BRPI0716319A2 - mÉtodo para reduzir a absorÇço de fosfato em um individuo anmal humano ou nço-humano correndo o risco de desenvolver ou que desenvolveu hiperfosfatomia e mÉtodo para reduzir dos efeitos colaterais da terapia de vitamina d em um ser humano - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA REDUZIR A ABSORÇçO DE FOSFATO EM UM INDIVÍDUO ANIMAL HUMANO OU NçO - HUMANO CORRENDO O RISCO DE DESENVLOVER OU QUE DESENVOLVEU HIPERFOSFATOMIA E MÉTODO PARA REDUZIR OS EFEITOS COLATERAIS DA TERAPIA DE VITAMINA D EM UM SER HUMANO. Trata-se de um método para reduzir a absorção de fosfato em um indivíduo animal humano ou não-humano correndo o risco de desenvolver ou que desenvolveu hiperfosfatomia. O método inclui a etapa de administração oral ao indivíduo de um anticorpo cotransportador de fosfato de sódio anti-intestinal do tipo 2B (Npt 2B) em uma quantidade eficaz para reduzir ou manter a concentração de fosfato de soro no indivíduo.

Description

MÉTODO PARA REDUZIR A ABSORÇÃO DE FOSFATO EM UM INDIVÍDUO ANIMAL HUMANO OU NÃO-HUMANO CORRENDO O RISCO DE DESENVOLVER OU QUE DESENVOLVEU HIPERFOSFATOMIA E MÉTODO PARA REDUZIR OS EFEITOS COLATERAIS DA TERAPIA DE VITAMINA D EM UM SER HUMANO

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O fósforo é um elemento essencial na nutrição humana e desempenha papéis estruturais e funcionais essenciais na bioquímica, na integridade celular e nos processos fisiológicos do corpo. Nos alimentos que compreendem matéria animal ou vegetal, o fósforo pode ser encontrado como fosfato inorgânico (Pi) (por exemplo, em sua forma pentavalente em combinação com o oxigênio como fosfato (PO43")), que pode ser prontamente absorvido pelo trato gastrointestinal. Além disso, o fosfato pode ser encontrado como um constituinte das bio-macromoléculas tais como proteínas, ácidos nucléicos, lipídeos e açúcares. O material de plantas também pode ser enriquecido em ácido fítico (C6H6 [ΟΡΟ (OH) 2] 6) , que é a forma de armazenagem principal do fosfato (fosfato fítico) em muitos tecidos de plantas (por exemplo, farelo e sementes), sendo o responsável por 7 0% a 80% de fosfato nas plantas. O ácido fítico ou os seus sais (fitato) tipicamente não podem ser absorvidos por animais monogástricos e serão eliminados com as fezes. O ácido fítico/fitato pode ser o responsável por aproximadamente 25%

da ingestão alimentar diária de fosfato de um adulto, ν 0 fosfato é um componente essencial do mineral

ósseo, uma vez que aproximadamente 85% do fosfato no corpo de um adulto estão na matriz extracelular mineralizada, tal como nos ossos e nos dentes. Aproximadamente 15% do fosfato são intracelulares (por exemplo, em tecidos moles) e aproximadamente 0,1% é encontrado nos fluidos extracelulares (Tenenhouse et al. , Vitamin D, 2a edição, Elsevier, 2005). O fosfato celular também pode ser encontrado na forma de fosfolipídeos que constituem a estrutura das membranas celulares. 0 fosfato também é um componente estrutural essencial de ácidos nucléicos tais como o DNA e o RNA, bem como de nucleotideos tais como o trifosfato de adenosina (ATP) , que é uma molécula importante de armazenagem e de transferência de energia, e o monofosfato de adenosina cíclico, que é uma molécula de sinalização celular importante. Outras funções fisiológicas do fosfato intracelular incluem os seguintes: (1) fosforilação de uma série de enzimas de proteínas, hormônios e de moléculas de sinalização de células para a sua ativação; (2) manutenção do equilíbrio ácido-base normal como um tampão fisiológico; e (3) compreende a molécula que contém fosfato 2,3- difosfoglicerato (2,3-DPG) em células vermelhas do sangue. Um ser humano médio contém aproximadamente de 700 a 1.000 gramas de fósforo (Lau K., Phosphate Disorders. Saunders; 1986:398- 4 70) e consome e excreta aproximadamente de um grama a três gramas aproximadamente de fósforo por dia na forma de PO43".

2 0 Os seres humanos mantêm a homeostase de fosfato por

pelo menos três vias: o trato gastrointestinal, os rins e os ossos. 0 trato gastrointestinal participa na homeostase de fosfato como um órgão de absorção e de excreção/reabsorção de fosfato. Os ossos servem como um reservatório de fosfato que pode ser mobilizado em resposta a vários sinais fisiológicos. A absorção gastrointestinal do fosfato alimentar é muito eficiente, sendo que os sítios de absorção principais são o duodeno e o jejuno (Delmez JA et al. , Am J Kidney Dis, 1992, 19:303-317). Uma quantidade variável de fosfato alimentar

3 0 (10% a 8 0% da quantidade ingerida) é excretada nas fezes,

dependendo se a dieta é de origem de tecido vegetal (fosfato amplamente inacessível) ou animal (amplamente digerível). O fosfato inorgânico nos alimentos é absorvido de duas maneiras, uma via transcelular ativa através da membrana da borda em escova e uma via paracelular passiva através das junções apertadas entre as células (Cross et al. , Miner Electrolyte Metab 1990, 16:115-124 e Walton J et al. Clin Sci 1979, 56:407-412). Alguns relatórios baseados em estudos com ratos indicam que o transporte de fosfato colônico é mediado principalmente através da passagem difusiva paracelular (Hu et al., Miner Electrolyte Metab, 1997, 23:7-12; e Peters et al., Res Exp Med (Berl) , 1988, 188:139-149). Outros relatórios baseados em estudos com ratos sugerem que o transporte ativo transcelular é a via dominante na absorção de fosfato através do intestino delgado (Eto et al. , Drug Metab Pharmacokinet, 2006, 21:217-221).

Os rins participam da homeostase de fosfato como um órgão de filtração, reabsorção e excreção de fosfato. Os rins são um órgão regulador principal que mantém a homeostase de fosfato. Em indivíduos adultos saudáveis, a excreção renal diária de fosfato se iguala à quantidade de absorção gastrointestinal diária de fosfato. No entanto, nos estados de diminuição de fosfato, os rins reduzem a excreção urinária de fosfato até virtualmente zero (Knox F et al. , Am. J. Physiol. 1977, 233:f261-f268). A reabsorção renal de fosfato ocorre principalmente no túbulo proximal. A excreção urinária fracionária de fosfato pode variar entre 0,1% a 20%, representando desse modo um mecanismo homeostático poderoso. Na falha renal grave, tal como aquela que resulta da doença renal crônica, a hiperfosfatomia ocorre da remoção renal de

fosfato inadequado.

Os fatores reguladores principais da homeostase de fosfato são o fosfato no soro e o hormônio da paratireóide (PTH). Os níveis aumentados de fosfato no soro intensificam a excreção urinária de fosfato. O PTH diminui a reabsorção de fosfato tubular e a excreção crescente de fosfato solúvel na urina. Outros fatores que afetam a homeostase de fosfato incluem, mas sem ficar a eles limitados, a existência, a dieta (isto é, a quantidade de fosfato ingerida e/ou a forma química de fosfato ingerida), a doença, agentes farmacêuticos e variação diurna.

A vitamina D, especialmente na sua forma ativa 1,25-diidroxivitamina D (também chamada de calcitriol), também pode afetar a homeostase de fosfato ao estimular diretamente a absorção intestinal de fosfato. Além disso, a vitamina D intensifica a mobilização da reabsorção óssea através do cálcio e do fosfato no plasma (Albaaj F & Hutchison A, Drugs 2003, 63:577-596).

Um exemplo de homeostase de fosfato anormal é a hiperfosfatomia, que pode ocorrer por um ou mais dos três seguintes mecanismos. O primeiro mecanismo é a absorção excessiva de fosfato. 0 segundo mecanismo é a excreção diminuída de fosfato. O terceiro mecanismo é o deslocamento do fosfato dos espaços intracelulares aos espaços extracelulares. A hiperfosfatomia grave pode causar paralisia, convulsões e parada cardíaca. A hiperfosfatomia ocorre em concentrações de fosfato no soro acima de 5 mg/dl, que são associadas com um risco aumentado de morte (Block G et al., J. Am. Soe. Nephrol. 2004, 15:2208-2218). Uma concentração fisiológica normal de fosfato no soro é considerada geralmente como sendo uma concentração de fosfato no soro entre aproximadamente 2,4 mg/dl a aproximadamente 4,5 mg/dl (Block G & Port F, Am. J. Kidney Dis. 2000, 35:1226- 1237) .

Os pacientes com função renal prejudicada podem desenvolver hiperfosfatomia em conseqüência da excreção diminuída de fosfato pelo rim. A hiperfosfatomia ocorre quando o suprimento vascular aos rins fica reduzido ou quando os glomérulos ficam danificados e param de filtrar o fosfato do sangue. Dessa maneira, a hiperfosfatomia é uma conseqüência previsível da doença renal e a maior parte dos pacientes com doença renal tem ou vai desenvolver a hiperfosfatomia. Os exemplos de tais doenças renais incluem, mas sem ficar a elas limitados, doença renal de estágio final, falha renal aguda, falha renal crônica, doença de rim policístico, doença renal crônica, necrose tubular aguda (por exemplo, estenose arterial renal), infecções que reduzem a função renal (por exemplo, septicemia ou infecção renal tal como pielonefrite aguda), rejeição a transplante de rim e obstrução do trato urinário.

A hiperfosfatomia associada com a doença renal crônica conduz a patofisiologias graves na homeostase do cálcio e do fosfato, especialmente se estiver presente por períodos de tempo prolongados. Tais patofisiologias incluem, mas sem ficar a eles limitadas, o hiperparatiroidismo, a doença óssea (por exemplo, osteodistrofia renal) e a calcificação nas juntas, nos pulmões, nos olhos e vasculatura. A hiperfosfatomia em pacientes com doença renal 2 0 crônica é associada independentemente com o risco de mortalidade, e o mecanismo exato pelo qual a hiperfosfatomia aumenta o risco de mortalidade é desconhecido. Para indivíduos que exibem insuficiência renal, uma elevação do fosfato no soro dentro da faixa normal foi associada com a 2 5 progressão da falha renal e do risco aumentado de eventos cardiovasculares. O National Kidney Disease Outcomes Quality Initiative Clinicai Practice Guidelines for Bone Metabolism and Disease in Chronic Kidney Disease recomenda a manutenção de fosfato abaixo de 5,5 mg/dl, o produto de cálcio-fosfato no soro (CA X P) menor do que 55 mg2/dl2 e o hormônio paratireóide intacto (iPTH) entre 150 pg/ml e 300 pg/ml. Embora a etiologia não tenha sido inteiramente demonstrada, o produto elevado do cálcio-fosfato foi considerado como responsável pela calcificação de tecido mole e pela doença cardiovascular. A doença cardiovascular é a causa de morte de quase metade de todos os pacientes de diálise.

Muitos pacientes com doença renal necessitam tomar uma forma ativa da vitamina D tal como Ια, 25- diidroxivitamina D3 para a manutenção da homeostase do cálcio e/ou para o tratamento ou a prevenção da hipocalcemia e/ou do hiperparatiroidismo secundário, uma vez que estes pacientes são deficientes em vitamina ativa D. A vitamina D3 é metabolizada primeiramente como 2 5-hidroxivitamina D3 (também chamada de calcidiol) no fígado e subseqüentemente como Ια, 25-diidroxivitamina D3 nos rins. A Ια, 25-diidroxivitamina D3 é muito mais ativa do que a 25-hidroxivitamina D3. Os rins com função prejudicada não podem converter a 25- hidroxivitamina D3 em Ια, 2 5-diidroxivitamina D3. Um baixo nível de Ια, 25-diidroxivitamina D3 estimula a glândula paratireóide a segregar mais PTH, e disso resultam a hiperplasia paratireóide e o hiperparatiroidismo secundário. O tratamento padrão do hiperparatiroidismo secundário em indivíduos com doença renal crônica inclui a vitamina ativa D ou seus análogos. Do mesmo modo, aproximadamente 7 0% dos indivíduos com doença ou falha renal de estágio final recebem alguma forma de vitamina D. Conforme discutido acima, a vitamina D estimula a absorção intestinal de fosfato. Portanto, os pacientes com doença renal que tomam vitamina D tal como a Ια, 25-diidroxivitamina D3 são mais suscetíveis à hiperfosfatomia e também podem ter a sua hiperfosfatomia existente exacerbada devido a uma combinação da absorção aumentada de fosfato com a excreção diminuída de fosfato concomitante.

Os esforços terapêuticos para reduzir os níveis de fosfato no soro incluem, mas sem ficar a elas limitados, a diálise, a redução na ingestão alimentar de fosfato, a administração de nicotinamida e a administração oral de aglutinantes de fosfato insolúveis. Os exemplos de aglutinantes de fosfato insolúveis incluem, mas sem ficar a eles limitados, compostos de alumínio (por exemplo, o gel de hidróxido de alumínio Amphojel®), compostos de cálcio (por exemplo, carbonato de cálcio, acetato, tal como comprimidos de acetato de cálcio PhosLo®, citrato, alginato e sais de cetoácidos), polímeros de troca aniônica (por exemplo, polímeros com funcionalidade amina descritos nas Patentes Norte-americanas n°s. 5.985.938, 5.980.881, 6.180.094, 6.423.754 e na publicação de patente PCT WO 95/05184, resinas de troca aniônica da Dowex® na forma de cloreto, RenaGel® e cloridreto de guanidínio ligado a polímero), compostos inorgânicos tais como o carbonato de lantânio tetra-hidratado (Fosrenal™) , sais férricos de citrato e de acetato e um material cerâmico poroso à base de lantânio (RenaZorb™) .

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para reduzir a absorção de fosfato em um indivíduo 2 0 animal humano ou não humano correndo o risco de desenvolver ou que desenvolveu a hiperfosfatomia. O método inclui a etapa de administração oral ao indivíduo de um anticorpo cotransportador de fosfato de sódio anti-intestinal do tipo 2B (Npt2B) (por exemplo, um anticorpo que se liga a um laço extracelular de Npt2B intestinal) em uma quantidade eficaz para reduzir ou manter a concentração de fosfato no soro no '· indivíduo. 0 anticorpo pode ser um anticorpo de IgY ou um anticorpo que se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 234-362 ou dos aminoácidos 429-485 da proteína de Npt2B intestinal humano definida pela SEQ ID n°.:l. O método pode incluir adicionalmente a etapa de observação de uma diminuição ou estabilização da concentração de fosfato no soro. Por exemplo, as concentrações de fosfato no soro antes e depois do tratamento com o anticorpo podem ser medidas e comparadas.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para reduzir os efeitos colaterais da terapia com a vitamina D em um indivíduo humano (por exemplo, um indivíduo humano que tenha uma doença renal, uma deficiência de vitamina D ou ambas) . O método inclui a etapa de administração oral ao indivíduo de (a) um composto da vitamina D e de (b) um anticorpo anti-intestinal de Npt2B tal como um anticorpo intestinal anti-humano de Npt2B (SEQ ID n°.:l) em que o anticorpo é administrado em uma quantidade eficaz para reduzir a hiperfosfatomia induzida pela terapia com a vitamina D. Por exemplo, o nível de fosfato no soro do indivíduo pode ser reduzido ou mantido. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo de IgY. Em uma outra realização, o anticorpo se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 234-3 62 ou dos aminoácidos 429-485 da proteína de Npt2B intestinal humano definida pela SEQ ID n°.:l. O método pode incluir adicionalmente a etapa de observação de uma diminuição ou estabilização da concentração de fosfato no soro. Por exemplo, as concentrações de fosfato no soro antes e depois do tratamento com o anticorpo podem ser medidas e comparadas.

Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para a atenuação ou a prevenção da hiperfosfatomia. Em algumas realizações, a concentração de fosfato no soro é reduzida ou mantida a um nível de aproximadamente 150%, 125%, 120%, 115%, 110% ou 105% ou menos de uma concentração fisiológica máxima de fosfato no soro na faixa normal aceita. Em algumas realizações, a concentração de fosfato no soro é reduzida ou mantida a um nível dentro da faixa normal. Para um indivíduo humano, a concentração de fosfato no soro normal elevada máxima é de 5,0 mg/dl. Em uma realização preferida, a concentração de fosfato no soro é reduzida ou mantida em 5,5 mg/dl ou menos ou 5,0 mg/dl ou menos em um indivíduo humano.

Em algumas realizações dos métodos aqui descritos, o indivíduo que tem uma doença renal, recebe um composto da vitamina D (por exemplo, Ια, 25-diidroxivitamina D3) , ou ambos. Em algumas realizações, o indivíduo é um paciente humano com doença renal que toma um composto da vitamina D (por exemplo, Ια, 25-diidroxivitamina D3) e a um nível de fosfato no soro acima de 5,0 mg/dl ou de 5,5 mg/dl. Os exemplos de doenças renais incluem a doença renal de estágio

final, falha renal aguda, doença de rim policístico, doença renal crônica, necrose tubular aguda, as infecções que reduzem a função renal (por exemplo, septicemia ou infecção do rim tal como a pielonefrite aguda), rejeição a transplante de rim ou obstrução do trato urinário.

Em algumas realizações dos métodos aqui descritos,

o anticorpo anti-intestinal de Npt2B é administrado concomitantemente com um aglutinante de fosfato. Em algumas realizações, o anticorpo anti-intestinal de Npt2B é administrado com alimentos ou imediatamente em seguida (isto

2 0 é, dentro de aproximadamente uma hora antes ou depois) ao

consumo de um alimento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um mapa do antígeno do peptídeo de Npt 2B intestinal humano. Os laços extracelulares (ECLI -

ECL4) e intracelulares (ICL1-ICL3) bem como os domínios da transmembrana (1-8) de Npt2B intestinal humano são mostrados. Os números 11-20 e 31-35 mostram onde os peptídeos do antígeno utilizados para gerar anticorpos ficam situados nos laços extracelulares.

3 0 A Figura 2 mostra os efeitos da nicotinamida

(controle positivo na inibição da captação de fósforo) e de vários anticorpos anti- intestinais do peptídeo de Npt2B na captação de fósforo pelas células Caco-2 in vitro. Da esquerda para a direita, os tratamentos são: 2A, controle (anticorpo de galinhas injetadas com o adjuvante), nicotinamida, e anticorpos do anti-peptídeo (PEG purificado a partir da gema de ovo) 16, 17, 18 e 19; 2B, controle, nicotinamida e anticorpos do anti-peptídeo (PEG purificado a partir da gema de ovo) 12, 13, 14 e 15.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO É aqui descrito que determinados anticorpos anti- intestinais de Npt2B podem ser administrados oralmente a um indivíduo animal humano ou não humano para reduzir a absorção de fosfato no indivíduo. Npt2B é associado com a membrana da borda em escova intestinal (Hilfiker H et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95:14564-14569). A técnica anterior sugere que um anticorpo anti-intestinal de Npt2B não deve ser eficaz para obstruir a atividade de Npt2B in vivo porque a membrana da borda em escova intestinal é revestida com uma camada de muco permeável somente aos solutos com baixo peso molecular, mas não macromoléculas grandes (por exemplo, anticorpos) a fim de proteger a superfície da mucosa da degradação pelas enzimas proteolíticas no lúmen intestinal (Atuma et al, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001, 280:922; e M. Mantle e A. Allen, 1989, Gastrointestinal mucus, páginas 202-229 em Gastrointestinal Secretions, J. S. Davison, ed., Butterworth and Co., Grã Bretanha). Além disso, é incerto se um anticorpo particular administrado oralmente pode sobreviver no ambiente ácido do estômago e permanecer ativo. Apesar da evidência da técnica anterior em contrário, os autores da presente invenção mostraram, utilizando anticorpos para Npt2B intestinal bem como outra fosfatase alcalina intestinal da proteína associada com a membrana da borda em escova intestinal (Nakano et al. , Arch Histol Cytol 2001, 64:483- 4 91), que anticorpos administrados oralmente podem alcançar e bloquear a atividade de uma proteína associada com a membrana da borda em escova intestinal (exemplos abaixo). Nos exemplos abaixo, os autores da presente invenção mostraram que os anticorpos anti-intestinais de Npt2B administrados oralmente podem abaixar os níveis de fosfato no plasma, reduzir o ganho de peso corpóreo, reduzir a cinza dos ossos e aumentar a excreção de fosfato.

A menos que esteja definido de alguma outra maneira, todos os termos técnicos e científicos utilizados na presente invenção têm o mesmo significado que o que é normalmente compreendido por um elemento versado na técnica à qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalente àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e os materiais preferidos serão

descritos agora.

Ao descrever as realizações e as reivindicações da invenção, a seguinte terminologia é utilizada de acordo com as definições apresentadas abaixo.

Conforme utilizado na presente invenção, "anticorpo" inclui uma molécula de imunoglobulina imunologicamente reativa com um antígeno particular, e inclui anticorpos monoclonais e policlonais. O termo também inclui formas geneticamente projetadas tais como anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos murinos humanizados) e .2 5 anticorpos heteroconjugados (por exemplo, anticorpos biespecíficos). O termo também inclui moléculas, diacorpos, triacorpos e tetracorpos bivalentes ou biespecíficos. As moléculas bivalentes e biespecíficas são descritas, por exemplo, em Kostelny et al., J. Immunol. 1992, 148:1547; Block e Pluckthun, Biochemistry 1992, 31:1579; Zhu et al. , Protein Sci 1997, 6:781; Hu et al., Câncer Res. 1996, 56:3055; Adams et al., Câncer Res. 1993, 53:4026; e McCartney et al., Protein Eng. 1995, 8:301. O termo "anticorpo" também inclui formas de ligação do antígeno de anticorpos tais como fragmentos com capacidade de ligação a antígeno (por exemplo, Fab1, F (ab1 ) 2, Fab, Fv e rlgG) . O termo também se refere a fragmentos de Fv de cadeia simples recombinantes (scFv). Além disso, o termo "anticorpo" engloba um anticorpo que tem um grupo de estabilização ligado de maneira covalente ao mesmo para tornar o anticorpo mais estável. Anticorpos com uma afinidade Kd de IO"4 M ou menos podem ser empregados na presente invenção. Preferivelmente, são empregados anticorpos com uma afinidade Kd <510"5 M ou <510"6 M. Mais preferivelmente, são empregados anticorpos com uma afinidade Kd <51(Γ7 Μ, <510"8 M ou <510~9 M.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo "hiperfosfatomia" é utilizado amplamente para descrever uma condição em um indivíduo em que o fosfato no soro está presente a uma concentração acima da faixa normal medicamente aceita.

Conforme utilizado na presente invenção, os termos "atenuar" ou "prevenir" significam atingir um benefício terapêutico ou um benefício profilático. Por benefício terapêutico, entenda-se a melhora ou a erradicação do distúrbio subjacente que está sendo tratado. Por exemplo, em um indivíduo com hiperfosfatomia, o benefício terapêutico inclui a melhora ou a erradicação da hiperfosfatomia subjacente. Além disso, um benefício terapêutico inclui a melhora ou a erradicação de um ou mais dos sintomas patofisiológicos associados com o distúrbio subjacente, de uma maneira tal que uma melhoria seja observada no indivíduo, apesar de o indivíduo ainda estar com o distúrbio subjacente. Por exemplo, em um paciente que sofre de insuficiência renal e/ou de hiperfosfatomia, um benefício terapêutico refere-se não somente a uma diminuição no nível de fosfato no soro do paciente, mas também a uma melhoria do paciente com relação a outros distúrbios que acompanham a falha renal e/ou a hiperfosfatomia, tais como a calcificação ectópica e a osteodistrofia renal. Para o benefício profilático, um anticorpo de acordo com a presente invenção é administrado a um paciente com risco de desenvolver hiperfosfatomia ou a um paciente que relata um ou mais dos sintomas patofisiológicos da hiperfosfatomia mesmo que um diagnóstico de hiperfosfatomia possa não ter sido feito. Por exemplo, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser administrado a um paciente com doença renal crônica onde a hiperfosfatomia não foi diagnosticada. O benefício profilático inclui a prevenção ou o retardamento da hiperfosfatomia.

Conforme utilizado na presente invenção, uma quantidade eficaz de um anticorpo é uma quantidade que abaixa o fosfato no soro em um indivíduo que tem hiperfosfatomia, impede que o fosfato no soro aumente em um indivíduo que tem ou com risco de ter hiperfosfatomia ou reduz a absorção de fosfato do alimento que pode ser medida, por exemplo, pelo 2 0 fosfato fecal aumentado ou pelo nível abaixado ou estabilizado de fosfato no soro.

Conforme utilizado na presente invenção, "doença do rim" refere-se a qualquer doença ou distúrbio que afeta a função dos rins, incluindo as doenças renais que resultam em

2 5 uma filtração pobre de fosfato e incluindo as doenças que

afetam a fonte do sangue ao rim, bem como defeitos funcionais e estruturais nos rins. Os exemplos de doença renal incluem, mas sem ficar a elas limitados, a doença renal de estágio final, falha renal aguda, falha renal crônica, doença de rim

3 0 policístico, doença renal crônica (por exemplo, doença renal

crônica de estágio I, II, III, IV ou V tal como classificada sob o National Kidney Disease Outcomes Quality Initiative Clinicai Practice Guidelines, que se manifesta como insuficiência renal e falha renal de estágios posteriores), necrose tubular aguda (por exemplo, estenose arterial renal), infecções que reduzem a função renal (por exemplo, septicemia ou infecção renal tal como a pielonefrite aguda), rejeição a transplante de rim e obstrução do trato urinário.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo "vitamina D" refere-se amplamente aos compostos orgânicos denominados vitamina D2, vitamina D3, vitamina D4, etc., e a seus metabólitos e formas hormonais que influenciam a homeostase do cálcio e do fosfato. Os exemplos de compostos da vitamina D incluem, mas sem ficar a eles limitados, a vitamina D2 (ergocalciferol) , 25-hidroxivitamina D2, Ια, 25- diidroxivitamina D2, vitamina D3 (colecalciferol), 25- hidroxivitamina D3, Ια, 25-diidroxivitamina D3, um análogo de qualquer um dos anteriores ou que pode ocupar substancialmente o receptor intracelular da vitamina D e aqueles descritos em Bouillon et al., Endocrine Reviews 1995, 16:200-257, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Os compostos da vitamina D também incluem 2 0 aqueles que, atualmente, estão comercialmente disponíveis ou em experimentações clínicas incluindo, mas sem ficar a eles limitados, 19-nor-la, 25 diidroxivitamina D2 (Paricalcitol), Ia-hidroxivitamina D2 (Doxercalciferol), la-hidroxivitamina D3 (Alfacalcidol), drogas investigacionais junto à Leo Pharmaceutical incluindo EB 1089 (Seocalcitol) , KH 1060 (20- epi-22-oxa-24a, 26a, 27a-triomo-Ια, 25-diidróxi-D3) , MC 1288 e MC 903 (Calcipotriol) , drogas da Roche Pharmaceutical que incluem 1,25-diidróxi-16-eno-D3 , 1,25-diidróxi-16-ena-23-ina- D3 e 25-diidróxi-16-eno-23 -ina-D3 , 22-oxacalcitriol da Chugai Pharmaceutical (22-oxa- Ια, 25-diidróxi-D3) , Ia hidróxi D5 da Universidade de Illinois, drogas do Instituto de Química Médica-Schering AG que incluem ZK 161422 e ZK 157202.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para reduzir a absorção de fosfato em um indivíduo animal humano ou não humano correndo risco de desenvolver ou que desenvolveu a hiperfosfatomia. O método inclui a etapa de administração oral ao indivíduo de um anticorpo cotransportador de fosfato de sódio anti-intestinal do tipo 2B (Npt2B) (por exemplo, um anticorpo que se liga a um laço extracelular de Npt2B intestinal) em uma quantidade eficaz para reduzir ou manter a concentração de fosfato no soro no indivíduo. 0 anticorpo pode ser um anticorpo de IgY ou um anticorpo que se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 234-362 ou dos aminoácidos 429-485 da proteína de Npt2B intestinal humano definida pela SEQ ID n° . : 1. O método pode incluir adicionalmente a etapa de observação de uma diminuição ou estabilização da concentração de fosfato no soro. Por exemplo, as concentrações de fosfato no soro antes e depois do tratamento com o anticorpo podem ser medidas e comparadas.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para reduzir os efeitos colaterais da terapia com

2 0 a vitamina D em um indivíduo humano (por exemplo, um

indivíduo humano que tem uma doença renal, uma deficiência de vitamina D ou ambas). O método inclui a etapa de administração oral ao indivíduo de (a) um composto da vitamina D e (b) de um anticorpo anti- intestinal de Npt2B tal como um anticorpo intestinal anti-humano de Npt2B (SEQ ID n°.:l) em que o anticorpo é administrado em uma quantidade eficaz para reduzir a hiperfosfatomia induzida pela terapia com a vitamina D. Por exemplo, o nível de fosfato no soro do indivíduo pode ser reduzido ou mantido. Em uma realização, o

3 0 anticorpo é um anticorpo de IgY. Em uma outra realização, o

anticorpo se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 234-3 62 ou dos aminoácidos 429-485 da proteína de Npt2B intestinal humano definida pela SEQ ID n°.:l. O método pode incluir adicionalmente a etapa de observação de uma diminuição ou estabilização da concentração de fosfato no soro. Por exemplo, as concentrações de fosfato no soro antes e depois do tratamento com o anticorpo podem ser medidas e comparadas.

Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para

a atenuação ou a prevenção da hiperfosfatomia. Em algumas realizações, a concentração de fosfato no soro é reduzida ou mantida a um nível de aproximadamente 150%, 125%, 120%, 115%, 110% ou 105% ou menor de uma concentração fisiológica máxima de fosfato no soro na faixa normal aceita. Em algumas realizações, a concentração de fosfato no soro é reduzida ou mantida a um nível dentro da faixa normal. Para um indivíduo humano, a concentração de fosfato no soro normal elevada máxima é de 5,0 mg/dl. Em uma realização preferida, a concentração de fosfato no soro é reduzida ou mantida em 5,5 mg/dl ou menos ou 5,0 mg/dl ou menos em um indivíduo humano.

Os pacientes com risco de desenvolver ou que desenvolveram a hiperfosfatomia incluem, mas sem ficar a eles limitados, os pacientes com: intoxicação por vitamina D pela 2 0 ingestão excessiva de compostos da vitamina D; ingestão excessiva de fosfato tal como o uso excessivo de laxantes ou de enemas contendo fosfato; doença renal ou insuficiência tal como falha renal, aguda ou crônica, tal como descrito na presente invenção; hipoparatiroidismo primário; estados de resistência ao PTH tais como as síndromes de resistência tubular ao PTH incluindo os vários tipos de pseudo- hipoparatiroidismo (la, Ib, Ic e 2) ou hipomagnesemia grave, que prejudica a secreção de PTH e causa a resistência periférica ao PTH; e/ou condições em que o fosfato intracelular se desloca para o espaço extracelular, tal como rabdomiólise, Iise de tumor, deficiência à insulina ou acidose aguda.

Em algumas realizações, os métodos da presente invenção são aplicados para reduzir a absorção de fosfato em um indivíduo humano ou não humano que tem uma doença renal, recebe um composto da vitamina D (por exemplo, Ια, 25- diidroxivitamina D3), ou ambos.

As seqüências de aminoácido de Npt2B intestinal de várias espécies são conhecidas. Por exemplo, as seqüências de aminoácido de Npt2B intestinal humano (SEQ ID n°.:l), de Npt2B intestinal de camundongo (SEQ ID n°.:2), de Npt2B intestinal de rato (SEQ ID n°.:3) e de Npt2B intestinal de galinha (SEQ ID n°.:4) podem ser encontradas nos números de acesso no NCBI GenBank 095436, Q9DBPO, Q9JJ09 e AAQ90408, respectivamente. As proteínas de Npt2B intestinal mostram que quatro laços extracelulares conservados. Por exemplo, a similaridade da seqüência em todos os laços entre as quatro espécies providas acima é elevada (laço 1: > 76%, laço 2: > 64%, laço 3: >82, 5% e laço 4: > 87,5%) em que as três seqüências de mamíferos têm uma porcentagem de identidade mais elevada do que com a seqüência da galinha. Para o Npt2B intestinal humano (SEQ ID n°.:l), os laços extracelulares 1-4 são aminoác idos 122-135, 234-362, 429-485 e 547-552, respectivamente. Para o Npt2B intestinal de camundongo (SEQ ID n°. :2) , os laços extracelulares 1-4 são 125-138, 188-361, 440-461 e 549-554, respectivamente. Para o Npt2B intestinal de rato (SEQ ID n°.:3), os laços extracelulares 1-4 são 112- 136, 235-363, 430-486 e 548-551, respectivamente. Para o Npt2B intestinal de galinha (SEQ ID n°.:4), os laços extracelulares 1-4 são 109-133, 185-358, 427-482 e 544-551,

respectivamente.

Preferivelmente, um anticorpo que se liga a um epítopo dentro do laço extracelular 2 ou 3 de uma proteína intestinal de Npt2B é utilizado para praticar os métodos da presente invenção. Por exemplo, é utilizado um anticorpo que se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 234-362 da SEQ ID η° . : 1 (isto é, o laço 2) ou dos aminoácidos 429-485 da SEQ ID n° . : 1 (isto é, o laço 3). Sob este aspecto, o anticorpo pode se ligar a pelo menos 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos consecutivos dentro dos aminoácidos 234-362 ou 429-485 da SEQ ID n° . : 1 e, opcionalmente, tem uma afinidade Kd de aproximadamente IO"4 Μ, IO"5 Μ, IO"6 Μ, IO"7 Μ, IO"8 M, IO"9 M ou menos. Em algumas realizações, os anticorpos que se ligam a um epitopo dentro dos aminoácidos 245-340 da SEQ ID n°.:l, aminoácidos 252-330 da SEQ ID n°.:l, aminoácidos 445-480 da SEQ ID n° . : 1 ou aminoácidos 455-474 da SEQ ID n° . : 1 são utilizados para praticar a presente invenção. Em algumas realizações, os anticorpos contra um epitopo dentro de fragmentos do laço 2 ou 3 de Npt2B intestinal seguinte são utilizados para praticar a presente invenção: peptideo 252- 259, 278-285, 297-304, 323-330, 455-462 e 467-474 dos aminoácidos de Npt2B intestinal humano (SEQ ID n°.:l); os fragmentos de Npt2B intestinal de camundongo (SEQ ID n°.:2) que correspondem aos fragmentos de Npt2B intestinal humano acima; os fragmentos de Npt2B intestinal de rato (SEQ ID n° . : 3) que corresponde aos fragmentos de Npt2B intestinal humano; ou os fragmentos de Npt2B intestinal de galinha (SEQ ID n°.:4) que correspondem aos fragmentos de Npt2B intestinal humano. Em uma realização, os anticorpos contra um epitopo dentro dos aminoácidos 323-330 ou 455-462 da proteína de

2 5 Npt2B intestinal humano (SEQ ID n°.:l) ou um fragmento

correspondente da proteína de Npt2B intestinal de camundongo, rato ou de galinha são utilizados para praticar a presente invenção.

Os fragmentos correspondentes podem ser prontamente

3 0 identificados por qualquer programa de alinhamento familiar a

um elemento versado na técnica. Por exemplo, Gapped BLAST pode ser utilizado, tal como descrito em Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997) . Gapped BLAST está disponível no Website NCBI. Ao utilizar o programa Gapped BLAST, os parâmetros padrão do programa podem ser utilizados.

Está bem dentro da capacidade de um elemento versado na técnica a fabricação de um anticorpo anti- intestinal de Npt2B tal como um anticorpo ou um anticorpo de IgY que se liga a um epítopo dentro de um laço extracelular de Npt2B. Em algumas realizações, o anticorpo empregado no método é derivado de um ovo (por exemplo, gema de ovo) , particularmente de um ovo de uma ave, tal como um ovo de galinha. O método de Polson, Α., M. B. von Wechmar e Μ. H. van Regenmortel, " Isolation of Viral IgY Antibodies from Yolks of Immunized Hens, 11 Immunological Communications 9:475- 493 (1980) , aqui incorporado a título de referência em sua totalidade, pode ser utilizado para produzir um preparado de anticorpos de gema de ovo. As galinhas poedeiras podem ser inoculadas com uma proteína intestinal de Npt2B ou um fragmento imunogênico desta a partir de um laço extracelular. Preferivelmente, um adjuvante apropriado é administrado conjuntamente com a inoculação para intensificar a imunização. Um adjuvante útil para esta finalidade é um adjuvante de emulsão do tipo água-em-óleo, tal como o adjuvante de Freund integral. A proteína intestinal de Npt2B ou um fragmento imunogênico desta a partir de um laço extracelular faz com que as galinhas produzam anticorpos anti-intestinais de Npt2B que são transferidos passivamente à gema de ovo dos ovos postos pelas galinhas. As gemas de ovo ou os ovos inteiros que contêm o anticorpo podem ser coletados e homogeneizados para formar uma emulsão. A emulsão resultante pode ser secada para formar um pó que contém o anticorpo. Este pó pode ser então formulado de uma maneira apropriada para a administração oral e então ser administrado oralmente a um indivíduo animal humano ou não humano. O preparado pode ser administrado oralmente como um suplemento nutricional ou alimentar.

Os anticorpos de qualquer classe ou subclasse de isótipo (por exemplo, IgY, IgG, IgM, IgD, IgA, IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) bem como fragmentos destes (se produzidos pela digestão enzimática ou química de tais anticorpos) e a preparação de tais anticorpos por meio de um dispositivo sintético ou pela expressão de seqüências de genes que codificam tais anticorpos ou fragmentos destes são contemplados. Em uma realização de IgY, os anticorpos nas gemas de ovo de uma ave (por exemplo, galinhas, faisões, patos, perus, gansos, e outros ainda) são utilizados para praticar a presente invenção (vide, por exemplo, as Patentes Norte-americanas n°s. 5.080.895, 5.989.584 e 6.213.930, cada uma das quais é incorporada na presente invenção a título de referência em sua totalidade). Kits de purificação de anticorpo do ovo comercialmente disponíveis, tais como EGGstract® IgY Purification Systems (Promega; Madison, WI) ou Eggcellent® Chicken IgY Purification (Pierce Biotechnology, Inc.; Rockford, IL), podem ser utilizados para purificar os anticorpos. Os anticorpos também podem ser purificados com base em sua afinidade a peptídeos ou fragmentos de proteína utilizando dispositivos padrão para a purificação por afinidade. Alternativamente, os ovos, as gemas de ovo ou o pó de gema de ovo seco que contêm os anticorpos podem ser misturados com um alimento diretamente para o consumo oral ou ser facilmente introduzidos em uma pílula, em um comprimido ou em uma cápsula. Os genes que codificam tais anticorpos também podem ser identificados utilizando tais anticorpos através de clonagem molecular ou técnicas de exibição de fagos bem estabelecidas para dar surgimento a formas monoclonais inteiras ou parciais de tais anticorpos que podem ser utilizados sozinhos ou em combinação.

As composições que contêm anticorpos anti- intestinais de Npt2B de acordo com a presente invenção podem ser dosadas, por exemplo, uma, duas ou três vezes ao dia. A dosagem pode ser opcionalmente subdividida de uma maneira em que uma porção da dose prescrita seja ingerida antes do consumo de alimentos ou de bebidas, uma outra porção seja ingerida junto com alimentos ou bebidas, sendo que outras porções sejam ingeridas logo após a ingestão de alimentos ou de bebidas. Os ingredientes ativos podem ser administrados pela via oral como partículas ou pó espalhados ou distribuídos sobre ou dentro de alimentos; ou dissolvidos ou suspensos em bebidas; ou providos em formas de dosagem farmacêutica sólidas, tais como comprimidos, cápsulas e pós ou em formas de dosagem líquidas, tais como elixires, xaropes e suspensões. Em algumas realizações, o anticorpo é administrado com alimentos ou imediatamente em seguida (isto é, dentro de aproximadamente uma hora antes ou depois) ao consumo de um alimento que tem o fosfato alimentar. Em algumas realizações, o anticorpo é administrado concomitantemente com um aglutinante de fosfato.

As composições farmacêuticas exemplificadoras de acordo com a presente invenção compreendem IgY e componentes do ovo e, opcionalmente, IgY ou componentes da gema do ovo e opcionalmente com estabilizantes ou carreadores adicionais ou farmaceuticamente aceitáveis. Os ovos inteiros ou as gemas de ovo, ou as gemas de ovo em que os lipídeos são parcialmente ou na maior parte removidos podem ser emulsifiçados, opcionalmente misturados com um composto de encapsulação ou lioprotetor, e ser submetidos à secagem por aspersão ou a secagem por congelamento para a formação de um pó.

Os anticorpos da gema podem ser parcialmente purificados, por exemplo, para remover grandes quantidades de lipídeos. Consultar Camenisch C et al., FASEB J. 1999, 13:81- 88; Akita E Sc Nakai S, J. Immunol. Methods 1993, 160:207-214, cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência como se fosse apresentado em sua totalidade; bem como a Publicação de Patente Norte-americana n°. 2004/0087522, incorporada na presente invenção a título de referência como se fosse apresentada em sua totalidade.

As cápsulas ou os comprimidos podem conter formulações de liberação controlada, uma vez que podem ser providos em uma dispersão do composto ativo em hidróxi propil metil celulose ou no material relacionado conhecido por alterar a cinética de liberação do agente ativo. As formas de dosagem sólidas podem ser manufaturadas como produtos de liberação sustentada para prover a liberação contínua da medicação durante um período de tempo utilizando as técnicas farmacêuticas conhecidas. Os tabletes comprimidos podem ser revestidos por açúcar ou revestidos por película para mascarar qualquer gosto desagradável e para proteger o comprimido da atmosfera, ou podem ser revestidos entericamente para a desintegração seletiva no trato gastrointestinal. As formas de dosagem oral sólidas e 2 0 líquidas podem conter corantes e flavorizantes para aumentar a aceitação pelo paciente.

Os estabilizantes são agentes protetores que mantêm a atividade de ligação do anticorpo sob condições de desnaturação, tais como o calor ou o ácido. O estabilizante não inibe a interação dos anticorpos com o antígeno alvo, de modo que o efeito biológico desejado também é mantido. Os estabilizantes exemplificadores incluem clara de ovo, albumina ou compostos de sacarídeo. Preferivelmente, o composto de sacarídeo está presente de aproximadamente 5% a 30% do líquido do ovo inteiro (em peso) , e com mais preferência na quantidade de 10% a 20% do líquido do ovo integral (em peso) . 0 anticorpo é misturado com um composto de sacarídeo em uma suspensão líquida e a suspensão é então 10

secada para produzir um sólido que contém a proteína e o sacarídeo. Os compostos de sacarídeo úteis como estabilizantes incluem monossacarideos, dissacarídeos, polissacarídeos, monossacarideos alquilados, dissacarídeos alquilados, polissacarídeos alquilados, álcoois de monossacarídeo e álcoois de monossacarídeo alquilados. Preferivelmente, tais compostos de sacarídeos são compostos de ou com base em unidades de monossacarídeo de cinco ou seis carbonos. Os monossacarideos são resíduos de açúcar simples que têm a fórmula (CH2O)n em que η é igual ou maior do que 3. Os exemplos de monossacarideos incluem, mas sem ficar a elas limitados, a glicose, ribose, frutose, galactose, talose, arabinose, fucose, manose, xilose e eritrose. Os monossacarideos em todas as formas isoméricas tais como a- isômeros, β-isômeros, D-isômeros e L-isômeros têm atividade. Os dissacarídeos são moléculas com dois resíduos de monossacarídeo unidos por uma ligação glicosídica. Os exemplos de dissacarídeos que podem ser utilizados na presente invenção incluem, mas sem ficar a elas limitados, a trealose, maltose, sacarose, lactose, maltose e lactulose. Os polissacarídeos são moléculas com três ou mais monossacarideos unidos em cadeias lineares, não ramificadas ou ramificadas. O amido, o glicogênio e a celulose são exemplos de polissacarídeos que têm centenas ou milhares de .25 resíduos de monossacarídeo. O amido pode conter cadeias lineares, não ramificadas (amilose) ou cadeias altamente ramificadas (amilopectina). O glicogênio contém cadeias ramificadas e a celulose contém cadeias lineares não ramificadas. Os monossacarideos alquilados, os dissacarídeos 3 0 alquilados e os polissacarídeos alquilados são monossacarideos, dissacarídeos e polissacarídeos com pelo menos um dos grupos hidrogênio substituídos por um grupo alquila. Os álcoois de monossacarídeo são polióis acíclicos que contêm três ou mais grupos hidroxila. Eles podem ser formados ao converter os grupos cetona ou aldeído dos monossacarídeos em grupos hidroxila. Os exemplos de álcoois de monossacarídeo incluem, mas sem ficar a eles limitados, a glicerina, manitol, sorbitol, xilitol, lactitol, isomalte, maltitol e hidrolisados de amido hidrogenado. Os álcoois os de monossacarídeo são álcoois de monossacarídeo com pelo menos um dos grupos hidrogênio substituídos por um grupo alquila.

Os anticorpos também podem ser unidos a um

substrato (polimérico ou não polimérico) de matriz para as finalidades de intensificar a eficácia ou a estabilidade dos anticorpos e então ser administrados.

A invenção será compreendida mais inteiramente

quando os seguintes exemplos não limitadores são levados em consideração.

EXEMPLO 1

INIBIÇÃO DO TRANSPORTE DE FOSFATO POR ANTICORPOS ANTI-

INTESTINAIS DE NPT2B

2 0 MATERIAIS E MÉTODOS

Animais: Galinhas poedeiras Single Comb White Leghorn foram utilizadas para a produção do anticorpo (3 galinhas por antígeno do peptídeo). Cada antígeno do peptídeo de Npt2B intestinal humano (vide a Tabela 1 abaixo para a

seqüência e a Figura 1 para a localização na proteína do cotransportador) foi preparado ao conjugar o peptídeo à gamaglobulina bovina utilizando o procedimento de glutaraldeído padrão.

Tabela 1. A seqüência de aminoácido dos peptídeos utilizados

3 0 para produzir anticorpos do ovo. As seqüências de aminoácido

são com base em regiões conservadas preditas de Npt2B intestinal entre as espécies animais. As regiões de interesse incluem a superfície hidrofílica nos laços extracelulares 1- Peptídeo Arbitrário# Seqüência de aminoácido Localização da enzima

(SEQ ID η ° · ) (posições do aminoácido na SEQ ID n°. :l) 11 (SEQ ID n° . 5) LVGGKMAG (124-131) ECL-1 1 12 (SEQ ID n° . 6) FHFKNGED (252-259) ECL- 2 PERTO DE D- 3 13 (SEQ ID n° . 7) LKVITKPF (264-271) ELC- 2 PERTO DE D- 3 14 (SEQ ID n° . 8) LDKKVISQ (278-285) ELC- 2 TOPO D-3 4 (SEQ ID n° . 9) SLVKIWCK (297-304) ELC- 2 TOPO t -3 4 16 (SEQ ID n° . 10) TSPSLCWT (323-330) ELC- 2 PERTO DE D- 4 17 (SEQ ID n° . 11) YPLTLGSN (455-462) ECL- 3 PERTO DE D- 6 18 (SEQ ID n° . 12) TTAILAAL (467-474) ECL- 3 PERTO DE D- 6 19 (SEQ ID n° . 13) VQSSSVFT (430-437) ECL- 3 PERTO DE D- 5 (SEQ ID n° . 14) LIGIGVIT (443-450) ECL- 3 PERTO DE D- 5 31 (SEQ ID n° . 15) EVATHYLE (235-242) ECL- 2 PERTO DE D- 3 32 (SEQ ID n° . 16) GIQNWTMK (332-339) ECL- 2 PERTO DE D- 4 33 (SEQ ID n° . 17) FVNFHLPD (354-361) ECL- 2 PERTO DE D- 4 34 (SEQ ID n° . 18) SPGNALRS (476-483) ECL- 2 PERTO DE D- 4 (SEQ ID n° . 19) ENIAKCQH (345-352) ECL- 3 PERTO DE D- 6

1ECL = laço extracelular. Há oito domínios de transmembrana (D) ao Npt2B intestinal e quatro laços extracelulares (ECL). Perto de D significa que é o mais próximo a esse domínio. T = Topo significa que é igualmente espaçado entre os domínios apresentados. Vide a Figura 1.

Preparação da conjugação: Embora o procedimento para a conjugação dos peptídeos em proteínas carreadoras possa variar consideravelmente (uma série de kits para a conjugação pode ser obtida junto à Pierce Scientific) , bem como a natureza das proteínas carreadoras, o método utilizado nos estudos descritos neste exemplo envolveu a utilização do procedimento de glutaraldeído para a conjugação do peptídeo desejado em gamaglobulina bovina da proteína carreadora (BgG). BgG (4 mg) em 0,8 ml de 0,1 M de tampão de acetato de sódio (pH = 7) foi misturado com 4 mg do peptídeo desejado. 0,52 ml de 0,02 M de glutaraldeído (em 0,1 M de tampão de acetato de sódio) foi adicionado por gotejamento (para evitar a formação de espuma) à mistura da proteína carreadora do peptídeo. A mistura foi agitada por duas horas. 2 0 mg de glicina foram então adicionados para interromper a reação. A mistura foi colocada em repouso por uma hora e então foi dialisada contra uma solução salina tamponada com fosfato (pH = 7) até a manhã seguinte (Peso molecular = 6.000 - 8.000) . 0 conjugado dialisado foi então congelado a -80°C até ser utilizado.

Preparação de vacina e utilização: Para preparar uma vacina para cada galinha, 0,5 mg do conjugado foi diluído a uma concentração final de 0,5 ml de PBS e misturado com 0,5 ml do adjuvante da Freund completo (primeira injeção) ou incompleto (vacinação impulsionadora) para formar uma emulsificação de água em óleo com capacidade de reter um grânulo quando gotejado em água gelada. A galinha foi então injetada intramuscularmente em quatro locais (cada pé e cada peito) com 0,25 ml da emulsão vacinai. A injeção impulsionadora no adjuvante incompleto ocorreu sete dias depois. Cada peptídeo mostrado na Tabela 1 foi conjugado separadamente a BgG e foi injetado em três galinhas poedeiras.

Preparação da amostra do anticorpo: Os anticorpos de pico foram conseguidos em 21 dias, e desse modo os ovos foram coletados do dia 21 ao dia 110. Em lotes de aproximadamente trinta dias, as gemas de ovo de cada galinha foram separadas .25 dos ovos integrais, misturadas e Iiofilizadas. Uma amostra dos ovos de cada galinha foi coletada, as gemas foram separadas e o IgY foi purificado com polietileno utilizando os procedimentos descritos em Polson et al., Immunol. Commun. 1980, 9:475-493). Os anticorpos preparados utilizando este método foram congelados (-20°C) e serviram como reagentes para a cultura de células e o ensaio de enzimas in vitro. Células: Células Caco-2 foram obtidas junto à ATCC (# HTB-37, ATCC). A linhagem de células Caco-2 é uma linhagem de células de adenocarcinoma colorretal e foi utilizada pra modelar os enterócitos intestinais neste estudo.

Ensaio da captação de fosfato: O meio de uma monocamada subconfluente de células Caco-2 foi removido e as células * 5 foram lavadas com um tampão A (137 raM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 2,8 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgSO4, 14 mM de Tris-HCl, pH 7,4 = tampão de sódio) ou com um tampão B (13 7 mM de cloreto de colina, 5,4 mM de KCl, 2,8 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgSO4, 14 mM de Tris-HCl, pH 7,4 = tampão livre de sódio) . Um ml do tampão A ou B contendo o anticorpo em 0,1 mg/ml foi adicionado às células e foi incubado por uma hora a 37°C. Após o período de incubação, o tampão A ou o tampão B foi aspirado e 100 μΐ do tampão A ou do tampão B contendo K2H32PO4 (1 pCi/ml) foram adicionados. As células foram incubadas por mais vinte minutos a 37°C. Durante o período de incubação, a placa foi agitada continuamente a 100 rpm/minuto. A captação de fosfato foi terminada ao remover os tampões de captação e ao lavar as células com uma solução de interrupção gelada (14 mM de Tris-HCl, pH 7,4 e 137 mM de cloreto de colina). As células foram lisadas e coletadas utilizando uma solução de 1% de Triton X-IOO. As alíquotas foram adicionadas ao fluido de cintilação e a radioatividade foi determinada pela contagem de cintilação líquida. A diferença na radioatividade recuperada entre os ensaios, utilizando os dois tampões .25 (tampão A e tampão B) representa o transporte dependente de sódio do fosfato.

RESULTADOS

Conforme mostrado na Figura 2 com as células Caco- 2, os anticorpos aos peptídeos 12, 14, 15, 16, 17 e 18 inibiram o transporte de fosfato. A eficácia relativa da inibição era 16>17>18>12>15=14. Os anticorpos ao peptídeo 16 e ao peptídeo 17 eram mais eficazes do que a nicotinamida (controle positivo para inibir a captação de fósforo) na inibição do transporte de fosfato.

EXEMPLO 2

EFEITO DOS ANTICORPOS ANTI-INTESTINAIS DE NPT2B NO GANHO DE PESO CORPÓREO, NA CONCENTRAÇÃO DE FOSFATO NO PLASMA E NA

EXCREÇÃO DE FOSFATO MATERIAIS E MÉTODOS A produção dos anticorpos de Npt2B intestinal anti- humano que utilizam vários peptídeos de Npt2B foi descrita no Exemplo 1 acima. Em vez dos anticorpos de IgY purificados, a gema de ovo seca em pó contendo os anticorpos foi utilizada diretamente no estudo de alimentação apresentado neste exemplo.

Pintinhos Single Comb White Leghorn machos com um dia de existência (dois galinheiros com cinco pintinhos) receberam uma dieta do controle ou uma dieta do anticorpo (dieta de 1 g/kg do anticorpo de gema de ovo secada por congelamento) a um dos catorze peptídeos de Npt2B (peptídeos 11-20 e 31-34 na Tabela 1) . A dieta do controle é uma refeição nutriente padrão com base em milho-soja adequada e continha dieta de 1 g/kg de gema de ovo em pó seca do controle injetada por adjuvante. A dieta do anticorpo é a mesma que a dieta do controle, exceto pelo fato que o pó do anticorpo específico do peptídeo é substituído pelo pó do controle. Os pintinhos foram alimentados com as dietas por 21 dias. Em seguida, os pesos corpóreos foram determinados, as amostras de sangue foram coletadas determinando o nível de fósforo no plasma total utilizando um analisador Roche/Hitachi (com base na reação do fosfato com molibdato de amônio para a formação de fosfomolibdato de amônio sem redução) e a amostra de excreção dos três últimos dias nas dietas foi coletada para cada galinheiro e foi analisada quanto ao fósforo total (base de peso a seco).

RESULTADOS Conforme mostrado na Tabela 2, os anti-peptídeos 11, 13, 15-17, 20, 31 e 32 suprimiram o ganho de peso corpóreo; os anti-peptídeos 20, 32 e 34 diminuíram os níveis de fosfato no plasma; e os anti-peptídeos 11, 12, 14, 17-20 e 32 aumentaram a excreção de fósforo.

Tabela 2. 0 efeito da alimentação com anticorpo do ovo (dieta de 1 g/kg) para selecionar os peptídeos de Npt2B intestinal no ganho de peso corpóreo, na concentração de fósforo no plasma e na excreção de fósforo.1

Ganho de : peso Fosfato do Fosfato da Fosfato médi Tratamento corpórec > (g)2 sangue (mg/dl)3 excreção (%) 4 da excreção' Controle 183 ± 8,4 6, 6 ± 0, 5 1, 24 , 1, 26 1,25 Anti-peptídeo 11 164 ± 6,I6 6 , 6 ± 0 , 2 1,3, 1, 44 1, 37 Anti-peptídeo 12 180 ± 5,9 6 , 2 ± 0,4 1, 38, 1,46 1, 42 Anti-peptídeo 13 166 + IO7 6,3 + 0,4 1, 16, 1, 34 1, 25 Anti-peptídeo 14 175 ± 3,9 6 , 6 ± 0, 2 1, 42, 1, 22 1,32 Anti-peptídeo 15 170 ± 8 , 6 7 6,7 ± 0,4 1,38, 1, 18 1,28 Anti-peptídeo 16 145 ± 145 6,7 ± 0,3 1, 02, 1, 22 1, 12 Anti-peptídeo 17 165 ± 7 , 56 6,3 ± 0,1 1, 32, 1,5 1,41 Anti-peptídeo 18 178 ± 6 , 2 6 , 6 ± 0,1 1,7, 1,2 1,45 Anti-peptídeo 19 176 ± 8 , 0 6,4 ± 0,3 1, 32, 1, 34 1,33 Anti-peptídeo 20 170 ± IO7 6, 0 ± 0,29 1,35, 1,5 1,43 Anti-peptídeo 31 169 ± 7 , O7 6,3 ± 0,2 1, 16, 1, 12 1, 14 Anti-peptídeo 32 163 ± 9, 25 5,7 ± 0 , 3 8 1, 28, 1,4 1, 34 Anti-peptídeo 33 177 ± 9,5 6, 6 ± 0 , 2 1, 14, 1, 18 1, 16 Anti-peptídeo 34 182 ± 5,2 6 , 0 ± 0,210 1, 22, 1, 24 1, 23

1 Dois galinheiros com cinco pintinhos machos Single Comb

White Leghorn com um dia de existência foram alimentados com

um nutriente adequado (dieta inicial para pintinho UW-Padrão)

com gema de ovo em pó do controle (dieta de 1 g/kg de gema de

ovo seca de galinhas injetadas com os adjuvantes sozinhos) ou

gema de ovo em pó (dieta de 1 g/kg) de galinhas imunizadas

com os antígenos do peptídeo indicado. Os pintinhos foram

alimentados por três semanas e o ganho de peso corpóreo durante este período (menos o peso inicial) foi medido. Com 21 dias de existência, todos os pintinhos tiveram seu sangue colhido, o plasma coletado e analisado quanto ao fósforo. Todas as excreções coletadas da bandeja de excrementos abaixo de cada galinheiro de pintinhos durante os três últimos dias de estudo foram coletadas e analisadas quanto ao fósforo total.

2Ganho ± erro padrão = peso aos 21 dias menos o peso inicial. 3Fosforo no plasma ± erro padrão. 4Dois galinheiros foram testados e analisados. Os valores brutos (% de matéria seca) e a média são mostrados. 6*, 5**, 7*** indicam ρ < 0,05**, ρ < 0,07* e ρ < 0,1*** em relação ao controle.

5P < 0,05; 6P < 0,07; 7p < 0,1; 8p = 0,07; 9p = 0,13 e 10p = 0,16.

EXEMPLO 3

EFEITO DOS ANTICORPOS ANTI-INTESTINAIS DE NPT2B NO GANHO DE

PESO CORPÓREO, NA CONCENTRAÇÃO DE FOSFATO NO PLASMA E NA

CINZA DE OSSO

2 0 MATERIAIS E MÉTODOS

A produção dos anticorpos intestinais anti-humanos de Npt2B que utilizam o peptídeo 16 foi descrita no Exemplo 1 acima. Em vez dos anticorpos de IgY purificados, a gema em pó seca contendo os anticorpos foi utilizada diretamente no estudo de alimentação apresentado neste exemplo.

Pintinhos Broiler com sete dias de existência receberam uma dieta do controle (quatro galinheiros com cinco Broilers) ou uma dieta do anticorpo (dieta de 1 g/kg do anticorpo da gema de ovo secada por congelamento (oito

3 0 galinheiros com cinco Broilers). A dieta do controle é uma

dieta nutriente padrão adequada e continha uma dieta de 1

g/kg de pó de gema de ovo seca do controle injetada com o

adjuvante. A dieta do anticorpo é a mesma que a dieta do controle exceto que o pó do anticorpo do anti-peptídeo 16 é substituído pelo pó do controle. As dietas começaram quando os pintinhos tinham sete dias de existência e foram alimentados até 21 dias de existência. Os pesos corpóreos foram determinados no 14° dia e no 21° dia. No 21° dia, as amostras de sangue foram coletadas para a determinação do nível de fósforo no plasma total utilizando um analisador Roche/Hitachi (com base na reação de fosfato com o molibdato de amônio para a formação de fosfomolibdato de amônio sem redução) e a tíbia direita foi colhida para a determinação da cinza de osso seca livre de gordura (o éter foi extraído, secado, a cinza foi tirada na mufla e a relação entre cinza/osso livre de gordura seco foi determinada e convertida em porcentagem). RESULTADOS

Conforme mostrado na Tabela 3, os Broilers alimentados com o anticorpo ao peptídeo 16 reduziram o ganho de peso corpóreo em catorze dias em comparação aos Broilers alimentados com o pó de gema de ovo do anticorpo do controle adjuvante (413 g versus 495 g para o grupo da dieta do anti- peptídeo 16 e para o grupo da dieta do controle, respectivamente, ρ = 0,08). 0 fósforo no plasma não diferiu entre estes grupos de dois tratamentos (6,12 mg/dl versus 6,14 mg/dl para o grupo da dieta do anti-peptídeo 16 e para o grupo da dieta do controle, respectivamente). Os Broilers alimentados com o anticorpo ao peptídeo 16 reduziram o teor mineral do osso em comparação aos Broilers alimentados com o pó de gema de ovo do anticorpo do controle adjuvante (0,524% versus 0,539% para o grupo da dieta do anti-peptídeo 16 e o 3 0 grupo da dieta do controle, respectivamente). Os pintinhos Broiler são uma cepa que cresce muito rapidamente em comparação a Leghorn. 0 peso corpóreo durante as primeiras três semanas nos Broilers aumenta de 3 5 gramas a aproximadamente 500-600 gramas (um aumento de mais de quinze vezes) , ao passo que na Leghorn o aumento varia de 35 g a somente aproximadamente 18 0 g (aumento de cinco a seis vezes). Desse modo, o ganho de peso corpóreo no Broiler pode ser um indicador sensível ao fósforo alimentar disponível. A partir dos dados da cinza de osso, a prioridade para a manutenção do fosfato no sangue é mais elevada nesta raça do que a criação de ossos e o crescimento de músculos. Isto sustenta que o crescimento é o indicador mais sensível nesta cepa.

Tabela 3. 0 efeito da alimentação com o anticorpo do ovo (dieta de 1 g/kg) ao peptídeo 16 de Npt2B intestinal no ganho de peso corpóreo, na concentração de fósforo no plasma e na cinza de osso.

Controle Anti-peptídeo 16

Ganho de peso corpóreo 495 ± 15* 413 ± 16*

Fosfato do plasma (mg/dl) 6,14± 0,31 6,12 ± 0,19

Cinza de osso (%) 0,539 ± 0,005** 0,524 ± 0,005**

*Broilers alimentados com o anticorpo ao peptídeo 16 2 0 reduziram o ganho de peso corpóreo em catorze dias em comparação aos Broilers alimentados com o pó de gema de ovo do anticorpo do controle adjuvante (p = 0,0003) . * *Broilers alimentados com o anticorpo ao peptídeo 16 reduziram o teor mineral do osso em comparação aos Broilers '25 alimentados com o pó de gema de ovo do anticorpo do controle adjuvante (p = 0,02) .

EXEMPLO 4

0 ANTICORPO ADMINISTRADO ORALMENTE PODE ALCANÇAR E OBSTRUIR A ATIVIDADE DE UMA PROTEÍNA ASSOCIADA Â MEMBRANA DA BORDA EM

30

ESCOVA INTESTINAL MATERIAIS E MÉTODOS Preparação do anticorpo: Galinhas poedeiras Single Comb White Leghorn foram utilizadas para a produção do anticorpo (três galinhas por antígeno do peptídeo). A fosfatase alcalina intestinal da galinha foi adquirida junto à Worthington. Para preparar uma vacina para cada galinha, 0,5 mg de fosfatase alcalina intestinal da galinha foram diluídas a uma concentração final de 0,5 ml de PBS e misturado com 0,5 ml do adjuvante da Freund completo (primeira injeção) ou incompleto (vacinação impulsionadora) para a formação de emulsificação de água em óleo capaz de reter um grânulo quando gotejado em água gelada. A galinha foi então injetada intramuscularmente em quatro locais (cada pé e cada peito) com 0,25 ml da emulsão vacinai. A injeção impulsionadora no adjuvante incompleto ocorreu 7 dias depois.

Os anticorpos de pico foram conseguidos em 21 dias, os ovos foram desse modo, coletados do dia 21 ao dia 110. Em lotes de aproximadamente trinta dias, as gemas de ovo de cada galinha foram separadas dos ovos integrais, misturadas e Iiof ilizadas. O pó da gema de ovo seca contendo o anticorpo foi armazenado à temperatura ambiente até ser utilizado nos estudos sobre alimentação animal.

Experiência animal: O modelo da galinha utilizado neste estudo foi descrito por Biehl e Baker, J. Nutr. 1997, 127:2054-2059 com exceção dos anticorpos para a fosfatase alcalina intestinal. O controle negativo utilizado neste estudo era uma dieta deficiente em Pi (Pi = fosfato inorgânico que são fosfatos amplamente minerais ou fosfato de tecidos animais e de produtos tais como o leite e os ovos) , em que o fósforo alimentar utilizado era o fosfato fítico. Conforme mostrado nos resultados abaixo, este tratamento 3 0 alimentar resultou em baixo teor de fósforo no plasma. O controle positivo era a mesma dieta que o controle negativo, porém suplementado com Ια-hidroxivitamina D3 (dieta de 20 pg/kg, Sigma). Conforme mostrado nos resultados abaixo, este tratamento alimentar aumentou os níveis de fósforo no sangue em comparação ao controle negativo. Todos os tratamentos alimentares restantes eram o controle positivo mais o anticorpo (1 g de pó de gema de ovo seca produzida tal como descrito acima). Os controles negativos e positivos foram alimentados com uma dieta de 1 g/kg de gema em pó seca das galinhas injetadas com o adjuvante. Estes pós de gema de ovo não tinham anticorpos específicos.

Um total de três tratamentos foi utilizado (controle negativo, controle positivo, controle positivo mais anticorpos da fosfatase alcalina intestinal anti-galinha). Seis pintinhos machos Single Comb White Leghorn receberam tratamentos alimentares. Os pintinhos foram alimentados com cada um dos tratamentos alimentares por dez dias, pesados, e as amostras de sangue foram coletadas para a determinação da concentração de fósforo no plasma utilizando um analisador Roche/Hitachi (com base na reação de fosfato com o molibdato de amônio para a formação de fosfomolibdato de amônio sem redução).

RESULTADOS

Os anticorpos à fosfatase alcalina intestinal da galinha eram eficazes na redução dos níveis de fósforo no plasma (Tabela 4).

Tabela 4. Fósforo no plasma de galinhas alimentadas com fosfatases alcalinas anti-intestinais (IAP) na presença da vitamina D1 ativa.

Fosfato do plasma Tratamento com dieta (mg/dl) erro padrão

Deficiente em Pi 3,92 0,35

Vitamina D2 ativa 6,70 0,51

Pintinhos IAP** 4,73 0,2 9

1Pintinhos Leghorn com um dia de vida (n = 6) foram

alimentados com uma dieta deficiente em Pi contendo fósforo fitico com a adição de Ια-hidroxivitamina D3 sozinha (vitamina D ativa, dieta de 2 0 pg/kg) ou a adição de Ia- hidroxivitamina D3 mais um anticorpo do ovo (dieta de 1 g/kg de pó do anticorpo da gema de ovo seca) à fosfatase alcalina intestinal da galinha. O fósforo no plasma foi medido após dez dias de alimentação seguindo a dieta.

2Galinhas na dieta da vitamina D ativa (loí-hidroxivitamina D3) tinham aumentado o fósforo no plasma em relação às galinhas na dieta deficiente em Pi (p = 0,0004) . * * Pintinhos alimentados com a dieta da vitamina D ativa (la- hidroxivitamina D3) suplementados com o anticorpo â fosfatase alcalina intestinal da galinha tinham reduzido o fósforo no plasma em relação ao tratamento sozinho com a vitamina D ativa em ρ < 0,05.

EXEMPLO 5

REDUÇÃO DO NÍVEL DE FOSFATO NO SORO EM ANIMAIS URÊMICOS

INDUZIDOS POR ADENOSINA

0 modelo animal utilizado neste exemplo é o modelo de rato urêmico induzido por adenosina (vide, por exemplo, Yokazawa et al., Nephron 1986, 44:230-234; Katsumata et al., Kid Intl 2003, 64:441-450; e Levi R et al., J Am Soc Nephrol 2006, 17:107-112, cada um dos quais é aqui incorporado a titulo de referência em sua totalidade).

Ratos (por exemplo, ratos Sprague Dawley machos com aproximadamente 175 - 250 g, até 10 ratos por grupo) são alimentados com uma dieta de controle ou uma dieta de adenina de indução à uremia (por exemplo, contendo 0,75% de adenina) por um periodo de semanas (por exemplo, três a cinco semanas ou mais) . Os ratos alimentados com a dieta de adenina irão desenvolver a hiperfosfatomia com nível de fosfato no soro mais elevado do que 4,4 mmol/1. Estes ratos também irão desenvolver a deficiência em vitamina D3, (la-hidroxivitamina D3 e Ια, 2 5-diidroxivitamina D3) . O tratamento oral diário destes ratos alimentados com a dieta de adenina com uma quantidade crescente de anticorpo anti-intestinal de Npt2B, tal como aqueles descritos no Exemplo 1, irá resultar em uma redução dos níveis de fosfato no soro dependente de dose. Se " 5 estes anticorpos forem aplicados dentro das primeiras quatro semanas de tratamento com a adenina e depois disso, estes anticorpos anti-intestinais de Npt2B irão prevenir, atrasar ou reverter o desenvolvimento da hiperfosfatomia nestes ratos.

Em outros grupos, os ratos alimentados com a dieta

de adenina recebem uma forma da vitamina D (por exemplo, 25- hidroxivitamina D ou derivados da mesma, ou um agente da vitamina D ativa tal como Ια, 2 5-diidroxivitamina D3) para prevenir ou corrigir a deficiência da vitamina D ativa. Este tratamento irá tornar os ratos mais suscetíveis à hiperfosfatomia e irá exacerbar a hiperf osf atomia nestes ratos, uma vez desenvolvidos. O tratamento oral destes ratos que recebem a vitamina D (por exemplo, Ια, 25- diidroxivitamina D3) com uma dose crescente do anticorpo anti-intestinal de Npt2B tal como aquele descrito no Exemplo 1 irá reduzir os níveis de fosfato no soro nestes ratos de uma maneira dependente de dose. Se os anticorpos forem aplicados dentro das primeiras quatro semanas de tratamento com a adenina e depois disso, estes anticorpos anti- intestinais de Npt2B irão prevenir ou atrasar o desenvolvimento ou a exacerbação da hiperfosfatomia.

Experiências similares podem ser realizadas utilizando outros animais urêmicos induzidos por adenosina, tais como cães, porcos e macacos. EXEMPLO 6

REDUÇÃO DO NÍVEL DE FOSFATO NO SORO EM RATOS 5/6

NEFRECTOMIZADOS Para a nefrectomia 5/6 (vide, por exemplo, Cozzolino M et al. , Kidney Int. 2003, 64：1653-61) , diversas ramificagoes da arteria renal esquerda foram ligadas e ο rim direito foi retirado· Ratos nefrectomizados 5/6 (por exemplo, ratos machos de Sprague Dawley, com aproximadamente 17 5 - 250 g, ate dez ratos por grupo) sao alimentados com uma dieta elevada em fosfato (por exemplo, 0,9% de fosfato) . Estes ratos irao se tornar uremicos semanas apos a cirurgia (por exemplo, quatro a oito semanas) e irao desenvolver falha renal, hiperfosfatomia e deficiencia da vitamina D3 ativa (Ια-hidroxivitamina D3 e la, 25-diidroxivitamina D3). 〇 tratamento oral diario destes ratos nefrectomizados 5/6 alimentados com a dieta elevada em fosfato com uma quantidade crescente de anticorpo anti-intestinal de Npt2B, tal como aqueles descritos no Exemplo 1, ira reduzir ο nivel de fosfato no soro de uma mane ira dependente de dose nestes ratos. Se os anticorpos tais como aqueles descritos no Exemplo 1 forem dados dentro das primeiras semanas apos a cirurgia e depois disso, irao prevenir ou atrasar ο desenvolvimento da hiperfosfatomia nestes ratos. Em outros grupos, ratos nefrectomizados 5/6

alimentados com a dieta elevada em fosfato recebem uma forma da vitamina D (por exemplo, 25-hidroxivitamina D ou derivados desta, ou um agente de vitamina D ativa tal como la, 25- diidroxivitamina D3) para prevenir ou corrigir a deficiencia ativa de vitamina D. No entanto, este tratamento ira tornar os ratos mais suscetiveis a hiperfosfatomia e ira exacerbar a hiperfosfatomia nestes ratos, uma vez desenvolvidos. 〇 tratamento oral destes ratos que recebem a vitamina D (por exemplo, la, 25-diidroxivitamina D3) com uma dose crescente 3 0 do anticorpo anti-intestinal de Npt2B, tal como aquele descrito no Exemplo 1, ira reduzir ο nivel de fosfato no soro. Se os anticorpos forem dados dentro das primeiras

semanas da cirurgia e depois disso, estes anticorpos anti- intestinais de Npt2B irao prevenir ou atrasar ο desenvolvimento ou a exacerbagao da hiperfosfatomia nestes ratos.

A presente invengao nao deve ficar limitada aos exemplos acima, mas engloba todas as modificagoes e variagoes de acordo com ο ambito das reivindicagoes em anexo.

Claims (33)

1. MÉTODO PARA REDUZIR A ABSORÇÃO DE FOSFATO EM UM INDIVÍDUO ANIMAL HUMANO OU NÃO-HUMANO CORRENDO O RISCO DE DESENVOLVER OU QUE DESENVOLVEU HIPERFOS FATOMIA, em que O método é caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: administração oral ao indivíduo de um anticorpo- intestinal anticorpo do cotransportador de fosfato de sódio anti-intestinal do tipo 2B (Npt2B) IgY que se liga a Npt2B da SEQ. ID. N°: 1 em uma quantidade eficaz para reduzir ou manter a concentração de fosfato de soro no indivíduo.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma doença dos rins.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a doença dos rins é selecionada entre doença renal de estágio final, falha renal aguda, falha renal crônica, doença de rim policístico, doença renal crônica, necrose tubular aguda, uma infecção que reduz a função dos rins, e uma obstrução do trato urinário.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está recebendo um composto de vitamina D.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é obtido de um ovo de uma ave.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado com um aglutinante de fosfato.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente as etapas de medigao da concentragao de fosfato de soro depois que ο anticorpo anti-intestinal de Npt2B e administrado e de comparagao da concentragao com aquela antes do anticorpo anti-intestinal de Npt2B ser administrado.

9. METODO PARA REDUZIR A ABSOR?AO DE FOSFATO EM UM INDIViDUO ANIMAL HUMANO OU NAO-HUMANO CORRENDO O RISCO DE DESENVOLVER OU QUE DESENVOLVEU HIPERFOSFATOMIA, em que ο metodo e caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: administragao oral ao individuo de um anticorpo cotransportador de fosfato de sodio anti-intestinal do tipo 2B (Npt2B) que se Iiga a um epitopo dentro dos aminoacidos -234 362 da SEQ. ID. N0 ： 1 em uma quant idade eficaz para reduzir ou manter a concentragao de fosfato de soro no individuo.

10.METODO, de acordo com a reivindicagao 9, caracterizado pelo fato de que ο anticorpo anti-intestinal de Npt2B se Iiga a um epitopo dentro dos aminoacidos 245-340 da SEQ. ID. n°：1.

11. METODO, de acordo com a reivindicagao 9, caracterizado pelo fato de que ο anticorpo anti-intestinal de Npt2B se Iiga a um epitopo dentro dos aminoacidos 252-330 da SEQ. ID. n°: 1.

12. METODO, de acordo com a reivindicagao 9, caracterizado pelo fato de que ο individuo e um individuo humano.

13. METODO, de acordo com a reivindicagao 9, caracterizado pelo fato de que ο individuo tem uma doenga dos rins .

14. METODO, de acordo com a reivindicagao 13, caracterizado pelo fato de que a doenga dos rins e selecionada entre doenga renal de estagio final, falha renal aguda, falha renal cronica, doenga de rim policistico, doen?a renal crônica, necrose tubular aguda, uma infecção que reduz a função dos rins, e uma obstrução do trato urinário.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está recebendo um composto de vitamina D.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgY.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado com um aglutinante de fosfato.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente as etapas de medição da concentração de fosfato de soro depois que o anticorpo anti-intestinal de Npt2B é administrado e de comparação da concentração com aquela antes do anticorpo anti-intestinal de Npt2B ser administrado.

19. MÉTODO PARA REDUZIR A ABSORÇÃO DE FOSFATO EM UM INDIVÍDUO ANIMAL HUMANO OU NÃO-HUMANO CORRENDO O RISCO DE DESENVOLVER OU QUE DESENVOLVEU HIPERFOSFATOMIAf em que o método é caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: administração oral ao indivíduo de um anticorpo cotransportador de fosfato de sódio anti-intestinal do tipo 2B (Npt2B) que se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 429-485 da SEQ. ID. N°: 1 em uma quantidade eficaz para reduzir ou manter a concentração de fosfato de soro no indivíduo.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-intestinal de Npt2B se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 445-480 da SEQ. ID. N°: 1.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-intestinal de Npt2B se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 455-474 da SEQ. ID. N°: 1.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma doença dos rins.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a doença dos rins é selecionada entre doença renal de estágio final, falha renal aguda, falha renal crônica, doença de rim policístico, doença renal crônica, necrose tubular aguda, uma infecção que reduz a função dos rins, e uma obstrução do trato urinário.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está recebendo um composto de vitamina D.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgY.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado com um aglutinante de fosfato.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente as etapas de medição da concentração de fosfato de soro depois que o anticorpo anti-intestinal de Npt2B é administrado e de comparação da concentração com aquela antes do anticorpo anti-intestinal de Npt2B ser administrado.

29. MÉTODO PARA REDUZIR OS EFEITOS COLATERAIS DA TERAPIA DE VITAMINA D EM UM SER HUMANO, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: administração oral ao indivíduo de (a) um composto de vitamina D e (b) um anticorpo cotransportador de fosfato de sódio anti-intestinal do tipo 2B (Npt2B) que se liga a Npt2B da SEQ. ID. N°: 1 em uma quantidade eficaz para reduzir a hiperfosfatomia induzida pela terapia de vitamina D.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma doença dos rins.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o ser humano tem uma deficiência de vitamina D.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado com um aglutinante de fosfato.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente as etapas de medição da concentração de fosfato de soro depois que o anticorpo anti-intestinal de Npt2B é administrado e de comparação da concentração com aquela antes do anticorpo anti-intestinal de Npt2B ser administrado.