BRPI0717135A2 - Antagonistas de receptores (sstr2) seletivos de so-mastotatina - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTAGO- NISTAS DE RECEPTORES (SSTR2) SELETIVOS DE SOMASTOTATINA".

Este pedido de patente reivindica prioridade do Pedido de Paten- te U.S. Serial No. 60/829 637, depositado em 16 de outubro de 2006, cuja descrição é aqui incorporada por referência.

Esta invenção foi feita com apoio de Governo sob a Concessão N0. DK-59953, concedido pelos National Institutes of Health. O Governo de- tém certos direitos sobre esta invenção.

A presente invenção refere-se a peptídeos relacionados à soma- tostatina e a métodos para tratamento farmacêutico de mamíferos utilizando estes peptídeos. Mais especificamente, a invenção refere-se a peptídeos encurtados que atuam como antagonistas de receptores seletivos de soma- tostatina, e a inclusão de substituições e/ou adições de aminoácidos nestes peptídeos que confere seletividade ao receptor aos mesmos, a composições farmacêuticas contendo estes peptídeos, à formação de complexos ou con- jugados destes peptídeos com nuclídeos radioativos, a métodos de diagnós- tico e tratamento terapêutico de doenças neoplásicas e não-neoplásicas de mamíferos usando estes peptídeos, especialmente peptídeos acoplados a quelantes ou, de outra forma, marcados, além de referir-se também a méto- dos para seleção de fármacos mais efetivos usando estes peptídeos. Antecedentes da invenção

O tetradecapeptídeo cíclico somatostatina-14 (SRIF) foi isolado originalmente do hipotálamo e caracterizado como um inibidor fisiológico do hormônio de crescimento (GH), liberado da hipófise anterior. Foi caracteriza- do por Guillemin et al. e descrito na Patente U.S. No. 3 904 594. Este tetra- decapeptídeo possui uma ligação do tipo ponte ou cíclica entre os grupos sulfidrilas dos dois resíduos aminoácidos cisteinila nas posições 3 e 14. S- RIF afeta múltiplos processos celulares e é conhecido também por inibir o crescimento de certos tumores. O análogo [D-Tri8J-SRIF, com a seqüência de aminoácidos: (ciclo 3-14)H-Ala-Gli-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Phe-Thr-Ser-Cys-OH, foi exposto na Patente U.S. No. 4 372 884 e, de acor- do com o afirmado, com potência muitas vezes maior para inibir a liberação de GH do que SRIF.

SRIF induz seus efeitos biológicos pela interação com uma famí- lia de receptores com estrutura similar que ligam-se à membrana. Cinco re- ceptores de SRIF foram clonados e são referidos como SSTR1-5. Todos os cinco receptores se ligam a SRIF e SRIF-28 com alta afinidade. Agonistas seletivos de SSTR2 e SSTR5 foram identificados e utilizados para revelar funções distintas destes receptores. Acredita-se que estes dois receptores sejam os subtipos predominantes em tecidos periféricos. Acredita-se que o SSTR2 atue como mediador na inibição de hormônio do crescimento, gluca- gon e secreção de ácido gástrico. Na Patente U.S. No. 5 846 934 são descri- tos análogos que, segundo o afirmado, possuem alguma especificidade para SSTR2. Octreotide, um agonista, demonstra alguma especificidade para SSTR2 (consultar Yang et al., 1998, PNAS USA 95: 10836). Por outro lado, SSTR5 aparenta estar primariamente envolvido no controle da liberação de insulina e amilase. A Publicação Internacional No. WO 97/11962 descreveu análogos, afirmados como exibindo alguma especificidade para SSTR5. SS- TR3 serve como mediador na inibição da contratilidade da musculatura lisa gástrica. A Patente U.S. No. 6 879 967 expõe análogos da somatostatina específicos para SSTR3, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência neste pedido de patente. SSTR4 é encontrado na hipófise, pulmões, trato Gl, rins e em certos tumores até a exclusão considerável dos outros receptores de SRIF; acredita-se que seja ativado mediante ligação pelo SRIF. A publi- cação do Pedido de Patente U.S. No. 2002/0137676 expõe métodos para o tratamento de células endoteliais utilizando Iigantes de receptores seletivos de somatostatina, específicos para SSTR1 ou SSTR4. As Patentes U.S. Nos. 5 750 499 e 7 019 109 expõem análogos peptídicos de somatostatina que são seletivos para SSTR1, cujas descrições são aqui incorporados por referência. A publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2005/0245438 des- creve análogos peptídicos de receptores seletivos de somatostatina, especí- ficos para SSTR4. Estes achados globais indicam que subtipos diferentes de receptores atuam como mediadores em funções distintas do SRIF no corpo.

Receptores de somatostatina são expressos em estados patoló- gicos, especialmente em tumores neuroendócrinos do trato gastrointestinal. A maioria dos tumores humanos, oriundos de tecidos que são alvo da soma- tostatina, mantém seus receptores de somatostatina. Esse achado foi inici- almente observado em adenomas produtores de hormônio de crescimento e adenomas produtores de TSH; aproximadamente metade dos adenomas endócrinos inativos exibe receptores de somatostatina. Noventa por cento dos carcinoides e a maioria dos carcinomas de células de ilhotas, incluindo suas metástases, apresentam geralmente alta densidade de receptores de somatostatina. Contudo, somente 10 por cento dos carcinomas colorretais e nenhum dos carcinomas pancreáticos exócrinos contêm receptores de so- matostatina. Os receptores de somatostatina em tumores podem ser identifi- cados por métodos de ligação in vitro ou com técnicas de imagens in vivo; as últimas permitem a localização precisa dos tumores e de suas metástases nos pacientes. Dado que os receptores de somatostatina em tumores gas- troentero-hepáticos são funcionais, sua identificação pode ser utilizada para avaliar a eficácia terapêutica de um análogo em inibir liberação hormonal excessiva nos pacientes.

Seria de valor que houvesse antagonistas peptídicos de soma- tostatina que se ligam fortemente a SSTR2, ao mesmo tempo em que de- monstrando somente propensão mínima para ligação aos outros 4 recepto- res. Portanto, a busca prosseguiu por estes antagonistas peptídicos de so- matostatina que são altamente seletivos para SSTR2, porém não internali- zados em células. Sumário da invenção Foram descobertas presentemente certas modificações capazes

de criar análogos peptídicos de SRIF que são seletivos para SSTR2, ao con- trato dos outros receptores clonados de SRIF. Foi descoberta uma classe de análogos peptídicos de somatostatina, altamente seletivos para SSTR2 e antagonistas da somatostatina e que, embora não-internalizados em células com receptores SSTR2, são captados em quantidades surpreendentemente maiores do que em comparação a agonistas peptídicos de receptores seleti- vos de somatostatina. Os peptídeos resultantes ligam-se seletivamente a SSTR2 clonado sem ativar o receptor, e estes análogos peptídicos, quando ligados a iodo ou, de outra forma, radiomarcados, conservarão as suas pro- priedades biológicas desejáveis. Dessa forma, estes novos peptídeos são úteis na determinação da localização tecidual e expressão celular do recep- tor SSTR2, bem como na regulação de certas funções farmacológicas sem certos efeitos colaterais que as acompanham, característicos da administra- ção de SRIF. Estes antagonistas peptídicos de SRIF1 quando radiomarca- dos, podem ser utilizados em cintigrafia para localizar tumores que expres- sam estes receptores, quer in vitro ou in vivo, utilizando SPECT ou PET; ou- tras marcações tão bem conhecidas nesta técnica, por exemplo, marcações fluorescentes, podem ser utilizadas alternativamente. Quando incluem um radionuclídeo apropriadamente quelado, conforme conhecido nesta técnica, estes análogos podem servir como substâncias radiofarmacêuticas, adequa- das para terapia com radionuclídeos no tratamento destes tumores. Os antagonistas peptídicos de SRIF da invenção inibem a liga-

ção de 125l-[Tir11]SRIF e 125I-ILeu8lD-Tr22,Tir25ISRIF^S ao receptor SSTR2 humano clonado, porém não se ligam fortemente a SSTR1, SSTR3, SSTR4 ou SSTR5. Dessa forma, antagonistas não-marcados poderiam ser adminis- trados para bloquear terapeuticamente o funcionamento deste receptor. Es- tes antagonistas de SRIF, aos quais 99mTc, 111In, 68Ga ou 90Y1 por exemplo, foram acoplados por quelante, como DOTA ou DTPA (ou ao qual um outro agente formador de complexo/conjugação é unido ao Terminal N para efeito de prender um grupamento útil para fins diagnósticos ou terapêuticos), não se ligam significativamente a SSTR1, 3, 4 ou 5, porém continuam a Iigarem- se forte e saturadamente a SSTR2.

Antagonistas preferidos de SRIF não se ligam somente seleti- vamente a SSTR2, porém ligam-se aos mesmos com alta afinidade. Por li- gação seletiva pretende-se significar que exibem valor de Kd ou IC50 com SSTR2 de aproximadamente um centésimo ou menos daquele a respeito de todos os outros 4 receptores. Análogos preferidos serão, pelo menos, 200 vezes mais seletivos para SSTR2 do que por qualquer outro receptor de S- RIF1 e mais preferivelmente, pelo menos, 500 vezes mais seletivos. Estes análogos de SRIF podem ser marcados facilmente e, des- sa forma, utilizados eficazmente em seleção de fármaco, exames de ima- gens, diagnóstico e terapia com radionuclídeos. Por exemplo, estes análo- gos portando marcações detectáveis são úteis em localizar estes receptores no corpo e em diagnosticar as localizações de tumores, especialmente, de tumores neuroendócrinos. Como agentes terapêuticos os radionuclídeos, são considerados especialmente úteis em combate de tumores que expres- são os receptores SSTR2; além do mais, são capazes de executar o mesmo sem provocar os efeitos colaterais, ou seja, sem destruir parte substancial de tecido adjacente, como resultado da interação com uma pluralidade de re- ceptores de SRIF.

Em uma característica especial, a invenção prove um antagonis- ta peptídico cíclico de somatostatina (SRIF) que se liga seletivamente ao receptor SSTR2 de SRIF sem desencadear a internalização em uma célula, sendo que o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (ciclo 3-14) Xaa ι -Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaai 0-Xaai ι -Xaa12- Xaai3-Xaai4-Xaai5, em que Xaai é des-Xaa; Xaa2 é Trp(A), Phe(B), Nal ou Tyr, onde A é H, Cl1 F, Br, Me, NO2, OMe ou N-formila e B é H, halogênio, CH3, NO2 ou OCH3; D-Xaa3 é D-Cys, D-Pen, D-HCis ou um outro D-isômero de α-aminoácido com cadeia lateral SH; Xaa4, Xaa5 e Xaa6 são des-Xaa; Xaa7 é Aph(Q1), Tyr(X), Ala(tienil) ou Trp(A), onde Qi é Cbm, OH-Cbm, CH3- Cbm, OCH3-Cbm, OEt-Cbm, Cbm-Et(OEt)2 ou Hor e X é H ou halogênio; Xaa8 é D-Trp(A), Trp(A), Tyr, D-Tyr, Phe(B), D-Phe(B), L ou D-BzIHis, L ou D-(DNP)His, L ou D-Aph(Cbm); Xaa9 é Lys, NaMeLys, hLis, NaMehLis, Orn ou , NaMeOrn; Xaai0 é Thr, Ser ou Vai; Xaan, Xaai2 e Xaai3 são des-Xaa; Xaai4 é Cys, Pen1 hCys ou outro L-isômero de α-aminoácido com cadeia lateral SH; e Xaai5 é 2Nal, D-2Nal, Aph(Q2), D-Aph(Q2)1 (Ri)Cha1 (R1)D-Cha, (R1)Leu, (R1)D-Leul Tyr, D-Tyr, Trp, D-Trp ou des-Xaa; onde R1 é H ou Ca" Me, e Q2 é Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-Cbm ou OEt-Cbm. Um grupa- mento contendo quelante pode ser acoplado no Terminal N, conforme co- nhecido na técnica. Alternativamente, um grupamento contendo quelante pode ser unido formando um complexo (por exemplo, sistema biotina- avídina) a seu complemento no Terminal N do peptídeo.

Em uma característica mais especial, a invenção provê um pep- tídeo cíclico análogo de somatostatina (SRIF) que se liga seletivamente ao receptor SSTR2 de SRIF1 sendo que o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (ciclo S-I^XaarXaa2-D-Cys-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaar-Xaae-Xaag- Xaa io-Xaa-ii-Xaa-i2-Xaai3~Cys-Xaai5—NH2, em que Xaai é des-Xaa; Xaa2 é cloro ou nitro Phe; Xaa4, Xaa5 e Xaa6 são des-Xaa; Xaa7 é Aph(Hor)1 Tyr ou ITir; Xaa8 é D-Aph(Cbm) ou D-Trp; Xaa9 é Lys, Orn, hLis, NaMeLys ou Na" MeOrn; Xaaio é Thr; Xaan, Xaai2 e Xaai3 são des-Xaa; e Xaai5 é 2Nal ou D- Tyr.

Em ainda uma característica especial, a invenção provê um mé- todo de visualização externa de tecido no corpo de um ser humano, o qual expressa SSTR2, compreendendo: (i) administrar para um ser humano, em quantidade suficiente para visualização externa, uma composição compre- endendo um antagonista peptídico de SRIF1 seletivo para SSTR2 ao contrá- rio dos outros receptores clonados de SRIF, que se liga com alta afinidade ao receptor SSTR2 humano clonado, porém não ativa o receptor, o referido antagonista peptídico de SRIF portando uma marcação detectável, e (ii) submeter o ser humano a exame para visualização externa. Em ainda uma outra característica especial, a invenção provê

um método de irradiação de tecido neoplásico no corpo de um ser humano, o qual expressa SSTR2, compreendendo: (i) administrar para um ser huma- no, em quantidade suficiente para irradiar tecido neoplásico, uma composi- ção compreendendo um antagonista peptídico de SRIF, seletivo para SSTR2 ao contrário dos outros receptores clonados de SRIF, que se liga com alta afinidade ao receptor SSTR2 humano clonado, porém não ativa o receptor, o referido antagonista peptídico de SRIF portando uma marcação detectável, e (ii) permitir que o antagonista peptídico de SRIF ligue-se ao tecido neoplási- co.

Em uma outra característica especial, a invenção provê um mé-

todo para detectar, no corpo de um ser humano, tumores e suas metástases com SSTR2 em tecidos, os quais não contêm quantidades substanciais de SSTR2 em condições de saúde ou em condições não-neoplásicas de infla- mação crônica, cujo método compreende (i) administrar para o referido ser humano, em quantidade suficiente para visualização externa, uma composi- ção compreendendo um peptídeo de acordo com a reivindicação 1, o referi- do peptídeo sendo marcado com (a) um isótopo radioativo de metal que está ligado por meio de um quelante adequado ou (b) um átomo de metal para- magnético ou marcado com isótopo radioativo de halogênio e, posteriormen- te, (ii) submeter o referido ser humano a exame para visualização externa, por varredura radioativa ou por visualização de imagens por ressonância magnética, para determinar os sítios visados no corpo do mesmo em relação à atividade de fundo, com a finalidade de permitir a detecção e localização dos referidos tumores no corpo de modo semiquantitativo.

A presente invenção provê ainda um método para seleção de Iigantes altamente seletivos para SSTR2, utilizando um modelo de farmacó- foro estabelecido como premissa com base em perfil de características de ligantes, determinadas como necessárias para ligação seletiva. Tal método pode compreender a condução de um ensaio de ligação competitiva com um receptor SSTR2, um Iigante de acordo com a presente invenção e um candi- dato a antagonista, em que o referido Iigante possui uma marcação detectá- vel adequada; a determinação da capacidade do candidato a antagonista em deslocar o Iigante marcado; e a realização de testes do referido candidato a antagonista quanto a sua capacidade de antagonizar uma atividade associa- da ao SRIF.

Descrição detalhada das concretizações preferidas As abreviações-padrão de 3 letras identificam os resíduos de

alfa-aminoácidos e, quando o resíduo de aminoácido possui formas isoméri- cas, é a forma L do aminoácido que está representada, a não ser que ex- pressamente indicado de outra forma, por exemplo, Ser = L-serina. Por L ou D pretende-se significar os isômeros L e D de um α-aminoácido. Quando for feita referência a seguir a uma posição no peptídeo, esta pretende referir-se à posição correspondente do peptídeo nativo de 14 resíduos da somatostati- na (SRIF). Antagonistas peptídicos de SRIF são providos com afinidade seletiva pelo receptor SSTR2 de SRIF; possuem também, de preferência, alta afinidade por SSTR2, ou seja, igual a K0 de aproximadamente 10 na- nomolares ou menos. Estes peptídeos incluem análogos cíclicos encurtados de SRIF, nos quais a porção em anel é reduzida em somente 6 resíduos e em que há um resíduo no Terminal N e, de preferência, um resíduo é adicio- nado também no Terminal C. Em outras palavras, os resíduos das posições 1, 4, 5, 6, 11, 12 e 13 são excluídos do SRIF nativo de 14 resíduos, criando heptapeptídeos e, de preferência, um resíduo (ou seja, o resíduo 15) é adi- cionado também no Terminal C, dando origem a um octapeptídeo.

Exemplos de antagonistas peptídicos representativos, exibindo a especificidade desejada para SSTR2, são providos pela seguinte seqüência de aminoácidos com base em sistema numérico compatível com a seqüên- cia de 14 resíduos de SRIF nativo de mamífero, em que os resíduos nas po- sições 1, 4-6 e 11-13 são, de preferência, eliminados: (ciclo 3-14)XaarXaa2- D-Xaa3-Xaa^Xaa5-Xaae-Xaa7-Xaa8-Xaag-Xaa 10-Xaai 1 -Xaai 2-Xaai 3-Xaai 4- Xaa-I5, em que Xaai é des-Xaa; Xaa2 é Trp(A), Phe(B), Nal ou Tyr, onde A é H, Cl, F, Br, Me, NO2, OMe ou N-formila e B é H, halogênio, CH3, NO2 ou OCH3; D-Xaa3 é D-Cys, D-Pen, D-HCis ou um outro D-isômero de a- aminoácido com cadeia lateral SH; Xaa4, Xaa5 e Xaa6 são des-Xaa; Xaa7 é Aph(Q-i), Ala(tienil), Tyr(X) ou Trp(A)1 onde Qi é Cbm, OH-Cbm1 CH3-Cbm, OCH3-Cbm1 OEt-Cbm1 Cbm-Et(OEt)2 ou Hor e X é H ou halogênio; Xaa8 é D- Trp(A), Trp(A), Tyr1 D-Tyr1 Phe(B)1 D-Phe(B)1 L ou D-BzIHis, L ou D- (DNP)His, L ou D-Aph(Cbm); Xaa9 é Lys, NaMeLys, hLis, NaMehLis, Orn ou , NaMeOrn; Xaai0 é Thr, Ser ou Vai; Xaa-n, Xaai2 e Xaai3 são des-Xaa; Xaai4 é Cys, Pen, hCis ou outro L-isômero de α-aminoácido com cadeia lateral SH; e Xaa15 é 2Nal, D-2Nal, Aph(Q2)1 D-Aph(Q2)1 (Ri)Cha1 (R1)D-Cha, (R1)Leu, (Ri)D-Leu, Tyr1 D-Tyr1 Trp1 D-Trp ou des-Xaa; onde R1 é H ou CaMe1 e Q2 é Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-Cbm ou OEt-Cbm. Tyr na posição 2 pode ser radioiodado, ou um agente formador de complexo, conjugação ou de quelação pode ser unido diretamente ou por meio de um Iigante ao grupo a- amino do resíduo Terminal N de qualquer destes análogos peptídicos que seja capaz de ligar um nuclídeo radioativo ao mesmo. Por exemplo, um que- Iante macrocíclico, como DOTA, pode ser adicionado ao Terminal N por jun- ção direta do mesmo a Xaa2, ou indiretamente ao mesmo utilizando um Ii- gante como GABA (ácido gama aminobutírico, por exemplo, consultar a Pa- tente U.S. N0 6 022 523) ou pAla.

Um subgênero preferido de análogos de SRIF compreende a seqüência de aminoácidos: (ciclo 3-14)Xaai-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6- Xaa7-Xaa8-Lys-Thr-Xaan-Xaai2-Xaai3-Cys, em que Xaa2 é Phe substituído; D-Xaa3 é D-Cys; Xaa7 é Aph(Qi)1 Tyr ou ITir; e Xaas é D-Trp ou D- Aph(Cbm). Deve ser entendido que os demais grupos Xaa são conforme definidos acima, sempre que não forem especificados.

De modo geral, para fins deste pedido de patente, referência a Trp e D-Trp na descrição, a não ser em um exemplo específico, deve ser entendida de modo a incluir o resíduo não substituído, bem como aquele no qual uma única substituição de hidrogênio é efetuada na posição 5 ou 6 no Trp, e com esses substituintes sendo selecionados entre cloro, flúor, bromo, metila, nitro e metóxi, com cloro, flúor e bromo sendo preferidos ou com for- mila substituindo o hidrogênio do N-indol. Nal significa o isômero de alanaina que é substituído por naftila no átomo de β-carbono, com a união ao naftale- no ocorrendo, de preferência, na posição 2 no anel ou, opcionalmente, na posição 1. Aph significa aminofenilalanina, onde o grupo amino é unido, de preferência, à posição 4 no anel fenila, porém a união na posição 2 ou 3 é geralmente equivalente. Aph(Cbm) significa 4-ureído-fenilalanina. Aph(OH- Cbm) significa 4-(3-hidróxi)-ureído-fenilalanina. Aph(OCH3-Cbm) significa 4- (3-metóxi)-ureído-fenilalanina. Aph(OCH3-cbm) significa 4-(3-metóxi)-ureído- fenilanina. Aph[(Et02)Et-Cbm] significa 4-{3-[2-(2-etóxi-etóxi)-etil]}-ureído- fenilalanina. ITir significa L-tirosina iodada, por exemplo, 3-iodo-Tyr. Cpa significa cloro-Phe e, de preferência, 4CIFen. Aph(Hor) significa 4-[(2,6- dioxo-hexa-hidro-pirimidina-4-carbonil)-amino]-fenilalanina. SIRF significa o peptídeo cíclico somatostatina de 14 resíduos. Cha significa ciclohexilalanina e Pen, penicilamina (β-mercapto valina). hLis ou hCis significa o a- aminoácido com um grupo CH2 adicional na cadeia lateral. O Terminal C possui geralmente um grupo amida, embora um equivalente, por exemplo, GIi-OH possa ser utilizado. O Terminal N pode ser modificado em várias maneiras sem prejudicar significativamente a afinidade de ligação, sendo a inclusão de todas estas modificações nestes peptídeos cíclicos consideradas como parte dos peptídeos da invenção global. Por e- xemplo, uma variedade de adições pode ser efetuada e são, de preferência feitas no aminoácido do Terminal N na forma de um agente formador de complexo ou conjugação (Z) que pode, então, ser utilizado para unir um gru- pamento desejado ao peptídeo ou prover a marcação. De modo geral, este O grupamento Z pode ser selecionado do grupo consistindo por quelantes à base de DOTA e DTPA, quelantes à base de NOTA, compostos carbonila, 2- hidrazino nicotinamida (HYNIC), quelantes N4, desferrioxamina, quelantes NxSy, todos formando complexos com um radioisótopo, Tirosina (Tyr) para halogenação, um corante fluorescente e biotina. Cpa pode servir também como precursor para titulação. Por exemplo, pode ser acoplado um quelante como DTA, DOTA, HYNIC e P2S2-COOH; quelantes preferidos podem incluir P-NH2-BZ-DOTA (ácido 2-p-aminobenzil-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano- 1,4,7,10-tetra-acético) e DOTA-p-NH2-anilido[ácido 1,4,7,1O-tetra- azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético mono(p-aminoanilido)]. Alternativa- mente, um agente de quelação pode ser ligado covalentemente ao Terminal N por meio de um Iigante adequado (L), se desejado; Iigantes L adequados incluem tirosina, lisina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopropiônico, polie- tilenoglicol, ácidos graxos e seus derivados, β-alanina, ácido 5-amino valéri- co, sarcosina e ácido glucerônico. Quando apreciar no Terminal N, Tyr pode ser radioiodado ou, de outra forma, marcada. Grupos acila com não mais do que 20 aminoácidos podem estar presentes também no Terminal N, uma vez que o resíduo Terminal N pode ser também acilado, se desejado, com gru- pamento grande sem perda da seletividade.

A seletividade de ligação dos peptídeos análogos da invenção por SSTR2 foi demonstrada em testes de sua interação com os cinco dife- rentes receptores humanos clonados de SRIF, conforme descrito mais deta- lhadamente a seguir. De modo geral, células recombinantes que expressam o receptor são lavadas e homogeneizadas para preparar um homogeinato bruto de proteínas em tampão adequado, conforme conhecido na técnica. Em um ensaio típico, uma quantidade de proteína do homogeinato celular é colocada em pequeno volume de um tampão apropriado do ensaio em pH apropriado. Substâncias candidatas, como possíveis agonistas e antagonis- tas de SRIF, são adicionadas à mistura em concentrações convenientes, e a interação entre a substância candidata e o polipeptídeo receptor é monitora- da. Os peptídeos da invenção ligam-se fortemente de modo considerável somente ao SSTR2, e sua ligação exibe alta afinidade. Os ensaios de ligação a receptor são conduzidos em receptores

clonados de SRIF, e ensaios de competição são utilizados para gerar valo- res de IC5O, os quais são indicativos da concentração de um Iigante competi- tivo, necessária para deslocar uma concentração de saturação de um Iigante pretendido, cuja medição é efetuada em 50% dos sítios de ligação. De acordo com uma característica da presente invenção, um

método de detecção intra-operatória de tumores malignos no corpo de um ser humano, presentes em tecidos nos quais, em condição de saúde, não há quantidades consideráveis de SSTR2, compreende (i) administrar para este ser humano uma composição, em quantidade suficiente para detecção por uma sonda de detecção gama, um peptídeo seletivo para SSTR2, sendo este peptídeo marcado, por exemplo, radioativamente com 99mTc, 161Tb, 90Y, 177Lu, 123I ou 125I e (ii) após permitir que a substância ativa ligue-se e seja absorvida nos referidos tumores e após A depuração sangüínea da radioati- vidade, submeter este ser humano a uma técnica de radiodetecção na área pertinente do corpo, utilizando uma sonda de detecção gama.

Os antagonistas da SRIF da presente invenção são altamente seletivos para SSTR2, e são absorvidos em quantidades maiores do que os agonistas peptídicos anteriores de SRIF que eram somente parcialmente específicos para SSTR2. De modo mais importante, antagonistas de SRIF são considerados úteis no combate de tipos de câncer que expressam SS- TR2, utilizando radioterapia, quando o êxito desta é diretamente dependente da quantidade de radiação absorvida por um tumor; dessa forma, prevê-se que serão mais efetivos do que agonistas conhecidos para radioterapia de tumores. Evidentemente, são considerados também especialmente úteis em cintigrafia para determinar a distribuição de células e tecidos que expressam SSTR2 por todo o corpo, e o uso de visualização externa por varredura de radioatividade ou por ressonância magnética permite a detecção semiquanti- tativa no interior do corpo. Adicionalmente, são úteis em bloquear seletiva- mente certos efeitos farmacológicos mediados pelo SSTR2, os muitos efei- tos de SRIF tendo sido determinados durante as 2 últimas décadas.

Mais especificamente, estes antagonistas radioativos são consi- derados especialmente úteis para o tratamento terapêutico de tumores ma- lignos no corpo de um ser humano, presentes em tecidos que em condições de saúde não contêm quantidades consideráveis de SSTR2. Tal antagonista peptídico seletivo para SSTR2 é administrado em composição que inclui uma quantidade eficaz para cintigrafia ou para combate ou controle de tumo- res, e pode ser marcado com um isótopo selecionado do grupo

selecionado em 186Re, 188Re, 111In, 113mIn, 71As, 90Y, 64Cu, 67Cu, 99mTc, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Prl 143Prl 66Ga1 67Ga1 68Ga1 72Ga1 127Te, 195Pt, 211At, 198Au, 199Au, 161Tbl 109Pdl 165Dyl 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gdl 166Hol 172Tm, 169Ybl 175Ybl 177Lul 105Rhl 111Agl 124I e 131L Análogos marcados de SRIF da invenção são também conside-

rados úteis em ensaios de seleção de fármacos para selecionar novos agen- tes peptídicos e não-peptídicos efetivos com alta afinidade de ligação a SS- TR2 e que poderão ser antagonistas altamente eficazes. Utilizando um Iigan- te da invenção seletivo para o receptor SSTR2, é possível obter uma ativi- dade basal para o receptor produzido por recombinação. Um ensaio de liga- ção competitiva com o SSTR2, o Iigante marcado e com o candidato pode, então, ser conduzido para determinar sua afinidade relativa de ligação. Al- ternativamente, candidatos em perspectiva a inibidores ou modificadores, ou seja, antagonistas, da função do receptor podem ser incorporados direta- mente em mistura de teste para que o efeito deste candidato sobre o recep- tor possa ser testado. Pela comparação do nível de atividade do receptor na presença ou ausência da substância candidata, é possível obter então in- formação referente ao efeito da substância candidata sobre a função normal do receptor e, por conseguinte, determinar sua função como agonista ou antagonista, comparado a um análogo conhecido seletivo para SSTR2. Os peptídeos cíclicos de SRIF descritos nos Exemplos seguintes são antagonis- tas, podendo ser empregados para mediação da função normal de SSTR2.

Os peptídeos da presente invenção podem ser sintetizados por síntese clássica em solução, porém os peptídeos amidados são sintetizados, de preferência, por técnica em fase sólida, conforme em resina de metilben- zidrilamina (MBHA) ou resina de BHA, conforme é bem conhecido nesta téc- nica. A síntese de peptídeos com carboxila livre em Terminal C é, de prefe- rência, conforme ensinada na Patente U.S. No. 7 019 109. A síntese de pep- tídeos contendo Terminal C amidado pode ser conforme ensinada na Paten- te U.S. No. 5 874 227. A síntese de fase sólida é conduzida em uma maneira que aminoácidos sejam adicionados na cadeia em etapas, iniciando no Ter- minai C conforme descrito em qualquer uma destas patentes norte- americanas, cujas descrições são aqui incorporados por referência. Grupos de proteção em cadeia lateral, os quais são bem conhecidos na técnica, são incluídos preferivelmente como parte de qualquer aminoácido que possua uma cadeia lateral especialmente reativa e, opcionalmente, podem ser utili- zados em caso de outros, como Tri, quando estes aminoácidos são acopla- dos na cadeia em construção sobre a resina. Tal síntese provê uma peptidil- resina intermediária inteiramente protegida. Geralmente, os grupos de prote- ção são divididos e o peptídeo é clivado do suporte de resina antes de ser oxidado para criar uma ligação dissulfeto entre as cadeias laterais da Cys. Os análogos de SRIF da invenção são geralmente efetivos em

níveis abaixo de 100 microgramas por quilo de peso corporal. Para ação pro- longada, pode ser desejável utilizar níveis de dose de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5 miligramas por quilo de peso corporal. Estes análo- gos são solúveis em água e, por conseguinte, podem ser preparados como soluções relativamente concentradas para administração.

Os Exemplos a seguir ilustram a provisão de alguns antagonis- tas peptídicos de SRIF, concretizando várias características da invenção. Em cada peptídeo, os resíduos de cisteína nas posições 3 e 14 são unidos por ligação dissulfeto que forma o ciclo. Exemplo 1

O análogo da somatostatina DOTA-des-AA1A5'6'11'1213[Cpa2,D- Cis3,Tir7,D-4Aph(Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2 com a estrutura

(ciclo 3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-Tyr-D-4Aph(Cbm)-Lys-Ter-Cys-2Nal-NH2 é sintetizado. A metodologia em fase sólida, empregando a estratégia BOC é utilizada para sintetizar o octapeptídeo em etapas sobre uma resina de M- BHA, de modo geral conforme descrito no Exemplo Il da patente 277. Boc-D- 4Aph(Cbm)-OH foi pré-preparado, conforme descrito em publicação anterior por Jiang, e acoplado na posição 8.

Após clivagem do peptídeo da resina e retirada simultaneamente de grupos protetores em cadeias laterais (exceto Fmoc de Lys) por HF1 o peptídeo sofreu oxidação para criar a ponte dissulfeto em solução com 75% de ácido acético, por adição de uma solução de iodo a 10 por cento em me- tanol, até que a solução resultante permanecesse com cor laranja, agitando- se, em seguida, por 40 minutos e extinguido com ácido ascórbico. O peptí- deo bruto foi purificado por RP-HPLC preparativa, utilizando aumentos de gradiente linear de 1% de B por 1 min, a partir do % basal de B (Eluente A = 0,1% TFA, eluente B = 60% CH3CN, 40% A), em vazão de 100 ml/min. DO- TA foi acoplado, em seguida, no Terminal N, como quelante, por adição de DOTA.NHS.3TFA.HPF6 (Macrocyclis, Dallas, TX) (198 mg, -20 pm) em DMF (1 ml) e N, Ν'-di-isopropiletilamina (DIPEA) (36 μΙ, -22 μΜ) ao peptídeo puri- ficado (32 mg, -20 μΜ) em Ν,Ν-dimetilformamida seco (DMF, 3,5 ml). A mis- tura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. O progresso da reação foi acompanhado por HPLC analítica, e a análise de MS revelou que o produto desejado, DOTA-des-AA1'4'5'6'1112'13[Cpa2, D-Cis3,Tir7, D- 4Aph(Cbm)8,Lys(Fmoc)9]-SRIF-2Nal-NH2 puro, tinha sido obtido. Após con- clusão da reação, a retirada do grupo de proteção Fmoc da cadeia lateral de Lys9 foi obtida por adição de 4 ml de uma solução de piperidina a 20% em DMF e espera de 30 minutos. DOTA-des-AA1A5'6'11'1213[Cpa2,D-Cis3,Tir7,D- 4Aph(Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2 foi dessalinizado por RP-HPLC preparativa uti- lizando as mesmas condições descritas acima. A pureza do conjunto DOTA- peptídeo cíclico final foi determinada por CZE analítica. O produto era 94% puro.

A análise de MS revelou massa [M+H]+ de 1583,72 Da, que se

compara muito favoravelmente à massa calculada de 1583,62 Da. O peptí- deo é a seguir referido como Peptídeo N0. 1. Exemplo 2

A síntese inicial descrita no Exemplo 1 é repetida com duas mo- dificações; 4Aph(Cbm) e D-Trp são utilizados nas posições 7 e 8 para forne- cer o octapeptídeo-resina: resina des-AA1'4'5'6'11,12,13]Cpa2,D- Cis3,4Aph(Cbm)7,D-Tri8,Lys(Fmoc)9]-SRIF-2Nal-MBHA.

Após clivagem do peptídeo da resina, como a amida, e retirada simultânea dos grupos de proteção das cadeias laterais dos aminoácidos (exceto Fmoc de Lys) por HF1 o peptídeo sofreu oxidação para criar a ponte de dissulfeto em solução com 75% de ácido acético, por adição de uma so- lução de iodo a 10 por cento em metanol até que a solução resultante per- manecesse com cor laranja, agitando-se, em seguida, por 40 minutos e ex- tinguido com ácido ascórbico. O peptídeo bruto foi purificado por RP-HPLC preparativa, utilizando aumentos de gradiente linear de 1% de B por 1 min, a partir da porcentagem de linha de base de B (Eluente A = 0,1% TFA, eluente B = 60% CH3CN, 40% A), em vazão de 100 ml/min. Ao peptídeo purificado (34 mg, -24 μΜ) em Ν,Ν-dimetilformamida seco (DMF, 3,5 ml), foi adiciona- do DOTA.NHS.3TFA.HPFe (Macrocyclis, Dallas, TX) (24 mg, 24,2 μιτι) em DMF (150 μΙ) e N, N-di-isopropiletilamina (DIPEA) (40 μΙ, 24 μΜ). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. O progresso da reação foi acompanhado por HPLC analítica e, após conclusão da reação, 1 ml de piperidina foi adicionado à mistura da reação para remover o grupo de prote- ção Fmoc da cadeia lateral de Lis9, por 30 minutos, resultando em DOTA- des-AA1A5'6'11'12'13[Cpa2, D-Cis3, D-4Aph(Cbm)7,D-Tri8]-SRIF-2Nal-NH2 que possui a fórmula: (ciclo 3-14)DOTA-Cpa,D- Cys,4Aph(Cbm)-D-Trp-Lys-Cys-2Nal-NH2.

O peptídeo foi dessalinizado por RP-HPLC preparativa utilizando as mesmas condições descritas acima. A pureza do conjuntado DOTA-peptídeo cíclico final foi determinada por CZE analítica como de aproximadamente 98% puro. A análise de MS revelou massa [M+H]+ de 1606,5 Da, que se compara muito favoravelmente à massa calculada de 1606,64 Da. O peptí- deo é a seguir referido como Peptídeo N0. 2. Exemplo 3

A síntese descrita no Exemplo 1 foi repetida, omitindo 2 Nal no Terminal C e subtituindo 4Aph(Hor) por Tir7. Boc-4Aph(Hor)-OH foi pré- preparado, conforme descrito em publicação anterior por G. Jiang, Stalewski et al. (2001), "GnRH antagonists: A new generation of Iong acting analogues incorporating urea functions at positions 5 and 6", J. Med. Chem. 44(3):453- 467. Clivagem, retirada de proteção, ciclização e purificação do peptídeo foram conduzidas conforme no Exemplo 1. O peptídeo cíclico purificado possui a fórmula:

I-1

(ciclo 3-14)DOTA-Cpa-D-Cys(-4Aph(Hor) D-4Aph(cbm)-Lys-Thr-Cys-NH2.

Exibe pureza em CZE de aproximadamente 98%. É referido como Peptídeo N0 3. A análise de MS revela em massa [M+H]+ de 1525,68 da, que se com- para favoravelmente com o valor calculado de 1525,58 Da. Exemplo 4

A síntese descrita no Exemplo 1 é repetida com uma modifica- ção, em vez de pCI-Phe, no Terminal N, é utilizado pN02-PHE. O clivagem, retirada de proteção, ciclização e purificação do peptídeo são conduzidas conforme no Exemplo 1. O peptídeo cíclico purificado possui a fórmula:

(ciclo 3-14)D0TA-pN02-Phe-D-dys-Tyr-D-4-ApH(Cbm)-l_ys-Ter-C^s-2Nal- NH2. A pureza do conjuntado peptídeo-Dota cíclico final detemrinado por Cze analítico para ser aproximadamente 98% puro. É referido como Peptídeo N0. 4. A análise de MS revela massa [M+H]+ de 1594,17 Da, que se compara favoravelmente ao valor calculado de 1594,65 Da. Exemplo 5

A síntese inicial descrita no Exemplo 1 é repetida com uma mo- dificação; Aph(Hor) é utilizado em vez de Tyr1 na posição 7, para prover o octapeptídeo-resina: resina des-AA1A5'6'11'12'13[Cpa2,D-Cis3,4Aph(Hor)7,D- Aph(Cbm)8,Lys(Fmoc)9]-SRIF-2Nal-MBHA. As reações são conduzidas con- forme descritas no Exemplo 2, resultando em

DOTA-des-AA1,4,5'6'11'12,13[Cpa2,D-Cis3,4Aph(Hor)7,D-Aph(Cbm)8]-SRIF-2Nal- NH2, que possui a fórmula:

I I

(ciclo 3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-4Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Lys-Ter-Cys-2Nal-

NH2.

A pureza do conjugado peptídeo DOTA ciclo final foi determina- do por CZE analítico para ser aproximadamente 98% puro. É referido como Peptídeo N0. 5. A análise de MS revela massa [M+H]+ de 1722,56 Da, que se compara favoravelmente ao valor calculado de 1722,65 Da.

Exemplo 6

A síntese descrita no Exemplo 5 é repetida, substituindo D-Tyr por 2Nal no Terminal C. A clivagem, retirada de proteção, ciclização e purifi- cação do peptídeo são conduzidas conforme no Exemplo 1. O peptídeo cí- clico purificado possui a fórmula:

(ciclo 3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Lys-Ter-Cys-D-Tyr- NH2. Sua pureza em CZE é de aproximadamente 98%. É referido como Pep- tídeo N0. 6. A análise de MS revela massa [M+H]+ de 1688,83 Da, que se compara favoravelmente ao valor calculado de 1688,64 Da. Exemplo 7

A síntese descrita no Exemplo 4 é repetida, substituindo D-Tyr

por 2Nal no Terminal C. A clivagem, retirada de proteção, ciclização e purifi- cação do peptídeo são conduzidas conforme no Exemplo 1. O peptídeo cí- clico purificado possui a fórmula:

(ciclo 3-14)D0TA-pN02-Phe-D-Cys-Tyr-D-4Aph(Cbm)-Lys-Ter-Cys-D-Tyr-

NH2. Sua pureza em CZE é de aproximadamente 98%. É referido como Pep- tídeo N0. 7. A análise de MS revela massa [M+H]+ de 1560,63 Da, que se compara favoravelmente ao valor calculado de 1560,83 Da. Exemplo 8

A síntese descrita no Exemplo 8 é repetida com duas modifica- ções; ITir é utilizada na posição 7 e D-Trp é utilizado na posição 8 para pro- ver o octapeptídeo-resina: des-AA1i4'5,6'11'12'13[pN02-Phe2-D-Cys3- Ityr7-D- Trp8, Iys (F|noc)9]-SRIF-D-Tyr-MBHA de resina. Após a clivagem do peptí- deo da resina assim como a amida e após a realização de reações como geralmente descritas no exemplo 2, o peptídeo tendo a forma (ciclo 3-15)

DOTA- PNO2-Phe-D-Cys-Ityr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-D-Tyr-NH2. ITir-D-Trp-

Lys-Trp-Cys-D-Tyr-NH2. A pureza do conjutado DOTA-peptídeo cíclico final foi determinada por CZE analítico como sendo de aproximadamente 98% puro. É referido como Peptídeo N0 8. A análise de MS revela massa [M+H]+ de 1667,74 Da, que se compara favoravelmente ao valor calculado de 1667,52 Da.

Bioensaio in vitro: Os efeitos dos vários análogos de somatosta- tina são testados in vitro quanto a sua capacidade de ligar-se a receptores clonados isolados, expressos em células CHO-K1 e células CCL39. Células CHO-K1 são cultivas em meio F-12 de Ham e células CCL39, em mistura de meio de Eagle modificado de Dulbecco/F-12 de Ham (1:1), complementado por soro bovino fetal a 10%, 100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estropto- micina em ar umidificado contendo 5% de CO2 a 37 °C.

A clonagem molecular dos genes codificadores de múltiplos sub- tipos de somatostatina permite a expressão individual destes receptores em células de mamíferos e a caracterização de seus respectivos perfis farmaco- lógicos. Cinco subtipos destes receptores, denominados SSTR1 a SSTR5, foram clonados e são relatados e descritos em Raynor et ai, Molecular Pharmacology, 43, 838-844 (1993) e em Raynor et ai, Molecular Pharmaco- Iogy, 44, 385-392 (1993). Essas referências descrevem ensaios de ligação que podem ser utilizados para determinar se análogos de SRIF em particular ligam-se seletivamente a um ou mais dos 5 tipos de receptores, também se a ligação a estes tipos de receptores é com alta ou baixa afinidade. Uma vez que estes tipos de receptores foram presentemente caracterizados de modo geral a respeito de seus perfis farmacológicos, o conhecimento dos resulta- dos destes estudos de ligação, associado ao conhecimento dos padrões Cí- nicos de distribuição destes receptores no corpo indicam que cada subtipo de receptor pode mediar efeitos fisiológicos distintos, porém sobrepostos de SRIF. Como resultado, compostos que se ligam seletivamente a receptores SSTR2, por exemplo, podem ser utilizados para modular uma função fisioló- gica em particular do SRIF sem potencialmente exibir um efeito não deseja- do, resultante de uma outra função fisiológica do SRIF que é mediada por outros receptores de SRIF.

As células são lavadas duas vezes e raspadas com Tris-HCI a 0,05 gelado (pH 7,4), coletadas por centrifugação e homogeneizadas utili- zando um rotor/estator/sistema no mesmo tampão. Após centrifugação a 120 g por 5 min a 4 °C, o sobrenadante é coletado e centrifugado de novo a 48.000 g por 30 min a 4 °C. O sedimento resultante é ressupendido em tam- pão Tris gelado, transferido para um tubo de microcentrifugação e centrifu- gado a 20.000 g por 15 min a 4 °C. Depois de retirada do sobrenadante, o sedimento membranoso é armazenado a -80 °C.

A autorradiografia do receptor é realizada em cortes por micros- tato de 20 μιτι de espessura dos sedimentos membranosos, dispostos em lâminas de microscópio e, em seguida, armazenados a -20 °C. Para cada composto testado, são realizados experimentos completos de deslocamento com o radioligante Iigante universal de somatostatina 125l-[Leu8,D-Tri22,Tir25]- somatostatina 28 que se liga com grande afinidade a todos os cinco recepto- res. Concentrações crescentes do peptídeo não marcado são utilizadas, va- riando de 0,1 a 1000 nM. Somatostatina-28 não marcada é testada em para- lelo utilizando as mesmas concentrações crescentes, como controle. Valores de IC5O são calculados após quantificação dos dados utilizando um sistema de processamento de imagens, assistido por computador, conforme conhe- cido nesta técnica. Em concentrações de 100 nM, o Peptídeo N0. 1 exibiu efeitos mínimos sobre a ligação do radioligante SRIF-28 a SSTR1, SSTR3, SSTR4 e SSTR5. Por outro lado, ligou-se seletivamente a SSTR2, deslo- cando a ligação do radioligante para SSTR2 humano com valor de IC50 de aproximadamente 1,8 nM.

As potências de certos análogos de SRIF para inibir a ligação do

radioligante de 125l-[Leu8-D-Tri22,Tir24JSRIF^e a vários receptores humanos clonados de SRIF são apresentadas na tabela seguinte, na qual os valores de IC50 são fornecidas em concentração nanomolar. Os números em parên- teses indicam o número de vezes que um teste de ligação em particular foi conduzido.

Tabela

Composto IC50 (nM) hSSTRI hSSTR2 hSSTR3 hSSTR4 hSSTR5 Peptídeo N0. 1 406-034-15 >1.000 (2) 1,8 ±0,2 (3) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000(2) Peptídeo N0. 2 363-246-15 >1.000 (3) 9,4 ± 1,6 (3) >1.000 (2) 816 ±114 (3) >1.000 (3) Peptídeo N0. 3 363-300-15 >1.000 (2) 230; 219 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) Peptídeo N0. 4 406-032-20 >1.000 (2) 1,5 ±0 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) Peptídeo N0. 5 363-2298-15 >1.000 (2) 1,7 ±0,3 (3) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) Peptídeo N0. 6 406-094-15 >1.000 (2) 0,6 ±0,05 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) Peptídeo N0. 7 406-092-15 >1.000 (2) 0,53 ± 0,06 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) Peptídeo N0. 8 406-090-15 >1.000 (2) 1,02 ± 0,88 (2) >1.000 (2) 493 ±206 (2) >1.000 (2) Adicionalmente, todos os peptídeos testados e relatados na Ta- bela acima não exibiram internalização significativa nas células, embora an- tagonizando a internalização induzida por octreotide. Os Peptídeos Nos 1 e 4 a 8 exibiram propriedades muito boas de ligação e excelentes propriedades de direcionamento a tumores in vivo, a saber, imensa captação nos tumores sst2 em 4 horas e 24 horas, e excelente relação tumor para rim; por conse- guinte, a captação em tumor pode ser bloqueada por peptídeo frio em ex- cesso.

Os peptídeos da invenção não provêem Iigantes mais seletivos para ligação a SSTR2, porém o uso de peptídeos marcados, por exemplo, uma versão radiomarcada do Peptídeo N0. 1, facilita seleção de fármacos para antagonistas ainda mais efetivos. Ensaios de seleção, conforme são conhecidos na técnica, que empregam o receptor polipeptídico SSTR2 dire- tamente do hospedeiro recombinante, podem ser utilizados para identificar agentes úteis no bloqueio ou imitação de certas características da somatos- tatina, conforme desejado, ao mesmo tempo em que eliminam as caracterís- ticas não desejadas do hormônio que podem surgir da ativação ou bloqueio de outros receptores. A esse respeito, se um análogo radioiodado for dese- jado com a finalidade de seleção, Tyr pode ser adicionada no Terminal N, em vez de DOTA, ou pode ser utilizada na posição 2 em vez de Cpa, ou um radioligante adequado pode ser unido por um quelante do tipo DOTA. Ensai- os de ligação competitiva com compostos candidatos poderia ser, em princí- pio, conduzidos nessa maneira com SSTR2 para pesquisar alta afinidade de ligação; em seguida, por seleção dos múltiplos receptores de SRIF, poderia ser confirmado se houve ligação seletiva a somente este receptor, conforme é desejado. Peptídeos não radiomarcados da invenção podem ser utilizados para tratar doenças de todos os órgãos que expressam sabidamente SS- TR2, incluindo o pulmão, trato gastrointestinal e rins.

Pela razão, conforme mostrada acima, de que adições ao Ter- minal N do análogo de SRIF aparentemente não afetam desfavoravelmente a ligação seletiva, deve ser evidente que estes compostos podem formar complexos com nuclídeo radioativo com a finalidade de transportar aquele agente até um tumor ou outro tecido ao qual se deseja apoptose. Por exem- plo, agentes adequados de quelação, como DOTA ou DTPA ou outros, po- dem ser utilizados para formarem complexos do análogo de SRIF com um metal altamente radioativo, conforme indicado acima. Alguns exemplos de quelação adequados para combinar um átomo de metal radioativo são agen- tes ou grupos de quelação tetradenticulados, derivados do ácido etileno di- amino tetra-acético (EDTA), ácido dietileno triamino penta-acético (DTPA), ácido ciclohexil 1,2-diamino tetra-acético (CDTA), ácido etilenoglicol-0,0'- bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetra-acético (EGTA), ácido N,N-bis(hidroxibenzil)- etilenodiamino-N,N'-diacético (HBED)1 ácido trietileno tetramino hexa-acético (TTHA), ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,N,,N",N",-tetra-acético (DOTA), ácido hidroetildiamino triacético (HEDTA), ácido 1,4,8,11-tetra- azaciclo-tetradecano- N,N',N,,,NM,-tetra-acético (TETA), DTPA substituído, EDTA substituído. Outros quelantes, bem como agentes radioativos, são expostos em WO 95/22341 e WO 04/082722 e nas Publicações de Patentes U.S. 2004/0242842 e 2005/0070470, cujas descrições são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Quelantes preferidos são derivados de EDTA e DOTA. Alguns sais adequados são 111ln-oxinato e 99mTc- tartarato, os quais podem ser geralmente formados em maneira simples sob condições que não prejudicam o antagonista peptídico, e 99mTc(CO)3 que pode ser acoplado por meio da Tyr ou um quelante tridentado adequado.

Se desejado, a solubilidade dos antagonistas de SRIF pode ser melhorada por acilação do grupo amino Terminal N, utilizando um composto hidrofílico como ácido hidro-orótico (Hor) ou similars ou por reação com um isocianato adequado, como metilisocianato ou isopropilisocianato, para dar origem a um grupamento uréia no Terminal N. Outros agentes podem ser unidos também ao Terminal N para aumentar a duração de ação do antago- nista de SRIF, conforme conhecido nesta técnica.

Estes antagonistas de SRIF ou sais não-tóxicos destes, combi- nados a um veículo farmacêutico ou veterinariamente aceitável para formar uma composição farmacêutica, podem ser administrados para animais, in- cluindo humanos e outros mamíferos, por via intravenosa, subcutânea, in- tramuscular, percutânea, por exemplo, intranasal, intracerebrospinhal ou o- ral. Esta composição farmacêutica, criada para ser utilizada em detecção de tumores malignos humanos, incluindo as metástases destes, em tecidos po- de incluir além de material de veículo farmaceuticamente aceitável e um ad- juvante opcional farmaceuticamente aceitável, o antagonista peptídico mar- cado como o princípio ativo, em quantidade suficiente para visualização ex- terna, para detecção por sonda de detecção gama ou para combate ou con- trole de tumores. Os antagonistas peptídicos devem ser pelo menos aproxi- madamente 90% puros e, de preferência, apresentarem pureza de, pelo me- nos, 98%; no entanto, valores menores de pureza são efetivos e podem bem ser utilizados com outros mamíferos diferentes de humanos. Esta pureza significa que o peptídeo pretendido constitui o % declarado de peso de todos os peptídeos similars e fragmentos de peptídeos presentes. A administração para humanos deve ser sob orientação de um médico para o combate de tumores e tipos de câncer específicos ou para mediar outras condições onde os receptores SSTR2 exercem função de controle, como acoplamento a uma tirosina fosfatase de modo que a estimulação dessa enzima possa ser con- duzida para mediar os efeitos antiproliferativos do SRIF. A dose exigida vari- ará com a condição a ser tratada, com a gravidade da condição e com a du- ração do tratamento desejado.

De acordo com o determinado recentemente, tumores freqüen- temente expressam diversos tipos de receptores peptídicos (Reubi, J.C.; Waser, B. Concomitant expression of severa! peptide receptors in neuroen- docrine tumors: molecular basis for in vivo multireceptor tumour targeting. Eur. J. Nuci Med. Molec. Imaging 2003, 30, 781-793). Esses grupos de múl- tiplos receptores peptídicos podem incluir receptores sst2, bem como recep- tores de bombesina, receptores CCK, receptores VIP, receptores GLP-1, receptores de neurotensina, receptores de secretina, receptores de neuro- medina B e receptores CRF, etc. Nessa circunstância, a administração de antagonistas de SSRT2, em combinação sob a forma de coquetel, com um ou mais antagonistas radiomarcados para estes vários receptores deve me- lhorar bem substancialmente o direcionamento in vivo para estes tumores. Estes antagonistas peptídicos são administrados freqüentemen- te na forma de sais não-tóxicos farmacêutico ou veterinariamente aceitáveis, como sais ácidos de adição ou complexos de metal, por exemplo, com zinco, ferro, cálcio, bário, magnésio, alumínio e similars. Exemplos destes sais não- tóxicos incluem cloridrato, bromato, sulfato, fosfato, tanato, oxalato, fumara- to, gliconato, alginato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartarato e similars.

Pode ser desejável também liberar estes antagonistas de SRIF por períodos prolongados de tempo, por exemplo, por períodos de uma se- mana a um ano, a partir de uma única adminsitração, e apresentações far- macêuticas para liberação lenta, depósito ou implante podem ser utilizadas, conforme bem conhecido nesta técnica. Por exemplo, uma apresentação farmacêutica pode conter um sal não-tóxico farmaceuticamente aceitável do composto com nível baixo de solubilidade em líquidos corporais, por exem- plo, um sal ácido de adição com um ácido polibásico; um sal com um cátion de metal polivalente; ou combinação dos dois sais. Um sal relativamente insolúvel pode ser formulado em gel, por exemplo, um gel de estearato de alumínio. Uma formulação adequada de depósito de liberação lenta para injetável pode conter também um antagonista de SRIF ou um sal deste dis- perso ou encapsulado em polímero não antigênico ou não-tóxico de degra- dação, como polímero de ácido poliláctico/poliglicólico, por exemplo, confor- me descrito na Patente U.S. No. 3 773 919.

Quantidades terapeuticamente efetivas dos antagonistas peptí- dicos devem ser administradas sob orientação de um médico, e composi- ções farmacêuticas conterão geralmente o peptídeo associado a um veículo convencional, farmacêutico ou veterinariamente aceitável. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é considerada como aquela pré-determinada calcu- lada para atingir um efeito desejado. A dose exigida variará com o tratamen- to em particular e com a duração do tratamento desejado; no entanto, prevê- se que doses entre aproximadamente 10 microgramas e aproximadamente 1 miligrama por quilo de peso corporal serão utilizadas para tratamento tera- pêutico. Pode ser especialmente vantajoso administrar estes compostos em forma de depósito ou de duração prolongada, conforme descrito anterior- mente. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é tipicamente aquele de um antagonista de SRIF que, quando administrada perifericamente, por e- xemplo, por via intravenosa, em composição fisiologicamente aceitável, é suficiente para tingir uma concentração plasmática deste de aproximada- mente 0,1 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, de preferência, de aproxi- madamente 1 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml, mais preferivelmente, de pelo menos 2 pg/ml e geralmente de 5 a 10 pg/ml. Nestas quantidades, es- tes podem ser utilizados para afetar de modo desejado a secreção gástrica. Quando a composição for utilizada para imagens ou tratamentos

terapêuticos, o prazo de validade pequeno do composto radiomarcos e/ou a meia-vida curta do radionuclídeo pode requerer que a reação de marcação com o radionuclídeo, no usuário, seja efetuada no hospital clínico ou labora- tório. Nessas circunstâncias, os vários ingredientes da reação podem ser fornecidos para o usuário na forma assim chamada de "kit". Os manuseios necessários para realização da reação desejada devem ser tão simples quanto possível para permitir que o usuário prepare a composição com mar- cação radioativa do kit, utilizando instalações que normalmente estão dispo- níveis. De acordo com o mesmo, um kit para o preparo de uma composição radiofarmacêutica, para detecção e localização de tumores malignos e de suas metástases em tecidos, poderia compreender (i) um peptídeo seletivo para SSTR2, um veículo inerte e/ou agente excipiente com adjuvantes op- cionais farmaceuticamente aceitável, (ii) uma solução de um sal ou quelante de isótopo radioativo de metal, e (iii) instruções para uso com prescrição pa- ra reação dos ingredientes presentes no kit.

De preferência, um antagonista peptídico a ser utilizado como ingrediente deste kit foi derivado por reação com agente de quelação, con- forme definido acima. O conjugado peptídico resultante provê um recurso para união firme do radionuclídeo em maneira simples. Agentes adequados de quelação para modificação do peptídeo são descritos detalhadamente acima. Ácidos di ou poliacéticos contendo N, ou seus derivados, como os compostos mencionados anteriormente, provaram ser de forma predominan- te adequados para união de vários radionuclídeos metálicos, como 111In e 113mIn, a moléculas de peptídeos. O kit a ser suprido ao usuário pode conter também outros ingredientes definidos acima, juntamente com instruções pa- ra uso, enquanto que a solução de um sal ou quelato do radionuclídeo com prazo de validade limitado pode ser suprida separadamente ao usuário.

Por exemplo, um kit para preparar uma composição radiofarma- cêutica marcada com 99mTc, 186Re ou 188Re pode compreender, além de os ingredientes definidos em (i) e (ii) acima, um agente redutor e, se desejado, um quelante, e (iii) instruções para uso com prescrição para reação dos in- gredientes do kit com 99mTc na forma de solução de pertecnetato, ou com 186Re ou 188Re na forma de solução de perrenato. Se desejado, vários ingre- dientes do kit podem ser combinados, desde que compatíveis. O kit deve compreender um agente redutor para reduzir o pertecnetato ou perrenato, por exemplo, ditionita, agente redutor metálico ou um agente redutor estabi- Iizante de complexo, por exemplo, SnCI2, Sn(ii)-tartarato, Sn(ii)-fosfanato ou -piro-fosfato ou Sn(ll)-glicohpetonato. A solução de pertecnetato ou perrena- to pode simplesmente ser obtida de um fornecedor adequado. Quando o radionuclídeo está presente no próprio kit, a reação formadora de complexo com o peptídeo pode ser simplesmente produzida pela combinação dos componentes em meio neutro e fazendo com que estes reajam. Para que o radionuclídeo possa reagir com o peptídeo na forma de um quelato ligando- se a um quelante de modo comparativamente fraco, conforme descrito ante- riormente acima.

Quando o kit compreender um derivado de peptídeo, conforme definido anteriormente acima, e for destinado ao preparo de uma composi- ção radiofarmacêutica, marcada com 99mTc, 186Re ou 188Re, o radionuclídeo será adicionado, de preferência, separadamente na forma de uma solução de pertecnetato ou perrenato. Nessa situação, o kit compreenderá um agen- te redutor adequado e, se desejado, um quelante, o primeiro para reduzir o pertecnetato ou o perrenato. Como agente redutor pode ser utilizado, por exemplo, ditionita ou um agente redutor metálico. Os ingredientes podem ser opcionalmente combinados, desde que compatíveis. Este kit monocompo- nente, no qual os ingredientes combinados estão, de preferência, liofilizados, é excelentemente adequado para ser reagido, pelo usuário, com a solução do radionuclídeo. Um agente redutor metálico, por exemplo, Sn(II), Ce(III), Fé(ll), Cu(I), Ti(III) ou Sb(III) podem ser utilizados. O constituinte peptídico dos kits supramencionados pode ser fornecido em solução, por exemplo, na forma de solução salina fisiológica, ou em alguma solução tampão, porém está presente, de preferência, em condição seca, por exemplo, na condição liofilizada. Quando utilizado como componente para líquido injetável, deve ser estéril, em que, quando o constituinte estiver no estado seco, o usuário deve utilizar, de preferência, uma solução salina fisiológica estéril como sol- vente. Se desejado, o constituinte supramencionado pode ser estabilizado na maneira convencional com estabilizantes adequados, por exemplo, ácido ascórbico, ácido gentísico ou sais destes ácidos.

Embora a invenção tenha sido descrita em referência a suas concretizações preferidas, as quais constituem o melhor modo presentemen- te conhecido para os inventores, deve ser entendido que várias alterações e modificações, conforme seria óbvio para qualquer técnico neste assunto, poderão ser feitas sem se afastarem do escopo da invenção, o qual é apre- sentado nas reivindicações anexas ao presente. Embora as reivindicações definam de modo variado a invenção em termos de seqüência de peptídeos, deve ser entendido que esta se destina a incluir sais não-tóxicos destes, os quais são bem conhecidos por serem o equivalente completo dos mesmos e que são mais freqüentemente administrados.

As exposições de todas as patentes e pedidos publicados de patentes, apresentadas anteriormente acima, são expressamente aqui in- corporadas por referência neste pedido de patente. Conforme utilizadas na presente exposição, todas as temperaturas são em °C, e todas as relações são por volume. Percentuais de materiais líquidos são também por volume.

Várias características da invenção são enfatizadas nas reivindi- cações que se seguem.

Claims (15)

1. Antagonista peptídico cíclico de somatostatina (SRIF) que se liga seletivamente ao receptor SSTR2 de SRIF sem desencadear a internali- zação em célula, cujo peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (ciclo 3-14) XaarXaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8 -Xaag-Xaa1O- Xaa1I-Xaai2-Xaai3-Xaa14-Xaai5, em que Xaa1 é des-Xaa; Xaa2 é Trp(A)1 Phe(B), Nal ou Tyr, onde A é H, Cl, F, Br, Me, NO2, OMe ou N-formila e B é H, halogênio, CH3, NO2 ou OCH3; D-Xaa3 é D-Cys, D-Pen, D-HCis ou um outro D-isômero de α-aminoácido com cadeia lateral SH; Xaa4, Xaa5 e Xaa6 são des-Xaa; Xaa7 é Aph(Q1), Tyr(X)1 Ala(tienil) ou Trp(A), onde Q1 é Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-Cbm1 OEt-Cbm, Cbm-Et(OEt)2 ou Hor e X é H ou halogênio; Xaa8 é D-Trp(A), Trp(A), Tyr, D-Tyr, Phe(B), D-Phe(B), L ou D- BzIHis1 L ou D-(DNP)His, L ou D-Aph(Cbm); Xaa9 é Lys, NaMeLys1 hLis, Na" MehLis, Orn ou NaMeOrn; Xaa10 é Thr1 Ser ou Vai; Xaa11l Xaa12 e Xaa13 são des-Xaa; Xaa14 é Cys1 Pen, hCis ou outro L-isômero de α-aminoácido com cadeia lateral SH; e Xaa15 é 2Nal, D-2Nal, Aph(Q2)1 D-Aph(Q2)1 (R1)Cha, (R1)D-Cha, (R1)Leu, (R1)D-Leu, Tyr1 D-Tyr1 Trp1 D-Trp ou des-Xaa; onde R1 é H ou CaMe1 e Q2 é Cbm, OH-Cbm1 CH3-Cbm1 OCH3-Cbm ou OEt-Cbm.

2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 em que Xaa7 é A- 20 Ph(Q1)l Ala(tienil) ou Trp(A) e D-Xaa3 é D-Cys.

3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 em que Xaa7 é A- ph(hor), Aph(Cbm)1 Tyrou ITir.

4. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 em que Xaa8 é se- lecionado do grupo consistindo por Trp(A), D-Trp(A) e D-Aph(Cbm)1 em que a é 5F, 5CI, 5Br, 5Me, 50Me, 7F, 6CI ou 6Br.

5. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 em que Xaa7 é A- ph(Hor), Xaa8 é D-Aph(Cbm) e Xaa15 é 2Nal ou D-Tyr.

6. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 em que Xaa2 é Cpa1 Xaa7 é Aph(Hor)1 Xaa8 é D-Aph(Cbm)1 Xaa9 é Lys e Xaa15 é 2Nal ou D- Tyr.

7. Peptídeo de acordo com a Reivindicação 1, em que Xaa2 é4CI(Phe) ou 4N02(Phe).

8. Peptídeo de acordo com a Reivindicação 1, em que Xaa2 é 4CI(Phe) ou 4N02(Phe), Xaa7 é Tyr(X)1 Xaa8 é D-Aph(Cbm) ou D-Ter e Xa- a-15 é 2Nal ou D-Tyr.

9. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, em que está presente também no Terminal N um grupamento Z que é um quelante, agente formador de complexo, agente de conjugação ou uma mar- cação.

10. Peptídeo de acordo com a reivindicação 9, em que Z é sele- cionado do grupo consistindo por quelantes à base de DOTA e DTPA, que- Iantes à base de NOTA, compostos carbonila, 2-hidrazino nicotinamida, que- lantes N4, desferrioxamina e quelantes NxSy, e em que o referido agrupa- mento Z é unido opcionalmente a Xaa2 por um Iigante L.

11. Composição farmacêutica compreendendo uma mistura do peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 e, pelo menos, um veículo farmaceuticamente aceitável.

12. Análogo peptídico cíclico de somatostatina (SRIF) que se liga seletivamente ao receptor SSTR2 de SRIF, cujo peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (ciclo 3-14) Xaai-Xaa2-D-Cys-Xaa4-Xaas-Xaa6- Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaaio-Xaaii-Xaai2-Xaai3-Cys-Xaai5-NH2, em que Xaai é des-Xaa; Xaa2 é Cl ou nitro Phe; Xaa4, Xaa5 e Xaa6 são des-Xaa; Xaa7 é Aph(Hor), Tyr ou ITir; Xaa8 é D-Aph(Cbm) ou D-Trp; Xaa9 é Lys, Orn1 hLys, NaMeLys ou NaMeOrn; Xaai0 é Thr; Xaan, Xaai2 e Xaa-13 são des-Xaa; e Xaai5 é 2Nal ou D-Tyr.

13. Peptídeo de acordo com a reivindicação 12 que possui uma das seguintes seqüências de aminoácidos, em que o Terminal C é amidado: <formula>formula see original document page 30</formula> <formula>formula see original document page 30</formula> <formula>formula see original document page 30</formula> <formula>formula see original document page 30</formula> D-Trp-Lys-Thr-Cysj-D-Tyr; <formula>formula see original document page 31</formula>

14. Peptídeo de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que, unido a Xaa2, há um agrupamento (Z) selecionado do grupo consistindo por quelantes à base de DOTA, quelantes à base de DTPA1 quelantes à base de NOTA, compostos carbonila, 2hidrazino nicotinamida, quelantes N4, desfer- rioxamina e quelantes NxSy.

15. Peptídeo de acordo com a reivindicação 14, em que Xaa2 é4CI(Phe) ou 4N02(Phe), e um quelante do tipo DOTA está unido covalente- mente ao mesmo.