BRPI0712921A2 - planta e semente de milho que correspondem ao evento transgênico mon89034 e métodos para detecção e uso das mesmas - Google Patents

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Abstract

PLANTA E SEMENTE DE MILHO QUE CORRESPONDEM AO EVENTO TRANSGêNICO MON89034 E MéTODOS PARA DETECçãO E USO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a um evento de milho transgênico MON89034, e células, sementes, e plantas compreendendo o DNA diagnóstico para o evento de milho. A invenção também fornece composições compreendendo sequências de nucleotídeo que são diagnóstico para o dito evento de milho em uma amostra, métodos para detectar a presença da ditas sequências de nucleotídeo de evento de milho em uma amostra, sondas e iniciadores para o uso na detecção das sequências de nucleotídeo que são diagnóstico para a presença do dito evento de milho em uma amostra, cultivar as sementes de tal evento de milho para plantas de milho, e procriar para produzir plantas de milho compreendendo o DNA diagnóstico para o evento de milho.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTA E SEMENTE DE MILHO QUE CORRESPONDEM AO EVENTO TRANSGÊ- NICO MON89034 E MÉTODOS PARA DETECÇÃO E USO DAS MES- MAS".
REFERÊNCIA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido de Patente Provisório US N0 60/808.834 depositado em 26 de maio de .2006.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao evento de milho transgênico MON89034 e partes de planta e semente do mesmo. O evento exibe resis- tência à infestação de insetos dos insetos na ordem Lepidópteros. A invenção também refere-se aos métodos para usar plantas e sementes compreendendo DNA que é diagnóstico para a presença do evento transgê- nico quando sondado para a presença de seqüências de nucleotídeo que são únicas para o evento transgênico, e aos métodos para detectar a pre- sença do dito evento de milho em uma amostra biológica detectando seqüências de nucleotídeo específicas que são únicas para o evento trans- gênico. A invenção fornece seqüências de nucleotídeo que são únicas para o evento.
Antecedentes da Invenção
Esta invenção refere-se à variedade transgênica resistente a Lepidópteros de planta de milho (Zea mays) referida aqui como evento MON89034, e às seqüências de DNA únicas presentes que, quando detec- tadas em qualquer amostra ou variedade de milho, são diagnóstico para a presença do evento de planta de milho transgênica MON89034 naquela a- mostra ou variedade, e também refere-se à detecção da região de inserção do transgene/genômica em milho MON89034, e plantas da progênie e se- mentes derivadas destas.
O evento de planta de milho MON89034 é particularmente resis- tente a insetos na família de Lepidópteros tais como lagarta-militar (Spodoptera frugiperda), broca-do-colmo européia (Ostrinia nubilalis), lagarta-da-espiga (Helicoverpa zea), broca-do-colmo (Diatraea grandiosella), e lagarta-rosca (Agrotis ipsilon) e outros, todos estes são pestes de insetos agronomicamente importantes.
Milho é uma plantação importante e é uma fonte alimentícia pri- mária em muitas áreas do mundo. Métodos de biotecnologia foram aplicados a milho para o propósito de melhorar os traços agronômicos e a qualidade do produto. Um tal traço agronômico é resistência a insetos, por exemplo, resistência geneticamente engenheirada para espécies lepidópteros e cole- ópteros que surgem geneticamente em plantas de milho engenheiradas para conter um ou mais genes que codificam agentes inseticidas (vide por exem- plo, patente US 6.489.542 e patente US 6.620.988). É vantajoso detectar a presença de um evento transgênico particular em uma amostra biológica para determinar se uma ou mais progênies de um cruzamento sexual con- têm o material transgênico. Por exemplo, a detecção do .evento em uma a- mostra é importante para propósitos de autorização, para estabelecer e manter padrões de pureza, importante para obedecer órgãos fiscalizadores, para obedecer padrões de componentes alimentícios, para uso em procedi- mentos legais estabelecendo que um ou mais indivíduos ou entidades parti- culares têm usado o evento particular sem uma licença do proprietário ou licenciado de qualquer patente direcionada ao evento transgênico, e para assegurar complacência com várias regulações e/ou leis governamentais.
Além disso, os métodos que permitem a detecção de uma planta particular seriam úteis quando obedecer as regulações que requerem a a- provação de pré-mercado e rotulação dos alimentos derivados das plantas de plantação recombinantes. Indivíduos ou entidades que são resistentes à presença de um evento transgênico em uma amostra também desejam mé- todos seguros para detectar a presença do transgene em uma amostra a fim de que eles possam se capitalizar em seu negócio, tirando proveito de uma ausência dos transgenes em seus produtos.
Apesar destas vantagens, é possível que os insetos possam e- voluir a resistência às plantas que expressam apenas uma δ-endotoxina de B. thuringiensis. Tal resistência, caso venha a ser difundida, claramente Iimi- 3
taria o valor comercial de germoplasma contendo genes Bt simples.
Um possível modo de aumentar a eficácia dos agentes insetici- das fornecidos por meio de plantas transgênicas e direcionados no controle de pestes de insetos alvos e contemporaneamente reduzir a probabilidade de aparecimento de pestes de inseto resistentes a tais agentes inseticidas seria assegurar que as plantações transgênicas expressassem níveis altos destes agentes inseticidas, tais como delta-endotoxinas de Bacillus thuringi- ensis (McGaughey e Whalon (1992), Science 258:1451-55; Roush (1994) Biocontrol. Sei. Technol. 4:501-516). Além disso, tendo um repositório de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de pestes de inseto e que manifestam seus efeitos através de modos diferentes de ação pode salva- guardar contra desenvolvimento da resistência. O princípio de resistência poderia ser substancialmente tardado como resultado de fornecer uma plan- tação que expresse duas ou mais atividades inseticidas exibindo toxicidade de sobreposição para as mesmas espécies de inseto. Um meio para alcan- çar tais modos duais de ação poderia ser fornecer uma planta expressando um gene Bt tóxico para uma espécie de inseto particular junto com um dsR- NA que é fornecido para o propósito de alvejamento para supressão de um gene essencial da mesma espécie de inseto alvejada pela toxina Bt1 o dsR- NA suscitando uma resposta de RNAi sob ingestão pela peste alvo, forne- cendo um meio para redundância no evento do inseto desenvolver resistên- cia ao dsRNA ou ao gene Bt. Alternativamente, co-expressão em uma planta de duas ou mais toxinas inseticidas ambas tóxicas para as mesmas espé- cies de inseto mas cada uma exibindo um modo diferente de realizar sua atividade de matança, particularmente quando ambas forem expressas em níveis altos, fornece um meio para gerenciamento eficaz da resistência. E- xemplos de tais inseticidas úteis em tais combinações incluem mas não são limitados a toxinas de Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Pho- torhabdus sp., proteínas de patatina e/ou permuteínas desalergenizadas e desglicosiladas, Iectinas vegetais, e outras.
A expressão de genes estranhos em plantas é conhecida ser influenciada por sua posição cromossômica, talvez devido à estrutura de cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou à proximidade dos elementos de regulação transcricional (por exemplo, intensificadores) perto do sítio de integração (Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet 22:421-477). Por este mo- tivo, é freqüentemente necessário triar um número grande de eventos para identificar um evento caracterizado por ótima expressão de um gene introdu- zido de interesse. Até mesmo depois, com dúzias ou até mesmo centenas de eventos transgênicos diferentes em mão, não há nenhuma certeza de sucesso em identificar um evento transgênico simples que forneça os níveis ótimos de expressão das pelo menos duas toxinas diferentes ou agentes inseticidas e careça de quaisquer deficiências agronômicas indesejáveis ou efeitos fitotóxicos, ou como resultado da inserção em alguma região essen- cial ou parcialmente essencial do genoma da planta, ou como resultado dos efeitos tóxicos provocados pelos níveis de expressão dos transgenes. Por exemplo, foi observado em plantas e em outros organismos que pode haver variação ampla nos níveis de expressão de um gene introduzido entre os eventos. Pode também haver diferenças nos padrões espaciais ou temporais da expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transge- ne em vários tecidos de planta que podem não corresponder aos padrões esperados de elementos reguladores transcricionais presentes na constru- ção de gene introduzido. Por este motivo, é comum produzir várias centenas a vários milhares de eventos diferentes e triar os eventos para um evento simples que tem níveis e padrões de expressão de transgene desejados pa- ra propósitos comerciais. Um evento que tem os níveis ou padrões de ex- pressão de transgene desejados é útil para introgressar o transgene em ou- tros antecedentes genéticos por meio de cruzamento sexual sem conexão usando métodos de procriação convencionais. Progênie de tais cruzamentos mantém as características da expressão do transgene do transformante ori- ginal. Esta estratégia é usada para assegurar expressão de gene segura em diversas variedades que são adaptadas adequadamente às condições cres- centes locais específicas.
É possível detectar a presença de um transgene por qualquer método de detecção de ácido nucléico bem conhecido tal como a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou hibridação de DNA usando sondas de ácido nucléico. Estes métodos de detecção em geral focam em elementos genéti- cos freqüentemente usados, tais como promotores, terminadores, genes marcadores, ou até mesmo a seqüência de codificação que codifica a prote- ína ou dsRNA de interesse expresso do(s) transgene(s), etc. Como resulta- do, tais métodos podem não ser úteis para discriminar entre eventos diferen- tes, particularmente aqueles produzidos usando a mesma construção de DNA, a menos que a seqüência de DNA cromossômica adjacente ao DNA inserido ("DNA de flanqueamento") seja conhecida. Dependendo do método usado para introduzir o(s) transgene(s) em um genoma de planta, efeitos aberrantes ou incomuns podem ser observados, que com freqüência seve- ramente complicam a identificação das seqüências do genoma da planta flanqueando o DNA transgênico que foi intencionado ser introduzido na plan- ta. Freqüentemente, rearranjos do DNA inserido, rearranjos do DNA do ge- noma de flanqueamento, ou rearranjos tanto do DNA inserido como do DNA do genoma de flanqueamento são prevalecentes, e complicam a análise do evento de inserção sendo avaliado. Portanto, é vantajoso ter um meio para selecionar, identificar, e assegurar a pureza e características de um evento transgênico particular em uma amostra, e o único modo para realizar isto é identificar uma ou mais seqüências únicas associadas apenas com o evento transgênico desejado, e a presença de tais seqüências em uma amostra bio- lógica contendo o DNA das espécies de planta às quais o DNA transgênico foi inserido para dar origem ao evento é desse modo diagnóstico para o e- vento em tal amostra. Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se à planta de milho transgênica de- signada MON89034 e progênie que são indistinguíveis do evento de milho MON89034 (na medida em que elas também contenham pelo menos um alelo que corresponda ao DNA transgênico inserido) do mesmo tendo se- mente depositada em 28 de março de 2006 junto à American Type Culture Collection (ATCC) com Acesso No. PTA-7455. Outro aspecto da invenção são as plantas de progênie, ou sementes, ou partes regeneráveis das plantas e sementes do evento de milho MON89034 que contêm um polinu- cleotídeo selecionado do grupo que consiste na SEQ ID N0: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4, e SEQ ID N0: 5. A invenção também inclui par- tes de planta do evento de milho MON89034 que incluem, mas não são Iimi- tadas a pólen, óvulo, flores, brotos, raízes, talos, cabelos, pendões, espigas, e folhas, desde que estas partes contenham pelo menos os polinucleotídeos como expostos acima. Composições genéticas novas contidas no genoma de MON89034 e produtos de MON89034 tais como refeição, farinha, óleo, polpa, e biomassa deixados em um campo de plantas de milho que corres- pondem ao evento de MON89034 são um aspecto desta invenção.
A invenção fornece uma planta de milho resistente a inseto ten- do todas as características fisiológicas e morfológicas do evento de milho MON89034.
De acordo com um aspecto da invenção, composições e méto- dos são fornecidos para detectar a presença da região de inserção do trans- gene/genômica de uma planta de milho nova designada MON89034. Se- qüências de DNA são fornecidas que compreendem pelo menos uma se- qüência de junção de MON89034 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID N0: 1 (localizada nas posições 2051 a 2070 na SEQ ID N0: 5) e SEQ ID N0: 2 (localizada nas posições 11367 a 11388) e complementos das mesmas; em que uma seqüência de junção atravessa a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA da célula de milho flanqueando o sítio de inserção e é diagnóstico para o evento (Figura 1). Um evento de mi- lho MON89034 e semente compreendendo estas moléculas de DNA são um aspecto desta invenção.
Seqüências de DNA que compreendem a região de inserção do transgene/genômica nova, SEQ ID N0: 3 e SEQ ID N0: 4 (Figura 2) do evento de milho MON89034 são aspectos desta invenção. A planta de milho e se- mente compreendendo estas moléculas são também aspectos desta inven- ção.
De acordo com outro aspecto da invenção, duas moléculas de DNA são fornecidas para o uso em um método de detecção de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende pelo menos 11 ou mais polinucleo- tídeos contíguos de qualquer porção da região de transgene da molécula de DNA da SEQ ID N0: 3 e uma molécula de DNA de comprimento similar de qualquer porção de uma região de DNA genômica de milho de flanqueamen- to de 5' da SEQ ID N°: 3 onde estas moléculas de DNA quando usadas junto são úteis como iniciadores de DNA em um método de amplificação de DNA que produz um amplicon. O amplicon produzido usando estes iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA é diagnóstico para evento de milho MON 89304 quando o amplicon contiver a SEQ ID N0: 1. Qualquer amplicon produzido por iniciadores de DNA homólogos ou complementares a qualquer porção da SEQ ID N0: 3 e qualquer amplicon compreendendo a SEQ ID N°: .1 é um aspecto da invenção.
De acordo com outro aspecto da invenção, duas moléculas de DNA são fornecidas para o uso em um método de detecção de DNA1 em que a primeira molécula de DNA compreende pelo menos 11 ou mais polinucleo- tídeos contíguos de qualquer porção da região de transgene da molécula de DNA da SEQ ID N0: 4 e uma molécula de DNA de comprimento similar de qualquer porção de um DNA genômico de flanqueamento de milho de 3' da SEQ ID N0: 4 onde estas moléculas de DNA são úteis como iniciadores de DNA em um método de amplificação de DNA. O amplicon produzido usando estes iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA é diagnóstico para evento de milho MON 89304 quando o amplicon contiver a SEQ ID N0: .2. Quaisquer amplicons produzidos por iniciadores de DNA homólogos ou complementares a qualquer porção da SEQ ID N0: 4 e qualquer amplicon compreendendo a SEQ ID N0: 2 são um aspecto da invenção.
De acordo com outro aspecto da invenção, métodos de detectar a presença de DNA que corresponde ao evento de milho MON89034 em uma amostra são fornecidos. Tais métodos compreendem: (a) contatar a amostra compreendendo o DNA com um conjunto de iniciador que, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA genômi- co do evento de milho MON89034, produz um amplicon que é diagnóstico para evento de milho MQN89034; (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico, assim produzindo o amplicon; e (c) detectar o amplicon em que o dito amplicon compreende SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2.
Uma planta de milho, ou semente, ou produto derivado da planta ou semente MON89034 em que o DNA genômico compreende uma molécu- Ia de DNA que consiste essencialmente em SEQ ID N0: 5 e complementos dos mesmos. Uma planta de milho, ou semente, ou produto derivado da planta ou semente MON89034 em que o DNA genômico quando isolado da planta de milho, ou semente, ou produto compreende uma molécula de DNA incorporando os nucleotídeos 2061 a 11377 da SEQ ID N0: 5 e complemen- tos da mesma.
Uma planta de milho, ou semente, ou produto derivado da planta ou semente MON89034 em que o DNA genômico quando isolado da planta de milho, ou semente, ou produto produz um amplicon em um método de amplificação de DNA, em que DNA iniciador moléculas SEQ ID N0: 6 e SEQ ID N°: 7 é usado no método de amplificação de DNA.
De acordo com outro aspecto da invenção, os métodos de de- tectar a presença de um DNA que corresponde ao evento de MON89034 em uma amostra, tais métodos compreendendo: (a) contatar a amostra compre- endendo o DNA com uma sonda que hibrida sob condições de hibridação rigorosa com DNA genômico do evento de milho MON89034 e não hibrida sob as condições de hibridação rigorosa com uma planta de milho de contro- .le; (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridação rigorosa; e (c) detectar a hibridação da sonda com o DNA do evento de milho MON89034 em que a dita sonda compreende SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
Outro aspecto da invenção é um método de determinar a zigosi- dade da progênie do evento de milho MON89034 que compreende: (a) con- tatar a amostra compreendendo DNA de milho com um conjunto de iniciador que compreende SQ2842 (SEQ ID N0: 6), SQ2843 (SEQ ID N0: 7), SQ6523 (SEQ ID N0: 10), SQ6524 (SEQ ID N0: 11), PB880 (SEQ ID N0: 14) e PB2931 (SEQ ID N0: 15) que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA genômico do evento de milho MON89034, pro- duz um primeiro amplicon que é diagnóstico para evento de milho 9
ΜΟΝ89034 e (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico, assim produzindo o primeiro amplicon; e (c) detectar o primeiro amplicon; e (d) contatar a amostra compreendendo DNA de milho com o dito conjunto de iniciador que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléi- co com DNA genômico das plantas de milho produz um segundo amplicon compreendendo o DNA genômico nativo de milho homólogo à região genô- mica de milho de uma inserção do transgene identificada como evento de milho MON89034; e (e) executar uma reação de amplificação de ácido nu- cléico, assim produzindo o segundo amplicon e (f) detectar o segundo ampli- con; e (g) comparar o primeiro e segundo amplicons em uma amostra, em que a presença de ambos os amplicons indica que a amostra é heterozigota para a inserção do transgene.
Um aspecto da invenção é fornecer na dieta de uma peste Iepi- dóptero uma quantidade inseticidamente eficaz do evento de milho MON89034.
Outro aspecto da presente invenção é fornecer uma composição ou amostra biológica na forma de uma mercadoria ou gênero alimentício que é derivado do evento de milho MON89034, a mercadoria ou gênero alimentí- cio compreendendo espigas de milho, milho debulhado, cabelos de milho, pólen de milho, milho quebrado, fubá, milho esmagado, farinha de milho, óleo de milho, amido de milho, água de maceração de milho, malte de milho, açúcar de milho, xarope de milho, margarina produzida de óleo de milho, óleo de milho insaturado, óleo de milho saturado, flocos de milho, milho de pipoca, etanol e/ou licor produzido de milho ou produtos de milho compreen- dendo o DNA diagnóstico para evento de milho MON89034, sólidos de pro- dutos perecíveis de destiladores (DDGS) produzidos de fermentação de tal evento de milho, e alimentações animais compreendendo tais DDGS e/ou milho, se ou não inteiro, quebrado, ou esmagado, gêneros alimentícios pro- cessados, um cosmético, e um agente de massa em que é encontrada uma quantidade detectável de um polinucleotídeo que é diagnóstico para a pre- sença do evento de milho transgênico MON89034 na amostra biológica. Um meio alternativo para fornecer milho como um gênero alimentício é fornecer milho em várias formas de grão para alimentação, tais como milho inteiro, milho quebrado, milho esmagado, e várias formas dos antecedentes em uma mistura com milo, sebo, painço, girassol, aveias, trigo, arroz, feijões, e ou- tros. Quantidades detectáveis de uma seqüência de nucleotídeo em tal mer- cadoria ou gênero alimentício, tal como é exposto na SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2, ou os complementos das mesmas, são diagnósticos para a presen- ça de tal DNA de do evento transgênico MON89034 na amostra, e portanto, a presença das células do evento transgênico como tendo originado o DNA na amostra.
O antecedente e outros aspectos da invenção ficarão mais evi- dentes da descrição detalhada a seguir. Desenhos
Figura 1. Organização da inserção do transgene presente dentro do genoma do evento de milho transgênico MON89034..A barra aberta ou branca central representa o DNA inserido. Abaixo da barra branca está um diagrama que representa os vários elementos dentro do DNA inserido. As terminações do DNA inserido foram designadas arbitrariamente como 5' (ao lado esquerdo da Figura) e 3' (ao lado direito da Figura). As seqüências ou segmentos da Borda Direita e da Borda Esquerda são marcados em baixo de cada extremidade do diagrama ilustrando os vários elementos dentro do DNA inserido. Os elementos marcados nos cassetes de expressão dentro do DNA inserido são, em ordem sucessiva a partir da Borda Direita: o promotor de e35S, o líder não-transladado de CAB de trigo, íntron de actina de arroz, seqüência de codificação para Cry1A.105, seqüência de terminação e de poliadenilação de 3' de HSP17 de trigo, promotor de FMV, íntron de hsp70, seqüência de codificação de peptídeo alvo de cloroplasto de subunidade pequena da rubisco, seqüência de codificação de Cry2Ab, na seqüência si- nal de terminação e poliadenilação de 3', e depois a Borda Esquerda. As barras verticalmente traçadas em qualquer extremidade da barra aberta ou branca central correspondem às seqüências de flanqueamento do genoma de milho de 5' e 3' arbitrariamente marcadas. A linha preta mais longa acima da barra traçada e aberta ou branca representa SEQ ID N0: 5 (a seqüência 11
de comprimento total representada pela figura que descreve a seqüência de flanqueamento de 5', a seqüência de DNA inserida, e a seqüência de flan- queamento de 3'). As linhas pretas mais curtas acima e abaixo da linha preta marcada como SEQ ID N0: 5 representam as posições aproximadas dentro da SEQ ID N0: 5 em que cada uma das seqüências especificamente marca- das podem ser encontradas (isto é, SEQ ID N0: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 3, e SEQ ID N0: 4). SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2, e qualquer seqüência deri- vada do evento de milho MON89034 contendo SEQ ID N0: 1 e/ou SEQ ID N0: 2, somos diagnósticos para DNA do evento de milho MON89034 em uma amostra biológica. Descrição Detalhada
As definições a seguir e métodos são fornecidos para melhor definir a presente invenção e guiar aqueles de habilidade usual na técnica na prática da presente invenção. A menos que do contrário observado, os ter- mos serão entendidos de acordo com uso convencional por aqueles de habi- lidade usual na técnica relevante. Definições de termos comuns em biologia molecular podem também ser encontradas em Rieger et al., Glossary of Ge- netic: Classic and Molecular 5a edição, Springer - Verlag: Nova Iorque, 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nova Iorque, 1994.
Como aqui usado, o termo "milho" significa Zea mays ou milho e inclui todas as variedades de planta que possam ser procriadas com milho, incluindo espécies de milho selvagem.
Como aqui usado, o termo "compreendendo" significa "incluindo mas não limitado".
Um "evento" transgênico é produzido pela transformação das células de planta com DNA heterólogo, isto é, uma construção de ácido nu- cléico que inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população de plantas resultando da inserção do transgene no genoma da planta, e se- leção de uma planta particular caracterizada por inserção em uma Iocaliza- ção de genoma particular. O termo "evento" refere-se ao transformante ori- ginal e progênie do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "e- vento" também refere-se à progênie produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra variedade incluindo o DNA heterólogo. Até mesmo após retrocruzamento repetido com um pai recorrente, o DNA inseri- do e DNA de flanqueamento do pai transformado estão presentes na progê- nie do cruzamento na mesma localização cromossômica. O termo "evento" também refere-se ao DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido e seqüência genômica de flanqueamento imediatamente adjacente ao DNA inserido que seria esperado que fosse transferido para uma progê- nie que recebe o DNA inserido incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linha parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resultante do au- tocruzamento) e uma linha parental que não contém o DNA inserido. A pre- sente invenção refere-se ao DNA do evento MON89034, células de planta, tecidos, sementes e produtos processados derivados de MON89034.
É também para ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes podem também ser acasaladas para produzir descendência que contém dois genes exógenos segregantes independentemente adicionados. Autocruzamento apropriado da progênie pode produzir plantas que são ho- mozigotos para ambos genes exógenos adicionados. Retrocruzamento de uma planta parental e cruzamento sem conexão com uma planta não- transgênica são também contemplados, como é propagação vegetativa. Descrições de outros métodos de procriação que são comumente usados para traços diferentes e plantações podem ser encontradas em uma das vá- rias referências, por exemplo, Fehr, Breeding Methods for Cultivar Develop- ment, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wl (1987).
Uma "sonda" é um ácido nucléico isolado ao qual está ligada uma marcação detectável convencional ou molécula repórter, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente, ou enzima. Uma tal sonda é complementar a um filamento de um ácido nucléico alvo, no caso da presente invenção, para um filamento de DNA genômico do evento de milho MON89034 quer de uma planta de milho quer de uma amostra que inclui o DNA do evento. Sondas de acordo com a presente invenção não só incluem ácidos desoxirribonucléicos ou ribonucléicos mas também poliami- 13
das e outros materiais de sonda que especificamente ligam a uma seqüência de DNA alvo e podem ser usados para detectar a presença daquela seqüên- cia de DNA alvo.
"Iniciadores" são ácidos nucléicos isolados que são anelados a um filamento de DNA alvo complementar por hibridação de ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, depois estendido ao longo do filamento de DNA alvo por uma polimerase, por e- xemplo, uma DNA polimerase. Pares de iniciador da presente invenção refe- rem-se a seu uso para amplificação de uma seqüência de ácido nucléico alvo, por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucléico convencionais.
Sondas e iniciadores são em geral 11 nucleotídeos ou mais em comprimento, preferivelmente 18 nucleotídeos ou mais, mais preferivelmente 24 nucleotídeos ou mais, e o mais preferivelmente 30 nucleotídeos ou mais. Tais sondas e iniciadores especificamente hibridam com a uma seqüência alvo sob condições de hibridação de severidade alta. Preferivelmente, son- das e iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade de seqüência completa com a seqüência alvo, embora as sondas que diferem da seqüência alvo e que retêm a habilidade para hibridar com as seqüências alvos possam ser projetadas através de métodos convencionais.
Métodos para preparar e usar sondas e iniciadores são descri- tos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1- 3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (doravante, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley- Interscience, Nova Iorque, 1992 (com atualizações periódicas) (doravante, "Ausubel et al., 1992"); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pares de iniciador de PCR podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo, u- sando programas de computação intencionados para aquele propósito tais como Primer (Version 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Rese- arch, Cambridge, MA). Iniciadores e sondas com base nas seqüências de DNA de flan- queamento e de inserção descritas aqui podem ser usados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as seqüências descritas através de métodos con- vencionais, por exemplo, reclonagem e sequenciação de tais seqüências.
As sondas de ácido nucléico e iniciadores da presente invenção hibridam sob condições rigorosas com uma seqüência de DNA alvo. Qual- quer método hibridação ou de amplificação de ácido nucléico convencional pode ser usado para identificar a presença de DNA de um evento transgêni- co em uma amostra. Moléculas de ácido nucléico ou fragmentos das mes- mas são capazes de especificamente hibridar com as outras moléculas de ácido nucléico sob certas circunstâncias. Como aqui usado, as duas molécu- las de ácido nucléico são ditas ser capazes de especificamente hibridar uma com a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico antiparalela, bifilamentar. É dito que urpa molécula de áci- do nucléico é o "complemento" de outra molécula de ácido nucléico se elas exibirem complementaridade completa. Como aqui usado, as moléculas são ditas apresentar "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. As duas moléculas são ditas ser "minimamente complementar" se elas puderem hi- bridar uma com a outra com estabilidade suficiente para as permitir perma- necer aneladas entre si sob condições convencionais de "severidade baixa". Similarmente, é o dito que as moléculas são "complementares" se elas pu- derem hibridar umas com as outras com estabilidade suficiente para as per- mitir permanecer aneladas umas às outras sob condições convencionais de "severidade alta". Condições convencionais de severidade são descritas por Sambrook et al., 1989, e por Haymes et al., Em: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Abandonos de complementaridade completa são portanto permissíveis, contanto que tais abandonos não impeçam a capacidade das moléculas de formar uma estru- tura completamente bifilamentar. Para que uma molécula de ácido nucléico sirva como um iniciador ou sonda ela necessita apenas ser em seqüência suficientemente complementar para poder formar uma estrutura bifilamentar 15
estável sob as concentrações de solvente e de sal particulares empregadas.
Como aqui usado, uma seqüência substancialmente homóloga é uma seqüência de ácido nucléico que especificamente hibridar com o com- plemento da seqüência de ácido nucléico à qual está sendo comparada sob condições de severidade alta. Condições de severidade apropriadas que promovem hibridação de DNA1 por exemplo, 6,0 χ cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 χ SSC a 50°C, são conhecidas àqueles versados na técnica ou podem ser encontra- das em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ν. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lava- gem pode ser selecionada de uma severidade baixa de cerca de 2,0 χ SSC a 50°C a uma severidade alta de cerca de 0,2 χ SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de se- veridade baixa em temperatura ambiente, cerca de 22°C, para condições de severidade alta em cerca de 65°C. Tanto temperatura como sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto a outra variável é alterada. Em uma modalidade prefe- rida, um ácido nucléico da presente invenção híbrida especificamente com uma ou mais das moléculas de ácido nucléico expostas na SEQ ID N0: 1 e 2 ou complementos ou fragmentos das mesmas ou sob condições moderada- mente rigorosas, por exemplo a cerca de 2,0 χ SSC e cerca de 65°C. Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucléico da presente invenção especificamente hibridar com uma ou mais das moléculas de ácido nucléico expostas na SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 ou complementos ou fragmentos ou sob condições de severidade alta. Em um aspecto da presen- te invenção, uma molécula de ácido nucléico de marcador preferida da pre- sente invenção tem a seqüência de ácido nucléico exposta na SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 ou complementos ou fragmentos das mesmas. Em outro as- pecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico de marcador preferida da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência de ácido nucléico expos- ta na SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 ou complemento ou fragmentos das mesmas. Em um outro aspecto da presente invenção, uma molécula de áci- do nucléico de marcador preferida da presente invenção compartilha entre .95% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência exposta na SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 ou complemento ou fragmentos das mesmas. SEQ ID N0: 1 e SEQ que ID N0: 2 podem ser usadas como marcadores em méto- dos de melhoramento genético de plantas para identificar a progênie de cru- zamentos genéticos similares aos métodos descritos para análise de marca- dor de DNA de repetição de seqüência simples, em "DNA markers: Proto- cols, applications, and overviews: (1997) 173-185, Cregan, et al., eds., Wi- Iey-Liss NY; todas estas são incorporadas aqui por referência em sua totali- dade. A hibridação da sonda para a molécula de DNA alvo pode ser detec- tada por qualquer número de métodos conhecidos àqueles versados na téc- nica, estes podem incluir, mas não são limitados a, marcadores fluorescen- tes, marcadores radioativos, marcadores com base em anticorpo, e marca- dores quimioluminescentes.
Com relação à amplificação de uma seqüência de ácido nucléico alvo (por exemplo, por PCR) usando um par de iniciadores de amplificação particular, "condições rigorosas" são condições que permitem o par de inici- adores hibridar com apenas a seqüência de ácido nucléico alvo à qual um iniciador tendo a seqüência do tipo selvagem correspondente (ou seu com- plemento) ligaria e preferivelmente para produzir um produto de amplificação único, o amplicon, em um reação de amplificação térmica de DNA.
O termo "específico para (uma seqüência alvo)" indica que uma sonda ou iniciador híbrida sob condições de hibridação rigorosa apenas com a seqüência alvo em uma amostra compreendendo a seqüência alvo.
Como aqui usado, "DNA amplificado" ou "amplicon" refere-se ao produto da amplificação de ácido nucléico de uma seqüência de ácido nu- cléico alvo que faz parte de um modelo de ácido nucléico. Por exemplo, para determinar se a planta de milho resultante de um cruzamento sexual contém DNA genômico do evento transgênico da planta de milho da presente inven- ção, o DNA extraído de uma amostra de tecido de planta de milho pode ser submetido ao método de amplificação de ácido nucléico usando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado da seqüência de flanqueamento no genoma da planta adjacente ao sítio de inserção de DNA heterólogo inse- rido, e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido para pro- duzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA do evento. O amplicon é de um comprimento e tem uma seqüência que é também diag- nóstico para o evento. O amplicon pode variar em comprimento do compri- mento combinado dos pares de iniciador mais um par de base de nucleotí- deo, preferivelmente mais cerca de cinqüenta pares de base de nucleotídeo, mais preferivelmente mais cerca de duzentos e cinqüenta pares de base de nucleotídeo, e até mesmo mais preferivelmente mais cerca de quatrocentos e cinqüenta pares de base de nucleotídeo. Alternativamente, um par de ini- ciadores pode ser derivado da seqüência de flanqueamento em ambos os lados do DNA inserido para produzir um amplicon que inclui a seqüência de nucleotídeo inserida inteira. Um membro de um par de iniciadores derivado da planta seqüência genômica pode ser localizada uma distância da molécu- la de DNA inserida, esta distância pode variar de um par de base de nucleo- tídeo até cerca de vinte mil pares de base de nucleotídeo. O uso do termo "amplicon" especificamente exclui dímeros de iniciador que podem ser for- mados na reação de amplificação térmica de DNA.
Amplificação de ácido nucléico pode ser realizada por quaisquer dos vários métodos de amplificação de ácido nucléico conhecidos na técni- ca, incluindo a reação em cadeia de polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na técnica e é descrita, inter alia, nas patentes U. S. Nos 4.683.195 e 4.683.202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, .1990. Métodos de amplificação de PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico e até 42 kb de DNA de bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:5695-5699, 1994). Estes métodos como também outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA po- dem ser usados na prática da presente invenção. A seqüência da inserção de DNA heterólogo ou seqüência de flanqueamento do evento de milho MQN89034 com amostras de semente depositadas como números de ATCC podem ser verificadas (e corrigidas se necessário) amplificando tais seqüên- cias do evento usando iniciadores derivados das seqüências fornecidas aqui seguido por sequenciação de DNA padrão do amplicon de PCR ou do DNA clonado.
O amplicon produzido por estes métodos podem ser detectados por uma pluralidade de técnicas. Um tal método é Genetic Bit Analysis (Niki- forov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994) onde um oligonucleotí- deo de DNA é projetado que sobrepõe tanto a seqüência de DNA genômico de flanqueamento adjacente e a seqüência de DNA inserida. O oligonucleo- tídeo é imobilizado em poços de uma placa de micropoços. Seguindo PCR da região de interesse (usando um iniciador na seqüência inserida e um na seqüência genômica de flanqueamento adjacente), um produto de PCR unifi- Iamentar pode ser hibridado com o oligonucleotídeo imobilizado e servir co- mo um modelo para uma reação de extensão de base siijiples usando uma DNA polimerase e ddNTPs marcados específicos para a próxima base espe- rada. Estágio de leitura pode ser fluorescente ou com base em ELISA. Um sinal indica presença da seqüência de inserção/flanqueamento devido à am- plificação, hibridação, e extensão de base simples bem sucedidas.
Outro método é a técnica de piro sequenciação como descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método, um oligo- nucleotídeo é projetado que sobrepõe o DNA genômico adjacente e a junção de DNA de inserção. O oligonucleotídeo é hibridado com o produto de PCR unifilamentar da região de interesse (um iniciador na seqüência inserida e um na seqüência genômica de flanqueamento) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, fosfossulfato de 5' adenosina e luciferina. dNTP é adicionado individualmente e a incorpora- ção resulta em um sinal leve que é medido. Um sinal leve indica a presença da seqüência de inserção/flanqueamento do transgene devido à amplifica- ção, hibridação, e extensão de base simples ou múltiplas bem sucedidas.
Polarização da fluorescência como descrita por Chen, et al., (Genoma Res. 9:492-498, 1999) é um método que pode ser usado para de- tectar o amplicon da presente invenção. Usando este método um oligonucle- otídeo é projetado que sobrepõe o flanqueamento genômico e a junção de DNA inserida. O oligonucleotídeo é hibridado com produto de PCR unifila- mentar da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na se- qüência de DNA genômica de flanqueamento) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP fluorescente-marcado. Extensão de base simples resulta na incorporação do ddNTP. Incorporação pode ser medida como uma alteração na polarização usando um fluorímetro. Uma alteração na polarização indica a presença da seqüência de inserção/flanqueamento do transgene devido à amplificação, hibridação, e extensão de base simples bem sucedidas.
Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) é descrito como um método de detectar e quantificar a presença de uma seqüência de DNA e é inteiramente entendido nas instruções fornecidas pelo fabricante. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo de FRET é projetada que so- brepõe o flanqueamento genômico e junção de DNA inserida. A sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na seqüência de DNA inserida e um na seqüência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Hibridação da sonda de FRET resulta na clivagem e liberação da metade fluorescente longe da metade de extinção na sonda de FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da se- qüência de inserção de flanqueamento/transgene devido à amplificação e hibridação bem sucedidas.
Balizas moleculares foram descritas para o uso na seqüência como descrito em Tyangi, et al. (Nature Biotech.14:303-308, 1996). Breve- mente, uma sonda de oligonucleotídeo de FRET é projetada que sobrepõe a junção de DNA genômico de flanqueamento e inserida. A única estrutura da sonda de FRET resulta nela contendo a estrutura secundária que mantém as metades fluorescentes e de extinção em proximidade íntima. A sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na seqüência de DNA inserida e um na seqüência genômica de flanqueamento) são ciclizadas na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Seguindo amplificação de PCR bem sucedida, hibridação da sonda de FRET com a seqüência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das me- tades fluorescentes e de extinção que resulta na produção de um sinal fluo- rescente. O sinal fluorescente indica a presença da seqüência de inserção de flanqueamento/transgene devido à amplificação e hibridação bem suce- didas.
Outros métodos descritos, tais como, microfluídicos (pub. de pa- tente US 2006068398, patente US N0 6.544.734) fornecem métodos e dis- positivos para separar e amplificar as amostras de DNA. Tinturas ópticas usadas para detectar e quantificar as moléculas de DNA específicas (WO/05017181). Dispositivos de nanotubo (W0/06024023) que compreende um sensor eletrônico para a detecção das moléculas de DNA ou nanocontas que ligam as moléculas de DNA específicas e podem depois ser detectadas.
Kits de detecção de DNA são fornecidos usando as composi- ções descritas aqui. Os kits são úteis para a identificação .de DNA do evento de milho MON89034 em uma amostra e podem ser aplicados pelo menos para métodos para geneticamente melhorar plantas de milho contendo o DNA apropriado do evento. Os kits contêm iniciadores e/ou sondas de DNA que são homólogos ou complementares aos segmentos selecionados das seqüências como expostas na SEQ ID N0: 1-7, ou iniciadores ou sondas de DNA homólogos ou complementares ao DNA contido nos elementos genéti- cos de DNA do transgene como expostos na Listagem de Seqüência. Estas seqüências de DNA podem ser usadas nas reações de amplificação de DNA ou como sondas em um método de hibridação de DNA para detectar a pre- sença de polinucleotídeos diagnósticos para a presença do DNA alvo em uma amostra. A produção de um amplicon pré-definido em uma reação de amplificação térmica é diagnóstico para a presença de DNA que correspon- de ao DNA do genoma de PTO-7455 na amostra. Se hibridação for selecio- nada, a detecção da hibridação da sonda para a amostra biológica é diag- nóstico para a presença do DNA do evento transgênico MON89034 na a- mostra. Tipicamente, a amostra é milho, ou produtos de milho ou subprodu- tos do uso de milho.
A presente invenção fornece uma planta de milho transgênica designada como evento de milho MON89034, progênie da planta, e células da planta, como também semente produzida da planta. Semente representa- tiva para cultivar a planta, para produzir progênie, para obter células, ou para produzir uma plantação da dita semente compreendendo o evento de milho transgênico foi depositada em 28 de março de 2006 junto à American Type Culture Collection (ATCC) e tem o número de acesso PTA-7455.
A planta e células e produtos produzidos destas modalidades e outros contêm DNA que é diagnóstico para a presença de DNA derivada de qualquer célula derivada do evento de milho transgênico MON89034 em qualquer amostra biológica. Isto é porque estas duas seqüências novas es- tão contidas dentro das células do evento de milho transgênico MON89034. O DNA diagnóstico compreende uma seqüência de nucleotídeo que é sele- cionada do grupo que consiste na SEQ ID N0: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: .3, SEQ ID N0: 4, e SEQ ID N0: 5. A relação destas seqüências é descrita mais particularmente aqui e na legenda para a Figura 1 e com referência à Figura 1.
Plantas de milho crescidas de semente que são homozigotos para o DNA diagnóstico para evento de milho transgênico MON89Ü34 estão também dentro do escopo da presente invenção. Plantas de milho crescidas de semente que são heterozigotos para o DNA diagnóstico para evento de milho transgênico MON89034 estão também dentro do escopo da presente invenção desde que estas semente também compreendam as seqüências de DNA diagnóstico. Células, semente, e tecido produzidos de tais plantas compreendendo o DNA diagnóstico estão também dentro do escopo da pre- sente invenção.
Plantas de milho e células de planta de milho e outros compre- endendo o DNA diagnóstico para o evento de milho transgênico MON89034 exibem resistência à infestação de insetos lepidópteros. Estas células e plantas contêm DNA que codifica a proteína inseticida (agente inseticida, tóxico) Cry2Ab e DNA tendo seqüências de nucleotídeo da SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 que formam uma parte do genoma das células da planta. Es- tas plantas e células da planta também contêm um DNA que codifica a pro- 22
teína inseticida (agente inseticida, tóxico) Cry1A.105. Estas proteínas podem ser referidas como uma primeira e uma segunda proteína inseticida, respec- tivamente ou no inverso. Expressão destas proteínas é alcançada dos com- ponentes reguladores/elementos genéticos que estão embutidos dentro dos cassetes de expressão que fornecem a expressão de cada uma das se- qüências de DNA que codifica estas toxinas e são descritos completamente aqui e na legenda para a Figura 1 e com referência à Figura 1 e a seqüência como exposta na SEQ ID N0: 5. Plantas de milho e células da planta de mi- lho compreendendo estas seqüências são eficazes para proteger plantas de infestação de peste lepidóptero, ou heterozigoto ou homozigoto para os ale- los nos quais estas seqüências de codificação estão presentes.
A presente invenção também fornece amplicons que pode ser produzidos das seqüências descritas aqui que são diagnóstico para a pre- sença em uma amostra biológica de DNA derivada de DNA do evento de milho transgênico MON89034. Um amplicon diagnóstico para a presença de DNA transgênico do evento de milho MON89034 em uma amostra biológica contém pelo menos um segmento de polinucleotídeo que consiste na se- qüência de nucleotídeo como exposta na SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2. Es- tes amplicons podem ser produzidos usando seqüências de iniciador como descritas aqui abaixo de qualquer amostra biológica contendo pelo menos cerca de 0,5 femto-mole ou cerca de 0,5 pico-grama de DNA derivado do evento de milho transgênico MON89034. Tais fontes de amostra biológica de DNA que correspondem ao evento de milho transgênico MON89034 podem ser fubá, óleo de milho, bolo de milho, semente de milho, germe de milho, amido de milho, e farinha de milho e outras derivadas daquele evento trans- gênico.
A invenção também fornece moléculas de polinucleotídeo isola- das tais como as que exibem seqüências de nucleotídeo contíguas como aquelas expostas na SEQ ID N0: 5. Estas seqüências de nucleotídeo contí- guas compreendem: (1) de cerca de 11 a cerca de 12000 nucleotídeos e qualquer comprimento entre este, e também compreendem os nucleotídeos contíguos como expostos na posição de nucleotídeo 1-11 ou 9-20 na SEQ ID N0: 1 e 1-11 ou 9-20 como expostos na SEQ ID N0: 2; (2) qualquer se- qüência de nucleotídeo contígua como exposta na SEQ ID N0: 3 de cerca de .11a cerca de 2000 nucleotídeos e qualquer comprimento entre este, e tam- bém compreendem os nucleotídeos contíguos como expostos na posição de nucleotídeo 1-11 e 9-20 como expostos na SEQ ID N0: 1; qualquer seqüên- cia de nucleotídeo contígua como exposta na SEQ ID N0: 4 de cerca de 11 a cerca de 914 nucleotídeos e qualquer comprimento entre este, e também compreende os nucleotídeos contíguos como expostos na posição de nucle- otídeo 1-11 e 9-20 como expostos na SEQ ID N0: 2. Estas moléculas de po- linucleotídeo isoladas são úteis no método de amplificação de DNAs para produzir um ou mais amplicons de uma amostra biológica contendo DNA de milho. A detecção de um tal amplicon é diagnóstico para a presença de DNA do evento de milho transgênico MON89034 na amostra. As moléculas de polinucleotídeo isoladas são também úteis em vários métodos de detecção de nucleotídeo para detectar a presença de DNA derivado do evento de mi- lho transgênico MON89034 em uma amostra biológica. Em particular, son- das de polinucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 11 nucleotí- deos contíguos como expostos na SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2 são úteis como sondas em tais métodos para detectar o DNA do evento transgênico MON89034 em uma amostra. As seqüências complementares destas molé- culas de polinucleotídeo isoladas são também úteis nos mesmos métodos de detecção e/ou de amplificação.
Kits para o uso na detecção da presença de DNA derivado do evento de milho transgênico MON89034 em uma amostra biológica são também fornecidos pela presente invenção. Um kit usa uma molécula de polinucleotídeo de sonda, a molécula de sonda contendo pelo menos de cerca de 11 a cerca de 12000 nucleotídeos contíguos que exibem homologia substancial, ou exibem complementaridade substancial a um segmento de nucleotídeo compreendendo uma seqüência como exposta na SEQ ID N°: 5, seria útil para detectar a presença de DNA de MON89034 em uma amostra. A molécula de sonda deveria conter pelo menos uma das seqüências como expostas na SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2. As seqüências expostas na SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 podem também ser referidas como seqüências de junção, isto é, as seqüências em qualquer terminação do DNA transgênico inserido na planta de milho para dar origem ao evento de milho transgênico MON89034. Estas seqüências, arbitrariamente referidas como terminações 5' e 3' respectivamente, contêm parte da seqüência de DNA inserida e parte da seqüência de genoma de milho de flanqueamento. Por exemplo, SEQ ID N0: 1 representa em sua metade 5" o término 3' da terminação de genoma de milho flanqueando a terminação 5' do DNA inserido, a terminação 5' do DNA inserido sendo representada pela metade da terminação 3' da seqüência como exposta na SEQ ID N0: 1. SEQ ID N0: 2 representa em sua metade de 5' os términos 3' da terminação do DNA inserido, e em sua metade da 3' os términos 5' da terminação da seqüência de genoma de milho flanqueando a terminação 3' do DNA inserido. No genoma de milho de ocorrência natural na posição da seqüência inserida exposta na SEQ ID N0: 5, a seqüência de flanqueamento na terminação 5' do DNA inserido e a seqüência de flanque- amento na terminação 3' do DNA inserido são unidas, e uma primeira molé- cula de iniciador que hibridar com a seqüência complementar à seqüência exposta na SEQ ID N0: 3 (diferente dos 21 nucleotídeos da terminação 3' da SEQ ID N0: 3) e uma segunda molécula de iniciador que hibridar com a se- quência como exposta na SEQ ID N0: 4 (diferente dos 20 nucleotídeos da terminação 5' da SEQ ID N0: 4) produzirá um amplicon em uma reação de amplificação térmica com modelo que é DNA diferente do DNA de MON89034 que é diagnóstico para a ausência do DNA inserido em MON89034, e os mesmos iniciadores produzirão um amplicon que é Iigeira- mente maior que 12000 nucleotídeos (dependendo da posição dos iniciado- res nas seqüências de flanqueamento expostas na SEQ ID N0: 3 e SEQ ID N0: 4) quando usando DNA de MON89034 como um modelo. Outras modali- dades são também fornecidas.
Um kit para detectar a seqüência de junção SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N0: 2 do evento de milho MON89034 em uma amostra biológica é fornecido. O kit contém uma sonda de polinucleotídeo que é ou é completa- mente complementar a uma seqüência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2 ou complementos das mesmas, e também contém um par de iniciadores para uso em uma reação de amplificação de ácido nucléico. O par de iniciadores pode ser referido como um primeiro ini- ciador consistindo em pelo menos cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos contíguos da porção de genoma de milho da SEQ ID N0: 3 e um segundo iniciador que consiste em pelo menos cerca de 15 a cerca de 50 nucleotí- deos contíguos complementares à porção de DNA inserido heterólogo da SEQ ID N0: 5. O primeiro iniciador do par de iniciadores de polinucleotídeo especificamente hibrida com a seqüência de complemento reversa que cor- responde à exposta na SEQ ID N0: 3 de cerca da posição de nucleotídeo 1 a cerca da posição 2050 e o segundo iniciador do dito par de iniciadores de polinucleotídeo especificamente hibrida com a seqüência como exposta na SEQ ID N0: 5 de cerca da posição de nucleotídeo 2060 a cerca da posição de nucleotídeo 12.208, e são estendidas uma em direção à outra para for- mar um amplicon compreendendo a SEQ ID N0: 1, o dito amplicon sendo diagnóstico para a presença de DNA do evento de MON89034 na amostra. Um par diferente de iniciadores pode ser referido como um primeiro iniciador consistindo em pelo menos cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos contí- guos complementares à porção do genoma de milho da SEQ ID N°: 4 e um segundo iniciador que consiste em pelo menos cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos contíguos da porção de DNA inserido heterólogo da SEQ ID N0: 5. O primeiro iniciador do par de iniciadores de polinucleotídeo especifi- camente hibrida com a seqüência de complemento reversa que corresponde à exposta na SEQ ID N0: 5 de cerca da posição de nucleotídeo 1 a cerca da posição 11.370 e o segundo iniciador do par de iniciadores de polinucleotí- deo especificamente hibrida com a seqüência como exposta na SEQ ID N°: 4 de cerca da posição de nucleotídeo 1 a cerca da posição de nucleotídeo 914, e são estendidas uma em direção à outra para formar um amplicon compreendendo a SEQ ID N0: 2, o dito amplicon sendo diagnóstico para a presença de DNA do evento de MON89034 na dita amostra.
Estes pares de iniciador são úteis em produzir amplicons com- preendendo ou SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2, como pode ser o caso, e são desse modo diagnóstico para a presença de DNA de MON89034 em uma amostra biológica. Estes amplicons permitem a detecção da presença de uma seqüência de junção diagnóstico do evento de milho MON89034 em uma amostra biológica.
Um método para produzir e detectar um amplicon que é diagnós- tico para um DNA do evento de milho transgênico MON89034 em uma a- mostra biológica compreendendo DNA de milho é também fornecido. O mé- todo compreende contatar a amostra biológica junto com dois ou mais inicia- dores em uma reação de amplificação de ácido nucléico, executar uma rea- ção de amplificação de ácido nucléico, depois detectar o amplicon. A pre- sença do amplicon é diagnóstico para o dito DNA do evento na amostra desde que o amplicon contenha pelo menos uma das seqüências contíguas como expostas na SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2, de cerca da posição de nu- cleotídeo 1 - 11 ou 9-20, ou as seqüências complementares que correspon- dem a estas posições.
As seqüências de nucleotídeo diagnóstico para a presença de evento de milho transgênico MON89034 em uma amostra biológica podem também ser detectadas usando outros métodos. Por exemplo, contatando uma amostra biológica suspeita de conter DNA de MON89034 com uma sonda que hibrida sob condições de hibridação rigorosa com uma ou mais das seqüências de nucleotídeo como expostas na SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2, submetendo a amostra e sonda às condições de hibridação rigorosa; e depois detectando a hibridação da sonda para a seqüência de nucleotídeo. Detecção da hibridação é diagnóstico para a presença do DNA de MON89034 na amostra.
Polinucleotídeos iniciadores para o uso na produção, em uma reação de amplificação térmica, de um amplicon que é diagnóstico para a presença de DNA do evento de milho MON89034 em uma amostra biológica são também fornecidos pela presente invenção. Tipicamente, os iniciadores são fornecidos em pares, os membros do par de iniciadores sendo referido para conveniência como um primeiro iniciador e um segundo iniciador. Um primeiro iniciador pode consistir em pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos da porção de genoma de milho como exposto na SEQ ID N0: 3 e um segundo iniciador pode consistir em pelo menos cerca de 15 nucleotí- deos contíguos complementares à porção de DNA inserido heterólogo como exposta na SEQ ID N0: 5. Estes dois iniciadores produziriam um amplicon em uma reação de amplificação térmica com DNA modelo obtido do evento do DNA do evento de milho MON89034 contendo uma seqüência de polinu- cleotídeo como exposta na SEQ ID N0: 1. Alternativamente, um primeiro ini- ciador pode consistir em pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos da porção de genoma de milho da SEQ ID N0: 4, e um segundo iniciador pode consistir em pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos complementa- res à porção de DNA inserido heterólogo da SEQ ID N0: 5. Estes dois inicia- dores produziriam um amplicon em uma reação de amplificação térmica com DNA modelo obtido do DNA do evento de milho MON89034 contendo uma seqüência de polinucleotídeo como exposta na SEQ ID N0: 2.
Um método alternativo para detectar uma seqüência de junção do evento de milho MON89034 em uma amostra biológica compreendendo DNA de milho, tal como SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2, consiste em contatar a amostra com uma sonda de polinucleotídeo que híbrida sob condições de hibridação rigorosa com uma das seqüências de junção, submeter a amostra e sonda às condições de hibridação rigorosa; e detectar a hibridação da sonda para a seqüência de junção. Detecção da ligação/hibridização da sonda à seqüência de junção é indicativo da presença do DNA de MON89034 na amostra biológica. Uma planta de milho estavelmente trans- formada, o DNA desta produz um amplicon de DNA compreendendo a SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2 quando submetida ao método exposto aqui, está dentro do escopo da presente invenção. Seqüências de iniciador exempla- res, em particular, um par de seqüências de iniciador, são expostas aqui nos exemplos e na SEQ ID N0: 6 e SEQ ID N0: 7.
Um método alternativo de detectar a presença de DNA do even- to de milho MON89034 em uma amostra biológica pode consistir nas etapas de contatar a amostra com uma sonda que híbrida sob condições de hibrida- ção rigorosa com DNA de MQN89034 e não híbrida sob condições de hibri- dação rigorosa com DNA genômico da planta de milho que não seja o DNA de MON89034, submeter a amostra e sonda às condições de hibridação ri- gorosa, e depois detectar a hibridação da sonda com o DNA de MON89034. Uma sonda consistente com esta modalidade é ou é complementar a uma seqüência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2. Detecção da hibridação da sonda para a amostra é diagnóstico para a presença do polinucleotídeo do evento de milho MON89034 na amostra. A amostra biológica pode ser qualquer amostra contendo DNA de MON89034 incluindo mas não limitada a óleo de milho, fubá, farinha de milho, glúten de de milho transgênico MON89034 junto com uma planta de milho diferente de evento MON89034 para produzir uma planta de milho híbrida compreenden- do o DNA diagnóstico para o dito evento. Uma tal planta de milho híbrida compreendendo o DNA diagnóstico para o evento de milho transgênico MON89034 está dentro do escopo da presente invenção, como são semente produzida do híbrido (desde que compreenda o DNA diagnóstico para even- to de milho transgênico MON89034), e pólen, óvulo, semente, raízes, ou fo- lhas da planta de milho híbrido MQN89034, também à medida que estas 29
contenham as seqüências de DNA diagnóstico, e progênie produzida de tais modalidades.
A presente invenção fornece um método para proteger uma planta de milho de infestação de insetos lepidópteros compreendendo forne- cer na dieta de um peste de inseto lepidóptero alvo uma ou mais células de planta de milho transgênica, cada célula de planta de milho compreendendo em seu genoma um polinucleotídeo que corresponde à seqüência como ex- posta em ambas as SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 e a seqüência de nucleotí- deo contígua como exposta na SEQ ID N0: 5 entre SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2. O inseto lepidóptero alvo que alimenta em tais células de planta de milho transgênica é inibido de outra alimentação na planta de milho da qual as células de planta de milho são derivadas.
Composições são também fornecidas pela presente invenção que são tóxicas para alvejar pestes lepidópteros de plantas de milho. Uma compo- sição de células de planta transgênica fornecida na dieta de uma peste de inseto lepidóptero alvo em que cada célula de planta de milho transgênica compreende em seu genoma um polinucleotídeo correspondendo à seqüên- cia como exposta em ambas as SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2, junto com a seqüência de nucleotídeo contígua como exposta na SEQ ID N0: 5 entre SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2, é eficaz para fornecer proteção contra infestação de insetos lepidópteros para uma planta de milho ou célula de planta de milho, desde que a planta de milho ou célula esteja expressando Cry1A.105 e/ou Cry2Ab2 dos cassetes de expressão contidos dentro da seqüência de nucleo- tídeo contígua. Tais composições, na forma de semente de milho transgênico, foram depositadas junto à American Type Culture Collection sob número de acesso PTA-9708. Tais plantas de milho resistentes a insetos, ou partes das mesmas, conterão o DNA no genoma das células de tal planta tendo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste na SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4, e SEQ ID N0: 5. Progênie e semente da planta de milho resistente a inseto em que a progênie e semente têm as seqüências diagnosticas referidas aqui, estão também in- clusas dentro do escopo da presente invenção. Tais plantas de milho resisten- tes a insetos podem ser produzidas por um método compreendendo cruzar um evento da planta de milho transgênica MON89034 com uma planta de mi- lho diferente, e selecionando a progênie resistente a inseto analisando pelo menos uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste na SEQ ID N0: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4 e SEQ ID N0: 5.
O evento de milho transgênico resistente a insetos MON89034 pode ser combinado com outras variedades transgênicas de milho, tais como milho resistente a herbicidas tais como glifosato, glufosinato, e diacamba, e outros, ou milho resistente a insetos devoradores de raiz como resultado da inserção das seqüências que codificam as proteínas tais como PS149BI e Cry3Bb modificado, ou outras variedades de milho transgênico resistente à infestação de insetos lepidópteros como resultado da inserção das seqüên- cias que codificam outras proteínas de toxina tais como VIP3A, CryIAb, e CryIFa e outros. Várias combinações de todos estes eventos transgênicos diferentes são desenvolvidas juntamente com as plantas de milho da presente invenção, isto é, o evento de MON89034, para fornecer variedades melhora- das de milho transgênico híbrido resistente à infestação de coleópteros e lepi- dópteros, e resistente a herbicidas seletivos. Tal exibição de variedades me- lhorou as características de rendimento e de tolerância à seca comparadas às variedades transgênicas de traço não-transgênico e individuais.
Um método de produzir uma planta de milho resistente à infesta- ção de inseto é fornecido, em que a planta de milho compreende uma quan- tidade inseticidamente eficaz das seqüências de codificação de toxina como expostas na SEQ ID N0: 5. O método compreende extrair as seqüências de codificação de toxina do evento de milho transgênico MON89034 e introduzir estas seqüências de codificação, sozinhas ou juntas, em uma ou mais célu- las de milho, para produzir células de milho transgênico compreendendo es- tas uma ou mais seqüências de codificação de toxina. As células de milho transgênico são depois crescidas (regeneradas) em plantas de milho trans- gênicas compreendendo a uma ou mais seqüências de codificação, e as plantas transgênicas depois exibindo resistência à infestação de insetos.
Um método para determinar a zigosidade do DNA de uma planta de milho transgênica compreendendo DNA do evento de milho MON89034, com respeito ao DNA que é diagnóstico para a presença de tal DNA de MON89034 em uma amostra biológica, é fornecido pela presente invenção. O método consiste em, como uma primeira etapa, contatar a amostra com três iniciadores diferentes compreendendo SEQ ID N0: 6, SEQ ID N0: 7, e SEQ ID N0: 10, que quando usada junto em uma reação de amplificação de ácido nu- cléico compreendendo DNA do evento de milho MON89034, produz um pri- meiro amplicon que é diagnóstico para o evento de milho MON89034, e quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico compreen- dendo DNA de milho genômico diferente de DNA de MON89034, produz um segundo amplicon que é diagnóstico para DNA de milho genômico diferente de DNA de MON89034. As etapas a seguir consistem em executar uma rea- ção de amplificação de ácido nucléico, e comparar os amplicons produzidos durante a reação de amplificação térmica. Detecção da presença de ambos os amplicons é diagnóstico da zigosidade da amostra. Detecção apenas do primeiro amplicon é indicativo da amostra contendo apenas DNA de MON89034, isto é, uma amostra homozigota. Detecção apenas do segundo amplicon é indicativo da amostra não contendo nenhum DNA de MON89034. Detecção de ambos os primeiro e segundo amplicons junto em uma amostra é indicativo de uma amostra contendo (1) DNA heterozigoto com referência a uma amostra pura contendo apenas material de partida heterozigoto, ou (2) uma amostra contendo DNA's de amostra de partida tanto homozigoto como heterozigoto, ou (3) uma amostra contendo um pouco da combinação de ho- mozigoto, heterozigoto, e/ou amostras diferentes de DNA de MON89034.
A invenção também fornece cultivar plantas de milho compreen- dendo o DNA diagnóstico para um segmento de DNA transgênico inserido no genoma das células das plantas de milho. O DNA no genoma das células de milho compreende qualquer uma ou todas as seqüências selecionadas do grupo que consiste em: (a) a seqüência de nucleotídeo como exposta na SEQ ID N0: 5; (b) ambas as seqüências de nucleotídeo como expostas na SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N°: 2; (c) a seqüência de nucleotídeo como exposta na SEQ ID N0: 3; e (d) a seqüência de nucleotídeo como exposta na SEQ ID N0: 4. 32
Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar exemplos de certas modalidades preferidas da invenção. Deveria ser apreciado por aqueles de habilidade na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam métodos que os inventores descobriram para bom funcionamento na prática da invenção, e desse modo podem ser considera- dos constituírem exemplos de modos preferidos para sua prática. Porém, aqueles de habilidade na técnica devem, levando em conta a descrição pre- sente, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades es- pecíficas que são descritas e ainda obter um resultado igual ou similar sem divergir do espírito e escopo da invenção. Exemplos Exemplo 1
Este Exemplo ilustra a construção e caracterização molecular do evento de milho transgênico MON89Q34.
A planta de milho MON89034 foi produzida por um processo de transformação mediado por Agrobacterium de uma linha de milho congênita com a construção de plasmídeo pMON38850 (o cassete de expressão é mostrado na Figura 1). O método de transformação usado é similar ao des- crito na patente US No. 6.603.061. A construção de plasmídeo pMON38850 contém os cassetes de expressão da planta ligados com os elementos gené- ticos reguladores necessários para a expressão da proteína inseticida Cry1A.105 em células de planta de milho. As células de milho foram regene- radas nas plantas de milho intactas consistindo em pelo menos cerca de 23.000 eventos transgênicos diferentes. Eventos transgênicos individuais (plantas) foram selecionados da população de eventos mostrando integrida- de dos cassetes de expressão da planta e resistência ao dano de alimenta- ção por larvas de insetos Lepidópteros. Uma planta de milho contendo em seu genoma os cassetes de expressão da planta ligados de pMON38850 é um aspecto da presente invenção. Após análise substancial destes eventos transgênicos, o evento transgênico MON89034 foi selecionado em base de sua caracterização molecular e a ausência de qualquer efeito de deficiência fenotípica ou agronômica indesejável. 33
As seqüências dos elementos genéticos de transgene contidas no genoma de milho de MON89034 como ilustrado na Figura 1 consistem nos elementos a seguir cada em ligação operável um com o outro. Primeiro na terminação 5' arbitrariamente definida da seqüência (isto é, próximo à porção central esquerda do segmento descrito na Figura 1) é marcada uma porção da região de borda direita (RB) de Agrobacterium tumefaciens. Este é seguido em seqüência por um cassete de expressão que consiste em um elemento de promotor de CaMV 35S intensificado (aqui referido como P-CaMV35Sen, localizado nas posições 2350 a 2651 na SEQ ID N0: 5); uma seqüência líder não-transladada da proteína Iigadora A/B de clorofila de trigo (aqui referida como L-Ta.lhcbl, localizada nas posições 2678 a 2738 na SEQ ID N0: 5); uma seqüência de íntron de actina de arroz (aqui referida como L-Os.Actl1 localizada nas posições 2755 a 3234 na SEQ ID N0: 5); uma se- qüência de ocorrência não-natural codificando o gene quimérico Cry1A.105 (localizada nas posições 3244 a 6777 na SEQ ID N0: 5); e uma região de terminação 3' de trigo (aqui referida como T-Ta.Hspl7-l:l:l, localizada nas po- sições 6809 a 7018 na SEQ ID N0: 5). A combinação dos elementos acima referidos, diferente da seqüência da borda, funciona junto quando em uma planta de milho para causar a expressão da proteína inseticida de Cry1A.105. Estes elementos são depois ligados em seqüência a outro cas- sete de expressão que consiste nos elementos a seguir: um promotor do mosaico de escrofulária (localizado nas posições 7086 a 7649 na SEQ ID N0: 5), um líder de Hsp70 de Zea mays (aqui referido como HSP70 ou L- Hsp70, localizado nas posições 7672 a 8475 na SEQ ID N0: 5), e uma se- quência de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto (aqui referida como CTP2 ou TS-SSU-CTP, localizada nas posições 8492 a 8892 na SEQ ID N0: 5). Estes segmentos operavelmente ligados são depois ligados a uma seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína inseticida Cry2Ab (locali- zada nas posições 8893 a 10800 na SEQ ID N0: 5) que está ligada em sua terminação 3' a uma região não-transladada de 3' do gene da nopalina sinta- se de Agrobacterium tumefaciens (aqui referido como T-AGRtu.nos-1:1:13, localizado nas posições 10827 a 11377 na SEQ ID N0: 5). Estes elementos flanqueando a seqüência de codificação de Cry2Ab juntos funcionam para direcionar a expressão de Cry2Ab quando presente em uma planta de milho. O cassete de expressão de Cry2Ab é depois seguido em seqüência por uma seqüência de nucleotídeo que consiste em uma porção suficiente da região da borda esquerda (LB) de Agrobacterium tumefaciens.
Moléculas de DNA úteis como iniciadores em métodos de ampli- ficação de DNA podem ser derivadas das seqüências dos elementos genéti- cos da inserção do transgene contida no evento de MON89034. Estas molé- culas de iniciador podem ser usadas como parte de um conjunto de iniciador que também inclui uma molécula de iniciador de DNA derivada do genoma do evento flanqueando a inserção do transgene.
A porção do DNA do plasmídeo pMON38850 inserido no genoma de milho, dando origem ao evento de planta de milho transgênica MON89034, consistindo nos segmentos das bordas esquerda e direita, e os dois cassetes de expressão da planta ligados (um primeiro cassete de expressão codifican- do Cry1A.105, e um segundo cassete de expressão codificando Cry2Ab, em que cada cassete pode ser alternável sobre um se for designado como sendo um primeiro ou um segundo cassete) entre os segmentos da borda foi carac- terizado por análises moleculares detalhadas. Estas análises foram conduzi- das para identificar eventos que continham apenas um segmento inserido sim- ples e intacto que consiste nas bordas e nos dois cassetes de expressão dese- jados entre as bordas (número de sítios de integração dentro do genoma de milho), no número de cópias (o número de cópias do T-DNA dentro de um Io- cus), e na integridade dos cassetes de gene inseridos (isto é, ausência de qual- quer rearranjo ou variação de seqüência da seqüência conhecida estar presen- te no plasmídeo pMON38850). Sondas moleculares de DNA foram usadas que incluíram a região de codificação de Cry1A.105 intacta e seus respectivos ele- mentos reguladores, os promotores, íntrons, e seqüências de poliadenilação dos cassetes de expressão da planta, e a região de DNA da cadeia principal do plasmídeo pMON38850. Os dados obtidos das análises de todos os eventos demonstraram que MON89034 contém uma inserção de T-DNA simples com uma cópia do cassete de expressão de Cry 1 A. 105. Nenhum elemento adicional 35
do vetor de transformação pMON38850, ligado ou não-ligado aos cassetes de genes intactos, foi detectado no genoma de MON89034. Por fim, análises de seqüência de PCR e de DNA foram executadas para determinar as junções do genoma de inserção-à-planta de 5' e 3', que confirmam a organização dos elementos dentro da inserção (vide por exemplo, Figura 1), e determinam a seqüência completa do DNA inserido no genoma da planta de milho que deu origem ao evento de milho transgênico MON89034. A seqüência inserida completa, junto com uma porção das seqüências de flanqueamento do geno- ma de milho em qualquer terminação do DNA inserido, é descrita na sequên- cia como exposta na SEQ ID N0: 5.
DNA genômico de MON89034, e DNA não-transgênico de milho diferente de MON89034 (DNA de controle) foi extraído da semente de milho primeiro processando a semente (até 200 sementes) para um pó fino em um agitador de tinta Harbil 5G-HD (Harbil lnc, Cincinnati, Ohio). Brevemente, a se- mente em pó foi extraída em tampão de extração (EM Science Cat. N0 3700, EM Science, Gibbstown, Nova Jersey, USA) e o DNA precipitado da solução com isopropanol (Sigma Cat. N0 1-0398, Sigma, St., Louis, MO, USA). O DNA precipitado foi enrolado em carretei em um tubo de microcentrífuga contendo 70 por cento de etanol. O DNA foi empelotado em uma microcentrífuga em ve- Iocidade máxima (-14,000 rpm) durante ~5 minutos, secado a vácuo, e redis- solvido em tampão de TE (pH 8,0). O DNA foi depois armazenado em um refri- gerador de 4°C. Este método pode ser modificado por alguém versado na téc- nica para extrair o DNA de uma semente de milho simples.
Métodos exemplares usados para identificar o evento MON89034 em uma amostra são descritos em um ponto terminal específico para evento Taqman PCR para o qual exemplos de condições são descritos na Tabela 1 e Tabela 2. Os iniciadores de DNA usados no ensaio são inicia- dores SQ2842 (SEQ ID N0: 6), SQ2843 (SEQ ID N0: 7), iniciador marcado 6FAM® PB880 (SEQ ID N0: 14) e iniciador marcado VIC® PB2931 (SEQ ID N0: 15), 6FAM e VIC são produtos de tintura florescente de Applied Biosys- tems (Foster City, CA) ligados aos iniciadores de DNA. Para sondas de MGB de Taqman, a atividade de 5'-exonuclease de Taq DNA polimerase cliva a sonda da terminação 5', entre o fluoróforo e extintor. Quando hibridada com o filamento de DNA alvo, o extintor e o fluoróforo são suficientemente sepa- rados em espaço tridimensional para produzir um sinal fluorescente (com- primento de onda de excitação de fluoróforo).
SQ2842 (SEQ ID N0: 6), e SQ2843 (SEQ ID N0: 7), quando usa- do nestes métodos de reação com PB880 (SEQ ID N0: 14) produzem um amplicon de DNA que é diagnóstico para o DNA do evento MON89034. Os controles para esta análise deveriam incluir um controle positivo de milho contendo o DNA do evento MON89034, um controle negativo de milho não- transgênico ou de milho transgênico diferente do evento MON89034, e um controle negativo não contendo nenhum DNA modelo.
SQ1564 (SEQ ID N0: 17) e SQ1565 (SEQ ID N0: 18) quando u- sados nestes métodos de reação com PB351 (SEQ ID N0: 21) produzem um amplicon que é diagnóstico de Cry1A.105 em MON89034.
Estes ensaios são otimizados para o uso com Applied Biosys- tems GeneAmp PCR System 9700 ou Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou termociclizador de Eppendorf Mastercycler Gradiente. Outros métodos e aparelho conhecidos àqueles versados na técnica que produzem amplicons que identificam o DNA do evento MON89034 alvo es- tão dentro da habilidade da técnica.
Qualquer sonda que especificamente liga à SEQ ID N0: 1 ou à sua seqüência complementar perfeita em uma amostra biológica e contém pelo menos 11 nucleotídeos contíguos como expostos na SEQ ID N0: 1, ou como pode ser o caso, o complemento reverso da seqüência na SEQ ID N°: .1, desde que a ligação possa ser detectada, é diagnóstico para a presença de DNA do evento de milho MON89034 naquela amostra. Qualquer sonda que especificamente liga à SEQ ID N0: 2 ou à sua seqüência complementar perfeita em uma amostra biológica e contém pelo menos 11 nucleotídeos contíguos como expostos na SEQ ID N0: 2, ou como pode ser o caso, o complemento reverso da seqüência na SEQ ID N0: 2, desde que a ligação possa ser detectada, é diagnóstico para a presença de DNA do evento de milho MQN89034 naquela amostra. 37 Qualquer par de iniciadores que é usado ou projetado para o uso em produzir um amplicon de uma amostra biológica compreendendo DNA de milho, e o amplicon compreende ou SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2, ou como pode ser o caso, compreende ambas as seqüências, é considerado estar dentro do escopo da presente invenção. Qualquer tal amplicon compreen- dendo ou SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2, ou ambas, é considerado, para o propósito da invenção descrita aqui, ser diagnóstico para a presença do DNA do evento de milho MON89034 em tal amostra biológica. O exemplo a seguir é fornecido como referência a alguém versado na técnica.
Tabela 1. PCR Taqman de Ponto Terminal Específico para Evento de Milho
<table>table see original document page 38</column></row><table> 38
<table>table see original document page 39</column></row><table>
A amplificação de DNA pode ser montada e conduzida usando quaisquer meios de termociclo, incluindo manipulações manuais ou manipu- lações eletronicamente controladas das etapas e ciclos de temperatura. S- tratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou termociclizador Eppendorf Mastercycler Gradiente ou Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou ciclizadores térmicos de MJ Research DNA Engine PTC- 225 foram usados de forma bem sucedida para conduzir os parâmetros de ciclismo a seguir. Ao operar a PCR no Eppendorf Mastercycler Gradiente ou MJ Engine, o termociclizador foi submetido a ciclos no modo calculado. Ao usar o Perkin-Elmer 9700, as condições de ciclismo foram conduzidas com a velocidade de elevação ajustada no máximo.
Tabela 2. Condições do termociclizador do ensaio de zigosidade
Ciclo N0 Ajustes: Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 <table>table see original document page 39</column></row><table>
Exemplo 2
Este exemplo ilustra a identificação de uma planta de milho compreendendo o DNA diagnóstico para o evento de milho transgênico 39
ΜΟΝ89034 em seu genoma e a determinação da zigosidade de tal planta de milho.
Os métodos usados para identificar heterozigoto da progênie ho- mozigoto contendo DNA do evento MON89034 em seu genoma são descritos em um ensaio de zigosidade para os quais as condições são exemplificadas na Tabela 3 e Tabela 4. Os iniciadores de DNA exemplares usados no ensaio de zigosidade são iniciadores SQ2842 (SEQ ID N0: 6), SQ2843 (SEQ ID N0: 7), SQ6523 (SEQ ID N0: 10), SQ6524 (SEQ ID N0: 11), iniciador marcado 6FAM® PB880 (SEQ ID N0: 14) e iniciador marcado VIC® PB2931 (SEQ ID N°: 15). Como indicado acima, 6FAM e VIC são produtos de tintura florescente de Applied Biosystems (Foster City, CA) ligado ao iniciador de DNA.
SQ2842 (SEQ ID N0: 6), SQ2843 (SEQ ID N0: 7), SQ6523 (SEQ ID N0: 10), SQ6524 (SEQ ID N0: 11), quando usado junto em uma reação de amplificação térmica em que uma amostra biológica contendo o DNA modelo contém DNA que é diagnóstico para a presença do evento de milho MON89034 na amostra, produz um amplicon de DNA diagnóstico para DNA de milho diferente do DNA do evento de milho MON89034 (independente se o DNA de milho é derivado de amostra transgênica ou de alguma outra não- transgênica). Alternativamente, a reação produzirá dois amplicons de DNA diferentes de uma amostra biológica contendo o DNA derivado de um geno- ma de milho que é heterozigoto para o alelo que corresponde ao DNA inse- rido presente no evento de milho transgênico MON89034. Estes dois ampli- cons diferentes corresponderão a um primeiro amplicon que é derivado do Iocus do genoma de milho do tipo selvagem, e um segundo amplicon que é diagnóstico para a presença de DNA do evento de milho MON89034. Uma amostra do DNA de milho que dá origem apenas a um amplicon simples que corresponde ao segundo amplicon descrito para o genoma heterozigoto é diagnóstico para a presença do evento de milho MON89034 na amostra e é diagnóstico para determinar que o DNA de milho usado como modelo surge de uma semente de milho que é homozigoto para o alelo que corresponde ao DNA do evento de milho transgênico MON89034 inserido. Os controles para esta análise deveriam incluir um controle positivo de milho homozigoto 40
e heterozigoto contendo o DNA do evento MON89Ü34, um controle negativo de milho não-transgênico ou qualquer outra variedade transgênica de milho, e um controle negativo não contendo nenhum DNA modelo. Este ensaio é otimizado para o uso com um Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin- Elmer 9700, ou termociclizador Eppendorf Mastercycler Gradiente. Outros métodos e aparelho conhecidos àqueles versados na técnica que produzem amplicons que identifica a zigosidade da progênie dos cruzamentos feitos com plantas de MQN89034 estão dentro da habilidade da técnica.
Tabela 3. Soluções de reação do ensaio de zigosidade
<table>table see original document page 41</column></row><table> 41
<table>table see original document page 42</column></row><table>
Amplificação do DNA em um Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou termociclizador Eppendorf Mastercycler Gradiente ou Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou termociclizador MJ Re- search DNA Engine PTC-225 foram usados de forma bem sucedida para conduzir os parâmetros de ciclismo a seguir. Ao usar o Eppendorf Masterey- cler Gradiente ou MJ Engine, os ciclos foram conduzidos no modo calculado. Ao usar o Perkin-Elmer 9700, os ciclos foram conduzidos com a velocidade de elevação ajustada no máximo.
Tabela 4. Condições do termociclizador do ensaio de zigosidade3
<table>table see original document page 42</column></row><table>
a: usando Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
Semente que corresponde ao evento transgênico MON89034 foi depositada em 28 de março de 2006 sob o Tratado de Budapeste junto à American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Bulevar, Ma- nassas, Va. 20110. O número de acesso da ATCC ou designação de depósi- to de patente é PTA-7455. O depósito será mantido no local durante um pe- ríodo de 30 anos, ou 5 anos após a última solicitação, ou durante a vida efi- caz da patente, qualquer que seja mais longo, e será substituído conforme necessário durante aquele período.
Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deveria ser evidente às pessoas versadas na técnica que a invenção pode ser modificada em arranjo e detalhe sem divergir de tais princípios. Reivindi- ca-se todas as modificações que estejam dentro do espírito e escopo das reivindicações em anexo.
Todas as publicações e documentos de patente publicados cita- dos neste relatório descritivo estão incorporados aqui por referência na mesma proporção como se cada publicação individual ou pedido de patente específica e individualmente fossem indicados para serem incorporados por referência.
Listagem de Seqüência
<110> MONSANTO TECHNOLOGY LLC
Anderson, HEATHER
Douglas, Jennifer
GROAT, JEANNA
JOHNSON, SCOTT
KELLY, REBECCA
KORTE, JOHN
RICE, JAMES
<120> Planta e semente de milho que correspondem ao evento transgênico mon89034 e métodos para detecção e uso das mesmas
<130> 11899.0260.OOPCOO
<150> PCT/US2007/069662
<151> 2007-05-24
<150> 60/808,834
<151> 2006-05-26 43
<160> 22
<170> PatentXn versão 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223>Seqüência de junção 5'; correspondendo a SEQ ID N0: 5 a 2051-
2071
<400> 1
aatgagtatg atggatcagc a
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223>Seqüência de junção 3'; correspondendo a SEQ ID N°: 5 a 11295-
11314
<400> 2
actcattgca tccccggaaa
<210> 3
<211> 2071
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Seqüência franqueadora 5' mais função; correspondendo a SEQ ID
N°: 5 a 1-2071
<400> 3
aatatttaaa aatggaagta atactatatt aaaatgattc atgtggaact cctgcgcttc 60 tttttgaagt ttcaaaaggg agctttcagg gtcgcttaga gtttgtttgg ttggaaatac 120
aagcgaaaag agagctaatg agggggacat ccatattttc tatggtgttt gaataagagt 180
cacgcgggaa taagatgaac accgaaacaa tttttttgta gctacgtggt tccaaaaaat 240 44
cgagtagacg gtgtcgcttc cacctcatac tacttcaacc tcaaaccaca catccttacg 300
cgcccgccgg tgtctccgtc gtctcaagtt ctcaacatac ctacacatgt aaccactacc 360
ggtctttgtc atgtttcgaa agaagattac aggtcctcta gaagagagga cgcggggtgg 420
cgagaaagct ggggaagaaa aaggctagta catatgattg gtctgtgaac ctgtgaggtg 480
ggtaggtagg taggtggaga tttttgttaa ctggtgttgt tgacggactc gaacggggcc 540
gggcgtgtgg tgtggctagc tgtggtggtt tgctcgccag ccagccagcc acacatcagc 600
gagcatgcag agcttaagca tgtatgtacg gatcggcttg cttagcggtt aagggtgtgt 660
ttggtttggc ttttggcttt ggcttttgcc ccctaaaagc caaaagccaa ccaagggtgt 720
atttggtttg acttttggct tttggctttt gtcccctaaa agccaaaagc caaacaaagg 780
gttagatcta ggaagcagct ttttctaaaa gctggctttc tcacagtgca aatctgaaag 840
cacccctgaa cctgctttta gtggcttttc gaatggaact gtgaaaacat atatcgaaga 900 acttttaacg acttttagtg gtttccacca aacagtttag ctttttaacg gcttacagcc 960
tacaacagct ttttccacag ctcacagccc acagcaactt ttttcacagc cacagcccaa 1020
ccaaacagac cccaaagggc tgaatccagg aagcagcttt ttctaaaagc cgactttctc 1080
gtagtgtaaa actgaaaaca cccctggacc tgcttttagt ggcttttgga tggaactgtg 1140
aaaacatata tcgaagaact tttaacgact tttagtggtt tccaccaaac gatttctagc 1200
tttttaacag cacacagcct acaacagctt ttttcacagc tcacagccca caacaacttt 1260
ttctacagcc acaacccaac caaacggacc ctaaggcggc cgagcgagcg caaagcgtcg 1320
tcagctttga ttgccatgcc atctcctgct ccacttgtct ctctggccgt cgtcagccac 1380
catccaacaa ggccggtgct actggcggct cctaggtaga cgacgacgac gacgacacct 1440
ccaccgttcg ccgccgtcca ctcaccaatc aacacggaac gcccaaaaca cacacacacg 1500
cacgctgggg agggaaaaaa aggcagagac atatgcgtgc gtcgctgcat tattgtacgc 1560
gatcgaatgg catctctctc actctctctc ctccctttat taatctggta ctggctagct 1620
ggtccggcga caccgacgtg tcagctccgt cgcgcgcgtc cgtccgtccg ctggagcgga 1680
cacggaccgc ggcgtctgtc gatcgccggc tcgccgcagc gcagctacct agcacgctca 1740
cgcatgctac actgcctaca cgcacacggc cggcccaaaa gcgttccctg ccgcctgccg 1800
gccggctttt ttattattat tggaacatga ggctatttct cctcccacac gggctacgac 1860
gtgagcacga gtactgggat ccccggatcc gccctctctg tccctgctgc tactccagcc 1920
actgaaatgt tgtcagatga aacagcagag ccgatctccg cacggaaacc catgcacggc 1980
cattcaaatt caggtgccca cgtacgtcag ggtgctgctg ctactactat caagccaata 2040
aaaggatggt aatgagtatg atggatcagc a 2071 <210> 4 <211> 914
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Seqüência franqueadora 3' mais função; correspondendo a SEQ ID N°: 5 a 11295-12208
<400> 4
actcattgca tccccggaaa ttatgttttt ttaaaaacca cggtattata gataccgtgt 60
tattttttga gtattggaaa tttcatttca acccaaagtt tcttcatggc acatctagct 120
tttgcctaat accatgtagg gctacatctt aaaaatctat actactatat taaagctgca 180
ggggtagcct gtctccacct ggttctgcct cgagccaatc taaaccgtcc atctatatcc 240
atcaaatcag caccgtccgg tccgtgcgca cctcctctcc cgctattcag ttgcatactt 300
gcagcaggtt ctccctcctc accatttcct ctgcctcctc tctcgctcac tggtcagatt 360
catcctgcct ctcccgcatg cgctccctcc ccatgccccg tctcgcacta tcgccacacc 420
tcaccgcggg gagacgaaga cggtggacgc atcctcacct cctccgctag ttgtcgctct 480
tccatcctct tcaacaactt ctacataggg agaggcggtt cggcgtcccg acgccgccgc 540
ttctcccctc cccatggagg acgagaacat cgacctcggc ggcgggggcg atgcctccgc 600
tctgcataga ggagggttgt agtggcaagc agcaatgcca acaccgaggc gggccaagac 660
taggcaacaa taggacggca cgcccggttg tcagcgaggt ggcggcatcg tgtgccgcta 720
ccgaacaaca tctccggcgc tggagtcggt gagttactgc gccacccgga cgccctcaat 780
gcactgatat ctacccggtc tccatcgccg cccttcctcc cttccctctc cctgtgcctc 840
cctctcttgc cctctccctt ccaactgctc ccgccccagc cctagcccaa ccacctcccg 900
cgcagggtca ccaa 914
<210> 5
<211> 12208
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Seqüência franqueadora 5' mais Seqüência de DNA inserido mais
seqüência franqueadora 3'
<400> 5
aatatttaaa aatggaagta atactatatt aaaatgattc atgtggaact cctgcgcttc 60 46
tttttgaagt ttcaaaaggg agctttcagg gtcgcttaga gtttgtttgg ttggaaatac 120
aagcgaaaag agagctaatg agggggacat ccatattttc tatggtgttt gaataagagt 180
cacgcgggaa taagatgaac accgaaacaa tttttttgta gctacgtggt tccaaaaaat 240
cgagtagacg gtgtcgcttc cacctcatac tacttcaacc tcaaaccaca catccttacg 300
cgcccgccgg tgtctccgtc gtctcaagtt ctcaacatac ctacacatgt aaccactacc 360
ggtctttgtc atgtttcgaa agaagattac aggtcctcta gaagagagga cgcggggtgg 420
cgagaaagct ggggaagaaa aaggctagta catatgattg gtctgtgaac ctgtgaggtg 480
ggtaggtagg taggtggaga tttttgttaa ctggtgttgt tgacggactc gaacggggcc 540
gggcgtgtgg tgtggctagc tgtggtggtt tgctcgccag ccagccagcc acacatcagc 600
gagcatgcag agcttaagca tgtatgtacg gatcggcttg cttagcggtt aagggtgtgt 660
ttggtttggc ttttggcttt ggcttttgcc ccctaaaagc caaaagccaa ccaagggtgt 720
atttggtttg acttttggct tttggctttt gtcccctaaa agccaaaagc caaacaaagg 780
gttagatcta ggaagcagct ttttctaaaa gctggctttc tcacagtgca aatctgaaag 840
cacccctgaa cctgctttta gtggcttttc gaatggaact gtgaaaacat at^tcgaaga 900
acttttaacg acttttagtg gtttccacca aacagtttag ctttttaacg gcttacagcc 960
tacaacagct ttttccacag ctcacagccc acagcaactt ttttcacagc cacagcccaa 1020
ccaaacagac cccaaagggc tgaatccagg aagcagcttt ttctaaaagc cgactttctc 1080
gtagtgtaaa actgaaaaca cccctggacc tgcttttagt ggcttttgga tggaactgtg 1140
aaaacatata tcgaagaact tttaacgact tttagtggtt tccaccaaac gatttctagc 1200
tttttaacag cacacagcct acaacagctt ttttcacagc tcacagccca caacaacttt 1260
ttctacagcc acaacccaac caaacggacc ctaaggcggc cgagcgagcg caaagcgtcg 1320
tcagctttga ttgccatgcc atctcctgct ccacttgtct ctctggccgt cgtcagccac 1380
catccaacaa ggccggtgct actggcggct cctaggtaga cgacgacgac gacgacacct 1440
ccaccgttcg ccgccgtcca ctcaccaatc aacacggaac gcccaaaaca cacacacacg 1500
cacgctgggg agggaaaaaa aggcagagac atatgcgtgc gtcgctgcat tattgtacgc 1560
gatcgaatgg catctctctc actctctctc ctccctttat taatctggta ctggctagct 1620
ggtccggcga caccgacgtg tcagctccgt cgcgcgcgtc cgtccgtccg ctggagcgga 1680
cacggaccgc ggcgtctgtc gatcgccggc tcgccgcagc gcagctacct agcacgctca 1740
cgcatgctac actgcctaca cgcacacggc cggcccaaaa gcgttccctg ccgcctgccg 1800
gccggctttt ttattattat tggaacatga ggctatttct cctcccacac gggctacgac 1860
gtgagcacga gtactgggat ccccggatcc gccctctctg tccctgctgc tactccagcc 1920
actgaaatgt tgtcagatga aacagcagag ccgatctccg cacggaaacc catgcacggc 1980 47
cattcaaatt caggtgccca cgtacgtcag ggtgctgctg ctactactat caagccaata 2040
aaaggatggt aatgagtatg atggatcagc aattacgatc atggtcaata tggagaaaaa 2100
gaaagagtaa ttaccaattt tttttcaatt caaaaatgta gatgtccgca gcgttattat 2160
aaaatgaaag tacattttga taaaacgaca aatgagtatg cgtcgtattt ataggcgaaa 2220
gcaataaaca aaattattcta attcggaaat ctttatttcg acgtgtctac attcacgtcc 2280 aaatgggggc ttagatgag aacttcacga tttggcgcgc caaagcttgg tcgagtggaa 2340
gctagctttc cgatcctacc tgtcacttca tcaaaaggac agtagaaaag gaaggtggct 2400
cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca 2460
gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa 2520
ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac 2580
aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga 2640
ggacacgctg acaagctgac tctagcagat cctctagaac catcttccac acactcaagc 2700 cacactattg gagaacacac agggacaaca caccataaga tccaagggag gcctccgccg 2760
ccgccggtaa ccaccccgcc cctctcctct ttctttctcc gttttttttt ccgtctcggt 2820
ctcgatcttt ggccttggta gtttgggtgg gcgagaggcg gcttcgtgcg cgcccagatc 2880
ggtgcgcggg aggggcggga tctcgcggct ggggctctcg ccggcgtgga tccggcccgg 2940
atctcgcggg gaatggggct ctcggatgta gatctgcgat ccgccgttgt tgggggagat 3000
gatggggggt ttaaaatttc cgccgtgcta aacaagatca ggaagagggg aaaagggcac 3060
tatggtttat atttttatat atttctgctg cttcgtcagg cttagatgtg ctagatcttt 3120
ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct 3180
tttcatgatt tgtgacaaat gcagcctcgt gcggagcttt tttgtaggta gaagtgatca 3240
accatggaca acaacccaaa catcaacgag tgcatcccgt acaactgcct cagcaaccct 3300
gaggtcgagg tgctcggcgg tgagcgcatc gagaccggtt acacccccat cgacatctcc 3360
ctctccctca cgcagttcct gctcagcgag ttcgtgccag gcgctggctt cgtcctgggc 3420
ctcgtggaca tcatctgggg catctttggc ccctcccagt gggacgcctt cctggtgcaa 3480
atcgagcagc tcatcaacca gaggatcgag gagttcgcca ggaaccaggc catcagccgc 3540
ctggagggcc tcagcaacct ctaccaaatc tacgctgaga gcttccgcga gtgggaggcc 3600
gaccccacta acccagctct ccgcgaggag atgcgcatcc agttcaacga catgaacagc 3660
gccctgacca ccgccatccc actcttcgcc gtccagaact accaagtccc gctcctgtcc 3720
gtgtacgtcc aggccgccaa cctgcacctc agcgtgctga gggacgtcag cgtgtttggc 3780
cagaggtggg gcttcgacgc cgccaccatc aacagccgct acaacgacct caccaggctg 3840
atcggcaact acaccgacca cgctgtccgc tggtacaaca ctggccgtcc tggacattgt 3900 gtccctcttc ccgaactacg actcccgcac ctacccgatc cgcaccgtgt cccaactgac 3960 ccgcgaaatc tacaccaacc ccgtcctgga gaacttcgac ggtagcttca ggggcagcgc 4020 ccagggcatc gagggctcca tcaggagccc acacctgatg gacatcctca acagcatcac 4080 tatctacacc gatgcccacc gcggcgagta ctactggtcc ggccaccaga tcatggcctc 4140 cccggtcggc ttcagcggcc ccgagtttac ctttcctctc tacggcacga tgggcaacgc 4200 cgctccacaa caacgcatcg tcgctcagct gggccagggc gtctaccgca ccctgagctc 4260 caccctgtac cgcaggccct tcaacatcgg tatcaacaac cagcagctgt ccgtcctgga 4320 tggcactgag ttcgcctacg gcacctcctc caacctgccc tccgctgtct accgcaagag 4380 cggcacggtg gattccctgg acgagatccc accacagaac aacaatgtgc cccccaggca 4440 gggtttttcc cacaggctca gccacgtgtc catgttccgc tccggcttca gcaactcgtc 4500 cgtgagcatc atcagagctc ctatgttctc ttggatacac cgtagtgctg agttcaacaa 4560 catcattgca tccgacagca ttactcaaat acccttggtg aaagcacata cacttcagtc 4620 aggtactact gttgtcagag gtccagggtt tacaggagga gacattcttc gtcgcacaag 4680 tggaggaccc tttgcttaca ctattgttaa catcaatggc caattgcccc aaqggtatcg 4740 tgcaagaatc cgctatgcct ctactacaaa tctcaggatc tacgtgactg ttgcaggtga 4800 aaggatcttt gctggtcagt tcaacaagac tatggatacc ggtgaccctt tgacattcca 4860 atcttttagc tacgcaacta tcaacacagc ttttacattc ccaatgagcc agagtagctt 4920 cacagtaggt gctgacactt tcagctcagg gaatgaagtt tacatcgaca ggtttgaatt 4980 gattccagtt actgcaaccc tcgaggctga gtacaacctt gagagagccc agaaggctgt 5040 gaacgccctc tttacctcca ccaatcagct tggcttgaaa actaacgtta ctgactatca 5100 cattgaccaa gtgtccaact tggtcaccta ccttagcgat gagttctgcc tcgacgagaa 5160 gcgtgaactc tccgagaaag ttaaacacgc caagcgtctc agcgacgaga ggaatctctt 5220 gcaagactcc aacttcaaag acatcaacag gcagccagaa cgtggttggg gtggaagcac 5280 cgggatcacc atccaaggag gcgacgatgt gttcaaggag aactacgtca ccctctccgg 5340 aactttcgac gagtgctacc ctacctactt gtaccagaag atcgatgagt ccaaactcaa 5400 agccttcacc aggtatcaac ttagaggcta catcgaagac agccaagacc ttgaaatcta 5460 ctcgatcagg tacaatgcca agcacgagac cgtgaatgtc ccaggtactg gttccctctg 5520 gccactttct gcccaatctc ccattgggaa gtgtggagag cctaacagat gcgctccaca 5580 ccttgagtgg aatcctgact tggactgctc ctgcagggat ggcgagaagt gtgcccacca 5640 ttctcatcac ttctccttgg acatcgatgt gggatgtact gacctgaatg aggacctcgg 5700 agtctgggtc atcttcaaga tcaagaccca agacggacac gcaagacttg gcaaccttga 5760 gtttctcgaa gagaaaccat tggtcggtga agctctcgct cgtgtgaaga gagcagagaa 5820 gaagtggagg gacaaacgtg agaaactcga atgggaaact aacatcgttt acaaggaggc 5880 caaagagtcc gtggatgctt tgttcgtgaa ctcccaatat gatcagttgc aagccgacac 5940 caacatcgcc atgatccacg ccgcagacaa acgtgtgcac agcattcgtg aggcttactt 6000 gcctgagttg tccgtgatcc ctggtgtgaa cgctgccatc ttcgaggaac ttgagggacg 6060 tatctttacc gcattctcct tgtacgatgc cagaaacgtc atcaagaacg gtgacttcaa 6120 caatggcctc agctgctgga atgtgaaagg tcatgtggac gtggaggaac agaacaatca 6180 gcgttccgtc ctggttgtgc ctgagtggga agctgaagtg tcccaagagg ttagagtctg 6240 tccaggtaga ggctacattc tccgtgtgac cgcttacaag gagggatacg gtgagggttg 6300 cgtgaccatc cacgagatcg agaacaacac cgacgagctt aagttctcca actgcgtcga 6360 ggaagaaatc tatcccaaca acaccgttac ttgcaacgac tacactgtga atcaggaaga 6420 gtacggaggt gcctacacta gccgtaacag aggttacaac gaagctcctt ccgttcctgc 6480 tgactatgcc tccgtgtacg aggagaaatc ctacacagat ggcagacgtg agaacccttg 6540 cgagttcaac agaggttaca gggactacac accacttcca gttggctatg ttaccaagga 6600 gcttgagtac tttcctgaga ccgacaaagt gtggatcgag atcggtgaaa ccgagggaac 6660 cttcatcgtg gacagcgtgg agcttctctt gatggaggaa taatgagatc tatcgattct 6720 agaaggcctg aattctgcat gcgtttggac gtatgctcat tcaggttgga gccaatttgg 6780 ttgatgtgtg tgcgagttct tgcgagtctg atgagacatc tctgtattgt gtttctttcc 6840 ccagtgtttt ctgtacttgt gtaatcggct aatcgccaac agattcggcg atgaataaat 6900 gagaaataaa ttgttctgat tttgagtgca aaaaaaaagg aattagatct gtgtgtgttt 6960 tttggatccc cggggcggcc gcgttaacaa gcttgagctc aggatttagc agcattccag 7020 attgggttca atcaacaagg tacgagccat atcactttat tcaaattggt atcgccaaaa 7080 ccaagaagga actcccatcc tcaaaggttt gtaaggaaga attctcagtc caaagcctca 7140 acaaggtcag ggtacagagt ctccaaacca ttagccaaaa gctacaggag atcaatgaag 7200 aatcttcaat caaagtaaac tactgttcca gcacatgcat catggtcagt aagtttcaga 7260 aaaagacatc caccgaagac ttaaagttag tgggcatctt tgaaagtaat cttgtcaaca 7320 tcgagcagct ggcttgtggg gaccagacaa aaaaggaatg gtgcagaatt gttaggcgca 7380 cctaccaaaa gcatctttgc ctttattgca aagataaagc agattcctct agtacaagtg 7440 gggaacaaaa taacgtggaa aagagctgtc ctgacagccc actcactaat gcgtatgacg 7500 aacgcagtga cgaccacaaa agaattccct ctatataaga aggcattcat tcccatttga 7560 aggatcatca gatactcaac caatccttct aggatctacc gtcttcggta cgcgctcact 7620 ccgccctctg cctttgttac tgccacgttt ctctgaatgc tctcttgtgt ggtgattgct 7680 gagagtggtt tagctggatc tagaattaca ctctgaaatc gtgttctgcc tgtgctgatt 7740 acttgccgtc ctttgtagca gcaaaatata gggacatggt agtacgaaac gaagatagaa 7800 cctacacagc aatacgagaa atgtgtaatt tggtgcttag cggtatttat ttaagcacat 7860 gttggtgtta tagggcactt ggattcagaa gtttgctgtt aatttaggca caggcttcat 7920 actacatggg tcaatagtat agggattcat attataggcg atactataat aatttgttcg 7980 tctgcagagc ttattatttg ccaaaattag atattcctat tctgtttttg tttgtgtgct 8040 gttaaattgt taacgcctga aggaataaat ataaatgacg aaattttgat gtttatctct 8100 gctcctttat tgtgaccata agtcaagatc agatgcactt gttttaaata ttgttgtctg 8160 aagaaataag tactgacagt attttgatgc attgatctgc ttgtttgttg taacaaaatt 8220 taaaaataaa gagtttcctt tttgttgctc tccttacctc ctgatggtat ctagtatcta 8280 ccaactgaca ctatattgct tctctttaca tacgtatctt gctcgatgcc ttctccctag 8340 tgttgaccag tgttactcac atagtctttg ctcatttcat tgtaatgcag ataccaagcg 8400 gcctctagag gatcagcatg gcgcccaccg tgatgatggc ctcgtcggcc accgccgtcg 8460 ctccgttcca ggggctcaag tccaccgcca gcctccccgt cgcccgccgc tcctccagaa 8520 gcctcggcaa cgtcagcaac ggcggaagga tccggtgcat gcaggtaaca aat^gcatcct 8580 agctagtagt tctttgcatt gcagcagctg cagctagcga gttagtaata ggaagggaac 8640 tgatgatcca tgcatggact gatgtgtgtt gcccatccca tcccatttcc- caaccccaaa 8700 cgaaccaaaa cacacgtact acgtgcaggt gtggccggcc tacggcaaca agaagttcga 8760 gacgctgtcg tacctgccgc cgctgtcgac cggcgggcgc atccgctgca tgcaggccat 8820 ggacaactcc gtcctgaact ctggtcgcac caccatctgc gacgcctaca acgtcgcggc 8880 gcatgatcca ttcagcttcc agcacaagag cctcgacact gttcagaagg agtggacgga 8940 gtggaagaag aacaaccaca gcctgtacct ggaccccatc gtcggcacgg tggccagctt 9000 ccttctcaag aaggtcggct ctctcgtcgg gaagcgcatc ctctcggaac tccgcaacct 9060 gatctttcca tctggctcca ccaacctcat gcaagacatc ctcagggaga ccgagaagtt 9120 tctcaaccag cgcctcaaca ctgataccct tgctcgcgtc aacgctgagc tgacgggtct 9180 gcaagcaaac gtggaggagt tcaaccgcca agtggacaac ttcctcaacc ccaaccgcaa 9240 tgcggtgcct ctgtccatca cttcttccgt gaacaccatg caacaactgt tcctcaaccg 9300 cttgcctcag ttccagatgc aaggctacca gctgctcctg ctgccactct ttgctcaggc 9360 tgccaacctg cacctctcct tcattcgtga cgtgatcctc aacgctgacg agtggggcat 9420 ctctgcagcc acgctgagga cctaccgcga ctacctgaag aactacacca gggactactc 9480 caactattgc atcaacacct accagtcggc cttcaagggc ctcaatacga ggcttcacga 9540 catgctggag ttcaggacct acatgttcct gaacgtgttc gagtacgtca gcatctggtc 9600 gctcttcaag taccagagcc tgctggtgtc cagcggcgcc aacctctacg ccagcggctc 9660 tggtccccaa caaactcaga gcttcaccag ccaggactgg ccattcctgt attcgttgtt 9720 ccaagtcaac tccaactacg tcctcaacgg cttctctggt gctcgcctct ccaacacctt 9780 ccccaacatt gttggcctcc ccggctccac cacaactcat gctctgcttg ctgccagagt 9840 gaactactcc ggcggcatct cgagcggcga cattggtgca tcgccgttca accagaactt 9900 caactgctcc accttcctgc cgccgctgct caccccgttc gtgaggtcct ggctcgacag 9960 cggctccgac cgcgagggcg tggccaccgt caccaactgg caaaccgagt ccttcgagac 10020 cacccttggc ctccggagcg gcgccttcac ggcgcgtgga aattctaact acttccccga 10080 ctacttcatc aggaacatct ctggtgttcc tctcgtcgtc cgcaacgagg acctccgccg 10140 tccactgcac tacaacgaga tcaggaacat cgcctctccg tccgggacgc ccggaggtgc 10200 aagggcgtac atggtgagcg tccataacag gaagaacaac atccacgctg tgcatgagaa 10260 cggctccatg atccacctgg cgcccaatga ttacaccggc ttcaccatct ctccaatcca 10320 cgccacccaa gtgaacaacc agacacgcac cttcatctcc gagaagttcg gcaaccaggg 10380 cgactccctg aggttcgagc agaacaacac caccgccagg tacaccctgc gcggcaacgg 10440 caacagctac aacctgtacc tgcgcgtcag ctccattggc aactccacca tcagggtcac 10500 catcaacggg agggtgtaca cagccaccaa tgtgaacacg acgaccaaca atgatggcgt 10560 caacgacaac ggcgcccgct tcagcgacat caacattggc aacgtggtgg ccagcagcaa 10620 ctccgacgtc ccgctggaca tcaacgtgac cctgaactct ggcacccagt tcgacctcat 10680 gaacatcatg ctggtgccaa ctaacatctc gccgctgtac tgataggagc tctgatcccc 10740 atgggaattc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 10800 gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 10860 aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 10920 tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 10980 gcggtgtcat ctatgttact agatcgggga tatccccggg gcggccgcgg ggaattcggt 11040 accaagcttt ggcgcgccaa atcgtgaagt ttctcatcta agcccccatt tggacgtgaa 11100 tgtagacacg tcgaaataaa gatttccgaa ttagaataat ttgtttattg ctttcgccta 11160 taaatacgac ggatcgtaat ttgtcgtttt atcaaaatgt actttcattt tataataacg 11220 ctgcggacat ctacattttt gaattgaaaa aaaattggta attactcttt ctttttctcc 11280 atattgacca tcatactcat tgcatccccg gaaattatgt ttttttaaaa accacggtat 11340 tatagatacc gtgttatttt ttgagtattg gaaatttcat ttcaacccaa agtttcttca 11400 tggcacatct agcttttgcc taataccatg tagggctaca tcttaaaaat ctatactact 11460 atattaaagc tgcaggggta gcctgtctcc acctggttct gcctcgagcc aatctaaacc 11520 gtccatctat atccatcaaa tcagcaccgt ccggtccgtg cgcacctcct ctcccgctat 11580 tcagttgcat acttgcagca ggttctccct cctcaccatt tcctctgcct cctctctcgc 11640 tcactggtca gattcatcct gcctctcccg catgcgctcc ctccccatgc cccgtctcgc 11700 actatcgcca cacctcaccg cggggagacg aagacggtgg acgcatcctc acctcctccg 11760 ctagttgtcg ctcttccatc ctcttcaaca acttctacat agggagaggc ggttcggcgt 11820 cccgacgccg ccgcttctcc cctccccatg gaggacgaga acatcgacct cggcggcggg 11880 ggcgatgcct ccgctctgca tagaggaggg ttgtagtggc aagcagcaat gccaacaccg 11940 aggcgggcca agactaggca acaataggac ggcacgcccg gttgtcagcg aggtggcggc 12000 atcgtgtgcc gctaccgaac aacatctccg gcgctggagt cggtgagtta ctgcgccacc 12060 cggacgccct caatgcactg atatctaccc ggtctccatc gccgcccttc ctcccttccc 12120 tctccctgtg cctccctctc ttgccctctc ccttccaact gctcccgccc cagccctagc 12180 ccaaccacct cccgcgcagg gtcaccaa 12208
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência sintética; correspondendo a SEQ XD N0: 5a 2034-2055
<4 00> 6
gccaataaaa ggatggtaat ga 22 <210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência sintética; correspondendo a SEQ ID N0: 5a 11345-11367
<400> 7
ctttttctcc atattgacca tca 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <223> Seqüência sintética E
<4 00> 8
ggtatccctc cagaccagca 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência sintética
<400> 9
gtggactcct tctggatgtt gtaa 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Seqüência sintética
<400> 10 gtcagggtgc tgctgctgct a 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Seqüência sintética
<400> 11 ggtttaagaa ccattttgct ccc 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial <220> <223> Seqüência sintética; correspondendo a SEQ ID N°: 5a 2003-2026
<400> 12
tacgtcaggg tgctgctgct acta 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência sintética
<4 00> 13
atratttycg gggatgcaac caac 24
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Seqüência sintética; correspondendo a SEQ ID N°: 5a 2061-2076
<4 00> 14
atggatcagc aatgag 16
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Seqüência sintética
<400> 15
ctgtcaagcc aataaaaggg ttgttt 26
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <223> Seqüência sintética
<4 00> 16
ctgtcaagcc aataaaaggg ttgttt 26
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência sintética
<4 00> 17
caactcgtcc gtgagcatca 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Seqüência sintética; complemento reverso da seqüência correspon- dente a SEQ ID N°: 5a 4605-4628
<400> 18
aactcagcac tacggtgtat ccaa 24
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Seqüência sintética
<400> 19
gcctgccgca gaccaa
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Seqüência sintética
<400> 20
caatgcagag ctcagcttca tc 22
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Seqüência sintética; correspondendo a SEQ ID N°: 5a 4587-4
<400> 21
cagagctcct atgttct 17
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Seqüência sintética
<400> 22
tccagtacgt gcagtccctc ctccct 26

Claims (66)

1. Planta de milho transgênica designada como evento de milho transgênico MON89034, semente representativa para obter a dita planta, para produzir progênie, para obter plantas crescentes, ou para produzir uma plantação de semente compreendendo o dito evento de milho transgênico, depositado junto à American Type Culture Collection (ATCC) tendo o núme- ro de acesso PTA-7455.
2. Planta de milho transgênica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo o DNA diagnóstico para o dito evento, em que o dito DNA compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID N0: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4, e SEQ ID N0: 5.
3. Planta de milho transgênica, progênie da dita planta, células de uma planta crescida da dita planta, ou semente produzida da dita planta, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito DNA diagnóstico para o dito evento é também selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
4. Planta de milho transgênica de acordo com a reivindicação 3 processada em uma mercadoria ou comestíveis selecionados do grupo que consiste em fubá, farinha de milho, óleo de milho, proteína de milho, etanol, e DDGS.
5. Planta de milho transgênica da reivindicação 1, exibindo resis- tência à infestação de insetos lepidópteros.
6. Planta de milho transgênica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo no genoma das células da dita planta uma molécula de DNA selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
7. Amplicon diagnóstico para a presença de DNA de evento de milho transgênico MON89034 em uma amostra biológica, o dito amplicon compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste nas seqüências como expostas em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N°: -2.
8. Amplicon da reivindicação 7, em que a dita amostra biológica compreende fubá, óleo de milho, bolo de milho, semente de milho, germe de milho, amido de milho, e farinha de milho.
9. Molécula de polinucleotídeo isolada compreendendo nucleotí- deos contíguos selecionados do grupo de nucleotídeos contíguos como ex- postos em SEQ ID N0: 5, em que os ditos nucleotídeos contíguos compreen- dem de cerca de 11 a cerca de 12000 nucleotídeos, e também compreen- dem os nucleotídeos contíguos selecionados do grupo que consiste em nu- cleotídeos 1-11 ou 9-20 como expostos em SEQ ID N0: 1 e nucleotídeos 1- -11 ou 9-20 como expostos em SEQ ID N0: 2.
10. Molécula de polinucleotídeo isolada compreendendo nucleo- tídeos contíguos selecionados do grupo de nucleotídeos contíguos como expostos em SEQ ID N0: 3, em que os ditos nucleotídeos contíguos compre- endem de cerca de 11 a cerca de 2000 nucleotídeos, e também compreen- dem os nucleotídeos contíguos selecionados do grupo que consiste em nu- cleotídeos 1-11 e 9-20 como expostos em SEQ ID N0: 1.
11. Molécula de polinucleotídeo isolada compreendendo nucleo- tídeos contíguos selecionados do grupo de nucleotídeos contíguos como expostos em SEQ ID N0: 4, em que os ditos nucleotídeos contíguos compre- endem de cerca de 11 a cerca de 914 nucleotídeos, e também compreen- dem os nucleotídeos contíguos selecionados do grupo que consiste em nu- cleotídeos 1-11 e 9-20 como expostos em SEQ ID N0: 2.
12. Molécula de polinucleotídeo isolada de qualquer uma das reivindicações 9-11 em que os ditos nucleotídeos contíguos, ou o comple- mento dos mesmos, são úteis em um método de amplificação de DNA para produzir um amplicon de uma amostra biológica compreendendo DNA de milho, em que a dita detecção do dito amplicon é diagnóstico para a presen- ça de DNA de evento de milho transgênico MON89034 na dita amostra.
13. Molécula de polinucleotídeo isolada de qualquer uma das reivindicações 9-11, em que os ditos nucleotídeos contíguos, ou o comple- mento dos mesmos, são úteis em um método de detecção de nucleotídeo para detectar a presença de evento de milho transgênico MON89034 em uma amostra biológica.
14. Kit para detectar a presença de DNA de evento de milho transgênico MON89034 em uma amostra biológica compreendendo uma mo- lécula de polinucleotídeo de sonda que consiste em pelo menos de cerca de -11 a cerca de 12000 nucleotídeos contíguos exibindo homologia substancial, ou exibindo complementaridade substancial a um segmento de nucleotídeo compreendendo uma seqüência como exposta em SEQ ID N0: 5, em que a dita sonda compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em seqüências como expostas em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
15. Método para detectar um amplicon que é diagnóstico para um DNA de evento de milho transgênico MON89034 em uma amostra bioló- gica compreendendo DNA de milho, o método compreendendo: (a) contatar a dita amostra biológica junto com dois ou mais ini- ciadores em uma reação de amplificação de ácido nucléico; (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico; e (c) detectar o amplicon; em que o amplicon compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N°: 2; e em que a presença do dito amplicon é diagnóstico para o dito DNA de evento na dita amostra.
16. Método da reivindicação 15, em que o dito amplicon com- preende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em nucleotídeos contíguos 1-11 ou 9-20 da SEQ ID N0: 1 e 1-11 ou 9-20 da SEQ ID N0: 2.
17. Método para detectar a presença de uma molécula de poli- nucleotídeo diagnóstico para a presença de evento de milho transgênico MON89034 em uma amostra, o método compreendendo: (a) contatar a dita amostra com uma sonda que hibrida sob con- dições de hibridação rigorosas com a dita molécula de polinucleotídeo; (b) submeter a dita amostra e sonda a condições de hibridação rigorosas; e (c) detectar hibridação da dita sonda com a dita molécula de po- linucleotídeo; em que a dita molécula de polinucleotídeo compreende uma se- qüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: -2; e em que a detecção da hibridação na dita etapa de detecção é diagnóstico para a presença da dita molécula de polinucleotídeo na dita a- mostra.
18. Molécula de polinucleotídeo isolada e purificada compreen- dendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N°: 2.
19. Planta de milho híbrida compreendendo DNA diagnóstico para evento de milho transgênico MON89034 produzida procriando um e- vento de milho transgênico MON89034 junto com uma planta de milho dife- rente do evento MON89034.
20. Semente da planta de milho híbrida da reivindicação 20, em que a dita semente compreende o dito DNA.
21. Planta de milho híbrida compreendendo o DNA diagnóstico para o evento de milho transgênico MON89034.
22. Semente da planta de milho híbrida da reivindicação 21, em que a dita semente compreende o DNA diagnóstico para evento de milho transgênico MON89034.
23. Planta de milho crescida de semente compreendendo o DNA diagnóstico para evento de milho transgênico MON89034.
24. Célula, semente produzida, ou tecido colhido da planta de milho da reivindicação 23, em que a dita célula, semente, ou tecido compre- endem o dito DNA.
25. Método para proteger uma planta de milho de infestação de insetos lepidópteros compreendendo fornecer na dieta de uma peste de in- seto lepidóptero alvo uma ou mais células de planta de milho transgênica, cada célula de planta de milho compreendendo em seu genoma um polinu- cleotídeo que corresponde à seqüência como exposta em ambas as SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 e a seqüência de nucleotídeo contígua como exposta em SEQ ID N°: 5 entre a SEQ ID N0: 1 e a SEQ ID N0: 2, em que um inseto lepidóptero alvo que alimenta na dita célula de planta de milho transgênica é inibido de outra alimentação na dita planta de milho.
26. Método da reivindicação 25, em que a dita planta de milho também compreende um agente inseticida diferente selecionado do grupo que consiste em uma toxina de proteína para um inseto de uma classe dife- rente de um lepidóptero, uma proteína tóxica a um nematódeo, um dsRNA alvejando um gene em uma peste alvo para supressão, e uma proteína anti- fúngica.
27. Composição de células de planta transgênica para proteger uma planta de milho de infestação de insetos lepidópteros, a dita composição sendo fornecida na dieta de uma peste de inseto lepidóptero alvo, em que cada dita célula de planta de milho transgênica compreende em seu genoma um polinucleotídeo que corresponde à seqüência como exposta em ambas as SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 e a seqüência de nucleotídeo contígua como exposta em SEQ ID N0: 5 entre a dita SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
28. Planta de milho resistente a inseto, ou partes da mesma, semente da dita planta de milho tendo sito depositada junto à American Type Culture Collection sob número de acesso PTA-7455.
29. Célula de planta de milho resistente a inseto, em que o DNA tendo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4, e SEQ ID N0: 5 forma parte do genoma da célula de planta.
30. Células de progênie da célula de planta de milho resistente a inseto da reivindicação 28 em que o DNA tendo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4, e SEQ ID N0: 5 forma parte do genoma da célula de planta.
31. Células da progênie da reivindicação 30, em que as ditas células são encontradas dentro de uma semente de uma planta regenerada ou crescida da célula de planta de milho ou células da progênie da reivindi- cação 29, em que a dita semente compreende a dita pelo menos uma se- qüência de nucleotídeo.
32. Método de produzir uma planta de milho resistente a inseto compreendendo regenerar uma planta de milho da célula ou célula da pro- gênie da reivindicação 30 e cruzar a dita planta de milho com uma planta de milho diferente para produzir plantas de milho da progênie, e selecionar as plantas da progênie resistentes a inseto analisando cada para pelo menos uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4 e SEQ ID N0: 5.
33. Planta de milho resistente a inseto, ou uma parte da mesma, em que o DNA que codifica Cry2Ab e o DNA tendo seqüências de nucleotí- deo de SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2 formam uma parte do genoma nas célu- las da dita planta ou parte da mesma.
34. Célula de planta de milho resistente a inseto da reivindicação -33, compreendendo também um DNA que codifica Cry1A.105.
35. Planta de milho resistente a inseto da reivindicação 34, em que as células da planta de milho (exceto os gametas) são heterozigotas para a seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4, e SEQ ID N0: 5.
36. Célula de planta de milho resistente a inseto da reivindicação -28, em que a célula de planta de milho é homozigota para a seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 4, e SEQ ID N°: 5.
37. Método de detectar um polinucleotídeo em uma amostra bio- lógica compreendendo DNA de milho diagnóstico para evento de milho MON89034, em que o dito polinucleotídeo compreende uma seqüência de junção como exposta em SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2, o método compre- endendo: (a) contatar a dita amostra com um par de iniciadores que quan- do usados em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA de evento de milho MON89034, produzem um amplicon que é diagnóstico para evento de milho MON89034; (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico, as- sim produzindo o amplicon; e (c) detectar o amplicon; em que o dito par de iniciadores é sele- cionado do grupo que consiste em (1) um primeiro iniciador compreendendo pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos da porção de genoma de milho da SEQ ID N0: 3 e um segundo iniciador compreendendo pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos complementares para a porção de DNA inserido heterólogo da SEQ ID N0: 5, e (2) um primeiro iniciador compreen- dendo pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos complementares para a porção de genoma de milho da SEQ ID N0: 4 e um segundo iniciador com- preendendo pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos da porção de DNA inserido heterólogo da SEQ ID N0: 5; em que o dito amplicon em (1) compreende SEQ ID N0: 1 e em (2) compreende SEQ ID N0: 2.
38. Par de iniciadores de polinucleotídeo para uso na produção em uma reação de amplificação térmica um amplicon diagnóstico para a pre- sença de DNA de evento de milho MON89034 em uma amostra biológica, o par de iniciadores sendo selecionado do grupo que consiste em: (a) um primeiro iniciador compreendendo pelo menos cerca de nucleotídeos contíguos da porção de genoma de milho da SEQ ID N°: 3; e um segundo iniciador compreendendo pelo menos cerca de 15 nucleotí- deos contíguos complementares para a porção de DNA inserido heterólogo da SEQ ID N0: 5; e (b) um primeiro iniciador compreendendo pelo menos cerca de -15 nucleotídeos contíguos complementares para a porção de genoma de milho da SEQ ID N0: 4; e um segundo iniciador compreendendo pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos da porção de DNA inserido heterólogo da SEQ ID N0: 5, em que o dito amplicon produzido com o par de iniciadores em (1) compreende SEQ ID N0: 1 ou seu complemento e o dito amplicon em (2) compreende SEQ ID N0: 2 ou seu complemento.
39. Kit para Detectar a seqüência de junção SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2 do evento de milho MON89034 em uma amostra biológica, o dito kit compreendendo: (1) uma sonda de nucleotídeo que é ou é comple- tamente complementar a uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N0: 2, e (2) um par de iniciadores para uso em uma reação de amplificação de ácido nucléico, o dito par de iniciadores sen- do selecionado do grupo que consiste em: (a) um primeiro iniciador compreendendo pelo menos cerca de -15 nucleotídeos contíguos da porção de genoma de milho da SEQ ID N0: 3 e um segundo iniciador compreendendo pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos complementares para a porção de DNA inserido heterólogo da SEQ ID N0: 5; e (b) um primeiro iniciador compreendendo pelo menos cerca de -15 nucleotídeos contíguos complementares para a porção de genoma de milho da SEQ ID N0: 4; e um segundo iniciador compreendendo pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos da porção de DNA inserido heterólogo da SEQ ID N0: 5.
40. Método para detectar a seqüência de junção SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2 do evento de milho MON89034 em uma amostra biológica compreendendo DNA de milho, o dito método compreendendo: (a) contatar a dita amostra com uma sonda que híbrida sob con- dições de hibridação rigorosas com a dita seqüência de junção; (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridação rigo- rosas; e (c) detectar hibridação da sonda com a seqüência de junção; em que detecção da hibridação da sonda com a amostra biológi- ca é indicativa da presença da dita seqüência de junção na dita amostra.
41. Kit de detecção de DNA compreendendo uma sonda de poli- nucleotídeo que híbrida sob condições de hibridação rigorosas com uma ou mais seqüências de DNA compreendendo (1) pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N0: 3 e compreende SEQ ID N0: 1 ou complementos das mesmas ou (2) pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°: 4 e compreende SEQ ID N0: 2, ou complementos das mesmas.
42. Kit de detecção de DNA compreendendo um par de iniciado- res de polinucleotídeo para uso em detectar a presença de uma seqüência de junção diagnóstico de evento de milho MON89034 em uma amostra bio- lógica, em que o primeiro iniciador do dito par de iniciadores de polinucleotí- deo especificamente híbrida com a seqüência de complemento reversa que corresponde à exposta em SEQ ID N0: 3 de cerca da posição de nucleotídeo -1 a cerca da posição 2050 e o segundo iniciador do dito par de iniciadores de polinucleotídeo especificamente híbrida com a seqüência como exposta em SEQ ID N0: 5 de cerca da posição de nucleotídeo 2060 a cerca da posi- ção de nucleotídeo 12,208, e são estendidas uma em direção à outra para formar um amplicon compreendendo SEQ ID N0: 1, o dito amplicon sendo diagnóstico para a presença de DNA de evento de MON89034 na dita amos- tra.
43. Kit de detecção de DNA da reivindicação 42 em que o dito par de iniciadores é selecionado do grupo que consiste em um primeiro inici- ador compreendendo qualquer seqüência de nucleotídeo contígua pelo me- nos de cerca de 11 a cerca de 2000 nucleotídeos em comprimento como exposta em SEQ ID N0: 3 e um segundo iniciador compreendendo o com- plemento reverso de qualquer seqüência de nucleotídeo contígua pelo me- nos de cerca de 11 a cerca de 914 nucleotídeos em comprimento como ex- posta em SEQ ID N0: 4.
44. Kit de detecção de DNA compreendendo um par de iniciado- res de polinucleotídeo para uso em detectar a presença de uma seqüência de junção diagnóstico de evento de milho MON89034 em uma amostra bio- lógica, em que o primeiro iniciador do dito par de iniciadores de polinucleotí- deo especificamente hibrida com a seqüência de complemento reversa que corresponde à exposta em SEQ ID N0: 5 de cerca da posição de nucleotídeo -1 a cerca da posição 11.370 e o segundo iniciador do dito par de iniciadores de polinucleotídeo especificamente hibrida com a seqüência como exposta em SEQ ID N0: 4 de cerca da posição de nucleotídeo 1 a cerca da posição de nucleotídeo 914, e são estendidas uma em direção à outra para formar um amplicon compreendendo SEQ ID N0: 2, o dito amplicon sendo diagnós- tico para a presença de DNA de evento de MON89034 na dita amostra.
45. Molécula de DNA isolada que é ou é complementar a uma molécula de DNA selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
46. Molécula de DNA isolada para uso como uma sonda de DNA1 em que a presença da dita molécula de DNA isolada em uma amostra biológica é diagnóstico para DNA de evento de milho MON89034 em uma amostra biológica, compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos contíguos da SEQ ID N0: 1, ou o complemento da mesma.
47. Molécula de DNA isolada para uso como uma sonda de DNA, a presença da dita molécula de DNA isolada em uma amostra biológi- ca sendo diagnóstico para a presença de evento de milho MON89034 na dita amostra biológica, em que a dita molécula compreende pelo menos 11 nucleotídeos contíguos da SEQ ID N0: 2, ou o complemento da mesma.
48. Método de detectar a presença de um polinucleotídeo de evento de milho MON89034 em uma amostra biológica, o método compre- endendo: (a) contatar a amostra com um par de iniciadores de DNA; (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico, as- sim produzindo um amplicon; e (c) detectar o dito amplicon; em que o dito amplicon compreende SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2 e a detecção do dito amplicon é diagnóstico para a presença de evento de milho MON89034 na dita amostra.
49. Célula de planta de milho estavelmente transformada, o DNA desta produz um amplicon de DNA compreendendo SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 2 quando submetido ao método da reivindicação 48.
50. Método da reivindicação 48, em que o dito par de iniciadores de DNA compreende as seqüências de nucleotídeo como expostas em SEQ ID N0: 6 e SEQ ID N0: 7.
51.Método de detectar a presença de DNA de evento de milho MON89034 em uma amostra biológica compreendendo: (a) contatar a amostra com uma sonda que híbrida sob condi- ções de hibridação rigorosas com DNA de MON89034 e não híbrida sob as ditas condições com DNA genômico da planta de milho que é diferente do DNA de MQN89034, em que a dita sonda é ou é complementar a uma se- quência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0: 2; (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridação rigo- rosas; e (c) detectar hibridação da sonda para DNA de MON89034; em que a detecção da hibridação é diagnóstico para a presença do dito evento de milho MON89034 na dita amostra biológica.
52. Método de determinar a zigosidade de DNA de uma planta de milho compreendendo DNA de evento de milho MON89034 em uma a- mostra biológica compreendendo: (a) contatar a amostra com três iniciadores diferentes compre- endendo SEQ ID N0: 6, SEQ ID N0: 7, e SEQ ID N0: 10, que (1) quando usa- dos em uma reação de amplificação de ácido nucléico compreendendo DNA de evento de milho MON89034, produzem um primeiro amplicon que é diag- nóstico para evento de milho MON89034, e (2) quando usados em uma rea- ção de amplificação de ácido nucléico compreendendo DNA de milho genô- mico diferente do DNA de MON89034 produzem um segundo amplicon que é diagnóstico para DNA de milho genômico diferente do DNA de MON89034; (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico; e (c) comparar os amplicons produzidos, em que a presença de um ou ambos amplicons é diagnóstico da zigosidade da amostra.
53. Planta de milho híbrida em que pelo menos um antecessor é evento de milho MON89034.
54. Pólen, óvulo, semente, raízes, ou folhas produzidos de uma planta de milho gerada ou crescida da planta de milho híbrida da reivindica- ção 53, em que o dito pólen, óvulo, semente, raízes, ou folhas compreendem o DNA diagnóstico para o evento de milho transgênico MON89034.
55. Progênie da planta de milho híbrida MON89034 da reivindi- cação 53, em que células da dita progênie compreendem em seu genoma as seqüências como expostas em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
56. Segmento de polinucleotídeo isolado compreendendo pelo menos de cerca de 11 a cerca de 20 nucleotídeos sucessivos selecionados do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2, em que o dito seg- mento é derivado de uma célula de planta de milho transgênica MON89034.
57. Segmento de polinucleotídeo isolado derivado de genoma de planta de milho transgênica MON89034 compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que é ou é complementar a uma seqüência selecionada do gru- po que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
58. Método de detectar a presença de um polinucleotídeo de evento de milho MON89034 em uma amostra biológica, o método compre- endendo: (a) contatar a amostra com uma sonda sob condições de hibri- dação rigorosas, em que a dita sonda compreende uma seqüência de nucle- otídeo contígua que é ou é complementar a uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2; e (b) detectar hibridação da dita sonda para a dita amostra; em que hibridação da dita sonda para a dita amostra é diagnós- tico para a presença do dito polinucleotídeo de evento de milho MON89034 na dita amostra.
59. Composição compreendendo um polinucleotídeo compreen- dendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N°: 2, em que a dita composição é um produto de mercadoria sele- cionado do grupo que consiste em fubá, farinha de milho, óleo de milho, se- da de milho, amido de milho, e comestíveis processados.
60. Sonda de polinucleotídeo compreendendo de cerca de 11 a cerca de 20 nucleotídeos sucessivos em comprimento para uso em detectar a presença de DNA de evento de milho MON89034 em uma amostra bioló- gica, em que os ditos nucleotídeos sucessivos são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
61. Sonda de polinucleotídeo como expostas na Reivindicação -60 em que a dita sonda compreende um nucleotídeo selecionado do grupo que consiste em um ácido desoxirribonucléico, um ácido ribonucléico, e um análogo de nucleotídeo.
62. Sonda de polinucleotídeo como exposta na reivindicação 61 em que a dita sonda é marcada com pelo menos um fluoróforo.
63. Mercadoria ou comestíveis compreendendo seqüências de nucleotídeo de evento de milho MON89034, em que as ditas seqüências são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID N0: 1 e SEQ ID N0: 2.
64. Mercadoria ou comestíveis da reivindicação 63 selecionados do grupo que consiste em óleo de milho, amido de milho, fubá, farinha de milho, um cosmético, e um agente de massa.
65. Detecção da presença de uma seqüência de nucleotídeo diagnóstico para a presença de evento de milho MON89034 em uma amos- tra biológica, em que a dita amostra biológica é selecionada do grupo que consiste em óleo de milho, fubá, farinha de milho, glúten de milho, bolos de milho, e amido de milho.
66. Células de milho crescente compreendendo o DNA diagnós- tico para o segmento de DNA inserido inserido no genoma que corresponde ao evento de milho transgênico MON89Ü34, em que o dito segmento de DNA inserido compreende a seqüência de nucleotídeo como exposta em SEQ ID N0: 5.
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