BRPI0713286A2 - polipeptìdeo - Google Patents

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BRPI0713286A2
BRPI0713286A2 BRPI0713286-7A BRPI0713286A BRPI0713286A2 BR PI0713286 A2 BRPI0713286 A2 BR PI0713286A2 BR PI0713286 A BRPI0713286 A BR PI0713286A BR PI0713286 A2 BRPI0713286 A2 BR PI0713286A2
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variant polypeptide
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Patrick Maria Franciscus Derkx
Rie Mejldal
Hemmingsen Anja Kellet-Smitz
Soerensen Bo Spange
Karsten Matthias Kragh
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Danisco
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Abstract

POLIPEPTìDEO. A presente invenção se refere a um polipeptídeo variante PS4 derivável de um polípeptídeo de origem com atividade exoamilase não-maltogênica, no qual o polipeptídeo variante PS4 compreende uma substituição de aminoácido na posição 307 para lisina (k) ou arginina (R), com referência à numeração de posição de uma seqüência de exoamilase de pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID No: 1. Preferivelmente, o polipeptídeo variante PS4 ainda compreende uma substituição de aminoácido na posição 70, preferivelmente G70D. O aminoácido nas posições 272 e 303 da seqüência são preferivelmente histidina (H) e glicina (G).

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO
Pedido de Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEO".
É feita referência aos Pedidos Provisórios Americanos Nos. de Série 60/485.413, 60/485.539 e 60/485.616, depositados em 7 de julho de 2003. Também é feita referência aos pedidos internacionais PCT/US2004/021723 e PCT/US2004/021739, depositados em 7 de julho de 2004, e designando US (requerente: Genencor International, Inc.). Também é feia referência aos pedidos de utilidade americanos Nos. de série 10/886.905 e 10/866.903, todos os quais sendo também depositados em 7 de julho de 2004.
Também é feita referência ao pedido provisório americano no. de série 60/608.919 (depositado como pedido de utilidade americano número de série 10/887.056 em 7 de julho de 2004, porém convertido ao pedido provisório em 15 de setembro de 2004). Também é feita referência ao pedido provisório americano número de série 60/612.407, o qual foi depositado em 22 de setembro de 2004.
Também é feita referência adicional ao pedido americano no. de série 60/485.539, depositado em 7 de julho de 2003. Também é feita referência ao pedido internacional PCT/IB2004/0024 87, depositado em 7 de julho de 2004 e designando US (requerente: Danisco A/S). Também é feita referência ao pedido de utilidade americano número de série 10/886.023, depositado em 7 de julho de 2004. Também é feita referência aos pedidos de utilidade americanos números de série 10/886.505, 10/886.527 e 10/886.504, todos os quais sendo depositados em 7 de julho de 2004. Também é feita referência ao pedido de utilidade americano número de série 10/947.612, requerido em 22 de setembro de 2004.
Também é feita referência ao Pedido de Patente Internacional número de série PCT/GB2005/002675, depositado em 7 de julho de 2005 e designando US (requerentes: Danisco A/S e Genencor International, Inc, D Young & Co, referência da procuração: P02016iw0). Também é feita referência ao pedido provisório americano número de série 60/697.302, depositado em 7 de julho de 2005.
Os pedidos precedentes, e cada documento citado ou referenciado em cada um dos pedidos presentes e precedentes, incluindo durante a execução de cada um dos pedidos precedentes ("pedido e documentos citados no artigo") e quaisquer instruções ou catálogos do fabricante para quaisquer produtos citados ou mencionados em cada um dos pedidos e artigos precedentes e em qualquer um dentre o pedido e os documentos citados no artigo são por meio disso aqui incorporados por referência. Além disso, todos os documentos citados nesse texto, e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos citados nesse texto, e quaisquer instruções ou catálogos do fabricante para quaisquer produtos citados ou mencionados nesse texto u em qualquer documento por meio deste incorporado nesse texto são, por meio disso, aqui incorporados por referência. Documentos incorporados por referência nesse texto ou em quaisquer ensinamentos ali podem ser usados na prática dessa invenção. Documentos incorporados por referência nesse texto não são admitidos como sendo técnica anterior.
campo
A invenção se refere aos polipeptideos, especificamente polipeptideos da amilase e ácidos nucleicos os codificando, e seus usos como exoamilases não- maltogênicas na produção de produtos alimentícios. As amilases da presente invenção foram projetadas para terem mais qualidades benéficas. Especificamente, as amilases da atual invenção apresentam uma exoespecificidade alterada e/ou uma termoestabilidade alterada. Particularmente, os polipeptídeos são derivados dos polipeptídeos com atividade exoamilase não-maltogênica, particularmente a atividade da glucano-1,4-alfa-maltotetraidrolase (EC 3.2.1.60).
ANTECEDENTES
Amilases melhoradas podem melhorar os problemas inerentes em certos processos, tais como panificação. A cristalização da amilopectina ocorre em grânulos de amido dias depois da assadura, o que leva a uma firmeza aumentada do pão e causa o envelhecimento do pão. Quando o pão envelhece, o pão perde a maciez do miolo e a umidade do miolo. Como resultado, miolos se tornam menos elásticos e o pão desenvolve uma crosta dura.
A hidrólise enzimática (por amilases, por exemplo) das cadeias laterais da amilopectina pode reduzir a cristalização e aumentar o antienvelhecimento. A cristalização depende da extensão das cadeias laterais de amilopectina: quanto mais longas são as cadeias, maior é a cristalização. A maior parte dos grânulos de amido é composta de uma mistura de dois polímeros: amilopectina e amilose, das quais cerca de 75% é amilopectina. Amilopectina é uma molécula ramificada muito grande consistindo de cadeias de unidades a-D-glicopiranosil unidas por ligações (1-4), onde as cadeias são ligadas por ligações a-D-(l-6) para formar ramificações. Amilose é uma cadeia linear de unidades a-D-glicopiranosil (1-4) ligadas com algumas ramificações a-D-(l,6).
A panificação de produtos de pão farináceos, tais como pão de forma, pão feito a partir de farinha de centeio peneirada e farinha de trigo e pães franceses é efetuada pela assadura da massa de pão em temperaturas de forno na faixa de 180 a 250 0C por cerca de 15 a 60 minutos. Durante o processo de panificação um gradiente de temperatura abrupto (200 -» 120 °C) prevalece em relação às camadas de farinha mais externas, onde a crosta do produto assado se desenvolve. Entretanto, devido ao vapor, a temperatura no miolo é somente de 100 °C no final do processo de assadura. Acima de temperaturas de cerca de 85 °C, a inativação enzimática pode ocorrer e a enzima não terá propriedades antienvelhecimento. Deste modo, somente amilases termoestáveis são capazes de modificar o amido eficientemente durante a assadura.
A atividade da endoamilase pode afetar negativamente a qualidade do produto de pão final pela produção de um miolo grudento ou gomoso devido ao acúmulo de dextrinas ramificadas. A atividade da exoamilase é preferida, uma vez que ela efetua a modificação desejada do amido que leva ao retardo do envelhecimento, com menos dos efeitos negativos associados com atividade da endoamilase. A redução da atividade da endoamilase pode levar a uma maior exoespecificidade, a qual pode reduzir as dextrinas ramificadas e produzir um pão de qualidade superior.
Resumo
Nós fornecemos, de acordo com a invenção, um polipeptideo variante PS4 conforme estabelecido nas reivindicações. Nós ainda fornecemos o uso de tal polipeptideo variante PS4, incluindo como aditivos alimentares, produtos alimentícios, produtos assados, composições melhoradoras, produtos de ração incluindo rações animais, etc., conforme estabelecido nas reivindicações. Nós fornecemos ácidos nucleicos os quais codificam e os quais se referem aos polipeptídeos variantes PS4, conforme estabelecido nas reivindicações. Métodos para produzir tais polipeptídeos variantes PS4, assim como outros aspectos da invenção, também são estabelecidos nas reivindicações.
Breve descrição dos desenhos
Figura 1 mostra um exemplo de uma curva de um analisador de textura.
Figura 2 mostra os resultados de um experimento para determinar a estabilidade térmica dos polipeptídeos variantes PS4 aqui descritos. Eixo X: temperatura, eixo Y: meia-vida (minutos). Diamantes: pSac-D34/pMD3 (SEQ ID NO: .2), quadrados: pSac-pMD22 9 (SEQ ID NO: 13). Triângulos: pSac-pMS382 (SEQ ID NO: 21).
Figura 3 mostra os resultados de um teste de panificação no qual a firmeza do pão tratado com várias concentrações de polipeptídeo variante PS4 e pão não- tratado é testada. 0 eixo X mostra a quantidade de dias, enquanto que o eixo Y mostra a firmeza expressa como hPa (ver Exemplo 13). Diamante: 20.000 unidades de Betamyl/kg de pSac-pMS382. Quadrado: 40.000 unidades betamil/kg de pSac-pMS382. Triângulo: 60.000 unidades betamil/kg de pSac- pMS382. Cruz: controle (sem enzima).
Figura 4 mostra os resultados de um teste de panificação no qual a resiliência do pão tratado com várias concentrações do polipeptídeo variante PS4 e pão não- tratado são testadas. O eixo X mostra a quantidade de dias, enquanto que o eixo Y mostra a resiliência expressa como Unidades de Resiliência (ver Exemplo 14). Diamante: 20.000 unidades de Betamyl/kg de pSac-pMS382. Quadrado: 40.000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMS382. Triângulo: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMS382. Cruz: controle (sem enzima).
Figura 5 mostra os resultados de um teste de panificação no qual a coesão do pão tratado com várias concentrações de polipeptideo variante PS4 e pão não- tratado são testados. 0 eixo X mostra a quantidade de dias, enquanto que o eixo Y mostra a coesão expressa como unidades de coesão (ver Exemplo 15). Diamante: 20.000 Betamyl/kg de pSac-pMS382. Quadrado: 40.000 Betamyl/kg de pSac-pMS382. Triângulo: 60.000 Betamyl/kg de pSac-pMS382. Cruz: controle (sem enzima).
Figura 6 mostra os resultados de um teste de panificação no qual a firmeza do pão tratado com polipeptideo variante PS4 com substituição em 307 é testada. 0 eixo X mostra a quantidade de dias, enquanto que o eixo Y mostra a firmeza expressa como hPa (ver Exemplo 13). Diamante: controle (sem enzima). Quadrado: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-D34/pMD3 (SEQ ID NO: 2) . Triângulo: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 13). Cruz: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac- pMS382.
Figura 7 mostra os resultados de um teste de panificação no qual a resiliência do pão tratado com polipeptideo variante PS4 com substituição em 307 é testada, O eixo X mostra a quantidade de dias, enquanto que o eixo Y mostra a resiliência expressa como unidades de resiliência (ver Exemplo 14). Diamante: controle (sem enzima). Quadrado: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac- D34/pMD3 (SEQ ID NO: 2). Triângulo: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 13). Cruz: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMS382.
Figura 8 mostra os resultados de um teste de panificação no qual a coesão do pão tratado com polipeptideo variante PS4 com substituição em 307 é testada. O eixo X mostra a quantidade de dias, enquanto que o eixo Y mostra a coesão expressa como unidades de coesão (ver Exemplo 15). Diamante: controle (sem enzima). Quadrado: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-D34/pMD3 (SEQ ID NO: 2). Triângulo: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac- pMD229 (SEQ ID NO: 13). Cruz: 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMS382.
Figura 9: Teste de capacidade de flexibilidade no dia 8 após a assadura de tortillas com 400 ppm de Novamyl™ 1500 e 50 BMK/kg de pSac-pMS382 (SEQ ID NO: 21).
Figura 10: Teste de flexibilidade no dia 8 depois da assadura das tortillas com 400 ppm de Novamyl™ 1500 e 50 BMK/kg de pSac-pMS382 (SEQ ID NO: 21). Figura 11. Teste de firmeza da torrada americana preparada com SSM 471 BlO (SEQ ID NO: 27) e SSM 471 C04 (SEQ ID NO: 29) .
Figura 12. Teste de resiliência da torrada americana preparada com SSM 471 BlO (SEQ ID NO: 27) e SSM 471 C04 (SEQ ID NO: 29).
Figura 13. Teste de resiliência da torrada americana preparada com PMS 370 (SEQ ID NO: 31) e SSM 471 C04 (SEQ ID NO: 29).
LISTAGENS DE SEQÜÊNCIAS
SEQ ID NO: 1 mostra uma seqüência de referência PS4, derivada da seqüência de aminoácidos da maltotetraidrolase de Pseudomonas saccharophila. SEQ ID NO: 2 mostra uma seqüência pSac-D34; seqüência de aminoácidos da maltotetraidrolase de Pseudonionas saccharophila com 11 substituições e deleção do domínio de ligação do amido. SEQ ID NO: 3 mostra uma seqüência pSac-D20; seqüência de aminoácidos da maltotetraidrolase de Pseudomonas saccharophila com 13 substituições e deleção do domínio de ligação do amido. SEQ ID NO: 4 mostra uma seqüência pSac- D14; seqüência de aminoácidos da maltotetraidrolase de Pseudomonas saccharophila com 14 substituições e deleção do domínio de ligação do amido. SEQ ID NO: 5 mostra um precursor da glucano-1,4-alfa-maltotetraidrolase de Pseudomonas saccharophila (EC 3.2.1.60) (G4-amilase) (amilase formadora de maltotetraose) (exoamilase formadora de maltotetraose). Número de acesso SWISS-PROT P22963. SEQ ID NO: 6 mostra um gene mta de P. Saccharophila codificando a maltotetraidrolase (número EC = 3.2.1.60). Número de acesso GenBank X16732. SEQ ID NO: 7 mostra uma seqüência de referência PS4, derivada da seqüência de aminoácidos da maltotetraidrolase de Pseudomonas stutzeri. SEQ ID NO: 8 mostra uma seqüência de PStu-D34; seqüência de aminoácidos da maltotetraidrolase de Pseudomonas stutzeri com 9 substituições. SEQ ID NO: 9 mostra uma seqüência de PStu- D20; seqüência de aminoácidos da maltotetraidrolase de Pseudomonas stutzeri com 11 substituições. SEQ ID NO: 10 mostra uma seqüência PStu-D14; seqüência de aminoácidos da maltotetraidrolase de Pseudomonas stutzeri com 12 substituições. SEQ ID NO: 11 mostra uma Pseudomonas stutzeri (Pseudomonas perfectomarina). O precursor de glucano-1,4-alfa-maltotetraidrolase (EC 3.2.1.60) (G4- amilase) (amilase formadora de maltotetraose) (Exomaltotetraidrolase) (Exoamilase formadora de maltotetraose). Número de acesso SWISS-PROT P13507. SEQ ID NO: 12 mostra um gene da amilase formadora de maltotetraose de P. Stutzeri (amyP), CDs completos. Número de acesso GenBank M24516.
SEQ ID NO: 13 mostra uma seqüência de aminoácidos pSac-pMD22 9 com as mutações 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P e 334P. SEQ ID NO: 14 mostra uma seqüência de ácido nucleico pSac-pMD229. SEQ ID NO: 15 mostra uma seqüência de aminoácidos pSac-pMD248 com mutações 33Y, 34N, 121F, 134R, .141P, 14 5D, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, .307L e 334P. SEQ ID NO: 16 mostra uma seqüência de ácidos nucleicos pSac-pMD248. SEQ ID NO: 17 mostra uma seqüência de ácidos nucleicos pSac-pMD253 com mutações 33Y, 34N, .121D, 134R, 14 IP, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, .303E, 307L, 309P e 334P. SEQ ID NO: 18 mostra uma seqüência de ácidos nucleicos pSac-pMD253. SEQ ID NO: 19 mostra uma seqüência de ácidos nucleicos pSac-pMD271 com mutações 3S, .33Y, 34N, 7 0D, 121D, 134R, 141P, 146G, 157L, 178F, 179T, .223E, 22 9P, 272Q, 303E, 307L, 309P e 334P. SEQ ID NO: 20 mostra uma seqüência de ácidos nucleicos de pSac-pMD271.
SEQ ID NO: 21 mostra uma seqüência de aminoácidos pSac-pMS382 com mutações 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, .146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K, 309P e .334P. SEQ ID NO: 22 mostra uma seqüência de nucleotideos pSac-pMS382. SEQ ID NO: 23 mostra uma seqüência de aminoácidos pSac-pMS382R com mutações 33Y, 34N, 70D, 121F, .134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307R, .309P e 334P. SEQ ID NO: 24 mostra uma seqüência de nucleotideos pSac-pMS382R. SEQ ID NO: 25 mostra uma seqüência de aminoácidos pSac-pMS382H com mutações 33Y, .34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, .223E, 229P, 309P e 334P. SEQ ID NO: 26 mostra uma seqüência de nucleotideos pSac-pMS382H. SEQ ID NO: 27 mostra uma seqüência de aminoácidos SSM471 BlO com mutações 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 17 8 F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307R, 309P e 334P. SEQ ID NO: 28 mostra uma seqüência de ácido nucleico SSM471 BlO. SEQ ID NO: 29 mostra uma seqüência de aminoácidos SSM471 C04 com mutações 33Y, 34N, 121F, 134R, 14 IP, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307K, 309P e 334P. SEQ ED NO: 30 mostra uma seqüência de ácidos nucleicos SSM471 C04. SEQ ID NO: 31 mostra uma seqüência de aminoácidos PMS 370 com mutações 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 309P e 334P. SEQ ID NO: 32 mostra uma seqüência de ácido nucleico PMS 370.
Descrição detalhada
Na descrição e nos exemplos a seguir, a não ser que o contexto fale algo ao contrário, as dosagens de polipeptideos variantes PS4 são dadas em partes por milhão (microgramas por grama) de farinha. Por exemplo, "1 D34" indica 1 parte por milhão de pSac-D34 baseando-se em peso por peso. Preferivelmente, as quantidades ou total de enzima são determinadas baseando-se nos ensaios de atividade como equivalentes de proteína enzimática pura medida com albumina de soro bovino (BSA) como padrão, usando o ensaio descrito em Bradford (1976, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein- dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254).
Na descrição das diferentes variantes de polipeptideo variante PS4 produzidas ou as quais são contempladas como sendo englobadas por esse documento, a seguinte nomenclatura será adotada por facilidade de referência:
(i) Onde a substituição inclui um número e uma letra, por exemplo, 141P, então ela se refere à [posição de acordo com o sistema de numeração/aminoácido substituído] . Concordantemente, por exemplo, a substituição de um aminoácido por prolina na posição 141 é designada como .141P ;
(ii) Onde a substituição inclui uma letra, um número e uma letra, por exemplo, A141P, então isso se refere ao [aminoácido origina/posição de acordo com o sistema de numeração/aminoácido substituído]. Concordantemente, por exemplo, a substituição de alanina com prolina na posição .141 é designada como A141P.
Onde dois ou mais substituintes possíveis são possíveis numa posição particular, isso será designado por letras contíguas, as quais podem ser opcionalmente separadas por marcas de barras diagonais "/", por exemplo, G303ED ou G303E/D. Onde o aminoácido relevante na posição pode ser substituído por qualquer aminoácido, este é designado por [posição de acordo com o sistema de numeração/X], por exemplo, 121X. Múltiplas mutações podem ser designadas por sendo separadas por marcas de barras diagonais "/", por exemplo, Al 4IP/G223A ou vírgulas x\", por exemplo, A141P, G223A representando mutações na posição 141 e 223 substituindo alanina com prolina e glicina com alanina, respectivamente.
A não ser que seja definido aqui de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que os comumente entendidos por uma pessoa normalmente versada na técnica para a qual essa invenção pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a ED., John Wiley and Sons, New York (1994) e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionam a alguém habilitado um dicionário geral de muitos dos termos usados nessa invenção. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou testagem da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos. Faixas numéricas são inclusivas dos números definindo a faixa. A não ser que seja indicado de outra forma, ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita em orientação 5' para 3'; seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi, respectivamente.
A prática da presente invenção irá empregar, a não ser que seja indicado de outra forma, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, as quais estão dentro das capacidades de uma pessoa normalmente versada na técnica. Tais técnicas são explicadas na literatura. Ver, por exemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Livros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et ai. (1995 e suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, cap. 9, 13 e 16, John 235 Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, e A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak e James O1 D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principies and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), .1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approachf Irl Press; D. M. J. Lilley e J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual por Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87 969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson "Imiriunocytochemistry: Theory and Practice", CRC Press inc. , Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); "Immunochemical Protocols, vol 80", na série: "Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, Nova Jérsei, 1998, ISBN 0-8 9 60 3-4 93-3, Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B.
Fernandes (2001, New York, NY, Mareei Dekker, ISBN 0-8247- 0562-9); e Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams e Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-8 7 969-630-3. Cada um destes textos gerais sendo aqui incorporado por referência.
Todas as patentes e publicações, incluindo todas as seqüências reveladas dentro de tais patentes e publicações referidas aqui são expressamente incorporadas por referência.
Polipeptideos variantes PS4
Nós proporcionamos um polipeptideo com uma substituição em uma ou mais posições as quais efetuam uma propriedade alterada, a qual pode ser qualquer combinação de exoespecificidade alterada ou termoestabilidade alterada, ou uma propriedade de manuseio alterada, em relação à enzima de origem. Tais polipeptideos variantes são referidos neste documento por conveniência como "polipeptideos variantes PS4".
Os polipeptideos variantes PS4 exibem preferivelmente atividade enzimática. Mais preferivelmente, os polipeptideos variantes PS4 compreendem atividade amilase, preferivelmente atividade de exoamilase. Em modalidades altamente preferidas, os polipeptideos variantes PS4 exibem atividade exoamilase não-maltogênica.
Nós ainda proporcionamos composições, incluindo aditivos alimentares, produtos alimentícios, produtos de padaria, composições melhoradoras, produtos de ração incluindo rações animais, etc. compreendendo tais polipeptideos variantes PS4 alterados, preferivelmente aqueles os quais têm atividade exoamilase não-maltogênica, assim como métodos para fazer e usar tais polipeptídeos e as composições.
Conforme notado acima, os polipeptídeos variantes PS4 podem compreender uma ou mais propriedades de manuseio, preferivelmente de propriedades de assadura melhoradas. Deste modo, os polipeptídeos variantes PS4 são tais que os produtos alimentícios tratados dessa forma têm um ou mais dentre (preferivelmente todos) uma menor firmeza, uma maior resiliência, uma maior coesão, uma menor desagregação ou uma maior flexibilidade. Tais propriedades de manuseio ou panificação exibidas pelos polipeptídeos variantes PS4 são descritas em maiores detalhes abaixo.
Nós proporcionamos o tratamento de produtos alimentícios, particularmente massas e produtos de padaria com tais polipeptídeos, e de modo que os produtos alimentícios exibem as qualidades desejadas estabelecidas acima. Nós proporcionamos para outros usos de tais composições, tal como na preparação de detergentes, como adoçantes, xaropes, etc. As composições incluem o polipeptideo juntamente com pelo menos um outro componente. Particularmente, nós proporcionamos aditivos de ração ou alimentares compreendendo os polipeptídeos. Tais polipeptídeos e ácidos nucleicos variam dentre suas seqüências de origem pela inclusão de uma variedade de mutações. Em outras palavras, a seqüência do ácido nucleico ou polipeptideo variante PS4 é diferente daquela de sua origem numa variedade de posições ou resíduos. Em modalidades preferidas, as mutações compreendem substituições de aminoácidos, isto é, uma alteração num resíduo de aminoácido por outro. Deste modo, os polipeptídeos variantes PS4 compreendem uma quantidade de alterações na natureza do resíduo de aminoácido em uma ou mais posições da seqüência de origem.
Conforme aqui utilizado, o termo "variante" deve ser tomado para significar uma molécula sendo derivável de uma molécula de origem. Variantes incluem polipeptídeos, assim como ácidos nucleicos. Variantes incluem deleções, inserções e substituições no nível do aminoácido transversões, transições e inversões no nível do ácido nucleico dentre outras coisas, em um ou mais locais. Variantes também incluem mutilações. Variantes incluem homólogos e derivados funcionais de moléculas de origem. Variantes incluem seqüências que são complementares às seqüências que são capazes de hibridizar nas seqüências de nucleotideos aqui apresentadas.
MUTANTES DO RESÍDUO BÁSICO DA POSIÇÃO 307
Nós proporcionamos polipeptideo variantes PS4 com alterações de seqüência compreendendo substituições de aminoácidos numa seqüência da amilase, preferivelmente uma atividade da exoamilase, mais preferivelmente uma seqüência da exoamilase não-maltogênica.
Especificamente, nós proporcionamos um polipeptideo variante PS4 derivável de um polipeptideo de origem com atividade exoamilase não-maltogênica compreendendo uma mutação de aminoácido na posição 307 com referência à numeração da posição de uma seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1. A substituição na posição 307 é preferivelmente uma substituição para um aminoácido básico ou positivamente carregado, preferivelmente lisina (K) ou arginina (R).
Numa modalidade, nós proporcionamos um polipeptideo variante PS4 no qual a substituição no aminoácido na posição 307 é uma substituição para lisina (307K), preferivelmente H307K. Em outra modalidade, nós proporcionamos um polipeptideo variante PS4 de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, no qual a substituição de aminoácido na posição 307 é uma substituição para arginina (307R), preferivelmente H307R. O polipeptídeo variante PS4 pode ainda compreender uma mutação na posição 70 para ácido aspártico (D), preferivelmente 70D. Em modalidades preferidas, a substituição é G70D. Concordantemente, em algumas modalidades, nós proporcionamos um polipeptídeo variante PS4 compreendendo as substituições G70D, H307K ou G70D, H307R em relação à sequencia de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.
Os resíduos nas posições 272 e 303 podem ser do "tipo selvagem" ou eles podem sofrer mutação. Em modalidades preferidas, o resíduo na posição 272 é um resíduo do tipo selvagem, isto é, histidina (H). Preferivelmente, o resíduo na posição 303 é também um resíduo do tipo selvagem, isto é, glicina (G). Nós, deste modo, proporcionamos um polipeptídeo variante PS4 compreendendo substituições G70D e H307K com o resíduo na posição 272 sendo Heo resíduo na posição 303 sendo G, ou G70D e H307R com o resíduo na posição 272 sendo Heo resíduo na posição 303 sendo G em relação à seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.
Tais polipeptídeos variantes, e outros conforme descritos neste documento, são referidos neste documento como "polipeptídeos variantes PS4". Ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos variantes também são revelados e serão referidos, por conveniência, como "ácidos nucleicos variantes PS4". Ácidos nucleicos e polipeptideos variantes PS4 serão descritos em maiores detalhes abaixo.
As seqüências "de origem", isto é, as seqüências nas quais os polipeptideos variantes PS4 e ácidos nucleicos estão baseadas, são preferivelmente polipeptideos com atividade exoamilase não-maltogênica. Os termos "enzimas de origem" e "polipeptideos de origem" devem ser interpretados concordantemente, e tomados para significar as enzimas e polipeptideos nos quais os polipeptideos variantes PS4 são baseados. Eles são descritos em maiores detalhes abaixo.
As mutações e alterações de aminoácidos podem ser feitas em qualquer estrutura ou fundo de polipeptideo, do tipo selvagem ou modificado, conforme descrito em maiores detalhes abaixo.
Em modalidades particularmente preferidas, as seqüências de origem são enzimas exoamilase não- maltogênicas, preferivelmente enzimas exoamilase não- maltogênicas bacterianas. Em modalidades altamente preferidas, a seqüência de origem compreende uma glucano- 1, 4-alfa-maltotetraidrolase (EC 3.2.1.60). Preferivelmente, a seqüência de origem é derivável de espécies Pseudomonas, por exemplo, Pseudomonas saccharophilia ou Pseudomonas stutzeri.
Em algumas modalidades, o polipeptideo de origem compreende, ou é homólogo, a uma seqüência de exoamilase não-maltogênica do tipo selvagem, por exemplo, de Pseudomonas spp.
Deste modo, o polipeptideo de origem pode compreender uma exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas saccharophilia com uma seqüência mostrada como SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades preferidas, o polipeptideo de origem compreende uma exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas stutzeri com uma seqüência conforme mostrada como SEQ ID NO: 11, ou uma exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas stutzeri com número de acesso SWISS-PROT P13507 .
Por outro lado, o polipeptideo de origem pode ser uma variante de qualquer uma das seqüências do tipo selvagem, em outras palavras, o polipeptideo de origem pode por si só ser projetado, ou compreendido de um polipeptideo variante PS4 .
Em modalidades preferidas, as mutações e alterações são feitas numa seqüência PS4, a qual já tenha sido modificada, preferivelmente pMD229 (SEQ ID NO: 13 ou 14) .
Entretanto, será claro para um leitor versado na técnica que embora os polipeptideos variantes PS4 possam ser deriváveis pela mutação de seqüências já modificadas, é possível construir tais polipeptideos variantes partindo de uma seqüência do tipo selvagem (ou de fato qualquer seqüência adequada), identificando as diferenças entre a seqüência de partida e a variante desejada, e introduzindo as mutações requeridas na seqüência de partida para alcançar a variante desejada.
Proteínas e ácidos nucleicos relacionados preferivelmente com homologia de seqüência ou funcional com seqüência de exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1 ou uma exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas stutzeri com uma seqüência mostrada como SEQ ID NO: 11 são referidas neste documento como membros da "família PS4". Exemplos das enzimas de exoamilase não-maltogênica da "família PS4" adequadas para uso na geração dos polipeptídeos e ácidos nucleicos variantes PS4 são revelados em maiores detalhes abaixo.
Os polipeptídeos variantes PS4 descritos neste documento preferivelmente retêm as características dos polipeptídeos de origem, e adicionalmente preferivelmente têm propriedades benéficas adicionais, por exemplo, atividade ou termoestabilidade intensificada, ou resistência ao pH, ou qualquer combinação (preferivelmente todas). Isto é descrito em maiores detalhes abaixo.
Os mutantes de substituição PS4 descritos aqui podem ser usados para qualquer propósito adequado. Eles podem ser preferivelmente usados para propósitos para os quais a enzima de origem é adequada. Particularmente, eles podem ser usados em qualquer aplicação para a qual a exomaltotetraidrolase é usada. Em modalidades altamente preferidas, eles têm a vantagem adicional de uma maior termoestabilidade, ou uma maior atividade exoamilase ou uma maior estabilidade de pH, ou qualquer combinação. Exemplos de usos adequados para os ácidos nucleicos e polipeptideos variantes PS4 incluem produção de alimentos, particularmente de padaria, assim como a produção de gêneros alimentícios; outros exemplos estão estabelecidos em detalhes abaixo.
Os polipeptideos variantes PS4 podem compreender uma ou mais outras mutações além daquelas posições estabelecidas abaixo. Eles podem ser uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais mutações, preferivelmente substituições além daquelas já estabelecidas. Outras mutações, tais como deleções, inserções e substituições no nível do aminoácido e transversões, transições e inversões no nível do ácido nucleico, em um ou em mais outros locais, também podem ser incluídas, conforme descrito abaixo. Além disso, as variantes PS4 não precisam ter todas as substituições nas posições listadas. De fato, pode haver uma, duas, três, quatro ou cinco substituições faltando, isto é, o resíduo de aminoácido tipo selvagem estar presente em tais posições.
Outras modificações
Posições 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 e/ou 334. Em modalidades preferidas, o polipeptideo variante PS4 pode compreender uma ou mais outras mutações em outros sítios ou posições na sua seqüência.
Por exemplo, o polipeptideo variante PS4 pode ainda compreender uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo das posições: 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, .157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 ou 334. Os resíduos nestas posições podem preferivelmente compreender 33Y, 34N, .70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, .229P, 307K, 309P ou 334P.
0 polipeptideo variante PS4 pode, deste modo, compreender, além de 307K/R/H, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, .10, 11, 12, 13, 14 ou todas as 15 mutações nas posições 33, .34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, .309 ou 334. 0 resíduo da posição 307 em tais modalidades pode compreender histidina (H), particularmente onde tais mutações adicionais estão presentes.
0 polipeptideo variante PS4 pode, deste modo, compreender, além de 307K/R/H, 1 mutação adicional em qualquer uma das posições 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, .157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 ou 334, conforme mostrado em "Anexo A: 1 Mutação", isto é, 33Y; 34N; 70D; 121F; 134R; .141P; 146G; 157L; 161A; 178F; 179T; 223E; 229P; 309P ou .334 P.
Em outras palavras, o polipeptideo variante PS4 pode compreender qualquer um dentre os seguintes: 33Y, 307K/R/H; .34Ν, 30 7K/R/H; 70D, 307K/R/H; 121F, 307K/R/H; 134R, .3 0 7K/R/H; 141Ρ, 307K/R/H; 146G, 307K/R/H, 157L, 307K/R/H; .161Α, 307K/R/H; 178F, 307K/R/H; 179Τ, 307K/R/H; 223Ε, .307K/R/H; 229Ρ, 307K/R/H; 309Ρ, 307K/R/H; ou 334P, .307K/R/H.
O polipeptídeo variante PS4 pode alternativamente compreender, além de 307K/R/H, 2 outras modificações em qualquer uma das posições 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, .157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 ou 334, conforme mostrado em "Anexo A: 2 mutações", isto é, 33Y, 34N; 33Y, 70D; 33Y, .121F; 33Y, 134R; 33Y, 141P; 33Y, 146G; 33Y, 157L; 33Y, .161A; 33Y, 178F; 33Y, 179T; 33Y, 223E; 33Y, 229P; 33Y, .309 P; 33Υ, 3 34P; 34N, 70D; 34N, 121F; 34N, 134R; 34N, 14 IP; .34N, 146G; 34N, 157L; 34N, 161A; 34N, 178F; 34N, 179T; 34N, .223 E; 3 4N, 22 9P; 34N, 30 9P; 34N, 334 P; 7 0D, 121F; 7 0D, .134 R; 7 0D, 141P; 70D, 146G; 70D, 157L; 70D, 161A; 70D, .178 F; 70D, 179T; 70D, 223E; 70D, 229P; 70D, 309P; 70D, .334 P; 121F, 134R; 121F, 141P; 121F, 146G; 121F, 157L; 121F, .161A; 121F, 178F; 121F, 179T; 121F, 223E; 121F, 229P; 121F, .309 P; 121F, 334P; 134R, 141P; 134R, 146G; 134R, 157L; 134R, .161A; 134R, 178F; 134R, 179T; 134R, 223E; 134R, 229P; 134R, .309 P; 134R, 334P; 141P, 146G; 141P, 157L; 141P, 161A; 141P, .178 F; 14 IP, 179T; 141P, 223E; 141P, 229P; 141P, 309P; 141P, .334 P; 146G, 157L; 146G, 161A; 146G, 178F; 146G, 179T; 146G, .223 E; 146G, 229P; 146G, 309P; 146G, 334P; 157L, 161A; 157L, .178 F; 157L, 179T; 157L, 223E; 157L, 229P; 157L, 309P; 157L, 334P ; 161A, 178F; 161A, 179T; 161A, 223E; 161A, 229P; 161A, 309P ; 161A, 334P; 178F, 179T; 178F, 223E; 178F, 229P; 178F, 309P ; 178F, 334P; 179T, 223E; 179T, 229P; 179T, 309P; 179T, 334P ; 223E, 229P; 223E, 309P; 223E, 334P; 229P, 309P; 229P, 334P; ou 309P, 334P.
Em outras palavras, o polipeptideo variante PS4 pode compreender qualquer um dentre os seguintes: 33Y, 34N, 307K/R/H; 33Y, 70D, 307K/R/H; 33Y, 121F, 307K/R/H; 33Y, 134R, 307K/R/H; 33Y, 141P, 307K/R/H; 33Y, 146G, 307K/R/H; 33Y, 157L, 307K/R/H; 33Y, 161A, 307K/R/H; 33Y, 178F, 307K/R/H; 33Y, 179T, 307K/R/H; 33Y, 223E, 307K/R/H; 33Y, 229P, 307K/R/H; 33Y, 309P, 307K/R/H; 33Y, 334P, 307K/R/H; 34N, 70D, 307K/R/H; 34N, 121F, 307K/R/H; 34N, 134R, 307K/R/H; 34N, 141P, 307K/R/H; 34N, 146G, 307K/R/H; 34N, 157L, 307K/R/H; 34N, 161A, 307K/R/H; 34N, 178F, 307K/R/H; 34N, 179T, 307K/R/H; 34N, 223E, 307K/R/H; 34N, 229P, 307K/R/H; 34N, 309P, 307K/R/H; 34N, 334P, 307K/R/H; 70D, 121F, 307K/R/H; 70D, 134R, 307K/R/H; 70D, 141P, 307K/R/H; 70D, 146G, 307K/R/H; 70D, 157L, 307K/R/H; 70D, 161A, 307K/R/H; 70D, 178F, 307K/R/H; 70D, 179T, 307K/R/H; 70D, 223E, 307K/R/H; 70D, 229P, 307K/R/H; 70D, 309P, 307K/R/H; 70D, 334P, 3 07K/R/H; 121F, 134R, 307K/R/H; 121F, 141P, 307K/R/H; 121F, 146G, 307K/R/H; 121F, 157L, 307K/R/H; 121F, 161A, 307K/R/H; 121F, 178F, 307K/R/H; 121F, 179T, 307K/R/H; 121F, 223E, 307K/R/H; 121F, 229P, 307K/R/H; 121F, 309P, 307K/R/H; 121F, 334P, 307K/R/H; 134R, 141P, 307K/R/H; 134R, 146G, 307K/R/H; 134R, 157L, 307K/R/H; 134R, 161Α, 307K/R/H; 134R, 178F, 307K/R/H; 134R, 179Τ, 307K/R/H; 134R, 223Ε, 3 07K/R/H; 134R, 229Ρ, 307K/R/H; 134R, 309Ρ, 307K/R/H; 134R, 334Ρ, 307K/R/H; 141Ρ, 146G, 307K/R/H; 141Ρ, 157L, 307K/R/H; 141P, 161A, 307K/R/H; 141P, 178F, 307K/R/H; 141P, 179T, 307K/R/H; 141P, 223E, 307K/R/H; 141P, 229P, 307K/R/H; 141P, 309P, 307K/R/H; 141P, 334P, 307K/R/H; 146G, 157L, 307K/R7H; 146G, 161A, 307K/R/H; 146G, 178F, 307K/R/H; 146G, 179T, 307K/R/H; 146G, 223E, 307K/R/H; 146G, 229P, 307K/R/H; 146G, 309P, 307K/R/H; 146G, 334P, 307K/R/H; 157L, 161A, 307K/R/H; 157L, 17 8 F, 307K/R/H; 157L, 179T, 307K/R/H; 157L, 223E, 307K/R/H; 157L, 229P, 307K/R/H; 157L, 309P, 307K/R/H; 157L, 334 P, 307K/R/H; 161A, 178F, 307K/R/H; 161A, 179T, 307K/R/H; 161A, 223E, 307K/R/H; 161A, 229P, 307K/R/H; 161A, 309P, 307K/R/H; 161A, 334P, 307K/R/H; 178F, 179T, 307K/R/H; 178F, 223E, 307K/R/H; 178F, 229P, 307K/R/H; 178F, 309P, 307K/R/H; 178 F, 334P, 307K/R/H; 179T, 223E, 307K/R/H; 179T, 229P, 307K/R/H; 179T, 309P, 307K/R/H; 179T, 334P, 307K7R/H; 223E, 229P, 307K/R/H; 223E, 309P, 307K/R/H; 223E, 334P, 307K/R/H; 229P, 309P, 307K/R/H; 229P, 334P, 307K/R/H; 309P, 334P, 307K/R/H.
O polipeptídeo variante PS4 pode compreender alternativamente, além de 307K/R/H, 3 outras mutações em qualquer uma das posições 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 ou 334, conforme mostrado em "Anexo A: 3 Mutações". O polipeptideo variante PS4 pode alternativamente compreender, além de 307K/R/H, 4 outras mutações em qualquer uma das posições: 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 ou 334, conforme mostrado em "Anexo A: 4 Mutações".
O polipeptideo variante PS4 pode alternativamente compreender, além de 307K/R/H, 5 outras mutações em qualquer uma das posições: 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 ou 334, conforme mostrado em "Anexo A: 5 Mutações".
O polipeptideo variante PS4 pode alternativamente compreender, além de 307K/R/H, 6 outras mutações em qualquer uma das posições: 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 ou 334, conforme mostrado em "Anexo A: 6 Mutações".
0 polipeptideo variante PS4 pode alternativamente compreender, além de 307K/R/H, 7 outras mutações em qualquer uma das posições: 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 ou 334, conforme mostrado em "Anexo A: 7 Mutações".
0 polipeptideo variante PS4 pode compreender uma seqüência com 9 mutações, isto é, cada uma dos seguintes resíduos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 17 8 F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P, porém não incluindo os septetos de resíduos mostrados em "Anexo A: 7 Mutações". O polipeptideo variante PS4 pode compreender uma seqüência com 10 mutações, isto é, cada uma dos seguintes resíduos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, .178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P, porém não incluindo os sextetos de resíduos mostrados em "Anexo A: 6 Mutações".
O polipeptideo variante PS4 pode compreender uma seqüência com 11 mutações, isto é, cada uma dos seguintes resíduos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, .178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P, porém não incluindo os quintetos de resíduos mostrados em "Anexo A: 5 Mutações".
0 polipeptideo variante PS4 pode compreender uma seqüência com 12 mutações, isto é, cada uma dos seguintes resíduos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, .178 F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P, porém não incluindo os quadrupletes de resíduos mostrados em "Anexo A: 4 Mutações".
O polipeptideo variante PS4 pode compreender uma seqüência com 13 mutações, isto é, cada uma dos seguintes resíduos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178 F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P, porém não incluindo os tripletes de resíduos mostrados em "Anexo A: 3 Mutações".
O polipeptideo variante PS4 pode compreender uma seqüência com 14 mutações, isto é, cada uma dos seguintes resíduos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, .178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P, porém não incluindo os pares de resíduos mostrados em "Anexo A: 2 Mutações".
O polipeptídeo variante PS4 pode compreender uma seqüência com 15 mutações, isto é, cada uma dos seguintes resíduos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, .178 F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P, porém não incluindo os resíduos individuais mostrados em "Anexo A: 1 Mutação".
Seqüências de polipeptídeos variantes PS4 preferidas
Preferivelmente, entretanto, o polipeptídeo variante PS4 compreende ainda mutações em cada uma dessas posições.
Nós especificamente proporcionamos um polipeptídeo variante PS4 derivável de um polipeptídeo de origem com atividade exoamilase não-maltogênica, no qual o polipeptídeo variante PS4 compreende uma mutação em cada uma das seguintes posições 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, .157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309, 334, com referência à numeração de posição de uma seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia apresentada como SEQ ID NO: 1.
Em modalidades preferidas, a mutação na posição 307 compreende um resíduo positivamente carregado ou básico. Em algumas modalidades, a mutação na posição 307 compreende .307K ou 307R. Em outra modalidade preferida, o resíduo da posição 307 é H. Nós, deste modo, proporcionamos um polipeptideo variante PS4 derivável de um polipeptideo de origem com atividade exoamilase não-maltogênica, no qual o polipeptideo variante PS4 compreende uma mutação na posição .307 para K ou R, ou no qual o resíduo da' posição 307 é H, juntamente com mutações em cada uma das posições 33, 34, .70, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, .309, 334.
Preferivelmente, o resíduo da posição 33 pode compreender Y, preferivelmente 33Y, mais preferivelmente N33Y. Preferivelmente, o resíduo da posição 34 pode compreender N, preferivelmente 34N, mais preferivelmente D34N. Preferivelmente, o resíduo da posição 70 pode compreender D, preferivelmente 70D, mais preferivelmente G70D. Preferivelmente, o resíduo da posição 121 pode compreender F, preferivelmente 121F, mais preferivelmente G121F. Preferivelmente, o resíduo da posição 134 pode compreender R, preferivelmente 134R, mais preferivelmente G134R. Preferivelmente, o resíduo da posição 141 pode compreender P, preferivelmente 141P, mais preferivelmente A141P. Preferivelmente, o resíduo da posição 146 pode compreender G, preferivelmente 146G, mais preferivelmente Y146G. Preferivelmente, o resíduo da posição 157 pode compreender L, preferivelmente 157L, mais preferivelmente I157L. Preferivelmente, o resíduo da posição 161 pode compreender A, preferivelmente 161A, mais preferivelmente S161A. Preferivelmente, o resíduo da posição 178 pode compreender F, preferivelmente 178F, mais preferivelmente L178F. Preferivelmente, o resíduo da posição 179 pode compreender T, preferivelmente 179T, mais preferivelmente A179T. Preferivelmente, o resíduo da posição 223 pode compreender E, preferivelmente 223E, mais preferivelmente G223E. Preferivelmente, o resíduo da posição 229 pode compreender P, preferivelmente 229P, mais preferivelmente S229P. Preferivelmente, o resíduo da posição 307 pode compreender K, preferivelmente 307K, mais preferivelmente H307K. Preferivelmente, o resíduo da posição 309 pode compreender P, preferivelmente 309P, mais preferivelmente A309P. Preferivelmente, o resíduo da posição 334 pode compreender P, preferivelmente 334P, mais preferivelmente S334P.
Conforme notado acima, em modalidades preferidas a mutação da posição 70 é 70D, preferivelmente G70D. Nós, deste modo, proporcionamos um polipeptídeo variante PS4 derivável de um polipeptídeo de origem com atividade exoamilase não-maltogênica, no qual o polipeptídeo variante PS4 compreende uma mutação na posição 307 para K ou R, ou no qual o resíduo da posição 307 é H, e uma mutação na posição 70 para 70D, juntamente com mutações em cada uma das posições 33, 34, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309, 334.
Em modalidades preferidas, o resíduo na posição 272 é "do tipo selvagem", isto é, não-modifiçado. 0 resíduo da posição 272 é deste modo, preferivelmente histidina (H) . Nós, deste modo, proporcionamos um polipeptideo variante PS4 derivável de um polipeptideo de origem com atividade exoamilase não-maltogênica, no qual o polipeptideo variante PS4 compreende uma mutação na posição 307 para K ou R, ou no qual o resíduo da posição 307 é H, e uma mutação na posição 70 para 70D, no qual o resíduo da posição 272 é H, juntamente com mutações em cada uma das posições 33, 34, .121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309, .334 .
Semelhantemente, o resíduo na posição 303 é "do tipo selvagem" ou não-modifiçado, e é preferivelmente glicina (G) em outras modalidades preferidas. Nós, deste modo, proporcionamos um polipeptideo variante PS4 derivável de um polipeptideo de origem com atividade exoamilase não- maltogênica, no qual o polipeptideo variante PS4 compreende uma mutação na posição 307 para K ou R, ou no qual o resíduo da posição 307 é H, e uma mutação na posição 70 para 70D, no qual o resíduo da posição 303 é G, juntamente com mutações em cada uma das posições 33, 34, 121, 134 , .141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309, 334.
Em modalidades preferidas, em cada uma das modalidades acima do polipeptideo variante PS4, as quais compreendem outras mutações nas posições 33, 34, 70, 121, 134, 141, .146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 307, 309, 334, o resíduo da posição 33 é preferivelmente Υ, o resíduo da posição 34 é preferivelmente N, o resíduo da posição 70 é preferivelmente D, o resíduo da posição 121 é preferivelmente F, 0 resíduo da posição 134 é preferivelmente R, o resíduo da posição 141 é preferivelmente p, o resíduo da posição 146 é preferivelmente G, O resíduo da posição 157 é preferivelmente L, O resíduo da posição 161 é preferivelmente A, O resíduo da posição 178 é preferivelmente F, O resíduo da posição 179 é preferivelmente T, O resíduo da posição 223 é preferivelmente E, O resíduo da posição 229 é preferivelmente P, O resíduo da posição 309 é preferivelmente P e o resíduo da posição 334 é
preferivelmente Ρ.
Em modalidades altamente preferidas, nós fornecemos um polipeptideo variante PS4 o qual compreende os seguintes resíduos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K/R/H, 309P, 334P. 0 polipeptideo variante PS4 pode compreender cada uma das seguintes mutações N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307K/R, A309P e S334P.
Nós especificamente fornecemos um polipeptideo variante PS4 o qual compreende as seguintes substituições 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K, 309P, 334P, preferivelmente N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, Α141Ρ, Y146G, I157L, S161A, L178F, Α179Τ, G223E, S229P, Η307Κ, Α309Ρ, S334P em relação à seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1. Em tal modalidade, o polipeptideo variante PS4 pode compreender uma seqüência SEQ ID NO: 21.
Nós ainda fornecemos um polipeptideo variante PS4 o qual compreende as seguintes substituições 33Y, 34N, 70D, .121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, .307R, 309P, 334P, preferivelmente N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307R, A309P, S334P em relação à seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1. Em tal modalidade, o polipeptideo variante PS4 pode compreender uma seqüência SEQ ID NO: 23.
Nós ainda fornecemos um polipeptideo variante PS4 derivável de um polipeptideo de origem com atividade exoamilase não-maltogênica, no qual o polipeptideo variante PS4 compreende as seguintes substituições 33Y, 34N, 70D, .121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, .309P, 334P, preferivelmente N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, A309P, S334P em relação à seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1. Em tal modalidade, o polipeptideo variante PS4 pode compreender uma seqüência SEQ ID NO: 25. OUTRAS SUBSTITUIÇÕES
Uma ou mais outras mutações conforme estabelecidas na tabela abaixo podem ainda estar presentes no polipeptídeo variante PS4 aqui descrito.
<table>table see original document page 38</column></row><table> <table>table see original document page 39</column></row><table>
ÁCIDOS NUCLEICOS VARIANTES PS4
Nós também descrevemos ácidos nucleicos PS4 com seqüências as quais correspondem a ou codificam as alterações nas seqüências de polipeptideos variantes PS4, para uso na produção de tais polipeptideos para os propósitos aqui descritos. Deste modo, nós fornecemos ácidos nucleicos capazes de codificar qualquer seqüência de polipeptideos estabelecida neste documento.
A pessoa habilitada estará ciente da relação entre seqüência de ácido nucleico e seqüência de polipeptideo, particularmente, o código genético e a degeneração deste código, e será capaz de construir tais ácidos nucleicos PS4 sem dificuldade. Por exemplo, ela estará ciente de que para cada substituição de aminoácido na seqüência do polipeptideo variante PS4, pode haver um ou mais códons os quais codifiquem o aminoácido substituto. Concordantemente, será evidente que, dependendo da degeneração do código genético em relação àquele resíduo de aminoácido particular, uma ou mais seqüências de ácidos nucleicos PS4 podem ser geradas correspondendo àquela seqüência de polipeptideo variante PS4. Além disso, onde o polipeptideo variante PS4 compreende mais de uma substituição, por exemplo H307K/G70D, os ácidos nucleicos correspondentes podem compreender combinações em pares dos códons os quais codificam respectivamente as duas alterações de aminoácidos.
As seqüências de ácidos nucleicos variantes PS4 podem ser deriváveis de ácidos nucleicos de origem os quais codificam qualquer um dos polipeptideos de origem descritos acima. Particularmente, ácidos nucleicos de origem podem compreender seqüências do tipo selvagem, por exemplo, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 12. Os ácidos nucleicos variantes PS4 podem, deste modo, compreender ácidos nucleicos codificando exoamilases não-maltogênicas do tipo selvagem, porém as quais codificam outro aminoácido na posição relevante ao invés do resíduo de aminoácido do tipo selvagem. As seqüências de ácido nucleico variantes PS4 podem também compreender seqüências do tipo selvagem com uma ou mais mutações, por exemplo, as quais codifiquem os polipeptideos de origem descritos acima sob "Combinações".
Será entendido que seqüências de ácidos nucleicos as quais não são idênticas às seqüências de ácidos nucleicos variantes PS4 particulares, porém que são relativas a essas, também serão úteis para os métodos e composições aqui descritos, tais como uma variante, homólogo, derivado ou fragmento de uma seqüência de ácido nucleico variante PS4, ou um complemento ou uma seqüência capaz de hibridizar daí. A não ser que o contexto diga o contrário, o termo "ácido nucleico variante PS4" deve ser tomado para incluir cada uma dessas entidades listadas acima.
Mutações na seqüência de aminoácidos e na seqüência de ácidos nucleicos podem ser feitas por qualquer uma dentre uma variedade de técnicas, conforme é conhecido na técnica. Seqüências variantes podem ser facilmente feitas usando qualquer uma das técnicas de mutagênese conhecidas, por exemplo, mutagênese direcionada a sítio usando PCR com iniciadores de oligonucleotídeo apropriados, mutagênese de complemento 5' , mutagênese de iniciador mal-emparelhado (mismatch), etc. Alternativamente, ou além disso, as seqüências de ácido nucleico variantes PS4 podem ser feitas de novo.
Em modalidades particularmente preferidas, as mutações são introduzidas em seqüências de origem através de PCR (reação em cadeia de polimerase) usando iniciadores apropriados, conforme é ilustrado nos Exemplos. É, consequentemente, possível alterar a seqüência de um polipeptídeo através da introdução de quaisquer substituições de aminoácidos desejadas num polipeptídeo de origem, preferivelmente com atividade exoamilase não- maltogênica, tal como numa seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia ou de Pseudomonas stutzeri no nível de aminoácido ou de ácido nucleico, conforme descrito. Nós descrevemos um método no qual a seqüência de uma exoamilase não-maltogênica é alterada pela alteração da seqüência de um ácido nucleico o qual codifica a exoamilase não-maltogênica.
Entretanto, será claramente percebido que o polipeptídeo variante PS4 não precisa de fato ser efetivamente derivado de uma seqüência de polipeptídeo ou ácido nucleico do tipo selvagem, por exemplo, por mutação passo a passo. Preferivelmente, uma vez que a seqüência do polipeptídeo variante PS4 é estabelecida, a pessoa versada na técnica pode fazer facilmente aquela seqüência a partir do tipo selvagem com todas as mutações, através de meios conhecidos na técnica, por exemplo, usando iniciadores de oligonucieotideo apropriados e PCR. De fato, o polipeptideo variante PS4 pode ser feito de novo com todas as suas mutações, por exemplo, através da metodologia de síntese de peptídeo.
Entretanto, em geral, os polipeptideos e/ou ácidos nucleicos variantes PS4 são derivados ou deriváveis de uma seqüência "precursora". 0 termo "precursor" conforme aqui utilizado, significa uma enzima que precede a enzima a qual é modificada de acordo com os métodos e composições aqui descritas. Um precursor, portanto, inclui uma enzima utilizada para produzir uma enzima modificada. Deste modo, o precursor pode ser uma enzima que é modificada por mutagênese conforme descrito em outros locais neste documento. Da mesma forma, o precursor pode ser uma enzima do tipo selvagem, uma enzima do tipo selvagem variante ou uma enzima já modificada.
Os polipeptideos e ácidos nucleicos variantes PS4 podem ser produzidos através de quaisquer formas conhecidas na técnica. Especificamente, eles podem ser expressos a partir de sistemas de expressão, os quais podem ser in vitro ou in vivo na natureza. Especificamente, nós descrevemos plasmídeos e vetores de expressão compreendendo seqüências de ácidos nucleicos PS4, preferivelmente capazes de expressar polipeptideos variantes PS4. As células e as células hospedeiras as quais compreendem e são preferivelmente transformadas com tais ácidos nucleicos PS4, plasmídeos e vetores também são reveladas, e deve ficar claro que estas também estão englobadas neste documento.
Os polipeptideos variantes PS4 podem ser, por exemplo, feitos usando mutagênese direcionada a sitio usando PCR com iniciadores oligonucleotideos apropriados, adjuvantes mutagênese 5' , mutagênese com iniciador mal-emparelhado (mismatch), etc. conforme descrito no Exemplo 4A. Para produzir polipeptideos variantes PS4 com mutações nas posições 307, por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico correspondendo a uma seqüência pSac-pMD229; seqüência de nucleotideo da maltotetraidrolase de Pseudômonas saccharophila com 17 substituições e deleção do dominio de ligação ao amido (SEQ ID NO: 14) pode ser feita e as alterações relevantes introduzidas. O leitor versado estará, entretanto, ciente de que qualquer seqüência de partida adequada pode ser usada, e de fato é possível partir de uma seqüência de exoamilase do tipo selvagem para obter o polipeptídeo variante desejado ou num único passo ou através de outras seqüências intermediárias.
Em modalidades preferidas, a seqüência de polipeptídeo variante PS4 é usada como um aditivo alimentar numa forma isolada. 0 termo "isolado" significa que a seqüência é pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente com o qual a seqüência está naturalmente associada e conforme é encontrada na natureza. Em um aspecto, preferivelmente a seqüência está na forma purificada. O termo "purificada" significa que a seqüência está num estado relativamente puro - por exemplo, pelo menos cerca de 90% puro, ou pelo menos cerca de 95% puro ou pelo menos cerca de 98% puro.
Em modalidades altamente preferidas, a seqüência de ácido nucleico compreende as seqüências mostradas nas SEQ ID Nos: 22, 24 ou 26.
NUMERAÇÃO DA POSIÇÃO
Todas as posições referidas no presente documento por numeração se referem à numeração de uma seqüência de referência de exoamilase de Pseudômonas saccharophilia mostrada abaixo (SEQ ID NO: 1).
.1 DQAGKSPASV RYBGGDEIIL QGFBWNWRE APNDWYNILR QQASTIAADG FSAIWMPVPW .61 RDFSSWTDGG KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQLRQAAG ALGGAGVKVL YDWPNHMNR .121 GYPDKEINLP AGQGFWRNDC ADPGNYPNDC DDGDRFIGGS SDLNTGHPQI YGtiFRDELAN .181 LRSGYGAGGF RFDFVRGYAP ERVDSWMSDS ADSSFCVGEL WKGPSEYPSW DWRNTASWQQ .241 IIKDWSDRAK CPVFDFALKE HMQNGSVADW XHGLNGNPDP RWREVAVTFV DNHDTGYSPG .301 QNGGQHHWAL QDGLIRQAYA YILTSPGTPV VfWSHMYDWG YGDFIRQLIQ VRRTAGVRAD .361 SAISFHSGYS GLVATVSGSQ QTLWALNSD LANPGQVASG SFSEAVNASN GQVRVWRSGS .421 GDGGGNDGGE GGLVNVNFRC DNGVTQMGDS VYAVGNVSQL GNWSPASAVR LTDTSSYPTW .481 KGSIALPDGQ NVEWKCLIRN EADATLVRQW QSGGNNQVQA AAGASTSGSF
A seqüência de referência é derivada da seqüência de Pseudômonas saccharophilia com número de acesso SWISS-PROT P22963, porém sem a seqüência de sinal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA.
O domínio de ligação a amido C-terminal EGGLVNVNFR CDNGVTQMGD SVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT WKGSIALPDG QNVEWKCLIR NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS F pode ser opcionalmente deletado ou desconsiderado. Alternativamente, ele pode ser incluído na seqüência de polipeptídeo variante PS4 .
No contexto da presente descrição, uma numeração específica das posições de resíduo de aminoácido nas enzimas exoamilase PS4 é empregada. Sob esse aspecto, através do alinhamento das seqüências de aminoácidos de várias exoamilases conhecidas, é possível dividir claramente uma numeração de posição de um aminoácido de exoamilase para qualquer posição de resíduo de aminoácido em qualquer enzima exoamilase, a seqüência de aminoácido da qual sendo conhecida. Usando este sistema de numeração originado, por exemplo, da seqüência de aminoácidos da exoamilase obtida a partir de Pseudomonas saccharophilía, alinhada com seqüências de aminoácidos de uma variedade de outras exoamilases conhecidas, é possível indicar a posição de um resíduo de aminoácido numa exoamilase de forma clara.
Consequentemente, o sistema de numeração, embora possa usar uma seqüência específica como um ponto de referência de base, também é aplicável a todas as seqüências homólogas relevantes. Por exemplo, a numeração de posição pode ser aplicada em seqüências homólogas a partir de outras espécies de Pseudomonas, ou de seqüências homólogas a partir de outras bactérias. Preferivelmente, tais homólogos têm 60% ou mais de homologia, por exemplo 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais ou 95% ou mais de homologia, com a seqüência de referência SEQ ID NO: 1 acima, ou as seqüências com números de acesso SWISS-PROT P22963 ou P13507, preferivelmente com todas essas seqüências. A homologia de seqüência entre as proteínas pode ser determinada usando programas de alinhamento bem conhecidos e técnicas de hibridização neste descritas. Tais seqüências homólogas, assim como os equivalentes funcionais descritos abaixo, serão referidos neste documento como a "família PS4 " .
Além disso, conforme notado acima, o sistema de numeração usado neste documento faz referência a uma seqüência de referência SEQ ID NO: 1, a qual é derivada da seqüência de Pseudômonas saccharophilia com número de acesso SWISS-PROT P22963, porém sem a seqüência de sinal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA. Essa seqüência de sinal é localizada no N terminal da seqüência de referência e consiste de 21 resíduos de aminoácidos. Concordantemente, será trivial identificar os resíduos particulares a serem modificados ou substituídos em seqüências correspondentes compreendendo a seqüência de sinal, ou de fato, seqüências correspondentes compreendendo quaisquer outras extensões ou deleções N- ou C-terminais. Em relação às adições ou deleções N-terminais, tudo o que é necessário é compensar a numeração de posição pelo número de resíduos inseridos ou deletados. Por exemplo, posição 1 na SEQ ID NO: 1 corresponde à posição 22 numa seqüência com a seqüência de sinal.
ENZIMA/POLIPEPTíDEO DE ORIGEM Os polipeptideos variantes PS4 são derivados de, ou são variantes de outra seqüência, conhecida como "enzima de origem", um "polipeptídeo de origem" ou uma "seqüência de origem".
O termo "enzima de origem", conforme usado neste documento, significa a enzima que tem uma estrutura química próxima, preferivelmente a mais próxima da variante resultante, isto é, o polipeptídeo ou ácido nucleico variante PS4. A enzima de origem pode ser uma enzima precursora (isto é, a enzima que é de fato modificada) ou ela pode ser preparada de novo. A enzima de origem pode ser uma enzima do tipo selvagem, ou ela pode ser uma enzima do tipo selvagem compreendendo uma ou mais modificações.
0 termo "precursor", conforme aqui utilizado, significa uma enzima que precede a enzima a qual é modificada para produzir a enzima. Deste modo, o precursor pode ser uma enzima que seja modificada por mutagênese. Da mesma forma, o precursor pode ser uma enzima do tipo selvagem, uma enzima do tipo selvagem variante ou uma enzima já modificada.
0 termo "tipo selvagem" é um termo da técnica compreendido pelas pessoas versadas e significa um fenótipo que é característico da maioria dos membros de uma espécie que ocorre naturalmente e contrastando com o fenótipo de um mutante. Deste modo, no presente contexto, a enzima do tipo selvagem é uma forma da enzima naturalmente encontrada na maioria dos membros das espécies relevantes. Geralmente, a enzima do tipo selvagem relevante em relação aos polipeptideos variantes descritos aqui é a enzima do tipo selvagem correspondente mais intimamente relacionada em termos de homologia de seqüência. Entretanto, onde uma seqüência do tipo selvagem particular foi usada como a base para produzir um polipeptideo PS4 variante conforme aqui descrito, ela será a seqüência do tipo selvagem correspondente, independentemente da existência de outra seqüência do tipo selvagem que seja mais intimamente relacionada em termos de homologia de seqüência de aminoácido.
A enzima ou polipeptideo de origem pode ser qualquer polipeptideo de partida adequado. Ele pode ter preferivelmente alguma atividade enzimática. Preferivelmente, essa atividade enzimática é uma atividade amilase. Mais preferivelmente, o polipeptideo de origem compreende atividade exoamilase.
A enzima de origem é preferivelmente um polipeptideo o qual exibe preferivelmente atividade exoamilase não- maltogênica. Preferivelmente, a enzima de origem é uma própria exoamilase não-maltogênica. Por exemplo, a enzima de origem pode ser uma exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas saccharophíla, tal como um polipeptideo com número de acesso SWISS-PROT P22963, ou uma exoamilase não- maltogênica Pseudomonas stutzeri, tal como um polipeptídeo com número de acesso SWISS-PROT P13507.
Outros membros da família PS45 podem ser usados como enzimas de origem; tais "membros da família PS 4" serão geralmente semelhantes a, homólogos a ou funcionalmente equivalentes a qualquer uma dessas duas enzimas, e podem ser identificados por métodos padrão, tais como varredura de hibridização de uma biblioteca adequada usando sondas, ou por análise de seqüência de genoma.
Particularmente, os equivalentes funcionais de qualquer uma dessas duas enzimas, assim como outros membros da "família PS4", também podem ser usados como pontos de partida ou polipeptídeos de origem para a geração de polipeptídeos variantes PS4 conforme aqui descrito.
Um "equivalente funcional" de uma proteína significa alguém que compartilha uma ou mais, preferivelmente substancialmente todas as funções daquela proteína. Preferivelmente, tais funções são funções biológicas, preferivelmente funções enzimáticas, tais como atividade amilase, preferivelmente atividade exoamilase não- maltogênica. Tais funções podem incluir qualquer propriedade da proteína, incluindo exoespecificidade, termoestabilidade e manuseio melhorado, tal como firmeza, resiliência, coesão, friabilidade e flexibilidade (conforme descrito abaixo) . Em relação à enzima de origem, o termo "equivalente funcional" significa preferivelmente uma molécula com função semelhante ou idêntica a uma molécula de origem. A molécula de origem pode ser uma exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas saccharophila ou uma exoamilase não- maltogênica de Pseudomonas stutzeri ou um polipeptideo obtido a partir de outras fontes.
O termo "equivalente funcional" em relação a uma enzima de origem sendo uma exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas saccharophila, tal como um polipeptideo com número de acesso SWISS-PROT P22963 ou uma exoamilase não- maltogênica de Pseudomonas stutzeri, tal como um polipeptideo com número de acesso SWISS-PROT P13507, significa que o equivalente funcional poderia ser obtido a partir de outras fontes. A enzima funcionalmente equivalente pode ter uma seqüência de aminoácido diferente porém terá atividade exoamilase não-maltogênica. Exemplos de ensaios para determinar a funcionalidade são aqui descritos e são conhecidos por uma pessoa versada na técnica.
Em modalidades altamente preferidas, o equivalente funcional terá homologia de seqüência às exoamilases não- maltogênicas de Pseudomonas saccharophila ou de Pseudomonas stutzeri mencionadas acima, preferivelmente ambas. O equivalente funcional pode também ter homologia de seqüência com qualquer uma das seqüências estabelecidas como SEQ ID Nos: 1 a 14, preferivelmente SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, ou ambas. Homologia de seqüência entre tais seqüências é preferivelmente de pelo menos 60%, preferivelmente 65% ou mais, preferivelmente 75% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, preferivelmente 85% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, preferivelmente 95% ou mais. Tais homologias de seqüência podem ser geradas por qualquer um dentre uma variedade de programas de computador conhecidos na técnica, por exemplo BLAST ou FASTA, etc. Um programa de computador adequado para executar tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Universidade de Wisconsin, E.U.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Exemplos de outros programas de computador que podem efetuar comparações entre seqüências incluem, porém não estão limitados, ao pacote BLAST (ver Ausubel et al., 1999 ibid, Capitulo 18), FASTA (Atschul et al, 1990, J. Mol. Biol., 403-410) e o pacote de programas de ferramentas de comparação GENEWORKS. Tanto BLAST e FASTA são disponíveis para buscas tanto online quanto offline (ver Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Entretanto, é preferível usar o programa GCG Bestfit.
Em outras modalidades, os equivalentes funcionais serão capazes de hibridizar especificamente com qualquer uma das seqüências estabelecida acima. Métodos para a determinação se uma seqüência é capaz de hibridizar com outra são conhecidos na técnica, e estão, por exemplo, descritos em Sambrook et al. (acima) e Ausubel, F. M. et al. (acima). Em modalidades altamente preferidas, os equivalentes funcionais serão capazes de hibridizar sob condições estringentes, por exemplo, 65 0C e 0,1 χ SSC {1 x SSC = NaCl 0,15 M, Citrato de Na3 0,015 M pH 7,0}.
Por exemplo, equivalentes funcionais, os quais têm homologia de seqüência em relação às exoamilases não- maltogênicas de Pseudomonas saccharophila e Pseudomonas stutzeri são adequados para uso como enzimas de origem. Tais seqüências podem diferir da seqüência de Pseudomonas saccharophila em uma ou em mais posições. Além disso, exoamilases não-maltogênicas de outras cepas de Pseudomonas spp, tal como ATCC17 686, também podem ser usadas como polipeptideo de origem. Os resíduos de polipeptídeo variantes de PS4 podem ser inseridos em qualquer uma dessas seqüências de origem para gerar as seqüências de polipeptídeo variantes PS4.
Será entendido que onde é desejável para os polipeptídeo variantes PS4 compreender adicionalmente uma ou mais mutações, conforme estabelecido acima, mutações correspondentes podem ser feitas nas seqüências de ácido nucleico de equivalentes funcionais de exoamilase não- maltogênica de Pseudomonas spp, assim como outros membros da "família PS4", para que eles possam ser usados como pontos de partida ou polipeptídeos de origem para a geração de polipeptídeos variantes PS4 conforme aqui descrito. Estão incluídos no termo "polipeptideos variantes PS4" os polipeptideos revelados em: US 60/485.413, 60/485.539 e 60/485.616; PCT/US2004/021723 e PCT/US2004/021739; US 10/886.905 e 10/866.903; US 60/608.919; US 60/612.407; US 60/485.539; PCT/IB2004/002487; US 10/886.023; US 10/886.505, US 10/886.527 e US 10/886.504; US 10/947.612. Esses documentos, entretanto, não são admitidos como técnica anterior.
Tais polipeptideos são adequados para uso nas aplicações aqui descritas, particularmente como aditivos alimentares, para tratar amido conforme descrito, para preparar um produto alimentício, para fazer um produto de padaria, para a formulação de composições melhoradoras, para a formulação de combinações, etc.
Modificação de seqüências de origem
As enzimas de origem podem ser modificadas no nível de aminoácido ou no nível de ácido nucleico para gerar as seqüências variantes PS4 descritas aqui. Consequentemente, nós proporcionamos a geração de polipeptideos variantes PS4 pela introdução de uma ou mais alterações de códon correspondentes na seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo de exoamilase não-maltogênica.
A numeração do ácido nucleico deve estar preferivelmente com referência à numeração de posição de uma sequencia de nucleotídeo de exoamilase mostrada como SEQ ID NO: 6. Alternativamente, ou além disso, pode ser feita referência à seqüência com o número de acesso GenBank X16732. Em modalidades preferidas, a numeração do ácido nucleico deve ser com referência á seqüência de nucleotideo mostrada como SEQ ID NO: 6. Entretanto, como com a numeração de resíduo de aminoácido, a numeração do resíduo desta seqüência é para ser usada somente com propósitos de referência. Particularmente, será percebido que as alterações de códon acima podem ser feitas em qualquer seqüência de ácido nucleico da família PS4. Por exemplo, alterações de seqüências podem ser feitas para uma seqüência de ácido nucleico de exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas saccharophila ou Pseudomonas stutzeri (por exemplo, X16732, SEQ ID NO: 6 ou M24516, SEQ ID NO: 12).
A enzima de origem pode compreender a enzima "completa", isto é, no seu comprimento total como ela ocorre na natureza (ou como mutada) , ou ela pode compreender uma forma truncada sua. A variante PS4 derivada dela pode ser concordantemente truncada, ou ser de "comprimento total". O truncamento pode ser na extremidade N-terminal, ou na extremidade C-terminal, preferivelmente na extremidade C-terminal. A enzima de origem ou variante PS4 pode não ter uma ou mais porções, tais como subsequências, seqüências de sinal, domínios ou porções, quer sejam ativos ou não, etc. Por exemplo, a enzima de origem ou o polipeptídeo variante PS4 pode não ter uma seqüência de sinal, conforme descrito acima. Alternativamente, ou além disso, a enzima de origem ou a variante PS4 pode não ter um ou mais domínios de ligação ou cataliticos.
Em modalidades altamente preferidas, a enzima de origem ou variante PS4 pode não ter um ou mais dos domínios presentes em exoamilases não-maltogênicas, tal como o domínio de ligação ao amido. Por exemplo, os polipeptídeos PS4 podem ter somente seqüência até a posição 429, em relação à numeração de uma exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1. É para ser observado que este é o caso para as variantes PS4 pSac-pMS382, pSac-pMS382R e pSac-pMS382H.
Em outras modalidades, a enzima de origem ou variante PS4 pode compreender uma enzima "completa", isto é, no seu comprimento total como ela ocorre na natureza (ou como mutada) , juntamente com uma ou mais seqüências de aminoácidos adicionais no terminal N ou no terminal C. Por exemplo, a enzima de origem ou polipeptídeo variante PS4 pode compreender um resíduo de aminoácido individual extra no C-terminal ou no N-terminal, por exemplo, M, A, G, etc. Prefer ivelmente, o resíduo de aminoácido adicional está presente no N-terminal. Onde um ou mais resíduos adicionais está incluído, a numeração de posição será compensada pelo comprimento da adição. Amilase Os polipeptideos variantes PS4 compreendem geralmente atividade amilase.
O termo "amilase" é usado no seu sentido normal - por exemplo, uma enzima que é inter alia capaz de catalisar a degradação do amido. Particularmente, elas são hidrolases as quais são calazes de clivar ligações α-D-(1—»4)O- glicosídicas no amido.
Amilases são enzimas degradadoras de amido, classificadas como hidrolases, as quais clivam ligações a- D- (1—»4)O-glicosídicas no amido. Geralmente, a-amilases (E.C. 3.2.1.1, α-D- (1—>4 ) -glucan glucanoidrolase) são definidas como enzimas de endo-ação clivando ligações a-D- (1—>4)O-glicosídicas na molécula de amido de modo aleatório. Ao contrário, as enzimas amilolíticas de exo- ação, tais como β-amilases (E.C. 3.2.1.2, α-D-(1—>4)-glucan maltoidrolase), e algumas amilases produto-especificas como alfa-amilase maltogênica (E.C. 3.2.1.133) clivam a molécula de amido a partir da extremidade não-redutora do substrato. β-amilases, α-glucosidases (E.C. 3.2.1.20, a-D-glicosídeo glicoidrolase) , glicoamilase (E.C. 3.2.1.3, a-D-(l—>4)- glucan glicoidrolase) e amilases produto-especificas podem produzir malto-oligossacarídeos de um comprimento específico a partir do amido.
Exoamilase não-maltogênica Os polipeptídeos variantes PS4 descritos neste documento são derivados de polipeptídeos (ou suas variantes) os quais preferivelmente exibem atividade exoamilase não-maltogênica. Preferivelmente, essas enzimas de origem são por si só exoamilases não-maltogênicas. Os polipeptídeos variantes PS4 por si só em modalidades altamente preferidas também exibem atividade exoamilase não-maltogênica.
Em modalidades altamente preferidas, o termo "enzima exoamilase não-maltogênica" conforme usado neste documento deve ser tomado como significando que a enzima não degrada inicialmente o amido até quantidades substanciais de maltose, conforme analisado de acordo com o procedimento de determinação de produto conforme descrito neste documento.
Em modalidades altamente preferidas, a exoamilase não- maltogênica compreende uma exo-maltotetraidrolase. Exo- maltotetraidrolase (E.C. 3.2.1.60) é mais formalmente conhecida como glucan 1,4-alfa-maltotetraidrolase. Essa enzima hidrolisa as ligações 1,4-alfa-D-glicosídicas em polissacarídeos amiláceos de modo a remover sucessivos resíduos de maltotetraose a partir das extremidades da cadeia não-redutoras.
Exoamilases não-maltogênicas são descritas em detalhes na Patente Americana Número 6.667.065, incorporadas aqui por referência.
Ensaios para atividade exoamilase não-maltogênica O sistema a seguir é usado para caracterizar polipeptideos com atividade exoamilase não-maltogênica, os quais são adequados para uso de acordo com os métodos e composições aqui descritos. Esse sistema pode, por exemplo, ser usado para caracterizar os polipeptideos de origem ou variantes PS4 aqui descritos.
Através de informação de experiência inicial, amilopectina de milho cerosa (obtenivel como WAXILYS 200 da Roquette, França) é um amido com um conteúdo de amilopectina muito elevado (acima de 90%) . 20 mg/mL de amido de milho ceroso são levados à ebulição por 3 min num tampão de MES 50 mM de (ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico), cloreto de cálcio 2 mM, pH 6,0 e subseqüentemente incubados a 50 0C e usados dentro de meia hora.
Uma unidade da exoamilase não-maltogênica é definida como a quantidade de enzima a qual libera produtos de hidrólise equivalentes a 1 μιηοΐ de açúcar redutor por min quando incubada a 50 0C num tubo de teste com 4 mL de 10 mg/mL de amido de milho ceroso em MES 50 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 6,0 preparado conforme descrito acima. Açúcares redutores são medidos usando maltose como padrão e usando o método do ácido dinitrossalicilico de Bernfeld, Methods Enzymol(1954), 1, 149-158 ou outro método conhecido na técnica para quantificar açúcares redutores. O padrão do produto de hidrólise da exoamilase não- maltogênica é determinado pela incubação de 0,7 unidades de exoamilase não-maltogênica por 15 ou 300 min a 50 0C num tubo de teste com 4 mL de 10 mg/mL de amido de milho ceroso no tampão preparado conforme descrito acima. A reação é interrompida pela imersão do tubo de teste por 3 min num banho de água em ebulição.
Os produtos de hidrólise são analisados e quantificados por HPLC de troca iônica usando uma coluna Dionex PA 100 com acetato de sódio, hidróxido de sódio e água como eluentes, com detecção amperométrica pulsada e com maltooligossacarideos lineares conhecidos ou a partir de glicose a maltoeptaose como padrões. 0 fator de resposta usado para maltoctaose a maltodecaose é o fator de resposta encontrado para maltoeptaose.
Preferivelmente, os polipeptideos variantes PS4 têm atividade exoamilase não-maltogênica de modo que se uma quantidade de 0,7 unidades da referida exoamilase não- maltogênica fosse incubada por 15 minutos na temperatura de 50 0C em pH 6,0 em 4 mL de solução aquosa de 10 mg de amido de milho ceroso pré-fervido por mL de solução tampão contendo ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico 50 mM e cloreto de cálcio 2 mM, então a enzima poderia produzir produto(s) de hidrólise que poderiam consistir de um ou mais maltoligossacarideos lineares de duas a dez unidades D-glicopiranosil e opcionalmente glicose; de modo que pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80% e mais preferivelmente pelo menos 85% em peso dos referidos produtos de hidrólise poderiam consistir de maltoligossacarideos lineares de três a dez unidades de D-glicopiranosil, preferivelmente de maltoligossacarideos lineares consistindo de quatro a oito unidades D-glicopiranosil.
Por facilidade de referência, e para os presentes propósitos, a característica de incubar uma quantidade de 0,7 unidades da exoamilase não-maltogênica por 15 minutos numa temperatura de 50 0C em pH 6,0 em 4 mL de solução aquosa de 10 mg de amido de milho ceroso pré-fervido por mL de solução tamponada contendo ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico 50 mM e cloreto de cálcio 2 mM, pode ser referida como o "Teste de Incubação de Amido de Milho Ceroso".
Deste modo, alternativamente expresso, polipeptídeos variantes PS4 preferidos, os quais não são exoamilases não- maltogênicas, são caracterizados como tendo a capacidade no teste de incubação de amido de milho ceroso de produzir produto (s) de hidrólise que possam consistir de um ou mais maltoligossacarideos lineares ou de duas a dez unidades D- glicopiranosil e opcionalmente de glicose, de modo que pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80% e mais preferivelmente pelo menos 85% em peso do(s) referido(s) produto(s) de hidrólise possam consistir de maltoligossacarideos lineares ou de três a dez unidades D-glicopiranosil, preferivelmente de maltoligossacarideos lineares consistindo de quatro a oito unidades D-glicopiranosil.
Os produtos de hidrólise no teste de incubação de amido de milho ceroso podem incluir um ou mais maltoligossacarideos lineares ou de duas a dez unidades D- glicopiranosil e opcionalmente glicose. Os produtos de hidrólise no teste de incubação de amido de milho ceroso também podem incluir outros produtos hidroliticos. No entanto, as quantidades % em peso dos maltoligossacarideos lineares de três a dez unidades D-glicopiranosil são baseadas na quantidade de produto de hidrólise que consiste de um ou mais maltoligossacarideos lineares de duas a dez unidades D-glicopiranosil e opcionalmente glicose. Em outras palavras, as quantidades % em peso de maltoligossacarideos lineares de três a dez unidades D- glicopiranosil não são baseadas na quantidade de produtos de hidrólise diferentes de um ou mais maltoligossacarideos lineares de duas a dez unidades D-glicoprianosil e glicose.
Os produtos de hidrólise podem ser analisados através de quaisquer formas adequadas. Por exemplo, os produtos de hidrólise podem ser analisados por HPLC de troca aniônica usando uma coluna Dionex PA 100 com detecção amperométrica pulsada e, por exemplo, com maltoligossacrideos lineares conhecidos de glicose até maltoeptaose como padrões. Por facilidade de referência, e para os propósitos atuais, a característica de analisar o(s) produto(s) de hidrólise usando HPLC de troca aniônica usando uma coluna Dionex PA 100 com detecção amperométrica pulsada e com maltoligossacrídeos lineares conhecidos de glicose até maltoeptaose usados como padrões pode ser referida como "analisando por troca aniônica". É claro e, conforme exatamente indicado, que outras técnicas analíticas poderiam satisfazer, assim como outras técnicas de troca aniônica específicas.
Desta forma, alternativamente expresso, um polipeptídeo variante PS4 é um o qual tem atividade não- maltogênica de modo que ele tenha a capacidade, num teste de incubação de amido de milho ceroso, de produzir 15 produto (s) de hidrólise que possam consistir de um ou mais maltoligossacarídeos lineares ou de duas a dez unidades D- glicopiranosil e opcionalmente glicose, os referidos produtos de hidrólise sendo capazes de ser analisados por troca aniônica; de modo que pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais pref erivelmente pelo menos 80% e mais preferivelmente pelo menos 85% em peso do(s) referido (s) produto(s) de hidrólise possam consistir de maltoligossacrídeos lineares de três a dez unidades D- glicopiranosil, preferivelmente de maltoligossacarídeos lineares consistindo de quatro a oito unidades D- glicopiranosil. Conforme aqui utilizado, o termo "maltoligossacarideo linear" é usado no sentido normal como significando 2-10 unidades de α-D-glicopiranose ligada por uma ligação a- (1—>4 ) .
Em modalidades altamente preferidas, os polipeptideos PS4 descritos aqui têm atividade exoamilase melhorada, preferivelmente atividade exoamilase não-maltogênica, em comparação com o polipeptideo de origem, preferivelmente quando testados sob as mesmas condições. Particularmente, em modalidades altamente preferidas, os polipeptideos variantes PS4 têm 10% ou mais, preferivelmente 20% ou mais, preferivelmente 50% ou mais de atividade exoamilase em comparação com os seus de origem, preferivelmente quando medidos num teste de amido de milho ceroso.
Os produtos de hidrólise podem ser analisados por quaisquer meios adequados. Por exemplo, os produtos de hidrólise podem ser analisados por HPLC de troca aniônica usando uma coluna Dionex PA 100 com detecção amperométrica pulsada e com, por exemplo, maltoligossacarideos lineares conhecidos de glicose até maltoeptaose como padrões.
Conforme aqui utilizado, o termo "maltoligossacarídeo linear" é usado no sentido normal como significando 2-20 unidades de α-D-glicopiranose ligada por uma ligação a- (1—>4 ) .
PROPRIEDADES DE MANUSEIO MELHORADAS As variantes PS4 descritas aqui têm propriedades melhoradas em comparação com suas enzimas de origem, tal como qualquer uma dentre termoestabilidade melhorada, estabilidade em pH melhorada ou exoespecificidade melhorada. As variantes PS4 descritas aqui preferivelmente também têm propriedades de manuseio melhoradas, de modo que um produto alimentício tratado com um polipeptídeo variante PS4 tenha somente uma ou todas dentre firmeza menor, resiliência maior, coesão maior, menor desagregação ou maior capacidade de flexibilidade em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem.
Sem desejar estar ligado em qualquer teoria particular, nós acreditamos que as mutações nas posições particulares têm efeitos individuais e cumulativos nas propriedades de um polipeptídeo, compreendendo tais mutações.
Termoestabilidade e estabilidade ao pH
Preferivelmente, o polipeptídeo variante PS4 é termoestável; preferivelmente,ele tem uma termoestabilidade maior do que a sua enzima de origem.
Em trigo e em outros cereais, as cadeias laterais externas na amilopectina estão na faixa de DP 12-19. Deste modo, a hidrólise enzimática das cadeias laterais de amilopectina, por exemplo, por polipeptídeos variantes PS4 conforme descrito tendo atividade exoamilase não- maltogênica, pode reduzir acentuadamente suas tendências de cristalização.
Amido no trigo e em outros cereais usados para propósitos de panificação está presente na forma de grânulos de amido, os quais são geralmente resistentes ao ataque enzimático por amilases. Deste modo, a modificação do amido é principalmente limitada a amido danificado e progride muito lentamente durante o processamento da massa e panificação inicial até a gelatinização começar em aproximadamente 60 C. Como uma conseqüência disto, somente amilases com um alto grau de termoestabilidade são capazes de modificar o amido de modo eficiente com aumento da termoestabilidade. Isto ocorre porque quanto mais termoestável é a enzima maior é o tempo que ela pode ficar ativa durante a assadura e, deste modo, maior é o efeito antienvelhecimento que ela pode proporcionar.
Concordantemente, o uso de polipeptideos variantes PS4 conforme aqui descrito quando adicionados ao amido em qualquer estágio de seu processamento num produto alimentício, por exemplo, antes, durante ou após a assadura em pão pode retardar ou impedir ou lentificar a retrogradação. Tal uso é descrito em maiores detalhes abaixo.
Conforme aqui utilizado, o termo "termoestável" se refere à capacidade da enzima de reter atividade depois da exposição às temperaturas elevadas. Preferivelmente, o polipeptideo variante PS4 é capaz de degradar amido em temperaturas de cerca de 55 0C até cerca de 80 0C ou mais. Adequadamente, a enzima retém a sua atividade após a exposição às temperaturas de até cerca de 95 °C.
A termoestabilidade de uma enzima tal como uma exoamilase não-maltogênica é medida por sua meia vida. Deste modo, os polipeptideos variantes PS4 descritos aqui têm meias vidas prolongadas em relação à enzima de origem de preferivelmente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, .90%, 100%, 200% ou mais, preferivelmente em temperaturas elevadas de 55 0C até cerca de 95 0C ou mais, preferivelmente de cerca de 80 °C.
Conforme aqui utilizado, meia vida (tl/2) é o tempo (em minutos) durante o qual metade da atividade enzimática é inativada sob condições de aquecimento definidas. Era. modalidades preferidas, a meia vida é analisada a 80 graus C. Preferivelmente, a amostra é aquecida por 1-10 minutos a 80 0C ou mais. 0 valor da meia vida é, a seguir, calculado pela medição da atividade amilase residual, por qualquer um dos métodos aqui descritos. Preferivelmente, um ensaio de meia vida é efetuado conforme descrito em maiores detalhes nos Exemplos.
Preferivelmente, as variantes PS4 descritas aqui são ativas durante a assadura e hidrolisam o amido durante e após a gelatinização dos grânulos de amido, o que se inicia em temperaturas de cerca de 55 °C. Quanto mais termoestável é a exoamilase não-maltogênica, mais longo é o tempo o qual ela pode estar ativa e, deste modo, maior é o efeito antienvelhecimento que ela irá proporcionar. Entretanto, durante a assadura acima de temperaturas de cerca de 85 °C, a inativação enzimática pode acontecer. Se isso ocorrer, a exoamilase não-maltogênica pode ser gradualmente inativada de modo que não haja substancialmente atividade depois do processo de panificação no pão final. Consequentemente, preferivelmente as exoamilases não-maltogênicas adequadas para uso conforme descritas têm uma temperatura ótima acima de 50 0C e abaixo de 98 °C.
A termoestabilidade das variantes PS4 descritas aqui pode ser melhorada pelo uso de engenharia de proteína para se tornarem mais termoestáveis e, deste modo, serem melhor adequadas para os usos aqui descritos; nós, deste modo, englobamos o uso das variantes PS4 modificadas para se tornarem mais termoestáveis por engenharia de proteína.
Preferivelmente, o polipeptídeo variante PS4 é estável ao pH; mais preferivelmente, ele tem uma estabilidade ao pH maior do que seu polipeptídeo de origem cognato. Conforme aqui utilizado, o termo "estabilidade ao pH" se refere à capacidade da enzima de reter atividade numa ampla faixa de pHs. Preferivelmente, o polipeptídeo variante PS4 é capaz de degradar amido num pH de cerca de 5 até cerca de 10,5. Numa modalidade, o grau de estabilidade ao pH pode ser avaliado pela medição da meia vida da enzima em condições de pH especificas. Em outra modalidade, o grau de estabilidade ao pH pode ser avaliado pela medição da atividade da atividade especifica da enzima em condições de pH especificas. As condições de pH especificas podem ser qualquer pH de pH 5 até pH 10,5.
Deste modo, o polipeptideo variante PS4 pode ter uma meia vida mais longa, ou uma atividade maior (dependendo do ensaio) em comparação com o polipeptideo de origem sob condições idênticas. Os polipeptideos variantes PS4 podem ter 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% de meia-vida mais longa em comparação com seus polipeptideos de origem sob condições de pH idênticas. Alternativamente ou, além disso, eles podem ter tal atividade maior em comparação com o polipeptideo de origem sob condições de pH idênticas.
Exoespecificidade
Sabe-se que algumas exoamilases não-maltogênicas podem ter algum grau de atividade de endoamilase. Em alguns casos, esse tipo de atividade pode precisar ser reduzido ou eliminado, uma vez que a atividade da endoamilase pode possivelmente afetar negativamente a qualidade do produto de pão final pela produção de um miolo pastoso e grudento devido ao acúmulo de dextrinas ramificadas. A exoespecificidade pode ser utilmente medida pela determinação da proporção da atividade da amilase total em relação à atividade da endoamilase total. Essa proporção é referida neste documento como um "índice de exoespecificidade". Em modalidades preferidas, uma enzima é considerada uma exoamilase se ela tiver um índice de exoespecif icidade de 20 ou mais, isto é, sua atividade amilase total (incluindo atividade exoamilase) é de 20 vezes ou mais do que a sua atividade endoamilase. Em modalidades altamente preferidas, o índice de exoespecif icidade das exoamilases é de 30 ou mais, 40 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, 80 ou mais, 90 ou mais ou 100 ou mais. Em modalidades altamente preferidas, o índice de exoespecificidade é de 150 ou mais, 200 ou mais, .300 ou mais, 400 ou mais, 500 ou mais ou 600 ou mais.
A atividade amilase total e a atividade endoamilase podem ser medidas por quaisquer meios conhecidos na técnica. Por exemplo, a atividade amilase total pode ser medida através do ensaio da quantidade total de extremidades redutoras liberadas a partir de um substrato de amido. Alternativamente, o uso de um ensaio Betamyl é descrito em maiores detalhes nos Exemplos, e por conveniência, a atividade da amilase conforme analisada nos Exemplos é descrita em termos de "unidades Betamyl" nas Tabelas.
Atividade endoamilase pode ser avaliada pelo uso de um Kit Phadebas (Pharmacia and Upjohn) . Isso faz uso de um amido reticulado marcado em azul (marcado com um corante azo); somente cortes internos na molécula de amido liberam o marcador, enquanto que os cortes externos não o fazem. A liberação de corante pode ser medida por espectrofotometria. Concordantemente, o Kit Phadebas mede a atividade da endoamilase e, por conveniência, os resultados de tal ensaio (descritos nos Exemplos) são referidos neste documento como "unidades Phadebas".
Numa modalidade altamente preferida, consequentemente, o índice de exoespecificidade é expresso em termos de unidades Betamyl/unidades Phadebas, também referido como "B/Phad".
Exoespecificidade também pode ser avaliada de acordo com os métodos descritos na técnica anterior, por exemplo, no nosso Pedido de Patente Internacional Número W099/50399. Este mede a exoespecificidade através de uma proporção entre a atividade endoamilase e a atividade exoamilase. Deste modo, num aspecto preferido, as variantes PS4 descritas aqui terão menos do que 0,5 unidades endoamilase (EAU) por unidade de atividade exoamilase. Preferivelmente, as exoamilases não-maltogênicas, as quais são adequadas para uso de acordo com a presente invenção, têm menos do que 0,05 EAU por unidade de atividade exoamilase e, mais preferivelmente, menos do que 0,01 EAU por unidade de atividade exoamilase.
As variantes PS4 descritas aqui terão preferivelmente exoespecificidade, por exemplo, medida pelos índices de exoespecificidade, conforme descrito acima, consistente com as suas sendo exoamilases. Além disso, elas têm preferivelmente exoespecificidade maior ou aumentada em comparação com as enzimas de origem ou polipeptideos a partir do qual elas são derivadas. Deste modo, por exemplo, os polipeptideos variantes PS4 podem ter 10%, 20%, 30%, .40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% de Índice de exoespecificidade maior em comparação com seus polipeptideos de origem, preferivelmente sob condições idênticas. Eles podem ter l,5x ou mais, 2x ou mais, 5x ou mais, IOx ou mais, 50x ou mais, IOOx ou mais em comparação com seus polipeptideos de origem, preferivelmente sob condições idênticas.
Propriedades de manuseio melhoradas As variantes PS4 descritas aqui preferivelmente compreendem uma ou mais propriedades de manuseio melhoradas em comparação com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem. As propriedades de manuseio melhoradas podem, em modalidades preferidas, compreender propriedades de panificação melhoradas.
Deste modo, as variantes PS4 são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 apresentam uma propriedade de manuseio ou preferivelmente de panificação melhorada em comparação com um produto alimentício, o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem. A propriedade de manuseio ou de panificação pode ser selecionada do grupo consistindo de: firmeza, resiliência, coesão, friabilidade e flexibilidade.
Essas propriedades de manuseio podem ser testadas por quaisquer meios conhecidos na técnica. Por exemplo, firmeza, resiliência e coesão podem ser determinados pela análise de fatias de pão por Análise de Perfil de Textura usando, por exemplo, um Analisador de Textura, conforme descrito nos Exemplos. Firmeza
As variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 terá uma menor firmeza em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem.
A firmeza é, nas modalidades preferidas, inversamente correlacionada com a maciez do produto alimentício; deste modo, uma maior maciez pode refletir uma firmeza menor e vice-versa.
Firmeza é preferivelmente medida pelo "Protocolo de Avaliação de Firmeza" estabelecido no Exemplo 13.
Deste modo, as variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 tenha uma firmeza 10%, 20%, .30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou menor em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptideo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem. Um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 pode ter uma firmeza l,lx, l,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, IOx ou menor em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem.
Resiliência
As variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 tenha uma resiliência maior em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem.
Resiliência é preferivelmente medida pelo "Protocolo de Avaliação de Resiliência" estabelecido no Exemplo 14.
Deste modo, as variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 tenha 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, .60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou mais de resiliência em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem. Um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 pode ter uma resiliência maior l,lx, l,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, .9χ, IOx ou mais em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem.
Coesão
As variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 tenha uma coesão maior em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem.
Coesão é preferivelmente medida pelo "Protocolo de Avaliação de Coesão" estabelecido no Exemplo 15.
Deste modo, as variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 tenha 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, .60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou mais de coesão em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem. Um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 pode ter uma coesão maior l,lx, l,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, IOx ou mais em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem. Friabilidade As variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 tenha uma friabilidade menor em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem.
Friabilidade é preferivelmente medida pelo "Protocolo de Avaliação de Friabilidade" estabelecido no Exemplo 16.
Deste modo, as variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 tenha 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, .60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou mais de menor friabilidade em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem. Um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 pode ter uma coesão l,lx, l,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, IOx ou menor em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem.
Flexibili da de
As variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante PS4 tenha uma flexibilidade maior em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptideo de origem ou com um polipeptideo do tipo selvagem.
Flexibilidade é preferivelmente medida pelo "Protocolo de Avaliação de Flexibilidade" estabelecido no Exemplo 17.
Deste modo, as variantes PS4 descritas aqui são preferivelmente tais que um produto alimentício tratado com o polipeptideo variante PS4 tenha 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, .60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou mais de flexibilidade superior em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptideo de origem ou com um polipeptideo do tipo selvagem. Um produto alimentício tratado com o polipeptideo variante PS4 pode ter uma flexibilidade maior em l,lx, l,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, .8x, 9x, IOx ou mais em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptideo de origem ou com um polipeptideo do tipo selvagem.
Nós descrevemos especificamente o uso de polipeptídeos variantes PS4 descritos aqui juntamente com uma xilanase para aumentar a flexibilidade. Usos de polipeptideos e ácidos nucleicos variantes PS4 Os polipeptídeos variantes PS4, ácidos nucleicos, células hospedeiras, vetores de expressão, etc. podem ser usados em qualquer aplicação para a qual uma amilase possa ser usada. Particularmente, eles podem ser usados para substituir qualquer exoamilase não-maltogênica. Eles podem ser usados para suplementar a atividade amilase ou exoamilase não-maltogênica, quer sozinhos ou em combinação com outras amilases ou exoamilases não-maltogênicas conhecidas.
As seqüências variantes PS4 descritas aqui podem ser usadas em várias aplicações na indústria de alimentos - tal como em padarias e produtos de bebidas, eles também podem ser usados em outras aplicações, tais como em composições farmacêuticas, ou mesmo na indústria química. Particularmente, os polipeptideos variantes PS4 e ácidos nucleicos são úteis para várias aplicações industriais, incluindo assadura (conforme revelado em WO 99/50399) e padronização de farinha (aumento ou melhora do volume). Eles também podem ser usados para produzir maltotetraose a partir de amido e outras substâncias. Nós, deste modo, descrevemos um método para preparar um produto alimentício, o método compreendendo: (a) obter uma exoamilase não-maltogênica; (b) introduzir uma mutação em qualquer uma ou mais das posições da exoamilase não- maltogênica conforme estabelecido neste documento; (c) misturar o polipeptídeo resultante com um ingrediente alimentício.
Os polipeptídeos variantes PS4 podem ser usados para aumentar o volume dos produtos de padaria, tal como pão. Embora não desejemos nos prender a qualquer teoria particular, nós acreditamos que isto resulte da redução na viscosidade da massa durante o aquecimento (tal como Assadura) como resultado da exoamilase encolhendo moléculas de amilose. Isso permite que o dióxido de carbono gerado pela fermentação aumente o tamanho do pão com menor impedimento.
Deste modo, produtos alimentícios compreendendo ou tratados com polipeptídeos variantes PS4 apresentam volume expandido em comparação com os produtos os quais não tenham sido tratados dessa forma, ou tratados com polipeptídeos de origem. Em outras palavras, os produtos alimentícios têm um volume maior de ar por volume de produto alimentício. Alternativamente ou além disso, os produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4 têm uma densidade menor, ou peso (ou massa) por proporção de volume. Em modalidades particularmente preferidas, os polipeptídeos variantes PS4 são usados para intensificar o volume do pão. 0 aumento de volume ou expansão é benéfico porque ele reduz a gomosidade ou rigidez dos alimentos. Alimentos leves são preferidos pelos consumidores, e a experiência do consumido e é intensificada. Em modalidades preferidas, o uso de polipeptídeos variantes PS4 aumentam o volume em 10%, 20%, .30%, 40%, 50% ou mais.
0 uso de polipeptídeos variantes PS4 para aumentar o volume dos alimentos é descrito em detalhes nos Exemplos.
Usos alimentícios
Os polipeptídeos variantes PS4 e ácidos nucleicos descritos aqui podem ser usados como - ou no preparo - de Um alimento. Particularmente, eles podem ser adicionados a um alimento, isto é, como um aditivo alimentar. 0 termo "alimento" é tencionado para incluir tanto alimento preparado quanto um ingrediente para um alimento, tal como farinha de trigo. Num aspecto preferido, o alimento é para consumo humano. 0 alimento pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.
Os polipeptideos variantes PS4 e ácidos nucleicos podem ser usados como ingrediente alimentício. Conforme aqui utilizado, o termo "ingrediente alimentar" inclui uma formulação, a qual é ou pode ser adicionada a alimentos funcionais ou gêneros alimentícios e inclui formulações as quais podem ser usadas em baixos níveis numa ampla variedade de produtos que requerem, por exemplo, acidificação ou emulsificação. O ingrediente alimentício pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.
Os polipeptideos variantes PS4 e ácidos nucleicos aqui revelados podem ser - ou podem ser adicionados - a suplementos alimentares. Os polipeptideos variantes PS4 e ácidos nucleicos aqui revelados podem ser - ou podem ser adicionados - a alimentos funcionais. Conforme aqui utilizado, o termo "alimento funcional" significa alimento o qual é capaz de proporcionar não somente um efeito nutricional e/ou uma satisfação no sabor, mas que também seja capaz de fornecer um outro efeito benéfico ao consumidor. Embora não haja definição legal de um alimento funcional, a maioria das partes com interesse nessa área concorda que estes são alimentos comercializados como tendo efeitos na saúde específicos.
Os polipeptídeos variantes PS4 podem também ser usados na produção de um produto alimentício ou de um gênero alimentício. Gêneros alimentícios típicos incluem produtos de laticínio, produtos cárneos, produtos de aves, produtos de peixe e produtos de massa. 0 produto de massa pode ser qualquer produto de massa processada, incluindo massas fritas, fritas em fritadeira, assadas, cozidas, cozidas a vapor e fervidas, tais como pão cozido a vapor e bolos de arroz. Em modalidades altamente preferidas, o produto alimentício é um produto de padaria.
Preferivelmente, o gênero alimentício é um produto de padaria. Produtos de padaria típicos (assados) incluem pão - tais como pães, pães franceses, pães doces de passas, bases de pizza, etc., massas para torta, roscas salgadas em forma de laço, tortillas, bolos, biscoitos, bolachas, biscoitos finos, etc.
Os produtos alimentícios preferivelmente se beneficiam de uma ou mais das propriedades de manuseio ou de panificação dos polipeptídeos variantes PS4 aqui descritos. A propriedade de manuseio ou panificação melhorada pode ser Selecionada do grupo consistindo de: firmeza melhorada, resiliência melhorada, coesão melhorada, friabilidade melhorada e flexibilidade melhorada.
Nós, desta forma, descrevemos um método de modificação de um aditivo alimentício compreendendo uma exoamilase não- maltogênica, o método compreendendo a introdução de uma modificação em qualquer uma ou mais das posições da exoamilase não-maltogênica conforme estabelecido neste documento. 0 mesmo método pode ser usado para modificar um ingrediente alimentício, ou um suplemento alimentício, um produto alimentício ou um gênero alimentício.
Retrogradação/envelhecimento
Nós descrevemos o uso de proteínas variantes PS4 que são capazes de retardar o envelhecimento do meio de amido, tais como géis de amido. Os polipeptídeos variantes PS4 são especialmente capazes de retardar a retrogradação prejudicial do amido.
A maior parte dos grânulos de amido são compostos de uma mistura de dois polímeros: uma amilose essencialmente linear e uma amilopectina altamente ramificada. Amilopectina é uma molécula ramificada muito grande consistindo de cadeias de unidades a-D-glicopiranosil unidas por ligações (1-4), em que as referidas cadeias são ligadas por ligações a-D-(l-6) para formar ramificações. Amilopectina está presente em todos os amidos naturais, constituindo cerca de 75% da maior parte dos amidos comuns. Amilose é essencialmente uma cadeia linear de unidades a- D-glicopiranosil (1-4) ligadas com algumas ramificações a- D-(1-6). A maioria dos amidos contém cerca de 25% de amilose.
Grânulos de amido aquecidos na presença de água sofrem uma transição de fase ordem-desordem chamada de gelatinização, onde o liquido é captado pelos grânulos incháveis. As temperaturas de gelatinização variam para diferentes amidos. Durante o esfriamento de pão recentemente assado a fração de amilose, em algumas horas, se retrograda para desenvolver uma rede. Esse processo é benéfico porque cria uma estrutura desejável de miolo com um baixo grau de firmeza e propriedades de corte melhoradas. Mais gradualmente a cristalização da amilopectina ocorre nos grânulos de amido gelatinizados durante os dias após a assadura. Nesse processo, acredita- se que a amilopectina reforce a rede de amilose na qual os grânulos de amido estejam embebidos. Esse reforço leva a uma maior firmeza do miolo do pão. Este reforço é uma das principais causas do envelhecimento do pão.
Sabe-se que a qualidade dos produtos assados gradualmente se deteriora durante o armazenamento. Como conseqüência da recristalização do amido (também chamada retrogradação), a capacidade de retenção de água do miolo é alterada com importantes implicações nas propriedades organolépticas e dietéticas. O miolo perde a maciez e a elasticidade e se torna firme e friável. O aumento na firmeza do miolo é geralmente usado como uma medida do processo de envelhecimento do pão.
A taxa de retrogradação prejudicial da amilopectina depende do comprimento das cadeias laterais da amilopectina. Deste modo, a hidrólise enzimática das cadeias laterais de amilopectina, por exemplo, por polipeptideos variantes PS4 com atividade exoamilase não- maltogênica, pode reduzir significativamente suas tendências de cristalização.
Concordantemente, o uso de polipeptideos variantes PS4 conforme aqui descrito, quando adicionados ao amido em qualquer estágio de seu processamento num produto alimentício, por exemplo, durante ou após a assadura em pão, pode retardar ou impedir ou lentificar a retrogradação. Tal uso é descrito em detalhes adicionais abaixo.
Nós, deste modo, descrevemos um método de melhoria da capacidade de uma exoamilase não-maltogênica prevenir o envelhecimento, preferivelmente a retrogradação prejudicial de um produto de farinha, o método compreendendo a introdução de uma mutação em qualquer uma ou mais das posições da exoamilase não-maltogênica conforme estabelecido neste documento. Ensaios para medição da retrogradação (inc. envelhecimento) Para avaliação do efeito antienvelhecimento dos polipeptideos variantes PS4 com atividade exoamilase não- maltogênica aqui descritos, a firmeza do miolo pode ser medida 1, 3 e 7 dias depois da assadura através de um Analisador de Textura de Alimentos Universal Instron 4301 ou um equipamento similar conhecido na técnica.
Outro método tradicionalmente usado na técnica e o qual é usado para avaliar o efeito da retrogradação do amido de um polipeptideo variante PS4 com atividade exoamilase não-maltogênica é baseado em DSC (calorimetria exploratória diferencial) . Aqui, a entalpia de fusão da amilopectina retrogradada no miolo do pão ou no miolo de uma massa de sistema modelo assada com ou sem enzimas (controle) é medida. 0 equipamento DSC aplicado nos exemplos descritos é um Mettler-Toledo DSC 820 executado com um gradiente de temperatura de 10 0C por minuto de 20 até 95 °C. Para a preparação das amostras 10 - 20 mg de miolo são pesados e transferidos para cadinhos de alumínio Mettler-Toledo os quais são, a seguir, hermeticamente fechados.
As massas do sistema modelo usadas nos exemplos descritos contêm farinha de trigo padrão e quantidades ótimas de água ou tampão com ou sem a exoamilase variante PS4 não-maltogênica. Elas são misturadas num farinógrafo Brabender de 10 ou 50 g por 6 ou 7 min, respectivamente. Amostras das massas são colocadas em tubos de teste de vidro (15*0,8 cm) com uma tampa. Esses tubos de teste são submetidos a um processo de panificação num banho de água partindo de 30 min de incubação a 33 0C seguido por aquecimento de 33 até 95 0C com um gradiente de 1,1 0C por min e, finalmente, uma incubação de 5 min a 95 °C. Subseqüentemente, os tubos são armazenados num termostato a .20 0C antes da análise DSC.
Em modalidades preferidas, as variantes PS4 descritas aqui têm uma entalpia de fusão reduzida, em comparação com o controle. Em modalidades altamente preferidas, as variantes PS4 têm uma entalpia de fusão reduzida em 10% ou mais. Preferivelmente, elas têm uma entalpia de fusão reduzida em 20% ou mais, em 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, .90% ou mais em comparação com o controle. Preparação de produtos de amido Nós proporcionamos o uso de polipeptideos variantes PS4 na preparação de produtos alimentícios, particularmente produtos de amido. 0 método compreende a formação de produto de amido pela adição de uma enzima exoamilase não- maltogênica tal como um polipeptídeo variante PS4, a um meio de amido. Se o meio de amido for uma massa, então a massa é preparada pela mistura de farinha, água, da exoamilase não-maltogênica que é um polipeptídeo variante PS4 e, opcionalmente, outros ingredientes e aditivos possíveis. O termo "amido" deve ser tomado para significar amido per se ou um componente seu, especialmente amilopectina. O termo "meio de amido" significa qualquer meio adequado compreendendo amido. 0 termo "produto de amido" significa qualquer produto que contém ou é baseado em ou é derivado de amido. Preferivelmente, o produto de amido contém ou é baseado em ou é derivado de amido obtido a partir de farinha de trigo. 0 termo "farinha", conforme aqui utilizado, é um sinônimo para a farinha finamente moida de trigo ou outro grão. Preferivelmente, entretanto, o termo significa farinha obtida a partir de farinha per se e não a partir de outro grão. Deste modo, e a não ser que seja expresso de outra forma, referências a "farinha de trigo", conforme aqui utilizadas, preferivelmente significam referências a farinha de trigo per se, assim como farinhas de trigo quando presentes num meio, tal como uma massa.
Uma farinha preferida é farinha de trigo ou farinha de centeio ou misturas das farinhas de trigo e centeio. Entretanto, massas compreendendo farinha derivada de outros tipos de cereais, tal como, por exemplo, de arroz, milho, cevada e durra também são contempladas. Preferivelmente, o produto de amido é um produto de padaria. Mais preferivelmente, o produto de amido é um produto de pão. Ainda mais preferivelmente, o produto de amido é um produto de pão farináceo assado. 0 termo "produto de pão farináceo assado" se refere a qualquer produto assado baseado numa Massa obtenível pela mistura de farinha, água e um agente de fermentação sob condições de formação de massa. Claramente, outros componentes podem ser adicionados à mistura de massa.
Deste modo, se o produto de amido for um produto de pão farináceo assado, então o processo compreende a mistura - em qualquer ordem adequada - de farinha, água e de um agente de fermentação sob condições de formação de massa e a adição extra de um polipeptideo variante PS4, opcionalmente na forma de uma pré-mistura. 0 agente fermentador pode ser um agente fermentador químico, tal como bicarbonato de sódio ou qualquer cepa de Saccharomyces cerevisiae (levedura de padeiro).
A exoamilase não-maltogênica variante PS4 pode ser adicionada juntamente com qualquer ingrediente de massa, incluindo a água ou mistura de ingredientes de farinha ou com qualquer aditivo ou mistura de aditivos. A massa pode ser preparada por qualquer método de preparação de massa convencional comum na indústria de panificação ou em qualquer outra indústria que faça produtos baseados em massa fina.
A panificação de produtos de pão farináceos tal como, por exemplo, pão de forma, pão feito a partir de farinha de centeio e farinha de trigo, pães franceses e semelhantes é tipicamente efetuada pela assadura da massa de pão em temperaturas de forno na faixa de 180 a 250 0C por cerca de .15 a 60 minutos. Durante o processo de assadura, um gradiente de temperatura íngreme (200 —» 120 °C) prevalece nas camadas de farinha externas onde a crosta característica do produto assado se desenvolve. Entretanto, devido ao consumo de calor durante a geração de vapor, a temperatura no miolo é somente próxima de 100 0C no final do processo de assadura.
Nós, deste modo, descrevemos um processo para fazer um produto de pão compreendendo: (a) fornecer um meio de amido; (b) adicionar ao meio de amido um polipeptídeo variante PS4 conforme descrito neste documento; e (c) aplicar calor ao meio de amido durante ou após o passo (b) para produzir um produto de pão. Nós também descrevemos um processo para fazer um produto de pão compreendendo a adição a um meio de amido de um polipeptídeo variante PS4, conforme descrito.
O polipeptídeo variante PS4 de exoamilase não- maltogênica pode ser adicionado como uma preparação líquida ou como uma composição pulverulenta seca compreendendo ou a enzima como o único componente ativo ou em mistura com um ou mais ingredientes de massa adicionais ou aditivos de massa.
Composição melhoradora
Nós descrevemos composições melhoradoras, as quais incluem composições melhoradoras de pão e composições melhoradoras de massa. Essas compreendem um polipeptídeo variante PS4, opcionalmente juntamente com um outro ingrediente, ou uma outra enzima, ou ambos.
Nós também proporcionamos o uso de tais composições melhoradoras de pão e massa na panificação. Num aspecto adicional, nós proporcionamos um produto assado ou massa obtida a partir da composição melhoradora de pão ou composição melhoradora de massa. Em outro aspecto, nós descrevemos um produto assado ou massa obtida a partir do uso de uma composição melhoradora de pão ou de uma composição melhoradora de massa.
Preparação da massa
Uma massa pode ser preparada pela mistura de farinha, água, uma composição melhoradora de massa compreendendo o polipeptideo variante PS4 (conforme descrito acima) e opcionalmente outros ingredientes e aditivos.
A composição melhoradora de massa pode ser adicionada juntamente com qualquer ingrediente de massa incluindo a farinha, água ou outros ingredientes opcionais ou aditivos. A composição melhoradora de massa pode ser adicionada antes da farinha ou da água ou de outros ingredientes e aditivos opcionais. A composição melhoradora de massa pode ser adicionada depois da farinha ou água, ou outros ingredientes e aditivos opcionais. A massa pode ser preparada por qualquer método de preparação de massa convencional comum na indústria de panificação ou em qualquer outra indústria fazendo produtos baseados em massa de farinha.
A composição melhoradora de massa pode ser adicionada com uma preparação liquida ou na forma de uma composição em pó seca compreendendo ou a composição como o único componente ativo ou numa mistura com um ou mais outros ingredientes de massa ou aditivos.
A quantidade de exoamilase não-maltogênica de polipeptideo variante PS4 que é adicionada está normalmente numa quantidade a qual resulta na presença da massa acabada de 50 a 100.000 unidades por Kg de farinha, preferivelmente de 100 a 50.000 unidades por Kg de farinha. Preferivelmente, a quantidade está na faixa de 200 a 20.000 unidades por Kg de farinha. Alternativamente, a exoamilase não-maltogênica de polipeptideo variante PS4 é adicionada numa quantidade a qual resulta na presença da massa acabada de 0, 02 - 50 ppm de enzima baseando-se na farinha (0,02 - .50 mg de enzima por Kg de farinha), preferivelmente 0,2 a .10 ppm.
No presente contexto, 1 unidade da exoamilase não- maltogênica é definida como a quantidade de enzima a qual libera produtos de hidrólise equivalentes a 1 μυιοί de açúcar redutor por minuto quando incubada a 50 graus C em um tubo de teste com 4 mL de amido de milho ceroso 10 mg/mL em MES 50 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 6,0 conforme descrito de agora em diante. A massa conforme descrita aqui geralmente compreende farelo de trigo ou farinha de trigo e/ou outros tipos de farelo, farinha ou amido tal como farinha de milho (com flour), amido de milho, (maize flour), farinha de arroz, farelo de centeio, farinha de centeio, farinha de aveia, farelo de aveia, farinha de soja, farelo de sorgo, farinha de sorgo, farelo de batata, farinha de batata ou amido de batata. A massa pode ser fresca, congelada ou parcialmente assada.
A massa pode ser uma massa fermentada ou uma massa a ser submetida à fermentação. A massa pode ser fermentada de diversas formas, tal como pela adição de agentes de fermentação químicos, por exemplo, bicarbonato de sódio ou pela adição de um fermento (massa fermentadora), porém é preferível fermentar a massa pela adição de uma cultura de levedura adequada, tal como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (levedura de padeiro), por exemplo, uma cepa comercialmente disponível da S. cerevisiae.
A massa pode compreender gordura, tal como gordura granulada ou manteiga para fazer bolos. A massa pode ainda compreender um outro emulsificante tal como mono- ou diglicerídeos, ésteres de açúcar de ácidos graxos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, ésteres de monoglicerídeos de ácido lático, ésteres de monoglicerídeos de ácido acético, estearatos de polioxietileno ou lisolecitina. nós também descrevemos uma pré-mistura compreendendo farinha juntamente com a combinação conforme aqui descrita. A pré-mistura pode conter outros aditivos melhoradores de massa e/ou melhoradores de pão, por exemplo, qualquer um dos aditivos, incluindo enzimas, aqui mencionados.
Outros aditivos ou ingredientes de massa
Para melhorar ainda mais as propriedades do produto assado e conferir qualidades distintas ao produto assado, outros ingredientes de massa e/ou aditivos de massa podem ser incorporados na massa. Tipicamente, tais outros componentes adicionados podem incluir ingredientes de massa tais como sal, grãos, gorduras e óleos, açúcar ou adoçantes, fibras dietéticas, fontes de proteína tais como leite em pó, glúten de soja ou ovos e aditivos de massa tais como emulsificantes, outras enzimas, hidrocolóides, agentes flavorizantes, agentes oxidantes, minerais e vitaminas.
Os emulsificantes são úteis como fortificantes de massa e amaciantes de miolo. Como fortificantes de massa, os emulsificantes podem proporcionar tolerância em relação ao tempo de repouso e tolerância ao choque durante a provação. Além disso, fortificantes de massa melhorarão a tolerância de uma dada massa às variações no tempo de fermentação. A maioria dos fortificantes de massa também melhoram o crescimento no forno, o que significa um aumento no volume das mercadorias provadas às assadas. Por último, os fortificantes de massa irão emulsificar quaisquer gorduras presentes na mistura da receita culinária.
Emulsificantes adequados incluem lecitina, estearato de polioxietileno, mono- e diglicerideos de ácidos graxos comestíveis, ésteres do ácido acético de mono- e diglicerideos de ácidos graxos comestíveis, ésteres do ácido lático de mono- e diglicerideos de ácidos graxos comestíveis, ésteres de ácido cítrico de mono- e diglicerideos de ácidos graxos comestíveis, ácido diacetiltartárico de mono- e diglicerideos de ácidos graxos comestíveis, ésteres de sacarose de ácidos graxos comestíveis, estearoil-2-lactilato de sódio e estearoil-2- lactilato de cálcio.
0 aditivo de massa ou ingrediente adicional pode ser adicionado juntamente com qualquer ingrediente de massa incluindo farinha, água ou outros ingredientes ou aditivos opcionais, ou a composição melhoradora de massa. 0 outro aditivo de massa ou ingrediente pode ser adicionado antes da farinha, água, outros ingredientes e aditivos opcionais ou da composição melhoradora de massa. 0 outro aditivo ou ingrediente de massa pode ser adicionado depois da farinha, água, outros ingredientes e aditivos opcionais ou da composição melhoradora de massa.
0 outro ingrediente ou aditivo de massa pode ser convenientemente uma preparação líquida. Entretanto, o outro ingrediente ou aditivo de massa pode estar convenientemente na forma de uma composição seca.
Preferiveimente o outro ingrediente ou aditivo de massa é pelo menos 1% em peso do componente de farinha da massa. Mais preferivelmente, o outro ingrediente ou aditivo de massa é pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos 3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos .5%, pref erivelmente pelo menos 6%. Se o aditivo for uma gordura, então a gordura tipicamente pode estar presente numa quantidade de 1 a 5%, tipicamente de 1 a 3%, mais tipicamente de cerca de 2%.
Enzima adicional
Uma ou mais outras enzimas podem ser adicionadas juntamente com os polipeptideos variantes PS4 . Tais combinações, por exemplo, podem ser adicionadas ao alimento, à preparação de massa, ao gênero alimentício ou à composição de amido.
As outras enzimas podem ser selecionadas, por exemplo, de qualquer combinação dos seguintes: (a) Novamyl, ou uma variante, homólogo ou mutantes suas, as quais têm atividade alfa-amilase maltogênica; (b) uma xilanase tal como GRINDAMYL™ POWERBake 900 (Danisco A/S); (c) uma a-amilase bacteriana tal como Max-Life U4 (Danisco A/S) ; e (d) uma lipase tal como GRINDAMYL™ POWERBake 4050 (Danisco A/S). Numa modalidade, o polipeptídeo variante PS4 de acordo com a invenção é usado juntamente com pelo menos uma enzima selecionada da lista correspondendo às oxidorredutases, hidrolases, lipases, esterases, glicosidases, amilases, pululanases, xilanases, celulases, hemicelulases, enzimas degradadoras de amido, proteases e lipoxigenases. Numa modalidade preferida, a composição compreende pelo menos uma variante PS4 e uma amilase maltogênica de Bacillus, conforme revelado em W091/04669. Uma modalidade preferida compreende uma variante PS4 e farinha.
Outras enzimas que podem ser adicionadas à massa incluem oxidorredutases, hidrolases, tais como lipases e esterases, assim como glicosidases tipo a-amilase, pululanase e xilanase. Oxidorredutases, tais como, por exemplo, glicose oxidase e hexose oxidase, podem ser usadas para a fortificação da massa e controle de volume dos produtos assados, e xilanases e outras hemicelulases podem ser adicionadas para melhorar as propriedaes de manuseio, firmeza do miolo e volume do pão. Lipases são úteis como fortificantes de massa e amaciantes de miolo e a-amilases e outras enzimas amilolíticas podem ser incorporadas na massa para controlar o volume de pão e ainda reduzir a firmeza do miolo.
Outras enzimas que podem ser usadas podem ser selecionadas do grupo consistindo de uma celulase, de uma hemicelulase, de uma enzima degradadora de amido, de uma protease e de uma lipoxigenase. Exemplos de oxidorredutases úteis incluem oxidases tais como enzima oxidante de maltose, uma glicose oxidase (EC 1.1.3.4), carboidrato oxidase, glicerol oxidase, piranose oxidase, galactose oxidase (EC 1.1.3.10) e hexose oxidase (EC 1.1.3.5). Essas enzimas podem ser usadas para a fortificação da massa e controle do volume dos produtos assados.
Dentre as enzimas degradadoras de amido, as amilases são particularmente úteis como aditivos melhoradores de massa. Δ α-amilase quebra o amido em dextrinas, as quais são posteriormente quebradas pela β-amilase até maltose. Exemplos de amilases adequadas incluem alfa-amilase maltogênica, também chamada de glucan-1, 4-a-maltoidrolase (EC 3.2.1.133) de Bacillus stearothermophilus (tal como Novamyl™ (Novozymes)), α-amilase (EC 3.2.1.1) de Bacillus amyloliquefaciens (tal como Max Life U4 (Danisco A/S), amilase de B. flavothermus (US 20050048611A1), variantes da amilase fúngica com inserções de alfa-amilase (EC .3.2.1.133) de Bacillus stearotermophilus (W02005019443) , híbridos da amilase conforme descrito em US20060147581A1, e variantes, homólogos e derivados seus, os quais têm atividade alfa-amilase maltogênica. Numa modalidade preferida, um polipeptídeo variante PS4 pode ser combinado com amilases, particularmente, com amilases maltogênicas. Alfa-amilase maltogênica (glucan-1,4-a-maltoidrolase, E.C. .3.2.1.133) é capaz de hidrolisar amilose e amilopectina em maltose na configuração alfa. Outras enzimas degradadoras de amido úteis, as quais podem ser adicionadas numa composição de massa incluem glicoamilases e pululanases.
Preferivelmente, a enzima adicional é pelo menos uma xilanase e/ou pelo menos uma amilase. 0 termo "xilanase", conforme aqui utilizado, se refere às xilanases (EC .3.2.1.32) as quais hidrolisam ligações xilosidicas. Uma lipase também pode ser adicionada. Exemplos de xilanases adequadas incluem xilanases de padaria (EC 3.2.1.8) de, por exemplo, Bacillus sp. , Aspergillus sp., Thermomyces sp. ou Trichoderma sp. (tal como GRINDAMYL™ POWERBake 900 (Danisco A/S)) e xilanases pertencendo à Família 10 ou 11, por exemplo, de Thermomyces lanoginosus (anteriormente chamado de Humicola insolens), Aspergillus aculeatus (WO 94/21785), Baeillus halodurans (WO 2005/059084), Baeillus sp (EP 0 720 .649 BI), B. agadeherens (US 5.770.424) e variantes, homólogos e derivados seus.
0 termo "amilase", conforme aqui utilizado, se refere às amilases tais como α-amilases (EC 3.2.1.1), β-amilases (EC 3.2.1.2) e γ-amilases (EC 3.2.1.3).
A enzima adicional pode ser adicionada juntamente com qualquer outro ingrediente de massa incluindo a farinha, água ou outros aditivos ou ingredientes opcionais, ou a composição melhoradora de massa. A outra enzima pode ser adicionada antes da farinha, água e opcionalmente outros aditivos e ingredientes ou da composição melhoradora de massa. A outra enzima pode ser adicionada depois da farinha, água e opcionalmente outros aditivos e ingredientes ou da composição melhoradora de massa. A outra enzima pode convenientemente ser uma preparação liquida. Entretanto, a composição pode estar convenientemente na forma de uma composição seca.
Algumas enzimas da composição melhoradora de massa são capazes de interagir umas com as outras sob as condições da massa até uma extensão onde o efeito na melhora das propriedades reológicas e/ou de "maquinabilidade" de uma massa de farinha e/ou da qualidade do produto feito a partir da massa pelas enzimas não seja somente aditivo, mas sim o efeito seja sinergistico.
Em relação à melhoria do produto feito a partir de massa (produto acabado), pode ser descoberto que a combinação resulta num efeito sinergistico substancial em relação à estrutura do miolo. Também em relação ao volume especifico do produto assado um efeito sinergistico pode ser verificado.
A outra enzima pode ser uma lipase (EC 3.1.1) capaz de hidrolisar ligações éster carboxilicas para liberar carboxilato. Exemplos de lipases incluem, porém não estão limitadas, a triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3), galactolipase (EC 3.1.1.26), fosfolipase Al (EC 3.1.1.32), fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4) e lipoproteina lipase A2 (EC .3.1.1.34). Mais especificamente, lipases adequadas incluem lipases de Mucor mieheí, F. venenatun, H. Ianuginosa, Rhizomucor miehei candida antarctica, F. oxysporum, glicolipase de Fusarium heterosporum (tal como GRINDAMYL™ POWERBake 4050 (Danisco A/S) ) e variantes, homólogos e derivados seus.
Outros usos
As variantes PS4 são adequadas para a produção de maltose e de xaropes com alto teor de maltose. Tais produtos são de interesse considerável na produção de certos produtos de confeitaria devido à baixa higroscopicidade, baixa viscosidade, boa estabilidade ao calor e sabor brando, não muito doce de maltose. 0 processo industrial de produção de xaropes de maltose compreende a liquefação do amido, a seguir a sacarificação com uma enzima produtora de maltose e opcionalmente com uma enzima clivando os pontos de ramificação 1.6 na amilopectina, por exemplo, uma alfa-1.6-amiloglicosidase.
As variantes PS4 descritas aqui podem ser adicionadas a e, deste modo, se tornar um componente de uma composição detergente. A composição detergente pode ser, por exemplo, formulada como uma composição detergente para máquinas de lavar ou para lavagem manual incluindo uma composição aditiva de lavagem de roupa adequada para o pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciante de tecido adicionado de enxágue, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza de superfícies duras domésticas gerais, ou ser formulada para operações de lavagem de louça em máquina ou manuais. Num aspecto especifico, nós descrevemos um aditivo detergente compreendendo a variante PS4 . O aditivo detergente, assim como a composição detergente, pode compreender uma ou mais outras enzimas tais como uma protease, uma lípase, uma cutinase, uma amilase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lacase e/ou uma peroxidase. Em geral, as propriedades da (s) enzima(s) escolhida(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (isto é, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos, etc.) e as enzimas devem estar presentes em quantidades eficazes.
A variante PS4 também pode ser usada na produção de materiais lignocelulósicos, tais como polpa, papel e papelão, a partir de papel e papelão de rejeito reforçado com amido, especialmente onde a nova redução a polpa ocorre em pH acima de 7 e onde as amilases podem facilitar a desintegração do material de rejeito através da degradação do amido reforçado. As variantes PS4 podem ser especialmente úteis num processo para a produção de uma polpa para fazer papel de papel impresso revestido com amido. O processo pode ser efetuado conforme descrito em WO .95/14807, compreendendo os seguintes passos: a) desintegração do papel para produzir a polpa, b) tratamento com uma enzima degradadora de amido antes, durante ou após o passo a) , e c) separação das partículas de tinta da polpa depois dos passos a) e b) . A variante PS4 pode também ser muito útil na modificação do amido, onde amido enzimaticamente modificado é usado para fazer papel juntamente com enchimentos alcalinos tais como carbonato de cálcio, caulim e barros. Com as variantes PS4 descritas aqui se torna possível modificar o amido na presença de enchimento, permitindo dessa forma um processo integrado mais simples. Uma variante PS4 pode também ser muito útil na desengomadura têxtil. Na indústria de processamento têxtil, amilases são tradicionalmente usadas como adjuvantes em processos de desengomagem para facilitar a remoção de goma contendo amido, a qual tenha servido como um revestimento protetor em fios de tecido durante a trama do tecido. A completa remoção do revestimento de goma depois da trama é importante para assegurar os resultados ótimos nos processos subsequentes, no qual o tecido é esfregado, alvejado e pintado. A quebra enzimática do amido é preferida porque ela não envolve qualquer efeito danoso no material de fibra. A variante PS4 pode ser usada sozinha ou em combinação com uma celulase durante a desengomagem do tecido ou pano contendo celulose.
A variante PS4 também pode ser uma amilase de escolha para a produção de adoçantes a partir de amido. Um processo "tradicional" para a conversão de amido em xaropes de frutose normalmente consiste de três processos enzimáticos consecutivos, isto é, um processo de liquefação seguido por um processo de sacarificação e um processo de isomerização. Durante o processo de liquefação, amido é degradado em dextrinas por uma amilase em valores de pH entre 5,5 e 6,2 e em temperaturas de 95 a 160 0C por um período de aproximadamente 2 horas. Para assegurar uma estabilidade enzimática ótima sob essas condições, 1 mM de cálcio é adicionado (40 ppm de íons cálcio livres). Depois do processo de liquefação, as dextrinas são convertidas em dextrose pela adição de uma glicoamilase e uma enzima desramificadora, tal como uma isoamilase ou uma pulanase. Antes desse passo, o pH é reduzido até um valor abaixo de .4,5, mantendo a temperatura elevada (acima de 95 °C) e a atividade da amilase liqüefeita é desnaturada. A temperatura é reduzida até 60 °C, e glicoamilase e enzima desramificadora são adicionadas. 0 processo de sacarificação procede por 24-72 horas.
Composições detergentes de lavagem de roupas e uso As variantes da α-amilase aqui discutidas podem ser formuladas em composições detergentes para uso em composições de lavagem de louça ou outras de limpeza, por exemplo. Estas podem ser géis, pós ou líquidos. As composições podem compreender a variante a-amilase sozinha, outras enzimas amilolíticas, outras enzimas de limpeza e outros componentes comuns às composições de limpeza.
Deste modo, uma composição detergente de lavagem de louça pode compreender um tensoativo. O tensoativo pode ser aniônico, não-iônico, catiônico, anfotérico ou uma mistura desses tipos. 0 detergente pode conter de 0% até cerca de .90% em peso de um tensoativo não-iônico, tal como alcoóis de cadeia linear propoxilados etoxilados com pouca ou nenhuma espumação. Nas aplicações detergentes, variantes da α-amilase são geralmente usadas numa composição liquida contendo propilenoglicol. A variante α-amilase pode ser solubilizada em propilenoglicol, por exemplo, pela circulação numa solução de propilenoglicol 25% volume/volume contendo 10% de cloreto de cálcio.
A composição detergente de lavagem de louça pode conter sais abrasivos de detergente dos tipos inorgânico e/ou orgânico. Os abrasivos de detergente podem ser subdivididos em tipos contendo fósforo e em tipos sem conter fósforo. A composição detergente geralmente contém cerca de 1% até cerca de 90% de abrasivos detergentes. Exemplos de abrasivos detergentes alcalinos inorgânicos contendo fósforo, quando presentes, incluem os sais solúveis em água, especialmente pirofosfatos de metal alcalino, ortofosfatos e polifosfatos. Um exemplo de abrasivo detergente alcalino orgânico contendo fósforo, quando presente, inclui os sais solúveis em água de fos fonat os. Exemplos de abrasivos inorgânicos sem conter fósforo, quando presentes, incluem carbonatos, boratos e silicatos de metais alcalinos solúveis em água, assim como os vários tipos de aluminossilicatos cristalinos ou amorfos insolúveis em água, dos quais os zeólitos são os representantes mais bem conhecidos.
Exemplos de abrasivos orgânicos adequados incluem o metal alcalino; amônia e amônia substituída; citratos/ succinatos; malonatos; sulfonatos de ácido graxo; carboximetoxissuccinatos; poliacetatos de amônio; carboxilatos; policarboxilatos; aminopolicarboxilatos; poliacetilcarboxilatos; e poli-hidróxissulfonatos.
Outros abrasivos orgânicos adequados incluem os polímeros e copolímeros com maiores pesos moleculares conhecidos por terem propriedades abrasivas, por exemplo, ácido poliacrílico, polimaléico e copolímeros do ácido poliacrílico/polimaléico apropriados, e seus sais.
A composição de limpeza pode conter agentes alvejantes do tipo cloro/bromo ou do tipo oxigênio. Exemplos de alvejantes tipo cloro/bromo inorgânicos são hipoclorito de cálcio, lítio ou sódio, e hipobromito, assim como fosfato trissódico clorado. Exemplos de alvejantes tipo cloro/bromo orgânicos são N-bromo e N-clorimidas heterocíclicas, tais como ácidos tricloroisocianúrico, tribromoisocianúrico, dibromoisocianúrico e dicloroisocianúrico, e seus sais com cátions solúveis em água, tais como potássio e sódio. Compostos de hidantoina também são adequados. A composição de limpeza pode conter alvejantes de oxigênio, por exemplo, na forma de um persal inorgânico, opcionalmente com um precursor alvejante ou como uma composto peroxiácido. Exemplos típicos de compostos alvejantes peróxi adequados são os perboratos de metal alcalino, ambos os tetraidratos e monoidratos, percarbonatos de metal alcalino, persilicatos e perfosfatos. Materiais ativadores adequados incluem tetracetiletilenodiamina (TAED) e triacetato de glicerol. Sistemas de ativação alvejantes enzimáticos também podem estar presentes, tais como perborato e percarbonato, triacetato de glicerol e peridrolase, conforme revelado em WO 2005/056783, por exemplo.
A composição de limpeza pode ser estabilizada usando agentes estabilizantes convencionais para a(s) enzima(s), por exemplo, um poliol tal como, por exemplo, propilenoglicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico (por exemplo, um éster borato aromático). A composição de limpeza pode também conter outros ingredientes detergentes convencionais, por exemplo, material desfloculante, material de enchimento, depressores de espuma, agentes anticorrosão, agentes suspensores de manchas, agentes sequestrantes, agentes de redeposição antimancha, agentes desidratantes, corantes, bactericidas, agentes
fluorescentes, espessantes e perfumes.
Finalmente, as variantes da α-amilase podem ser usadas em detergentes e lavagem de louça convencionais, por exemplo, em qualquer um dos detergentes descritos nas seguintes publicações de patente, com consideração de que as variantes de α-amilase aqui reveladas são usadas ao invés de, ou além de uma α-amilase revelada nas patentes e pedidos de publicação listados: CA 2006687, GB 2200132, GB .2234930, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE .4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO .93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP .554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP .318279, EP 27115 5, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP .518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP .516555, EP 530635, EP 414197, e nas Patentes Americanas Nos. 5.112.518; 5.141.664; e 5.240.632.
De acordo com a modalidade, uma ou mais variantes de α-amilase podem ser tipicamente um componente de uma composição detergente. Como tal, pode ser incluído na composição detergente na forma de um granulado não- pulverizável, de um líquido estabilizado ou de uma enzima protegida. Granulados não-pulverizáveis podem ser produzidos, por exemplo, conforme revelado nas Patentes Americanas Nos. 4.106.991 e 4.661.452, e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno); (polietilenoglicol, PEG), com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxilados com de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a .20 átomos de carbono e no qual existem de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerideos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados, por exemplo, na Patente da Grã-Bretanha No. 1483591. Preparações enzimáticas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol tal como propilenoglicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Outros estabilizantes enzimáticos são bem conhecidos na técnica. Enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método revelado em US 5.879.920 (Genencor International, Inc.) ou EP 238216, por exemplo. Polióis há muito tempo têm sido reconhecidos como estabilizantes de proteínas, assim como para melhorar a solubilidade de proteínas. Ver, por exemplo, Kaushik et al., "Why is trehalose an exceptional protein stabilizer? An analysis of the thermal stability of proteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose" J Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003) e referências ali citadas; e M. Conti et al., "Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility, " J Chromatography 757: 237-245 (1997).
A composição detergente pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, como géis, pós, grânulos, pastas ou líquidos. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até cerca de 70% de água, e de 0% até cerca de 30% de solvente orgânico, ele também pode estar na forma de um tipo de gel compacto contendo somente cerca de .30% de água.
A composição detergente compreende um ou mais tensoativos, cada um dos quais podendo ser aniônico, não- iônico, catiônico ou zwitteriônico. 0 detergente irá geralmente conter de 0% até cerca de 50% de tensoativo aniônico, tal como alquilbenzenossulfonato linear (LAS); α-olefinossulfonato (AOS); sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo) (AS) ; etoxissulfato de álcool (AEOS ou AES) ; alcanossulfonatos secundários (SAS); ésteres metílicos do ácido α-sulfograxo; ácido alquil- ou alquenilsuccínico; ou sabão. A composição pode também conter de 0% até cerca de .40% de tensoativo não-iônico, tal como etoxilato de álcool (AEO ou AE), etoxilatos de álcool carboxilado, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilaminóxido, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo ou amida de ácido graxo poliidroxialquil, conforme descrito em WO 92/06154, por exemplo. A composição detergente pode compreender adicionalmente uma ou mais outras enzimas, tal como lípase, cutinase, protease, celulase, peroxidase e/ou lacase em qualquer combinação.
O detergente pode conter cerca de 1% até cerca de 65% de um abrasivo detergente ou agente complexante tal como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminotetracét ico (EDTA), ácido dietilenotriaminopentacético (DTMPA), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-β da Hoechst) . O detergente também pode ser sem abrasivo, isto é, essencialmente livre de abrasivo detergente. Enzimas podem ser usadas em qualquer composição compatível com a estabilidade da enzima. Enzimas podem ser protegidas contra componentes de um modo geral prejudiciais por formas conhecidas de encapsulamento, como por granulação ou seqüestro em hidrogéis, por exemplo. Enzimas e especificamente α-amilases, quer com ou sem os domínios de ligação a amido, não estão limitadas às aplicações de lavagem de louça ou de roupa, porém podem ter uso em limpadores de superfície e na produção de etanol a partir de amido ou biomassa.
O detergente pode compreender um ou mais polímeros . Exemplos incluem carboximetilcelulose (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG), álcool (poli) vinílico (PVA), policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolimeros do ácido maleico/acríIico e copolimeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.
0 detergente pode conter um sistema alvejante, o qual pode compreender uma fonte de H2O2, tal como perborato ou percarbonato opcionalmente combinado com um ativador de alve jante formador de perácido, tal como TAED ou nonanoiloxibenzenossulfonato (NOBS). Alternativamente, o sistema alvejante pode compreender peroxiácidos do tipo amida, imida ou sulfona, por exemplo. 0 sistema alvejante pode também ser um sistema alvejante enzimático onde uma peridrolase ativa peróxido, tal como aquela descrita em WO 2005/056783.
As enzimas da composição detergente podem ser estabilizadas usando agentes estabilizantes convencionais, por exemplo, um poliol tal como propilenoglicol ou glicerol; um açúcar ou álcool de açúcar; ácido lático; ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, tal como um éster de borato aromático; e a composição pode ser formulada conforme descrito em WO 92/19709 e WO 92/19708, por exemplo.
0 detergente também pode conter outros ingredientes detergentes convencionais, tais como condicionadores de tecido incluindo barros, geradores de espuma, supressores de espuma, agentes anticorrosão, agentes suspensores de sujeira, agentes de redeposição antimancha, corantes, bactericidas, branqueadores óticos ou perfume, por exemplo. O pH (medido em solução aquosa na concentração de uso) é qeralmente neutro ou alcalino, por exemplo, com pH de cerca de 7,0 até cerca de 11,0.
A variante da α-amilase pode ser incorporada em concentrações convencionalmente empregadas nos detergentes. E atualmente contemplado que, na composição detergente, a variante da α-amilase pode ser adicionada numa quantidade correspondendo a 0,00001 a 1,0 mg (calculado como a proteína de enzima pura) de variante de α-amilase por litro de líquido de lavagem. Formas particulares de composições detergentes compreendendo as variantes da a- amilase podem ser formuladas para incluir:
(1) Uma composição detergente formulada como um granulado com uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 7% até cerca de 12%; etoxissulfato de álcool (por exemplo, álcool C\2-w, oxido de 1-2 etileno (EO)) ou sulfato de alquila (por exemplo, C16-Is) de cerca de 1% até cerca de 4%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool Ci4=i5, 7 EO) de cerca de 5% até cerca de 9%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2COs) de cerca de 14% até cerca de 20%; silicato solúvel, de cerca de 2 até cerca de 6%; zeólito (por exemplo, NaAlSiO4) de cerca de 15% até cerca de 22%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) de 0% até cerca de 6%; citrato de sódio/ácido cítrico (por exemplo, C6H5Na3O7ZC6H8O7) de cerca de 0% até cerca de 15%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3-H2O) de cerca de 11% até cerca de 18%; TAED de cerca de 2% até cerca de 6%; carboximetilcelulose (CMC) e 0% até cerca de 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 0 - 3%; enzimas (calculadas como enzima pura) 0,0001 - 0,1% de proteína; e ingredientes menores (por exemplo, espuma, supressores, perfumes, branqueador ótico, fotoalvejante) 0 - 5%.
(2) Uma composição detergente formulada como um granulado com uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 6% até cerca de 11%; etoxissulfato de álcool (por exemplo, álcool Ci2-IS/ 1-2 EO) ou sulfato de alquila (por exemplo, Ci6-I8) de cerca de 1% até cerca de 3%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool Ci4-I5, 7 EO) de cerca de 5% até cerca de 9%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) de cerca de 15% até cerca de 21%; silicato solúvel, de cerca de 1% até cerca de 4%; zeólito (por exemplo, NaAlSiO4) de cerca de 24% até cerca de 34%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) de cerca de 4% até cerca de 10%; citrato de sódio/ácido cítrico (por exemplo, C6H5Na307/C6H807) de cerca de 0% até cerca de 15%; carboximetilcelulose (CMC) de 0% até cerca de 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1 - 6%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; ingredientes menores (por exemplo, espuma, supressores, perfumes) 0-5%.
(3)Uma composição detergente formulada como um granulado com uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 5% até cerca de 9%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO) de cerca de 7% até cerca de 14%; Sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido graxo C16-22) de cerca de 1 até cerca de 3%; carbonato de sódio (como Na2CO3) de cerca de 10% até cerca de 17%; silicato solúvel, de cerca de 3% até cerca de 9%; zeólito (como NaAlSiO4) de cerca de 23% até cerca de 33%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) de cerca de 0% até cerca de 4%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3-H2O) de cerca de 8% até cerca de 16%; TAED de cerca de 2% até cerca de 8%; fosfonato (por exemplo, EDTMPA) de 0% até cerca de 1%; carboximetilcelulose (CMC) de 0% até cerca de 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrilico, PVP, PEG) 0 - 3%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; ingredientes menores (por exemplo, supressores de espuma, perfumes, branqueadores óticos) 0 - 5% .
(4) Uma composição detergente formulada como um granulado com uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 8% até cerca de 12%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO) de cerca de 10% até cerca de 25%; carbonato de sódio (como Na2CO3) de cerca de 14% até cerca de 22%; silicato solúvel, de cerca de 1% até cerca de 5%; zeólito (como NaAlSiO4) de cerca de 25% até cerca de 35%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) de 0% até cerca de 10%; carboximet ilcelulose (CMC) de 0% até cerca de 2%; polímeros (por exemplo, copolimero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1 - 3%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0 - 5% .
(5) Uma composição detergente líquida compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 15% até cerca de 21%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool Ci2-I5, 7 EO ou álcool Ci2-I5, 5 EO) de cerca de 12% até cerca de 18%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido oléico) de cerca de 3% até cerca de 13%; ácido alquenilsuccínico (Ci2_i4) de 0% até cerca de 13%; aminoetanol de cerca de 8% até cerca de 18%; ácido cítrico de cerca de 2% até cerca de 8%; fosfonato de 0% até cerca de 3%; polímeros (por exemplo, PVP, PEG) de 0% até cerca de 3%; borato (por exemplo, B4O7) de 0% até cerca de 2%; etanol de 0% até cerca de 3%; propilenoglicol de cerca de 8% até cerca de 14%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; ingredientes menores (por exemplo, dispersantes, supressores de espuma, perfume, branqueadores óticos) 0-5%.
(6)Uma composição detergente liquida estruturada aquosa compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 15% até cerca de 21%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO ou álcool C12-15/ 5 EO) 3-9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido oleico) de cerca de 3% até cerca de 10%; zeólito (como NaAlSiO4) de cerca de 14% até cerca de 22%; citrato de potássio de cerca de 9% até cerca de 18%; borato (por exemplo, B4O7) de 0% até cerca de 2%; carboximetilcelulose (CMC) de 0% até cerca de 2%; polímeros (por exemplo, PEG, PVP) de 0% até cerca de 3%; polímeros fixadores (por exemplo, copolímero de metacrilato de laurila/ácido acrílico); proporção molar de 25:1; PM 3800) de 0% até cerca de 3%; glicerol de 0% até cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, dispersantes, supressores de espuma, perfume, branqueadores óticos) 0 - 5% .
(7)Uma composição detergente formulada como um granulado com uma densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo sulfato de ácido graxo de cerca de 5% até cerca de 10%; monoetanolamida de ácido graxo etoxilado de cerca de 3% até cerca de 9%; sabão como ácido graxo e 0 - 3%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) de cerca de 5% até cerca de 10%; silicato solúvel, de cerca de 1% até cerca de 4%; zeólito (por exemplo, NaAlSiO4) de cerca de .20% até cerca de 40%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) de cerca de 2% até cerca de 8%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3-H2O) de cerca de 12% até cerca de 18%; TAED de cerca de 2% até cerca de 7%; polímeros (por exemplo, copolimero do ácido maleico/acriIico, PEG) de cerca de 1% até cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1% de proteína; e ingredientes menores (por exemplo, branqueadores óticos, supressores de espuma, perfume) 0-5%.
(8) Composição detergente formulada como um granulado compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 8% até cerca de 14%; monoetanolamida de ácido graxo etoxilado de cerca de 5% até cerca de 11%; sabão como ácido graxo de 0% até cerca de 3%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) de cerca de 4% até cerca de 10%; silicato solúvel, de cerca de 1% até cerca de .4%; zeólito (como NaAlSiO4) de cerca de 30% até cerca de .50%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) de cerca de 3% até cerca de 11%; citrato de sódio (por exemplo, C6H5Na3O7) de cerca de 5% até cerca de 12%; polímeros (por exemplo, PVP, copolimero do ácido maleico/acrílico, PEG) de cerca de .1% até cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0-5%. (9) Composição detergente formulada como um granulado compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 6% até cerca de 12%; tensoativo não-iônico de cerca de 1% até cerca de 4%; sabão como ácido graxo de cerca de 2% até cerca de 6%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) de cerca de 14% até cerca de 22%; zeólito (por exemplo, NaAlSiO4) de cerca de 18% até cerca de 32%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) de cerca de .5% até cerca de 20%; citrato de sódio (por exemplo, C6H5Na3O7) de cerca de 3% até cerca de 8%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3. H2O) de cerca de 4% até cerca de .9%; ativador de clarificação (por exemplo, NOBS ou TAED) de cerca de 1% até cerca de 5%; carboximetilcelulose (CMC) de .0% até cerca de 2%; polímeros (por exemplo, policarboxilato ou PEG) de cerca de 1% até cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, branqueador ótico, perfume) 0-5%.
(10) Uma composição detergente líquida aquosa compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 15% até cerca de 23%; etoxissulfato de álcool (por exemplo, álcool Cx2-I5, 2-3 EO de cerca de 8% até cerca de 15%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool Ci2-I5, 7 EO, ou álcool Cx2-I5, 5 EO) de cerca de 3% até cerca de 9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido láurico) de 0% até cerca de 3%; amioetanol de cerca de 1% até cerca de 5%; citrato de sódio de cerca de 5% até cerca de 10%; hidrótropo (por exemplo, toluenossulfonato de sódio) de cerca de 2% até cerca de 6%; borato (por exemplo, B4O7) de 0% até cerca de 2%; carboximetilcelulose de 0% até cerca de 1%; etanol de cerca de 1% até cerca de 3%; propilenoglicol de cerca de 2% até cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, polímeros, dispersantes, perfume, branqueadores óticos) 0-5%.
(11)Uma composição detergente líquida aquosa compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) de cerca de 20% até cerca de 32%; etoxilato de álcool (por exemplo, álcool C12-15, 7 EO ou álcool C12-15, 5 EO) de 6-12%; aminoetanol de cerca de 2% até cerca de 6%; ácido cítrico de cerca de 8% até cerca de 14%; borato (por exemplo, B4O7) de cerca de 1% até cerca de 3%; polímero (por exemplo, copolímero do ácido maleico/acrílico, polímero fixador, tal como copolímero de metacrilato de laurila/ácido acrílico) de 0% até cerca de 3%; glicerol de cerca de 3% até cerca de 8%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, hidrótropos, dispersantes, perfume, branqueadores óticos) 0-5%.
(12)Composição detergente formulada como um granulado com densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo tensoativo aniônico (alquilbenzenossulfonato linear, sulfato de alquila, α-olefinossulfonato, ésteres metílicos do ácido α-sulfograxo, alcanossulfonatos, sabão) de cerca de 25% até cerca de 40%; tensoativo não-iônico (por exemplo, etoxilato de álcool) de cerca de 1% até cerca de .10%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) de cerca de .8% até cerca de 25%; silicatos solúveis, de cerca de 5% até cerca de 15%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) de cerca de 0% até cerca de 5%; zeólito (NaAlSiO4) de cerca de .15% até cerca de 28%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO3-H2O) de 0% até cerca de 20%; ativador de branqueamento (por exemplo, NOBS ou TAED) de cerca de 0% até cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, branqueador ótico, perfume) 0-3%.
(13) Composições detergentes conforme descrito nas composições 1) 12) acima, em que todo ou parte do alquilbenzenossulfonato linear é substituído por sulfato de alquila (Ci2-Ci8) .
(14) Composição detergente formulada como um granulado com densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo sulfato de alquila (C12-Ci8) de cerca de 9% até cerca de .15%; etoxilato de álcool de cerca de 3% até cerca de 6%; amida de ácido poliidroxialquilgraxo de cerca de 1% até cerca de 5%; zeólito (por exemplo, NaAlSiO4) de cerca de .10% até cerca de 20%; dissilicato em camadas (por exemplo, SK56 da Hoechst) de cerca de 10% até cerca de 20%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) de cerca de 3% até cerca de 12%; silicato solúvel, de 0% até cerca de 6%; citrato de sódio de cerca de 4% até cerca de 8%; percarbonato de sódio de cerca de 13% até cerca de 22%; TAED de cerca de 3% até cerca de 8%; polímeros (por exemplo, policarboxilatos e PVP) de 0% até cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, branqueador ótico, fotoalvejante, perfume, supressores de espuma) 0 - .5% .
(15) Composição detergente formulada como um granulado com densidade aparente de pelo menos 600 g/L compreendendo sulfato de alquila (Ci2-Cx8) de cerca de 4% até cerca de 8%; etoxilato de álcool de cerca de 11% até cerca de 15%; sabão de cerca de 1% até cerca de 4%; zeólito MAP ou zeólito A de cerca de 35% até cerca de 45%; carbonato de sódio (como Na2CO3) de cerca de 2% até cerca de 8%; silicato solúvel, de 0% até cerca de 4%; percarbonato de sódio de cerca de .13% até cerca de 22%; TAED 1-8%; carboximetilcelulose (CMC) de 0% até cerca de 3%; polímeros (por exemplo, policarboxilatos e PVP) de 0% até cerca de 3%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001 - 0,1%; e ingredientes menores (por exemplo, branqueador ótico, fosfonato, perfume) 0 - 3%.
(16) Formulações detergentes conforme descrito em 1) - .15) acima, as quais contêm um perácido estabilizado ou encapsulado, seja como um componente adicional ou como um substituto para os sistemas alvejantes já especificados.
(17) Composições detergentes conforme descrito acima em 1), 3), 7), 9) e 12), em que o perborato é substituído por percarbonato. (18) Composições detergentes conforme descrito acima em D/ 3), 7), 9), 12), 14) e 15), as quais contêm adicionalmente um catalisador de manganês.
(19) Composição detergente formulada como um líquido detergente não-aquoso, compreendendo um tensoativo não- iônico líquido tal como, por exemplo, álcool primário alcoxilado linear, um sistema abrasivo (por exemplo, fosfato), enzima(s) e álcali. 0 detergente também pode compreender tensoativo aniônico e/ou um sistema alvejante.
Em outra modalidade, a 2,β-β-D-frutan hidrolase pode ser incorporada em composições detergentes e usada para a remoção/limpeza do biofilme presente em residências e/ou indústria têxtil/lavanderia.
A composição detergente pode ser, por exemplo, formulada como uma composição detergente para lavar roupas em máquina ou com as mãos, incluindo uma composição aditiva de lavar roupas adequada para o pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciante de tecidos adicionados de enxágue, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza de superfícies duras residenciais em geral, ou ser formulada para operações de limpeza de louças em máquinas ou com as mãos.
Num aspecto especifico, a composição detergente pode compreender 2,β-β-D-frutan hidrolase, uma ou mais variantes de α-amilase e uma ou mais enzimas de limpeza, tal como uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, uma lacase e/ou uma peroxidase, e/ou suas combinações. Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) escolhida(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (por exemplo, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos, etc.) e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes.
Proteases: proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Mutantes projetados de proteína ou quimicamente modificados também são adequados. A protease pode ser uma serina protease ou uma metaloprotease, por exemplo, uma protease microbiana alcalina ou uma protease tipo tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus sp. , por exemplo, subtilisina Movo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309 (ver, por exemplo, Patente Americana No. 6.287.841), subtilisina 147 e subtilisina 168 (ver, por exemplo, WO 89/06279). Exemplos de proteases tipo tripsina são tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina) e proteases Fusarium (ver, por exemplo, WO 39/06270 e WO 94/25583) . Exemplos de proteases úteis também incluem, porém não estão limitadas, às variantes descritas em WO 92/19729 e WO 98/20115. Enzimas proteases comercialmente adequadas incluem Alcalase©, Savinase®, Esperase© e Kannase™ (Novozvmes, anteriormente Novo Nordisk A/S) ; Maxatase®, Maxacal'", Maxapem™, Properase™, Purafect®, Purafect OxP™, FN2™ e FN3™ (Genencor International, Inc.).
Lipases: lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes projetados de proteína ou quimicamente modificados estão incluídos. Exemplos de lipases úteis incluem, porém não estão limitadas, às lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, H. Ianuginosa (T. Ianuginosa) (ver, por exemplo, EP 258068 e EP 305216) e H. insolens (ver, por exemplo, WO 96/13580); uma lípase de Pseudomonas (por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaiigenes; ver, por exemplo, EP 218 272), P. cepacia (ver, por exemplo, EP 331 376), P. stutzeri (ver, por exemplo, GB 1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (ver, por exemplo, WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (ver, por exemplo, WO 96/12012); uma lipase de Bacilius (por exemplo, de B. subtilis; ver, por exemplo, Dartois et al . , Bioehemiea Biophysiea Aetar 1131: .253-360 (1993)), B. stearothermophilus (ver, por exemplo, JP 64/744992) ou B. pumílus (ver, por exemplo, WO .91/16422). Variantes de lipase adicionais contempladas para uso nas formulações incluem aquelas descritas, por exemplo, em WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO .95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO .97/04079, WO 97/07202, EP 407225 e EP 260105. Algumas enzimas lipase comercialmente disponíveis incluem Lipolase© e LipolaseID Ultra (Novozymes, anteriormente Novo Nordisk A/S) .
Poliesterases: poliesterases adequadas incluem, porém não estão limitadas, àquelas descritas em WO 01/34899 (Genencor International, Inc.) e WO 01/14629 (Genencor International, Inc.), e podem ser incluídas em qualquer combinação com outras enzimas discutidas aqui.
Amilases: As composições podem ser combinadas com outras α-amilases, tal como com uma α-amilase não- variante. Estas podem incluir amilases comercialmente disponíveis, tais como, porém não limitadas, a Duramyl®, Termamy1™, Fungamyl© e ΒΑΝ™ (Novozymes, anteriormente Novo Nordisk A/S), RapidaseCD e Purastar® (Genencor International, Inc.).
Celulases: celulases podem ser adicionadas nas composições. Celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes projetados de proteína ou quimicamente modificados estão incluídos. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacilius, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremoniumf por exemplo, as celulases fúngicas produzidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophíia e Fusarium oxysporum reveladas nas Patentes Americanas Nos. 4.435.307; .5.648.263; 5.691.178; 5.776.757; e WO 89/09259, por exemplo. Celulases exemplares contempladas para uso são aquelas com o beneficio de cuidados com cor para tecido. Exemplos de tais celulases são as celulases descritas em EP .0495257; EP 531 372; WO 99/25846 (Genencor International, Inc.), WO 96/34108 (Genencor International, Inc.), WO .96/11262; WO 96/29397; e WO 98/08940, por exemplo. Outros exemplos são variantes de celulase, tais como aquelas descritas em WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/0 02 99; EP 531 315; Patentes Americanas Nos. .5.457.046; 5.686.593; e 5.763.254. Celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme© e Carezyme® (Novozymes, anteriormente Novo Mordisk A/S); Clazinase™ e Puradax© HA (Genencor International, Inc.); e KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
Peroxidases/Oxidases: peroxidases/oxidases adequadas contempladas para uso nas composições incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. Mutantes projetados de proteína ou quimicamente modificados estão incluídos. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus, e suas variantes conforme aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602 e WO .98/15257. A(s) enzima(s) detergente(s) pode(m) ser incluída(s) numa composição detergente pela adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou pela adição de um aditivo combinado compreendendo todas essas enzimas. Um aditivo detergente, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado como um granulado, liquido, pasta, etc. Formulações aditivas detergentes granuladas adequadas incluem granulados não-pulverizáveis.
Granulados não-pulverizáveis podem ser produzidos, por exemplo, conforme revelado nas Patentes Americanas Nos. 4.106.991 e 4.661.452, e opcionalmente podem ser revestidos pelos métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de óxido de (poli)etileno (por exemplo, polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxilados contendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e no qual existem de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoois graxos; e mono-, di- e triglicerídeos dos ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filmes adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dadas na GB 1483591, por exemplo. Preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol, tal como propilenoglicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático ou ácido bórico de acordo com os métodos estabelecidos. Enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método revelado na EP 238 216.
A composição detergente pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, em barra, tablete, gel, pó, grânulo, pasta ou liquido. Um detergente liquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até cerca de 70% de água, e de .0% até cerca de 30% de solvente orgânico. Géis detergentes compactos contendo 30% ou menos de água também são contemplados. A composição detergente compreende um ou mais tensoativos, os quais podem ser não-iônicos, incluindo semi-polares, aniônicos, catiônicos ou zwitteriônicos, ou qualquer combinação destes. Os tensoativos estão tipicamente presentes num nivel de 0,1% até 60% em peso.
Quando ali incluídos o detergente irá conter tipicamente de cerca de 1% até cerca de 40% de um tensoativo aniônico, tal como alquilbenzenossulfonato linear, α-olefinossulfonato, sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo), etoxissulfato de álcool, alcanossulfonato secundário, éster metílico do ácido α-sulfograxo, ácido alquil- ou alquenilsuccínico ou sabão.
Quando ali incluídos o detergente irá conter tipicamente de cerca de 0,2% até cerca de 40% de um tensoativo não-iônico, tal como etoxilato de álcool, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilaminóxido, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo, amida do ácido poliidroxialquilgraxo ou derivados N-acil-N-alquil de glucosamina ("glucamidas").
0 detergente pode conter 0% até cerca de 65% de um abrasivo de detergente ou agente complexante, tal como um zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentacético, ácido alquil- ou alquenilsuccinico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst).
0 detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são a carboximetilcelulose (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) (PEG), álcool (poli)vinilico (PVA), N-óxido de (poli)vinilpiridina, (poli)vinilimidazol, policarboxilatos, por exemplo, poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.
0 detergente pode conter um sistema alvejante que pode compreender uma fonte de H2O2, tal como perborato ou percarbonato, o qual pode ser combinado com um ativador de alvejante formador de perácido (por exemplo, tetracetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzenossulfonato). Alternativamente, o sistema alvejante pode compreender peroxiácidos (por exemplo, os peroxiácidos do tipo amida, imida ou sulfona) . O sistema alvejante pode também ser um sistema alvejante enzimático.
A(s) enzima(s) da composição detergente pode(m) ser estabilizada(s) usando agentes estabilizantes convencionais, por exemplo, poliol (por exemplo, propilenoglicol ou glicerol), um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico, um derivado de ácido bórico (por exemplo, um éster de borato aromático) ou um derivado do ácido fenilborônico (por exemplo, ácido 4- formilfenilborônico). A composição pode ser formulada conforme descrito em WO 92/19709 e WO 92/19708.
0 detergente também pode conter outros ingredientes detergentes convencionais, tais como, por exemplo, condicionadores de tecido incluindo barros, geradores de espuma, supressores de espuma, agentes anticorrosão, agentes suspensores de sujeiras, agentes de anti- redeposição de mancha, corantes, bactericidas, branqueadores óticos, hidrótopos, inibidores de manchas ou perfumes.
É contemplado que nas composições detergentes, as variantes de enzimas podem ser adicionadas numa quantidade correspondendo a cerca de 0,01 até cerca de 100 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, particularmente de cerca de 0,05 até cerca de 5,0 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, ou ainda mais particularmente em 0,1 até cerca de 1,0 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem.
Composições de processamento de amido e uso
Em outro aspecto, composições com as variantes de a- amilase reveladas podem ser utilizadas para a liquefação e/ou sacarificação de amido. 0 processamento do amido é útil para produzir adoçante, produzir álcool para combustível ou bebida (isto é, álcool potável), produzir uma bebida, processamento de cana-de-açúcar ou produzir compostos orgânicos desejados, por exemplo, ácido cítrico, ácido itacônico, ácido lático, ácido glucônico, cetonas, aminoácidos, antibióticos, enzimas, vitaminas e hormônios. A conversão de amido em xaropes de frutose normalmente consiste de três processos enzimáticos consecutivos: um processo de liquefação, um processo de sacarificação e um processo de isomerização. Durante o processo de liquefação, uma α-amilase degrada o amido em dextrinas por um pH entre cerca de 5,5 e cerca de 6,2 e em temperaturas de cerca de .95 0C até cerca de 160 0C por um período de aproximadamente .2 horas. Cerca de 1 mM de cálcio (40 ppm de íons cálcio livres) é tipicamente adicionada para otimizar a estabilidade enzimática sob essas condições. Outras variantes de α-amilase podem requerer diferentes condições.
Depois do processo de liquefação, as dextrinas podem ser convertidas em dextrose pela adição de glicoamilase (por exemplo, AMG™) e opcionalmente uma enzima desramificadora, tal como uma isolamilase ou uma pululanase (por exemplo, Promozyme®). Antes desse passo, o pH é reduzido até um valor abaixo de cerca de 4,5, mantendo a temperatura elevada (acima de 95 °C) e a atividade da variante de α-amilase liqüefeita é desnaturada. A temperatura é reduzida até 60 °C, e uma glicoamilase e uma enzima desramificadora podem ser adicionadas. 0 processo de sacarificação procede tipicamente por cerca de 24 até cerca de 72 horas.
Depois do processo de sacarificação, o pH é aumentado até um valor na faixa de cerca de 6,0 até cerca de 8,0, por exemplo, pH 7,5, e o cálcio é removido por troca iônica. O xarope de dextrose é, a seguir, convertido em xarope com alto teor de frutose e glicose isomerase imobilizada (tal como Sweetzyme(D) , por exemplo.
A variante de α-amilase pode proporcionar pelo menos uma propriedade enzimática melhorada para efetuar o processo de liquefação. Por exemplo, a α-amilase variante pode ter uma atividade maior, ou ela pode ter uma necessidade reduzida por cálcio. A adição de cálcio livre é requerida para assegurar adequadamente a alta estabilidade da α-amilase; entretanto, o cálcio livre inibe fortemente a atividade da glicose isomerase. Concordantemente, o cálcio deve ser removido antes do passo de isomerização, através de uma operação unitária dispendiosa, até uma extensão que reduza o nivel de cálcio livre até abaixo de 3 - 5 ppm. As economias de custo podem ser obtidas se tal operação puder ser evitada, e o processo de liquefação puder ser efetuado sem a adição de ions cálcio livres. Deste modo, variantes da α-amilase que não requerem ions cálcio ou que tenham uma necessidade reduzida por cálcio são particularmente vantajosos. Por exemplo, uma variante da α-amilase menos dependente de cálcio, a qual seja estável e altamente ativa em baixas concentrações de cálcio livre (< 40 ppm) pode ser utilizada na composição e procedimentos. Tal variante da α-amilase deve ter um pH ótimo na faixa de cerca de 4,5 até cerca de 6,5, por exemplo, pH de cerca de 4,5 até pH de cerca de 5,5; As variantes da α-amilase podem ser usadas sozinhas para proporcionar a hidrólise especifica ou podem ser combinadas com outras amilases para proporcionar um "coquetel" com um amplo espectro de atividade.
0 amido a ser processado pode ter uma qualidade de amido altamente refinado, por exemplo, de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99,5% de pureza. Alternativamente, o amido pode ser um material contendo amido mais bruto compreendendo grãos inteiros moidos, incluindo frações que não são amido, tal como resíduos de gérmen e fibras. A matéria-prima, tal como grão inteiro, é moída para abrir a estrutura e permitir o processamento adicional. Dois processos de moagem são adequados: moagem úmida e seca. Também grãos de milho, e grãos de milho moidos podem ser aplicados. Grão moido seco irá compreender quantidades significativas de compostos de carboidrato que não são amido, além de amido. Quando tal material heterogêneo é processado de modo continuo, geralmente somente uma gelatinização parcial do amido é alcançada. Concordantemente, variantes de α-amilase com uma alta atividade para o amido não-gelatinizado são vantajosamente aplicadas num processo compreendendo a liquefação e/ou a sacarificação do amido moido a seco de modo continuo.
Uma variante α-amilase com uma atividade de hidrólise superior durante o processo de liquefação vantajosamente aumenta a eficiência do passo de sacarificação (ver WO .98/22613) e a necessidade por glicoamilase durante o passo de sacarificação. A glicoamilase vantajosamente está presente numa quantidade não maior do que, ou mesmo menor do que 0,5 de unidade de atividade de glicoamilase (AGU)/g DS (isto é, unidades de atividade de glicoamilase por grama de sólidos secos). A glicoamilase pode ser derivada de uma cepa dentre Aspergillus sp. , Talaromyces sp. , Pachykytospora sp., ou Trametes sp., com exemplos exemplares sendo Aspergillus niger, Talaromyces emersonii, Trametes cingulata, ou Paohykytospora papyracea. Numa modalidade, o processo também compreende o uso de um domínio de ligação a carboidrato do tipo revelado em WO .98/22613.
Ainda em outro aspecto, o processo pode compreender a hidrólise de uma pasta de amido gelatinizado ou granular, particularmente a hidrólise de amido granular num hidrolisado de amido solúvel numa temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do amido granular. Além de entrar em contato com uma variante da α-amilase, o amido pode entrar em contato com uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma α-amilase fúngica (EC 3.2.1.1), uma β-amilase (EC 3.2.1.2) e uma glicoamilase (EC 3.2.1.3). Numa modalidade, ainda outra enzima amilolítica ou uma enzima desramificadora, tal como uma isoamilase (EC 3.2.1.68) ou pululanases (EC 3.2.1.41) podem ser adicionadas à variante de α-amilase.
Numa modalidade, o processo é efetuado numa temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial.
Tais processos são geralmente efetuados pelo menos a 30°C, pelo menos a 31°c, pelo menos a 32°C, pelo menos a 33°C, pelo menos a 34°C, pelo menos a 35°c, pelo menos a 36°C, pelo menos a 37°C, pelo menos a 38°C, pelo menos a 39°C, pelo menos a 40°C, pelo menos a 41°C, pelo menos a 42°C, pelo menos a 43°C, pelo menos a 44°C, pelo menos a 45°C, pelo menos a 46°C, pelo menos a 47°C, pelo menos a 48°C, pelo menos a 49°C, pelo menos a 50°C, pelo menos a 51°C, pelo menos a 52°C, pelo menos a 53°C, pelo menos a 54°C, . pelo menos a 55 °C, pelo menos a 56 °C, pelo menos a 57 0C, pelo menos a 58 0C, pelo menos a 59 °C ou pelo menos a 60 °C. O pH no qual o processo é efetuado pode estar na faixa de cerca de 3,0 até cerca de 7,0, de cerca de 3,5 até cerca de 6,0 ou de cerca de 4,0 até cerca de 5,0. Um aspecto contempla um processo compreendendo fermentação com uma levedura, por exemplo, para produzir etanol numa temperatura de aproximadamente 32 °C, tal como de 30 0C até .35 °C. Em outro aspecto, o processo compreende a sacarificação simultânea e a fermentação com uma levedura para produzir etanol ou com outro organismo de fermentação adequado para produzir um composto orgânico desejado, por exemplo, numa temperatura de 30 0C a 35 °C, por exemplo, aproximadamente a 32 °C. Nos processos de fermentação acima, o conteúdo de etanol alcança pelo menos cerca de 7%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de .12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15% ou pelo menos cerca de 16% de etanol.
A pasta de amido a ser usada em qualquer um dos aspectos acima pode ter cerca de 20% até cerca de 55% de sólidos secos de amido granular, cerca de 25% até 40% de sólidos secos de amido granular ou cerca de 30% até cerca de 35% de sólidos secos de amido granular. A variante da enzima converte o amido solúvel num hidrolisato de amido solúvel do amido granular na quantidade de pelo menos 85%, pelo menos 8 6%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos .8 9%, pelo menos 90%, pelo menos 91 %, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.
Em outra modalidade, a variante α-amilase é usada num processo para liquefação ou sacarificação de um amido gelatinizado incluindo, porém sem se limitar, à gelatinização de modo continuo. O processo pode compreender fermentação para produzir um produto de fermentação, por exemplo, etanol. Tal processo para produzir etanol a partir de material contendo amido por fermentação compreende: (i) a liquefação de material contendo amido com uma variante de α-amilase; (ii) a sacarificação da mistura liqüefeita obtida; e (iii) a fermentação do material obtido no passo (ii) na presença de um organismo fermentador. Opcionalmente o processo ainda compreende a recuperação do etanol. Os processos de sacarificação e de fermentação podem ser executados como um processo de sacarificação e fermentação simultâneo (SSF). Durante a fermentação, o conteúdo de etanol alcança pelo menos cerca de 7%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10% tal como pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos .15%, ou pelo menos 16% de etanol.
O amido a ser processado nos aspectos acima pode ser obtido a partir de tubérculos, raízes, talos, legumes, cereais ou grãos inteiros. Mais especificamente, o amido granular pode ser obtido a partir de milhos, sabugos, trigo, cevada, centeio, sorgo (milo), sagu, mandioca, tapioca, sorgo (sorghum) , arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas. São especialmente contemplados os tipos tanto cerosos quanto não-cerosos de milho e cevada.
Conforme aqui utilizado, o termo "liquefação" ou "liqüefaz" significa um processo pelo qual o amido é convertido em dextrinas de cadeia mais curta e menos viscosas. Geralmente, este processo envolve a gelatinização do amido simultaneamente com ou seguido pela adição de uma variante da α-amilase. Enzimas indutoras de liquefação adicionais podem ser opcionalmente adicionadas. Conforme aqui utilizado, o termo "liquefação primária" se refere a um passo de liquefação quando a temperatura da pasta é elevada até ou próximo de sua temperatura de gelatinização. Subseqüentemente à elevação de temperatura, a pasta é enviada através de um trocador de calor ou jato até temperaturas de cerca de 90 a 150 °C, por exemplo, de 100 a .110 °C. Subseqüentemente à aplicação a um trocador de calor ou Jet temperature, a pasta é mantida por um período de 3 a .10 minutos naquela temperatura. Esse passo de manter a pasta a 90 - 150 0C é chamado de liquefação primária.
Conforme aqui utilizado, o termo "liquefação secundária" se refere ao passo de liquefação subsequente à liquefação primária (aquecimento até 90 - 150 °C) quando a pasta é deixada esfriar até a temperatura ambiente. Esse passo de esfriamento pode ser de 30 minutos até 130 minutos, por exemplo, de 90 minutos até 12 0 minutos. Conforme aqui utilizado, o termo "minutos de liquefaçâo secundária" se refere ao tempo que se passou do inicio da liquefaçâo secundária até o tempo que o Equivalente de Dextrose (DE) é medido.
Outro aspecto contempla o uso adicional de uma β- amilase na composição compreendendo a variante da a- amilase. β-amilases (EC 3.2.1.2) são amilases maltogênicas de ação externa, as quais catalisam a hidrólise de ligações .1,4-tt-glicosídicas em amilose, amilopectina e polímeros de glicose relacionados, liberando desta forma maltose. β- amilases foram isoladas a partir de várias plantas e microrganismos (Fogarty et al., PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, pp. 112-115, 1979). Essas β-amilases são caracterizadas por ter temperaturas ótimas na faixa de .40 0C até 65 °C, e um pH ótimo na faixa de cerca de 4,5 até cerca de 7,0. β-amilases contempladas incluem, porém não estão limitadas, às β-amilases da cevada Spezyme© BBA 1500, Spezyme© DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Genencor International, Inc.); e Novozyraa WBA (Novozymes A/S).
Outra enzima contemplada para uso na composição é uma glicoamilase (EC 3.2.1.3). Glicoamilases são derivadas de um microrganismo ou uma planta. Por exemplo, glicoamilases podem ser de origem fúngica ou bacteriana. Glicoamilases bacterianas exemplares são glicoamilases de Aspergillus, particularmente glicoamilase de A. Niger Gl ou G2 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3(5): 1097-1102), ou suas variantes, tal como revelado em WO 92/00381 e WO 00/04136; Glicoamilase de A. awamori (WO 84/02921); Glicoamilase de A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55(4): 941-949) ou variantes ou fragmentos seus.
Outras variantes e glicoamilase de Aspergillus contempladas incluem variantes para intensificar a estabilidade térmica: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9: 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301: 275-281); ligações dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistryl 35: 8698-8704); e introdução de resíduos Pro nas posições A435 e S436 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204). Outras glicoamilases contempladas incluem glicoamilases de Talaromyces, particularmente derivadas de T. emersonii (WO 99/28448), T. Ieycettanus (Patente Americana No. RE 32.153), T. duponti ou T. thermophilus (Patente Americana Mo. 4.587.215). Glicoamilases bacterianas contempladas incluem glicoamilases do gênero Clostridium,
particularmente C. thermoamylolyticum (EP 135138) e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). Glicoamilases adequadas incluem as glicoamilases derivadas de Aspergillus oryzae, tal como glicoamilase com 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, .75%, 80%, 85% ou mesmo 90% de homologia à seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 em WO 00/04136. São também adequadas as glicoamilases comerciais, tais como AMG .200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER e AMGtmE (Novozymes) ; OPTIDEX® .300 (Genencor International, Inc.); AMIGASEtk e AMIGASE™ PLUS (da DSM); G-ZYME© G900 (Enzyme Bio-Systems); e G-ZYME© G990 ZR (glicoamilase de A. niger e baixo conteúdo de protease) . Glicoamilaes podem ser adicionadas numa quantidade de 0,02-2,0 AGU/g DS ou 0,1-1,0 AGU/g DS, por exemplo, 0,2 AGU/g DS.
Variantes enzimáticas adicionais podem ser incluídas na composição. Duas ou mais variantes de α-amilase podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outras enzimas discutidas aqui, Por exemplo, uma terceira enzima pode ser outra α-amilase, por exemplo, uma α-amilase de levedura, ou outra variante de α-amilase. Estas podem ser a-amilases de Bacillus ou α-amilases não-Bacillus.
Outra enzima que pode ser opcionalmente adicionada é uma enzima desramificadora, tal como uma isoamilase (EC .3.2.1.68) ou pululanases (EC 3.2.1.41). Isoamilase hidrolisa as ligações das ramificações a-l,6-D- glicosídicas na amilopectina e dextrinas β-limite e pode ser distinguida das pululanases pela incapacidade da isoamilase de atacar o pululano e pela ação limitada da isoamilase em dextrinas α-limite. Enzimas desramificadoras podem ser adicionadas em quantidades eficazes bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica.
A composição exata dos produtos dos processos depende da combinação das enzimas aplicadas, assim como do tipo de amido granular processado. 0 hidrolisato solúvel pode ser maltose com uma pureza de pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95,0%, pelo menos cerca de 95,5%, pelo menos cerca de 96,0%, pelo menos cerca de 96,5%, pelo menos cerca de 97,0%, pelo menos cerca de .97,5%, pelo menos cerca de 98,0%, pelo menos cerca de .98,5%, pelo menos cerca de 99,0% ou pelo menos cerca de .99,5%. Alternativamente, o hidrolisato de amido solúvel é glicose, ou o hidrolisato de amido tem um DE (porcentual de glicose de sólidos secos solubilizados totais) de pelo menos 94,5%, pelo menos 95,0%, pelo menos 95,5%, pelo menos .96,0%, pelo menos 96,5%, pelo menos 97,0%, pelo menos .97,5%, pelo menos 98,0%, pelo menos 98,5%, pelo menos 99,0% ou pelo menos 99,5%, Numa modalidade, um processo para a fabricação de sorvetes, bolos, bombons, frutas em conserva usa um xarope peculiar contendo uma mistura de glicose, maltose, DP3 e DPn.
Dois processos de moagem são adequados: moagem úmida e moagem seca. Na moagem seca, todo o núcleo é moido e usado. A moagem úmida proporciona uma boa separação do gérmen e do farelo (grânulos de amido e proteína) e é geralmente usada quando o hidrolisato de amido é usado na produção de xaropes. Tanto a moagem seca quanto a úmida são bem conhecidas na técnica do processamento de amido e também são contempladas para uso com as composições e métodos revelados. 0 processo pode ser efetuado num sistema de ultrafiltração onde o retido é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido bruto e água, onde o permeado é o hidrolisato de amido solúvel. Outro método é o processo efetuado num reator de membrana continuo com membranas de ultrafiltração, onde o retido é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido bruto e água, e onde o permeado é o hidrolisado de amido solúvel. É também contemplado o processo efetuado num reator de membrana continuo com membranas de microfiltração, onde o retido é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido bruto e água, e onde o permeado é o hidrolisado de amido solúvel.
Num aspecto, o hidrolisato de amido solúvel do processo é submetido à conversão em xarope baseado em amido com alto teor de frutose (HFSS) , tal como xarope de milho com alto teor de frutose (HFCS) . Essa conversão pode ser conseguida usando uma glicose isomerase, particularmente uma glicose isomease imobilizada num suporte sólido. Isomerases contempladas incluíram os produtos comerciais Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI e G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme© G993, G-zyme® G993 liquida e GenSweet® IGI. Em outro aspecto, o hidrolisato de amido solúvel do produzido fornece a produção de combustível ou etanol potável. No processo do terceiro aspecto a fermentação pode ser executada simultaneamente ou separadamente/em seqüência à hidrólise da pasta de amido granular. Quando a fermentação é efetuada simultaneamente com a hidrólise, a temperatura pode ficar entre 30 0C e 35 °C, particularmente entre 31 0C e 34 °C. 0 processo pode ser efetuado num sistema de ultrafiltração onde o retido é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido bruto, leveduras, nutrientes de leveduras e água, e onde o permeado é um líquido contendo etanol. É também contemplado o processo efetuado num reator de membrana contínua com membranas de ultrafiltração e onde o retido é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido bruto, leveduras, nutrientes de leveduras e água, e onde o permeado é um líquido contendo etanol.
0 hidrolisado de amido solúvel do processo também pode ser usado para a produção de um produto de fermentação compreendendo a fermentação do amido tratado num produto de fermentação, tal como ácido cítrico, glutamato monossódico, ácido glucônico, gliconato de sódio, gliconato de cálcio, gliconato de potássio, glucono delta-lactona ou eritorbato de sódio.
Δ atividade amilolítica da variante da α-amilase pode ser determinada usando amido de batata como substrato. Esse método é baseado na quebra do amido de batata modificado pela enzima, e a reação é efetuada pela mistura das amostras da solução de amido/enzima com uma solução de iodo. Inicialmente, uma cor azul enegrecido é formada, porém durante a quebra do amido a cor azul se torna mais fraca e gradualmente se transforma numa cor marrom avermelhada, a qual é comparada com um padrão vidro colorido.
Produção de etanol O polipeptideo variante PS4 pode ser em geral usado para converter amido em açúcares que podem ser a seguir processados em etanol ou outros produtos de valor adicionado, tais como adoçante de milho com alto teor de frutose. Deste modo, nós revelamos o uso de polipeptideos variantes PS4 na produção de etanol e, especificamente, bioetanol, o qual neste documento deve ser considerado como qualquer etanol produzido por fermentação de biomassa.
0 etanol produzido dessa forma pode ser usado como combustível ou bebida ou pode ser usado num processo de fermentação para produzir compostos orgânicos, tais como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido glutâmico. Estes são descritos em maiores detalhes abaixo.
Etanol (ou álcool etílico) é mais bem conhecido como sendo a base das bebidas alcoolicas como destilados, cerveja e vinho. Além disso, etanol tem muitos usos na produção de substâncias químicas industriais, compostos farmacêuticos e como um combustível de transporte.
Etanol pode ser produzido a partir de quase toda a matéria-prima contendo açúcar ou carboidratos. Como tal, etanol pode ser eito a partir de uma ampla variedade de material biológico. Os 3 tipos principais de matérias- primas de biomassa usados para produzir etanol incluem safras de açúcar, tal como cana-de-açúcar; safras de amido, incluindo trigo e milho, e materiais celulósicos, tais como resíduos de safras (palha, etc.) e rejeitos de área florestal. A produção de etanol a partir de fontes prontamente disponíveis de celulose proporciona uma fonte de combustível estável e renovável.
A tecnologia de processamento mais freqüentemente usada é a moagem de grãos secos. Nesse processo, o grão é primeiramente moído até uma consistência de farinha de grão. A farinha é, a seguir, misturada com água e amilase e passada através de fogões onde o amido no grão é liqüefeito. Sob a adição de glicoamilase, o amido liqüefeito é convertido em açúcares fermentáveis. Levedura é, a seguir, adicionada à mistura para fermentar os açúcares até etanol. Depois da fermentação, a mistura passa através de um processo de destilação e desidratação onde o álcool é removido a partir dos sólidos e da água. Na prática, cerca de dois terços de cada tonelada de grãos é convertida em etanol combustível. Os subprodutos remanescentes - resíduos finos e grãos de bebidas alcoolicas úmidos - são uma ração para criações altamente proteica a qual é particularmente bem adequada para animais, tais como gado ou ovelha.
Etanol também pode ser feito a partir de fontes contendo celulose, tal como polpa de madeira. Matérias- primas baseadas em celulose são compreendidas de rejeitos de agricultura, capim e madeiras e outras biomassas de baixo valor, tal como rejeito municipal (por exemplo, papel reciclado, aparas de jardins, etc.). Etanol pode ser produzido a partir da fermentação de qualquer uma dessas matérias-primas celulósicas. Entretanto, a celulose deve ser primeiramente convertida em açúcares antes que possa ocorrer a conversão em etanol, por tratamento com uma enzima adequada, tal como celulase.
Uma vez que o etanol saia da usina de tratamento, ele pode ser teoricamente usado como um combustível automotivo por si só ou ele pode ser misturado com gasolina numa proporção de 8 5 para 15 para formar o que é chamado de "combustível etanol puro". Entretanto, mais comumente, etanol é misturado com gasolina em concentrações de 7 a 10% em volume. 0 etanol pode ser usado como um intensificador de octano. Etanol como uma fonte de combustível é menos nocivo sob um ponto de vista ambiental do que os produtos derivados de petróleo. Sabe-se que o uso de etanol irá melhorar a qualidade do ar e possivelmente reduzir os níveis cie ozônio e poluição locais. Além disso, a utilização de etanol no lugar da gasolina pode ser de importância estratégica no amortecimento do impacto de mudanças repentinas na energia não-renovável e fornecimento de petroquímicos.
Aplicações de fermentação
Etanol (ou álcool etílico) é mais bem conhecido como sendo a base das bebidas alcoolicas como destilados, cerveja e vinho. Deste modo, os polipeptídeos variantes PS4 descritos aqui podem ser usados para fermentação, particularmente, fermentações de cervejaria. Todas as cervejas são fermentadas usando um processo baseado numa fó rmuIa s imp1e s.
0 processo de fermentação envolve o uso de grãos maltados, os quais dependendo da região, podem ser tradicionalmente cevada, trigo ou algumas vezes centeio. Malte é feito deixando os grãos germinarem, depois do que eles são, a seguir, secos numa estufa e, algumas vezes, torrados. O processo de germinação cria uma variedade de enzimas, notoriamente α-amilase e β-amilase, as quais serão usadas para converter o amido no grão em açúcar. Dependendo da quantidade de torrefação, o malte irá adquirir coloração escura e irá influenciar fortemente a cor e flavor da cervej a.
O malte é quebrado para separar os núcleos do grão, aumentar as suas áreas superficiais e separar as peças menores das cascas. O grão moido resultante é misturado com água aquecida num tonei chamado de "barril de mistura" para um processo conhecido como "misturação". Durante esse processo, enzimas naturais no malte quebram a maior parte do amido em açúcares, os quais desempenham uma parte vital no processo de fermentação. Δ misturação geralmente dura de .1 até 2 horas, e durante este tempo vários repousos de temperatura (períodos de espera) ativam diferentes enzimas dependendo do tipo de malte sendo usado, seu nível de modificação e dos desejos do mestre cervejeiro. A atividade dessas enzimas converte os amidos dos grãos em dextrinas e, a seguir, em açúcares fermentáveis, tais como maltose. O barril de mistura geralmente contém um "fundo falso" fendido ou outra forma de tubo, o qual age como uma peneira permitindo a separação do líquido do grão.
Um repouso da mistura de 120 0F até 130 0F (49 0C até .55 °C) ativa várias proteinases, as quais quebram proteínas que podem, de outra forma, fazer com que a cerveja se torne turva. Porém cuidado é essencial, uma vez que a espuma da cerveja também é composta primariamente de proteínas, de modo que um repouso muito agressivo para uma proteína pode resultar numa cerveja que não consegue manter a espuma. Esse repouso é usado geralmente com maltes submodifiçados (isto é, submaltados) os quais são decrescentemente populares na Alemanha e na República Checa, ou em grãos não-maltados tais como de milho e arroz, os quais são amplamente usados nas cervejas norte-americanas. Um repouso de mistura a 60 0C ou 140 0F ativa a beta-glucanase, a qual quebra os beta-glucanos gomoscs na mistura, fazendo com que os açúcares fluam mais livremente posteriormente no processo. No processo de misturação moderno, beta-glucanase baseada em fungos comercial pode ser adicionada como um suplemento. Finalmente, uma temperatura de repouso da mistura de 149 até 160 0F (65 até 71 °C) é usada para converter os amidos no malte em açúcar, o qual é a seguir usável pela levedura mais tarde no processo de fermentação. A execução do último repouso na extremidade inferior da faixa produz açúcares de baixa ordem, os quais são mais fermentáveis pelas leveduras. Isto, por sua vez, cria uma cerveja com menos corpo e mais álcool. Um repouso mais próximo da extremidade superior da faixa cria açúcares de ordens superiores, os quais são menos fermentáveis pela levedura, de modo que resulte numa cerveja mais encorpada com menos álcool.
Depois da mistura, o liquido resultante é puxado dos grãos num processo conhecido como filtragem da mistura (Iautering). Antes da filtragem da mistura, a temperatura da mistura pode ser elevada até 165 0F até 170 0F (cerca de .75 °C) (conhecido como remoção da pasta) para desativar as enzimas. Águia adicional pode ser espalhada nos grãos para extrair açúcares adicionais (um processo conhecido como pulverização) . Neste ponto o liquido é conhecido como mosto. 0 mosto é movido para um grande tanque conhecido como uma "caldeira de cobre" ou caldeirão, onde ele é fervido com lúpulo e, algumas vezes, outros ingredientes tais como ervas ou açúcares. 0 processo de ebulição serve para terminar os processos enzimáticos, precipitar proteínas, isomerizar resinas do lúpulo, concentrar e esterilizar o mosto. 0 mosto confere flavor, aroma e amargor à cerveja. No final da fervura, o mosto com lúpulo decanta para clarificá-lo num recipiente chamado de "redemoinho de água" e o mosto clarificado é, a seguir, esfriado.
O mosto é, a seguir, removido para um "frasco de fermentação" onde levedura é adicionada ou "lançada" com isso. A levedura converte os açúcares do malte em álcool, dióxido de carbono e outros componentes através de um processo chamado de glicólise. Depois de uma a três semanas, a cerveja fresca (ou "verde") é escoada para os tanques de condicionamento. Depois de condicionar por de uma semana até vários meses, a cerveja é comumente filtrada para remover leveduras, e particulados. A "cerveja clara" está, então, pronta para ser servida ou embalada.
Um ou mais dos polipeptídeos variantes PS4 aqui descritos podem, deste modo, ser adicionados em qualquer estágio do processo de fermentação para suplementar ou a atividade amilase gerada naturalmente.
Aplicações de ração Numa modalidade, o polipeptídeo variante PS4 é capaz de degradar amido resistente.
Conforme aqui utilizado, o termo "degradar" se refere à hidrólise parcial ou completa ou degradação de amido resistente á glicose e/ou oligossacarideos - tais como maltose e/ou dextrinas.
O polipeptídeo variante PS4 pode degradar amido resistente residual que não tenha sido completamente degradado por uma amilase de origem animal. A título de exemplo, o polipeptídeo variante PS4 pode ser usado para auxiliar uma amilase animal (por exemplo, amilase pancreática) na melhoria da degradação de amido resistente. α-amilase pancreática é excretada no sistema digestivo pelos animais. α-amilase pancreática degrada amido na ração. Entretanto, uma parte do amido, o amido resistente, não é degradada completamente pela α-amilase pancreática e não é, deste modo, absorvido no intestino delgado (ver definição de amido resistente). O polipeptídeo variante PS4, em algumas modalidades, é capaz de ajudar na a- amilase pancreática na degradação do amido no sistema digestivo e, deste modo, aumentar a utilização de amido pelo animal.
A capacidade de uma enzima de degradar amido resistente pode ser analisada, por exemplo, por um método desenvolvido e revelado por Megazyme International Ireland Ltd. Para a medição do conteúdo de amido resistente, amido solubilizado e amido total de uma amostra (Procedimento de Ensaio de Amido Resistente, Método AOAC 2002.02, Método AACC 32-4 0).
Concordantemente, os polipeptídeos variantes PS4 podem ser ingeridos por um animal para propósitos benéficos, e pode ser deste modo incorporado nas rações animais.
Nós, deste modo, revelados o uso de um polipeptideo variante PS4 como um componente para uso numa ração compreendendo amido, ou para uso numa composição de melhoria de ração, na qual o polipeptideo variante PS 4 é capaz de degradar amido resistente. Nós também revelamos uma ração compreendendo um amido e um polipeptideo variante PS4. Nós ainda revelamos um método de degradação de amido resistente numa ração compreendendo o contato do referido amido resistente com um polipeptideo variante PS4.
Nós ainda descrevemos o uso de um polipeptideo variante PS4 no preparo de uma ração compreendendo um amido, para degradar amido resistente. Além disso, nós revelamos o uso de um polipeptideo variante PS4 no preparo de uma ração para melhorar o valor calorifico da referida ração. Nós revelamos o uso de uma enzima na preparação de uma ração para melhorar o desempenho animal. Numa modalidade adicional, nós descrevemos um processo para preparar uma ração compreendendo a mistura de um amido e de uma enzima polipeptideo variante PS4. Α titulo de exemplo, o uso de um component compreendendo polipeptídeos variantes PS4 e o qual seja capaz de degradar amido resistente é vantajoso porque existe um aumento acentuado na degradação de amido e/ou de produtos de degradação de amido num animal. Além disso, tal uso é vantajoso porque existe um aumento acentuado na digestibilidade de amido e/ou de produtos de degradação de amido por um animal. Além disso, tal uso é vantajoso porque ele proporciona uma forma de aumentar a eficiência de originar energia de uma ração por um animal. Além disso, tal uso é vantajoso porque ele proporciona uma forma de aumentar a biodisponibilidade de amido resistente.
Rações animais
Rações animais para as quais os polipeptídeos variantes PS4 são adequados para uso podem ser formuladas para atender às necessidades específicas de grupos de animais particulares e para proporcionar os carboidratos, gorduras, proteínas e outros nutrientes necessários numa forma que possa ser metabolizada pelo animal.
Preferivelmente, a ração animal é uma ração para suínos ou aves domésticas.
Conforme aqui utilizado, o termo "suíno" se refere aos onívoros não-ruminantes tais como porcos (pigs) , porcos (hogs) ou varrões. Tipicamente, a ração suína inclui cerca de 50 por cento de carboidratos, cerca de 20 por cento de proteína e 5% de gordura. Um exemplo de uma ração suína altamente energética é baseado em milho, o qual é geralmente combinado com suplementos de ração, por exemplo, proteínas, minerais, vitaminas e aminoácidos, tais como lisina e triptofano. Exemplos de rações suínas incluem produtos de proteína animal, produtos marinhos, produtos de leite, produtos de grãos e produtos de proteína vegetal, todos os quais podendo ainda compreender flavorizantes naturais, flavorizantes artificiais, micro e macrominerais, gorduras animais, gorduras vegetais, vitaminas, conservantes ou medicamentos, tal como antibióticos.
É para ser entendido que onde é feita referência na presente especificação, incluindo nas reivindicações associadas, para "ração suína" tal referência significa incluir rações de "transição" ou "de partida" (usado para significar porcos jovens) e rações "terminais" ou "de crescimento" (usadas após o estágio de transição para crescimento do suíno até uma idade e/ou tamanho adequado para o mercado).
Conforme aqui utilizado, o termo "aves" se refere a aves comestíveis, tais como galinhas (chickens), frangos, galinhas (hens), gaios, capões, perus, patos, gaios de briga, frangas ou pintinhos. Rações para aves podem ser referidas como rações "completas", porque elas contêm todas as proteínas, energia, vitaminas, minerais e outros nutrientes necessários para o crescimento correto, produção de ovos e saúde dos pássaros. Entretanto, rações de aves podem ainda compreender vitaminas, minerais ou medicações tais como coccidiostáticos (por exemplo, Monensin sódica, Lasalccid, Amprolium, Saiinomicina e Suifaquinoxalina) e/ou antibióticos (por exemplo, penicilina, bacitracina, clortetraciclina e oxitetraciclina).
Galinhas jovens ou frangos, perus e patos criados para a produção de carne são alimentados diferentemente de frangas resguardadas para a produção de ovos. Frangos, perus e patos têm corpos maiores e ganham peso mais rapidamente do que os tipos de galinhas para a produção de ovos. Consequentemente, estes pássaros são alimentados com dietas com maiores níveis de proteína e energia.
É para ser entendido que onde é feita referência na presente especificação, incluindo nas reivindicações em anexo, a "ração de aves" tal referência é feita para incluir rações "iniciais" (pós incubação), "terminais", de "crescimento" ou de "desenvolvimento" (de 6-8 semanas de idade até ser alcançado o tamanho de abate) e rações "de leito" (alimentação durante a produção de ovos).
Rações animais podem ser formuladas pra atender ás necessidades nutricionais do animal com relação, por exemplo, à produção de carne, produção de leite, produção de ovos, reprodução e resposta ao estresse. Além disso, as rações animais são formuladas para melhorar a qualidade de adubo. Num aspecto preferido, a ração animal contém uma matéria-prima tal como um legume, por exemplo, ervilha ou soja ou um cereal, por exemplo trigo, milho (maiza) , centeio ou cevada. Adequadamente, a matéria-prima pode ser batata.
Rações
Os polipeptideos variantes PS4 podem ser usados em rações para consumo animal pela aplicação indireta ou direta dos polipeptideos variantes PS4 na ração, quer sozinhos ou em combinação com outros ingredientes, tais como ingredientes alimentícios.
Ingredientes alimentícios típicos podem incluir qualquer um ou mais de um aditivo, tal como uma gordura animal ou vegetal, um tempero natural ou sintético, antioxidante, modificador de viscosidade, óleo essencial e/ou flavor, tintura e/ou corante, vitamina, mineral, aminoácido natural e/ou não-natural, nutriente, enzima adicional (incluído enzimas geneticamente manipuladas), um agente de ligação tal como goma guar ou goma xantana, tampão, emulsificante, lubrificante, adjuvante, agente suspensor, conservante, agente de revestimento ou agente solubilizante e semelhante.
Exemplos dos métodos de aplicação incluem, porém não estão limitados, ao revestimento da ração num material compreendendo o polipeptídeo variante PS4, a aplicação direta pela mistura do polipeptídeo variante PS4 com a ração, a pulverização cio polipeptídeo variante PS4 na superfície da ração ou mergulho da ração numa preparação do polipeptídeo variante PS4.
0 polipeptídeo variante PS4 é preferivelmente aplicado pela mistura dele com uma ração ou pela pulverização em partículas de ração para consumo animal. Alternativamente, o polipeptídeo variante PS4 pode ser incluído na emulsão de uma ração, ou no interior de produtos sólidos por injeção ou por rolagem.
0 polipeptídeo variante PS4 pode ser aplicado para entremear, revestir e/ou impregnar uma ração. Misturas com outros ingredientes também podem ser usadas e podem ser aplicadas separadamente, simultaneamente ou seqüencialmente. Agentes quelantes, agentes de ligação, emulsificantes e outros aditivos, tais como micro e macrominerais, aminoácidos, vitaminas, gorduras animais, gorduras vegetais, conservantes, flavorizantes, corantes podem ser semelhantemente aplicados na ração simultaneamente (ou em mistura ou separadamente) ou aplicados seqüencialmente.
Quantidade de polipeptídeo variante PS4
A quantidade ótima de polipeptídeo variante PS4 a ser usada irá depender da ração a ser tratada e/ou do método de contato da ração com o polipeptídeo variante PS4 e/ou com o uso tencionado para o mesmo. A quantidade de polipeptídeo variante PS4 deve estar numa quantidade suficiente para ser eficaz para degradar substancialmente amido resistente, após a ingestão e durante a digestão da ração.
Vantajosamente, o polipeptideo variante PS4 deve permanecer eficaz após a ingestão de uma ração para consumo animal e durante a digestão da ração até uma digestão mais completa da ração ser obtida, isto é, um valor calorifico aumentado da ração ser liberado.
Combinações de amilase
Nós revelamos particularmente combinações de polipeptideos variantes PS4 com amilases, particularmente, amilases maltogênicas. Alfa-amilase maltogênica (glucano- 1, 4-a-maltoidrolase, E.C. .3.2.1.133) é capaz de hidrolisar amilose e amilopectina em maltose na configuração alfa.
Uma alfa-amilase maltogênica de Bacillus (EP 120 693) é comercialmente disponível sob a marca comercial Novamyl (Novo Nordisk A/S, Dinamarca) e é amplamente utilizada na indústria de panificação como um agente antienvelhecimento devido à sua capacidade de reduzir a retrogradação do amido. Novamyl é descrito em detalhes no Pedido de Patente Internacional WO 91/04669. A alfa-amilase maltogênica Novamyl compartilha várias características com as ciclodextrina glicotransferases (CGTases), incluindo a homologia de seqüência (Henrissat B, Bairoch A; Biochem. J., 316, 695-696 (1996)) e a formação de produtos de transglicosilação (Christophersen, C, et al., 1997, Starch, vol. 50, No. 1, 39-45). Em modalidades altamente preferidas, nós revelamos combinações compreendendo polipeptídeos variante PS4 juntamente com Movamyl ou suas variantes. Tais combinações são úteis para a produção de alimentos, tal como assadura. Novamyl, particularmente, compreende Movamyl 1500 MG.
Outros documentos descrevendo Novamyl e seus usos incluem Christophersen, C, Pedersen, S. e Christensen, T. (1993) Method for production of maltose and a limit dextrin, the limit dextrin, and use of the limit dextrin. Dinamarca, e WO 95/10627. É ainda descrito na Patente Americana No. 4.598.048 e na Patente Americana Mo. 4.604.355. Cada um destes documentos é por meio deste incorporado por referencia, e qualquer um dos polipeptídeos Novamyl ali descritos pode ser usado em combinações com qualquer um dos polipeptídeos variantes PS4 aqui descritos.
Variantes, homólogos e mutantes de Novamyl podem ser usados para as combinações, com a condição de que eles retenham atividade da alfa-amilase. Por exemplo, qualquer uma das variantes Novamyl reveladas na Patente Americana Número 6.162.628, a descoberta total da qual sendo por meio deste incorporada por referência, pode ser usada juntamente com os polipeptídeos variantes PS4 aqui descritos. Particularmente, qualquer um dos polipeptídeos descritos naquele documento, especificamente variantes da SEQ ID NO: 1 da US 6.162.628 em qualquer uma ou mais posições correspondendo a Q13, 116, D17, N26, N28, P29, A30, S32, Y 3 3, G34, L35, K 40, M45, P73,V74,D76 N77, D79, N 8 6, R95, N 9 9, I100, H103, Ql19, N120, N131, S141, T142, Al48 , N152 , Al63, Hl69, M171, G172, I174, N176, N187 , Fl88, Al92, Q201, M203, H220, N234, G236, Q247, K249, D261, N266, L268, R272, N275, N 276, V279, N280, V281, D285, N287, F297, Q299, N305, K316, N320 , L321, N327 , A341, N342, A348, Q365, N371, N375, M378, G397, A381, F389, M401, A403, K425, N436, S442 , N454 , N468 , N474, S479, A483, A486, V487, S493, T494 , S495, A496, S497, A498, Q500, N507, I510, N513, K520, Q526, A555, A564, S573, M575 , Q581, S583, F586, K589, N595, G618, N621, Q624, Α629, F636, Κ645, Ν664 e/ou T681 podem ser usados.
Seqüências de aminoácidos
A invenção faz uso de um ácido nucléico variante PS4 e as seqüências de aminoácidos de tais ácidos nucléicos variantes PS4 são englobadas pelos métodos e composições ali descritos.
Conforme aqui utilizado, o termo "seqüência de aminoácidos" é sinônimo com o termo "polipeptídeo" e/ou o termo "proteína". Em alguns exemplos, o termo "seqüência de aminoácido" é sinônimo com o termo "peptídeo". Em alguns exemplos, o termo "seqüência de aminoácidos" é sinônimo com o termo "enzima".
A seqüência de aminoácidos podem ser preparada/isolada a partir de uma fonte adequada, ou ela pode ser feita sinteticamente ou ela pode ser preparada pelo uso de técnicas de DNA recombinante. A enzima variante PS 4 descrita aqui pode ser usada juntamente com outras enzimas. Deste modo, nós adicionalmente revelamos uma combinação de enzimas em que a combinação compreende uma enzima de polipeptideo variante PS4 descrita aqui e outra enzima, a qual por si só pode ser outra enzima de polipeptideo variante PS4.
Seqüência de nucleotideo variante PS4
Conforme verificado acima, nós revelamos seqüências de nucleotideos codificando as enzimas variantes PS4 com as propriedades especificas reveladas.
0 termo "seqüência de nucleotideo" ou "seqüência de ácido nucléico", conforme aqui utilizado, se refere a uma seqüência de oligonucleotideo ou seqüência de polinucleotideo, e variante, homólogos, fragmentos e derivados seus (tais como suas porções) . A seqüência de nucleotideo pode ser de origem genômica ou sintética ou recombinante, a qual pode ser de fita dupla ou de fita única, seja representando a fita de sentido ou anti- sentido.
O termo "seqüência de nucleotideo", conforme aqui utilizado neste documento, inclui DNA genômico, DNAc, DNA sintético e RNA. Preferivelmente ele significa DNA, mais preferivelmente seqüência de DNAc codificando um polipeptideo variante PS4.
Tipicamente, a seqüência de nucleotideo variante PS4 é preparada usando técnicas de DNA recombinante (isto é, DNA recomomante) . Entretanto, numa modalidade alternativa, a seqüência de nucleotideo poderia ser sintetizada, como um todo ou em partes, usando métodos químicos bem conhecidos na técnica (ver Caruthers MH et al.r (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 e Horn T et al.r (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
Preparação de seqüências de ácidos nucléicos
Uma seqüência de nucleotideo codificando ou uma enzima a qual tenha as propriedades específicas conforme aqui definidas (por exemplo, um polipeptídeo variante PS4) ou uma enzima a qual seja adequada para modificação, tal como uma enzima de origem, pode ser identificada e/ou isolada e/ou purificada a partir de qualquer célula ou organismo produtor da referida enzima. Vários métodos são bem conhecidos na técnica para a identificação e/ou isolamento e/ou purificação das seqüências de nucleotídeos. A título de exemplo, técnicas de amplificação por PCR para preparar mais de uma seqüência podem ser usadas uma vez que uma seqüência adequada tenha sido identificada e/ou isolada e/ou purificada.
A título de outro exemplo, uma biblioteca de DNA e/ou de DNAc genômica pode ser construída usando DNA cromossomal ou RNA mensageiro a partir do organismo produtor da enzima. Se a seqüência de aminoácido da enzima ou uma parte da seqüência de aminoácido da enzima for conhecida, sondas de oligonucleotídeo marcadas podem ser sintetizadas e usadas para identificar clones cociificantes de enzima a partir da biblioteca genômica preparada a partir do organismo. Alternativamente, uma sonda de oligonucleotídeo marcada contendo as seqüências homólogas a outro gene de enzima conhecida poderia ser usada para identificar clones codificantes de enzima. No último caso, a hibridização e as condições de lavagem de menor estringência são usadas.
Alternativamente, os clones codificantes e enzima poderiam ser identificados pela inserção de fragmentos de DNA genômico num vetor de expressão, tal como um plasmideo, bactéria negativa de enzima transformadora com a biblioteca de DNA genômico resultante e, a seguir, pelo plaqueamento da bactéria transformada em placas de Agar contendo um substrato para a enzima (isto é, maltose). Permitindo desta forma que os clones expressando as enzimas sejam identificados.
Ainda numa outra alternativa, a seqüência de nucleotideo codificando a enzima pode ser preparada sinteticamente por métodos padrões estabelecidos, por exemplo, o método de fosforoamidita descrito por Beucage S. L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, ρ 1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, ρ .801-805. No método da fosforoamidita, oligonucleotideos são sintetizados, por exemplo, num sintetizador de DNA automático, purificados, anelados, ligados e clonados em vetores apropriados. A seqüência de nucleotídeos pode ser de origem genômica e sintética misturada, de origem sintética e de DNAc misturada ou de origem genômica e de DNAc misturada, preparada pela ligação de fragmentos de origem sintética, genômica ou de DMAc (conforme apropriado) de acordo com técnicas padrões. Cada fragmento ligado corresponde às várias partes da seqüência de nucleotídeos total. A seqüência de DNA pode também ser preparada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) usando iniciadores específicos, por exemplo, conforme descrito na US 4.683.202 ou em Saiki RK Et al., (Science (1988) 239, PP 487-491). Variantes/homólogos/derivados
Nós ainda descrevemos o uso de variantes, homólogos e derivados de qualquer seqüência de aminoácidos de uma enzima ou de qualquer seqüência de nucleotídeos codificando tal enzima, tal como um polipeptídeo variante PS 4 ou um ácido nucléico variante PS4 . A não ser que o contexto diga o contrário, o termo "ácido nucléico variante PS4" deve ser tomado para incluir cada uma das entidades de ácido nucléico descritas abaixo, e o termo "polipeptídeo variante PS4" deve, da mesma forma, ser tomado para incluir cada uma das entidades de polipeptídeos ou aminoácidos descritas abaixo.
Aqui, o termo "homólogo" significa uma entidade com uma certa homologia com as referidas seqüências de aminoácidos e as referidas seqüências de nucleotídeo. Aqui, O termo "homologia" pode ser igualado ao termo "identidade".
Mo presente contexto, uma seqüência homóloga é tomada para incluir uma seqüência de aminoácidos a qual possa ser pelo menos 75, 80, 85 ou 90% idêntica, preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica com a referida seqüência. Tipicamente, os homólogos irão compreender os mesmos sítios ativos, etc. que a referida seqüência de aminoácidos. Embora também possa ser considerada homologia em termos de similaridade (isto é, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas similares), no contexto deste documento é preferível expressar homologia em termos de identidade de seqüência.
No presente contexto, uma seqüência homóloga é tomada para incluir uma seqüência de nucleotídeos a qual possa ser pelo menos 75, 80, 85 ou 90% idêntica, preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma enzima de polipeptídeo variante PS4 (tal como um ácido nucléico variante PS4) . Tipicamente, os homólogos irão compreender as mesmas seqüências que codificam os sítios ativos, etc. que a referida seqüência, Embora homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (isto é, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto deste documento é preferível expressar homologia em termos de identidade de seqüência. Comparações de homologia podem ser efetuadas a olho nu, ou mais comumente, com a ajuda de programas de comparação de seqüência prontamente disponíveis. Esses programas computadorizados comercialmente disponíveis podem calcular a % de homologia entre duas ou mais seqüências.
A % de homologia pode ser calculada em seqüências contíguas, isto é, uma seqüência está alinhada com a outra seqüência e cada aminoácido numa seqüência é diretamente comparado com o aminoácido correspondente na outra seqüência, um resíduo de cada vez. Este é chamado de um alinhamento "não-intervalado". Tipicamente, tais alinhamentos não-intervaladcs são efetuados somente num número relativamente curto de resíduos.
Embora este seja um método muito simples e consistente, ele falha ao levar em consideração, por exemplo, que num diferente par idêntico de seqüências, uma inserção ou deleção irá fazer com que os seguintes resíduos de aminoácidos sejam colocados fora de alinhamento, resultando potencialmente numa grande redução na % de homologia quando um alinhamento global é efetuado. Consequentemente, a maior parte dos métodos de comparação de seqüências é projetada para produzir alinhamentos ótimos que levam em consideração inserções e deleções possíveis sem penalizar indevidamente a pontuação de homologia global. Isso é alcançado pela inserção de "intervalos" no alinhamento de seqüências para tentar maximizar a homologia local.
Entretanto, esses métodos mais complexos atribuem "penalidades de intervalo" em cada intervalo que ocorre no alinhamento de modo que, para a mesma quantidade de aminoácidos idênticos, um alinhamento de seqüências com a menor quantidade de intervalos possível - refletindo uma maior relação entre as duas seqüências comparadas - irá alcançar uma maior pontuação do que um com muitos intervalos. "Custos de intervalos semelhantes" são tipicamente usados que carregam um custo relativamente alto para a existência de um intervalo e uma menor penalidade para cada resíduo subsequente no intervalo. Este é o sistema de pontuação de intervalos mais comumente usado. Altas penalidades de intervalo irão claramente produzir alinhamentos ótimos com menos intervalos. A maioria dos programas de alinhamento permitem que as penalidades de intervalo sejam modificadas. Entretanto, é preferível usar os valores preestabelecidos ao usar tal programa de computador para comparações de seqüências. Por exemplo, ao usar o pacote GCG Wisconsin Bestfit, a penalidade de intervalo preestabelecida para seqüências de aminoácidos é de -12 para um intervalo e de -4 para cada extensão.
0 cálculo da % de homologia máxima, consequentemente, primeiramente requer a produção de um alinhamento ótimo, levando-se em consideração as penalidades de intervalo. Um programa de computador adequado para efetuar tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al. 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Exemplos de outros programas de computador que podem efetuar comparações de seqüências incluem, porém não estão limitados, ao pacote BLAST (ver Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Blologyr 4a Ed - Capitulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J Mol Biol. 403-410) e o pacote de programas GENEWORKS de ferramentas de comparação. Tanto BLAST quanto FASTA são disponíveis para buscas offline e online (ver Ausubel et al., i999, Short Protocols in Molecular BloIogy, páginas 7-58 até 7-60).
Entretanto, para algumas aplicações, é preferível usar o programa GCG Bestfit. Uma nova ferramenta, chamada de BLAST 2 Sequences, também é disponível para comparar seqüências de proteína e de nucleotídeos (ver FEMS Mlcrobiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Mlcroblol Lett .1999 177(1): 187-8 e tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento é tipicamente não baseado numa comparação de pares "tudo ou nada". Ao invés disso, uma matriz de pontuação de similaridade escalada é geralmente usada que atribui pontuações a cada comparação de pares baseando-se na similaridade química ou distância evolucionária. Um exemplo de tal matriz comumente usada é a matriz BLOSUM62 - a matriz preestabelecida para o grupo de programas BLAST. Programas GCG Wisconsin geralmente usam ou os valores preestabelecidos públicos ou uma tabela de comparação de símbolos customizada, caso seja fornecida (ver manual do usuário para maiores detalhes). Para algumas aplicações, é preferível usar os valores preestabelecidos públicos para o pacote GCG, ou no caso de outro programa de computador, a matriz preestabelecida, tal como BLOSUM62.
Alternativamente, homologias percentuais podem ser calculadas usando a característica de alinhamento múltiplo em DNASIStk (Hitachi Software) baseando-se num algoritmo, análogo ao CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene .73(1), 237-244).
Uma vez que o programa de computador tenha produzido um alinhamento ótimo, é possível calcular a % de homologia, preferivelmente a % de identidade de seqüência. O programa de computador tipicamente faz isso como parte da comparação de seqüência e gera um resultado numérico.
As seqüências também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos os quais produzem uma alteração silenciosa e resultam numa substância funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácidos deliberadas podem ser feitas com base na similaridade nas propriedades dos aminoácidos (tais como polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfifática dos resíduos) e é, consequentemente, útil para agrupar aminoácidos juntos em grupos funcionais. Aminoácidos podem ser agrupados juntos baseando-se nas propriedades somente de suas cadeias laterais. Entretanto, é mais útil incluir dados de mutações da mesma forma. Os grupos de aminoácidos derivados desta forma são propensos a serem conservados por razões estruturais. Esses grupos podem ser descritos na forma de um diagrama de Venn (Livingstone CD. e Barton GJ. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). Substituições conservativas podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a tabela abaixo, a qual descreve um agrupamento de aminoácidos em diagrama de Venn geralmente aceito.
<table>table see original document page 171</column></row><table>
Nós ainda revelamos seqüências compreendendo
substituição homóloga (substituição e reposição são ambos aqui utilizados para significar a permuta de um resíduo de aminoácido existente com um resíduo alternativo) que pode ocorrer, isto é, uma substituição de um tipo por outro do mesmo tipo (like-for-like), tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. A substituição não- homóloga pode também ocorrer, isto é, de uma classe de resíduos para outra ou alternativamente envolvendo a inclusão de aminoácidos não-naturais tais como ornitina (de agora em diante referida como Z), ornitina ácido diaminobutírico (de agora em diante chamada de Β), norleucina ornitina (de agora em diante chamada de O) , pirilalanina, trienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.
Seqüências de aminoácidos variantes incluem grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácidos da seqüência, incluindo grupos alquil, tais como grupos metil, etil ou propil além de espaçadores de aminoácidos tais como resíduos de glicina ou de β-alanina. Uma outra forma de variação que envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma peptóide, será bem entendida pelas pessoas versadas na técnica. Para evitar dúvidas, a "forma peptóide" é usada para se referir a resíduos de aminoácidos variantes em que o grupo substituinte de carbono α está no átomo de nitrogênio do resíduo ao invés de no carbono a. Processos para preparar peptídeos na forma peptóide são conhecidos na técnica, por exemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 e Horwell DC, Trands Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
As seqüências de nucleotideos aqui descritas, e adequadas para uso nos métodos e composições aqui descritos (tais como ácidos nucléicos variantes PS4) podem incluir neles termos de nucleotideos sintéticos ou modificados. Uma variedade de diferentes tipos de modificação para oligonucleotideos é conhecida na técnica. Estas incluem estruturas de metilfosfonato e fosforotioato e/ou a adição de cadeias de acridina ou de polilisina nas extremidades 3' e/ou 5' da molécula. Para os propósitos deste documento, é para ser entendido que as seqüências de nucleotideos aqui descritas podem ser modificadas por qualquer método disponível na técnica. Tais modificações podem ser executadas para aumentar a atividade in vivo ou o tempo de vida das seqüências de nucleotideos.
Nós ainda descrevemos o uso de seqüências de nucleotideos que são complementares às seqüências aqui apresentadas, ou qualquer derivado, fragmento ou derivado seu. Se a seqüência for complementar a um fragmento seu, então aquela seqüência pode ser usada como uma sonda para identificar seqüências codificantes similares em outros organismos, etc.
Polinucleotideos, os quais não são 100% homólogos às seqüências variantes PS4, podem ser obtidos de diferentes formas. Outras variantes das seqüências aqui descritas podem ser obtidas, por exemplo, pela sondagem de bibliotecas de DNA a partir de uma faixa de indivíduos, por exemplo, indivíduos a partir de diferentes populações. Além disso, outros homólogos podem ser obtidos e tais homólogos e fragmentos seus, em geral, serão capazes de hibridizar seletivamente com as seqüências mostradas aqui na listagem de seqüências. Tais seqüências podem ser obtidas pela sondagem das bibliotecas de DNAc feitas a partir de bibliotecas de DMA. genômicc· a partir de outras espécies, e a sondagem de tais bibliotecas com sondas compreendendo toda ou parte de uma das seqüências nas listagens de seqüências em anexo sob as condições de estringência média para alta. Considerações semelhantes se aplicam para obter espécies homólogas e variantes alélicas do polipeptídeo ou seqüências de nucleotídeos aqui descritas.
Variantes e homólogos de cepa/espécies podem também ser obtidos usando PCR degenerado, o qual irá usar iniciadores projetados para seqüências alvos nas variantes e homólogos codificando seqüências de aminoácidos conservadas. Seqüências conservadas podem ser previstas, por exemplo, pelo alinhamento das seqüências de aminoácidos a partir de várias variantes/homólogos. Alinhamentos de seqüências podem ser efetuados usando programas de computador conhecidos na técnica. Por exemplo, o programa GCG Wisconsin PileUp é amplamente usado. Os iniciadores usados na degeneração do PCR irão conter uma ou mais posições degeneradas e serão usados em condições de estringência mais baixas do que aquelas usadas para clonagem de seqüências com iniciadores de seqüências individuais contra seqüências conhecidas.
Alternativamente, tais polinucleotideos podem ser obtidos por mutagênese direcionada a sitio de seqüências caracterizadas. Estes podem ser úteis, por exemplo, para alterações de seqüências de códons silenciosas e requeridos para otimizar preferências de códons para uma célula hospedeira particular na qual as seqüências de polinucleotideos estão sendo expressas. Outras alterações de seqüências podem ser desejadas para introduzir sítios de reconhecimento de enzimas de restrição, ou para alterar a propriedade ou função dos polipeptídeos codificados pelos polinucleotideos.
Os polinucleotideos (seqüências de nucleotídeos) tais como os ácidos nucléicos variantes PS4 descritos neste documento pode ser usados para produzir um iniciador, por exemplo, um iniciador de PCR, um iniciador para uma reação de amplificação alternativa, uma sonda, por exemplo, marcada com uma sonda reveladora por meios convencionais usando marcadores radioativos ou não-radioativos, ou os polinucleotideos podem ser clonados nos vetores. Tais iniciadores, sondas e outros fragmentos serão de pelo menos 15, preferivelmente de pelo menos 20, por exemplo, de pelo menos 25, 30 ou 40 nucleotídeos de comprimento, e também são englobados pelo termo polinucleotideos.
Polinucleotideos, tais como polinucleotideos de DNA e sondas podem ser produzidos de modo recombinante, sinteticamente ou através de quaisquer formas disponíveis para as pessoas versadas na técnica. Eles também podem ser clonados por técnicas padrões. Em geral, iniciadores serão produzidos pelos meios sintéticos, envolvendo uma produção em etapas da seqüência desejada de ácido nucléico um nucleotideo por vez. Técnicas para alcançar isto usando técnicas automatizadas são prontamente disponíveis na técnica.
Polinucleotideos mais longos serão geralmente produzidos usando meios recombinantes, por exemplo, usado técnicas de clonagem de PCR (reação em cadeia da polimerase). Os iniciadores podem ser projetados para conter sítios de reconhecimento de enzimas de restrição adequados de modo que o DMA amplificado possa ser clonado num vetor de clonagem adequado. Preferivelmente, as seqüências variantes, etc. são pelo menos tão biologicamente ativas quanto as seqüências aqui apresentadas.
Conforme aqui utilizado, "biologicamente ativo" se refere a uma seqüência com uma função estrutural similar (porém não necessariamente até o mesmo grau) e/ou uma função regulatória similar (porém não necessariamente até o mesmo grau), e/ou uma função bioquímica similar (porém não necessariamente até o mesmo grau) da seqüência de ocorrência natural.
Hibridi zação
Nós ainda descrevemos seqüências que são complementares às seqüências de ácido nucléico das variantes PS4 ou seqüências que são capazes de hibridizar ou as seqüências variantes PS4 ou as seqüências que são complementares a elas. 0 termo "hibridização" conforme aqui utilizados deve incluir "o processo pelo qual uma fita de ácido nucléico se une com uma fita complementar através do pareamento de bases", assim como o processo de amplificação conforme executado em tecnologias de reação em cadeia da polimerase (PCR). Consequentemente, nós revelamos o uso de seqüências de nucleotídeos que são capazes de hibridizar com as seqüências que são complementares às seqüências aqui apresentadas, ou qualquer derivado, fragmento ou derivado seu.
0 termo "variante" também engloba seqüências que sejam complementares às seqüências que são capazes de hibridizar até as seqüências de nucleotídeos aqui apresentadas.
Preferivelmente, o termo "variante" engloba seqüências que são complementares às seqüências que são capazes de hibridizar sob condições estringentes (por exemplo, 50 0C e .0,2 χ SSC {1 χ SSC = NaCl 0,15 M, citrato de Na3 0,015 M, ρΗ 7,0} para as seqüências de nucleotídeos aqui apresentadas. Mais preferivelmente, o termo "variante" engloba seqüências que são complementares às seqüências que são capazes de hibridizar sob condições altamente estringentes (por exemplo, 65 0C e 0,1 χ SSC {1 χ SSC = NaCl 0,15 Μ, citrato de Na3 0,015 Μ, ρΗ 7,0} para as seqüências de nucleotídeos aqui apresentadas.
Nós ainda revelamos seqüências de nucleotídeos que podem ser hibridizadas nas seqüências de nucleotídeos das variantes PS4 (incluindo seqüências complementares daquelas aqui apresentadas), assim como seqüências de nucleotídeos que são complementares às seqüências que podem hibridizar nas seqüências de nucleotídeos das variantes PS4 (incluindo seqüências complementares daquelas aqui apresentadas). Nós ainda revelamos seqüências de polinucleotídeos que são capazes de hibridizar nas seqüências de nucleotídeos aqui apresentadas sob condições de estringência de intermediária para máxima.
Num aspecto preferido, nós revelamos seqüências de nucleotídeos que podem hibridizar na seqüência de nucleotídeo e um ácido nucléico variante PS4, ou ao seu complemento, sob condições estringentes (por exemplo, 50 0C e 0,2 χ SSC). Mais preferivelmente, as seqüências de nucleotídeos podem hibridizar na seqüência de nucleotídeos de uma variante PS4, ou ao seu complemento, sob condições de alta estringência (por exemplo, 65 0C e 0,1 χ SSC). Mutagênese direcionada a sitio
Uma vez que uma seqüência de nucleotideo codificando uma enzima tenha sido isolada, ou uma seqüência de nucleotideo codificante de enzima tenha sido identificada, pode ser desejável modificar a seqüência para preparar a enzima. Concordantemente, uma seqüência variante PS4 pode ser preparada a partir de uma seqüência de origem. Mutações podem ser introduzidas usando oligonucleotideos sintéticos. Esses oligonucleotideos contêm seqüências de nucleotideos flanqueando os sítios de mutação desejados.
Um método adequado é revelado em Morinaga et al., Biotechnology (1984) 2, ρ 646-649). Outro método de introdução de mutações nas seqüências de nucleotideos codificantes de enzima é descrito em Nelson e Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, ρ 147-151). Um outro método é descrito em Sarkar e Sommer (Biotechniques (1990), 8, P 404-407 - "The megaprimer method of site directed mutagenesis").
Num aspecto, a seqüência para uso nos métodos e composições aqui descritos é uma seqüência recombinante - isto é, uma seqüência que tenha sido preparada usando técnicas de DNA recombinante. Essas técnicas de DNA recombinante estão dentro das capacidades de uma pessoa normalmente versada na técnica. Tais técnicas são explicadas na literatura, por exemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Livros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Mum aspecto, a seqüência para uso nos métodos e composições aqui descritos é uma seqüência sintética - isto é, uma seqüência que tenha sido preparada por síntese química ou enzimática in vítro. Ela inclui, porém não está limitada, às seqüências feitas com o uso de códon ótimo para organismos hospedeiros - tais como as leveduras metilotrópicas Pichia e Hansenula. A seqüência de nucleotideo para uso nos métodos e composições aqui descritos pode ser incorporada num vetor replicável recombinante. 0 vetor pode ser usado para replicar e expressar a seqüência de nucleotideo, na forma de enzima em e/ou de uma célula hospedeira compatível. A expressão pode ser controlada usando seqüências de controle, por exemplo, seqüências regulatórias. A enzima produzida por uma célula recombinante hospedeira pela expressão da seqüência de nucleotideo pode ser secretada ou pode estar contida intracelularmente dependendo da seqüência e/ou do vetor usado. As seqüências codificantes podem ser projetadas com seqüências de sinal, as quais direcionam a secreção das seqüências codificantes de substância através de uma membrana celular procariótica ou eucariótica particular. Expressão de ácidos nucléicos e polipeptideos PS4 Os polinucleotideos e ácidos nucléicos PS4 podem incluir DNA ou RMA de origem tanto natural quanto sintética, cujo DNA ou RNA pode conter desóxi- ou didesoxinucleotideos ou ribonucleotideos modificados ou não-modifiçados ou seus análogos. O ácido nucléico PS4 pode existir como uma fita única ou dupla de DNA ou RNA, e um heteroduplex de RNA/DNA ou um copolimero de RNA/DNA, em que o termo "copolimero" se refere a uma fita de ácido nucléico individual que compreende tanto ribonucleotideos quanto desoxirribonucleotideos. O ácido nucléico PS4 pode mesmo ter o seu códon otimizado para aumentar ainda mais a expressão.
O termo "sintético", conforme aqui utilizado, é definido como aquele o qual é produzido por síntese química ou enzimática in vítro. Ele inclui, porém não está limitado, aos ácidos nucléicos PS4 feitos com os habituais códons ótimos para organismos hospedeiros, tais como as leveduras metilotrópicas Pichia e Hansenula.
Polinucleotídeos, por exemplo, polinucleotideos PS4 variantes descritos aqui, podem ser incorporados num vetor replicável recombinante. 0 vetor pode ser usado para replicar o ácido nucléico numa célula hospedeira compatível. 0 vetor compreendendo a seqüência de polinucleotídeo pode ser transformado numa célula hospedeira adequada. Hospedeiros adequados podem incluir células bacterianas, de levedura, de insetos e fúngicas. Os termos "célula transformada" incluem células que foram transformadas pelo uso de técnicas de DNA recombinante. A transformação tipicamente ocorre pela inserção de uma ou mais seqüências de nucleotideos numa célula que deve ser transformada. A seqüência de nucleotídeo inserida pode ser uma seqüência de nucleotideo heteróloga (isto é, é uma seqüência que não é natural à célula que está para ser transformada) . Além disso, ou alternativamente, a seqüência de nucleotideo inserida pode ser uma seqüência de nucleotideo homóloga (isto é, ser uma seqüência que é natural para a célula que está para ser transformada) - de modo que a célula receba uma ou mais cópias extras de uma seqüência de nucleotideos já presente nela.
Deste modo, numa outra modalidade, nós proporcionamos um método para fazer polipeptideos e polinucleotideos variantes PS4 pela introdução de um polinucleotideo num vetor replicável, introdução do vetor numa célula hospedeira compatível e crescimento da célula hospedeira sob condições as quais realizem a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado a partir da célula hospedeira.
Constructos de expressão
0 ácido nucléico PS4 pode ser operativamente ligado aos elementos regulatórios transcricionais e traducionais ativos numa célula hospedeira de interesse. 0 ácido nucléico PS4 também pode codificar uma proteína de fusão compreendendo seqüências de sinal tais como, por exemplo, aquelas derivadas do gene da glicoamilase de Schwanniomyces oceidentalis, gene tipo fator de parelhamento α de Saccharomyces cerevisiae e a TAKA-amilase de Aspergillus oryzae. Alternativamente, o ácido nucléico PS4 pode codificar uma proteína de fusão compreendendo um domínio de ligação à membrana.
Vetor de expressão
O ácido nucléico PS4 pode ser expresso nos níveis desejados num organismo hospedeiro usando um vetor de expressão.
Um vetor de expressão compreendendo um ácido nucléico PS4 pode ser qualquer vetor o qual seja capaz de expressar o gene codificando o ácido nucléico PS4 no organismo hospedeiro selecionado, e a escolha do vetor irá depender da célula hospedeira na qual ele deve ser introduzido. Deste modo, o vetor pode ser um vetor de replicação autonômica, isto é, um vetor que existe como uma entidade epissomal, a replicação do qual sendo independente da replicação cromossomal, tal como, por exemplo, um plasmídeo, um bacteriófago ou um elemento epissomal, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. Alternativamente, o vetor pode ser um o qual, quando introduzido numa célula hospedeira, seja integrado no genoma da célula hospedeira e replicado juntamente com o cromossomo. Coraponentes do vetor de expressão
O vetor de expressão tipicamente inclui os componentes de um vetor de clonagem, tal como, por exemplo, um elemento que permite a replicação autonômica do vetor no organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores fenotipicamente detectáveis para propósitos de seleção. O vetor de expressão normalmente compreende seqüências de nucleotideo de controle codificando um promotor, um operador, um sitio de ligação a ribossomo, um sinal de iniciação de tradução e, opcionalmente, um gene repressor ou um ou mais genes ativadores. Adicionalmente, o vetor de expressão pode compreender uma seqüência codificando uma seqüência de aminoácidos capaz de alvejar o polipeptideo variante PS4 numa organela de célula hospedeira, tal como um peroxissoma ou num compartimento celular hospedeiro particular. Tal seqüência de alvejamento inclui, porém não está limitada à seqüência SKL. No presente contexto, o termo "sinal de expressão" inclui qualquer uma das seqüências de controle acima, seqüências repressoras ou ativadoras. Para expressão sob a orientação das seqüências de controle, a seqüência de ácido nucléico do polipeptideo variante PS4 é operativamente ligada às seqüências de controle da maneira própria em relação à expressão.
Preferivelmente, um polinucleotideo num vetor é operativamente ligado a uma seqüência de controle que é capaz de proporcionar a expressão da seqüência codificante pela célula hospedeira, isto é, o vetor é um vetor de expressão. 0 termo "operativãmente ligado" significa que os componentes descritos estão numa relação que os permite que funcionem nas suas formas tencionadas. Uma seqüência regulatória "operativamente ligada" numa seqüência codificante é ligada de tal forma que a expressão da seqüência codificante é alcançada sob uma condição compatível com as seqüências de controle.
As seqüências de controle podem ser modificadas, por exemplo, pela adição de mais elementos regulatórios transcricionais para tornar o nível de transcrição orientado pelas seqüências de controle mais responsivo aos moduladores transcricionais. As seqüências de controle podem, particularmente, compreender promotores. Promotor
No vetor, a seqüência de ácido nucléico codificando o polipeptídeo PS4 variante é operativamente combinada com uma seqüência promotora adequada. 0 promotor pode ser qualquer seqüência de DNA com atividade de transcrição no organismo hospedeiro de escolha e pode ser derivado dos genes que são homólogos ou heterólogos ao organismo hospedeiro.
Promotores bacterianos
Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição da seqüência de nucleotídeo modificada, tais como ácidos nucléicos PS4, num hospedeiro bacteriano incluem o promotor do cperon Iac de E. coli, os promotores dagA do gene agarase de Streptomyces CoeliColorf os promotores do gene da α-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene da amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM) , os promotores do gene da α-amilase de Baciilus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, o promotor do gene aprE de Baeillus subtilis e um promotor derivado de um promotor derivado de Lactococcus sp. incluindo o promotor P170. Quando o gene codificando o polipeptideo variante PS4 é expresso numa espécie bacteriana, tal como E. coli, um promotor adequado pode ser selecionado, por exemplo, a partir de um promotor bacteriófago incluindo um promotor T7 e um promotor lambda f ago.
Promotores fúngicos
Para transcrição numa espécie fúngica, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados dos genes codificando a TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, α-amilase neutra de Aspergillus Niger, α-amilase estável em ácido de A. Niger, glicoamilase de A. niger, lipase de Rhizomueor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae ou acetamidase de Aspergillus nidulans.
Promotores de levedura Exemplos de promotores adequados para a expressão numa espécie de levedura incluem, porém não estão limitados, aos promotores Gai 1 e Gal 10 de Saccharomyces eerevisiae e os promotores AOXIl ou AOXI2 de Pichia pastoris.
Organismos hospedeiros
(I) Organismos hospedeiros bacterianos
Exemplos de organismos hospedeiros bacterianos adequados são espécies de bactérias gram-positivas tais como Baeillaeeae incluindo Baeillus elausii. Baeillus subtilis, Baeillus lieheniformis, Baeillus lentus, Baeillus brevis, Baeillus stearothermophilus, Baeillus alkalophilus, Baeillus amyloliquefaeiens, Baeillus eoagulans, Baeillus lautus, Baeillus megaterium e Baeillus thuringiensis, espécies de Streptomyees, tal como Streptomyees murinus, espécies bacterianas de ácido lático incluindo Laetocoeeus sp. , tais como Laetocoeeus laetis, Lactobacillus spp. incluindo Lactobaeillus reuteri, Leueonostoe spp., Pedioeoceus spp. e Streptoeoecus spp. Alternativamente, cepas de uma espécie bacteriana gram-negativa pertencendo às Enterobaeteriaeeae incluindo E. coli, ou às Pseudomonadaeeae podem ser selecionadas como o organismo hospedeiro.
(II) Organismos hospedeiros de levedura
Um organismo hospedeiro de levedura adequado pode ser selecionado das espécies de levedura biotecnologicamente relevantes tais como, porém não limitadas, às espécies de levedura tais como as espécies Pichia sp. , Hansenula sp ou Kluyveromyces, Yarrowinia ou uma espécie de Saccharomyces incluindo Saeeharomyees eerevisiae ou uma espécie pertencendo às Schizosaccharomyce tais como, por exemplo, espécies de S. Pombe.
Preferivelmente uma cepa da espécie de levedura metilotrófica Piehia pastoris é usada como o organismo hospedeiro. Preferivelmente, o organismo hospedeiro é a espécie Hansenula.
(III) Organismos hospedeiros fúngieos
Organismos hospedeiros adequados dentre os fungos filamentosos incluem espécies de Aspergillus, por exemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigens is, Aspergillus awamori ou Aspergillus nidulans. Alternativamente, cepas de espécies Fusarium, por exemplo, Fusarium oxvsporum ou de uma espécie Rhizomoeur tal como Rhizomoeur miehei podem ser usadas como o organismo hospedeiro. Outras cepas adequadas incluem espécies Thermomyees e Mueor.
Organismos hospedeiros fúngieos adequados também podem incluir Triehoderma spp (especialmente Triehoderma reesei, anteriormente Triehoderma longibraehiatum; também conhecido como Hypoerea jecorina) .
Expressão de proteína e purificação
Células hospedeiras compreendendo polinucleotideos podem ser usadas para expressar polipeptideos, tais como polipeptideos PS4 variantes, fragmentos, homólogos, variantes ou derivados seus. Células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas as quais permitam a expressão das proteínas. Expressão dos polipeptideos pode ser constitutiva, de modo que eles sejam continuamente produzidos, ou induzivel, requerendo um estímulo para iniciar a expressão. Mo caso de expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando requerido, por exemplo, pela adição de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, dexametasona ou IPTG.
Polipeptideos podem ser extraídos das células hospedeiras por uma variedade de técnicas conhecidas na arte, incluindo a Iise enzimática, química ou osmótica e rompimento físico. Polipeptideos também podem ser produzidos recombinantemente num sistema sem células in vitro, tal como um sistema reticulócito de coelho TnT™ (Promega) .
Exemplos
Exemplo 1. Clonagem de PS4
É crescida Pseudomonas sacharophila de um dia para o outro em meio LB e o DNA cromossoma! é isolado por métodos padrão (Sambrook J, 1989) . Um fragmento de 2190 pb contendo a estrutura de leitura aberta PS4 (Zhou et al., 1989} é amplificado a partir de DMA cromossomal de P. sacharophila por PCR usando os inicíadores Pl e P2 (ver Tabela 3) . O fragmento resultante é usado como molde num nested PCR com Os imciadores Ρ3 e Ρ4, amplificando a estrutura de leitura aberta de PS4 sem a sua seqüência de sinal e introduzindo um sitio NcoI na extremidade 5' do gene e um sitio BamHI na extremidade 3' . Juntamente com o sitio McoI um códon para uma metionina N-terminal é introduzido, permitindo a expressão intracelular de PS4 . O fragmento de 1605 pb é clonado em PCRBLUNT TOPO (Invitrogen) e a integridade do constructo é analisada por sequenciamento. 0 vetor tipo shuttle de E. coli Bacillus pDP66K (Penniga et al.r 1996) é modificado para permitir a expressão de PS4 sob o controle do promotor P32 e da seqüência de sinal ctgase. O plasmideo resultante, pCSmta, é transformado em B. subtilis.
Um segundo constructo de expressão é feito no qual o domínio de ligação ao amido de PS4 é removido. Num PCR com iniciadores P3 e P6 (Tabela 3) em pCSmta, uma versão truncada do gene mta é gerada. 0 gene mta de comprimento total em pCSmta é trocado com a versão truncada, o que resultou no plasmideo pCSmta-SBD.
Exemplo 2. Mutagênese direcionada a sitio de PS4
São introduzidas mutações no gene mta por 2 métodos. Seja por um método baseado em PCR de dois passos, ou por um método Quick Exchange (QE). Por conveniência, o gene mta é separado em 3 partes; um fragmento Pvul-FspI, um fragmento FspI-PstI e um fragmento PstI-AspI, adicionalmente referidos como fragmento 1, 2 e 3, respectivamente. No método baseado em PCR de dois passos, as mutações são introduzidas usando Pfu DNA poiimerase (Stratagene). Um primeiro PCR é executado com um iniciador de mutagênese (Tabela 4) para a codificação da fita mais um iniciador à jusante da fita inferior (seja 2R ou 3R Tabela 3} . O produto reacional é usado como um iniciador num segundo PCR, juntamente com um iniciador à montante na fita codificante. O produto da última reação é clonado em pCRBLÜNT topo (Invitrogen) e após o sequenciamento o fragmento é trocado com o fragmento correspondente em pCSmta.
No uso do método Quick Exchenge (Stratagene), as mutações são introduzidas usando dois iniciadores complementares num PCR num plasmideo contendo o gene mta, ou parte do gene mta.
Para esse propósito, um grupo conveniente de plasmideos é construído, compreendendo 3 plasmídeos SDM e 3 plasmídeos pCSA. Cada um dos plasmídeos SDM suporta 1 dos fragmentos do gene mta conforme mencionados acima, nos quais a mutação desejada é introduzida por QE. Depois da verificação por sequenciamento, os fragmentos são clonados no plasmideo pCSA receptor correspondente. Os plasmídeos pCSA são derivados inativos de pCSmta. A atividade é restabelecida pela clonagem do fragmento correspondente a partir do plasmideo SDM, permitindo uma fácil varredura. Tabela 3. Iniciadores usados na clonagem do gene mta, e iniciadores padrões usados na construção dos mutantes direcionados a sitio com o método de PCR em dois passos.
<table>table see original document page 192</column></row><table>
Tabela 4. Iniciadores usados para introduzir as mutações direcionadas a sitio em mta
<table>table see original document page 192</column></row><table> <table>table see original document page 193</column></row><table>
Tabela 5. Características dos plasmídeos SDM e pCSA
<table>table see original document page 193</column></row><table>
Exemplo 3. Multi SDM
As variantes PS4 foram geradas usando um Kit de Mutagênese Direcionado a Sítios Múltiplos QuikChange© (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante com algumas modificações conforme descritas.
Passo 1. Reação da Sintese do Filamento Mutante (PCR) Inocular 3 mL. LB (22 g/L Base de Caldo Lennox L, Sigma) + antibióticos (0,05 μg/mL de canamicina, Sigma) num tubo Falcon 10 mL
- Incubar a 37 °C, ca. 200 rpm.
- Decantar as células por centrifugação (5000 rpm/5 min)
-Remoção do meio
Preparar molde de ds-DNA usando o protocolo de minipurifi CclCci o de plasmideo QIAGEN
1. A reação de síntese de fita mutante para a ciclização térmica foi preparada como se segue:
Mistura de PCR:
.2,5 μL IOX Tampão multirreacional QuickChange©
.0,75 ^iL QuickSolution
Comprimento do iniciador 28 a 35 pb —»10 pmol X μL Iniciadores Comprimento do iniciador 24 a 27 pb —7 pmol Comprimento do iniciador 20 a 23 pb —» 5 pmol
.1 μL Mistura de dNTP
X μL molde de ds-DNA (200 ng)
.1 μL Mistura multienzimática QuickChange©
(2,5 U/íiL) (PfuTurbo® DNA polimerase)
X μL dH20 (até um volume final de 2 5 μL) Misturar todos os componentes por pipetagem e rapidamente decantar as misturas reacionais.
2. Ciclizar os reagentes usando os seguintes parâmetros: 33 ciclos cie desnaturação (96 °C/1 min)
Anelamento do iniciador (62,8 °C/1 min)
Alongamento (65 °C/15 min)
A seguir manter a 4 °C Pré-aquecer a tampa da máquina de PCR até 105 0C e a placa até 95 °C antes dos tubos de PCR serem colocados na máquina (ciclizador térmico eppendorf).
Passo 2: Digestão de Dpn I
1.Adicionar 2 μΐ de enzima de restrição DpnI (10 U/pL) em cada reação de amplificação, misturar por pipetagem e decantar a mistura.
2.Incubar a 37 0C por ~ 3 h.
Passo 3. Transformação de Células ultracompetentes XLIO-Gold®
1. Descongelar células XLlO-Gold em gelo. Aliquotar 45 μL de células por reação de mutagênese em tubos Falcon pré- resfriados.
2. Ligar o banho Maria (42 °C) e colocar um tubo com caldo NZY+ no banho até o pré-aquecimento.
3. Adicionar 2 μL de mistura de β-mercaptoetanol em cada tubo. Agitar e bater gentilmente e incubar 10 min em gelo, rodando a cada 2 min.
4. Adicionar 1,5 μΕ de DNA tratado com DpnI em cada alíquota de células, rodar para misturar e incubar em gelo por 30 min.
5. Pulso de calor dos tubos em banho Maria a 42 0C por .30 s e colocar em gelo por 2 min.
6.Adicionar 0,5 mL de caldo NZY+ pré-aquecido em cada tubo e incubar a 37 0C por 1 h com agitação em 225 - 250 rpm.
7. Plaquear 200 μL de cada reação de transformação em placas LB (33,6 g/L de Lennoz L Agar, Sigma) contendo 1% de amido e 0,0 5 μg/mL de canamicina.
8. Incubar as placas de transformação a 37 0C de um dia para o outro.
Tabela 6. Tabela de iniciadores para pPD77dl4:
<table>table see original document page 196</column></row><table> <table>table see original document page 197</column></row><table>
Tabela 7: Tabela de iniciadores para pPD77d20:
<table>table see original document page 197</column></row><table> <table>table see original document page 198</column></row><table>
Tabela 8: Tabela de iniciadores para pPD77d34:
<table>table see original document page 198</column></row><table>
Sistema de vetores baseado em pPD77 O sistema cie vetores usado para pPD77 é baseado em pCRbluntTOPOII (Invitrogen). 0 cassete de resistência à zeocina foi removido por pmll, um fragmento de 393 pb removido. 0 cassete de expressão do vetor pCC (P32- ssCGTase-PS4-tt) foi, a seguir, inserido no vetor.
Ligação da variante PS4 em pCCMini
0 plasmideo o qual continha as mutações relevantes (criado por MSDM) é cortado com a enzima de restrição Nco 1 e Hind III (Biolabs):
.3 μg de DNA de plasmideo, X μΐ de tampão 10 χ 2, 10 unidades de Ncol, 20 unidades de HindIII
Incubação por 2 h a 37 0C
Efetuar a digestão num gel de agarose 1%. Os fragmentos com tamanho de 1293 pb (gene PS4) são cortados do gel e purificados usando o kit de purificação em gel Qiagen.
0 vetor pCCMini é, a seguir, cortado com enzimas de restrição, Nco 1 e Hind III, e a digestão a seguir ocorre num gel de agarose 1%. 0 fragmento com tamanho de 3569 pb é cortado do gel e purificado usando o kit de purificação em gel Qiagen.
Ligação: Usar kit de ligação de DNA rápido (Roche)
Usar o dobro da quantidade de inserção em comparação com o vetor.
Por exemplo, 2 μL de inserção (gene PS4)
.1μL, de vetor 5 μΐ de tampão de ligação de DNA T4 2 χ conc. 1 μΐ de dH:0 1 μΕ de T4 DNA ligase Ligar 5 min/TA
Transformar a ligação nas células competentes One Shot TOPO de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). Usar 5 μ]1 de ligação por transformação.
Plaquear 50 μΤ de mistura de transformação em placas LB (33,6 g/L de Lennox L Agar, Sigma) contendo 1% de amido e 0,05 μg/mL de canamicina. Vetores contendo a inserção (variantes PS4) podem ser reconhecidos pela formação de halo nas placas de amido.
Exemplo 3A. Produção do polipeptideo variante PS4 com substituição na posição 307 pSac-pMD229
A seqüência pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 14) compreendendo as mutações em N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L, A309P, S334P em relação à exoamilase não-maltogênica do tipo selvagem é feita a partir de uma seqüência do tipo selvagem usando mutagênese direcionada a sitio (conforme descrito acima no Exemplo 2) ou mutagênese direcionada a múltiplos sítios (conforme descrito acima no Exemplo 3), com os iniciadores na tabela abaixo: Iniciadores para pMD229 <table>table see original document page 201</column></row><table> <table>table see original document page 202</column></row><table>
pSac - pMS382
Seqüência pSac-pMS382 (SEQ ID NO: 22) compreendendo 307K é feita a partir de pSac-pSac-pMD229 usando mutagênese direcionada a múltiplos sítios (conforme descrito acima no Exemplo 3), com os iniciadores na tabela abaixo:
Iniciadores para pMD229 => pMS382:
<table>table see original document page 202</column></row><table> <table>table see original document page 203</column></row><table>
*pMS382 foi gerado a partir do gene sintetico pMS230, o qual, consequentemente, tambêm precisou ser revertido na posigao 14 5 de D para N
<table>table see original document page 203</column></row><table>
Polipeptídeos variantes PS4 com outros resíduos na posição 307 são gerados usando mutagênese direcionada a múltiplos sítios (conforme descrito acima no Exemplo 3), com os iniciadores da tabela abaixo:
<table>table see original document page 203</column></row><table> <table>table see original document page 204</column></row><table> Iniciador usado para varredura de sidio na posição
.307:
<table>table see original document page 205</column></row><table>
Exemplo 4. Transformação em Bacillus subtilis (Transformação de protoplasto)
Bacillus subtilis (cepa DB104A; Smith et al. 1988; Gene 70, 351-361) é transformado com os plasmídeos modificados de acordo com o seguinte protocolo.
A. Meio para protoplastificação e transformação
2 χ SMM por litro: 342 g de sacarose (1
M) ; 4,72 g de maleato de sódio (0,04 M) ; 8:12 g de MgCl2, 6H20 (0,04 M); pH 6,5 com NaOH concentrado. Distribuir em porções
de 50 mL e autoclavar por 10 min.
4 χ YT (1/2 NaCl) 2 g de extrato de levedura + 3,2 g
de triptona + 0,5 g de NaCl por 100 mL.
SMMP Misturar volumes iguais de 2 χ SMM e 4 χ YT. PEG 10 g de polietilenoglicol 6000
(BDH) ou 8000 (Sigma) em 25 mL 1 χ
SMM (autoclavar por 10 min).
B. Meio para plaqueamento/regeneração
Agar 4% de Agar mínimo Difco.
Autoclavar por 15 min. Succinato de sódio 270 g/L (1 Μ) , pH 7,3 com HCl.
Autoclavar por 15 min.
Tampão fosfato 3,5 g de K2HPO4 + 1,5 g de KH2PO4
por 100 mL. Autoclavar por 15 min.
MgCl2 20, 3 g MgCl2, 6H20 por 100 mL (1
M) .
Casaminoácidos Solução 5% (p/v). Autoclavar por
15 min.
Extrato de levedura 10 g por 100 mL, autoclavar por 15
min.
Glicose Solução 20% (p/v). Autoclavar por
10 min.
Meio de regeneração DM3: misturar a 60 C (banho-maria;
garrafa de 500 mL):
250 mL de succinato de sódio
50 mL de casaminoácido
25 mL de extrato de levedura
50 mL de tampão fosfato
15 mL de glicose
10 mL de MgCl2 100 mL de Agar fundido
Adicionar os antibióticos apropriados: cloranfenicol e tetraciclina, 5 ug/mL; eritromicina, 1 ug/mL. Seleção de canamicina é problemática em meio DM3: concentrações de 2 50 ug/mL podem ser requeridas.
C. Preparação de protoplastos
1.Usar plástico ou vidraria sem detergente em todas as etapas.
2.Inocular 10 mL de meio 2 χ YT num frasco de 100 mL a partir de uma colônia individual. Crescer em cultura de um dia para o outro a 25 - 30 0C num agitador (200 ciclos/min).
3.Diluir a cultura de um dia para o outro 20 vezes em 100 mL de meio 2 χ YT fresco (frasco de 250 mL) e crescer até OD6OO = 0,4 - 0,5 (aproximadamente 2 h) a 37 0C num agitador (200 - 250 ciclos/min).
4.Coletar as células por centrifugação (9000 g, 20 min, 4 C).
5.Remover o sobrenadante com pipeta e ressuspender as células em 5 mL de SMMP + 5 mg de lisozima, filtrada esterilmente.
6.Incubar a 37 0C num agitador de banho-maria (100 ciclos/min).
Depois de 30 min e, a seguir, em intervalos de 15 min, examinar amostras de 25 uL por microscopia. Continuar a incubação até 99% das células serem protoplasmadas (aparência globular). Coletar os protoplastos por centrifugação (4000 g, 20 min, TA) e remover por pipetagem o sobrenadante. Ressuspender o pélete suavemente em 1 - 2 mL de SMMP.
Os protoplastos estão agora prontos para o uso. (Porções (por exemplo, de 0,15 mL) podem ser congeladas a -80 0C para uso futuro (não é necessária a adição de glicerol) . Embora isso possa resultar em certa redução da transformabilidade, 106 transformantes por ug de DNA podem ser obtidos com os protoplastos congelados).
D. Transformação
1.Transferir 450 uL de PEG para um microtubo.
2.Misturar 1 - 10 uL de DNA (0,2 ug) com 150 uL de protoplastos e adicionar a mistura ao microtubo com PEG. Misturar imediatamente, porém suavemente.
3.Deixar por 2 min em TA, e a seguir adicionar 1,5 mL de SMMP e misturar.
4.Coletar os protoplastos por microcentrifugação (10 min, 13.000 ciclos/min (10 - 12.000 g)) e verter o sobrenadante. Remover as gotículas remanescentes com um tecido.
Adicionar 300 uL de SMMP (não submeter ao vórtex) e incubar por 60 - 90 min a 37 0C num agitador em banho-maria (100 ciclos/min) para permitir a expressão demarcadores de resistência a antibióticos. (Os protoplastos são suficientemente ressuspensos através da ação de agitação do banho-maria). Fazer diluições apropriadas em 1 χ SSM e plaquear 0,1 mL em placas DM3.
Exemplo 5. Fermentação de variantes PS4 em frascos de agitação
0 substrato do frasco de agitação é preparado como se segue:
<table>table see original document page 209</column></row><table>
0 substrato é ajustado até pH 6,8 com ácido sulfúrico 4 N ou hidróxido de sódio antes de autoclavar. 100 mL de substrato são colocados num frasco de 500 mL com um defletor e autoclavado por 30 minutos. Subseqüentemente, 6 mL de xarope de dextrose estéril é adicionado. O xarope de dextrose é preparado pela mistura de um volume de 50% p/v de dextrose com um volume de água, seguido por autoclavagem por 20 minutos.
Os frascos de agitação são inoculados com as variantes e incubados por 24 horas a 35 °C/180 rpm num incubador. Depois da incubação, as células são separadas do caldo por centrifugação (10.000 χ g em 10 minutos) e finalmente o sobrenadante fica livre de células por microfiltração a 0,2 μm. O sobrenaciante livre de células é usado para ensaios e testes de aplicação.
Exemplo 6. Ensaios de amilase
Ensaio de Betamyl
Uma unidade Betamyl é definida como a atividade de degradação de 0, 0351 nrniol por 1 min de maltopentaose acoplada com PNP, de modo que 0,0351 mmol de PNP por 1 min possa ser liberado por excesso de a-glicosidase na mistura do ensaio. A mistura do ensaio contém 50 uL de citrato de Na 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 6,5 com 25 uL de amostra de enzima e 25 uL de substrato Betamvl (Glc5-PNP e a-glicosidase) de Megazyme, Irlanda (1 frasco dissolvido em 10 mL de água). A mistura do ensaio é incubada por 30 min a 40 0C e, a seguir, interrompida pela adição de 150 uL de Tris 4%. Absorvância a 420 nm é medida usando um leitor de ELISA e a atividade Betamyl é calculada baseando-se na Atividade = A420*d em unidades Betamyl/mL de amostra de enzima ensaiada.
Ensaio da endoamílase
O Ensaio da endoamilase é idêntico ao ensaio Phadebas, de acordo com o fabricante (Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB) .
Exoespecificidade
A proporção da atividade de exoamilase em relação à atividade Phadebas foi usada para avaliar a exoespecificidade. Exemplo 7. Determinação da meia-vida
Tl/2 é definida como o tempo (em minutos) durante o qual metade da atividade enzimática é inativada sob condições de aquecimento definidas. Para determinar a meia vida da enzima, a amostra é aquecida por 1-40 minutos em temperaturas constantes de 60 0C a 90 °C. Δ meia vida é calculada baseando-se no ensaio de Betamyl residual.
Procedimento: Num frasco Eppendorf, 1000 μΐ, de tampão é pré-aquecido por pelo menos 10 minutos a 60 0C ou mais. O tratamento com calor da amostra é iniciado na adição de 100 μί da amostra ao tampão pré-aquecido sob mistura continua (800 rpm) do frasco de Eppendorf num incubador de aquecimento (Termomixer comfort da Eppendorf). Depois de 0, 2, 4, 6, 8 e 9 minutos de incubação, o tratamento é interrompido pela transferência de 45 μΐι da amostra para 1000 μΐ, do tampão equilibrado a 20 0C e incubando por 1 minuto a 1500 rpm e a 20 °C. A atividade residual é medida com o ensaio Betamyl.
Cálculo: 0 cálculo de tl/2 é baseado na inclinação de IoglO (logaritmo de base 10) da atividade Betamyl residual versus o tempo de incubação. Tl/2 é calculada como a inclinação/0,301 = tl/2.
Exemplo 8. Testes de assadura de sistema modelo
As massas são feitas no Farinógrafo a 30,0 °C. 10,00 g de farinha reformada são removidos por pesagem e adicionados no farinógrafo. Depois de 1 min, a mistura referência/amostra (referência = tampão ou água, amostra = enzima + tampão ou água) é adicionada com uma pipeta estéril através dos orifícios do tonei do misturador. Depois de 30 seg, a farinha é removida por raspagem dos cantos - também através dos orifícios do tonei do misturador. A amostra é raspada por 7 min.
Um teste com tampão ou água é efetuado no farinógrafo antes de correr a referência final. FU deve ser de 4 00 na referência, caso não seja, este deve ser ajustado, por exemplo, com a quantidade de líquido. A referência/amostra é removida com uma espátula e colocada na mão (com uma luva descartável nela), antes dela ser preenchida em pequenos tubos de vidro (de aproximadamente 4,5 cm de comprimento) que são colocados em tubos de RMN e arrolhados. São feitos .7 tubos por massa.
Quando todas as amostras forem preparadas, os tubos são colocados num banho-maria (programável) a 33 0C (sem rolhas) por 25 min e, daí por diante, o banho-maria é ajustado para ficar por 5 min a 33 °C, a seguir para ser aquecido até 98 0C em 56 min (1,1 0C por minuto) e finalmente para ficar por 5 min. a 96 °C.
Os tubos são armazenados a 20,0 0C num armário térmico. 0 conteúdo de sólidos do miolo de pão foi medido por RMN de prótons usando um anaiisador de RMN 120 Minispec Bruker no dia 1, 3 e 7 conforme mostrado para as amostras de miolo preparadas com 0, 05, 1 e 2 ppm de PSacD34 na Fig. 2. O menor acréscimo no conteúdo de sólidos no decorrer do tempo representa a redução na retrogradação de amilopectina. Depois de 7 dias de armazenagem a 20,0 0C num armário térmico, amostras de 10 - 20 g de miolo são pesados e colocados em cápsulas DSC padrão de alumínio e mantidas a 20 °C.
As cápsulas são usadas para Calorimetria de Varredura Diferencial num instrumento DSC 820 Mettler Toledo. Como parâmetros são usados um ciclo de aquecimento de 20 - 95 0C com 10 0C por min, aquecimento e fluxo de gás: INh/SO mL por min. Os resultados são analisados e a entalpia para fusão da amilopectina retrogradada é calculada em J/g.
Exemplo 9. Efeitos antienvelhecimento
Miolos de pão modelo são preparados e medidos de acordo com o Exemplo 8. Variantes PS4 apresentam uma forte redução da retrogradação de amilopectina depois de assar conforme medido por calorimetria de varredura diferencial em comparação com o controle. As variantes PS4 apresentam um claro efeito de dosagem.
Exemplo 10. Receita para testes de assadura Os testes de assadura foram executados com uma receita para pão esponja branco e de massa para torrada americana. A massa tipo esponja é preparada a partir de 1400 g de farinha "Gold Medal" da General Mills, EUA, 800 g de água, 40 g de óleo de semente de colza, 7,5 g de GRINDSTED™ SSL P55 Veg, 10 g de emulsif icante DIMODAN™ PH200 e 60 g de levedura comprimida. O pão é misturado por 1 min em baixa velocidade e subseqüentemente por 3 min em velocidade 2 num misturador em espiral Hobart. 0 pão é subseqüentemente fermentado por 3 horas a 25 °C, 85% de UR.
Depois disso, 600 g de farinha "Gold Medal", 18 g de levedura comprimida, 5 g de propionato de cálcio, 160 g de sacarose, 5 g de propionato de cálcio, 432 g de água e ácido ascórbico (concentração final de 60 ppm) e ADA (azodicarbonamida; concentração final de 40 ppm) são adicionados no pão esponja. A massa resultante é misturada por 1 min em baixa velocidade e, a seguir, 2 min em alta velocidade num misturador Diosna. A seguir 30 g de sai são adicionados na massa.
A massa repousa por 5 min em temperatura ambiente, e a seguir 550 g de pedaços de massa são descascados, moldados num cilindro com os ajustes de 1:4, 2:4, 3:5, 4:12 e largura de 8 em ambos os lados e transferida para uma forma de assar. Depois de 65 min de provação a 43 0C a 95% de UR, as massas são assadas por 26 min a 200 0C num forno MIWE.
Exemplo 11. Controle do volume dos pães franceses dinamarqueses.
Pães dinamarqueses são preparados a partir de uma massa baseada em 2000 g de farinha corrigida dinamarquesa (de Cerealia), 120 g de levedura comprimida, 32 g de sal e .32 g de sacarose. Água é adicionada à massa de acordo com a otimização com água anterior. A massa é misturada num misturador Diosna (2 min em baixa velocidade e 5 min em alta velocidade). A temperatura da massa depois da mistura é mantida a 26 °C. 1350 g de massa são descascadas e repousadas por 10 min numa cabine de aquecimento a 30 °C. Os pães franceses são moldados num moIdador Fortuna e provados por 4 5 min a 34 0C e em 85% de umidade relativa. Subseqüentemente, os pães franceses são assados num forno Bago 2 por 18 min a 250 0C com vapor nos primeiros 13 segundos. Depois da assadura os pães são esfriados por 25 min antes de pesar e medir o volume. Os pães são avaliados em relação à aparência da crosta, homogeneidade do miolo, cobertura da crosta, abertura e volume especifico (medição do volume com o método de deslocamento da semente de colza).
Baseando-se nestes critérios, foi descoberto que as variantes PS4 aumentam o volume especifico e melhoram os parâmetros de qualidade dos pães dinamarqueses. Deste modo, as variantes PS4 são capazes de controlar o volume dos produtos assados.
Exemplo 12. Protocolo de avaliação de firmeza, resiliência e coesão
Análise de perfil de textura do pão
Firmeza, resiliência e coesão são determinados pela análise de fatias de pão por análise do perfil de textura usando um Analisador de Textura da Stable Micro Systems, Reino Unido. 0 cálculo da firmeza e resiliência é feito de acordo com o padrão predeterminado fornecido pela Stable Micro System, Reino Unido. A sonda usada é um anel de 50 mm de alumínio.
Pão é fatiado com a largura de 12,5 mm. As fatias são estampadas para uma peça circular com um diâmetro de 4 5 mm e medidas individualmente.
Os seguintes ajustes são usados:
Velocidade pré-teste: 2 mm/s
Velocidade de teste: 2 mm/s
Velocidade pós-teste: 10 mm/s
Distância do teste de ruptura: 1%
Distância: 40%
Força: 0,098 N
Tempo: 5,00 seg
Contagem: 5
Carga de células: 5 Kg
Tipo de gatilho: Auto - 0,01 M
O modo de compressão é uma modificação ao usado no Método Padrão AACC 74-09. A amostra é compressa duas vezes no teste. Figura 1 mostra um exemplo de uma curva do Analisador de Textura.
Exemplo 13. Protocolo para Avaliação de Firmeza
A firmeza é determinada em 40% de compressão durante a primeira compressão. A figura é a força necessária para comprimir a fatia até 40% da espessura total. Quanto menor o valor, mais macio é o pão. A firmeza é expressa como uma pressão, por exemplo, em hPa.
Esse ensaio pode ser referido como o "Protocolo de Avaliação de Firmeza".
Exemplo 14. Protocolo pra Avaliação de Resiliência
A área sob a curva é uma medida de trabalho aplicada durante o teste. A área sob a curva na parte de compressão (Al) e a parte de retirada (A2) durante a primeira compressão estão mostradas na Figura 1.
A proporção entre Al e A2 é definida como a resiliência da amostra, e é expressa como Unidades de Resiliência. O material elástico verdadeiro irá fornecer uma curva simétrica, uma vez que a força aplicada durante a primeira parte será igual à força na segunda parte. Para materiais de pão e tipo pão, A2 é normalmente menor do que A2 devido a um distúrbio da estrutura durante a compressão. Deste modo, a resiliência é sempre menor do que 1.
Esse ensaio pode ser referido como o "Protocolo de Avaliação de Resiliência".
Exemplo 15. Protocolo para Avaliação de Coesão
A coesão é definida como a proporção entre a área sob a segunda compressão até a área sob a primeira compressão (A3/A1 + A2), e é expressa como Unidades de Coesão. Ela é uma medida do decaimento da amostra durante a compressão. Quanto maior é a capacidade da amostra de recuperar a sua forma após a primeira compressão, mais próximo será o valor de 1. Para pães e materiais tipo pão, a coesão é sempre inferior a 1.
Esse ensaio pode ser referido como o "Protocolo de Avaliação de Coesão".
Exemplo 16. Protocolo para avaliação de desagregação (Resistência à desagregação)
Duas fatias de pão são colocadas num pedaço de papel. Cada fatia é dividida em 4 quadrados por cortes vertical e subseqüentemente horizontal da fatia.
O corte é feito separando o miolo com os dedos. Primeiramente a fatia é dividida do meio do tipo da superfície do pão até o meio da superfície do pão de baixo. Em seguida, cada metade da fatia original é dividida do lado da crosta até dentro da fatia. As pequenas peças de miolo, as quais são separadas dos 4 quadrados, são removidas agitando-se cada pedaço depois de um corte pelo menos 3 vezes movendo as mãos para cima e para baixo.
O peso dos pedaços de miolo pequenos separados é determinado como uma medida da desagregação. Esse ensaio pode ser referido como o "Protocolo de Avaliação de Desagregação".
Exemplo 17. Protocolo para Avaliação da Flexibilidade
0 pão torrada é fatiado usando um fatiador de pão automático com uma espessura de fatia ajustada de 15 mm. A fatia é dobrada com as mãos do topo da fatia para baixo, de modo que a direção da dobra seja de lado a lado. A tiexibilidade é visualmente avaliada usando o seguinte sistema de pontuação:
<table>table see original document page 219</column></row><table>
Esse ensaio pode ser referido como o "Protocolo de Avaliação de Flexibilidade".
Exemplo 18. Termoestabilidade melhorada dos polipeptideos variantes PS4.
A estabilidade térmica da amilase pSac-pMS382 é medida conforme descrito acima e comparada com aquela da pSac- D34/pMD3 (SEQ ID NO: 2) e pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 13). Devido à inativação por calor seguir uma reação de Ia ordem, a meia vida definida como o tempo (em minutos) para .50% de inativação é determinada baseando-se na atividade residual usando o ensaio Betamyl depois da incubação por 1 - 40 minutos a 75, 80 e 85 0C (167, 176 e 185 °F, respectivamente) em citrato de sódio 50 mM, cloreto de cálcio 5 mM, pH 6,5.
Os resultados estão apresentados na Figura 2. Esta figura mostra que a termoestabilidade (meia vida) dos polipeptideos variantes PS4 compreendendo uma substituição na posição 307 para um aminoácido básico ou positivamente carregado é melhorada em comparação com os polipeptideos sem tal mutação.
Exemplo 19. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: Firmeza
Pão é assado com quantidades variadas de pSAc-pMS382 (SEQ ID MO: 21) compreendendo uma substituição para um resíduo básico ou positivamente carregado na posição 307, isto é, 20.000, 40.000 e 60.000 unidades Betamyl/Kg de pSac-pMS382.
A firmeza do pão é testada de acordo com o protocolo estabelecido no Exemplo 13 em vários momentos depois da assadura. Como controle, a firmeza do pão assado sem qualquer enzima é também medida. Figura 3 mostra os resultados de um teste de assadura no qual é testada a firmeza do pão.
Exemplo 20. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: Resiliência
Pão é assado com quantidades variadas de pSAc-pMS3 8 2 (SEQ ID NO: 21) compreendendo uma substituição para um resíduo básico ou positivamente carregado na posição 307, isto é, 20.000, 40.000 e 60.000 unidades Betamyl/Kg de pSac-pMS382.
A resiliência do pão é testada de acordo com o protocolo estabelecido no Exemplo 14 em vários momentos depois da assadura. Como controle, a resiliência do pão assado sem qualquer enzima é também medida.
Figura 4 mostra os resultados de um teste de assadura no qual é testada a resiliência do pão.
Exemplo 21. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: Coesão
Pão é assado com quantidades variadas de pSAc-pMS382 (SEQ ID NO: 21) compreendendo uma substituição para um resíduo básico ou positivamente carregado na posição 307, isto é, 20.000, 40.000 e 60.000 unidades Betamyl/Kg de pSac-pMS382.
A coesão do pão é testada de acordo com o protocolo estabelecido no Exemplo 15 em vários momentos depois da assadura. Como controle, a coesão do pão assado sem qualquer enzima é também medida.
Figura 5 mostra os resultados de um teste de assadura no qual é testada a coesão do pão.
Exemplo 22. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: Firmeza
Pão é assado com 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac- pMS382 (SEQ ID NO: 21) compreendendo uma substituição para um resíduo básico ou positivamente carregado na posição 307 e a firmeza do pão é testada de acordo com o protocolo estabelecido no Exemplo 13 em vários momentos depois da assadura.
Pão é também assado com 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-D34 (SEQ ID NO: 2) e 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 13), cada uma sem uma substituição na posição 307 para um aminoácido básico ou positivamente carregado. A firmeza do pão é testada.
Como controle, a firmeza do pão assado sem qualquer enzima também é medida.
Figura 6 mostra os resultados de um teste de assadura no qual a firmeza do pão tratado com polipeptídeo variante PS4 com e sem substituição em 307 é testada.
Exemplo 23. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: Firmeza, Resiliência e Coesão Pão é assado com 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac- pMS332 (SEQ ID NO: 21) compreendendo uma substituição para um resíduo básico ou positivamente carregado na posição 307 e a resiliência do pão é testada de acordo com o protocolo estabelecido no Ezemplo 14 em vários momentos depois da assadura.
Pão é também assado com 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-D34 (SEQ ID NO: 2) e 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 13), cada um sem uma substituição na posição 307 para um aminoácido básico ou positivamente carregado. A resiliência do pão é testada.
Como controle, a resiliência do pão assado sem qualquer enzima também é medida.
Figura 7 mostra os resultados de um teste de assadura no qual a resiliência do pão tratado com polipeptídeo variante PS4 com e sem substituição em 307 é testada.
Exemplo 24. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: Coesão
Pão é assado com 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac- pMS382 (SEQ ID NO: 21) compreendendo uma substituição para um resíduo básico ou positivamente carregado na posição 307 e a coesão do pão é testada de acordo com o protocolo estabelecido no Exemplo 15 em vários momentos depois da assadura. Pão é também assado com 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-D34/pMD3 (SEQ ID NO: 2) e 60.000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 13), cada um sem uma substituição na posição 307 para um aminoácido básico ou positivamente carregado. A coesão do pão é testada.
Como controle, a coesão do pão assado sem qualquer enzima também é medida.
Figura 8 mostra os resultados de um teste de assadura no qual a coesão do pão tratado com polipeptideo variante PS4 com e sem substituição em 307 é testada.
Exemplo 25. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: Flexibilidade
Pão esponja e massa de torrada tratados com 4 ppm de pSac-pMS382 (SEQ ID NO: 21, substituição H307K) é assado e a flexibilidade dos pães resultantes é testada e classificada conforme descrito acima.
Como um controle, pão esponja e massa de torrada não tratado com enzima é assado e testado quanto á flexibilidade e classificado.
Os testes são feitos em três fatias no dia 13 após a assadura.
<table>table see original document page 224</column></row><table> Conforme mostrado na tabela acima e Figuras, a flexibilidade é melhorada em pão esponja e massa de torrada tratado com um polipeptideo variante PS4 compreendendo uma substituição na posição 307 para um aminoácido básico ou positivamente carregado em comparação com pão de torrada não-tratado.
Exemplo 26. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: Flexibilidade
Pão esponja e massa de torrada tratado com 4 ppm de pSac-pMS382 (SEQ ID NO: 21, substituição H307K) é assado e a flexibilidade dos pães resultantes é testada e classificada conforme descrito acima.
Como controles, pão esponja e massa de torrada não tratado com enzima é assado e a flexibilidade é testada e classificada. A flexibilidade do pão esponja e massa de torrada tratados com outras enzimas conforme apresentado abaixo também é testada.
Enzima pSac-D34 (também conhecida como pMD3) compreende as mutações N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L, S334P em relação à exoamilase não-maltogênica do tipo selvagem e sua seqüência é apresentada como SEQ ID NO: 2.
A enzima pSac-pMD229 compreende as mutações N33Y, D 3 4 N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L, A309P, S334P em relação à exoamilase não-maltogênica do tipo selvagem e sua seqüência é apresentada como SEQ ID NO: 13.
Os testes são efetuados em três fatias no dia 8 após a as sadura.
<table>table see original document page 226</column></row><table>
Conforme demonstrado na tabela acima, a flexibilidade é melhorada em pão de torrada de massa e pão tratado com um polipeptideo variante PS4 compreendendo uma substituição na posição 307 para um aminoácido básico ou positivamente carregado em comparação com as enzimas sem esta substituição.
Exemplo 27. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com combinações de polipeptídeos variantes PS4 e outras enzimas: Flexibilidade
Pão esponja e massa de torrada tratado com 6 ppm de pSac-pMS382 (SEQ ID NO: 21, substituição em 307K) sozinho ou em combinação com outras enzimas conforme apresentado abaixo é assado e a flexibilidade dos pães resultantes é testada e classificada conforme descrito acima.
Combinação 1: 6 ppm de pSac-pMS382 + 50 ppm GRINDAMYL™ POWERBake 900 + 15 ppm de GRINDAMYL™ Max-Life U4. Combinação 2: 6 ppm de pSac-pMS382 + 50 ppm GRINDAMYL™ POWERBake 900.
Combinação 3: 6 ppm de pSac-pMS382 + 50 ppm GRINDAMYL™ POWERBake 900 + 150 ppm de GRINDAMYL™ POWERBake 4050.
GRIMDAMYL™ POWERBake 900 é uma xilanase comercialmente disponível de Danisco A/S. GRINDAMYL™ POWERBake 4050 é uma lipase comercialmente disponível da Danisco A/S. Como controles, pão esponja e massa de torrada não tratados com enzima é assado e testado quanto à flexibilidade e classificados.
Os testes são feitos em três fatias no dia 5 após a assadura.
<table>table see original document page 227</column></row><table>
Conforme mostrado na tabela acima, a flexibilidade é melhorada em pão esponja e massa de torrada tratado com um polipeptideo variante PS4 compreendendo uma substituição na posição 307 para um aminoácido básico ou positivamente carregado sozinho ou em combinação com outras enzimas, tais como lipase, xilanase e α-amilase bacteriana.
Exemplo 28. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: testes de desagregação.
Pão esponja e massa de torrada com 4 ppm de pSac- pMS382 (SEQ ID NO: 21, substituição em 307K) é assado e a desagregação dos pães resultantes é testada e classificada conforme descrito acima.
Como controle, pão esponja e massa de torrada não tratado com enzima é assado e testado quanto à flexibilidade e classificado.
Os testes são feitos no dia 13 após a assadura.
<table>table see original document page 228</column></row><table>
Conforme mostrado na tabela acima, a desagregação é reduzida em pão esponja e massa de torrada depois de 13 dias, tratado com um polipeptideo variante PS4 compreendendo uma substituição na posição 307 para um aminoácido básico ou positivamente carregado.
Exemplo 29. Propriedades de manuseio melhoradas de produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes PS4: testes de desagregação. Pão esponja e massa de torrada com 4 ppm de pSac- pMS3 3 2 (SEQ ID NO: 21, substituição em 307K) é assado e a desagregação dos pães resultantes é testada e classificada conforme descrito acima.
Como controle, pão esponja e massa de torrada não tratado com enzima é assado e testado quanto à flexibilidade e classificado.
Os testes são feitos no dia 15 após a assadura.
<table>table see original document page 229</column></row><table>
Conforme mostrado na tabela acima, a desagregação é reduzida em pão esponja e massa de torrada depois de 15 dias, tratado com um polipeptideo variante PS4 compreendendo uma substituição na posição 307 para um aminoácido básico ou positivamente carregado.
Exemplo 30. Polipeptideos variantes PS4 com substituições na posição 307K.
Os seguintes peptideos com substituições na posição 307 para lisina são feitos e suas propriedades são testadas conforme descrito acima. As seqüências dos polipeptideos compreendem a seqüência da SEQ ID NO: 2 juntamente com as substituições especificadas. <table>table see original document page 230</column></row><table> <table>table see original document page 231</column></row><table> <table>table see original document page 232</column></row><table> <table>table see original document page 233</column></row><table>
Exemplo 31: Polipeptideos variantes PS4 com a posição .307H
Os seguintes polipeptídoes com histidina na posição .307, juntamente com outras mutações, são feitos e suas propriedades são testadas conforme descrito acima. As seqüências dos polipeptideos compreendem a seqüência da SEQ ID NO: 2 juntamente com as substituições especificadas. <table>table see original document page 234</column></row><table>
Exemplo 32: Geração de polipeptideos PS4 com mutações L307R e L307K
SSM 471 BlO e SSM 471 C04 com outros resíduos na posição 307 (L307R, L307K) são gerados usando Mutagênese Direcionada a Múltiplos Sítios (conforme descrito acima no Exemplo 3) com os iniciadores na tabela abaixo:
Iniciador usado para varredura de sitio na posição
.307:
<table>table see original document page 234</column></row><table> <table>table see original document page 235</column></row><table> .96 clones da biblioteca de varredura de sitio são sequenciados e as duas variantes SSM 471 BlO e SSM 471 C04 contendo os aminoácidos ReK respectivamente na posição .307 são identificados.
A seqüência de aminoácidos de SSM471 BlO é estabelecida como SEQ ID NO: 27, enquanto que a seqüência de ácidos nucléicos de SSM471 BlO é estabelecida como SEQ ID NO: 28.
A seqüência de aminoácidos de SSM471 C04 é estabelecida como SEQ ID NO: 29, enquanto que a seqüência de ácidos nucléicos de SSM471 C04 é estabelecida como SEQ ID NO: 30.
Outros polipeptidoes variantes PS 4 derivados de um polipeptideo de origem e com mutações L307R ou L307K são da mesma forma gerados usando Mutagênese Direcionada a Múltiplos Sitios (conforme descrito acima no Exemplo 3) com os iniciadores na tabela abaixo:
Iniciador usado para varredura de sítio na posição 307 Iniciador usado para varredura de sitio na posição
307 :
<table>table see original document page 235</column></row><table> TTCAAGATGGCC
Para polipeptideos com uma mutação adicional na região de 301 a 306 ou 308 a 313, a mutação adicional é gerada por Mutagênese Direcionada a Múltiplos Sítios (de acordo com o método descrito no Exemplo 3).
.96 clones da biblioteca de varredura de sítio são sequenciados e, deste modo, variantes contendo os aminoácidos ReK respectivamente na posição 307 são identificados.
Exemplo 33. Teste da tortilla
Tortillas são assadas segundo uma receita como se segue:
<table>table see original document page 236</column></row><table> <table>table see original document page 237</column></row><table>
Procedimento
A temperatura da massa deve ser de 30 °C. Colocar todos os ingredientes secos num misturador aK emper e misturar lentamente por 1 min. Adicionar água - misturar 12 minutos lentamente. Crosta: 1350 g. Moldagem: Glimek: tempo de compressão 3,0 - tempo de arredondamento: 3,0. Repousar a massa por 10 min a 30 °C. Passar as bolas de massa através da máquina de tortilla CFO 40:
Aj ustes:
Pressão: Pressionar a quente as bolas de massa.
Placa do topo: 205 °C; placa do fundo: 200 °C.
Transportadores:
Do topo: 230 °C; Meio: 225 °C; de baixo: 160 °C.
Tempo de assadura: aproximadamente 30 segundos.
Esfriamento: 12 min a: 20 °C, 80% de UR.
Embalagem: a vácuo com C02.
Ajustes: vácuo: 40; C02: 41; Temp: 82 °C.
Exemplo 34: Resultados do teste de flexibilidade no dia 8 após a assadura.
Um teste de flexibilidade é efetuado no dia 8 após a assadura de acordo com o Exemplo 17.
Figura 9 mostra os resultados de um teste de flexibilidade no dia 8 após a assadura das tortillas com 400 ppm de Novamyl ™ 1500 e 50 BMK/Kg de pSac-pMS382 (SEQ ID MO: 21) . Figura 10 apresenta os resultados de um teste de flexibilidade no dia 3 após a assadura das tortillas com .400 ppm de NovamylTM 1500 e 50 BMK/Kg de pSac-pMS382 (SEQ ID NO: 21).
Quando 10 tortillas com 400 ppm de Novamyl™ 1500 são dobradas, todas quebraram durante a dobragem, conforme mostrado nas Figuras 9 e 10.
Quando 10 tortillas com 50 BMK/Kg de pSac-pMS382 (SEQ ID NO: 21) são dobradas, nenhuma quebrou durante a dobragem conforme mostrado nas Figuras 9 e 10.
Exemplo 35. Teste da assadura com SSM 471 BlO (SEQ ID NO: 27, 307R) e SSM 471 C04 (SEQ ID NO: 29, 307K)
Torradas americanas preparadas por um procedimento de massa e esponja conforme descrito no Exemplo 10 são usadas para testar as variantes SSM 471 BlO (SEQ ID NO: 27) com .307R e SSM 471 C04 (SEQ ID NO: 29) com 307K numa dosagem de .4 0 BMK/Kg.
A torrada é avaliada quanto á firmeza e resiliência conforme descrito nos Exemplos 12 e 14.
Figura 11 mostra os resultados de um teste de firmeza da torrada americana preparada com SSM 471 BlO (SEQ ID NO: .27) e SSM 471 C04 (SEQ ID NO: 29) . Figura 12 mostra os resultados de um teste de resiliência da torrada americana preparada com SSM 471 BlO (SEQ ID NO: 27) e SSM 471 C04 (SEQ ID NO: 29). Ambas as variantes são demonstradas como apresentando um decréscimo significativo na firmeza (Figura 11) e um aumento significativo na resiliência (Figura 12) indicando que as variantes 307R e 307K proporcionam efeitos antienvelhecimento significativos.
Exemplo 36. Teste da assadura com PMS 370 (SEQ ID NO: 31, 307H) e SSM 471 C04 (SEQ ID NO: 29, 307K)
PMS 370 é gerado usando a Mutagênese Direcionada a Múltiplos Sitios conforme descrito acima no Exemplo 3. A seqüência de PMS 370 é estabelecida como SEQ ID NO: 31.
Torrada americana é preparada por um procedimento de esponja e massa conforme descrito no Exemplo 10. A torrada é usada para testar as variantes PMS 370 com 307H e SSM 471 CO4 com 307K numa dosagem de 20, 40 e 60 BMK/Kg.
A torrada é avaliada quanto à resiliência conforme descrito nos Exemplos 12 e 14.
Figura 13 mostra os resultados de um teste de resiliência da torrada americana preparada com PMS 370 (SEQ ID NO: 31) e SSM 471 C04 (SEQ ID NO: 29).
Ambas as variantes são demonstradas como apresentando um aumento significativo na firmeza (Figura 13) com o aumento da dosagem, indicando que as variantes 307H e 307K proporcionam uma resiliência melhorada como função da dosagem. Entretanto, o efeito das dosagens da variante 307K é substancialmente mais forte do que o efeito das dosagens variantes 307H respectivas. Referências
Penninga, D., van der Veen, B.A., Knegtel, R.M., van Hijum, S.A., Rozeboom, H. J., Kalk, K.H., Dijkstra, B. W., Dij khuizen, L. (1996). The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251. J.Biol.Chem. 271, 32777-32784.
Sambrook J, F.E.M.T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 a Edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY.
Zhou, J.H., Baba,T., Takano,T., Kobayashi,S., Arai,Y. (1989). Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila. FEBS Lett. 255, 37- .41.
Cada um dos pedidos e patentes mencionadas neste documento, e cada documento citado ou referenciado em cada um dos pedidos e patentes acima, incluindo durante a execução de cada um dos pedidos e patentes ("documentos citados pelo pedido") e quaisquer instruções ou catálogos do fabricante para quaisquer produtos citados ou mencionados em cada um dos pedidos e patentes e em qualquer um dos documentos citados pelo pedido são por meio deste incorporados aqui por referência. Além disso, todos os documentos citados neste texto, e todos os documentos citados ou referenciados em documentos citados neste texto, e quaisquer instruções ou catálogos do fabricante para quaisquer produtos citados ou mencionados neste texto sao por meio deste incorporados aqui por referência.
Várias modificações e variações dos métodos e sistema descrito da invenção serão aparentes para as pessoas versadas na técnica sem sair do escopo e espirito da invenção. Embo ITcl cl invenÇa o tenha sido descrita -juntamente com modalidades especificas preferidas, deve ser entendido que a invenção conforme reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades especificas. De fato, várias modificações dos modos descritos para executar a invenção, as quais são óbvias para as pessoas versadas em biologia molecular ou campos relacionados são tencionadas para estarem dentro do escopo das reivindicações.

Claims (70)

1.Polipeptideo variante PS4 derivável de um polipeptideo de origem com atividade amilase, no qual o polipeptideo variante PS4 é caracterizado pelo fato de compreender uma substituição de aminoácido na posição 307 para lisina (K) ou arginina (R) , com referência à numeração de posição de uma seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.
2.Polipeptideo variante PS4, de acordo com a Reivindicação .1, caracterizado pelo fato de ser derivável de um polipeptideo de origem com atividade exoamilase, preferivelmente atividade exoamilase não-maltogênica.
3.Polipeptideo variante PS4, de acordo com a Reivindicação .1, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido na posição 307 é uma substituição para lisina (307K), preferivelmente H307K ou uma substituição para arginina (307R), preferivelmente H307R.
4.Polipeptideo variante PS4, de acordo com a Reivindicação .1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma substituição de aminoácido na posição 70.
5.Polipeptideo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido na posição 70 é uma substituição para ácido aspártico (70D), preferivelmente G70D.
6.Polipeptideo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 272 da seqüência do polipeptideo variante PS4 é histidina (H) .
7.Polipeptideo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 303 da seqüência do polipeptideo variante PS4 é glicina (G).
8.Polipeptideo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo variante PS4 compreende ainda uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo das posições: 33, 34, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 ou 334.
9.Polipeptideo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a(s) outra(s) mutação(ões) no polipeptideo variante PS4 são selecionadas do grupo consistindo de: 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 309P, 334P, preferivelmente N33Y, D34N, G121F, G134R, Al41P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, A309P e S334P.
10. Polipeptideo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo variante PS4 compreende as seguintes substituições 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, .157L, 161Α, 178F, 179Τ, 223Ε, 229Ρ, 307Κ, 309Ρ, 334Ρ, preferivelmente N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307K, A309P, S334P em relação à seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.
11. Polipeptideo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo variante PS4 compreende uma seqüência SEQ ID NO: 21 (pSac-pMS382).
12. Polipeptideo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo variante PS4 compreende as seguintes substituições 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, .157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307R, 309P, 334P, preferivelmente N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307R, A309P, S334P em relação à seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.
13. Polipeptideo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo variante PS4 compreende uma seqüência SEQ ID NO: 23 (pSac-pMS382R).
14. Polipeptideo variante PS4 derivável de um polipeptideo de origem com atividade de exoamilase não-maltogênica, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo variante PS4 compreende as seguintes substituições 33Y, 34N, 70D, .121F, 134R, 14 IP, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, .229P, 309P, 334P, preferivelmente N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, A309P, S334P em relação à seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.
15. Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo variante PS4 compreende uma seqüência SEQ ID NO: 25 (pSac-pMS382H).
16. Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de origem compreende uma exoamilase não- maltogênica, preferivelmente uma glucano-1,4-alfa- maltotetraidrolase (EC 3.2.1.60).
17. Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de origem é ou é derivável da espécie Pseudomonas, preferivelmente Pseudomonas saccharophilia ou Pseudomonas stutzeri.
18. Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de origem é uma exoamilase não- maltogênica da exoamilase de Pseudomonas saccharophilia com uma seqüência mostrada como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.
19.Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de ter uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 1 ou à SEQ ID NO: 5.
20.Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de origem é uma exoamilase não-maltogênica de Pseudomonas stutzeri com uma seqüência mostrada como SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 11.
21.Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8 ou 11, caracterizado pelo fato de que ter uma seqüência de aminoácido com pelo menos 75% de identidade em relação à SEQ ID NO: 7 ou à SEQ ID NO: 11.
22.Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência conforme estabelecido no relatório descritivo, reivindicações ou figuras.
23.Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 21 (pSac-pMS382) , SEQ ID NO: 23 (pSac-pMS3 82R) e SEQ ID NO: 25 (pSac-pMS382H).
24.Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo variante PS4 tem uma termoestabilidade maior em comparação com o polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem quando testado sob as mesmas condições.
25. Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a meia-vida (tl/2), preferivelmente a 60 graus C, é aumentada em 15% ou mais, pref erivelmente 50% ou mais, mais pref erivelmente 100% ou mais em relação ao polipeptídeo de origem ou do polipeptídeo do tipo selvagem.
26. Polipeptídeo variante PS4, de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que um produto alimentício tratado com um polipeptídeo variante PS4 tem qualquer uma ou mais, preferivelmente todas as seguintes propriedades: (a) menor firmeza; (b) maior resiliência; (c) maior coesão; (d) menor desagregação; e (e) maior capacidade de dobramento em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptídeo de origem ou com um polipeptídeo do tipo selvagem.
27. Polipeptídeo variante PS4, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a resiliência, coesão ou capacidade de dobramento do produto alimentício é independentemente aumentada por .15% ou mais, pref erivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 100% ou mais em relação ao produto alimentício, o qual foi tratado com um polipeptideo de origem ou com um polipeptideo do tipo selvagem.
28.Polipeptideo variante PS4, de acordo com a Reivindicação 2 6 ou 27, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre a resiliência, coesão ou capacidade de dobramento de um produto alimentício tratado com um polipeptideo variante PS4 é aumentada em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptideo de origem ou com um- polipeptideo do tipo selvagem.
29.Polipeptideo variante PS4, de acordo com a Reivindicação 2 6, caracterizado pelo fato de que a firmeza ou a desagregação do produto alimentício é independentemente reduzida por 15% ou mais, preferivelmente por 50% ou mais, mais preferivelmente 100% ou mais em relação ao produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptideo de origem ou com um polipeptideo do tipo selvagem.
30.Polipeptideo variante PS 4, de acordo com a Reivindicação 2 6 ou 29, caracterizado pelo fato de que cada uma dentre a firmeza e desagregação de um produto alimentício tratado com o polipeptideo variante PS4 é reduzido em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptideo de origem ou com um polipeptideo do tipo selvagem.
31. Polipeptideo, caracterizado pelo fato de compreender um fragmento de pelo menos 20 resíduos de um polipeptideo variante PS4 de acordo com qualquer reivindicação precedente, no qual o polipeptideo tenha atividade exoamilase não-maltogênica.
32. Polipeptideo, derivável de um polipeptideo variante PS4 de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de ser por uma mutação em um ou mais resíduos da seqüência do polipeptideo variante PS4, no qual o polipeptideo tem uma maior termoestabilidade ou uma maior exoespecificidade, ou ambos, em comparação com o polipeptideo de origem do polipeptideo variante PS4 com o polipeptideo do tipo selvagem, ou no qual um produto alimentício tratado com o polipeptideo variante PS4 tem qualquer uma ou mais, preferivelmente todas as propriedades a seguir: (a) menor firmeza; (b) maior resiliência; (c) maior coesão; (d) menor desagregação; ou (e) maior capacidade de dobramento em comparação com um produto alimentício o qual tenha sido tratado com um polipeptideo de origem ou com um polipeptideo do tipo selvagem.
33. Uso de um polipeptideo variante PS4, conforme estabelecido em qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de ser como um aditivo alimentar ou de ração.
34. Processo para tratar amido, caracterizado pelo fato de compreender o contato de amido com um polipeptideo, conforme estabelecido em qualquer uma das Reivindicações .1 a 32, e a permissão de que o polipeptideo gere a partir do amido de um ou mais produtos lineares.
35. Uso de um polipeptideo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de ser para o preparo de um produto alimentício ou ração.
36. Processo para preparar um produto alimentício ou ração, caracterizado pelo fato de compreender a mistura de um polipeptideo conforme estabelecido em qualquer uma das Reivindicações 1 a 32 com um ingrediente alimentício ou ração.
37. Uso, de acordo com a Reivindicação 35, ou um processo, de acordo com a Reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício compreende um produto de massa ou massa, preferivelmente um produto de massa processado.
38. Uso ou processo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é um produto de padaria.
39. Processo para fazer um produto de padaria, caracterizado pelo fato de compreender: (a) proporcionar um meio de amido; (b) adicionar ao meio de amido um polipeptideo conforme estabelecido em qualquer uma das Reivindicações 1 a 32; e (c) a aplicação de calor ao meio de amido durante ou após o passo (b) para produzir um produto de padaria.
40. Produto alimentício, produto de ração, produto de massa ou um produto de padaria, caracterizado pelo fato de ser obtido por um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 35 a 39.
41. Composição melhoradora para uma massa, caracterizada pelo fato de que a composição melhoradora compreende um polipeptídeo conforme estabelecido em qualquer uma das Reivindicações 1 a 32, e pelo menos um outro ingrediente de massa ou aditivo de massa.
42. Composição, caracterizada pelo fato de compreender farinha fina e um polipetídeo conforme estabelecido em qualquer uma das Reivindicações 1 a 32.
43. Uso de um polipeptídeo variante PS4, conforme estabelecido em qualquer uma das Reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de ser num produto de massa para retardar ou reduzir o envelhecimento, preferivelmente a retrogradação prejudicial do produto de massa.
44. Uso de um polipeptídeo variante PS4, conforme estabelecido em qualquer uma das Reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de ser num produto para melhorar qualquer uma ou mais das propriedades de firmeza, resiliência, coesão, desagregação ou capacidade de dobramento do produto de massa.
45.Combinação de polipeptideo variante PS4, conforme estabelecido em qualquer reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de ser juntamente com qualquer um ou mais dos seguintes: (a) alfa-amilase maltogênica, também chamada de glucan-1,4-a-maltoidrolase (EC 3.2.1.133) de Bacillus stearothermophilus ou uma variante, homólogo ou mutantes seus, os quais têm a atividade alfa-amilase maltogênica; (b) xilanase de padaria (EC 3.2.1.8) de Bacillus sp., Aspergillus sp. , Thermomyces sp. ou Triehoderma sp.; (c) α-amilase (EC 3.2.1.1) de Bacillus amyloliqufaeiens ou uma variante, homólogo ou mutantes seus, os quais têm atividade alfa-amilase; e (d) uma lipase, tal como glicolipase de Fusarium heterosporum.
46.Uso de uma combinação, de acordo com a Reivindicação 45, caracterizado pelo fato de ser para a aplicação em qualquer reivindicação precedente.
47.Produto alimentício ou de ração, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo tratamento com uma combinação de acordo com a Reivindicação 31.
48.Ácido nucléico, caracterizado pelo fato de ser capaz de codificar um polipeptideo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 32.
49. Ácido nucléico, de acordo com a Reivindicação 48, caracterizado pelo fato de ter uma seqüência de ácido nucléico a qual seja pelo menos 75% idêntica à SEQ ID NO: 6 ou à SEQ ID NO: 12.
50. Ácido nucléico, caracterizado pelo fato de compreender um fragmento de pelo menos 60 resíduos de um ácido nucléico, de acordo com a Reivindicação 48 ou 49, o qual seja capaz de codificar um polipeptídeo com atividade exoamilase não-maltogênica.
51. Seqüência de ácido nucléico derivável de uma seqüência de origem, caracterizada pelo fato de que a seqüência de origem é capaz de codificar uma exoamilase não- maltogênica, cuja seqüência de ácido nucléico compreende uma substituição em um ou mais resíduos, de modo que o ácido nucléico codifique um resíduo de lisina (R) ou arginina (K) na posição 307, opcionalmente juntamente com um ou mais outra (s) modificação/ões de modo que o ácido nucléico codifique um ou mais resíduos selecionados do grupo consistindo de: 33Y, 34N, 121F, .134R, 14 IP, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, .309P, 334P, com referência à numeração de posição de uma seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.
52. Seqüência de ácido nucléico PS4, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 4 8 a 52, caracterizada pelo fato de ser derivada de uma seqüência de origem codificando uma exoamiiase não-maitogênica pela substituição de um ou mais resíduos de nucleotídeo.
53.Seqüência de ácido nucléico PS4, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 4 8 a 52, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 22 (pSac-pMS382), SEQ ID NO: 24 (pSac- pMS382R) e SEQ ID NO: 26 (pSac-pMS382H).
54.Plasmídeo, caracterizado pelo fato de compreender um ácido nucléico PS4 de acordo com qualquer uma das Reivindicações 48 a 53.
55.Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender um ácido nucléico PS4 de acordo com qualquer uma das Reivindicações 48 a 54, ou capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 32.
56.Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender, preferivelmente transformada com um plasmídeo de acordo com a Reivindicação 54, ou um vetor de expressão de acordo com a Reivindicação 55.
57.Célula, caracterizada pelo fato de ser capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 32.
58.Célula hospedeira, de acordo com a Reivindicação 56, ou uma célula de acordo com a Reivindicação 57, caracterizada pelo fato de ser uma célula bacteriana, fúngica ou de levedura.
59.Método de expressão de um polipeptídeo variante PS4, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender a obtenção de uma célula hospedeira ou de uma célula de acordo com a Reivindicação 56, 57 ou 58, e a expressão do polipeptídeo da célula ou da célula hospedeira, e opcionalmente a purificação do polipeptídeo.
60.Método de alteração da seqüência de um polipeptídeo, prefervelmente de uma exoamilase não-maltogênica, caracterizado pelo fato de ser pela introdução de uma substituição de um aminoácido na posição 70 num resíduo básico ou positivamente carregado, opcionalmente juntamente com uma ou mais modificação/modificações selecionada(s) do grupo consistindo de: 33Y, 34N, 121F, 134R, 14 IP, 14 6G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272H, 303G, 309P, 334P (com referência à numeração de posição de uma seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1) num polipeptídeo de origem com atividade exoamilase não- maltogênica .
61.Método, de acordo com a Reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o resíduo básico ou positivamente carregado compreende lisina (K) , arginina (R) ou histidina (H).
62.Método, de acordo com a Reivindicação 60 ou 61, caracterizado pelo fato de que a seqüência da exoamilase não-maltogênica é alterada pela alteração da seqüência de um ácido nucléico, o qual codifique a exoamilase não- maltogênica.
63. Método de produção de uma variante de polipeptideo PS4, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender a introdução de uma substituição de aminoácido num polipeptideo de origem com atividade exoamilase não-maltogênica, a substituição do aminoácido sendo selecionada do grupo consistindo de: 33Y, 34N, .70K/R/H, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, .223E, 229P, 272H, 303G, 309P, 334P com referência à numeração de posição de uma seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.
64. Método, de acordo com a Reivindicação 62 ou 63, caracterizado pelo fato de que a seqüência de um ácido nucléico codificando o polipeptideo de origem é alterada para introduzir a substituição do aminoácido.
65. Método de alteração da seqüência de um ácido nucléico codificando uma exoamilase não-maltogênica, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender a introdução na seqüência de um códon, o qual codifique um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: 33Y, 34N, 70K/R/H, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, .161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272H, 303G, 309P, 334P com referência à numeração de posição de uma seqüência de exoamilase de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.
66.Método para aumentar a termoestabilidade ou a exoespecificidade, ou ambas, de um polipeptideo, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender os passos conforme estabelecidos em qualquer uma das Reivindicações 58 a 65.
67.Método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 a 66, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo é isolado ou purificado, ou ambos.
68.Polipeptideo, caracterizado pelo fato de ser obtenivel por um método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 58 a 67.
69.Polipeptideo, caracterizado pelo fato de ser obtenivel por um método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 58 a 68.
70.Polipeptideo variante PS4, uso, processo, produto alimentício, produto de ração, produto de massa, produto de padaria, composição melhoradora, composição, ácido nucléico, vetor ou célula hospedeira, caracterizado pelo fato de ser conforme anteriormente aqui descrito com referência a e conforme apresentado nos desenhos associados.
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