para uma proteína H-NOX é entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 a cerca de 10 s"1 a 37°C como entre 1 χ IO"4 s"1 a cerca de 0,012 s"1, cerca de 1 χ IO"4 s"1 a cerca de 0,007 s"1, cerca de 0,005 s" 1 a cerca de 0,011 s"1, ou cerca de 1 χ IO"4 s"1 a cerca de 1 x 10"3 s"1. Em várias modalidades, a koff para O2 para uma proteína H-NOX é entre cerca de 1 a cerca de 1.000 s"1 a 37°C, como cerca de 1 a cerca de 50 s"1, cerca de 50 a cerca de 100 s"1, cerca de 100 a cerca de 250 s"1, cerca de 250 a cerca de 500 s"1, cerca de 500 a cerca de 750 s"1, ou cerca de 750 a cerca de 1.000 s"1 a 37°C.
0 termo "kon" significa uma taxa de associação, por exemplo, a taxa de ligação de O2 ou NO a uma proteína. Um valor numérico menor da kon indica uma taxa de associação mais lenta. Em várias modalidades, a koff para O2 para uma proteína H-NOX é entre cerca de 0,14 a cerca de 60 μΜ"1 s"1 a 20°C como, cerca de 6 a cerca de 60 μΜ"1 s"1, cerca de 6 a 12 μΜ"1 s"1, cerca de 15 a cerca de 60 μΜ"1 s"1, cerca de 5 a cerca de 18 μΜ"1 s"1 ou cerca de 6 a cerca de 15 μΜ"1 s"1.
Por "constante de dissociação" significa uma "constante de dissociação cinêtica" ou uma "constante de dissociação calculada". Uma "constante de dissociação cinética" ou "KD" significa uma proporção de taxa cinética off (koff) para a taxa cinética on (k0n) > por exemplo, um valor de Kd determinado como um valor absoluto com a utilização de métodos padronizados (por exemplo, métodos espectroscópicos, de fluxo interrompido ou de fotólise instantânea padronizados), incluindo métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica e/ou aqui descritos. A "constante de dissociação calculada" ou wK0 calculada" refere-se a uma aproximação da constante de dissociação cinética com base em uma koff medida. Um valor para a kon é derivado por meio da correlação entre a Kd cinética e a k0ff, como aqui descritas. Para a KD calculada para NO, o valor para a kon para NO para uma proteína H-NOX é 710 μΜ"1 s"1, que é uma kon relatada para βΐ (1-385) que foi medida a 40C e não aumenta significativamente a 37°C (Zhao, e cols., (1999). "A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble Guanylate Cyclase," PNAS. 96:14753-14758, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de kon de NO para proteínas H-N0X) . Para a KD calculada para O2, um valor para kon é derivado por meio da correlação entre KD cinético e koff como aqui descrito.
Em várias modalidades, a Kd cinética ou calculada para a ligação de NO por uma proteína H-NOX está dentro de cerca de 0,01 a cerca de 100 vezes a da hemoglobina sob as mesmas condições (por exemplo, a 20°C), por exemplo, entre cerca de 0,1 a cerca de 10 vezes ou entre cerca de 0,5 a cerca de 2 vezes a da hemoglobina sob as mesmas condições (como a 20°C). Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está entre cerca de 0,1 a cerca de 20 pM a 37°C, como cerca de 0,5 a cerca de 15, cerca de 0,5 a cerca de 12, cerca de 0,7 a cerca de 4, ou cerca de 0,7 a cerca de 3 a 370C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX é pelo menos cerca de
0.1 pM a 37°C, como pelo menos cerca de qualquer um de 0,5, 1,3, 5, 10, 12, 50, 100, 400, 500, 1.000, 2.000, 3.000, OU 4.000 pM a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX is less menos que cerca de 5.000 pM a 37°C, como menos que cerca de qualquer um de 4.000 pM, 3.000 pM, 2.000 pM, 1.000 pM, 500 pM, 400 pM, 100 pM, 50 pM, 12 pM, 10 pM, 5 pM, 3 pM ou 1 pM a 37°C.
Em várias modalidades, a K0 cinética ou calculada para a ligação de O2 por uma proteína H-NOX está dentro de cerca de 0,01 a cerca de 100 vezes a da hemoglobina sob as mesmas condições (por exemplo, a 20°C), por exemplo, entre cerca de 0,1 a cerca de 10 vezes ou entre cerca de 0,5 a cerca de 2 vezes a da hemoglobina sob as mesmas condições (por exemplo, a 20°C). Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, como pelo menos cerca de 5 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ, 30 μΜ, 40 μΜ, 50 μΜ, 60 μΜ, 70 μΜ, 80 μΜ, 90 μΜ, ou 100 μΜ a 37 °C. Em algumas modalidades, não há qualquer ligação detectável a O2 a 37°C, como a ausência de ligação de O2 detectável com o uso de espectroscopia visível de UV como aqui descrito (por exemplo, uma ausência de um pico observável a -418 nm na presença de O2, como quando o pico de Soret permanece a -431 nm como observado na ausência de O2 ou quando o pico de Soret troca para -410 nm devido à proteína oxidada). Como aqui usado, o termo "afinidade por NO" é um termo qualitativo que se refere à potência da ligação de NO a uma proteína (como a ligação a um grupo heme ou a um oxigênio ligado a um grupo heme associado com uma proteína) . Essa afinidade é afetada tanto pela koff quanto pela kon por NO.
Um valor de Kd por NO numericamente inferior significa uma afinidade maior. "Afinidade por oxigênio" é um termo qualitativo que se refere à potência da ligação de oxigênio ã porção heme de uma proteína. Essa afinidade é afetada tanto pela koff quanto pela kon por oxigênio. Um valor de Kd por oxigênio numericamente inferior significa uma afinidade maior.
Como aqui usado, o termo "estabilidade ao NO" refere- se à estabilidade ou resistência de uma proteína à oxidação por NO na presença de oxigênio. Por exemplo, a habilidade da proteína para não ser oxidada quando ligada ao NO na presença de oxigênio é indicativa da estabilidade da proteína ao NO. Em algumas modalidades, menos do que cerca de 50, 40, 30, 10 ou 5% de uma proteína H-NOX são oxidados após incubação por cerca de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 ou 20 horas a 20°C.
Como aqui usado, o termo "reatividade ao NO" refere-se à taxa na qual o ferro no heme de uma proteína de ligação de heme é oxidado por NO na presença de oxigênio em uma concentração de 2 μΜ de proteína. Um menor valor numérico para a reatividade ao NO em unidades de s"1 indica uma reatividade ao NO menor. Em várias modalidades, a reatividade ao NO de uma proteína H-NOX é de menos do que cerca de 700 s"1 a 20°C como, por exemplo, menos do que cerca de 600 s~\ 500 s"1, 400 s"1, 300 s~\ 200 s"1, 100 s"\ 75 s"1, 50 s"1, 25 s"1, 20 s'1, 10 s~\ 50 s~\ 3 s"1, 2S"1, 1,8 s"1, 1,5 s"1, 1,2 s"1, 1,0 s"1, 0, 8 s"1, 0,7 s'1 ou 0,6 s"1 a 20°C. Em várias modalidades, a reatividade ao NO de uma proteína H-NOX é entre cerca de 0,1 a cerca de 600 s"1 a 20°C como, por exemplo, entre cerca de 0,5 a cerca de 4 00 s"1, cerca de 0,5 a cerca de 100 s"1, cerca de 0,5 a cerca de 50 s"1, cerca de 0,5 a cerca de 10 s"1, cerca de 1 a cerca de 5 s"1 ou cerca de 0,5 a cerca de 2,1 s"1 a 20°C. Em várias modalidades, a reatividade de uma proteína H-NOX é pelo menos cerca de 10, 100, 1.000 ou 10.000 vezes menor do que aquela da hemoglobina sob as mesmas condições, por exemplo, a 20°C.
Como aqui usado, o termo "taxa de auto-oxidação" refere-se à taxa na qual o ferro no heme de uma proteína de ligação de heme é auto-oxidado. Um valor numérico menor da taxa de auto-oxidação em unidades de s"1 indica uma taxa de auto-oxidação menor. Em várias modalidades, a taxa de auto- oxidação de heme de uma proteína H-NOX é de menos do que cerca de 1,0 h"1 a 37°C como, por exemplo, menos do que cerca de 0,9 h"1, 0,8 h"\ 0,7 h"1, 0,6 h"\ 0,5 h"1, 0,4 h"\ 0,3 h"1, 0,2 h"1, 0,1 h"1 ou 0,05 h"1 a 37°C. Em várias modalidades, a taxa de auto-oxidação de heme de uma proteína H-NOX é entre cerca de 0,006 a cerca de 5,0 h"1 a 37°C como, por exemplo, cerca de 0,006 a cerca de 1,0 h"1, 0,006 a cerca de 0,9 h"1 ou cerca de 0,06 a cerca de 0,5 h"1 a 37°C.
Em várias modalidades, uma proteína H-NOX mutante possui: (a) uma constante de dissociação de O2 ou NO, uma taxa de associação (kon para O2 ou NO) ou uma taxa de dissociação (koff para O2 ou NO) dentro de 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, (b) possui uma afinidade por NO mais fraca (por exemplo, pelo menos cerca de 10 vezes, 100 vezes ou 1.000 vezes mais fraca) do que aquela de sGC βΐ, (c) uma reatividade ao NO com O2 ligado pelo menos 1.000 vezes menor do que a hemoglobina, (d) um tempo de retenção plasmática in vivo pelo menos 2, 10, 100 ou 1.000 vezes maior do que aquele da hemoglobina, ou (e) qualquer combinação de dois ou mais dos citados anteriormente.
Transportadores de NO adequados exemplares fornecem constantes de dissociação dentro de duas ordens de magnitude daquela da hemoglobina, ou seja entre cerca de 0,01 e 100 vezes, como entre cerca de 0,1 e 10 vezes, ou entre cerca de 0,5 e 2 vezes daquelas da hemoglobina. Podem ser usadas diversas técnicas estabelecidas para quantificar as constantes de dissociação, por exemplo, as técnicas aqui descritas (Boon, E.M. e cols. (2005), "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chem.
Biol. 1: 53-59; Boon, E.M. e cols. (outubro de 2005), "Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins", Curr. Opin. Chem.
Biol. 9(5): 441-446; Boon, E.M. e cols. (2005), "Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors", J. Inorg. Biochem. 99(4): 892-902), Vandegriff, K.D. e cols. (15 de agosto de 2004), "Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin", Biochem. J. 382(Pt 1): 183-189, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à medida de constantes de dissociação), além daquelas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Transportadores de NO exemplares fornecem reatividade da proteína H-NOX ao NO baixa ou minimizada com O2 ligado, como uma reatividade ao NO menor do que aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades, a reatividade ao NO é bem menor como, por exemplo, pelo menos cerca de 10, 100, 1.000 ou 10.000 vezes menor do que aquela da hemoglobina. Podem ser usadas diversas técnicas estabelecidas para quantificar a reatividade ao NO (Boon, E.M. e cols. (2 005), "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chem. Biol. 1: 53-59; Boon, E.M. e cols. (outubro de 2005) , "Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins", Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5): 441-446; Boon, E.M. e cols. (2005), "Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors", J. Inorg. Biochem. 99(4): 892-902), Vandegriff, K.D. e cols. (15 de agosto de 2004), wKinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin", Biochem. J. 382(Pt 1): 183-189, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à medida da reatividade ao NO) , além daquelas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Como as H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis possuem uma reatividade ao NO muito baixa, outras proteínas H-NOX do tipo selvagem e proteínas H-NOX mutantes podem ter uma baixa reatividade ao NO similar. Por exemplo, H-NOX Y14 0H de T. tengcongensis possui uma reatividade ao NO similar àquela da H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis.
Mutantes de exemplo para liberação de NO têm uma afinididade mais fraca por NO, preferivelmente pelo menos 10 vezes, 100 vezes, ou 1.000 vezes mais fraca que aquela de sGC βΐ. Para a liberação terapêutica de NO (por exemplo, durante/após um ataque cardíaco, cirurgia cardíaca aberta, ou AVC) várias proteínas H-NOX projetadas com afinidades variáveis são empiricamente testadas para eficácia emn estados de doença particulares, com uma faixa em algumas modalidades de afinidades de NO de 0,1 a 1.000 nM.
Além disso, transportadores de NO adequados fornecem estabilidade elevada ou maximizada, particularmente estabilidade in vivo. Podem ser utilizadas diversas medidas da estabilidade, como a estabilidade oxidativa (por exemplo, estabilidade à auto-oxidação ou à oxidação por NO) , estabilidade à temperatura e a estabilidade in vivo.
Podem ser usadas diversas técnicas estabelecidas para quantificar a estabilidade, como as técnicas aqui descritas (Boon, E.M. e cols. (2005), "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E.M. e cols. (outubro de 2005), "Ligand Discrimination in Soluble. Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins", Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5): 441-446; Boon, E.M. e cols. (2005), "Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors", J. Inorg. Biochem. 99(4): 892-902), além daquelas conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
Para a estabilidade in vivo no plasma, sangue ou tecido, medidas exemplares da estabilidade incluem o tempo de retenção, a taxa de depuração e a meia-vida. Espera-se que as proteínas H-NOX de organismos termofílicos sejam estáveis em temperaturas elevadas. Em várias modalidades, os tempos de retenção plasmática são pelo menos cerca de 2, 10, 100 ou 1.000 vezes maior do que aquela da hemoglobina (por exemplo, Bobofchak, K.M. e cols. (agosto de 2003), "A Recombinant Polymeric Hemoglobin With Conformational, Functional, And Physiological Characteristics of an in vivo O2 transporter", Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285(2): H549-H561). Como será observado por aqueles habilitados na técnica, transportadores com base em hemoglobina são limitados pela depuração rápida da hemoglobina sem células do plasma em função da presença de receptores para hemoglobina que removem hemoglobina sem células do plasma. Como não há receptores para proteínas H- NOX no plasma, espera-se que as proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes tenham um tempo de retenção plasmática mais longo do que o da hemoglobina. Se desejado, o tempo de retenção plasmática pode ser aumentado por PEGuilação ou entrecruzamento de uma proteína H-NOX ou por fusão de uma proteína H-NOX com outra proteína com a utilização de métodos padronizados (por exemplo, aqueles aqui descritos e aqueles conhecidos por aqueles habilitados na técnica).
Em várias modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades, a koff, k1 ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 a cerca de 10 s"1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C. Em algumas modalidades, a koff, kl ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 a cerca de 10 s"1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C. a koff, kl ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 a cerca de 10 s"1 a 37°C, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1 a 20°C (por exemplo, Iess menos que cerca de 600 s" ¹,500 s"1, 100 s"1, 20 s"1, ou 1,8 s"1 a 20°C) . Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1 a 20°C (por exemplo, menos que cerca de 600 s"1, 500 s"1, 100 s"1, 20 s"1, ou 1,8 s"1 a 20°C) . Em algumas modalidades, a koff, kl ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 a cerca de 10 s"1 a 37°C, e a taxa de auto-oxidação de heme da proteína H-NOX é de menos cerca de 1 h"1 a 37°C.
Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37 °C. Em algumas modalidades, a taxa de auto- oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de h"1 a 37°C, ea reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1 a 20°C (por exemplo, Iess menos que cerca de 600 s"1, 500 s"1, 100 s"1, 20 s"1, ou 1,8 s"1 a 20°C). Em algumas modalidades, a viscosidade da solução de proteína H-NOX é entre 1 e 4 centipoise (cP) . Em algumas modalidades, a pressão oncótica coloidal da solução de proteína H-NOX é entre 20 e 50 mm Hg.
A Tabela 3 lista tamanhos, afinidades por oxigênio, estabilidades à auto-oxidação, taxas de reatividade ao NO e modificações exemplares para proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes. Na Tabela 3, o tamanho do veículo refere-se ao peso molecular de uma proteína H-NOX modificada (por exemplo, PEGuilada) ou não modificada
Tabela 3: Modalidades exemplares para proteínas H-NOX
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Dados exemplares para mutantes particulares são registrados nas Tabelas 4-14. Nas Tabelas 4-14, β1 e β2 referem-se às proteínas derivadas de proteínas H-NOX de rato. Como as seqüências de aminoácidos de domínios de proteínas βΐ H-NOX de mamíferos diferem em, no máximo, dois aminoácidos, esperam-se resultados similares para as mutações correspondentes em proteínas βΐ H-NOX de outros mamíferos, como βΐ humana.
A Tabela 4 demonstra que a constante de dissociação para ligação de NO pode ser significativamente alterada por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX.
Adicionalmente, a capacidade de reguladores alostéricos para afetar dramaticamente a constante de dissociação e taxa de dissociação de NO para sGC sustenta a capacidade de mutações que alteram a estrutura de sGC ou outras proteínas H-NOX para alterar a constante de dissociação e taxa de dissociação de NO. Se desejado, a constante de dissociação para ligação de NO pode ser ainda alterada por combinação de qualquer uma das mutações listadas na Tabela 4 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.
Table 4. Vlored e KD para ligação de NO a H-NOX e outras hemoproteínas
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Soluble Guanylate Cyclasef" PNAS. 96:14753-14758, medido a 4°C, as taxas se aproximam da taxa de difusão e não aumentam significativamente a 37°C; Winger, J. A. e cols., (janeiro de 2007) "Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme- Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs" J. Biol. Chem. 282 (2) : 897-907; d as faixas mais amplas de valores de k combinam da dissociação de NO da 5-coordenada e 6- coordenada, cada uma com média de 2 — 4 experimentos de dissociacao com o uso de CO de saturação e 30 mM Na2S204 como o NO trap e contendoi 0,88 — 2,2 μΜ de proteína. Os dados forma melhor adequados por uma equação exponencial dupla: <formula>formula see original document page 90</formula>
e medido a 20°C; f Morris, e cols., 1980 J Biol. Chem. 255: 8050-8053; 9 cálculo de KD, ajustado a 2>1°C, assumindo duplicação de taxa a cada 10°C, valor a 20°C mostrdo em parênteses; h Moore, e cols., (1976) . "Cooperativity in the Dissociation of Nitric Oxide from Hemoglobin," J Biol. Chem. 251: 2788-27 94; iassumindo a mesma kon que a de βΐ (1-385) (710 μΜ"3^"1) ; Βοοη, Ε. Μ. et al., (agosto de 2006), "Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase βΐ HONOX Domain,"J. Biol. Chem. 281(31): 21892-21902.
A Tabela 5 demonstra que a constante de dissociação (koff) para ligação de NO pode ser significativamente alterada por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX. A koff para essas proteínas H-NOX mutantes de exemplo varia de 0,00013 a 0,011 s"1 a 37°C. Para a Tabela 5, as taxas de dissociação de NO de hemoproteínas são derivadas com o uso de traps químicos como indicado em cada referência citada. Para comparação, as taxas de dissociação de NO de nitratos orgânicos e NONOatos são medidas com o uso de um eletrodo de NO e confirmadas com o ouso de um trap de oxihemoglobina. Quando necessário, os valores são ajustados para 37°C com o uso do fato de que as taxas duplicam aproximadamente para cada 10°C. Se desejado, a koff para ligação de NO pode ser também alterada por combinação de qualquer uma das mutações única ou dupla listadas na Tabela 5 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.
Tabela 5. Comparação de taxas de dissociação de NO de hemoproteína e nitrovasodilatador a 37°C. <table>table see original document page 91</column></row><table>
a Winger, J. A. e cols., (janeiro de 2007) "Dissociation
of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme- Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs" J. Biol. Chem. 282(2): 897-907; b Βοοη, Ε. M. e cols., (August 2006), "Nitric Oxide Binding to Prokaryotie Homologs of the Solube Guanylate Cyelase βΐ HONOX Domain,"J. Biol. Chem. 281(31): 21892-21902; cMorrisi e cols., (1980). "The role of dif fusion in limiting the rate of ligand binding to hemoglobin" J Biol. Chem. 255:8050-8053; d Moore, e cols., (1976). wCooperativity in the dissociation of nitric oxide from hemoglobin," J BioL Chem. 251: 2788-27 94; e Maes, e cols., (2004) "Role of Binding Site Loops in Controlling Nitric Oxide Release: Structure and Kinetics of Mutant Forms of Nitrophorin 4" Biochemistry 43 (21) :6679-90; f Artz, J.D. e cols., (1998) "NO Release from NO Donors e Nitrovasodilators: Comparisons between Oxyhemoglobin and Potentiometric Assays," Chem. Res. ToxicoL 11(12):1393- 1397; 9Boon, Ε. M e cols., (2006) "Sensitive and Selective Detection of Nitric Oxide Using an H-NOX Domain," JACS 128:10022-10023.
Como mostrado na Tabela 6, a introdução de uma ou mais mutações nas proteínas H-NOX de tipo selvagem permite que sejam alteradas a taxa de auto-oxidação e a taxa de dissociação de O2. Se desejado, a taxa de auto-oxidação ou a taxa de dissociação de O2 também podem ser alteradas por combinação de qualquer uma das mutações única ou dupla listadas na Tabela 6 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína HNOXf como aqui descrito.
Tabela 6. Estabilidade à auto-oxidação, propriedades de ligação de O2 (por exemplo, taxa de dissociação de O2) e resíduos de ligação de H da bolsa distai estão listados para proteínas H-NOX da classe II do tipo selvagem e mutantes
<table>table see original document page 92</column></row><table> <table>table see original document page 93</column></row><table> <table>table see original document page 94</column></row><table> 37°C, ainda não há indicação de auto-oxidação. d Apenas uma pequena porção da proteína forma um complexo com O2; a taxa relatada representa a cinética para essa população. e A proteína se liga ao O2, mas a koff não foi determinada. f Embora relativamente estável, essa proteína se precipitava à medida que era oxidada, tornando difícil medir a Jcox. 9 Não aplicável em função da instabilidade ou da oxidação rápida. h "Construção não estável" significa que a proteína se oxida imediatamente sob as condições testadas. 1 "Ligeiramente mais estável" significa que a proteína se oxida ao longo de um período de minutos a horas, mas não permanece estável além de 24 horas sob as condições testadas.
A Tabela 7 ilustra a alteração da taxa de associação de O2 (Jcon) , a taxa de dissociação de O2 (kaff) , a constante de dissociação de O2 (Kd) e a taxa de auto-oxidação (Jcox) em proteínas H-NOX pela introdução de uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 7 é combinada com outra mutação (por exemplo, outra mutação na Tabela 7 ou qualquer outra mutação aqui descrita) para alterar ainda mais a taxa de associação de O2, a taxa de dissociação de O2, a constante de dissociação de O2, a taxa de auto-oxidação ou combinações de dois ou mais dos citados anteriormente.
Tabela 7. Constantes de cinética de ligação de O2 para proteínas heme Fe11 ligadas por histidil_
<table>table see original document page 95</column></row><table> <table>table see original document page 96</column></row><table> <table>table see original document page 97</column></row><table>
a Constante de dissociação a 200C (nM) ; b Taxa de associação de O2 ao heme a 20°C (PM-1S"1) ; c Taxa de dissociação de O2 do heme a 20°C (s"1) ; d Taxa de auto- oxidação de heme (h"1) a 37°C; e Após 24 horas a 37°C, ainda não havia indicação de auto-oxidação; f Apenas uma pequena porção da proteína forma um complexo com O2, embora a cinética para essa população pudesse ser medida; 1 Boon, E.M. e cols. (junho de 2005), "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chemical Biology 1(1): 53-59, j Dados não publicados; k Springer, B.A. e cols. (1994) "Family Physicians Key Partners in Preventing Suicide Among Youth", Chem. Rev. 94: 699-714; 1Gilles-Gonzalez e cols. (1994) "Heme-Based Sensors, Exemplified by the Kinase FixL, are a New Class of Heme Protein with Distinctive Ligand Binding and Autoxidation", Biochemistry 33: 8.067-8.073. m Aono, S. e cols. (2002) "Resonance Raman and Ligand Binding Studies of the Oxygen-Sensing Signal Transducer Protein HemAT from Bacillus Subtilis", J. Biol. Chem. 277: 13.528- 13.538. "Antonini, E. e cols. (1971), "Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands", North-Hollanà
Publ., Amsterdam.
A Tabela 8 ilustra que a taxa de associação de O2, a taxa de dissociação de O2, o O2, a taxa de auto-oxidação, a reatividade ao NO e a estabilidade de complexos de FeII-O2 em proteínas H-NOX podem ser alterados pela introdução de uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 8 é combinada com outra mutação (por exemplo, outra mutação na Tabela 8 ou qualquer outra mutação aqui descrita) para alterar ainda mais a taxa de associação de O2, a taxa de dissociação de O2, o O2, a taxa de auto-oxidação, a reatividade ao NO ou a estabilidade dos complexos de FeII-O2 em uma proteína H-NOX. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, a introdução de uma ou mais mutações adicionais, tais como aquelas aqui descritas, pode ser usada para alterar ainda mais esses valores.
Tabela 8. Taxa de associação de O2, taxa de dissociação de O2, O2, taxa de auto-oxidação, reatividade ao NO e estabilidade de complexos de Fe11-O2 em proteínas H-NOX.
<table>table see original document page 98</column></row><table> <table>table see original document page 99</column></row><table>
Taxa de O2 associação ao heme a 20°C (μΜ-l s"1) ; b Taxa de dissociação de O2 do heme a 20°C (s-1) ; c Taxa de auto- oxidação de heme (h"1) a 37°C; d Para determinação de reatividades ao NO: proteínas purificadas (Tt WT H-NOX, Tt V140H H-NOX, hemoglobina de Homo sapiens (Hs Hb) ) foram preparadas a 2 μΜ em Tampão A, e óxido nítrico (NO) foi preparado a 200 μΜ em Tampão A (Tampão A: 50 mM Hepesf pH 7,5, 50 mM NaCl) a 20°C. Com o uso de espectroscopia de fluxo interrompido, a proteína foi rapidamente misturada com NO em uma proporção 1:1 com um tempo de integração de 0,00125 segundo. Os comprimentos de onda de mudança máxima foram ajustados para uma exponencial simples, medindo basicamente a etapa de taxa limitante da oxidação por NO. Os produtos finais da reação foram férrico-NO para as proteínas H-NOX e férrico-água para Hs Hb. e Para Hs Hb, a reação da proteína com NO foi tão rápida que a reação estava completa dentro do tempo morto do experimento (0,001 segundo). A reatividade ao NO para a hemoglobina é de aproximadamente 7.000 s"1 a 20°C, com base em Eich, R.F. e cols. (1996) "Mechanism of NO-Induced Oxidation of Myoglobin and Hemoglobin", Biochemistry 35: 6.976-6.983.
A Tabela 9 demonstra que a constante de dissociação para ligação de O2 pode ser alterada significativamente por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX. Os valores da Kd cinética para essas proteínas H-NOX exemplares variam de 21,20 nM a 1.000.000,00 nM a 20°C. Se desejado, a constante de dissociação para ligação de O2 pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 9 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.
Tabela 9. Proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes e proteínas de referência dispostas pelo valor da constante de dissociação para ligação de O2
<table>table see original document page 100</column></row><table> <table>table see original document page 101</column></row><table>
A Tabela 10 demonstra que as taxas de dissociação para a ligação de O2 podem ser alteradas significativamente por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX. As taxas de dissociação para essas proteínas H-NOX exemplares variam de 0,21 s"1 a 23,4 s"1 a 20°C. Se desejado, a taxa de dissociação para a ligação de O2 pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 10 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.
Table 10. Proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes e proteínas de referência dispostas pelo valor da taxa de dissociação para a ligação de O2
<table>table see original document page 101</column></row><table> <table>table see original document page 102</column></row><table>
A Tabela 11 demonstra que as taxas de associação para ligação de O2 podem ser alteradas significativamente por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX. As taxas de associação para essas proteínas H-NOX exemplares variam de 60 PW1S"1 a 0,14 PM-1S"1 a 20°C. Se desejado, a taxa de associação para a ligação de O2 pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 11 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito
Tabela 11. Proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes e proteínas de referência dispostas pelo valor da taxa de associação para a ligação de O2
<table>table see original document page 103</column></row><table>
A Tabela 12 ilustra o efeito de mutações de H-NOX exemplares sobre a ligação de O2 e NO. Cada número listado na Tabela 10 para a forma de Fe não ligada é para um pico único (que está listado entre as colunas β e a) . Quando o O2 ou o NO se liga, esse pico único se divide em dois picos, ββα (que estão listados abaixo das colunas β e a, respectivamente) . Se desejado, a ligação de O2 ou NO pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 12 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.
Tabela 12: Posições a de pico do UV visível para alguns complexos de proteína heme FeII ligados por histidil
<table>table see original document page 104</column></row><table> <table>table see original document page 105</column></row><table>
Complexo de Fe11-O2
<table>table see original document page 105</column></row><table>
A Tabela 13 contém posições de pico UV visível para alguns complexos de Fe (II), Fe (III), Fe (II)NO e Fe(II)- O2. Quando uma hemoglobina ou proteína H-NOX é anaeróbica, ela possui um pico de Soret a -431 nm, e está em um estado não ligado. Caso a proteína H-NOX não se ligue ao NO, então o pico de Soret não será alterado quando o NO for adicionado. Caso a proteína H-NOX se ligue ao NO e forme um complexo 6-coordenado ferroso-nitrosil, então seu pico de Soret será alterado entre 42 0 nm e 424 nm quando NO for adicionado. Se a proteína H-NOX. Caso a proteína H-NOX se ligue ao NO e forme um complexo de ferroso-nitrosil de 5 coordenadas, o pico de Soret irá mudar para -3 99 nm. Se a proteína H-NOX não liga 02/ então o pico de Soret não será alterado quando O2 for adicionado. Se a proteína H-NOX liga O2, então o pico de Soret será alterado entre 414 nm e 418 nm quando O2 for adicionado, que é a mesma alteração que ocorre na hemoglobina, indicativa de O2 ligado ao heme. Picos de Soret para H-NOX (Fe(III)) oxidada podem ser relevantes para o estado da proteína H-NOX após estocagem iu uso. Se desejado, a ligação de O2 ou NO pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 13 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.
Tabela 13. Posições possíveis do pico de UV visível para alguns complexos de Fe (II)f Fe (III)f Fe(II)-NO e Fe(II)- O2-
<table>table see original document page 106</column></row><table> <table>table see original document page 107</column></row><table>
a nN.A." representa bandas α e β não atribuíveis em conseqüência de sinal baixo em comprimentos de onda mais longos.
<table>table see original document page 107</column></row><table> <table>table see original document page 108</column></row><table>
A Tabela 14 contém taxas de auto-oxidação para proteínas H-NOX de T. tengcongensis exemplares. Se desejado, a taxa de auto-oxidação pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações listadas na Tabela 14 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX7 como aqui descrito. Os valores médios de 2 nm e 3 nm na Tabela 14 referem-se a uma mudança no pico de Soret de UV-Vis por 2 a 3 nm ao longo do período de tempo da observação; essa mudança extremamente pequena pode ser causada por auto-oxidação.
Tabela 14. Taxas de auto-oxidação para proteínas H-NOX de Γ. tengcongensis (Tt)
<table>table see original document page 108</column></row><table> a "Estável" representa ausência de oxidação de heme após pelo menos 24 horas.
wRt" repersenta temperatura ambiente
Ácidos nucléicos de H-NOX
A invenção também apresenta ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das proteínas H-NOX mutantes aqui descritas. Como aqui usado, o termo "ácido nucléico" refere-se a dois ou mais desoxirribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos na forma de fita simples ou dupla e, a menos que limitado de forma diferente, engloba análogos conhecidos de nucleotídeos de ocorrência natural que hibridizam para os ácidos nucléicos de forma similar aos nucleotídeos que ocorrem na natureza. Em algumas modalidades, o ácido nucléico é um ácido nucléico recombinante. O termo "ácido nucléico recombinante" significa um ácido nucléico de interesse que é livre de um ou mais ácidos nucléicos (por exemplo, genes), os quais, no genoma que ocorre na natureza do organismo do qual o ácido nucléico de interesse é derivado, flanqueia o ácido nucléico de interesse. Em algumas modalidades, um ácido nucléico de H-NOX está ligado operacionalmente a outro ácido nucléico que codifica toda ou uma porção de outra proteína, de tal forma que o ácido nucléico recombinante codifique uma proteína de fusão que inclui uma proteína H- NOX (por exemplo, um domínio de H-NOX, com ou sem outro domínio de uma proteína H-NOX) e toda ou parte de outra proteína, por exemplo, albumina sérica humana. Portanto, o termo inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus que se replica de forma autônoma, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA, um fragmento de DNA genômico ou um fragmento de cDNA produzido por PCR ou digestão por endonuclease de restrição) independente de outras seqüências.
A invenção também apresenta vetores com um ou mais ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das proteínas H-NOX mutantes que são aqui descritas. Como aqui usado, o termo "vetor" significa uma construção que é capaz de liberação e, opcionalmente expressar, um ou mais ácidos nucléicos de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, sem limitação, plasmideos, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA, cosmídeos e vetores de fago. Em algumas modalidades, o vetor contém um ácido nucléico sob o controle de uma seqüência de controle de expressão. Uma "seqüência de controle de expressão" significa uma seqüência de ácidos nucléicos que dirige a transcrição de um ácido nucléico de interesse. Uma seqüência de controle de expressão pode ser um promotor, por exemplo, um promotor constitutivo ou um promotor indutível, ou um intensificador. A seqüência de controle de expressão está ligada operacionalmente ao segmento de ácido nucléico a ser transcrito.
Em modalidades específicas, o ácido nucléico inclui um segmento ou toda a seqüência de ácidos nucléicos de qualquer um dos ácidos nucléicos mostrados nas FIGS. 2-4D ou 8A-8DD. Em algumas modalidades, o ácido nucléico inclui pelo menos cerca de 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou mais nucleotídeos contíguos de um ácido nucléico de H-NOX, e contém uma ou mais mutações (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações), comparado com o ácido nucléico de H-NOX do qual foi derivado. Em várias modalidades, um ácido nucléico de H-NOX mutante contém menos do que cerca de 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 mutações, comparado com o ácido nucléico de H-NOX do qual foi derivado. A invenção também apresenta variantes degeneradas de qualquer ácido nucléico que codifica uma proteína H-NOX mutante.
A invenção também inclui uma célula ou uma população de células que contêm pelo menos um ácido nucléico que codifica uma proteína H-NOX mutante aqui descrita. Células exemplares incluem células de insetos, plantas, leveduras, bacterianas e mamíferas. Essas células são úteis para a produção de proteínas H-NOX mutantes com a utilização de métodos padronizados como, por exemplo, aqueles aqui descritos.
Formulações de proteínas H-NOX
Qualquer proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante aqui descrita pode ser usada para a formulação de composições farmacêuticas ou não farmacêuticas. Como discutido com mais detalhe anteriormente, essas formulações são úteis em diversas aplicações terapêuticas e industriais.
Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui uma ou mais das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes (por exemplo, qualquer uma das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes aqui descritas) e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em várias modalidades, a proteína H-NOX é uma proteína isolada ou purificada. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha a atividade biológica e não provoque uma resposta imune inaceitável (por exemplo, uma alergia grave ou um choque anafilático) à luz dos conhecimentos daqueles habilitados na técnica. Exemplos incluem, sem limitação, qualquer um dos veículos farmacêuticos padronizados como, por exemplo, soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões como, por exemplo, emulsão óleo/água, e vários tipos de agentes umidificantes. Um diluente exemplar para administração em aerossol ou parenteral é a solução salina tamponada com fosfato ou solução salina normal (0,9%). Composições que compreendem esses veículos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos (veja, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a edição, A. Gennaro, ed. , Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e "Remington, The Science and Practice of Pharmacy", 20a Ed. Mack Publishing, 2000, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação às formulações).
Embora qualquer veículo adequado conhecido por aqueles habilitados na técnica possa ser empregado nas composições farmacêuticas dessa invenção, o tipo de veículo irá variar, dependendo do modo de administração. As composições podem ser formuladas por qualquer meio de administração adequado, incluindo, por exemplo, administração intravenosa, intra- arterial, intravesicular, por inalação, intraperitoneal, intrapulmonar, intramuscular, subcutânea, intratraqueal, transmucosa, intra-ocular, intratecal ou transdérmica. Para administração parenteral, por exemplo, injeção subcutânea, o veículo pode incluir, por exemplo, água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, pode ser empregado qualquer um dos veículos acima ou um veículo sólido, por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose ou carbonato de magnésio. Microesferas biodegradáveis (por exemplo, polilactato poliglicolato) também podem ser usadas como veículos.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas ou não farmacêuticas incluem um tampão (por exemplo, solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato etc.), um carboidrato (por exemplo, glicose, manose, sacarose, dextrana etc.), um antioxidante, um agente quelante (por exemplo, EDTA, glutationa etc.), um conservante, outro composto útil para ligação e/ou transporte de oxigênio, um ingrediente inativo (por exemplo, um estabilizante, um enchimento etc.), ou combinações de dois ou mais dos citados anteriormente. Em algumas modalidades, a composição é formulada como um liofilizado. As proteínas H-NOX também podem ser encapsuladas dentro de lipossomos ou nanopartículas com a utilização de tecnologia bem conhecida. Outras formulações exemplares que podem ser usadas para proteínas H-NOX são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 6.974.795 e 6.432.918, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente com relação às formulações de proteínas.
As composições aqui descritas podem ser administradas como parte de uma formulação de liberação sustentada (por exemplo, uma formulação como uma cápsula ou esponja que produz a liberação lenta do composto após administração). Essas formulações podem geralmente ser preparadas com a utilização de tecnologia bem conhecida, e administradas, por exemplo, por via oral, retal ou implantação subcutânea, ou por implantação no local-alvo desejado. Formulações de liberação sustentada podem conter uma proteína H-NOX dispersa em uma matriz de veículo e/ou contida dentro de um reservatório, circundada por uma membrana que controla a taxa de liberação. Veículos para uso com estas formulações são biocompatíveis, e também podem ser biodegradáveis. Em algumas modalidades, a formulação fornece um nível relativamente constante de liberação de proteína H-NOX. A quantidade de proteína H-NOX contida dentro de uma formulação de liberação sustentada depende do local de implantação, da taxa e da duração da liberação esperadas, e da natureza da condição a ser tratada ou evitada.
Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém uma quantidade eficaz de uma proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante. 0 termo "quantidade eficaz" significa uma quantidade de uma ou mais proteínas aqui descritas que, em combinação com seus parâmetros de eficácia e toxicidade, deve ser eficaz em certa forma terapêutica com base no conhecimento do profissional especialista. Como é do conhecimento da técnica, uma quantidade eficaz pode ser em uma ou mais doses. Como faz parte do contexto clínico, uma dosagem eficaz de uma composição farmacêutica pode ou não ser obtida em conjunto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Dessa forma, uma quantidade eficaz pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável ou benéfico puder ser ou for obtido.
Uma dose exemplar de hemoglobina como substituto do sangue é de cerca de 10 mg a cerca de 5 gramas ou mais de hemoglobina extracelular por quilograma de peso corporal do paciente. Doses similares de proteínas H-NOX podem ser usadas para a liberação de NO. Dessa forma, em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma proteína H-NOX para administração a um ser humano é entre poucas gramas a até mais de cerca de 350 gramas. Outras doses exemplares de uma proteína H-NOX incluem cerca de 4,4, 5, 10 ou 13 g/dl (em que g/dl é a concentração da solução de proteína H-NOX, antes da infusão na circulação) em uma taxa de infusão apropriada como cerca de 0,5 ml/min (veja, por exemplo, Winslow, R. Capítulo 12 em "Blood Substitutes")- Em algumas modalidades, uma dose de menos que 10 mg de proteína H-NOX é usada para vasodilatação temporária. Será observado que o teor da unidade de ingredientes ativos contido em uma dose individual de cada forma de dosagem não precisa, por si mesmo, constituir uma quantidade eficaz, na medida que a quantidade eficaz necessária poderia ser obtida pelo efeito combinado de várias administrações. A seleção da quantidade de uma proteína H-NOX a ser incluída em uma composição farmacêutica depende da forma de dosagem utilizada, da condição tratada e do objetivo específico a ser obtido de acordo com a determinação daqueles habilitados na técnica.
Composições exemplares incluem proteínas H-NOX recombinantes projetadas geneticamente, que podem ser isoladas ou purificadas, que compreendem uma ou mais mutações que coletivamente transmitem ligação de ligante de O2 ou NO alterada em relação à proteína H-NOX do tipo selvagem correspondente, e operacional como um transportador de gás NO sangüíneo de mamífero fisiologicamente compatível. Por exemplo, as proteínas H- NOX mutantes aqui descritas.
A invenção também fornece transportadores de NO que compreendem ou consistem basicamente em uma ou mais das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes. Tampões e outros ingredientes adequados à formulação de proteínas (como proteínas liberadas ao sangue ou sistema gastrointestinal) são conhecidos na técnica.
Para reduzir ou evitar uma resposta imune em indivíduos humanos que recebem a administração de uma composição farmacêutica, podem ser usadas proteínas H-NOX humanas (proteínas humanas do tipo selvagem ou proteínas humanas nas quais uma ou mais mutações foram introduzidas) ou outras proteínas H-NOX não antigênicas (por exemplo, proteínas H-NOX de mamíferos). Para reduzir ou eliminar a imunogenicidade de proteínas H-NOX derivadas de outras fontes não humanas, os aminoácidos em uma proteína H-NOX podem ser mutados para os aminoácidos correspondentes em uma H-NOX humana. Por exemplo, um ou mais aminoácidos na superfície da estrutura terciária de uma proteína H-NOX não humana podem ser mutados para o aminoácido correspondente em uma proteína H-NOX humana.
Aplicações terapêuticas das proteínas H-NOX
Qualquer uma das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes (por exemplo, proteínas H-NOX isoladas ou purificadas) ou composições farmacêuticas aqui descritas podem ser usadas em aplicações terapêuticas.
Proteínas H-NOX particulares podem ser selecionadas para estas aplicações com base na constante de dissociação de NO, constante de dissociação de O2, koff de NO, koff de O2, reatividade ao NO, estabilidade ao NO, taxa de auto- oxidação, no tempo de retenção plasmática desejado, meia- vida ou qualquer combinação de dois ou mais dos citados anteriormente para a indicação específica tratada. As proteínas H-NOX podem ser usadas para tratar qualquer condição para a qual a liberação de NO seja benéfica. As indicações de exemplo incluem doenças da deficiência funcional de NO, como quando um vasodi latador ou um transportador de NO é indicado, incluindo condições exacerbadas por hipertensão crônica, como insuficiência cardíaca, insuficiência renal, e AVC. Em várias modalidades, a condição tratada é uam condição cardiovascular (por exemplo, infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca) , hipertensão, uma condição vasoconstrictora (por exemplo, AVC), disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal. Para o tratamento de constipação ou obstrução intestinal, proteínas H-NOX podem ser usadas para liberar NO para tratar um déficit de controle de esfíncter, assim relaxando a musculatura lisa.
Por exemplo, proteínas H-NOX que funcionam no sistema digestivo podem relaxar a musculatura lisa do íleo uma vez que as proteínas H-NOX passam através do sistema digestivo. Os métodos e composições são aplicáveis tanto a situações agudas (fornecendo NO rápido aos tecidos ou um local específico, por exemplo, infarto agudo do miocárdio ou AVC) quanto crônicas (por exemplo, hipertensão crônica ou recuperação pós aguda de infarto do miocárdio ou AVC).
Em várias modalidades, a invenção apresenta um método de liberação de NO a um indivíduo (por exemplo, um mamífero, como um primata (por exemplo, um ser humano, um macaco, um gorila, um chipanzé, um lêmure etc.), um bovino, um eqüino, um suíno, um canino ou um felino) pela administração a um indivíduo que dela necessita de uma proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante em uma quantidade suficiente para liberar NO ao indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de transporte ou liberação de gás sangüíneo a um indivíduo como um mamífero, que compreendem a etapa de liberação ao sangue do indivíduo (por exemplo, um mamífero) de uma ou mais das composições de H-NOX. Métodos para a liberação de proteínas ao sangue, sistema digestivo ou aos tecidos (por exemplo, sangue ou tecidos de mamíferos) são conhecidos na técnica. Em várias modalidades, a proteína H-NOX é uma apoproteína que é capaz de se ligar ao heme, ou é uma holoproteína com heme ligado. A proteína H-NOX pode ter ou não heme ligado, antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo. Em algumas modalidades, NO é ligado à proteína H-NOX, antes de ser liberada ao indivíduo. Em outras modalidades, NO não está ligado à proteína H-NOX antes da administração da proteína ao indivíduo, e a proteína H-NOX transporta NO de uma localização no indivíduo para outra localização no indivíduo. Por exemplo, em modalidades particulares, proteínas H-NOX ligam NO na corrente sangüínea e apenas o liberam quando as concentrações de NO estão muito baixas (como em locais de vasoconstricção). Essa liberação direcionada de NO pode produzir menos efeitos colaterais que os vasodilatadores convencionais que liberam NO independente da concentração local de NO e assim funcionam sistemicamente, com efeitos colaterais como dores de cabeça e formigamento periférico.
Os métodos da presente invenção podem ser usados para o tratamento de qualquer indivíduo. Para uso nesta especificação, a menos que claramente indicado de forma diferente, "um indivíduo", como aqui usado, significa um mamífero, incluindo, sem limitação, um primata (por exemplo, um ser humano, macaco, gorila, chimpanzé, lêmure etc.), um bovino, um eqüino, um suíno, um canino e um felino. Dessa forma, a invenção encontra utilidade tanto na medicina humana quanto no contexto veterinário, incluindo uso em animais agrícolas e animais domésticos de estimação. O indivíduo pode ter sido diagnosticado, ser suspeito de ter ou está em risco de desenvolver uma indicação como uma condição cardiovascular (por exemplo, infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca) , hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC), uma condição vasoconstritora (por exemplo, AVC), uma deficiência funcional de NO, disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal. O indivíduo pode exibir um ou mais sintomas associados à indicação. O indivíduo pode estar geneticamente ou de algum outro modo predisposto ao desenvolvimento desta condição.
Como aqui usado, o termo "que necessita deste" inclui indivíduos que possuem uma condição ou doença (por exemplo, uma condição cardiovascular como infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão como insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC, uma condição vasoconstritora como AVC, uma deficiência funcional de NO, disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal ou estão "era risco" para a condição ou doença. Como aqui usado, o termo um indivíduo "em risco" é um indivíduo que está em risco para o desenvolvimento de uma condição como uma doença cardiovascular (por exemplo, infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca), hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC), uma condição vasoconstrictora (por exemplo, AVC), uma deficiência funcional de NO, disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal. 0 indivíduo pode exibir um ou mais sintomas associados à indicação. Um indivíduo "em risco" pode ter ou não uma doença ou condição detectável, e pode ter ou não exibido doença detectável antes dos métodos de tratamento aqui descritos. "Em risco" representa que um indivíduo possui um ou mais dos denominados fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que estão correlacionados com o desenvolvimento de uma doença ou condição, e são conhecidos na técnica. Um indivíduo que possui um ou mais desses fatores de risco possui uma probabilidade maior para o desenvolvimento da doença ou condição do que um indivíduo sem esses fatores de riscos.
Esses fatores de risco incluem, sem limitação, idade, sexo, raça, dieta, história de doença prévia, presença de doença precursora, fatores genéticos (ou seja, hereditários) considerações e exposição ambiental.
Esses métodos podem ser usados para tratar ou retardar qualquer condição para a qual a liberação de NO seja benéfica. Por "tratamento" ou "que trata" significa uma abordagem para a obtenção de um resultado benéfico ou desejado, incluindo resultados clínicos. Para as finalidades dessa invenção, resultados benéficos ou desejados incluem, sem limitação, o alivio dos sintomas associados a uma condição (como, sem limitação, uma condição cardiovascular, como infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão como insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC, uma condição vasoconstritora como AVC, uma deficiência funcional de NO, disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal, diminuição da extensão dos sintomas associados a uma condição ou prevenção de uma piora dos sintomas associados a uma condição. Em algumas modalidades, o tratamento com uma ou mais proteínas aqui reveladas é acompanhado por ausência ou redução dos efeitos colaterais em relação aos que estão associados às terapias atualmente disponíveis.
Como aqui usado, o termo "retardo" do desenvolvimento de uma doença ou condição significa adiar, impedir, tornar mais lento, retardar, estabilizar e/ou postergar o desenvolvimento da doença ou condição, como uma doença cardiovascular, (por exemplo, infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca) , hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC), uma condição vasoconstrictora (por exemplo, AVC), uma deficiência funcional de NO, disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal.
Esse retardo pode ser de durações de tempo variáveis, dependendo da história da doença e/ou do indivíduo tratado. Como é evidente para aqueles habilitados na técnica, um retardo suficiente ou significativo pode, na verdade, englobar a prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a doença ou condição. Por exemplo, o método pode reduzir a probabilidade do desenvolvimento da doença em certo intervalo de tempo e/ou reduzir a extensão da doença em certo intervalo de tempo, quando comparado com a não utilização do método. Em algumas modalidades, essas comparações se baseiam em estudos clínicos com a utilização de um número estatisticamente significativo de indivíduos.
O desenvolvimento da doença pode ser detectável com a utilização de técnicas clínicas padronizadas. O desenvolvimento também se refere à progressão da doença que pode ser inicialmente não detectável, e inclui ocorrência, recorrência e surgimento.
Em algumas modalidades, para a liberação direta de uma proteína H-NOX com NO ligado a um local específico no corpo (por exemplo, um tecido, órgão) , a koff para NO é mais importante do que o valor de KD, pois o NO já está ligado à proteína (o que torna o kon menos importante) , e o NO precisa ser liberado em um local específico (ou próximo a ele) no corpo (em uma taxa influenciada pela k0ff) . Em algumas modalidades, para o tratamento de condições agudas, a proteína H-NOX tem uma koff, kx, ou k2 relativamente altas para NO (como pelo menos cerca de 0,05 s"1 ou 1,0 s"1) de modo que a vasodilatação ocorra rapidamente. Em algumas modalidades para administração sistêmica, a proteína H-NOX tem uma koff, kl, ou k2 para NO relativamente baixa (como menos que cerca de 0,05 s"1, 0,01 s"1, ou 0,001 s"1) de modo que NO não seja liberado até que a proteína H-NOX atinja um local de caixa concentração de NO (por exemplo, um local vasoconstrito).
As proteínas H-NOX também podem ser usadas para exames de imagem. Em particular, imagens ópticas (por exemplo, tomografia de coerência óptica; veja, por exemplo, Villard, J.W. (2002), uUse of a Blood Substitute to Determine Instantaneous Murine Right Ventricular Thickening with Optical Coherence Tomography", Circulation 105: 1.843- 1.849, que é incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à tomografia de coerência óptica) são ofuscadas por eritrócitos. A perfusão com uma solução de H-NOX permite imagens mais nítidas da circulação e das paredes dos vasos, pois a proteína H-NOX é bem menor do que os eritrócitos.
As proteínas H-NOX e as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas a um indivíduo por qualquer meio convencional como, por exemplo, por administração oral, tópica, intra-ocular, intratecal, intrapulmonar, intratraqueal, ou por aerossol; por adsorção transdérmica ou por membrana mucosa; ou por injeção (por exemplo, por injeção subcutânea, intravenosa, intra- arterial, intravesicular ou intramuscular) . As proteínas H- NOX também podem ser incluídas em soluções parenterais de grande volume para administração ao sangue. Em modalidades exemplares, a proteína H-NOX é administrada no sangue (por exemplo, administração a um vaso sangüíneo como, por exemplo, uma veia, uma artéria ou um capilar) do indivíduo.
Em algumas modalidades, é usada uma formulação de liberação contínua sustentada da composição. A administração de uma proteína H-NOX pode ocorrer, por exemplo, por um período de segundos a horas, dependendo da finalidade da administração. Para condições agudas, uma duração de tempo de administração é tão rápida quanto possível. Outros períodos de tempo exemplares incluem cerca de 10, 20, 30, 40, 60, 90 ou 120 minutos. Taxas de infusão exemplares para soluções de H-NOX são de cerca de 3 0 ml/hora a cerca de 13.260 ml/hora como, como cerca de 100 ml/hora a cerca de 3.000 ml/hora. Uma dose total exemplar de proteína H-NOX é de cerca de 900 mg/kg administrada ao longo de 20 minutos a 13.260 ml/hora. Uma dose total exemplar de proteína H-NOX para um suíno é de cerca de 18,9 gramas.
Freqüências de dosagem exemplares incluem, sem limitação, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 vezes (ou seja, diariamente) por semana. Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX é administrada pelo menos 2, 3, 4 ou 6 vezes ao dia. A proteína H-NOX pode ser administrada, por exemplo, ao longo de um período de poucos dias ou semanas. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é administrada por um período mais longo como, por exemplo, poucos meses ou anos. A freqüência de dosagem da composição pode ser ajustada ao longo do período do tratamento, com base na avaliação do médico responsável pela administração.
Como observado anteriormente, a seleção de quantidades de dosagem para as proteínas H-NOX depende da forma de dosagem utilizada, da freqüência e do número de administrações, da condição tratada e da finalidade específica a ser obtida de acordo com a determinação daqueles habilitados na técnica. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma proteína H-NOX para administração a seres humanos é entre poucas gramas a mais de 350 gramas.
Em algumas modalidades, duas ou mais proteínas H-NOX diferentes são administradas simultânea, seqüencial ou concomitantemente. Em algumas modalidades, outro composto ou terapia útil para a liberação de NO é administrado simultânea, seqüencial ou concomitantemente à administração de uma ou mais proteínas H-NOX.
Aplicações industriais das proteínas H-NOX
As proteínas H-NOX e composições aqui descritas também podem ser usadas para diversas aplicações in vitro ou industriais (veja, por exemplo, a Patente U.S. N0 6.455.676, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, particularmente com relação às aplicações in vitro ou industriais) . Proteínas H-NOX específicas podem ser selecionadas para essas aplicações com base na constante de dissociação de NO, constante de dissociação de O2, koff de NO, koff de O2, reatividade de NO, estabilidade de NO, taxa de auto-oxidação, meia-vida, ou qualquer combinação de dois ou mais das citadas anteriormente para a aplicação específica. Em várias modalidades de aplicações industriais, a proteína H-NOX é uma apoproteína que é capaz de se ligar ao heme, ou é uma holoproteína com heme ligado.
As proteínas H-NOX podem ser usadas para adicionar NO a soluções para as quais o NO é desejável. Em modalidades que usam biorreatores que requerem fermentação anaeróbica, proteínas H-NOX são usadas para liberar NO para as células. Por exemplo, a liberação de NO para mitocôndria pode limitar a fosforilação oxidativa e aumentar o metabolismo através da via de lactato. A proteína H-NOX em Clostridium acetobutylicum, que é cultivado sob fermentação anaeróbica como um gerador de biocombustível, podem servir naturalmente a essa função. Além disso, as proteínas H-NOX podem ser usadas para remover NO de soluções que requerem a remoção de NO. Por exemplo, proteínas H-NOX podem ser usadas para absorver ou remover NO em bio-reatores quando NO é um inibidor de proliferação celular e/ou função mitocondrial. A remoção de NO pode melhorar a função mitocondrial, limitar a apoptose, aumentar a produtividade por célula, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores.
Kits com proteínas H-NOX
Também são fornecidos artigos manufaturados e kits que incluem qualquer uma das proteínas H-NOX aqui descritas e uma embalagem adequada. Em algumas modalidades, a invenção inclui um kit com: (i) uma proteína H-NOX (por exemplo, uma proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante aqui descrita,, ou formulações desta, como aqui descritas) e (ii) instruções para utilização do kit para a liberação de NO a um indivíduo. Em várias modalidades, a invenção apresenta um kit com: (i) uma proteína H-NOX (por exemplo, uma proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante aqui descrita, ou formulações desta, como aqui descritas) e (ii) instruções para utilização do kit para qualquer um dos usos industriais aqui descritos (por exemplo, a adição de NO a uma solução ou remoção de NO de uma solução).
Embalagens adequadas às composições aqui descritas são conhecidas na técnica, e incluem, por exemplo, frascos (por exemplo, frascos lacrados), vasos, ampolas, garrafas, jarras, embalagens flexíveis (por exemplo, bolsas Mylar ou plásticas), e semelhantes. Esses artigos manufaturados podem ainda ser esterilizados e/ou lacrados. Também são fornecidas formas de dosagem unitária que compreendem as composições aqui descritas. Essas formas de dosagem unitária podem ser armazenadas em uma embalagem adequada em dosagens unitárias únicas ou múltiplas, e também podem ainda ser esterilizadas e lacradas. As instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções escritas em um rótulo ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções que possam ser lidas por máquinas (por exemplo, instruções fornecidas em um disco de armazenamento magnético ou óptico) também são aceitáveis. As instruções relacionadas ao uso de proteínas H-NOX geralmente incluem informações sobre a dosagem, esquema de dosagem e via de administração para o tratamento ou uso industrial desejado. O kit pode ainda compreender uma descrição da seleção de um indivíduo adequado ou tratamento.
Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multidoses) ou doses subunitárias. Por exemplo, também podem ser fornecidos kits que contêm dosagens suficientes de proteínas H-NOX aqui reveladas para fornecer tratamento eficaz para um indivíduo por um período de tempo prolongado como, por exemplo, cerca de uma semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, ou mais. Os kits também podem incluir doses unitárias múltiplas de proteínas H-NOX e instruções para uso, e embaladas em quantidades suficientes para armazenamento e uso em farmácias, por exemplo, farmácias hospitalares e farmácias de manipulação. Em algumas modalidades, o kit inclui uma composição seca (por exemplo, liofilizada) que pode ser reconstituída, re-suspensa ou re- hidratada para formar geralmente uma suspensão aquosa estável de proteína H-NOX.
Métodos exemplares para a produção de proteínas H-NOX
A presente invenção também fornece métodos para a produção de qualquer uma das proteínas H-NOX mutantes aqui descritas. Em algumas modalidades, o método envolve o cultivo de uma célula que possui um ácido nucléico que codifica uma proteína H-NOX mutante sob condições adequadas à produção da proteína H-NOX mutante. Em várias modalidades, a H-NOX mutante também é purificada (por exemplo, purificação da proteína H-NOX das células ou do meio de cultura).
Como observado anteriormente, as seqüências de várias proteínas H-NOX do tipo selvagem e de ácidos nucléicos são conhecidas e podem ser utilizadas para a geração de proteínas H-NOX mutantes e ácidos nucléicos da presente invenção. Técnicas para a mutação, expressão e purificação de proteínas H-NOX recombinantes foram descritas, por exemplo, por Boon, E.M. e cols. (2005) , "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chemical Biology 1: 53-59 e Karow, D.S. e cols. (10 de agosto de 2004), "Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Herne Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis", Biochemistry 43(31): 10.203-10.211, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à mutação, expressão e purificação de proteínas H- NOX recombinantes. Essas técnicas ou outras técnicas padronizadas podem ser usadas para a geração de proteína H- NOX mutante.
Em particular, as proteínas H-NOX mutantes aqui descritas podem ser geradas por diversos métodos que são conhecidos na técnica. A mutação pode ocorrer no nível de aminoãcido por modificação química de um aminoácido ou no nível de códon por alteração da seqüência de nucleotídeos que codifica certo aminoácido. A substituição de um aminoácido em certa posição em uma proteína pode ser obtida por alteração do códon que codifica aquele aminoácido. Isso pode ser obtido por mutagênese sítio-dirigida, por exemplo: (i) a técnica de Amersham (kit de mutagênese Amersham, Amersham, Inc., Cníveland, Ohio) com base nos métodos de Taylor, J.W. e cols. (20 de dezembro de 1985) , "The Use of Phosphorothioate-Modified DNA in Restriction Enzyme Reactions to Prepare Nicked DNA", Nucleic Acids Res., 13(24): 8.749-8.764; Taylor, J.W. e cols. (20 de dezembro de 1985) , "The Rapid Generation of Oligonucleotide-Directed Mutations at High Frequency Using Phosphorothioate-Modified DNA", Nucleic Acids Res. 13 (24): 8.765-8.785; Nakamaye, K.L. e cols. (22 de dezembro de 1986) , "Inhibition of Restriction Endonuclease Nci I Cleavage by Phosphorothioate Groups and its Application to Oligonucleotide-Directed Mutagenesis", Nucleic Acids Res. 14 (24): 9.679-9.698; e Dente e cols. (1985), em "DNA Cloning" , Glover, Ed., IRL Press, páginas 791-802, (ii) o kit Promega (Promega Inc., Madison, Wis.), ou (iii) o kit Biorad (Biorad Inc., Richmond, Calif.), com base nos métodos de Kunkel, T.A. (janeiro de 1985), "Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82(2): 488-492; Kunkel, Τ.A. (1987), wRapid And Efficient Site-Speeifie Mutagenesis Without Phenotypie, Selection", Methods Enzymol. 154: 367-382; Kunkel, Patente U.S. N0 4.873.192, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à mutagênese de proteínas. A mutagênese também pode ser obtida por outros meios comercialmente disponíveis ou não- comerciais, por exemplo, aqueles que utilizam mutagênese sítio-dirigido com oligonucleotídeos mutantes.
A mutagênese sítio-dirigido também pode ser obtida com o uso de mutagênese baseada em PCR, por exemplo, aquela descrita em Zhengbin e cols. (1992), páginas 205-207 em "PCR Methods and Applications", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York; Jones, D.H. e cols. (fevereiro 1990), "A Rapid Method For Site-Specific Mutagenesis And Directional Subcloning by Using the Polymerase Chain Reaction to Generate Recombinant Circles", Biotechnigues 8(2): 178-183; Jones, D. Fl. e cols. (janeiro 1991), "A Rapid Method For Recombination And Site-Specific Mutagenesis by Placing Homologous Ends on DNA Using Polymerase Chain Reaction", Biotechniques 10(1): 62-66, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente com relação à mutagênese de proteínas. A mutagênese sítio-dirigida também pode ser obtida com o uso de mutagênese por cassete com técnicas que são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
Um ácido nucléico de H-NOX mutante pode ser incorporado em um vetor, como um vetor de expressão, com o uso de técnicas padronizadas. Por exemplo, podem ser usadas enzimas de restrição para clivar o ácido nucléico de H-NOX mutante e o vetor. A seguir, as extremidades compatíveis do ácido nucléico clivado de H-NOX mutante e o vetor clivado podem ser ligados. 0 vetor resultante pode ser inserido em uma célula (por exemplo, uma célula de inseto, uma célula de planta, uma célula de levedura ou uma célula bacteriana) com o uso de técnicas padronizadas (por exemplo, eletroporação) para expressão da proteína H-NOX codificada.
Em particular, foram expressas proteínas heterólogas em diversos sistemas de expressão biológicos, como células de inseto, células de planta, células de levedura e células bacterianas. Dessa forma, qualquer sistema de expressão biológico de proteína adequado pode ser utilizado para a produção de grandes quantidades de proteína H-NOX recombinante. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX (por exemplo, uma proteína H-NOX mutante ou do tipo selvagem) é uma proteína isolada. Como aqui usado, uma "proteína isolada" significa uma proteína separada de um ou mais componentes com os quais a proteína está naturalmente associada na natureza, incluindo, por exemplo, ácidos nucléicos, lipídeos e outras proteínas. Uma proteína isolada também não ocorre em uma biblioteca de proteínas, por exemplo, uma biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 ou mais proteínas diferentes. Uma proteína isolada pode ser obtida, por exemplo, por expressão de um ácido nucléico recombinante que codifica a proteína ou por síntese química da proteína.
Se desejado, as proteínas H-NOX podem ser purificadas com o uso de técnicas padronizadas. Como aqui usado, o termo "proteína purificada" significa uma proteína (por exemplo, uma proteína H-NOX mutante ou do tipo selvagem) que foi separada de um ou mais componentes que estão presentes quando a proteína é produzida. Em algumas modalidades, a proteína é pelo menos cerca de 60%, por peso, livre de outros componentes que estão presentes quando a proteína é produzida. Em várias modalidades, a proteína é pelo menos cerca de 75%, 90% ou 99%, por peso, pura. Uma proteína purificada pode ser obtida, por exemplo, por purificação (por exemplo, extração) de uma fonte natural, de um sistema de expressão recombinante ou de uma mistura de reação para síntese química. Métodos de purificação exemplares incluem imunoprecipitação, cromatografia em coluna, por exemplo, cromatografia por imunoafinidade, purificação por imunoafinidade com glóbulo magnético e cozimento com um anticorpo ligado à placa, além de outras técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. A pureza pode ser avaliada por qualquer método apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou análise por HPLC.
Em algumas modalidades, a proteína purificada é incorporada em uma composição farmacêutica da invenção ou usada em um método da invenção. A composição farmacêutica da invenção pode ter aditivos, veículos ou outros componentes, além da proteína purificada.
EXEMPLOS
Os exemplos, que têm a intenção de serem puramente exemplares da invenção e, portanto, não devem ser considerados como limitantes da invenção de forma alguma, também descrevem e detalham aspectos e modalidades da invenção discutidos acima. Os exemplos não visam representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. A menos que indicado de forma diferente, a temperatura está em graus Centígrados e pressão está na pressão atmosférica ou próxima a ela.
Exemplo I: Produção de proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes
As proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes foram produzidas, expressas e purificadas com a utilização de métodos padronizados, basicamente como descrito por Boon, E.M. e cols. (2005) , "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chemical Biology 1: 53- 59 e Karow, D.S. e cols. (10 de agosto de 2004), "Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis", Biochemistry 43(31): 10.203-10.211, ambos aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à mutagênese, expressão e purificação de proteínas H-NOX. A mutagênese foi efetuada com a utilização do protocolo QuickChange® de Strategene (La Jolla, CA) . A expressão das proteínas em cultura de células e a purificação subseqüente das proteínas foram realizadas como descrito por Karow, D. S. e cols. (10 de agosto de 2004), nSpectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis", Biochemistry 43(31): 10.203-10.211. Exemplo 2s Caracterização de proteínas H-NOX mutantes Kd calculada para NOs proporção de koff para k0n
Para determinar a Kd calculada para NO, os valores para a kon para NO para uma proteína H-NOX é assumido como sendo 710 μΜ"1 s"1, e a taxa de dissociação para NO (koff- para uma proteína H-NOX com um complexo 6-coordenado Fe11- NO ou kl ou k2 para uma proteína H-NOX com um complexo 5- coordenado Fe11-NO) é determinada como descrito abaixo. Koff, kl e k2 (taxas de dissociação de NO)
Valores de koff para proteínas H-NOX com um complexo 6- coordenado Fe11-NO
Para uma proteína H-NOX com um complexo 6-coordenado Fe11-NO, a koff para NO é calculada como descrito por Boon, Ε. M. e cols., (August 2006), "Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase βΐ HONOX Domain," J. Biol. Chem. 281(31): 21892- 21902 e Boon, E.M. e cols. (2005). nMolecular Basis Para NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase," Nature Chemical Biology 1:53-59, que são aqui incorporados em suas totalidades por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO para proteínas H-NOX. Resumidamente, complexos Fe11- NO da proteína H-NOX (5 μΜ heme concentração final) diluídos em trietanolamina, tampão anaeróbico 50 mM, 50 mM NaCl, pH 7,5, foram rapidamente misturados com monóxido de carbono saturado e 30 mM (concentração final) de trap de ditionita (Na2S2O4) no mesmo tampão (anaeróbico) (Kharitonov, V. G. e cols. (1997). Biochemistry 36:6814- 6818 e Moore, E. G. et al. (1976). J. Biol. Chem. 251:2788- 2794, que são aqui incorporados em suas totalidades por referência, particularmente com relação ao cálculo de taxas e dissociação de NO) . Foi estabelecido previamente que a ligação de CO não é limitada por taxa nesses experimentos (Kharitonov, V. G. et al. (1997) Biochemistry 36:6814 - 6818); isso foi confirmado em experimentos que usa, apenas 30 mM Na2S2O4 sem CO como um trap. Os dados foram adquiridos por rastreamento periódico em um espectrofotômetro Cary 3E equipado com um conjunto de banho de temperatura constante Neslab RTE-100 para temperaturas variáveis (0-70°C) com o uso de uma cuveta de quartzo com um tamanho de 100 μL a 1 mL e um comprimento de 1 cm (Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA) . A dissociacao de NO de heme foi monitorada como a formação tion do complexo Fe11-CO a 423 nm. Diferenças de espectro foram calculadas por subtração do primeiro scan de cada scan subseqüente. A taxa de dissociação de NO foi determinada a partir do aumento na absorvência a 423 nm versus tempo e ajustada com um único exponencial da forma f (x) =A χ (1 - e_kx) usando Kaleidagraph 3.X (Synergy Software, Reading, PA) . Em particular, um único aumento exponencial na concentração de heme-CO (por ligação de CO do trap de NO) pode ser descrito pela equação 1:
ΔΑ( = ΔΑΤ (1 - e k,t) (equação 1)
em que AAt é a mudança na amplitude de sinal no tempo t; ΔΑΤ é a mudança total na amplitude de sinal, e k1 é a constante de taxa de reação observada. Cada experimento foi realizada por um mínimo de seis vezes, e as taxas resultantes tiveram a média calculada. As taxas de dissociação medidas são independentes da concentração de CO e ditionita (3, 30, e 300 mM ditionita foram testados).
Valores de kl e k2 para proteínas H-NOX com um complexo 5- coordenado Fe11-NO
Para uma proteína H-NOX com um complexo 5-coordenado Fe11-NO, a koff para NO é calculada pela kl para NO e a k2 para NO como descrito por Winger, J. A. et al. , (janeiro de 2007) wDissociation of nitric oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme- nitric oxide/Oxygen Binding Domain Constructs" I Biol. Chem. 282(2): 897-907, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO, kl de NO e k2 de NO para proteínas H-NOX. Resumidamente, a dissociação de NO do heme de proteínas H-NOX com um complexo 5-coordenado Fe11-NO foi medida a 37 e 10°C com o uso do método de trapping de CO/ditionita previamente descrito (Cary, S. P. L., e cols. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. U S. A. 102: 13064 -13069 e Kharitonov, V. G. e cols. (1997) Biochemistry 36:6814-6818, que são aqui incorporados em suas totalidades por referência, particularmente com relação ao cálculo de taxas e dissociação de NO) . A solução de trapping foi preparada como se segue: uma solução de ditionita de sódio (Na2S2O4) em 50 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl foi preparada em um Reacti-Vial selado de Teflon (Pierce) com o uso de uma câmara anaeróbica (Coy Laboratory Products). A solução foi removida da câmara anaeróbica e saturada com CO por borbulhamento do gás através da solução por 10 minutos. Complexos de proteína H-N0X-N0 foram formados por incubação com excesso de DEA/NO (em 10 mM NaOH) a 25°C em 50 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl por 10 min. Completa conversão à espécie nitrosil foi verificada seguindo a alteração no máximo de Soret de 431 para 399 nra.
As proteínas H-NOX foram colocadas em uma cuveta anaeróbica selada por septo (uma cuveta de quartzo com um tamanho de 100 μΕ a 1 mL e um comprimento de 1 cm) e desoxigenada com o uso de um "oxygen-scavenged gas train" . Uma pequena quantidade de DEA/N0 (~3 eq) foi adicionada logo antes da desoxigenação para manter a espécie nitrosil (qualquer restante foi subseqüentemente destruído pelo grande excesso de Na2S2O4 na solução de trapping). O espaço superior da cuveta anaeróbica foi substituído com CO, e a cuveta e soluções de trap foram equilibradas em temperatura de ensaio por 1 minuto. A reação foi iniciada por adição de solução de CO/ditionita à cuveta anaeróbica com uma seringa de gás Hamilton e mistura. A concentração final de Na2S2O4 na mistura de reação foi de 3 0 mM. As concentrações finais da proteína foram 1,9 a 2,5 μΜ para β1(1-194), β1(1-385), e β2(1-217), e 0,88 a 2,5 μΜ para sGC. A coleta de dados foi iniciada 10 segundos depois da adição do trap. A reação foi monitorada por espectroscopia de absorção eletrônica com o uso de um espectrofotômetro Cary 3 E equipado com um controlador de temperatura Neslab RTE-100 (Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA). Os dados foram coletados por uma faixa de 380 - 450 nm a 909 nm/min com um intervalo de ponto de dados de 1,5-nm. Os espectros foram registrados a cada 18 segundos por 5 minutos, cada 1 minuto por 10 minutos, e cada 2 minutos depois por um total de 3 horas, ou até que a reação estivesse completa. Uma linha de base de tampão foi subtraída de cada espectro, e os espectros foram corrigidos para movimento de linha de base por normalização a um ponto isosbéstico a 410 nm. Diferenças de espectros foram obtidas por subtração do espectro de tempo 0 de todos os espectros subseqüentes. Os valores para a mudança na absorvência a 423 nm (ΔΑ423; βΐ (1-194) e β1(1- 385)) ou 424 nm (ΔΑ424; sGC e β2(1-217)) foram extraídas da diferença de espectro e colcoada em gráfico versus tempo para obter durações de tempo de dissociação para cada experimento. As durações de tempo de dissociação foram obtidas em duplicata ou triplicata, e cada experimento foi repetido 2-5 vezes por vários dias. Geralmente, por causa da relativa dificuldade na obtenção de grandes quantidades de s GC purificado, os valores de ΔΑ424 para sGC de comprimento total, que são proporcionais às concentrações de proteína experimental, foram menores que para as construções de domínio de heme
Ajuste de curva, análise de dados e geração de figura foram realizados com o uso de Kaleidagraph 3. X (Synergy Software Reading, PA). Os dados de cada experimento de dissociação foram ajustados a exponenciais duplos como mostrado na Equação 2 abaixo para obter constantes de taxa observadas. Em particular, a equação 2 descreve um aumento de dois-exponenciais na concentração de heme-CO (pela ligação de CO do trap de NO):
(equação 2)
<formula>formula see original document page 138</formula>
em que AAt é a mudança na amplitude de sinal no tempo t; ΔΑ1 e ΔΑ2 são as contribuições de cada processo exponencial para a mudança total na amplitude de sinal, e k1 e k1 são as constantes de taxa observadas para cada processo.
Os dados observados são consistentes com um modelo em que a dissociação prossegue a partir de uma mistura de equilíbrio inicial de dois complexos 5-coordenados heme-NO, como apontado no Esquema 1. Portanto, k1 corresponde à dissociação de NO da conformação heme-N05c, enquanto k2 representa a taxa de reação observada, que corresponde a ko— kc, que é limitada pela conversão mais lenta de heme-NO NO* 5c heme-NO5c. <formula>formula see original document page 139</formula>
Esquema 1
Valores de k1 e k2 para proteínas H-NOX com uma mistura de complexo 5-coordenado e 6-coordenado Fe11-NO
Para uma proteína H-NOX que contém uma mistura de complexos 5-coordenado e 6-coordenado Fe11-NO, a koff para NO é descrita pela kl para NO e a k2 para NO. A kl e a k2 para NO são medidas como acima descrito para proteínas H- NOX com um complexo 5-coordenado Fe11-NO, como descrito por Winger, J. A. et al., (janeiro de 2007) "Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme- Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs" J. Biol. Chem. 282 (2): 897-907, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO, kl de NO e k2 de NO para proteínas H-NOX.
Kd calculada para NO
Para medir a K0 calculada para NO, o valor para a kOI1 para NO para uma proteína H-NOX é 710 μΜ"1 s"1, que é uma kon relatada para βΐ (1-385) que foi medida a 4°C e não aumenta significativamente a 37°C (Zhao, e cols., (1999). "A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble Guanylate Cyclase," PNAS. 96:14 753-14 758, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de kon de NO para proteínas H-NOX). Portanto, a KD calculada para NO pe determinada por cálculo da proporção de koff, kl, ou k2 (medidas como acima descrito) para kon (assumida como sendo 710 μΜ"1 s"1).
Kd cinética para O2: proporção de k0ff para kon
O valor da Kd cinética para O2 foi determinado para as proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes basicamente como descrito por Boon, E.M. e cols. (2005), "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase", Nature Chemical Biology 1: 53-59, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à medida das taxas de associação de O2, das taxas de dissociação de O2, das constantes de dissociação para a ligação de O2, das taxas de auto-oxidação e das taxas de dissociação de NO.
kon (taxa de associação de O2)
A associação de O2 ao heme foi medida com o uso de fotólise instantânea a 20°C. Não foi possível vaporizar o complexo de Fe11-O2 em conseqüência da cinética de recombinação geminada muito rápida; dessa forma, o complexo de Fe11-O2 foi submetido à fotólise instantânea com luz de laser a 560 nm (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) , produzindo o intermediário de Fe11 de 5 coordenadas, do qual a ligação de O2 molecular foi seguida em vários comprimentos de onda.
As amostras de proteína foram feitas por redução anaeróbica com 10 mM ditionita, seguida por dessalinização em uma coluna PD-IO (Millipore, Inc., Billerica, MA). As amostras foram então diluídas até 20 μΜ de heme em tampão de 50 mM de TEA, 50 mM de NaCl, pH 7,5, em um cadinho de quartzo com atmosfera controlada, com um tamanho de 100 μΐ até 1 ml, e um comprimento de trajeto de 1 cm. 0 gás CO foi fluído sobre o headspace desse cadinho por 10 minutos para formar o complexo de Fe11-CO, cuja formação foi verificada por espectroscopia de UV visível (Soret máximo de 423 nm) . Essa amostra ou foi usada para medir a cinética da re-ligação de CO após fotólise instantânea, enquanto ainda sob 1 atmosfera de gás CO, ou foi aberta e agitada no ar por 30 minutos para oxigenar completamente o tampão, antes da fotólise instantânea para observar os eventos de re-ligação de O2- A associação de O2 ao heme foi monitorada em vários comprimentos de onda versus tempo. Esses traços foram ajustados com uma exponencial única com o uso do software Igor Pro (Wavemetrics, Inc., Oswego, 0R; última versão - 2005). Essa taxa era independente do comprimento de onda de observação, mas dependente da concentração de O2. A espectroscopia de UV visível foi usada ao longo do experimento para confirmar todos os complexos e intermediários (Cary 3K, Varian, Inc. Palo Alto, CA) . Os dados da adsorção transitória foram coletados com o uso de instrumentos descritos em Dmochowski, I.J. e cols. (31 de agosto de 2000), "Enantiomeric Discrimination of Ru- Substrates by Cytochrome P450cam", J. Inorg. Biochem. 81(3): 221-228, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à instrumentação. O instrumento possui um tempo de resposta de 20 ns, e os dados são digitalizados a 200 mega-amostras s-1.
k0ff (taxa de dissociação de O2)
Para medir a koff, complexos de Fe11-O2-Proteina (5 μΜ de heme) , diluídos em tampão anaeróbico de 50 mM de TEA, 50 mM de NaCl, pH 7,5, foram misturados rapidamente com um volume igual do mesmo tampão (anaeróbico) contendo várias concentrações de ditionita e/ou gás CO saturante. Os dados foram adquiridos em um espectrofotômetro de fluxo interrompido HI-TECH Scientific SF-61 equipado com um banho Neslab RTE-100 em temperatura constante ajustado em 20°C (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, Reino Unido). A dissociação de O2 do heme foi monitorada como um aumento na absorvência a 437 nm, um máximo no espectro de diferença de Fe11-Fe11-O2, ou 425 nm, um máximo no espectro de diferença de Fe11-Fe11-CO. Os traços finais foram ajustados para uma exponencial única com o uso do software que é parte do instrumento. Cada experimento foi feito um mínimo de seis vezes, e foram calculadas as médias das taxas resultantes. As taxas de dissociação medidas são independentes da concentração de ditionita (100, 50, 25, 10, 5 e 2,5 mM de ditionita foram testadas) e independentes do CO saturante como um cerco para a espécie reduzida, com e sem a presença de 10 mM de ditionita. Kd cinética para O2
A Kd cinética para O2 é determinada pelo cálculo da proporção de koff para kon com a utilização das medidas de k0ff e kon descritas acima.
Kd calculada
Para medir a Kd calculada, os valores para a k0ff e Kd cinética que foram obtidos como descritos acima foram colocados em um gráfico. Um relacionamento linear entre kDff e a Kd cinética foi definido pela equação (y = mx + b) . Os valores de k0ff foram então interpolados ao longo da linha, para derivar a Kd calculada usando Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA) . Na ausência de uma kon medida, essa interpolação fornece uma forma para relacionar k0ff à KD.
Taxa de auto-oxidação
Para medir a taxa de auto-oxidação, as amostras de proteína foram reduzidas anaerobicamente, depois diluídas até 5 μΜ de heme em tampão aeróbico de 50 mM de TEA, 50 mM de NaCl, pH 75. Essas amostras foram então incubadas em um espectrofotômetro Cary 3E equipado com um banho Neslab RTE- 100 em temperatura constante ajustado em 37°C, e rastreadas periodicamente (Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA). A taxa de auto-oxidação foi determinada pela diferença entre o máximo e mínimo no espectro de diferença Fe11-Fe11 plotado versus tempo, e ajustada com uma exponencial única usando Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA).
Taxa de reação com NO
A reatividade ao NO foi medida com o uso das proteínas purificadas (Tt WT H-NOX, Tt Y14 0H H-NOX e hemoglobina de Homo sapiens (Hs Hb) ) preparadas a 2 μΜ em tampão A, e o NO foi preparado a 200 μΜ em Tampão A (Tampão A: 50 mM de Hepes, pH 7,5, 50 mM de NaCl) . Os dados foram adquiridos em um espectrofotômetro de fluxo interrompido HI-TECH Scientific SF-61 equipado com um banho Neslab RTE-100 em temperatura constante a 20°C (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, Reino Unido). A proteína foi misturada rapidamente com NO em uma proporção de 1:1 com um tempo de integração de 0,00125 segundo. Os comprimentos de onda de mudança máxima foram ajustados até uma exponencial única com o uso do software que é parte do espectrômetro, medindo-se basicamente a etapa de taxa limitante da oxidação por NO.
Os produtos finais da reação foram férrico-NO para as proteínas H-NOX e férrico-água para Hs Hb. Medidas da p50
Se desejado, o valor de p50 para proteínas H-NOX mutante ou do tipo selvagem pode ser medido como descrito por Guarnone, R. e cols. (setembro/outubro de 1995), "Performance Characteristics of Hemox-Analyzer For Assessment of The Hemoglobin Dissociation Curve", Haematologica SO (5): 426-430, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à medida de valores de p50. O valor de p50 ê determinado com o uso de um analisador HemOx. A câmara de medida começa a 0% de oxigênio e é lentamente elevada, de forma incrementai, em direção a 100% de oxigênio. Uma sonda de oxigênio na câmara mede o % de saturação de oxigênio. Uma segunda sonda (luz UV-Vis) mede dois comprimentos de onda de adsorção, ajustados para os espectros UV-Vis dos picos alfa e beta da hemoproteína (por exemplo, uma proteína como H-NOX em complexo com heme). Esses picos de adsorção aumentam linearmente à medida que a hemoproteína se liga ao oxigênio. A mudança percentual de não ligado a 100% ligado é então plotada contra os valores do % de oxigênio para gerar uma curva. A p50 é o ponto na curva onde 50% da hemoproteína estão ligados ao oxigênio.
Especificamente, o Analisador Hemox (TCS Scientific Corporation, New Hope, PA) determina a curva de dissociação de oxi-hemoproteína (ODC) por exposição de 50 μl de sangue ou hemoproteína a uma pressão parcial crescente de oxigênio e sua desoxigenação com gás nitrogênio. Um eletrodo de oxigênio Clark detecta a mudança da tensão de oxigênio, que é registrada no eixo χ de um gravador x-y. O aumento resultante na fração de oxi-hemoproteína é simultaneamente monitorado por espectrofotometria de comprimento de onda duplo a 560 nm e 576 nra, e exibida no eixo y. São coletadas amostras de sangue da veia mediai do antebraço, anticoaguladas com heparina e mantidas a 4°C em gelo úmido até o ensaio. Cinqüenta μl de sangue total são diluídos em 5 μl de solução Hemox, um tampão fornecido pelo fabricante que mantém o pH da solução em um valor de 7,4 + 0,01. A amostra-tampão é aspirada para um cadinho que é parte do analisador Hemox, e a temperatura da mistura é equilibrada e elevada até 37°C; a amostra é então oxigenada até 100% com ar. Após ajuste do valor de p02, a amostra é desoxigenada com nitrogênio; durante o processo de desoxigenação, a curva é registrada em um papel de gráfico.
O valor de P50 é extrapolado no eixo χ como o ponto no qual a saturação de O2 é de 50% com o uso do software que ê parte do analisador Hemox. O tempo necessário para um registro completo é de aproximadamente 30 minutos.
Os valores de p50 para qualquer uma das proteínas H- NOX podem ser comparados com aqueles da hemoglobina como uma indicação da afinidade relativa da proteína H-NOX por O2, comparados com aquele da hemoglobina. A Tabela 15 lista os valores de p50 relatados previamente para hemoglobina.
Tabela 15. Variantes de hemoglobina e suas afinidades registradas por oxigênio
<table>table see original document page 145</column></row><table> <table>table see original document page 146</column></row><table>
Medidas da viscosidade
Se desejado, a viscosidade das soluções de H-NOX pode ser medida com o uso de um reômetro de cone/placa (modelo DV-III, Brookfield; Middleboro, MA) com o fuso cone CPE-40 em uma taxa de cisalhamento de 200/s. As soluções com viscosidades entre 1 e 4 centipoise (cP) administradas em experimentos de liberação de oxigênio em hemodiluição são relatadas como seguras (Winslow, R.M. e cols. (outubro de 2004), wComparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat", J. Appl Physiol. 97(4): 1.527-1.534, Patentes U.S. Nos 6.974.795 e 6.432.918, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à medida de viscosidade). Conseqüentemente, em algumas modalidades, a viscosidade da solução de proteína H-NOX é entre 1 e 4 cP.
Medidas da pressão oncótica coloidal
Se desejado, a pressão oncótica coloidal pode ser medida usando um osmômetro colóide de acordo com as instruções do fabricante (modelo 4420, Wescor; Logan, UT) . Métodos exemplares para medir a pressão oncótica coloidal são descritos em Vandegriff, K. D. e cols. (novembro de 1997), "Colloid Osmotic Properties of Modified Hemoglobins: Chemically Cross-Linked Versus Polyethilene Glycol Surface- Conjugated", Biophys. Chem. 69(1): 23-30, em uma página na Internet "anaesthesiamcq.com/FluidBook/fl2_4.php"; Patentes U.S. Nos 6.974.795 e 6.432.918, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à medida da pressão oncótica coloidal. Soluções com pressão oncótica coloidal entre 20 e 50 mm Hg administradas em experimentos de liberação de oxigênio em hemodiluição são relatadas como seguras (Winslow, R. M. e cols. (outubro de 2004), "Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat", J. Appl. Physiol. 97(4): 1.527-1.534). Conseqüentemente, em algumas modalidades, a pressão oncótica coloidal da solução de proteína H-NOX é entre 20 e 50 mm Hg.
Exemplo 3: Modelos de doença cardíaca para mutantes de H- NOX de transportador de NO
Dois modelos animais podem ser usados para comparar a eficácia de proteínas H-NOX como transportadores de NO para terapia padronizada de nitrato. Para comparar os efeitos das proteínas H-NOX com liberação autentica de NO com isosorbide dinitrato (ISDN) em um modelo de rato de doença cardiovascular crônica, uma adaptação de um protocolo estabelecido (Shimamura, S. e cols. (2006) . J Vet Med Sci Vol. 68(3) :213-7, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação a modelos de doença cardiovascular) podem ser realizados com o uso de machos de ratos Wistar. Para simular hipertrofia cardiovascular, a aorta abdominal é constrita (constrição da aorta abdominal ou modelo "AC") via laparotomia abdominal ventral e aplicação de um manguito de constricção por uma agulha inserida de calibre 21, que é então removida para permitir a constrição uniforme do vaso. Ratos falsamente operados passam por cirurgia similar, mas sem a criação de AC. Após a cirurgia, os ratos são aleatoriamente divididos em grupos de tratamento de 14 animais por grupo (7 sob medicação e 7 em placebo) , e deixados em recuperação por 7 dias. Os tratamentos por grupo (grupos de controle são pareados com cada caso de teste como placebo) são: (1) ratos AC administrados por via oral com sr-ISDN ou placebo; (2) ratos AC administrados por via IV com uma ou mais proteínas H-NOX de tipo selvagem ou mutantes aqui descritas ou placebo (por exemplo, uma proteína H-NOX inativada); (3) e (4) Ratos falsamente operados tratados como em (1) ou (2), respectivamente. Os tratamentos são uma vez ao dia por 12 semanas, depois do que os animais são sacrificados, e os corações são retirados para análises padrão de histopatologia para a determinação da morfologia de cardiomiócito, fibrose, depósito de colágeno, diâmetro ventricular, morfologia aórtica, e outras análises padrão para avaliação da progressão ou prevenção da doença.
Para comparar a eficácia de proteínas H-NOX àquela de ISDN na medicação de remodelagem ventricular esquerda de longa duração após infarto agudo do miocárdio, um modelo de cão, em que ISDN mostrou alguma eficácia via administração crônica, é realizado com o uso de um protocolo padrão (Bodh I. Jugdutt, MBChB, MSc; Mohammad I. Khan, MBBS (1994) . Circulation 89 (S)). Para cada experimento, quarenta cães saudáveis mestiços (peso de 16 a 29 kg) de ambos os sexos recebem uma toracotomia lateral esquerda sob anestesia geral (pentobarbital de sódio, 3 0 mg/kg IV) . Cateters de polietileno são inseridos na veia jugular externai, artéria carótida interna, e átrio esquerdo, preenchidos com solução salina heparinizada, e suas extremidades exteriorizadas atrás do pescoço. Uma ligadura de seda é colocada ao redor da artéria coronária descendente anterior esquerda, entre o primeiro e segundo ramos diagonais, e apertada. Glóbulos de metal são suturados as superfícies epicárdicas anterior, lateral, e posterior no plano de eixo curto no nível ventricular esquerdo médio para orientação ecocardiográfica consistente para topografia serial. O pericárdio e tronco foram então fechados. Penicilina (1 milhão de unidades) e estreptomicina (1 g) são dados por via intramuscular, e os cães são devolvidos a suas gaiolas.
Dois dias depois da laqueadura da artéria coronária, os 70 sobreviventes saudáveis são aleatoriamente destinados a terapia com nitrato (n=10), terapia com proteína H-NOX (por exemplo, uma ou mais proteínas H-NOX de tipo selvagem ou mutantes que foram opcionalmente caracterizadas in vitro com o uso de qualquer um dos ensaios aqui descritos e opcionalmente foram submetidas a otimização para toxicidade e/ou farmacocinética) (10) , e subgrupos de controle combinados (sem tratamento, n=20): subgrupo 1 (10 controle, 10 nitrato), e subgrupo 2 (10 controle, 10 proteína H-NOX) .
Os cães têm livre acesso a fluidos, e nenhuma tentativa é feita para tratar insuficiência cardíaca por restrição de fluido ou f armacoterapia. Em seis semanas, os cães sobreviventes são anestesiados, e os corações são interrompidos em diástole com uma overdose de cloreto de potássio intravenoso, retirados, lavados em solução salina normal, e pesados. As amostras de sangue são retiradas para monitoramento de gases sangüíneos, hemogramas, e eletrólitos. Com o uso dos procedimentos padrão, as medições durante a cicatrização são feitas (como ECG, hemodinâmica etc.), e as análises post-mortem incluem aquelas medidas acima descritas para insuficiência cardíaca crônica (por exemplo, acúmulo de colágeno, morfologia do miócito etc.). As proteínas H-NOX que são tão eficazes ou mais eficazes que ISDN (o padrão de tratamento de terapias com base em nitrato para insuficiência cardíaca aguda e crônica) no infarto do miocárdio e/ou nos experimentos de modelo de AC crônico são particularmente úteis para o tratamento de infarto do miocárdio e/ou AC crônico. Tais proteínas H-NOX também são úteis para tratar outras indicações para as quais a liberação de NO seja benéfica.
Os exemplos e a descrição detalhada apresentados anteriormente são oferecidos apenas como forma de ilustração, e não como forma de limitação. Todas as publicações, pedidos de patente e patentes citados nessa especificação são aqui incorporados por referência como se cada publicação, pedido de patente ou patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Embora a invenção tenha sido descrita com algum detalhe como forma de ilustração e exemplo a fim de facilitar sua compreensão, ficará facilmente aparente por aqueles habilitados na técnica à luz dos ensinamentos dessa invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas a ela, sem se afastar do espírito ou do escopo das reivindicações em anexo. A menos que definidos de forma diferente, os significados de todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados são aqueles comumente conhecidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa invenção pertence.
Aqueles habilitados na técnica também irão observar que quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos também podem ser usados para a prática ou teste da invenção.
Para uso nesse pedido, a menos que claramente indicado de forma diferente, o uso dos termos "um", "uma", e semelhantes refere-se a um ou mais.
Referências feitas nesse pedido a um valor de "cerca de" ou parâmetro incluem (e descrevem) modalidades que são dirigidas àquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, uma descrição que se refere a "cerca de X" inclui a descrição de "X".
Entende-se que aspectos e modalidades da invenção aqui descritas incluem "que compreende", "que consiste" e "que consiste basicamente em" aspectos e modalidades.

Claims (320)

1. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender: (i) uma quantidade farmaceuticamente aceitável de uma proteína H-NOX, em que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está dentro de 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor do que aquela da hemoglobina, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de NO dá proteína H-NÒX é entre 0,1 a 10 vezes aquela da hemoglobina.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX é entre 0,5 a 2 vezes aquela da hemoglobina.
4. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que é reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 100 vezes menor do qué aquela da hemoglobina.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 1.000 vezes menor do que aquela da hemoglobina.
6. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que a k0ff, K1 ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a k0ff, K1 ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 0,012 s"1 a 37°C.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a koff, K1 ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 1 χ 10"3 s"1 a 37°C.
10. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 10 μΜ a 37°C.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C.
13. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou - 12, caracterizada pelo fato de que a kQff, Ki ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
14. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que a koff, K1 ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
15. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
16. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37 °C.
17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que a koff, K1 ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37 °C, e em que a taxa de auto- oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
18. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
19. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17 õu 18, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s-1.
20. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 òu 19, caracterizada pelo fato de que heme é ligado à proteína H-NOX.
21. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 òu 20, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína mutante.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação dã bolsa distal.
23. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 ou 21, caracterizada pelo fato de, que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que não está na bolsa distal.
24. Composição farmacêutica, dé acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 OU 23, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a koff para NO, a k1 para NÓ, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
25. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a reatividade de NO comparada àquela de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
26. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Tyrl4Ò de H-NOX de T. t etigcongensis é substituído por qualquer outro aminoácido.
27. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 OU - 26, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX- compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Phel4 8 de H-NOX de L. pneumophilia 8 é substituído por qualquer outro aminoácido.
28. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizada pelo fato de que pelo menos um aminoácido C-terminal na proteína H-NOX mutante foi removido comparado a uma proteína de tipo selvagem correspondente.
29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de 50 aminoácidos C-terminais contíguos na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondeíite.
30. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 ou 29, caracterizada pelo fato de que entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos C- terminais contíguos na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
31. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, - 27, 28, 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tehgcongensis, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L- P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H- NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NÒX N74A-Y14 0H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y14OF de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y4 0L de T. tengcongensis, H-NÔX Y14 0H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, -2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfuricans, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y13 9L de D. desulfuricans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, βΐ I140Y de H. sapiens, βΐ I145Y de H. sapiens, βΐ(1-385) de H. sapiens, βΐ(1-385)I145Y de H. sapiens, βΐ(1-385) I145H de H. sapiens, βΐ(1-194) de H. sapiens, βΐ(1-194) I145Y de H. sapiens, βΐ(1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de H. sapiens, β2(1-217) I142Y de H. sapiens, βΐ H-NOX H105G de H. sapiens, βΐ H-NOX H105F de H. sapiens, βΐ H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ(1- 385) de R. norvegicus, βΐ (1-385) I145Y de R. norvegicus, βΐ(1-385) I145H de R. norvegicus, βΐ(1-194) de R. norvegicus, βΐ (1-194) I145Y de R. norvegicus, βΐ(1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2 (1-217) de R. norvegicus, β2(1-217) I142Y de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105G de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX(1- -175), Cb H-NOX (1-186), H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1- -183) de C. acetobutylicum, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14 8 86 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster; H-NOX do tipo selvagem de N. puncti forme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, R. norvegicus do tipo selvagem; H-NOX do tipo selvagem de X. Iaevis, H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-37 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme.
32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ(1-385) do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ(1-217)de R. norvegicus, βΐ (1-194) de R. norvegicus, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0L de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T.- tengcongensis, HNOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 1, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 2, e H-NOX F142Y de L. pneumophilia 2.
33. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, -27, 28, 29, 30, 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de mamífero ou é derivada de uma proteína de mamífero.
34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína humana ou é derivada de uma proteína humana.
35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a proteína humana é β1 ou é derivada de β1.
36. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, - 27, 28, 29, 30, 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína bacteriana ou é derivada de uma proteína bacteriana.
37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de T. tetigcongensis ou é derivada de uma proteína de T. tengcongensis.
38. Composição farmacêutica, de acordo còm qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, - 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37, caracterizada pelo fato de que NO é ligado à proteína H-NOX.
39. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, - 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 OU 38, caracterizada por compreender um ou mais lipossomos ou nanopartículas que compreendem a proteína H-NOX.
40. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, - 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.
41. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a polietileno glicol.
42. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, -27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ou -41, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína H-NOX mutante de qualquer uma das reivindicações -245-314.
43. Composição farmacêutica caracterizada por compreender (i) uma quantidade farmaceuticamente aceitável de uma proteína H-NOX, em que a koff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entrè cèrca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de -10 s"1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 370C, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.
44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que a koff, kx, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 0,012 s"1 a 37°C.
45. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que a k0ff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 1 χ IO"3 s"1 a 37°C.
46. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44 ou 45, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H- NOX é pelo menos cerca de 10 μΜ a 37°C.
47. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de 02 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 50 μΜ 37°C.
48. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46 ou 47, caracterizada pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
49. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47 ou 48, caracterizada pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de s"1 a 37°C, e em que a cpnstante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
50. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49, caracterizada pelo fato de que a koff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H- NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
51. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
52. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1a 37°C.
53. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 52, caracterizada pelo fato de que a k0ff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
54. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, -52 ou 53, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, eem que a taxa de auto-oxidação da proteína H- NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
55. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, -52, 53 ou 54, caracterizada pelo fato de que a taxa dè auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1 .
56. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, -52, 53, 54 ou 55, caracterizada pelo fato de que heme é ligado à proteína H-NOX.
57. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, -52, 53, 54, 55 ou 56, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína mutante.
58. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação da bolsa distai.
59. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 ou 58, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que não está na bolsa distai.
60. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, - 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 ou 59, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a k0ff para NO, a kx para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
61. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, - 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a reatividade de NO comparada àquela de: uma proteína de tipõ selvagem correspondente.
62. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, - 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ou 61, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Tyrl40 de T. tengcongensis H-NOX é substituído por qualquer outro aminoácido.
63. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, - 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 ou 62, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Phel4 8 de H-NOX de li. pneumophilia 8 é substituído por qualquer outro aminoácido.
64. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, -52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 OU 63, caracterizada pelo fato de que pelo menos um aminoácido C- terminal na proteína H-NOX mutante foi removido comparado a uma proteína de tipo selvagem correspondente.
65. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de 50 aminoácidos C-terminais contíguos na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
66. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 ou 65, caracterizada pelo fato de que entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos C- terminais contíguos na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
67. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, -52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 ou -66, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX dó tipo selvagem de T. tengcongensis, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX -I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F- Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H- NOX W9H de Γ. tehgcongensis, H-NOX N74E de Τ. tengcongensis, H-NOX N74A de Τ. tengcongensis, H-NOX N74H de Τ. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de Τ. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de Τ. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. púeumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfuricans, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, βΐ I145Y de H. sapiens, β1(1- - 385) de H. sapiens, βΐ(1-385) I145Y de H. sapiens, β1(1- - 385) I145H de H. sapiens, βΐ (1-194) de H. sapiens, βΐ(1- - 194) I145Y de H. sapiens, βΐ (1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de H. sapiens, β2(1-217) I142Y de H. sapiens, βΐ H-NOX I-1105G de H. sapiens, βΐ H-NOX H105F de H. sapiens, βΐ H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1(1-385) de R. norvegicus, βΐ(1-385) I145Y de R. norvegicus, βΐ(1-385) I145H de R. norvegicus, βΐ(1-194) de R. norvegicus, βΐ(1-194) I145Y de R. norvegicus, βΐ(1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2(1-217) de R. norvegicus, β2(1-217) I142Y de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105G de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX(1- - 175), Cb H-NOX (1-186) , H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1- - 183) de C. acetobutylicum, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster; H-NOX do tipo selvagem de N. puncti forme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagèiin de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, R. norvegicus do tipo selvagem; H-NOX do tipo selvagem de X. laevis, H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-37 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme.
68. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ (1-385) do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ(1-217)de R. norvegicus, βΐ(1-194) de R. norvegicus, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0L de T tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T tengcongensis, HNOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 1, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 2, e H-NOX F142Y de L. pneumophilia 2.
69. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, -52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, -67 ou 68, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de mamífero ou é derivada de uma proteína de mamífero.
70. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína humana ou é derivada de uma proteína humana.
71. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a proteína humana é β1 ou é derivada de β1.
72. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, -52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, -67 ou 68, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína bacteriana ou é derivada de uma proteína bacteriana.
73. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de T. tengcongensis ou é derivada de uma proteína de T. tengcongensis.
74. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, -52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, -67, 68, 69, 70, 71, 72 ou 73, caracterizada pelo fato de que NO é ligado à proteína H-NOX.
75. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, - 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, - 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 ou 74, caracterizada por compreender um ou mais lipossomos ou nanopartículas que compreendem a proteína H-NOX.
76. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, - 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, - 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 ou 75, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NÒX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.
77. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a polietileno glicol.
78. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, - 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, - 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 ou 77, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína H-NOX mutante de qualquer uma das reivindicações 245-314.
79. Método de liberação de NO a um indivíduo, caracterizado por compreender a administração a um indivíduo que dela necessita de uma proteína H-NOX em uma quantidade suficiente para liberar uma quantidade eficaz de NO ao indivíduo, em que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina.
80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está entre 0,1 a 10 vezes aquela da hemoglobina.
81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está entre 0,5 a 2 vezes aquela da hemog1obina.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80 ou 81, caracterizado pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NÒX é pelo menos 100 vezes menor que aquela da hemoglobina.
83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 1.000 vezes menor que aquela da hemoglobina.
84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82 Du 83, caracterizado pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s-1.
85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83 ou 84, caracterizado pelo fato de que a koff, kl7 ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 e cerca de 10 s-1 a 37°C.
86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a koff, kx, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 e cerca de -0, 012 s-1 a 37°C.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a kQff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1e cerca de 1 χ 10-3 s-1 a 37°C.
88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 ou 87, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 10 μΜ a 37°C.
90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fatò de que á constante de dissociação de 02 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C.
91. Método, dé acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ou 90, caracterizado pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, - 90 ou 91, caracterizado peló fato de que a koff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
93. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, - 90, 91 ou 92, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NÒX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, - 90, 91, 92 ou 93, caracterizado pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menòs que cerca de 1 h-1 37°C.
95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93 ou 94, caracterizado pèlò fato de que a koff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ -IO"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a taxa de auto- oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de Ih"1 a 37°C.
96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94 ou 95, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de ΙμΜ a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de Ih"1 a 37°C.
97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95 ou 96, caracterizado pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de Ih"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
98. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 ou 97, caracterizado pelo fato de que heme é ligado à proteína H-NOX.
99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 ou 98, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína mutante.
100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação da bolsa distai.
101. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 99 ou 100, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que não está na bolsa distai.
102. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, - 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 OU 101, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a k0ff para NO, a kj. para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
103. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, - 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 ou 102, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a reatividade de NO comparada àquela de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
104. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, - 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 ou - 103, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Tyrl4 0 of T. tengcongensis H-NOX é substituído por qualquer outro aminoácido.
105. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103 ou 104, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Phel410 de L. pneumophilia 10 H-NOX é substituído pór qualquer outro aminoácido.
106. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, -104 ou 105, caracterizado pelo fato de que pelo menos um aminoácido C-terminal na proteína H-NÕX mutante foi removido comparado a uma proteína de tipo selvagem correspondente.
107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 5 0 aminoácidos C-terminais contíguos na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 106 ou 107, caracterizado pelo fato de que entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos C-terminais na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
109. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, -104, 105, 106, 107 ou 108, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de Τ. tengcongensis, H-NOX I5L- Ρ115Α de Τ. tengcongensis, H-NOX W9F de Τ. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de Τ. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de Τ. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de Τ. tengcongensis, H-NOX W9Y de Τ. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H- NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y14 0H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0A de T.. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfuricans, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, βΐ I145Y de H. sapiens, β1(1- -385) de H. sapiens, βΐ (1-385) I145Y de H. sapiens, β1(1- -385) I145H de. Η. sapiens, β1(1-194) de H. sapiens, β1(1- -194) I145Y de H. sapiens, βΐ(1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de H. sapiens, β2 (1-217) I142Y de H. -sapiens, βΐ H-NOX H105G de H. sapiens, βΐ H-NOX H105F de H. sapiens, βΐ H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1(1- -385) de R. norvegicus, βΐ (1-385) I145Y de R. norvegicus, β1(1-385) I145H de R. norvegicus, βΐ(1-194) de R. norvegicus, βΐ (1-194) I145Y de R. norvegicus, β1(1->194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2 (1-217) de R. norvegicus, β2 (1-217) Ι142Υ de R. norvegicus, β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX (1- -175), Cb H-NOX (1-186), H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1- -183) de C. acetobutylicum, GCY-35 H-NÓX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster; H-NOX do tipo selvagem de N. puncti forme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do, tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, R. norvegicus do tipo selvagem; H-NOX do tipo selvagem de X. laevis, H-NOX do tipo selvagem de 0. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-37 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme.
110. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, β1 (1-385) do tipo selvagem de R. norvegicus, β(1-217)de R. norvegicus, β(1-194) de R. norvegicus, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H- NOX Y140L de T tengcongensis, H-NOX Y140F de T tengcongensis, HNOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 1, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 2, e H-NOX F142Y de L. pneumophilia 2.
111. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, -104, 105, 106, 107, 108, 109 ou 110, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de mamífero ou é derivada de uma proteína de mamífero.
112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína humana ou é derivada de uma proteína humana.
113. Método, de acordo com a reivindicação 112, caracterizado pelo fato de que a proteína humana é β1 ou é derivada de β1.
114. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, -104, 105, 106, 107, 108, 109 ou 110, caracterizado pelo fato de qué a proteína H-NOX é uma proteína bacteriana ou é derivada de uma proteína bacteriana.
115. Método, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de T. tengcongensis ou é derivada de uma proteína de T. tengcongensis.
116. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, - 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 ou - 115, caracterizado por compreender um ou mais lipossomos ou nanopartícuias que compreendem a proteína H-NOX.
117. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, - 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, - 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 ou 116, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.
118. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a polietileno glicol.
119. Método, de acordo cõm qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, - 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, - 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, - 116, 117 ou 118, caracterizado pelo fato de que NO é ligado- à proteína H-NOX antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo.
120. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, - 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, - 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, - 116, 117 ou 118, caracterizado pelo fato de que NO não é ligado à proteína H-NOX antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo, e em que a proteína H-NOX transporta NO de uma localização no indivíduo para uma outra localização no indivíduo.
121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, -104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, -116, 117, 118, 119 ou 120, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é administrada por via oral, retal, ou ao sangue do indivíduo.
122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, -104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, -116, 117, 118, 119, 120 ou 121, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, -104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, -116, 117, 118, 119, 120, 121 ou 122, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofre ou está em risco de contrair uma condição cardiovascular, hipertensão, uma condição exacerbada pòr hipertensão ou uma deficiência funcional de NO.
124. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo fato de que uma condição exacerbada por hipertensão é insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou um AVC.
125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, -104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, -116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123 ou 124, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é administrada ao indivíduo pelo menos duas vezes.
126. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, -90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, -104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, -116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 OU 125, caracterizado pelo fato dè que a proteína H-NOX é uma proteína H-NÒX mutante de qualquer uma das reivindicações -245-314.
127. Método de liberação de NO a um indivíduo, caracterizado por compreender a administração a um indivíduo que dela necessita de uma proteína H-NOX em uma quantidade suficiente para liberar uma quantidade eficaz de NO ao indivíduo, em que a koff, k1 ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 e cerca de 10 a 37°C, e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo merios cerca de 1 μΜ a 37°C.
128. Método, de acordo a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que a koff, k1 ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 e cerca de -0, 012 s-1 a 37°C.
129. Método, de acordo a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que a koff, k1 ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 e cerca de 1 χ 10-3 s-1 a 37°C.
130. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128 ou 129, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 10 μΜ a 37°C.
131. Método, de acordo a reivindicação 13 0, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C.
132. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130 ou 131, caracterizado pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
133. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131 ou 132, caracterizado pelo fatò de que a koff, ki ou k2 para NO da proteína H-NÒX está entre cerca de 1 χ ICT4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132 ou 133, caracterizado pelo fato de que a koff, ki ou k2 para NO da proteína H-NOX está eiltre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H- NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
135. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ou 134, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
136. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 ou 135, caracterizado pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
137. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 ou 13 6, caracterizado pelo fato de que a k0ff, ki ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
138. Método, de acordo cõm qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 ou 137, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H- NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
139. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 13 7 ou 13 8, caracterizado pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NÒX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
140. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 13 8 ou 13 9, caracterizado pelo fato de que heme é ligado à proteína H-NOX.
141. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139 ou 140, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína mutante.
142. Método, de acordo com a reivindicação 141, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação da bolsa distai.
143. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 141 ou 142, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que não está na bolsa distai.
144. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142 ou 143, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a Koff para NO, a ki para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a taxa de auto- oxidação, ou qualquer combinação de dois Ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
145. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143 OU 144, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a reatividade de NO comparada àquela de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
146. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144 OU 145, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Tyrl4 0 de H-NOX de T. tengcongensis é substituído por qualquer outro aminoácido.
147. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 OU 146, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Phel410 de H-NOX de L. pneumophilia 10 é substituído por qualquer outro aminoácido.
148. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, - 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 OU - 147, caracterizado pelo fato de que pelo menos um aminoácido C-terminal na proteína H-NOX mutante foi removido comparado a uma proteína de tipo selvagem correspondente.
149. Método, de acordo com a reivindicação 14 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 50 aminoácidos C-terminais contíguos na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
150. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 148 ou 149, caracterizádo pelo fato de que entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos C-terminais contíguos na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
151. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, - 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, - 148, 14 9 ou 150, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L- P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H- NOX W9H de Τ. t engcongensis, H-NOX N74E de Τ. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y14OF de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y14 0L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NÓX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y4 0L de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfuricans, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, βΐ I145Y de H. sapiens, β1{1- -385) de H. sapiens, βΐ (1-385) I145Y de H. sapiens, β1(1- -385) I145H de H. sapiens, βΐ (1-194) de H. sapiens, β1(1- -194) I145Y de H. sapiens, βΐ(1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de H. sapiens, β2(1-217) I142Y de H. sapiens, βΐ H-NOX H105G de H. sapiens, βΐ H-NOX H105F de H. sapiens, βΐ H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1(1- -385) de R. norvegicus, βΐ (1-385) I145Y de R. norvegicus, β1 (1-385) I145H de R. norvegicus, βΐ(1-194) de R. norvegicus, βΐ (1-194) I145Y de R. norvegicus, β1(1-ι194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2 (1-217) de R. norvegicus, β2(1-217) I142Y de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105G de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX(1- -175), Cb H-NOX (1-186), H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-N0X(1- -183) de C. acetobutylicum, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de D. melanôgaster, CG14 885-PA do tipo selvagem de D. melanôgaster, CG148 86 do tipo selvagem de D. melanôgaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanôgaster; H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagèm de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, R. norvegicus do tipo selvagem; H-NOX do tipo selvagem de X. laevis, H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A.. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-37 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punetiforme.
152. Método, de acordo com a reivindicação 151, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ (1-385) do tipo selvagem de R. norvegicus, β(1-217)de R. norvegicus, β(1-194) de R. norvegicus, H-NOX do tipo selvagem de T. tengeongensis, H- NOX Y14 0L de T tengeongensis, H-NOX Y14 0F de T tengeongensis, HNOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 1, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 2, e H-NOX F142Y de L. pneumophilia 2.
153. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, -148, 149, 150, 151 ou 152, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de mamífero ou é derivada de uma proteína de mamífero.
154. Método, de acordo com a reivindicação 153, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína humana ou é derivada de uma proteína humana.
155. Método, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que a proteína humana é βΐ ou é derivada de βi.
156. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, -148, 149, 150, 151 ou 152, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína bacteriana ou é derivada de. uma proteína bacteriana.
157. Método, de acordo com a reivindicação 156, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de T. tengcongensis ou é derivada de uma proteína de T. tengcongensis.
158. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, -148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 OU 157, caracterizado pelo fato de que um ou mais lipossomos ou nanopartículas compreendem a proteína H-NOX.
159. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, -148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 OU 158, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.
160. Método, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a polietileno glicol.
161. Método, de acordo cóm qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, -148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ou 160, caracterizado pelo fato de que NO é ligado à proteína H-NOX antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo.
162. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, -148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ou 160, caracterizado pelo fato de que NO não é ligado à proteína H-NOX antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo, e em que a proteína H-NOX transporta NO de uma localização no indivíduo para uma outra localização no indivíduo.
163. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, -136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, -148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, -160, 161 ou 162, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é administrada por via oral, retal, ou ao sangue do indivíduo.
164. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, - 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, - 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, - 160, 161, 162 ou 163, caracter i zado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
165. Método, de acordo còm qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, - 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, - 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, - 160, 161, 162, 163 ou 164, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofre ou está em risco de contrair uma condição cardiovascular, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão, uma condição vasoconstritora, AVC, ou uma deficiência funcional de NO.
166. Método, de acordo com a reivindicação 165, caracterizado pelo fato de que uma condição exacerbada por: hipertensão é insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou um AVC.
167. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, - 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, - 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, - 160, 161, 162, 163, 164, 165 ou 166, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é administrada ao indivíduo pelo menos duas vezes.
168. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, - 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, - 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, -160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 ou 167, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NÒX é uma proteína de H-NOX mutante de qualquer uma das reivindicações 245-314.
169. Kit caracterizado por compreender (i) uma quantidade farmaceuticamènte aceitável de uma proteína H- NOX, em que a constante de dissociação de NO da proteína H- NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos -10 vezes menor que aquela da hemoglobina, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.
170. Kit, de acordo corti a reivindicação 169, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação· de NO da proteína H-NOX está entre 0.1 a 10 vezes aquela da hemoglobina.
171. Kit, de acordo com a reivindicação 170, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de NO da proteína H-NÓX está entre 0,5 a 2 vezes aquela da hemoglobina.
172. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170 ou 171, caracterizado pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NÒX é pelo menos 100 vezes menor que aquela da hemoglobina.
173. Kit, de acordo com a reivindicação 172, caracterizado pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 1.0Ò0 vezes menor que aquela da hemoglobina.
174. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172 ou 173, caracterizado pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s-1.
175. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173 ou 174, caracterizado pelo fato de que a koff, k1; ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 3715 C.
176. Kit, de acordo com a reivindicação 175, caracterizado pelo fato de que a koff, klf òu k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de -0,012 s"1 a 37°C.
177. Kit, dé acordo com a reivindicação 176, caracterizado pelo fato de que a k0ff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1e cerca de 1 χ IO"3 s_1a 3715 C.
178. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176 ou -177, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de 02 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1. μΜ a 37°C.
179. Kit, de acordo com a reivindicação 178, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 10 μΜ a 37°C.
180. Kit, de acordo com a reivindicação 179, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de 02 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C.
181. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179 ou 180, caracterizado pelo fato de que a koff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μm a 37°C.
182. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, - 178, 179, 180 ou 181, caracterizado pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 á 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
183. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, - 178, 179, 180, 181 ou 182, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
184. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, - 178, 179, 180, 181, 182 ou 183, caracterizado peló fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
185. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, - 178, 179, 180, 181, 182, 183 ou 184, caracterizado pelo fato de que a kQff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 371C.
186. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, - 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184 ou 185, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h-1 a 37°C.
187. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 OU 186, caracterizado pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s-1.
188. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 OU 187, caracterizado pelo fato de que heme é ligado à proteína H- NOX.
189. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187 ou 188,, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína mutante.
190. Kit, de acordo com a reivindicação 189, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação da bolsa distai.
191. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 189 ou 190, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que não está na bolsa distai.
192. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, -190 ou 191, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a K0ff para NO, a ki para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
193. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, -190, 191 ou 192, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a reatividade de NO comparada àquela de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
194. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, -190, 191, 192 ou 193, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Tyrl4 0 de H-NOX de T. tengcongensis é substituído pór qualquer outro aminoácido.
195. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, -190, 191, 192, 193 ou 194, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Phel4 9 de H-NOX L. pneumophilia. 9 é substituído por qualquer outro aminoácido.
196. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, - 190, 191, 192, 193, 194 ou 195, caracterizado pelo fato de que pelo menos um aminoácido C-terminal na proteína H-NOX mutante foi removido comparado a uma proteína de tipo selvagem correspondente.
197. Kit, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 50 aminoácidos C-terminais contíguos or entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos C-terminais na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
198. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, - 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, - 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 ou 197, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H- NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-YI40H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y14OH de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y14 0F de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y14 0L de T. tengcongensis, H- NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75F- His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F- His6 de Τ. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H- NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfuricans, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, βΐ I145Y de H. sapiens, βΐ(1- -385) de H. sapiens, βΐ (1-385) I145Y de H. sapiens, β1(1- -385) I145H de H. sapiens, β1 (1-194) de H. sapiens, β1(1- -94) I145Y de H. sapiens, βΐ (1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de H. sapiens, p2(1-217) I142Y de H. sapiens, βΐ H-NOX H105G de H. sapiens, βΐ H-NOX H105F de H. sapiens, βΐ H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1(1- -385) de R. norvegicus, βΐ(1-385) I145Y de R. norvegicus, - βΐ (1-385) I145H de R. norvegicus, βΐ (1-194) de R. norvegicus, βΐ(1-194) I145Y de R. norvegicus, βΐ (1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2 (1-217) de R. norvegicus:, β2 (1-217) I142Y de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105G de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX(1- -175), Cb H-NOX(1-186), H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1- -183) de C. acetobutylicum, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo -selvagem de D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster; H-NOX do tipo selvagem de N. puncti forme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de Β. taurus, R. norvegicus do tipo selvagem; H-NOX do tipo selvagem de X. Iaevisl H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-3 7 do tipò selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme.
199. Kit, de acordo com a reivindicação 198, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste ém sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ (1-385) do tipo selvagem de R. norvegicus, β (1-217)de R. norvegicus, β(1-194) de R. norvegicus, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H- NOX Y140L de T tengcongensis, H-NOX Y140F de T tengcongensis, HNOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 1, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 2, e H-NÓX F142Y de L. pneumophilia 2.
200. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, -190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 ou 199, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de mamífero ou é derivada de uma proteína de mamífero.
201. Kit, de acordo com a reivindicação 200, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de ser humano, é derivada de uma proteína humana, é β1 humana, ou é derivada de βΐ humana.
202. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, -190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 ou 199, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína bacteriana ou é derivada de uma proteína bacteriana.
203. Kit, de acordo com a reivindicação 202, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de T. tengcongensis ou é derivada de uma proteína de T. tengcongensis.
204. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, -190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, -202 ou 203, caracterizado pelo fato de que NO é ligado à proteína H-NOX.
205. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, -190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, -202, 203 ou 204, caracterizado por compreender um ou mais lipossomos ou nanopartículas que compreendem a proteína H- NOX.
206. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, -178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, - 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, - 202, 203, 204 ou 205, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NÓX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.
207. Kit, de acordo com a reivindicação 206, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a polietileno glicol.
208. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, - 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, - 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, - 202, 203, 204, 205, 206 ou 207, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína H-NOX mutante de qualquer uma das reivindicações 245-314.
209. Kit caracterizado por compreender (i) uma proteína H-NOX, em que a koff, k1# ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e (ii) instruções para uso do kit para liberar NO a um indivíduo.
210. Kit, de acordo com a reivindicação 209, caracterizado pelo fato de que a koff, kx, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 0,012 s-1 a 37°C.
211. Kit, de acordo com a reivindicação 210, caracterizado pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 1 χ 10"3 s"1 a 37°C.
212. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210 ou 211, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 10 μΜ a 37°C.
213. Kit, de acordo com a reivindicação 212, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C.
214. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212 ou 213, caracterizado pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s-1.
215. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 21Ò, 211, 212, 213 ou 214, caracterizado pelo fato de que a koff, klf ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 e cerca de -10 s-1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
216. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214 ou 215, caracterizado pelo fató de que a koff, kx, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10-4 s-1 e cerca de -10 s-1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H- NOX é de menos que cerca de 700 s-1.
217. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215 ou 216, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é menos que cerca de 700 s-1.
218. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216 ou -217, caracterizado pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
219. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217 ou 218, caracterizado pelo fato de que a koff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
220. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218 ou 219, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, ê em que a taxa de auto-oxidação da proteína H- NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
221. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218, 219 ou 220, caracterizado pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s"1.
222. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218, 219, 220 ou 221, caracterizado pelo fato de que heme é ligado à proteína H-NOX.
223. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218, 219, 220, 221 ou 222, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína mutante.
224. Kit, de acordo com a reivindicação 223, caracterizado pelo fato de que a a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação da bolsa distai.
225. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 223 ou 224, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que não está na bolsa distai.
226. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218, 219, 220, 221, 222, 223, 224 ou 225, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a koff -para NO, a ki para NO, ou a k2 para NO, a constante de dissociação dé Ò2, a estabilidade de NÒ, a taxa de auto- oxidação, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
227. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 ou 226, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a reatividade de NO comparada àquela de uma proteína de tipo selvagem correspondente.
228. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226 OU 227, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Tyrl4 0 de H-NOX de T. tengcongensis é substituído por qualquer outro aminoácido.
229. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, - 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227 ou 228, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Phel49 de H-NOX de L. pneumophilia 9 é substituído por qualquer outro aminoácido.
230. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, - 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228 ou - 229, caracterizado pelo fato de que pelo menos um aminoácido C-terminal na proteína H-NOX mutante foi removido comparado a uma proteína de tipo selvagem correspondente.
231. Kit, de acordo com a reivindicação 230, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 50 aminoácidos C-terminais contíguos na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
232. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 230 ou 231, caracterizado pelo fato de que entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos C-terminais contíguos na proteína H-NOX mutante foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
233. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, - 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, - 230, 231 ou 232, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L- P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de Τ. tengcongensis, H-NOX W9F-YI40H de Τ. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de Τ. tengcongensis, H-NOX W9Y de Τ. tengcongensis, H-NOX W9N de Τ. tengcongensis, H- NOX W9H de Τ. tengcongensis, H-NOX Ν74Ε de Τ. tengcongensis, H-NOX N74A de Γ. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y14OF de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfuricans, H-NOX (728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, βΐ H-NOX dò tipo selvagem de H. sapiens, βΐ I145Y de H. sapiens, β1(1- -385) de H. sapiens, βΐ (1-385) I145Y de H. sapiens, β1(1- -385) I145H de H. sapiens, βΐ (1-194) de H. sapiens, β1(1- -194) I145Y de H. sapiens, βΐ (1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de H. sapiens, β2(1-217) I142Y de H. sapiens, βΐ H-NOX H105G dè H. sapiens, βΐ H-NOX H105F de H. sapiens, βΐ H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1(1- -385) de R. norvegicus, βΐ (1-385) I145Y de R. norvegicus, β1(1-385) I145H de R. norvegicus, βΐ(1-194) de R. norvegicus, βΐ (1-194) I145Y de R. norvegicus, βΐ(1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2(1-217) de R. norvegicus, β2 (1-217) I142Y de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105G de R. norvegicus, βΐ H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX(1- -175), Cb H-NOX (1-186) , H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1- -183) de C. acetobutylicum, GCY-35 H-NOX do tipo selvágem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, βΐ H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14 885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster; H-NOX do tipo selvagem de N. pune ti forme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, R. norvegicus do tipo selvagem; H-NOX do tipo selvagem de X. laevis, H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-3 5 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-3 6 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-3 7 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punetiforme.
234. Kit, de acordo com a reivindicação 233, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ (1-385) do tipo selvagem de R. norvegicus, β (1-217)de R. norvegicus, β (1-194) de R. norvegicus, H-NOX do tipo selvagem de T. tengeongensis, H- NOX Y14 0L de T tengeongensis, H-NOX Y14 0F de T tengcongensis, HNOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 1, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia 2, e H-NOX F142Y de L. pneumophilia 2.
235. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, - 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, - 230, 231, 232, 233 ou 234, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de mamífero ou é derivada de uma proteína de mamífero.
236. Kit, de acordo com a reivindicação 235, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína humana ou é derivada de uma proteína humana.
237. Kit, de acordo com a reivindicação 236, caracterizado pelo fato de que a proteína humana é βΐ ou é derivada de β1.
238. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, - 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, - 230, 231, 232, 233 ou 234, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína bacteriana ou é derivada de uma proteína bacteriana.
239. Kit, de acordo com a reivindicação 238, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de T. tengcongensis ou é derivada de uma proteína de T. tengcongensis.
240. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, - -218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, - 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238 ou 239, caracterizado pelo fato de que NO é ligado à proteína H- NOX.
241. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, -230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239 ou 240, caracterizado por compreender um ou mais lipossòmos ou nanopartículas que compreendem a proteína H-NQX·
242. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, -230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240 ou -241, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemènte a outra molécula ou porção.
243. Kit, de acordo com a reivindicação 242, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a polietileno glicol.
244. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, -218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, -230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, -242 ou 243, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína H-NOX mutante de qualquer uma das reivindicações 245-314.
245. Proteína de H-NOX isolada caracterizada por compreender pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO ou reatividade de NO comparada aquela de uma proteína de H-NOX de tipo selvagem correspondente, em que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX mutante está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, em que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina, e em que a proteína H-NOX mutante não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX de tipo selvagem de T. tengcongensis, sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, ou H- NOX F142Y de L. pneumophilia 2.
246. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 245, caracterizada pelo fato de que proteína H-NOX mutante não é H-NOX F78Y/Y14 0L de T. tengcongensis.
247. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 5 ou 24 6, caracterizada pelo fato de que a proteína de H-NOX mutant não é H-NOX de tipo selvagem de L. pneumophilia, βΐ H-NOX de tipo selvagem de H. sapiens, sGC βΐ H-NOX (1-385) de R. norvegicus, βΐ H-NOX de tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ H-NOX de tipo selvagem de D. melangaster, CG14 885-PA H-NOX de tipo selvagem de D. melangaster, GCY-35 HNOX de tipo selvagem de C. elegans, H-NOX de tipo selvagem de N. pune ti forme, H-NOX de tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX de tipo selvagem de S. oneidensis, ou H-NOX de tipo selvagem de C. acetobutylicum.
248. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 24 6 ou 24 7, caracterizada pelo fato de que a proteína de H-NOX mutante não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y14 0F de T. tengcongensis, βΐ H-NOX (1-385) 1145Y de R. norvegicus sGC, sGC βΐ H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC βΐ HNOX H105F de R. norvegicus, sGC βΐ H-NOX I145Y de R. norvegicus, sGC βΐ H-NOX C78S de R. norvegicus, ou sGC βΐ H-NOX C78E de R. norvegicus.
249. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247 ou 248, caracterizada pelo fato de que a proteína de H-NOX mutante não é H-NOX Y14 0H de T. tengcongensis ou β1 114 OY de H. sapiens.
250. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 24 6, 24 7, 24 8 ou 249, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX mutante está entre 0,1 a 10 vezes aquela da hemoglobina.
251. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 250, caracterizada pelo fatò de que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX mutante está entre 0,5 a 2 vezes aquela da hemoglobina.
252. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250 ou 251, caracterizada pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é pelo menos 100 vezes menor que aquela da hemoglobina.
253. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 252, caracterizada pelo fato de que a reatividade de NO da proteína de H-NOX mutante é pelo menos -1.000 vezes menor que aquela da hemoglobina.
254. Proteína de H-NÒX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252 ou 253, caracterizada pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s"
255. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253 ou 254, caracterizada pelo fato de que a koff, Jc3., ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de -1 x 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C.
256. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254 ou 255, caracterizada pelo fato de que a koff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 0,012 s"1 a 37°C.
257. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 5, 246, 247, 248, 24 9, 250, 251, -252, 253, 254, 255 ôu 256, caracterizada pelo fato de que a k0ff/ ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 1 χ IO"3 s"1 a 37°C.
258. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256 ou 257, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
259. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquér uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,. -252, 253, 254, 255, 256, 257 ou 258, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H- NOX mutante é pelo menos cerca de 10 μΜ a 37°C.
260. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 259, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C.
261. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 ou 260, caracterizada pelo fato de que a koff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 10 s-1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de 02 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
262. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, - 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260 OU 261, caracterizada pelo fato de que a koff, kif ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s"1.
263. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, - 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261 ou 262, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s"1.
264. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, - 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262 ou - 263, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
265. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, - 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263 ou 264, caracterizada pelo fato de que a kOff, kx, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a taxa de auto- oxidação da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
266. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, -264 ou 265, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NÓX mutante é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de h"1 a 37°C.
267. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, -264, 265 ou 266, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de h"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s-1.
268. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263„ -264, 265, 266 ou 267, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação da bolsa distai.
269. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, -264, 265, 266, 267 ou 268, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação que não está na bolsa distai.
270. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, -264, 265, 266, 267, 268 ou 269, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Tyrl4 0 de H-NOX de T. tengcongensis é substituído por qualquer outro aminoácido.
271. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, -264, 265, 266, 267, 268, 269 ou 270, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Phel42 de H-NOX de L. pneumophilia 2 ê substituído por qualquer outro aminoácido.
272. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, -264, 265, 266, 267, 268, 269, 270 ou 271, caracterizada pelo fato de que pelo menos um aminoácido C-terminal foi removido comparado à proteína de tipo selvagem correspondente.
273. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 272, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de 50 aminoácidos C-terminais contíguos foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
274. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 272 ou 273, caracterizada pelo fato de que entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos C- terminais contíguos foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
275. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, -264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 ou 274, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é uma proteína de mamífero.
276. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 275, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é uma proteína de ser humano.
277. Proteína de H-NÒX isolada, de acordo com a reivindicação 276, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é β1.
278. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, -264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 ou 274,. caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é uma proteína bacteriana.
279. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 278, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é uma proteína de T. tengcongensis.
280. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, -252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, -264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, -276, 277, 278 ou 279, caracterizada pelo fato de que a proteína de H-NOX mutante está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.
281. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 280, caracterizada pelo fato de que proteína H-NOX mutante está ligada covalentemente a polietileno glicol.
282. Proteína de H-NOX isolada caracterizada por compreender pelo menos uma mutação que altera a koff, ki, ou k 2 para NO ou altera a constante de dissociação de O2 comparado auqla de uma proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente, em que a koff/ k1# ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ IO"4 s"1 e cerca de 10 s-1 a 37 °C, em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a proteína H-NOX mutante não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX de tipo selvagem de T. tengcongensis, sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, ou H-NOX F142Y de L. pneumophilia 2.
283. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 282, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX mutante não é H-NOX F78Y/Y14ÔL de T. tengcongensis.
284. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282 ou 283, caracterizada pelo fato. de que a proteína de H-NOX mutante não é H-NOX de tipo selvagem de L. pneumophilia, βΐ H-NOX de tipo selvagem de H. sapiens, sGC βΐ H-NOX (1-385) de R. norvegicus, βΐ H-NOX de tipo selvagem de R. norvegicus, βΐ H-NOX de tipo selvagem de D. melangaster, CG14885-PA H-NOX de tipo selvagem de D. melangaster, GCY-35 HNOX de tipo selvagem de C. elegans, HNOX de tipo selvagem de N. punctiforme, HNOX de tipo selvagem de C. crescentus, HNOX de tipo selvagem de S. oneidensis ou HNOX de tipo selvagem de C. acetobutylicum.
285. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283 ou 284, caracterizada pelo fato de que a proteína de H-NOX mutante não é H-NOX W9F de Τ. tengcongensis, H-NOX Y14 0F de Τ. tengcongensis, sGC βΐ H-NOX (1-385) 1145Υ de R. norvegicus, sGC βΐ H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC βΐ HNOX H105F de R. norvegicus, sGC βΐ H-NOX 1145Y de R. norvegicus, sGC βΐ H-NOX C78S de R. norvegicus, sGC βΐ H-NOX C78E de R. norvegicus, ou βΐ H-NOX (1-385)1145Y de H. sapiens.
286. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284 ou 285, caracterizada pelo fato de que a proteína de H-NOX mutante não é H-NOX Y140H de T. tengcongensis ou βΐ 1140Y de H sapiens.
287. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285 ou 286, caracterizada pelo fato de que koff, kj., ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ IO-4 s-1 e cerca de 0,012 s-1 a 37°C.
288. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 287, caracterizada pelo fato de que a kQff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ IO-4 s-1 e cerca de 1 χ IO-3 s-1 a 37°C.
289. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287 ou 288, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 10 μΜ a 37°C.
290. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 28 9, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 50 μΜ a 37°C.
291. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, - 289 ou 290, caracterizada pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s"1.
292. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, - 289, 290 ou 291, caracterizada pelo fato de que a k0ff, ki, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de 02 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C.
293. Proteína de H-NÒX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, - 289, 290, 291 ou 292, caracterizada pelo fato de que a k0ff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOx mutante está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a 37°C, e èm que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s"1.
294. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, - 289, 290, 291, 292 ou 293, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s-ι.
295. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, - 289, 290, 291, 292, 293 ou 294, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
296. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294 ou 295, caracterizada pelo fato de que a k0ff, Jc1, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 χ 10"4 s"1 e cerca de 10 s"1 a -37°C, e em que a taxa de auto-õxidação da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
297. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295 ou 296, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C.
298. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296 ou 297, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 1 h"1 a 37°C, e em que a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s"1.
299. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297 OU 298, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação da bolsa distai.
300. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298 ou 299, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação que não está na bolsa distai.
301. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299 ou -300, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Tyrl40 de H-NOX de T. tengcongensis é substituído por qualquer outro aminoácido.
302. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 ou 301, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação em que um resíduo que corresponde a Phel42 de H-NOX de L. pneumophilia 2 é substituído por qualquer outro aminoácido.
303. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, -301 ou 3 02, caracterizada pelo fato de que pelo menos um aminoácido C-terminal foi removido comparado à proteína de tipo selvagem correspondente.
304. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 3 03, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de 50 aminoácidos C-terminais contíguos foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
305. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 03 ou 3 04, caracterizada pelo fato de que entre cerca de 25 a cerca de 2 00 aminoácidos C- terminais contíguos foram removidos comparados à proteína de tipo selvagem correspondente.
306. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, -301, 302, 304 ou 305, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é uma proteína de mamífero.
307. Proteína de H-NÒX isolada, de acordo còm a reivindicação 306, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é uma proteína de ser humano.
308. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 3 07, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é βΐ.
309. Proteína de H-NOX isolada, dé acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, -301, 302, 304 ou 305, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente ê uma proteína bacteriana.
310. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 309, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é uma proteína de T. tengcongensis.
311. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, -289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, -301, 302, 304, 305, 306, 307, 308, 309 ou 310, caracterizada pelo fato de que a proteína de H-NOX mutante está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.
312. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com a reivindicação 311, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX mutante está ligada covalentemente a polietileno glicol.
313. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, - 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, - 301, 302, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311 OU 312, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens.
314. Proteína de H-NOX isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, - 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, - 301, 302, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312 ou - 313, caracterizada pelo fato de que a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina alfa de Hómo sapiens.
315. Ácido nucleico recombinante caracterizado por codificar uma proteína H-NOX de qualquer uma das reivindicações 245-314.
316. Vetor caracterizado por compreender um ácido nucleico da reivindicação 315.
317. Célula caracterizada por compreender um ácido nucleico da reivindicação 315.
318. Célula caracterizada por compreender um vetor da reivindicação 316.
319. Método de produção de uma proteína H-NOX caracterizado por compreender o cultivo de uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína H- NOX de qualquer uma das reivindicações 245-314 sob condições adequadas para a produção da proteína.
320. Método, de acordo com a reivindicação 319, caracterizado por compreender a etapa de purificação da proteína H-NOX.
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Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ594457A (en) * 2006-05-22 2013-06-28 Univ California Compositions and methods for the delivery of oxygen
US20110243849A1 (en) * 2010-04-02 2011-10-06 Marletta Michael A Heme-binding photoactive polypeptides and methods of use thereof
ES2886531T3 (es) 2013-01-07 2021-12-20 Omniox Inc Formas poliméricas de proteínas H-NOX
CA2979974A1 (en) * 2015-03-17 2016-09-22 Omniox, Inc. Modulation of tumor immunity by protein-mediated o2 delivery
CA3014651A1 (en) * 2016-02-16 2017-08-24 Omniox, Inc. Modulation of hypoxia associated with stroke
JP6467073B2 (ja) * 2018-01-04 2019-02-06 オムニオクス， インコーポレイテッド Ｈ−ｎｏｘタンパク質の重合体形態
EP3836911A1 (en) 2018-08-15 2021-06-23 Omniox, Inc. H-nox proteins for treating cardiovascular and pulmonary conditions
CN119264211A (zh) 2018-08-27 2025-01-07 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
WO2020263830A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
ES2973832T3 (es) 2019-10-18 2024-06-24 Forty Seven Inc Terapias combinadas para el tratamiento de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda
JP2022552748A (ja) 2019-10-31 2022-12-19 フォーティ セブン， インコーポレイテッド 抗ｃｄ４７及び抗ｃｄ２０による血液癌の治療
TWI778443B (zh) 2019-11-12 2022-09-21 美商基利科學股份有限公司 Mcl1抑制劑
IL294032A (en) 2019-12-24 2022-08-01 Carna Biosciences Inc Compounds that regulate diacylglycerol kinase
TWI890283B (zh) 2020-02-14 2025-07-11 美商基利科學股份有限公司 結合ccr8之抗體及融合蛋白及其用途
IL297327B2 (en) 2020-05-01 2026-01-01 Gilead Sciences Inc 4,2-dioxopyrimidine compounds CD73 inhibitors
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
WO2022245671A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Gilead Sciences, Inc. Methods of using flt3l-fc fusion proteins
AU2022299051B2 (en) 2021-06-23 2025-03-13 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
JP7651018B2 (ja) 2021-06-23 2025-03-25 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ジアシルグリセロールキナーゼ調節化合物
MX2023014762A (es) 2021-06-23 2024-01-15 Gilead Sciences Inc Compuestos moduladores de diacilglicerol quinasa.
JP7686091B2 (ja) 2021-06-23 2025-05-30 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ジアシルグリセロールキナーゼ調節化合物
AU2022375782B2 (en) 2021-10-28 2026-02-26 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
JP7787991B2 (ja) 2021-10-29 2025-12-17 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｃｄ７３化合物
KR20240123836A (ko) 2021-12-22 2024-08-14 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 이카로스 아연 핑거 패밀리 분해제 및 이의 용도
US12122764B2 (en) 2021-12-22 2024-10-22 Gilead Sciences, Inc. IKAROS zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
WO2023178181A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
KR20240165995A (ko) 2022-03-24 2024-11-25 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Trop-2 발현 암의 치료를 위한 병용요법
TWI876305B (zh) 2022-04-05 2025-03-11 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
CR20240451A (es) 2022-04-21 2024-12-04 Gilead Sciences Inc Compuestos de modulación de kras g12d
KR20250028371A (ko) 2022-07-01 2025-02-28 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Cd73 화합물
WO2024064668A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPα DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY
AU2023409398A1 (en) 2022-12-22 2025-06-05 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
AU2024252725A1 (en) 2023-04-11 2025-11-06 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
CR20250446A (es) 2023-04-21 2025-12-02 Gilead Sciences Inc Inhibidores de prmt5 y usos de los mismos
AU2024306338A1 (en) 2023-06-30 2026-01-08 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
CN121620513A (zh) 2023-07-26 2026-03-06 吉利德科学公司 Parp7抑制剂
KR20260046403A (ko) 2023-07-26 2026-04-07 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Parp7 저해제
US20250101042A1 (en) 2023-09-08 2025-03-27 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
US20250109147A1 (en) 2023-09-08 2025-04-03 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
US20250154172A1 (en) 2023-11-03 2025-05-15 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2025137640A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
WO2025245003A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US20260098049A1 (en) 2024-08-12 2026-04-09 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873192A (en) * 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US6022849A (en) 1987-05-16 2000-02-08 Baxter Biotech Technology Saarl Mutant recombinant hemoglobins containing heme pocket mutations
US5731454A (en) 1990-02-12 1998-03-24 Virginia Commonwealth University Allosteric modifiers of hemoglobin useful for decreasing oxygen affinity and preserving oxygen carrying capability of stored blood
WO1995027040A1 (en) 1994-04-01 1995-10-12 Unisyn Technologies, Inc. Culture media additives for hollow fiber bioreactors
ATE302019T1 (de) 1997-02-28 2005-09-15 Univ California Verfahren und zusammensetzungen zur optimierung des sauerstofftransportes in zellfreien systemen
CA2299049C (en) * 1997-05-02 2008-07-15 Baxter Biotech Technology S.A.R.L. Hemoglobin mutants with increased soluble expression and/or reduced nitric oxide scavenging
DE19837015C2 (de) * 1998-08-14 2003-03-20 Vasopharm Biotech Gmbh Isolierte und gereinigte humane lösliche Guanylylcyclase alpha1/beta1 (hsGCalpha1/beta1)
US6773613B1 (en) * 1998-10-15 2004-08-10 Sangart, Inc. Method for production of stroma-free hemoglobin
EP1250155B1 (en) * 1999-12-22 2008-04-16 The Scripps Research Institute Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors
WO2002002757A2 (en) 2000-06-29 2002-01-10 Incyte Genomics, Inc. Adenylyl and guanylyl cyclases
US20030096240A1 (en) * 2000-09-19 2003-05-22 Ferid Murad Genomic organization of mouse and human sGC
US6780849B2 (en) * 2000-12-21 2004-08-24 Scimed Life Systems, Inc. Lipid-based nitric oxide donors
US20030153491A1 (en) 2002-01-11 2003-08-14 Winslow Robert M. Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
US20060130158A1 (en) * 2002-08-30 2006-06-15 Turner Andrew J Modified transferrin fusion proteins comprising duplicate transferrin amino or carboxy terminal domains
CN1660100A (zh) * 2002-12-09 2005-08-31 上海倍艺医药科技有限公司 一种治疗糖尿病及其并发症的药物
NZ594457A (en) 2006-05-22 2013-06-28 Univ California Compositions and methods for the delivery of oxygen

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