ES2399662T3

ES2399662T3 - Composiciones y procedimientos para la administración de oxígeno

Info

Publication number: ES2399662T3
Application number: ES07795174T
Authority: ES
Inventors: Stephen P.L. Cary; Elizabeth M. Boon; Emily Weinert; Jonathan A. Winger; Michael A. Marletta
Original assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 2006-05-22
Filing date: 2007-05-21
Publication date: 2013-04-02
Anticipated expiration: 2027-05-21
Also published as: CN101495506B; IN2013MN00600A; EP2463297A1; WO2007139791A2; NZ573003A; JP6118296B2; US20100285104A1; CN108273040A; IN2013MN00601A; BRPI0711767A2; JP5698905B2; NZ594456A; NZ594457A; WO2007139791A3; EP2040740A4; WO2007139767A3; JP5698906B2; EP2474554A2; JP2015007108A; CA2653101A1

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 que comprende (i) una cantidadfarmacéuticamente aceptable de una proteína H-NOX, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que (a) la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre 1 nM y 1 mM a 20 ºC, y la reactividad delNO de la proteína H-NOX es inferior a 700 s-1 a 20 ºC, o (b) la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de lahemoglobina alfa humana, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la dela de hemoglobina alfa humana.

Description

Composiciones y procedimientos para la administración de oxígeno

Campo técnico

La presente solicitud se refiere a proteínas H-NOX y, en particular, a su uso en medicina para administrar oxígeno. Las proteínas H-NOX proporcionan una nueva herramienta terapéutica para administrar O2 a seres humanos y, con fines veterinarios, a animales.

Antecedentes de la invención

El actual sistema de bancos de sangre tiene riesgos inherentes y graves limitaciones. Los errores de tipado de la sangre, inmunogenicidad, transmisión de agentes bacterianos e infecciones víricas tales como VIH-1 y hepatitis plantean peligros potencialmente mortales a los pacientes de transfusión. Además, la limitada disponibilidad de donantes, el requisito de tipos de sangre específicos, la corta estabilidad en almacén de glóbulos rojos y la necesidad de refrigeración limitan todos la accesibilidad de las transfusiones a pacientes. El desarrollo de un sucedáneo de la sangre estable podría eliminar los riesgos del actual sistema de bancos de sangre y aumentar la disponibilidad de transfusiones a pacientes en la mayoría de los entornos. Por tanto, la administración de oxígeno (O2) a órganos y tejidos para aliviar síntomas debidos a pérdida de sangre o hipoxia es un objetivo terapéutico importante.

Las terapias basadas en no hemoglobina han sido aprobadas para su uso en seres humanos en los EE.UU. Posibles terapias incluyen una variedad de vehículos de O2 artificiales (revisado por Spahn, D. R. y col. (2005). “Artificial O2 carriers: status in 2005,” Curr. Pharm. Des., 11(31):4099-4114), tal como hemoglobinas manipuladas (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 6.022.849). Sin embargo, algunos posibles sucedáneos de la sangre, tales como sucedáneos de la sangre basados en hemoglobina, están limitados debido a su reactividad con óxido nítrico (NO). En particular, el NO actúa de mensajero químico en el control de muchos procesos importantes in vivo, que incluyen neurotransmisión, inflamación, agregación de plaquetas y regulación del tono de músculo liso gastrointestinal y vascular. El NO reacciona directamente con el O2 que está unido a hemoglobina para formar metahemoglobina y nitrato. Tanto el hierro del hemo como el NO son oxidados por los átomos de oxígeno unidos, y la reacción se produce tan rápidamente que no se observa la sustitución de O2 por NO (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.455.676).

Como el NO se produce y se consume continuamente, hay una renovación natural del NO in vivo. Cuando se administra hemoglobina sin células, el equilibrio entre la producción de NO y el consumo se altera mediante reacciones con hemoglobina sin células. La reacción oxidativa entre NO y O2 unido a hemoglobina es irreversible, produciendo la destrucción de NO, O2 y hemoglobina. La unión de NO a hemoglobina sin O2 unido es eficazmente irreversible en escalas de tiempo fisiológicas ya que la semivida para la disociación de la nitrosilhemoglobina es 5-6 horas, inactivando así eficazmente la hemoglobina como vehículo de O2 sin células.

Una vez una molécula de NO reacciona con hemoglobina, se elimina del conjunto de moléculas señal, produciendo así ciertas condiciones adversas. Por ejemplo, la unión de NO a hemoglobina (con o sin O2 unido) puede prevenir relajación vascular y posiblemente conduce a hipertensión, que se observa algunas veces después de la administración de ciertas disoluciones de hemoglobina extracelular.

El NO también se necesita para mediar en ciertas respuestas inflamatorias. Por ejemplo, el NO producido por el endotelio inhibe la agregación de plaquetas. Por consiguiente, como el NO se une por hemoglobina sin células (con

o sin O2 unido), la agregación de plaquetas puede aumentar. A medida que se agregan las plaquetas, liberan potentes compuestos vasoconstrictores tales como tromboxano A2 y serotonina. Estos compuestos pueden actuar sinérgicamente con los niveles de NO reducidos producidos por la captación de hemoglobina para producir vasoconstricción significativa. Además de inhibir la agregación de plaquetas, el NO también inhibe la unión de neutrófilos a paredes celulares, que a su vez puede conducir a lesión de la pared celular. La lesión de la pared de células endoteliales se ha observado con la infusión de ciertas disoluciones de hemoglobina.

Otro inconveniente importante de los sucedáneos de la sangre basados en hemoglobina es su alta afinidad por O2. Esta alta afinidad limita la capacidad de la hemoglobina para liberar oxígeno a una velocidad clínicamente útil en localizaciones deseadas (tal como tejidos periféricos). Alternativamente, la liberación de O2 por sucedáneos de la sangre basados en hemoglobina de menor afinidad en arterias antes de alcanzar los lechos microvasculares puede producir vasoconstricción debido a una respuesta vasoconstrictora hiperóxica (hipótesis de Winslow). Adicionalmente, los sucedáneos de la sangre basados en hemoglobina son evitados por la rápida eliminación de hemoglobina sin células del plasma debido a la presencia de receptores para hemoglobina que eliminan la hemoglobina sin células del plasma. La hemoglobina sin células también puede producir toxicidad renal, posiblemente debido al agotamiento del NO en los glomérulos, causando constricción y posterior disfunción.

Debido a las limitaciones de los actuales sucedáneos de la sangre y la escasez crónica de sangre donada, sigue existiendo un nivel significativo de interés en y necesidad de terapias adicionales o alternativas para administrar oxígeno. En particular se desean sucedáneos de la sangre con una menor reactividad del NO y/o un tiempo de retención en plasma prolongado. También se necesitan vehículos de oxígeno con constantes de disociación para la unión a O2 que sean apropiados para aplicaciones clínicas o industriales particulares. Una aplicación industrial a modo de ejemplo para la que son deseables vehículos de O2 incluye el crecimiento de células en cultivo, que está frecuentemente limitado por la cantidad de O2 que llega a las células.

Breve resumen de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para su uso en medicina como vehículo de O2 que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de una proteína H-NOX como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de que las proteínas H-NOX naturales y mutantes tienen una reactividad del NO mucho menor que la hemoglobina y, por tanto, son vehículos de O2 deseables. Si se desea, las mutaciones pueden introducirse en proteínas H-NOX para alterar su unión de O2 y ligandos de NO para optimizar adicionalmente el uso de proteínas H-NOX como vehículos de O2.

En un aspecto, la invención se refiere al uso médico de proteínas H-NOX mutantes. Por consiguiente, en el presente documento se describe una proteína H-NOX aislada que tiene al menos una mutación que altera la constante de disociación del O2 o reactividad del NO en comparación con la de una proteína H-NOX natural correspondiente. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 50 µM a 20 ºC, aproximadamente 50 nM y aproximadamente 10 µM a 20 ºC, aproximadamente 20 nM y aproximadamente 2 µM a 20 ºC, aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM a 20 ºC, aproximadamente 150 nM y aproximadamente 1 µM a 20 ºC, o aproximadamente 100 nM y aproximadamente 255 nM a 20 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 80 nM a 20 ºC, tal como entre aproximadamente 20 nM y aproximadamente 75 nM a 20 ºC. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina, tal como al menos 1.000 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC, tal como inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1,8 s-1, 1,5 s-1, 1,2 s-1, 1,0 s-1, 0,8 s-1, 0,7 s-1 o 0,6 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 200 s-1 a 20 ºC, tal como aproximadamente 1,0 s-1 y aproximadamente 16,0 s-1. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM a 20 ºC, y la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 14,5 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 14,5 s-1 a 20 ºC, y la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 14,5 s-1 a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC).

En algunas realizaciones, la invención se refiere al uso médico de una proteína H-NOX aislada que tiene al menos una mutación que altera la kdis para el oxígeno o reactividad del NO en comparación con la de una proteína H-NOX natural correspondiente. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 200 s-1 a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX mutante tiene una kdis para el oxígeno que es inferior a o igual a aproximadamente 0,65 s-1 a 20 ºC (tal como entre aproximadamente 0,21 s-1 y aproximadamente 0,65 s-1 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la proteína H-NOX mutante se deriva de una proteína de T. tengcongensis y tiene kdis para el oxígeno entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 18 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina, tal como al menos 1.000 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC, tal como inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1,8 s-1, 1,5 s-1, 1,2 s-1, 1,0 s-1, 0,8 s-1, 0,7 s-1 o 0,6 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM a 20 ºC, entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 50 µM a 20 ºC, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 10 µM a 20 ºC, o entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM a 20 ºC. En algunas realizaciones, la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM a 20 ºC, y la velocidad de autooxidación del hemo de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1, o 1,8 s-1 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC).

En diversas realizaciones, la invención se refiere al uso médico de una proteína H-NOX aislada que tiene al menos una mutación que altera la constante de disociación del O2 o reactividad del NO en comparación con la de una proteína H-NOX natural correspondiente. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 255 nM a 20 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante es inferior a 80 nM a 20 ºC, tal como entre aproximadamente 20 nM y aproximadamente 75 nM a 20 ºC. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina, tal como al menos 1.000 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX mutante tiene una kdis para el oxígeno que es inferior a o igual a aproximadamente 0,65 s-1 a 20 ºC (tal como entre aproximadamente 0,21 s-1 y aproximadamente 0,65 s-1 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 2,9 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 5,8 s-1 y aproximadamente 19 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX mutante es estable a 4 ºC en aire.

En algunas realizaciones, la invención se refiere al uso médico de una proteína H-NOX aislada que tiene al menos una mutación que altera la kdis para el oxígeno o reactividad del NO en comparación con la de una proteína H-NOX natural correspondiente. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX mutante es inferior a

o igual a aproximadamente 0,65 s-1 a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 0,21 s-1 y aproximadamente 0,65 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina, tal como al menos 1.000 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC, tal como inferior a aproximadamente 600 s1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1,8 s-1, 1,5 s-1, 1,2 s-1, 1,0 s-1, 0,8 s-1, 0,7 s-1 o 0,6 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM a 20 ºC. En algunas realizaciones, la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM a 20 ºC, y la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX mutante está entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1, 1,8 s-1 o 0,7 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX mutante es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1, 1,8 s-1 o 0,7 a 20 ºC).

En diversas realizaciones, la invención se refiere al uso médico de una proteína H-NOX aislada seleccionada del grupo que consiste en H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de

T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, L2 F9W-F142Y, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, 11(1-385), 11(1-385) I145Y, 11(1385) I145H, 11(1-194), 11(1-194) I145Y, 11(1-194) L9W-I145Y, 12(1-217), 12(1-217) I142Y, H-NOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum y H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans. En algunas realizaciones, la proteína 11 o 12 se deriva de una proteína 11 o 12 de R. norvegicus u H. sapiens.

En diversas realizaciones, la invención se refiere al uso médico de una proteína H-NOX aislada seleccionada del grupo que consiste en H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9FN74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, 11(1-385)1145H, 11(1-194), 11(1-194) I145Y, 11(1-194) L9W-I145Y, 12(1-217), 12(1-217) I142Y, HNOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de

C. acetobutylicum y H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans. En algunas realizaciones, la proteína 11 o 12 se deriva de una proteína 11 o 12 de R. norvegicus u H. sapiens.

En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens, tal como una constante de disociación del O2 entre 0,1 y 10 veces o entre 0,5 y 2 veces la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens, tal como al menos 100 veces o 1.000 veces menor que la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX contiene una o más mutaciones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mutaciones) en comparación con la proteína H-NOX de la que se derivó. En diversas realizaciones, la proteína H-NOX contiene menos de 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ó 2 mutaciones en comparación con la proteína H-NOX de la que se derivó. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene al menos una mutación en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene al menos una mutación que no está en el bolsillo distal. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene al menos una mutación en la que un residuo que se corresponde con Ile5, Trp9, Asn74, Pro115 o Arg135 de H-NOX de T. tengcongensis o I145 de 11(1-385) está sustituido con cualquier otro aminoácido. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene al menos dos mutaciones, en la que al menos una mutación es la sustitución de un residuo que se corresponde con Ile5, Trp9, Asn74, Pro115 o Arg135 de H-NOX de

T. tengcongensis o I145 de 11(1-385) con cualquier otro aminoácido. En algunas realizaciones, la mutación en la proteína H-NOX se corresponde con una mutación I5A, una mutación I5L, una mutación W9F, una mutación Y140F, una mutación Y140H, una mutación doble W9F Y140H, o una mutación doble F78Y Y 140F de T. tengcongensis o una mutación I145Y de 11. En algunas realizaciones, la mutación en la proteína H-NOX se corresponde con una mutación W9Y, una mutación W9H, una mutación W9N, una mutación N74H, una mutación N74E, una mutación N74A, una mutación P115A, una mutación R135Q, un mutante doble I5L P115A, un mutante doble N74A Y140H, o un doble W9F N74A de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, al menos un aminoácido del extremo C (tal como al menos aproximadamente 50 aminoácidos del extremo C contiguos o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 200 aminoácidos del extremo C contiguos) en la proteína H-NOX ha sido eliminado en comparación con la proteína natural correspondiente.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX se deriva de una proteína de mamífero (por ejemplo, una proteína humana tal como 11). En diversas realizaciones, la proteína H-NOX se derivó de una proteína bacteriana (por ejemplo, una proteína de T. tengcongensis). En algunas realizaciones, la proteína H-NOX está covalentemente unida a otra molécula o resto, tal como polietilenglicol. El hemo puede o puede no unirse a la proteína H-NOX. En algunas realizaciones, el oxígeno está unido a la proteína H-NOX. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína de fusión que incluye un dominio de H-NOX y parte o toda de otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano).

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F79Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX de T. tengcongensis natural, o 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es 12(1-217) de R. norvegicus, 11(1-194) de R. norvegicus, 11(1-385) de R. norvegicus o 11(1-385) I145Y de R. norvegicus. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX W9F de

T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, o 11 H-NOX (1-385) I145Y de H. sapiens. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX Y140H de T. tengcongensis, 11 I140Y de H. sapiens o 11 I145Y de

H. sapiens. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX Y140F de T. tengcongensis, 2 H-NOX de L. pneumophilia natural, 11 H-NOX I140Y de H. sapiens, 11 H-NOX de H. sapiens natural, sGC 11 H-NOX (1-385) de

R. norvegicus, sGC 11 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105F de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX I145Y de R. norvegicus, 11 H-NOX de R. norvegicus natural, 11 H-NOX de D. melanogaster natural, CG14885-PA H-NOX de D. melanogaster natural, GCY-35 H-NOX de C. elegans natural, H-NOX de N. punctiforme natural, H-NOX de C. crescentus natural, H-NOX de S. oneidensis natural o H-NOX de C. acetobutylicum natural. En algunas realizaciones de las proteínas H-NOX aisladas, la proteína H-NOX no es H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX de T. tengcongensis natural, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 2 H-NOX de L. pneumophilia natural, 11 H-NOX 1140Y de H. sapiens, 11 I145Y de H. sapiens, 11 H-NOX de H. sapiens natural, sGC 11 H-NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105F de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX 1145Y de R. norvegicus, 11 H-NOX de R. norvegicus natural, 11 H-NOX de D. melanogaster natural, CG 14885-PA H-NOX de D. melanogaster natural, GCY-35 H-NOX de C. elegans natural, H-NOX de N. punctiforme natural, H-NOX de C. crescentus natural, H-NOX de S. oneidensis natural o H-NOX de C. acetobutylicum natural. En algunas realizaciones de H-NOX , la proteína H-NOX no es ninguna de las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de gen, seguido de su abreviatura de especie e identificadores de Genbank (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir de 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007): Npun5905_Npu_23129606, alr2278_Ana_17229770, S02144_Sone_24373702, Mdeg1343_Mde_23027521, VCA0720_Vch_15601476, CC2992_Ccr_16127222, Rsph2043 _Rhsp_22958463 (gi:46192757), Mmc10739_Mcsp_22999020, Tar4_Tte_20807169, Ddes2822_Dde_23475919, CAC3243_Cac_15896488 , gcy31_Ce_17568389, CG14885_Dm_24647455, GUCY1B3_Hs_4504215, HpGCS-beta1_Hpul_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577, CG4154_Dm_24646993 (gi:NP_650424.2, gi:62484298), gcy-32_Ce_13539160, gcy36_Ce_17568391 (gi:32566352, gi:86564713), gcy-35_Ce-17507861 (gi:71990146), gcy-37_Ce_17540904 (gi:71985505), GCY1a3_Hs_20535603, GCY1a2-Hs_899477 o GYCa-99B Dm_729270 (gi:68067738) (Lakshminarayan y col. (2003). “Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins”, BMG Genomics 4:5-13). Las abreviaturas de especies usadas en estos nombres incluyen Ana - Anabaena Sp; Ccr -Caulobacter crescentus; Cac -Clostridium acetobutylicum; Dde -Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp -Magnetococcus sp.; Mde - Microbulbifer degradans; Npu - Nostoc punctiforme; Rhsp -Rhodobacter sphaeroides; Sone - Shewanella oneidensis; Tte -Thermoanaerobacter tengcongensis; Vch -Vibrio cholerae; Ce -Caenorhabditis elegans; Dm - Drosophila melanogaster, Hpul - Hemicentrotus pulcherrimus; Hs -Homo sapiens. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es ninguna de las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de organismo y número de acceso de la base de datos Pfam (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir de 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 17 de mayo de 2007; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007): Q622M5_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61P44_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61R54_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61V90_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61A94_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q60TP4_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q60M10_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, GCY37_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY31_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY36_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY32_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY35_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY34_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY33_CAEEL de Caenorhabditis elegans, Q7T040_ORYCU de Oryzias curvinotus, Q75WF0_ORYCU de Oryzias curvinotus, P79998_ORYLA de Oryzias latipes, Q7ZS25_ORYLA de Oryzias latipes, Q4SW38_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q4RZ94_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q4S6K5_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q90VY5_FUGRU de Fugu rubripes, Q6INK9_XENLA de Xenopus laevis, Q5T8J7_HUMAN de Homo sapiens, GCYA2_HUMAN de Homo sapiens, GCYB2_HUMAN de Homo sapiens, GCYB1_HUMAN de Homo sapiens, Q9N193_9PRIM de Gorilla gorilla, Q5RAN8_PONPY de Pongo pygmaeus, Q9N192_PANTR de Pan troglodytes, Q9N194_MACMU de Macaca mulatta, Q9N191_HYLLA de Hylobates lar, Q8BXH3_MOUSE de Mus musculus, GCYB 1_MOUSE de Mus musculus, Q3UTI4_MOUSE de Mus musculus, Q3UH83_MOUSE de Mus musculus, Q6XE41_MOUSE de Mus musculus, Q80YP4_MOUSE de Mus musculus, Q80WX7_RAT de Rattus norvegicus, Q80WX8_RAT de Rattus norvegicus, Q920Q1_RAT de Rattus norvegicus, Q54A43_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY0_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY4_RAT de Rattus norvegicus, Q8CH85_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY5_RAT de Rattus norvegicus, GCYB1_RAT de Rattus norvegicus, Q8CH90_RAT de Rattus norvegicus, Q91XJ7_RAT de Rattus norvegicus, Q80WX9_RAT de Rattus norvegicus, GCYB2_RAT de Rattus norvegicus, GCYA2_RAT de Rattus norvegicus, Q4ZHR9_CANFA de Canis familiaris, GCYB 1_BOVIN de Bos taurus, Q4ZHR7_PIG de Sus scrofa, QS9HN5_GRYBI de Gryllus bimaculatus, O77106_MANSE de Manduca sexta, O76340_MANSE de Manduca sexta, Q5UAFO_APIME de Apis mellifera, Q5FANO_APIME de Apis mellifera, Q6L5L6_APIME de Apis mellifera, PEST Q7PYK9_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7Q9W6_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7QF31_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7PSO1_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7PFY2_ANOGA de Anopheles gambiae str, Q7KQ93_ANOGA de Anopheles gambiae, Q24086_DROME de Drosophila melanogaster, GCYH_DROME de Drosophila melanogaster, GCY8E_DROME de Drosophila melanogaster, GCYDA_DROME de Drosophila melanogaster, GCYDB_DROME de Drosophila melanogaster, Q9VA09_DROME de Drosophila melanogaster, Q29CE1_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q296C7_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q296C8_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q29BU7_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q7YWK7_APLCA de Aplysia californica, Q95NK5_HEMPU de Hemicentrotus pulcherrimus, Q5YLC2_CHLRE de Chlamydomonas reinhardtii, Q8YUQ7_ANASP de Anabaena sp, BBFL7 Q26GR8_9BACT de Flavobacteria bacterium, ATCC 700755 Q 1 VQE5_9FLAO de Psychroflexus torquis, HTCC2207 Q 1 YPJ5_9GAMM de proteobacteria gamma marina, HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM de proteobacteria gamma marina, Q9A451_CAUCR de Caulobacter crescentus, JF-5 Q2DG60_ACICY de Acidiphilium cryptum, Q3J0U9_RHOS4 de Rhodobacter sphaeroides, Q5LPV1_SILPO de Silicibacter pomeroyi, PD1222, Q3PC67_PARDE de Paracoccus denitrificans, TM1040 Q3QNY2_9RHOB de Silicibacter sp, Q28ML8_JANSC de Jannaschia sp, MC-1 Q3XT27_9PROT de Magnetococcus sp, Q5WXP0_LEGPL de Legionella pneumophila, Q5WTZ5_LEGPL de Legionella pneumophila, Q5X268_LEGPA de Legionella pneumophila, QSX2R2_LEGPA de Legionella pneumophila, QSZWM9_LEGPH de Legionella pneumophila subsp pneumophila, Q5ZSQ8_LEGPH de Legionella pneumophila subsp pneumophila, Q47Y43_COLP3 de Colwellia psychrerythraea, T6c Q3CSZ5_ALTAT de Pseudoalteromonas atlantica, Q8EF49_SHEON de Shewanella oneidensis, Q21E20_SACD2 de Saccharofagus degradans, Q21ER7_SACD2 de Saccharofagus degradans, S14 Q1ZWE5_9VIBR de Vibrio angustum, Q8DAE2_VIBVU de Vibrio vulnificus, 12G01 Q1VCP6_VIBAL de Vibrio alginolyticus, DAT722 Q2FA22_9VIBR de Vibrio sp, Q87NJ1_VIBPA de Vibrio parahaemolyticus, Q5E1F5_VIBF1 de Vibrio fischeri, Q7MJS8_VIBVY de Vibrio vulnificus, SKA34 Q2C6Z5_9GAMM de Photobacterium sp, Q2SFY7_HAHCH de Hahella chejuensis, MED92 Q2BKV0_9GAMM de Oceanospirillum sp, RED65 Q1N035_9GAMM de Oceanobacter sp, Q310U7_DESDG de Desulfovibrio desulfuricans, H 168 Q2AIW5_9FIRM de Halothermothrix orenii, Q8RBX6_THETN de Thermoanaerobacter tengcongensis, DSM 8903 Q2ZH17_CALSA de Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Q97E73_CLOAB de Clostridium acetobutylicum, QYMF Q3C763_9CLOT de Alkaliphilus metalliredigenes, Q899J9_CLOTE de Clostridium tetani y NCIMB 8052 Q2WVN._CLOBE Clostridium beijerinckii. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es sGC 11 H-NOX C78S de R. norvegicus o sGC 11 H-NOX C78E de R. norvegicus. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no tiene una mutación en el motivo Y-S-R, que incluye Tyr135, Ser137 y Arg139 de H-NOX humana.

En el presente documento también se describe un ácido nucleico recombinante que codifica una cualquiera o más de las proteínas H-NOX mutantes descritas en el presente documento. En realizaciones particulares, el ácido nucleico incluye un segmento de o la secuencia de ácidos nucleicos entera de cualquiera de los ácidos nucleicos mostrados en las FIGS. 2-4D o 8A-8DD. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que incluye un dominio de H-NOX y parte o toda de otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano). En algunas realizaciones, el ácido nucleico incluye al menos aproximadamente 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o más nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de H-NOX y contiene una o más mutaciones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mutaciones) en comparación con el ácido nucleico de H-NOX del que se derivó. En diversas realizaciones, un ácido nucleico de H-NOX mutante contiene menos de aproximadamente cualquiera de 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ó 2 mutaciones en comparación con el ácido nucleico de H-NOX del que se derivó. La invención también caracteriza variantes degeneradas de cualquier ácido nucleico que codifica una proteína H-NOX mutante.

En el presente documento también se describe un vector que incluye uno cualquiera o más de los ácidos nucleicos de H-NOX mutantes descritos en el presente documento. En otro aspecto, la invención caracteriza una célula que incluye uno cualquiera o más de los ácidos nucleicos de H-NOX mutantes descritos en el presente documento. En un aspecto, la invención caracteriza una célula que incluye cualquier vector descrito en el presente documento.

En el presente documento también se describe un procedimiento de producir una proteína H-NOX. Este procedimiento implica cultivar una célula que tiene un ácido nucleico que codifica una cualquiera o más de las proteínas H-NOX mutantes descritas en el presente documento en condiciones adecuadas para la producción de la proteína H-NOX mutante. En algunas realizaciones, la invención incluye adicionalmente la etapa de purificar la proteína H-NOX mutante.

En un aspecto, la invención se refiere al uso médico de composiciones farmacéuticas que incluyen una o más proteínas H-NOX, tales como cualquiera de las proteínas H-NOX naturales o mutantes descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye una cantidad farmacéuticamente aceptable de una proteína H-NOX descrita en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 20 nM y aproximadamente 2 µM a 20 ºC, y la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 1,0 s-1 y aproximadamente 16,0 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 20 nM y aproximadamente 2 µM a 20 ºC, y la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 20 nM y aproximadamente 2 µM a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 1,0 s-1 y aproximadamente 16,0 s-1 a 20 ºC, y la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína X es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 1,0 s-1 y aproximadamente 16,0 s-1 a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC).

En algunas realizaciones, la invención se refiere al uso médico de una composición farmacéutica que incluye una cantidad farmacéuticamente aceptable de una proteína H-NOX y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 200 s-1 a 20 ºC, en la que la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina.

En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas para su uso en medicina como se describe en el presente documento, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens, tal como una constante de disociación del O2 entre 0,1 y 10 veces o entre 0,5 y 2 veces la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens, tal como al menos 100 veces o 1.000 veces menor que la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX es una proteína natural.

En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX es una proteína mutante como se describe en el presente documento. En diversas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX tiene al menos una mutación que altera la constante de disociación del O2, la kdis para oxígeno, la velocidad de auto-oxidación del hemo, la reactividad del NO, la estabilidad del NO o cualesquiera dos o más de las anteriores en comparación con la de una proteína natural correspondiente. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX es una seleccionada del grupo que consiste en H-NOX de T. tengcongensis natural, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, 175F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX de L. pneumophilia natural, 2 H-NOX de L. pneumophilia natural, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX de D. desulfuricans natural, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, 11 H-NOX de H. sapiens natural, 11 I145Y de H. sapiens, 11(1-385) de H. sapiens, 11(1-385) I145Y de H. sapiens, 11(1-385) I145H de H. sapiens, 11(1-194) de H. sapiens, 11(1-194)I145Y de H sapiens, 11(1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, 12(1217) de H. sapiens, 12(1-217) I142Y de H. sapiens, 11 H-NOX H105G de H. sapiens, 11 H-NOX H105F de H. sapiens, 11 H-NOX de R. norvegicus natural, 11(1-385) de R. norvegicus, 11(1-385) I145Y de R. norvegicus, 11(1385) I145H de R. norvegicus, 11(1-194) de R. norvegicus, 11(1-194) I145Y de R. norvegicus, 11(1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, 12(1-217) de R. norvegicus, 12(1-217) I142Y de R. norvegicus, 11 H-NOX H105G de R. norvegicus, 11 H-NOX H105F de R. norvegicus, H-NOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX de C. acetobutylicum natural, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum, GCY35 H-NOX de C. elegans natural, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, 11 H-NOX de D. melanogaster natural, CG14885-PA de D. melanogaster natural, CG14886 de D. melanogaster natural, CG4154 de D. melanogaster natural; H-NOX de N. punctiforme natural, H-NOX de C. crescentus natural, H-NOX de S. oneidensis natural, H-NOX de M musculus natural, H-NOX de C. familiaris natural, H-NOX de B. taurus natural, R. norvegicus natural; H-NOX de X. laevis natural, H-NOX de O. latipes natural, H-NOX de O. curvinotus natural, H-NOX de F. rubripes natural, H-NOX de A. gambiae natural, H-NOX de M. sexta natural; gcy-31 de C. elegans natural, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 de C. elegans natural, gcy-34 de C. elegans natural, gcy-35 de C. elegans natural, gcy-36 de C. elegans natural, gcy-37 de C. elegans natural; H-NOX de V. cholera natural, H-NOX de V. fischeri natural y H-NOX de N. punctiforme natural. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la composición farmacéutica incluye uno o más liposomas o nanopartículas que incluyen o encapsulan la proteína H-NOX.

En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas para su uso en medicina como se describen en el presente documento, la proteína H-NOX no es H-NOX Y140H de T. tengcongensis. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX no es H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de

T. tengcongensis, H-NOX de T. tengcongensis natural o 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX no es 12(1-217) de R. norvegicus, 11(1-194) de R. norvegicus, 11(1-385) de R. norvegicus o 11(1-385) I145Y de R. norvegicus. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX no es H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis o 11 H-NOX (1-385) I145Y de H. sapiens. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX Y140H de T. tengcongensis, 11 I140Y de H. sapiens o 11 I145Y de H. sapiens. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX no es H-NOX Y140F de T. tengcongensis, 2 H-NOX de L. pneumophilia natural, 11 H-NOX I140Y de H. sapiens, 11 H-NOX de H. sapiens natural, sGC 11 H-NOX (1-385) de

R. norvegicus, sGC 11 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105F de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX I145Y de R. norvegicus, 11 H-NOX de R. norvegicus natural, 11 H-NOX de D. melanogaster natural, CG14885-PA H-NOX de D. melanogaster natural, GCY-35 H-NOX de C. elegans natural, H-NOX de N. punctiforme natural, H-NOX de C. crescentus natural, H-NOX de S. oneidensis natural o H-NOX de C. acetobutylicum natural. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX no es H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX de T. tengcongensis natural, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 2 H-NOX de L. pneumophilia natural, 11 H-NOX I140Y de H. sapiens, B 1 I145Y de H. sapiens, 11 H-NOX de H. sapiens natural, sGC 11 H-NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105F de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX I145Y de R. norvegicus, 11 H-NOX de R. norvegicus natural, 11 H-NOX de D. melanogaster natural, CG 14885-PA H-NOX de D. melanogaster natural, GCY-35 H-NOX de C. elegans natural, H-NOX de N. punctiforme natural, H-NOX de C. crescentus natural, H-NOX de S. oneidensis natural o H-NOX de C. acetobutylicum natural. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX no es ninguna de las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de gen, seguido de su abreviatura de especie e identificadores de Genbank (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir de 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007): Npun5905_Npu_23129606, alr2278_Ana_17229770, SO2144_Sone_24373702, Mdeg1343_Mde_23027521, VCA0720_Vch_15601476, CC2992_Ccr_16127222, Rsph2043_Rhsp_22958463 (gi:46192757), Mmcl0739_Mcsp_22999020, Tar4_Tte_20807169, Ddes2822_Dde_23475919, CAC3243_Cac_15896488, gcy-31_Ce_17568389, CG14885_Dm_24647455, GUCY1B3_Hs_4504215, HpGCS-beta1_Hpu1_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577, CG4154_Dm_24646993 (gi:NP_650424.2, gi:62484298), gcy-32_Ce_13539160, gcy-36_Ce_17568391 (gi:32566352, gi:86564713), gcy35_Ce-17507861 (gi:71990146), gcy-37_Ce_17540904 (gi:71985505), GCY1a3_Hs_20535603, GCY1a2Hs_899477 o GYCa-99B_Dm_729270 (gi:68067738) (Lakshminarayan y col. (2003). “Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins”, BMG Genomics 4:5-13). Las abreviaturas de especies usadas en estos nombres incluyen Ana - Anabaena Sp; Ccr -Caulobacter crescentus; Cac -Clostridium acetobutylicum; Dde -Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp -Magnetococcus sp.; Mde -Microbulbifer degradans; Npu - Nostoc punctiforme; Rhsp -Rhodobacter sphaeroides; Sone -Shewanella oneidensis; Tte-Thermoanaerobacter tengcongensis; Vch -Vibrio cholerae; Ce -Caenorhabditis elegans; Dm -Drosophila melanogaster; Hpul -Hemicentrotus pulcherrimus; Hs -Homo sapiens. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX no es sGC 11 H-NOX C78S de R. norvegicus o sGC 11 H-NOX C78E de R. norvegicus. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX no es ninguna de las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de organismo y número de acceso de la base de datos Pfam (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir de 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 17 de mayo de 2007; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007): Q622M5_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61P44_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61R54_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61V90_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61A94_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q60TP4_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q60M10_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, GCY37_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY31_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY36_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY32_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY35_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY34_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY33_CAEEL de Caenorhabditis elegans, Q7T040_ORYCU de Oryzias curvinotus, Q75 WF0_ORYCU de Oryzias curvinotus, P79998_ORYLA de Oryzias latipes, Q7ZSZ5_ORYLA de Oryzias latipes, Q4SW38_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q4RZ94_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q4S6K5_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q90VY5_FUGRU de Fugu rubripes, Q6INK9_XENLA de Xenopus laevis, Q5T8J7_HUMAN de Homo sapiens, GCYA2_HUMAN de Homo sapiens, GCYB2_HUMAN de Homo sapiens, GCYB1_HUMAN de Homo sapiens, Q9N193_9PRIM de Gorilla gorilla, Q5RAN8_PONPY de Pongo pygmaeus, Q9N192_PANTR de Pan troglodytes, Q9N194_MACMU de Macaca mulatta, Q9N191_HYLLA de Hylobates lar, Q8BXH3_MOUSE de Mus musculus, GCYB1_MOUSE de Mus musculus, Q3UTI4_MOUSE de Mus musculus, Q3UH83_MOUSE de Mus musculus, Q6XE41_MOUSE de Mus musculus, Q80YP4_MOUSE de Mus musculus, Q80WX7_RAT de Rattus norvegicus, Q80WX8_RAT de Rattus norvegicus, Q920Q1_RAT de Rattus norvegicus, Q54A43_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY0_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY4_RAT de Rattus norvegicus, Q8CH85_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY5_RAT de Rattus norvegicus, GCYB1_RAT de Rattus norvegicus, Q8CH90_RAT de Rattus norvegicus, Q91XJ7_RAT de Rattus norvegicus, Q80WX9_RAT de Rattus norvegicus, GCYB2_RAT de Rattus norvegicus, GCYA2_RAT de Rattus norvegicus, Q4ZHR9_CANFA de Canis familiaris, GCYB 1_BOVIN de Bos taurus, Q4ZHR7_PIG de Sus scrofa, Q59HN5_GRYBI de Gryllus bimaculatus, O77106_MANSE de Manduca sexta, O76340_MANSE de Manduca sexta, Q5UAF0_APIME de Apis mellifera, Q5FAN0_APIME de Apis mellifera, Q6LSL6_APIME de Apis mellifera, PEST Q7PYK9_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7Q9W6_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7QF31_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7PS01_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7PFY2_ANOGA de Anopheles gambiae str, Q7KQ93_ANOGA de Anopheles gambiae, Q24086_DROME de Drosophila melanogaster, GCYH_DROME de Drosophila melanogaster, GCY8E_DROME de Drosophila melanogaster, GCYDA_DROME de Drosophila melanogaster, GCYDB_DROME de Drosophila melanogaster, Q9VA09_DROME de Drosophila melanogaster, Q29CE1_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q296C7_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q296C8_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q29BU7_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q7YWK7_APLCA de Aplysia californica, Q95NK5_HEMPU de Hemicentrotus pulcherrimus, Q5YLC2_CHLRE de Chlamydomonas reinhardtii, Q8YUQ7_ANASP de Anabaena sp, BBFL7 Q26GR8_9BACT de Flavobacteria bacterium, ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO de Psychroflexus torquis, HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM de proteobacteria gamma marina, HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM de proteobacteria gamma marina, Q9A451_CAUCR de Caulobacter crescentus, JF-5 Q2DG60_ACICY de Acidiphilium cryptum, Q3J0U9_RHOS4 de Rhodobacter sphaeroides, Q5LPV1_SILPO de Silicibacter pomeroyi, PD1222, Q3PC67_PARDE de Paracoccus denitrificans, TM1040 Q3QNY2_9RHOB de Silicibacter sp, Q28ML8_JANSC de Jannaschia sp, MC-1 Q3XT27_9PROT de Magnetococcus sp, Q5WXP0_LEGPL de Legionella pneumophila, Q5WTZ5_LEGPL de Legionella pneumophila, Q5X268_LEGPA de Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, de Legionella pneumophila, Q5ZWM9_LEGPH de Legionella pneumophila subsp pneumophila, QSZSQ8_LEGPH de Legionella pneumophila subsp pneumophila, Q47Y43_COLP3 de Colwellia psychrerythraea, T6c Q3CSZ5_ALTAT de Pseudoalteromonas atlantica, Q8EF49_SHEON de Shewanella oneidensis, Q21E20_SACD2 de Saccharofagus degradans, Q21ER7_SACD2 de Saccharofagus degradans, S14 Q1ZWE5_9VIBR de Vibrio angustum, Q8DAE2_VIBVU de Vibrio vulnificus, 12G01 Q1VCP6_VIBAL de Vibrio alginolyticus, DAT722 Q2FA22_9VIBR de Vibrio sp, Q87NJ1_VIBPA de Vibrio parahaemolyticus, Q5E1F5_VIBF1 de Vibrio fischeri, Q7MJS8_VIBVY de Vibrio vulnificus, SKA34 Q2C6Z5_9GAMM de Photobacterium sp, Q2SFY7_HAHCH de Hahella chejuensis, MED92 Q2BKV0_9GAMM de Oceanospirillum sp, RED65 Q1N035_9GAMM de Oceanobacter sp, Q310U7_DESDG de Desulfovibrio desulfuricans, H 168 Q2AIW5_9FIRM de Halothermothrix orenii, Q8RBX6_THETN de Thermoanaerobacter tengcongensis, DSM 8903 Q2ZH17_CALSA de Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Q97E73_CLOAB de Clostridium acetobutylicum, QYMF Q3C763_9CLOT de Alkaliphilus metalliredigenes, Q899J9_CLOTE de Clostridium tetani y NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE de Clostridium beijerinckii. En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX no tiene una mutación en el motivo Y-S-R, que incluye Tyr135, Ser137 y Arg139 de H-NOX humana.

A menos que se observe o dicte explícitamente de otro modo por el contexto, todas las proteínas H-NOX naturales y mutantes descritas en el presente documento pueden usarse en cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. La proteína H-NOX puede o puede no tener hemo y/u oxígeno unido y puede o puede no unirse covalentemente a otra molécula o resto, tal como polietilenglicol. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína de fusión que incluye un dominio de H-NOX y parte o toda de otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano).

En un aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en medicina para administrar oxígeno a un individuo (por ejemplo, un mamífero, tal como un primate (por ejemplo, un ser humano, un simio inferior, un gorila, un simio superior, un lémur, etc.), un bovino, un equino, un porcino, un canino o un felino) usando una proteína H-NOX. En algunas realizaciones, el individuo padece o está en riesgo de una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia tumoral, una pérdida de sangre o una herida. Indicaciones cardiovasculares a modo de ejemplo incluyen infarto de miocardio (por ejemplo, infarto de miocardio por elevación del segmento ST), cardioplejía, anemia de células falciformes, isquemia perioperativa, oclusión vascular periférica y angioplastia. Indicaciones neurológicas a modo de ejemplo incluyen accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral traumática y lesión de médula espinal. Para el tratamiento de hipoxia tumoral, las proteínas H-NOX pueden usarse, por ejemplo, como un complemento de radioterapia en tumores sólidos (por ejemplo, individuos con malos pronósticos pre-metastásicos) o como un complemento de terapia PDT en tumores superficiales (por ejemplo, cáncer de colon, pulmón o piel, o cáncer en otra superficie o localización accesible). Las aplicaciones de proteínas H-NOX como alternativa a la transfusión de sangre incluyen traumatismo (por ejemplo, campo de batalla, alivio de desastres o accidentes), cirugía (por ejemplo, cirugía de aneurisma abdominal, cirugía ortopédica tal como cirugía de atroplastia de cadera, o cualquier otra cirugía que produce alta pérdida de sangre), hemorragias, choque hemorrágico, hemodilución, y usos de ampliación de sangre (por ejemplo, auto-donación suplementaria). Ejemplos de aplicaciones de reparación de heridas incluyen cicatrización después de radiación (por ejemplo, efecto de oxígeno hiperbárico), reparación posquirúrgica, reparación de úlceras diabéticas y heridas por quemaduras.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la invención proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en medicina para administrar oxígeno a un individuo (por ejemplo, un ser humano) administrando a un individuo en necesidad de las mismas una proteína H-NOX en una cantidad suficiente para administrar una cantidad eficaz de oxígeno al individuo. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina.

En algunas realizaciones, el oxígeno está unido a la proteína H-NOX antes de la administración de la proteína H-NOX al individuo. En algunas realizaciones, el oxígeno no se une a la proteína H-NOX antes de la administración de la proteína H-NOX al individuo y la proteína H-NOX transporta oxígeno de una localización en el individuo a otra localización en el individuo. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX se administra a la sangre del individuo. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX se administra a la sangre, una herida, un tumor, un tejido hipóxico o un órgano hipóxico del individuo. En algunas realizaciones, el individuo padece o está en riesgo de una pérdida de sangre. En algunas realizaciones de los procedimientos, la proteína H-NOX se administra al individuo al menos dos veces.

En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens, tal como una constante de disociación del O2 entre 0,1 y 10 veces o entre 0,5 y 2 veces la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens, tal como al menos 100 veces o 1.000 veces menor que la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína natural. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína mutante como se describe en el presente documento. En diversas realizaciones, la proteína H-NOX tiene al menos una mutación que altera la constante de disociación del O2, la kdis para el oxígeno, la velocidad de auto-oxidación del hemo, la reactividad del NO, o cualesquiera dos o más de las anteriores en comparación con las de una proteína natural correspondiente. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una seleccionada del grupo que consiste en H-NOX de T. tengcongensis natural, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74AY140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, 175F-His6 de T. tengcongensis, 175F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1

H-NOX de L. pneumophilia natural, 2 H-NOX de L. pneumophilia natural, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX de D. desulfuricans natural, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, 11 H-NOX de

H. sapiens natural, 11 I145Y de H. sapiens, 11(1-385) de H. sapiens, 11(1-385) I145Y de H. sapiens, 11(1-385) I145H de H. sapiens, 11(1-194) de H. sapiens, 11(1-194) I145Y de H. sapiens, 11(1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, 12(1-217) de H. sapiens, 12(1-217) I142Y de H. sapiens, 11 H-NOX H105G de H. sapiens, 11 H-NOX H105F de H. sapiens, 11 H-NOX de R. norvegicus natural, 11(1-385) de de R. norvegicus, 11(1-385) I145Y de R. norvegicus, 11(1-385) I145H de R. norvegicus, 11(1-194) de R. norvegicus, 11(1-194) I145Y de R. norvegicus, 11(1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, 12(1-217) de R. norvegicus, 12(1-217) I142Y de R. norvegicus, 11 H-NOX H105G de R. norvegicus, 11 H-NOX H105F de R. norvegicus, H-NOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX de C. acetobutylicum natural, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum, GCY35 H-NOX de C. elegans natural, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, 11 H-NOX de D. melanogaster natural, CG14885-PA de D. melanogaster natural, CG14886 de D. melanogaster natural, CG4154 de D. melanogaster natural; H-NOX de N. punctiforme natural, H-NOX de C. crescentus natural, H-NOX de S. oneidensis natural, H-NOX de M. musculus natural, H-NOX de C. familiaris natural, H-NOX de B. taurus natural, R. norvegicus natural; H-NOX de X. laevis natural, H-NOX de O. latipes natural, H-NOX de O. curvinotus natural, H-NOX de F. rubripes natural, H-NOX de A. gambiae natural, H-NOX de M. sexta natural; gcy-31 de C. elegans natural, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 de C. elegans natural, gcy-34 de C. elegans natural, gcy-35 de C. elegans natural, gcy-36 de C. elegans natural, gcy-37 de C. elegans natural; H-NOX de V. cholera natural, H-NOX de V. fischeri natural y H-NOX de N. punctiforme natural. En algunas realizaciones, uno o más liposomas o nanopartículas incluyen o encapsulan la proteína H-NOX.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX Y140H de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX de T. tengcongensis natural o 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es 12(1-217) de R. norvegicus, 11(1-194) de R. norvegicus, 11(1-385) de R. norvegicus o 11(1-385) I145Y de R. norvegicus. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de

T. tengcongensis o 11 H-NOX (1-385) I145Y de H. sapiens. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX Y 140H de T. tengcongensis, 11 I140Y de H. sapiens o 11 I145Y de H. sapiens. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX Y140F de T. tengcongensis, 2 H-NOX de L. pneumophilia natural, 11 H-NOX I140Y de H. sapiens, 11 H-NOX de H. sapiens natural, sGC 11 H-NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105F de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX I145Y de R. norvegicus, 11 H-NOX de R. norvegicus natural, 11 H-NOX de D. melanogaster natural, CG14885-PA H-NOX de D. melanogaster natural, GCY-35 H-NOX de C. elegans natural, H-NOX de N. punctiforme natural, H-NOX de C. crescentus natural, H-NOX de S. oneidensis natural o H-NOX de C. acetobutylicum natural. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y 140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX de T. tengcongensis natural, 2 H-NOX F 142Y de L. pneumophilia, 2 H-NOX de L. pneumophilia natural, 11 H-NOX I140Y de H. sapiens, 11 I145Y de H. sapiens, 11 H-NOX de H. sapiens natural, sGC 11 H-NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX H105F de R. norvegicus, sGC 11 H-NOX I145Y de R. norvegicus, 11 H-NOX de R. norvegicus natural, 11 H-NOX de D. melanogaster natural, CG14885-PA H-NOX de D. melanogaster natural, GCY-35 H-NOX de C. elegans natural, H-NOX de N. punctiforme natural, H-NOX de C. crescentus natural, H-NOX de S. oneidensis natural o H-NOX de C. acetobutylicum natural. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es ninguna de las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de gen, seguido de su abreviatura de especie e identificadores de Genbank (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir de 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007): Npun5905_Npu_23129606, alr2278_Ana_17229770, SO2144_Sone_24373702, Mdeg1343_Mde_23027521, VCA0720_Vch_15601476, CC2992_Ccr_16127222, Rsph2043_Rhsp_22958463 (gi:46192757), Mmc10739_Mcsp_22999020, Tar4_Tte_20807169, Ddes2822_Dde_23475919, CAC3243_Cac_15896488, gcy-31_Ce_17568389, CG14895_Dm_24647455, GUCY1B3_Hs_4504215, HpGCSbeta1_Hpu1_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577, CG4154_Dm_24646993 (gi:NP_650424.2, gi:62484298), gcy-32_Ce_13539160, gcy-36_Ce_17568391 (gi:32566352, gi:86564713), gcy-35_Ce-17507861 (gi:71990146), gcy37_Ce_17540904 (gi:71985505), GCY1a3_Hs_20535603, GCY1a2-Hs_899477 o GYCa-99B_Dm_729270 (gi:68067738) (Lakshminarayan y col. (2003). “Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins”, BMG Genomics 4:5-13). Las abreviaturas de especies usadas en estos nombres incluyen Ana - Anabaena Sp; Ccr -Caulobacter crescentus; Cac -Clostridium acetobutylicum; Dde -Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp - Magnetococcus sp.; Mde -Microbulbifer degradans; Npu - Nostoc punctiforme; Rhsp -Rhodobacter sphaeroides; Sone -Shewanella oneidensis; Tte -Thermoanaerobacter tengcongensis; Vch -Vibrio cholerae; Ce -Caenorhabditis elegans; Dm - Drosophila melanogaster; Hpul -Hemicentrotus pulcherrimus; Hs

-: Homo sapiens. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es ninguna de las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de organismo y número de acceso de la base de datos Pfam (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir de 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 17 de mayo de 2007; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007): Q622M5_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61P44_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61R54_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61V90_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61A94_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q60TP4_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q60M10_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, GCY37_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY31_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY36_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY32_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY35_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY34_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY33_CAEEL de Caenorhabditis elegans, Q7T040_ORYCU de Oryzias curvinotus, Q75WF0_ORYCU de Oryzias curvinotus, P79998_ORYLA de Oryzias latipes, Q7ZSZ5_ORYLA de Oryzias latipes, Q4SW38_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q4RZ94_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q4S6K5_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q90VY5_FUGRU de Fugu rubripes, Q6INK9_XENLA de Xenopus laevis, Q5T8J7_HUMAN de Homo sapiens, GCYA2_HUMAN de Homo sapiens, GCYB2_HUMAN de Homo sapiens, GCYB1_HUMAN de Homo sapiens, Q9N193_9PRIM de Gorilla gorilla, Q5RAN8_PONPY de Pongo pygmaeus, Q9N192_PANTR de Pan troglodytes, Q9N194_MACMU de Macaca mulatta, Q9N191_HYLLA de Hylobates lar, Q8BXH3_MOUSE de Mus musculus, GCYB1_MOUSE de Mus musculus, Q3UTI4_MOUSE de Mus musculus, Q3UH83_MOUSE de Mus musculus, Q6XE41_MOUSE de Mus musculus, Q80YP4_MOUSE de Mus musculus, Q80WX7_RAT de Rattus norvegicus, Q80WX8_RAT de Rattus norvegicus, Q920Q1_RAT de Rattus norvegicus, Q54A43_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY0_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY4_RAT de Rattus norvegicus, Q8CH85_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY5_RAT de Rattus norvegicus, GCYB1_RAT de Rattus norvegicus, Q8CH90_RAT de Rattus norvegicus, Q91XJ7_RAT de Rattus norvegicus, Q80WX9_RAT de Rattus norvegicus, GCYB2_RAT de Rattus norvegicus, GCYA2_RAT de Rattus norvegicus, Q4ZHR9_CANFA de Canis familiaris, GCYB1_BOVIN de Bos taurus, Q4ZHR7_PIG de Sus scrofa, Q59HN5_GRYBI de Gryllus bimaculatus, 077106_MANSE de Manduca sexta, 076340_MANSE de Manduca sexta, Q5UAF0_APIME de Apis mellifera, Q5FAN0_APIME de Apis mellifera, Q6L5L6_APIME de Apis mellifera, PEST Q7PYK9_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7Q9W6_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7QF31_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7PS01_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7PFY2_ANOGA de Anopheles gambiae str, Q7KQ93_ANOGA de Anopheles gambiae, Q24086_DROME de Drosophila melanogaster, GCYH_DROME de Drosophila melanogaster, GCY8E_DROME de Drosophila melanogaster, GCYDA_DROME de Drosophila melanogaster, GCYDB_DROME de Drosophila melanogaster, Q9VA09_DROME de Drosophila melanogaster, Q29CE1_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q296C7_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q296C8_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q29BU7_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q7YWK7_APLCA de Aplysia californica, Q95NK5_HEMPU de Hemicentrotus pulcherrimus, Q5YLC2_CHLRE de Chlamydomonas reinhardtii, Q8YUQ7 ANASP de Anabaena sp, BBFL7 Q26GR8_9BACT de Flavobacteria bacterium, ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO de Psychroflexus torquis, HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM de proteobacteria gamma marina, HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM de proteobacteria gamma marina, Q9A451_CAUCR de Caulobacter crescentus, JF-5 Q2DG60_ACICY de Acidiphilium cryptum, Q3J0U9_RHOS4 de Rhodobacter sphaeroides, Q5LPV1_SILPO de Silicibacter pomeroyi, PD1222, Q3PC67_PARDE de Paracoccus denitrificans, TM1040 Q3QNY2_9RHOB de Silicibacter sp, Q28ML8_JANSC de Jannaschia sp, MC-1 Q3XT27_9PROT de Magnetococcus sp, Q5WXP0_LEGPL de Legionella pneumophila, Q5WTZ5_LEGPL de Legionella pneumophila, Q5X268_LEGPA de Legionella pneumophila, Q5X2R2_LEGPA de Legionella pneumophila, Q5ZWM9 LEGPH de Legionella pneumophila subsp pneumophila, Q5ZSQ8_LEGPH de Legionella pneumophila subsp pneumophila, Q47Y43_COLP3 de Colwellia psychrerythraea, T6c Q3CSZ5_ALTAT de Pseudoalteromonas atlantica, Q8EF49_SHEON de Shewanella oneidensis, Q21E20_SACD2 de Saccharofagus degradans, Q21ER7_SACD2 de Saccharofagus degradans, S14 QIZWE5_9VIBR de Vibrio angustum, _Q8DAE2_VIBVU de Vibrio vulnificus, 12G01 Q1VCP6_VIBAL de Vibrio alginolyticus, DAT722 Q2FA22_9VIBR de Vibrio sp, Q87NJ1_VIBPA de Vibrio parahaemolyticus, Q5E1F5_VIBF1 de Vibrio fischeri, Q7MJS8_VIBVY de Vibrio vulnificus, SKA34 Q2C6Z5_9GAMM de Photobacterium sp, Q2SFY7_HAHCH de Hahella chejuensis, MED92 Q2BKV0_9GAMM de Oceanospirillum sp, RED65 Q1N035_9GAMM de Oceanobacter sp, Q310U7_DESDG de Desulfovibrio desulfuricans, H 168 Q2AIW5_9FIRM de Halothermothrix orenii, Q8RBX6_THETN de Thermoanaerobacter tengcongensis, DSM 8903 Q2ZH17_CALSA de Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Q97E73_CLOAB de Clostridium acetobutylicum, QYMF Q3C763_9CLOT de Alkaliphilus metalliredigenes, Q899J9_CLOTE de Clostridium tetani y NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE de Clostridium beijerinckii. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no es sGC 11 H-NOX C78S de R. norvegicus o sGC 11 H-NOX C78E de R. norvegicus. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX no tiene una mutación en el motivo Y-S-R, que incluye Tyr135, Ser137 y Arg139 de H-NOX humana.

A menos que se observe o dicte explícitamente de otro modo por el contexto, todas las proteínas naturales y mutantes y todas las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden usarse en cualquiera de los procedimientos de administración de oxígeno descritos en el presente documento. La proteína H-NOX puede

o puede no tener hemo y/o oxígeno unido y puede o puede no unirse covalentemente a otra molécula o resto, tal como polietilenglicol. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína de fusión que incluye un dominio de H-NOX y parte o toda de otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano).

En el presente documento también se describen kits que incluyen una o más proteínas H-NOX. El kit puede incluir una proteína H-NOX e instrucciones para usar el kit para administrar oxígeno a un individuo. La constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX puede estar entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC). La constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX puede estar dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. La constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX puede estar entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC). La proteína H-NOX puede no ser H-NOX Y140H de T.

tengcongensis. A menos que se observe o dicte explícitamente de otro modo por el contexto, todas las proteínas naturales y mutantes y todas las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden usarse en cualquiera de los kits descritos en el presente documento. La proteína H-NOX puede o puede no tener hemo y/o oxígeno unido y puede o puede no unirse covalentemente a otra molécula o resto, tal como polietilenglicol. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína de fusión que incluye un dominio de H-NOX y parte o toda de otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano).

La invención proporciona una proteína H-NOX (tal como cualquiera de las proteínas naturales o mutantes descritas en el presente documento) para su uso como un medicamento. En particular, la invención caracteriza una proteína H-NOX para su uso en un procedimiento de administración de oxígeno a un individuo. La proteína H-NOX puede usarse para tratar cualquier afección para la que la administración de O2 sea beneficiosa, tal como una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia tumoral, una pérdida de sangre o una herida.

La invención proporciona además el uso de una proteína H-NOX (tal como cualquiera de las proteínas naturales o mutantes descritas en el presente documento) para la fabricación de un medicamento para administrar oxígeno a un individuo. En algunas realizaciones, la invención caracteriza el uso de una proteína H-NOX para administrar oxígeno a un individuo. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX se usa para tratar cualquier afección para la que la administración de O2 sea beneficiosa, tal como una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia tumoral, una pérdida de sangre o una herida.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1A es una imagen de la estructura tridimensional de residuos del bolsillo distal de proteínas H-NOX de unión a NO y unión a O2 (arriba hemo). Los residuos de coordinación de hemo de las proteínas H-NOX de unión a NO y unión a O2 también se muestran (debajo de hemo). La FIG. 1A se basa en la estructura tridimensional de H-NOX de

T. tengcongensis informada por Pellicena, P. y col. (31 de agosto de 2004). “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859.

La FIG. 1B es una vista lateral estereoscópica de la estructura tridimensional de HNOX de T. tengcongensis que ilustra rasgos estructurales del dominio de H-NOX. El pliegue de la proteína se representa por diagramas de cintas, El hemo, ligando de dioxígeno, y la histidina proximal se muestran como modelos de esferas y varillas. Las hélices a se marcan A-G según la nomenclatura mostrada en la FIG. 5B. Las cadenas 1 se marcan 1-4. La FIG. 1B es de Pellicena, P. y col. (31 de agosto de 2004). “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859.

Las FIGS. 1C-1H son imágenes de la estructura tridimensional de HNOX de T. tengcongensis que ilustran residuos del bolsillo distal a modo de ejemplo en HNOX de T. tengcongensis. Los siguientes residuos representados en las FIGS. 1C-1H son los principales residuos que comprenden el bolsillo distal de H-NOX: Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140 y Leu144, que están contenidos dentro de las hélices A, D, E y G. Las FIGS. 1C-1H se crearon usando PYMOL (DeLano Scientific, LLP).

La FIG. 2 es un alineamiento de secuencias de las siguientes proteínas H-NOX que se unen o se predice que se unen a O2 y NO: Majority (SEC ID Nº: 1); gcy-31 de Ce. (SEC ID Nº: 2); gcy-33 de Ce. (SEC ID Nº: 3); gcy-35 de Ce. (SEC ID Nº: 4); CG14885 HNOX de Dm. (SEC ID Nº: 5); CG4154 HNOX de Dm. (SEC ID Nº: 6); HNOX beta 3 de Ms. (SEC ID Nº: 7); HNOX de Tt (SEC ID Nº: 8); y HNOX de Ca (SEC ID Nº: 9). Se predice que estas proteínas H-NOX se unen a O2, además de a NO, debido a que tienen una tirosina en la posición correspondiente a Y140 de H-NOX de T. tengcongensis. La numeración de aminoácidos usada en la FIG. 2 empieza con el primer aminoácido en el dominio de H-NOX o proteína de longitud completa como número de residuo 1. El alineamiento se generó usando los parámetros por defecto en el programa MegAlign. Las abreviaturas usadas en la FIG. 2 se describen más adelante con respecto a las FIGS. 4A-4D.

La FIG. 3A-3D son un alineamiento de secuencias de las siguientes proteínas H-NOX que se unen o se predice que se unen a NO, pero no a O2: Majority (SEC ID Nº: 10); proteína sGC beta 1 de Dm. (SEC ID Nº: 11); proteína sGC beta 1 (SEC ID Nº: 12); proteína sGC beta 1 de hs. (SEC ID Nº: 13); proteína beta 2 de hs. (SEC ID Nº: 14); proteína sGC beta 1 de Ms. (SEC ID Nº: 15); proteína sGC beta 1 de Mm. (SEC ID Nº: 16); similar a HD beta 1 de Np. (SEC ID Nº: 17); proteína sGC beta 1 de Tr. (SEC ID Nº: 18); Anopheles_gambiae[XP_310919 (SEC ID Nº: 19); Apis_mellifera|NP_001011632 (SEC ID Nº: 20); proteína sGC beta 1 de Bt. (SEC ID Nº: 21); Chlamydomonas_reinhardtii|AAR02 (SEC ID Nº: 22); Oryzias_curvinotus|BAC98396 (SEC ID Nº: 23); Oryzias_latipes|BAA76691 (SEC ID Nº: 24); Strongylocentrotus_purpuratus|X (SEC ID Nº: 25); y Sus scrofa beta1|NP_001018042+ (SEC ID Nº: 26). El alineamiento se generó usando los parámetros por defecto en el programa MegAlign. Las abreviaturas usadas en las FIGS. 3A-3D se describen a continuación con respecto a la FIG.

4.

Las FIGS. 4A-4D son un alineamiento de secuencias de proteínas H-NOX de las FIGS. 2 y 3A-3D: Majority (SEC ID Nº: 27); proteína sGC beta 1 de Dm. (SEC ID Nº: 11); proteína sGC beta 1 (SEC ID Nº: 12); proteína sGC beta 1 de hs. (SEC ID Nº: 13); proteína beta 2 de hs. (SEC ID Nº: 14); proteína sGC beta 1 de Mm. (SEC ID Nº: 16); similar a HD beta 1 de Np. (SEC ID Nº: 17); proteína sGC beta 1 de Tr. (SEC ID Nº: 18); Chlamydomonas_reinhardtii|AAR02 (SEC ID Nº: 22); Oryzias_curvinotus|BAC98396 (SEC ID Nº: 23); Strongylocentrotus_purpuratus|X (SEC ID Nº: 25); Sus scrofa beta1|NP_001018042 (SEC ID Nº: 26); gcy-31a (SEC ID Nº: 2); gcy-33 (SEC ID Nº: 3); HNOX de Ca. (SEC ID Nº: 9); similar a HD beta 1 de T. (SEC ID Nº: 8); proteína sGc beta 3 de Ms. (SEC ID Nº: 7); CG 14885 (SEC ID Nº: 5); y variante corta de sGC de Dm. (SEC ID Nº: 6). El alineamiento se generó usando los parámetros por defecto en el programa MegAlign. Para las FIGS. 2-4D, “proteína Dm. sGC beta 1” indica 11 H-NOX de Drosophila melanogaster; “proteína sGC beta 1” indica 11 H-NOX de Rattus norvegicus; “proteína sGC beta 1 de hs.” indica 11 H-NOX de Homo sapiens; “proteína beta 2 de hs.” indica 12 H-NOX de Homo sapiens; “proteína sGC beta 1 de Mm.” indica 11 H-NOX de Mus musculus; “similar a HD beta 1 de Np.” indica H-NOX de Nostoc punctiforme; “proteína sGC beta 1 de Tr.” indica 11 H-NOX de Takifugu rubripes; “Anopheles_gambiae|XP_310919” indica 11 H-NOX de Anopheles gambiae; “Apis_mellifera|NP_001011632” indica 11 H-NOX de Apis mellifera; “proteína sGC beta 1 de Bt.” indica 11 H-NOX de Bos taurus; “Chlamydomonas_reinhardtii|AAR02” indica 11 H-NOX de Chlamydomonas reinhardtii; “Oryzias_curvinotus|BAC98396 indica 11 H-NOX de Oryzias curvinotus; “Oryzias_latipes|BAA76691” indica 11 H-NOX de Oryzias latipes; “Strongylocentrotus_purpuratus|X” indica 11 H-NOX de Strongylocentrotus purpuratus; “beta 1 de Sus scrofa |NP_001018042+” indica 11 H-NOX de Sus scrofa; “gcy-31a” indica Gcy-31a H-NOX de Caenorhabditis elegans; “gcy-33” indica Gcy-33 H-NOX de Caenorhabditis elegans; “gcy-35” indica Gcy-35 H-NOX de Caenorhabditis elegans; “HNOX de Ca.” indica H-NOX de Clostridium acetobutylicum; “similar a HD beta 1 de T.” indica H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis; “proteína sGc beta 3 de Ms.” indica 13 H-NOX de Manduca sexta; “CG14885” indica CG 14885 H-NOX de Drosophila melanogaster; “variante corta de sGC de Dm.” indica Gcy-88-E-S H-NOX de Drosophila melanogaster, y “CG4154 HNOX de Dm.” indica CG4154 H-NOX de Drosophila melanogaster.

La FIG. 5A es un alineamiento de secuencias de miembros de la familia H-NOX. La numeración de secuencias es la de H-NOX de T. tengcongensis. Los residuos invariantes se indican por “V”, residuos muy altamente conservados se indican por “s”. Y140 de H-NOX de T. tengcongensis se indica por “H”. Los residuos de tirosina del bolsillo predichos que pueden estabilizar un complejo de FeII-O2 en otras proteínas H-NOX son: posición 70 para GCY-35 de Caenorhabditis elegans; posición 140 en CG14885-PA de Drosophila melanogaster; posición 138 de GCY-35 de Caenorhabditis elegans; posición 140 de Clostridium acetobutylicum; numerado según Thermoanaerobacter tengcongensis. Los números de acceso son: 11 [gi:2746083] de Homo sapiens (SEC ID Nº: 28), 11 [gi:27127318] de Rattus norvegicus (SEC ID Nº: 29), 11 [gi:861203] de Drosophila melanogaster (SEC ID Nº: 30), CG14885-PA [gi:23171476] de Drosophila melanogaster (SEC ID Nº: 31), GCY-35 [gi:52782806] de Caenorhabditis elegans (SEC ID Nº: 32), [gi:23129606] de Nostoc punctiforme (SEC ID Nº: 33), [gi:16127222] de Caulobacter crescentus (SEC ID Nº: 34), [gi:24373702] de Shewanella oneidensis (SEC ID Nº: 35), (ORF 2) [CUCGC_272624] de Legionella pneumophila (SEC ID Nº: 36), [gi:15896488] de Clostridium acetobutylicum (SEC ID Nº: 37) y [gi:20807169] de Thermoanaerobacter tengcongensis (SEC ID Nº: 38). Los alineamientos se generaron usando el programa MegAlign, Lasergene, DNA Star, (véase, la malla mundial en “DNAstar.com/products/megalign.php”). Se usaron los parámetros por defecto de Clustal-W.

La FIG. 5B es un alineamiento de secuencias de dominios de H-NOX a modo de ejemplo. Las anotaciones de la estructura secundaria y la numeración encima del alineamiento se corresponden con el dominio de H-NOX de T. tengcongensis. Las hélices a se representan por espirales, y las cadenas 1 por flechas. El bolsillo distal se define por las hélices aaA, aD, aE y aG. Los números de acceso de Pubmed/NCBI son del siguiente modo: Ther_tengcongensis gi | 20807169 | (SEC ID Nº: 39), Clos_acetobutylicum gi |15896888| (SEC ID Nº: 40), Clos_tetani GI:75543266 (SEC ID Nº: 41), Desu_desulfuricans gi|23475919| (SEC ID Nº: 42), Vibr_vulnificus gi |2761734| (SEC ID Nº: 43), Caul_crescentus gi |16127222 (SEC ID Nº: 44), Micr_degradans gi |23027521| (SEC ID Nº: 45), Vibr_cholerae gi |15601476| (SEC ID Nº: 46), Shew_oneidensis gi |24373702| (SEC ID Nº: 47), Rat_beta1_sGC gi |27127318| (SEC ID Nº: 48), Rat_beta2_sGC gi |21956635| (SEC ID Nº: 49), Nost_punctiforme gi |23129606| (SEC ID Nº: 50) y Nost_sp. gi |7229770| (SEC ID Nº: 51). La secuencia consenso se muestra en la parte inferior de la FIG. 5B (SEC ID Nº: 52). Los alineamientos se generaron usando el programa MULTALIN (Corpet, F. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890) y la FIG. 5B se preparó usando el programa ESPRIPT (Gouet, P. y col. (1999) Bioinformatics 15: 305-308.).

Las FIGS. 6A y 6B son imágenes de la estructura tridimensional del entorno hemo del dominio de H-NOX de T. tengcongensis. Las FIGS. 6A y 6B son de Pellicena, P. y col. (31 de agosto de 2004). “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):1285412859.

Las FIGS. 7A-7F son gráficas de la espectroscopía UV-visible de proteínas H-NOX después de la reducción anaerobia (complejos sin ligar de FeII; línea superior en cada gráfica) antes y después de exponerse a aire (complejos de FeII-O2; línea inferior en cada gráfica) para Tt H-NOX (FIG. 7A), Tt Y140L (FIG. 7B), Tt W9F-Y140L (FIG. 7C), Tt F78Y-Y140L (FIG. 7D), L2 H-NOX y L2 F142Y (FIG. 7E), y 11(1-385) y 11(1-385) I145Y (FIG. 7F). Además de los complejos de FeII y FeII-O2 de L2 F142Y y 11(1-385) I145Y se muestran el espectro de L2 H-NOX y 11-(1-385) H-NOX natural después de la reducción y exposición al aire en la línea central en la FIG. 7E y 7F, respectivamente, para demostrar que estas proteínas no se unen a O2 antes de la adición de una tirosina del bolsillo distal. Los dos o tres números escritos en la esquina superior izquierda de cada panel representan la longitud de onda para el pico de las líneas en la gráfica. Los números están escritos verticalmente en el orden en el que aparecen las líneas correspondientes verticalmente en la gráfica. Por ejemplo, el valor de 430 nm en la FIG. 7A indica el pico de la longitud de onda para la línea superior en la gráfica (que representa un complejo sin ligar de Fell), y el valor de 416 nm en la FIG. 7A indica el pico de la longitud de onda para la línea inferior en la gráfica (que representa un complejo de FeII-O2). Un desplazamiento en la longitud de onda en presencia de aire indica que la proteína se une a O2. La formación de un doble pico entre 500 y 600 nm en presencia de aire también es indicativa de unión de O2. Las FIGS. 7A-7F son de Boon, E. M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1:53-59.

Las FIGS. 8A-8DD contienen secuencias de polinucleótidos de ácidos nucleicos a modo de ejemplo que codifican proteínas H-NOX y las secuencias de aminoácidos de las proteínas H-NOX correspondientes (SEC ID Nº: 53-162).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de que proteínas H-NOX tienen una reactividad del NO mucho menor que la hemoglobina. Esta baja reactividad del NO intrínseca (y alta estabilidad del NO) hace que las proteínas H-NOX naturales y mutantes sean sucedáneos de la sangre deseables debido a la menor probabilidad de inactivación de proteínas H-NOX por NO endógeno y la menor probabilidad de eliminación de NO endógeno por proteínas H-NOX. Y, lo que es más importante, la presencia de una tirosina del bolsillo distal en algunas proteínas H-NOX (Pellicena, P. y col. (31 de agosto de 2004). “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859) sugiere alta reactividad del NO no deseable, contraindicando el uso como sucedáneo de la sangre. Por ejemplo, por analogía, una proteína hemoglobina de Mycobacterium tuberculosis, con una tirosina del bolsillo distal estructuralmente análoga, reacciona extremadamente rápidamente con NO, y es usada por la Mycobacterium para eliminar y evitar eficazmente el NO defensivo producido por un huésped infectado (Ouellet, H. y col. (30 de abril de 2002). “Truncated Hemoglobin HbN Protects Mycobacterium Bovis From Nitric Oxide”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):5902-5907). Sin embargo, los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que las proteínas H-NOX tienen en realidad una reactividad del NO mucho menor que la de la hemoglobina, haciendo posible su uso como sucedáneos de la sangre.

Adicionalmente se descubrió sorprendentemente que las proteínas H-NOX que se unen a NO pero no a O2 pueden convertirse en proteínas H-NOX que se unen tanto a NO como a O2 por la introducción de una mutación de un único aminoácido. Por tanto, la afinidad de proteínas H-NOX por O2 y NO y la capacidad de proteínas H-NOX para discriminar entre ligandos de O2 y de NO puede alterarse por la introducción de una o más mutaciones de aminoácidos, permitiendo que las proteínas H-NOX sean confeccionadas para unirse a O2 o NO con afinidades deseadas. Pueden introducirse mutaciones adicionales para alterar adicionalmente la afinidad por O2 y/o NO. Por tanto, la familia de proteínas H-NOX puede manipularse para presentar propiedades cinéticas y termodinámicas mejoradas u óptimas para administración de O2. Por ejemplo, se han generado proteínas H-NOX mutantes con constantes de disociación alteradas para la unión a O2 que mejoran la utilidad de proteínas H-NOX para una variedad de aplicaciones clínicas e industriales. La capacidad para ajustar las proteínas H-NOX para que se unan a y administren O2 es una vía terapéutica que trata y vence los defectos centrales de los presentes vehículos de O2. Por consiguiente, la presente invención proporciona composiciones para la administración de oxígeno.

Hay numerosos beneficios con el uso de proteínas H-NOX para la administración de O2. La principal función de la transfusión de sangre tras traumatismo y cirugía es administrar O2. Un sucedáneo de la sangre ideal evita los desafíos de la sangre convencional: contaminación vírica, requisitos de tipado, estabilidad en almacén limitada y disponibilidad limitada. Las principales limitaciones de los sucedáneos de la sangre basados en hemoglobina son su alta afinidad por O2 y su propensión a reaccionar con NO. Como se ha mencionado anteriormente, la destrucción de niveles de NO incluso bajos puede tener graves efectos sobre el estado de reposo tónico de la vasculatura y órganos y conduce a hipertensión y dolor gastrointestinal. Adicionalmente, en el proceso de reaccionar con NO, la hemoglobina pierde su capacidad para administrar O2 en un periodo de tiempo clínicamente relevante. Se han hecho numerosos intentos para minimizar la toxicidad de los vehículos de oxígeno basados en hemoglobina de primera generación (HBOC) que incluyen reticulación intra- e inter-molecular (“Blood Substitutes”, R. Winslow ed. Academic Press, 2006). Aunque estas modificaciones vencieron algunos de los graves problemas de toxicidad relacionados con la extravasación de hemoglobina, siguió la destrucción de la unión de oxígeno debido a la alta reactividad del NO. Estos HBOC de segunda generación presentan afinidad reducida por el oxígeno, con valores de p50 próximos al valor de p50 de eritrocitos, ya han fracaso en ensayos clínicos. Winslow y colaboradores han propuesto una hipótesis alternativa: un HBOC de p50 baja con una viscosidad y presión oncótica coloidal apropiada es más apropiado para la administración de oxígeno sin células que un HBOC de p50 alta (Tsai, A. G. y col. (2003). “Targeted O2 Delivery by low-P50 hemoglobin: A New Basis for O2 Therapeutics,” Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285:H1411-H1419; Winslow (2007). “Red Cell Substitutes”, Seminars in Hematology 44:51-59). Queda por ver si la reactividad del NO de un HBOC tal se convierte o no en un problema en ensayos clínicos. La manipulación de proteínas H-NOX para unirse a y administrar O2 con reactividad del NO mínima proporciona un nuevo vehículo de O2 gaseoso en la sangre para su uso en sucedáneos de la sangre en los que las proteínas H-NOX administran O2 sin eliminar NO o son inactivadas como vehículos de O2 por NO. Estas proteínas H-NOX, composiciones, kits y procedimientos se describen adicionalmente en el presente documento.

Proteínas H-NOX

Visión general de la familia de proteínas H-NOX

A menos que se indique lo contrario, cualquier proteína H-NOX natural o mutante puede usarse en las composiciones para su uso en medicina como se describe en el presente documento. Como se usa en el presente documento, una “proteína H-NOX” significa una proteína que tiene un dominio de H-NOX (llamado dominio de unión al Hemo-Óxido Nítrico y Oxígeno). Una proteína H-NOX puede o puede no contener uno o varios de otros dominios, además del dominio de H-NOX. Las proteínas H-NOX son miembros de una familia bien caracterizada altamente conservada de hemoproteínas (Iyer, L. M. y col. (3 de febrero de 2003). “Ancient Conserved domains Shared by Animal Soluble Guanylyl Cyclases And Bacterial Signaling Proteins”, BMC Genomics 4(1):5; Karow, D. S. y col. (10 de agosto de 2004). “Spectroscopic Characterization of the Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis”, Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, E. M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. y col. (octubre de 2005). “Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins”, Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. y col. (2005). “Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors”, J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902). Las proteínas H-NOX también se denominan proteínas 07700 o proteínas HNOB de Pfam (Pfam – A database of protein domain family alignments and Hidden Markov Models, Copyright (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc., 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, EE.UU.). En algunas realizaciones, una proteína H-NOX tiene, o se predice que tiene, una estructura secundaria que incluye seis hélices alfa, seguidas de dos cadenas beta, seguidas de una hélice alfa, seguida de dos cadenas beta. Una proteína H-NOX puede ser una apoproteína que puede unirse a hemo o una holoproteína con hemo unido. Una proteína H-NOX puede unirse covalentemente o no covalentemente a un grupo hemo. Algunas proteínas H-NOX se unen a NO, pero no a O2, y otras se unen tanto a NO como a O2. Los dominios de H-NOX de aerobios facultativos que han sido aislados se unen a NO, pero no a O2. Las proteínas H-NOX de procariotas aerobios obligados, C. elegans, y D. melanogaster, se unen a NO y O2. Los mamíferos tienen dos proteínas H-NOX: 11 y 12. Un alineamiento de secuencias de H-NOX de ratón, rata, vaca y humana muestra que estas especies comparten >99 % de identidad. En algunas realizaciones, el dominio de H-NOX de una proteína H-NOX o la proteína H-NOX entera es al menos aproximadamente cualquiera del 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 o el 99,5 % idéntica al de la región correspondiente de una proteína H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis que se produce naturalmente o una proteína sGC que se produce naturalmente (por ejemplo, una proteína sGC 11 que se produce naturalmente). Como se ha tratado adicionalmente en el presente documento, una proteína H-NOX puede contener opcionalmente una o más mutaciones con respecto a la proteína H-NOX que se produce naturalmente correspondiente. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX incluye uno o más dominios, además del dominio H-NOX. En realizaciones particulares, la proteína H-NOX incluye uno o más dominios o la secuencia entera de otra proteína. Por ejemplo, la proteína H-NOX puede ser una proteína de fusión que incluye un dominio de H-NOX y parte o toda de otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano). En algunas realizaciones, sólo el dominio de H-NOX está presente.

Una estructura de cristal de una H-NOX de unión a O2 procariota de Thermoanaerobacter tengcongensis (Nioche, P. y col. (26 de noviembre de 2004). “Femtomolar Sensitivity of a NO Sensor From Clostridium Botulinum”, Science 306(5701):1550-1553; Pellicena, P. y col. (31 de agosto de 2004). “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc Natl. Acad Sci USA 101 (35):12854-12859) muestra que un grupo hidroxilo de la cadena lateral de tirosina hace un enlace de H crítico con el resto de FeII-O2. Esta red de unión a hidrógeno del bolsillo distal, que implica principalmente Y140, estabiliza un complejo de FeII-O2 (FIG. 6B). Esta tirosina no está presente en proteínas H-NOX que discriminan al O2 y sólo se unen a NO. Por ejemplo, se predice que esta red de enlace de hidrógeno está ausente en las proteínas H-NOX de sGC y procariotas aerobios, sugiriendo esto que un factor molecular clave en la sorprendente selectividad del ligando contra el O2 mostrado por estas proteínas hemo. Las FIGS. 7A-7G demuestran claramente que la adición de una tirosina en el bolsillo distal de una proteína H-NOX natural que se une a NO pero no a O2 puede permitir que la proteína H-NOX mutante se una a O2. Por tanto, una tirosina en el bolsillo hemo distal del pliegue hemo de H-NOX actúa de interruptor para activar o desactivar la unión de O2.

Como se ilustra en las FIGS. 6A y 6B, la estructura de la porfirina está altamente distorsionada. Como se ilustra en la FIG. 6A, el motivo Y-S-R conservado hace interacciones enlace de hidrógeno con las de cadenas laterales de ácido propiónico del grupo hemo. FIG. 6B, el H102 conservado es el ligando proximal al hemo (FIG. 6B).

Como se usa en el presente documento, una “proteína” incluye proteínas y fragmentos de proteínas tanto si se aíslan de fuentes naturales, se producen por técnicas recombinantes como si se sintetizan químicamente. Una proteína puede tener una o más modificaciones, tales como una modificación postraduccional (por ejemplo, glucosilación, etc.) o cualquier otra modificación (por ejemplo, PEGilación, etc.). La proteína puede contener uno o más aminoácidos que no se producen naturalmente (por ejemplo, tales como un aminoácido con una modificación en la cadena lateral). En diversas realizaciones, la proteína H-NOX tiene al menos aproximadamente 50, 100, 150, 181, 200, 250, 300, 350, 400 o más aminoácidos. En algunas realizaciones, las proteínas H-NOX pueden incluir de aproximadamente 50 a aproximadamente 600 aminoácidos, tal como aproximadamente 100 a aproximadamente 500 aminoácidos, aproximadamente 150 a aproximadamente 400 aminoácidos, aproximadamente 150 a aproximadamente 300 aminoácidos, o aproximadamente 175 a aproximadamente 200 aminoácidos.

Fuentes de proteínas H-NOX

Las proteínas H-NOX de cualquier género o especie pueden usarse en las composiciones, kits y procedimientos descritos en el presente documento. En diversas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína de un mamífero (por ejemplo, un primate (por ejemplo, ser humano, simio inferior, gorila, simio superior, lémur, etc.), un bovino, un equino, un porcino, un canino o un felino), un insecto, una levadura o una bacteria o se deriva de una proteína tal. Proteínas H-NOX de mamífero a modo de ejemplo incluyen guanilato ciclasa soluble humana y de rata natural (tal como la subunidad 11). Ejemplos de proteínas H-NOX incluyen proteínas H-NOX de mamífero naturales, por ejemplo, H. sapiens, M. musculus, C. familiaris, B. taurus y R. norvegicus; y proteínas H-NOX de vertebrado no mamífero naturales, por ejemplo, X. laevis, O. latipes, O. curvinotus y F. rubripes. Ejemplos de proteínas H-NOX de unión a NO naturales de no mamífero incluyen proteínas H-NOX naturales de D. melanogaster, A. gambiae y M. sexta; ejemplos de proteínas H-NOX de unión a O2 naturales de no mamífero incluyen proteínas H-NOX naturales de gcy-31, gcy-32, gcy-33, gcy-34, gcy-35, gcy-36 y gcy-37 de C. elegans; CG14885, CG14886 y CG4154 de D. melanogaster; y beta-3 de M. sexta; ejemplos de proteínas H-NOX naturales procariotas incluyen T. tengcongensis,

V. cholera, V. fischeri, N. punctiforme, D. desulfuricans, L. pneumophila 1, L. pneumophila 2 y C. acetobutylicum.

Los números de acceso de NCBI para proteínas H-NOX a modo de ejemplo incluyen los siguiente: 11 [gi:2746083] de Homo sapiens, 11 [gi:27127318] de Rattus norvegicus, 11 [gi:861203] de Drosophila melanogaster, CG 14885-PA [gi:23171476] de Drosophila melanogaster, GCY-35 [gi:52782806] de de Caenorhabditis elegans, [gi:23129606] de Nostoc punctiforme, [gi:16127222] de Caulobacter crescentus, [gi:24373702] de Shewanella oneidensis, [CUCGC_272624] de Legionella pneumophila (ORF 2), [gi:15896488] de Clostridium acetobutylicum y [gi:20807169] de Thermoanaerobacter tengcongensis.

Proteínas H-NOX a modo de ejemplo también incluyen las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de gen, seguido de su abreviatura de especie e identificadores de Genbank (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir de 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007, que se incorporan cada una por este documento por referencia en sus totalidades): Npun5905_Npu_23129606, alr2278_Ana_17229770, SO2144_Sone_24373702, Mdeg1343_Mde_23027521, VCA0720_Vch_15601476, CC2992_Ccr_16127222, Rsph2043-Rhsp_22958463 (gi:46192757), Mmc10739_Mcsp_22999020, Tar4_Tte_20807169, Ddes2822_Dde_23475919, CAC3243_Cac_15896488, gcy31_Ce_17568389, CG14885_Dm_24647455, GUCYIB3_Hs_4504215, HpGCS-betal_Hpul_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577, CG4154_Dm_24646993 (gi:NP_650424.2, gi:62484298), gcy-32_Ce_13539160, gcy36_Ce_17568391 (gi:32566352, gi:86564713), gcy-35_Ce-17507861 (gi:71990146), gcy-37_Ce_17540904 (gi:71985505), GCY1a3_Hs_20535603, GCY1a2-Hs_899477 o GYCa-99B_Dm_729270 (gi:68067738) (Lakshminarayan y col. (2003). “Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins”, BMG Genomics 4:5-13). Las abreviaturas de especies usadas en estos nombres incluyen Ana - Anabaena Sp; Ccr -Caulobacter crescentus; Cac -Clostridium acetobutylicum; Dde - Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp -Magnetococcus sp.; Mde - Microbulbifer degradans; Npu - Nostoc punctiforme; Rhsp -Rhodobacter sphaeroides; Sone -Shewanella oneidensis; Tte -Thermoanaerobacter tengcongensis; Vch -Vibrio cholerae; Ce -Caenorhabditis elegans; Dm -Drosophila melanogaster; Hpul -Hemicentrotus pulcherrimus; Hs -Homo sapiens.

Otras proteínas H-NOX a modo de ejemplo incluyen las siguientes proteínas H-NOX que se enumeran por su nombre de organismo y número de acceso de la base de datos Pfam (tal como las siguientes secuencias de proteínas disponibles a partir de 21 de mayo de 2006; 22 de mayo de 2006; 17 de mayo de 2007; 21 de mayo de 2007; o 22 de mayo de 2007, que se incorporan cada una por este documento por referencia en sus totalidades): Q622M5_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61P44_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61R54_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61V90_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q61A94_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q60TP4_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, Q60M10_CAEBR de Caenorhabditis briggsae, GCY37_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY31_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY36_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY32_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY35_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY34_CAEEL de Caenorhabditis elegans, GCY33_CAEEL de Caenorhabditis elegans, Q7T040_ORYCU de Oryzias curvinotus, Q75WF0_ORYCU de Oryzias curvinotus, P79998_ORYLA de Oryzias latipes, Q7ZSZ5_ORYLA de Oryzias latipes, Q4SW38_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q4RZ94_TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q4S6K5-TETNG de Tetraodon nigroviridis, Q90VY5_FUGRU de Fugu rubripes, Q6INK9_XENLA de Xenopus laevis, QST8J7_HUMAN de Homo sapiens, GCYA2_HUMAN de Homo sapiens, GCYB2_HUMAN de Homo sapiens, GCYB1_HUMAN de Homo sapiens, Q9N193_9PRIM de Gorilla gorilla, Q5RAN8_PONPY de Pongo pygmaeus, Q9N192_PANTR de Pan troglodytes, Q9N194_MACMU de Macaca mulatta, Q9N191_HYLLA de Hylobates lar, Q8BXH3_MOUSE de Mus musculus, GCYB1_MOUSE de Mus musculus, Q3UTI4_MOUSE de Mus musculus, Q3UH83_MOUSE de Mus musculus, Q6XE41_MOUSE de Mus musculus, Q80YP4_MOUSE de Mus musculus, Q80WX7_RAT de Rattus norvegicus, Q80WX8_RAT de Rattus norvegicus, Q920Q1_RAT de Rattus norvegicus, Q54A43_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY0_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY4_RAT de Rattus norvegicus, Q8CH85_RAT de Rattus norvegicus, Q80WY5_RAT de Rattus norvegicus, GCYB1_RAT de Rattus norvegicus, Q8CH90_RAT de Rattus norvegicus, Q91XJ7_RAT de Rattus norvegicus, Q80WX9_RAT de Rattus norvegicus, GCYB2_RAT de Rattus norvegicus, GCYA2_RAT de Rattus norvegicus, Q4ZHR9_CANFA de Canis familiaris GCYB1_BOVIN, de Bos taurus, Q4ZHR7_PIG de Sus scrofa, Q59HN5_GRYBI de Gryllus bimaculatus, O77106_MANSE de Manduca sexta, O76340_MANSE de Manduca sexta, Q5UAF0_APIME de Apis mellifera, Q5FAN0_APIME de Apis mellifera, Q6L5L6_APIME de Apis mellifera, PEST Q7PYK9_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7Q9W6_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7QF31_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7PS01_ANOGA de Anopheles gambiae str, PEST Q7PFY2_ANOGA de Anopheles gambiae str, Q7KQ93_ANOGA de Anopheles gambiae, Q24086_DROME de Drosophila melanogaster, GCYH_DROME de Drosophila melanogaster, GCY8E_DROME de Drosophila melanogaster, GCYDA_DROME de Drosophila melanogaster, GCYDB_DROME de Drosophila melanogaster, Q9VA09_DROME de Drosophila melanogaster, Q29CE1_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q296C7_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q296C8_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q29BU7_DROPS de Drosophila pseudoobscura, Q7YWK7_APLCA de Aplysia californica, Q95NK5_HEMPU de Hemicentrotus pulcherrimus, QSILC2_CHLRE de Chlamydomonas reinhardtii, Q8YUQ7_ANASP de Anabaena sp, BBFL7 Q26GR8_9BACT de Flavobacteria bacterium, ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO de Psychroflexus torquis, HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM de proteobacteria gamma marina, HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM de proteobacteria gamma marina, Q9A451_CAUCR de Caulobacter crescentus, JF-5 Q2DG60_ACICY de Acidiphilium cryptum, Q3J0U9_RHOS4 de Rhodobacter sphaeroides, QSLPV1_SILPO de Silicibacter pomeroyi, PD1222 de Paracoccus denitrificans, Q3PC67_PARDE, TM1040 Q3QNY2_9RHOB de Silicibacter sp, Q28ML8_JANSC de Jannaschia sp, MC-1 Q3XT27_9PROT de Magnetococcus sp, Q5WXPO_LEGPL de Legionella pneumophila, Q5WTZ5_LEGPL de Legionella pneumophila, Q5X268_LEGPA de Legionella pneumophila, Q5X2R2_LEGPA de Legionella pneumophila, Q5ZWM9_LEGPH de Legionella pneumophila subsp pneumophila, QSZSQ8_LEGPH de Legionella pneumophila subsp pneumophila, Q47Y43_COLP3 de Colwellia psychrerythraea, T6c Q3CSZ5_ALTAT de Pseudoalteromonas atlantica, Q8EF49_SHEON de Shewanella oneidensis, Q21E20_SACD2 de Saccharofagus degradans, Q21ER7_SACD2 de Saccharofagus degradans, S 14 Q1ZWE5_9VIBR de Vibrio angustum, Q8DAE2_VIBVU de Vibrio vulnificus, 12G01 Q1VCP6_VIBAL de Vibrio alginolyticus, DAT722 Q2FA22_9VIBR de Vibrio sp, Q87NJ1_VIBPA de Vibrio parahaemolyticus, QSE1F5_VIBF1 de Vibrio fischeri, Q7MJS8_VIBVY de Vibrio vulnificus, SKA34 Q2C6Z5_9GAMM de Photobacterium sp, Q2SFY7_HAHCH de Hahella chejuensis, MED92 Q2BKV0_9GAMM de Oceanospirillum sp, RED65 Q1N035_9GAMM de Oceanobacter sp, Q310U7_DESDG de Desulfovibrio desulfuricans, H 168 Q2AIW5_9FIRM de Halothermothrix orenii, Q8RBX6_THETN de Thermoanaerobacter tengcongensis, DSM 8903 Q2ZH17_CALSA de Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Q97E73_CLOAB de Clostridium acetobutylicum, QYMF Q3C763_9CLOT de Alkaliphilus metalliredigenes, Q899J9_CLOTE de Clostridium tetani y NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE de Clostridium beijerinckii. Se predice que estas secuencias codifican proteínas H-NOX basadas en la identificación de estas proteínas como que pertenecen a la familia de proteínas H-NOX usando la base de datos Pfam como se describe en el presente documento.

Proteínas y ácidos nucleicos H-NOX adicionales, que pueden ser adecuados para su uso en las composiciones farmacéuticas y procedimientos descritos en el presente documento, pueden identificarse usando procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden usarse programas de alineamiento de secuencias y/o predicción de estructuras convencionales para identificar proteínas y ácidos nucleicos H-NOX adicionales basándose en la similitud de su estructura de proteína primaria y/o secundaria predicha con la de proteínas y ácidos nucleicos H-NOX conocidos. Por ejemplo, la base de datos Pfam usa algoritmos de alineamiento definidos y modelos de Hidden Markov (tal como Pfam 21.0) para clasificar proteínas en familias tales como la familia de proteínas H-NOX (Pfam - A database of protein domain family alignments and Hidden Markov Models, Copyright (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc., 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, EE.UU.). También pueden usarse bases de datos convencionales tales como la base de datos swissprot-trembl (malla mundial en “expasy.org”, Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH1211 Geneva 4, Suiza) para identificar miembros de la familia de proteínas H-NOX. La estructura secundaria y/o terciaria de una proteína H-NOX puede predecirse usando los parámetros por defecto de programas de predicción de estructuras convencionales tales como PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, Nueva York, N.Y. 10032, EE.UU.). Alternativamente, la estructura secundaria y/o terciaria real de una proteína H-NOX puede determinarse usando procedimientos convencionales.

En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene el mismo aminoácido en la posición correspondiente que cualquiera de los siguientes residuos del bolsillo distal en H-NOX de T. tengcongensis: Thr4, He5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140, Leu144, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una prolina o una arginina en una posición correspondiente a la de Pro115 o Arg135 de H-NOX de T. tengcongensis, respectivamente, basándose en el alineamiento de secuencias de sus secuencias de aminoácidos. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una histidina que se corresponde con His 105 de 11 H-NOX de R. norvegicus. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene o se predice que tiene una estructura secundaria que incluye seis hélices alfa, seguidas de dos cadenas beta, seguidas de una hélice alfa, seguida de dos cadenas beta. Esta estructura secundaria se ha informado para proteínas H-NOX.

Si se desea, una proteína H-NOX recientemente identificada puede probarse para determinar si se une a hemo usando procedimientos convencionales. La capacidad de una proteína H-NOX para actuar de vehículo de O2 puede probarse determinando si la proteína H-NOX se une a O2 usando procedimientos convencionales tales como aquellos descritos en el presente documento. Si se desea, una o más de las mutaciones descritas en el presente documento pueden introducirse en la proteína H-NOX para optimizar sus características como vehículo de O2. Por ejemplo, una o más mutaciones pueden introducirse para alterar su constante de disociación del O2, kdis para oxígeno, velocidad de auto-oxidación del hemo, reactividad del NO, estabilidad del NO o cualquier combinación de dos o más de las anteriores. Pueden usarse técnicas convencionales tales como aquellas descritas en el presente documento para medir estos parámetros.

Como se ha tratado en el presente documento, las proteínas H-NOX mutantes (por ejemplo, mutantes de clase I y clase II tratados más adelante) pueden derivarse por mutagénesis de estas u otras secuencias de fuentes naturales (por ejemplo, las secuencias enumeradas en la FIG. 2-4D o 8A-8DD o cualquier otra secuencia descrita en el presente documento). Como se usa en el presente documento, “derivado de” se refiere a la fuente de la proteína en la que una o más mutaciones se introducen. Por ejemplo, una proteína que se “deriva de una proteína de mamífero” se refiere a proteína de interés que resulta de introducir una o más mutaciones en la secuencia de una proteína de mamífero natural (es decir, una secuencia que se produce en la naturaleza).

Proteínas H-NOX mutantes

Como se ha tratado adicionalmente en el presente documento, una proteína H-NOX puede contener una o más mutaciones, tales como una mutación que altera la constante de disociación del O2, la kdis para el oxígeno, la velocidad de auto-oxidación del hemo, la reactividad del NO, la estabilidad del NO, o cualquier combinación de dos o más de las anteriores en comparación con las de la proteína natural correspondiente. Pueden generarse paneles de proteínas H-NOX manipuladas por mutagénesis al azar seguido de cribado empírico para constantes de disociación requeridas o deseadas, velocidades de disociación, reactividad del NO, estabilidad, fisio-compatibilidad, o cualquier combinación de dos o más de las anteriores en vista de la enseñanza proporcionada en el presente documento usando técnicas como se describen en el presente documento y, adicionalmente, como son conocidas por el experto. Alternativamente, la mutagénesis puede elegirse selectivamente como diana para regiones o residuos particulares tales como residuos de bolsillo distales evidentes de la estructura tridimensional experimentalmente determinada o predicha de una proteína H-NOX (FIG. 1A en el presente documento; y véase, por ejemplo, Boon, E.

M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1:5359, particularmente con respecto a las secuencias de proteínas H-NOX naturales y mutantes) o residuos evolutivamente conservados identificados a partir de alineamientos de secuencias (FIGS. 2-4 en el presente documento; y véase, por ejemplo, Boon E.M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1:53-59, particularmente con respecto a las secuencias de proteínas H-NOX naturales y mutantes).

Como se usa en el presente documento, una “proteína mutante” significa una proteína con una o más mutaciones en comparación con una proteína que se produce en la naturaleza. En una realización, la proteína mutante tiene una secuencia que se diferencia de la de todas las proteínas que se producen en la naturaleza. En diversas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína mutante es al menos aproximadamente cualquiera del 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 o el 99,5 % idéntica a la de la región correspondiente de una proteína que se produce en la naturaleza. En algunas realizaciones, la proteína mutante es un fragmento de proteína que contiene al menos aproximadamente cualquiera de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ó 400 aminoácidos contiguos de una proteína de longitud completa. La identidad de secuencias puede medirse, por ejemplo, usando software de análisis de secuencias con dichos parámetros por defecto especificados (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Este programa de software iguala secuencias similares asignando grados de homología a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones de aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, una “mutación” significa una alteración en una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de referencia que se produce en la naturaleza. Mutaciones de ácidos nucleicos a modo de ejemplo incluyen una inserción, deleción, mutación por desplazamiento del marco, mutación silenciosa, mutación terminadora o mutación de aminoácido. En algunas realizaciones, la mutación de ácido nucleico no es una mutación silenciosa. Mutaciones de proteínas a modo de ejemplo incluyen la inserción de uno o más aminoácidos (por ejemplo, la inserción de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos), la deleción de uno o más aminoácidos (por ejemplo, una deleción del extremo N, extremo C y/o residuos internos tales como la deleción de al menos aproximadamente cualquiera de 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 o más aminoácidos o una deleción de aproximadamente cualquiera de 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ó 400 aminoácidos), la sustitución de uno o más aminoácidos (por ejemplo, la sustitución de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos), o combinaciones de dos o más de lo anterior. Una truncación funcional a modo de ejemplo de una proteína H-NOX incluye los residuos 1-385 de la secuencia de

11. En algunas realizaciones, una proteína mutante tiene al menos una alteración de aminoácidos en comparación con una proteína que se produce en la naturaleza. En algunas realizaciones, una secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica una proteína que tiene al menos una alteración de aminoácidos en comparación con una proteína que se produce en la naturaleza. En algunas realizaciones, el ácido nucleico no es una versión degenerada de un ácido nucleico que se produce en la naturaleza que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos idéntica a una proteína que se produce en la naturaleza. La nomenclatura usada con referencia a una mutación de aminoácido particular identifica primero el aminoácido natural, seguido del número de residuo y finalmente el aminoácido sustituto. Por ejemplo, Y140L significa que la tirosina ha sido sustituida con una leucina en el residuo número 140.

Una “mutación evolutivamente conservada” es la sustitución de un aminoácido en una proteína con un aminoácido en la posición correspondiente de otra proteína de la misma familia de proteínas. Mutaciones evolutivamente conservadas a modo de ejemplo (también indicadas mutaciones de clase I) se enumeran en la Tabla 1A. En la Tabla 1A, las mutaciones se numeran/anotan según la secuencia de 11 H-NOX humana, pero son análogas para todas las 5 secuencias de H-NOX. Por tanto, la posición correspondiente en cualquier otra proteína H-NOX puede mutarse al residuo indicado. Por ejemplo, Phe4 de 11 H-NOX humana puede mutarse a una tirosina ya que otras proteínas H-NOX tienen una tirosina en esta posición. El residuo de fenilalanina correspondiente puede mutarse a una tirosina en cualquier otra proteína H-NOX. En realizaciones particulares, la una o más mutaciones están confinadas en residuos evolutivamente conservados. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones pueden incluir al menos una

10 mutación evolutivamente conservada y al menos una mutación no evolutivamente conservada. Si se desea, estas proteínas H-NOX mutantes se someten a cribado empírico para constantes de disociación de NO/O2, reactividad del NO, estabilidad y fisio-compatibilidad en vista de la enseñanza proporcionada en el presente documento.

Tabla 1A. Mutaciones de H-NOX de clase I a modo de ejemplo que eligen como diana residuos evolutivamente conservados

F4Y Q30G I145Y

F4L E33P I145H

H7G N61G K151E

A8E C78H I157F

L9W A109F E183F

15 En algunas realizaciones, la mutación es una mutación del bolsillo distal tal como mutación de un residuo en la hélice alfa A, D, E o G (Pellicena, P. y col. (31 de agosto de 2004). “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc Natl. Acad Sci USA 101 (35):12854-12859). Mutaciones del bolsillo distal a modo de ejemplo (también indicadas mutaciones de clase II) se enumeran en la Tabla 1B. En la Tabla 1B, las mutaciones se numeran/anotan según la secuencia de 11 H-NOX humana, pero son análogas para

20 todas las secuencias de H-NOX. Debido a que varias sustituciones proporcionan mutaciones viables en cada residuo citado, el residuo en cada posición indicada puede cambiarse a cualquier otro aminoácido que se produzca naturalmente o que no se produzca naturalmente (indicado “X”). Tales mutaciones pueden producir proteínas H-NOX con una variedad de características de afinidad, estabilidad y reactividad deseadas.

Tabla 1B. Mutaciones de H-NOX de clase II a modo de ejemplo que eligen como diana residuos del bolsillo 25 distal

V8X M73X I145X

L9X F77X I149X

F70X C78X

En realizaciones particulares, la mutación es una mutación del bolsillo distal de hemo. Como se describe en el presente documento, un determinante molecular crucial que previene la unión de O2 en miembros de unión de NO de la familia H-NOX es la falta de un donante de enlace de H en el bolsillo distal del hemo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la mutación altera el enlace de H entre el dominio de H-NOX y el ligando dentro del bolsillo

30 distal. En algunas realizaciones, la mutación interrumpe un donante de enlace de H del bolsillo distal y/o confiere unión al ligando de O2 reducida con respecto al dominio de H-NOX natural correspondiente. Residuos del bolsillo distal a modo de ejemplo incluyen hr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140 y Leu144 de H-NOX de T. tengcongensis y los residuos correspondientes en cualquier otra proteína H-NOX.

Los residuos que no están en el bolsillo distal también pueden afectar la estructura tridimensional del grupo hemo;

35 esta estructura afecta a su vez la unión de O2 y NO al hierro en el grupo hemo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una o más mutaciones fuera del bolsillo distal. Ejemplos de residuos que pueden mutarse, pero que no están en el bolsillo distal, incluyen Pro115 y Arg135 de H-NOX de T. tengcongensis. En algunas realizaciones, la mutación está en el bolsillo proximal que incluye His105 como residuo que se liga con el hierro del hemo.

40 En algunas realizaciones, cuando dos o más mutaciones están presentes; al menos una mutación está en el bolsillo distal y al menos una mutación está fuera del bolsillo distal (por ejemplo, una mutación en el bolsillo proximal). En algunas realizaciones, todas las mutaciones están en el bolsillo distal.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína H-NOX no es idéntica a la secuencia de una proteína que se produce por un organismo en la naturaleza. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos 45 de la proteína H-NOX no es idéntica a una secuencia encontrada en cualquier base de datos el 21 de mayo de 2006

o 22 de mayo de 2006 (tal como todas las secuencias conocidas predichas o conocidas por ser una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de H-NOX). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína H-NOX no es idéntica a una secuencia encontrada en ninguna base de datos el 21 de mayo de 2007 o 22 de mayo de 2007 (tal como todas las secuencias conocidas predichas o conocidas por ser una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de H-NOX).

Para reducir la inmunogenicidad de proteínas H-NOX derivadas de fuentes distintas de seres humanos, los

5 aminoácidos en una proteína H-NOX pueden mutarse a los aminoácidos correspondientes en una H-NOX humana. Por ejemplo, uno o más aminoácidos sobre la superficie de la estructura terciaria de una proteína H-NOX no humana pueden mutarse al aminoácido correspondiente en una proteína H-NOX humana. En algunas variaciones, la mutación de uno o más aminoácidos de superficie puede combinarse con la mutación de dos o más residuos del bolsillo distal, mutación de uno o más residuos fuera del bolsillo distal (por ejemplo, una mutación en el bolsillo

10 proximal), o combinaciones de dos o más de lo anterior.

Mutaciones a modo de ejemplo se muestran en la Tabla 2. Además, cualquiera de los residuos enumerados en la Tabla 2 puede mutarse a cualquier otro aminoácido. La invención también se refiere a cualquier combinación de mutación descrita en el presente documento, tal como mutaciones dobles, triples o múltiples superiores. Por ejemplo, combinaciones de cualquiera de las mutaciones descritas en el presente documento pueden hacerse en la 15 misma proteína H-NOX. Obsérvese que mutaciones en posiciones equivalentes en otras proteínas H-NOX de mamífero o de no mamífero también están englobadas por la presente invención. Si se desea también pueden mutarse residuos distintos de los mencionados en la Tabla 2. Las proteínas H-NOX mutantes a modo de ejemplo comprenden una o más mutaciones que imparten unión a ligando de O2 o NO alterada con respecto al dominio de H-NOX natural correspondiente y son operativas como vehículo de gas O2 en sangre de mamífero fisiológicamente

20 compatible.

En la Tabla 2 y todas las tablas posteriores, el número de residuo para una mutación indica la posición en la secuencia de la proteína H-NOX particular que se describe. Por ejemplo, 15A de T. tengcongensis se refiere a la sustitución de isoleucina por alanina en la quinta posición en H-NOX de T. tengcongensis. La misma isoleucina para la mutación de alanina puede hacerse en el residuo correspondiente en cualquier otra proteína H-NOX (este residuo

25 puede o puede no ser el quinto residuo en la secuencia de otras proteínas H-NOX). Como las secuencias de aminoácidos de dominios de 11 H-NOX de mamífero se diferencian como máximo en dos aminoácidos, también se espera que las mutaciones que producen proteínas H-NOX mutantes deseables cuando se introducen en proteínas 11 H-NOX de rata naturales produzcan proteínas H-NOX mutantes deseables cuando se introducen en proteínas 11 H-NOX naturales de otros mamíferos, tales como seres humanos.

30 Tabla 2. Mutantes de H-NOX a modo de ejemplo de T. tengcongensis (Tt), L. pneumophila (Lp), D. desulfuricans (Dd), V. cholera (Vc), N. punctiforme (Np), C. botulinum (Cb), C. acetobutylicum (Ca), rata, ser humano, C. elegans (Ce).

TtLp Dd Otras Rata Ser humano Gusano bacterias

Tt H-NOX L2 H-NOX Dd H-NOX(728-Vc H-NOX 11(1-385) 11(1-385) Ce GCY-35(1899) 252)

Tt H-NOX L2 F142Y Dd Y139L Np H-NOX 11(1-385) 11(1-385) His6 I145Y 1145Y

Tt I5A: L2 F9W-F142Y Cb H-NOX(1175) 11(1-385) I145H 11(1-385) I145H

Tt I5L: L1 H-NOX Cb H-NOX(1186) 11(1-385) C78Y 11(1-385) C78Y

Tt I5L-P115A: L1 F142Y Ca H-NOX(1197) 11(1-194) 11(1-194)

Tt W9F: Ca H- NOX(1 11 H105F 11 H105F

183)

Tt: W9F 11 H105G 11 H105G

Y140L

Tt W9F-Y140H: 11(1-194) I145Y 11(1-194) I145Y

Tt W9F-N74A: 11(1-194) L9W-I145Y 11(1-194) L9W-I145Y

Tt W9Y: 12(1-217) 12(1-217)

Tt W9N: 12(1-217) 12(1-217)

I142Y
I142Y

Tt W9H

(continuación)

Tt Lp Dd Otras Rata Ser humano Gusano bacterias

Tt N74E

Tt N74A Tt N74H Tt N74A- Y140H Tt I75F His6 Tt F78Y- Y140L Tt F78Y- Y140F Tt P115A Tt R135Q His6 Tt Y140F Tt Y140L Tt Y140H Tt Y140A Tt L144F His6

Modificaciones a proteínas H-NOX

Cualquiera de las proteínas H-NOX naturales o mutantes puede modificarse y/o formularse usando procedimientos convencionales para potenciar aplicaciones terapéuticas o industriales. Por ejemplo, y particularmente como se 5 aplica a proteínas H-NOX manipuladas heterólogas, en la técnica se conoce una variedad de procedimientos para aislar tales agentes de supervisión inmune que incluyen reticulación, PEGilación, decoloración de hidratos de carbono, etc. (por ejemplo, Rohlfs, R. J. y col. (15 de mayo de 1998). “Arterial Blood Pressure Responses to Cell-Free Hemoglobin Solutions And The Reaction With Nitric Oxide”, J. Biol. Chem. 273(20):12128-12134; Migita, R. y col. (junio de 1997). “Blood Volume And Cardiac Index in Rats After Exchange Transfusion With Hemoglobin-Based 10 Oxygen Carriers”, J. Appl. Physiol. 82(6):1995-2002; Vandegriff, K. D. y col. (15 de agosto de 2004). “Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin”, Biochem J. 382(Pt 1):183189, particularmente con respecto a la modificación de proteínas), además de otras técnicas conocidas para el experto. Fusionando una proteína H-NOX con una proteína humana tal como albúmina de suero humano puede aumentarse la semivida en suero, viscosidad y presión oncótica coloidal. En algunas realizaciones, una proteína H

15 NOX se modifica durante o después de su síntesis para reducir su inmunogenicidad y/o para aumentar su tiempo de retención en plasma. Las proteínas H-NOX también pueden encapsularse (tal como encapsulación dentro de liposomas o nanopartículas).

Características de proteínas H-NOX naturales y mutantes

Como se describe en el presente documento, se ha generado un gran número de diversas proteínas mutantes H

20 NOX que proporcionan intervalos de constantes de disociación del NO y O2, kdis de O2, reactividad y estabilidad del NO. Para proporcionar vehículos de gas en sangre operativos, las proteínas H-NOX pueden usarse para sustituir o complementar funcionalmente vehículos de O2 endógenos tales como hemoglobina. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una proteína H-NOX tiene una velocidad de asociación del O2, velocidad de disociación del O2, constante de disociación para la unión de O2, estabilidad del NO, reactividad del NO, velocidad de auto-oxidación,

25 tiempo de retención en plasma, o cualquier combinación de dos o más de las anteriores, similar o mejorada en comparación con un vehículo de O2 endógeno, tal como hemoglobina.

Como se usa en el presente documento, “hemoglobina” significa una proteína o un mutante de la misma de la familia bien caracterizada de hemoglobinas, que son metaloproteínas de transporte de O2 que contienen hierro en glóbulos rojos. La hemoglobina humana libre de estromas purificada tiene una KD cinética para O2 de aproximadamente 200

30 500 nM. Este valor es dependiente de la subunidad.

Como se usa en el presente documento, una “kdis” significa una velocidad de disociación, tal como la velocidad de liberación de O2 o NO de una proteína. Una menor kdis numérica indica una velocidad más lenta de disociación. En diversas realizaciones, la kdis para O2 para una proteína H-NOX está entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 200 s-1 a 20 ºC, tal como aproximadamente 0,1 y aproximadamente 200 s-1, aproximadamente 0,1 y 100 s-1, aproximadamente 1,0 y aproximadamente 16,0 s-1, aproximadamente 1,35 y aproximadamente 23,4 s-1, aproximadamente 1,34 y aproximadamente 18 s-1, aproximadamente 1,35 y aproximadamente 14,5 s-1, aproximadamente 0,21 y aproximadamente 23,4 s-1, aproximadamente 1,35 y aproximadamente 2,9 s-1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3 s-1, aproximadamente 5 y aproximadamente 15 s-1, o aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1 s-1. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una kdis para el oxígeno que es inferior a o igual a aproximadamente 0,65 s-1 a 20 ºC (tal como entre aproximadamente 0,21 s-1 y aproximadamente 0,65 s-1 a 20 ºC).

Por una “kas” se indica una velocidad de asociación, tal como la velocidad de unión de O2 o NO a una proteína. Una menor kas numérica indica una velocidad más lenta de asociación. En diversas realizaciones, la kas para O2 para una proteína H-NOX está entre aproximadamente 0,14 y aproximadamente 60 µM-1s-1 a 20 ºC, tal como aproximadamente 6 y aproximadamente 60 µM-1s-1, aproximadamente 6 y 12 µM-1s-1, aproximadamente 15 y aproximadamente 60 µM-1s-1, aproximadamente 5 y aproximadamente 18 µM-s-1, o aproximadamente 6 y aproximadamente 15 µM-1s-1.

Por “constante de disociación” se indica una “constante de disociación cinética” o una “constante de disociación calculada”. Una “constante de disociación cinética” o “KD” significa una relación de velocidad de disociación cinética (kdis) con respecto a velocidad de asociación cinética (kas), tal como un valor de KD determinado como un valor absoluto usando procedimientos convencionales (por ejemplo, procedimientos espectroscópicos convencionales, de flujo interrumpido o fotólisis de destello) que incluyen procedimientos conocidos para el experto y/o descritos en el presente documento. “Constante de disociación calculada” o “KD calculada” se refiere a una aproximación de la constante de disociación cinética basándose en una kdis medida. Un valor para la kas se deriva mediante la correlación entre KD y kdis cinética como se describe en el presente documento.

En diversas realizaciones, la KD cinética o calculada para la unión de O2 por una proteína H-NOX está entre aproximadamente 1 nM y 1 mM, tal como aproximadamente 2 nM y aproximadamente 2 µM, aproximadamente 2µM y aproximadamente 1 mM, aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 µM, aproximadamente 9 µM y aproximadamente 50 µM, aproximadamente 100 µM y aproximadamente 1 mM, aproximadamente 50 nM y aproximadamente 10 µM, aproximadamente 2 nM y aproximadamente 50 µM, aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM, aproximadamente 150 nM y aproximadamente 1 µM, o aproximadamente 100 nM y aproximadamente 255 nM, aproximadamente 20 nM y aproximadamente 2 µM, 20 nM y aproximadamente 75 nM, aproximadamente 1 µM y aproximadamente 2 µM, aproximadamente 2 µM y aproximadamente 10 µM, aproximadamente 2 µM y aproximadamente 9 µM, o aproximadamente 100 nM y 500 nM a 20 ºC. En algunas realizaciones, la KD cinética o calculada para la unión de O2 es inferior a aproximadamente cualquiera de 100 nM, 80 nM, 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM o 10 nM a 20 ºC.

En diversas realizaciones, la KD cinética o calculada para la unión de O2 por una proteína H-NOX está dentro de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 veces la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones (tal como a 20 ºC), tal como entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 veces o entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2 veces la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones (tal como a 20 ºC). En diversas realizaciones, la KD cinética o calculada para la unión de NO por una proteína H-NOX está dentro de aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 veces la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones (tal como a 20 ºC), tal como entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 veces o entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2 veces la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones (tal como a 20 ºC).

Como se usa en el presente documento, “afinidad del oxígeno” es un término cualitativo que se refiere a la intensidad de la unión del oxígeno al resto hemo de una proteína. Esta afinidad está afectada por tanto la kdis como la kas para el oxígeno. Un valor de KD del oxígeno numéricamente menor significa una mayor afinidad. “Afinidad de NO” es un término cualitativo que se refiere a la intensidad de la unión del NO a una proteína (tal como unión a un grupo hemo o a un oxígeno unido a un grupo hemo asociado a una proteína). Esta afinidad está afectada por tanto la kdis como la kas para el NO. Un valor de KD del NO numéricamente menor significa una mayor afinidad.

Como se usa en el presente documento, “estabilidad del NO” se refiere a la estabilidad o resistencia de una proteína a la oxidación por NO en presencia de oxígeno. Por ejemplo, la capacidad de la proteína para no oxidarse cuando se une a NO en presencia de oxígeno es indicativa de la estabilidad del NO de la proteína. En algunas realizaciones, menos de aproximadamente cualquiera del 50, 40, 30, 10 o el 5 % de una proteína H-NOX se oxida después de incubación durante aproximadamente cualquiera de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 ó 20 horas a 20 ºC.

Como se usa en el presente documento, “reactividad del NO” se refiere a la velocidad a la que el hierro en el hemo de una proteína de unión a hemo se oxida por NO en presencia de oxígeno a una concentración de proteína 2 µM. Un menor valor numérico para la reactividad del NO en unidades de s-1 indica una menor reactividad del NO. En diversas realizaciones, la reactividad del NO de una proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC, tal como inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1,8 s-1, 1,5 s-1, 1,2 s-1, 1,0 s-1, 0,8 s-1, 0,7 s-1 o 0,6 s-1 a 20 ºC. En diversas realizaciones, la reactividad del NO de una proteína H-NOX está entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 600 s-1 a 20 ºC, tal como entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 400 s-1, aproximadamente 0,5 y aproximadamente 100 s-1,

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aproximadamente 0,5 y aproximadamente 50 s, aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10 s, aproximadamente 1 y aproximadamente 5 s-1, o aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2,1 s-1 a 20 ºC. En diversas realizaciones, la reactividad de una proteína H-NOX es al menos aproximadamente 10, 100, 1.000 ó 10.000 veces inferior a la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones, tal como a 20 ºC.

Como se usa en el presente documento, una “velocidad de auto-oxidación” se refiere a la velocidad a la que el hierro en el hemo de una proteína de unión a hemo se auto-oxida. Una menor velocidad de auto-oxidación numérica en unidades de s-1 indica una menor velocidad de auto-oxidación. En diversas realizaciones, la velocidad de autooxidación del hemo de una proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 1,0 h-1 a 37 ºC, tal como inferior a aproximadamente cualquiera de 0,9 h-1, 0,8 h-1, 0,7 h-1, 0,6 h-1, 0,5 h-1, 0,4 h-1, 0,3 h-1, 0,2 h-1, 0,1 h-1 o 0,05 h-1 a 37 ºC. En diversas realizaciones, la velocidad de auto-oxidación del hemo de una proteína H-NOX está entre aproximadamente 0,006 y aproximadamente 5,0 h-1 a 37 ºC, tal como aproximadamente 0,006 y aproximadamente 1,0 h-1, 0,006 y aproximadamente 0,9 h-1, o aproximadamente 0,06 y aproximadamente 0,5 h-1 a 37 ºC.

En diversas realizaciones, una proteína H-NOX mutante tiene (a) una constante de disociación del O2 o NO, velocidad de asociación (kas para O2 o NO) o velocidad de disociación (kdis para O2 o NO) dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, (b) tiene una afinidad del NO más débil (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 veces, 100 veces o 1000 veces más débil) que la de sGC 11, respectivamente, (c) una reactividad del NO con O2 unido al menos 1000 veces inferior a hemoglobina, (d) un tiempo de retención en plasma in vivo de al menos 2, 10, 100 ó 1000 veces superior al de la hemoglobina, o (e) cualquier combinación de dos o más de las anteriores.

Vehículos de O2 adecuados a modo de ejemplo proporcionan constantes de disociación dentro de dos órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, es decir, entre aproximadamente 0,01 y 100 veces, tal como entre aproximadamente 0,1 y 10 veces, o entre aproximadamente 0,5 y 2 veces la de la hemoglobina. Puede usarse una variedad de técnicas establecidas para cuantificar constantes de disociación, tales como las técnicas descritas en el presente documento (Boon, E. M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. y col. (octubre de 2005). “Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins”, Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. y col. (2005). “Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors”, J. Inorg. Biochem. 99(4):892902), Vandegriff, K. D. y col. (15 de agosto de 2004). “Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly/ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin”, Biochem J. 382(Pt 1):183-189, particularmente con respecto a la medición de constantes de disociación), además de aquellas conocidas para el experto. Vehículos de O2 a modo de ejemplo proporcionan reactividad del NO baja o minimizada de la proteína H-NOX con O2 unido, tal como una reactividad del NO inferior a la de la hemoglobina. En algunas realizaciones, la reactividad del NO es mucho menor, tal como al menos aproximadamente 10, 100, 1.000 ó 10.000 veces menor que la de la hemoglobina. Puede usarse una variedad de técnicas establecidas para cuantificar la reactividad del NO (Boon, E. M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. y col. (octubre de 2005). “Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins”, Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. y col. (2005). “Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors”, J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. y col. (15 de agosto de 2004). “Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly/ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin”, Biochem J. 382(Pt 1):183-189, particularmente con respecto a la medición de la reactividad del NO), además de aquellas conocidas para el experto. Debido a que la H-NOX de T. tengcongensis natural tiene una reactividad del NO tan baja, otras proteínas H-NOX naturales y proteínas H-NOX mutantes pueden tener una reactividad del NO baja similar. Por ejemplo, H-NOX Y140H de T. tengcongensis tiene una reactividad del NO similar a la de H-NOX de T. tengcongensis natural.

Además, vehículos de O2 adecuados proporcionan alta estabilidad o maximizada, particularmente estabilidad in vivo. Puede usarse una variedad de métricas de estabilidad, tal como estabilidad oxidativa (por ejemplo, estabilidad a la auto-oxidación u oxidación por NO), estabilidad a la temperatura y estabilidad in vivo. Puede usarse una variedad de técnicas establecidas para cuantificar la estabilidad, tal como las técnicas descritas en el presente documento (Boon,

E. M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. y col. (octubre de 2005). “Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins”, Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. y col. (2005). “Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors”, J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), además de aquellas conocidas para el experto. Para la estabilidad in vivo en plasma, sangre o tejido, métricas de estabilidad a modo de ejemplo incluyen tiempo de retención, velocidad de eliminación y semivida. Se espera que las proteínas H-NOX de organismos termófilos sean estables a altas temperaturas. En diversas realizaciones, los tiempos de retención en plasma son al menos aproximadamente 2, 10, 100 ó 1000 veces mayores que los de la hemoglobina (por ejemplo, Bobofchak, K. M. y col. (agosto de 2003). “A Recombinant Polymeric Hemoglobin With Conformational, Functional, And Physiological characteristics of an in vivo O2 transporter”, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285(2):H549-H561). Como será apreciado por el experto, los sucedáneos de la sangre basados en hemoglobina están limitados por la rápida eliminación de la hemoglobina sin células del plasma debido a la presencia de receptores para la hemoglobina que eliminan la hemoglobina sin células del plasma. Como no hay receptores para proteínas H-NOX en el plasma, se espera que las proteínas H-NOX naturales y mutantes tengan un tiempo de retención en el plasma más largo que el de la hemoglobina. Si se desea, el tiempo de retención en el plasma puede aumentarse PEGilando

o reticulando una proteína H-NOX o fusionando una proteína H-NOX con otra proteína usando procedimientos

convencionales (tales como aquellos descritos en el presente documento y aquellos conocidos para el experto).

En diversas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una constante de disociación del O2 entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM a 20 ºC y una reactividad del NO al menos aproximadamente 10 veces menor que la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones, tal como a 20 ºC. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una constante de disociación del O2 entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM a 20 ºC y una reactividad del NO inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una constante de disociación del O2 dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina y una reactividad del NO al menos aproximadamente 10 veces menor que la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones, tal como a 20 ºC. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una kdis para el oxígeno entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 200 s-1 a 20 ºC y una reactividad del NO al menos aproximadamente 10 veces menor que la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones, tal como a 20 ºC. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX tiene una kdis para el oxígeno que es inferior a aproximadamente 0,65 s-1 a 20 ºC (tal como entre aproximadamente 0,21 s-1 y aproximadamente 0,64 s-1 a 20 ºC) y una reactividad del NO al menos aproximadamente 10 veces menor que la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones, tal como a 20 ºC. En realizaciones particulares, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 50 µM, aproximadamente 50 nM y aproximadamente 10 µM, aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM, aproximadamente 150 nM y aproximadamente 1 µM, o aproximadamente 100 nM y aproximadamente 255 nM a 20 ºC. En diversas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 80 nM a 20 ºC, tal como entre aproximadamente 20 nM y aproximadamente 75 nM a 20 ºC. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos aproximadamente 100 veces inferior

o aproximadamente 1.000 veces inferior a la de la hemoglobina bajo las mismas condiciones, tal como a 20 ºC. En algunas realizaciones, la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC, tal como inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1,8 s-1, 1,5 s-1, 1,2 s-1, 1,0 s-1, 0,8 s-1, 0,7 s-1 o 0,6 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX está entre 0,01 y 200 s-1 a 20 ºC, tal como aproximadamente 0,1 y aproximadamente 200 s-1, aproximadamente 0,1 y 100 s-1, aproximadamente 1,35 y aproximadamente 23,4 s-1, aproximadamente 1,34 y aproximadamente 18 s-1, aproximadamente 1,35 y aproximadamente 14,5 s-1,

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aproximadamente 0,21 y aproximadamente 23. 4 s, aproximadamente 2 y aproximadamente 3 s, aproximadamente 5 y aproximadamente 15 s-1, o aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1 s-1. En algunas realizaciones, la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1,9 µM a 20 ºC, y la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 14,5 s-1 a 20 ºC. En algunas realizaciones, la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC, tal como inferior a aproximadamente cualquiera de 0,9 h-1, 0,8 h-1, 0,7 h-1, 0,6 h-1, 0,5 h-1, 0,4 h-1, 0,3 h-1, 0,2 h-1 o 0,1 h-1. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 14,5 s-1 a 20 ºC, y la velocidad de autooxidación del hemo de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC. En algunas realizaciones, la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 1,35 s-1 y aproximadamente 14,5 s-1 a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC). En algunas realizaciones, la velocidad de autooxidación del hemo de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 1 h-1 a 37 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a aproximadamente 700 s-1 a 20 ºC (por ejemplo, inferior a aproximadamente 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1 o 1,8 s-1 a 20 ºC).

En algunas realizaciones, la viscosidad de la disolución de proteína H-NOX está entre 1 y 4 centipoise (cP). En algunas realizaciones, la presión oncótica coloidal de la disolución de proteína H-NOX está entre 20 y 50 mm de Hg.

La Tabla 3 enumera tamaños, afinidades del oxígeno, estabilidades de auto-oxidación, velocidades de reactividad del NO y modificaciones para proteínas H-NOX naturales y mutantes a modo de ejemplo. En la Tabla 3, el tamaño del vehículo se refiere al peso molecular de una proteína H-NOX modificada (por ejemplo, PEGilada) o sin modificar.

Tabla 3: Realizaciones a modo de ejemplo para proteínas H-NOX

Tamaño del vehículo: Afinidad del oxígeno Estabilidad (autooxidación) Reactividad del NO (s-1) Decoración de la partícula

>1 MD: <1nM 1 hora 0,01 a 0,1 Reticulación

0,5 kD a 1 MD: 1 nM a 100 nM 1 h a 12 h 0,1 a 1 PEGilación

0,1 kD a 0,5 kD: 100 nM a 1 uM 12 h a 48 h 1 a 10 Encapsulación

0,01 kD a 0,1 kD: 1 uM a 10 uM 48 h a 2 semanas 10 a 100

Datos a modo de ejemplo para mutantes particulares se informan en las Tablas 4-12. En la Tablas 4-12, 11 y 12 se refieren a proteínas derivadas de proteínas H-NOX de rata. Como las secuencias de aminoácidos de dominios de 11 H-NOX de mamífero se diferencian como mucho por dos aminoácidos, se esperan resultados similares para las mutaciones correspondientes en otras proteínas 11 H-NOX de mamífero, tales como 11 humana. Como se muestra en la Tabla 4, la introducción de una o más mutaciones en proteínas H-NOX naturales permite alterar la velocidad de auto-oxidación y velocidad de disociación del O2. Si se desea, la velocidad de auto-oxidación o velocidad de disociación del O2 puede alterarse adicionalmente combinando cualquiera de las mutaciones individuales o dobles enumeradas en la Tabla 4 o introduciendo una o más mutaciones adicionales en una proteína H-NOX, como se describe en el presente documento.

Tabla 4. Se enumeran estabilidad a la auto-oxidación, propiedades de unión del O2 (tales como velocidad de disociación del O2) y residuos de enlace de H del bolsillo distal para proteínas H-NOX naturales y mutantes de la clase II

Proteína: Estabilidad Actividad de unión de O2 b Residuos del bolsillo distal

Tt H-NOX, una H-NOX procariota y un ligador de O2 fuerte

Tt H-NOX: kox ~0c kdis = 1,22 Trp9, Phe78, Tyr140

Tt Y140F: kox = 0,05 kdis= 15,7d Trp9, Phe78, The 140

Tt Y140L: kox = 0,19 kdis=20.d Phe78, Leu 140

Tt Y140H: kox = 0,87 kdis = 5,03 Trp9, Phe78, His140

Tt Y140A: Establea Complejo parciald,e Trp9, Phe78, Ala140

Tt W9F: kox-0c kdis= 1,84 Phe9, Phe78, Tyr140

Tt W9F-Y140L: kox = 0,12 No se forma complejo Phe9, Phe78, Leu140

Tt W9F-Y 140H: kox = 0,11 kdis = 23,4 Phe9, Phe78, His140

Tt F78Y-Y140L: kox~0c kdis = 0,83 Trp9, Tyr78, Leu140

Tt F78Y-Y140F: kox~0c kdis = 1,48 Trp9, Tyr78, Phe140

Proteínas H-NOX procariotas para las que la proteína natural no se une a O2

L2 H-NOX: Establea No se forma complejo Phe9, Phe78, Phe142

L2 F 142Y: Establef kdis = 3,68 Phe9, Phe78, Tyr142

L2 F9W-F142Y: Establef Se une a O2 e Trp9, Phe78, Tyr142

L1 H-NOX: kox = 0,31 No se forma complejo Leu9, Leu78, Phe142

L1 F142Y: kox = 1,8 kdis = 1,73d Leu9, Leu78, Tyr142

H-NOX eucariotas para las que la proteína natural no se une a O2

12(1-217): kox = 0,18 No se forma complejo Leu9, Cys76, Ile142

12(1-217)I142Y: g Leu9, Cys76, Tyr142

11(1-194): kox = 4,3 No se forma complejo Leu9, Cys78, Ile145

11(1-194)I145Y: kox = 2,8 g Leu9, Cys78, Tyr145

11(1-194) L9W-I145Y: kox ~ 10 g Trp9, Cys78, Tyr145

11(1-385): Establee No se encuentra complejo Leu9, Cys78, Ile145

11(1-385) I145Y: kox = 0,72 kdis = 2,69 Leu9, Cys78, Tyr145

11(1-385) I145H: Leu9, Cys78, His145

11(1-385) C78Y: Leu9, Tyr78, Ile145

Otras H-NOX predichas que se unen a O2 como construcción natural

Dd H-NOX(728-899): kox = 0,98 kdis= 5,80 Phe9, Phe75, Tyr139

Dd Y139L: Phe9, Phe75, Leu139

Cb H-NOX(1-175): Construcción no estableh g Trp9, Phe78, Tyr140

Cb H-NOX(1-186): Ligeramente más establei g Trp9, Phe78, Tyr140

Ca H-NOX(1-197): Construcción no estableh g Trp9, Phe78, Tyr140

Ca H-NOX(1-183): Ligeramente más establei g Trp9, Phe78, Tyr140

(continuación)

Ce GCY-35(1-252): Estable Se une a O2 e Phe9, Thr78, Tyr144

aLa construcción es estable a la oxidación (evaluada por la velocidad de auto-oxidación, kox [h-1] a 37 ºC) y/o pérdida de hemo. bLa actividad de unión de O2 se evaluó por la velocidad de disociación del O2 del hemo a 20 ºC (s-1). cDespués de 24 horas a 37 ºC, todavía no hay indicación de auto-oxidación. dSólo una pequeña porción de la proteína forma un complejo con O2, la velocidad informada representa la cinética para esta población. cLa proteína se une a O2, pero la kdis no se determinó. fAunque relativamente estable, esta proteína precipitó a medida que se oxidó, dificultando medir la kox. gNo aplicable debido a la inestabilidad o rápida oxidación. h“Construcción no estable” significa que la proteína se oxida inmediatamente en las condiciones probadas. i“Ligeramente más estable” significa que la proteína se oxida durante un periodo de minutos a horas, pero no sigue siendo estable más allá de 24 horas en las condiciones probadas.

La Tabla 5 ilustra la alteración de la velocidad de asociación del O2 (kas), velocidad de disociación del O2 (kdis), constante de disociación del O2 (KD) y velocidad de auto-oxidación (kox) en proteínas H-NOX por la introducción de una o más mutaciones. En algunas realizaciones, cualquiera de las mutaciones individuales o dobles enumeradas en la Tabla 5 se combinan con otra mutación (tal como otra mutación en la Tabla 5 o cualquier otra mutación descrita en el presente documento) para alterar adicionalmente la velocidad de asociación del O2, velocidad de disociación del O2, constante de disociación del O2, velocidad de auto-oxidación, o combinaciones de dos o más de las anteriores.

Tabla 5. Constantes cinéticas de unión de O2 para proteínas hemo de FeII ligado a histidilo

Proteína: KD a kas b kdis c kox d Ref.

Tt H-NOX: 89,7 ± 6,2 13,6 ± 1,0 1,22 ± 0,09 e i

Tr P115A: 21,2 ± 2,1 10,4 ± 1,1 0,22 ± 0,01 e j

Tt I5A: ~80 0,82 ± 0,03 0,7 j

Tt I5L: ~1000 9,50 ± 0,64 0,6 j

Tt I5L-P115A: ~30 0,28 ± 0,01 0,6 j

Tt W9F: 305 ± 31 6,02 ± 0,62 1,84 ± 0,17 e i

Tt Y140F: f 15,7 ± 1,4 15,7 ± 9,8 0,05 j

Tt Y140L: ~2000 Geminal 20,1 ± 2,0 0,19 i

Tt Y140H: ~500 5,03 ± 0,69 0,87 j

Tt W9F-Y140H: ~2500 23,4 ± 3,7 0,11 j

Tt W9F-Y140L: No se observa complejo con O2 0,12 i

Tt F78Y-Y140F: ~150 1,48 ± 0,33 e j

Tt F78Y-Y140L: ~80 0,83 ± 0,17 e i

Tt W9F-N74A: Milimolar muy lenta j

Dd H-NOX: Milimolar muy lenta 7,13 ± 0,45 0,14 j

Dd Y139L: No se observa complejo con O2 j

11(1-385) I145Y: 70.000,00 0,00004 2,69 ± 0,61 0,72 i

L2 F 142Y: 9200 ± 3000 0,40 ± 0,14 3,68 ± 0,71 i

Hs Hb beta: 267 60 16 n

Hs Hb alfa: 560 50 28 k

Sw Mb: 880 17 15 0,006 k

Bj FixL: 140.000 0,14 20 2,7 l

HemAT-B: 720 32 23 0,06 M

aconstante de disociación a 20 ºC (nM); bvelocidad de asociación del O2 al hemo a 20 ºC (µM-1s -1); cvelocidad de disociación del O2 del hemo a 20 ºC (s-1); dvelocidad de auto-oxidación del hemo (h-1) a 37 ºC; edespués de 24 horas a 37 ºC, todavía no hay indicación de auto-oxidación; fsólo una pequeña porción de la proteína forma un complejo con O2, aunque la cinética para esta población pudo medirse; iBoon, E.M. y col. (junio de 2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1(1):53-59, jdatos sin publicar; kSpringer, B. A. y col. (1994) “Family Physicians Key Partners in Preventing Suicide Among Youth”, Chem. Rev. 94:699-714;iGilles-Gonzalez y col. (1994) “Heme-Based Sensors, Exemplified for the Kinase FixL, are a New Class of Heme Protein with Distinctive Ligand Binding and Autoxidation”, Biochemistry 33:8067-8073. mAono, S. y col. (2002) “Resonance Raman and Ligand Binding Studies of the Oxygen-Sensing Signal Transducer Protein HemAT from Bacillus Subtilis”, J. Biol. Chem. 277:13528-13538. nAntonini, E. y col. (1971). “Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands”, North-Holland Pub., Ámsterdam.

La Tabla 6 ilustra que la velocidad de asociación del O2, velocidad de disociación del O2, velocidad de autooxidación del O2, reactividad del NO y estabilidad de complejos FeII-O2 en proteínas H-NOX puede alterarse por la introducción de una o más mutaciones. En algunas realizaciones, cualquiera de las mutaciones individuales o dobles enumeradas en la Tabla 6 se combinan con otra mutación (tal como otra mutación en la Tabla 6 o cualquier otra

5 mutación descrita en el presente documento) para alterar adicionalmente la velocidad de asociación del O2, velocidad de disociación del O2, velocidad de auto-oxidación del O2, reactividad del NO o estabilidad de complejos FeII-O2 en una proteína H-NOX. Como será apreciado por el experto, la introducción de una o más mutaciones adicionales, tales como aquellas descritas en el presente documento, puede usarse para alterar adicionalmente estos valores.

10 Tabla 6. Velocidad de asociación del O2, velocidad de disociación del O2, velocidad de auto-oxidación del O2, reactividad del NO y estabilidad de complejos FeII-O2 en proteínas H-NOX.

Proteína: kas a kdis b kox c Reactividadd del NO Estabilidad del complejo Fell-O2

Hs Hb: 23 11 0,006 <0,001 s (~7.000 s1)c se oxida durante la noche en aire a TA, estable a 4 ºC en aire, estable anaeróbica

Tt H-NOX: 13,6 1,22 Muy lenta 0,54 ± 0,07 s-1 siempre estable

Tt Y140H: ~10 5,03 0,87 1,7 ± 0,4s-1 se oxida durante la noche en aire a TA, estable a 4 ºC en aire, estable anaeróbica

11(1-385) I145Y: ~105 2,69 0,72 lenta a FeIII-NO se oxida durante la noche en aire a TA, estable a 4 ºC en aire, estable anaeróbica

avelocidad de asociación del O2 al hemo a 20 ºC (µM-1s -1); bvelocidad de disociación del O2 del hemo a 20 ºC (s-1); cvelocidad de auto-oxidación del hemo (h-1) a 37 ºC; dPara la determinación de reactividades del NO: proteínas purificadas (Tt WT HNOX, Tt Y140H HNOX, hemoglobina de Homo sapiens (Hs Hb)) se prepararon a 2 µM en tampón A y se preparó óxido nítrico (NO) a 200 µM en tampón A (tampón A: Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM) a 20 ºC. Usando espectroscopía de flujo interrumpido, la proteína se mezcló rápidamente con NO en una relación 1:1 con un tiempo de integración de 0,00125 segundos. Las longitudes de onda del cambio máximo se ajustaron a una exponencial simple, midiendo esencialmente la etapa limitante de la velocidad de la oxidación por NO. Los productos finales de la reacción fueron NO férrico para las proteínas H-NOX y acuo férrico para Hs Hb. cPara Hs Hb, la reacción de la proteína con NO fue tan rápida que la reacción se completó en el plazo del tiempo muerto del experimento (0,001 segundos). La reactividad del NO por la hemoglobina es aproximadamente 7.000 s-1 a 20 ºC basado en Eich, R. F. y col. (1996) “Mechanism of NO-Induced Oxidation of Myoglobin and Hemoglobin”, Biochemistry 35:6976-6983.

La Tabla 7 demuestra que la constante de disociación para la unión de O2 puede cambiarse significativamente mutando uno o más residuos en proteínas H-NOX. Los valores de KD cinética para estas proteínas H-NOX a modo

15 de ejemplo oscilan de 21,20 nM a 1000000,00 nM a 20 ºC. Si se desea, la constante de disociación para la unión de O2 puede alterarse adicionalmente combinando cualquiera de las mutaciones individuales o dobles enumeradas en la Tabla 7 o introduciendo una o más mutaciones adicionales en una proteína H-NOX, como se describe en el presente documento.

Tabla 7. Proteínas H-NOX naturales y mutantes y proteínas de referencia dispuestas por el valor de la 20 constante de disociación para la unión de O2

Proteína: KD cinética (nM) ± KD calculada (nM)

Tt P115A: 21,2 2,1

Tt N74H: 27

Tt I5L-P115A: 30

Tt N74A: 32

Tt I5A: 80

Tt F78Y-Y140L: 80

Tt H-NOX His6: 89

Tt H-NOX: 89,7 6,2

Tt wt: 90

Tt F78Y-Y140F: 150

(continuación)

Proteína: KD cinética (nM) ± KD calculada (nM)

Tt W9Y: 218

Tt R135Q His6: 252

Hs Hb beta: 267

Tt W9F: 305 31

Tt W9H: 456

Tt Y140H: 500

Hs Hb alfa: 560

Tt W9N: 573

Tt I75F-His6: 713-773

HemAT-B: 720

Sw Mb: 880

Tt 15L: 1000

Tt L144F-His6: 1092-1185

Tt Y140L: 2000

Tt W9F-Y140H: 2500

L2 F142Y: 9200 3000

Bj FixL: 140000

Tt W9F-N74A: 1000000

Dd H-NOX: 1000000

11(1-385) I145Y: 1000000

La Tabla 8 demuestra que las velocidades de disociación para la unión de O2 pueden cambiarse significativamente mutando uno o más residuos en proteínas H-NOX. Las velocidades de disociación para estas proteínas H-NOX a modo de ejemplo oscilan de 0,21 s-1 a 23,4 s-1 a 20 ºC. Si se desea, la velocidad de disociación para la unión de O2 puede alterarse adicionalmente combinando cualquiera de las mutaciones individuales o dobles enumeradas en la Tabla 8 o introduciendo una o más mutaciones adicionales en una proteína H-NOX, como se describe en el presente documento.

Tabla 8. Proteínas H-NOX naturales y mutantes y proteínas de referencia dispuestas por el valor de la velocidad de disociación para la unión de O2

Proteína: kdis (s-1) ±

Tt N74A: 0,21 0,004

Tt P115A: 0,22 0,01

Tt I5L-P115A: 0,28 0,03

Tt N74E: 0,38 0,01

Tt N74H: 0,44 0,01

Tt I5A: 0,82 0,03

Tt F78Y-Y140L: 0,83 0,17

Tt H-NOX His6: 1,2 0,02

Tt H-NOX: 1,22 0,09

Tt F78Y-Y140F: 1,48 0,33

L1 F142Y: 1,73

(continuación)

Proteína: kdis (s-1) ±

Tt W9F: 1,84 0,17

11(1-385) I145Y: 2,69 0,61

Tt W9Y: 3,07 0,1

Tt R135Q His6: 3,56 0,08

L2 F 142Y: 3,68 0,71

Tt Y140H: 5,03 0,69

Tt W9H: 6,42 0,11

Dd H-NOX: 7,13 0,45

Tt W9N: 8,09 0,14

Tt ISL: 9,5 0,64

Tt 175F-His6: 10,48 0,12

Sw Mb: 15

Tt Y140F: 15,7 9,8

Hs Hb beta: 16

Tt L144F-His6: 16,06 0,21

Bj FixL: 20

Tt Y140L: 20,1 2

HemAT-B: 23

Tt W9F-Y140H: 23,4 3,7

Hs Hb alfa: 28

La Tabla 9 demuestra que las velocidades de asociación para la unión de O2 pueden cambiarse significativamente mutando uno o más residuos en proteínas H-NOX. Las velocidades de asociación para estas proteínas H-NOX a modo de ejemplo oscilan de 60 µM-1s-1 a 0,14 µM-1s-1 a 20 ºC. Si se desea, la velocidad de asociación para la unión de O2 puede alterarse adicionalmente combinando cualquiera de las mutaciones individuales o dobles enumeradas en la Tabla 9 o introduciendo una o más mutaciones adicionales en una proteína H-NOX, como se describe en el presente documento.

Tabla 9. Proteínas H-NOX naturales y mutantes y proteínas de referencia dispuestas por el valor de la velocidad de asociación para la unión de O2

Proteína: kas (µM-1s -1) ±

Hs Hb beta: 60

Hs Hb alfa: 50

HemAT-B: 32

Sw Mb: 17

Tt Y140F: 15,7 1,4

Tt H-NOX: 13,6 1

Tt P115A: 10,4 1,1

Tt W9F: 6,02 0,62

L2 F142Y: 0,4 0,14

Bj FixL: 0,14

Tt W9F-N74A: muy lentaa

Dd H-NOX: muy lentaa

(continuación)

Proteína: kas (µM-1s-1) ±

11(1-385) I145Y: muy lentaa

aPor “muy lenta” se indica más lenta que la hemoglobina, tal como aproximadamente uno a dos órdenes de magnitud más lenta que la hemoglobina.

La Tabla 10 ilustra el efecto de mutaciones de H-NOX a modo de ejemplo en la unión de O2 y NO. Cada número enumerado en la Tabla 10 para las formas no ligadas a Fe es para un único pico (que está enumerado entre las columnas 1 y a). Si se une O2 o NO, este único pico se fracciona en dos picos 1 y a (que están enumerados bajo las columnas 1 y a, respectivamente). Si se desea, la unión de O2 o NO puede alterarse adicionalmente combinando cualquiera de las mutaciones individuales o dobles enumeradas en la Tabla 10 o introduciendo una o más mutaciones adicionales en una proteína H-NOX, como se describe en el presente documento.

Tabla 10: Posiciones de picos de UV-visiblea para algunos complejos de proteína hemo de FeII ligado a histidilo

Proteína Soret 1a Complejo no ligado de FeII

sGC 431 555 11(1-385) I145Y 429 549 Tt H-NOX 431 565 Tt W9F-Y140L 430 560 Vc H-NOX 429 568 Np H-NOX 430 555 L2 H-NOX 428 557 L2 F142Y 428 557 Tt I75F-His6 431 569 Tt L144F-His6 433 564 Hb 430 555 Complejo de FeII-NO

sGC 398 537 572 11(1-385)I145Y 399/416 542 574 Tt H-NOX 420 547 575 Tt W9F-Y140L 423 540 573 Vc H-NOX 398 540 573 Np H-NOX 416/400 543 576 L2 H-NOX 399/416 544 575 L2 F142Y 417 544 578 Tt 175F-His6 418 545 574 Tt L144F-His6 416 544 574 Hb 418 545 575 Complejo de FeII-O2

sGC No se observa complejo 11(1-385) I145Y 416 541 575 Tt H-NOX 416 556 591 Tt W9F-Y 140L No se observa complejo Vc H-NOX No se observa complejo Np H-NOX No se observa complejo L2 H-NOX No se observa complejo L2 F142Y 417 542 577 Tt 175F-His6 416 552 589 Tt L144F-His6 416 544 574 Hb 415 541 577

anm (a 20 ºC)

La Tabla 11 contiene posiciones de picos de UV-visible para algunos complejos de Fe (II), Fe (III), Fe(II)-NO y Fe(II)-O2. Si una hemoglobina o proteína H-NOX es anaerobia, tiene un pico de Soret a ~431 nm, y está en un estado no ligado. Si la proteína H-NOX no se une a O2, entonces el pico de Soret no cambiará cuando se añada O2. Si la proteína H-NOX se une a O2, entonces su pico de Soret se desplazará a entre 414 nm y 418 nm cuando se añada 5 O2, que es el mismo desplazamiento que se produce en hemoglobina, indicativo de O2 unido al hemo. Los picos de Soret para H-NOX oxidada (Fe(III)) o H-NOX unida a NO en un estado hexacoordinado pueden ser relevantes para el estado de la proteína H-NOX después del almacenamiento o uso. Si la proteína H-NOX no se une a NO, entonces el pico de Soret no cambiará cuando se añada NO. Si la proteína H-NOX se une a NO y forma un complejo de nitrosilo ferroso hexacoordinado, entonces su pico de Soret se desplazará a entre 420 nm y 424 nm cuando se

10 añada NO. Si la proteína H-NOX se une a NO y forma un complejo de nitrosilo ferroso pentacoordinado, el pico de Soret se desplazará a ~399 nm. Si se desea, la unión de O2 o NO puede alterarse adicionalmente combinando cualquiera de las mutaciones individuales o dobles enumeradas en la Tabla 11 o introduciendo una o más mutaciones adicionales en una proteína H-NOX, como se describe en el presente documento.

Tabla 11. Posiciones de picos de UV-visible para algunos complejos de Fe (II), Fe (III), Fe(II)-NO y Fe(II)-O2.

Complejo: Proteína Soret 1 a

Fe (II): Tt wt 430 563

Tt W9Y: 430 569

Tt N74A: 433 558

Tt N74H: 431 561

Tt N74A-Y140H: 430 567

Tt W9H: 431 563

Tt N74E: 433 559

Tt W9N: 431 569

Tt wt His6: 430 565

Complejo: Proteína Soret 1a a

Fe (III): Tt wt 413 550 585

Tt W9Y: 409 N.A.

Tt N74A: 416 554 586

Tt N74H: 408 N.A.

Tt N74A-Y140H: 407 N.A.

Tt W9H: 407 N.A.

Tt N74E: 408 N.A.

Tt W9N: 408 N.A.

Tt wt His6: 413 550 586

a”N.A.” indica bandas a y 1 no asignables debido a baja señal a longitudes de onda más largas.

Complejo: Proteína Soret 1 a

Fe(II) - NO: Tt wt 420 550 578

Tt W9Y: 420 552 576

Tt N74A: 421 572

Tt N74H: 424 562

Tt N74A-Y140H: 421 549 576

Tt W9H: 420 548 575

Tt N74E: 422 544 571

Tt W9N: 421 541 576

Tt wt His6: 420 547 576

Complejo: Proteína Soret 1 a

Fe(II)-O2: Tt wt 416 556 591

Tt W9Y: 416 555 590

Tt N74A: 418 553 589

(continuación)

Complejo: Proteína Soret 1 a

Tt N74H: 418 553 589

Tt N74A-Y140H: 414 555 584

Tt W9H: 418 556 589

Tt N74E: 417 555 587

Tt W9N: 416 588 553

Tt wt His6: 416 556 591

La Tabla 12 contiene velocidades de auto-oxidación para proteínas H-NOX de T. tengcongensis a modo de ejemplo. Si se desea, la velocidad de auto-oxidación puede alterarse adicionalmente combinando cualquiera de las mutaciones enumeradas en la Tabla 12 o introduciendo una o más mutaciones individuales en una proteína H-NOX, como se describe en el presente documento. La media de valores de 2 nm y 3 nm en la Tabla 12 se refieren a un desplazamiento en el pico de Soret de UV-Vis de 2 a 3 nm durante el periodo de tiempo de la observación; este cambio extremadamente pequeño puede ser debido a auto-oxidación.

Tabla 12. Velocidades de auto-oxidación para proteínas H-NOX de T. tengcongensis (Tt)

Proteína: Velocidad de auto-oxidación (25 ºC, h-1)a

Tt wt: Estable

Tt W9Y: Estable

Tt N74A: Estable

Tt N74H: Estable a 4 ºC, muy lenta a TA (2 nm)

Tt W9H: Estable

Tt N74E: Muy lenta a 4 ºC (2 nm), lenta a TA

Tt W9N: Estable a 4 ºC, muy lenta a TA (3 nm)

Tt wt His6: Estable

Tt I75F-His6: Estable

Tt L144F-His6: Estable

a“Estable” indica falta de oxidación del hemo después de al menos 24 horas. “TA” indica temperatura ambiente.

Ácidos nucleicos de H-NOX

10 En el presente documento también se describen ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las proteínas H-NOX mutantes descritas en el presente documento. Como se usa en el presente documento, un “ácido nucleico” se refiere a dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos en forma tanto mono como bicatenaria y, a menos que se limite de otro modo, engloba análogos conocidos de nucleótidos que se producen naturalmente que se hibridan con ácidos nucleicos de un modo similar a nucleótidos que se producen en la naturaleza. El ácido nucleico puede ser un

15 ácido nucleico recombinante. ”Ácido nucleico recombinante” significa un ácido nucleico de interés que está libre de uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, genes) que, en el genoma que se produce en la naturaleza del organismo del que se deriva el ácido nucleico de interés, flanquean el ácido nucleico de interés. Un ácido nucleico de H-NOX puede estar operativamente ligado a otro ácido nucleico que codifica toda o una parte de otra proteína de forma que el ácido nucleico recombinante codifique una proteína de fusión que incluye una proteína H-NOX (por ejemplo, un

20 dominio de H-NOX con o sin otro dominio de una proteína H-NOX) y toda o parte de otra proteína, tal como albúmina de suero humano. Por tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus autónomamente replicante, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADN, un fragmento de ADN genómico o un fragmento de ADNc producido por PCR o digestión con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias.

25 En el presente documento también se describen vectores con uno o más ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las proteínas H-NOX mutantes que se describen en el presente documento. Como se usa en el presente documento, un “vector” significa una construcción que puede administrar, y opcionalmente expresar, uno o más ácidos nucleicos de interés en una célula huésped. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores víricos, vectores de expresión de ADN o ARN, cósmidos y vectores de fago. El vector puede contener un

30 ácido nucleico bajo el control de una secuencia de control de la expresión. Una “secuencia de control de la expresión” significa una secuencia de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de un ácido nucleico de interés. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de la expresión puede estar operativamente ligada al segmento de ácido nucleico a transcribir.

El ácido nucleico puede incluir un segmento de o la secuencia de ácidos nucleicos entera de cualquiera de los ácidos nucleicos mostrados en FIGS. 2-4D o 8A-8DD. El ácido nucleico puede incluir al menos aproximadamente 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o más nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de H-NOX y contiene una o más mutaciones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mutaciones) en comparación con el ácido nucleico de H-NOX del que se derivó. Un ácido nucleico de H-NOX mutante puede contener menos de aproximadamente 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ó 2 mutaciones en comparación con el ácido nucleico de H-NOX del que se derivó.

En el presente documento también se describe una célula o población de células que contienen al menos un ácido nucleico que codifica una proteína H-NOX mutante descrita en el presente documento. Células a modo de ejemplo incluyen células de insecto, planta, levadura, bacterianas y de mamífero. Estas células son útiles para la producción de proteínas H-NOX mutantes usando procedimientos convencionales, tales como aquellos descritos en el presente documento.

Formulaciones de proteínas H-NOX

Cualquier proteína H-NOX natural o mutante descrita en el presente documento puede usarse para la formulación de composiciones farmacéuticas o no farmacéuticas. Como se ha tratado adicionalmente más adelante, estas formulaciones son útiles en una variedad de aplicaciones terapéuticas.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye una o más proteínas H-NOX naturales o mutantes (tal como cualquiera de las proteínas naturales o mutantes H-NOX descritas en el presente documento) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En diversas realizaciones, la proteína H-NOX es una proteína aislada o purificada. Por “vehículo farmacéuticamente aceptable” se indica cualquier material que, cuando se combina con un principio activo, permite que el componente retenga la actividad biológica y no provoque una respuesta inmunitaria inaceptable (por ejemplo, una alergia grave o choque anafiláctico) basándose en el conocimiento de un médico experto. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Diluyentes a modo de ejemplo para administración de aerosol o parenteral son solución salina tamponada con fosfato o solución salina normal (0,9 %). Las composiciones que comprenden tales vehículos se formulan por procedimientos convencionales muy conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20ª ed. Mack Publishing, 2000, particularmente con respecto a formulaciones).

Aunque puede emplearse cualquier vehículo adecuado conocido para aquellos expertos en la materia en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones pueden formularse para cualquier modo apropiado de administración que incluye, por ejemplo, administración intravenosa, intra-arterial, intravesicular, inhalación, intraperitoneal, intrapulmonar, intramuscular, subcutánea, intra-traqueal, transmucosa, intraocular, intratecal o transdérmica. Para administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo puede incluir, por ejemplo, agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para administración por vía oral puede emplearse cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa o carbonato de magnesio. También pueden usarse microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato, poliglicolato) como vehículos.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen un tampón (por ejemplo, solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato, etc.), un hidrato de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa, dextrano, etc.), un antioxidante, un agente quelante (por ejemplo, EDTA, glutatión, etc.), un conservante, otro compuesto útil para unir y/o transportar oxígeno, un principio inactivo (por ejemplo, un estabilizador, carga, etc.), o combinaciones de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, la composición se formula como un liofilizado. Las proteínas H-NOX también pueden encapsularse dentro de liposomas o nanopartículas usando tecnología muy conocida. Otras formulaciones a modo de ejemplo que pueden usarse para proteínas H-NOX se describen, por ejemplo, por las patentes de EE.UU. nº 6.974.795 y 6.432.918, particularmente con respecto a formulaciones de proteínas.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse como parte de una formulación de liberación sostenida (por ejemplo, una formulación tal como una cápsula o esponja que produce una lenta liberación del compuesto tras la administración). Tales formulaciones pueden prepararse generalmente usando tecnología muy conocida y administrarse, por ejemplo, por implantación oral, rectal o subcutánea, o por implantación en el sitio diana deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener una proteína H-NOX dispersada en una matriz de vehículo y/o contenida dentro de un depósito rodeado por una membrana controladora de la velocidad. Los vehículos para su uso dentro de tales formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables. En algunas realizaciones, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de proteína H-NOX. La cantidad de proteína H-NOX contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de la liberación, y la naturaleza de la afección que va a tratarse o prevenirse.

La composición farmacéutica contiene una cantidad eficaz de una proteína H-NOX natural o mutante. El término “cantidad eficaz” se refiere a tal cantidad de una o más proteínas descritas en el presente documento que en combinación con sus parámetros de eficacia y toxicidad deben ser eficaces en una forma terapéutica dada basándose en el conocimiento del especialista practicante. Como se entiende en la materia, una cantidad eficaz puede estar en una o más dosis. Como se entiende en el contexto clínico, una dosificación eficaz de una composición farmacéutica puede o puede no lograrse conjuntamente con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, una cantidad eficaz puede considerarse en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos, y un único agente puede considerarse que se administra en una cantidad eficaz si, conjuntamente con uno o varios de otros agentes, puede ser o se logra un resultado deseable o beneficioso.

Una dosis a modo de ejemplo de hemoglobina como sucedáneo de la sangre es de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 5 gramos o más de hemoglobina extracelular por kilogramo de peso corporal del paciente. Por tanto, en algunas realizaciones, una cantidad eficaz de una proteína H-NOX para administración a un ser humano está entre algunos gramos y más de aproximadamente 350 gramos. Otras dosis a modo de ejemplo de una proteína H-NOX incluyen aproximadamente cualquiera de 4,4, 5, 10 ó 13 G/DL (en la que G/DL es la concentración de la disolución de proteína H-NOX antes de infusión en la infusión) a una velocidad de infusión apropiada tal como aproximadamente 0,5 ml/min (véase, por ejemplo, Winslow, R. Capítulo 12 en Blood Substitutes). Se apreciará que el contenido unitario de principios activos contenidos en una dosis individual de cada forma de dosificación no necesita constituir por sí misma una cantidad eficaz ya que la cantidad eficaz necesaria podría alcanzarse por el efecto combinado de una pluralidad de administraciones. La selección de la cantidad de una proteína H-NOX para incluir en una composición farmacéutica depende de la forma de dosificación utilizada, la afección que está tratándose y el fin particular a lograr según la determinación del experto en la materia en el campo.

Composiciones a modo de ejemplo incluyen proteínas H-NOX recombinantes genéticamente manipuladas que pueden aislarse o purificarse, que comprenden una o más mutaciones que confieren en conjunto unión de ligando de O2 o NO alterada con respecto a la proteína H-NOX natural correspondiente, y operativas como un vehículo de gas en sangre de mamífero fisiológicamente compatible. Por ejemplo, proteínas H-NOX mutantes como se describen en el presente documento.

La invención también proporciona sucedáneos de la sangre que comprenden o consisten esencialmente en una o más proteínas H-NOX naturales o mutantes. En la técnica se conocen tampones adecuados y otros componentes para formular sucedáneos de la sangre.

Para reducir o prevenir una respuesta inmunitaria en sujetos humanos a los que se administra una composición farmacéutica pueden usarse proteínas H-NOX humanas (tanto proteínas humanas naturales como proteínas humanas en las que se han introducido una o más mutaciones) u otras proteínas H-NOX no antigénicas (por ejemplo, proteínas H-NOX de mamífero). Para reducir o eliminar la inmunogenicidad de proteínas H-NOX derivadas de fuentes distintas de seres humanos, los aminoácidos en una proteína H-NOX pueden mutarse a los aminoácidos correspondientes en una H-NOX humana. Por ejemplo, uno o más aminoácidos sobre la superficie de la estructura terciaria de una proteína H-NOX no humana pueden mutarse al aminoácido correspondiente en una proteína H-NOX humana.

Aplicaciones terapéuticas de las proteínas H-NOX

Cualquiera de las proteínas H-NOX naturales o mutantes (por ejemplo, proteínas H-NOX aisladas o purificadas) o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento puede usarse en aplicaciones terapéuticas. Pueden seleccionarse proteínas H-NOX particulares para tales aplicaciones basándose en la velocidad de asociación del O2 deseada, velocidad de disociación del O2, constante de disociación para la unión de O2, estabilidad del NO, reactividad del NO, velocidad de auto-oxidación, tiempo de retención en plasma, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores para la indicación particular que está tratándose. Las proteínas H-NOX pueden usarse para tratar enfermedad cardiovascular, enfermedad neurológica, hipoxia tumoral, pérdida de sangre

o heridas. Por ejemplo, una proteína H-NOX de unión de O2 puede usarse en la mayoría de las situaciones en las que actualmente se utilizan glóbulos rojos o expansores del plasma. Específicamente, la proteína H-NOX puede usarse como sucedáneos de glóbulos rojos para el tratamiento de traumatismo (por ejemplo, campo de batalla, alivio de desastres o accidentes), hemorragias, choque hemorrágico, cirugía (por ejemplo, cirugía de aneurisma abdominal, cirugía ortopédica tal como cirugía de atroplastia de cadera, o cualquier otra cirugía que produce alta pérdida de sangre), hemodilución, usos de ampliación de sangre (por ejemplo, auto-donación suplementaria), y cualquier otra situación en la que se pierde volumen de sangre o se reduce la capacidad de llevar O2. Ejemplos de aplicaciones de reparación de heridas incluyen cicatrización después de radiación (por ejemplo, efecto de oxígeno hiperbárico), reparación posquirúrgica, reparación de úlceras diabéticas y heridas por quemaduras.

También puede usarse una H-NOX de unión de oxígeno para aumentar temporalmente la administración de O2 durante o después de la pre-donación de sangre autóloga antes de la devolución de la sangre autóloga al individuo (tal como una sustitución de sangre que se extrae durante procedimientos quirúrgicos en los que la sangre del individuo se extrae y se guarda para reinfusión al final de la cirugía o durante la recuperación). En algunas realizaciones, las proteínas H-NOX también actúan de simples expansores del volumen que proporcionan presión oncótica debido a la presencia de la gran molécula de proteína H-NOX.

Debido a que la distribución en la vasculatura de proteínas H-NOX extracelulares no está limitada por el tamaño de los glóbulos rojos, las proteínas H-NOX de la presente invención pueden usarse para administrar O2 a áreas en las que no pueden penetrar los glóbulos rojos. Estas áreas pueden incluir cualquier área de tejido que se localice aguas abajo de obstrucciones al flujo de glóbulos rojos tales como áreas aguas abajo de uno o más trombos, oclusiones de células falciformes, oclusiones arteriales, oclusiones vasculares periféricas, globos de angioplastia, instrumentos quirúrgicos, tejidos que padecen privación de oxígeno o son hipóxicos, y similares. Adicionalmente, todos los tipos de isquemia de tejido pueden tratarse usando proteínas H-NOX. Tales isquemias de tejido incluyen, por ejemplo, isquemia perioperativa, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular emergente, ataques isquémicos transitorios, aturdimiento miocárdico e hibernación, angina aguda o inestable, angina emergente e infarto de miocardio (por ejemplo, infarto de miocardio por elevación del segmento ST). Otras indicaciones cardiovasculares a modo de ejemplo que pueden tratarse usando proteínas H-NOX incluyen cardioplejía y anemia de células falciformes. Indicaciones diana a modo de ejemplo incluyen afecciones de deficiencia de hemoglobina funcional tales como en las que se indica un sucedáneo de la sangre o vehículo de O2, que incluyen pérdida de sangre, hipoxia, etc.

Las proteínas H-NOX también pueden usarse como complemento con radiación o quimioterapia para el tratamiento de cáncer. En algunas realizaciones, una proteína H-NOX se usa como complemento de radioterapia en tumores sólidos (por ejemplo, individuos con malos pronósticos pre-metastásicos) o como complemento de terapia PDT en tumores superficiales (por ejemplo, cáncer de colon, pulmón o de piel, o cáncer en otra superficie o localización accesible). Las proteínas H-NOX pueden usarse para tratar anemia, proporcionándose capacidad portadora de oxígeno adicional en un paciente que padece anemia. Indicaciones neurológicas a modo de ejemplo incluyen accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral traumática y lesión de médula espinal. Los procedimientos y composiciones son aplicables tanto a situaciones agudas (que proporcionan el oxígeno rápido a tejidos o un sitio específico, por ejemplo, infarto agudo de miocardio, oxigenación de tejidos local o sistémica aguda, o transfusión de sangre) y crónicas (por ejemplo, recuperación pos-aguda de infarto cardíaco).

En diversas realizaciones, la invención caracteriza una composición farmacéutica para administrar O2 a un individuo (por ejemplo, un mamífero, tal como un primate (por ejemplo, un ser humano, un simio inferior, un gorila, un simio superior, un lémur, etc.), un bovino, un equino, un porcino, un canino o un felino) administrando a un individuo en necesidad del mismo una proteína H-NOX natural o mutante en una cantidad suficiente para administrar O2 al individuo. En algunas realizaciones, la invención proporciona procedimientos de llevar o administrar gas en sangre a un individuo tal como un mamífero, que comprende la etapa de administrar (por ejemplo, transfundir, etc.) a la sangre del individuo (por ejemplo, un mamífero) una o más de composiciones de H-NOX. Los procedimientos para administrar vehículos de O2 a sangre o tejidos (por ejemplo, sangre o tejidos de mamífero) se conocen en la técnica. En diversas realizaciones, la proteína H-NOX es una apoproteína que puede unirse a hemo o es una holoproteína con hemo unido. La proteína H-NOX puede o puede no tener hemo unido antes de la administración de la proteína H-NOX al individuo. En algunas realizaciones, el O2 está unido a la proteína H-NOX antes de que se administre al individuo. En otras realizaciones, el O2 no está unido a la proteína H-NOX antes de la administración de la proteína al individuo y la proteína H-NOX transporta O2 de una localización en el individuo a otra localización en el individuo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse para tratar cualquier individuo. Para su uso en el presente documento, a menos que se indique claramente de otro modo, “un individuo” como se usa en el presente documento se refiere a un mamífero que incluye, pero no se limita a, un primate (por ejemplo, un ser humano, simio inferior, gorila, simio superior, lémur, etc.), un bovino, un equino, un porcino, un canino y un felino. Por tanto, la invención se usa tanto en el contexto de medicina humana con de veterinaria, que incluye uso en animales agrícolas y mascotas domésticas. El individuo puede haber sido diagnosticado con, ser sospechoso de tener o estar en riesgo de desarrollar una indicación, tal como una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia (por ejemplo, hipoxia tumoral), una pérdida de sangre o una herida. El individuo puede presentar uno o más síntomas asociados a la indicación. El individuo puede estar genéticamente o de otro modo predispuesto a desarrollar una afección tal.

Como se usa en el presente documento, “en necesidad del mismo” incluye individuos que tienen una afección o enfermedad (tal como una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia tal como hipoxia tumoral, una pérdida de sangre o una herida) o están “en riesgo” de la afección o enfermedad. Como se usa en el presente documento, un individuo “en riesgo” es un individuo que está en riesgo de desarrollo de una afección, tal como una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia (por ejemplo, hipoxia tumoral), una pérdida de sangre o una herida. Un individuo “en riesgo” puede o puede no tener una enfermedad o afección detectable, y puede o puede no tener enfermedad detectable mostrada antes de los procedimientos de tratamiento descritos en el presente documento. “En riesgo” indica que un individuo tiene uno o más de los llamados factores de riesgo, que son parámetros medibles que establecen una correlación con el desarrollo de una enfermedad o afección y se conocen en la técnica. Un individuo que tiene uno o más de estos factores de riesgo tiene una mayor probabilidad de desarrollar la enfermedad o afección que un individuo sin este (estos) factor(es) de riesgo. Estos factores de riesgo incluyen, pero no se limitan a, edad, sexo, raza, dieta, historia de enfermedad previa, presencia de enfermedad precursora, consideraciones genéticas (es decir, hereditarias) y exposición medioambiental. La cirugía, presencia en o próxima a zona militar o de guerra, o condiciones que predisponen a un individuo a pérdida de sangre (tal como hemofilia) son factores de riesgo a modo de ejemplo para la pérdida de sangre.

Estas composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratar o retrasar cualquier afección para la que la administración de O2 es beneficiosa. Por “tratamiento” o “tratar” se indica un enfoque para obtener un resultado beneficioso o deseado, que incluye resultados clínicos. Para los fines de la presente invención, resultados beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas asociados a una afección (tal como, pero no se limita a, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia tal como hipoxia tumoral, una pérdida de sangre o una herida), reducción del grado de los síntomas asociados a una afección, o prevención de un empeoramiento de los síntomas asociados a una afección. En algunas realizaciones, el tratamiento con una o más proteínas desveladas en el presente documento va acompañado por ninguno o menos efectos secundarios que están asociados a las terapias actualmente disponibles.

Como se usa en el presente documento, “retrasar” el desarrollo de una enfermedad o afección significa aplazar, impedir, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad o afección, tal como una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia (por ejemplo, hipoxia tumoral), una pérdida de sangre o una herida. Este retraso puede ser de duraciones de tiempo variables, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o individuo que está tratándose. Como es evidente para un experto en la materia, un retraso suficiente

o significativo puede, en efecto, englobar prevención, en el que el individuo no desarrolla la enfermedad o afección. Por ejemplo, el procedimiento puede reducir la probabilidad de desarrollo de enfermedad en un periodo de tiempo dado y/o reducir el grado de la enfermedad en un periodo de tiempo dado, cuando se compara con no usar el procedimiento. En algunas realizaciones, tales comparaciones se basan en estudios clínicos usando un número estadísticamente significativo de sujetos. El desarrollo de enfermedad puede ser detectable usando técnicas clínicas convencionales. El desarrollo también puede referirse a progresión de la enfermedad que puede ser inicialmente indetectable e incluye manifestación, reaparición y aparición.

Se espera que las proteínas H-NOX naturales y mutantes con una KD relativamente baja para O2 (tal como inferior a aproximadamente 80 nM o inferior a aproximadamente 50 nM) sean particularmente útiles para tratar tejidos con baja tensión del oxígeno (tal como tumores, algunas heridas u otras áreas en las que la tensión del oxígeno es muy baja, tal como una p50 inferior a 1 mm de Hg). La alta afinidad de tales proteínas H-NOX por O2 puede aumentar la duración de tiempo que el O2 permanece unido a la proteína H-NOX, reduciéndose así la cantidad de O2 que es liberada antes de que la proteína H-NOX alcance el tejido que va a tratarse.

Aunque no se pretende quedar ligado a teoría alguna particular, la utilidad de un sucedáneo de glóbulos rojos sin células como líquido de reanimación se cree que está influido por la p50 del vehículo de O2. Por ejemplo, un vehículo de O2 basado en hemoglobina PEGilada llamado MP4 parece administrar O2 más eficazmente a la microvasculatura que algunos vehículos de O2 basados en hemoglobina de menor afinidad. Se informa que MP4 tiene una p50 de ~ 5 mm de Hg, (quizás KD 100 a 200 nm), y la p50 de la hemoglobina sin estroma es 14 mm de Hg (KD ~400 nm). Como MP4 puede administrar oxígeno en tejidos (PO2 ~ 5 a 10 mm de Hg), es probable que la afinidad de O2 apropiada por vehículos para administrar O2 a tejido hipóxicos sea inferior a aproximadamente 5 mm de Hg, y quizás inferior a aproximadamente 2 mm de Hg, que se corresponde aproximadamente con una KD inferior a aproximadamente 80 nm. Estos valores indican que MP4 ha sido manipulado con una mayor afinidad de O2 (inferior a p50) que la hemoglobina nativa. Desde una perspectiva del equilibrio, esto sugiere que las proteínas de unión de O2 de alta afinidad pueden ser más satisfactorias en la administración de O2 a áreas de baja tensión de O2, tales como la vasculatura periférica.

En algunas realizaciones para la administración directa de una proteína H-NOX con O2 unido a un sitio particular en el cuerpo (tal como un tejido, órgano, herida o tumor), la kdis para O2 es más importante que el valor de kD debido a que el O2 ya está unido a la proteína (haciendo que la kas sea menos importante) y se necesite liberar oxígeno en o próximo a un sitio particular en el cuerpo (a una velocidad influida por la kdis). En algunas realizaciones, la kdis también puede ser importante cuando las proteínas H-NOX están en presencia de glóbulos rojos en la circulación, en la que facilitan la difusión de O2 de glóbulos rojos, y quizás prolonguen la capacidad de glóbulos rojos diluidos de transportar O2 a otros puntos en la vasculatura.

En algunas realizaciones para la administración de una proteína H-NOX que circula en la circulación sanguínea de un individuo, la proteína H-NOX se une a O2 en los pulmones y libera O2 en uno o varios de otros sitios en el cuerpo. Para algunas de estas aplicaciones, el valor de kD es más importante que la kdis ya que la unión de O2 está en o próxima al equilibrio. En algunas realizaciones para hemodilución extrema, la kD es más importante que la kdis cuando la proteína H-NOX es el vehículo de O2 primario debido a que la proteína H-NOX se unirá y liberará O2 continuamente a medida que se desplaza a través de la circulación. Como la hemoglobina tiene una p50 de 14 mm de Hg, los glóbulos rojos (que actúan de capacitores) tienen una p50 de ~30 mm de Hg, y los HBOC se han desarrollado con intervalos entre 5 mm de Hg y 90 mm de Hg, el intervalo de KD óptimo para proteínas H-NOX puede estar por tanto entre ~2 mm de Hg y ~100 mm de Hg para algunas aplicaciones.

También puede usarse proteínas H-NOX para la obtención de imágenes. En particular, la obtención de imágenes de luz (por ejemplo, tomografía de coherencia óptica; véase, por ejemplo, Villard, J. W. (2002). “Use of a Blood Substitute to Determine Instantaneous Murine Right Ventricular Thickening with Optical Coherence Tomography”, Circulation 105:1843-1849, particularmente con respecto a tomografía de coherencia óptica) es complicada por los eritrocitos. La perfusión con una disolución de H-NOX permite imágenes más claras de la circulación y paredes de vasos debido a que la proteína H-NOX es mucho más pequeña que los eritrocitos.

Las proteínas H-NOX y composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse a un individuo por cualquier medio convencional tal como por administración oral, tópica, intraocular, intratecal, intrapulmonar, intratraqueal o aerosol; por adsorción de membrana transdérmica o mucosa; o mediante inyección (por ejemplo, inyección subcutánea, intravenosa, intra-arterial, intravesicular o intramuscular). Las proteínas H-NOX también pueden incluirse en disoluciones parenterales de gran volumen para su uso como sucedáneos de la sangre. En realizaciones a modo de ejemplo, la proteína H-NOX se administra a la sangre (por ejemplo, administración a un vaso sanguíneo tal como una vena, arteria o capilar), una herida, un tumor, un tejido hipóxico o un órgano hipóxico del individuo.

En algunas realizaciones se usa una formulación de liberación continua sostenida de la composición. La administración de una proteína H-NOX puede producirse, por ejemplo, durante un periodo de segundos a horas dependiendo del fin de la administración. Por ejemplo, como vehículo de administración a la sangre, un transcurso de tiempo de administración a modo de ejemplo es tan rápido como sea posible. Otros transcursos de tiempo a modo de ejemplo incluyen aproximadamente cualquiera de 10, 20, 30, 40, 60, 90 ó 120 minutos. Velocidades de infusión a modo de ejemplo para disoluciones de H-NOX como sustitución de sangre son de aproximadamente 30 ml/hora a aproximadamente 13.260 ml/hora, tal como aproximadamente 100 ml/hora a aproximadamente 3.000 ml/hora. Una dosis total a modo de ejemplo de proteína H-NOX es aproximadamente 900 mg/kg administrada durante 20 minutos a 13.260 ml/hora. Una dosis total a modo de ejemplo de proteína H-NOX para un cerdo es aproximadamente 18,9 gramos.

Frecuencias de dosificación a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 veces (es decir, diariamente) a la semana. En algunas realizaciones, una proteína H-NOX se administra al menos 2, 3, 4 ó 6 veces al día. La proteína H-NOX puede administrarse, por ejemplo, durante un periodo de algunos días o semanas. En algunas realizaciones, la proteína H-NOX se administra durante un periodo prolongado, tal como algunos meses

o años. La frecuencia de dosificación de la composición puede ajustarse durante el transcurso del tratamiento basándose en la opinión del médico que administra.

Como se observa anteriormente, la selección de cantidades de dosificación para proteínas H-NOX depende de la forma de dosificación utilizada, la frecuencia y número de administraciones, la afección que está tratándose y el fin particular a lograr según la determinación del experto en la materia en el campo. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de una proteína H-NOX para administración a ser humano está entre algunos gramos a más de 350 gramos.

En algunas realizaciones, dos o más proteínas H-NOX diferentes se administran simultáneamente, secuencialmente

o concurrentemente. En algunas realizaciones, otro compuesto o terapia útil para la administración de O2 se administra simultáneamente, secuencialmente o concurrentemente con la administración de una o más proteínas H-NOX.

Otras aplicaciones terapéuticas a modo de ejemplo para las que pueden usarse proteínas H-NOX se describen, por ejemplo, por las patentes de EE.UU. nº 6.974.795 y 6.432.918, particularmente con respecto a aplicaciones terapéuticas para vehículos de O2.

Procedimientos a modo de ejemplo para la producción de proteínas H-NOX

En el presente documento también se describen procedimientos para la producción de cualquiera de las proteínas H-NOX mutantes descritas en el presente documento. El procedimiento puede implicar cultivar una célula que tiene un ácido nucleico que codifica una proteína H-NOX mutante en condiciones adecuadas para la producción de la proteína H-NOX mutante. La H-NOX mutante puede purificarse (tal como purificación de la proteína H-NOX de las células o el medio de cultivo).

Como se observa anteriormente, las secuencias de varias proteínas H-NOX naturales y ácidos nucleicos son conocidas y pueden usarse para generar proteínas H-NOX mutantes y ácidos nucleicos de la presente invención. Técnicas para la mutación, expresión y purificación de proteínas H-NOX recombinantes se han descrito por, por ejemplo, Boon, E.M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1:53-59, y Karow, D. S. y col. (10 de agosto de 2004). “Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis”, Biochemistry 43(31):10203-10211, particularmente con respecto a la mutación, expresión y purificación de proteínas H-NOX recombinantes. Estas técnicas u otras técnicas convencionales pueden usarse para generar cualquier proteína H-NOX mutante.

En particular, las proteínas H-NOX mutantes descritas en el presente documento pueden generarse por varios procedimientos que se conocen en la técnica. La mutación puede producirse en tanto al nivel de aminoácidos por modificación química de un aminoácido como al nivel de codones por alteración de la secuencia de nucleótidos que codifica un aminoácido dado. La sustitución de un aminoácido en cualquier posición dada en una proteína puede lograrse alterando el codón que codifica ese aminoácido. Esto puede llevarse a cabo por mutagénesis dirigida a sitio usando, por ejemplo: (i) la técnica de Amersham (kit de mutagénesis de Amersham, Amersham, Inc., Cleveland, Ohio) basado en los procedimientos de Taylor, J.W. y col. (20 de diciembre de 1985). “The Use of Phosphorothioate- Modified DNA in Restriction Enzyme Reactions to Prepare Nicked DNA”, Nucleic Acids Res. 13(24):8749-8764; Taylor, J.W. y col. (20 de diciembre de 1985). “The Rapid Generation of Oligonucleotide-Directed Mutations at High Frequency Using Phosphorothioate-Modified DNA”, Nucleic Acids Res. 13(24):8765-8785; Nakamaye, K. L. y col. (22 de diciembre de 1986). “Inhibition of Restriction Endonuclease Nci I Cleavage by Phosphorothioate Groups and its Application to Oligonucleotide-Directed Mutagenesis”, Nucleic Acids Res, 14(24):9679-9698; y Dente y col. (1985). En DNA Cloning, Glover, Ed., IRL Press, páginas 791-802, (ii) el kit de Promega (Promega Inc., Madison, Wis.), o (iii) el kit de Biorad (Biorad Inc., Richmond, Calif.), basado en los procedimientos de Kunkel, T. A. (enero de 1985). “Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(2):488492; Kunkel, T. A. (1987). “Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection”, Methods Enzymol. 154:367-382; Kunkel, patente de EE.UU. nº 4.873.192, particularmente con respecto a la mutagénesis de proteínas. La mutagénesis también puede llevarse a cabo por otros medios comercialmente disponibles o no comerciales, tales como aquellos que utilizan mutagénesis dirigida a sitio con oligonucleótidos mutantes.

La mutagénesis dirigida a sitio también puede llevarse a cabo usando mutagénesis basada en PCR tal como la descrita en Zhengbin y col. (1992), páginas 205-207, en PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York; Jones, D. H. y col. (febrero de 1990). “A Rapid Method For Site-Specific Mutagenesis And Directional Subcloning by Using the Polymerase Chain Reaction to Generate Recombinant Circles”, Biotechniques 8(2):178-183; Jones, D. H. y col. (enero de 1991). “A Rapid Method For Recombination And-Site-Specific Mutagenesis by Placing Homologous Ends on DNA Using Polymerase Chain Reaction”, Biotechniques 10(1):62-66, particularmente con respecto a la mutagénesis de proteínas. La mutagénesis dirigida a sitio también puede llevarse a cabo usando mutagénesis en casete con técnicas que son conocidas para aquellos expertos en la materia.

Un ácido nucleico de H-NOX mutante puede incorporarse en un vector, tal como un vector de expresión, usando técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden usarse enzimas de restricción para escindir el ácido nucleico de H-NOX mutante y el vector. Luego pueden ligarse los extremos compatibles del ácido nucleico de H-NOX mutante escindido y el vector escindido. El vector resultante puede insertarse en una célula (por ejemplo, una célula de insecto, una célula de planta, una célula de levadura o una célula bacteriana) usando técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación) para la expresión de la proteína H-NOX codificada.

En particular, proteínas heterólogas se han expresado en varios sistemas de expresión biológicos tales como células de insecto, células vegetales, células de levadura y células bacterianas. Por tanto, puede utilizarse cualquier sistema de expresión de proteínas biológicas adecuadas para producir grandes cantidades de proteína H-NOX recombinante. La proteína H-NOX (por ejemplo, una proteína H-NOX mutante o natural) puede ser una proteína aislada. Como se usa en el presente documento, una “proteína aislada” significa una proteína separada de uno o más componentes con los que la proteína está naturalmente asociada en la naturaleza que incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos, lípidos y otras proteínas. Una proteína aislada tampoco se produce en una biblioteca de proteínas, tal como una biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 o más proteínas diferentes. Una proteína aislada puede obtenerse, por ejemplo, por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica la proteína o por síntesis química de la proteína.

Si se desea, las proteínas H-NOX pueden purificarse usando técnicas convencionales. Como se usa en el presente documento, una “proteína purificada” significa una proteína (por ejemplo, una proteína H-NOX mutante o natural) que ha sido separada de uno o más componentes que están presentes cuando la proteína se produce. La proteína puede tener al menos aproximadamente el 60 %, en peso, libre de otros componentes que están presentes cuando la proteína se produce. La proteína puede tener al menos aproximadamente el 75 %, 90 % o el 99 % en peso de pureza. Una proteína purificada puede obtenerse, por ejemplo, por purificación (por ejemplo, extracción) de una fuente natural, un sistema de expresión recombinante o una mezcla de reacción para síntesis química. Procedimientos de purificación a modo de ejemplo incluyen inmunoprecipitación, cromatografía en columna tal como cromatografía de inmunoafinidad, purificación por inmunoafinidad de perlas magnéticas e inmunopurificación con un anticuerpo unido a placa, además de otras técnicas conocidas para el experto. La pureza puede ensayarse por cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, por cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis de HPLC. La proteína purificada puede incorporarse en una composición farmacéutica de la invención. La composición farmacéutica de la invención puede tener aditivos, vehículos u otros componentes, además de la proteína purificada.

Ejemplos

También describen ejemplos, que pretenden ser puramente a modo de ejemplo de la invención y, por tanto, no deben considerarse que limitan la invención de ningún modo, y detallan aspectos y realizaciones de la invención tratados anteriormente. Los ejemplos no pretenden representar que los experimentos más adelante sean todos o los únicos experimentos realizados. A menos que se indique lo contrario, la temperatura es en grados centígrados y la presión es atmosférica o próxima a atmosférica.

Ejemplo 1: Producción de proteínas H-NOX naturales y mutantes

Se produjeron, expresaron y purificaron proteínas H-NOX naturales y mutantes usando procedimientos convencionales, esencialmente como se describe por Boon, E.M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1:53-59 y Karow, D. S. y col. (10 de agosto de 2004). “Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis”, Biochemistry 43(31):10203-10211, particularmente con respecto a la mutagénesis, expresión y purificación de proteínas H-NOX. La mutagénesis se realizó usando el protocolo QuickChange® de Strategene (La Jolla, CA). La expresión de las proteínas en cultivo celular y posterior purificación de las proteínas se realizó como se describe por Karow, D. S. y col. (10 de agosto de 2004). “Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis”, Biochemistry 43(31):10203-10211.

Ejemplo 2: Caracterización de proteínas H-NOX mutantes como vehículos de administración de oxígeno

KD cinética: Relación de kdis con respecto a kas

El valor de KD cinética se determinó para proteínas H-NOX naturales y mutantes esencialmente como se describe por Boon, E.M. y col. (2005). “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1:53-59, particularmente con respecto a la medición de las velocidades de asociación del O2, velocidades de disociación del O2, constantes de disociación para la unión de O2, velocidades de auto-oxidación y velocidades de disociación del NO.

kas (velocidad de asociación del O2)

La asociación de O2 al hemo se midió usando fotólisis de destello a 20 ºC. No fue posible evaporar el complejo de FeII-O2 como resultado de la muy rápida cinética de recombinación geminada; por tanto, el complejo de FeII-CO se sometió a fotólisis de destello con luz de láser a 560 nm (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA), produciendo el producto intermedio de FeII pentacoordinado, a lo que le siguió la unión de O2 molecular a diversas longitudes de onda. Se prepararon muestras de proteína por reducción anaerobia con ditionito 10 mM, seguido de desalación sobre una columna PD-10 (Millipore, Inc., Billerica, MA). Entonces, las muestras se diluyeron a hemo 20 µM en TEA 50 mM, NaCl 50 mM, tampón a pH 7,5, en una cubeta de cuarzo de atmósfera controlada, con un tamaño de 100 µl a 1 ml y una longitud de trayectoria de 1 cm. El gas CO se circuló sobre el espacio de cabeza de esta cubeta durante 10 minutos para formar el complejo de FeII-CO, formación que se verificó por espectroscopía UV-visible (máximo de Soret 423 nm). Entonces, esta muestra se usó tanto para medir la cinética de re-enlace de CO después de la fotólisis de destello mientras que estaba bajo 1 atmósfera de gas CO, como se abrió y se agitó en aire durante 30 minutos para oxigenar completamente el tampón antes de que la fotólisis de destello observara eventos de re-enlace de CO. La asociación del O2 al hemo se monitorizó a múltiples longitudes de onda frente al tiempo. Estas trazas se ajustaron con una exponencial simple usando el software Igor Pro (Wavemetrics, Inc., Oswego, OR; última versión de 2005). Esta velocidad fue independiente de la longitud de onda de observación, pero dependiente de la concentración de O2. Durante todo el transcurso se usó espectroscopía de UV-visible para confirmar todos los complejos y productos intermedios (Cary 3K, Varian, Inc. Palo Alto, CA). Los datos de absorción transitoria se recogieron usando instrumentos descritos en Dmochowski, I. J. y col. (31 de agosto de 2000). “Enantiomeric Discrimination of Ru-Substrates by Cytochrome P450cam”, J Inorg Biochem. 81(3):221-228, particularmente con respecto a la instrumentación. El instrumento tiene un tiempo de respuesta de 20 ns, y los datos se digitalizan a 200 megamuestras s-1.

kdis (velocidad de disociación del O2)

Para medir la kdis, los complejos de FeII-O2 de proteína (hemo 5 µM), diluidos en TEA 50 mM anaerobio, NaCl 50 mM, tampón a pH 7,5, se mezclaron rápidamente con un volumen igual del mismo tampón (anaerobio) que contenía diversas concentraciones de ditionito y/o gas CO saturante. Los datos se adquirieron en un espectrofotómetro de flujo interrumpido HI-TECH Scientific SF-61 con un baño de temperatura constante Neslab RTE-100 fijado a 20 ºC (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, Reino Unido). La disociación del O2 del hemo se monitorizó como un aumento en la absorbancia a 437 nm, un máximo en el espectro de diferencia de FeII - FeII-O2, o 425 nm, un máximo en el espectro de diferencia de FeII - FeII-CO. Las trazas finales se ajustaron a una exponencial simple usando el software que es parte del instrumento. Cada experimento se hizo un mínimo de seis veces, y las velocidades resultantes se promediaron. Las velocidades de disociación medidas son independientes de la concentración de ditionito (se probaron ditionito 100, 50, 25, 10, 5 y 2,5 mM) e independiente de CO saturante como trampa para las especies reducidas, tanto con como sin ditionito 10 mM presente.

KD cinética

La KD cinética se determina calculando la relación de kdis con respecto a kas usando las mediciones de kdis y kas descritas anteriormente.

KD calculada

Para medir la KD calculada se representaron los valores para la kdis y la KD cinética que se obtuvieron como se ha descrito anteriormente. Se definió una relación lineal entre kdis y KD cinética por la ecuación (y=mx+b). Entonces, los valores de kdis se interpolaron a lo largo de la línea para derivar la KD calculada usando Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA). En ausencia de una kas medida, esta interpolación proporciona una forma para relacionar kdis con KD.

Velocidad de auto-oxidación

Para medir la velocidad de auto-oxidación, las muestras de proteína se redujeron anaerobiamente, luego se diluyeron a hemo 5 µM en TEA 50 mM aerobio, NaCl 50 mM, tampón a pH 7,5. Estas muestras se incubaron luego en un espectrofotómetro Cary 3E equipado con un baño de temperatura constante Neslab RTE-100 fijado a 37 ºC y se barrieron periódicamente (Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA). La velocidad de auto-oxidación se determinó a partir de la diferencia entre el máximo y el mínimo en el espectro de diferencia de FeIII - FeII representado frente al tiempo y se ajustó con una exponencial simple usando Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA).

Velocidad de reacción con NO

La reactividad del NO se midió usando proteínas purificadas (Tt WT HNOX, Tt Y140H HNOX y hemoglobina de Homo sapiens (Hs Hb)) preparada a 2 µM en tampón A y NO preparado a 200 µM en tampón A (tampón A: Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM). Los datos se adquirieron en un espectrofotómetro de flujo interrumpido HI-TECH Scientific SF-61 equipado con un baño de temperatura constante Neslab RTE-100 fijado a 20 ºC (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, Reino Unido). La proteína se mezcló rápidamente con NO en una relación 1:1 con un tiempo de integración de 0,00125 s. Las longitudes de onda del cambio máximo se ajustaron a una exponencial simple usando el software que es parte del espectrómetro, esencialmente midiendo la etapa limitante de la velocidad de la oxidación por NO. Los productos finales de la reacción fueron NO férrico para las proteínas H-NOX y acuo férrico para Hs Hb.

Mediciones de p50

Si se desea, el valor de p50 para las proteínas H-NOX mutantes o naturales puede medirse como se describe por Guarnone, R. y col. (septiembre/octubre de 1995). “Performance Characteristics of Hemox-Analyzer For Assessment of The Hemoglobin Dissociation Curve”, Haematologica 80(5):426-430, que se incorpora por este documento por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a la medición de valores de p50. El valor de p50 valor se determina usando un analizador HemOx. La cámara de medición empieza al 0 % de oxígeno y se eleva lentamente, incrementalmente, hacia el 100 % de oxígeno. Una sonda de oxígeno en la cámara mide el % de saturación de oxígeno. Una segunda sonda (luz UV-Vis) mide dos longitudes de onda de absorción, ajustadas a los picos alfa y beta de los espectros de UV-Vis de la hemoproteína (por ejemplo, una proteína tal como H-NOX complejada con hemo). Estos picos de absorción aumentan linealmente a medida que la hemoproteína se une oxígeno. Entonces se representa el cambio en porcentaje de sin unir al 100 % unido contra los valores de % de oxígeno para generar una curva. La p50 es el punto en la curva en el que el 50 % de la hemoproteína está unida a oxígeno.

Específicamente, el analizador Hemox (TCS Scientific Corporation, New Hope, PA) determina la curva de disociación de oxihemoproteína (ODC) exponiendo 50 µl de sangre o hemoproteína a una presión parcial creciente de oxígeno y desoxigenándola con gas nitrógeno. Un electrodo de oxígeno Clark detecta el cambio en la tensión del oxígeno, que se registra en el eje x de un registrador x-y. El aumento resultante en la fracción de oxihemoproteína se monitoriza simultáneamente por espectrofotometría de longitud de onda dual a 560 nm y 576 nm y se muestra sobre el eje y. Se toman muestras de sangre de la vena antemedia, se anticoagula con heparina y se mantiene a 4 ºC sobre hielo húmedo hasta el ensayo. Cincuenta µl de sangre completa se diluyen en 5 µl de disolución Hemox, un tampón proporcionado por el fabricante que mantiene el pH de la disolución a un valor de 7,4 ± 0,01. El tampón de muestra se extrae en una cubeta que es parte del analizador Hemox y la temperatura de la mezcla se equilibra y se lleva a 37 ºC; entonces la muestra se oxigena al 100 % con aire. Después de ajustar el valor de pO2, la muestra se desoxigena con nitrógeno; durante el procedimiento de desoxigenación la curva se registra en un papel cuadriculado. El valor de p50 se extrapola en el eje x como el punto al que la saturación de O2 es el 50 % usando el software que es parte del analizador Hemox. El tiempo requerido para un registro completo es aproximadamente 30 minutos.

Los valores de p50 para cualquiera de las proteínas H-NOX pueden compararse con los de la hemoglobina como indicación de la afinidad relativa de la proteína H-NOX por el O2 en comparación con la de la hemoglobina. La Tabla 13 enumera previamente valores de p50 informados para hemoglobina.

Tabla 13. Variantes de hemoglobina y sus afinidades de oxígeno informadas

Nombre: Modificación KD (nM) p50 (mm de Hg) Referencia/fabricante

Hemoglobina (sin estromas): ~400 14

Hemoglobina (RBC): 27

Hemopure (HBOC-201): Bovina polimerizada 36 Biopure

Oxiglobina (HBOC-301: Bovina polimerizada 54 Biopure

Hemospan (MP4): Maleimida-PEG 5 Sangart

Polyheme: Piridoxal 28-30 Northfield Labs

Hemolink: O-rafinosa 40 Hemosol

Hemassist: Diaspirina 32 Baxter

Mediciones de la viscosidad

Si se desea, la viscosidad de las disoluciones de H-NOX puede medirse usando un reómetro de cono/plato (modelo DV-III, Brookfield; Middleboro, MA) con el husillo del cono CPE-40 a una velocidad de cizallamiento de 200/s.

5 Disoluciones con viscosidades entre 1 y 4 centipoise (cP) administradas en experimentos de administración de oxígeno por hemodilución se informan como seguras (Winslow, R. M. y col. (octubre de 2004). “Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat”, J Appl Physiol. 97(4):1527-1534, las patentes de EE.UU. nº 6.974.795 y 6.432.918, particularmente con respecto a la medición de viscosidad). Por consiguiente, en algunas realizaciones, la viscosidad de la disolución de proteína H-NOX está entre 1 y 4 cP.

10 Mediciones de la presión oncótica coloide

Si se desea, la presión oncótica coloide puede medirse usando un osmómetro coloide según las instrucciones del fabricante (modelo 4420, Wescor; Logan, UT). Procedimientos a modo de ejemplo para medir la presión oncótica coloide se describen en Vandegriff, K. D. y col. (noviembre de 1997). “Colloid Osmotic Properties of modified Hemoglobins: Chemically Cross-Linked Versus Polyethylene Glycol Surface-Conjugated”, Biophys. Chem. 69(1):2315 30, en la malla mundial en “anaesthesiamcq.com/FluidBook/fl2_4.php”; las patentes de EE.UU. nº 6.974.795 y 6.432.918, particularmente con respecto a medir la presión oncótica coloide. Disoluciones con la presión oncótica coloide entre 20 y 50 mm de Hg administradas en experimentos de administración de oxígeno por hemodilución se informan como seguras (Winslow, R. M. y col. (octubre de 2004). “Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat”, J Appl Physiol. 97(4):1527-1534). Por consiguiente, en algunas

20 realizaciones, la presión oncótica coloide de la disolución de proteína H-NOX está entre 20 y 50 mm de Hg.

Ejemplo 3: Modelo de cirugía para mutantes de H-NOX de vehículos de O2: Comparación de un panel de mutantes de H-NOX de vehículos de O2 y H-NOX en hemodilución extrema en la rata.

Para evaluar la capacidad de mutantes de H-NOX para transportar O2 en un modelo de cirugía puede realizarse una adaptación de un protocolo establecido (Winslow, R. M. y col. (octubre de 2004). “Comparison of PEG-Modified

25 Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat”, J Appl Physiol. 97(4):1527-1534, particularmente con respecto a modelos de cirugía) usando transfusión de intercambio continuo en la rata.

Ratas Sprague-Dawley macho aclimatadas se anestesian por inyección intramuscular de una mezcla para roedor que contiene una mezcla de ketamina (40 mg/kg), acepromazina (0,75 mg/kg) y xilazina (3 mg/kg). Catéteres hechos de tubo de polietileno (PE-50 y PE-10 de Clay Adams) se implantan en ambas arterias femorales y una vena 30 femoral. Los catéteres se externalizan en la base de la cola y se cubren por una vaina para la cola para protección y futuro acceso. Después del cierre de las heridas quirúrgicas, los animales se devuelven a sus jaulas y se deja que se despierten y se recuperen durante 24 h antes del inicio del experimento. A los animales se les da libre acceso a alimento y agua durante la recuperación. Para las medidas hemodinámicas, el catéter de la arteria femoral se conecta mediante una llave de paso y una aguja de calibre 23 a un transductor de presión, y la tensión arterial se

35 muestrea continuamente a 100 Hz.

El pH arterial, PCO2 y PO2 se miden en un analizar de gas en sangre modelo 248 de Bayer usando muestras de sangre heparinizadas de 100 µl. Se mide ácido láctico en sangre de la arteria femoral usando un analizador de lactato de YSI (Yellow Springs Institute, Yellow Springs, OH). El CO2 total, bicarbonato convencional (HCO) y exceso de base (EB) se calculan a partir de PCO2, pH y la concentración de Hb.

40 Animales completamente conscientes (n = 5 para cada grupo de tratamiento) se colocan en jaulas de plexiglas. Las cánulas arteriales y venosas se lavan con 200 y 100 µl, respectivamente, de solución salina heparinizada (100 U/ml). Los catéteres arteriales y venosos se conectan a una bomba de infusión (Labconco modelo 4262000, Kansas City, MO), y la transfusión por intercambio se lleva a cabo a una velocidad de 0,5 ml/min durante 100 minutos. Por tanto, el volumen total de disolución intercambiada es 50 ml o 2,5 volúmenes de sangre. La bomba peristáltica se opera de forma que la sangre se extraiga a exactamente la misma velocidad a la que se infunde el material de prueba. Las disoluciones de prueba se calientan a 37 ºC en un baño de agua antes de la infusión y se mantienen calientes durante la infusión por una almohadilla calentadora. Al final del periodo de intercambio de 100 minutos, los animales que sobreviven se monitorizan durante 70 minutos adicionales antes de la eutanasia. Se toman muestras de sangre (0,3 ml) cada 10 minutos para análisis hematológicos y de gas en sangre.

Los grupos de tratamiento incluyen animales a los que se administran una o más proteínas H-NOX que han sido previamente probadas para constantes de disociación del NO u O2, reactividad del NO, estabilidad, fisiocompatibilidad, o combinaciones de dos o más de las anteriores. Los grupos tratados con H-NOX de glóbulos rojos y penta-almidón proporcionan controles positivos y negativos, respectivamente.

Los criterios de valoración objetivos incluyen supervivencia y la aparición de metabolismo anaerobio, señalizado por el desequilibrio ácido-base y la acumulación de ácido láctico. Las proteínas H-NOX que aumentan la velocidad de supervivencia (tal como produciendo un aumento estadísticamente significativo en la velocidad de supervivencia) en comparación con las del grupo de control son útiles para oxigenar tejidos en hemodilución extrema. Se espera que tales proteínas H-NOX también sean útiles para tratar otras indicaciones para las que es beneficiosa la administración de O2.

Ejemplo 4: Modelo de traumatismo para mutantes de H-NOX de vehículos de O2: Comparación de los efectos de mutantes de H-NOX de vehículos de O2 y disoluciones de hemoglobina recombinantes sobre la tensión arterial, circulación sanguínea intestinal y oxigenación del intestino en un modelo de rata de choque hemorrágico.

Para evaluar la capacidad de proteínas H-NOX para transportar O2 en un modelo de traumatismo puede realizarse una adaptación de un protocolo establecido (Raat, N. J. y col. (enero de 2005). “Effects of Recombinant-Hemoglobin Solutions rHb2.0 and rhb1.1 on Blood Pressure, Intestinal Blood Flow, And Gut Oxygenation in a Rat Model of Hemorrhagic Shock”, J Lab Clin Med. 145(1):21-32, particularmente con respecto a modelos animales de traumatismo) en un modelo de rata de presión fijada (40 mm de Hg) de choque hemorrágico y reanimación.

Se anestesian ratas Wistar con una inyección intraperitoneal de una mezcla de 90 mg/kg de ketamina, 0,5 mg/kg de medetomidina y 0,005 mg/kg de sulfato de atropina. La temperatura corporal de cada rata se mantiene entre 36,5 ºC y 37,5 ºC usando una almohadilla calefactora termocontrolada por una sonda de temperatura dispuesta en el recto de la rata. Además, la pérdida de calor se compensa usando una lámpara de calentamiento cerámica posicionada 40 a 50 cm por encima de la rata. Para la ventilación mecánica se realiza una traqueotomía y una longitud de 3,5 cm de tubo de poli(cloruro de vinilo) 6F se dispone 0,5 cm en la tráquea y se asegura con una sutura. Se usa un ventilador para bebés modificado para ventilar al animal. Para minimizar la pérdida de líquido ventilatorio, un filtro de humedad se coloca antes del tubo de ventilación. Se usa un puerto lateral de este filtro para monitorizar el CO2 al final de la respiración usando un capnógrafo. Los parámetros de ventilación tales como la fase inspiratoria (0,25 - 0,35) y la velocidad de respiración (50-75 respiraciones/min) se ajustan para mantener los valores de la PCO2 arterial entre 35 y 45 mm de Hg durante la cirugía como se comprueba tomando una muestra de sangre de referencia. No se hacen más ajustes hasta el final del experimento.

Se canulan vasos usando catéter de vena de polietileno de 0,5 x 0,9 mm. Los catéteres se llenan de 0,9 % de disolución de NaCl con 25 UI de heparina. El catéter de la arteria carótida derecha se acorta a 20 cm y se ajusta a un transductor de presión para la monitorización continua de la tensión arterial media (MAP) y la frecuencia cardíaca. La MAP se calcula usando esta fórmula: (tensión arterial sistólica - tensión arterial diastólica)/3 + tensión arterial diastólica. Además, la vena yugular se canula para el soporte de líquido con 15 ml/kg/h de lactato de Ringer y 5 ml/kg/h de anestesia de mantenimiento (ketamina 50 mg/kg/h en lactato de Ringer). La arteria femoral se canula para la extracción de sangre y el muestreo de gas en sangre arterial. La vena femoral se canula para la infusión de los líquidos de reanimación y el muestreo de gas en sangre venosa.

Se realiza una laparotomía en la línea media en cada rata: el abdomen se cubre con envoltura de Saran para prevenir la evaporación de fluidos corporales. Se perfora un pequeño orificio en la envoltura de Saran para permitir el acceso de la fibra óptica para mediciones de PO2 microcirculatoria. También se canula una vena ileocecal con un catéter de polietileno de 0,8 mm para el muestreo de sangre venosa mesentérica.

La PO2 microvascular intestinal se mide usando la técnica previamente descrita de extinción dependiente del oxígeno de fosforescencia de paladio-porfirina. Después de 2,5 a 3 horas de cirugía, meso-tetra(4-carboxifenil)porfina de paladio (II) acoplada a disolución de HSA (50 mg en 10 ml de 4 % de disolución de albúmina, 4 mmol/l de disolución de paladio-porfirina, pH ajustado a 7,4 con HCl) se infunde a una dosis de 12 mg/ kg de peso corporal a una velocidad de 9,6 ml/kg/h durante 15 minutos.

La excitación del paladio-porfirina con un pulso de luz produce emisión de fosforescencia con un decaimiento en el tiempo que se relaciona cuantitativamente con la concentración de oxígeno (Vanderkooi, J. M. y col. (25 de abril de 1987). “An Optical Method for Measurement of Dioxygen Concentration Based Upon Quenching of Phosphorescence”, J. Biol. Chem. 262(12):5476-5482). Se hacen mediciones de PO2 microvascular con una fibra óptica posicionada por encima de la parte proximal del íleon. La lámpara de destello se registra antes de infundir el paladio-porfirina y se usa un algoritmo de desconvolución para calcular las concentraciones de oxígeno. Después de la infusión de la disolución de paladio-porfirina y 45 minutos de estabilización se toman muestras de sangre de referencia (0,2 ml/muestra) de la arteria femoral, vena femoral y vena mesentérica para la determinación del gas en sangre. Las muestras de sangre se analizan en un analizador de gas en sangre y un hemoxímetro.

Se induce choque hemorrágico extrayendo sangre de la arteria femoral en jeringuillas de 3 ml con heparina (25 UI/ml de sangre) a una velocidad de aproximadamente 1 ml/min durante varios minutos hasta que la MAP es aproximadamente 40 mm de Hg. La MAP se mantiene a este nivel usando más extracciones de sangre o infusiones de sangre durante 45 minutos. Justo antes de la reanimación se extraen muestras de sangre (0,2 ml/muestra) de la arteria femoral, vena femoral y vena mesentérica para la determinación de gas en sangre, y se reinfunde una cantidad similar de sangre de rata (recogida durante el choque hemorrágico). Después de este periodo de choque, los animales se asignan aleatoriamente a 1 de 8 grupos de reanimación diferentes. La reanimación se lleva a cabo con proteínas H-NOX naturales o mutantes o con otro vehículo de O2, tal como disolución de hemoglobina recombinante rHb1.1 (Baxter), rHb2.0 (Baxter), hemoglobina sin suero (disolución patrón), MP4 (Sangart), Hemopure (Biopure) o Polyheme (Northfield Labs) (Raat, N. J. y col. (enero de 2005). J Lab Clin Med. 145(1):21-32; concentración de reserva 100 mg/ml), todas a una dosis de 20 ml/kg (2 g/kg) infundida a una velocidad de 60 ml/kg/h. Se usa HSA (13,4 % de disolución de albúmina) infundida a la misma dosificación (20 ml/kg) y velocidad como control para el efecto del volumen sobre la presión y flujo durante la reanimación. Cuando se completa la reanimación se toman muestras de sangre de 0,2 ml de la arteria femoral, vena femoral y vena mesentérica después de 30, 60, 90 y 120 minutos, y cada vez se devuelve una cantidad similar de sangre de rata.

H-NOX que producen la misma vasoconstricción sistémica o menos (tal como sustancialmente o significativamente menos), el mismo aumento de MAP o menos, o el mismos aumento en la resistencia vascular mesentérica (MVR) o menos después de la reanimación en comparación con la que se produce por otro vehículo de O2 (tal como rHb1.1, rHb2.0, hemoglobina sin suero, MP4, Hemospan, o Polyheme) o por HAS oncóticamente igual son útiles para tratar choque hemorrágico. Se espera que tales proteínas H-NOX también sean útiles para tratar otras indicaciones para las que es beneficiosa la administración de O2.

A menos que se defina de otro modo, los significados de todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento son aquellos comúnmente entendidos por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Un experto en la materia también apreciará que cualquier procedimiento y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento también puede usarse para poner en práctica o probar la invención.

Para su uso en el presente documento, a menos que se indique claramente de otro modo, el uso de los términos “un”, “una” y similares se refiere a uno o más.

Referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren al valor o parámetro por sí mismo. Por ejemplo, descripción con referencia a “aproximadamente X” incluye descripción de “X”.

Se entiende que el aspecto y realizaciones de la invención descritos en el presente documento incluyen “que comprende”, “que consiste” y “que consiste esencialmente en” aspectos y realizaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 que comprende (i) una cantidad farmacéuticamente aceptable de una proteína H-NOX, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que

(a)

la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre 1 nM y 1 mM a 20 ºC, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a 700 s-1 a 20 ºC, o

(b)

la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina alfa humana, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la de hemoglobina alfa humana.
2.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 1, en la que la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre 1 nM y 1 mM a 20 ºC, y en la que la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a 700 s-1 a 20 ºC.
3.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 1, en la que la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está dentro de 2 órdenes de magnitud de la de la hemoglobina, y en la que la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina.
4.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 2, en la que la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre 2 nM y 50 µM a 20 ºC.
5.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 1, en la que la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre 50 nM y 50 µM a 20 ºC.
6.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 1, en la que la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX está entre 1 µM y 10 µM a 20 ºC.
7.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 2, en la que la reactividad del NO de la proteína H-NOX es inferior a 1 s-1 a 20 ºC.
8.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 100 veces menor que la de la hemoglobina.
9.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la kdis para el oxígeno de la proteína H-NOX está entre 0,01 s-1 y 200 s-1 a 20 ºC.
10.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 2, en la que la velocidad de auto-oxidación del hemo de la proteína H-NOX es inferior a 1 h-1 a 37 ºC.
11.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la proteína H-NOX comprende al menos una mutación del bolsillo distal, o en la que la proteína H-NOX comprende al menos una mutación que no está en el bolsillo distal.
12.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que la proteína H-NOX comprende al menos una mutación en el bolsillo distal.
13.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 12, en la que la proteína H-NOX es L144F de T. tengcongensis.
14.

La composición farmacéutica de una cualquiera para su uso en medicina como vehículo de O2 según las reivindicaciones 1-13, en la que la proteína H-NOX está covalentemente unida a otra molécula.
15.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 14, en la que la proteína H-NOX está unida a polietilenglicol.
16.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 14, en la que la proteína H-NOX es una proteína de fusión que incluye un dominio de H-NOX y parte o la totalidad de otra proteína.
17.

La composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 16, en la que la otra proteína es albúmina.
18.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es para su uso como un sucedáneo de la sangre.
19.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de una enfermedad

cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia tumoral, pérdida de sangre o una herida.
20.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 19, en donde la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de una enfermedad cardiovascular.
21.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 20, en donde la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de infarto de miocardio.
22.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 19, en donde la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de hipoxia tumoral.
23.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 22, en donde la composición farmacéutica es para su uso como complemento con radiación o quimioterapia para el tratamiento de cáncer.
24.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 19, en donde la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de una herida.
25.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 24, en donde la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de heridas pos-radiación, heridas posquirúrgicas, úlceras diabéticas o heridas por quemaduras.
26.

Una composición farmacéutica para su uso en medicina como vehículo de O2 según la reivindicación 19, en donde la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de:

(a)

accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral traumática y lesión de médula espinal;

(b)

pérdida de sangre durante traumatismo, hemorragias, choque hemorrágico, pérdida de sangre durante cirugía, o hemodilución;

(c)

isquemia de tejido asociada a trombos, oclusiones de células falciformes, oclusiones arteriales, oclusiones vasculares periféricas, globos de angioplastia o instrumentos quirúrgicos; o

(d)

isquemia de tejido asociada a isquemia perioperativa, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular emergente, ataques isquémicos transitorios, aturdimiento miocárdico e hibernación, angina aguda o inestable, angina emergente e infarto de miocardio.
27.

Uso de una proteína H-NOX como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en la preparación de un medicamento para administrar oxígeno in vivo a seres humanos o animales, en el que el medicamento comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28.

El uso de una proteína H-NOX según la reivindicación 27, en el que el medicamento es un sucedáneo de la sangre.
29.

El uso de una proteína H-NOX según la reivindicación 27, en el que el medicamento es para su uso en el tratamiento de una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurológica, hipoxia tumoral, pérdida de sangre o una herida.
30.

El uso de una proteína H-NOX según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en el que el medicamento es para tratar enfermedad cardiovascular, enfermedad neurológica, hipoxia tumoral, pérdida de sangre, cicatrización, traumatismo, hemorragias, choque hemorrágico, cirugía, hemodilución, pérdida de volumen de sangre, cicatrización después de radiación, reparación posquirúrgica, reparación de úlceras diabéticas, reparación de heridas por quemadura, trombos, anemia de células falciformes, oclusiones de células falciformes, oclusiones arteriales, oclusiones vasculares periféricas, isquemia perioperativa, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular isquémico, accidente cerebrovascular emergente, ataques isquémicos transitorios, aturdimiento miocárdico e hibernación, angina aguda o inestable, angina emergente, infarto de miocardio, cardioplejía, cáncer, cáncer como complemento con radiación o quimioterapia, lesión cerebral traumática, lesión de médula espinal o anemia.

Secuencias de H-NOX mutante y la H-NOX WT parental

NUCLEÓTIDOS seguidos de AMINOÁCIDOS H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis