BRPI0713097A2 - processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ativo, molécula de ácido nucleico isolada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptìdeo, polipeptìdeo, anticorpo, tecido de planta, material de propagação, material colhido ou uma planta, método para a identificação de um produto de gene, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico, do polipeptìdeo, da construção de ácido nucleico, do vetor, da planta ou tecido de planta, do material colhido da célula hospedeira ou do produto de gene identificado de acordo com o método - Google Patents

processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ativo, molécula de ácido nucleico isolada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptìdeo, polipeptìdeo, anticorpo, tecido de planta, material de propagação, material colhido ou uma planta, método para a identificação de um produto de gene, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico, do polipeptìdeo, da construção de ácido nucleico, do vetor, da planta ou tecido de planta, do material colhido da célula hospedeira ou do produto de gene identificado de acordo com o método Download PDF

Info

Publication number
BRPI0713097A2
BRPI0713097A2 BRPI0713097-0A BRPI0713097A BRPI0713097A2 BR PI0713097 A2 BRPI0713097 A2 BR PI0713097A2 BR PI0713097 A BRPI0713097 A BR PI0713097A BR PI0713097 A2 BRPI0713097 A2 BR PI0713097A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
polypeptide
nitrogen
accumulation
Prior art date
Application number
BRPI0713097-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Gunnau Plesch
Piotr Puzio
Astrid Blau
Ralf Looser
Birgit Wendel
Beate Kamlage
Oliver Schmitz
Original Assignee
Metanomics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Metanomics Gmbh filed Critical Metanomics Gmbh
Publication of BRPI0713097A2 publication Critical patent/BRPI0713097A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

PROCESSO PARA A ASSIMILAçãO, ACúMULO E/OU UTILIZAçãO DE NITROGêNIO INTENSIFICADOS E/OU PARA O TEOR DE NITROGêNIO TOTAL AUMENTADO EM UM ORGANISMO FOTOSSINTéTICO ATIVO, MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADA, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTìDEO, POLIPEPTìDEO, ANTICORPO, TECIDO DE PLANTA, MATERIAL DE PROPAGAçãO, MATERIAL COLHIDO OU UMA PLANTA, MéTODO PARA A IDENTIFICAçãO DE UM PRODUTO DE GENE, COMPOSIçãO, E, USO DA MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO, DO POLIPEPTìDEO, DA CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, DO VETOR, DA PLANTA OU TECIDO DE PLANTA, DO MATERIAL COLHIDO, DA CéLULA HOSPEDEIRA OU DO PRODUTO DE GENE IDENTIFICADO DO ACORDO COM O MéTODO. A presente invenção diz respeito à manipulação do metabolismo de nitrogênio em organismos fotossintéticos ativos, preferivelmente em plantas. Em particular, a presente invenção diz respeito a um processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados, e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ativo.

Description

"PROCESSO PARA A ASSIMILAÇÃO, ACÚMULO E/OU UTILIZAÇÃO DE NITROGÊNIO INTENSIFICADOS E/OU PARA O TEOR DE NITROGÊNIO TOTAL AUMENTADO EM UM ORGANISMO FOTOS SINTÉTICO ATIVO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, POLIPEPTÍDEO, ANTICORPO, TECIDO DE PLANTA, MATERIAL DE PROPAGAÇÃO, MATERIAL COLfflDO OU UMA PLANTA, MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE UM PRODUTO DE GENE, COMPOSIÇÃO, E, USO DA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, DO POLIPEPTÍDEO, DA CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, DO VETOR, DA PLANTA OU TECIDO DE PLANTA, DO MATERIAL COLHIDO, DA CÉLULA HOSPEDEIRA OU DO PRODUTO DE GENE IDENTIFICADO DE ACORDO COM O MÉTODO"
A presente invenção diz respeito à manipulação do metabolismo de nitrogênio em organismos ativos fotossintéticos, preferivelmente em plantas. Em particular, a presente invenção diz respeito a um processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo ativo fotossintético.
A assimilação de nutrição vegetal é essencial para o crescimento e desenvolvimento de plantas e portanto também para a quantidade e qualidade de produtos da planta. Por causa da forte influência da eficiência de utilização de nutrição sobre o rendimento da planta e qualidade do produto, uma imensa quantidade de fertilizante é vertida nos campos para otimizar o crescimento e qualidade da planta. A produtividade das plantas ordinariamente é limitada pelos três nutrientes primários, fósforo, potássio e nitrogênio, que são usualmente os elementos limitantes de taxa no crescimento da planta destes três. Portanto o elemento nutricional principal requerido para o crescimento da planta é o nitrogênio (N). Este é um constituinte de numerosos compostos importantes encontrados nas células vivas, incluindo aminoácidos, proteínas (enzimas), ácidos nucleicos e clorofila. 1,5% a 2% de matéria seca de planta são nitrogênio e aproximadamente 16% da proteína vegetal total. Assim, a disponibilidade de nitrogênio é um fator limitante principal para o crescimento de safra e produção da planta (Frink et al., 1999) e tem também um impacto maior no acúmulo de proteína e composição de aminoácido.
A planta pode utilizar uma ampla faixa de espécies de nitrogênio incluindo amônia volátil (NH3), óxidos de nitrogênio (NOx), nitrogênio mineral, como nitrato (N03-) e sais de amônio (NH4+), uréia e derivados de uréia e nitrogênio orgânico (aminoácidos, peptídeos, etc.). Algumas plantas são capazes de utilizar o nitrogênio atmosférico pelas bactérias simbióticas ou certos fungos. Entretanto, na maioria dos solo agrícolas, o nitrato (N03-) é a fonte mais importante de nitrogênio (Crawford e Glass, 1998; Hirsch e Sussman, 1999). Não obstante também o amônio NH4+ desempenha um papel importante provavelmente subestimado, porque a maioria das plantas preferencialmente captam o NH4+ quando ambas as formas estão presentes, mesmo se o NH4+ está presente em concentrações mais baixas do que o N03- (Von Wiren et al., 2000).
Por causa das exigências de nitrogênio altas para as plantas de safra, a fertilização com nitrogênio é um investimento agrícola mundial principal, com 80 milhões de toneladas métricas de fertilizantes de nitrogênio (como nitrato e/ou amônia) aplicadas anualmente (Frink et al., 1999). Existem também conseqüências ambientais negativas para o uso extensivo de fertilizantes contendo nitrogênio na produção de safra porque as safras agrícolas retêm apenas cerca de dois terços do nitrogênio aplicado. Portanto entradas altas de fertilizante são seguidas por saídas grandes por lixiviamento, perdas gasosas e remoção de safra. O nitrogênio não absorvido pode subseqüentemente lixiviar no solo e contaminar suprimentos de água (Frink et al., 1999). Por causa das altas perdas por lixiviamento altas de nitrogênio a partir dos ecossistemas agrícolas para lençóis d'água e água superficial, o nitrogênio é agora reconhecido como um poluente importante. A lixiviação do nitrogênio, a saber como nitrato das terras agrícolas, afeta a qualidade da água potável e causa eutroficação de lagos e áreas costeiras. O uso abundante de fertilizantes contendo nitrogênio pode ainda levar à deterioração final da qualidade do solo, à poluição ambiental e perigos para a saúde.
Por causa dos altos custos do fertilizante de nitrogênio para a produção agrícola e adicionalmente seus efeitos nocivos sobre o ambiente, é desejável desenvolver estratégias para reduzir a entrada de nitrogênio e/ou para otimizar a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio por uma dada disponibilidade de nitrogênio enquanto simultaneamente se mantenha a produtividade ótima e a qualidade dos organismos ativos fotossintéticos, preferivelmente plantas cultivadas, por exemplo safras. Preferivelmente as plantas cultivadas usadas como alimento e/ou ração devem ter uma qualidade melhorada, especialmente em termos de acúmulo e composição de proteína.
[006.0.0.1] Para a assimilação, acúmulo e utilização da captação de nitrogênio eficiente, processos complexos associados com a absorção, translocalização, assimilação e redistribuição de nitrogênio são requeridos para operar eficazmente. As diferenças na absorção e utilização de nitrogênio entre genótipos foram demonstradas para diversas espécies por pesquisadores diferentes (Chang & Robison, 2001). Evidência considerável de diferenças genotípicas na captação de nitrogênio por exemplo, o acúmulo também foi relatado para o milho e canola (Weisler et al., 2001; Gallais & Hirel, 2004).
A captação de nitrato em plantas é altamente regulada e coordenada com outros caminhos de transporte e metabólicos (Crawford,1995) e vários genes de captação de nitrato e relacionados com a assimilação foram identificados e caracterizados (Forde, 2002). As plantas absorvem nitrato por intermédio de transportadores localizados na membrana plasmática da célula epidérmica de raiz e cortical em uma ampla faixa de concentração de nitrato usando diversos mecanismos de transporte diferentes, incluindo sistemas de transporte de afinidade alta constitutivos e indutíveis de nitrato, assim como transportadores de afinidade baixa indutíveis por nitrato (Stitt, 1999). Uma vez no citoplasma da célula de raiz, o nitrato pode ser armazenado no vacúolo para uso posterior, transportado no xilema e translocado para o broto para a assimilação e/ou armazenagem, liberado de volta na rizosfera ou reduzido para nitrito e depois amônia por intermédio da nitrato redutase (NR) e nitrito redutases (NiR). A redução de nitrato para nitrito e depois amônia gera nitrogênio em uma forma que pode ser assimilada em aminoácidos por intermédio do caminho GOGAT (Stitt, 1999). De modo a ser incorporado nos aminoácidos, ácidos nucleicos e outros compostos, o NO3" deve ser reduzido para NH/. A NR (nitrato redutase ) é a primeira enzima no processo de redução de NO"3 para a forma de amino. Esta é uma enzima indutível por substrato e é considerada ser a etapa mais limitante na assimilação de nitrogênio.
A taxa in situ da redução de NO"3 é controlada primariamente pela taxa de captação de NO"3, ao invés de pelas alterações na atividade da nitrato redutase (NRA) ou limitações no poder de redução. Assim, a captação de NO3 parece ser de importância primária na assimilação de nitrogênio nas plantas alimentadas com NO3. A variação genética na NRA é bem documentada em diversas espécies. A NRA é afetada por fatores tais como condições ambientais e estágios desenvolvimentais da planta, assim como partes da planta, tais como raízes e topos. Além disso, ensaios in vivo e in vitro usualmente dão resultados diferentes. Resultados variáveis foram encontrados por diversos pesquisadores em seus esforços para relacionar NRA ao rendimento de grão e traços relacionados com o N tal como o N da planta total reduzido, teor de nitrogênio no grão, concentração de nitrogênio no grão e índice de colheita de nitrogênio.
De modo a descrever a eficiência do caminho completo de nitrogênio, partindo com a captação do solo, assimilação, acumulação e finalmente utilização do nitrogênio para o crescimento até a maturidade e para o amadurecimento das frutas e sementes, métodos diferentes são conhecidos. Considerando-se a importância da aquisição e utilização de nitrogênio ótimas, estratégias diferentes foram seguidas para as otimizações em planta.
A patente US 6.727.411 divulga um método de produzir tomates transgênicos tendo um teor de aminoácido livre aumentado nas frutas de tomate pela transformação de um tomate com uma construção genética contendo a seqüência de anti-sentido de um gene que codifica a glutamato descarboxilase.
Em alguns casos as enzimas do caminho da assimilação de nitrogênio foram super expressadas. Apesar do insucesso inicial como a super expressão de um gene da glutamina sintetase citossólica em Lotus (Vincent et aL, Planta. 201(4): 424-33, 1997), documentos recentes mostram pelo menos algum sucesso. A WO 95/09911 descreve a super expressão de glutamina- sintetase, asparagina-sintetase e asparaginase em planta transgênica para a aplicação na fixação de nitrogênio realçada e rendimento melhorado. Chichkova et aL, J. Exp. Bot.; (2001) relataram que as plantas de tabaco transgênicas que superexpressam a NADH-glutamato-sintase de alfafa têm teor de carbono e nitrogênio mais alto, mas não um enriquecimento específico no nitrogênio em comparação com o carbono. Em outro caso, por exemplo como descrito em Long et aL, Plant-Physiol.; (1996) 111,2, Supl., 48, a super expressão de um gene da assimilação de nitrogênio, neste caso a glutamato- desidrogenase de Escherichia coli, não levou a um aumento relativo no teor de nitrogênio, mas ao invés a um aumento significante no peso fresco e peso seco. Em um outro caso, a super expressão do gene ASNl realça a situação do nitrogênio nas sementes de Arabidopsis (Lam et al., Planta Physiology, 2003, 321, 926-935. Em sementes daquelas linhagens que superexpressam os autores observaram a elevação de teores de proteína de semente solúvel, elevação da proteína total, teores de sementes hidrolisadas em ácido e uma tolerância mais alta das mudas jovens quando cultivadas sob condições limitantes de nitrogênio, demonstrando que estes traços são firmemente interligados.
A Patente US 6.969.782 divulga plantas contendo aminoácidos livres acumulados em uma grande quantidade pela expressão excessiva da glutamato desidrogenase (GDH). O Pedido de patente dos Estados Unidos 20030115638 fornece uma planta transformada tendo o teor de aminoácido livre aumentado pela introdução dos genes da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC). Plantas com níveis elevados de proteínas da utilização de nitrogênio na raiz destas plantas são divulgadas na US 20050044585 pela expressão de um gene da alanina aminotransferase.
Um método interessante diferente foi seguido por Yanagisawa et al., PNAS (2004) 101, 20, 7833-7838. Os autores identificaram e super expressaram um fator regulador, que induziu a super-regulagem de genes que codificam enzimas para a produção de esqueleto de carbono, um aumento acentuado de teores de aminoácido e uma redução do nível de glicose na Arabidopsis transgênica. A análise elementar revelou que o teor de nitrogênio aumentou na planta transgênicas (aproximado a 30%), indicando a promoção da assimilação de nitrogênio livre. Mais significantemente, as plantas transgênicas Dofl exibem crescimento melhorado sob condições de nitrogênio baixo, um traço agronomicamente importante. Apesar de parecer promissor, este método provavelmente tem a desvantagem de que conta com um fator de transcrição vegetal e a cascata de sinalização correspondente complexa que poderia ser o objeto tanto de mecanismos regulatórios internos diferentes quanto do mecanismo de retroalimentação que modificam ou mesmo diminuem o efeito desejado pelo menos sob certas condições. Além disso, a função de um fator de transcrição de planta reside na sua interação com as suas seqüências alvo em promotores diferentes, tornando a transferência de resultados entre espécies de planta diferentes complexos e imprevisíveis.
Não obstante, existe uma necessidade quanto a organismos ativos fotossintéticos que sejam capazes de assimilar e acumular nitrogênio mais eficientemente. Além disso, os organismos ativos fotossintéticos devem ser capazes de uma utilização mais eficiente de nitrogênio de modo que menos nitrogênio seja requerido para o mesmo rendimento ou rendimentos mais altos podem ser obtidos com os níveis correntes de uso de nitrogênio.
Existe além disso uma necessidade quanto a organismos ativos fotossintéticos que mostrem um rendimento de biomassa aumentado, preferivelmente com uma taxa de crescimento mais rápida, que possa levar a uma fruta ou rendimento de semente maiores. Os novos organismos ativos fotossintéticos devem apresentar uma proporção maior mais definida (com respeito à proporção dos aminoácidos diferentes) do teor de aminoácido na fruta ou semente ou no organismo inteiro. Os novos organismos ativos fotossintéticos devem apresentar um teor de proteína maior mas definido (com respeito à proporção dos aminoácidos diferentes) na fruta ou semente ou no organismo inteiro.
Os novos organismos ativos fotossintéticos devem mostrar pelo menos um destes traços também sob condições de teor de nitrogênio reduzido no meio circundante, solo ou ambiente.
Em uma forma de realização da presente invenção, estes traços são obteníveis por um processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo ativo fotossintético levando a um teor de nitrogênio total aumentado na fruta ou semente ou no organismo inteiro.
Em uma forma de realização da presente invenção, isto é obtido por uma eficiência no uso de nitrogênio aumentada (NTJE).
Em uma forma de realização da presente invenção, a NUE é definida como o rendimento de grão por unidade de nitrogênio disponível do solo, incluindo fertilizante de nitrogênio.
Em um outra forma de realização da presente invenção, aNUE é definida de acordo com Reynolds, M. P., J. J. Ortiz-Monasterio e A. McNab (eds.), 2001. Application of Physiology in Wheet Breeding, México, D.F.:CIMMYT, que é incorporado por referência.
Em um outra forma de realização da presente invenção, a NUE é definida como o rendimento de biomassa por unidade de nitrogênio disponível do solo, incluindo fertilizante de nitrogênio.
Em um outra forma de realização da presente invenção, a NUE é definida como o teor de nitrogênio total do organismo ativo fotossintético por unidade de nitrogênio disponível do solo, incluindo fertilizante de nitrogênio.
As plantas pode captar nitrogênio também na forma de amônio. Embora as concentrações de NH4+ médias no solo sejam freqüentemente de 10 a 1000 vezes mais baixas do que aquelas de N03- (Marschner HL, Mineral Nutrition in Higher Plants. Londres: Academic Press; 1995), a diferença nas concentrações do solo não refletem necessariamente a razão de captação de cada fonte de nitrogênio. As plantas captam NH4+ preferencialmente quando ambas as formas de nitrogênio são disponíveis, eventualmente porque a sua assimilação requeira menos energia porque o N03- deve ser reduzido antes da assimilação (Bloom et al., Planta Phys. 1992, 1294-1301).
Os sistemas de captação de amônio foram caracterizados em organismos diferentes, incluindo levedura e plantas. A levedura saccharomyces cerevisiae contém três genes MEP para transportadores de amônio, que são todos controlados pelo nitrogênio, sendo reprimidos na presença de uma fonte de nitrogênio que seja facilmente metabolizado, tal como NH4+ (Marini et al., Mol Cell Biol 1997, 17: 4282-4293). Os genes vegetais que codificam sistemas de transportes de amônio foram clonados pela complementação de um mutante de levedura, pesquisas de homologia em base de dados e hibridizações heterólogas (Revisados em van Wieren et al., Current Opinion in Plant Biology, 200, 3: 254-261. Evidência experimental da função fisiológica dos transportadores de NH4+ principalmente se situam nas correlações entre a expressão de transportador de amônio e influxo de amônio rotulado. A situação é complicada pelo fato de que na Arabidopsis mas também em outras plantas os transportadores de amônio estão presentes em famílias de gene, os membros das quais têm padrões de expressão e características fisiológicas diferentes. Embora a DE 4337597 reivindique seqüências para transportadores de amônio de planta e seu uso para a manipulação do metabolismo de nitrogênio e crescimento da planta sob certas condições, qualquer evidência quanto aos efeitos positivos sobre a assimilação de nitrogênio ou crescimento da planta sob certas condições através da expressão ectópica dos transportadores de amônio de planta foram perdidos. Portanto a evidência da literatura quanto ao engenheiramento da assimilação de nitrogênio em plantas é ainda limitada a uns poucos casos, não incluindo transportadores.
É um objetivo da presente invenção desenvolver um processo barato para uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de hidrogênio realçados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo ativo fotossintético levando a um teor de nitrogênio total aumentado na fruta ou semente ou no organismo inteiro e uma eficiência de uso de nitrogênio (NUE) aumentada.
Foi agora descoberto que este objetivo é obtido fornecendo-se o processo de acordo com a invenção aqui descrita e as formas de realização caracterizadas nas reivindicações. Consequentemente, em uma primeira forma de realização, a invenção diz respeito a um processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo ativo fotossintético.
Consequentemente, em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um processo para aumentar o teor de nitrogênio total em um organismo ativo fotossintético.
Consequentemente, em uma forma de realização isto é obtido pela produção (aumentada) de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio, por meio do qual o nitrogênio ou os compostos contendo nitrogênio são um composto contendo nitrogênio (N). Em uma forma de realização o termo "nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio " como aqui usado diz respeito a compostos contendo "aminoácido", preferivelmente fenilalanina, prolina, ácido aspártico, 5-oxoprolina e/ou alanina, "heme- complexo", "purina" e/ou "pririmidina" e/ou derivados. Além disso, em uma outra forma de realização o termo "nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio" como aqui usado também diz respeito às composições de produtos químicos finos que compreendem compostos contendo N.
Consequentemente, a presente invenção diz respeito a um processo que compreende
(a) aumentar ou gerar a atividade de uma ou mais da proteína como mostrada na tabela II, coluna 3 codificada pelas seqüências de ácido nucleico como mostrada na tabela I, coluna 5, em um organismo não humano ou em uma ou mais partes ou compartimentos deste e
(b) cultivar o organismo sob condições que permitam a produção de nitrogênio ou de compostos que contenham nitrogênio, assim, os composto contendo N e/ou a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou aumentar o teor de nitrogênio total, no dito organismo.
Consequentemente, a presente invenção diz respeito a um processo para a produção de um produto químico fino que compreende
(a) aumentar ou gerar a atividade de uma ou mais proteínas tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3, aplicação n° 1 e/ou 2 e/ou 3, linhas 1 e/ou 2 e/ou 3 e/ou 4 e/ou 5 respectivamente ou tendo a seqüência de um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucleico indicada na Tabela I, coluna 5 ou 7, aplicação n° 1 e/ou 2 e/ou 3, em um organismo não humano em uma ou mais partes ou compartimentos deste e
(b) cultivar o organismo sob condições que permitam a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio, em particular composto contendo N.
Compreende/compreendendo e variações gramaticais destes quando usados neste relatório descritivo devem ser interpretados para especificar a presença de características estabelecidas, números inteiros, etapas ou componentes ou grupos destes, mas não para impedir a presença ou adição de uma ou mais outras características, números inteiros, etapas, componentes ou grupos destes.
O termo "Tabela I" usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Tabela IAe Tabela I Β. O termo "Tabela II" usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Tabela II A e Tabela II Β. O termo "Tabela I A" usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Tabela I A. O termo "Tabela I B" usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Tabela I Β. O termo "Tabela II A" usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Tabela II A. O termo "Tabela II B" usado neste relatório descritivo deve ser interpretado para especificar o conteúdo da Tabela II B. Em uma forma de realização preferida, o termo "Tabela I" significa Tabela I B. Em uma forma de realização preferida, o termo "Tabela II" significa Tabela II Β.
Os termos "realçado" ou "aumento" significam uma produção pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%, preferivelmente pelo menos 60%,70%, 80%, 90% ou 100%, mais preferivelmente150%,200%, 300%, 400% ou 500% mais alta de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em comparação com a referência como definida abaixo, por exemplo que significa em comparação a um organismo sem a modificação anteriormente mencionada da atividade de uma proteína tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3, aplicação nfi 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3 ou codificada pela molécula de ácido nucleico indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, aplicação n° 1 e/ou aplicação n2 .2 e/ou aplicação 3. O termo compartimento diz respeito a todos os compartimentos subcelulares diferentes de uma célula, incluindo mas não limitados à mitocôndria, vacúolo, os núcleos, todos os tipos de plastídeos, tais como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, o espaço extracelular, a mitocôndria, o retículo endoplasmático, elaioplastos, peroxissomas, glicossomas e outros compartimentos.
Surpreendentemente foi descoberto, que a expressão transgênica de pelo menos uma das proteínas de Saccharomyces cerevisiae indicadas na Tabela II, Coluna 3, aplicação n° 1 ou aplicação n° 2, linhas 1 ou
.3 respectivamente e/ou aplicação n° 3, linhas 4 e/ou 5 e/ou pelo menos uma das proteínas de Eseheriehia eoli Kl2 indicadas na Tabela II, Coluna 3, aplicação n° 2, linha 2 em Arabidopsis thaliana conferiu um aumento no teor do composto contendo N e/ou conferiu uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado do organismo transformado.
Surpreendentemente foi descoberto, que a expressão transgênica de pelo menos uma das proteínas de Saccharomyees cerevisiae indicadas na Tabela II, Coluna 3, aplicação n~ 1, linha 1 em Arabidopsis thaliana conferiu um aumento no teor do composto contendo N e/ou conferiu uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado do organismo transformado, quando expressada nas células hospedeiras, preferivelmente no citossol das células vegetais
Surpreendentemente foi descoberto que a expressão transgênica de pelo menos uma das proteínas de Saccharomyces eerevisiae indicadas na Tabela II, Coluna 3, aplicação na 2, linha 3 e/ou aplicação ne 3, linha 4 e/ou 5 e/ou pelo menos uma das proteínas de Eseheriehia eoli K12 indicadas na Tabela II, Coluna 3, aplicação n° 2, linha 2 na Arabidopsis thaliana conferiu um aumento no teor do composto contendo N e/ou conferiu uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado do organismo transformado, quando expressada nas células hospedeiras, preferivelmente quando expressada nos plastídeos.
De acordo com a invenção, o termo "organismo" como aqui entendido diz respeito sempre a um organismo não humano, em particular a um organismo ativo fotossintético, preferivelmente organismo vegetal ou a um microorganismo.
A seqüência de YPRl38C da Saceharomyces eerevisiae foi publicada em Goffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996 e Bussey et al., Nature 387 (6632 Supl), 103-105 (1997) e a sua atividade está sendo definida como um transportador de NEU+. Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso de um produto de gene com uma atividade de proteína transportadora de amônio; superfamília nrgA transportadora de amônio, preferivelmente uma proteína com uma atividade transportadora de NH4+, de Saccharomyees eerevisiae ou seu homólogo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio, significativo de composto contendo N e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, em particular para aumentar a quantidade de um composto contendo N em um organismo ou uma parte deste, como mencionado.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso de um produto de gene com uma atividade de proteína transportadora de amônio; superfamília nrgA transportadora de amônio, preferivelmente uma proteína com uma atividade transportadora NHj+, de Saccharomyces eerevisiae ou seu homólogo, por exemplo como aqui mostrado, para a captação e/ou assimilação melhoradas de nitrogênio.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso de um produto de gene com uma atividade de proteína transportadora de amônio; superfamília nrgA transportadora de amônio, preferivelmente uma proteína com uma atividade transportadora de NH4+, de Saccharomyees eerevisiae ou seu homólogo, por exemplo como aqui mostrado, para a captação e/ou utilização e/ou assimilação aumentadas de nitrogênio sob condições limitadas de nitrogênio.
A seqüência de YNL241C (Número de acesso NP014158) de Saccharomyees eerevisiae foi publicada em Goffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996 e Philippsen et al., Nature 387 (6632 Supl), 93-98 (1997) e a sua atividade está sendo definida como "glicose-6-fosfato desidrogenase (Zwflp)". Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para aumentar a quantidade de um composto contendo N em um organismo ou um parte deste, como mencionado.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso do dito "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou assimilação melhoradas de nitrogênio.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou utilização e/ou assimilação aumentadas de nitrogênio sob condições limitadas de nitrogênio.
A seqüência de bl852 (Número de acesso NP_416366) de Escherichia eoli foi publicada em Blattner et al., Science 277 (5331), 1453- .1474 (1997) e a sua atividade está sendo definida como "glicose-6-fosfato desidrogenase". Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso de uma "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para aumentar a quantidade de um composto contendo N em um organismo ou uma parte deste, como mencionado.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso de uma "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, para a captação e/ou assimilação melhoradas de nitrogênio.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso de uma "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou utilização e/ou assimilação aumentadas de nitrogênio sob condições limitadas de nitrogênio.
A seqüência de YJL167W (Número de acesso NP_0123 68.1) de Saccharomyces eerevisiae foi publicada em Goffeau et ai, Science 274 (5287), 546-547, 1996 e Anderson et al., J. Biol. Chem 264, 19176-19184 (1989) e a sua atividade está sendo definida como "farnesil pirofosfato sintetase (FPP sintase)". Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "farnesil pirofosfato sintetase (FPP sintase)" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para aumentar a quantidade de um composto contendo N em um organismo ou uma parte deste, como mencionado.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "farnesil pirofosfato sintetase (FPP sintase)" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou assimilação melhoradas de nitrogênio.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "farnesil pirofosfato sintetase (FPP sintase)" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou utilização e/ou assimilação aumentadas de nitrogênio sob condições limitadas de nitrogênio.
A seqüência de YML045C (Número de acesso NP_013658.1) de Saccharomyces eerevisiae foi publicada em Goffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996 e Guiard et al., EMBO J. 4, 3265-3272 (1985) e a sua atividade está sendo definida como "L-lactato citocromo c oxidorredutase/ citocromo b2". Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "L-lactato citocromo c oxidorredutase/citocromo b2" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para aumentar a quantidade de um composto contendo N em um organismo ou uma parte deste, como mencionado.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "L-lactato citocromo c oxidorredutase/citocromo b2" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou assimilação melhoradas de nitrogênio. Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "L-lactato citocromo c oxidorredutase/citocromo b2" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou utilização e/ou assimilação aumentadas de nitrogênio sob condições limitadas de nitrogênio.
Homólogos (= homólogos) do presente produto de genes podem ser derivados de quaisquer organismos contanto que o homólogo confira a atividade aqui mencionada, em particular, confira um aumento na quantidade ou teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio. Além disso, na presente invenção, o termo "homólogo" diz respeito à seqüência de um organismo tendo a homologia de seqüência mais alta às seqüências aqui mencionadas ou listadas de todas as seqüências expressadas do dito organismo. Entretanto, a pessoa habilitada na técnica sabe, que, preferivelmente, o homólogo tem a dita atividade de aumento no teor de nitrogênio e, se conhecida, a mesma função biológica ou atividade no organismo como pelo menos uma das proteínas selecionadas do grupo como indicado na Tabela I, Coluna 3, aplicação na 1 e/ou aplicação n2 2 e/ou aplicação n° 3, por exemplo tendo a seqüência de um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende a seqüência indicada na Tabela I, Coluna 5 ou 7, aplicação na 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação n° .3.
Em uma forma de realização, o homólogo de qualquer um dos polipeptídeos indicados na Tabela II, linhas 1 ou 3 ou 4 ou 5 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos e sendo derivados de um Eucariota. Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linha 2 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio nos organismos ou parte destes e sendo derivados de bactérias.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linhas 1 ou 3 ou 4 ou 5 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou parte deste e sendo derivado de Fungos.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linha 2 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio nos organismos ou parte destes e sendo derivado de Proteobacteria.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linhas 1 ou 3 ou 4 ou 5 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos ou uma parte destes e sendo derivados de Ascomycota.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linha 2 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos ou parte destes e sendo derivados de Gamaproteobacteria.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linhas 1 ou 3 ou 4 ou 5 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos ou parte destes e sendo derivados de Saeeharomycotina.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linha 2 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos ou parte destes e sendo derivados de Enterobaeteriales.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linhas 1 ou 3 ou 4 ou 5 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos ou uma parte deste e sendo derivados de Saccharomycetes.
Em uma forma de realização, o homólogo do um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linha 2 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos ou parte destes e sendo derivados de Enterobaeteriaeeae.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linhas 1 ou 3 ou 4 ou 5 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos e sendo derivados de Saecharomyeetales.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linha 2 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos ou uma parte deste e sendo derivados de Escheriehia.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linhas 1 ou 3 ou 4 ou 5 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos ou uma parte deste e sendo derivados de Saccharomycetaeeae.
Em uma forma de realização, o homólogo de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3, linha 1 ou 3 ou 4 ou 5 é um homólogo tendo a mesma ou uma atividade similar, em particular um aumento de atividade confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio nos organismos ou uma parte deste e sendo derivados de Saccharomycetes.
Os homólogos dos polipeptídeos indicados na Tabela II, coluna 3, aplicação ns 1 e/ou aplicação na 2 e/ou aplicação n° 3, podem ser os polipeptídeos codificados pelos polipeptídeos de moléculas de ácido nucleico indicados na Tabela I, coluna 7, aplicação n° 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação ns 3 ou podem ser os polipeptídeos indicados na Tabela II, coluna 7, aplicação n° 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3.
Outros homólogos são descritos aqui abaixo.
De acordo com a invenção, uma proteína ou polipeptídeo tem a "atividade de uma proteína da invenção" ou de uma proteína como usada na invenção, por exemplo uma proteína tendo a atividade de uma proteína indicada na Tabela II, coluna 3, aplicação n° 1 se sua atividade de novo ou sua expressão aumentada direta ou indiretamente leva a um teor de nitrogênio total aumentado, preferivelmente de compostos contendo N, preferivelmente aminoácidos, mais preferivelmente os níveis de fenilalanina, prolina, ácido aspártico, 5-oxoprolina e/ou alanina no organismo ou uma parte deste, preferivelmente em uma célula do dito organismo.
Em uma forma de realização da presente invenção a expressão de uma proteína tendo a atividade de uma proteína indicada na Tabela II, coluna 3, aplicação n° 1 tem a atividade de uma proteína da invenção se a sua atividade de novo ou a sua expressão aumentada direta ou indiretamente leva a um teor de nitrogênio total aumentado, preferivelmente de compostos contendo N, preferivelmente aminoácidos, mais preferivelmente os níveis de fenilalanina, prolina nas folhas de um planta e dos níveis de ácido aspártico,5-oxoprolina e/ou alanina preferivelmente nas sementes de uma planta.
De acordo com a invenção, uma proteína ou polipeptídeo tem a "atividade de uma proteína da invenção" ou de uma proteína como usada na invenção, por exemplo uma proteína tendo a atividade de uma proteína indicada na Tabela II, coluna 3, aplicação nfi 2, linha 2 se a sua atividade de novo ou a sua atividade aumentada direta ou indiretamente leva a um teor de nitrogênio total aumentado, preferivelmente de compostos contendo N, preferivelmente aminoácidos, mais preferivelmente do nível de prolina no organismo ou uma parte deste, preferivelmente em uma célula do dito organismo.
Em uma forma de realização da presente invenção a expressão de uma proteína tendo a atividade de uma proteína indicada na Tabela II, coluna 3, aplicação n° 2, linha 2 tem a atividade de uma proteína da invenção se a sua atividade de novo ou a sua aumentada direta ou indiretamente leva a um teor de nitrogênio total aumentado, preferivelmente de compostos contendo N, preferivelmente aminoácidos, mais preferivelmente do nível de prolina em folhas uma planta.
De acordo com a invenção, uma proteína ou polipeptídeo tem a "atividade de uma proteína da invenção" ou de uma proteína como usada na invenção, por exemplo uma proteína tendo a atividade de uma proteína indicada na Tabela II, coluna 3, aplicação n° 2, linha 3 se a sua atividade de novo ou a sua expressão aumentada direta ou indiretamente leva a um teor de nitrogênio total aumentado, preferivelmente de compostos contendo N, preferivelmente aminoácidos, mais preferivelmente do nível de tirosina, triptofano, isoleucina, arginina, treonina, valina e/ou alanina no organismo ou uma parte deste, preferivelmente em uma célula do dito organismo.
Em uma forma de realização da presente invenção a expressão de uma proteína tendo a atividade de uma proteína indicada na Tabela II, coluna 3, aplicação ne 2, linha 3 tem a atividade de uma proteína da invenção se a sua atividade de novo ou a sua atividade aumentada direta ou indiretamente leva a um teor de nitrogênio total aumentado, preferivelmente de compostos contendo N, preferivelmente aminoácidos, mais preferivelmente do nível de tirosina, triptofano, isoleucina, arginina, treonina, valina e/ou alanina em folhas de uma planta e/ou alanina nas sementes de uma planta.
Em uma forma de realização preferida, a proteína ou polipeptídeo tem as atividades adicionais acima mencionadas de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3, aplicação na 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, preferivelmente aplicação na 1. Durante o relatório descritivo a atividade ou preferivelmente a atividade biológica de uma tal proteína ou polipeptídeo ou uma molécula de ácido nucleico ou seqüência que codifica tal proteína ou polipeptídeo é idêntica ou similar se a mesma ainda tem a atividade biológica ou enzimática de qualquer uma da proteínas selecionadas do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3, aplicação rr 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, preferivelmente aplicação ns 1, isto é, se a mesma tem pelo menos 10% da atividade enzimática original, preferivelmente 20%, particular e preferivelmente 30%, o mais particular e preferivelmente 40% em comparação a qualquer uma das proteínas indicadas na Tabela II, coluna 3, aplicação n° 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, preferivelmente aplicação n° 1.
Em uma forma de realização, o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção confere a dita atividade, por exemplo o aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo ou uma parte deste, se o mesmo é derivado de um organismo, que está evolucionariamente distante do organismo em que o mesmo é expressado. Por exemplo os organismos de origem e expressão são derivados de famílias, ordens, classes ou filos diferentes.
Em uma forma de realização, o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção confere à dita atividade, por exemplo o aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo ou uma parte deste, se o mesmo é derivado de um organismo, que seja evolucionariamente próximo ao organismo indicado na Tabela I, coluna 4 e é expressada em um organismo, que seja evolucionariamente distante do organismo de origem. Por exemplo os organismos de origem e expressão são derivados de famílias, ordens, classes ou filos diferentes ao passo que o organismo de origem e o indicado na Tabela I, coluna 4 são derivados das mesmas famílias, ordens, classes ou filos.
Os termos "aumentado", "elevado", "prolongado", "realçado", "melhorado" ou "amplificado" diz respeito a uma mudança correspondente de uma propriedade em um organismo, um parte de um organismo tal como um tecido, semente, raiz, folha, flor etc. ou em uma célula e são intercambiáveis. Preferivelmente, a atividade global no volume é aumentada ou realçada no caso se o aumento ou realce está relacionado com o aumento ou realce de uma atividade de um produto de gene, independente se a quantidade de produto de gene ou a atividade específica do produto de gene ou ambos é aumentada ou realçada ou se a quantidade, estabilidade ou eficácia de tradução da seqüência de ácido nucleico ou gene que codifica o produto de gene é aumentada ou realçada. Os termos "redução", "diminuição" ou "deleção" diz respeito a uma mudança correspondente de uma propriedade em um organismo, um parte de um organismo tal como um tecido, semente, raiz, folha, flor, etc. ou em uma célula. Preferivelmente, a atividade global no volume é reduzida, diminuída ou deletada em casos se a redução, diminuição ou deleção está relacionada com a redução, diminuição ou deleção de uma atividade de um produto de gene, independente se a quantidade de produto de gene ou da atividade específica do produto de gene ou ambos é reduzida, diminuída ou deletada ou se a quantidade, estabilidade ou eficácia de tradução da seqüência de ácido nucleico ou gene que codifica o produto de gene é reduzida, diminuída ou deletada.
Os termos "aumento" ou "diminuição" diz respeito a uma mudança correspondente de uma propriedade de um organismo ou em uma parte de um organismo, tal como um tecido, semente, raiz, folha, flor etc. ou em uma célula.. Preferivelmente, a atividade global no volume é aumentada em casos em que o aumento diz respeito ao aumento de uma atividade de um produto de gene, independente se a quantidade de produto de gene ou da atividade específica do produto de gene ou ambos é aumentada ou gerada ou se a quantidade, estabilidade ou eficácia de tradução da seqüência de ácido nucleico ou gene que codifica o produto de gene é aumentada.
Sob "mudança de uma propriedade" é entendido que a atividade, nível de expressão ou quantidade de um produto de gene ou o teor de metabólito ou o teor de elemento é mudado em um volume específico em relação a um volume correspondente de um controle, referência ou tipo selvagem, incluindo a criação de novo da atividade ou expressão.
Os termos "aumento" ou "diminuição" incluem a mudança ou a modulação da dita propriedade em apenas partes do paciente da presente invenção, por exemplo, a modificação pode ser descoberta no compartimento de uma célula, como uma organela ou em uma parte de uma planta, como tecido, semente, raiz, folha, flor etc. mas não é detectável se o objeto global, isto é, célula ou planta completas, é testada. Preferivelmente, o aumento ou diminuição é descoberta celular, assim o termo "aumento de uma atividade" ou "aumento de um teor de metabólito ou elemento" diz respeito ao aumento celular comparado à célula do tipo selvagem. Entretanto, os termos aumento ou diminuição como aqui usados também incluem a mudança ou modulação de uma propriedade no organismo inteiro como mencionado.
Consequentemente, o termo "aumento" ou "diminuição" significa que a atividade específica de uma enzima, preferivelmente a quantidade de um composto ou metabólito, por exemplo de um polipeptídeo, uma molécula de ácido nucleico ou de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio da invenção ou um que codifica mRNA ou DNA, pode ser aumentada ou diminuída em um volume.
Os termos "tipo selvagem", "controle" ou "referência" são intercambiáveis e podem ser uma célula ou uma parte de organismos tais como uma organela ou um tecido ou um organismo, em particular um microorganismo ou uma planta, que não foi modificada ou tratada de acordo com o processo aqui descrito de acordo com a invenção. Consequentemente, a célula ou uma parte de organismos tais como uma organela ou um tecido ou um organismo, em particular um microorganismo ou uma planta usados como tipo selvagem, controle ou referência corresponde à célula, organismo ou parte deste tanto quanto possível e é em qualquer outra propriedade mas no resultado do processo da invenção como idêntica à questão objeto da invenção como possível. Assim, o tipo selvagem, controle ou referência são tratados de modo idêntico ou tão idêntico quanto possível, dito que apenas condições ou propriedades seriam diferentes que não influenciaria a qualidade da propriedade testada.
Preferivelmente, qualquer comparação é realizada sob condições análogas. O termo "condições análogas" significa que todas as condições tais como, por exemplo, condições de cultura ou cultivo, condições de ensaio (tal como composição de tampão, temperatura, substratos, cepa patogênica, concentrações e outras) são mantidas idênticas entre os experimentos a serem comparados.
A "referência", "controle" ou "tipo selvagem" é preferivelmente um objeto, por exemplo uma organela, uma célula, um tecido, um organismo, em particular uma planta ou um microorganismo, que não foram modificados ou tratados de acordo com o processo aqui descrito da invenção e é em qualquer outra propriedade como similar ao assunto objeto da invenção como possível. A referência, controle ou tipo selvagem está no seu genoma, transcriptoma, proteoma ou metaboloma tão similar quanto possível ao objeto da presente invenção. Preferivelmente, o termo organela, célula, tecido ou organismo de "referência" "controle" ou "tipo selvagem", em particular planta ou microorganismo, diz respeito a uma organela, célula, tecido ou organismo, em particular planta ou microorganismo, que é quase geneticamente idêntica à organela, célula, tecido ou organismo, em particular microorganismo ou planta, da presente invenção ou uma parte deste preferivelmente 95%, mais preferido são 98%, ainda mais preferido são .99,00%, em particular 99,10%, 99,30%, 99,50%, 99,70%, 99,90%, 99,99%,99, 999% ou mais. O mais preferível a "referência", "controle" ou "tipo selvagem" é um objeto, por exemplo uma organela, uma célula, um tecido, um organismo, que é geneticamente idêntico ao organismo, célula ou organela usados de acordo com o processo da invenção exceto que as moléculas de ácido nucleico responsíveis ou que conferem atividade ou o produto de gene codificado por eles são melhorados, manipulados, trocados ou introduzidos de acordo com o processo da invenção.
Preferivelmente, a referência, controle ou tipo selvagem difere do objeto da presente invenção apenas na atividade celular do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção, por exemplo como resultado de um aumento no nível da molécula de ácido nucleico da presente invenção ou um aumento da atividade específica do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção. Por exemplo, diferem pelo ou no nível de expressão ou atividade de uma proteína tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3, aplicação η2 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação ns 3, preferivelmente aplicação n° 1 ou sendo codificada por uma molécula de ácido nucleico indicada na Tabela I, coluna 5, aplicação n° 1 e/ou aplicação n° .2, preferivelmente aplicação n° 1 ou seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela I, coluna 7, aplicação n° 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, preferivelmente aplicação n° 1, suas causas bioquímicas ou genéticas e portanto o mostram a quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio aumentada, a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou o teor de nitrogênio total aumentado.
No caso, um controle, referência ou tipo selvagem que diferem do objeto da presente invenção apenas por não serem objetos do processo da invenção não podem ser fornecidos, um controle, referência ou tipo selvagem pode ser um organismo em que a causa para a modulação de uma atividade que confere o aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio ou a expressão da molécula de ácido nucleico como aqui descrita foi retornada à situação anterior ou desligada, por exemplo pelo silenciamento da expressão do produto de gene responsável, por exemplo pela inibição de anti-sentido, pela inativação de um ativador ou agonista, pela ativação de um inibidor ou antagonista, pela inibição através da adição de anticorpos inibidores, pela adição de compostos ativos como por exemplo hormônios, pela introdução de mutantes dominantes negativos, etc. Uma produção de gene por exemplo pode ser silenciada pela introdução de mutações pontuais inativadoras, que levam a uma inibição enzimática ou da atividade biológica ou uma desestabilização ou uma inibição da capacidade para ligar-se aos co-fatores, etc.
Consequentemente, objeto de referência preferido é o objeto de partida do presente processo da invenção. Preferivelmente, a referência e o assunto objeto da invenção são comparados depois da padronização e normalização, por exemplo para a quantidade de RNA total, DNA ou Proteína ou atividade ou expressão de genes de referência, como os genes de manutenção, tais como ubiquitina, actina ou proteínas ribossômicas.
Uma série de mecanismos existe por intermédio dos quais uma modificação de uma proteína, por exemplo o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção podem direta ou indiretamente afetar a captação ou assimilação de nitrogênio ou o rendimento, produção e/ou eficiência de produção dos compostos contendo nitrogênio.
Por exemplo, o número de molécula ou a atividade específica do polipeptídeo ou da molécula de ácido nucleico podem ser aumentados. Quantidades maiores de nitrogênio podem ser assimiladas ou absorvidas ou no caso de compostos contendo nitrogênio produzidas se o polipeptídeo ou o ácido nucleico da invenção forem expressados de novo em um organismo que carece da atividade da dita proteína. Entretanto, também é possível aumentar a expressão do gene que está naturalmente presente nos organismos, por exemplo pela amplificação do número de gene(s), pela modificação da regulagem do gene ou aumentando-se a estabilidade do mRNA correspondente ou do produto de gene correspondente codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou pela introdução de genes homólogos de outros organismos que são diferentemente regulados, por exemplo não sensíveis à retroalimentação.
O aumento, diminuição ou modulação de acordo com esta invenção podem ser constitutivos, por exemplo devido a uma expressão transgênica permanente estável ou a uma mutação estável no gene endógeno correspondente que codifica a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou a uma modulação da expressão ou do comportamento de um gene que confere a expressão do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção ou transitória, por exemplo devido a uma transitória transformação ou adição temporária de um modulador tal como um agonista ou antagonista ou indutível, por exemplo depois da transformação com uma construção indutível que carrega a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção sob o controle de um promotor indutível e adicionando o indutor, por exemplo tetraciclina ou como aqui descrito abaixo.
O aumento na atividade do polipeptídeo importa em uma célula, um tecido, uma organela, um órgão ou um organismo ou uma parte deste preferivelmente em pelo menos 5%, preferivelmente em pelo menos .20% ou em pelo menos 50%, de modo especialmente preferível em pelo menos 70%, 80%, 90% ou mais, de modo muito especialmente preferível em pelo menos 200%, o mais preferivelmente em pelo menos 500% ou mais em comparação com controle, referência ou tipo selvagem.
A atividade específica de um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucleico da presente invenção ou do polipeptídeo da presente invenção pode ser testada como descrito nos exemplos. Em particular, a expressão de uma proteína em questão em uma célula, por exemplo uma célula vegetal ou um microorganismo e a detecção de um aumento no nível de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em comparação a um controle é um teste fácil e pode ser realizado como descrito no estado da técnica.
O termo "aumento" inclui, que um composto ou uma atividade são introduzidos em uma célula de novo ou que o composto ou a atividade não foram detectáveis antes, em outras palavras os mesmos são "gerados".
Consequentemente, no que segue, o termo "aumentar" também compreende o termo "gerar" ou "estimular". A atividade aumentada manifesta-se por si só em uma quantidade aumentada de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína YPRl 3 8C de Saccharomyces eerevísiae ou seus homólogos, por exemplo como indicados na Tabela II, colunas 5 ou 7, aplicação n° 1, linha 1, é aumentada; preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio entre 17% e 24% ou mais é conferido, preferivelmente um aumento do teor de proteína ou aminoácido em uma planta entre 17% e .24% ou mais é conferido. Preferivelmente este aumento é conferido nas sementes ou frutas da planta.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína YPRl 3 8C de Saccharomyces eerevisiae ou seus homólogos é aumentada, preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e de coenzima QlO, ácido fiimárico, ácido málico e/ou ácido lignocérico em folhas e/ou glicerol-3-fosfato, ácido benzóico, ácido hidroxil- benzóico e/ou dodecanol em sementes de uma planta é conferido.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína YNL241C de Saceharomyces eerevisiae ou seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, aplicação n° 2, linha 3, é aumentada, preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio entre 10% e 15% ou mais, preferivelmente de 12% ou mais é conferido, preferivelmente um aumento no teor de aminoácido em uma planta entre 10% e 15% ou mais, preferivelmente de 12% ou mais é conferido. Preferivelmente este aumento é conferido em sementes ou frutas da planta.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína bl852 de Eeheriehia eoli ou seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, aplicação n° 2, linha 2, é aumentada, preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio entre 10% e 15% ou mais, preferivelmente de 13% ou mais é conferido, preferivelmente um aumento no teor de aminoácido em uma planta entre 10%» e 15% ou mais, preferivelmente de 13%» ou mais é conferido preferivelmente nas sementes.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína YJL167W de Saccharomyces eerevisiae ou seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, aplicação n° 3, linha 4, é aumentada, preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio entre 5% e 30% ou mais, preferivelmente entre 8% e .26% ou mais é conferido preferivelmente nas sementes.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína YML054C de Saccharomyees eerevisiae ou seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, aplicação n° 3, linha 5, é aumentada, preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio entre 5% e 20% ou mais, preferivelmente entre 6% e .15% ou mais é conferido preferivelmente nas sementes.
Uma proteína tendo uma atividade que confere um aumento na quantidade ou nível de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou o teor de nitrogênio total aumentado preferivelmente tem a estrutura do polipeptídeo aqui descrito, em particular de um polipeptídeo que compreende uma seqüência de consenso selecionada do grupo como indicado na Tabela IV, colunas 7, aplicação η2 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação nQ 3, preferivelmente aplicação n° 1 ou de um polipeptídeo selecionado do grupo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, aplicação n° 1 e/ou aplicação ns 2 e/ou aplicação ns 3, preferivelmente aplicação n° 1 ou os homólogos funcionais deste como aqui descritos ou de um polipeptídeo que é codificado pela molécula de ácido nucleico aqui caracterizada ou a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, por exemplo uma molécula de ácido nucleico como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, aplicação η2 1 e/ou aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, preferivelmente aplicação n° 1 ou seus homólogos funcionais aqui descritos e tem a atividade aqui mencionada. Devido à atividade biológica das proteínas que são usadas no processo de acordo com a invenção e que são codificadas pelas moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção, é possível produzir composições que compreendem nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio. Dependendo da escolha do organismo usado para o processo de acordo com a presente invenção, por exemplo um microorganismo ou uma planta, composições ou misturas de vários compostos contendo nitrogênio, por exemplo que compreendem outros aminoácidos, ácidos graxos, vitaminas, hormônios, açúcares, lipídeos, etc. distintos podem ser produzidas.
O termo "expressão" refere-se à transcrição e/ou tradução de um segmento de gene codogênico ou gene. Como uma regra, o produto resultante é um mRNA ou uma proteína. Entretanto, produtos de expressão também podem incluir RNAs funcionais tais como, por exemplo, anti-sentido, ácidos nucleicos, tRNAs, snRNAs, rRNAs, RNAi, siRNA, ribozimas etc. A expressão pode ser sistêmica, local ou temporal, por exemplo limitada a certos tipos de célula, tecidos, órgãos ou períodos de tempo.
Em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende uma ou mais das seguintes etapas:
a) estabilizar uma proteína que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou do polipeptídeo da invenção ou da molécula de ácido nucleico ou do polipeptídeo usado no método da invenção, por exemplo de um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3 ou a atividade de seus homólogos, por exemplo como indicados na Tabela II, colunas 5 ou 7, tendo a atividade aumentada aqui mencionada;
b) estabilizar um mRNA que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção, por exemplo de um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3 ou a atividade de seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, ou de um mRNA que codifica o polipeptídeo da presente invenção tendo a atividade aumentada aqui mencionada;
c) aumentar a atividade específica de uma proteína que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou do polipeptídeo da presente invenção ou a molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo usado no método da invenção, tendo a atividade aumentada aqui mencionada, por exemplo de um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3, ou a atividade de seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou diminuir a regulagem inibidora do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção;
d) gerar ou aumentar a expressão de um fator de transcrição endógeno ou artificial que medeie a expressão de uma proteína que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção tendo a atividade aumentada aqui mencionada, por exemplo de um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3, ou a atividade de seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7;
e) estimular a atividade de uma proteína que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da presente invenção ou um polipeptídeo da presente invenção tendo a atividade aumentada aqui mencionada, por exemplo de um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3 ou a atividade de seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, pela adição de um ou mais fatores indutores exógenos ao organismo ou partes deste;
f) expressar um gene transgênico que codifica uma proteína que confere a expressão aumentada de um polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico da presente invenção ou um polipeptídeo da presente invenção, tendo a atividade aumentada aqui mencionada, por exemplo de um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3 ou a atividade de seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7;
g) aumentar o número de cópia de um gene que confere a expressão aumentada de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção tendo a atividade aumentada aqui mencionada, por exemplo de um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3 ou a atividade de seus homólogos, por exemplo como indicado na
Tabela II, colunas 5 ou 7;
h) aumentar a expressão do gene endógeno que codifica o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção, por exemplo um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3 ou a atividade de seus homólogos, por exemplo selecionado do grupo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, pela adição de elementos de expressão positiva ou que remove a expressão negativa, por exemplo recombinação homóloga pode ser usada para introduzir elementos reguladores positivos como para plantas o realçador 35S no promotor ou para remover elementos repressores das regiões reguladoras. Outros métodos de conversão de gene podem ser usados para romper elementos repressores ou para realçar a atividade de elementos positivos. Elementos positivos podem ser aleatoriamente introduzidos em plantas pelo T-DNA ou mutagênese de transposon e linhagens podem ser identificadas em que os elementos positivos foram integrados próximos a um gene da invenção, a expressão do qual é por meio destes realçada;
i) modular as condições de crescimento de um organismo em uma tal maneira, que a expressão ou atividade do gene que codifica a proteína da invenção ou a própria proteína é realçada por exemplo microorganismos ou plantas podem ser cultivados sob um regime de temperatura mais alta levando a uma expressão realçada de proteínas de choque térmico, por exemplo a proteína de choque térmico da invenção, que pode levar a uma produção de produto químico fino realçada; e/ou
j) selecionar organismos com atividade especialmente altas das proteínas da invenção a partir de recursos naturais ou mutageneizados e cruzá-los nos organismos alvo, por exemplo as safras de elite.
Preferivelmente, o dito mRNA é a molécula de ácido nucleico da presente invenção e/ou a proteína que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da presente invenção ou o polipeptídeo tendo a atividade aqui mencionada é o polipeptídeo da presente invenção, por exemplo que confere o aumento de composto contendo N depois de aumentando a expressão ou atividade do polipeptídeo codificado ou tendo a atividade de um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na Tabela II, coluna 3 ou a atividade de seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7.
No geral, a quantidade de mRNA ou polipeptídeo em uma célula ou um compartimento de um organismo correlaciona-se com a quantidade de proteína codificada e assim com a atividade global da proteína codificada no dito volume. A dita correlação não é sempre linear, a atividade no volume é dependente da estabilidade das moléculas ou da presença de co- fatores ativadores ou inibidores. Além disso, produto e inibições de deduções de enzimas são bem conhecidos e descritos em livros texto, por exemplo Stryer, Biochemistry.
No geral, a quantidade de mRNA, polinucleotídeo ou molécula de ácido nucleico em uma célula ou um compartimento de um organismo correlaciona-se com a quantidade de proteína codificada e assim com a atividade global da proteína codificada no dito volume. A dita correlação não é sempre linear, a atividade no volume é dependente da estabilidade das moléculas, da degradação das moléculas ou da presença de co-fatores ativadores ou inibidores. Além disso, produto e inibições de dedução de enzimas são bem conhecidos, por exemplo Zinser et ai. "Enzyminibitoren"/Inibidores de Enzima".
A atividade das proteínas e/ou polipeptídeo mencionados acima codificados pela molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser aumentada em vários modos. Por exemplo, a atividade em um organismo ou em uma parte deste, como uma célula ou uma organela, é aumentada por intermédio do aumento do número de produto de gene, por exemplo aumentando-se a taxa de expressão, como introduzindo um promotor mais forte ou aumentando-se a estabilidade do mRNA expressado, aumentando assim a taxa de tradução e/ou aumentando a estabilidade do produto de gene, reduzindo assim as proteínas deterioradas. Além disso, a atividade ou metabolização de enzimas podem ser influenciadas em um tal modo que uma redução ou aumento da taxa de reação ou uma modificação (redução ou aumento) da afinidade ao substrato resulta, é atingida. Uma mutação no centro catalítico de um polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção, por exemplo como enzima, pode modular a taxa de metabolização da enzima, por exemplo um silenciamento de um aminoácido essencial pode levar a uma atividade reduzida ou completa silenciada da enzima ou a deleção ou mutação de sítios de ligação reguladores pode reduzir uma regulagem negativa como uma inibição de retroalimentação (ou uma inibição de substrato, se o nível de substrato também é aumentado). A atividade específica de uma enzima da presente invenção pode ser aumentada tal que a taxa de metabolização é aumentada ou a ligação de um co-fator é melhorada. Melhorar a estabilidade do mRNA codificador ou da proteína também pode aumentar a atividade de um produto de gene. A estimulação da atividade também está sob o escopo do termo "atividade aumentada".
Além disso, a regulagem das seqüências de ácido nucleico supra citadas pode ser modificada de modo que a expressão de gene seja aumentada. Isto pode ser obtido vantajosamente por meio de seqüências reguladoras heterólogas ou pela modificação, por exemplo mutação, das seqüências reguladoras naturais que estão presentes. Os métodos vantajosos também podem ser combinados entre si.
No geral, uma atividade de um produto de gene em um organismo ou parte deste, em particular em uma célula vegetal, uma planta ou um tecido vegetal, uma parte deste ou uma organela ou em um microorganismo pode ser aumentada aumentando-se a quantidade do mRNA codificador específico ou da proteína correspondente no dito organismo ou parte deste. "Quantidade de proteína ou mRNA" é entendido como significativo do número de molécula de polipeptídeos ou moléculas de mRNA em um organismo, um tecido, uma célula ou um compartimento celular. "Aumento" na quantidade de uma proteína significa o aumento quantitativo do número de molécula da dita proteína em um organismo, um tecido, uma célula ou um compartimento celular ou parte deste - por exemplo por um dos métodos aqui descritos abaixo - em comparação a um tipo selvagem, controle ou referência.
O aumento no número de molécula importa preferivelmente em pelo menos 1%, preferivelmente em mais do que 10%, mais preferivelmente em 30% ou mais, de modo especialmente preferível em 50%, .70% ou mais, de modo muito especialmente preferível em 100%, o mais preferivelmente em 500% ou mais. Entretanto, uma expressão de novo também é considerada como objeto da presente invenção.
Uma modificação, isto é, um aumento ou diminuição, pode ser causada por fatores endógenos ou exógenos. Por exemplo, um aumento na atividade em um organismo ou uma parte deste pode ser causado pela adição de um produto de gene ou um precursor ou um ativador ou um agonista ao meio ou nutrição ou pode ser causado pela introdução dos ditos objetos em um organismo, transitório ou estável.
Em uma forma de realização o aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio no organismo ou uma parte deste, por exemplo em uma célula, um tecido, um órgão, uma organela etc., é obtido aumentando-se o nível endógeno do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção no citossol ou em um compartimento como os plastídeos. Consequentemente, em uma forma de realização da presente invenção, a presente invenção diz respeito a um processo em que o número de cópia de gene de um gene que codifica o polinucleotídeo ou molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção como aqui descrito é aumentado. Além disso, o nível endógeno do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção como descrito pode ser por exemplo aumentado pela modificação da regulagem transcricional ou traducional do polipeptídeo.
Em uma forma de realização a quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio no organismo ou parte deste pode ser aumentada pela mutagênese alvejada ou aleatória dos genes endógenos da invenção. Por exemplo a recombinação homóloga pode ser usada para introduzir elementos reguladores positivos como para plantas o realçador 35S no promotor ou para remover elementos repressores das regiões reguladoras. Além da conversão de gene, métodos equivalentes descritos por Kochevenko e Willmitzer (Plant Physiol. Maio de 2003; 132(1): 174-84) e citações nesta podem ser usados para romper elementos repressores ou para realçar a atividade de elementos reguladores positivos. Além disso elementos positivos podem ser aleatoriamente introduzidos em genomas (vegetais) pelo T-DNA ou mutagênese de transposon e linhagens podem ser tríadas, em que os elementos positivos tem que ser integrados próximos a um gene da invenção, a expressão dos quais é deste modo realçada. A ativação de genes vegetais pelas integrações aleatórias de elementos realçadores foi descrita por Hayashi et al., 1992 (Science 258: 1350-1353) ou Weigel et al., 2000 (Plant Physiol. .122, 1003-1013) e outras aqui citadas. As estratégias genéticas reversas para identificar inserções (que eventualmente carregam os elementos de ativação) próximo dos genes de interesse foram descritas para vários casos por exemplo Krysan et al., 1999 (Plant Cell 1999, 11, 2283-2290); Sessions et al., 2002 (Plant Cell 2002, 14, 2985-2994); Young et al., 2001, (Plant Physiol. 2001,125, 513-518); Koprek et al., 2000 (Plant J.2000, 24, 253-263); Jeon et al., 2000 (Plant J. 2000, 22, 561-570); Tissier et al., 1999 (Plant Cell 1999,11,18411852); Speulmann et al., 1999 (Plant Cell 1999, 11, 1853-1866). Em resumo, material de todas as plantas de uma população grande de plantas mutagenizadas no T-DNA ou transposon é colhido e o DNA genômico preparado. Depois o DNA genômico é reunido seguindo arquiteturas específicas como descrito por exemplo em Krysan et al., 1999 (Plant Cell .1999, 11, 2283-2290). As reuniões de DNAs genômicos são depois tríadas pelas reações de PCR multiplex específicas detectando a combinação do mutageno insercional (por exemplo T-DNA ou Transposon) e o gene de interesse. Portanto as reações de PCR são conduzidas nos agrupamentos de DNA com combinações específicas de iniciadores marginais de T-DNA ou transposon e iniciadores específicos de gene. as regras gerais para o planejamento de iniciador podem ser mais uma vez tirados de Krysan et al.,1999 (Plant Cell 1999, 11, 2283-2290). A retriagem de reuniões de DNA de níveis mais baixo levam à identificação de plantas individuais em que o gene de interesse é rompido pelo mutágeno insercional. O realce de elementos reguladores positivos ou o rompimento ou enfraquecimento de elementos regulatórios negativos também podem ser obtidos através das técnicas de mutagênese comuns: A produção de populações mutadas quimicamente ou por radiação é uma técnica comum e conhecida pelo técnico habilitado. Os métodos para plantas são descritos por Koorneef et al. 1982 e as citações nesta e por Lightner e Caspar em "Methods in Molecular Biology" Vol 82. Estas técnicas usualmente induzem as mutações pontuais que podem ser identificadas em qualquer gene conhecido usando métodos tais como tilling (Colbert et al. 2001).
Consequentemente, o nível de expressão pode ser aumentado se os genes endógenos que codificam um polipeptídeo que confere uma expressão aumentada do polipeptídeo da presente invenção, em particular genes que compreendem a molécula de ácido nucleico da presente invenção, são modificados por intermédio da recombinação homóloga, métodos de tilling ou conversão de gene.
As seqüências reguladoras podem ser operativamente ligadas à região codificadora de uma proteína endógena e controlam a sua transcrição e tradução ou a estabilidade ou deterioração do mRNA codificador ou da proteína expressada. De modo a modificar e controlar a expressão, promotor, UTRs, sítios de junção, sinais de processamento, sítios de poliadenilação, terminadores, realçadores, repressores, sítios de modificação pós transcricionais ou pós traducionais podem ser mudados, adicionados ou emendados por exemplo, a ativação de genes vegetais pelas integrações aleatórias de elementos realçadores foi descrita por Hayashi et al., 1992 (Science 258: 1350-1353) ou Weigel et al., 2000 (Plant Physiol. 122, 1003-1013) e outros citados neste. Por exemplo, o nível de expressão da proteína endógena pode ser modulado substituindo-se o promotor endógeno com um promotor transgênico mais forte ou substituindo-se a 3'UTR endógena com uma 3'UTR, que forneça mais estabilidade sem emendar a região codificadora. Além disso, a regulagem transcricional pode ser modulada pela introdução de um fator de transcrição artificial como descrito nos exemplos. Promotores, terminadores e UTR alternativos são descritos abaixo.
A ativação de um polipeptídeo endógeno tendo a atividade mencionada acima, do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção, por exemplo que confere o aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio depois do aumento da expressão ou atividade no citossol e/ou em uma organela como um plastídeo, também pode ser aumentada pela introdução de um fator de transcrição sintético, que liga próximo da região codificadora de um polipeptídeo endógeno da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção ou usado no processo da invenção ou seu homólogo endógeno - que codifica gene por meio do qual o fator de transcrição sintético ativa a sua transcrição. Uma proteína de dedo de zinco quimérica pode ser interpretada, que compreende um domínio de ligação de DNA específico e um domínio de ativação como por exemplo o domínio VP16 do vírus Simples do Herpes. O domínio específico de ligação pode ligar à região reguladora da região codificadora da proteína endógena. A expressão do fator de transcrição quimérico em um organismo, em particular em uma planta, leva a uma expressão específica de um polipeptídeo endógeno da invenção ou usado no processo da invenção, em particular um homólogo vegetal deste, ver por exemplo na WO 01/52620, Oriz, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2002, Vol. 99, 13290 ou Guan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2002, Vol. 99, 13296.
Em uma outra forma de realização do processo de acordo com a invenção, organismos são usados em que um dos genes supra citados ou um dos ácidos nucleicos supra citados, são mutados em um modo que a atividade dos produtos de gene codificados seja menos influenciada pelos fatores celulares ou de jeito nenhum, em comparação com as proteínas não mutadas. Por exemplo, mecanismos de regulagem bem conhecidos de atividade enzimática são a inibição de substrato ou os mecanismos de regulagem da retroalimentação. Modos e técnicas para a introdução de substituições, deleções e adições de uma ou mais bases, nucleotídeos ou aminoácidos de uma seqüência correspondente são aqui descritas abaixo nos parágrafos correspondentes e nas referências aí listados, por exemplo em Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habour, NY, 1989. A pessoa habilitada na técnica será capaz de identificar domínios de regulagem e sítios de ligação de reguladores comparando-se a seqüência da molécula de ácido nucleico da presente invenção ou o produto de expressão desta com o estado da técnica por meios de software de computador que compreendem algoritmos para a identificação de sítios de ligação e domínios de regulagem ou pela introdução em uma molécula de ácido nucleico ou em uma proteína sistematicamente mutações e ensaiando quanto a estas mutações que levarão a uma atividade aumentada específica ou uma atividade aumentada por volume, em particular por célula.
É portanto vantajoso expressar em um organismo uma molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou um polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção derivado de um organismo de modo evolucionário distantemente relacionado, como por exemplo usando um gene procariótico em um hospedeiro eucariótico, visto que nestes casos o mecanismo de regulagem da célula hospedeira não pode enfraquecer a atividade (celular ou específica) do gene ou o seu produto de expressão.
Menos influência sobre a regulagem de um gene ou seu produto de gene é entendido como significativo de uma regulagem reduzida da atividade enzimática ou biológica levando a um atividade específica ou celular aumentada do gene ou seu produto. Um aumento da atividade enzimática ou biológica é entendido como significativo de uma atividade enzimática ou biológica, que é aumentada em pelo menos 10%, vantajosamente pelo menos 20, 30 ou 40%, de modo especialmente vantajoso em pelo menos 50, 60 ou 70% em comparação com o organismo de partida. Isto leva a uma produtividade aumentada do nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio desejada.
Devido à introdução de um gene ou de uma pluralidade de genes que conferem a expressão da molécula de ácido nucleico da invenção ou da molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção como descrito abaixo, por exemplo a construção de ácido nucleico mencionada abaixo, em um organismo sozinho ou em combinação com outros genes, é possível não apenas aumentar o fluxo biossintético na direção do produto final, por exemplo compostos significativos contendo nitrogênio, mas também aumentar, modificar ou criar de novo uma composição de metabólitos vantajosa, preferivelmente nova no organismo, por exemplo uma composição de aminoácido vantajosa que compreende um teor mais alto de (a partir de um ponto de vista de fisiologia nutricional limitada) dos respectivos produtos químicos finos, em particular aminoácidos, do mesmo modo nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio.
Preferivelmente a composição compreende ainda quantidades mais altas de metabólitos afetando positivamente ou quantidades mais baixas de metabólitos afetando negativamente a nutrição ou saúde de animais ou seres humanos fornecidos com as ditas composições ou organismos da invenção ou partes destes. Do mesmo modo, o número ou atividade de outros genes que são requeridos para a importação ou exportação de nutrientes ou metabólitos, incluindo aminoácidos ou seus precursores, requeridos para a biossíntese da célula de aminoácidos podem ser aumentados de modo que a concentração de precursores, co-fatores ou intermediários dentro da(s) célula(s) ou dentro dos compartimentos de armazenagem correspondentes é aumentada. Devido à atividade aumentada ou gerada de novo do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção ou devido ao número aumentado de seqüências de ácido nucleico da invenção e/ou à modulação de outros genes que estão envolvidos na biossíntese dos aminoácidos, por exemplo aumentando-se a atividade de enzimas que sintetizam precursores ou pela destruição da atividade de um ou mais genes que estão envolvidos na ruptura dos aminoácidos, é possível aumentar o rendimento, produção e/ou eficiência de produção de aminoácidos no organismo hospedeiro, tal como as plantas ou nos microorganismos.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo de acordo com a invenção diz respeito a um processo que compreende:
a) fornecer um organismo ativo fotossintético, preferivelmente um microorganismo, uma planta ou um tecido vegetal ou uma planta;
b) aumentar uma atividade de um polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção ou um homólogo deste, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou de um polipeptídeo que é codificado pela molécula de ácido nucleico da presente invenção e descrito abaixo, isto é, que confere um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio no organismo, preferivelmente em um organismo ativo fotossintético, preferivelmente um microorganismo, uma planta ou um tecido vegetal ou uma planta,
c) cultivar o organismo, preferivelmente um organismo ativo fotossintético, preferivelmente um microorganismo, uma planta ou um tecido vegetal ou uma planta, sob condições que permitam o acúmulo e/ou produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente no organismo, preferivelmente um organismo ativo fotossintético, preferivelmente um microorganismo, uma planta ou um tecido vegetal ou uma planta.
d) Depois do aumento descrito acima (que como definido acima também abrange a geração de uma atividade em um organismo, isto é, uma atividade de novo), por exemplo depois da introdução e da expressão das moléculas de ácido nucleico da invenção ou descrito nos métodos ou processos de acordo com a invenção, o organismo de acordo com a invenção, vantajosamente, um organismo ativo fotossintético, preferivelmente um microorganismo, uma planta ou um tecido vegetal ou uma planta, é cultivado e subseqüentemente colhido.
Os organismos adequados ou organismos hospedeiros (organismo transgênico) para a molécula de ácido nucleico usada de acordo com a invenção e para o processo da invenção, a construção de ácido nucleico ou o vetor (ambos como descrito) são, em princípio, todos os organismos que são capazes de sintetizar nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio e que são adequados para a ativação, introdução ou estimulação de genes. Os exemplos que pode ser mencionados são plantas, microorganismos tais como fungos, bactérias, leveduras, algas ou diatomáceas, transgênicos ou obtidos pela mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese aleatória combinadas com procedimentos de seleção específicos. Os organismos preferidos são aqueles que são naturalmente capazes de acumular e/ou que sintetizam nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio em quantidades substanciais, como fungos, leveduras, bactérias ou plantas. Em princípio, os animais transgênicos, por exemplo Caenorhabditis elegans, também são adequados como organismos hospedeiros.
No evento em que o organismo transgênico é um microorganismo, tal como um organismo eucariótico, por exemplo um fungo, uma alga, diatomáceas ou uma levedura em particular um fungo, alga, diatomáceas ou levedura selecionado das famílias Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaeeae, Moniliaeeae, Mortierellaeeae, Mueoraeeae, Pythiaeeae, Sacharomyeetaeeae, Saprolegniaeeae, Schizosaeharomyeetaeeae, Sodariaeeae, Sporobolomycetaceae Tuberculariaeeae, Adelotheciac eae, Dinophyceae, Ditriehaeeae ou Prasinophyeeae ou um organismo procariótico, por exemplo uma bactéria ou alga azul, em particular uma bactéria das famílias Actinomyeetaceae, Baeillaeeae, Brevibaeteriaeeae, Corynebaeteriaceae, Enterobaeteriaeae, Gordoniaceae, Noeardiaeeae, Micrococcaceae, Mycobacteriaceae, Pseudomonaeeae, Rhizobiaeeae ou Streptomyeetaeeae, este microorganismo é cultivado em um sólido ou em um meio líquido que é conhecido pelo técnico habilitado e se adapte ao organismo. Depois da fase de cultivo, os organismos podem ser colhidos.
Os microorganismos ou o nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio recuperados e se desejado isolados, respectivos como aminoácidos podem ser depois processados ainda diretamente em gêneros alimentícios ou rações de animal ou para outras aplicações, por exemplo de acordo com as divulgações feitas na EP-B-O 533 039 ou EP-A-O 615 693, que são aqui 15 expressamente incorporadas por referência. O caldo de fermentação ou os produtos de fermentação podem ser purificados na maneira habitual pela extração e precipitação ou por intermédio de trocadores de íon e outros métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e aqui descritos abaixo. Os produtos destes procedimentos de trabalho diferentes são aminoácidos ou composições de aminoácido que compreendem ainda caldo de fermentação e componentes celulares em quantidades diferentes, vantajosamente na faixa de 0 a 99% em peso, preferivelmente abaixo de 80% em peso, de modo especialmente preferível abaixo de 50% em peso.
As cepas preferidas são cepas selecionadas do grupo que consiste de Baeillaceae, Brevibaeteriaeeae, Corynebaeteriaceae, Noeardiaeeae, Myeobaeteriaeeae, Streptomyeetaeeae, Enterobaeteriaeeae tal como Bacillus circulans, Bacillus subtilis, Bacillus sp., Brevibacterium albidum, Brevibacterium álbum, Brevibacterium cerinum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium glutamigenes, Brevibacterium iodinum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium laetofermentum, Brevibaeterium linens, Brevibacterium roseum, Brevibaeterium saceharolytieum, Brevibaeterium sp., Corynebaeterium acetoaeidophilum, Corynebaeterium aeetoglutamieum, Corynebaeterium amoniagenes, Corynebaeterium glutamieum (= Micrococcus glutamica), Corynebaeterium melasseeola, Corynebaeterium sp., Noeardia rhodoehrous (.Rhodococcus rhodoehrous), Myeobacterium rhodoehrous, Streptomyees lividans e Escheriehia eoli especialmente Eseheriehia eoli Kl2.
Além disso, as cepas preferidas particulares são cepas selecionadas do grupo que consiste de Cryptococcaceae, Saccharomycetaeeae, Sehizosaecharomycetacease tais como os gêneros Candida, Hansenula, Piehia, Saceharomyces e Schizosaccharomyces preferidas são as cepas selecionadas do grupo que consiste das espécies Rhodotorula rubra, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Yarrowia lipolitica, Sporobolomyces salmonicolor, Sporobolomyces shibatanus, Saccharomyees eerevisiae, Candida boidinii, Candida bombieola, Candida cilindracea, Candida parapsilosis, Candida rugosa, Candida tropiealis, Piehia metanoliea e Piehia pastoris.
Anaeardiaeeae tais como os gêneros Pistaeia, Mangifera, Anaeardium por exemplo as espécies Pistaeia vera [pistaches], Mangifer indica [Manga] ou Anacardium oeeidentale [Caju]; Asteraeeae tais como os gêneros Calendula, Carthamus, Centaurea, Ciehorium, Cynara, Helianthus, Laetuea, Loeusta, Tagetes, Valeriana por exemplo as espécies Calendula officinalis [Tagetes], Carthamus tinetorius [cártamo], Centauréia eyanus [centáurea-azul], Ciehorium intybus [margarida azul], Cynara scolymus [alcachofra], Helianthus annus [girassol], Laetuea sativa, Laetuea erispa, Laetuea esculenta, Laetuea seariola L. ssp. sativa, Laetuea seariola L. var. integrata, Laetuca seariola L. var. integrifolia, Lactuea sativa subsp. romana, Loeusta eommunis, Valeriana loeusta [alface], Tagetes lúcida, Tagetes ereeta ou Tagetes tenuifolia [tagetes]; Apiaceae tais como os gêneros Daucus por exemplo as espécies Daueus earota [cenoura]; Betulaeeae tais como os gêneros Corilus por exemplo as espécies Corilus avellana ou Corilus eolurna [avelã]; Boraginaeeae tais como os gêneros Borago por exemplo as espécies Borago offieinalis [borragem]; Brassieaeeae tais como os gêneros Brassiea, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis por exemplo as espécies Brassiea napus, Brassiea rapa ssp. [canola, colza, nabo], Sinapis arvensis Brassiea juneea, Brassiea juneea var. juneea, Brassiea juneea var. erispifolia, Brassiea juneea var. foliosa, Brassiea nigra, Brassiea sinapioides, Melanosinapis eommunis [mostarda], Brassiea oleracea [beterraba forrageira] ou Arabidopsis thaliana; Bromeliaeeae tais como os gêneros Anana, Bromelia por exemplo as espécies Anana eomosus, Ananas ananas ou Bromelia eomosa [abacaxi]; Carieaeeae tais como os gêneros Cariea por exemplo as espécies Cariea papaya [mamão]; Cannabaceae tais como os gêneros Cannabis por exemplo as espécies Cannabis sative [cânhamo], Convolvulaceae tais como os gêneros Ipomea, Convolvulus por exemplo as espécies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba ou Convolvulus panduratus [batata doce, Man of the Earth, batata selvagem], Chenopodiaeeae tais como os gêneros Beta, isto é, as espécies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altíssima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta marítima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. eonditiva ou Beta vulgaris var. eseulenta [beterraba açucareira]; Cucurbitaceae tais como os gêneros Cueubita por exemplo as espécies Cueurbita maxima, Cueurbita mixta, Cueurbita pepo ou Cueurbita moschata [abóbora]; Elaeagnaeeae tais como os gêneros Elaeagnus por exemplo as espécies Olea europaea [oliva]; Ericaeeae tais como os gêneros Kalmia por exemplo as espécies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia mierophilla, Kalmia polifolia, Kalmia oeeidentalis, Cistus ehamaerhodendros ou Kalmia lúcida [louro americano, louro de folha ampla, calico bush, spoon wood, sheep laurel, alpine laurel, bog laurel, western bog-laurel, swamp-laureT]·, Euphorbiaceae tais como os gêneros Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus por exemplo as espécies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [manihot, araruta, tapioca, mandioca] ou Ricinus communis [mamona, arbusto da mamona, Planta da mamona, Palma Christi, Wonder Tree]', Fabaeeae tais como os gêneros Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acaeia, Mimosa, Medicajo, Glieina, Doliehos, Phaseolus, Soja por exemplo as espécies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [ervilha], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeek, Aeaeia berteriana, Aeaeia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Aeaeia julibrissin, Aeaeia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speeiosa, Serieanrda julibrissin, Aeaeia lebbeek, Aeaeia macrophilla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeek, Mimosa lebbeek, Mimosa speeiosa [bastard logwood, silk tree, East Indian Walnut], Medieago sativa, Medieago faleata, Medieago varia [alfafa] Glieina max Doliehos soja, Glieina graeilis, Glieina hispida, Phaseolus max, Soja hispida ou Soja max [soja]; Geraniaeeae tais como os gêneros Pelargonium, Cocos, Oleum por exemplo as espécies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides ou Oleum cocois [coco]; Graminaae tais como os gêneros Saccharum por exemplo as espécies Saceharum officinarum-, Juglandaceae tais como os gêneros Juglans, Wallia por exemplo as espécies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans ealifornica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra ou Wallia nigra [noz, noz negra, noz comum, noz da pérsia, noz branca, noz branca, noz negra]; Lauraceae tais como os gêneros Persea, Laurus por exemplo as espécies laurel Laurus nobilis [bay, louro, bay laurel, sweet bay], Persea americana Persea americana, Persea gratíssima ou Persea persea [abacate]; Leguminosae tais como os gêneros Arachis por exemplo as espécies Arachis hypogaea [amendoim]; Linaeeae tais como os gêneros Linum, Adenolinum por exemplo as espécies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifoIium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense ou Linum trigynum [linho, linhaça]; Lythrarieae tais como os gêneros Punica por exemplo as espécies Puniea granatum [romã]; Malvaceae tais como os gêneros Gossypium por exemplo as espécies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum ou Gossypium thurberi [algodão]; Musaeeae tais como os gêneros Musa por exemplo as espécies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisíaca, Musa spp. [banana]; Onagraceae tais como os gêneros Camissonia, Oenothera por exemplo as espécies Oenothera biennis ou Camissonia brevipes [prímula, onagrácea]; Palmae tais como os gêneros Elacis por exemplo as espécies Elaeis guineensis [dendê]; Papaveraceae tais como os gêneros Papaver por exemplo as espécies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [papoula, papoula oriental, com poppy, papoula do campo, shirley poppies, papoula do campo, papoula de cabeça alongada, papoula de vagem alongada]; Pedaliaceae tais como os gêneros Sesamum por exemplo as espécies Sesamum indicum [gergelim]; Piperaceae tais como os gêneros Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia por exemplo as espécies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betei, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata. [pimenta de Caiena, pimenta selvagem]; Poaceae tais como os gêneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea, Triticum por exemplo as espécies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cevada, cevadinha, cevada rabo de raposa, wall barley, cevada dos prados], Secale cereale [centeio], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [aveia], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aetiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum cajfrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum millet, Panicum militaceum [Sorgo, painço], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zea mays [milho] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum ou Triticum vulgare [trigo, bread wheat, common wheat], Proteaceae tais como os gêneros Macadamia por exemplo as espécies Macadamia intergrifolia [macadâmia]; Rubiaceae tais como os gêneros Coffea por exemplo as espécies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora ou Cojfea liberica [café]; Scrophulariaceae tais como os gêneros Verbaseum por exemplo as espécies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum ou Verbascum thapsus [verbasco, verbasco mosca branca, verbasco de folha irritante, verbasco de flor densa, verbasco prata, verbasco de folha alongada, verbasco branco, verbasco escuro, verbasco grego, verbasco laranja, verbasco púrpura, verbasco grisalho, verbasco grande]; Solanaceae tais como os gêneros Capsicum, Nieotiana, Solanum, Lycopersicon por exemplo as espécies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pimenta], Capsicum annuum [pimentão], Nieotiana tabacum, Nieotiana alata, Nieotiana attenuata, Nieotiana glauca, Nieotiana langsdorffii, Nieotiana obtusifolia, Nieotiana quadrivalvis, Nieotiana repanda, Nieotiana rústica, Nieotiana silvestris [tabaco], Solanum tuberosum [batata], Solanum melongena [beringela] (Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon piriforme, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum [tomate]; Sterculiaceae tais como os gêneros Theobroma por exemplo as espécies Theobroma cacao [cacau]; Theaceae tais como os gêneros Camellia por exemplo as espécies Camellia sinensis) [chá] podem ser organismos doadores para os ácidos nucleicos ou polipeptídeos da invenção ou usados na presente invenção ou representam organismos hospedeiros preferidos.
As plantas hospedeiras preferidas particulares são plantas selecionadas do grupo que consiste de Asteraceae tais como os gêneros Helianthus, Tagetes por exemplo as espécies Helianthus annus [girassol], Tagetes lúcida, Tagetes erecta ou Tagetes tenuifolia [tagetes], Brassicaeeae tais como os gêneros Brassica, Arabadopsis por exemplo as espécies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo] ou Arabidopsis thaliana. Fabaceae tais como os gêneros Glicina por exemplo as espécies Glicina max, Soja hispida ou Soja max [soja]. Linaceae tais como os gêneros Linum por exemplo as espécies Linum usitatissimum, [linho, linhaça]; Poaceae tais como os gêneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Oryza, Zea, Triticum por exemplo as espécies Hordeum vulgare [cevada]; Secale cereale [centeio], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [aveia], Sorghum bicolor [Sorgo, painço], Oryza sativa, Oiyza latifolia [arroz], Zea mays [milho] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Tritieum maeha, Tritieum sativum ou Tritieum vulgare [trigo, bread wheat, eommon wheat]; Solanaeeae tais como os gêneros Solanum, Lyeopersieon por exemplo as espécies Solanum tuberosum [batata], Lyeopersieon eseulentum, Lyeopersieon lyeopersieum., Lyeopersieon piriforme, Solanum integrifolium ou Solanum lyeopersieum [tomate]. Um outro organismo hospedeiro preferido é o algodão por exemplo Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaeeum ou Gossypium thurberi.
Todos os organismos supra citados podem em princípio funcionar também como organismos doadores.
Com respeito à seqüência de ácido nucleico como representada uma construção de ácido nucleico que contém uma seqüência de ácido nucleico aqui mencionada ou um organismo (= organismo transgênico) que é transformado com a dita seqüência de ácido nucleico ou a dita construção de ácido nucleico, "transgene" significa todas aquelas construções que foram realizadas pelos métodos de manipulação genética, preferivelmente em que
a) uma seqüência de ácido nucleico selecionada do grupo como indicado na Tabela I, colunas 5 ou 7, linhas 1, 2, 3, 4 e/ou 5, ou uma derivada desta, ou
b) um elemento regulador genérico, por exemplo um promotor, que é funcionalmente ligado à seqüência de ácido nucleico como indicado na Tabela I, colunas 5 ou 7, linhas 1, 2, 3 4 e/ou 5 ou um derivado deste, ou
c) (a) e (b) não está/estão presente(s) no seu ambiente genético natural ou foi/foram modificado(s) por meio de métodos de manipulação genética, sendo possível para a modificação ser, por via de exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais nucleotídeos. "Ambiente genético natural" significa o local cromossômico no organismo de origem ou na presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente natural, genético da seqüência de ácido nucleico é preferivelmente pelo menos ainda parcialmente preservado. O ambiente flanqueia a seqüência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimento de seqüência de pelo menos 50 pares de base, preferivelmente pelo menos 500 pares de base, de modo particularmente preferível pelo menos 1000 pares de base, de modo muito particularmente preferível pelo menos 5000 pares de base.
O uso da seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção ou da construção de ácido nucleico de acordo com a invenção para a geração de plantas transgênicas é portanto também matéria objeto da invenção.
Em uma forma de realização vantajosa da invenção, o organismo toma a forma de uma planta cujo teor de nitrogênio ou composto contendo nitrogênio é modificado vantajosamente devido à molécula de ácido nucleico da presente invenção expressada. Isto é importante para os criadores de planta por diversas razões:
a) A vasta maioria do nitrogênio está presente nas células na forma de aminoácidos ligados a proteína. Portanto um teor de nitrogênio ou composto contendo nitrogênio aumentado reflete um teor de proteína aumentado e portanto valor nutricional adicional para a indústria alimentícia.
b) Um método para a captação de nitrogênio e/ou acúmulo de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio aumentados poderia reduzir a aplicação de fertilizantes nitrogenados, que por sua vez levam a custos reduzidos e benefícios ambientais.
c) Um método para a captação e/ou acúmulo de nitrogênio aumentados sustentaria o crescimento, saúde e produtividade da planta, preferivelmente sob condições limitadas de nitrogênio.
Em uma forma de realização, depois que uma atividade de um polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da presente invenção foi aumentada ou gerada ou depois que a expressão de uma molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo de acordo com a invenção foi gerada ou aumentada, a planta transgênica gerada pode ser cultivada no ou em um meio nutriente ou mesmo no solo e subseqüentemente colhida. Em uma forma de realização a planta transgênica gerada pode ser cultivada sob condições limitantes de nitrogênio.
As plantas ou partes destas, por exemplo as folhas, raízes, flores e/ou troncos e/ou outro material colhível como descrito abaixo, podem ser depois usadas diretamente como gêneros alimentícios ou rações de animal ou mesmo ser ainda processadas. Mais uma vez, os aminoácidos podem ser ainda purificados de maneira costumeira por intermédio de extração e precipitação ou por intermédio de trocas iônicas e outros métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e aqui descritos abaixo. Os produtos que são adequados para várias aplicações e que resultam destes procedimentos de processamento diferentes são aminoácidos ou composições de aminoácido que podem compreender ainda outros componentes de planta em quantidades diferentes, vantajosamente na faixa de 0 a 99% em peso, preferivelmente de abaixo de 90% em peso, de modo especialmente preferível abaixo de 80% em peso. As plantas também podem ser vantajosamente usadas diretamente sem outro processamento, por exemplo como ração ou por extração.
Os compostos quimicamente puros contendo nitrogênio ou composições quimicamente puras que compreendem nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio também podem estar produzidos pelo processo descrito acima. Para esta finalidade, nitrogênio ou compostos ou as composições contendo nitrogênio são isolados de maneira conhecida a partir de um organismo de acordo com a invenção, tal como os microorganismos, animal não humano ou as plantas e/ou seu meio de cultura em que ou no qual os organismos forma cultivados. Estes compostos quimicamente puros contendo nitrogênio ou as ditas composições são vantajosas para aplicações no campo da indústria de ração ou alimentícia.
Em uma forma de realização preferida, a presente invenção diz respeito a um processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em organismos ativos fotossintéticos, que compreende, aumentar ou gerar em um organismo ou uma parte ou um compartimento deste a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste de:
a) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo como mostrada na tabela II, colunas 5 e 7 ou um fragmento deste, que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados,
b) molécula de ácido nucleico que compreende de uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo como mostrada na tabela I, colunas 5 e 7 que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados
c) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode ser deduzida a partir de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula de ácido nucleico de (a) ou (b) como um resultado da degeneração do código genético e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados
d) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificada pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados
e) molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (a) a (c) sob hibridização estringente e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados
f) molécula de ácido nucleico que abrange uma molécula de ácido nucleico que é obtida pela amplificação das moléculas de ácido nucleico de uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando os iniciadores ou pares de iniciador como indicado na tabela III, coluna 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados
g) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que é isolado com auxílio de anticorpos monoclonais mais uma vez contra um polipeptídeo codificado por uma das molécula de ácido nucleicos de (a) a (f) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados
h) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende um consenso como mostrada na tabela IV, colunas 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados
i) molécula de ácido nucleico que é obtenível pela triagem de uma biblioteca de ácido nucleico adequada sob condições de hibridização estringentes com uma sonda que compreende uma das seqüências da molécula de ácido nucleico de (a) a (k) ou com um fragmento deste tendo pelo menos 15 nucleotídeos, preferivelmente 20 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou 500 nucleotídeos da molécula de ácido nucleico caracterizada de (a) a (k) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados ou que compreende um seqüência que é complementar a esta.
Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico usada no processo da invenção distingue a seqüência indicado na Tabela IA, colunas 5 ou 7, por um ou mais nucleotídeos. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico usada no processo da invenção não consiste da seqüência mostrada na Tabela I A, colunas 5 ou 7,: Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico usada no processo da invenção é menos do que 100%, 99,999%, 99,99%, 99,9% ou 99% idêntica a um seqüência indicado na Tabela I A, colunas 5 ou 7. Em uma outra forma de realização, a molécula de ácido nucleico não codifica um polipeptídeo de um seqüência indicado na Tabela II A, colunas 5 ou 7.
Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico usada no processo da invenção distingue a seqüência indicado na Tabela I B, colunas 5 ou 7, por um ou mais nucleotídeos. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico usada no processo da invenção não consiste da seqüência mostrada indicada na Tabela IB, colunas 5 ou 7.
Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico usada no processo da invenção é menos do que 100%, 99,999%, 99,99%,99,9% ou 99% idêntica a um seqüência indicado na Tabela I B, colunas 5 ou .7. Em uma outra forma de realização, a molécula de ácido nucleico não codifica um polipeptídeo de um seqüência indicado na Tabela II B, colunas 5 ou 7.
Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção distingue a seqüência indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, por um ou mais nucleotídeos. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico da invenção ou o ácido nucleico usado no processo da invenção não consiste da seqüência mostrada indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico da presente invenção é menos do que 100%, 99,999%, 99,99%, 99,9% ou 99% idêntica a um seqüência indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7. Em uma outra forma de realização, a molécula de ácido nucleico não codifica um polipeptídeo de um seqüência indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7.
A menos que de outro modo especificado, os termos "polinucleotídeos", "ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" são intercambiáveis no presente contexto. A menos que de outro modo especificado, os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são intercambiáveis no presente contexto. O termo "seqüência" pode dizer respeito a polinucleotídeos, ácidos nucleicos, molécula de ácido nucleicos, peptídeos, polipeptídeos e proteínas, dependendo do contexto em que o termo "seqüência" é usado. Os termos "gene(s)", "polinucleotídeo", "seqüência de ácido nucleico", "seqüência de nucleotídeo" ou "molécula(s) de ácido nucleico" como aqui usado refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Os termos referem-se apenas à estrutura primária da molécula.
Assim, Os termos "gene(s)", "polinucleotídeo", "seqüência de ácido nucleico", "seqüência de nucleotídeo" ou "molécula(s) de ácido nucleico" como aqui usado incluem DNA e RNA de filamento duplo e único. Eles também incluem tipos conhecidos de modificações, por exemplo, metilação, "encapuzamento", substituições de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo. Preferivelmente, a seqüência de DNA ou RNA da invenção compreende uma seqüência codificadora que codifica o polipeptídeo aqui definido.
Uma "seqüência codificadora" é uma seqüência de nucleotídeo, que é transcrita em mRNA e/ou traduzida em um polipeptídeo quando colocado sob o controle das seqüências regulatórias apropriadas. Os limites da seqüência codificadora são determinados por um códon de início de tradução no terminal 5' e um códon de parada de tradução no terminal 3'. Uma seqüência codificadora pode incluir, mas não é limitada a mRNA, cDNA, seqüências de nucleotídeo recombinantes ou DNA genômico, embora os introns também possam estar presentes sob certas circunstâncias.
As moléculas de ácido nucleico com a seqüência como indicado na Tabela I, colunas 5 ou 7, as moléculas de ácido nucleico que são derivadas de uma seqüências de aminoácido como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou de polipeptídeos que compreendem a seqüência de consenso como indicado na Tabela IV, colunas 7 ou seus derivados ou homólogos que codificam polipeptídeos com a atividade enzimática ou biológica de um polipeptídeo como indicado na Tabela II, coluna 3, 5 ou 7 ou por exemplo que conferem um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio depois de aumentar a sua expressão ou atividade no citossol ou nos plastídeos são vantajosamente aumentados no processo de acordo com a invenção.
Em uma forma de realização, as ditas seqüências são clonadas em construções de ácido nucleico, individualmente ou em combinação. Estas construções de ácido nucleico possibilitam um ótimo acúmulo e/ou síntese de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente produzidos no processo de acordo com a invenção.
As moléculas de ácido nucleico, que são vantajosas para o processo de acordo com a invenção e que codificam polipeptídeos com uma atividade de um polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção ou usado no processo da invenção, por exemplo de uma proteína como indicado na Tabela II, coluna 5 ou sendo codificada por uma molécula de ácido nucleico indicada na Tabela I, coluna 5 ou de seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, coluna 7, podem ser determinadas no geral a partir de bases de dados acessíveis.
Aquelas que devem ser mencionadas, em particular neste contexto são no geral bases de dados de gene tal como a base de dados de EMBL (Stoesser G. et al., Nucleic Acids Res 2001, Vol. 29, 17-21), a base de dados GenBank (Benson D. A. et al., Nucleic Acids Res 2000, Vol. 28, 15-18) ou a base de dados PIR (Barker W. C. et al., Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, 39-43). Além disso é possível usar bases de dados de gene específicas de organismo para determinar seqüências vantajosas, no caso de levedura por exemplo vantajosamente a base de dados SGD (Cherry J. M. et al., Nucleic Acids Res. 1998, Vol. 26, 73-80) ou a base de dados MIPS (Mewes H. W. et al., Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, 44-48), no caso de E. coli a base de dados GenProtEC (http://web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html) e no caso de Arabidopsis a base de dados TAIR (Huala, E. et al., Nucleic Acids Res. 2001 Vol. 29(1), 102-5) ou a base de dados MIPS. As moléculas de ácido nucleico usadas no processo de acordo com a invenção tomam a forma de seqüências isoladas de ácido nucleico, que codificam polipeptídeos com uma atividade de um polipeptídeo selecionado do grupo como indicado na Tabela I, coluna 3, linhas 1, 2,3 4 e/ou 5 ou tendo a seqüência de um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 e 7, linhas 1, 2, 3, 4 e/ou 5 e que conferem um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio.
A(s) seqüência(s) de ácido nucleico usada(s) no processo para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em organismos transgênicos originam-se vantajosamente de um eucariota mas também pode originam-se de um procariota ou um arquibactéria, assim o mesmo pode derivar-se por exemplo de um microorganismo, um animal ou uma planta.
Para o propósito da invenção, como uma regra o plural é intencionado abranger o singular e vice versa.
De modo a melhorar a introdução da seqüências de ácido nucleico e a expressão da seqüências nos organismos transgênicos, que são usados no processo, as seqüências de ácido nucleico são incorporados em uma construção de ácido nucleico e/ou um vetor. Além das seqüências aqui descritas que são usadas no processo de acordo com a invenção, outras seqüências de ácido nucleico, que codificam vantajosamente genes da assimilação de nitrogênio ou biossíntese de aminoácido ou armazenagem de proteínas de valor nutricional, adicionalmente pode estar presente na construção de ácido nucleico ou no vetor e pode ser introduzido junto no organismo. Entretanto, estas seqüências adicionais também podem ser introduzidas no organismos por intermédio de outra, construção separada de ácido nucleico ou vetores.
Usando os vetores de clonagem aqui mencionados e métodos de transformação tais como aqueles que são publicados e citados em: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), capítulo 6/7, pp. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Planta transgênicas, vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Planta Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)) e ainda citados abaixo, os ácidos nucleicos podem ser usados para a modificação recombinante de uma ampla faixa de organismos, em particular microorganismos ou plantas procarióticas ou eucarióticas, de modo que eles se tornem um acumulador e/ou produtor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio mais eficientes respectivamente de acordo com a invenção. Este acúmulo ou produção de nitrogênio melhorados dos compostos contendo nitrogênio ou produtos derivados destes, tais como proteínas, podem ser realizados por um efeito direto de manipulação ou por um efeito indireto desta manipulação.
Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção originam-se de uma planta, tal como uma planta selecionado das famílias Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassieaeeae, Caetaeeae, Cueurbitaeeae, Euphorbiaeeae, Fabaeeae, Malvaeeae, Nymphaeaeeae, Papaveraeeae, Rosaceae, Salieaceae, Solanaeeae, Areeaeeae, Bromeliaeeae, Cyperaeeae, Iridaeeae, Liliaceae, Orehidaeeae, Gentianaeeae, Labiaceae, Magnoliaeeae, Ranunculaceae, Carifolaeeae, Rubiaeeae, Serophulariaeeae, Caryophillaeeae, Erieaeeae, Poligonaeeae, Violaeeae, Juneaceae ou Poaeeae e preferivelmente de uma planta selecionada do grupo das famílias Apiaeeae, Asteraceae, Brassieaeeae, Cucurbitaceae, Fabaeeae, Papaveraeeae, Rosaceae, Solanaeeae, Liliaceae ou Poaceae. Preferidas são as plantas de safra e em particular plantas aqui acima mencionadas como plantas hospedeiras tais como as famílias e gêneros mencionados acima por exemplo as espécies preferidas Anacardium occidentale, Calendula officinalis, Carthamus tinctorius, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Helianthus annus, Tagetes lúcida, Tagetes ereeta, Tagetes tenuifolia; Daueus carota; Corilus avellana, Corilus eolurna, Borago officinalis; Brassica napus, Brassiea rapa ssp., Sinapis arvensis Brassiea juneea, Brassiea juneea var. juneea, Brassiea juneea var. erispifolia, Brassiea juneea var. foliosa, Brassiea nigra, Brassiea sinapioides, Melanosinapis eommunis, Brassiea oleraeea, Arabidopsis thaliana, Anana eomosus, Ananas ananas, Bromelia eomosa, Cariea papaya, Cannabis sative, Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaeeus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliaeea, Ipomoea triloba, Convolvulus panduratus, Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altíssima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta marítima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. eonditiva, Beta vulgaris var. eseulenta, Cueurbita maxima, Cueurbita mixta, Cucurbita pepo, Cueurbita mosehata, Olea europaea, Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot duleis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot eseulenta, Rieinus eommunis, Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile, Medieago sativa, Medieago faleata, Medieago varia, Glieina max Doliehos soja, Glieina graeilis, Glieina hispida, Phaseolus max, Soja hispida, Soja max, Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides, Oleum cocoas, Laurus nobilis, Persea americana, Araehis hypogaea, Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum eatharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense, Linum trigynum, Puniea granatum, Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium thurberi, Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisíaca, Musa spp., Elaeis guineensis, Vapaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium, Sesamum indicum, Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betei, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata, Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum seealinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregular e, Hordeum sativum, Hordeum secalinum, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida, Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aetiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum millet, Panicum militaceum, Zea mays, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum ou Triticum vulgare, Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica, Capicum annuum, Capicum annuum var. glabriusculum, Capicum frutescens, Capicum annuum, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lyeopersieon piriforme, Solanum integrifolium, Solanum lycopersicum Theobroma cacao ou Camellia sinensis.
Em uma forma de realização, a seqüência da molécula de ácido nucleico para o acúmulo e/ou produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio originam-se vantajosamente de um microorganismo como mencionado acima sob organismo hospedeiro tal como um fungo por exemplo os gêneros Aspergillus, Penicillium ou Claviceps ou de leveduras tais como os gêneros Pichia, Torulopsis, Hansenula, Schizosaccharomyces, Candida, Rhodotorula ou Saceharomyces, de modo muito especialmente vantajoso da levedura da família Saccharomycetaceae, tal como o gênero vantajoso Saccharomyces e o gênero e espécies muito vantajoso Saceharomyces eerevisiae.
O técnico habilitado conhece outras fontes adequadas para ácidos nucleicos que podem ser usados para o acúmulo e/ou produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente. Eles incluem no geral todas as células procarióticas ou eucarióticas, preferivelmente microorganismos unicelulares, tais como fungos como os gêneros Clavieeps ou Aspergillus ou bactérias gram-positivas tais como os gêneros Bacillus, Corynebaeterium, Mierocoecus, Brevibaeterium, Rhodoeoeeus, Noeardia, Caseobaeter ou Arthrobaeter ou bactérias gram- positivas tais como os gêneros Eseheriehia, Flavobaeterium ou Salmonella ou leveduras tais como os gêneros Rhodotorula, Hansenula ou Candida.
Entretanto, também é possível usar seqüências artificiais, que diferem em uma ou mais bases das seqüências de ácido nucleico encontradas em organismos ou em uma ou mais moléculas de aminoácido das seqüências de polipeptídeo encontradas em organismos, em particular das seqüências de polipeptídeo indicadas na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou os homólogos funcionais destes como aqui descritos, preferivelmente que conferem atividade mencionada acima, isto é, que conferem um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio depois de aumentar a sua atividade. Em formas de realização preferidas da presente invenção as seqüências de polipeptídeo indicadas na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou os homólogos funcionais destas como aqui descritos, preferivelmente que conferem a atividade mencionada acima, isto é, que conferem um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio depois de aumentar a sua atividade, são expressadas a partir da seqüências de ácido nucleico que foram otimizadas de acordo com o uso de códon no organismo ou organela hospedeiros selecionados. A pessoa habilitada na técnica está familiarizada com fontes para tabelas mostrando o uso de códon preferido para aminoácidos diferentes nos organismos selecionados.
No processo de acordo com a invenção as seqüências de ácido nucleico podem ser usadas, que, se apropriado, contêm bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou modificadas, que podem ser incorporadas em DNA ou RNA. As ditas bases sintéticas, não naturais ou modificadas podem por exemplo aumentar a estabilidade da molécula de ácido nucleico fora ou dentro de uma célula. As moléculas de ácido nucleico da invenção podem conter as mesma modificações como anteriormente mencionado.
Como usado no presente contexto o termo "molécula de ácido nucleico" também pode abranger a seqüência não traduzida localizada nas extremidades 3' e 5' da região do gene codificador, por exemplo pelo menos 500, preferivelmente 200, de modo especialmente preferível 100, nucleotídeos da seqüência a montante da extremidade 5' da região codificadora e pelo menos 100, preferivelmente 50, de modo especialmente preferível 20, nucleotídeos da seqüência a jusante da extremidade 3' da região do gene codificador. É freqüentemente vantajoso escolher apenas a região codificadora para o propósitos de clonagem e expressão.
Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico usada no processo de acordo com a invenção ou a molécula de ácido nucleico da invenção é uma molécula isolada de ácido nucleico.
Um polinucleotídeo ou molécula de ácido nucleico "isolados" é separado de outros polinucleotídeos ou as moléculas de ácido nucleico, que estão presentes na fonte natural da molécula de ácido nucleico. Uma molécula isolada de ácido nucleico pode ser um fragmento cromossômico de diversos kb ou preferivelmente, uma molécula apenas que compreende a região codificadora do gene. Consequentemente, uma molécula isolada de ácido nucleico da invenção pode compreender regiões cromossômicas, que são adjacentes 5' e 3' ou ainda regiões cromossômicas adjacentes, mas preferivelmente não compreende nenhuma de tais seqüências que naturalmente flanqueiam a seqüência da molécula de ácido nucleico no contexto genômico ou cromossômico no organismo a partir do qual a molécula de ácido nucleico origina-se (por exemplo seqüências que são adjacentes às regiões que codificam a 5'- e 3'-UTRs da molécula de ácido nucleico). Em várias formas de realização, a molécula de ácido nucleico isolada usada no processo de acordo com a invenção por exemplo, pode compreender menos do que aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb seqüências de nucleotídeo que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual a molécula de ácido nucleico originou-se.
As moléculas de ácido nucleico usadas no processo, por exemplo os polinucleotídeos da invenção ou de uma parte destas podem ser isoladas usando técnicas molecular-biológicas padrão e a informação de seqüência aqui fornecida. Também, por exemplo uma seqüência homóloga ou regiões de seqüências homólogas, conservadas ao nível de aminoácido ou DNA podem ser identificadas com auxílio de algoritmos de comparação. A primeira pode ser usada como sondas de hibridização sob técnicas de hidridização padrão (por exemplo aquelas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989) para isolar outras seqüências de ácido nucleico úteis neste processo.
Uma molécula de ácido nucleico abrange uma seqüência completa das moléculas de ácido nucleico usadas no processo, por exemplo o polinucleotídeo da invenção ou uma parte deste pode ser adicionalmente isolado pela reação da cadeia de polimerase, iniciadores de oligonucleotídeo com base nesta seqüência ou na parte desta que são usadas. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende a seqüência completa ou parte desta pode ser isolada pela reação da cadeia de polimerase usando iniciadores de oligonucleotídeo que foram gerados na base desta seqüência por exemplo, mRNA pode ser isolado de células (por exemplo por meio de método de extração com tiocianato de guanidina de Chirgwin et ai. (1979) Biochemistry 18:5294-5299) e cDNA pode ser gerada por meio de transcriptase reversa (por exemplo transcriptase reversa MLV de Moloney, disponível de Gibco/BRL, Betesda, Transcriptase reversa de MD ou AMV, obtenível de Seikagakn America, Inc., St.Petersburg, FL).
Iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos para a amplificação, por exemplo como os pares indicado na Tabela III, colunas 7, linhas 1, 2, 3 4 e/ou 5, por meio da reação de cadeia da polimerase pode ser gerada na base de uma seqüência aqui mostrada, por exemplo a seqüência como indicado na Tabela I, colunas 5 ou 7, linhas 1, 2, 3, 4 e/ou 5 ou as seqüências de ácido nucleico derivadas das seqüências de polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, linhas 1, 2, 3, 4 e/ou 5.
Além disso, é possível identificar regiões conservadas de vários organismos pela realização dos alinhamentos de seqüência de proteína com o polipeptídeo codificado pelas moléculas de ácido nucleico da presente invenção, em particular com as seqüências selecionadas do grupo como mostrado nas colunas 5 ou 7 da Tabela II, das quais as regiões conservadas e por sua vez, os iniciadores degenerados podem ser derivados.
As regiões conservadas são aquelas, que mostram uma variação muito pequena no aminoácido em uma posição particular de vários homólogos de origem diferente. Os motivos de seqüência e polipeptídeo de consenso mostrados na coluna 7 da Tabela IV são derivados from o dito alinhamentos. Além disso, é possível identificar as regiões conservadas de vários organismos pela realização dos alinhamentos de seqüência de proteína com o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico da presente invenção, em particular com as moléculas de polipeptídeo mostradas nas colunas 5 ou 7 da Tabela II, das quais as regiões conservadas e por sua vez, os iniciadores degenerados podem ser derivados.
Em uma forma de realização vantajosa, no método da presente invenção a atividade de um polipeptídeo é aumentada que compreende ou que consiste de uma seqüência de consenso ou um motivo de polipeptídeo mostrado na tabela IV coluna 7 e em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um polipeptídeo que compreende ou que consiste de uma seqüência de consenso ou um motivo de polipeptídeo mostrado na tabela IV, coluna 7 por meio do qual 20 ou menos, preferivelmente de 15 ou 10, preferivelmente de 9, 8, 7 ou 6, mais preferido de 5 ou 4, ainda mais preferido de 3, ainda mais preferido de 2, ainda mais preferido de 1, o mais preferido 0 das posições de aminoácidos indicados podem ser substituídos por qualquer aminoácido. Em uma forma de realização não mais do que 15%, preferivelmente 10%, ainda mais preferido .5%, 4%, 3% ou 2%, o mais preferido 1% ou 0% das posições de aminoácido 15 indicado por uma letra é substituído por um outro aminoácido. Em uma forma de realização 20 ou menos, preferivelmente de 15 ou 10, preferivelmente de .9, 8, 7 ou 6, mais preferido de 5 ou 4, ainda mais preferido de 3, ainda mais preferido de 2, ainda mais preferido de 1, o mais preferido de 0 aminoácidos são inseridos em uma seqüência de consenso ou motivo de proteína.
A seqüência de consenso foi derivada de um alinhamento múltiplo das seqüências como listadas nas colunas 5 e 7 da tabela II. As letras representam o código de aminoácido de uma letra e indicam que os aminoácidos são conservados em todas as proteínas alinhadas. A letra X significa aminoácidos, que não são conservados em toda as seqüências. Em um exemplo, no caso onde apenas um pequeno subconjunto selecionado de aminoácidos é possível em uma certa posição estes aminoácidos são dados colchetes. O número de X dado indica a distância entre os resíduos de aminoácido conservados, por exemplo Y-x(21,23)-F significa que os resíduos de tirosina e fenilalanina são separados um do outro por um mínimo de 21 e máximo de 23 resíduos de aminoácido em todas as seqüências investigadas.
Domínios conservados foram identificados de todas as seqüências e são descritos usando um subconjunto da notação de Prosite padrão, por exemplo, o padrão Y-x(21,23)-[FW] significa que uma tirosina conservada é separada por um mínimo de 21 e máximo de 23 resíduos de aminoácido de uma fenilalanina ou triptofano.
Os padrões conservados foram identificados com a ferramenta de software versão MEME 3.5.1 ou manualmente. MEME foi desenvolvido por Timothy L. Bailey e Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engeneering, University of Califórnia, San Diego, USA e é descrito por Timothy L. Bailey e Charles Elkan [Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, 1994], O código fonte para o programa autônomo é público disponível da San Diego Supercomputer center (http://meme.sdsc.edu).
Para identificar motivos comuns em todas as seqüências com a ferramenta de software MEME, os seguintes ajustes foram usados: -maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0,001, -maxw 60, -distância le-3, -minsites número de seqüências usado para a análise. Seqüências de entrada para MEME foram seqüências não alinhadas no formato Fasta. Outros parâmetros foram usados no ajuste de default nesta versão de software.
Os padrões Prosite de domínios conservados foram gerados com a ferramenta de software Pratt versão 2.1 ou manualmente. Pratt foi desenvolvido por Inge Jonassen, Dept. of Informatics, University of Bergen, Norway e é descrito por Jonassen et al. [I. Jonassen, J. F. Collins e D. G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned protein sequences, Protein Science 4 (1995), pp. 1587-1595; I. Jonassen, Eficiente discovery of conserved patterns using a pattern graph, Submitted to CABIOS Febr. 1997], O código fonte (ANSI C) para o programa autônomo é público disponível, por exemplo em centros de Bioinformática estabelecidos como o EBI (European Bioinformatics Institute).
Para gerar padrões com a ferramenta de software Pratt, os seguintes ajustes foram usados: PL (Comprimento de Padrão max): 100, PN (max Nr de Símbolos Padrão): 100, PX (max Nr de x's consecutivos): 30, FN (max Nr de espaçadores flexíveis): 5, FL (max Flexibilidade): 30, FP (max Flex.Produto): 10, ON (padrões de número max): 50. Seqüências de entrada para Pratt foram regiões distintas das seqüências de proteína que exibem similaridade alta como identificadas a partir da ferramenta de software MEME. O número mínimo de seqüências, que têm que emparelhar os padrões gerados (CM, min Nr de Seqs para Emparelhar) foi ajustado a pelo menos .80% das seqüências fornecidas. Os parâmetros não mencionados aqui foram usados em seus ajustes de default.
Os padrões Prosite dos domínios conservados pode ser usado para pesquisar quanto as seqüências de proteína que se emparelham com este padrão. Vários centros de Bioinformática estabelecidos fornecem portais de internet públicos para o uso destes padrões na pesquisa de base de dados (por exemplo PIR [Protein Information Resource, localizada no Georgetown University Medicai Center] ou ExPASy [Expert Protein Analysis System]). Alternativamente, software independente está disponível, como o programa Fiizzpro que é parte do pacote de software EMBOS S. Por exemplo, o programa Fuzzpro não apenas permite pesquisar quanto a um emparelhamento de padrão-proteína exato mas também permite ajustar várias ambigüidades na pesquisa realizada.
O alinhamento foi realizado com o software ClustalW (versão .1.83) e é descrito por Thompson et ai. [Thompson, J. D., Higgins, D. G. e Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Aeids Research, 22:4673-4680]. O código fonte para o programa autônomo é público disponível da European Molecular Biology Laboratory; Heidelberg, Alemanha. A análise foi realizada usando os parâmetros de default de ClustalW ν 1.83 (penalidade de abertura de intervalo: 10,0; penalidade de extensão de intervalo: 0,2; matriz de proteína: Gonnet; proteína/DNA endgap: -1; proteína/DNA gapdist:4)·
Iniciadores degenerados podem ser depois usados pela PCR para a amplifícação de fragmentos de novas proteínas tendo a atividade mencionada acima, por exemplo que confere o aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio depois de aumentar a sua expressão ou atividade ou outros homólogos funcionais do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção de outros organismos.
Estes fragmentos podem ser depois utilizados como sonda de hibridização para isolar a seqüência do gene completa. Como uma alternativa, as seqüências 5' e 3' perdidas podem ser isoladas por meio de RACE-PCR (amplifícação rápida de extremidades de cDNA). Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser amplificada usando cDNA ou, como uma alternativa, DNA genômico como padrão e iniciadores adequados de oligonucleotídeo, seguindo as técnicas de amplifícação pela PCR padrão. A molécula de ácido nucleico assim amplificada pode ser clonada em um vetor adequado e caracterizado por meio de análise de seqüência de DNA. Os oligonucleotídeos, que correspondem a uma das moléculas de ácido nucleico usadas no processo, podem ser gerados pelos métodos de síntese padrão, por exemplo usando um sintetizador de DNA automático.
As moléculas de ácido nucleico que são vantajosas para o processo de acordo com a invenção podem ser isoladas com base na sua homologia às moléculas de ácido nucleico aqui divulgadas usando a seqüências ou parte desta como sonda de hibridização e seguindo técnicas de hibridização padrão sob condições de hibridização estringentes. Neste contexto, é possível usar, por exemplo, moléculas isoladas de ácido nucleico de pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ou mais nucleotídeos, preferivelmente de pelo menos 15, 20 ou 25 nucleotídeos no comprimento que hibridizam sob condições estringentes com as moléculas de ácido nucleico descritas acima, em particular com aquelas que abrangem uma seqüência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico usada no processo da invenção ou que codifica uma proteína usada na invenção ou da molécula de ácido nucleico da invenção. As moléculas de ácido nucleico com 30, 50, 100, 250 ou mais nucleotídeos também podem ser usados.
O termo "homologia" significa que as respectivas moléculas de ácido nucleico ou proteínas codificadas são funcional e/ou estruturalmente equivalentes. As moléculas de ácido nucleico que são homólogas às moléculas de ácido nucleico descritas acima e que são derivadas das ditas moléculas de ácido nucleico são, por exemplo, variações das ditas moléculas de ácido nucleico que representam as modificações tendo a mesma função biológica, em particular que codificam proteínas com a mesma ou substancialmente a mesma função biológica. Estas podem ser variações que ocorrem naturalmente, tais como seqüências de outras variedades ou espécies ou mutações de plantas. Estas mutações podem ocorrer naturalmente ou podem ser obtidas pelas técnicas de mutagênese. As variações alélicas podem ser variações alélicas que ocorrem naturalmente assim como variantes sinteticamente produzidas ou geneticamente engendradas. Equivalentes estruturais por exemplo, podem ser identificados testando-se a ligação do dito polipeptídeo aos anticorpos ou prognóstico com base em computador. Os equivalentes estruturais têm a característica imunológica similar, por exemplo compreendem epítopos similares.
Por "hibridização" é intencionado que tais moléculas de ácido nucleico hibridizem sob condições de hibridização convencionais, preferivelmente sob condições estringentes tais como descrito por, por exemplo, Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989)) ou in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1989), 6,3,1-6,3,6.
De acordo com a invenção, moléculas de DNA assim como de RNA do ácido nucleico da invenção podem ser usadas como sondas. Além disso, como padrão para a identificação de homólogos funcionais os ensaio de Northern blot assim como ensaios de Southern blot podem ser realizados. O ensaio de Northern blot vantajosamente fornece mais informação a cerca do produto de gene expressado: por exemplo padrão de expressão, ocorrência de etapas de processamento, como união e encapuzamento, etc. O ensaio de Southern blot fornece informação adicional a cerca de localização cromossômica e organização do gene que codifica a molécula de ácido nucleico da invenção.
Um exemplo preferido, condições de hibridização estringentes não limitantes são hibridizações em 6 χ cloreto de sódio/citrato de sódio (= SSC) em aproximadamente 45°C, seguido por uma ou mais etapas de lavagem em 0,2 χ SSC, 0,1% de SDS de 50 a 65°C, por exemplo a 50°C, 55°C ou 60°C. O técnico habilitado sabe que estas condições de hibridização diferem como uma função do tipo do ácido nucleico e, por exemplo quando solventes orgânicos estão presentes, com respeito à temperatura e concentração do tampão. A temperatura sob "condições de hibridização padrão" difere por exemplo como uma função do tipo do ácido nucleico entre . 42°C e 58°C, preferivelmente entre 45°C e 50°C em um tampão aquoso com uma concentração de 0,1 χ 0,5 χ, 1 χ, 2 χ, 3 χ, 4 χ ou 5 χ SSC (ρΗ 7,2). Se o(s) solvente(s) orgânico(s) é/estão presente(s) no tampão supra citado, por exemplo 50% de formamida, a temperatura sob condições padrão é aproximadamente de 40°C, 42°C ou 45°C. As condições de hibridização para híbridos de DNA:DNA são preferivelmente por exemplo de 0,1 χ SSC e 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C ou 45°C, preferivelmente entre 30°C e 45°C. As condições de hibridização para híbridos de DNA:RNA são preferivelmente por exemplo de 0,1 χ SSC e 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C ou 55°C, preferivelmente entre 45°C e 55°C. As temperaturas de hibridização supra citadas são determinadas por exemplo para um ácido nucleico aproximadamente de 100 pares de base (= pares de base) no comprimento e um teor de G + C de 50% na ausência de formamida. O técnico habilitado sabe determinar as condições de hibridização requeridas com auxílio de livros texto, por exemplo aqueles mencionados acima ou dos seguintes livros texto: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames e Higgins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Um outro exemplo de uma tal condição de hibridização estringente é hibridização a 4XSSC a 65°C, seguida por uma lavagem em 0,1 XSSC a 65°C por uma hora. Alternativamente, uma condição de hibridização estringente exemplar é em 50% de formamida, 4XSSC a 42°C. Além disso, as condições durante a etapa de lavagem pode ser selecionada da faixa de condições delimitadas pelas condições de severidade baixa (aproximadamente2X SSC a 50°C) e condições de severidade alta (aproximadamente 0,2X SSC a 50°C, preferivelmente a 65°C) (20X SSC: citrato de sódio 0,3M, NaCl 3 M, pH 7,0). Além disso, a temperatura durante a etapa de lavagem pode ser elevada de condições de severidade baixa na temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, até as condições de severidade mais alta em aproximadamente 65°C. Ambos os parâmetros de condições salinas e temperatura podem ser variados simultaneamente ou mesmo um dos dois parâmetros pode ser mantido constante enquanto o outro é apenas variado. Os desnaturantes, por exemplo formamida ou SDS, também podem ser utilizados durante a hibridização. Na presença de 50% de formamida, hibridização é preferivelmente efetuada a 42°C. Os fatores relevantes como i) duração de tratamento, ii) condições salinas, iii) condições de detergente, iv) competidores DNAs, v) temperatura e vi) a seleção de sonda pode ser combinada caso a caso de modo que nem todas as possibilidades podem ser aqui mencionadas.
Assim, em uma forma de realização preferida, Northern blots são pré hibridizadas com o tampão Rothi-Hybri-Quick (Roth, Karlsruhe) a 68°C por 2 horas. A hibridização com a sonda radioativa rotulada é feita durante a noite a 68°C. As etapas de lavagem subsequentes são realizadas a 68°C com lxSSC.
Para os ensaios de Southern blot a membrana é pré hibridizada com o tampão Rothi-Hybri-Quick (Roth, Karlsruhe) a 68°C por 2 horas. A hibridização com a sonda radioativa rotulada é conduzida durante a noite a 68°C. Subseqüentemente o tampão de hibridização é descartado e o filtro lavado por pouco tempo usando 2xSSC; 0,1% de SDS. Depois de descartar o tampão de lavagem novo tampão 2xSSC; 0,1% de SDS é adicionado e incubado a 68°C por 15 minutos. A etapa de lavagem é realizada duas vezes seguidas por uma etapa de lavagem adicional usando IxSSC; 0,1% de SDS a 68°C por 10 min.
Alguns outros exemplos de condições para a hibridização de DNA (ensaios de Southern blot) e etapa de lavagem são aqui mostrados abaixo:
.1. As condições de hibridização podem ser selecionadas, por exemplo, das seguintes condições: a) 4X SSC a 65°C,
b) 6X SSC a 45°C, c) 6X SSC, 100 mg/ml DNA de esperma de peixe fragmentado desnaturado a 68°C,
d) 6X SSC, 0,5% de SDS, 100 mg/ml DNA de esperma de
salmão desnaturado a 68°C,
e)6X SSC, 0,5% de SDS, 100 mg/ml DNA de esperma de
salmão fragmentado desnaturado, 50% de formamida a 42°C,
f) 50% de formamida, 4X SSC a 42°C,
g) 50% (vol/vol) de formamida, 0,1% albumina sérica bovina,0,1% de Ficoll, 0,1% de polivinilpirrolidona, 50 mM tampão de fosfato de sódio pH 6,5, 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de sódio a 42°C,
h) 2X ou 4X SSC a 5 0°C (condição de severidade baixa), ou
i) 30 a 40% de formamida, 2X ou 4X SSC a 42°C (condição de severidade baixa).
.2. As etapas de lavagem podem ser selecionadas, por exemplo, das seguintes condições: a) NaCl 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M /0,1% de SDS a .50°C.
b) 0,1X SSC a 65°C.
c) 0,1X SSC, 0,5% de SDS a 68°C.
d) 0,1X SSC, 0,5% de SDS, 50% de formamida a 42°C. e) 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 42°C.
f) 2X SSC a 65°C (condição de severidade baixa). Os polipeptídeos tendo a atividade mencionada acima, isto é, que conferem o aumento de nitrogênio ou composto contendo nitrogênio, derivados de outros organismos, pode ser codificados por outras seqüências de DNA que hibridizam a uma seqüência indicada na Tabela I, colunas 5 ou .7, preferivelmente na Tabela I B, colunas 5 ou 7, sob as condições de hibridização relaxadas e que codificam a expressão para peptídeos tendo a atividade aumentada de nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio.
Além disso, algumas aplicações têm que ser realizadas em condições de hibridização de severidade baixa, sem quaisquer conseqüências para a especificidade da hibridização. Por exemplo, uma análise de Southern blot do DNA total pode ser sondada com uma molécula de ácido nucleico da presente invenção e lavada com severidade baixa (55°C em 2xSSPE0,l% de SDS). A análise de hibridização pode revelar um padrão simples apenas de genes que codificam polipeptídeos da presente invenção ou usados no processo da invenção, por exemplo tendo atividade aqui mencionada de aumentar nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio. Um outro exemplo de tais condições de hibridização de severidade baixa é 4XSSC a 50°C ou a hibridização com 30 a 40% de formamida a 42°C. Tais moléculas compreendem aqueles que são fragmentos, análogos ou derivados do polipeptídeo da invenção ou usados no processo da invenção e diferem, por exemplo, por via de deleção(ões), inserção(ões), substituição(ões), adição(ões) e/ou recombinação(ões) de aminoácido e/ou nucleotídeo ou qualquer outra modificação(ões) conhecida(s) na técnica sozinha ou em combinação com as seqüências de aminoácido descritas acima ou sua(s) seqüência(s) de nucleotídeo subjacente(s). Entretanto, é preferido usar condições de hibridização de severidade alta.
A hibridização deve ser vantajosamente realizada com fragmentos de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 pares de base, vantajosamente pelo menos 50, 60, 70 ou 80 pares de base, preferivelmente pelo menos 90, 100 ou 110 pares de base. O mais preferivelmente são fragmentos de pelo menos 15, 20, 25 ou 30 pares de base. Preferivelmente também são hibridizações com pelo menos 100 pares de base ou 200, de modo muito especialmente preferível pelo menos 400 pares de base no comprimento. Em uma forma de realização especialmente preferida, a hibridização deve ser realizada com a seqüência de ácido nucleico inteira com as condições descrita acima.
Os termos "fragmento", "fragmento de uma seqüência" ou "parte de uma seqüência" significam uma seqüência trancada da seqüência original aludida. A seqüência trancada (seqüência de ácido nucleico ou proteína) pode variar amplamente no comprimento; o tamanho mínimo sendo uma seqüência de tamanho suficiente para fornecer uma seqüência com pelo menos uma função e/ou atividade comparáveis da seqüência original aludida ou hibridização com a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou usada no processo da invenção sob condições estringentes, embora o tamanho máximo não seja crítico. Em algumas aplicações, o tamanho máximo usualmente não é substancialmente maior do que aquele requerido para fornecer da atividade e/ou função(ões) desejadas da seqüência original.
Tipicamente, a seqüência de aminoácido trancada variará de cerca de 5 a cerca de 310 aminoácidos no comprimento. Mais tipicamente, entretanto, a seqüência terá um máximo de cerca de 250 aminoácidos no comprimento, preferivelmente um máximo de cerca de 200 ou 100 aminoácidos. É usualmente desejável selecionar seqüências de pelo menos cerca de 10, 12 ou 15 aminoácidos, até um máximo de cerca de 20 ou 25 aminoácidos.
O termo "epítopo" diz respeito a sítios imunorreativos específicos dentro de um antígeno, também conhecido como determinantes antigênicos. Estes epítopos podem ser um arranjo linear de monômeros em uma composição polimérica - tais como aminoácidos em uma proteína - ou consistem de ou compreendem uma estrutura secundária ou terciária mais complexa. Aqueles de habilidade reconhecerão que os imunogenes (isto é, substâncias capazes de evocar uma resposta imune) são antígenos; entretanto, alguns antígenos, tais como heptanos, não são imunogenes mas podem ser tornados imunogênicos pela ligação a uma molécula carregadora. O termo "antígeno" inclui referências a uma substância para a qual um anticorpo pode ser gerado e/ou para a qual o anticorpo é especificamente imunorreativo. Em uma forma de realização a presente invenção diz respeito a um epítopo de polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da presente invenção e que confere a atividade mencionada acima, preferivelmente que confere um aumento no nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio.
O termo "um ou vários aminoácidos" diz respeito a pelo menos um aminoácido mas não mais do que este número de aminoácidos, que resultaria em uma homologia abaixo de 50% de identidade. Preferivelmente, a identidade é maior do que 70% ou 80%, mais preferidos são 85%, 90%, 91%,92%), 93%, 94% ou 95%, ainda mais preferidos são 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade.
Além disso, a molécula de ácido nucleico da invenção compreende uma molécula de ácido nucleico, que é um complemento de uma das seqüências de nucleotídeo das moléculas de ácido nucleico mencionadas acima ou uma porção destas. Uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma das seqüências de nucleotídeo indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela I B, colunas 5 ou 7, é uma que seja suficientemente complementar a uma das ditas seqüências de nucleotídeo tal que possa hibridizar a uma das ditas seqüências de nucleotídeo formando deste modo um duplex estável. Preferivelmente, a hibridização é realizada sob condições de hibridização estringentes. Entretanto, um complemento de uma das seqüências aqui divulgadas é preferivelmente uma seqüência complementar a esta de acordo com o emparelhamento de base das moléculas de ácido nucleico bem conhecido pela pessoa habilitada. Por exemplo, as bases AeG sofrem emparelhamento de base com as bases T e U ou C, resp. e vice e versa. As modificações de bases podem influenciar o parceiro de
emparelhamento de base.
A molécula de ácido nucleico da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos cerca de 30%, 35%, 40% ou 45%, preferivelmente pelo menos cerca de 50%, 55%, 60% ou 65%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga a uma seqüência de nucleotídeo indicada na Tabela I, colunas 5 ou .7, preferivelmente na Tabela I B, colunas 5 ou 7,ou uma porção funcional desta e preferivelmente tem a atividade mencionada acima, em particular tem a atividade de aumentar o nitrogênio ou o composto contendo nitrogênio depois aumentar a sua atividade ou uma atividade de um produto de um gene que codifica a dita seqüência ou seus homólogos.
A molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza, preferivelmente hibridiza sob condições estringentes como aqui definida, a uma das seqüências de nucleotídeo indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela I B, colunas 5 ou 7 ou um porção desta e codifica uma proteína tendo atividade mencionada acima e como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, colunas 5 ou 7, por exemplo que confere um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio.
Opcionalmente, a seqüência de nucleotídeo, que hibridiza a uma das seqüências de nucleotídeo indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela I B, colunas 5 ou 7, tem ainda uma ou mais das atividades anotadas ou conhecidas para uma proteína como indicada na Tabela II, coluna 3,
Além disso, a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção pode compreender apenas uma porção da região codificadora de uma das seqüências indicadas na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela I B, colunas 5 ou 7, por exemplo um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento que codifica uma porção biologicamente ativa do polipeptídeo da presente invenção ou de um polipeptídeo usado no processo da presente invenção, isto é, tendo atividade mencionada acima, por exemplo que confere um teor aumentado de nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio se a sua atividade é aumentada. As seqüências de nucleotídeo determinadas a partir da clonagem do presente gene que codifica a proteína de acordo com a invenção permite a geração de sondas e iniciadores designados para o uso na identificação e/ou clonagem de seus homólogos em outros tipos de célula e organismos. A sonda/iniciador tipicamente compreende oligonucleotídeo substancialmente purificado. O oligonucleotídeo tipicamente compreende uma região de seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes a pelo menos cerca de 12, 15 preferivelmente cerca de 20 ou 25, mais preferivelmente cerca de 40, 50 ou 75 nucleotídeos consecutivos de um filamento de sentido de uma das seqüências indicadas na Tabela I, colunas 5 ou 7, uma seqüência de anti-sentido de uma das seqüências indicadas na Tabela I, colunas 5 ou 7, ou mutantes destas que ocorrem naturalmente. Os iniciadores com base em uma seqüência de nucleotídeo da invenção podem ser usados em reações de PCR para clones homólogos do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no processo da invenção, por exemplo como os iniciadores descritos nos exemplos da presente invenção, por exemplo como mostrado nos exemplos. Uma PCR como os pares de iniciador indicados na Tabela III, coluna 7, resultará em um fragmento de uma seqüência de polinucleotídeo como indicado na Tabela I, colunas 5 ou 7. Preferida é a Tabela IB, coluna 7.
Os conjuntos de iniciador são intercambiáveis. A pessoa habilitada na técnica sabe combinar os ditos indicadores para resultar no produto desejado, por exemplo em um clone de tamanho natural ou uma seqüência parcial. As sondas com base nas seqüências da molécula de ácido nucleico da invenção ou usadas no processo da presente invenção podem ser usadas para detectar seqüências transcritas ou genômicas que codificam a mesma ou proteínas homólogas. A sonda pode ainda compreender um grupo de rótulo ligado a estas, por exemplo o grupo de rótulo pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima. Tais sondas podem ser usadas como uma parte de um kit de teste de marcador genômico para identificar células que expressam um polipeptídeo da invenção ou usadas no processo da presente invenção, tal como medindo- se um nível de uma molécula codificadora de ácido nucleico em uma amostra de células, por exemplo, detectando níveis de mRNA ou determinando, se um gene genômico que compreende a seqüência do polinucleotídeo da invenção ou usado nos processos da presente invenção foi mutado ou deletado.
A molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção codifica um polipeptídeo ou porção deste que inclui uma seqüência de aminoácido que seja suficientemente homóloga a uma seqüência de aminoácido como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, linhas 1, 2, 3, 4 e/ou 5 tal que a proteína ou porção desta mantenha a capacidade de participar na acumulação e/ou produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente, em particular uma atividade que aumente o teor de proteína como mencionado acima ou como descrito nos exemplos em plantas ou microorganismos é compreendido.
Como aqui usado, a linguagem "suficientemente homóloga" refere-se a proteínas ou porções destas que têm seqüências de aminoácido que incluem um número mínimo de resíduos de aminoácido idênticos ou equivalentes (por exemplo, um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar como um resíduo de aminoácido em uma das seqüências do polipeptídeo da presente invenção) a uma seqüência de aminoácido como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, tal que a proteína ou porção destas é capaz de participar no acúmulo e/ou produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente. Em uma forma de realização, uma proteína ou porção desta como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, tem por exemplo uma atividade de um polipeptídeo indicado na Tabela II, coluna 3.
Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende um ácido nucleico que codifica uma porção da proteína da presente invenção. A proteína é pelo menos cerca de 30%, 35%,40%, 45% ou 50%, preferivelmente pelo menos cerca de 55%, 60%, 65% ou70% e mais preferivelmente de pelo menos de cerca de 75%, 80%, 85%, 90%,91%, 92%, 93% ou 94% e o mais preferivelmente de pelo menos de cerca de95%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga a uma seqüência de aminoácido inteira como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7 e tem atividade mencionada acima, por exemplo que confere preferivelmente o aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio.
As porções de proteínas codificadas pela molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usadas no método da invenção são de modo preferível biologicamente ativas, preferivelmente tendo atividade anotada mencionada acima, por exemplo que confere um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio depois do aumento de atividade.
Como aqui mencionado, o termo "porção biologicamente ativa" é intencionado incluir uma porção, por exemplo, um domínio/motivo, que confere o aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio ou tem uma atividade imunológica tal que a mesma se ligue a uma ligação de anticorpo especificamente ao polipeptídeo da presente invenção ou um polipeptídeo usado no processo da presente invenção para produzir nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio;
A invenção ainda diz respeito às moléculas de ácido nucleico que diferem de uma das seqüências de nucleotídeo indicadas na Tabela I, colunas 5 ou 7, (e porções destas) devido a degeneração do código genético e assim codificam um polipeptídeo da presente invenção, em particular um polipeptídeo tendo a atividade mencionada acima, por exemplo que confere um aumento no nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio em um organismo, por exemplo como aqueles polipeptídeos que compreendem a seqüências de consenso como indicados na Tabela IV, coluna 7 ou do polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou seus homólogos funcionais. Vantajosamente, a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção compreende ou em uma outra forma de realização tem, uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína que compreende ou em uma outra forma de realização tendo, uma seqüência de consenso como indicada na Tabela IV, coluna 7 ou do polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou os homólogos funcionais. Ainda em uma outra forma de realização, a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção codifica uma proteína de tamanho natural que é substancialmente homóloga a uma seqüência de aminoácido que compreende uma seqüência de consenso como indicada na Tabela IV, coluna 7 ou de um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou os homólogos funcionais destas. Entretanto, em uma forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico da presente invenção não consiste de uma seqüência como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente como indicada na Tabela I A, colunas 5 ou 7. Preferivelmente a molécula de ácido nucleico da invenção é um homólogo funcional ou idêntica a uma molécula de ácido nucleico indicada na Tabela IB, colunas 5 ou 7.
Além disso, será avaliado por aqueles de habilidade na técnica que os polimorfismos de seqüência de DNA que levam as mudanças nas seqüências de aminoácido podem existir dentro de uma população, tal polimorfismo genético no gene que codifica o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção ou que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção podem existir entre indivíduos dentro de uma população devido à variação natural.
Como aqui usado, os termos "gene" e "gene recombinante" referem-se às moléculas de ácido nucleico que compreendem uma matriz de leitura aberta que codifica o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção ou que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou que codifica o polipeptídeo usado no processo da presente invenção, preferivelmente de uma planta de safra ou de um microorganismo úteis para a cumulação e/ou produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente, em particular para a produção de proteínas, tais variações naturais podem tipicamente resultar em 1 a 5% de variação na seqüência de nucleotídeo do gene. Qualquer e todas de tais variações e polimorfismos de aminoácido resultante em genes que codificam um polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção ou que compreende uma molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção que são o resultado de variação natural e que não alteram a atividade funcional como descrito são intencionados a estarem dentro do escopo da invenção. As moléculas de ácido nucleico correspondentes aos
homólogos variantes naturais de uma molécula de ácido nucleico da invenção ou da molécula de ácido nucleico usada no método da invenção, que também podem ser um cDNA, podem ser isoladas com base na sua homologia com as moléculas de ácido nucleico aqui divulgadas usando a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou uma porção deste, como uma sonda de hibridização de acordo com técnicas de hibridização padrão sob condições de hibridização estringentes.
Consequentemente, em uma outra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção tem pelo menos 15, 20, 25 ou 30 nucleotídeos no comprimento. Preferivelmente, a mesma hibridiza sob condições estringentes a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma seqüência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico da presente invenção ou usada no processo da presente invenção, por exemplo que compreende uma seqüência como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7. A molécula de ácido nucleico tem preferivelmente pelo menos 20, 30, 50, 100, 250 ou mais nucleotídeos no comprimento.
O termo "hibridiza sob condições estringentes" é definido acima. Em uma forma de realização, o termo "hibridiza sob condições estringentes" é intencionado descrever condições para a hibridização e lavagem sob as quais as seqüências de nucleotídeo pelo menos 30%, 40%,50% ou 65% idênticas entre si tipicamente permanecem hibridizadas entre si. Preferivelmente, as condições são tais que as seqüências pelo menos cerca de .70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75% ou 80% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% ou mais idênticas entre si tipicamente permanecem hibridizadas entre si.
Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção que hibridiza sob condições estringentes a uma seqüência como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, linhas 1, 2, 3, 4 e/ou 5 correspondem a uma molécula de ácido nucleico da invenção que ocorre naturalmente. Como aqui usado, um molécula de ácido nucleico "que ocorre naturalmente" refere-se a uma molécula de RNA ou DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo que ocorre na natureza (por exemplo, codifica uma proteína natural). Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína natural tendo a atividade mencionada acima, por exemplo que confere aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio depois de aumentar a expressão ou atividade desta ou a atividade de uma proteína da invenção ou usada no processo da invenção.
Além das variantes que ocorre naturalmente das seqüências do polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico da invenção assim como do polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico usados no processo da invenção que possam existir na população, o técnico habilitado avaliará ainda que mudanças podem ser introduzidas pela mutação em uma seqüência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da invenção ou usado no processo da presente invenção, levando deste modo ás mudanças na seqüência de aminoácido do dito polipeptídeo codificado, sem alterar a capacidade funcional do polipeptídeo, preferivelmente não diminuindo a dita atividade.
Por exemplo, as substituições de nucleotídeo que levam às substituições de aminoácido em resíduos de aminoácido "não essenciais" podem ser fabricadas em uma seqüência da molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção, por exemplo como indicado na Tabela I, colunas 5 ou 7, linhas 1, 2, 3 4 e/ou 5.
Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da seqüência do tipo selvagem de um sem alterar a atividade do dito polipeptídeo, ao passo que um resíduo de aminoácido "essencial" é requerido para uma atividade como mencionada acima, por exemplo que leva a um aumento no nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio em um organismo depois um aumento de atividade do polipeptídeo. Outros resíduos de aminoácido, entretanto, (por exemplo, aqueles que não são conservados ou apenas semi-conservados no domínio tendo a dita atividade) pode não ser essenciais para a atividade e assim provavelmente devem ser passíveis de alteração sem que altere a dita atividade.
Além disso, uma pessoa habilitada na técnica sabe que o uso de códon entre organismos pode diferir. Portanto, pode-se adaptar o uso de códon na molécula de ácido nucleico da presente invenção ao uso do organismo em que o polinucleotídeo ou polipeptídeo são expressados.
Consequentemente, a invenção diz respeito às moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo tendo a atividade mencionada acima, por exemplo que conferem um aumento no nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio em um organismo ou partes deste que contêm mudanças em resíduos de aminoácido que não são essenciais para a dita atividade. Tais polipeptídeos diferem na seqüência de aminoácido de uma seqüência contida em uma seqüência como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7, embora retenham a dita atividade aqui descrita. A molécula de ácido nucleico pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos cerca de 50% idêntica a uma seqüência de aminoácido como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7 e é capaz de participar no acúmulo e/ou produção aumentados de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente depois de aumentar a sua atividade, por exemplo a sua expressão. Preferivelmente, a proteína codificada pela molécula de ácido nucleico é pelo menos cerca de 60% idêntica a uma seqüência como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, linhas 1, 2, 3 4 e/ou 5, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70% idêntica a uma das seqüências como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, 90% ou 95% homóloga a uma seqüência como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7 e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7.
Para determinar a homologia (= identidade) percentual de duas seqüências de aminoácido ou de duas das moléculas de ácido nucleico, as seqüências são escritas uma embaixo da outra para uma comparação ótima (por exemplo intervalos podem ser inseridos na seqüência de uma proteína ou de um ácido nucleico de modo a gerar um alinhamento ótimo com a outra proteína ou o outro ácido nucleico).
Os resíduos de aminoácido ou as moléculas de ácido nucleico nas posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são depois comparados. Se uma posição em uma seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou pela mesma molécula de ácido nucleico como a posição correspondente na outra seqüência, as moléculas são homólogas nesta posição (isto é, "homologia" de aminoácido ou ácido nucleico como usado no presente contexto corresponde à "identidade" de aminoácido ou ácido nucleico. A homologia percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é,% de homologia = número de posições idênticas/número total de posições χ 100). Os termos "homologia" e "identidade" devem ser assim considerados como sinônimos.
Para a determinação da homologia percentual (= identidade) de dois ou mais aminoácidos ou de duas ou mais seqüências de nucleotídeo diversos programas de software de computador foram desenvolvidos. A homologia de duas ou mais seqüências pode ser calculada por exemplo com o software fasta, que presentemente foi usado na versão fasta 3 (W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological Sequence Comparation. PNAS 85:2444- 2448; W. R. Pearson (1990) Rapid and Sensitive Sequence Comparation with FASTP e FASTA, Methods in Enzymology 183: 63 - 98. Um outro programa útil para o cálculo de homologias de seqüências diferentes é o programa blast padrão, que é incluído no software meticuloso Biomax (Biomax, Munich, República Federal da Alemanha). Infelizmente isto leva algumas vezes a resultados subótimos visto que o nível de operação nem sempre inclui seqüências completas do objeto e da dúvida. Não obstante como este programa é muito eficiente o mesmo pode ser usado para a comparação de um grande número de seqüências. Os seguintes ajustes são tipicamente usados para uma tal comparação de seqüências:
-p Nome do Programa [Filamento]; -d Base de dados [Filamento]; default = nr; -i Arquivo Dúvida [Entrada de Arquivo]; default = stdin; -e valor de Expectativa (E) [Real]; default = 10,0; -m opções de visualização de alinhamento: 0 = aos pares; 1 = ancorado à dúvida mostrando identidades; 2 = ancorado à dúvida nenhuma identidade; 3 = ancorado à dúvida completamente, mostra identidades; 4 = ancorado à dúvida completamente, nenhuma identidade; 5 = ancorado à dúvida nenhuma identidade e extremidades abruptas; 6 = ancorado à dúvida completamente, nenhuma identidade e extremidades abruptas; 7 = Produto do nível de operação XML; 8 = tabular; 9 tabular com linhas de comentário [Inteiro]; default = 0; -o BLAST reporta Arquivo de Saída [Saída de Arquivo] Opcional; default = stdout; -F Filtrar a seqüência dúvida (DUST com blastn, SEG com outros) [Filamento]; default = T; -G Custo para abrir um intervalo (zero invoca comportamento de default) [Inteiro]; default = 0; -E Custo para prolongar um intervalo (zero invoca comportamento de default) [Inteiro]; default = 0; -X X valor de queda para alinhamento com intervalo (em bits) (zero invoca comportamento de default); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, todos os outros 15 [Inteiro]; default = 0; -I Mostra GFs in define [T/F]; default = F; -q Penalidade para um desemparelhamento de nucleotídeo (apenas blastn) [Inteiro]; default = -3; -r Recompensa para um emparelhamento de nucleotídeo (apenas blastn) [Inteiro]; default = 1; -v Número de seqüência da base de dados para mostrar descrições de linha única para (V) [Inteiro]; default = 500; -b Número de seqüência da base de dados para mostrar os alinhamentos para (B) [Inteiro]; default = 250; -f Limiar para acertos de extensão, default se zero; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast O [Inteiro]; default = 0; -g Realiza o alinhamento de intervalo (não disponível com tblastx) [T/F]; default = T; -Q código genético da dúvida para usar [Inteiro]; default = 1; -D DB Código genético (apenas para tblast[nx] apenas) [Inteiro]; default = 1; -a Número de processadores para usar [Inteiro]; default = 1; -O arquivo SeqAlign [Saída de Arquivo] Opcional; -J Acreditar na defline dúvida [T/F]; default = F; -M Matriz [Filamento]; default - BLOSUM62; -W Tamanho da palavra, default se zero (blastn 11, megablast 28, todos os outros 3) [Inteiro]; default = 0; -z Comprimento eficaz da base de dados (usar zero para o tamanho real) [Real]; default = 0; -K Número de melhor acerto de uma região para manter (desligado por default, se usado um valor de 100 é recomendado) [Inteiro]; default = 0; -P 0 para acerto múltiplo, 1 para acerto único [Inteiro]; default =0; -Y Comprimento eficaz do espaço de pesquisa (usar zero para o tamanho real) [Real]; default = 0; -S filamentos dúvida para pesquisar search mais uma vez contra base de dados (para blast[nx] e tblastx); 3 é ambos, 1 é topo, 2 é fundo [Inteiro]; default = 3; -T Produzir saída de HTML [T/F]; default = F; -1 pesquisa restrita de base de dados para listar de GI's [Filamento] Opcional; -U Usar filtração de letra minúscula de seqüência FASTA [T/F] Opcional; default = F; -y X valor de queda para extensões sem intervalo em bits (0,0 invoca comportamento de default); blastn 20, megablast 10, todos os outros 7 [Real]; default = 0,0; -Z X valor de queda para alinhamento de intervalo final em bits (0,0 invoca comportamento de default); blastn/megablast 50, tblastx 0, todos os outros 25 [Inteiro]; default = 0; -R PSI-TBLASTN arquivo de ponto de checagem [Entrada de arquivo] Opcional; -n pesquisa de MegaBlast [T/F]; default = F; -L Localização na seqüência dúvida [Filamento] Opcional; -A tamanho da janela de acertos Múltiplos, default se zero (blastn/megablast 0, todos os outros 40 [Inteiro]; default = 0; -w penalidade de mudança de matriz (algoritmo OOF para blastx) [Inteiro]; default = 0; -t Comprimento do intron maior permitido no tblastn para ligar HSPs (0 desativa a ligação) [Inteiro]; default = 0.
Resultados de alta qualidade são atingidos usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman. Portanto programas com base nos ditos algoritmos são preferidos. Vantajosamente as comparações de seqüências podem ser feitas com o programa PileUp (J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou preferivelmente com os programas Gap e BestFit, que são respectivamente com base nos algoritmos de Needleman e Wunsch [J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)] e Smith e Waterman [Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)]. Ambos os programas são parte do pacote de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 et seq.]. Portanto preferivelmente os cálculos para determinar as porcentagens de homologia de seqüência são feitos com o programa Gap na faixa inteira das seqüências. Os seguintes ajustes padrão para a comparação de seqüências de ácido nucleico foram usados: peso de intervalo: 50, peso de comprimento: 3, emparelhamento médio: 10.000, desemparelhamento médio: 0,000.
Por exemplo uma seqüência que tem uma homologia de 80% com a seqüência SEQ ID NO: 1 ao nível do ácido nucleico é entendido como significativo de uma seqüência que, na comparação com a seqüência SEQ ID NO: 1 pelo algoritmo do programa Gap acima com o conjunto de parâmetros acima, tem uma homologia de 80%.
No estado da técnica, a homologia entre dois polipeptídeos também é entendido como significativo da identidade da seqüência de aminoácido em relação em cada caso o comprimento da seqüência inteira que é calculado pela comparação com auxílio do algoritmo de programa GAP (Wisconsin Package Versão 10.0, University of Wisconsin, Genetics
Computer Group (GCG), Madison, USA), ajustando os seguintes parâmetros:
peso de intervalo: 8 Peso de comprimento: 2 Emparelhamento médio: 2.912
Desemparelhamento médio: -2.003
Por exemplo uma seqüência que tenha uma homologia de 80% com a seqüência SEQ ID NO: 2 ao nível de proteína é entendido como significativo de uma seqüência que, na comparação com a seqüência SEQ ID NO: 2 pelo algoritmo de programa acima com o conjunto de parâmetros acima, tem uma homologia de 80%.
Equivalentes funcionais derivados de um dos polipeptídeos como indicados na Tabela II, colunas 5 ou 7, de acordo com a invenção pela substituição, inserção ou deleção têm pelo menos 30%, 35%, 40%, 45% ou .50%, preferivelmente pelo menos 55%, 60%, 65% ou 70% por preferência pelo menos 80%, de modo especialmente preferível pelo menos 85% ou 90%,91%, 92%, 93% ou 94%, de modo muito especialmente preferível pelo menos .95%, 97%, 98% ou 99% de homologia com um dos polipeptídeos como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, de acordo com a invenção e são distinguidos essencialmente pelas mesmas propriedades como um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7.
Equivalentes funcionais derivados de uma seqüência de ácido nucleico como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela I B, coluna 7, linhas 1, 2, 3,4 e/ou 5 de acordo com a invenção pela substituição, inserção ou deleção têm pelo menos 30%, 35%, 40%, 45% ou .50%, preferivelmente pelo menos 55%, 60%, 65% ou 70% por preferência pelo menos 80%, de modo especialmente preferível pelo menos 85% ou 90%,91%, 92%, 93% ou 94%, de modo muito especialmente preferível pelo menos .95%, 97%, 98% ou 99% de homologia com um de um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, de acordo com a invenção e codificam polipeptídeos tendo essencialmente as mesmas propriedades como um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7.
"Essencialmente as mesmas propriedades" de um equivalente funcional é acima de tudo entendido como significativo de que o equivalente funcional tem a atividade mencionada acima, por exemplo que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio enquanto aumenta a quantidade de proteína, atividade ou função do dito equivalente funcional em um organismo, por exemplo um microorganismo, uma planta ou tecido vegetal ou animal, células vegetais ou de animal ou uma parte da mesma, por exemplo os plastídeos.
Uma molécula de ácido nucleico que codifica um homólogo de uma seqüência de proteína como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7 preferivelmente na Tabela II B, coluna 7, pode ser criada pela introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo em uma seqüência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico da presente invenção, em particular como indicado na Tabela I, colunas 5 ou 7, tal que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido sejam introduzidas na proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas nas seqüências codificadoras por exemplo nas seqüências como indicadas na Tabela I, colunas 5 ou 7, pelas técnicas padrão, tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada pela PCR.
Preferivelmente, as substituições de aminoácido conservativas são fabricadas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais prognosticados. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
Assim, um resíduo de aminoácido não essencial prognosticado em um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo usado no processo da invenção é preferivelmente substituído com um outro resíduo de aminoácido da mesma família. Alternativamente, em uma outra forma de realização, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüência codificadora de uma molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção, tal como pela mutagênese de saturação e os mutantes resultantes podem ser triados quanto a atividade aqui descrita para identificar mutantes que retenham ou ainda tenham aumentada a atividade mencionada acima, por exemplo que confere um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio.
A seguir da mutagênese de uma das seqüências aqui mostrada, a proteína codificada pode ser expressada recombinantemente e a atividade da proteína pode ser determinada usando, por exemplo, ensaios aqui descritos (ver os Exemplos).
A homologia mais alta da molécula de ácido nucleico usada no processo de acordo com a invenção pode ser descoberta nas entrada de bases de dados gerais acessíveis pela pesquisa de Gap. Estas bases de dados, que devem ser mencionadas, em particular neste contexto são no geral bases de dados de gene tais como a base de dados de EMBL (Stoesser G. et al., Nucleic Acids Res 2001, Vol. 29, 17-21), a base de dados do GenBank (Benson D. A. et al., Nucleic Acids Res 2000, Vol. 28, 15-18) ou a base de dados de PIR (Barker W. C. et al., Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, 39-43). Além disso é possível usar bases se dados de gene específicas de organismo para determinar seqüências vantajosas, no caso de levedura por exemplo vantajosamente a base de dados de SGD (Cherry J. M. et al., Nucleic Acids Res. 1998, Vol. 26, 73-80) ou a base de dados MIPS (Mewes H. W. et al., Nucleic Aeids Res. 1999, Vol. 27, 44-48), no caso de E. coli a base de dados GenProtEC (http://web.bham.ac.uk/bem4ght6/res.html) e no caso de Arabidopsis a base de dados TAIR (Huala, E. et al., Nucleic Acids Res. 2001 Vol. 29(1), 102-5) ou a base de dados MIPS.
Homólogos das seqüências de ácido nucleico usados, com uma seqüência como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela I B, coluna 7 ou das seqüências de ácido nucleico derivadas de umas seqüências como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, linhas 1, 2, 3, 4 e/ou 5, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7, compreendem também variantes alélicas com pelo menos aproximadamente 30%, 35%, 40% ou 45% de homologia, por preferência pelo menos aproximadamente 50%, 60% ou 70%, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% e ainda mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia com uma das seqüências de nucleotídeo mostrada ou as seqüências de ácido nucleico derivadas supra citadas ou seus homólogos, derivados ou análogos ou partes deste. As variantes alélicas abrangem em particular variantes funcionais que podem ser obtidas pela deleção, inserção ou substituição de nucleotídeos das seqüências mostradas, preferivelmente de uma seqüência como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7 ou das seqüências de ácido nucleico derivadas, a intenção sendo, entretanto, que a atividade da enzima ou a atividade biológica das proteínas resultantes sintetizadas seja vantajosamente retida ou aumentada.
Em uma forma de realização da presente invenção, a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção compreende uma ou mais seqüências como indicadas na Tabela I, colunas 5 ou 7 preferivelmente na Tabela I B, coluna 7. Em uma forma de realização, é preferido que a molécula de ácido nucleico compreenda tão pouco quanto possível outras seqüências de nucleotídeo não mostradas em qualquer uma das seqüências como indicadas na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela I B, coluna 7. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico compreende menos do que 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60,50 ou 40 nucleotídeos adicionais. Em uma outra forma de realização, a molécula de ácido nucleico compreende menos do que 30, 20 ou 10 nucleotídeos adicionais. Em uma forma de realização, uma molécula de ácido nucleico usada no processo da invenção é idêntica a uma seqüência como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela I B, coluna 7.
Também preferido é que uma ou mais moléculas de ácido nucleico usadas no processo da invenção codifiquem um polipeptídeo que compreenda uma seqüência selecionada do grupo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7, linhas 1, 2, 3, 4 e/ou .5. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica menos do que 150, 130, 100, 80, 60, 50, 40 ou 30 aminoácidos adicionais. Em uma outra forma de realização, o polipeptídeo codificado compreende menos do que 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos adicionais. Em uma forma de realização, o polipeptídeo codificado usado no processo da invenção é idêntico às seqüências como indicadas na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7.
Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, coluna 7, compreende menos do que 100 nucleotídeos adicionais. Em uma outra forma de realização, a dita molécula de ácido nucleico compreende menos do que 30 nucleotídeos adicionais. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico usada no processo é idêntica a uma seqüência codificadora que codifica uma seqüência como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela II B, coluna .7. Polipeptídeos (= proteínas), que ainda têm a atividade enzimática essencial do polipeptídeo da presente invenção que confere um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio isto é, cuja atividade não é essencialmente reduzida, são polipeptídeos com pelo menos 10% ou 20%, por preferência 30% ou 40%, de modo especialmente preferível 50% ou 60%, de modo muito especialmente preferível 80% ou 90% ou mais da atividade biológica ou atividade enzimática do tipo selvagem, vantajosamente, a atividade não é essencialmente reduzida em comparação com a atividade de um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, preferivelmente comparada a uma seqüência como indicada na Tabela II, coluna 3 e 5 e expressada sob condições idênticas. Em uma forma de realização, o polipeptídeo da invenção é um homólogo que consiste de ou que compreende a seqüência como indicada na Tabela II B, coluna 7.
Homólogos de uma seqüência como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7 ou de uma seqüência derivada como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, também significam seqüências truncadas, cDNA, DNA ou RNA de filamento único da seqüência de DNA codificadora e não codificadora. Homólogos das ditas seqüências também são entendidas como derivados significativos, que compreendem regiões não codificadoras tais como, por exemplo, variantes UTRs, terminadoras, realçadoras ou promotoras. Os promotores a montante das seqüências de nucleotídeo estabelecidas podem ser modificados por uma ou mais substituição(s), inserções e/ou deleções de nucleotídeo sem, entretanto, interferir com a funcionalidade ou atividade dos promotores, a matriz de leitura aberta (= ORF) ou com a região reguladora 3' tais como terminadores ou outras regiões reguladoras 3', que estejam muito distantes da ORF. Além disso é possível que a atividade dos promotores seja aumentada pela modificação de sua seqüência ou que eles sejam substituídos completamente por promotores mais ativos, mesmo promotores de organismos heterólogos. Os promotores apropriados são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e são aqui mencionados abaixo.
Em uma outra forma de realização, o processo de acordo com a presente invenção compreende as seguintes etapas:
(a) selecionar um organismo ou uma parte deste que expressem o polipeptídeo desta invenção no citossol e/ou em uma organela tal como um plastídeo ou mitocôndria;
(b) mutagenizar o organismo selecionado ou a parte deste;
(c) comparar a atividade ou o nível de expressão do dito polipeptídeo no organismo mutagenizado ou a parte deste com a atividade ou a expressão do dito polipeptídeo nos organismos selecionados ou da parte destes;
(d) selecionar os organismos mutagenizados ou partes destes, que compreendem uma atividade ou nível de expressão do dito polipeptídeo aumentados comparados com o organismo selecionado (a) ou a parte deste;
(e) opcionalmente, desenvolver e cultivar os organismos ou as partes destes:
Vantajosamente os organismos selecionados são mutagenizados de acordo com a invenção. De acordo com a invenção a mutagênese é qualquer mudança da informação genética no genoma de um organismo, que significa qualquer mudança estrutural ou composicional no ácido nucleico preferivelmente DNA de um organismo que não seja causado pela segregação normal ou processos de recombinação genética. Tais mutações podem ocorrer espontaneamente ou podem ser induzidas pelos mutágenos como descrito abaixo. Tal mudança pode ser induzida aleatória ou seletivamente. Em ambos os casos a informação genética do organismo é modificada. No geral isto leva à situação de que a atividade do produto de gene dos genes relevantes dentro das células ou dentro do organismo é aumentada. No caso da mutagênese específica ou chamada de direcionada ao sítio um gene distinto é mutado e por meio disso a sua atividade e/ou a atividade ou o produto de gene codificado são reprimidos, reduzidos ou aumentados, preferivelmente aumentados. No evento de uma mutagênese aleatória um ou mais genes são mutados ao acaso e as suas atividades e/ou as atividades dos seus produtos de gene são reprimidas, reduzidas ou aumentadas, preferivelmente aumentadas.
Para o propósito de uma mutagênese de uma vasta população de organismos, tal população pode ser transformada com uma construção de DNA, que seja útil para a ativação tanto quanto possível de genes de um organismo, preferivelmente todos os genes. Por exemplo a construção pode conter um promotor forte ou um ou mais realçadores, que sejam capazes de ativar transcricionalmente genes na vicinidade de seu lado de integração. Com este método é possível mutagenizar estatisticamente, por exemplo ativar quase todos os genes de um organismo pela integração aleatória de uma construção de ativação. Posteriormente o técnico habilitado pode identificar aquelas linhagens mutagenizadas em que um gene da invenção foi ativado, que por sua vez leva ao aumento desejado no nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio.
Os genes da invenção também podem ser ativados pela mutagênese, de regiões reguladoras ou codificadoras. No evento de uma mutagênese aleatória um vasto número de organismos são tratados com um agente mutagênico. A quantidade do dito agente e a intensidade do tratamento será escolhido em uma tal maneira que estatisticamente quase todos os genes são mutados de uma vez. O processo para a mutagênese aleatória assim como os respectivos agentes são bem conhecidos pela pessoa habilitada. Tais métodos são divulgados por exemplo por A. M. van Harten [(1998), "Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, UK] e Friedberg, G Walker, W Siede [(1995), "DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing] ou K. Sankaranarayanan, J. M. Gentile, L. R. Ferguson [(2000) "Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences]. Como o técnico habilitado sabe a taxa de mutação espontânea nas células de um organismo é muito baixa e que um grande número de agentes químicos, físicos ou biológicos são disponíveis para a mutagênese de organismos. Estes agentes são chamados de mutágenos ou agentes mutagênicos. Como mencionado antes três tipos diferentes de mutágenos (agentes químicos, físicos ou biológicos) são disponíveis.
Existem classes diferentes de mutágenos químicos, que podem ser separados pelo seu modo de ação. Por exemplo análogos de base tais como 5-bromouracila, 2-amino purina. Outros mutágenos químicos são os que interagem com o DNA tais como ácido sulfurico, ácido nitroso, hidroxilamina; ou outros agentes alquiladores tais como agentes monofuncionais como metanossulfonato de etila, sulfato de dimetila, metanossulfonato de metila), bifimcionais como sulfeto de dicloroetila, Mitomicina, Nitrosoguanidina - dialquilnitrosamina, derivados de N- Nitrosoguanidina, N-alquil-N-nitro-N-nitroso-guanidina-), corantes de intercalação como Acridina, brometo de etídio).
Os mutágenos físicos são por exemplo irradiação ionizante (raio X), irradiação de UV. Formas diferentes de irradiação são disponíveis e elas são mutágenos fortes. Duas classes principais de irradiação podem ser distinguidas: a) irradiação não ionizante tal como luz UV ou irradiação ionizante tal como raio X. os mutágenos biológicos são por exemplo elementos transponíveis por exemplo elementos IS tais como transposons IS100, tais como Tn5, TnlO, Tn916 ou TnlOOO ou fagos como Muamplac, PI, T5, Xplac etc. Métodos para introduzir este DNA de fago no microorganismo apropriado são bem conhecidos pelo técnico habilitado (ver Microbiology, Terceira Edição, Eds. Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, Η. N. e Ginsberg, H. S., Harper International Edition, 1980). O procedimento comum de uma mutagênese de transposon é a inserção de um elemento transponível dentro de um gene ou próximo por exemplo na região promotora ou terminadora e levando deste modo a uma perda da função de gene. Os procedimentos para localizar o transposon dentro do genoma dos organismos são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica.
Preferivelmente um procedimento químico ou bioquímico é usado para a mutagênese dos organismos. Um método químico preferido é a mutagênese com N-metil-N-nitro-nitrosoguanidina.
Outros métodos biológicos são divulgados por Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, Ni2 3, 1993: 777 - 778). Spee et al. divulga um método de PCR usando dITP para a mutagênese aleatória. Este método descrito por Spee et al. foi ainda melhorado por Rellos et al. (Protein Expr. Purif., 5, 1994: 270 - 277). O uso de uma técnica de recombinação in vitro para a mutagênese molecular é descrito por Stemmer (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 91, 1994: 10747 - 10751). Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458 - 467) descrevem a combinação da PCR e métodos de recombinação para aumentar a atividade enzimática de uma esterase voltada para um éster para-nitrobenzílico. Uma outra via para a mutagênese de enzimas é descrita por Greener et al. em Methods in Molecular Biology (Vol. .57, 1996: 375 - 385). Greener et al. usam a cepa de Escherichia coli específica XLl-Red para gerar mutantes de Escherichia coli que têm resistência a antibiótico aumentada.
Em uma forma de realização, a proteína de acordo com a invenção ou a molécula de ácido nucleico aqui caracterizada originam-se de um organismo eucariótico ou procariótico tal como um animal não humano, uma planta, um microorganismo tal como um fungo, uma levedura, uma alga, uma diatomácea ou uma bactéria. As moléculas de ácido nucleico, que vantajosamente podem ser usadas no processo da invenção originam-se de leveduras, por exemplo da família Saccharomyeetaceae, em particular do gênero Saccharomyces ou gêneros de levedura tais como Candida, Hansenula, Piehia, Yarrowia, Rhodotorula ou Schizosaceharomyees e especialmente vantajoso da espécie Saccharomyees eerevisiae.
Em uma forma de realização, as moléculas de ácido nucleico, que vantajosamente podem ser usadas no processo da invenção originam-se de bactérias, por exemplo das Proteobactérias, em particular da Gamaproteobactérias, mais preferido das Enterobactérias, por exemplo da família Enterobaeteriaeeae, particularmente dos gêneros Eseheriehia, Salmonella, Klebsiella, vantajosamente da espécie Eseheriehia eoli Kl2.
Se, no processo de acordo com a invenção, plantas são selecionadas como o organismo doador, esta planta, em princípio, pode estar em qualquer relação filogenética da planta receptora. As plantas doadora e receptora podem pertencer à mesma família, gênero, espécie, variedade ou linha, resultado em uma homologia aumentada entre os ácidos nucleicos a serem integrados e as partes correspondentes do genoma da planta receptora. Isto também se aplica analogamente aos microorganismos como organismos doadores e receptores. Também seria vantajoso usar moléculas de ácidos nucleicos de espécies muito distintas, visto que estas exibiriam sensibilidade reduzida mais uma vez contra mecanismos reguladores endógenos e tais seqüências não seriam reconhecidas pelos mecanismos de silenciamento endógeno.
Consequentemente, uma forma de realização do pedido diz respeito ao uso das moléculas de ácido nucleico no processo da invenção de plantas, por exemplo plantas de safra, por exemplo de: B. napus; Glieina max\ girassol, arroz, algodão, linhaça ou milho ou seus homólogos.
Consequentemente, em uma forma de realização, a invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste de:
a) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo como mostrado na tabela II; preferivelmente tabela II B, colunas 5 e 7 ou um fragmento deste, e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo fotossintético ou uma parte deste
b) molécula de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo como mostrado na tabela I, preferivelmente tabela I B colunas 5 e 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo fotossintético ou uma parte deste;
c) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode ser deduzida a partir de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula de ácido nucleico de (a) ou (b) como um resultado da degeneração do código genético e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo fotossintético ou uma parte deste;
d) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificada pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo fotossintético ou uma parte deste;
e) molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (a) a (c) sob condições de hibridização estringente e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo fotossintético ou uma parte deste;
f) molécula de ácido nucleico que abrange uma molécula de ácido nucleico que é obtida pela amplificação das moléculas de ácido nucleico de uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando os iniciadores ou pares de iniciador como mostrados na tabela III, coluna 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo fotossintético ou uma parte deste; g) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que é isolado com auxílio de anticorpos monoclonais mais uma vez contra um polipeptídeo codificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (f) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo fotossintético ou uma parte deste;
h) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende um consenso como mostrado na tabela IV, coluna 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo fotossintético ou uma parte deste; e
i) molécula de ácido nucleico que é obtenível pela triagem de uma biblioteca de ácido nucleico adequada sob condições de hibridização estringentes com uma sonda que compreende uma das seqüências da molécula de ácido nucleico de (a) a (k) ou com um fragmento deste tendo pelo menos nucleotídeos, preferivelmente 20 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou 500 nucleotídeos da molécula de ácido nucleico caracterizado de (a) a (k) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo fotossintético ou uma parte deste,
ou que abrange uma seqüência que é complementar a esta; por meio da qual, preferivelmente, a molécula de ácido nucleico de acordo com (a) a (1) distingue da seqüência indicada na Tabela IA ou I B, colunas 5 ou 7, por um ou mais nucleotídeos. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico não consiste da seqüência mostrada e indicada na Tabela I A ou I B, colunas 5 ou 7. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico é menos do que 100%, 99,999%, 99,99%, 99,9% ou 99% idêntica a uma seqüência indicada na Tabela I A ou I B, colunas 5 ou 7. Em uma outra forma de realização, a molécula de ácido nucleico não codifica um polipeptídeo de uma seqüência indicada na Tabela II A ou II B, colunas 5 ou 7. Em uma outra forma de realização, a molécula de ácido nucleico da presente invenção é pelo menos 30%, 40%, 50% ou 60% idêntica e menos do que 100%, 99,999%, 99,99%, 99,9% ou 99% idêntica a uma seqüência indicada na Tabela I A ou I B, colunas 5 ou 7. Em uma outra forma de realização a molécula de ácido nucleico não codifica uma seqüência de polipeptídeo como indicado na Tabela II A ou II B, colunas 5 ou 7. Consequentemente, em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico da invenção difere pelo menos em um ou mais resíduos de uma molécula de ácido nucleico indicada na Tabela I A ou I B, colunas 5 ou 7. Consequentemente, em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico da presente invenção codifica um polipeptídeo, que difere pelo menos em um ou mais aminoácidos de um polipeptídeo indicado na Tabela II A ou I B, colunas 5 ou 7. Consequentemente, em uma forma de realização, a proteína codificada por uma seqüência de um ácido nucleico de acordo com (a) a (1) não consiste de uma seqüência como indicada na Tabela II A ou II B, colunas 5 ou 7. Em uma outra forma de realização, a proteína da presente invenção tem pelo menos 30%, 40%, 50% ou 60% idêntica a uma seqüência de proteína indicada na Tabela II A ou II B, colunas 5 ou 7 e menos do que 100%, preferivelmente menos do que 99,999%, 99,99% ou 99,9%, mais preferivelmente menos do que 99%, 98%, 97%, 96% ou 95% idêntica a uma seqüência como indicada na Tabela II A ou II B, colunas 5 ou 7.
As seqüências de ácido nucleico usadas no processo são vantajosamente introduzidas em uma construção de ácido nucleico, preferivelmente um cassete de expressão que torna possível a expressão das moléculas de ácido nucleico em um organismo, vantajosamente uma planta ou um microorganismo. As seqüências de ácido nucleico mostradas na tabela I A ou IB colunas 5 ou 7 aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3 são preferivelmente introduzidas em uma construção de ácido nucleico, que adicionalmente contém uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma seqüência de alvejamento plastídica, em um tal modo que uma proteína de fusão seja codificada, que na tradução direcione o polipeptídeo codificado em uma seqüência de ácido nucleico mostrada na tabela I A ou IB colunas 5 ou 7 no compartimento plastídico. A pessoa habilitada na técnica está familiarizada com o planejamento de tais construções de ácidos nucleicos. Consequentemente, a invenção também diz respeito a uma construção de ácido nucleico, preferivelmente a uma construção de expressão, que compreende a molécula de ácido nucleico da presente invenção funcionalmente ligada a um ou mais elementos ou sinais reguladores. Consequentemente, a invenção também diz respeito a uma construção de ácido nucleico, preferivelmente a uma construção de expressão, que compreende a molécula de ácido nucleico da presente invenção, preferivelmente uma seqüência como mostrada na tabela I A ou IB colunas 5 ou 7 aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3 funcionalmente ligada a uma seqüência de alvejamento plastídica.
Como aqui descrita, a construção de ácido nucleico também pode compreender outros genes, que devem ser introduzidos nos organismos ou células. É possível e vantajoso introduzir dentro e expressar nos, genes reguladores de organismos hospedeiros tais como genes para indutores, repressores ou enzimas, que, devido à sua atividade enzimática, se empenham na regulagem de um ou mais genes de um caminho biossintético. Estes genes podem ser de origem heteróloga ou homóloga. Além disso, outros genes de biossíntese podem estar vantajosamente presentes ou mesmo estes genes podem estar localizados em uma ou mais outras construções de ácido nucleico. Os genes, que são vantajosamente utilizados como genes de biossíntese são genes do metabolismo de aminoácido, de glicólise, do metabolismo do ácido tricarboxílico ou suas combinações. Como aqui descrito, as seqüências ou fatores reguladores podem ter um efeito positivo preferivelmente sobre a expressão de gene do genes introduzidos, assim aumentando-a. Assim, um realce dos elementos reguladores pode vantajosamente ocorrer ao nível transcricional usando-se sinais de transcrição fortes tais como promotores e/ou realçadores. Além disso, entretanto, um realce de tradução também é possível, por exemplo aumentando-se a estabilidade do mRNA ou pela inserção de uma seqüência realçadora de tradução.
Em princípio, a construção de ácido nucleico pode compreender as seqüências reguladoras aqui descritas e outras seqüências relevantes para a expressão dos genes compreendidos. Assim, a construção de ácido nucleico da invenção pode ser usada como cassete de expressão e assim pode ser usada diretamente para a introdução na planta ou mesmo estas podem ser introduzidas em um vetor. Consequentemente em uma forma de realização a construção de ácido nucleico é um cassete de expressão que compreende um microorganismo promotor ou um microorganismo terminador ou ambos. Em uma outra forma de realização o cassete de expressão abrange um promotor vegetal ou um terminador vegetal ou ambos. Em uma outra forma de realização o cassete de expressão abrange uma seqüência alvejadora plastídica vegetal.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo de acordo com a invenção compreende as seguintes etapas:
(a) introdução de uma construção de ácido nucleico que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção ou que codifica o polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da invenção; ou
(b) introdução de uma molécula de ácido nucleico, incluindo seqüências ou fatores regulatórios, cuja expressão aumenta a expressão da molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção ou que codifica o polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da invenção em uma célula ou um organismo ou uma parte deste, preferivelmente em uma planta, célula vegetal ou um microorganismo, e (c) expressão do produto de gene codificado pela construção de ácido nucleico ou da molécula de ácido nucleico mencionada sob (a) ou (b) na célula, no citossol ou em uma organela tal como um plastídeo ou mitocôndria ou ambos, preferivelmente em plastídeo ou preferivelmente no citossol ou no organismo.
Depois da introdução e expressão da construção de ácido nucleico o organismo ou célula transgênicos são vantajosamente cultivados e subseqüentemente colhidos. O organismo ou célula transgênicos podem ser um organismo procariótico ou eucariótico tal como um microorganismo, uma célula vegetal, um tecido vegetal, preferivelmente uma planta de safra ou uma parte desta.
Para introduzir uma molécula de ácido nucleico em uma construção de ácido nucleico, por exemplo como parte de um cassete de expressão, o segmento de gene codogênico é vantajosamente submetido a uma reação de amplificação e ligação na maneira conhecida por uma pessoa habilitada. É preferido seguir um procedimento similar ao protocolo para a Pfu DNA polimerase ou uma mistura de Pfu/Taq DNA polimerase. Os iniciadores são selecionados de acordo com a seqüência a ser amplificada. Os iniciadores devem ser convenientemente escolhido em um tal modo que o amplificado compreenda a seqüência codogênica do códon de início para o de parada. Depois da amplificação, o amplificado é convenientemente analisadas. Por exemplo, a análise pode considerar a qualidade e quantidade e ser realizada seguindo a separação pela eletroforese em gel. Em seguida, o amplificado pode ser purificado seguindo um protocolo padrão (por exemplo Qiagen). Uma alíquota do amplificado purificado é depois disponível para a etapa de clonagem subsequente. Os vetores de clonagem adequados são no geral conhecidos pelo técnico habilitado.
Estes incluem, em particular, vetores que são capazes de replicação em sistemas de clonagem fáceis de manusear como sistemas com base em célula bacteriana, de levedura ou inseto (por exemplo expressão de baculovírus), que sejam digamos especialmente vetores que garantam clonagem eficiente na E. coli e que torne possível a transformação estável de plantas. Vetores, que devem ser mencionados em particular são vários sistemas de vetor binários e co-integrados que são adequados para a transformação mediada por T-DNA. Tais sistemas de vetor são no geral caracterizados em que eles contêm pelo menos os genes vir, que são requeridos para a transformação mediada por Agrobacterium e as seqüências da borda de T-DNA.
No geral, sistemas de vetor preferivelmente também compreendem outras regiões reguladoras eis tais como promotores e terminadores e/ou marcadores de seleção por meio dos quais organismos adequadamente transformados podem ser identificados. Embora os genes vir e as seqüências de T-DNA estejam localizados no mesmo vetor no caso de sistemas de vetor co-integrado, sistemas binários são fundamentados em pelo menos dois vetores, um dos quais carrega os genes vir, mas nenhum T-DNA, enquanto um segundo carrega o T-DNA, mas nenhum gene vir. Devido a este fato, os vetores mencionados por último são relativamente pequenos, fáceis de manipular e capazes de replicação em E. coli e em Agrobaeterium. Estes vetores binários incluem vetores das séries pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Aqueles que são preferivelmente usados de acordo com a invenção são Bin 19, pBIlOl, pBinAR, pGPTV e pCAMBIA. Uma revisão de vetores binários e seu uso é dada por Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5,446-451.
Para uma preparação de vetor, vetores podem ser primeiro linearizados usando endonuclease(s) de restrição e depois ser modificados enzimaticamente em uma maneira adequada. Em seguida, o vetor é purificado e uma alíquota é utilizada na etapa de clonagem. Na etapa de clonagem, o amplificado clivado pela enzima e, se requerido, purificado é clonado junto com fragmentos de vetor similarmente preparados, usando ligase. Neste contexto, uma construção de ácido nucleico específica ou construção de vetor ou plasmídeo, pode ter um ou mesmo mais segmentos de gene codogênicos. Os segmentos de gene codogênicos nestas construções são preferivelmente ligados de modo operável às seqüências reguladoras. As seqüências reguladoras incluem, em particular, seqüências vegetais como os promotores e terminadores descritos acima e eventualmente uma seqüência alvejadora entre o segmento codogênico e o promotor. As construções podem ser vantajosamente propagadas de modo estável em microorganismos, em particular Escherichia eoli e/ou Agrobaeterium tumefaeiens, sob condições seletivas e possibilitam a transferência de DNA heterólogo em plantas ou outros microorganismos. De acordo com uma forma de realização particular, as construções são fundamentadas em vetores binários (revisão de um vetor binário: Hellens et ai, 2000). Como uma regra, elas contêm seqüências reguladoras procarióticas, tais como origem de replicação e marcadores de seleção, para a multiplicação em microorganismos tais como Eseherichia coli e Agrobaeterium tumefaeiens. Vetores podem conter ainda seqüências de T- DNA agrobacterianas para a transferência de DNA em genomas vegetais ou outras seqüências reguladoras eucarióticas para a transferência em outras células eucarióticas, por exemplo Saccharomyees sp. ou outras seqüências reguladoras procarióticas para a transferência em outras células procarióticas, por exemplo Corynebaeterium sp. ou Bacillus sp. Para a transformação de plantas, a seqüência da borda direita, que compreende aproximadamente 25 pares de base, da seqüência de T-DNA agrobacteriano total é vantajosamente incluída. Usualmente, as construções de vetor de transformação vegetal de acordo com a invenção contêm seqüências de T-DNA tanto da região da borda direita quanto da esquerda, que contêm sítios de reconhecimento apropriados para as enzimas que atuam específicas de sítio que, e por sua vez, são codificadas por alguns dos genes vir. Os organismos hospedeiros adequados são conhecidos pelo técnico habilitado. Os organismos vantajosos são descritos mais acima na presente aplicação. Eles incluem em particular eucariotas ou eubactérias, por exemplo procariotas ou arqueo bactérias. Vantajosamente, os organismos hospedeiros são microorganismos selecionados do grupo que consistem de Actinomycetaceae, Bacillaceae, Brevibaeteriaeeae, Corynebacteriaceae, Enterobacteriacae, Gordoniaceae, Micrococcaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Pseudomonaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae, Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae,
Sodariaeeae, Sporobolomycetaeeae, Tubereulariaeeae, Adelotheeiaeeae, Dinophyeeae, Ditrichaceae e Prasinophyeeae. Preferivelmente são microorganismos unicelulares, por exemplo fungos, bactérias ou protozoários, tais como fungos como os gêneros Clavieeps ou Aspergillus ou bactérias gram-positivas tais como os gêneros Baeillus, Corynebaeterium, Mierococeus, Brevibaeterium, Rhodoeoeeus, Noeardia, Caseobaeter ou Arthrobaeter ou bactérias gram-positivas tais como os gêneros Eseheriehia, Flavobaeterium ou Salmonella ou leveduras tais como os gêneros Rhodotorula, Hansenula, Piehia, Yerrowia, Saceharomyces, Schizosaceharomyees ou Candida.
Os organismos hospedeiros que são de modo especialmente vantajoso selecionados no processo de acordo com a invenção são microorganismos selecionados do grupo dos gêneros e espécies que consistem de Hansenula anômala, Candida utilis, Clavieeps purpuréia, Baeillus eireulans, Baeillus subtilis, Baeillus sp., Brevibaeterium albidum, Brevibaeterium álbum, Brevibaeterium eerinum, Brevibaeterium flavum, Brevibaeterium glutamigenes, Brevibaeterium iodinum, Brevibaeterium ketoglutamieum, Brevibaeterium laetofermentum, Brevibaeterium linens, Brevibacterium roseum, Brevibaeterium saceharolytieum, Brevibaeterium sp., Corynebaeterium acetoacidophilum, Corynebaeterium aeetoglutamicum, Corynebaeterium amôniagenes, Corynebaeterium glutamieum (= Mierococeus glutamica), Corynebaeterium melasseeola, Corynebacterium sp. ou Eseheriehia eoli, especificamente Eseherichia eoli Kl2 e suas cepas descritas.
Vantajosamente preferidos de acordo com a invenção são organismos hospedeiros do gênero Agrobaeterium tumefaciens ou plantas. As plantas preferidas são selecionadas dentre as famílias Aceraeeae, Anacardiaeeae, Apiaeeae, Asteraeeae, Apiaeeae, Betulaeeae, Boraginaeeae, Brassicaceae, Bromeliaeeae, Cactaceae, Caricaeeae, Caryophillaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaeeae, Elaeagnaeeae, Geraniaeeae, Graminaae, Juglandaeeae, Lauraeeae, Leguminosae, Linaceae, Cueurbitae eae, Cyperaeeae, Euphorbiaeeae, Fabaeeae, Malvaeeae, Nymphaeaeeae, Papaveraceae, Rosaeeae, Salieaeeae, Solanaeeae, Areeaeeae, Iridaeeae, Liliaceae, Orehidaeeae, Gentianaeeae, Labiaceae, Magnoliaeeae, Ranunculaeeae, Carifolaeeae, Rubiaeeae, Scrophulariaceae, Erieaceae, Poligonaeeae, Violaeeae, Juneaeeae, Poaeeae, gramas perenes, safras forrageiras, vegetais e ornamentais.
Especialmente preferidas são as plantas selecionadas do grupo das famílias Apiaeeae, Asteraeeae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaeeae, Papaveraceae, Rosaeeae, Solanaeeae, Liliaceae ou Poaceae. Especialmente vantajosas são, em particular, plantas de safra. Consequentemente, uma planta vantajosa preferivelmente pertence ao grupo do gênero amendoim, colza, canola, girassol, cártamo, oliva, gergelim, avelã, amêndoa, abacate, louro, abóbora, linhaça, soja, pistache, borragem, milho, trigo, centeio, aveia, sorgo e painço, triticale, arroz, algodão, cevada, mandioca, batata, beterraba açucareira, beterraba forrageira, beringela e gramas perenes e plantas forrageiras, dendê, vegetais (brassicas, vegetais de raiz, vegetais de tubérculo, vegetais de vagem, vegetais de frutas, vegetais de cebola, vegetais folhosos e vegetais de haste), trigo-mouro, alcachofra de Jerusalem, feijão-fava, ervilhacas, lentilha, alfafa, feijão anão, tremoços, trevo e alfafa.
De modo a introduzir, em uma planta, a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo de acordo com a invenção, tem se mostrado vantajoso primeiro transferi-la em um hospedeiro intermediário, por exemplo uma bactéria ou uma célula unicelular eucariótica. A transformação em E. coli, que pode ser realizada em uma maneira conhecida por si, por exemplo por meio de choque térmico ou eletroporação, tem mostrado por si mesmo conveniente neste contexto. Assim, as colônias de E. coli transformadas podem ser analisadas para a sua eficiência de clonagem. Isto pode ser realizado com auxílio de uma PCR. Aqui, não apenas a identidade, mas também a integridade, da construção de plasmídeo podem ser verificadas com o auxílio de um número de colônia definido submetendo-se uma alíquota das colônias da dita PCR. Como uma regra, iniciadores universais que são derivados de seqüências de vetor são usados para este propósito, sendo possível, por exemplo, para um iniciador avançado ser arranjado a montante do ATG de partida e um iniciador reverso ser arranjado a jusante do códon de parada do segmento de gene codogênico. Os amplificados são separados pela eletroforese e avaliado com respeito à quantidade e qualidade.
As construções de ácido nucleico, que são opcionalmente verificadas, são subseqüentemente usadas para a transformação das plantas ou outros hospedeiros, por exemplo outras células eucarióticas ou outras células procarióticas. Para esta finalidade, pode ser primeiro necessário obter as construções do hospedeiro intermediário. Por exemplo, as construções podem ser obtidas como plasmídeos a partir de hospedeiros bacterianos por um método similar à isolação de plasmídeo convencional.
A molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo de acordo com a invenção também pode ser introduzida em vetores virais modificados como vetores de baculovírus para a expressão em células de inseto ou vetores virais vegetais como o vírus mosaico do tabaco ou vetores com base no vírus X da batata. Os métodos que levam à expressão de proteínas a partir do genoma viral modificado incluindo a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo de acordo com a invenção envolvem por exemplo a inoculação de plantas de tabaco com RNA infeccioso transcrito in vitro de uma cópia de cDNA do genoma viral recombinante. Um outro método utiliza a transfecção de plantas inteiras a parti de ferimentos inoculados com Agrobacterium tumefaciens contendo cópias de cDNA de vírus de RNA de sentido positivo recombinantes. Diferentes vetores e vírus são conhecidos pelo técnico habilitado para a expressão em alvo diferente por exemplo, plantas de produção.
Um grande número de métodos para a transformação de plantas é conhecido. Visto que, de acordo com a invenção, uma integração estável de DNA heterólogo no genoma de plantas é vantajosa, a transformação mediada pelo T-DNA têm se mostrado apropriada em particular. Para este propósito, é primeiro necessário transformar veículos adequados, em particular agrobactérias, com um segmento de gene codogênico ou a construção de plasmídeo correspondente que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção. Isto pode ser realizado em uma maneira conhecida por si. Por exemplo, a dita construção de ácido nucleico da invenção ou a dita construção de expressão ou a dita construção de plasmídeo, que foram geradas de acordo com o que foi detalhado acima, podem ser transformadas em agrobactérias competentes por meio da eletroporação ou choque térmico. Em princípio, deve-se diferenciar entre a formação de vetores co-integrados por um lado e a transformação com vetores binários por outro lado. No caso da primeira alternativa, as construções, que compreendem o segmento de gene codogênico ou a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção não têm nenhuma seqüência de T-DNA, mas a formação dos vetores ou construções co-integrados ocorre nas agrobactérias pela recombinação homóloga da construção com T-DNA. O T-DNA está presente nas agrobactérias na forma de plasmídeos Ti ou Ri em que o DNA exógeno foi convenientemente substituído nos oncogenes. Se vetores binários são usados, estes podem ser transferidos para agrobactérias pela conjugação bacteriana ou pela transferência direta. Estas agrobactérias convenientemente já compreendem o vetor que carrega os genes vir (correntemente aludido como plasmídeo Ti(Ri) auxiliar).
Um ou mais marcadores também podem ser convenientemente usados juntos com a construção de ácido nucleico ou o vetor da invenção e, se plantas ou células vegetais devam ser transformadas juntas com o T-DNA, com o auxílio do que a isolação ou seleção de organismos transformados, tais como agrobactérias ou células vegetais transformadas, é possível. Estes genes marcadores possibilitam a identificação de uma transferência bem sucedida das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção por intermédio de uma série de princípios diferentes, por exemplo por intermédio de identificação visual com auxílio de fluorescência, luminescência ou na faixa de comprimento de onda de luz que seja discernível para o olho humano, por uma resistência aos herbicidas ou antibióticos, por intermédio do que são conhecidos como marcadores nutritivos (marcadores de auxotrofismo) ou marcadores antinutritivos, por intermédio de ensaios enzimáticos ou por intermédio de fito-hormônios. Os exemplos de tais marcadores que podem ser mencionados são GFP (= proteína fluorescente verde); o sistema de luciferina/luciferase, a -galactosidase com seus substratos coloridos, por exemplo X-Gal, as resistências a herbicida, por exemplo, à imidazolinona, glifosato, fosfmotricina ou sulfoniluréia, as resistências a antibiótico, por exemplo, à bleomicina, higromicina, estreptomicina, canamicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina, para mencionar apenas uns poucos, marcadores nutritivos tais como a utilização de manose ou xilose ou marcadores antinutritivos tais como a resistência à 2-desoxiglicose ou D-aminoácidos. Esta lista é um número pequeno de marcadores possíveis. O técnico habilitado está muito familiarizado com tais marcadores. Os marcadores diferentes são preferidos, dependendo do organismo e do método de seleção.
Como uma regra, é desejado que as construções de ácido nucleico vegetais são flanqueadas pela T-DNA em um ou ambos lados do segmento de gene codogênico. Isto é particularmente útil quando bactérias das espécies Agrobacterium tumefaeiens ou Agrobacterium rhizogenes são usadas para a transformação. Um método, que é preferido de acordo com a invenção, é a transformação com auxílio de Agrobaeterium tumefaeiens. Entretanto, métodos biolísticos também podem ser usados vantajosamente para a introdução das seqüências no processo de acordo com a invenção e a introdução por meio de PEG também é possível. As agrobactérias transformadas podem ser cultivadas na maneira conhecida por si e são assim disponíveis para a transformação conveniente das plantas. As plantas ou partes de planta a serem transformadas são cultivadas ou fornecidas de maneira costumeira. As agrobactérias transformadas são subseqüentemente deixadas atuar sobre as plantas ou partes de planta até que uma taxa de transformação suficiente seja atingida. Deixar as agrobactérias atuarem sobre as plantas ou partes de planta pode tomar formas diferentes. Por exemplo, uma cultura de células ou tecido vegetais morfogênicos podem ser usados. Depois da transferência do T-DNA, as bactérias são, como uma regra, eliminadas pelos antibióticos e a regeneração de tecido vegetal é induzida. Isto é feito em particular usando hormônios vegetais adequados de modo a induzir inicialmente a formação de calo e depois promover o desenvolvimento de broto.
A transferência de genes estranhos no genoma de uma planta é chamada de transformação. Fazendo isto os métodos descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais são utilizados para a transformação transitória ou estável. Um método de transformação vantajoso é a transformação em planta. Para esta finalidade, é possível, por exemplo, permitir que as agrobactérias atuem sobre as sementes da planta ou inocular o meristema da planta com agrobactérias. Tem se mostrado particularmente conveniente de acordo com a invenção permitir que uma suspensão de agrobactérias transformadas atue sobre a planta intacta ou pelo menos a flor primordial. A planta é subseqüentemente cultivada até que as sementes da planta tratada sejam obtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Para selecionar as plantas transformadas, o material vegetal obtido na transformação é, como uma regra, submetido às condições selecionativas de modo que as plantas transformadas possam ser distinguidas das plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas na maneira descrita acima possam ser plantadas e, depois de um período de cultivo inicial, submetidas a uma seleção adequada pela pulverização. Uma outra possibilidade consiste em cultivar as sementes, se apropriado depois de esterilização, sobre placas de ágar usando um agente de seleção adequado de modo que apenas as sementes transformadas possam crescer em plantas. Outros métodos de transformação vantajosos, em particular para plantas, são conhecidos ao técnico habilitado e são aqui descritos abaixo.
Outros métodos vantajosos e adequados são a transformação de protoplasto pela captação de DNA induzida pelo poli(etileno glicol), o método "biolístico" usando o canhão de gene - aludido como o método de bombardeamento de partícula, eletroporação, a incubação de embriões secos em solução de DNA, microinjeção e transferência de gene mediada pela Agrobacterium. Os ditos métodos são descritos por via de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos ou a construção a ser expressada são preferivelmente clonados em um vetor, que é adequado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por exemplo pBinl9 (Bevan et ai., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). As agrobactérias transformada por um tal vetor podem ser depois usadas na maneira conhecida para a transformação de plantas, em particular de plantas de safra tais como por via de exemplo plantas de tabaco, por exemplo banhando-se as folhas esmagadas ou folhas picadas em uma solução agrobacteriana e depois cultivá-las em meio adequado. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hõfgen e Willmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida inter alia de F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
As moléculas de ácido nucleico supra citadas podem ser clonadas nas construções de ácido nucleico ou vetores de acordo com a invenção em combinação junto com outros genes ou mesmo genes diferentes são introduzidos pela transformação de diversas construções de ácido nucleico ou vetores (incluindo plasmídeos) em uma célula hospedeira, vantajosamente em uma célula vegetal ou um microorganismo.
Além de uma seqüência indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7 ou seus derivados, é vantajoso adicionalmente expressar e/ou mutuar outros genes nos organismos. De modo especialmente vantajoso, adicionalmente pelo menos um outro gene do caminho biossintético de aminoácido tal como para L-lisina, L-treonina e/ou L-metionina é expressado nos organismos tais como plantas ou microorganismos. Também é possível que a regulagem dos genes naturais seja modificada vantajosamente de modo que o gene e/ou seu produto de gene não seja mais submetido aos mecanismos reguladores que existem nos organismos. Isto leva a uma síntese aumentada dos aminoácidos desejados visto que, por exemplo, regulagens de retroalimentação não mais existem no mesmo grau ou de jeito nenhum. Além disso seria vantajoso combinar uma seqüência como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7, com genes que no geral sustentam ou realçam o crescimento ou rendimento dos organismos alvo, por exemplo genes que levam à taxa de crescimento mais rápida de microorganismos ou genes que produzem plantas resistentes ao estresse, patógeno ou herbicida.
Em uma outra forma de realização vantajosa do processo da invenção, os organismos usados no processo são aqueles em que simultaneamente pelo menos um dos genes anteriormente mencionados ou um dos ácidos nucleicos anteriormente mencionados é mutado de modo que a atividade das proteínas correspondentes seja influenciada pelos metabólitos a um grau menor comparado com as proteínas não mutadas ou de jeito nenhum e que em particular o acúmulo ou produção de acordo com a invenção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente não sejam prejudicados ou de modo que a sua atividade enzimática específica seja aumentada. Menos influência significa nesta conexão que a regulagem da atividade enzimática é menor em pelo menos 10%, vantajosamente pelo menos 20, 30 ou 40%, particularmente vantajoso em pelo menos 50, 60, 70,80 ou 90%, comparada com o organismo de partida e assim a atividade da enzima é aumentada por estas figuras mencionadas comparadas com o organismo de partida. Um aumento na atividade enzimática significa uma atividade enzimática que é aumentada em pelo menos 10%, vantajosamente pelo menos 20, 30, 40 ou 50%, de modo particularmente vantajoso em pelo menos 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 500 ou 1000%, comparado com o organismo de partida. Isto leva a uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados no organismo.
Em uma outra forma de realização vantajosa do processo da invenção, os organismos usados no processo são aqueles em que simultaneamente uma proteína que degrada o composto contendo N é atenuada, em particular pela redução da taxa de expressão do gene correspondente.
Em uma outra forma de realização do processo da invenção, os organismos usados no processo são aqueles em que simultaneamente pelo menos um dos ácidos nucleicos anteriormente mencionados ou dos genes anteriormente mencionados é mutado em um tal modo que a atividade enzimática ou biológica da proteína correspondente é parcialmente reduzida ou completamente bloqueada. Uma redução na atividade enzimática ou biológica significa uma atividade enzimática, que é reduzida em pelo menos 10%, vantajosamente pelo menos 20, 30 ou 40%, de modo particularmente vantajoso em pelo menos 50, 60 ou 70%, preferivelmente mais, comparado com o organismo de partida.
Se é intencionado transformar a célula hospedeira, em particular a célula vegetal, com diversas construções ou vetores, o marcador de uma transformação precedente deve ser removido ou um outro marcador utilizado em uma transformação seguinte. Os marcadores podem ser removidos da célula hospedeira, em particular da célula vegetal, como aqui descrita abaixo por intermédio de métodos com que o técnico habilitado está familiarizado. Em particular plantas sem um marcador, em particular sem resistência aos antibióticos, são uma forma de realização especialmente preferida da presente invenção.
No processo de acordo com a invenção, as seqüências de ácido nucleico usadas no processo de acordo com a invenção são vantajosamente ligadas operavelmente a um ou mais sinais reguladores de modo a aumentar a expressão de gene. Estas seqüências reguladoras são intencionadas a possibilitar a expressão específica dos genes e a expressão da proteína. Dependendo do organismo hospedeiro por exemplo planta ou microorganismo, isto pode significar, por exemplo, que o gene é expressado e/ou super expressado apenas depois da indução ou que o mesmo é expressado e/ou super expressado constitutivamente. Estas seqüências reguladoras são, por exemplo, seqüências às quais os indutores ou repressores se ligam e que assim regulam a expressão do ácido nucleico. Além destas novas seqüências reguladoras ou ao invés destas seqüências, a regulagem natural destas seqüências pode estar ainda presente antes dos genes estruturais reais e, se apropriado, pode ter sido geneticamente modificada de modo que a regulagem natural fosse desligada e a expressão de gene fosse aumentada. Entretanto, a construção de ácido nucleico da invenção adequada como cassete de expressão (= construção de expressão = construção de gene) também podem ser mais simples em construção, isto quer dizer nenhum sinal regulador adicional foi inserido antes da seqüência de ácido nucleico ou seus derivados e o promotor natural junto com a sua regulagem não foi removido. Ao invés, a seqüência reguladora natural foi mutada em um tal modo que a regulagem não mais ocorre e/ou a expressão de gene é aumentada. Estes promotores modificados também podem ser introduzidos por si mesmos antes do gene natural na forma de seqüências parte (= promotor com partes das seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção) de modo a aumentar a atividade. Além disso, a construção de gene vantajosamente também pode compreender uma ou mais do que é conhecido como seqüências realçadoras em ligação operável com o promotor e estas possibilitam uma expressão aumentada da seqüência de ácido nucleico. Também, é possível inserir seqüências adicionais vantajosas na extremidade 3' das seqüências de DNAs, tais como, por exemplo, outros elementos reguladores ou terminadores.
As moléculas de ácido nucleico, que codificam proteínas de acordo com a invenção e as moléculas de ácido nucleico, que codificam outros polipeptídeos podem estar presentes em uma construção de ácido nucleico ou vetor ou em diversos destes. Vantajosamente, apenas uma cópia da molécula de ácido nucleico da invenção ou da molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou seus genes codificadores está presente na construção de ácido nucleico ou vetor. Diversos vetores ou construção de ácido nucleico ou vetor podem ser expressados juntos no organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleico ou a construção de ácido nucleico ou vetor de acordo com a invenção podem ser inseridos em um vetor e estar presentes na célula em uma forma livre. Se uma transformação estável é preferida, um vetor é usado, que é estavelmente duplicado em diversas gerações ou que é mesmo para ser inserido no genoma. No caso de plantas, a integração no genoma plastídico ou, em particular, no genoma nuclear pode ter ocorrido. Para a inserção de mais do que um gene no genoma hospedeiro os genes a serem expressados estão presentes juntos em uma construção de gene, por exemplo nos vetores descritos acima que carregam uma pluralidade de genes.
Como uma regra, as seqüências reguladoras para a taxa de expressão de um gene estão localizadas a montante (5'), dentro e/ou a jusante (3') em relação à seqüência codificadora da molécula de ácido nucleico da invenção ou à molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou um outro segmento de gene codogênico. Elas controlam em particular a transcrição e/ou tradução e/ou a estabilidade do transcrito. O nível de expressão é dependente da conjunção de outros sistemas regulatórios celulares, tais como os sistemas de biossíntese e degradação de proteína da célula.
As seqüências reguladoras incluem a transcrição e tradução de seqüências ou sinais reguladores, por exemplo seqüências localizadas a montante (5'), que diz respeito em particular à regulagem de transcrição ou início de tradução, tais como promotores ou códons e seqüências de início localizadas a jusante (3'), que dizem respeito em particular à regulagem da terminação de transcrição ou tradução e estabilidade do transcrito, tais como sinais de poliadenilação ou códons de parada. As seqüências reguladoras também podem estar presentes nas regiões codificadoras igualmente nas regiões não codificadoras transcritas, por exemplo em introns, como por exemplo sítios de junção. Promotores para a regulagem de expressão da molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção em uma célula e que podem ser utilizados são, em princípio, todos aqueles que são capazes de estimular a transcrição de genes nos organismos em questão, tais como microorganismos ou plantas. Os promotores adequados, que são funcionais nestes organismos são no geral conhecidos. Eles podem tomar a forma de promotores constitutivos ou indutíveis. Os promotores adequados podem possibilitar a expressão específica de desenvolvimento e/ou tecido em eucariotas multi-celulares; assim, os promotores específicos de folha, raiz, flor, semente, estornas, tubérculo ou fruta podem ser vantajosamente usados em plantas.
As seqüências ou fatores regulatórios, como descrito acima, podem ter um efeito positivo sobre a expressão dos genes introduzidos aumentando assim a sua expressão. Assim, um realce da expressão pode vantajosamente ocorrer ao nível transcricional usando-se sinais de transcrição fortes tais como promotores fortes e/ou realçadores fortes. Além disso, o realce de expressão ao nível traducional também é possível, por exemplo pela introdução de seqüências realçadoras de tradução, por exemplo, o realçador por exemplo melhorando a ligação ribossômica para o transcrito ou aumentando-se a estabilidade do mRNA, por exemplo substituindo-se a região codificadora 3'UTR por uma região que codifica uma 3'UTR conhecida como conferindo uma alta estabilidade do transcrito ou pela estabilização do transcrito através da eliminação da instabilidade do transcrito, de modo que a molécula de mRNA é traduzida mais freqüentemente do que o tipo selvagem. Por exemplo em transcritos desestabilizados por elementos ricos em AU vegetal (AREs) e elementos DST (a jusante). Estudos de mutagênese demonstraram que os resíduos dentro de dois dos domínios conservados, as regiões ATAGAT e GTA, são necessárias para a função de instabilidade. Portanto a remoção ou mutação de tais elementos obviamente levaria a transcritos mais estáveis, taxas de transcrito mais altos e atividade de proteína mais altas. Os realçadores de tradução também são a "seqüência de sobremarcha", que compreende a seqüência líder 5'-não traduzida do vírus mosaico do tabaco e que aumenta a razão de proteína/RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
Realçadores são no geral definidos como elementos ativos em eis, que podem estimular a transcrição de gene independente de posição e orientação. Realçadores diferentes foram identificados em plantas, que podem estimular a transcrição constitutivamente ou específicos de tecido ou estímulo. Os exemplos bem conhecidos para os realçadores constitutivos são o realçador do promotor 35S (Odell et al., 1985, Nature 313: 810-812) ou o realçador oes (Fromm et al., 1989, Plant Cell 1: 977: 984) Um outro exemplo são o tetrâmero do motivo G-Box que confere a expressão constitutiva de alto nível em plantas dicotiledônea e monocotiledônea (Ishige et al., 1999, Planta Journal, 18, 443-448) ou a petE, uma seqüência rica em A/T que atua como realçadores quantitativos da expressão de gene em plantas de tabaco e batata transgênicas (Sandhu et al., 1998; Planta Mol Biol. 37(5):885-96). Além do que, uma grande variedade de elementos ativos em eis foi descrita que contribui para o padrão de expressão específico, como a expressão específica de órgão ou expressão induzida em resposta ao estresse biótico ou abiótico. Os exemplos são elementos que fornecem a expressão induzida por patógeno ou ferimento (Rushton, 2002, Plant Cell, 14, 749-762) ou expressão específica de célula guarda (Plesch, 2001, Plant Journal 28, 455-464).
As seqüências reguladoras vantajosas para a expressão da molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção em microorganismos estão presentes por exemplo em promotores tais como o promotor cos, tac, rha, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, IacIq", T7, T5, T3, gal, tre, ara, SP6, λ-ΡΛ ou λ-Ρί? que são vantajosamente usados em Bactérias gram-positivas. Outras seqüências reguladoras vantajosas estão presentes por exemplo nos promotores Gram-positivos amy, dnaK, xilS e SP02, nos promotores de levedura ou fóngicos ADC1, MFa, AC, P-60, UASH, MCB, PHO, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Os promotores, que são particularmente vantajosos, são promotores constitutivos, tecido ou compartimento específica e promotor indutíveis. No geral, "promotor" é entendido como significativo, no presente contexto, de uma seqüência reguladora em uma molécula de ácido nucleico, que medeia a expressão de um segmento de seqüência codificadora de uma molécula de ácido nucleico. No geral, o promotor está localizado a montante do segmento de seqüência codificadora. Alguns elementos, por exemplo elementos realçadores da expressão tais como realçador, entretanto, também podem estar localizados a jusante ou mesmo na região transcrita.
Em princípio, é possível usar promotores naturais junto com suas seqüências reguladoras, tais como aqueles mencionados acima, para o novo processo. Também é possível vantajosamente usar promotores sintéticos, adicionalmente ou sozinho, em particular quando eles medeiam a expressão específica de semente tal como descrito, por exemplo, na WO 99/16890.
A expressão das moléculas de ácido nucleico usadas no processo pode ser desejada sozinha ou em combinação com outros genes ou ácidos nucleicos. As moléculas de ácido nucleico múltiplas que conferem a expressão de genes vantajosos podem ser introduzidas por intermédio da transformação simultânea de diversas construções de ácido nucleico individuais adequadas, isto é, construções de expressão, ou, preferivelmente, combinando-se diversos cassetes de expressão em uma construção. Também é possível transformar diversos vetores em cada caso com diversos cassetes de expressão escalonadamente nos organismos receptores.
Como descrito acima a transcrição dos genes introduzidos deve ser vantajosamente terminada pelos terminadores adequados na extremidade 3' dos genes de biossíntese introduzidos (atrás do códon de parada). Um terminador, que pode ser usado para este propósito é, por exemplo, o terminador OCS1, o terminador nos3 ou o terminador 35S. Como é o caso com os promotores, seqüências terminadoras diferentes devem ser usadas para cada gene. Terminadores, que são úteis em microorganismo são por exemplo o terminador fimA, terminador txn ou terminador trp. Tais terminadores podem ser dependentes de rho ou independentes de rho.
Promotores vegetais diferentes tais como, por exemplo, o promotor USP, o LegB4-, o DC3 ou o promotor da ubiquitina da salsa ou outro promotor aqui mencionado e terminadores diferentes podem ser vantajosamente usados na construção de ácido nucleico.
De modo a garantir a integração estável, na planta transgênica, das moléculas de ácido nucleico usadas no processo de acordo com a invenção em combinação com outros genes de biossíntese em uma pluralidade de gerações, cada uma das regiões codificadoras usadas no processo devem ser expressadas sob o seu próprio controle, preferivelmente promotor único visto que os motivos de seqüência de repetição podem levar aos eventos de recombinação ou ao silenciamento ou, em plantas, à instabilidade do T-DNA.
A construção de ácido nucleico é vantajosamente construída em um tal modo que um promotor é seguido por um sítio de clivagem adequado para a inserção do ácido nucleico a ser expressado, vantajosamente em um poliligador, seguido, se apropriado, por um terminador localizado atrás do poliligador. Se apropriado, esta ordem é repetida diversas vezes de modo que diversos genes são combinados em uma construção e assim podem ser introduzidos na planta transgênica de modo a serem expressados. A seqüência é vantajosamente repetida até três vezes. Para a expressão, as seqüências de ácido nucleico são inseridas por intermédio do sítio de clivagem adequado, por exemplo no poliligador atrás do promotor. É vantajoso para cada seqüência de ácido nucleico ter o seu próprio promotor e, se apropriado, o seu próprio terminador, como mencionado acima. Entretanto, também é possível inserir diversas seqüências de ácido nucleico atrás de um promotor e, se apropriado, antes de um terminador se uma transcrição policistrônica é possível nas células hospedeiras ou alvo. Neste contexto, o sítio de inserção ou a seqüência das moléculas de ácido nucleico inseridas, na construção de ácido nucleico não é decisiva, isto quer dizer uma molécula de ácido nucleico pode ser inserida na primeira ou última posição no cassete sem que isto tenha um efeito substancial na expressão. Entretanto, também é possível usar apenas um tipo de promotor na construção. Entretanto, isto pode levar a eventos de recombinação indesejados ou efeitos de silenciamento, como dito.
Consequentemente, em uma forma de realização preferida, a construção de ácido nucleico de acordo com a invenção confere expressão da molécula de ácido nucleico da invenção ou da molécula de ácido nucleico usada no método da invenção, e, opcionalmente outros genes, em uma planta e compreende um ou mais elementos reguladores de planta. A dita construção de ácido nucleico de acordo com a invenção vantajosamente abrange um promotor vegetal ou um terminador vegetal ou um promotor vegetal e um terminador vegetal.
Um promotor "vegetal" compreende elementos reguladores, que medeiam a expressão de um segmento de seqüência codificadora em células vegetais. Consequentemente, um promotor vegetal não necessita ser de origem vegetal, mas podem originar-se de vírus ou microorganismos, em particular por exemplo de vírus que atacam células vegetais.
O promotor vegetal também pode originar-se de uma célula vegetal, por exemplo da planta, que é transformada com a construção de ácido nucleico ou vetor como aqui descrito. Isto também se aplica a outros sinais reguladores "vegetais", por exemplo em terminadores "vegetais".
Uma construção de ácido nucleico adequada para a expressão vegetal preferivelmente compreende elementos reguladores que são capazes de controlar a expressão de genes em células vegetais e que são operavelmente ligados de modo que cada seqüência possa satisfazer a sua função. Consequentemente, a construção de ácido nucleico também pode compreendem terminadores de transcrição. Os exemplos para a terminação transcricional são sinais de poliadenilação. Os sinais de poliadenilação preferidos são aqueles que se originam do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, tais como o gene 3 do plasmídeo Ti pTiACH5, que é conhecido como octopina sintase (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 et seq.) ou equivalentes funcionais deste, mas todos os outros terminadores que são funcionalmente ativos em plantas também são adequados.
A construção de ácido nucleico adequada para a expressão vegetal preferivelmente também compreende outros elementos reguladores operavelmente ligados tais como realçadores de tradução, por exemplo a seqüência de sobremarcha, que compreende a seqüência líder 5' não traduzida do vírus mosaico do tabaco, que aumenta a razão de proteína/RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
Outras seqüências preferidas para o uso em ligação operável em construções de expressão de gene são seqüências alvejadoras, que são requeridas para alvejar o produto de gene em compartimentos celulares específicos (para uma revisão, ver Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 e faz alusão ao citado neste ponto), por exemplo no vacúolo, no núcleo, todos os tipos de plastídeos, tais como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, no espaço extracelular, na mitocôndria, no retículo endoplasmático, elaioplastos, peroxissomas, glicossomas e outros compartimentos de células ou extracelulares. As seqüências, que devem ser mencionadas neste contexto são, em particular, as seqüências que codificam peptídeo de sinal ou peptídeo de trânsito que codifica seqüências que são conhecidas por si. Por exemplo, seqüências que codificam plastídeo-peptídeo de trânsito possibilitam o alvejamento do produto de expressão nos plastídeos de uma célula vegetal. Seqüências de alvejamento também são conhecidas para organismos eucarióticos e a um grau menor para os procarióticos e podem ser vantajosamente operavelmente ligadas com a molécula de ácido nucleico da presente invenção para se obter uma expressão em um dos ditos compartimentos ou extracelularmente. Especialmente preferido é a ligação operável das seqüências de ácido nucleico mostradas na tabela I A ou IB colunas 5 ou 7 aplicação n° 2 ou n° 3 com uma seqüência alvej adora para o compartimento plastídico. Para a expressão em plantas, a molécula de ácido nucleico, como descrita acima, deve estar ligada operavelmente ou compreender um promotor adequado que expresse o gene no ponto certo no tempo e em uma maneira específica de célula ou tecido. Os promotores utilizáveis são promotores constitutivos (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), tais como aqueles que originam-se de vírus vegetais, tais como 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (ver também US 5352605 e WO 84/02913), 34S FMV (Sanger et al, Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443), o promotor da ubiquitina da salsa ou promotores vegetais tais como o promotor da subunidade pequena de Rubisco na US 4.962.028 ou os promotores vegetais PRPl [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, PGEL1, OCS [Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553-2557], lib4, usp, mas [Cornai (1990) Plant Mol Biol 15 (3):373-381], STLS1, ScBV (Schenk (1999) Plant Mol Biol 39(6): 1221-1230), B33, SADl ou SAD2 (promotores do linho, Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696-1701) ou nos [Shaw et al (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846], A expressão estável, constitutiva das proteínas de acordo com a invenção em uma planta pode ser vantajosa. Entretanto, a expressão indutível do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção é vantajosa, se uma expressão posterior antes da colheita for de vantagem, visto que a manipulação metabólica pode levar a um retardo do crescimento da planta.
A expressão de genes vegetais também pode ser facilitada como descrito acima por intermédio de um promotor químico indutível (para uma revisão, ver Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Os promotores quimicamente indutíveis são particularmente adequados quando é desejado expressar o gene em uma maneira específica de tempo. Os exemplos de tais promotores são um promotor indutível pelo ácido salicílico (WO 95/19443) e promotor indutível pelo ácido abscísico (EP 335 528), um promotor indutível por tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J. 2,397-404), um promotor indutível pelo ciclo-hexanol ou etanol (WO93/21334) ou outros como aqui descritos.
Outros promotores adequados são aqueles que reagem às condições de estresse biótico ou abiótico, por exemplo o promotor do gene PRPl induzido por patógeno (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), o promotor hsp80 indutível por calor do tomate (US 5.187.267), opromotor da alfa-amilase indutível pelo frio da batata (WO 96/12814) ou o promotor pinll indutível por ferimento (EP-A-O 375 091) ou outros como aqui descritos.
Os promotores preferidos são em particular aqueles que
realizam a expressão de gene em tecidos e órgãos em que a biossíntese de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio como aminoácidos ou proteínas ocorre, em células de semente, tais como células de endosperma e células do embrião em desenvolvimento. Os promotores adequados são o promotor do gene napin da colza (US 5.608.152), o promotor USP da Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), o promotor da oleosina da Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor da faseolina da Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), o promotor Bce4 da Brassica (WO91/13980), o promotor arc5 do feijão, o promotor DcG3 da cenoura ou o promotor B4 de Legumin (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): .233-9) e promotores que realizam a expressão específica de semente em plantas monocotiledôneas tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz e outros. Os promotores específicos de semente vantajosos são o promotor da proteína de ligação da sacarose (WO 00/26388), o promotor da faseolina e o promotor da napina. Os promotores adequados que devem ser considerados são o promotor dos genes lpt2 ou Iptl da cevada (WO 95/15389 e WO .95/23230) e os promotores descritos na WO 99/16890 (promotores do gene da hordeína da cevada, o gene da glutelina do arroz, o gene da orizina do arroz, o gene da prolamina do arroz, o gene da gliadina do trigo, o gene da glutelina do trigo, o gene da zeína do milho, o gene da glutelina da aveia, o gene da casirina do sorgo e o gene da secalina do centeio). Outros promotores adequadas são Amy32b, Amy 6-6 e Aleurain [US 5.677.474], Bce4 (colza) [US 5.530.149], glicinina (soja) [EP 571 741], fosfoenolpiruvato carboxilase (soja) [JP 06/62870], ADRl2-2 (soja) [WO 98/08962], isocitrato liase (colza) [US 5.689.040] ou α-amilase (cevada) [EP 781 849], Outros promotores que estão disponíveis para a expressão de genes em plantas são promotores específicos de folha tais como aqueles descritos na DE-A 19644478 ou promotores regulados pela luz tais como, por exemplo, o promotor petE da ervilha.
Outros promotores vegetais adequados são o promotor FBPase citossólico ou o promotor ST-LSI da batata (Stockhaus et al., EMBO J. 8, .1989, 2445), o promotor da fosforribosilpirofosfato amidotransferase da Glicina max (Acesso do GenBank N° U87999) ou o promotores específico de nó descrito na EP-A-O 249 676.
Outros promotores, que são particularmente adequados, são aqueles que realizam a expressão específica de plastídeo. Promotores adequados tais como o promotor da RNA polimerase viral são descritos na WO 95/16783 e WO 97/06250 e o promotor clpP de Arabidopsis, que é descrito na WO 99/46394.
Outros promotores, que são usados para a expressão forte de seqüências heterólogas em tantos tecidos quanto possível, em particular também em folhas, são, além dos diversos dos promotores virais e bacterianos supra citados, preferivelmente, promotores vegetais dos genes da actina ou ubiquitina tais como, por exemplo, o promotor da actinal do arroz. Outros exemplos de promotores vegetais constitutivos são os promotores de V- ATPase da beterraba açucareira (WO 01/14572). Os exemplos de promotores constitutivos sintéticos são o Super promotor (WO 95/14098) e promotores derivados de G-boxes (WO 94/12015). Se apropriado, promotores químicos indutíveis além disso também podem ser usados, comparar a EP-A 388186, EP-A 335528, WO 97/06268.
Como já aqui mencionado, outras seqüências reguladoras, que podem ser convenientes, se apropriadas, também incluem seqüências, que alvejam o transporte e/ou a localização dos produtos de expressão. As seqüências, que devem ser mencionadas neste contexto são, em particular, as seqüências que codificam peptídeo de sinal ou peptídeo de trânsito que são conhecidas por si. Por exemplo, seqüências que codificam plastídeo-peptídeo de trânsito possibilitam o alvejamento do produto de expressão nos plastídeos de uma célula vegetal.
As plantas receptoras preferidas são, como descrito acima, em particular aquelas plantas, que podem ser transformadas em uma maneira adequada. Estas incluem plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. As plantas que devem ser mencionadas em particular são plantas agricolamente úteis tais como cereais e gramas, por exemplo Triticum spp., Zea mays, Hordeum vulgar e, aveia, Secale cereale, Oryza sativa, Pennisetum glaucum, Sorgo bicolor, Triticale, Agrostis spp., Cenchrus eiliaris, Daetilis glomerata, Festuea arundinaeea, Lolium spp., Medieago spp. e Saeeharum spp., legumes e safras oleosas, por exemplo Brassiea juneea, Brassiea napus, Glieina max, Arachis hypogaea, Gossypium hirsutum, Cicer arietinum, Helianthus annuus, Lens eulinaris, Linum usitatissimum, Sinapis alba, Trifolium repens e Vicia narbonensis, vegetais e frutas, por exemplo bananas, uvas, Lyeopersieon eseulentum, asparago, repolho, melancias, fruta kiwi, Solanum tuberosum, Beta vulgaris, mandioca e chicória, árvores, por exemplo espécies Coffea, Citrus spp., Eucalyptus spp., Picea spp., Pinus spp. e Populus spp., plantas medicinais e árvores e flores.
Uma forma de realização da presente invenção também diz respeito a um método para gerar um vetor, que compreende a inserção, em um vetor, da molécula de ácido nucleico aqui caracterizada, da molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção ou do cassete de expressão de acordo com a invenção. O vetor por exemplo, pode ser introduzido em uma célula, por exemplo um microorganismo ou uma célula vegetal, como aqui descritos para a construção de ácido nucleico ou abaixo sob transformação ou transfecção ou mostrada nos exemplos. Uma transformação transitória ou estável da célula hospedeira ou alvo é possível, entretanto, uma transformação estável é preferida. O vetor de acordo com a invenção é preferivelmente um vetor, que seja adequado para expressar o polipeptídeo de acordo com a invenção em uma planta. O método pode assim abranger também uma ou mais etapas para a integração de sinais reguladores no vetor, em particular sinais, que medeiem a expressão em microorganismos ou plantas.
Consequentemente, a presente invenção também diz respeito a um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico aqui caracterizada como parte de uma construção de ácido nucleico adequada para a expressão vegetal ou a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção.
Os vetores vantajosos da invenção compreendem as moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de acordo com a invenção, as moléculas de ácido nucleico que são usadas no processo ou construção de ácido nucleico adequadas para a expressão vegetal que compreende as moléculas de ácido nucleico usadas, sozinhas ou em combinação com outros genes tais como os genes da biossíntese ou reguladores do metabolismo de aminoácido por exemplo com os genes aqui acima mencionados. De acordo com a invenção, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico, que é capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual a mesma está ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que significa uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, sendo possível ligar segmentos de ácidos nucleicos adicionais no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles tenham sido introduzidos (por exemplo vetores bacterianos com origem de replicação bacteriana). Outros vetores preferidos são de modo vantajoso completa ou parcialmente integrados no genoma de uma célula hospedeira quando eles são introduzidos na célula hospedeira e assim replicam junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de controlar a expressão de genes com os quais eles estão em ligação operável. No presente contexto, estes vetores são aludidos como "vetores de expressão". Como mencionado acima, eles são capazes de replicação autônoma ou podem ser integrados parcial ou completamente no genoma hospedeiro. Os vetores de expressão, que são adequados para as técnicas de recombinação de DNA usualmente tomam a forma de plasmídeos. Na presente descrição, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente visto que o plasmídeo é a forma mais freqüentemente usada de um vetor. Entretanto, a invenção também é intencionada a abranger estas outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais, que exercem funções similares. O termo vetor é além disso também para abranger outros vetores que são conhecidos pelo técnico habilitado, tais como fagos, vírus tais como SV40, CMV, TMV, transposons, elementos IS, fasmídeos, fagomídeos, cosmídeos e DNA linear ou circular. Os vetores de expressão recombinantes que são vantajosamente usados no processo compreendem as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção ou a construção de ácido nucleico de acordo com a invenção em uma forma que seja adequada para expressar, em uma célula hospedeira, as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção ou aqui descritas. Consequentemente, os vetores de expressão recombinantes compreendem um ou mais sinais reguladores selecionados com base nas células hospedeiras a serem usadas para a expressão, em ligação operável com a seqüência de ácido nucleico a ser expressada.
Em um vetor de expressão recombinante, "ligação operável" significa que a molécula de ácido nucleico de interesse está ligada aos sinais reguladores em um tal modo que a expressão da molécula de ácido nucleico seja possível: elas são ligadas entre si em um tal modo que as duas seqüências satisfaçam a função prognosticada designada para a seqüência (por exemplo em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira se o vetor é introduzido na célula hospedeira).
O termo "seqüência reguladora" é intencionada a compreender promotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo sinais de poliadenilação). Estas seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) ou ver: Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Flórida, Ed.: Glick e Thompson, capítulo 7, 89-108, incluindo as referências aí citadas. As seqüências reguladoras abrangem aquelas, que controlam a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que controlam a expressão direta da seqüência de nucleotídeo apenas em células hospedeiras específicas e sob condições específicas. O técnico habilitado sabe que o planejamento do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a seleção da célula hospedeira a ser transformada, do grau ao qual a proteína desejada é expressada e outros. Uma seleção preferida de seqüências reguladoras é descrita acima, por exemplo promotores, terminadores, realçadores e outros. O termo seqüência reguladora deve ser considerada como sendo abrangida pelo termo sinal regulador. Diversas seqüências reguladoras vantajosas, em particular promotoras e terminadoras são descritas acima. No geral, as seqüências reguladoras descritas como vantajosas para a construção de ácido nucleico adequadas para a expressão também são aplicáveis para vetores. Os vetores de expressão recombinantes usados podem ser planejados especificamente para a expressão, em células procarióticas e/ou eucarióticas, das moléculas de ácido nucleico usadas no processo. Isto é vantajoso visto que as etapas intermediárias da construção de vetor são freqüentemente realizadas em microorganismos por causa de simplicidade. Por exemplo, os genes de acordo com a invenção e outros genes podem ser expressados em células bacterianas, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), células de levedura e outras células fungicas [Romanos (1992), Yeast 8: 423-488; van den Hondel, (1991), em: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego; e van den Hondel, C.A.M.J.J. (1991), em: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F., et al., Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge], algas [Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology, 1,3: 239-251] usando vetores e seguindo um método de transformação como descrito na WO 98/01572 e preferivelmente em células de plantas de células múltiplas [ver Schmidt, R. e Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep.: 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Flórida, capítulo 6/7, pp. 71-119 (1993); F. F. White, em: Transgenics Plant, Bd. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. BioL 42 (1991), 205-225 (e faz alusão ao citado neste ponto)]. As células hospedeiras adequadas são além disso debatidas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Como uma alternativa, a seqüência do vetor de expressão recombinante pode ser transcrita e traduzida in vitro, por exemplo usando seqüências reguladoras do promotor T7 e T7 polimerase.
As proteínas podem ser expressadas em procariotas usando vetores que compreendem promotores constitutivos ou indutíveis, que controla a expressão das proteínas de fusão ou proteínas que não de fusão. Os vetores de expressão de fusão típicas são, inter alia, pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. e Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), em que a glutationa-S-transferase (GST), proteína de ligação de maltose E ou proteína A é fundida com a proteína alvo recombinante. Os exemplos de vetores de expressão de E. coli que não de indutíveis adequadas são, inter alia, pTrc (Amann et ai. (1988) Gene 69: 301-315) e pET Ild [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89]. A expressão de gene alvo do vetor pTrc é fundamentado na transcrição de um promotor de fusão de trp-lac híbrido pela RNA polimerase hospedeira. A expressão de gene alvo do vetor de pET 1 Id é fundamentada na transcrição de um promotor de fusão de T7-gnl O-Iac, que é mediada por uma RNA polimerase viral coexpressada (T7 gnl). Esta polimerase viral é fornecida pelas cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) por um λ-profago residente que abriga um gene T7 gnl sob o controle transcricional do promotor IacUV 5.
Outros vetores que são adequados em organismos procarióticos são conhecidos pelo técnico habilitado; estes vetores são por exemplo na E. coli pLG338, pACYC184, a série pBR, tal como pBR322, a série pUC tal como pUC18 ou pUC19, a série M113mp, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, Xgtl 1 ou pBdCI, em Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 ou pIJ361, em Bacillus pUBl 10, pC194 ou pBD214, em Corynebaeterium pSA77 ou pAJ667.
Em uma outra forma de realização, o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Os exemplos de vetores para a expressão nas leveduras S. cerevisiae abrangem ρYeDesaturasecl (Baldari et ai. (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et ai. (1987) Gene 54: 113-123) e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vetores e métodos para a construção de vetores que são adequados para o uso em outros fungos, tais como os fungos filamentosos, abrangem aqueles que são descritos em detalhes em: van den Hondel, C.A.MJJ. [(1991), J. F. Peberdy, Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge; ou em: More Gene Manipulations in Fungi; J. W. Bennet & L. L. Lasure, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego]. Os exemplos de outros vetores de levedura adequados são 2ιχΜ, pAG-1, YEp6, YEp 13 ou pEMBLYe23.
Outros vetores, que podem ser mencionados por via de exemplo, são pALSl, pIL2 ou pBBlló em fungos ou pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51 em plantas.
Como uma alternativa, as seqüências de ácido nucleico podem ser expressadas em células de inseto usando vetores de expressão de baculovírus. Vetores de baculovírus, que são disponíveis para expressar proteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo células Sf9) abrangem a série pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) e a série pVL (Lucklow e Summers (1989) Virology 170: 31-39).
Os vetores supra citados são apenas um pequeno resumo de vetores potencialmente adequados. Outros plasmídeos são conhecidos pelo técnico habilitado e são descritos, por exemplo, em: Cloning Vectors (Ed. Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-Nova Iorque-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018). Outros sistemas de expressão adequadas para as células procarióticas e eucarióticas, ver os capítulos 16 e 17 por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Consequentemente, uma forma de realização da invenção diz respeito a um vetor onde a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção é ligada operavelmente às seqüências reguladoras que permitam a expressão em um hospedeiro procariótico ou eucariótico ou em um procari ótico e eucariótico.
Consequentemente, uma forma de realização da invenção diz respeito a uma célula hospedeira, que foi transformada estável ou transitoriamente com o vetor de acordo com a invenção ou a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção ou a construção de ácido nucleico de acordo com a invenção.
A presente invenção também diz respeito a um processo para a produção de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, o polipeptídeo sendo expressada em uma célula hospedeira de acordo com a invenção, preferivelmente em um microorganismo ou uma célula vegetal transgênica.
Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico usada no processo para a produção do polipeptídeo é derivada de um microorganismo, preferivelmente de uma célula procariótica ou protozoárica com um organismo eucariótico como célula hospedeira. Por exemplo, em uma forma de realização o polipeptídeo é produzido em uma célula vegetal ou planta com uma molécula de ácido nucleico derivada de um procariota ou um fungo ou uma alga ou um outro microorganismo mas não de planta.
O técnico habilitado sabe que a proteína e DNA expressados em organismos diferentes diferem em muitos aspectos e propriedades, por exemplo modulação e impressão de DNA, tal como metilação ou modificação pós-traducional, como por exemplo glicosilação, fosforilação, acetilação, miristoilação, ADP-ribosilação, farnesilação, carboxilação, sulfatação, ubiquinação, etc. não obstante tendo a mesma seqüência codificadora. Preferivelmente, o controle de expressão celular da proteína correspondente difere consequentemente nos mecanismos de controle que controla a atividade e expressão de uma proteína endógena ou uma outra proteína eucariótica. Uma diferença maior entre as proteínas expressadas em organismos procarióticos ou eucarióticos é a quantidade e o padrão de glicosilação. Por exemplo na E. coli não existe nenhuma proteína glicosilada. As proteínas expressadas em leveduras têm alto teor de manose nas proteínas glicosiladas, ao passo que em plantas o padrão de glicosilação é complexo.
O polipeptídeo da presente invenção é preferivelmente produzido pelas técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína é clonada em um vetor (como descrito acima), o vetor é introduzido em uma célula hospedeira (como descrito acima) e o dito polipeptídeo é expressado na célula hospedeira. O dito polipeptídeo pode ser depois isolado das células por um esquema de purificação apropriado usando técnicas de purificação de proteína padrão. Alternativo para a expressão recombinante, o polipeptídeo ou peptídeo da presente invenção podem ser quimicamente sintetizados usando técnicas de
síntese de peptídeo padrão.
Além disso, um polipeptídeo nativo que confere o aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou parte deste podem ser isolados de células (por exemplo, células endoteliais), por exemplo usando o anticorpo da presente invenção como descrito abaixo, em particular, um anticorpo mais uma vez contra uma proteína como indicado na Tabela II, coluna 3. Por exemplo um anticorpo mais uma vez contra um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou uma parte antigênica deste que pode ser produzido pelas técnicas padrão utilizando polipeptídeos que compreendem ou que consistem das seqüências acima mencionadas, por exemplo o polipeptídeo da presente invenção ou fragmento deste. Preferido são anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ao polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7.
Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou obtenível por um processo da invenção. O dito polipeptídeo confere preferivelmente a atividade anteriormente mencionada, em particular, o polipeptídeo confere o aumento no nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio em uma célula ou um organismo ou uma parte deste depois de aumentar a atividade celular, por exemplo aumentando- se a expressão ou a atividade específica do polipeptídeo.
Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada do grupo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou como codificada por uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo como indicado na Tabela I, colunas 5 ou 7 ou homólogos funcionais deste.
Em uma forma de realização vantajosa, no método da presente invenção a atividade de um polipeptídeo é aumentada que compreende ou consiste de uma seqüência de consenso selecionada do grupo como indicado na Tabela IV, coluna 7 e em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um polipeptídeo que compreende ou que consiste de uma seqüência de consenso como indicada na Tabela IV, coluna 7 por meio da qual 20 ou menos, preferivelmente 15 ou 10, preferivelmente 9, 8, 7 ou 6, mais preferido 5 ou 4, ainda mais preferido 3, ainda mais preferido 2, ainda mais preferido 1, o mais preferido 0 das posições de aminoácidos indicados podem ser substituídas por qualquer aminoácido ou, em uma outra forma de realização, podem ser substituídas e/ou ausentes. Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método da presente invenção que compreende um polipeptídeo ou a um polipeptídeo que compreende mais do que uma das seqüências de consenso (de uma linhagem individual) como indicado na Tabela IV, coluna 7.
Em uma forma de realização não mais do que 15%, preferivelmente 10%, ainda mais preferido 5%, 4%, 3% ou 2%, o mais preferido 1 % ou 0% das posições de aminoácido indicadas por uma letra são substituídas por um outro aminoácido ou, em uma outra forma de realização, são ausentes e/ou substituídas. Em uma outra forma de realização os trechos de aminoácidos não conservados, indicados por (X), variam no seu comprimento em 20%, preferivelmente em 15 ou 10%, ainda mais preferido em 5%, 4%, 3%, 2% ou o mais preferido em apenas 1%.
Em uma forma de realização 20 ou menos, preferivelmente 15 ou 10, preferivelmente 9, 8, 7 ou 6, mais preferido 5 ou 4, ainda mais preferido 3, ainda mais preferido 2, ainda mais preferido 1, o mais preferido 0 aminoácidos são inseridos na seqüência de consenso ou, em uma outra forma de realização, estão ausentes e/ou substituídos.
As seqüências de consenso foram derivadas de múltiplos alinhamentos das seqüências como listadas na tabela II. As letras representam o código de aminoácido de uma letra e indicam que os aminoácidos são conservados em todas as proteínas alinhadas. A letra X significa aminoácidos, que não são conservados em todas as seqüências. Em um exemplo, nos casos onde apenas um pequeno subconjunto selecionado de aminoácidos é possível em uma certa posição estes aminoácidos são dados em colchetes. O número de X dado indica a distância entre os resíduos de aminoácido conservados, por exemplo Y-x(21,23)-F significa que os resíduos de tirosina e fenilalanina são separados um do outro por um mínimo de 21 e máximo de 23 resíduos de aminoácido em todas as seqüências investigadas. Os domínios conservados foram identificados de todas as seqüências e são descritos usando um subconjunto da notação de Prosite padrão, por exemplo, o padrão Y-x(21,23)-[FW] significa que uma tirosina conservada é separada por um mínimo de 21 e máximo de 23 resíduos de aminoácido de uma fenilalanina ou triptofano.
Os padrões conservados foram identificados com a ferramenta de software versão MEME 3.5.1 ou manualmente. MEME foi desenvolvido por Timothy L. Bailey e Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engeneering, University of Califórnia, San Diego, USA e é descrito por Timothy L. Bailey e Charles Elkan [Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolimers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, 1994]. O código fonte para o programa autônomo é público disponível da San Diego Supercomputer center (http: //meme.sdsc.edu).
Para identificar motivos comuns em todas as seqüências com a ferramenta de software MEME, os seguintes ajustes foram usados: -maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0,001, -maxw 60, -distância le-3, -minsites número de seqüências usado para a análise. Seqüências de entrada para MEME foram seqüências não alinhadas no formato Fasta. Outros parâmetros foram usados no ajuste de default nesta versão de software.
Os padrões Prosite de domínios conservados foram gerados com a ferramenta de software Pratt versão 2.1 ou manualmente. Pratt foi desenvolvido por Inge Jonassen, Dept. of Informatics, University of Bergen, Norway e é descrito por Jonassen et al. [I. Jonassen, J. F. Collins e D. G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned proteins sequences, Protein Science 4 (1995), pp. 1587-1595; I. Jonassen, Efficient discovery of conserved pattern using a pattern graph, Submitted to CABIOS Fev. 1997]. O código fonte (ANSI C) para o programa autônomo é público disponível, por exemplo em centros de Bioinformática estabelecidos como o EBI (European Bioinformatics Institute).
Para gerar padrões com a ferramenta de software Pratt, os seguintes ajustes foram usados: PL (Comprimento de Padrão max): 100, PN (Nr max de Símbolos Padrão): 100, PX (Nr max de x's consecutivos): 30, FN (Nr max de espaçadores flexíveis): 5, FL (Flexibilidade max): 30, FP (Flex.Produto max): 10, ON (padrões de número max): 50. As seqüências de entrada para Pratt foram regiões das seqüências de proteínas distintas que exibem alta similaridade como identificadas da ferramenta de software MEME. O número mínimo de seqüências, que têm que emparelhar os padrões gerados (CM, Nr min de Seqs para emparelhar) foi ajustado a pelo menos .80% das seqüências fornecidas. Os parâmetros não mencionados aqui foram usados nos seus ajustes de default.
Os padrões Prosite dos domínios conservados podem ser usados para pesquisar quanto às seqüências de proteínas que se emparelham neste padrão. Vários centros de bioinformática estabelecidos fornecem portais da internet públicos para usar estes padrões nas pesquisas de base de dados (por exemplo PIR [Protein Information Resource, localizada na Georgetown University Medicai Center] ou ExPASy [Expert Protein Analysis System]). Alternativamente, software autônomo está disponível, como o programa Fuzzpro, que é parte do pacote de software EMBOSS. Por exemplo, o programa Fuzzpro não apenas permite pesquisar quanto a um emparelhamento de padrão-proteína exato mas também permite ajustar várias ambigüidades na pesquisa realizada.
O alinhamento foi realizado com o software ClustalW (versão .1.83) e é descrito por Thompson et al. [Thompson, J. D., Higgins, D. G. e Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specifíc gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673- .4680]. O código fonte para o programa autônomo é público disponível da European Molecular Biology Laboratory; Heidelberg, Alemanha. A análise foi realizada usando os parâmetros de default de ClustalW ν 1.83 (penalidade de abertura de intervalo: 10,0; penalidade de extensão de intervalo: 0,2; matriz de proteína: Gonnet; proteína/DNA endgap: -1; proteína/DNA gapdist:
4)·
Em uma forma de realização vantajosa, o método da presente invenção compreende o aumento de um polipeptídeo que compreende ou que consiste de seqüências de consenso específicas de planta ou microorganismo. Consequentemente, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um polipeptídeo que compreende ou que consiste de seqüências de consenso específicas de planta ou microorganismo.Em uma forma de realização, o dito polipeptídeo da invenção distingue em uma seqüência como indicado na Tabela II A ou IIB, colunas 5 ou 7 por um ou mais aminoácidos. Em uma forma de realização, o polipeptídeo distingue de uma seqüência como indicada na Tabela II A ou IIB, colunas 5 ou 7 em mais do que 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos, preferivelmente em mais do que 10, 15, 20, 25 ou 30 aminoácidos, ainda mais preferidos são mais do que 40, 50 ou 60 aminoácidos e, preferivelmente, a seqüência do polipeptídeo da invenção distingue de uma seqüência como indicada na Tabela II A ou II B, colunas 5 ou 7 em não mais do que 80% ou 70% dos aminoácidos, preferivelmente não mais do que 60% ou 50%, mais preferido não mais do que 40% ou 30%, ainda mais preferido não mais do que 20% ou 10%. Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo da invenção não consiste de uma seqüência como indicada na Tabela IIA ou IIB, colunas 5 ou 7.
Em uma forma de realização, o polipeptídeo da invenção compreende qualquer uma das seqüências não conhecidas pelo público antes. Em uma forma de realização, o polipeptídeo da invenção origina-se de uma célula não vegetal, em particular de um microorganismo e foi expressada em uma célula vegetal. Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção para a qual uma atividade não foi ainda descrita. Em uma outra forma de realização preferida o polipeptídeo da invenção compreende qualquer uma das seqüências mostradas na tabela II coluna 5 ou 7 aplicação ne 2 ou n° 3 e ainda uma seqüência de alvejamento plastídica.
Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a polipeptídeo que confere um aumento no nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio em um organismo ou parte deste sendo codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção ou por uma molécula de ácido nucleico usada no processo da invenção. Em uma forma de realização, o polipeptídeo da invenção tem uma seqüência que distingue de uma seqüência como indicada na Tabela II A ou II B, colunas 5 ou 7 em um ou mais aminoácidos. Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo da invenção não consiste da seqüência como indicada na Tabela II A ou II B, colunas 5 ou 7. Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo da presente invenção é menos do que 100%, 99,999%, 99,99%, 99,9% ou 99% idêntico. Em uma forma de realização, o dito polipeptídeo não consiste da seqüência codificada por uma molécula de ácido nucleico como indicada na Tabela I A ou IB, colunas 5 ou .7. Em uma forma de realização o dito polipeptídeo é um peptídeo de fusão com uma seqüência de alvejamento plastídica.
Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um polipeptídeo tendo uma atividade de uma proteína como indicado na Tabela II, coluna 3, que distingue em uma seqüência como indicada na Tabela II A ou II B, colunas 5 ou 7 em um ou mais aminoácidos, preferivelmente em mais do que 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos, preferivelmente em mais do que 10, .15, 20, 25 ou 30 aminoácidos, ainda mais preferidos são mais do que 40, 50 ou 60 aminoácidos mas ainda mais preferido em menos do que 70% dos aminoácidos, mais preferido em menos do que 50%, ainda mais preferido em menos do que 30% ou 25%, mais preferidos são 20% ou 15%, ainda mais preferidos são menos do que 10%.
Os termos "proteína" e "polipeptídeo" usados neste pedido são intercambiáveis. "Polipeptídeo" refere-se a um polímero de aminoácidos (seqüência de aminoácido) e não se refere a um comprimento específico da molécula. Assim peptídeos e oligopeptídeos são incluídos dentro da definição de polipeptídeo. Este termo também refere-se a ou inclui modificações pós traducionais do polipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e outros. Incluídos dentro da definição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), polipeptídeos com ligações substituídas, assim como outras modificações conhecidas na técnica, tanto de ocorrência natural quanto de ocorrência não natural.
Preferivelmente, o polipeptídeo é isolado. Uma proteína ou molécula de ácido nucleico ou porção biologicamente ativa destas "isoladas" ou "purificadas" são substancialmente livres de material celular quando produzidas pelas técnicas de DNA recombinante ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados.
A linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações do polipeptídeo da invenção em que a proteína é separada de componentes celulares das células em que a mesma é naturalmente ou recombinantemente produzida. Em uma forma de realização, a linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações tendo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de "proteína contaminante", mais preferivelmente menos do que cerca de 20% de "proteína contaminante", ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10% de "proteína contaminante" e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5% de "proteína contaminante". O termo "proteína contaminante" diz respeito a polipeptídeos, que não são polipeptídeos da presente invenção. Quando o polipeptídeo da presente invenção ou porção biologicamente ativa deste é recombinantemente produzido, também é de modo preferível substancialmente livre de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos do que cerca de 20%, mais preferivelmente menos do que cerca de .10% e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5% do volume da preparação de proteína. A linguagem "substancialmente livre de químicos precursores ou outros produtos químicos" inclui preparações em que o polipeptídeo da presente invenção é separado de precursores químicos ou outros produtos químicos, que estão envolvidos na síntese da proteína. A linguagem "substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos" inclui preparações tendo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de precursores químicos ou não polipeptídeo da invenção-produtos químicos, mais preferivelmente menos do que cerca de 20% de precursores químicos ou não polipeptídeo da invenção-produtos químicos, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10% de precursores químicos ou não polipeptídeo da invenção-produtos químicos e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5% de precursores químicos ou não polipeptídeo da invenção- produtos químicos. Em formas de realização preferidas, as proteínas isoladas ou porções biologicamente ativas deste carecem de contaminantes de proteína do mesmo organismo a partir do qual o polipeptídeo da presente invenção é derivado. Tipicamente, tais proteínas são produzidas pelas técnicas recombinantes.
Não polipeptídeo da invenção-produtos químicos são por exemplo polipeptídeos que não têm a atividade e/ou seqüência de aminoácido de um polipeptídeo indicado na Tabela II, colunas 3, 5 ou 7.
Um polipeptídeo da invenção pode participar no processo da presente invenção. O polipeptídeo ou uma porção deste compreende preferivelmente uma seqüência de aminoácido que seja suficientemente homóloga a uma seqüência de aminoácido como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7 tal que a proteína ou porção deste mantenha a capacidade para conferir a atividade da presente invenção. A porção da proteína é preferivelmente uma porção biologicamente ativa como aqui descrita. Preferivelmente, o polipeptídeo usado no processo da invenção tem uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7.
Além disso, o polipeptídeo pode ter uma seqüência de aminoácido que é codificada por uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza, preferivelmente hibridiza sob condições estringentes como descrito acima, a uma seqüência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico da presente invenção. Consequentemente, o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é codificada por uma seqüência de nucleotídeo que seja pelo menos cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% ou 70%, preferivelmente pelo menos cerca de 75%, 80%, 85% ou 90 e mais preferivelmente pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga a uma das seqüências de nucleotídeo como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7. O polipeptídeo preferido da presente invenção preferivelmente possui pelo menos uma das atividades de acordo com a invenção e aqui descritas. Um polipeptídeo preferido da presente invenção inclui uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza, preferivelmente hibridiza sob condições estringentes, a uma seqüência de nucleotídeo como indicada na Tabela I, colunas 5 ou 7 ou que seja homóloga a esta, como definida acima.
Consequentemente o polipeptídeo da presente invenção pode variar de uma seqüência como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7 na seqüência de aminoácido devido à variação natural ou mutagênese, como descrito aqui em detalhes. Consequentemente, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 35%, 40%, 45%, .50%, 55%, 60%, 65% ou 70%, preferivelmente pelo menos cerca de 75%, .80%, 85%) ou 90 e mais preferivelmente pelo menos cerca de 91%, 92%, .93%, 94% ou 95% e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, .98%), 99% ou mais homóloga a uma seqüência de aminoácido inteira de uma seqüência como indicada na Tabela IIA ou IIB, colunas 5 ou 7.
Para a comparação de seqüências de aminoácido os mesmos algoritmos como descritos acima ou seqüências de ácido nucleico podem ser usados. Resultados de alta qualidade são atingidos usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman. Portanto programas com base nos ditos algoritmos são preferidos. Vantajosamente as comparações de seqüências podem ser feitas com o programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, .351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou preferivelmente com os programas Gap e BestFit, que são respectivamente com base nos algoritmos de Needleman e Wunsch [J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)] e Smith e Waterman [Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)]. Ambos os programas são parte do pacote de software da GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 et seq.]. Portanto preferivelmente os cálculos para determinar as porcentagens de homologia de seqüência são feitos com o programa Gap sobre a faixa inteira das seqüências. Os seguintes ajustes padrão para a comparação de seqüências de aminoácido foram usados: peso de intervalo: 8, peso de comprimento: 2, emparelhamento médio: 2,912, desemparelhamento médio: -2,003.
As porções biologicamente ativas de um polipeptídeo da presente invenção incluem peptídeos que compreendem seqüências de aminoácido derivadas da seqüência de aminoácido do polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da presente invenção, por exemplo, uma seqüência de aminoácido como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou a seqüência de aminoácido de uma proteína homóloga a esta, que inclui menos aminoácidos do que um polipeptídeo de tamanho natural da presente invenção ou usado no processo da presente invenção ou a proteína de tamanho natural que seja homóloga a um polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da presente invenção aqui representado e exibe pelo menos uma atividade de polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da presente invenção.
Tipicamente, as porções biologicamente (ou imunologicamente) ativas isto é, peptídeos, por exemplo, peptídeos que têm, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 ou mais aminoácidos no comprimento compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade ou epítopo de um polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da presente invenção. Além disso, outras porções biologicamente ativas, em que outras regiões do polipeptídeo são deletadas, podem ser preparadas pelas técnicas recombinantes e avaliadas quanto a uma ou mais das atividades aqui descritas.
A manipulação da molécula de ácido nucleico da invenção ou da molécula de ácido nucleico usada no método da invenção pode resultar na produção de uma proteína tendo essencialmente a atividade dos polipeptídeos como indicados na Tabela II, coluna 3 mas tendo diferenças na seqüência da dita proteína do tipo selvagem. Estas proteínas podem ser melhoradas em eficiência ou atividade, podem estar presentes em maiores números na célula do que é usual ou podem ser diminuídos em eficiência ou atividade em relação à proteína tipo selvagem.
Qualquer estratégia de mutagênese para o polipeptídeo da presente invenção ou o polipeptídeo usado no processo da presente invenção para resultar em aumento da dita atividade não são intencionados a serem limitantes; variações destas estratégias estarão facilmente evidentes a uma pessoa habilitada na técnica. Usando tais estratégias e incorporando os mecanismos aqui divulgados, a molécula de ácido nucleico e polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção pode ser utilizada para gerar plantas ou partes destas, que expressem uma ou mais proteínas do tipo selvagem ou uma ou mais proteína mutada que codifica molécula(s) de ácido nucleico ou molécula(s) de polipeptídeo da invenção tal que o rendimento, produção e/ou eficiência de produção de um composto desejado seja melhorados.
Este composto desejado pode ser qualquer produto natural de plantas, que inclui os produtos finais dos caminhos da biossíntese e intermediários de caminhos metabólicos que ocorrem naturalmente, assim como moléculas que não ocorrem naturalmente no metabolismo das ditas células, mas que são produzidos por uma das ditas células da invenção. Preferivelmente, o composto é uma composição que compreende nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio.
A invenção também fornece proteínas quiméricas ou de fusão.
Como aqui usado, uma "proteína quimérica" ou "proteína de fusão" compreende um polipeptídeo operativamente ligado a um polipeptídeo que não confere a atividade mencionada acima, em particular, que não confere um aumento do teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em uma célula ou um organismo ou uma parte deste, se a sua atividade é aumentada.
Em uma forma de realização, uma referência a uma "proteína (= polipeptídeo) da invenção" ou como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 referem-se a um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido correspondente ao polipeptídeo da invenção ou usado no processo da invenção, ao passo que um "não polipeptídeo da invenção" ou "outro polipeptídeo" que não esteja indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 refere-se a um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido correspondente a uma proteína que não é substancialmente homóloga a um polipeptídeo da invenção, preferivelmente que não é substancialmente homóloga a um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 por exemplo, uma proteína que não confere a atividade aqui descrita ou anotada ou conhecida como indicado na Tabela II, coluna 3 e que é derivada do mesmo ou de um organismo diferente. Em uma forma de realização, um "não polipeptídeo da invenção" ou "outro polipeptídeo" que não esteja indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 não conferem um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou parte deste.
Dentro da proteína de fusão, o termo "operativamente ligado" é intencionado a indicar que o polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo usado no processo da invenção e o "outro polipeptídeo" ou uma parte deste são fundidos entre si de modo que ambas as seqüências satisfaçam a função proposta dependente da seqüência usada. O "outro polipeptídeo" pode ser fundido ao terminal N ou terminal C do polipeptídeo da invenção ou usado no processo da invenção. Por exemplo, em uma forma de realização a proteína de fusão é uma proteína de fusão de GST-LMRP em que as seqüências do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no processo da invenção são fundidas ao terminal C da seqüência de GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação de polipeptídeos recombinantes da invenção ou um polipeptídeo útil no processo da invenção.
Em uma outra forma de realização, a proteína de fusão é um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo usado no processo da invenção contendo uma seqüência de sinal heteróloga no seu terminal N. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamífero), a expressão e/ou secreção de um polipeptídeo da invenção ou de um polipeptídeo usado no processo da invenção pode ser aumentada através do uso de uma seqüência de sinal heteróloga. Como já mencionado acima, seqüências alvejadoras, são requeridas para alvejar o produto de gene no compartimento celular específico (para uma revisão, ver Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 e faz alusão ao citado neste ponto), por exemplo no vacúolo, no núcleo, todos os tipos de plastídeos, tais como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, o espaço extracelular, a mitocôndria, o retículo endoplasmático, elaioplastos, peroxissomas, glicossomas e outros compartimentos de células ou extracelulares. As seqüências, que devem ser mencionadas neste contexto são, em particular, as seqüências codificadoras de peptídeo de sinal ou peptídeo de trânsito que são conhecidas por si. Por exemplo, as seqüências que codificam plastídeo- peptídeo de trânsito possibilitam o alvejamento do produto de expressão nos plastídeos de uma célula vegetal. As seqüências alvejadoras também são conhecidas para organismos eucarióticos e a um grau mais baixo para procarióticos e podem ser de modo vantajoso operavelmente ligadas com a molécula de ácido nucleico da presente invenção para se obter uma expressão em um dos ditos compartimentos ou extracelularmente. Portanto em uma forma de realização preferida o polipeptídeo da invenção, especificamente o polipeptídeo abrange uma seqüência como mostrada na tabela II coluna 5 ou 7 estão em "ligação operativa" com uma seqüência de alvejamento plastídica, resultando em uma proteína de fusão funcional, que é capaz de direcionar a proteína de fusão ao compartimento plastídico e que medeia a importação do polipeptídeo da invenção, especificamente o polipeptídeo abrange uma seqüência como mostrada na tabela II, coluna 5 ou 7, no compartimento plastídico.
Preferivelmente, uma proteína quimérica ou de fusão da invenção é produzida pelas técnicas de DNA recombinante padrão. Por exemplo, fragmentos de DNA que codificam as seqüências de polipeptídeo diferentes são ligados juntos na matriz de acordo com técnicas convencionais, por exemplo pela utilização de terminais de extremidade abrupta ou de extremidade escalonada para a ligação, digestão com enzima de restrição para fornecer os terminais apropriados, preenchimento de extremidades coesivas como apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar uniões indesejáveis e ligação enzimática. O gene de fusão pode ser sintetizado pelas técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a amplificação pela PCR de fragmentos de gene pode ser realizada usando iniciadores âncora, que dá origem às projeções complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem ser subseqüentemente recozidos e reamplificados para gerar uma seqüência de gene quimérico (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et ai John Wiley & Sons: 1992). Além disso, muitos vetores de expressão são comercialmente disponíveis que já codificam uma porção de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). A molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção pode ser clonada em um tal vetor de expressão tal que a porção de fusão é ligada na matriz à proteína codificada.
Além disso, simulações de desdobramento e remodelação computacional de motivos estruturais da proteína da invenção podem ser realizadas usando programas de computador apropriados (Olszewski, Proteins .25 (1996), 286-299; Hoffinan, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). A modelagem computadorizada de desdobramento de proteína pode ser usada para as análises conformacional e energética de modelos detalhados de peptídeo e proteína (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). Os programas apropriados podem ser usados para a identificação de sítios interativos do polipeptídeo da invenção ou polipeptídeos usados no processo da invenção e seus substratos ou fatores de ligação ou outras proteínas interventoras pelas pesquisas auxiliadas por computador para complementar seqüências de peptídeo (Fassina, Immunomethods (1994), 114-120). Outros sistemas de computador apropriados para o planejamento de proteína e peptídeos são descritos na técnica anterior, por exemplo em Berry, Biochem. Soe. Trans. 22 (1994), .1033-1036; Wodak, Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Os resultados obtidos a partir da análise de computador descrita acima podem ser usados, por exemplo, para a preparação de peptidomiméticos da proteína da invenção ou fragmentos deste. Tais análogos de pseudopeptídeo da seqüência de aminoácido natural da proteína podem muito eficientemente imitar a proteína precursora (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por exemplo, a incorporação de resíduos de aminoácido Q aquirais facilmente disponíveis em uma proteína da invenção ou um fragmento desta resulta na substituição de ligações de amida pelas unidades de polimetileno de uma cadeia alifática, fornecendo deste modo uma estratégia conveniente para a construção de um peptidomimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777).
Análogos peptidomiméticos superativos de hormônios peptídicos pequenos em outros sistemas são descritos na técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Os peptidomiméticos apropriados da proteína da presente invenção também podem ser identificados pela síntese de bibliotecas combinatórias peptidomiméticas através da alquilação de amida sucessiva e testando os compostos resultantes, por exemplo, quanto a sua ligação e propriedades imunológicas. Os métodos para a geração e uso de bibliotecas combinatórias peptidomiméticas são descritos na técnica anterior, por exemplo em Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 e Dorner, Bioorg. Med. Chem. .4(1996), 709-715.
Além disso, uma estrutura tridimensional e/ou cristalográfica da proteína da invenção pode ser usada para o planejamento de inibidores peptidomiméticos da atividade biológica da proteína da invenção (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).
Além disso, uma estrutura tridimensional e/ou cristalográfica da proteína da invenção e a identificação de sítios interativos do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção e seus substratos ou fatores de ligação pode ser usada para a identificação ou planejamento de mutantes com atividades de ligação ou metabolização moduladas. Por exemplo, o centro ativo do polipeptídeo da presente invenção pode ser modelado e resíduos de aminoácido que participam na reação catalítica podem ser modulados para aumentar ou diminuir a ligação do substrato para ativar ou melhorar o polipeptídeo. A identificação do centro ativo e dos aminoácidos envolvidos na reação catalítica facilita a triagem quanto a mutantes tendo uma atividade aumentada.
As seqüências aqui mostradas também foram descritas sob seus nomes de proteína como descrito nas Tabelas I, II, III ou IV, coluna 3.
Em uma forma de realização especialmente preferida, o polipeptídeo de acordo com a invenção além disso também não tem as seqüências destas proteínas que são codificadas pelas seqüências mostradas na Tabela II, coluna 5 ou 7.
Uma forma de realização da invenção também diz respeito a um anticorpo, que se liga especificamente ao polipeptídeo de acordo com a invenção ou partes, isto é, fragmentos específicos ou epítopos de uma tal proteína.
Os anticorpos da invenção podem ser usados para identificar e isolar o polipeptídeo de acordo com a invenção e genes codificadores em qualquer organismo, preferivelmente plantas, preparadas em plantas aqui descritas. Estes anticorpos podem ser anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais ou anticorpos sintéticos assim como fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab, Fv ou scFv etc. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados, por exemplo, pelas técnicas como originalmente descritas em Kõhler e Milstein, Nature 256 (1975), 495 e Galfró, Met. Enzymol. 73 (1981),3, que compreendem a fusão de células de mieloma de camundongo às células do baço derivadas de mamíferos imunizados.
Além disso, anticorpos ou fragmentos destes para os peptídeos anteriormente mencionados podem ser obtidos usando-se métodos, que são descritos, por exemplo, em Harlow e Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Estes anticorpos podem ser usados, por exemplo, para a imunoprecipitação e imunolocalização de proteínas de acordo com a invenção assim como para o monitoramento da síntese de tais proteínas, por exemplo, em organismos recombinantes e para a identificação de compostos que interagem com a proteína de acordo com a invenção. Por exemplo, a ressonância de plasma de superfície como utilizada no sistema BIAcore pode ser usada para aumentar a eficiência de seleções de anticorpos de fago, produzindo um alto incremento de afinidade de uma única biblioteca de anticorpos de fago, que se ligam a um epítopo da proteína da invenção (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Em muitos casos, os fenômenos de ligação de anticorpos aos antígenos são equivalentes a outra ligação de ligando/anti-ligando.
Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico de anti-sentido que compreende a seqüência complementar da molécula de ácido nucleico da presente invenção.
Métodos para modificar os níveis de expressão e/ou a atividade são conhecidos pelas pessoas habilitada na técnica e incluem por exemplo, a super expressão, co-supressão, o uso de ribozimas, estratégias de sentido e anti-sentido ou outros métodos de silenciamento de gene como a interferência de RNA (RNAi) ou metilação de promotor. "Filamento de sentido" refere-se ao filamento de uma molécula de DNA de filamento duplo que seja homólogo a um mRNA transcrito deste. O "filamento de anti- sentido" contém uma seqüência invertida, que é complementar àquela do "filamento de sentido". Além disso os níveis de expressão e/ou a atividade podem ser modificados pela introdução de mutações nas regiões reguladoras ou codificadoras dos ácidos nucleicos da invenção. Além disso anticorpos podem ser expressados que especificamente se ligam a um polipeptídeo de interesse e deste modo bloqueia a sua atividade. Os fatores de ligação de proteína também podem ser, por exemplo, aptâmeros [Famulok M e Mayer G (1999) Curr. Top Microbiol. Immunol. 243: 123-36] ou anticorpos ou fragmentos de anticorpo ou anticorpos de cadeia única. A obtenção destes fatores foi descrita e o técnico habilitado está familiarizado com isso. Por exemplo, um anticorpo scFv citoplasmático foi utilizado para modular a atividade da proteína de fitocromo A em plantas de tabaco geneticamente modificadas [Owen M et al. (1992) Biotechnology (NY) 10(7): 790-794; Franken E et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8(4): 411-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sei. 1: 286- .272]. Em uma outra forma de realização preferida da invenção o nível de expressão e/ou a atividade podem ser mudados através das modificações de reguladores internos. A pessoa habilitada na técnica está familiarizada com as diferente opções de reguladores internos que podem ser usados para modificar o nível de expressão dos genes ou proteínas da invenção. Em forma de realização exemplar um regulador transcricional negativo, por exemplo um repressor de um ácido nucleico da invenção é inibido ou silenciado, por exemplo através da inibição de anti-sentido ou RNAi, levando a uma expressão realçada do ácido nucleico da invenção. Similarmente um inibidor alostérico de uma proteína da invenção pode ser submetido à infrarregulagem pela mutação ou inibição de anti-sentido ou RNAi.
Uma molécula de ácido nucleico de "anti-sentido" compreende uma seqüência de nucleotídeo, que é complementar a uma molécula de ácido nucleico de "sentido" que codifica uma proteína, por exemplo, complementar ao filamento codificador de uma molécula de cDNA de filamento duplo ou complementar a uma seqüência de mRNA codificadora. Consequentemente, uma molécula de ácido nucleico de anti-sentido pode ligar-se por intermédio de ligações de hidrogênio a uma molécula de ácido nucleico de sentido. A molécula de ácido nucleico de anti-sentido pode ser complementar a um filamento codificador inteiro de uma molécula de ácido nucleico que confere a regulagem ou expressão do polipeptídeo da invenção ou usado no processo da presente invenção, como o filamento codificador da molécula de ácido nucleico da invenção ou da molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou apenas a uma porção destas.
Uma outra forma de realização da invenção também diz respeito a um método para a geração de um hospedeiro ou célula hospedeira transgênicos, por exemplo uma célula eucariótica ou procariótica, preferivelmente um microorganismo transgênico, uma célula de planta transgênica ou um tecido de planta transgênica ou uma planta transgênica, que compreende a introdução, na planta, na célula vegetal ou no tecido vegetal, da construção de ácido nucleico de acordo com a invenção, do vetor de acordo com a invenção ou da molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção.
Uma outra forma de realização da invenção também diz respeito a um método para a geração transitória de um hospedeiro ou célula hospedeira, célula eucariótica ou procariótica, preferivelmente um microorganismo transgênico, uma célula de planta transgênica ou um tecido de planta transgênica ou uma planta transgênica, que compreende a introdução, na planta, na célula vegetal ou no tecido vegetal, da construção de ácido nucleico de acordo com a invenção, do vetor de acordo com a invenção, da molécula de ácido nucleico aqui caracterizada como estando contida na construção de ácido nucleico da invenção ou na molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, por meio do qual as moléculas de ácido nucleico, construção de ácido nucleico e/ou vetor introduzidos não são integrados no genoma do hospedeiro ou célula hospedeira. Portanto os transformantes não são estáveis durante a propagação do hospedeiro com respeito às moléculas de ácido nucleico, construção de ácido nucleico e/ou vetor introduzidos.
No processo de acordo com a invenção, organismos transgênicos também devem ser entendidos como significativos - se eles tomam a forma de plantas - de células vegetais, tecidos vegetais, órgãos vegetais tais como raiz, broto, haste, semente, flor, tubérculo ou folha ou plantas intactas que são cultivadas para assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados.
Cultivar deve ser entendido como significativo por exemplo de cultivar as células de planta, tecido vegetal ou órgãos de planta transgênicos no ou em um meio nutriente ou a planta intacta no ou em um substrato, por exemplo em cultura hidropônica, composto de vaso ou em um solo de campo. Em uma forma de realização específica cultivar diz respeito ao crescimento das plantas transgênicas, célula vegetais, tecido vegetal sob condições limitadas de nitrogênio.
Em uma outra forma de realização vantajosa do processo, as moléculas de ácido nucleico podem ser expressadas em células vegetais de célula única (tal como algas), ver Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 e faz alusão ao citado neste ponto e células vegetais de plantas superiores (por exemplo espermatófitos tais como de safras). Os exemplos de vetores de expressão vegetal abrangem aqueles que são descritos aqui em detalhes ou em: Becker, D. [(1992) Plant Mol. Biol. 20: .1195-1197] e Bevan, M. W. [(1984), Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. .15-38]. Um resumo de vetores binários e seu uso também é encontrada em Hellens, R. [(2000), Trends in Plant Science, Vol. 5 Ns 10, 446-451.
Em uma forma de realização da invenção, vetores de expressão vegetal abrangem aqueles que são descritos nas figuras: Fig. 1 e/ou Fig- 2. DNA vetorial pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas por intermédio de técnicas de transformação ou transfecção convencionais. Os termos "transformação" e "transfecção" incluem conjugação e transdução e, como usado no presente contexto, são intencionados a abranger uma multiplicidade de métodos da técnica anterior para a introdução de moléculas de ácido nucleico estranhas (por exemplo DNA) em uma célula hospedeira, incluindo coprecipitação com fosfato de cálcio ou coprecipitação com cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por PEG, lipofecção, competência natural, transferência quimicamente mediada, eletroporação ou bombardeamento de partícula. Os métodos adequados para a transformação ou transfecção de células hospedeiras, incluindo células vegetais, podem ser encontradas em Sambrook et ai (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, .2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e em outros manuais de laboratório tais como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed.: Gartland e Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Os métodos descritos acima para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais são explorados para a transformação transitória ou estável de plantas. Os métodos adequados são a transformação de protoplastos pela captação de DNA induzida pelo polietileno glicol, o método biolístico com a pistola de gene - conhecido como o método do bombardeamento de partícula -, eletroporação, a incubação de embriões secos em solução contendo DNA, microinjeção e a transferência de gene mediada por Agrobacterium. Os métodos supra citados são descritos por exemplo em B. Jenes, Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225. A construção a ser expressada é preferivelmente clonada em um vetor, que é adequado para a transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo pBinl9 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobactérias transformadas com um tal vetor podem ser depois usadas de maneira conhecida para a transformação de plantas, em particular plantas de safra, tais como, por exemplo, plantas de tabaco, por exemplo banhando-se as folhas ou segmentos de folha escarificadas em uma solução agrobacteriana e subseqüentemente cultivando- as em meios adequados. A transformação de plantas com Agrobaeterium tumefaeiens é descrita por exemplo por Hõfgen e Willmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou conhecida, inter alia, de F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. .15-38.
Para selecionar quanto a transferência bem sucedida da molécula de ácido nucleico, vetor ou construção de ácido nucleico da invenção de acordo com a invenção em um organismo hospedeiro, é vantajoso usar genes marcadores como já foi descrito em detalhes acima. E conhecido da integração estável ou transitória de ácidos nucleicos em células vegetais que apenas uma minoria das células absorvem o DNA estranho e, se desejado, o integra no seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada. Para identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (como descrito acima, por exemplo resistência aos antibióticos) é usualmente introduzida nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos em plantas compreendem aqueles, que conferem resistência a um herbicida tal como glifosato ou glifosinato. Outros marcadores adequados são, por exemplo, marcadores, que codificam genes envolvidos nos caminhos biossintéticos, por exemplo, de açúcares ou aminoácidos, tais como β-galactosidase, ura3, ilv2 ou um gene da aceto-hidroxiácido sintase (AHAS) mutado, também conhecido como gene da acetolactato sintase (ALS) ou um gene para uma enzima metabolizadora de D-aminoácido. Marcadores, que codificam genes tais como luciferase, gfp ou outros genes de fluorescência, são do mesmo modo adequados. Marcadores adicionais chamados na literatura algumas vezes como marcadores secundários, genes que codificam a resistência mais uma vez contra herbicidas tal como fosfinotricina (= glifosinato, BASTA®, Liberty®, codificados pelo gene bar), glifosato (= N- (fosfonometil)glicina, Roundup Ready®, codificado pelo gene da 5- enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase = epsps), sulfoniluréia (= Staple®, codificada pelo gene da acetolactato sintase), imidazolinona [= EMI, imazetapir, imazamox, Clearfield®, codificada pelo gene da aceto- hidroxiácido sintase (AHAS), também conhecido como gene da acetolactato sintase (ALS)] ou bromoxinil (= Buctril®, codificado pelo gene oxy) ou genes que codificam antibióticos tais como higromicina ou G418 são úteis para a seleção. Além disso marcadores de seleção negativos tais como a citosina desaminase bacteriana (codificada pelo gene codA) também são úteis para a transformação de plastídeos.
Estes marcadores e os marcadores anteriormente mencionados podem ser usados em mutantes nos quais estes genes não são funcionais visto que, por exemplo, eles foram deletados por métodos convencionais. Além disso, as moléculas de ácido nucleico, que codificam um marcador selecionável, podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesma vetor como aqueles, que codificam os polipeptídeos da invenção ou usados no processo ou mesmo em um vetor separado. As células que foram estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por exemplo pela seleção (por exemplo, células que têm integrado o marcador selecionável sobrevivem ao passo que as outras células morrem).
Visto que os genes marcadores, como uma regra especificamente o gene para a resistência aos antibióticos e herbicidas, não são mais requeridos ou são indesejados na célula hospedeira transgênica uma vez que os ácidos nucleicos foram introduzidos com êxito, o processo de acordo com a invenção para a introdução dos ácidos nucleicos vantajosamente utiliza técnicas que possibilitam a remoção ou excisão, destes genes marcadores. Um tal método é o que é conhecido como cotransformação. O método de cotransformação utiliza dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor que carrega o ácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo que carrega o(s) gene(s) marcador(es). Uma grande proporção de transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até .40% dos transformantes e acima), ambos vetores. No caso de transformação com Ãgrobacteria, os transformantes usualmente recebem apenas uma parte do vetor, a seqüência flanqueada pelo T-DNA, que usualmente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subseqüentemente removidos da planta transformada realizando-se cruzamentos. Em um outro método, os genes marcadores integrados em um transposon são usados para a transformação junto com o ácido nucleico desejado (conhecido como a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes podem ser criados com um recurso de transposase ou os transformantes são transformados com uma construção de ácido nucleico que confere expressão de uma transposase, transitória ou estavelmente. Em alguns casos (aprox. 10%), o transposon pula do genoma da célula hospedeira uma vez que transformação tenha ocorrido com êxito e é perdido. Em vários casos, o transposon pula para uma localização diferente. Nestes casos, o gene marcador deve ser eliminado realizando-se cruzamentos. Em microbiologia, técnicas foram desenvolvidas que tornam possível ou facilitam, a detecção de tais eventos. Um outro método vantajoso conta com o que é conhecido como sistemas de recombinação, cuja vantagem é que a eliminação pelo cruzamento pode ser dispensado. O sistema melhor conhecido deste tipo é o que é conhecido como o sistema Cre/lox. Crel é uma recombinase, que remove as seqüências localizadas entre as seqüências IoxP- Se o gene marcador é integrado entre as seqüências IoxP, este é removido, uma vez que a transformação tenha ocorrido com êxito, pela expressão da recombinase. Outros sistemas de recombinação são o sistema HIN/HIX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255- .22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Uma integração específica de sítio no genoma da planta das seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção é possível. Naturalmente, estes métodos também podem ser aplicados aos microorganismos tais como levedura, fungos ou bactérias.
As agrobactérias transformadas com um vetor de expressão de acordo com a invenção também podem ser usadas na maneira conhecida por si para a transformação de plantas tais como plantas experimentais como Arabidopsis ou plantas de safra, tais como, por exemplo, cereais, milho, aveia, centeio, cevada, trigo, soja, arroz, algodão, beterraba açucareira, canola, girassol, linho, cânhamo, batata, tabaco, tomate, cenoura, pimentão sino, colza, tapioca, mandioca, araruta, tagetes, alfafa, alface e as várias árvores, nozes e espécies de videira, em particular plantas de safra contendo óleo tais como soja, amendoim, planta da mamona, girassol, milho, algodão, linho, colza, algodão, coco, dendê, cártamo (<Carthamus tinctorius) ou cacau, por exemplo banhando-se folhas ou segmentos de folhas escarificados em uma solução agrobacteriana e subseqüentemente cultivando-as em meios adequados.
Além das transformação de células somáticas, que depois têm que ser regeneradas em plantas intactas, também é possível transformar as células de meristemas vegetais e em particular aquelas células que desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimento da planta natural, dando origem às plantas transgênicas. Assim, por exemplo, sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobactérias e sementes são obtidas das plantas em desenvolvimento da qual uma certa proporção é transformada e assim transgênica (Feldman, KA e Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208: 274-289; Feldmann K (1992). Em: C Koncz, N- H Chua e J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapura, pp. 274-289). Os métodos alternativos são fundamentados na remoção repetida das influorescências e incubação do sítio de excisão no centro da roseta com agrobactérias transformadas, por meio dos quais as sementes transformadas do mesmo modo podem ser obtidas em um ponto posterior no tempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Entretanto, um método especialmente eficaz é o método da infiltração a vácuo com as suas modificações tais como o método da "imersão floral". No caso de infiltração a vácuo de Arabidopsis, plantas intactas sob pressão reduzida são tratadas com uma suspensão agrobacteriana (Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sei, 316: 1194-1199), enquanto no caso do método da "imersão floral" o tecido floral em desenvolvimento é incubado ligeiramente com uma suspensão agrobacteriana tratada com tensoativo (Clough, SJ und Bent, AF (1998). The Plant J. 16, .735-743). Uma certa proporção de sementes transgênicas são colhidas em ambos os casos e estas sementes podem ser distinguidas de sementes não transgênicas cultivando-se sob as condições selecionativas descritas acima. Além disso a transformação estável de plastídeos é de vantagem porque os plastídeos são herdados maternalmente na maioria das safras reduzindo ou eliminando o risco de fluxo de transgene através do pólen. A transformação do genoma de cloroplasto é no geral obtida por um processo, que foi esquematicamente demonstrado em Klaus et al., 2004 (Nature Biotechnology .22(2), 225-229). Em resumo as seqüências a serem transformadas são clonadas junto com um gene marcador selecionável entre seqüências homólogas flanqueadoras ao genoma de cloroplasto. Estas seqüências flanqueadoras homólogas direcionam a integração específica de sítio no plastoma. A transformação plastídica foi descrita para muitas espécies de planta diferentes e Um resumo pode ser tirada de Bock (2001) Transgenic plastides in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 21 de Set de .2001; 312 (3): 425-38 ou Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastide transformation technology. Trends Biotechnol. .21, 20-28. Outro progresso biotecnológico foi recentemente relatado na forma de transformantes plastídico isentos de marcador, que podem ser produzidos por um gene marcador co-integrado transitório (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225-229).
As células vegetais geneticamente modificadas podem ser regeneradas por intermédio de todos os métodos com que o técnico habilitado está familiarizado. Os métodos adequados podem ser descobertos nas publicações supra citadas por S. D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hõfgen e Willmitzer.
Consequentemente, a presente invenção assim também diz respeito a uma célula vegetal que compreende a construção de ácido nucleico de acordo com a invenção, a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção.
Consequentemente a presente invenção diz respeito a qualquer célula transgênica para qualquer ácido nucleico caracterizado como parte da invenção, por exemplo que confere o aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em uma célula ou um organismo ou uma parte deste, por exemplo a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção, a construção de ácido nucleico da invenção, a molécula de anti-sentido da invenção, o vetor da invenção ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção, por exemplo o polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7. Devido à atividade mencionada acima o teor de nitrogênio ou de composto contendo nitrogênio em uma célula ou um organismo é aumentado. Por exemplo, devido à modulação ou manipulação, a atividade celular do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção ou da molécula de ácido nucleico da invenção ou da molécula de ácido nucleico usada no método da invenção são aumentadas, por exemplo devido a uma expressão ou atividade específica aumentadas do assunto objeto da invenção em uma célula ou um organismo ou uma parte deste. Em uma forma de realização, transgênica para um polipeptídeo tendo uma atividade de um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 significa aqui que devido à modulação ou manipulação do genoma, uma atividade como anotada para um polipeptídeo como indicado na Tabela II, coluna 3, por exemplo tendo uma seqüência como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 é aumentada em uma célula ou um organismo ou uma parte deste. Os exemplos são descritos acima no contexto com o processo da invenção.
"Transgênica", por exemplo com respeito a uma molécula de ácido nucleico, uma construção de ácido nucleico ou um vetor que compreende a dita molécula de ácido nucleico ou um organismo transformado com a dita molécula de ácido nucleico, construção de ácido nucleico ou vetor, refere-se a todos aqueles objetos que se originam pelos métodos recombinantes em que
a) a seqüência de ácido nucleico ou
b) uma seqüência de controle genético operavelmente ligado à seqüência de ácido nucleico, por exemplo um promotor, ou
c) (a) e (b) não estão localizados no seu ambiente genético natural ou foi modificado pelos métodos recombinantes, um exemplo de uma modificação sendo uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. Ambiente genético natural refere-se ao local cromossômico natural no organismo de origem ou à presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da seqüência de ácido nucleico é preferivelmente retida, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a seqüência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem uma seqüência de pelo menos 50 pares de base, preferivelmente pelo menos 500 pares de base, de modo especialmente preferível pelo menos 1000 pares de base, de modo muito especialmente preferível pelo menos 5000 pares de base, no comprimento.
Um cassete de expressão que ocorre naturalmente - por exemplo a combinação que ocorre naturalmente de um promotor de um polipeptídeo da invenção com a seqüência codificadora de proteína correspondente - torna-se um cassete de expressão transgênico quando o mesmo é modificado por métodos não naturais, sintéticos "artificiais" tais como, por exemplo, mutagenização. Tais métodos foram descritos (US .5.565.350; WO 00/15815; também ver acima).
Além disso, a célula vegetal, tecido vegetal ou planta também podem ser transformados tal que outras enzimas e proteínas sejam (super)expressadas cuja expressão sustente um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio.
Entretanto, transgênica também significa que os ácidos nucleicos de acordo com a invenção estão localizados na sua posição natural no genoma de um organismo, mas que a seqüência foi modificada em comparação com a seqüência natural e/ou que as seqüências reguladoras das seqüências naturais foram modificadas. Preferivelmente, transgênica/ recombinante devem ser entendidos como significando que a transcrição dos ácidos nucleicos usados no processo de acordo com a invenção ocorre em uma posição não natural no genoma, isto quer dizer a expressão dos ácidos nucleicos é homóloga ou, preferivelmente, heteróloga. Esta expressão pode ser transitoriamente ou de uma seqüência estavelmente integrada no genoma.
O termo "plantas transgênicas" usado de acordo com a invenção também refere-se à progênie de uma planta transgênica, por exemplo as gerações de planta T1, T2, T3 e subsequentes ou as gerações de planta BCi, BC2, BC3 e subsequentes. Assim, as plantas transgênicas de acordo com a invenção podem ser elevadas e auto-polinizadas ou cruzadas com outros indivíduos de modo a obter outras plantas transgênicas de acordo com a invenção. As plantas transgênicas também podem ser obtidas propagando-se as células de planta transgênica vegetativamente. A presente invenção também diz respeito a material de planta transgênica, que pode ser derivada de uma população de planta transgênica de acordo com a invenção. Tal material inclui células vegetais e certos tecidos, órgãos e partes de plantas em todas as suas manifestações, tais como sementes, folhas, anteras, fibras, tubérculos, raízes, pelos de raiz, troncos, embrião, calos, cotilédones, pecíolos, material colhido, tecido vegetal, tecido reprodutivo e culturas de célula, que sejam derivados da planta transgênica real e/ou possam ser usados para realizar a planta transgênica.
Qualquer planta transformada obtida de acordo com a invenção pode ser usada em um esquema de cruzamento convencional ou em propagação de planta in vitro para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características e/ou pode ser usada para introduzir a mesma característica em outras variedades da mesma ou de espécies relacionadas. Tais plantas também são parte da invenção. Sementes obtidas das plantas geneticamente transformadas também contêm a mesma característica e são parte da invenção. Como mencionado antes, a presente invenção é em princípio aplicável a qualquer planta e safra que possam ser transformadas com qualquer um dos método de transformação conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
Em uma forma de realização especialmente preferida, o organismo, a célula hospedeira, célula vegetal, planta, microorganismo ou tecido vegetal de acordo com a invenção são transgênicos.
Consequentemente, a invenção portanto diz respeito a organismos transgênicos transformados com pelo menos uma molécula de ácido nucleico, construção de ácido nucleico ou vetor de acordo com a invenção e às células, culturas de célula, tecidos, partes - tais como, por exemplo, no caso de organismos vegetais, tecido vegetal, por exemplo folhas, raízes e outros - ou material de propagação derivado de tais organismos ou plantas intactas. Os termos "(hospedeiro) recombinante" e "(hospedeiro) transgênico" são usados intercambiavelmente neste contexto. Naturalmente, estes termos se referem não apenas ao organismo hospedeiro ou célula alvo em questão, mas também à progênie ou progênie potencial, destes organismos ou células. Visto que certas modificações possam ocorrer nas gerações subsequentes devido à mutação ou efeitos ambientais, tal progênie não é necessariamente idêntica com a célula precursora, mas ainda se situa dentro do escopo do termo como aqui usado.
Os organismos adequados para o processo de acordo com a invenção ou como hospedeiros são todos estes organismos eucarióticos ou procarióticos, que são capazes de acumular ou assimilar nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio respectivamente. Os organismos usados como hospedeiros são microorganismos, tais como bactérias, fungos, leveduras ou algas, animais não humanos ou plantas, tais como plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas.
Em princípio todas as plantas podem ser usadas como organismo hospedeiro, especialmente as plantas mencionadas acima como organismo fonte. As plantas transgênicas preferidas são, por exemplo, selecionadas das famílias Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaeeae, Fabaeeae, Malvaeeae, Nymphaeaeeae, Papaveraceae, Rosaeeae, Salieaeeae, Solanaeeae, Areeaeeae, Bromeliaeeae, Cyperaeeae, Iridaeeae, Liliaeeae, Orehidaeeae, Gentianaeeae, Labiaeeae, Magnoliaeeae, Ranunculae eae, Carifolaeeae, Rubiaeeae, Scrophulariaceae, Caryophillaeeae, Erieaeeae, Poligonaceae, Violaceae, Juncaceae ou Poaeeae e preferivelmente de uma planta selecionada do grupo das famílias Apiaeeae, Asteraeeae, Brassieaeeae, Cueurbitaeeae, Fabaceae, Papaveraeeae, Rosaeeae, Solanaeeae, Liliaeeae ou Poaeeae. Preferidas são as plantas de safra tais como plantas vantajosamente selecionadas do grupo do gênero amendoim, colza, canola, girassol, cártamo, oliva, gergelim, avelã, amêndoa, abacate, louro, abóbora, linhaça, soja, pistache, borragem, milho, trigo, centeio, aveia, sorgo e painço, triticale, arroz, cevada, mandioca, batata, beterraba açucareira, beringela, alfafa e gramas perenes e plantas forrageiras, dendê, vegetais (brassicas, vegetais de raiz, vegetais de tubérculos, vegetais de vagem, vegetais de fruta, vegetais de cebola, vegetais folhosos e vegetais de haste), trigo mouro, alcachofra de Jerusalem, feijão-fava, ervilhacas, lentilha, feijão anão, tremoços, trevo e Alfafa para mencionar apenas alguns deles.
As células vegetais, órgãos vegetais, tecidos vegetais ou partes preferidas de plantas originam-se do organismo fonte sob as famílias de planta mencionadas, preferivelmente dos gêneros de planta supra citados, mais preferido das espécies de plantas supra citadas.
Plantas transgênicas compreendendo o nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio, por exemplo os aminoácidos ou proteínas sintetizadas no processo de acordo com a invenção podem ser comercializadas diretamente sem isolação dos compostos sintetizados. No processo de acordo com a invenção, plantas são entendidas como significativas de todas as partes de planta, órgãos de planta tais como folhas, hastes, raiz, tubérculos ou sementes ou material de propagação ou material colhido ou a planta intacta. Neste contexto, a semente abrange todas as partes da semente tais como a cobertura da semente, células epidérmicas, células de semente, endosperma ou tecido embrionário. O nitrogênio acumulado ou assimilado no processo de acordo com a invenção, entretanto, também pode ser isolado da planta na forma de seus aminoácidos livres ou ligados em proteínas. Os aminoácidos produzidos por este processo podem ser colhidos colhendo-se os organismos da cultura em que eles crescem ou do campo. Isto pode ser feito por intermédio da expressão, trituração e/ou extração, precipitação salina e/ou cromatografia de troca iônica das partes de planta, preferivelmente das sementes de planta, frutas de planta, tubérculos de planta e outros.
Já em um outro aspecto, a invenção também diz respeito a partes colhíveis e ao material de propagação das plantas transgênicas de acordo com a invenção que contêm células de planta transgênica que expressam uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção ou que contêm células que mostram uma atividade celular aumentada do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção, por exemplo um nível de expressão aumentado ou atividade superior da proteína descrita.
As partes colhíveis podem ser em princípio quaisquer partes úteis de uma planta, por exemplo, flores, pólen, mudas, tubérculos, folhas, troncos, frutas, sementes, raízes etc. O material de propagação inclui, por exemplo, sementes, frutas, cortes, mudas, tubérculos, rizomas etc. Preferidos são sementes, frutas, mudas ou tubérculos como material colhível ou de propagação.
A invenção além disso diz respeito ao uso dos organismos transgênicos de acordo com a invenção e das células, culturas de célula, partes - tais como, por exemplo, raízes, folhas e outras como mencionadas acima no caso de organismos vegetais transgênicos - derivados destes e ao material de propagação transgênico tal como sementes ou frutas e outros como mencionado acima, para a produção de gêneros alimentícios ou rações, produtos farmacêuticos ou produtos químicos finos, preferivelmente rações.
Consequentemente em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito ao uso da molécula de ácido nucleico, do organismo, por exemplo do microorganismo, da planta, célula vegetal ou tecido vegetal, do vetor ou do polipeptídeo da presente invenção para fabricar ácidos graxos, carotenóides, isoprenóides, vitaminas, lipídeos, ésteres cerosos, (poli)sacarídeos e/ou poliidroxialcanoatos e/ou seus produtos de metabolismo, em particular, hormônios de esteróide, colesterol, prostaglandina, triacilgliceróis, ácidos biliares e/ou corpos de cetona para produzir células, tecidos e/ou plantas. Existem vários mecanismos pelos quais o rendimento, produção e/ou eficiência de produção de ácidos graxos, carotenóides, isoprenóides, vitaminas, ésteres cerosos, lipídeos, (poli)sacarídeos e/ou poliidroxialcanoatos e/ou seus produtos de metabolismo, em particular, hormônios esteróides, colesterol, triacilgliceróis, prostaglandina, ácidos biliares e/ou corpos de cetona ou outros dos produtos químicos finos definidos acima que incorporam uma tal proteína alterada pode ser afetada. No caso de plantas, por exemplo aumentando-se a expressão de acetil-CoA que é a base para muitos produtos, por exemplo, ácidos graxos, carotenóides, isoprenóides, vitaminas, lipídeos, (poli)sacarídeos, ésteres cerosos e/ou poliidroxialcanoatos e/ou seus produtos de metabolismo, em particular, prostaglandina, hormônios de esteróide, colesterol, triacilgliceróis, ácidos biliares e/ou corpos de cetona em uma célula, pode ser possível aumentar a quantidade dos ditos compostos produzidos permitindo assim maior facilidade de colheita e purificação ou no caso de plantas particionamento mais eficiente. Além disso, um ou mais dos ditos produtos de metabolismo, quantidades aumentadas dos co-fatores, moléculas precursoras e compostos intermediários para os caminhos biossintéticos apropriados podem ser requeridos. Portanto, aumentando-se o número e/ou atividade de proteínas transportadoras envolvidas na importação de nutrientes, tais como fontes de carbono (isto é, açúcares), fontes de nitrogênio (isto é, aminoácidos, sais de amônio), fosfato e enxofre, pode ser possível melhorar a produção de acetil CoA e seus produtos de metabolismo como mencionado acima, devido à remoção de quaisquer limitações do fornecimento de nutriente no processo biossintéticas. Em particular, pode ser possível aumentar o rendimento, produção e/ou eficiência de produção dos ditos compostos, por exemplo ácidos graxos, carotenóides, isoprenóides, vitaminas, ésteres cerosos, lipídeos, (poli)sacarídeos e/ou poliidroxialcanoatos e/ou seus produtos de metabolismo, em particular, hormônios de esteróide, colesterol, prostaglandina, triacilgliceróis, ácidos biliares e/ou moléculas de corpos de cetona etc. em plantas.
Os organismos, preferivelmente plantas da presente invenção mostra assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados mesmo sob condições de nitrogênio limitadas. Em conseqüência os organismos, preferivelmente plantas da presente invenção mostram também crescimento realçado, biomassa e/ou rendimento, preferivelmente sob condições de
nitrogênio limitadas.
Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a identificação de um produto de gene que confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo, que compreende as seguintes etapas:
contatar, por exemplo hibridizar, as moléculas de ácido nucleico de uma amostra, por exemplo células, tecidos, plantas ou microorganismos ou uma biblioteca de ácido nucleico, que pode conter um gene candidato que codifica um produto de gene que confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados depois da expressão, com a molécula de ácido nucleico da presente invenção;
identificar as moléculas de ácido nucleico, que hibridizam sob condições estringentes relaxadas com a molécula de ácido nucleico da presente invenção em particular a uma seqüência da molécula de ácido nucleico como indicado na Tabela I, colunas 5 ou 7, preferivelmente na Tabela I B, colunas 5 ou 7 e, opcionalmente, isolar o clone de cDNA de tamanho natural ou clone genômico completo; introduzir as moléculas de ácido nucleico candidatas em células hospedeiras, preferivelmente em uma célula vegetal ou um microorganismo, apropriados para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados;
a) que expressem as moléculas de ácido nucleico identificadas nas células hospedeiras;
b) ensaiar os níveis de assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados nas células hospedeiras; e
c) identificar a molécula de ácido nucleico e seu produto de gene cuja expressão confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados na célula hospedeira depois da expressão comparada com a do tipo selvagem.
As condições de hibridização relaxadas são: Depois dos procedimentos de hibridização padrão as etapas de lavagem podem ser realizadas em condições de severidade de baixa a média usualmente com condições de lavagem de 40° a 55°C e condições salinas entre 2x SSC e 0,2x SSC com 0,1% de SDS em comparação com as condições de lavagem estringentes como por exemplo 60° a 68°C com 0,1% de SDS. Outros exemplos podem ser encontrados nas referências listadas acima para as condições de hibridização estringentes. Usualmente as etapas de lavagem são repetidas com severidades e duração crescentes até que uma razão de sinal para ruído útil seja detectada e depende de muitos fatores como o alvo, por exemplo a sua pureza, teor de GC, tamanho etc, da sonda, por exemplo o seu comprimento, seja ela uma sonda de RNA ou uma de DNA, condições salinas, temperatura de lavagem ou hibridização, tempo de lavagem ou hibridização, etc.
Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a identificação de um produto de gene que confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em um organismo, que compreende as seguintes etapas:
identificar as moléculas de ácido nucleico de um organismo; que pode conter um gene candidato que codifica um produto de gene que confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados depois da expressão, que são pelo menos 20%, preferivelmente 25%, mais preferivelmente 30%, ainda mais preferidos são 35%. 40% ou 50%, ainda mais preferidos são 60%, 70% ou 80%, os mais preferidos são 90% ou 95% ou mais de homologia com a molécula de ácido nucleico da presente invenção, por exemplo por intermédio de pesquisa por homologia em um banco de dados;
introduzir as moléculas de ácido nucleico candidatas em células hospedeiras, preferivelmente em uma célula vegetal ou microorganismos, apropriados que realcem a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio;
a) expressando as moléculas de ácido nucleico identificadas nas células hospedeiras;
b) ensaiando o nível de assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados nas células hospedeiras; e
c) identificando a molécula de ácido nucleico e seu produto de gene cuja expressão confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados na célula hospedeira depois da expressão comparada com a do tipo selvagem.
Eventualmente produtos de gene que conferem o aumento na assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados também podem ser identificados de acordo com uma estrutura 3D idêntica ou similar na etapa
(a) e pelo método acima descrito.
As moléculas de ácido nucleico identificadas podem ser depois usadas para a produção de ou organismos com assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados do mesmo modo como a molécula de ácido nucleico da presente invenção.
Consequentemente, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um processo para o acúmulo ou produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente, que compreende (a) identificar uma molécula de ácido nucleico de acordo com as etapas (a) a (f) ou (a) a (e) anteriormente mencionadas e recuperar os compostos contendo nitrogênio livres ou ligados, especialmente proteínas, a partir de um organismo tendo uma atividade celular aumentada de um polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico isolada comparada com a de um tipo selvagem.
Além disso, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a identificação de um composto que estimule a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados na dita planta que compreende:
a) contatar células que expressam o polipeptídeo da presente invenção ou seu mRNA com um composto candidato sob condições de cultivo de célula;
b) ensaiar um aumento na expressão do dito polipeptídeo ou do dito mRNA;
c) comparar o nível de expressão a uma resposta padrão feita na ausência do dito composto candidato; por meio do qual, uma expressão aumentada em relação ao padrão indica que o composto é estimulador da assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados.
Além disso, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a triagem quanto a agonistas ou um antagonista da atividade do polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da presente invenção que compreende:
a) contatar células, tecidos, plantas ou microorganismos que expressem o polipeptídeo de acordo com a invenção com um composto candidato ou uma amostra que compreenda uma pluralidade de compostos sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da presente invenção;
b) ensaiar o nível de assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados ou o nível de expressão do polipeptídeo na célula, tecido, planta ou microorganismo ou no meio que a célula, tecido, planta ou microorganismos são cultivados ou mantidos; e
c) identificar um agonista ou antagonista comparando-se o nível de assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio medido ou nível de expressão do polipeptídeo da invenção ou usado na invenção com um nível de assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio ou nível de expressão polipeptídeo padrão medidos na ausência do dito composto candidato ou uma amostra que compreende a dita pluralidade de compostos, por meio do qual um nível aumentado em relação ao padrão indica que o composto ou a amostra que compreende a dita pluralidade de compostos é um agonista e um nível diminuído em relação ao padrão indica que o composto ou a amostra que compreende a dita pluralidade de compostos é um antagonista.
Além disso, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a processo para a identificação de um composto que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados em uma planta ou microorganismo, que compreende as etapas:
a) cultivar uma célula ou tecido ou microorganismo ou manter uma planta que expresse o polipeptídeo de acordo com a invenção ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo e um sistema de leitura capazes de interagir com o polipeptídeo sob condições adequadas que permitam a interação do polipeptídeo com o dito sistema de leitura na presença de um composto ou uma amostra que compreenda uma pluralidade de compostos e capazes de fornecer um sinal detectável em resposta à ligação de um composto ao dito polipeptídeo sob condições que permitam a expressão do dito sistema de leitura e do polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da invenção; e
b) identificar se o composto é um agonista eficaz detectando- se a presença ou ausência ou aumento de um sinal produzido pelo dito sistema de leitura.
A triagem quanto a um produto de gene ou um agonista que confira um aumento na produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio pode ser realizada pelo cultivo de um organismo por exemplo um microorganismo na presença de quantidades redutoras de crescimento de um inibidor do acúmulo ou síntese de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente. Melhor crescimento, por exemplo taxa de divisão mais alta ou massa seca alta em comparação com o controle sob tais condições pode identificar um gene ou produto de gene ou um agonista que confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados.
Pode-se pensar em triar quanto a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados por exemplo pesquisando-se uma resistência a um medicamento que bloqueie a síntese de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e observar se este efeito é dependente da atividade ou expressão de um polipeptídeo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 ou um homólogo deste, por exemplo comparar o fenótipo de organismos quase idênticos com atividades baixa e alta de uma proteína como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7 depois da incubação com o medicamento.
O dito composto pode ser quimicamente sintetizado ou microbiologicamente produzido e/ou compreendido, por exemplo, nas amostras, por exemplo, extratos de célula, por exemplo, de plantas, animais ou microorganismos, por exemplo patógenos. Além disso, o(s) dito(s) composto(s) pode(m) ser conhecido(s) na técnica mas até agora não conhecidos como sendo capazes de suprimir ou ativar o polipeptídeo da presente invenção. A mistura de reação pode ser um extrato isento de célula ou pode compreender uma cultura de célula ou tecido. Ajustes adequados para o método da invenção são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e são, por exemplo, no geral descritos em Alberts et ai, Molecular Biology of the Cell, terceira edição (1994), em particular Capítulo 17. Os compostos podem ser, por exemplo, adicionados à mistura de reação, meio de cultura, injetados na célula ou pulverizados sobre a planta.
Se uma amostra contendo um composto é identificada no método da invenção, depois é possível isolar o composto da amostra original identificada como contendo o composto capaz de ativar ou aumentar o teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou parte deste ou pode-se subdividir ainda a amostra original, por exemplo, se a mesma consiste de uma pluralidade de compostos diferentes, de modo a reduzir o número de substâncias diferentes por amostra e repetir o método com as subdivisões da amostra original. Dependendo da complexidade das amostras, as etapas descritas acima podem ser realizadas diversas vezes, preferivelmente até que a amostra identificada de acordo com o método da invenção apenas compreenda um número limitado de substâncias ou apenas uma substância. Preferivelmente a dita amostra compreende substâncias de propriedades químicas e/ou físicas similares e o mais preferivelmente as ditas substâncias são idênticas. Preferivelmente, o composto identificado de acordo com o método acima descrito ou seu derivado é formulado ainda em uma forma adequada para a aplicação na criação de planta ou cultura de célula e tecido vegetais.
Os compostos que podem ser testados e identificados de acordo com um método da invenção podem ser bibliotecas de expressão, por exemplo, bibliotecas de expressão de cDNA, peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, anticorpos, compostos orgânicos pequenos, hormônios, peptidomiméticos, PNAs ou coisa parecida (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193- .198 e faz alusão ao citado acima). Os ditos compostos também podem ser derivados funcionais ou análogos de inibidores ou ativadores conhecidos. Métodos para a preparação de derivados químicos e análogos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e são descritos, por exemplo, em Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer Edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, Nova Iorque, N.Y. 10010 U.S.A. e Organic Synthesis, Wiley, Nova Iorque, USA. Além disso, os ditos derivados e análogos podem ser testados quanto aos seus efeitos de acordo com métodos conhecidos na técnica. Além disso, peptidomiméticos e/ou modelos auxiliados por computador de derivados e análogos apropriados podem ser usados, por exemplo, de acordo com os métodos descritos acima. A célula ou tecido que podem ser utilizados no método da invenção preferivelmente são uma célula hospedeira, célula vegetal ou tecido vegetal da invenção descritos nas formas de realização mais acima.
Assim, em uma outra forma de realização a invenção diz respeito a um composto obtido ou identificado de acordo com o método para identificar um agonista da invenção o dito composto sendo um agonista do polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da presente invenção.
Consequentemente, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito ainda a um composto identificado pelo método para identificar um composto da presente invenção.
O dito composto é, por exemplo, um homólogo do polipeptídeo da presente invenção. Homólogos do polipeptídeo da presente invenção podem ser gerados pela mutagênese, por exemplo, mutação pontual separada ou truncagem do polipeptídeo da presente invenção. Como aqui usado, o termo "homólogo" refere-se a uma forma variante da proteína, que atua como um agonista da atividade do polipeptídeo da presente invenção. Um agonista da dita proteína pode reter substancialmente a mesma ou um subconjunto, das atividades biológicas do polipeptídeo da presente invenção. Em particular, o dito agonista confere o aumento do nível de expressão do polipeptídeo da presente invenção e/ou a expressão do dito agonista em um organismo ou parte deste confere a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados no organismo ou parte deste.
Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo que reconhece especificamente o composto ou agonista da presente invenção.
A invenção também diz respeito a uma composição de diagnóstico que compreende pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico, vetores, proteínas, anticorpos ou compostos da invenção anteriormente mencionados e opcionalmente meios adequados para a detecção.
A composição de diagnóstico da presente invenção é adequada para a isolação de mRNA de uma célula e contatar o mRNA assim obtido com uma sonda que compreende uma sonda de ácido nucleico como descrita acima sob condições de hibridização, detectar a presença de mRNA hibridizado à sonda e por meio deste detectar a expressão da proteína na célula. Outros métodos de detectar a presença de uma proteína de acordo com a presente invenção compreende imunotécnicas bem conhecidas no ramo, por exemplo ensaio imunossorvente ligado à enzima. Além disso, é possível usar as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção como marcadores moleculares ou iniciador na criação de planta. Meios adequados para a detecção são bem conhecidos a uma pessoa habilitada no ramo, por exemplo tampões e soluções para ensaios de hidridização, por exemplo as soluções e tampões anteriormente mencionados, além disso e meios para as Southern-, Western-, Northern- etc. -blots, como por exemplo descrito em Sambrook et ai. são conhecidos.
Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um kit que compreende a molécula de ácido nucleico, o vetor, a célula hospedeira, o polipeptídeo, o ácido nucleico de anti-sentido, o anticorpo, célula vegetal, a planta ou tecido vegetal, a parte colhível, o material de propagação e/ou o composto ou agonista ou antagonistas identificados de acordo com o método da invenção.
Os compostos do kit da presente invenção podem ser embalados em recipientes tais como frascos, opcionalmente com/em tampões e/ou solução. Se apropriado, um ou mais dos ditos componentes podem ser embalados em um e no mesmo recipiente. Adicional ou alternativamente, um ou mais dos ditos componentes podem ser absorvidos em um suporte sólido como, por exemplo um filtro de nitrocelulose, uma placa de vidro, um chip ou uma membrana de náilon ou ao reservatório de uma micro placa tituladora. O kit pode ser usado para qualquer um dos métodos e formas de realização aqui descritos, por exemplo para a produção das células hospedeiras, plantas transgênicas, composições farmacêuticas, detecção de seqüências homólogas, identificação de antagonistas ou agonistas, como alimento ou ração ou como um suplemento destes, como suplemento para o tratamento de plantas, etc.
Além disso, o kit pode compreender instruções para o uso do kit para qualquer uma das ditas formas de realização, em particular para o uso para produzir organismos ou parte destes tendo assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados.
Em uma forma de realização o dito kit compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica uma ou mais da proteína anteriormente mencionada e/ou um anticorpo, um vetor, uma célula hospedeira, um ácido nucleico de anti-sentido, uma célula vegetal ou tecido vegetal ou uma planta.
Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a produção de uma composição agrícola que fornece a molécula de ácido nucleico, o vetor ou o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção ou que compreende as etapas do método de acordo com a invenção para a identificação do dito composto, agonista ou antagonista; e formular a molécula de ácido nucleico, o vetor ou o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção ou o agonista ou composto identificados de acordo com os métodos ou processos da presente invenção ou com o uso do matéria objeto da presente invenção em uma forma aplicável como composição agrícola vegetal.
Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a produção de uma composição de cultura vegetal que sustenta a produção de "composto contendo nitrogênio" que compreende as etapas do método da presente invenção; e formular o composto identificado em uma forma aceitável como composição agrícola.
Sob "aceitável como composição agrícola" é entendido, que uma tal composição está de acordo com as leis que regulam o teor de fungicidas, nutrientes de planta, herbicidas, etc. Preferivelmente uma tal composição é sem qualquer dano para as plantas protegidas e para os animais (seres humanos incluídos) alimentados com isso.
A presente invenção também diz respeito a diversas formas de realização que dizem respeito a outros usos e métodos. A molécula de ácido nucleico, polipeptídeo, homólogos de proteína, proteínas de fusão, iniciadores, vetores, células hospedeiras, aqui descritos podem ser usados em um ou mais dos seguintes métodos: identificação de plantas úteis para a produção de nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio como mencionado e organismos relacionados; mapeamento de genomas; identificação e localização de seqüências de interesse; estudos evolucionários; determinação das regiões requeridas para a função; modulação de uma atividade.
As moléculas de ácido nucleico da presente invenção têm uma variedade de usos. Primeiro, estas podem ser usadas para identificar um organismo ou um parente próximo deste. Também, estas podem ser usadas para identificar a presença deste ou um parente deste em uma população misturada de microorganismos ou plantas. Sondando-se o DNA genômico extraído de uma cultura de uma população única ou misturada de plantas sob condições estringentes com uma sonda que transpõem uma região do gene da presente invenção que é única para isto, pode-se averiguar se a presente invenção foi usada ou se o mesmo ou um parente próximo está presente.
Além disso, a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção pode ser suficientemente homóloga às seqüências de espécies relacionadas tal que estas moléculas de ácido nucleico possam servir como marcadores para a construção de um mapa genômico no organismo relacionado.
Consequentemente, a presente invenção diz respeito a um método para cruzar plantas com assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados, que compreende
(a) fornecer uma primeira variedade de planta produzida de acordo com o processo da invenção preferivelmente que (super)expressem a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção;
(b cruzar a primeira variedade de planta com uma segunda variedade de planta; e selecionar as plantas descendentes que super-acumulam nitrogênio ou super-produz compostos contendo nitrogênio por meio da análise a distribuição de um marcador molecular no descendente que representa a primeira variedade de planta e a sua capacidade para (super)acumular nitrogênio ou (super)produzir compostos contendo nitrogênio.
Além disso, a molécula de ácido nucleico aqui divulgada, em particular a molécula de ácido nucleico mostrada na coluna 5 ou 7 da Tabela I A ou B, pode ser suficientemente homóloga às seqüências de espécies relacionadas tal que estas moléculas de ácido nucleico possam servir como marcadores para a construção de um mapa genômico no organismo relacionado ou para o mapeamento de associação. Além disso a variação natural nas regiões genômicas correspondentes aos ácidos nucleicos aqui divulgados, em particular a molécula de ácido nucleico mostrada na coluna 5 ou 7 da Tabela I A ou B ou homóloga desta pode levar à variação na atividade das proteínas aqui divulgadas, em particular as proteínas que compreendem polipeptídeos como mostrados nas colunas 5 ou 7 da Tabela II A ou B ou que compreende a seqüência de consenso ou o motivo de polipeptídeo como mostrado nas colunas 7 da Tabela IV e seus homólogos e em conseqüência em variação natural na produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio. Em conseqüência a variação natural eventualmente também existe na forma de variantes alélicas mais ativas levando já a um aumento relativo na produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio. Variantes diferentes da molécula de ácidos nucleicos aqui divulgada, em particular do ácido nucleico que compreende a molécula de ácido nucleico como mostrada na coluna 5 ou 7 da Tabela I A ou B, que corresponde aos níveis de produção diferentes de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio podem ser identificadas e usadas para a criação auxiliada por marcador para aumentar a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio.
Consequentemente, a presente invenção diz respeito a um método para criar plantas quanto a produção aumentada de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio, que compreende
a) selecionar uma primeira variedade de planta com produção de nitrogênio aumentada ou de compostos contendo nitrogênio com base na expressão aumentada de um ácido nucleico da invenção como aqui divulgado, em particular de uma molécula de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico como mostrada nas colunas 5 ou 7 da Tabela I A ou B ou um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo como mostrado nas colunas 5 ou 7 da Tabela II A ou B ou que compreende uma seqüência de consenso ou um motivo de polipeptídeo como mostrado nas colunas 7 da Tabela IV ou um homólogo deste como aqui descrita;
b) associar o nível de produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio com o nível de expressão ou a estrutura genômica de um gene que codifica o dito polipeptídeo ou a dita molécula de ácido nucleico;
c) cruzar a primeira variedade de planta com uma segunda variedade de planta, que significantemente difere no seu nível de produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e
d) identificar, quais das variedades descendentes aumentou o nível de produção para nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio pelo nível de expressão do dito polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico ou a estrutura genômica dos genes que codificam o dito polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico da invenção.
Em uma forma de realização, o nível de expressão do gene de acordo com etapa (b) é aumentado
Detalhes a cerca do uso de marcadores moleculares na criação podem ser encontrado em Kumar et al, 1999 (Biotech Adv., 17: 143-182) e Peleman e van der Voort 2003 (Trends Plant Sei. Jul de 2003; 8(7): 330-334)
O marcador molecular pode por exemplo dizer respeito à molécula de ácido nucleico da invenção ou à molécula de ácido nucleico usada no método da invenção e/ou seu nível de expressão. Consequentemente, o marcador molecular pode ser uma sonda ou um conjunto iniciador de PCR útil para a identificação da existência genômica ou localização genômica da molécula de ácido nucleico da invenção ou da molécula de ácido nucleico usada no método da invenção, por exemplo em uma análise de Southern blot ou uma PCR ou seu nível de expressão, por exemplo, em uma análise de
Northern Blot ou uma PCR quantitativa.
Consequentemente, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito ao uso da molécula de ácido nucleico da presente invenção ou que codifica o polipeptídeo da presente invenção como marcador molecular para a criação, especialmente para a criação para uma produção alta ou baixa do respectivo produto químico fino.
As moléculas de ácido nucleico da invenção também são úteis para estudos evolucionários e estruturais da proteína. Comparando-se as seqüências da invenção ou usadas no processo da invenção com aquelas que codificam enzimas similares de outros organismos, a relacionabilidade evolucionária dos organismos pode ser avaliada. Similarmente, uma tal comparação permite que uma avaliação de quais regiões da seqüência são conservadas e quais não o são, o que pode ajudar na determinação daquelas regiões da proteína que são essenciais para o funcionamento da enzima. Este tipo de determinação é de valor para estudos de engenheiramento de proteína e pode dar uma indicação do que a proteína pode tolerar em termos de mutagênese sem perder a função.
Consequentemente, a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção podem ser usadas para a identificação de outros ácidos nucleicos que conferem um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio depois da expressão.
Além disso, a molécula de ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou um fragmento de um gene que confere a expressão do polipeptídeo da invenção ou do polipeptídeo usado no método da invenção, preferivelmente que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção, podem ser usadas para a criação auxiliada por marcador ou mapeamento de associação de traços derivados de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio.
Consequentemente, o ácido nucleico da invenção, o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção, a construção de ácido nucleico da invenção, os organismos, a célula hospedeira, os microorganismos, a planta, tecido vegetal, célula vegetal ou a parte destes da invenção, o vetor da invenção, os agonistas identificados com o método da invenção, as moléculas de ácido nucleico identificadas com o método da presente invenção, podem ser usados para a produção de composto contendo N ou dos composto contendo N e um ou mais outros produtos químicos finos.Consequentemente, o ácido nucleico da invenção ou a molécula de ácido nucleico identificada com o método da presente invenção ou as seqüências de complemento destes, o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção, a construção de ácido nucleico da invenção, os organismos, a célula hospedeira, os microorganismos, a planta, tecido vegetal, célula vegetal ou a parte deste da invenção, o vetor da invenção, o antagonista identificado com o método da invenção, o anticorpo da presente invenção, a molécula de anti-sentido da presente invenção, pode ser usada para a redução de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou parte deste, por exemplo em uma célula.
Além disso, o ácido nucleico da invenção, o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção, a construção de ácido nucleico da invenção, os organismos, a célula hospedeira, os microorganismos, a planta, tecido vegetal, célula vegetal ou a parte deste da invenção, o vetor da invenção, o antagonista ou o agonista identificados com o método da invenção, o anticorpo da presente invenção, a molécula de anti- sentido da presente invenção ou a molécula de ácido nucleico identificadas com o método da presente invenção, podem ser usadas para a preparação de uma composição agrícola.
Além disso, o ácido nucleico da invenção, o polipeptídeo da invenção ou o polipeptídeo usado no método da invenção, a construção de ácido nucleico da invenção, os organismos, a célula hospedeira, os microorganismos, a planta, tecido vegetal, célula vegetal ou a parte deste da invenção, o vetor da invenção, antagonista ou o agonista identificados com o método da invenção, o anticorpo da presente invenção, a molécula de anti- sentido da presente invenção ou a molécula de ácido nucleico identificadas com o método da presente invenção, podem ser usados para a identificação e produção de compostos capazes de conferir uma modulação de nitrogênio ou de compostos contendo níveis de nitrogênio em um organismo ou partes deste, preferivelmente para identificar e produzir compostos que confere um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo níveis de nitrogênio em um organismo ou partes deste, se o dito composto identificado é aplicado ao organismo ou parte deste, isto é, como parte do seu alimento ou no meio de cultivo ou cultura.
Estas e outras formas de realização são divulgadas e abrangidas pela descrição e exemplos da presente invenção. Outra literatura diz respeito a qualquer um dos métodos, usos e compostos a serem utilizados de acordo com a presente invenção pode ser recuperada de bibliotecas públicas, usando por exemplo dispositivos eletrônicos. Por exemplo a base de dados pública "Medline" pode ser utilizada que está disponível na Internet, por exemplo sob hftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Outras bases de dados e endereços, tais como hftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/, hftp://www.infobiogen.fr/, hftp://www.fmi.ch/biology/research-tools.html, hftp://www.tigr.org/, são conhecidas pela pessoa habilitada na técnica e também podem ser obtidas usando, por exemplo, hftp://www.lycos.com. Um resumo de informação de patente em biotecnologia e uma vista geral de fontes relevantes de informação de patente úteis para pesquisar retrospectiva e para a ciência corrente é dada em Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
A presente invenção é ilustrada pelos exemplos, que seguem.
Os presentes exemplos ilustram a invenção básica sem estar intencionado como limitando o objeto da invenção. O conteúdo de todas das referências, pedidos de patente, patentes e pedidos de patente publicados citados no presente pedido de patente são juntamente incorporados por referência. Exemplo 1: Clonar a SEQ ID NO: 689 de Saccharomyces eerevisiae para a expressão em plantas
A menos que de outro modo especificado, métodos padrão como descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press são usados.
A SEQ ID NO: 689 é amplificada pela PCR como descrito no protocolo da Pfu Turbo ou DNA Herculase polimerase (Stratagene).
A composição para o protocolo da Pfii Turbo DNA polimerase foi como segue: Ix tampão de PCR (Stratagene), 0,2 mM de cada dNTP, 100 ng de DNA genômico de Saccharomyees eerevisiae (cepa S288C; Research Genetics, Inc., agora Invitrogen), 50 pmol de iniciador avançado, 50 pmol de iniciador reverso, 2,5 u de Pfu Turbo DNA polimerase. Os ciclos de amplificação foram como segue:
1 ciclo de 3 minutos de 94 a 95°C, seguido por 25 a 36 ciclos em cada caso de 1 minuto a 95°C ou 30 segundos a 94°C, 45 segundos a 50°C, 30 segundos a 50°C ou 30 segundos a 55°C e 210 a 480 segundos a 72°C, seguido por 1 ciclo de 8 minutos a 12°C, depois 4°C. A composição para o protocolo da Herculase polimerase foi como segue: Ix tampão de PCR (Stratagene), 0,2 mM de cada dNTP, 100 ng de DNA genômico de Saccharomyees eerevisiae (cepa S288C; Research Genetics, Inc., agora Invitrogen), 50 pmol de iniciador avançado, 50 pmol de iniciador reverso, 2,5 u de Herculase polimerase. Os ciclos de amplificação foram como segue:
1 ciclo de 2 a 3 minutos a 94°C, seguido por 25 a 30 ciclos em cada caso de 30 segundos a 94°C, 30 segundos de 55 a 60°C e 5 a 10 minutos a 72°C, seguido por 1 ciclo de 10 minutos a Il0C, depois 4°C.
As seguintes seqüências de iniciador foram selecionadas para o gene SEQ ID NO: 689
i) iniciador avançado (SEQ ID NO: 949) atggctcggg gtgacggaca t ii) iniciador reverso (SEQ ID NO: 950) tcatgcttct tttgcgtgat gcaat
Depois disso, o amplificado foi purificado em colunas QIAquick seguindo o protocolo padrão (Qiagen).
Para a clonagem de produtos de PCR5 produzidos pela Pfii Turbo DNA polimerase, o DNA vetorial (30 ng) foi restringido com SmaI seguindo o protocolo padrão (MBI Fermentas) e interrompido pela adição de tampão de sal alto. Os fragmentos de vetor restringidos foram purificados por intermédio de colunas Nucleobond usando o protocolo padrão (Macherey- Nagel). Depois disso, o vetor linearizado foi desfosforilado seguindo o protocolo padrão (MBI Fermentas).
Os produtos de PCR, produzidos pela Pfu Turbo DNA polimerase, foram fosforilados usando uma T4 DNA polimerase usando um protocolo padrão (por exemplo MBI Fermentas) e clonados no vetor binário processado.
Os terminais do DNA dos produtos da PCR, produzidos pela Herculase DNA polimerase, foram embotados em uma segunda reação de síntese usando Pfu Turbo DNA polimerase. A composição para o protocolo do embotamento dos terminais do DNA foi como segue: 0,2 mM de dTTP embotado e 1,25 u de Pfu Turbo DNA polimerase. A reação foi incubada a 72°C por 30 minutos. Depois os produtos de PCR foram fosforilados usando uma T4 DNA polimerase usando um protocolo padrão (por exemplo MBI Fermentas) e também clonados no vetor processado.
Um vetor binário que compreende um cassete de seleção (promotor, marcador de seleção, terminador) e um cassete de expressão com promotor, cassete de clonagem e seqüência terminadora entre as seqüências de borda de T-DNA foi usado. Além daqueles dentro do cassete de clonagem, o vetor binário não tem nenhum sítio de clivagem SmaI. Vetores binários que podem ser usados são conhecidos pelo técnico habilitado; um resumo de vetores binários e seu uso pode ser encontrado em Hellens, R., Mullineaux, P. e Klee H., [(2000) "A guide to Agrobacterium binary vectors", Trends in Plant Science, Vol. 5 Ns 10, 446-451. Dependendo do vetor usado, a clonagem também pode ser vantajosamente realizada por intermédio de outras enzimas de restrição. Os sítios de clivagem vantajosos adequados podem ser adicionados à ORF usando-se iniciadores adequados para a amplificação pela PCR.
Aproximadamente 30 ng de vetor preparado e uma quantidade definida de amplificado preparada foram misturados e ligados pela adição de ligase.
Os vetores ligados foram transformados no mesmo vaso de reação pela adição de células E. coli competentes (cepa DH5alfa) e incubação por 20 minutos a 10C seguido por um choque térmico por 90 segundos a 42°C e esfriamento a 4°C. Depois, meio completo (SOC) foi adicionado e a mistura foi incubada por 45 minutos a 37°C. A mistura inteira foi subseqüentemente plaqueada em uma placa de ágar com antibióticos (selecionado como uma função do vetor binário usado) e incubado durante a noite a 37°C.
O resultado da etapa de clonagem foi verificada pela amplificação com auxílio de iniciadores que ligam a montante e a jusante do sítio de integração, permitindo assim a amplificação da inserção. Além disso combinações dos iniciadores específicos de gene acima mencionado e iniciadores a montante e a jusante foram usados em reações de PCR para identificar clones com a orientação de inserto correta. As amplificações foram realizadas como descritas no protocolo da Taq DNA polimerase (Gibco- BRL).
Os ciclos de amplificação foram como segue: 1 ciclo de 5 minutos a 94°C, seguido por 35 ciclos em cada caso de 15 segundos a 94°C, segundos de 50 a 66°C e 5 minutos a 72°C, seguido por 1 ciclo de 10 minutos a 72°C, depois 4°C. Diversas colônias foram checadas, mas apenas uma colônia para a qual um produto de PCR do tamanho esperado foi detectado foi usada nas etapas seguintes.
Uma porção desta colônia positiva foi transferida em um vaso de reação cheio com meio completo (LB) e incubado durante a noite a 37°C. O meio LB conteve um antibiótico escolhido para combinar com o vetor binário (ver acima) usado e o gene de resistência presente neste ponto de modo a selecionar o clone.
A preparação de plasmídeo foi realizada como especificado no protocolo padrão Qiaprep (Qiagen).
Exemplo 2: Geração de plantas transgênicas que expressam a SEQ ID NO: 689
1 ng do DNA plasmídico isolado foi transformado pela eletroporação em células competentes de Agrobacterium tumefaciens, da cepa GV 3101 pMP90 (Koncz e Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383-396, 1986). A escolha da cepa agrobacteriana depende da escolha do vetor binário. Um resumo de cepas possíveis e suas propriedades é encontrado em Hellens, R., Mullineaux, P. e Klee H., (2000) "A guide to Agrobacterium binary vectors, Trends in Plant Science, Vol. 5 N^ 10, 446-451. Depois disso, meio completo (YEP) foi adicionado e a mistura foi transferida em um vaso de reação novo por 3 horas a 28°C. Depois disso, toda a mistura de reação foi plaqueada em placas YEP de ágar suplementadas com os respectivos antibióticos, por exemplo rifampicina e gentamicina para GV3101 pMP90 e um outro antibiótico para a seleção no vetor binário, foi plaqueado e incubado por 48 horas a 28°C.
As agrobactérias gerada no Exemplo 2, que contiveram a construção de plasmídeo foram depois usadas para a transformação de plantas.
Uma colônia foi escolhida da placa de ágar com auxílio de uma ponta de pipeta e coletada em 3 ml de meio TB líquido, que também conteve antibióticos adequados, dependendo da cepa agrobacteriana e do plasmídeo binário. A pré cultura foi cultivada por 48 horas a 28°C e 120 rpm.
.400 ml de meio LB contendo os mesmos antibióticos como acima foram usados para a cultura principal. A pré cultura foi transferida na cultura principal. Esta foi cultivada por 18 horas a 28°C e 120 rpm. Depois da centrifugação a 4000 rpm, a pelota foi recolocada em suspensão em meio de infiltração (meio MS, 10% de sacarose).
De modo a cultivar as plantas para a transformação, placas (Piki Saat 80, verde, fornecidas com um fundo em tela, 30 χ 20 χ 4,5 cm, da Wiesauplast, Kunststofftechnik, Alemanha) foram enchidas pela metade com um substrato GS 90 (solo padrão, Werkverband Ε. V., Alemanha). As placas foram regadas durante a noite com 0,05% de solução Proplant (Chimac- Apriphar, Bélgica). Sementes C24 de Arabidopsis thaliana (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK; NASC Stock N906) foram dispersas sobre a placa, aproximadamente 1000 sementes por placa. As placas foram cobertas com uma campânula e colocadas na instalação de estratificação (8 h, 110 μmol/m2/8-1, 22°C; 16 h, escuro, 6°C). Depois de 5 dias, as placas foram colocadas na câmara de ambiente controlado com dia curto (8 h 130 μmol/ιη2/8-1, 22°C; 16 h, escuro 20°C), onde elas permaneceram por aproximadamente 10 dias até que as primeira folhas verdadeiras se formaram.
As mudas foram transferidas em vasos contendo o mesmo substrato (Teku pots, 7 cm, LC série, fabricado pela Põppelmann GmbH & Co, Alemanha). Cinco plantas foram selecionadas em cada vaso. Os vasos foram depois retornados para a câmara de ambiente controlado com dia curto para a planta continuar a crescer.
Depois de 10 dias, as plantas foram transferidas para a estufa (iluminação suplementar, 16 h, 340 μΕ, 22°C; 8 h, escuro, 20°C), onde elas foram deixadas crescer por mais 17 dias. Para a transformação, plantas de Arabidopsis com 6 semanas de idade que apenas iniciaram o florescimento foram imersas por 10 segundos na suspensão agrobacteriana descrita acima que foi previamente tratada com 10 μl de Silwett L77 (Crompton S. A., Osi Specialties, Suíça). O método em questão está descrito em Clough e Bent, 1998 (Clough, JC e Bent, AF. 1998 Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735-743.
As plantas foram subseqüentemente colocadas por 18 horas em uma câmara úmida. Depois disso, os vasos foram retornados para a estufa para as plantas continuarem a crescer. As plantas permaneceram na estufa por mais 10 semanas até que as sementes estivessem prontas para a colheita.
Dependendo do marcador de resistência usado para a seleção das plantas transformadas as sementes colhidas foram plantadas na estufa e submetidas a uma seleção por pulverização ou ainda primeiro esterilizadas e depois cultivadas em placas de ágar suplementadas com o respectivo agente de seleção. No caso de resistência a BASTA®, as plantinhas foram pulverizadas quatro vezes em um intervalo de 2 a 3 dias com 0,02% de BASTA® e as plantas transformadas foram deixadas formar sementes. As sementes das plantas A. thaliana transgênicas foram armazenadas no congelador (a -20°C).
Exemplo 3: Análise do Teor de Nitrogênio
A determinação de nitrogênio nas amostras é realizada usando o método Dumas que conta com a combustão completa do material de teste. A amostra é aquecida em um forno de temperatura alta e rapidamente comburido na presença de oxigênio puro. Os produtos de combustão (principalmente C02, H20, NOx e N2) são coletados e deixados equilibrar. Uma alíquota da mistura gasosa é passada sobre cobre quente para remover qualquer oxigênio e converter N02 a N2. A amostra é depois passada através de um sifao que remove C02 e H20. O nitrogênio remanescente é medido por um detetor de condutividade térmica.
Para a análise de material folhoso ou para os núcleos de semente, o material secado por congelamento homogeneizado é usado. No caso de sementes de Arabidopsis, as sementes são analisadas diretamente sem pré tratamento.
.4 a 7 mg da amostra foram pesados em uma folha de estanho junto com 15 mg de óxido de tungstênio (VI) (W03). A análise foi realizada usando um analisador elementar comercial (por exemplo ELEMENTAR vario EL III, ELEMENTAR, Hanau, Alemanha).
A Tabela VI mostra o teor de nitrogênio total aumentado de sementes de plantas transgênicas transformadas com a ORF de levedura YPRl38c, correspondente à SEQ ID NO: 689 sob o controle do promotor 35S duplo. A coluna 1 mostra os elementos medidos, a coluna 2 mostra a variabilidade do tipo selvagem com relação ao desvio padrão, a coluna 3 mostra a mudança média no teor de elemento para linhas transgênicas diferentes transformadas com a SEQ ID NO: 689 em relação ao controle do tipo selvagem que é padronizado como "1", a coluna 4 mostra o desvio padrão para as linhas transgênicas diferentes e a coluna 5 mostra a mudança observada máxima. Como esperado, o aumento relativo no nitrogênio
<table>table see original document page 204</column></row><table>
Exemplo 4: Eficiência do uso de nitrogênio realçada Triagem de planta (Arabidopsis) para o cultivo sob fornecimento de nitrogênio limitado
Para a triagem de plantas transgênicas uma instalação de cultura específica foi usada. Para propósitos de alto rendimento as plantas foram tríadas quanto a produção de biomassa em placas de ágar com fornecimento limitado de nitrogênio (adaptado de Estelle e Somerville, 1987). Os canais de triagem consistem de três níveis. As linhas transgênicas são submetidas ao nível subsequente se a produção de biomassa foi significantemente melhorada em comparação com as plantas do tipo selvagem. Com cada nível o número de réplicas e a severidade estatística foram aumentados.
Para a semeadura, as sementes, que foram armazenadas no refrigerador (a -20°C), foram removidas dos tubos Eppendorf com auxílio de um palito de dente e transferidas sobre as placas. No total, aproximadamente 15 a 30 sementes foram distribuídas horizontalmente em cada placa (12 χ 12 cm).
Depois que as sementes foram semeadas, as placas são submetidas à estratificação por 2 a 4 dias no escuro a 4°C. Depois da estratificação, as plantas de teste foram cultivadas por 22 a 25 dias em um ritmo de 16 h de luz, 8 h de escuro a 20°C, uma umidade atmosférica de 60% e uma concentração de C02 de aproximadamente 400 ppm. As fontes de luz usadas geram uma luz que se parece com o espectro de cor solar com uma intensidade de luz de aproximadamente 100 μΕ/1112/s-l.
O cultivo melhorado sob condições limitadas de nitrogênio foi avaliado pela produção de biomassa de brotos e raízes de plantas transgênicas em comparação com plantas de controle do tipo selvagem depois de 20 a 25 dias de cultivo.
As linhas transgênicas que expressam a ORF de levedura YPRl38c, correspondente à SEQ ID NO: 689 sob o controle de um promotor constitutivo forte como o promotor 35S duplo, mostrou produção de biomassa realçada de brotos e raízes sob condições limitadas de nitrogênio em comparação com as plantas de controle do tipo selvagem.
Exemplo 5: Engenheiramento de plantas de grama de centeio pela super expressão do polinucleotídeo caracterizado na invenção, por exemplo derivado de Saccharomyces, Ε. eoli ou um outro organismo
As sementes de diversas variedades de grama de centeio diferentes podem ser usadas como fontes de explante para transformação, incluindo a variedade comercial Gunne disponível da companhia de semente Svalof Weibull ou a variedade Affmity. As sementes são esterilizadas na superfície seqüencialmente com 1% de Tween-20 por 1 minuto, 100% de branqueador por 60 minutos, 3 enxágües com 5 minutos cada com H20 desionizada e destilada e depois germinadas por 3 a 4 dias em papel de filtro estéril, úmido no escuro, as mudinhas são ainda esterilizadas por 1 minuto com 1% de Tween-20, 5 minutos com 75% de branqueador e enxaguado 3 vezes com ddH20, 5 min cada.
As sementes esterilizadas na superfície são colocadas sobre o meio de indução de calo contendo sais basais de Murashige e Skoog e vitaminas, 20 g/l de sacarose, 150 mg/l de asparagina, 500 mg/l de hidrolisado de caseína, 3 g/l de Phytagel, 10 mg/l de BAP e 5 mg/l de dicamba. As placas são incubadas no escuro a 25°C por 4 semanas para a germinação de semente e indução de calo embriogênico.
Depois de 4 semanas no meio de indução de calo, os brotos e raízes das mudas são cortados fora, o calo é transferido para meio fresco, é mantido em cultura por mais 4 semanas e é depois transferido para meio MSO na luz por 2 semanas. Diversos pedaços de calo (11 a 17 semanas de idade) são passados através de uma peneira de malha IOe colocados sobre o meio de indução de calo ou são cultivados em 100 ml de meio de indução de calo de grama centeio líquido (o mesmo meio como para a indução de calo com ágar) em um frasco de 250 ml. O frasco é enrolado em folha metálica e agitado a 175 rpm no escuro a 23 0C por 1 semana. Peneirando a cultura líquida com uma peneira de 40 malhas as células são coletadas. A fração coletada sobre a peneira é plaqueada e é cultivada em meio de indução de calo de grama de centeio sólido por 1 semana no escuro a 25°C. O calo é depois transferido para meio MS contendo 1% de sacarose e é cultivado por 2 semanas.
A transformação pode ser realizada com Agrobacterium ou com métodos de bombardeamento de partícula. Um vetor de expressão é criado contendo um promotor vegetal constitutivo e o cDNA do gene em um vetor pUC. O DNA plasmídico é preparado a partir de células E. coli usando kit Qiagen de acordo com a instrução do fabricante. Aproximadamente 2 g de calo embriogênico é espalhado no centro de um papel de filtro estéril em uma placa de Petri. Uma alíquota de MSO líquido com 10 g/l de sacarose é adicionada ao papel de filtro. Partículas de ouro (1,0 μιη no tamanho) são revestidas com DNA plasmídico de acordo com o método de Sanford et al., .1993 e são liberados ao calo embriogênico com os seguintes parâmetros: 500 μg de partículas e 2 μg de DNA por broto, 1300 psi (8970 kPa) e uma distância do alvo de 8,5 cm da placa de parada até a placa de calo e 1 tiro por placa de calo.
Depois do bombardeamento, os calos são transferidos de volta para o meio de desenvolvimento de calo fresco e mantidos no escuro na temperatura ambiente por um período de 1 semana. O calo é depois transferido para condições de crescimento na luz a 250C para iniciar a diferenciação de embrião com o agente de seleção apropriado, por exemplo .250 nM de Arsenal, 5 mg/l de PPT ou 50 mg/L de canamicina. Os brotos resistentes ao agente de seleção estão aparecendo e uma vez enraizados são transferidos para o solo.
Amostras das plantas transgênicas primárias (TO) são analisadas pela PCR para confirmar a presença de T-DNA. Estes resultados são confirmados pela hibridização de Southern em que o DNA é submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1% e transferido a uma membrana de náilon positivamente carregada (Roche Diagnostics). O Kit de Síntese da Sonda DIG de PCR (Roche Diagnostics) é usado para preparar uma sonda rotulada com digoxigenina pela PCR e usado como recomendado pelo fabricante.
As plantas de grama de centeio TO transgênicas são propagadas vegetativamente pela excisão dos brotos. Os brotos transplantados são mantidos na estufa por 2 meses até bem estabelecidos. Os brotos são desfoliados e deixados crescer por 2 semanas.
As sementes de grama de centeio transgênica podem ser analisadas quanto ao teor aumentado de nitrogênio com o analisador elementar como descrito sob o exemplo 3.
Exemplo 6: Engenheiramento de plantas de soja pela super expressão do polinucleotídeo caracterizado na invenção, por exemplo derivado de Saccharomyces, E. eoli ou um outro organismo
A soja pode ser transformada de acordo com a seguinte modificação do método descrito na patente da Texas A&M US 5.164.310. Diversas variedades de soja comercial são passíveis de transformação por este método. O cultivar Jack (disponível da Illinois Seed Foundation) é habitualmente usado para a transformação. As sementes são esterilizadas pela imersão em 70% (v/v) de etanol por 6 min e em branqueador comercial a 25% (NaOCl) suplementado com 0,1% (v/v) de Tween por 20 min, seguido pelo enxágue 4 vezes com água duplamente destilada estéril. Removendo a radícula, hipocotilo e um cotilédone de cada muda propaga mudas de sete dias. Depois, o epicotilo com um cotilédone é transferido para meio de germinação fresco em placas de petri e incubados a 25°C sob um fotoperíodo de 16 horas (aprox. 100 μΕ-ηι-28-1) por três semanas. Os nós axilares (aprox.4 mm no comprimento) são cortados de plantas de 3 a 4 semanas de idade. Os nós axilares são excisados e incubados em cultura de Agrobacterium LBA4404.
Muitos sistemas de vetor binário diferentes foram descritos para a transformação de planta (por exemplo An, G. em Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA e MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Muitos são fundamentados no vetor pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12: 8711-8721) que inclui um cassete de expressão de gene vegetal flanqueado pelas seqüências da bordas esquerda e direita do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Um cassete de expressão de gene vegetal consiste de pelo menos dois genes - um gene marcador de seleção e um promotor vegetal que regula a transcrição do cDNA ou DNA genômico do gene traço. Vários genes marcadores de seleção podem ser usados como descrito acima, incluindo o gene da Arabidopsis que codifica uma enzima da aceto-hidróxi ácido sintase (AHAS) mutada (patentes US 57673666 e 6225105). Similarmente, vários promotores podem ser usados para regular o gene de traço para fornecer a regulagem constitutiva, desenvolvimental, tecidual ou ambiental da transcrição de gene como descrito acima. Neste exemplo, o promotor 34S (Números de Acesso no GenBank M59930 e Xl6673) é usado para fornecer a expressão constitutiva do gene traço.
Depois do tratamento de co-cultivo, os explantes são lavados e transferidos para meio de seleção suplementado com 500 mg/L de timentina. Os brotos são excisados e colocados em um meio de alongamento de broto. Os brotos mais longos do que 1 cm são colocados em meio de enraizamento por duas a quatro semanas antes do transplante para o solo.
As plantas transgênicas primárias (TO) são analisadas pela PCR para confirmar a presença de T-DNA. Estes resultados são confirmados pela hibridização de Southern em que o DNA é submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1% e transferido a uma membrana de náilon positivamente carregada (Roche Diagnostics). O Kit de Síntese de Sonda DIG de PCR (Roche Diagnostics) é usado para preparar uma sonda rotulada com digoxigenina pela PCR e é usada como recomendada pelo fabricante.
As sementes de soja transgênica podem ser analisadas quanto ao teor aumentado de nitrogênio com o analisador elementar como descrito sob o exemplo 3.
Exemplo 7: Engenheiramento com plantas pela super expressão do polinucleotídeo caracterizado na invenção, por exemplo derivado de Saccharomyces, E. eoli ou um outro organismo A transformação de milho (Zea Mays L.) pode ser realizada
com uma modificação do método descrito por Ishida et ai. (1996. Nature Biotech 14745-50). A transformação é dependente de genótipo no milho e apenas genótipos específicos são passíveis de transformação e regeneração. A linha Al88 congênita (University of Minnesota) ou híbridos com Al88 como um precursor são boas fontes de material doador para a transformação (Fromm et al. 1990 Biotech 8: 833-839), mas outros genótipos também podem ser usados com êxito. As espigas são colhida das plantas de milho em aproximadamente 11 dias depois da polinização (DAP) quando o comprimento dos embriões imaturos é cerca de 1 a 1,2 mm. Os embriões imaturos são co-cultivados com Agrobaeterium tumefaciens que carrega vetores "super binários" e plantas transgênicas são recuperadas através da organogênese. O sistema de super vetor binário da Japan Tobacco é descrito nas patentes WO W094/00977 e W095/06722. Vetores podem ser construídos como descrito. Vários genes marcadores de seleção podem ser usados incluindo o gene do milho que codifica uma enzima da aceto-hidróxi ácido sintase (AHAS) mutada (patente US 6025541). Similarmente, vários promotores podem ser usados para regular o gene de traço para fornecer a regulagem constitutiva, desenvolvimental, tecidual ou ambiental da transcrição de gene. Neste exemplo, o promotor 34S (Números de Acesso no GenBank M59930 e Xl6673 pode ser usado para fornecer a expressão constitutiva do gene traço.
Os embriões excisados podem ser cultivados em meio de indução de calo, depois meio de regeneração do milho, contendo imidazolinona como um agente de seleção. As placas de Petri podem ser incubadas na luz a 25°C por 2 a 3 semanas ou até que os brotos se desenvolvam. Os brotos verdes podem ser transferidos de cada embrião para o meio de enraizamento do milho e incubado a 250C por 2 a 3 semanas, até que as raízes se desenvolvam. Os brotos enraizados podem ser transplantados para o solo na estufa. As sementes Tl podem ser produzidas a partir de plantas que exibem tolerância aos herbicidas de imidazolinona e que podem ser positivos em PCR para os transgenes.
A geração Tl de inserções de local único do T-DNA pode segregar o transgene em uma razão de 3:1. Estas progênies contendo uma ou duas cópias do transgene podem ser tolerantes do herbicida de imidazolinona. Sementes de milho transgênico podem ser analisadas quanto ao teor aumentado de nitrogênio com o analisador elementar como descrito sob o exemplo 3.
Exemplo 8: Engenheiramento de plantas de trigo pela super-expressão do polinucleotídeo caracterizado na invenção, por exemplo derivado de Saccharomyces, E. eoli ou um outro organismo
A transformação de trigo pode ser realizada com o método descrito por Ishida et al. (1996 Nature Biotech. 14745-50). O cultivar Bobwhite (disponível da CYMMIT, México) pode ser habitualmente usado na transformação. Os embriões imaturos podem ser co-cultivados com Agrobaeterium tumefaciens que carregam vetores "super binários" e plantas transgênicas são recuperadas através da organogênese. O sistema de vetor super binário da Japan Tobacco é descrito nas patentes WO W094/00977 e W095/06722. Vetores podem ser construídos como descrito. Vários genes marcadores de seleção podem ser usados incluindo o gene que codifica uma enzima da aceto-hidróxi ácido sintase (AHAS) mutada do milho (patente US 6025541). Similarmente, vários promotores podem ser usados para regular o gene de traço para fornecer a regulagem constitutiva, desenvolvimental, tecidual ou ambiental da transcrição de gene. O promotor 34S (Números de Acesso no GenBank M59930 e Xl6673) pode ser usado para fornecer a expressão constitutiva do gene traço.
Depois da incubação com Agrobacterium, os embriões podem ser cultivados no meio de indução de calo, depois meio de regeneração, contendo imidazolinona como um agente de seleção. As placas de Petri podem ser incubadas na luz a 25°C por 2 a 3 semanas ou até que os brotos se desenvolvam. Os brotos verdes podem ser transferidos de cada embrião para o meio de enraizamento e incubados a 25°C por 2 a 3 semanas, até que as raízes se desenvolvam. Os brotos enraizados podem ser transplantados para o solo na estufa. As sementes Tl podem ser produzidas a partir das plantas que exibem tolerância aos herbicidas de imidazolinona e que são positivos na PCR quanto aos transgenes.
A geração Tl de inserções de local único do T-DNA pode segregar qu8anto ao transgene em uma razão de 3:1. Estas progênies contendo uma ou duas cópias do transgene podem ser tolerantes do herbicida imidazolinona. As plantas T2 homozigotas exibiram fenótipos similares. Sementes de trigo transgênicas podem ser analisadas quanto ao teor aumentado de nitrogênio com o analisador elementar como descrito sob o exemplo 3.
Exemplo 9: Engenheiramento de plantas de Colza/Canola pela super expressão do polinucleotídeo caracterizado na invenção, por exemplo derivado de Saccharomyces eerevisiae, E. eoli ou um outro organismo
Os pecíolos cotiledonários e hipocotilos de 5 a 6 dias de idade de mudas jovens podem ser usados como explantes para a cultura de tecido e transformados de acordo com Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). O cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) pode ser a variedade padrão usada para a transformação, mas outras variedades podem ser usadas.
Agrobacterium tumefaeiens LBA4404 contendo um vetor binário pode ser usado para a transformação de canola. Muitos sistemas de vetor binário diferentes foram descritos para a transformação de planta (por exemplo An, G. em Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA e MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Muitos são fundamentados no vetor pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12: 8711-8721) que inclui um cassete de expressão de gene vegetal flanqueado pelas seqüências das bordas esquerda e direita do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Um cassete de expressão de gene vegetal pode consistir de pelo menos dois genes - um gene marcador de seleção e um promotor vegetal que regula a transcrição do cDNA ou DNA genômico do gene traço. Vários genes marcadores de seleção podem ser usados incluindo o gene de Arabidopsis que codifica uma enzima da aceto-hidróxi ácido sintase (AHAS) mutada (Patentes US 57673666 e .6225105). Similarmente, vários promotores podem ser usados para regular o gene traço para fornecer a regulagem constitutiva, desenvolvimental, tecidual ou ambiental da transcrição de gene. O promotor 34S (Números de Acesso no GenBank M59930 e Xl6673) pode ser usado para fornecer a expressão constitutiva do gene traço.
Sementes de Canola podem ser esterilizadas na superfície em .70% de etanol por 2 min. e depois em 30% de Clorox com uma gota de Tween-20 por 10 min, seguido por três enxágües com água destilada esterilizada. As sementes podem ser depois germinadas in vitro 5 dias em metade da concentração de meio MS sem hormônios, 1% de sacarose, 0,7% de Phytagar a 23°C, 16 horas de luz. Os explantes de pecíolo cotiledonário com o cotilédone ligado pode ser excisado das mudas in vitro e podem ser inoculados com Agrobacterium pela imersão da extremidade do corte do explante de pecíolo na suspensão bacteriana. Os explantes podem ser depois cultivados por 2 dias em meio MSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, 3% de sacarose, 0,7% de Phytagar a 23 °C, 16 horas de luz. Depois de dois dias de co-cultivo com Agrobacterium, os explantes de pecíolo podem ser transferidos ao meio de MSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina ou timentina (300 mg/l) por 7 dias e podem ser depois cultivados em meio de MSBAP-3 com cefotaxima, carbenicilina ou timentina e agente de seleção até a regeneração de broto. Quando os brotos têm 5 a 10 mm no comprimento, estes podem ser cortados e transferidos para o meio de alongamento de broto (MSBAP-0,5, contendo 0,5 mg/l de BAP). Os brotos de cerca de 2 cm no comprimento podem ser transferidos ao meio de enraizamento (MSO) para a indução de raiz.
As amostras das plantas transgênicas primárias (TO) podem ser analisadas pela PCR para confirmar a presença de T-DNA. Estes resultados podem ser confirmados pela hibridização de Southern em que o DNA é submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1% e são transferidos a uma membrana de náilon positivamente carregada (Roche Diagnostics). O kit de Síntese de Sonda DIG da PCR (Roche Diagnostics) pode ser usado para preparar uma sonda rotulada com digoxigenina pela PCR e usado como recomendado pelo fabricante.
Sementes de canola transgênica podem ser analisadas quanto ao teor aumentado de nitrogênio com a analisador elementar como descrito sob o exemplo 3.
Exemplo 10: Engenheiramento de plantas de alfafa pela super expressão do polinucleotídeo caracterizado na invenção, por exemplo derivado de Saccharomyces, E. eoli ou um outro organismo.
Um clone de regeneração de alfafa (Medieago sativa) pode ser transformado usando o método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). A regeneração e transformação de alfafa pode ser dependente de genótipo e portanto uma planta de regeneração é requerida. Métodos para se obter as plantas de regeneração foram descritos. Por exemplo, estes podem ser selecionados do cultivar Rangelander (Agriculture Canada) ou qualquer outra variedade comercial de alfafa como descrito por Brown DCW e A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Cultura 4: 111-112). Alternativamente, a variedade RA3 (University of Wisconsin) pode ser selecionada para o uso na cultura de tecido (Walker et ai, 1978 Am J Bot 65: 654-659).
Explantes de pecíolo podem ser co-cultivados com uma cultura durante a noite de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) ou LBA4404 contendo um vetor binário. Muitos sistemas de vetor binários diferentes foram descritos para a transformação de planta (por exemplo An, G. em Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA e MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Muitos são fundamentados no vetor pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research.1984. 12: 8711-8721) que inclui um cassete de expressão de gene vegetal flanqueado pelas seqüências das bordas esquerda e direita do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Um cassete de expressão de gene vegetal pode consistir de pelo menos dois genes - um gene marcador de seleção e um promotor vegetal que regula a transcrição do cDNA ou DNA genômico do gene traço. Vários genes marcadores de seleção podem ser usados incluindo o gene da Arabidopsis que codifica uma enzima da aceto-hidróxi ácido sintase (AHAS) mutada (Patentes US 57673666 e 6225105). Similarmente, vários promotores podem ser usados para regular o gene traço que fornece a regulagem constitutiva, desenvolvimental, tecidual ou ambiental da transcrição do gene. O promotor 34S (Números de Acesso no GenBank M59930 e Xl6673) pode ser usado para fornecer a expressão constitutiva do gene traço.
Os explantes podem ser cocultivados por 3 dias no escuro em
meio de indução SH contendo 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2S04 e 100 μηι de acetossiringinona. Os explantes podem ser lavados com metade da concentração de meio de Murashige-Skoog (Murashige e Skoog, 1962) e plaqueados no mesmo meio de indução SH sem acetossiringinona mas com um agente de seleção adequado e antibiótico adequado para inibir o crescimento de Agrobacterium. Depois de diversas semanas, os embriões somáticos podem ser transferidos para meio de desenvolvimento BOÍ2Y não contendo nenhum regulador de crescimento, nenhum antibiótico e 50 g/L de sacarose. Os embriões somáticos são subseqüentemente germinados em metade da concentração de meio de Murashige-Skoog. As mudas enraizadas podem ser transplantadas em vasos e cultivadas em uma estufa.
As plantas transgênicas TO são propagadas pelos cortes de nó e enraizados em meio de crescimento Turface. As plantas são desfoliadas e cultivadas a uma altura de cerca de 10 cm (aproximadamente 2 semanas depois da desfoliação).
Sementes de alfafa transgênica podem ser analisadas quanto ao teor aumentado de nitrogênio com o analisador elementar como descrito sob o exemplo 3.
Exemplo 11: Preparação de seqüências homólogas de plantas
Plantas diferentes podem ser cultivadas sob condições padrão ou variáveis na estufa. O RNA pode ser extraído seguindo o protocolo de Jones, Dunsmuir e Bedbrook (1985) EMBO J. 4: 2411-2418. Aprox. 1 grama de material de tecido de vários órgãos é triturado em nitrogênio líquido. O pó é transferido a um tubo Falcon de 13 ml contendo 4,5 ml de tampão NTES (100 mM de NaCl, 10 mM de Tris/HCl pH 7,5, 1 mM de EDTA, 1% de SDS; em água isenta de RNase) e 3 ml de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25/24/1), imediatamente misturado e armazenado em gelo. A mistura é girada por 10 minutos a 7000 rpm usando uma centrífuga (Sorval; rotor SM24 ou SS34). O sobrenandante é transferido a um novo tubo, 1/10° do volume de NaAcetate 3 M (pH 5,2; em água isenta de RNase) e 1 volume de isopropanol é adicionado, misturado e armazenado por 1 hora ou durante a noite a -20°C. A mistura é girada por 10 minutos a 7000 rpm. O sobrenandante é descartado e a pelota lavada com 70% de etanol (v/v). A mistura é girada por 5 minutos a 7000 rpm, o sobrenandante é descartado e a pelota é secada ao ar. 1 ml de água isenta de RNase é adicionado e deixada a pelota de DNA/RNA dissolver em gelo a 4°C. A solução de ácido nucleico é transferida a um tubo de Eppendorf de 2 ml e 1 ml de LiAcetate 4 M é adicionado. Depois de misturar a solução é mantida por pelo menos 3 horas ou durante a noite, a 4°C. A mistura é girada por 10 minutos a 14000 rpm, o sobrenandante descartado, a pelota lavada com 70% de Etanol, secada ao ar e dissolvida em 200 μΐ de água isenta de RNase.
O RNA total pode ser usado para construir uma biblioteca de cDNA de acordo com o protocolo do fabricante (por exemplo usando a síntese de ZAP-cDNA e kit de clonagem da Stratagene, La Jolla, USA). Basicamente, o RNA mensageiro (mRNA) é iniciado na síntese do primeiro filamento com um ligador-iniciador oligo(dT) e é transcrita de modo reverso usando a transcriptase reversa. Depois da síntese de cDNA do segundo filamento, o cDNA de filamento duplo é ligado no vetor Uni-ZAP XR. O vetor Uni-ZAP XR permite a excisão in vivo do fagomídeo pBluescript. O poliligador do fagomídeo pBluescript tem 21 sítios de clonagem flanqueados pelos promotores T3 e T7 e uma escolha de 6 sítios de iniciador diferentes para o sequenciamento de DNA. O sequenciamento de rodada única sistemático da extremidade iniciadora 5 esperada dos clones pode permitir a anotação preliminar das seqüências por exemplo com a ajuda do pacote pro Software pedante (Biomax, München). Os clones para os ácidos nucleicos da invenção ou usados no processo de acordo com a invenção podem ser identificados com base na pesquisa de homologia com algoritmos padrão como blastp ou gap. Os clones de tamanho natural putativos identificados com identidade ou homologia alta podem ser submetidos a outro sequenciamento de modo a obter a seqüência completa.
Novas seqüências homólogas adicionais podem ser identificadas em uma maneira similar preparando-se as respectivas bibliotecas de cDNA de várias fontes de planta como descritas acima. As bibliotecas podem ser depois tríadas com seqüências da invenção disponíveis sob condições de severidade baixa por exemplo como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Os clones positivos purificados podem ser submetidos à excisão in vivo e sequenciamento completo. Um alinhamento de seqüência aos pares da seqüência original e da nova usando os programas blastp ou gap permite a identificação de ortólogos, seqüências homólogas significativas de organismos diferentes, que devem ter uma identidade de seqüência de pelo menos 30%. Além disso a conservação de resíduos de aminoácido ou domínios funcionalmente importantes, que podem ser identificados pelo alinhamento de diversos parálogos já disponíveis, pode identificar uma nova seqüência como um novo ortólogo. Alternativamente as bibliotecas podem ser submetidas ao
sequenciamento de massa e as seqüências obtidas podem ser armazenadas em uma base de dados de seqüência, que depois pode ser tríada quanto aos ortólogos putativos pelos algoritmos de pesquisa diferentes, por exemplo o algoritmo tbastn para pesquisar as seqüências de ácido nucleico obtidas com uma seqüência de aminoácido da invenção. Clones com a identidade de seqüência mais alta são usados para uma determinação de seqüência completa e ortólogos podem ser identificados como descrito acima.
O caminho da pentose fosfato oxidativa é conhecido como uma fonte principal de energia redutora para processos biossintéticos tais como a síntese de ácido graxo e a assimilação de nitrogênio (Neuhaus e Emes, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 200, 51: 111-140). Além disso o mesmo fornece intermediários metabólicos para os processos biossintéticos. As enzimas para este caminho são encontradas tanto no citossol quanto nos plastídeos, por meio das quais a distribuição precisa das atividades varia entre espécies de planta e condições de crescimento. Uma das enzimas importantes do caminho da pentose fosfato oxidativa é a glicose-6-fosfato desidrogenase, com genes diferentes que codificam isoenzimas citossólica e plastídicas separadas. Duas classes de G6PDH plastídico foram distinguidas em plantas superiores. Embora ambas as atividades plastídicas sejam inibidas pelo NADPH/NADP+ aumentada e inativada pelo ditiotreitol, uma das enzimas é surpreendentemente menos sensível a ambas as formas de modulação. O envolvimento da isoenzima menos sensitiva de G6PDH no fornecimento do NADPH para as reações dependentes de ferredoxina é sugerido por um aumento na expressão de genes que codificam estas isoformas em Arabidopsis depois da transferência de um meio contendo amônio a um incluindo nitrato (Wang et al., Plant Cell 2000, 12: 1491-15009). Adicionalmente estudos recentes sobre as raízes da cevada identificaram uma isoforma plastídica similar na cevada a ser induzida em resposta à exposição ao amônio ou glutamato (Esposito et al., Physiol Plant 2001, 113: 469-476).
Embora as características básicas do caminho da pentose fosfato oxidativa sejam bem estabelecidas, detalhes de como o caminho opera em plantas e como ele influência outros processos (como a fixação de nitrogênio) permanece basicamente na conjectura (revisado em Krüger e von Schaewen, Current Opinion in Plant Biology, 2003, 6: 236-264).
Farnesil pirofosfato sintetase (FPP sintase) é conhecida como uma enzima citossólica que tem atividades de dimetil-alil-transtransferase e geranil-transtransferase (Wang et al., Plant Journal, 43, 413-424, 2005; Barth et al., Physiologica Plantarium, 121, 282-293, 2004; Glichet et al., Curr. Opinion Planta Biol., 6, 530-535, 2003). A FPP sintase catalisa a ligação 1 '-4 seqüencial de difosfato de isopentenila (IPP) com difosfato de dimetilalila e difosfato de geranila, formando unidades de pirofosfato de farnesila Cl5 para a biossíntese de isoprenóide e esterol. É incerto como a biossíntese de esterol ou farnesilação de proteína estaria envolvida no aumento do teor de nitrogênio em uma célula, preferivelmente em plantas ou partes destas, particularmente pela geração ou aumento a atividade de FPP sintase em uma organela, preferivelmente em plastídeo.
A L-Iactato citocromo c oxidorredutase/citocromo b2 é conhecida como um componente do espaço intermembrana mitiocondrial, requerido para a utilização de lactato. É incerto como a atividade do citocromo b2 poderia estar envolvida no aumento do teor de nitrogênio em uma célula, preferivelmente em plantas ou partes destas, particularmente pela geração ou aumento da atividade de citocromo bs2 em uma organela, preferivelmente em plastídeo.
Consequentemente, em uma forma de realização isto é obtido pelo acúmulo ou produção de um nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio. Em uma forma de realização o termo "nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio" como aqui usado diz respeito à proteína, contendo "aminoácidos", ou outros compostos contendo nitrogênio como compostos contendo "heme-complexo", "purina" e/ou "pririmidina" e/ou derivados. Além disso, em uma outra forma de realização o termo "nitrogênio ou compostos contendo nitrogênio" como aqui usado também diz respeito às composições de produtos químicos finos que compreendem compostos contendo N.
Consequentemente, a presente invenção diz respeito a um processo que compreende
(a) aumentar ou gerar a atividade de uma ou mais de uma proteína como mostrada na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação na 3, coluna 3 codificada pelas seqüências de ácido nucleico como mostrada na tabela I, aplicação ns 2 e/ou aplicação n2 3, coluna 5, em uma organela de um microorganismo ou planta, ou
(b) aumentar ou gerar a atividade de uma proteína como mostrada na tabela II, aplicação n2 2 e/ou aplicação n2 3, coluna 3 codificada pelas seqüências de ácido nucleico como mostrada na tabela I, aplicação n2 2 e/ou aplicação n2 3, coluna 5 no plastídeo de um microorganismo ou planta ou em uma ou mais partes deste; e
(c) cultivar o organismo sob condições que permitam o acúmulo e/ou produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio, assim, composto contendo N, no dito organismo ou no meio de cultura que circunda o organismo.
Consequentemente, a presente invenção diz respeito a um processo para o acúmulo e/ou produção de nitrogênio ou de compostos
contendo nitrogênio respectivamente que compreende
a) aumentar ou gerar a atividade de uma proteína selecionada do grupo como mostrado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n2 3, coluna 3 codificada pelas seqüências de ácido nucleico selecionadas do grupo como mostrado na tabela I, coluna 5, em uma organela de um organismo não
humano, ou
b) aumentar ou gerar a atividade de uma proteína selecionada do grupo como mostrado na tabela II, aplicação n2 2 e/ou aplicação n2 3, coluna 3 codificada pelas seqüências de ácido nucleico selecionadas do grupo como mostrado na tabela I, aplicação n2 2 e/ou aplicação ns 3, coluna 5, que
são unidos a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito em um organismo não humano ou em uma ou mais partes deste; ou
c) aumentar ou gerar a atividade de uma proteína selecionada do grupo como mostrado na tabela II, aplicação n2 2 e/ou aplicação n2 3, coluna 3 codificada pelas seqüências de ácido nucleico selecionadas do grupo
como mostrado na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação n2 3, coluna 5, que são unidos a uma seqüência de ácido nucleico que codifica a seqüência de localização de cloroplasto, em um organismo não humano ou em uma ou mais partes deste, e
d) cultivar o organismo sob condições que permitam o acúmulo de nitrogênio e/ou a produção de composto contendo N no dito organismo.
Vantajosamente a atividade da proteína selecionada do grupo como mostrado na tabela II, aplicação rr 2 e/ou aplicação n° 3, coluna 3 codificada pelas seqüências de ácido nucleico selecionadas do grupo como mostrado na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação n2 3, coluna 5 é aumentada ou gerada no processo supra citado no plastídeo de uma planta.
Em princípio a seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito pode ser isolada de cada organismo tal como microorganismos tais como algas ou plantas contendo plastídeos preferivelmente cloroplastos. Um "peptídeo de trânsito" é uma seqüência de aminoácido, cuja seqüência de ácido nucleico codificadora é traduzida junto com o gene estrutural correspondente. Isto significa que o peptídeo de trânsito é uma parte integral da proteína traduzida e forma uma extensão de terminal amino da proteína. Ambas são traduzidas como a chamada "preproteína". No geral o peptídeo de trânsito é clivado da preproteína durante ou exatamente depois da importação da proteína na organela celular correta tal como um plastídeo para produzir a proteína madura. O peptídeo de trânsito garante a localização correta da proteína madura pela facilitação do transporte de proteínas através de membranas intracelulares. As seqüências de ácido nucleico preferidas que codificam um peptídeo de trânsito são derivadas de uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína finalmente residida no plastídeo e é proveniente de um organismo selecionado do grupo que consiste dos gêneros
Acetabularia, Arabidopsis, Brassica, Capsicum,
Chlamydomonas, Cururbita, Dunaliella, Euglena, Flaveria, Glicina, Helianassim, Hordeum, Lemna, Lolium, Lycopersion, Malus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Oenotherea, Oryza, Petunia, Phaseolus, Physcom itrella, Pinus, Pisum, Raphanus, Sileno, Sinapis, Solanum, Spinacea, Stevia, Synechococcus, Triticum e Zea.
Vantajosamente tais peptídeos de trânsito, que são beneficamente usados no processo da invenção, são derivados da seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste de ribulose bisfosfato carboxilase/oxigenase, 5-enolpiruvil- shiquimato-3-fosfato sintase, acetolactato sintase, proteína ribossômica de cloroplasto CS17, proteína Cs, ferredoxina, plastocianina, ribulose bisfosfato carboxilase ativase, triptofano sintase, proteína carregadora de acila, chaperonina-60 plastídica, citocromo c552, proteína de choque térmico de 22 kDA, proteína 1 realçadora que envolve oxigênio de 33 kDa, subunidade γ da ATP sintase, subunidade δ da ATP sintase, proteína de ligação da clorofila a/b II-1, proteína realçadora que envolve oxigênio 2, proteína realçadora que envolve oxigênio 3, fotossistema I: P21, fotossistema I: P28, fotossistema I: P30, fotossistema I: P35, fotossistema I: P37, glicerol-3-fosfato aciltransferases, proteína de ligação da clorofila a/b, proteína CAB2, hidroximetil-bilano sintase, piruvato-ortofosfato dicinase, proteína CAB3, ferritina plastídica, ferritina, proteína indutível por luz inicial, glutamato-1- semialdeído aminotransferase, protoclorofilide redutase, amilase sintase ligada a grânulo de amido, proteína de ligação da clorofila a/b de coleta de luz do fotossistema II, alérgeno de pólen principal Lol ρ 5a, protease dependente do plastídeo ClpB ATP, superóxido dismutase, ferredoxina NADP oxidorredutase, ribonucleoproteína de 28 kDa, ribonucleoproteína de 31 kDa, ribonucleoproteína de 33 kDa, acetolactato sintase, subunidade CFO 1 da ATP sintase, subunidade CFO 2 da ATP sintase, subunidade CFO 3 da ATP sintase, subunidade CFO 4 da ATP sintase, citocromo f, ADP-glicose pirofosforilase, glutamina sintase, glutamina sintase 2, anidrase carbônica, proteína GapA, proteína de choque térmico hsp21, translocador de fosfato, protease dependente de plastídeo ClpA ATP, proteína ribossômica de plastídeo CL24, proteína ribossômica de plastídeo CL9, proteína ribossômica de plastídeo PsCL 18, proteína ribossômica de plastídeo PsCL25, DAHP sintase, amido fosforilase, proteína carregadora de acila de raiz II, betaína-aldeído desidrogenase, proteína GapB, glutamina sintetase 2, fosforribulocinase, nitrito redutase, proteína ribossômica L12, proteína ribossômica L13, proteína ribossômica L21, proteína ribossômica L35, proteína ribossômica L40, translocador da triose fosfato-3-fosfoglicrato-fosfato, glutamato sintase dependente de ferredoxina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, enzima málica dependente de NADP e NADP-malato desidrogenase.
Mais preferido a seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito é derivada de uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína finalmente residida no plastídeo e é proveniente de um organismo selecionado do grupo que consiste das espécies:
Acetabularia mediterrâneo, Arabidopsis thaliana, Brassica campestris, Brassiea napus, Capsieum annuum, Chlamydomonas reinhardtii, Cururbita mosehata, Dunaliella salina, Dunaliella tertioleeta, Euglena graeilis, Flaveria trinervia, Glicina max, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lemna gibba, Lolium perenne, Lyeopersion eseulentum, Malus domestica, Medicago faleata, Medieago sativa, Mesembryanthemum erystallinum, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana silvestris, Nieotiana tabaeum, Oenotherea hookeri, Oryza sativa, Petunia hybrida, Phaseolus vulgaris, Physcomitrella patens, Pinus tunbergii, Pisum sativum, Raphanus sativus, Silene pratensis, Sinapis alba, Solanum tuberosum, Spinaeea oleraeea, Stevia rebaudiana, Synechococcus, Syneehocystis, Triticum aestivum e Zea mays.
As seqüências de ácido nucleico ainda mais preferidas são peptídeos de trânsito codificadores como divulgado por von Heijne et ai. [Plant Molecular Biology Repórter, Vol. 9 (2), 1991: 104 - 126], que é por meio deste incorporada por referência. A Tabela V mostra alguns exemplos das seqüências de peptídeo de trânsito divulgadas por von Heijne et ai. De acordo com a divulgação da invenção especialmente nos exemplos o técnico habilitado é capaz de ligar outras seqüências de ácido nucleico divulgadas por von Heijne et ai. às seqüências de ácido nucleico mostradas na tabela I, aplicação ns 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7. O mais preferido as seqüências de ácido nucleico que codificam peptídeos de trânsito são derivadas do gênero Spinacia tal como a proteína ribossômica de cloroplasto 3OS PSrp-1, proteína carregadora de acila de raiz II, proteína carregadora de acila, ATP sintase: subunidade γ, ATP sintase: subunidade δ, citocromo f, ferredoxina I, ferredoxina NADP oxidorredutase (= FNR), nitrito redutase, fosforribulocinase, plastocianina ou anidrase carbônica. O técnico habilitado reconhecerá que várias outras seqüências de ácido nucleico que codificam peptídeos de trânsito podem ser facilmente isoladas a partir de proteínas localizadas em plastídeo, que são expressadas a partir de genes nucleares como precursores e são depois alvejadas aos plastídeos. Tais peptídeos de trânsito que codificam seqüências podem ser usados para a construção de outras construções de expressão. Os peptídeos de trânsito vantajosamente usados no processo da invenção e que são parte das seqüências de ácido nucleico e proteínas da invenção têm tipicamente de 20 a 120 aminoácidos, preferivelmente de 25 a 110, 30 a 100 ou 35 a 90 aminoácidos, mais preferivelmente de 40 a 85 aminoácidos e o mais preferivelmente de 45 a 80 aminoácidos no comprimento e funcionam pós traducionalmente para direcionar a proteína ao plastídeo preferivelmente ao cloroplasto. As seqüências de ácido nucleico que codificam tais peptídeos de trânsito são localizadas a montante da seqüência de ácido nucleico que codifica a proteína madura. Para a união molecular correta do ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito e o ácido nucleico que codifica a proteína a ser alvejada é algumas vezes necessário introduzir pares de base adicionais na posição de união, que forma seqüências de reconhecimento de enzima de restrição úteis para a junção molecular das diferentes moléculas de ácido nucleico. Este procedimento pode levar a muito poucos aminoácidos adicionais no terminal N da proteína importada madura, que usual e preferivelmente não interferem com a função da proteína. Em qualquer caso, os pares de base adicionais na posição de junção que forma seqüências de reconhecimento de enzima de restrição têm que ser escolhidas com cuidado, de modo a evitar a formação de códons de parada ou códons que codificam aminoácidos com uma influência forte no desdobramento de proteína, como por exemplo prolina. É preferido que tais códons adicionais codifiquem aminoácidos flexíveis estruturais n.d. pequenos tais como glicina ou alanina. Como mencionado acima as seqüências de ácido nucleico que
codificam as proteínas como mostradas na tabela II, aplicação 2 e/ou aplicação n° 3, coluna 3 e seus homólogos como divulgados na tabela I, colunas 5 e 7, respectivamente são unidos a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito, esta seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito garante o transporte da proteína para o plastídeo. A seqüência de ácido nucleico do gene a ser expressado e a seqüência de ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito são operavelmente ligado. Portanto o peptídeo de trânsito é fundido na matriz à seqüência de ácido nucleico que codifica proteínas como mostradas na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, coluna 3 e seus homólogos como divulgados na tabela I, aplicação ns 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7.
O termo "organela" de acordo com a invenção deve significar por exemplo "mitocôndria" ou preferivelmente "plastídeo" (por todo o relatório descritivo o "plural" deve compreender o "singular" e vice e versa). 25 O termo "plastídeo" de acordo com a invenção são intencionados a incluir várias formas de plastídeos incluindo proplastídeos, cloroplastos, cromoplastos, gerontoplastos, leucoplastos, amiloplastos, elaioplastos e etioplastos preferivelmente cloroplastos. Todos estes têm como um ancestral comum os proplastos anteriormente mencionados. Outros peptídeos de trânsito são divulgados por Schmidt et al. [J. Biol. Chem., Vol. 268, N5 36, 1993: 27447 - 27457], Della-Cioppa et ai. [Plant. Physiol. 84, 1987: 965 - 968], de Castro Silva Filho et ai [Plant Mol. Biol., 30, 1996: 769 - 780], Zhao et ai. [J. Biol. Chem. Vol. 270, NM1, 1995: 6081 - 6087], Rõmer et al. [Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 196, N2 3, 1993: 1414 - 1421], Keegstra et al. [Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 1989: 471 - 501], Lubben et al. [Photosynthesis Res., 17, 1988: 173 - 194] e Lawrence et al. [J. Biol. Chem., Vol. 272, Ns 33, 1997: 20357 - 20363]. Uma revisão geral a cerca do alvejamento é divulgado por Kermode Allison R. em Criticai Reviews em Plant Science 15 (4): 285 - 423 (1996) sob o título "Mechanisms of Intracellular Protein Transport and Targeting in Plant Cell."
As seqüências de peptídeo de trânsito favorecidas, que são usadas no processo da invenção e que forma parte das seqüências de ácido nucleico da invenção são no geral enriquecidas em resíduos de aminoácido hidroxilados (serina e treonina), com estes dois resíduos no geral constituindo 20 a 35% do total. Estas freqüentemente têm uma região de terminal amino vazia de Gly, Pro e resíduos carregados. Além disso elas têm vários aminoácidos hidrofóbicos pequenos tais como valina e alanina e no geral aminoácidos ácidos estão faltando. Além disso elas no geral têm uma região central rica em Ser, Thr, Lys e Arg. De ponta a ponta elas têm muito freqüentemente uma carga positiva líquida.
Alternativamente, as seqüências de ácido nucleico que codificam os peptídeos de trânsito podem ser quimicamente sintetizadas em parte ou inteiramente de acordo com a estrutura das seqüências de peptídeo de trânsito divulgadas na técnica anterior. As ditas seqüências naturais ou quimicamente sintetizadas podem ser diretamente ligadas às seqüências que codificam a proteína madura ou por intermédio de uma seqüência de ácido nucleico ligadora, que pode ter tipicamente menos do que 500 pares de base, preferivelmente menos do que 450, 400, 350, 300, 250 ou 200 pares de base, mais preferivelmente menos do que 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ou 30 pares de base e o mais preferivelmente menos do que 25, 20, 15, 12, 9, 6 ou 3 pares de base no comprimento e estão na matriz com a seqüência codificadora. Além disso, as seqüências de ácido nucleico favoráveis que codificam peptídeos de trânsito podem compreender seqüências derivadas de mais do que uma fonte biológica e/ou química e podem incluir uma seqüência de ácido nucleico derivada da região de terminal amino da proteína madura, que no seu estado nativo está ligada ao peptídeo de trânsito. Em uma forma de realização preferida da invenção a dita região de terminal amino da proteína madura têm tipicamente menos do que 150 aminoácidos, preferivelmente menos do que 140, 130, 120, 110, 100 ou 90 aminoácidos, mais preferivelmente menos do que 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25 ou 20 aminoácidos e o mais preferivelmente menos do que 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos no comprimento. Mas mesmo os trechos mais curtos ou mais longos também são possíveis. Além disso as seqüências alvo, que facilitam o transporte de proteínas para outros compartimentos celulares tais como o vacúolo, retículo endoplasmático, complexo de golgi, glioxissomas, peroxissomas ou mitocôndria também podem ser parte da seqüência de ácido nucleico da invenção. As proteínas traduzidas a partir das ditas seqüências de ácido nucleico da invenção são um tipo de proteínas de fusão o que significa que as seqüências de ácido nucleico que codificam o peptídeo de trânsito por exemplo aquelas mostradas na tabela V, preferivelmente a última da tabela são unidas às seqüências de ácido nucleico mostradas na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação ns 3, colunas 5 e 7. A pessoa habilitada na técnica é capaz de unir as ditas seqüências em uma maneira funcional. Vantajosamente a parte do peptídeo de trânsito é clivada da parte da proteína mostrada na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n2 3, colunas 5 e 7 durante o transporte preferivelmente nos plastídeos. Todos os produtos da clivagem do peptídeo de trânsito preferido mostrado na última linha da tabela V têm preferivelmente as seqüências de aminoácido de terminal N QIA CSS ou QIA EFQLTT em frente da metionina de partida da proteína mencionada na tabela II, colunas 5 e 7. Outras seqüências de aminoácido curtas de uma faixa de 1 a 20 aminoácidos preferivelmente de 2 a 15 aminoácidos, mais preferivelmente de 3 a 10 aminoácidos o mais preferivelmente de 4 a 8 aminoácidos também são possíveis em frente da metionina de partida da proteína mencionada na tabela II, colunas 5 e 7. No caso da seqüência de aminoácido QIA CSS os três aminoácidos em frente da metionina de início são derivados do cassete LIC (= clonagem independente de ligação). A dita seqüência de aminoácido curta é preferida no caso da expressão de genes da E. coli. No caso da seqüência de aminoácido QIA EFQLTT os seis aminoácidos em frente da metionina de partida são derivados do cassete LIC. A dita seqüência de aminoácido curta é preferida no caso da expressão dos genes da S. cerevisiae. O técnico habilitado sabe que outras seqüências curtas também são úteis na expressão dos genes mencionados na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação nfi 3, colunas 5 e 7. Além disso o técnico habilitado está ciente do fato de que não existe uma necessidade quanto a tais seqüências curtas na expressão dos genes.
Tabela V: Exemplos de peptídeos de trânsito divulgados por von Heijne et ai.
<table>table see original document page 229</column></row><table> <table>table see original document page 230</column></row><table> Alternativamente ao alvejamento das seqüências mostradas na tabela II, aplicação ns 2 e/ou aplicação ns 3, colunas 5 e 7 preferivelmente de seqüências no geral codificadas no núcleo com auxílio das seqüências alvejadoras mencionadas por exemplo na tabela V sozinhas ou em combinação com outras seqüências alvej adoras preferivelmente nos plastídeos, os ácidos nucleicos da invenção podem ser diretamente introduzidos no genoma plastídico. Preferivelmente as seqüências de ácido nucleico mostradas na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e .7 são diretamente introduzidas no genoma plastídico em um tal modo que eles estejam sob o controle de um promotor ativo em plastídeo.
Portanto em uma forma de realização preferida as seqüências de ácido nucleico mostradas na tabela I, aplicação ns 2 e/ou aplicação ns 3, colunas 5 e 7 são diretamente introduzidas e expressadas em plastídeo.
O termo "introduzida" no contexto deste relatório descritivo deve significar a inserção de uma seqüência de ácido nucleico no organismo por meio de uma "transfecção", "transdução" ou preferivelmente pela "transformação".
Um plastídeo, tal como um cloroplasto, foi "transformado" por uma seqüência de ácido nucleico exógena (preferivelmente estranha) se a seqüência de ácido nucleico foi introduzida no plastídeo o que significa que esta seqüência cruzou a membrana ou as membranas do plastídeo. O DNA estranho pode ser integrado (covalentemente ligado) no DNA plastídico compondo o genoma do plastídeo ou o mesmo pode permanecer não integrado (por exemplo, pela inclusão de uma origem de cloroplasto de replicação). "Estavelmente" seqüências de DNAs integradas são aquelas, que são herdadas através da replicação de plastídeo, transferindo deste modo novos plastídeos, com as características da seqüência de DNA integrada à progênie.
Para a expressão uma pessoa habilitada na técnica está familiarizada com métodos diferentes para introduzir as seqüências de ácido nucleico em organelas diferentes tais como os plastídeos preferidos. Tais métodos são por exemplo divulgados por Pal Maiga (Annu. Rev. Plant Biol., 2004, 55: 289 - 313), Thomas Evans (WO 2004/040973), Kevin E. McBride et ai. (US 5,455,818), Henry Daniell et al. (US 5.932.479 e US 5.693.507) e Jeffrey M. Straub et al. (US 6.781.033). Um método preferido é a transformação de hipocotilo ou tecido cotiledonário derivado de tecido de folha de microsporo (que são verdes e assim contêm numerosos plastídeos) e subseqüentemente a regeneração de brotos do dito material vegetal transformado em meio seletivo. Como métodos para a transformação o bombardeamento do material vegetal ou o uso de vetores de transporte que replicam independentemente são bem conhecidos pelo técnico habilitado. Mas também uma transformação mediada por PEG dos plastídeos ou transformação de Agrobacterium com vetores binários são possíveis. Os marcadores úteis para a transformação de plastídeos são marcadores de seleção positivos por exemplo os genes de resistência ao cloranfenicol, estreptomicina, canamicina, neomicina, amicamicina, espectinomicina, triazina e/ou lincomicina. Como marcadores adicionais denominados na literatura freqüentemente como marcadores secundários, os genes que codificam a resistência mais uma vez contra herbicidas tais como fosfmotricina (= glifosinato, BASTA®, Liberty®, codificados pelo gene bar), glifosato (= N-(fosfonometil)glicina, Roundup Ready®, codificada pelo gene da 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase = epsps), sulfoniluréia (= Staple®, codificada pelo gene da acetolactato sintase), imidazolinona [= IMI, imazetapir, imazamox, Clearfield®, codificada pelo gene da aceto-hidróxi ácido sintase (AHAS), também conhecido como o gene da acetolactato sintase (ALS)] ou bromoxinil (= Buctril®, codificado pelo gene oxy) ou genes que codificam antibióticos tais como higromicina ou G418 são úteis para outra seleção. Tais marcadores secundários são úteis no caso quando mais cópias do genoma são transformadas. Além disso marcadores de seleção negativos tais como a citosina desaminase bacteriana (codificada pelo gene codA) também são úteis para a transformação de plastídeos.
Para aumentar a possibilidade de identificação de transformantes também é desejável usar outros genes repórter depois dos genes de resistência anteriormente mencionados ou além dos ditos genes. Os genes repórter são por exemplo os genes da β-galactosidase, β-glicuromdase (GUS), fosfatase alcalina e/ou proteína fluorescente verde (GFP).
Para o processo da invenção é de enorme vantagem que pela transformação dos plastídeos o fluxo de transgene específico de intraespécies é bloqueado, porque um lote de espécies tais como milho, algodão e arroz têm uma herança materna estrita de plastídeos. Colocando-se os genes especificados na tabela I, aplicação ne 2 e/ou aplicação nfi 3, colunas 5 e 7 ou fragmentos ativos destes nos plastídeos de plantas, estes genes não estarão
presentes no pólen das ditas plantas.
Uma outra forma de realização preferida da invenção diz
respeito ao uso das chamadas "seqüências de localização de cloroplasto", em que uma primeira seqüência ou molécula de RNA é capaz de transportar ou "acompanhar" uma segunda seqüência de RNA, tal como uma seqüência de RNA transcrita a partir das seqüências selecionadas do grupo como descrito na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação ns 3, colunas 5 e 7 ou uma seqüência que codifica uma proteína selecionada do grupo como descrito na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação ns 3, colunas 5 e 7, de um ambiente externo dentro de uma célula ou fora de um plastídeo em um cloroplasto. Em uma forma de realização o sinal de localização de cloroplasto é substancialmente similar ou complementar a uma seqüência de viróide completa ou intacta. O sinal de localização de cloroplasto pode ser codificado por uma seqüência de DNA, que é transcrita no RNA de localização do cloroplasto. O termo "viróide" refere-se a uma molécula de RNA de filamento único que ocorre naturalmente (Flores, C R Acad Sci III. Out de 2001; 324(10): 943-52). Viróides usualmente contêm cerca de 200 a 500 nucleotídeos e no geral existem como moléculas circulares. Os exemplos de viróides que contêm sinais de localização de cloroplasto incluem mas não são limitados ao ASBVd, PLMVd, CChMVd e ELVd. A seqüência de viróide ou uma parte funcional desta podem ser fundidas às seqüências selecionadas do grupo como descrito na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação ns 3, colunas 5 e 7 ou uma seqüência que codifica uma proteína selecionada do grupo como descrito na tabela II, aplicação nfi 2 e/ou aplicação n2 3, colunas 5 e 7 em uma tal maneira que a seqüência de viróide transporte uma seqüência transcrita de uma seqüência como descrita na tabela I, aplicação ns 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou uma seqüência que codifica uma proteína como descrita na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 nos cloroplastos. Uma forma de realização preferida usa um ASBVd modificado (Navarro et al., Virology. 1 de Mar de 2000; 268(1): 218-25).
Em uma outra forma de realização específica a proteína a ser expressada nos plastídeos tal como as proteínas selecionadas do grupo como descrito na tabela II, aplicação n° 2 e ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 são codificadas pelos ácidos nucleicos diferentes. Um tal método é divulgado na WO 2004/040973, que deve ser incorporada por referência. A WO .2004/040973 divulga um método, que diz respeito à translocalização de um RNA correspondente a um gene ou fragmento de gene no cloroplasto por meio de uma seqüência de localização de cloroplasto. Os genes, que devem ser expressados na planta ou células da planta, são divididas em fragmentos de ácido nucleico, que são introduzidos em compartimentos diferentes na planta por exemplo no núcleo, nos plastídeos e/ou mitocôndria. Adicionalmente as células vegetais são descritas em que o cloroplasto contém uma ribozima fundida em uma extremidade a um RNA que codifica um fragmento de uma proteína usada no processo da invenção tal que a ribozima possa trans-unir o RNA de fusão translocalizada ao RNA que codifica o fragmento de gene para formar e como o caso pode ser tornar a unir os fragmentos de ácido nucleico a um mRNA intacto que codifica uma proteína funcional por exemplo selecionado do grupo como divulgado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n2 3, colunas 5 e 7.
Em uma forma de realização preferida da invenção as seqüências de ácido nucleico selecionadas do grupo como mostrado na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 usada no processo da invenção são transformadas nos plastídeos, que são metabolicamente ativos. Estes plastídeos devem preferivelmente se manter em um número de cópia alto na planta ou tecido vegetal de interesse, o mais preferivelmente os cloroplastos encontrados em tecidos vegetais verdes, tais como folhas ou cotilédones ou em sementes.
Para uma boa expressão nos plastídeos as seqüências de ácido nucleico como mostradas na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 são introduzidas em um cassete de expressão usando preferivelmente um promotor e terminador, que sejam ativos em plastídeo preferivelmente um promotor de cloroplasto e terminador de cloroplasto respectivamente. Os exemplos de tais promotores incluem o promotor psbA do gene do espinafre ou ervilha, o promotor rbcL e o promotor atpB do milho.
Surpreendentemente foi descoberto que a expressão transgênica da proteína selecionada do grupo como mostrado na tabela II, aplicação nfi 2 e/ou aplicação n° 3, coluna 3 em plastídeo de uma planta tal como Arabidopsis thaliana por exemplo através da ligação a pelo menos uma seqüência alvejadora por exemplo como mencionado na tabela V conferiu um aumento no teor de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio das plantas transformadas.
Em uma forma de realização, no processo da presente invenção a atividade de uma proteína selecionada do grupo como mostrado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, coluna 3 é aumentada ou gerada ou um homólogo deste, preferivelmente ligado pelo menos a um peptídeo de trânsito como mencionado por exemplo na tabela V. Em uma outra forma de realização, no processo da presente invenção a atividade de uma proteína selecionada do grupo como mostrado na tabela II, aplicação n2 2 e/ou aplicação n~ 3, coluna 3 é aumentada ou gerada em um subcompartimento celular do organismo ou célula do organismo tal como em uma organela como um plastídeo ou mitocôndria.
A seqüência de YNL241C (Número de acesso NP_014158) de Saccharomyces eerevisiae foi publicada em Goffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996 e Philippsen et al., Nature 387 (6632 Supl), 93-98 (1997) e a sua atividade está sendo definida como a "glicose-6-fosfato desidrogenase (Zwflp)". Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrada, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para aumentar a quantidade de um composto contendo N em um organismo ou uma parte deste, como mencionado.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou assimilação melhoradas de nitrogênio. Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrada, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou utilização e/ou assimilação aumentadas de nitrogênio sob condições limitadas de nitrogênio.
A seqüência de bl852 (Número de acesso NP_416366) de Escherichia coli foi publicada em Blattner et ai, Science 277 (5331), 1453- .1474 (1997) e a sua atividade está sendo definida como "glicose-6-fosfato desidrogenase". Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso de uma "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrada, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para aumentar a quantidade de um composto contendo N em um organismo ou uma parte deste, como mencionado.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso de uma "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrada, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, para a captação e/ou assimilação melhoradas de nitrogênio..
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso de uma "glicose-6-fosfato desidrogenase" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrada, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou utilização e/ou assimilação aumentadas de nitrogênio sob condições limitadas de nitrogênio.
A seqüência de YJL167W (Número de acesso NP_012368,1) de Saccharomyces eerevisiae foi publicada em Goffeau et ai., Science 274 (5287), 546-547, 1996 e Anderson et ai, J. Biol. Chem 264, 19176-19184 (1989) e a sua atividade está sendo definida como "farnesil pirofosfato sintetase (FPP sintase)". Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "farnesil pirofosfato sintetase (FPP sintase)" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para aumentar a quantidade de um composto contendo N em um organismo ou uma parte deste, como mencionado.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "farnesil pirofosfato sintetase (FPP sintase)" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou assimilação melhoradas de nitrogênio. Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "farnesil pirofosfato sintetase (FPP sintase)" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrada, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou utilização e/ou assimilação aumentadas de nitrogênio sob condições limitadas de nitrogênio.
A seqüência de YML045C (Número de acesso NP_013658.1) de Saccharomyces eerevisiae foi publicada em Goffeau et al., Science 274 (5287), 546-547, 1996 e Guiard et al., EMBO J. 4, 3265-3272 (1985) e a sua atividade está sendo definida como "L-lactato citocromo c oxidorredutase/citocromo b2". Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "L- lactato citocromo c oxidorredutase/citocromo b2" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrada, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para aumentar a quantidade de um composto contendo N em um organismo ou uma parte deste, como mencionado.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "L-lactato citocromo c oxidorredutase/citocromo b2" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou assimilação melhoradas de nitrogênio.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende o uso da dita "L-lactato citocromo c oxidorredutase/citocromo b2" ou seu homólogo, preferivelmente em plastídeo, por exemplo como aqui mostrado, para a produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e/ou para conferir uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio realçados e/ou um teor de nitrogênio total aumentado, significativo de um composto contendo N, em particular para a captação e/ou utilização e/ou assimilação aumentadas de nitrogênio sob condições limitadas de nitrogênio.
Por exemplo, o número de molécula ou a atividade específica do polipeptídeo ou da molécula de ácido nucleico podem ser aumentados. Quantidades maiores do composto contendo N pode ser produzido se o polipeptídeo ou o ácido nucleico da invenção é expressado de novo em um organismo que carece da atividade da dita proteína, preferivelmente as moléculas de ácido nucleico selecionadas do grupo como mencionado na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação n~ 3, colunas 5 e 7 sozinho ou preferivelmente em combinação com um peptídeo de trânsito por exemplo como mencionado na tabela V ou em uma outra forma de realização pela introdução das ditas moléculas de ácido nucleico em uma organela tal como um plastídeo ou mitocôndria no organismo transgênico. Entretanto, também é possível modificar a expressão do gene que está naturalmente presente nos organismos, por exemplo pela integração de uma seqüência de ácido nucleico, que codifica uma seqüência que alveja plastídeo em frente (iniciador 5) da seqüência codificadora, levando a uma preproteína funcional, que é direcionada por exemplo aos plastídeos.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína YNL241C de Saccharomyces eerevisiae ou seus homólogos, por exemplo como indicada na Tabela II, colunas 5 ou 7, linha 3, é aumentada preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos; preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio, preferivelmente de teor de nitrogênio total entre 9% e 12% ou mais é conferido, preferivelmente um aumento no teor de aminoácido em uma planta entre 14% e 27% ou mais é conferido.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína YNL241C de Saccharomyces cerevisiae ou seus homólogos é aumentada preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio e de ácidos graxos, fitosterol, frutose e/ou glicose em folhas e/ou carboidrato nas sementes de uma planta é conferido.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína bl852 de E. coli ou seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, linha 2, é aumentada preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos; preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio, preferivelmente de teor total de nitrogênio entre 6% e 13% ou mais é conferido, preferivelmente um aumento no teor de aminoácido em uma planta entre 28% e 62% ou mais é conferido.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína YJL167W de Saccharomyees cerevisiae ou seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, aplicação n2 3, linha 4, é aumentada, preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio entre 5% e 30% ou mais, preferivelmente entre 8% e 26% ou mais é conferido preferivelmente nas sementes.
Em uma forma de realização, no caso a atividade da proteína YML054C de Saccharomyees cerevisiae ou seus homólogos, por exemplo como indicado na Tabela II, colunas 5 ou 7, aplicação n° 3, linha 5, é aumentada, preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, preferivelmente, um aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio entre 5% e 20% ou mais, preferivelmente entre 6% e 15% ou mais é conferido preferivelmente nas sementes.
Em uma forma de realização, o processo da presente invenção compreende uma ou mais das seguintes etapas
a) estabilizar uma proteína que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou do polipeptídeo da invenção, por exemplo de um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou a atividade de seus homólogos tendo o composto aqui mencionado contendo a atividade de aumentar N preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos; e/ou
b) estabilizar um mRNA que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção, que é no sentido da invenção uma fusão de uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito e de uma seqüência de ácido nucleico selecionada do grupo como mostrado na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7, por exemplo uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou seus homólogos ou de um mRNA que codifica o polipeptídeo da presente invenção tendo a atividade aumentada do composto contendo N aqui mencionado; e/ou
c) aumentar a atividade específica de uma proteína que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou do polipeptídeo da presente invenção tendo a atividade de aumentar o composto contendo N aqui mencionado, por exemplo de um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação nfi 2 e/ou aplicação ne 3, colunas 5 e 7 ou a atividade de seus homólogos preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos ou diminuir a regulagem inibidora do polipeptídeo da invenção; e/ou
d) gerar ou aumentar a expressão de um fator de transcrição endógeno ou artificial que medeie a expressão de uma proteína que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou do polipeptídeo da invenção tendo a atividade de aumentar o composto contendo N aqui mencionado, por exemplo de um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou seus homólogos preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos; e/ou
e) estimular a atividade de uma proteína que confere a expressão aumentada de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da presente invenção ou um polipeptídeo da presente invenção tendo a atividade de aumentar o composto contendo N aqui mencionado, por exemplo de um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação n~ 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou a atividade de seus homólogos preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, pela adição de um ou mais fatores indutores exógenos aos organismos ou partes destes; e/ou
f) expressar um gene transgênico que codifica uma proteína que confere a expressão aumentada de um polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico da presente invenção ou um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, tendo a atividade de aumentar o composto contendo N aqui mencionado, por exemplo de um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação ns 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou a atividade de seus homólogos, e/ou
g) aumentar o número de cópia de um gene que confere a expressão aumentada de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção ou o polipeptídeo da invenção tendo a atividade de aumentar o composto contendo N aqui mencionado, por exemplo de um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação n2 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou a atividade de seus homólogos; e/ou
h) aumentar a expressão do gene endógeno que codifica o polipeptídeo da invenção, por exemplo um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação ns 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou a atividade de seus homólogos preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, pela adição de elementos de expressão positiva ou que remove a expressão negativa, por exemplo a recombinação homóloga pode ser usada para introduzir elementos reguladores positivos como para as plantas o realçador 35S no promotor ou para remover elementos repressores das regiões reguladoras. Outros métodos de conversão de gene podem ser usados para romper elementos repressores ou para realçar a atividade de elementos positivos. Elementos positivos podem ser aleatoriamente introduzidos em plantas pela T-DNA ou mutagênese de transposon e linhagens podem ser identificadas em que os elementos positivos foram integrados próximo a um gene da invenção, a expressão do qual é por meio deste realçada;e/ou
i) modular as condições de crescimento de um organismo em uma tal maneira, que a expressão ou atividade do gene que codifica a proteína da invenção ou a própria proteína sejam realçadas por exemplo microorganismos ou plantas podem ser cultivados por exemplo sob um regime de temperatura mais alta levando a uma expressão realçada de proteínas de choque térmico, que pode levar a uma produção realçada de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio; e/ou
j) selecionar de organismos com atividade especialmente alta das proteínas da invenção preferivelmente em um compartimento celular, preferivelmente nos plastídeos, de recursos naturais ou de mutagenizado e reproduzi-las nos organismos alvo, por exemplo, as safras de elite; e/ou
k) direcionar uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou do polipeptídeo da presente invenção tendo a atividade de aumentar o composto contendo N aqui mencionado, por exemplo de um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou a atividade de seus homólogos, aos plastídeos pela adição de uma seqüência de alvejamento plastídica; e/ou
1) gerar a expressão de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou do polipeptídeo da presente invenção tendo a atividade de aumentar o composto contendo N aqui mencionado, por exemplo de um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas .5 e 7 ou a atividade de seus homólogos em plastídeo pela transformação estável ou transitória vantajosamente transformação estável de organelas preferivelmente plastídeos com uma seqüência de ácido nucleico da invenção preferivelmente na forma de um cassete de expressão contendo a dita seqüência que leva à expressão plastídica dos ácidos nucleicos ou polipeptídeos da invenção; e/ou
m) gerar a expressão de uma proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção ou do polipeptídeo da presente invenção tendo a atividade de aumentar o composto contendo N aqui mencionado, por exemplo de um polipeptídeo tendo a atividade de uma proteína selecionada do grupo como indicado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação ne 3, colunas 5 e 7 ou a atividade de seus homólogos em plastídeo pela integração de um ácido nucleico da invenção no genoma plastídico sob o controle preferivelmente de um promotor plastídico.
Pode-se considerar também introduzir seqüências de ácidos nucleicos, que codificam sinais alvej adores plastídicos, como por exemplo presente na tabela V, pela recombinação homóloga ou outros métodos de integração específica de sítio, no genoma deste modo, que um gene endógeno é funcionalmente fundido às seqüência alvej adoras e a proteína é redirecionada aos plastídeos. Eventualmente a integração também pode ocorrer aleatoriamente e o evento de fusão desejado é selecionado.
Em uma forma de realização preferida, a presente invenção diz respeito a um processo para o acúmulo e/ou produção de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio respectivamente que compreende ou gerar em um organismo ou uma parte deste, preferivelmente em um compartimento celular tal como um plastídeo ou mitocôndria, a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste de:
a) molécula de ácido nucleico que codifica, preferivelmente pelo menos a forma madura, do polipeptídeo selecionado do grupo mostrado na tabela II, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou um fragmento deste, que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste;
b) molécula de ácido nucleico que compreende, preferivelmente pelo menos a forma madura, da molécula de ácido nucleico selecionada do grupo mostrado na tabela I, aplicação n~ 2 e/ou aplicação na 3, colunas 5 e 7;
c) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode ser deduzida a partir de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula de ácido nucleico de (a) ou (b) como resultado da degeneração do código genético e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste;
d) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificada pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste;
e) molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (a) a (c) sob condições de hibridização estringente e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste;
f) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, o polipeptídeo sendo derivado pela substituição, deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos da seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pelas moléculas de ácido nucleico de (a) a (d), preferivelmente de (a) a (c) e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste;
g) molécula de ácido nucleico que codifica um fragmento ou um epítopo de um polipeptídeo que é codificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (e), preferivelmente de (a) a (c) e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste;
h) molécula de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico que é obtida pela amplificação das moléculas de ácido nucleico de uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando os iniciadores mostrados na tabela III, aplicação n° 2 e/ou aplicação n~ 3, coluna 7 e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste; i) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que é isolado, por exemplo de uma biblioteca de expressão, com o auxílio de anticorpos monoclonais mais uma vez contra um polipeptídeo codificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (h), preferivelmente de (a) a (c) e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste;
j) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende a seqüência de consenso selecionada do grupo mostrado na tabela IV, aplicação ns 2 e/ou aplicação n2 3, coluna 7 e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste;
k) molécula de ácido nucleico que compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo que codifica um domínio do polipeptídeo selecionado do grupo mostrado na tabela II, aplicação ττ 2 e/ou aplicação ns 3, colunas 5 e 7 e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste; e
1) molécula de ácido nucleico que é obtenível pela triagem de uma biblioteca adequada sob condições estringentes com uma sonda que compreende uma das seqüências da molécula de ácido nucleico de (a) a (k), preferivelmente de (a) a (c) ou com um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos, preferivelmente 20 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou 500 nucleotídeos da molécula de ácido nucleico caracterizada de (a) a (k), preferivelmente de (a) a (c) e que confere um aumento na quantidade de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio em um organismo ou uma parte deste; ou que compreende uma seqüência que seja complementar a esta.
As moléculas de ácido nucleico com a seqüência mostrada na tabela I, aplicação n° 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7, as moléculas de ácido nucleico que são derivadas das seqüências de aminoácido mostradas na tabela II, aplicação n2 2 e/ou aplicação n° 3, colunas 5 e 7 ou de polipeptídeos que compreendem a seqüência de consenso mostrada na tabela IV, aplicação ns 2 e/ou aplicação n° 3, coluna 7 ou seus derivados ou homólogos que codificam polipeptídeos com a atividade enzimática ou biológica de uma proteína como mostrada na tabela II, aplicação ns 2 e/ou aplicação n° 3, coluna 3 ou que confere aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio depois de aumentar a sua expressão ou atividade são vantajosamente aumentadas no processo de acordo com a invenção pela expressão no citossol ou em uma organela tal como um plastídeo ou mitocôndria ou ambos, preferivelmente em plastídeo.
As moléculas de ácido nucleico usadas no processo de acordo com a invenção tomam a forma de seqüências isoladas de ácido nucleico, que codificam polipeptídeos com a atividade das proteínas selecionadas do grupo como mostrado na tabela II, aplicação nfi 2 e/ou aplicação n~ 3, coluna 3 e que confere aumento de nitrogênio ou de compostos contendo nitrogênio pela expressão no citossol ou em uma organela tal como um plastídeo ou mitocôndria ou ambas, preferivelmente em plastídeo.
A seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção mencionada acima é de modo vantajosamente funcional unida a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito, em uma tal maneira que uma preproteína seja traduzida, que é capaz de direcionar o polipeptídeo para a organela tal como para o plastídeo. Em uma outra forma de realização preferida os ácidos nucleicos de acordo com a invenção mencionados acima são de modo vantajosamente funcional unidos a uma região promotora funcional em plastídeo como por exemplo o promotor de operon de RNA fundido à 5'UTR do gene rbcL e em uma outra forma de realização preferida unida a uma seqüências de plastome homólogas aos sítios de integração. Os exemplo para os sítios de integração úteis são o trnV- rpsl2/7 (Skidar et al., Plant Cell Rep. 1998, 18: 20-24 e outros relatos), os sítio thr rbvL-aacD (Svab et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 913-917), o sítio trnl-trnA (De Cosa et al., 2001, Nat. Biotech. 19, 71-74) o sítio rps7-ndhB (Hou et al., 2003, Transgenie Res. 12, 111-114) e o sítio ndhF- trnL Zhang et al., 2001c, Plant Physiol. 127, 131-141)
A seqüência de ácido nucleico que codifica o peptídeo de trânsito é vantajosamente derivado de uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína finalmente residida no plastídeo e é derivada de um organismo selecionado do grupo que consiste dos gênerosAcetabularia, Arabidopsis, Brassica, Chlamydomonas, Cururbita, Dunaliella, Euglena, Flaveria, Glicina, Helianassim, Hordeum, Lemna, Lolium, Lycopersion, Malus, Mesembryanthemum, Nicotiana, Oenotherea, Oryza, Petúnia, Phaseolus, Physcomitrella, Pinus, Pisum Raphanus, Sileno, Sinapis, Solanum, Spinacea, Triticum e Zea.
Preferivelmente o peptídeo de trânsito é derivado de uma proteína selecionada do grupo que consiste da ribulose bisfosfato carboxilase/oxigenase, 5-enolpiruvil-shiquimato-3-fosfato sintase, acetolactato sintase, proteína ribossômica de cloroplasto CS17, proteína Cs, ferredoxina, plastocianina, ribulose bisfosfato carboxilase ativase, triptofano sintase, proteína carregadora de acila, plastídeo chaperonin-60, citocromo C552, proteína de choque térmico de 22 kDA, proteína 1 realçadora que envolve oxigênio de 33 kDa, subunidade γ da ATP sintase, subunidade δ da ATP sintase, proteína de ligação a/b de clorofila II-1, proteína 2 realçadora que envolve oxigênio, proteína 3 realçadora que envolve oxigênio, fotossistema I: P21, fotossistema I: P28, fotossistema I: P30, fotossistema I: P35, fotossistema I: P37, glicerol-3-fosfato aciltransferases, proteína de ligação a/b de clorofila, proteína CAB2, hidroximetil-bilano sintase, piruvato- ortofosfato dicinase, proteína CAB3, ferritina de plastídeo, ferritina, proteína indutível por luz inicial, glutamato-l-semialdeído aminotransferase, protoclorofilida redutase, amilase sintase ligada a grânulo de amido, proteína de ligação a/b de clorofila de coleta de luz do fotossistema II, alérgeno de pólen maior Lol ρ 5 a, protease dependente de ClpB ATP de plastídeo, superóxido dismutase, ferredoxina NADP oxidorredutase, ribonucleoproteína de 28 kDa, ribonucleoproteína de 31 kDa, ribonucleoproteína de 33 kDa, acetolactato sintase, ATP sintase CF0 subunidade 1, ATP sintase CF0 subunidade 2, ATP sintase CF0 subunidade 3, ATP sintase CF0 subunidade 4, citocromo f, ADP-glicose pirofosforilase, glutamina sintase, glutamina sintase .2, anidrase carbônica, proteína GapA, proteína de choque térmico hsp21, translocador de fosfato, protease dependente de ClpA ATP de plastídeo, proteína ribossômica CL24 de plastídeo, proteína ribossômica CL9 de plastídeo, proteína ribossômica PsCL 18 de plastídeo, proteína ribossômica PsCL25 de plastídeo, DAHP sintase, amido fosforilase, proteína carregadora de acila II de raiz, betaína-aldeído desidrogenase, proteína GapB, glutamina sintetase 2, fosforibulocinase, nitrito redutase, proteína ribossômica L12, proteína ribossômica L13, proteína ribossômica L21, proteína ribossômica L35, proteína ribossômica L40, deslocador da triose fosfato-3-fosfoglicerato- fosfato, glutamato sintase dependente de ferredoxina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, enzima málica dependente de NADP e NADP-malato desidrogenase. As seqüências de plastoma são derivados preferenciais do plastoma dos próprios organismos alvo e são vantajosamente derivados de um dos seguintes sítios de integração: trnV-rpsl2/7 (Skidar et al, Plant Cell Rep. .1998, 18: 20-24 e outros relatos), rbvL-aacD (Svab et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 913-917), trnl-trnA (De Cosa et al, 2001, Nat. Biotech. .19, 71-74) rps7-ndhB (Hou et al., 2003, Transgenic Res. 12, 111-114) ou sítio ndhF-trnL Zhang et al., 2001c, Plant Physiol. 127, 131-141).
As seqüências de ácido nucleico usadas no processo são vantajosamente introduzidas em uma construção de ácido nucleico, preferivelmente um cassete de expressão, que torna possível a expressão das moléculas de ácido nucleico em um organismo, vantajosamente uma planta ou um microorganismo tal como uma alga, vantajosamente nos plastídeos destes organismos.
Em princípio, a construção de ácido nucleico pode compreender as seqüências reguladoras aqui descritas e outras seqüências relevantes quanto a expressão dos genes compreendidos. Assim, a construção de ácido nucleico da invenção pode ser usada como cassete de expressão e assim pode ser usada diretamente para a introdução na planta ou mesmo estas podem ser introduzidas em um vetor. Consequentemente em uma forma de realização a construção de ácido nucleico é um cassete de expressão que compreende um microorganismo promotor ou um microorganismo terminador ou ambos. Em uma outra forma de realização o cassete de expressão abrange um promotor vegetal ou um terminador vegetal ou ambos. Em uma outra forma de realização o cassete de expressão abrange seqüências para a transcrição pelas RNA polimerases de plastídeo.
Consequentemente, em uma forma de realização, o processo de acordo com a invenção compreende as seguintes etapas:
(a) introdução de uma construção de ácido nucleico que compreende a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção ou que codifica o polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da invenção; ou
(b) introdução de uma molécula de ácido nucleico, incluindo seqüências ou fatores regulatórios, cuja expressão aumenta a expressão da molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção ou que codifica o polipeptídeo da presente invenção ou usado no processo da invenção;
em uma célula ou um organismo ou uma parte deste, preferivelmente em uma planta, célula vegetal ou um microorganismo preferivelmente nas organelas tais como os plastídeos deste, e (c) expressar o produto de gene codificado pela construção de ácido nucleico ou a molécula de ácido nucleico mencionada sob (a) ou (b) na célula ou no organismo ou parte destes.
Em uma forma de realização da invenção, vetores de expressão vegetal abrangem aqueles que são descritos nas figuras: Fig. 3 e/ou Fig,4.
Exemplo 1: Clonagem das seqüências da invenção de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 327, 987 ou 1156 para a expressão em plantas
A menos que de outro modo especificado, métodos padrão como descritos em Sambrook et ai., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press são usados.
As seqüências da invenção foram amplificadas pela PCR como descrito no protocolo da Pfu Turbo ou Herculase DNA polimerase (Stratagene).
A composição para o protocolo da Pfu Turbo ou Herculase
DNA polimerase foi como segue: Ix tampão de PCR (Stratagene), 0,2 mM de cada dNTP, 100 ng de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae (cepa S288C; Research Genetics, Inc., agora Invitrogen) ou Eseheriehia eoli (cepa MG165 5; E. coli Genetic Stock Center), 50 pmol de iniciador avançado, 50 pmol de iniciador reverso, 2,5 u de Pfu Turbo ou Herculase DNA polimerase. Os ciclos de amplificação foram como segue:
Saccharomyees cerevisiae: 1 ciclo de 3 minutos de 94 a 95°C, seguido por 25 a 36 ciclos em cada caso de 1 minuto a 95°C ou 30 segundos a 94°C, 45 segundos a 50°C, 30 segundos a 50°C ou 30 segundos a 55°C e 210 a 480 segundos a 72°C, seguido por 1 ciclo de 8 minutos a 72°C, depois 4°C.
Eseheriehia coli: 1 ciclo de 2 a 3 minutos a 94°C, seguido por 25 a 30 ciclos em cada caso de 30 segundos a 94°C, 30 segundos de 55 a 60°C e 5 a 10 minutos a 12°C, seguido por 1 ciclo de 10 minutos a 72°C, depois 4°C. As seguintes seqüências adaptadora foram adicionadas aos iniciadores específicos da ORF de Saccharomyces eerevísiae (ver a tabela IV) com propósitos de clonagem:
i) iniciador avançado: 5'-GGAATTCCAGCTGACCACC-3'
SEQ ID NO: 985
ii) iniciador reverso: 5'-GATCCCCGGGAATTGCCATG-3'
SEQ ID NO: 986
As seguintes seqüências adaptadoras foram adicionadas aos iniciadores específicos de ORF de Eseheriehia eoli com propósitos de clonagem:
iii) iniciador avançado: 5'-TTGCTCTTCC-3'
SEQ ID NO: 979
iiii) iniciador reverso: 5"-TTGCTCTTCG-3'
SEQ ID NO: 980
Portanto para a amplificação e clonagem da SEQ ID NO: 327 de Saccharomyees eerevisiae, um iniciador que consiste da seqüência adaptadora i) e a seqüência específica de ORF da SEQ ID NO: 675 e um segundo iniciador que consiste da seqüência adaptadora ii) e a seqüência específica de ORF da SEQ ID NO: 676 foram usados. Para a amplificação e clonagem da SEQ ID NO: 1 de Eeheriehia eoli, um iniciador que consiste da seqüência adaptadora iii) e a seqüência específica de ORF da SEQ ID NO: 317 e um segundo iniciador que consiste da seqüência adaptadora iiii) e a seqüência específica de ORF da SEQ ID NO: 318 foram usados.
Para a amplificação e clonagem da SEQ ID NO: 987 Saccharomyees eerevisiae, um iniciador que consiste da seqüência adaptadora i) e a seqüência específica de ORF da SEQ ID NO: 1147, como indicado na tabela III, coluna 7, linha 4 e um segundo iniciador que consiste da seqüência adaptadora ii) e a seqüência específica de ORF da SEQ ID NO: 1148 como indicado na tabela III, coluna 7, linha 4 foram usados. Para a amplificação e clonagem da SEQ ID NO: 1156 de Saccharomyces eerevisiae, um iniciador que consiste da seqüência adaptadora i) e a seqüência específica de ORF da SEQ ID NO: 1184, como indicado na tabela III, coluna 7, linha 5 e um segundo iniciador que consiste da seqüência adaptadora ii) e a seqüência específica de ORF da SEQ ID NO: 1185 como indicado na tabela III, coluna 7, linha 5 foram usados.
Construção de vetores binários para o alvejamento de proteínas expressadas para os plastídeos.
Para a expressão constitutiva os vetores binários usados para a clonagem da seqüência alvejadora foram IbxSuperResgen SEQ ID NO: 958 e IbxSuperColi SEQ ID NO: 957. Para a expressão forte em sementes os vetores binários usados para a clonagem da seqüência alvejadora, foram IbxUSPResgen SEQ ID NO: 1194 (Fig. 3) e IbxUSPColi SEQ ID NO: 1195 (Fig. 4), contendo o promotor USP (Baeumlein et ai, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67). Outros vetores binários úteis são conhecidos pelo técnico habilitado; um resumo de vetores binários e seu uso pode ser encontrado em Hellens, R., Mullineaux, P. e Klee H., [(2000) "A guide to Agrobacterium binary vectors", Trends in Plant Science, Vol. 5 N- 10, 446-451. Tais vetores têm que ser igualmente equipados com promotores e seqüências alvej adoras apropriados.
A amplificação da seqüência alvejadora do gene FNR de Spinaeia oleraeea
De modo a amplificar a seqüência alvejadora do gene FNR de S. oleraeea, o DNA genômico foi extraído de folhas de plantas de S. oleraeeas de 4 semanas de idade (DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, Hilden). O gDNA foi usado como o padrão para uma PCR.
Para possibilitar a clonagem da seqüência de trânsito no vetor IbxSuperResgen uma seqüência de reconhecimento de enzima de restrição de EcoRI foi adicionado a ambos os iniciadores avançado e reverso, ao passo que para a clonagem nos vetores lbxSuperColI A seqüência de reconhecimento da enzima de restrição PmeI foi adicionada ao iniciador avançado e um sítio NcoI foi adicionado ao iniciador reverso.
FNR5EcoResgen ATA gAA TTC gCA TAA ACT TAT CTT CAT AgT TgC C SEQ ID NO: 983
FNR3 EcoResgen ATA gAA TTC AgA ggC gAT CTg ggC CCT SEQ ID NO: 981
FNR5PmeColic ATA gTT TAA ACg CAT AAA CTT ATC TTC ATA gTT gCC SEQ ID NO: 984
FNR3NcoColic ATA CCA Tgg AAg AgC AAg Agg CgA TCT ggg CCC T SEQ ID NO: 982
A seqüência amplificada de espinafre, SEQ ID NO: 959 compreendeu uma 5'UTR (bpl-166) e a região codificadora (167 a 275 e 353 a 419 pares de base). A seqüência codificadora é interrompida por uma seqüência intrônica de 276 pares de base para 352 pares de base.
Gcataaacttatcttcatagttgccactccaatttgctccttgaatctcctccacccaataca taatccactcctccatcacccacttcactactaaatcaaacttaactctgtttttctctctcctcctttcatttcttattctt ccaatcatcgtactccgccatgaccaccgctgtcaccgccgctgtttctttcccctctaccaaaaccacctctctct ccgcccgaagctcctccgtcatttcccctgacaaaatcagctacaaaaaggtgattcccaatttcactgtgtttttt attaataatttgttattttgatgatgagatgattaatttgggtgctgcaggttcctttgtactacaggaatgtatctgca actgggaaaatgggacccatcagggcccagatcgcctct
O fragmento de PCR derivado com os iniciadores FNR5 EcoResgen e FNR3 EcoResgen foi digerido com EcoRI e ligado no vetor IbxSuperResgen SEQ ID NO: 958 ou IbxUSPResgen SEQ ID NO: 1194 que também foi digerido com EcoRL A orientação correta da seqüência alvejadora FNR foi testada pelo seqüenciamento. O vetor gerado nesta etapa de ligação foi IbxSuperTPFNRResgen ou IbxUSPTPFNRResgen respectivamente.
O fragmento de PCR derivado com os iniciadores FNR5PmeColic e FNR3NcoColic foi digerido com PmeI e NcoI e ligado no vetor lbxSuperColic SEQ ID NO: 957 ou lbxUSPColic SEQ NO: 1195 que foi digerido com SmaI e NcoI. O vetor gerado nesta etapa de ligação foi lbxSuperTPFNRColic ou lbxUSPTPFNRColic respectivamente.
Para a clonagem da ORF da SEQ ID NO: 327, 987 ou 1156 respectivamente o DNA vetorial da S. cerevisiae foi tratado com a enzima de restrição NcoI. Para a clonagem de ORFs de E. coli, por exemplo, SEQ ID NO: 1, o DNA vetorial foi tratado com as enzimas de restrição PacI e NcoI seguindo o protocolo padrão (MBI Fermentas). A reação foi interrompida pela inativação a 70°C por 20 minutos e purificado em colunas QIAquick seguindo o protocolo padrão (Qiagen).
Depois o produto de PCR que representa a ORF amplificada e o DNA vetorial foi tratado com T4 DNA polimerase de acordo com o protocolo padrão (MBI Fermentas) para produzir projeções de filamento único com os parâmetros 1 unidade de T4 DNA polimerase a 37°C por 2 a 10 minutos para o vetor e 1 u de T4 DNA polimerase a 150C por 10 a 60 minutos.
As reações foram interrompidas pela adição de tampão de sal alto e purificadas em colunas QIAquick seguindo o protocolo padrão (Qiagen).
Aproximadamente 30 ng de vetor preparado e uma quantidade definida de amplificado preparado foram misturados e hibridizados a 65°C por 15 minutos seguido por 37°C 0,1°C/1 segundo, seguido por 37°C 10 minutos, seguido por 0,1 °C/1 segundo, depois 4°C.
As construções ligadas foram transformadas no mesmo vaso de reação pela adição de células E. coli competentes (cepa DH5alfa) e incubação por 20 minutos a 1°C seguido por um choque térmico por 90 segundos a 42°C e esfriando a 4°C. Depois, meio completo (SOC) foi adicionado e a mistura foi incubada por 45 minutos a 37°C. A mistura inteira foi subseqüentemente plaqueada em uma placa de ágar com 0,05 mg/ml de canamicina e incubada durante a noite a 37°C. O resultado da etapa de clonagem foi verificado pela amplificação com o auxílio de iniciadores que se ligam a montante e a jusante do sítio de integração, permitindo assim a amplificação da inserção. As amplificações foram realizadas como descrito no protocolo da Taq DNA polimerase (Gibco-BRL).
Os ciclos de amplificação foram como segue: 1 ciclo de 5 minutos a 94°C, seguido por 35 ciclos em cada caso de 15 segundos a 94°C,15 segundos de 50 a 66°C e 5 minutos a 72°C, seguido por 1 ciclo de 10 minutos a 72°C, depois 4°C.
Diversas colônias foram checadas, mas apenas uma colônia para a qual um produto de PCR do tamanho esperado foi detectada foi usada nas seguintes etapas.
Uma porção desta colônia positiva foi transferida em um vaso de reação enchido com meio completo (LB) suplementado com canamicina (50 μg/ml) e incubado durante a noite a 37°C.
A preparação de plasmídeo foi realizada como especificada no protocolo padrão Qiaprep (Qiagen).
Exemplo 2: Geração de plantas transgênicas que expressam a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 327 ou SEQ ID NO: 987 ou SEQ ID NO: 1156 respectivamente
.1 a 5 ng do DNA plasmídico isolado foram transformados pela eletroporação em células competentes de Agrobacterium tumefaciens, da cepa GV 3101 pMP90 (Koncz e Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383-396, 1986). Depois disso, meio completo (YEP) foi adicionado e a mistura foi transferida a um vaso de reação fresco por 3 horas a 28°C. Depois disso, toda a mistura de reação foi plaqueada em placas YEP de ágar suplementadas com os respectivos antibióticos, por exemplo rifampicina (0,1 mg/ml), gentamicina (0,025 mg/ml) e canamicina (0,05 mg/ml) e incubada por 48 horas a 28°C.
As agrobactérias que contém a construção de plasmídeo foram depois usadas para a transformação de plantas.
Uma colônia foi escolhida da placa de ágar com auxílio de uma ponta de pipeta e recolhida em 3 ml de meio TB líquido, que também conteve antibióticos adequados como descrito acima. A précultura foi cultivada por 48 horas a 28°C e 120 rpm.
.400 ml de meio LB contendo os mesmos antibióticos como acima foram usados para a cultura principal, a pré-cultura foi transferida na cultura principal. Esta foi cultivada por 18 horas a 28°C e 120 rpm. Depois da centrifugação a 4000 rpm, a pelota foi recolocada em suspensão no meio de infiltração (meio MS, 10% de sacarose).
De modo a cultivar as plantas para a transformação, as placas (Piki Saat 80, verdes, fornecidas com um fundo em tela, 30 χ 20 χ 4,5 cm, da Wiesauplast, Kunststofftechnik, Alemanha) foram enchidas pela metade com um substrato GS 90 (solo padrão, Werkverband Ε. V., Alemanha). As placas foram regadas durante a noite com 0,05% de solução Proplant (Chimac- Apriphar, Bélgica). Sementes de Arabidopsis thaliana C24 (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK; NASC Stock N906) foram espalhadas sobre a placa, aproximadamente 1000 sementes por placa. As placas foram cobertas com uma campânula e colocadas na instalação de estratificação (8 h, 110 μπιοΐ/πι2/^1, 22°C; 16 h, escuro, 6°C). Depois de 5 dias, as placas foram colocadas na câmara de ambiente controlado de dia curto (8 h 130 μπιο1/ιη2/322°C; 16 h, escuro 20°C), onde ela permaneceu por aproximadamente 10 dias até que as primeiras folhas verdadeiras tenham se formado.
As mudas foram transferidas em vasos contendo o mesmo substrato (Teku pots, 7 cm, série LC, fabricada pela Põppelmann GmbH & Co, Alemanha). Cinco plantas foram escolhidas em cada vaso. Os vasos foram depois retornados para a câmara de ambiente controlado com dia curto controlada para a planta continuar a crescer.
Depois de 10 dias, as plantas foram transferidas para a cabine de estufa (iluminação suplementar, 16 h, 340 μΕ, 22°C; 8 h, escuro, 20°C), onde elas foram deixadas crescer por mais 17 dias.
Para a transformação, plantas de Arabidopsis de 6 semanas de idade, que apenas começaram a florir foram imersas por 10 segundos na suspensão agrobacteriana descrita acima que foi previamente tratada com 10 □ 1 de Silwett L77 (Crompton S. A., Osi Specialties, Suíça). O método em questão é descrito em Clough e Bent, 1998 (Clough, JC e Bent, AF. 1998 Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735-743.
As plantas foram subseqüentemente colocadas por 18 horas em uma câmara úmida. Depois disso, os vasos foram retornados para a estufa para que as plantas continuassem a crescer. As plantas permaneceram na estufa por mais 10 semanas até que as sementes estivessem prontas para a colheita.
Dependendo do marcador de resistência usado para a seleção das plantas transformadas as sementes colhida foram plantadas na estufa e submetidas a uma seleção por pulverização ou ainda primeiro esterilizadas e depois cultivadas em placas de ágar suplementadas com o respectivo agente de seleção. Visto que o vetor conteve o gene bar como o marcador de resistência, as plantinhas foram pulverizadas quatro vezes em um intervalo de .2 a 3 dias com 0,02% de BASTA® e as plantas transformadas foram deixadas formar sementes. As sementes das plantas de A. thaliana transgênicas foram armazenadas no congelador (a -20°C).
As plantas foram subseqüentemente colocadas por 18 horas em uma câmara úmida. Depois disso, os vasos foram retornados para a estufa para que as plantas continuassem a crescer. As plantas permaneceram na estufa por mais 10 semanas até que as sementes estivessem prontas para a colheita.
Exemplo 3: Análise do Teor de Nitrogênio
A determinação de nitrogênio nas amostras é realizada usando o método Dumas que conta com a combustão completa do material de teste. A amostra é aquecida em um forno de temperatura alta e rapidamente comburido na presença de oxigênio puro. Os produtos de combustão (principalmente CO2, H2O, NOx e N2) são coletados e deixados equilibrar. Uma alíquota da mistura gasosa é passada sobre cobre quente para remover qualquer oxigênio e converter NO2 a N2. A amostra é depois passada através de um sifao que remove CO2 e H2O. O nitrogênio remanescente é medido por um detetor de condutividade térmica.
Para a análise de material de folha ou para os núcleos de semente, o material seco por congelamento homogeneizado é usado. No caso de sementes de Arabidopsis, as sementes são analisadas diretamente sem pré tratamento.
4 a 7 mg da amostra foram pesados em um copo de folha de estanho junto com 15 mg de óxido de tungstênio (VI) (WO3). A análise foi realizada usando um analisador elementar comercial (por exemplo ELEMENTAR vario EL III, ELEMENTAR, Hanau, Alemanha).
A Tabela VII mostra o teor de nitrogênio total aumentado de sementes de plantas transgênicas que expressam a ORF de Escherichia coli ORF bl852 de levedura, correspondente à SEQ ID NO: 1 ou a ORF de Saccharomyees cerevisiae YNL241c, correspondente à SEQ ID NO: 327 ou a ORF de Saccharomyees cerevisiae YJLl67W, correspondente à SEQ ID NO: 987 ou a ORF de Saccharomyees cerevisiae YML054C, correspondente à SEQ ID NO: 1156 respectivamente no compartimento plastídico sob o controle do promotor USP como descrito acima. A Coluna 1 mostra a ORF analisada expressada no compartimento plastídico, a Coluna 2 mostra o elemento medido, a Coluna 3 mostra a variabilidade do tipo selvagem como "desvio padrão relativo", a Coluna 4 mostra a mudança média no teor de elemento para as linhagens transgênicas diferentes transformadas com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ DD NO: 327 ou SEQ ID NO: 987 ou SEQ ID NO: 1156 respectivamente em relação ao controle do tipo selvagem que é padronizado como "1", a Coluna 5 mostras o desvio padrão para as linhagens transgênica diferentes e a Coluna 6 mostra a mudança máxima observada. Como esperado, o aumento relativo no nitrogênio corresponde a uma diminuição relativa no teor de carbono.
<table>table see original document page 262</column></row><table> Exemplo 4: Eficiência do Uso de Nitrogênio Realçada
De modo a testar a eficiência do uso de nitrogênio realçada das
linhas transgênicas, as plantas foram cultivadas sob condições limitadas de nitrogênio:
As linhas transgênicas que expressam a ORF de Escherichia coli ORF de levedura bl852, correspondente à SEQ ID NO: 1 ou ORF de Saccharomyees eerevisiae YNL241c, correspondente à SEQ ID NO: 327 ou a ORF YJL167W de Saccharomyees eerevisiae, correspondente à SEQ ID NO:987 ou a ORF de Saccharomyces eerevisiae YML054C, correspondente à SEQ ID NO: 1156 respectivamente no compartimento plastídico, mostrou crescimento realçado sob condições limitadas de nitrogênio e menos sintomas de deficiência de nitrogênio (descoramento, crescimento retardado, senescência) em comparação com as plantas de controle do tipo selvagem. Tabela I A:Numero ID de sequenceia de acido nucleico
<table>table see original document page 263</column></row><table> <table>table see original document page 264</column></row><table> <table>table see original document page 265</column></row><table> <table>table see original document page 266</column></row><table> <table>table see original document page 267</column></row><table> Tabela IIB: Números ID de sepuencia de ácido nucleico
<table>table see original document page 268</column></row><table> <table>table see original document page 269</column></row><table> <table>table see original document page 270</column></row><table> <table>table see original document page 271</column></row><table> <table>table see original document page 272</column></row><table> <table>table see original document page 273</column></row><table> Tabela III: Numeros ID de sequencia de acido nucleico de iniciador
<table>table see original document page 274</column></row><table> Tabela IV: Numeros ID de acido nucleico de consenso
<table>table see original document page 275</column></row><table>

Claims (29)

1. Processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ativo, caracterizado pelo fato de que compreende a) aumento ou geração da atividade de um transportador de amônio em um organismo fotossintético b) ou aumento ou geração da atividade da glicose-6-fosfato- desidrogenase em um organismo fotossintético, preferivelmente nos plastídeos de tais organismos c) e crescimento do organismo fotossintético ativo sob condições que permitam a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificada e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende (a) aumento ou geração da atividade de uma proteína codificada pelas seqüências de ácido nucleico como mostrado na tabela I, coluna 5, em uma organela de um organismo não humano, ou (b) aumento ou geração da atividade de uma proteína codificada pelas seqüências de ácido nucleico como mostrado na tabela I, coluna 5, que são unidas a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito em um organismo não humano, ou em uma ou mais partes deste; ou (c) ou aumento ou geração da atividade de uma proteína codificada pelas seqüências de ácido nucleico como mostrado na tabela I, coluna 5, que são unidas a uma seqüência de ácido nucleico que codifica seqüência de localização de cloroplasto, em um organismo não humano, ou em uma ou mais partes deste, e (d) crescimento do organismo fotossintético sob condições que permitam a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado.
3. Processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em organismos fotossintéticos ativos, caracterizado pelo fato de que compreende, aumentar ou gerar em um organismo ou um parte ou um compartimento deste a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste de: a) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo como mostrado na tabela II, colunas 5 e 7 ou um fragmento desta, que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado, b) molécula de ácido nucleico que compreende de uma molécula de ácido nucleico como mostrada na tabela I, colunas 5 e 7 que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado c) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode ser deduzida de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula de ácido nucleico de (a) ou (b) como um resultado da degenerescência do código genético e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado d) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado e) molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (a) a (c) sob hibridização severa e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado f) molécula de ácido nucleico que abrange uma molécula de ácido nucleico que é obtida pela amplificação de moléculas de ácido nucleico a partir de uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando os iniciadores ou pares de iniciador como indicado na tabela III, coluna 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado; g) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que é isolada com a ajuda de anticorpos monoclonais contra um polipeptídeo codificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (f) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado h) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende um consenso como mostrado na tabela IV, colunas 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado i) molécula de ácido nucleico que é obtenível pela triagem de uma biblioteca de ácido nucleico adequada sob condições de hibridização severas com uma sonda que compreende uma das seqüências da molécula de ácido nucleico de (a) a (k) ou com um fragmento desta tendo pelo menos 15 nucleotídeos, preferivelmente 20 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou 500 nucleotídeos da molécula de ácido nucleico caracterizada em (a) a (k) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado ou que compreende uma seqüência que é complementar a esta.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de -1 a 3, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com a dita atividade aumentada ou gerada de um transportador de amônio ou a glicose-6-fosfato-desidrogenase é derivada de um microorganismo.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de .2 a 4, caracterizado pelo fato de que a atividade da dita proteína ou a expressão da dita molécula de ácido nucleico é aumentada ou gerada transitória ou estavelmente.
6. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste de: a) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo como mostrado na tabela II, colunas 5 e 7 ou um fragmento desta, e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste b) molécula de ácido nucleico que compreende de uma molécula de ácido nucleico como mostrada na tabela IB, colunas 5 e 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; c) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode ser deduzida a partir de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula de ácido nucleico de (a) ou (b) como um resultado da degenerescência do código genético e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; d) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; e) molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (a) a (c) sob condições de hibridização severa e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; f) molécula de ácido nucleico que abrange uma molécula de ácido nucleico que é obtida pela amplificação de moléculas de ácido nucleico a partir de uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando os iniciadores ou pares de iniciador como mostrado na tabela III, coluna 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; g) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que é isolado com a ajuda de anticorpos monoclonais contra um polipeptídeo codificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (f) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; h) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende um consenso como mostrado na tabela IV, coluna 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados em um organismo fotossintético ou uma parte deste; e i) molécula de ácido nucleico que é obtenível pela triagem de uma biblioteca de ácido nucleico adequada sob condições de hibridização severas com uma sonda que compreende uma das seqüências da molécula de ácido nucleico de (a) a (k) ou com um fragmento desta tendo pelo menos 15 nucleotídeos, preferivelmente 20 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou 500 nucleotídeos da molécula de ácido nucleico caracterizada em (a) a (k) e que confere um e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste, por meio do qual a molécula de ácido nucleico distingue a seqüência como indicada na tabela I A ou I B, preferivelmente distingue a seqüência como indicada na tabela I A em um ou mais nucleotídeos.
7. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende um molécula de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste de: a) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo como mostrado na tabela II B, coluna 7 ou um fragmento desta, e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste b) molécula de ácido nucleico que compreende de uma molécula de ácido nucleico como mostrado na tabela I B, coluna 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; c) molécula de ácido nucleico cuja seqüência pode ser deduzida a partir de uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma molécula de ácido nucleico de (a) ou (b) como um resultado da degenerescência do código genético e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; d) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de (a) a (c) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; e) molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (a) a (c) sob condições de hibridização severas e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; f) molécula de ácido nucleico que abrange uma molécula de ácido nucleico que é obtida pela amplificação de moléculas de ácido nucleico a partir de uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca genômica usando os iniciadores ou pares de iniciador como mostrados na tabela III, coluna 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; g) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que é isolado com a ajuda de anticorpos monoclonais contra um polipeptídeo codificado por uma das moléculas de ácido nucleico de (a) a (f) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; h) molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende um consenso como mostrado na tabela IV, coluna 7 e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste; e i) molécula de ácido nucleico que é obtenível pela triagem de uma biblioteca de ácido nucleico adequada sob condições de hibridização severas com uma sonda que compreende uma das seqüências da molécula de ácido nucleico de (a) a (k) ou com um fragmento desta tendo pelo menos 15 nucleotídeos, preferivelmente 20 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou 500 nucleotídeos da molécula de ácido nucleico caracterizada em (a) a (k) e que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste.
8. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que confere a expressão da molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7, compreendendo um ou mais elementos reguladores.
9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7 ou a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 8.
10. Vetor de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico está em ligação operável com seqüências regulatórias para a expressão em um hospedeiro procariótico ou eucariótico, ou em um procariótico e eucariótico.
11. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que foi transformada estável ou transitoriamente com o vetor como definido nas reivindicações 9 ou 10 ou a molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7 ou a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 8.
12. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é uma célula hospedeira transgênica.
13. Célula hospedeira de acordo com as reivindicações 11 ou .12, caracterizada pelo fato de que é uma célula de planta.
14. Processo para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é expressado em uma célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações de 11 a 13.
15. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo como definido na reivindicação 14 ou codificado pela molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7 por meio do qual o polipeptídeo distingue uma seqüência como indicada na tabela IIA em um ou mais aminoácidos.
16. Processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ativo, Molécula de ácido nucleico isolada, Construção de ácido nucleico, Vetor, Célula hospedeira, Processo para produzir um polipeptídeo, Polipeptídeo,Anticorpo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao polipeptídeo como definido na reivindicação .15.
17. Tecido de planta, material de propagação, material colhido ou uma planta, caracterizado(a) pelo fato de que compreende a célula hospedeira como definida na reivindicação 13 que é célula de planta ou um Agrobacterium.
18. Método para a identificação de um produto de gene que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) contatar as moléculas de ácido nucleico de uma amostra, que pode conter um gene candidato que codifica um produto de gene que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste depois da expressão com a molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7; b) identificar as moléculas de ácido nucleico, que hibridizam sob condições severas relaxadas com a molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7; c) introduzir as moléculas de ácido nucleico candidatas nas células hospedeiras apropriadas para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado; d) expressar as moléculas de ácido nucleico identificadas nas células hospedeiras; e) ensaiar a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado; e f) identificar a molécula de ácido nucleico e seu produto de gene cuja expressão confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio aumentados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado na célula hospedeira depois da expressão comparada com o tipo selvagem.
19. Método para a identificação de um produto de gene que confere assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) identificar em um banco de dados moléculas de ácido nucleico de um organismo; que podem conter um gene candidato que codifica um produto de gene que confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ou uma parte deste depois da expressão, e que são pelo menos 20 % homólogos à molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7; b) introduzir as moléculas de ácido nucleico candidatas em célula hospedeiras apropriadas assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado; c) expressar as moléculas de ácido nucleico identificadas nas células hospedeiras; d) ensaiar a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado; e e) identificar molécula de ácido nucleico e seu produto de gene cuja expressão confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio aumentados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado na célula hospedeira depois da expressão comparada com o tipo selvagem.
20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7, o polipeptídeo como definido na reivindicação 15, a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 8, o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, o produto de gene como definido nas reivindicações 18 ou 19, o anticorpo como definido na reivindicação 16, e opcionalmente um carreador agricolamente aceitável.
21. Uso da molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de ser para a identificação de uma molécula de ácido nucleico que confere uma assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio aumentada e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado na célula hospedeira depois da expressão comparada com o tipo selvagem.
22. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 15 ou da construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 8 ou do produto de gene identificado de acordo com o método como definido nas reivindicações 18 ou 19, caracterizado pelo fato de ser para identificar compostos capazes de conferir uma modulação da assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo ou parte deste.
23. Composição agroquímica, farmacêutica, alimentícia ou de ração, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7, o polipeptídeo como definido na reivindicação 15, a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 8, o vetor como definido nas reivindicações 9 ou 10, o anticorpo como definido na reivindicação 16, a planta ou tecido de planta como definida(o) na reivindicação 17, o material colhido como definido na reivindicação 17, a célula hospedeira como definida nas reivindicações de 11 a 13 ou o produto de gene identificado de acordo com o método como definido nas reivindicações 18 ou 19.
24. Célula hospedeira ou planta de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 13, caracterizadas pelo fato de que são resistentes a um herbicida que inibe a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio e/ou inibe o aumento do teor de nitrogênio total.
25. Processo de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser pelo rendimento total (biomassa) ou rendimento de proteína (massa) intensificados.
26. Processo de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser pelo rendimento total intensificado de biomassa ou massa de proteína.
27. Processo de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser pelo crescimento intensificado de plantas sob condições limitantes de nitrogênio.
28. Uso da molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7, do polipeptídeo como definido na reivindicação 15, da construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 8, do vetor como definido nas reivindicações 9 ou 10, da planta ou tecido de planta como definida(o) na reivindicação 17, do material colhido como definido na reivindicação 17, da célula hospedeira como definida nas reivindicações de 11 a 13 ou do produto de gene identificado de acordo com o método como definido nas reivindicações 18 ou 19, caracterizado pelo fato de ser para a obtenção de rendimento total intensificado na biomassa, preferivelmente semente ou rendimento na massa de proteína.
29. Uso da molécula de ácido nucleico como definida nas reivindicações 6 ou 7, do polipeptídeo como definido na reivindicação 15, da construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 8, do vetor como definido nas reivindicações 9 ou 10, da planta ou tecido de planta como definida(o) na reivindicação 17, do material colhido como definido na reivindicação 17, da célula hospedeira como definida nas reivindicações de 11 a 13 ou do produto de gene identificado de acordo com o método como definido nas reivindicações 18 ou 19, caracterizado pelo fato de ser para a obtenção de crescimento ou rendimento intensificados sob condições limitantes de nitrogênio.
BRPI0713097-0A 2006-05-31 2007-05-23 processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ativo, molécula de ácido nucleico isolada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptìdeo, polipeptìdeo, anticorpo, tecido de planta, material de propagação, material colhido ou uma planta, método para a identificação de um produto de gene, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico, do polipeptìdeo, da construção de ácido nucleico, do vetor, da planta ou tecido de planta, do material colhido da célula hospedeira ou do produto de gene identificado de acordo com o método BRPI0713097A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06114744.3 2006-05-31
EP06114744 2006-05-31
PCT/EP2007/054979 WO2007137973A2 (en) 2006-05-31 2007-05-23 Manipulation of the nitrogen metabolism using ammonium transporter or glucose 6-phosphate deshydrogenases or farnesyl phosphate synthetase (fpp)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0713097A2 true BRPI0713097A2 (pt) 2012-10-16

Family

ID=38741510

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0713097-0A BRPI0713097A2 (pt) 2006-05-31 2007-05-23 processo para a assimilação, acúmulo e/ou utilização de nitrogênio intensificados e/ou para o teor de nitrogênio total aumentado em um organismo fotossintético ativo, molécula de ácido nucleico isolada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptìdeo, polipeptìdeo, anticorpo, tecido de planta, material de propagação, material colhido ou uma planta, método para a identificação de um produto de gene, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico, do polipeptìdeo, da construção de ácido nucleico, do vetor, da planta ou tecido de planta, do material colhido da célula hospedeira ou do produto de gene identificado de acordo com o método

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20090300794A1 (pt)
EP (2) EP2497778A3 (pt)
CN (2) CN101460517B (pt)
AR (1) AR061148A1 (pt)
BR (1) BRPI0713097A2 (pt)
CA (1) CA2651961A1 (pt)
CL (1) CL2007001553A1 (pt)
ES (1) ES2402309T3 (pt)
MX (1) MX2008015090A (pt)
WO (1) WO2007137973A2 (pt)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009037279A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield
MX2010003064A (es) * 2007-09-21 2010-04-07 Basf Plant Science Gmbh Plantas con rendimiento aumentado.
WO2010011997A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Mary Kay Inc. Compositions comprising docynia delavajy extract and/or elaeagnus lancelotus extract
JP5645366B2 (ja) * 2009-02-25 2014-12-24 日立造船株式会社 長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子
CN102433349A (zh) * 2011-11-28 2012-05-02 山东省农业科学院作物研究所 小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS及其分离克隆、酶活性测定方法
CN103087167B (zh) * 2013-01-09 2014-07-30 中国农业科学院生物技术研究所 来源于硅藻的与植物氮利用和生长相关的蛋白质及其编码基因与应用
AU2014302296B2 (en) 2013-06-26 2016-02-25 Indigo Ag, Inc. Seed-origin endophyte populations, compositions, and methods of use
JP5870464B2 (ja) * 2014-08-12 2016-03-01 日立造船株式会社 長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子
JP6719174B2 (ja) * 2015-02-23 2020-07-08 住友ゴム工業株式会社 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法
JP6090700B2 (ja) * 2015-12-25 2017-03-08 日立造船株式会社 長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子
WO2019028355A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Rutgers, The State University Of New Jersey COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING ENDOPHYTIC BACTERIUM FOR APPLICATION TO TARGET PLANTS TO PROMOTE PLANT GROWTH AND STRENGTHEN RESISTANCE TO ABIOTIC AND BIOTIC STRESS FACTORS
CN110257419A (zh) * 2019-06-06 2019-09-20 中国科学院南京土壤研究所 一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体及其应用
CN110642929B (zh) * 2019-09-29 2022-11-01 深圳市作物分子设计育种研究院 一种水稻造粉体蛋白转运信号肽及其在花粉育性调控中的应用

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3484215D1 (de) 1983-01-17 1991-04-11 Monsanto Co Chimaerische gene geeignet zur expression in pflanzenzellen.
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
DK162399C (da) 1986-01-28 1992-03-23 Danisco Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
NZ228320A (en) 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
AU3756889A (en) 1988-06-01 1990-01-05 The Texas A & M University System Method for transforming plants via the shoot apex
CA1341467C (en) 1988-07-29 2004-12-07 John C. Rogers Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5932479A (en) 1988-09-26 1999-08-03 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
DE3843628A1 (de) 1988-12-21 1990-07-05 Inst Genbiologische Forschung Wundinduzierbare und kartoffelknollenspezifische transkriptionale regulation
EP0388186A1 (en) 1989-03-17 1990-09-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company External regulation of gene expression
EP0472712B1 (en) 1990-03-16 2001-09-12 Calgene LLC Novel sequences preferentially expressed in early seed development and methods related thereto
US5187267A (en) 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
US5767366A (en) 1991-02-19 1998-06-16 Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants
DE4130868C2 (de) 1991-09-17 1994-10-13 Degussa Tierfuttermittelsupplement auf der Basis einer Aminosäure und Verfahren zu dessen Herstellung
US5455818A (en) 1992-01-22 1995-10-03 Brother Kogyo Kabushiki Kaisha Optical recording medium
DE4208050A1 (de) 1992-03-13 1993-09-23 Bayer Ag Azolylmethyl-fluorcyclopropyl-derivate
CA2092069A1 (en) 1992-03-27 1993-09-28 Asako Iida An expression plasmid for seeds
DE69331055T2 (de) 1992-04-13 2002-06-20 Syngenta Ltd., Haselmere Dna-konstruktionen und diese enthaltende pflanzen
US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
JPH0662870A (ja) 1992-08-18 1994-03-08 Mitsui Giyousai Shokubutsu Bio Kenkyusho:Kk 大豆ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター領域及び５’非翻訳領域
JPH08503853A (ja) 1992-11-30 1996-04-30 チューア，ナム−ハイ 植物における組織−及び発生−特異的な発現を付与する発現モチーフ
DE4308498C2 (de) 1993-03-17 1997-01-09 Degussa Tierfuttermittel-Additiv auf Fermentationsbrühe-Basis, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung
ATE267870T1 (de) 1993-09-03 2004-06-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation von monocotyledonen mittels des schildes von unreifen embryonen
CA2173730C (en) 1993-10-06 2010-03-09 Gloria M. Coruzzi Transgenic plants that exhibit enhanced nitrogen assimilation
US6969782B2 (en) 1993-10-06 2005-11-29 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition
DE4337597C2 (de) 1993-10-28 2002-07-18 Aventis Cropscience Gmbh DNA-Sequenzen für Ammoniumtransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen und Pflanzen enthaltend den Transporter
WO1995014098A1 (en) 1993-11-19 1995-05-26 Biotechnology Research And Development Corporation Chimeric regulatory regions and gene cassettes for expression of genes in plants
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
EP0733059B1 (en) 1993-12-09 2000-09-13 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
US5750866A (en) 1994-09-08 1998-05-12 American Cyanamid Company AHAS promoter useful for expression of introduced genes in plants
GB9421286D0 (en) 1994-10-21 1994-12-07 Danisco Promoter
US5689040A (en) 1995-02-23 1997-11-18 The Regents Of The University Of California Plant promoter sequences useful for gene expression in seeds and seedlings
DE69637252T2 (de) 1995-07-05 2008-06-19 Sapporo Breweries, Ltd. Verfahren unter verwendung eines gewebespezifischen promotors
GB9516241D0 (en) 1995-08-08 1995-10-11 Zeneca Ltd Dna constructs
DE69632403T2 (de) 1995-08-10 2005-05-19 Rutgers University Zellkern-codiertes transkriptionssystem plastiden höherer pflanzen
US7390937B2 (en) * 1996-02-14 2008-06-24 The Governors Of The University Of Alberta Plants with enhanced levels of nitrogen utilization proteins in their root epidermis and uses thereof
DE19626564A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Hoechst Ag Genetische Transformation von Ciliatenzellen durch Microcarrier-Bombardement mit DNA beladenen Goldpartikeln
US5981841A (en) 1996-08-30 1999-11-09 Monsanto Company Early seed 5' regulatory sequence
DE19644478A1 (de) 1996-10-25 1998-04-30 Basf Ag Blattspezifische Expression von Genen in transgenen Pflanzen
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US6642437B1 (en) 1997-09-30 2003-11-04 The Regents Of The University Of California Production of proteins in plant seeds
PL342807A1 (en) 1998-03-11 2001-07-02 Novartis Ag Novel plastidic promoter sequence of plant origin
US6833492B2 (en) * 1998-08-28 2004-12-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nitrogen transport metabolism
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
DE19852195C2 (de) 1998-11-04 2000-11-02 Inst Pflanzengenetik & Kultur Neue Expressionskassette zur Expression von beliebigen Genen in Pflanzensamen
EP1206560B1 (de) 1999-08-26 2005-11-09 BASF Plant Science GmbH Pflanzliche genexpression unter der kontrolle von konstitutiven pflanzlichen v-atpase promotoren
US6727411B2 (en) 1999-12-13 2004-04-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition
EP1276869A2 (en) 2000-01-21 2003-01-22 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
EP1276886B1 (en) 2000-04-26 2012-11-28 Monsanto Technology LLC Method for the transformation of plant cell plastids
USH2191H1 (en) * 2000-10-24 2007-06-05 Snp Consortium Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome
US20040063182A1 (en) * 2000-12-28 2004-04-01 Chikara Ohto Process for producing prenyl alcohol
US6721977B2 (en) * 2001-08-03 2004-04-20 Angela Solesbee Medical procedure table pad
US20030115638A1 (en) 2001-08-17 2003-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Plants having increased amino acids content and methods for producing the same
AU2002328223A1 (en) * 2001-09-21 2003-04-01 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Purified polypeptides involved in co-factor metabolism
US7314974B2 (en) * 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
US20040142476A1 (en) 2002-11-01 2004-07-22 New England Biolabs, Inc. Organellar targeting of RNA and its use in the interruption of environmental gene flow
EP2361977A1 (en) * 2003-04-15 2011-08-31 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response, and transgenic plant cells transformed with the same
EP2080769A3 (en) 2004-07-02 2010-12-01 Metanomics GmbH Process for the production of fine chemicals
US20080148432A1 (en) * 2005-12-21 2008-06-19 Mark Scott Abad Transgenic plants with enhanced agronomic traits
AU2007299219A1 (en) * 2006-04-05 2008-03-27 Metanomics Gmbh Process for the production of a fine chemical

Also Published As

Publication number Publication date
CA2651961A1 (en) 2007-12-06
WO2007137973A3 (en) 2008-04-17
WO2007137973A8 (en) 2011-11-10
EP2029619B1 (en) 2013-01-09
CN101460517B (zh) 2013-11-06
WO2007137973A9 (en) 2008-02-28
US20090300794A1 (en) 2009-12-03
WO2007137973A2 (en) 2007-12-06
EP2497778A3 (en) 2012-12-12
CN101460517A (zh) 2009-06-17
AR061148A1 (es) 2008-08-06
CL2007001553A1 (es) 2008-05-16
MX2008015090A (es) 2008-12-15
EP2497778A2 (en) 2012-09-12
ES2402309T3 (es) 2013-04-30
CN106222179A (zh) 2016-12-14
EP2029619A2 (en) 2009-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101952305B (zh) 具有增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性(iv-bm)的植物
CN101861393B (zh) 产量提高的植物
ES2402309T3 (es) Manipulación del metabolismo de nitrógeno usando transportador de amonio o glucosa 6-fosfato deshidrogenasas o farnesil fosfato sintetasas (FPP)
CN102186974B (zh) 通过在植物或其部分中提高或产生一种或更多活性具有提高产量的植物
EP2594646A2 (en) Plant with increased yield
CN102264907A (zh) 产量增加的植物(nue)
CN102770542A (zh) 对环境胁迫具有提高的耐性和/或抗性以及增加的生物量产生的植物
BRPI0708976A2 (pt) célula de planta, planta, semente, molécula de ácido nucleico isolada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, proteìna relacionada com estresse isolada, métodos para produzir uma planta transgênica e para modificar a toleráncia a estresse de uma planta, e, usos de um ácido nucleico codificando srp e de toleráncia e/ou resistência aumentadas a estresse ambiental e/ou um ácido nucleico codificando srp
CN102224246A (zh) 产量增加的植物(lt)
CN102575260A (zh) 具有增加的产量的植物
CN102016048A (zh) 产量增加的植物
US7982095B2 (en) Increase in yield by reducing gene expression
MX2007003358A (en) Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07G Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette]
B08F Application fees: application dismissed [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 11A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]