ES2435779T3

ES2435779T3 - Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapéutico

Info

Publication number: ES2435779T3
Application number: ES07290904T
Authority: ES
Inventors: Laurence Gauzy; Hervé Bouchard; Alain Commercon; Yonghong Deng; Ravi V.J. Chari
Original assignee: Sanofi SA; Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi SA; Sanofi Aventis France
Priority date: 2007-07-19
Filing date: 2007-07-19
Publication date: 2013-12-23
Anticipated expiration: 2027-07-19
Also published as: ATE530553T1; SI2019104T1; EP2019104A1; EP2170890B1; ES2376026T3; NZ582679A; ZA201000389B; PT2019104E; US20100316656A1; DOP2010000014A; PL2019104T3; BRPI0814267A2; PL2170890T3; US8404678B2; TN2010000002A1; PE20090889A1; EA201070163A1; AU2008281439A1; WO2009016516A3; AR067575A1

Abstract

Compuestos de fórmula (I) donde: representa un enlace sencillo opcional; representa o un enlace sencillo o un doble enlace; con la condición de que cuando represente un enlace sencillo, U y U', iguales o diferentes, representanindependientemente H, y W y W', iguales o diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consisteen -OH, -OR, -OCOR, -OCOOR, -OCONRR', un carbamato cíclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo,-NRCONRR', -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, -SR, -SOR, -SOOR,-SO3 -, -NRSOOR', -NRR', opcionalmente amina cíclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NROR', -NRCOR',-N3, un ciano, un halo, un trialquilo o triarilfosfonio; y cuando represente un doble enlace, U y U' están ausentes y W y W' representan H; - R1, R2, R1', R2' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de: H, Haluro o Alquilo opcionalmentesustituido por uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR o R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos un dobleenlace que contiene grupo >=B y >=B' respectivamente. - B y B' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquenilo que está opcionalmente sustituidocon uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR o B y B' representan un átomo de oxígeno. - A y A' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de: Alquilo o Alquenilo, estando cada unoopcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo. - Y e Y' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, OR; - q es 0, 1 ó 2 ; - n, n', iguales o diferentes, son 0 ó 1 ; - R y R' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, Alquilo, Arilo, estando cada uno de ellosopcionalmente sustituido con Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR, Arilo, Het; - T es -NR- o un arilo, cicloalquilo, heterocíclico o heteroarilo de 4 a 10 miembros, estando cada uno de ellosopcionalmente sustituido con uno o más de Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR y estando cada uno sustituido conuno o más ligante(s) no escindible(s) elegidos de la siguiente lista.

Description

Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapéutico

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nuevos agentes citotóxicos y a su uso terapéutico. Más específicamente, la

5 invención se refiere a nuevos agentes citotóxicos que comprenden derivados de tomaimicina y a su uso terapéutico. Estos nuevos agentes citotóxicos tienen utilidad terapéutica como resultado de la liberación de los derivados de tomaimicina en una población específica de células de una manera dirigida por medio de la asociación química del derivado de tomaimicina con un agente de unión a las células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

10 Se han descrito muchos intentos de dirigir específicamente conjugados anticuerpo monoclonal-fármaco a células tumorales (Sela et al., en Immuno-conjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al., en Targeted Drugs 1-22

(E. Goldberg; ed. 1.983); Diener et al, en Antibody mediated delivery systems, 1-23 (J. Rodwell, ed. 1.988); Pietersz et al, en Antibody mediated delivery systems, 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bumol et al, en Antibody mediated delivery systems, 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988); G.A. Pietersz & K. Krauer, 2, J. Drug Targeting, 183-215 (1.994); R.

15 V. J. Chari, 31 Adv. Drug Delivery Revs., 89-104 (1.998); W.A. Blattler & R.V.J. Chari, en Anticancer Agents, Frontiers in Cancer Chemotherapy, 317-338, ACS Symposium Series 796; Ojima et al eds, American Chemical Society 2.001; J.M.Lambert, 5 Current Opinion in Pharmacology, 543-549 (2.005); P.R. Hamann, 15 Expert Opinion on Therapeutics Patents, 1.087-1.103 (2.005)). Todas las referencias y patentes citadas en la presente memoria se incorporan como referencia.

20 Se han conjugado fármacos citotóxicos, tales como: metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalán, mitomicina C y clorambucilo, con varios anticuerpos monoclonales murinos. En algunos casos, las moléculas del fármaco se unieron a las moléculas de anticuerpo a través de una molécula portadora intermedia, tal como albúmina sérica (Garnett et al., 46 el Cancer Res. 2.407-2.412 (1.986); Ohkawa et al 23, Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1.986); Endo et al, 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980), dextrano (Hurwitz et al, 2 Appl. Biochem.

25 25-35 (1980); Manabi et al, 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman et al, 46 Cancer Res., 4.886-4.891 (1.986); Shoval et al, 85, Proc. Natl. Acad. Sci., 8.276-8.280 (1.988)) o ácido poliglutámico (Tsukada et al, 73, J. Natl. Canc. Inst., 721-729 (1.984); Kato et al, 27 J. Med. Chem., 1.602-1.607 (1.984); Tsukada et al, 52, Br. J. Cancer, 111-116 (1.985)).

Se ha empleado una amplia serie de tecnologías de ligantes para la preparación de tales inmunoconjugados y se

30 han investigado tanto ligantes escindibles como no escindibles. En la mayoría de los casos, el alto potencial citotóxico de los fármacos sólo podía observarse, sin embargo, si se podían liberar las moléculas de fármaco de los conjugados en forma no modificada en el sitio diana usando un ligante escindible.

Los ensayos in vitro de citotoxicidad han revelado, sin embargo, que los conjugados anticuerpo-fármaco podían destruir no sólo células positivas de antígeno sino también otras células en los alrededores, con independencia de la 35 expresión del antígeno en su superficie. Este fenómeno se denomina el efecto espectador. Este efecto se observó en conjugados del anticuerpo anti-CanAg; huC242, con maitansinoides y con un análogo CC1065 (Erickson et al, 66 Cancer Res., 4.426-4.433 (2.006); Kovtun et al, 66 Cancer Res., 3.214-3.221 (2.006)). Hasta ahora sólo los conjugados unidos mediante un enlace escindible tal como un enlace disulfuro reducible, demostraron citotoxicidad del espectador, mientras los conjugados unidos mediante un enlace tioéter no reducible no presentaban efecto

40 espectador.

Las moléculas efectoras citotóxicas muy potentes unidas a agentes diana tales como anticuerpos podían generar potentes derivados de fármacos después del proceso intracelular del conjugado. Esto podía ser un problema si los metabolitos celulares generados manifestaran efectos secundarios no deseados o no fácilmente manejables. Para controlar la toxicidad de conjugados anticuerpo-fármaco, podía ser muy beneficioso usar ligantes no escindibles.

45 Otra desventaja principal de la mayoría de los conjugados anticuerpo-fármaco es su incapacidad para suministrar una concentración suficiente de fármaco al sitio diana debido al número limitado de antígenos diana y la citotoxicidad relativamente moderada de los fármacos canceroestáticos como: metotrexato, daunorubicina y vincristina. Para conseguir una citotoxicidad significativa, se hace necesaria la unión de un gran número de moléculas de fármaco, bien directamente al anticuerpo o mediante una molécula portadora polimérica. Sin embargo, tales anticuerpos

50 modificados de forma importante presentan a menudo una unión debilitada con el antígeno diana y una eliminación in vivo rápida del torrente circulatorio. Así, una alternativa es usar moléculas de fármacos mucho más potentes tales como las descritas a continuación.

También se han usado en conjugación ligantes no escindibles. Tienen interés en aplicaciones radioinmunoterapéuticas en particular. Esto se ha utilizado también en la unión de toxinas a anticuerpos 55 monoclonales, en cuanto a Pseudomonas exotoxina con MAb 9.2.27 usando 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1carboxilato de maleimidasuccinimidilo (SMCC, por sus siglas en inglés) heterobifuncional (patente europea EP 306943). La toxina conjugada MAb resulta tener mayor especificidad in vitro frente a líneas celulares positivas que el

correspondiente conjugado de enlace disulfuro y así menos tóxica en modelos de ratones. La toxicidad no específica disminuye significativamente cuando se usa un ligante no escindible. Este ligante no escindible se ha usado en el caso de trastuzumab (Herceptina) cuya diana HER2 (ErbB) HERR2 es una diana clave y se están investigando métodos para maximizar el efecto de usar MAbs para inhibir a este receptor. Una propuesta se dirige a aumentar la

5 eficacia de trastuzumab (Herceptina) acoplándolo a un agente quimioterapéutico, permitiendo así la administración de tratamiento citotóxico a un nivel celular (Ranson y Sliwkowski, 63 (Supl. 1) Oncology, 17-24 (2.002)).

Existen otras versiones del reactivo SMCC, por ejemplo también se ha usado 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) soluble en agua, en reacción de conjugación. Otros ligandos no escindibles incluyen en particular S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA), SATA-SMCC, 2-iminotiazol (2IT) y

10 2IT-SMCC (Foulon et al, 10, Bioconjugate Chem., 867-876 (1.999)). También se han usado reactivos de acoplamiento que comprenden un resto basado en haloacetilo e incluyen 4-(yodoacetil)-aminobenzoato de Nsuccinimidilo (SIAB) yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), bromoacetato de N-succinimidilo (SBA) y 3-(bromoacetamido)propionato de N-succinimidilo (SBAP). Estos reactivos de entrecruzamiento forman conectores no escindibles procedentes de restos basados en haloacetilo.

15 A pesar de las dificultades descritas anteriormente debido a las moléculas de fármaco, se han descrito agentes citotóxicos útiles que comprenden restos de unión a la célula y el grupo de fármacos citotóxicos conocidos como maitansinoides (patente de EE.UU. 5.208.020, patente de EE.UU. 5.416.064 y R. V. J. Chari, 31 Advanced Drug Delivery Reviews 89-104 (1.998)). De manera similar, también se han descrito agentes citotóxicos útiles que comprenden restos de unión a la célula y análogos y derivados del potente antibiótico antitumoral CC-1065 (patente

20 de EE.UU. 5.475.092, patente de EE.UU. 5.585.499 y patente de EE.UU. 6.756.397).

Los derivados de tomaimicina son pirrolo[1.4]benzodiazepinas (las PBD), una clase conocida de compuestos que ejercen sus propiedades biológicas por medio de la unión covalente al N2 de guanina en el surco menor del ADN. Las PBD incluyen una serie de aglutinantes de surco menor tales como antramicina, neotramicina y DC-81. Sin embargo, la actividad antitumoral de la tomaimicina está limitada sin embargo debido a su toxicidad no específica 25 para las células normales. De esta manera, existe la necesidad de aumentar la actividad terapéutica y disminuir los efectos tóxicos no específicos de los compuestos de tomaimicina. Los presentes autores han demostrado que esta necesidad puede satisfacerse por la liberación dirigida de compuestos de tomaimicina por medio de su unión con agentes de unión a la célula. Adicionalmente, existe la necesidad de desarrollar derivados de tomaimicina que sean solubles y estables en disoluciones acuosas. Además, la tomaimicina no es suficientemente potente como para

30 usarse en conjugados de agentes de unión a la célula.

Recientemente se han descrito algunos derivados de PBD y su actividad antitumoral en modelos preclínicos (documentos WO 00/12508 y WO 2005/085260). Sin embargo, los ensayos clínicos iniciales realizados en seres humanos indican que los compuestos de esta clase son muy tóxicos, basándose en la muy baja dosis que puede administrarse a los seres humanos (I. Puzanov, Proc. AACR-NCI-EORTC International Conference, Filadelfia, USA

35 2.005, Resumen #B117). Por lo tanto, es deseable proporcionar derivados alternativos que sean más potentes y/o puedan unirse a agentes de unión a las células.

Por consiguiente, es muy necesario un método para tratar enfermedades con derivados de tomaimicina en el que sus efectos colaterales se reduzcan sin comprometer su citotoxicidad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

40 Como se describe en una primera realización, un objeto de la presente invención es proporcionar derivados de tomaimicina que son altamente tóxicos pero que pueden usarse eficazmente en el tratamiento de muchas enfermedades.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar nuevos derivados de tomaimicina, que opcionalmente se pueden unir o unidos a un agente de unión a las células.

45 En un segundo modo de realización, la presente invención proporciona una composición terapéutica que comprende:

(A): una cantidad eficaz de uno o más derivados de tomaimicina que opcionalmente se pueden unir o unidos a un agente de unión a las células, y

(B): un vehículo, diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente.

50 En una tercera realización, la presente invención proporciona un método para eliminar poblaciones celulares elegidas que comprende poner en contacto las células diana o el tejido que contiene las células diana con una cantidad citotóxica de un agente citotóxico que comprende uno o más derivados de tomaimicina, que opcionalmente se pueden unir o unidos a un agente de unión a las células.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Esta invención se basa en la síntesis de nuevos derivados de tomaimicina que retienen alta citotoxicidad y que pueden enlazarse eficazmente a agentes de unión a la célula con ligantes no escindibles, demostrando dichos conjugados alta potencia en la destrucción de células tumorales. Previamente se ha demostrado que la unión de 5 fármacos altamente citotóxicos con anticuerpos usando un ligante escindible, tal como un enlace disulfuro, asegura la liberación de fármacos totalmente activos dentro de la célula y tales conjugados son citotóxicos con especificidad de antígeno (patentes de EE.UU. US 6.340.701; US 6.372.738; US 6.436.931). Sin embargo, la técnica revela que es extremadamente difícil modificar los fármacos existentes sin disminuir su potencial citotóxico. La invención descrita resuelve este problema modificando los derivados de tomaimicina descritos con restos químicos. Como 10 resultado, los nuevos derivados de tomaimicina descritos conservan y en algunos casos podían incluso aumentar la potencia citotóxica de los derivados de tomaimicina. Los complejos agente de unión a la célula-derivado de tomaimicina permiten la medición completa de la acción citotóxica de los derivados de tomaimicina que se van a aplicar de forma dirigida contra células no deseadas sólo, evitando por lo tanto los efectos secundarios debidos al daño en las células sanas no diana. Así, la invención proporciona agentes útiles para la eliminación de células 15 enfermas o anormales que deben destruirse o lisarse, tales como las células tumorales (particularmente, las células

de tumor sólido).

El agente citotóxico de acuerdo con la presente invención comprende uno o más derivados de tomaimicina, opcionalmente ligables o ligados a un agente de unión a la célula mediante un grupo ligante no escindible. El grupo 20 ligante es parte de un resto químico que se une por enlaces covalentes a un derivado de tomaimicina por métodos convencionales.

Los derivados de tomaimicina útiles en la presente invención tienen la fórmula (I) mostrada a continuación:

en la que 25 ---- representa un enlace sencillo opcional;

representa o un enlace sencillo o un doble enlace;

con la condición de que cuando

represente un enlace sencillo, U y U', iguales o diferentes, representan independientemente H, y W y W', iguales o diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, -OR, -OCOR, -OCOOR, - OCONRR', un carbamato cíclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo,

30 -NRCONRR', -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, -SR, -SOR, -SOOR, -SO3 -, -NRSOOR', -NRR', opcionalmente amina cíclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NROR', -NRCOR', -N3, un ciano, un halo, un trialquil o triarilfosfonio; preferiblemente W y W' son iguales o diferentes y son OH, OMe, OEt, NHCONH2, SMe;

y cuando

represente un doble enlace, U y U’ están ausentes y W y W’ representan H;

35 ■ R1, R2, R1’, R2’ son iguales o diferentes y se eligen independientemente de: H, Haluro o Alquilo opcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR o R1 y R2 y R1’ y R2’ forman juntos un doble enlace que contiene grupo =B y =B’ respectivamente.

Preferiblemente, R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos un grupo que contiene un enlace doble: =B y =B' respectivamente.

■ B y B’ son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquenilo que está opcionalmente sustituido con uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR o B y B’ representan un átomo de oxígeno. Preferiblemente, B=B’. Más preferiblemente, B=B’= =CH2 o =CH-CH3, 5 ■ A, A’ son iguales o diferentes y se eligen independientemente de: Alquilo o Alquenilo, estando cada uno opcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo.

Preferiblemente, A=A’. Más preferiblemente, A=A’=alquilo lineal no sustituido.

■ Y, Y’ son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, OR;

10 Preferiblemente Y=Y’. Más preferiblemente y=Y’=OAlquilo, más preferiblemente OMetilo.

■ T es -NR- o un arilo, cicloalquilo, heterocíclico, heteroarilo de 4 a 10 miembros, estando cada uno de ellos opcionalmente sustituido con uno o más ligante(s) no escindible(s) y opcionalmente sustituidos con uno o más de Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR.

15 Preferiblemente, T es un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, más preferiblemente fenilo o piridilo, sustituido con uno o más ligante(s) no escindible(s) y opcionalmente sustituidos con uno o más de Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR.

Dicho ligante no escindible se puede describir que comprende una cadena terminada por un grupo ligante. Preferiblemente, dicho ligante no contiene grupos escindibles tales como grupos disulfuro, grupos ácidos lábiles, 20 grupos fotolábiles, grupos lábiles peptidasa y grupos lábiles esterasa. Según la presente invención, dicho ligante contiene grupos no escindibles. El ligante no escindible comprende un grupo ligante terminal. Dicho grupo ligante terminal es preferiblemente un grupo carboxi o amida, en el extremo terminal de la cadena lateral. La cadena lateral puede ser lineal o ramificada, aromática o heterocíclica. Los especialistas en la materia pueden identificar fácilmente cadenas laterales adecuadas. Los ligantes preferidos constan de cadenas lineales que contienen funciones

25 solubilizantes tales como: amino, hidroxi, éter, grupos sulfónico y carboxílico.

Se puede describir lo siguiente:

-G-D-(Z)p-C(=O)-Z'R"

donde

G es un enlace sencillo, uno doble o uno triple, –O-, -S- o –NR-;

30 D es un enlace sencillo o –E-, -E-NR-, -E-NR-F-, -E-O-, -E-O-F-, -E-NR-CO-, -E-CO-NR-, -E-NR-CO-F-, -E-CO-NR-F-, -E-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-NR-CS-, -E-CS-NR-, -E-NR-CS-F-, -E-CS-NR-F-;

donde E y F son iguales o diferentes y se eligen independientemente de: (OCH2CH2)iAlquil(OCH2CH2)j-, -Alquil(OCH2CH2)i-Alquil-, -(OCH2CH2)j-, (OCH2CH2)iCicloalquil(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iheterociclo(OCH2CH2)j-, (OCH2CH2)iArilo(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iHeteroaril(OCH2CH2)j-, –Alquil-(OCH2CH2)iAlquil(OCH2CH2)j-,

35 -Alquil-(OCH2CH2)i-, -Alquil-(OCH2CH2)iCicloalquil(OCH2CH2)j-, Alquil(OCH2CH2)iheterociclo(OCH2CH2)j-, -Alquil-(OCH2CH2)iAril(OCH2CH2)j-, Alquil(OCH2CH2)iHeteroaril(OCH2CH2)j-, -Cicloalquil-Alquil-, -Alquil-Cicloalquil-, -heterociclo-Alquil-, -Alquil-heterociclo-, -Alquil-Aril-, -Aril-Alquil-, -Alquil-Heteroaril-, -Heteroaril-Alquil-, lineal o ramificado;

donde i y j, iguales o diferentes, son números enteros y se eligen independientemente entre 0, 1 a 2000;

40 Z es un Alquilo lineal o ramificado, cicloalquilo, Arilo, heteroarilo, heterociclilo, aralquilo, cicloalquilo, heteroaralquilo o heterociclilalquilo, opcionalmente sustituido por funciones solubilizantes tales como grupos: amino, éter, sulfónico y carboxílico;

p es 0 ó 1;

-: C(=O)-Z'R" es una función que contiene carbonilo en la que

45 Z' representa un enlace sencillo o un O, -S(O)q-, NR- sustituido y

R" representa: H, Alquilo, Cicloalquilo, Arilo, heteroarilo o heterocíclico, estando cada uno opcionalmente sustituido por uno o más: Hal, CN, NRR’, CF3, R, OR, S(O)qR, Arilo, Het ;

■: n, n’, iguales o diferentes, son 0 ó 1.

■: q es 0, 1 ó 2.

■: R, R’ son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, Alquilo, Arilo, estando cada uno de ellos opcionalmente sustituido con Hal, CN, NRR’, CF3, R, OR, S(O)qR, Arilo, Het;

o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmacéuticamente o las estructuras cristalinas polimórficas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros.

La presente invención se refiere a las siguientes realizaciones preferidas o a cualquier combinación de cualquiera de ellas:

! G es un enlace sencillo, doble o triple o –O-, -S- o –NR-;

! G es un enlace sencillo u O;

! D es un enlace sencillo o –E- o -E-O-;

! D es -E-;.

! E es –Alquil-, -Alq(OCH2CH2)i- lineal o ramificado;

! Z es -Alquil- lineal o ramificado;

! p es 0;

! Z’ es un enlace sencillo u O;

! Z' es O;

! R" es H o –Alquil- lineal o ramificado o heterociclo opcionalmente sustituido;

! R" es H o alquilo o un grupo succinimida ().

Los ligantes no escindibles de la invención se eligen de la lista siguiente:

-: (CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CR13R14)t(OCH2CH2)yO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)y(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CR13R14)t(OCO)(R15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CR13R14)t(CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CR13R14)t(CONR19)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", , -(CR13R14)t-furil-CO(CR15R16)uCOZ'R", , -(CR13R14)t-tiazolilCO(CR15R16)uCOZ'R", , -(CR13R14)t-imidazolil-CO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)tpiperazin-CO(CR15R16)uCOZ'R", -(CR13R14)t-fenil-QCOZ'R", -(CR13R14)t-furil-QCOZ'R", -(CR13R14)t-oxazolil-QCOZ'R", -(CR13R14)t-tiazolil-QCOZ'R", -(CR13R14)t-tienil-QCOZ'R", -(CR13R14)t-imidazolil-QCOZ'R", -(CR13R14)t-piperazin-QCOZ'R", o

-: O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R",, -O(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -O(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)yCOZ'R", -O-fenil-QCOZ'R", -O-furil-QCOZ'R", -O-oxazolil-QCOZ'R", -O-tiazolil-Q COZ'R", -O-tienil-QCOZ'R", -O-imidazolil-QSCOZ'R", -O-morfolin-QCOZ'R",,

, -OCO-(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -OCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)yCOZ'R", -OCO-fenil-QCOZ'R", -OCO-furil-QCOZ'R", -OCO-oxazolil-QCOZ'R", -OCO-tiazolil-QCOZ'R", -OCO-tienil-QCOZ'R", -OCO-imidazolil-QCOZ'R", -OCO-piperazin-QCOZ'R", o

-: CO(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)yCOZ'R", -CO-(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)yCOZ'R", -CO-fenil-QCOZ'R", -CO-furil-QCOZ'R" -CO-oxazolil-QCOZ'R", -CO-tiazolil-QCOZ'R", -CO-tienil-QCOZ'R", -CO-imidazolil-QCOZ'R", -CO-piperazin-QCOZ'R" -CO-piperidin-QCOZ'R",

-: NR19(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CO(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CO NR12 (CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CO-fenil-QCOZ'R", , -NR19CO-oxazolil-QCOZ'R", -NR19CO-tiazolil-QCOZ'R", -NR19CO-tienil-QCOZ'R", -NR19CO-imidazolil-QCOZ'R", -NR19CO-morfolin-QCOZ'R", -NR19CO-piperazin-QCOZ'R", -NR19CO-piperidin-QCOZ'R", -NR19-fenil-QCOZ'R", -NR19-furil-QCOZ'R", -NR19-oxazolil-QCOZ'R", -NR19tiazolil-QCOZ'R", -NR19-tienil-QCOZ'R", -NR19-imidazolil-QCOZ'R", -NR19-piperazin-QCOZ'R", -NR19-piperidin-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-fenil-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-oxazolil-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-tiazolil-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-tienil-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-piperidin-QCOZ'R",

-: S(O)q(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -S(O)q(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)yCOZ'R", -SCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)yCOZ'R", -SCO-piperazin-QCOZ'R", y -SCO-piperidin-QCOZ'R",

y más preferiblemente:

-: (CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -(CR13R14)t(OCH2CH2)yO(CR15R16)uCOZ'R", -O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R",,

donde:

Q es un enlace directo o un alquilo lineal o alquilo ramificado que tiene de 1-10 átomos de carbono o un espaciador de polietilenglicol con 2 a 20 unidades repetitivas etilenoxi;

R19 y R12 son iguales o diferentes y son alquilo lineal, alquilo ramificado o alquilo cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, o un grupo arilo o heterocíclico simple o sustituido, y R12 puede ser además H,

R13, R14, R15 y R16 son iguales o diferentes y son H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono,

R17 y R18 son H o alquilo,

u es un número entero de 1 a 10 y también puede ser 0,

t es un número entero de 1 a 10 y también puede ser 0,

y es un número entero de 1 a 20 y también puede ser 0;

C(=O)-Z'R" es una función que contiene carbonilo en la que:

-: Z' representa un enlace sencillo o -O-, S(O)q-, -NR- sustituido, y -R" representa H, Alquilo, Cicloalquilo, Arilo, heteroarilo, heterocíclico, cada uno estando opcionalmente sustituido con uno o más Hal, CN, NRRi, CF3, R, OR, S(O)qR, Arilo, Het;

Cuando un compuesto de fórmula (I) está en forma de un ión (por ejemplo sulfonato), puede estar presente el contraión (por ejemplo Na+ o K+).

De acuerdo con un aspecto preferido, los compuestos de la invención son los de fórmula (I) en la que T= arilo sustituido con uno o más ligante(s) no escindible(s) y sustituido opcionalmente con uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, R, OR, S(O)qR, y/o enlazador(es) y A, A’, X, X’, U, U’, W, W’, m, m’, n, n’, ----, son como se han definido anteriormente.

De acuerdo con otro aspecto preferido, los compuestos de la invención se seleccionan entre el grupo que consiste en:

! ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi)-butírico

! Éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butírico

! ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi)-acético

! Éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acético

! éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-metiliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-propanoico

! ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-metiliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenil)-propanoico;

! éster metílico del ácido (2-{2-[2-(2-{3-[3,5-Bis-(7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5,11a-tetrahidro-1Hbenzo[e]pirrolo[1.2-a][1.4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-acético;

! ácido (2-{2-[2-(2-{3-[3,5-Bis-(7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2a][1,4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-acético;

así como su éster de N-hidroxisuccinimida correspondiente

Los compuestos preferidos son los de fórmula:

donde A, A’, Y, Y’, T, n, n’ son como se han definido anteriormente.

Como se ha usando anteriormente o como se usa a continuación en este documento:

Alk representa alquilo, alqueno o alquino.

"Alquilo" significa un grupo hidrocarbonado alifático que puede ser lineal o ramificado, con 1 a 20 átomos de carbono en la cadena o cíclico con 3 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquilo preferidos tienen de 1 a 12 átomos de carbono en la cadena. "Ramificado" significa que uno o más grupos alquilo inferior tales como metilo, etilo o propilo se unen a una cadena alquílica lineal. Los grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, 3-pentilo, octilo, nonilo, decilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

"Alqueno" significa un grupo hidrocarbonado alifático que contiene un doble enlace carbono-carbono y que puede ser lineal o ramificado, que tiene de 2 a 15 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquenilo preferidos tienen de 2 a 12 átomos de carbono en la cadena; y más preferiblemente de aproximadamente 2 a 4 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquenilo ejemplares incluyen etenilo, propenilo, n-butenilo, i-butenilo, 3-metilbut-2-enilo, n-pentenilo, heptenilo, octenilo, nonenilo, decenilo.

"Alquino" significa un grupo hidrocarbonado alifático que contiene un triple enlace carbono-carbono y que puede ser lineal o ramificado, que tiene de 2 a 15 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquinilo preferidos tienen de 2 a 12 átomos de carbono en la cadena y más preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquinilo ejemplares incluyen etinilo, propinilo, n-butinilo, 2-butinilo, 3-metilbutinilo, n-pentinilo, heptinilo, octinilo y decinilo.

“Átomo de halógeno” se refiere a un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo; preferiblemente un átomo de flúor y cloro.

"Arilo" significa un sistema de anillos hidrocarbonado, monocíclico o multicíclico, aromático, de 6 a 14 átomos de carbono, preferiblemente de 6 a 10 átomos de carbono. Los grupos arilo ejemplares incluyen fenilo o naftilo.

El término “Het” se refiere a heterociclo o heteroarilo.

Como se usan en este documento, las expresiones “heterociclo” o “grupo heterocíclico” se refieren a anillos mono, bi

o multicíclicos, saturados, parcialmente insaturados o insaturados, no aromáticos, estables, de 3 a 14 y preferiblemente de 5 a 10 miembros, donde al menos un miembro del anillo es un heteroátomo. Típicamente, los heteroátomos incluyen, pero no se limitan a, átomos de oxígeno, nitrógeno, azufre, selenio y fósforo. Los heteroátomos preferidos son oxígeno, nitrógeno y azufre.

También se describen heterociclos adecuados en The Handbook of Chemistry and Physics, 76ª Edición, CRC Press, Inc., 1.995-1.996, págs. 2-25 a 2-26, cuya descripción se incorpora de ese modo como referencia.

Los grupos heterocíclicos no aromáticos preferidos incluyen, pero sin limitación, pirrolidinilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, oxiranilo, tetrahidrofuranilo, dioxolanilo, tetrahidro-piranilo, dioxanilo, dioxolanilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo, piranilo, imidazolinilo, pirrolinilo, pirazolinilo, tiazolidinilo, tetrahidrotiopiranilo, ditianilo, tiomorfolinilo, dihidro-piranilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidro-piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropirinidinilo, dihidrotiopiranilo, azepanilo, así como los sistemas condensados producidos por la condensación con un grupo fenilo.

Como se usa en este documento, el término “heteroarilo” o heterociclos aromáticos se refiere a un anillo mono-, bi- o multicíclico, aromático, de 5 a 14 y preferiblemente de 5 a 10 miembros. Los ejemplos incluyen pirrolilo, piridilo, pirazolilo, tienilo, pirimidinilo, pirazinilo, tetrazolilo, indolilo, quinolinilo, purinilo, imidazolilo, tienilo, tiazolilo, benzotiazolilo, furanilo, benzofuranilo, 1,2,4-tiadiazolilo, isotiazolilo, triazoilo, tetrazolilo, isoquinolilo, benzotienilo, isobenzofurilo, pirazolilo, carbazolilo, bencimidazolilo, isoxazolilo, N-óxido de piridilo, así como los sistemas condensados producidos por la condensación con un grupo fenilo.

Los términos "alquilo", "cicloalquilo", “alquenilo”, "alquinilo", "arilo", "heteroarilo", "heterociclo" y similares también se refieren a los términos "alquileno", "cicloalquileno", "alquenileno", "alquinileno", "arileno", "heteroarileno", "heterociclona" correspondientes y similares que se forman por la retirada de dos átomos de hidrógeno.

Tal como se usa en la presente memoria, "ligantes no escindibles" significa cualquier grupo adecuado para unir de forma covalente dicho derivado de tomaimicina a un agente de unión a la célula para formar dicho conjugado, en donde, en dicho conjugado, dicho ligante es no escindible en las condiciones fisiológicas. Dicho ligante no escindible no contiene grupos disulfuro, grupos ácido lábiles, grupos fotolábiles, grupos peptidasa lábiles y grupos esterasa lábiles. Preferiblemente, dichos “ligantes no escindibles” comprenden un grupo carboxi o amido terminal o precursores de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión “ligable a un agente de unión a la célula” se refiere a los derivados de tomaimicina que comprenden al menos un grupo ligante, que a su vez comprende un grupo ligante o un precursor del mismo, adecuado para unir dichos derivados a un agente de unión a la célula; son grupos ligantes preferidos: carboxi, enlaces amido o precursores de los mismos.

Como se usa en este documento, la expresión “enlazado a un agente de unión a las células” se refiere a la molécula conjugada que comprende al menos un derivado de tomaimicina unido a un agente de unión a las células mediante un grupo ligante adecuado, o un precursor del mismo; grupos ligantes preferidos son enlaces no escindibles o precursores de los mismos.

Como se usa en este documento, el “precursor” de un grupo dado se refiere a cualquier grupo que pueda conducir a ese grupo mediante cualquier reacción de desprotección, modificación química o acoplamiento.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "paciente" se refiere a un animal, tal como un animal valioso para fines de cría, compañía o conservación, o preferiblemente un ser humano o un niño que padece o que presenta el potencial de padecer una o más enfermedades y afecciones descritas en la presente memoria.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una "cantidad eficaz terapéuticamente" se refiere a una cantidad de un compuesto de la presente invención que es eficaz para prevenir, reducir, eliminar, tratar o controlar los síntomas de las enfermedades y afecciones descritas en la presente memoria. El término "controlar" pretende referirse a todos los procesos en los que puede existir un retraso, interrupción, detención o parada de la progresión de las enfermedades y afecciones descritas en la presente memoria, pero no indica necesariamente una eliminación total de todos los síntomas de la enfermedad y afección, y pretende incluir tratamiento profiláctico.

Como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a los compuestos, materiales, excipientes, composiciones o formas de dosificación que, dentro del alcance del juicio médico, son adecuados para ponerse en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin provocar toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivas u otras complicaciones problemáticas en proporción a una relación beneficio/riesgo razonable.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sales aceptables farmacéuticamente" se refiere a derivados de los compuestos descritos donde el compuesto precursor se modifica preparando sales de ácidos o bases del mismo. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales o la sales de amonio cuaternario del compuesto precursor formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos, no tóxicos. Por ejemplo, dichas sales no tóxicas convencionales incluyen las procedentes de ácidos inorgánicos tales como: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos tales como: acético, propiónico, succínico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, bencenosulfónico, glucorónico, glutámico, benzoico, salicílico, toluenosulfónico, oxálico, fumárico, maleico, láctico y similares. Otras sales de adición incluyen sales de amonio tales como trometamina, meglumina, epolamina, etc., sales de metales tales como sodio, potasio, calcio, cinc o magnesio.

Las sales aceptables farmacéuticamente de la presente invención pueden sintetizarse a partir del compuesto precursor que contiene un resto básico o ácido por métodos químicos convencionales. En general, tales sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas ácidas o básicas libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiado, en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. En general, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1.985, p. 1418, cuya descripción se incorpora en la presente memoria por referencia.

Los compuestos de fórmula general (I) que tienen isómeros geométricos y estereoisómeros también son una parte de la invención.

Se sabe que el doble enlace N-10, C-11 de los derivados de tomaimicina de fórmula (I) puede convertirse fácilmente y de manera reversible en los aductos de imina correspondientes en presencia de agua, un alcohol, un tiol, una amina primaria o secundaria, urea y otros nucleófilos. Este proceso es reversible y puede regenerar fácilmente los derivados de tomaimicina correspondientes en presencia de un agente deshidratante, en un disolvente orgánico no prótico, al vacío o a temperaturas elevadas (Z. Tozuka, 36, J. Antibiotics, 276 (1.983).

Así, esta invención también proporciona derivados reversibles de derivados de tomaimicina de fórmula general (II):

donde A, X, Y, n, T, A', X', Y', n', R1, R2, R1', R2' se definen como en la fórmula (I) y W , W son iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en OH, -OR, -OCOR, -COOR, -OCOOR, -OCONRR', un carbamato cíclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NRCONRR', -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, -SR, -SOR, -SOOR, -SO3, -NRSOOR', -NRR', opcionalmente amina cíclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NROR', -NRCOR', -NRCONRR', -N3, un ciano, un halo, un trialquil o triarilfosfonio. Preferiblemente, W y W' son iguales o diferentes y son OH, OMe, OEt, NHCONH2, SMe.

Así, los compuestos de fórmula (II) pueden considerarse como solvatos, incluyendo el agua cuando el disolvente es agua; estos solvatos pueden ser particularmente útiles.

De acuerdo con otro aspecto adicional, la presente invención también es de interés con el proceso de preparación de los compuestos de fórmula (I).

Los compuestos y procesos de la presente invención pueden prepararse por varias rutas muy conocidas por los expertos en la técnica. Los compuestos pueden sintetizarse, por ejemplo, por aplicación o adaptación de los métodos que se describen a continuación, o variaciones de los mismos que puedan apreciarse por los especialistas en la técnica. Las modificaciones y sustituciones apropiadas serán obvias y se conocerán bien o podrán obtenerse fácilmente a partir de la bibliografía científica por los expertos en la técnica.

En particular, dichos métodos pueden encontrarse en R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH Publishers, 1.999.

Se apreciará que los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más átomos de carbono asimétricamente sustituidos y pueden aislarse en formas ópticamente activas o racémicas. Por lo tanto, se desean todas las formas quirales, diastereoméricas, racémicas y todas las formas isoméricas geométricas de una estructura, a menos que se indique específicamente la estereoquímica o la forma isomérica específica. Se sabe bien en la técnica cómo preparar y aislar dichas formas ópticamente activas. Por ejemplo, pueden separarse mezclas de estereoisómeros por técnicas estándar que incluyen, pero no se limitan a, resolución de formas racémicas, cromatografía normal, de fase reversa y quiral, formación de sales preferencial, recristalización y similares o por síntesis quiral bien a partir de materiales de partida quirales o por síntesis deliberada de centros quirales diana.

Los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante varias rutas sintéticas. Los reactivos y materiales de partida están disponibles comercialmente, o se sintetizan fácilmente por técnicas muy conocidas por el experto en la técnica. Todos los sustituyentes, a menos que se indique otra cosa, son como se han definido anteriormente.

En las reacciones descritas a continuación en la presente memoria, puede ser necesario proteger grupos funcionales reactivos, por ejemplo grupos hidroxi, amino, imino, tio o carboxi, cuando se desean en el producto final, para evitar su participación no deseada en las reacciones. Pueden usarse grupos protectores convencionales de acuerdo con la práctica estándar, para ejemplos, véanse T. W. Greene y P. G. M. Wuts in Protective Groups in Organic Chemistry, 3ª ed., John Wiley and Sons, 1999; J. F. W. McOmie en Protective Groups in Organic Synthesis, Plenum Press, 1973.

Algunas reacciones pueden realizarse en presencia de una base. No existe ninguna restricción particular sobre la naturaleza de la base que se tiene que usar en esta reacción y puede usarse aquí igualmente cualquier base usada convencionalmente en reacciones de este tipo, con la condición de que no afecte de forma adversa a otras partes de la molécula. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen: hidróxido de sodio, carbonato de potasio, trietilamina, hidruros de metales alcalinos, tales como hidruro de sodio e hidruro de potasio; compuestos de alquil-litio, tales como metil-litio y butil-litio; y alcóxidos de metales alcalinos, tales como metóxido de sodio y etóxido de sodio.

Habitualmente, las reacciones se realizan en un disolvente adecuado. Pueden usarse varios disolventes, con la condición de que no afecten de forma adversa a la reacción o a los reactivos implicados. Los ejemplos de disolventes adecuados incluyen: hidrocarburos, que pueden ser hidrocarburos aromáticos, alifáticos o cicloalifáticos, tales como hexano, ciclohexano, benceno, tolueno y xileno; amidas, tales como dimetilformamida; alcoholes tales

5 como etanol y metanol y éteres, tales como éter dietílico y tetrahidrofurano.

Las reacciones pueden realizarse en un amplio intervalo de temperaturas. En general, se encuentra conveniente realizar la reacción a una temperatura de -20ºC a 150ºC (más preferiblemente de aproximadamente la temperatura ambiente a 100ºC). El tiempo requerido para la reacción también puede variar ampliamente, dependiendo de muchos factores, en particular de la temperatura de la reacción y de la naturaleza de los reactivos. Sin embargo, si

10 la reacción se realiza en las condiciones preferidas indicadas anteriormente, normalmente será suficiente un periodo de 3 horas a 20 horas.

El compuesto preparado de esta manera puede recuperarse de la mezcla de reacción por medios convencionales. Por ejemplo, los compuestos pueden recuperarse mediante retirada por destilación del disolvente de la mezcla de reacción o, si es necesario después de la retirada por destilación del disolvente de la mezcla de reacción, vertiendo

15 el residuo en agua seguido de la extracción con un disolvente orgánico inmiscible en agua y retirando por destilación el disolvente del extracto. Además, si se desea, el producto puede purificarse adicionalmente mediante diversas técnicas bien conocidas, tales como recristalización, reprecipitación o las diversas técnicas de cromatografía, principalmente cromatografía en columna o cromatografía preparativa de capa fina.

El proceso de preparación de un compuesto de fórmula (I) de la invención es un objeto adicional de la presente 20 invención.

Un proceso de preparación de los compuestos de fórmula (I) donde T comprende un grupo carboxi terminal comprende la etapa de desproteger los compuestos correspondientes de fórmula (I):

donde Y, Y', A, A', n, n', W, W', U, U', ----, R1, R2, R1', R2', - se definen como en la fórmula (I) y T' corresponde a T 25 donde el grupo carboxi terminal está protegido o esterificado.

Una reacción representativa es la hidrólisis de un compuesto de fórmula (I) en el caso de que T’ corresponda a T en el caso de que el grupo carboxi terminal esté en forma de éster. Dicha reacción de hidrólisis se realiza generalmente en condiciones alcalinas, en presencia de una base orgánica o mineral, tal como LiOH, seguido por la adición de un ácido orgánico o mineral, tal como el ácido clorhídrico.

30 Los compuestos de fórmula (I) donde el grupo carboxi terminal está esterificado o protegido se puede obtener del acoplamiento de los compuestos correspondientes de fórmulas (IV), (IV') y (V):

donde Y, Y’, A, A’, n, n’, T’, W, W', U, U’, ----, , R1, R2, R1’, R2’ son como se han definido en la fórmula (III), y Lg es un grupo saliente tal como un halógeno, OMs, OTs u OPPh3+ (intermedio formado en una reacción de Mitsunobu)

35 Los compuestos de fórmula (IV) y (IV’) son generalmente compuestos conocidos, como se describe por ejemplo en las solicitudes de patente WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 2005/085260, o están disponibles en el mercado, y/o están disponibles por síntesis total (M. Mori et al, 42 Tetrahedron, 3793-3806, 1986) o se producen por especies de Streptomyces, en particular, siguiendo el procedimiento de la patente de Francia Fr. 1.516.743 o pueden prepararse por aplicación o adaptación de los procedimientos ilustrativos dados en los ejemplos.

40 Los compuestos de fórmula (V) pueden obtenerse a partir de compuestos correspondientes de fórmula (VI):

HO-An-T’-A’n’-OH (VI)

donde A, A’, n, n’, T’ son como se han definido en la fórmula (III).

Esta reacción se realiza generalmente en presencia de PPh3 y CHal4 o por reacción con un clorosulfonato en presencia de una base tal como trietilamina o hidróxido potásico, preferiblemente trietilamina.

Los compuestos de fórmula (VI) pueden obtenerse a partir de compuestos correspondientes de fórmula (VII):

5 HO-An-T’’-A’n’-OH (VII)

donde A, A', n, n' se definen como en la fórmula (III) y T" es un grupo precursor de T. Un grupo precursor de T se refiere a cualquier grupo que puede conducir a T por cualquier desprotección, modificación química o acoplamiento. Preferiblemente, T se obtiene por acoplamiento de T’ con la porción complementaria, donde T' y la porción complementaria comprenden funciones que son reactivas entre sí, por ej., comprendiendo T' una función hidroxilo y

10 comprendiendo la porción complementaria una función bromuro.

Un ejemplo representativo para esta reacción es:

En general, esta reacción se realiza en presencia de carbonato de potasio

Los compuestos de fórmula (VII) pueden estar disponibles en el mercado o prepararse por adaptación o aplicación 15 de métodos conocidos o de acuerdo con los ejemplos.

A continuación se da un esquema ejemplar, no limitante, para esta realización del proceso de la invención:

El compuesto de fórmula (I) también se puede obtener a partir del compuesto correspondiente de fórmula (III):

20 en la que Y, Y’, X, A, A’, X’, n, n’, W, W', U, U’, ----, -, R1, R2, R1’, R2’ son como se han definido en la fórmula (I) y T’’ es un grupo precursor opcionalmente protegido de T.

Un grupo precursor de T se refiere a cualquier grupo que pueda conducir a T por modificación química o acoplamiento. Preferiblemente, T se obtiene por acoplamiento de T’ con la porción complementaria correspondiente, donde T' y la porción complementaria comprenden funciones que son reactivas entre sí, por ej., comprendiendo T'

25 una función amina y comprendiendo la porción complementaria una función ácido.

En general, esta reacción se realiza en presencia de: N-hidroxisuccinimida y HOBT.

El compuesto de fórmula (III’) puede obtenerse por acoplamiento del compuesto correspondiente de fórmulas (IV), (IV’) y (V’):

donde Y, Y’, A, A’, n, n’, W, W', U, U’, ----, -, R1, R2, R1’, R2’ son como se han definido en la fórmula (III’), T’’ es un 5 grupo precursor opcionalmente protegido de T y Lg es un grupo saliente, tal como halógeno o OMs, OTs o PPh3+ (intermedio formado en una reacción de Mitsunobu).

Los compuestos de fórmula (IV) y (IV’) son generalmente compuestos conocidos y están disponibles por síntesis total (M. Mori et al, 42 Tetrahedron, 3793-3806, 1986) o se producen por especies de Streptomyces, en particular, siguiendo el procedimiento de la patente de Francia Fr. 1.516.743.

10 Los compuestos de fórmula (V’) pueden obtenerse a partir de compuestos correspondientes de fórmula (VII):

HO-An-T’’-A’n’-OH (VII)

en la que A, A’, n, n’ son como se han definido en la fórmula (I), T’’ es un grupo precursor opcionalmente protegido de T’.

Esta reacción generalmente se lleva a cabo en presencia de PPh3 y CHal4 o por mesilación de las funciones hidroxi.

15 Los compuestos de fórmula (VII) pueden estar disponibles en el mercado o prepararse por adaptación o aplicación de métodos conocidos o de acuerdo con los ejemplos.

La presente invención también se refiere a un proceso para la preparación del compuesto de fórmula (I), que comprende la etapa de ciclar el compuesto correspondiente de fórmula (VIII):

20 donde Y, Y’, A, A’, n, n’, R1, R2, R1’, R2’, T son como se han definido en la fórmula (I). En general, esta reacción se realiza en presencia de un reactivo tal como hidrosulfito sódico (Na2S2O4), en un disolvente apropiado tal como una mezcla de THF y agua, seguido de la adición de metanol y AcCl.

El compuesto de fórmula (VIII) puede obtenerse a partir del compuesto correspondiente de fórmula (IX):

25 donde Y, Y’, A, A’, n, n’, R1, R2, R1’, R2’, T son como se han definido en la fórmula (I). En general, esta reacción se realiza en presencia de un reactivo tal como DIBAL-H en un disolvente apropiado, tal como tolueno.

El compuesto de fórmula (IX) puede obtenerse por acoplamiento de los compuestos correspondientes de fórmula (X) y (XI):

donde Y, Y’, A, A’, n, n’, R1, R2, R1’, R2’, T son como se han definido en la fórmula (I).

En general, esta reacción se realiza mediante la adición a (X) de un reactivo tal como cloruro de oxalilo en un disolvente apropiado, tal como DMF, seguido de adición de (XI) en un disolvente apropiado, tal como THF. A continuación se da un esquema representativo:

Las reacciones anteriores pueden realizarse por el especialista aplicando o adaptando los métodos ilustrados en los ejemplos de ahora en adelante.

Además, el proceso de la invención también puede comprender la etapa adicional de aislar el compuesto de fórmula

10 (I) y (II). Esto puede realizarse por el especialista mediante cualquiera de los medios convencionales conocidos, tales como los métodos de recuperación descritos anteriormente.

Los productos de partida están disponibles en el mercado o pueden obtenerse aplicando o adaptando cualquiera de los métodos conocidos o los descritos en los ejemplos.

La síntesis también puede realizarse en un recipiente como una reacción multicomponente.

15 De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una molécula conjugada que comprende al menos un derivado de tomaimicina unido a un agente de unión a las células a través de un grupo ligante no escindible. Dicho conjugado comprende un derivado o más de tomaimicina de acuerdo con la invención unido por enlaces covalentes al agente de unión a la célula por el grupo ligante del ligante del derivado de tomaimicina. Como ejemplo representativo, dicho conjugado comprende un derivado de tomaimicina de la invención unido mediante

20 enlaces covalentes al agente de unión a la célula por el grupo terminal –CO-Z’R’’ del ligante de dicho derivado de tomaimicina. Dicho grupo ligante se une mediante enlaces covalentes al agente de unión a la célula con el ligante del derivado de tomaimicina.

Según un aspecto preferido, dicho derivado de tomaimicina es de fórmula (I'):

donde ---- representa un enlace sencillo opcional; ---- representa o un enlace sencillo o un doble enlace;

con la condición de que cuando

represente un enlace sencillo, U y U', iguales o diferentes, representan independientemente H, y W y W', iguales o diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, -OR, -OCOR, -OCOOR, -OCONRR', un carbamato cíclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NRCONRR', -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, -SR, -SOR, -SOOR,

10 -SO3 -, -NRSOOR', -NRR', opcionalmente amina cíclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NROR', -NRCOR', -N3, un ciano, un halo, un trialquil o triarilfosfonio; preferiblemente W y W' son iguales o diferentes y son OH, OMe, OEt, NHCONH2, SMe;

y cuando

represente un doble enlace, U y U’ están ausentes y W y W’ representan H;

■ R1, R2, R1’, R2’ son iguales o diferentes y se eligen independientemente de: H, Haluro o Alquilo opcionalmente

15 sustituido por uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR o R1 y R2 y R1’ y R2’ forman juntos un doble enlace que contiene grupo =B y =B’ respectivamente.

■ B y B’ son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquenilo que está opcionalmente sustituido 20 con uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR o B y B’ representan un átomo de oxígeno.

Preferiblemente, B=B’.

Más preferiblemente, B=B’= =CH2 o =CH-CH3,

■ A, A’ son iguales o diferentes y se eligen independientemente de: Alquilo o Alquenilo, estando cada uno opcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo.

25 Preferiblemente, A=A’.

Más preferiblemente, A=A’=alquilo lineal no sustituido.

Preferiblemente Y=Y’.

Más preferiblemente y=Y’=OAlquilo, más preferiblemente OMetilo.

30 ■ T es -NR- o un arilo, cicloalquilo, heterocíclico, heteroarilo de 4 a 10 miembros, estando cada uno de ellos opcionalmente sustituido con uno o más ligante(s) no escindible(s) y opcionalmente sustituidos con uno o más de Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR.

Preferiblemente, T es un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, más preferiblemente fenilo o piridilo, sustituido con uno o más ligante(s) no escindible(s) y opcionalmente sustituidos con uno o más de Hal, CN, NRR', CF3, R, OR,

35 S(O)qR.

Dicho ligante no escindible se puede describir que comprende una cadena terminada por un grupo ligante. Preferiblemente, dicho ligante no contiene grupos escindibles tales como grupos disulfuro, grupos ácidos lábiles, grupos fotolábiles, grupos lábiles peptidasa y grupos lábiles esterasa. Según la presente invención, dicho ligante contiene grupos no escindibles. El grupo ligante se une preferiblemente a través de una función carbonilo en el 40 extremo terminal de la cadena lateral. La cadena lateral puede ser lineal o ramificada, aromática o heterocíclica. Los

especialistas en la materia pueden identificar fácilmente cadenas laterales adecuadas. Los ligantes preferidos constan de cadenas lineales que contienen funciones solubilizantes tales como: amino, hidroxi, éter, grupos sulfónico y carboxílico.

Los ligantes no escindibles se eligen en la lista siguiente:

-: O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R",, -O(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -O(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)yCOZ'R", -O-fenil-QCOZ'R", -O-furil-QCOZ'R", -O-oxazolil-QCOZ'R", -O-tiazolil-Q COZ'R", -O-tienil-QCOZ'R", -O-imidazolil-QSCOZ'R", -O-piperazin-QCOZ'R",,

-OCO-(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -OCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)yCOZ'R", -OCO-fenil-QCOZ'R", -OCO-furil-QCOZ'R", -OCO-oxazolil-QCOZ'R", -OCO-tiazolil-QCOZ'R", -OCO-tienil-QCOZ'R", -OCO-imidazolil-QCOZ'R", -OCO-piperazin-QCOZ'R", o

-: NR19(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CO(CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u (OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CO NR12 (CR13R14)t (CR17=CR18)(CR15R16)t (OCH2CH2)yCOZ'R", -NR19CO-fenil-QCOZ'R", -NR19CO-oxazolil-QCOZ'R", -NR19CO-tiazolil-QCOZ'R", -NR19CO-tienil-QCOZ'R", -NR19CO-imidazolil-QCOZ'R", -NR19CO-piperazin-QCOZ'R", -NR19CO-piperidin-QCOZ'R", -NR19-fenil-QCOZ'R", -NR19-furil-QCOZ'R", -NR19-oxazolil-QCOZ'R", -NR19-tiazolil-QCOZ'R", -NR19-tienil-QCOZ'R", -NR19-imidazolil-QCOZ'R", -NR19-piperazin-QCOZ'R", -NR19-piperidin-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-fenil-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-oxazolil-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-tiazolil-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-tienil-QCOZ'R", -NR19CO-NR12-piperidin-QCOZ'R",

y más preferiblemente:

donde:

R17 y R18 son H o alquilo,

u es un número entero de 1 a 10 y también puede ser 0,

t es un número entero de 1 a 10 y también puede ser 0,

y es un número entero de 1 a 20 y también puede ser 0.

y - COZ'R" es como se define anteriormente.

De acuerdo con un aspecto preferido, los conjugados de la invención comprenden un agente de unión a la célula unido de forma covalente a uno o más derivados de tomaimicina de fórmula (I) en la que T= arilo sustituido con uno

o más ligante(s) no escindible(s) y sustituido opcionalmente con uno o más Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR, y/o ligante(s) y A, A', U, U', W, W', m, m', n, n', ----, - son como se han definido anteriormente.

5 Según otro aspecto preferido, los conjugados de la invención comprenden un agente de unión a la célula unido de forma covalente a uno o más derivados de tomaimicina de fórmula (I) seleccionado del grupo que consiste en:

! Éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] 10 benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butírico

15 ! éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-metiliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-propanoico

! ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-metiliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenil)-propanoico;

! éster metílico del ácido (2-{2-[2-(2-{3-[3,5-Bis-(7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5,11a-tetrahidro-1H20 benzo[e]pirrolo[1.2-a][1.4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-acético;

! así como su éster de N-hidroxisuccinimida correspondiente

! o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmacéuticamente o las estructuras cristalinas 25 polimórficas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros.

Los derivados preferidos son los de fórmula:

30 donde A, A’, Y, Y’, T, n, n’ son como se han definido anteriormente,

o sus sales farmacéuticamente aceptables, hidratos o sales hidratadas, o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereoisómeros o enantiómeros,

estando dicho derivado unido covalentemente a un agente de unión a las células a través de dicho enlazador.

Preferiblemente, el ligante está unido al agente de unión a la célula por una función reactiva por, por ejemplo, 35 funciones tiol y amino del agente de unión a la célula que va de enlaces disulfuro reducidos y restos lisina respectivamente.

Más particularmente, dicho derivado está unido por el grupo –CO- a la función amino del resto lisina de dicho agente de unión a la célula, de manera que se forme un enlace amido.

Los agentes de unión a la célula pueden ser de cualquier tipo e incluyen péptidos y no péptidos. En general, pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales) o un fragmento de un anticuerpo que contenga al menos un sitio de unión, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina) o cualquier otra molécula o sustancia que se une a células. Los ejemplos más específicos de agentes que se unen a células que se pueden usar incluyen: anticuerpos monoclonales; anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanizados; anticuerpos totalmente humanos; anticuerpos monocatenarios; fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', F(ab') 2 y Fv {Parham, 131 J. Immunol. 2.895-2.902 (1.983); Spring et al, 113 J. Immunol. 470-478 (1.974); Nisonoff et al, 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (1960)}; interferones; péptidos; linfocinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; hormonas tales como insulina, TRH (hormonas liberadoras de tirotropina), MSH (hormona estimuladora de melanocitos), hormonas esteroideas, tales como andrógenos y estrógenos; factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGFα, factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF y GM-CSF {Burgess, 5 Immunology Today 155-158 (1.984)}; vitaminas, tales como folato y transferrina {O'Keefe et al, 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1.985)}.

La expresión “agente de unión a las células” incluida en este documento también incluye agentes de unión a las células modificados, donde dicho agente de unión a las células se modifica por un agente de modificación para mejorar la reactividad de dicho agente de unión a las células con el grupo de unión del enlazador del derivado de tomaimicina.

La tecnología de los anticuerpos monoclonales permite la producción de agentes que se unen a células extremadamente selectivos en forma de anticuerpos monoclonales específicos. Son particularmente bien conocidas en la técnica las técnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos por inmunización de ratones, ratas, hámsters o cualquier otro mamífero con el antígeno de interés tal como la célula diana intacta, antígenos aislados a partir de la célula diana, virus enteros, virus enteros atenuados y proteínas virales tales como proteínas de la cubierta viral.

La selección del agente que se une a células apropiado se elige dependiendo de la población celular particular que se vaya a fijar como diana, pero en general se prefieren los anticuerpos monoclonales si está disponible uno apropiado.

Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG1 murino que se une específicamente al antígeno CD33 {J. D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)} y puede usarse si las células diana expresan CD33 como en la enfermedad de la leucemia mielógena aguda (AML). De manera similar, el anticuerpo monoclonal anti-B4 es una IgG1 murina que se une al antígeno CD19 en células B {Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)} y puede usarse si las células diana son células B o células enfermas que expresan este antígeno tal como en linfoma no-Hodgkin o leucemia linfoblástica crónica. Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos MY9 y anti-B4 pueden ser murinos, quiméricos, humanizados o totalmente humanos.

Además, GM-CSF que se une a las células mieloides puede usarse como agente que se une a células para unirse a células enfermas de la leucemia mielógena aguda. IL-2, que se une a células T activadas, puede usarse para la prevención del rechazo de injertos trasplantados, para la terapia y prevención de la enfermedad de injerto contra el anfitrión y para el tratamiento de la leucemia aguda de células T. MSH, que se une a los melanocitos, puede usarse para el tratamiento de melanoma.

Las moléculas conjugadas de la invención pueden formarse usando cualquier técnica. Los derivados de tomaimicina de la invención pueden estar unidos a un anticuerpo u otro agente de unión a la célula por una función de tipo amida. Preferiblemente, los derivados se sintetizan para que contengan una función carboxílica y después uno o más derivados que contienen ácido carboxílico están unidos cada uno mediante enlaces covalentes al agente de unión a la célula por un enlace amido.

Son conjugados representativos de la invención anticuerpo-derivado de tomaimicina, fragmento de anticuerpoderivado de tomaimicina, factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés)-derivado de tomaimicina, hormona estimuladora de melanocitos (MSH, por sus siglas en inglés)-derivado de tomaimicina, hormona estimuladora del tiroides (TSH, por sus siglas en inglés)-derivado de tomaimicina, estrógeno-derivado de tomaimicina, análogo de estrógeno-derivado de tomaimicina, andrógeno-derivado de tomaimicina, análogo de andrógeno-derivado de tomaimicina y folato-derivado de tomaimicina. Los conjugados se pueden purificar por HPLC

o por filtración en gel.

Preferiblemente, los conjugados anticuerpo monoclonal -o agente de unión a la célula -derivado de tomaimicina, son los que están unidos mediante un enlace amido, como se ha indicado anteriormente, que son capaces de liberar los derivados de tomaimicina. Se pueden preparar conjugados usando derivados de N-hidroxisuccinimida de la función carboxílica en el terminal del ligante de dímeros de tomaimicina. Por este método se preparan fácilmente conjugados que contienen 1 a 10 fármacos derivados de tomaimicina unidos por un enlace amido.

Más específicamente, se trata una disolución de anticuerpo huB4 en una concentración de 8 mg/ml, en un tampón acuoso que contiene fosfato de potasio 0,05 M, cloruro de sodio 0,05 M y ácido etilendiaminotetra-acético (EDTA) 2 mM a pH 8 con un exceso molar de 5 veces de una disolución del derivado N-hidroxisuccinimida de un dímero de

tomaimicina en dimetilformamida (DMA) tal que la concentración final de DMA en el tampón es 20 %. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 70 min. El conjugado anticuerpo - derivado de tomaimicina se purifica y se libera del fármaco sin reaccionar y otro material de bajo peso molecular por filtración en gel a través de una columna de Sephadex G-25 o Sephacryl S300 o Superdex 200. También se puede dializar la muestra durante la noche en un tampón de pH 6,5 para purificar además el producto. El número de restos de derivado de tomaimicina unidos por molécula de anticuerpo se puede determinar midiendo la relación de la absorbancia a 320 nm y a 280 nm. Por este método se pueden unir mediante un enlace amido un promedio de 1-10 moléculas de derivado de tomaimicina/molécula de anticuerpo.

El efecto de la conjugación sobre la afinidad de unión por las células que expresan el antígeno se puede determinar utilizando los métodos descritos previamente por Liu et al., 93 Proc. Natl. Acad. Sci 8618-8623 (1.996). La citotoxicidad de los derivados de tomaimicina y sus conjugados de anticuerpo para líneas celulares se puede medir por retro-extrapolación de las curvas de proliferación celular, como se describe en Goldmacher et al., 135 J. Immunol. 3648-3651 (1.985). La citotoxicidad de estos compuestos contra líneas de células adherentes se puede determinar por ensayos clonogénicos, como se describe en Goldmacher et al., 102 J. Cell Biol. 1.312-1.319 (1.986).

Son conjugados representativos de la invención los derivados de tomaimicina con anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), hormona estimuladora de melanocitos (MSH), hormona estimuladora del tiroides (TSH), estrógenos, análogos de estrógenos, andrógenos y análogos de andrógenos.

A continuación se describen ejemplos representativos de la preparación de diversos conjugados de derivados y agentes de unión a la célula.

Ligantes de amida: Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG1 murino que se une específicamente al antígeno CD33 {J. D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)} y puede usarse si las células diana expresan CD33 como en la enfermedad de la leucemia mielógena aguda (AML). De manera similar, el anticuerpo monoclonal anti-B4 es una IgG1 murina que se une al antígeno CD19 en células B {Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)} y puede usarse si las células diana son células B o células enfermas que expresan este antígeno tal como en linfoma no-Hodgkin o leucemia linfoblástica crónica.

El anticuerpo u otro agente de unión a la célula se hace reaccionar con el derivado del ácido de la N-hidroxisuccinimida para producir un conjugado unido a amida.

Los conjugados preparados por los métodos anteriores pueden purificarse por técnicas de cromatografía convencionales tales como exclusión por tamaño, cromatografía de adsorción incluyendo, pero no limitándose a, intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxiapatito cerámico o en Porapak o por HPLC. También puede usarse la purificación por diálisis o diafiltración.

Preferiblemente, los conjugados entre anticuerpos monoclonales o agentes de unión a la célula y derivados de la presente invención son los que se unen a través de un enlace amido, como se ha descrito anteriormente. Dichos conjugados de unión a la célula se preparan por métodos conocidos tales como la modificación de moléculas de fármacos unibles que poseen una función carboxílica para conseguir el derivado de ácido de la N-hidroxisuccinimida. Los grupos carboxílicos activados resultantes acilan después los restos que contienen lisina del anticuerpo para producir conjugados unidos a amida. Por este método se preparan fácilmente conjugados que contienen de 1 a 10 derivados unidos por un puente amido.

De acuerdo con un aspecto preferido, el agente de unión a la célula es un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal.

De acuerdo con otro aspecto preferido, el agente de unión a las células es un fragmento de anticuerpo con especificidad de antígeno, tal como sFV, Fab, Fab', o F(ab')2.

De acuerdo con otro objetivo, la presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula conjugada de la invención o un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se describe un método para eliminar o inhibir el crecimiento de las células, preferiblemente poblaciones celulares seleccionadas, que comprende poner en contacto las células diana o el tejido que contiene células diana con una cantidad eficaz de la composición farmacéutica según la invención.

Las poblaciones celulares seleccionadas son las células cancerosas y/o proliferativas. Se describe un método para el tratamiento, preferiblemente tratamiento selectivo, de cáncer que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica según la invención a un paciente con necesidad de la misma.

“Tratamiento selectivo del cáncer” se refiere a la destrucción de células cancerosas y/o proliferativas sustancialmente sin destruir células normales y/o no proliferativas.

De acuerdo con otro objetivo, la presente invención también se refiere al uso de una molécula conjugada de la invención o un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cánceres.

El método para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas puede ponerse en práctica in vitro, in vivo o ex vivo.

Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de cultivos celulares para destruir todas las células excepto variantes deseadas que no expresen el antígeno diana o para destruir las variantes que expresen un antígeno no deseado.

Las condiciones de uso in vitro no clínico se determinan fácilmente por el experto en la técnica.

Los ejemplos de usos ex vivo incluyen tratamientos de médula ósea autóloga antes de su trasplante en el mismo paciente para destruir células enfermas o malignas; tratamientos de médula ósea antes de su trasplante para destruir células T competentes y prevenir la enfermedad de injerto contra el anfitrión (GVHD).

El tratamiento ex vivo clínico para eliminar células tumorales o células linfoides de médula ósea antes del trasplante autólogo en el tratamiento de cáncer o en el tratamiento de enfermedad autoinmune o para eliminar células T y otras células linfoides de médula ósea o de tejido alogénico antes del trasplante para prevenir la GVHD, puede realizarse como se indica a continuación. Se recoge médula ósea del paciente u otro individuo y después se incuba en un medio que contiene suero al que se añade el agente citotóxico de la invención, en un intervalo de concentraciones de aproximadamente 10 μM a 1 pM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37 °C. Las condiciones exactas de concentración y tiempo de incubación (= dosis) se determinan fácilmente por el experto en la técnica. Después de la incubación, las células de la médula ósea se lavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente por infusión i.v. según métodos conocidos. En circunstancias en las que el paciente recibe otro tratamiento tal como un curso de quimioterapia ablativa o irradiación de todo el cuerpo entre el momento de la recolección de la médula y la reinfusión de las células tratadas, las células de médula ósea tratadas se conservan congeladas en nitrógeno líquido usando un equipo médico estándar.

Para uso in vivo clínico, el agente citotóxico de la invención se suministrará como disoluciones que se ensayan con respecto a la esterilidad y con respecto a los niveles de endotoxinas o como un sólido liofilizado que puede redisolverse en agua estéril para inyección. A continuación se proporcionan ejemplos de protocolos adecuados de administración de conjugados. Los conjugados se administran semanalmente durante 6 semanas como un bolo i.v. Las dosis de bolo se administran en 50 a 400 ml de disolución salina normal a la que puede añadirse albúmina de suero humano (por ej., de 0,5 a 1 ml de una disolución concentrada de albúmina de suero humano, 100 mg/ml). Las dosificaciones serán de aproximadamente 50 μg a 10 mg/kg de peso corporal por semana, i.v. (intervalo de 10 μg a 100 mg/kg por inyección). Seis semanas después del tratamiento, el paciente puede recibir un segundo tratamiento. El experto en la técnica puede determinar los protocolos clínicos específicos con respecto a la ruta de administración, excipientes, diluyentes, dosificaciones, tiempos, etc., cuando lo justifique la situación clínica.

Los ejemplos de condiciones médicas que pueden tratarse de acuerdo con los métodos in vivo o ex vivo de destrucción de poblaciones celulares seleccionadas incluyen tumor maligno de cualquier tipo incluyendo, por ejemplo, cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, ovarios y órganos linfáticos; melanomas; enfermedades autoinmunes, tales como lupus sistémico, artritis reumatoide y esclerosis múltiple; rechazos de injerto tales como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante hepático, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardíaco y rechazo de trasplante de médula ósea; enfermedad del injerto frente al anfitrión; infecciones víricas tales como infección por CMV, infección por VIH, SIDA etc.; infección bacteriana e infecciones parasitarias tales como giardiasis, amebiasis, esquistosomiasis y otras, como determine un experto en la técnica.

La identificación de los pacientes que necesitan tratamiento de las enfermedades y afecciones descritas en este documento está bien dentro de la capacidad y conocimiento del especialista en la técnica. Un veterinario o un médico especialistas en la técnica pueden identificar fácilmente, por medio del uso de ensayos clínicos, examen físico, historia médica/familiar o ensayos biológicos y diagnósticos, los sujetos que necesitan dicho tratamiento.

Una cantidad terapéuticamente eficaz puede determinarse fácilmente por el médico a cargo del caso, como especialista en la materia, por medio del uso de técnicas convencionales y observando los resultados obtenidos en circunstancias análogas. Para determinar la cantidad terapéuticamente eficaz, el médico a cargo del diagnóstico considera varios factores que incluyen, pero no se limitan a: la especie de sujeto; su tamaño, edad y salud general; la enfermedad específica implicada; el grado de complicación o la gravedad de la enfermedad; la respuesta del sujeto individual; el compuesto particular administrado; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; el régimen posológico seleccionado; el uso de medicación concomitante; y otras circunstancias relevantes.

La cantidad de un compuesto de fórmula (I) o conjugado que se requiere para conseguir el efecto biológico deseado variará dependiendo de varios factores que incluyen las características químicas (por ejemplo, hidrofobia) de los

5 compuestos empleados, la potencia de los compuestos, el tipo de enfermedad, la especie a la que pertenece el paciente, el estado de enfermedad del paciente, la vía de administración, la biodisponibilidad del compuesto por la vía elegida, todos los factores que dictan las cantidades de dosificación requeridas, la liberación y el régimen que se va a administrar.

"Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no

10 producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción desfavorable cuando se administran a un animal o a un ser humano, según sea apropiado.

Como se usa en este documento, “excipiente farmacéuticamente aceptable” incluye cualquier soporte, diluyente, adyuvante o vehículo, tales como agentes conservantes o antioxidantes, cargas, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, disolventes, medios de dispersión, revestimientos,

15 agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y para retrasar la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que algún medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se considera su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios como combinaciones terapéuticas adecuadas.

20 En el contexto de la invención, el término “tratar” o "tratamiento", como se usa en este documento, significa invertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o la afección a la que se aplica tal término, o uno o más síntomas de dicho trastorno o afección.

“Cantidad terapéuticamente eficaz” significa una cantidad de un compuesto/medicamento de acuerdo con la presente invención eficaz para prevenir o tratar el estado patológico al que se hace referencia en este documento.

25 De acuerdo con la invención, el término “paciente” o “paciente que lo necesita" pretende hacer referencia a un animal o un ser humano que padece o que probablemente padecerá uno de los estados patológicos a los que se hace referencia en este documento. Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En términos generales, los compuestos de esta invención pueden proporcionarse en una solución acuosa de tampón fisiológico que contiene de 0,1 a 10 % p/v de compuesto para administración parenteral. Los intervalos de las dosis 30 típicas son de 1 μg/kg a 0,1 g/kg de peso corporal al día; un intervalo de dosis preferido es de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal al día o una dosis equivalente en un niño. La dosificación preferida de fármaco a administrar probablemente dependerá de variables tales como el tipo y grado de progresión de la enfermedad o trastorno, el estado de salud general del paciente particular, la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado, la formulación del compuesto, la vía de administración (intravenosa, intramuscular u otra), las propiedades

35 farmacocinéticas del compuesto por la vía de administración elegida y la velocidad (embolada o infusión continua) y el programa de administración (número de repeticiones en un periodo de tiempo dado).

Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse en formas de dosificación unitarias, donde el término “dosis unitaria” significa una sola dosis que puede administrarse a un paciente, y que puede manipularse y envasarse fácilmente, permaneciendo como una dosis unitaria física y químicamente estable que comprende el 40 propio compuesto activo, o como una composición farmacéuticamente aceptable, como se describe más adelante en este documento. Como tales, los intervalos típicos de las dosis diarias totales son de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal. A modo de pauta general, las dosis unitarias para los seres humanos varían de 1 mg a 3000 mg al día. Preferiblemente, el intervalo de dosis unitaria es de 1 a 500 mg administrados de una a seis veces al día, e incluso más preferiblemente de 10 mg a 500 mg una vez al día. Los compuestos proporcionados en este documento pueden

45 formularse en composiciones farmacéuticas por medio de su mezcla con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones de dosis unitarias pueden prepararse para uso por administración oral, particularmente en forma de comprimidos, cápsulas sencillas o cápsulas de gel blando; o por vía intranasal, particularmente en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles; o por vía dérmica, por ejemplo, tópicamente o en pomadas, cremas, lociones, geles o pulverizaciones, o por medio de parches transdérmicos.

50 Las composiciones pueden administrarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª ed.; Ed. Gennaro, A. R.; Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia, PA, 2.000.

Las formulaciones preferidas incluyen composiciones farmacéuticas en las que un compuesto de la presente 55 invención se formula para administración oral o parenteral.

Para la administración oral, los comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas, trociscos y similares pueden contener uno o más de cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como

celulosa microcristalina o goma de tragacanto; un diluyente tal como almidón o lactosa; un disgregante tal como almidón y derivados de celulosa; un lubricante tal como estearato de magnesio; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta o salicilato de metilo. Las cápsulas pueden estar en forma de una cápsula dura o una cápsula blanda, que generalmente se preparan a partir de mezclas de gelatina opcionalmente combinadas con plastificantes, así como una cápsula de almidón. Además, Las formas de dosificación unitarias pueden contener otros diversos materiales que modifican la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, recubrimientos de azúcar, goma laca o agentes entéricos. Otras formas de dosificación orales tales como jarabes o elixires pueden contener agentes edulcorantes, conservantes, tintes, colorantes y aromatizantes. Además, los compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de disolución rápida, de liberación modificada o de liberación sostenida, siendo preferiblemente dichas formulaciones de liberación sostenida bimodales. Los comprimidos preferidos contienen lactosa, almidón de maíz, silicato de magnesio, croscarmelosa sódica, povidona, estearato de magnesio o talco en cualquier combinación.

Las preparaciones líquidas para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones, acuosas o no acuosas, estériles. Las composiciones líquidas también pueden incluir aglutinantes, tampones, conservantes, agentes quelantes, agentes edulcorantes, saporíferos y colorantes, y semejantes. Los disolventes no acuosos incluyen: alcoholes, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen mezclas de alcoholes y agua, medios tamponados y disolución salina. En particular, pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación de los compuestos activos, los polímeros biocompatibles y biodegradables de lactida, copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno. Los vehículos intravenosos pueden incluir reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y semejantes. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles para estos compuestos activos incluyen partículas de copolímero etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas.

Los modos alternativos de administración incluyen formulaciones para inhalación, que incluyen medios tales como polvo seco, aerosol o gotas. Pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietileno-9-lauril éter, glicocolato y desoxicolato, o soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales, o como un gel para aplicación intranasal. Las formulaciones para administración bucal incluyen, por ejemplo, grageas o pastillas y también pueden incluir una base aromatizada, tal como sacarosa y goma arábiga, y otros excipientes tales como glicocolato. Las formulaciones adecuadas para administración rectal preferiblemente se presentan como supositorios de una sola dosis, con un vehículo sólido, tal como manteca de cacao, y pueden incluir un salicilato. Las formulaciones para aplicación tópica a la piel preferiblemente toman la forma de una pomada, crema, loción, pasta, gel, pulverización, aerosol o aceite. Los vehículos que pueden usarse incluyen parafina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes o sus combinaciones. Las formulaciones adecuadas para administración transdérmica pueden presentarse como parches discretos y pueden ser emulsiones lipófilas o soluciones acuosas tamponadas, disueltas y/o dispersas en un polímero o un adhesivo.

FIGURAS

La Figura 1 representa la citotoxicidad in vitro del derivado de éster metílico del compuesto del ejemplo 1.

La Figura 2 representa la citotoxicidad in vitro del derivado de éster metílico del compuesto del ejemplo 2.

La Figura 3 representa la potencia de citotoxicidad in vitro de los compuestos 8 y 9 del ejemplo 3.

La Figura 4 representa el análisis espectral de masa de huMy9-6-IGP08 desglicosilado (compuesto 9 del ejemplo 3) (Fármacos/Anticuerpo=4,2).

La Figura 5 representa las propiedades de unión comparativas de huMy9-6 y huMy9-6-IGP08 desnudo (compuesto 9 del ejemplo 3) al antígeno CD33.

La Figura 6 representa la potencia de citotoxicidad in vitro de huB4-IGP08 (compuesto 9 del ejemplo 3) frente a células Ramos y HL60/QC.

La Figura 7 representa el análisis espectral de masas de huB4-IGP08 desglicosilado (compuesto 9 del ejemplo 3) (Los picos a la derecha de los picos principales se deben a las variantes Lys C-terminales).

La Figura 8 muestra las propiedades de citotoxicidad de huB4-IGP08 (compuesto 9 del ejemplo 3) frente a las células BJAB, Ramos y MOLT-4.

La Figure 9 representa las propiedades de unión comparativas de huB4 y huB4-IGP08 desnudos (compuesto 9 del ejemplo 3).

La invención se ilustra adicionalmente pero sin restricción por la descripción de los siguientes ejemplos.

Parte experimental

Método A1: Cromatografía Líquida de Alta Resolución -Espectrometría de Masas (LCMS)

Se usa un software Micromass MassLynx y el análisis se realiza en un HPLC Waters Alliance con una columna WATERS XBridge C18 de 3,5 μm (100 x 3 mm) usando un gradiente de elución con una mezcla de (A) metanol y (B)

5 agua/ácido fórmico al 0,1% (gradiente: 5% de A: 95% de B hasta 95% de A: 5% de B durante 10 minutos, 95% de A: 5% de B disminuyendo a 5% de A: 95% de B durante 1 minuto, 5% de A: 95% de B durante 2 minutos) con un caudal de 1,1 ml/minuto; espectrómetro Waters-Micromass Plataforma II con Electronebulización (ionización positiva y negativa); Serie de Diodos en línea (190-500 nm); detector auxiliar Sedere (Francia) detector Evaporativo de Luz Dispersa (ELS) Modelo SEDEX 85.

10 Método A2: Cromatografía Líquida de Alta Resolución - Espectrometría de Masas (LCMS)

Se usa un software Micromass MassLynx y el análisis se realiza en un HPLC Agilent 1100 series con una columna XBridge C18 de 2,5 μm (50 x 3 mm) usando un gradiente de elución con una mezcla de (A) acetonitrilo y (B) agua/ácido fórmico al 0,1% (gradiente: 5% de A: 95% de B hasta 100% de A durante 5 minutos, 100% de A durante 0,5 minutos, 100% de A disminuyendo a 5% de A: 95% de B durante 1 minuto, 5% de A: 95% de B durante 0,5

15 minutos) con un caudal de 1,1 ml/minuto; espectrómetro Waters-Micromass ZQ con Electrospray (ionización positiva y negativa); Serie de Diodos en línea (210-254 nm).

Método B: Espectro de Resonancia Magnética Nuclear de 1H (RMN)

Los espectros de RMN de 1H se registraron o en un espectrómetro BRUKER AVANCE DRX -500, un BRUKER AVANCE DRX -400 o un espectrómetro BRUKER AVANCE DRX -300. Se registraron LOS espectros de RMN de

20 13C indicados en un espectrómetro BRUKER AVANCE DRX -300

Método D: Espectro de masas por Ionización Química (CI, por sus siglas en inglés)

Los espectros de masas CI se registraron usando un espectrómetro de masas FINNIGAN SSQ 7000 (amoníaco)

Ejemplo 1 : Se puede preparar ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butírico como sigue:

A una disolución de éster metílico del ácido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butírico (60 mg) en tetrahidrofurano (0,9 ml) se añadió metanol (0,3 ml), agua (0,3 ml) y una disolución acuosa de hidróxido de litio (1 M, 87 μl). Después de 3 horas, se diluyó la mezcla de reacción con agua (10 ml) y se ajustó el pH a 2 por adición de una disolución acuosa de ácido

30 clorhídrico 1 N. La fase acuosa se extrajo tres veces con diclorometano (10 ml) y las disoluciones orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío para dar un residuo. El residuo se purificó por cromatografía de gel de sílice (Merck SuperVarioFlash columna de 10g, SiOH 15-40 μm), eluido con una mezcla de diclorometano / metanol / ácido acético (100 : 4: 0,5) para proporcionar ácido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7dimetoxi-1,2,3,11 a-tetrahidro-pirrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butírico :

LC/MS (Método A2):: ES : m/z = 749 MH+

: m/z = 375 (M + 2H)2+ /2

: Tiempo de retención = 3,7 min

1H R.M.N. (400 MHz, DMSO-d6, δ en ppm): δ = 1,69 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 1,95 (m, 2H) ; 2,39 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 2,91 (m, 2H) ; 3,05 (m, 2H) ; 3,83 (s, 6H); 3,98 (m, 2H) ; 4,01 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,10 (m, 4H) ; 5,11 (d, J = 12.5 Hz, 2H) ; 5,20 (d, J = 12.5 Hz, 2H) ; 5,55 (m, 2H) ; de 6,90 a 7,15 (m, 5H) ; 7,34 (s, 2H); 7,77 (m, 2H) ; 12,1 (m ancho, 1H).

Se puede preparar éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro40 pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butírico como sigue :

A una disolución enfriada (0ºC) de éster metílico del ácido 4-(3,5-bis-(hidroximetil-fenoxi)-butírico (50 mg) y trietilamina (110 μl) en tetrahidrofurano (tetrahidrofurano) (1,4 ml) se le añadió cloruro de metanosulfonilo (46 μl). Después de 1 hora, la mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (10 ml) y se lavó dos veces con agua (5 ml). 5 La disolución orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para dar un residuo. Se purificó el residuo por cromatografía sobre gel de sílice (columna de Merck SuperVarioFlash 10 g; SiOH 15-40 μm), usando elución en gradiente con una mezcla de metanol (A)/diclorometano (B), (gradiente : 100% de B disminuyendo a 5% de A: 95% de B) para dar 71,8 mg del compuesto dimesilato. A una mezcla de tomaimicina (80 mg), yoduro de potasio (49 mg), carbonato de potasio (122 mg) en dimetiformamida (dimetilformamida) (1 ml), se añadió una 10 disolución del compuesto di-mesilato (71,8 mg) en dimetiformamida (1,6 ml). Se agitó la mezcla de reacción durante 16 h, a 30ºC. Se añadió agua (12 ml) y se filtró el sólido resultante, se lavó con agua y se secó al vacío para dar un residuo. Se purificó el residuo por cromatografía sobre gel de sílice (columna de Merck SuperVarioFlash 30 g; SiOH 15-40 μm), usando elución en gradiente con una mezcla de metanol (A)/diclorometano (B), (gradiente : 100% de B disminuyendo a 5% de A: 95%B) para dar éster metílico del ácido (4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi

15 1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butírico (65,4 mg):

LC/MS (Método A2):: ES : m/z = 763 MH+

: m/z = 382 (M + 2H)2+ /2

: Tiempo de retención = 4,0 min

1H R.M.N. (500 MHz, CDCl3-d1, δ en ppm) : δ = 1,75 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 2,11 (m, 2H); 2,53 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 2,98 (m, 4H) ; 3,69 (s, 3H); 3,89 (m, 2H); 3,97 (s, 6H); 4,00 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,28 (s ancho, 4H) ; 5,12 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,19 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,61 (m, 2H); 6,82 (s, 2H); 6,92 (s, 2H); 7,06 (s, 1 H); 7,52 (s, 2H); 7,64 (d, J = 4,5

20 Hz, 2H).

Se puede preparar éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-butírico como sigue :

A una disolución de 3,5-bis-hidroximetilfenol (Felder, D.; Gutiérrez Nava, M.; del Pilar Carreon, M.; Eckert, J. F.; Luccisano, M.; Schall, C.; Masson, P.; Gallani, J. L.; Heinrich, B.; Guillon, D.; Nierengarten, J. F. Helv. Chimica Acta 25 2.002, 85, 288) (200 mg), yoduro de potasio (50 mg) y carbonato de potasio (540 mg) en tetrahidrofurano (2,5 ml) se añadió éster metílico del ácido 4-bromo-butírico (400 l). Se agitó la mezcla de reacción durante 20 h a temperatura ambiente después se separó por filtración la parte insoluble. Se concentró el líquido filtrado a vacío y se purificó el residuo por cromatografía sobre gel de sílice (columna de Merck SuperVarioFlash 30 g; Si60 15-40 m); usando elución en gradiente con una mezcla de metanol (A)/ diclorometano (B); (gradiente : 100% de B disminuyendo a 5%

30 de A: 95%B) para dar éster metílico del ácido 4-(3,5-bis-hidroximetil-fenoxi)-butírico (53,5 mg) : 1H R.M.N. (400 MHz, DMSO-d6, δ en ppm): δ = 1,96 (m, 2H) ; 2,47 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 3,61 (s, 3H); 3,96 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,43 (d, J = 6.0 Hz, 4H) ; 5,11 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ; 6,71 (s, 2H); 6,82 (s, 1 H).

LC/MS (Método A2):: ES : m/z = 255 MH+

: m/z = 237 (M+H -H2O)+

: Tiempo de retención = 2,5 min

Ejemplo 2 : ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin-5ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acético:

Se puede preparar ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acético siguiendo el procedimiento para la preparación de ácido 4-(3,5-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butírico empezando con éster metílico del ácido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro

10 pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acético:

LC/MS (Método A2):: ES : m/z = 721 MH+

: m/z = 361 (M + 2H)2+ /2

: Tiempo de retención = 3,5 min

Éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acético

15 El éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acético se puede preparar siguiendo el procedimiento para la preparación del éster metílico del ácido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butírico, partiendo del éster metílico del ácido 4-(3,5-bishidroximetil-fenoxi)-acético:

LC/MS (Método A2):: ES : m/z = 735 MH+

: m/z = 368 (M + 2H)2+ /2

: Tiempo de retención = 3,8 min

20

1H R.M.N. (500 MHz, CDCl3-d1, δ en ppm) : δ = 1,76 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 2,96 (m, 4H) ; 3,78 (s, 3H); 3,88 (m, 2H); 3,97 (s, 6H); 4,27 (s ancho, 4H) ; 4,64 (s, 2H); 5,13 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,19 (d, J = 12.5 Hz, 2H) ; 5,60 (m, 2H) ; 6,80 (s, 2H); 6,96 (s, 2H); 7,11 (s, 1H); 7,53 (s, 2H); 7,63 (d, J = 4,5 Hz, 2H).

25

LC/MS (Método A2):: ES : m/z = 227 MH+

m/z = 209: (M+H -H2O)+

Tiempo de retención = 1,9 min

Éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-acético :

Se puede preparar éster metílico del ácido 4-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-acético siguiendo el procedimiento para la preparación de éster metílico del ácido 4-(3,5-bis-hidroximetil-fenoxi)-butírico, empezando con éster metílico del ácido 4-bromo-acético :

1H R.M.N. (400 MHz, DMSO-d6, δ en ppm): δ = 3,70 (s, 3H) ; 4,43 (d, J = 6.0 Hz, 4H) ; 4,74 (s, 2H); 5,14 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ; 6,72 (s, 2H); 6,88 (s, 1H).

Ejemplo 3 : éster N-hidrosuccinimídico del ácido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-metiliden-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-propanoico

Compuesto 2: A una suspensión de hidruro de litio y aluminio 2,19 g; 54,8 mmoles) en THF anhidro (50 ml) se añadió disolución de 5-bromoisoftalato de dimetilo (9,98 g; 36,5 mmoles) en THF (100 ml) a 0ºC, durante un periodo de 1 h. Después de terminar la adición, se agitó la mezcla a ta durante 2 h. En ese tiempo, se añadieron 150 ml de

THF. Se volvió a enfriar la mezcla a 0ºC y se enfrió rápidamente con NaCl acuoso saturado. Se separó por filtración el precipitado blanco y se lavó además el sólido con THF extra (100 ml). Se secó la disolución de THF combinada con Na2SO4, se filtró y se concentró. La purificación adicional con cromatografía por desorción súbita sobre gel de sílice (95:5 CH2Cl2/CH3OH) proporcionó 2 como un sólido blanco (7,42 g; 95%).

Compuesto 3: Se suspendió compuesto 2 (3,36 g; 15,5 mmoles) en CH2Cl2 anhidro (31 ml). Se añadió TBSCl (5,14 g; 34,1 mmoles), seguido por imidazol (3,16 g; 46,5 mmoles). Se agitó la mezcla a ta durante 1 h. Se separó por filtración el precipitado blanco y se concentró el líquido filtrado con rotavapor. Se purificó el residuo resultante por cromatografía por desorción súbita (gel de sílice, 97:3 hexanos/EtOAc) para dar 3 como aceite incoloro (6,15 g; 89%): 1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ 0,081 (s, 12H), 0,92 (s, 18H), 4,67 (s, 4H), 7,18 (s, 1H), 7,31 (s, 2H).

Compuesto 4: Un matraz que contiene compuesto 3 (4,16 g; 9,36 mmoles), acrilato de metilo (1,3 ml; 14,0 mmoles), Pd(OAc)2 (105 mg; 0,47 mmoles); P(o-tolil)3 (285 mg; 0,94 mmoles) y Et3N (9 ml) en 19 ml de CH3CN se calentó para hacerlo hervir a reflujo en atmósfera de argón, durante 16 h. Después de enfriar a ta, se añadió H2O de hielo (20 ml). Se extrajo la mezcla con EtOAc (3 x 40 mL). Se lavaron las capas orgánicas combinadas con HCl 1 N, salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. La purificación adicional del residuo con cromatografía por desorción súbita (gel de sílice, hexanos/EtOAc 97:3) para dar 4 como aceite incoloro (3,91 g; 93%): 1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ 0,089 (s, 12H), 0,93 (s, 18H), 3,79 (s, 3H), 4,72 (s, 4H), 6,41 (d, J = 12 Hz, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,34 (s, 2H), 7,68 (d, J = 12 Hz, 1H). EIMS m/z 473 ([M]+Na).

Compuesto 5: Se hidrogenó la mezcla de 4 (2,54 g; 5,63 mmoles) y Pd/C (563 mg) en 55 ml de EtOAc a presión atmosférica, durante 30 min. Después se hizo pasar la disolución por celite, se lavó el sólido con EtOAc extra (25 ml). Se concentraron las disoluciones de EtOAc combinadas para proporcionar 5 como aceite incoloro (2,55 g; 99+%), que es suficientemente puro para la siguiente etapa. 1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ 0,067 (s, 12H), 0,91 (s, 18H), 2,60 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,92 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,65 (s, 3H), 4,68 (s, 4H), 7,00(s, 2H), 7,12 (s, 1 H). EIMSm/z 475 ([M]++Na).

Compuesto 6: A una disolución de 5 (1,48 g; 3,28 mmoles) en THF anhidro (33 ml) se añadieron 8,2 ml de disolución 1 M de TBAF en THF, a 0ºC. Después de agitar a esta temperatura durante 1 h, se añadió NH4Cl acuoso saturado (30 ml) a la mezcla. Se extrajo la mezcla con EtOAc (3 x 40 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. La purificación adicional del residuo por cromatografía por desorción súbita (gel de sílice, CH2Cl2/CH3OH 95:5) da 6 como aceite incoloro (625 mg; 85%), que se solidifica después de dejarlo reposar en el refrigerador. 1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ 2,59 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,91 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,63 (s, 3H), 4,61 (s, 4H), 7,08 (s, 2H), 7,16 (s, 1H).

Compuesto 7: Se disolvió el diol 6 (59 mg; 0,26 mmoles) en CH2Cl2 (2,6 ml). Se enfrió la disolución a 0ºC y se trató con Et3N (82 μl; 0,58 mmoles) y MsCl (46 μl; 0,58 mmoles). Se agitó la mezcla a 0ºC durante 30 min y se enfrió rápidamente con H2O de hielo (2 ml). Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo además con CH2Cl2 (3 x 2 ml). Se lavaron con salmuera las capas de diclorometano combinadas, se secó con Na2SO4 y se concentró. Además secado con bomba de alto vacío proporcionó 7 como aceite amarillo pálido, que se usó inmediatamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Compuesto 8: A una mezcla de monómero de PBD (165 mg; 0,64 mmoles) y 7 (se asume que es 0,26 mmoles) en DMF (2,7 ml) se añadió K2CO3 (147 mg; 1,06 mmoles), KI (22 mg; 0,13 mmoles) y Bu4NI (49 mg; 0,13 mmoles) secuencialmente. Se agitó la mezcla en argón a ta, durante 7 h. Después se retiró DMF con alto vacío. Se repartió el residuo entre diclorometano y agua y se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo además con CH2Cl2 (3 x 3 ml). Las capas de CH2Cl2 combinadas se lavaron con salmuera, se secó (Na2SO4) y se concentró. La purificación del residuo con cromatografía sobre gel de sílice (CH2Cl2/CH3OH, 25:1) proporcionó 8 como sólido similar a vidrio amarillo pálido (101 mg; 54%). EIMS m/z 763 ([M]++Na+2H2O), 745 ([M]++Na+H2O), 727 ([M]++Na).

Compuesto 9: A una disolución agitada de éster 8 metílico (16 mg; 0,023 mmoles) en THF-MeOH-H2O (3:1:1; 0,45 ml) se añadió LiOH ac. 1 M (0,025 ml; 1,1 eq.) a ta y se controló la reacción por TLC. Después de 3,5 h, se diluyó la mezcla con H2O (5 ml) y se ajustó el pH a 2 con HCl 1 N. Después se extrajo la mezcla con CH2Cl2 (3 X 5 ml). Las capas combinadas de CH2Cl2 se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. La purificación adicional por cromatografía por desorción súbita sobre gel de sílice (CH2Cl2:MeOH:AcOH = 100:4:0,5) proporcionó el ácido 9 deseado (8,2 mg; 60% brsm); EIMS m/z 749 ([M]++Na+2H2O); 731 ([M]++Na+H2O); 713 ([M]++Na); más una pequeña cantidad (~ 2 mg) de éster 8 metílico.

Compuesto 10: A una disolución de ácido 9 (8,2 mg, 0,011 mmol) en CH2Cl2 (1 mL) se añadió poli-DCC (38 mg, 0,059 mmol) y NHS (2,7 mg, 0,024 mmol). Se agitó la mezcla a ta, durante 2 h, después se filtró por un pequeño lecho de celite, se lavó con CH2Cl2, se concentró. Se purificó el residuo resultante por cromatografía por desorción súbita (CH2Cl2:MeOH/100:3) para proporcionar el producto 10 deseado (7 mg; 81 %). EIMS m/z 874 ([M]++Na+2MeOH); 842 ([M]++Na+MeOH); 810 ([M]++Na).

Ejemplo 4: éster metílico del ácido (2-{2-[2-(2-{3-[3,5-Bis-(7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5,11a-tetrahidro-1Hbenzo[e]pirrolo[1.2-a][1.4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-acético;

Compuesto 12: Se añadió NaOH acuoso (50%; 6,9 mL) a tetraetilenglicol (68,08 g; 350 mmoles). Se agitó la mezcla

5 a ta, durante 2 h, seguido por adición de yoduro de alilo (8 mL; 87,6 mmoles). Después de agitar durante otras 24 h, se repartió la mezcla entre H2O y EtOAc (50/50 mL). La capa acuosa se extrajo de nuevo con EtOAc (5 x 30 mL). Se secaron las capas de EtOAc combinadas sobre Na2SO4 y se concentró. La cromatografía por desorción súbita del residuo (gel de sílice, hexanos:EtOAc 4:6 a 0:1) proporcionó 12 como aceite incoloro: 1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ 2,44 (br s, 1H), 3,63 - 3,71 (m, 16H), 3,99 -4,01 (m, 2H), 5,13 -5,17 (m, 1 H), 5,22 -5,27 (m, 1 H), 5,84 - 5,92 (m,

10 1 H); 13CNMR δ 61,8, 69,4, 70,4, 70,59, 70,61, 70,63, 72,2, 72,5, 117,0, 134,8. EIMS mlz 257 ([M]++Na).

Compuesto 13: A una suspensión de NaH (89 mg; 2,2 mmoles) en THF anhidro (2,5 ml) se le añade una disolución de 12 (370 mg; 1,58 mmoles) en THF (5 ml) a 0ºC, en argón. Se agitó la mezcla a esta temperatura durante 30 min, después ta durante otros 30 min. Se volvió a enfriar la mezcla a 0ºC y se añadió gota a gota bromoacetato de etilo (0,29 ml; 3,16 mmoles) gota a gota. Después de agitar a 0ºC durante 1 h, se retiró el baño de hielo y se continuó la

15 agitación durante otras 24 h, a ta. El sólido se eliminó y se evaporó el disolvente. La purificación adicional del residuo con cromatografía por desorción súbita (gel de sílice, hexanos/EtOAc 1:1) para dar 13 como aceite amarillo pálido (220 mg): 1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ 3,57 - 3,74 (m, 19H), 3,98 - 4,0 (m, 2H), 4,26 (s, 2H), 5,15 (d, J = 7,8Hz, 1 H), 5,24 (dd, J = 12,9, 1,2Hz, 1 H), 5,84 - 5,93 (m, 1 H); RMN de 13C 51,7; 68,6; 69,4; 70,56; 70,60; 70,62; 70,9; 72,2; 117,0; 134,8; 170,9. EIMS m/z 329 ([M]++Na).

20 El compuesto 14 se preparó a partir del compuesto 13 según el mismo procedimiento que se usó para la síntesis de

4. 1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ 0,076 (s, 12H), 0,92 (s, 18H), 3,61 -3,72 (m, 19H), 4,14 (s, 2H), 4,15 -4,17 (m, 2H), 4,69 (s, 4H), 6,23 - 6,28 (m, 1 H), 6,57 (d, J = 12,0Hz, 1 H), 7,16(s, 1 H), 7,19 (s, 2H); 13CNMR δ -5,2, 14,2, 18,4, 26,0, 51,7, 64,9, 68,6, 69,4, 70,57, 70,61, 70,64, 70,7, 70,9, 71,9, 122,8, 123,2, 125,9, 132,8, 136,5, 141,7, 170,9. EIMS m/z 693 ([M]++Na).

25 El compuesto 15 se preparó a partir del compuesto 14 según el mismo procedimiento que se usó para la síntesis de

5.: 1HNMR (300 MHz, CDCl3) δ 0,072 (s, 12H), 0,92 (s, 18H), 1,87 - 1,89 (m, 2H), 2,64 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,43 - 3,70 (m, 21 H), 4,14 (s, 2H), 4,68 (s, 4H), 6,98 (s, 2H), 7,10 (s, 1H). EIMS m/z 695 ([M]++Na).

El compuesto 16 se preparó a partir del compuesto 15 según el mismo procedimiento que se usó para la síntesis de

6.: EIMS m/z 467 ([M]++Na).

30 El compuesto 17 se preparó a partir del compuesto 16 según el mismo procedimiento que se usó para la síntesis de

7. EIMS m/z 623 ([M]++Na).

Ejemplo 5. Preparación de Disolución Patrón de IGP-08-NHS

Se prepararon disoluciones frescas de IGP-08-NHS (compuesto 10 del ej. 3) en un patrón 0,005 M basado en un peso molecular de 787,81 en dimetilacetamida. Se analizó la disolución patrón espectrofotométricamente usando un

35 coeficiente de extinción de referencia determinado a 320nm (ε320 = 9137 M-1 cm-1).

Ejemplo 6: huMy9-6-IGP-08

Se selecciona anticuerpo huMy9-6 que se une al antígeno CD33 para la conjugación de derivados de PBD.

Se trata una disolución de anticuerpo huMy9-6 en una concentración de 5 mg/ml en un tampón acuoso que contiene ácido N-(2-hidroxietil)-piperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES) 0,05 M y ácido etilendiaminotetra-acético (AEDT) 2 mM, pH 8, con un exceso molar de 6 veces de una disolución de IGP-08-NHS (compuesto 10 del ejemplo 3) en dimetilacetamida (DMA) tal que la concentración final de DMA en el tampón es 20%. Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente, durante 120 min. y después se carga en una columna de filtración de gel Sephadex G25 (Columna de Desalación 26/10 HiPrep™ GE# 17-5087-01) que se había equilibrado previamente en un tampón acuoso que contenía citrato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,135 M, pH 5,5. Se recogieron las fracciones que contenían anticuerpo conjugado y se combinaron para proporcionar producto. Se dializó la muestra combinada durante la noche contra el mismo tampón de elución (citrato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,135 M, pH 5,5) para purificar además el producto.

Se analiza el conjugado final espectrofotométricamente usando los coeficientes de extinción que se determinaron para el compuesto 9 del ejemplo 3 (ε320 = 9137 M-1 cm-1 y ε 280 = 7743 M-1 cm-1) y anticuerpo huMy9-6 (ε280nm= 206,460 M-1cm-1). Se enlazó un promedio de 4,5 moléculas de PBD (Compuesto 9 del ejemplo 3) por molécula de anticuerpo.

Ejemplo 7: huB4-IGP-08

Se selecciona anticuerpo Hu-Anti-B4 que se une al antígeno CD19 expresado preferentemente en la superficie de las células de linfoma humano, para la conjugación de derivados de PBD.

Se trata una disolución de anticuerpo huB4 en una concentración de 8 mg/ml, en un tampón acuoso que contiene fosfato de potasio 0,05 M, cloruro de sodio 0,05 M y ácido etilendiaminotetra-acético (AEDT) 2 mM, pH 7,1 con un exceso molar de 5 veces de una disolución de IGP-08-NHS (compuesto 10 del ejemplo 3) en dimetilacetamida (DMA) tal que la concentración final de DMA en el tampón es 20 %. Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente, durante 70 min. y después se carga en una columna de filtración de gel Sephadex G25 (Columnas NAP™, GE# 17-0852-02) que se habían equilibrado previamente en un tampón acuoso que contenía fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5. Se recogieron las fracciones que contenían anticuerpo conjugado y se combinaron para proporcionar producto. Se dializó la muestra combinada durante la noche contra el mismo tampón de elución (fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5) para purificar además el producto.

Se analiza el conjugado final espectrofotométricamente usando los coeficientes de extinción que se determinaron para el compuesto 9 del ejemplo 3 (ε320 = 9137 M-1 cm-1 y ε 280 = 7743 M-1 cm-1) y anticuerpo huB4(ε280nm = 222,960

M-1

cm-1).

Se enlazó un promedio de 3,1 moléculas de PBD (Compuesto 9 del ejemplo 3) por molécula de anticuerpo.

Ejemplo 8. Ensayo de Unión

Las afinidades de unión relativas del anticuerpo anti-B4 y su conjugado de tomaimicina en células Ramos que expresan el antígeno se determinan usando un ensayo basado en fluorescencia. Se añaden el conjugado anticuerpo -tomaimicina y el anticuerpo desnudo en concentraciones iniciales de 1 a 10-7 M, en placas de 96 pozos y se valoran utilizando diluciones en serie de 3 veces, a fin de que haya duplicados para cada concentración. Se añaden células Ramos 50.000 células por pozo, a cada pozo conteniendo distintas concentraciones del anticuerpo o conjugado, así como a los pozos de control. Las placas se incubaron en hielo durante 3 horas. Después del periodo de incubación, se lavaron las células en la placa y se añade un anticuerpo secundario marcado para fluorescencia que se une a IgG humanizada, como anti-B4 y se incubaron las placas durante 1 hora en hielo. Se lavaron las placas de nuevo después del periodo de incubación y se fijaron las células con disolución de formaldehído al 1%/PBS . Se leyó la fluorescencia en cada pozo de las placas utilizando un analizador de fluorescencia FACSCalibur Becton Dickinson. Los datos se representaron gráficamente como un porcentaje de la fluorescencia máxima obtenida para la concentración más alta de anticuerpo o conjugado.

Ejemplo 9. Potencia y especificidad in vitro del derivado de tomaimicina o de conjugados del derivado de tomaimicina.

Protocolo general a usar:

Se añaden muestras de un derivado libre de tomaimicina o de un conjugado de derivado de tomaimicina a una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano y se valoran usando diluciones en serie que varían de 1 x 10-12 M a 3 x 10-7 M. Se añaden células tumorales antígeno-positivas o células tumorales antígeno-negativas a los pocillos de tal manera que haya muestras por triplicado para cada concentración de fármaco para cada línea celular. Las placas se incuban a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO2 durante 4 días.

Al final del periodo de incubación, se añadieron 20 μl del reactivo de tetrazolio WST-8 sal monosódica de (2-(2-metoxi-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2-tetrazolio) a cada pozo y las placas se devuelven a la incubadora, durante 2 horas. Después se mide la absorbancia en cada pozo de las placas utilizando el lector de placas de Molecular Devices a 450 nm. Se representó gráficamente la fracción de supervivencia de células en cada concentración de derivado de tomaimicina o conjugado.

Se ensayó la citotoxicidad de los compuestos y su especificidad frente a los conjugados de la invención contra líneas celulares MOLT-4 y BJAB o HL60/GC y Ramos. Los resultados se ilustran en las figuras 1, 2, 3, 6 y 8.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuestos de fórmula (I)

donde:

5 ---- representa un enlace sencillo opcional;

----

representa o un enlace sencillo o un doble enlace;

con la condición de que cuando

represente un enlace sencillo, U y U', iguales o diferentes, representan independientemente H, y W y W', iguales o diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -OH, -OR, -OCOR, -OCOOR, -OCONRR', un carbamato cíclico, tal que N10 y C11 son una parte del ciclo,

10 -NRCONRR', -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -SH, -SR, -SOR, -SOOR, -SO3-, -NRSOOR', -NRR', opcionalmente amina cíclica tal que N10 y C11 son una parte del ciclo, -NROR', -NRCOR', -N3, un ciano, un halo, un trialquilo o triarilfosfonio;

y cuando

represente un doble enlace, U y U’ están ausentes y W y W’ representan H;

■ R1,R2,R1', R2' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de: H, Haluro o Alquilo opcionalmente

15 sustituido por uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR o R1 y R2 y R1’ y R2’ forman juntos un doble enlace que contiene grupo =B y =B’ respectivamente.

■ B y B' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre Alquenilo que está opcionalmente sustituido con uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, OR, Arilo, Het, S(O)qR o B y B’ representan un átomo de oxígeno.

■

A y A' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de: Alquilo o Alquenilo, estando cada uno 20 opcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR’, CF3, OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo.

■

Y e Y' son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, OR;

■

q es 0, 1 ó 2 ;

■

n, n’, iguales o diferentes, son 0 ó 1 ;

■

R y R’ son iguales o diferentes y se eligen independientemente entre H, Alquilo, Arilo, estando cada uno de ellos 25 opcionalmente sustituido con Hal, CN, NRR’, CF3, R, OR, S(O)qR, Arilo, Het;

■ T es -NR- o un arilo, cicloalquilo, heterocíclico o heteroarilo de 4 a 10 miembros, estando cada uno de ellos opcionalmente sustituido con uno o más de Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR y estando cada uno sustituido con uno o más ligante(s) no escindible(s) elegidos de la siguiente lista:

-

(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ’R” , -(CR13R14)t(OCH2CH2)yO(CR15R16)uCOZ’R”,

30 -(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)y(OCH2CH2)yCOZ’R”;

-

(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ’R” ;

-

(CR13R14)t(OCO)(R15R16)u(OCH2CH2)yCOZ’R”;

-

(CR13R14)t(CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R" ;

-

(CR13R14)t(CONR19)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R"; -(CR13R14)t-furil-CO(CR15R16)uCOZ'R" ;

35 -(CR13R14)t-tiazolil-CO(CR15R16)uCOZ'R" ; -(CR13R14)t-imidazolil-CO(CR15R16)uCOZ'R" ;

-

(CR13R14)tpiperazin-CO(CR15R16)uCOZ'R" ;

-

(CR13R14)t-fenil-QCOZ'R" ; -(CR13R14)t-furil-QCOZ'R" ; -(CR13R14)t-oxazolil-QCOZ'R" ;

-(CR13R14)t-tiazolil-QCOZ'R" ; -(CR13R14)t-tienil-QCOZ'R" ; -(CR13R14)t-imidazolil-QCOZ'R" ; -(CR13R14)t-piperazin-QCOZ'R" ; -O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R"; -O(CR13R14)t(NR19CO)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R" ;

5 -O(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)yCOZ'R" ; -O-fenil-QCOZ'R" ; -O-furil-QCOZ'R" ; -O-oxazolil-QCOZ'R" ; -O-tiazolil-Q COZ'R" ; -O-tienil-QCOZ'R" ; -O-imidazolil-QSCOZ'R" ; -O-piperazin-QCOZ'R" ; -OCO-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R' ; -OCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R" ;

10 -OCO-fenil-QCOZ'R" ; -OCO-furil-QCOZ'R" ; -OCO-oxazolil-QCOZ'R" ; -OCO-tiazolil-QCOZ'R" ; -OCO-tienil-QCOZ'R" ; -OCO-imidazolil-QCOZ'R" ; -OCO-piperazin-QCOZ'R" ; -CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R" ; -CO-(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R" ;

15 -CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R" ; -CO-fenil-QCOZ'R" ; -CO-furil-QCOZ'R" ; -CO-oxazolil-QCOZ'R" ; -CO-tiazolil-QCOZ'R" ; -CO-tienil-QCOZ'R" ; -CO-imidazolil-QCOZ'R" ; -CO-piperazin-QCOZ'R" ; -CO-piperidin-QCOZ'R" ; -NR19(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R" ;

20 -NR19CO(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R" ; -NR19(CR13R14)t(CR17=CR15)(CR15R16)t(OCH2CH2)yCOZ'R" ; -NR19CO(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)yCOZ'R"; -NR19CONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R"; -NR19CONR12(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)yCOZ'R";

25 -NR19CO-fenil-QCOZ'R"; -NR19CO-oxazolil-QCOZ'R"; -NR19CO-tiazolil-QCOZ'R" ; -NR19CO-tienil-QCOZ'R" ; -NR19CO-imidazolil-QCOZ'R" ; -NR19CO-piperazin-QCOZ'R"; -NR19CO-piperidin-QCOZ'R" ; -NR19-fenil-QCOZ'R" ; -NR19-furil-QCOZ'R" ; -NR19-oxazolil-QCOZ'R" ; -NR19-tiazolil-QCOZ'R" ; -NR19-tienil-QCOZ'R" ; -NR19-imidazolil-QCOZ'R" ; -NR19-piperazin-OCOZ'R" ;

30 -NR19-piperidin-QCOZ'R"; -NR19CO-NR12-fenil-QCOZ'R"-NR19CO-NR12-oxazolil-QCOZ'R" -NR19CO-NR12-tiazolil-QCOZ'R"; -NR19CO-NR12-tienil-QCOZ'R"; -NR19CO-NR12-piperidin-QCOZ'R" ; -S(O)q(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R";

35 -S(O)q(CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)t(OCH2CH2)yCOZ'R"; -SCONR12(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R" ; -SCO-piperazin-QCOZ'R" ; y -SCO-piperidin-QCOZ'R"; donde:

■ Q es un enlace directo o un alquilo lineal o alquilo ramificado que tiene de 1-10 átomos de carbono o un espaciador de polietilenglicol con 2 a 20 unidades repetitivas etilenoxi;

■ R19 y R12 son iguales o diferentes y son alquilo lineal, alquilo ramificado o alquilo cíclico que tiene de 1 a 10 átomos 5 de carbono o arilo simple o sustituido o heterociclo y R12 puede ser además H;

■

R13, R14, R15 y R16 son iguales o diferentes y son H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono,

■

R17 y R18 son H o alquilo,

■

u es un número entero de 1 a 10 y también puede ser 0,

10 ■ t es un número entero de 1 a 10 y también puede ser 0,

■

y es un número entero de 1 a 20 y también puede ser 0;

■

C(=O)-Z'R" es una función que contiene carbonilo en la que:

-

Z' representa un enlace sencillo o un O, -S(O)q-, NR- sustituido y

-

R" representa: H, Alquilo, Cicloalquilo, Arilo, heteroarilo o heterocíclico, estando cada uno opcionalmente sustituido 15 por uno o más: Hal, CN, NRR’, CF3, R, OR, S(O)qR, Arilo, Het;

o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmacéuticamente o las estructuras cristalinas polimórficas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros o enantiómeros.
2. Compuestos según la reivindicación 1 en donde n=n'=1.
3. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el ligante se elige entre: 20 - (CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R";

-

(CR13R14)t(OCH2CH2)yO(CR15R18)uCOZ'R”;

-

O(CR13R14)t(CR15R16)u(OCH2CH2)yCOZ'R"
4. Compuestos según las reivindicaciones 1 a 3, en donde W y W’ son iguales o diferentes y son OH, OMe, OEt, NHCONH2, SMe.

25 5. Compuestos según la reivindicación 1 a 4 en donde B=B' representan =CH2 o =CH-CH3.
6.

Compuestos según la reivindicación 1 a 5, con la siguiente formula (II):
7.

Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 a 3 de fórmula:

30 o de fórmula:
8.

Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que A=A’= alquilo no sustituido lineal.
9.

Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Y=Y’

5 10. Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Y=Y’=OAlquilo.
11.

Compuestos según la reivindicación 10 en donde Y=Y'=OMe.
12.

Compuestos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde T es un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros cada uno sustituido con uno o más ligando(s) no escindible(s) y opcionalmente sustituido con uno o más de Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR.

10 13. Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde T es un fenilo o piridilo, estando cada uno sustituido con uno o más ligando(s) no escindible(s) y estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o más de Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR.
14.

Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Z' es un enlace sencillo u O.
15.

Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Z' es O.

15 16. Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde R" es H o –Alquil-lineal o ramificado o heterociclo opcionalmente sustituido.
17.

Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde R" es H o alquilo o un grupo succinimida.
18.

Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde -C(=O)-Z'R" es -COOH o
19.

Un conjugado que comprende uno o más compuesto(s) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 unido químicamente a agente de unión a la célula a través de dicho ligante no escindible.
20.

Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho agente de unión a las células se elige entre

anticuerpos o un fragmento de un anticuerpo que contiene al menos un sitio de unión, hormonas, factores de 25 crecimiento, moléculas transportadoras de nutrientes, o cualquier otra molécula o sustancia de unión celular.
21. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, en el que dicho agente de unión a las células se elige entre anticuerpos monoclonales; anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanizados; anticuerpos totalmente humanos; anticuerpos monocatenarios; fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', F(ab') 2 y Fv, interferones; péptidos; linfocinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; hormonas tales como insulina, TRH (hormonas liberadoras de

30 tirotropina), MSH (hormona estimuladora de melanocitos), hormonas esteroideas, tales como andrógenos y estrógenos; factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGFα, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF y GM-CSF; vitaminas, tales como folato y transferrina.
22. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en donde el agente de unión a la célula y 35 dicho(s) compuesto(s) están unidos por un grupo amido.
23.

Proceso de preparación de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende la etapa de ciclar el compuesto correspondiente de fórmula (VIII):

donde Y, Y', A, A', T, R1, R2, R1', R2', n y n' se definen en las reivindicaciones 1 a 18.
24.

Compuestos de fórmula (VIII), (IX) o (X):

donde Y, Y', A, A', R1, R2, R1', R2', n, n', T son como se definen en las reivindicaciones 1 a 18.
25. Proceso de preparación de un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 que comprende la etapa donde un compuesto como se define en las reivindicaciones 1 a 18, en el que T comprende un grupo

10 carboxi terminal, estando opcionalmente activado dicho grupo carboxi como un grupo amido o un precursor del mismo, se hace reaccionar con un agente de unión a la célula a fin de que el compuesto y el agente de unión a la célula se unan por un enlace amido.
26. Proceso según la reivindicación 25 en donde un anticuerpo u otro agente de unión a la célula se hace reaccionar con un derivado ácido de N-hidroxisuccinimida para producir un conjugado unido por amida.

15 27. Proceso según las reivindicaciones 25 o 26 en donde el agente de unión a la célula elegido de anticuerpos monoclonales; anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanizados; anticuerpos totalmente humanos; anticuerpos monocatenarios; fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', F(ab') 2 y Fv, interferones; péptidos; linfocinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; hormonas tales como insulina, TRH (hormonas liberadoras de tirotropina), MSH (hormona estimuladora de melanocitos), hormonas esteroideas, tales como andrógenos y estrógenos; factores de

20 crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGFα, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF y GM-CSF; vitaminas, tales como folato y transferrina.
28. Una composición farmacéutica que comprende una molécula conjugada como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, o un compuesto de fórmula (I) como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25 29. Uso de una cantidad eficaz de una molécula conjugada como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 o un compuesto de fórmula (I) como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cánceres.
30. Una molécula de conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 para uso en el tratamiento del cáncer.