BRPI0714871A2 - anticorpo antagonista para o tratamento de cÂncer - Google Patents

anticorpo antagonista para o tratamento de cÂncer Download PDF

Info

Publication number
BRPI0714871A2
BRPI0714871A2 BRPI0714871-2A BRPI0714871A BRPI0714871A2 BR PI0714871 A2 BRPI0714871 A2 BR PI0714871A2 BR PI0714871 A BRPI0714871 A BR PI0714871A BR PI0714871 A2 BRPI0714871 A2 BR PI0714871A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
epitope binding
binding fragment
cancer
seq
Prior art date
Application number
BRPI0714871-2A
Other languages
English (en)
Inventor
Blanc Véronique
Fromond Claudia
Parker Fabienne
Han Jiawen
Tavares Daniel
Zhang Chonghui
Li Min
Zhou Xiao-Mai
Streuli Michel
Original Assignee
Sanofi-Aventis
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37635710&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0714871(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sanofi-Aventis filed Critical Sanofi-Aventis
Publication of BRPI0714871A2 publication Critical patent/BRPI0714871A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

ANTICORPO ANTAGONISTA PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER. A presente invenção refere-se a nticorpos, anticorpos humanizados, anticorpos ressurgido, fragmentos de anticorpo, anticorpos derivados, e conjugados dos mesmos com agentes citotóxicos, que especificamente ligam-se a, e inibem a classe A de receptores de Eph, antagonizam os efeitos de fatores de crescimento sobre o crescimento e sobrevivência de células tumorosas, e que têm atividade agonística mínima ou são preferencialmente destituídos de atividade agonista. Os ditos anticorpos e fragmentos destes podem ser usados no tratamento de tumores que expressam níveis elevados da classe A de receptores de Eph, tais como cãncer de mama, câncer do cólon, câncer pulmonar, carcinoma ovariano, sarcoma sinovial e câncer pancreático, e os ditos anticorpos derivados podem ser usados no diagnóstico e imageamento de tumores que expressam níveis elevados da classe A de receptores de Eph. Também fornecidos são conjugados citotóxicos compreendendo um agente de ligação de célula e um agente citotóxico, composições terapêuticas compreendendo o conjugado, métodos para usar os conjugados na inibição do crescimento celular e no tratamento de doença, e um kit compreendendo o conjugado citotóxico são descritos são todos modalidades da invenção. Em particular, o agente de ligação de célula é um anticorpo monoclonal, e fragmentos de ligação de epítopo destes, que reconhece e liga a classe A de receptores de Eph.

Description

10
15
20
25
30
Relatorio Descritivo da Patente de Invengao para "ANTICORPO ANTAGONISTA PARA O TRATAMENTO DE CANCER".
CAMPO DA INVENQAO
A presente invengao fornece novos anticorpos monoclonais anti- Eph de murino ou fragmentos destes, e versoes humanizadas ou ressurgi- das destes. Mais especificamente, a invengao refere-se a novos anticorpos monoclonais ou fragmentos destes, e vers5es humanizadas ou ressurgidas destes, que interagem com a familia do receptor de EphA e agem como an- tagonistas. Mais particularmente, a invengao refere-se a anticorpos do re- ceptor anti-EphA2 que inibem as fung5es celulares do receptor de EphA2. Ainda mais particularmente, a invengao refere-se a anticorpos do receptor anti-EphA2 que antagonizam ο crescimento e sobrevivencia de celulas tumo- rosas e que sao destituidas de atividade agonista.
A presente invengao e dirigida ainda a conjugados citotoxicos compreendendo um agente de Iigagao de celula e um agente citotoxico, composigoes terapeuticas compreendendo ο conjugado, metodos para usar os conjugados na inibigao de crescimento celular e no tratamento de doen- ？a. e um kit compreendendo ο conjugado citotoxico. Em particular, ο agente de Iigagao de celula e um anticorpo monoclonal, ou fragment。de Iigagao de epitopo deste, e uma versao humanizada ou ressurgida deste que reconhe- ce e Iiga a familia de EphA dos receptores. ANTECEDENTES DA INVENQAO
Tirosina cinases do receptor desempenham um papel diverso no crescimento e diferenciagao celulares durante respostas fisiologicas normais e na transformagao oncogenica e progressao do tumor. Receptores de Eph sao uma unica familia de tirosina cinases do receptor (RTK), a maior no ge- noma, consistindo em pelo menos 16 receptores que interagem com nove Iigandos de efrina Iigados a membrana (Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6: 462-475). Eles podem ser divididos ainda em dois grupos, classe A e B, com base na homologia de sequencia e afinidade de Iigagao (Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6: 462- 475). Receptores de Eph da classe A interagem com Iigantes miiltiplos da familia de efrina-A, um grupo de proteinas de membrana Iigadas a glicosil- fosfatidilinositol (GPI)1 enquanto os receptores de Eph da classe B ligam-se a Iigantes de efrina-B, uma familia de proteinas de transmembrana. A Iiga- ？ao de receptores de Eph aos seus Iigantes induz a aglomeragao do recep- tor, ativagao da atividade de cinase, e trans-fosforilagao subsequente dos dominios citoplasmaticos nos residuos de tirosina, criando sitios de encur- tamento para varias proteinas de sinalizagao (Kullander, K. e Klein, R., 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 3: 475-486; Noren1 N. K. e Pasquale1 E. B., 2004, Cell signal., 16: 655-666). Cancer e uma doenga caracterizada por proliferagao descontro-
lada，que resulta da transdugao de sinal aberrante. As formas mais perigo- sas de cancer sao celulas malignas que tern a capacidade destas para di- fundir, por crescimento dire to em tecido adjacente atraves de invasao, ou por implantagao em sitios distantes por metastase. Celulas metastaticas adquiri- ram a capacidade para escapar do tumor primario, deslocar para sitios dis- tantes atraves da corrente sanguinea ou sistema linfatico, e colonizar micro- ambientes distantes e estranhos.
Agora esta claro que as moleculas de Eph tambem tern um pa- pel em estados de doenga tais como cancer. Em particular, a superexpres- sao do receptor de EphA2 foi reIatada em canceres do ovario, mama, prosta- ta, pulmao, colon, esofago, celula renal, cervix, e melanoma. EphA2 foi su- gerido ser um regulador positivo do crescimento e sobrevivencia celulares em celulas malignas (Landen, C. N. etal., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187). Um papel para EphA2 na metastase tambem foi descrito, visto que a superexpressao de EphA2 sozinha e suficiente para transformar celulas epiteliais mamarias em um fenotipo maligno (Zelinski et al., 2001, Cancer Res., 61: 2301-2306), e aumenta a metastase espontanea a sitios distantes (Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187). Alem disso, a evidencia crescente sugere que EphA2 esta en- volvido na angiogenese do tumor (Ogawa et al., 2000, Oncogene, 19: 6043- 6052; Cheng et al. 2002, Mol. Cancer Res., 1:2-11; Cheng et al., 2003, Ne-
oplasia, 5 (5): 445-456; Dobrzanski et al., 2004, Cancer Res., 64: 910-919). A fosforilagao de EphA2 mostrou estar Iigada a sua abundancia. EphA2 fosforilado com tirosina e rapidamente incorporado e destinado para a degradagao, ao passo que EphA2 nao fosforilado demonstra mudanga re- duzida e portanto acumula-se na superficie da celula. E correntemente con- siderado que este tipo de modelo pode contribuir para a alta frequencia da superexpressao de EphA2 no cancer (Landen, C. N. et al., 2005’ Expert. O- pin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187). Entretanto, a realidade pode ser mais complexa, visto que dados recentes parecem indicar um papel para fungoes dependentes e independentes de cinase de EphA2 na progressao do tumor (Fang W. B., 2005，Oncogene, 24: 7859-7868).
Anticorpos agonisticos foram desenvolvidos que promovem a fosforilagao e incorporagao de tirosina de EphA2, basicamente resultando na •nibigao do crescimento de celula tumorosa (Dodge-Zantek et al., 1999, Cell Growth & Differ., 10: 629-638; WO 01/12172, WO 03/094859，WO 2004/014292’ WO 2004/101764, WO 2006/023403, WO 2006/047637，WO 2007/030642). Estes anticorpos sao dirigidos contra ο dominio extracelular de EphA2. Visto que estes anticorpos agonistas nao inibem mas preferivel- mente estimulam a fosforilagao do receptor de EphA2 e sinais a jusante, es_ tes anticorpos podem nao ser eficazes para tumores que tiram vantagem da atividade de cinase de EphA2. Por outro lado, ο uso de agentes antagonisti- cos, incluindo anticorpos, foi proposto (WO 2004/092343), mas nenhum anti- corpo antagonistico real foi descrito nesta. Alem disso, tais anticorpos foram propostos estimular, ao inves de inibir, a proliferagao celular. O Pedido WO 2006/084226 descreve anticorpos que nunca aumentam nem diminuem a atividade de cinase de EphA2 mas sao capazes de impedir a proliferagao de celula tumorosa. Entretanto, nao existe nenhuma indicag;ao neste de que estes anticorpos impedem a Iigagao de efrinaAI ao receptor e inibem a fos- forila?ao de EphA2 induzida por efrinaAI. Preferivelmente1 eles podem afe- tar a proliferagao de celula tumorosa atraves de um mecanismo totalmente diferente, por exemplo, impedindo-se a aglomeragao do receptor a seguir da Iigagao de efrinaAI. A pessoa versada assim nao teria concluido que estes anticorpos sao antagonistas, mas, preferivelmente, que seu mecanismo de agao e incerto. Portanto1 existe uma necessidade para novos, anticorpos anti- EphA2 antagonisticos, que ligam-se aos dominios extracelulares do receptor de EphA2, inibem sua ativagao pela efrina A1 do Iigando e inibem cresci- mento de celula tumorosa dependente de cinase de EphA2. Tais anticorpos antagonisticos devem ser uteis para ο tratamento de cancer. sumArio da invenqao
Consequentemente1 e um objetivo da invengao fornecer agentes que especificamente ligam-se a membros da familia do receptor de Eph da classe A, tais como EphA2, e inibem a atividade celular do receptor antago- nizando-se ο receptor. Assim, a presente invengao inclui anticorpos ou frag- mentos destes que reconhecem ο receptor de EphA2, preferivelmente hu- manos, e funcionam como antagonistas do dito receptor.
O receptor de EphA2 tern um papel no desenvolvimento e no crescimento de tumores, e tambem foi envolvido na metastase. Em algumas modalidades, os anticorpos da invengao sao capazes de inibir ο crescimento de uma celula cancerosa. Em algumas outras modalidades, os anticorpos da invengao sao capazes de impedir a migragao de celulas cancerosas metas- taticas. Em modalidades preferidas, a celula cancerosa e uma celula de um cancer selecionado do grupo consistindo em um cancer de mama, cancer do colon, cancer endometrial, carcinoma ovariano, osteossarcoma, cancer cer- vical, cancer de prostata, cancer pulmonar, carcinoma sinovial cancer pan- creatico, um sarcoma, um glioma, cancer de cabega e pescogo, cancer gas- trico, cancer hepatico, e outros carcinomas. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invengao sao capazes de inibir a angiogenese.
Ao passo que os anticorpos anti-EphA2 descritos na tecnica an- terior foram principalmente agonistas (por exemplo, WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/101764, WO 2006/023403’ WO 2006/047637，WO 2007/030642), esta invengao abrange anticorpos que reconhecem ο dito re- ceptor que tern atividade agonistica minima, ou, preferencialmente, que sao destituidos de qualquer atividade agonista com respeito ao receptor. Em
uma modalidade preferida, os anticorpos da invengao nao estimulam a fosfo- rilagao de tirosina de EphA2.
Os anticorpos da invengao sao capazes de inibir a Iigagao de um ligante’ preferivelmente efrina A1 ’ ao receptor de EphA2. Em algumas moda- lidades，eles sao capazes de inibir a fosforilagao de tirosina de EphA2. Em uma outra modalidade, a fosforilagao de tirosina de EphA2 e inibida pelos anticorpos da invengao mesmo na presenga de efrinaAI. Em algumas moda- lidades, os anticorpos da invengao podem bloquear a sinalizagao mediada por EphA2; em particular, eles sao capazes de inibir a fosforilagao depen- dente de EphA2 de Akt. Esta invengao tambem fornece anticorpos que Iigam ο receptor
de EphA2 com uma Kd de 0,3 χ 10"9 M ou menor.
Anticorpos da invengao podem ser policlonais ou monoclonais. Fragmentos de Iigagao de epitopo tais como fragmentos Fab, Fab', F(Sb1)2, ou Fv sao incluidos dentro do escopo desta invengao. Preferidos sao anti- corpos anti-EphA2 monoclonais. Em uma modalidade mais preferida, sao fornecidos anticorpos de murino selecionados de 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1; e EphA2-N2, que sao completamente caracterizados aqui com respeito as sequencias de aminoacido de ambas as suas regioes variaveis de cadeia Ieve e pesada, as sequencias de cDNA dos genes para as regides variaveis de cadeia Ieve e pesada, a identificagao de suas CDRs (regioes determinantes de compiementaridade), a identificagao de seus aminoacidos superficiais, e meios para sua expressao na forma recombinante. Os anti- corpos monoclonais anti-EphA2 de murino que produzem hibridoma 37.3D7, 37.1 F5, e 53.2H11, e EphA2-N1 e EphA2-N2 foram depositados sob ο Bu- dapest Treaty em 16 de Junho de 2006 e em 3 de Maio de 2007, respecti- vamente, na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209’ USA, sob os niimeros de acesso PTA-7660, PTA-7661，PTA-7662, PTA-8407, e PTA-8408, respectivamente.
A presente invengao inclui ο anticorpo monoclonal anti-EphA2de murino selecionado de 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1，e EphA2-N2, e versdes ressurgidas ou humanizadas dos anticorpos 37.3D7, 37.1 F5,
53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2 em que residuos expostos na superficie das estruturas de regiao variavel dos anticorpos, ou seus fragmentos de Ii- 9a?ao de epitopo, sao substituidos tanto em cadeias Ieves quanto pesadas para assemelhar-se mais estritamente as superficies de anticorpo humano conhecidas. Os anticorpos humanizados e fragmentos de Iigagao de epitopo destes da presente invengao tern propriedades melhoradas em que eles sao menos imunogenicos (ou completamente nao imunogenicos) do que vers5es de murino em pacientes humanos aos quais eles sao administrados. Assim, as diferentes versoes de anticorpos humanizados 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1; e EphA2-N2 e fragmentos de Iigagao de epitopo destes da pre- sente invengao especificamente reconhecem ο receptor de EphA2 embora nao sendo imunogenicos a um ser humano.
As versoes humanizadas dos anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2 da presente invengao sao completamente caracterizadas aqui com respeito a suas sequencias de aminoacido respec- tivas de ambas as regi5es variaveis de cadeia Ieve e pesada, as sequencias de DNA dos genes para as regides variaveis de cadeia Ieve e pesada, a i- dentificagao das regimes determinantes de complementaridade (CDRs), a identificagao de seus residuos de aminoacido de superficie de estrutura de regiao variavel, e descrigao de um meio para sua expressao na forma re- combinante.
Esta invengao tambem considera ο uso de conjugados entre conjugados citotoxicos compreendendo (1) um agente de Iigagao de celula que reconhece e Iiga ο receptor de EphA, tal como, receptor de EphA2, e (2) um agente citotoxico. Nos conjugados citotoxicos, ο agente de Iigagao de celula tern uma afinidade alta para ο receptor de EphA (por exemplo, recep- tor de EphA2) e ο agente citotoxico tem um grau alto de citotoxicidade para celulas que expressam ο receptor de EphA1 tal que os conjugados citotoxi- cos da presente invengao formam agentes exterminadores eficazes.
Em uma modalidade preferida, ο agente de Iigagao de celula e um anticorpo anti-EphA2 (por exemplo, 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2- N1, ou EphA2-N2) ou um fragmento de Iigagao de epitopo deste, mais prefe-
rivelmente um anticorpo anti-EphA2 humanizado (por exemplo, 37.3D7, 10
15
37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, ou EphA2-N2) ou um fragment。de Iigagao de epitopo deste, em que um agente citotoxico e covalentemente Iigado1 dire- tamente ou por intermedio de um Iigante clivavel ou nao clivavel, ao anticor- po ou fragmento de Iigagao de epitopo deste. Em modalidades mais preferi- das, ο agente de Iigagao de celula sao os anticorpos humanizados 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1; e EphA2-N2 ou um fragmento de Iigagao de epitopo deste, e ο agente citotoxico e um taxol, um maitansinoide, um deri- vado de tomaimicina, um derivado de leptomicina, CC-1065 ou um analogo de CC-1065.
Em modalidades preferidas da invengao, ο agente de Iigagao de celula e ο anticorpo humanizado anti-EphA2 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, E- phA2-N1, ou EphA2-N2 e ο agente citotoxico e um composto de maitansina, tal como DM1 ou DM4.
A presente invengao tambem abrange ο uso de fragmentos de anticorpos anti-EphA2 que mantem a capacidade para Iigar ο receptor de EphA2. Em um outro aspect。da invengao, ο uso de equivalentes funcionais de anticorpos anti-EphA2 e considerado.
A presente invengao tambem inclui um metodo para inibir ο crescimento de uma celula que expressa ο receptor de EphA2. Em modali- dades preferidas, ο metodo para inibir ο crescimento da celula que expressa ο receptor de EphA2 ocorre in vivo e resulta na morte da celula, embora a- plicagoes in vitro e ex vivo tambem sejam incluidas.
A presente invengao tambem fornece uma composigao terapeu- tica compreendendo um anticorpo anti-EphA2 ou um agente citotoxico con- jugado a anticorpo anti-EphA2, e um portador ou excipientes farmaceutica- mente aceitaveis. Em algumas modalidades, a composigao terapeutica com- preende um segundo agente terapeutico. Este segundo agente terapeutico pode ser escolhido do grupo compreendendo os antagonistas do fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento de hepatocito (HGF), fator tecidual (TF)1 proteina C, proteina S, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), ou receptor de HER2.
A presente invengao inclui ainda um metodo de tratar um pacien- te tendo cancer usando a composigao terapeutica. Em algumas modalida- des, ο cancer e um cancer metastatico. Em particular, a celula cancerosa e uma celula de um cancer selecionado do grupo consistindo em cancer de mama, cancer do colon, cancer endometrial, carcinoma ovariano, osteossar- coma, cancer cervical, cancer de prostata, cancer pulmonar, carcinoma si- novial, cancer pancreatico, um sarcoma, um glioma, cancer de cabega e pescogo, cancer gastrico, cancer hepatico, e outros carcinomas. Em modali- dades preferidas, ο conjugado citotoxico compreende um anticorpo anti- EphA2 e um agente citotoxico. Em modalidades mais preferidas, ο conjuga- do citotoxico compreende um conjugado de anticorpo humanizado 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2-DM1, anticorpo humanizado 37.3D7’ 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2-DM4, um conjugado de anticorpo humanizado 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2- taxano, ou um conjugado de derivado de anticorpo humanizado 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2-tomaimicina, e ο conjugado e ad- ministrado junto com um portador ou excipie门tes farmaceuticamente aceita- veis.
Em um outro aspecto da invengao, os anticorpos anti-EphA2 sao usados para detectar a proteina de EphA2 em uma amostra biologica. Em uma modalidade preferida, os ditos anticorpos sao usados para determinar ηiveis de EphA2 em um tecido tumoroso.
A presente invengao tambem inclui um kit compreendendo um anticorpo anti-EphA2 ou um agente citotoxico conjugado ao anticorpo anti- EphA2 e instru?5es para ο uso. Em modalidades preferidas, os anticorpos anti-EphA2 sao os anticorpos humanizados 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, E- phA2-N1, e EphA2-N2, ο agente citotoxico e um composto de maitansina, tal como DM1 ou DM4, um taxano, um derivado de leptomicina, ou um derivado de tomaimicina, e as instrug5es sao para usar os conjugados no tratamento de um paciente tendo cancer. O kit tambem pode incluir componentes ne- cessarios para a preparagao de uma formulagao farmaceuticamente aceita- vel, tal como um diluente se ο conjugado estiver em um estado Iiofilizado ou forma concentrada, e para a administragao da formulagao. A menos que de outro modo estabelecido, todas as referencias e patentee citadas aqui sao incorporadas por referencia. BREVE DESCRIQAO DAS FIGURAS
A Fig. 1 mostra a analise da Iigagao especifica de anticorpos anti-EphA2 a celulas que superexpressam EphA2 humano (celulas 300- 19/hu-EphA2) por analise de FACS. A Fig. 1A mostra os dados para ο anti- corpo 37.3D7, a Fig. 1B para ο anticorpo 37.1 F5, e a Fig. 1C para ο anticor- po 53.2H11, respectivamente.
A Fig. 2 mostra a Iigagao especifica de anticorpo 37.3D7 purifi- cado a celulas de cancer pancreatico humano BxPC3, celulas de cancer de mama humano MDA-MB-231, e celulas de cancer de colon humano HT-29. Histogramas de analise de FACS sao mostrados.
A Fig. 3 mostra curvas de Iigagao para os anticorpos 37.3D7 (Fig. 3A), 37.1 F5 (Fig. 3B), e 53.2H11 (Fig. 3C) estabelecidas com EphA2 humano que superexpressa celulas de murino 300-19 (300-19/hu-EphA2).
A Fig. 4 mostra a Iigagao especifica de anticorpos 37.3D7 e 53.2H11 purificados a celulas que superexpressam EphA2. Histogramas de analise de FACS sao mostrados. A Fig. 4A mostra os dados para celulas que superexpressam EphA2 de murino (300-19/mu-EphA2) e a Fig. 4B mos- tra os dados para celulas que superexpressam EphA2 de rato (300-19/rat- EphA2).
A Fig. 5A mostra a Iigagao especifica de anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, e 53.2H11 purificados a celulas epiteliais do rim de macaco VERO. Histogramas de analise de FACS sao mostrados.
A Fig. 5B mostra as curvas de Iigagao para os anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, e 53.2H11 estabelecidas com celulas epiteliais do rim de macaco VERO.
A Fig. 6 mostra a inibigao da Iigagao de efrinaAI biotinilada a celulas de cancer de mama humano MDAMB-231 mamarias por anticorpos 37.3D7, 37.1F5, Θ53.2Η11.
A Fig. 7A mostra a inibigao de fosforilagao de EphA2 estimulada
por efrinaAI em celulas MDA-MB-231 mamarias por anticorpos 37.3D7 e 37.1 F5.
A Fig. 7B mostra a inibigao de fosforiIagao de EphA2 estimulada por efrinaAI em celulas MDA-MB-231 mamarias por anticorpos 37.3D7 e 53.2H11.
A Fig. 7C mostra a inibigao de fosforiIagao de Akt estimulada por
efrinaAI em celulas CFPAC-1 pancreaticas por anticorpos 37.3D7 e 37.1 F5.
As Figs. 8A e B mostram a estimulagao da fosforilagao de E- phA2 por efrinaAI e a ausencia de estimulagao da fosforilagao de EphA2 pelos anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, e 53.2H11 em celulas MDA-MB-231 ma- marias.
As Figs. 9A a 9D mostram a inibigao de crescimento e sobrevi- vencia estimulados por soro de celulas HT-29 do colon (9A), celulas LoVo do colon (9B), celulas CFPAC-1 pancreaticas (9C) e celulas UACC-257 de me- lanoma (9D) por anticorpos 37.3D7 e 53.2H11. A Fig. 10A mostra a inibigao dependente de dose de crescimen-
to estimulado por soro de celulas BxPC3 pancreaticas por anticorpo 37.3D7.
A Fig. 10B mostra a inibigao dependente de dose de crescimen- to estimulado por soro de celulas LoVo do colon pelo anticorpo 53.2H11 ·
A Fig. 10C mostra a inibigao dependente de dose de crescimen- to estimulado por EGF de celulas LoVo do colon por anticorpo 53.2H11.
A Fig. 11A mostra a curva de Iigagao de anticorpo 37.3D7 a ce- lulas HUVEC.
A Fig. 11B mostra a curva de Iigagao de anticorpo 37.1 F5 a celu- las HUVEC.
A Fig. 12 mostra a inibigao de crescimento e sobrevivencia de
celula HUVEC estimulados por VEGF por anticorpo 37.3D7.
A Fig. 13 mostra a inibigao de fosforilagao de Akt induzida por VEGF por anticorpo 37.3D7 em celulas HUVEC.
A Fig. 14 mostra ο efeito do tratamento com anticorpo 37.3D7 sobre ο crescimento de xenoenxerto de cancer do colon HT-29 em camun- dongos. O efeito e comparado com aquele de um anticorpo anti-EGFR e um
anticorpo de IgGI de controle de nao Iigagao. A Fig. 15A mostra a inibigao do crescimento de celulas de tumor de prostata PC3 por hu37.3D7-SPDB-DM4.
A Fig. 15B mostra a inibigao do crescimento de celulas de tumor de prostata PC3 por hu53.2H11-SPDB-DM4.
A Fig. 16A mostra ο efeito do tratamento com hu37.3D7-SPDB- DM4 sobre ο crescimento de xenoenxerto de tumor de mama MDA-MB-231 em camundongos.
A Fig. 16B mostra ο efeito do tratamento com hu53.2H11-SPDB- DM4 sobre ο crescimento de xenoenxerto de tumor de mama MDA-MB-231 em camundongos.
DESCRIQAO DETALHADA DA INVENQAO
Novos agentes capazes de Iigar especificamente receptores de EphA e antagonizar os ditos receptores sao aqui fornecidos. Em particular, os presentes inventores descobriram novos anticorpos que especificamente ligam-se a receptores de EphA na superficie da celula. Embora anticorpos previamente conhecidos que especificamente Iigam ο receptor de EphA tambem ο ativassem mesmo na ausencia de seus ligantes, os anticorpos ou fragmentos da presente invengao sao preferencialmente destituidos de qual· quer atividade agonista. Por outro lado, eles tern a Cinica capacidade para inibir as fungdes celulares do receptor mesmo na presenga de seus ligantes, uma caracteristica que e totalmente ausente dos anticorpos de Iigagao de EphA2 previamente conhecidos. Alem disso, os anticorpos antagonisticos e fragmentos de anticorpo da presente invengao inibem ο crescimento e/ou a migragao de celulas tumorosas humanas, e/ou angiogenese, tres proprieda- des totalmente imprevistas em vista da tecnica anterior (Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187; WO 01/12172; WO 2004/014292; WO 2004/092343).
Como usado aqui, ο termo "receptor de Eph" refere-se a uma tirosina cinase que pertence a familia de receptores de Eph (revisado em Pasquale, E. B. et al·, 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6, 462-475). "Familia do receptor de Eph da classe A" ou "receptores de EphA" como u- sados aqui preferencialmente interagem com ligantes Iigados a glicosilfosfa- 5
10
15
20
25
30
tidilinositol (GPI) (da subclasse de Efrina-A, que presentemente compreende cinco ligandos). Receptores de EphA especificos incluem: EphAI (tambem chamado Eph e Esk); EphA2 (tambem chamado Eck, mEck, Myk2, Sek2); EphA3 (tambem denominado Hek, Mek4, 丁yro4 e Cek4); EphA4 (tambem conhecido como Hek8, Sek1, Tyrol, e Cek8); EphA5 (tambem chamado Hek7，Bsk, Ehk1, Rek7 e Cek7); EphA6 (tambem chamado mEhk2 e Ehk2); EphA7 (de outro modo denominado Hek11, Mdk1, Ebk1 Ehk3); e EphA8 (tambem denominado Eek e mEek) e variantes que ocorrem naturalmente destes. O receptor de Eph preferido aqui e ο "receptor de EphA2", compre- endendo, por exemplo, uma sequencia de amino como no acesso no Gen- bank NsS NM_004431 (EphA2 humano), NM_010139 (EphA2 de murino), ou NXM_345596 (EphA2 de rato). O termo "ligante de Eph" como usado aqui refere-se a uma proteina que liga-se a, e opcionalmente ativa (por exemplo, estimula a autofosforilagao de), um receptor de Eph. Um ligante de Eph pre- ferido aqui e "efrinaAI", que liga-se ao receptor de EphA2 e compreende, por exemplo, uma sequencia de amino como no acesso no Genbank NM_004428 (efrinaAI humana).
O termo "antagonista" como usado aqui refere-se a uma molecu- Ia que e capaz de inibir uma ou mais das atividades biologicas de uma mole- cula aIvo1 tal como um receptor de EphA. Antagonistas podem agir interfe- rindo-se com a Iigagao de um receptor a um Iigando e vice versa, diminuin- do-se a fosforilagao de EphA2, e/ou incapacitando-se ou matando-se celulas que foram ativadas por um ligante. O antagonista pode bloquear completa- mente as intera?6es de receptor-ligante ou podem reduzir substancialmente tais interagoes. Todos os tais pontos de intervengao por um antagonista de- vem ser considerados equivalentes para os propositos desta invengao. As- sim，incluidos dentro do escopo da invengao estao os antagonistas (por e- xemplo, anticorpos neutralizantes) que ligam-se ao receptor de EphA, Iigan- do de Eph ou um complexo de um receptor de Eph e Iigando de Eph; varian- tes da sequencia de aminoacido ou derivados de um receptor de EphA ou Iigando de EphA que antagoniza a interagao entre um receptor de EphA e Iigando de EphA; receptor de EphA soliivel ou Iigando de EphA soliivel, op- cionalmente fundido a uma molecula heterologa tal como uma regiao de i- munoglobulina (por exemplo, uma imunoadesina); um complexo compreen- dendo um receptor de EphA em associagao com Iigando de EphA; peptideos de sequencia sintetica ou nativa que ligam-se ao receptor de EphA ou Iigan- do de EphA.
O termo "agonista" como usado aqui refere-se a qualquer com- posto, incluindo uma proteina, um polipeptideo, um peptideo, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um conjugado, uma molecula grande, uma mo- lecula pequena, capaz de ativar uma ou mais das atividades biologicas da molecula alvo. Agonistas de EphA agem estimulando-se a fosforilagao da proteina, provocando deste modo a degradagao da dita proteina.
Assim em uma modalidade preferida a presente invengao forne- ce，entre outras caracteristicas, anticorpos monoclonais anti-EphA, anticor- pos humanizados anti-EphA, e fragmentos dos anticorpos anti-EphA. Cada um dos anticorpos e fragmentos de anticorpo da presente invengao e desig- nado para reconhecer e Iigar especificamente ο receptor de EphA2, e age como um antagonista do receptor de EphA2. Alem disso, os anticorpos an- tagonisticos e fragmentos de anticorpo da invengao tem as iinicas proprie- dades de serem capazes para inibir ο crescimento de celulas tumorosas humanas, e/ou a migragao de celulas cancerosas metastaticas, e/ou angio- genese.
Um receptor de EphA preferido Iigado pelos anticorpos antago- nisticos e fragmentos de anticorpo da invengao e ο receptor de EphA2. E- phA2 humano e um receptor de EphA2 preferido.
O receptor de EphA2 pertence a uma familia de receptor cuja fosforiIagao de cauda citoplasmatica e aumentada depois da Iigagao do Ii- gando para interagir com uma variedade de proteinas adaptadoras e de si- nalizagao, Ievando a ativagao de diferentes vias de sinalizagao celular a ju- sante (Kullander, K. e Klein, R.’ 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 3: 475- 486; Noren, N. K. e Pasquale, E. B., 2004，Cell signal., 16: 655-666). Como usado aqui, ο termo "sinalizagao mediada por EphA2" refere-se a todos os eventos celulares que ocorrem em resposta a Iigagao do Iigando por EphA2. Ao passo que anticorpos descritos na tecnica anterior agonizam ο receptor de EphA2, e, em particular, aumentam a fosforilagao de tirosina da proteina de EphA2, os anticorpos e fragmentos de anticorpo da invengao sao prefe- rencialmente destituidos de qualquer uma de tais propriedades agonisticas. Em particular, eles sao incapazes de estimular a fosforilagao de EphA2 por si so.
Por οutro lado, esta invengao fornece os primeiros anticorpos anti-EphA2 antagonisticos reais. Em uma modalidade, os anticorpos e frag- mentos de anticorpo da invengao podem inibir a Iigagao de um Iigante a um receptor de EphA. Em uma modalidade preferida, a Iigagao de efrinaAI a EphA2 e impedida pelos anticorpos e fragmentos destes fornecidos por esta invengao. Notavelmente, em uma outra modalidade, os anticorpos e frag- mentos de anticorpo da invengao sao capazes de inibir a fosforilagao de tiro- sina do receptor de EphA2, mesmo na presenga de efrinaAI. Alem disso, os ditos anticorpos e fragmentos destes sao capazes de inibir a sinalizagao mediada por EphA2. Em particular, a fosforilagao dependente de Akt efrina- AI pode ser impedida pelos anticorpos e fragmentos de anticorpo da inven- ？ao.
Anticorpos
O term ο "anticorpo" e usado aqui no sentido mais amplo e espe- cificamente abrange anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclo- nais de tamanho natural) de qualquer isotipo tal como IgG, IgM, IgA1 IgD, e IgE, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecificos, anticorpos quimeri- cos, e fragmentos de anticorpo. Um anticorpo reativo com um antigeno es- pecifico pode ser gerado por metodos recombinantes tais como selegao de bibliotecas de anticorpos recombinantes em vetores de fago ou similares, ou imunizando-se um animal com ο antigeno ou um acido nucleico que codifica antigeno.
Um anticorpo tipico e compreendido de duas cadeias pesadas indenticas e duas cadeias Ieves indenticas que sao unidas por Iigagoes de dissulfeto. Cada cadeia pesada e Ieve contem uma regiao constante e uma regiao variavel. Cada regiao variavel contem tres segmentos chamados "re- 5
10
15
20
25
30
Qi0es determinantes de complementaridade" ("CDRs") ou "regides hipervari- aveis··，que sao primariamente responsaveis pela Iigagao de um epitopo de um antigeno. Elas sao usualmente referidas como CDR1 ’ CDR2, e CDR3, numeradas sequencialmente a partir do termino N. As porg5es mais alta- mente conservadas das regioes variaveis sao chamadas as "regioes de es- trutura".
Como usado aqui, "VH" ou "VH" refere-se a regiao variavel de uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo, incluindo a cadeia pesada de um fragmento Fv1 scFv, dsFv, Fab, Fab·，ou F(ab')2. A referenda a "VL" ou "VL" refere-se a regiao variavel da cadeia Ieve de imunoglobulina de um anticorpo, incluindo a cadeia Ieve de um fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab11 ou F(ab')2.
Um "anticorpo policlonal" e um anticorpo que foi produzido entre ou na presenga de um ou mais outros anticorpos nao indenticos. Em geral, anticorpos policlonais sao produzidos a partir de um Iinfocito B na presenga de varios outros Iinfocitos B que produzem anticorpos nao identicos. Usual- mente, anticorpos policlonais sao obtidos diretamente a partir de um animal imunizado.
Um "anticorpo monoclonal", como usado aqui, e um anticorpo obtido a partir de uma populagao de anticorpos substancialmente homoge- neos，isto e, os anticorpos que formam esta populagao sao essencialmente indenticos exceto para mutag5es que ocorrem naturalmente possiveis que poderiam estar presentes em quantidades menores. Estes anticorpos sao dirigidos contra um Cinico epitopo e sao portanto altamente especificos.
Um "epitopo" e ο sitio no antigeno ao qual um anticorpo liga. Ele pode ser formado por residuos contiguos ou por residuos nao contiguos Ie- vados em proximidade imediata pela duplicagao de uma proteina antigenica. Epitopos formados por aminoacidos contiguos sao tipicamente mantidos em exposigao a solventes desnaturantes, ao passo que epitopos formados por aminoacidos nao-contiguos sao tipicamente perdidos sob a dita exposigao.
Como usado aqui, ο termo "KD" refere-se a constante de dissoci- agao de uma interagao de anticorpo/antigeno particular. A presente invengao procede a partir de anticorpos de murino anti-EphA2, aqui 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1; e EphA2-N2 que sao completamente caracterizados com respeito as sequencias de aminoacido tanto de cadeias Ieves quanto pesadas, a identificagao das CDRs, a identifi- ca?ao de aminoacidos superficiais, e meios para sua expressao na forma recombinante. As sequencias de aminoacido e DNA primarias de cadeias Ieves e pesadas de anticorpos 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1; e E- phA2-N2, e de versoes humanizadas, sao descritas aqui.
Anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2 sao produzidos por hibridomas respectivamente designados 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2N2, e depositados sob ο Budapest Treaty em 16 de Junho de 2006 e 3 de Maio de 2007，respectivamente, na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209，USA, sob os niimeros de acesso PTA-7660, PTA-7661 PTA- 7662, PTA-8407 e PTA-8408, respectivamente.
O escopo da presente invengao nao e Iimitado a anticorpos e fragmentos compreendendo estas sequencias. Ao contrario, todos os anti- corpos e fragmentos que especificamente ligam-se ao receptor de EphA2 e antagonizam a atividade biologica do receptor, mas que sao destituidos de atividade agonista, caem dentro do escopo da presente invengao. Assim, anticorpos e fragmentos de anticorpo podem diierir de anticorpo 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1; e EphA2-N2 ou os derivados humanizados nas sequencias de aminoacido de suas CDRs de suporte, cadeia Ieve e cadeia pesada, e ainda caem dentro do escopo da presente invengao. Em uma modalidade, esta invengao fornece anticorpos ou frag-
mento de Iigagao de epitopo destes compreendendo uma ou mais CDRs tendo uma sequencia de aminoacido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1，2’ 3，4, 5，6，7, 8，9’ 10’ 11，12，13, 14，15, 16’ 17, 18, 61’ 62’ 63’ 64’ 65，66’ 67, 68’ 69，70，71，e 72. Em uma modalidade preferida, os anticorpos da invengao com-
preendem pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, e
a dita cadeia pesada compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias 10
15
de aminoacido selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1’ 2’ 3’ 7’ 8，9’ 13’ 14，15, 61, 62，63, 67，68, e 69’ e a dita cadeia Ieve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4’ 5, 6, 10，11，12’ 16，17，18，64’ 65， 66，70’ 71’ e 72.
Em uma modalidade mais preferida, os anticorpos da invengao compreendem tres CDRS tendo sequencias de aminoacido selecionadas do grupo de SEQ ID NOS: 1, 2’ 3’ 4’ 5, e 6. Em uma outra modalidade mais preferida, e fornecido um anticorpo 37.3D7, que compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, e a dita cadeia pesada compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido con- sistindo nas SEQ ID NOS: 1’ 2，e 3，e a dita cadeia Ieve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistindo nas SEQ ID NOS: 4, 5，e 6.
Em uma outra modalidade mais preferida, os anticorpos da in- vengao compreendem tres CDRS tendo sequencias de aminoacido selecio- nadas do grupo de SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, e 12. Em outra modalidade mais preferida, e fornecido um anticorpo 37.1 F5, que compreende pelo me- nos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, e a dita cadeia pe- sada compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistindo nas SEQ ID NOS: 7’ 8, e 9’ e a dita cadeia leve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistindo nas SEQ ID NOS: 10’ 11, e 12.
Em uma outra modalidade mais preferida, os anticorpos da in- vengao compreendem tres CDRS tendo sequencias de aminoacido selecio- nadas do grupo de SEQ ID NOS: 13，14’ 15, 16’ 17, e 18. Em uma outra modalidade mais preferida, e fornecido um 53.2H11, que compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, e a dita cadeia pesada compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoaci- do consistindo nas SEQ ID NOS: 13，14，e 15’ e a dita cadeia leve compre- ende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistindo
20
25
nas SEQ ID NOS: 16, 17, e 18. Em uma outra modalidade mais preferida, os anticorpos da in- vengao compreendem tres CDRS tendo sequencias de aminoacido selecio- nadas do grupo de SEQ ID NOS: 61, 62，63, 64, 65，e 66. Em uma outra modalidade mais preferida, e fornecido um anticorpo EphA2-N1, que com- preende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve，e a dita cadeia pesada compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistindo nas SEQ ID NOS: 61，62, e 63, e a dita cadeia Ieve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido con- sistindo nas SEQ ID NOS: 64’ 65，e 66. Em uma outra modalidade mais preferida, os anticorpos da in-
vengao compreendem tres CDRS tendo sequencias de aminoacido selecio- nadas do grupo de SEQ ID NOS: 67, 68, 69, 70, 71, e 72. Em uma outra modalidade mais preferida, e fornecido um anticorpo EphA2-N2, que com- preende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, e a dita cadeia pesada compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistindo nas SEQ ID NOS: 67，68，e 69, e a dita cadeia Ieve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido con- sistindo nas SEQ ID NOS: 70，71 ’ e 72.
Em uma outra modalidade, os anticorpos da invengao compre- endem um Vh tendo uma sequencia de aminoacido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 20, 22, 24, 74 e 76. Em uma modalidade pre- ferida, e fornecido um anticorpo 37.3D7 compreendendo um Vh tendo uma sequencia de aminoacido consistindo na SEQ ID NO 20. Em uma outra mo- dalidade preferida, e fornecido um anticorpo 37.1 F5 compreendendo um Vh tendo uma sequencia de aminoacido consistindo na SEQ ID NO 22. Em uma outra modalidade preferida, e fornecido um anticorpo 53.2H11 compreen- dendo um Vh tendo uma sequencia de aminoacido consistindo na SEQ ID NO 24. Em uma outra modalidade preferida, e fornecido um anticorpo E- phA2-N1 compreendendo um Vh tendo uma sequencia de aminoacido con- sistindo na SEQ ID NO 74. Em uma outra modalidade preferida, e fornecido um anticorpo EphA2-N2 compreendendo um Vh tendo uma sequencia de
aminoacido consistindo na SEQ ID NO 76. Em uma outra modalidade preferida, os anticorpos da invengao compreendem um Vl tendo uma sequencia de aminoacido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 26’ 28，30, 78 e 80. Em uma modalida- de preferida, e fornecido um anticorpo 37.3D7 compreendendo um Vl tendo uma sequencia de aminoacido consistindo na SEQ ID NO 26. Em uma outra modalidade preferida, e fornecido um anticorpo 37.1 F5 compreendendo um Vl tendo uma sequencia de aminoacido consistindo na SEQ ID NO 28. Em uma outra modalidade preferida, e fornecido um anticorpo 53.2H11 compre- endendo um Vl tendo uma sequencia de aminoacido consistindo na SEQ ID NO 30. Em uma outra modalidade preferida, e fornecido um anticorpo E- phA2-N1 compreendendo um Vl tendo uma sequencia de aminoacido con- sistindo na SEQ ID NO 78. Em uma outra modalidade preferida, e fornecido um anticorpo EphA2-N2 compreendendo um Vl tendo uma sequencia de aminoacido consistindo na SEQ ID NO 80. Anticorpos Humanizados ou Ressurqidos 37.3D7, 37.1 F5; 53.2H11; EphA2- N1; e EphA2-N2
Como usado aqui, ο termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo quimerico que contem sequencia minima derivada de imuno- globulina nao humana. Um "anticorpo quimerico", como usado aqui, e um anticorpo em que a regiao constante, ou uma porgao deste, e alterada, subs- tituida, ou trocada, de modo que a regiao variave丨 e Iigada a uma regiao constante de uma especie diferente, ou que pertence a uma outra classe ou subclasse de anticorpo. "Anticorpo quimerico" tambem refere-se a um anti- corpo em que a regiao variavel, ou uma por?ao deste, e alterada, substitui- da, ou trocada, de modo que a regiao constante e Iigada a uma regiao varia- vel de uma especie diferente, ou que pertence a uma outra classe ou sub- classe de anticorpo.
O objetivo da humanizagao e uma redugao na imunogenicidade de um anticorpo xenogenico, tal como um anticorpo de murino, para a intro- dugao em um ser humano, enquanto mantendo a afinidade de Iigagao de antigeno inteiro e especificidade do anticorpo. Anticorpos humanizados, ou
anticorpos adaptados para a nao rejeigao por outros mamiferos, podem ser produzidos usando varias tecnologias tais como recomposigao da superficie e enxertagem de CDR. Como usado aqui, a tecnologia de recomposigao da superficie usa uma combinagao de moldagem molecular, analise estatistica e mutagenese para alterar as superficies que nao de CDR de regi5es varia- veis de anticorpo para assemelhar-se as superficies de anticorpos conheci- dos do hospedeiro alvo.
Estrategias e metodos para a recomposigao da superficie de anticorpos, e outros metodos para reduzir a imunogenicidade de anticorpos dentro de um hospedeiro diferente, sao descritos na Patente US 5.639.641 ’ que e por meio desta incorporada em sua totalidade por referenda. Breve- mente’ em um metodo preferido, (1) alinhamentos de posigao de uma mistu- ra de regi5es variaveis de cadeia pesada e Ieve de anticorpo sao gerados para fornecer um conjunto de posig5es exposta na superficie de estrutura de regiao variavel de cadeia pesada e Ieve em que as posig5es de alinhamento para todas as regi5es variaveis sao pelo menos cerca de 98 % indenticas; (2) um conjunto de residuos de aminoacido expostos na superficie de estru- tura de regiao variavel de cadeia pesada e Ieve e definido para um anticorpo de roedor (ou fragmento deste); (3) um conjunto de residuos de aminoacido expostos na superficie de estrutura de regiao variavel de cadeia pesada e Ieve que e ο mais estritamente identico ao conjunto de residuos de aminoa- cido expostos na superficie de roedor e identificado; (4) ο conjunto de resi- duos de aminoacido expostos na superficie de estrutura de regiao variavel de cadeia pesada e Ieve definido na etapa (2) e substituido com ο conjunto de residuos de aminoacido expostos na superficie de estrutura de regiao variavel de cadeia pesada e Ieve identificados na etapa (3), exceto para a- queles residuos de aminoacido que estao dentro de 5 A de qualquer atomo de qualquer residuo das regioes determinantes de complementaridade do anticorpo de roedor; e (5) ο anticorpo de roedor humanizado tendo especifi- cidade de Iigagao e produzido. Anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de
outras tecnicas incluindo enxertagem de CDR (EP O 239 400; WO 91/09967; Pat. U.S. NQs 5.530.101; e 5.585.089), folheamento ou recomposigao da su- perficie (EP O 592 106; EP 0 519 596; Padlan Ε. Α., 1991，Molecular Immu- nology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. Μ. et al., 1994，Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994，Proc. Natl. Acad. SciHJ.S.A., 91:969-973), e embaralhamento de cadeia (Pat. U.S. N2 5.565.332). Anticor- pos humanos podem ser fabricados por uma variedade de metodos conhe- cidos na tecnica incluindo metodos de exibigao de fago. Ver tambem Pat. U.S. N9S 4.444.887，4.716.111，5.545.806, e 5.814.318; e publicagao do pe- dido de patente internacional niimeros WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735’ e WO 91/10741 (as ditas referencias incorporadas por referencia em suas totalidades).
A presente invengao fornece anticorpos humanizados ou frag- mentos destes, que reconhecem receptor de EphA2 e agem como antago- nistas. Em uma outra modalidade, os anticorpos humanizados ou fragmen- tos de Iigagao de epitopo destes tem a capacidade adicional para inibir ο crescimento de uma celula cancerosa que expressa ο receptor de EphA2. Em uma outra modalidade, ο anticorpo humanizado ou Iigagao de epitopo deste tem a capacidade adicional para inibir a migragao de um celula cance- rosa metastatica que expressa ο receptor de EphA2.
Uma modalidade preferida de um tal anticorpo humanizado e um anticorpo 37.3D7, 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1 ou EphA2-N2 humanizado, ou um fragmento de Iigagao de epitopo deste.
Em modalidades mais preferidas, sao fornecidas versoes res- surgidas ou humanizadas dos anticorpos 37.3D7, 37.1 F5; 53.2H11; EphA2- N1 ou EphA2-N2 em que residuos expostos na superficie do anticorpo ou seus fragmentos sao substituidos tanto em cadeias Ieves quanto pesadas para assemelhar-se mais estritamente a superficies de anticorpo human。 conhecidas. Os anticorpos humanizados 37.3D7, 37.1 F5; 53.2H11; EphA2- N1 ou EphA2-N2 ou fragmentos de Iigagao de epitopo destes da presente invengao tem propriedades melhoradas. Por exemplo, anticorpos 37.3D7, 37.1 F5; e 53.2H11 humanizados ou fragmentos de Iigagao de epitopo destes especificamente reconhecem receptor de EphA2. Mais preferivelmente, os
anticorpos humanizados 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2 ou fragmentos de Iigagao de epitopo destes tem a capacidade adicional para inibir ο crescimento de uma celula que expressa ο receptor de EphA2.
As versoes humanizadas dos anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2 tambem sao completamente caracteriza- das aqui com respeito a suas sequencias de aminoacido respectivas das regi5es variaveis tanto de cadeia Ieve quanto pesada, as sequencias de DNA dos genes para as regioes variaveis de cadeia Ieve e pesada, a identi- ficagao das CDRs, a identificagao de seus aminoacidos superficiais, e des- crigao de um meio para sua expressao na forma recombinante. Entretanto, ο escopo da presente invengao nao e Iimitado a anticorpos e fragmentos com- preendendo estas sequencias. Ao contrario, todos os anticorpos e fragmen- tos que especificamente ligam-se ao receptor de EphA2 sao incluidos na presente invengao. Preferivelmente, os anticorpos e fragmentos que especi- ficamente ligam-se ao receptor de EphA2 antagonizam a atividade biologica do receptor. Mais preferivelmente, tais anticorpos ainda sao substancialmen- te destituidos de atividade agonista. Assim, anticorpos e fragmentos de Iiga- gao de epitopo de anticorpo da presente invengao podem diferir do anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2 ou os derivados humani- zados destes, em as sequencias de aminoacido de suas CDRs de suporte, e/ou cadeia Ieve e cadeia pesada, e ainda caem dentro do escopo da pre- sente invengao.
As CDRs dos anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2 sao identificadas por moldagem e suas estruturas moleculares foram prognosticadas. Novamente, embora as CDRs sejam importantes para ο reconhecimento de epitopo, elas nao sao essenciais para os anticorpos e fragmentos da invengao. Consequentemente, anticorpos e fragmentos sao fornecidos que tem propriedades melhoradas produzidas por, por exemplo, maturagao por afinidade de um anticorpo da presente inver^ao.
Os genes de Iinha germinativa de IgVk e Jk de cadeia Ieve e ca- deia pesada de camundongo dos quais 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2- N1, e EphA2-N2 foram provavelmente derivados foram identificados, com ο
descrito na segao de Exemplos experimentais. Tais sequencias de gene de Iinha germinativa sao iiteis para identificar mutag5es somaticas nos anticor- pos, incluindo nas CDRs.
As sequencias das regides variaveis de cadeia pesada e cadeia Ieve dos anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2, e as sequencias de suas CDRs nao foram previamente conhecidas e sao apre- sentadas neste pedido. Tal informagao pode ser usada para produzir ver- soes humanizadas dos anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2. Estes anticorpos anti-EphA humanizados ou seus derivados tambem podem ser usados como ο agente de Iigagao de celula da presente invengao.
Assim, em uma modalidade, esta invengao fornece anticorpos humanizados ou fragmento de Iigagao de epitopo destes compreendendo uma ou mais CDRs tendo uma sequencia de aminoacido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1’ 2’ 3, 4，5，6’ 7，8’ 9’ 10, 11，12’ 13， 14’ 15, 16, 17，18’ 61, 62, 63，64, 65，66，67，68，69’ 70，71’ e 72. Em uma modalidade preferida, os anticorpos humanizados da invengao compreen- dem pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia Ieve, e a dita cadeia pesada compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1，2，3, 7， 8, 9’ 13，14，15, 61’ 62，63’ 67’ 68’ e 69’ e a dita cadeia Ieve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 10’ 11，12’ 16, 17, 18，64’ 65’ 66’ 70’ 71’ e 72. Em uma outra modalidade preferida, os anticorpos humani- zados da invengao compreendem pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia Ieve, em que a dita cadeia pesada compreende tres C- DRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido representadas pelas SEQ ID NOS: 1, 2, e 3, e em que a dita cadeia Ieve compreende tres CDRs se- quenciais tendo sequencias de aminoacido representadas pelas SEQ ID NOS: 4，5’ e 6. Em uma outra modalidade mais preferida, os anticorpos hu- manizados da invengao compreendem pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende tres
CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido representadas pelas SEQ ID NOS: 7’ 8，e 9，e em que a dita cadeia Ieve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido representadas pelas SEQ ID NOS: 10, 11, e 12. Em uma outra modalidade mais preferida, os anticorpos humanizados da invengao compreendem pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido representadas pelas SEQ ID NOS: 13’ 14’ e 15，e em que a dita cadeia Ieve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido representadas pelas SEQ ID NOS: 16’ 17，e 18. Em uma outra modalidade mais preferida, os an- ticorpos humanizados da invengao compreendem pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve，em que a dita cadeia pesada com- preende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistin- do nas SEQ ID NOS: 61, 62，e 63, e em que a dita cadeia leve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistindo nas SEQ ID NOS: 64, 65，e 66. Em uma outra modalidade mais preferida, os an- ticorpos humanizados da invengao compreendem pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada com- preende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistin- do nas SEQ ID NOS: 67, 68’ e 69，e em que a dita cadeia leve compreende tres CDRs sequenciais tendo sequencias de aminoacido consistindo nas SEQ ID NOS: 70, 71, e 72.
Em uma modalidade, esta invengao fornece anticorpos humani- zados ou fragmentos destes que compreendem um Vh tendo uma sequencia de aminoacido escolhida do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 32’ 34, 36, 37’ 38，40，42，43, e 45. Em uma modalidade preferida, um anticorpo 37.1D7 humanizado e fornecido que compreende um Vh tendo uma sequencia de aminoacido escolhida do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 32，34，e 36. Em uma outra modalidade preferida, um anticorpo humanizado 37.1 F5 e fornecido que compreende um Vh tendo uma sequencia de aminoacido es- colhida do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 37 e 38. Em uma outra mo- dalidade preferida, um anticorpo humanizado 53.2H11 e fornecido que com-
preende um Vh tendo uma sequencia de aminoacido escolhida do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 40, 42，43, e 45.
Em uma outra modalidade, esta invengao fornece anticorpos humanizados ou fragmentos destes que compreendem um Vl tendo uma sequencia de aminoacido escolhida do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 47, 48，49，50, e 52. Em uma modalidade preferida, um anticorpo 37.1 D7 humanizado e fornecido que compreende um Vl tendo uma sequencia de aminoacido consistindo na SEQ ID NO 47. Em uma outra modalidade prefe- rida, um anticorpo humanizado 37.1 F5 e fornecido que compreende um Vl tendo uma sequencia de aminoacido escolhida do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 48, 49, e 50. Em uma outra modalidade preferida, um anticor- po humanizado 53.2H11 e fornecido que compreende um Vl tendo uma se- quencia de aminoacido consistindo na SEQ ID NO 52.
Os anticorpos humanizados 37.3D7 e fragmentos de Iigagao de epitopo destes da presente invengao tambem podem incluir substituigao em res id uos de aminoacido de cadeia Ieve e/ou pesada em uma ou mais posi- goes definidas pelos residuos cinzentos na Tabela 1A e 1B que representam os residuos de estrutura de superficie de murino que foram mudados a partir do res id uo de murino original ao residuo de superficie de estrutura corres- pondente no anticorpo humano, 28E4. Os residuos marcados com asterisco (*) na Tabela 1B correspondem as retro-mutag5es de murino nas variantes de cadeia pesada de 37.3D7 humanizado (SE〇 ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36). Os residuos para retro-mutag5es sao proximais aos de CDR e foram escolhidos como descrito na Patente U.S. N5 5.639.641 ou em analogia a selegao de residuos que tiveram em esforgos de humanizagao anteriores resultaram em uma diminuigao na afinidade de Iigagao de antigeno (Rogus- ka et al., 1996，Protein Eng.; 9(10): 895-904; Publicagoes do Pedido de Pa- tente U.S. 2003/0235582 e 2005/0118183).
Do mesmo modo, os anticorpos humanizados 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1 ； e EphA2-N2 e fragmentos de Iigagao de epitopo destes da pre- sente invengao tambem podem incluir substituigao em residuos de aminoa- cido de cadeia Ieve e/ou pesada.
Polinucleotideos, veto res, e celulas hospedeiras Acidos nucleicos que codificam anticorpos anti-EphA2 da inven- ς§ο sao fornecidos. Em uma modalidade, a molecula de acido nucleico codi- fica uma cadeia pesada e/ou uma Ieve de uma imunoglobulina anti-EphA2. Em uma modalidade preferida, um Cinico acido nucleico codifica uma cadeia pesada de uma imunoglobulina anti-EphA2 e uma outra molecula de acido nucleico codifica a cadeia Ieve de uma imunoglobulina anti-EphA2.
Em um outro aspecto desta invengao, sao fornecidos polinucleo- tideos que codificam polipeptideos tendo uma sequencia de aminoacido se- Iecionada do grupo de SEQ ID NOS: 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14’ 15’ 16’ 17，18’ 20’ 22’ 24，26，28, 30，32，34’ 36，37, 38，40’ 42’ 43’ 45, 47, 48，49’ 50, 52’ 61, 62’ 63，64，65，66, 67，68，69, 70，71, 72, 74，76, 78 e 80. Em uma modalidade preferida, ο polinucleotideo da invengao e selecio- nado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 19，21，23，25, 27’ 29，31，33, 35，39, 41，44, 46, 51, 73，75’ 77，e 79. A invengao nao e Iimitada ao ditos polinucleotideos por si mas tambem inclui todos os polinucleotideos que exi- bem pelo menos 80 % de identidade com os ditos polinucleotideos.
A invengao fornece veto res compreendendo os polinucleotideos da invengao. Em uma modalidade, ο vetor contem um polinucleotideo que codifica uma cadeia pesada de uma imunoglobulina anti-EphA2. Em uma outra modalidade, ο dito polinucleotideo codifica a cadeia Ieve de uma imu- noglobulina anti-EphA2. A invengao tambem fornece vetores compreenden- do moleculas de polinucleotideo que codificam proteinas de fusao, anticor- pos modificados, fragmentos de anticorpo, e sondas destes.
De modo a expressar a cadeia pesada e/ou Ieve dos anticorpos anti-EphA2 da invengao, os polinucleotideos que codificam as ditas cadeias pesadas e/ou Ieves sao inseridos em vetores de expressao tais que os ge- nes sao operativamente Iigados a sequencias transcricionais e traducionais. Vetores de expressao incluem plasm ideos, YACs, cosmideos, retrovirus, epissomas derivados de EBV, e todos os outros vetores que ο tecnico ver- sado conhecera ser conveniente para garantir a expressao das ditas cadeias pesadas e/ou leves. O tecnico versado constatara que os polinucleotideos
que codificam as cadeias pesadas e as leves podem ser clonados em dife- rentes vetores ou no mesmo vetor. Em uma modalidade preferida, os ditos polinucleotfdeos sao clonados no mesmo vetor.
Polinucleotideos da invengao e vetores compreendendo estas moleculas podem ser usados para a transformagao de uma celula hospedei- ra mam if era adequada, ou qualquer outro tipo de celula hospedeira conheci- da a pessoa versada. A transformagao pode ser por qualquer metodo co- nhecido para introduzir polinucleotfdeos em um hospedeiro celular. Tais me- todos sao bem-conhecidos do tecnico versado na tecnica e incluem trans- formagao mediada por dextrano, precipitagao de fosfato de calcio, transfec- gao mediada por polibreno, fusao de protoplasto, eletroporagao, encapsula- do polinucleotideo em lipossomos, injegao biolistica e microinjegao dire- ta de DNA nos nCicleos. Fraamentos de anticomo
Os anticorpos da presente invengao incluem tanto os anticorpos de tamanho natural debatidos acima, assim como fragmentos de Iigagao de epitopo. Como usado aqui, "fragmentos de anticorpo" incluem qualquer por- ?ao de um anticorpo que mantem a capacidade para ligarem-se ao epitopo reconhecido pelo anticorpo de tamanho natural, geralmente denominado "fragmentos de Iigagao de epitopo." Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem，mas nao sao Iimitados a, Fab, Fab, e F(ab')2, Fd1 Fvs de cadeia ύηί- ca (scFv), anticorpos de cadeia iinica, Fvs Iigados a dissulfeto (dsFv) e fragmentos compreendendo uma regiao Vl ou Vh. Fragmentos de Iigagao de epitopo, incluindo anticorpos de cadeia Linica, podem compreender a regiao variavel sozinha ou em combinagao com a totalidade ou uma porgao do que segue: regiao da dobradipa, dominios Ch 1 ’ CH2, e CH3.
Tais fragmentos podem conter um ou am bos os fragmentos Fab ou ο fragmento F(ab')2. Preferivelmente, os fragmentos de anticorpo contem todas as seis CDRs do anticorpo integral, embora fragmentos contendo me- nos do que todas as tais regi5es, tais como tres, quatro ou cinco CDRs, tambem sejam funcionais. Alern disso, os fragmentos podem ser ou podem combinar membros de qualquer uma das classes de imunoglobulina seguin- tes: IgG, IgM1 IgA, IgD, ou IgE, e as subclasses destas. 5
10
15
20
25
30
Fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser produzidos por clivagem proteolitica, usando enzimas tais como papaina (fragmentos Fab) ou pepsi- na (fragmentos F(ab')2).
Os fragmentos "FVs de cadeia iinica" ("scFvs") sao fragmentos de Iigagao de epitopo que contem pelo menos um fragmento de uma regiao variavel de cadeia pesada (Vh) de anticorpo Iigada a pelo menos um frag- mento de uma regiao variavel de cadeia Ieve (Vl) de anticorpo. O Iigante pode ser um peptideo curto, flexivel selecionado para garantir que a propria duplicagao tridimensional das regioes (Vl) e (Vh) ocorra uma vez que elas sao Iigadas de modo a manter a especificidade de Iigagao de molecula alvo do anticorpo integral a partir do qual ο fragmento de anticorpo de cadeia ύηΐ- ca e derivado. O termino carboxila da sequencia (Vl) ou (Vh) pode ser cova- Ientemente Iigado por um Iigante ao termino aminoacido de uma sequencia (Vl) ou (Vh) complementar.
Fragmentos de anticorpo de cadeia unica da presente invengao contem sequencias de aminoacido tendo pelo menos uma das regides varia- veis ou determinantes de complementaridade (CDRs) dos anticorpos inte- grals descritos neste relatorio descritivo, mas estao carecendo de alguns ou todos os dominios constantes destes anticorpos. Estes dominios constantes nao sao necessarios para a Iigagao de antigeno, mas constituem uma prin- cipal porgao da estrutura dos anticorpos integrals. Fragmentos de anticorpo de cadeia iinica portanto podem superar alguns dos problemas associados com ο uso de anticorpos contendo uma parte ou todo um dominio constante. Por exemplo, fragmentos de anticorpo de cadeia Clnica tendem a serem Ii- vres de intera^des indesejadas entre moleculas biologicas e a regiao cons- tante de cadeia pesada, ou outra atividade biologica indesejada. Adicional- mente, fragmentos de anticorpo de cadeia ijnica sao consideravelmente me- nores do que anticorpos integrals e portanto podem ter maior permeabilidade capilar do que anticorpos integrals, permitindo que fragmentos de anticorpo de cadeia Cinica Iocalizem θ ligusm-se a sitios de Iigapao de antigeno alvo mais eficientemente. Tambem1 fragmentos de anticorpo podem ser produzi-
dos em uma escala relativamente ampla em celulas procarioticas, facilitando 5
10
15
20
25
30
assim sua produgao. Alem disso, ο tamanho relativamente pequeno de fragmentos de anticorpo de cadeia Linica os tornam menos provaveis a pro- vocar uma resposta imune em um receptor do que anticorpos integrals.
Fragmentos de anticorpo de cadeia Cinica podem ser gerados por clonagem molecular, biblioteca de exibigao de fago de anticorpo ou tec- nicas similares bem-conhecidas ao tecnico versado. Estas proteinas podem ser produzidas, por exemplo, em celulas eucarioticas ou celulas procarioti- cas’ incluindo bacterias. Os fragmentos de Iigagao de epitopo da presente invengao tambem podem ser gerados usando varios metodos de exibigao de fago conhecidos na tecnica. Em metodos de exibigao de fago, dominios de anticorpo funcionais sao exibidos na superficie de particulas de fago que carregam as sequencias de polinucleotideo que os codificam. Em particular, tal fago pode ser utilizado para exibir dominios de Iigagao de epitopo ex- pressados a partir de uma biblioteca de anticorpo de repertorio ou combina- torial (por exemplo, humana ou de murino). O fago que expressa um dominio de Iigagao de epitopo que Iiga ο antigeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com antigeno, por exemplo, usando antigeno Iigado rotulado ou capturado a uma superficie solida ou perola. O fago usado nestes meto- dos sao tipicamente fago filmentoso incluindo dominios de Iigagao fd e M13 expressados a partir de fago com dominios de anticorpo de Fab, Fv ou Fv estabilizado em dissulfeto recombinantemente fundidos a proteina de gene III ou gene Vlll de fago.
Exemplos de metodos de exibigao de fago que podem ser usa- dos para fabricar os fragmentos de Iigagao de epitopo da presente invengao incluem aqueles descritos em Brinkman et al, 1995’ J. Immunol. Methods, 182: 41-50; Ames et al., 1995’ J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettlebo- rough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton etal., 1994, Advances in Immunology, 57: 191-280; Pedido PCT Ns PCT/GB91/01134; Publica?5es PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236； WO 95/15982; WO 95/20401 ； e Pat. U.S. N5S 5.698.426； 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908； 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225； 5
10
15
20
25
30
5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais e incorporado aqui por referenda em sua totalidade.
Depois da selegao do fago, as regi5es do fago que codifica os fragmentos podem ser isoladas e usadas para gerar os fragmentos de Iiga- ?ao de epitopo atraves da expressao em um hospedeiro escolhido, incluindo celulas mamiferas, celulas de inseto, celulas vegetais, levedura, e bacterias, usando tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, como descrito em detalhe abaixo. Por exemplo, tecnicas para produzir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 tambem podem ser utilizadas usando meto- dos conhecidos na tecnica tais como aqueles descritos na publicagao PCT WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques, 12(6): 864-869; Sawai et al., 1995，AJRI1 34: 26-34; e Better et al., 1988, Science, 240: 1041-1043; as ditas referencias incorporadas por referenda em suas totalidades. Exem- plos de tecnicas que podem ser usadas para produzir Fvs e anticorpos de cadeia iinica incluem aqueles descritos nas Pat. U.S. NQs 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203: 46-88; Shu et al； 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 7995-7999; Skerra et al., 1988, Science, 240: 1038-1040. Equivalentes funcionais
Tambem incluidos dentro do escopo da invengao estao equiva- Ientes funcionais do anticorpo anti-EphA e do anticorpo receptor anti-EphA2 humanizado. O term ο "equivalentes funcionais" inclui anticorpos com se- quencias homologas, anticorpos quimericos, anticorpos artificiais e anticor- pos modificados, por exemplo, em que cada equivalente funcional e definido por sua capacidade para ligar-se ao receptor de EphA2. O tecnico versado entendera que existe uma sobreposigao no grupo de molecules denominado "fragmentos de anticorpo" e no grupo denominado "equivalentes funcionais." Metodos de produzir equivalentes funcionais sao conhecidos a pessoa ver- sada na tecnica e sao descritos, por exemplo, no Pedido PCT WO 93/21319， Patente Europeia Nq EP 0239400; Pedido PCT WO 89/09622; Patente Euro- peia Ne EP 0338745; e Pedido de Patente Europeu EP 0332424, que sao
incorporados em suas totalidades respectivas por referenda. 5
10
15
20
25
30
Anticorpos com sequencias homologas sao aqueles anticorpos com sequencias de aminoacido que tern homologia de sequencia com se- quencia de aminoacido de um anticorpo anti-EphA e um anticorpo anti-EphA humanizado da presente inven?ao. Preferivelmente homologia e com a se- quencia de aminoacido das regioes variaveis do anticorpo anti-EphA e anti- corpo anti-EphA humanizado da presente invengao. "Homologia de sequen- cia" como aplicado a uma sequencia de aminoacido aqui e definido como uma sequencia com pelo menos cerca de 90 %, 91 %, 92 %，93 %, ou 94 % de homologia de sequencia, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 %’ ou 99 % de homologia de sequencia a uma outra se- quencia de aminoacido, como determinado, por exemplo, pelo metodo de pesquisa FASTA de acordo com Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444-2448.
Um anticorpo quimerico e um em que diferentes porgoes de um anticorpo sao derivadas de diferentes especies de animal. Por exemplo, um anticorpo tendo uma regiao variavel derivada de um anticorpo de murino monoclonal pareado com uma regiao constante de imunoglobulina humana. Metodos para produzir anticorpos quimericos sao conhecidos na tecnica. Ver，por exemplo, Morrison, 1985，Science, 229: 1202; Oi et al., 1986，Bio- Techniques, 4: 214; Gillies et al., 1989，J. Immunol. Methods, 125: 191-202; Pat. U.S. N2S 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397, que sao incorporados aqui por referenda em suas totalidades.
Formas humanizadas de anticorpos quimericos sao fabricadas substituindo-se as regioes determinantes de complementaridade, por exem- plo，de um anticorpo de camundongo, em um dominio de estrutura humano, por exemplo, ver Pub. PCT N5 W092/22653. Anticorpos quimericos humani- zados preferivelmente tem regioes constantes e regioes variaveis exceto as regi5es determinantes de complementaridade (CDRs) derivadas substancial ou exclusivamente das regioes de anticorpo humano e CDRs corresponden- tes derivadas substancial ou exclusivamente de um mamifero exceto um ser humano.
Anticorpos artificials incluem fragmentos scFv, diacorpos, tria- corpos，tetracorpos e mru (ver as revis5es de Winter, G. e Milstein1 C., 1991’ Nature, 349: 293-299; Hudson, P.J., 1999，Current Opinion in Immunology, 11: 548-557)，cada um dos quais tem capacidade de Iigagao de antigeno. No fragment。Fv de cadeia Linica (scFv), os dominios Vh e Vl de um anticorpo sao Iigados por um peptideo flexivel. Tipicamente, este peptideo Iigante e de cerca de 15 residuos de aminoacido de comprimento. Se ο Iigante for muito menor, por exemplo 5 aminoacidos, diacorpos sao form ados, que sao dime- ros de scFv bivalentes. Se ο Iigante for reduzido a menos do que tres resi- duos de aminoacido, estruturas trimericas e tetramericas sao formadas que sao chamadas triacorpos e tetracorpos. A menor unidade de Iigagao de um anticorpo e uma CDR1 tipicamente a CDR2 da cadeia pesada que tem reco- nhecimento e Iigagao especificos suficientes que podem ser usados separa- damente. Um tal fragmento e chamado uma unidade de reconhecimento mo- lecular ou mru. Varias de tais mrus podem ser Iigadas entre si com pepti- deos Iigantes curtos, que form am portanto uma proteina de Iigagao artificial com avidez mais alta do que uma Cinica mru.
Os equivalentes funcionais do presente pedido tambem incluem anticorpos modificados, por exemplo, anticorpos modificados pela Iigagao covalente de qualquer tipo de molecula ao anticorpo. Por exemplo, anticor- pos modificados incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilagao, acetiiagao, peguilagao, fosforilagao, amidagao, derivagao por grupos de protegao/bloqueio conhecidos, clivagem proteolitica, Iigagao a um Iigante celular ou outra proteina, etc. A Iigagao covalente nao impede ο anticorpo de gerar uma resposta anti-idiotipica. Estas modificagdes podem ser realizadas por tecnicas conhecidas, incluindo, mas nao Iimitadas a, cli- vagem quimica especifica, acetiiagao, formiIagao, sintese metabolica de tu- nicamicina, etc. Adicionalmente, os anticorpos modificados podem conter um ou mais aminoacidos nao classicos.
Equivalentes funcionais podem ser produzidos premutando-se diferentes CDRs em diferentes cadeias dentro de diferentes estruturas. As- sim, por exemplo, diferentes classes de anticorpo sao possiveis para um
conjunto dado de CDRs por substituigao de diferentes cadeias pesadas, por meio das quais, por exemplo, tipos de anticorpo de IgGI-4, IgM, IgAI-2, IgD’ IgE e isotipos podem ser produzidos. Similarmente, anticorpos artificiais den- tro do escopo da invengao podem ser produzidos embutindo-se um conjunto dado de CDRs dentro de uma estrutura inteiramente sintetica.
Equivalentes funcionais podem ser facilmente produzidos por
mutagao, supressao e/ou insergao dentro das sequencias de regiao variavel e/ou constante que flanqueiam um conjunto particular de CDRs, usando uma ampla variedade de metodos conhecidos na tecnica.
Os fragmentos de anticorpo e equivalentes funcionais da presen- te invengao abrangem aquelas moleculas com um grau detectavel de Iigagao a EphA1 quando comparado ao anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2- N1 ou EphA2-N2. Um grau detectavel de Iigagao inclui todos os valores na faixa de pelo menos 10 a 100 %, preferivelmente pelo menos 50 %, 60 % ou 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %’ 95 % ou 99 % da capacidade de Iigagao do anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11，EphA2- N1 ou EphA2-N2 de murino a EphA. Anticorpos melhorados
As CDRs sao de importancia primaria para ο reconhecimento de epitopo e Iigagao de anticorpo. Entretanto, mudangas podem ser feitas aos residuos que compreendem as CDRs sem interferir com a capacidade do anticorpo para reconhecer e Iigar seu epitopo cognato. Por exemplo, mu- dangas que nao afetam ο reconhecimento de epitopo, ainda aumentam a afinidade de Iigagao do anticorpo para ο epitopo podem ser feitas.
Assim, tambem incluido no escopo da presente invengao estao versoes melhoradas tanto dos anticorpos de murino quanto humanizados, que tambem especificamente reconhecem e Iigam EphA1 preferivelmente com afinidade aumentada.
Varios estudos avaliaram os efeitos de introduzir uma ou mais mudangas de aminoacido em varias posig5es na sequencia de um anticorpo, com base no conhecimento da sequencia de anticorpo primaria, em suas propriedades tais como Iigagao e nivel de expressao (Yang, W. P. et a/·, 1995， J. Mol. Biol., 254: 392-403; Rader, C. et at； 1998, Proc. Natl. Acad. Scl. U.S.A., 95: 8910-8915; Vaughan, Τ. J. et ai, 1998’ Nature Biotechno- logy, 16: 535-539).
Nestes estudos, equivalentes do anticorpo primario foram gera- dos mudando-se as sequencias dos genes de cadeia pesada e Ieve na C- DR1, CDR2, CDR3, ou regi5es de estrutura, usando metodos tais como mu- tagenese dirigida ao sitio mediada por oligonucleotideo, mutagenese de cassete, PCR propensa a erros, embaralhamento de DNA, ou cepas causa- doras de mutagao de E. coli (Vaughan, T. J. et ai, 1998’ Nature Biotechno- logy, 16: 535-539; Adey1 N. B. etal., 1996, Capitulo 16’ paginas 277-291’ em "Phage Display of Peptides and Proteins", Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). Estes metodos de mudar a sequencia do anticorpo primario resulta- ram em afinidades melhoradas dos anticorpos secundarios (Gram, H. et al., 1992’ Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 3576-3580; Boder, E. T. et al., 2000， Proc· Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97: 10701-10705; Davies1 J. e Riechmann, L.， 1996，lmmunotechnolgy, 2: 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol. Biol., 256: 77-88; Short, M. K. et al., 2002’ J. Biol. Chem., 277: 16365-16370; Fu- rukawa, K. etal., 2001, J. Biol. Chem., 276: 27622-27628).
Por uma estrategia direcionada similar de mudar um ou mais res id uos de aminoacido do anticorpo, as sequencias de anticorpo descritas nesta invengao podem ser usadas para desenvolver anticorpos anti-EphA com fungoes melhoradas, incluindo afinidade melhorada por EphA.
Substituigoes de aminoacido preferidas sao aquelas que: (1) re- duzem a suscetibilidade a proteolise, (2) reduzem a suscetibilidade a oxida- ？ao, (3) alteram a afinidade de Iigagao para formar complexos de proteina, e (4) conferem ou modificam outras propriedades fisico-quimicas ou funcionais de tais analogos. Analogos podem incluir varias muteinas de uma sequencia exceto a sequencia de peptideo que ocorre naturalmente. Por exemplo, substituigoes de aminoacido Linicas ou multiplas (preferivelmente substitui- ？oes de aminoacido conservativas) podem ser feitas na sequencia que ocor- re naturalmente (preferivelmente na porgao do polipeptideo fora do dominio (s) formando contatos intermoleculares. Uma substituigao de aminoacido conservativa nao deveria mudar substancialmente as caracteristicas estrutu- 10
15
rais da sequencia precursora (por exemplo, um aminoacido de substituigao nao deveria tender a quebrar uma helice que ocorre na sequencia precurso- ra, ou romper outros tipos de estrutura secundaria que caracteriza a sequen- cia precursora). Exemplos de estruturas secundarias e terciarias de polipep- tideo reconhecidas na tecnica sao descritos em Proteins, Structures and Mo- lecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman e Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze1 eds., Gar- land Publishing, Nova Iorque1 N. Y. (1991)); e Thornton et al., 1991, Nature, 354: 105，que sao todos incorporados aqui por referencia.
Anticorpos melhorados tambem incluem aqueles anticorpos ten- do caracteristicas melhoradas que sao preparados pelas tecnicas padrao de imunizagao animal, formagao de hibridoma e selegao para anticorpos com caracteristicas especificas.
A presente invengao tambem inclui conjugados citotoxicos. Es- tes conjugados citotoxicos compreendem dois componentes primarios, um agente de Iigagao de celula e um agente citotoxico.
Como usado aqui, ο termo "agente de Iigagao de celula" refere- se a um agente que especificamente reconhece e Iiga os receptores de E- PhA na superficie da celula. Em uma modalidade, ο agente de Iigagao de celula especificamente reconhece ο receptor de EphA tal que ele permite que os conjugados ajam em uma forma alvejada com poucos efeitos colate- rais que resultam de Iigagao nao especifica.
Em uma outra modalidade, ο agente de Iigagao de celula da pre- sente invengao tambem especificamente reconhece ο receptor de EphA de modo que os conjugados estarao em contato com a celula-alvo durante um periodo de tempo suficiente para permitir que a porgao de farmaco citotoxico do conjugado aja na celula, e/ou para permitir aos conjugados tempo sufici- ente para que sejam incorporados pela celula.
Em uma modalidade preferida, os conjugados citotoxicos com- preendem um anticorpo anti-EphA como ο agente de Iigagao de celula, mais preferivelmente ο anticorpo monoclonal anti-EphA de murino 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2. Em uma modalidade mais prefe-
20 rida，ο conjugado citotoxico compreende um anticorpo humanizado 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2 ou um fragmento de Iigagao de epitopo deste. O anticorpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2- N2 e capaz de reconhecer especificamente um receptor de EphA1 tal como EphA2, e direciona ο agente citotoxico a uma celula anormal ou um tecido, tal como celulas cancerosas, em uma forma alvejada.
O segundo componente dos conjugados citotoxicos da presente invengao e um agente citotoxico. O termo "agente citotoxico" como usado aqui refere-se a uma substancia que reduz ou bloqueia a fungao, ou cresci- mento, de celulas e/ou causa a destruigao de celulas.
Em modalidades preferidas, ο agente citotoxico e um taxoide, um maitansinoide tal como DM1 ou DM4, um farmaco Ieve, um derivado de tomaimicina, um derivado de leptomicina, um pro-farmaco, CC-1065 ou um analogo de CC-1065. Em modalidades preferidas, ο agente de Iigagao de celulas da presente invengao sao covalentemente ligados, diretamente ou por intermedio de um Iigante clivavel ou nao clivavel, ao agente citotoxico.
O agente de Iigagao de celulas, agentes citotoxicos, e Iigantes sao debatidos em mais detalhe abaixo. Agentes de Ligacao de Celula A efetividade dos compostos da presente invengao como agen-
tes terapeuticos depende da selegao cuidadosa de um agente de Iigagao de celula apropriado. Agentes de Iigagao de celula podem ser de qualquer tipo presentemente conhecido, ou que tornam-se conhecidos, e incluem pepti- deos e nao peptideos. O agente de Iigagao de celula pode ser qualquer composto que pode Iigar uma celula, em uma maneira especifica ou nao especifica. Geralmente, estes podem ser anticorpos (especialmente anticor- pos monoclonais), linfocinas, hormonios, fatores de crescimento, vitaminas, moleculas de transporte de nutriente (tais como transferrina), ou qualquer outra molecula ou substancia de Iigagao de celula. Exemplos mais especificos de agentes de Iigagao de celula que
podem ser usados incluem: • anticorpos policlonais; • anticorpos monoclonais;
• fragmentos de anticorpos tais como Fab, Fab', e F(ab')2, Fv (Parham, 1983, J- Immunol” 131:2895-2902; Spring et ai, 1974，J. Immunol., 113: 470-478; Nisonoff etal., 1960，Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244).
Preferivelmente, um anticorpo anti-EphA humanizado e usado
como ο agente de Iigagao de celula da presente invengao. Mais preferivel- mente ο anticorpo anti-EphA humanizado e selecionado a partir de anticor- pos 37.3D7, 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1 ou EphA2-N2 humanizados ou ressurgidos. Agentes citotoxicos
Em uma outra modalidade, ο anticorpo humanizado ou um frag- mento de Iigagao de epitopo deste pode ser conjugado a um farmaco, tal como um maitansinoide ou um derivado de tomaimicina, para formar um pro- fa rmaco tendo citotoxicidade especifica com respeito as celulas que expres- sam antigeno alvejando-se ο farmaco ao receptor de EphA2. Conjugados citotoxicos compreendendo tais anticorpos e um farmaco pequeno, altamen- te toxico (por exemplo, maitansinoides, taxanos, derivados de tomaimicina, um derivado de leptomicina, CC-1065, e analogos de CC-1065) podem ser usados como um produto terapeutico para ο tratamento de tumores, tais co- mo tumores de mama e ovarianos.
〇 agente citotoxico usado no conjugado citotoxico da presente invengao pode ser qualquer composto que resulta na mode de uma celula, ou induz a morte celular, ou em alguma maneira diminui a viabilidade da ce- lula. Agentes citotoxicos preferidos incluem, por exemplo, maitansinoides e analogos de maitansinoide, um pro-farmaco, derivados de tomaimicina, ta- xoides, um derivado de leptomicina, CC-1065 e analogos de CC-1065, defi- nidos abaixo. Estes agentes citotoxicos sao conjugados aos anticorpos, anti- corpos fragmentos, equivalentes funcionais, anticorpos melhorados e seu analogos como descrito aqui. Os conjugados citotoxicos podem ser preparados por metodos in
vitro. De modo a Iigar um farmaco ou pro-farmaco ao anticorpo, um grupo de
Iigagao e usado. Grupos de Iigagao adequados sao bem-conhecidos na tec- nica e incluem grupos dissulfeto, grupos tioeter, grupos Iabeis em acido, grupos fotolabeis, grupos Iabeis em peptidase e grupos Iabeis em esterase. Grupos de Iigagao preferidos sao grupos dissulfeto e grupos tioeter. Por e- xemplo，conjugados podem ser construidos usando uma reagao de troca de dissulfeto ou formando-se uma Iigagao de tioeter entre ο anticorpo e ο far- maco ou pro-farmaco. Maitansinoides
Entre os agentes citotoxicos que podem ser usados na presente invengao para formar um conjugado citotoxico, estao maitansinoides e ana- logos de maitansinoide. Exemplos de maitansinoides adequados incluem maitansinol e analogos de maitansinol. Maitansinoides sao farmacos que inibem a formagao de microtiibulos e que sao altamente toxicos a celulas mamiferas.
Exemplos de analogos de maitansinol adequados incluem aque- Ies tendo um anel aromatico modificado e aqueles tendo modifica?5es em outras posigoes. Tais maitansinoides adequados sao descritos nas Patentes U.S. Ngs 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929； 4.331.598； 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533； 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; e 5.846.545.
Exemplos especificos de analogos adequados de maitansinol tendo um anel aromatico modificado incluem:
(1) C-19-descloro (Pat. U.S. Nq 4.256.746) (preparado por redu- gao de LAH de ansamitocina P2);
(2) C-20-hidroxi (ou C-20-desmetil) +/-C-19-descloro (Pat. U.S. Nes 4.361.650 e 4.307.016) (preparado por desmetilagao usando Streptomy- ces ou Actinomyces ou descloragao usando LAH); e
(3) C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/- descloro (Pat. U.S. Ng 4.294.757) (preparado por acilagao usando cloretos de acila).
Exemplos especificos de analogos adequados de maitansinol tendo modificagoes de outras posig5es incluem:
(1) C-9-SH (Pat. U.S. Ne 4.424.219) (preparado pela reagao de
maitansinol com H2S ou P2S5); (2) C-14-alcoximetila (desmet0xi/CH2OR) (Pat. U.S. Ns
4.331.598);
(3) C-14-hidroximetila ou aciloximetila (CH2OH ou CH2OAc) (Pat. U.S. Ns 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia)·,
(4) C-15-hidr0xi/aciloxi (Pat. U.S. Ns 4.364.866) (preparado pela
conversao de maitansinol por Streptomyces)·,
(5) C-15-metoxi (Pat. U.S. N2S 4.313.946 e 4.315.929) (isolado a partir de Trewia nudiflora)·,
(6) C-18-N-desmetila (Pat. U.S. NQs 4.362.663 e 4.322.348) (preparado pela desmetilagao de maitansinol por Streptomyces)·, e
(7) 4,5-desoxi (Pat. U.S. N2 4.371.533) (preparado pela redugao com tricloreto de titanio/LAH de maitansinol).
Em uma modalidade preferida, os conjugados citotoxicos da presente invengao utilizam ο maitansinoide contendo tiol (DM1), formalmente denominado N2'-desacetil-N2'-(3-mercapto-1- oxopropil)-maitansina, como ο agente citotoxico. DM1 e representado pela seguinte formula estrutural (I):
Em uma outra modalidade preferida, os conjugados citotoxicos da presente invengao utilizam ο maitansinoide contendo tiol N2.-desacetil-N2.- (4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina como ο agente citotoxico. DM4 e representado pela seguinte formula estrutural (II): Em outras modalidades da invengao, outras maitansinas, inclu- indo maitansinoides contendo tiol e dissulfeto portando uma substituigao de mono ou di-alquila no atomo de carbono portando ο atomo de enxofre, po- dem ser usadas. Estas incluem um maitansinoide tendo, em C-3, C-14 hi- droximetila, C-15 hidroxi, ou C-20 desmetila, uma cadeia lateral de aminoa- cido acilada com um grupo acila portando um grupo sulfidrila impedido, em que ο atomo de carbono do grupo acila portando a funcionalidade tiol tem um ou dois substituintes, os ditos substituintes sendo CH3, C2H5, alquila ou alquenila Iineares ou ramificados tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, fenila substituido, ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila, e outros em que um dos substituintes pode ser H, e em que ο grupo acila tem um comprimen- io da cadeia linear de pelo menos tres atomos de carbono entre a funcionali- dade carbonila e ο atomo de enxofre. Tais maitansinas adicionais incluem compostos representados
pela formula (III): em que: Y' representa
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CFl5R6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)sBt(CR3R4)nCR1 R2SZ, em que:
R1 e R2 sao todos independentemente CH3, C2H5, alquila ou al- quenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ra- mificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, feni- Ia substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila, e alem disso R2 pode ser H;
A, B, D sao cicloalquila ou cicloalquenila tendo 3 a 10 atomos de carbono, radical arila simples ou substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila;
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 e R12 sao todos independen- temente H, CH3, C2H5, alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ramificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 ato- mos de carbono, radical fenila, fenila substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila;
I，m, n, o, p, q, r, s, e t sao todos independentemente 0 ou um numero inteiro de 1 a 5，contanto que pelo menos dois de I，m, n, o, p, q, r, s e t nao sejam zero em nenhum momento; e
Z e H, SR ou -COR, em que R e alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ramificados ou cicli- cos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, ou radical arila simples ou substitu- ido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila.
Modalidades preferidas da formula (III) incluem compostos da formula (III) em que:
R1 e metila, R2 e H e Z e H.
R1 e R2 sao metila e Z e H. R1 e metila, R2 e H, e Z e -SCH3
R1 e R2 sao metila, e Z e -SCH3
Tais maitansinas adicionais tambem incluem compostos repre- sentados pela formula (IV-L)1 (IV-D)1 ou (IV-D.L):
(IV-L)
em que:
(IV-D) (JV-D1L)
Y representa (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3Fl4)nCR1R2SZ,
em que:
R1 e R2 sao todos independentemente CH3, C2H5, alquila ou al-
quenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ra- mificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, feni- Ia substituido, ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila, e alem disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 e R8 sao todos independentemente H, CH3,
C2H5, alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alqui- la ou alquenila ramificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, fenila substituido, ou heterociclico aromatico ou heterocicloal- quila;
I, m e η sao todos independentemente um numero inteiro de 1 a
5, e alem disso η pode ser 0;
Z e H, SR ou -COR em que R e alquila ou alquenila Iineares ou ramificados tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, ou radical arila simples ou substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila; e
May representa um maitansinoide que porta a cadeia lateral em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidroxi ou C-20 desmetila.
Modalidades preferidas das formulas (IV-L), (IV-D) e (IV-DtL) incluem compostos das formulas (IV-L), (IV-D) e (IV-D1L) em que: R1 e metila, R2 e H, R5, R6, R7, e R8 sao todos H, I e m sao todos
1, η e O, e Z e H.
R1 e R2 sao metila, R5, Re, R7, Re sao todos H，I θ m sao 1, π θ O, eZe H.
Ri e metila, R2 e H, R5, R6l R7, e R8 sao todos H, I e m sao todos 1, η e O1 e Ze-SCH3.
R1 e R2 sao metila, R5, R6, R7, R8 sao todos H, I e m sao 1, η e 0, eZe -SCH3.
Preferivelmente ο agente citotoxico e representado pela formula
(IV-L).
Tais maitansinas adicionais tambem incluem compostos repre- sentados pela formula (V):
em que:
Y representa (CR7R8)l(CR5Fi6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, em que:
R1 e R2 sao todos independentemente CH3, C2H5, alquila ou al· quenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ra- mificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, feni- Ia substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila, e alem disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, Re, R7 e R8 sao todos independentemente H, CH3, C2H5, alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alqui- Ia ou alquenila ramificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, fenila substituido, ou heterociclico aromatico ou heterocicloal- quila;
!,men sao todos independentemente um numero inteiro de 1 a 5’ e alem disso η pode ser 0; e
Z έ H’ SR ou -COR, em que R e alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ramificados ou cicli- cos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, ou radical arila simples ou substitu- ido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila.
Modalidades preferidas da formula (V) incluem compostos da formula (V) em que:
R1 e metila, R2 e H, R5, R6, R7, e R8 sao todos H; I e m sao todos 1; neO; eZe H.
R1 e R2 sao metila; R5, R6, R7, R8 sao todos H, I e m sao 1; η e 0;
eZe H.
R1 e metila, R2 e H1 R5, R6, R7, e R8 sao todos H, I e m sao todos 1，η e O, e Z e -SCH3.
R1 e R2 sao metila, R5, R6, R7, R8 sao todos H1 I e m sao 1, η e O1 e Z e -SCH3.
Tais maitansinas adicionais incluem ainda compostos represen- tados pela formula (Vl-L), (Vl-D), ou (VI-D1L):
(VI-L) (VI-D) (Vl-D, L)
em que:
Y2 representa (CR7FI5)丨(CFl5Fi6)m(CR3R4)nCR1 R2SZ2,
em que:
R1 e R2 sao todos independentemente CH3, C2H5, alquila ou al· quenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ra- mificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, feni- Ia substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila, e alem disso R2 pode ser H;
R3, R4, Rs, Re, R7 e R8 sao todos independentemente H, CH3, C2H5, linear alquila ou alquenila ciclicos tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ramificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de car- bono，radical fenila, fenila substituido ou heterociclico aromatico ou heteroci- cloalquila;
I, m e η sao todos independentemente um niimero inteiro de 1 a 5，e alem disso η pode ser 0;
Z2 e SR ou COR, em que R e alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ramificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, ou radical arila simples ou substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila; e May e um maitansinoide.
Tais maitansinas adicionais tambem incluem compostos repre- sentados pela formula (VII):
em que: Y21 represe 门 ta
(CR7R8)i(CR9=CR1o)p(C=C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CRi2)r(C=C)sBt(CR3R4)nCRi R2SZ2’ em que:
R1 e R2 sao todos independentemente CH3, C2H5, Iineares rami- ficados ou alquila ou alquenila tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, fenila substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila, e alem disso R2 pode ser H; A, B, e D todos independentemente sao cicloalquila ou cicloal· quenila tendo 3 a 10 atomos de carbono, radical arila simples ou substituido, ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila;
R3, R4, R5, Re. R7，Re, Rg, R10, R11, e R12 sao todos independen- temente H, CH3, C2H5, alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ramificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 ato- mos de carbono, radical fenila, fenila substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila;
I’ m, n, 0’ p, q, r, s, e t sao todos independentemente O ou um niimero inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, 0，p, q, r, s e t nao sejam zero em nenhum moment。； e
Z2 e SR ou -COR, em que R e alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ramificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, ou radical arila simples ou substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila.
Modalidades preferidas da formula (VII) incluem os compostos da formula (VII) em que: R1 e metila, R2 e H.
Os maitansinoides mencionados acima podem ser conjugados ao anticorpo anti-EphA 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2 ou um homologo ou fragmento deste, em que ο anticorpo e Iigado ao mai- tansinoide usando a funcionalidade tiol ou dissulfeto que esta presente no grupo acila de uma cadeia lateral de aminoacido acilada encontrada em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidroxi ou C-20 desmetila do maitansinoide, e em que ο grupo acila da cadeia lateral de aminoacido acilada tern sua funciona- lidade tiol ou dissulfeto Iocalizada em um atomo de carbono que tern um ou dois substituintes, os ditos substituintes sendo CH3, C2H5, alquila ou alqueni- la Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ramifica- dos ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, fenila substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila, e alem disso um dos substituintes pode ser H, e em que ο grupo acila tem um comprimento da cadeia linear de pelo menos tres atomos de carbono entre a funcionalida-
de carbonila e 0 atomo de enxofre. Um conjugado preferido da presente invengao e ο Cinico que compreende ο anticorpo anti-EphA 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2 ou um homologo ou fragment。deste, conjugado a um maitansi- noide da formula (VIII):
ο
(VlII)
em que:
Yi' representa
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(CEC)qAr(CFI5Fl6)mDu(CR11=CR12)r(OC)sBt(CR3R4)nCR1 R2S-,
em que:
A, B, e D, todos independentemente sao cicloalquila ou cicloal-
quenila tendo 3 a 10 atomos de carbono, radical arila simples ou substituido, ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila;
R3，R4, R5, Re, R7, Re, R9, R10. R11, e R12 sao todos independen- temente H, CH3, C2H5, alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ramificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 ato- mos de carbono, radical fenila, fenila substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloalquila; e
I, m, n, 0, p, q, r, s, e t sao todos independentemente O ou um numero inteiro de 1 a 5，contanto que pelo menos dois de I, m, n, 0, p, q, r, s
20
e t nao sejam zero em nenhum momento. Preferivelmente1 R1 e metila, R2 e H, ou R1 e R2 sao metila. Um conjugado ainda mais preferido da presente invengao e ο unico que compreende ο anticorpo anti-EphA 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, E- phA2-N1 ou EphA2-N2 ou um homologo ou fragmento deste, conjugado a um maitansinoide da formula (IX-L), (IX-D)1 ou (IX-D1L):
Ma/ J N γι May, 丫, May,
O 丨 O I
(IX-L) (IX-D) (IX-D.L)
em que:
Y1 represents (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2S-, em que:
R1 e R2 sao todos independentemente CH3, C2H5, alquila ou a卜 quenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alquila ou alquenila ra- mificados ou cfcIicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, feni- Ia substituido, heterociclico aromatico ou heterocicloalquila, e alem disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 e R8 sao todos independentemente H, CH3, C2H5, alquila ou alquenila Iineares tendo de 1 a 10 atomos de carbono, alqui- la ou alquenila ramificados ou ciclicos tendo de 3 a 10 atomos de carbono, radical fenila, fenila substituido ou heterociclico aromatico ou heterocicloal- quila;
I, m e η sao todos independentemente um niimero inteiro de 1 a 5，e alem disso η pode ser 0; e
May representa um maitansinol que porta a cadeia lateral em C- 3，C-14 hidroximetila, C-15 hidr0xi ou C-20 desmetila.
Modalidades preferidas das formulas (IX-L), (IX-D) e (IX-D1L) incluem os compostos das formulas (IX-L), (IX-D) e (IX-D1L) em que: Ri e metila, R2 e H, ou R1 e R2 sao metila,
R1 e metila, R2 e H, R5, R6, R7 e R8 sao todos H; I e m sao todos 1; η é Ο,
Ri e R2 são metila; R5, R6, R7 e R8 são todos Η; I e m são 1; η é 0.
Preferivelmente o agente citotóxico é representado pela fórmula
(IX-L).
Um outro conjugado preferido da presente invenção é o único que compreende o anticorpo anti-EphA 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2 ou um homólogo ou fragmento deste, conjugado a um maitan- sinóide da fórmula (X):
(X)
em que os substituintes são como definidos para a fórmula (IX) acima.
Especialmente preferidos são qualquer um dos compostos des- critos acima, em que Ri é H1 R2 é metila, R5, R6, R7 e R8 são todos Η, I e m são todos 1, e η é 0.
Mais especialmente preferidos são qualquer um dos compostos descritos acima, em que Ri e R2 são metila, R5, Re, R7, Re são todos Η, I e m são 1, e η é 0.
Além disso, o estereoisômero L-aminoacila é preferido.
Cada um dos maitansinóides mostrados no Pedido de Patente U.S. pendente número 10/849.136, depositado em 20 de Maio de 2004, também pode ser usado no conjugado citotóxico da presente invenção. A descrição inteira do Pedido de Patente U.S. número 10/849.136 é incorpora- da aqui por referência. Grupos de ligação contendo dissulfeto
De modo a ligar o maitansinóide a um agente de ligação de célu- Ia, tal como o anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2, o maitansinóide compreende uma porção de ligação. A porção de ligação contém uma ligação química que leva em consideração a liberação de mai- tansinóides completamente ativos em um sítio particular. Ligações químicas adequadas são bem-conhecidas na técnica e incluem ligações de dissulfeto, ligações lábeis em ácido, ligações fotolábeis, ligações lábeis em peptidase e ligações lábeis em esterase. Preferidas são ligações de dissulfeto.
A porção de ligação também compreende um grupo químico rea- tivo. Em uma modalidade preferida, o grupo químico reativo pode ser cova- Ientemente ligado ao maitansinóide por intermédio de uma porção de ligação de ligação de dissulfeto.
Grupos químicos reativos particularmente preferidos são ésteres N-succinimidílicos e ésteres N-sulfossuccinimidílicos.
Maitansinóides particularmente preferidos compreendendo uma porção de ligação que contém um grupo químico reativo são ésteres C-3 de maitansinol e seus análogos onde a porção de ligação contém uma ligação de dissulfeto e o grupo químico reativo compreende um éster N- succinimidílico ou N-sulfossuccinimidílico.
Muitas posições nos maitansinóides podem servir como a posi- ção para ligar quimicamente a porção de ligação. Por exemplo, a posição C- 3 tendo um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C-15 modificada com hidróxi e a posição C-20 tendo um grupo hi- dróxi são todas esperadas serem úteis. Entretanto a posição C-3 é preferida e a posição C-3 de maitansinol é especialmente preferida.
Embora a síntese de ésteres de maitansinol tendo uma porção de ligação seja descrita em termos de porções de ligação contendo ligação de dissulfeto, uma pessoa de habilidade na técnica entenderá que porções de ligação com outras ligações químicas (como descrito acima) também po- dem sem usadas com a presente invenção, como podem outros maitansi- nóides. Exemplos específicos de outras ligações químicas incluem ligações lábeis em ácido, ligações fotolábeis, ligações lábeis em peptidase e ligações lábeis em esterase. A descrição de Patente U.S. N9 5.208.020, incorporada aqui, mostra a produção de maitansinóides que porta tais ligações.
A síntese de maitansinóides e derivados de maitansinóide tendo uma porção de dissulfeto que porta um grupo reativo é descrita nas Patentes U.S. NQs 6.441.163 e 6.333.410, e Pedido U.S. Ne 10/161.651, cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Os maitansinóides contendo grupo reativo, tais como DM1, são
reagidos com um anticorpo, tal como o anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2, para produzir conjugados citotóxicos. Estes conju- gados podem ser purificados por HPLC ou por filtração em gel.
Vários esquemas excelentes para produzir tais conjugados de anticorpo-maitansinóide são fornecidos na Patente U.S. Ns 6.333.410, e Pe- didos U.S. N-s 09/867.598, 10/161.651 e 10/024.290, cada um dos quais é incorporado aqui em sua totalidade.
Em geral, uma solução de um anticorpo em tampão aquoso po- de ser incubada com um excesso molar de maitansinóides tendo uma por- ção de dissulfeto que porta um grupo reativo. A mistura de reação pode ser extinta por adição de amina em excesso (tal como etanolamina, taurina, etc.). O conjugado de maitansinóide-anticorpo depois pode ser purificado por filtração em gel.
O número de moléculas de maitansinóide ligadas por molécula de anticorpo pode ser determinado medindo-se espectrofotometricamente a razão da absorbância a 252 nm e 280 nm. Uma média de 1 a 10 moléculas de maitansinóide/molécula de anticorpo é preferida.
Conjugados de anticorpos com fármacos de maitansinóide po- dem ser avaliados quanto à sua capacidade para suprimir a proliferação de várias linhagens de célula indesejadas in vitro. Por exemplo, linhagens de célula tais como a linhagem de carcinoma epidermóide humano A-431, a linhagem de célula de câncer pulmonar de célula pequena humana SW2, a linhagem de tumor de mama humano SKBR3 e a linhagem de célula de Iin- foma de Burkitt Namalwa podem ser facilmente usadas para a avaliação da citotoxicidade destes compostos. Células a serem avaliadas podem ser ex- postas aos compostos durante 24 horas e as frações de sobrevivência de células medidas em ensaios diretos por métodos conhecidos. Valores de IC5O depois podem ser calculados dos resultados dos ensaios. Grupos de ligação contendo PEG
Maitansinóides também podem ser ligados a agentes de ligação de célula usando grupos de ligação de PEG1 como apresentado no Pedido U.S. N9 10/024.290. Estes grupos de ligação de PEG são solúveis tanto em água quanto em solventes não aquosos, e podem ser usados para unir um ou mais agentes citotóxicos a um agente de ligação de célula. Grupos de ligação de PEG exemplares incluem Iigantes de PEG heterobifuncionais que ligam-se a agentes citotóxicos e agentes de ligação de célula em extremida- des opostas dos Iigantes através de um grupo sulfidrila ou dissulfeto funcio- nal em uma extremidade, e um éster ativo na outra extremidade.
Como um exemplo geral da síntese de um conjugado citotóxico usando um grupo de ligação de PEG1 a referência é novamente feita ao Pe- dido U.S. N6 10/024.290 para detalhes específicos. A síntese começa com a reação de um ou mais agentes citotóxicos portando uma porção de PEG reativa com um agente de ligação de célula, resultando no deslocamento do éster ativo terminal de cada porção de PEG reativa por um resíduo de ami- noácido do agente de ligação de célula, tal como o anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2, para produzir um conjugado cito- tóxico compreendendo um ou mais agentes citotóxicos covalentemente liga- dos a um agente de ligação de célula através de um grupo de ligação de PEG. Taxanos
O agente citotóxico usado nos conjugados citotóxicos de acordo com a presente invenção também podem ser um taxano ou derivado deste.
Taxanos são uma família de compostos que inclui paclitaxel (ta- xol), um produto natural citotóxico, e docetaxel (Taxotere), um derivado se- 10
mi-sintético, dois compostos que são amplamente usados no tratamento de câncer. Taxanos são tóxicos de eixo mitótico que inibem a despolimerização de tubulina, resultando na morte celular. Embora docetaxel e paclitaxel se- jam agentes úteis no tratamento de câncer, sua atividade antitumor é limita- da por causa de sua toxicidade não específica com respeito a células nor- mais. Além disso, compostos como paclitaxel e docetaxel por si só não são suficientemente potentes para serem usados em conjugados de agentes de ligação de célula.
Um taxano preferido para o uso na preparação de conjugados citotóxicos é o taxano da fórmula (XI):
Õ OAc >=0
(XI)
MeO
OMe
Métodos para sintetizar taxanos que podem ser usados nos con- jugados citotóxicos da presente invenção, junto com métodos para conjugar os taxanos a um agente de ligação de célula, tal como o anticorpo 37.307, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou EphA2-N2, são descritos em detalhe nas Patentes U.S. N2S 5.416.064, 5.475.092, 6.340.701, 6.372.738 e 6.436.931, e nos Pedidos U.S. NQs 10/024.290, 10/144.042, 10/207.814, 10/210.112 e 10/369.563.
Derivados de tomaimicina
O citotóxico de acordo com a presente invenção também pode ser um derivado de tomaimicina. Derivados de tomaimicina são pirro- lo[1,4]benzodiazepinas (PBDs)1 uma classe conhecida de compostos que exercem suas propriedades biológicas ligando-se covalentemente ao N2 de guanina no sulco menor de DNA. PBDs incluem vários Iigantes de sulco me- nor tais como antramicina, neotramicina e DC-81. Novos derivados de tomaimicina que mantêm citotoxicidade ele- vada e que podem ser efetivamente ligados a agentes de ligação de célula são descritos no Pedido Internacional Nq PCT/IB2007/000142, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. Os complexos de agente de ligação de célula-derivado de tomaimicina permitem a medição completa da ação cito- tóxica dos derivados de tomaimicina a serem aplicados em uma forma alve- jada contra células indesejadas apenas, evitando portanto efeitos colaterais devido ao dano a células saudáveis não alvejadas.
O agente citotóxico de acordo com a presente invenção compre- ende um ou mais derivados de tomaimicina, ligados a um agente de ligação de célula, tal como o anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1 ou E- phA2-N2, por intermédio de um grupo de ligação. O grupo de ligação é parte de uma porção química que é covalentemente ligada a um derivado de to- maimicina através de métodos convencionais. Em uma modalidade preferi- da, a porção química pode ser covalentemente ligada ao derivado de tomai- micina por intermédio de uma ligação de dissulfeto.
Os derivados de tomaimicina úteis na presente invenção têm a fórmula (XII) mostrada abaixo:
(XII)
em que
—- representa uma ligação única opcional;
—- representa uma ligação única ou uma ligação dupla; contanto que quando —- representa uma ligação única, U e U', os mesmos ou diferentes, independentemente representam H, e W e W', os mesmos ou diferentes, são independentemente selecionados do grupo consistindo em OH, um éter tal como -OR, um éster (por exemplo, um acetato), tal como - OCOR, um carbonato tal como -OCOOR, um carbamato tal como - O- CONRR', um carbamato cíclico, tal que N10 e C11 são uma parte do ciclo, uma uréia tal como -NRCONRR', um tiocarbamato tal como -OCSNHR, um tiocarbamato cíclico tal que N10 e C11 são uma parte do ciclo, -SH1 um sul- feto tal como -SR, um sulfóxido tal como -SOR, uma sulfona tal como - SOOR, um sulfonato tal como -S03 -, uma sulfonamida tal como -NRSOOR, uma amina tal como -NRR', opcionalmente amina cíclica tal que N10 e C11 são uma parte do ciclo, um derivado de hidroxilamina tal como -NROR', uma amida tal como -NRCOR, um azido tal como -N3, um ciano, um halo, um trialquila ou triarilfosfônio, um grupo derivado de aminoácido; Preferivelmen- te W e W' são os mesmos ou diferentes e são OH, Ome, Oet1 NHCONH2, SMe;
e quando —- representa uma ligação dupla, UeU' estão ausentes e W e W1 representam H;
• R1, R2, R1', R2' são os mesmos ou diferentes e independentemente esco- Ihidos de Haleto ou Alquila opcionalmente substituído por um ou mais Hal,
CN, NRR', CF3, OR, Arila, Het, S(O)qR,
ou R1 e R2 e R1' e R2' formam juntos uma ligação dupla contendo grupo =B e =B' respectivamente.
Preferível mente, R1 e R2 e R1' e R2' formam juntos uma ligação dupla contendo grupo =B e =B' respectivamente.
• B e B1 são os mesmos ou diferentes e independentemente escolhidos de Alquenila sendo opcionalmente substituídos por um ou mais Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arila, Het, S(O)qR ou B e B' representam um átomo de oxigênio.
Preferivelmente, B=B'. Mais preferivelmente, B=B'= =CH2 ou =CH-CH3,
• Χ, X' são os mesmos ou diferentes e independentemente escolhidos de um ou mais -O-, -NR-, -(C=O)-, -S(O)q-.
Preferivelmente, X=X'. Mais preferivelmente, X=X1=O. · A, A' são os mesmos ou diferentes e independentemente escolhidos de Alquila ou Alquenila opcionalmente contendo um átomo de oxigênio, um de nitrogênio ou um de enxofre, todos sendo opcionalmente substituídos por um ou mais Hal1 CN, NRR', CF3, 0R, S(O)qR, Arila, Het1 Alquila, Alquenila. Preferivelmente, A=A'.
Mais preferivelmente, A=A'=alquila linear não substituído. • Y, Y1 são os mesmos ou diferentes e independentemente escolhidos de H, OR;
Preferivelmente, Y=Y'.
Mais preferivelmente, Y=Y1=OAIquiIa1 mais preferivelmente OMe-
tila.
•Té -NR-, -O-, -S(O)q., ou uma arila, cicloalquila, heterocíclico ou heteroarila de 4 a 10 membros, todos sendo opcionalmente substituídos por um ou mais Hal1 CN1 NRR', CF3, R, OR1 S(O)qR, e/ou ligante(es), ou um Alquila ramifica- do, opcionalmente substituído por um ou mais Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR e/ou ligante(es), ou um Alquila linear substituído por um ou mais Hal, CN, NRR', CF3, OR1 S(O)qR e/ou ligante(es). Preferivelmente, T é um arila ou heteroarila de 4 a 10 membros,
mais preferivelmente fenila ou piridila, opcionalmente substituído por um ou mais ligante(es).
O dito Iigante compreende um grupo de ligação. Grupos de liga- ção adequados são bem-conhecidos na técnica e incluem grupos tiol, sulfe- to, dissulfeto, grupos tioéter, grupos lábeis em ácido, grupos fotolábeis, gru- pos lábeis em peptidase e grupos lábeis em esterase. Preferidos são grupos dissulfeto e grupos tioéter.
Quando o grupo de ligação for um grupo contendo tiol-, sulfeto (ou assim chamado tioéter -S-) ou dissulfeto (-S-S-), a cadeia lateral que por- ta o tiol, o grupo sulfeto ou dissulfeto pode ser linear ou ramificado, aromáti- co ou heterocíclico. Uma pessoa versada na técnica pode facilmente identifi- car as cadeias laterais adequadas.
Preferivelmente, o dito Iigante é da fórmula; -G-D-(Z)P-S-Z' onde
G é uma ligação única ou dupla, -O-, -S- ou -NR-;
D é uma ligação única ou -E-, -E-NR-, -E-NR-F-, -Ε-O-, -E-O-F-, -E-NR-CO-, -E-NR-CO-F-, -Ε-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-NR-C-S-, -E-NR- CS-F-;
onde EeF são os mesmos ou diferentes e são independentemente escolhi- dos de -(OCH2CH2)iAlquil(OCH2CH2)j-, -Alquil(OCH2CH2)i-Alquil-, - (OCH2CH2)i-, -(OCH2CH2)iCicloalquil(OCH2CH2)j-,
(OCH2CH2)iHeterocíclico(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iAril(OCH2CH2)j-, - (OCH2CH2)iHeteroaril(OCH2CH2)j-, -Alquil(OCH2CH2)iAlquil(OCH2CH2)j-, -Alquil-(OCH2CH2)i-, -Alquil(OCH2CH2)iCicloalquil(OCH2CH2)j-, Alquil(OCH2CH2)iHeterocíclico(OCH2CH2)j-, -AIquiI-
(OCH2CH2)iAril(OCH2CH2)j-, -Alquil(OCH2CH2)iHeteroaril(OCH2CH2)]-, - Cicloalquil-Alquila-, -Alquil-Cicloalquila-, -Heterocíclico-Alquila-, -AIquiIa- Heterocíclico-, -Alquil-Arila-, -Aril-Alquila-, -Alquil-Heteroarila-, -HeteroariI- Alquila- lineares ou ramificados;
onde i e j, indênticos ou diferentes são números inteiros e independentemen- te escolhidos de O, 1 a 2000; Z é -AIquiI- linear ou ramificado; ρ é 0 ou 1;
Z' representa H1 um grupo de proteção de tiol tal como COR, R20 ou SR20, em que R20 representa H, metila, Alquila, Cicloalquila opcionalmente substi- tuído, arila, heteroarila ou heterocíclico, contanto que quando Z1 for Η, o dito composto está em equilíbrio com o composto correspondente formado por ciclização intramolecular que resulta da adição do grupo tiol -SH na ligação de imina -NH= de uma das porções de PBD.
• n, n', iguais ou diferentes são 0 ou 1. · q é 0, 1 ou 2.
• R, R' são iguais ou diferentes e independentemente escolhidos de H1 Alqui- la, Arila, todos sendo opcionalmente substituídos por Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR, Arila, Het;
ou seus sais, hidratos, ou sais hidratados farmaceuticamente aceitáveis, ou as estruturas cristalinas polimórficas destes compostos ou seus isômeros ópticos, racematos, diastereômeros ou enatiômeros.
Os compostos da fórmula geral (XII) tendo geométricos e este- reoisômeros também são uma parte da invenção.
A ligação dupla N-10, C-11 de derivados de tomaimicina da fór- mula (XII) é conhecido ser facilmente conversível em uma maneira reversível a adutos de imina correspondentes na presença de água, um álcool, um tiol, uma amina primária ou secundária, uréia e outros nucleófilos. Este processo é reversível e pode regenerar facilmente os derivados de tomaimicina cor- respondentes na presença de um agente desidratante, em um solvente or- gânico não prótico, a vácuo ou em temperaturas elevadas (Z. Tozuka, 1983, J. Antibiotics, 36: 276).
Assim, derivados reversíveis de derivados de tomaimicina da fórmula geral (XIII) também podem ser usados na presente invenção:
(XlII)
onde A, Χ, Υ, η, Τ, A', X', Y1, n1, R1, R2, R1\ R2' são definidos como na fór- mula (XII) e W, W' são os mesmos ou diferentes e são selecionados do gru- po consistindo em OH, um éter tal como -OR1 um éster (por exemplo, um acetato), tal como -OCOR, -COOR, um carbonato tal como -OCOOR, um carbamato tal como -OCONRR', um carbamato cíclico, tal que N10 e C11 são uma parte do ciclo, uma uréia tal como -NRCONRR', um tiocarbamato tal como -OCSNHR, um tiocarbamato cíclico tal que N10 e C11 são uma parte do ciclo, -SH, um sulfeto tal como -SR, um sulfóxido tal como -SOR, uma sulfona tal como - SOOR, um sulfonato tal como -S03-, uma sulfonami- da tal como -NRSOOR, uma amina tal como -NRR', opcionalmente amina cíclica tal que N10 e C11 são uma parte do ciclo, um derivado de hidroxila- mina tal como -NROR', uma amida tal como -NRCOR, - NRCONRR', um a- zido tal como -N3, um ciano, um halo, um trialquila ou triarilfosfônio, um gru- po derivado de aminoácido. Preferivelmente, WeW' são os mesmos ou dife- rentes e são OH, Ome, Oet, NHC0NH2, SMe. Os compostos da fórmula (XIII) assim podem ser considerados como solvatos, incluindo água quando o solvente for água; estes solvatos podem ser particularmente úteis.
Em uma modalidade preferida, os derivados de tomaimicina da invenção são selecionados do grupo consistindo em:
8,8'-[1,3-benzenodi-ilbis(metileno-óxi)1 -bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi- 1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
8,8'-[5-metóxi-1,3-benzenodi-ilbis(metileno-óxi)-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7- metóxi-1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
8,8'-[1,5-pentanodi-ilbis(óxi)-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11 a- tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[1,4-butanodi-ilbis(óxi)-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11 a-tetra- hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
8,8'-[3-metil-1,5-pentanodi-ilbis(óxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi- 1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[2,6-piridinodi-ilbis(óxi)-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11 a-tetra- hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[4-(3-terc-butoxicarbonilaminopropilóxi)-2,6-piridinodi-ilbis-(metileno- óxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(3-aminopropilóxi)-1,3-benzenodi-ilbis(metileno-óxi)]-bis[(S)-2-et-(E)- ilideno-7-metóxi-1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]-benzodiazepin-5- ona]
• 8,8'-[5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)-1,3-benzenodi-ilbis- (metileno-óxi)-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-5H- pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-{5-[3-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoilamino)propilóxi]-1,3- benzeno- di-ilbis(metileno-óxi)}-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro- 5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-acetiltiometil-1,3-benzenodi-ilbis(metileno-óxi)]-bis[(S)-2- metileno-7- metóxi-1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 - c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• Éster terc-butílico do ácido bis-{2-[(S)-2-metileno-7-metóxi-5-oxo-1,3„11a- tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-8-ilóxi]-etil)-carbâmico
• 8,8'-[3-(2-acetiltioetil)-1,5-pentanodi-ilbis(óxi)-bis[(S)-2-metileno-7- metóxi- 1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(N-4-mercapto-4,4-dimetilbutanoil)amino-1,3-benzenodi-ilbis- (metileno-óxi)-bis[7-metóxi-2-metileno-1,2,3,11a-tetra-hidro-5H^irrolo[2,1-
c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(N-4-metilditio-4,4-dimetilbutanoil)-amino-1,3-benzenodi-ilbis- (metileno-óxi)]-bis[7-metóxi-2-metileno-1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 - c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
· 8,8'-[5-(N-metil-N-(2-mercapto-2,2-dimetiletil)amino-1,3-benzenodi-il-
(metileno-óxi)]-bis[7-metóxi-2-metileno-1,2,3,11 a-tetra-hidro5H-pirrolo[2,1 - c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(N-metil-N-(2-metilditio-2,2-dimetiletil)amino-1,3-benzenodi-il- (metileno-óxi)-bis[7-metóxi-2-metileno-1,2,3,11a-tetra-hidro5H-pirrolo[2,1-
c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(2-(4-mercapto-4-metil)^entanamido-etóxi)-piridin-2,6-dimetil)- dió- xi-]bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-pirrolo[2,1-
c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(1 -(2-(4-metil-4-metildissulfanil)-pentanamido-etóxi)-benzeno-3,5- di- metil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-
pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(3-(4-metil-4-metildissulfanil)-pentanamido-propóxi)-piridin-2,6- di- metil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro- pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
· 8,8'-[(4-(4-(4-metil-4-metildissulfanil)-pentanamido-butóxi)-piridin-2,6^ dime- til)-dióxi-]bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(3-[4-(4-metil-4-metildissulfanil^entanoil)-piperazin-1-il]-propil)- piridin-2,6-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetra-
hidro-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(1 -(3-[4-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoil)-piperazin-1 -il]-propil)- benzeno-3,5-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetra- hidro-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoilamino)-etóxi]-etóxi}- etóxi)-piridin-2,6-dimetil)-dióxi]^is[^ ,2,3,11 a- tetra-hidro-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
· 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoilamino)-etóxi]- etóxi}-etóxi)-etóxi]-etóxi}-etóxi)-benzeno-3,5-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2- et-(E)- ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-pirrolo[2,1 - c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'4(1 -(2-{2-[2-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoilamino)-etóxi]-etóxi}- etóxi)-benzeno-3,5-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-
1,2,3,11a-tetra-hidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
8,8'-[(4-(2-{2-[2-(242-[2-(4-metil-4-metildissulfanil^entanoilamino)-etóxn^ etóxi}-etóxi)-etóxi]-etóxi}-etóxi)-piridin-2,6-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-el· ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5- ona]
• 8,8'-[(1 -(2-[metil-(2-metil-2-metildissulfanil-propil)-aminol-etóxi)- benzeno- 3,5-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetra-hidro- pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(3-[metil-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoil)-amino]-propil)-piri^ 2,6-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetra-hidro-
pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(3-[metil-(2-metil-2-metildissulfann-propil)-amino]-propil)-piridin-2,6- dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hid pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
· 8,8,[(1-(4-metil-4-metildissulfanil)-pentanamido)-benzeno-3,5-dimetil)- dió- xi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
assim como os derivados de mercapto correspondentes, ou seus sais, hidra- tos, ou sais hidratados farmaceuticamente aceitáveis, ou as estruturas crista- Iinas polimórficas destes compostos ou seus isômeros ópticos, racematos, diastereômeros ou enatiômeros.
Compostos preferidos são aqueles da fórmula: ou
H « .X-An-T-Α'η'-Χ'
onde Χ, X', A, A1, Y, Y', T, n, n' são definidos como acima.
Os compostos da fórmula (XII) podem ser preparados em vários modos bem-conhecidos àqueles versados na técnica. Os compostos podem ser sintetizados, por exemplo, por aplicação ou adaptação dos métodos des- critos abaixo, ou variações nestes como avaliado pelo técnico versado. As modificações e substituições apropriadas estarão prontamente evidentes e serão bem-conhecidas ou facilmente obteníveis a partir da literatura científi- ca àqueles versados na técnica. Em particular, tais métodos podem ser en- contrados em R.C. Larock1 Comprehensive Organic Transformations, Wiley- VCH Publishers, 1999.
Métodos para sintetizar os derivados de tomaimicina que podem ser usados na invenção são descritos no Pedido Internacional Ne PCT/IB2007/000142. Os compostos da presente invenção podem ser prepa- rados por uma variedade de vias sintéticas. Os reagentes e materiais de par- tida estão comercialmente disponíveis, ou são facilmente sintetizados por técnicas bem-conhecidas por uma pessoa de habilidade comum nas técni- cas (ver, por exemplo, WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 2005/085260, FR1516743, M. Mori et ai, 1986, Tetrahedron, 42: 3793- 3806).
As moléculas conjugadas da invenção podem ser formadas u-
sando quaisquer técnicas. Os derivados de tomaimicina da invenção podem ser ligados a um anticorpo ou outro agente de ligação de célula por intermé- dio de um Iigante lábil em ácido, ou por um Iigante fotolábil. Os derivados podem ser condensados com um peptídeo tendo uma seqüência adequada e subseqüentemente ligados a um agente de ligação de célula para produzir um Iigante lábil em peptidase. Os conjugados podem ser preparados para conter um grupo hidroxila primário, que pode ser succinilado e ligado a um agente de ligação de célula para produzir um conjugado que pode ser cliva- do por esterases intracelulares para liberar o derivado livre. Preferivelmente, os derivados são sintetizados para conter um grupo tiol livre ou protegido, e depois um ou mais derivados contendo dissulfeto ou tiol são todos covalen- temente ligados ao agente de ligação de célula por intermédio de uma Iiga- ção de dissulfeto ou uma ligação de tioéter.
Numerosos métodos de conjugação são mostrados na USP 5.416.064 e USP 5.475.092. Os derivados de tomaimicina podem ser modifi- cados para produzir um grupo amino livre e depois ligados a um anticorpo ou outro agente de ligação de célula por intermédio de um Iigante lábil em ácido ou um Iigante fotolábil. Os derivados de tomaimicina com um grupo amino ou carboxila livre podem ser condensados com um peptídeo e subseqüente- mente ligados a um agente de ligação de célula para produzir um Iigante lábil em peptidase. Os derivados de tomaimicina com um grupo hidroxila li- vre no Iigante podem ser succinilados e ligados a um agente de ligação de célula para produzir um conjugado que pode ser clivado por esterases intra- celulares para liberar o fármaco livre. O mais preferivelmente, os derivados de tomaimicina são tratados para criar um grupo tiol livre ou protegido, e de- pois os dímeros de tomaimicina contendo dissulfeto ou tiol são ligados ao agente de ligação de célula por intermédio de ligações de dissulfeto. Preferivelmente, conjugados de anticorpo monoclonal- ou agente
de ligação de célula-derivado de tomaimicina são aqueles que são unidos por intermédio de uma ligação de dissulfeto, como debatido acima, que são capazes de liberar derivados de tomaimicina. Tais conjugados de ligação de célula são preparados por métodos conhecidos tais como modificando-se anticorpos monoclonais com piridil-ditiopropionato de succinimidila (SPDP) (Carlsson et al., 1978, Biochem. J., 173: 723-737). O grupo tiopiridila resul- tante depois é deslocado por tratamento com derivados de tomaimicina con- tendo tiol para produzir conjugados ligados a dissulfeto. Alternativamente, no caso dos derivados de tomaimicina de arilditio, a formação do conjugado de ligação de célula é efetuada por deslocamento direto do aril-tiol do derivado de tomaimicina por grupos sulfidrila previamente introduzidos em moléculas de anticorpo. Conjugados contendo 1 a 10 fármacos derivados de tomaimi- cina ligados por intermédio de uma ponte de dissulfeto são facilmente prepa- rados por qualquer método.
Mais especificamente, uma solução do anticorpo modificado por ditio-nitropiridila em uma concentração de 2,5 mg/ml em tampão de fosfato de potássio 0,05 M, no pH 7,5 contendo 2 mM de EDTA é tratada com o de- rivado de tomaimicina contendo tiol (1,3 eq. molar/grupo ditiopiridila). A libe- ração de tio-nitropiridino a partir do anticorpo modificado é monitorada es- pectrofotometricamente em 325 nm e é completa em cerca de 16 horas. O conjugado de anticorpo-derivado de tomaimicina é purificado e isento de fármaco não reagido e outro material de peso molecular baixo por filtração em gel através de uma coluna de Sephadex G25 ou Sephacryl S300. O nú- mero de porções de derivado de tomaimicina ligadas por molécula de anti- corpo pode ser determinado medindo-se a razão da absorbância em 230 nm e 275 nm. Uma média de 1 a 10 moléculas de derivado de tomaimici- na/molécula de anticorpo pode ser ligada por intermédio de ligações de dis- sulfeto por este método.
O efeito de conjugação sobre a afinidade de ligação com respei- to às células que expressam antígeno pode ser determinado usando os mé- todos previamente descritos por Liu et ai, 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 93: 8618-8623. A citotoxicidade dos derivados de tomaimicina e seus conjugados de anticorpo para linhagens de célula pode ser medida por retro- extrapolação de curvas de proliferação celular como descrito em Goldma- cher et aí., 1985, J. Immunol., 135: 36483651. A citotoxicidade destes com- postos para linhagens de célula aderentes pode ser determinada por ensaios clonogênicos como descrito em Goldmacher et ai, 1986, J. Cell Biol., 102: 1312-1319.
Derivados de Ieptomicina O citotóxico de acordo com a presente invenção também pode um derivado de leptomicina. De acordo com a presente invenção, "derivados de leptomicina" referem-se a membros da família de leptomicina como defi- nido em Kalesse et ai (2002, Synthesis 8: 981-1003), e inclui: leptomicinas, tais como leptomicina A e leptomicina B, calistatinas, ratjadones tais como ratjadone A e ratjadone B, anguinomicinas tais como anguinomicina A, B, C, D, casusamicinas, leptolstatina, leptofuraninas, tais como Ieptofuranina A, B, C, D. Derivados de leptomicina AeB são preferidos.
Mais especificamente, os derivados da invenção são da fórmula
(I):
R17
(!)
em que
Ra e Ra' são H ou -Alk; preferivelmente Ra é -Alk, preferivelmente metila e Ra' é H;
R17 é alquila opcionalmente substituído por OR1 CN, NRR', perfluoroalquila; preferivelmente, R17 é alquila, mais preferivelmente metila ou etila;
R9 é alquila opcionalmente substituído por OR, CN, NRR1, perfluoroalquila; preferivelmente, R9 é alquila, mais preferivelmente metila; X é -O- ou -NR-; preferivelmente, X é -NR-; Y é -U-, -NR-U-, -0-U-, -NR-CO-U-, -U-NR-CO-, -U-CO-, -CO-U-; preferivelmente, quando X for -O-, Y é -U-, -NR-U-, -U-NR-CO-;
onde U é escolhido de -Alk- linear ou ramificado, -AIk(OCH2CH2)m-, - (OCH2CH2)m-AIk-, -AIk(OCH2CH2)m-AIk-, -(OCH2CH2)m-, -Cicloalquil-, - Heterocíclico-, -Cicloalquil-Alk-, -Alk-Cicloalquil-, -Heterocíclico-Alk-, -AIk- Heterocíclico-;
onde m é um número inteiro escolhido de 1 a 2000; preferivelmente, U é -AIk- linear ou ramificado, Z é -AIk-;
η é 0 ou 1; preferivelmente η é 0;
T representa H, um grupo de proteção de tiol tal como Ac, Ri ou SRi, em que R1 representa H, metila, Alk1 Cicloalquila, arila opcionalmente substituí- do ou heterocíclico, ou T representa
R17
onde:
Ra, Ra', R17, R9, Χ, Υ, Ζ, η são definidos como acima; preferivelmente, T é H ou SRil em que Ri representa Alk, mais preferivel- mente metila;
R, R' indênticos ou diferentes são H ou alquila;
Alk representa um alquila linear ou ramificado; preferivelmente Alk represen- ta (-(CH2-q(CH3)q)p- onde ρ representa um número inteiro de 1 a 10; e q re- presenta um número inteiro de 0 a 2; preferivelmente, Alk representa -(CH2)- Ou-C(CH3)2-.
ou seus sais, hidratos, ou sais hidratados farmaceuticamente aceitáveis, ou as estruturas cristalinas polimórficas destes compostos ou seus isômeros ópticos, racematos, diastereômeros ou enatiômeros.
Compostos preferidos podem ser escolhidos de: · (2-Metilsulfanil-etil)-amida do ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-Hidróxi- 3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran- 2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenóico
• Bis-[(2-mercaptoetil)-amida do ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidróxi- 3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-
2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenóico
• Bis(2-Mercapto-etil)-amida do ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidróxi- 3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran- 2-il)-8- oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenóico
• (2-Metildissulfanil-etil)-amida do ácido (2E,10E)12E)16Z,18E)-(R)-6-hidróxi- 3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran- 2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenóico
· (2-Metil-2-metildissulfanil-propil)-amida do ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)- (R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di- hidro-2H-piran-2-ιΊ)-8-oxo-nonadeca-2, 10,12,16,18-pentenóico
• (2-Mercapto-2-metil-propil)-amida do ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6- hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-
2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenóico
ou seus sais, hidratos, ou sais hidratados farmaceuticamente aceitáveis, ou as estruturas cristalinas polimórficas destes compostos ou seus isômeros ópticos, racematos, diastereômeros ou enatiômeros.
De modo a lugar o derivado a um agente de ligação de célula, o derivado deve incluir uma porção (grupo de ligação) que permite que os de- rivados sejam ligados a um agente de ligação de célula por intermédio de uma ligação tal como uma ligação de dissulfeto, uma ligação de sulfeto (ou chamado aqui tioéter), um grupo lábil em ácido, um grupo fotolábil, um grupo lábil em peptidase, ou um grupo lábil em esterase. Os derivados são prepa- rados de modo que eles contêm uma porção necessária para ligar o deriva- do de Ieptomicina a um agente de ligação de célula por intermédio de, por exemplo, uma ligação de dissulfeto, uma ligação de tioéter, um grupo lábil em ácido, um grupo fotolábil, um grupo lábil em peptidase, ou um grupo lábil em esterase. De modo a realçar ainda a solubilidade em soluções aquosas, o grupo de ligação pode conter um espaçador de polietileno glicol. Preferi- velmente, uma ligação de sulfeto ou dissulfeto é usada porque o ambiente de redução da célula alvejada resulta na clivagem do sulfeto ou dissulfeto e liberação dos derivados com um aumento associado na citotoxicidade.
Os compostos da presente invenção podem ser preparados por uma variedade de vias sintéticas. Os reagentes e materiais de partida estão comercialmente disponíveis, ou são facilmente sintetizados por técnicas bem-conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Métodos para sinteti- zar derivados de Ieptomicina que podem ser usados nos conjugados citotó- xicos da presente invenção, junto com métodos para conjugar os ditos deri- vados de Ieptomicina aos agentes de ligação de célula tais como anticorpos, são descritos em detalhe no Pedido de Patente Europeu N5 06290948,6, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência. Análogos de CC-1065
O agente citotóxico usado nos conjugados citotóxicos de acordo com a presente invenção também pode ser CC-1065 ou um derivado deste.
CC-1065 é um antibiótico antitumor potente isolado do caldo de cultura de Streptomyces zelensis. CC-1065 é cerca de 1000 vezes mais po- tente in vitro do que são fármacos anticâncer comumente usados, tais como doxorrubicina, metotrexato e vincristina (B.K. Bhuyan et ai, 1982, Câncer Res., 42, 3532-3537). CC-1065 e seus análogos são descritos nas Patentes U.S. NQs 6.372.738, 6.340.701, 5.846.545 e 5.585.499. A potência citotóxica de CC-1065 foi correlacionada com sua
atividade alquilante e sua atividade de ligação de DNA ou intercalação de DNA. Estas duas atividades consistem em partes separadas da molécula. Assim, a atividade alquilante está contida na subunidade de ciclopropapirro- Ioindol (CPI) e a atividade de ligação de DNA consiste nas duas subunida- des de pirroloindol.
Embora CC-1065 tenha certas características atrativas como um agente citotóxico, ele tem limitações no uso terapêutico. A administração de CC-1065 a camundongos causou uma hepatotoxicidade retardada levando à mortalidade no dia 50 depois de uma única dose intravenosa de 12,5 Mg/kg (V. L. Reynolds et ai, 1986, J. Antibiotics, XXIX: 319-334). Isto estimulou esforços para desenvolver análogos que não causam toxicidade retardada, e a síntese de análogos mais simples moldados em CC-1065 foi descrita (M.A. Warpehoski et ai, 1988, J. Med. Chem., 31: 590-603).
Em uma outra série de análogos, a porção de CPI foi substituída por uma porção de ciclopropabenzindol (CBI) (D.L. Boger et ai, 1990, J. Org. Chem., 55: 5823-5833; D.L. Boger et ai, 1991, BioOrg. Med. Chem. Lett., 1: 115-120). Estes compostos mantêm a potência in vitro alta do fár- maco parental, sem causar toxicidade retardada em camundongos. Como CC-1065, estes compostos são agentes alquilantes que ligam-se ao sulco menor de DNA em uma maneira covalente para causar a morte celular. En- tretanto, a avaliação clínica dos análogos mais promissores, Adozelesin e Carzelesin, tem levado a resultados insatisfatórios (B.F. Foster et ai, 1996, Investigational New Drugs, 13: 321-326; I. Wolff et al, 1996, Clin. Câncer Res., 2: 1717-1723). Estes fármacos exibem efeitos terapêuticos deficientes por causa de sua toxicidade sistêmica alta.
A eficácia terapêutica de análogos de CC-1065 pode ser muito melhorada mudando-se a distribuição in vivo através de liberação alvejada ao sítio de tumor, resultando em toxicidade mais baixa a tecidos não alveja- dos, e assim, toxicidade sistêmica mais baixa. De modo a alcançar este ob- jetivo, conjugados de análogos e derivados de CC-1065 com agentes de ligação de célula que especificamente alvejam células tumorosas foram des- critos (Patentes US; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545). Estes conjugados tipicamente exibem citotoxicidade específica alvo elevada in vitro, e atividade antitumor excepcional em modelos de xenoenxerto de tumor humano em camundongos (R.V. J. Chari etal., 1995, Câncer Res., 55: 4079-4084).
Recentemente, pró-fármacos de análogos de CC-1065 com so- Iubilidade realçada em meio aquoso foram descritos (Pedido de Patente Eu- ropeu N2 06290379,4). Nestes pró-fármacos, o grupo fenólico da porção al- quilante da molécula é protegido com uma funcionalidade que torna o fárma- co estável em armazenamento em solução aquosa ácida, e confere solubili- dade em água aumentada ao fármaco comparado a um análogo desprotegi- do. O grupo de proteção é facilmente clivado in vivo no pH fisiológico para fornecer o fármaco ativo correspondente. Nos pró-fármacos descritos na EP 06290379.4, o substituinte fenólico é protegido como um ácido sulfônico con- tendo carbamato de fenila que possui uma carga no pH fisiológico, e assim tem solubilidade em água realçada. De modo a realçar ainda a solubilidade em água, um espaçador de polietileno glicol opcional pode ser introduzido no Iigante entre a subunidade indolila e a ligação clivável tal como um grupo dissulfeto. A introdução deste espaçador não altera a potência do fármaco. Métodos para sintetizar análogos de CC-1065 que podem ser usados nos conjugados citotóxicos da presente invenção, junto com méto- dos para conjugar os análogos aos agentes de ligação de célula tais como anticorpos, são descritos em detalhe em EP 06290379,4 (cujo conteúdo é incorporado aqui por referência) e Patentes U.S. NsS 5.475.092, 5.846.545, 5.585.499, 6.534.660 e 6.586.618 e nos Pedidos U.S. NsS 10/116.053 e 10/265.452. Outros Fármacos
Fármacos tais como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vimblastina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, caliqueamici- na, tubulisina e análogos de tubulisina, duocarmicina e análogos de duocar- micina, dolastatina e análogos de dolastatina também são adequados para a preparação de conjugados da presente invenção. As moléculas de fármaco também podem ser ligadas às moléculas de anticorpo através de uma molé- cuia portadora intermediária tal como albumina sérica. Os compostos Doxor- rubicina e Daunorrubicina, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. Ns 6.630.579, também podem ser agentes citotóxicos úteis. Composição terapêutica
A invenção também refere-se a uma composição terapêutica para o tratamento de um distúrbio hiperproliferativo em um mamífero que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção e um portador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade a dita composição farmacêutica é para o tratamento de câncer, incluindo (mas não limitado a) o seguinte: carcinoma, incluindo aquele da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estômago, cérvix, tireóide e pele; incluindo carcinoma de célula escamosa; tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, Iinfoma de célula B, Iinfoma de célula T, Iinfoma de Bur- kitt; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo Ieucemias mie- Iogenosas agudas e crônicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neu- roblastoma, glioma, e schwanomas; tumores de origem mesenquimal, inclu- indo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoactantoma, seminoma, câncer folicular da tireóide e teratocarcinoma, e outros cânceres ainda a se- rem determinados em que EphA é expressado predominantemente. Em uma modalidade preferida, as composições farmacêuticas da invenção são usa- das para o tratamento de câncer do pulmão, mama, cólon, próstata, rim, pâncreas, ovário, cérvix e órgãos linfáticos, osteossarcoma, carcinoma sino- vial, um sarcoma, cabeça e pescoço, um glioma, gástrico, fígado ou outros carcinomas em que EphA é expressado. Em particular, o câncer é um cân- cer metastático. Em uma outra modalidade, a dita composição farmacêutica refere-se a outros distúrbios tais como, por exemplo, doenças autoimunes, tais como lúpus sistêmico, artrite reumatóide, e esclerose múltipla; rejeições a enxerto, tais como rejeição ao transplante renal, rejeição ao transplante hepático, rejeição ao transplante pulmonar, rejeição ao transplante cardíaco, e rejeição ao transplante de medula óssea; doença do enxerto versus hos- pedeiro; infecções virais, tais como infecção por mV, infecção por HIV, AIDS, etc.; e infecções por parasitas, tais como giardíase, amebíase, esquistosso- míase, e outras como determinado por uma pessoa versada na técnica.
A presente invenção fornece composições farmacêuticas com- preendendo:
• uma quantidade eficaz de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou conju- gado de anticorpo da presente invenção, e
• um portador farmaceuticamente aceitável, que pode ser inerte ou fisiologi- camente ativo.
Como usado aqui, "portadores farmaceuticamente aceitáveis" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, e semelhantes que são fisiologica- mente compatíveis. Exemplos de portadores, diluentes e/ou excipientes a- dequados incluem um ou mais de água, solução salina, solução salina tam- ponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, e semelhantes, assim como combinação destes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotôni- cos, tais como açúcares, poliálcoois, ou cloreto de sódio na composição. Em particular, exemplos relevantes de portador adequado incluem: (1) solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, pH ~ 7,4, contendo ou não cer- ca de 1 mg/ml a 25 mg/ml de albumina sérica humana, (2) solução salina a 0,9 % (0,9 % p/v de cloreto de sódio (NaCI)), e (3) 5 % (p/v) de dextrose; e também podem conter um antioxidante tal como triptamina e um agente es- tabilizante tal como Tween 20.
As composições aqui também podem conter um outro agente terapêutico, como necessário para o distúrbio particular que é tratado. Prefe- rivelmente, o anticorpo, fragmento de anticorpo ou conjugado de anticorpo da presente invenção, e o composto ativo suplementar terão atividades complementares, que não afetam adversamente entre si. Em uma modalida- de preferida, o outro agente terapêutico é um antagonista do fator de cres- cimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator tecidual (TF), proteína C1 proteína S, fator de crescimento derivado de pla- queta (PDGF), ou receptor de HER2.
As composições da invenção podem estar em uma variedade de formas. Estas incluem por exemplo formas de dosagem líquidas, semi- sólidas, e sólidas, mas a forma preferida depende do modo intencionado de administração e aplicação terapêutica. Composições preferidas típicas estão na forma de soluções injetáveis ou infundíveis. O modo preferido de adminis- tração é parenteral (por exemplo, intravenosa, intramuscular, intraperinoneal, subcutânea). Em uma modalidade preferida, as composições da invenção são administradas intravenosamente como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo. Em uma outra modalidade preferida, elas são injetadas pelas vias intramuscular, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratumoral, peritumoral, intralesional, ou perilesional, para exercer efeitos terapêuticos locais assim como sistêmicos. Composições estéreis para a administração parenteral podem
ser preparadas incorporando-se o anticorpo, fragmento de anticorpo ou con- jugado de anticorpo da presente invenção na quantidade necessária no sol- vente apropriado, seguido por esterilização por microfiltração. Como solven- te ou veículo, podem ser usados água, solução salina, solução salina tam- ponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, e semelhantes, assim como uma combinação destes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, poliálcoois, ou cloreto de sódio na composi- ção. Estas composições também podem conter adjuvantes, em particular agentes umectantes, isotonizantes, emulsificantes, dispersantes e estabili- zantes. Composições estéreis para a administração parenteral também po- dem ser preparadas na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas no momento do uso em água estéril ou qualquer outro meio estéril injetável.
O anticorpo, fragmento de anticorpo ou conjugado de anticorpo da presente invenção também podem ser oralmente administrados. Como composições sólidas para a administração oral, comprimidos, pílulas, pós (cápsulas de gelatina, sachês) ou grânulos podem ser usados. Nestas com- posições, o ingrediente ativo de acordo com a invenção é misturado com um ou mais diluentes inertes, tais como amido, celulose, sacarose, Iactose ou sílica, sob uma corrente de argônio. Estas composições também podem compreender substâncias exceto diluentes, por exemplo um ou mais lubrifi- cantes tais como estearato de magnésio ou talco, um corante, um revesti- mento (tablete revestido com açúcar) ou um esmalte.
Como composições líquidas para a administração oral, podem ser usados soluções farmaceuticamente aceitáveis, suspensões, emulsões, xaropes e elixires contendo diluentes inertes tais como água, etanol, glicerol, óleos vegetais ou óleo de parafina. Estas composições podem compreender substâncias exceto diluentes, por exemplo produtos umectantes, adoçantes, espessantes, flavorizantes ou estabilizantes.
As doses dependem do efeito desejado, da duração do trata- mento e da via de administração usada; elas estão geralmente entre 5 mg e 1000 mg por dia oralmente para um adulto com doses unitárias variando de 1 mg a 250 mg de substância ativa. Em geral, o médico determinará a dosa- gem apropriada dependendo da idade, peso e quaisquer outros fatores es- pecíficos ao paciente a ser tratado. Métodos terapêuticos de uso
Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um mé- todo para inibir a atividade do receptor de EphA2 administrando-se um anti- corpo que antagoniza o dito receptor de EphA2, a um paciente em necessi- dade deste. Qualquer um dos tipos de anticorpo, fragmentos de anticorpo, ou conjugados citotóxicos da invenção, podem ser usados terapeuticamente. A invenção assim inclui o uso de anticorpos antagonísticos anti-EphA2, fragmentos destes, ou conjugados citotóxicos destes como fármacos. Em uma modalidade preferida, anticorpos, fragmentos de anti-
corpo, ou conjugados citotóxicos da invenção são usados para o tratamento de um distúrbio hiperproliferativo em um mamífero. Em uma modalidade mais preferida, uma das composições farmacêuticas descritas acima, e que contém um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou conjugado citotóxico da invenção, é usada para o tratamento de um distúrbio hiperproliferativo em um mamífero. Em uma modalidade, o distúrbio é um câncer. Em particular, o câncer é um câncer metastático. Os anticorpos, fragmentos de anticorpo, e conjugados citotóxicos da invenção também podem ser usados para tratar a neovascularização do dito tumor cancerígeno. Consequentemente, as composições farmacêuticas da invenção
são úteis no tratamento ou prevenção de uma variedade de canceres, inclu- indo (mas não limitados a) o seguinte: carcinoma, incluindo aquele da bexi- ga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estômago, cérvix, tireóide e pele; incluindo carcinoma de célula escamosa; tumores hemato- poiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, Iinfoma de célula B, Iinfoma de célula T, Iinfo- ma de Burkitt; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo Ieu- cemias mielogenosas agudas e crônicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; outro tumores, incluindo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocito- ma, neuroblastoma, glioma, e schwanomas; tumores de origem mesenqui- mal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoactantoma, seminoma, câncer folicular da tireóide e teratocarcinoma, e outros canceres ainda a serem determinados em que EphA é expressado predominantemen- te. Em uma modalidade preferida, o câncer é um câncer do pulmão, mama, cólon, próstata, rim, pâncreas, útero, ovário, cérvix e órgãos linfáticos, oste- ossarcoma, carcinoma sinovial, um sarcoma, cabeça e pescoço, um glioma, gástrico, fígado ou outros carcinomas em que EphA é expressado. Em uma outra modalidade, a dita composição farmacêutica refere-se a outros distúr- bios tais como, por exemplo, doenças autoimunes, tais como lúpus sistêmi- co, artrite reumatóide, e esclerose múltipla; rejeições a enxerto, tais como rejeição ao transplante renal, rejeição ao transplante hepático, rejeição ao transplante pulmonar, rejeição ao transplante cardíaco, e rejeição ao trans- plante de medula óssea; doença do enxerto versus hospedeiro; infecções virais, tais como infecção por mV, infecção por HIV, AIDS, etc.; e infecções por parasitas, tais como giardíase, amebíase, esquistossomíase, e outras como determinado por uma pessoa de habilidade comum na técnica.
Similarmente, a presente invenção fornece um método para ini- bir o crescimento de populações de célula selecionadas compreendendo contatar células-alvo, ou células-alvo contendo tecido, com uma quantidade eficaz de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou conjugado de anticorpo da presente invenção, ou um anticorpo, fragmento de anticorpo ou um agen- te terapêutico compreendendo um conjugado citotóxico, sozinho ou em combinação com outros agentes citotóxicos ou terapêuticos. O método para inibir o crescimento de populações de célula se-
lecionadas pode ser praticado in vitro, in vivo, ou ex vivo. Como usado aqui, "inibição do crescimento" significa reduzir o crescimento de uma célula, di- minuir a viabilidade celular, causar a morte de uma célula, Iisar uma célula e induzir a morte celular, se durante um período de tempo curto ou longo. Exemplos de usos in vitro incluem tratamentos de medula óssea
autóloga antes de seu transplante no mesmo paciente de modo a matar cé- lulas doentes ou malignas; tratamentos de medula óssea antes de seu transplante de modo a matar células T competentes e prevenir doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD); tratamentos de culturas celulares de modo a matar todas as células exceto para variantes desejadas que não ex- pressam o antígeno alvo; ou a matar variantes que expressam antígeno in- desejado.
As condições de uso não clínico in vitro são facilmente determi- nadas por uma pessoa versada na técnica.
Exemplos de uso clínico ex vivo são para remover células tumo- rosas ou células linfóides da medula óssea antes do transplante autólogo no tratamento do câncer ou no tratamento de doença autoimune, ou para remo- ver células T e outras células linfóides da medula óssea ou tecido autólogos ou alogênicos antes do transplante de modo a prevenir doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD). O tratamento pode ser realizado como segue. A medula óssea é colhida do paciente ou outro indivíduo e depois incubada em meio contendo soro ao qual é adicionado o agente citotóxico da invenção. As concentrações variam de cerca de 10 μΜ a 1 μΜ, durante cerca de 30 minutos a cerca de 48 horas a cerca de 37° C. As condições exatas de con- centração e tempo de incubação, isto é, a dose, são facilmente determina- das por uma pessoa versada na técnica. Depois da incubação as células da medula óssea são lavadas com meio contendo soro e devolvidas ao pacien- te por infusão i.v. de acordo com métodos conhecidos. Em circunstâncias onde o paciente recebe outro tratamento tal como um curso de quimioterapia ablativa ou irradiação de corpo total entre o tempo da colheita da medula e reinfusão das células tratadas, as células da medula tratadas são armaze- nadas congeladas em nitrogênio líquido usando equipamento médico pa- drão.
Para o uso clínico in vivo, o anticorpo, o fragmento de anticorpo de ligação de epítopo, ou o conjugado citotóxico da invenção serão forneci- dos como soluções que são testadas quanto à esterilidade e quanto a níveis de endotoxina. Exemplos de protocolos adequados de administração de con- jugado citotóxico são como segue. Conjugados são fornecidos semanalmen- te durante 4 semanas como um bolo i.v. toda semana. Doses de bolo são fornecidas em 50 a 100 ml de solução salina normal à qual 5 a 10 ml de al- bumina sérica humana podem ser adicionados. As dosagens serão de 10 pg a 100 mg por administração, i.v. (faixa de 100 ng a 1 mg/kg por dia). Mais preferivelmente, as dosagens variarão de 50 pg a 30 mg. O mais preferivel- mente, as dosagens variarão de 1 mg a 20 mg. Depois de quatro semanas de tratamento, o paciente pode continuar a receber tratamento em uma base semanal. Protocolos clínicos específicos com respeito à via de administra- ção, excipientes, diluentes, dosagens, tempos, etc., podem ser determinados por uma pessoa de habilidade comum na técnica como as autorizações de situação clínica. Diagnóstico
Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção também podem ser usado para detectar EphA2 em uma amostra biológica in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, o anti-EphA2 da invenção é usado para deter- minar o nível de EphA2 em um tecido ou em células derivadas do tecido. Em uma modalidade preferida, o tecido é um tecido doente. Em uma modalidade preferida do método, o tecido é um tumor ou uma biópsia deste. Em uma modalidade preferida do método, um tecido ou uma biópsia deste é primeiro excisado de um paciente, e os níveis de EphA2 no tecido ou biópsia depois podem ser determinados em um imunoensaio com os anticorpos ou frag- mentos de anticorpo da invenção. O tecido ou biópsia deste podem ser con- gelados ou fixos. O mesmo método pode ser usado para determinar outras propriedades da proteína de EphA2, tal como seu nível de fosforilação de tirosina, níveis de superfície celular, ou localização celular. O método descrito acima pode ser usado para diagnosticar um
câncer em um paciente conhecido ou suspeito de ter um câncer, em que o nível de EphA2 medido no dito paciente é comparado com aquele de um paciente de referência normal ou padrão. O dito método depois pode ser usado para determinar se um tumor expressa EphA2, que pode sugerir que o tumor responderá bem ao tratamento com os anticorpos, fragmentos de anticorpo ou conjugados de anticorpo da presente invenção. Preferivelmen- te, o tumor é um câncer do pulmão, mama, cólon, próstata, rim, pâncreas, útero, ovário, cérvix e órgãos linfáticos, um sarcoma, um glioma, gástrico, fígad< nomas em que EphA2 é expressado, e terminados em que EphA2 é expressad< A presente invenção leva
monoclonais, anticorpos humanizados destes que são rotulados ainda para o diagnóstico. Em modalidades preferidas róforo, um cromóforo, um agente de ima Um método para diagnóstic
tos anticorpos rotulados ou fragmento! administrados a um paciente suspeito c rótulo dentro do corpo do paciente é m& Kit
A presente invenção tambe
endendo um conjugado citotóxico descr gado citotóxico para a morte de tipos < podem incluir direções para usar os con ex vivo.
Tipicamente, o kit terá um c
citotóxico. O conjugado citotóxico pode < líquida, ou outra forma melhorável para pode conter elementos adicionais neces to nas instruções no kit, uma tal soluçãc liofilizado, agentes adicionais para comi
Geração de Hibridomas de Anticorpo Monoclonal Anti-EphA2
Quatro camundongos BALB/c VAF foram imunizados com célu- las 300-19 transfectadas com EphA2 humano, uma pré linhagem de célula B derivada de um camundongo BALB/c. As células estavelmente transfectadas que super-expressam o antígeno foram geradas por transfecção de células 300-19 com o cDNA humano de EphA2 de tamanho natural e selecionadas quanto aos clones de expressão elevada por citometria de fluxo. O clone 4- 6, um clone que expressa altamente o receptor de EphA2 humano na super- fície da célula, foi selecionado como imunógeno para a imunização de ca- mundongos e para a triagem de anticorpo de hibridomas. As células trans- fectadas com EphA2 foram mantidas no meio de seleção contendo G418 em uma concentração final de 1 mg/mL e foram testadas quanto à expressão de EphA2 regularmente usando um anticorpo comercialmente disponível.
Os camundongos Balb/c foram subcutaneamente injetados com aproximadamente 5 χ 106 células 300-19 transfectadas com EphA2 em 200 μΙ_ de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por camundongo. As injeções são realizadas a cada 2 a 3 semanas por protocolos de imunização padrão usados em ImmunoGen1 Inc. Três dias antes da fusão celular, os camundongos foram intraperitonealmente reforçados uma vez mais com a mesma dose de antígeno, e sacrificados para a preparação de células do baço de acordo com os protocolos padrão para procedimentos em uso ani- mal no dia de fusão celular. O baço foi coletado do camundongo imunizado sob condições
cirúrgicas esterilizadas e foi moído entre duas lâminas de microscópio esté- reis e congeladas para obter suspensão de célula única em meio RPMI- 1640. Os esplenócitos foram peletizados e lavados duas vezes com meio RPMI-1640 antes da fusão celular. As células do baço foram misturadas e fundidas com células P3X63Ag8,653 de mieloma de murino (Kearney, J.F. et ai, 1979. J. Immunol., 123: 1548-1550) usando polietileno glicol-1500 como fusogen (Roche 783 641). Depois da fusão celular e centrifugação, as célu- las foram colocadas em suspensão em meio RPMI-1640 completo (200 mL) contendo suplemento de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma H- 0262), e foram plaqueadas em dez placas de fundo plano de 96 reservató- rios (Corning-Costar 3596, 200 μΙ_ de suspensão celular por reservatório). A seguir da incubação a 37° C, 5 % de CO2 durante 5 dias, 100 pL de sobre- nadante de cultura foram removidos de cada reservatório das placas e subs- tituídos com um volume igual de meio RPMI-1640 completo contendo su- plemento de hipoxantina-timidina (HT) (Sigma H-0137). A incubação (em uma atmosfera de 5 % de CO2 a 37° C) foi continuada até que clones de hibridoma tivessem cultivado colônias grandes o bastante para a triagem de anticorpo.
No dia 10 pós fusão quando as células de hibridoma cultivaram a metade de confluência nos reservatórios e o sobrenadante mudou para uma cor laranja, os sobrenadantes de hibridoma foram testados a partir das placas de fusão quanto à triagem de anticorpo por imunoensaios. Para a triagem preliminar, sobrenadantes de hibridoma foram testados em células transfectadas com EphA2 vs. as células 300-19 parentais por citometria de fluxo. As células foram manchadas com 50 μΙ_ de sobrenadante de hibrido- ma, seguido por incubação com conjugado de fluoresceína-lgG de cabra anti-camundongo (H+L), e analisados por citometria de fluxo com máquina FACSCaIibur ou FACSArray da Becton Dickinson. Clones de hibridoma que analisaram positivos para células transfectadas com EphA2 mas negativos para células 300-19 foram selecionados, expandidos, congelados para o ar- mazenamento, ou subclonados por diluições Iimitantes para atingir uma po- pulação monoclonal. Os anticorpos específicos secretados por células de hibridoma foram isotipados usando reagentes de isotipagem comercialmente disponíveis (Roche 1493027).
Com base nos dados citométricos de fluxo, 29 clones de hibri- doma, que foram especificamente reativos com células transfectadas com EphA2 humano mas não com as células 300-19 parentais, foram identifica- dos e selecionados da imunização de camundongos com antígenos de E- phA2 humano. Exemplo 2
Caracterização da Ligação de Anticorpos Anti-EphA2, 37.3D7. 37.1 F5. 53.2H11. EphA2-N1 e EphA2-N2.
A ligação específica de cada um dos anticorpos anti-EphA2, 37.3D7, 37.1 F5 e 53.2H11 purificados foi demonstrada por separação celular ativada por fluorescência (FACS) usando células que superexpressam E- phA2 humano e usando-se células que não expressam EphA2 (FIG. 1A, B, e C). A incubação do anticorpo 37.3D7, ou anticorpo 37.1 F5 ou anticorpo 53.2H11 (60 nM) em 100 μΙ de tampão de FACS frio (1 mg/mL de BSA em meio MEM de Dulbecco) foi realizada usando células que superexpressam EphA2 e células que não expressam EphA2 em uma placa de 96 cavidades de fundo redondo em gelo. Depois de 1 h, as células foram peletizadas por centrifugação e lavadas com tampão de FACS frio e depois incubadas com conjugado de anticorpo de IgG de cabra anti-camundongo-FITC (100 pL, 6 pg/ml em tampão de FACS) em gelo durante 1 h. As células depois foram peletizadas, lavadas, e recolocadas em suspensão em 200 pL de solução de formaldeído a 1 % em PBS. As amostras de célula depois foram analisadas usando um leitor FACSCaIibur (BD Biosciences).
Uma forte mudança na fluorescência foi obtida na incubação de células que superexpressam EphA2 humano com anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, ou 53.2H11, em contraste a uma mudança insignificante na incubação de células que não expressam EphA2 humano com anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, ou 53.2H11 (FIG. 1A, 1B, e 1C), que demonstra que os anticorpos 37.3D7, 37.1 F5 e 53.2H11 estavam ligando seletivamente ao EphA2 humano. O an- ticorpo anti-EphA2 de controle positivo, B2D6 (Upstate), mostrou uma mu- dança similar na fluorescência em incubações com células que super- expressaram EphA2 humano (FIG. 1A). Uma forte mudança na fluorescência também foi observada por ensaio FACS usando 37.3D7 e células cancero- sas humanas, tais como células MDA-MB-231 de câncer de mama humano, células HT-29 de câncer do cólon humano, células BxPC3 de câncer pan- creático humano, que mostra que o anticorpo 37.3D7 liga-se a EphA2 hu- mano na superfície de células tumorosas humanas (FIG. 2). Dados similares também foram obtidos usando os anticorpos 37.1 F5 e 53.2H11 com linha- gens de célula de tumor humanas. As constantes de dissociação aparentes (Kd) para a ligação de
anticorpos 37.3D7, 37.1 F5 e 53.2H11 com EphA2 humano na superfície das células foram determinadas por ensaios FACS da ligação de anticorpo em várias concentrações a células que superexpressam EphA2 humano e célu- las MDA-MB-231 de câncer de mama humano (FIG. 3). Os valores de Kd foram estimados por regressão não linear para a ligação de um sítio. As cur- vas de ligação produziram os valores de K0 aparentes de 0,3 nM para anti- corpo 37.3D7, 0,07 nM para anticorpo 37.1 F5, e 0,14 nM para anticorpo 53.2H11 (FIG. 3A, 3C, e 3E).
Usando o mesmo protocolo experimental, valores de kD aparen- tes de 0,18 nM e 0,05 nM foram determinados para EphA2-N1 e EphA2-N2, respectivamente.
Uma forte mudança na fluorescência foi obtida na incubação de
células que super-expressam EphA2 de murino ou EphA2 de rato com anti- corpo 37.3D7 ou anticorpo 53.2H11, em contraste a uma mudança insignifi- cante na incubação de células que não expressam EphA2 de murino ou E- phA2 de rato com anticorpo 37.3D7 ou anticorpo 53.2H11 (FIG. 4), o que demonstra que os anticorpos 37.3D7 e 53.2H11 ligam também a EphA2 de murino e EphA2 de rato. Uma forte mudança na fluorescência também foi observada por ensaio FACS usando anticorpo 37.3D7 ou 37.1 F5 ou 53.2H11 com células VERO epiteliais de macaco (Cercopithecus aetiops) (FIG. 5A), o que mostra que 37.3D7, 37.1 F5 e 53.2H11 ligam-se a EphA2 de macaco igualmente. Os valores aparentes de Kd foram estimados por regressão não linear para ligação de um sítio. As curvas de ligação por ensaio FACS pro- duziram valores de K0 de 0,15 nM para 37.3D7, 0,05 nM para 37.1 F5, e 0,07 nM para 53.2H11 em células de macaco (FIG. 5B, 5D e 5F). Exemplo 3
Inibicão da Ligação de EfrinaAI a células MDA-MB-231 por anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11. EphA2-N1 e EphA2-N2
A ligação de efrinaAI a células MDA-MB-231 de câncer de ma- ma humano foi inibida por anticorpos 37.3D7, 37.1 F5 e 53.2H11 (FIG. 6). As células MDA-MB-231 foram incubadas com ou sem 5 pg/mL de anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, ou 53.2H11 durante 2 h, seguido por incubação com 100 ng/mL de efrinaAI biotinilada durante 30 min a 4o C. As células depois foram lavadas duas vezes com meio isento de soro para remover biotina-efrinaAI não ligada, e depois foram Iisadas em 50 mM de tampão de HEPES1 pH 7,4, contendo 1 % de NP-40 e inibidores de protease. Placas de ELISA Immulon- 2HB foram revestidas com um anticorpo anti-EphA2 monoclonal de camun- dongo (D7, Upstate) e foram usadas para capturar o EphA2 e biotina- efrinaAI ligada a partir do lisato. A ligação do anticorpo revestido ao domínio de terminal C citoplasmático do EphA2 não interferiu com a ligação de bioti- na-efrinaA1 ao domínio extracelular de EphA2. Os reservatórios foram lava- dos, incubados com conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano sil- vestre, lavados novamente, e depois desenvolvidos com substrato de ABTS/H202. A inibição da ligação de efrinaAI a células MDA-MB-231 por 5 pg/mL de anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, ou 53.2H1 foi essencialmente quantita- tiva; o sinal foi quase equivalente àquele do sinal de fundo de ELISA obtido usando um controle que carece de biotina-efrinaAI (Fig 6A, 6B e 6C).
Tanto EphA2-N1 quanto Epha2-N2 foram capazes de inibir a ligação de efrinaAI humana a células MDA-MB-231 à mesma extensão co- mo 37.3D7. Exemplo 4
Inibição de Sinalização Celular Mediada por EphA2 por Anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11. EphA2N1 e EphA2-N2
O tratamento de células MDA-MB-231 de câncer de mama hu- mano com anticorpo 37.3D7, ou 37.1 F5 inibiu completamente a sinalização de receptor de EphA2 intracelular como mostrado pela inibição da autofosfo- rilação do receptor de EphA2 (FIG. 7A) e pela inibição da fosforilação de seus efetores a jusante tais como Akt (FIG. 7B). O tratamento de células CFPAC-1 de câncer pancreático com anticorpo 37.3D7 ou anticorpo 53.2H11 inibiu completamente a sinalização de receptor de EphA2 intracelu- lar como mostrado pela inibição da autofosforilação do receptor de EphA2 (FIG. 7C).
Na FIG. 7A e 7C, as células MDA-MB-231 mamárias ou as célu- las CFPAC-1 pancreáticas foram cultivadas em meio regular (como sugerido a partir de ATCC para cada linhagem de célula) com soro durante 3 dias, depois cultivadas em meio isento de soro durante 12 a 14 h. Células priva-
20
25
30 das de soro foram tratadas com 15 μς/mL de anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, ou 53.2H11 ou IgGi de controle durante 2 h, seguido por estimulação com 1 pg/mL de efrina Al-Fc (R&D) durante 10 min a 37° C. As células depois fo- ram Iisadas em tampão de Iise gelado contendo inibidores de protease e fos- fatase (50 mM de tampão de HEPES, pH 7,4, 1 % de NP-40, 1 mM de orto- vanadato de sódio, 100 mM de fluoreto de sódio, 10 mM de pirofosfato de sódio, 2,5 mM de EDTA, 10 μΜ de leupeptina, 5 μΜ de pepstatina, 1 mM de PMSF, 5 mM de benzamidina, e 5 μg/mL de aprotinina). Os Iisatos foram imunoprecipitados com anticorpo anti-EphA2 D7 (Upstate) ligado a pérolas de proteína A/G. O EphA2 imunoprecipitado foi resolvido em um gel de SDS- poliacrilamida e submetido à análise Western blot com anticorpo monoclonal específico de fosfotirosina, 4G10 (Cell Signaling Technology). Para avaliar o nível de proteína de EphA2 em cada amostra imunoprecipitada, a mesma membrana foi manchada novamente com anticorpo anti-EphA2, D7 (Upsta- te). O uso de um anticorpo de controle não mostrou nenhuma inibição da autofosforilação estimulada por efrina A1 do receptor de EphA2 (Fig. 7C). Ao contrário, uma inibição completa da autofosforilação estimulada por efrinaAI do receptor de EphA2 foi obtida em tratamento com anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, ou 53.2H11 (Fig. 7A e 7C). a ativação estimulada por efrina A1 dos efetores a jusante, tais como Akt1 também foi inibida em células MDA-MB- 231 por anticorpo 37.3D7 ou 37.1 F5, como mostrado usando Western blots de Iisatos e anticorpo Akt anti-fosfo-Ser473 policlonal de coelho (Cell Signa- Iing Technology) (FIG. 7B).
Os anticorpos 37.3D7 e 53.2H11 por si só não estimularam a autofosforilação de EphA2 em células MDA-MB-231 de câncer de mama humano, ao contrário ao efeito estimulador da autofosforilação de efrinaAI sobre EphA2 em células MDA-MB-231 (FIG. 8A e 8B). Dados similares fo- ram obtidos para o anticorpo 37.1 F5 usando células MDA-MB231. Na FIG. 8, as células MDA-MB-231 foram cultivadas em meio regular com soro durante 3 dias, depois cultivadas em meio isento de soro durante 12 a 14 h. Células privadas de soro foram tratadas com 1 μg/mL de efrinaAI-Fc ou 15 μg/mL de anticorpo 37.3D7 ou 53.2H11 durante 10 min. Os Iisatos celulares foram submetidos à imunoprecipitação com anticorpo anti-EphA2, D7 (Upstate). Depois da separação em um gel de SDS-poliacrilamida, a mancha foi son- dada com anticorpo anti-fosfotirosina, 4G10 (Cell Signaling Technology) e anticorpo anti-EphA2 D7 (Upstate). Resultados similares foram obtidos tanto com EphA2-N1 quanto com EphA2-N2 em células MDA-MB-231 de câncer de mama humano, visto que nenhum anticorpo estimula autofosforilação de EphA2 por si só, ao passo que cada um deles impede a fosforilação depen- dente de efrinaAI do receptor de EphA2.
Os anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, 53.2H11, EphA2-N1, e EphA2-N2 portanto são únicos entre todos os anticorpos anti-EphA2 conhecidos em sua efetividade para inibir a sinalização intracelular de EphA2 estimulada por efrinaAI. Exemplo 5
Inibição do Crescimento e Sobrevivência Estimulados por Soro de Células de Tumor Humano por Anticorpos 37.3D7 e 53.2H11
Várias linhagens de célula de tumor humano foram testadas em condições isentas de soro quanto à sua resposta de crescimento e sobrevi- vência ao soro na presença de anticorpo 37.3D7 ou 53.2H11. Aproximada- mente 3000 células/reservatório foram plaqueadas em uma placa de 96 re- servatórios em meio regular (como sugerido a partir de ATCC para cada li- nhagem de célula) com soro, que foi substituído com meio isento de soro no dia seguinte. Depois de um dia de crescimento em meio isento de soro, as células foram incubadas com 15 pg/mL de anticorpo 37.3D7 ou anticorpo 53.2H11 ou IgGi de controle seguido pela adição de soro para obter uma concentração final de 1 % ou 1,5 % soro. As células depois foram deixadas cultivar durante um adicional de 3 dias. Uma solução de MTT [brometo de 3- (4,5)-dimetiltiazol-2-il-2,3-difeniltetrazólio; 25 μΙ_ de uma solução a 5 mg/mL em PBS] depois foram adicionados e as células foram devolvidas à incuba- dora durante 2 a 3 h. O meio depois foi removido e substituído por 100 pL de DMSO, misturado, e a absorbância da placa foi medida a 545 nm. Várias linhagens de célula de tumor humano mostraram uma resposta de cresci- mento e sobrevivência na adição de soro que foi significantemente inibida por anticorpo 37.3D7 ou 53.2H11. Como exemplos, as descobertas com as linhagens de célula de tumor de cólon, HT-29, LoVo; a linhagem de célula de tumor pancreático, CFPAC-2, BxPC3; e UACC-257 de melanoma são mos- tradas.
O anticorpo 37.3D7 fortemente inibiu o crescimento e sobrevi-
vência estimulados por soro de células HT-29 de câncer do cólon humano (FIG. 9A). Em um outro experimento, o anticorpo 37.3D7 inibiu fortemente o crescimento e sobrevivência estimulados por soro de células BxPC3 de cân- cer pancreático humano em uma maneira dependente de dose com um valor de IC50 de 4 nM (FIG. 10A). Além disso, o anticorpo 37.3D7 ou 53.2H11 ini- biu fortemente o crescimento e sobrevivência estimulados por soro de célu- las LoVo de câncer de cólon humano (FIG. 9B), células CFPAC-1 de câncer pancreático humano (FIG. 9C) e células cancerosas de melanoma UACC- 257 (FIG. 9D) e o anticorpo 53.2H11 inibiu crescimento e sobrevivência es- timulados por soro ou EGF de células LoVo em uma maneira dependente de dose com um valor de IC50 de 2 nM (FIG. 10B e 10C). Na FIG. 10, valores de OD545 para amostras tratadas com soro a O % foram ajustados para 10O % de inibição e 0 % de inibição foi ajustado usando amostras tratadas com 1,5 % de soro ou 10 ng/ml de EGF. Nenhum dos anticorpos anti-EphA2 rela- tados anteriores tem atividades inibitórias sobre o crescimento dependente de ancoragem (monocamada) de células tumorosas humanas. Portanto, an- ticorpos 37.3D7 e 53.2H11 são únicos em sua capacidade para inibir o cres- cimento dependente de ancoragem (crescimento de monocamada) de célu- las tumorosas humanas. Exemplo 6
Inibição de Sinalização de Célula Mediada por VEGF e Crescimento e So- brevivência Estimulados por VEGF de Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs) por Anticorpo 37.3D7. 37.1 F5. e 53.2H11
Uma forte mudança na fluorescência foi obtida na incubação de células HUVEC com anticorpo 37.3D7, 37.1 F5, ou 53.2H11 por análise de FACS, indicando que anticorpos 37.3D7, 37.1 F5 e 53.2H11 ligam-se aos receptores de EphA2 expressados em células HUVEC. As constantes de dissociação aparentes (K0) para a ligação de anticorpos 37.3D7, 37.1 F5, e 53.2H11 com EphA2 na superfície das células foram determinadas a partir das curvas de ligação estabelecidas com ensaios de ligação FACS realiza- dos em várias concentrações e mostradas na FIG. 11. Um valor de K0 = 0,3 nM para o anticorpo 37.3D7 foi estimado por regressão não linear para liga- ção de um sítio (FIG. 11), que é similar ao valor de K0 da ligação de anticor- po 37.3D7 a células cancerosas humanas. Um valor de K0 = 0,01 nM para o anticorpo 37.1 F5 e um valor de K0 = 0,06 nM para o anticorpo 53.2H11 fo- ram similarmente obtidos. Isto indica que anticorpos 37.3D7, 37.1 F5 e 53.2H11 especificamente ligam-se a células HUVEC através do receptor de EphA2.
O anticorpo 37.3D7 inibiu fortemente crescimento e sobrevivên- cia de HUVEC induzidos por VEGF. A atividade é similar ou melhor do que aquele de Avastin®, um anticorpo de bloqueio anti-VEGF (Genentech) (FIG. 12). Um anticorpo anti-EphA2 agonístico não inibiu o crescimento e sobrevi- vência de HUVEC induzidos por VEGF (FIG. 12). Na FIG. 12, células HU- VEC foram cultivadas em meio EBM-2 com suplementos de soro e célula endotelial (EC) (CIonetics) durante 3 dias. As células foram cultivadas em meio isento de soro mais suplementos de crescimento EC que carecem de VEGF durante 12 a 14 h. A seguir da privação de soro, as células foram es- timuladas com 5 ng/mL de VEGF mais 0,4 % de soro com ou sem anticorpos indicados (100 pg/mL). Os efeitos dos anticorpos sobre crescimento e so- brevivência de célula HUVEC induzidos por VEGF foi determinado 3 dias depois da adição de anticorpos e VEGF usando o ensaio MTT como descrito no Exemplo 5. A porcentagem de inibição de crescimento e sobrevivência mediados por VEGF por anticorpos é mostrada na FIG. 12. Os valores de OD545 para amostras tratadas com veículo foram ajustados para 0 % de ini- bição e 100 % de inibição foi ajustado usando amostras que carecem de VEGF.
Este tratamento de células HUVEC com anticorpo 37.3D7 inibe a
sinalização de receptor de EphA2 intracelular foi mostrado medindo-se a inibição de fosforilação de seus esfetores a jusante tais como Akt. A inibição é similar àquela de Avastin®, um anticorpo de bloqueio anti-VEGF (Genentech) (FIG. 13). O anticorpo anti-EphA2 agonístico não inibiu a fosforilação de Akt induzida por VEGF em células HUVEC. Na FIG. 13, células HUVEC foram privadas durante 12 a 14 h em meio isento de soro mais suplementos de EC que carecem de VEGF. As células foram tratadas com anticorpos (20 Mg/mL) durante 1 h antes da adição de VEGF (100 ng/mL). As células foram Iisadas 15 min depois da adição de VEGF e imu- nomanchas foram sondadas com os anticorpos indicados. Exemplo 7
Supressão do Crescimento de Xenoenxerto de HT-29 de Câncer do Cólon Humano em Camundonqos por Anticorpo 37.3D7 (FIG. 14)
Xenoenxertos de HT-29 de câncer do cólon humano foram esta- belecidos em camundongos SCID por injeção subcutânea de 2 χ 106 células HT-29. Quando os camundongos mostraram tumores de xenoenxerto de HT- 29 evidentes (50 mm3), eles foram tratados com anticorpo 37.3D7 ou um anticorpo de controle (IgGi) (1 mg/camundongo, i. v., duas vezes por sema- na) ou PBS sozinho (100 Ml_/camundongo, i. v., duas vezes por semana). O crescimento de tumores foi significantemente reduzido por tratamento com anticorpo 37.3D7 comparado a um tratamento com anticorpo de controle ou PBS sozinho. Nenhuma toxicidade de anticorpo 37.3D7 foi observada, com base em medições dos pesos dos camundongos. Exemplo 8
Inibição da metástase de MDA-MB-231 mamária precoce pelo anticorpo anti- EphA2 hu53.2H11
A atividade antitumor do anticorpo anti-EphA2 hu532H11 foi ava-
liada em um nível de dose contra tumor de MDA-MB-231 mamário precoce implantado subcutaneamente em camundongos SCID fêmeas. O efeito des- te anticorpo sobre a invasão do tumor de MDA-MB-231 nos Iinfonodos axiais e inguinais superficiais também foi investigado. Para isso, hu532H11 foi ad- ministrado a 40 mg/kg/adm por via iv, nos dias 1, 5, 8, 12, 15, 19, 22 e 26 pós implantação de tumor. O grupo de controle foi deixado não tratado.
Para a avaliação da atividade antitumor de hu532H11, os ani- mais foram pesados diariamente e tumores foram medidos 2 a 3 vezes se- manalmente por calibre. Os pesos do tumor foram calculados usando a fór- mula massa (mg) = [comprimento (mm) χ largura (mm)2]/2. A atividade anti- tumor foi avaliada de acordo com 3 critérios: 1) incluindo T/C, definido como peso de tumor médio (mg) de um grupo tratado dividido pelo peso de tumor médio do controle não tratado; 2) a determinação do retardo do crescimento do tumor (T-C), onde T é definido como o tempo médio em dias necessário para que tumores do grupo de tratamento atinjam 750 mg e C é o tempo médio para que os tumores do grupo de controle atinjam o mesmo tamanho, e 3) morte de célula tumorosa é definida como IogIO de morte celular (bruto) = [valor de T-C em dias]/(Td χ 3,32). T-C é definido acima, e Td é o tempo de duplicação de volume de tumor em dias dos tumores de controle, que é estimado a partir da linha reta de melhor ajuste a partir de um gráfico de Iog- crescimento linear dos tumores do grupo de controle em crescimento expo- nencial (faixa de 100 a 1.000 mg).
Em um estudo paralelo, os animais foram tratados como descrito antes, e no dia 28 pós implantação do tumor todos os camundongos foram sacrificados e Iinfonodos axiliares e inguinais foram coletados (tamanho de tumor médio no grupo de controle = 1558 mg). O anticorpo Ki67 humano foi usado de modo a identificar especificamente células tumorosas MDA-MB- 231 nos Iinfonodos por imunomanchamento. A área de superfície das metás- tases em Iinfonodos foi calculada (média de 2 seções) como S = área de superfície de Ki67 humano χ 100/área de superfície de linfonodo. • Eficácia no tumor primário: hu532H11 foi bem tolerado em 40 mg/kg/adm (dose total de 320
mg/kg) com +8,9 % de mudança de peso corporal no dia 27. Esta dose re- tardou o crescimento do tumor do tumor primário (T/C = 27 % e 1,0 Iog de inclusão de extermínio celular), ainda que o tumor sobrevivesse sob a tera- pia.
· Atividade antimetastática:
hu532H11 induziu uma redução de superfície de metástases (> 50 %) tanto em Iinfonodos axiliares quanto em inguinais. Em conclusão em camundongos que portam MDA-MB-231 de tumor mamário, hu532H11 retarda o crescimento do tumor primário tratado em um estágio inicial do desenvolvimento do tumor (T/C = 27 % e 1,0 Iog de inclusão de morte celular), e reduz a superfície de metástases (> 50 %) tanto em Iinfonodos axiliares quanto em inguinais.
Em um outro estudo, a atividade de um anticorpo anti-EphA2 pode ser avaliada no modelo de "metástase" hepática de HT29 de cólon humano. O anticorpo anti-EphA2 de murino 53.2H11 é administrado iv, duas vezes semanalmente, a partir do dia 4 pós implantação intraesplênica de células HT29 em camundongos fêmeas SCID (n = 20 camundongos por grupo para animais que não portam tumor (NTBA), tratado e controle). No dia 50, 3 dias após a 13â administração de anti-EphA2, os camundongos são submetidos à necrópsia e seu baço e fígado são pesados de modo a avaliar a massa do tumor no sítio de tumor primário (baço) ou no sítio de metástase (fígado). O número de metástases também é avaliado. Os dados são anali- sados usando as ferramentas estatísticas conhecidas à pessoa versada na técnica.
• Tratamento com anti-EphA2 a 40 mg/kg/inj (dose total de 520 mg/kg) é bem tolerado. · Peso do tumor primário (baço): Uma diferença significante do
peso do baço é observada entre NTBA e camundongos implantados com controle, o último sendo maior. Não existe nenhuma diferença significante entre o peso do baço de camundongos implantados com controle e o de ca- mundongos tratados com anti-EphA2. · Peso das metástases (fígado): o peso do fígado de camundon-
gos implantados com controle é significantemente maior do que o peso do fígado de NTBA; por outro lado, ele é significantemente menor em camun- dongos tratados com anti-EphA2 do que em camundongos implantados com controle.
· Número de metástases hepáticas: nenhuma diferença estatísti-
ca é observada entre camundongos implantados com controle e tratados com anti-EphA2. Em conclusão, a implantação intraesplênica de HT-29 de adeno- carcinoma cólico humano significantemente induz um aumento no peso do fígado devido à carga de tumor metastático. O tratamento com anti-EphA2 é capaz de diminuir significantemente a carga de tumor metastático como ob- servado pela redução do peso do fígado de camundongos implantados sem afetar o número de metástases contadas no fígado. Exemplo 9
Clonagem e sequenciamento das cadeias leves e pesadas de Anticorpo 37.1 F5. Preparação de RNA a partir de células de hibridoma que produzem o anticorpo 37.1F5
Preparações de RNA total foram obtidas a partir de 5 χ 106 célu- las de hibridoma, que produzem anticorpo 37.1 F5, usando o kit miniprep RNeasy de Qiagen. Brevemente, 5 χ 106 células foram peletizadas e recolo- cadas em suspensão em 350 pl_ de tampão de RLT (contendo 1 % de β- mercaptoetanol). A suspensão foi homogeneizada passando-a através de uma agulha calibre 21,5 e seringa aproximadamente 10 a 20 vezes ou até que ela não fosse mais viscosa. Etanol (350 μΙ_ de etanol aquoso a 70 %) foi adicionado ao homogenado, que foi misturado bem. A solução foi transferida a uma coluna de rotação, colocada em um tubo de coleta de 2 ml_ e girada a > 8000 χ g durante 15 segundos. A coluna foi lavada duas vezes com 500 pl_ de tampão de RPE, depois transferida a um tubo fresco e eluída com 30 pl_ de água isenta de RNase e uma rotação de 1 minuto. O eluato (30 μΙ_) foi colocado de volta na coluna durante uma Segunda rotação de eluição de 1 minuto. Uma alíquota dos 30 pl_ de eluato foi diluída com água e usada para medir a absorção de UV a 260 nm para a quantificação de RNA. Preparação de cDNA com reação de Transcriptase Reversa (RT)
O cDNA de anticorpo 37.1 F5 de região variável foi gerado a par- tir do RNA total usando o kit Superscriptll da Invitrogen. Os protocolos do kit foram seguidos rigorosamente, utilizando até 5 pg de RNA total a partir das mini preps da Qianeasy. Brevemente, o RNA, 1 pl_ de iniciadores ao acaso, e 1 pL de mistura de dNTP foram levados até 12 pl_ com água destilada es- téril isenta de RNase e incubados a 65° C durante 5 minutos. A mistura de- pois foi colocada em gelo durante pelo menos 1 minuto. Em seguida 4 μΙ_ de χ de tampão de reação, 2 pL a 0,1 M de DTT, e 1 pL de RNaseOUT foram adicionados e a mistura foi incubada a 25° C durante 2 minutos em um cicli- zador térmico MJ Research. O ciclizador térmico foi pausado de modo que 1 pL de enzima Superscriptll pode ser adicionado e depois reiniciado durante um adicional de 10 minutos a 25° C antes de mudar para 55° C durante 50 minutos. A reação foi inativada por calor aquecendo-se até 70° C durante 15 min e o RNA foi removido adicionando-se 1 pL de RNase H e incubando a 37° C durante 20 minutos. Reações de PCR degeneradas
O procedimento para a reação de PCR degenerada de primeira rodada no cDNA derivado de células de hibridoma foi fundamentado em mé- todos descritos em Wang et ai (2000; J Immunol Methods.; 233(1-2): 167-77) e Co et al. (1992; J Immunol.; 148(4): 1149-54). Os iniciadores para esta ro- dada (Tabela 2) contêm sítios de restrição para facilitar a clonagem nos plasmídeos de pBluescriptll.
Os componentes de reação de PCR (Tabela 3) foram misturados em gelo em tubos de PCR de parede fina e depois transferidos a um cicliza- dor térmico de pesquisa MJ pré aquecido e pausado a 94° C. As reações foram realizadas usando um programa derivado de
Wang et al. (2000; J Immunol Methods.; 233(1 -2):167-77), como segue: Nome: Wang45
1)94° C 3:00 min
2) 94° C 0:15 s 3) 45° C 1:00 min
4) 72° C 2:00 min
5) Goto 2 29 vezes
6) 72° C 6:00 min
7) 4o C para sempre 8) fim
As misturas de reação de PCR depois foram conduzidas em um gel de agarose de fusão baixa a 1 %, as faixas de 300 a 400 bp foram exci- sadas, purificadas usando mini colunas de DNA Zymo, e enviadas para A- gencourt biosciences para sequenciamento. Os iniciadores de PCR 5' e 3' respectivos foram usados como iniciadores de sequenciamento para gerar os cDNAs de região variável de 37.1 F5 de ambas as direções.
Clonagem da seqüência de extremidade 5'
Visto que os iniciadores degenerados usados para clonar as se- qüências de cDNA de cadeia leve e cadeia pesada de região variável de 37.1 F5 altera as seqüências de extremidade 5', esforços de sequenciamento adicionais foram necessários para decifrar as seqüências completas. A se- quência cDNA preliminar dos métodos descritos acima foi usada para pes- quisar o sítio de NCBI IgBIast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) para as seqüências de linha germinativa de murino a partir das quais a seqüência de 37.1 F5 é derivada. Iniciadores de PCR foram designados (Tabela 4) para fortalecimento até a seqüência líder do anticorpo de murino de modo que uma nova reação PCR possa produzir o cDNA de região variável completo, inalterado pelos iniciadores de PCR. As reações de PCR1 purificações de faixa, e sequenciamento foram realizadas como descrito acima. As seqüên- cias de linha germinativa a partir das quais a cadeia leve e cadeia pesada de mu37.1F5 são provavelmente derivadas, são acessíveis sob os números de acesso no Genbank MUSIGKVR3 e AF303839, respectivamente. Análise de peptídeo para confirmação de seqüência
A informação de seqüência de cDNA para a região variável foi combinada com a seqüência de região constante de linha germinativa para obter seqüências de cDNA de anticorpo de tamanho natural. Os pesos mo- Ieculares da cadeia pesada e cadeia leve depois foram calculados e compa- rados com os pesos moleculares obtidos por análises de LC/MS do anticor- po 37.1 F5 de murino.
A Tabela 5 fornece a massa calculada das seqüências de cDNA para LC e HC de 37.1 F5 juntamente com os valores medidos por LC/MS. As medições do peso molecular são compatíveis com as seqüências de cDNA tanto para a cadeia leve quanto pesada de 37.1 F5.
Essencialmente o mesmo método foi usado para a clonagem das cadeias leves e pesadas de 37.3D7 e 53.2H11. Os números de acesso no Genbank das seqüências de linha germinativa a partir das quais a cadeia leve e a cadeia pesada de 37.3D7 são provavelmente derivadas, são res- pectivamente MMU231217 e AF303868. Para 53.2H11, eles são respecti- vãmente MMU231196 e AF303833; para EphA2-N1, K02161 e J00488 res- pectivamente; e para EphA2-N2, AJ231222 e J00488 respectivamente. Exemplo 10
Inibição do crescimento de células tumorosas que expressam EphA2 por humanizado-37.3D7-SPDB-DM4 e humanizado-53.2H11-SPDB-DM4 Os anticorpos 37.3D7 humanizado e 53.2H11 humanizado foram
conjugados a L-DM4 N2desacetil-N2(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)- maitansina usando Iigante de SPDB (éster de N-hidroxissucinimda do ácido 4-[2-piridilditio]butanóico). Brevemente, o anticorpo foi modificado a 8 mg/mL com excesso molar de 5,5 ou 6,5 vezes de SPDB para hu53.2H11 e hu37.3D7 respectivamente. A reação foi realizada em Tampão A (50 mM de KP/50 mM de NaCI/2 mM de EDTA, pH 6,5, 95 % v/v) com EtOH (5 % v/v) durante 90 minutos em temperatura ambiente. O anticorpo modificado de- pois foi purificado por coluna de dessalinização SephadexG25 com Tampão A. Em seguida, o anticorpo modificado foi reagido com um excesso molar de 1,7 vezes de DM4 sobre o Iigante de SPDB. A reação foi realizada a 2,5 mg/mL de anticorpo em Tampão A (97 % v/v) e DMA (dimetilacetamida, 3 % v/v) em temperatura ambiente durante 20 horas. O conjugado foi purificado por coluna de dessalinização SephadexG25 com 10 mM de Histidina, 130 mM de Glicina, 5 % de sacarose, pH 5,5. A razão de fármaco para anticorpo foi de 4,0 para hu37.3D7-SPDB-DM4 e 3,1 para hu53.2H11-SPDB-DM4.
Os efeitos de hu37.3D7-SPDB-DM4 e hu53.2H11-SPDB-DM4 sobre o crescimento de células tumorosas que expressam EphA2 foram pri- meiro testados usando o ensaio de WST-8 ((2-(2-metóxi-4-nitrofenil)-3-(4- nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazólio, sal monossódico) de proliferação celular in vitro (Catálogo# CK04-11, Dojindo Molecular Technogies, Inc). Vá- rias linhagens de célula de tumor humano foram testadas. Aproximadamente 2000 células/reservatório foram plaqueadas em uma placa de 96 reservató- rios em meio regular (como sugerido a partir de ATCC para cada linhagem de célula) com 10 % de soro na presença de uma variedade de concentra- ção de hu37.3D7-SPDB-DM4 ou hu53.2H11-SPDB-DM4. As células depois foram deixadas cultivar durante 5 dias. Uma solução de WST-8 [20 μΙ_ de solução] depois foi adicionada e as células foram devolvidas à incubadora durante 2 a 3 h. A absorbância da placa foi medida a 450 nm e 650 nm. Dois grupos de controle foram usados nos experimentos. 0 % de sobrevivência é o controle apenas do meio. 100 % de sobrevivência é o controle apenas de células. Para a análise de dados, os valores de A650 nm (comprimento de onda de referência) foram primeiro subtraídos dos valores de A450 nm cor- respondentes. Depois, valores de A450 nm de cada amostra foram normali- zados por subtração de valores de A450 nm do controle de fundo (meio a- penas). As frações de sobrevivência foram calculadas pelos valores de A450 normalizados das amostras divididos pelos valores de A450 normalizados a partir dos controles apenas de células (100 % de sobrevivência - 0 % de so- brevivência). Valores de Iog [Ab-DM4] foram plotados no eixo χ e frações de sobrevivência foram plotadas no eixo y.
Hu37.3D7-SPDB-DM4 e hu53.2H11-SPDB-DM4 significante- mente inibiram o crescimento de células tumorosas que expressam EphA2 humanas, incluindo células de tumor de próstata PC3, células de tumor de mama MDA-MDA-MB-231, células de melanoma WM-115, melanoma célu- las A375 e células de tumor de cólon LoVo. Como um exemplo, as desco- bertas com as células de tumor de próstata PC3 são mostradas. O hu37.3D7-SPDB-DM4 ou hu53.2H11-SPDB-DM4 inibiu fortemente o cresci- mento de células PC3 em uma maneira dependente de dose com um valor de IC50 similar de 0,02 nM (FIG. 15A & 15B). A potência de conjugados cor- relacionou-se com os níveis de expressão de EphA2. Mais do que a concen- tração mais alta de 50 vezes de hu37.3D7-SPDB-DM4 ou hu53.2H11-SPDB- DM4 foi necessário para inibir o crescimento das células SK-Mel28 (valores de IC50: 1,3 nM e > 5 nM, respectivamente; FIG. 15A & 15B), que expressa- ram nível quase indetectável de EphA2 na superfície da célula (medido por dados de FACS não mostrados) (FIG. 15A & 15B). Portanto, resultados dos ensaios de inibição de crescimento in vitro demonstraram a capacidade de conjugados de anticorpo anti-EphA2 antagonista para inibir especificamente o crescimento de linhagens de célula de tumor que expressam EphA2.
Os efeitos de hu37.3D7-SPDB-DM4 e hu53.2H11-SPDB-DM4 sobre o crescimento de xenoenxertos de tumor que expressam EphA2 foram testados. Um estudo usando o modelo de xenoenxerto de tumor de mama MDA-MB-231 é mostrado como um exemplo. Xenoenxertos de câncer de mama humano MDA-MB-231 foram estabelecidos em camundongos SCID CB17 fêmeas de 5 semanas de idade por injeção subcutânea de 1 χ 107 cé- lulas MDA-MB-231. Quando tumores de xenoenxerto de MDA-MB-231 foram estabelecidos (tamanho médio de 83 mm3), os camundongos foram tratados com uma única injeção i.v. de hu3D7-SPDB-DM4 ou hu2H11-SPDB-DM4 ou PBS. As doses de anticorpos foram 15 mg/kg de peso corporal do camun- dongo, 7,5 mg/kg de peso corporal do camundongo e 3,25 mg/kg de peso corporal do camundongo. Os crescimentos de tumores de MDA-MB-231 fo- ram completamente inibidos por conjugados de anticorpo hu3D7-SPDB-DM4 ou hu2H11-SPDB-DM4 em todas as concentrações testadas exceto em 3,25 mg/kg de hu2H11-SPDB-DM4, que mostra o retardo marcante do crescimen- to de célula tumorosa em relação ao controle de PBS (FIG. 16A & 16B). Os volumes de tumor médios em cada grupo (6 camundongos por grupo) são mostrados na FIG. 16A & B. Em resumo, tanto hu3D7-SPDB-DM4 quanto hu2H11-SPDB-DM4 têm atividades inibitórias de crescimento potente sobre tumores que expressam EphA2 in vivo. Nenhuma toxicidade de ambos os conjugados de anticorpo foi observada, com base nas medições do peso corporal. TABELAS Tabela 1A:
Os resíduos de superfície de estrutura de cadeia leve de mu37.3D7 e resíduos correspondentes na mesma posição de Kabat no anti- corpo 28E4 humano. Os resíduos que são diferentes e portanto mudados no anticorpo hu37.3D7 estão nas caixas acinzentadas. Resíduos de Superfície de Estrutura de Cadeia Leve de mu37.3D7 E Resí- duos Correspondentes No Anticorpo 28E4 Humano
40
41
G
57
G
60
67
80
81
*100ΐ
107
S
K
K
108
R
R
Tabela 1B:
Os resíduos de superfície de estrutura de cadeia pesada de mu37.3D7 e resíduos correspondentes na mesma posição de Kabat no anti- corpo 28E4 humano. Os resíduos que são diferentes e portanto mudados no anticorpo hu37.3D7 estão em caixas acinzentadas. Os resíduos marcados com asterisco (*) são retromutados ao resíduo de mu37.3D7 em uma ou mais variantes de hu37.3D7.
Resíduos de Superfície de Estrutura de Cadeia Pesada de mu37.3D7 E Re- síduos Correspondentes No Anticorpo 28E4 Humano Posição de Kabat mu37.3D7 28E4 1 Q Q 3 Q Q 14 P P G G
..... „ - 41 P P 42 G G 43 K Q
82B S S 84 S S 85 E E 105 Q Q 112 S S
Tabela 2:
Iniciadores usado para as reações de PCR degeneradas são fundamentados naqueles em Wang et al., 2000 exceto HindKL (SEQ ID NO: 58) que é fundamentado em Co et al. 1992. Bases mistas são definidas co- segue: H = A + T + C,S = g + C, Y = C + T,K = G + T,M = A + C, R = A
mo
Iniciador Seqüência BamIgGI (SEQ ID NO: 53) GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCG Illl GGC lgG2Abam (SEQ ID NO: 54) GGAGGATCCCTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA EcoMHI (SEQ ID NO: 55) CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC EcoMH2 (SEQ ID NO: 56) CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG SacIMK (SEQ ID NO: 57) GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA HindKL (SEQ ID NO: 58) TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC Tabela 3:
As misturas de reação de PCR de cadeia leve e pesada para a clonagem das seqüências de cDNA de região variável de 37.1 F5._
Mistura de reação de cadeia leve Mistura de reação de cadeia pesada μΙ de tampão de reação de PCR de 10 X (Roche) 4 μΙ de mistura de dNTP a 10 mM (2,5 mM cada) 2 μΙ de Padrão (reação RT) 5 μΙ de iniciador esquerdo SacIMK a 10 μΜ 5 μΙ de iniciador direito HindKL a 10 μΜ 5 μΙ de DMSO 0,5 μΙ de Taq Polimerase (Roche) 23,5 μΙ de H20 destilada estéril 5 μΙ de tampão de reação de PCR de 10 X (Roche) 4 μΙ de mistura de dNTP a 10 mM (2,5 mM cada) 2 μΙ de Padrão (reação RT) 2,5 μΙ de iniciador esquerdo EeoMHI a 10 μΜ 2,5 μΙ de iniciador esquerdo EcoMH2 a 10 μΜ 5 μΙ de iniciador direito BamIgGI a 10 μΜ 5 μΙ de DMSO 0,5 μΙ de Taq Polimerase (Roche) 23,5 μΙ de H20 destilada estéril Total de 50 μ I Total de 50 μ I
Tabela 4:
Os iniciadores de seqüência líder de murino de extremidade 51
usados para as reações de PCR de segunda rodada de 37.1 F5. Os iniciado- res de extremidade 3' são indênticos àqueles usados nas reações de primei- ra rodada visto que eles iniciam às seqüências de região constante respecti- vas.
Iniciador_Seqüência___
Líder de LC de 38SB13 (SEQ ID NO: 59) gacagacacactcctgctatggg_
Líder de HC de 5F85 (SEQ ID NO: 60) gcagaattcatgogatggagcyggatcttt<
Tabela 5:
Os pesos moleculares calculados de cDNA e medidos de LC/MS
Cadeia leve Cadeia pesada cDNA LC/MS Diferença cDNA LC/MS Diferença 37.1F5 24031 Da 24029 Da 2 Da 49316 Da 49333 Da 17 Da Listagem de Seqüência
<110>" SANOFI-AVENTIS
<120> Anticorpo Antagonista para o Tratamento de Câncer
<130> FR20060?0 PCT
<150> EP 06291160.7
<151> 2006-07-18
<160> 80
<170> Patentln versão 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 1
Ser Tyr Trp Met His 1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 2
Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Met 10 15
Asn
<210> 3
<211» 12
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 3
Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> mus sp.
<400> 4
Thr vai ser ser Ser vai Asn Ser ser Tyr Leu His 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 5
Ser Thr Ser Asn Leu Pro ser 1 5
<210> 6 <211> 10 <212> PRT <213>, Mus sp.
<400> 6
His Gln Tyr His Arg ser Pro Gln Phe Thr ίο
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 7
Gly Tyr Thr Met Asn
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 8
Leu Ile Asri Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Lys Phe Lys 10 15
Gly
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp,
<400> 9
Trp Gly Asp Tyr Gly ser phe Ala Tyr
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 10
Ara Ala Ser G"lu Ser vai Asp Thr Phe Glv Ivr Ser Phe Ilp Tyr
1 5 10' ' IS
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 11
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Khjs sp.
<400> 12
Gln Gln Ser Asrt Glu Asp Pro Pro Thr <210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 13
Ala Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus Sp.
<400> 14
Leu vai Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Glu 1 5 10 IS
ASp
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 15
Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp vai
1 5 10
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> mus sp.
<400> 16
Lys ser ser Gln Ser Leu Ile His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 10 15
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 17
Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 18
Trp Gln Gly Ser His Phe Pro Arg Thr
<210> 19 <211> 363 <212> DNA <213> Mus sp. <220>
<221> COS
<222> Cl)..(363)
cag gtç caa ctg caa caa cct gag tct gaa ctg gtg agg cct gga gct 48
Gln Vai Gln Leu Gln Gln Pro Gly ser Glu Leu vai Arg Pro GIy Ala 1 5 10 15
tca gtq cag ctg tcc tgt aag gct tct gac tac tca ttc acc age tac 96
Ser Val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr ser Phe Thr ser Tyr 25 30
tgg atg cac tgg gtg aga cag agg cct gga caa ggc ctt caa tgg att 144 Trp Met His Trp vai Arg Gln Arg Pro Giy Gln GTy Leu Gln Trp Ile 40 45
gga aat att tat cct gat act ggt aat act aat tac gat gag aaa ttc 192
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
atg aac aag gcc aca ctg act gta gac aca tat tcc age aca acc tac 240 Met Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr ser Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80
atg cag ctc age age ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
gea aga tgg ggg tta gta cgg tat ttc ttt gea atg gac tac tgg ggt Ala Arg Trp Gly Leu vai Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
ι nn irtc -ι ι λ
100 105 110
caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly ser Glu Lpu Val Ara Pro Gly Ala
10 15'
Ser vai Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr ser Phe Thr Ser Tyr 25 30
Trp Met His Trp vai Arg Gln Arg pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Met Asn Lys Ala Thr Leu Ttir vai Asp Thr Tyr Ser Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ttir Ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
336 363 Gln Gly Thr ser Val Thr Val Ser Ser . 115 120
<210> 21
<211> 354
<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(354)
<400> 21
gag gtç cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct gga gct 48
Glu Val Gln Leu Gln Gln ser Gly pro Glu Leu VaT Lys Pro Gly Ala
15
tca atg aag att tcc tgc agg gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac ser Met Lys lie Ser Cys Arg Ala ser Giy Tyr ser Phe Thr Gly Tyr 25 30
gga ctt att aat cct cac aat ggt ggt tct age tac aac ctg aag ttc Gly Leu lie Asn Pro His Asn Gly Gly ser ser Tyr Asn Leu Lys Phe 50 55 60
gta aga tgg ggt gac tac ggc tct ttt gct tac tgg ggc caa ggg act Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
96
acc atg aac tgg gtg agg cag age cat gga aag aac ctt gag tgg att 144
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 40 45
192
aag gac aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc age aca gcc tac 240
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ttrr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gaa gac tct gea gtc tat tac tgt 288
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys
85 90 95
336
ctg gtc act gtc tct gea 354
Leu Val Thr vai Ser Ala 115
<210> 22
<211> IlS
<212 > PRT
<213> Mus sp.
<400> 22
Glu vai Gln Leu Gln Gln ser Gly pro Glu Leu vai Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser cys Arg Ala Ser Gly Tyr ser Phe Thr Gly Tyr 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys Ser Ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
>
vai Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr IOO 105 110
Leu Val Thr vai ser Ala 115
<210> 23
<211> 357
<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(357)
<400> 23
gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct Glu Val Gln Leu Gln Gln ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15
gga ctt gtt aat cct tac aat ggt ttt agt age tac aac cag aat ttc Gly Leu vai Asn Pro Tyr Asn Gly Phe ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60
gea aga gaa ttc tac ggc tac cgg tac ttc gat gtc tgg ggc gea ggg Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp vai Trp Gly Ala Gly 100 105 110
48
tca gtg aag att tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act gcc tac 96
Ser vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ttir Ala Tyr 25 30
tac atg cac tgg gtg aag caa agt cat gta aag agt ctt gag tgg att 144
Tyr Met His Trp Val Lys Gln ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
192
gag gac aag gcc age ttg act gta gat aag ttc tcc age acc gcc tac 240
Glu Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Ala Tyr
€5 70 75 80
atg gaa ctc cac age ctg aca tct gag gac tct gea gtc tat tac tgt 288
Met Giu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
336
acc gea gtc act gtt tcc tca 3 57
Thr Ãla vai Thr vai ser Ser 115
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 24
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu vai Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 25 30
Tyr Met His Trp vai Lys Gln Ser His vai Lys Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Leu vai Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Glu asρ Lys Ala Ser Leu Thr vai Asp Lys Phe Ser ser Thr Ala Tyr 65 70 * ' 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp vai Trp Gly Ala Gly 100 105 110
Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 25
<211> 333
<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> Cl)·· (333)
<400> 25
caa att gtt ctc acc cag tct cca gca ate atg tet gea tet cta ggg
Gln lie vai Leu Thr Gln ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
48
gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gtc age tca agt gtg aat tcc agt 96
Glu Arg vai Thr Met Thr Cys Thr vai ser ser Ser VaT Asn Ser Ser 25 30
tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg 144
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
40 45
att tat age aca tcc aac ctg cct tct gga gtc cca gct cgc ttc agt Ile Tyr Ser Thr ser Asn Leu Pro Ser GTy vai Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60
ggc agt gga tct ggg acc tct tac tct ctc aca ate age acc ata gag
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ttir lie Ser Thr Ile Glu 65 70 75 80
192
240
tct gaa gat gct gcc act tat tac tgt cac cag tat cat cgt tcc cca 288
ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln TVr His Arg Ser Pro 85 90 95
caa tic acc ttc aac tcg qqa aca aac itg qaa ata aaa cgg act 533
Gln Phe Thr Phe Gly Ser c,ly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ara Ala 100 IOS 11Õ
<210> 26 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 26
Gln Ile vai Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 10 15
Glu Arg vai Thr Met Thr Cys Thr Val ser Ser Ser Val Asn ser Ser 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly ser ser Pro Lys Leu Tr*p 40 45 Ile Tvr ser Thr Ser Asn Leu Pro ser Gly vai Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Ile Glu 65 70 75 80
Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr cys His Glri Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95
Gln Phe Thr Phe Gly ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105 110
<210> 27 <211> 336 <212> ONA <213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(336)
<400> 27
gac att gtg ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct gtg tct cta ggg 48
Asp Ile vai Leu Thr Gln ser Pro Ala Ser Leu Ala Val ser Leu Gly 10 15
cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt gtt gat act ttt 96
Gln Arg Ala Thr Ile ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser vai Asp Ttir Phe 25 30
ggc tat agt ttt ata tac tgg tac cag cag aag cca gga cag cca ccc 144
Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 40 45
aga ctc ctc ate tat cgt gea tcc aac cta gaa tct ggg ate cct gcc 192 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60
agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc acc ctc acc att aat 240 Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80
cct gtg gag gct gat gat gtt gea acc tat tac tgt cag caa agt aat 288
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95
gag aat cct ccg aca ttc gqt gaa qqc acc aac ctc caa ate aaa cga 336
Glu Asp Pro Pro Ihr Phe Glv Glv Õlv Thr lví Leu Glu Ilc Lys Arq 100 * 105 110
<210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> MUS sp.
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gln ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser vai Asp Thr Phe 25 30
Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60
Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80
Pro vai Glu Ala Asp Asp vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 29 <211> 339 <212> DNA <213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (1)..(339)
<400> 29
gat gtt gtg atg tcc cag att cca ctc act ttg tcg gtc acc att gga 48
Asp vai vai Met ser Gln lie Pro Leu Thr Leu Ser vai Thr Ile Gly 10 15
caa cca gcc tcc ate tet tgc aag tca agt cag age ctc ata cat agt 96
Gln Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His ser 25 30
gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tet 144
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 40 45
cca aag cgc cta att tat ctg gtg tet aga ctg gac tet gga gtc cct 192
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu vai Ser Arg Leu Asp Ser Gly vai Pro 50 55 60
gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa ate 240
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
age aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt 288 Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly vai TVr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95
tca cat ttt cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate aaa 336 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
cgg 339
Arci
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400?· 30
Asp vai Val Met Ser Gln Ile Pro Leu Thr Leu ser vai Thr Ile Gly 10 IS
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser ser Gln Ser Leu Ile His Ser 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35
40
45
ΡΓΟ Arg Leu Ile Tyr Leu val Ser Ar9 ^eu Asp ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly vai Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95
Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
Arg
<210> 31
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial
<220> . .
<223> Anticorpo humanizado
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<220>
<221> source
<222> CO . · (90)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (106)..(147)
<223> homo sapiens
<220>
<22.1> source
<222> (146)..(192)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (193)..(294)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (295)..(330)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (331)..(363)
<223> homo sapiens
<400> 31
cag gtt cag ctt gtc cag cct gqa gct gaa gtg gta aag cca gga gcc Gln vai Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15 tct gtg aag ctc tct tgt aaa gca age ggc tac aac ttc acc age tat 96
Ser v^l Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr 25 BO
tgg atg cac tgg gtg cgt cag cgt ccc ggc cag gga ctc cag tgg ata 144
Trp Met His Trp vai Arg GTn Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 40 45
ggc aac ate tac ccc ggc acc ggt aat aca aac tat gac cag aag ttc Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60
caa ggc aag gct acc ctt aca gtt gac acc tct acc age act act tat Gln Giy Lys Ala Tlir Leu Thr vai Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80
192
240
atg caa ttg tcc age ctg act age gag gat tcc gcc gtg tat tat tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala VaT Tyr Tyr Cys 85 90 95
gcc agg tgg ggc ctt gtt agg tac ttc ttc gct atg gat tac tgg ggg 336
Ala Arg Trp Gly Leu vai Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
cag ggt act age gtt aca gtt tcc agt 363
Gln Gly Thr ser vai Thr vai Ser ser 115 120
<210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Construto sintético
<400> 32
Gln vai Gln Leu vai Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Asn Phe Thr ser Tyr 25 30
Trp Met His Trp vai Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tvr Asp Gln Lvs Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu ser ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr ser vai Thr Val ser Ser 115 120
<210> 33
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223>. Anticorpo humanizado
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<220>
<221> source
<222> (1)-·(90)
<223> homo sapiens
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
source (91).. (105) MUS Sp.
source (106)..(147) homo sapiens
source (148)..(192) MUS Sp.
source (193)..(294) horao sapiens
source (295)..(330) HUS Sp.
<220>
<221> source
<222> (331)..(363)
<223> homo sapiens
<400> 33
cag gtg cag ctc gtc cag ccc ggt gcc gaa gtg gtg aaa ccc ggt gct Gln vai Gln Leu Val Gln Pro Giy Ala Glu vai vai Lys Pro Gly Ala
10
15
tct gtg aag ctg tca tgc aag gcc tca Ser vaT Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser 25
jc tat agt ttc acc tca tat Ty Tyr Ser Phe Thr ser Tyr
30
tgg atg cat tgg gtc cgc cag agg cca gqc cag gqc ctc caa tgg ate
Trp Met Hie Trp Val Ara Gln Ara Pro Glv Gln Glv leu Glrs Trp lie 3 S 40" ' AS
48
96
144
gqa aac ate tac cct ggc aca gqa aat acc aat tat gac cag aaa ttc
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glii Lys Phe 50 55 60
caa ggt aag gcc act ctg acc gtg gac act age aca tca acc aca tac
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr ser Thr ser Thr Thr Tyr
65
70
75
80
atg cag ctg tct tct ctc act tca gaa cac agt gct gtc tac tac tgc
Met Gln Leu ser Ser Leu Thr ser Glu Ãsp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
gea cga tgg ggc ctc gtt cgt tat ttc ttc gea atg gat tat tgg ggt
Ala Arg Trp Gly Leu vai Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
caa ggc aca tca gtt acc gtg tcc tct
Gln Gly Thr Ser Val Thr vai Ser Ser
192
240
288
336
363
115
120 <210> 34
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Construto sintético <400» 34
Gln vai Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15
ser Val Lys Leu ser cys Lys Ala ser Gly Tyr Ser Phe Thr ser Tyr 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr ser Ttir Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr ser vai Thr vai ser ser 115 120
<210> 35
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpohumanizado <220>
<221> CDS <222> (1)..(363)
<220>
<221> source
<222> (1)..(90)
<223> horoo sapiens
<220>
<221> source
<222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (106)..(147)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (148)..(192)
<223> Mus sp. <220>
<221>. source
<222> (193)..(294)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (295)..(330)
<223> Mus sp.
<220>
<22l> source
<222> (331)..(363)
<22 3> homo sapiens
<400> 35
cag Qta cag ctg gtg cag ccc ggg gct gag gtg gta aag cca gga gcc
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15
tgg atg cat tgg gtg cgt cag cgg cct gag caa gga ctt caa tgg ate
Trp Met His Trp vai Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 40 45
ggg aat att tac ccc gqt acc gqc aat aca aat tat gat cag aag ttc
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60
48
agt gtg aag ttg tcc tgc aag gcc tcc ggg tac aat ttc acc tet tac 96
Ser Val Lys Leu ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr 25 30
144
192
cag ggc aag gct aca ttg acc gtg gat acc tac act tet act act tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr Thr ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80
atg caa ctg age tca ctg acc tcc gag gac tca gcc gtg tac tat tgc 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
gea cgc tgg gga ctc gtc agg tat ttc ttt gcc atg gat tac tgg gga 336
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
cag ggg acc tet gtc acc gtg age agt 363
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 36
<231> 121
<212> PRl
<213> Artificial
<220>
<223> Construto sintético <400> 36
Gln vai Gln Leu vai Gln Pro Gly Ala Glu vai Val Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser vai Lys Leu ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr ser Tyr 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Thr Tyr Thr ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr T^r Cys
85 90
Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val ser Ser 115 120
<210> 37
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Anticorpo humanizado <400> 37
Glu vai Gln Leu Leu Gln ser Gly Gly Glu Leu vai Gln Pro Gly Ala 10 15
Ser Met Arg lie Ser Cys Ala Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 25 30
Thr Met Asn Trp vai Arg Gln ser Pro Gly Lys Asn Leu Glu Trp lie 40 45
Gly Leu lie Asn Pro His Asn Gly Gly ser Ser Tyr Asn Asp ser Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ttir Val Asp Lys Ser ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Leu ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr vai Ser Ser 115
<210> 38
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo humanizado <400> 38
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala 10 15
Ser Met Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 25 30
Thr Met Asn Trp vai Arg Gln Ser Pro Gly Lys Asn Leu Glu Trp rle 40 45
Gly Leu Ile Asn ργο His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp ser Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys ser Ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Het Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ala Glu Asp ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
vai Ara Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu vai Thr vai Ser ser 115
<210> 39 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo humanizado
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<220>
<221> source
<222> (1)..(90)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (91)- -(105)
<223> mus sp.
<220>
<221> source
<222> (106)..(147)
<223> homo sapiens
<22Q>
<223> source
<222> (148).. (195)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (196)..(294)
<223> horao sapiens
<220>
<221> source
<222> (295)..(324)
<223> Mus Sp.
<220>
<221> source
<222> (325)..(357)
<223> homo sapiens
<400> 39
cag gtg caa ctg gtg caa tcc ggt gcc gag gtc gtc aaa ccc gga gca Gln vai Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Giy Ala 10 15 tct gtg aag ata tcc tgt aag gcc tcc ggc tac act ttt aca gcc tac 96
Ser ν.?! Lys Ile Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 25 30
tat atg cat tgg gtt aaa cag agt ccc gtg cag tcc ctg gaa tgg ate 144
Tyr Met His Trp Val Lys Gln ser Pro vai Gln Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
ggc ttg gtg aac cct tat aac gga ttc tca agt tac aat caa aag ttt 192
Giy Leu vai Asn Pro Tyr Asn GÍy Phe ser ser Tyr Asn Gln Lys Phe SO 55 60
cag ggc aag gct tcc ctg act gta gac aag age agt tcc aca gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr vai Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
atg gag etc cat tca ctg aca tca gaa gac age gcc gta tac tat tgc 288
Met Glu Leu His ser Leu Thr Ser Glu Asp ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
gea cgt gag ttc tac ggc tat aga tac ttt gac gtc tgg ggc caa ggc 336 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110
aca gcc gtc aca gtg age tct 357
Thr Ala vai Thr vai ser ser 115
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<22 3> Construto sintético <400> 40
Gln vai Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val vai Lys Pro Gly Ala 10 15
ser vai Lys Ile ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 25 30
Tyr Met His Trp vai Lys Gln Ser Pro Val Gln ser Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Leu vai Asn Pro Tyr Asn Glv Phe Ser Ser Tyr Asn Cln Lys Phe 50 55 ' 60
Gln Gly Lys Ala ser Leu Thr vai Asp Lys Ser ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu His ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp vai Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Ala vai Thr vai Ser Ser
115
<210> 41
<211> 357
<212> DNA <213> Artificial <220> " " <223>. Anticorpo humanizado
<220>
<221> CDS <222> Cl) · · (357)
<220>
<221> source <222> (1) .. (90)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (106)..(147)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (148),.(195)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (196)..(294)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (295)..(324)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (325)..(357)
<223> homo sapiens
<400> 41
cag gtc cag ttg gtg cag tct gga gca gag gtt gtg aaa cca ggc gca 48
Gln vai Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
agt gtc aaa ate age tgt aag gct age gga tac tcc ttt aca gca tat 96
ser vai Lys lie ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr ser Phe Thr Ala Tyr 25 30
tat ato cac tgg gta aag cag age cct qtt cacj aac ctc qaa tgg ate 144
Tyr Met Hii. Trp vai Lys Gln sêr Pro vai G'n Sti Leu C3Iu Trp Ile BS 40 4 5
ggt ctc gtc aac cct tat aat gga ttt tct tct tat aac caa aag ttc 192 Gly Leu vai Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
cag ggc aaa gcc age ctg aca gtg gat aag agt age age act gcc tat 240 Gln Gly Lys Ala ser Leu Thr vai Asp Lys ser ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
atg gaa ctg cat tct ctc acc tct gaa gat agt gca gtg tac tat tgt 288 Met Glu Leu His Ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
gct cgc gag ttc tac ggt tat cga tat ttc gac gtg tgg ggc cag ggt 336 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp vai Trp Gly Gln Gly 100 105 110
act gcc gtg aca gta age agt 357
Thr Ala vai Thr vai Ser Ser 115 <210* 42
<2U> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Construto sintético <400> 42
Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr ser Phe Thr Ala Tyr 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln ser Pro vai Gln Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Leu vai Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr vai Asp Lys ser ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr ser Glu Asp ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Ptie Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp vai Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Ala vai Thr Val Ser Ser 115
<210> 43
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo humanizado
<40G> 4 3
Gln Val Gln Leu vai Gln ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15
ser vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 25 30
Tyr Met His Trp vai Lys Gln ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Leu vai Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser ser Tyr Asn Gln Lys Phe SO 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr vai Asp Lys ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu His ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Ala vai Thr vai Ser Ser 115
<210> 44
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo humanizado
<220>
<221> CDS <222> (1)..(357)
<220>
<221> source
<222> (1)..(90)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (106)..(147)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (148)..(195)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (196)..(294)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (295)..(324)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (325)..(357)
<223> homo sapiens
<400> 44
cag gtt caa ctg gtt cag agt ggg gca gaa gtc gta aag ccc gga gct 48
Gln vai Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15
tcc gtt aag att age tgt aaa gcc tcc ggc tat age ttt aca gct tac 96
ser Val Lys Ile ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 25 30
tat atg cac tgg gtc aag caa tet cct ggg cag age ctg gag tgg ate 144 Tyr Met His Trp vai Lys Gln Ser Pro Giy Gln Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
ggc ctg gtc aat cca tac aat ggc ttc tet agt tac aac caa aaa ttt 192 Gly Leu vai Asn Pro Tyr Asn Gly Phe ser ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
cag gga aaa gcc tcc ctt aca gta gac aag tca tet tcc act gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys ser ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
atg gàa ctt cac tcc ctt aca age gag gat age gcc gtt tat tat tgt 288
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
gcc aga gaa ttt tac gqa tat cgg tat ttc gat gtc tgg ggg cag ggg Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 1Ô5 110
336
act gcc gtg acc gtc agt tet 357
Thr Ala vai Thr Val Ser Ser 115
<210> 45
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<22 3> Construto sintético <400> 45
Gln vai Gln Leu vai Gln ser Gly Ala Glu vai vai Lys Pro Gly Ala 10 15
ser vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 25 30
Tyr Met His Trp vai Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Leu vai Asn Pro Tyr Asn Gly Phe ser ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys ser ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu His ser Leu Ttir Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp VaT Trp Gly GVn Gly 100 105 110
Thr Ala Val Thr vai Ser ser 115
<21Q> 46
<211> 330
<212> ONA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo humanizado <220>
<221> CDS <222> (Ι)--(330)
<220>
<221> source
<222> (1)..(71)
<223> homo sapiens
<220> <221> sotirce <222>, (72)..(105) <223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (106)..(150)
<223> homo sapieris
<220>
<22l> source
<222> (151)..(171)
<223> Mus Sp.
<220>
<221> source
<222> (172)..(269)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (270)..(299)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (300)..(330)
<223> homo sapiens
<400> 46
gag ate gtt ctc aca cag tca cca gcc acc atg age gcc tet ccc ggg
Glu lie vai Leu Thr Gln ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly 10 15
gaa cga gtg ace atg act tgt aca gta tcc tcc tet gtg aac tet tet Glu Arg vai Thr Met Thr cys Thr val ser ser ser vai Asn ser ser 25 30
tac ctg cat tgg tac cag cag aag cct ggt tcc age ccc aaa ctc tgg Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly ser Ser Pro Lys Leu Trp 40 45
ate tac agt aca age aat ctg ccc tca ggc gtt ccc gct agg ttc tcc lie Tyr Ser Thr ser Asn Leu Pro ser Gly vai Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60
gat tca qot tet qac act aat tac tn πα acc ate aac acc ate qaa Gly Ser C-Iv Ser Gly Thr sir Tyr Ser Leu Tfir Ile ser Thr Ile Glu 65 70 7 5 80
tcc gaa gat gct gea aca tac tac tgt cac cag tat cac agg tcc ccc Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95
cag ttt aca ttc ggt ggc ggc acc aaa ctt gag att aag cgt Gln Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110
<210> 47 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Construto sintético <400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Hir Met Ser Ala ser Pro Gly 10 15
Glu Arg vai Thr Met Thr Cys Thr vai Ser Ser Ser Val Asn ser Ser 25 30 Tyr ^eu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser ser Pro Lys Leu Trp 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly vai Pro Ala Arg Phe Ser SO 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr ser Leu Thr Ile ser Thr He Glu 65 70 75 80
Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95
Gln Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys An 100 105 Ili
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo humanizado <400> 48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp ser Leu Ala vai Ser Leu Gly 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu ser vai Asp Thr Phe
25 30
Gly Tyr ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60
Arg Phe ser Gly ser Gly ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro vai Glu Ala Glu ASp vai Ala Thr Tvr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110
<210> 49 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo humanizado <400> 49
Asp Ile vai Leu Thr Gln ser Pro Asp Ser Leu Ala vai ser Leu Gly 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala ser Glu Ser vai Asp Thr Phe 25 30 Gly Tyr ser phe He Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80
Pro vai Glu Ala Glu Asp vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95
Glu Asp pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg IOO 105 110
<210> 50 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo humanizado <400> 50
Asp Ile vai Leu Ttir Gln ser Pro Asp Ser Leu Ala vai Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile ser cys Arg Ala Ser Glu ser vai Asp Thr Phe
25 30
Gly Tyr ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
€5 70 75 80
Pro vai Glu Ala Asp Asp vai Ala Thr Tvr Tvr Cys Gln Gin ser Asn 85 90 ' 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110
<210> 51 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo humanizado <220>
<221> CDS <222> Cl)..(339)
<220>
<221> source
<222> Cl)..(69)
<223> homo sapiens <220>.
<221> source
<222> (70)..(117)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (118)..(162)
<223> howo sapiens
<220>
<221> source
<222> (163)..(183)
<223> Mus sp.
<220>
<221> source
<222> (184)..(279)
<223> homo sapiens
<220>
<221> source
<222> (280)..(306)
<223> mus sp.
<220>
<221> source
<222> (307)..(339)
<223> homo sapiens
<400> 51
gac gtc gtg atg aca caa acc cct ctg tcc ctg age gtc act ctg gga 48
Asp vai vai Met Thr Gln Thr Pro Leu ser Leu ser vai Thr Leu Gly 10 15
caa ccc gct tcc att age tgc aaa tca tca caa tet ctc ate cac tca 96
Gln Pro Ala ser lie Ser Cys Lys ser ser Gln ser Leu Ile His Ser 25 30
gac ggc aaa aca tac ctc aat tgg ctg ctg cag aga cca gga cag tcc 144 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln ser 40 45
cct aaa agg ctt ate tac ctg gtc tet cgt ttg gac tet ggt gta cca 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
gac cgg ttt act ggt tcc ggg gcc gga acc gat ttc act ctg aag att Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Ttir Leu Lys Ile
65 70 75 80
240
tcc agg gtc gaa gel gaa gat ctc goa gtg tat tat tgc tgg caq gqc 288
Ser a rã Val Giu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tvr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 " 95
age cat ttc ccc cgt act ttt ggt ggg ggt acc aaa ttg gaa att aag 336 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
cgt 339
Arg
<21Q> 52
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Construto sintético
<400> 52
Asp vai Val Met Thr Gln Thr Pro Leu ser Leu Ser vai Thr Leu Gly 1 5 10 15
Gln Pro Ala ser Ile ser Cys Lys Ser Ser Gln ser Leu Ile His ser 25 BO
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln ser 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu vai ser Arg Leu Asp Ser Gly vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly vai Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95
Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
Arg <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> MUS sp. <400> S3 ggaggatcca tagacagatg <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> MUS sp.
<400> 54
ggaggatccc ttgaccaggc atcctagagt ca
<210> 55
<211> 32
<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> misc_feature <222> MV.r«">
<223> bases mistas são definidas como a seguir: ; h=A+T+C, S=G+C, y=C+T , G+T, M=A+C ι R=A-Kj1 W=A+T, V « A+C+G, N = A+C+G+T
<400> 55
cttccggaat tcsargtruna gctgsagsag tc
<210> 56
<211> 35
<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> η is a, c, g, or t <400> 56
cttcçggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg
<210> 57
<211> 31
<212> ONA
<213> Mus sp.
<220>
<221> misc_feature <222> Cl).. GlD
<223> bases mistas são definidas como a seguir: H-A+T+C, S=G+C, Y=C+T,
G+T, M=A+C, R-A+G, W=A+T, V = A+C+G, N « A+C+G+T
<400> 57
ggagctcgay attgtgmtsa cmcarwctmc a
<210> 58
<211> 46
<212> ONA
<213> Mus sp.
<400> 58
tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 59
gacagacaca ctcctgctat ggg
<210> 60
<211> 32
<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> mi sc_feature <222> (1)..(32)
<223> bases mistas são definidas como a seguir: H=A+T+C, S=G+C, Y=C+T,
G+T, M-A+C, R-A+C, W«A+T, V « A+C+G, N » A+C+G+T
<400> 60
qcagaattca tgggatggag cyggatcttt ct
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 61
Glu Tyr Asn Met His 1 5
<2 IOs- 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 62
Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe Lys 10 15 Asn
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 63
Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Hir Tyr 10
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 64
Arg Ala Ser Glu ser vai Asp Thr Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 10 15
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 65
Arg Ala Ser Asn Leu Glu ser 1 5
<21G> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 66
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 67
Asp Tyr Asn Met His 1 5
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> Nus sp.
<400> 68
Phe Ile Tyr Pro Tyr aso Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 10 15
As η
<210> 69 <211> 10 <212» PRT <213»«- MUS sp.
<400» 69
Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Tyr 10
<210> 70
<211> 10
<212» PRT
<213> Mus sp.
<400> 70
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10
<210» 71
<211> 7
<212» PRT
<213» MUS sp.
<400» 71
Ile Thr ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<210> 72
<211> 9
<212» PRT
<213> Mus sp.
<400> 72
Gln Gln Trp ser ser Asn Pro Pro Thr 1 5
<210> 73
<211» 360
<212» DNA
<213» Mus sp.
<220>
<221» CDS <222> Cl)..(360)
<4OCte 73
oag gtc cag ctt cag cag tca gqa cct gac ctg gtq aaa cct gag gcc 48
Glu vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15
tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct gga tac aga ttc act gaa tac 96
Ser vai Lys Ile ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Arg Phe Thr Glu Tyr 25 30
aat atg cac tgg atg aag cag age cat gga gag age ctt gag tgg att 144 Asn Met His Trp Met Lys Gln ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
gga tat att tat cct tac aat gat gat act ggc tac agg cag aaa ttc 192 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe 50 55 60
aag aac atg gcc aca ttg act gea gac att tcc tcc aat aca gcc tac 240
Lys Asn Met Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
atg gaa ctc cgc age ctg aca tct gac gac tct gea gtc tat ttc tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga tgg ggc tac ggt agt ggc ggg ggg ttt act tac tgg ggc caa 336 Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Ser Gty Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 IOS 110
ggg act ctg gtc act gtc tct gca 360
Gly Thr Leu Val Thr Val ser Ala 115 120
<210> 74
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 74
Glu Val Gln Leu Gln Gln ser Gly Pro Asp Leu vai Lys Pro Gly Ala 10 15
ser vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Glu Tyr 25 30
Asn Het His Trp Met Lys Gln ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe 50 55 60
Lys Asn Met Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile ser ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp ser Ala vai Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Trp Gly Tyr Gly ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<21Q> 75
<211> 357
<212> DNA
<213> MUS sp.
<220>
<221> CDS <222> C1)..C3S7)
<400> 75
gag gtc cag ctt cag eag tca gga cct gag ctg gtg aaa cct ggg gcc 48
Glu vai Gln Leu Gln Gln ser Gly Pro Glu Leu vai Lys Pro Gly Ala 10 15
tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc act gac tac 96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 25 30
aac atg cac tgg gtg aaa cag age cat gga aag age ctt gag tgg att 144
Asn Met His Trp vai Lys Gln ser Hls Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
gga ttt att tat cct tac aat ggt ggt act ggc tac aac cag agg ttc 192
Giy Phe Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 aag aac aag gcc aca ttg act gta gac act tcc tcc age aca gcc tac 240 Lys A^n Lys Ala Thr Leu Thr vai asd Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
atg gag gtc cgc age ctg aca tet gag gac tet gea gtc tat ttc tgt 288 Met Glu vai Arg ser teu Thr Ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Phe Cys 85 90 95
gea agg gga tat tac tac ggt agg cac ttt gac tac tgg gac caa gac Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Giy Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Glri Gly 100 105 110
336
acc act ctc aca gtc tcc tca 357
Thr Thr Leu Thr vai Ser ser 115
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 76
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu vai Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 25 30
Asn Met His Trp vai Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Phe lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu vai Arg ser Leu Thr ser Glu Asp ser Ala vai Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arc Glv Tyr Tyr Tyr Glv Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 1Ô0 ' 105 UO
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
<210> 77
<211> 336
<212> WIA
<213> Mus sp.
<220>
<221> COS <222> (1)..(336)
<40Q> 77
gac att gtg ctg acc caa tet cca ggt tet ttg gct gtg tet cta ggg 48
Asp Ile VaT Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala VaT Ser Leu GTy 10 15
cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt gtt gac act tat 96
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala ser Glu Ser vai Asp Thr Tyr 25 30
ggc aat agt ttc atg cac tgg tac cag cag aaa gea gga cag ccg ccc 144 Gly Asn ser Phe Met His Trp Tyr Cln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro . 35 40 45
aga ctc ctc ate tat cgt gea tcc aac cta gaa tet ggg ate cct gcc 192
Arg Leu Leu He Tyr Arg Ala ser Asn Leu Glu ser Gly Jle Pro Ala 50 55 60
agg ttc agt ggc agt ggg tet agg aca gac ttc acc ctc acc att aat Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80
240
cct gtg gag gct gat gat gtt gea acc tat tac tgt cag caa agt aat 288
Pro Val Glu Ala Asp Asp vai Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln ser Asn 85 90 95
336
gag gat cct ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgg Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110
<210> 78
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 78
Asp Ile vai Leu Ttir Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala vai Ser Leu Gly IS 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu ser vai Asp Thr Tyr 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80
Pro vai Glu Ala Asp Asp vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln ser Asn 85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110
<210> /fI <211> 321 <212> DNA <213> Mus sp.
<220>
<221> CDS <222> (13..(321)
<400> 79
caa att gtt ctc acc cag tet cca gea ctc atg tet gea tet cca ggg 48
Gln Ile vai Leu Thr Gln ser Pro Ala Leu Met Ser Ala ser Pro Gly 10 15
gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc age tca agt gtg agt tac atg 96
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 25 30
tac tgg tac cag cag aag cca aga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 40 45
ir'
ate aca tcc aac ctg gct tet gqa gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 lie Thr Ser Asn Leu Ala Ser GTy Val Pro Ala Arg Phe Ser Giy Ser 50 55 60
ggg tet gqg acc tet tac tet ctc aca ate age age atg gag gct gaa 240 Giy ser Gly Ttir ser Tyr ser Leu Thr Ile ser ser Met Glu Ala Glu 65 70 7S 80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca ccc acg 288
Trp ser ser Asn Pro Prc 90 95
Asp Ala Ala Thr T^r Tyr Cys Gln Gln Trp ser ser Asn Pro Pro Thr
ttc gga gqg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 80 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 80 Gln Ile vai Leu
10 15
Glu Lys vai Thr Het Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser vai Ser Tyr Met 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser pro Lys Pro Trp Xle Tyr 40 45
Ile Thr ser Asn Leu Ala ser Gly Val Pro Ala Arg Phe ser Gly Ser 50 55 60
Gly ser Gly Thr ser Tyr Ser Leu Thr Ile ser ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln Trp ser ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95
321
Phe Gly Gly Gly Ttir Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 IOS

Claims (74)

1. Anticorpo ou um fragmento de ligação de epítopo deste que especificamente liga-se a um receptor de EphA2 e é um antagonista do dito receptor.
2. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é um anticorpo monoclonal.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é um fragmento Fab1 Fab', F(ab')2 ou Fv.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é capaz de inibir o crescimento de uma célula cancerosa.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é capaz de inibir a migração de uma célula cancerosa.
6. Anticorpo ou um fragmento de ligação de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 e 5, caracterizado em que a dita célula cancerosa é uma célula de um câncer selecionado do grupo consistindo em um câncer de mama, câncer do cólon, câncer endometrial, carcinoma ovariano, osteossarcoma, câncer cervical, câncer de próstata, câncer pulmonar, carcinoma sinovial, câncer pancreático, um sarcoma, um glioma, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer hepático, e outros carcinomas.
7. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é capaz de inibir a angiogênese.
8. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é destituído de ativi- dade agonista.
9. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acordo com a reivindicação 8, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste não estimula fosforilação de EphA2 tirosina.
10. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é capaz de inibir a ligação de um ligando ao dito receptor.
11. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 10, caracterizado em que o dito ligando é ephrinAI.
12. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é capaz de inibir a fosforilação de EphA2 tirosina.
13. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 12, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste é capaz de inibir a fosforilação de EphA2 tirosina na presença de ephrinAI.
14. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é capaz de inibir a sinalização mediada por EphA2.
15. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 14, caracterizado em que a sinalização mediada por EphA2 é um aumento na Fosforilação de Akt.
16. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste liga EphA2 com um Kd de 3 χ 10'10 M ou menor.
17. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito receptor de EphA2 é o ser humano.
18. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, /6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, /70, 71, e 72.
19. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácido selecio- nada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 26, 28, 30, 78, e 80.
20. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido sele- cionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 74, e 76.
21. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementari- dade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 1, 2, e 3, e em que a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais tendo seqüências de a- minoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 4, 5, e 6.
22. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 21, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de ca- deia leve tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: /26.
23. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 21, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: 20.
24. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementari- dade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 7, 8, e 9, e em que a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais tendo seqüências de a- minoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 10, 11, e 12.
25. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 24, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de ca- deia leve tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: 28.
26. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 24, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: 22.
27. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementari- dade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 13, 14, e 15, e em que a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 16, 17, e 18.
28. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 27, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de ca- deia leve tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: 30.
29. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 27, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: 24.
30. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementari- dade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 61, 62, e 63, e em que a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 64, 65, e 66.
31. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 30, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de ca- deia leve tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: 78.
32. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 30, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: 74.
33. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementari- dade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 67, 68, e 69, e em que a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 70, 71, e 72.
34. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 33, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de ca- deia leve tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: 80.
35. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com a reivindicação 33, caracterizado em que o dito anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido consistindo na SEQ ID NO: 76.
36. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste é um anticorpo de murino ou fragmento de ligação de epítopo deste e é produzido por um hibri- doma designado 37.3D7, em que o dito hibridoma é depositado na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA-7660; um hibridoma designado 37.1 F5, em que o dito hibridoma é depositado na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA-7661; um hibridoma desig- nado 53.2H11, em que o dito hibridoma é depositado na American Type Cul- ture Collection sob o número de acesso PTA-7662; um hibridoma designado EphA2-N1, em que o dito hibridoma é depositado na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTM-8407; ou um hibridoma designado EphA2-N2, em que o dito hibridoma é depositado na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTM-8408.
37. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste que liga o mesmo epítopo como um anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivin- dicações anteriores.
38. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de Iiga- ção de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações ante- riores, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, /10 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, e /72.
39. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações ante- riores, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo con- sistindo nas SEQ ID NOS: 47, 48, 49, 50, e 52.
40. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações ante- riores, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, e 45.
41. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de Iiga- ção de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações ante- riores, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada com- preende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais ten- do seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 1, 2, e 3, e em que a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de com- plementaridade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 4, 5, e 6.
42. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com a reivindicação 41, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de cadeia leve tendo uma seqüência representada pela SEQ ID NO: 47.
43. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com a reivindicação 41, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consis- tindo nas SEQ ID NOS: 32, 34, e 36.
44. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 40, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada com- preende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais ten- do seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 7, 8, e 9, e em que a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de com- plementaridade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 10, 11, e 12.
45. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com a reivindicação 44, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 48, 49, e 50.
46. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de Iiga- ção de epítopo deste de acordo com a reivindicação 44, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consis- tindo nas SEQ ID NOS: 37, e 38.
47. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a /40, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada com- preende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais ten- do seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOS: 13, 14, e /15, e em que a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido represen- tadas pelas SEQ ID NOS: 16, 17, e 18.
48. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com a reivindicação 47, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma região variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 52.
49. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com a reivindicação 47, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende uma ou mais de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consis- tindo nas SEQ ID NOS: 40, 42, 43, e 45.
50. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a /40, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, e a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais tendo se- qüências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 61, 62, e 63, e a dita cadeia leve compreende três regiões determinan- tes de complementaridade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 64, 65, e 66.
51. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 40, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, e a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade seqüenciais tendo se- qüências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 67, 68, e 69, e a dita cadeia leve compreende três regiões determinan- tes de complementaridade seqüenciais tendo seqüências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 70, 71, e 72.
52. Anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de liga- ção de epítopo deste de acordo com qualquer uma das reivindicações ante- riores, caracterizado em que o dito anticorpo humanizado ou ressurgido ou fragmento de ligação de epítopo deste é selecionado de um grupo consistin- do em hu37.3D7, hu37.1F5, hu53.2H11, huEphA2-N1, e huEphA2-N2.
53. Conjugado compreendendo o anticorpo ou fragmento de li- gação de epítopo deste como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 52 ligado a um agente citotóxico.
54. Conjugado de acordo com a reivindicação 53, caracterizado em que o dito agente citotóxico é selecionado do grupo consistindo em um maitansinóide, um fármaco leve, um derivado de tomaimicina, um derivado de leptomicina, um pró-fármaco, um taxóide, CC-1065 e um análogo de CC- 1065.
55. Conjugado de acordo com a reivindicação 53, caracterizado em que o dito agente citotóxico é a maitansina DM1 da fórmula: <formula>formula see original document page 144</formula>
56. Conjugado de acordo com a reivindicação 53, caracterizado em que o dito agente citotóxico é a maitansina DM4 da fórmula: <formula>formula see original document page 144</formula> em que o dito agente citotóxico é um derivado de tomaimicina selecionado do grupo consistindo em: • 8,8'-[1,3-benzenodi-ilbis(metileno-óxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno- 7-metóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[5-metóxi-1,3-benzenodi-ilbis(metileno-óxi)-bis[(S)-2-et-(E)- ilideno-7-metóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5- ona] • 8,8'-[1,5-pentanodi-ilbis(óxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi- 1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] 8,8'-[1,4-butanodi-ilbis(óxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi- 1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[3-metil-1,5-pentanodi-ilbis(óxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7- metóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] (II)
57. Conjugado de acordo com a reivindicação 53, caracterizado /8,8,-[2J6-piridinodi-ilbis(óxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi- -1,2,3,11a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • S.e^K-ÍS-terc-butoxicarbonilaminopropilóxiJ^.e-piridinodi-ilbis- (metileno-óxi)]^is[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-5 pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[5-(3-aminopropilóxi)-1,3-benzenodi-ilbis(metileno-óxi)- bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 - c][1,4]benzodiazepin-5-ona] -8,8'-[5-(N-metil-3-terc-butoxicarbonilaminopropil)-1,3- benzenodi-ilbis-(metileno-óxi)-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11a- tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-{5-[3-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoilamino)propilóxi]- -1,3-benzenodi-ilbis(metileno-óxi)}-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-metóxi-1,2,3,11 a- tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • -8,8'-[5-acetiltiometil-1,3-benzenodi-ilbis(metileno-óxi)-bis[(S)-2- metileno-7-metóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin- 5-ona] • éster terc-butílico do ácido bis-{2-[(S)-2-metileno-7-metóxi-5- oxo-1,3,11 a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-8-ilóxi]-etil}- carbâmico -8,8'-[3-(2-acetiltioetil)-1,5-pentanodi-ilbis(óxi)]-bis[(S)-2- metileno-7-metóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin- -5-ona] • e.eHõ-ÍN^-mercapto^^-dimetilbutanoiOamino-I.S- benzeno- di-ilbis(metileno-óxi)]-bis[7-metóxi-2-metileno-1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H- pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[5-(N-4-metilditio-4,4-dimetilbutanoil)-amino-1,3-benzenodi- ilbis(metileno-óxi)]-bis[7-metóxi-2-metileno-1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H- pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[5-(N-metil-N-(2-mercapto-2,2-dimetiletil)amino-1,3- benze- nodi-il(metileno-óxi)-bis[7-metóxi-2-metileno-1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H- pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[5-(N-metil-N-(2-metilditio-2,2-dimetiletil)amino-1,3- benze- nodi-il(metileno-óxi)-bis[7-metóxi-2-metileno-1,2,3,11 a-tetra-hidro-5H- pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[(4-(2-(4-mercapto-4-metil)-pentanamido-etóxi)-piridin-2,6- dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetra-hidro- pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[(1-(2-(4-metil-4-metildissulfanil)-pentanamido-etóxi)- benzeno-3,5-dimetil)-dióxi-]bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra- hidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[(4-(3-(4-metil-4-metildissulfanil)-pentanamido-propóxi)- piridin-2,6-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetra- hidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] -8,8'-[(4-(4-(4-metil-4-metildissulfanil)-pentanamido-butóxi)- piridin-2,6-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetra- hidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[(4-(3-[4-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoil)-piperazin-1-il]- propil)^iridin-2,6-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxl· ,2,3,11 a- tetra-hidro-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[(1-(3-[4-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoil)-piperazin-1 -il]- propil)-benzeno-3,5-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi- -1,2,3,11a-tetra-hiòro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] -8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoilamino)- etóxi]-etóxi}-etóxi)-piridin-2,6-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7- dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] -8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildissulfanil- pentanoilamino)-etóxi]-etóxi}-etóxi)-etóxi]-etóxi}-etóxi)-benzeno-3,5-di^ dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro^irrolo[2,1^ c][1,4]benzodiazepin-5-ona] -8,8'-[(1-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoilamino)- etóxi]-etóxi}-etóxi)-benzeno-3,5-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7- dimetóxi-1,2,3,11a-tetra-hidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] -8,8'-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildissulfanil- pentanoilamino)-etóxi]-etóxi}-etóxi)-etóxi]-etóxi dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetra-hidro-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[(1-(2-[metil-(2-metil-2-metildissulfanil-propil)-amino]-etóxi)- benzeno-3,5-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetra- hidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona] -8,8'-[(4-(3-[metil-(4-metil-4-metildissulfanil-pentanoil)-amino]- propil)-piridin-2,6-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a- tetra-hidro-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] · 8,8'-[(4-(3-[metil-(2-metil-2-metildissulfanil-propil)-amino]- propil)-piridin-2,6-dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dime^ ,2,3,11 a- tetra-hidro-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona] • 8,8'-[(1-(4-metil-4-metildissulfanil)-pentanamido)-benzeno-3,5- dimetil)-dióxi]-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetra-hidro- pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona].
58. Conjugado de acordo com a reivindicação 53, caracterizado em que o agente citotóxico é um derivado de Ieptomicina selecionado do grupo consistindo em: • (2-metilsulfanil-etil)-amida de (2-metilsulfanil-etil)-amida do áci- do (2E,10E,12E,16ZI18E)-(R)-6-Hidróxi-3,5)7,9,11,15,17-heptametil-19- ((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- -2,10,12,16,18-pentenóico • Bis-[(2-mercaptoetil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)- (R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di- hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenóico] • (2-Mercapto-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6- hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- -2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenóico • (2-Metildissulfanil-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)- (R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di- hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenóico • (2-Metil-2-metildissulfanil-propil)-amida de ácido (2Ε, 10E112Ε,16Ζ, 18E)-(R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19- ((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- -2,10,12,16,18-pentenóico • (2-Mercapto-2-metil-propil)-amida do ácido (2E, 10E112E,16Z, 18E)-(R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19- ((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- -2,10,12,16,18-pentenóico.
59. Composição farmacêutica contendo um anticorpo ou frag- mento de ligação de epítopo deste como definido em qualquer uma das rei- vindicações de 1 a 52, ou um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 58, e um portador ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
60. Anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste de acor- do com qualquer uma das reivindicações de 1 a 52, ou um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 58, para o uso como um fármaco.
61. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 52, ou um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 58, para fabricar um fármaco para tratar câncer.
62. Uso de acordo com a reivindicação 61, caracterizado em que o dito câncer é um câncer metastático.
63. Uso de acordo com as reivindicações 61 e 62, caracterizado em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste, ou o dito conjugado inibem a neovascularização do tumor.
64. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a -63 caracterizado em que o dito câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer do cólon, câncer endometrial, carcinoma ovari- ano, osteossarcoma, câncer cervical, câncer renal, câncer de próstata, cân- cer pulmonar, carcinoma sinovial, câncer pancreático, um sarcoma, glioma, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer hepático, e outros car- cinomas.
65. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a -64, compreendendo ainda o uso de um outro agente terapêutico na fabrica- ção da mesma composição ou diferente.
66. Uso de acordo com a reivindicação 65 caracterizado em que o outro agente terapêutico é um antagonista de fator de crescimento de fi- broblasto (FGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator tecidual (TF), proteína C, proteína S, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), ou receptor de HER2.
67. Método de diagnosticar um câncer em um paciente conheci- do ou suspeito ter um câncer, o dito método compreendendo: a) contatar as células do dito paciente com um anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste, b) medir a ligação do dito anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste às ditas células, e c) comparar a expressão na parte (b) com aquela de um pacien- te de referência normal ou padrão.
68. Método de acordo com a reivindicação 67, em que o dito câncer é uma célula de um câncer selecionado do grupo consistindo em um câncer de mama, câncer do cólon, câncer endometriai, carcinoma ovariano, osteossarcoma, câncer cervical, câncer renal, câncer de próstata, câncer pulmonar, carcinoma sinovial, câncer pancreático, um sarcoma, glioma, cân- cer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer hepático, e outros carci- nomas.
69. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado em que as ditas células estão em tecido congelado ou estável ou células do dito paciente.
70. Polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 45, -30 47, 48, 49, 50, 52, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 78 e -80.
71. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 70 caracteri- zado em que o dito polinucleotídeo tem uma seqüência que compartilha pelo menos 80 % de homologia com um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 39, 41, 44, -46, 51, 73, 75, 77, e 79.
72. Vetor recombinante compreendendo um ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 70 e 71.
73. Célula hospedeira compreendendo um vetor de acordo com a reivindicação 72.
74. Linhagem de célula de hibridoma caracterizada em que ela é selecionada do grupo consistindo na linhagem de célula de hibridoma desig- nada 37.3D7 em que a dita linhagem de célula de hibridoma é depositada na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA-7660; a li- nhagem de célula de hibridoma designada 37.1F5, em que a dita linhagem de célula de hibridoma é depositada na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA-7661; a linhagem de célula de hibridoma de- signada 53.2H11, em que a dita linhagem de célula de hibridoma é deposi- tada na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA- 7662; a linhagem de célula de hibridoma designada EphA2-N1, em que a dita linhagem de célula de hibridoma é depositada na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTM-8407; ou a linhagem de célula de hibridoma designada EphA2-N2, em que a dita linhagem de célula de hibri- doma é depositada na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTM-8408.
BRPI0714871-2A 2006-07-18 2007-07-13 anticorpo antagonista para o tratamento de cÂncer BRPI0714871A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06291160 2006-07-18
EP06291160.7 2006-07-18
PCT/IB2007/003074 WO2008010101A2 (en) 2006-07-18 2007-07-13 Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0714871A2 true BRPI0714871A2 (pt) 2013-05-07

Family

ID=37635710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0714871-2A BRPI0714871A2 (pt) 2006-07-18 2007-07-13 anticorpo antagonista para o tratamento de cÂncer

Country Status (31)

Country Link
US (4) USRE47123E1 (pt)
EP (1) EP2044122B1 (pt)
JP (2) JP5622390B2 (pt)
KR (1) KR101528939B1 (pt)
CN (1) CN101622276B (pt)
AR (1) AR061911A1 (pt)
AU (1) AU2007274738B2 (pt)
BR (1) BRPI0714871A2 (pt)
CA (1) CA2658276A1 (pt)
CL (2) CL2007002085A1 (pt)
CO (1) CO6160239A2 (pt)
CR (1) CR10558A (pt)
EA (1) EA020324B1 (pt)
EC (1) ECSP099074A (pt)
ES (1) ES2673822T3 (pt)
GT (1) GT200900002A (pt)
IL (2) IL196470A (pt)
MA (1) MA30634B1 (pt)
ME (1) ME00581B (pt)
MX (1) MX2009000709A (pt)
MY (1) MY157757A (pt)
NI (1) NI200900005A (pt)
NO (1) NO20090758L (pt)
NZ (1) NZ574215A (pt)
PE (2) PE20120431A1 (pt)
SV (1) SV2009003151A (pt)
TN (1) TN2009000007A1 (pt)
TW (1) TW200821329A (pt)
UY (1) UY30492A1 (pt)
WO (1) WO2008010101A2 (pt)
ZA (1) ZA200900545B (pt)

Families Citing this family (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
WO2006122355A1 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Qrsciences Pty Ltd A system and method for improving the analysis of chemical substances using nqr
CN102989000B (zh) 2005-08-24 2016-04-20 伊缪诺金公司 制备美登木素生物碱抗体缀合物的方法
USRE47123E1 (en) 2006-07-18 2018-11-13 Sanofi EPHA2 receptor antagonist antibodies
DK2173379T3 (en) 2007-07-02 2015-12-07 Oncomed Pharm Inc Compositions and methods for treatment and diagnosis of cancer
ES2435779T3 (es) * 2007-07-19 2013-12-23 Sanofi Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapéutico
NZ583966A (en) 2007-08-30 2012-04-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-epha2 antibody
EP2177630A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-21 Institut Gustave Roussy Methods for predicting or monitoring whether a patient affected by a cancer is responsive to a treatment with a molecule of the taxoid family
WO2010070253A1 (en) 2008-12-15 2010-06-24 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
MX2011006314A (es) 2008-12-15 2011-09-22 Zealand Pharma As Analogos de glucagon.
US8685919B2 (en) 2008-12-15 2014-04-01 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
CA2747197A1 (en) 2008-12-15 2010-06-24 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
HUE043645T2 (hu) 2009-06-03 2019-08-28 Immunogen Inc Konjugációs módszerek
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
PT2454282E (pt) 2009-07-13 2015-06-23 Zealand Pharma As Análogos de glucagão acilados
FR2949469A1 (fr) 2009-08-25 2011-03-04 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique
TW201116297A (en) 2009-10-02 2011-05-16 Sanofi Aventis Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor
UY32913A (es) * 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Nuevos maitansinoides y el uso de dichos maitansinoides para preparar conjugados con un anticuero
WO2011057251A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of heart disease
WO2011057249A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of heart disease
CN102858796B (zh) 2010-03-03 2016-05-11 不列颠哥伦比亚大学 寡聚体特异性淀粉样蛋白β表位和抗体
KR101687054B1 (ko) 2010-04-15 2016-12-15 메디뮨 리미티드 증식성 질환 치료용 피롤로벤조디아제핀
WO2011130613A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Seattle Genetics, Inc. Targeted pyrrolobenzodiazapine conjugates
UY33462A (es) 2010-06-23 2012-01-31 Zealand Pharma As Analogos de glucagon
US9169310B2 (en) 2010-06-24 2015-10-27 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
FR2963007B1 (fr) 2010-07-26 2013-04-05 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application therapeutique
SG10201601792UA (en) * 2010-12-08 2016-04-28 Stemcentrx Inc Novel modulators and methods of use
KR20230128583A (ko) 2011-03-29 2023-09-05 이뮤노젠 아이엔씨 일-단계 방법에 의한 메이탄시노이드 항체 접합체의 제조
WO2013012747A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Rspo binding agents and uses thereof
BR112014006703A8 (pt) 2011-09-20 2018-01-09 Spirogen Sarl "pirrolobenzodiazepinas
CN108164551A (zh) 2011-10-14 2018-06-15 西雅图基因公司 吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物
CN103998449A (zh) 2011-10-14 2014-08-20 斯皮罗根有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓
BR122021017842B1 (pt) 2011-10-14 2021-12-14 Medimmune Limited Compostos pirrolobenzodiazepinas e conjugados alvos
BR112014008888A2 (pt) 2011-10-14 2017-04-18 Seattle Genetics Inc pirrolobenzodiazepinas
AP2014007797A0 (en) 2011-12-23 2014-07-31 Boehringer Ingelheim Int Glucagon analogues
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
AR090903A1 (es) 2012-05-01 2014-12-17 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-pmel17
JP6228187B2 (ja) 2012-05-03 2017-11-08 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ Ｇｉｐ−ｇｌｐ−１デュアルアゴニスト化合物及び方法
BR112015000437A2 (pt) 2012-07-09 2017-06-27 Genentech Inc imunoconjugados, formulação farmacêutica, métodos de tratamento e de inbir a proliferação de uma célula
MX2015000357A (es) 2012-07-09 2015-05-12 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-cd22.
SG11201500233PA (en) * 2012-07-13 2015-04-29 Oncomed Pharm Inc Rspo3 binding agents and uses thereof
JP6534927B2 (ja) 2012-07-23 2019-06-26 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ グルカゴン類似体
KR20150039818A (ko) 2012-08-02 2015-04-13 제넨테크, 인크. 항-etbr 항체 및 면역접합체
TWI608013B (zh) 2012-09-17 2017-12-11 西蘭製藥公司 升糖素類似物
SG10201702737TA (en) * 2012-10-04 2017-05-30 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
ES2660029T3 (es) 2012-10-12 2018-03-20 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpo-pirrolobenzodiazepinas
TR201902494T4 (tr) 2012-10-12 2019-03-21 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinler ve onların konjugatları.
WO2014057114A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
CA2885340C (en) 2012-10-12 2016-11-08 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
RS56520B1 (sr) 2012-10-12 2018-02-28 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepin-anti-cd22 konjugati antitela
US10751346B2 (en) 2012-10-12 2020-08-25 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—anti-PSMA antibody conjugates
JP6367204B2 (ja) 2012-10-12 2018-08-01 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 結合用のピロロベンゾジアゼピン誘導体の合成および中間体
LT2906296T (lt) 2012-10-12 2018-06-11 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepino-antikūno konjugatai
HUE042731T2 (hu) 2012-10-12 2019-07-29 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepin-antitest konjugátumok
CN109180815B (zh) 2012-11-20 2022-06-21 赛诺菲 抗ceacam5抗体及其用途
EP3400961B1 (en) * 2012-12-27 2021-02-24 Sanofi Anti-lamp1 antibodies and antibody drug conjugates, and uses thereof
KR102066318B1 (ko) 2013-03-13 2020-01-14 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트
TWI680766B (zh) 2013-03-13 2020-01-01 英商梅迪繆思有限公司 吡咯并苯并二氮呯及其共軛物
EA201591750A1 (ru) 2013-03-14 2016-05-31 Дженентек, Инк. Антитела против b7-h4 и иммуноконъюгаты
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
EP3033111B1 (en) 2013-08-12 2019-03-13 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
RU2016109247A (ru) 2013-09-17 2017-10-19 Дженентек, Инк. Способы применения антител к lgr5
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317981D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US9988429B2 (en) 2013-10-17 2018-06-05 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
PE20160683A1 (es) 2013-10-17 2016-07-21 Zealand Pharma As Analogos de glucagon acilados
MX2016005556A (es) 2013-11-06 2016-07-15 Zealand Pharma As Compuestos agonistas duales de gip-glp-1 y procedimientos.
US10131702B2 (en) 2013-11-06 2018-11-20 Zealand Pharma A/S Glucagon-GLP-1-GIP triple agonist compounds
AR098743A1 (es) 2013-12-13 2016-06-08 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-cd33
CN105828840B (zh) 2013-12-16 2020-08-04 基因泰克公司 1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法
RU2016150370A (ru) 2014-05-22 2018-06-26 Дженентек, Инк. Антитела и иммуноконъюгаты против GPC3
TW202136296A (zh) * 2014-06-27 2021-10-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
ES3034398T3 (en) 2014-08-28 2025-08-18 Bioatla Inc Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SG11201701627PA (en) 2014-09-12 2017-03-30 Genentech Inc Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
EP3191518B1 (en) 2014-09-12 2020-01-15 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
TWI758784B (zh) 2014-09-12 2022-03-21 美商建南德克公司 抗her2抗體及免疫結合物
CA2957354A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US10064937B2 (en) 2014-09-16 2018-09-04 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of dermal fibrosis
HK1243629A1 (zh) 2014-09-17 2018-07-20 基因泰克公司 包含抗her2抗体和吡咯并苯并二氮杂䓬的免疫缀合物
ES2883345T3 (es) 2014-10-29 2021-12-07 Zealand Pharma As Compuestos agonistas del GIP y métodos
US10780096B2 (en) 2014-11-25 2020-09-22 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2016168388A2 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Palatin Technologies, Inc. Therapies for obesity, diabetes and related indications
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
AU2016247499B2 (en) 2015-04-16 2020-09-03 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogue
KR101636882B1 (ko) * 2015-06-25 2016-07-06 전남대학교 산학협력단 인간 피브로넥틴 도메인 Ⅲ 기본 골격의 신규 인간 ＥｐｈＡ2 특이적 결합 단백질 및 그의 용도
EP3350224B1 (en) 2015-09-20 2024-06-19 The United States of America, as Represented By the Secretary, Department of Health and Human Services Monoclonal antibodies specific for fibroblast growth factor receptor 4 (fgfr4) and methods of their use
JP6621919B2 (ja) 2015-10-16 2019-12-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド 束縛ジスルフィド薬物コンジュゲート
TWI714661B (zh) 2015-11-05 2021-01-01 法商賽諾菲公司 新穎念珠藻素化合物及接合物、其製備與其治療用途
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US11534466B2 (en) 2016-03-09 2022-12-27 Aal Scientifics, Inc. Pancreatic stem cells and uses thereof
AU2017248644B2 (en) 2016-04-15 2019-10-31 Bioatla, Llc Anti-Axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017196847A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Variable new antigen receptor (vnar) antibodies and antibody conjugates targeting tumor and viral antigens
LT3455261T (lt) 2016-05-13 2022-11-10 Bioatla, Inc. Antikūnai prieš ror2, antikūnų fragmentai, jų imunokonjugatai ir panaudojimas
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
WO2017214182A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 The United States Of America. As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Fully human antibody targeting pdi for cancer immunotherapy
CA3031559A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (gpc2) and use thereof
WO2018031662A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
KR20220147721A (ko) 2016-11-14 2022-11-03 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 결합 링커, 그러한 결합 링커를 함유하는 세포 결합 분자-약물 결합체, 링커를 갖는 그러한 결합체의 제조 및 사용
CA3036983A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Cureab Gmbh Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
US11236171B2 (en) 2016-12-21 2022-02-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for FLT3 and uses thereof
HRP20210979T1 (hr) 2017-02-08 2021-09-17 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin-protutijelo
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
PT3612537T (pt) 2017-04-18 2022-08-29 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
MX2019012464A (es) 2017-04-20 2019-12-11 Adc Therapeutics Sa Terapia combinada con un conjugado de anticuerpo y farmaco anti-axl.
US20200093934A1 (en) 2017-05-10 2020-03-26 Sanofi Novel peptidic linkers and cryptophycin conjugates, their preparation and their therapeutic use
EP3625256A1 (en) 2017-05-19 2020-03-25 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Human monoclonal antibody targeting tnfr2 for cancer immunotherapy
BR112019026564A2 (pt) 2017-06-14 2020-06-30 Adc Therapeutics Sa regimes de dosagem para a administração de um adc anti-cd19
WO2019005208A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services ANTIBODIES TO HUMAN MESOTHELIN AND USES IN ANTICANCER THERAPY
CA3066953A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Lentigen Technology, Inc. Human monoclonal antibodies specific for cd33 and methods of their use
SMT202200225T1 (it) 2017-08-18 2022-07-21 Medimmune Ltd Coniugati di pirrolobenzodiazepina
IL301636B2 (en) 2017-09-29 2025-02-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugation of an antibody with a pyrrolobenzodiazepine derivative
TWI825046B (zh) * 2017-12-19 2023-12-11 英商拜西可泰克斯有限公司 Epha2特用之雙環胜肽配位基
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
CN108490180B (zh) * 2018-03-12 2020-03-10 南通大学附属医院 EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2020014482A1 (en) 2018-07-12 2020-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Affinity matured cd22-specific monoclonal antibody and uses thereof
US12012463B2 (en) 2018-08-08 2024-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-2 and uses thereof
EP3883608A1 (en) 2019-01-08 2021-09-29 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Cross-species single domain antibodies targeting mesothelin for treating solid tumors
US12122843B2 (en) 2019-01-22 2024-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use
KR20210124260A (ko) 2019-02-07 2021-10-14 사노피 폐암을 치료하기 위한 항-ceacam5 면역접합체의 용도
EP3693023A1 (en) 2019-02-11 2020-08-12 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
EP3938372B1 (en) 2019-03-15 2023-10-25 MedImmune Limited Azetidobenzodiazepine dimers and conjugates comprising them for use in the treatment of cancer
US20220213187A1 (en) * 2019-05-08 2022-07-07 Agilvax Inc. Compositions and methods related to xct antibodies
EP4031250A1 (en) 2019-10-22 2022-07-27 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services High affinity nanobodies targeting b7h3 (cd276) for treating multiple solid tumors
AU2020402752A1 (en) 2019-12-12 2022-06-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibody-drug conjugates specific for CD276 and uses thereof
US20250122282A2 (en) 2020-09-04 2025-04-17 Merck Patent Gmbh Anti-ceacam5 antibodies and conjugates and uses thereof
US20230391852A1 (en) 2020-10-26 2023-12-07 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
CA3200955A1 (en) 2020-11-10 2022-05-19 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugate formulation
AU2021401052A1 (en) 2020-12-18 2023-06-22 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
US12162945B2 (en) 2021-03-05 2024-12-10 Immunome, Inc. EPHA2 antibodies
WO2022232612A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
CN113151473A (zh) * 2021-04-30 2021-07-23 宁夏医科大学 一种用于检测浸润性乳腺癌中EphA2 DNA甲基化的方法及用途
CN117693519A (zh) 2021-05-25 2024-03-12 瓦克斯细胞生物 基于单体拟抗体的嵌合抗原受体和包含其的免疫细胞
US20240270851A1 (en) 2021-06-09 2024-08-15 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
WO2023057564A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Sanofi IMIDAZO[4,5-c]QUINOLINE-4-AMINE COMPOUNDS AND CONJUGATES THEREOF, THEIR PREPARATION, AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATIONS
US20250000988A1 (en) * 2021-10-14 2025-01-02 Xizang Haisco Pharmaceutical Co., Ltd. Epha2 bicyclic peptide ligand and conjugate thereof
IL312519A (en) 2021-11-05 2024-07-01 Lilly Co Eli Anticancer combinations containing antibody-drug conjugates anti-CEACAM5 and anti-VEGFR-2 antibodies
EP4440603A1 (en) 2021-12-02 2024-10-09 Sanofi Cea assay for patient selection in cancer therapy
JP2024545427A (ja) 2021-12-02 2024-12-06 サノフイ Ｃｅａｃａｍ５ ａｄｃ－抗ｐｄ１／ｐｄ－ｌ１組み合わせ療法
CN119677543A (zh) 2022-03-09 2025-03-21 默克专利股份公司 用于与抗体缀合的方法和工具
JP2025509269A (ja) 2022-03-09 2025-04-11 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗ｇｄ２抗体、免疫コンジュゲート、及びその治療的使用
TW202406934A (zh) 2022-05-03 2024-02-16 美商建南德克公司 抗Ｌｙ６Ｅ抗體、免疫結合物及其用途
CN120813387A (zh) 2023-03-01 2025-10-17 赛诺菲 抗ceacam5免疫缀合物用于治疗表达ceacam5的神经内分泌癌症的用途
EP4427763A1 (en) 2023-03-06 2024-09-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-vegfr-2 antibodies and anti-pd1/pd-l1 antibodies
AU2024240376A1 (en) 2023-03-23 2025-11-06 Sanofi CEACAM5 mRNA ASSAY FOR PATIENT SELECTION IN CANCER THERAPY
CN121443320A (zh) 2023-06-05 2026-01-30 赛诺菲 含有抗ceacam5抗体-药物缀合物、抗pd1/pd-l1抗体和抗ctla4抗体的抗肿瘤组合
AU2024295016A1 (en) 2023-07-20 2026-02-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fully human monoclonal antibodies and chimeric antigen receptors against cd276 for the treatment of solid tumors
EP4509142A1 (en) 2023-08-16 2025-02-19 Ona Therapeutics S.L. Fgfr4 as target in cancer treatment
WO2025171238A1 (en) 2024-02-07 2025-08-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind the juxta-membrane region of mesothelin and uses thereof
WO2025172525A1 (en) 2024-02-15 2025-08-21 Merck Patent Gmbh Anti-gd2 antibodies and immunoconjugates for the treatment of gd2 positive cancer
WO2025210264A1 (en) 2024-04-04 2025-10-09 Merck Patent Gmbh Antibody-drug-conjugates binding napi2b
WO2025242845A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Merck Patent Gmbh Colorectal cancer treatment

Family Cites Families (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1516743A (fr) 1966-04-01 1968-02-05 Rhone Poulenc Sa Nouvel antibiotique et son procédé de préparation par culture de streptomyces croceus
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
EP0362371A4 (en) 1988-04-15 1990-10-24 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
ATE119198T1 (de) 1988-04-16 1995-03-15 Celltech Ltd Verfahren zur herstellung von proteinen mittels rekombinanter dna.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP1997891A1 (en) 1988-09-02 2008-12-03 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
US6797492B2 (en) * 1991-05-17 2004-09-28 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
EP0590067A1 (en) 1991-06-14 1994-04-06 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5546806A (en) * 1991-10-17 1996-08-20 Kain; Aron Z. Microwave vector displacement and acceleration transducer
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5656727A (en) * 1992-09-15 1997-08-12 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Antagonists of LHRH
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
AU1736495A (en) 1994-01-31 1995-08-15 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
NZ298145A (en) * 1994-12-29 1998-08-26 Yamanouchi Pharma Co Ltd Monoclonal antibodies having inhibitory effect on type ii phospholipase a2, proteins forming part thereof, cells producing them, dna encoding them, recombinant vector comprising the dna and medicament
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
NO971448L (no) * 1996-04-01 1997-10-02 Sankyo Co Rekombinante anti-Fas-antistoffer og DNA for disse
US6107090A (en) * 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6986890B1 (en) * 1996-11-21 2006-01-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anti-human VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibody
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
EP0970126B1 (en) 1997-04-14 2001-04-18 Micromet AG Novel method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP1071700B1 (en) 1998-04-20 2010-02-17 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
ATE240334T1 (de) 1998-08-27 2003-05-15 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepine
GB9818731D0 (en) * 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Compounds
EP2665062A3 (en) * 1998-12-11 2016-10-19 Sony Corporation Technique for controlling copying of data
ES2261230T3 (es) * 1999-08-17 2006-11-16 Purdue Research Foundation Tratamiento de la enfermedad metastasica.
EP1242401B1 (en) 1999-11-24 2006-12-27 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
CA2395660A1 (en) 1999-12-29 2001-07-12 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US7101976B1 (en) 2000-09-12 2006-09-05 Purdue Research Foundation EphA2 monoclonal antibodies and methods of making and using same
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US7408041B2 (en) * 2000-12-08 2008-08-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
AU2003236015A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition
ES2373715T3 (es) * 2002-05-10 2012-02-08 Medimmune, Llc Anticuerpos monoclonales frente a epha2 y procedimientos de uso de los mismos.
WO2004014292A2 (en) 2002-05-10 2004-02-19 Purdue Research Foundation EphA2 AGONISTIC MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7390898B2 (en) 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
EP1534674A4 (en) 2002-08-02 2007-11-28 Immunogen Inc CYTOTOXIC AGENTS CONTAINING NEW, EFFECTIVE TAXANES AND THEIR THERAPEUTIC USE
SI2345671T1 (sl) 2002-09-27 2016-03-31 Xencor Inc. Optimizirane Fc-variante in postopki za njihovo izdelavo
EP1578446B1 (en) 2002-11-07 2015-04-08 ImmunoGen, Inc. Anti-cd33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
US20040223970A1 (en) * 2003-02-28 2004-11-11 Daniel Afar Antibodies against SLC15A2 and uses thereof
US20050281828A1 (en) * 2003-03-04 2005-12-22 Bowdish Katherine S Method of treating autoimmune disease by inducing antigen presentation by tolerance inducing antigen presenting cells
JP2006523240A (ja) * 2003-04-11 2006-10-12 メディミューン，インコーポレーテッド ＥｐｈＡ２、低増殖性細胞障害ならびに上皮および内皮の再構成
JP4838720B2 (ja) * 2003-05-13 2011-12-14 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 転移および転移がもたらす骨格関連現象を調節する方法
MX342007B (es) * 2003-05-14 2016-09-09 Immunogen Inc Composicion de farmaco conjugado.
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
EP1646655A2 (en) * 2003-07-09 2006-04-19 Eli Lilly And Company Tgf-beta1 ligands
AU2004280066A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genomically modified cell
EP1675857B1 (en) * 2003-10-22 2011-07-13 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
US7528126B2 (en) 2004-03-09 2009-05-05 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines
KR101200133B1 (ko) * 2004-06-01 2012-11-13 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
US7541330B2 (en) * 2004-06-15 2009-06-02 Kosan Biosciences Incorporated Conjugates with reduced adverse systemic effects
AU2005272993B2 (en) 2004-07-15 2010-02-11 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20060223147A1 (en) 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
EP1778726A4 (en) 2004-08-16 2009-03-18 Medimmune Inc INTEGRIN ANTAGONISTS WITH IMPROVED ANTIBODY-DEPENDENT CELL-ASSAYED CYTOTOXICITY ACTIVITY
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
US20060121043A1 (en) * 2004-10-27 2006-06-08 Medimmune, Inc. Use of modulators of EphA2 and EphrinA1 for the treatment and prevention of infections
KR101363252B1 (ko) * 2005-02-04 2014-02-13 레이븐 바이오테크놀로지스, 인코퍼레이티드 Ｅｐｈａ2에 결합하는 항체 및 그것의 사용방법
CA2602663A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
AU2006287416A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Medimmune, Llc Toxin conjugated Eph receptor antibodies
CA2624189A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
SI1813614T1 (sl) 2006-01-25 2012-01-31 Sanofi 174 Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomajmicinske derivate
EP1832577A1 (en) 2006-03-07 2007-09-12 Sanofi-Aventis Improved prodrugs of CC-1065 analogs
USRE47123E1 (en) 2006-07-18 2018-11-13 Sanofi EPHA2 receptor antagonist antibodies
US7840452B2 (en) * 2006-08-30 2010-11-23 International Business Machines Corporation Application, method and process for managing part exchangeability across functional boundaries
KR20140117638A (ko) 2007-08-29 2014-10-07 사노피 인간화된 항-ｃｘｃｒ5 항체, 이의 유도체 및 이들의 용도
TW201116297A (en) 2009-10-02 2011-05-16 Sanofi Aventis Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor

Also Published As

Publication number Publication date
TW200821329A (en) 2008-05-16
SV2009003151A (es) 2010-01-21
ME00581A (bs) 2011-12-20
ECSP099074A (es) 2009-02-27
EA020324B1 (ru) 2014-10-30
WO2008010101A9 (en) 2009-01-29
MY157757A (en) 2016-07-15
CA2658276A1 (en) 2008-01-24
PE20080430A1 (es) 2008-05-19
CN101622276A (zh) 2010-01-06
ZA200900545B (en) 2010-03-31
IL243376A0 (en) 2016-02-29
US8460667B2 (en) 2013-06-11
JP5622390B2 (ja) 2014-11-12
CL2007002085A1 (es) 2008-04-18
KR20090059110A (ko) 2009-06-10
IL196470A (en) 2016-07-31
EA200970130A1 (ru) 2009-06-30
WO2008010101A2 (en) 2008-01-24
NZ574215A (en) 2012-07-27
US20130302316A1 (en) 2013-11-14
AU2007274738A1 (en) 2008-01-24
NO20090758L (no) 2009-03-17
CR10558A (es) 2010-09-13
GT200900002A (es) 2010-11-03
ES2673822T3 (es) 2018-06-25
EP2044122B1 (en) 2018-03-28
US20150274824A1 (en) 2015-10-01
WO2008010101A8 (en) 2009-03-26
JP2009543575A (ja) 2009-12-10
CL2012001387A1 (es) 2012-09-28
UY30492A1 (es) 2008-02-29
EP2044122A2 (en) 2009-04-08
MX2009000709A (es) 2009-02-04
US8992912B2 (en) 2015-03-31
US20100047257A1 (en) 2010-02-25
USRE47123E1 (en) 2018-11-13
CN101622276B (zh) 2015-04-22
IL196470A0 (en) 2011-08-01
ME00581B (me) 2011-12-20
AU2007274738B2 (en) 2013-11-28
NI200900005A (es) 2010-01-26
WO2008010101A3 (en) 2008-07-17
JP2014221757A (ja) 2014-11-27
PE20120431A1 (es) 2012-05-04
MA30634B1 (fr) 2009-08-03
CO6160239A2 (es) 2010-05-20
AR061911A1 (es) 2008-10-01
TN2009000007A1 (en) 2010-08-19
KR101528939B1 (ko) 2015-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0714871A2 (pt) anticorpo antagonista para o tratamento de cÂncer
ES2726754T3 (es) Nuevos anticuerpos anti-CD38 para el tratamiento del cáncer
MX2012003996A (es) Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2.
AU2013209322A1 (en) Novel anti-cd38 antibodies for the treatment of cancer
HK1140492A (en) Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer
HK1139956B (en) Novel anti-cd38 antibodies for the treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 9A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2384 DE 13-09-2016 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.