BRPI0713963A2 - conjugados de proteìna e métodos para sua preparação - Google Patents

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Abstract

CONJUGADOS DE PROTéINA E MéTODOS PARA SUA PREPARAçãO. A presente invenção refere-se à aminação redutora dos aldeídos derivados de peptídeo com anilinas ou heteroarilaminas que contêm um grupo de modificação de propriedade que provê novos conjugados de proteína hidroliticamnete estáveis adequados para terapia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGA- DOS DE PROTEÍNA E MÉTODOS PARA SUA PREPARAÇÃO".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se aos novos conjugados de proteína e novos conjugados de hormônios do crescimento com propriedades farma- cológicas melhoradas, aos métodos para a preparação dos mesmos, e uso ao dos ditos conjugados em terapia.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
É bem-conhecido que as propriedades das proteínas podem ser modificadas conjugando covalentemente grupos para as ditas proteínas. Tal conjugação geralmente requer algum grupo funcional na proteína para reagir com outro grupo funcional no composto a ser conjugado para a proteína. Tipicamente, grupos amino, tais como grupo amino de terminal N, e grupo ε- amino em Iisinas ou o grupo de cisteína tiol têm sido usados em combinação com um reagente de acilação ou alquilação apropriado.
É muitas vezes desejado se conjugar em sítios específicos, por- que a atividade biológica de uma proteína quimicamente modificada vai de- pender do sítio de modificação, e isso é referido como conjugação regiosse- letiva. A acilação regiosseletiva de hormônios do crescimento, tais como, por exemplo, hormônio de crescimento de ser humano (hGH) é, entretanto, difícil porque essa proteína contém nove resíduos de Iisina de reatividade similar, e usualmente resulta em misturas de produtos. Os componentes únicos des- sas misturas são difíceis para isolar e dessa maneira, usualmente serão ob- tidos somente em baixo rendimento e pureza.
Uma estratégia para alcançar a conjugação regiosseletiva de um grupo modificador de propriedades para uma proteína consiste, em gerar um grupo funcional na proteína, que não pode ser encontrado nos aminoácidos proteinogênicos naturais. Tal grupo funcional único pode, por exemplo, ser um aldeído ou uma cetona, uma alquina, ou uma azida.
Em particular, os aldeídos derivados de proteína têm muitas ve- zes sido usados para a conjugação de grupos de modificação de proprieda- de para proteínas. Essa conjugação pode ser realizada tratando o aldeído derivado de proteína com uma alcoxilamina (R-O-NH2) para formar uma o- xima, com derivados de hidrazina para formar hidrazonas, ou com 2- aminoetanotióis para formar tiazolidinas (vide por exemplo Zhang and Tam, Analytical Biochemistry 233, 87-93 (1996); Zatsepin et al.f Bioconjugado Chemistry 13, 822-830 (2002)). Todos esses grupos funcionais de conjuga- ção são hidroliticamente instáveis, e podem ser hidrolizados através de tra- tamento com ácidos ou bases (Shao and Tam, J. Am. Chem. Soe. 117, .3893-3899 (1995)) em taxas muito mais altas do que as ligações de peptí- deos normais. Por esse motivo, os conjugados mencionados acima se de- compõem lentamente em solução aquosa, o que limita a utilidade deles.
Gaertner et al (Bioconjugado Chem. 7, 38-44 (1996)) descreve um método para conjugar Polietileno glicol (PEG) à IL-8, G-CFS e IKL-Ira gerando um aldeído no terminal N dessas proteínas, seguido pela reação com um PEG de alcoxiamina- funcionalizada. O aldeído é gerado em um terminal N ou por oxidação com periodato se o resíduo de aminoácido do terminal N é serina ou treonina, ou por desaminação oxidativa catalizada ou metal se o resíduo de aminoácido do terminal N é diferente de serina.
O hormônio de crescimento humano de serina-extendida de ter- minal N, Ser-hGH, é descrito como SEQ ID No. 66 em WO 04/007687. Esse pedido refere-se a formas multiméricas de, por exemplo, hGH com proprie- dades melhoradas.
O US 20040127417 descreve a alquilação redutora de hormônio de crescimento nativo com um aldeído derivado de PEG. No dito procedi- mento a ligeira diferença em basicidade entre os grupos amino de cadeia lateral de Iisina e o grupo amino do terminal N é explorado: a formação de imina sob condições acídicas com o grupo amino de terminal N menos ex- tensivamente protonado é mais rápida do que a formação de imina com as cadeias laterais de lisina, de tal modo que a PEGilação regiosseletiva do aminoácido do terminal N pode ser alcançada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção provê peptídeos conjugados de acordo com a fórmula (I) <formula>formula see original document page 4</formula> (I)
em que
Prot representa um radical derivado de peptídeo gerado pela re- moção formal de um átomo de hidrogênio de um grupo amino (-NH2) do dito peptídeo,
R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substi- tuído com um grupo C-i-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou arila;
R2 representa uma ligação ou um ligante, em que o dito Iigante compreende um dirradical selecionado do grupo que consiste em <formula>formula see original document page 4</formula> , e combinaçoes dos mesmos, e
R3 representa um grupo de modificação da propriedade;
R4 representa hidrogênio ou C-|.6-alquila;
R5 representa -CH2- ou -C(=0)-,
ou sais, pró-fármacos e solvatos dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis.
A presente invenção provê métodos para preparar um composto de peptídeo compreendendo um grupo de modificação da propriedade, o dito método compreendendo as etapas de
(a) tratamento de um aldeído ou cetona derivado do composto de peptídeo com uma anilina ou heteroarilamina derivada do grupo de modi- ficação da propriedade para render uma imina ou um hemiaminal,
(b) tratamento dessa imina ou hemiaminal com um agente de redução apropriado, tal como NaCNBH3, para render uma amina secundária.
A presente invenção provê compostos de fórmula (III)
R3-R-R-NH2
(III)
em que R11 R21 e R3 são como definido acima.
A presente invenção provê compostos de acordo com a presente invenção para uso em terapia.
A presente invenção provê preparações farmacêuticas compre- endendo um composto de acordo com a presente invenção.
A presente invenção provê métodos de tratar doenças benefici- ando-se de um aumento no nível de circulação do hormônio do crescimento, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um composto ou uma preparação farmacêutica de acordo com a presente invenção para um paciente com necessidade do mesmo.
A presente invenção provê o uso de um composto de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença se beneficiando de um aumento no nível de hormônio de cres- cimento em circulação.
DESCRIÇÃO DA FIGURA
Figura 1, Mudança no peso corporal comparada ao Dia 0 de ratos Sprague Dawley hipofissectomisados depois de uma dose subcutânea única do composto do exemplo 2.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se aos novos peptídeos e novos com- postos de hormônios de crescimento (GH) regiosseletivamente conjugados para melhorar as propriedades farmacológicas comparadas ao peptídeo pa- rente. Essa descrição também provê métodos para a preparação desses compostos, e para o seu uso para o tratamento de doenças. Os conjugados da presente invenção são desprovidos de grupos que podem ser hidroliza- dos mais prontamente do que as ligações de peptídeo, e a estabilidade de- les deverá portanto ser similar à estabilidade dos peptídeos não-conjugados.
De acordo com a presente invenção, aldeídos peptídeo-derivados (ou "aldeídos derivados de peptídeo") podem ser com precisão acoplados às anilinas ou heteroarilaminas PEG-derivadas. Devido à basicidade mais baixa de anilinas e heteroarilaminas, se comparadas às aminas alifáticas tais como os grupos amino de cadeia lateral de Iisina ou o grupo amino de terminal N de peptídeos ou proteínas, e por causa da alta estabilidade de iminas deri- vadas de anilina- ou heteroarilamina (conjugação da ligação dupla de imina com o sistema aromático), uma formação de imina seletiva entre a funciona- lidade de aldeído do peptídeo e a anilina ou heteroarilamina é observada. A redução dessa imina leva à formação de N-alquila anilinas/heteroarilaminas estáveis.
Desta maneira, em uma modalidade, essa invenção provê com- postos de fórmula (I)
<formula>formula see original document page 6</formula> (I) em que Prot representa um radical derivado de peptídeo gerado pela re- moção formal de um átomo de hidrogênio de um grupo amino (-NH2) do dito peptídeo,
R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substi- tuído com um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou arila; R2 representa uma ligação ou um ligante, em que o dito Iigante compreende um dirradical selecionado do grupo que consiste em -C(=0)-NH-, -NH-, -O-, -S-, -O-P(O)(OH)-O-, -0-C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-NH-,
-(CH2)MO-, -0-(CH2)3-NH-C(=0)-, -C(=0)NH(CH2)2.3O-, -(CH2)-1-30C(=0)NH(CH2)2-3o-, -(CH2)o-30C(=0)NH-(CH2CH20)i-io-(CH2)i-5-C(=0)-, -C(=0)NH-[(CH2CH20)i-10-(CH2)1.5-C(=0)]1.5NH(CH2)2-30-, -C(=0)-, -(CH2)1-30- NHC(=0)-, -(CH2)i-3oC(=0)-, -NHC(=0)NH(CH2)2-3o-, -(CH2)1-so- NHC(=0)NH(CH2)2.3o-, -(CH2)o-3oC(=0)NH(CH2)2-3o-NHC(=0)-(CH2)o-3o-, -(CH2)o.3oC(=0)NH(CH2CH20)i.3o-CH2CH2NHC(=0)-(CH2)o.3o-, ou
-NH(CH2)2-30-
<formula>formula see original document page 7</formula>
e combinações dos mesmos, e
R3 representa um grupo de modificação da propriedade; R4 representa hidrogênio ou Ci-6-alquila; R5 representa -CH2- ou -C(=0)-,
ou sais, pró-fármacos e solvatos dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis.
Birradicais assimétricos são destinados a ser conectáveis a ou-
tros fragmentos moleculares em ambas as possíveis direções, isto é, um birradical tal como -C(=0)-NH- representa ambos -C(=0)-NH- e -HN-(C=O)-.
Os ditos compostos têm propriedades farmacológicas melhora- das em compração ao peptídeo não-conjugado correspondente. Exemplos de tais propriedades farmacológicas incluem média de vida funcional in vivo, imunogenicidade, filtragem renal, proteção de protease e ligação de albumi- na.
O termo "peptídeo" é destinado a indicar uma seqüência de dois ou mais aminoácidos unidos pelas ligações de peptídeo, em que os ditos aminoácidos podem ser naturais ou não-naturais. O termo abrange os ter- mos polipeptídeos e proteínas, que podem consistir de dois ou mais polipep- tídeos mantidos juntos por interações covalentes, tais como, por exemplo, pontes de cisteína, ou inerações não -covalentes. Deve-se entender que o termo é também destinado a incluir peptídeos, que foram derivados, por e- xemplo, pela ligação de grupos lipofílicos, PEG ou grupos prostéticos.
O termo "aldeído derivado de peptídeo (ou cetona)" ou "aldeído (ou cetona) derivado de um peptídeo" é destinado a indicar um peptídeo ao qual um aldeído ou grupo funcional cetona foi covalentemente ligado, ou um peptídeo em que um aldeído ou grupo funcional cetona foi gerado. A prepa- ração de aldeídos derivados de peptídeo á bem-conhecida daqueles versa- dos na técnica, e qualquer um desses procedimentos conhecidos pode ser usado para preparar o aldeído derivado de peptídeo necessário para a reali- zação da invenção descrita aqui a seguir.
No presente contexto, o termo "alquila" é destinado a indicar um radical de hidrocarboneto monovalente saturado linear ou ramificado. O ter- mo "alquileno" indica o dirradical correspondente. Uma "alquila inferior" é uma alquila que tem de 1 a 6 átomos de carbono, também designada como C-i-6-alquila. Grupos CWaIquiIa incluem, por exemplo, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, sec-butila, isobutila, terc-butila, n-pentila, 2-metilbutila, 3- metilbutila, 4-metilpentila, n-hexila, 1,1-dimetilpropila, 1,2-dimetilpropila, 2,2- dimetilpropila (neopentila) e 1,2,2-trimetilpropila.
O termo "arila" como usado aqui a seguir é destinado a indicar um radical de anel aromático carbocíclico mono- ou policíclico com, por e- xemplo, 6 a 8 átomos de membro, ou um radical de sistema de anel aromáti- co com por exemplo de 12 a 18 átomos membros. Arila é também destinada a incluir os derivados parcialmente hidrogenados dos sistemas carbocíclicos, em que pelo menos um anel é aromático. Exemplos de tais derivados parci- almente hidrogenados incluem 1,2,3,4-tetraidronaftila, fluorenila e 1,4- diidronaftila.
O termo "heteroarila" como usado aqui a seguir é destinado a in- dicar um radical de anel aromático heterocíclico mono- ou policíclico com, por exemplo, 5 a 7 átomos membro, ou um radical de sistema de anel aro- mático heterocíclico com por exemplo de 7 a 18 átomos membros, contendo um ou mais heteroátomos selecionados de nitrogênio, oxigênio, e enxofre, em que N-óxidos e monóxidos de enxofre e dióxidos de enxofre são substitu- ições heteroaromáticas permissíveis, tais como por exemplo furila, tienila, tiofenila, pirrolila, oxazolila, tiazolila, imidazolila, pirazolila isoxazolila, oxadia- zol, tiadiazolila, isotiazolila, 1,2,3-triazolila, 1,2,4-triazolila, piranila, piridila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, 1,2,3-triazinila, 1,2,4-triazinila, 1,3,5- triazi- nila, 1,2,3-oxadiazolila, 1,2,4-oxadiazolila, 1,2,5-oxadiazolila, 1,3,4- oxadiazolila, 1,2,3-tiadiazolila, 1,2,4-tiadiazolila, 1,2,5-tiadiazolila, 1,3,4- tiadiazolila, tetrazolila, tiadiazinial, indolila, isoindolila, benzofurila, benzotieni- Ia, indazolila, benzimidazolila, benztiazolila, benzisotiazolila, benzoxazolila, benzisoxazolila, purinila, quinazolinila, quinolizinila, quinolinila, isoquinolinila, quinoxalinila, naftiridinila, pteridinila, carbazolila, azepinila, diazepinila, acri- dinila e os similares. Heteroarila é também destinada a incluir os derivados parcialmente hidrogenados dos sistemas heterocíclicos, desde que pelo me- nos um anel que compreende um heteroátomo seja aromático. Exemplos de tais derivados parcialmente hidrogenados incluem 2,3-diidrobenzofuranila, pirrolinila, pirazolinila, indolinila, oxazolidinila, oxazolinila e oxazepinila.
Exemplos de "arila" e "heteroarila" incluem, mas não são Iimita- dos a fenila, bifenilila, indenila, fluorenila, fenantrenila, azulenila, naftila (1- naftila, 2-naftila), antracenila (1- antracenila, 2- antracenila, 3- antracenila), tienila (2-tienila, 3-tienila), furila (2-furila, 3-furila), indolila, oxadiazolila, iso- xazolila, tiadiazolila, oxatriazolila, tiatriazolila, quinazolina, fluorenila, xanteni- Ia1 isoindanila, benzidrila, acridinila, tiazolila, pirrolila (1-pirrolila, 2-pirrolila, 3- pirrolila), pirazolila (1-pirazolila, 3-pirazolila, 4-pirazolila, 5-pirazolila), imida- zolila (1-imidazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila, 5-imidazolila), triazolila (1,2,3-triazol-1 -ila, 1,2,3-triazol-4-ila 1,2,3-triazol-5-ila, 1,2,4-triazol-3-ila, .1,2,4-triazol-5-ila), oxazolila (2-oxazolila, 4-oxazolila, 5-oxazolila), isooxazoli- Ia (isooxazo-3-ila, isooxazo-4-ila, isooxaz-5-ila), isotiazolila (isotiazo-3-ila, isotiazo-4-ila, isotiaz-5-ila) tiazolila (2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila), piridila (2-piridila, 3- piridila, 4- piridila), pirimidinila (2-pirimidinila, 4-pirimidinila, 5- pirimidinila, 6-pirimidinila), pirazinila, piridazinila (3- piridazinila, 4-piridazinila, .5-piridazinila), quinolila (2-quinolila, 3-quinolila, 4-quinolila, 5-quinolila, 6- quinolila, 7-quinolila, 8-quinolila), isoquinolila (1-isoquinolila, 3-isoquinolila, 4- isoquinolila, 5-isoquinolila, 6-isoquinolila, 7-isoquinolila, 8-isoquinolila), ben- zo[b]furanila (2-benzo[b]furanila, 3-benzo[b]furanila, 4-benzo[b]furanila, 5- benzo[b]furanila, 6-benzo[b]furanila, 7-benzo[b]furanila), 2,3-diidro-benzo[b] furanila (2-(2,3-diidro-benzo[b]furanila), 3-(2,3-diidro-benzo[b]furanila), 4- (2,3-diidro-benzo[b]furanila), 5-(2,3-diidro-benzo[b]furanila), 6-(2,3-diidro- benzo[b]furanila), 7-(2,3-diidro-benzo[b]furanila)), benzo[b]tiofenila (ben- zo[b]tiofen-2-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, benzo[b]tiofen-4-ila, benzo[b]tiofen-5- ila, benzo[b]tiofen-6-ila, benzo[b]tiofen-7-ila), 2,3-diidro-benzo[b]tiofenila (2,3- diidro-benzo[b]tiofen-2-ila, 2,3-diidro-benzo[b]tiofen-3-ila, 2,3-diidro- benzo[b]tiofen-4-ila, 2,3-diidro-benzo[b]tiofen-5-ila, 2,3-diidro-benzo[b]tiofen- .6-ila, 2,3-diidro-benzo[b]tiofen-7-ila), indolila (1-indolila, 2-indolila, 3-indolila, .4-indolila, 5-indolila, 6-indolila, 7-indolila), indazol (1-indazolila, 3-indazolila, .4-indazolila, 5-indazolila, 6-indazolila, 7-indazolila), benzimidazolila (1- benzimidazolila, 2-benzimidazolila, 4-benzimidazolila, 5-benzimidazolila, 6- benzimidazolila, 7-benzimidazolila, 8-benzimidazolila), benzoxazolila (2- benzoxazolila, 3-benzoxazolila, 4-benzoxazolila, 5-benzoxazolila, 6-benzoxa- zolila, 7-benzoxazolila), benzotiazolila (2-benzotiazolila, 4-benzotiazolila, 5- benzotiazolila, 6-benzotiazolila, 7-benzotiazolila), carbazolila (1-carbazolila, .2-carbazolila, 3-carbazolila, 4-carbazolila), 5H-dibenz[b,f]azepina (5H- dibenz[b,f]azepin-1 -ila, 5H-dibenz[b,f]azepin-2-ila, 5H-dibenz[b,f]azepin-3-ila, 5H-dibenz[b,f]azepin-4-ila, 5H-dibenz[b,f]azepin-5-ila), 10,11-diidro-5H- dibenz[b,f]azepina (10,11-diidro-5H-dibenz[b,f]azepin-1-ila, 10,11-diidro-5H- dibenz[b,f]azepin-2-ila, 10,11-diidro-5H-dibenz[b,f]azepin-3-ila, 10,11-diidro- .5H-dibenz[b,f]azepin-4-ila, 10,11 -diidro-5H-dibenz[b,f]azepin-5-ila), ben- zo[1,3]dioxol (2-benzo[1,3]dioxol, 4-benzo[1,3]dioxol, 5-benzo[1,3]dioxol, 6- benzo[1,3]dioxol, 7-benzo[1,3]dioxol), e tetrazolila (5-tetrazolila, N-tetrazolila).
O termo "arileno" como usado aqui a seguir é destinado a indicar um derivado dirradical de um anel aromático mono- ou policíclico carbocícli- co com, por exemplo, 6 a 8 átomos membros (para um anel monocíclico), ou por exemplo de 12 a 18 átomos membros (para um anel policíclico). Exem- plos de "arileno" incluem, mas não são limitados a, benzeno-1,4-diila, nafta- leno-1,8-diila, 1,2-fenileno, 1,3-fenileno, 1,4-fenileno, 1,2-naftileno, 1,4- naftileno, 4,4'-bifenileno, 4,4"-terfenileno e 4,4'"-quaterfenileno e os similares e também qualquer dirradial correspondente dos radicais mencionados como exemplos de "arila".
O termo "heteroarileno" como usado aqui a seguir é destinado a indicar um dirradical derivado de um anel aromático heterocíclico mono- ou policíclico, com por exemplo 5 a 18 átomos membros, contendo um ou mais heteroátomos selecionados de nitrogênio, oxigênio, e enxofre, em que N- óxidos e monóxidos de enxofre e dióxidos de enxofre são substituições hete- roaromáticas permissíveis. Exemplos de "heteroarileno" usado aqui a seguir são furano-2,5-diila, tiofeno-2,4-diila, 1 ,3,4-oxadiazol-2,5-diila, 1,3,4-tiadiazol-2,5-diila, 1,3-tiazol-2,4-diila, 1,3-tiazol-2,5-diila, piridina-2,4-diila, piridina-2,3- diiia, piridina-2,5-diila, pirimidina-2,4-diila, quinoline-2,3-diila, 2,5-piridinadiila,1,2,4-pirazol-2,5-diila, imidazol-1,2-diila, tiazol-2,4-diila, (4-fenilaimidazol)-4,1'-diila e (3,5-difenil-1,2,4-oxadiazol)-4,4"-diila e os similares e também qualquer dirradical correspondente os radicais mencionados como exemplos de "heteroarila".
O termo 'Iigante1 é destinado a significar um dirradical orgânico com um peso molecular de 14 a 5000,
O termo "grupo de modificação de propriedade" é destinado a in- dicar um grupo químico, que, quando ligado ao peptídeo em questão altera uma ou mais das propriedades fisicoquímicas ou farmacológicas do peptí- deo. Tais propriedades podem ser solubilidade, distribuição de tecido e ór- gão, lipofilicidade, susceptibilidade à degradação por várias proteases, afini- dade às proteínas de plasma, tais como albumina, média de vida funcional in vivo, média de vida do plasma in vivo, tempo médio de residência, depura- ção, imunogenicidade, e filtragem renal. É bem-conhecido na técnica que diversos tipos de grupos químicos podem ter tais efeitos modificadores de propriedades.
O termo "média de vida funcional in vivo" é usado em seu signifi- cado normal, isto é, o tempo em que 50% da atividade biológica do peptídeo, por exemplo, hormônio do crescimento, ou peptídeo conjugado, por exem- pio, ainda está presente no corpo/órgão alvo, ou o tempo em que a atividade do peptídeo, por exemplo hormônio do crescimento, ou peptídeo, por exem- plo hormônio do crescimento, o conjugado é 50% de seu valor inicial. Como uma alternativa para determinar a média de vida funcional in vivo, a "média de vida de plasma in vivo" pode ser determinada, isto é, o tempo em que50% do peptídeo, por exemplo, hormônio do crescimento, ou peptídeo, por exemplo hormônio do crescimento, conjugado circula no plasma ou corrente sangüínea para ser depurado. A determinação da média de vida do plasma é em geral mais simples do que determinar a média de vida funcional, e a magnitude da média de vida do plasma é usualmente uma boa indicação da magnitude da média de vida funcional in vivo. Termos alternativos para mé- dia de vida do plasma incluem média de vida de soro, média de vida em cir- culação, média de vida circulatória, depuração de soro, depuração de plas- ma, e média de vida da depuração.
A mensuração da média de vida do plasma in vivo pode ser reali- zada de diversas maneiras como descrito na literatura. Um aumento na mé- dia de vida do plasma in vivo pode ser quantificado como uma diminuição em depuração (CL) ou como um aumento no tempo médio de residência (MRT). Peptídeo conjugado, por exemplo hormônio do crescimento, da pre- sente invenção para o qual o CL é diminuído até menos de 70%, tal como menos de 50%, tal como menos de 20%, tal como menos de 10% da CL do peptídeo parente como determinado em um ensaio apropriado, é dito ter um aumento da média de vida do plasma in vivo. Peptídeo conjugado, por e- xemplo hormônio do crescimento, da presente invenção para o qual a MRT é aumentada para mais de 130%, tal como mais de 150%, tal como mais de200%, tal como mais de 500% do MRT do peptídeo parente em um ensaio apropriado, é dito ter uma média de vida do plasma in vivo aumentada. De- puração e tempo médio de residência podem ser avaliados em estudos far- macocinéticos padrão usando animais de teste apropriados. Está dentro da capacidade de uma pessoa versada na técnica escolher um animal de teste apropriado para um dado peptídeo. Testes em seres humanos, naturalmen- te, representam o teste fundamental. Animais de teste apropriados incluem ratos machos, camundongos Sprague-Dawley e macacos cinomólogos nor- mais. Tipicamente em camundongos e ratos é injetado um único bolo subcu- tâneo, enquanto nos macacos pode ser injetado um único bolo subcutâneo ou uma única dose intravenosa. A quantidade injetada depende do animal de teste. Subseqentémente, amostras de sangue são tiradas durante um período de um a cinco dias, conforme apropriado, para a avaliação de CL e MRT. As amostras de sangue são convenientemente analisadas por técni- cas de ELISA. O termo "imunogenicidade" de um composto refere-se à capaci- dade do composto, quando administrado a um ser humano, de extrair uma resposta imune deletéria, quer seja humoral, celular, ou ambas. Em qualquer subpopulação humana, podem existir indivíduos que mostram sensibilidade a peptídeos administrados em particular. A imunogenicidade pode ser medi- da por quantificar a presença de anticorpos contra o peptídeo e/ou células T de peptídeo receptivo em um indivíduo sensível, usando os métodos con- vencionais conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o GH conjugado da presente invenção exibe uma diminiução em imunogenicidade em um indiví- duo sensível de pelo menos cerca de 10%, preferably pelo menos cerca de 25%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 40% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 50%, relativo à imunogenicidade para aquele indivíduo de GH parente. Em outro aspecto, imunogenicidade pode referir-se à res- posta típica em uma população de indivíduos similares, tal como a resposta típica de uma população de pacientes em uma experiência clínica.
O termo "proteção de protease" ou "protease protegida" como usado aqui a seguir é destinado a indicar que o peptídeo conjugado, por e- xemplo o hormônio do crescimento da presente invenção é mais resistente à peptidase ou proteases do plasma do que é o peptídeo parente. Enzimas de protease e peptidase presentes no plasma são conhecidas por estarem en- volvidas na degradação das proteínas e peptídeos em circulação, tais como por exemplo homônios de peptídeos em circulação, tal como o hormônio do crescimento. Os peptídeos conjugados da presente invenção podem tam- bém ser mais resistentes à degradação pelas proteases presentes em certos tecidos e órgãos, por exemplo as proteases presentes no pulmão, e os pep- tídeos conjugados devem ser dessa maneira mais adequados para a distri- buição pulmonar ou nasal do que os peptídeos não-conjugados correspon- dentes.
A resistência de um peptídeo à degradação por, por exemplo, di- peptidil aminopeptidase IV (DPPIV) é determinada pelo ensaio de degrada- ção a seguir: alíquotas do peptídeo (5 nmols) são incubadas a 37°C com 1 μL de dipeptidila aminopeptidase purificada IV que corresponde a uma ativi- dade enzimática de 5 mU por 10-180 minutos em 100 μΙ_ de 0,1 M de tam- pão de trietilamina-HCI, pH 7,4. As reações enzimáticas são terminadas pela adição de 5 μ!_ de 10% de ácido trifluoroacético, e os produtos de degrada- ção do peptídeo são separados e quantificados usando a análise de HPLC. Um método para realizar essa análise é : As misturas são aplicadas sobre um Vydac C18 de poros abertos (30 nm de poros, 5 pm em partículas) colu- na de 250 χ 4,6 mm e depuração a uma taxa de fluxo de 1 ml/min com gra- dientes lineares em etapas de acetonitrila em 0,1% de ácido trifluoroacético (0% de acetonitrila por 3 min, 0-24% de acetonitrila por 17 min, 24-48% de acetonitrila por 1 min), de acordo com Siegel et al., Regul. Pept. 79, 93-102 (1999) and Mentlein et al. Eur. J. Biochem. 214, 829-35 (1993). Os peptídeos e seus produtos de degradação podem ser monitorados através de sua ab- sorvência a 220 nm (ligações de peptídeo) ou 280 nm (aminoácidos aromáti- cos), e são quantificados pela integração de suas áreas de pico relacionadas aqueles padrões. A taxa de hidrólise de um peptídeo por dipeptidila amino- peptidasa IV é estimada em horas de incubação que resulta em menos de .10% do peptídeo que está sendo hidrolisado. A resistência a outras protea- ses ou peptidases de plasma pode ser determinada de maneiras similares. Em uma modalidade, a taxa de hidrólise do peptídeo, por exemplo, o hormô- nio do crescimento conjugado é menos de 70%, tal como menos de 40%, tal como menos de 10% daquele peptídeo parente.
O componente de proteína mais abundante na circulação san- güínea de espécies de mamíferos é a albumina do soro, que está normal- mente presente em uma concentração de aproximadamente 3 a 4,5 gramas por 100 mL do sangue todo. A albumina do soro é uma proteína do sangue de aproximadamente 70,000 dáltons que tem diversas funções importantes no sistema circulatório. Ela funciona como um transportador de uma varie- dade de moléculas orgânicas encontradas no sangue, como o principal transportador de vários metabólitos tais como ácidos graxos e bilirubina a- través do sangue, e, devido a sua abundância, como um regulador osmótico do sangue em circulação. A albumina do soro tem uma média de vida de mais de uma semana, e uma abordagem para aumentar a média de vida de plasma de peptídeos tem sido conjugar ao peptídeo um grupo que liga à al- bumina do soro. A propriedade de ligação da albumina pode ser determina- da como descrito em J. Med. Chem1 43, 1986-1992 ( 2000), que está incor- porado aqui a seguir por referência.
Em uma modalidade, a propriedade modificada pelo grupo de modificação de propriedade é a média de vida funcional in vivo do composto de peptídeo. Em uma modalidade, adicional a média de vida funcional in vivo do composto de peptídeo é aumentada em comparação ao composto de peptídeo sem o grupo de modificação da propriedade.
O termo "aumentado" como usado em conexão com a média de vida funcional in vivo ou média de vida do plasma, é usado para indicar que a média de vida relevante do peptídeo, por exemplo o hormônio do cresci- mento conjugado, é estatisticamente aumentada de maneira siignificativa em relação àquela do peptídeo parente, como determinado sob condições com- paráveis. Por exemplo, a média de vida relevante pode ser aumentada por pelo menos cerca de 25%, tal como por pelo menos cerca de 50%, por e- xemplo por pelo menos cerca de 100%, 150%, 200%, 250%, ou 500%. Em uma modalidade, os compostos da presente invenção exibem um aumento na média de vida de pelo menos cerca de 5 horas, preferivelmente pelo me- nos cerca de 24 horas, mais preferivelmente pelo menos cerca de 72 horas, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 7 dias, relativo à média de vida do GH parente.
Em uma modalidade, a propriedade modificada pelo grupo de modificação de propriedades é a média de vida do plasma in vivo do com- posto de peptídeo. Em uma modalidade, adicional a média de vida do plas- ma in vivo do peptídeo é aumentada quando comparada ao composto de peptídeo sem o grupo de modificação da propriedade. Em uma modalidade, adicional a média de vida do plasma in vivo do peptídeo é aumentada por 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 10 horas, 1 dias, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias,14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias,19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias,23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, ou 30 dias. Em uma modalidade, R3 representa um polímero ou oligômero li- near ou ramificado, opcionalmente substituído com grupos funcionais acídi- cos ou negativamente carregados (tais como por exemplo grupos carboxila, grupos tetrazolila, grupos acilsulfonila, grupos fosfonila, grupos de ácido bo- rônico, fosfatos, sulfatos etc), com grupos funcionais básicos ou catiônicos (por exemplo grupos amino, grupos amônio, grupos fosfônio), ou com com- binações dos mesmos; ou R3 representa um grupo alquila Ci0-C90 linear ou ramificado, opcionalmente substituído com grupos funcionais acídicos ou negativamente carregados (por exemplo grupos carboxila, grupos tetrazolila, grupos acilsulfonila, grupos fosfonila, grupos acídicos borônicos, fosfatos, sulfatos, etc), com grupos funcionais básicos ou catiônicos (por exemplo grupos amino, grupos amônio, grupos fosfônio), ou com combinações dos mesmos.
O termo "polímero" como usado aqui a seguir é destinado a indi- car uma molécula grande que consiste em unidades estruturais e unidades de repetição conectas por ligações químicas covalentes. Os polímeros são distinguidos de outras moléculas na repetição de muitas sub-unidades mole- culares idênticas, similares ou complementares, também conhecidas como monômeros nessas cadeias. Os monômeros são moléculas pequenas de peso molecular baixo a moderado, e são ligadas umas às outras por políme- rização. Em vez de serem idênticos, monômeros similares podem ter substi- tuintes químicos variados. As diferenças entre monômeros podem afetar propriedades tais como solubilidade, flexibilidade e resistência. Os polímeros podem ser orgânicos ou inorgânicos. Exemplos de polímeros para uso com a presente invenção são polietileno glicol (PEG) linear ou ramificado, polo- xâmero, ácido poli(láctico), copolímeros de polilactideo-glicolídeo, oligossa- carídeo, peptídeos, proteínas, e oligossacarídeos lineares ou ramificados selecionados de tais como celulose, amido, ácido hialurônico, ágar, hidroxie- til celulose, hidroxietil amido ou pentosano, ou combinações dos mesmos.
O termo "oligômero" como usado aqui a seguir é destinado a in- dicar uma molécula grande que consiste em unidades estruturais e unidades de repetição conectadas por ligações químicas covalentes, e que consiste em um número conhecido relativamente pequeno de unidades de monôme- ros, em contraste ao polímero que consiste em um número grande, desco- nhecido de monômeros.
Em uma modalidade, R3 representa um polietileno glicol (PEG) Ii- near ou ramificado, poloxâmero, ácido poli(láctico), copolímero poli(lactídeo)- glocólido, oligossacarídeo, peptídeos, proteínas, ou combinações dos mes- mos, opcionalmente substituídos com grupos funcionais acídicos ou negati- vamente carregados, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combinações dos mesmos.
O termo "polietileno glicol", "Peg" ou "PEG" (poli(eí/'teno glicol) significa um dirradical polidisperso ou monodisperso da estrutura
em que η é um número inteiro maior do que 1, e seu peso mole- cular está entre aproximadamente 100 e aproximadamente 1,000,000 Da.
O termo "mPEG" ou "mPeg" significa um radical polidisperso ou monodisperso da estrutura
<formula>formula see original document page 17</formula>
em que m é um número inteiro maior do que 1, Dessa maneira, um mPEG em que m é 90 tem um peso molecular de 3991 Da, isto é apro- ximadamente 4 kDa. Da mesma forma, um mPEG com um peso molecular médio de 20 kDa tem uma média de m de 454. Devido ao processo para produzir mPEG essas moléculas muitas vezes têm uma distribuição de pe- sos moleculares. Essa distribuição é descrita pelo índice de polidispersão.
Devido a essa distribuição de m, mPEG com um peso molecular de 20 kDa pode também ser referida como MeO-(CH2CH2O)4Oo-Soo, mPEG com um peso molecular de 30 kDa pode também ser referida como MeO- (CH2CH20)6oo-7oo, e mPEG com um peso molecular de 40 kDa pode também ser referida como MeO-(CH2CH2O)850-950, As cadeias de mPEG mais pesa- das podem ser difíceis para preparar como e uma molécula de cadeia única, e dessa maneira elas são feitas como mPEG ramificada. Notavelmente, mPEG com um peso molecular de 40 kDa pode ser conseguida com uma mPEG ramificado compreendendo os braços de 20 kDa cada.
O termo "índice de polidispersão" como usado aqui a seguir signi- fica a relação entre a média de peso do peso molecular e a média de núme- ro do peso molecular, como conhecido na técnica da química de polímero (vide por exemplo "Polímero Synthesis and Characterization", J.A. Nairn, University of Utah1 2003). O índice de polidispersão é um número que é mai- or ou igual a um, e ele pode ser estimado a partir dos dados da Cromatogra- fia de Permeação de Gel. Quando o índice de polidispersão é 1, o produto é monodisperso e é desssa maneira feito de compostos com um peso molecu- lar único. Quando o índice de polidispersão é maior do que 1 ele é uma me- dida da polidispersão daquele polímero, isto é, o quanto é ampla a distribui- ção de polímeros com pesos moleculares diferentes.
O uso de por exemplo "mPEG20000" em fórmulas, nomes com- postos ou em estruturas moleculares indica um resíduo de mPEG em que mPEG é polidisperso e tem um peso molecular de aproximadamente 20 kDa.
O índice de polidispersão tipicamente aumenta com o peso mole- cular da PEG ou mPEG. Quando é feito referência a 20 kDa PEG e em par- ticular 20 kDa mPEG é destinado a indicar um composto (ou de fato uma mistura de compostos) com um índice de polidispersão abaixo de 1,06, tal como abaixo de 1,05, tal como abaixo de 1,04, tal como abaixo de 1,03, tal como entre 1,02 e 1,03. Quando é feito referência a 30 kDa PEG e em parti- cular 30 kDa mPEG ela é destinada a indicar um composto (ou de fato uma mistura de compostos) com um índice de polidispersão abaixo de 1,06, tal como abaixo de 1,05, tal como abaixo de 1,04, tal como abaixo de 1,03, tal como entre 1,02 e 1,03. Quando é feito referência a 40 kDa PEG e em parti- cular 40 kDa mPEG ela é destinada a indicar um composto (ou de fato uma mistura de compostos) com um índice de polidispersão abaixo de 1,06, tal como abaixo de 1,05, tal como abaixo de 1,04, tal como abaixo de 1,03, tal como entre 1,02 e 1,03.
Em uma modalidade, R3 representa um grupo alquila Ci0-C90 li- near ou ramificado, opcionalmente substituído com grupos funcionais acídi- cos ou negativamente carregados (por exemplo grupos carboxila, grupos tetrazolila, grupos acilsulfonila, grupos fosfonila, grupos de ácido borônico, fosfatos, sulfatos etc), com grupos funcionais básico ou catiônicos (por e- xemplo grupos amino, grupos amônio, grupos fosfônio), ou com combina- ções dos mesmos.
Na fórmula (I), Prot designa um peptídeo monoradical, que é um peptídeo tendo um elétron não-disposto em pares. O elétron não-disposto em pares pode estar presente em qualquer lugar no peptídeo, mas será principalmente obtido pela remoção de um átomo de hidrogênio de um grupo NH. Em uma modalidade, o radical de Prot é formado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio do grupo amino de terminal N. Em uma modali- dade, o radical de Prot é formado pela remoção formal de um átomo de hi- drogênio de uma cadeia lateral de aminoácido. Em uma modalidade, o radi- cal de Prot é formado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio do grupo amino de cadeias laterais de lisina. Em uma modalidade, the Prot é formado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio do grupo NH2 de cadeias laterais de glutamina. Em uma modalidade, o radical de Prot é for- mado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio do grupo NH de ca- deias laterais de asparagina. Essa remoção formal pode ser realizada por qualquer um dos diversos métodos conhecidos na técnica, por exemplo pelo uso de um método de acordo com a invenção.
Em uma modalidade, Prot pode ser obtido a partir de um aldeído derivado de peptídeo ou cetona de fórmula
R6-C(=0)-R5-Prot, em que R5 é como descrito acima, e R6 representa hidrogênio ou um átomo de α-carbono opcional- mente substituído.
Em uma modalidade, R6 representa hidrogênio, C1-6-alquila ou C1-6-cicloalquila.
No presente contexto, o termo "cicloalquila" é destinado a indicar um radical de hidrocarboneto monovalente saturado cíclico. Uma "cicloalqui- la inferior" é uma cicloalquila que tem de três a seis átomos de carbono, tam- bém designada como Ci.6-cicloalquila. Grupos Ci-6-cicloalquila incluem por exemplo ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, 2-metil-ciclopentila, e cicloexila.
Em uma modalidade, Prot representa um radical derivado de peptídeo gerado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio de um grupo amino (-NH2) de um peptídeo ou uma proteína, e em que o dito grupo amino é o grupo amino de terminal N do peptídeo, um grupo amino de ca- deia lateral de resíduo de Iisina no peptídeo, ou um grupo amino de cadeia lateral de resíduo de glutamina ou asparagina (CONH2) no peptídeo.
Em uma modalidade, Prot representa um radical derivado do hormônio do crescimento.
O termo "hormônio do crescimento" ou "GH" é destinado a indicar uma proteína, que exibe atividade de hormônio do crescimento como deter- minado no ensaio I aqui a seguir, ou, quando usado em conexão com fórmu- las estruturais, um radical derivado de tal proteína. O hGH indica o hormônio do crescimento de ser humano. Um peptídeo que exibe uma atividade acima de 20%, tal como acima de 40%, tal como acima de 60%, tal como acima de80% daquela de hGH no ensaio (I) é definido como um hormônio do cresci- mento composto.
Em uma modalidade, Prot representa um radical derivado do hormônio do crescimento de ser humano. Em uma modalidade, Prot é um radical do hormônio do crescimento de ser humano (hGH) que tem uma se- qüência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID No. 1, Em uma mo- dalidade, Prot é formado pela remoção de um átomo de hidrogênio do ami- noácido de terminal N. Em uma modalidade, o radical de Prot é formado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio do grupo aminocarbonila de ca- deia lateral (H2N-CO-) da glutamina na posição correspondente à posição 40 em SEQ ID No. 1, Em uma modalidade, o radical de Prot é formado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio de um grupo aminocarbonila de cadeia lateral (H2N-CO-) da glutamina na posição correspondente à posição141 em SEQ ID No. 1,
Em uma modalidade, o hormônio do crescimento parte do radical derivado do hormônio do crescimento é uma variante de hGH, em que uma variante é compreendida como sendo o composto obtido substituindo um ou mais resíduos de aminoácido na seqüência de hGH com outro aminoácido natural ou não-natural; e/ou adicionando um ou mais aminoácidos naturais ou não-naturais à seqüência de hGH; e/ou deletando um ou mais resíduos de aminoácido da seqüência de hGH, em que qualquer uma dessas etapas pode opcionalmente ser seguida por derivatização adicional de um ou mais resíduos de aminoácido, por exemplo por peguilação resultando em uma variante de hormônio do crescimento di- ou multipeguilada. Em particular, tais substituições são conservadoras no sentido de que um resíduo de ami- noácido é substituído por outro resíduo de aminoácido do mesmo grupo, isto é, por outro resíduo de aminoácido com propriedades similares. Os aminoá- cidos podem ser convenientemente divididos nos grupos a seguir com base em suas propriedades: aminoácidos básicos (tais como arginina, histidina e lisina), aminoácidos acídicos (tais como ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (tais como glutamina, histidina, cisteína e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (tais como leucina, isoleucina, prolina, metionina e valina), aminoácidos aromáticos (tais como fenilalanina, triptofan, tirosina) e aminoácidos pequenos (tais como glicina, alanina, serina e treonina).
Em uma modalidade, o peptídeo pode ser estendido com até cerca de 100 resíduos de aminoácidos no terminal N quando comparado ao peptídeo parente. Tal peptídeo estendido N-terminalmente pode ser descrito pela fórmula Z-XX-Prot, em que Z representa serina ou treonina, XX repre- senta qualquer seqüência de 1-50 aminoácidos, e Prot representa o peptí- deo parente. Em uma modalidade, Z representa serina. Em uma modalida- de, XX representa uma seqüência com até 40, tal como até 20, tal como até 10, tal como até 5, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, o peptídeo é hGH prolongado com até 100 resíduos de aminoácidos no terminal N quando comparado à SEQ ID No. 1, Em particu- lar, a dita extensão é até 50, tal como até 40, tal como até 20, tal como até 10, tal como até 5, tal como 1, 2 ou 3 resíduos de aminoácidos.
Em uma modalidade, o peptídeo tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a seqüência de aminoácidos em SEQ ID No. 1, Em uma mo- dalidade, a dita identidade é acoplada a pelo menos 20%, tal como pelo me- nos 40%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 80% da atividade do hormônio do crescimento de hGH como determinado no ensaio I aqui a seguir.
O termo "identidade", como conhecido na técnica, refere-se a um relacionamento entre as seqüências de dois ou mais peptídeos, como de- terminado comparando as seqüências. Na técnica, "identidade" também sig- nifica o grau de seqüência de relacionamento entre peptídeos, como deter- minado pelo número de combinações de fios de dis ou mais resíduos de a- minoácidos. A "Identidade" mede o percentual de combinações idênticas entre a menor de duas ou mais seqüências com alinhamentos de intervalo (se houver algum) dirigido por um modelo matemático em particular ou pro- grama de computador (isto é, "algoritmos"). A identidade de peptídeos rela- cionados pode ser prontamente calculada pelos métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não são limitados a, àqueles descritos em Computa- tional Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Da- ta, Part 1, Griffin5 A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; e Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073(1988).
Os métodos preferidos para determinar a identidade são projeta- dos para dar a combinação maior entre as seqüências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programa de computador preferi- dos para determinar a identidade entre duas seqüências incluem o pacote de programas GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Grupo, Universidade de Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTΡ, BLASTN, and FASTA (Altschul et ai-, J. Mol. Biol. 215, 403- 410 (1990)). O programa BLASTX está publicamente disponível do National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional de Biotecnologia da Informação) (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al.
NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). O algoritimo bem-conhecido de Smith Águaman pode ser também usado para determinar identidade.
Por exemplo, usando o algoritmo de computador GAP (Genetics Computer Grupo, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dois peptídeos para os quais a percentagem da identidade da seqüência tem de ser deter- minada são alinhados para a combinação ideal de seus respectivos aminoá- cidos (o "espaço de tempo combinado", como determinado pelo algoritmo). Uma penalidade na abertura do intervado (que é calculada como 3 vezes a diagonal média; a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação que está sendo usada; a "diagonal" é o score ou número desig- nado para cada combinação de aminoácido perfeita por uma matriz de com- paração particular) e uma penalidade na extesão do intervalo (que é usual- mente {fração (1/10)} vezes a penalidade de abertura do intervalo), como também uma matriz de comparação tal como PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunto com o algoritmo. Uma matriz de comparação padrão (vide Dayhoff et al., Atlas of Proteína Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992) para a matriz de comparação BLO- SUM 62) é também usada pelo algoritmo.
Os parâmetros preferidos para uma comparação de seqüência de peptídeo incluem o seguinte:
Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); Ma- triz de Comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915- 10919 (1992); Gap Penalty: 12, Gap Length Penalty: 4, Threshold of Simila- rity: 0,
O programa GAP é útil com os parâmetros acima. Os parâmetros mencionados acima são parâmetros padrão para as comparações de peptí- deos (junto com nenhuma penalidade pelos intervalos) usando o algoritmo de GAP.
Em uma modalidade, Prot representa um radical derivado de an- ticorpo. Em uma modalidade, Prot representa um radical derivado de um fragmento de um anticorpo.
O termo "anticorpo" é destinado para indicar uma molécula de imunoglobulina ou um derivado ou da mesma, que tem a capacidade para especificamente ligar para um antígeno sob condições fisiológicas típicas por períodos de tempo significativos tal como pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo me- nos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias etc., ou qual- quer outro período de definido funcionalmente relevante (tal como um tempo suficiente para induzir, promover, aumentar, e/ou modular uma resposta fisi- ológica associada com a ligação do anticorpo para o antígeno). O termo an- ticorpo também inclui diacorpos e anticorpos de cadeia única.
Além disso, embora os dois domínios do fragmento de Fv , Vl e VH, sejam codificados para genes separados, eles podem ser unidos, usan- do métodos recombinantes, por um Iigante sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia de peptídeo única em que o par de regiões de Vl e Vh formam moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeia única (scFv), vide por exemplo Bird et al., Sci- ence 242, 423-426 (1988) e Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única estão contidos dentro do termo an- ticorpo, a menos que seja de outra maneira informado, ou claramente indi- cado pelo contexto. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos estão incluídas dentro do termo anticorpo.
Deverá também ficar entendido que termo anticorpo também ge- ralmente inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), poli- peptídeos tipo anticorpo, tal como anticorpos quiméricos e anticorpos huma- nizados, e anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld) para anticorpos. Um anticorpo, quando gerado, pode possuir qualquer isotipo.
O termo "imunoglobulina" refere-se a uma classe de glicoproteí- nas estruturalmente relacionadas que consiste em dois pares de cadeias de polipeptídeos, um par de cadeias de peso molecular baixo leve (L) e um par de cadeias pesdas (H)1 todas as quatro interconectadas por ligações de dis- sulfeto. A estrutura de imunoglobulinas tem sido bem caracterizada. Vide por exemplo Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Resumidamente, cada cadeia pesada tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui a seguir como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região cons- tante de cadeia pesada tipicamente é compreendida de três domínios, Ch1, Ch2, e Ch3. Cada cadeia leve tipicamente é compreendida de uma região de variável de cadeia leve (abreviada aqui a seguir como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve tipicamente é compreendida de um domínio, Cl. As regiões Vh e Vl podem ser adicional- mente subdivididas em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariá- veis que podem ser hipervariáveis em seqüência e/ou formar Ioops estrutu- ralmente definidos), também denominadas de regiões determinantes da complementaridade (CDRs), disseminadas com regiões que são mais con- servadas, denominadas regiões de esboço (FRs). Cada Vh e Vl é tipicamen- te composto de três CDRs e quatro FRs, dispostos da terminação de amino para a terminação de carbóxi na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (vide também Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)).
O termo "fragmento de um anticorpo" ou "anticorpo-fragmento" é destinado para indicar um fragmento de um anticorpo cujo fragmento retem a capacidade para especificamente se ligar a um antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação contidos dentro do termo "anticorpo" incluem (i) um fragmento de Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, Vh, Cl e CH1; (") fragmentos F(ab)2 e F(ab')2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo essencialmente nos domínios Vh e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo essencialmente dos domínios Vl e Vh de um ramo único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341_> 544-546 (1989)), que consiste essencialmente de um domínio de Vh domain; e (vi) uma região determinando a complementa- ridade isolada (CDR). Os fragmentos de anticorpos podem ser providos por qualquer ténica conhecida, tal como clivagem enzimática, síntese de peptí- deo e técnicas recombinantes.
Os exemplos de fórmulas estruturais para compostos de fórmula I compreendem: <formula>formula see original document page 27</formula>
Exemplos não-limitantes de compostos de fórmula (I) compreen- dem:
<formula>formula see original document page 27</formula> <formula>formula see original document page 28</formula>
e sais, pró-fármacos e solvatos dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis, em que GH representa um radical formado de um hormônio do crescimento, por exemplo hormônio do crescimento de ser humano, em que o radical de GH é formado pela remoção de um átomo de hidrogênio do gru- po amino de terminal N. Esses compostos podem ser preparados pela oxi- dação mediada por periodato de Ser-GH (hormônio do crescimento estendi- do no terminal N com uma serina), seguidos pela condensação do aldeído resultante com uma 4-aminobenzamida e redução da imina resultante com NaCNBH3 ou outro agente de redução apropriado.
Exemplos não-limitantes de compostos de fórmula (I) compreen- dem:
<formula>formula see original document page 28</formula> <formula>formula see original document page 29</formula>
e sais, pró-fármacos e solvatos dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis, em que hGH(40) representa um radical formado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio do grupo aminocarbonila de cadeia lateral (H2N-CO-) de glutamina na posição 40 no hormônio do crescimento humano (hGH). Esses compostos podem ser preparados por transaminação mediada por transglutaminase de hGH com 1,3-diamino-2-propanol, seguido por oxi- dação mediada por periodato para um aldeído de fórmula H-CO-CH2- hGH(40), seguido pela formação de imina com uma 4-aminobenzamida e redução da imina resultando com NaCNBH3 ou outro agente de redução a- propriado.
Exemplos não-limitantes de compostos de fórmula (I) compreen- dem:
<formula>formula see original document page 29</formula> <formula>formula see original document page 30</formula>
e sais, pró-fármacos e solvatos dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis, em que hGH(141) representa um radical formado pela remoção de um áto- mo de hidrogênio de um grupo aminocarbonila de cadeia lateral (H2N-CO-) de glutamina na posição 141 no hormônio do crescimento de ser humano (hGH). Esses compostos podem ser preparados por transaminação mediada por transglutaminase de hGH com 1,3-diamino-2-propanol, seguido por oxi- dação mediada por periodato para um aldeído da fórmula H-CO-CH2- hGH(141), seguida pela formação de imina com uma 4-aminobenzamida e redução da imina resultante com NaCNBH3 ou outro agente de redução a- propriado.
NaCNBH3 é mencionado aqui a seguir como um exemplo de um agente de redução apropriado. Entretanto, um número de outros reagentes pode ser considerado como alternativas para NaCNBH3 como agente de re- dução para a conversão de iminas em aminas secundárias. Dessa maneira, as iminas derivadas de carboidratos e proteínas oxidados têm sido reduzidas em solução aquosa com adução de borano comercialmente disponível (BH3) e piridina (Hashimoto et al., J. Biochem. 123, 468-478 (1998); Yoshida and Lee, Carbohydr. Res 251. 175-186 (1994)). Reagentes relacionados são a- duções de borano e dimetilsulfeto, fosfinas, fosfitos, piridinas substituídas, pirimidinas, imidazóis, pirazóis, tiazóis, sulfetos, éteres, e os similares. Alter- nativas adicionais para o NaCNBH3 são hidrogenação catalítica (heterogê- nea ou homogênea), NaBH4, (Ehrenfreund-Kleinmann et al., Biomaterials 23, .1327-1335 (2002); Zito and Martinez-Carrion, J. Biol. Chem. 255, 8645-8649 (1980)), NaHB(OAc)3 (Drummond et al., Proteomics 1, 304-310 (2001)), NADPH (a forma reduzida de NADP, fosfato de dinucleotídeo de nicotinami- da adenina) ou diidropiridinas relacionadas (Itoh et al., Tetrahedron Lett. 43, .3105-3108 (2002)), ou misturas de NaBH4 e AcOH. NADPH podem também ser usadas em combinação com uma enzima apropriada, tal como deidroge- nase de glutamato (Fisher et al., J. Biol. Chem. 257, 13208-13210 (1982)). Cada um desses reagentes pode requerer o adjuste do pH da solução, a fim de prover um taxa alta de redução de imina, se comparada à taxa de forma- ção de hidrogênio (redução de íon de hidronio). Dessa maneira, alguns rea- gentes podem reduzir a imina sob condições de reação neutra ou básica, enquanto que outros reagentes podem requerer mais condições de reação acídica. Além disso, alguns desses reagentes podem requerer o uso de co- solventes, tais como formamida, NMP1 acetonitrila, etileno glicol, isopropa- nol, e os similares, a fim de melhorar a solubilidade de todos os reagentes a fim de reduzir a concentração de água e, desse modo, a taxa de redução de íon de hidrônio.
Como usado aqui a seguir, o termo "pró-fármaco" inclui amidas bioidrolizáveis e ésteres bioidrolizáveis, acetais, aminais, tioaminais, tioace- tais, e hidrazonas, e também abrange a) compostos em que a funcionalidade bioidrolizável em tal pró-fármaco é contida no composto de acordo com a presente invenção, e b) compostos que podem ser oxidados ou reduzidos biologicamente em um dado grupo funcional para render substâncias de fármacos de acordo com a presente invenção. Exemplos desses grupos fun- cionais incluem 1,4-diidropiridina, N-alquilcarbonil-1,4-diidropiridina, 1,4- cicloexadieno, terc-butila, e os similares.
Como usado aqui a seguir, o termo "éster bioidrolizável" é um és- ter de uma substância de fármaco (in casu, um composto de acordo com a invenção) que ou a) não interfere com a atividade biológica da substância parente mas confere sobre aquela substância propriedades vantajosas in vivo tal como duração da ação, princípio da ação, e os similares, ou b) é bio- Iogicamente inativa mas é prontamente convertida in vivo pelo indivíduo para o princípio biologicamente ativo. A vantagem é, por exemplo, solubilidade aumentada ou que o éster bioidrolizável é absorvido do intestino e é trans- formado em um composto de acordo com a presente invenção em plasma. Muitos exemplos deses são conhecidos na técnica e incluem, a título de e- xemplo, ésteres de alquila inferior (por exemplo Ci-C4-alquila), ésteres de aciloxoalquila inferior, ésteres de alcoxiaciloxialquila inferior, ésteres de alco- xiacilóxi, ésteres de alquil acilamino alquila, e ésteres de colina.
Como usado aqui a seguir, o termo "amida bioidrolizável" é uma amida de uma substância de fármaco (in casu, um composto de acordo com a presente invenção) que ou a) não interfere com a atividade biológica da substância parente mas confere sobre essa substância propriedades vanta- josas in vivo tal como duração da ação, princípio da ação, e as similares, ou b) é biologicamente inativa mas é prontamente convertida in vivo pelo indiví- duo para o princípio biologicamente ativo. A vantagem é por exemplo solubi- lidade aumentada ou que a amida bioidrolizável é absorvida do intestino e é transformado para um composto de acordo com a presente invenção em plasma. Muitos exemplos de tais são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, amidas de alquila inferior, amidas de α-aminoácidos, ami- das de alcoxiacila e amidas de alquilaminoalquilcarbonila.
No presente contexto, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" é destinado a indicar sais que não são prejudiciais ao paciente. Tais sais incluem ácidos de adição de sais farmaceuticamente aceitáveis, sais de a- mônio e amônio alquilatado. Sais de adição de ácido incluem sais de ácidos inorgânicos como também ácidos orgânicos. Exemplos representativos de ácidos inorgânicos apropriados incluem ácidos clorídrido, bromídrico, hidroi- ódico, fosfórico, enxofreico, nítrico e os similares. Exemplos representativos de ácidos orgânicos apropriados incluem ácidos fórmico, acético, tricloroacé- tico, trifluoroacético, propiônico, benzóico, cinâmico, cítrico, fumárico, glicóli- co, láctico, maleico, málico, malônico, mandélico, oxálico, pícrico, pirúvico, salicílico, succínico, metanossulfônico, etanossulfônico, tartárico, ascórbico, pamóico, bismetileno salicílico, etanodissulfônico, glucônico, citracônico, as- pártico, esteárico, palmítico, EDTA1 glicólico, p-aminobenzóico, glutâmico, benzenossulfônico, p-toluenossulfônico e os similares. Exemplos adicionais de sais de adição de ácido inorgânico ou orgânico farmaceuticamente acei- tável incluemos sais farmaceuticamente aceitáveis listados em J. Pharm. Sei. 66, 2 (1977), que está incorporado aqui a seguir por referência. Exem- plos de sais de metal incluem sais de lítio, sódio, potássio, magnésio e os similares. Exemplos de amônio e sais de amônio alquilados incluem sais de amônio, metilamônio, dimetilamônio, trimetilamônio, etilamônio, hidroxietila- mônio, dietilamônio, butilamônio, tetrametilamônio e os similares.
Como usado aqui a seguir, o termo "solvato" é um complexo de estoiquiometria definida formada por um soluto e um solvente. Solventes pordem ser, a título de exemplo, água, etanol, ou ácido acético.
Em uma modalidade, a invenção refere-se aos métodos de me- lhorar as propriedades farmacológicas de um peptídeo, tal como o hormônio do crescimento, o método compreendendo preparar um peptídeo conjugado como descrito abaixo. Em particular, melhorar as propriedades farmacológi- cas é destinado a indicar um aumento na média de vida funcional in vivo, na média de vida do plasma in vivo, a média do tempo de residência, ou uma diminuição na liberação como também descrito em algum lugar aqui a se- guir.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de pre- parar um composto de fórmula (I), o dito método compreendendo as etapas de
(a) tratamento de um aldeído ou cetona derivado do composto de peptídeo com uma anilina ou heteroarilamina derivada do grupo de modi- ficação da propriedade para render uma imina ou um hemiaminal,
(b) tratamento desta imina ou hemiaminal com um agente de redução apropriado para render uma amina secundária.
Em uma modalidade, a propriedade modificada pelo grupo de modificação da propriedade é a média de vida funcional in vivo do composto de peptídeo com o grupo de modificação da propriedade, quando compara- da ao composto de peptídeo sem o dito grupo de modificação da proprieda- de. Em uma modalidade, a média de vida funcional in vivo do composto de peptídeo é aumentada quando comparada ao composto de peptídeo sem o gupo de modificação da propriedade. Em uma modalidade, adicional, a mé- dia de vida funcional aproximada in vivo do peptídeo é aumentada por 1 ho- ra, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 10 horas, 1 dias, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, ou 30 dias.
Aldeídos ou cetonas derivadas de peptídeo podem ser prepara- dos por diversas vias.
Em uma modalidade, o aldeído ou cetona derivada de peptídeo é preparado por oxidação mediada por periodato de um peptídeo contendo serina ou treonina como aminoácido do terminal N. Tal peptídeo pode ou ter um peptídeo natural, ou pode ser preparado por modificação genética pa- drão de E. coli ou outras células apropriadas para produzir a variante recom- binante desejada do peptídeo de interesse. Alternativamente, um ou mais aminoácidos compreendendo uma serina ou treonina do terminal N pode ser ligada à posição do terminal N de um peptídeo, tal como por exemplo hGH, por meio de uma enzima, por exemplo uma aminopeptidase, na presença de um grande excesso do(s) dito(s) aminoácido(s). A serina ou treonina adicio- nada ao peptídeo necessita ser ligada diretamente ao resíduo de aminoácido do terminal N. Um ou mais resíduos de aminoácido podem ser inseridos en- tre a serina ou treonina e o terminal N original. Nessa modalidade, o peptí- deo compreendendo serina- ou treonina resultante pode ser descrito pela fórmula Z-XX-Prot, tal como Z-XX-hGH, em que Z representa serina ou treo- nina, XX representa qualquer seqüência de 1-50 aminoácidos, e Prot repre- senta o peptídeo, por exemplo hormônio do crescimento. Em uma modalida- de, Z representa serina. Em uma modalidade, XX representa uma seqüência com até 40, tal como até 20, tal como até 10, tal como até 5, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácido.
Em uma modalidade, o aldeído ou cetona derivados de peptídeo, é preparado por oxidação mediada por periodato de um derivado do peptí- deo, no qual uma ou diversas cadeias laterais disponíveis de asparagina ou glutamina têm sido usadas para acilatar uma amina da fórmula geral H2N- CH2-CH(R7)-CH2-NH2, em que R7 representa OH1 SH, ou NH2. Tal acilação pode ser realizada seletivamente por tratar um peptídeo, tal como por exem- plo hGH, com um excesso da dita amina e uma enzima apropriada, tal como transpeptidase de glutamila ou aspartila.
Em uma modalidade, o aldeído ou cetona derivada de peptídeo é preparado por oxidação mediada por periodato de um composto de peptídeo contendo uma substrutura de 2-aminoetanol.
Em uma modalidade, um aldeído derivado de peptídeo é prepa- rado pela oxidação mediada por periodato de um peptídeo transaminado enzimaticamente com 1,3-diamino-2-propanol.
Em uma modalidade, um aldeído ou cetona derivado de peptídeo é preparado acoplando um tiol da fórmula geral HS-R8-C(=0)-R9, em que R8 representa um dirradical orgânico, e R9 representa hidrogênio ou um radical orgânico radical, para um dos resíduos de tirosina disponível por meio de uma tirosinase, por exemplo uma tirosinase de cogumelo, como descrito na literatura (S. Ito et al., J. Med. Chem. 24, 673-677 (1981)).
Em uma modalidade, um aldeído derivado de peptídeo é prepa- rado acoplando um tiol da fórmula geral HS-R10-CH(R11)-CH2-R12, em que R10 representa um dirradical orgânico, e R11 e R12 independentemente um do outro representa OH ou NH2, por meio de uma tirosinase, por exemplo uma tirosinase de cogumelo, como descrito na literatura (S. Ito et al., J. Med. Chem. 24, 673-677 (1981))., seguida pela oxidação mediada por periodato do produto resultante.
Em uma modalidade, um aldeído ou cetona derivado de peptídeo é preparado pela formação de amida do aminoácido do terminal de carbóxi do peptídeo com uma amida não-natural de α-aminoácido, que contém uma cetona ou aldeído como grupo funcional de cadeia lateral. Tal amida de ami- noácido não-natural de α-aminoácidos pode ser acoplada com o peptídeo com a ajuda de uma enzima, tal como uma carboxipeptidase. Em uma modalidade, um aldeído ou cetona derivado de peptídeo é obtido pela alquilação regiosseletiva do grupo de terminal N com um com- posto compreendendo uma porção que subseqüentemente pode ser trans- formada em um aldeído ou uma cetona, explorando a basicidade inferior do grupo amino de terminal N se comparado aos grupos amina de cadeia lateral de Iisina (vide US 20040127417).
Em uma modalidade, um aldeído ou cetona derivado de peptídeo é preparado por hidrólise de um acetal ou um hemiacetal.
Em uma modalidade, um aldeído ou cetona derivado de peptídeo é preparado alimentando um organismo geneticamente modificado ou não- modificado produzindo o dito peptídeo com um aminoácido não-natural con- tendo uma funcionalidade de aldeído ou cetona, em que o dito aminoácido será incorporado no peptídeo, seguido pelo isolamento e purificação do pep- tídeo no qual o aminoácido não-natural foi incorporado. Isso pode ser, por exemplo, também realizado por meio de uma sintetase de tRNA alterada, como descrito na literatura (Tsao et al., J. Am. Chem. Soe. 128, 4572-4573 (2006), e artigos citados aqui a seguir). O uso desse método pode prover controle sobre a posição em que o grupo de modificação da propriedade é inserido como o aminoácido não-natural será incorporado a um certo códon, a posição do qual pode ser escolhida como desejado. Em uma modalidade, o dito aminoácido não-natural é (acetilfenil)alanina ou (formilfenil)alanina. Em uma modalidade, o mRNA codificando o peptídeo compreende pelo menos um códon codificando fenilalanina.
A parte do peptídeo de um aldeído ou cetona derivado de peptí- deo pode ser qualquer peptídeo, para o qual a conjugação para um grupo de modificação da propriedade é desejável. O peptídeo pode dessa maneira pode ser um peptídeo terapeuticamente eficaz. Existe uma infinidade de peptídeos terapeuticamente eficazes e de interesse na literatura científica e literatura de patentes, e é bem-sabido que a modificação da propriedade de tais peptídeos pode prover benefícios terapêuticos ou outros benefícios. Por exemplo, um aumento na média de vida funcional in vivo será de interesse para um número desses peptídeos, mas existem também outros exemplos de propriedades interessantes para serem modificadas como descrito em algum lugar aqui a seguir. A pessoa versada na técnica é bastante capaz de determinar quais peptídeos se beneficiariam da derivatização de acordo com a presente invenção. Os métodos e compostos da invenção são, dessa ma- neira, não-limitados pela natureza do peptídeo escolhido.
Em uma modalidade, o peptídeo é um hormônio do crescimento. Em uma modalidade, o peptídeo é hormônio do crescimento de ser humano. Em uma modalidade, o peptídeo é hormônio do crescimento de ser humano (hGH) que compreende a seqüência de aminoácido demonstrada em SEQ ID No. 1, Em uma modalidade, a parte do hormônio de crescimento do radi- cal derivado do hormônio do crescimento é uma variante de hGH como des- crito em outro lugar aqui a seguir. Em uma modalidade, o peptídeo é hormô- nio do crescimento, tal como hormônio do crescimento de ser humano es- tendido com até cerca de 100 resíduos de aminoácido no terminal N, quando comparado ao peptídeo parente como descrito em outro lugar aqui. Em uma modalidade, o peptídeo é um hormônio do crescimento, por exemplo, hor- mônio do crescimento de ser humano, tal como um hormônio do crescimento de ser humano que tem a seqüência de aminoácidos def SEQ ID No. 1, cujo hormônio do crescimento foi estendido N-terminalmente com um resíduo, em que esse resíduo é serina ou treonina. Em uma modalidade, o peptídeo tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a seqüência de aminoácido em SEQ ID No. 1, Em uma modalidade, a dita identidade é acoplada a pelo me- nos 20%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 80% da atividade do hormônio do crescimento de hGH como determinado no ensaio I aqui a seguir.
Em uma modalidade, o peptídeo do hormônio do crescimento é derivado com a funcionalidade de aldeído ou cetona na posição correspon- dente à posição 40 na SEQ ID No. 1 e em outra modalidade, o peptídep do hormônio do crescimento é derivado com a fucionalidade do aldeído ou ce- tona na posição correspondente à posição 141 na SEQ ID No. 1, Essa deri- vatização regiosseletiva pode ser obtida pelo uso de um método apropriado como descrito acima, por exemplo por acoplamento mediado por transglu- taminase de hGH com 1,3-diamino-2-propanol, seguido pela oxidação medi- ada por periodato do hGH transaminado para o aldeído correspondente. Em uma modalidade, o GH é convertido em um aldeído pela oxidação mediada por periodato de Ser-GH.
Em uma modalidade, Prot representa um radical derivado de an- ticorpo. Em uma modalidade, Prot representa um radical derivado de um fragmento de um anticorpo.
A parte de peptídeo do aldeído ou cetona derivado de peptídeo pode ser preparada de diversas maneiras diferentes dependendo da nature- za do peptídeo, tal como por exemplo síntese usando técnicas de síntese de proteína padrão. Em uma modalidade, entretanto, o peptídeo é expresso em um hospedeiro apropriado depois da incorporação de um montagem de um ácido nucléico apropriado no dito hospedeiro.
Como usado aqui a seguir o termo "montagem de ácido nucléico" é destinado a indicar qualquer molécula de ácido nucléico de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou origem de RNA. O termo "montagem" é destina- do a indicar um segmento de ácido nucléico que pode ser simples- ou duplo- filamentado, e que pode ser baseado em uma seqüência de nucleotídeos parcial ou completa codificando um peptídeo de interesse. O constructo po- de opcionalmente conter outros segmentos de ácido nucléico.
O montagem de ácido nucléico da invenção codificando o peptí- deo de interesse pode ser apropriadamente de origem genômica ou cDNA, por exemplo obtido pela preparação de uma biblioteca genômica ou cDNA e a triagem para as seqüências de DNA codificando todo ou parte do peptídeo por hibridização usando sondas de oligonucleotídeo sintético de acordo com técnicas-padrão (cf. J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Mole- cular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). Em uma modalidade, a seqüência de DNA codificando o peptídeo, tal como um hormônio do crescimento, é de origem humana, isto é, derivado de uma biblioteca de DNA ou cDNA genômico de ser humano. Em particular, a seqüência de DNA pode ser de origem humana, por exemplo cDNA de um órgão ou tipo de célula de um ser humano em particular ou um gene deriva- do de DNA genômico humano.
O constructo de ácido nucléico que codifica o peptídeo pode também ser preparada sinteticamente pelos métodos padrão estabelecidos, por exemplo o método de fosfoamidita descrito por Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859 - 1869 (1981), ou o método descrito por Mat- thes et al., EMBO Journal 3, 801 - 805 (1984). De acordo com o método de fosfoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo em um sin- tetizador de DNA automático, purificado, anealado, ligado e clonado em ve- tores apropriados.
Além disso, o constructo de ácido nucléico pode ser de origem misturada sintética e genômica, misturada sintética e cDNA ou misturada genômica e cDNA preparado por fragmentos de origem Iigante ou sintética, genômica ou de cDNA (como apropriado), os fragmentos correspondendo a diversas parles do constructo de ácido nucléico inteira, de acordo com as técnicas-padrão.
O constructo de ácido nucléico pode também ser preparado por reação de cadeia de polímerase usanado prímeros específicos, por exemplo como descrito em US 4.683.202 ou Saiki et al., Science 239, 487 - 491 (1988).
Em uma modalidade, o constructo de ácido nucléico é umo cons- tructo de DNA cujo termo será usado como exemplo de umo constructo de ácido nucléico a seguir.
O constructo de DNA codificando o peptídeo de interesse pode ser inserida em um vetor recombinante. O vetor recombinante, no qual o constructo do DNA é inserida, pode ser qualquer vetor que pode ser conve- nientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante, e a esco- lha do vetor muito dependerá da célula hospedeira na qual ele deve ser in- troduzido. Dessa maneira, o vetor pode ser um vetor de reprodução autôno- ma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossomal, uma reprodução que é independente da reprodução cromossomal por exemplo um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzi- do na célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e re- produzido junto com o(s) cromossoma(s) em que ele foi integrado.
O vetor pode ser um vetor de expressão em que a seqüência de DNA que codifica o peptídeo de interesse é operavelmente ligado aos seg- mentos adicionais requeridos para transcrição do DNA. Em geral, o vetor da expressão é derivado do plasmídeo ou DNA viral, ou pode conter elementos de ambos. O termo "operavelente ligado" indica que os segmentos são dis- postos de modo que eles funcionam em de comum acordo com seus propó- sitos pretendidos, por exemplo a transcrição inicia em um promotor e pros- segue através da seqüência de DNA codificando para o peptídeo.
O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que mostra ati- vidade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes codificando proteínas ou homólogas ou heterólogas para a célula hospedeira.
Exemplos de promoteres apropriados para dirigir a transcrição do DNA codificando um peptídeo, tal como o hormônio do crescimento, em cé- lulas de mamífero são o promotor de SV40 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1, 854-864 (1981)), o promotor de MT-1 (gene de metalotioneina) (Palmiter et al., Science 222, 809-814 (1983)) ou o promotor atrasado principal de a- denovirus 2.
Um exemplo de promotor apropriado para uso em células de in- seto e o promotor de poliedrina (US 4,745,051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311. 7-11 (1992)), o promotor P10 (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 765- 776 (1988), o promotor de proteína básica de vírus de poliedrose Autogra- pha californica (EP 397 485), o promotor 1 de gene precoce imediato bacu- Iovirus (US 5.155.037; US 5.162.222), ou o promotor de gene precoce atra- sado de baculovirus 39K (US 5.155.037; US 5.162.222).
Exemplos de promoteres apropriados para uso em células hos- pedeiras de levedura incluem promoteres de genes glicolíticos de levedura (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 12073-12080 (1980); Alber and Kawa- saki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 - 434 (1982)) ou genes de hidrogenase de álcool (Young et al., em Genetic Engineering of Microorganisms for Chemi- cais (Hollaender et al, eds.), Plenum Press1 New York, 1982), ou os promoto- res de TPM (US 4,599,311) ou ADH2-4c (Russell et al., Nature 304, 652 - .654 (1983)).
Exemplos de promoteres apropriados para uso em células hos- pedeiras de fungus filamentosos são, por exemplo, o promotor de ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4, 2093 - 2099 (1985)) ou o promotor de tpiA. Exemplos de outros promotores úteis são aqueles derivados do gene que codifica amilase de A. oryzae TAKA, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, α-amylase neutra de A. niger, α-ácido estável α-amilase de A. niger, glucoamilase de A. niger ou A. awamori (gluA), Iipase de Rhizomucor miehei, prótese alcalina de A. oryzae, isomerase de fosfato de triose A. oryzae ou acetamidase de A. nidulans. Preferidos são os promotores de TAKA-amilase e gluA.
Exemplos de promotores apropriados para uso em células hos- pedeiras bactérianas incluem o promotor do gene de amilase maltogênica do Bacilius stearothermophiius, o gene de amilase alfa de Bacilius iicheniformis, o gene de amilase de Bacillus amyloliquefacíens ΒΑΝ, o gene de protease alcalina de Bacillus subtilis, ou o gene de xilosidase de Bacillus pumilus, ou pelo bacteriófago Lambda Pr ou Pl promotores ou a E. coli lac, trp ou tac promoteres.
A seqüência de DNA que codifica o peptídeo, tal como um hor- mônio do crescimento, pode também, se necessário, ser operacionalmente conectada a um terminador apropriado, tal como o hormônio do crescimento de ser humano terminador (Palmiter et al., op. cit.) ou (para hospedeiros fún- gicos) os terminadores TPI1 (Alber and Kawasaki, op. cit.) ou ADH3 (McKni- ght et al., op. cit.). O vetor pode adicionalmente compreender elementos tais como sinais de poliadenilação (por exemplo da região de SV40 ou do ade- novirus 5 Elb), seqüências intensificadoras transcricionais (por exemplo o intensificador de SV40) e as seqüências de intensificador traducional (por exemplo as que codificam o adenovirus VA RNAs).
O vetor recombinante pode ainda compreender uma seqüência de DNA permitindo o vetor replicar na célula hospedeira em questão. Um exemplo de tal seqüência (quando a célula hospedeira é uma célula de ma- mífero) é a origem da replicação de SV40,
Quando a célula hospedeira é uma célula de levedura, seqüên- cias apropriadas que habilitam o vetor a replicar são genes de replicação 2μ de plasmídeo de Ievadura REP 1-3 e origem de replicação.
Quando a célula hospedeira é uma célula bactériana, as seqüên- cias que habilitam o vetor a replicar são genes de codificação de complexo de DNA de polímeroase Ill e origem de replicação.
O vetor pode também compreender uma marcador selecionável, por exemplo um gene, cujo produto complementa um defeito na célula hos- pedeira, tal como o gene que codifica para diidrofolato redutase (DHFR) ou o gene de TPI Schizosaccharomyces pombe (descrito por P.R. Russell, Gene .40, 125-130 (1985), ou um que confere resistência a um fármaco, por exem- plo ampicilina, canamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina ou metotrexato. Para fungos filamentosos, marcadores selecionáveis inclu- em amdS, pyrG, argB, niaD e sC.
Para dirigir o peptídeo na via secretora das células hospedeiras, uma seqüência secretora de sinal (também conhecida como uma seqüência líder, prepro seqüência ou pré- seqüência) pode ser provida no vetor recom- binante. A seqüência de sinal secretora é unida à seqüência de DNA codifi- cando o peptídeo em uma estrutura de leitura correta. Seqüências secreto- ras de sinal são comumente posicionados a 5' para a seqüência de DNA que codifica o peptídeo. A seqüência secretora de sinal pode ser aquela que é normalmente associada com o peptídeo ou pode ser de um gene codificando outro peptídeo secretado.
Para a secreção de células de levedura, a seqüência secretora de sinal pode codificar qualquer peptídeo de sinal que garante a direção efi- ciente do peptídeo expresso na via secretora da célula. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de ocorrência natural, ou uma parte funcional do mesmo, ou ele pode ser um peptídeo sintético. Descobriu-se que os pep- tídeos de sinal são peptídeos de sinal de α-factor (cf. US 4.870,008), o pep- tídeo de sinal de amilase de saliva de camundongo (cf. O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 643-646 (1981)), um peptídeo de sinal de carboxipeptidase modificada (cf. L.A. Valls et al., Cell 48, 887-897 (1987)), peptídeo de sinal BAR1 de levedura (cf. WO 87/02670), ou peptídeo de sinal de protease as- pártica de levedura 3 (YAP3) peptídeo de sinal (cf. M. Egel-Mitani et al., Ye- ast 6, 127-137 (1990)).
Para a secreção eficiente na levedura, uma seqüência codifican- do um peptídeo líder pode também ser inserida a jusante da seqüência de sinal e a montante da seqüência de DNA que codifica o peptídeo. A função do peptídeo líder é permitir que o peptídeo expresso seja direcionado do re- tículo endoplásmico para o aparelho de Golgi e adicionalmente para uma vesícula secretora para a secreção no meio de cultura (isto é exportação do peptídeo pela parede da célula ou pelo menos através da membrana celular no espaço periplásmico da célula de levedura). O peptídeo líder pode ser um Iierd α-factor de levedura (o uso do qual é descrito em por exemplo US 4.546.082, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 e EP 163 529). Alternativa- mente, o peptídeo líder pode ser um peptídeo líder sintético, o que é para dizer um peptídeo líder não encontrado na natureza. Peptídeos líder sintéti- cos podem, por exemplo, ser montados como descrito em WO 89/02463 ou WO 92/11378.
Para uso em fungos filamentosos, o peptídeo de sinal pode con- venientemente ser derivado de um gene que codifica uma amilase ou gluco- amilase de Aspergillus sp., um gene que codifica uma lípase ou protease de Rhizomucor miehei ou uma Iipase de Humicola lanuginosa. O peptídeo de sinal é preferivelmente derivado de um gene que codifica a amilase TAKA A. oryzae, α-amilase neutra A. Niger, amilase ácida estável A. niger ou gluco- amilase de A. niger.
Para uso em células de insetos, o peptídeo de sinal pode conve- nientemente ser derivado de um gene de inseto (cf. WO 90/05783), tal como o peptídeo de sinal precursor de hormônio adipocinático Manduca sexta Ie- pidopterano (cf. US 5.023.328).
Os procedimentos usados para ligar as seqüências de DNA que codificam o peptídeo de interesse, o promotor e opcionalmente o terminador e/ou a seqüência secretora de sinal, respectivamene, e para inseri-los em vetores apropridos que contêm as informações necessárias para a replica- ção, são bem-conhecidos das pessoas versadas na técnica (cf., por exem- plo, Sambrook et al., op.cit.).
A célula hospedeira dentro da qual o constructo do DNA ou o ve- tor recombinante é introduzido pode ser qualquer célula que é capaz de pro- duzir o peptídeo codificado e inclue bactérias, levedura, fungos e células eu- carióticas maiores.
Exemplos de células hospedeiras bactérianas que, em cultivo, são capazes de produzir GH são bactérias grampositivas tais como cepas de Bacillus, tais como cepas de B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium ou B. thuringiensis, ou cepas de S- treptomyces, tais como S. Iividans ou S. murinus, ou bactérias gram- negativos tais como Echerichia coli. A transformação da bactéria pode ser efetuada por transformação do protoplasto ou usando células competentes de uma maneira conhecida per se (cf. Sambrook et al., supra).
Quando expressar um peptídeo em uma bactéria tal como E. coli, o peptídeo pode ser retido no citoplasma, tipicamente como grânulos insolú- veis (conhecidos como corpos de inclusão), ou pode ser direcionado para o espaço periplásmico por uma seqüência de secreção bacteriana. Em um caso anterior, as células são Iisadas e os grânulos são recuperados e desna- turados depois do que o peptídeo é redobrado pela diluição do agente de desnaturação. No caso posterior, o peptídeo pode ser recuperado do espaço periplásmico rompendo as células, por exemplo por sonicação ou choque osmótico, para liberar os conteúdos do espaço periplásmico e recuperando o peptídeo.
Exemplos de linhas de células de mamíferos são COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) ou as linhas de células CHO (ATCC CCL 61). Métodos de transfectar células de mamíferos e expressar seqüências de DNA introduzidos nas células são descritos em, por exemplo, Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159, 601 - 621 (1982); Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327 - 341 (1982); Loyter et a!., PNAS USA 79, 422 - 426 (1982); Wigler et al., Cell 14, 725 (1978); Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981), Graham and van der Eb, Virology 52, 456 (1973); and Neumann et al., EMBO J. 1, 841 - 845 (1982).
Exemplos de células de levedura apropriadas incluem células de Saccharomyces spp. ou Schizosaccharomyces spp., em particular cepas de Saccharomyees eerevisiae ou Saccharomyees kluyveri. Métodos para trans- formar células de levedura com DNA heterólogo e produzir peptídeos heteró- Iogos a partir daí são descritos, por exemplo em US 4.599.311, US .4.931,373, US 4.870,008, 5.037.743, e US 4.845.075, todos os quais são são aqui a seguir incorporados por referência. As células transformadas são selecionadas por um fenótipo determinado por um marcador selecionável, comumente resistente a fármaco ou a capacidade de crescer na ausência de um nutriente particular, por exemplo leucina. Um vetor apropriado para uso em levedura é o vetor de POT1 descrito em US 4.931,373. A seqüência de DNA que codifica um peptídeo da invenção pode ser precedida por uma se- qüência de sinal e opcionalmente uma seqüência líder, por exemplo, como descrito acima. Exemplos adicionais de células de levedura apropriadas são as cepas de Kluyveromyees, tais como K. laetis, Hansenula, por exemplo H. polymorpha, ou Piehia, por exemplo P. pastoris (cf. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 (1986); US 4,882,279).
Exemplos de outras células fúngicas são células de fungos fila- mentosos, por exemplo Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. ou Triehoderma spp., em particular cepas de A. oryzae, A. nidulans ou A. niger. O uso de Aspergillus spp. Para a expressão de peptídeos é descrito em, por exemplo, EP 272 277 e EP 230 023. A transformação de F. oxysporum po- de, por exemplo, ser realizada como as descrito por Malardier et al., Gene .78, 147-156 (1989).
Quando um fungo filamentoso é usado como a célula hospedeira, ele pode ser transformado com o constructo do DNA1 convenientemente in- tegrando o constructo do DNA no cromossoma hospedeiro para obter uma célula hospedeira recombinante. Essa integração é geralmente considerada como sendo uma vantagem, pois a seqüência do DNA tem mais probabilida- de de ser estavelmente mantida na célula. A integração das construções de DNA dentro do cromossoma hospedeiro pode ser realizada de acordo com os métodos convencionais, por exemplo por recombinação homóloga ou he- teróloga.
A transformação de células de insetos e a produção de peptídeos heterólogos a esse respeito podem ser realizadas conforme descrito em US 4.745.051; US 4.879.236; US 5.155.037; 5.162.222; EP 397.485) todos os quais estão incorporados aqui a seguir por referência. A linha de células de inseto usada como o hospedeiro pode apropriadamente ser uma linha de células de Lepidoptera, tal como células de Spodoptera frugiperda ou células de Trichoplusia ni cells (cf. US 5.077.214). As condições de cultura podem apropriadamente ser como descrito em, por exemplo, WO 89/01029 ou WO 89/01028, ou qualquer uma das referências menciondas acima.
A célula hospedeira transformada ou transfectada descrita acima é depois culturada em um meio nutriente apropriado sob condições que permitem a expressão do peptídeo de interesse, depois do que o peptídeo resultante é recuperado da cultura.
O meio usado para culturar as células pode ser qualquer meio convencional apropriado para o crescimento de células hospedeiras, tais como os meios mínimo ou complexo que contêm suplementos apropriados. Os meios apropriados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou po- dem ser preparados de acordo com as receitas publicadas (por exemplo nos catálogos da American Type Culture Collection). O peptídeo produzido pelas células podem depois ser recuperados do meio de cultura pelos procedimen- tos convencionais incluindo separar as células hospedeiras do meio por cen- trifugação ou filtragem, precipitando os componentes proteináceos da sobre- nadante ou filtrado por meio de um sal, por exemplo sulfato de amônio, puri- ficação por uma variedade de procedimentos cromatográficos, por exemplo cromatografia de troca de íon, cromatografia de gelfiltragem, cromatografia de afinidade, ou os similares, dependendo do peptídeo específico em ques- tão.
Os peptídeos conjugados, tais como os hormônios do crescimen-
to que podem ser obtidos pelo uso de um método usado de acordo com a invenção, podem também ser derivados por outros meios, se assim deseja- do. Tal derivatização adicional pode ser realizada antes, durante ou depois do uso de etapas do método da invenção. Está dentro da habilidade de uma pessoa versada na técnica determinar a regulagem de tal derivatização adi- cional. O peptídeo usado pode também já ser conjugado a um grupo de mo- dificação da propriedade em uma ou mais posições adicionais para o sítio ou sítios a serem conjugados de acordo com a presente invenção.
Em uma modalidade, a anilina ou heteroarilamina derivada do grupo de modificação da propriedade é da fórmula
R3-R2-R1-NH2
(III)
em que R1, R2, e R3 são como definida acima.
Em uma modalidade, R2 representa uma ligação, -C(=0)-, -C(=0)-NH-, ou
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Em uma modalidade, a propriedade modificada pelo grupo de modificação de propriedade é a média de vida funcional in vivo do composto de peptídeo. Em uma modalidade, adicional a média de vida funcional in vivo do composto de peptídeo é aumentada quando comparada a do composto de peptídeo sem o grupo de modificação da propriedade.
Em uma modalidade, a média de vida funcional aproximada in vi- vo do peptídeo é aumentada por 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas,10 horas, 1 dias, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias,10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias,19 dias, 20 dias,21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias,28 dias, 29 dias, ou 30 dias.
Em uma modalidade, a propriedade modificada pelo grupo de modificação da propriedade é a média de vida do plasma in vivo do compos- to de peptídeo. Em uma modalidade, adicional a média de vida do plasma in vivo do peptídeo é aumentada quando comparada ao composto de peptídeo sem o grupo de modificação da propriedade. Em uma modalidade, adicional a média de vida do plasma in vivo do peptídeo é aumentada por 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 10 horas, 1 dias, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, .15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, .24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, ou 30 dias.
Em uma modalidade, R3 representa um polímero ou oligômero li- near ou ramificado, opcionalmente substituído com grupos funcionais acídi- gos ou carregados negativamente (tal como por exemplo grupos carboxila, grupos tetrazolila, grupos acilsulfonila, grupos fosfonila, grupos acídicos bo- rônicos, fosfatos, sulfatos etc), com grupos funcionais básicos ou catiônicos (por exemplo grupos amino, grupos amônio, grupos fosfônio), ou com com- binações dos mesmos; ou R3 representa um grupo alquila linear ou ramifica- doC icrCgo, opcionalmente substituído com grupos funcionais acídicos ou negativamente carregados (por exemplo grupos carboxila, grupos tetrazolila, grupos acilsulfonila, grupos fosfonila, grupos de ácido barônico, fosfatos, sulfatos etc), com grupos funcionais básicos ou catiônicos (por exemplo gru- pos amino, grupos amônio, grupos fosfônio), ou com combinações dos mesmos.
Em uma modalidade, R3 representa um grupo alquila linear ou ramificadoC-io-Cgo, opcionalmente substituído com grupos funcionais acídi- cos ou negativamente carregados (por exemplo grupos carboxila, grupos tetrazolila, grupos acilsulfonila, grupos fosfonila, grupos de ácido barônico, fosfatos, sulfatos etc), com grupos funcionais básicos ou catiônicos (por e- xemplo grupos amino, grupos amônio, grupos fosfônio), ou com combina- ções dos mesmos.
Em uma modalidade, the peptídeo-derivado aldeído or cetona is of the fórmula
R6-C(=0)-R5-Prot, em que
Prot é como descrito acima
R5 é -CH2- ou -C(=0)-, e
R6 representa hidrogênio ou um átomo de α-carbono opcional- mente substituído.
Em uma modalidade, R5 representa -CH2-. Em uma modalidade, R5 representa -C(=0)-. Em uma modalidade, R6 representa hidrogênio, Ci-6- alquila ou Ci-6-cicloalquila. Em uma modalidade, R6 representa hidrogênio, metila, etila, propila, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ou cicloexila. Em uma modalidade, R6 representa hidrogênio ou metila.
A presente invenção provê compostos de fórmula (III)
R3-R-R-NH2
(III)
em que R1, R2, e R3 são como definido acima.
Em uma modalidade, a propriedade modificada pelo grupo de modificação da propriedade é a média de vida funcional in vivo do composto de peptídeo. Em uma modalidade, adicional a média de vida funcional in vivo do composto de peptídeo é aumentada quando comparada ao composto de peptídeo sem o grupo de modificação da propriedade.
Em uma modalidade, a propriedade modificada pelo grupo de modificação da propriedade é a média de vida do plasma in vivo do compos- to de peptídeo. Em uma modalidade, adicional a média de vida do plasma in vivo do peptídeo é aumentada quando comparado ao composto de peptídeo sem o grupo de modificação da propriedade. Em uma modalidade, adicional a média de vida do plasma in vivo do peptídeo é aumentada por 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 10 horas, 1 dias, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, .15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, .24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, ou 30 dias.
Em uma modalidade, R3 representa um polímero ou oligômero li- near ou ramificado, opcionalmente substituído com grupos funcionais acídi- cos ou negativamente carregados (tais como por exemplo grupos carboxila, grupos tetrazolila, grupos acilsulfonila, grupos fosfonila, grupos de ácido ba- rônico, fosfatos, sulfatos etc), com grupos funcionais básicos ou catiônicos (por exemplo grupos amino, grupos amônio, grupos fosfônio), ou com com- binações dos mesmos; ou R3 representa um grupo alquila linear ou ramifica- do C10-C90, opcionalmente substituído com grupos funcionais acídicos ou negativamente carregados (por exemplo grupos carboxila, grupos tetrazolila, grupos acilsulfonila, grupos fosfonila, grupos acídicos borônicso, fosfatos, sulfatos etc), com grupos funcionais básicos ou catiônicos (por exemplo gru- pos amino, grupos amônio, grupos fosfônio), ou com combinações dos mesmos.
Em uma modalidade, R3 representa um grupo alquila linear ou ramificadoC10-C90, opcionalmente substituído com grupos funcionais acídi- cos ou negativamente carregados (por exemplo grupos carboxila, grupos tetrazolila, grupos acilsulfonila, grupos fosfonila, grupos acídicos borônicos, fosfatos, sulfatos, etc), com grupos funcionais básicos ou catiônicos (por e- xemplo grupos amino, grupos amônio, grupos fosfônio), ou com combina- ções dos mesmos.
Em uma modalidade, a invenção provê o uso de um composto de acordo com a fórmula (III) para a preparação do peptídeo conjugado com propriedades farmacológicas melhoradas comparadas às do peptídeo não- conjugado. Em uma modalidade, adicional a conjugação é realizada pelo uso de um método da presente invenção.
Em uma modalidade, o dito hormônio do crescimento é um hor- mônio do crescimento de ser humano.
Em uma modalidade, o dito hormônio do crescimento compreen- de a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No. 1,
Em uma modalidade, o peptídeo tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a seqüência de aminoácidos em SEQ ID No. 1, Em uma mo- dalidade, a dita identidade é acoplada a pelo menos 20%, tal como pelo me- nos 40%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 80% da atividade do hormônio do crescimento de hGH como determinado no ensaio I aqui a seguir.
Em uma modalidade, a dita propriedade farmacológica melhora- da é a média de vida funcional aumentada in vivo do peptídeo.
Compostos de fórmula (I) em que Prot representa o hormônio do crescimento e que exerce a atividade do hormônio do crescimento podem como tal ser usados no tratamento de doenças ou estados que se beneficia- rão de um aumento na quantidade de hormônio do crescimento circulante.
A presente invenção conseqüentemente provê uma composição farmacêutica compreendendo um hormônio do crescimento conjugado da presente invenção. Em uma modalidade, o hormônio do crescimento conju- gado está presente em uma concentração correspondente a 10"15 mg de hormônio do crescimento por ml até 200 mg hormônio do crescimento por ml, tal como por exemplo correspondendo a 10"10 mg de hormônio do cres- cimento pr ml a 5 mg de hormônio do crescimento pr ml. Em uma modalida- de, uma composição farmacêutica da presente invenção tem um pH de 2,0 a .10,0, A composição pode compreender adicionalmente um sistema de tam- pão, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabili- zadores) e tensoativo(s). Em uma modalidade, da invenção a composição farmacêutica é um composição aquosa, isto é uma composição que com- preende água. Tal composição é tipicamente uma solução ou uma suspen- são. Em uma modalidade, adicional a composição farmacêutica é uma solu- ção aquosa. O termo "composição aquosa" é destinado a indicar uma com- posição compreendendo pelo menos 50% em peso/peso de água. Da mes- ma forma, o termo "solução aquosa" é destinado a indicar uma solução compreendendo pelo menos 50% em peso/peso de água, e o termo "sus- pensão aquosa" é destinado a indicar uma suspensão que compreende pelo menos 50% em peso/peso de água.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica é uma compo- sição seca por congelamento, à qual o médico ou o paciente adiciona sol- ventes e/ou diluentes antes de usar.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica é uma compo- sição seca (por exemplo seca por congelamento ou seca por atomização) pronta para uso sem qualquer dissolução anterior.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreenden- do uma solução aquosa de um hormônio do crescimento conjugado da in- venção, e um tampão, em que o dito hormônio do crescimento conjugado está presente em uma concentração correspondente a de 0,1-100 mg de hormônio do crescimento pr ml ou acima, e em que a dita composição tem um pH de 2,0 para 10,0,
Em uma modalidade, o pH da composição farmacêutica é sele- cionado da lista que consiste em 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, .3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3.9, 4.0, 4,1, 4,2, 4,3, 4.4, 4,5, 4,6, .4.7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5.8, 5.9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, .6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7.7, 7,8, 7,9, 8,0, .8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9.6, 9,7, .9.8, 9,9, e 10,0,
Em uma modalidade, da invenção o tampão é selecionado do grupo que consiste em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilgli- cina, histidina, glicina, lisina, arginina, fosfato de diidrogênio do sódio, fosfato de hidrogênio dissódio, fosfato de sódio, e tris(hidroximetil)aminometano, bicino, tricino, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas dos mesmos. Cada um desses consti- tuintes de tampões específicos em uma modalidade alternativa da invenção.
Em uma modalidade, a composição compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, adicio- nal, o conservante é selecionado do grupo que consiste em fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metila, p-hidroxibenzoato de propila, .2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de propila, 2-feniletanol, álcool de benzila, clorobutanol, e tiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imiduréia, cloroexidina, deidroacetato de sódio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetonio, clorfenesina (3p-clorofenoxipropano-1,2-diol) ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade, o conservante está presente em uma con- centração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Em uma modalidade, o conservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma mo- dalidade, o conservante está presente em uma concentração de 5 mg/ml a 10 mg/ml. Em uma modalidade, o conservante está presente em uma con- centração de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um desses conservantes específi- cos constitui uma modalidade alternativa da invenção. O uso de um conser- vante nas composições farmacêuticas é bem-conhecido da pessoa versada. Por conveiência é feito referência à Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20* edição, 2000,
Em uma modalidade, a composição farmacêutica ainda compre- ende um agente isotônico. Em uma modalidade, adicional da invenção o a- gente isotônico é selecionado do grupo que consiste em um sal (por exem- plo cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofan, treonina), um alditol (por exemplo glicerol (glicerina), 1,2- propanodiol (propileneglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenegli- col (por exemplo PEG400), ou misturas dos mesmos. Qualquer açúcar tal como mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glucanos solúveis na água, incluin- do por exemplo frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrana, pululano, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido hidroxietila e carboximetilcelulose-Na podem ser usados. Em uma modalidade, o aditivo de açúcar é sacarose. Álcool de açúcar é definido co- mo um C4.8-hidrocarbono tendo pelo menos um grupo -OH e inclui, por e- xemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Em uma modalidade, o aditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcares ou alcoóis de açúcar mencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não existe limite fixo para a quantidade usada, desde que o açúcar ou álcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não afete adversamente os efeitos estabilizadores obtidos usando os métodos da in- venção. Em uma modalidade, a concentração de açúcar ou álcool de açúcar é entre 1 mg/ml and 150 mg/ml. Em uma modalidade, o agente isôtonico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 50 mg/ml. Em uma moda- lidade, o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma modalidade, o agente isotônico está presente em uma concentração de 8 mg/ml e 24 mg/ml. Em uma modalidade, da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um desses agentes isotônicos específicos constitui uma moda- lidade alternativa da invenção. O uso de um agente isotônico em composi- ções farmacêuticas é bem-conhecido da pessoa versada. Por referência de conveniência é feita à Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ê edição, 2000,
Em uma modalidade, a composição farmacêutica adicionalmente compreende um agente quelante. Em uma modalidade, adicional da inven- ção o agente quelante é selecionado de sais de ácido etilenodiaminotetracé- tico (EDTA), ácido cítrico e ácido aspártico e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, o agente quelante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma modalidade, o agente quelante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml. Em uma modalidade, o agente quelante está presente em uma concentração de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Cada um desses agentes quelantes específicos constitui uma modalidade alterna- tiva da invenção. O uso de um agente quelante em composições farmacêuti- cas é bem-conhecido da pessoa versado. Por referência de conveniência é feita à Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ã edição, 2000,
Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende
um estabilizador. O uso de um estabilizador em composições farmacêuticas é bem-conhecido da pessoa versada. Por conveniência é feito referência à Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20- edição, 2000,
Uma composição farmacêutica da invenção pode adicionalmente compreender uma quantidade de um agente suficiente para diminuir a for- mação de agregados pelo peptídeo durante a armazenagem da composição. O termo "formação de agregado" é destinado a indicar uma interação física entre as moléculas de peptídeo que resulta na formação de oligômeros, que podem permanecer solúveis, ou agregados visíveis grandes que se precipi- tam da solução. O termo "durante armazenagem" é destinado a indicar uma composição farmacêutica líquida ou composição preparada uma vez, que não é imediatamente administrada um indivíduo. Ou melhor, em seguida à preparação, ela é embalada para armazenagem em uma forma líquida, em um estado de congelamento, ou em uma forma seca para reconstituição posterior em uma forma líquida ou outra forma apropriada para administra- ção para um indivíduo. O termo "forma seca" é destinado a indicar que a composição farmacêutica líquida ou composição é seca ou através de seca- gem por congelamento (isto é, liofilização; vide, por exemplo, Williams and Polli J. Parenteral Sei. Technol. 38, 48-59 (1984)), secagem por atomização (vide Masters (1991) em Atomização-Drying Handbook (5- edição; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. Drug Devei. Ind. Pharm. 18, 1169-1206 (1992); e Mumenthaler et al. Pharm. Res.11, 12-20 (1994) ), ou secagem por ar (Carpenter and Crowe Cryobiology25, 459-470 (1988); e Roser Biopharm. 4, 47-53 (1991)). Em uma modalida- de, o dito agente é uma base de aminoácido. O termo "base de aminoácido" é destinado a indicar um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, em que qualquer dado aminoácido está presente ou em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Em que uma combinação de aminoácidos é usada, todos os aminoácidos podem estar presentes em suas formas de base livre, todos podem estar presentes em suas formas de sal, ou alguns podem estar presentes em suas formas de base livre enquanto outros estão presentes em suas formas de sal. Em uma modalidade, os aminoácidos a serem usados para preparar as composições da invenção, são aqueles que levam uma cadeia lateral carregada, tais como arginina, lisina, ácido aspárti- co, e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero (isto é, isômero L ou D ou misturas dos mesmos) de um aminoácido particular (metionina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofan, treonina e misturas dos mesmos) ou combinações desses estereoisômeros ou glicina ou uma base orgânica tal como, mas não-limitado a imidazol, podem estar presentes nas composições farmacêuticas da invenção contanto que o aminoácido ou base orgânica particular esteja presente ou em sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma modalidade, o L-estereoisômero de um aminoácido é usado. Em uma modalidade, o L-estereoisômero é usado. Composições da invenção podem também ser formuladas como análogos desses aminoáci- dos. O termo "aminoácido análogo" é destinado a indicar um derivado de aminoácido de ocorrência natural que produz o efeito desejado de diminui- ção da formação do agregado pelo peptídeo durante a armazenagem das composições farmacêuticas líquidas da invenção. Análogos de arginina a- propriados incluem, por exemplo, aminoguanidina, ornitina e N-monoetil L- arginina, análodos de metionina apropriados incluem etionina e butionina e análogos de cisteína apropriados incluem S-metil-L cisteína. Como com os outros aminoácidos, os análogos de aminoácidos são incorporados nas composições em sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma mo- dalidade, os análogos de aminoácidos são usados em uma concentração, que é suficiente para prevenir ou retardar a agregação do peptídeo.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica ainda compre- ende metionina (ou outros aminoácidos sulfúricos ou aminoácidos análogos) para inibir a oxidação de resíduos de metionina para sulfóxido de metionina, quando o peptídeo que está atuando como o agente terapêutico é um peptí- deo que compreende pelo menos um resíduo de metionina suscetível a tal oxidação. O termo "inibir" é destinado a indicatar a acumulação mínima de espécias oxidadas de metionina no de correr do tempo. Inibir a oxidação de metionina resulta em maior retenção do peptídeo em sua forma molecular própria. Qualquer estereoisômero de metionina (isômero L ou D) ou quais- quer combinações dos mesmos podem ser usadas. A quantidade a ser adi- cionada deverá ser uma quantidade suficiente para inibir a oxidação dos re- síduos de metionina de tal forma que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável pelas agências reguladoras. Tipicamente, isso significa que a composição contém não mais do que cerca de 10% a cerca de 30% de sul- fóxido de metionina. Geralmente, isso pode ser obtido pela adição de metio- nina de tal modo que a proporção de metionina adicionada aos resíduos de metionina varia de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1, tal como 10:1 a cerca de 100:1,
Em uma modalidade, a composição farmacêutica ainda compre- ende um estabilizador, selecionado do grupo de polímeros de peso molecu- lar alto ou compostos de peso molecular baixo. Em uma modalidade, o esta- bilizador é selecionado de polietileno glicol (por exemplo PEG 3350), álcool de polivinila (PVA), polivinilpirrolidona, carbóxiVhidroxicelulose ou derivados dos mesmos (por exemplo HPC1 HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias contendo enxofre como monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2- metiltioetanol, e sais diferentes (por exemplo, cloreto de sódio). Cada um desses estabilizadores específicos constitue uma modalidade alternativa da invenção.
Uma composição farmacêutica da invenção pode também com- preender agentes de estabilização adicionais, que adicionalmente intensifi- cam a estabilidade de um peptídeo terapeuticamente ativo no mesmo. Agen- tes de estabilização incluem, mas não estão limitados a, metionina e EDTA, que protegem o peptídeo contra a oxidação da metionina, e um tensoativo não-iônico, que protege o peptídeo contra a agregação associada com con- gelar-descongelar ou cisallhamento mecânico.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica ainda compre- ende um tensoativo. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado de um detergente, óleo de rícino etoxilado, glicerídeos poliglicolizados, monoglice- rídeos acetilados,
ésteres de ácido graxo de sorbitan, polímeros de bloco de polio- xipropileno-polioxietileno (por exemplo poloxâmeros tais como Pluronic® F68, poloxâmero 188 e 407, Triton X-100 ), ésteres de ácido graxo de polio- xietileno sorbitan, derivados de polioxietileno e polietileno tais como deriva- dos alquilados e alcoxilados (tweens, por exemplo Tween-20, Tween-40, Tween-80 e Brij-35), derivados de monoglicerídeos ou etoxilados dos mes- mos, derivados de diglicerídeos ou polioxietileno dos mesmos, alcoóis, glice- rol, Iecitinas e fosfolipideos (por exemplo fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol, difosfatidil glicerol e esfingomielina), derivados de fosfolipideos (por exemplo ácido de dipalmitoil fosfatídico) e lisofosfolipídeos (por exemplo palmitoil lisofosfatidil-L-serina e ésteres de 1- acil-sn-glícero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina ou treonina) e alquila, alcoxila (alquil éster), alcóxi (alquil éter)- derivados de Iisofosfatidil e fosfati- dilcolinas, por exemplo derivados de lauroíla e miristoíla de Iisofosfatidilcoli- na, dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do grupo frontal polar, isto é colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, e os DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP positivamente carregados, Iisofosfati- dilserina e lisofosfatidiltreonina, e glicerofosfolipideos (por exemplo cefali- nas), gliceroglicolipideos (por exemplo galactopiransoido), esfingoglicolipide- os (por exemplo ceramidas, gangliosídeos), dodecilfosfocolina, Iisolecitina de ovo de galinha, derivados de ácido fusídico - (por exemplo tauro- diidrofusidato de sódio etc.), ácidos graxos de cadeia longa e sais dos mes- mos (por exemplo, ácido oléico e ácido caprílico), acilcarnitinas e derivados, derivados Na-acilados de lisina, arginina ou histidina, ou derivados adiados de cadeia lateral de lisina ou arginina, derivados Na-acilados de dipeptídeos compreendendo qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou acídico, derivado Na-acilado de um tripeptídeo com- preendendo qualquer combinação de um aminoácido neutral e dois aminoá- cidos carregados, DSS (sódio docusato, CAS registro no [577-11-7]), cálcio docusate, CAS registro no [128-49-4]), potássio docusato, CAS registro no [7491-09-0]), SDS (sulfato dodecil de sódio ou sulfato de Iaurila de sódio), caprilato de sódio, ácido cólico e derivados dos mesmos, ácidos da bile e sais dos mesmos, e glicina ou taurina conjugados, ácido ursodeoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-ammonio-1 -propanossulfonato, tensoativos monovalentes aniônicos (alquil-aril-sulfonatos), tensoativos zwiteriônicos (por exemplo N-alquil-N,N-dimetilamonio-1 -propanossulfonatos, 3-colamido-1 - propildimetilamonio-1 -propanossulfonato, tensoativos catiônicos (bases de amônio quaternário) (por exemplo brometo de cetil-trimetilamônio, cloreto de cetilpiridinio), tensoativos não-iônicos (por exemplo Dodecil β-D- glucopiranosideo), poloxaminas (por exemplo Tetronic1S), que são copolíme- ros tetrafuncionais em bloco, derivados da adição seqüencial de óxido de propileno e óxido de etileno para etilenodiamina, ou o tensoativo pode ser selecionado do grupo de derivados de imidazolina ou misturas dos mesmos. Cada um desses tensoativos específicos constitui uma modalidade alternati- va da invenção. O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas é bem- conhecido da pessoa versada. Por conveniência, é feito referência à Re- mington: The Science and Practice of Pharmacy, 20- edição, 2000,
É possível que outros ingredientes possam estar presentes em uma composição farmacêutica da presente invenção. Tais ingredientes adi- cionais podem incluir agentes umectantes, emulsificantes, antioxidantes, agentes volumosos, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, íons de metal, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo albumina de soro hu- mano, gelatina ou outras proteínas) e um zwitterion (por exemplo um amino- ácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, Iisina e histidina). Tais in- gredientes adicionais, naturalmente, não devem afetar adversamente a es- tabilidade total da composição farmacêutica da presente invenção.
Composições farmacêuticas contendo um hormônio do cresci- mento conjugado de acordo com a presente invenção podem ser adminis- tradas para um paciente com necessidade de tal tratamento em diversos sítios, por exemplo, em sítios tópicos, por exemplo, sítios da pele e muco- sais, em sítios que desviam a absorção, por exemplo, administração em uma artéria, em uma veia, no coração, e em sítios que envolvem absorção, por exemplo, administração na pela, sob a pele, em um músculo ou no abdôme.
A administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser através de diversas vias de administração, por exemplo, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pul- monar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou uma combinação dos mesmos, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular, por exemplos através de conjuntiva, uretal, e parenteral para pacientes com ne- cessidade de tal tratamento.
Composições farmacêuticas da invenção podem ser administra- das em diversas formas de dosagem, por exemplo, as soluções, suspen- sões, emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas, pomadas, pas- tas, emplastros, ungüentos, coprimidos, comprimidos revestidos, enxágues, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina dura e cápsulas de gelatina mo- le, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, atomizaçãos, pó, aerossóis, inalantes, colírios, ungüentos oftálmicos, enxágües oftálmicos, pessários vaginais, anéis vaginais, ungüentos vaginais, solução de injeção, soluções de transformação in situ, por exemplo gelificação in situ, ajuste in situ, preci- pitação in situ, cristalização in situ, solução de infusão, e implantes.
Composições farmacêuticas da invenção podem ainda ser com- postas em, ou ligadas, por exemplo através de interações covalentes, hidro- fóbicas e eletrostáticas, a um veículo de fármaco, sistema de distribuição de fármaco e sistema de distribuição de fármaco avançado a fim de ainda au- mentar a estabilidade do conjugado de GH, aumento da biodisponibilidade, aumento da solubilidade, diminuição de efeitos adversos, realizar cronotera- pia bem-conhecida daqueles versados na técnica, e aumento da aquiescên- cia do paciente ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de veícu- los, sistemas de distribuição de fármacos avançados incluem, mas não estão limitados a, polímeros, por exemplo celulose e derivados, polissacarídeos, por exemplo dextrana e derivados, amido e derivados, poli(vinil álcool), polí- meros de acrilato e metacrilato, ácido poliláctico e poliglicólico e copolímeros bloqueadores dos mesmos, polietileno glicois, proteínas de veículos, por e- xemplo albumina, géis, por exemplo, sistemas de termogelificação, por e- xemplo sistemas co-polimeróicos bloqueadores bem-conhecidos daqueles versados na técnica, micelas, lipossomas, microsferas, nanoparticulados, cristais líquidos e dispersões dos mesmos, fase L2 e dispersões da mesma, bem-conhecidas daqueles versados na técnica de comportamento de fase em sistemas de lipídeo-água, micelas polimeróicas, emulsões múltiplas, au- to-emulsificantes, auto-microemulsificantes, ciclodextrinas e derivados dos mesmos, e dendrímeros.
As composições farmacêuticas da invenção são úteis na compo- sição de sólidos, semissólidos, pó e soluções para administração pulmonar de conjugado de GH, usando, por exemplo um inalador de dose medida, inalador de pó seco e nebulizador, todos sendo dispositivos bem-conhecidos daqueles versados na técnica.
As composições farmacêuticas da invenção são especificamente úteis na composição de sistemas de distribuição de fármacos controlados, sustentados, demorados, retardados e de liberação lenta. Mais especifica- mente, mas não-limitado a, as composições são úteis na composição de sis- temas de liberação sustentada e de liberação controlada parenteral (ambos os sistemas levando a uma redução múltipla em número de administrações), bem-conhecidos daqueles versados na técnica. Ainda mais preferivelmente, são os sistemas de liberação controlada e liberação sustentada administra- dos subcutaneamente. Sem limitar o escopo da invenção, exemplos de sis- tema de liberação controlada e composições úteis são hidrogéis, géis olea- ginosos, cristais líquidos, micelas polimeróicas, microsferas, nanopartículas.
Métodos para produzir sistemas de liberação controlada para composições da invenção incluem, mas não são limitados a, cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co-precipitação, emulsificação, dispersão, homogenisação de alta pressão, encapsulação, secagem por a- tomização, microencapsulagem, co-acervação, separação de fase, evapora- ção de solvente para produzir microesferas, extrusão e processos fluidos supercríticos. Referência geral é feita ao Handbook of Pharmaceutical Con- trolled Release (Wise, D.L., ed. Mareei Dekker, New York, 2000) e ao Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Composition and Delivery (MacNally, E.J., ed. Mareei Dekker, New York, 2000).
A administração parenteral pode ser realizada por injeção subeu- tânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de uma serin- ga, opcionalmente uma seringa do tipo pena. Alternativamente, a adminis- tração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Uma opção adicional é uma composição que pode ser uma solução ou sus- pensão para a administração do conjugado de GH na forma de um atomiza- ção nasal ou pulmonar. Como uma opção adicional ainda, as composições farmacêuticas contendo o conjugado de GH da invenção podem também ser adaptados para administração transdérmica, por exemplo por injeção livre de agulha ou de um emplastro, opcionalmente um emplastro iontoforético, ou transmucosal, por exemplo administração bucal.
O termo "composição estabilizada" refere-se a uma composição com estabilidade física aumentada, estabilidde química aumentada ou esta- bilidade física e química aumentada.
O termo "estabilidade física" de uma composição de peptídeo como usado aqui a seguir refere-se à tendência do peptídeo para formar a- gregados biologicamente inativos e/ou insolúveis do peptídeo como um re- sultado da exposição do peptídeo para estresses termomecânicos e/ou inte- ração com interfaces e surperfícies que são desestabilizantes, tais como su- perfícies e interfaces hidrofóbicas. A estabilidade física das composições de peptídeo aquoso é avaliada por meio de inspeção visual inspection e/ou me- dições da turvação depois de expor a composição colocada em recipientes apropriados (por exemplo cartuchos ou frascos) para tensão mecânica/física (por exemplo agitação) a temperaturas diferentes por vários períodos de tempo. A inspeção visual das composições é realizada em uma luz focada nítida com um fundo escuro. A turvação da composição é caracterizada por um score visual classificando o grau de turvação por exemplo em uma esca- Ia de 0 a 3 (uma composição que não mostra turvação corresponde a um score visual de 0, e uma composição que mostra turvação visual na luz do dia corresponde a um score visual 3). Uma composição é classificada instá- vel física, com respeito à gregação do peptídeo, quando ela mostra turvação visual na luz do dia. Alternativamente, a turvação da composição pode ser avaliada por simples medidas de turvação bem-conhecidas da pessoa ver- sada. A estabilidde física das composições de peptídeo aquoso pode tam- bém ser avaliada usando um agente ou sonda espectroscópica do status conformacional do peptídeo. A sonda é preferivelmente uma molécula pe- quena que preferencialmente liga a um adaptador não-nativo do peptídeo. Um exemplo de sonda espectroscópica molecular pequena de estrutura de peptídeo é Thioflavin T. Thioflavin T é um corante fluorescente que tem sido amplamente usado para a detecção de fibrilas amilóides. Na presença de fibrilas, e talvez de outras configurações de peptídeo também, a Thioflavin T dá origem a uma nova excitação máxima a cerca de 450 nm e emissão in- tensificada a cerca de 482 nm, quando ligada uma uma forma de peptídeo fibrilar. Thioflavin T não ligado é essencialmente uma não-fluorescente em comprimentos de ondas. Outras pequenas moléculas podem ser usadas como sondas de mudanças em estrutura de peptídeo de estados nativos para estados não nativos. Por exemplo, as sondas de "emplastro hidrofóbica" que ligam prefe- rencialmente os emplastros hidrofóbicos expostos de um peptídeo. Os em- plastos hidrofóbicos são geralmente enterrados em uma estrutura terciária de um peptídeo em seu estado nativo, mas tornam-se expostos à medida que um peptídeo começa a abrir ou desnaturar. Exemplos dessas pequenas moléculas, sondas espectroscópicas são aromáticas, moldes hidrofóbicos, tais como antraceno, acridina, fenantrolina ou os similares. Outras sondas espectroscópicas são complexos de ácido metilamino, tais como complexos de metal cobalto de ácidos de amido hidrofóbico, tais como fenilalanina, Ieu- cina, isoleucina, metionina, e valina, ou os similares.
O termo "estabilidade química" das composições de peptídeo conforme usadas nesta refere à habilidade do peptídeo mencionado a resis- tir às reações químicas envolvendo a quebra de ligações covalentes ou à formação de novas ligações covalentes da estrutura do peptídeo levando à formação de produtos de degradação química com potência biológica menos potencial e/ou propriedades imunogênicas aumentadas de potencial compa- radas à estrutura de peptídeo nativo. Vários produtos de degradação quími- ca podem ser formados dependendo do tipo e da natureza do peptídeo nati- vo e do ambiente no qual o peptídeo é exposto. Quando conjugado a um grupo apropriado, os peptídeos da presente invenção podem ser significan- temente mais estáveis que os peptídeos não-conjugados correspondentes.
A maioria dos peptídeos tende à desamidação, um processo no qual o encadeamento do lado do grupo do amido em resíduos de glutaminila ou asparaginila é hidrolisado para formar um ácido carboxílico livre. Outro caminho de degradação envolve formação de altos produtos de transforma- ção de peso de molécula onde duas ou mais moléculas de peptídeo são li- gadas covalentemente a cada outra através de moléculas de transamidação e/ou interações de bissulfeto levando à formação de dímero limite covalen- temente, oligômero e produtos de degradação de polímero (Stability of Pro- tein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York .1992). A oxidação (de, por exemplo, resíduos de metionina) pode ser men- cionada como outra variante de degradação química. A estabilidade química da composição de peptídeo pode ser avaliada através da medida da quanti- dade dos produtos de degradação química em vários espaços de tempo a- pós exposição a diferentes condições ambientais (a formação de produtos de degradação pode ser geralmente acelerada através de, por exemplo, aumentar a temperatura). A quantidade de cada produto de degradação in- dividual é geralmente determinada através da separação dos produtos de degradação dependendo do tamanho da molécula e/ou energia usando vá- rias técnicas cromatográficas (por exemplo, SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).
Por conseguinte, como descrito acima, uma "composição estabi- lizada" refere-se a uma composição com estabilidade física aumentada, es- tabilidade física aumentada ou estabilidade quimicamente ou fisicamente aumentada. Em geral, uma composição precisa ser estável durante o uso e estocagem (em consentimento com o uso recomendado e condições de es- tocagem) até que a data de expiração seja alcançada.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica englobando o conjugado de hormônio de crescimento é estável por mais de 6 semanas de uso e por mais de 3 anos de estocagem.
Em uma modalidade, mais de 4 semanas de uso e por mais de 3 anos de estocagem.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica englobando o conjugado de hormônio de crescimento e estável por mais de 4 semanas de uso e por mais que dois anos de estocagem.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica englobando o conjugado de hormônio de crescimento e estável por mais de 2 semanas de uso e por mais que dois anos de estocagem.
Conforme declarado, os compostos da fórmula (I) em que Prot representa hormônio de crescimento e as quais exercem atividade de cres- cimento de hormônio (ou composições farmacêuticas englobando tais com- postos) podem tanto ser usados no tratamento de doenças ou estados que irão beneficiar de um aumento na quantidade de hormônio de crescimento circulatório.
Conseqüentemente, a presente invenção fornece um composto da presente invenção para o uso em terapia.
A presente invenção também fornece um método de tratamento de uma doença, condições ou distúrbio beneficiado de um aumento no nível de hormônio de crescimento circulatório, o método compreendendo a admi- nistração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção para um paciente em necessidade do mesmo.
A presente invenção também fornece um método para o trata- mento de deficiência de hormônio de crescimento (GHD); Síndrome de Tur- ner; Síndrome de Prader-Willi (PWS); Síndrome de Noonan; Síndrome de Down; doença renal crônica, artrite reumática infantil; fibrose cística, infec- ção de HIV em crianças recebendo tratamento de HAART (crianças HIV/HALS); crianças nascidas pequenas por idade gestacional curta (SGA); estatura pequena em crianças nascidas com peso de nascimento muito bai- xo (VLBW), mas SGA; displasia esquelética; hipocondroplasia; acondropla- sia; estatura baixa idiopática (ISS); GHD em adultos; fraturas em ou de lon- gos ossos, tais como tíbia, fíbula, fêmur, úmero, rádio, ulna, clavícula, mata- carpea, matatarsea, e dígito; fraturas em ou de ossos esponjosos, tais como o crânio, base da mão e base do pé; pacientes após cirurgia de Iigamento ou de tendão em, por exemplo, mão, joelho ou ombro; pacientes tendo ou que passarão por distúrbio de osteogênese; pacientes após substituição de disco ou coxa, reparo de menisco, fusões espinhais ou ficção de prótese, tais co- mo no joelho, coxa, ombro, cotovelo, pulso ou maxilar; pacientes dentro do qual material osteossíntese, tais como unhas, parafusos e placas, tenham sido fixados; pacientes com não-união ou mal-união de fraturas; pacientes após osteatomia, por exemplo da tíbia ou 1Q dedo do pé; pacientes após im- plantação de enxerto; degeneração de cartilagem articular no joelho causada por trauma ou artrite; osteoporose em pacientes com síndrome de Turner; osteoporose em homens; pacientes adultos em diálise crônica (APCD); do- ença cardiovascular associada mal-nutricional em APCD; reversão de ca- quexia em APCD; câncer em APCD; doença pulmonar abstrativa crônica em APCD; HIV em APCD; idoso com APCD; doença fígado crônica em APCD, síndrome de fadiga em APCD; doença de Crohn; função de fígado debilita- da; machos com infecções de HIV; síndrome de intestino curto; obesidade central; síndrome de Iipodistrofia HlV-associada (HALS); fertilidade masculi- na; pacientes após cirurgia eletiva principal, desintoxicação de álcool/droga ou trauma neurológico; envelhecimento; envelhecimento frágil; osteoartrite; cartilagem danificada traumaticamente; disfunção erétil; fibromialgia; desor- dens memoriais; depressão; ferimento traumático de cérebro; ferimento de cordão espinhal traumático; hemorragia sub-aracnóide; peso de nascimento muito baixo; síndrome metabólica; miopatia glucocorticóide; ou estatura pe- quena devido ao tratamento de glucocorticóide em criança, o método com- preendendo administração para um paciente com necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a fór- mula (I).
O termo "tratamento" e "tratando" é intencionado a indicar o ge- renciamento e o cuidado de um paciente com o propósito de combater uma condição, uma doença ou um distúrbio. O termo é intencionado a incluir um espectro inteiro de tratamentos para uma condição dada da qual o paciente está sofrendo, tal como a administração de composto ativo para aliviar os sintomas ou complicações, para atrasar o progresso da doença, distúrbio ou condição, para aliviar ou reparar os sintomas e complicações, e/ou para cu- rar ou eliminar a doença, distúrbio ou condição tal como para prevenir a condição, em que prevenção é para ser entendida como o gerenciamento e cuidado de um paciente para o propósito de combater a doença, condição ou distúrbio e inclui a administração dos compostos ativos para prevenir o princípio dos sintomas e complicações. O paciente a ser tratado é preferen- cialmente mamífero, em particular um ser humano, mas ele também pode incluir animais, tal como cachorros, gatos, vacas, carneiros e porcos.
O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto é intencionado a indicar uma quantidade suficiente para curar, aliviar ou apri- sionar parcialmente as manifestações clínicas de uma dada doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para executar isso é definida co- mo "quantidade terapeuticamente eficaz". As quantidades eficazes para ca- da propósito irão depender, por exemplo, da gravidade da doença ou feri- mento tal como do peso, sexo, idade e estado geral da pessoa. Será enten- dido que a determinação de uma dosagem apropriada pode ser alcançada usando experimentação de rotina, através da construção de uma matriz de valores e testando pontos diferentes na matriz, a qual seja toda dentro das técnicas ordinárias de um médico ou veterinário treinado.
Em uma modalidade, o composto da invenção é administrado por administração parental. Uma dose parenteral típica está em uma ordem de .10"9 mg/kg para aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por adminis- tração. Doses de administração típica são de aproximadamente 0,0000001 para aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por administração. A do- se exata dependerá, por exemplo, de indicação, medicamento, freqüência e modo de administração, do sexo, idade e condição geral da pessoa a ser tratada, da natureza e gravidade da doença ou condição a ser tratada, do efeito desejado do tratamento e de outros fatores evidentes para a pessoa versada na técnica.
Freqüências de dosagem típica são de duas vezes ao dia, uma vez ao dia, por diária, duas vezes semanalmente, uma vez semanalmente ou até com intervalos de dosagem mais longos. Devido as meia-vidas pro- longadas dos peptídeos conjugados da presente invenção, um regime de dosagem com intervalos de dosagem longos, tais como duas vezes sema- nalmente, uma vez semanalmente ou até com intervalos de dosagem mais longos é uma modalidade particular da invenção.
Em uma modalidade, a dita administração é executada a cada segundo dia ou com intervalos mais longos.
Em uma modalidade, a dita administração é executada uma vez por semana ou com intervalos mais longos.
Em uma modalidade, a dita administração é executada uma vez ao mês ou com intervalos mais longos.
Em uma modalidade, dada a condição, doença ou distúrbio é pre- judicial em pacientes de AIDS, deficiência GH devido a um tumor pituitário, e crescimento pobre em crianças devido à deficiência GH, falha renal, síndro- me de Turner e síndrome de Prader-Willi.
Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a ace- leração da cura do tecido do músculo, tecido nervoso ou feridas; a acelera- ção ou melhora da corrente sangüínea para tecido danificado; ou a diminui- ção da taxa de infecção em tecido danificado, o método compreendendo administração para um paciente em necessidade de uma quantidade eficaz de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da fórmula (I).
A presente invenção também fornece o uso de um composto da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma con- dição, doença ou distúrbio beneficiando de um aumento no nível de hormô- nio de crescimento circulatório.
Em uma modalidade, dada condição, doença ou distúrbio é sele- cionado da deficiência do hormônio de crescimento (GHD); Síndrome de Turner; Síndrome de Prader-Willi (PWS); Síndrome de Noonan; Síndrome de Down; doença crônica renal, artrite reumática infantil; fibrose cística, infec- ção por HIV em crianças recebendo tratamento HAART (crianças HIV/HALS); crianças nascidas pequenas por idade gestacional curta (SGA); estatura pequena em crianças nascidas com peso de nascimento muito bai- xo (VLBW), mas SGA; displasia esquelética; hipocondroplasia; acondropla- sia; estatura baixa idiopática (ISS); GHD em adultos; fraturas em ou de lon- gos ossos, tais como tíbia, fíbula, fêmur, úmero, rádio, ulna, clavícula, mata- carpea, matatarsea, e dígito; fraturas em ou de ossos esponjosos, tais como o crânio, base da mão e base do pé; pacientes após cirurgia de Iigamento ou de tendão em, por exemplo, mão, joelho ou ombro; pacientes tendo ou que passarão por distúrbio de osteogênese; pacientes após substituição de disco ou coxa, reparo de menisco, fusões espinhais ou ficção de prótese, tais co- mo no joelho, coxa, ombro, cotovelo, pulso ou maxilar; pacientes dentro do qual material osteossíntese, tais como unhas, parafusos e placas, tenham sido fixados; pacientes com não-união ou mal-união de fraturas; pacientes após osteatomia, por exemplo da tíbia ou 1? dedo do pé; pacientes após im- plantação de enxerto; degeneração de cartilagem articular no joelho causada por trauma ou artrite; osteoporose em pacientes com síndrome de Turner; osteoporose em homens; pacientes adultos em diáiise crônica (APCD); do- ença cardiovascular associada mal-nutricional em APCD; reversão de ca- quexia em APCD; câncer em APCD; doença pulmonar abstrativa crônica em APCD; HIV em APCD; idoso com APCD; doença fígado crônica em APCD, síndrome de fadiga em APCD; doença de Crohn; função de fígado debilita- da; machos com infecções de HIV; síndrome de intestino curto; obesidade central; síndrome de Iipodistrofia HlV-associada (HALS); fertilidade masculi- na; pacientes após cirurgia eletiva principal, desintoxicação de álcool/droga ou trauma neurológico; envelhecimento; envelhecimento frágil; osteoartrite; cartilagem danificada traumaticamente; disfunção erétil; fibromialgia; desor- dens memoriais; depressão; ferimento traumático de cérebro; ferimento de cordão espinhal traumático; hemorragia sub-aracnóide; peso de nascimento muito baixo; síndrome metabólica; miopatia glucocorticóide; e estatura pe- quena devido ao tratamento de glucocorticóide em criança.
Em uma modalidade, a dita doença é selecionada a partir do en- fraquecimento em pacientes com AIDS, deficiência GH devido ao tumor pi- tuitário e crescimento pobre em crianças devido à deficiência GH, Síndrome de Turner ou síndrome de Prader-Willi.
Várias doenças são tratadas usando mais de um medicamento no tratamento, tanto simultaneamente administrado quanto seqüencialmente administrado. É então, dentro do escopo da presente invenção usar compos- tos da fórmula (I) em métodos terapêuticos para o tratamento de uma das doenças mencionadas acima em combinação com um ou outros mais com- postos ativos terapêutica e normalmente usados no tratamento das ditas doenças. Por analogia, também está dentro do escopo da presente invenção usar compostos da fórmula (I) em combinação com outros compostos ativos terapêutica e normalmente usados em tratamento de uma das doenças mencionadas acima na fabricação de um medicamento de uma dita doença.
O que segue é uma lista de modalidades da presente invenção: Modalidade 1: Peptídeo conjugado de acordo com a fórmula (I) <formula>formula see original document page 70</formula>
(i)
em que
Prot representa um radical derivado de peptídeo gerado pela re- moção formal de um átomo de hidrogênio a partir de um grupo amino (-NH2) do dito peptídeo,
R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substi- tuído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou arila;
R2 representa uma ligação ou um ligante, em que o dito Iigante compreende um dirradical selecionado do grupo consistindo em<formula>formula see original document page 70</formula> , e combinaçoes dos mesmos, e
R3 representa um grupo de modificação de propriedade;
R4 representa hidrogênio ou C-i-6-alquila;
R5 representa -CH2- ou -C(=0)-,
ou sais, pró-fármacos e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Modalidade 2: Um composto de acordo com a modalidade 1, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo C1^alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou C5-22- arila.
Modalidade 3: Um composto de acordo com a modalidade 2, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou Ce-18- arila.
Modalidade 4: Um composto de acordo com a modalidade 3, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou C4-16- arila.
Modalidade 5: Um composto de acordo com a modalidade 4, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou C6-8- arila.
Modalidade 6: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que R1 representa um C5^arileno, opcionalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 7: Um composto de acordo com a modalidade 6, em que R1 representa um C6-i8-arileno, opcionalmente substituído como descri- to acima.
Modalidade 8: Um composto de acordo com a modalidade 7, em que R1 representa um C6--i4-arileno, opcionalmente substituído como descri- to acima.
Modalidade 9: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que R1 representa um C5.22-heteroarileno opcional- mente substituído como descrito acima.
Modalidade 10: Um composto de acordo com a modalidade 9, em que R1 representa um C6-i8-heteroarileno opcionalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 11: Um composto de acordo com a modalidade 10, em que R1 representa um C6-i4-heteroarileno opcionalmente substituído co- mo descrito acima.
Modalidade 12: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que R1 representa um C6-8-arileno, um Ci2-i8-arileno ou um C5.18-heteroarileno opcionalmente substituído como descrito acima. Modalidade 13: Um composto de acordo com a modalidade 12, em que R1 representa um grupo fenileno ou um piridileno.
Modalidade 14: Um composto de acordo com a modalidade 13, em que R1 representa 1,4-fenileno.
Modalidade 15: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que R2 representa uma ligação, -C(=0)-, -C(=0)-NH-, ou
<formula>formula see original document page 72</formula>
Modalidade 16: Um composto de acordo com a modalidade 15, em que R2 representa -C(=0)-NH-.
Modalidade 17: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 16, em que a propriedade modificada pelo grupo de modifi- cação de propriedade é a meia-vida in vivo funcional do composto peptídeo.
Modalidade 18: Um composto de acordo com a modalidade 17, em que a meia-vida in vivo funcional do composto peptídeo é aumentada em comparação ao composto peptídeo sem o grupo de modificação de proprie- dade.
Modalidade 19: Um método de acordo com a modalidade 18, em que a meia-vida in vivo funcional aproximada do peptídeo é aumentada por 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 10 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, .14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, .23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, ou 30 dias.
Modalidade 20: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que
R3 representa um polímero ou oligômero linear ou ramificado, op- cionalmente substituído por grupos funcionais ácidos ou negativamente car- regados, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combinações dos mesmos; ou
R3 representa um grupo C10-C90 alquila linear ou ramificado, op- cionalmente substituído por grupos funcionais ácidos, ou negativamente carregados com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combina- ções dos mesmos.
Modalidade 21: Um composto de acordo com a modalidade 20, em que R3 representa um polietileno glicol (PEG) linear ou ramificado, polo- xâmero, poli (ácido láctico), copolímero de poli (lactídeo)-glicolídeo, oligos- sacarídeo, peptídeos, proteínas, ou combinações dos mesmos, opcional- mente substituído por grupos funcionais ácidos ou negativamente carrega- dos, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combinações dos mesmos.
Modalidade 22: Um composto de acordo com a modalidade 21, em que R3 representa um oligossacarídeo linear ou ramificado selecionado de tal como celulose, amido, ácido hialurônico, ágar, hidroxietil celulose, hi- droxietil amido, ou pentosano ou combinações dos mesmos, opcionalmente substituído por grupos funcionais ácidos ou negativamente carregados, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combinações dos mesmos.
Modalidade 23: Um composto de acordo com a modalidade 21, em que R3 representa um polietileno glicol linear ou ramificado de um peso molecular de 5-60 kDa.
Modalidade 24: Um composto de acordo com a modalidade 20, em que R3 representa um grupo alquila Ci0-C9O linear ou ramificado, opcio- nalmente substituído por grupos funcionais ácidos ou negativamente carre- gados, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combinações dos mesmos.
Modalidade 25: Um composto de acordo com a modalidade 24, em que R3 representa CH3-(CH2)-10-30-, (5-tetrazolil)-(CH2)io-3o-, ou HO2C-(CH2)-10-30"·
Modalidade 26: Um composto de acordo com a modalidade 20, em que R3 é selecionado de:
<formula>formula see original document page 73</formula> <formula>formula see original document page 74</formula>
Modalidade 27: Um composto de acordo com a modalidade 20, em que R3 é selecionado de Me-(CH2)i2-, Me-(CH2)i4-, Me-(CH2)16-, Me-(CH2)i8-, (5-tetrazolil)-(CH2)i2-, (5-tetrazolil)-(CH2)13-, (5-tetrazolil)-(CH2)i4-, (5-tetrazolil)-(CH2)i5-. (5-tetrazolil)-(CH2)i6-, (5-tetrazolil)-(CH2)17-, (5-tetrazolil)-(CH2)18-, H02C-(CH2)i4-, H02C-(CH2)i5-, HO2C-(CH2)16-, HO2C-(CH2)17-, HO2C-(CH2)18-, (5-tetrazolil)2CH-(CH2)14-,
<formula>formula see original document page 75</formula>
Modalidade 28: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 27, em que R4 representa hidrogênio.
Modalidade 29: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 27, em que R4 representa C1^alquila.
Modalidade 30: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 29, em que R5 representa -CH2-.
Modalidade 31: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 29, em que R5 representa -C(=0)-.
Modalidade 32: Um composto de acordo com a modalidade 1 tendo uma fórmula estrutural selecionada de:
<formula>formula see original document page 75</formula> <formula>formula see original document page 76</formula>
ou sais, pró-fármacos e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Modalidade 33: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 32, em que Prot é obtenível de um aldeído derivado de peptídeo ou cetona da fórmula
R6-C(=0)-R5-Prot,
em que
R5 é como descrito acima, e
R6 representa hidrogênio ou um átomo de carbono α opcional- mente substituído.
Modalidade 34: Um composto de acordo com a modalidade 33, em que R6 representa hidrogênio, C-|.6-alquila ou Ci-6-cicloalquila.
Modalidade 35: Um composto de acordo com a modalidade 34, em que R6 representa hidrogênio, metila, etila, propila, ciclopropila, ciclobuti- Ia1 ciclopentila, ou ciclohexila.
Modalidade 36: Um composto de acordo com a modalidade 35, em que R6 representa hidrogênio ou metila.
Modalidade 37: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 36, em que Prot representa um radical derivado de peptí- deo gerado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio de um grupo amino (-NH2) de um peptídeo ou proteína, e em que o dito grupo amino é o grupo amino N-terminal do peptídeo, um grupo amino de cadeia lateral do resíduo de Iisina no peptídeo, ou um grupo amino de cadeia lateral do resí- duo de glutamina ou asparagina (CONH2) no peptídeo.
Modalidade 38: Um composto de acordo com a modalidade 37, em que Prot representa um radical peptídeo gerado formalmente pela remo- ção de um átomo de hidrogênio do grupo amino N-terminal.
Modalidade 39: Um composto de acordo com a modalidade 37, em que Prot representa um radical peptídeo gerado formalmente pela remo- ção de um átomo de hidrogênio de um grupo amino de cadeia lateral do re- síduo de Iisina no peptídeo.
Modalidade 40: Um composto de acordo com a modalidade 37, em que Prot representa um radical peptídeo gerado formalmente pela remo- ção de um átomo de hidrogênio de um grupo amino de cadeia lateral do re- síduo de glutamina ou asparagina no peptídeo.
Modalidade 41: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 40, em que Prot representa um radical derivado do hormô- nio de crescimento.
Modalidade 42: Um composto de acordo com a modalidade 41, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 43: Um composto de acordo com a modalidade 42, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 44: Um composto de acordo com a modalidade 43, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1, Modalidade 45: Um composto de acordo com a modalidade 44, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 46: Um composto de acordo com a modalidade 41, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento humano.
Modalidade 47: Um composto de acordo com a modalidade 46, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento humano compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID No. 1,
Modalidade 48: Um composto de acordo com a modalidade 40, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento.
Modalidade 49: Um composto de acordo com a modalidade 48, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 50: Um composto de acordo com a modalidade 49, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 51: Um composto de acordo com a modalidade 50, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 52: Um composto de acordo com a modalidade 51, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 53: Um composto de acordo com a modalidade 48, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento humano.
Modalidade 54: Um composto de acordo com a modalidade 53, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento humano compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID No. 1,
Modalidade 55: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 48 a 54, em que o radical Prot representa um radical peptídeo gerado formalmente pela remoção de um átomo de hidrogênio do grupo a- minocarbonila de cadeia lateral (H2N-CO-) da glutamina na posição corres- pondente à posição 40 na SEQ ID No. 1,
Modalidade 56: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 48 a 54, em que o radical Prot representa um radical peptídeo gerado formalmente pela remoção de um átomo de hidrogênio do grupo a- minocarbonila de cadeia lateral (H2N-CO-) da glutamina na posição corres- pondente à posição 141 na SEQ ID No. 1,
Modalidade 57: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 41 a 56, em que o peptídeo tem uma atividade de pelo menos 20% da atividade de hGH no ensaio (I).
Modalidade 58: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 41 a 56, em que o peptídeo tem uma atividade de pelo menos 40% da atividade de hGH no ensaio (I).
Modalidade 59: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 41 a 56, em que o peptídeo tem uma atividade de pelo menos 60% as atividade de hGH no ensaio (I).
Modalidade 60: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 41 a 56, em que o peptídeo tem uma atividade de pelo menos 80% da atividade de hGH no ensaio (I).
Modalidade 61: Um composto de acordo com a modalidade 1, em que o peptídeo é
<formula>formula see original document page 79</formula> <formula>formula see original document page 80</formula> <formula>formula see original document page 81</formula>
ou sais, pró-fármacos e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Modalidade 62: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 40, em que Prot representa um radical derivado de anticor- po.
Modalidade 63: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 40, em que Prot representa a radical derivado de um frag- mento de um anticorpo.
Modalidade 64: Um método para a preparação de um composto peptídeo compreendendo um grupo de modificação de propriedade, o dito método compreendendo as etapas de: (a) tratamento de um aldeído ou cetona derivada do composto peptídeo com um grupo de modificação de propriedade derivado de anilina ou heteroarilamina para render uma imina ou um hemiaminal, (b) tratamento desta imina ou hemiaminal com um agente de redução adequado, tal como NaCNBH3, para render uma amina secundária.
Modalidade 65: Um método de acordo com a modalidade 64, em que a propriedade modificada pelo grupo de modificação de propriedade do composto peptídeo compreendendo um grupo de modificação de proprieda- de quando comparado ao composto peptídeo sem o dito grupo de modifica- ção de propriedade ser a meia-vida in vivo funcional do composto peptídeo.
Modalidade 66: Um método de acordo com a modalidade 65, em que a meia-vida in vivo funcional do composto peptídeo é aumentada quan- do comparada ao composto peptídeo sem o grupo de modificação de propri- edade.
Modalidade 67: Um método de acordo com a modalidade 66, em que a meia-vida in vivo funcional aproximada do peptídeo tem sido aumen- tada por 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 10 horas, 1 dias, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, ou 30 dias.
Modalidade 68: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 64 a 67, em que o composto peptídeo compreendendo um gru- po de modificação de propriedade é um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 63.
Modalidade 69: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 64 a 68, em que o aldeído ou cetona derivado de peptídeo é preparado pela oxidação mediada por periodato de um composto peptídeo que contém uma subestrutura de 2-aminoetanol.
Modalidade 70: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 64 a 68, em que o aldeído derivado de peptídeo ou cetona é preparado por hidrólise de um acetal ou um hemiacetal.
Modalidade 71: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 64 a 68, em que o aldeído derivado de peptídeo é preparado por oxidação mediada por periodato de um peptídeo contendo serina ou tre- onina como o ácido amino N-terminal. Modalidade 72: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 64 a 68, em que o aldeído derivado de peptídeo é preparado por oxidação mediada por periodato de um peptídeo transaminado enzimati- camente com 1,3-diamino-2-propanol.
Modalidade 73: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 64 a 68, em que o aldeído derivado de peptídeo ou cetona é preparado por alimentação de um organismo geneticamente modificado ou não-modificado que produz o dito peptídeo com um aminoácido não-natural contendo um aldeído ou cetona funcionalmente, em que o dito aminoácido será incorporado ao peptídeo, seguido pelo isolamento e a purificação do peptídeo ao qual o aminoácido não-natural tem sido incorporado.
Modalidade 74: Um método de acordo com a modalidade 73, em que o aminoácido não-natural é (acetilfenil) alanina ou (formilfenil) alanina.
Modalidade 75: Um método de acordo com a modalidade 73 ou modalidade 74, em que o mRNA que codifica o peptídeo compreende pelo menos um códon que codifica a fenilalanina.
Modalidade 76: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 64 a 75, em que a anilina ou heteroarilamina derivada do grupo de modificação de propriedade é da fórmula R3-R-R-NH2
(III)
em que R1, R2, e R3 são como definidos na modalidade 1,
Modalidade 77: Um método de acordo com a modalidade 76, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou C5-22- arila.
Modalidade 78: Um método de acordo com a modalidade 77, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo C1^alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou C6--Ie- arila.
Modalidade 79: Um método de acordo com a modalidade 78, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou C4-16- arila.
Modalidade 80: Um método de acordo com a modalidade 79, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou Οβ-β- arila.
Modalidade 81: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 76 a 80, em que R1 representa um C5-22-arileno, opcionalmente substituído como descrito acima. Modalidade 82: Um método de acordo com a modalidade 81, em que R1 representa um C6--18-arileno, opcionalmente substituído como descri- to acima.
Modalidade 83: Um método de acordo com a modalidade 82, em que R1 representa um C6-i4-arileno, opcionalmente substituído como descri- to acima.
Modalidade 84: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 76 a 80, em que R1 representa um C5-22-heteroarileno opcio- nalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 85: Um método de acordo com a modalidade 84, em que R1 representa um C6-i8-heteroarileno opcionalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 86: Um método de acordo com a modalidade 85, em que R1 representa um C6-i4-heteroarileno opcionalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 87: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 76 a 80, em que R1 representa um C6-8-arileno, um Ci2-ie- arileno ou um C5.i8-heteroarileno opcionalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 88: Um método de acordo com a modalidade 87, em que R1 representa um grupo fenileno ou um piridileno.
Modalidade 89: Um método de acordo com a modalidade 88, em que R1 representa 1,4-fenileno. Modalidade 90: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 76 a 89, em que R2 representa a ligação, -C(=0)-NH-, ou <formula>formula see original document page 85</formula>
Modalidade 91: Um método de acordo com a modalidade 90, em que R2 representa -C(=0)-NH-.
Modalidade 92: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 76 a 91, em que
R3 representa um polímero ou oligômero linear ou ramificado, op- cionalmente substituído por grupos funcionais ácidos ou negativamente car- regados; ou
R3 representa um grupo C10-C90 alquila linear ou ramificado, op- cionalmente substituído por grupos funcionais ácidos ou negativamente car- regados.
Modalidade 93: Um método de acordo com a modalidade 92, em que R3 representa um polietileno glicol (PEG) linear ou ramificado, poloxâ- mero, poli(ácido láctico), copolímero de poli(lactídeo)-glicolídeo, oligossaca- rídeo, peptídeos, proteínas, ou combinações dos mesmos.
Modalidade 94: Um método de acordo com a modalidade 93, em que R3 representa um oligossacarídeo linear ou ramificado selecionado de tal como celulose, amido, ácido hialurônico, ágar, hidroxietil celulose, hidro- xietil amido, ou pentosano ou combinações dos mesmos.
Modalidade 95: Um método de acordo com a modalidade 93, em que R3 representa um polietileno glicol linear ou ramificado de um peso mo- lecular de 5-60 kDa.
Modalidade 96: Um método de acordo com a modalidade 92, em que R3 representa CH3-(CH2)10-30", (5-tetrazolil)-(CH2)io-3o-, ou HO2C-(CH2)l0-30-·
Modalidade 97: Um método de acordo com a modalidade 92, em
que R3 é selecionado de <formula>formula see original document page 85</formula> <formula>formula see original document page 86</formula>
Modalidade 98: Um método de acordo com a modalidade 92, em que R3 é selecionado de Me-(CH2)i2-, Me-(CH2)I4-, Me-(CH2)i6-, Me-(CH2)18-, (5-tetrazolil)-(CH2)i2-, (5-tetrazolil)-(CH2)i3-, (5-tetrazolil)-(CH2)14-, (5- tetrazolil)-(CH2)i5-, (5-tetrazolil)-(CH2)i6-, (5-tetrazolil)-(CH2)i7-, (5-tetrazolil)- (CH2)18-, HO2C-(CH2)14-, HO2C-(CH2)15-, HO2C-(CH2)16-, HO2C-(CH2)17-, HO2C-(CH2)18-, (5-tetrazolil)2CH-(CH2)14-,
<formula>formula see original document page 87</formula>
Modalidade 99: Um método de acordo com a modalidade 76, em que a anilina ou heteroarilamina derivada do grupo de modificação de pro- priedade é selecionada de
<formula>formula see original document page 87</formula> <formula>formula see original document page 88</formula>
Modalidade 100: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 64 a 99, em que o aldeído derivado de peptídeo ou cetona é da fórmula
R6-C(=0)-R5-Prot,
em que
Prot é como descrito na modalidade 1
R5 is -CH2- ou -C(=0)-, e
R6 representa hidrogênio ou um átomo de carbono α opcional- mente substituído.
Modalidade 101: Um método de acordo com a modalidade 100 em que R5 representa -CH2-.
Modalidade 102: Um método de acordo com a modalidade 100, em que R5 representa -C(=0)-.
Modalidade 103: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 100 a 102, em que R6 representa hidrogênio, Ci.6-alquila ou C1-6-cicloalquila.
Modalidade 104: Um método de acordo com a modalidade 103, em que R6 representa hidrogênio, metila, etila, propila, ciclopropila, ciclobuti- la, ciclopentila, ou ciclohexila.
Modalidade 105: Um método de acordo com a modalidade 104, em que R6 representa hidrogênio ou metila.
Modalidade 106: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 64 a 105, em que o dito peptídeo é um hormônio do crescimen- to.
Modalidade 107: Um método de acordo com a modalidade 106, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 108: Um método de acordo com a modalidade 107, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 109: Um método de acordo com a modalidade 108, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 110: Um método de acordo com a modalidade 109, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento com uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com a seqüência de aminoácido na SEQ ID No. 1,
Modalidade 111: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 106 a 110, em que o peptídeo tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 80% da atividade do hormônio de crescimento de hGH como determinado no ensaio I aqui a seguir.
Modalidade 112: Um método de acordo com a modalidade 106, em que o dito hormônio de crescimento é hormônio de crescimento humano.
Modalidade 113: Um método de acordo com a modalidade 106, em que o dito hormônio de crescimento compreende a seqüência de amino- ácido de SEQ ID No. 1,
Modalidade 114: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 106 a 113, em que o grupo de modificação de propriedade é conjugado ao peptídeo na posição que corresponde à posição 40 na SEQ ID No. 1,
Modalidade 115: Um método de acordo com a modalidade 106 a113, em que o grupo de modificação de propriedade é conjugado ao peptí- deo na posição que corresponde à posição 141 na SEQ ID No. 1, Modalidade 116: Um composto de fórmula (III) R3-R-R-NH2
(III)
em que R11 R21 e R3 são como definidos na modalidade 1,
Modalidade 117: Um composto de acordo com a modalidade 116, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo C^e-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou C5-22-arila.
Modalidade 118: Um composto de acordo com a modalidade 117, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou Οβ-18-arila.
Modalidade 119: Um composto de acordo com a modalidade 118, em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou C4-16-arila.
Modalidade 120: Um composto de acordo com a modalidade 119,
em que R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substituído por um grupo Ci.6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou Ce-8-arila.
Modalidade 121: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 116 a 120, em que R1 representa um C5-22-arileno, opcional- mente substituído como descrito acima.
Modalidade 122: Um composto de acordo com a modalidade 121, em que R1 representa um C6-i8-arileno, opcionalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 123: Um composto de acordo com a modalidade 122, em que R1 representa um C6-i4-arileno, opcionalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 124: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 116 a 120, em que R1 representa um C5-22-heteroarileno opcio- nalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 125: Um composto de acordo com a modalidade 124, em que R1 representa um C6-i8-heteroarileno opcionalmente substituído co- mo descrito acima.
Modalidade 126: Um composto de acordo com a modalidade 125, em que R1 representa um C6-i4-heteroarileno opcionalmente substituído co- mo descrito acima.
Modalidade 127: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 116 a 120, em que R1 representa um C6-8-arileno, um C12-18- arileno ou um Cs-ie-heteroarileno opcionalmente substituído como descrito acima.
Modalidade 128: Um composto de acordo com a modalidade 127, em que R1 representa um grupo fenileno ou um piridileno.
Modalidade 129: Um composto de acordo com a modalidade 128, em que R1 representa 1,4-fenileno.
Modalidade 130: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 116 a 129, em que R2 representa uma ligação, -C(=0)-, -C(=0)-NH-, ou
<formula>formula see original document page 91</formula>
Modalidade 131: Um composto de acordo com a modalidade 130, em que R2 representa -C(=0)-NH-.
Modalidade 132: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 116 a 131, em que a propriedade modificada pelo grupo de modificação de propriedade é a meia-vida in vivo funcional do composto peptídeo.
Modalidade 133: Um composto de acordo com a modalidade 132, em que a meia-vida in vivo funcional do composto peptídeo é aumentada quando comparada ao composto peptídeo sem o grupo de modificação de propriedade.
Modalidade 134: Um composto de acordo com a modalidade 133, em que a meia-vida in vivo funcional aproximada do peptídeo tem sido au- mentada por 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 10 horas, 1 dias, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, ou30 dias.
Modalidade 135: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 116 a 134, em que
R3 representa um polímero ou oligômero linear ou ramificado, opcionalmente substituído por grupos funcionais ácidos ou negativamente carregados, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combina- ções dos mesmos; ou
R3 representa um grupo Ciq-C90 alquila linear ou ramificado, op- cionalmente substituído por grupos funcionais ácidos ou negativamente car- regados, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combinações dos mesmos.
Modalidade 136: Um composto de acordo com a modalidade 135, em que R3 representa um polietileno glicol (PEG) linear ou ramificado, polo- xâmero, poli (ácido láctico), poli (lactídeo)-glicolídeo de copolímero, oligos- sacarídeo, peptídeos, proteínas, ou combinações dos mesmos, opcional- mente substituído por grupos funcionais ácidos ou negativamente carrega- dos, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combinações dos mesmos.
Modalidade 137: Um composto de acordo com a modalidade 136, em que R3 representa um oligossacarídeo linear ou ramificado selecionado de tal como celulose, amido, ácido hialurônico, ágar, hidroxietil celulose, hi- droxietil amido, ou pentosano ou combinações dos mesmos, opcionalmente substituídos por grupos funcionais ácidos ou negativamente carregados, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combinações dos mesmos.
Modalidade 138: Um composto de acordo com a modalidade 136, em que R3 representa um polietileno glicol linear ou ramificado de um peso molecular de 5-60 kDa.
Modalidade 139: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 116 a 135, em que R3 representa CH3-(CH2)io-3o-, (5-tetrazolil)-(CH2)io-3o-, ou HO2C-(CH2)10-So-.
Modalidade 140: Um composto de acordo com a modalidade 135, em que R3 é selecionado de:
<formula>formula see original document page 93</formula> <formula>formula see original document page 94</formula>
Modalidade 141: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 116 a 135, em que R3 is selecionado de:
Me-(CH2)i2-, Me-(CH2)14-, Me-(CH2)i6-, Me-(CH2)i8-, (5-tetrazolil)- (CH2)12-, (5-tetrazolil)-(CH2)i3-, (5-tetrazolil)-(CH2)i4-, (5-tetrazolil)-(CH2)i5-, (5-tetrazolil)-(CH2)16-, (5-tetrazol il)-(CH2) 17-, (5-tetrazolil)-(CH2)18-, HO2C- (CH2)14-, HO2C-(CH2)15-, HO2C-(CH2)16-, HO2C-(CH2)17-, HO2C-(CH2)18-, (5- tetrazolil)2CH-(CH2)14-,
<formula>formula see original document page 94</formula>
Modalidade 142: Um composto de acordo com a modalidade 116 selecionado de:
<formula>formula see original document page 94</formula> Modalidade 143: Uso de um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 116 a 142 para a preparação do peptídeo conjugado com propriedades farmacológicas melhoradas em comparação às do peptí- deo conjugado parente.
Modalidade 144: Uso de acordo com a modalidade 143, em que o dito peptídeo conjugado é um anticorpo conjugado ou fragmento de anti- corpo.
Modalidade 145: Uso de acordo com a modalidade 143, em que o dito peptídeo conjugado é um hormônio de crescimento conjugado.
Modalidade 146: Uso de acordo com a modalidade 145, em que o dito hormônio de crescimento é um hormônio de crescimento humano.
Modalidade 147: Uso de acordo com qualquer uma das modali- dades 143 a 146, em que a dita propriedade farmacologicamente melhorada é a meia-vida in vivo funcional aumentada.
Modalidade 148: Uso de acordo com a modalidade 147, em que a meia-vida in vivo funcional aproximada do peptídeo tem sido aumentada por 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 10 horas, 1 dias, 2 dias, 3 di- as, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, ou 30 dias.
Modalidade 149: Um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 41 a 61 para o uso na terapia.
Modalidade 150: Uma preparação farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 41 a 61,
Modalidade 151: Um método de tratamento de doenças que se beneficiam de um aumento no nível do hormônio de crescimento em circula- ção, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das modali- dades 41 a 61 ou uma preparação farmacêutica de acordo com a modalida- de 150 a um paciente em necessidade dos mesmos.
Modalidade 152: Um método de acordo com a modalidade 151, em que a dita administração é realizada a cada segundo dia ou com interva- los mais longos.
Modalidade 153: Um método de acordo com a modalidade 152, em que a dita administração é realizada uma vez na semana ou com interva- Ios mais longos.
Modalidade 154: Um método de acordo com a modalidade 153, em que a dita administração é realizada uma vez ao mês ou com intervalos mais longos.
Modalidade 155: Um método de acordo com qualquer uma das modalidades 151 a 154, em que a dita doença é selecionada do enfraqueci- mento nos pacientes com AIDS, deficiência GH devido a um tumor na pitui- tária, e crescimento pobre em crianças devido à deficiência GH, falência re- nal, síndrome de Turner, e síndrome de Prader-Willi.
Modalidade 156: Uso de um composto de acordo com qualquer uma das modalidades 41 a 61 na fabricação de um medicamento para o tra- tamento de uma doença que se beneficia de um aumento no nível do hor- mônio de crescimento em circulação.
Modalidade 157: Uso de acordo com a modalidade 156, em que a dita doença é selecionada do enfraquecimento em pacientes com AIDS, deficiência GH devido a um tumor na pituitária, e crescimento pobre em cri- anças devido a deficiência GH, falência renal, síndrome de Turner, ou sín- drome de Prader-Willi.
Todas as referências, incluindo as publicações, pedidos de pa- tente e patentes, citados aqui a seguir são por meio desta incorporados por referência na mesma extensão como se cada referência fosse individual- mente e especificamente indicada para ser incorporada por referência e foi ajustada em sua totalidade aqui a seguir. Todos os tópicos e subtópicos são usados aqui a seguir por con- veniência apenas e não devem ser construídos como limitação da invenção de qualquer maneira.
Qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as possíveis variações dos mesmos é abrangida pela invenção a menos que de outra maneira indicada aqui a seguir ou de outra forma claramente con- tradito em contexto.
Os termos "um" e "uma", e "o" e os referentes similares como u- sados no contexto da descrição da invenção devem ser construídos para cobrir tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado aqui a seguir ou claramente contradito por contexto.
A recitação das faixas de valores aqui a seguir pretende mera- mente servir como um método taquigráfico de referência individual a cada valor separado caindo dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma aqui a seguir, e cada valor separado é incorporado ao relatório descritivo como se fosse individualmente recitado aqui a seguir. A menos que determi- nado de outra forma, todos os valores exatos fornecidos aqui a seguir são representativos dos valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exemplares exatos fornecidos com relação a um fator parti- cular ou medição podem ser considerados para também fornecer uma medi- ção aproximada correspondente, modificada por "cerca de," onde apropria- do).
Todos os métodos descritos aqui a seguir podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que indicado de outra forma aqui a seguir ou claramente contradito de outra forma por contexto.
O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exem- plar ("por exemplo", "tal como") fornecidos aqui a seguir, pretende meramen- te iluminar melhor a invenção e não impõe uma limitação ao escopo da in- venção a menos que indicado de outra forma. Nenhuma linguagem no rela- tório descritivo deve ser construída como indicando que qualquer elemento é essencial à prática da invenção a menos que tanto quanto é determinado explicitamente. A citação e a incorporação dos documentos de patente aqui a seguir são feitas por conveniência apenas e não refletem qualquer vista de validade, patenteabilidade e/ou capacidade de execução de tais documentos de patente.
A descrição aqui a seguir de qualquer aspecto ou modalidade da invenção usando termos tais como "compreendendo", "tendo", "incluindo" ou "contendo" com referência a um elemento ou elementos pretende fornecer suporte para um aspecto ou modalidade similar da invenção que "consiste em", "consiste essencialmente em", ou "substancialmente compreende" na- quele elemento ou elementos particulares, a menos que determinado de ou- tro modo ou claramente contradito por contexto (por exemplo, uma composi- ção descrita aqui a seguir quando compreendendo um elemento particular deve ser entendida também como descrevendo uma composição consistindo naquele elemento a menos que determinado de outra forma ou claramente contradito por contexto).
Esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do as- sunto recitado nos aspectos ou reivindicações apresentados aqui a seguir até a extensão máxima permitida por lei aplicável.
EXEMPLOS As abreviações a seguir são usadas: Boc: terc-butiloxicarbonila Bt: 1 -benzotriazolila DBU: 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno DCM: diclorometano, cloreto de metileno DIPEA diisopropiletilamina DMF: Ν,Ν-dimetil formamida DMSO: sulfóxido de dimetila EDAC: cloridrato de N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonila HBTU: hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1-il-)-1,1,3,3 tetrameti- lurônio HOBt: N-hidroxibenzotriazol, 1 -hidroxibenzotriazol NMP: N-metilpirrolidona HPLC: cromatografia líquida de alta pressão t.a temperatura ambiente
Su: succinimidila
5 TFA: ácido trifluoroacético
TSTU hexafluorofosfato de 0-(1-succinimidil)-N,N,N',N,-tetrametilurônio
Os espectros de RMN foram registrados nos instrumentos Bruker 300 MHz e 400 MHz. HPLC-MS foi realizada em um instrumento Perkin El- mer (API 100).
Os sistemas de HPLC de Merck-Hitachi (Hibar® RT 250-4, Lic- hrosorb® RP 18, 5,0 μιτι, 4,0 χ 250 mm, eluição de gradiente, 20% a 80% de acetonitrila em água dentro de 30 min, 1,0 ml/min, detecção a 254 nm) e Á- guas (Simmetry®, C18, 3,5 pm, 3,0 χ 150 mm, eluição de gradiente, 5% a 90% de acetonitrila em água dentro de 15 min, 1,0 ml/min, detecção a 214 nm) foram usados.
Método Geral (A)
Os compostos da fórmula (I) de acordo com esta invenção po- dem ser preparados como a seguir: <formula>formula see original document page 99</formula>
Uma solução do aldeído derivado de peptídeo em um solvente adequado, tal como água e um solvente dipolar opcional, é adicionada a uma solução da anilina ou heteroarilamina derivada do grupo de modificação de propriedade em uma mistura de ácido acético, água e um solvente dipolar opcional, tal como NMP ou DMF. A mistura resultante é deixada repousar por algum tempo, por exemplo, entre 1 e 70 horas, e uma solução aquosa de NaCNBH4, opcionalmente acidificada pela adição pela adição de ácido acé- tico, é adicionada. A mistura resultante é agitada ou deixada repousar à temperatura ambiente por 1-60 horas. A adição de um tampão (pH > 7), se- guida por purificação padrão rende o composto da fórmula (I). O termo "sol- vente dipolar" se refere a um solvente com uma constante dielétrica maior do que 6,0, Exemplo 1
Hormônio de crescimento humano peguilado no término N (posição 1) com mPeg (40k)
(A):preparacão de Ser-hGH
O plasmídeo de expressão análogo Ser-hGH foi criado na base de pNNC13 (Zbasic2mt-D4K-hGH), que expressa o hGH do tipo selvagem em fusão com o domínio Zbásico.
MVDNKFNKERRRARREIRHLPNLNREQRRAPIRSLRDDPSQSA NLLA EAKKLN RAQAPKIRGGSDDDDKSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLA FDTIQEFEEAIIPKEQKISFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRI SLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVIGASDSNVIDLLKDLEEGIQTLMGRLEDG SPRTGQIFKQTISKFDTNSHNDDALLKNIGLLICFRKDMDKVETFLRIVQCRS VEGSCGF.
Ser adicional foi inserido na frente de Fe, o primeiro aminoácido de hGH maduro, por Kit de Mutagênese Direcionada a sítio XL QuikChan- ge® XL de Stratagene com um par de iniciadores:
Extremidade 5': pNNC13 Ser-F
5'-GGATCAGACGACGACGACAAAagcTTCCCAACCATTCCCT TATCC-3'
e
Extremidade 3': pNNC13 Ser-R
5'-GGAT AAGGGAATGGTTGGGAAgctTTTGTCGTCGTCGTCT GATCC-3'.
E. coli BL21(DE3) foi transformado por pET11 a-Zbasic2mt-D4K- Ser-hGH. Uma colônia única foi inoculada em 100 ml de meio LB com 100 pg/ml de Amp e desenvolvida a 37°C. Quando OD6OO alcançou 0,6, a tem- peratura da cultura da célula foi reduzida a 30°C, e as células foram induzi- das com IPTG a 1 mM por 4 horas a 30SC. As células das bactérias foram colhidas por centrifugação a 3000 g por 15 min (centrífuga Eppendorf5810R). O pélete da célula foi ressuspenso em tampão de lise de célula (Na2HPO4 a 25 mM, NaH2PO4 a 25 mM pH 7, EDTA a 5 mM, 0,1% de Triton X-100), e as células foram rompidas por rompimento da célula a 207 MPa (30 kpsi) (Sistemas de Rompimento de Célula Constante). O Iisado foi clarifi- cado por centrifugação a 10000 g por 30 min. O sobrenadante foi salvo e usado para purificação, enquanto o pélete era descartado.
Zbasic2mt-D4K-Ser-hGH foi purificado sobre SP-Sefarose usan- do uma etapa de gradiente de eluição (tampão A: 25 mM Na2HPO4 25 mM NaH2PO4 pH 7; tampão B: 25 mM Na2HPO4 25 mM NaH2PO4 pH 7, NaCI a 1 Μ). A proteína foi clivada subseqüentemente usando enteropeptidase para a liberação de Ser-hGH. Ser-hGH foi ainda purificado emu ma coluna de Butila Sefarose 4FF para separar o produto do domínio de Zbasic2mt-D4K e Ente- ropeptidase (tampão A: 100 mM Hepes pH 7.5; tampão B: 100 mM Hepes pH 7.5, 2 M NaCI, um gradiente linear foi usado). O produto final de Ser-hGH foi trocado por tampão e Iiofilizado de 50 mM NH4HCO3, pH 7,8.
(B) 4-(Boc-Amino)benzoil mPeq(40k) <formula>formula see original document page 101</formula>
A uma solução de mPeg (40k)-amina (GL2-400PA de NOF Cor- poration; 5,0 g, 0,125 mmol) em DCM (40 ml) foram adicionados ácido 4- Boc-aminobenzóico (0,31 g, 1,31 mmol), hidrato de HOBt (0,25 g, 1,63 mmol), EDAC (0,44 g, 2,30 mmols), e finalmente DIPEA (2,0 ml), Após a agi- tação à temperatura ambiente por 70 h, aminometil poliestireno (5 g; aprox 1 mmol/g) foi adicionado. Após a agitação por 3 h, a mistura foi filtrada, o poli- estireno foi lavado com DCM, os filtrados combinados foram concentrados, e o produto precipitado pela adição de Et2O. A dissolução em DCM, a precipi- tação com Et2O e a filtração foram repetidas duas vezes. O sólido foi dissol- vido em DCM, e uma resina de troca de íons ácida (Amberlist 15; 10 g, lava- da com DCM + MeOH) foi adicionada. A mistura foi agitada por 0,5 h, filtra- da, e o produto isolado do filtrado por precipitação com Et2O. A secagem sob pressão reduzida rendeu 5 g do composto do título.
(C) 4-Aminobenzoil mPeq(40k)
<formula>formula see original document page 101</formula>
A 4-(Boc-amino)benzoil mPeg(40k) (100 mg, 2,5 pmols) foram a- dicionados DCM (10 ml) e TFA (10 ml). Após 0,5 h, a mistura foi concentra- da, e o resíduo coevaporado duas vezes com EtOH. Após a secagem em vácuo durante a noite, o resíduo foi transferido com DCM para um frasco menor e, concentrado, e dissolvido em água (0,66 ml) + AcOH (0,66 ml). Es- ta solução foi usada para a peguilação de Ser-hGH oxidado.
(D) Oxidacão de Ser-hGH a qlioxalil-hGH
<formula>formula see original document page 102</formula>
As soluções a seguir foram preparadas:
Tampão A: trietanolamina (270 mg, 1,8 mmol), 3- metiltiopropanol (580 mg, 5,46 mmol), água (40 ml).
Tampão B: 3-metiltiopropanol (1,2 g) + água (80 ml).
Periodato: NaIO4 (48,1 mg, 0,225 mmol) + água (1,0 ml).
SerhGH (50 mg, 2,3 μιτιοίε) foi dissolvido em tampão A (5,0 ml), e a solução de periodato (0,5 ml) foi adicionada. Após o repouso à temperatu- ra ambiente por 20 min, a mistura foi transferida para um tubo de diálise (A- micon; corte 5000), e dializado quatro vezes com tampão Β. O resíduo foi diluído com tampão B a 0,6 ml, e NMP (0,6 ml) foi adicionado.
(E) Aminacão redutora de Ser-hGH oxidado com 4-aminobenzoil mPeq (40k) <formula>formula see original document page 102</formula>
A solução de Ser-hGH oxidado em água e NMP foi adicionada imediatamente após a sua preparação à solução de 4-aminobenzoil mPeg (40k), e a mistura resultante foi girada lentamente à temperatura ambiente. Após 1 h, NaCNBH3 (100 μΙ de uma solução de 20 mg de NaCNBH3 e 15 μΙ de AcOH em 0,5 ml de água) foi adicionada. A mistura é mantida à tempera- tura ambiente no escuro. Após 42 h, a mistura foi adicionada em porções a uma mistura de trietanolamina (2 g) e água (4 ml). A purificação por croma- tografia rendeu o composto do título.
Exemplo 2 Hormônio de crescimento humano peguilado na posição 141 com mPeg(40k)
(A) Transaminacão de hGH com 1.3-diamino-2-propanol <formula>formula see original document page 103</formula> hGH (200 mg, 9 umols) foi dissolvido em um tampão de fosfato (50 mM, pH 8,0, 14 ml). A solução resultante foi misturada com uma solução de 1,3-diaminopropan-2-ol (378 mg, 4 mmols) em tampão de fosfato (50 mM, .1 ml, pH 8,0) e o pH foi ajustado a 8,0 com ácido clorídrico diluído. Uma so- lução de transglutaminase (TGase, 18 mg, ~ 40 U) dissolvida em tampão de fosfato (50 mM, pH 8,0, 1 ml) foi adicionada e o volume foi ajustado para 20 ml por adição de tampão de fosfato (50 mM, pH 8,0), o que levou a uma concentração de 1,3-diaminopropan-2-ol de 0,2 Μ. A solução resultante foi incubada por 4 h a 37°C.
A temperatura foi a seguir diminuída até a temperatura ambiente e N-etilmaleimida foi adicionada a uma concentração final de 1 mM. Após 1 h, a mistura foi diluída com 10 volumes de tampão tris (50 mM, pH 8,5).
A solução foi aplicada a uma coluna MonoQ 10/100 GL (Amer- sham Biosciences cat. No. 17- 5167-01) pré-equilibrada com eluente A (50 mM tris, pH 8,5). A eluição foi realizada em um fluxo de 2,5 ml/min com um gradiente de 0% a 100% de eluente B (50 mM tris, 0,2 M NaCI, pH 8,5) em eluente A ao longo de 63 min. As frações foram coletadas com base na ab- sorção de UV a 280 nm e análise Maldi-Tof foi realizada em frações selecio- nada. As frações que correspondem ao pico maior dando o peso molecular esperado de acordo com espectrometria de massa Maldi-Tof foram reunidas ("pooled"). Este conjunto ("pool") continha uma mistura de hGH e Νε141-(2- hidróxi-3-aminopropil) hGH em uma razão 60:40, como determinado por CE; método A, e por experimentos de mapeamento de peptídeo como descritos em W02005070468.
(B) Oxidacão de hGH transaminado com 1,3-diamino-2-propanol <formula>formula see original document page 104</formula>
As soluções a seguir foram preparadas: Tampão B: 3-metiltiopropanol (1,2 g + água (80 ml). Periodato: NaIO4 (48.1 mg, 0,225 mmol) + água (1,0 ml). A uma solução de hGH transaminado com 1,3-diamino-2- propanol (55 mg (2.5 pmols) transaminado + 45 mg de hGH não-modificado) em um tampão de trietanolamina (4.7 ml) foi adicionado 3-metiltiopropanol (70 μΙ) e a seguir a solução de periodato (0,55 ml). Após 20 min, a mistura foi diluída com tampão B re dializada 4 vezes com tampão Β. O resíduo foi diluído com tampão B a 0,6 ml e distribuído igualmente em dois frascos.
(C) Aminação redutora de hGH oxidado, transaminado com 4- aminobenzoil mPeg(40k)
<formula>formula see original document page 104</formula>
A 4-(Boc-amino)benzoil mPeg(40k) (75 mg, 1,88 μιηοΙ) foi adicio- nado DCM (10 ml) e TFA (10 ml). Após 30 min, a mistura foi concentrada, e o resíduo coevaporado duas vezes com EtOH. Após a secagem durante a noite em vácuo, o resíduo foi redissolvido em uma mistura de água (0,5 ml) e AcOH (0,5 ml, 8.3 mmols).
O teor de um frasco de hGH oxidado, transaminado (vide (B)) foi diluído com NMP (0,3 ml) e adicionado à solução PEG. Uma hora depois, a solução de NaCNBH3 (0,05 ml de uma solução de NaCNBH3 (22 mg, 0,35 mmol; Mwt: 62.8 g/mol) foi dissolvida em água (0,5 ml; c = 700 mM) e AcOH (0,015 ml); esta solução foi preparada um pouco antes do uso) foi adiciona- do. Após 66 h, a mistura foi neutralizada pela adição a uma mistura de trie- tanolamina (1,7 g, 11,4 mmols) e água (2 ml), e o produto foi purificado por cromatografia; 9 mg do composto do título foram obtidos. MÉTODOS FARMACOLÓGICOS
Ensaio (I) BAF-3GHR ensaio para determinar a atividade do hormônio de crescimento
As células BAF-3 (uma linhagem de célula linfóide pro-B de muri- no derivada da medula óssea) foram originalmente dependentes de IL-3 pa- ra o crescimento e sobrevivência. Os ativados de IL-3 JAK-2 e STAT os quais são os mesmos mediadores de GH estão sendo ativados mediante estimulação. Após a transfecção do receptor do hormônio de crescimento humano, a linhagem de célula foi transformada em uma linhagem de célula dependente do hormônio de crescimento. Este clone poderia ser usado para avaliar o efeito das amostras do hormônio de crescimento diferente sobre a sobrevivência do BAF-3GHR.
As células BAF-3GHR foram desenvolvidas em meio de inanição (meio de cultura sem o hormônio de crescimento ) por 24 h a 37°C, 5% de CO2.
As células foram lavadas e ressuspensas em meio de inanição e semeadas em placas. 10 μΙ do composto do hormônio de crescimento ou do hormônio de crescimento humano em diferentes concentrações ou controle foram adicionados às células, e as placas foram incubadas por 68 h a 37°C, 5% de CO2.
AlamarBIue® foi adicionado a cada cavidade e as células foram incubadas por mais 4 h. AlamarBIue® é um indicador redox, que é reduzido por reações inatas ao metabolismo celular e, portanto, fornece uma medição indireta do número celular viável.
Finalmente, a atividade metabólica das células foi medida em um leitor de placa de fluorescência. A absorbância nas amostras foi expressa em % de células não estimuladas com o composto de hormônio de cresci- mento ou controle, e das curvas de concentração-resposta da atividade (quantidade de um composto que estimula as células com 50%) poderia ser calculada.
Os dados para os compostos descritos nos exemplos podem ser encontrados na tabela 1, Tabela 1
<table>table see original document page 106</column></row><table>
Ensaio para a Determinação da estabilidade in vitro
As soluções dos compostos da invenção em vários tampões são incubadas a 20-40°C por 1 d a 30 d. As amostras são anlisadas por HPLC e espectrometria de massa para determinar a extensão e o tipo de degradação como função do tampão, temperatura e tempo.
Estudo da Dose-Resposta In vivo em ratos Sprague Dawley hipofisectomisados
O relacionamento da dose-resposta in vivo do composto do e- xemplo 2 foi estudado em ratos machos Sprague Dawley hipofisectomisa- dos. O rato hipofisectomisado é um modelo animal bem-conhecido e reco- nhecido da deficiência do hormônio de crescimento, onde nenhuma produ- ção de hormônio de crescimento ocorre após a remoção cirúrgica da glându- la pituitária. Isto também leva a baixos níveis de circulação do fator de cres- cimento do tipo insulina 1 (IGF-1) uma outra característica clínica importante da deficiência do hormônio de crescimento em seres humanos.
A hipofisectomia foi realizada em ratos machos de 4 semanas de idade pesando 90-100 g. Os animais entraram no estudo 3-4 semanas após a cirurgia pesando 100-110 g. Os animais com um ganho de peso do corpo de mais do que 10 % durante as 3-4 semanas após a cirurgia não foram dei- xados entrar no estudo.
Sessenta ratos hipofisectomisados Sprague Dawley foram aloca- dos randomicamente a seis grupos de dosagem com dez animais em cada grupo. Um grupo recebeu o veículo apenas e serviu como um grupo de con- trole não tratado. Os cinco grupos restantes receberam 1,5, 15, 50 e 150 nmols do composto de exemplo 2 respectivamente como uma dose única subcutânea no pescoço. O peso do corpo foi medido diariamente entre 8-10 a.m. por uma semana. Os dados são apresentados como ganho em peso do corpo em comparação ao dia da dosagem (Dia 0) por 7 dias e são apresen- tados na Figura 1. Listagem de Seqüência
<110> Novo Nordisk A/S
<120> Conjugados de proteína e métodos para preparação deles <130> 7361.204-WO <160> 1
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Phe Pro Thr Ile Pro Leu ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 15 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30
Glu Ala Tyr lie Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45
Gln Thr ser Leu Cys Phe Ser Glu ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg lie Ser Leu 65 70 75 80
Leu Leu lie Gln ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser vai 85 90 95
Phe Ala Asn ser Leu vai Tyr Gly Ala ser Asp Ser Asn vai Tyr Asp 100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125
Glu A5p Gly ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175
Leu Arg Ile vai Gln Cys Arg ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190

Claims (20)

1, Peptídeo conjugado de acordo com a fórmula (I) <formula>formula see original document page 109</formula> em que Prot representa um radical derivado de peptídeo gerado pela re- moção formal de um átomo de hidrogênio de um grupo amino (-NH2) do dito peptídeo, R1 representa arileno ou um heteroarileno opcionalmente substi- tuído por um grupo Ci-6-alquila, halogênio, ciano, nitro, hidroxila, carboxila, ou arila; R2 representa uma ligação ou um ligante, em que o dito Iigante compreende um dirradical selecionado do grupo consistindo em -C(=0)-NH-, -NH-, -O-, -S-, -O-P(O)(OH)-O-, -0-C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-NH-, -(CH2)M0-, -0-(CH2)3-NH-C(=0)-, -C(=O)NH(CH2)2.30-, -(CH2)I-3oC(=0)NH(CH2)2-3O-, -(CH2)0.3OC(=0)NH-(CH2CH20)1.10-(CH2)1.5-C(=0)-, -C(=0)NH-[(CH2CH20)I-IO-(CH2)I.5-C(=0)]I.5NH(CH2)2.3O-, -C(=0)-, -(CH2)1-S0- NHC(=0)-, -(CH^.aoC^O)-, -NHC(=O)NH(CH2)2.30-, -(CH2)1-S0- NHC(=O)NH(CH2)2.30-, -(CH2)O-3OC(=0)NH(CH2)2.3O-NHC(=0)-(CH2)O-3O-, -(CH2)0.30C(=O)NH(CH2CH2O)i-30-CH2CH2NHC(=O)-(CH2)0.30-, ou -NH(CH2)2.3o-, <formula>formula see original document page 109</formula>, <formula>formula see original document page 109</formula>, e combinações dos mesmos e R3 representa um grupo de modificação de propriedade; R4 representa hidrogênio ou C1^alquila; R5 representa -CH2- ou -C(=0)-, ou sais, pró-fármacos e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R1 repre- senta um C6-8-arileno, um Ci2-i8-arileno ou um C5-i8-heteroarileno opcional- mente substituído como definido na reivindicação 1,
3.Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que R representa a ligação, -C(=0)-, -C(=0)-NH-, ou <formula>formula see original document page 110</formula>
4.Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a .3, em que R3 representa um polietileno glicol (PEG) linear ou ramificado, po- loxâmero, poli (ácido láctico), copolímero de poli(lactídeo)-glicolídeo, oligos- sacarídeo, peptídeos, proteínas, ou combinações dos mesmos opcionalmen- te substituídos por grupos funcionais negativamente carregados ou ácidos, com grupos funcionais básicos ou catiônicos, ou com combinações dos mesmos.
5. Composto de acordo com a reivindicação 4, em que R3 repre- senta um polietileno glicol linear ou ramificado de um peso molecular de 5-60 kDa.
6.Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a .5, em que Prot é obtenível a partir de um aldeído derivado de peptídeo ou cetona da fórmula R6-C(=0)-R5-Prot, em que R5 é como descrito na reivindicação 1, e R6 representa hidrogênio ou um átomo de carbono α opcional- mente substituído.
7.Composto de acordo com a reivindicação 6, em que R6 repre- senta hidrogênio, Ci-6-alquila ou Ci-6-cicloalquila.
8.Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a .7, em que Prot representa radical derivado de peptídeo gerado pela remoção formal de um átomo de hidrogênio de um grupo amino (-NH2) de um peptí- deo ou proteína, e em que o dito grupo amino é o grupo amino N-terminal do peptídeo, um grupo amino de cadeia lateral do resíduo de Iisina no peptídeo, ou um grupo amino de cadeia lateral do resíduo de glutamina ou asparagina (CONH2) no peptídeo.
9, Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que Prot representa um radical derivado do hormônio de crescimento.
10, Método para a preparação de um composto peptídeo com- preendendo um grupo de modificação de propriedade, o dito método com- preendendo as etapas de: (a) tratamento de um aldeído ou cetona derivada do composto peptídeo com anilina ou heteroarilamina derivada de um grupo de modifica- ção de propriedade para render uma imina ou um hemiaminal, (b) tratamento desta imina ou hemiaminal com um agente de redução adequado, tal como NaCNBH3, para render uma amina secundária.
11, Método de acordo com a reivindicação 10, em que o aldeído derivado de peptídeo ou cetona é preparado por oxidação mediada por peri- odato de um composto peptídeo contendo uma subestrutura de 2-aminoetanol.
12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o aldeído derivado de peptídeo é preparado por oxidação mediada por perio- dato de um peptídeo transaminado enzimaticamente com 1,3-diamino-2- propanol.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que a anilina ou heteroarilamina derivada de um grupo de modifica- ção de é da fórmula R3-R-R-NH2 (III) em que R1, R2, e R3 são como definidos acima.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que o aldeído derivado de peptídeo ou cetona é da fórmula R6-C(=0)-R5-Prot, em que Prot, R5, e R6 são como definidos acima.
15. Composto da fórmula (III) R3-R-R-NH2 (III) em que R11 R2, e R3 são como definidos acima.
16. Uso de um composto como definido na reivindicação 15 para preparação do peptídeo conjugado com propriedades farmacológicas melho- radas em comparação às do peptídeo parente não-conjugado.
17. Composto de acordo com a reivindicação 9, para o uso na te- rapia.
18. Preparação farmacêutica compreendendo um composto co- mo definido na reivindicação 9.
19. Método de tratamento das doenças que se beneficiam de um aumento no nível do hormônio de crescimento em circulação, o método com- preendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto como definido na reivindicação 9.
20. Uso de um composto como definido na reivindicação 9, na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença que se beneficia de um aumento no nível do hormônio de crescimento em circula- ção.
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