BRPI0714718A2 - polipeptìdeo fisiologicamente ativo, micela polimérica com proteìna em seu interior e processo para produção da micela polimérica - Google Patents
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Abstract
POLIPEPTìDEO FISIOLOGICAMENTE ATIVO, MICELA POLIMéRICA COM PROTEìNA EM SEU INTERIOR E PROCESSO PARA PRODUçãO DA MICELA POLIMéRICA. A presente invenção refere-se a uma composição de micela pollimérica, derivada de copolímero em bloco, para encapsulamento de polipeptídeo ou de proteína fisiologicamente ativo, compreendendo segmentos hidrofólicos e segmentos hidrofóbicos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍ- DEO FISIOLOGICAMENTE ATIVO, MICELA POLIMÉRICA COM PROTEÍ- NA EM SEU INTERIOR E PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA MICELA POLIMÉRICA".
Camoo da Técnica
A presente invenção refere-se a micelas poliméricas com alto teor de polipeptídeos ou de proteínas fisiologicamente ativos que podem ser biologicamente administradas e que permanecem estáveis in vivo. Antecedentes da Técnica
Avanços em técnicas da engenharia genética têm permitido que inúmeros polipeptídeos e proteínas com atividade fisiológica possam ser su- pridos em maneira estável, empregando métodos de cultura de células, para aplicação no tratamento ou prevenção de doenças. Estes polipeptídeos, no entanto, possuem geralmente meia-vida curta in vivo por sua enzimólise, metabolismo e processos similares extremamente rápidos, sendo que, na maioria dos casos, não tem sido possível obter efeitos satisfatórios quando estes são administrados como fármacos. Um grande número de pesquisas tem sido conduzido para resolver essa questão, com enfoque em modifica- ção dos polipeptídeos e proteínas com polímeros ou em suas fórmulas para liberação prolongada.
Por exemplo, a glicolação de polietileno é uma técnica de modi- ficação de polímero correntemente utilizada para finalidades clínicas. O pro- longamento da meia-vida in wVofoi obtido para interferon e substâncias simi- lares, possibilitando, dessa forma, algum grau de efeito sustentado. Este efeito sustentado resultou na administração menos freqüente e, por conse- guinte, redução da carga exercida sobre pacientes; contudo, estas proteínas com polímeros modificados exibem, de modo geral, atividade mais baixa decorrente da modificação, além de ser difícil controlar os sítios e as taxas da modificação de maneira reprodutível.
Microcápsulas são também utilizadas correntemente na clínica como uma tecnologia para liberação sustentada. Esta tecnologia é praticada pelo uso in vivo do copolímero degradável formado por ácido polilácti- co/ácido glicólico, como a base para inclusão de um fármaco em partículas finas. No entanto, o tamanho de partículas é geralmente na ordem de mi- crometros enão é adequado para administração intravenosa. Há relatos de microcápsulas com tamanhos de partículas reduzidos para nanotamanho cuja superfície é modificada visando controlar a sua captação e penetração no sistema retículoendotelial do fígado ou do baço após administração intra- venosa (Adv. Drug Deliv. Rev. 17, 31-48 (1995)). Contudo, os tamanhos de partículas obtidos por esses métodos são em, no mínimo, de algumas cen- tenas de nanômetros {Int. J. Pharm. 149, 43-49 (1997)), além de esta modifi- cação de superfície ser trabalhosa e ser difícil o controle da distribuição nos órgãos de maneira reprodutível.
Lipossomos que utilizam fosfolipídios podem ser mencionados também como exemplo de tecnologia utilizada correntemente na clínica para liberação sustentada (Pharm. Tech. Japan 19, 99-110 (2003)). A vantagem dos Iipossomos é a sua baixa toxicidade e antigenicidade, uma vez que fos- folipídios são substâncias biológicas, e o fato de que a alteração da compo- sição lipídica torna possível o encapsulamento de inúmeras substâncias bio- ativas, como fármacos solúveis em água ou em gordura, macromoléculas, proteínas, ácidos nucléicos e os similares. Contudo, estes Iipossomos não possuem necessariamente as propriedades adequadas para retenção de fármacos. Especificamente, as quantidades de fármacos que podem ser en- capsulados por fórmula unitária de Iipossomo são atualmente inadequadas e métodos mais eficientes são desejados. Ademais, as questões como estabi- lidade insuficiente in vivo e relacionadas à dificuldade da produção industrial ainda não foram satisfatoriamente superadas.
Uma das tecnologias para liberação sustentada correntemente investigada na clínica refere-se ao uso de micelas poliméricas como um re- curso para resolução destas questões (Sr. J. Câncer 93, 678-697 (2005), Br. J. Câncer 92, 1240-1246 (2005)). Micelas poliméricas podem ser produzidas utilizando copolímeros em bloco, compostos por polímeros hidrofílicos e po- límeros hidrofóbicos. Em água, estes copolímeros em bloco formam geral- mente micelas poliméricas com o núcleo compreendendo segmentos hidro- fóbicos e, por conseguinte, exibem propriedades excelentes em termos de encapsulamento de fármaco solúvel em gordura, solubilização e liberação sustentada (Publicação de Patente Japonesa ns 2777530).
Estas micelas poliméricas estão sendo estudadas também para encapsulamento e liberação sustentada de fármacos solúveis em água. Por exemplo, um método de encapsulamento de adriamicina, como composto solúvel em água, em micelas poliméricas envolve a ligação química do fár- maco às cadeias laterais do polímero hidrofóbico (Publicação de Patente Japonesa ns 2694923). Foram expostos também métodos alternativos para encapsulamento eficiente por interação eletrostática introduzida entre mice- las poliméricas e um peptídeo, por exemplo, um método no qual grupos fun- cionais com carga negativa são introduzidos nas cadeias laterais de seg- mentos hidrofóbicos em um copolímero em bloco, destinado a fármacos con- tendo substâncias carregadas eIetricamente, como, por exemplo, peptídeos básicos com cargas positivas (Publicação de Patente Japonesa n® 2690276), ou um método no qual um polímero biodegradável com um grupo carboxila, como ácido poliláctico ou ácido poli(iáctico-co-glicólico), é adicionado (W02005/023230). No entanto, o mesmo não pode ser aplicado a fármacos solúveis em água com pesos moleculares mais altos e, especialmente, pro- teínas e poli peptídeos. A Publicação de Patente Japonesa ne 2690276 ex- põe exemplos de proteínas encapsuiadas em micelas. No entanto, as pró- prias micelas não são suficientemente estáveis e, quando efetivamente ad- ministradas para o corpo, acredita-se que sofram quebra imediata porque não possuem porções hidrofóbicas e formam-se somente sob carga elétrica. Um método para estabilização de micelas para encapsulamento
de polieletrólitos foi exposto, em que micelas poliiônicas complexas com es- trutura nuclear em concha, compostas por polieletrólitos e um copolímero em bloco contendo segmentos hidrofílicos eletricamente carregados, possuem, pelo menos, um grupo tiol contido nos segmentos eletricamente carregados que constituem o núcleo, de modo que a estabilidade é promovida por liga- ção cruzada com pontes dissulfeto entre os segmentos eletricamente carre- gados, por intermédio dos grupos tiol que contêm (Publicação de Patente Japonesa Não-Examinada (Kokai) η9 2001-146556). No entanto, quando efetivamente utilizadas, após administração por injeção intravenosa, as mi- celas dissociam-se por diluição ou interação com proteínas séricas ou so- frem interação com proteínas que contêm pontes SS em suas moléculas.
Estas interações levam à inativação das proteínas e desestabilização das micelas. Por conseguinte, este método não pode ser aplicado para grande parte das proteínas ou polipeptídeos.
A fim de aumentar os efeitos terapêuticos de polipeptídeos e de proteínas fisiologicamente ativos, é necessário prover micelas poliméricas para encapsulamento dos polipeptídeos e das proteínas fisioiogicamente ativos de modo estável e eficiente, ao mesmo tempo em que permitindo a sua liberação de maneira controlada, conforme explicado acima, porém, não há atualmente esse tipo de micelas que produza baixa resposta imune e que possa ser aplicado a uma ampla gama de polipeptídeos e de proteínas fisio- logicamente ativos.
Até a data atual, foram propostas também as técnicas a seguir, visando atender às especificações mencionadas acima, para que os efeitos terapêuticos de polipeptídeos e de proteínas fisiologicamente ativos pudes- sem ser aumentados, porém nem todas foram bem sucedidas. (A) A Publicação de Patente Japonesa Não-Examinada (Kohyo)
ne 2004-525939 refere-se a uma suspensão coloidal de nanopartículas, com base em blocos de ácido poliamino e blocos de polímero hidrofílico do tipo polialquileno-glicol, como polietilenoglicol (PEG). Uma vez que a formação de nanopartículas de fármacos (proteína ou polipeptídeo) baseia-se na ad- sorção do fármaco sobre nanopartículas, a proteína ou polipeptídeo está presente sobre as superfícies das nanopartículas. Especificamente, acredita- se que o ataque por enzimas digestivas no corpo cause decomposição rápi- da da proteína ou de outra substância sobre a superfície das nanopartículas, resultando em sua inativação. Ademais, como os pontos isoelétricos das proteínas e dos polipeptídeos a serem encapsulados não são considerados na formação das nanopartículas, a liberação pode ser relativamente rápida, tornando impossível obter-se um efeito de duração prolongada. (B) A Publicação da Patente Européia ns EP1084172B1 refere- se à liberação de ácidos nucléicos, em especial, utilizando paimitoil poli-L- Iisina poiietiienoglicol ou paimitoil poli-L-ornitina poiietiienoglicol, na presença de colesterol. Os menores tamanhos de partículas das partículas finas, obti-
dos por esta técnica, são de algumas centenas de nanômetros e, como se acumulam rapidamente no sistema retículoendotelial após administração intravenosa, não são capazes de produzir efeitos duradouros.
(C) A Publicação de Patente Japonesa Não-Examinada (Kokai) ns 11-269097 refere-se a partículas finas com funções como capacidade de
direcionamento a órgãos e liberação sustentada, cuja base é um copolímero em bloco compreendendo um polímero biodegradável responsável por seg- mentos hidrofóbicos e o ácido poliamino responsável por segmentos hidrofí- licos. Essa abordagem é caracterizada pelo uso de ácido poliamino biode- gradável como os segmentos hidrofílicos, porém comparado a polietilenogii- col, prevê-se que possua imunogenicidade mais alta e mais interação com proteínas séricas após administração intravenosa, levando a retenção mais curta na circulação sangüínea, tornando impossível obter-se efeito de dura- ção prolongada.
(D) USP6090925 descreve um método no qual uma solução tampão de acetato ou fosfato, contendo poiietiienoglicol e polivinilpirrolidona,
é adicionada a uma solução aquosa de um composto de baixo peso molecu- lar ou peptídeo a ser encapsulado e, em seguida, é adicionado à mesma um polímero, por exemplo, albumina sérica, com ponto isoelétrico próximo do pH da solução tampão, e micropartículas são formadas por etapas de aque- cimento e de resfriamento. Por incluir uma etapa de aquecimento em apro- ximadamente 70°C, este método não é considerado suficientemente ade- quado para proteínas sensíveis a calor. Descrição da Invenção
Além de inúmeros polipeptídeos ou proteínas básicos fisioiogi- camente ativos, existe também um grande número de polipeptídeos e de proteínas com pontos isoelétricos de fracamente ácidos a neutros, como in- terferon-α, G-CSF e insulina. Atualmente, não existe uma composição de miceia polimérica que possa ser aplicada para esta ampla gama de proteí- nas ou peptídeos fisiologicamente ativos que permita o seu encapsulamento estável e eficiente e liberação em taxa controlada. Por conseguinte, um dos objetivos da presente invenção é prover uma composição de copolímero em bloco que satisfaça as condições mencionadas acima, bem como um méto- do para sua produção.
Como resultado de muita pesquisa criteriosamente conduzida à luz das circunstâncias atuais explicadas acima, os presentes inventores des- cobriram ser possível encapsular eficientemente proteínas e polipeptídeos fisiologicamente ativos em micelas poliméricas peio uso de um copolímero em bloco compreendendo segmentos hidrofílicos, compostos por polietileno- glicol, e segmentos hidrofóbicos compostos por um ácido poliamino, selecio- nado do grupo constituído por aminoácidos ácidos, derivados hidrofóbicos destes e misturas dos referidos aminoácidos ácidos e referidos derivados hidrofóbicos. Demais a mais, ao ajustarem o pH utilizado para preparar as micelas poliméricas, levando em consideração os pontos isoelétricos das proteínas e polipeptídeos fisiologicamente ativos, os inventores conseguiram obter um encapsu lamento mais eficiente. Os presentes inventores completa- ram esta invenção ao constatarem que este método pode ser aplicado a i- númeras proteínas e polipeptídeos fisiologicamente ativos, independente- mente de sua acidez ou alcalinidade, que a modificação do copolímero em bloco pode contribuir para interação hidrofóbica entre os segmentos hidrofó- bicos e o polipeptídeo ou a proteína, possibilitando, dessa forma, aumentar a eficiência do encapsu lamento e a taxa de liberação do fármaco e, em espe- ciai, que a estrutura das cadeias laterais hidrofóbicas no copolímero em blo- co contribui significativamente para a taxa de liberação do fármaco.
A presente invenção abrange as seguintes características.
[1] Composição de miceia polimérica para encapsulamento de proteínas ou polipeptídeos fisiologicamente ativos, formada por um copolí- mero em bloco compreendendo segmentos hidrofílicos, compostos por polie- tilenoglicol, e segmentos hidrofóbicos compostos por um ácido poliamino, selecionado entre aminoácidos ácidos, seus derivados hidrofóbicos e mistu- ras de aminoácidos ácidos e de seus derivados hidrofóbicos.
[2] Composição de acordo com [1] acima, em que os derivados hidrofóbicos de aminoácidos ácidos são ésteres de alquil aminoácidos ou alquilamidas de aminoácidos ácidos.
[3] Composição de acordo com [1] acima, em que o aminoácido
ácido é ácido aspártico ou ácido giutâmico.
[4] Composição de acordo com [1] acima, em que o copolímero em bloco possui a seguinte fórmula (I) ou (II): R,-!OCH1 CH,h—1|-(COCHNBh-(COK1 CHNHhi-R|
I I (I)
(CH,). C=O
I I
C=O R,
I I
Rs Re
R>
ou
Ri-(OCH1 CHifr- L1-OTCHCOb-(NHCHR, C0)T-R1
I I (II)
(CHi), C=O
I 1
C=O Rs
I I
R1 R.
I
Ri
em que, Ri e R3 representam cada um independentemente hidrogênio ou grupo alquila menor, quer não-substituído ou substituído com grupo funcio- nal opcionalmente protegido, R2 representa hidrogênio, um grupo carbonila alifático Ci-C29 saturado ou não-saturado ou um grupo arilcarbonila, R4 re- presenta hidroxila, um grupo óxi alifático Ci-C30 saturado ou não-saturado ou aril-alquilóxi menor, R5 representa -O- ou -NH-, R6 representa hidrogênio, fenila, -(CH2VfeniIa, C4-Cie alquila, quer não-substituído ou substituído com um grupo amino ou grupo carboxila, ou benziia, R7 representa metileno, η representa um número inteiro de 10 a 2500, χ representa um número inteiro de 10 a 300, m representa um número inteiro de 0 a 300, com a ressalva que se m estiver presente, as unidades de (COCHNH) e de {COR7CHNH) serão aleatórias, Rg pode ser selecionado para cada unidade de aminoácido em um copolímero em bloco e está aleatoriamente presente, porém hidrogê- nio como R6 constitui menos do que 60% do Re total, y representa o número inteiro 1 ou 2, Li representa um grupo de ligação selecionado do grupo cons- tituído por -NH-, -O-, -O-Z-NH-, -CO-, -CH2-, -O-Z-S-Z- e -OCO-Z-NH-, onde cada Z representa independentemente um grupo Ci-Ce alquileno e L2 repre- senta um grupo de ligação selecionado do grupo constituído por -OCO-Z- CO- e -NHCO-Z-CO-, onde Z é um grupo Ci-C6 alquileno.
[5] Composição de acordo com [4] acima, em que a taxa de for-
mação de éster ou de amida na cadeia lateral de um ácido poliamino do co- polímero em bloco é de 40-100%.
[6] Composição de acordo com qualquer um entre [1] e [5] aci- ma, em que o ponto isoelétrico (pi) da proteína ou do polipeptídeo é de 3 a
11,5.
[7] Método de preparo de composição de micela polimérica de acordo com qualquer um entre [1] a [6] acima, caracterizado por compreen- der uma etapa de mistura do copolímero em bloco com a proteína ou poli- peptídeo fisiologicamente ativo e ajuste do pH da mistura para um pH dife-
rente do ponto isoelétrico (pl) da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamen- te ativo, para encapsular a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo na região do núcleo hidrofóbico de micelas compostas pelo copolímero em bloco,
Em que o pl da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ati-
vo, o ponto isoelétrico (pl1) do aminoácido ácido e/ou de seus derivados nos segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco e o pH que é diferente do pl, estão presentes na seguinte relação:
pl > pH > pl'
de modo que os segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco possuam
carga negativa no pH, enquanto a proteína ou polipeptídeo fisiologicamente ativo possuem carga positiva.
[8] Método de acordo com [7] acima, em que o pH possui uma diferença de, pelo menos, 1 do pl do fármaco macromoiecular solúvel em água.
A invenção oferece a vantagem de permitir o encapsulamento eficiente de fármacos de alto peso molecular, como proteínas e polipeptí- deos fisiologicamente ativos em micelas poliméricas, ao mesmo tempo em que permitindo também controle de sua taxa de liberação. Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 apresenta um ciclo de tempo de liberação de IgG en- capsulado em diferentes micelas poliméricas. A Figura 2 apresenta um ciclo de tempo de concentração pias-
mática de interferon-α após administração in vivo de interferon-α encapsula- do em diferentes micelas poliméricas.
A Figura 3 apresenta um ciclo de tempo de concentração pias- mática de Iisozima FITC marcada após administração intravenosa para ratos de Iisozima FITC marcada encapsulada em micelas poliméricas ou de Iiso- zima FITC marcada em solução.
A Figura 4 apresenta um ciclo de tempo de concentração plas- mática de interferon-α após administração intravenosa para ratos de interfe- ron-α encapsulado em micelas poliméricas ou de interferon-α em solução. A Figura 5 apresenta um ciclo de tempo de concentração plas-
mática de interferon-α após administração intravenosa para ratos de interfe- ron-α encapsulado em miceias poliméricas ou de interferon-α em solução.
A Figura 6 apresenta um ciclo de tempo de concentração plas- mática de fator estimulador de colônias de granulócitos humano após admi- nistração intravenosa para ratos de fator estimulador de colônias de granuló- citos humano encapsulado em micelas poliméricas ou de fator estimulador de colônias de granulócitos humano em solução.
A Figura 7 apresenta um ciclo de tempo de concentração pias- mática de fator estimulador de colônias de granulócitos humano após admi- nistração intravenosa para ratos de fator estimulador de colônias de granuló- citos humano encapsulado em micelas poliméricas ou de fator estimulador de colônias de granulócitos humano em solução. Meihor Modo para Realizar a invenção
De acordo com um modo preferido da invenção, é possível en- capsular eficientemente proteínas ou polipeptídeos fisiologicamente ativos em micelas poliméricas utilizando um copolímero em bloco, compreendendo segmentos hidrofílicos, compostos por polietilenoglicol, e segmentos hidro- fóbicos compostos por um ácido poiiamino selecionado do grupo constituído por aminoácidos ácidos, derivados hidrofóbicos destes e misturas dos referi- dos aminoácidos ácidos e dos referidos derivados hidrofóbicos.
De acordo com um outro modo preferido da invenção, é possível encapsular mais eficientemente proteínas ou polipeptídeos fisiologicamente ativos nas regiões hidrofóbicas do núcleo de micelas poliméricas, compre- endendo um copolímero em bloco, pelo ajuste do pH durante o preparo das micelas poliméricas com base no ponto isoelétrico (pi) da proteína ou do po- lipeptídeo fisiologicamente ativo a ser encapsulado. Para encapsulamento mais eficiente de proteínas ou polipeptí-
deos fisiologicamente ativos nas micelas poliméricas, o pH durante o prepa- ro das micelas poliméricas é ajustado, de preferência, para um valor diferen- te do pl dos polipeptídeos ou proteínas. O pH durante o preparo das micelas poliméricas difere e, mais especificamente, difere de preferência em pelo menos 1, do pt da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo, em um intervalo em que não ocorra desnaturação da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo. Para um encapsulamento ainda mais eficiente da pro- teína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo, a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo possui, de preferência, carga elétrica oposta àquela dos segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco, ou seja, as seções que formam o núcleo das micelas poliméricas, no pH durante o preparo das mi- celas poliméricas. Por exemplo, se a proteína ou o polipeptídeo fisiologica- mente ativo possuir carga positiva no pH durante o preparo das micelas po- liméricas, os segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco terão, de pre- ferência, carga negativa, e se a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo possuir carga negativa, os segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco terão, de preferência, carga positiva. De acordo com um modo preferi- do, por exemplo, se o pi da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ati- vo, o ponto isoelétrico (pP) do aminoácido ácido e/ou de seus derivados nos segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco e o pH durante o preparo das micelas poliméricas for na seguinte relação: pl > pH > pP
os segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco terão carga negativa e a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo terá carga positiva naquele pH. Os pontos isoelétricos dos aminoácidos ácidos, o ácido aspártico e ácido glutâmico, são 2,77 e 3,22, respectivamente. De acordo com um outro modo preferido da invenção, a especi-
ficação do pl da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo permite selecionar os segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco e determinar apropriadamente o pH durante o preparo das micelas poliméricas, conforme adequado para as condições, de modo que possa se aplicar a diferentes proteínas e polipeptídeos fisiologicamente ativos exibindo ampla gama de valores de pl. Por exemplo, quando se desejar encapsular um polipeptídeo ou proteína com pl básico, é selecionado um copolímero em bloco de modo que o pP do aminoácido ácido e/ou de seus derivados nos segmentos hidro- fóbicos seja ainda mais ácido do que o pl, e é efetuada uma seleção apro- priada de pH entre os valores do pl e pP para formação das micelas naquele pH, para que um encapsulamento eficiente possa ser obtido. Por outro lado, quando se desejar encapsular um polipeptídeo ou proteína com pl ácido, é selecionado um copolímero em bloco de modo que o pP seja ainda mais áci- do ou ainda mais básico do que o pl, e é efetuada uma seleção apropriada de pH entre os valores do pl e pl' para formação das micelas naquele pH, para que um encapsulamento eficiente possa ser obtido. De preferência, os segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco da invenção possuem gru- pos funcionais com carga negativa em um intervalo neutro, como em pH 5-8. Utilizando este copolímero em bloco, um pH em intervalo neutro pode ser selecionado como o pH durante a formação de micelas e para evitar a expo- sição do polipeptídeo ou da proteína a um meio extremamente ácido ou bá- sico. Ao se considerar o pH durante o preparo das micelas poliméri- cas, o pl da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo e o pi' do a- minoácido ácido e/ou de seu derivado nos segmentos hidrofóbicos, o encap- sulamento da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo nas micelas poliméricas pode ser obtido pelo preparo de uma mistura aquosa do copolí- mero em bloco que formará as micelas poliméricas e da proteína ou do poli- peptídeo fisiologicamente ativo a ser encapsulado, e o pH da mistura é ajus- tado para um pH apropriadamente selecionado com base no pl do fármaco e no pl' do aminoácido ácido e/ou de seu derivado nos segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco, conforme explicado acima.
De acordo com um modo preferido, o copolímero em bloco é dissolvido em um solvente orgânico apropriado, por exemplo, um solvente orgânico não-miscível em água como diclorometano, clorofórmio, dietil éter, dibutil éter, acetato de etila ou acetato de butila, um solvente orgânico miscí- vel em água como metanol, etanol, álcool propílico, álcool isopropílico, sulfó- xido de dimetila, dimetilformamida, dimetilacetamida, acetonitrila, acetona ou tetra-hidrofurano, ou uma mistura destes. Opcionalmente, a solução pode ser secada ao ar até a formação de um filme sólido sob corrente de gás ni- trogênio, por exemplo, e o solvente orgânico é removido, se necessário, du- rante secagem sob pressão negativa. Uma solução aquosa do fármaco ma- cromolecular solúvel em água a ser encapsulado é adicionada, em seguida, e misturada ao copolímero em bloco que foi tratado. Finalmente, o pH da mistura é ajustado lentamente até o desejado para formar micelas poliméri- cas, ao mesmo tempo em que a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo é encapsulado nas mesmas.
As micelas poliméricas podem ser formadas, por exemplo, agi- tando-se uma mistura do copolímero em bloco e da proteína ou do polipeptí- deo fisiologicamente ativo. A formação das micelas poliméricas é conduzida, de preferência, com aplicação de energia, por exemplo, sonicação. Quando se utiliza sonicação, a formação pode ser obtida com Biodisruptor (Nippon Seiki Co., Ltd.), por exemplo, em Nível 4, ao mesmo tempo em que resfrian- do em gelo. O tempo de exposição não é especialmente restringido, desde que não leve à desnaturação da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo, e pode ser em intervalos de 1 segundo durante 5 segundos - 10 minu- tos, de preferência, 5 segundos ■ 2 minutos.
De acordo com um outro modo preferido, o copolímero em bloco seco pode ser tratado com argamassa ou substância similar para se trans- formar em pó homogêneo, e a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo em forma em pó, ou a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo dissolvido em uma pequena quantidade de solução que pode ser adicionada e misturada suavemente ao mesmo, após o qual uma solução tampão ade- quada pode ser adicionada e misturada aos mesmos por entre 2 e 24 horas, antes de tratamento ultrassônico.
De acordo com ainda um outro modo preferido, micelas vazias são preparadas inicialmente e, em seguida, a proteína ou o polipeptídeo fisi- ologicamente ativo é adicionado, com agitação ou colocação, para obtenção da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo encapsulado em mice- las potiméricas. Especificamente, uma solução tampão adequada pode ser adicionada ao copolímero em bloco e submetida a tratamento ultrassônico para preparo de micelas vazias, conforme mencionado acima, e, em segui- da, a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo dissolvido na mesma solução tampão ou a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo diluído na solução tampão pode ser adicionado às mesmas e a mistura agitada com agitador ou colocada suavemente. O período de tempo para agitação ou co- locação é, de preferência, entre 2 e 24 horas, e a temperatura, de preferên- cia, de 4°C a 30°C, sendo o mais preferível, de 4°C. Este método é vantajo- so do ponto de vista de estabilidade da proteína ou do polipeptídeo fisiologi- camente ativo, visto que a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo não é submetido a tratamento ultrassônico. Em qualquer caso, a solução tampão adequada é, de preferência, uma que atenda à relação supramen- cionada entre pl e pH. De acordo com o método da invenção, não há restrições especi-
ais sobre proteínas ou polipeptídeos fisiologicamente ativos que possam ser eficientemente encapsulados nas micelas poliméricas, porém, de preferên- cia, as proteínas ou polipeptídeos fisiologicamente ativos são solúveis em água e com pesos moleculares de, pelo menos, 1.500 e, de preferência, de pelo menos 2.000. Exemplos de proteínas e polipeptídeos fisiologica mente ativos que podem ser mencionados incluem interferon-α, β e γ, eritropoietina, G-CSF1 hormônio de crescimento, interleucinas, TNF, fator estimulador de colônias de leucócito-macrófago granular, fator estimulador de colônias de macrófago, fator de crescimento de hepatócito, a superfamília de TGF-β, EGF, FGF1 IGF-I e os similares. Naturalmente, estão incluídos também deri- vados das proteínas supramencionadas, como aquelas com uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos, desde que a sua ativi- dade não seja comprometida.
A proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo exibirá pontos isoelétricos diferentes, mesmo com a mesma proteína, dependendo da pre- sença de cadeias de açúcar ou sua estrutura em ordem mais alta, especial- mente quando produzida por recombinação gênica. Por conseguinte, ao se preparar micelas poliméricas levando em consideração o pH durante o seu preparo, o pl da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo e o pr do aminoácido ácido e/ou de seu derivado nos segmentos hidrofóbicos, é prefe- rível estabelecer o pH durante o encapsulamento após determinar o ponto isoelétrico da proteína ou do polipeptídeo a ser encapsulado, empregando eletroforese para essa determinação.
A quantidade de proteína ou polipeptídeo fisiologicamente ativo utilizada para formação de micelas não é especialmente restringida, porém será geralmente de 0,01-50% por peso e, de preferência, de 0,1-10% por peso relativo ao peso do fármaco macromoiecular solúvel em água em rela- ção ao copolímero em bloco.
Polímeros que podem ser utilizados para formar micelas polimé- ricas para encapsulamento de fármaco, de acordo com a invenção, são co- polímeros em bloco compreendendo segmentos hidrofílicos, compostos por polietilenoglicol, e segmentos hidrofóbicos compostos por um ácido poliami- no selecionado do grupo constituído por aminoácidos ácidos, derivados hi- drofóbicos destes e misturas dos referidos aminoácidos ácidos e os referidos derivados hidrofóbicos, dos quais um tipo pode ser um segmento hidrofóbico com grupo funcional com carga. "Segmento hidrofóbico com grupo funcionai com carga" significa que o segmento, como um todo, possui a hidrofobicida- de necessária para formar o núcleo das micelas poliméricas compostas pelo copolímero em bloco, e que a hidrofobicidade é decorrente de seções hidro- fóbicas presentes aleatoriamente nos segmentos, contendo porções com carga negativa presentes também no segmento.
Os segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco da invenção são capazes de manter firmemente o fármaco macromolecuiar a ser encap- sulado por interação hidrofóbica e, quando os segmentos hidrofóbicos pos- suem carga elétrica, podem manter também o fármaco macromolecular por meio de interação eletrostática. Os presentes inventores constataram que a estrutura dos grupos hidrofóbicos nos segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco pode controlar a interação hidrofóbica entre a proteína ou o poli- peptídeo fisiologicamente ativo encapsulado e o copolímero em bloco, pos- sibilitando, dessa forma, o controle da taxa de liberação. Embora não te- nham pretendido ficarem limitados a qualquer teoria em particular, os inven- tores acreditam que, conforme será demonstrado pelos exemplos que se- guem, a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo é mantido mais firmemente nos núcleos das micelas se a estrutura dos grupos hidrofóbicos introduzidos nos segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco, formador das micelas, for uma estrutura linear de grupos alquila em vez de estrutura em plano, como a de benzila ou fenila, sendo, por conseguinte, liberado por um período mais prolongado de tempo. Em outras palavras, modificando-se a estrutura dos grupos hidrofóbicos introduzidos nos segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco, é possível ajustar a taxa de liberação da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo. Por exemplo, quando se desejar obter uma taxa mais alta de liberação de fármaco, a introdução de grupos hidrofóbicos com estrutura em plano, como benzila ou fenila, pode ser au- mentada, e se o desejado for uma taxa mais baixa de liberação de fármaco, a introdução de grupos hidrofóbicos com estrutura linear, como grupos alqui- la, pode ser aumentada. Quando uma taxa intermediária de liberação de fármaco for desejada, a razão entre introdução de grupos hidrofóbicos com estrutura em plano, como benzila ou fenila, e de grupos hidrofóbicos com estrutura linear, como grupos alquila, pode ser variada para ajustar apropria- damente a taxa de liberação.
A seguir são apresentados exemplos de copolímeros em bloco
que podem ser utilizados na invenção.
Os segmentos hidrofílicos são compostos por poli(etilenoglicol) [ou poli(óxido de etileno)] e podem incluir opcionalmente segmentos deriva- dos de polissacarídeos, poli(vínilpirrolidona), poli(vinil álcool), po- li(acrilamida), poii(ácido acrílico), poli(metacrilamida), poii(ácido metacrílico), poli(ésteres de ácido metacrílico), poli(ésteres de ácido acrílico), ácidos poli- amino ou derivados destes, embora essa relação não pretenda ser restritiva. Os polissacarídeos referidos nesta exposição incluem pululano, dextrano, frutano e galactano.
Os segmentos hidrofóbicos, por outro lado, podem ser aminoá-
cidos ácidos, e especialmente poli(ácido aspártico) e/ou seus derivados ou poli(ácido glutâmico) e/ou seus derivados. Exemplos específicos porém não exclusivos incluem derivados de poli(aminoácido ácido) como segmentos poli(p-benzil aspartato), poli(P-benzil aspartato-co-ácido aspártico), ροϋ(β- alquil aspartato), ροΙΚβ-alquil aspartato-co-ácido aspártico), poli(p-alil aspar- tato), ροΙΚβ-alil aspartato-co-ácido aspártico), ροΙΚβ-alil aspartato), ροϋ(β- aralquil aspartato-co-ácido aspártico), poli$-aralquil aspartato), poli{y-benzil glutamato), ροΙΚγ-benzil glutamato-co-ácido glutâmico), poli(y-alquil glutama- to), poli(y-alquil glutamato-co-ácido glutâmico), polift-aralquií glutamato), po- li(Y-aralquil glutamato-co-ácido glutâmico), poli(P-alquil aspartamida-co-ácido aspártico) e poli(y-aralquil-glutamida-co-ácido glutâmico).
Os segmentos hidrofóbicos são hidrofóbicos em decorrência de cadeias laterais hidrofóbicas. A título de exemplos destas cadeias laterais hidrofóbicas podem ser mencionados benzila, fenila, alquila, C 4-C16 alquila quer não-substituído ou substituído com um grupo amino ou grupo carboxila e -(CH2)4-fenila, bem como quaisquer combinações desejadas destes. Con- forme explicado acima, uma vez que a taxa de liberação do fármaco encap- sulado é ajustada pela estrutura de cadeias laterais hidrofóbicas introduzidas nos segmentos poli(derivados de aminoácido), as cadeias laterais hidrofóbi- cas são, de preferência, fenila ou benzila quando uma taxa de liberação rá- pida é desejada, e as cadeias laterais hidrofóbicas são, de preferência, aiqui- la, como grupos C4-C16 alquila, quando uma taxa mais ienta de liberação é
Estes segmentos pol!(derivados de aminoácido) podem ser for- mas modificadas conhecidas de polietilenoglicol-co-poliéster benzílico de ácido aspártico ou polietilenoglicol-co-poliéster benzílico de ácido glutâmico. Polietilenoglicoi-co-poiiéster benzílico de ácido aspártico ou polietilenoglicol- co-poliéster benzílico de ácido glutâmico podem ser preparados utilizando polietilenoglicol com uma extremidade protegida e um grupo amino na outra extremidade, por exemplo, MeO-PEG-CH2CH2CH2-NH2, como o material inicial, e adicionando N-carbóxi-p-benzil-L-aspartato (BLA-NCA) ou N- carbóxi-y-benzil-L-glutamato (BLG-NCA) até o grau desejado de polimeriza- ção (número de unidades de aminoácidos) em solvente desidratado para reação.
Após acetilação das extremidades do copolímero em bloco obti- do com cloreto de acetila ou anidrido acético, os grupos benzila são removi- dos por hidrólise alcalina para formar polietilenoglicol-co-poliácido aspártico ou polietilenogiicol-co-poliácido glutâmico e, em seguida, áícooí benzílico é adicionado até a razão desejada de esterificação em solvente orgânico, sen- do a reação conduzida na presença de um agente de condensação como N- Ν'-diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC) ou Ν-Ν'-di-isopropilcarbodi-imida (DIPCI), para ser obtido um copolímero em bloco com porções de éster benzílico.
A reação com 1-octanol, por exemplo, em vez de com álcool benzílico produzirá polietilenoglicol-co-poliéster octílico de ácido aspártico e polietíienogiicol-co-poliéster octílico de ácido glutâmico, enquanto o uso de 1-dodecanol produzirá, da mesma forma, polietilenoglicol-co-poliéster dode- cílico de ácido aspártico e 1-hexadecanol produzirá polietilenoglicol-co- poliéster hexadecílico de ácido aspártico.
Quando as cadeias laterais hidrofóbicas forem introduzidas por ligações amida, uma cadeia lateral hidrofóbica com grupo amino pode ser reagida com o grupo carboxiia do poIietiIenoglicoi-co-poliéster benzílico de ácido aspártico ou polietilenoglicol-co-poliéster benzílico de ácido glutâmico que foi acetíiado conforme descrito acima e, em seguida, o grupo benzila removido por hidrólise alcalina, ou polietilenoglicol-co-poliéster benzílico de ácido aspártico pode ser reagido com um composto com uma amina primá- ria, utilizando-se aminólise para conversão da ligação éster em ligação ami- da.
Alternativamente, 1-octiiamina ou similar pode ser inicialmente adicionado ao polietilenoglicol-co-poliéster benzílico de ácido aspártico em solvente orgânico até a taxa desejada de amidação e a reação conduzida por um período prescrito de tempo e, em seguida, 1,8-diaminooctano ou si- milar adicionado em excesso ao éster benzílico não convertido, para serem obtidos segmentos poíi(derivado de aminoácido) com uma combinação de cadeias laterais hidrofóbicas com as extremidades do grupo hidrofóbico substituídas com grupos amino e cadeias laterais hidrofóbicas sem substitui- ção do grupo amino. A taxa de esterificação ou de amidação é de 40%- 100% em relação ao número total de unidades de aminoácidos. Ácido aspár- tico e ácido glutâmico podem estar em formas opcionalmente ativas ou mis- turas destes. Os segmentos hidrofílicos e segmentos hidrofóbicos podem ser unidos por grupos de ligação conhecidos, como ligações éster, ligações a- mida, grupos imino, ligações carbono-carbono ou ligações éter.
Copolímeros em bloco que são facilmente produzidos e que po- dem ser convenientemente utilizados para a invenção incluem aqueles re- presentados pelas seguintes fórmulas (I) e (II).
Rs-(OCH1 CH1H- Li-(COCHNHh-(CORi CHNH)-;-R1
I I (I)
(CHl)y C=O
I i
C=O R5
I I
h Ri
I Ϊ.
ou - (OCBi CHjH- Li-(NHCBCOh-CHHCHR7 COIi-R1
I I (II)
(CBs), C-O
I I
C=O ι,
I I
Ki Rt
Nas fórmulas, Ri e R3 representam, cada um independentemen- te, hidrogênio ou um grupo alquila menor, quer não-substituído ou substituí- do com um grupo funcional opcionalmente protegido, R2 representa hidrogê- nio, um grupo carbonila alifático Ci-C29 saturado ou não-saturado ou um grupo arilcarbonila, R4 representa hidroxila, um grupo C1-C30 óxi alifático ou aril-alquilóxi menor saturado ou não-saturado, R5 representa -O- ou -NH-, Re representa hidrogênio, fenila, -(CH2)4 -fenila, C4-C16 alquila quer não* substituído ou substituído com um grupo amino ou grupo carboxila, ou benzi- la, R7 representa metileno, η representa um número inteiro de 10 a 2500, χ representa um número inteiro de 10 a 300, m representa um número inteiro de 0 a 300, com a ressalva que se m estiver presente, as unidades de (CO- CHNH) e de {COR7CHNH) serão aleatórias, Re pode ser selecionado para cada unidade de aminoácido em um copolímero em bloco e está presente aleatoriamente, porém hidrogênio como R6 constituí menos do que 60% do Rç total, y representa o número inteiro 1 ou 2, Li representa um grupo de ligação selecionado do grupo constituído por -NH-, -O-, -O-Z-NH-, -CO-, - CH2-, -O-Z-S-Z- e -OCO-Z-NH-, onde cada Z representa independentemente um grupo Ci-Ce alquiieno e L2 representa um grupo de ligação selecionado do grupo constituído por -OCO-Z-CO- e -NHCO-Z-CO-, onde Z é um grupo CrC6 alquiieno.
Como grupos funcionais opcionalmente protegidos podem ser mencionados hidroxila, acetal, cetal, aldeído, resíduos de açúcar, maleimida, carboxila, amino, tíol e grupos ativos éster. Segmentos hidrofílicos, em que Ri e R3 representam grupos alquila menores substituídos com grupos fun- cionais opcionalmente protegidos, podem ser obtidos pelos métodos descri- tos em W096/33233, W096/32434 e W097/06202, por exemplo, Um grupo alquila menor é um grupo C7 ou menor, de preferência, C4 ou grupo alquila menor de cadeia reta ou ramificada, cujos exemplos incluem metila, etila, propila, isopropila, butila e isobutila.
As micelas poliméricas podem ser formadas, por exemplo, por dissolução do copolímero em bloco e da proteína ou do polipeptídeo fisiolo- gicameníe ativo em solução tampão adequada e agitação da mistura, con- forme explicado acima. A formação da micela vazia é conduzida, de prefe- rência, com aplicação de energia, por exemplo, por sonicação. Quando soni- cação é utilizada, a formação pode ser obtida com Biodisruptor (Nippon Seiki Co., Ltd.), por exemplo, em Nível 4, ao mesmo tempo em que resfriando em gelo. O tempo de exposição não é especialmente restrito, desde que a prote- ína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo não seja desnaturado, e pode ser em intervalos de 1 segundo durante 5 segundos-10 minutos e, de prefe- rência, de 5 segundos-2 minutos. Como um método diferente, o copolímero em bloco secado pode ser tratado para se transformar em pó homogêneo ou similar e a proteína ou polipeptídeo fisiologicamente ativo em forma em pó, ou a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo dissolvido em quanti- dade pequena de solução pode ser adicionado e misturado suavemente ao mesmo por entre 2 e 24 horas a 4°C antes de tratamento uitrassônico ao mesmo tempo em que resfriado em gelo.
Ainda como um outro método, uma solução tampão adequada pode ser adicionada ao copolímero em bloco e a mistura submetida a trata- mento uitrassônico para o preparo de micelas vazias, conforme mencionado acima, e, em seguida, a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo dissolvido na mesma solução tampão ou a proteína ou o polipeptídeo fisiolo- gicamente ativo diluído na solução tampão pode ser adicionado à mesma, e a mistura agitada com agitador ou colocada suavemente. O tempo para agi- tação ou colocação é, de preferência, entre 2 horas e 5 dias, e a temperatu- ra, de preferência, de 4°C a 30°C, sendo o mais preferível de 4°C. Este mé- todo é vantajoso do ponto de vista de estabilidade da proteína ou do polipep- tídeo fisiologicamente ativo, uma vez que a proteína ou o polipeptídeo fisio- logicamente ativo não é submetido a tratamento uitrassônico. Em qualquer caso, a solução tampão adequada é, de preferência, aquela que satisfaça a relação supramencionada entre pl e pH.
Não há restrições especiais quanto ao tamanho de partículas das micelas poliméricas para encapsulamento da proteína ou do polipeptí- deo fisiologicamente ativo, preparadas nesta maneira, desde que este permi- ta administração in vivo, porém, de preferência, o tamanho não é maior do que 10 μιη, sendo mais preferível que não seja maior do que 5 μηι. Especi- almente para uso em administração intravenosa, o tamanho, de preferência, não é maior do que 500 nm, sendo mais preferível que não seja maior do que 300 nm. Se necessário, uma solução contendo a proteína ou o polipep- tídeo fisiologicamente ativo encapsulado em micelas poliméricas pode ser filtrada em filtro hidrofílico com tamanho desejado de poro.
Quando a proteína ou o polipeptídeo fisiologicamente ativo en- capsulado em micelas poliméricas da invenção forem administradas in vivo, a via de administração pode ser qualquer uma desejada como, por exemplo, administração intravenosa, administração subcutãnea, administração intra- muscular, administração intra-articular, administração intraperitoneal ou ad- ministração intraocular. Em um modo preferido da invenção, o método de produção pode incluir uma etapa na qual vários sacarídeos e/ou vários polie- tilenoglicóis (por exemplo, Macrogol) são adicionados às micelas poliméricas para encapsulamento do fármaco (ou à solução aquosa) antes que a filtra- ção estéril. Sacarídeos que podem ser utilizados incluem maltose, tre- halose, xilitol, glicose, sacarose, frutose, lactose, manitol, dextrina e simila- res, e polietiIenoglicóis que podem ser utilizados incluem aqueles com pesos moleculares de aproximadamente 1000 a aproximadamente 35.000, como Macrogol 1000, 1540, 4000, 6000, 20.000 e 35.000, embora estes exemplos não sejam limitações.
Uma fórmula de micela polimérica para encapsulamento de pro- teína ou polipeptídeo fisiologicamente ativo da invenção pode ser Iiofilizada desde que o mesmo não afete a estabilidade da proteína ou do polipeptídeo fisiologicamente ativo encapsulado. Quando liofilizada, a fórmula seca pode ser novamente dissolvida ou reconstituída em uma solução contendo mice- Ias poliméricas que encapsulam proteína ou poiipeptídeo fisiologicamente ativo, empregando água ou uma solução aquosa.
Para liofilização, um sacarídeo pode ser adicionado à solução antes que a liofilização até uma concentração final de 0,1-15% (p/v), ou poli- etilenoglicol pode ser adicionado até uma concentração final de 0,5-10% (p/v). A proporção entre o copolímero em bloco e o sacarídeo ou polietileno- glicol será normalmente de 1:1-1:10 ou de 1:0,5-1:10 por peso.
De acordo com um modo preferido, as extremidades dos seg- mentos hidrofílicos podem possuir grupos funcionais capazes de se ligarem a uma molécula pretendida como alvo. Como grupos funcionais capazes de se ligarem a moléculas pretendidas como alvo, podem ser mencionados grupos hidroxila, acetal, cetal, aldeído, carboxila, maleimida, amino, tiol e grupos ativos éster, sem quaisquer restrições em especial, e estes grupos funcionais podem ser também protegidos. Como moléculas pretendidas co- mo alvo, podem ser mencionados Iigantes1 anticorpos ou seus fragmentos funcionais, proteínas, peptídeos e similares, sem quaisquer restrições em especial. Quando for ligada a um grupo funcional, a ligação com a molécula pretendida como alvo pode ser por qualquer método apropriadamente sele- cionado de acordo com a estrutura da molécula. Exemplos e exemplos comparativos serão a seguir apresenta-
dos para uma descrição mais detalhada da invenção.
Na descrição seguinte, por exemplo, um copolímero em bloco de PEG com peso molecular médio de 12.000, unidade de ácido poliamino em média de 40 resíduos e razão de introdução de éster benzílico de aproxima- damente 65% é indicado por 12-40(65) após o nome do copolímero em blo- co, enquanto que o mesmo com éster octílico ou outra razão de introdução de aproximadamente 65% é indicado por 12-40(65). O termo "aproximada- mente 65%" significa aproximadamente 62%-68%. Exemplos
1) Medição de eficiência de encapsulamento
Exemplo 1 (Preparo 1 de micelas para encapsulamento de IgG humana)
O copolímero em bloco utilizado foi polietilenoglícol-co-poliéster benzílico de ácido aspártico (a seguir denominado PEG-PBLA. Neste polí- mero, os resíduos de ácido aspártico sem éster benzílico pertencem à fór- mula geral (I), em que R5 é -O- e Rg é hidrogênio (o mesmo abaixo nesta exposição)). Além disso, todos os copolímeros em bloco seguintes perten- cem à fórmula geral (I) em que Ri é CH3, Li é -0(CH2)3NH e R2 é COCH3. Após pesar precisamente 10 mg de PEG-PBLA 12-50(65) em um frasco de vidro, 1 mi de diclorometano foi adicionado para dissolução. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás nitrogênio, sendo em seguida secada ainda mais por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta foram adicionados 62 μΙ de uma solução tampão fosfato a 20 mM (pH 6, 16,5 mg/ml) contendo IgG humana purificada (MP Biomedicals Co.) (pl: aproximadamente 8) e, em seguida, 1,938 ml de tam- pão fosfato a 20 mM (pH 6) ou tampão TAPS a 20 mM TAPS (pH 8) foram lentamente adicionados sob agitação suave a 4°C. Após agitação durante a noite a 4°C, foi utilizado um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) para sonicação por aproximadamente 10 segundos (em intervalos de 1 segundo, rendimento: Baixo) enquanto resfriada em gelo, e a mistura foi submetida à filtração em gel (Sepharose® CL-4B, Sigma-Aldrich Corp., ~2φ χ 30 cm). A concentração de IgG de cada fração recuperada (e- luente: tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4), vazão: 1,0 ml/min, volume de fra- ção: 1 ml) foi analisada utilizando um Ensaio BCA para Proteína {Pierce Corp.). A eficiência do encapsulamento foi calculada pela seguinte fórmula:
, t (Teorprotéicoemfraçãodemicela)xlOO
Eficiência de encapsulamento (%) = —-—-—-—, * .-—t—z-
Teor proteico total em todas as frações
A eficiência do encapsulamento foi de 94% com o preparo em pH 6, tendo sido de 41 % com o preparo em pH 8. Os resultados indicam que a proteína foi encapsulada mais eficientemente pelo preparo das micelas sob condições em que o pH era diferente do ponto isoelétrico da proteína encapsulada, do que quando foram preparadas próximo ao ponto isoelétrico, com base em interação eletrostática entre a proteína e PEG-PBLA 12- 50(65). Exemplo 2 (Preparo 2 de micelas para encapsulamento de IgG humana)
O copolímero em bloco utilizado foi polietilenoglicol-co-poliéster benzílico de ácido glutâmico (a seguir denominado PEG-PBLG. Neste polí- mero, os resíduos de ácido glutâmico sem éster benzílico pertencem à fór- mula geral (I), em que R5 é -O- e Re é hidrogênio (o mesmo abaixo nesta exposição)). Após pesar precisamente 10 mg de PEG-PBLG 12-40(65) em um frasco de vidro, 1 ml de diclorometano foi adicionado para dissolução. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás ni- trogênio, sendo em seguida secada ainda mais por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta foram adicionados 62 μΙ de uma solução tam- pão fosfato (pH 6, 16,5 mg/ml) contendo IgG humana purificada (MP Biome- dicals Co.) (pl: aproximadamente 8) e, em seguida, 1,938 ml de tampão fos- fato a 20 mM (pH 6) ou tampão TAPS a 20 mM (pH 8) foram adicionados lentamente sob agitação suave a 4°C. Após agitação durante a noite a 4°C, um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utili- zado para sonicação por aproximadamente dez segundos (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo), sendo a mistura submetida à filtração em gel (Sepharose® CL-4B, Sigma-Aldrich Corp., ~2φ χ 30 cm). A concentração de IgG de cada fração recuperada (eluente: tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4), vazão: 1,0 ml/min, volume de fração: 1 ml) foi analisada com um Ensaio BCA para Proteína (Pierce Corp.). A eficiência do encapsulamento foi calculada pela seguinte fórmula:
x (Teorprotéicoemfraçãodemicela)xlOO
Eficiência de encapsulamento (%) = —-———..,..,-;—;-
Teor protéico total em todas as frações
A eficiência do encapsulamento foi de 83% com preparo em pH 6, tendo sido de 63% com preparo em pH 8. Os resultados indicam que a proteína foi encapsulada mais eficientemente pelo preparo das micelas sob condições em que o pH era diferente do ponto isoelétrico da proteína encap- sulada, do que quando foram preparadas próximo ao ponto isoelétrico, com base em interação eletrostática entre a proteína e PEG-PBLG 12-40(65). Exemplo 3 (Preparo 3 de micelas para encapsulamento de IgG humana) O copolímero em bloco utilizado foi polietilenoglicol-co-poliéster octilfco de ácido aspártico (a seguir denominado PEG-POLA. Neste políme- ro, os resíduos de ácido aspártico sem éster octilíco pertencem à fórmula geral (I), em que R5 é -O- e R6 é hidrogênio (o mesmo abaixo nesta exposi- ção)). Após pesar precisamente 10 mg de PEG-POLA 12-40(65) em um frasco de vidro, 1 ml de diclorometano foi adicionado para dissolução. A so- lução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás nitro- gênio e, em seguida, secada ainda mais por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta foram adicionados 62 μΙ de uma solução de tam- pão fosfato a 20 mM (pH 6, 16,5 mg/ml) contendo IgG humana purificada (MP Biomedicals Co.) (pl: aproximadamente 8) e, em seguida, 1,938 ml de tampão fosfato a 20 mM (pH 6) ou tampão TAPs a 20 mM (pH 8) foram adi- cionados lentamente sob agitação suave a 4°C. Após agitação durante a noite a 4°C, um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utilizado para sonicação por aproximadamente 10 segundos (inter- valo de 1 segundo, Baixo) enquanto resfriada em gelo, sendo a mistura submetida à filtração em gel (Sepharose® CL-4B, Slgma-Aldrich Corp., ~2φ χ cm). A concentração de IgG de cada fração recuperada (eluente: tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4), vazão: 1,0 ml/min, volume de fração: 1 ml) foi ava- liada por análise de aminoácidos (AccQ-Tag™, Waters Co.). A eficiência do encapsulamento Ioi calculada pela seguinte fórmula:
,„,, (Teor protéico em fração de micela) χ 100
Eficiência de encapsulamento %) = -1——-————;-—3- , „„,„,
Teor protéico total em todas as frações
A eficiência do encapsulamento foi de 97% com preparo em pH 6, tendo sido de 24% com preparo em pH 8. Os resultados indicam que a proteína foi encapsulada mais eficientemente pelo preparo das micelas sob condições em que o pH era diferente do ponto isoelétrico da proteína encap- sulada, do que quando foram preparadas próximo ao ponto isoelétrico, com base em interação eletrostética entre a proteína e PEG-POLA 12-40(65). Exemplo Comparativo 1 (Preparo 4 de micelas para encapsulamento de IgG humana) Após pesar precisamente 10 mg de PEG-PBLA 12-50(100) em um frasco de vidro, 1 ml de diclorometano foi adicionado para dissolução. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás ni- trogênio e, em seguida, secada ainda mais por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta foram adicionados 62 μΙ de uma solução de tam- pão fosfato a 20 mM (pH 6, 16,5 mg/ml) contendo IgG humana purificada (MP Biomedicals Co.) (pl: aproximadamente 8) e, em seguida, 1,938 ml de tampão fosfato a 20 mM (pH 6) ou tampão TAPS a 20 mM (pH 8) foram adi- cionados lentamente sob agitação suave a 4°C. Após agitação durante a noite a 4°C, um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utilizado para sonicação por aproximadamente dez segundos (in- tervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo) enquanto resfriada em gelo, sendo a mistura submetida à filtração em gel (Sepharose® CL-4B, Sigma-Aldrich Corp., ~2φ χ 30 cm). A concentração de IgG de cada fração recuperada (e- luente: tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4), vazão: 1,0 mi/min, voiume de fra- ção: 1 ml) foi analisada com um Ensaio BCA para Proteína (Pierce Corp.). A eficiência do encapsulamento foi calculada pela seguinte fórmula:
Eficiência de encapsulamento (%) = (Teorprotéicoemfraçãodemicela)x100 Teor protéico total em todas as frações
A eficiência do encapsulamento foi de 22% com preparo em pH 6, tendo sido de 65% com preparo em pH 8. Os resultados indicam que utili- zando PEG-PBLA 12-50(100) que não possui grupos carboxila, não houve participação da interação eletrostática, mesmo quando as micelas foram preparadas sob condições em que o pH era diferente do ponto isoelétrico da proteína encapsulada, tendo sido, por conseguinte, difícil obter um encapsu- lamento eficiente da proteína. A proteína foi encapsulada com base na inte- ração hidrofóbica quando o preparo foi próximo do ponto isoelétrico. Exemplo Comparativo 2 (Preparo de micelas para encapsulamento de IgG com FITC marcado)
Três copolímeros em bloco foram utilizados, um copolímero em bloco composto por polietilenoglicol-poliácido aspártico (número médio de resíduos: aproximadamente 50, não-esterífiçados), PEG-PBLA 12-50(65) e PEG-POLA 12-40(65). Após pesar precisamente 20 mg de cada polímero em um frasco de vidro, 2 ml de diclorometano foram adicionados para disso- lução. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás nitrogênio e, em seguida, secada ainda mais por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta foram adicionados 100 μΙ de uma solução tampão fosfato contendo imunoglobulina humana com FITC marcado (FITC- IgG) (Sigma-AIdrich Corp., 20 mg/ml) e, em seguida, 1,9 ml de tampão fosfa- to a 20 mM (pH 6) foram adicionados lentamente enquanto sob agitação su- ave a 4°C. Após agitação adicional durante a noite a 4°C, um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utilizado para sonica- ção por aproximadamente 10 segundos (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo) enquanto resfriada em gelo, sendo a mistura submetida à ultracentri- fugação (30.000 rpm, 1 hora, 4°C, Rotor MLA-130 da Beckman Coulter). A fração de micelas recuperada com precipitação foi suspensa em tampão fos- fato a 20 mM (pH 6) e submetida, em seguida, à filtração em gel (Sepharo- se® CL-4B, Sigma-AIdrich Corp., ~2<f> χ 30 cm). A concentração de FITC-igG em cada fração recuperada (eluente: tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4), va- zão: 1,0 ml/min, volume de fração: 1 ml) foi analisada utilizando um leitor de placa (PowerScan® HT, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) (cumprimen- to de onda de excitação: 485 nm ± 20 nm, comprimento de onda de emis- são: 528 nm ± 20 nm) e a eficiência do encapsulamento foi calculada pela seguinte fórmula:
Eficiência de encapsulamento (%) = (Teor protéicoemfragãodemicela)x100 Teor protéico total em todas as frações
A eficiência do encapsulamento foi de 6% quando um copolíme-
ro em bloco composto por polietilenoglicol-poliácido aspártico (número médio de resíduos: 50, não-esterificados) foi utilizado. Quando PEG-PBLA 12- 50(65) e PEG-POLA 12-40(65) foram utilizados, a eficiência do encapsula- mento foi de 51% e 60%, respectivamente. Os resultados indicam que a pro- teína pode ser encapsulada mais eficientemente pelo uso de um polímero compreendendo, no geral, segmentos hidrofóbicos com substituintes hidro- fóbicos e grupos com carga elétrica, sugerindo que a interação hidrofóbica é responsável também pelo encapsulamento, em acréscimo à interação ele- trostática. Estes resultados quando considerados à luz dos resultados dos Exemplos 1-3 indicam que a estrutura dos grupos hidrofóbicos nos segmen- tos hidrofóbicos do copoiímero em bloco não desempenha um papel impor- tante na eficiência do encapsulamento.
Exemplo 4 (Preparo de micelas para encapsulamento de albumina sérica bovina com FITC marcado) Após pesar precisamente 40 mg de PEG-PBLA 12-50(65) em
um frasco de vidro, 2 ml de diclorometano foram adicionados para dissolu- ção. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás nitrogênio, sendo secada ainda por aproximadamente 1 hora sob pres- são negativa. A esta foram adicionados 200 μ! de uma solução aquosa (20 mg/ml) de albumina sérica bovina com FITC marcado (SigmarAldrich Corp.) (pl: aproximadamente 5) e, em seguida, 3,8 ml de tampão citrato a 50 mM (pH 3,5) ou tampão fosfato a 20 mM (pH 6) foram adicionados gradualmente enquanto sob agitação suave a 4°C. Após agitação adicional durante a noite a 4°C, um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utilizado para sonicação por aproximadamente 10 segundos (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo) enquanto resfriada em gelo, tendo sido a mis- tura submetida à uItracentrifugação (30.000 rpm, 1 hora, 4°C, Rotor MLA- 130 da Beckman Coulter). A concentração de albumina sérica bovina com FITC marcado no sobrenadante foi analisada empregando um leitor de placa (PowerScan® HT, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) (comprimento de onda de excitação: 485 nm ± 20 nm, comprimento de onda de emissão: 528 nm ± 20 nm), e a eficiência do encapsulamento foi calculada pela seguinte fórmula:
(Teor protéico antes da ultracentrifugação
. . . /a/, teor protéico do sobrenadante) x100
Eficiência de encapsuiam ento (%) = ——-----—-—--—-=—
Teor protéico antes da ultracentrifugaçao
A eficiência do encapsulamento foi de 16% com preparo em pH 3,5, tendo sido de 7% com preparo em at pH 6. Os resultados indicam que a proteína foi encapsulada mais eficientemente pelo preparo das micelas sob condições em que o pH era diferente do ponto isoelétrico da proteína encap- sulada, do que quando preparadas próximo ao ponto isoelétrico, com base em interação eletrostática entre a proteína e PEG-PBLA 12-50(65).
Exemplo 5 (Preparo de micelas para encapsulamento de hemoglobina bovi- na)
Após pesar precisamente 20 mg de PEG-PBLA 12-50(65) em um frasco de vidro, 2 ml de diclorometano foram adicionados para dissolu- ção. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás nitrogênio e, em seguida, secada ainda por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta foram adicionados 100 μΙ de uma solução a- quosa (20 mg/ml) de hemoglobina bovina (Sigma-AIdrich Corp.) (pl: aproxi- madamente 7) e, em seguida, 1,9 ml de tampão fosfato a 20 mM (pH 6,0) ou tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4) foram adicionados gradualmente enquanto sob agitação suave a 4QC. Após agitação durante a noite a 4°C, um Biodis- ruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utilizado para sonicação por aproximadamente 10 segundos (intervalo de 1 segundo, ren- dimento: Baixo) enquanto resfriada em gelo, e a mistura foi submetida à fil- tração em gel (Sepharose® CL-4B, Sigma-AIdrich Corp., ~2φ χ 30 cm). A concentração de hemoglobina em cada fração recuperada (eluente: tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4), vazão: 1,0 ml/min, volume de fração: 1 ml) foi ana- lisada utilizando um leitor de placa (PowerScan® HT1 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.). A eficiência do encapsulamento foi calculada pela seguin- te fórmula:
,_,. .. . . . ..... (Teorprotéicoemfraçãodemicela)x100
Eficiência de encapsulamento (%) = ---—;--—-—--τ-*—ζ-
Teor proteico total em todas as frações
A eficiência do encapsulamento foi de 19% com preparo em pH 6,0, tendo sido de 10% com preparo em pH 7,4. Os resultados indicam que a proteína foi encapsulada mais eficientemente pelo preparo das micelas sob condições mais ácidas do que o ponto isoelétrico da proteína encapsulada, do que quando preparadas sob condições mais aicalinas do que o ponto i- soelétrico, com base em interação eletrostática entre a proteína e PEG- PBLA 12-50(65).
Exemplo 6 (Preparo micelas para encapsulamento de interferon-α humano recombinante)
Por um lado, após pesar precisamente 7,0 mg de PEG-PBLA 12- 50(65) em um frasco de vidro, 0,7 ml de diclorometano foram adicionados para dissolução. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás nitrogênio e foi secada ainda por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta foi adicionada uma solução de PBS com inter- feron-α humano recombinante (pl: aproximadamente 6,0) (IFN-α, PBL Bio- medical Laboratories) (0,2 mg/ml, 35 μΙ) e, em seguida, 200 μΙ de tampão MES a 0,1 M MES (pH 5,0) foram adicionados. A mistura foi misturada sua- vemente a 4°C até essencialmente dissolução total do polímero e, em segui- da, tampão MES a 20 mM (pH 5,0) foi adicionado até um volume total de 1,4 ml e a agitação prosseguiu durante a noite a 4°C. Quando concluída a agita- ção, a mistura foi submetida a uItracentrifugação (30.000 rpm, 1 hora, 4°C, Rotor MLA-130 da Beckman Coulter) e a concentração de IFN-α do sobre- nadante foi avaliada empregando um kit de ELISA (PBL Biomedical Labora- tories).
Por outro lado, após pesar precisamente 2,6 mg de PEG-PBLA 12-50(65) em um frasco de vidro, 0,26 ml de diclorometano foram adiciona- dos para dissolução. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás nitrogênio e foi secada ainda por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta, foi adicionada uma solução de PBS com interferon-α humano recombinante (0,2 mg/ml, 12,5 μΙ) igual à de antes e, em seguida, 100 μΙ tampão TAPS a 0,1 M (pH 8,0) foram adicionados. A mistura foi misturada suavemente a 4°C até essencialmente dissolução total do polímero e, em seguida, 400 μΙ de tampão TAPS a 20 mM (pH 8,0) foram adicionados e a agitação prosseguiu durante a noite a 4°C. Quando concluí- da a agitação, a mistura foi submetida a ultracentrifugação (30.000 rpm, 1 hora, 4°C, Rotor MLA-130 da Beckman Coulter) e a concentração de IFN-α do SObrenadante foi avaliada empregando um kit de ELISA (PBL Biomedical Laboratories). A eficiência do encapsulamento foi calculada pela fórmula a- baixo com base nos valores medidos obtidos de cada teste.
(Teor protéico no preparo teor protéico do
Eficiênciade encapsulamento(%) = sobrenadante)x100_
Teor protéico no preparo
A eficiência do encapsulamento foi de 100% com preparo em pH 5,0, tendo sido de 36% com preparo em pH 8,0. Os resultados indicam que a proteína foi encapsulada mais eficientemente pelo preparo das mícelas sob condições mais ácidas do que o ponto isoelétrico da proteína encapsulada, do que quando preparadas sob condições mais alcalinas do que o ponto i- soelétrico, com base em interação eletrostática entre a proteína e PEG- PBLA 12-50(65).
Exemplo 7 (Preparo de micelas para encapsulamento de papaína) Após pesar precisamente 20 mg de PEG-PBLA 12-40(65) em
um frasco de vidro, 2 ml de diclorometano foram adicionados para dissolu- ção. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás nitrogênio e, em seguida, secada ainda por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta foram adicionados 100 μΙ de uma solução a- quosa de papaína (Sigma-AIdrich Corp.) (pl: aproximadamente 8) (20 mg/ml) e, em seguida, 1,9 ml de tampão fosfato a 20 mM (pH 6,0) ou tampão TAPS a 20 mM (pH 8,0) foram adicionados gradualmente sob agitação suave a 4°C. Após agitação durante a noite a 4°C, um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utilizado para sonicação por aproxi- madamente 10 segundos (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo) en- quanto resfriada em gelo, e a mistura foi submetida à filtração em gel (Se- pharose® CL-4B, Sigma-AIdrich Corp., -2φ χ 30 cm). A concentração de pa- paína em cada fração recuperada (eluente: tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4), vazão: 1,0 mi/min, fração de volume: 1 ml) foi analisada com um Ensaio BCA para proteína (Pierce Corp.) A eficiência do encapsulamento foi calcu- lada pela seguinte fórmula: . . ,„,. (Teorprotéicoemíraçãodemicela)xlOO
Eficiência de encapsulamenio (%) = -------l^-
Teor protéico tota! em todas as frações
A eficiência do encapsulamenio foi de 27% com preparo em pH 6,0, sendo de 9% com preparo em pH 8,0. Os resultados indicam que a pro- teína pode ser encapsulada mais eficientemente pelo preparo de micelas sob condições em que o pH é diferente do ponto isoelétrico da proteína en- capsulada, do que quando preparadas próximo do ponto isoelétrico, com base em interação eletrostática entre a proteína e PEG-PBLA 12-40(65).
Além disso, os resultados dos exemplos descritos acima de- monstram que uma ampla gama de proteínas pode ser encapsulada eficien- temente em micelas poliméricas de acordo com a invenção. 2) Avaliação de taxa de liberação de proteína de micelas Exemplo 8 (Avaliação de liberação de IgG humana com FITC marcado en- capsulado em micelas)
O copolímero em bloco utilizado foi PEG-PBLA 12-50(65) ou PEG-POLA 12-40(50). Após pesar precisamente 20 mg de cada polímero em um frasco, 2 ml de diclorometano foram adicionados para dissolução. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás ni- trogênio e, em seguida, secada ainda por aproximadamente 1 hora sob pressão negativa. A esta foram adicionados 100 μΙ de imunoglobulina huma- na com FITC marcado (FITC-IgG) (Sigma-AIdrich Corp., 20 mg/ml) e, em seguida, 3,9 ml de tampão fosfato a 20 mM (pH 6,0) foram adicionados len- tamente sob agitação suave. Após agitação adicional durante a noite a 4°C, um Biodisruptor (Unidade de Aita Potência, produto da Nissei Corp.) foi utili- zado para sonicação por aproximadamente 10 segundos (intervalo de 1 se- gundo, rendimento: Baixo) enquanto resfriada em gelo, e a mistura foi sub- metida à uItracentrifugação (30.000 rpm, 4°C, 1 hora) para serem obtidas micelas. As micelas recuperadas foram suspensas em tampão fosfato a 20 mM (pH 6), adicionadas a soro bovino [concentração final do soro bovino: 50% (v/v)] e, em seguida, incubadas a 37°C. A fim de avaliar a liberação do FITC-IgG encapsulado, 1 ml de amostra foi submetido à filtração em gel (Sepharose® CL-4B, Sigma-AIdrich Corp., -2φ χ 30 cm) após um tempo de incubação predeterminado. A concentração de FITC-IgG em cada fração recuperada (eluente: tampão fosfato a 20 mM (pH 7,4), vazão: 1,0 ml/min, volume de fração: 1 ml) foi analisada empregando um leitor de placas (Po- werScan® HT1 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) (comprimento de on- da de excitação: 485 nm ± 20 nm, comprimento de onda de emissão: 528 nm ± 20 nm) e a taxa de liberação, calculada pela seguinte fórmula:
Teor protéico da fração de IgG humana
... j . _ . .„,. com FITCmarcado χ 100
Eficiência de encapsuiam ento (%) =-
Teor protéico de fração micelar recuperada por
filtração em gel aplicada imediatamente após
mistura com solução tampão
(A solução tampão foi tampão fosfato as 20 mM (pH 6).)
O ciclo de tempo da liberação é apresentado na Figura 1. Estes resultados indicam que a proteína encapsulada nas micelas exibiu liberação prolongada sem liberação inicial, mesmo na presença de soro. Dessa forma, foi demonstrado que a taxa de liberação era dependente da estrutura dos grupos hidrofóbicos. Sem estar restrito a qualquer teoria em particular, acre- dita-se que um fármaco macromolecular é mantido mais firmemente nos nú- cleos de micelas se a estrutura dos grupos hidrofóbicos introduzidos nos segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco, formador das micelas, é uma estrutura linear de grupos alquila em vez de estrutura em plano, como a de benzila, de modo que a liberação ocorre de maneira mais controlada. Exemplo 9 (Teste de administração intravenosa de interferon-a) O copolímero em bloco utilizado foi PEG-PBLA 12-50(65) ou
PEG-POLA 12-40(65). Após pesar precisamente 10 mg do polímero em um frasco, 1 ml de diclorometano foi adicionado para dissolução. A solução foi secada até transformar-se em filme sob uma corrente de gás nitrogênio e, em seguida, secada ainda por aproximadamente 3 horas sob pressão nega- tiva. A esta foi adicionada uma solução PBS de interferon-α humano recom- binante (IFN-α, PBL Biomedical Laboratories) (0,2 mg/ml, 46 μΙ) e, em se- guida, 200 μΙ de tampão MES a 0,2 M (pH 5,0) foram adicionados. A mistura foi agitada suavemente a 4°C até essencialmente dissolução total do políme- ro e, em seguida, tampão MES a 20 mM (pH 5,0) foi adicionado até o volu- me total de 2 ml e a agitação prosseguiu por todo um dia a 4°C. A amostra foi submetida à ultracentrifugação (30.000 rpm, 1 hora, 4°C, Rotor MI_A-130 da Beckman Coulter) e o INF-cc não-encapsulado foi removido ao mesmo tempo em que eram recuperadas as micelas precipitadas. As micelas foram suspensas em solução aquosa de glicose a 5% e fornecidas para o experi- mento seguinte com animais.
Ratos machos Wistar de seis semanas de vida foram divididos em grupos de 2 ratos cada, e solução em teste foi administrada através da veia do rabo em dose de 1 χ 106 lU/kg. 5 minutos e 1, 3, 6, 9 e 24 horas a- pós a administração, cerca de 0,2 ml de sangue foram coletados da veia cervical utilizando uma seringa revestida com heparina. O sangue foi centri- fugado imediatamente em 13.800 rpm, 4"C (EF-1300, ECO-Fuge™, Tomy Seiko Co., Ltd.) e o plasma foi colhido e armazenado a -30°C até ser anali- sado. A concentração plasmática de interferon-α foi determinada por um kit ELISA para interferon-α humano (PBL Biomedical Laboratories).
Os resultados são apresentados na Figura 2. O encapsulamento
de interferon-α em micelas poliméricas melhorou a retenção da concentra- ção plasmática. Os parâmetros farmacocinéticos, calculados de acordo com um modelo não-compartimental, são apresentados abaixo._
Parâmetros farmaco- cinéticos Solução de NaCI a 0,9% Micelas de PEG-POLA 12-40(65)s Micelas de PEG-PBLA 12-50(65) AUCm (% dose/ml h) 0,20 7,0 3,5 Tv2 (h) 0,11 10,4 1,3 Cl (ml/h/corpo) 491 14,4 28,9 MRTinl (h) 0,2 3,2 0,4 Vss (ml/corpo) 81 46 12
O encapsulamento em micelas aumentou a AUC em de 17 a 35
vezes. Esses resultados indicam que as micelas que encapsularam a proteí- na permaneceram na circulação sangüínea por tempo prolongado sem libe- ração inicial. Estes resultados mostram também que a taxa de liberação da proteína in vivo depende da estrutura do grupo hidrofóbico do copolímero em bloco, de modo similar aos resultados in vitro.
Exemplo 10 (Teste de administração intravenosa a ratos com Iisozima FITC marcada encapsulada em micelas)
1) Marcação de FITC da Iisozima
Após dissolver 100 mg de Iisozima (proveniente de clara de ovo)
(Sigma-AIdrich Corp.) em 2 ml de tampão de ácido bórico a 100 mM (pH 8,5), 170 μΙ de solução de 50 mg/ml de DMSO contendo FITC (PIERCE) fo- ram adicionados. Após agitação em temperatura ambiente por 1 hora, o FITC não reagido foi removido por filtração em gei (PD-10, produto da GE Healthcare Bioscience) (eluente: tampão fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,4). Após diálise subsequente em água a 4°C, a mistura foi purificada por filtra- ção adicionai em gel (Sepharose® CL-4B, Sigma-AIdrich Corp.) (eluente: tampão fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,4).
2) Preparo de micelas para encapsulamento de Iisozima FITC marcada e teste PK em ratos
Após pesar precisamente 40 mg do copolímero em bloco PEG- POLA 12-40(65) em um frasco de vidro, 4 mg de Iisozima FITC marcada (29,2 mg/ml, 137 μΙ) e, em seguida, 500 μΙ de tampão fosfato de sódio a 20 mM (pH 6,0) foram adicionados. Após agitação adicional durante a noite a 4°C, um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utilizado para sonicação por aproximadamente 10 segundos (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo) enquanto resfriada em gelo. A fração recupe- rada de micelas sob a forma de precipitado obtido por uitracentrifugação (80.000 rpm, 1 hora, 4°C, Rotor MLA-80 da Beckman Coulter) foi suspensa em tampão fosfato de sódio a 20 mM (pH 7,4)/5% de glicose e, em seguida, lavada pelo mesmo procedimento de uitracentrifugação, ressuspendida na mesma solução tampão para o teste seguinte de administração a ratos.
Ratos Wistar machos de seis semanas de vida foram divididos em grupos de 3 ratos cada, e a solução em teste foi administrada através da veia do rabo em dose de 10 mg/kg de Iisozima FITC marcada. 5 minutos e 1, 3, 6, 9 e 24 horas após a administração, cerca de 0,2 ml de sangue foram coletados da veia cervical utilizando uma seringa revestida com heparina. O sangue foi centrifugado imediatamente a 4°C (EF-1300, ECO-Fuge™, Tomy Seiko Co., Ltd.) e o plasma foi colhido e armazenado a -30°C até ser anali- sado. Uma solução de Iisozima FITC marcada (tampão fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,4/5% de glicose) foi testada também na mesma maneira. A con- centração plasmática do sangue foi medida por HPLC, empregando as se- guintes condições para o procedimento. Sistema: Waters Alliance System
Coluna: Tosoh TSK-gel Super SW3000 (4,6 φ χ 300 mm)(30°C) Fase líquida: tampão fosfato de sódio a 20 mM (pH 7,4) Vazão: 0,25 ml/min
Detecção: Fluorescência (Ex: 492 nm, Em: 520 nm) Volume de injeção: 10 μΙ
Os resultados são apresentados na Figura 3. A AUC aumentou aproximadamente 15 vezes para encapsulamento em micelas, comparado à administração de somente a solução. Estes resultados indicam que a proteí- na encapsulada nas micelas permanece na circulação sangüínea por tempo prolongado sem liberação inicial.
Exemplo 11 (Teste 2 de administração intravenosa com interferon-α encap- sulado em micelas) - - -
O copolímero em bloco utilizado foi polietilenoglicol-co-poliéster
dodecílico de ácido aspártico (a seguir denominado PEG-PDLA. Neste polí- mero, os resíduos de ácido aspártico sem ésteres dodecílico pertencem à fórmula geral (I), em que R5 é -O- e R6 é hidrogênio (o mesmo abaixo)), ou polietilenoglicol-co-poliéster hexadecílico de ácido aspártico (a seguir deno- minado PEG-PHLA. Os resíduos de ácido aspártico sem ésteres hexadecíli- co pertencem à mesma fórmula geral, em que R5 é -O- e R6 é hidrogênio (o mesmo abaixo nesta exposição)). Após pesar precisamente 200 mg de PEG-PDLA 12-40(65) ou de PEG-PHLA 12-40(65) em um frasco de vidro, 10 ml de tampão MES a 20 mM (pH 5,0) foram adicionados e a mistura agitada vigorosamente durante a noite a 4°C. A dispersão do polímero foi submetida a tratamento ultrassônico por aproximadamente 15 minutos (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo), utilizando um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) enquanto resfriada em gelo, para obten- ção de uma solução de micelas vazias com concentração de polímero de 20 mg/ml. Uma alíquota de 0,65 ml da solução de micelas vazias foi transferida para um microtubo (leda Chemicals Co., Ltd.) e, em seguida, 65 μΙ de uma solução PBS de interferon-α humano recombinante (IFN-α, PBL Biomedical Laboratories) e 60 μ) de tampão MES a 0,1 M (pH 5,0) foram adicionados e a mistura coletada cuidadosamente com pipeta e deixada a seguir em re- pouso a 4°C por 4 dias. Em seguida, foi lavada com solução de glicose a 6%, utilizando uma unidade de ultrafiltração [AMICON® ULTRA-4 pela Milli- pore (limite molecular: 100.000)] e concentrada para uso no experimento seguinte com animais.
Ratos Wistar machos de seis semanas de vida foram divididos em grupos de 3 ratos cada, e a solução em teste foi administrada através da veia do rabo em dose de 1 χ 106 lU/kg. 5 minutos e 1, 3, 6, 9 e 24 horas a- pós a administração, cerca de 0,2 ml de sangue foram coletados da veia cervical utilizando uma seringa revestida com heparina. O sangue foi centri- fugado imediatamente em 13.800 rpm, 4°C (EF-1300, ECO-Fuge™, Tomy Seiko Co., Ltd.) e o plasma foi colhido e armazenado a -30°C até ser anali- sado. A concentração plasmática de interferon-α foi determinada por um kit ELISA para interferon-α humano (PBL Biomedical Laboratories).
A Figura 4 apresenta o cicio de tempo da concentração plasmá- tica de interferon-α após administração de interferon-α encapsulado em mi- celas poliméricas. A AUC foi aumentada em 32 vezes quando foram utiliza- das micelas poliméricas de PEG-PDLA 12-40(65) e em 27 vezes quando foram utilizadas micelas poliméricas de PEG-PHLA 12-40(65), em compara- ção ao uso de apenas a solução.
Exemplo 12 (Teste 3 de administração intravenosa com interferon-α encap- sulado em micelas)
O copolímero em bloco utilizado foi polietilenoglicol-co-poliéster octílico de ácido glutâmíco (a seguir denominado PEG-POLG. Neste políme- ro, os resíduos de ácido glutãmico sem ésteres octílico pertencem à fórmula geral (I), em que R5 é -O- e R6 é hidrogênio (o mesmo abaixo nesta exposi- ção)). Após pesar precisamente 150 mg de PEG-POLG 12-40(65) em um frasco de vidro, 5 ml de tampão MES a 20 mM (pH 5,0) foram adicionados e a mistura agitada vigorosamente durante a noite a 4°C. A dispersão do polí- mero foi submetida a tratamento ultrassônico por aproximadamente 15 minu- tos (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo), utilizando um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) enquanto resfriada em gelo, para obter uma solução de micelas vazias com concentração de polí- mero de 30 mg/ml. Uma alíquota de 0,6 ml da solução de micelas vazias foi transferida para um criotubo (leda Chemicals Co., Ltd.) e, em seguida, 90 μΙ de uma solução de interferon-α humano recombinante (IFN-α, PBL Biomedi- cal Laboratories) e 110 μΙ de tampão MES a 0,1 M (pH 5,0) foram adiciona- dos e a mistura cuidadosamente coletada com pipeta e deixada em repouso a 4°C por 3 dias. Uma alíquota de 400 μ! da mesma foi injetada em seguida em um microtubo, tampão MES a 20 mM (pH 5,0) adicionado até completar 500 μΙ e a mistura lavada com solução de glicose a 5% utilizando uma uni- dade de ultrafiitração [AMICONr ULTRA-4 pela Millipore (limite molecular: 100.000)] e concentrada para uso no experimento seguinte com animais.
Ratos Wistar machos de seis semanas de vida foram divididos em grupos de 2 ratos cada, e a solução em teste foi administrada através da veia do rabo em dose de 1 χ 106 lU/kg. 5 minutos e 1, 3, 6, 9 e 24 horas a- pós a administração, cerca de 0,2 mi de sangue Ioram coletados da veia cervical utilizando uma seringa revestida com heparina. O sangue foi centri- fugado imediatamente em 13.800 rpm, 4°C (EF-1300, ECO-Fuge™, Tomy Seiko Co., Ltd.) e o plasma foi colhido e armazenado a -30°C até ser anali- sado. A concentração plasmática de interferon-α foi determinada por um kit ELISA para interferon-α humano (PBL Biomedical Laboratories).
A Figura 5 apresenta o ciclo de tempo de concentração plasmá- tica de interferon-α após administração de interferon-α encapsulado em mi- celas poliméricas. O encapsulamento em micelas aumentou a AUC em 57 vezes.
Exemplo 13 (Preparo de micelas para encapsulamento de melitina)
O copolímero em bloco utilizado foi PEG-POLA 12-40(65) ou PEG-POLG 12-40(65). Após pesar precisamente 150 mg de polímero em um frasco de vidro, 5 ml de tampão fosfato de sódio a 20 mM (pH 7,4) foram adicionados e a mistura agitada vigorosamente a 4°C. A dispersão do polí- mero foi submetida a tratamento uitrassónico por aproximadamente 15 minu- tos (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo), utilizando um Biodisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) enquanto resfriada em gelo, para obter uma solução de micelas vazias com concentração de polí- mero de 30 mg/ml. Em seguida à adição de tampão fosfato de sódio a 20 mM (pH 7,4) para ajuste para 10 mg/ml (1 mL), o polipeptídeo básico meliti- na (Sigma-AIdrich Corp.) (1 mg) foi adicionado e a mistura deixada em re- pouso durante a noite a 4°C, sendo submetida a seguir à filtração em gel (Sepharose® CL-4B, GE Healthcare Bioscience, 1φ χ 30 cm). A concentra- ção de melitina em cada fração recuperada (eluente: tampão fosfato de só- dio a 20 mM (pH 7,4), vazão: 1,0 ml/min, volume de fração: 1 ml) foi analisa- da utilizando um Ensaio BCA para Proteína (Pierce Corp.). A eficiência do encapsulamento foi calculada pela seguinte fórmula:
Eficiência de encapsulamento (%) = (Teor protéico em fração de micela) χ 100 Teor protéico total em todas as frações
A eficiência do encapsulamento foi de 71% para PEG-POLA 12- 40(65) e de 48% para PEG-POLG 12-40(65). Os resultados indicam que po- lipeptídeos com pesos moleculares de aproximadamente 2.800 podem ser encapsulados eficientemente.
Exemplo 14 (Teste 1 de administração intravenosa em ratos de fator estimu- Iador de colônias de granulócitos humano encapsulado em micelas)
O copolímero em bloco utilizado foi polietiIenoglicol-co- polioctilamida de ácido aspártico (a seguir denominado PEG-PONLA. Este polímero compreende 50% de resíduo de aminoácido da fórmula geral (I), em que R5 é -NH- e R6 é um grupo octila, e 50% de resíduo de aminoácido em que R5 é -NH- e Re é um grupo octila substituído com um grupo amino (o mesmo abaixo nesta exposição)). Após pesar precisamente 30 mg de PEG- PONLA 12-40(50) em um frasco de vidro, 2 ml de tampão fosfato a 20 mM contendo 5% de glicose (pH 7,4) foram adicionados e, em seguida, um Bio- disruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utilizado para sonicação por aproximadamente 10 minutes (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo) enquanto resfriados em gelo, para preparar micelas vazi- as. Fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (G- CSF1 Green Cross) (pl: aproximadamente 6,0) (300 iig/ml, 1 ml) foi adiciona- do e a mistura deixada em repouso por todo um dia a 4°C. O G-CSF não- encapsulado foi removido em seguida, utilizando uma unidade de ultrafiltra- ção [AMICON® ULTRA-4 pela Millipore (limite molecular: 100.000)] para pre- parar micelas para o experimento seguinte com animais.
em grupos de 3 ratos cada (6 ratos por grupo para a solução isolada) e a solução em teste foi administrada através da veia do rabo em dose de 100 μg/kg da solução em teste. 5 minutos e 1, 3, 6, 9 e 24 horas após a adminis- tração, cerca de 0,2 ml de sangue foram coletados da veia cervical utilizando uma seringa revestida com heparina. A amostra foi centrifugada imediata- mente em 13.800 rpm, 4°C (EF-1300, ECO-Fuge™, Tomy Seiko Co., Ltd.) e o plasma foi colhido e armazenado a -30°C até ser analisado. Um kit ELISA para G-CSF Humano RayBion (RayBiotech Inc.) foi utilizado para ensaio de concentração plasmática.
râmetros farmacocinéticos, calculados de acordo com um modelo não- compartimentai, são apresentados na Tabela 2. O encapsulamento em mice- las aumentou a AUC em 3 vezes e prolongou a meia-vida em 2 vezes.
Tabela 2 Parâmetros farmacocinéticos para fator estimulador de colônias de granulócitos humano encapsuiado em micelas poliméricas ou fator estimula- dor de colônias de granulócitos humano em solução, após administração intravenosa para ratos._
Ratos Wistar machos de seis semanas de vida foram divididos
Os resultados do ensaio são apresentados na Figura 6, e os pa-
Parâmetros farmacocinéticos Solução
Micelas de PEG- PONLA 12-40(50)
AUCinf (% dose/ml-h) Tv2 (h)
7,4
2,6
22 4,1 Parâmetros farmacocinéticos Solução Micelas de PEG- PONLA 12-40(50) Cl (mLVh/corpo) 13 4,4 MRTinf (h) 1,9 2,8 Vss (ml/corpo) 25 13
Exemplo 15 (Teste 2 de administração intravenosa em ratos de fator estimu- Iador de colônias de granulócitos humano encapsulado em micelas)
O copolímero em bloco utilizado foi PEG-POLG. Após pesar precisamente 30 mg de PEG-POLG 12-40(65) em um frasco de vidro, 2 ml de tampão MES a 20 mM (pH 5,0) foram adicionados e, em seguida, um Bi- odisruptor (Unidade de Alta Potência, produto da Nissei Corp.) foi utilizado para sonicação por aproximadamente 10 minutos (intervalo de 1 segundo, rendimento: Baixo) enquanto resfriados em gelo, para preparar micelas vazi- as. Uma solução de G-CSF humano recombinante (Green Cross) (300 μς/ιηΙ, 1 ml) foi adicionada e a mistura deixada em repouso por um dia a 4°C. O G-CSF não-encapsulado foi removido em seguida utilizando uma unidade de uItrafiItração [AMICON® ULTRA-4 da Miliipore (limite molecular: 100.000)] e diluído com tampão fosfato a 20 mM contendo 5% de glicose (pH 7,4) para uso como micelas para um experimento com animais. As mice- Ias foram administradas por via intravenosa para os ratos em dose de 100 μg/ml de G-CSF, na mesma maneira conforme no Exemplo 12. O sangue foi coletado e a concentração, analisada na mesma maneira.
Os resultados são apresentados na Figura 7 e os parâmetros farmacocinéticos calculados de acordo com um modelo não-com parti mental, na Tabela 3. O encapsulamento em micelas poliméricas de granulócitos hu- mano aumentou a AUC em 15 vezes e prolongou a meia-vida em 5 vezes, comparado com a solução, e a concentração plasmática pode ainda ser de- tectada até mesmo 120 horas após a administração. Estes resultados indi- cam que a proteína encapsulada em micelas permanece na circulação san- guínea por tempo prolongado sem liberação inicial.
Tabela 3 Parâmetros farmacocinéticos para fator estimulador de colônias de granulócitos humano encapsulado em micelas poliméricas ou fator estimula- dor de colônias de granulócitos humano em solução após administração in- travenosa para ratos._
Parâmetros farmacocinéticos Solução Micelas de PEG- POLG 12-40(65) AUCini (% dose/mlh) 7,4 111 T,« (h) 2,6 14 Cl (mL/h/corpo) 13 0,90 MRTm (h) 1,9 12 Vss (ml/corpo) 25 11
A explicação acima da invenção pretende meramente servir para
concretização ilustrativa. Deverá ser entendido que várias modificações à mesma poderão ser implementadas como aquelas incluídas no conceito e escopo da invenção. As reivindicações destinam-se, por conseguinte, a se- rem interpretadas de modo a abranger todas estas modificações.
Claims (8)
1. Composição de micela polimérica de encapsulamento de poli- peptídeos ou proteínas, compreendendo um copotímero em bloco com seg- mentos hidrofílicos, compostos por polietilenoglicol, e segmentos hidrofóbi- cos, compostos por poliaminoácido selecionado do grupo constituído por aminoácidos ácidos, derivados hidrofóbicos destes e por misturas dos referi- dos aminoácidos ácidos e os referidos derivados hidrofóbicos.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os de- rivados hidrofóbicos dos aminoácidos ácidos são ésteres alquila de aminoá- cido ácido ou alquilamidas de aminoácido ácido.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os a- minoácidos ácidos são ácido aspártico e ácido giutâmico.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o copo- límero em bloco possui a fórmula (I) ou (li) seguinte: R1-(OCHt CH2^T— L1-(COCHNHh-(COR7 CHNHh-R2 <formula>formula see original document page 44</formula> em que Ri e Rs representam, cada um independentemente, hidrogênio ou grupo alquila pequeno, seja não-substítuído ou substituído com um grupo funcional opcional de proteção, Rg representa hidrogênio, um grupo C1-C29 carbonila alifático ou grupo arilcarbonila, saturado ou não-saturado, R4 re- presenta um grupo hidroxila, um grupo Ci-C30 óxi ou aril-baixo alquilóxi alifá- tico, saturado ou não-saturado, R5 representa -0- ou -NH-, R6 representa hidrogênio, fenila, -(CH2)<r fenila, C4-C16 alquila, seja não-substituído ou substituído com grupo amino ou grupo carboxila, ou benzila, R7 representa metileno, η representa um número inteiro de 10-2500, χ representa um nú- mero inteiro de 10-300, com a ressalva de que se m estiver presente, as u- nidades de (COCHNH) e as de (COR7HNH) serão aleatórias, R6 poderá ser selecionado para cada unidade de aminoácido, em um copolímero em bloco e estará aleatoriamente presente, porém hidrogênio, como R6, constituirá menos de 60% do número tal de R6, y representa o número íntegro 1 ou 2, Li representa um grupo de ligação, selecionado do grupo constituído por - NH-, -O-, -O-Z-NH-, -CO-, CH2-, -O-Z-S-Z- e -OCO-Z-NH-, onde cada Z re- presenta independentemente um grupo CrC6 alquileno e L2 representa um grupo de ligação, selecionado do grupo constituído por -OCO-Z-CO- e - NHCO-Z-CO-, onde Z é um grupo CrC6 alquileno.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que a taxa de esterificação ou amidação de poliaminoácidos da cadeia lateral do copo- límero em bloco é de 40-100%.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que o ponto isoelétrico (pt) da proteína ou polipeptídeo é 3 - 11,5.
7. Método de preparo de composição de miceia polimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada por compreender uma etapa de mistura do copolímero em bloco com a proteína ou polipeptídeo, e ajuste do pH da mistura para um pH diferente do ponto isoelétrico (pl) da proteína ou polipeptídeo para permitir o encapsulamento da proteína ou polipeptídeo na região central hidrofóbica das micelas com- postas pelo copolímero em bloco, em que a relação entre o pl da proteína ou do polipeptídeo, o ponto isoelétri- co (pl1) do aminoácido ácido e/ou de seus derivados, presentes nos segmen- tos hidrofóbicos do copolímero em bloco, e o pH diferente daquele do pl é a seguinte: <formula>formula see original document page 46</formula> para que os segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco exibam carga negativa no pH, enquanto que a proteína ou poiipeptideo exibem carga posi- tiva, ou esta relação é: <formula>formula see original document page 46</formula> para que os segmentos hidrofóbicos do copolímero em bloco exibam carga positiva no pH, enquanto que a proteína ou poiipeptideo exibem carga nega- tiva.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o pH possui uma diferença de, pelo menos, 1 do pl da proteína ou do poiipeptideo.
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