PT2076535E - Antagonistas da somatostatina seletivos do receptor (sstr2) - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ANTAGONISTAS DA SOMATOSTATINA SELETIVOS DO RECEPTOR (SSTR2)

Esta invenção é dirigida a péptidos relacionados com a somatostatina e a métodos para o tratamento farmacêutico de mamiferos utilizando esses péptidos. Mais especificamente, a invenção refere-se a péptidos antagonistas seletivos dos receptores de somatostatina encurtados e à inclusão de substituições de aminoácidos e/ou adições em tais péptidos que conferem seletividade aos mesmos receptores, a composições farmacêuticas que contenham tais péptidos, com tais péptidos conjugados ou complexados com nuclideos radioativos, a métodos de diagnóstico e tratamento terapêutico de doenças neoplásicas e não-neoplásicas de mamiferos, utilizando estes péptidos, em particular os péptidos que são acoplados a agentes quelantes ou de outra forma marcados, e também a métodos para o rastreio de fármacos mais eficazes que utilizem estes péptidos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 tetradecapéptido ciclico de somatostatina-14 (SRIF) foi originalmente isolado a partir do hipotálamo e caracterizado como um inibidor fisiológico da hormona do crescimento (GH) da pituitária anterior. Foi caracterizado por Guillemin et al. e foi descrito na Patente US 3904594. Este tetradecapéptido tem uma ligação em ponte ou ciclização entre os grupos sulfidrilo de dois residuos de aminoácidos de cisteinilo nas posições 3 e 14. O SRIF afecta vários processos celulares e também é conhecida por inibir o crescimento de certos tumores. O análogo [D-Trp8]-SRIF, possuindo a sequência de aminoácidos: (ciclo 3-14) H-Ala-Gli-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr- 1

Ser-Cys-OH, foi divulgado na Patente US 4372884 e indicado como tendo uma potência muitas vezes maior para inibir a libertação de GH do que SRIF. 0 SRIF induz os seus efeitos biológicos através da interação com uma familia de receptores ligados à membrana estruturalmente semelhantes. Cinco receptores de SRIF foram clonados e são referidos como SSTR1-5. Todos os cinco receptores se ligam a SRIF e SRIF-28 com elevada afinidade. Agonistas seletivos em SSTR2 e SSTR5 foram identificados e utilizados para revelar distintas funções destes receptores. Estes dois receptores são acreditados ser os subtipos predominantes em tecidos periféricos. 0 SSTR2 é acreditado mediar a inibição da hormona do crescimento, glucagon e a secreção de ácido gástrico. A Patente US 5846934 descreve análogos que se encontram registados como tendo alguma especificidade para SSTR2. A octreotida, um agonista, mostra alguma especificidade para SSTR2 (ver Yang et al, 1998, PNAS USA 95:10836). Em contraste, o SSTR5 parece estar principalmente envolvidos no controlo da libertação da insulina e da amilase. A Publicação Internacional WO 97/11962 descreve análogos que são indicados como tendo alguma especificidade para SSTR5. O SSTR3 medeia a inibição da contração do músculo liso gástrico. A Patente US 6579967 divulga análogos da somatostatina, que são específicos para SSTR3. O SSTR4 é encontrado na hipófise, pulmões, trato gastrointestinal, rins, e em certos tumores com a exclusão substancial de outros receptores de SRIF; acredita-se ser ativado pela ligação de SRIF. A publicação de patente US n° 2002/0137676 descreve métodos para o tratamento das células endoteliais utilizando ligandos de receptores seletivos de somatostatina que são específicos tanto para SSTR1 ou 2 e 7019109 SSTR4. As Patentes US 5750499 e 7019109 divulgam os análogos peptídicos da somatostatina que são seletivos para SSTR1. A publicação de Patente US n° 2005/0245438 divulga receptores seletivos análogos peptidicos de somatostatina que são específicos para SSTR4. Estes resultados em conjunto indicam que diferentes subtipos de receptores medeiam as funções distintas de SRIF no corpo. A WO 98/24807 revela uma série de antagonistas ciclicos e refere que os antagonistas da somatostatina podem atuar através do subtipo do receptor de SSTR-2. Ginj et al. (2006, USA PNAS 103:16436) refere-se a receptores radiomarcadores de somatostatina.

Os receptores de somatostatina são expressos em estados patológicos, em particular em tumores neuroendócrinos do trato gastrointestinal. A maioria dos tumores humanos provenientes do tecido alvo da somatostatina conserva os seus receptores de somatostatina. Foi observado pela primeira vez em adenomas produtores da hormona do crescimento e em adenomas produtores de TSH; cerca de metade dos adenomas endócrinos inativos exibem receptores de somatostatina. Noventa por cento dos carcinóides e uma maioria dos carcinomas de células das ilhotas, incluindo as suas metástases, têm geralmente uma elevada densidade de receptores de somatostatina. No entanto, apenas 10 por cento dos carcinomas colorretais e nenhum dos carcinomas do pâncreas exócrino contêm receptores de somatostatina. Os receptores de somatostatina em tumores podem ser identificados utilizando métodos de ligação in vitro ou utilizando técnicas de imagiologia in vivo; esta última permite a localização precisa dos tumores e das suas metástases nos pacientes. Na medida em que, os receptores 3 de somatostatina em tumores gastroenteropancreáticos são funcionais, a sua identificação pode ser utilizada para avaliar a eficácia terapêutica de um análogo para inibir a libertação da hormona em excesso nos pacientes.

Seria vantajoso ter antagonistas peptidicos da somatostatina que se ligam fortemente ao SSTR2, enquanto ao mesmo tempo exibem apenas propensão minima para a ligação com os outros quatro receptores. Assim, a pesquisa por tais antagonistas peptidicos de somatostatina tem continuado, os quais são altamente seletivos para SSTR2, mas não estão internalizados nas células.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Certas alterações foram agora descobertas, que são eficazes para criar análogos peptidicos de SRIF que são seletivos para SSTR2 em contraste com os outros receptores de SRIF clonados. Foi descoberta uma classe de análogos peptidicos de somatostatina, que são altamente seletivos para SSTR2, que são antagonistas da somatostatina, e que, embora não estejam internalizados em células possuem receptores SSTR2, e são absorvidos em quantidades que são surpreendentemente maior do que os péptidos receptores de somatostatina seletivos agonistas comparáveis. Os peptideos resultantes ligam seletivamente ao SSTR2 clonado sem ativar o receptor, e esses peptideos análogos, quando iodados ou radiomarcados, vão manter as suas desejáveis propriedades biológicas. Assim, estes novos péptidos são úteis na determinação da localização do tecido celular e expressão do receptor de SSTR2, bem como na regulação de certas funções farmacológicas sem alguns efeitos secundários que acompanham a administração até aqui caracteristicos do SRIF. Estes antagonistas peptidicos SRIF, quando 4 radiomarcados, podem ser usados em cintigrafia, a fim de localizar, ou seja, localizar, os tumores que expressam esses receptores, quer in vitro ou in vivo, utilizando SPECT ou PET; outros rótulos bem conhecidos nesta técnica, por exemplo, etiquetas fluorescentes, podem ser usados como alternativa. Quando incluem um radionuclideo quelatado apropriado tal como é conhecido na técnica, estes análogos podem servir como radiofármacos, que são adequados para a terapia de radionuclideo no tratamento desses tumores.

Os antagonistas peptidicos SRIF da invenção inibem a ligação de 125I-[Tyr11] SRIF e 122I-[Leu8, D-Trp22, Tyr25]SRIF-28 para o receptor humano clonado SSTR2, mas não se ligam fortemente a SSTR1, SSTR3, SSTR4 ou SSTR5. Assim, os antagonistas não marcados podem ser administrados terapeuticamente para bloquear o funcionamento desse receptor. Estes antagonistas SRIF, ao qual 99mTc, 1:L1In, 68Ga ou 90Y, por exemplo, tem sido acompanhados por um agente quelante, tal como DOTA ou DTPA (ou a que um outro agente de complexação/conjugante é ligada ao terminal N para a finalidade de fixar uma porção útil para fins de diagnóstico ou terapêutica), não se ligam significativamente ao SSTR1, 3, 4 ou 5, mas continuam a ligar de forma potente e saturável a SSTR2.

Antagonistas SRIF preferidos não só se ligam seletivamente ao SSTR2, mas ligam-se com alta afinidade aos mesmos. Por ligação seletiva entende-se que exibem um KD ou um IC50 com SSTR2, que é de cerca de um centésimo ou menos, com respeito a todos os quatro outros receptores. Os análogos preferidos serão pelo menos cerca de 200 vezes mais seletivos para SSTR2 do que para qualquer outro receptor 5 SRIF, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 500 vezes mais seletivos.

Estes análogos SRIF podem, também, ser prontamente marcados e, assim, utilizados de forma eficaz no rastreio de fármacos, imagiologia, diagnóstico e terapêutica de radionuclideos. Por exemplo, estes análogos que transportam marcadores detectáveis são úteis na localização de tais receptores no corpo e no diagnóstico dos locais de tumores, particularmente tumores neuroendócrinos. Como agentes terapêuticos radionuclideos, são considerados como sendo particularmente úteis no combate de tumores que expressam os receptores SSTR2; além disso, são capazes de fazer isso sem os efeitos colaterais, ou seja, sem destruir uma parte substancial do tecido vizinho, como resultado de interagirem com uma pluralidade de receptores SRIF.

Num aspecto particular, a descrição providencia um antagonista de péptido cíclico de somatostatina (SRIF) que se liga seletivamente ao receptor SRIF SSTR2 sem provocar a internalização para uma célula, que compreende o péptido de sequência de aminoácidos (ciclo3-14) Xaai_Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaaio-Xaan-Xaai2-Xaai3-Xaai4-Xaai5 em que Xaai é des-Xaa, Xaa2 é Trp (A) , Phe (B) , Nal ou Tyr, onde A é H, Cl, F, Br, Me, NO2, OMe ou N-formilo e B é H, halogénio, CH3, NO2 ou OCH3; D-Xaa3 é D-Cys, D-Pen, D-HCys ou outro isómero D de α aminoácido tendo uma cadeia lateral SH, Xaa4, Xaa5 e Xaa6 são des-Xaa, Xaa7 é Aph (Qi) , Tyr (X) , Ala (tienilo) ou Trp (A) em que Qi é Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-CBM, OEt-Cbm, CBM-Et (OEt)2 ou Hor e X é H ou halogénio; Xaa8 é D-Trp (A) , Trp (A), Tyr, D-Tyr, Phe (B), D-Phe-(B) , L ou D-BzlHis, L ou D-(DNP)His, L ou D-Aph (Cbm) ; Xaa9 é Lys, NaMelys, hLys, NaMehLys, Orn ou NaMeOrn; 6

Xaaio é Thr, Ser ou Vai; Xaan, Xaai2 e Xaai3 são des-Xaa; Xaai4 é Cys, Pen, hCys ou outro isómero L do α aminoácido possuindo uma cadeia lateral de SH; e Xaai5 é 2Nal, D-2Nal, Aph (Q2) , D-Aph (Q2) , (Ri) Cha (Ri) D-Cha, (Ri) Leu, (Ri) D-Leu, Tyr, D-Tyr, Trp, D-Trp ou des-Xaa; onde Ri é H ou C01 Me, e Q2 é Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-Cbm ou OEt-Cbm. Uma porção contendo o agente quelante pode estar acoplado ao terminal N tal como é conhecido na técnica. Alternativamente, uma porção contendo o agente quelante pode ser complexada (por exemplo no sistema de biotina-avidina) para o seu complemento no N-terminal do péptido.

Num aspecto mais particular, a descrição providencia um peptideo ciclico análogo de somatostatina (SRIF) que se liga seletivamente ao receptor SRIF SSTR2, cujo péptido compreende a sequência de aminoácidos Ciclo (3-14)Xaai-Xaa2-D-Cys-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaaio-Xaan-Xaai2-Xaai3-Cys-Xaai5-NH2 em que Xaai é des-Xaa; Xaa2 é cloro ou nitro Phe; Xaa4, Xaas e Xaa6 sãoo des-Xaa; Xaa7 é Aph (Hor) , Tyr ou ITyr; Xaas é D-Aph (Cbm) ou D-Trp; Xaag é Lys, Orn, hLys, N^elys ou NaMeOrn; Xaaio é Thr; Xaan, Xaai2 e Xaai3 são des-Xaa; e Xaai5 é 2Nal ou D-Tyr.

Num aspecto mais particular, a invenção proporciona péptido ciclico de somatostatina (SRIF), tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3 e uma composição farmacêutica compreendendo um péptido de acordo com a reivindicação 1.

Num outro aspecto, a descrição providencia um método de imagem externa de tecido no corpo de um ser humano, que expressa SSTR2, compreendendo: (i) a administração a um ser 7 humano, numa quantidade suficiente para imagiologia externa, de uma composição compreendendo um péptido antagonista SRIF que é seletivo para SSTR2 em contraste com os outros receptores de SRIF clonados e que se liga com elevada afinidade ao receptor humano clonado SSTR2 mas não ativa o receptor, tendo o dito péptido antagonista SRIF um marcador detectável, e (ii) submeter o ser humano a imagem externa.

Num aspecto ainda mais especifico, a descrição providencia um método de irradiação de tecido neoplásico no corpo de um ser humano, que expressa SSTR2, compreendendo: (i) a administração a um ser humano, numa quantidade suficiente para irradiar o tecido neoplásico, de uma composição compreendendo um peptideo antagonista SRIF que é seletivo para SSTR2 em contraste com os outros receptores SRIF clonados e que se liga com elevada afinidade ao receptor do SSTR2 humano clonado, mas não ativa o receptor, tendo o dito péptido antagonista SRIF um marcador radioativo, e (ii) permitindo que o péptido antagonista SRIF se ligue ao tecido neoplásico.

Num outro aspecto particular, a descrição providencia um método de detecção, no corpo de um ser humano, de tumores e suas metástases possuindo SSTR2 nos tecidos, que não contenham quantidades substanciais de SSTR2 quando na condição saudável ou em condições não neoplásicas de inflamação crónica, método esse que compreende (i) a administração ao referido ser humano, numa quantidade suficiente para imagiologia externa, de uma composição compreendendo um péptido de acordo com a reivindicação 1, sendo o referido péptido marcado com (a) , um isótopo de metal radioativo, que está ligado através de um agente 8 quelante adequado ou (b) um átomo de metal paramagnético ou marcado com um isótopo radioativo de halogénio, e, posteriormente, (i i) sujeição do referido ser humano a imagiologia externa, por varrimento radioativo ou por ressonância magnética, para determinar os locais-alvo no corpo desea último em relação à atividade de fundo, a fim de permitir a detecção e localização semi-quantitativamente dos ditos tumores no corpo. A presente descrição proporciona adicionalmente um método de rastreio para ligandos que são altamente seletivos para SSTR2 usando um modelo farmacofórico que tem como premissa um padrão de caracteristicas de ligandos que são determinados serem necessários para a ligação seletiva. Tal método pode compreender a execução de um ensaio de ligação competitiva com um receptor SSTR2, um ligando de acordo com a presente invenção, e um antagonista candidato, em que o referido ligando tem um marcador detectável apropriado, determinando a capacidade do antagonista candidato para deslocar o ligando marcado; e testando o referido antagonista candidato para a sua capacidade para antagonizar uma atividade associada com SRIF.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERENCIAIS

As abreviaturas padrão de três letras identificam os resíduos de alfa-aminoácidos, e em que o resíduo de aminoácido tem formas isoméricas, é a forma L do aminoácido que é representada a menos que expressamente indicado de outra forma, por exemplo, Ser = L-serina. Por L ou D entende-se ambos os isómeros D e L de um determinado a-aminoácido. Quando é feita a seguir referência a uma posição do péptido, tal pretende referir-se à posição 9 correspondente do residuo-14 nativo do péptido de somatostatina (SRIF).

Os antagonistas peptidicos SRIF são fornecidos com uma afinidade seletiva para o receptor SRIF SSTR2; têm de preferência também uma alta afinidade para SSTR2, ou seja, igual a um KD de cerca de 10 nanomolares ou menos. Estes péptidos compreendem análogos ciclicos de SRIF mais curtos, onde a porção de anel é encurtada para apenas 6 residuos, e onde há um residuo no terminal N e de preferência um residuo também é adicionado ao terminal C. Em outras palavras, os residuos na posição 1, 4, 5, 6, 11, 12 e 13 são excluídos do residuo-14 nativo SRIF, criando heptapéptidos, e de preferência um residuo (isto é, o residuo 15) está também adicionado no terminal C, o qual cria um octapéptido.

Exemplos representativos de antagonistas de péptidos que exibem a especificidade desejada para SSTR2 são fornecidos através da seguinte sequência de aminoácidos, a qual é baseada num sistema de numeração de acordo com a sequência de residuos 14 do mamífero nativo SRIF, em que os resíduos nas posições 1, 4-6 e 11-13 são, de preferência eliminados: (ciclo3-14) Xaai-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa4-Xaaio-Xaan_Xaai2-Xaai3-Xaai4-Xaai5 em que Xaai é des-Xaa; Xaa2 é Trp (A) , Phe (B) , Nal ou Tyr, onde A é H, Cl, F, Br, Me, N02, OMe ou N-formilo e B é H, halogénio, CH3, N02 ou OCH3; D-Xaa3 é D-Cys, D-Pen, D-HCys ou outro isómero D de a- aminoácido tendo uma cadeia lateral SH; Xaa^ Xaas e Xaa3 são des-Xaa; Xaa7 é Aph (Qi) , Ala (tienilo), Tyr (X) ou Trp (A) em que Qi é Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-CBM, OEt-Cbm, CBM-Et (OEt)2 ou Hor e X é H ou halogénio; Xaag é D-Trp (A) , Trp (A) , Tyr, D-Tyr, Phe (B) , D-Phe- (B) , L ou D- 10

BzlHis, L ou D-(DNP)His, L ou D-Aph(Cbm); Xaa9 é Lys, N“ Melys, hLys, N“MehLys, Orn ou N“MeOrn; Xaaio é Thr, Ser ou Vai; Xaa3i, Xaai2 e Xaai3 sao des—Xaa; Xaa34 e Cys, Pen, hCys ou outro isómero L do α-aminoácido possuindo uma cadeia lateral SH; e Xaais é 2Nal, D-2Nal, Aph (Q2) , D-Aph (Q2) , (Ri)Cha, (Ri)D-Cha, (Ri) i Leu, (Ri)D-Leu, Tyr, D- Tyr, Trp, D- Trp ou des-Xaa; em que Ri é H ou C“Me, e Q2 é Cbm, OH-Cbm, CH3-Cbm, OCH3-Cbm ou OEt-Cbm. Tyr na posição 2 pode ser radioiodado, ou um complexante, a conjugação ou o agente quelante pode ser ligado diretamente ou através de um ligante ao grupo α-amino do residuo N-terminal de qualquer destes análogos de péptidos que é capaz de ligar um mesmo nuclideo radioativo. Por exemplo, um quelante macrociclico, tal como DOTA, pode ser adicionado ao terminal-N, quer juntando-se diretamente a Xaa2 ou indiretamente usando um ligante, tal como GABA (ácido gama-aminobutirico, ver, por exemplo, a Patente US 6022523) ou 3Ala.

Um subgénero preferido de análogos SRIF compreende a sequência de aminoácidos: (ciclo 3-14) Xaai-Xaa2~D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Lys-Thr-Xaan-Xaai2-Xaai3-Cys em que Xaa2 é Phe substituído; D-Xaa3 é D-Cys; Xaa7 é Aph (Qi) , Tyr ou ITyr; e Xaag é D-Trp ou D-Aph (Cbm) . Deve entender-se que os restantes grupos Xaa são tal como definidos anteriormente, sempre que não são especificados.

Geralmente, para os fins deste pedido, a referência a Trp e D-Trp na descrição, excepto num exemplo especifico, deve ser entendida incluir o resíduo não substituído, bem como um resíduo em que uma única substituição por hidrogénio é feita em ambas as posição 5 ou 6 em Trp, e com tais substituintes a serem selecionados de entre cloro, flúor, bromo, metilo, nitro e metoxi, com cloro, bromo e flúor 11 sendo preferidos, ou com formilo substituindo o hidrogénio de indole N. Por Nal entende-se o isómero da alanina que é substituído por naftilo no átomo de β-carbono, com a ligação de naftaleno sendo, de preferência, na posição 2 do anel, ou, opcionalmente, na posição 1. Por Aph entende-se aminofenilalanina, onde o grupo amino é de preferência ligado na posição 4 do anel fenilo, mas a ligação na posição 2 ou 3 é geralmente equivalente. Por Aph (Cbm) entende-se -4-ureido-fenilalanina. Por Aph (OH-Cbm) entende-se 4-(3-hidroxi)-ureido-fenilalanina. Por Aph (CHsCbm) entende-se 4-(3-metil)-ureido-fenilalanina. Por Aph (OCH3-Cbm) entende-se 4-(3-metoxi)-ureido-fenilalanina. Por Aph [ (EtO)2Et-Cbm] entende-se 4-{3-[2-(2-etoxi-etoxi)-etil]-ureido}-fenilalanina. Por ITyr entende-se L-tirosina iodada, por exemplo, 3-iodo-Tyr. Por Cpa entende-se cloro-Phe e, de preferência 4CIPhe. Por Aph (Hor) entende-se 4-[(2,6-dioxo-hexa-hidro-pirimidina-4-carbonil)-amino]-fenilalanina. Por SRIF entende-se o resíduo 14 do péptido cíclico de somatostatina. Por Cha entende-se ciclohexilalanina, e por Pen entende-se penicilamina (β mercapto-valina). Por hLys ou hCys entende-se o a-aminoácido com um grupo CH2 adicional na cadeia lateral. 0 C-terminal está geralmente amidado, embora um equivalente, por exemplo, Gly-OH, pode ser usado. 0 N-terminal pode ser modificado de diversas formas sem afectar significativamente de modo adverso a afinidade de ligação, cujas modificações nesses péptidos cíclicos são consideradas serem incluídas como uma parte dos péptidos da invenção em geral. Por exemplo, podem ser feitas uma variedade de adições; e de preferência são feitas, para o aminoácido N-terminal na forma de um agente (Z) de complexação ou de conjugação, que podem ser usados para 12 unir uma porção desejada do péptido ou para fornecer marcação. Geralmente uma tal porção Z pode ser selecionada de entre o grupo consistindo de agentes quelantes baseados em DOTA e DTPA, quelantes à base de NOTA, compostos de carbonilo, 2-hidrazino nicotinamida (HYNIC), quelantes N-4, desferrioxamina, quelantes NxSy, todos complexados opcionalmente com um radioisótopo, Tirosina (Tyr) para halogenação, um pigmento fluorescente e biotina. Cpa também pode servir como um precursor para tritiação. Por exemplo, pode ser anexado um agente quelante, tal como DTPA, DOTA, HYNIC e P2S2-COOH; quelantes preferidos podem incluir p-NH2-Bz-DOTA (2-p-aminobenzil-l,4,7,10-azaciclododecano-1,4,7,10- ácido tetra-acético), e DOTA-p-NH2-anilida [1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-l,4,7,10-tetracético mono (p-aminoanilida)]. Alternativamente, um agente quelante pode ser ligado covalentemente à extremidade N-terminal através de um ligante adequado (L), se desejado; ligantes L adequados incluem tirosina, lisina, ácido diaminobutirico, ácido diaminopropiónico, polietilenoglicol, ácidos gordos e seus derivados, β-alanina, ácido 5-amino-valérico, sarcosina e ácido glucerónico. Quando Tyr aparece no terminal-N, pode ser radioiodado ou marcado. Grupos acilo com não mais do que cerca de 20 aminoácidos podem também estar presentes na extremidade N-terminal, como o residuo do terminal N também pode ser acilado, se desejado, com uma porção volumosa, sem a perda de seletividade. A seletividade para a ligação dos péptidos análogos da invenção para SSTR2 foi demonstrada testando a sua interação com os cinco receptores clonados humanos diferentes SRIF como descrito em grande detalhe a seguir. Geralmente, as células recombinantes que expressam o receptor são lavados e homogeneizadas para preparar um 13 homogenato de proteína bruta num tampão adequado, tal como conhecido na técnica. Num ensaio típico, uma quantidade de proteína a partir do homogenato celular é colocada num pequeno volume de um tampão de ensaio adequado a um pH apropriado. Substâncias candidatas, tais como potenciais agonistas e antagonistas SRIF, são adicionados à mistura, em concentrações convenientes, e a interação entre a substância candidata e o polipéptido receptor é monitorizada. Os péptidos da invenção ligam-se fortemente substancialmente apenas a SSTR2, e as suas ligações exibem alta afinidade.

Os ensaios de ligação do receptor são realizadas em receptores clonados SRIF, e ensaios competitivos são utilizados para gerar valores de IC50, que são indicativos da concentração de um ligando competitivo necessário para deslocar uma concentração de saturação de um ligando-alvo a ser medido a partir de 50% dos sítios de ligação.

De acordo com um aspecto da presente descrição, um método de detecção intra-operatório de tumores malignos no corpo de um ser humano, em que os tecidos em condições saudáveis não contêm quantidades substanciais de SSTR2 compreende (i) a administração a tal ser humano de uma composição que compreende, numa quantidade suficiente para uma detecção com uma sonda de detecção gama, de um péptido SSTR2 seletivo, cujo péptido é marcado, por exemplo, radioactivamente com 99mTc, 161Tb, 90Y, 177Lu, 123I ou 125I e (ii) depois permitir que a substância ativa a ser ligada e levada aos referidos tumores e depois da depuração da radioatividade do sangue, sujeitá-la como sendo uma técnica de radiodetecção na área relevante do corpo, usando uma sonda de detecção gama. 14

Os antagonistas SRIF da presente divulgação são altamente seletivos para SSTR2, e são absorvidos em quantidades maiores do que os agonistas peptídicos SRIF anteriores, que eram apenas parcialmente específicos para SSTR2. Mais importante ainda, os antagonistas do SRIF são considerados úteis no combate de cancros que expressam SSTR2 utilizando radioterapia onde o êxito qual está diretamente dependente da quantidade de radiação feita num tumor; assim, espera-se que seja mais eficaz do que os agonistas conhecidos para radioterapia de tumores. É claro que também são considerados como sendo particularmente úteis em cintigrafia para determinar a distribuição de células e tecidos que expressam SSTR2 por todo o corpo, e a utilização de imagiologia por varrimento radioativo externo ou por ressonância magnética permite a detecção semiquantitativa dentro do corpo. São ainda úteis em bloquear seletivamente alguns dos efeitos farmacológicos que são mediados por SSTR2, tendo muitos efeitos do SRIF sido determinados durante as duas passadas décadas.

Mais especificamente, estes antagonistas radioativos são considerados particularmente úteis para o tratamento terapêutico de tumores malignos no corpo de um ser humano, em que os tecidos em condições saudáveis não contêm quantidades substanciais de SSTR2. Tal antagonista do péptido SSTR2 seletivo é administrado numa composição que inclui uma quantidade eficaz para a cintigrafia ou para combater ou controlar os tumores, e que pode ser marcado com um isótopo selecionado entre o grupo que consiste em 186Re, 188Re, inIn, 113mIn, 71As 90 Y t x t 64Cu, 67Cu, 99mTc, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 66Ga, 68Ga, 72Ga, 127Te, 195Pt, 211At, 198Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, U1Ag, 124I e 131 j 15 SRIF marcados análogos da invenção também são considerados como úteis em ensaios de despistagem de fármacos para triagem de novos péptidos eficazes e agentes não-peptídicos que se ligam com elevada afinidade aos SSTR2 e que podem ser antagonistas altamente eficazes. Usando um ligando da invenção, que é seletivo para o receptor SSTR2, pode-se obter uma atividade de linha de base para o receptor produzido de forma recombinante. Um ensaio de ligação competitiva com o SSTR2, o ligando marcado e o candidato pode então ser realizado para determinar a sua afinidade de ligação relativa. Alternativamente, os candidatos potenciais para os inibidores ou modificadores, ou seja, os antagonistas da função do receptor, podem ser incorporados diretamente na mistura de teste para testar o efeito de tal candidato sobre o receptor. Ao comparar a extensão da atividade do receptor na presença ou ausência da substância candidata, pode-se então obter informação sobre o efeito da substância candidata sobre a função normal do receptor e, assim, determinar a sua função tanto como um agonista ou um antagonista em relação ao um análogo SSTR2 seletivo conhecidos. Os péptidos cíclicos SRIF descritos nos Exemplos seguintes são antagonistas, e eles podem ser utilizados para mediar a função normal do SSTR2.

Os péptidos da presente invenção podem ser sintetizados por solução de síntese clássica, mas os péptidos amidados são, de preferência sintetizados por técnica de fase sólida, tal como numa resina de metilbenzidrilamina (MBHA) ou uma resina de BHA, como é bem conhecido nesta técnica. Péptidos possuindo um grupo carboxilo livre C-terminal são sintetizados de preferência, como ensinado na Patente US 7019109. Péptidos possuindo um C-terminal amidado podem ser sintetizados tal como descrito na Patente US 5874227. 16 Síntese em fase sólida é conduzida de forma a adicionar passo a passo os aminoácidos na cadeia, começando no C-terminal no modo estabelecido em qualquer das patentes US, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. Os grupos protetores de cadeia lateral, os quais são bem conhecidos na técnica, são incluídos de preferência como parte de qualquer aminoácido que tenha uma cadeia lateral particularmente reativa e, opcionalmente, podem ser utilizados no caso de outros, como Trp, quando tais aminoácidos são acoplados na cadeia a ser construída sobre a resina. Esta síntese proporciona um péptido-resina intermediário completamente protegido. Geralmente, os grupos protetores são separados e o péptido é clivado do suporte de resina, antes da oxidação para criar uma ligação dissulfureto entre as cadeias laterais de Cys.

Os análogos de SRIF da invenção são geralmente eficazes a níveis inferiores a 100 microgramas por quilograma de peso corporal. Para ação prolongada, pode ser desejável a utilização de níveis de dosagem de cerca de 0,1 a cerca de 2,5 miligramas por quilograma de peso corporal. Estes análogos são solúveis em água e, assim, podem ser preparados como soluções relativamente concentradas para administração.

Os seguintes Exemplos ilustram a disposição de uma série de antagonistas de péptidos SRIF incorporando várias características da invenção. Em cada peptídeo, os resíduos de cisteína nas posições 3 e 14 estão unidos por ligação de dissulfureto de ciclização. 17

Exemplo 1 0 análogo de somatostatina DOTA-des-AA1,4,5,6'11,12,13 [Cpa 2, D-Cys3, Tyr7, D-4Aph (Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2 possuindo a estrutura: (cyclo 3-14)DOTA-Cpa-D~Cp;-Tyr- D-4Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-2Nal-NH2 é sintetizado. Metodologia de fase sólida utilizando a estratégia de BOC é usada para sintetizar o octapéptido de uma forma passo a passo numa resina MBHA, como geralmente descrito no Exemplo II da patente '277. Boc-D-4Aph(Cbm)-OH foi previamente feito como descrito numa publicação anterior por Jiang e acoplado na posição 8.

Após a clivagem do péptido da resina e remoção simultaneamente dos grupos protetores da cadeia lateral (excepto Fmoc de Lys) por HF, o péptido foi oxidado para criar a ponte de dissulfureto em solução a 75% de ácido acético por adição de uma solução a 10 por cento de iodo em metanol até a solução resultante ficar cor de laranja, em seguida, agitada por 40 minutos e resfriada com ácido ascórbico. O péptido em bruto foi purificado por RP-HPLC preparativa, utilizando um gradiente linear de 1% de B por 1 min aumentado da linha de base %B (Eluente A = 0,1% de TFA, eluente B = 60% CH3CN, 40% de A) , a uma taxa de fluxo de 100 ml/min. DOTA foi então acoplado ao terminal-N, como um quelante por adição de DOTA-NHS.3TFA.HPF6 (Macrocyclics, Dallas, TX) (198 mg, ~20 μΜ) em DMF (1 ml) e N,N'-diisopropiletilamina (DIPEA) (36 μΐ, -22 μΜ) do péptido purificado (32 mg, ~20 μΜ) em N, N-dimetilformamida seca (DMF, 3,5 ml). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. O progresso da reação foi seguido por HPLC 18 analítica, análise MS mostrando que o produto desejado, puro DOTA-des-AA1'4'5'6'11'12'13 [Cpa2, D-Cys3, Tyr7, D-4Aph(Cbm)8, Lys (Fmoc) 9]-SRIF-2Nal-NH2, tinha sido obtido. Após a conclusão da reação, a remoção do grupo protetor Fmoc a partir da cadeia lateral de Lys9 foi obtida pela adição de 4 ml de uma solução de 20% de piperidina em DMF e espera de 30 minutos. DOTA-des-AA1,4'5'6'11,12'13 [Cpa2, D-Cys3, Tyr7, D-4Aph (Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2 foi dessalinizada por RP-HPLC preparativa utilizando as mesmas condições que as descritas acima. A pureza do péptido conjugado cíclico final DOTA foi determinada por CZE analítica. Foi de 94% de pureza. A análise MS mostra uma [M+H]+ de massa de 1583, 72 Da, que se compara muito favoravelmente com a massa calculada de 1583,62 Da. O péptido é em seguida referido como péptido n° 1.

Exemplo 2 A primeira síntese descrita no Exemplo 1 é repetida com duas mudanças; 4Aph(Cbm) e D-Trp são utilizados nas posições 7 e 8 para fornecer o octapéptido-resina: resina des-AA1'4'5'6'11'12'13 [Cpa2, D-Cys3' 4Aph(Cbm)7, D-Trp8' Lys (Fmoc)9] -SRIF-2Nal-MBHA.

Após clivagem do péptido a partir da resina como a amida e a remoção simultânea dos grupos protetores das cadeias laterais dos aminoácidos (com exceção de Fmoc de Lys) por HF, o péptido foi oxidado para criar a ponte de dissulfureto em solução a 75% de ácido acético, adicionando uma solução a 10 por cento de iodo em metanol até a solução resultante ficar de cor laranja, em seguida, agitada 19

durante 40 minutos e desativada com ácido ascórbico. O péptido em bruto foi purificado por RP-HPLC preparativa, utilizando um gradiente linear de 1% de B por 1 min aumentado da linha de base %B (Eluente A = 0,1% de TFA, eluente B = 60% CH3CN, 40% de A) , a uma taxa de fluxo de 100 ml/min. Para o péptido purificado (34 mg, ~24 μΜ) em N,N-dimetilformamida (DMF, 3,5 ml) adicionou-se DOTA-NHS.3TFA.HPF6 (Macrocyclics, Dallas, TX) (24 mg, 24,2 μΜ) em DMF (150 μΐ) e N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) (40 μΐ, 24 μΜ). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. O progresso da reação foi seguido por HPLC analítica, e depois de se completar a reação, adicionou-se 1 ml de piperidina à mistura de reação para remover o grupo protetor Fmoc da cadeia lateral Lys9, durante 30 minutos, resultando em DOTA-des-AA1'4'5'6,11,12'13 [Cpa2, D-Cys3, 4Aph(Cbm)7, D-Trp8] -SRIF-2Nal-NH2, que tem a fórmula: (cyclo 3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-4 Aph(Cbm)-D-T rp-Lys-Thr-Cys~2Nal- nh2.

Este péptido foi dessalinizado por RP-HPLC preparativa utilizando as mesmas condições como descrito acima. A pureza do péptido conjugado cíclico final DOTA foi determinada por CZE analítico para ser cerca de 98% puro. A análise MS mostra uma [M+H]+ de massa de 1606,50 Da, que se compara favoravelmente com o valor calculado de 1606,64 Da. O péptido é referido como péptido n° 2.

Exemplo 3 A síntese descrita no Exemplo 1 é repetida omitindo 2Nal no terminal C e substituindo 4Aph(Hor) por Tyr7. Boc-4Aph (Hor)-OH foi previamente produzida como descrito numa publicação anterior por G. Jiang, J. Stalewski, et al., 20 (2001). "GnRH antagonists: A new generation of long acting analogues incorporating urea funstions at positions 5 and 6", J. Med. Chem. 44(3):453-467. A clivagem, desproteção, ciclização e purificação do péptido é efectuada tal como no Exemplo 1. O péptido cíclico purificado tem a fórmula: I-:-1 (cyclo 3-14)DOTA-Cpa-D-Cys-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-NH2.

Tem um grau de pureza de CZE de cerca de 98%. O péptido é referido como péptido n° 3. A análise MS mostra uma [M+H]+ de massa de 1525,68 Da, que se compara favoravelmente com o valor calculado de 1525,58 Da.

Exemplo 4 A síntese descrita no Exemplo 1 é repetida com uma mudança, em vez de pCl-Phe, no terminal-N, é usado pNC>2-Phe. A clivagem, desproteção, ciclização e purificação do péptido é efectuada tal como no Exemplo 1. O péptido cíclico purificado tem a fórmula: (cyclo 3*14)DOTA-pN02-Phe-D-Cys-Tyr-D-4Aph(Cbm)-LyS'Thr-Cys- 2Nal-NH2.

Tem um grau de pureza de CZE de cerca de 98%. É referido como péptido n° 4. A análise MS mostra uma [M+H]+ de massa de 1594,17 Da, que se compara favoravelmente com o valor calculado de 1594,65 Da.

Exemplo 5 A síntese inicial descrita no Exemplo 1 é repetida com uma variação; é usado Aph(Hor) em vez de Tyr na posição 7 para 1 Δ 5 (5 i i 12 13 proporcionar o octapéptido-resina: resina des-AA ' ' ' ' ' ' 21 [Cpa2, D-Cys3, 4Aph (Hor)7, D-Aph(Cbm)8, Lys (Fmoc) 9]-SRIF-2Nal-MBHA. As reações são então realizadas como descrito no Exemplo 2, resultando em DOT A-des-AA1,4,5'6'11,12'13 [Cpa2, D-Cys3, 4Aph(Hor)7, D-Aph (Cbm) 8]-SRIF-2Nal-NH2, que tem a fórmula: (cyclo 3 - Í 4)DOTA-Cpa-D-Cys-4Aph(Hor)~D'Aph(Cbm)'Lys-

Thr-cJ^Nal-NHj. A pureza do péptido conjugado cíclico final DOTA foi determinada por CZE analítico para ser cerca de 98% puro. É referido como o péptido n° 5. A análise MS mostra uma [M+H]+ de massa de 1722,56 Da, que se compara favoravelmente com o valor calculado de 1722,65 Da.

Exemplo 6 A síntese descrita no Exemplo 5 é repetida, substituindo D-Tyr por 2Nal na extremidade C-terminal. A clivagem, desproteção, ciclização e purificação do péptido é efectuada tal como no Exemplo 1. 0 péptido cíclico purificado tem a fórmula: (cyclo 3- i-—--í 14)DOTA-Cpa-D-Cys-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-D-Tyr-NH2.

Tem um grau de pureza de CZE de cerca de 98%. É referido como o péptido n° 6. A análise MS mostra uma [M+H]+ de massa de 1688,83 Da, que se compara favoravelmente com o valor calculado de 1688,64 Da.

Exemplo 7 A síntese descrita no Exemplo 4 é repetida substituindo D-Tyr por 2Nal na extremidade C-terminal. A clivagem, 22 desproteção, ciclização e purificação do péptido é efectuada tal como no Exemplo 1. 0 péptido cíclico purificado tem a fórmula: (cyclo 3- i4)D0TA-pN02-Phe-D-Cys-Tyr-D-4Aph(Cbm>Lys-Thr-Cys-D.Tyr-NH2.

Tem um grau de pureza de CZE de cerca de 98%. É referido como o péptido n° 7. A análise MS mostra uma [M+H]+ de massa de 1560, 63 Da, que se compara favoravelmente com o valor calculado de 1560,83 Da.

Exemplo 8 A síntese descrita no Exemplo 7 é repetida com duas alterações; ITyr é utilizado na posição 7 e D-Trp é utilizado na posição 8 para proporcionar o octapéptido-resina: resina des-AA1,4,5'6'11'12'13 [pN02-Phe2, D-Cys3, ITyr7, D-Trp8, Lys(Fmoc)9] -SRIF-D-Tyr-MBHA.

Após clivagem do péptido a partir da resina como a amida e realizadas as reações tal como geralmente descrito no Exemplo 2, obtém-se o péptido possuindo a fórmula: (cyclo i-1 3-14)D0TA-pN02-Phe-D-Cys-ITyr-D-Trp-Lys-Thr-Cy$*D-Tyr-NH2, A pureza do péptido conjugado cíclico final DOTA foi determinada por CZE analítico para ser cerca de 98% puro. É referido como o péptido n° 8. A análise MS mostra uma [M+H]+ de massa de 1667,74 Da, que se compara favoravelmente com o valor calculado de 1667,52 Da. 23

Bio ensaio in vitro: Os efeitos dos vários análogos de somatostatina são testados in vitro quanto à sua capacidade para se ligarem aos receptores clonados isolados expressos em células CH0-K1 e células CCL39. As células CH0-K1 são cultivadas em meio de Ham F-12 e as células CCL39 são cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco mistura de Ham/F-12 (1:1), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina, em ar humidificado contendo 5% de C02 a 37 °C. A clonagem molecular dos genes que codificam múltiplos subtipos de receptores de somatostatina permite a expressão individual destes receptores em células de mamiferos e a caracterização dos seus respectivos perfis farmacológicos. Cinco desses subtipos de receptores, denominados por SSTR1 a SSTR5, têm sido clonados e estão descritos e discutidos em Raynor et al., Molecular Pharmacology, 43, 838-844 (1993) e em Raynor et al., Molecular Pharmacology, 44, 385-392 (1993). Estas referências descrevem ensaios de ligação que podem ser usados para determinar se certos análogos SRIF se ligam seletivamente a um ou mais dos 5 receptores tipo e também se ligam a esses receptores tipo, com alta ou baixa afinidade. Porque estes receptores tipo já tem sido geralmente caracterizados no que diz respeito aos seus perfis farmacológicos, o conhecimento dos resultados de tais estudos de ligação, em conjunto com o conhecimento dos padrões únicos de distribuição destes receptores no corpo indicam que cada subtipo de receptor pode mediar distintos mas sobrepostos efeitos fisiológicos de SRIF. Como resultado, os compostos que se ligam seletivamente aos receptores SSTR2, por exemplo, podem ser utilizados para modular a função fisiológica particular de 24 SRIF sem terem um efeito potencialmente indesejável, resultante de uma outra função fisiológica de SRIF que é mediado por outros receptores de SRIF.

As células são lavadas duas vezes e raspadas em 0,05 M de Tris-HCl gelado (pH 7,4), recolhidas por centrifugação e homogeneizadas utilizando um sistema rotor/estator no mesmo tampão. Após a centrifugação a 120 g durante 5 min a 4°C, o sobrenadante é recolhido e centrifugado novamente a 48000 g durante 30 min a 4°C. O sedimento resultante é ressuspenso em tampão Tris arrefecido em gelo, transferido para um tubo de microcentrifugação e centrifugado a 20000 g durante 15 min a 4°C. Após a retirada do sobrenadante, o sedimento de membrana é armazenado a -80°C. A autorradiografia do receptor é realizada em secções criostáticas de 20 ym de espessura do sedimento de membrana, montadas em lâminas de microscópio e depois armazenadas a -20°C. Para cada um dos compostos testados, as experiências de deslocamento completo são realizadas com o radioligando universal de somatostatina, o ligando de somatostatina 28 125I-[Leu8, D-Trp22, Tyr25] , que se liga com forte afinidade para todos os cinco receptores. Concentrações crescentes do péptido não marcado são utilizadas numa gama de 0, 1-1000 nM. A somatostatina 28 não marcada é executada em paralelo usando as mesmas concentrações crescentes, como um controlo. Os valores de IC50 são calculados após quantificação dos resultados, utilizando um sistema de processamento de imagem assistido por computador como é conhecido nesta técnica. As concentrações de 100 nM, péptido n° 1 têm efeitos minimos sobre a ligação do radioligando SRIF 28 para SSTR1, SSTR3, SSTR4 e SSTR5. Em contraste, é seletivamente ligado a 25 SSTR2, deslocando a ligação do radioligando ao SSTR2 humano com um valor de IC50 de cerca de 1,8 nM.

As potências de certos análogos SRIF para inibir a ligação do radioligando 125I-[Leu8, D- Trp, Tyr 24] SRIF 28 para os vários receptores de SRIF humanos clonados são mostradas na tabela a seguir, em que os valores de IC50 são apresentados na concentração nanomolar. Os números entre parênteses indicam o número de vezes que o teste de ligação especifica foi realizado. 26 TABELA.

Composto IC5o (nM) hSSTRl hSSTR2 hSSTR3 hSSTR4 hSSTR5 Péptido n° 1 >1,000 1,8±0,2 >1,000 >1,000 >1,000 406-034-15 (2) (3) (2) (2) (2) Péptido n° 2 >1,000 (3) 9,4±1,6 (3) >1,000 (2) 8161114 (3) >1,000 (3) 363-246-15 Péptido n° 3 363-300-15 >1,000 (2) 230,-219 (2) >1,000 (2) >1,000 (2) >1,000 (2) Péptido n° 4 >1,000 1,5±0 (2) >1,000 >1,000 >1,000 406-032-20 (2) (2) (2) (2) Péptido n° 5 >1,000 1,7±0,3 >1,000 >1,000 >1,000 363-298-15 (2) (3) (2) (2) (2) Péptido n° 6 >1,000 0,6±0,05 >1,000 >1,000 >1,000 406-094-15 (2) (2) (2) (2) (2) Péptido n° 7 >1,000 0,53±0,06 >1,000 >1,000 >1,000 406-092-15 (2) (2) (2) (2) (2) Péptido n° 8 >1,000 1,0210,88 >1,000 4931206 >1,000 406-090-15 (2) (2) (2) (2) (2)

Além disso, todos os péptidos testados e relatados na Tabela acima não mostraram internalização significativa nas células, enquanto antagonizavam a internalização octreotida induzida. Os péptidos n°s 1 e 4 a 8 exibiram muito boas propriedades de ligação e propriedades tumorais alvo excelentes in vivo, ou seja, grande absorção nos tumores sst2 a 4h e 24 h, e excelentes em relação ao tumor do rim; assim a absorção do tumor pode ser bloqueada por um excesso 27 de péptido frio.

Os péptidos da presente invenção não só proporcionam mais ligandos seletivos para a ligação SSTR2, mas a utilização de péptidos marcados, por exemplo, uma versão do péptido radiomarcado n° 1, facilita o rastreio de fármacos para os antagonistas mais eficazes. Os ensaios de rastreio, tal como é bem conhecido na técnica que utilizam o receptor de polipéptido SSTR2 diretamente a partir do hospedeiro recombinante, podem ser usados para identificar agentes úteis para bloquear ou imitar determinados aspectos da somatostatina como desejado, eliminando os aspectos indesejáveis da hormona que podem surgir da ativação ou do bloqueio de outros receptores. A este respeito, se um análogo radioiodado é desejável para fins de rastreio, Tyr pode ser adicionado ao terminal N em vez de DOTA, ou Tyr pode ser utilizado na posição 2 em vez de Cpa, ou um radioligando adequado pode ser ligado por um DOTA quelante. Ensaios de ligação competitiva com os compostos candidatos podem ser primeiro realizados desta maneira com SSTR2 para procurar por elevada afinidade de ligação; em seguida, por rastreio de múltiplos receptores de SRIF, pode ser confirmado se havia uma ligação seletiva de apenas este receptor, como desejado. Péptidos não marcados da invenção podem ser usados para tratar doenças em todos os órgãos que se sabe expressarem SSTR2, incluindo o pulmão, trato gastrointestinal e rins.

Uma vez que, como demonstrado acima, as adições ao terminal N do SRIF analógico não parecem afectar negativamente a ligação seletiva, deve ficar claro que estes compostos podem ser complexados com um nuclideo radioativo com o objectivo de levar o agente a um tumor ou outro tecido para 28 o qual é desejada a apoptose. Por exemplo, os agentes quelantes adequados, tais como DOTA ou DTPA, ou outros, podem ser utilizados para complexar o SRIF análogo com um metal altamente radioativo tal como anteriormente indicado. Alguns exemplos de grupos quelantes adequados para a quelação de um átomo de metal radioativo são agentes quelantes tetradentados ou grupos derivados de ácido etileno diamino tetra-acético (EDTA), ácido triamina penta-acético dietileno (DTPA), ácido ciclo-hexil-1,2-diamina tetra-acético (CDTA), ácido etilenoglicol-0,0'-bis (2- aminoetil)-N,N,N',N'-tetra-acético (EGTA), ácido N,N-bis (hidroxibenzil)-etilenodiamina-N,N'-diacético (HBED), ácido trietileno tetramina hexa-acético (TTHA), ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,N',N",N"-tetra-acético (DOTA), ácido hidroxietildiamina triacético (HEDTA), ácido 1,4,8,ll-tetraazaciclo-tetradecano-N,N',N",N"'-tetra-acético (TETA), DTPA substituído, EDTA substituído. Outros agentes quelantes, bem como agentes radioativos, são revelados na WO 95/22341 e WO 04/082722 e em Publicações de Patente US 2004/0242842 e 2005/0070470, cujas descrições são aqui incorporadas por referência. Quelantes preferidos são derivados a partir de EDTA e DOTA. Alguns sais adequados são o 111In-oxinato e o 99mTc-tartarato, que geralmente podem ser formados de uma maneira simples, sob condições que não sejam prejudiciais para o antagonista péptido, e o 99mTc (CO)3 pode ser acoplado através de um Tyr ou tridendete quelante adequado.

Se desejado, a solubilidade dos antagonistas SRIF pode ser melhorada através da acilação do grupo amino N-terminal usando um composto hidrófilo, tal como o ácido hidroorótico (Hor) ou semelhante, ou por reação com um isocianato adequado, tal como isocianato de metilo ou o 29 isopropilisocianato, para criar uma porção de ureia na extremidade N-terminal. Outros agentes podem também ser ligados no terminal-N, o que irá aumentar a duração da ação do antagonista SRIF como é conhecido nesta técnica.

Estes antagonistas SRIF ou sais não tóxicos dos mesmos, combinados com um transportador farmacêutica ou veterinariamente aceitável para formar uma composição farmacêutica, podem ser administrados a animais, incluindo seres humanos e outros mamíferos, quer por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, percutânea, por exemplo, por via intranasal, intracerebroespinal ou oral. Tal composição farmacêutica destinada a ser utilizada para a detecção de tumores malignos humanos, incluindo as metástases dos mesmos, em tecidos podem incluir, para além de um material transportador farmaceuticamente aceitável, e um adjuvante farmaceuticamente aceitável facultativo, o antagonista de péptido marcado como substância ativa, numa quantidade suficiente para imagiologia externa, para detecção com uma sonda de detecção gama ou para combater ou controlar tumores. Os antagonistas peptídicos devem ser pelo menos cerca de 90% puro e, de preferência devem ter uma pureza de pelo menos cerca de 98%; no entanto, purezas inferiores são eficazes e podem assim ser usadas com outros mamíferos que não seres humanos. Esta pureza significa que o péptido pretendido constitui a % do peso indicado de todos os péptidos e fragmentos peptídicos presentes. A administração aos seres humanos deve estar sob a direção de um médico para combater tumores e cancros específicos ou para mediar outras condições em que os receptores SSTR2 exercem uma função de controlo, tal como o acoplamento de uma tirosina fosfatase de modo que a estimulação desta enzima possa ser realizada para mediar os efeitos anti-proliferativos de 30 SRIF. A dosagem necessária irá variar com a condição particular a ser tratada, com a gravidade do estado e com a duração desejada do tratamento.

Foi recentemente determinado que os tumores expressam frequentemente vários tipos de receptores de peptideos (Reubi, JC; Waser, B. Concomitant expression of several peptide receptors in neuroendocrine tumours; molecular basis for in vivo multireceptor targeting. Eur. J Nucl. Med. Chem. Moleca. Imaging 2003, 30, 781-793). Tais grupos de receptores de péptidos múltiplos podem incluir receptores sst2, bem como receptores de bombesina, receptores de CCK, receptores VIP, receptores de GLP-1, receptores de neurotensina, receptores de secretina, receptores de neuromedina B e receptores de CRF, etc. Em tal caso, a administração de antagonistas de SSTR2, em combinação como um cocktail, com um ou mais antagonistas radiomarcados para estes diferentes receptores deve melhorar substancialmente o direcionamento in vivo de tais tumores.

Tais antagonistas de péptidos são frequentemente administrados na forma de sais não tóxicos, farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis, tais como sais de adição de ácido ou complexos metálicos, por exemplo, com zinco, ferro, cálcio, bário, magnésio, alumínio ou semelhantes. Ilustrativos de tais sais não tóxicos, são o cloridrato, bromidrato, sulfato, fosfato, tanato, oxalato, fumarato, gluconato, alginato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartarato e semelhantes. 31

Também pode ser desejável administrar estes antagonistas SRIF ao longo de periodos de tempo prolongados, por exemplo, por periodos de uma semana a um ano a partir de uma única administração, e liberação lenta, depósito ou formas de dosagem de implantes podem ser utilizados como conhecido na técnica. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não tóxico farmaceuticamente aceitável do composto tendo um baixo grau de solubilidade nos fluidos corporais, por exemplo, um sal de adição de ácido com um ácido polibásico; um sal com um catião metálico polivalente; ou combinação dos dois sais. Um sal relativamente insolúvel pode, também, ser formulado num gel, por exemplo, um gel de estearato de alumínio. A formulação de depósito adequada de libertação lenta para injeção pode conter também um antagonista de SRIF ou um seu sal disperso ou encapsulado num polímero de degradação lenta, não tóxico ou não antigénico, como um polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por exemplo, conforme descrito na Patente US 3773919.

As quantidades terapeuticamente eficazes dos antagonistas de péptidos devem ser administradas sob a orientação de um médico, e as composições farmacêuticas conterão usualmente o péptido em conjunção com um veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável convencional. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é considerada uma quantidade predeterminada calculada para alcançar o efeito desejado. A dosagem necessária irá variar de acordo com o tratamento particular e com a duração do tratamento desejado; no entanto, antecipa-se que dosagens entre cerca de 10 microgramas e cerca de 1 miligrama por quilograma de peso corporal por dia, será usado para o tratamento terapêutico. Pode ser particularmente vantajoso administrar tais 32 compostos na forma de depósito ou de longa duração, tal como descrito anteriormente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é tipicamente uma quantidade de um antagonista SRIF que, quando administrada perifericamente, por exemplo por via intravenosa, numa composição fisiologicamente aceitável, é suficiente para atingir uma concentração no plasma do mesmo a partir de cerca de 0,1 yg/ml a cerca de 100 yg/ml, de preferência desde cerca de 1 yg/ml a cerca de 50 yg/ml, mais preferivelmente pelo menos cerca de 2 yg/ml e normalmente 5 a 10 yg/ml. Nestas quantidades, podem ser usadas para afectar desejavelmente a secreção gástrica.

Quando a composição é para ser usada para imagiologia ou tratamentos terapêuticos, a curta vida de prateleira do composto marcado e/ou curta meia-vida do radionuclideo podem exigir que o utilizador efetue a reação de marcação com o radionuclideo no hospital ou laboratório. Em tais casos, os vários ingredientes da reação podem ser fornecidos ao utilizador sob a forma de um assim chamado "kit". As manipulações necessárias para realizar a reação desejada deve ser tão simples quanto possível para permitir que o utilizador possa preparar a composição radioativa marcada do kit utilizando as instalações que normalmente estariam à sua disposição. Assim, um kit para a preparação de uma composição de radiofarmacêutica, para a detecção e localização de tumores malignos e as suas metástases em tecidos pode compreender (i) um péptido seletivo SSTR2, um transportador inerte farmaceuticamente aceitável e/ou um agente de formulação com adjuvantes opcionais, (ii) uma solução de um sal ou quelato de um isótopo de metal radioativo, e (iii) instruções para o uso com uma prescrição para reagir os ingredientes presentes no kit. 33

De preferência, um antagonista do péptido a ser utilizado como um ingrediente de um tal kit tem sido derivatizado por reação com um agente quelante tal como definido anteriormente. 0 conjugado péptido resultante fornece um mecanismo para prender firmemente o radionuclideo de uma maneira simples. Os agentes quelantes adequados para modificar o péptido foram descritos em detalhe anteriormente. 0 contudo em N ou di-ácidos poliacéticos, ou seus derivados, tais como os compostos mencionados antes, provaram ser pré-eminentemente adequados para a fixação de vários radionuclideos metálicos, tais como o inIn e o 113mIn, com as moléculas de péptidos. 0 kit para ser fornecido ao utilizador pode também compreender outros ingredientes definidos acima, em conjunto com instruções de utilização, enquanto a solução de um sal ou um quelato de radionuclideo tendo uma vida útil limitada, pode ser fornecida ao utilizador separadamente.

Por exemplo, um kit para preparar uma composição de radiofarmacêutica marcada com 99mTc, 186Re ou 188Re pode compreender, para além dos ingredientes definidos em (i) e (ii) acima, um agente redutor e, se desejado, um quelante, e (iii) instruções para utilização, com uma prescrição para reagir os componentes do kit com 99mTc na forma de uma solução de pertecnetato, ou com 186Re ou 188Re na forma de uma solução de perrenato. Se desejado, os vários ingredientes do kit podem ser combinados, desde que sejam compatíveis. 0 kit deve compreender um agente redutor para reduzir o pertecnetato ou perrenato, por exemplo, um ditionito, um agente de redução metálico ou um agente redutor complexo de estabilização, por exemplo, SnCl2, Sn (II)-tartarato, Sn(II)-fosfonato ou -piro-fosfato, ou Sn (II)-glucoheptonato. A solução de pertecnetato ou 34 perrenato pode simplesmente ser obtida a partir de um fornecedor apropriado. Quando o radionuclideo está presente no kit em si, a reação de formação de complexos com o péptido pode ser simplesmente produzida por combinação dos componentes num meio neutro e levados a reagir. Para esse efeito, o radionuclideo pode ser feito reagir com o péptido sob a forma de quelato ligado a um quelante relativamente fraco, tal como descrito anteriormente.

Quando o kit compreende um péptido derivado como definido anteriormente e é destinado para a preparação de uma composição de radiofarmacêutica, marcada com 99mTc, 186Re ou 188Re, o radionuclideo será preferencialmente adicionado separadamente sob a forma de uma solução de pertecnetato ou perrenato. Nesse caso, o kit compreende um agente redutor adequado e, se desejado, um quelante, o primeiro para reduzir o pertecnetato ou perrenato. Como agente redutor pode ser utilizado, por exemplo, um ditionito ou um agente redutor metálico. Os ingredientes podem opcionalmente ser combinados, desde que sejam compatíveis. Um tal kit de monocomponente, na qual os ingredientes combinados são de preferência liofilizados, é excelentemente adequado para ser feito reagir, pelo utilizador, com a solução de radionuclideo. Um agente redutor metálico, por exemplo, Sn (II), Ce (III), Fe(II), Cu(I), Ti (III) ou Sb (III); Sn (II), podem ser utilizados. 0 componente péptido dos kits acima mencionados pode ser fornecido como uma solução, por exemplo, sob a forma de uma solução salina fisiológica, ou uma solução tampão, mas estando de preferência presente num estado seco, por exemplo, na condição de liofilizada. Quando utilizado como um componente de um líquido de injeção deve ser esterilizado, no qual, quando o componente 35 está no estado seco, o utilizador deve utilizar de preferência uma solução salina fisiológica estéril como um solvente. Se desejado, o componente acima mencionado pode ser estabilizado de uma forma convencional com estabilizadores adequados, por exemplo, ácido ascórbico, ácido gentisico ou sais destes ácidos.

Embora a invenção tenha sido descrita em relação às suas concretizações preferidas, as quais constituem o melhor modo atualmente conhecido para os inventores, deve ser entendido que várias alterações e modificações, como será óbvio para um perito na técnica, podem ser feitas sem se afastar do âmbito da invenção que é definido nas reivindicações anexas. Embora as reivindicações variadamente definam a invenção em termos de uma sequência de péptido, deve ser entendido que tal, pretende incluir os seus sais não tóxicos, os quais são bem conhecidos por serem equivalentes completos e que são mais frequentemente administrados.

Tal como aqui utilizado, todas as temperaturas são em °C, e todas as proporções são em volume. As percentagens de materiais liquidos também são em volume. Várias características da invenção são realçadas nas reivindicações que se seguem. 36

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Peptídeo análogo cíclico de somatostatina (SRIF) que se liga seletivamente ao receptor SRIF SSTR2, cujo péptido tem uma das seguintes sequências de aminoácidos em que o terminal C é amidado: Cpa-cyclo[D-Cys-4Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-2Nal· ou Cpa-cyclo[D-Cys-4Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-D'Tyr, em que Cpa significa cloro-Phe, Aph(Hor) significa 4-[(2, 6-dioxo-hexa-hidro-pirimidina-4-carbonil)-amino]-fenilalanina, e Aph(Cbm) significa 4-ureido-fenilalanina.
2. 2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 em que é ligado a uma porção de Cpa (Z) selecionado de entre o grupo constituído por quelantes à base de DOTA, quelantes de à base DTPA, quelantes à base de NOTA, compostos de carbonilo, 2hidrazino nicotinamida, quelantes N4, desferrioxamina e quelantes Nx Sy.
3. 3. Péptido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o quelante DOTA ser covalentemente ligado a Cpa.
4. 4. Composição farmacêutica compreendendo uma mistura de péptido de acordo com a reivindicação 1 e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.