ES2410207T3

ES2410207T3 - Antagonistas de la somatostatina selectivos para receptor(SSTR2)

Info

Publication number: ES2410207T3
Application number: ES07854075T
Authority: ES
Inventors: Jean E. F. Rivier; Judit Erchegyi; Jean Claude Reubi; Helmut R. Maecke
Original assignee: Universitaet Bern; Universitaetsspital Basel USB; Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Universitaet Bern; Universitaetsspital Basel USB; Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 2006-10-16
Filing date: 2007-10-15
Publication date: 2013-07-01
Anticipated expiration: 2027-10-15
Also published as: EP2383289A1; PL2383289T3; BRPI0717135A2; SI2076535T1; US7960342B2; EP2433963B1; WO2008048942A3; DK2076535T3; AU2007311137B2; BRPI0717135B1; ES2526292T3; EP2076535A2; JP5295967B2; CN103288919A; BRPI0717135B8; CN101631801B; US20080260638A1; WO2008048942A2; AU2007311137A1; CA2666642C

Abstract

Un péptido análogo de somatostatina (SRIF) cíclico que se une selectivamente al receptor de SRIF SSTR2,péptido que tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos en las que el extremo C está amidado:**Fórmula** en las que Cpa significa cloro-Phe, Aph (Hor) significa 4-[(2,6-dioxo-hexahidro-pirimidina-4-carbonil)-amino]-fenilalanina y Aph (Cbm) significa 4-ureido-fenilalanina.

Description

Antagonistas de la somatostatina selectivos para receptor (SSTR2)

La presente invención se refiere a péptidos relacionados con la somatostatina y a procedimientos para el tratamiento farmacéutico de mamíferos usando tales péptidos. Más específicamente, la invención se refiere a antagonistas del péptido somatostatina selectivos para receptores acortados y a la inclusión de sustituciones de aminoácidos y/o adiciones en tales péptidos que confieren selectividad para receptor a los mismos, a composiciones farmacéuticas que contienen tales péptidos, a tales péptidos complejados con o conjugados con núclidos radiactivos, a procedimientos de diagnóstico y tratamiento terapéutico de enfermedades de mamífero neoplásicas y no neoplásicas usando tales péptidos, particularmente péptidos que se acoplan a quelantes o marcados de otro modo, y también a procedimientos para buscar fármacos más eficaces usando tales péptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El tetradecapéptido cíclico somatostatina-14 (SRIF) se aisló originalmente del hipotálamo y se caracterizó como un inhibidor fisiológico de la liberación de hormona de crecimiento (GH) de la adenohipófisis. Fue caracterizado por Guillemin y col. y se describió en la patente de EE.UU. nº 3.904.594. Este tetradecapéptido tiene un enlace de puente o de ciclación entre los grupos sulfhidrilo de los dos residuos de aminoácidos de cisteinilo en las posiciones 3 y 14. SRIF afecta múltiples procesos celulares y también es conocido por inhibir el crecimiento de ciertos tumores. El análogo [D-Trp8]-SRIF, que tiene la secuencia de aminoácidos: (ciclo 3-14)H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-D-TrpLys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, se desveló en la patente de EE.UU. nº 4.372.884 y se establece que tiene potencia muchas veces mayor que SRIF para inhibir la liberación de GH.

SRIF induce sus efectos biológicos interaccionando con una familia de receptores estructuralmente similares unidos a membrana. Se han clonado cinco receptores de SRIF y se denominan SSTR1-5. Los cinco receptores se unen a SRIF y SRIF-28 con alta afinidad. Se han identificado y usado agonistas selectivos en SSTR2 y SSTR5 que revelan funciones distintas de estos receptores. Se cree que estos dos receptores son los subtipos predominantes en tejidos periféricos. Se cree que SSTR2 media en la inhibición de la secreción de hormona de crecimiento, glucagón y ácido gástrico. La patente de EE.UU. nº 5.846.934 describe análogos que se establece que tienen alguna especificidad por SSTR2. Octreotida, un agonista, muestra alguna especificidad por SSTR2 (véase Yang y col., 1998, PNAS USA 95: 10836). A diferencia, SSTR5 parece participar principalmente en el control de la liberación de insulina y amilasa. La publicación internacional nº WO 97/11962 describió análogos que establece que tienen alguna especificidad por SSTR5. SSTR3 media en la inhibición de la contracción de músculo liso gástrico. La patente de EE.UU. nº 6.579.967 desvela análogos de la somatostatina que son específicos para SSTR3. SSTR4 se encuentra en la pituitaria, pulmones, tubo GI, riñones y en ciertos tumores para la exclusión sustancial de los otros receptores de SRIF; se cree que se activa tras la unión por SRIF. La solicitud de patente publicada de EE.UU. nº 2002/0137676 desvela procedimientos para el tratamiento de células endoteliales usando ligandos selectivos para receptores de somatostatina que son específicos tanto para SSTR1 como SSTR4. Las patentes de EE.UU. nº 5.750.499 y

7.019.109 desvelan análogos del péptido somatostatina que son selectivos para SSTR1. La solicitud de patente de EE.UU. publicada nº 2005/0245438 desvela análogos del péptido somatostatina selectivos para receptores que son específicos para SSTR4. Estos hallazgos globales indican que diferentes subtipos de receptores median en distintas funciones de SRIF en el cuerpo.

El documento WO 98/24807 desvela varios antagonistas cíclicos y menciona que los antagonistas de la somatostatina pueden actuar mediante el subtipo de receptor SSTR-2. Ginj y col. (2006, PNAS USA 103: 16436) se refiere a radiotrazadores de receptores de somatostatina.

Los receptores de somatostatina se expresan en estados patológicos, particularmente en tumores neuroendocrinos del tubo gastrointestinal. La mayoría de los tumores humanos que se originan a partir del tejido diana de somatostatina han conservado sus receptores de somatostatina. Se observó por primera vez en adenomas productores de hormona de crecimiento y adenomas productores de TSH; aproximadamente la mitad de los adenomas inactivos endocrinos muestran receptores de somatostatina. El noventa por ciento de los carcinoides y la mayoría de los carcinomas de células de los islotes, que incluyen sus metástasis, normalmente tienen una alta densidad de receptores de somatostatina. Sin embargo, sólo el 10 por ciento de los carcinomas colorrectales y ninguno de los carcinomas pancreáticos exocrinos contienen receptores de somatostatina. Los receptores de somatostatina en tumores pueden identificarse usando procedimientos de unión in vitro o usando técnicas de obtención de imágenes in vivo; éstas últimas permiten la localización precisa de los tumores y sus metástasis en los pacientes. Debido a que los receptores de somatostatina en tumores gastroenteropancreáticos son funcionales, su identificación puede usarse para evaluar la eficacia terapéutica de un análogo para inhibir la excesiva liberación de hormona en los pacientes.

Sería valioso tener agonistas del péptido somatostatina que se unieran fuertemente a SSTR2, mientras que al mismo solo mostraran una mínima propensión a unirse a los otros 4 receptores. Por tanto, ha continuado la búsqueda de tales agonistas del péptido somatostatina que sean altamente selectivos para SSTR2, pero que no estén internalizados en células.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Ahora se han descubierto ciertas modificaciones que son eficaces para crear análogos de péptidos de SRIF que son selectivos para SSTR2, a diferencia de los otros receptores de SRIF clonados. Se ha descubierto una clase de análogos del péptido somatostatina que son altamente selectivos para SSTR2, que son antagonistas de somatostatina y que, aunque no están internalizados en células que tienen receptores SSTR2, se recogen en cantidades que son sorprendentemente mayores que son comparables a agonistas del péptido somatostatina selectivos para receptor. Los péptidos resultantes se unen selectivamente a SSTR2 clonado sin activar el receptor, y estos análogos de péptido, cuando se yodan o radiomarcan de otro modo, retendrán sus propiedades biológicas deseables. Por tanto, estos péptidos novedosos son útiles en determinar la localización de tejido y expresión celular del receptor SSTR2, además de en regular ciertas funciones farmacológicas sin ciertos efectos secundarios concomitantes característicos hasta ahora de la administración de SRIF. Estos antagonistas del péptido SRIF, cuando se radiomarcan, pueden usarse en escintigrafía con el fin de ubicar, es decir, localizar tumores que expresan estos receptores, tanto in vitro como in vivo, usando SPECT o PET; alternativamente pueden usarse otras marcas también conocidas en esta materia, por ejemplo, marcas fluorescentes. Si incluyen un radionúclido quelado apropiado como se conoce en esta técnica, estos análogos pueden servir de productos radiofarmacéuticos que son adecuados para la terapia con radionúclidos en el tratamiento de tales tumores.

Los antagonistas del péptido SRIF de la invención inhiben la unión de 125I-[Tyr11]SRIF y 122I-[Leu8,D-Trp22,Tyr25]SRIF28 al receptor humano clonado SSTR2, pero no se unen fuertemente a SSTR1, SSTR3, SSTR4 o SSTR5. Por tanto, los antagonistas sin marcar podrían administrarse para bloquear terapéuticamente el funcionamiento de este receptor. Estos antagonistas de SRIF, a los que 99mTc, 111In, 68Ga o 90Y, por ejemplo, se ha acoplado por un quelante, tal como DOTA o DTPA (o al que otro agente complejante/de conjugación está ligado al extremo N con el fin de unir un resto útil para fines de diagnóstico o terapéuticos), no se unen significativamente a SSTR1, 3, 4 ó 5, pero continúan uniéndose potentemente y saturablemente a SSTR2.

Antagonistas de SRIF preferidos no solo se unen selectivamente a SSTR2, sino que se unen al mismo con alta afinidad. Por unión selectiva se indica que presentan una KD o una CI50 con SSTR2 que es aproximadamente una centésima o menos de la con respecto a los otros 4 receptores. Análogos preferidos serán al menos aproximadamente 200 veces más selectivos por SSTR2 que por cualquier otro receptor de SRIF, y más preferentemente al menos aproximadamente 500 veces más selectivos.

Estos análogos de SRIF también pueden marcarse fácilmente y, por tanto, usarse eficazmente en la búsqueda de fármacos, obtención de imágenes, diagnóstico y terapia con radionúclidos. Por ejemplo, estos análogos que llevan marcas detectables son útiles en localizar tales receptores en el cuerpo y en diagnosticar las localizaciones de tumores, particularmente tumores neuroendocrinos. Como agentes terapéuticos de radionúclido se consideran que son particularmente útiles en combatir tumores que expresan los receptores SSTR2; además, pueden realizar esto sin los efectos secundarios, es decir, sin destruir una parte sustancial del tejido vecino como resultado de interaccionar con una pluralidad de receptores de SRIF.

En un aspecto particular, la divulgación proporciona un antagonista del péptido somatostatina (SRIF) cíclica que se une selectivamente al receptor de SRIF SSTR2 sin producir la internalización en una célula, péptido que comprende la secuencia de aminoácidos (ciclo3-14)Xaa1-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15 en la que Xaa1 es des-Xaa; Xaa2 es Trp(A), Phe(B), Nal o Tyr en la que A es H, Cl, F, Br, Me, NO2, OMe o N-formilo y B es H, halógeno, CH3, NO2 o OCH3; D-Xaa3 es D-Cys, D-Pen, D-HCys u otro C-aminoácido de D-isómero que tiene una cadena lateral de SH; Xaa4, Xaa5 y Xaa6 son des-Xaa; Xaa7 es Aph(Q1), Tyr(X), Ala(tienilo) o Trp(A) en la que Q1 es Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-Cbm, OEt-Cbm, Cbm-Et(OEt)2 o Hor y X es H

o halógeno; Xaa8 es D-Trp(A), Trp(A), Tyr, D-Tyr, Phe(B), D-Phe(B), L o D-BzlHis, L o D-(DNP)His, L o D-Aph(Cbm); Xaa9 es Lys, NCMeLys, hLys, NCMehLys, Orn o NCMeOrn; Xaa10 es Thr, Ser o Val; Xaa11, Xaa12 y Xaa13 son des-Xaa; Xaa14 es Cys, Pen, hCys u otro C-aminoácido de L-isómero que tiene una cadena lateral de SH; y Xaa15 es 2Nal, D-2Nal, Aph(Q2), D-Aph(Q2), (R1)Cha, (R1)D-Cha, (R1)Leu, (R1)D-Leu, Tyr, D-Tyr, Trp, D-Trp o des-Xaa; en la que R1 es H o CCMe, y Q2 es Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-Cbm o OEt-Cbm. Un resto que contiene quelante puede acoplarse en el extremo N como se conoce en la técnica. Alternativamente, un resto que contiene quelante puede complejarse (por ejemplo sistema de biotina-avidina) con su complemento en el extremo N del péptido.

En un aspecto más particular, la divulgación proporciona un péptido análogo de somatostatina (SRIF) cíclico que se une selectivamente al receptor de SRIF SSTR2, péptido que comprende la secuencia de aminoácidos ciclo(3-14)Xaa1-Xaa2-D-Cys-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Cys-Xaa15-NH2 en la que Xaa1 es des-Xaa; Xaa2 es cloro o nitro Phe; Xaa4, Xaa5 y Xaa6 son des-Xaa; Xaa7 es Aph(Hor), Tyr o Idadr; Xaa8 es D-Aph(Cbm) o D-Trp; Xaa9 es Lys, Orn, hLys, NCMeLys o NCMeOrn; Xaa10 es Thr; Xaa11, Xaa12 y Xaa13 son des-Xaa; y Xaa15 es 2Nal o D-Tyr.

En un aspecto más particular, la invención proporciona el péptido somatostatina (SRIF) cíclico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 y una composición farmacéutica que comprende un péptido según la reivindicación 1.

En otro aspecto particular, la divulgación proporciona un procedimiento de obtener externamente imágenes de tejido en el cuerpo de un ser humano, que expresa SSTR2, que comprende: (i) administrar a un ser humano, en una cantidad suficiente para la obtención de imágenes externas, una composición que comprende un antagonista del péptido SRIF que es selectivo para SSTR2 a diferencia de los otros receptores de SRIF clonados y que se une con alta afinidad con el receptor SSTR2 humano clonado, pero no activa el receptor, llevando dicho antagonista del péptido SRIF una marca detectable, y (ii) someter el ser humano a obtención de imágenes externas.

En todavía otro aspecto más particular, la divulgación proporciona un procedimiento de irradiar tejido neoplásico en el cuerpo de un ser humano, que expresa SSTR2, que comprende: (i) administrar a un ser humano, en una cantidad suficiente para irradiar tejido neoplásico, una composición que comprende un antagonista del péptido SRIF que es selectivo para SSTR2 a diferencia de los otros receptores de SRIF clonados y que se une con alta afinidad con el receptor SSTR2 humano clonado, pero no activa el receptor, llevando dicho antagonista del péptido SRIF una marca radiactiva, y (ii) permitir que el antagonista del péptido SRIF se una al tejido neoplásico.

En otro aspecto particular, la divulgación proporciona un procedimiento de detectar, en el cuerpo de un ser humano, tumores y sus metástasis que tienen SSTR2 en tejidos, que no contienen cantidades sustanciales de SSTR2 cuando están en condición sana o en condiciones no neoplásicas de inflamación crónica, procedimiento que comprende (i) administrar a dicho ser humano, en una cantidad suficiente para la obtención de imágenes externas, una composición que comprende un péptido según la reivindicación 1, estando dicho péptido marcado con (a) un isótopo de metal radiactivo que está ligado mediante un quelante adecuado o (b) un átomo de metal paramagnético o marcado con un isótopo de halógeno radiactivo, y después (ii) someter dicho ser humano a obtención de imágenes externas, por barrido radiactivo o por resonancia magnética, para determinar los sitios elegidos como diana en el cuerpo del mismo en relación con la actividad de fondo, con el fin de permitir la detección y localización de dichos tumores en el cuerpo semicuantitativamente.

La presente divulgación proporciona además un procedimiento de búsqueda de ligandos que son altamente selectivos para SSTR2 usando un modelo de farmacóforo que se basa en un patrón de características de ligandos que se determina que se requieren para la unión selectiva. Tal procedimiento puede comprender llevar a cabo un ensayo de unión competitiva con un receptor SSTR2, un ligando según la presente invención y un antagonista candidato, en el que dicho ligando tiene una marca detectable adecuada; determinar la capacidad del antagonista candidato para desplazar el ligando marcado; y probar dicho antagonista candidato para su capacidad para antagonizar una actividad asociada a SRIF.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Las abreviaturas convencionales de 3 letras identifican los residuos de alfa-aminoácidos, y si el residuo de aminoácido tiene formas isoméricas, es la forma L del aminoácido la que se representa, a menos que se indique expresamente de otro modo, por ejemplo, Ser = L-serina. Por L o D se indica cualquiera de los isómeros D y L de un C-aminoácido particular. Cuando en lo sucesivo se hace referencia a una posición en el péptido, tal se indica para referirse a la posición correspondiente del péptido somatostatina (SRIF) nativo de 14 residuos.

Se proporciona que los antagonistas del péptido SRIF tienen una afinidad selectiva por el receptor de SRIF SSTR2; preferentemente también tienen una alta afinidad por SSTR2, es decir, igual a una KD de aproximadamente 10 nanomolar o menos. Estos péptidos engloban análogos cíclicos acortados de SRIF en los que la porción de anillo está acortada a solo 6 residuos, y en los que hay un residuo en el extremo N y preferentemente también se añade un residuo al extremo C. En otras palabras, los residuos en las posiciones 1, 4, 5, 6, 11, 12 y 13 están delecionados del SRIF nativo de 14 residuos, creando heptapéptidos, y preferentemente también se añade un residuo (es decir, residuo 15) al extremo C, que crea un octapéptido.

Ejemplos de antagonistas de péptidos representativos que presentan la especificidad deseada por SSTR2 se proporcionan por la siguiente secuencia de aminoácidos, que se basa en un sistema de numeración de acuerdo con la secuencia de 14 residuos de SRIF de mamífero nativa, en la que los residuos en las posiciones 1, 4-6 y 11-13 están preferentemente eliminados: (ciclo3-14)Xaa1-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xa4-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15 en la que Xaa1 es des-Xaa; Xaa2 es Trp(A), Phe(B), Nal o Tyr en la que A es H, Cl, F, Br, Me, NO2, OMe o N-formilo y B es H, halógeno, CH3, NO2 o OCH3; D-Xaa3 es D-Cys, D-Pen, D-HCys u otro C-aminoácido de D-isómero que tiene una cadena lateral de SH; Xaa4, Xaa5 y Xaa6 son des-Xaa; Xaa7 es Aph(Q1), Ala(tienilo), Tyr(X) o Trp(A) en la que Q1 es Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-Cbm, OEt-Cbm, Cbm-Et(OEt)2 o Hor y X es H o halógeno; Xaa8 es D-Trp(A), Trp(A), Tyr, D-Tyr, Phe(B), D-Phe(B), L o D-BzlHis, L o D-(DNP)His, L o D-Aph(Cbm); Xaa9 es Lys, NCMeLys, hLys, NCMehLys, Orn o NCMeOrn; Xaa10 es Thr, Ser o Val; Xaa11, Xaa12 y Xaa13 son des-Xaa; Xaa14 es Cys, Pen, hCys u otro C-aminoácido de L-isómero que tiene una cadena lateral de SH; y Xaa15 es 2Nal, D-2Nal, Aph(Q2), D-Aph(Q2), (R1)Cha, (R1)D-Cha, (R1)Leu, (R1)D-Leu, Tyr, D-Tyr, Trp, D-Trp o des-Xaa; en la que R1 es H o CCMe, y Q2 es Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-Cbm o OEt-Cbm. Tyr en la posición 2 puede estar radioyodada, o un agente complejante, de conjugación o quelante puede unirse directamente o mediante un ligador al grupo C-amino del residuo del extremo N de cualquiera de estos análogos de péptidos que puede ligar un núclido radiactivo al mismo. Por ejemplo, un quelante macrocíclico, tal como DOTA, puede añadirse al extremo N tanto uniéndolo directamente a Xaa2 como indirectamente al mismo usando un ligador tal como GABA (ácido gammaaminobutírico, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.022.523) o �Ala.

Un subgénero preferido de análogos de SRIF comprende la secuencia de aminoácidos: (ciclo 3-14)Xaa1-Xaa2-DXaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Lys-Thr-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Cys en la que Xaa2 es Phe sustituido; D-Xaa3 es D-Cys; Xaa7 es Aph(Q1), Tyr o Idadr; y Xaa8 es D-Trp o D-Aph(Cbm). Debe entenderse que los restantes grupos Xaa son como se han definido anteriormente en este documento, siempre que no se especifiquen.

Generalmente para los fines de la presente solicitud, referencia a Trp y D-Trp en la descripción distinta de en un ejemplo específico debe entenderse que incluye el residuo sin sustituir, además de un residuo en el que una única sustitución con hidrógeno se hace en tanto la posición 5 como 6 sobre Trp, y estando tales sustituyentes seleccionados de cloro, flúor, bromo, metilo, nitro y metoxi, prefiriéndose cloro, fluoro y bromo o sustituyendo formilo el hidrógeno del N del indol. Por Nal se indica el isómero de alanina que está sustituido con naftilo sobre el átomo de carbono �, siendo la unión a naftaleno preferentemente con la posición 2 sobre el anillo, u opcionalmente con la posición 1. Por Aph se indica aminofenilalanina, en la que el grupo amino está preferentemente unido a la posición 4 sobre el anillo de fenilo, pero la unión en cualquiera de la posición 2 ó 3 es generalmente equivalente. Por Aph(Cbm) se indica 4-ureido-fenilalanina. Por Aph(OH-Cbm) se indica 4-(3-hidroxi)-ureido-fenilalanina. Por Aph (CH3-Cbm) se indica 4-(3-metil)-ureido-fenilalanina. Por Aph(OCH3-Cbm) se indica 4-(3-metoxi)-ureido-fenilalanina. Por Aph[(EtO)2Et-Cbm] se indica 4-{3-[2-(2-etoxi-etoxi)-etil]}-ureido-fenilalanina. Por Idadr se indica L-tirosina yodada, por ejemplo 3-yodo-Tyr. Por Cpa se indica cloro-Phe, y preferentemente 4ClPhe. Por Aph(Hor) se indica 4-[(2,6-dioxohexahidro-pirimidina-4-carbonil)-amino]-fenilalanina. Por SRIF se indica el péptido cíclico de 14 residuos somatostatina. Por Cha se indica ciclohexilalanina, y por Pen se indica penicilamina (�-mercaptovalina). Por hLys o hCys se indica el C-aminoácido con un grupo CH2 adicional en la cadena lateral.

El extremo C está normalmente amidado, aunque podría usarse un equivalente, por ejemplo, Gly-OH. El extremo N puede modificarse de diversas formas sin afectar significativamente adversamente la afinidad de unión, considerándose que todas las modificaciones en estos péptidos cíclicos están incluidas como parte de los péptidos de la invención global. Por ejemplo, puede hacerse una variedad de adiciones; y preferentemente se hacen, al aminoácido del extremo N en forma de un agente complejante o de conjugación (Z) que luego puede usarse para unir un resto deseado al péptido o para proporcionar marcado. Generalmente, un resto Z tal puede seleccionarse del grupo constituido por quelantes basados en DOTA y DTPA, quelantes basados en NOTA, compuestos de carbonilo, 2-hidrazinonicotinamida (HYNIC), quelantes N4, desferrioxamina, quelantes NxSy, todos opcionalmente complejados con un radioisótopo, tirosina (Tyr) para halogenación, un colorante fluorescente y biotina. Cpa puede también servir de precursor para la tritiación. Por ejemplo, un quelante tal como DTPA, DOTA, HYNIC y P2S2-COOH puede unirse; quelantes preferidos pueden incluir p-NH2-Bz-DOTA (ácido 2-p-aminobencil-1,4,7,10-tetraazaciclododecano1,4,7,10-tetraacético) y DOTA-p-NH2-anilida [mono(p-aminoanilida) de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano1,4,7,10-tetraacético]. Alternativamente, un agente quelante puede ligarse covalentemente al extremo N mediante un ligador adecuado (L), si se desea; ligadores L adecuados incluyen tirosina, lisina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopropiónico, polietilenglicol, ácidos grasos y sus derivados, �-alanina, ácido 5-aminovalérico, sarcosina y ácido glucerónico. Si Tyr aparece en el extremo N, puede radioyodarse o marcarse de otro modo. Grupos acilo que tienen no más de aproximadamente 20 aminoácidos también pueden estar presentes en el extremo N, ya que el residuo del extremo N también puede acilarse, si se desea, con un resto voluminoso sin pérdida de selectividad.

La selectividad para la unión de los péptidos análogos de la invención a SSTR2 se ha demostrado probando su interacción con los cinco receptores de SRIF humanos clonados diferentes como se describe en gran detalle en lo sucesivo. Generalmente, células recombinantes que expresan el receptor se lavan y homogeneízan para preparar un homogeneizado de proteínas en bruto en un tampón adecuado, como se conoce en la técnica. En un ensayo típico, una cantidad de proteína del homogeneizado de células se dispone en un volumen pequeño de un tampón de ensayo apropiado a un pH apropiado. Sustancias candidatas, tales como posibles agonistas y antagonistas de SRIF, se añaden a la mezcla en concentraciones convenientes, y se monitoriza la interacción entre la sustancia candidata y el polipéptido del receptor. Los péptidos de la invención solo se unen sustancialmente fuertemente a SSTR2, y su unión presenta alta afinidad.

Los ensayos de unión a receptor se realizan sobre receptores de SRIF clonados, y se usan ensayos competitivos para generar valores de CI50 que son indicativos de la concentración de un ligando competitivo necesaria para desplazar una concentración de saturación de un ligando diana que se mide del 50% de los sitios de unión.

Según un aspecto de la presente divulgación, un procedimiento de detectar intraoperatoriamente tumores malignos en el cuerpo de un ser humano en tejidos que en condición sana no contienen cantidades sustanciales de SSTR2 comprende (i) administrar a tal ser una composición que comprende, en una cantidad suficiente para la detección por una sonda de detección gamma, un péptido selectivo para SSTR2, péptido que está marcado, por ejemplo, radiactivamente con 99mTc, 161Tb, 90Y, 177Lu, 123I o 125I y (ii) después de permitir que la sustancia activa se una y sea capturada en dichos tumores y después de la eliminación de la sangre de la radioactividad, someter tal ser a una técnica de radiodetección en el área relevante del cuerpo usando una sonda de detección gamma.

Los antagonistas de SRIF de la presente divulgación son altamente selectivos por SSTR2, y se recogen en mayores cantidades que los anteriores agonistas del péptido SRIF que solo eran parcialmente específicos para SSTR2. Y, lo que es más importante, los antagonistas de SRIF se consideran que son útiles en combatir cánceres que expresan SSTR2 usando radioterapia, siendo su éxito directamente dependiente de la cantidad de radiación capturada por un tumor; por tanto, se espera que sean más eficaces que los agonistas conocidos para radioterapia de tumores. Por supuesto, también se considera que son particularmente útiles en escintigrafía para determinar la distribución de células y tejidos que expresan SSTR2 en todo el cuerpo, y el uso de obtención de imágenes externas por barrido radiactivo o por resonancia magnética permite la detección semicuantitativa dentro del cuerpo. Son adicionalmente útiles en bloquear selectivamente ciertos de los efectos farmacológicos que están mediados por SSTR2, habiendo sido determinados los muchos efectos de SRIF durante las 2 últimas décadas.

Más específicamente, se considera que estos antagonistas radiactivos son particularmente útiles para el tratamiento terapéutico de tumores malignos en el cuerpo de un ser humano en tejidos que en condición sana no contienen cantidades sustanciales de SSTR2. Tal antagonista de péptidos selectivos para SSTR2 se administra como una composición que incluye una cantidad eficaz para escintigrafía o para combatir o controlar tumores, y puede marcarse con un isótopo seleccionado del grupo constituido por 186Re, 188Re, 111In, 113mIn, 71As, 90Y, 64Cu, 67Cu,99mTc, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 72Ga, 127Te, 195Pt, 211At, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157 Gd, 159 Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, 111Ag, 124I y 131I.

También se considera que son útiles análogos de SRIF marcados de la invención en ensayos de búsqueda de fármacos para nuevos agentes peptídicos y no peptídicos eficaces que se unirán con alta afinidad a SSTR2 y que pueden ser antagonistas altamente eficaces. Usando un ligando de la invención que es selectivo para el receptor SSTR2 puede obtenerse una actividad inicial para el receptor recombinantemente producido. Luego puede llevarse a cabo un ensayo de unión competitiva con el SSTR2, el ligando marcado y el candidato para determinar su afinidad de unión relativa. Alternativamente, posibles candidatos para inhibidores o modificadores, es decir, antagonistas, de la función del receptor pueden incorporarse directamente en una mezcla de prueba para probar el efecto de tal candidato sobre el receptor. Comparando el grado de actividad del receptor en presencia o ausencia de la sustancia candidata puede entonces obtenerse información referente al efecto de la sustancia candidata sobre la función normal del receptor y así determinar su función como tanto agonista como antagonista en comparación con un análogo selectivo para SSTR2 conocido. Los péptidos SRIF cíclicos descritos en los siguientes ejemplos son antagonistas, y pueden emplearse para mediar en la función normal de SSTR2.

Los péptidos de la presente invención pueden sintetizarse por síntesis en disolución clásica, pero los péptidos amidados se sintetizan preferentemente por técnica en fase sólida, como sobre una resina de metilbenzhidrilamina (MBHA) o una resina de BHA, como es muy conocido en esta materia. Los péptidos que tienen un extremo C carboxilo libre se sintetizan preferentemente como se enseña en la patente de Estados Unidos nº 7.019.109. Los péptidos que tienen un extremo C amidado pueden sintetizarse como se enseña en la patente de Estados Unidos nº

5.874.227. La síntesis en fase sólida se realiza de manera que se añadan escalonadamente aminoácidos en la cadena que empieza en el extremo C en el modo expuesto en cualquiera de aquellas patentes de EE.UU., cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia. Los grupos protectores de las cadenas laterales, que son muy conocidos en la técnica, se incluyen preferentemente como una parte de cualquier aminoácido que tiene una cadena lateral particularmente reactiva, y opcionalmente pueden usarse en el caso de otros tales como Trp, cuando tales aminoácidos se acoplan sobre la cadena que se está formando sobre la resina. Tal síntesis proporciona una resina de péptido intermedia completamente protegida. Generalmente, los grupos protectores se separan y el péptido se escinde del soporte de resina antes de oxidarse para crear un enlace disulfuro entre las cadenas laterales de Cys.

Los análogos de SRIF de la invención son generalmente eficaces a niveles inferiores a 100 microgramos por kilogramo de peso corporal. Para acción prolongada puede desearse usar niveles de dosificación de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5 miligramos por kilogramo de peso corporal. Estos análogos son solubles en agua y así pueden prepararse como disoluciones relativamente concentradas para administración.

Los siguientes ejemplos ilustran la provisión de varios antagonistas del péptido SRIF que plasman diversas características de la invención. En cada péptido, los residuos de cisteína en las posiciones 3 y 14 están unidos por el enlace disulfuro ciclante.

Ejemplo 1

Se sintetiza el análogo de somatostatina DOTA-des-AA1,4,5,6,11,12,13[Cpa2, D-Cys3, Tyr7, D-4Aph(Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2 que tiene la estructura:

Se usa metodología en fase sólida empleando la estrategia de BOC para sintetizar el octapéptido en un modo escalonado sobre una resina de MBHA, generalmente como se describe en el Ejemplo II de la patente 277. Boc-D4Aph(Cbm)-OH se preparó previamente como se ha descrito en una publicación anterior por Jiang y se acopla en la posición 8.

Después de escindir el péptido de la resina y eliminar simultáneamente los grupos protectores de la cadena lateral (excepto Fmoc de Lys) por HF, el péptido se oxidó para crear el puente de disulfuro en 75% de disolución de ácido acético añadiendo un 10 por ciento de disolución de yodo en metanol hasta que la disolución resultante quedó de color naranja, luego agitación durante 40 minutos y extinción con ácido ascórbico. El péptido en bruto se purificó por RP-HPLC preparativa usando un gradiente lineal del 1% de B por aumentos de 1 min desde el % de B inicial (eluyente A = 0,1% de TFA, eluyente B = 60% de CH3CN, 40% de A) a una velocidad de flujo de 100 ml/min. Entonces se acopló DOTA al extremo N como quelante añadiendo DOTA-NHS·3TFA·HPF6 (Macrocyclics, Dallas, TX) (198 mg, ~20 μM) en DMF (1 ml) y N,N'-diisopropiletilamina (DIPEA) (36 μl, ~22 μM) al péptido purificado (32 mg, ~20 μM) en N,N-dimetilformamida seca (DMF, 3,5 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El progreso de la reacción se siguió por HPLC analítica, y el análisis de EM mostró que se había obtenido el producto deseado, DOTA-des-AA1,4,5,6,11,12,13[Cpa2, D-Cys3, Tyr7, D-4Aph (Cbm)8, Lys (Fmoc)9]-SRIF-2Nal-NH2 puro. Después de completarse la reacción, la eliminación del grupo protector Fmoc de la cadena lateral de Lys9 se logró añadiendo 4 ml de una disolución de 20% de piperidina en DMF y esperando 30 minutos. DOTA-desAA1,4,5,6,11,12,13[Cpa2, D-Cys3, Tyr7, D-4Aph (Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2 se desaló por RP-HPLC preparativa usando las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. La pureza del conjugado de DOTA-péptido cíclico final se determinó por CZE analítica. Tuvo el 94% de pureza.

El análisis de EM muestra una masa de [M+H]+ de 1583,72 Da, que se compara muy favorablemente con la masa calculada de 1583,62 Da. El péptido se denomina en lo sucesivo el Péptido nº 1.

Ejemplo 2

La síntesis inicial descrita en el Ejemplo 1 se repite con dos cambios; 4Aph (Cbm) y D-Trp se usan en las posiciones 7 y 8 para proporcionar la resina de octapéptido: resina de des-AA1,4,5,6,11,12,13[Cpa2, D-Cys3, 4Aph(Cbm)7, D-Trp8, Lys (Fmoc)9]-SRIF-2Nal-MBHA.

Después de escindir el péptido de la resina como la amida y eliminar simultáneamente los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos (excepto Fmoc de Lys) por HF, el péptido se oxidó para crear el puente de disulfuro en 75% de disolución de ácido acético añadiendo un 10 por ciento de disolución de yodo en metanol hasta que la disolución resultante quedó de color naranja, luego agitación durante 40 minutos y extinción con ácido ascórbico. El péptido en bruto se purificó por RP-HPLC preparativa usando un gradiente lineal del 1% de B por aumentos de 1 min desde el % de B inicial (eluyente A = 0,1% de TFA, eluyente B = 60% de CH3CN, 40% de A) a una velocidad de flujo de 100 ml/min. Al péptido purificado (34 mg ~24 μM) en N,N-dimetilformamida seca (DMF, 3,5 ml) se añadió DOTA-NHS·3TFA·HPF6 (Macrocyclics, Dallas, TX) (24 mg, 24,2 μM) en DMF (150 μl) y N,N'diisopropiletilamina (DIPEA) (40 μl, 24 μM). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El progreso de la reacción se siguió por HPLC analítica, y después de completarse la reacción, se añadió 1 ml de piperidina a la mezcla de reacción para eliminar el grupo protector Fmoc de la cadena lateral de Lys9 durante 30 minutos produciendo DOTA-des-AA1,4,5,6,11,12,13[Cpa2, D-Cys3, 4Aph(Cbm)7, D-Trp8]-SRIF-2Nal-NH2, que tiene la fórmula:

Este péptido se desaló por RP-HPLC preparativa usando las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Se determinó que la pureza del conjugado de DOTA-péptido cíclico final por CZE era de aproximadamente el 98% de pureza. El análisis de EM muestra una masa de [M+H]+ de 1606,50 Da, que se compara favorablemente con el valor calculado de 1606,64 Da. Se denomina el Péptido nº 2.

Ejemplo 3

La síntesis expuesta en el Ejemplo 1 se repite omitiendo 2Nal en el extremo C y sustituyendo Tyr7 con 4Aph(Hor). Boc-4Aph(Hor)-OH se preparó previamente como se ha descrito en una publicación anterior por G. Jiang, J. Stalewski, y col., (2001). “GnRH antagonists: A new generación of long acting analogues incorporating urea functions at positions 5 and 6”, J. Med. Chem. 44(3): 453-467. La escisión, desprotección, ciclación y purificación del péptido se llevan a cabo como en el Ejemplo 1. El péptido cíclico purificado tiene la fórmula:

Tiene una pureza según CZE de aproximadamente el 98%. Se denomina el Péptido nº 3. El análisis de EM muestra una masa de [M+H]+ de 1525,68 Da, que se compara favorablemente con el valor calculado de 1525,58 Da.

Ejemplo 4

La síntesis expuesta en el Ejemplo 1 se repite con un cambio, en lugar de pCl-Phe en el extremo N se usa pNO2-Phe. La escisión, desprotección, ciclación y purificación del péptido se llevan a cabo como en el Ejemplo 1. El péptido cíclico purificado tiene la fórmula:

Tiene una pureza según CZE de aproximadamente el 98%. Se denomina el Péptido nº 4. El análisis de EM muestra una masa de [M+H]+ de 1594,17 Da, que se compara favorablemente con el valor calculado de 1594,65 Da.

Ejemplo 5

La síntesis inicial descrita en el Ejemplo 1 se repite con un cambio; se usa Aph(Hor) en lugar de Tyr en la posición 7 para proporcionar la resina de octapéptido: resina des-AA1,4,5,6,11,12,13[Cpa2, D-Cys3, 4Aph(Hor)7, D-Aph(Cbm)8, Lys (Fmoc)9]-SRIF-2Nal-MBHA. Entonces, las reacciones se llevan a cabo como se describen en el Ejemplo 2

A-des-AA1,4,5,6,11,12,13[Cpa2, D-Cys3, 4Aph(Hor)7, D-Aph(Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2, que tiene la produciendo DOT fórmula:

Se determinó que la pureza del conjugado de DOTA-péptido cíclico final por CZE analítica era de aproximadamente el 98% de pureza. Se denomina el Péptido nº 5. El análisis de EM muestra una masa de [M+H]+ de 1722,56 Da, que se compara favorablemente con el valor calculado de 1722,65 Da.

Ejemplo 6

La síntesis expuesta en el Ejemplo 5 se repite, sustituyendo 2Nal con D-Tyr en el extremo C. La escisión, desprotección, ciclación y purificación del péptido se llevan a cabo como en el Ejemplo 1. El péptido cíclico purificado tiene la fórmula:

Tiene una pureza según CZE de aproximadamente el 98%. Se denomina el Péptido nº 6. El análisis de EM muestra una masa de [M+H]+ de 1688,83 Da, que se compara favorablemente con el valor calculado de 1688,64 Da.

Ejemplo 7

La síntesis expuesta en el Ejemplo 4 se repite sustituyendo 2Nal con D-Tyr en el extremo C. La escisión, desprotección, ciclación y purificación del péptido se llevan a cabo como en el Ejemplo 1. El péptido cíclico purificado tiene la fórmula:

Tiene una pureza según CZE de aproximadamente el 98%. Se denomina el Péptido nº 7. El análisis de EM muestra una masa de [M+H]+ de 1560,63 Da, que se compara favorablemente con el valor calculado de 1560,83 Da.

Ejemplo 8

La síntesis descrita en el Ejemplo 7 se repite con dos cambios; se usa Idadr en la posición 7 y se usa D-Trp en la posición 8 para proporcionar la resina de octapéptido: resina de des-AA1,4,5,6,11,12,13[pNO2-Phe2, D-Cys3, Idadr7, D-Trp8, Lys (Fmoc)9]-SRIF-D-Tyr-MBHA.

Después de escindir el péptido de la resina como la amida y llevar a cabo las reacciones que se han descrito generalmente en el Ejemplo 2, se obtiene el péptido que tiene la fórmula:

Se determinó que la pureza del conjugado de DOTA-péptido cíclico final por CZE analítica era de aproximadamente el 98% de pureza. Se denomina el Péptido nº 8. El análisis de EM muestra una masa de [M+H]+ de 1667,74 Da, que se compara favorablemente con el valor calculado de 1667,52 Da.

Bioensayo in vitro: Los efectos de los diversos análogos de somatostatina se prueban in vitro para su capacidad para unirse a receptores clonados aislados expresados sobre células CHO-K1 y células CCL39. Células CHO-K1 se cultivan en medio Ham's F-12, y células CCL39 se cultivan en mezcla de medio Eagle modificado por Dulbecco/Ham's F-12 (1:1), complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina, en aire humidificado que contiene 5% de CO2 a 37 ºC.

La clonación molecular de los genes que codifican múltiples subtipos de receptores de somatostatina permite la expresión individual de estos receptores en células de mamífero y la caracterización de sus respectivos perfiles farmacológicos. Cinco de tales subtipos de receptores, llamados SSTR1 a SSTR5, se han clonado y se informan y describen en Raynor y col., Molecular Pharmacology, 43, 838-844 (1993) y en Raynor y col., Molecular Pharmacology, 44, 385-392 (1993). Estas referencias describen ensayos de unión que pueden usarse para determinar si análogos de SRIF particulares se unen selectivamente a uno o más de los 5 tipos de receptores, y también si se unen a tales tipos de receptores con alta o baja afinidad. Debido a que estos tipos de receptores se han caracterizado ahora generalmente con respecto a sus perfiles farmacológicos, el conocimiento de los resultados de tales estudios de unión, junto con el conocimiento de los únicos patrones de distribución de estos receptores en el cuerpo, indican que cada subtipo de receptores puede mediar en efectos fisiológicos distintos, pero solapantes, de SRIF. Como resultado, compuestos que se unen selectivamente a receptores SSTR2, por ejemplo, pueden usarse para modular una función fisiológica particular de SRIF sin tener potencialmente un efecto no deseado resultante de otra función fisiológica de SRIF que está mediada por otros receptores de SRIF.

Las células se lavan dos veces con y se raspan en Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4) frío en hielo, se recogen por centrifugación y se homogeneízan usando un sistema de rotor/estator en el mismo tampón. Después de la centrifugación a 120 g durante 5 min a 4 ºC, el sobrenadante se recoge y se centrifuga de nuevo a 48.000 g durante 30 min a 4 ºC. El sedimento resultante se resuspende en tampón Tris frío en hielo, se transfiere a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga a 20.000 g durante 15 min a 4 ºC. Después de extraerse el sobrenadante, el sedimento de membrana se almacena a -80 ºC.

Se realiza autorradiografía del receptor sobre secciones de Cryostat de 20 μm de espesor de los sedimentos de la membrana, se montan sobre portaobjetos de microscopio y luego se guardan a -20 ºC. Para cada uno de los compuestos probados se realizan experimentos de desplazamiento completo con el ligando de somatostatina universal el radioligando 125I-[Leu8,D-Trp22,Tyr25]-somatostatina 28 que se une con fuerte afinidad a los cinco receptores. Se usan concentraciones crecientes del péptido sin marcar que oscilan de 0,1-1000 nM. La somatostatina-28 sin marcar se ejecuta en paralelo usando las mismas concentraciones crecientes, como control. Los valores de CI50 se calculan después de la cuantificación de los datos usando un sistema de procesamiento de imágenes asistido por ordenador como se conoce en esta técnica. A concentraciones de 100 nM, el Péptido nº 1 tuvo efectos mínimos sobre la unión del radioligando de SRIF-28 a SSTR1, SSTR3, SSTR4 y SSTR5. A diferencia, se unió selectivamente a SSTR2, desplazando la unión del radioligando a SSTR2 humano con un valor de CI50 de aproximadamente 1,8 nM.

Las potencias de ciertos análogos de SRIF para inhibir la unión del radioligando de 125I-[Leu8,D-Trp22,Tyr24]SRIF-28 a los diversos receptores de SRIF humanos clonados se muestran en la siguiente tabla, en la que los valores de CI50 se facilitan en concentración nanomolar. Los números entre paréntesis indican el número de veces que se llevó a cabo la prueba de unión particular.

TABLA

Compuesto: CI50 (nM)

hSSTR1: hSSTR2 hSSTR3 hSSTR4 hSSTR5

Péptido nº 1 406-034-15: >1.000 (2) 1,8 ± 0,2 (3) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 2 363-246-15: >1.000 (3) 9,4 ± 1,6 (3) >1.000 (2) 816 ± 114 (3) >1.000 (3)

Péptido nº 3 363-300-15: >1.000 (2) 230; 219 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 4 406-032-20: >1.000 (2) 1,5 ±0 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 5 363-298-15: >1.000 (2) 1,7 ± 0,3 (3) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 6 406-094-15: >1.000 (2) 0,6 ± 0,05 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 7 406-092-15: >1.000 (2) 0,53 ± 0,06 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 8 406-090-15: >1.000 (2) 1,02 ± 0,88 (2) >1.000 (2) 493 ± 206 (2) >1.000 (2)

Además, todos los péptidos probados informados en la tabla anterior no mostraron internalización significativa en las células mientras que antagonizaban la internalización inducida por octreótidos. Los Péptidos nº 1 y 4 a 8 presentaron muy buenas propiedades de unión y excelentes propiedades de elección de tumores como diana in vivo, concretamente la enorme captación en los tumores sst2 a las 4 h y 24 h, y excelente relación de tumor con respecto a riñón; la captación de tumores puede así bloquearse por péptido frío en exceso.

Los péptidos de la invención no solo proporcionan ligandos más selectivos para la unión a SSTR2, sino que el uso de péptidos marcados, por ejemplo, una versión radiomarcada del Péptido nº 1, facilita la búsqueda de fármacos para antagonistas incluso más eficaces. Los ensayos de búsqueda como son muy conocidos en la técnica, que emplean el polipéptido receptor SSTR2 directamente del huésped recombinante, pueden usarse para identificar agentes útiles en bloquear o imitar ciertos aspectos de la somatostatina según se desee mientras que se eliminan los aspectos no deseables de la hormona que pueden surgir de la activación o bloqueo de otros receptores. A este respecto, si se desea un análogo radioyodado para fines de búsqueda, Tyr puede añadirse al extremo N en lugar de DOTA, o Tyr puede usarse en la posición 2 en lugar de Cpa, o un radioligando adecuado puede unirse por un quelante DOTA. Ensayos de unión competitiva con compuestos candidatos podrían primero llevarse a cabo de este modo con SSTR2 para buscar alta afinidad de unión; luego buscando los receptores de SRIF múltiples podría confirmarse si había o no unión selectiva a solo este receptor, según se desee. Pueden usarse péptidos no radiomarcados de la invención para tratar enfermedades de todos los órganos que se sabe que expresan SSTR2, que incluyen el pulmón, tubo gastrointestinal y riñones.

Debido a que, como se muestra anteriormente, las adiciones al extremo N del análogo de SRIF no parecen afectar adversamente la unión selectiva, debe ser evidente que estos compuestos pueden complejarse con un núclido radiactivo con el fin de que llevar ese agente a un tumor u otro tejido para el que se desea la apoptosis. Por ejemplo, agentes quelantes adecuados tales como DOTA o DTPA u otros pueden usarse para complejar el análogo de SRIF con un metal altamente radiactivo como se indica anteriormente en este documento. Algunos ejemplos de grupos quelantes adecuados para quelar un átomo de metal radiactivo son agentes quelantes tetradentados o grupos derivados de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido ciclohexil-1,2diaminatetraacético (CDTA), ácido etilenglicol-0,0'-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido N,Nbis(hidroxibencil)-etilendiamina-N,N'-diacético (HBED), ácido trietilentetraminahexaacético (TTHA), ácido 1,4,7,10tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA), ácido hidroxietildiaminatriacético (HEDTA), ácido 1,4,8,11tetraazaciclo-tetradecano-N,N',N",N"'-tetraacético (TETA), DTPA sustituido, EDTA sustituido. Otros quelantes, además de agentes radiactivos, se desvelan en los documentos WO 95/22341 y WO 04/082722 y en las publicaciones de patente de EE.UU. 2004/0242842 y 2005/0070470, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia. Quelantes preferidos se derivan de EDTA y DOTA. Algunas sales adecuadas son oxinato de 111In y tartrato de 99mTc, que pueden formarse generalmente en una manera más simple en condiciones que no sean perjudiciales para el antagonista de péptido, y 99mTc(CO)3 puede acoplarse mediante Tyr o un quelante tridentado adecuado.

Si se desea, la solubilidad de los antagonistas de SRIF puede mejorarse por acilación del grupo amino del extremo N usando un compuesto hidrófilo, tal como ácido hidroorótico (Hor) o similares, o mediante reacción con un isocianato adecuado, tal como metilisocianato o isopropilisocianato, para crear un resto urea al extremo N. También pueden ligarse otros agentes al extremo N que aumentarán la duración de la acción del antagonista de SRIF como se conoce en esta técnica.

Estos antagonistas de SRIF o sales no tóxicas de los mismos, combinados con un vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable para formar una composición farmacéutica, pueden administrarse a animales, que incluyen seres humanos y otros mamíferos, tanto intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente, percutáneamente, por ejemplo, intranasalmente, intracerebroespinalmente como por vía oral. Una composición farmacéutica tal diseñada para ser usada para detectar tumores humanos malignos, que incluyen las metástasis de los mismos, en tejidos puede incluir, además de un material de vehículo farmacéuticamente aceptable y un adyuvante farmacéuticamente aceptable opcional, el antagonista de péptido marcado como sustancia activa, en una cantidad suficiente para la obtención de imágenes externas, para la detección por una sonda detectora de gamma o para combatir o controlar tumores. Los antagonistas de péptidos deben tener al menos aproximadamente el 90% de pureza y preferentemente deben tener una pureza de al menos aproximadamente el 98%; sin embargo, purezas inferiores son eficaces y pueden usarse bien con mamíferos distintos de seres humanos. Esta pureza significa que el péptido previsto constituye el % en peso establecido de todos los péptidos similares y fragmentos de péptidos presentes. La administración a seres humanos debe ser bajo la dirección de un médico para combatir tumores y cánceres específicos o para mediar en otras afecciones en la que los receptores SSTR2 ejercen una función de control, tal como acoplando a una tirosina fosfatasa de manera que la estimulación de esta enzima pueda llevarse a cabo para mediar en los efectos antiproliferativos de SRIF. La dosificación requerida variará con la afección particular que está tratándose, con la gravedad de la afección y con la duración del tratamiento deseado.

Se ha determinado recientemente que los tumores frecuentemente expresan varios tipos de receptores de péptidos (Reubi, J. C.; Waser, B. Concomitant expression of several peptide receptors in neuroendocrine tumours: molecular basis for in vivo multireceptor tumour targeting. Eur. J Nucl. Med. Molec. Imaging 2003, 30, 781-793). Tales grupos de múltiples receptores de péptidos pueden incluir receptores de sst2, además de receptores de bombesina, receptores de CCK, receptores de VIP, receptores de GLP-1, receptores de neurotensina, receptores de secretina, receptores de neuromedina B y receptores de CRF, etc. En un caso tal, la administración de antagonistas de SSTR2, en combinación como una mezcla, con uno o más antagonistas radiomarcados para estos diversos receptores debe mejorar muy sustancialmente la elección como diana in vivo de tales tumores.

Tales antagonistas de péptidos se administran frecuentemente en forma de sales no tóxicas farmacéuticamente o veterinariamente aceptables tales como sales de adición de ácido o complejos metálicos, por ejemplo, con cinc, hierro, calcio, bario, magnesio, aluminio o similares. Ilustrativas de tales sales no tóxicas son clorhidrato, bromhidrato, sulfato, fosfato, tanato, oxalato, fumarato, gluconato, alginato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartrato y similares.

También puede desearse la administración de estos antagonistas de SRIF durante periodos de tiempo prolongados, por ejemplo, durante periodos de una semana a un año de una única administración, y pueden utilizarse formas de dosificación de liberación lenta, de liberación prolongada o por implante como es muy conocido en esta técnica. Por ejemplo, una forma de dosificación puede contener una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable del compuesto que tiene un bajo grado de solubilidad en fluidos corporales, por ejemplo, una sal de adición de ácido con un ácido polibásico; una sal con un catión metálico polivalente; o combinación de las dos sales. Una sal relativamente insoluble también puede formularse en un gel, por ejemplo, un gel de estearato de aluminio. Una formulación de liberación prolongada de liberación lenta adecuada para inyección también puede contener un antagonista de SRIF

o una sal del mismo dispersa o encapsulada en un polímero no tóxico o no antigénico de baja degradación tal como un polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. nº

3.773.919.

Cantidades terapéuticamente eficaces de antagonistas de péptidos deben administrarse bajo la orientación de un médico, y composiciones farmacéuticas contendrán normalmente el péptido conjuntamente con un vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable convencional. Una cantidad terapéuticamente eficaz se considera que es una cantidad predeterminada calculada para lograr el efecto deseado. La dosificación requerida variará con el tratamiento particular y con la duración del tratamiento deseado; sin embargo, se tiene previsto que se usen dosificaciones entre aproximadamente 10 microgramos y aproximadamente 1 miligramo por kilogramo de peso corporal por día para tratamiento terapéutico. Puede ser particularmente ventajoso administrar tales compuestos en forma de liberación prolongada o de larga duración como se ha descrito anteriormente. Una cantidad terapéuticamente eficaz es normalmente una cantidad de un antagonista de SRIF que, cuando se administra periféricamente, por ejemplo, intravenosamente, en una composición fisiológicamente aceptable es suficiente para lograr una concentración en plasma del mismo de aproximadamente 0,1 μg/ml a aproximadamente 100 μg/ml, preferentemente de aproximadamente 1 μg/ml a aproximadamente 50 μg/ml, más preferentemente al menos aproximadamente 2 μg/ml y normalmente 5 a 10 μg/ml. En estas cantidades, pueden usarse para afectar deseablemente la secreción gástrica.

Si la composición va a usarse para la obtención de imágenes o tratamientos terapéuticos, la escasa estabilidad en almacén del compuesto radiomarcado y/o la corta semivida del radionúclido puede requerir que el usuario lleve a cabo la reacción de marcado con el radionúclido en el hospital o laboratorio clínico. En tales casos, los diversos componentes de reacción pueden proporcionarse al usuario en forma de un llamado “kit”. Las manipulaciones necesarias para realizar la reacción deseada deben ser tan simples como sea posible para permitir que el usuario prepare la composición marcada radiactiva del kit usando facilidades que normalmente están a disposición de uno mismo. Por consiguiente, un kit para preparar una composición radiofarmacéutica, para detectar y localizar tumores malignos y sus metástasis en tejidos podría comprender (i) un péptido selectivo para SSTR2, un vehículo farmacéuticamente aceptable inerte y/o agente de formulación con adyuvantes opcionales, (ii) una disolución de una sal o quelato de un isótopo de metal radiactivo, e (iii) instrucciones para su uso con una prescripción para hacer reaccionar los componentes presentes en el kit.

Preferentemente, un antagonista de péptidos que va a usarse como componente de tal kit se ha derivatizado por una reacción con un agente quelante como se define anteriormente en este documento. El conjugado de péptido resultante proporciona la posibilidad de unir firmemente el radionúclido de una manera simple. Agentes quelantesadecuados para modificar el péptido se han descrito anteriormente en detalle en este documento. Ácidos di-o poliacéticos que contienen N o sus derivados, tales como los compuestos mencionados anteriormente, han demostrado ser preferentemente adecuados para unir diversos radionúclidos de metales tales como 111In y 113mIn a moléculas de péptido. El kit que va a suministrarse al usuario también puede comprender los otros componentes definidos anteriormente, junto con instrucciones para su uso, mientras que la disolución de una sal o quelato del radionúclido que tiene una estabilidad en almacén limitada puede suministrarse al usuario por separado.

Por ejemplo, un kit para preparar una composición radiofarmacéutica marcada con 99mTc, 186Re o 188Re puede comprender, además de los componentes definidos en (i) y (ii) anteriormente, un agente reductor y, si se desea, un quelante, y (iii) instrucciones para su uso, con una prescripción para hacer reaccionar los componentes del kit con99mTc en forma de una disolución de pertecnetato, o con 186Re o 188Re en forma de una disolución de perrenato. Si se desea, diversos componentes del kit pueden combinarse, siempre que sean compatibles. El kit debe comprender un agente reductor para reducir el pertecnetato o perrenato, por ejemplo, un ditionito, un agente reductor metálico o un agente reductor estabilizante del complejo, por ejemplo, SnCl2, tartrato de Sn (II), fosfonato o pirofosfato de Sn (II), o glucoheptonato de Sn (II). La disolución de pertecnetato o perrenato puede obtenerse simplemente de un vendedor adecuado. Cuando el radionúclido está presente en el propio kit, la reacción formadora de complejos con el péptido puede producirse simplemente combinando los componentes en un medio neutro y haciendo que reaccionen. Para ese fin, el radionúclido puede hacerse reaccionar con el péptido en forma de un quelato unido a un quelante comparativamente débil, como se ha descrito anteriormente en este documento.

Si el kit comprende un péptido derivatizado como se ha definido anteriormente en este documento y está previsto para la preparación de una composición radiofarmacéutica marcada con 99mTc, 186Re o 188Re, el radionúclido se añadirá preferentemente por separado en forma de una disolución de pertecnetato o perrenato. En ese caso, el kit comprenderá un agente reductor adecuado y, si se desea, un quelante, reduciendo el primero el pertecnetato o el perrenato. Como agente reductor puede usarse, por ejemplo, un ditionito o un agente reductor metálico. Los componentes pueden combinarse opcionalmente, siempre que sean compatibles. Un kit monocomponente tal, en el que los componentes combinados están preferentemente liofilizados, es excelentemente adecuado para hacerse reaccionar, por el usuario, con la disolución de radionúclidos. Puede usarse un agente reductor metálico, por ejemplo, Sn (II), Ce (III), Fe (II), Cu (I), Ti (III) o Sb (III); Sn (II). El constituyente de péptido de los kits anteriormente mencionados puede suministrarse como una disolución, por ejemplo, en forma de una solución salina fisiológica, o en alguna disolución de tampón, pero está preferentemente presente en una condición seca, por ejemplo, en la condición liofilizada. Cuando se usa como componente para un líquido de inyección debe ser estéril, en el que, cuando el constituyente está en el estado seco, el usuario debe usar preferentemente una solución salina fisiológica estéril como disolvente. Si se desea, el constituyente anteriormente mencionado puede estabilizarse en el modo convencional con estabilizadores adecuados, por ejemplo, ácido ascórbico, ácido gentísico o sales de estos ácidos.

Aunque la invención se ha descrito con respecto a sus realizaciones preferidas, que constituyen el mejor modo presentemente conocido para los inventores, debe entenderse que diversos cambios y modificaciones que serían obvios para un experto habitual en esta materia pueden hacerse sin apartarse del alcance de la invención que se expone en las reivindicaciones adjuntas a la misma. Aunque las reivindicaciones definen de diversas maneras la invención en términos de una secuencia de péptidos, debe entenderse que está prevista que tal incluya sales no tóxicas de la misma que son muy conocidas por ser el equivalente completo de la misma, y que son las más administradas.

Como se usa en el presente documento, todas las temperaturas son ºC y todas las relaciones son en volumen. Los porcentajes de materiales líquidos también son en volumen.

En las siguientes reivindicaciones se enfatizan diversas características de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido análogo de somatostatina (SRIF) cíclico que se une selectivamente al receptor de SRIF SSTR2, péptido que tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos en las que el extremo C está amidado:

o

en las que Cpa significa cloro-Phe, Aph (Hor) significa 4-[(2,6-dioxo-hexahidro-pirimidina-4-carbonil)-amino]fenilalanina y Aph (Cbm) significa 4-ureido-fenilalanina.
2.

El péptido según la reivindicación 1, en el que unido al Cpa hay un resto (Z) seleccionado del grupo constituido por quelantes basados en DOTA, quelantes basados en DTPA, quelantes basados en NOTA, compuestos de carbonilo, 2-hidrazinonicotinamida, quelantes N4, desferrioxamina y quelantes NxSy.
3.

El péptido según la reivindicación 2, en el que un quelante DOTA está unido covalentemente a Cpa.
4.

Una composición farmacéutica que comprende una mezcla del péptido según la reivindicación 1 y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.