ES2673822T3 - Anticuerpo antagonista contra EphA2 para el tratamiento de cáncer - Google Patents

Anticuerpo antagonista contra EphA2 para el tratamiento de cáncer Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo que se une específicamente a un receptor EphA2, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es capaz de inhibir la unión de efrinaA1 a dicho receptor, y es capaz de inhibir la fosforilación de tirosina de EphA2 en presencia de efrinaA1, (i) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 4, 5 y 6; (ii) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 10, 11 y 12; (iii) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 16, 17 y 18; (iv) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 61, 62 y 63, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 64, 65 y 66; (v) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 67, 68 y 69, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 70, 71 y 72; o (vi) en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es una versión humanizada o modificada en superficie de un anticuerpo murino o fragmento de éste que se une al epítopo, y en el que dicho anticuerpo murino o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 16, 17 y 18.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpo antagonista contra EphA2 para el tratamiento de cáncer CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona nuevos anticuerpos monoclonales murinos anti-Eph o fragmentos de éstos, y versiones de éstos humanizadas o modificadas en superficie. Más específicamente, la invención se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales o fragmentos de éstos, y versiones de éstos humanizadas o modificadas en superficie, que interaccionan con la familia del receptor EphA y que actúan como antagonistas. Más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos anti-receptor EphA2 que inhiben las funciones celulares del receptor EphA2. Aún más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos anti-receptor EphA2 que antagonizan el crecimiento y la supervivencia de células tumorales y que carecen de actividad agonista.
La presente invención está dirigida además a conjugados citotóxicos que comprenden un agente de unión a células y un agente citotóxico, a composiciones terapéuticas que comprenden el conjugado, a métodos para la utilización de los conjugados en la inhibición del crecimiento celular y el tratamiento de enfermedades, y a un kit que comprende el conjugado citotóxico. En particular, el agente de unión a células es un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de éste que se une al epítopo, y una versión de éste humanizada o modificada en superficie que reconoce y se une a la familia de receptores EphA.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las tirosina cinasas receptoras juegan un papel diverso en el crecimiento y diferenciación celulares durante las repuestas fisiológicas normales y en la transformación oncogénica y la progresión tumoral. Los receptores Eph son una familia única de tirosina cinasas receptoras (RTK), la más grande en el genoma, que consiste en al menos 16 receptores que interaccionan con nueve ligandos de efrina unidos a la membrana (Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6: 462-475). Pueden dividirse en dos grupos, clase A y B, en base a la homología de secuencia y la afinidad de unión (Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6: 462-475). La clase A de receptores Eph interacciona con múltiples ligandos de la familia de la efrina A, un grupo de proteínas de membrana unidas por glicosil-fosfatidilinositol (GPI), mientras que la clase B de receptores Eph se unen a ligandos de efrina B, una familia de proteínas transmembránicas. La unión de los receptores Eph a sus ligandos induce la agrupación de los receptores, la activación de la actividad de cinasa y la transfosforilación posterior de los dominios citoplasmáticos en restos de tirosina, creando sitios de acoplamiento para varias proteínas de señalización (Kullander, K. y Klein, R., 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 3: 475-486; Noren, N. K. y Pasquale, E. B., 2004, Cell signal., 16: 655-666).
El cáncer es una enfermedad caracterizada por proliferación incontrolada, que resulta de una transducción de señales aberrante. Las formas más peligrosas de cáncer son células malignas que tienen la capacidad de diseminarse, bien por crecimiento directo en el tejido adyacente mediante invasión, o mediante implantación en sitios distantes por metástasis. Las células metastásicas han adquirido la capacidad de liberarse del tumor primario, translocarse a sitios distantes a través del torrente sanguíneo o el sistema linfático, y colonizar microentornos distantes y extraños.
Ahora resulta claro que las moléculas Eph también tienen una función en estados patológicos tales como el cáncer. En particular, se ha dado a conocer la sobreexpresión del receptor EphA2 en cánceres de ovario, mama, próstata, pulmón, colon, esófago, células renales, cuello del útero, y melanoma. Se ha sugerido que EphA2 es un regulador positivo del crecimiento y supervivencia celulares en las células malignas (Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187). También se ha descrito una función de EphA2 en la metástasis, ya que la sobreexpresión de EphA2 sola es suficiente para transformar células epiteliales de mama en el fenotipo maligno (Zelinski et al., 2001, Cancer Res., 61: 2301-2306), e incrementa la metástasis espontánea a sitios distantes (Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187). Además, cada vez más pruebas sugieren que EphA2 está implicado en la angiogénesis tumoral (Ogawa et al., 2000, Oncogene, 19: 6043-6052; Cheng et al. 2002, Mol. Cancer Res., 1: 2-11; Cheng et al., 2003, Neoplasia, 5 (5): 445-456; Dobrzanski et al., 2004, Cancer Res., 64: 910-919).
Se ha mostrado que la fosforilación de EphA2 está asociada a su abundancia. El EphA2 fosforilado en tirosina se internaliza rápidamente y se degrada, mientras que el EphA2 no fosforilado demuestra una velocidad de recambio reducida, y por lo tanto se acumula en la superficie celular. Actualmente se cree que esta clase de modelo puede contribuir a la alta frecuencia de sobreexpresión de EphA2 en el cáncer (Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opln. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1 187). Sin embargo, la realidad puede ser más compleja, ya que datos recientes parecen indicar que existe un papel para las funciones dependientes e independientes de la EphA2 cinasa en la progresión tumoral (Fang W. B., 2005, Oncogene, 24: 7859-7868).
Se han desarrollado anticuerpos agonistas que promueven la fosforilación en tirosina y la internalización de EphA2, dando finalmente como resultado la inhibición del crecimiento de las células tumorales (Dodge-Zantek et al., 1999, Cell Growth & Differ., 10: 629-638; documentos WO 01/12172, WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/101764, WO 2006/023403, WO 2006/047637, WO 2007/030642). Estos anticuerpos están dirigidos contra el dominio extracelular de EphA2. Debido a que estos anticuerpos agonistas no inhiben sino que estimulan la fosforilación del receptor EphA2 y las señales posteriores, estos anticuerpos pueden no ser eficaces en tumores que se aprovechan de la actividad de
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cinasa de EphA2. Por otra parte, se ha propuesto la utilización de agentes antagonistas, incluyendo anticuerpos (documento WO 2004/092343), pero no se ha descrito ningún anticuerpo antagonista en ese trabajo. Además, se propuso que dichos anticuerpos estimulan, en lugar de inhibir, la proliferación celular. La solicitud WO 2006/084226 describe anticuerpos que ni incrementan ni disminuyen la actividad de cinasa de EphA2, pero que son capaces de impedir la proliferación de las células tumorales. Sin embargo, no existe ninguna indicación en ese documento de que estos anticuerpos impidan la unión de efrinaA1 al receptor e inhiban la fosforilación de EphA2 inducida por efrinaA1. En lugar de esto, pueden influir en la proliferación de las células tumorales a través de un mecanismo totalmente diferente, por ejemplo impidiendo la agrupación de los receptores tras la unión de efrinaA1. El experto podría, de este modo, no haber concluido que estos anticuerpos son antagonistas, sino que su mecanismo de acción no está claro.
Por lo tanto, existe una necesidad de nuevos anticuerpos antagonistas anti-EphA2, que se unan a los dominios extracelulares del receptor EphA2, inhibiendo su activación por el ligando efrina A1 e inhibiendo el crecimiento de las células tumorales dependiente de la cinasa de EphA2. Dichos anticuerpos antagonistas deberían ser útiles para el tratamiento del cáncer.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con esto, es un objeto de la invención proporcionar agentes que se unan específicamente a la clase A de los miembros de la familia de receptores Eph, tales como EphA2, y que inhiban la actividad celular del receptor antagonizando el receptor. Así, la presente invención incluye anticuerpos o fragmentos de éstos que reconocen el receptor EphA2, preferiblemente humano, y que funcionan como antagonistas de dicho receptor. La invención se define en las reivindicaciones.
El receptor EphA2 tiene un papel en el desarrollo y crecimiento de tumores, y también se ha implicado en la metástasis. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son capaces de inhibir el crecimiento de una célula cancerosa. En algunas otras realizaciones, los anticuerpos de la invención son capaces de impedir la migración de células cancerosas metastásicas. En las realizaciones preferidas, la célula cancerosa es una célula de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, carcinoma de ovario, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, sarcoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de hígado, y otros carcinomas. En otra realización, los anticuerpos de la invención son capaces de inhibir la angiogénesis.
Mientras los anticuerpos anti-EphA2 descritos en la técnica anterior eran principalmente agonistas (por ejemplo, documentos WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/101764, WO 2006/023403, WO 2006/047637, WO 2007/030642), esta invención comprende anticuerpos que reconocen dicho receptor y que tienen una actividad agonista mínima, o, preferiblemente, que carecen de cualquier actividad agonista hacia el receptor. En una realización preferida, los anticuerpos de la invención no estimulan la fosforilación en tirosina de EphA2.
Los anticuerpos de la invención son capaces de inhibir la unión de efrina A1 al receptor EphA2. Son capaces además de inhibir la fosforilación en tirosina de EphA2. En particular, la fosforilación en tirosina de EphA2 se inhibe mediante los anticuerpos de la invención incluso en presencia de efrinaA1. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden bloquear la señalización mediada por EphA2; en particular, son capaces de inhibir la fosforilación de Akt dependiente de EphA2.
Esta memoria descriptiva también proporciona anticuerpos que se unen al receptor EphA2 con una Kd de 0,3 x 10"9 M o menor.
Los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales o monoclonales. Los fragmentos que se unen al epítopo, tales como los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, o Fv, están incluidos dentro del alcance de esta invención. Se prefieren los anticuerpos anti-EphA2 monoclonales. En una realización más preferida, se proporcionan anticuerpos murinos seleccionados de 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; y EphA2-N2, que están totalmente caracterizados en la presente memoria con respecto a las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, las secuencias de ADNc de los genes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, la identificación de sus CDRs (regiones determinantes de la complementariedad), la identificación de sus aminoácidos de superficie, y los medios para su expresión en forma recombinante. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales murinos anti-EphA2 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11, y EphA2-N1 y EphA2-N2 se han depositado bajo el Tratado de Budapest el 16 de junio de 2006 y el 3 de mayo de 2007, respectivamente, en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EEUU, con los números de acceso PTA-7660, PTA-7661, PTA-7662, PTA-8407 y PTA-8408, respectivamente.
La presente invención incluye el anticuerpo monoclonal murino anti-EphA2 seleccionado de 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2, y versiones modificadas en superficie o humanizadas de los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2, en los que los restos expuestos en la superficie de los marcos de la región variable de los anticuerpos, o sus fragmentos de unión al epítopo, se han reemplazado tanto en las cadenas ligeras como pesadas para hacerlos más semejantes a superficies conocidas de anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de éstos de unión al epítopo de la presente invención presentan propiedades mejoradas, ya que son menos inmunógenos (o totalmente no inmunógenos) que las versiones murinas en sujetos
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humanos a los que se administran. Así, las diferentes versiones de los anticuerpos humanizados 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; y EphA2-N2, y los fragmentos de éstos de unión al epítopo de la presente invención, reconocen específicamente el receptor EphA2 y no son inmunógenos para un ser humano.
Las versiones humanizadas de los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2 de la presente invención están completamente caracterizadas en la presente memoria respecto a sus secuencias de aminoácidos respectivas de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, a las secuencias de ADN de los genes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, a la identificación de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), a la identificación de sus restos de aminoácidos de superficie del marco de la región variable, y a la descripción de un medio para su expresión en forma recombinante.
Esta invención también contempla la utilización de conjugados entre conjugados citotóxicos que comprenden (1) un agente de unión a células que reconoce y se une al receptor EphA, tal como el receptor EphA2, y (2) un agente citotóxico. En los conjugados citotóxicos, el agente de unión a células tiene una alta afinidad por el receptor EphA (por ejemplo, el receptor EphA2) y el agente citotóxico tiene un alto grado de citotoxicidad para las células que expresan el receptor EphA, de manera que los conjugados citotóxicos de la presente invención forman agentes eliminadores eficaces.
En una realización preferida, el agente de unión a células es un anticuerpo anti-EphA2 (por ejemplo, 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, o EphA2-N2) o un fragmento de éste que se une al epítopo, más preferiblemente un anticuerpo anti-EphA2 humanizado (por ejemplo, 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, o EphA2-N2) o un fragmento de éste que se une al epítopo, en el que un agente citotóxico se une covalentemente, directamente o a través de un conector escindible o no escindible, al anticuerpo o al fragmento de éste que se une al epítopo. En realizaciones más preferidas, el agente de unión a células es el anticuerpo humanizado 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; y EphA2-N2, o un fragmento de éstos que se une al epítopo, y el agente citotóxico es un taxol, maitansinoide, un derivado de tomaimicina, un derivado de leptomicina, CC-1065, o un análogo de CC-1065.
En las realizaciones preferidas de la invención, el agente de unión a células es el anticuerpo anti-EphA2 humanizado 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, o EphA2-N2, y el agente citotóxico es un compuesto maitansina, tal como DM1 o DM4.
La presente invención también comprende la utilización de fragmentos de anticuerpos anti-EphA2 que retienen la capacidad para unirse al receptor EphA2. En otro aspecto de la invención, se contempla la utilización de equivalentes funcionales de los anticuerpos anti-EphA2.
La presente memoria descriptiva también incluye un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa el receptor EphA2. En aspectos preferidos de la memoria descriptiva, el método para inhibir el crecimiento de la célula que expresa el receptor EphA2 se produce in vivo, y da como resultado la muerte de la célula, aunque también se incluyen las aplicaciones in vitro y ex vivo.
La presente invención también proporciona una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti-EphA2 o un conjugado de anticuerpo anti-EphA2-agente citotóxico según la invención, y un vehículo o excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la composición terapéutica comprende un segundo agente terapéutico. Este segundo agente terapéutico puede elegirse del grupo que comprende los antagonistas del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor tlsular (TF), proteína C, proteína S, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), o receptor HER2.
La presente memoria descriptiva incluye además un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer utilizando la composición terapéutica. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer metastásico. En particular, la célula cancerosa es una célula de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, carcinoma de ovario, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, sarcoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de hígado, y otros carcinomas. En realizaciones preferidas, el conjugado citotóxico comprende un anticuerpo anti-EphA2 y un agente citotóxico. En las realizaciones más preferidas, el conjugado citotóxico comprende un conjugado de anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2-DM1, anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2-DM4, un conjugado de anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2-taxano, o un conjugado de anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2-derivado de tomaimicina, y el conjugado se administra junto con un vehículo o excipientes farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-EphA2 se utilizan para detectar la proteína EphA2 en una muestra biológica. En una realización preferida, dichos anticuerpos se utilizan para determinar los niveles de EphA2 en un tejido tumoral.
La presente memoria descriptiva también incluye un kit que comprende un anticuerpo anti-EphA2, o un conjugado de anticuerpo anti-EphA2-agente citotóxico, e instrucciones para su utilización. En las realizaciones preferidas, los anticuerpos anti-EphA2 son los anticuerpos humanizados 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2, el agente citotóxico es un compuesto de maitansina, tal como DM1 o DM4, un taxano, un derivado de leptomicina, o un derivado
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de tomaimicina, y las instrucciones son para utilizar los conjugados en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer. El kit también puede incluir componentes necesarios para la preparación de una formulación farmacéuticamente aceptable, tal como un diluyente si el conjugado está en estado liofilizado o en forma concentrada, y para la administración de la formulación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra el análisis de la unión específica de anticuerpos anti-EphA2 a células que sobreexpresan EphA2 humano (células 300-19/hu-EphA2) mediante análisis FACs. La Figura 1A muestra los datos para el anticuerpo 37.3D7, la Figura 1B para el anticuerpo 37.1F5, y la Figura 1C para el anticuerpo 53.2H11, respectivamente.
La Figura 2 muestra la unión específica del anticuerpo purificado 37.3D7 a células de cáncer pancreático humano BxPC3, células de cáncer de mama humano MDA-MB-231, y células de cáncer de colon humano HT-29. Se muestran los histogramas del análisis FACS.
La Figura 3 muestra las curvas de unión para los anticuerpos 37.3D7 (Figura 3A), 37.1F5 (Figura 3B) y 53.2H11 (Figura 3C) establecidas con células murinas 300-19 que sobreexpresan EphA2 humano (300-19/hu-EphA2).
La Figura 4 muestra la unión específica de los anticuerpos purificados 37.3D7 y 53.2H11 a células que sobreexpresan EphA2. Se muestran los histogramas del análisis FACS. La Figura 4A muestra los datos para células que sobreexpresan EphA2 murino (300-19/mu-EphA2), y la Figura 4B muestra los datos para células que sobreexpresan EphA2 de rata (300-19/rat-EphA2).
La Figura 5A muestra la unión específica de los anticuerpos purificados 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H11 a células epiteliales de riñón de mono VERO. Se muestran los histogramas del análisis FACS.
La Figura 5B muestra las curvas de unión para los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11 establecidas con células epiteliales de riñón de mono VERO.
La Figura 6 muestra la inhibición de la unión de efrinaA1 biotinilada a células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 por los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11.
La Figura 7A muestra la inhibición de la fosforilación de EphA2 estimulada por efrinaA1 en células de mama MDA-MB-231 por los anticuerpos 37.3D7 y 37.1F5.
La Figura 7B muestra la inhibición de la fosforilación de EphA2 estimulada por efrinaA1 en células de mama MDA-MB-231 por los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H11.
La Figura 7C muestra la inhibición de la fosforilación de Akt estimulada por efrinaA1 en células pancreáticas CFPAC-1 por los anticuerpos 37.3D7 y 37.1F5.
Las Figura 8A y B muestran la estimulación de la fosforilación de EphA2 por efrinaA1 y la ausencia de estimulación de la fosforilación de EphA2 por los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11 en células de mama MDA-MB-231.
Las Figura 9A-9D muestran la inhibición del crecimiento y supervivencia estimulados por suero de células de colon HT-29 (9A), células de colon LoVo (9B), células pancreáticas CFPAC-1 (9C) y células de melanoma UACC-257 (9D) por los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H11.
La Figura 10A muestra la inhibición dependiente de la dosis del crecimiento estimulado por suero de células pancreáticas BxPC3 por el anticuerpo 37.3D7.
La Figura 10B muestra la inhibición dependiente de la dosis del crecimiento estimulado por suero de células de colon LoVo por el anticuerpo 53.2H11.
La Figura 10C muestra la inhibición dependiente de la dosis del crecimiento estimulado por EGF de células de colon LoVo por el anticuerpo 53.2H11.
La Figura 11A muestra la curva de unión del anticuerpo 37.3D7 a células HUVEC.
La Figura 11B muestra la curva de unión del anticuerpo 37.1F5 a células HUVEC.
La Figura 12 muestra la inhibición del crecimiento y supervivencia de células HUVEC estimulados por VEGF por el anticuerpo 37.3D7.
La Figura 13 muestra la inhibición de la fosforilación de Akt inducida por VEGF por el anticuerpo 37.3D7 en células HUVEC.
La Figura 14 muestra el efecto del tratamiento con el anticuerpo 37.3D7 sobre el crecimiento de xenoinjerto de cáncer de colon HT-29 en ratones. El efecto se compara con el de un anticuerpo anti-EGFR y un anticuerpo lgG1
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de control sin unión.
La Figura 15A muestra hu37.3D7-SPDB-DM4.
La Figura 15B muestra hu53.2H11-SPDB-DM4.
la
inhibición del crecimiento de células de tumor de próstata PC3 por
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inhibición del crecimiento de células de tumor de próstata PC3 por
La Figura 16A muestra el efecto del tratamiento con hu37.3D7-SPDB-DM4 sobre el crecimiento de xenoinjerto de tumor de mama MDA-MB-231 en ratones.
La Figura 16B muestra el efecto del tratamiento con hu53.2H11-SPDB-DM4 sobre el crecimiento de xenoinjerto de tumor de mama MDA-MB-231 en ratones.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En la presente memoria se proporcionan nuevos agentes capaces de unirse específicamente a los receptores EphA y antagonizar dichos receptores. En particular, los presentes inventores han descubierto nuevos anticuerpos que se unen específicamente a los receptores EphA en la superficie celular. Mientras que los anticuerpos conocidos previamente que se unen específicamente al receptor EphA también lo activan incluso en ausencia de sus ligandos, los anticuerpos o fragmentos de la presente invención carecen preferiblemente de cualquier actividad agonista. Por otra parte, presentan la capacidad única de inhibir las funciones celulares del receptor incluso en presencia de sus ligandos, una característica de la que carecen totalmente los anticuerpos que se unen a EphA2 conocidos previamente. Además, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos antagonistas de la presente invención inhiben el crecimiento y/o la migración de células tumorales humanas, y/o la angiogénesis, tres propiedades que no se podían prever en absoluto en vista de la técnica anterior (Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187; documentos WO 01/12172; WO 2004/014292; WO 2004/092343).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “receptor Eph” se refiere a una tirosina cinasa que pertenece a la familia de receptores Eph (revisado en Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Revlews Mol. Cell Biol., 6, 462-475). La “clase A de la familia de receptores Eph” o “receptores EphA”, tal como se utiliza en la presente memoria, interaccionan preferiblemente con ligandos unidos por glicosilfosfatidilinositol (GPI) (de la subclase A de efrina, que comprende actualmente cinco ligandos). Los receptores EphA específicos incluyen: EphA1 (también denominado Eph y Esk); EphA2 (también denominado Eck, mEck, Myk2, Sek2); EphA3 (también denominado Hek, Mek4, Tyro4 y Cek4); EphA4 (también conocido como Hek8, Sek1, Tyrol y Cek8); EphA5 (también denominado Hek7, Bsk, Ehk1, Rek7 y Cek7); EphA6 (también denominado mEhk2 y Ehk2); EphA7 (también denominado Hek11, Mdk1, Ebk, Ehk3); y EphA8 (también denominado Eek y mEek), y variantes naturales de éstos. El receptor Eph preferido en la presente memoria es el “receptor EphA2'', que comprende, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos como en los números de acceso de Genbank nM_004431 (EphA2 humano), NM_010139 (EphA2 murino), o NXM_345596 (EphA2 de rata). El término “ligando Eph”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una proteína que se une a, y opcionalmente activa (por ejemplo, estimula la autofosforilación de), un receptor Eph. Un ligando Eph preferido es “efrinaA1 ”, que se une al receptor EphA2 y comprende, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos como en el acceso de Genbank NM_004428 (efrina humana A1).
El término “antagonista”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula que es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de una molécula diana, tal como un receptor EphA. Los antagonistas pueden actuar interfiriendo con la unión de un receptor a un ligando y viceversa, disminuyendo la fosforilación de EphA2, y/o incapacitando o matando a las células que han sido activadas por un ligando. El antagonista puede bloquear completamente las interacciones receptor-ligando, o puede reducir sustancialmente dichas interacciones. Todos estos puntos de intervención por un antagonista deben considerarse equivalentes para los fines de esta invención. Así, dentro del alcance de la memoria descriptiva están incluidos antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen al receptor EphA, al ligando Eph, o a un complejo de un receptor Eph y un ligando Eph; variantes o derivados de la secuencia de aminoácidos de un receptor EphA o ligando EphA que antagonizan la interacción entre un receptor EphA y un ligando EphA; receptor EphA soluble o ligando EphA soluble, opcionalmente condensado con una molécula heteróloga tal como una región de inmunoglobulina (por ejemplo, una inmunoadhesina); un complejo que comprende un receptor EphA en asociación con un ligando EphA; secuencias peptídicas sintéticas o nativas que se unen al receptor EphA o al ligando EphA.
El término “agonista”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier compuesto, incluyendo una proteína, polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un conjugado, una molécula grande, una molécula pequeña, capaz de activar una o más de las actividades biológicas de la molécula diana. Los agonistas de EphA actúan estimulando la fosforilación de la proteína, desencadenando de esta manera la degradación de dicha proteína.
Así, en un aspecto, la presente memoria descriptiva describe, entre otras características, anticuerpos monoclonales anti-EphA, anticuerpos humanizados anti-EphA, y fragmentos de los anticuerpos anti-EphA. Cada uno de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención se diseña para reconocer y unirse específicamente al receptor EphA2 y actúa como un antagonista del receptor EphA2. Más aún, los anticuerpos y fragmentos de
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anticuerpos antagonistas de la invención tienen las propiedades únicas de ser capaces de inhibir el crecimiento de células tumorales humanas, y/o la migración de células cancerosas metastásicas, y/o la angiogénesis.
Un receptor EphA preferido unido por los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos antagonistas de la invención es el receptor EphA2. Un receptor EphA2 preferido es EphA2 humano.
El receptor EphA2 pertenece a una familia de receptores cuya fosforilación de su cola citoplásmica se incrementa tras la unión del ligando para interaccionar con varias proteínas adaptadoras y señalizadoras, lo que da lugar a la activación de diferentes rutas de señalización celular posteriores (Kullander, K. y Klein, R., 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 3: 475-486; Noren, N. K. y Pasquale, E. B., 2004, Cell signal., 16: 655-666). Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “señalización mediada por EphA2” se refiere a todos los eventos celulares que se producen en respuesta a la unión al ligando por EphA2. Mientras que los anticuerpos descritos en la técnica anterior actúan como agonistas del receptor EphA2, y, en particular, incrementan la fosforilación en tirosina de la proteína EphA2, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención carecen preferiblemente de cualquiera de dichas propiedades agonistas. En particular, son incapaces de estimular la fosforilación de EphA2 por sí mismos.
Por otra parte, esta invención proporciona los primeros anticuerpos anti-EphA2 antagonistas reales. En una realización, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención pueden inhibir la unión de un ligando a un receptor EphA. En una realización preferida, mediante los anticuerpos y fragmentos de éstos proporcionados por esta invención, se impide la unión de efrinaA1 a EphA2. De manera extraordinaria, en otra realización, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención son capaces de inhibir la fosforilación en tirosina del receptor EphA2, incluso en presencia de efrinaA1. Además, dichos anticuerpos y fragmentos de éstos son capaces de inhibir la señalización mediada por EphA2. En particular, mediante los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención puede evitarse la fosforilación de Akt dependiente de efrinaA1.
Anticuerpos
El término “anticuerpo” se utiliza en la presente memoria en el sentido más amplio, y específicamente cubre anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa) de cualquier isotipo tal como IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos quiméricos y fragmentos de anticuerpos. Un anticuerpo reactivo con un antígeno específico puede generarse mediante métodos recombinantes, tales como selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores de fagos o similares, o mediante inmunización de un animal con el antígeno o un ácido nucleico que codifique el antígeno.
Un anticuerpo típico está comprendido por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable. Cada región variable contiene tres segmentos denominados “regiones determinantes de la complementariedad” (“CDRs”) o “regiones hipervariables”, que son las principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Se refieren habitualmente como CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N terminal. Las partes más altamente conservadas de las regiones variables se denominan “regiones marco”.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “Vh” o “VH” se refiere a la región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena pesada de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', o F(ab')2. La referencia a “Vl” o “VL” se refiere a la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena ligera de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', o F(ab')2.
Un “anticuerpo policlonal” es un anticuerpo que se ha producido entre o en presencia de uno o más anticuerpos no idénticos diferentes. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de un linfocito B en presencia de otros muchos linfocitos B que producen anticuerpos no idénticos. Habitualmente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente de un animal inmunizado.
Un “anticuerpo monoclonal”, tal como se utiliza en la presente memoria, es un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos que forman esta población son esencialmente idénticos excepto por mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades muy pequeñas. Estos anticuerpos están dirigidos contra un único epítopo, y son, por lo tanto, altamente específicos.
Un “epítopo” es el sitio en el antígeno al que se une un anticuerpo. Puede estar formado por restos contiguos o por restos no contiguos que se aproximan mucho por el plegamiento de una proteína antigénica. Los epítopos formados por aminoácidos contiguos se retienen típicamente en la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por aminoácidos no contiguos se pierden típicamente bajo dicha exposición.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “Kd” se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo/antígeno particular.
La presente invención se realiza a partir de anticuerpos murinos anti-EphA2, en la presente memoria 37.3D7; 37.1 F5; 53.2H11; EphA2-N1; y EphA2-N2, que están completamente caracterizados con respecto a las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada, a la identificación de las CDRs, a la identificación de los aminoácidos de
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superficie, y a los medios para su expresión en forma recombinante. Las secuencias primarias de aminoácidos y de aDn de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; y EphA2-N2, y de las versiones humanizadas, se describen en la presente memoria.
Los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2 son producidos por hibridomas denominados respectivamente 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2, y que están depositados bajo el Tratado de Budapest el 16 de junio de 2006 y el 3 de mayo de 2007, respectivamente, en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EEUU, con los números de acceso PTA-7660, PTA-7661, PTA-7662, PTA-8407 y PTA-8408, respectivamente.
El alcance de la presente invención no está limitado a anticuerpos y fragmentos que comprenden estas secuencias. En su lugar, todos los anticuerpos y fragmentos que se unen específicamente al receptor EphA2 y que antagonizan la actividad biológica del receptor, pero que carecen de actividad agonista, se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Así, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos pueden diferir de los anticuerpos 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; y EphA2-N2, o de los derivados humanizados, en las secuencias de aminoácidos de su esqueleto, en sus CDRs, en su cadena ligera y cadena pesada, e incluso así se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
En una realización, esta memoria descriptiva describe anticuerpos o fragmentos de éstos que se unen al epítopo que comprenden una o más CDRs que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 y 72.
En un aspecto preferido, los anticuerpos como se describen aquí comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, y dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1,2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 61,62, 63, 67, 68 y 69, y dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 64, 65, 66, 70, 71 y 72.
En un aspecto más preferido, los anticuerpos como se describen aquí comprenden tres CDRs que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 y 6. En una realización, se proporciona un anticuerpo 37.3D7, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, y dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 4, 5 y 6.
En otro aspecto más preferido, los anticuerpos como se describen aquí comprenden tres CDRs que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11 y 12. En una realización, se proporciona un anticuerpo 37.1F5, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, y dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, y dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 10, 11 y 12.
En otro aspecto más preferido, los anticuerpos como se describen aquí comprenden tres CDRs que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17 y 18. En una realización, se proporciona un anticuerpo 53.2H11, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, y dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en sEq ID NOS: 13, 14 y 15, y dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 16, 17 y 18.
En otro aspecto más preferido, los anticuerpos como se describen aquí comprenden tres CDRs que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOS: 61,62, 63, 64, 65 y 66. En una realización, se proporciona un anticuerpo EphA2-N1, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, y dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en sEq ID NOS: 61, 62 y 63, y dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 64, 65 y 66.
En otro aspecto más preferido, los anticuerpos como se describen aquí comprenden tres CDRs que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOS: 67, 68, 69, 70, 71 y 72. En una realización, se proporciona un anticuerpo EphA2-N2, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, y dicha cadena pesada comprende tres cDr secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 67, 68 y 69, y dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 70, 71 y 72.
En otro aspecto, los anticuerpos como se describen aquí comprenden una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 20, 22, 24, 74 y 76. En una realización preferida, se proporciona un anticuerpo 37.3D7 que comprende una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 20. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo 37.1F5 que comprende una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 22. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo 53.2H11 que
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comprende una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 24. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo EphA2-N1 que comprende una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 74. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo EphA2-N2 que comprende una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 76.
En otro aspecto, los anticuerpos como se describen aquí comprenden una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 26, 28, 30, 78 y 80. En una realización preferida, se proporciona un anticuerpo 37.3D7 que comprende una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ iD NO 26. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo 37.1 F5 que comprende una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 28. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo 53.2H11 que comprende una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 30. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo EphA2-N1 que comprende una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 78. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo EphA2-N2 que comprende una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en sEq ID NO 80.
Anticuerpos Humanizados o Modificados en Superficie 37.3D7. 37.1F5: 53.2H11: EphA2-N1: y EphA2-N2
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que contiene una secuencia mínima obtenida de inumunoglobulina no humana. Un “anticuerpo quimérico”, tal como se utiliza en la presente memoria, es un anticuerpo en el que la región constante, o una parte de ésta, está alterada, reemplazada, o intercambiada, de manera que la región variable está enlazada a la región constante de una especie diferente, o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo. “Anticuerpo quimérico” también se refiere a un anticuerpo en el que la región variable, o una parte de ésta, está alterada, reemplazada, o intercambiada, de manera que la región constante está enlazada a la región variable de una especie diferente, o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo.
La meta de la humanización es una reducción de la inmunogenicidad de un anticuerpo xenógeno, tal como un anticuerpo murino, para su introducción en un ser humano, a la vez que se mantienen intactas la afinidad y especificidad de unión del anticuerpo frente al antígeno. Los anticuerpos humanizados, o anticuerpos adaptados para evitar el rechazo de otros mamíferos, pueden producirse utilizando varias tecnologías, tales como modificación en superficie e injerto de CDR. Tal como se utiliza en la presente memoria, la tecnología de modificación en superficie utiliza una combinación de modelado molecular, análisis estadístico y mutagénesis para alterar las superficies no CDR de las regiones variables del anticuerpo para que se asemejen a las superficies de anticuerpos conocidos del hospedante diana.
Las estrategias y métodos para la modificación en superficie de anticuerpos, y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos en un hospedante diferente, están descritos en la patente de EEUU 5.639.641. Brevemente, en un método preferido, (1) se generan alineamientos de posiciones de un conjunto de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos para dar lugar a un conjunto de posiciones expuestas en la superficie del marco de la región variable de las cadenas pesada y ligera, en el que las posiciones de alineamiento para todas las regiones variables son al menos aproximadamente idénticas en un 98%; (2) se define para un anticuerpo de roedor (o fragmento de éste) un conjunto de restos de aminoácidos expuestos en la superficie del marco de la región variable de las cadenas pesada y ligera; (3) se identifica un conjunto de restos de aminoácidos expuestos en la superficie del marco de la región variable de las cadenas pesada y ligera que sea los más idéntico al conjunto de restos de aminoácidos expuestos en la superficie de roedor; (4) el conjunto de restos de aminoácidos expuestos en la superficie del marco de la región variable de las cadenas pesada y ligera definido en la etapa (2) se sustituye por el conjunto de restos de aminoácidos expuestos en la superficie del marco de la región variable de las cadenas pesada y ligera definido en la etapa (3), excepto aquellos restos de aminoácidos que están en dentro de 5 A de cualquier átomo de cualquier resto de las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo de roedor; y (5) se produce el anticuerpo de roedor humanizado que tiene especificidad de unión.
Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando varias técnicas diferentes, incluyendo injerto de CDR (documentos EP 0 239 400; WO 91/09967; Patentes de EEUU Nos. 5.530.101; y 5.585.089), recubrimiento o modificación en superficie (documentos EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:969-973), e intercambio de cadenas (Patente de EEUU No. 5.565.332). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse mediante varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos de presentación de fagos. Véanse también las Patentes de EEUU Nos. 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806 y 5.814.318; y las publicaciones de solicitudes de patente internacional números WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741).
La presente invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de éstos que reconocen el receptor EphA2 y actúan como antagonistas. En otra realización, los anticuerpos humanizados o fragmentos de éstos que se unen al epítopo tienen la capacidad adicional de inhibir el crecimiento de una célula cancerosa que expresa el receptor EphA2. En una realización más, el anticuerpo humanizado o fragmento de éste que se une al epítopo tiene la capacidad adicional de inhibir la migración de una célula cancerosa metastásica que expresa el receptor EphA2.
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Una realización preferida de dicho anticuerpo humanizado es un anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1 o EphA2-N2, o un fragmento de éste que se une al epítopo.
En realizaciones más preferidas, se proporcionan versiones modificadas en superficie o humanizadas de los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1 y EphA2-N2, en las que los restos expuestos en la superficie del anticuerpo o sus fragmentos se reemplazan tanto en las cadenas ligeras como pesadas para que se asemejen mucho a superficies de anticuerpos humanos conocidos. Los anticuerpos humanizados 37.3D7, 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1 y EphA2-N2, o los fragmentos de éstos que se unen al epítopo de la presente invención, tienen propiedades mejoradas. Por ejemplo, los anticuerpos humanizados 37.3D7, 37.1 F5; y 53.2H11, o los fragmentos de éstos que se unen al epítopo, reconocen específicamente el receptor EphA2. Más preferiblemente, los anticuerpos humanizados 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2, o los fragmentos de éstos que se unen al epítopo, tienen la capacidad adicional de inhibir el crecimiento de una célula que expresa el receptor EphA2.
Las versiones humanizadas de los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2 también están completamente caracterizadas en la presente memoria con respecto a sus secuencias de aminoácidos respectivas de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, a las secuencias de ADN de los genes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, a la identificación de las CDR, a la identificación de sus aminoácidos de superficie, y a la descripción de un medio para su expresión en forma recombinante. Sin embargo, el alcance de la presente invención no está limitado a los anticuerpos y fragmentos que comprenden estas secuencias. En su lugar, todos los anticuerpos y fragmentos que se unen específicamente al receptor EphA2 están descritos en la presente memoria. Preferiblemente, los anticuerpos y fragmentos que se unen específicamente al receptor EphA2 antagonizan la actividad biológica del receptor. Más preferiblemente, dichos anticuerpos además carecen sustancialmente de actividad agonista. Así, los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpo que se unen al epítopo de la presente invención pueden diferir del anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, o de los derivados humanizados de éstos, en las secuencias de aminoácidos de su esqueleto, CDR, y/o cadena ligera y cadena pesada, e incluso así se encuentran dentro del alcance la presente invención.
Las CDRs de los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2- N1 o EphA2-N2 se identifican mediante modelado, y se han predicho sus estructuras moleculares. De nuevo, aunque las CDRs son importantes para el reconocimiento del epítopo, no son esenciales para los anticuerpos y fragmentos de la invención. De acuerdo con esto, se proporcionan anticuerpos y fragmentos que tienen propiedades mejoradas producidos, por ejemplo, mediante maduración de la afinidad de un anticuerpo de la presente invención.
Se han identificado los genes de la línea germinal de la cadena ligera IgVK y Jk de ratón, y los genes de la línea germinal de la cadena pesada IgVh y Jh, de los que es probable que derivaran 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2, como se describe en la sección experimental de los Ejemplos. Dichas secuencias de los genes de la línea germinal son útiles para identificar mutaciones somáticas en los anticuerpos, incluyendo en las CDRs.
Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2, y las secuencias de sus CDRs, no se conocían previamente, y se muestran en esta solicitud. Dicha información puede utilizarse para producir versiones humanizadas de los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2. Estos anticuerpos anti-EphA humanizados, o sus derivados, también pueden utilizarse como el agente de unión a células de la presente invención.
De este modo, en una realización, esta memoria descriptiva describe anticuerpos humanizados, o fragmento de éste que se une al epítopo, que comprenden una o más CDRs que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 y 72. En un aspecto preferido, los anticuerpos humanizados descritos aquí comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, y dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1,2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 61, 62, 63, 67, 68 y 69, y dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 64, 65, 66, 70, 71 y 72. En una realización preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 4, 5 y 6. En otra realización adicional preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 10, 11 y 12. En otra realización adicional preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 16, 17 y 18. En otra realización más preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 61, 62 y 63, y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDRs
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secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 64, 65 y 66. En otra realización más preferida, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 67, 68 y 69, y en el que dicha cadena ligera comprende tres CDRs secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NOS: 70, 71 y 72.
En una realización, esta invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de éstos que comprenden una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43 y 45. En una realización preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 37.1D7 que comprende una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 32, 34 y 36. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 37.1F5 que comprende una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 37 y 38. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 53.2H11 que comprende una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 40, 42, 43 y 45.
En otra realización, esta invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de éstos que comprenden una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 47, 48, 49, 50 y 52. En una realización preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 37.1D7 que comprende una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 47. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 37.1F5 que comprende una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 48, 49 y 50. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo humanizado 53.2H11 que comprende una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO 52.
Los anticuerpos humanizados 37.3D7 y los fragmentos de éstos que se unen al epítopo de la presente invención también pueden incluir sustitución de los restos de aminoácidos de la cadena ligera y/o pesada en una o más posiciones definidas por los restos grises en la Tabla 1A y 1B que representan los restos de superficie del marco murino que se han cambiado del resto murino original al resto correspondiente de superficie del marco en el anticuerpo humano, 28E4. Los restos con asterisco (*) en la Tabla 1B corresponden a las retromutaciones murinas en las variantes humanizadas de la cadena pesada de 37.3D7 (SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO:36). Los restos de las retromutaciones están próximos a las cDr, y se eligieron como se describe en la patente de EEUU No. 5.639.641 o de manera análoga a la selección de restos que han dado como resultado, en intentos previos de humanización, una disminución de la afinidad de unión al antígeno (Roguska et al., 1996, Protein Eng.;9(10): 895-904; publicaciones de solicitud de patente de EEUU 2003/0235582 y 2005/0118183).
De forma similar, los anticuerpos humanizados 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; y EphA2-N2, y fragmentos de éstos que se unen al epítopo, de la presente invención, también pueden incluir sustitución de restos de aminoácidos de la cadena ligera y/o pesada.
Polinucleótidos, vectores y células hospedantes
Se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-EphA2 de la invención. En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y/o ligera de una inmunoglobulina anti-EphA2. En una realización preferida, un único ácido nucleico codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-EphA2, y otra molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-EphA2.
En otro aspecto de esta invención, se proporcionan polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NOS: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 78 y 80. En una realización preferida, el polinucleótido de la invención se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 39, 41, 44, 46, 51, 73, 75, 77 y 79. La invención no está limitada a dichos polinucleótidos per se, sino que también incluye todos los polinucleótidos que presentan al menos un 80 % de identidad con dichos polinucleótidos.
La invención proporciona vectores que comprenden los polinucleótidos de la invención. En una realización, el vector contiene un polinucleótido que codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-EphA2. En otra realización, dicho polinucleótido codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-EphA2. La invención también proporciona vectores que comprenden moléculas de polinucleótido que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpos, y sondas de éstos.
Con el fin de expresar la cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos anti-EphA2 de la invención, los polinucleótidos que codifican dichas cadenas pesadas y/o ligeras se insertan en vectores de expresión de manera que los genes están unidos de manera operativa a secuencias de transcripción y traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, YAC, cósmidos, retrovirus, episomas derivados de EBV, y todos los demás vectores que el experto en la técnica sabrá que son convenientes para asegurar la expresión de dichas cadenas pesadas y/o ligeras. El experto en la técnica se dará cuenta de que los polinucleótidos que codifican las cadenas pesadas y ligeras pueden clonarse en diferentes vectores o en el mismo vector. En una realización preferida, dichos polinucleótidos se clonan en el mismo vector.
Los polinucleótidos de la invención y los vectores que comprenden estas moléculas pueden utilizarse para la
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transformación de una célula hospedante de mamífero adecuada, o cualquier otro tipo de célula hospedante conocida por el experto en la técnica. La transformación puede realizarse mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedante. Dichos métodos son muy conocidos para el experto en la técnica, e incluyen transformación mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulamiento del polinucleótido en liposomas, inyección biolística y microinyección directa de ADN en núcleos.
Fragmentos de anticuerpos
Los anticuerpos de la presente invención incluyen los anticuerpos de longitud completa discutidos anteriormente, así como fragmentos que se unen al epítopo. Tal como se utiliza en la presente memoria, “fragmentos de anticuerpo” incluyen cualquier parte de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse al epítopo reconocido por el anticuerpo de longitud completa, denominados de manera general “fragmentos que se unen al epítopo”. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única, Fv enlazados por disulfuro (dsFv), y fragmentos que comprenden una región Vl o Vh. Los fragmentos que se unen al epítopo, incluyendo los anticuerpos de cadena única, pueden comprender la región o regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una parte de los siguientes: región bisagra, dominios Ch1, Ch2 y Ch3.
Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab, o el fragmento F(ab')2. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpos contienen las seis CDRs del anticuerpo completo, aunque también son funcionales los fragmentos que contienen menos de todas estas regiones, tal como tres, cuatro o cinco CDRs. Además, los fragmentos pueden ser o pueden combinar miembros de una cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, y las subclases de éstas.
Los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse mediante escisión proteolítica, utilizando enzimas tales como papaína (fragmentos Fab) o pepsina (fragmentos F(ab')2).
Los fragmentos FVs de cadena única (scFVs) son fragmentos que se unen al epítopo que contienen al menos un fragmento de una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo (Vh) enlazada a al menos un fragmento de una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo (Vl). El conector puede ser un péptido corto flexible, seleccionado para asegurar que se produce el plegamiento tridimensional apropiado de las regiones (Vl) y (Vh) una vez que se han enlazado, con el fin de mantener la especificidad de unión a la molécula diana del anticuerpo completo del que se obtiene el fragmento del anticuerpo de cadena única. El extremo carboxilo terminal de la secuencia (Vl) o (Vh) puede enlazarse covalentemente mediante un conector al extremo del aminoácido de una secuencia complementaria (Vl) o (Vh).
Los fragmentos de anticuerpos de cadena única de la presente invención contienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos una de las regiones variables o determinantes de la complementariedad (CDRs) de los anticuerpos completos descritos en esta memoria descriptiva, pero que carecen de algunos o de todos los dominios constantes de esos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para la unión al antígeno, pero constituyen una parte importante de la estructura de los anticuerpos completos. Los fragmentos de anticuerpos de cadena única pueden, por lo tanto, solucionar algunos de los problemas asociados con la utilización de anticuerpos que contienen una parte de o todo un dominio constante. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos de cadena única normalmente no presentan interacciones no deseadas entre moléculas biológicas y la región constante de la cadena pesada, u otra actividad biológica no deseada. Adicionalmente, los fragmentos de anticuerpos de cadena única son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos, y pueden tener, por lo tanto, una mayor permeabilidad capilar que los anticuerpos completos, lo que permite que los fragmentos de anticuerpos de cadena única se localicen y se unan más eficazmente a sitios diana de unión a antígenos. Además, los fragmentos de anticuerpos pueden producirse en una escala relativamente grande en células procariotas, facilitando así su producción. Es más, el tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpos de cadena única hace que sea menos probable que provoquen una respuesta inmune en un receptor que los anticuerpos completos.
Los fragmentos de anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante clonación molecular, biblioteca de presentación de anticuerpos en fagos, o técnicas similares muy conocidas por el experto en la técnica. Estas proteínas pueden producirse, por ejemplo, en células eucariotas o células procariotas, incluyendo bacterias. Los fragmentos que se unen al epítopo de la presente invención también pueden generarse utilizando varios métodos de presentación de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación de fagos, los dominios funcionales del anticuerpo se exponen en la superficie de las partículas del fago que contienen las secuencias polinucleotídicas que las codifican. En particular, dicho fago puede utilizarse para exponer dominios que se unen al epítopo expresados de un repertorio o de una biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o murina). El fago que expresa un dominio que se une al epítopo que se une al antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, utilizando un antígeno marcado unido o capturado en una superficie o perla sólida. El fago utilizado en estos métodos son típicamente fagos filamentosos, incluyendo los dominios de unión de fd y M13 expresados a partir de fagos con los dominios del anticuerpo Fab, Fv, o Fv estabilizado con disulfuro, fusionados recombinantemente con la proteína del fago del gen III o gen VIII.
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Los ejemplos de métodos de presentación de fagos que pueden utilizarse para obtener los fragmentos que se unen al epítopo de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182: 41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 57: 191-280; solicitud PCT No. PCT/GB91/01134; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes de EEUU Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Después de la selección del fago, las regiones del fago que codifican los fragmentos pueden aislarse y utilizarse para generar los fragmentos que se unen al epítopo mediante expresión en un hospedante elegido, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levaduras, y bacterias, utilizando tecnología de ADN recombinante, por ejemplo como se describe con detalle más adelante, Por ejemplo, también pueden utilizarse técnicas para producir de manera recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques, 12(6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI, 34: 26-34; y Better et al., 1988, Science, 240: 1041-1043. Los ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para producir Fvs y anticuerpos de cadena única incluyen los descritos en las patentes de EEUU Nos. 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203: 46-88; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 7995-7999; Skerra et al., 1988, Science, 240: 1038-1040.
Equivalentes funcionales
Dentro del alcance de la memoria descriptiva también están incluidos los equivalentes funcionales del anticuerpo anti-EphA y el anticuerpo humanizado anti-receptor EphA2. La expresión “equivalentes funcionales” incluye anticuerpos con secuencias homologas, anticuerpos quiméricos, anticuerpos artificiales y anticuerpos modificados, por ejemplo, en los que cada equivalente funcional está definido por su capacidad para unirse al receptor EphA2. El experto en la técnica entenderá que existe una superposición entre el grupo de moléculas denominado “fragmentos de anticuerpo” y el grupo denominado “equivalentes funcionales”. Los métodos para producir equivalentes funcionales son conocidos por el experto en la técnica y están descritos, por ejemplo, en la Solicitud PCT WO 93/21319, Patente Europea No. EP 0239400; Solicitud PCT Wo 89/09622; Patente Europea No. EP 0338745; y Solicitud de Patente Europea EP 0332424, que se incorporan en sus totalidades respectivas mediante referencia.
Los anticuerpos con secuencias homologas son aquellos anticuerpos con secuencias de aminoácidos que tienen homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-EphA y un anticuerpo humanizado anti-EphA de la presente memoria descriptiva. Preferiblemente, la homología es con la secuencia de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo anti-EphA y del anticuerpo humanizado anti-EphA de la presente memoria descriptiva. “Homología de secuencia”, tal como se aplica a una secuencia de aminoácidos en la presente memoria, se define como una secuencia con al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, o 94% de homología de secuencia, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de homología de secuencia con otra secuencia de aminoácidos, como se determina, por ejemplo, mediante el método de búsqueda FASTA según Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444-2448.
Un anticuerpo quimérico es aquel en el que diferentes partes de un anticuerpo se obtienen a partir de diferentes especies de animales. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una región variable obtenida a partir de un anticuerpo monoclonal murino emparejada con una región constante de una inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Morrison, 1985, Science, 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods, 125: 191-202; patentes de EEUU Nos. 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397.
Las formas humanizadas de los anticuerpos quiméricos se obtienen sustituyendo las regiones determinantes de la complementariedad de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, en un dominio marco humano, por ejemplo véase la Pub. PCT No. W092/22653. Los anticuerpos quiméricos humanizados tienen preferiblemente regiones constantes y regiones variables distintas de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) obtenidas sustancial o exclusivamente a partir de las regiones del anticuerpo humano correspondiente, y de las CDRs obtenidas sustancial o exclusivamente a partir de un mamífero distinto de un ser humano.
Los anticuerpos artificiales incluyen fragmentos scFv, fragmentos bivalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes y mru (véanse las revisiones por Winter, G. y Milstein, C., 1991, Nature, 349: 293-299; Hudson, P.J., 1999, Current Opinión in Immunology, 11: 548-557), cada uno de los cuales tienen capacidad para unirse al antígeno. En el fragmento Fv de cadena única (scFv), los dominios Vh y Vl de un anticuerpo están enlazados mediante un péptido flexible. Típicamente, este péptido conector tiene una longitud de aproximadamente 15 restos de aminoácidos. Si el conector es mucho más pequeño, por ejemplo 5 aminoácidos, se forman fragmentos divalentes, que son dímeros divalentes scFv. Si el conector se reduce a menos de tres restos de aminoácidos, se forman estructuras triméricas y tetraméricas que se denominan fragmentos trivalentes y tetravalentes. La unidad de unión más pequeña de un anticuerpo es una CDR, típicamente la CDR2 de la cadena pesada, que tiene un reconocimiento y unión específicos suficientes como para poder utilizarse de manera independiente. Dicho fragmento se denomina unidad de reconocimiento molecular o mru. Varios de estas mrus pueden unirse con péptidos conectores cortos, formando por lo tanto una proteína de unión artificial con una mayor avidez que una única mru.
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Los equivalentes funcionales de la presente solicitud también incluyen anticuerpos modificados, por ejemplo anticuerpos modificados mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos modificados incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. La unión covalente no impide al anticuerpo generar una respuesta anti-idiotípica. Estas modificaciones pueden realizarse mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, los anticuerpos modificados pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los equivalentes funcionales pueden producirse intercambiando diferentes CDRs en diferentes cadenas en diferentes marcos. Así, por ejemplo, son posibles diferentes clases de anticuerpo para un conjunto de CDRs dado mediante sustitución de diferentes cadenas pesadas, con lo que pueden producirse, por ejemplo, tipos e isotipos de anticuerpos IgG1-4, IgM, lgA1-2, IgD, e IgE. De manera similar, los anticuerpos artificiales dentro del alcance de la invención pueden producirse embebiendo un conjunto dado de CDRs en un marco completamente sintético.
Los equivalentes funcionales pueden producirse mediante mutación, supresión y/o inserción en las secuencias de la región variable y/o constante que flanquean un conjunto particular de CDRs, utilizando una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica.
Los fragmentos de anticuerpo y los equivalentes funcionales de la presente invención comprenden aquellas moléculas con un nivel detectable de unión a EphA, cuando se comparan con el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2. Un nivel detectable de unión incluye todos los valores en el intervalo de al menos 10-100%, preferiblemente al menos 50%, 60% o 70%, más preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de la afinidad de unión del anticuerpo murino 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2 a EphA.
Anticuerpos mejorados
Las CDRs son muy importantes para el reconocimiento del epítopo y la unión del anticuerpo. Sin embargo, pueden realizarse cambios en los restos que comprenden las CDRs sin interferir con la capacidad del anticuerpo para reconocer y unirse a su epítopo correspondiente. Por ejemplo, pueden realizarse cambios que no afectan al reconocimiento del epítopo, pero que incrementan la capacidad de unión del anticuerpo al epítopo.
Así, también están incluidas dentro del alcance de la presente invención versiones mejoradas de anticuerpos murinos y humanizados, que también reconocen y se unen específicamente a EphA, preferiblemente con una afinidad incrementada.
Numerosos estudios han examinado los efectos de introducir uno o más cambios de aminoácidos en diferentes posiciones en la secuencia de un anticuerpo, tomando como base el conocimiento de la secuencia del anticuerpo primario, sobre sus propiedades tales como unión y nivel de expresión (Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol. Biol., 254: 392-403; Rader, C. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95: 8910-8915; Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535-539).
En estos estudios, se generaron equivalentes del anticuerpo primario cambiando las secuencias de los genes de la cadena pesada y ligera en las regiones CDR1, CDR2, CDR3, o marco, utilizando métodos tales como mutagénesis dirigida a sitio mediada por oligonucleótido, mutagénesis de casete, PCR tendente a error, transposición de secuencias de ADN, o cepas mutadoras de E. coli (Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535-539; Adey, N. B. et al., 1996, Capítulo 16, p. 277-291, en “Phage Display of Peptides and Proteins”, Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). Estos métodos para cambiar la secuencia del anticuerpo primario han dado como resultado afinidades mejoradas de los anticuerpos secundarios (Gram, H. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 3576-3580; Boder, E. T. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97:10701-10705; Davies, J. y Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2: 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol. Biol., 256: 77-88; Short, M. K. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277: 16365-16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 27622- 27628).
Mediante una estrategia dirigida similar para cambiar uno o más restos de aminoácidos del anticuerpo, pueden utilizarse las secuencias de anticuerpo descritas en esta invención para desarrollar anticuerpos anti-EphA con funciones mejoradas, incluyendo afinidad mejorada por EphA.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, y (4) confieren o modifican otras propiedades físico-químicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica natural. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia natural (preferiblemente en la parte del polipéptido fuera del dominio o de los dominios que forman los contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazamiento no debe romper una hélice que está presente en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan a la secuencia parental). Los ejemplos de estructuras polipeptídicas secundarias y terciarias reconocidas en la técnica están descritos en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and
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Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N. Y. (1991)); y Thornton et al., 1991, Nature, 354: 105.
Los anticuerpos mejorados también incluyen aquellos anticuerpos que tienen características mejoradas que se preparan mediante técnicas estándar de inmunización animal, formación de hibridomas, y selección para detectar anticuerpos con características específicas.
La presente invención también incluye conjugados citotóxicos como se definen en las reivindicaciones. Estos conjugados citotóxicos comprenden dos componentes principales, un agente de unión a células y un agente citotóxico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “agente de unión a células” se refiere a un agente que reconoce y se une específicamente a los receptores EphA en la superficie celular. En una realización, el agente de unión a células reconoce específicamente el receptor EphA de manera que permite a los conjugados actuar de manera dirigida con pocos efectos secundarios que resultan de la unión no específica.
En otra realización, el agente de unión a células de la presente invención también reconoce específicamente el receptor EphA de manera que los conjugados estarán en contacto con la célula diana durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir a la parte del fármaco citotóxico del conjugado actuar en la célula, y/o permitir a los conjugados un tiempo suficiente como para ser internalizados por la célula.
En una realización preferida, los conjugados citotóxicos comprenden un anticuerpo anti-EphA como agente de unión a células, más preferiblemente el anticuerpo monoclonal murino anti-EphA 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2. En una realización más preferida, el conjugado citotóxico comprende un anticuerpo humanizado 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, o un fragmento de éste que se une al epítopo. El anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2 es capaz de reconocer específicamente un receptor EphA, tal como EphA2, y dirige al agente citotóxico hacia una célula o tejido anormal, tal como células cancerosas, de una manera dirigida.
El segundo componente de los conjugados citotóxicos de la presente invención es un agente citotóxico. La expresión “agente citotóxico”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una sustancia que reduce o bloquea la función, o crecimiento, de células, y/o produce la destrucción de células.
En realizaciones preferidas, el agente citotóxico es un taxoide, un maitansinoide tal como DM1 o DM4, un fármaco pequeño, un derivado de tomaimicina, un derivado de leptomicina, un profármaco, CC-1065 o un análogo de CC-1065. En realizaciones preferidas, los agentes de unión a células de la presente invención están unidos covalentemente, directamente o a través de un conector escindióle o no escindible, al agente citotóxico.
Los agentes de unión a células, agentes citotóxicos y conectores se discuten con más detalle a continuación.
Agentes de unión a células
La eficacia de los compuestos de la presente invención como agentes terapéuticos depende de la selección cuidadosa de un agente de unión a células apropiado. Los agentes de unión a células como se describen aquí pueden ser de cualquier clase actualmente conocida, o que llegue a conocerse, e incluyen péptidos y no péptidos. El agente de unión a células puede ser cualquier compuesto que pueda unirse a una célula, de manera específica o no específica. Generalmente, éstos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales), linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas, moléculas transportadoras de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia que se una a células.
Los ejemplos más específicos de agentes de unión a células que pueden usarse incluyen:
• anticuerpos policlonales;
• anticuerpos monoclonales;
• fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab'y F(ab')2, Fv (Parham, 1983, J. Immunol., 131:2895-2902; Spring et al., 1974, J. Immunol., 113: 470-478; Nisonoff et al., 1960, Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244).
Preferiblemente, como el agente de unión a células de la presente invención se utiliza un anticuerpo humanizado anti-EphA. Más preferiblemente, el anticuerpo humanizado anti-EphA se selecciona de anticuerpos humanizados o modificados en superficie 37.3D7, 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1 y EphA2-N2.
Agentes citotóxicos
En otra realización, el anticuerpo humanizado o un fragmento de éste que se une al epítopo puede conjugarse con un fármaco, tal como un maitansinoide o un derivado de tomaimicina, para formar un profármaco que tiene una citotoxicidad específica frente a células que expresan el antígeno al dirigir el fármaco hacia el receptor EphA2. Los conjugados citotóxicos que comprenden dichos anticuerpos y un fármaco pequeño altamente tóxico (por ejemplo, maitansinoides, taxanos, derivados de tomaimicina, un derivado de leptomicina, CC-1065 y análogos de cC-1065) pueden utilizarse como una sustancia terapéutica para el tratamiento de tumores, tales como tumores de mama y de
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ovario.
El agente citotóxico utilizado en el conjugado citotóxico de la presente invención puede ser cualquier compuesto que dé como resultado la muerte de una célula, o induzca la muerte celular, o de alguna manera disminuya la viabilidad celular. Los agentes citotóxicos preferidos incluyen, por ejemplo, maitansinoides y análogos de maitansinoide, un profármaco, derivados de tomaimicina, taxoides, un derivado de leptomicina, cC-1065 y análogos de CC-1065, definidos a continuación. Estos agentes citotóxicos se conjugan con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, equivalentes funcionales, anticuerpos mejorados y sus análogos, como se describe en la presente memoria.
Los conjugados citotóxicos pueden prepararse mediante métodos in vitro. Con el de fin de enlazar un fármaco o profármaco al anticuerpo, se utiliza un grupo conector. En la técnica son muy conocidos los grupos conectores adecuados, e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasas, y grupos lábiles a esterasas. Los grupos conectores preferidos son grupos disulfuro y grupos tioéter. Por ejemplo, los conjugados pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro, o formando un enlace de tioéter entre el anticuerpo y el fármaco o profármaco.
Maitansinoides
Entre los agentes citotóxicos que pueden utilizarse en la presente invención para formar un conjugado citotóxico, están los maitansinoides y análogos de maitansinoide. Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinol y análogos de maitansinol. Los maitansinoides son fármacos que inhiben la formación de microtúbulos, y son altamente tóxicos para las células de mamíferos.
Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides adecuados están descritos en las patentes de EEUU Nos. 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; y 5.846.545.
Los ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que tienen un anillo aromático modificado incluyen:
(1) C-19-descloro (patente de EEUU No. 4.256.746) (preparado por reducción con LAH de ansamitocina P2);
(2) C-20-hidroxi (o C-20-desmetil) +/-C-19-descloro (patentes de EEUU Nos. 4.361.650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces, o descloración utilizando LAH); y
(3) C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-descloro (Pat. de EEUU No 4.294.757) (preparado por acilación utilizando cloruros de acilo).
Los ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que tienen modificaciones en otras posiciones incluyen:
(1) C-9-SH (patente de EEUU No. 4.424.219) (preparado por la reacción de maitansinol con H2S o P2S5);
(2) C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2OR) (patente de EEUU No. 4.331.598);
(3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente de EEUU No. 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia);
(4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente de EEUU No. 4.364.866) (preparado por la conversión de maitansinol por Streptomyces);
(5) C-15-metoxi (patentes de EEUU Nos. 4.313.946 y 4.315.929) (aislado a partir de Trewia nudiflora);
(6) C-18-/V-desmetilo (patentes de EEUU Nos. 4.362.663 y 4.322.348) (preparado por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces), y
(7) 4,5-desoxi (patente de EEUU No 4.371.533) (preparado por la reducción de maitansinol mediante tricloruro de titanio/LAH).
En una realización preferida, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide que contiene tiol (DM1), denominado formalmente Ai2-desacetil-W2-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como el agente citotóxico. DM1 está representado por la siguiente fórmula estructural (I):
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por la siguiente fórmula estructural (II):
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contienen tiol y disulfuro, que presentan una mono- o dialquil sustitución en el átomo de carbono que porta al átomo de azufre. Éstos incluyen un maitansinoide que tiene, en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi, o C-20 desmetilo, una cadena lateral de aminoácido acilada portando un grupo acilo un grupo sulfhidrilo, en el que el átomo de carbono del grupo acilo que porta la funcionalidad tiol tiene uno o dos sustituyentes, siendo estos sustituyentes CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo, y en el que además uno de los sustituyentes puede ser H, y en el que el grupo acilo tiene una cadena lineal con una longitud de al menos tres átomos de carbono entre la funcionalidad carbonilo y el átomo de azufre.
Dichas maitansinas adicionales incluyen compuestos representados por la fórmula (III):
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en la que:
Y’ representa (CR7R8)l(CR9=CR1o)p(C-C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C-C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ, en el que:
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Ri y R2 son, cada uno independientemente, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo, y adicionalmente R2 puede ser be H;
A, B, D son cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3-10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo;
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rio, R11, y R12 son, cada uno independientemente, H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo;
I, m, n, o, p, q, r, s, y t son, cada uno independientemente, 0 o un número entero de 1 a 5, con la condición de que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en todo momento; y Z es H, SR o -COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo.
Realizaciones preferidas de fórmula (III) incluyen los compuestos de fórmula (III) en la que:
R1 es metilo, R2 es H y Z es H.
R1 y R2 son metilo y Z es H.
R1 es metilo, R2 es H, y Z es -SCH3
R1 y R2 son metilo, y Z es -SCH3.
Dichas maitansinas adicionales también incluyen compuestos representados por la fórmula (IV-L), (IV-D), o (IV-D,L):
imagen4
en las que:
Y representa (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, en el que:
R1 y R2 son, cada uno independientemente, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo, y adicionalmente R2 puede ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son, cada uno independientemente, H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo;
I, m y n son, cada uno independientemente, un número entero de 1 a 5, y adicionalmente n puede ser 0;
Z es H, SR o -COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; y
May representa un maitansinoide que porta la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo.
Realizaciones preferidas de fórmulas (IV-L), (IV-D) y (IV-D,L) incluyen compuestos de fórmulas (IV-L), (IV-D) y (IV-D,L), en las que:
R1 es metilo, R2 es H, R5, R6, R7, y R8 son, cada uno, H, I y m son, cada uno, 1, n es 0, y Z es H.
R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son, cada uno, H, I y m son 1, n es 0, y Z es H.
R1 es metilo, R2 es H, R5, R6, R7, y R8 son, cada uno, H, I y m son, cada uno, 1, n es 0, y Z es -SCH3.
R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son, cada uno, H, I y m son 1, n es 0, y Z es - SCH3.
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Preferiblemente, el agente citotóxico está representado mediante la fórmula (IV-L).
Dichas maitansinas adicionales también incluyen compuestos representados por la fórmula (V):
imagen5
en la que:
Y representa (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, en el que:
R1 y R2 son, cada uno independientemente, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo, y adicionalmente R2 puede ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son, cada uno independientemente, H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo;
I, m y n son, cada uno independientemente, un número entero de 1 a 5, y adicionalmente n puede ser 0; y
Z es H, SR o -COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo.
Realizaciones preferidas de fórmula (V) incluyen compuestos de fórmula (V) en la que:
R1 es metilo, R2 es H, R5, R6, R7, y R8 son, cada uno, H; I y m son, cada uno, 1; n es 0; y Z es H.
R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7, R8 son, cada uno, H, I y m son 1; n es 0; y Z es H.
R1 es metilo, R2 es H, R5, R6, R7, y R8 son, cada uno, H, I y m son, cada uno, 1, n es 0, y Z es -SCH3.
R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son, cada uno, H, I y m son 1, n es 0, y Z es -SCH3.
Dichas maitansinas adicionales incluyen además compuestos representados por la fórmula (Vl-L), (Vl-D), o (VI-D,L):
imagen6
en las que:
Y2 representa (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, en el que:
R1 y R2 son, cada uno independientemente, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo, y adicionalmente R2 puede ser H;
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R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son, cada uno independientemente, H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo;
I, m y n son, cada uno independientemente, un número entero de 1 a 5, y adicionalmente n puede ser 0;
Z2 es SR o COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; y
May es un maitansinoide.
Dichas maitansinas adicionales también incluyen compuestos representados por la fórmula (VII):
imagen7
en la que:
Y2’ representa (CR7R8)l(CR9=CR10)p(CZC)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(CZC)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2, en el que:
R1 y R2 son, cada uno independientemente, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo, y adicionalmente R2 puede ser H;
A, B, y D son, cada uno independientemente, cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3 a 10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo;
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, y R12 son, cada uno independientemente, H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo;
I, m, n, o, p, q, r, s, y t son, cada uno independientemente, 0 o un número entero de 1 a 5, con la condición de que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en todo momento; y
Z2 es SR o -COR, en el que R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 - 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo.
Realizaciones preferidas de fórmula (VII) incluyen compuestos de fórmula (VII) en la que: R1 es metilo, R2 es H.
Los maitansinoides mencionados anteriormente pueden conjugarse con un anticuerpo anti-EphA 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, o un homólogo o fragmento de éste, en el que el anticuerpo se une al maitansinoide utilizando la funcionalidad tiol o disulfuro que está presente en el grupo acilo de una cadena lateral de aminoácidos acilada que se encuentra en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo del maitansinoide, y en el que el grupo acilo de la cadena lateral de aminoácidos acilada tiene su funcionalidad tiol o disulfuro localizada en un átomo de carbono que tiene uno o dos sustituyentes, siendo dichos sustituyentes CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo, y además uno de los sustituyentes puede ser H, y en el que el grupo acilo tiene una cadena lineal con una longitud de al menos tres átomos de carbono entre la funcionalidad carbonilo y el átomo de azufre.
Un conjugado preferido de la presente invención es aquel que comprende el anticuerpo anti-EphA 37.3D7, 37.1F5,
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53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, o un homólogo o fragmento de éste, conjugado con un maitansinoide de fórmula (VIII):
imagen8
en la que:
Yi’ representa (CR7R8)i(CR9-CRio)p(C“C)qAr(CR5R6)mDu(CRii-CRi2)r(C“C)sBt(CR3R4)nCRiR2S-, en el que:
A, B, y D, cada uno independientemente, son cicloalquilo o cidoalquenilo que tiene 3-10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo;
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rio, R11, y R12 son, cada uno independientemente, H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo; y
I, m, n, o, p, q, r, s, y t son, cada uno independientemente, 0 o un número entero de 1 a 5, con la condición de que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en todo momento.
Preferiblemente, R1 es metilo, R2 es H, o R1 y R2 son metilo.
Un conjugado aún más preferido de la presente invención es aquel que comprende el anticuerpo anti-EphA 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, o un homólogo o fragmento de éste, conjugado con un maitansinoide de fórmula (IX-L), (IX-D), o (IX-D,L):
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en las que:
Y1 representa (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2S-, en el que:
R1 y R2 son, cada uno independientemente, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo, y adicionalmente R2 puede ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son, cada uno independientemente, H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o radical aromático heterocíclico o heterocicloalquilo;
I, m y n son, cada uno independientemente, un número entero de 1 a 5, y adicionalmente n puede ser 0; y
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May representa un maitansinol que porta la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo.
Realizaciones preferidas de fórmulas (IX-L), (IX-D) y (IX-D,L) incluyen compuestos de fórmulas (IX-L), (IX-D) y (IX-D,L) en las que:
R1 es metilo, R2 es H, o R1 y R2 son metilo,
R1 es metilo, R2 es H, R5, R6, R7 y R8 son, cada uno, H; I y m son, cada uno, 1; n es 0,
R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7 y R8 son, cada uno, H; I y m son 1; n es 0.
Preferiblemente, el agente citotóxico está representado por la fórmula (IX-L).
Un conjugado preferido adicional de la presente invención es aquel que comprende el anticuerpo anti-EphA 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, o un homólogo o fragmento de éste, conjugado con un maitansinoide de fórmula (X):
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en la que los sustituyentes son como se definen para la fórmula (IX) anterior.
Especialmente preferidos son cualesquiera de los compuestos descritos anteriormente, en los que R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7 y R8 son, cada uno, H, I y m son, cada uno, 1, y n es 0.
Son especialmente preferidos además cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, en los que R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son, cada uno, H, I y m son 1, y n es 0.
Además, se prefiere el estereoisómero L-aminoacílico.
Cada uno de los maitansinoides mostrados en la solicitud de patente de EEUU número 10/849,136, en tramitación, presentada el 20 de mayo de 2004, también pueden utilizarse en el conjugado citotóxico de la presente invención.
Grupos conectores que contienen disulfuro
Con el fin de unir el maitansinoide al agente de unión a células, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, el maitansinoide comprende un resto conector. La porción conectora contiene un enlace químico que permite la liberación de maitansinoides completamente activos en un sitio particular. Los enlaces químicos adecuados son muy conocidos en la técnica, e incluyen enlaces de disulfuro, enlaces lábiles a ácidos, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles a peptidasas, y enlaces lábiles a esterasas. Se prefieren los enlaces de disulfuro.
La porción conectora también comprende un grupo químico reactivo. En una realización preferida, el grupo químico reactivo puede unirse covalentemente al maitansinoide a través de una porción conectora con enlace de disulfuro.
Los grupos químicos reactivos particularmente preferidos son ésteres N-succinimidílicos y ésteres N-sulfosuccinimidílicos.
Los maitansinoides particularmente preferidos que comprenden un resto conector que contiene un grupo químico reactivo son ésteres C-3 de maitansinol y sus análogos, en los que la porción conectora contiene un enlace de disulfuro y el grupo químico reactivo comprende un éster N-succinimidílico o N-sulfosuccinimidílico.
Muchas posiciones de los maitansinoides pueden servir como la posición para enlazar químicamente la porción
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conectora. Por ejemplo, es esperable que sean útiles la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con hidroxi, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxi. Sin embargo, se prefiere la posición C-3, y la posición C-3 de maitansinol es especialmente preferida.
Aunque la síntesis de ésteres de maitansinol que tienen un resto conector se describe en términos de restos conectores con enlace de disulfuro, un experto en la técnica entenderá que también pueden utilizarse con la presente invención los restos conectores con otros enlaces químicos (como se ha descrito anteriormente), así como otros maitansinoides. Los ejemplos específicos de otros enlaces químicos incluyen enlaces lábiles a ácidos, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles a peptidasas, y enlaces lábiles a esterasas. La descripción de la patente de EEUU No. 5.208.020, incorporada en la presente memoria, muestra la producción de maitansinoides que portan dichos enlaces.
La síntesis de maitansinoides y derivados de maitansinoide que tienen un resto de disulfuro que porta un grupo reactivo se describe en las patentes de EEUU Nos. 6.441.163 y 6.333.410 y en la Solicitud de EeUu No. 10/161.651.
Los maitansinoides que contienen un grupo reactivo, tal como DM1, se hacen reaccionar con un anticuerpo, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, para producir conjugados citotóxicos. Estos conjugados pueden purificarse mediante HPLC o mediante filtración en gel.
Numerosos esquemas excelentes para producir tales conjugados de anticuerpo-maitansinoide se proporcionan en la patente de EEUU No. 6.333.410 y en las solicitudes de EEUU Nos. 09/867.598, 10/161.651 y 10/024.290, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria en su totalidad.
En general, una disolución de un anticuerpo en amortiguador acuoso puede incubarse con un exceso molar de maitansinoides que tienen un resto de disulfuro que presenta un grupo reactivo. La mezcla de reacción puede paralizarse mediante la adición de amina en exceso (tal como etanolamina, taurina, etc.). El conjugado de maitansinoide-anticuerpo puede purificarse entonces mediante filtración en gel.
El número de moléculas de maitansinoide unidas por molécula de anticuerpo puede determinarse midiendo espectrofotométricamente la relación de la absorbancia a 252 nm y 280 nm. Se prefiere un promedio de 1-10 moléculas de maitansinoide/molécula de anticuerpo.
Los conjugados de los anticuerpos con fármacos de maitansinoide pueden evaluarse por su capacidad de suprimir in vitro la proliferación de varias líneas celulares no deseadas. Por ejemplo, para evaluar la citotoxicidad de estos compuestos, pueden utilizarse líneas celulares tales como la línea de carcinoma epidermoide humano A-431, la línea celular de cáncer de pulmón microcítico SW2, la línea de tumor de mama humano SKBR3, y la línea celular Namalwa de linfoma de Burkitt. Las células a evaluar pueden exponerse a los compuestos durante 24 horas, y las fracciones de células supervivientes se pueden medir en ensayos directos por métodos conocidos. Los valores de Cl50 pueden calcularse después a partir de los resultados de los ensayos.
Grupos conectores que contienen PEG
Los maitansinoides también pueden enlazarse a los agentes de unión a células, utilizando grupos conectores de PEG, como se muestra en la solicitud de EEUU No. 10/024.290. Estos grupos conectores de PEG son solubles tanto en agua como en disolventes no acuosos, y pueden utilizarse para unir uno o más agentes citotóxicos a un agente de unión a células. Los grupos conectores de PEG ejemplares incluyen conectores de PEG hetero-bifuncionales que se unen a agentes citotóxicos y agentes de unión a células en extremos opuestos de los conectores a través de un grupo sulfhidrilo o disulfuro funcional en un extremo y un éster activo en el otro extremo.
Como ejemplo general de la síntesis de un conjugado citotóxico que utiliza un grupo conector de PEG, se hace referencia de nuevo a la solicitud de EEUU No. 10/024.290 para detalles específicos. La síntesis comienza con la reacción de uno o más agentes citotóxicos que portan un resto de PEG reactivo con un agente de unión a células, lo que da como resultado el desplazamiento del éster activo terminal de cada resto de PEG reactivo por un resto de aminoácido del agente de unión a células, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, para proporcionar un conjugado citotóxico que comprende uno o más agentes citotóxicos enlazados covalentemente a un agente de unión a células a través de un grupo conector de PEG.
Taxanos
El agente citotóxico utilizado en los conjugados citotóxicos según la presente invención también puede ser un taxano o derivado de éste.
Los taxanos son una familia de compuestos que incluye paclitaxel (taxol), un producto natural citotóxico, y docetaxel (Taxotere), un derivado semisintético, dos compuestos que se utilizan ampliamente en el tratamiento del cáncer. Los taxanos son tóxicos para el huso mitótico que inhiben la despolimerización de la tubulina, lo que da como resultado la muerte celular. Aunque el docetaxel y el paclitaxel son agentes útiles en el tratamiento del cáncer, su actividad antitumoral es limitada debido a su toxicidad no específica frente a las células normales. Además, los compuestos como el paclitaxel y el docetaxel por sí mismos no son suficientemente potentes como para utilizarlos en conjugados con agentes de unión a células.
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Un taxano preferido para utilizarlo en la preparación de conjugados citotóxicos es el taxano de fórmula (XI):
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Los métodos para sintetizar taxanos que pueden utilizarse en los conjugados citotóxicos de la presente invención, junto con los métodos para conjugar los taxanos con un agente de unión a células, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, se describen con detalle en las patentes de EEUU Nos. 5.416.064, 5.475.092,6.340.701,6.372.738 y 6.436.931, y en las solicitudes de EEUU Nos. 10/024.290, 10/144.042, 10/207.814, 10/210.112 y 10/369.563.
Derivados de tomaimicina
El citotóxico según la presente invención también puede ser un derivado de tomaimicina. Los derivados de tomaimicina son pirrolo[1,4]benzodiacepinas (PBDs), una clase conocida de compuestos que ejercen sus propiedades biológicas por medio de la unión covalente al N2 de la guanina en el surco menor del ADN. Las PBDs incluyen varios agentes de unión al surco menor, tales como antramicina, neotramicina y DC-81.
Los nuevos derivados de tomaimicina que retienen una alta citotoxicldad y que pueden unirse eficazmente a agentes de unión a células están descritos en la Solicitud Internacional No. PCT/IB2007/000142. Los complejos de agente de unión a células-derivado de tomaimicina permiten la medida total de la acción citotóxica de los derivados de tomaimicina que se van a aplicar de forma dirigida solamente contra las células no deseadas, evitando por lo tanto los efectos secundarios debidos al daño a las células sanas que no son diana.
El agente citotóxico según la presente invención comprende uno o más derivados de tomaimicina, enlazados a un agente de unión a células, tal como el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 o EphA2-N2, a través de un grupo conector. El grupo conector es parte de un resto químico que está unido covalentemente a un derivado de tomaimicina mediante métodos convencionales. En una realización preferida, el resto químico puede estar unido covalentemente al derivado de tomaimicina mediante un enlace de disulfuro.
Los derivados de tomaimicina útiles en la presente invención tienen la fórmula (XII) mostrada a continuación:
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en la que
— representa un enlace sencillo opcional;
-— representa un enlace sencillo o un enlace doble; con la condición de que cuando represente un enlace sencillo, U y U’, iguales o diferentes, representen independientemente H, y W y W’, iguales o diferentes, se seleccionen independientemente del grupo que consiste en OH, un éter tal como -OR, un éster (por ejemplo un acetato), tal como -OCOR, un carbonato tal como -OCOOR, un carbamato tal como -OCONRR’, un carbamato cíclico, tal que N10 y C11 sean una parte del ciclo, una urea tal como -NRCONRR’, un tiocarbamato tal como -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 sean una parte del ciclo, -SH, un sulfuro tal como -SR, un sulfóxido tal como -SOR, una sulfona tal como -SOOR, un sulfonato tal como -SO3-, una sulfonamida tal como -NRSOOR, una amina tal como -NRR’, opcionalmente amina cíclica tal que N10 y C11 sean una parte del ciclo, un derivado de hidroxilamina tal como -NROR’, una amida tal como -NRCOR, un azido tal como -N3, un ciano, un halo, un trialquil- o triarilfosfonio, un grupo derivado de aminoácido; Preferiblemente W y W’ son iguales o diferentes, y son OH, Ome, Oet, NHCONH2, SMe;
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y cuando —- representa un enlace doble, U y U' están ausentes, y Wy W' representan H;
■ R1, R2, R1', R2' son iguales o diferentes, y se eligen independientemente de Haluro o Alquilo opcionalmente sustituido con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR, o R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos un grupo que contiene un enlace doble =B y =B' respectivamente.
Preferiblemente, R1 y R2 ,y R1' y R2', forman juntos un grupo que contiene un enlace doble =B y =B' respectivamente.
■ B y B' son iguales o diferentes, y se eligen independientemente de Alquenilo que está opcionalmente sustituido con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR, o B y B' representan un átomo de oxígeno.
Preferiblemente, B=B'.
Más preferiblemente, B=B'= =CH2 o =CH-CH3,
■ X, X' son iguales o diferentes, y se eligen independientemente de uno o más -O-, -NR-, -(C=O)-, -S(O)q-. Preferiblemente, X=X'.
Más preferiblemente, X=X'=0.
■ A, A' son iguales o diferentes, y se eligen independientemente de Alquilo o Alquenilo que contiene opcionalmente un átomo de oxígeno, un átomo de nitrógeno o un átomo de azufre, estando cada uno de ellos opcionalmente sustituido con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo.
Preferiblemente, A=A'.
Más preferiblemente, A=A'=alquilo lineal no sustituido.
■ Y, Y' son iguales o diferentes, y se eligen independientemente de H, OR;
Preferiblemente, Y=Y'.
Más preferiblemente, Y=Y'=OAIquilo, más preferiblemente OMetilo.
■ T es -NR-, -O-, -S(O)q., o un arilo, cicloalquilo, grupo heterocíclico o heteroarilo de 4 a 10 miembros, estando cada uno de ellos opcionalmente sustituido con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR, y/o conector(es), o un Alquilo ramificado, opcionalmente sustituido con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, y/o conector(es), o un Alquilo lineal sustituido con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, y/o conector(es).
Preferiblemente, T es un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, más preferiblemente fenilo o piridilo, opcionalmente sustituido con uno o más conectores.
Dicho conector comprende un grupo enlazante. Los grupos enlazantes adecuados son muy conocidos en la técnica, e incluyen grupos tiol, sulfuro, disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasas, y grupos lábiles a esterasas. Se prefieren los grupos disulfuro y tioéter.
Cuando el grupo enlazante es un grupo que contiene tiol, sulfuro (o el denominado tioéter -S-) o disulfuro (-S-S-), la cadena lateral que tiene el grupo tiol, sulfuro o disulfuro puede ser lineal o ramificada, aromática o heterocíclica. El experto en la técnica puede identificar fácilmente cadenas laterales adecuadas.
Preferiblemente, dicho conector es de fórmula:
-G-D-(Z)p-S-Z'
en la que
G es un enlace sencillo o doble, -O-, -S- o -NR-;
D es un enlace sencillo, o -E-, -E-NR-, -E-NR-F-, -E-O-, -E-O-F-, -E-NR-CO-, -E-NR-CO-F-, -E-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-NR-C-S-, -E-NR-CS-F-;
en los que E y F son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -(OCH2CH2)iAlquil(OCH2CH2)j-, -Alquil(OCH2CH2)i-Alquil-, -(OCH2CH2)i-,
-(OCH2CH2)iCicloalquil(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iHeterocíclico(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iAril(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iHeteroaril(OCH2CH2)j-, -Alquil-(OCH2CH2)iAlquil(OCH2CH2)j-, -Alquil-(OCH2CH2)i-,
-Alquil-(OCH2CH2)iCicloalquil(OCH2CH2)j-, -Alquil(OCH2CH2)iHeterocíclico(OCH2CH2)j-,
-Alquil-(OCH2CH2)iAril(OCH2CH2)j-, -Alquil(OCH2CH2)iHeteroaril(OCH2CH2)j-, -Cicloalquil-Alquilo-,
-Alquil-Cicloalquilo-, -Heterocíclico-Alquilo-, -Alquil-Heterocíclico-, -AlquilArilo-, -Aril-Alquilo-, -Alquil-Heteroarilo- , -Heteroaril-Alquilo-, lineales o ramificados;
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en los que i y j, iguales o diferentes, son números enteros, y se seleccionan independientemente de 0, 1 a 2000;
Z es -Alquilo- lineal o ramificado; p es 0 o 1;
Z’ representa H, un grupo protector de tiol, tal como COR, R20 o SR20, en el que R20 representa H, metilo, Alquilo, Cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo, heteroarilo o heterocíclico, con la condición de que cuando Z’ sea H, dicho compuesto esté en equilibrio con el compuesto correspondiente formado por ciclación intramolecular que resulta de la adición del grupo tiol -SH al enlace de imina -NH= de uno de los restos de PBD.
- n, n’, iguales o diferentes, son 0 o 1.
■ q es 0, 1 o 2.
■ R, R’ son iguales o diferentes, y se eligen independientemente de H, Alquilo, Arilo, estando cada uno opcionalmente sustituido con Hal, cN, NRR’, CF3, R, Or, S(O)qR, Arilo, Het;
o sus sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, o sales hidratadas, o las estructuras cristalinas polimórficas de estos compuestos, o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros.
Los compuestos de fórmula general (XII) que tienen isómeros geométricos y estereoisómeros también son una parte de la invención.
Se sabe que el enlace doble N-10, C-11 de los derivados de tomaimicina de fórmula (XII) puede convertirse fácilmente de manera reversible en los aductos de imina correspondientes en presencia de agua, un alcohol, un tiol, una amina primaria o secundaria, urea y otros nucleófilos. Este proceso es reversible, y puede regenerar fácilmente los derivados de tomaimicina correspondientes en presencia de un agente de deshidratación, en un disolvente orgánico no prótico, en vacío o a temperaturas elevadas (Z. Tozuka, 1983, J. Antibiotics, 36: 276).
Así, los derivados reversibles de los derivados de tomaimicina de fórmula general (XIII) también pueden utilizarse en la presente invención:
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en la que A, X, Y, n, T, A’, X’, Y’, n’, R1, R2, R1’, R2’ son como se definen en la fórmula (XII), y W, W’ son iguales o diferentes, y se seleccionan del grupo que consiste en OH, un éter tal como -OR, un éster (por ejemplo un acetato), tal como -OcOr, -COOR, un carbonato tal como -OCOOR, un carbamato tal como -OCONrR’, un carbamato cíclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, una urea tal como -NRCONRR’, un tiocarbamato tal como -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, un sulfuro tal como -SR, un sulfóxido tal como -SOR, una sulfona tal como -SOOR, un sulfonato tal como -SO3-, una sulfonamida tal como -NRSOOR, una amina tal como -NRR’, opcionalmente amina cíclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, un derivado de hidroxilamina tal como -NROR’, una amida tal como -NRCOR, -NRCONRR’, un azido tal como -N3, un ciano, un halo, un trialquil- o triarilfosfonio, un grupo derivado de aminoácido. Preferiblemente, W y W’ son iguales o diferentes, y son OH, Ome, Oet, NHCONH2, SMe.
De este modo, los compuestos de fórmula (XIII) pueden considerarse como solvatos, incluyendo el agua cuando el disolvente sea agua; estos solvatos pueden ser particularmente útiles.
En una realización preferida, los derivados de tomaimicina de la invención se seleccionan del grupo que consiste en:
• 8,8’-[1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4 ]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8’-[5-metoxi-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[ 2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8’-[1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzod iazepin-5-ona]
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• 8,8'-[1,4-butanodNlbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodi azepin-5-ona]
• 8,8'-[3-metil-1,5-pentanodülbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4] benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[2,6-piridindülbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c] [1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[4-(3-terc-butoxicarbonilaminopropiloxi)-2,6-piridindiilbis-(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2 ,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(3-aminopropiloxi)-1,3-bencenodülbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro -5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(N-metil-3-tert-butoxicarbonilaminopropil)-1,3-bencenodiilbis-(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-me toxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-{5-[3-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)propiloxi]-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)}-bis[(S)-2-et-(E)-i liden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-acetiltiometil-1,3-bencenodülbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrol o[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• Éster terc-butílico del ácido
bis-{2-[(S)-2-metilen-7-metoxi-5-oxo-1,3,,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-iloxi]-etil}-carbámico
• 8,8'-[3-(2-acetiltioetil)-1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(N-4-mercapto-4,4-dimetilbutanoil)amino-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1,2,3, 11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(N-4-metilditio-4,4-dimetilbutanoil)-amino-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1,2,3 ,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(N-metil-N-(2-mercapto-2,2-dimetiletil)amino-1,3-bencenodiil(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1,2, 3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[5-(N-metil-N-(2-metilditio-2,2-dimetiletil)amino-1,3-bencenodiil(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen-1,2,3 ,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(2-(4-mercapto-4-metil)-pentanamido-etoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetox
1- 1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(1-(2-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7- dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(3-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-propoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7- dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(4-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-butoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7- dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(3-[4-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-piperazin-1-il]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et- (E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(1-(3-[4-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-piperazin-1-il]-propil)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2- et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-
2- et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)- benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-o na]
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• 8,8’-[(1-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis [(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8’-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)- piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8’-[(1-(2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)- iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][l,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8’-[(4-(3-[metil-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-amino]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)- iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8’-[(4-(3-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)- iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
• 8,8’-[(1-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi- 1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
así como los correspondientes mercapto derivados, o sus sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, o sales hidratadas, o las estructuras cristalinas polimórficas de estos compuestos, o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros.
Los compuestos preferidos son los de fórmula:
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en la que X, X’, A, A’, Y, Y’, T, n, n’ son como se definen anteriormente.
o
Los compuestos de fórmula (XII) pueden prepararse de diferentes formas muy conocidas por los expertos en la técnica. Los compuestos pueden sintetizarse, por ejemplo, por aplicación o adaptación de los métodos que se describen a continuación, o variaciones de los mismos como puedan apreciarse por el experto en la técnica. Las modificaciones y sustituciones apropiadas serán muy obvias, y se conocerán bien o podrán obtenerse fácilmente a partir de la bibliografía científica por los expertos en la técnica. En particular, dichos métodos pueden encontrarse en R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH Publishers, 1999.
Los métodos para sintetizar los derivados de tomaimicina que pueden utilizarse en la invención se describen en la Solicitud Internacional No. PCT/IB2007/000142. Los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante diferentes rutas sintéticas. Los reactivos y materiales de partida están disponibles comercialmente, o se sintetizan fácilmente mediante técnicas muy conocidas por el experto en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 2005/085260, FR1516743, M. Morí et al., 1986, Tetrahedron, 42: 3793-3806).
Las moléculas de conjugado de la invención pueden formarse usando cualquier técnica. Los derivados de tomaimicina de la invención pueden enlazarse a un anticuerpo u otro agente de unión a células a través de un conector lábil de ácidos o un conector fotolábil. Los derivados pueden condensarse con un péptido que tenga una secuencia adecuada y, posteriormente, enlazarse a un agente de unión a células para producir un conector lábil a peptidasas. Los conjugados pueden prepararse de manera que contengan un grupo hidroxilo primario, que puede succinilarse y enlazarse a un agente de unión a células para producir un conjugado que pueda escindirse por esterasas intracelulares para liberar el derivado libre. Preferiblemente, los derivados se sintetizan de manera que contengan un grupo tiol libre o protegido, y después uno o más derivados que contienen disulfuro o tiol se enlazan covalentemente al agente de unión a células a través de un enlace de disulfuro o un enlace de tioéter.
En los documentos USP 5.416.064 y USP 5.475.092 se describen numerosos métodos de conjugación. Los derivados de tomaimicina pueden modificarse para proporcionar un grupo amino libre, y luego enlazarse al anticuerpo o a otro agente de unión a células mediante un conector lábil de ácidos o un conector fotolábil. Los derivados de tomaimicina
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con un grupo amino o carboxilo libre pueden condensarse con un péptido y, posteriormente, enlazarse a un agente de unión a células para producir un conector lábil a peptidasas. Los derivados de tomaimicina con un grupo hidroxilo libre en el conector pueden succinilarse y enlazarse a un agente de unión a células para producir un conjugado que puede ser escindido por esterasas intracelulares para liberar el fármaco libre. Lo más preferiblemente, los derivados de tomalmicina se tratan para crear un grupo tiol libre o protegido, y luego los dímeros de tomaimicina que contienen disulfuro o tiol se enlazan al agente de unión a células mediante enlaces de disulfuro.
Preferiblemente, los conjugados de derivado de tomaimicina-anticuerpo monoclonal, o derivado de tomaimicina-agente de unión a células, son aquellos que están unidos mediante un enlace de disulfuro, como se ha indicado anteriormente, que son capaces de suministrar los derivados de tomaimicina. Dichos conjugados de unión a células se preparan mediante métodos conocidos tales como por modificación de anticuerpos monoclonales con piridil-ditiopropionato de succinimidilo (SPDP) (Carlsson et al., 1978, Biochem. J., 173:723-737). El grupo tiopiridilo resultante se desplaza después por tratamiento con derivados de tomaimicina que contienen tiol para producir conjugados enlazados por enlaces de disulfuro. Alternativamente, en el caso de los arilditio-derivados de tomaimicina, la formación del conjugado de unión a células se realiza por desplazamiento directo del aril-tiol del derivado de tomaimicina por grupos sulfhidrilo previamente introducidos en las moléculas del anticuerpo. Los conjugados que contienen 1 a 10 fármacos de derivado de tomaimicina enlazados mediante un puente de disulfuro se preparan fácilmente por cualquier método.
Más específicamente, una disolución del anticuerpo modificado por ditio-nitropiridilo, a una concentración de 2,5 mg/ml en amortiguador de fosfato potásico 0,05 M, a pH 7.5, que contiene EDTA 2 mM, se trata con el derivado de tomaimicina que contiene tiol (1,3 eq. molares/grupo ditiopiridilo). La liberación de la tio-nitropiridina del anticuerpo modificado se sigue espectrofotométricamente a 325 nm, y se completa en aproximadamente 16 horas. El conjugado de derivado de tomaimicina-anticuerpo se purifica y se libera del fármaco sin reaccionar y de otro material de bajo peso molecular mediante filtración en gel a través de una columna de Sephadex G-25 o Sephacryl S300. El número de restos de derivado de tomaimicina unidos por molécula de anticuerpo se puede determinar midiendo la relación entre la absorbancia a 230 nm y a 275 nm. Por este método se pueden enlazar mediante enlaces de disulfuro un promedio de 1-10 moléculas de derivado de tomaimicina/molécula de anticuerpo.
El efecto de la conjugación sobre la afinidad de unión frente a células que expresan el antígeno puede determinarse utilizando los métodos descritos previamente por Liu et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sel. U.S.A., 93: 8618-8623. La citotoxicidad de los derivados de tomaimicina y sus conjugados con anticuerpo frente a líneas celulares se puede medir por retro-extrapolación de las curvas de proliferación celular como se describe en Goldmacher et al., 1985, J. Immunol., 135:3648-3651. La citotoxicidad de estos compuestos frente a líneas celulares adherentes puede determinarse mediante ensayos clonogénicos como se describe en Goldmacher et al., 1986, J. Cell Biol., 102: 1312-1319.
Derivados de leptomicina
El citotóxico según la presente invención también puede ser un derivado de leptomicina. Según la presente invención, "derivados de leptomicina” se refiere a los miembros de la familia de la leptomicina como se define en Kalesse et al. (2002, Synthesis 8: 981-1003), e incluyen: leptomicinas, tales como leptomicina A y leptomicina B, calistatinas, ratjadones tales como ratjadona A y ratjadona B, anguinomicinas tales como anguinomicina A, B, C, D, kasusamicinas, leptolstatina, leptofuraninas, tales como leptofuranina A, B, C, D. Se prefieren los derivados de leptomicina A y B.
Más específicamente, los derivados de la invención son de la fórmula (I):
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en la que
Ra y Ra’ son H o -Alk; preferiblemente Ra es -Alk, preferiblemente metilo, y Ra’ es H;
R17 es alquilo opcionalmente sustituido con OR, CN, NRR’, perfluoroalquilo; preferiblemente, R17 es alquilo, más preferiblemente metilo o etilo;
R9 es alquilo opcionalmente sustituido con OR, CN, NRR’, perfluoroalquilo; preferiblemente, R9 es alquilo, más preferiblemente metilo;
X es -O- o -NR-; preferiblemente, X es -NR-;
Y es -U-, -NR-U-, -O-U-, -NR-CO-U-, -U-NR-CO-, -U-CO-, -CO-U-;
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preferiblemente, cuando X es -O-, Y es -U-, -NR-U-, -U-NR-CO-;
en el que U se selecciona de -Alk-, -Alk(OCH2CH2)m-, -(OCH2CH2)m-Alk-, -Alk(OCH2CH2)m-Alk-, -(OCH2CH2V, -Cicloalquilo-, -Heterocíclico-, -Cicloalquil-Alk-, -Alk-Cicloalquilo-, -Heterocíclico-Alk-, -Alk-Heterocíclico-, lineales o ramificados;
en los que m es un número entero seleccionado de 1 a 2000; preferiblemente, U es -Alk- lineal o ramificado,
Z es -Alk-;
n es 0 o 1; preferiblemente n es 0;
T representa H, un grupo protector de tiol, tal como Ac, R1 o SR1, en el que R1 representa H, metilo, Alk, Cicloalquilo, arilo opcionalmente sustituido o heterocíclico, o T representa
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en la que:
Ra, Ra’, R17, R9, X, Y, Z, n son como se definen anteriormente;
preferiblemente, T es H o SR1, en el que R1 representa Alk, más preferiblemente metilo;
R, R’, iguales o diferentes, son H o alquilo;
Alk representa un alquilo lineal o ramificado; preferiblemente Alk representa (-(CH2-q(CH3)q)p- en el que p representa un número entero de 1 a 10; y q representa un número entero de 0 a 2; preferiblemente, Alk representa -(CH2)- o -C(CH3)2-.
o sus sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, o sales hidratadas, o las estructuras cristalinas polimórficas de estos compuestos, o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros.
Los compuestos preferidos pueden elegirse de:
• (2-Metilsulfanil-etil)-amida del ácido
(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)- 8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenoico
• Bis-[(2-mercaptoetil)-amida del ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,
7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenoi co]
• (2-Mercapto-etil)-amida del ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,
15.17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenoico
• (2-Metildisulfanil-etil)-amida del ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,
7.9.11.15.17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenoi co
• (2-Metil-2-metildisulfanil-propil)-amida del ácido
(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)- 8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenoico
• (2-Mercapto-2-metil-propil)-amida del ácido
(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)- 8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenoico
o sus sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, o sales hidratadas, o las estructuras cristalinas polimórficas de estos compuestos, o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros.
Con el fin de enlazar el derivado a un agente de unión a células, el derivado debe incluir un resto (grupo conector) que permita a los derivados enlazarse a un agente de unión a células a través de un enlace tal como un enlace de disulfuro,
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un enlace de sulfuro (o llamado en la presente memoria tioéter), un grupo lábil de ácidos, un grupo fotolábil, un grupo lábil a peptidasas, o un grupo lábil a esterasas. Los derivados se preparan de manera que contengan un resto necesario para enlazar el derivado de leptomicina a un agente de unión a células, por ejemplo mediante un enlace de disulfuro, un enlace de tioéter, un grupo lábil de ácidos, un grupo fotolábil, un grupo lábil a peptidasas, o un grupo lábil a esterasas. Con el fin de aumentar más la solubilidad en disoluciones acuosas, el grupo conector puede contener un espaciador de polietilenglicol. Preferiblemente, se utiliza un enlace de sulfuro o disulfuro porque el entorno reductor de la célula seleccionada como diana da como resultado la escisión del sulfuro o disulfuro y la liberación de los derivados con un incremento asociado de la citotoxicidad.
Los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante diferentes rutas sintéticas. Los reactivos y materiales de partida están disponibles comercialmente, o se sintetizan fácilmente mediante técnicas muy conocidas por el experto en la técnica. Los métodos para sintetizar los derivados de leptomicina que pueden utilizarse en los conjugados citotóxicos de la presente invención, junto con los métodos para conjugar dichos derivados de leptomicina a agentes de unión a células tales como anticuerpos, se describen con detalle en la Solicitud de Patente Europea No. 06290948.6.
Análogos de CC-1065
El agente citotóxico utilizado en los conjugados citotóxicos según la presente invención también puede ser CC-1065 o un derivado de éste.
CC-1065 es un potente antibiótico anti-tumoral aislado del caldo de cultivo de Streptomyces zelensis. CC-1065 es aproximadamente 1.000 veces más potente in vitro que los fármacos anti-cancerígenos utilizados habitualmente, tales como doxorrubicina, metotrexato y vincristina (B.K. Bhuyan et al., 1982, Cancer Res., 42, 3532-3537). CC-1065 y sus análogos se describen en las patentes de EeUu Nos. 6.372.738, 6.340.701, 5.846.545 y 5.585.499.
La potencia citotóxica de CC-1065 se ha correlacionado con su actividad alquilante y su actividad de unión al ADN e intercalación en el ADN. Estas dos actividades residen en partes separadas de la molécula. Así, la actividad alquilante está contenida en la subunidad de ciclopropapirroloindol (CPI), y la actividad de unión al ADN reside en las dos subunidades de pirroloindol.
Aunque CC-1065 tiene ciertas características atractivas como agente citotóxico, tiene limitaciones en el uso terapéutico. La administración de CC-1065 a ratones produjo una hepatotoxicidad retardada que dio lugar a mortalidad en el día 50 después de una única dosis intravenosa de 12,5 |ig/kg (V. L. Reynolds et al., 1986, J. Antibiotics, XXIX: 319-334). Esto ha estimulado los esfuerzos para desarrollar análogos que no produzcan una toxicidad retardada, y se ha descrito la síntesis de análogos más simples modelados sobre cC-1065 (M.A. Warpehoski et al., 1988, J. Med. Chem., 31: 590-603).
En otra serie de análogos, el resto de CPI se reemplazó por un resto de ciclopropabencindol (CBI) (D.L. Boger et al., 1990, J. Org. Chem., 55: 5823-5833; D.L. Boger et al., 1991, BioOrg. Med. Chem. Lett., 1: 115-120). Estos compuestos mantienen la elevada potencia in vitro del fármaco parental, sin causar toxicidad retardada en ratones. Al igual que CC-1065, estos compuestos son agentes alquilantes que se unen al surco menor del ADN de un modo covalente para causar la muerte celular. Sin embargo, la evaluación clínica de los análogos más prometedores, Adozelesina y Carzelesina, ha producido resultados decepcionantes (B.F. Foster et al., 1996, Investigational New Drugs, 13: 321-326; I. Wolff et al., 1996, Clin. Cancer Res., 2: 1717-1723). Estos fármacos presentan efectos terapéuticos pobres a causa de su elevada toxicidad sistémica.
La eficacia terapéutica de los análogos de CC-1065 se puede mejorar mucho cambiando la distribución in vivo mediante suministro dirigido al sitio del tumor, lo que da como resultado una menor toxicidad en tejidos no diana, y de este modo, menor toxicidad sistémica. Con el fin de lograr esta meta, se han descrito conjugados de análogos y derivados de CC-1065 con agentes de unión a células que se seleccionan específicamente como dianas a células tumorales (patentes de EEUU; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545). Estos conjugados presentan típicamente in vitro una alta citotoxicidad específica para la diana, y una actividad anti-tumoral excepcional en modelos de xenoinjertos de tumores humanos en ratones (R.V. J. Chari et al., 1995, Cancer Res., 55: 4079-4084).
Recientemente, se han descrito profármacos de análogos de CC-1065 con solubilidad incrementada en medio acuoso (Solicitud de Patente Europea No. 06290379.4). En estos profármacos, el grupo fenólico de la parte alquilante de la molécula está protegido con una funcionalidad que convierte al fármaco en estable después de almacenarlo en una disolución acuosa ácida, y confiere al fármaco una solubilidad en agua incrementada en comparación con el análogo sin proteger. El grupo protector se escinde fácilmente in vivo a pH fisiológico para dar el fármaco activo correspondiente. En los profármacos descritos en EP 06290379.4, el sustituyente fenólico está protegido como un ácido sulfónico que contiene carbamato de fenilo que posee una carga a pH fisiológico, y así tiene una solubilidad en agua Incrementada. Con el fin de aumentar más la solubilidad en agua, se puede introducir un espaciador de polietilenglicol opcional en el conector entre la subunidad de indolilo y el enlace escindidle, tal como un grupo disulfuro. La introducción de este espaciador no altera la potencia del fármaco.
Los métodos para sintetizar los análogos de CC-1065 que pueden utilizarse en los conjugados citotóxicos de la presente invención, junto con los métodos para conjugar los análogos con agentes de unión a células tales como
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anticuerpos, se describen con detalle en el documento EP 06290379.4 y en las patentes de EEUU Nos. 5.475.092, 5.846.545, 5.585.499, 6.534.660 y 6.586.618, y en las solicitudes de EEUU Nos. 10/116.053 y 10/265.452.
Otros fármacos
Los fármacos tales como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, caliqueamicina, tubulisina y análogos de tubulisina, duocarmicina y análogos de duocarmicina, dolastatina y análogos de dolastatinao también son adecuados para la preparación de los conjugados de la presente invención. Las moléculas de fármaco también pueden enlazarse a las moléculas de anticuerpo mediante una molécula transportadora intermedia, tal como seroalbúmina. Los compuestos de Doxarrubicina y Danorrubicina, como se describen, por ejemplo, en la Patente de EEUU No. 6.630.579, también pueden ser agentes citotóxicos útiles.
Composición terapéutica
La invención también se refiere a una composición terapéutica para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento del cáncer, incluyendo (pero sin limitarse a) los siguientes: carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello del útero, tiroides y piel; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de la línea linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de la línea mieloide, incluyendo leucemias mielogenosas agudas y crónicas, y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma, rabdomioscarama y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo y teratocarcinoma, y otros cánceres todavía por determinar en los que EphA se expresa de manera predominante. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se utilizan para el tratamiento de cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, ovario, cuello del útero y órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, un sarcoma, cabeza y cuello, un glioma, gástrico, hígado, y otros carcinomas en los que se expresa EphA. En particular, el cáncer es un cáncer metastásico. En otra realización, dicha composición farmacéutica se refiere a otros trastornos tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, tales como lupus sistémico, artritis reumatoide y esclerosis múltiple; rechazos de injertos tales como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante hepático, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardiaco y rechazo de trasplante de médula ósea; enfermedad de injerto frente a hospedante; infecciones virales tales como infección por mV, infección por VIH, SIDA etc.; e infecciones parasitarias tales como giardiasis, amebiasis, esquistosomiasis, y otras determinadas por un experto en la técnica.
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden:
• una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención y
• un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser inerte o fisiológicamente activo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “vehículos farmacéuticamente aceptables” incluye todos y cadao uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos y similares, que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen uno o más de agua, disolución salina, disolución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como una combinación de éstos. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, tales como azúcares, polialcoholes, o cloruro sódico. En particular, los ejemplos relevantes de vehículo adecuado incluyen: (1) disolución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco, pH ~ 7,4, que contiene o no aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de seroalbúmina humana, (2) disolución salina al 0,9% (cloruro sódico al 0,9% p/v (NaCI)), y (3) dextrosa al 5% (p/v); y también puede contener un antioxidante, tal como triptamina, y un agente estabilizante, tal como Tween 20.
Las composiciones de la presente memoria también pueden contener un agente terapéutico más, según sea necesario para el trastorno particular que se está tratando. Preferiblemente, el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención, y el compuesto activo adicional, tendrán actividades complementarias, que no se perjudiquen entre sí. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es un antagonista del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor tisular (TF), proteína C, proteína S, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), o receptor HER2.
Las composiciones de la invención pueden estar en diferentes formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, aunque la forma preferida depende del modo de administración pretendido y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicamente preferidas están en forma de disoluciones inyectables o para infusión. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo). En una realización preferida, las composiciones de la invención se
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administran por vía intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo. En otra realización preferida, se inyectan por vía intramuscular, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratumoral, peritumoral, intralesional, o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos.
Las composiciones estériles para administración parenteral pueden prepararse incorporando el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, seguido de esterilización mediante microfiltración. Como disolvente o vehículo, puede utilizarse agua, disolución salina, disolución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como una combinación de éstos. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, tales como azúcares, polialcoholes, o cloruro sódico. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, en particular agentes humectantes, isotonificantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. Las composiciones estériles para administración parenteral también pueden prepararse en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en el momento de su utilización en agua estéril o en cualquier otro medio estéril inyectable.
El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención también puede administrarse oralmente. Como composiciones sólidas para administración oral, pueden utilizarse comprimidos, pastillas, polvos (cápsulas de gelatina, sobres) o gránulos. En estas composiciones, el ingrediente activo según la invención se mezcla con uno o más diluyentes inertes, tales como almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, bajo una corriente de argón. Estas composiciones también pueden comprender sustancias distintas de los diluyentes, por ejemplo uno o más lubricantes, tales como estearato de magnesio o talco, un colorante, un recubrimiento (comprimidos recubiertos con azúcar) o un glaseado.
Como composiciones líquidas para administración oral, pueden utilizarse disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes tales como agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender sustancias distintas de los diluyentes, por ejemplo productos humectantes, edulcorantes, espesantes, saporíferos o estabilizantes.
Las dosis dependen del efecto deseado, la duración del tratamiento y la vía de administración utilizada; generalmente están entre 5 mg y 1000 mg por día oralmente para un adulto con dosis unitarias en el intervalo de 1 mg a 250 mg de sustancia activa. En general, el médico determinará la dosis adecuada dependiendo de la edad, peso y cualquier otro factor específico del sujeto que se va a tratar.
Métodos terapéuticos de utilización
En otra realización, la presente memoria descriptiva proporciona un método para inhibir la actividad del receptor EphA2 mediante la administración de un anticuerpo que antagoniza dicho receptor EphA2, a un paciente que lo necesita. Pueden utilizarse terapéuticamente cualquiera de los tipos de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, o conjugados citotóxicos de la invención. La invención incluye así la utilización de anticuerpos antagonistas anti-EphA2, fragmentos de éstos, o conjugados citotóxicos de éstos como medicamentos.
En un aspecto de la memoria descriptiva, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o conjugados citotóxicos de la invención se utilizan para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En una realización más preferida, una de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, y que contiene un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado citotóxico de la invención, se utiliza para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En una realización, el trastorno es un cáncer. En particular, el cáncer es un cáncer metastásico. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y conjugados citotóxicos de la invención también pueden utilizarse para tratar la neovascularización de dicho tumor canceroso.
En consecuencia, las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles en el tratamiento o prevención de diferentes cánceres, incluyendo (pero sin limitarse a) los siguientes: carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello del útero, tiroide y piel; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de la línea linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de la línea mieloide, incluyendo leucemias mielogenosas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma, rabdomioscarama y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo y teratocarcinoma, y otros cánceres todavía por determinar en los que EphA se expresa de manera predominante. En una realización preferida, el cáncer es un cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, útero, ovario, cuello del útero y órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, sarcoma, cabeza y cuello, glioma, gástrico, hígado, y otros carcinomas en los que se expresa EphA. En otra realización, dicha composición farmacéutica se refiere a otros trastornos tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, tales como lupus sistémico, artritis reumatoide, y esclerosis múltiple; rechazos de injertos, tales como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante hepático, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardiaco, y rechazo de trasplante de médula ósea; enfermedad de injerto frente a hospedante; infecciones virales, tales como infección por mV, infección por VIH, SIDA etc.; e infecciones parasitarias tales como giardiasis, amebiasis,
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esquistosomiasis, y otras determinadas por un experto en la técnica.
De manera similar, la presente memoria descriptiva proporciona un método para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas, que comprende poner en contacto las células diana, o tejido que contiene las células diana, con una cantidad eficaz de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención, o un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o agente terapéutico que comprende un conjugado citotóxico, bien solo o en combinación con otros agentes citotóxicos o terapéuticos.
Como se describe aquí, el método para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas puede ponerse en práctica in vitro, in vivo o ex vivo. Tal como se utiliza en la presente memoria, “inhibir el crecimiento” significa ralentizar el crecimiento de una célula, disminuir la viabilidad celular, producir la muerte de una célula, lisar una célula e inducir la muerte celular, en un periodo de tiempo ya sea corto o largo.
Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de médula ósea autóloga antes de su trasplante en el mismo paciente a fin de destruir células enfermas o malignas; tratamientos de médula ósea antes de su trasplante a fin de destruir células T competentes y prevenir la enfermedad de injerto frente a hospedante (GVHD); tratamientos de cultivos celulares a fin de eliminar todas las células excepto las variantes deseadas que no expresan el antígeno diana; o para destruir variantes que expresan un antígeno indeseado.
Las condiciones de la utilización no clínica in vitro las determina fácilmente el experto en la técnica.
Los ejemplos de utilización clínica ex vivo son para eliminar células tumorales o células linfoides de la médula ósea antes del trasplante autólogo en el tratamiento del cáncer o en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, o para eliminar células T y otras células linfoides de médula ósea autóloga o alogénica o de tejidos antes del trasplante para prevenir la enfermedad de injerto frente a hospedante (GVHD). El tratamiento puede realizarse como sigue. Se recoge la médula ósea del paciente o de otro individuo y entonces se incuba en medio que contiene suero, al que se añade el agente citotóxico de la invención. Las concentraciones varían de aproximadamente 10 |iM a 1 pM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37°C. Las condiciones exactas de concentración y tiempo de incubación, es decir, la dosis, las determinará fácilmente un experto en la técnica. Después de la incubación, las células de la médula ósea se lavan con medio que contiene suero, y se devuelven al paciente por infusión i.v. según métodos conocidos. En circunstancias en las que el paciente recibe otro tratamiento, tal como un curso de quimioterapia ablativa o irradiación de todo el cuerpo entre el momento de la recolección de la médula y la reinfusión de las células tratadas, las células de la médula ósea tratadas se conservan congeladas en nitrógeno líquido usando un equipo médico convencional.
Para la utilización clínica in vivo, el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo que se une al epítopo, o el conjugado citotóxico de la invención se proporcionará como disoluciones que se han ensayado para determinar su esterilidad y niveles de endotoxinas. Los ejemplos de protocolos adecuados para la administración de los conjugados citotóxicos son los siguientes. Los conjugados se administran semanalmente durante 4 semanas como un bolo i.v. cada semana. Las dosis del bolo se proporcionan en 50 a 100 ml de disolución salina normal, a la que pueden añadirse 5 a 10 ml de seroalbúmina humana. Las dosis serán 10 |ig a 100 mg por administración, i.v. (intervalo de 100 ng a 1 mg/kg por día). Más preferiblemente, las dosis variarán de 50 |ig a 30 mg. Lo más preferiblemente, las dosis variarán de 1 mg a 20 mg. Después de cuatro semanas de tratamiento, el paciente puede continuar recibiendo el tratamiento semanalmente. El experto en la técnica puede determinar los protocolos clínicos específicos con respecto a la vía de administración, excipientes, diluyentes, dosificaciones, tiempos, etc., cuando lo permita la situación clínica.
Diagnóstico
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención también pueden utilizarse para detectar EphA2 in vitro o in vivo en una muestra biológica. En una realización, el anti-EphA2 de la invención se utiliza para determinar el nivel de EphA2 en un tejido o en células obtenidas del tejido. En una realización preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una realización preferida del método, el tejido es un tumor o una biopsia del mismo. En una realización preferida del método, en primer lugar se obtiene un tejido o una biopsia de éste de un paciente, y los niveles de EphA2 en el tejido o biopsia pueden determinarse entonces en un inmunoensayo con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención. El tejido o biopsia de éste puede congelarse o fijarse. El mismo método puede utilizarse para determinar otras propiedades de la proteína EphA2, tales como su nivel de fosforilación en tirosina, niveles en la superficie celular, o localización celular.
El método descrito anteriormente puede utilizarse para diagnosticar un cáncer en un sujeto que se sabe o sospecha que tiene un cáncer, en el que el nivel de EphA2 determinado en dicho paciente se compara con el de un sujeto o estándar de referencia normal. Dicho método puede utilizarse para determinar si un tumor expresa EphA2, lo que puede sugerir que el tumor responderá bien al tratamiento con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o conjugados de anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, el tumor es un cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, útero, ovario, cuello del útero, y órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, un sarcoma, un glioma, gástrico, hígado, cabeza y cuello, u otros carcinomas en los que se expresa EphA2, y otros cánceres todavía por determinar en los que EphA2 se expresa de manera predominante.
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La presente memoria descriptiva proporciona además anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados y fragmentos de éstos que se unen al epítopo, que se marcan además para utilizarse en aplicaciones de investigación o diagnósticas. En realizaciones preferidas, el marcador es un marcador radiactivo, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de formación de imagen, o un ion metálico.
También se proporciona un método para diagnóstico, en el que dichos anticuerpos marcados o fragmentos de éstos que se unen al epítopo se administran a un sujeto que se sospecha que tiene cáncer, y se determina o monitoriza la distribución del marcador en el cuerpo del sujeto.
Kit
La presente memoria descriptiva también describe kits que comprenden, por ejemplo, un conjugado citotóxico descrito, e instrucciones para la utilización del conjugado citotóxico para eliminar tipos celulares particulares. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para utilizar los conjugados citotóxicos in vitro, in vivo o ex vivo.
Típicamente, el kit tendrá un compartimento que contiene el conjugado citotóxico. El conjugado citotóxico puede estar en forma liofilizada, en forma líquida, o en otra forma adecuada para incluirla en un kit. El kit también puede contener elementos adicionales necesarios para llevar a la práctica el método descrito en las instrucciones en el kit, tal como solución esterilizada para reconstituir un polvo liofilizado, agentes adicionales para combinarlos con el conjugado citotóxico antes de administrarlo a un paciente, y medios que faciliten la administración del conjugado a un paciente.
Ejemplos
Ejemplo 1
Generación de hibridomas de anticuerpo monoclonal anti-EphA2
Se inmunizaron cuatro ratones BALB/c VAF con células 300-19 transfectadas con EphA2 humano, una línea celular pre-B obtenida de un ratón BALB/c. Las células transfectadas de manera estable que sobreexpresan el antígeno se generaron mediante transfección de células 300-19 con el ADNc de longitud completa de EphA2 humano, y se seleccionaron en busca de los clones con una alta expresión mediante citometría de flujo. El clon 4-6, un clon que expresa fuertemente el receptor EphA2 humano en la superficie celular, se seleccionó como inmunógeno para la inmunización de ratones y para el cribado de anticuerpos de hibridomas. Las células transfectadas con EphA2 se mantuvieron en el medio de selección que contiene G418 a una concentración final de 1 mg/ml, y se analizaron regularmente para detectar la expresión de EphA2 utilizando un anticuerpo comercialmente disponible.
Se les inyectaron subcutáneamente a los ratones Balb/c aproximadamente 5x106 células 300-19 transfectadas con EphA2 en 200 |il de disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) por ratón. Las inyecciones se realizan cada 2-3 semanas mediante protocolos de inmunización estándar utilizados en ImmunoGen, Inc. Tres días antes de la fusión celular, los ratones se reforzaron intraperitonealmente una vez más con la misma dosis de antígeno, y se sacrificaron para la preparación de células de bazo según los protocolos estándar para los procedimientos de utilización de animales en el día de la fusión celular.
Se recogió el bazo del ratón inmunizado en condiciones quirúrgicas estériles y se trituró entre dos portaobjetos microscópicos estériles y fríos para obtener una suspensión de células individuales en medio RPMI-1640. Los esplenocitos se peletizaron y se lavaron dos veces con medio RPMI-1640 antes de la fusión celular. Las células del bazo se mezclaron y se fusionaron con células de mieloma murino P3X63Ag8.653 (Kearney, J.F. et al., 1979. J. Immunol., 123: 1548-1550) utilizando polietilenglicol-1500 como fusógeno (Roche 783 641). Después de la fusión celular y centrifugación, las células se suspendieron en medio RPMI-1640 completo (200 ml), que contiene suplemento de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma H-0262), y se sembraron en diez placas de 96 pocillos de fondo plano (Corning-Costar 3596, 200 |il de suspensión celular por pocillo). Después de incubar a 37°C, 5% de CO2 durante 5 días, se eliminaron 100 |il del sobrenadante del cultivo de cada pocillo de las placas y se reemplazaron por un volumen igual de medio RPMI-1640 completo que contiene suplemento de hipoxantina-timidina (HT) (Sigma H-0137). La incubación (en una atmósfera de 5% de CO2 a 37°C) se continuó hasta que los clones de hibridoma hubieron formado colonias lo suficientemente grandes para cribar el anticuerpo.
En el día 10 después de la fusión, cuando las células de hibridoma hubieron crecido hasta la mitad de la confluencia en los pocillos y el sobrenadante hubo cambiado a un color naranja, los sobrenadantes de los hibridomas se muestrearon de las placas de fusión para el cribado de anticuerpos mediante inmunoensayos. Para el cribado preliminar, los sobrenadantes de hibridomas se analizaron en células transfectadas con EphA2 frente a las células 300-19 parentales, mediante citometría de flujo. Las células se tiñeron con 50 |il de sobrenadante de hibridoma, seguido de incubación con conjugado de IgG de cabra anti-ratón-fluoresceína (H+L), y se analizaron mediante citometría de flujo con un equipo Becton Dickinson FACSCalibur o FACSArray. Los clones de hibridoma que resultaron positivos para las células transfectadas con EphA2 pero negativos para las células 300-19 se seleccionaron, se expandieron, se congelaron para almacenarlos, o se subclonaron mediante diluciones limitantes, para obtener una población monoclonal. Los anticuerpos específicos segregados por las células de hibridoma se isotiparon utilizando reactivos de isotipado comercialmente disponibles (Roche 1493027).
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En base a los datos de citometría de flujo, se identificaron y seleccionaron 29 clones de hibridoma, que fueron reactivos específicamente con células transfectadas con EphA2 humano pero no con las células 300-19 parentales, de la inmunización de ratones con antígenos EphA2 humanos.
Ejemplo 2
Caracterización de la unión de los anticuerpos anti-EphA2. 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11. EphA2-N1 y EphA2-N2.
La unión específica de cada uno de los anticuerpos anti-EphA2 purificados, 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11, se demostró mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando células que sobreexpresan EphA2 humano y mediante la utilización de células que no expresan EphA2 (FIG. 1A, B y C). La incubación del anticuerpo 37.3D7, o del anticuerpo 37.1 F5 o del anticuerpo 53.2H11 (60 nM) en 100 |il de amortiguador de FACS frío (1 mg/ml BSA en medio MEM de Dulbecco) se realizó utilizando células que sobreexpresan EphA2 y células que no expresan EphA2, en una placa de 96 pocillos de fondo redondo en hielo. Después de 1 h, las células se peletizaron mediante centrifugación y se lavaron con amortiguador de FACS frío, y se incubaron con el conjugado de anticuerpo IgG de cabra anti-ratón-FITC (100 |il, 6 |ig/ml en amortiguador de FACS) en hielo durante 1 h. Las células se peletizaron, se lavaron y se resuspendieron en 200 |il de disolución de formaldehído al 1% en PBS. Las muestras de células se analizaron utilizando un lector FACSCalibur (BD Biosciences).
Se obtuvo un fuerte desplazamiento de la fluorescencia después de la incubación de células que sobreexpresan EphA2 humano con el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, o 53.2H11, en contraste con un desplazamiento insignificante después de la incubación de las células que no expresan EphA2 humano con el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, o 53.2H11 (FIG. 1A, 1B y 1C), lo que demuestra que los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11 se unían selectivamente a EphA2 humano. El anticuerpo anti-EphA2 utilizado como control positivo, B2D6 (Upstate), mostró un desplazamiento de la fluorescencia similar después de incubaciones con células que sobreexpresaban EphA2 humano (FIG. 1A). También se observó un fuerte desplazamiento de la fluorescencia mediante el ensayo de FACS utilizando 37.3D7 y células de cáncer humano, tal como células de cáncer de mama humano MDA-MB-231, células de cáncer de colon humano HT-29, células de cáncer pancreático humano BxPC3, lo que muestra que el anticuerpo 37.3D7 se une a EphA2 humano en la superficie de células tumorales humanas (FIG. 2). También se obtuvieron datos similares utilizando los anticuerpos 37.1F5 y 53.2H11 con líneas celulares tumorales humanas.
Las constantes de disociación aparentes (Kd) para la unión de los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H11 a EphA2 humano en la superficie de las células se determinaron mediante ensayos de FACS de la unión del anticuerpo a diferentes concentraciones a células que sobreexpresan EphA2 humano y a células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (FIG. 3). Los valores de Kd se estimaron mediante regresión no lineal para la unión a un sitio. Las curvas de unión proporcionaron los valores de Kd aparente de 0,3 nM para el anticuerpo 37.3D7, 0,07 nM para el anticuerpo 37.1F5, y 0,14 nM para el anticuerpo 53.2H11 (FIG. 3A, 3C y 3E).
Utilizando el mismo protocolo experimental, se determinaron los valores de kD aparente de 0,18 nM y 0,05 nM para EphA2-N1 y EphA2-N2, respectivamente.
Se obtuvo un fuerte desplazamiento de la fluorescencia después de la incubación de células que sobreexpresan EphA2 murino o EphA2 de rata con el anticuerpo 37.3D7 o el anticuerpo 53.2H11, en contraste con un desplazamiento insignificante después de la incubación de células que no expresan EphA2 murino o EphA2 de rata con el anticuerpo 37.3D7 o el anticuerpo 53.2H11 (FIG. 4), lo que demuestra que los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H11 también se unen a EphA2 murino y EphA2 de rata. También se observó un fuerte desplazamiento de la fluorescencia mediante el ensayo de FACS utilizando el anticuerpo 37.3D7 o 37.1F5 o 53.2H11 con células epiteliales de mono (Cercopithecus aethiops) VERO (FIG. 5A), lo que muestra que 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11 también se unen a EphA2 de mono. Los valores aparentes de Kd se estimaron mediante regresión no lineal para la unión a un sitio. Las curvas de unión mediante el ensayo de FACS proporcionaron valores de Kd de 0,15 nM para 37.3D7, 0,05 nM para 37.1F5 y 0,07 nM para 53.2H11 en células de mono (FIG. 5B, 5D y 5F).
Ejemplo 3
Inhibición de la unión de efrina A1 a células MDA-MB-231 por los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2
La unión de efrinaA1 a células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 fue inhibida por los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H11 (FIG. 6). Células MDA-MB-231 se incubaron con o sin 5 |ig/ml del anticuerpo 37.3D7, 37.1 F5, o 53.2H11 durante 2 h, seguido de la incubación con 100 ng/ml de efrinaA1 biotinilada, durante 30 min a 4°C. Las células se lavaron entonces dos veces con medio libre de suero, para eliminar la efrinaA1 biotinilada sin unir, y se lisaron entonces en amortiguador de HEPES 50 mM, pH 7,4, que contiene NP-40 al 1% e inhibidores de proteasas. Se recubrieron placas de ELISA lmmulon-2HB con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-EphA2 (D7, Upstate), y se utilizaron para capturar del lisado el EphA2 y la biotina-efrinaA1 unida. La unión del anticuerpo recubierto al dominio citoplásmico C terminal de EphA2 no interfirió con la unión de biotina-efrinaA1 al dominio extracelular de EphA2. Los pocillos se lavaron, se incubaron con conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano, se lavaron de nuevo, y después se revelaron con el sustrato ABTS/H2O2. La inhibición de la unión de efrinaA1 a las células MDA-MB-231 por
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5 |ig/ml del anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, o 53.2H1 fue esencialmente cuantitativa; la señal fue prácticamente equivalente a la de la señal de fondo del ELISA obtenida utilizando un control que carecía de biotina-efrinaA1 (FIG. 6A, 6B y 6C).
Tanto EphA2-N1 como Epha2-N2 fueron capaces de inhibir la unión de efrinaA1 humana a células MDA-MB-231, en el mismo grado que 37.3D7.
Ejemplo 4
Inhibición de la señalización celular mediada por EphA2 por los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2
El tratamiento de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 con el anticuerpo 37.3D7, o 37.1F5, inhibió completamente la señalización intracelular del receptor EphA2, como se muestra mediante la inhibición de la autofosforilación del receptor EphA2 (FIG. 7A) y mediante la inhibición de la fosforilación de efectores aguas abajo, tal como Akt (FIG. 7B). El tratamiento de células de cáncer pancreático CFPAC-1 con el anticuerpo 37.3D7 o el anticuerpo 53.2H11 inhibió completamente la señalización intracelular del receptor EphA2, como se muestra mediante la inhibición de la autofosforilación del receptor EphA2 (FIG. 7C).
En las FIG. 7A y 7C, las células mamarias MDA-MB-231 o las células pancreáticas CFPAC-1 se hicieron crecer en medio regular (como sugiere la ATCC para cada línea celular) con suero durante 3 días y después se cultivaron en medio libre de suero durante 12-14 h. Las células desprovistas de suero se trataron con 15 |ig/ml del anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, o 53.2H11, o con IgG1 de control, durante 2 h, seguido de la estimulación con 1 |ig/ml de efrina A1-Fc (R&D) durante 10 min a 37°C. Las células se lisaron entonces en amortiguador de lisis enfriado en hielo que contiene inhibidores de proteasas y fosfatasas (amortiguador de HEPES 50 mM, pH 7,4, 1% de NP-40, ortovanadato sódico1 mM, fluoruro sódico 100 mM, pirofosfato sódico 10 mM, EDTA 2,5 mM, leupeptina 10 |iM, pepstatina 5 |iM, PMSF 1 mM, benzamidina 5 mM y aprotinina 5 |ig/ml). Los lisados se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-EphA2 D7 (Upstate) acoplado a perlas de proteína A/G. El EphA2 inmunoprecipitado se resolvió en un gel de poliacrilamida con SDS, y se transfirieron mediante transferencia Northern con anticuerpo monoclonal específico de fosfotirosina, 4G10 (Cell Signaling Technology). Para evaluar el nivel de la proteína EphA2 en cada muestra inmunoprecipitada, la misma membrana se volvió a transferir con anticuerpo anti-EphA2, D7 (Upstate). La utilización de un anticuerpo de control no mostró inhibición de la autofosforilación del receptor EphA2 estimulada por efrina A1 (Fig. 7C). Por el contrario, se obtuvo una inhibición completa de la autofosforilación del receptor EphA2 estimulada por efrinaA1 después del tratamiento con el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, o 53.2H11 (Fig. 7A y 7C). La activación estimulada por efrina A1 de los efectores aguas abajo, tal como Akt, también se inhibió en células MDA-MB-231 por el anticuerpo 37.3D7 o 37.1F5, como se muestra utilizando transferencias Western de los lisados y anticuerpo policlonal de conejo anti-fosfo-Ser473 Akt (Cell Signaling Technology) (FIG. 7B).
Los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H11 no estimularon por sí mismos la autofosforilación de EphA2 en células de cáncer de mama humano MDA-MB-231, en contraste con el efecto estimulador de efrinaA1 sobre la autofosforilación de EphA2 en células MDA-MB-231 (FIG. 8A y 8B). Se obtuvieron datos similares para el anticuerpo 37.1 F5 utilizando células MDA-MB-231. En la FIG. 8, las células MDA-MB-231 se hicieron crecer en medio regular con suero durante 3 días, y entonces se cultivaron en medio libre de suero durante 12-14 h. Las células desprovistas de suero se trataron con 1 |ig/ml de efrinaA1-Fc, o 15 |ig/ml de anticuerpo 37.3D7 o 53.2H11, durante 10 min. Los lisados celulares se sometieron a inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-EphA2, D7 (Upstate). Después de separar en un gel de poliacrilamida con SDS, la transferencia se sondó con el anticuerpo anti-fosfotirosina, 4G10 (Cell Signaling Technology) y con el anticuerpo D7 anti-EphA2 (Upstate). Se obtuvieron resultados similares tanto con EphA2-N1 como con EphA2-N2 en células de cáncer de mama humano MDA-MB-231, ya que ningún anticuerpo estimula la autofosforilación de EphA2 por sí mismo, mientras que cada uno de ellos impide la fosforilación del receptor EphA2 dependiente de efrinaA1.
Los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 y EphA2-N2 son, por lo tanto, únicos entre todos los anticuerpos anti-EphA2 conocidos, ya que inhiben eficazmente la señalización intracelular de EphA2 estimulada por efrinaA1.
Ejemplo 5
Inhibición del crecimiento y supervivencia, estimulados por suero, de células tumorales humanas por los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H11
Se analizaron diferentes líneas celulares tumorales humanas en condiciones libres de suero para determinar su respuesta de crecimiento y supervivencia al suero en presencia del anticuerpo 37.3D7 o 53.2H11. Se sembraron aproximadamente 3000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en medio regular (como sugiere la ATCC para cada línea celular) con suero, que se reemplazó al día siguiente por medio libre de suero. Después de un día de crecimiento en medio libre de suero, las células se incubaron con 15 |ig/ml del anticuerpo 37.3D7 o el anticuerpo 53.2H11, o IgG1 de control, seguido de la adición de suero para obtener una concentración final de 1% o 1,5% de suero. Se dejó que las células crecieran durante 3 días más. Entonces se añadió una disolución de MTT [bromuro de 3-(4,5)-dimetiltiazol-2-il-2,3-difeniltetrazolio; 25 |il de una disolución 5 mg/ml en PBS], y las células se volvieron a poner en el incubador durante 2-3 h. El medio se eliminó entonces y se reemplazó por 100 |il de DMSO, se mezcló, y se
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determinó la absorbancia de la placa a 545 nm. Diferentes líneas celulares tumorales humanas mostraron una respuesta de crecimiento y supervivencia después de la adición de suero, que fue inhibida significativamente por el anticuerpo 37.3D7 o 53.2H11. Como ejemplos, se muestran los descubrimientos con las líneas celulares tumorales de colon, HT-29, LoVo; la línea celular de tumor pancreático, CFPAC-2, BxPC3; y melanoma UACC-257.
El anticuerpo 37.3D7 inhibió fuertemente el crecimiento y supervivencia, estimulados por suero, de células de cáncer de colon humano HT-29 (FIG. 9A). En otro experimento, el anticuerpo 37.3D7 inhibió fuertemente el crecimiento y supervivencia, estimulados por suero, de células de cáncer pancreático humano BxPC3, de una manera dependiente de la dosis, con un valor de CI50 de 4 nM (FIG. 10A). Además, el anticuerpo 37.3D7 o 53.2H11 inhibió fuertemente el crecimiento y supervivencia, estimulados por suero, de células de cáncer de colon humano LoVo (FIG. 9B), de células de cáncer pancreático humano CFPAC-1 (FIG. 9C), y de células de cáncer de melanoma UACC-257 (FIG. 9D), y el anticuerpo 53.2H11 inhibió el crecimiento y supervivencia, estimulados por suero o EGF, de células LoVo, de una manera dependiente de la dosis, con un valor de Cl50 de 2 nM (FIG. 10B y 10C). En la FIG. 10, los valores de DO545 para muestras tratadas con 0% de suero se ajustaron al 100% de inhibición, y el 0% de inhibición se ajustó utilizando muestras tratadas con 1,5% de suero o 10 ng/ml de EGF. Ninguno de los anticuerpos anti-EphA2 dados a conocer previamente tiene actividades inhibidoras sobre el crecimiento, dependiente del anclaje (monocapa), de células tumorales humanas. Por lo tanto, los anticuerpos 37.3D7 y 53.2H11 son únicos en su capacidad para inhibir el crecimiento, dependiente del anclaje (crecimiento en monocapa), de células tumorales humanas.
Ejemplo 6
Inhibición de la señalización celular mediada por VEGF, y del crecimiento y supervivencia estimulados por VEGF, de células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC) por el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11
Se obtuvo un fuerte desplazamiento de la fluorescencia después de la incubación de células HUVEC con el anticuerpo 37.3D7, 37.1F5, o 53.2H11 mediante análisis de FACS, lo que indica que los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11 se unen a los receptores EphA2 expresados en células HUVEC. Las constantes de disociación aparentes (Kd) para la unión de los anticuerpos 37.3D7, 37.1 F5 y 53.2H11 a EphA2 en la superficie de las células se determinaron a partir de las curvas de unión establecidas con ensayos de unión de FACS realizados a diferentes concentraciones, y se muestran en la FIG. 11. Se estimó un valor de Kd = 0,3 nM para el anticuerpo 37.3D7 mediante regresión no lineal para la unión a un sitio (FIG. 11), que es similar al valor de Kd de la unión del anticuerpo 37.3D7 a células cancerosas humanas. De manera similar, se obtuvo un valor de Kd = 0,01 nM para el anticuerpo 37.1F5 y un valor de Kd = 0,06 nM para el anticuerpo 53.2H11. Esto indica que los anticuerpos 37.3D7, 37.1F5 y 53.2H11 se unen específicamente a las células HUVEC a través del receptor EphA2.
El anticuerpo 37.3D7 inhibió fuertemente el crecimiento y supervivencia de HUVEC inducidos por VEGF. La actividad es similar o mejor que la de Avastin®, un anticuerpo bloqueante anti-VEGF (Genentech) (FIG. 12). Un anticuerpo agonista anti-EphA2 no inhibió el crecimiento y supervivencia de HUVEC inducidos por VEGF (FIG. 12). En la FIG. 12, las células HUVEC se hicieron crecer en medio EBM-2 con suero y suplementos de células endoteliales (EC) (Clonetics) durante 3 días. Las células se cultivaron en medio libre de suero más suplementos de crecimiento de EC que carece de VEGF, durante 12-14 h. Después de estar sin suero, las células se estimularon con 5 ng/ml de VEGF más 0,4% de suero con o sin los anticuerpos indicados (100 |ig/ml). Los efectos de los anticuerpos sobre el crecimiento y supervivencia de las células HUVEC inducidos por VEGF se determinaron 3 días después de la adición de los anticuerpos y VEGF utilizando el ensayo de MTT como se describe en el Ejemplo 5. El porcentaje de inhibición del crecimiento y supervivencia mediados por VEGF por los anticuerpos se muestra en la FIG. 12. Los valores de DO545 para las muestras tratadas con vehículo se ajustaron al 0% de inhibición, y el 100% de inhibición se ajustó utilizando muestras que carecen de VEGF.
El hecho de que el tratamiento de células HUVEC con el anticuerpo 37.3D7 inhiba la señalización intracelular del receptor EphA2 se mostró midiendo la inhibición de la fosforilación de sus efectores aguas abajo, tal como Akt.
La inhibición es similar a la de Avastin®, un anticuerpo bloqueante anti-VEGF (Genentech) (FIG. 13). El anticuerpo agonista anti-EphA2 no inhibió la fosforilación de Akt inducida por VEGF en las células HUVEC. En la FIG. 13, las células HUVEC se pusieron durante 12-14 h en medio libre de suero más suplementos de EC que carece de VEGF. Las células se trataron con anticuerpos (20 |ig/ml) durante 1 h antes de la adición de VEGF (100 ng/ml). Las células se lisaron 15 min después de la adición de VEGF, y las inmunotransferencias se sondaron con los anticuerpos indicados.
Ejemplo 7
Supresión del crecimiento del xenoinierto de cáncer de colon humano HT-29 en ratones por el anticuerpo 37.3D7 (FIG. 14)
Se establecieron xenoinjertos de cáncer de colon humano HT-29 en ratones SCID mediante inyección subcutánea de 2 x 106 células HT-29. Cuando los ratones mostraron xenoinjertos de tumores HT-29 palpables (50 mm3), se trataron con el anticuerpo 37.3D7 o con un anticuerpo de control (IgG-i) (1 mg/ratón, i. v., dos veces por semana) o con PBS sola (100 |il/ratón, i. v., dos veces por semana). El crecimiento de los tumores se ralentizó significativamente por el tratamiento con el anticuerpo 37.3D7, comparado con un tratamiento con el anticuerpo de control o PBS sola. No se
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observó toxicidad del anticuerpo 37.3D7, en base a determinaciones de los pesos de los ratones.
Ejemplo 8
Inhibición de metástasis mamarias tempranas MDA-MB-231 por el anticuerpo anti-EphA2 hu53.2H11
Se evaluó la actividad anti-tumoral del anticuerpo anti-EphA2 hu532H11 a nivel de una dosis frente a tumor mamario temprano MDA-MB-231 implantado subcutáneamente en ratones SCID hembra. También se investigó el efecto de este anticuerpo en la invasión del tumor MDA-MB-231 en los ganglios linfáticos axial e inguinal superficiales. Para llevar esto a cabo, se administró hu532H11 a 40 mg/kg/adm mediante vía iv, en los días 1, 5, 8, 12, 15, 19, 22 y 26 después del implante del tumor. El grupo de control no se trató.
Para la evaluación de la actividad anti-tumoral de hu532H11, los animales se pesaron diariamente y los tumores se midieron 2-3 veces por semana mediante un calibre. Los pesos de los tumores se calcularon utilizando la fórmula: masa (mg) = [longitud (mm) x anchura (mm)2]/2. La actividad antitumoral se evaluó según 3 criterios: 1) incluyendo T/C, definido como el peso mediano del tumor (mg) de un grupo tratado dividido entre el peso mediano del tumor del control no tratado; 2) la determinación del retraso del crecimiento tumoral (T-C), en el que T se define como el tiempo mediano en días requerido para que los tumores del grupo de tratamiento alcancen 750 mg, y C es el tiempo mediano para que los tumores del grupo de control alcancen el mismo tamaño, y 3) la muerte de la célula tumoral se define como log10 de la muerte celular (bruto) = [valor de T-C en días]/(Td x 3,32). T-C se ha definido anteriormente, y Td es el tiempo en el que el volumen del tumor se duplica, en días, de los tumores del control, que se estima a partir de la línea recta mejor ajustada a partir de una gráfica logarítmica de crecimiento lineal de los tumores del grupo de control en crecimiento exponencial (intervalo 100-1.000 mg).
En un estudio paralelo, los animales se trataron como se ha descrito anteriormente, y en el día 28, después del implante del tumor, todos los ratones se sacrificaron y se recogieron los ganglios linfáticos axilares e inguinales (tamaño tumoral mediano en el grupo de control = 1558 mg). Se utilizó el anticuerpo humano Ki67 para identificar específicamente mediante inmunotinción las células tumorales MDA-MB-231 en los ganglios linfáticos. El área superficial de las metástasis en los ganglios linfáticos se calculó (media de 2 secciones) como S = área superficial de Ki67 humano x 100 / área superficial del ganglio linfático.
• Eficacia en tumor primario:
hu532H11 se toleró bien a 40 mg/kg/adm (dosis total 320 mg/kg) con un cambio de +8,9% en el peso corporal en el día 27. Esta dosis retrasó el crecimiento tumoral del tumor primario (T/C = 27% y 1,0 log de muerte celular bruta), incluso aunque el tumor no respondió a terapia.
• Actividad anti-metastásica:
hu532H11 indujo una reducción de la superficie de las metástasis (> 50 %) tanto en los ganglios linfáticos axilares como inguinales.
En conclusión, en ratones que portan tumor mamario MDA-MB-231, hu532H11 retrasa el crecimiento del tumor primario tratado en una etapa temprana del desarrollo del tumor (T/C = 27% y 1,0 log de muerte celular bruta), y reduce la superficie de las metástasis (> 50 %) tanto en los ganglios linfáticos axilares como inguinales.
En otro estudio, la actividad de un anticuerpo anti-EphA2 puede evaluarse en el modelo de “metástasis” de hígado de cáncer de colon humano HT29. El anticuerpo murino anti-EphA2 53.2H11 se administra iv, dos veces por semana, desde el día 4 después del implante intraesplénico de células HT29 en ratones SCID hembra (n = 20 ratones por grupo para animales que no portan tumores (NTBA), tratados y de control). En el día 50, 3 días después de la 13a administración de anti-EphA2, los ratones se necropsiaron, y sus bazos e hígados se pesaron para evaluar la masa tumoral en el sitio del tumor primario (bazo) o en el sitio de la metástasis (hígado). También se evaluó el número de metástasis. Los datos se analizaron utilizando herramientas estadísticas conocidas por el experto en la técnica.
• El tratamiento con anti-EphA2 a 40 mg/kg/iny (dosis total de 520 mg/kg) se tolera bien.
• Peso del tumor primario (bazo): Se observa una diferencia significativa en el peso del bazo entre los ratones NTBA y de control implantados, siendo mayor el de estos últimos. No existe una diferencia significativa entre el peso del bazo de los ratones de control implantados y el de los ratones tratados con anti-EphA2.
• Peso de las metástasis (hígado): el peso del hígado de los ratones de control implantados es significativamente mayor que el peso del hígado de NTBA; por otra parte, es significativamente menor en los ratones tratados con anti-EphA2 que en los ratones de control implantados.
• Número de metástasis hepáticas: no se observa diferencia significativa entre los ratones de control implantados y los ratones tratados con anti-EphA2.
En conclusión, el implante intraesplénico de adenocarcinoma de colon humano HT-29 induce significativamente un
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incremento del peso del hígado debido a la carga metastásica tumoral. El tratamiento con anti-EphA2 es capaz de disminuir significativamente la carga metastásica tumoral, como se observa por la reducción del peso del hígado de los ratones implantados, sin verse afectado el número de metástasis contadas en el hígado.
Ejemplo 9
Clonación y secuenciación de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 37.1F5.
Preparación de ARN a partir de células de hibridoma que producen el anticuerpo 37.1F5
Las preparaciones de ARN total se obtuvieron a partir de 5 x 106 células de hibridoma, que producen anticuerpo 37.1 F5, utilizando el kit RNeasy miniprep de Qiagen. Brevemente, se peletizaron 5 x 106 células y se resuspendieron en 350 |il de amortiguador RLT (que contiene 1% de p-mercaptoetanol). La suspensión se homogeneizó haciéndola pasar a través de una aguja y jeringa de calibre 21,5 aproximadamente 10 - 20 veces, o hasta que dejó de ser viscosa. Se añadió etanol (350 |il de etanol acuoso al 70%) al homogenado, que se mezcló bien. La disolución se transfirió a una columna de centrifugado, colocada en un tubo de recogida de 2 ml, y se centrifugó a >8000 x g durante 15 segundos. La columna se lavó dos veces con 500 |il de amortiguador RPE, después se transfirió a un tubo nuevo y se eluyó con 30 |il de agua libre de ARNasa y una centrifugación de 1 minuto. El eluato (30 |il) se colocó de nuevo en la columna para un segundo centrifugado de elución de 1 minuto. Una alícuota del eluato de 30 |il se diluyó con agua y se utilizó para determinar la absorción de UV a 260 nm para la cuantificación del ARN.
Preparación de ADNc con la reacción de la transcriptasa inversa (RT)
El ADNc de la región variable del anticuerpo 37.1F5 se generó a partir del ARN total utilizando el kit Superscriptll de Invitrogen. Se siguieron exactamente los protocolos del kit, utilizando hasta 5 |ig de ARN total de las mini prep de Qianeasy. Brevemente, el ARN, 1 |il de cebadores aleatorios y 1 |il de mezcla de dNTP se llevaron hasta 12 |il con agua destilada estéril libre de ARNasa, y se incubaron a 65 °C durante 5 minutos. La mezcla se puso en hielo durante al menos 1 minuto. Después, se añadieron 4 |il de amortiguador de reacción 5 x, 2 |il de DTT 0,1 M, y 1 |il de RNasaOUT, y la mezcla se incubó a 25 °C durante 2 minutos en un termociclador MJ Research. El termociclador se detuvo de manera que se pudo añadir 1 |il de enzima Superscriptll, y entonces se volvió a poner en marcha durante 10 minutos adicionales a 25 °C antes de cambiar a 55 °C durante 50 minutos. La reacción se inactivó con calor calentándola hasta 70 °C durante 15 min, y el ARN se eliminó por adición de 1 |il de ARNasa H e incubando a 37 °C durante 20 minutos.
Reacciones de PCR degenerada
El procedimiento para la primera ronda de reacción de PCR degenerada en el ADNc obtenido a partir de células de hibridoma se basó en los métodos descritos en Wang et al. (2000; J Immunol Methods.; 233(1-2):167-77) y Co et al. (1992; J Immunol.; 148(4):1149-54). Los cebadores para esta ronda (Tabla 2) contienen sitios de restricción para facilitar la clonación en los plásmidos pBluescriptlI.
Los componentes de la reacción de PCR (Tabla 3) se mezclaron en hielo en tubos de PCR de paredes finas, y después se transfirieron a un termociclador MJ research precalentado y detenido a 94 °C. Las reacciones se realizaron utilizando un programa obtenido de Wang et al. (2000; J Immunol Methods.; 233(1-2):167-77), como sigue:
Nombre: Wang45
1)
94°C 3:00 min
2)
94°C 0:15 seg
3)
45°C 1:00 min
4)
72°C 2:00 min
5)
Ir a 2 29 veces
6)
72°C 6:00 min
7)
4°C hasta el final
8)
final
Las mezclas de la reacción de PCR se llevaron entonces a un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1%, las bandas de 300 a 400 pb se escindieron, se purificaron utilizando mini columnas de ADN de Zymo, y se mandaron a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Agencourt Biosciences para la secuenciación. Los cebadores de PCR 5' y 3' respectivos se utilizaron como cebadores de secuenciación para generar los ADNc de la región variable de 37.1F5 a partir de ambas direcciones.
Clonación de la secuencia del extremo 5'
Debido a que los cebadores degenerados utilizados para clonar las secuencias de ADNc de la región variable de la cadena ligera y pesada de 37.1F5 alteran las secuencias del extremo 5', se necesitaron trabajos de secuenciación adicionales para descifrar las secuencias completas. La secuencia de ADNc preliminar obtenida mediante los métodos descritos anteriormente se utilizó para buscar en el sitio NCBI IgBlast (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/iqblast/) las secuencias de la línea germinal murina de las que se deriva la secuencia de 37.1 F5. Se diseñaron cebadores de PCR (Tabla 4) para hibridar con la secuencia líder del anticuerpo murino, de manera que una nueva reacción de PCR pudiera proporcionar el ADNc completo de la región variable, sin alteraciones debidas a los cebadores de PCR. Las reacciones de PCR, las purificaciones de las bandas y la secuenciación se realizaron como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de la línea germinal de las que probablemente derivan la cadena ligera y la cadena pesada de mu37.1F5 son accesibles con los números de registro de Genbank MUSIGKVR3 y AF303839, respectivamente.
Análisis peptídico para la confirmación de la secuencia
La información de la secuencia de ADNc de la región variable se combinó con la secuencia de la región constante de la línea germinal para obtener secuencias de ADNc del anticuerpo de longitud completa. Los pesos moleculares de la cadena pesada y de la cadena ligera se calcularon entonces y se compararon con los pesos moleculares obtenidos mediante análisis de LC/MS del anticuerpo murino 37.1F5.
La Tabla 5 proporciona la masa calculada de las secuencias de ADNc de LC y HC de 37.1F5, junto con los valores determinados mediante LC/MS. Las determinaciones del peso molecular son consistentes con las secuencias de ADNc tanto de la cadena ligera como pesada de 37.1 F5.
Se utilizó esencialmente el mismo método para clonar las cadenas ligera y pesada de 37.3D7 y 53.2H11. Los números de registro de Genbank de las secuencias de la línea germinal de las que probablemente derivan la cadena ligera y la cadena pesada de 37.3D7 son, respectivamente, MMU231217 y AF303868. Para 53.2H11, son respectivamente MMU231196 y AF303833; para EphA2-N1, K02161 y J00488 respectivamente; y para EphA2-N2, AJ231222 y J00488 respectivamente.
Ejemplo 10
Inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan EphA2 por 37.3D7-SPDB-DM4 humanizado y 53.2H11-SPDB-DM4 humanizado
Los anticuerpos 37.3D7 humanizado y 53.2H11 humanizado se conjugaron con L-DM4 N2 desacetil-N2 (4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina utilizando el conector SPDB (éster de N-hidroxisuccinimda del ácido 4-[2-piridilditio]butanoico). Brevemente, el anticuerpo se modificó a 8 mg/ml con un exceso molar de 5,5 o 6,5 veces de SPDB para hu53.2H11 y hu37.3D7 respectivamente. La reacción se llevó a cabo en el Amortiguador A (50 mM KPi/50 mM NaCI/2 mM EDTA, pH 6,5, 95% v/v) con EtOH (5% v/v) durante 90 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo modificado se purificó entonces mediante una columna desaladora SephadexG25 con el Amortiguador A. Después, el anticuerpo modificado se hizo reaccionar con un exceso molar de 1,7 veces de DM4 sobre el conector SPDB. La reacción se llevó a cabo a 2,5 mg/ml del anticuerpo en el Amortiguador A (97% v/v) y DMA (dimetilacetamida, 3% v/v) a temperatura ambiente durante 20 horas. El conjugado se purificó mediante una columna desaladora SephadexG25 con 10 mM Histidina, 130 mM Glicina, 5% de sacarosa, pH 5,5. La relación del fármaco al anticuerpo fue 4,0 para hu37.3D7-SPDB-DM4 y 3,1 para hu53.2H11-SPDB-DM4.
Los efectos de hu37.3D7-SPDB-DM4 y hu53.2H11-SPDB-DM4 sobre el crecimiento de células tumorales que expresan EphA2 se ensayó en primer lugar utilizando el ensayo de proliferación celular in vitro WST-8 ((2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) (n° de catálogo CK04-11, Dojindo Molecular Technogies, Inc). Se analizaron numerosas líneas celulares tumorales. Se sembraron aproximadamente 2000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en medio regular (como sugiere la ATCC para cada línea celular) con 10% de suero en presencia de diferentes concentraciones de hu37.3D7-SPDB-DM4 o hu53.2H11-SPDB-DM4. Se dejó que las células crecieran durante 5 días. Se añadió una disolución de WST-8 [20 |il de disolución], y las células se volvieron a poner en el incubador durante 2-3 h. La absorbancia de la placa se determinó a 450 nm y 650 nm. En los experimentos se utilizaron dos grupos de control. 0% de supervivencia es el control sólo con el medio. 100% de supervivencia es el control sólo con las células. Para el análisis de los datos, en primer lugar se restaron los valores de A650 nm (longitud de onda de referencia) de los valores de A450 nm correspondientes. Después, los valores de A450 nm de cada muestra se normalizaron restando de los valores de A450 nm el control de fondo (sólo medio). Las fracciones supervivientes se calcularon mediante los valores de A450 normalizados de las muestras divididos entre los valores de A450 normalizados de los controles sólo con células (100% de supervivencia-0% de supervivencia). Los valores de log [Ab-DM4] se representaron en el eje de las x, y las fracciones supervivientes se representaron en el eje y.
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30
Hu37.3D7-SPDB-DM4 y hu53.2H11-SPDB-DM4 inhibieron significativamente el crecimiento de células tumorales humanas que expresan EphA2, incluyendo células de tumor de próstata PC3, células de tumor de mama MDA-MDA-MB-231, células de melanoma WM-115, células de melanoma A375, y células de tumor de colon LoVo. Como ejemplo, se muestran los hallazgos con las células de tumor de próstata PC3. El hu37.3D7-SPDB-DM4 o hu53.2H11-SPDB-DM4 inhibió fuertemente el crecimiento de las células PC3 de una manera dependiente de la dosis, con un valor de Cl50 similar de 0,02 nM (FIG. 15A y 15B). La potencia de los conjugados estuvo correlacionada con los niveles de expresión de EphA2. Se requirió una concentración 50 veces mayor de hu37.3D7-SPDB-DM4 o hu53.2H11-SPDB-DM4 para inhibir el crecimiento de las células SK-Mel28 (valores de CI50: 1,3 nM y >5 nM, respectivamente; FIG. 15A y 15B), que expresaron un nivel casi indetectable de EphA2 en la superficie celular (determinado mediante datos de FACS no mostrados) (FIG. 15A y 15B). Por lo tanto, los resultados de los ensayos de inhibición del crecimiento in vitro demostraron la capacidad de los conjugados de anticuerpo antagonista anti-EphA2 para inhibir específicamente el crecimiento de líneas celulares tumorales que expresan EphA2.
Se analizaron los efectos de hu37.3D7~SPDB-DM4 y hu53.2H11-SPDB-DM4 sobre el crecimiento de xenoinjertos tumorales que expresan EphA2. Se muestra como ejemplo un estudio utilizando el modelo de xenoinjerto de tumor de mama MDA-MB-231. Los xenoinjertos de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se establecieron en ratones SCID hembra CB17 de 5 semanas de edad mediante inyección subcutánea de 1 x 107 células MDA-MB-231. Cuando los xenoinjertos de tumores MDA-MB-231 estaban establecidos (tamaño promedio de 83 mm3), los ratones se trataron con una única inyección i.v. de hu3D7-SPDB-DM4 o hu2H11-SPDB-DM4 o PBS. Las dosis de los anticuerpos fueron 15 mg/kg de peso corporal del ratón, 7,5 mg/kg de peso corporal del ratón y 3,25 mg/kg de peso corporal del ratón. Los crecimientos de los tumores MDA-MB-231 se inhibieron completamente por los conjugados de anticuerpo hu3D7-SPDB-DM4 o hu2H11-SPDB-DM4 a todas las concentraciones ensayadas, excepto a 3,25 mg/kg de hu2H11-SPDB-DM4, lo que muestra el retraso marcado del crecimiento de las células tumorales con respecto al control de PBS (FIG. 16A y 16B). Los volúmenes medianos de los tumores en cada grupo (6 ratones por grupo) se muestran en las FIG. 16A y B. En resumen, tanto hu3D7-SPDB-DM4 como hu2H11-SPDB-DM4 tienen in vivo potentes actividades inhibidoras del crecimiento de tumores que expresan EphA2. No se observaron toxicidades de ninguno de los conjugados de anticuerpo, en base a las determinaciones del peso corporal.
TABLAS
Tabla 1A:
Los restos de superficie del marco de la cadena ligera de mu37.3D7 y los restos correspondientes en la misma posición de Kabat en el anticuerpo humano 28E4. Los restos que son diferentes, y que por lo tanto están cambiados en el anticuerpo hu37.3D7, están en recuadros sombreados.
Restos Superficiales del Marco de la Cadena Ligera de mu37.3D7 y Restos Correspondientes en el Anticuerpo Humano 28e4
Posición de Kabat
mu37.3D7 28E4
1
Q E
3
V V
5
T T
9
A A
10
I T
15
L P
18
R R
40
P P
41
G G
57
G G
60
A A
67
S S
80
S S
81
E E
100
S G
107
K K
108
R R
Tabla 1B:
Los restos de superficie del marco de la cadena pesada de mu37.3D7 y los restos correspondientes en la misma posición de Kabat en el anticuerpo humano 28E4. Los restos que son diferentes, y que por lo tanto están cambiados en el anticuerpo hu37.3D7, están en recuadros sombreados. Los restos con asterisco (*) están retromutados al resto de 5 mu37.3D7 en una o más variantes de hu37.3D7.
Restos Superficiales del Marco de la Cadena Pesada de mu37.3D7 y Restos Correspondientes en el Anticuerpo Humano 28e4
Posición de Kabat
mu37.3D7 28e4
1
Q Q
3
Q Q
5
Q V
9
S A
11
L V
13
R K
14
P P
15
G G
19
Q K
23
K K
* 00 C\l
S* N*
41
P P
42
G G
43
Q Q
61
E Q
62
K K
64
M Q
65
N G
73
T T
74*
Y* S*
75
S T
82B
S S
84
S S
85
E E
105
Q Q
112
S S
Tabla 2:
Los cebadores utilizados para las reacciones de PCR degenerada se basan en los que aparecen en Wang et al., 2000, excepto HindKL (SEQ ID NO: 58), que se basa en Co et al. 1992. Las bases mixtas se definen como sigue: H=A+T+C, S=g+C, Y=C+T, K= G+T, M=A+C, R=A+g,
W=A+T, V = A+C+G.
Cebador
Secuencia
BamIgG1 (SEQ ID NO: 53)
GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC
IgG2Abam (SEQ ID NO: 54)
GGAGGATCCCTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA
EcoMH1 (SEQ ID NO: 55)
CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC
EcoMH2 (SEQ ID NO: 56)
CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG
SaclMK (SEQ ID NO: 57)
GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA
HindKL (SEQ ID NO: 58)
T AT AG AGCT CAAGCTTGG ATGGT GGG AAG ATGG AT ACAGTT G GTGC
Tabla 3:
Las mezclas de la reacción de PCR de la cadena ligera y pesada para la clonación de las secuencias de ADNc de la región variable de 37.1 F5
Mezcla de Reacción de la Cadena Ligera
Mezcla de Reacción de la Cadena Pesada
5 ul de amortiguador de reacción de PCR 10 X (Roche)
5 ul de amortiguador de reacción de PCR 10 X (Roche)
4 ul de mezcla de dNTP 10mM (2,5 mM cada uno)
4 ul de mezcla de dNTP 10 mM (2,5mM cada uno)
2 ul de Molde (reacción de RT)
2 ul de Molde (reacción de RT)
5 ul de cebador izquierdo Sac1MK 10 uM
2,5 ul de cebador izquierdo EcoMH1 10 uM
5 ul de cebador derecho HindKL 10 uM
2,5 ul de cebador izquierdo EcoMH2 10 uM
5 ul de DMSO
5 ul de cebador derecho BamlgG1 10 uM
0,5 ul de Taq Polimerasa (Roche)
5 ul de DMSO
23,5 ul de H2O destilada estéril
0,5 ul de Taq Polimerasa (Roche)
23,5 ul de H2O destilada estéril
50 ul Total
50 ul Total
5
Tabla 4:
Los cebadores de la secuencia líder murina del extremo 5' utilizados para de reacciones de PCR de la segunda ronda de 37.1F5. Los cebadores del extremo 3' son idénticos a los utilizados en las reacciones de la primera ronda, ya que ceban las secuencias respectivas de la región constante.
Cebador Secuencia
Cadena ligera 38SB13 LC Líder (SEQ ID NO: 59) GACAGACACACTCCTGCTATGGG
Cadena pesada 5F85 HC Líder (SEQ ID NO: 60) GCAGAATTCATGGGATGGAGCYGGATCTTTCT
Tabla 5:
Los pesos moleculares del ADNc calculados y determinados por LC/MS de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo murino 37.1 F5.
Cadena ligera Cadena pesada
ADNc LC/MS Diferencia ADNc LC/MS Diferencia
37.1F5
24031 Da 24029 Da 2 Da 49316 Da 49333 Da 17 Da
5
5
10
15
20
25
30
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> SANOFI-AVENTIS
<120> Anticuerpo antagonista para el tratamiento de cáncer
<130> FR2006030 PCT
<150> EP 06291160,7
<151> 2006-07-18
<160> 80
<170> PatentIn version 3,3
<210> 1
<211>5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 1
Ser Tyr Trp Met His 1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 2
Asn lie Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Met 15 10 15
Asn
<210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 3
Trp Gly Leu val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 4
Thr Val ser ser Ser Val Asn Ser Ser Tyr Leu His 15 10
<210> 5
5
10
15
20
25
30
<212> PRT <213> Mus sp.
<400>5
Ser Thr ser Asn Leu Pro Ser 1 5
<210>6
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 6
His Gln Tyr His Arg ser pro Gln Phe Thr
1 5 10
<210>7
<211>5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 7
Gly Tyr Thr Met Asn 1 5
<210>8
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 8
Leu lie Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Lys Phe Lys
15 10 15
Gly
<210>9 <211>9 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 9
Trp Gly Asp Tyr Gly ser Phe Ala Tyr 1 5
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 10
5
10
15
20
25
30
Arg Ala Ser Glu ser val Asp Thr Phe Gly Tyr Ser Phe lie Tyr 15 10 15
<210> 11
<211>7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 11
Arg Ala Ser Asn Leu Glu ser 1 5
<210> 12
<211>9 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 12
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr
1 5
<210> 13 <211>5 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 13
Ala Tyr Tyr Met His 1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 14
Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Glu 15 10 15
Asp
<210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 15
Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp val 1 5 10
5
10
15
20
25
<211> 16 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 16
Lys ser Ser Gln ser Leu lie His ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 15 10 15
<210> 17
<211>7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 17
Leu Val Ser Arg Leu Asp ser 1 5
<210> 18
<211>9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 18
Trp Gln Gly ser His Phe Pro Arg Thr 1 5
<210> 19
<211> 363
<212> ADN
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<400> 19
5
cag
Gln
1
tea
ser
tgg T rp
99a
Gly
atg
Met
65
atg
Met
gca
Ala
caa
Gln
gtc
caa ctg caa caa cct ggg tet gaa ctg gtg agg cct gga gct
val
Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu val Arg Pro Gly Ala
5 10 15
gtg
cag ctg tcc tgt aag gct tet ggc tac tea ttc acc age tac
val
Gln Leu Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr ser Phe Thr ser Tyr
20 25 30
atg
cae tgg gtg aga cag agg cct gga caa ggc ctt caa tgg att
Met
His Trp val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp lie
35 40 45
aat
att tat cct ggt act ggt aat act aat tac gat gag aaa ttc
Asn
lie Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50
55 60
aac
aag gee aca ctg act gta gac aca tat tcc age aca acc tac
Asn
tys Ala Thr Leu Thr val Asp Thr Tyr ser ser Thr Thr Tyr
70 75 80
cag
etc age age ctg aca tet gag gac tet gcg gtc tat tac tgt
Gln
Leu Ser ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys
85 90 95
aga
tgg ggg tta gta cgg tat ttc ttt gca atg gac tac tgg ggt
Arg
T rp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100
105 110
gga
acc tea gtc acc gtc tcc tea
Gly
Thr Ser val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus sp. <400> 20
Gln
val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu val Arg Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser
val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp
Met Hi s Trp val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp lie
35 40 45
Gly
Asn lie Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Met
Asn Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Thr Tyr Ser Ser Thr Thr Tyr
65
70 75 80
Met
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr cys
85 90 95
Ala
Arg Trp Gly Leu val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr ser val Thr val ser Ser , 115 120
<210> 21 <211> 354 <212> ADN
96
144
192
240
288
336
363
10
<213> Mus sp. <220>
<221> CDS <222> (1)..(354) <400> 21
gag Glu 1
gtc val cag Gln ctg Leu caa Gln 5 cag Gln tet Ser gga Gly
tea ser
atg Met aag Lys att lie 20 tcc Ser tgc cys agg Arg gct Ala
acc Thr
atg Met aac Asn 35 tgg Trp gtg Val agg Arg cag Gln age Ser 40
gga Gly
ctt Leu 50 att lie aat Asn cct Pro cae Hi s aat Asn 55 ggt Gly
aag Lys 65
ggc Gly aag Lys gee Ala aca Thr tta Leu 70 act Thr gta val
atg Met
gag Glu etc Leu etc Leu agt Ser 85 ctg Leu aca Thr tet Ser
gta val
aga Arg tgg Trp ggt Gly 100 gac Asp tac Tyr ggc Gly tet Ser
ctg Leu
gtc val act Thr 115 gtc val tet Ser gca Ala
<210> 22
cct
gag ctg gtg aag cct gga gct
Pro
Glu Leu val Lys Pro Gly Ala
10 15
tet
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25
30
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75 80
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Glu
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90 95
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
105
110
48
96
144
192
240
288
336
354
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 22
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35 40
Gly
Leu lie Asn Pro Hi s Asn
Gly
50
55
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65
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10 15
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25
30
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45
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75 80
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15
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<220>
<221> CDS
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15 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<211> 119
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<213> Mus sp.
<400> 24
48
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144
192
240
288
336
357
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val Gln Leu Gln Gln ser Gly Pro Glu Leu val Lys Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser
val Lys lie Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50
55 60
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65 70 75 80

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85 90 95

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<221> CDS
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<400> 25
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1 5
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65 70
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10 15

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25 30

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5
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Thr lie Glu

65 70 75 80
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85 90 95

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<400> 27
5
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15
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5
10
15
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20
25
30
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35
40
45
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50
55
60
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90
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105
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1
5
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20 25
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35
40
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144
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288
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Arg
Arg
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<210> 29 <211> 339 <212> ADN <213> Mus sp. <220>
<221> CDS
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Leu
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59
55
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70
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85
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100 105
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5
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1
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val
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5 10
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20 25 30
gga
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Gly
35 40 45
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50
55 60
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Arg
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70 75
aga
gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg
Arg
val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr cys Trp
85 90
cat
ttt cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa
Hi s
Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
gat
Asp
cea
pro
gac
Asp
65
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Ser
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Ser
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<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 30
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10
15
40
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Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 45
48
96
144
192
240
288
336
339
Pro
Lys Arg Leu lie Tyr Leu val Ser
50 55
Asp
Arg Phe Thr Gly Ser Gly ser Gly
65
70
Ser
Arg Val Glu Al a Glu Asp Leu Gly
85
Ser
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100 105
Arg Leu Asp ser Gly val Pro 60
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5
10
15
20
25
30
35
<212>ADN <213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <220>
<221> CDS <222> (1)..(363)
<220>
<221> fuente <222> (1)..(90)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (106)..(147)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (148)..(192)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (193)..(294)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (295)..(330)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (331)..(363)
5
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30
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31 i
60
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65
70
75
80
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85
90
95
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105
110
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115
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<223> construcción sintética <400> 32
120
Gln
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1
5
Ser
val Lys Leu Ser cys Lys Ala
Ser
20 25
Trp
Met Hi S Trp val Arg Gln Arg Pro
35 40
Gly
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50
55
Gln
Gly Lys Ala Thr Leu Thr val Asp
65
70
Met
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85
Ala
Arg Trp Gly Leu val Arg Tyr Phe
100 105
Gln
Gly Thr Ser val Thr val Ser Ser
115 120
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Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr 30
Gly Gln Gly Leu Gln Trp lie 45
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Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 75 80
Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys 90 95
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<210> 33
96
144
192
240
288
336
363
5
10
15
20
25
30
35
<211> 363 <212>ADN <213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <220>
<221> CDS <222> (1)..(363)
<220>
<221> fuente <222> (1)..(90)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (106)..(147)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (148)..(192)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (193)..(294)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (295)..(330)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (331)..(363)
5
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5 10
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20
25
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35
40
ate
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lie
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55
aag
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Lys
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70
ctg
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Leu
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85 90
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Trp
Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe
100
105
aca
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ser val Thr Val Ser Ser
115
120
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gca atg gat tat tgg gqt Ala Met Asp Tyr Trp Gly 110
<210> 34 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Construcción sintética <400> 34
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Ser Val
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Gly Asn 50
Gln Gly 65
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Gln Gly
Gln
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Lys
Leu 20 Ser cys
Lys
Hi s 35
Trp val Arg Gln
lie
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Lys
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Leu
Ser Ser 85 Leu Thr
Trp
Gly 100 Leu val Arg
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Gly Ala Glu Val val Lys Pro Gly Ala 10 15

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Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 60

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Ser Ser 120
96
144
192
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288
336
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5
10
15
20
25
30
35
<211> 363 <212>ADN <213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <220>
<221> CDS <222> (1)..(363)
<220>
<221> fuente <222> (1)..(90)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (106)..(147)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (148)..(192)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (193)..(294)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (295)..(330)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (331)..(363)
5
cag
gtq cag ctg gtg cag ccc ggg gct gag gtg gta aag cea gga gee
Gln
val Gln Leu val Gln Pro Gly Ala Glu val Val Lys Pro Gly Ala
1
5 10 15
agt
gtq aag ttg tcc tgc aag gee tcc ggg tac aat ttc acc tet tac
Ser
Val Lys Leu Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
tgg
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Trp
Met HÍS Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp lie
35 40 45
ggg
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Gly
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50 55 60
cag
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Gln
Gly Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Thr Tyr Thr Ser Thr Thr Tyr
65
70 75 80
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caa ctg age tea ctg acc tcc gag gac tea gee gtg tac tat tgc
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Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca
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Ala
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100 105 110
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ggg Gly acc Thr tet Ser gtc val acc Thr gtg val age ser agt Ser
115 120
<210> 36 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Construcción sintética <400> 36
Gln
1
Ser
Trp
Gly
Gln
65
val
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val
Lys Leu 20 Ser Cys Lys Ala
Met
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Gly
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70
Ala Glu val Val Lys Pro Gly Ala 10 15
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Asp Thr Tyr Thr Ser Thr Thr Tyr 75 80
Met
Ala
Gln
Gln
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
85
Arg
Trp Gly Leu val Arg Tyr Phe
100 105
Gly
Thr Ser val Thr val Ser Ser
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 110
96
144
192
240
288
336
363
<212> PRT <213> Artificial <220>
5 <223> Anticuerpo humanizado
<400> 37

Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Met Arg lie Ser cys Ala Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

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Gly Leu lie Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp Ser Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu val Thr Val Ser Ser 115
<210> 38 <211> 118 10 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <400> 38
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Met Arg lie Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
15 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Asn Leu Glu Trp lie
5
10
15
20
25

Gly Leu lie Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp Ser Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys

85 90 95

val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 39 <211> 357 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <220>
<221> CDS <222> (1)..(357)
<220>
<221> fuente <222> (1)..(90)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (106)..(147)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (148)..(195)
<223> Mus sp.
<222> (196)..(294) <223> homo sapiens <220>
5 <221> fuente
<222> (295)..(324) <223> Mus sp. <220>
<221> fuente
10 <222> (325)..(357)
<223> homo sapiens <400> 39

cag gtq caa ctg gtq caa tcc gqt gcc gag gtc gtc aaa ccc gqa gca 48
Gln val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

15 10 15

tct gtq aag ata tcc tgt aag gcc tcc gqc tac act ttt aca gcc tac 96
Ser val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

tat atg cat tgg gtt aaa cag agt ccc gtq cag tcc ctg gaa tgg ate 144

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp lie

35 40 45

gqc ttg gtq aac cct tat aac gqa ttc tea agt tac aat caa aag ttt 192
Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

cag gqc aag gct tcc ctg act gta gac aag age agt tcc aca gcc tac 240
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

atg gag etc cat tea ctg aca tea gaa gac age gcc gta tac tat tgc 288

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gca cgt gag ttc tac gqc tat aga tac ttt gac gtc tgg gqc caa gqc 336
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

aca gcc gtc aca gtq age tct 357
Thr Ala Val Thr val Ser Ser 115
15 <210> 40
<211> 119 <212> PRT
<213> Artificial <220>
20 <223> Construcción sintética
<400> 40

Gln val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Leu val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr val Asp Lys Ser ser ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp val Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 41 <211> 357 <212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223>, Anticuerpo humanizado <220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(357)
<220>
<221> fuente <222> (1)..(90)
<223> homo sapiens 15 <220>
<221> fuente <222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
20 <221> fuente
<222> (106)..(147)
<223> homo sapiens <220>
10
15
<222> (148)..(195) <223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (196)..(294) <223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (295)..(324) <223> Mus sp.
<220>
<221> fuente
<222> (325)..(357) <223> homo sapiens <400> 41
cag Gln 1
gtc val cag Gln ttg Leu gtq Val 5 cag Gln
agt ser
gíc val aaa Lys ate lie 20 age ser tgt cys
tat Tyr
atg Met cae Hi s 35 tgg Trp gtq val aag Lys
gqt Gly
etc Leu 50 gtc val aac Asn cct Pro tat Tyr
cag Gln 65
ggc Gly aaa Lys gee Ala age Ser ctg Leu 70
atg Met
gaa Glu ctg Leu cat Hi s tet ser 85 etc Leu
gct Ala
cgc Arg gag Gl u ttc Phe 100 tac Tyr gqt Gly
act Thr
gee Ala gtg val 115 aca Thr gta val age Ser
<210> 42
<211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Construcción sintética <400> 42
tet Ser
gga Gly gca Ala gag Glu 10 gtt val gtg val
aag Lys
gct Al a age Ser 25 gga Gly tac Tyr tcc Ser
cag Gln
age ser 40 cct pro gtt val cag Gln age Ser
aat Asn 55
gga Gly ttt Phe tet Ser tet Ser tat Tyr 60
aca Thr
gtg val gat Asp aag Lys agt Ser 75 age Ser
acc Thr
tet Ser gaa Glu gat Asp 90 agt Ser gca Ala
tat Tyr
cga Arg tat Tyr 105 ttc Phe gac Asp gtg val
agt Ser
aaa
cea ggc gca 48
Lys
Pro Gly Ala
15
ttt
aca gca tat 96
Phe
Thr Ala Tyr
30
ctg
gaa tgg ate 144
Leu
Glu Trp lie
45
aac
caa aag ttc 192
Asn
Gln Lys Phe
age
act gee tat 240
Ser
Thr Ala Tyr
80
gtg
tac tat tgt 288
val
Tyr Tyr Cys
95
tgg Trp
ggc Gly cag Gln ggt Gly 336
110
357
5
Gln
val Gln Leu val
1
5
Ser
val Lys lie
Ser
20
Tyr
Met His Trp val
35
Gly
Leu Val Asn Pro
50
Gln
Gly Lys Ala Ser
65
Met
Glu Leu Hi s Ser
85
Ala
Arg Glu Phe Tyr
100
Thr
Ala Val Thr val
115

Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 10 15

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 25 30

Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp lie 40 45

Tyr Asn Gly Phe ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 55 60

Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 70 75 80

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95

Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp val Trp Gly Gln Gly 105 110
Ser Ser 115
<210> 43 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <400> 43

Gln val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly Leu val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys

85 90 95
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp val Trp Gly Gln Gly

' 100 105 110
Thr Ala val Thr val Ser ser 115
<210> 44 <211> 357
5
10
15
20
25
30
35
<213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <220>
<221> CDS <222> (1)..(357)
<220>
<221> fuente <222> (1)..(90)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (91)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (106)..(147)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (148)..(195)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (196)..(294)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (295)..(324)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (325)..(357)
<223> homo sapiens <400> 44
5
cag
Gln
1
tcc
Ser
tat
Tyr
ggc
Gly
cag
Gln
gtt
caa ctg gtt cag agt ggg gca gaa gtc gta aag ccc gga gct
val
Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val val Lys Pro Gly Ala
5 10 15
gtt
aag att age tgt aaa gee tcc ggc tat age ttt aca gct tac
val
Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr ser Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
atg
cae tgg gtc aag caa tet cct ggg cag age ctg gag tgg ate
Met
His Trp val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp lie
35 40 45
ctg
gtc aat cea tac aat ggc ttc tet agt tac aac caa aaa ttt
Leu
Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50
55 60
gga
aaa gee tcc ctt aca gta gac aag tea tet tcc act gee tac
Gly
Lys Ala Ser Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80
atg gáa ctt cae tcc ctt aca age gag gat age gee gtt tat tat tgt

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys

85 90 95
gee aga gaa ttt tac gga tat cgg tat ttc gat gtc tgg ggg cag ggg
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp val Trp Gly Gln Gly

100 105 110
act gee gtg ace gtc agt tet Thr Ala Val Thr val Ser Ser 115
48
96
144
192
240
288
336
357
<210> 45 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Construcción sintética <400> 45
Gln
val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val val Lys Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser
Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr
Met Hi S Trp val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly
Leu val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50
55 60
Gln
Gly Lys Ala Ser Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Glu Leu Hi s Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala
Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr
Ala val Thr Val Ser Ser
115
5
10
15
20
25
30
35
<211> 330 <212>ADN <213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <220>
<221> CDS <222> (1)..(330)
<220>
<221> fuente <222> (1)..(71)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (72)..(105)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (106)..(150)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (151)..(171)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (172)..(269)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (270)..(299)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (300)..(330)
<400> 46
5
10
gag
ate gtt etc aca cag tea cea gee acc atg age gee tet ccc ggg
Glu
lie val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly
1
5 10 15
gaa
cga gtg ace atg act tgt aca gta tcc tcc tet gtg aac tet tet
Glu
Arg val Thr Met Thr cys Thr. val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser
20 25 30
tac
ctg cat tgg tac cag cag aag cct ggt tcc age ccc aaa etc tgg
Tyr
Leu His Trp Tyr Gl n Gln Lys Pro Gly ser Ser Pro Lys Leu T rp
35 40 45
ate
tac agt aca age aat ctg ccc tea ggc gtt ccc gct agg ttc tcc
lie
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
ggt
tea ggt tet ggc act agt tac tet ctg acc ate age acc ate gaa
Gly
ser Gly Ser Gly Thr ser Tyr Ser Leu Thr lie ser Thr lie Gl u
65
70 75 80
tcc
gaa gat gct gca aca tac tac tgt cae cag tat cae agg tcc ccc
Ser
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr cys His Gln Tyr Hi s Arg Ser Pro
85 90 95
cag
ttt aca ttc ggt ggc ggc acc aaa ctt gag att aag cgt
Gln
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg
100 105 110
<210> 47 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Construcción sintética <400> 47
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
96
144
192
240
288
330
Glu Arg val Thr Met Thr cys Thr val ser ser ser val Asn ser ser 20 25 30
Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 45
Gly val Pro Ala Arg Phe ser 60
Tyr
L,eu Hi s Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
35 40
lie
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser
50 55
Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
65
70
Ser
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr cys
85
Gln
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100 105
Leu Thr lie Ser Thr lie Glu 75 80
His Gln Tyr His Arg Ser Pro 90 95
Leu Glu lie Lys Arg 110
<210> 48 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial
5
10
<223> Anticuerpo humanizado <400> 48
Asp lie val Leu Thr Gln Ser 1 5
Glu Arg Ala Thr lie Ser Cys 20
Gly Tyr Ser Phe lie Tyr Trp 35
Arg Leu Leu lie Tyr Arg Ala 50 55
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70
Pro val Glu Ala Glu Asp Val 85
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly 100
<210> 49 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <400> 49
Asp lie val Leu Thr Gln Ser 1 5
Glu Arg Ala Thr lie Ser Cys 20
Pro
Asp Ser Leu Ala val Ser Leu Gly
10 15
Arg
Ala Ser Glu Ser val Asp Thr Phe
25
30
Tyr
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
40
45
Ser
Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Asp
60
Arg
Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn
75 80
Ala
Thr Tyr Tyr cys Gln Gln Ser Asn
90 95
Gly
Gly
Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg
105
110
Pro
Q. 1/) < Ser 10 Leu Ala val Ser Leu 15 Gly
Arg
Ala 25 Ser Glu Ser val Asp 30 Thr Phe
Gly Tyr ser Phe lie Tyr Trp 35
Arg Leu Leu lie Tyr Arg Ala 50 55
Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser 65 70
Pro val Glu Ala Glu Asp Val 85
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly 100
Tyr
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
40
45
Ser
Asn Leu Gl U Ser Gly lie Pro Ala
60
Arg
Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn
75 80
Ala
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
90 95
Gly
Gly
Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg
105 110
<210> 50 <211> 112
5
10
15
20
25
<213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <400> 50
Asp
lie val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala val Ser Leu Gly
1
5 10 15
Glu
Arg Ala Thr lie Ser cys Arg Ala Ser Glu Ser val Asp Thr Phe
20 25 30
Gly
Tyr ser Phe lie Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg
Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Asp
50
55 60
Arg
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn
65
70 75 80
Pro
val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu
Asp pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg
100 105 110
<210> 51 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Anticuerpo humanizado <220>
<221> CDS <222> (1)..(339)
<220>
<221> fuente <222> (1)..(69)
<223> homo sapiens <220>
<221> fuente <222> (70)..(117)
<223> Mus sp.
<220>
<222> (118)..(162) <223> homo sapiens <220>
<221> fuente 5 <222> (163)..(183)
<223> Mus sp.
<220>
<221> fuente <222> (184)..(279)
10 <223> homo sapiens
<220>
<221> fuente <222> (280)..(306) <223> Mus sp.
15 <220>
<221> fuente
<222> (307)..(339)
<223> homo sapiens <400> 51

gac gtc gtg atg aca caa acc cct ctg tcc ctg age gtc act ctg gga 48
Asp Val val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser val Thr Leu Gly

15 10 15

caa ccc gct tcc att age tgc aaa tea tea caa tet etc ate cae tea 96
Gln Pro Ala ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu lie His Ser

20 25 30

gac ggc aaa aca tac etc aat tgg ctg ctg cag aga cea gga cag tcc 144
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

cct aaa agg ctt ate tac ctg gtc tet cgt ttg gac tet ggt gta cea 192
Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly val Pro

50 55 60

gac cgg ttt act ggt tcc ggg gee gga acc gat ttc act ctg aag att 240

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie

65 70 75 80

tcc agg gtg gaa gct gaa gat etc gga gtg tat tat tgc tgg cag ggc 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

age cat ttc ccc cgt act ttt ggt ggg ggt acc aaa ttg gaa att aag 336

Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys

100 105 110

cgt 339
20 Ar9
<210> 52
<211> 113
<212> PRT <213> Artificial
<223> Construcción sintética <400> 52
Asp val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly

i 5 10 15
Gln Pro Ala ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu lie His Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45

Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie

65 70 75 80
Ser Arg val Glu Ala Glu Asp Leu Gly val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys

100 105 110

5 Ar9 .
<210> 53 <211> 36 <212> ADN <213> Mus sp.
10 <400> 53
ggaggatcca tagacagatg ggggtgtcgt tttggc 36 <210> 54 <211> 32 <212> ADN 15 <213> Mus sp.
<400> 54
ggaggatccc ttgaccaggc atcctagagt ca 32 <210> 55 <211> 32
20 <212> ADN
<213> Mus sp.
<220>
<221> característica diversa <222> (1)..(32)
5
10
15
20
25
30
35
<223> las bases mixtas se definen como sigue: H=A+T+C, S=G+C, Y=C+T, K= G+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T, V = A+C+G, N = A+C+G+T
<400> 55
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tc 32
<210> 56
<211> 35
<212>ADN
<213> Mus sp.
<220>
<221> característica diversa <222> (18)..(18)
<223> n es a, c, g, o t <400> 56
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg 35
<210> 57
<211> 31
<212> ADN
<213> Mus sp.
<220>
<221> característica diversa <222> (1)..(31)
<223> mixed bases are defined as follows: H=A+T+C, S=G+C, Y=C+T, K= G+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T, V = A+C+G, N = A+C+G+T
<400> 57
ggagctcgay attgtgmtsa cmcarwctmc a 31
<210> 58
<211> 46
<212> ADN
<213> Mus sp.
<400> 58
tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc 46
<210> 59
<211> 23
<212> ADN
<213> Mus sp.
<400> 59
gacagacaca ctcctgctat ggg 23
5
10
15
20
25
30
35
<210> 60
<211> 32 <212> ADN <213> Mus sp.
<220>
<221> característica diversa <222> (1)..(32)
<223> las bases mixtas se definen como sigue: H=A+T+C, S=G+C, Y=C+T, K= G+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T, V = A+C+G, N = A+C+G+T
<400> 60
gcagaattca tgggatggag cyggatcttt ct 32 <210> 61 <211>5 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 61
Glu Tyr Asn Met His 1 5
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 62
Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe Lys 15 10 15
Asn
<210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 63
Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr 15 10
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 64
5
10
15
20
25
30
Arg Ala ser Glu Ser val Asp Thr Tyr Gly Asn ser Phe Met His
15 10 15
<210> 65 <211>7 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 65
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<210> 66
<211>9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 66
Gln Gln ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 1 5
<210> 67
<211>5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 67
Asp Tyr Asn Met His 1 5
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 68
imagen18
<210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 69
Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Tyr 15 10
<210> 70
5
10
15
20
25
<213> Mus sp.
<400> 70
Ser Ala ser ser Ser val ser Tyr Met Tyr 15 10
<210> 71
<211>7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 71
lie Thr ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<210> 72
<211>9
<212> PRT
<213> Mus sp. <400> 72
Gln Gln Trp ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5
<210> 73
<211> 360
<212> ADN
<213> Mus sp. <220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 73
gag
Glu
1
tea
ser
aat
Asn
gga
Gly
aag
Lys
65
atg
Met
gtc
cag ctt cag cag tea gga cct gac ctg gtg aaa cct ggg gee
Val
Gln Leu Gln Gl n Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
5 10 15
gtg
aag ata tcc tgc aag gct tet gga tac aga ttc act gaa tac
val
Lys lie Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Arg Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
atg
cae tgg atg aag cag age cat gga gag age ctt gag tgg att
Met
Hi S Trp Met Lys Gln ser His Gly Gl u Ser Leu Glu Trp lie
35 40 45
tat
att tat cct tac aat ggt gat act ggc tac agg cag aaa ttc
Tyr
lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe
50
55 60
aac
atg gee aca ttg act gca gac att tcc tcc aat aca gee tac
Asn
Met Al a Thr Leu Thr Ala Asp lie Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
70 75 80
gaa
etc cgc age ctg aca tet gac gac tet gca gtc tat ttc tgt
Glu
Leu Arg Ser Leu Thr ser Asp Asp Ser Ala val Tyr Phe Cys
85 90 95
48
96
144
192
240
10

gca aga tgg ggc tac ggt agt ggc ggg ggg ttt act tac tgg ggc caa 336
Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

ggg act ctg gtc act gtc tct gca 360
Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ala

115 120
<210> 74
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus sp. <400> 74

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Arg Phe Thr Glu Tyr 20 25 30

Asn Met His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Asn Met Ala Thr Leu Thr Ala Asp lie Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 75
<211> 357
<212> ADN
<213> Mus sp. <220>
<221> CDS
<222> (1)..(357) <400> 75
5
gag
gtc cag ctt cag cag tea gga cct gag ctg gtg aaa cct ggg gee
Glu
Val Gln Leu Gln Gln ser Gly pro Glu Leu val Lys Pro Gly Ala
l
5 10 15
tea
gtg aag ata tcc tgc aag gct tet gga tac aca ttc act gac tac
Ser
Va? Lys lie Ser cys Lys Al a Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
aac
atg cae tgg gtg aaa cag age cat gga aag age ctt gag tgg att
Asn
Met His Trp Val Lys Gln Ser Hi s Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie
35 40 45
gga
ttt att tat cct tac aat ggt ggt act ggc tac aac cag agg ttc
Gly
Phe lie Tyr Pro Tyr Asn G?y G?y Thr G?y Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
aag
aac
aag
Lys
A?n
Lys
65
atg
gag gtc
Met
Glu Val
gca
agg gga
Ala
Arg Gly
acc
act etc
Thr
Thr
Leu 115
gee
aca ttg act gta gac act tcc tcc age aca gee tac
Ala
Thr Leu Thr val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
70 75 80
cgc
age ctg aca tet gag gac tet gca gtc tat ttc tgt
Arg
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Phe Cys
85
90 95
tat
tac tac ggt agg cae ttt gac tac tgg ggc caa ggc
Tyr
Tyr
Tyr
G?y Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100
105 110
aca
gtc tcc tea
Thr
Val Ser Ser
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus sp. <400> 76
Glu
val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
1
5
Ser
val Lys lie Ser Cys Lys Ala
20
Asn
Met Hi S Trp val Lys Gln Ser
35 40
Gly
Phe lie Tyr Pro Tyr Asn Gly
50
55
Lys
Asn Lys Ala Thr Leu Thr val
65
70
Met
Glu Val Arg Ser Leu Thr ser
85
Ala
Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg
100
Thr
Thr
Leu Thr Val Ser Ser
115
Pro Glu Leu val Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 25 30
His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 45
Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe 60

Asp Thr ser Ser Ser Thr Ala Tyr 75 80

Glu Asp Ser Ala val Tyr Phe Cys 90 95

His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 110
<210> 77
96
144
192
240
288
336
357
<211> 336
<213> Mus sp. <220>
10
<221> CDS <222> (1)..(336) <400> 77
gac att gtg ctg acc caa tct cea ggt
Asp lie Val Leu Thr Gln ser Pro Gly

1 5
cag agg gee acc ata tcc tgc aga gee
Gln Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala

20 25
ggc aat agt ttc atg cae tgg tac cag
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln

* 35 40
aga etc etc ate tat cgt gca tcc aac
Arg Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn

50 55
agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr

65 70

cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr
85
gag gat cct etc acg ttc ggt gct gqg
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly
100 105
<210> 78
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus sp. <400> 78
ASp
lie val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
1
5
Gln
Arg Ala Thr lie Ser cys Arg Ala
20 25
Gly
Asn Ser Phe Met HIS Trp Tyr Gln
35 40
Arg
Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn
50 55
Arg
Phe Ser Gly Ser Gly ser Arg Thr
65
70
Pro
val Glu Ala Asp Asp val Ala Thr
85
Glu
Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly
tct ttg gct gtg tct cta gqg Ser Leu Ala val Ser Leu Gly 10 15
agt gaa agt gtt gac act tat Ser Glu Ser val Asp Thr Tyr 30
cag aaa gca gga cag ccg ccc
Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro 45
cta gaa tct gag ate cct gee
Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala
60
gac ttc acc etc acc att aat
Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn
75 80
tat tac tgt cag caa agt aat
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
90 95
acc aag ctg gag ctg aaa cgg
Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
110
Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15
Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr 30
Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro 45
Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 60
Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn 75 80
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 90 95
Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 110
96
144
192
240
288
336
<212> ADN <213> Mus sp. <220>
5 <221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 79
caa att gtt etc acc cag tet cea gca
Gln lie val Leu Thr Gln ser Pro Ala

1 5
gag aag gtc acc atg acc tgc agt gee
Glu Lys val Thr Met Thr Cys Ser Ala

20 25

tac tgg tac cag cag aag cea aga tcc
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser

35 40
ate aca tcc aac ctg gct tet gga gtc

lie Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly val

50 55
ggg tet ggg acc tet tac tet etc aca
Gly Ser Gly Thr ser Tyr ser Leu Thr

65 70
gat gct gee act tat tac tgc cag cag
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85
ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie

100 105
10 <210> 80

etc atg tet gca tet cea ggg 48

Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 10 15

age tea agt gtg agt tac atg 96
Ser Ser Ser val Ser Tyr Met 30

tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr
45

cct gct cgc ttc agt ggc agt 192
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 60

ate age age atg gag gct gaa 240
lie ser ser Met Glu Ala Glu

75 80

tgg agt agt aac cea ccc acg 288

Trp ser ser Asn Pro Pro Thr 90 95

aaa cgg 321
Lys Arg
<211> 107 <212> PRT
<213> Mus sp. <400> 80

Claims (56)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    1. Un anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo que se une específicamente a un receptor EphA2, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es capaz de inhibir la unión de efrinaA1 a dicho receptor, y es capaz de inhibir la fosforilación de tirosina de EphA2 en presencia de efrinaA1,
    (i) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una
    cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 4, 5 y 6;
    (ii) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una
    cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 10, 11 y 12;
    (iii) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una
    cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 16, 17 y 18;
    (iv) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una
    cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 61, 62 y 63, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 64, 65 y 66;
    (v) en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una
    cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 67, 68 y 69, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos
    representadas por SEQ ID NOS: 70, 71 y 72; o
    (vi) en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es una versión humanizada o modificada en superficie de un anticuerpo murino o fragmento de éste que se une al epítopo, y en el que dicho anticuerpo murino o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 16, 17 y 18.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es un anticuerpo monoclonal.
  3. 3. Un anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es un fragmento Fab, Fab', F(ab')2 o Fv.
  4. 4. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es capaz de inhibir el crecimiento de una célula cancerosa.
  5. 5. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es capaz de inhibir la migración de una célula cancerosa.
  6. 6. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado por que dicha célula cancerosa es una célula de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en un cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, carcinoma de ovario, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, un sarcoma, un glioma, cáncer de cabeza y
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    cuello, cáncer gástrico, cáncer de hígado, y otros carcinomas.
  7. 7. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es capaz de inhibir la angiogénesis.
  8. 8. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo se une a EphA2 con una Kd de 3 x 10-10 M o menor.
  9. 9. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho receptor EphA2 es humano.
  10. 10. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 1,2 y 3, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 4, 5 y 6, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 26.
  11. 11. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 4, 5 y 6, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 20.
  12. 12. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 28.
  13. 13. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 22.
  14. 14. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 13, 14 y
  15. 15. y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 30.
  16. 15. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 14, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 13, 14 y
    15, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 24.
  17. 16. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 61,62 y 63, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 64, 65 y 66, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 78.
  18. 17. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 16, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 61,62 y 63, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 64, 65 y 66, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO:74.
  19. 18. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 67, 68 y 69, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 70, 71 y 72, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 80.
  20. 19. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 18, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 67, 68 y 69, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 70, 71 y 72, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO:76.
  21. 20. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es un anticuerpo murino o fragmento de éste que se une al epítopo, y es producido por un hibridoma denominado 37.307, en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7660; un hibridoma denominado 37.1F5, en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7661; un hibridoma denominado 53.2H11, en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7662; un hibridoma denominado EphA2-N1, en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTM-8407; o un hibridoma denominado EphA2-N2, en el que dicho hibridoma está depositado en la American Type Culture Collection con el número de registro PTM-8408.
  22. 21. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo es un anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o un fragmento de éste que se une al epítopo.
  23. 22. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según la reivindicación 21, caracterizado por que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 4, 5 y 6, y en el que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia representada por la SEQ ID NO: 47.
  24. 23. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según la reivindicación 21 o 22, caracterizado por que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 4, 5 y 6, y en el que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 32, 34 y 36.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
  25. 24. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según la reivindicación 21, caracterizado por que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, y en el que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 48, 49 y 50.
  26. 25. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según la reivindicación 21 o 24, caracterizado por que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, y en el que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 37 y 38.
  27. 26. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según la reivindicación 21, caracterizado por que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, es una versión humanizada o modificada en superficie de un anticuerpo murino o fragmento de éste que se une al epítopo, y en el que dicho anticuerpo murino o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, y en el que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 52.
  28. 27. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según la reivindicación 21 o 26, caracterizado por que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, es una versión humanizada o modificada en superficie de un anticuerpo murino o fragmento de éste que se une al epítopo, y en el que dicho anticuerpo murino o fragmento de éste que se une al epítopo comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, y en el que dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, y en el que dicho anticuerpo humanizado o modificado en superficie, o fragmento de éste que se une al epítopo, comprende una o más de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 40, 42, 43, y 45.
  29. 28. Un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1-27, enlazado a un agente citotóxico.
  30. 29. El conjugado de la reivindicación 28, caracterizado por que dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un maitansinoide, un fármaco pequeño, un derivado de tomaimicina, un derivado de leptomicina, un profármaco, un taxoide, CC-1065 y un análogo de CC-1065.
  31. 30. El conjugado de la reivindicación 28, caracterizado por que dicho agente citotóxico es la maitansina DM1 de fórmula:
    imagen1
  32. 31. El conjugado de la reivindicación 28, caracterizado por que dicho agente citotóxico es la maitansina DM4 de
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    fórmula:
    imagen2
  33. 32. El conjugado de la reivindicación 28, caracterizado por que dicho agente citotóxico es un derivado de tomaimicina seleccionado del grupo que consiste en:
    • 8,8’-[1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c]
    [1.4] benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[5-metoxi-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo [2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4] benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[1,4-butanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4] benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[3-metil-1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c]
    [1.4] benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[2,6-piridindiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4] benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[4-(3-terc-butoxicarbonilaminopropiloxi)-2,6-piridindiilbis-(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi- 1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[5-(3-aminopropiloxi)-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro -5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[5-(N-metil-3-tert-butoxicarbonilaminopropil)-1,3-bencenodiilbis-(metNenoxi)]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7- metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-{5-[3-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)propiloxi]-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)}-bis[(S)-2-et-(E)- iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[5-acetiltiometil-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H- pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • Éster terc-butílico del ácido
    bis-{2-[(S)-2-metilen-7-metoxi-5-oxo-1,3,,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-iloxi]-etil}- carbámico
    • 8,8’-[3-(2-acetiltioetil)-1,5-pentanodiilbis(oxi)]-bis[(S)-2-metilen-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo [2,1- c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[5-(N-4-mercapto-4,4-dimetilbutanoil)amino-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen- 1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[5-(N-4-metilditio-4,4-dimetilbutanoil)-amino-1,3-bencenodiilbis(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen- 1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8’-[5-(N-metil-N-(2-mercapto-2,2-dimetiletil)amino-1,3-bencenodiil(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen- 1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    • 8,8'-[5-(N-metil-N-(2-metilditio-2,2-dimetiletil)amino-1,3-bencenodiil(metilenoxi)]-bis[7-metoxi-2-metilen- 1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(4-(2-(4-mercapto-4-metil)-pentanamido-etoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7- dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(1-(2-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden- 7- dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(4-(3-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-propoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden- 7- dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(4-(4-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido-butoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7- dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(4-(3-[4-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-piperazin-1-il]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2- et- (E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(1-(3-[4-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-piperazin-1-il]-propil)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2- et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)- 2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)- benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin- 5-ona]
    • 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis [(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)- piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5- ona]
    • 8,8'-[(1-(2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etoxi)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)- iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(4-(3-[metil-(4-metil-4-metildisulfanil-pentanoil)-amino]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)- iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(4-(3-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-propil)-piridin-2,6-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)- iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]
    • 8,8'-[(1-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanamido)-benceno-3,5-dimetil)-dioxi]-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi- 1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona].
  34. 33. El conjugado de la reivindicación 28, caracterizado por que el agente citotóxico es un derivado de leptomicina seleccionado del grupo que consiste en:
    • (2-Metilsulfanil-etil)-amida de (2-Metilsulfanil-etil)-amida del ácido
    (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2 -il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenoico
    • Bis-[(2-mercaptoetil)-amida del ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,
  35. 7.9.11.15.17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pente noico]
    • (2-Mercapto-etil)-amida del ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,
  36. 15.17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentenoico
    • (2-Metildisulfanil-etil)-amida del ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,
  37. 7.9.11.15.17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pente noico
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    • (2-Metil-2-metildisulfanil-propil)-amida del ácido
    (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2 -il)-8-oxo-nonadeca-2,l0,12,16,18-pentenoico
    • (2-Mercapto-2-metil-propil)-amida del ácido
    (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidroxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-dihidro-2H-piran-2 -il)-8-oxo-nonadeca-2,l0,12,16,18-pentenoico.
  38. 34. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1-27, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 28-33, y un vehículo o excipientes farmacéuticamente aceptables.
  39. 35. El anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1-27, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 28-33, para uso como un medicamento.
  40. 36. El uso de un anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 1-27, o del conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 28-33, o la composición según la reivindicación 34, para fabricar un medicamento para tratar cáncer.
  41. 37. El uso de la reivindicación 36, caracterizado por que dicho cáncer es un cáncer metastásico.
  42. 38. El uso de las reivindicaciones 36 o 37, caracterizado por que dicho anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo, o dicho conjugado, inhibe la neovascularización tumoral.
  43. 39. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 36-38, caracterizado por que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer endometrial, carcinoma de ovario, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, un sarcoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de hígado, y otros carcinomas.
  44. 40. Un polinucleótido que codifica el dominio de cadena pesada y ligera de un anticuerpo o fragmento de éste que se une al epítopo como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1-27.
  45. 41. Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 40.
  46. 42. Una célula hospedante que comprende un vector de la reivindicación 41.
  47. 43. Una línea celular de hibridoma caracterizada por que se selecciona del grupo que consiste en la línea celular de hibridoma denominada 37.3D7, en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7660; la línea celular de hibridoma denominada 37.1F5, en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7661; la línea celular de hibridoma denominada 53.2H11, en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTA-7662; la línea celular de hibridoma denominada EphA2-N1, en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTM-8407; o la línea celular de hibridoma denominada EphA2-N2, en la que dicha línea celular de hibridoma está depositada en la American Type Culture Collection con el número de registro PTM-8408.
    Conteo Conteo
    imagen3
    Altura de FL1
    60nM 37.3D7
    imagen4
    Altura de FL1
    imagen5
    imagen6
    imagen7
    60nM B2D6
    imagen8
    Fig. 1B
    IgG de cabra anti-ratón-FITC sólo
    imagen9
    Altura de FL1
    CO
    4^
    60nM 37.1 F5
    imagen10
    Altura de FL1
    Conteo Conteo
    IgG de cabra anti-ratón-FITC sólo
    imagen11
    Altura de FL1
    imagen12
    ~f-i' i r.rui[—i TW Ul|1 I II MUI | III llliq 10° 101 102 103 104
    Altura de FL1
    Células 300-19
    Conteo Conteo
    imagen13
    imagen14
    60nM 53.2H11
    imagen15
    60nM 53.2H11
    imagen16
    101 102 103 104 Altura de FL1
    Conteo Conteo
    imagen17
    10° 101 102 1 03 1 04 Altura de FL1
    imagen18
    imagen19
    60nM 37.3D7
    60nM 37.3D7
    60nM 37.3D7
    imagen20
    imagen21
    imagen22
    BXPC-3
    MDA-MB-231
    HT-29
    Fig. 3A
    Fig. 3B
    Fig. 3C
    Fluorescencia
    Fluorescencia
    Fluorescencia
    imagen23
    imagen24
    imagen25
    Conc. (M)
    Conc. (M)
    Conc. (M)
  48. 37.3D7
  49. 37.1F5
  50. 53.2H11
    Fig. 4A
    300-19/mu-EphA2
    IgG de cabra anti-ratón-FITC sólo 60nM 37.3D7
    imagen26
    imagen27
    Altura de FL1
    Altura de FL1
    60nM 53.2H11
    imagen28
    Fig. 4B
    300-19/Rat-EphA2
    IgG de cabra anti-ratón-FITC sólo 60nM 37.3D7
    imagen29
    imagen30
    101 102 103 Altura de FL1
    60nM 53.2H11
    imagen31
    I ' ........ ' r
    10° 101 102 103 104 Altura de FL1
    Conteo Conteo
    IgG de cabra anti-ratón-FITC sólo
    60nM 37.3D7
    imagen32
    Altura de FL1
    imagen33
    Altura de FL1
    60nM 37.1 F5
    imagen34
    60nM 53.2H11
    imagen35
    Células VERO
    Células VERO
  51. 37.3D7
  52. 37.1 F5
  53. 53.2H11
    Fluorescencia
    Fluorescencia
    Fluorescencia
    imagen36
    Conc. (M)
    imagen37
    102
    Fig.6
    Absorbancia, 405 nm (biotina-EfrinaAl unida)
    - biotina- EfrinaAl
  54. 37.3D7 37.1 F5 53.2H11
    No ab
    + biotina-EfrinaAl
    103
    126,4kD-
    + + +
    + + +
    efrinaA1/Fc, 10min IP con D7
    +
    +
    + + + +
    l||p|¡|p
    Fosfo-Tyr./EphA2 60kD- r w.
    :«m§
    EphA2 60kD-
    efrinaA1/Fc, 10min WB
    - Fosfo-AKT I- AKT
    Fig. 7C
    A* A' &
    V V
    - + + + +
    + + + + +
    efrinaA1/Fc, 10min WB
    126,4kD-
    126,4kD-
    imagen38
    Fosfo-Tyr./EphA2
    EphA2
    104
    IP: D7
    /
    *-,/ <# & 0°«> «&•
    +
    V 'b'
    + + +
    WB:
    126kD- 126kD-
    imagen39
    F-Tyr/EphA2
    EphA2
    4N
    o° # tf*
    IP: D7 +
    +
    WB:
    126kD- mtmmrn F-Tyr/EphA2
    126kD- j'◄- EphA2
    105
    Fig. 9B
    >
    cr
    en
    O
    —5
    cr
    Q)
    o
    £D
    o
    Q.
    £D
    1,2
    1
    0,8
    0,6
    0,4
    0,2
    Células HT-29 en el día 3
    0 0%FBS 0 1%FB$
    □ lgG1+1%FBS ■ 37.3D7+1%FBS
    imagen40
    0,450 > 0,400 en 0,350 §■ 0,300 § 0,250
    g- 0,200
    g 0,150
    S o.loo
    *>' 0,050
    0,000
    imagen41
    10%FBS S1.5%FBS ED37.3D7 □ 53.2H11
    células loVo en el día 3
    imagen42
    células UACC-257 en el día 3
    Inhibición (%)
    120%
    100%
    80%
    60%
    40%
    20%
    0%
    imagen43
    1r56E-09^6,25E-09 2.50E-08 1,00E-07
    1.00E-10 3.90E-1
    ♦ 37.3D7
    ■ igGi
    a 1.5%FBS
    ■ 0%FBS
    Conc.(M)
    O
    00
    imagen44
  55. 53.2H11 • lgG1 1 5%FBS ■ 0%FBS
    Conc.(M)
    Inhibición (%)
    120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% -20%
    imagen45
    —53.2H11 + EGF —■— lgG1 + EGF 10ng/ml EGF —0%FBS
    Conc.(M)
    Fluorescencia
    imagen46
    HUVEC
    Fluorescencia
    imagen47
    Conc. (M)
    HUVEC
    imagen48
    PBS
    imagen49
    iSli
    !!!!!l!ll!!!!!Í!j!!!Pjj|j iij
    = ■ === = ■ =: -JÜ . Jtn
    ■ 1 MHm
    ~r
    ■ i
    imagen50
    112
    + + + +
    - 37.1A4 37.3D7 Avastina
    imagen51
    imagen52
    VEGF (100 ng/ml) mAb (20 |jg/ml)
    Fosfo.-AKT(S473)
    Akt (re-blot)
    113
    (eUIUl)
    joiuni |ep ueuin|OA
    1.600
    1.500
    1.400
    1.300
    1.200
    1.100
    1.000
    900
    800
    700
    600
    500
    400
    300
    200
    100
    0
    PBS
  56. 37.3D7 lgG1 control anti-EGFR (Erbitux)
    imagen53
    t ■ i i i » i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—«—i—i—i—i—i—i—i—i
    10 15 20 25 30 35
    Tiempo (días) después de la inoculación
    imagen54
    imagen55
    hu37.3D7-SPDB-DM4/SK-Mel-28 □ hu37.3D7-SPDB-DM4/SK-Mel-28
    Volumen Mediano del Tumor
    imagen56
    t
    imagen57
    inyección i.v.
    Días después de la inoculación f
    Días después de la inoculación
    PBS
    hu37.3D7-SPDB-DM4 15 mg/kg hu37.3D7-SPDB-DM4 7,5 mg/kg hu37.3D7-SPDB-DM4 3,25 mg/kg
    inyección i.v.
    PBS
    hu53.2H11-SPDB-DM4 15 mg/kg hu53.2H11-SPDB-DM4 7,5 mg/kg hu53.2H11-SPDB-DM4 3,25 mg/kg
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